JPWO2020071265A1 - 脂質の製造方法 - Google Patents

Abstract

チオレドキシンドメイン及びチオレドキシン・レダクターゼドメインを有するタンパク質をコードする遺伝子の発現を促進させた藻類を培養し、脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質を生産させる、脂質の製造方法。

Description

本発明は、脂質の製造方法に関する。

脂肪酸は脂質の主要構成成分の１種であり、生体内においてグリセリンとのエステル結合により生成するトリアシルグリセロール（以下、単に「TAG」ともいう）等の脂質を構成する。また、多くの動植物において脂肪酸はエネルギー源として貯蔵され利用される物質でもある。動植物内に蓄えられた脂肪酸や脂質は、食用又は工業用として広く利用されている。
例えば、炭素原子数１２〜１８前後の高級脂肪酸を還元して得られる高級アルコールの誘導体は、界面活性剤として用いられている。アルキル硫酸エステル塩やアルキルベンゼンスルホン酸塩等は陰イオン性界面活性剤として利用されている。また、ポリオキシアルキレンアルキルエーテルやアルキルポリグリコシド等は非イオン性界面活性剤として利用されている。そしてこれらの界面活性剤は、いずれも洗浄剤又は殺菌剤に利用されている。同じく高級アルコールの誘導体としてアルキルアミン塩やモノ若しくはジアルキル４級アンモニウム塩等のカチオン性界面活性剤は、繊維処理剤や毛髪リンス剤又は殺菌剤に日常的に利用されている。また、ベンザルコニウム型４級アンモニウム塩は殺菌剤や防腐剤に日常的に利用されている。さらに、植物由来の油脂はバイオディーゼル燃料の原料としても利用されている。
このように脂肪酸や脂質の利用は多岐にわたる。そのため、植物等において生体内での脂肪酸や脂質の生産性を向上させる試みが行われている。さらに、脂肪酸の用途や有用性に影響する基本的な特性の一つとしてその炭素原子数があるため、脂肪酸の炭素原子数、即ち鎖長を制御する試みも行われている。

近年、持続可能な社会の実現に向けて再生可能エネルギーに関する研究が推し進められている。特に光合成微生物は、二酸化炭素の削減効果に加えて、穀物と競合しないバイオ燃料生物として期待されている。
特に近年、バイオ燃料生産に有用であるとして、藻類が注目を集めている。藻類は、バイオディーゼル燃料として利用可能な脂質を光合成によって生産でき、しかも食料と競合しないことから、次世代のバイオマス資源として注目されている。また、藻類は、植物に比べ、高い脂質生産・蓄積能力を有するとの報告もある。

植物や光合成微生物などの藻類は、カルビン回路（以下、「ＣＢＢ回路」ともいう）を通して光合成による炭酸固定を行うことが知られている。ＣＢＢ回路は１３段階の反応からなり、反応１サイクル毎に１分子のＣＯ_２が固定される。得られた光合成産物は生物の構成成分としてだけでなく、エネルギー源としても利用される。そのため、ＣＢＢ回路を強化して植物や藻類などの光合成能を高めることで、生産されるバイオマスを制御する試みも行われている（非特許文献１及び２参照）。

Liang F. and Lindblad P., Metab Eng. 2016 Nov;38:56-64 Driever S.M. et al., Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 2017 Sep 26;372(1730)

本発明は、チオレドキシンドメイン（以下、「ＴＲＸドメイン」ともいう）及びチオレドキシン・レダクターゼドメイン（以下、「ＴＲドメイン」ともいう）を有するタンパク質をコードする遺伝子の発現を促進した藻類の形質転換体を培養し、脂質を生産させる、脂質の製造方法に関する。
また本発明は、ＴＲＸドメイン及びＴＲドメインを有するタンパク質をコードする遺伝子の発現を促進した藻類の形質転換体に関する。

