WO2018047657A1 - 脂質の製造方法 - Google Patents

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WO2018047657A1
WO2018047657A1 PCT/JP2017/030759 JP2017030759W WO2018047657A1 WO 2018047657 A1 WO2018047657 A1 WO 2018047657A1 JP 2017030759 W JP2017030759 W JP 2017030759W WO 2018047657 A1 WO2018047657 A1 WO 2018047657A1
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des
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amino acid
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達郎 尾崎
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花王株式会社
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    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/64—Fats; Fatty oils; Ester-type waxes; Higher fatty acids, i.e. having at least seven carbon atoms in an unbroken chain bound to a carboxyl group; Oxidised oils or fats
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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    • C12N9/0071—Oxidoreductases (1.) acting on paired donors with incorporation of molecular oxygen (1.14)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12P7/6445—Glycerides
    • C12P7/6463—Glycerides obtained from glyceride producing microorganisms, e.g. single cell oil
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y114/00—Oxidoreductases acting on paired donors, with incorporation or reduction of molecular oxygen (1.14)
    • C12Y114/19—Oxidoreductases acting on paired donors, with incorporation or reduction of molecular oxygen (1.14) with oxidation of a pair of donors resulting in the reduction of molecular oxygen to two molecules of water (1.14.19)
    • C12Y114/19003—Linoleoyl-CoA desaturase (1.14.19.3)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y114/00—Oxidoreductases acting on paired donors, with incorporation or reduction of molecular oxygen (1.14)
    • C12Y114/19—Oxidoreductases acting on paired donors, with incorporation or reduction of molecular oxygen (1.14) with oxidation of a pair of donors resulting in the reduction of molecular oxygen to two molecules of water (1.14.19)
    • C12Y114/19006—DELTA12-fatty-acid desaturase (1.14.19.6), i.e. oleoyl-CoA DELTA12 desaturase

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing lipids. Moreover, this invention relates to the transformant used for the said method.
  • Fatty acids are one of the main constituents of lipids, and constitute lipids such as triacylglycerol produced by ester bonds with glycerin in vivo. In many animals and plants, fatty acids are also stored and used as energy sources. Fatty acids and lipids stored in animals and plants are widely used for food or industry. For example, long chain fatty acids having 18 or more carbon atoms have different chemical properties depending on the number of carbon atoms and the degree of unsaturation, and are used in various applications.
  • PUFA long-chain polyunsaturated fatty acids
  • EPA eicosapentaenoic acid
  • DHA docosahexaenoic acid
  • acetyl-acyl carrier protein hereinafter also referred to as “ACP”
  • ACP acetyl-acyl carrier protein
  • ⁇ -ketoacyl-ACP synthase hereinafter also referred to as “KAS” is an enzyme involved in chain length control of acyl groups.
  • KAS II is mainly involved in the elongation reaction up to stearoyl-ACP having 18 carbon atoms.
  • the synthesized acyl-ACP is converted into a free fatty acid by an acyl-ACP thioesterase (hereinafter also simply referred to as “TE”) and is carried to the endoplasmic reticulum.
  • TE acyl-ACP thioesterase
  • PUFA is synthesized on the endoplasmic reticulum by a multi-step reaction in which free fatty acids, acyl-CoA, or ester compounds of fatty acids and glycerol are used as substrates and a number of desaturases and elongases act.
  • Non-Patent Document 1 a desaturase derived from an algae belonging to the genus Nannochloropsis, which is a kind of microalgae attracting attention as a next-generation oil and fat production source, can be used for the synthesis of PUFA (Patent Document 1).
  • Patent Document 1 a desaturase derived from an algae belonging to the genus Nannochloropsis, which is a kind of microalgae attracting attention as a next-generation oil and fat production source, can be used for the synthesis of PUFA (Patent Document 1).
  • Non-Patent Documents 1 and 2 a desaturase derived from an algae belonging to the genus Nannochloropsis, which is a kind of microalgae attracting attention as a next-generation oil and fat production source
  • the present invention relates to a method for producing lipids by culturing algae belonging to the genus Nannochloropsis with enhanced expression of ⁇ 12-desaturase and ⁇ 6-desaturase to produce fatty acids or lipids comprising these as constituents.
  • the present invention also provides a fatty acid composition that promotes the expression of ⁇ 12-desaturase and ⁇ 6-desaturase in algae belonging to the genus Nannochloropsis, and increases the proportion of PUFA in the total fatty acids produced in the cells of the algae. It relates to a method of modification.
  • the present invention relates to a transformant of algae belonging to the genus Nannochloropsis, in which the expression of ⁇ 12-desaturase and ⁇ 6-desaturase is promoted.
  • the present invention provides a method for producing lipid, which improves the productivity of PUFA or a lipid comprising the same. Moreover, this invention provides the transformant which improved productivity of PUFA or the lipid which uses this as a structural component.
  • the present inventor has intensively studied the above points. Algae belonging to the genus Nannochloropsis are excellent in the ability to produce PUFAs such as EPA. In addition, in the late stage of algae culture (specifically, conditions where nitrogen and other nutrient sources are depleted), the total fatty acid production increases significantly. However, as a result of detailed examination of the ability of the algae belonging to the genus Nannochloropsis to produce PUFA, the present inventor showed that the production amount of PUFA relative to the production amount of total fatty acid increased as the culture period increased and the production amount of total fatty acid increased. We found that the ratio decreased significantly. Therefore, the present inventor first examined various synthetic pathways of PUFA in algae belonging to the genus Nannochloropsis and tried to identify them.
  • C18: 1 ⁇ 9 oleic acid
  • C18: 2 ⁇ 9,12 linoleic acid
  • C18: 3 ⁇ 6,9,12 ⁇ -linolenic acid
  • the expression of an enzyme that catalyzes the rate-limiting reaction in the PUFA synthesis pathway is promoted, and the production amount of PUFA can be increased. Therefore, according to the lipid production method of the present invention, it is possible to improve the productivity of PUFA or a lipid comprising this as a constituent.
  • the transformant of the present invention is promoted in the expression of an enzyme that catalyzes the rate-limiting reaction in the PUFA synthesis pathway, and is excellent in the productivity of PUFA or a lipid comprising this.
  • lipid refers to neutral lipids (monoacylglycerol (MAG), diacylglycerol (DAG), triacylglycerol (TAG), etc.), waxes, ceramides and other simple lipids; phospholipids, glycolipids, sulfo Complex lipids such as lipids; and derived lipids derived from these lipids, such as fatty acids (free fatty acids), alcohols, hydrocarbons and the like.
  • Fatty acids generally classified as derived lipids refer to the fatty acids themselves, meaning “free fatty acids”.
  • a fatty acid moiety or an acyl group moiety in simple lipid and complex lipid molecules is referred to as “fatty acid residue”.
  • fatty acid is used as a general term for “free fatty acid” and “fatty acid residue”.
  • fatty acid or lipid containing this as a constituent is used generically as “free fatty acid” and “lipid having the fatty acid residue”.
  • the “fatty acid composition” means the weight ratio of each fatty acid to the total fatty acid (total fatty acid) weighted by regarding the free fatty acid and the fatty acid residue as a fatty acid. The weight (production amount) and fatty acid composition of the fatty acid can be measured by the methods used in the examples.
  • Cx: y in the notation of fatty acids and acyl groups constituting fatty acids means that the number of carbon atoms is x and the number of double bonds is y.
  • Cx represents a fatty acid or acyl group having x carbon atoms.
  • identity of a base sequence and an amino acid sequence is calculated by the Lipman-Pearson method (Science, 1985, vol. 227, p. 1435-1441). Specifically, it is calculated by performing an analysis assuming that Unit size to compare (ktup) is 2 using the homology analysis (Search homology) program of genetic information processing software Genetyx-Win.
  • stringent conditions include the method described in Molecular Cloning-A LABORATORY MANUAL THIRD EDITION [Joseph Sambrook, David W. Russell., Cold Spring Harbor Laboratory Press].
  • composition of 1 ⁇ SSC 0.15M sodium chloride, 0.015M sodium citrate, pH 7.0
  • SDS 0.5% SDS
  • 5 ⁇ Denhart 100 mg / mL herring sperm DNA
  • hybridization with the probe at 65 ° C. for 8 to 16 hours.
  • upstream of a gene refers to a region continuing on the 5 ′ side of a gene or region regarded as a target, not a position from the translation start point.
  • downstream indicates a region continuing 3 ′ side of the gene or region captured as a target.
  • FIG. 2 shows a general synthesis route of PUFA in algae and plants.
  • C20: 4 is detected, but stearidonic acid (hereinafter also referred to as “C18: 4 ⁇ 6,9,12,15”) Is hardly detected.
  • the present inventors have identified various desaturases derived from algae belonging to the genus Nannochloropsis. Then, the expression of these desaturases was promoted, and the production amount of PUFA such as EPA was measured. As a result, even if the expression of various desaturases was promoted independently, a large change in the amount of PUFA could not be confirmed. Therefore, further studies were conducted on the synthesis pathway of PUFA in algae belonging to the genus Nannochloropsis.
  • ⁇ 12-desaturase hereinafter also referred to as “ ⁇ 12-DES”
  • ⁇ 6-desaturase hereinafter also referred to as “ ⁇ 6-DES”
  • the ratio of the PUFA amount to the total fatty acid amount is significantly increased as compared with the wild strain.
  • the “rate-determining stage” means that when a dynamic process such as a chemical reaction or a complicated metabolic pathway is composed of several stages, the progress is slow compared to other stages. It is the stage that actually controls the progress of the whole process.
  • ⁇ 12-DES means a protein (enzyme) that catalyzes a reaction that introduces an unsaturated bond at the ⁇ 12 position of C18: 1 ⁇ 9 to produce C18: 2 ⁇ 9,12, which is an ⁇ -6 fatty acid.
  • ⁇ 12-desaturase activity hereinafter also referred to as“ ⁇ 12-DES activity ” means an activity of introducing an unsaturated bond at the ⁇ 12 position of C18: 1 ⁇ 9. Whether a protein has ⁇ 12-DES activity can be confirmed, for example, by a system using a ⁇ 12-DES synthetic gene-deficient strain.
  • ⁇ 12-DES synthetic gene-deficient strain
  • ⁇ 12-DES or a cell disruption solution containing the same is prepared, reacted with a reaction solution containing oleic acid, oleoyl CoA, etc., and a decrease in the amount of oleic acid or an increase in the amount of linoleic acid is measured according to a conventional method. It can be confirmed with.
  • Preferred ⁇ 12-DES in the present invention includes the following proteins (A) to (D).
  • a protein comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1.
  • B A protein comprising an amino acid sequence having 60% or more identity with the amino acid sequence of the protein (A) and having ⁇ 12-desaturase activity.
  • C A protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 45.
  • D A protein comprising an amino acid sequence having 60% or more identity with the amino acid sequence of the protein (C) and having ⁇ 12-desaturase activity.
  • the protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 is ⁇ 12-DES (hereinafter also referred to as “No ⁇ 12-DES”) derived from Nannochloropsis oculata NIES2145 strain, which is an algae belonging to the genus Nannochloropsis.
  • the protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 45 is also referred to as ⁇ 12-DES (hereinafter referred to as “Ng ⁇ 12-DES”) derived from Nannochloropsis gaditana B-31, which is an algae belonging to the genus Nannochloropsis. ).
  • Ng ⁇ 12-DES derived from Nannochloropsis gaditana B-31
  • the identity of the amino acid sequence of protein (C) with respect to the amino acid sequence of protein (A) is 86%. All of the proteins (A) to (D) have ⁇ 12-DES activity.
  • the identity with the amino acid sequence of the protein (A) is preferably 65% or more, more preferably 70% or more, more preferably 75% or more, more preferably 80% The above is more preferable, 85% or more is more preferable, 90% or more is more preferable, 92% or more is more preferable, 95% or more is more preferable, 98% or more is more preferable, and 99% or more is more preferable. Further, as the protein (B), one or more (for example, 1 to 176, preferably 1 to 154, more preferably 1 to 132) amino acid sequences of the protein (A).
  • the identity with the amino acid sequence of the protein (C) is preferably 65% or more, more preferably 70% or more, more preferably 75% or more, more preferably 80%
  • the above is more preferable, 85% or more is more preferable, 90% or more is more preferable, 92% or more is more preferable, 95% or more is more preferable, 98% or more is more preferable, and 99% or more is more preferable.
  • the protein (D) one or more (for example, 1 to 181 or less, preferably 1 to 159 or less, more preferably 1 to 136 or less) in the amino acid sequence of the protein (C) , More preferably 1 to 113, more preferably 1 to 91, more preferably 1 to 68, more preferably 1 to 46, and more preferably 1 to 37 And more preferably 1 to 23, more preferably 1 to 10 and more preferably 1 to 5 amino acids), which are deleted, substituted, inserted or added.
  • an amino acid sequence encoding an enzyme protein does not necessarily indicate enzyme activity unless the sequence of the entire region is conserved, and there are regions that do not affect enzyme activity even if the amino acid sequence changes. It is known to exist. In such a region that is not essential for enzyme activity, the original activity of the enzyme can be maintained even if a mutation such as amino acid deletion, substitution, insertion or addition is introduced. Also in the present invention, a protein having a desired activity and a partially mutated amino acid sequence can be used. Examples of the method for introducing a mutation into an amino acid sequence include a method for introducing a mutation into a base sequence encoding an amino acid sequence. Examples of the method for introducing mutation include site-specific mutagenesis.
  • Specific methods for introducing site-specific mutations include a method using SOE-PCR, an ODA method, a Kunkel method, and the like. Also, commercially available kits such as Site-Directed Mutagenesis System Mutan-SuperExpress Km Kit (Takara Bio), Transformer TM Site-Directed Mutagenesis Kit (Clonetech), KOD-Plus-Mutagenesis Kit (Toyobo) may be used. it can. Moreover, after giving a random gene mutation, the target gene can also be obtained by performing enzyme activity evaluation and gene analysis by an appropriate method.
  • the proteins (A) to (D) can be obtained by ordinary chemical techniques, genetic engineering techniques, and the like.
  • a protein derived from a natural product can be obtained by isolation and purification from Nannochloropsis oculata or Nannochloropsis gaditana.
  • the proteins (A) to (D) can be obtained by artificial chemical synthesis based on the amino acid sequence information shown in SEQ ID NO: 1 or 45.
  • the proteins (A) to (D) may be prepared as recombinant proteins by gene recombination techniques. In the case of producing a recombinant protein, a gene encoding ⁇ 12-DES described later can be used.
  • Nannochloropsis oculata can be obtained from a preservation organization such as a private or public laboratory.
  • Nannochloropsis oculata strain NIES-2145 can be obtained from the National Institute for Environmental Studies (NIES).
  • ⁇ 12-DES gene As a gene encoding the ⁇ 12-DES (preferably any one of the proteins (A) to (D)) (hereinafter also referred to as “ ⁇ 12-DES gene”), the following DNA (a) to (d) A gene consisting of any one of them can be mentioned.
  • A DNA consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 2.
  • B DNA encoding a protein comprising a base sequence having 60% or more identity with the base sequence of DNA (a) and having ⁇ 12-DES activity.
  • C DNA consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 46.
  • D A DNA encoding a protein comprising a nucleotide sequence having 60% or more identity with the DNA (c) and having ⁇ 12-DES activity.
  • the base sequence of SEQ ID NO: 2 is the base sequence of a gene encoding a protein (No ⁇ 12-DES) consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 (hereinafter also referred to as “No ⁇ 12-DES gene”).
  • the base sequence of SEQ ID NO: 46 is the base sequence of a gene encoding a protein (Ng ⁇ 12-DES) consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 45 (hereinafter also referred to as “Ng ⁇ 12-DES gene”).
  • the identity with the base sequence of the DNA (a) is preferably 65% or more, more preferably 70% or more, more preferably 75% or more, more preferably 80%
  • the above is more preferable, 85% or more is more preferable, 90% or more is more preferable, 92% or more is more preferable, 95% or more is more preferable, 98% or more is more preferable, and 99% or more is more preferable.
  • the DNA (b) one or more (for example, 1 or more and 527 or less, preferably 1 or more and 461 or less, more preferably 1 or more and 396 or less) in the base sequence of the DNA (a) Preferably from 1 to 330, more preferably from 1 to 264, more preferably from 1 to 198, more preferably from 1 to 132, more preferably from 1 to 106, and more Preferably 1 or more and 66 or less, more preferably 1 or more and 27 or less, more preferably 1 or more and 14 or less) bases have been deleted, substituted, inserted or added, and ⁇ 12-DES activity
  • the DNA (b) is also preferably a DNA that hybridizes with a DNA comprising a base sequence complementary to the DNA (a) under stringent conditions and encodes a protein having ⁇ 12-DES activity.
  • the identity with the base sequence of the DNA (c) is preferably 65% or more, more preferably 70% or more, more preferably 75% or more, more preferably 80%
  • the above is more preferable, 85% or more is more preferable, 90% or more is more preferable, 92% or more is more preferable, 95% or more is more preferable, 98% or more is more preferable, and 99% or more is more preferable.
  • ⁇ 6-DES refers to a protein (enzyme) that catalyzes a reaction that introduces an unsaturated bond at the ⁇ 6 position of C18: 2 ⁇ 9,12 to produce C18: 3 ⁇ 6,9,12.
  • ⁇ 6-desaturase activity hereinafter also referred to as“ ⁇ 6-DES activity ” means an activity of introducing an unsaturated bond at the ⁇ 6 position of C18: 2 ⁇ 9,12. Whether a protein has ⁇ 6-DES activity can be confirmed, for example, by a system using a ⁇ 6-DES synthetic gene-deficient strain.
  • ⁇ 6-DES DNA linked with a gene encoding the protein downstream of a promoter that functions in the host cell into a ⁇ 6-DES synthetic gene-deficient strain and examining the production of ⁇ -linolenic acid.
  • ⁇ 6-DES or a cell disruption solution containing the same is prepared and reacted with a reaction solution containing linoleic acid, linoleoyl CoA, etc., and a decrease in the amount of linoleic acid or an increase in the amount of ⁇ -linolenic acid is measured according to a conventional method. This can be confirmed.
  • Preferred ⁇ 6-DES in the present invention includes the following proteins (E) to (H).
  • E A protein comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3.
  • F A protein comprising an amino acid sequence having 60% or more identity with the amino acid sequence of the protein (E) and having ⁇ 6-desaturase activity.
  • G A protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 47.
  • H A protein comprising an amino acid sequence having 60% or more identity with the amino acid sequence of the protein (G) and having ⁇ 6-desaturase activity.
  • the protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 is ⁇ 6-DES (hereinafter also referred to as “No ⁇ 6-DES”) derived from Nannochloropsis oculata strain NIES2145.
  • the protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 47 is ⁇ 6-DES (hereinafter also referred to as “Ng ⁇ 6-DES”) derived from Nannochloropsis gadytana B-31 strain.
  • Ng ⁇ 6-DES derived from Nannochloropsis gadytana B-31 strain.
  • the identity of the amino acid sequence of the protein (G) with respect to the amino acid sequence of the protein (E) is 89%. All of the proteins (E) to (H) have ⁇ 6-DES activity.
  • the identity with the amino acid sequence of the protein (E) is preferably 65% or more, more preferably 70% or more, more preferably 75% or more, more preferably 80%
  • the above is more preferable, 85% or more is more preferable, 90% or more is more preferable, 92% or more is more preferable, 95% or more is more preferable, 98% or more is more preferable, and 99% or more is more preferable.
  • amino acid sequences of the protein (E) More preferably 1 to 119, more preferably 1 to 95, more preferably 1 to 72, more preferably 1 to 48, and more preferably 1 to 38 And more preferably 1 to 24, more preferably 1 to 10, and more preferably 1 to 5 amino acids), which are deleted, substituted, inserted or added.
  • the identity with the amino acid sequence of the protein (G) is preferably 65% or more, more preferably 70% or more, more preferably 75% or more, more preferably 80%
  • the above is more preferable, 85% or more is more preferable, 90% or more is more preferable, 92% or more is more preferable, 95% or more is more preferable, 98% or more is more preferable, and 99% or more is more preferable.
  • amino acid sequence of the protein (G) More preferably 1 to 119, more preferably 1 to 95, more preferably 1 to 72, more preferably 1 to 48, and more preferably 1 to 38 And more preferably 1 to 24, more preferably 1 to 10, and more preferably 1 to 5 amino acids), which are deleted, substituted, inserted or added.
  • amino acid sequence of the protein (G) More preferably 1 to 119, more preferably 1 to 95, more preferably 1 to 72, more preferably 1 to 48, and more preferably 1 to 38 And more preferably 1 to 24, more preferably 1 to 10, and more preferably 1 to 5 amino acids
  • the proteins (E) to (H) can be obtained by ordinary chemical techniques, genetic engineering techniques, and the like.
  • a protein derived from a natural product can be obtained by isolation and purification from Nannochloropsis oculata or Nannochloropsis gaditana.
  • the proteins (E) to (H) can be obtained by artificial chemical synthesis based on the amino acid sequence information shown in SEQ ID NO: 3 or 47.
  • the proteins (E) to (H) may be produced as recombinant proteins by gene recombination techniques. When producing a recombinant protein, a gene encoding ⁇ 6-DES described later can be used.
  • ⁇ 6-DES gene As a gene encoding the ⁇ 6-DES (preferably any one of the proteins (E) to (H)) (hereinafter also referred to as “ ⁇ 6-DES gene”), the following DNA (e) to (h) A gene consisting of any one of them is mentioned.
  • E DNA consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 4.
  • F DNA encoding a protein comprising a nucleotide sequence having 60% or more identity with the nucleotide sequence of the DNA (e) and having ⁇ 6-DES activity.
  • G DNA consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 48.
  • H A DNA encoding a protein having a base sequence having 60% or more identity with the base sequence of the DNA (g) and having ⁇ 6-DES activity.
  • the base sequence of SEQ ID NO: 4 is the base sequence of a gene encoding a protein (No ⁇ 6-DES) consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 (hereinafter also referred to as “No ⁇ 6-DES gene”).
  • the base sequence of SEQ ID NO: 48 is the base sequence of a gene encoding a protein (Ng ⁇ 6-DES) consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 47 (hereinafter also referred to as “Ng ⁇ 6-DES gene”).
  • the identity with the base sequence of the DNA (e) is preferably 65% or more, more preferably 70% or more, more preferably 75% or more, more preferably 80% The above is more preferable, 85% or more is more preferable, 90% or more is more preferable, 92% or more is more preferable, 95% or more is more preferable, 98% or more is more preferable, and 99% or more is more preferable.
  • the DNA (f) one or more (for example, 1 or more and 570 or less, preferably 1 or more and 499 or less, more preferably 1 or more and 428 or less, more in the base sequence of the DNA (e), Preferably from 1 to 357, more preferably from 1 to 285, more preferably from 1 to 214, more preferably from 1 to 143, more preferably from 1 to 114, more Preferably 1 or more and 72 or less, more preferably 1 or more and 29 or less, more preferably 1 or more and 15 or less) bases have been deleted, substituted, inserted or added, and ⁇ 6-DES activity
  • the DNA (f) is also preferably a DNA that hybridizes with a DNA comprising a base sequence complementary to the DNA (e) under stringent conditions and encodes a protein having ⁇ 6-DES activity.
  • the identity with the base sequence of the DNA (g) is preferably 65% or more, more preferably 70% or more, more preferably 75% or more, more preferably 80% The above is more preferable, 85% or more is more preferable, 90% or more is more preferable, 92% or more is more preferable, 95% or more is more preferable, 98% or more is more preferable, and 99% or more is more preferable.
  • a DNA encoding a protein having Furthermore, as the DNA (h), a DNA that hybridizes with a DNA comprising a base sequence complementary to the DNA (g) under a stringent condition and encodes a protein having ⁇ 6-DES activity is also preferable.
  • ⁇ 3-DES ⁇ 3-desaturase
  • ⁇ 3-DES refers to EPA (hereinafter referred to as “ ⁇ -3 fatty acid”) by introducing an unsaturated bond at the ⁇ 3 position of C20: 4 ⁇ 5,8,11,14.
  • ⁇ 3-desaturase activity refers to the activity of introducing an unsaturated bond at the ⁇ 3 position of C20: 4 ⁇ 5,8,11,14. Means.
  • ⁇ 3-DES activity refers to the activity of introducing an unsaturated bond at the ⁇ 3 position of C20: 4 ⁇ 5,8,11,14. Means.
  • a protein has ⁇ 3-DES activity can be confirmed, for example, by a system using a ⁇ 3-DES synthetic gene-deficient strain. Alternatively, it can be confirmed by introducing DNA linked with a gene encoding the protein downstream of a promoter that functions in the host cell into a ⁇ 3-DES synthetic gene-deficient strain and examining the production of EPA. Alternatively, ⁇ 3-DES or a cell disruption solution containing this is prepared and reacted with a reaction solution containing an arachidonic acid derivative (such as a thioester compound with CoA or an ester compound with glycerol), and the amount of arachidonic acid is reduced according to a conventional method. Or it can be confirmed by measuring the increase in the amount of EPA.
  • an arachidonic acid derivative such as a thioester compound with CoA or an ester compound with glycerol
  • Preferred ⁇ 3-DES in the present invention includes the following proteins (I) to (L).
  • the protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5 is ⁇ 3-DES (hereinafter also referred to as “No ⁇ 3-DES”) derived from Nannochloropsis oculata strain NIES2145.
  • the protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 49 is ⁇ 3-DES (hereinafter also referred to as “Ng ⁇ 3-DES”) derived from Nannochloropsis gadytana CCMP526 strain.
  • Ng ⁇ 3-DES derived from Nannochloropsis gadytana CCMP526 strain.
  • the identity of the amino acid sequence of protein (K) with respect to the amino acid sequence of protein (I) is 82%. All of the proteins (I) to (L) have ⁇ 3-DES activity.
  • the identity with the amino acid sequence of the protein (I) is preferably 65% or more, more preferably 70% or more, more preferably 75% or more, more preferably 80%
  • the above is more preferable, 85% or more is more preferable, 90% or more is more preferable, 92% or more is more preferable, 95% or more is more preferable, 98% or more is more preferable, and 99% or more is more preferable.
  • the protein (J) one or more (for example, 1 or more and 164 or less, preferably 1 or more and 144 or less, more preferably 1 or more and 123 or less) in the amino acid sequence of the protein (I) 1 or more, 103 or less, more preferably 1 or more and 82 or less, more preferably 1 or more and 62 or less, more preferably 1 or more and 41 or less, more preferably 1 or more and 33 or less. And more preferably 1 to 21 or less, more preferably 1 to 9 or less, and more preferably 1 to 5 or less amino acids) deleted, substituted, inserted or added.
  • the identity with the amino acid sequence of the protein (K) is preferably 65% or more, more preferably 70% or more, more preferably 75% or more, more preferably 80%
  • the above is more preferable, 85% or more is more preferable, 90% or more is more preferable, 92% or more is more preferable, 95% or more is more preferable, 98% or more is more preferable, and 99% or more is more preferable.
  • the protein (L) one or more (for example, 1 or more and 163 or less, preferably 1 or more and 143 or less, more preferably 1 or more and 123 or less) in the amino acid sequence of the protein (K) , More preferably 1 to 102, more preferably 1 to 82, more preferably 1 to 62, more preferably 1 to 41, and more preferably 1 to 33 And more preferably 1 to 21 or less, more preferably 1 to 9 or less, and more preferably 1 to 5 or less amino acids) deleted, substituted, inserted or added.
  • the method for introducing a mutation into the amino acid sequence include the methods described above for ⁇ 12-DES.
  • the proteins (I) to (L) can be obtained by ordinary chemical techniques, genetic engineering techniques, and the like.
  • a protein derived from a natural product can be obtained by isolation and purification from Nannochloropsis oculata or Nannochloropsis gaditana.
  • the proteins (I) to (L) can be obtained by artificial chemical synthesis based on the amino acid sequence information shown in SEQ ID NO: 5 or 49.
  • the proteins (I) to (L) may be prepared as recombinant proteins by gene recombination techniques. In the case of producing a recombinant protein, a gene encoding ⁇ 3-DES, which will be described later, can be used.
  • ⁇ 3-DES gene As a gene encoding the ⁇ 3-DES (preferably any one of the proteins (I) to (L)) (hereinafter also referred to as “ ⁇ 3-DES gene”), the following DNA (i) to (l) A gene consisting of any one of them can be mentioned.
  • K DNA consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 50.
  • (L) A DNA encoding a protein having a base sequence having 60% or more identity with the base sequence of DNA (k) and having ⁇ 3-DES activity.
  • the base sequence of SEQ ID NO: 6 is the base sequence of a gene encoding a protein (No ⁇ 3-DES) consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5 (hereinafter also referred to as “No ⁇ 3-DES gene”).
  • the base sequence of SEQ ID NO: 50 is the base sequence of gene c encoding a protein (Ng ⁇ 3-DES) consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 49.
  • the identity with the base sequence of the DNA (i) is preferably 65% or more, more preferably 70% or more, more preferably 75% or more, more preferably 80%
  • the above is more preferable, 85% or more is more preferable, 90% or more is more preferable, 92% or more is more preferable, 95% or more is more preferable, 98% or more is more preferable, and 99% or more is more preferable.
  • the DNA (j) one or more (for example, 1 or more and 494 or less, preferably 1 or more and 432 or less, more preferably 1 or more and 370 or less, more in the base sequence of the DNA (i), Preferably from 1 to 309, more preferably from 1 to 247, more preferably from 1 to 185, more preferably from 1 to 124, more preferably from 1 to 99, more Preferably 1 to 62, more preferably 1 to 25, and more preferably 1 to 13) bases have been deleted, substituted, inserted or added, and ⁇ 3-DES activity
  • the DNA (j) is also preferably a DNA that hybridizes with a DNA comprising a base sequence complementary to the DNA (i) under stringent conditions and encodes a protein having ⁇ 3-DES activity.
  • the identity with the base sequence of the DNA (k) is preferably 65% or more, more preferably 70% or more, more preferably 75% or more, more preferably 80%
  • the above is more preferable, 85% or more is more preferable, 90% or more is more preferable, 92% or more is more preferable, 95% or more is more preferable, 98% or more is more preferable, and 99% or more is more preferable.
  • the DNA (l) one or more (for example, 1 or more and 490 or less, preferably 1 or more and 429 or less, more preferably 1 or more and 368 or less, and more in the base sequence of the DNA (k) Preferably from 1 to 306, more preferably from 1 to 245, more preferably from 1 to 184, more preferably from 1 to 123, more preferably from 1 to 98, more Preferably 1 to 62, more preferably 1 to 25, and more preferably 1 to 13) bases have been deleted, substituted, inserted or added, and ⁇ 3-DES activity
  • a DNA encoding a protein having Further, as the DNA (l), a DNA that hybridizes with a DNA comprising a base sequence complementary to the DNA (k) under stringent conditions and encodes a protein having ⁇ 3-DES activity is also preferable.
  • ⁇ 5-desaturase in addition to ⁇ 12-DES and ⁇ 6-DES, the expression of ⁇ 5-desaturase (hereinafter also referred to as “ ⁇ 5-DES”) is preferably promoted.
  • ⁇ 5-DES means that an unsaturated bond is introduced at the ⁇ 5 position of dihomo- ⁇ -linolenic acid (hereinafter also referred to as “C20: 3 ⁇ 8,11,14”) as shown in FIG.
  • C20: 3 ⁇ 8,11,14 dihomo- ⁇ -linolenic acid
  • a protein (enzyme) that catalyzes the reaction that produces C20: 4 ⁇ 5,8,11,14.
  • ⁇ 5-desaturase activity (hereinafter also referred to as“ ⁇ 5-DES activity ”” ”means the activity of introducing an unsaturated bond at the ⁇ 5 position of C20: 3 ⁇ 8,11,14.
  • ⁇ 5-DES activity the continuous reaction catalyzed by ⁇ 12-DES and ⁇ 6-DES resulted in C18: 3 ⁇ 6,9,12 and C18: 3 ⁇ 6,
  • the amount of C20: 3 ⁇ 8,11,14 synthesized by extending the carbon chain by 9 and 12 by 2 is increased.
  • ⁇ 5-DES or a cell disruption solution containing the same is prepared and reacted with a reaction solution containing a dihomo- ⁇ -linolenic acid derivative (thioester compound with CoA, ester compound with glycerol, etc.), and dihomo according to a conventional method. This can be confirmed by measuring a decrease in the amount of - ⁇ -linolenic acid or an increase in the amount of arachidonic acid.
  • Preferred ⁇ 5-DES in the present invention includes the following proteins (M) to (P).
  • M A protein comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 7.
  • N A protein comprising an amino acid sequence having 60% or more identity with the amino acid sequence of the protein (M) and having ⁇ 5-desaturase activity.
  • O A protein comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 51.
  • P A protein comprising an amino acid sequence having 60% or more identity with the amino acid sequence of the protein (O) and having ⁇ 5-desaturase activity.
  • the protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 7 is ⁇ 5-DES (hereinafter also referred to as “No ⁇ 5-DES”) derived from Nannochloropsis oculata strain NIES2145.
  • the protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 51 is ⁇ 5-DES (hereinafter also referred to as “Ng ⁇ 5-DES”) derived from Nannochloropsis gadytana B-31 strain.
  • Ng ⁇ 5-DES derived from Nannochloropsis gadytana B-31 strain.
  • the identity of the amino acid sequence of the protein (O) with respect to the amino acid sequence of the protein (M) is 81%. All of the proteins (M) to (P) have ⁇ 5-DES activity.
  • the identity with the amino acid sequence of the protein (M) is preferably 65% or more, more preferably 70% or more, more preferably 75% or more, more preferably 80%
  • the above is more preferable, 85% or more is more preferable, 90% or more is more preferable, 92% or more is more preferable, 95% or more is more preferable, 98% or more is more preferable, and 99% or more is more preferable.
  • the protein (N) one or more (for example, 1 or more and 211 or less, preferably 1 or more and 185 or less, more preferably 1 or more and 158 or less) in the amino acid sequence of the protein (M) 1 or more, 132 or less, more preferably 1 or more and 106 or less, more preferably 1 or more and 79 or less, more preferably 1 or more and 53 or less, more preferably 1 or more and 43 or less. And more preferably 1 to 27, more preferably 1 to 11, and more preferably 1 to 6 amino acids), which are deleted, substituted, inserted or added.
  • the identity with the amino acid sequence of the protein (O) is preferably 65% or more, more preferably 70% or more, more preferably 75% or more, more preferably 80%
  • the above is more preferable, 85% or more is more preferable, 90% or more is more preferable, 92% or more is more preferable, 95% or more is more preferable, 98% or more is more preferable, and 99% or more is more preferable.
  • amino acid sequences of the protein (O) More preferably 1 to 129, more preferably 1 to 103, more preferably 1 to 78, more preferably 1 to 52, more preferably 1 to 42 And more preferably 1 to 26, more preferably 1 to 11, and more preferably 1 to 6 amino acids), which are deleted, substituted, inserted or added.
  • amino acid sequences of the protein (O) More preferably 1 to 129, more preferably 1 to 103, more preferably 1 to 78, more preferably 1 to 52, more preferably 1 to 42 And more preferably 1 to 26, more preferably 1 to 11, and more preferably 1 to 6 amino acids
  • the proteins (M) to (P) can be obtained by ordinary chemical techniques, genetic engineering techniques, and the like.
  • a protein derived from a natural product can be obtained by isolation and purification from Nannochloropsis oculata or Nannochloropsis gaditana.
  • the proteins (M) to (P) can be obtained by artificial chemical synthesis based on the amino acid sequence information shown in SEQ ID NO: 7 or 51.
  • the proteins (M) to (P) may be prepared as recombinant proteins by gene recombination techniques. In the case of producing a recombinant protein, a gene encoding ⁇ 5-DES described later can be used.
  • ⁇ 5-DES gene As a gene (hereinafter also referred to as “ ⁇ 5-DES gene”) encoding the ⁇ 5-DES (preferably any one of the proteins (M) to (P)), the following DNA (m) to (p): A gene consisting of any one of them can be mentioned.
  • M DNA consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 8.
  • N A DNA encoding a protein comprising a base sequence having 60% or more identity with the base sequence of the DNA (m) and having ⁇ 5-DES activity.
  • O DNA consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 52.
  • P A DNA encoding a protein having a base sequence with 60% or more identity with the base sequence of DNA (o) and having ⁇ 5-DES activity.
  • the base sequence of SEQ ID NO: 8 is the base sequence of a gene encoding a protein (No ⁇ 5-DES) consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 7 (hereinafter also referred to as “No ⁇ 5-DES gene”).
  • the base sequence of SEQ ID NO: 52 is the base sequence of a gene encoding a protein (Ng ⁇ 5-DES) consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 51 (hereinafter also referred to as “Ng ⁇ 5-DES gene”).
  • the identity with the base sequence of the DNA (m) is preferably 65% or more, more preferably 70% or more, more preferably 75% or more, more preferably 80%
  • the above is more preferable, 85% or more is more preferable, 90% or more is more preferable, 92% or more is more preferable, 95% or more is more preferable, 98% or more is more preferable, and 99% or more is more preferable.
  • the DNA (n) one or more (for example, 1 or more and 633 or less, preferably 1 or more and 554 or less, more preferably 1 or more and 475 or less, more in the base sequence of the DNA (m) Preferably 1 to 396, more preferably 1 to 317, more preferably 1 to 238, more preferably 1 to 159, more preferably 1 to 127, and more Preferably 1 or more and 80 or less, more preferably 1 or more and 32 or less, more preferably 1 or more and 16 or less) bases have been deleted, substituted, inserted or added, and ⁇ 5-DES activity Also preferred is a DNA encoding a protein having Further, as the DNA (n), a DNA that hybridizes under stringent conditions with a DNA having a base sequence complementary to the DNA (m) and encodes a protein having ⁇ 5-DES activity is also preferable.
  • the identity with the base sequence of the DNA (o) is preferably 65% or more, more preferably 70% or more, more preferably 75% or more, more preferably 80%
  • the above is more preferable, 85% or more is more preferable, 90% or more is more preferable, 92% or more is more preferable, 95% or more is more preferable, 98% or more is more preferable, and 99% or more is more preferable.
  • ⁇ 9-DES ⁇ 9-desaturase
  • C18: 0 an unsaturated bond is introduced at the ⁇ 9 position of stearic acid (hereinafter also referred to as “C18: 0”) to generate C18: 1 ⁇ 9. It means a protein (enzyme) that catalyzes the reaction.
  • ⁇ 9-desaturase activity means an activity of introducing an unsaturated bond at the ⁇ 9 position of C18: 0.
  • ⁇ 9-DES activity By promoting the expression of ⁇ 9-DES, the production amount of C18: 1 ⁇ 9, which is the starting material of the continuous reaction catalyzed by ⁇ 12-DES and ⁇ 6-DES, can be increased, and the productivity of PUFA can be further improved. . Whether a protein has ⁇ 9-DES activity can be confirmed, for example, by a system using a ⁇ 9-DES synthetic gene-deficient strain.
  • ⁇ 9-DES or a cell disruption solution containing this is prepared, reacted with a reaction solution containing stearic acid, stearoyl CoA, etc. it can.
  • Preferred ⁇ 9-DES in the present invention includes the following proteins (Q) to (T).
  • (Q) A protein comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 9.
  • (R) A protein comprising an amino acid sequence having 60% or more identity with the amino acid sequence of the protein (Q) and having ⁇ 9-desaturase activity.
  • (S) A protein comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 53.
  • T A protein comprising an amino acid sequence having 60% or more identity with the amino acid sequence of the protein (S) and having ⁇ 9-desaturase activity.
  • the protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 9 is ⁇ 9-DES (hereinafter also referred to as “No ⁇ 9-DES”) derived from Nannochloropsis oculata strain NIES2145.
  • the protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 53 is ⁇ 9-DES (hereinafter also referred to as “Ng ⁇ 9-DES”) derived from Nannochloropsis gadytana B-31 strain.
  • Ng ⁇ 9-DES derived from Nannochloropsis gadytana B-31 strain.
  • the identity of the amino acid sequence of protein (S) with respect to the amino acid sequence of protein (Q) is 93%. All of the proteins (Q) to (T) have ⁇ 9-DES activity.
  • the identity with the amino acid sequence of the protein (Q) is preferably 65% or more, more preferably 70% or more, more preferably 75% or more, and 80% The above is more preferable, 85% or more is more preferable, 90% or more is more preferable, 92% or more is more preferable, 95% or more is more preferable, 98% or more is more preferable, and 99% or more is more preferable.
  • the identity with the amino acid sequence of the protein (S) is preferably 65% or more, more preferably 70% or more, more preferably 75% or more, and 80% The above is more preferable, 85% or more is more preferable, 90% or more is more preferable, 92% or more is more preferable, 95% or more is more preferable, 98% or more is more preferable, and 99% or more is more preferable.
  • the proteins (Q) to (T) can be obtained by ordinary chemical techniques, genetic engineering techniques, and the like.
  • a protein derived from a natural product can be obtained by isolation and purification from Nannochloropsis oculata or Nannochloropsis gaditana.
  • the proteins (Q) to (T) can be obtained by artificial chemical synthesis based on the amino acid sequence information shown in SEQ ID NO: 9 or 53.
  • the proteins (Q) to (T) may be produced as recombinant proteins by gene recombination techniques. In the case of producing a recombinant protein, a gene encoding ⁇ 9-DES described later can be used.
  • ⁇ 9-DES gene As a gene encoding the ⁇ 9-DES (preferably any one of the proteins (Q) to (T)) (hereinafter also referred to as “ ⁇ 9-DES gene”), the following DNA (q) to (t): A gene consisting of any one of them is mentioned.
  • Q DNA consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 10.
  • R DNA encoding a protein comprising a nucleotide sequence having an identity of 60% or more with the nucleotide sequence of DNA (q) and having ⁇ 9-DES activity.
  • S DNA consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 54.
  • the base sequence of SEQ ID NO: 10 is a base sequence of a gene encoding a protein (No ⁇ 9-DES) consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 9 (hereinafter also referred to as “No ⁇ 9-DES gene”).
  • the base sequence of SEQ ID NO: 54 is the base sequence of a gene encoding a protein (Ng ⁇ 9-DES) consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 53 (hereinafter also referred to as “Ng ⁇ 9-DES gene”).
  • the identity with the base sequence of the DNA (q) is preferably 65% or more, more preferably 70% or more, more preferably 75% or more, more preferably 80%
  • the above is more preferable, 85% or more is more preferable, 90% or more is more preferable, 92% or more is more preferable, 95% or more is more preferable, 98% or more is more preferable, and 99% or more is more preferable.
  • one or more for example, 1 to 432, preferably 1 to 378, more preferably 1 to 324 in the base sequence of the DNA (q), and more Preferably from 1 to 270, more preferably from 1 to 216, more preferably from 1 to 162, more preferably from 1 to 108, more preferably from 1 to 87, more Preferably 1 or more and 54 or less, more preferably 1 or more and 22 or less, more preferably 1 or more and 11 or less) bases have been deleted, substituted, inserted or added, and ⁇ 9-DES activity
  • a DNA encoding a protein having a DNA that hybridizes with a DNA having a base sequence complementary to the DNA (q) under stringent conditions and encodes a protein having ⁇ 9-DES activity is also preferable.
  • the identity with the base sequence of the DNA (s) is preferably 65% or more, more preferably 70% or more, more preferably 75% or more, more preferably 80% The above is more preferable, 85% or more is more preferable, 90% or more is more preferable, 92% or more is more preferable, 95% or more is more preferable, 98% or more is more preferable, and 99% or more is more preferable.
  • the DNA (t) is one or more (for example, 1 to 410, preferably 1 to 359, more preferably 1 to 307 in the base sequence of the DNA (s), and more.
  • ⁇ 9-elongase hereinafter also referred to as “ ⁇ 6-ELO”
  • ⁇ 6-ELO means, as shown in FIG. 1, by extending two carbon chains to ⁇ -linolenic acid (C18: 3 ⁇ 6,9,12) and dihomo- ⁇ -linolenic acid ( C20: 3 means a protein (enzyme) that catalyzes a reaction that produces ⁇ 8,11,14).
  • ⁇ 6-elongase activity (hereinafter also referred to as“ ⁇ 6-ELO activity ”” ”means an activity of extending two carbon chains of C18: 3 ⁇ 6,9,12.
  • ⁇ 6-ELO activity In algae belonging to the genus Nannochloropsis with enhanced expression of ⁇ 12-DES and ⁇ 6-DES, the continuous reaction catalyzed by ⁇ 12-DES and ⁇ 6-DES increases the production of C18: 3 ⁇ 6,9,12 . Therefore, in the algae belonging to the genus Nannochloropsis that promoted the expression of ⁇ 12-DES and ⁇ 6-DES, the expression of ⁇ 6-ELO was also promoted, so that two carbon chains to C18: 3 ⁇ 6,9,12 were obtained.
  • the introduction (elongation) is enhanced, and the production of C20: 3 ⁇ 8,11,14, C20: 4 ⁇ 5,8,11,14 and C20: 5 ⁇ 5,8,11,14,17 is further increased.
  • Whether the protein has ⁇ 6-ELO activity can be confirmed, for example, by a system using a ⁇ 6-ELO synthetic gene-deficient strain. Alternatively, it can be confirmed by introducing DNA linked with a gene encoding the protein downstream of a promoter that functions in the host cell into a ⁇ 6-ELO synthetic gene-deficient strain and examining the production of dihomo- ⁇ -linolenic acid.
  • ⁇ 6-ELO or a cell disruption solution containing the same is prepared and reacted with a reaction solution containing a ⁇ -linolenic acid derivative (such as a thioester compound with CoA or an ester compound with glycerol), and ⁇ -linolene is prepared according to a conventional method. This can be confirmed by measuring the decrease in acid or the increase in dihomo- ⁇ -linolenic acid.
  • a ⁇ -linolenic acid derivative such as a thioester compound with CoA or an ester compound with glycerol
  • Preferred ⁇ 6-ELO in the present invention includes the following proteins (U) and (V).
  • (U) A protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 74.
  • (V) A protein comprising an amino acid sequence having 60% or more identity with the amino acid sequence of the protein (U) and having ⁇ 6-ELO activity.
  • the protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 74 is ⁇ 6-ELO derived from Nannochloropsis oculata strain NIES2145 (hereinafter also referred to as “No ⁇ 6-ELO”). Both the proteins (U) and (V) have ⁇ 6-ELO activity.
  • the identity with the amino acid sequence of the protein (U) is preferably 65% or more, more preferably 70% or more, more preferably 75% or more, more preferably 80% The above is more preferable, 85% or more is more preferable, 90% or more is more preferable, 92% or more is more preferable, 95% or more is more preferable, 98% or more is more preferable, and 99% or more is more preferable.
  • the amino acid sequence of the protein (U) is one or more (for example, 1 to 111, preferably 1 to 97, more preferably 1 to 83).
  • amino acids are deleted, substituted, inserted or added.
  • Examples of the method for introducing a mutation into the amino acid sequence include the methods described above for ⁇ 12-DES.
  • the proteins (U) and (V) can be obtained by ordinary chemical techniques, genetic engineering techniques, and the like.
  • a protein derived from a natural product can be obtained by isolation, purification or the like from Nannochloropsis oculata.
  • the proteins (U) and (V) can be obtained by artificial chemical synthesis based on the amino acid sequence information shown in SEQ ID NO: 74.
  • the proteins (U) and (V) may be produced as recombinant proteins by genetic recombination techniques. In the case of producing a recombinant protein, a gene encoding ⁇ 6-ELO described later can be used.
  • ⁇ 6-ELO gene As a gene encoding the ⁇ 6-ELO (preferably one of the proteins (U) and (V)) (hereinafter also referred to as “ ⁇ 6-ELO gene”), the following DNA (u) and (v) A gene consisting of any one of them can be mentioned.
  • U DNA consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 73.
  • V DNA encoding a protein having a base sequence with 60% or more identity with the base sequence of DNA (u) and having ⁇ 6-ELO activity.
  • the base sequence of SEQ ID NO: 73 is a base sequence of a gene encoding a protein (No ⁇ 6-ELO) consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 74 (hereinafter also referred to as “No ⁇ 6-ELO gene”).
  • the identity with the base sequence of the DNA (u) is preferably 65% or more, more preferably 70% or more, more preferably 75% or more, more preferably 80% The above is more preferable, 85% or more is more preferable, 90% or more is more preferable, 92% or more is more preferable, 95% or more is more preferable, 98% or more is more preferable, and 99% or more is more preferable.
  • the DNA (v) one or more (for example, 1 to 333, preferably 1 to 291, more preferably 1 to 250 in the base sequence of the DNA (u), Preferably from 1 to 208, more preferably from 1 to 167, more preferably from 1 to 125, more preferably from 1 to 84, more preferably from 1 to 67, more Preferably 1 or more and 42 or less, more preferably 1 or more and 17 or less, more preferably 1 or more and 9 or less) bases have been deleted, substituted, inserted or added, and ⁇ 6-ELO activity
  • the DNA (v) is also preferably a DNA that hybridizes with a DNA having a base sequence complementary to the DNA (u) under stringent conditions and encodes a protein having ⁇ 6-ELO activity.
  • the reaction of producing linoleic acid from oleic acid and producing ⁇ -linolenic acid from the produced linoleic acid is the rate-limiting step. Therefore, in the present invention, expression of only ⁇ 12-DES and ⁇ 6-DES that catalyze this rate-limiting reaction may be promoted.
  • At least one enzyme selected from the group consisting of ⁇ 3-DES, ⁇ 5-DES, ⁇ 9-DES and ⁇ 6-ELO Is preferably promoted, and more preferably the expression of two or more enzymes selected from the group consisting of ⁇ 3-DES, ⁇ 5-DES, ⁇ 9-DES and ⁇ 6-ELO is promoted.
  • the method for promoting the expression of various enzymes can be appropriately selected from conventional methods, and a method for promoting the expression of genes encoding various enzymes is preferred.
  • Specific methods include introducing the various genes into a host to promote expression of the genes, and modifying expression control regions (promoters, terminators, etc.) of the genes in a host having the various genes on the genome. And a method for promoting the expression of the gene.
  • a method of introducing the various genes into a host and promoting the expression of the various genes is preferable.
  • transformants those that promote the expression of the target protein such as various enzymes are also referred to as “transformants”, and those that do not promote the expression of the target protein are also referred to as “host” or “wild strain”.
  • the transformant used in the present invention is higher in productivity of PUFA and lipids comprising this than in the host itself (production amount of PUFA and lipids comprising this, in all fatty acids produced or in all lipids. The ratio of PUFA and lipids comprising this as a constituent component) tends to increase. As a result, in the transformant, the fatty acid composition in the lipid is modified.
  • the present invention using the transformant is a fatty acid or lipid having a specific number of carbon atoms, particularly PUFA or a lipid comprising this as a constituent, preferably a PUFA having 18 or more carbon atoms or a constituent thereof.
  • Lipids more preferably PUFAs having 18 or 20 carbon atoms or lipids comprising the same, more preferably PUFAs having 20 carbon atoms or lipids comprising the same, more preferably C20: 3, C20: 4 Or C20: 5 or a lipid comprising this, more preferably dihomo- ⁇ -linolenic acid, arachidonic acid or eicosapentaenoic acid or a lipid comprising this, more preferably arachidonic acid or eicosapentaenoic acid or this Suitable for production of lipids as constituents, more preferably eicosapentaenoic acid or lipids containing it as constituents Can be.
  • the productivity of fatty acids and lipids in the host and transformant can be measured by the method used in the examples.
  • the various genes can be obtained by ordinary genetic engineering techniques. For example, the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 45, 47, 49, 51, 53 or 74, or SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 46, 48, 50, 52 , 54 or 73, various genes can be artificially synthesized. For the synthesis of various genes, for example, services such as Invitrogen can be used. It can also be obtained by cloning from algae belonging to the genus Nannochloropsis such as Nannochloropsis oculata and Nannochloropsis gadytana.
  • Nannochloropsis oculata NIES-2145 used in the examples can be obtained from the National Institute for Environmental Studies (NIES).
  • a transformant that can be preferably used in the present invention can be obtained by introducing the various genes into the host by a conventional method. Specifically, it can be prepared by preparing a recombinant vector or gene expression cassette capable of expressing the various genes in a host cell, introducing the gene into a host cell, and transforming the host cell.
  • the algae used in the present invention are algae belonging to the genus Nannochloropsis.
  • the algae belonging to the genus Nannochloropsis is a small algae (microalgae) of about 2 to 5 ⁇ m having a spherical or elliptical shape.
  • Specific examples of the algae belonging to the genus Nannochloropsis used in the present invention include Nannochloropsis oculata, Nannochloropsis gaditana, Nannochloropsis salina ( Nannochloropsis salina ), Nannochloropsis oceanica , Nannochloropsis atomus , Nannochloropsis maculata , Nannochloropsis granulata , Nannochloropsis sp. ) And the like.
  • Nannochloropsis oculata or Nannochloropsis gaditana is preferable, and Nannochloropsis oculata is more preferable.
  • a vector serving as a base for a plasmid for gene expression or a cassette for gene expression
  • a vector capable of introducing a gene encoding a target protein into a host and expressing the target gene in a host cell If it is.
  • a vector having an expression regulatory region such as a promoter or terminator according to the type of host to be introduced, and a vector having a replication origin or a selection marker can be used.
  • it may be a vector that autonomously grows and replicates outside the chromosome, such as a plasmid, or a vector that is integrated into the chromosome.
  • Expression vectors that can be preferably used in the present invention include pUC19 (manufactured by Takara Bio Inc.), P66 (Chlamydomonas Center), P-322 (Chlamydomonas Center), and pPha-T1 (Journal of Basic Microbiology, 2011, vol. 51, p. 666-672), and pJET1 (manufactured by Cosmo Bio).
  • pUC19, pPha-T1, or pJET1 is preferably used.
  • pUC19, pPha-T1, or pJET1 is preferably used.
  • a DNA fragment (gene expression cassette) comprising a target gene, promoter and terminator It can also be used to transform a host.
  • Examples of the DNA fragment include a DNA fragment amplified by a PCR method and a DNA fragment cleaved with a restriction enzyme.
  • promoter that regulates the expression of the gene encoding the target protein incorporated in the expression vector
  • Promoters that can be preferably used in the present invention can be induced by the addition of lac promoter, trp promoter, tac promoter, trc promoter, T7 promoter, SpoVG promoter, isopropyl ⁇ -D-1-thiogalactopyranoside (IPTG).
  • Promoters related to various derivatives Rubisco operon (rbc), PSI reaction center protein (psaAB), PSII D1 protein (psbA), c-phycocyanin ⁇ subunit (cpcB), cauliflower mozil virus 35SRNA promoter, housekeeping gene promoter (eg , tubulin promoter, actin promoter, ubiquitin promoter), rape or oilseed rape derived Napin gene promoter, a plant-derived Rubisco promoters, Nannochloropsis from the genus violaxanthin / chlorophyll a binding Tan Promoters of protein genes (VCP1 promoter, VCP2 promoter) (Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2011, vol.
  • the promoter of the violaxanthin / chlorophyll a binding protein gene and the promoter of the oleosin-like protein LDSP gene derived from the genus Nannochloropsis can be preferably used.
  • the type of selection marker for confirming that the gene encoding the target protein has been incorporated can be appropriately selected according to the type of host used.
  • Selectable markers that can be preferably used in the present invention include ampicillin resistance gene, chloramphenicol resistance gene, erythromycin resistance gene, neomycin resistance gene, kanamycin resistance gene, spectinomycin resistance gene, tetracycline resistance gene, blasticidin S Drug resistance genes such as resistance genes, bialaphos resistance genes, zeocin resistance genes, paromomycin resistance genes, gentamicin resistance genes, and hygromycin resistance genes.
  • a gene deficiency associated with auxotrophy can be used as a selectable marker gene.
  • transformation method can be appropriately selected from conventional methods according to the type of host used. For example, transformation methods using calcium ions, general competent cell transformation methods, protoplast transformation methods, electroporation methods, LP transformation methods, methods using Agrobacterium, particle gun methods, etc. . In the present invention, transformation can also be performed using the electroporation method described in Nature Communications, DOI: 10.1038 / ncomms1688, 2012 or the like.
  • ⁇ Selection of transformant introduced with target gene fragment> can be performed by using a selection marker or the like.
  • a drug resistance gene acquired by a transformant as a result of introduction of a drug resistance gene into a host cell together with a target DNA fragment at the time of transformation can be used as an indicator.
  • the introduction of the target DNA fragment can also be confirmed by PCR method using a genome as a template.
  • “Expression regulatory region” refers to a promoter or terminator, and these sequences are generally involved in regulating the expression level (transcription level, translation level) of adjacent genes.
  • “Expression regulatory region” refers to a promoter or terminator, and these sequences are generally involved in regulating the expression level (transcription level, translation level) of adjacent genes.
  • Examples of the method for modifying the expression regulatory region include exchanging promoters.
  • a promoter of the gene hereinafter also referred to as “desaturase promoter” or “elongase promoter”
  • elongase promoter By replacing a promoter of the gene (hereinafter also referred to as “desaturase promoter” or “elongase promoter”) with a promoter having higher transcriptional activity in a host having the various desaturase genes or elongase genes on the genome.
  • Gene expression can be promoted.
  • the No ⁇ 12-DES gene exists immediately below the DNA sequence consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 55.
  • the promoter region of the No ⁇ 12-DES gene is present in the DNA sequence consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 55. Further, the No ⁇ 6-DES gene exists immediately below the DNA sequence consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 56, and the promoter region of the No ⁇ 6-DES gene exists in the DNA sequence consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 56. Yes. Further, the No ⁇ 3-DES gene exists immediately below the DNA sequence consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 57, and the promoter region of the No ⁇ 3-DES gene exists in the DNA sequence consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 57. Yes.
  • the No ⁇ 5-DES gene exists immediately below the DNA sequence consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 58, and the promoter region of the No ⁇ 5-DES gene exists in the DNA sequence consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 58. Yes.
  • the No ⁇ 9-DES gene exists immediately below the DNA sequence consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 59, and the promoter region of the No ⁇ 9-DES gene exists in the DNA sequence consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 59. Yes.
  • No ⁇ 6-ELO gene exists immediately below the DNA sequence consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 75, and the promoter region of the No ⁇ 6-ELO gene exists in the DNA sequence consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 75. Yes. Therefore, the expression of each of the various genes can be promoted by replacing part or all of the DNA sequence consisting of the base sequence shown in any one of SEQ ID NOs: 55 to 59 and 75 with a promoter having higher transcriptional activity. it can.
  • the promoter used for replacement of the desaturase promoter or elongase promoter is not particularly limited, and is appropriately selected from those that have higher transcriptional activity than the desaturase promoter or elongase promoter and are suitable for the production of PUFA or lipids comprising this. be able to.
  • Promoters that can be preferably used in the present invention include tubulin promoters, heat shock protein promoters, promoters of the above-mentioned violaxanthin / chlorophyll a binding protein genes (VCP1 promoter, VCP2 promoter), and oleosin-like derived from the genus Nannochloropsis Examples include the promoter of the protein LDSP gene. From the viewpoint of improving the productivity of PUFA or a lipid comprising this as a constituent, the promoter of the violaxanthin / chlorophyll a binding protein gene or the promoter of the LDSP gene is more preferable.
  • the above-described promoter modification can be performed according to a conventional method such as homologous recombination. Specifically, a linear DNA fragment containing upstream and downstream regions of the target promoter and containing another promoter instead of the target promoter is constructed and incorporated into the host cell, and the target promoter of the host genome Two homologous recombination occurs at the upstream and downstream side of. As a result, the target promoter on the genome is replaced with another promoter fragment, and the promoter can be modified.
  • a method of modifying a target promoter by homologous recombination can be performed with reference to documents such as Methods in molecular biology, 1995, vol. 47, p. 291-302.
  • the host is an algae belonging to the genus Nannochloropsis
  • the genome is obtained by homologous recombination with reference to documents such as Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2011, vol. 108 (52). Specific regions within can be modified.
  • the transformant of the present invention preferably promotes the expression of KAS, and more preferably promotes the expression of a gene encoding KAS (hereinafter also simply referred to as “KAS gene”).
  • KAS is a type of fatty acid synthase that catalyzes the condensation reaction between acyl-ACP and malonyl ACP and is involved in the synthesis of acyl-ACP.
  • acetyl-ACP (or acetyl-CoA) is used as a starting material, and the carbon chain elongation reaction is repeated to finally synthesize acyl-ACP having 16 or 18 carbon atoms.
  • acetoacetyl ACP is produced by a condensation reaction of acetyl-ACP (or acetyl-CoA) and malonyl ACP. This reaction is catalyzed by KAS. Subsequently, the keto group of acetoacetyl ACP is reduced by ⁇ -ketoacyl-ACP reductase to produce hydroxybutyryl ACP. Subsequently, hydroxybutyryl ACP is dehydrated by ⁇ -hydroxyacyl-ACP dehydrase to produce crotonyl ACP. Finally, crotonyl ACP is reduced by enoyl-ACP reductase to produce butyryl ACP.
  • butyryl ACP in which two carbon chains of the acyl group are extended from acetyl-ACP is generated. Thereafter, by repeating the same reaction, the carbon chain of acyl-ACP is extended, and finally acyl-ACP having 16 or 18 carbon atoms is synthesized. Therefore, by promoting the expression of KAS, preferably by promoting the expression of the KAS gene, it is possible to further improve the productivity of algae lipids used for lipid production, particularly the productivity of fatty acids.
  • the KAS that can be preferably used in the present invention may be a protein having ⁇ -ketoacyl-ACP synthase activity (hereinafter also referred to as “KAS activity”).
  • KAS activity refers to an activity that catalyzes the condensation reaction of acetyl-ACP or acyl-ACP with malonyl ACP.
  • the fact that a protein has KAS activity means that, for example, a DNA in which a gene encoding the protein is linked downstream of a promoter that functions in the host cell is introduced into a host cell lacking the fatty acid degradation system, and the introduced gene is expressed.
  • the cells can be cultured under such conditions, and changes in fatty acid composition in the host cells or in the culture medium can be confirmed by a conventional method.
  • a DNA ligated with the gene encoding the protein downstream of a promoter that functions in the host cell into the host cell and culturing the cell under conditions in which the introduced gene is expressed, It can be confirmed by performing a chain extension reaction using various acyl-ACPs as substrates.
  • KAS is classified as KAS I, KAS II, KAS III, or KAS IV depending on its substrate specificity.
  • KAS III uses acetyl-ACP (or acetyl-CoA) having 2 carbon atoms as a substrate and catalyzes an elongation reaction having 2 to 4 carbon atoms.
  • KAS I mainly catalyzes elongation reactions with 4 to 16 carbon atoms to synthesize palmitoyl-ACP with 16 carbon atoms.
  • KAS II mainly synthesizes a long-chain acyl-ACP by catalyzing an extension reaction to a long-chain acyl group having 18 or more carbon atoms.
  • KAS IV mainly catalyzes the elongation reaction of 6 to 14 carbon atoms to synthesize medium chain acyl-ACP. Therefore, by promoting the expression of KAS II, preferably by promoting the expression of the gene encoding KAS II, the productivity of long-chain fatty acids can be further improved.
  • the KAS that can be preferably used in the present invention can be appropriately selected from normal KAS and functionally equivalent proteins according to the type of the host.
  • KAS II derived from Nannochloropsis oculata hereinafter also referred to as “NoKASII”
  • SEQ ID NO: 60 KAS II derived from Nannochloropsis oculata
  • a protein that is functionally equivalent to this from an amino acid sequence having an identity with the amino acid sequence of NoKASII of 50% or more (preferably 70% or more, more preferably 80% or more, more preferably 90% or more).
  • a protein having KAS activity can also be used.
  • the gene encoding NoKASII is 50% or more (preferably 70% or more, preferably) a gene consisting of a DNA consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 61, or the base sequence represented by SEQ ID NO: 61 More preferably 80% or more, and still more preferably 90% or more), and a gene comprising a DNA encoding a protein having KAS activity.
  • a transformant in which the expression of KAS is promoted (for example, a transformant in which the expression of KAS gene is promoted) can be prepared by a conventional method.
  • a method for introducing a gene encoding KAS into the host a method for modifying the expression regulatory region of the gene in a host having the gene encoding KAS on the genome A transformant can be prepared by, for example.
  • the expression of ACP is preferably promoted, and the expression of a gene encoding ACP (hereinafter also simply referred to as “ACP gene”) is more preferred.
  • ACP functions as a scaffold (carrier) for fatty acid biosynthesis (fatty acid elongation reaction).
  • the acyl group of the fatty acid forms a thioester bond with the phosphopantethein group bonded to the serine residue of ACP. In this state, the fatty acid is elongated. Therefore, by promoting the expression of ACP, preferably by promoting the expression of the ACP gene, it is possible to further improve the productivity of algae lipids used for lipid production, particularly the productivity of fatty acids.
  • the ACP that can be preferably used in the present invention may be any protein having acyl carrier protein activity (hereinafter also referred to as “ACP activity”).
  • ACP activity means an activity that functions as a scaffold for the elongation reaction of fatty acid by forming a thioester bond with the acyl group of the fatty acid. It is confirmed that a protein has ACP activity by, for example, introducing a DNA linking a gene encoding the protein downstream of a promoter functioning in a host into an ACP gene-deficient strain and complementing the ability to synthesize fatty acids. be able to.