発明の詳細な説明

ＣＢＢ回路強化による光合成能の制御と脂肪酸合成の関わりについてはまだ十分な知見が得られていないことに鑑み、本発明者は鋭意検討を行った。
チオレドキシンは様々な標的タンパク質を還元する活性を有することが知られている。特に葉緑体では、フェレドキシン、チオレドキシン還元酵素（チオレドキシン・レダクターゼ）を介してチオレドキシンが還元され、還元型チオレドキシンがＣＢＢ回路で働く酵素タンパク質等を還元し、標的タンパク質の酵素活性を調節していることが知られている。そこで本発明者らは、ＣＢＢ回路の制御に関与すると考えられているチオレドキシンに着目し、チオレドキシンの発現の強化による脂質の生産性の向上を試みた。
本発明者らはまず、ナンノクロロプシス・オセアニカ（Nannochloropsis oceanica）の全遺伝子の配列情報を基にレポーター遺伝子を用いた局在解析を行い、葉緑体で機能すると推測されるチオレドキシンを同定した。そして、これらチオレドキシンの中でも、ＴＲＸドメインと、ＴＲドメインの両方を有するタンパク質（以下、「TRTRX」ともいう）に着目し、TRTRXの発現を藻類の細胞内で促進させることで、生産される脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質の生産性が有意に向上することを見出した。
本発明はこれらの知見に基づき完成されるに至ったものである。

本発明は、脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質の生産性を向上させる、脂質の製造方法を提供することに関する。
また本発明は、脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質の生産性を向上させた形質転換体を提供することに関する。

本発明の形質転換体ではＴＲＸドメイン及びＴＲドメインを有するタンパク質の発現が促進され、結果として脂質の生産量を増大させることができる。よって本発明の脂質の製造方法によれば、脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質の生産性を向上させることができる。
また本発明の形質転換体は、ＴＲＸドメイン及びＴＲドメインを有するタンパク質の発現能が促進されており、脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質の生産性に優れる。
本発明の上記および他の特徴および利点は、下記の記載からより明らかになるであろう。

本明細書における「脂質」は、中性脂質（トリアシルグリセロール等）、ろう、セラミド等の単純脂質；リン脂質、糖脂質、スルホ脂質等の複合脂質；及びこれらの脂質から誘導される、脂肪酸（遊離脂肪酸）、アルコール類、炭化水素類等の誘導脂質を包含するものである。
一般に誘導脂質に分類される脂肪酸は、脂肪酸そのものを指し、「遊離脂肪酸」を意味する。本発明では単純脂質及び複合脂質分子中の脂肪酸部分を「脂肪酸残基」と表記する。そして、特に断りのない限り、「脂肪酸」は「遊離脂肪酸」と、塩又はエステル化合物等に含まれる「脂肪酸残基」の総称として用いる。
また本明細書において、「脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質」は、「遊離脂肪酸」と「当該脂肪酸残基を有する脂質」を総称して用いる。脂肪酸の重量（生産量）は、実施例で用いた方法により測定できる。
なお、本明細書において、「脂肪酸」とは、脂肪族カルボン酸であれば特に制限はないが、好ましくはアシル基の炭素原子数が２以上２２以下、より好ましくは炭素原子数が４以上２２以下、より好ましくは炭素原子数が６以上２２以下、より好ましくは炭素原子数が８以上２２以下、より好ましくは炭素原子数が１０以上２２以下、さらに好ましくは炭素原子数が１２以上２０以下であることをいう。
さらに本明細書において、脂肪酸や、脂肪酸を構成するアシル基の表記において「Cx:y」とあるのは、炭素原子数がxであり、二重結合の数がyであることを表す。「Cx」は炭素原子数xの脂肪酸やアシル基を表す。