  • DNA in which a gene encoding the protein is linked downstream of a promoter that functions in the host cell is introduced into the host cell, and the cell is cultured under conditions where the introduced gene is expressed. It can be confirmed by analyzing changes in the production amount and composition of the fatty acids by conventional methods.
  • the protein can be obtained by referring to the literature such as Biochemistry, 2011, vol. 50 (25), p. 5704-5717, etc. This can be confirmed by reacting with phosphopantetheinyl transferase to form holo-ACP to which a phosphopantethein group is bound.
  • the holo-ACP is converted to a fatty acid and an appropriate acyl-ACP synthetase. The reaction can be confirmed by forming an acyl-ACP having an acyl group bonded thereto.
  • the ACP that can be preferably used in the present invention can be appropriately selected from normal ACP and proteins functionally equivalent to them according to the type of host.
  • ACP derived from Nannochloropsis oculata hereinafter also referred to as “NoACP”
  • NoACP Nannochloropsis oculata
  • a protein functionally equivalent to this from an amino acid sequence having an identity with the amino acid sequence of NoACP of 50% or more (preferably 70% or more, more preferably 80% or more, more preferably 90% or more) And a protein having ACP activity can also be used.
  • the gene encoding NoACP is 50% or more (preferably 70% or more, preferably) a gene consisting of a DNA consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 63, or the base sequence represented by SEQ ID NO: 63 More preferably 80% or more, and still more preferably 90% or more), and a gene comprising a DNA encoding a protein having ACP activity.
  • a transformant in which ACP expression is promoted (for example, a transformant in which ACP gene expression is promoted) can be prepared by a conventional method.
  • a method for introducing a gene encoding ACP into the host a method for modifying the expression regulatory region of the gene in a host having the gene encoding ACP on the genome A transformant can be prepared by, for example.
  • ACP is preferably localized in chloroplasts.
  • it promotes the expression of a gene in which a base sequence encoding a chloroplast translocation signal that functions in the cells of algae belonging to the genus Nannochloropsis is added to the base sequence of an ACP gene derived from an algae belonging to the genus Nannochloropsis It is more preferable.
  • the transformant of the present invention preferably promotes TE expression, and preferably promotes expression of a gene encoding TE (hereinafter also simply referred to as “TE gene”).
  • TE is an enzyme that hydrolyzes the thioester bond of acyl-ACP synthesized by a fatty acid synthase such as KAS to produce a free fatty acid.
  • the fatty acid synthesis on the ACP is completed by the action of TE, and the extracted fatty acid is used for the synthesis of PUFA, triacylglycerol and the like.
  • the TE that can be used in the present invention may be a protein having acyl-ACP thioesterase activity (hereinafter also referred to as “TE activity”).
  • TE activity refers to an activity of hydrolyzing the thioester bond of acyl-ACP.
  • TE is known to have a plurality of TEs having different reaction specificities depending on the number of carbon atoms and the number of unsaturated bonds in the acyl group (fatty acid residue) constituting the substrate acyl-ACP.
  • TE is considered to be an important factor that determines the fatty acid composition in vivo.
  • introduction of a gene encoding TE, preferably a gene encoding TE having substrate specificity for long-chain acyl-ACP is effective. . By introducing such a gene, the productivity of PUFA can be further improved.
  • TE that can be used in the present invention can be appropriately selected from normal TE and functionally equivalent proteins according to the type of host.
  • TE derived from Nannochloropsis gaditana SEQ ID NO: 64
  • TE derived from Nannochloropsis oculata SEQ ID NO: 65 or 67
  • TE derived from Nannochloropsis granulata SEQ ID NO: 66
  • a protein functionally equivalent to this from an amino acid sequence having an identity with the amino acid sequence of TE of 50% or more (preferably 70% or more, more preferably 80% or more, more preferably 90% or more) And a protein having TE activity can also be used.
  • the transformant which promoted the expression of TE gene can be produced by a conventional method.
  • a transformant by a method of introducing a TE gene into a host, a method of modifying an expression regulatory region of the gene in a host having the TE gene on the genome, etc. can be produced.
  • the productivity of PUFA or a lipid comprising the same is improved as compared with a host in which expression of ⁇ 12-desaturase and ⁇ 6-desaturase is not promoted. Therefore, if the transformant of the present invention is cultured under appropriate conditions, and then PUFA or a lipid comprising this as a constituent is recovered from the obtained culture or growth product, PUFA or a lipid comprising this as a constituent is obtained. It can be manufactured efficiently.
  • “culture” refers to the culture solution and transformant after culturing, and “growth” refers to the transformant after growth.
  • the culture conditions of the transformant of the present invention can be appropriately selected depending on the host, and culture conditions usually used for the host can be used. From the viewpoint of fatty acid production efficiency, for example, glycerol, acetic acid, glucose or the like may be added to the medium as a precursor involved in the fatty acid biosynthesis system.
  • the medium used in the present invention may be a medium based on natural seawater or artificial seawater, or a commercially available culture medium.
  • the medium include f / 2 medium, ESM medium, Daigo IMK medium, L1 medium, and MNK medium.
  • f / 2 medium, ESM medium, or Daigo IMK medium is preferable, f / 2 medium or Daigo IMK medium is more preferable, and f / 2 medium is further included. preferable.
  • nitrogen sources, phosphorus sources, metal salts, vitamins, trace metals, and the like can be appropriately added to the medium.
  • the amount of the transformant inoculated on the medium can be selected as appropriate, and is preferably 1% (vol / vol) or more per medium from the viewpoint of growth. Moreover, the upper limit is preferably 50% (vol / vol) or less, and more preferably 10% (vol / vol) or less.
  • the numerical range of the amount of algae to be inoculated is preferably 1 to 50% (vol / vol), more preferably 1 to 10% (vol / vol).
  • the culture temperature is not particularly limited as long as it does not adversely affect the growth of algae, but it is usually in the range of 5 to 40 ° C. From the viewpoint of promoting the growth of algae, improving the productivity of fatty acids, and reducing the production cost, 10 ° C. or higher is preferable, and 15 ° C.
  • the upper limit is preferably 35 ° C. or lower, and more preferably 30 ° C. or lower.
  • the numerical range of the culture temperature is preferably 10 to 35 ° C, more preferably 15 to 30 ° C.
  • the algae is preferably cultured under light irradiation so that photosynthesis is possible.
  • the light irradiation may be performed under conditions that allow photosynthesis, and may be artificial light or sunlight.
  • the illuminance at the time of light irradiation is preferably 100 lux or more, more preferably 300 lux or more, and even more preferably 1000 lux or more from the viewpoint of promoting the growth of algae and improving the productivity of fatty acids.
  • the upper limit is preferably 50000 lux or less, more preferably 10,000 lux or less, and further preferably 6000 lux or less.
  • the numerical range of illuminance upon light irradiation is preferably in the range of 100 to 50000 lux, more preferably in the range of 300 to 10,000 lux, and still more preferably in the range of 1000 to 6000 lux.
  • the light irradiation interval is not particularly limited, but from the same viewpoint as described above, it is preferably performed in a light / dark cycle. Of the 24 hours, the light period is preferably 8 hours or more, and more preferably 10 hours or more.
  • the upper limit is preferably 24 hours or less, and more preferably 18 hours or less.
  • the numerical range of the light period is preferably 8 to 24 hours, more preferably 10 to 18 hours, and further preferably 12 hours.
  • the culture of algae is preferably performed in the presence of a gas containing carbon dioxide or a medium containing a carbonate such as sodium bicarbonate so that photosynthesis is possible.
  • concentration of carbon dioxide in the gas is not particularly limited, but is preferably 0.03% (similar to atmospheric conditions) or more, more preferably 0.05% or more from the viewpoint of promoting growth and improving the productivity of fatty acids. 1% or more is further preferable, and 0.3% or more is further more preferable.
  • the upper limit is preferably 10% or less, more preferably 5% or less, still more preferably 3% or less, and even more preferably 1% or less.
  • the numerical range of the carbon dioxide concentration is preferably 0.03 to 10%, more preferably 0.05 to 5%, further preferably 0.1 to 3%, and still more preferably 0.3 to 1%.
  • the concentration of the carbonate is not particularly limited.
  • sodium hydrogen carbonate it is preferably 0.01% by mass or more, more preferably 0.05% by mass or more from the viewpoint of promoting growth and improving the fatty acid productivity. 1 mass% or more is more preferable.
  • the upper limit is preferably 5% by mass or less, more preferably 2% by mass or less, and further preferably 1% by mass or less.
  • the numerical range of the concentration of sodium bicarbonate is preferably 0.01 to 5% by mass, more preferably 0.05 to 2% by mass, and further preferably 0.1 to 1% by mass.
  • the culture time is not particularly limited, and may be performed for a long period of time (for example, about 150 days) so that algal bodies that accumulate lipids at high concentrations can grow at high concentrations. 3 days or more are preferable, and 7 days or more are more preferable.
  • the upper limit is preferably 90 days or less, and more preferably 30 days or less.
  • the numerical range of the culture period is preferably 3 to 90 days, more preferably 3 to 30 days, and further preferably 7 to 30 days.
  • the culture may be any of aeration and agitation culture, shaking culture or stationary culture, and aeration and agitation culture is preferable from the viewpoint of improving aeration.
  • the method for collecting lipid from the culture or growth can be appropriately selected from conventional methods.
  • lipid components can be isolated from the aforementioned culture or growth by filtration, centrifugation, cell disruption, gel filtration chromatography, ion exchange chromatography, chloroform / methanol extraction method, hexane extraction method, ethanol extraction method, or the like. Can be separated and recovered.
  • oil is recovered from the culture or growth by pressing or extraction, and then general purification such as degumming, deoxidation, decolorization, dewaxing, deodorization, etc. is performed to obtain lipids. be able to.
  • a fatty acid can be obtained by hydrolyzing the isolated lipid.
  • Examples of the method for isolating the fatty acid from the lipid component include a method of treating at a high temperature of about 70 ° C. in an alkaline solution, a method of treating with lipase, a method of decomposing using high-pressure hot water, and the like.
  • the lipid produced in the production method of the present invention preferably contains a fatty acid or a fatty acid compound, and more preferably contains a fatty acid or a fatty acid ester compound, from the viewpoint of its availability.
  • the fatty acid ester compound is preferably at least one selected from the group consisting of MAG, DAG and TAG, more preferably TAG.
  • the fatty acid or fatty acid ester compound contained in the lipid is preferably a PUFA having 18 or more carbon atoms or an ester compound thereof from the viewpoint of availability to a surfactant or the like and nutritional aspects, and a PUFA having 18 or 20 carbon atoms or More preferably, the ester compound is a PUFA having 20 carbon atoms or an ester compound thereof, C20: 3, C20: 4 or C20: 5, or an ester compound thereof is more preferable, dihomo- ⁇ -linolenic acid, arachidonic acid Alternatively, eicosapentaenoic acid or an ester compound thereof is more preferable, arachidonic acid or eicosapentaenoic acid or an ester compound thereof is more preferable, and eicosapentaenoic acid or an ester compound thereof is further preferable. From the viewpoint of productivity, the fatty acid ester compound is preferably a simple lipid or a complex lipid, more preferably a simple
  • Lipids obtained by the production method of the present invention are used as edible, plasticizers, emulsifiers such as cosmetics, detergents such as soaps and detergents, fiber treatment agents, hair rinse agents, or bactericides and preservatives. Can do.
  • the present invention also provides a kit for producing a transformant of algae belonging to the genus Nannochloropsis, comprising a recombinant vector containing a ⁇ 12-DES gene and a recombinant vector containing a ⁇ 6-DES gene.
  • the kit of the present invention can be used for the production of transformants excellent in the productivity of PUFA or lipids comprising this as the expression of enzymes that catalyze the rate-limiting reaction of the PUFA synthesis pathway. .
  • the kit of the present invention comprises a recombinant vector containing a ⁇ 3-DES gene, a recombinant vector containing a ⁇ 5-DES gene, a recombinant vector containing a ⁇ 9-DES gene, and a recombinant vector containing a ⁇ 6-ELO gene
  • the kit of the present invention includes a host, a reagent usually used for transforming the host with the vector, a transformation buffer, a reagent used as an indicator for selecting a transformant, etc. Other elements necessary for the detection of the production of the transformant may be included.
  • the present invention further discloses the following methods for producing lipids, methods for modifying the fatty acid composition produced, transformants, methods for producing transformants, and kits for producing transformants with respect to the above-described embodiments.
  • ⁇ 3> Promotes the expression of ⁇ 12-DES and ⁇ 6-DES, or the expression of ⁇ 12-DES gene and ⁇ 6-DES gene in algae belonging to the genus Nannochloropsis, accounting for all fatty acids produced in algal cells A method of modifying the fatty acid composition to increase the proportion of PUFA.
  • ⁇ 4> In algae belonging to the genus Nannochloropsis, the expression of ⁇ 12-DES and ⁇ 6-DES, or the expression of ⁇ 12-DES gene and ⁇ 6-DES gene is promoted, and the fatty acid ester compound produced in algal cells, A method of modifying a fatty acid composition, preferably increasing the proportion of PUFA residues in all fatty acid residues of at least one selected from the group consisting of MAG, DAG and TAG, more preferably TAG.
  • ⁇ 5> Any one of the above ⁇ 1> to ⁇ 4>, wherein the expression of ⁇ 12-DES gene and ⁇ 6-DES gene is promoted in the algal cells, and the expression of ⁇ 12-DES and ⁇ 6-DES is promoted.
  • ⁇ 6> Any one of ⁇ 1> to ⁇ 5>, wherein the ⁇ 12-DES gene and the ⁇ 6-DES gene are introduced into the algae, and the expression of the introduced ⁇ 12-DES gene and ⁇ 6-DES gene is promoted. the method of.
  • ⁇ 12-DES is any one of the following proteins (A) to (D), preferably the following protein (A) or (B): The method described in the paragraph.
  • a protein comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1.
  • B) 60% or more of identity with the amino acid sequence of the protein (A), preferably 65% or more, more preferably 70% or more, more preferably 75% or more, more preferably 80% or more, more preferably 85 % Or more, more preferably 90% or more, more preferably 92% or more, more preferably 95% or more, more preferably 98% or more, more preferably 99% or more, and ⁇ 12-DES activity.
  • Protein
  • (C) A protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 45.
  • the identity with the amino acid sequence of the protein (C) is 60% or more, preferably 65% or more, more preferably 70% or more, more preferably 75% or more, more preferably 80% or more, more preferably 85 % Or more, more preferably 90% or more, more preferably 92% or more, more preferably 95% or more, more preferably 98% or more, more preferably 99% or more, and ⁇ 12-DES activity.
  • the protein (B) has one or more, preferably 1 or more and 176 or less, more preferably 1 or more and 154 or less, more preferably 1 or more amino acid sequences in the protein (A).
  • the protein (D) has one or more, preferably 1 or more and 181 or less, more preferably 1 or more and 159 or less, more preferably 1 or more amino acid sequences in the protein (C).
  • the gene encoding the ⁇ 12-DES, preferably any one of the proteins (A) to (D) is a gene consisting of any one of the following DNAs (a) to (d), preferably The method according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 9>, wherein is a gene consisting of the following DNA (a) or (b).
  • the identity with the base sequence of the DNA (c) is 60% or more, preferably 65% or more, more preferably 70% or more, more preferably 75% or more, more preferably 80% or more, more preferably 85 % Or more, more preferably 90% or more, more preferably 92% or more, more preferably 95% or more, more preferably 98% or more, and even more preferably 99% or more, and ⁇ 12-DES activity.
  • the DNA (b) has one or more, preferably 1 or more and 527 or less, more preferably 1 or more and 461 or less, more preferably 1 or more, in the base sequence of the DNA (a).
  • the DNA (d) has one or more, preferably 1 to 544, more preferably 1 to 476, more preferably 1 or more nucleotide sequences in the DNA (c). 408 or less, more preferably 1 or more and 340 or less, more preferably 1 or more and 272 or less, more preferably 1 or more and 204 or less, more preferably 1 or more and 136 or less, more preferably 1 or more 109 or less, more preferably 1 to 68, more preferably 1 to 28, more preferably 1 to 14 nucleotides deleted, substituted, inserted or added.
  • ⁇ 6-DES is any one of the following proteins (E) to (H), preferably the following protein (E) or (F): The method described in the paragraph.
  • E) A protein comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3.
  • F) The identity with the amino acid sequence of the protein (E) is 60% or more, preferably 65% or more, more preferably 70% or more, more preferably 75% or more, more preferably 80% or more, more preferably 85 % Or more, more preferably 90% or more, more preferably 92% or more, more preferably 95% or more, more preferably 98% or more, more preferably 99% or more, and ⁇ 6-DES activity. Protein.
  • (G) A protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 47.
  • (H) 60% or more identity with the amino acid sequence of the protein (G), preferably 65% or more, more preferably 70% or more, more preferably 75% or more, more preferably 80% or more, more preferably 85 % Or more, more preferably 90% or more, more preferably 92% or more, more preferably 95% or more, more preferably 98% or more, more preferably 99% or more, and ⁇ 6-DES activity.
  • the protein (F) has one or more, preferably 1 to 190, more preferably 1 to 166, more preferably 1 or more amino acid sequences in the protein (E).
  • the protein (H) has one or more, preferably 1 to 190, more preferably 1 to 166, more preferably 1 or more amino acid sequences in the protein (G).
  • the gene encoding the ⁇ 6-DES, preferably any one of the proteins (E) to (H) is a gene consisting of any one of the following DNAs (e) to (h), preferably The method according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 15>, wherein is a gene consisting of the following DNA (e) or (f).
  • the identity with the base sequence of the DNA (g) is 60% or more, preferably 65% or more, more preferably 70% or more, more preferably 75% or more, more preferably 80% or more, more preferably 85 % Or more, more preferably 90% or more, more preferably 92% or more, more preferably 95% or more, more preferably 98% or more, still more preferably 99% or more, and ⁇ 6-DES activity.
  • the DNA (f) has one or more, preferably 1 or more and 570 or less, more preferably 1 or more and 499 or less, more preferably 1 or more, in the base sequence of the DNA (e).
  • DNA encoding a protein having ⁇ 6-DES activity or a DNA comprising a base sequence complementary to the DNA (e) under a stringent condition And ⁇ 16>, wherein the DNA encodes a protein having ⁇ 6-DES activity.
  • the DNA (h) has one or more, preferably 1 to 572, more preferably 1 to 500, more preferably 1 or more nucleotide sequences in the DNA (g). 429 or less, more preferably 1 or more and 357 or less, more preferably 1 or more and 286 or less, more preferably 1 or more and 215 or less, more preferably 1 or more and 143 or less, more preferably 1 or more 115 or less, more preferably 1 to 72, more preferably 1 to 29, more preferably 1 to 15 nucleotides deleted, substituted, inserted or added.
  • DNA encoding a protein having ⁇ 6-DES activity or a DNA comprising a base sequence complementary to the DNA (g) under a stringent condition And ⁇ 16>, wherein the DNA encodes a protein having ⁇ 6-DES activity.
  • ⁇ 19> The method according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 18>, wherein the expression of ⁇ 3-DES or the expression of ⁇ 3-DES gene is promoted in the algae.
  • ⁇ 20> The method according to ⁇ 19> above, wherein the expression of the ⁇ 3-DES gene is promoted in the algal cells to promote the expression of ⁇ 3-DES.
  • ⁇ 21> The method according to ⁇ 19> or ⁇ 20> above, wherein the ⁇ 3-DES gene is introduced into the algae, and the expression of the introduced ⁇ 3-DES gene is promoted.
  • ⁇ 3-DES is any one of the following proteins (I) to (L), preferably the following protein (I) or (J): The method described in the paragraph.
  • (I) A protein comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 5.
  • (J) 60% or more of identity with the amino acid sequence of the protein (I), preferably 65% or more, more preferably 70% or more, more preferably 75% or more, more preferably 80% or more, more preferably 85 %, More preferably 90% or more, more preferably 92% or more, more preferably 95% or more, more preferably 98% or more, and even more preferably 99% or more, and ⁇ 3-DES activity.
  • Protein amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 5.
  • (K) A protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 49.
  • (L) 60% or more identity with the amino acid sequence of the protein (K), preferably 65% or more, more preferably 70% or more, more preferably 75% or more, more preferably 80% or more, more preferably 85 %, More preferably 90% or more, more preferably 92% or more, more preferably 95% or more, more preferably 98% or more, and even more preferably 99% or more, and ⁇ 3-DES activity.
  • the protein (J) has one or more, preferably 1 or more and 164 or less, more preferably 1 or more and 144 or less, more preferably 1 or more amino acid sequences in the protein (I).
  • the protein (L) is one or more, preferably 1 or more and 163 or less, more preferably 1 or more and 143 or less, more preferably 1 or more in the amino acid sequence of the protein (K).
  • the gene encoding the ⁇ 3-DES, preferably any one of the proteins (I) to (L), is a gene consisting of any one of the following DNA (i) to (l), preferably The method according to any one of ⁇ 19> to ⁇ 24>, wherein is a gene consisting of the following DNA (i) or (j).
  • (J) 60% or more of identity with the base sequence of DNA (i), preferably 65% or more, more preferably 70% or more, more preferably 75% or more, more preferably 80% or more, more preferably 85 % Or more, more preferably 90% or more, more preferably 92% or more, more preferably 95% or more, more preferably 98% or more, and even more preferably 99% or more, and ⁇ 3-DES activity.
  • K DNA consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 50.
  • (L) 60% or more, preferably 65% or more, more preferably 70% or more, more preferably 75% or more, more preferably 80% or more, and more preferably 85% or more identity with the base sequence of the DNA (k).
  • the DNA (j) has one or more, preferably 1 to 494, more preferably 1 to 432, more preferably 1 or more nucleotide sequences in the DNA (i).
  • a DNA encoding a protein having ⁇ 3-DES activity, or a DNA comprising a base sequence complementary to the DNA (i), under a stringent condition The method according to ⁇ 25>, wherein the DNA encodes a protein having ⁇ 3-DES activity.
  • ⁇ 27> One or more, preferably 1 or more and 490 or less, more preferably 1 or more and 429 or less, more preferably 1 or more of the DNA (l) in the base sequence of the DNA (k) 368 or less, more preferably 1 or more and 306 or less, more preferably 1 or more and 245 or less, more preferably 1 or more and 184 or less, more preferably 1 or more and 123 or less, more preferably 1 or more 98 or less, more preferably 1 to 62, more preferably 1 to 25, more preferably 1 to 13 nucleotides deleted, substituted, inserted or added.
  • ⁇ 28> The method according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 27>, wherein the expression of ⁇ 5-DES or ⁇ 5-DES gene is promoted in the algae.
  • ⁇ 29> The method according to ⁇ 28>, wherein the expression of the ⁇ 5-DES gene is promoted in the algal cells to promote the expression of ⁇ 5-DES.
  • ⁇ 30> The method according to ⁇ 28> or ⁇ 29>, wherein the ⁇ 5-DES gene is introduced into the algae and the expression of the introduced ⁇ 5-DES gene is promoted.
  • ⁇ 31> Any one of the above ⁇ 28> to ⁇ 30>, wherein the ⁇ 5-DES is any one of the following proteins (M) to (P), preferably the following protein (M) or (N): The method described in the paragraph.
  • M A protein comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 7.
  • N 60% or more of identity with the amino acid sequence of the protein (M), preferably 65% or more, more preferably 70% or more, more preferably 75% or more, more preferably 80% or more, more preferably 85 % Or more, more preferably 90% or more, more preferably 92% or more, more preferably 95% or more, more preferably 98% or more, more preferably 99% or more, and ⁇ 5-DES activity.
  • Protein Protein.
  • (O) A protein comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 51.
  • the identity with the amino acid sequence of the protein (O) is 60% or more, preferably 65% or more, more preferably 70% or more, more preferably 75% or more, more preferably 80% or more, more preferably 85 % Or more, more preferably 90% or more, more preferably 92% or more, more preferably 95% or more, more preferably 98% or more, more preferably 99% or more, and ⁇ 5-DES activity.
  • Protein. ⁇ 32> The protein (N) has one or more, preferably 1 to 211, more preferably 1 to 185, more preferably 1 or more amino acid sequences in the protein (M).
  • the protein (P) has one or more, preferably 1 or more and 206 or less, more preferably 1 or more and 181 or less, more preferably 1 or more amino acid sequences in the protein (O).
  • the gene encoding any one of ⁇ 5-DES, preferably any one of the proteins (M) to (P) is a gene comprising any one of the following DNA (m) to (p), preferably The method according to any one of ⁇ 28> to ⁇ 33>, wherein the gene is the following DNA (m) or (n).
  • the identity with the base sequence of the DNA (m) is 60% or more, preferably 65% or more, more preferably 70% or more, more preferably 75% or more, more preferably 80% or more, more preferably 85 % Or more, more preferably 90% or more, more preferably 92% or more, more preferably 95% or more, more preferably 98% or more, still more preferably 99% or more, and ⁇ 5-DES activity.
  • the identity with the base sequence of the DNA (o) is 60% or more, preferably 65% or more, more preferably 70% or more, more preferably 75% or more, more preferably 80% or more, more preferably 85 % Or more, more preferably 90% or more, more preferably 92% or more, more preferably 95% or more, more preferably 98% or more, still more preferably 99% or more, and ⁇ 5-DES activity.
  • the DNA (n) has one or more, preferably 1 to 633, more preferably 1 to 554, more preferably 1 or more nucleotide sequences in the DNA (m).
  • the DNA (p) has one or more, preferably 1 or more and 620 or less, more preferably 1 or more and 542 or less, more preferably 1 or more, in the base sequence of the DNA (o). 465 or less, more preferably 1 or more and 387 or less, more preferably 1 or more and 310 or less, more preferably 1 or more and 233 or less, more preferably 1 or more and 155 or less, more preferably 1 or more 124 or less, more preferably 1 to 78, more preferably 1 to 31, more preferably 1 to 16 nucleotides deleted, substituted, inserted or added.
  • ⁇ 37> The method according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 36>, wherein expression of ⁇ 9-DES or ⁇ 9-DES gene is promoted in the algae.
  • ⁇ 38> The method according to ⁇ 37>, wherein the expression of the ⁇ 9-DES gene is promoted in the algal cells to promote the expression of ⁇ 9-DES.
  • ⁇ 39> The method according to ⁇ 37> or ⁇ 38>, wherein the ⁇ 9-DES gene is introduced into the algae and the expression of the introduced ⁇ 9-DES gene is promoted.
  • ⁇ 40> Any one of the above ⁇ 37> to ⁇ 39>, wherein the ⁇ 9-DES is any one of the following proteins (Q) to (T), preferably the following protein (Q) or (R): The method described in the paragraph.
  • (Q) A protein comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 9.
  • (R) 60% or more of identity with the amino acid sequence of the protein (Q), preferably 65% or more, more preferably 70% or more, more preferably 75% or more, more preferably 80% or more, more preferably 85 % Or more, more preferably 90% or more, more preferably 92% or more, more preferably 95% or more, more preferably 98% or more, still more preferably 99% or more, and ⁇ 9-DES activity.
  • Protein amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 9.
  • (S) A protein comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 53.
  • the identity with the amino acid sequence of the protein (S) is 60% or more, preferably 65% or more, more preferably 70% or more, more preferably 75% or more, more preferably 80% or more, more preferably 85 % Or more, more preferably 90% or more, more preferably 92% or more, more preferably 95% or more, more preferably 98% or more, still more preferably 99% or more, and ⁇ 9-DES activity.
  • the protein (R) has one or more, preferably 1 to 144, more preferably 1 to 126, more preferably 1 or more amino acid sequences in the protein (Q).
  • the protein (T) has one or more, preferably 1 to 136, more preferably 1 to 119, more preferably 1 or more amino acid sequences in the protein (S).
  • the gene encoding any one of the ⁇ 9-DES, preferably any one of the proteins (Q) to (T) is a gene consisting of any one of the following DNA (q) to (t), preferably The method according to any one of ⁇ 37> to ⁇ 42>, wherein the gene is the following DNA (q) or (r).
  • (R) 60% or more of identity with the base sequence of DNA (q), preferably 65% or more, more preferably 70% or more, more preferably 75% or more, more preferably 80% or more, more preferably 85 % Or more, more preferably 90% or more, more preferably 92% or more, more preferably 95% or more, more preferably 98% or more, still more preferably 99% or more, and ⁇ 9-DES activity.
  • S DNA consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 54.
  • the identity with the base sequence of the DNA (s) is 60% or more, preferably 65% or more, more preferably 70% or more, more preferably 75% or more, more preferably 80% or more, more preferably 85 % Or more, more preferably 90% or more, more preferably 92% or more, more preferably 95% or more, more preferably 98% or more, still more preferably 99% or more, and ⁇ 9-DES activity.
  • the DNA (r) has one or more, preferably 1 or more and 432 or less, more preferably 1 or more and 378 or less, more preferably 1 or more, in the base sequence of the DNA (q).
  • DNA encoding a protein having ⁇ 9-DES activity or a DNA consisting of a base sequence complementary to the DNA (q) under stringent conditions The method according to ⁇ 43>, wherein the DNA encodes a protein having ⁇ 9-DES activity.
  • the DNA (t) has one or more, preferably 1 to 410, more preferably 1 to 359, more preferably 1 or more nucleotide sequences in the DNA (s). 307 or less, more preferably 1 or more and 256 or less, more preferably 1 or more and 205 or less, more preferably 1 or more and 154 or less, more preferably 1 or more and 103 or less, more preferably 1 or more 82 or less, more preferably 1 to 52, more preferably 1 to 21 and more preferably 1 to 11 nucleotides deleted, substituted, inserted or added.
  • ⁇ 46> The method according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 45>, wherein expression of ⁇ 6-ELO or ⁇ 6-ELO gene is promoted in the algae.
  • ⁇ 47> The method according to ⁇ 46>, wherein the expression of the ⁇ 6-ELO gene is promoted in the algal cell to promote the expression of ⁇ 6-ELO.
  • ⁇ 48> The method according to ⁇ 46> or ⁇ 47>, wherein the ⁇ 6-ELO gene is introduced into the algae and the expression of the introduced ⁇ 6-ELO gene is promoted.
  • ⁇ 49> The method according to any one of ⁇ 46> to ⁇ 48>, wherein the ⁇ 6-ELO is the following protein (U) or (V).
  • (U) A protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 74.
  • (V) 60% or more identity with the amino acid sequence of the protein (U), preferably 65% or more, more preferably 70% or more, more preferably 75% or more, more preferably 80% or more, more preferably 85 % Or more, more preferably 90% or more, more preferably 92% or more, more preferably 95% or more, more preferably 98% or more, more preferably 99% or more, and ⁇ 6-ELO activity.
  • the protein (V) has one or more, preferably 1 to 111, more preferably 1 to 97, more preferably 1 or more amino acid sequences in the protein (U).
  • the gene encoding the ⁇ 6-ELO preferably any one of the proteins (U) and (V), is a gene consisting of any one of the following DNA (u) and (v): The method according to any one of ⁇ 46> to ⁇ 50>.
  • the DNA (v) has one or more, preferably 1 or more and 333 or less, more preferably 1 or more and 291 or less, more preferably 1 or more, in the base sequence of the DNA (u).
  • ⁇ 54> In the algae, the expression of at least one protein selected from the group consisting of KAS II, ACP and TE is promoted, preferably at least one selected from the group consisting of KAS II, ACP and TE.
  • ⁇ 55> The method according to ⁇ 54>, wherein a gene encoding at least one selected from the group consisting of KAS II, ACP, and TE is introduced into the algae, and the expression of the introduced gene is promoted.
  • ⁇ 56> 50% or more, preferably 70% or more, more preferably 80%, of identity between the KAS II and the protein comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 60 or the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 60
  • the gene encoding KAS II has a identity of 50% or more, preferably 70%, with the gene consisting of the DNA consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 61 or the base sequence represented by SEQ ID NO: 61 Any one of the above ⁇ 54> to ⁇ 56>, which is a gene comprising a DNA having a base sequence of 80% or more, more preferably 90% or more, and more preferably having a KAS activity.
  • the protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 62 or the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 62 has an identity of 50% or more, preferably 70% or more, more preferably 80% or more.
  • a gene encoding ACP has a identity of 50% or more, preferably 70% or more, with a gene consisting of a DNA consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 63 or a base sequence represented by SEQ ID NO: 63 More preferably 80% or more, more preferably 90% or more of the above ⁇ 54>, ⁇ 55> and ⁇ 58>, which is a gene consisting of a DNA encoding a protein having an ACP activity
  • ⁇ 60>, ⁇ 55>, ⁇ 58> wherein the gene encoding ⁇ 60> ACP is a gene to which a nucleotide sequence encoding a chloroplast translocation signal sequence that functions in the algal cells is added.
  • ACP is a gene to which a nucleotide sequence encoding a chloroplast translocation signal sequence that functions in the algal cells is added.
  • ⁇ 59> The method according to any one of the above.
  • ⁇ 61> The method according to any one of ⁇ 54>, ⁇ 55>, ⁇ 58>, and ⁇ 59>, wherein a gene encoding ACP is introduced into a chloroplast genome and promotes expression of the introduced gene. .
  • TE is a protein consisting of the amino acid sequence represented by any one of SEQ ID NOs: 64-67, or a protein functionally equivalent thereto.
  • Method. ⁇ 63> 50% identity between the TE and the amino acid sequence represented by any one of SEQ ID NOs: 64-67 or the amino acid sequence represented by any one of SEQ ID NOs: 64-67 Or more, preferably 70% or more, more preferably 80% or more, more preferably 90% or more of the above ⁇ 54>, ⁇ 55> and ⁇ 62>, which is a protein having a TE activity.
  • the algae is Nannochloropsis oculata, Nannochloropsis gaditana, Nannochloropsis salina, Nannochloropsis oceanica, Nannochloropsis atomos, Nannochloropsis maculata, Nannochloropsis granata, Alternatively, the method according to any one of the above ⁇ 1> to ⁇ 63>, which is Nannochloropsis sp.
  • the fatty acid or the lipid is a PUFA having 18 or more carbon atoms or a fatty acid ester compound thereof, preferably a PUFA having 18 or 20 carbon atoms or a fatty acid ester compound thereof, more preferably a PUFA having 20 carbon atoms or a compound thereof.
  • Fatty acid ester compounds more preferably C20: 3, C20: 4 or C20: 5, or fatty acid ester compounds thereof, more preferably dihomo- ⁇ -linolenic acid, arachidonic acid or eicosapentaenoic acid, or fatty acid ester compounds thereof, more preferably The method according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 64> above, comprising arachidonic acid or eicosapentaenoic acid or an ester compound thereof, more preferably eicosapentaenoic acid or a fatty acid ester compound thereof.
  • ⁇ 6> The method according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 65>, wherein the algae are cultured using a f / 2 medium.
  • ⁇ 67> An algae transformant belonging to the genus Nannochloropsis, wherein expression of ⁇ 12-DES and ⁇ 6-DES, or expression of ⁇ 12-DES gene and ⁇ 6-DES gene is promoted.
  • ⁇ 68> The transformant according to ⁇ 67>, wherein the expression of ⁇ 12-DES gene and ⁇ 6-DES gene is promoted in the algal cells, and the expression of ⁇ 12-DES and ⁇ 6-DES is promoted.
  • ⁇ 69> The transformant according to ⁇ 68> above, comprising a recombinant vector containing a ⁇ 12-DES gene and a ⁇ 6-DES gene, or a ⁇ 12-DES gene, and a recombinant vector containing a ⁇ 6-DES gene. .
  • ⁇ 72> Any one of the above ⁇ 67> to ⁇ 71>, wherein the ⁇ 12-DES is any one of the proteins (A) to (D), preferably the protein (A) or (B).
  • ⁇ 73> The transformant according to ⁇ 72> above, wherein the protein (B) or (D) is a protein defined in any one of the above ⁇ 7> to ⁇ 9>, or a production method thereof, A kit for producing a transformant.
  • the gene encoding ⁇ 12-DES, preferably any one of the proteins (A) to (D) is a gene defined in any one of the above ⁇ 10> to ⁇ 12>.
  • ⁇ 75> Any one of the above ⁇ 67> to ⁇ 74>, wherein the ⁇ 6-DES is any one of the proteins (E) to (H), preferably the protein (E) or (F).
  • the gene encoding ⁇ 6-DES, preferably any one of the proteins (E) to (H) is the gene defined in any one of the above ⁇ 16> to ⁇ 18>.
  • ⁇ 78> Any one of the above ⁇ 67> to ⁇ 69> and ⁇ 72> to ⁇ 77>, wherein the transformant promotes the expression of ⁇ 3-DES or the expression of the ⁇ 3-DES gene.
  • ⁇ 79> The transformant according to ⁇ 78>, wherein the expression of the ⁇ 3-DES gene is promoted in the algal cells and the expression of ⁇ 3-DES is promoted.
  • ⁇ 80> The transformant according to ⁇ 79> above, comprising a ⁇ 3-DES gene or a recombinant vector containing the ⁇ 3-DES gene.
  • ⁇ 81> The transformant according to any one of ⁇ 70> and ⁇ 72> to ⁇ 77>, wherein a ⁇ 3-DES gene or a recombinant vector containing the ⁇ 3-DES gene is introduced into the algae. Manufacturing method.
  • ⁇ 82> The kit for producing a transformant according to any one of ⁇ 71> to ⁇ 77>, comprising a recombinant vector containing the ⁇ 3-DES gene.
  • ⁇ 83> Any one of the above ⁇ 78> to ⁇ 82>, wherein the ⁇ 3-DES is any one of the proteins (I) to (L), preferably the protein (I) or (J).
  • ⁇ 84> The transformant according to ⁇ 83> above, wherein the protein (J) or (L) is a protein defined in any one of the above ⁇ 22> to ⁇ 24>, A kit for producing a transformant.
  • the gene encoding ⁇ 3-DES, preferably any one of the proteins (I) to (L) is a gene defined in any one of the above ⁇ 25> to ⁇ 27>.
  • ⁇ 86> In the transformant, expression of ⁇ 5-DES or expression of ⁇ 5-DES gene is promoted, ⁇ 67> to ⁇ 69>, ⁇ 72> to ⁇ 80>, and ⁇ 83> to ⁇ 85> The transformant according to any one of the above.
  • ⁇ 87> The transformant according to ⁇ 86>, wherein the expression of the ⁇ 5-DES gene is promoted in the algal cells and the expression of ⁇ 5-DES is promoted.
  • ⁇ 88> The transformant according to ⁇ 87> above, comprising a ⁇ 5-DES gene or a recombinant vector containing the ⁇ 5-DES gene.
  • ⁇ 89> ⁇ 5-DES gene or a recombinant vector containing ⁇ 5-DES gene is introduced into the algae, ⁇ 70>, ⁇ 72> to ⁇ 77>, ⁇ 81>, and ⁇ 83> to ⁇ 83>85>
  • ⁇ 91> Any one of the above ⁇ 86> to ⁇ 90>, wherein the ⁇ 5-DES is any one of the proteins (M) to (P), preferably the protein (M) or (N).
  • ⁇ 92> The transformant according to ⁇ 91> above, wherein the protein (N) or (P) is a protein defined in any one of the above ⁇ 31> to ⁇ 33>, a method for producing the same, or A kit for producing a transformant.
  • the gene encoding any one of ⁇ 5-DES, preferably the proteins (M) to (P), is a gene defined in any one of the above ⁇ 34> to ⁇ 36>.
  • ⁇ 94> In the transformant, ⁇ 9-DES expression or ⁇ 9-DES gene expression is promoted, ⁇ 67> to ⁇ 69>, ⁇ 72> to ⁇ 80>, ⁇ 83> to ⁇ 83 88> and ⁇ 91> to ⁇ 93>.
  • ⁇ 95> The transformant according to ⁇ 94>, wherein the expression of the ⁇ 9-DES gene is promoted in the algal cells and the expression of ⁇ 9-DES is promoted.
  • ⁇ 96> The transformant according to ⁇ 95> above, comprising a ⁇ 9-DES gene or a recombinant vector containing the ⁇ 9-DES gene.
  • ⁇ 97> ⁇ 9-DES gene or a recombinant vector containing ⁇ 9-DES gene is introduced into the algae, ⁇ 70>, ⁇ 72> to ⁇ 77>, ⁇ 81>, ⁇ 83> to ⁇ 85 >, ⁇ 89>, and ⁇ 91> to ⁇ 93>.
  • ⁇ 98> The transformation according to any one of ⁇ 71> to ⁇ 77>, ⁇ 82> to ⁇ 85>, and ⁇ 90> to ⁇ 93>, including a recombinant vector containing the ⁇ 98> ⁇ 9-DES gene Body preparation kit.
  • the gene encoding ⁇ 9-DES, preferably any one of the proteins (Q) to (T), is a gene defined in any one of the above ⁇ 43> to ⁇ 45>.
  • ⁇ 6-ELO expression or ⁇ 6-ELO gene expression is promoted, ⁇ 67> to ⁇ 69>, ⁇ 72> to ⁇ 80>, ⁇ 83> to ⁇
  • ⁇ 103> The transformant according to ⁇ 102>, wherein the expression of the ⁇ 6-ELO gene is promoted in the algal cells and the expression of ⁇ 6-ELO is promoted.
  • ⁇ 104> The transformant according to ⁇ 103> above, comprising a ⁇ 6-ELO gene or a recombinant vector containing the ⁇ 6-ELO gene.
  • ⁇ 105> ⁇ 6-ELO gene or a recombinant vector containing ⁇ 6-ELO gene is introduced into the algae, ⁇ 70>, ⁇ 72> to ⁇ 77>, ⁇ 81>, ⁇ 83> to ⁇ 85 >, ⁇ 89>, ⁇ 91> to ⁇ 93>, ⁇ 97>, and ⁇ 99> to ⁇ 101>.
  • ⁇ 106> including the recombinant vector containing the ⁇ 6-ELO gene, ⁇ 71> to ⁇ 77>, ⁇ 82> to ⁇ 85>, ⁇ 90> to ⁇ 93>, and ⁇ 98> to ⁇ 101> A kit for producing the transformant according to any one of the above.
  • ⁇ 107> The transformant according to any one of the above ⁇ 102> to ⁇ 106>, the production method, or the trait thereof, wherein the ⁇ 6-ELO is any one of the proteins (U) and (V)
  • a kit for producing a converter A kit for producing a converter.
  • ⁇ 108> The transformant according to ⁇ 107>, the method for producing the transformant, or the kit for producing the transformant, wherein the protein (V) is a protein specified in the item ⁇ 49> or ⁇ 50>.
  • ⁇ 109> The ⁇ 102>, wherein the gene encoding ⁇ 6-ELO, preferably any one of the proteins (U) and (V) is the gene defined in the item ⁇ 51> or ⁇ 52> A transformant according to any one of ⁇ 108>, a method for producing the transformant, or a kit for producing the transformant.
  • ⁇ 111> at least one gene selected from the group consisting of ⁇ 3-DES gene, ⁇ 5-DES gene, ⁇ 9-DES gene and ⁇ 6-ELO gene, preferably ⁇ 3-DES gene, ⁇ 5-DES gene, ⁇ 9-DES gene And two or more genes selected from the group consisting of ⁇ 6-ELO genes or a recombinant vector containing the genes, ⁇ 70>, ⁇ 72> to ⁇ 77>, ⁇ 81>, ⁇ 83> ⁇ ⁇ 85>, ⁇ 89>, ⁇ 91> to ⁇ 93>, ⁇ 97>, ⁇ 99> to ⁇ 101>, ⁇ 105>, and ⁇ 107> to ⁇ 109> How to make a body.
  • ⁇ 112> from the group consisting of a recombinant vector containing the ⁇ 3-DES gene, a recombinant vector containing the ⁇ 5-DES gene, a recombinant vector containing the ⁇ 9-DES gene, and a recombinant vector containing the ⁇ 6-ELO gene
  • At least one selected recombinant vector preferably a recombinant vector containing a ⁇ 3-DES gene, a recombinant vector containing a ⁇ 5-DES gene, a recombinant vector containing a ⁇ 9-DES gene, and a ⁇ 6-ELO gene ⁇ 71> to ⁇ 77>, ⁇ 82> to ⁇ 85>, ⁇ 90> to ⁇ 93>, ⁇ 98>, comprising two or more recombinant vectors selected from the group consisting of contained recombinant vectors
  • ⁇ 113> In the transformant, expression of at least one protein selected from the group consisting of KAS II, ACP and TE is promoted, preferably at least selected from the group consisting of KAS II, ACP and TE ⁇ 67> to ⁇ 70>, ⁇ 72> to ⁇ 81>, ⁇ 83> to ⁇ 89>, ⁇ 91> to ⁇ 97>, ⁇ 99>, wherein expression of a gene encoding one is promoted
  • ⁇ 114> The transformant according to ⁇ 113> or a method for producing the same, wherein the gene is introduced into the algae, and the expression of the introduced gene is promoted in cells of the algae.
  • ⁇ 115> At least one set selected from the group consisting of a recombinant vector containing a gene encoding KAS II, a recombinant vector containing a gene encoding ACP, and a recombinant vector containing a gene encoding TE ⁇ 71> to ⁇ 77>, ⁇ 82> to ⁇ 85>, ⁇ 90> to ⁇ 93>, ⁇ 98> to ⁇ 101>, ⁇ 106> to ⁇ 109>, and ⁇ 112>, including a replacement vector A kit for producing a transformant according to any one of the above.
  • ⁇ 116> The transformant according to any one of ⁇ 113> to ⁇ 115>, the preparation method thereof, or the kit for preparing the transformant, wherein the KAS II is the protein defined in the item ⁇ 56>. . ⁇ 117>
  • ⁇ 118> The transformant according to any one of ⁇ 113> to ⁇ 117>, a method for producing the transformant, or a kit for producing the transformant, wherein the ACP is a protein defined in the item ⁇ 58>.
  • any one of the above ⁇ 113> to ⁇ 118>, the method for producing the transformant, or the transformant, wherein the gene encoding the ACP is a gene defined in the above item ⁇ 59> Preparation kit. Any one of the above ⁇ 113> to ⁇ 119>, wherein the gene encoding ⁇ 120> ACP is a gene to which a nucleotide sequence encoding a chloroplast transition signal sequence that functions in the algal cells is added.
  • ⁇ 121> A transformant according to any one of ⁇ 113> to ⁇ 119>, wherein a gene encoding ACP is introduced into the chloroplast genome, and expression of the introduced gene is promoted, and a method for producing the transformant Or a kit for producing a transformant.
  • ⁇ 122> The transformant according to any one of the above ⁇ 113> to ⁇ 121>, the method for producing the transformant, or the transformant, wherein the TE is a protein defined in the item ⁇ 62> or ⁇ 63> Preparation kit.
  • the algae is Nannochloropsis oculata, Nannochloropsis gaditana, Nannochloropsis salina, Nannochloropsis oceanica, Nannochloropsis atomos, Nannochloropsis maculata, Nannochloropsis granata, Or the transformation according to any one of the above ⁇ 67> to ⁇ 122>, which is Nannochloropsis sp., Preferably Nannochloropsis oculata, or Nannochloropsis gaditana, more preferably Nannochloropsis oculata. Body, its production method, or kit for producing a transformant.
  • the lipid is a PUFA having 18 or more carbon atoms or a fatty acid ester compound thereof, preferably a PUFA having 18 or 20 carbon atoms or a fatty acid ester compound thereof, more preferably a PUFA having 20 carbon atoms or a fatty acid ester compound thereof.
  • a fatty acid ester compound thereof more preferably dihomo- ⁇ -linolenic acid, arachidonic acid or eicosapentaenoic acid, or a fatty acid ester compound thereof, more preferably arachidonic acid
  • the use according to ⁇ 124> above comprising eicosapentaenoic acid or an ester compound thereof, more preferably eicosapentaenoic acid or a fatty acid ester compound thereof.
  • fatty acid ester compound is at least one selected from the group consisting of MAG, DAG and TAG, preferably TAG.
  • Example 1 Production of a desaturase gene expression plasmid derived from Nannochloropsis oculata, transformation of Nannochloropsis oculata, and production of lipid by the transformant
  • PCR was performed using the primer pair of primer number 13 and primer number 14 shown in Table 1, and the primer pair of primer number 15 and primer number 16 shown in Table 1, and the zeocin resistance gene and tube
  • Each of the phosphorus promoter sequences was amplified.
  • PCR was performed using the genome of Nannochloropsis oculata NIES2145 strain as a template and the primer pair of primer number 17 and primer number 18 shown in Table 1 to amplify the heat shock protein terminator sequence (SEQ ID NO: 19).
  • plasmid vector pUC19 manufactured by Takara Bio Inc.
  • PCR was performed using the primer pair of primer number 20 and primer number 21 shown in Table 1, and plasmid vector pUC19 was amplified.
  • This expression plasmid consists of an insert sequence linked in the order of a tubulin promoter sequence, a zeocin resistance gene, a heat shock protein terminator sequence, and a pUC19 vector sequence.
  • PCR was performed using the above cDNA as a template and the primer pair of primer number 24 and primer number 25 shown in Table 1 to obtain a gene (No ⁇ 12-DES gene) fragment consisting of the base sequence of SEQ ID NO: 2.
  • PCR was performed using the cDNA as a template and the primer pair of primer number 26 and primer number 27 shown in Table 1, and a gene (No ⁇ 6-DES gene) fragment consisting of the base sequence of SEQ ID NO: 4 was obtained.
  • PCR was performed using the above cDNA as a template and the primer pair of primer number 28 and primer number 29 shown in Table 1, and a gene (No ⁇ 5-DES gene) fragment consisting of the base sequence of SEQ ID NO: 8 was obtained.
  • PCR was performed using the cDNA as a template and a primer pair of primer number 30 and primer number 31 shown in Table 1, and a gene (No ⁇ 3-DES gene) fragment consisting of the base sequence of SEQ ID NO: 6 was obtained.
  • PCR was performed using the genome of Nannochloropsis oculata NIES2145 strain as a template, the primer pair of primer number 32 and primer number 33 and the primer pair of primer number 34 and primer number 35 shown in Table 1, and the LDSP promoter A fragment (SEQ ID NO: 36) and a VCP1 terminator fragment (SEQ ID NO: 37) were obtained. Further, PCR was performed using the zeocin resistance gene expression plasmid as a template and the primer pair of primer number 38 and primer number 21 shown in Table 1, and a zeocin resistance gene expression cassette (tubulin promoter sequence, zeocin resistance gene, heat shock) A fragment consisting of a protein terminator sequence) and a pUC19 sequence was amplified.
  • zeocin resistance gene expression cassette tubulin promoter sequence, zeocin resistance gene, heat shock
  • Various desaturase gene fragments, LDSP promoter fragment, VCP1 terminator fragment, zeocin resistance gene expression cassette and pUC19 sequence fragment were fused in the same manner as described above, No ⁇ 9-DES gene expression plasmid, No ⁇ 12-DES gene expression Plasmid, No ⁇ 6-DES gene expression plasmid, No ⁇ 5-DES gene expression plasmid, and No ⁇ 3-DES gene expression plasmid were constructed.
  • This expression plasmid consists of an LDSP promoter sequence, various desaturase genes, a VCP1 terminator sequence, a tubulin promoter sequence, a zeocin resistance gene, a heat shock protein terminator sequence, and an pUC19 vector sequence.
  • Nannochloropsis oculata strain NIES2145 washed with a 384 mM sorbitol solution to completely remove salts, and used as host cells for transformation.
  • About 500 ng of the various desaturase gene expression cassettes amplified above were each mixed with host cells and electroporated under the conditions of 50 ⁇ F, 500 ⁇ , and 2,200 v / 2 mm.
  • the culture medium was transferred to 18 mL of a medium (hereinafter referred to as “N5P5 medium”) with a 5-fold increase in phosphorus concentration and shake-cultured at 25 ° C. in a 0.3% CO 2 atmosphere for 12 weeks under 12 h / 12 h light / dark conditions.
  • N5P5 medium a medium
  • WT strain wild-type Nannochloropsis oculata NIES2145 strain
  • Nitrogen gas was blown into the resulting chloroform layer to dryness, 0.7 mL of 0.5N potassium hydroxide / methanol solution was added, and the temperature was kept constant at 80 ° C. for 30 minutes. Subsequently, 1 mL of 14% boron trifluoride solution (manufactured by SIGMA) was added, and the temperature was kept constant at 80 ° C. for 10 minutes. Thereafter, 0.5 mL of hexane and 1 mL of saturated saline were added and stirred vigorously, and allowed to stand at room temperature for 10 minutes, and the upper hexane layer was recovered to obtain a fatty acid methyl ester.
  • the fatty acid methyl ester was identified by subjecting the sample to gas chromatograph mass spectrometry analysis under the same conditions.
  • the amount of methyl ester of each fatty acid was quantified from the peak area of the waveform data obtained by gas chromatography analysis.
  • Each peak area was compared with the peak area of a fatty acid methyl ester having 17 carbon atoms derived from an internal standard, thereby correcting between samples, and calculating the amount of each fatty acid per liter of culture solution.
  • the sum total of each fatty acid amount was made into the total fatty acid amount, and the weight ratio of each fatty acid amount to the total fatty acid amount was calculated. The results are shown in Table 3.
  • Fatty acid composition (% TFA)” represents the ratio of the weight of each fatty acid to the weight of the total fatty acid.
  • N is an integer of 3 to 5
  • C20: n (% TFA)” is the ratio of the weight of C20: 3 fatty acid, C20: 4 fatty acid, and C20: 5 fatty acid to the weight of total fatty acid. Indicates the sum.
  • Example 2 Transformation of Nannochloropsis oculata using two types of desaturase genes derived from Nannochloropsis oculata, and production of lipids by the transformant (1) Construction of desaturase gene expression plasmid (paromomycin resistance) No. 6-DES gene expression plasmid, No ⁇ 5-DES gene expression plasmid and No ⁇ 3-DES gene expression plasmid constructed in 1 were used as templates, respectively, and primer pairs 16 and 17 shown in Table 1 were used. PCR was performed to amplify various desaturase gene fragments (including vector sequences and the like). In addition, PCR was performed using the artificially synthesized paromomycin resistance gene (SEQ ID NO: 39) as a template and the primer pair of primer number 40 and primer number 41 shown in Table 2 to amplify the paromomycin resistance gene.
  • SEQ ID NO: 39 the artificially synthesized paromomycin resistance gene
  • Various desaturase gene amplification fragments (including vector sequences and the like) and paromomycin resistance gene fragments were fused in the same manner as in Example 1, respectively, and a plasmid for expression of No ⁇ 6-DES gene (resistance to paromomycin) and plasmid for expression of No ⁇ 5-DES gene (Paromomycin resistance) and No ⁇ 3-DES gene expression plasmid (Paromomycin resistance) were constructed.
  • This expression plasmid consists of an LDSP promoter sequence, various desaturase genes, a VCP1 terminator sequence, an tubulin promoter sequence, a paromomycin resistance gene, a heat shock protein terminator sequence in this order, and a pUC19 vector sequence.
  • PCR was performed using the prepared desaturase gene expression plasmids (paromomycin resistance) as a template using the primer pairs of primer numbers 32 and 18 shown in Table 1, and various desaturase gene expression cassettes (LDSP promoter sequences, various desaturase genes).
  • LDSP promoter sequences various desaturase genes.
  • a DNA fragment comprising a VCP1 terminator sequence, a tubulin promoter sequence, a paromomycin resistance gene, and a heat shock protein terminator sequence).
  • the obtained amplified fragment was purified by the same method as in Example 1, and the purified fragment was introduced into the No ⁇ 12-DES gene-introduced strain prepared in Example 1 by electroporation.
  • Example 2 After recovery culture in the same manner as in Example 1, it was applied to an f / 2 agar medium containing 2 ⁇ g / mL zeocin and 100 ⁇ g / mL paromomycin, and light and dark conditions at 25 ° C. under 0.3% CO 2 atmosphere for 12 h / 12 h. For 2 to 3 weeks.
  • Nannochloropsis oculata strains containing various desaturase gene expression cassettes No ⁇ 12-DES gene and No ⁇ 6-DES gene-introduced strain ((delta12 DES + delta6 DES) strain), No ⁇ 12-DES gene and No ⁇ 5
  • the -DES gene-introduced strain ((delta12 DES + delta5 DES) strain) and the No ⁇ 12-DES gene and No ⁇ 3-DES gene-introduced strain ((delta12 DES + omega3 DES) strain) were selected by PCR.
  • Example 1 an increase in the amount of PUFA could not be confirmed even when the No ⁇ 6-DES gene and the No ⁇ 12-DES gene were independently promoted for their transcription amounts.
  • the transformant introduced with the No ⁇ 12-DES gene and the No ⁇ 6-DES gene ((delta12 DES + delta6 DES) strain) compared with the wild strain and the (delta12 DES) strain.
  • the ratio of C18: 1 ⁇ 9 amount was greatly reduced, and the ratio of C20: n amount was greatly increased.
  • the proportion of C20: 4 ⁇ 5,8,11,14 (arachidonic acid) amount increased greatly.
  • Example 3 Transformation of Nannochloropsis oculata using three kinds of desaturase genes derived from Nannochloropsis oculata, and production of lipids by the transformant (1) Construction of a plasmid for desaturase gene expression (hygromycin resistance) Using the No ⁇ 3-DES gene expression plasmid constructed in Example 1 as a template, PCR was performed using the primer pair of primer number 16 and primer number 17 shown in Table 1, and a No ⁇ 3-DES gene fragment (including vector sequence etc.) was obtained. Amplified. Furthermore, PCR was performed using the artificially synthesized hygromycin resistance gene (SEQ ID NO: 42) as a template and the primer pair of primer number 43 and primer number 44 shown in Table 2 to amplify the hygromycin resistance gene.
  • SEQ ID NO: 42 the artificially synthesized hygromycin resistance gene
  • No ⁇ 3-DES gene expression plasmid (hygromycin resistance).
  • This expression plasmid consists of an LDSP promoter sequence, a No ⁇ 3-DES gene, a VCP1 terminator sequence, a tubulin promoter sequence, a hygromycin resistance gene, a heat shock protein terminator sequence, and an insert sequence, and a pUC19 vector sequence.
  • No ⁇ 3-DES gene expression plasmid hygromycin resistance
  • PCR was performed using the primer pair of primer number 32 and primer number 18 shown in Table 1, and a No ⁇ 3-DES gene expression cassette (LDSP promoter sequence, A DNA fragment consisting of a No ⁇ 3-DES gene, a VCP1 terminator sequence, a tubulin promoter sequence, a hygrosine resistance gene, and a heat shock protein terminator sequence) was amplified.
  • the obtained amplified fragment was purified by the same method as in Example 1, and the purified fragment was introduced into the delta12 gene and No ⁇ 6-DES gene-introduced strain prepared in Example 2 by electroporation.
  • Example 2 After recovery culture in the same manner as in Example 1, it was applied to a 500 ⁇ g / mL hygromycin-containing f / 2 agar medium at 25 ° C. in a 0.3% CO 2 atmosphere under 12 h / 12 h light / dark conditions. Incubated for ⁇ 3 weeks. Among the obtained colonies, the Nannochloropsis oculata strain containing the No ⁇ 3-DES gene expression cassette (No ⁇ 12-DES gene, No ⁇ 6-DES gene and No ⁇ 3-DES gene-introduced strain ((delta12 DES + delta6 DES + omega3 DES)) Strain)) was selected by PCR.
  • No ⁇ 3-DES gene expression cassette No ⁇ 12-DES gene, No ⁇ 6-DES gene and No ⁇ 3-DES gene-introduced strain ((delta12 DES + delta6 DES + omega3 DES)) Strain
  • Example 2 shows the results of total fatty acid production and fatty acid composition at 3 weeks.
  • Table 6 shows the total amount of fatty acids, the production amount of C20: 5 fatty acids, and the production amount of C20: n fatty acids at the first week, the second week and the third week of culture.
  • Table 7 shows the ratio of the C20: 5 fatty acid amount and the ratio of the C20: n fatty acid amount in the first week, the second week, and the third week of the culture.
  • Example 4 Transformation of (delta12 DES + delta6 DES + omega3 DES) strain using ⁇ 9-DES gene, ⁇ 5-DES gene or ⁇ 6-ELO gene, and production of lipid by transformant (1) Desaturase gene or elongase Construction of a plasmid for gene expression (bialaphos resistance) Using the No ⁇ 9-DES gene expression plasmid or the No ⁇ 5-DES gene expression plasmid constructed in Example 1 as a template, primer pairs 16 and 17 shown in Table 1 were used. PCR was performed to amplify the No ⁇ 9-DES gene fragment and the No ⁇ 5-DES gene fragment (including the vector sequence of the pUC19 vector itself).
  • a bialaphos resistance gene (SEQ ID NO: 68) was artificially synthesized. PCR was performed using the synthesized DNA fragment as a template and the primer pair of primer number 69 and primer number 70 shown in Table 2 to amplify the bialaphos resistance gene.
  • the No ⁇ 9-DES gene fragment and the No ⁇ 5-DES gene fragment were fused with the bialaphos resistance gene fragment in the same manner as in Example 1, and the No ⁇ 9-DES gene expression plasmid (bialaphos resistance) and the No ⁇ 5-DES gene expression were fused.
  • Each plasmid (bialaphos resistance) was constructed.
  • the expression plasmid is composed of an LDSP promoter sequence, a No ⁇ 9-DES gene or a No ⁇ 5-DES gene, a VCP1 terminator sequence, a tubulin promoter sequence, a bialaphos resistance gene, a heat shock protein terminator sequence, and an insert sequence ligated in this order. Consists of a vector sequence.
  • Example 2 Using the Nannochloropsis Oculata strain NIES2145 strain prepared in Example 1 as a template, PCR was performed using the primer pair of primer number 71 and primer number 72 shown in Table 2, and the gene consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 73 ( No ⁇ 6-ELO gene) fragment was obtained. This amplified fragment was fused with an LDSP promoter fragment, a VCP1 terminator fragment, a zeocin resistance gene expression cassette and a pUC19 sequence in the same manner as in Example 1 to construct a plasmid for No ⁇ 6-ELO gene expression.
  • No ⁇ 6-ELO gene expression plasmid As a template, PCR was performed using the primer pair of primer number 16 and primer number 17 shown in Table 1, and a No ⁇ 6-ELO gene fragment (including the vector sequence of the pUC19 vector itself) was obtained. Amplified. This amplified fragment and the aforementioned bialaphos resistance gene fragment were fused in the same manner as in Example 1 to construct a plasmid for expressing No ⁇ 6-ELO gene (bialaphos resistance).
  • This expression plasmid consists of an LDSP promoter sequence, a No ⁇ 6-ELO gene, a VCP1 terminator sequence, a tubulin promoter sequence, a bialaphos resistance gene, a heat shock protein terminator sequence linked in this order, and a pUC19 vector sequence.
  • No ⁇ 9-DES gene expression plasmid (bialaphos resistance), No ⁇ 5-DES gene expression plasmid (bialaphos resistance) or No ⁇ 6-ELO expression plasmid (bialaphos resistance) as a template
  • primer numbers 32 and primer numbers shown in Table 1 PCR was carried out using 18 primer pairs and a No ⁇ 9-DES gene expression cassette, No ⁇ 5-DES gene expression cassette or No ⁇ 6-ELO gene expression cassette (LDSP promoter sequence, desaturase gene or elongase gene (No ⁇ 9-DES gene, No ⁇ 5-DES gene) Gene or No ⁇ 6-ELo gene), VCP1 terminator sequence, tubulin promoter sequence, bialaphos resistance gene, DNA fragment consisting of heat shock protein terminator sequence).
  • the obtained amplified fragment was purified by the same method as in Example 1, and the purified fragments were electroporated into the No ⁇ 12-DES gene, No ⁇ 6-DES gene and No ⁇ 3-DES gene-introduced strain prepared in Example 3, respectively. Introduced by. After recovery culture by the same method as in Example 1, it was applied to a f / 2 agar medium containing 750 ⁇ g / mL bialaphos and 2 to 2 hours at 25 ° C. in a 0.3% CO 2 atmosphere under 12 h / 12 h light / dark conditions. Cultured for 3 weeks.
  • the Nannochloropsis oculata strain containing the No ⁇ 9-DES gene expression cassette ((delta12 DES + delta6 DES + omega3 DES + delta9 DES) strain) and the Nannochloropsis strain containing the No ⁇ 5-DES gene expression cassette ⁇ Oculata strain ((delta12 DES + delta6 DES + omega3 DES + delta5 DES) strain) and Nannochloropsis oculata strain ((delta12 DES + delta6 DES + omega3 DES + delta6 ELO) strain containing the No ⁇ 6-ELO gene expression cassette )
  • Oculata strain ((delta12 DES + delta6 DES + omega3 DES + delta5 DES) strain)
  • Nannochloropsis oculata strain ((delta12 DES + delta6 DES + omega3 DES + delta6 ELO) strain containing the No ⁇ 6-ELO gene expression cassette )
  • strains into which the No ⁇ 12-DES gene, No ⁇ 6-DES gene, No ⁇ 3-DES gene, and No ⁇ 5-DES gene were introduced were (delta12 DES + delta6 DES + omega3 DES + delta5 DES) strain) were (delta12 DES + delta6 DES + The ratio of C20: 3 ⁇ 8,11,14 decreased and the ratio of C20: 4 ⁇ 5,8,11,14 and C20: 5 ⁇ 5,8,11,14,17 increased compared to the omega3 DES) strain.
  • Example 5 Analysis of fatty acid composition in TAG of (delta12 DES + delta6 DES + omega3 DES) strain and (delta12 DES + delta6 DES + omega3 DES + delta6 ELO) strain
  • the strains (delta12 DES + delta6 DES + omega3 DES), (delta12 DES + delta6 DES + omega3 DES + delta6 ELO) obtained in Examples 3 and 4 and the wild strain as a negative control were seeded in 20 mL of N5P5 medium, Pre-culture solution 1 was obtained by shaking culture for 5 days under a 12 h / 12 h light / dark condition in an atmosphere of 25 ° C. and 0.3% CO 2 .
  • preculture solution 12 1 mL of the preculture solution 12 was transferred to 18 mL of N5P5 medium and cultured under shaking under the same conditions for 5 days to obtain preculture solution 2. 22 mL of the preculture solution was transferred to 18 mL of N5P5 medium, and shaking culture was performed under the same conditions for 3 weeks.
  • the plate After development, the plate is dried, sprayed with 0.1% primulin (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) dissolved in methanol, and then dried with a handy UV lamp UVL-21 (manufactured by Mutual Rikagaku Glass Co., Ltd.). Minute detected.
  • a handy UV lamp UVL-21 manufactured by Mutual Rikagaku Glass Co., Ltd.
  • the TAG fraction was scraped off with a toothpick, 0.1 mL of chloroform and 0.5 mL of 14% boron trifluoride-methanol solution (manufactured by SIGMA) were added, and the mixture was incubated at 80 ° C. for 30 minutes. Thereafter, 0.5 mL of hexane and 1 mL of saturated brine were added and stirred vigorously. After standing at room temperature for 10 minutes, the upper hexane layer was recovered to obtain a fatty acid methyl ester. The obtained fatty acid methyl ester was subjected to gas chromatography analysis in the same manner as in Example 1 to analyze the constituent fatty acids. The results are shown in Table 9.
  • TAG-FA represents the total weight of fatty acid residues constituting TAG
  • Fatty acid composition (% TAG-FA) represents each fatty acid in the total weight of fatty acid residues constituting TAG.
  • the weight ratio of residues (composition ratio of fatty acid residues constituting TAG) is shown.
  • a strain into which a No ⁇ 12-DES gene, a No ⁇ 6-DES gene, a No ⁇ 3-DES gene, and a No ⁇ 6-ELO gene were introduced is a No ⁇ 12-DES gene, No ⁇ 6
  • the ratio of C20: n (especially C20: 3 ⁇ 8,11,14) is further increased compared to the strain introduced with -DES gene and No ⁇ 3-DES gene ((delta12 DES + delta6 DES + omega3 DES) strain) It was. From these results, it was found that the productivity of PUFA is further improved by promoting the expression of ⁇ 6-ELO in addition to ⁇ 12-DES, ⁇ 6-DES and ⁇ 3-DES.
  • ⁇ 12-DES and ⁇ 6-DES are enzymes that catalyze the rate-limiting reaction in the PUFA synthesis pathway of algae belonging to the genus Nannochloropsis. And the production amount of PUFA can be increased significantly by promoting these expressions. Then, by culturing a transformant of algae belonging to the genus Nannochloropsis that promotes the expression of ⁇ 12-DES and ⁇ 6-DES, the productivity of PUFA can be improved.

Abstract

Δ12-デサチュラーゼ及びΔ6-デサチュラーゼの発現を促進させたナンノクロロプシス（Nannochloropsis）属に属する藻類を培養し、脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質を生産させる、脂質の製造方法、並びに、Δ12-デサチュラーゼ及びΔ6-デサチュラーゼの発現が促進されている、ナンノクロロプシス属に属する藻類の形質転換体。

Description

脂質の製造方法
　本発明は、脂質の製造方法に関する。また本発明は、当該方法に用いる形質転換体に関する。
　脂肪酸は脂質の主要構成成分の１つであり、生体内においてグリセリンとのエステル結合により生成するトリアシルグリセロール等の脂質を構成する。また、多くの動植物において脂肪酸はエネルギー源として貯蔵され利用される物質でもある。動植物内に蓄えられた脂肪酸や脂質は、食用又は工業用として広く利用されている。
　例えば、炭素原子数が１８以上の長鎖脂肪酸は炭素原子数や不飽和度によって化学的性質が異なり、様々な用途に用いられている。例えば、エイコサペンタエン酸（eicosapentaenoic acid、以下「EPA」ともいう）やドコサヘキサエン酸（docosahexaenoic acid、以下、「DHA」ともいう）といった長鎖多価不飽和脂肪酸（以下、「ＰＵＦＡ」ともいう）の多くは、動物の生体内では合成できない必須脂肪酸であることが知られている。よってＰＵＦＡは栄養学的用途に特に有用であり、機能性食品などに用いられている。
　一般に、植物の脂肪酸合成経路は葉緑体に局在する。葉緑体ではアセチル－アシルキャリアープロテイン（acyl carrier protein、以下「ACP」ともいう）を出発物質とし、炭素鎖の伸長反応が繰り返され、最終的に炭素原子数１８程度のアシル-ACP（脂肪酸残基であるアシル基とACPとからなる複合体。ここで炭素原子数はアシル基の炭素数を示し、以下同様に示す場合がある。）が合成される。この脂肪酸合成経路に関与する酵素のうち、β－ケトアシル-ACPシンターゼ（β-ketoacyl-acyl carrier protein synthase、以下「KAS」ともいう）はアシル基の鎖長制御に関与する酵素である。植物では、KAS　I、KAS　II、KAS　III、KAS　IV、のそれぞれ機能が異なる４種のKASが存在することが知られている。このうち、KAS　IIは主に炭素原子数１８のステアロイル-ACPまでの伸長反応に関与する。
　合成されたアシル-ACPは、アシル-ACPチオエステラーゼ（以下、単に「TE」ともいう）によって遊離脂肪酸となり、小胞体に運ばれる。そして小胞体上で、遊離脂肪酸、アシル-CoA、又は脂肪酸とグリセロールとのエステル化合物を基質とし、多数のデサチュラーゼ（Desaturase）やエロンガーゼ（Elongase）が作用する多段階反応によって、ＰＵＦＡが合成される。
　近年、持続可能な社会の実現に向けて再生可能エネルギーに関する研究、開発が推し進められている。特に光合成微生物は、二酸化炭素の削減効果に加えて、穀物と競合しないバイオ燃料生物として期待されている。
　この中で、とりわけ、バイオ燃料生産に有用であるとして、藻類が注目を集めている。藻類は、バイオディーゼル燃料として利用可能な脂質を光合成によって生産でき、しかも食料と競合しないことから、次世代のバイオマス資源として注目されている。また、藻類は、植物に比べ、高い脂質生産能力や脂質蓄積能力を有するとの報告もある。藻類の脂質合成や蓄積のメカニズム、並びに藻類の脂質生産能力や脂質蓄積能力を応用した脂質生産技術について研究が始まってはいるが、未解明な部分も多い。
　前述のように、脂肪酸や脂質の利用は多岐にわたる。そのため、植物や細菌等の宿主において生体内での脂肪酸や脂質の生産性を向上させる試みが行われている。さらに、脂肪酸の用途や有用性はその炭素原子数（鎖長）や不飽和結合数（不飽和度）に依存するため、脂肪酸の炭素原子数や不飽和結合数を制御する試みも行われている。
　一般的にＰＵＦＡの生産性向上には、デサチュラーゼの強化が有効であると考えられており、様々な生物からこれらの酵素群が同定されている。例えば、次世代の油脂生産源として注目を集めている微細藻類の一種であるナンノクロロプシス（Nannochloropsis）属に属する藻類由来のデサチュラーゼが、ＰＵＦＡの合成に使用できることが知られている（特許文献１、非特許文献１及び２参照）。
　このように、油糧生物において所望のＰＵＦＡに富む脂質を効率的に産生させる方法に対しては、当技術分野における需要がある。
国際公開第２０１２／１４９４５７号
Algal Research，2015，Vol．11，p．387-398 Chinese Journal of Oceanology and Limnology，2011，Vol．29(2)，p．290-296
　本発明は、Δ12-デサチュラーゼ及びΔ6-デサチュラーゼの発現を促進させたナンノクロロプシス属に属する藻類を培養し、脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質を生産させる、脂質の製造方法に関する。
　また本発明は、ナンノクロロプシス属に属する藻類において、Δ12-デサチュラーゼ及びΔ6-デサチュラーゼの発現を促進し、前記藻類の細胞内で生産される全脂肪酸に占めるＰＵＦＡの割合を増加させる、脂肪酸組成を改変する方法に関する。
　さらに本発明は、Δ12-デサチュラーゼ及びΔ6-デサチュラーゼの発現が促進されている、ナンノクロロプシス属に属する藻類の形質転換体に関する。
　本発明の上記及び他の特徴及び利点は、適宜添付の図面を参照して、下記の記載からより明らかになるであろう。
ナンノクロロプシス属に属する藻類におけるEPAの主要な合成経路と、EPAなどのＰＵＦＡの合成における律速段階を示す図である。 藻類や植物でのＰＵＦＡの一般的な合成経路を示す図である。
　本発明は、ＰＵＦＡ又はこれを構成成分とする脂質の生産性を向上させる、脂質の製造方法を提供する。
　また本発明は、ＰＵＦＡ又はこれを構成成分とする脂質の生産性を向上させた形質転換体を提供する。
　本発明者は上記点について、鋭意検討を行った。
　ナンノクロロプシス属に属する藻類はEPAなどのＰＵＦＡの生産能に優れる。また藻類の培養後期（具体的には、窒素などの栄養源が枯渇した条件）では、全脂肪酸の生産量が有意に増加する。しかし、本発明者がナンノクロロプシス属に属する藻類のＰＵＦＡ生産能について詳細に検討した結果、培養期間が長くなり全脂肪酸の生産量が増加するに従い、全脂肪酸の生産量に対するＰＵＦＡの生産量の割合が大幅に減少することを見い出した。
　そこで本発明者はまず、ナンノクロロプシス属に属する藻類におけるＰＵＦＡの合成経路について種々検討し、それを特定することを試みた。そしてＰＵＦＡの合成における律速反応についてさらに検討を重ねた結果、デサチュラーゼの１種であるΔ12-デサチュラーゼの作用によりオレイン酸（以下、「C18:1Δ9」とも表記する）からリノール酸（以下、「C18:2Δ9,12」とも表記する）を生成し、同じくデサチュラーゼの１種であるΔ6-デサチュラーゼの作用により生成したC18:2Δ9,12からγ-リノレン酸（以下、「C18:3Δ6,9,12」とも表記する）を生成するまでの一連の工程が、ＰＵＦＡの合成反応における律速段階であることを見い出した。そしてこの律速段階の反応を触媒する酵素の発現を促進させることで、ＰＵＦＡの生産量が有意に増大することを見い出した。
　本発明はこれらの知見に基づいて完成するに至ったものである。
　本発明によりＰＵＦＡ合成経路の律速段階の反応を触媒する酵素の発現が促進され、ＰＵＦＡの生産量を増大させることができる。
　よって本発明の脂質の製造方法によれば、ＰＵＦＡ又はこれを構成成分とする脂質の生産性を向上させることができる。
　また本発明の形質転換体は、ＰＵＦＡ合成経路の律速段階の反応を触媒する酵素の発現が促進されており、ＰＵＦＡ又はこれを構成成分とする脂質の生産性に優れる。
　本明細書における「脂質」は、中性脂質（モノアシルグリセロール（ＭＡＧ）、ジアシルグリセロール（ＤＡＧ）、トリアシルグリセロール（ＴＡＧ）等）、ろう、セラミド等の単純脂質；リン脂質、糖脂質、スルホ脂質等の複合脂質；及びこれらの脂質から誘導される、脂肪酸（遊離脂肪酸）、アルコール類、炭化水素類等の誘導脂質を包含するものである。
　一般に誘導脂質に分類される脂肪酸は、脂肪酸そのものを指し、「遊離脂肪酸」を意味する。本発明では単純脂質及び複合脂質分子中の脂肪酸部分又はアシル基の部分を「脂肪酸残基」と表記する。そして、特に断りのない限り、「脂肪酸」は「遊離脂肪酸」と「脂肪酸残基」の総称として用いる。
　また本明細書において、「脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質」は、「遊離脂肪酸」と「当該脂肪酸残基を有する脂質」を総称して用いる。更に本明細書において、「脂肪酸組成」とは、前記遊離脂肪酸と脂肪酸残基を脂肪酸と見做して合計した全脂肪酸（総脂肪酸）の重量に対する各脂肪酸の重量割合を意味する。脂肪酸の重量（生産量）や脂肪酸組成は、実施例で用いた方法により測定できる。
　また本明細書において、脂肪酸や、脂肪酸を構成するアシル基の表記において「Cx:y」とあるのは、炭素原子数xで二重結合の数がyであることを表す。「Cx」は炭素原子数xの脂肪酸やアシル基を表す。
　さらに本明細書において、塩基配列及びアミノ酸配列の同一性は、Lipman-Pearson法（Science, 1985, vol. 227, p. 1435-1441）によって計算される。具体的には、遺伝情報処理ソフトウェアGenetyx-Winのホモロジー解析（Search homology）プログラムを用いて、Unit size to compare（ktup）を2として解析を行うことにより算出される。
　また本明細書において「ストリンジェントな条件」としては、例えばMolecular Cloning－A LABORATORY MANUAL THIRD EDITION［Joseph Sambrook, David W. Russell., Cold Spring Harbor Laboratory Press］記載の方法が挙げられる。例えば、６×ＳＳＣ（１×ＳＳＣの組成：０．１５Ｍ塩化ナトリウム、０．０１５Ｍクエン酸ナトリウム、pH７．０）、０．５％ＳＤＳ、５×デンハート及び１００ｍｇ／ｍＬニシン精子ＤＮＡを含む溶液にプローブとともに６５℃で８～１６時間恒温し、ハイブリダイズさせる条件が挙げられる。
　さらに本明細書において、遺伝子の「上流」とは、翻訳開始点からの位置ではなく、対象として捉えている遺伝子又は領域の5'側に続く領域を示す。一方、遺伝子の「下流」とは、対象として捉えている遺伝子又は領域の3'側に続く領域を示す。
　前述のように、本発明者は、ナンノクロロプシス属に属する藻類におけるＰＵＦＡの主な合成経路を特定した。今回特定したＰＵＦＡの主要な合成経路と、ＰＵＦＡの合成における律速段階を図１に示した。なお、参考として、藻類や植物でのＰＵＦＡの一般的な合成経路を図２に示す。
　後述の実施例に示すように、野生型のナンノクロロプシス属に属する藻類では、C20:4は検出されるが、ステアリドン酸（以下、「C18:4Δ6,9,12,15」とも表記する）がほとんど検出されない。これらの結果から、ナンノクロロプシス属に属する藻類におけるEPAの主な合成経路は、図１に示すようなアラキドン酸（以下、「C20:4Δ5,8,11,14」とも表記する）を経由する経路であると特定した。
　そして本発明者は、ナンノクロロプシス属に属する藻類由来の各種デサチュラーゼを特定した。そしてこれらデサチュラーゼの発現をそれぞれ促進させ、EPAなどのＰＵＦＡの生成量を測定した。その結果、各種デサチュラーゼをそれぞれ単独で発現を促進させても、ＰＵＦＡ量に大きな変化が確認できなかった。
　そこで、ナンノクロロプシス属に属する藻類におけるＰＵＦＡの合成経路について、さらに検討を行った。その結果、Δ12-デサチュラーゼ（以下、「Δ12-DES」ともいう）とΔ6-デサチュラーゼ（以下、「Δ6-DES」ともいう）が触媒する一連の工程（オレイン酸からリノール酸を生成し、生成したリノール酸からγ-リノレン酸を生成する反応）が、ナンノクロロプシス属に属する藻類におけるＰＵＦＡの合成経路の律速段階であることを見い出した。そして、この律速段階の反応を触媒する酵素の発現を促進することで、ナンノクロロプシス属に属する藻類のＰＵＦＡの生産能が向上する。さらに、藻類の培養時間の経過とともに、全脂肪酸量に対するＰＵＦＡ量の割合が、野生株と比較して有意に増加する。
　なお本明細書において「律速段階」とは、化学反応などの動的過程や複雑な代謝経路がいくつかの段階によって構成されているとき、それらの段階のうち他の段階に比べて進行が緩慢であり、全過程の進行を実際上支配する段階をいう。
　本明細書において「Δ12-DES」とは、C18:1Δ9のΔ12位に不飽和結合を導入し、ω-6脂肪酸であるC18:2Δ9,12を生成する反応を触媒するタンパク質（酵素）を意味する。そして本明細書において「Δ12-デサチュラーゼ活性（以下、「Δ12-DES活性」ともいう）」とは、C18:1Δ9のΔ12位に不飽和結合を導入する活性を意味する。
　タンパク質がΔ12-DES活性を有することは、例えば、Δ12-DES合成遺伝子欠損株を用いた系により確認することができる。あるいは、宿主細胞内で機能するプロモーターの下流に前記タンパク質をコードする遺伝子を連結したＤＮＡをΔ12-DES合成遺伝子欠損株に導入し、リノール酸の生成を検討することで確認できる。あるいは、Δ12-DES又はこれを含有する細胞破砕液を調製し、オレイン酸、オレオイルＣｏＡなどを含む反応液と反応させ、常法に従いオレイン酸量の減少又はリノール酸量の増加を測定することで確認できる。
　本発明における好ましいΔ12-DESとしては、下記タンパク質（Ａ）～（Ｄ）が挙げられる。
（Ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
（Ｂ）前記タンパク質（Ａ）のアミノ酸配列と同一性が６０％以上のアミノ酸配列からなり、かつΔ12-デサチュラーゼ活性を有するタンパク質。
（Ｃ）配列番号４５で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
（Ｄ）前記タンパク質（Ｃ）のアミノ酸配列と同一性が６０％以上のアミノ酸配列からなり、かつΔ12-デサチュラーゼ活性を有するタンパク質。
 
　配列番号１のアミノ酸配列からなるタンパク質は、ナンノクロロプシス属に属する藻類であるナンノクロロプシス・オキュラータ（Nannochloropsis oculata）NIES2145株由来のΔ12-DES（以下、「NoΔ12-DES」ともいう）である。また、配列番号４５のアミノ酸配列からなるタンパク質は、ナンノクロロプシス属に属する藻類であるナンノクロロプシス・ガディタナ（Nannochloropsis gaditana）B-31株由来のΔ12-DES（以下、「NgΔ12-DES」ともいう）である。
　なお、タンパク質（Ａ）のアミノ酸配列に対するタンパク質（Ｃ）のアミノ酸配列の同一性は８６％である。
　前記タンパク質（Ａ）～（Ｄ）はいずれも、Δ12-DES活性を有する。
　前記タンパク質（Ｂ）において、Δ12-DES活性の点から、前記タンパク質（Ａ）のアミノ酸配列との同一性は６５％以上が好ましく、７０％以上がより好ましく、７５％以上がより好ましく、８０％以上がより好ましく、８５％以上がより好ましく、９０％以上がより好ましく、９２％以上がより好ましく、９５％以上がより好ましく、９８％以上がより好ましく、９９％以上がさらに好ましい。また、前記タンパク質（Ｂ）として、前記タンパク質（Ａ）のアミノ酸配列に、１又は複数個（例えば１個以上１７６個以下、好ましくは１個以上１５４個以下、より好ましくは１個以上１３２個以下、より好ましくは１個以上１１０個以下、より好ましくは１個以上８８個以下、より好ましくは１個以上６６個以下、より好ましくは１個以上４４個以下、より好ましくは１個以上３６個以下、より好ましくは１個以上２２個以下、より好ましくは１個以上９個以下、より好ましくは１個以上５個以下）のアミノ酸を欠失、置換、挿入又は付加したタンパク質が挙げられる。
　前記タンパク質（Ｄ）において、Δ12-DES活性の点から、前記タンパク質（Ｃ）のアミノ酸配列との同一性は６５％以上が好ましく、７０％以上がより好ましく、７５％以上がより好ましく、８０％以上がより好ましく、８５％以上がより好ましく、９０％以上がより好ましく、９２％以上がより好ましく、９５％以上がより好ましく、９８％以上がより好ましく、９９％以上がさらに好ましい。また、前記タンパク質（Ｄ）として、前記タンパク質（Ｃ）のアミノ酸配列に、１又は複数個（例えば１個以上１８１個以下、好ましくは１個以上１５９個以下、より好ましくは１個以上１３６個以下、より好ましくは１個以上１１３個以下、より好ましくは１個以上９１個以下、より好ましくは１個以上６８個以下、より好ましくは１個以上４６個以下、より好ましくは１個以上３７個以下、より好ましくは１個以上２３個以下、より好ましくは１個以上１０個以下、より好ましくは１個以上５個以下）のアミノ酸を欠失、置換、挿入又は付加したタンパク質が挙げられる。
　一般に、酵素タンパク質をコードしているアミノ酸配列は、必ずしも全領域の配列が保存されていなければ酵素活性を示さないというものではなく、アミノ酸配列が変化しても酵素活性に影響を与えない領域も存在することが知られている。このような酵素活性に必須でない領域においては、アミノ酸の欠失、置換、挿入又は付加といった変異が導入されても酵素本来の活性を維持することができる。本発明においても、このように所望の活性が保持され、かつアミノ酸配列が一部変異したタンパク質を用いることができる。
　アミノ酸配列に変異を導入する方法としては、例えば、アミノ酸配列をコードする塩基配列に変異を導入する方法が挙げられる。変異を導入する方法としては、部位特異的な変異導入法が挙げられる。具体的な部位特異的変異の導入方法としては、SOE-PCRを利用した方法、ＯＤＡ法、Kunkel法等が挙げられる。また、Site-Directed Mutagenesis System Mutan-SuperExpress Kmキット（タカラバイオ社）、Transformer TM Site-Directed Mutagenesisキット（Clonetech社）、KOD-Plus-Mutagenesis Kit（東洋紡社）等の市販のキットを利用することもできる。また、ランダムな遺伝子変異を与えた後、適当な方法により酵素活性の評価及び遺伝子解析を行うことにより目的遺伝子を取得することもできる。
　前記タンパク質（Ａ）～（Ｄ）は、通常の化学的手法、遺伝子工学的手法等により得ることができる。例えば、ナンノクロロプシス・オキュラータやナンノクロロプシス・ガディタナから単離、精製等することで天然物由来のタンパク質を取得することができる。また、配列番号１又は４５に示すアミノ酸配列情報をもとに人工的に化学合成することで、前記タンパク質（Ａ）～（Ｄ）を得ることができる。あるいは、遺伝子組み換え技術により、組換えタンパク質として前記タンパク質（Ａ）～（Ｄ）を作製してもよい。組換えタンパク質を作製する場合には、後述する、Δ12-DESをコードする遺伝子を用いることができる。
　なお、ナンノクロロプシス・オキュラータ等の藻類は、私的又は公的な研究所等の保存機関より入手することができる。例えば、ナンノクロロプシス・オキュラータNIES-2145株は、国立環境研究所（NIES）から入手することができる。
　前記Δ12-DES（好ましくは前記タンパク質（Ａ）～（Ｄ）のいずれか１つ）をコードする遺伝子（以下、「Δ12-DES遺伝子」ともいう）として、下記ＤＮＡ（ａ）～（ｄ）のいずれか１つからなる遺伝子が挙げられる。
 
（ａ）配列番号２で表される塩基配列からなるＤＮＡ。
（ｂ）前記ＤＮＡ（ａ）の塩基配列と同一性が６０％以上の塩基配列からなり、かつΔ12-DES活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
（ｃ）配列番号４６で表される塩基配列からなるＤＮＡ。
（ｄ）前記ＤＮＡ（ｃ）の塩基配列と同一性が６０％以上の塩基配列からなり、かつΔ12-DES活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
 
　配列番号２の塩基配列は、配列番号１のアミノ酸配列からなるタンパク質（NoΔ12-DES）をコードする遺伝子（以下、「NoΔ12-DES遺伝子」ともいう）の塩基配列である。
　配列番号４６の塩基配列は、配列番号４５のアミノ酸配列からなるタンパク質（NgΔ12-DES）をコードする遺伝子（以下、「NgΔ12-DES遺伝子」ともいう）の塩基配列である。
　前記ＤＮＡ（ｂ）において、Δ12-DES活性の点から、前記ＤＮＡ（ａ）の塩基配列との同一性は６５％以上が好ましく、７０％以上がより好ましく、７５％以上がより好ましく、８０％以上がより好ましく、８５％以上がより好ましく、９０％以上がより好ましく、９２％以上がより好ましく、９５％以上がより好ましく、９８％以上がより好ましく、９９％以上がさらに好ましい。
　また前記ＤＮＡ（ｂ）として、前記ＤＮＡ（ａ）の塩基配列において１又は複数個（例えば１個以上５２７個以下、好ましくは１個以上４６１個以下、より好ましくは１個以上３９６個以下、より好ましくは１個以上３３０個以下、より好ましくは１個以上２６４個以下、より好ましくは１個以上１９８個以下、より好ましくは１個以上１３２個以下、より好ましくは１個以上１０６個以下、より好ましくは１個以上６６個以下、より好ましくは１個以上２７個以下、より好ましくは１個以上１４個以下）の塩基が欠失、置換、挿入、又は付加されており、かつΔ12-DES活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡも好ましい。
　さらに前記ＤＮＡ（ｂ）として、前記ＤＮＡ（ａ）と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつΔ12-DES活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡも好ましい。
　前記ＤＮＡ（ｄ）において、Δ12-DES活性の点から、前記ＤＮＡ（ｃ）の塩基配列との同一性は６５％以上が好ましく、７０％以上がより好ましく、７５％以上がより好ましく、８０％以上がより好ましく、８５％以上がより好ましく、９０％以上がより好ましく、９２％以上がより好ましく、９５％以上がより好ましく、９８％以上がより好ましく、９９％以上がさらに好ましい。
　また前記ＤＮＡ（ｄ）として、前記ＤＮＡ（ｃ）の塩基配列において１又は複数個（例えば１個以上５４４個以下、好ましくは１個以上４７６個以下、より好ましくは１個以上４０８個以下、より好ましくは１個以上３４０個以下、より好ましくは１個以上２７２個以下、より好ましくは１個以上２０４個以下、より好ましくは１個以上１３６個以下、より好ましくは１個以上１０９個以下、より好ましくは１個以上６８個以下、より好ましくは１個以上２８個以下、より好ましくは１個以上１４個以下）の塩基が欠失、置換、挿入、又は付加されており、かつΔ12-DES活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡも好ましい。
　さらに前記ＤＮＡ（ｄ）として、前記ＤＮＡ（ｃ）と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつΔ12-DES活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡも好ましい。
　本明細書において「Δ6-DES」とは、C18:2Δ9,12のΔ6位に不飽和結合を導入し、C18:3Δ6,9,12を生成する反応を触媒するタンパク質（酵素）を意味する。そして本明細書において本明細書において「Δ6-デサチュラーゼ活性（以下、「Δ6-DES活性」ともいう）」とは、C18:2Δ9,12のΔ6位に不飽和結合を導入する活性を意味する。
　タンパク質がΔ6-DES活性を有することは、例えば、Δ6-DES合成遺伝子欠損株を用いた系により確認することができる。あるいは、宿主細胞内で機能するプロモーターの下流に前記タンパク質をコードする遺伝子を連結したＤＮＡをΔ6-DES合成遺伝子欠損株に導入し、γ-リノレン酸の生成を検討することで確認できる。あるいは、Δ6-DES又はこれを含有する細胞破砕液を調製し、リノール酸、リノレオイルＣｏＡなどを含む反応液と反応させ、常法に従いリノール酸量の減少又はγ-リノレン酸量の増加を測定することで確認できる。
　本発明における好ましいΔ6-DESとしては、下記タンパク質（Ｅ）～（Ｈ）が挙げられる。
（Ｅ）配列番号３で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
（Ｆ）前記タンパク質（Ｅ）のアミノ酸配列と同一性が６０％以上のアミノ酸配列からなり、かつΔ6-デサチュラーゼ活性を有するタンパク質。
（Ｇ）配列番号４７で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
（Ｈ）前記タンパク質（Ｇ）のアミノ酸配列と同一性が６０％以上のアミノ酸配列からなり、かつΔ6-デサチュラーゼ活性を有するタンパク質。
 
　配列番号３のアミノ酸配列からなるタンパク質は、ナンノクロロプシス・オキュラータNIES2145株由来のΔ6-DES（以下、「NoΔ6-DES」ともいう）である。また、配列番号４７のアミノ酸配列からなるタンパク質は、ナンノクロロプシス・ガディタナB-31株由来のΔ6-DES（以下、「NgΔ6-DES」ともいう）である。
　なお、タンパク質（Ｅ）のアミノ酸配列に対するタンパク質（Ｇ）のアミノ酸配列の同一性は８９％である。
　前記タンパク質（Ｅ）～（Ｈ）はいずれも、Δ6-DES活性を有する。
　前記タンパク質（Ｆ）において、Δ6-DES活性の点から、前記タンパク質（Ｅ）のアミノ酸配列との同一性は６５％以上が好ましく、７０％以上がより好ましく、７５％以上がより好ましく、８０％以上がより好ましく、８５％以上がより好ましく、９０％以上がより好ましく、９２％以上がより好ましく、９５％以上がより好ましく、９８％以上がより好ましく、９９％以上がさらに好ましい。また、前記タンパク質（Ｆ）として、前記タンパク質（Ｅ）のアミノ酸配列に、１又は複数個（例えば１個以上１９０個以下、好ましくは１個以上１６６個以下、より好ましくは１個以上１４３個以下、より好ましくは１個以上１１９個以下、より好ましくは１個以上９５個以下、より好ましくは１個以上７２個以下、より好ましくは１個以上４８個以下、より好ましくは１個以上３８個以下、より好ましくは１個以上２４個以下、より好ましくは１個以上１０個以下、より好ましくは１個以上５個以下）のアミノ酸を欠失、置換、挿入又は付加したタンパク質が挙げられる。
　前記タンパク質（Ｈ）において、Δ6-DES活性の点から、前記タンパク質（Ｇ）のアミノ酸配列との同一性は６５％以上が好ましく、７０％以上がより好ましく、７５％以上がより好ましく、８０％以上がより好ましく、８５％以上がより好ましく、９０％以上がより好ましく、９２％以上がより好ましく、９５％以上がより好ましく、９８％以上がより好ましく、９９％以上がさらに好ましい。また、前記タンパク質（Ｈ）として、前記タンパク質（Ｇ）のアミノ酸配列に、１又は複数個（例えば１個以上１９０個以下、好ましくは１個以上１６６個以下、より好ましくは１個以上１４３個以下、より好ましくは１個以上１１９個以下、より好ましくは１個以上９５個以下、より好ましくは１個以上７２個以下、より好ましくは１個以上４８個以下、より好ましくは１個以上３８個以下、より好ましくは１個以上２４個以下、より好ましくは１個以上１０個以下、より好ましくは１個以上５個以下）のアミノ酸を欠失、置換、挿入又は付加したタンパク質が挙げられる。
　アミノ酸配列に変異を導入する方法としては、Δ12-DESについて前述した方法が挙げられる。
　前記タンパク質（Ｅ）～（Ｈ）は、通常の化学的手法、遺伝子工学的手法等により得ることができる。例えば、ナンノクロロプシス・オキュラータやナンノクロロプシス・ガディタナから単離、精製等することで天然物由来のタンパク質を取得することができる。また、配列番号３又は４７に示すアミノ酸配列情報をもとに人工的に化学合成することで、前記タンパク質（Ｅ）～（Ｈ）を得ることができる。あるいは、遺伝子組み換え技術により、組換えタンパク質として前記タンパク質（Ｅ）～（Ｈ）を作製してもよい。組換えタンパク質を作製する場合には、後述する、Δ6-DESをコードする遺伝子を用いることができる。
　前記Δ6-DES（好ましくは前記タンパク質（Ｅ）～（Ｈ）のいずれか１つ）をコードする遺伝子（以下、「Δ6-DES遺伝子」ともいう）として、下記ＤＮＡ（ｅ）～（ｈ）のいずれか１つからなる遺伝子が挙げられる。
 
（ｅ）配列番号４で表される塩基配列からなるＤＮＡ。
（ｆ）前記ＤＮＡ（ｅ）の塩基配列と同一性が６０％以上の塩基配列からなり、かつΔ6-DES活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
（ｇ）配列番号４８で表される塩基配列からなるＤＮＡ。
（ｈ）前記ＤＮＡ（ｇ）の塩基配列と同一性が６０％以上の塩基配列からなり、かつΔ6-DES活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
 
　配列番号４の塩基配列は、配列番号３のアミノ酸配列からなるタンパク質（NoΔ6-DES）をコードする遺伝子（以下、「NoΔ6-DES遺伝子」ともいう）の塩基配列である。
　配列番号４８の塩基配列は、配列番号４７のアミノ酸配列からなるタンパク質（NgΔ6-DES）をコードする遺伝子（以下、「NgΔ6-DES遺伝子」ともいう）の塩基配列である。
　前記ＤＮＡ（ｆ）において、Δ6-DES活性の点から、前記ＤＮＡ（ｅ）の塩基配列との同一性は６５％以上が好ましく、７０％以上がより好ましく、７５％以上がより好ましく、８０％以上がより好ましく、８５％以上がより好ましく、９０％以上がより好ましく、９２％以上がより好ましく、９５％以上がより好ましく、９８％以上がより好ましく、９９％以上がさらに好ましい。
　また前記ＤＮＡ（ｆ）として、前記ＤＮＡ（ｅ）の塩基配列において１又は複数個（例えば１個以上５７０個以下、好ましくは１個以上４９９個以下、より好ましくは１個以上４２８個以下、より好ましくは１個以上３５７個以下、より好ましくは１個以上２８５個以下、より好ましくは１個以上２１４個以下、より好ましくは１個以上１４３個以下、より好ましくは１個以上１１４個以下、より好ましくは１個以上７２個以下、より好ましくは１個以上２９個以下、より好ましくは１個以上１５個以下）の塩基が欠失、置換、挿入、又は付加されており、かつΔ6-DES活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡも好ましい。
　さらに前記ＤＮＡ（ｆ）として、前記ＤＮＡ（ｅ）と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつΔ6-DES活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡも好ましい。
　前記ＤＮＡ（ｈ）において、Δ6-DES活性の点から、前記ＤＮＡ（ｇ）の塩基配列との同一性は６５％以上が好ましく、７０％以上がより好ましく、７５％以上がより好ましく、８０％以上がより好ましく、８５％以上がより好ましく、９０％以上がより好ましく、９２％以上がより好ましく、９５％以上がより好ましく、９８％以上がより好ましく、９９％以上がさらに好ましい。
　また前記ＤＮＡ（ｈ）として、前記ＤＮＡ（ｇ）の塩基配列において１又は複数個（例えば１個以上５７２個以下、好ましくは１個以上５００個以下、より好ましくは１個以上４２９個以下、より好ましくは１個以上３５７個以下、より好ましくは１個以上２８６個以下、より好ましくは１個以上２１５個以下、より好ましくは１個以上１４３個以下、より好ましくは１個以上１１５個以下、より好ましくは１個以上７２個以下、より好ましくは１個以上２９個以下、より好ましくは１個以上１５個以下）の塩基が欠失、置換、挿入、又は付加されており、かつΔ6-DES活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡも好ましい。
　さらに前記ＤＮＡ（ｈ）として、前記ＤＮＡ（ｇ）と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつΔ6-DES活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡも好ましい。
　本発明において、Δ12-DES及びΔ6-DESに加えて、ω3-デサチュラーゼ（以下、「ω3-DES」ともいう）の発現も促進されていることが好ましい。
　本明細書において「ω3-DES」とは、図１に示すように、C20:4Δ5,8,11,14のω3位に不飽和結合を導入し、ω-3脂肪酸であるEPA（以下、「C20:5Δ5,8,11,14,17」とも表記する）を生成する反応を触媒するタンパク質（酵素）を意味する。そして本明細書において本明細書において「ω3-デサチュラーゼ活性（以下、「ω3-DES活性」ともいう」」とは、C20:4Δ5,8,11,14のω3位に不飽和結合を導入する活性を意味する。
　後述の実施例で示すように、Δ12-DES及びΔ6-DESの発現を促進させたナンノクロロプシス属に属する藻類において、ω3-DESの発現も促進することで、C20:4Δ5,8,11,14のω3位への不飽和結合の導入が亢進し、C20:5Δ5,8,11,14,17の生産量がさらに増加する。
　タンパク質がω3-DES活性を有することは、例えば、ω3-DES合成遺伝子欠損株を用いた系により確認することができる。あるいは、宿主細胞内で機能するプロモーターの下流に前記タンパク質をコードする遺伝子を連結したＤＮＡをω3-DES合成遺伝子欠損株に導入し、EPAの生成を検討することで確認できる。あるいは、ω3-DES又はこれを含有する細胞破砕液を調製し、アラキドン酸誘導体（ＣｏＡとのチオエステル化合物、グリセロールとのエステル化合物など）を含む反応液と反応させ、常法に従いアラキドン酸量の減少又はEPA量の増加を測定することで確認できる。
　本発明における好ましいω3-DESとしては、下記タンパク質（Ｉ）～（Ｌ）が挙げられる。
（Ｉ）配列番号５で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
（Ｊ）前記タンパク質（Ｉ）のアミノ酸配列と同一性が６０％以上のアミノ酸配列からなり、かつω3-デサチュラーゼ活性を有するタンパク質。
（Ｋ）配列番号４９で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
（Ｌ）前記タンパク質（Ｋ）のアミノ酸配列と同一性が６０％以上のアミノ酸配列からなり、かつω3-デサチュラーゼ活性を有するタンパク質。
 
　配列番号５のアミノ酸配列からなるタンパク質は、ナンノクロロプシス・オキュラータNIES2145株由来のω3-DES（以下、「Noω3-DES」ともいう）である。また、配列番号４９のアミノ酸配列からなるタンパク質は、ナンノクロロプシス・ガディタナCCMP526株由来のω3-DES（以下、「Ngω3-DES」ともいう）である。
　なお、タンパク質（Ｉ）のアミノ酸配列に対するタンパク質（Ｋ）のアミノ酸配列の同一性は８２％である。
　前記タンパク質（Ｉ）～（Ｌ）はいずれも、ω3-DES活性を有する。
　前記タンパク質（Ｊ）において、ω3-DES活性の点から、前記タンパク質（Ｉ）のアミノ酸配列との同一性は６５％以上が好ましく、７０％以上がより好ましく、７５％以上がより好ましく、８０％以上がより好ましく、８５％以上がより好ましく、９０％以上がより好ましく、９２％以上がより好ましく、９５％以上がより好ましく、９８％以上がより好ましく、９９％以上がさらに好ましい。また、前記タンパク質（Ｊ）として、前記タンパク質（Ｉ）のアミノ酸配列に、１又は複数個（例えば１個以上１６４個以下、好ましくは１個以上１４４個以下、より好ましくは１個以上１２３個以下、より好ましくは１個以上１０３個以下、より好ましくは１個以上８２個以下、より好ましくは１個以上６２個以下、より好ましくは１個以上４１個以下、より好ましくは１個以上３３個以下、より好ましくは１個以上２１個以下、より好ましくは１個以上９個以下、より好ましくは１個以上５個以下）のアミノ酸を欠失、置換、挿入又は付加したタンパク質が挙げられる。
　前記タンパク質（Ｌ）において、ω3-DES活性の点から、前記タンパク質（Ｋ）のアミノ酸配列との同一性は６５％以上が好ましく、７０％以上がより好ましく、７５％以上がより好ましく、８０％以上がより好ましく、８５％以上がより好ましく、９０％以上がより好ましく、９２％以上がより好ましく、９５％以上がより好ましく、９８％以上がより好ましく、９９％以上がさらに好ましい。また、前記タンパク質（Ｌ）として、前記タンパク質（Ｋ）のアミノ酸配列に、１又は複数個（例えば１個以上１６３個以下、好ましくは１個以上１４３個以下、より好ましくは１個以上１２３個以下、より好ましくは１個以上１０２個以下、より好ましくは１個以上８２個以下、より好ましくは１個以上６２個以下、より好ましくは１個以上４１個以下、より好ましくは１個以上３３個以下、より好ましくは１個以上２１個以下、より好ましくは１個以上９個以下、より好ましくは１個以上５個以下）のアミノ酸を欠失、置換、挿入又は付加したタンパク質が挙げられる。
　アミノ酸配列に変異を導入する方法としては、Δ12-DESについて前述した方法が挙げられる。
　前記タンパク質（Ｉ）～（Ｌ）は、通常の化学的手法、遺伝子工学的手法等により得ることができる。例えば、ナンノクロロプシス・オキュラータやナンノクロロプシス・ガディタナから単離、精製等することで天然物由来のタンパク質を取得することができる。また、配列番号５又は４９に示すアミノ酸配列情報をもとに人工的に化学合成することで、前記タンパク質（Ｉ）～（Ｌ）を得ることができる。あるいは、遺伝子組み換え技術により、組換えタンパク質として前記タンパク質（Ｉ）～（Ｌ）を作製してもよい。組換えタンパク質を作製する場合には、後述する、ω3-DESをコードする遺伝子を用いることができる。
　前記ω3-DES（好ましくは前記タンパク質（Ｉ）～（Ｌ）のいずれか１つ）をコードする遺伝子（以下、「ω3-DES遺伝子」ともいう）として、下記ＤＮＡ（ｉ）～（ｌ）のいずれか１つからなる遺伝子が挙げられる。
 
（ｉ）配列番号６で表される塩基配列からなるＤＮＡ。
（ｊ）前記ＤＮＡ（ｉ）の塩基配列と同一性が６０％以上の塩基配列からなり、かつω3-DES活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
（ｋ）配列番号５０で表される塩基配列からなるＤＮＡ。
（ｌ）前記ＤＮＡ（ｋ）の塩基配列と同一性が６０％以上の塩基配列からなり、かつω3-DES活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
 
　配列番号６の塩基配列は、配列番号５のアミノ酸配列からなるタンパク質（Noω3-DES）をコードする遺伝子（以下、「Noω3-DES遺伝子」ともいう）の塩基配列である。
　配列番号５０の塩基配列は、配列番号４９のアミノ酸配列からなるタンパク質（Ngω3-DES）をコードする遺伝子ｃの塩基配列である。
　前記ＤＮＡ（ｊ）において、ω3-DES活性の点から、前記ＤＮＡ（ｉ）の塩基配列との同一性は６５％以上が好ましく、７０％以上がより好ましく、７５％以上がより好ましく、８０％以上がより好ましく、８５％以上がより好ましく、９０％以上がより好ましく、９２％以上がより好ましく、９５％以上がより好ましく、９８％以上がより好ましく、９９％以上がさらに好ましい。
　また前記ＤＮＡ（ｊ）として、前記ＤＮＡ（ｉ）の塩基配列において１又は複数個（例えば１個以上４９４個以下、好ましくは１個以上４３２個以下、より好ましくは１個以上３７０個以下、より好ましくは１個以上３０９個以下、より好ましくは１個以上２４７個以下、より好ましくは１個以上１８５個以下、より好ましくは１個以上１２４個以下、より好ましくは１個以上９９個以下、より好ましくは１個以上６２個以下、より好ましくは１個以上２５個以下、より好ましくは１個以上１３個以下）の塩基が欠失、置換、挿入、又は付加されており、かつω3-DES活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡも好ましい。
　さらに前記ＤＮＡ（ｊ）として、前記ＤＮＡ（ｉ）と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつω3-DES活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡも好ましい。
　前記ＤＮＡ（ｌ）において、ω3-DES活性の点から、前記ＤＮＡ（ｋ）の塩基配列との同一性は６５％以上が好ましく、７０％以上がより好ましく、７５％以上がより好ましく、８０％以上がより好ましく、８５％以上がより好ましく、９０％以上がより好ましく、９２％以上がより好ましく、９５％以上がより好ましく、９８％以上がより好ましく、９９％以上がさらに好ましい。
　また前記ＤＮＡ（ｌ）として、前記ＤＮＡ（ｋ）の塩基配列において１又は複数個（例えば１個以上４９０個以下、好ましくは１個以上４２９個以下、より好ましくは１個以上３６８個以下、より好ましくは１個以上３０６個以下、より好ましくは１個以上２４５個以下、より好ましくは１個以上１８４個以下、より好ましくは１個以上１２３個以下、より好ましくは１個以上９８個以下、より好ましくは１個以上６２個以下、より好ましくは１個以上２５個以下、より好ましくは１個以上１３個以下）の塩基が欠失、置換、挿入、又は付加されており、かつω3-DES活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡも好ましい。
　さらに前記ＤＮＡ（ｌ）として、前記ＤＮＡ（ｋ）と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつω3-DES活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡも好ましい。
　本発明において、ω3-DESと同様、Δ12-DES及びΔ6-DESに加えて、Δ5-デサチュラーゼ（以下、「Δ5-DES」ともいう）の発現も促進されていることが好ましい。
　本明細書において「Δ5-DES」とは、図１に示すように、ジホモ-γ-リノレン酸（以下、「C20:3Δ8,11,14」とも表記する）のΔ5位に不飽和結合を導入し、C20:4Δ5,8,11,14を生成する反応を触媒するタンパク質（酵素）を意味する。そして本明細書において本明細書において「Δ5-デサチュラーゼ活性（以下、「Δ5-DES活性」ともいう」」とは、C20:3Δ8,11,14のΔ5位に不飽和結合を導入する活性を意味する。
　Δ12-DES及びΔ6-DESの発現を促進させたナンノクロロプシス属に属する藻類では、Δ12-DES及びΔ6-DESによって触媒される連続反応によって、C18:3Δ6,9,12と、C18:3Δ6,9,12に炭素鎖を２個分伸長させて合成されるC20:3Δ8,11,14の生成量が増加する。よって、Δ12-DES及びΔ6-DESの発現を促進させたナンノクロロプシス属に属する藻類において、Δ5-DESの発現も促進することで、C20:3Δ8,11,14のΔ5位への不飽和結合の導入が亢進し、C20:5Δ5,8,11,14,17合成の基質となるC20:4Δ5,8,11,14の生産量がさらに増加する。
　タンパク質がΔ5-DES活性を有することは、例えば、Δ5-DES合成遺伝子欠損株を用いた系により確認することができる。あるいは、宿主細胞内で機能するプロモーターの下流に前記タンパク質をコードする遺伝子を連結したＤＮＡをΔ5-DES合成遺伝子欠損株に導入し、アラキドン酸の生成を検討することで確認できる。あるいは、Δ5-DES又はこれを含有する細胞破砕液を調製し、ジホモ-γ-リノレン酸誘導体（ＣｏＡとのチオエステル化合物、グリセロールとのエステル化合物など）を含む反応液と反応させ、常法に従いジホモ-γ-リノレン酸量の減少又はアラキドン酸量の増加を測定することで確認できる。
　本発明における好ましいΔ5-DESとしては、下記タンパク質（Ｍ）～（Ｐ）が挙げられる。
（Ｍ）配列番号７で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
（Ｎ）前記タンパク質（Ｍ）のアミノ酸配列と同一性が６０％以上のアミノ酸配列からなり、かつΔ5-デサチュラーゼ活性を有するタンパク質。
（Ｏ）配列番号５１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
（Ｐ）前記タンパク質（Ｏ）のアミノ酸配列と同一性が６０％以上のアミノ酸配列からなり、かつΔ5-デサチュラーゼ活性を有するタンパク質。
 
　配列番号７のアミノ酸配列からなるタンパク質は、ナンノクロロプシス・オキュラータNIES2145株由来のΔ5-DES（以下、「NoΔ5-DES」ともいう）である。また、配列番号５１のアミノ酸配列からなるタンパク質は、ナンノクロロプシス・ガディタナB-31株由来のΔ5-DES（以下、「NgΔ5-DES」ともいう）である。
　なお、タンパク質（Ｍ）のアミノ酸配列に対するタンパク質（Ｏ）のアミノ酸配列の同一性は81％である。
　前記タンパク質（Ｍ）～（Ｐ）はいずれも、Δ5-DES活性を有する。
　前記タンパク質（Ｎ）において、Δ5-DES活性の点から、前記タンパク質（Ｍ）のアミノ酸配列との同一性は６５％以上が好ましく、７０％以上がより好ましく、７５％以上がより好ましく、８０％以上がより好ましく、８５％以上がより好ましく、９０％以上がより好ましく、９２％以上がより好ましく、９５％以上がより好ましく、９８％以上がより好ましく、９９％以上がさらに好ましい。また、前記タンパク質（Ｎ）として、前記タンパク質（Ｍ）のアミノ酸配列に、１又は複数個（例えば１個以上２１１個以下、好ましくは１個以上１８５個以下、より好ましくは１個以上１５８個以下、より好ましくは１個以上１３２個以下、より好ましくは１個以上１０６個以下、より好ましくは１個以上７９個以下、より好ましくは１個以上５３個以下、より好ましくは１個以上４３個以下、より好ましくは１個以上２７個以下、より好ましくは１個以上１１個以下、より好ましくは１個以上６個以下）のアミノ酸を欠失、置換、挿入又は付加したタンパク質が挙げられる。
　前記タンパク質（Ｐ）において、Δ5-DES活性の点から、前記タンパク質（Ｏ）のアミノ酸配列との同一性は６５％以上が好ましく、７０％以上がより好ましく、７５％以上がより好ましく、８０％以上がより好ましく、８５％以上がより好ましく、９０％以上がより好ましく、９２％以上がより好ましく、９５％以上がより好ましく、９８％以上がより好ましく、９９％以上がさらに好ましい。また、前記タンパク質（Ｐ）として、前記タンパク質（Ｏ）のアミノ酸配列に、１又は複数個（例えば１個以上２０６個以下、好ましくは１個以上１８１個以下、より好ましくは１個以上１５５個以下、より好ましくは１個以上１２９個以下、より好ましくは１個以上１０３個以下、より好ましくは１個以上７８個以下、より好ましくは１個以上５２個以下、より好ましくは１個以上４２個以下、より好ましくは１個以上２６個以下、より好ましくは１個以上１１個以下、より好ましくは１個以上６個以下）のアミノ酸を欠失、置換、挿入又は付加したタンパク質が挙げられる。
　アミノ酸配列に変異を導入する方法としては、Δ12-DESについて前述した方法が挙げられる。
　前記タンパク質（Ｍ）～（Ｐ）は、通常の化学的手法、遺伝子工学的手法等により得ることができる。例えば、ナンノクロロプシス・オキュラータやナンノクロロプシス・ガディタナから単離、精製等することで天然物由来のタンパク質を取得することができる。また、配列番号７又は５１に示すアミノ酸配列情報をもとに人工的に化学合成することで、前記タンパク質（Ｍ）～（Ｐ）を得ることができる。あるいは、遺伝子組み換え技術により、組換えタンパク質として前記タンパク質（Ｍ）～（Ｐ）を作製してもよい。組換えタンパク質を作製する場合には、後述する、Δ5-DESをコードする遺伝子を用いることができる。
　前記Δ5-DES（好ましくは前記タンパク質（Ｍ）～（Ｐ）のいずれか１つ）をコードする遺伝子（以下、「Δ5-DES遺伝子」ともいう）として、下記ＤＮＡ（ｍ）～（ｐ）のいずれか１つからなる遺伝子が挙げられる。
 
（ｍ）配列番号８で表される塩基配列からなるＤＮＡ。
（ｎ）前記ＤＮＡ（ｍ）の塩基配列と同一性が６０％以上の塩基配列からなり、かつΔ5-DES活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
（ｏ）配列番号５２で表される塩基配列からなるＤＮＡ。
（ｐ）前記ＤＮＡ（ｏ）の塩基配列と同一性が６０％以上の塩基配列からなり、かつΔ5-DES活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
 
　配列番号８の塩基配列は、配列番号７のアミノ酸配列からなるタンパク質（NoΔ5-DES）をコードする遺伝子（以下、「NoΔ5-DES遺伝子」ともいう）の塩基配列である。
　配列番号５２の塩基配列は、配列番号５１のアミノ酸配列からなるタンパク質（NgΔ5-DES）をコードする遺伝子（以下、「NgΔ5-DES遺伝子」ともいう）の塩基配列である。
　前記ＤＮＡ（ｎ）において、Δ5-DES活性の点から、前記ＤＮＡ（ｍ）の塩基配列との同一性は６５％以上が好ましく、７０％以上がより好ましく、７５％以上がより好ましく、８０％以上がより好ましく、８５％以上がより好ましく、９０％以上がより好ましく、９２％以上がより好ましく、９５％以上がより好ましく、９８％以上がより好ましく、９９％以上がさらに好ましい。
　また前記ＤＮＡ（ｎ）として、前記ＤＮＡ（ｍ）の塩基配列において１又は複数個（例えば１個以上６３３個以下、好ましくは１個以上５５４個以下、より好ましくは１個以上４７５個以下、より好ましくは１個以上３９６個以下、より好ましくは１個以上３１７個以下、より好ましくは１個以上２３８個以下、より好ましくは１個以上１５９個以下、より好ましくは１個以上１２７個以下、より好ましくは１個以上８０個以下、より好ましくは１個以上３２個以下、より好ましくは１個以上１６個以下）の塩基が欠失、置換、挿入、又は付加されており、かつΔ5-DES活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡも好ましい。
　さらに前記ＤＮＡ（ｎ）として、前記ＤＮＡ（ｍ）と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつΔ5-DES活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡも好ましい。
　前記ＤＮＡ（ｐ）において、Δ5-DES活性の点から、前記ＤＮＡ（ｏ）の塩基配列との同一性は６５％以上が好ましく、７０％以上がより好ましく、７５％以上がより好ましく、８０％以上がより好ましく、８５％以上がより好ましく、９０％以上がより好ましく、９２％以上がより好ましく、９５％以上がより好ましく、９８％以上がより好ましく、９９％以上がさらに好ましい。
　また前記ＤＮＡ（ｐ）として、前記ＤＮＡ（ｏ）の塩基配列において１又は複数個（例えば１個以上６２０個以下、好ましくは１個以上５４２個以下、より好ましくは１個以上４６５個以下、より好ましくは１個以上３８７個以下、より好ましくは１個以上３１０個以下、より好ましくは１個以上２３３個以下、より好ましくは１個以上１５５個以下、より好ましくは１個以上１２４個以下、より好ましくは１個以上７８個以下、より好ましくは１個以上３１個以下、より好ましくは１個以上１６個以下）の塩基が欠失、置換、挿入、又は付加されており、かつΔ5-DES活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡも好ましい。
　さらに前記ＤＮＡ（ｐ）として、前記ＤＮＡ（ｏ）と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつΔ5-DES活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡも好ましい。
　本発明において、ω3-DES及びΔ5-DESと同様、Δ12-DES及びΔ6-DESに加えて、Δ9-デサチュラーゼ（以下、「Δ9-DES」ともいう）の発現も促進されていることが好ましい。
　本明細書において「Δ9-DES」とは、図１に示すように、ステアリン酸（以下、「C18:0」とも表記する）のΔ9位に不飽和結合を導入し、C18:1Δ9を生成する反応を触媒するタンパク質（酵素）を意味する。そして本明細書において本明細書において「Δ9-デサチュラーゼ活性（以下、「Δ9-DES活性」ともいう」」とは、C18:0のΔ9位に不飽和結合を導入する活性を意味する。
　Δ9-DESの発現を促進することで、Δ12-DES及びΔ6-DESによって触媒される連続反応の出発物質であるC18:1Δ9の生成量を増加させ、ＰＵＦＡの生産性をさらに向上させることができる。
　タンパク質がΔ9-DES活性を有することは、例えば、Δ9-DES合成遺伝子欠損株を用いた系により確認することができる。あるいは、宿主細胞内で機能するプロモーターの下流に前記タンパク質をコードする遺伝子を連結したＤＮＡをΔ9-DES合成遺伝子欠損株に導入し、オレイン酸の生成を検討することで確認できる。あるいは、Δ9-DES又はこれを含有する細胞破砕液を調製し、ステアリン酸、ステアロイルＣｏＡなどを含む反応液と反応させ、常法に従いステアリン酸量の減少又はオレイン量の増加を測定することで確認できる。
　本発明における好ましいΔ9-DESとしては、下記タンパク質（Ｑ）～（Ｔ）が挙げられる。
（Ｑ）配列番号９で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
（Ｒ）前記タンパク質（Ｑ）のアミノ酸配列と同一性が６０％以上のアミノ酸配列からなり、かつΔ9-デサチュラーゼ活性を有するタンパク質。
（Ｓ）配列番号５３で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
（Ｔ）前記タンパク質（Ｓ）のアミノ酸配列と同一性が６０％以上のアミノ酸配列からなり、かつΔ9-デサチュラーゼ活性を有するタンパク質。
 
　配列番号９のアミノ酸配列からなるタンパク質は、ナンノクロロプシス・オキュラータNIES2145株由来のΔ9-DES（以下、「NoΔ9-DES」ともいう）である。また、配列番号５３のアミノ酸配列からなるタンパク質は、ナンノクロロプシス・ガディタナB-31株由来のΔ9-DES（以下、「NgΔ9-DES」ともいう）である。
　なお、タンパク質（Ｑ）のアミノ酸配列に対するタンパク質（Ｓ）のアミノ酸配列の同一性は９３％である。
　前記タンパク質（Ｑ）～（Ｔ）はいずれも、Δ9-DES活性を有する。
　前記タンパク質（Ｒ）において、Δ9-DES活性の点から、前記タンパク質（Ｑ）のアミノ酸配列との同一性は６５％以上が好ましく、７０％以上がより好ましく、７５％以上がより好ましく、８０％以上がより好ましく、８５％以上がより好ましく、９０％以上がより好ましく、９２％以上がより好ましく、９５％以上がより好ましく、９８％以上がより好ましく、９９％以上がさらに好ましい。また、前記タンパク質（Ｒ）として、前記タンパク質（Ｑ）のアミノ酸配列に、１又は複数個（例えば１個以上１４４個以下、好ましくは１個以上１２６個以下、より好ましくは１個以上１０８個以下、より好ましくは１個以上９０個以下、より好ましくは１個以上７２個以下、より好ましくは１個以上５４個以下、より好ましくは１個以上３６個以下、より好ましくは１個以上２９個以下、より好ましくは１個以上１８個以下、より好ましくは１個以上８個以下、より好ましくは１個以上４個以下）のアミノ酸を欠失、置換、挿入又は付加したタンパク質が挙げられる。
　前記タンパク質（Ｔ）において、Δ9-DES活性の点から、前記タンパク質（Ｓ）のアミノ酸配列との同一性は６５％以上が好ましく、７０％以上がより好ましく、７５％以上がより好ましく、８０％以上がより好ましく、８５％以上がより好ましく、９０％以上がより好ましく、９２％以上がより好ましく、９５％以上がより好ましく、９８％以上がより好ましく、９９％以上がさらに好ましい。また、前記タンパク質（Ｔ）として、前記タンパク質（Ｓ）のアミノ酸配列に、１又は複数個（例えば１個以上１３６個以下、好ましくは１個以上１１９個以下、より好ましくは１個以上１０２個以下、より好ましくは１個以上８５個以下、より好ましくは１個以上６８個以下、より好ましくは１個以上５１個以下、より好ましくは１個以上３４個以下、より好ましくは１個以上２８個以下、より好ましくは１個以上１７個以下、より好ましくは１個以上７個以下、より好ましくは１個以上４個以下）のアミノ酸を欠失、置換、挿入又は付加したタンパク質が挙げられる。
　アミノ酸配列に変異を導入する方法としては、Δ12-DESについて前述した方法が挙げられる。
　前記タンパク質（Ｑ）～（Ｔ）は、通常の化学的手法、遺伝子工学的手法等により得ることができる。例えば、ナンノクロロプシス・オキュラータやナンノクロロプシス・ガディタナから単離、精製等することで天然物由来のタンパク質を取得することができる。また、配列番号９又は５３に示すアミノ酸配列情報をもとに人工的に化学合成することで、前記タンパク質（Ｑ）～（Ｔ）を得ることができる。あるいは、遺伝子組み換え技術により、組換えタンパク質として前記タンパク質（Ｑ）～（Ｔ）を作製してもよい。組換えタンパク質を作製する場合には、後述する、Δ9-DESをコードする遺伝子を用いることができる。
　前記Δ9-DES（好ましくは前記タンパク質（Ｑ）～（Ｔ）のいずれか１つ）をコードする遺伝子（以下、「Δ9-DES遺伝子」ともいう）として、下記ＤＮＡ（ｑ）～（ｔ）のいずれか１つからなる遺伝子が挙げられる。
 
（ｑ）配列番号１０で表される塩基配列からなるＤＮＡ。
（ｒ）前記ＤＮＡ（ｑ）の塩基配列と同一性が６０％以上の塩基配列からなり、かつΔ9-DES活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
（ｓ）配列番号５４で表される塩基配列からなるＤＮＡ。
（ｔ）前記ＤＮＡ（ｓ）の塩基配列と同一性が６０％以上の塩基配列からなり、かつΔ9-DES活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
 
　配列番号１０の塩基配列は、配列番号９のアミノ酸配列からなるタンパク質（NoΔ9-DES）をコードする遺伝子（以下、「NoΔ9-DES遺伝子」ともいう）の塩基配列である。
　配列番号５４の塩基配列は、配列番号５３のアミノ酸配列からなるタンパク質（NgΔ9-DES）をコードする遺伝子（以下、「NgΔ9-DES遺伝子」ともいう）の塩基配列である。
　前記ＤＮＡ（ｒ）において、Δ9-DES活性の点から、前記ＤＮＡ（ｑ）の塩基配列との同一性は６５％以上が好ましく、７０％以上がより好ましく、７５％以上がより好ましく、８０％以上がより好ましく、８５％以上がより好ましく、９０％以上がより好ましく、９２％以上がより好ましく、９５％以上がより好ましく、９８％以上がより好ましく、９９％以上がさらに好ましい。
　また前記ＤＮＡ（ｒ）として、前記ＤＮＡ（ｑ）の塩基配列において１又は複数個（例えば１個以上４３２個以下、好ましくは１個以上３７８個以下、より好ましくは１個以上３２４個以下、より好ましくは１個以上２７０個以下、より好ましくは１個以上２１６個以下、より好ましくは１個以上１６２個以下、より好ましくは１個以上１０８個以下、より好ましくは１個以上８７個以下、より好ましくは１個以上５４個以下、より好ましくは１個以上２２個以下、より好ましくは１個以上１１個以下）の塩基が欠失、置換、挿入、又は付加されており、かつΔ9-DES活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡも好ましい。
　さらに前記ＤＮＡ（ｒ）として、前記ＤＮＡ（ｑ）と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつΔ9-DES活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡも好ましい。
　前記ＤＮＡ（ｔ）において、Δ9-DES活性の点から、前記ＤＮＡ（ｓ）の塩基配列との同一性は６５％以上が好ましく、７０％以上がより好ましく、７５％以上がより好ましく、８０％以上がより好ましく、８５％以上がより好ましく、９０％以上がより好ましく、９２％以上がより好ましく、９５％以上がより好ましく、９８％以上がより好ましく、９９％以上がさらに好ましい。
　また前記ＤＮＡ（ｔ）として、前記ＤＮＡ（ｓ）の塩基配列において１又は複数個（例えば１個以上４１０個以下、好ましくは１個以上３５９個以下、より好ましくは１個以上３０７個以下、より好ましくは１個以上２５６個以下、より好ましくは１個以上２０５個以下、より好ましくは１個以上１５４個以下、より好ましくは１個以上１０３個以下、より好ましくは１個以上８２個以下、より好ましくは１個以上５２個以下、より好ましくは１個以上２１個以下、より好ましくは１個以上１１個以下）の塩基が欠失、置換、挿入、又は付加されており、かつΔ9-DES活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡも好ましい。
　さらに前記ＤＮＡ（ｔ）として、前記ＤＮＡ（ｓ）と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつΔ9-DES活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡも好ましい。
　本発明において、ω3-DES、Δ5-DES及びΔ9-DESと同様、Δ12-DES及びΔ6-DESに加えて、Δ9-エロンガーゼ（以下、「Δ6-ELO」ともいう）の発現も促進されていることが好ましい。
　本明細書において「Δ6-ELO」とは、図１に示すように、γ-リノレン酸（C18:3Δ6,9,12）に炭素鎖を２個分伸長させて、ジホモ-γ-リノレン酸（C20:3Δ8,11,14）を生成する反応を触媒するタンパク質（酵素）を意味する。そして本明細書において「Δ6-エロンガーゼ活性（以下、「Δ6-ELO活性」ともいう」」とは、C18:3Δ6,9,12の炭素鎖を２個分伸長させる活性を意味する。
　Δ12-DES及びΔ6-DESの発現を促進させたナンノクロロプシス属に属する藻類では、Δ12-DES及びΔ6-DESによって触媒される連続反応によって、C18:3Δ6,9,12の生成量が増加する。よって、Δ12-DES及びΔ6-DESの発現を促進させたナンノクロロプシス属に属する藻類において、Δ6-ELOの発現も促進することで、C18:3Δ6,9,12への炭素鎖２個分の導入（伸長）が亢進し、C20:3Δ8,11,14、C20:4Δ5,8,11,14及びC20:5Δ5,8,11,14,17の生産量がさらに増加する。
　タンパク質がΔ6-ELO活性を有することは、例えば、Δ6-ELO合成遺伝子欠損株を用いた系により確認することができる。あるいは、宿主細胞内で機能するプロモーターの下流に前記タンパク質をコードする遺伝子を連結したＤＮＡをΔ6-ELO合成遺伝子欠損株に導入し、ジホモ-γ-リノレン酸の生成を検討することで確認できる。あるいは、Δ6-ELO又はこれを含有する細胞破砕液を調製し、γ-リノレン酸誘導体（ＣｏＡとのチオエステル化合物、グリセロールとのエステル化合物など）を含む反応液と反応させ、常法に従いγ-リノレン酸の減少又はジホモ-γ-リノレン酸の増加を測定することで確認できる。
　本発明における好ましいΔ6-ELOとしては、下記タンパク質（Ｕ）及び（Ｖ）が挙げられる。
（Ｕ）配列番号７４で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
（Ｖ）前記タンパク質（Ｕ）のアミノ酸配列と同一性が６０％以上のアミノ酸配列からなり、かつΔ6-ELO活性を有するタンパク質。
 
　配列番号７４のアミノ酸配列からなるタンパク質は、ナンノクロロプシス・オキュラータNIES2145株由来のΔ6-ELO（以下、「NoΔ6-ELO」ともいう）である。
　前記タンパク質（Ｕ）及び（Ｖ）はいずれも、Δ6-ELO活性を有する。
　前記タンパク質（Ｖ）において、Δ6-ELO活性の点から、前記タンパク質（Ｕ）のアミノ酸配列との同一性は６５％以上が好ましく、７０％以上がより好ましく、７５％以上がより好ましく、８０％以上がより好ましく、８５％以上がより好ましく、９０％以上がより好ましく、９２％以上がより好ましく、９５％以上がより好ましく、９８％以上がより好ましく、９９％以上がさらに好ましい。また、前記タンパク質（Ｖ）として、前記タンパク質（Ｕ）のアミノ酸配列に、１又は複数個（例えば１個以上１１１個以下、好ましくは１個以上９７個以下、より好ましくは１個以上８３個以下、より好ましくは１個以上６９個以下、より好ましくは１個以上５６個以下、より好ましくは１個以上４２個以下、より好ましくは１個以上２８個以下、より好ましくは１個以上２３個以下、より好ましくは１個以上１４個以下、より好ましくは１個以上６個以下、より好ましくは１個以上３個以下）のアミノ酸を欠失、置換、挿入又は付加したタンパク質が挙げられる。
　アミノ酸配列に変異を導入する方法としては、Δ12-DESについて前述した方法が挙げられる。
　前記タンパク質（Ｕ）及び（Ｖ）は、通常の化学的手法、遺伝子工学的手法等により得ることができる。例えば、ナンノクロロプシス・オキュラータから単離、精製等することで天然物由来のタンパク質を取得することができる。また、配列番号７４に示すアミノ酸配列情報をもとに人工的に化学合成することで、前記タンパク質（Ｕ）及び（Ｖ）を得ることができる。あるいは、遺伝子組み換え技術により、組換えタンパク質として前記タンパク質（Ｕ）及び（Ｖ）を作製してもよい。組換えタンパク質を作製する場合には、後述する、Δ6-ELOをコードする遺伝子を用いることができる。
　前記Δ6-ELO（好ましくは前記タンパク質（Ｕ）及び（Ｖ）のいずれか１つ）をコードする遺伝子（以下、「Δ6-ELO遺伝子」ともいう）として、下記ＤＮＡ（ｕ）及び（ｖ）のいずれか１つからなる遺伝子が挙げられる。
 
（ｕ）配列番号７３で表される塩基配列からなるＤＮＡ。
（ｖ）前記ＤＮＡ（ｕ）の塩基配列と同一性が６０％以上の塩基配列からなり、かつΔ6-ELO活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
 
　配列番号７３の塩基配列は、配列番号７４のアミノ酸配列からなるタンパク質（NoΔ6-ELO）をコードする遺伝子（以下、「NoΔ6-ELO遺伝子」ともいう）の塩基配列である。
　前記ＤＮＡ（ｖ）において、Δ6-ELO活性の点から、前記ＤＮＡ（ｕ）の塩基配列との同一性は６５％以上が好ましく、７０％以上がより好ましく、７５％以上がより好ましく、８０％以上がより好ましく、８５％以上がより好ましく、９０％以上がより好ましく、９２％以上がより好ましく、９５％以上がより好ましく、９８％以上がより好ましく、９９％以上がさらに好ましい。
　また前記ＤＮＡ（ｖ）として、前記ＤＮＡ（ｕ）の塩基配列において１又は複数個（例えば１個以上３３３個以下、好ましくは１個以上２９１個以下、より好ましくは１個以上２５０個以下、より好ましくは１個以上２０８個以下、より好ましくは１個以上１６７個以下、より好ましくは１個以上１２５個以下、より好ましくは１個以上８４個以下、より好ましくは１個以上６７個以下、より好ましくは１個以上４２個以下、より好ましくは１個以上１７個以下、より好ましくは１個以上９個以下）の塩基が欠失、置換、挿入、又は付加されており、かつΔ6-ELO活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡも好ましい。
　さらに前記ＤＮＡ（ｖ）として、前記ＤＮＡ（ｕ）と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつΔ6-ELO活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡも好ましい。
　前述のように、ナンノクロロプシス属に属する藻類におけるＰＵＦＡの合成経路では、オレイン酸からリノール酸を生成し、生成したリノール酸からγ-リノレン酸を生成する反応が律速段階である。よって、本発明において、この律速段階の反応を触媒するΔ12-DES及びΔ6-DESのみの発現を促進させてもよい。
　あるいは、ＰＵＦＡの生産性を一層向上させる観点から、Δ12-DES及びΔ6-DESに加えて、ω3-DES、Δ5-DES、Δ9-DES及びΔ6-ELOからなる群より選ばれる少なくとも１種の酵素の発現が促進されていることが好ましく、ω3-DES、Δ5-DES、Δ9-DES及びΔ6-ELOからなる群より選ばれる２種以上の酵素の発現が促進されていることがより好ましい。
　前記各種酵素の発現を促進する方法としては、常法より適宜選択することができ、各種酵素をコードする遺伝子の発現を促進する方法が好ましい。具体的な方法としては、前記各種遺伝子を宿主に導入し、当該遺伝子の発現を促進する方法、前記各種遺伝子をゲノム上に有する宿主において、当該遺伝子の発現調節領域（プロモーター、ターミネーター等）を改変し、当該遺伝子の発現を促進する方法、などが挙げられる。なかでも、前記各種遺伝子を宿主に導入し、各種遺伝子の発現を促進する方法が好ましい。
　以下本明細書において、各種酵素などの目的のタンパク質の発現を促進したものを「形質転換体」ともいい、目的のタンパク質の発現を促進させていないものを「宿主」又は「野生株」ともいう。
　本発明で用いる形質転換体は、宿主自体に比べ、ＰＵＦＡ及びこれを構成成分とする脂質の生産性（ＰＵＦＡ及びこれを構成成分とする脂質の生産量、生産される全脂肪酸中又は全脂質中に占めるＰＵＦＡ及びこれを構成成分とする脂質の割合）が増加傾向にある。そしてその結果、当該形質転換体では、脂質中の脂肪酸組成が改変される。そのため、当該形質転換体を用いた本発明は、特定の炭素原子数の脂肪酸又は脂質、特にＰＵＦＡ又はこれを構成成分とする脂質、好ましくは炭素原子数１８以上のＰＵＦＡ又はこれを構成成分とする脂質、より好ましくは炭素原子数１８若しくは２０のＰＵＦＡ又はこれを構成成分とする脂質、より好ましくは炭素原子数２０のＰＵＦＡ又はこれを構成成分とする脂質、より好ましくはC20:3、C20:4若しくはC20:5又はこれを構成成分とする脂質、より好ましくはジホモ-γ-リノレン酸、アラキドン酸若しくはエイコサペンタエン酸又はこれを構成成分とする脂質、より好ましくはアラキドン酸若しくはエイコサペンタエン酸又はこれを構成成分とする脂質、より好ましくはエイコサペンタエン酸又はこれを構成成分とする脂質、の生産に好適に用いることができる。
　なお、宿主や形質転換体の脂肪酸及び脂質の生産性については、実施例で用いた方法により測定することができる。
　前記各種遺伝子を宿主に導入して前記遺伝子の発現を促進させる方法について説明する。
　前記各種遺伝子は、通常の遺伝子工学的手法により得ることができる。例えば、配列番号１、３、５、７、９、４５、４７、４９、５１、５３若しくは７４に示すアミノ酸配列、又は配列番号２、４、６、８、１０、４６、４８、５０、５２、５４若しくは７３に示す塩基配列に基づいて、各種遺伝子を人工的に合成できる。各種遺伝子の合成は、例えば、インビトロジェン社等のサービスを利用することができる。また、ナンノクロロプシス・オキュラータやナンノクロロプシス・ガディタナなどのナンノクロロプシス属に属する藻類からクローニングによって取得することもできる。例えば、Molecular Cloning－A LABORATORY MANUAL THIRD EDITION［Joseph Sambrook，David W. Russell, Cold Spring Harbor Laboratory Press（2001）］記載の方法等により行うことができる。また、実施例で用いたナンノクロロプシス・オキュラータNIES-2145は、国立環境研究所(NIES)より入手することができる。
　本発明で好ましく用いることができる形質転換体は、前記各種遺伝子を常法により前記宿主に導入することで得られる。具体的には、前記各種遺伝子を宿主細胞中で発現させることのできる組換えベクターや遺伝子発現カセットを調製し、これを宿主細胞に導入して宿主細胞を形質転換させることにより作製できる。
　本発明で用いる藻類は、ナンノクロロプシス属に属する藻類である。ナンノクロロプシス属の藻類は、球形又は楕円形の形状を有する、２～５μｍ程度の小さな藻類（微細藻）である。
　本発明で用いるナンノクロロプシス属の藻類の具体例としては、遺伝子組換え手法が確立している観点から、ナンノクロロプシス・オキュラータ、ナンノクロロプシス・ガディタナ、ナンノクロロプシス・サリナ（Nannochloropsis salina）、ナンノクロロプシス・オセアニカ（Nannochloropsis oceanica）、ナンノクロロプシス・アトムス（Nannochloropsis atomus）、ナンノクロロプシス・マキュラタ（Nannochloropsis maculata）、ナンノクロロプシス・グラニュラータ（Nannochloropsis granulata）、ナンノクロロプシス・エスピー（Nannochloropsis sp.）等が挙げられる。なかでも、脂質生産性の観点から、ナンノクロロプシス・オキュラータ、又はナンノクロロプシス・ガディタナが好ましく、ナンノクロロプシス・オキュラータがより好ましい。
　遺伝子発現用プラスミド又は遺伝子発現用カセットの母体となるベクター（プラスミド）としては、目的のタンパク質をコードする遺伝子を宿主に導入することができ、宿主細胞内で目的の遺伝子を発現させることができるベクターであればよい。例えば、導入する宿主の種類に応じたプロモーターやターミネーター等の発現調節領域を有するベクターであって、複製開始点や選択マーカー等を有するベクターを用いることができる。また、プラスミド等の染色体外で自立増殖・複製するベクターであってもよいし、染色体内に組み込まれるベクターであってもよい。
　本発明で好ましく用いることができる発現ベクターとしては、pUC19（タカラバイオ社製）、P66（Chlamydomonas Center）、P-322（Chlamydomonas Center）、pPha-T1（Journal of Basic Microbiology, 2011, vol. 51, p. 666-672参照）、及びpJET1（コスモ・バイオ社製）が挙げられる。特に、pUC19、pPha-T1、又はpJET1が好ましく用いられる。また、Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2011, vol. 108(52)の記載の方法を参考にして、目的の遺伝子、プロモーター及びターミネーターからなるＤＮＡ断片（遺伝子発現カセット）を用いて宿主を形質転換することもできる。このＤＮＡ断片としては、例えば、ＰＣＲ法により増幅したDNA断片や制限酵素で切断したDNA断片が挙げられる。
　また、前記発現ベクターに組み込んだ目的のタンパク質をコードする遺伝子の発現を調整するプロモーターの種類も、使用する宿主の種類に応じて適宜選択することができる。本発明で好ましく用いることができるプロモーターとしては、lacプロモーター、trpプロモーター、tacプロモーター、trcプロモーター、T7プロモーター、SpoVGプロモーター、イソプロピルβ-D-1-チオガラクトピラノシド（IPTG）の添加によって誘導可能な誘導体に関するプロモーター、Rubiscoオペロン（rbc）、PSI反応中心タンパク質（psaAB）、PSIIのD1タンパク質（psbA）、c-phycocyanin βサブユニット（cpcB）、カリフラワーモザイルウイルス35SRNAプロモーター、ハウスキーピング遺伝子プロモーター（例えば、チューブリンプロモーター、アクチンプロモーター、ユビキチンプロモーター等）、西洋アブラナ又はアブラナ由来Napin遺伝子プロモーター、植物由来Rubiscoプロモーター、ナンノクロロプシス属由来のビオラキサンチン／クロロフィルａ結合タンパク質遺伝子のプロモーター（VCP1プロモーター、VCP2プロモーター）（Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2011, vol. 108(52)）、及びナンノクロロプシス属由来のオレオシン様タンパクLDSP(lipid droplet surface protein)遺伝子のプロモーター（PLOS Genetics, 2012;8(11):e1003064. doi: 10.1371）が挙げられる。本発明において、ビオラキサンチン／クロロフィルａ結合タンパク質遺伝子のプロモーターや、ナンノクロロプシス属由来のオレオシン様タンパクLDSP遺伝子のプロモーターを好ましく用いることができる。
　また、目的のタンパク質をコードする遺伝子が組み込まれたことを確認するための選択マーカーの種類も、使用する宿主の種類に応じて適宜選択することができる。本発明で好ましく用いることができる選択マーカーとしては、アンピシリン耐性遺伝子、クロラムフェニコール耐性遺伝子、エリスロマイシン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、スペクチノマイシン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子、ブラストサイジンＳ耐性遺伝子、ビアラフォス耐性遺伝子、ゼオシン耐性遺伝子、パロモマイシン耐性遺伝子、ゲンタマイシン耐性遺伝子、及びハイグロマイシン耐性遺伝子等の薬剤耐性遺伝子が挙げられる。さらに、栄養要求性に関連する遺伝子の欠損等を選択マーカー遺伝子として使用することもできる。
　目的のタンパク質をコードする遺伝子の前記ベクターへの導入は、制限酵素処理やライゲーション等の常法により行うことができる。
　また、形質転換方法は、使用する宿主の種類に応じて常法より適宜選択することができる。例えば、カルシウムイオンを用いる形質転換方法、一般的なコンピテントセル形質転換方法、プロトプラスト形質転換法、エレクトロポレーション法、LP形質転換方法、アグロバクテリウムを用いた方法、パーティクルガン法等が挙げられる。本発明では、Nature Communications, DOI:10.1038/ncomms1688，2012等に記載のエレクトロポレーション法を用いて形質転換を行うこともできる。
　目的遺伝子断片が導入された形質転換体の選択は、選択マーカー等を利用することで行うことができる。例えば、薬剤耐性遺伝子が、形質転換時に目的DNA断片とともに宿主細胞中に導入された結果、形質転換体が獲得する薬剤耐性を指標に行うことができる。また、ゲノムを鋳型としたＰＣＲ法等によって、目的DNA断片の導入を確認することもできる。
　前記各種遺伝子をゲノム上に有する宿主において、当該遺伝子の発現調節領域を改変して、前記遺伝子の発現を促進させる方法について説明する。
　「発現調節領域」とは、プロモーターやターミネーターを示し、これらの配列は一般に隣接する遺伝子の発現量（転写量、翻訳量）の調節に関与している。ゲノム上に前記各種遺伝子を有する宿主においては、当該遺伝子の発現調節領域を改変して前記各種遺伝子の発現を促進させることで、ＰＵＦＡ又はこれを構成成分とする脂質の生産性を向上させることができる。
　発現調節領域の改変方法としては、例えばプロモーターの入れ替えが挙げられる。ゲノム上に前記各種デサチュラーゼ遺伝子又はエロンガーゼ遺伝子を有する宿主において、当該遺伝子のプロモーター（以下、「デサチュラーゼプロモーター」、「エロンガーゼプロモーター」ともいう）を、より転写活性の高いプロモーターに入れ替えることで、前記各種遺伝子の発現を促進させることができる。
　例えば、ゲノム上に前記各種デサチュラーゼ遺伝子を有する宿主の１つであるナンノクロロプシス・オキュラータNIES-2145株においては、配列番号５５に示す塩基配列からなるＤＮＡ配列の直下にNoΔ12-DES遺伝子が存在しており、配列番号５５に示す塩基配列からなるＤＮＡ配列中にNoΔ12-DES遺伝子のプロモーター領域が存在している。
　また、配列番号５６に示す塩基配列からなるＤＮＡ配列の直下にNoΔ6-DES遺伝子が存在しており、配列番号５６に示す塩基配列からなるＤＮＡ配列中にNoΔ6-DES遺伝子のプロモーター領域が存在している。
　また、配列番号５７に示す塩基配列からなるＤＮＡ配列の直下にNoω3-DES遺伝子が存在しており、配列番号５７に示す塩基配列からなるＤＮＡ配列中にNoω3-DES遺伝子のプロモーター領域が存在している。
　また、配列番号５８に示す塩基配列からなるＤＮＡ配列の直下にNoΔ5-DES遺伝子が存在しており、配列番号５８に示す塩基配列からなるＤＮＡ配列中にNoΔ5-DES遺伝子のプロモーター領域が存在している。
　また、配列番号５９に示す塩基配列からなるＤＮＡ配列の直下にNoΔ9-DES遺伝子が存在しており、配列番号５９に示す塩基配列からなるＤＮＡ配列中にNoΔ9-DES遺伝子のプロモーター領域が存在している。
　さらに、配列番号７５に示す塩基配列からなるＤＮＡ配列の直下にNoΔ6-ELO遺伝子が存在しており、配列番号７５に示す塩基配列からなるＤＮＡ配列中にNoΔ6-ELO遺伝子のプロモーター領域が存在している。
　よって、配列番号５５～５９並びに７５のいずれか１つに示す塩基配列からなるＤＮＡ配列の一部又は全部をより転写活性の高いプロモーターに入れ替えることで、前記各種遺伝子それぞれの発現を促進させることができる。
　デサチュラーゼプロモーター又はエロンガーゼプロモーターの入れ替えに用いるプロモーターとしては特に限定されず、デサチュラーゼプロモーター又はエロンガーゼプロモーターよりも転写活性が高く、ＰＵＦＡ又はこれを構成成分とする脂質の生産に適したものから適宜選択することができる。
　本発明で好ましく用いることができるプロモーターとしては、チューブリンプロモーター、ヒートショックプロテインプロモーター、上述のビオラキサンチン／クロロフィルａ結合タンパク質遺伝子のプロモーター（VCP1プロモーター、VCP2プロモーター）、及びナンノクロロプシス属由来のオレオシン様タンパクLDSP遺伝子のプロモーターが挙げられる。ＰＵＦＡ又はこれを構成成分とする脂質の生産性向上の観点から、ビオラキサンチン／クロロフィルａ結合タンパク質遺伝子のプロモーター又はLDSP遺伝子のプロモーターがより好ましい。
　前述のプロモーターの改変は、相同組換えなどの常法に従い行うことができる。具体的には、標的とするプロモーターの上流、下流領域を含み、標的プロモーターに代えて別のプロモーターを含む直鎖状のDNA断片を構築し、これを宿主細胞に取り込ませ、宿主ゲノムの標的プロモーターの上流側と下流側とで２回交差の相同組換えを起こす。その結果、ゲノム上の標的プロモーターが別のプロモーター断片と置換され、プロモーターを改変することができる。
　このような相同組換えによる標的プロモーターの改変方法は、例えば、Methods in molecular biology, 1995, vol. 47, p. 291-302等の文献を参考に行うことができる。特に、宿主がナンノクロロプシス属に属する藻類の場合、Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2011, vol. 108(52)等の文献を参考にして、相同組換え法によりゲノム中の特定の領域を改変することができる。
　さらに本発明の形質転換体は、KASの発現が促進されていることが好ましく、KASをコードする遺伝子（以下単に、「KAS遺伝子」ともいう）の発現が促進されていることがより好ましい。
　KASは、アシル-ACPとマロニルACPとの縮合反応を触媒し、アシル－ACPの合成に関与する脂肪酸合成酵素の１種である。葉緑体では、アセチル-ACP（又はアセチル-CoA）を出発物質とし、炭素鎖の伸長反応が繰り返され、最終的に炭素原子数１６又は１８のアシル-ACPが合成される。
　脂肪酸合成の第一段階では、アセチル-ACP（又はアセチル-CoA）とマロニルACPとの縮合反応により、アセトアセチルACPが生成する。この反応をKASが触媒する。次いで、β-ケトアシル-ACPレダクターゼによりアセトアセチルACPのケト基が還元されてヒドロキシブチリルACPが生成する。続いて、β-ヒドロキシアシル-ACPデヒドラーゼによりヒドロキシブチリルACPが脱水され、クロトニルACPが生成する。最後に、エノイル-ACPレダクターゼによりクロトニルACPが還元されて、ブチリルACPが生成する。これら一連の反応により、アセチル-ACPからアシル基の炭素鎖が２個伸長されたブチリルACPが生成する。以下、同様の反応を繰り返すことで、アシル-ACPの炭素鎖が伸長し、最終的に炭素原子数１６又は１８のアシル-ACPが合成される。
　そのため、KASの発現を促進することで、好ましくはKAS遺伝子の発現を促進することで、脂質の製造に用いる藻類の脂質の生産性、特に脂肪酸の生産性を一層向上させることができる。
　本発明で好ましく用いることができるKASは、β-ケトアシル-ACPシンターゼ活性（以下、「KAS活性」ともいう）を有するタンパク質であればよい。ここで「KAS活性」とは、アセチル-ACPやアシル-ACPとマロニルACPとの縮合反応を触媒する活性をいう。
　タンパク質がKAS活性を有することは、例えば、宿主細胞内で機能するプロモーターの下流に前記タンパク質をコードする遺伝子を連結したＤＮＡを、脂肪酸分解系が欠損した宿主細胞へ導入し、導入した遺伝子が発現する条件下で細胞を培養し、宿主細胞内又は培養液中の脂肪酸組成の変化を常法により分析することで確認できる。あるいは、宿主細胞内で機能するプロモーターの下流に前記タンパク質をコードする遺伝子を連結したＤＮＡを宿主細胞へ導入し、導入した遺伝子が発現する条件下で細胞を培養した後、細胞の破砕液に対し、各種アシル-ACPを基質とした鎖長伸長反応を行うことにより確認できる。
　KASはその基質特異性によって、KAS I、KAS II、KAS III、又はKAS IVに分類される。例えば、KAS IIIは、炭素原子数２のアセチル-ACP（又はアセチル-CoA）を基質とし、炭素原子数２から４の伸長反応を触媒する。KAS　Iは、主に炭素原子数４から１６の伸長反応を触媒し、炭素原子数１６のパルミトイル-ACPを合成する。KAS IIは、主に炭素原子数１８以上の長鎖アシル基への伸長反応を触媒し、長鎖アシル-ACPを合成する。KAS IVは主に炭素原子数６から１４の伸長反応を触媒し、中鎖アシル-ACPを合成する。
　そのため、KAS IIの発現を促進することで、好ましくはKAS IIをコードする遺伝子の発現を促進することで、長鎖脂肪酸の生産性を一層向上させることができる。
　本発明で好ましく用いることができるKASは、通常のKASや、それらと機能的に均等なタンパク質から、宿主の種類等に応じて適宜選択することができる。例えば、ナンノクロロプシス・オキュラータ由来のKAS II（以下、「NoKASII」ともいう）（配列番号６０）等が挙げられる。また、これと機能的に均等なタンパク質として、前記NoKASIIのアミノ酸配列との同一性が５０％以上（好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上）のアミノ酸配列からなり、かつKAS活性を有するタンパク質も用いることができる。前記NoKASIIをコードする遺伝子としては、配列番号６１で表される塩基配列からなるＤＮＡからなる遺伝子、又は配列番号６１で表される塩基配列との同一性が５０％以上（好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上）の塩基配列からなり、かつKAS活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡからなる遺伝子が挙げられる。
　また、KASの発現を促進させた形質転換体（例えば、KAS遺伝子の発現を促進させた形質転換体）は、常法により作製できる。例えば、前述の各種デサチュラーゼ遺伝子の発現を促進させる方法と同様、KASをコードする遺伝子を宿主に導入する方法、KASをコードする遺伝子をゲノム上に有する宿主において当該遺伝子の発現調節領域を改変する方法、などにより形質転換体を作製することができる。
　さらに本発明の形質転換体は、ACPの発現が促進されていることが好ましく、ACPをコードする遺伝子（以下単に、「ACP遺伝子」ともいう）の発現が促進されていることがより好ましい。
　ACPは脂肪酸の生合成反応（脂肪酸の伸長反応）の足場（担体）として機能する。脂肪酸のアシル基は、ACPのセリン残基に結合したホスホパンテテイン基とチオエステル結合を形成する。この状態で脂肪酸が伸長される。
　そのため、ACPの発現を促進することで、好ましくはACP遺伝子の発現を促進することで、脂質の製造に用いる藻類の脂質の生産性、特に脂肪酸の生産性を一層向上させることができる。
　本発明で好ましく用いることができるACPは、アシルキャリアープロテイン活性（以下、「ACP活性」ともいう）を有するタンパク質であればよい。ここで「ACP活性」とは、脂肪酸のアシル基とチオエステル結合を形成することで脂肪酸の伸長反応の足場として機能する活性を意味する。
　タンパク質がACP活性を有することは、例えば、ACP遺伝子欠損株に、宿主内で機能するプロモーターの下流に前記タンパク質をコードする遺伝子を連結したＤＮＡを導入し、脂肪酸合成能を相補させることで確認することができる。あるいは、宿主細胞内で機能するプロモーターの下流に前記タンパク質をコードする遺伝子を連結したＤＮＡを宿主細胞へ導入し、導入した遺伝子が発現する条件下で細胞を培養し、宿主細胞内又は培養液中の脂肪酸の生産量や組成の変化を常法により分析することで確認できる。あるいは、前記タンパク質を、Biochemistry, 2011, vol. 50(25), p. 5704-5717等の文献を参考にして、補酵素A（CoA）と適当なACPシンターゼ（ACP synthase）（ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼ（phosphopantetheinyl transferase））と反応させ、ホスホパンテテイン基が結合したholo-ACPを形成させることで確認することができる。あるいは、The Journal of Biological Chemistry, 1979, vol. 254(15), p. 7123-7128等の文献を参考にして、前記holo-ACPを脂肪酸及び適当なアシル-ACPシンセターゼ（acyl-ACP synthetase）と反応させ、アシル基が結合したacyl-ACPを形成させることで確認することができる。
　本発明で好ましく用いることができるACPは、通常のACPや、それらと機能的に均等なタンパク質から、宿主の種類等に応じて適宜選択することができる。例えば、ナンノクロロプシス・オキュラータ由来のACP（以下、「NoACP」ともいう）（配列番号６２）等が挙げられる。また、これと機能的に均等なタンパク質として、前記NoACPのアミノ酸配列との同一性が５０％以上（好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上）のアミノ酸配列からなり、かつACP活性を有するタンパク質も用いることができる。前記NoACPをコードする遺伝子としては、配列番号６３で表される塩基配列からなるＤＮＡからなる遺伝子、又は配列番号６３で表される塩基配列との同一性が５０％以上（好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上）の塩基配列からなり、かつACP活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡからなる遺伝子が挙げられる。
　また、ACPの発現を促進させた形質転換体（例えば、ACP遺伝子の発現を促進させた形質転換体）は、常法により作製できる。例えば、前述の各種デサチュラーゼ遺伝子の発現を促進させる方法と同様、ACPをコードする遺伝子を宿主に導入する方法、ACPをコードする遺伝子をゲノム上に有する宿主において当該遺伝子の発現調節領域を改変する方法、などにより形質転換体を作製することができる。
　さらに、ナンノクロロプシス属に属する藻類において、ACPは葉緑体に局在することが好ましい。例えば、ナンノクロロプシス属に属する藻類由来のACP遺伝子の塩基配列に、ナンノクロロプシス属に属する藻類の細胞内で機能する葉緑体移行シグナルをコードする塩基配列を付加した遺伝子の発現を促進することがより好ましい。あるいは、ナンノクロロプシス属に属する藻類由来のACPをコードする遺伝子を葉緑体ゲノム中に導入し、導入した遺伝子の発現を促進することがより好ましい。
　さらに本発明の形質転換体は、TEの発現が促進されていることが好ましく、TEをコードする遺伝子（以下単に、「TE遺伝子」ともいう）の発現も促進されていることが好ましい。
　前述したように、TEは、KAS等の脂肪酸合成酵素によって合成されたアシル-ACPのチオエステル結合を加水分解し、遊離の脂肪酸を生成する酵素である。TEの作用によってACP上での脂肪酸合成が終了し、切り出された脂肪酸はＰＵＦＡの合成やトリアシルグリセロール等の合成に供される。そのため、TEの発現を促進することで、好ましくはTE遺伝子の発現を促進することで、脂質の製造に用いる形質転換体の脂質の生産性、特に脂肪酸の生産性を一層向上させることができる。
　本発明で用いることができるTEは、アシル-ACPチオエステラーゼ活性（以下、「TE活性」ともいう）を有するタンパク質であればよい。ここで「TE活性」とは、アシル-ACPのチオエステル結合を加水分解する活性をいう。
　TEは、基質であるアシル-ACPを構成するアシル基（脂肪酸残基）の炭素原子数や不飽和結合数によって異なる反応特異性を示す複数のTEが存在していることが知られている。よってTEは、生体内での脂肪酸組成を決定する重要なファクターであると考えられている。また、TEをコードする遺伝子を元来有していない宿主を用いる場合、TEをコードする遺伝子、好ましくは長鎖アシル-ACPに対する基質特異性を有するTEをコードする遺伝子の導入が効果的である。このような遺伝子を導入することで、ＰＵＦＡの生産性を一層向上させることができる。
　本発明で用いることができるTEは、通常のTEや、それらと機能的に均等なタンパク質から、宿主の種類等に応じて適宜選択することができる。例えば、ナンノクロロプシス・ガディタナ由来TE（配列番号６４）、ナンノクロロプシス・オキュラータ由来TE（配列番号６５又は６７）、ナンノクロロプシス・グラニュラータ由来TE（配列番号６６）などを用いることができる。また、これと機能的に均等なタンパク質として、前記TEのアミノ酸配列との同一性が５０％以上（好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上）のアミノ酸配列からなり、かつTE活性を有するタンパク質も用いることができる。
　また、TE遺伝子の発現を促進させた形質転換体は、常法により作製できる。例えば、前述の各種デサチュラーゼ遺伝子の発現を促進させる方法と同様、TE遺伝子を宿主に導入する方法、TE遺伝子をゲノム上に有する宿主において当該遺伝子の発現調節領域を改変する方法、などにより形質転換体を作製することができる。
　本発明の形質転換体は、ＰＵＦＡ又はこれを構成成分とする脂質の生産性が、Δ12-デサチュラーゼ及びΔ6-デサチュラーゼそれぞれの発現が促進されていない宿主と比較して向上している。したがって、本発明の形質転換体を適切な条件で培養し、次いで得られた培養物又は生育物からＰＵＦＡ又はこれを構成成分とする脂質を回収すれば、ＰＵＦＡ又はこれを構成成分とする脂質を効率よく製造することができる。ここで「培養物」とは培養した後の培養液及び形質転換体をいい、「生育物」とは生育した後の形質転換体をいう。
　本発明の形質転換体の培養条件は、宿主に応じて適宜選択することができ、その宿主に対して通常用いられる培養条件を使用できる。また脂肪酸の生産効率の点から、培地中に、例えば脂肪酸生合成系に関与する前駆物質としてグリセロール、酢酸、又はグルコース等を添加してもよい。
　本発明で用いる培地は、天然海水又は人工海水をベースにした培地でもよいし、市販の培養培地でもよい。具体的な培地としては、ｆ／２培地、ＥＳＭ培地、ダイゴＩＭＫ培地、Ｌ１培地、ＭＮＫ培地、等を挙げることができる。なかでも、脂質の生産性向上及び栄養成分濃度の観点から、ｆ／２培地、ＥＳＭ培地、又はダイゴＩＭＫ培地が好ましく、ｆ／２培地、又はダイゴＩＭＫ培地がより好ましく、ｆ／２培地がさらに好ましい。藻類の生育促進、脂肪酸の生産性向上のため、培地に、窒素源、リン源、金属塩、ビタミン類、微量金属等を適宜添加することができる。
　培地に接種する形質転換体の量は適宜選択することができ、生育性の点から、培地当たり１％（vol/vol）以上が好ましい。また、その上限値は５０％（vol/vol）以下が好ましく、１０％（vol/vol）以下がより好ましい。接種する藻類の量の数値範囲は、１～５０％（vol/vol）が好ましく、１～１０％（vol/vol）がより好ましい。培養温度は、藻類の増殖に悪影響を与えない範囲であれば特に制限されないが、通常、５～４０℃の範囲である。藻類の生育促進、脂肪酸の生産性向上、及び生産コストの低減の観点から、１０℃以上が好ましく、１５℃以上がより好ましい。またその上限値は３５℃以下が好ましく、３０℃以下がより好ましい。培養温度の数値範囲は、好ましくは１０～３５℃であり、より好ましくは１５～３０℃である。
　また藻類の培養は、光合成ができるよう光照射下で行うことが好ましい。光照射は、光合成が可能な条件であればよく、人工光でも太陽光でもよい。光照射時の照度としては、藻類の生育促進、脂肪酸の生産性向上の観点から、１００ルクス以上が好ましく、３００ルクス以上がより好ましく、１０００ルクス以上がさらに好ましい。またその上限値は、５００００ルクス以下が好ましく、１００００ルクス以下がより好ましく、６０００ルクス以下がさらに好ましい。光照射時の照度の数値範囲は、好ましくは１００～５００００ルクスの範囲、より好ましくは３００～１００００ルクスの範囲、さらに好ましくは１０００～６０００ルクスの範囲である。また、光照射の間隔は、特に制限されないが、前記と同様の観点から、明暗周期で行うことが好ましく、２４時間のうち明期は８時間以上が好ましく、１０時間以上がより好ましい。またその上限値は、２４時間以下が好ましく、１８時間以下がより好ましい。明期の数値範囲は、好ましくは８～２４時間、より好ましくは１０～１８時間、さらに好ましくは１２時間である。
　また藻類の培養は、光合成ができるように二酸化炭素を含む気体の存在下、又は炭酸水素ナトリウムなどの炭酸塩を含む培地で行うことが好ましい。気体中の二酸化炭素の濃度は特に限定されないが、生育促進、脂肪酸の生産性向上の観点から０．０３％（大気条件と同程度）以上が好ましく、０．０５％以上がより好ましく、０．１％以上がさらに好ましく、０．３％以上がよりさらに好ましい。またその上限値は、１０％以下が好ましく、５％以下がより好ましく、３％以下がさらに好ましく、１％以下がよりさらに好ましい。二酸化炭素の濃度の数値範囲は、０．０３～１０％が好ましく、０．０５～５％がより好ましく、０．１～３％がさらに好ましく、０．３～１％がよりさらに好ましい。炭酸塩の濃度は特に限定されないが、例えば炭酸水素ナトリウムを用いる場合、生育促進、脂肪酸の生産性向上の観点から０．０１質量％以上が好ましく、０．０５質量％以上がより好ましく、０．１質量％以上がさらに好ましい。またその上限値は、５質量％以下が好ましく、２質量％以下がより好ましく、１質量％以下がさらに好ましい。炭酸水素ナトリウムの濃度の数値範囲は、０．０１～５質量％が好ましく、０．０５～２質量％がより好ましく、０．１～１質量％がさらに好ましい。
　培養時間は特に限定されず、脂質を高濃度に蓄積する藻体が高い濃度で増殖できるように、長期間（例えば１５０日程度）行なってもよい。３日以上が好ましく、７日以上がより好ましい。またその上限値は、９０日以下が好ましく、３０日以下がより好ましい。培養期間の数値範囲は、好ましくは３～９０日間、より好ましくは３～３０日間、さらに好ましくは７～３０日間である。なお、培養は、通気攪拌培養、振とう培養又は静置培養のいずれでもよく、通気性の向上の観点から、通気撹拌培養が好ましい。
　培養物又は生育物から脂質を採取する方法としては、常法から適宜選択することができる。例えば、前述の培養物又は生育物から、ろ過、遠心分離、細胞の破砕、ゲルろ過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、クロロホルム／メタノール抽出法、ヘキサン抽出法、又はエタノール抽出法等により脂質成分を単離、回収することができる。より大規模な培養を行った場合は、培養物又は生育物より油分を圧搾又は抽出により回収後、脱ガム、脱酸、脱色、脱蝋、脱臭等の一般的な精製を行い、脂質を得ることができる。このように脂質成分を単離した後、単離した脂質を加水分解することで脂肪酸を得ることができる。脂質成分から脂肪酸を単離する方法としては、例えば、アルカリ溶液中で７０℃程度の高温で処理をする方法、リパーゼ処理をする方法、又は高圧熱水を用いて分解する方法等が挙げられる。
　本発明の製造方法において製造される脂質は、その利用性の点から、脂肪酸又は脂肪酸化合物を含んでいることが好ましく、脂肪酸又は脂肪酸エステル化合物を含んでいることがさらに好ましい。前記脂肪酸エステル化合物は、ＭＡＧ、ＤＡＧ及びＴＡＧからなる群より選ばれる少なくとも１種が好ましく、ＴＡＧがより好ましい。
　脂質中に含まれる脂肪酸又は脂肪酸エステル化合物は、界面活性剤等への利用性や栄養学的観点から、炭素原子数１８以上のＰＵＦＡ又はそのエステル化合物が好ましく、炭素原子数１８若しくは２０のＰＵＦＡ又はそのエステル化合物がより好ましく、炭素原子数２０のＰＵＦＡ又はそのエステル化合物がより好ましく、C20:3、C20:4若しくはC20:5、又はそのエステル化合物がより好ましく、ジホモ-γ-リノレン酸、アラキドン酸若しくはエイコサペンタエン酸、又はそのエステル化合物がより好ましく、アラキドン酸若しくはエイコサペンタエン酸、又はそのエステル化合物がより好ましく、エイコサペンタエン酸又はそのエステル化合物がさらに好ましい。
　脂肪酸エステル化合物は、生産性の点から、単純脂質又は複合脂質が好ましく、単純脂質がさらに好ましく、トリアシルグリセロールがさらにより好ましい。
　本発明の製造方法により得られる脂質は、食用として用いる他、可塑剤、化粧品等の乳化剤、石鹸や洗剤等の洗浄剤、繊維処理剤、毛髪リンス剤、又は殺菌剤や防腐剤として利用することができる。
　本発明は、Δ12-DES遺伝子を含有する組換えベクター、及びΔ6-DES遺伝子を含有する組換えベクターを含んでなる、ナンノクロロプシス属に属する藻類の形質転換体の作製用キットも提供する。本発明のキットは、ＰＵＦＡ合成経路の律速段階の反応を触媒する酵素の発現が促進され、ＰＵＦＡ又はこれを構成成分とする脂質の生産性に優れた形質転換体の作製に使用することができる。本発明のキットは、ω3-DES遺伝子を含有する組換えベクター、Δ5-DES遺伝子を含有する組換えベクター、Δ9-DES遺伝子を含有する組換えベクター、及びΔ6-ELO遺伝子を含有する組換えベクターからなる群より選ばれる少なくとも１種の組換えベクター、好ましくは、ω3-DES遺伝子を含有する組換えベクター、Δ5-DES遺伝子を含有する組換えベクター、Δ9-DES遺伝子を含有する組換えベクター、及びΔ6-ELO遺伝子を含有する組換えベクターからなる群より選ばれる２種以上の組換えベクター、も含んでもよい。
　なお本発明のキットは、前記組換えベクターの他、宿主、前記ベクターで宿主を形質転換するために通常用いられる試薬、形質転換用緩衝液、形質転換体を選抜するための指標となる試薬等、形質転換体の作製の検出に必要な他の要素を含んでいてもよい。
　上述した実施形態に関し、本発明はさらに以下の脂質の製造方法、生産される脂肪酸組成を改変する方法、形質転換体、形質転換体の作製方法、及び形質転換体の作製用キットを開示する。
＜１＞Δ12-DES及びΔ6-DESの発現、又はΔ12-DES遺伝子及びΔ6-DES遺伝子の発現を促進させたナンノクロロプシス属に属する藻類を培養し、脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質を生産させる、脂質の製造方法。
＜２＞ナンノクロロプシス属に属する藻類において、Δ12-DES及びΔ6-DESの発現、又はΔ12-DES遺伝子及びΔ6-DES遺伝子の発現を促進し、藻類の細胞内で生産されるＰＵＦＡ又はこれを構成成分とする脂質の生産性を向上させる、脂質の製造方法。
＜３＞ナンノクロロプシス属に属する藻類において、Δ12-DES及びΔ6-DESの発現、又はΔ12-DES遺伝子及びΔ6-DES遺伝子の発現を促進し、藻類の細胞内で生産される全脂肪酸に占めるＰＵＦＡの割合を増加させる、脂肪酸組成を改変する方法。
＜４＞ナンノクロロプシス属に属する藻類において、Δ12-DES及びΔ6-DESの発現、又はΔ12-DES遺伝子及びΔ6-DES遺伝子の発現を促進し、藻類の細胞内で生産される脂肪酸エステル化合物、好ましくはＭＡＧ、ＤＡＧ及びＴＡＧからなる群より選ばれる少なくとも１種、より好ましくはＴＡＧ、の全脂肪酸残基に占めるＰＵＦＡ残基の割合を増加させる、脂肪酸組成を改変する方法。
＜５＞Δ12-DES遺伝子及びΔ6-DES遺伝子の発現を前記藻類の細胞内で促進させ、Δ12-DES及びΔ6-DESの発現を促進する、前記＜１＞～＜４＞のいずれか１項記載の方法。
＜６＞Δ12-DES遺伝子及びΔ6-DES遺伝子を前記藻類に導入し、導入したΔ12-DES遺伝子及びΔ6-DES遺伝子の発現を促進させる、前記＜１＞～＜５＞のいずれか１項記載の方法。
＜７＞前記Δ12-DESが下記タンパク質（Ａ）～（Ｄ）のいずれか１つ、好ましくは下記タンパク質（Ａ）又は（Ｂ）、である、前記＜１＞～＜６＞のいずれか１項記載の方法。
（Ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
（Ｂ）前記タンパク質（Ａ）のアミノ酸配列と同一性が６０％以上、好ましくは６５％以上、より好ましくは７０％以上、より好ましくは７５％以上、より好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９２％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９８％以上、さらに好ましくは９９％以上、のアミノ酸配列からなり、かつΔ12-DES活性を有するタンパク質。
（Ｃ）配列番号４５で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
（Ｄ）前記タンパク質（Ｃ）のアミノ酸配列と同一性が６０％以上、好ましくは６５％以上、より好ましくは７０％以上、より好ましくは７５％以上、より好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９２％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９８％以上、さらに好ましくは９９％以上、のアミノ酸配列からなり、かつΔ12-DES活性を有するタンパク質。
＜８＞前記タンパク質（Ｂ）が、前記タンパク質（Ａ）のアミノ酸配列に、１又は複数個、好ましくは１個以上１７６個以下、より好ましくは１個以上１５４個以下、より好ましくは１個以上１３２個以下、より好ましくは１個以上１１０個以下、より好ましくは１個以上８８個以下、より好ましくは１個以上６６個以下、より好ましくは１個以上４４個以下、より好ましくは１個以上３６個以下、より好ましくは１個以上２２個以下、より好ましくは１個以上９個以下、より好ましくは１個以上５個以下、のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたタンパク質である、前記＜７＞項記載の方法。
＜９＞前記タンパク質（Ｄ）が、前記タンパク質（Ｃ）のアミノ酸配列に、１又は複数個、好ましくは１個以上１８１個以下、より好ましくは１個以上１５９個以下、より好ましくは１個以上１３６個以下、より好ましくは１個以上１１３個以下、より好ましくは１個以上９１個以下、より好ましくは１個以上６８個以下、より好ましくは１個以上４６個以下、より好ましくは１個以上３７個以下、より好ましくは１個以上２３個以下、より好ましくは１個以上１０個以下、より好ましくは１個以上５個以下、のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたタンパク質である、前記＜７＞項記載の方法。
＜１０＞前記Δ12-DES、好ましくは前記タンパク質（Ａ）～（Ｄ）のいずれか１つ、をコードする遺伝子が、下記ＤＮＡ（ａ）～（ｄ）のいずれか１つからなる遺伝子、好ましくは下記ＤＮＡ（ａ）又は（ｂ）からなる遺伝子、である、前記＜１＞～＜９＞のいずれか１項記載の方法。
（ａ）配列番号２で表される塩基配列からなるＤＮＡ。
（ｂ）前記ＤＮＡ（ａ）の塩基配列と同一性が６０％以上、好ましくは６５％以上、より好ましくは７０％以上、より好ましくは７５％以上、より好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９２％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９８％以上、さらに好ましくは９９％以上、の塩基配列からなり、かつΔ12-DES活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
（ｃ）配列番号４６で表される塩基配列からなるＤＮＡ。
（ｄ）前記ＤＮＡ（ｃ）の塩基配列と同一性が６０％以上、好ましくは６５％以上、より好ましくは７０％以上、より好ましくは７５％以上、より好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９２％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９８％以上、さらに好ましくは９９％以上、の塩基配列からなり、かつΔ12-DES活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
＜１１＞前記ＤＮＡ（ｂ）が、前記ＤＮＡ（ａ）の塩基配列に、１若しくは複数個、好ましくは１個以上５２７個以下、より好ましくは１個以上４６１個以下、より好ましくは１個以上３９６個以下、より好ましくは１個以上３３０個以下、より好ましくは１個以上２６４個以下、より好ましくは１個以上１９８個以下、より好ましくは１個以上１３２個以下、より好ましくは１個以上１０６個以下、より好ましくは１個以上６６個以下、より好ましくは１個以上２７個以下、より好ましくは１個以上１４個以下、の塩基が欠失、置換、挿入、若しくは付加された塩基配列からなり、かつΔ12-DES活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、又は前記ＤＮＡ（ａ）と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつΔ12-DES活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡである、前記＜１０＞項記載の方法。
＜１２＞前記ＤＮＡ（ｄ）が、前記ＤＮＡ（ｃ）の塩基配列に、１若しくは複数個、好ましくは１個以上５４４個以下、より好ましくは１個以上４７６個以下、より好ましくは１個以上４０８個以下、より好ましくは１個以上３４０個以下、より好ましくは１個以上２７２個以下、より好ましくは１個以上２０４個以下、より好ましくは１個以上１３６個以下、より好ましくは１個以上１０９個以下、より好ましくは１個以上６８個以下、より好ましくは１個以上２８個以下、より好ましくは１個以上１４個以下、の塩基が欠失、置換、挿入、若しくは付加された塩基配列からなり、かつΔ12-DES活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、又は前記ＤＮＡ（ｃ）と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつΔ12-DES活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡである、前記＜１０＞項記載の方法。
＜１３＞前記Δ6-DESが下記タンパク質（Ｅ）～（Ｈ）のいずれか１つ、好ましくは下記タンパク質（Ｅ）又は（Ｆ）、である、前記＜１＞～＜１２＞のいずれか１項記載の方法。
（Ｅ）配列番号３で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
（Ｆ）前記タンパク質（Ｅ）のアミノ酸配列と同一性が６０％以上、好ましくは６５％以上、より好ましくは７０％以上、より好ましくは７５％以上、より好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９２％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９８％以上、さらに好ましくは９９％以上、のアミノ酸配列からなり、かつΔ6-DES活性を有するタンパク質。
（Ｇ）配列番号４７で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
（Ｈ）前記タンパク質（Ｇ）のアミノ酸配列と同一性が６０％以上、好ましくは６５％以上、より好ましくは７０％以上、より好ましくは７５％以上、より好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９２％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９８％以上、さらに好ましくは９９％以上、のアミノ酸配列からなり、かつΔ6-DES活性を有するタンパク質。
＜１４＞前記タンパク質（Ｆ）が、前記タンパク質（Ｅ）のアミノ酸配列に、１又は複数個、好ましくは１個以上１９０個以下、より好ましくは１個以上１６６個以下、より好ましくは１個以上１４３個以下、より好ましくは１個以上１１９個以下、より好ましくは１個以上９５個以下、より好ましくは１個以上７２個以下、より好ましくは１個以上４８個以下、より好ましくは１個以上３８個以下、より好ましくは１個以上２４個以下、より好ましくは１個以上１０個以下、より好ましくは１個以上５個以下、のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたタンパク質である、前記＜１３＞項記載の方法。
＜１５＞前記タンパク質（Ｈ）が、前記タンパク質（Ｇ）のアミノ酸配列に、１又は複数個、好ましくは１個以上１９０個以下、より好ましくは１個以上１６６個以下、より好ましくは１個以上１４３個以下、より好ましくは１個以上１１９個以下、より好ましくは１個以上９５個以下、より好ましくは１個以上７２個以下、より好ましくは１個以上４８個以下、より好ましくは１個以上３８個以下、より好ましくは１個以上２４個以下、より好ましくは１個以上１０個以下、より好ましくは１個以上５個以下、のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたタンパク質である、前記＜１３＞項記載の方法。
＜１６＞前記Δ6-DES、好ましくは前記タンパク質（Ｅ）～（Ｈ）のいずれか１つ、をコードする遺伝子が、下記ＤＮＡ（ｅ）～（ｈ）のいずれか１つからなる遺伝子、好ましくは下記ＤＮＡ（ｅ）又は（ｆ）からなる遺伝子、である、前記＜１＞～＜１５＞のいずれか１項記載の方法。
（ｅ）配列番号４で表される塩基配列からなるＤＮＡ。
（ｆ）前記ＤＮＡ（ｅ）の塩基配列と同一性が６０％以上、好ましくは６５％以上、より好ましくは７０％以上、より好ましくは７５％以上、より好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９２％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９８％以上、さらに好ましくは９９％以上、の塩基配列からなり、かつΔ6-DES活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
（ｇ）配列番号４８で表される塩基配列からなるＤＮＡ。
（ｈ）前記ＤＮＡ（ｇ）の塩基配列と同一性が６０％以上、好ましくは６５％以上、より好ましくは７０％以上、より好ましくは７５％以上、より好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９２％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９８％以上、さらに好ましくは９９％以上、の塩基配列からなり、かつΔ6-DES活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
＜１７＞前記ＤＮＡ（ｆ）が、前記ＤＮＡ（ｅ）の塩基配列に、１若しくは複数個、好ましくは１個以上５７０個以下、より好ましくは１個以上４９９個以下、より好ましくは１個以上４２８個以下、より好ましくは１個以上３５７個以下、より好ましくは１個以上２８５個以下、より好ましくは１個以上２１４個以下、より好ましくは１個以上１４３個以下、より好ましくは１個以上１１４個以下、より好ましくは１個以上７２個以下、より好ましくは１個以上２９個以下、より好ましくは１個以上１５個以下、の塩基が欠失、置換、挿入、若しくは付加された塩基配列からなり、かつΔ6-DES活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、又は前記ＤＮＡ（ｅ）と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつΔ6-DES活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡである、前記＜１６＞項記載の方法。
＜１８＞前記ＤＮＡ（ｈ）が、前記ＤＮＡ（ｇ）の塩基配列に、１若しくは複数個、好ましくは１個以上５７２個以下、より好ましくは１個以上５００個以下、より好ましくは１個以上４２９個以下、より好ましくは１個以上３５７個以下、より好ましくは１個以上２８６個以下、より好ましくは１個以上２１５個以下、より好ましくは１個以上１４３個以下、より好ましくは１個以上１１５個以下、より好ましくは１個以上７２個以下、より好ましくは１個以上２９個以下、より好ましくは１個以上１５個以下、の塩基が欠失、置換、挿入、若しくは付加された塩基配列からなり、かつΔ6-DES活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、又は前記ＤＮＡ（ｇ）と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつΔ6-DES活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡである、前記＜１６＞項記載の方法。
＜１９＞前記藻類において、ω3-DESの発現、又はω3-DES遺伝子の発現を促進させた、前記＜１＞～＜１８＞のいずれか１項記載の方法。
＜２０＞ω3-DES遺伝子の発現を前記藻類の細胞内で促進させ、ω3-DESの発現を促進する、前記＜１９＞項記載の方法。
＜２１＞ω3-DES遺伝子を前記藻類に導入し、導入したω3-DES遺伝子の発現を促進させる、前記＜１９＞又は＜２０＞項記載の方法。
＜２２＞前記ω3-DESが下記タンパク質（Ｉ）～（Ｌ）のいずれか１つ、好ましくは下記タンパク質（Ｉ）又は（Ｊ）、である、前記＜１９＞～＜２１＞のいずれか１項記載の方法。
（Ｉ）配列番号５で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
（Ｊ）前記タンパク質（Ｉ）のアミノ酸配列と同一性が６０％以上、好ましくは６５％以上、より好ましくは７０％以上、より好ましくは７５％以上、より好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９２％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９８％以上、さらに好ましくは９９％以上、のアミノ酸配列からなり、かつω3-DES活性を有するタンパク質。
（Ｋ）配列番号４９で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
（Ｌ）前記タンパク質（Ｋ）のアミノ酸配列と同一性が６０％以上、好ましくは６５％以上、より好ましくは７０％以上、より好ましくは７５％以上、より好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９２％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９８％以上、さらに好ましくは９９％以上、のアミノ酸配列からなり、かつω3-DES活性を有するタンパク質。
＜２３＞前記タンパク質（Ｊ）が、前記タンパク質（Ｉ）のアミノ酸配列に、１又は複数個、好ましくは１個以上１６４個以下、より好ましくは１個以上１４４個以下、より好ましくは１個以上１２３個以下、より好ましくは１個以上１０３個以下、より好ましくは１個以上８２個以下、より好ましくは１個以上６２個以下、より好ましくは１個以上４１個以下、より好ましくは１個以上３３個以下、より好ましくは１個以上２１個以下、より好ましくは１個以上９個以下、より好ましくは１個以上５個以下、のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたタンパク質である、前記＜２２＞項記載の方法。
＜２４＞前記タンパク質（Ｌ）が、前記タンパク質（Ｋ）のアミノ酸配列に、１又は複数個、好ましくは１個以上１６３個以下、より好ましくは１個以上１４３個以下、より好ましくは１個以上１２３個以下、より好ましくは１個以上１０２個以下、より好ましくは１個以上８２個以下、より好ましくは１個以上６２個以下、より好ましくは１個以上４１個以下、より好ましくは１個以上３３個以下、より好ましくは１個以上２１個以下、より好ましくは１個以上９個以下、より好ましくは１個以上５個以下、のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたタンパク質である、前記＜２２＞項記載の方法。
＜２５＞前記ω3-DES、好ましくは前記タンパク質（Ｉ）～（Ｌ）のいずれか１つ、をコードする遺伝子が、下記ＤＮＡ（ｉ）～（ｌ）のいずれか１つからなる遺伝子、好ましくは下記ＤＮＡ（ｉ）又は（ｊ）からなる遺伝子、である、前記＜１９＞～＜２４＞のいずれか１項記載の方法。
（ｉ）配列番号６で表される塩基配列からなるＤＮＡ。
（ｊ）前記ＤＮＡ（ｉ）の塩基配列と同一性が６０％以上、好ましくは６５％以上、より好ましくは７０％以上、より好ましくは７５％以上、より好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９２％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９８％以上、さらに好ましくは９９％以上、の塩基配列からなり、かつω3-DES活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
（ｋ）配列番号５０で表される塩基配列からなるＤＮＡ。
（ｌ）前記ＤＮＡ（ｋ）の塩基配列と同一性が６０％以上、好ましくは６５％以上、より好ましくは７０％以上、より好ましくは７５％以上、より好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９２％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９８％以上、さらに好ましくは９９％以上、の塩基配列からなり、かつω3-DES活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
＜２６＞前記ＤＮＡ（ｊ）が、前記ＤＮＡ（ｉ）の塩基配列に、１若しくは複数個、好ましくは１個以上４９４個以下、より好ましくは１個以上４３２個以下、より好ましくは１個以上３７０個以下、より好ましくは１個以上３０９個以下、より好ましくは１個以上２４７個以下、より好ましくは１個以上１８５個以下、より好ましくは１個以上１２４個以下、より好ましくは１個以上９９個以下、より好ましくは１個以上６２個以下、より好ましくは１個以上２５個以下、より好ましくは１個以上１３個以下、の塩基が欠失、置換、挿入、若しくは付加された塩基配列からなり、かつω3-DES活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、又は前記ＤＮＡ（ｉ）と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつω3-DES活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡである、前記＜２５＞項記載の方法。
＜２７＞前記ＤＮＡ（ｌ）が、前記ＤＮＡ（ｋ）の塩基配列に、１若しくは複数個、好ましくは１個以上４９０個以下、より好ましくは１個以上４２９個以下、より好ましくは１個以上３６８個以下、より好ましくは１個以上３０６個以下、より好ましくは１個以上２４５個以下、より好ましくは１個以上１８４個以下、より好ましくは１個以上１２３個以下、より好ましくは１個以上９８個以下、より好ましくは１個以上６２個以下、より好ましくは１個以上２５個以下、より好ましくは１個以上１３個以下、の塩基が欠失、置換、挿入、若しくは付加された塩基配列からなり、かつω3-DES活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、又は前記ＤＮＡ（ｋ）と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつω3-DES活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡである、前記＜２５＞項記載の方法。
＜２８＞前記藻類において、Δ5-DESの発現、又はΔ5-DES遺伝子の発現を促進させた、前記＜１＞～＜２７＞のいずれか１項記載の方法。
＜２９＞Δ5-DES遺伝子の発現を前記藻類の細胞内で促進させ、Δ5-DESの発現を促進する、前記＜２８＞項記載の方法。
＜３０＞Δ5-DES遺伝子を前記藻類に導入し、導入したΔ5-DES遺伝子の発現を促進させる、前記＜２８＞又は＜２９＞項記載の方法。
＜３１＞前記Δ5-DESが下記タンパク質（Ｍ）～（Ｐ）のいずれか１つ、好ましくは下記タンパク質（Ｍ）又は（Ｎ）、である、前記＜２８＞～＜３０＞のいずれか１項記載の方法。
（Ｍ）配列番号７で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
（Ｎ）前記タンパク質（Ｍ）のアミノ酸配列と同一性が６０％以上、好ましくは６５％以上、より好ましくは７０％以上、より好ましくは７５％以上、より好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９２％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９８％以上、さらに好ましくは９９％以上、のアミノ酸配列からなり、かつΔ5-DES活性を有するタンパク質。
（Ｏ）配列番号５１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
（Ｐ）前記タンパク質（Ｏ）のアミノ酸配列と同一性が６０％以上、好ましくは６５％以上、より好ましくは７０％以上、より好ましくは７５％以上、より好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９２％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９８％以上、さらに好ましくは９９％以上、のアミノ酸配列からなり、かつΔ5-DES活性を有するタンパク質。
＜３２＞前記タンパク質（Ｎ）が、前記タンパク質（Ｍ）のアミノ酸配列に、１又は複数個、好ましくは１個以上２１１個以下、より好ましくは１個以上１８５個以下、より好ましくは１個以上１５８個以下、より好ましくは１個以上１３２個以下、より好ましくは１個以上１０６個以下、より好ましくは１個以上７９個以下、より好ましくは１個以上５３個以下、より好ましくは１個以上４３個以下、より好ましくは１個以上２７個以下、より好ましくは１個以上１１個以下、より好ましくは１個以上６個以下、のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたタンパク質である、前記＜３１＞項記載の方法。
＜３３＞前記タンパク質（Ｐ）が、前記タンパク質（Ｏ）のアミノ酸配列に、１又は複数個、好ましくは１個以上２０６個以下、より好ましくは１個以上１８１個以下、より好ましくは１個以上１５５個以下、より好ましくは１個以上１２９個以下、より好ましくは１個以上１０３個以下、より好ましくは１個以上７８個以下、より好ましくは１個以上５２個以下、より好ましくは１個以上４２個以下、より好ましくは１個以上２６個以下、より好ましくは１個以上１１個以下、より好ましくは１個以上６個以下、のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたタンパク質である、前記＜３１＞項記載の方法。
＜３４＞前記Δ5-DES、好ましくは前記タンパク質（Ｍ）～（Ｐ）のいずれか１つをコードする遺伝子が、下記ＤＮＡ（ｍ）～（ｐ）のいずれか１つからなる遺伝子、好ましくは下記ＤＮＡ（ｍ）又は（ｎ）からなる遺伝子、である、前記＜２８＞～＜３３＞のいずれか１項記載の方法。
（ｍ）配列番号８で表される塩基配列からなるＤＮＡ。
（ｎ）前記ＤＮＡ（ｍ）の塩基配列と同一性が６０％以上、好ましくは６５％以上、より好ましくは７０％以上、より好ましくは７５％以上、より好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９２％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９８％以上、さらに好ましくは９９％以上、の塩基配列からなり、かつΔ5-DES活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
（ｏ）配列番号５２で表される塩基配列からなるＤＮＡ。
（ｐ）前記ＤＮＡ（ｏ）の塩基配列と同一性が６０％以上、好ましくは６５％以上、より好ましくは７０％以上、より好ましくは７５％以上、より好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９２％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９８％以上、さらに好ましくは９９％以上、の塩基配列からなり、かつΔ5-DES活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
＜３５＞前記ＤＮＡ（ｎ）が、前記ＤＮＡ（ｍ）の塩基配列に、１若しくは複数個、好ましくは１個以上６３３個以下、より好ましくは１個以上５５４個以下、より好ましくは１個以上４７５個以下、より好ましくは１個以上３９６個以下、より好ましくは１個以上３１７個以下、より好ましくは１個以上２３８個以下、より好ましくは１個以上１５９個以下、より好ましくは１個以上１２７個以下、より好ましくは１個以上８０個以下、より好ましくは１個以上３２個以下、より好ましくは１個以上１６個以下、の塩基が欠失、置換、挿入、若しくは付加された塩基配列からなり、かつΔ5-DES活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、又は前記ＤＮＡ（ｍ）と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつΔ5-DES活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡである、前記＜３４＞項記載の方法。
＜３６＞前記ＤＮＡ（ｐ）が、前記ＤＮＡ（ｏ）の塩基配列に、１若しくは複数個、好ましくは１個以上６２０個以下、より好ましくは１個以上５４２個以下、より好ましくは１個以上４６５個以下、より好ましくは１個以上３８７個以下、より好ましくは１個以上３１０個以下、より好ましくは１個以上２３３個以下、より好ましくは１個以上１５５個以下、より好ましくは１個以上１２４個以下、より好ましくは１個以上７８個以下、より好ましくは１個以上３１個以下、より好ましくは１個以上１６個以下、の塩基が欠失、置換、挿入、若しくは付加された塩基配列からなり、かつΔ5-DES活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、又は前記ＤＮＡ（ｏ）と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつΔ5-DES活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡである、前記＜３４＞項記載の方法。
＜３７＞前記藻類において、Δ9-DESの発現、又はΔ9-DES遺伝子の発現を促進させた、前記＜１＞～＜３６＞のいずれか１項記載の方法。
＜３８＞Δ9-DES遺伝子の発現を前記藻類の細胞内で促進させ、Δ9-DESの発現を促進する、前記＜３７＞項記載の方法。
＜３９＞Δ9-DES遺伝子を前記藻類に導入し、導入したΔ9-DES遺伝子の発現を促進させる、前記＜３７＞又は＜３８＞項記載の方法。
＜４０＞前記Δ9-DESが下記タンパク質（Ｑ）～（Ｔ）のいずれか１つ、好ましくは下記タンパク質（Ｑ）又は（Ｒ）、である、前記＜３７＞～＜３９＞のいずれか１項記載の方法。
（Ｑ）配列番号９で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
（Ｒ）前記タンパク質（Ｑ）のアミノ酸配列と同一性が６０％以上、好ましくは６５％以上、より好ましくは７０％以上、より好ましくは７５％以上、より好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９２％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９８％以上、さらに好ましくは９９％以上、のアミノ酸配列からなり、かつΔ9-DES活性を有するタンパク質。
（Ｓ）配列番号５３で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
（Ｔ）前記タンパク質（Ｓ）のアミノ酸配列と同一性が６０％以上、好ましくは６５％以上、より好ましくは７０％以上、より好ましくは７５％以上、より好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９２％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９８％以上、さらに好ましくは９９％以上、のアミノ酸配列からなり、かつΔ9-DES活性を有するタンパク質。
＜４１＞前記タンパク質（Ｒ）が、前記タンパク質（Ｑ）のアミノ酸配列に、１又は複数個、好ましくは１個以上１４４個以下、より好ましくは１個以上１２６個以下、より好ましくは１個以上１０８個以下、より好ましくは１個以上９０個以下、より好ましくは１個以上７２個以下、より好ましくは１個以上５４個以下、より好ましくは１個以上３６個以下、より好ましくは１個以上２９個以下、より好ましくは１個以上１８個以下、より好ましくは１個以上８個以下、より好ましくは１個以上４個以下、のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたタンパク質である、前記＜４０＞項記載の方法。
＜４２＞前記タンパク質（Ｔ）が、前記タンパク質（Ｓ）のアミノ酸配列に、１又は複数個、好ましくは１個以上１３６個以下、より好ましくは１個以上１１９個以下、より好ましくは１個以上１０２個以下、より好ましくは１個以上８５個以下、より好ましくは１個以上６８個以下、より好ましくは１個以上５１個以下、より好ましくは１個以上３４個以下、より好ましくは１個以上２８個以下、より好ましくは１個以上１７個以下、より好ましくは１個以上７個以下、より好ましくは１個以上４個以下、のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたタンパク質である、前記＜４０＞項記載の方法。
＜４３＞前記Δ9-DES、好ましくは前記タンパク質（Ｑ）～（Ｔ）のいずれか１つをコードする遺伝子が、下記ＤＮＡ（ｑ）～（ｔ）のいずれか１つからなる遺伝子、好ましくは下記ＤＮＡ（ｑ）又は（ｒ）からなる遺伝子、である、前記＜３７＞～＜４２＞のいずれか１項記載の方法。
（ｑ）配列番号１０で表される塩基配列からなるＤＮＡ。
（ｒ）前記ＤＮＡ（ｑ）の塩基配列と同一性が６０％以上、好ましくは６５％以上、より好ましくは７０％以上、より好ましくは７５％以上、より好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９２％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９８％以上、さらに好ましくは９９％以上、の塩基配列からなり、かつΔ9-DES活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
（ｓ）配列番号５４で表される塩基配列からなるＤＮＡ。
（ｔ）前記ＤＮＡ（ｓ）の塩基配列と同一性が６０％以上、好ましくは６５％以上、より好ましくは７０％以上、より好ましくは７５％以上、より好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９２％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９８％以上、さらに好ましくは９９％以上、の塩基配列からなり、かつΔ9-DES活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
＜４４＞前記ＤＮＡ（ｒ）が、前記ＤＮＡ（ｑ）の塩基配列に、１若しくは複数個、好ましくは１個以上４３２個以下、より好ましくは１個以上３７８個以下、より好ましくは１個以上３２４個以下、より好ましくは１個以上２７０個以下、より好ましくは１個以上２１６個以下、より好ましくは１個以上１６２個以下、より好ましくは１個以上１０８個以下、より好ましくは１個以上８７個以下、より好ましくは１個以上５４個以下、より好ましくは１個以上２２個以下、より好ましくは１個以上１１個以下、の塩基が欠失、置換、挿入、若しくは付加された塩基配列からなり、かつΔ9-DES活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、又は前記ＤＮＡ（ｑ）と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつΔ9-DES活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡである、前記＜４３＞項記載の方法。
＜４５＞前記ＤＮＡ（ｔ）が、前記ＤＮＡ（ｓ）の塩基配列に、１若しくは複数個、好ましくは１個以上４１０個以下、より好ましくは１個以上３５９個以下、より好ましくは１個以上３０７個以下、より好ましくは１個以上２５６個以下、より好ましくは１個以上２０５個以下、より好ましくは１個以上１５４個以下、より好ましくは１個以上１０３個以下、より好ましくは１個以上８２個以下、より好ましくは１個以上５２個以下、より好ましくは１個以上２１個以下、より好ましくは１個以上１１個以下、の塩基が欠失、置換、挿入、若しくは付加された塩基配列からなり、かつΔ9-DES活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、又は前記ＤＮＡ（ｓ）と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつΔ9-DES活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡである、前記＜４３＞項記載の方法。
＜４６＞前記藻類において、Δ6-ELOの発現、又はΔ6-ELO遺伝子の発現を促進させた、前記＜１＞～＜４５＞のいずれか１項記載の方法。
＜４７＞Δ6-ELO遺伝子の発現を前記藻類の細胞内で促進させ、Δ6-ELOの発現を促進する、前記＜４６＞項記載の方法。
＜４８＞Δ6-ELO遺伝子を前記藻類に導入し、導入したΔ6-ELO遺伝子の発現を促進させる、前記＜４６＞又は＜４７＞項記載の方法。
＜４９＞前記Δ6-ELOが下記タンパク質（Ｕ）又は（Ｖ）である、前記＜４６＞～＜４８＞のいずれか１項記載の方法。
（Ｕ）配列番号７４で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
（Ｖ）前記タンパク質（Ｕ）のアミノ酸配列と同一性が６０％以上、好ましくは６５％以上、より好ましくは７０％以上、より好ましくは７５％以上、より好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９２％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９８％以上、さらに好ましくは９９％以上、のアミノ酸配列からなり、かつΔ6-ELO活性を有するタンパク質。
＜５０＞前記タンパク質（Ｖ）が、前記タンパク質（Ｕ）のアミノ酸配列に、１又は複数個、好ましくは１個以上１１１個以下、より好ましくは１個以上９７個以下、より好ましくは１個以上８３個以下、より好ましくは１個以上６９個以下、より好ましくは１個以上５６個以下、より好ましくは１個以上４２個以下、より好ましくは１個以上２８個以下、より好ましくは１個以上２３個以下、より好ましくは１個以上１４個以下、より好ましくは１個以上６個以下、より好ましくは１個以上３個以下、のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたタンパク質である、前記＜４９＞項記載の方法。
＜５１＞前記Δ6-ELO、好ましくは前記タンパク質（Ｕ）及び（Ｖ）のいずれか１つをコードする遺伝子が、下記ＤＮＡ（ｕ）及び（ｖ）のいずれか１つからなる遺伝子である、前記＜４６＞～＜５０＞のいずれか１項記載の方法。
（ｕ）配列番号７３で表される塩基配列からなるＤＮＡ。
（ｖ）前記ＤＮＡ（ｕ）の塩基配列と同一性が６０％以上、好ましくは６５％以上、より好ましくは７０％以上、より好ましくは７５％以上、より好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９２％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９８％以上、さらに好ましくは９９％以上、の塩基配列からなり、かつΔ6-ELO活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
＜５２＞前記ＤＮＡ（ｖ）が、前記ＤＮＡ（ｕ）の塩基配列に、１若しくは複数個、好ましくは１個以上３３３個以下、より好ましくは１個以上２９１個以下、より好ましくは１個以上２５０個以下、より好ましくは１個以上２０８個以下、より好ましくは１個以上１６７個以下、より好ましくは１個以上１２５個以下、より好ましくは１個以上８４個以下、より好ましくは１個以上６７個以下、より好ましくは１個以上４２個以下、より好ましくは１個以上１７個以下、より好ましくは１個以上９個以下、の塩基が欠失、置換、挿入、若しくは付加された塩基配列からなり、かつΔ6-ELO活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、又は前記ＤＮＡ（ｕ）と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつΔ6-ELO活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡである、前記＜５１＞項記載の方法。
＜５３＞前記藻類において、ω3-DES、Δ5-DES、Δ9-DES及びΔ6-ELOからなる群より選ばれる少なくとも１種の酵素、好ましくはω3-DES、Δ5-DES、Δ9-DES及びΔ6-ELOからなる群より選ばれる２種以上の酵素、又はこれをコードする遺伝子の発現が促進されている、前記＜１＞～＜５２＞のいずれか１項記載の方法。
＜５４＞前記藻類において、KAS II、ACP、及びTEからなる群より選ばれる少なくとも１つのタンパク質の発現を促進させた、好ましくはKAS II、ACP、及びTEからなる群より選ばれる少なくとも１つをコードする遺伝子の発現を促進させた、前記＜１＞～＜５３＞のいずれか１項記載の方法。
＜５５＞KAS II、ACP、及びTEからなる群より選ばれる少なくとも１つをコードする遺伝子を前記藻類に導入し、導入した遺伝子の発現を促進させる、前記＜５４＞項記載の方法。
＜５６＞前記KAS IIが、配列番号６０で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質、又は配列番号６０で表されるアミノ酸配列と同一性が５０％以上、好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、のアミノ酸配列からなり、かつKAS活性を有するタンパク質である、前記＜５４＞又は＜５５＞項記載の方法。
＜５７＞KAS IIをコードする遺伝子が、配列番号６１で表される塩基配列からなるＤＮＡからなる遺伝子、又は配列番号６１で表される塩基配列との同一性が５０％以上、好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、の塩基配列からなり、かつKAS活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡからなる遺伝子である、前記＜５４＞～＜５６＞のいずれか１項記載の方法。
＜５８＞前記ACPが、配列番号６２で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質、又は配列番号６２で表されるアミノ酸配列と同一性が５０％以上、好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、のアミノ酸配列からなり、かつACP活性を有するタンパク質である、前記＜５４＞又は＜５５＞項記載の方法。
＜５９＞ACPをコードする遺伝子が、配列番号６３で表される塩基配列からなるＤＮＡからなる遺伝子、又は配列番号６３で表される塩基配列との同一性が５０％以上、好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、の塩基配列からなり、かつACP活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡからなる遺伝子である、前記＜５４＞、＜５５＞及び＜５８＞のいずれか１項記載の方法。
＜６０＞ACPをコードする遺伝子が、前記藻類の細胞内で機能する葉緑体移行シグナル配列をコードする塩基配列が付加された遺伝子である、前記＜５４＞、＜５５＞、＜５８＞及び＜５９＞のいずれか１項記載の方法。
＜６１＞ACPをコードする遺伝子が葉緑体ゲノムに導入され、導入した遺伝子の発現を促進させる、前記＜５４＞、＜５５＞、＜５８＞及び＜５９＞のいずれか１項記載の方法。
＜６２＞前記TEが、配列番号６４～６７のいずれか１つで表されるアミノ酸配列からなるタンパク質、又はそれらと機能的に均等なタンパク質である、前記＜５４＞又は＜５５＞項記載の方法。
＜６３＞前記TEが、配列番号６４～６７のいずれか１つで表されるアミノ酸配列からなるタンパク質、又は配列番号６４～６７のいずれか１つで表されるアミノ酸配列と同一性が５０％以上、好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、のアミノ酸配列からなり、かつTE活性を有するタンパク質である、前記＜５４＞、＜５５＞及び＜６２＞のいずれか１項記載の方法。
＜６４＞前記藻類が、ナンノクロロプシス・オキュラータ、ナンノクロロプシス・ガディタナ、ナンノクロロプシス・サリナ、ナンノクロロプシス・オセアニカ、ナンノクロロプシス・アトムス、ナンノクロロプシス・マキュラタ、ナンノクロロプシス・グラニュラータ、又はナンノクロロプシス・エスピー、好ましくはナンノクロロプシス・オキュラータ又はナンノクロロプシス・ガディタナ、より好ましくはナンノクロロプシス・オキュラータ、である、前記＜１＞～＜６３＞のいずれか１項記載の方法。
＜６５＞前記脂肪酸又は前記脂質が、炭素原子数１８以上のＰＵＦＡ又はその脂肪酸エステル化合物、好ましくは炭素原子数１８若しくは２０のＰＵＦＡ又はその脂肪酸エステル化合物、より好ましくは炭素原子数２０のＰＵＦＡ又はその脂肪酸エステル化合物、より好ましくはC20:3、C20:4若しくはC20:5、又はその脂肪酸エステル化合物、より好ましくはジホモ-γ-リノレン酸、アラキドン酸若しくはエイコサペンタエン酸、又はその脂肪酸エステル化合物、より好ましくはアラキドン酸若しくはエイコサペンタエン酸、又はそのエステル化合物、より好ましくはエイコサペンタエン酸又はその脂肪酸エステル化合物、を含む、前記＜１＞～＜６４＞のいずれか１項記載の方法。
＜６６＞ｆ／２培地を用いて前記藻類を培養する、前記＜１＞～＜６５＞のいずれか１項記載の方法。
＜６７＞Δ12-DES及びΔ6-DESの発現、又はΔ12-DES遺伝子及びΔ6-DES遺伝子の発現が促進されている、ナンノクロロプシス属に属する藻類の形質転換体。
＜６８＞Δ12-DES遺伝子及びΔ6-DES遺伝子の発現が前記藻類の細胞内で促進され、Δ12-DES及びΔ6-DESの発現が促進されている、前記＜６７＞項記載の形質転換体。
＜６９＞Δ12-DES遺伝子及びΔ6-DES遺伝子、又はΔ12-DES遺伝子を含有する組換えベクター及びΔ6-DES遺伝子を含有する組換えベクターを含んでなる、前記＜６８＞項記載の形質転換体。
＜７０＞Δ12-DES遺伝子及びΔ6-DES遺伝子、又はΔ12-DES遺伝子を含有する組換えベクター及びΔ6-DES遺伝子を含有する組換えベクターを、ナンノクロロプシス属に属する藻類に導入する、形質転換体の作製方法。
＜７１＞Δ12-DES遺伝子を含有する組換えベクター、及びΔ6-DES遺伝子を含有する組換えベクターを含んでなる、ナンノクロロプシス属に属する藻類の形質転換体の作製用キット。
＜７２＞前記Δ12-DESが前記タンパク質（Ａ）～（Ｄ）のいずれか１つ、好ましくは前記タンパク質（Ａ）又は（Ｂ）、である、前記＜６７＞～＜７１＞のいずれか１項記載の形質転換体、その作製方法、又は形質転換体の作製用キット。
＜７３＞前記タンパク質（Ｂ）又は（Ｄ）が、前記＜７＞～＜９＞のいずれか１項で規定するタンパク質である、前記＜７２＞項記載の形質転換体、その作製方法、又は形質転換体の作製用キット。
＜７４＞前記Δ12-DES、好ましくは前記タンパク質（Ａ）～（Ｄ）のいずれか１つをコードする遺伝子が、前記＜１０＞～＜１２＞のいずれか１項で規定する遺伝子である、前記＜６７＞～＜７３＞のいずれか１項記載の形質転換体、その作製方法、又は形質転換体の作製用キット。
＜７５＞前記Δ6-DESが前記タンパク質（Ｅ）～（Ｈ）のいずれか１つ、好ましくは前記タンパク質（Ｅ）又は（Ｆ）、である、前記＜６７＞～＜７４＞のいずれか１項記載の形質転換体、その作製方法、又は形質転換体の作製用キット。
＜７６＞前記タンパク質（Ｆ）又は（Ｈ）が、前記＜１３＞～＜１５＞のいずれか１項で規定するタンパク質である、前記＜７５＞項記載の形質転換体、その作製方法、又は形質転換体の作製用キット。
＜７７＞前記Δ6-DES、好ましくは前記タンパク質（Ｅ）～（Ｈ）のいずれか１つをコードする遺伝子が、前記＜１６＞～＜１８＞のいずれか１項で規定する遺伝子である、前記＜６７＞～＜７６＞のいずれか１項記載の形質転換体、その作製方法、又は形質転換体の作製用キット。
＜７８＞前記形質転換体において、ω3-DESの発現、又はω3-DES遺伝子の発現が促進されている、前記＜６７＞～＜６９＞、及び＜７２＞～＜７７＞のいずれか１項記載の形質転換体。
＜７９＞ω3-DES遺伝子の発現が前記藻類の細胞内で促進され、ω3-DESの発現が促進されている、前記＜７８＞項記載の形質転換体。
＜８０＞ω3-DES遺伝子、又はω3-DES遺伝子を含有する組換えベクターを含んでなる、前記＜７９＞項記載の形質転換体。
＜８１＞ω3-DES遺伝子、又はω3-DES遺伝子を含有する組換えベクターを、前記藻類に導入する、前記＜７０＞、及び＜７２＞～＜７７＞のいずれか１項記載の形質転換体の作製方法。
＜８２＞ω3-DES遺伝子を含有する組換えベクターを含む、前記＜７１＞～＜７７＞のいずれか１項記載の形質転換体の作製用キット。
＜８３＞前記ω3-DESが前記タンパク質（Ｉ）～（Ｌ）のいずれか１つ、好ましくは前記タンパク質（Ｉ）又は（Ｊ）、である、前記＜７８＞～＜８２＞のいずれか１項記載の形質転換体、その作製方法、又は形質転換体の作製用キット。
＜８４＞前記タンパク質（Ｊ）又は（Ｌ）が、前記＜２２＞～＜２４＞のいずれか１項で規定するタンパク質である、前記＜８３＞項記載の形質転換体、その作製方法、又は形質転換体の作製用キット。
＜８５＞前記ω3-DES、好ましくは前記タンパク質（Ｉ）～（Ｌ）のいずれか１つをコードする遺伝子が、前記＜２５＞～＜２７＞のいずれか１項で規定する遺伝子である、前記＜７８＞～＜８４＞のいずれか１項記載の形質転換体、その作製方法、又は形質転換体の作製用キット。
＜８６＞前記形質転換体において、Δ5-DESの発現、又はΔ5-DES遺伝子の発現が促進されている、前記＜６７＞～＜６９＞、＜７２＞～＜８０＞、及び＜８３＞～＜８５＞のいずれか１項記載の形質転換体。
＜８７＞Δ5-DES遺伝子の発現が前記藻類の細胞内で促進され、Δ5-DESの発現が促進されている、前記＜８６＞項記載の形質転換体。
＜８８＞Δ5-DES遺伝子、又はΔ5-DES遺伝子を含有する組換えベクターを含んでなる、前記＜８７＞項記載の形質転換体。
＜８９＞Δ5-DES遺伝子、又はΔ5-DES遺伝子を含有する組換えベクターを、前記藻類に導入する、前記＜７０＞、＜７２＞～＜７７＞、＜８１＞、及び＜８３＞～＜８５＞のいずれか１項記載の形質転換体の作製方法。
＜９０＞Δ5-DES遺伝子を含有する組換えベクターを含む、前記＜７１＞～＜７７＞、及び＜８２＞～＜８５＞のいずれか１項記載の形質転換体の作製用キット。
＜９１＞前記Δ5-DESが前記タンパク質（Ｍ）～（Ｐ）のいずれか１つ、好ましくは前記タンパク質（Ｍ）又は（Ｎ）、である、前記＜８６＞～＜９０＞のいずれか１項記載の形質転換体、その作製方法、又は形質転換体の作製用キット。
＜９２＞前記タンパク質（Ｎ）又は（Ｐ）が、前記＜３１＞～＜３３＞のいずれか１項で規定するタンパク質である、前記＜９１＞項記載の形質転換体、その作製方法、又は形質転換体の作製用キット。
＜９３＞前記Δ5-DES、好ましくは前記タンパク質（Ｍ）～（Ｐ）のいずれか１つをコードする遺伝子が、前記＜３４＞～＜３６＞のいずれか１項で規定する遺伝子である、前記＜８６＞～＜９２＞のいずれか１項記載の形質転換体、その作製方法、又は形質転換体の作製用キット。
＜９４＞前記形質転換体において、Δ9-DESの発現、又はΔ9-DES遺伝子の発現が促進されている、前記＜６７＞～＜６９＞、＜７２＞～＜８０＞、＜８３＞～＜８８＞、及び＜９１＞～＜９３＞のいずれか１項記載の形質転換体。
＜９５＞Δ9-DES遺伝子の発現が前記藻類の細胞内で促進され、Δ9-DESの発現が促進されている、前記＜９４＞項記載の形質転換体。
＜９６＞Δ9-DES遺伝子、又はΔ9-DES遺伝子を含有する組換えベクターを含んでなる、前記＜９５＞項記載の形質転換体。
＜９７＞Δ9-DES遺伝子、又はΔ9-DES遺伝子を含有する組換えベクターを、前記藻類に導入する、前記＜７０＞、＜７２＞～＜７７＞、＜８１＞、＜８３＞～＜８５＞、＜８９＞、及び＜９１＞～＜９３＞のいずれか１項記載の形質転換体の作製方法。
＜９８＞Δ9-DES遺伝子を含有する組換えベクターを含む、前記＜７１＞～＜７７＞、＜８２＞～＜８５＞、及び＜９０＞～＜９３＞のいずれか１項記載の形質転換体の作製用キット。
＜９９＞前記Δ9-DESが前記タンパク質（Ｑ）～（Ｔ）のいずれか１つ、好ましくは前記タンパク質（Ｑ）又は（Ｒ）、である、前記＜９４＞～＜９８＞のいずれか１項記載の形質転換体、その作製方法、又は形質転換体の作製用キット。
＜１００＞前記タンパク質（Ｒ）又は（Ｔ）が、前記＜４０＞～＜４２＞のいずれか１項で規定するタンパク質である、前記＜９９＞項記載の形質転換体、その作製方法、又は形質転換体の作製用キット。
＜１０１＞前記Δ9-DES、好ましくは前記タンパク質（Ｑ）～（Ｔ）のいずれか１つをコードする遺伝子が、前記＜４３＞～＜４５＞のいずれか１項で規定する遺伝子である、前記＜９４＞～＜１００＞のいずれか１項記載の形質転換体、その作製方法、又は形質転換体の作製用キット。
＜１０２＞前記形質転換体において、Δ6-ELOの発現、又はΔ6-ELO遺伝子の発現が促進されている、前記＜６７＞～＜６９＞、＜７２＞～＜８０＞、＜８３＞～＜８８＞、＜９１＞～＜９６＞、及び＜９９＞～＜１０１＞のいずれか１項記載の形質転換体。
＜１０３＞Δ6-ELO遺伝子の発現が前記藻類の細胞内で促進され、Δ6-ELOの発現が促進されている、前記＜１０２＞項記載の形質転換体。
＜１０４＞Δ6-ELO遺伝子、又はΔ6-ELO遺伝子を含有する組換えベクターを含んでなる、前記＜１０３＞項記載の形質転換体。
＜１０５＞Δ6-ELO遺伝子、又はΔ6-ELO遺伝子を含有する組換えベクターを、前記藻類に導入する、前記＜７０＞、＜７２＞～＜７７＞、＜８１＞、＜８３＞～＜８５＞、＜８９＞、＜９１＞～＜９３＞、＜９７＞、及び＜９９＞～＜１０１＞のいずれか１項記載の形質転換体の作製方法。
＜１０６＞Δ6-ELO遺伝子を含有する組換えベクターを含む、前記＜７１＞～＜７７＞、＜８２＞～＜８５＞、＜９０＞～＜９３＞、及び＜９８＞～＜１０１＞のいずれか１項記載の形質転換体の作製用キット。
＜１０７＞前記Δ6-ELOが前記タンパク質（Ｕ）及び（Ｖ）のいずれか１つである、前記＜１０２＞～＜１０６＞のいずれか１項記載の形質転換体、その作製方法、又は形質転換体の作製用キット。
＜１０８＞前記タンパク質（Ｖ）が、前記＜４９＞又は＜５０＞項で規定するタンパク質である、前記＜１０７＞項記載の形質転換体、その作製方法、又は形質転換体の作製用キット。
＜１０９＞前記Δ6-ELO、好ましくは前記タンパク質（Ｕ）及び（Ｖ）のいずれか１つをコードする遺伝子が、前記＜５１＞又は＜５２＞項で規定する遺伝子である、前記＜１０２＞～＜１０８＞のいずれか１項記載の形質転換体、その作製方法、又は形質転換体の作製用キット。
＜１１０＞ω3-DES、Δ5-DES、Δ9-DES及びΔ6-ELOからなる群より選ばれる少なくとも１種の酵素、好ましくはω3-DES、Δ5-DES、Δ9-DES及びΔ6-ELOからなる群より選ばれる２種以上の酵素、又はこれをコードする遺伝子の発現が促進されている、前記＜６７＞～＜６９＞、＜７２＞～＜８０＞、＜８３＞～＜８８＞、＜９１＞～＜９６＞、＜９９＞～＜１０４＞、及び＜１０７＞～＜１０９＞のいずれか１項記載の形質転換体。
＜１１１＞ω3-DES遺伝子、Δ5-DES遺伝子、Δ9-DES遺伝子及びΔ6-ELO遺伝子からなる群より選ばれる少なくとも１種の遺伝子、好ましくはω3-DES遺伝子、Δ5-DES遺伝子、Δ9-DES遺伝子及びΔ6-ELO遺伝子からなる群より選ばれる２種以上の遺伝子、又は当該遺伝子を含有する組換えベクターを導入する、前記＜７０＞、＜７２＞～＜７７＞、＜８１＞、＜８３＞～＜８５＞、＜８９＞、＜９１＞～＜９３＞、＜９７＞、＜９９＞～＜１０１＞、＜１０５＞、及び＜１０７＞～＜１０９＞のいずれか１項記載の形質転換体の作製方法。
＜１１２＞ω3-DES遺伝子を含有する組換えベクター、Δ5-DES遺伝子を含有する組換えベクター、Δ9-DES遺伝子を含有する組換えベクター及びΔ6-ELO遺伝子を含有する組換えベクターからなる群より選ばれる少なくとも１種の組換えベクター、好ましくはω3-DES遺伝子を含有する組換えベクター、Δ5-DES遺伝子を含有する組換えベクター、Δ9-DES遺伝子を含有する組換えベクター及びΔ6-ELO遺伝子を含有する組換えベクターからなる群より選ばれる２種以上の組換えベクター、を含む、前記＜７１＞～＜７７＞、＜８２＞～＜８５＞、＜９０＞～＜９３＞、＜９８＞～＜１０１＞、及び＜１０６＞～＜１０９＞のいずれか１項記載の形質転換体の作製用キット。
＜１１３＞前記形質転換体において、KAS II、ACP、及びTEからなる群より選ばれる少なくとも１つのタンパク質の発現が促進されている、好ましくはKAS II、ACP、及びTEからなる群より選ばれる少なくとも１つをコードする遺伝子の発現が促進されている、前記＜６７＞～＜７０＞、＜７２＞～＜８１＞、＜８３＞～＜８９＞、＜９１＞～＜９７＞、＜９９＞～＜１０５＞、及び＜１０７＞～＜１１２＞のいずれか１項記載の形質転換体又はその作製方法。
＜１１４＞前記遺伝子を前記藻類に導入し、導入した遺伝子の発現が前記藻類の細胞内で促進されている、前記＜１１３＞項記載の形質転換体又はその作製方法。
＜１１５＞KAS IIをコードする遺伝子を含有する組換えベクター、ACPをコードする遺伝子を含有する組換えベクター、及びTEをコードする遺伝子を含有する組換えベクターからなる群より選ばれる少なくとも１つの組換えベクターを含む、前記＜７１＞～＜７７＞、＜８２＞～＜８５＞、＜９０＞～＜９３＞、＜９８＞～＜１０１＞、＜１０６＞～＜１０９＞、及び＜１１２＞のいずれか１項記載の形質転換体の作製用キット。
＜１１６＞前記KAS IIが前記＜５６＞項で規定したタンパク質である、前記＜１１３＞～＜１１５＞のいずれか１項記載の形質転換体、その作製方法、又は形質転換体の作製用キット。
＜１１７＞前記KAS IIをコードする遺伝子が前記＜５７＞項で規定した遺伝子である、前記＜１１３＞～＜１１６＞のいずれか１項記載の形質転換体、その作製方法、又は形質転換体の作製用キット。
＜１１８＞前記ACPが前記＜５８＞項で規定したタンパク質である、前記＜１１３＞～＜１１７＞のいずれか１項記載の形質転換体、その作製方法、又は形質転換体の作製用キット。
＜１１９＞前記ACPをコードする遺伝子が前記＜５９＞項で規定した遺伝子である、前記＜１１３＞～＜１１８＞のいずれか１項記載の形質転換体、その作製方法、又は形質転換体の作製用キット。
＜１２０＞ACPをコードする遺伝子が、前記藻類の細胞内で機能する葉緑体移行シグナル配列をコードする塩基配列が付加された遺伝子である、前記＜１１３＞～＜１１９＞のいずれか１項記載の形質転換体、その作製方法、又は形質転換体の作製用キット。
＜１２１＞ACPをコードする遺伝子が葉緑体ゲノムに導入され、導入した遺伝子の発現が促進されている、前記＜１１３＞～＜１１９＞のいずれか１項記載の形質転換体、その作製方法、又は形質転換体の作製用キット。
＜１２２＞前記TEが前記＜６２＞又は＜６３＞項で規定したタンパク質である、前記＜１１３＞～＜１２１＞のいずれか１項記載の形質転換体、その作製方法、又は形質転換体の作製用キット。
＜１２３＞前記藻類が、ナンノクロロプシス・オキュラータ、ナンノクロロプシス・ガディタナ、ナンノクロロプシス・サリナ、ナンノクロロプシス・オセアニカ、ナンノクロロプシス・アトムス、ナンノクロロプシス・マキュラタ、ナンノクロロプシス・グラニュラータ、又はナンノクロロプシス・エスピー、好ましくはナンノクロロプシス・オキュラータ又はナンノクロロプシス・ガディタナ、より好ましくはナンノクロロプシス・オキュラータ、である、前記＜６７＞～＜１２２＞のいずれか１項記載の形質転換体、その作製方法、又は形質転換体の作製用キット。
＜１２４＞脂質を製造するための、前記＜６７＞～＜１２３＞のいずれか１項記載の形質転換体、その作製方法により作製された形質転換体、又は形質転換体の作製用キットの使用。
＜１２５＞前記脂質が、炭素原子数１８以上のＰＵＦＡ又はその脂肪酸エステル化合物、好ましくは炭素原子数１８若しくは２０のＰＵＦＡ又はその脂肪酸エステル化合物、より好ましくは炭素原子数２０のＰＵＦＡ又はその脂肪酸エステル化合物、より好ましくはC20:3、C20:4若しくはC20:5、又はその脂肪酸エステル化合物、より好ましくはジホモ-γ-リノレン酸、アラキドン酸若しくはエイコサペンタエン酸、又はその脂肪酸エステル化合物、より好ましくはアラキドン酸若しくはエイコサペンタエン酸、又はそのエステル化合物、より好ましくはエイコサペンタエン酸又はその脂肪酸エステル化合物、を含む、前記＜１２４＞項記載の使用。
＜１２６＞前記脂肪酸エステル化合物がＭＡＧ、ＤＡＧ及びＴＡＧからなる群より選ばれる少なくとも１種、好ましくはＴＡＧ、である、前記＜６５＞項記載の方法、又は前記＜１２５＞項記載の使用。
　以下、本発明を実施例に基づきさらに詳細に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。ここで、本実施例で用いるプライマーの塩基配列を表１及び２に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
実施例１　ナンノクロロプシス・オキュラータ由来デサチュラーゼ遺伝子発現用プラスミドの作製、ナンノクロロプシス・オキュラータの形質転換、及び形質転換体による脂質の製造
（１）ゼオシン耐性遺伝子発現用プラスミドの構築
　ゼオシン耐性遺伝子（配列番号１１）、及び文献（Nature Communications, DOI:10.1038/ncomms1688, 2012）記載のナンノクロロプシス・ガディタナCCMP526株由来チューブリンプロモーター配列（配列番号１２）を人工合成した。合成したＤＮＡ断片を鋳型として、表１に示すプライマー番号１３及びプライマー番号１４のプライマー対、並びに表１に示すプライマー番号１５及びプライマー番号１６のプライマー対を用いてＰＣＲを行い、ゼオシン耐性遺伝子及びチューブリンプロモーター配列をそれぞれ増幅した。
　また、ナンノクロロプシス・オキュラータNIES2145株のゲノムを鋳型として、表１に示すプライマー番号１７及びプライマー番号１８のプライマー対を用いてＰＣＲを行い、ヒートショックプロテインターミネーター配列（配列番号１９）を増幅した。
　さらに、プラスミドベクターpUC19（タカラバイオ社製）を鋳型として、表１に示すプライマー番号２０及びプライマー番号２１のプライマー対を用いてＰＣＲを行い、プラスミドベクターpUC19を増幅した。
　これら４つの増幅断片をそれぞれ制限酵素DpnI（東洋紡社製）にて処理し、High Pure PCR Product Purification Kit（Roche Applied Science社製）を用いて精製した。その後、得られた４つの断片をIn-Fusion HD Cloning Kit（Clontech社製）を用いて融合し、ゼオシン耐性遺伝子発現用プラスミドを構築した。
　なお、本発現プラスミドは、チューブリンプロモーター配列、ゼオシン耐性遺伝子、ヒートショックプロテインターミネーター配列の順に連結したインサート配列と、pUC19ベクター配列からなる。
（２）デサチュラーゼ遺伝子の取得、及びデサチュラーゼ遺伝子発現用プラスミドの構築
　ナンノクロロプシス・オキュラータNIES2145株の全ＲＮＡを抽出し、SuperScript（商標）III First-Strand Synthesis SuperMix for qRT-PCR（invitrogen社製）を用いて逆転写を行ってｃＤＮＡを得た。
　このｃＤＮＡを鋳型として、表１に示すプライマー番号２２及びプライマー番号２３のプライマー対を用いてＰＣＲを行い、配列番号１０の塩基配列からなる遺伝子（NoΔ9-DES遺伝子）断片を取得した。
　同様に、前記ｃＤＮＡを鋳型として、表１に示すプライマー番号２４及びプライマー番号２５のプライマー対を用いてＰＣＲを行い、配列番号２の塩基配列からなる遺伝子（NoΔ12-DES遺伝子）断片を取得した。
　同様に、前記ｃＤＮＡを鋳型として、表１に示すプライマー番号２６及びプライマー番号２７のプライマー対を用いてＰＣＲを行い、配列番号４の塩基配列からなる遺伝子（NoΔ6-DES遺伝子）断片を取得した。
　同様に、前記ｃＤＮＡを鋳型として、表１に示すプライマー番号２８及びプライマー番号２９のプライマー対を用いてＰＣＲを行い、配列番号８の塩基配列からなる遺伝子（NoΔ5-DES遺伝子）断片を取得した。
　さらに、前記ｃＤＮＡを鋳型として、表１に示すプライマー番号３０及びプライマー番号３１のプライマー対を用いてＰＣＲを行い、配列番号６の塩基配列からなる遺伝子（Noω3-DES遺伝子）断片を取得した。
　また、ナンノクロロプシス・オキュラータNIES2145株のゲノムを鋳型として、表１に示すプライマー番号３２及びプライマー番号３３のプライマー対、並びにプライマー番号３４及びプライマー番号３５のプライマー対を用いてＰＣＲを行い、ＬＤＳＰプロモーター断片（配列番号３６）及びＶＣＰ１ターミネーター断片（配列番号３７）を取得した。
　さらに、前記ゼオシン耐性遺伝子発現プラスミドを鋳型として、表１に示すプライマー番号３８及びプライマー番号２１のプライマー対を用いてＰＣＲを行い、ゼオシン耐性遺伝子発現カセット（チューブリンプロモーター配列、ゼオシン耐性遺伝子、ヒートショックプロテインターミネーター配列）及びpUC19配列からなる断片を増幅した。
　各種デサチュラーゼ遺伝子断片と、ＬＤＳＰプロモーター断片、ＶＣＰ１ターミネーター断片、並びにゼオシン耐性遺伝子発現カセット及びpUC19配列からなる断片を前述と同様の方法にて融合し、NoΔ9-DES遺伝子発現用プラスミド、NoΔ12-DES遺伝子発現用プラスミド、NoΔ6-DES遺伝子発現用プラスミド、NoΔ5-DES遺伝子発現用プラスミド、Noω3-DES遺伝子発現用プラスミド、をそれぞれ構築した。
　なお、本発現プラスミドはＬＤＳＰプロモーター配列、各種デサチュラーゼ遺伝子、VCP1ターミネーター配列、チューブリンプロモーター配列、ゼオシン耐性遺伝子、ヒートショックプロテインターミネーター配列の順で連結したインサート配列と、pUC19ベクター配列からなる。
（３）デサチュラーゼ遺伝子発現カセットのナンノクロロプシス・オキュラータへの導入、及び形質転換体の培養
　作製した各種デサチュラーゼ遺伝子発現用プラスミドをそれぞれ鋳型として、表１に示すプライマー番号３２及びプライマー番号１８のプライマー対を用いてＰＣＲを行い、各種デサチュラーゼ遺伝子発現カセット（ＬＤＳＰプロモーター配列、各種デサチュラーゼ遺伝子、VCP1ターミネーター配列、チューブリンプロモーター配列、ゼオシン耐性遺伝子、ヒートショックプロテインターミネーター配列からなるＤＮＡ断片）をそれぞれ増幅した。
　増幅した各ＤＮＡ断片を、High Pure PCR Product Purification Kit（Roche Applied Science社製）を用いて精製した。なお、精製の際の溶出には、キットに含まれる溶出バッファーではなく、滅菌水を用いた。
　約1×109細胞のナンノクロロプシス・オキュラータNIES2145株を、384mMのソルビトール溶液で洗浄して塩を完全に除去し、形質転換の宿主細胞として用いた。上記で増幅した各種デサチュラーゼ遺伝子発現カセット約500ngをそれぞれ宿主細胞に混和し、50μF、500Ω、2,200v/2mmの条件でエレクトロポレーションを行った。
　ｆ／２液体培地（（NaNO3　75mg、NaH2PO4・2H2O　6mg、ビタミンB12　0.5μg、ビオチン　0.5μg、チアミン　100μg、Na2SiO3・9H2O　10mg、Na2EDTA・2H2O　4.4mg、FeCl3・6H2O　3.16mg、FeCl3・6H2O　12μg、ZnSO4・7H2O　21μg、MnCl2・4H2O　180μg、CuSO4・5H2O　7μg、Na2MoO4・2H2O　7μg／人工海水1L）にて２４時間回復培養を行った。その後に、2μg/mLゼオシン含有ｆ／２寒天培地に塗布し、25℃、0.3%CO２雰囲気下、12h/12h明暗条件にて２～３週間培養した。得られたコロニーの中から、各種デサチュラーゼ遺伝子発現カセットを含むナンノクロロプシス・オキュラータ株（NoΔ9-DES遺伝子導入株（(delta9 DES)株）、NoΔ12-DES遺伝子導入株（(delta12 DES)株）、NoΔ6-DES遺伝子導入株（(delta6 DES)株）、NoΔ5-DES遺伝子導入株（(delta5 DES)株）、及びNoω3-DES遺伝子導入株（(omega3 DES)株））をＰＣＲ法によりそれぞれ選抜した（それぞれの株について独立した３ラインを取得）。選抜した株を、ｆ／２培地の窒素濃度を１５倍、リン濃度を５倍に増強した培地（以下、「Ｎ１５Ｐ５培地」という）20mLに播種し、25℃、0.3%CO２雰囲気下、12h/12h明暗条件にて２週間振盪培養し、前培養液とした。前培養液2mLを、ｆ／２培地の窒素濃度を５倍、リン濃度を５倍に増強した培地（以下、「Ｎ５Ｐ５培地」という）18mLに植継ぎ、25℃、0.3%CO２雰囲気下、12h/12h明暗条件にて２週間振盪培養した。なお、陰性対照として、野生株であるナンノクロロプシス・オキュラータNIES2145株（WT株）についても同様に実験を行った。
（４）培養液中の脂質の抽出、及び構成脂肪酸の分析
　培養液1mLに、内部標準として1mg/mLのトリヘプタデカン酸グリセリル（Glyceryl triheptadecanoate、シグマアルドリッチ社製）クロロホルム溶液50μLを添加し、クロロホルム0.5mL及びメタノール1mLをさらに添加して激しく攪拌し、１０分間放置した。その後さらに、クロロホルム0.5mL及び1.5%ＫＣｌ 0.5mLを添加して攪拌し、3,000rpmにて５分間間遠心分離を行い、パスツールピペットにてクロロホルム層（下層）を回収した。
　得られたクロロホルム層に窒素ガスを吹き付けて乾固し、０．５Ｎ水酸化カリウム／メタノール溶液０．７ｍＬを添加し、８０℃で３０分間恒温した。続いて１４％三フッ化ホウ素溶液（SIGMA社製）１ｍＬを添加し、８０℃にて１０分間恒温した。その後、ヘキサン０．５ｍＬ、飽和食塩水１ｍＬを添加し激しく撹拌し、室温にて１０分間放置し、上層であるヘキサン層を回収して脂肪酸メチルエステルを得た。
　下記に示す測定条件下で、得られた脂肪酸メチルエステルをガスクロマトグラフィー解析に供した。
＜ガスクロマトグラフィー条件＞
分析装置：7890A（Agilent technology社製）
キャピラリーカラム：DB-WAX（10m×100μm×0.10μm、J＆W Scientific社製）
移動相：高純度ヘリウム
オーブン温度：100℃ 保持0.5分→100～250℃（20℃/min昇温）→250℃保持3分（ポストラン：1分）
注入口温度：300℃
注入方法：スプリット注入（スプリット比：50：1）
注入量：5μL
洗浄バイアル：メタノール
検出方法：ＦＩＤ
検出器温度：350℃
　脂肪酸メチルエステルの同定は、同サンプルを同条件でガスクロマトグラフ質量分析解析に供することにより行った。
　ガスクロマトグラフィー解析により得られた波形データのピーク面積より、各脂肪酸のメチルエステル量を定量した。各ピーク面積を、内部標準由来の炭素原子数１７の脂肪酸メチルエステルのピーク面積と比較することで試料間の補正を行い、培養液１Ｌあたりの各脂肪酸量を算出した。さらに、各脂肪酸量の総和を総脂肪酸量とし、総脂肪酸量に占める各脂肪酸量の重量割合を算出した。その結果を表３に示す。
　なお、以下の表において、「ＴＦＡ」は総脂肪酸量を示し、「脂肪酸組成（％ＴＦＡ）」は総脂肪酸の重量に対する各脂肪酸の重量の割合を示す。また、「ｎ」は３～５の整数であり、「C20:n（％ＴＦＡ）」は総脂肪酸の重量に対する、C20:3脂肪酸、C20:4脂肪酸、及びC20:5脂肪酸の重量の割合の総和を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　表３から明らかなように、NoΔ9-DES遺伝子を導入した形質転換体（（delta9 DES）株）では、野生株（WT株）と比べ、C18:1Δ9量の割合が有意に増加した。しかし、C20:5Δ5,8,11,14,17量の割合が減少した。この結果は、Δ9-DESが触媒する反応は、ＰＵＦＡ合成の律速段階とはなりにくいことを示唆している。
　また、NoΔ12-DES遺伝子を導入した形質転換体（（delta12 DES）株）では、野生株と比べ、C18:1Δ9量の割合が減少し、C18:2Δ9,12量の割合が有意に増加した。
　NoΔ6-DES遺伝子を導入した形質転換体（（delta6 DES）株）では、野生株と比べ、C18:2Δ9,12量の割合がわずかに減少し、C18:2Δ6,9量の割合がわずかに増加した。
　また、NoΔ5-DES遺伝子を導入した形質転換体（（delta5 DES）株）では、脂肪酸組成の大きな変化は見られなかった。
　さらに、Noω3-DES遺伝子を導入した形質転換体（（omega3 DES）株）では、野生株と比べ、C20:4Δ5,8,11,14量の割合が減少し、C20:5Δ5,8,11,14,17量の割合がわずかに増加した。この結果から、ナンノクロロプシスのＰＵＦＡの合成においては、C20:4Δ8,11,14,17を経由するものではなく、C20:4Δ5,8,11,14を経由することが示唆された。
　このように、各種デサチュラーゼ遺伝子の発現を促進することで脂肪酸組成が変化することが明らかになった。そして、ナンノクロロプシス属に属する藻類におけるEPAの主な合成経路は、図１に示すような、C20:4Δ5,8,11,14を経由する経路であることを特定した。
　しかし、１種類のデサチュラーゼ遺伝子のみの発現を促進しただけでは、C20:3、C20:4、C20:5などのＰＵＦＡ量を大きく増加させることはできなかった。
実施例２　２種類のナンノクロロプシス・オキュラータ由来デサチュラーゼ遺伝子を用いたナンノクロロプシス・オキュラータの形質転換、及び形質転換体による脂質の製造
（１）デサチュラーゼ遺伝子発現用プラスミド（パロモマイシン耐性）の構築
　実施例１で構築したNoΔ6-DES遺伝子発現用プラスミド、NoΔ5-DES遺伝子発現用プラスミド、Noω3-DES遺伝子発現用プラスミド、をそれぞれ鋳型として、表１に示すプライマー番号１６及びプライマー番号１７のプライマー対を用いてＰＣＲを行い、各種デサチュラーゼ遺伝子断片（ベクター配列等を含む）をそれぞれ増幅した。
　また、人工合成したパロモマイシン耐性遺伝子（配列番号３９）を鋳型として、表２に示すプライマー番号４０及びプライマー番号４１のプライマー対を用いてＰＣＲを行い、パロモマイシン耐性遺伝子を増幅した。
　各種デサチュラーゼ遺伝子増幅断片（ベクター配列等を含む）とパロモマイシン耐性遺伝子断片をそれぞれ実施例１と同様の方法にて融合し、NoΔ6-DES遺伝子発現用プラスミド（パロモマイシン耐性）、NoΔ5-DES遺伝子発現用プラスミド（パロモマイシン耐性）、Noω3-DES遺伝子発現用プラスミド（パロモマイシン耐性）、をそれぞれ構築した。
　なお、本発現用プラスミドは、LDSPプロモーター配列、各種デサチュラーゼ遺伝子、VCP1ターミネーター配列、チューブリンプロモーター配列、パロモマイシン耐性遺伝子、ヒートショックプロテインターミネーター配列の順で連結したインサート配列と、pUC19ベクター配列からなる。
　作製した各種デサチュラーゼ遺伝子発現用プラスミド（パロモマイシン耐性）を鋳型として、表１に示すプライマー番号３２及びプライマー番号１８のプライマー対を用いてＰＣＲを行い、各種デサチュラーゼ遺伝子発現カセット（LDSPプロモーター配列、各種デサチュラーゼ遺伝子、VCP1ターミネーター配列、チューブリンプロモーター配列、パロモマイシン耐性遺伝子、ヒートショックプロテインターミネーター配列からなるＤＮＡ断片）を増幅した。
　得られた増幅断片を実施例１と同様の方法にて精製し、実施例１で作製したNoΔ12-DES遺伝子導入株に、精製した断片をエレクトロポレーションにより導入した。実施例１と同様の方法にて回復培養を行った後、2μg/mLゼオシン及び100μg/mLパロモマイシン含有ｆ／２寒天培地に塗布し、25℃、0.3%CO２雰囲気下、12h/12h明暗条件にて２～３週間培養した。得られたコロニーの中から、各種デサチュラーゼ遺伝子発現カセットを含むナンノクロロプシス・オキュラータ株（NoΔ12-DES遺伝子及びNoΔ6-DES遺伝子導入株（(delta12 DES + delta6 DES)株）、NoΔ12-DES遺伝子及びNoΔ5-DES遺伝子導入株（(delta12 DES + delta5 DES)株）、並びにNoΔ12-DES遺伝子及びNoω3-DES遺伝子導入株（(delta12 DES + omega3 DES)株））をＰＣＲにより選抜した。
（２）形質転換体の培養、脂質の抽出及び構成脂肪酸の分析
　選抜した株（それぞれの株について独立した３ラインを取得）を、Ｎ１５Ｐ５培地20mLに播種し、25℃、0.3%CO２雰囲気下、12h/12h明暗条件にて３～４週間振盪培養し、前培養液とした。前培養液2mLをＮ５Ｐ５培地18mLに植継ぎ、25℃、0.3%CO2雰囲気下、12h/12h明暗条件にて２週間振盪培養した。なお、陰性対照として、野生株及びNoΔ12-DES遺伝子導入株についても同様の実験を行った。
　得られた培養液について、実施例１と同様の方法にて脂質の抽出及び構成脂肪酸の分析を行った。その結果を表４に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　実施例１に示したように、NoΔ6-DES遺伝子やNoΔ12-DES遺伝子をそれぞれ単独でこれらの転写量を促進させても、ＰＵＦＡ量の増加は確認できなかった。
　これに対して、表４から明らかなように、NoΔ12-DES遺伝子及びNoΔ6-DES遺伝子を導入した形質転換体（（delta12 DES + delta6 DES）株）では、野生株や（delta12 DES）株と比べ、C18:1Δ9量の割合が大きく減少し、C20:n量の割合が大幅に増加した。特にC20:4Δ5,8,11,14（アラキドン酸）量の割合が大きく増加した。
　また、表４に示すように、（delta12 DES + delta6 DES）株では、C18:3Δ6,9,12の蓄積をほとんど検知できなかった。これは、ナンノクロロプシスに属する藻類において、ＰＵＦＡ、特にC20:4Δ5,8,11,14及びC20:5Δ5,8,11,14,17、の合成経路では、Δ12-DES及びΔ6-DESによって触媒される連続する一連の工程（C18:1Δ9からC18:2Δ9,12が生成し、生成したC18:2Δ9,12からC18:3Δ6,9,12が生成する反応）が律速段階になっていることを示している。
　また、NoΔ12-DES遺伝子及びNoω3-DES遺伝子を導入した形質転換体（（delta12 DES + omega3 DES）株）では、（delta12 DES）株と比べ、C20:4Δ5,8,11,14量の割合が減少し、C20:5Δ5,8,11,14,17量の割合が増加した。しかし、C20:n量の割合はほとんど変化しなかった。さらに、NoΔ12-DES遺伝子及びNoΔ5-DES遺伝子を導入した形質転換体（（delta12 DES + delta5 DES）株）では、（delta12 DES）株と比べ、C20:4Δ5,8,11,14量、C20:5Δ5,8,11,14,17量、C20:n量の割合はほとんど変化しなかった。
　これらの結果からも、ナンノクロロプシスにおいてＰＵＦＡの生産性を向上させるためには、Δ12-DES及びΔ6-DESの発現を促進し、これらによって触媒される連続反応を強化することが重要であることがわかる。
実施例３　３種類のナンノクロロプシス・オキュラータ由来デサチュラーゼ遺伝子を用いたナンノクロロプシス・オキュラータの形質転換、及び形質転換体による脂質の製造
（１）デサチュラーゼ遺伝子発現用プラスミド（ハイグロマイシン耐性）の構築
　実施例１で構築したNoω3-DES遺伝子発現用プラスミドを鋳型として、表１に示すプライマー番号１６及びプライマー番号１７のプライマー対を用いてＰＣＲを行い、Noω3-DES遺伝子断片（ベクター配列等を含む）を増幅した。
　また、人工合成したハイグロマイシン耐性遺伝子（配列番号４２）を鋳型として、表２に示すプライマー番号４３及びプライマー番号４４のプライマー対を用いてＰＣＲを行い、ハイグロマイシン耐性遺伝子を増幅した。
　これら２つの断片を実施例１と同様の方法にて融合し、Noω3-DES遺伝子発現用プラスミド（ハイグロマイシン耐性）を構築した。
　なお、本発現用プラスミドは、LDSPプロモーター配列、Noω3-DES遺伝子、VCP1ターミネーター配列、チューブリンプロモーター配列、ハイグロマイシン耐性遺伝子、ヒートショックプロテインターミネーター配列の順で連結したインサート配列と、pUC19ベクター配列からなる。
　作製したNoω3-DES遺伝子発現用プラスミド（ハイグロマイシン耐性）を鋳型として、表１に示すプライマー番号３２及びプライマー番号１８のプライマー対を用いてＰＣＲを行い、Noω3-DES遺伝子発現カセット（LDSPプロモーター配列、Noω3-DES遺伝子、VCP1ターミネーター配列、チューブリンプロモーター配列、ハイグロイシン耐性遺伝子、ヒートショックプロテインターミネーター配列からなるＤＮＡ断片）を増幅した。
　得られた増幅断片を実施例１と同様の方法にて精製し、実施例２で作製したdelta12遺伝子及びNoΔ6-DES遺伝子導入株に、精製した断片をエレクトロポレーションにより導入した。実施例１と同様の方法にて回復培養を行った後、500μg/mLのハイグロマイシン含有ｆ／２寒天培地に塗布し、25℃、0.3%CO２雰囲気下、12h/12h明暗条件にて２～３週間培養した。得られたコロニーの中から、Noω3-DES遺伝子発現カセットを含むナンノクロロプシス・オキュラータ株（NoΔ12-DES遺伝子、NoΔ6-DES遺伝子及びNoω3-DES遺伝子導入株（(delta12 DES + delta6 DES + omega3 DES)株））をＰＣＲにより選抜した。
（２）形質転換体の培養、脂質の抽出及び構成脂肪酸の分析
　選抜した株を、Ｎ１５Ｐ５培地20mLに播種し、25℃、0.3%CO２雰囲気下、12h/12h明暗条件にて３～４週間振盪培養し、前培養液とした。前培養液2mLをＮ５Ｐ５培地18mLに植継ぎ、25℃、0.3%CO2雰囲気下、12h/12h明暗条件にて３週間振盪培養した。なお、陰性対照として、野生株、NoΔ12-DES遺伝子導入株、NoΔ12-DES遺伝子及びNoΔ6-DES遺伝子導入株、並びにNoΔ12-DES遺伝子及びNoω3-DES遺伝子導入株についても同様の実験を行った。
　得られた培養液について、実施例１と同様の方法にて脂質の抽出及び構成脂肪酸の分析を行った。３週目の総脂肪酸の生産量及び脂肪酸組成の結果を表５に示す。培養１週目、２週目、及び３週目の総脂肪酸量、C20:5脂肪酸の生産量、C20:n脂肪酸の生産量を表６に示す。そして、培養１週目、２週目、及び３週目のC20:5脂肪酸量の割合、C20:n脂肪酸量の割合を表７に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
　表５から明らかなように、NoΔ12-DES遺伝子、NoΔ6-DES遺伝子及びNoω3-DES遺伝子を導入した形質転換体（（delta12 DES + delta6 DES + omega3 DES）株）では、（delta12 DES + delta6 DES）株と比べ、C20:4Δ5,8,11,14量の割合が大きく減少し、C20:5Δ5,8,11,14,17量の割合が大幅に増加した。さらに、C20:n量の割合も増加した。これらの結果から、Δ12-DES及びΔ6-DESに加え、ω3-DESの発現を促進することで、ＰＵＦＡ、特にC20:5Δ5,8,11,14,17の生産性が一層向上することが分かった。
　さらに、表６及び７から明らかなように、野生株（WT株）では、培養期間が長くなるにつれて、C20:n量やC20:5量の割合は減少する。
　これに対して、（delta12 DES + delta6 DES）株では、野生株（WT株）及び（delta12 DES）株と比べ、C20:nの生産量と、全脂肪酸量に占めるC20:n量の割合が、いずれの培養期間においても増加していた。
　さらに、（delta12 DES + delta6 DES + omega3 DES）株では、（delta12 DES + delta6 DES）株と比較して、C20:n（特にC20:5Δ5,8,11,14,17）の生産量と、全脂肪酸量に占めるC20:n（特にC20:5Δ5,8,11,14,17）量の割合が一層増加した。
　さらに、（delta12 DES + delta6 DES）株や（delta12 DES + delta6 DES + omega3 DES）株では、培養期間の長期化に伴う、C20:n量の割合の減少率が、野生株（WT株）などと比較して抑制されている。
実施例４　Δ9-DES遺伝子、Δ5-DES遺伝子又はΔ6-ELO遺伝子を用いた(delta12 DES + delta6 DES + omega3 DES)株の形質転換、及び形質転換体による脂質の製造
（１）デサチュラーゼ遺伝子又はエロンガーゼ遺伝子発現用プラスミド（ビアラフォス耐性）の構築
　実施例１で構築したNoΔ9-DES遺伝子発現用プラスミド又はNoΔ5-DES遺伝子発現用プラスミドを鋳型として、表１に示すプライマー番号１６及びプライマー番号１７のプライマー対を用いてＰＣＲを行い、NoΔ9-DES遺伝子断片及びNoΔ5-DES遺伝子断片（pUC19ベクター自体のベクター配列等を含む）をそれぞれ増幅した。
　また、ビアラフォス耐性遺伝子（配列番号６８）を人工合成した。合成したＤＮＡ断片を鋳型として、表２に示すプライマー番号６９及びプライマー番号７０のプライマー対を用いてＰＣＲを行い、ビアラフォス耐性遺伝子を増幅した。
　NoΔ9-DES遺伝子断片及びNoΔ5-DES遺伝子断片それぞれと、ビアラフォス耐性遺伝子断片とを実施例１と同様の方法にて融合し、NoΔ9-DES遺伝子発現用プラスミド（ビアラフォス耐性）及びNoΔ5-DES遺伝子発現用プラスミド（ビアラフォス耐性）をそれぞれ構築した。
　なお、本発現用プラスミドは、LDSPプロモーター配列、NoΔ9-DES遺伝子又はNoΔ5-DES遺伝子、VCP1ターミネーター配列、チューブリンプロモーター配列、ビアラフォス耐性遺伝子、ヒートショックプロテインターミネーター配列の順で連結したインサート配列と、pUC19ベクター配列からなる。
　実施例１で調製したナンノクロロプシス・オキュラータNIES2145株のｃＤＮＡを鋳型として、表２に示すプライマー番号７１及びプライマー番号７２のプライマー対を用いてＰＣＲを行い、配列番号７３の塩基配列からなる遺伝子（NoΔ6-ELO遺伝子）断片を取得した。
　この増幅断片と、ＬＤＳＰプロモーター断片、ＶＣＰ１ターミネーター断片、並びにゼオシン耐性遺伝子発現カセット及びpUC19配列からなる断片を実施例１と同様の方法にて融合し、NoΔ6-ELO遺伝子発現用プラスミドを構築した。
　このNoΔ6-ELO遺伝子発現用プラスミドを鋳型として、表１に示すプライマー番号１６及びプライマー番号１７のプライマー対を用いてＰＣＲを行い、NoΔ6-ELO遺伝子断片（pUC19ベクター自体のベクター配列等を含む）を増幅した。この増幅断片と、前述のビアラフォス耐性遺伝子断片とを実施例１と同様の方法にて融合し、NoΔ6-ELO遺伝子発現用プラスミド（ビアラフォス耐性）を構築した。
　なお、本発現用プラスミドは、LDSPプロモーター配列、NoΔ6-ELO遺伝子、VCP1ターミネーター配列、チューブリンプロモーター配列、ビアラフォス耐性遺伝子、ヒートショックプロテインターミネーター配列の順で連結したインサート配列と、pUC19ベクター配列からなる。
　作製したNoΔ9-DES遺伝子発現用プラスミド（ビアラフォス耐性）、NoΔ5-DES遺伝子発現用プラスミド（ビアラフォス耐性）又はNoΔ6-ELO発現用プラスミド（ビアラフォス耐性）を鋳型として、表１に示すプライマー番号３２及びプライマー番号１８のプライマー対を用いてＰＣＲを行い、NoΔ9-DES遺伝子発現カセット、NoΔ5-DES遺伝子発現カセット又はNoΔ6-ELO遺伝子発現カセット（LDSPプロモーター配列、デサチュラーゼ遺伝子又はエロンガーゼ遺伝子（NoΔ9-DES遺伝子、NoΔ5-DES遺伝子又はNoΔ6-ELo遺伝子）、VCP1ターミネーター配列、チューブリンプロモーター配列、ビアラフォス耐性遺伝子、ヒートショックプロテインターミネーター配列からなるＤＮＡ断片）を増幅した。
　得られた増幅断片を実施例１と同様の方法にて精製し、実施例３で作製したNoΔ12-DES遺伝子、NoΔ6-DES遺伝子及びNoω3-DES遺伝子導入株に、精製した断片をそれぞれエレクトロポレーションにより導入した。実施例１と同様の方法にて回復培養を行った後、750μg/mLのビアラフォス含有ｆ／２寒天培地に塗布し、25℃、0.3%CO２雰囲気下、12h/12h明暗条件にて２～３週間培養した。得られたコロニーの中から、NoΔ9-DES遺伝子発現カセットを含むナンノクロロプシス・オキュラータ株（(delta12 DES + delta6 DES + omega3 DES + delta9 DES)株）、NoΔ5-DES遺伝子発現カセットを含むナンノクロロプシス・オキュラータ株（(delta12 DES + delta6 DES + omega3 DES + delta5 DES)株）、及びNoΔ6-ELO遺伝子発現カセットを含むナンノクロロプシス・オキュラータ株（(delta12 DES + delta6 DES + omega3 DES + delta6 ELO)株）をＰＣＲによりそれぞれ選抜した。
（２）形質転換体の培養、脂質の抽出及び構成脂肪酸の分析
　選抜した株を、Ｎ１５Ｐ５培地4mL（組織培養用マイクロプレート、IWAKI社製）に播種し、25℃、0.3%CO２雰囲気下、12h/12h明暗条件にて３～４週間振盪培養し、前培養液とした。前培養液0.4mLをＮ５Ｐ５培地4mL（組織培養用マイクロプレート、IWAKI社製）に植継ぎ、25℃、0.3%CO2雰囲気下、12h/12h明暗条件にて３週間振盪培養した。なお、陰性対照として、野生株、並びにNoΔ12-DES遺伝子、NoΔ6-DES遺伝子及びNoω3-DES遺伝子導入株についても同様の実験を行った。
　得られた培養液について、実施例１と同様の方法にて脂質の抽出及び構成脂肪酸の分析を行った。３週目の総脂肪酸の生産量及び脂肪酸組成の結果を表８に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
　表８から明らかなように、NoΔ12-DES遺伝子、NoΔ6-DES遺伝子、Noω3-DES遺伝子、及びNoΔ9-DES遺伝子を導入した株（(delta12 DES + delta6 DES + omega3 DES + delta9 DES)株）は delta12 DES + delta6 DES + omega3 DES）株と比較して、C16:0の割合が減少し、C18:1Δ9及びC20:nの割合が増加した。
　また、NoΔ12-DES遺伝子、NoΔ6-DES遺伝子、Noω3-DES遺伝子、及びNoΔ5-DES遺伝子を導入した株（(delta12 DES + delta6 DES + omega3 DES + delta5 DES)株）は（delta12 DES + delta6 DES + omega3 DES）株と比較して、C20:3Δ8,11,14の割合が減少し、C20:4Δ5,8,11,14及びC20:5Δ5,8,11,14,17の割合が増加した。
　さらに、NoΔ12-DES遺伝子、NoΔ6-DES遺伝子、Noω3-DES遺伝子、及びNoΔ6-ELO遺伝子を導入した株（(delta12 DES + delta6 DES + omega3 DES + delta6 ELO)株）は（delta12 DES + delta6 DES + omega3 DES）株と比較して、C18:3Δ6,9,12の割合が減少し、C20:3Δ8,11,14の割合及びC20:nの割合が向上した。
　これらの結果から、Δ12-DES、Δ6-DES及びω3-DESに加え、Δ9-DES、Δ5-DESやΔ6-ELOの発現を促進することで、ＰＵＦＡ、特にC20:5Δ5,8,11,14,17の生産性が一層向上することが分かった。
実施例５　(delta12 DES + delta6 DES + omega3 DES)株、及び(delta12 DES + delta6 DES + omega3 DES + delta6 ELO)株のTAG中の脂肪酸組成の分析
（１）野生株及び形質転換体の培養
　実施例３及び４で取得した(delta12 DES + delta6 DES + omega3 DES)株、(delta12 DES + delta6 DES + omega3 DES + delta6 ELO)株、及び陰性対照である野生株を、Ｎ５Ｐ５培地20mLに播種し、25℃、0.3%CO２雰囲気下、12h/12h明暗条件にて５日間振盪培養し、前培養液１とした。前培養液１　2mLをＮ５Ｐ５培地18mLに植継ぎ、同条件にて５日間振盪培養し、前培養液２とした。前培養液２　2mLをＮ５Ｐ５培地18mLに植継ぎ、同条件にて３週間振盪培養を行った。
（２）脂質の抽出、TAGの分画、TAG中の脂肪酸組成の分析
　前述の培養液0.25mLに、クロロホルム0.5mL、及びメタノール1mLを添加して激しく攪拌し、10分間放置した。その後さらに、クロロホルム0.5mL及び1.5%ＫＣｌ　0.5mLを添加して攪拌し、3,000rpmにて5分間間遠心分離を行い、パスツールピペットにてクロロホルム層（下層）を回収した。得られたクロロホルム層に窒素ガスを吹き付けて乾固し、クロロホルム20μLに溶解した。
　このようにして得られた脂質抽出液全量、及び標準溶液｛10mg/mLトリミリスチン（和光純薬工業社製）、クロロホルム溶液｝3μLをそれぞれTLCプレートシリカゲル60F254（メルク社製）上にスポットした。TLC展開槽DT-150（三菱化学メディエンス社製）を用い、展開溶媒（ヘキサン：ジエチルエーテル：ギ酸＝42：28：0.3（体積比））で約15分展開した。展開後プレートを乾燥させ、メタノールに溶解させた0.1%プリムリン（和光純薬工業社製）を噴霧して乾燥させた後、ハンデイ型UVランプUVL-21（相互理化学硝子製作所社製）でＴＡＧ画分を検出した。
　爪楊枝を用いてＴＡＧ画分を掻き取り、クロロホルム0.1mL、14%三フッ化ホウ素－メタノール溶液（SIGMA社製）0.5mLを添加し、80℃にて30分間恒温した。その後、ヘキサン0.5mL、飽和食塩水1mLを添加し激しく撹拌し、室温にて10分間放置後、上層であるヘキサン層を回収して脂肪酸メチルエステルを得た。
　得られた脂肪酸メチルエステルに対して実施例１と同様の方法にてガスクロマトグラフィー解析に供し、構成脂肪酸の分析を行った。その結果を表９に示す。なお、表９において、「TAG-FA」はＴＡＧを構成する脂肪酸残基の総重量を示し、「脂肪酸組成(%TAG-FA)」はＴＡＧを構成する脂肪酸残基の総重量に占める各脂肪酸残基の重量割合（ＴＡＧを構成する脂肪酸残基の組成比）を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000009
　表９から明らかなように、NoΔ12-DES遺伝子、NoΔ6-DES遺伝子及びNoω3-DES遺伝子を導入した株（(delta12 DES + delta6 DES + omega3 DES)株）は野生株と比較して、TAG中のC20:n（特にC20:5Δ5,8,11,14,17）の割合が向上していた。
　さらに、NoΔ12-DES遺伝子、NoΔ6-DES遺伝子、Noω3-DES遺伝子、及びNoΔ6-ELO遺伝子を導入した株（(delta12 DES + delta6 DES + omega3 DES + delta6 ELO)株）は、NoΔ12-DES遺伝子、NoΔ6-DES遺伝子及びNoω3-DES遺伝子を導入した株（(delta12 DES + delta6 DES + omega3 DES)株）と比較して、C20:n（特にC20:3Δ8,11,14）の割合がより一層増加していた。
　これらの結果から、Δ12-DES、Δ6-DES及びω3-DESに加え、Δ6-ELOの発現を促進することで、ＰＵＦＡの生産性が一層向上することが分かった。
　以上のように、ナンノクロロプシス属に属する藻類のＰＵＦＡの合成経路において、Δ12-DES及びΔ6-DESが、律速段階の反応を触媒する酵素である。そしてこれらの発現を促進することで、ＰＵＦＡの生産量を有意に増大させることができる。そして、Δ12-DES及びΔ6-DESの発現を促進させたナンノクロロプシス属に属する藻類の形質転換体を培養することで、ＰＵＦＡの生産性を向上させることができる。
　本発明をその実施態様とともに説明したが、我々は特に指定しない限り我々の発明を説明のどの細部においても限定しようとするものではなく、添付の請求の範囲に示した発明の精神と範囲に反することなく幅広く解釈されるべきであると考える。
　本願は、2016年9月7日に日本国で特許出願された特願2016-174752に基づく優先権を主張するものであり、これはここに参照してその内容を本明細書の記載の一部として取り込む。

Claims (20)

  1. 　Δ12-デサチュラーゼをコードする遺伝子及びΔ6-デサチュラーゼをコードする遺伝子の発現を促進させたナンノクロロプシス（Nannochloropsis）属に属する藻類を培養し、脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質を生産させる、脂質の製造方法。
  2. 　ナンノクロロプシス（Nannochloropsis）属に属する藻類において、Δ12-デサチュラーゼをコードする遺伝子及びΔ6-デサチュラーゼをコードする遺伝子の発現を促進し、藻類の細胞内で生産される全脂肪酸に占める長鎖多価不飽和脂肪酸の割合を増加させる、脂肪酸組成を改変する方法。
  3. 　Δ12-デサチュラーゼをコードする遺伝子及びΔ6-デサチュラーゼをコードする遺伝子を前記藻類に導入し、導入したΔ12-デサチュラーゼをコードする遺伝子及びΔ6-デサチュラーゼをコードする遺伝子の発現を促進させる、請求項１又は２記載の方法。
  4. 　前記Δ12-デサチュラーゼが下記タンパク質（Ａ）又は（Ｂ）である、請求項１～３のいずれか１項記載の方法。
    （Ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
    （Ｂ）前記タンパク質（Ａ）のアミノ酸配列と同一性が６０％以上のアミノ酸配列からなり、かつΔ12-デサチュラーゼ活性を有するタンパク質。
  5. 　前記Δ6-デサチュラーゼが下記タンパク質（Ｅ）又は（Ｆ）である、請求項１～４のいずれか１項記載の方法。
    （Ｅ）配列番号３で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
    （Ｆ）前記タンパク質（Ｅ）のアミノ酸配列と同一性が６０％以上のアミノ酸配列からなり、かつΔ6-デサチュラーゼ活性を有するタンパク質。
  6. 　前記藻類において、ω3-デサチュラーゼ、Δ5-デサチュラーゼ、Δ9-デサチュラーゼ及びΔ6-エロンガーゼからなる群より選ばれる少なくとも１種の酵素、又はこれをコードする遺伝子の発現を促進させた、請求項１～５のいずれか１項記載の方法。
  7. 　前記遺伝子を前記藻類に導入し、導入した前記遺伝子の発現を促進させる、請求項６記載の方法。
  8. 　前記ω3-デサチュラーゼが下記タンパク質（Ｉ）又は（Ｊ）である、請求項６又は７記載の方法。
    （Ｉ）配列番号５で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
    （Ｊ）前記タンパク質（Ｉ）のアミノ酸配列と同一性が６０％以上のアミノ酸配列からなり、かつω3-デサチュラーゼ活性を有するタンパク質。
  9. 　前記Δ5-デサチュラーゼが下記タンパク質（Ｍ）又は（Ｎ）である、請求項６又は７記載の方法。
    （Ｍ）配列番号７で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
    （Ｎ）前記タンパク質（Ｍ）のアミノ酸配列と同一性が６０％以上のアミノ酸配列からなり、かつΔ5-デサチュラーゼ活性を有するタンパク質。
  10. 　前記Δ9-デサチュラーゼが下記タンパク質（Ｑ）又は（Ｒ）である、請求項６又は７記載の方法。
    （Ｑ）配列番号９で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
    （Ｒ）前記タンパク質（Ｑ）のアミノ酸配列と同一性が６０％以上のアミノ酸配列からなり、かつΔ9-デサチュラーゼ活性を有するタンパク質。
  11. 　前記Δ6-エロンガーゼが下記タンパク質（Ｕ）又は（Ｖ）である、請求項６又は７記載の方法。
    （Ｕ）配列番号７４で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
    （Ｖ）前記タンパク質（Ｕ）のアミノ酸配列と同一性が６０％以上のアミノ酸配列からなり、かつΔ6-エロンガーゼ活性を有するタンパク質。
  12. 　前記脂肪酸又は前記脂質が、ジホモ-γ-リノレン酸、アラキドン酸若しくはエイコサペンタエン酸、又はそのエステル化合物を含む、請求項１～１１のいずれか１項記載の方法。
  13. 　Δ12-デサチュラーゼをコードする遺伝子及びΔ6-デサチュラーゼをコードする遺伝子の発現が促進されている、ナンノクロロプシス（Nannochloropsis）属に属する藻類の形質転換体。
  14. 　前記Δ12-デサチュラーゼが下記タンパク質（Ａ）又は（Ｂ）である、請求項１３記載の形質転換体。
    （Ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
    （Ｂ）前記タンパク質（Ａ）のアミノ酸配列と同一性が６０％以上のアミノ酸配列からなり、かつΔ12-デサチュラーゼ活性を有するタンパク質。
  15. 　前記Δ6-デサチュラーゼが下記タンパク質（Ｅ）又は（Ｆ）である、請求項１３又は１４記載の形質転換体。
    （Ｅ）配列番号３で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
    （Ｆ）前記タンパク質（Ｅ）のアミノ酸配列と同一性が６０％以上のアミノ酸配列からなり、かつΔ6-デサチュラーゼ活性を有するタンパク質。
  16. 　前記形質転換体において、ω3-デサチュラーゼ、Δ5-デサチュラーゼ、Δ9-デサチュラーゼ及びΔ6-エロンガーゼからなる群より選ばれる少なくとも１種の酵素、又はこれをコードする遺伝子の発現が促進されている、請求項１３～１５のいずれか１項記載の形質転換体。
  17. 　前記ω3-デサチュラーゼが下記タンパク質（Ｉ）又は（Ｊ）である、請求項１６記載の形質転換体。
    （Ｉ）配列番号５で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
    （Ｊ）前記タンパク質（Ｉ）のアミノ酸配列と同一性が６０％以上のアミノ酸配列からなり、かつω3-デサチュラーゼ活性を有するタンパク質。
  18. 　前記Δ5-デサチュラーゼが下記タンパク質（Ｍ）又は（Ｎ）である、請求項１６記載の形質転換体。
    （Ｍ）配列番号７で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
    （Ｎ）前記タンパク質（Ｍ）のアミノ酸配列と同一性が６０％以上のアミノ酸配列からなり、かつΔ5-デサチュラーゼ活性を有するタンパク質。
  19. 　前記Δ9-デサチュラーゼが下記タンパク質（Ｑ）又は（Ｒ）である、請求項１６記載の形質転換体。
    （Ｑ）配列番号９で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
    （Ｒ）前記タンパク質（Ｑ）のアミノ酸配列と同一性が６０％以上のアミノ酸配列からなり、かつΔ9-デサチュラーゼ活性を有するタンパク質。
  20. 　前記Δ6-エロンガーゼが下記タンパク質（Ｕ）又は（Ｖ）である、請求項１６記載の形質転換体。
    （Ｕ）配列番号７４で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
    （Ｖ）前記タンパク質（Ｕ）のアミノ酸配列と同一性が６０％以上のアミノ酸配列からなり、かつΔ6-エロンガーゼ活性を有するタンパク質。
     
     
     
     
     
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