本明細書において、塩基配列及びアミノ酸配列の同一性は、Lipman-Pearson法（Science，1985，vol．227，p．1435-1441）によって計算される。具体的には、遺伝情報処理ソフトウェアGenetyx-Winのホモロジー解析（Search homology）プログラムを用いて、Unit size to compare（ktup）を2として解析を行うことにより算出される。
また本明細書において「ストリンジェントな条件」としては、例えばMolecular Cloning−A LABORATORY MANUAL THIRD EDITION［Joseph Sambrook，David W．Russell.，Cold Spring Harbor Laboratory Press］記載の方法が挙げられる。例えば、６×ＳＳＣ（１×ＳＳＣの組成：０．１５Ｍ塩化ナトリウム、０．０１５Ｍクエン酸ナトリウム、pH７．０）、０．５％ＳＤＳ、５×デンハート及び１００ｍｇ／ｍＬニシン精子ＤＮＡを含む溶液にプローブとともに６５℃で８〜１６時間恒温し、ハイブリダイズさせる条件が挙げられる。
さらに明細書において、遺伝子の「上流」とは、翻訳開始点からの位置ではなく、対象として捉えている遺伝子又は領域の5'側に続く領域を示す。一方、遺伝子の「下流」とは、対象として捉えている遺伝子又は領域の3'側に続く領域を示す。

本明細書において、「TRTRX」とはTRXドメイン及びTRドメインを有するタンパク質を意味する。TRTRXは、チオレドキシンとチオレドキシン還元酵素の２つの機能を合わせもつタンパク質（酵素）である。一般的に葉緑体においては、光化学系Ｉで還元されたフェレドキシン又はNADPHによってチオレドキシン還元酵素が還元され、さらに還元型チオレドキシン還元酵素によって、チオレドキシンが還元される。還元型チオレドキシンは、ジチオール−ジスルフィド交換反応によって標的タンパク質を還元し、標的タンパク質の活性を制御している。
また、本発明において、「TRTRX遺伝子」とは、TRXドメイン及びTRドメインをコードするDNAを有する遺伝子を意味する。
本明細書において「TRXドメイン」とは、チオレドキシン活性（以下、「TRX活性」ともいう）のために必要な保存されたアミノ酸配列からなる領域を意味し、「TRドメイン」とは、チオレドキシン還元酵素活性（以下、「TR活性」ともいう）のために必要な保存されたアミノ酸配列からなる領域を意味する。そして本明細書において「TRX活性」とはジチオール−ジスルフィド交換反応によって、標的タンパク質を還元する活性を意味し、「TR活性」とは、チオレドキシンを還元する酵素活性を意味する。
なお、アミノ酸配列がＴＲＸドメイン又はＴＲドメインを有しているかは、NCBI Conserved Domain Searchプログラム（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）を用い、「Expect Value (e-value) threshold」を0.010000に設定し、CDD v3.16-50369 PSSMsデータベースに対して解析を行うことによって確認することができる。なお、CDD v3.16-50369 PSSMsデータベースにおいて、本発明で用いる「TRXドメイン」の１種としては「Thioredoxin_like superfamily (Accession No. cl00388)」が挙げられ、「TRドメイン」の１種としては「TRX_reduct (Accession No. TIGR01292)」が挙げられる。TRX活性及びTR活性の観点から、e-valueは0.01以下であることが好ましく、1×10^-5以下であることがより好ましく、1×10^-10以下であることがより好ましく、1×10^-20以下であることがさらに好ましい。また、TRX活性及びTR活性の観点から、TRXドメイン及びTRドメインはそれぞれシステイン−任意のアミノ酸−任意のアミノ酸−システイン（CXXC）モチーフを有することが好ましく、TRXドメインはシステイン−グリシン−プロリン−システイン（CGPC）モチーフ配列を有することがより好ましく、TRドメインはシステイン−アラニン−イソロイシン−システイン（CAIC）モチーフ配列を有することがより好ましい。

本発明で用いるタンパク質がTRX活性及びTR活性を有することは、例えば、TRXドメインを含むタンパク質又はTRドメインを有するタンパク質をコードする遺伝子について、Serrato A.J., et al., The Journal of Biological Chemistry, 2004, vol. 279(42)に記載の方法を用いて解析することで調べることができる。

本発明で用いるTRTRXは、TRXドメイン及びTRドメインを有し、かつ発現を促進することで藻類の脂質の生産性を向上させることができるタンパク質（酵素）であれば特に制限はない。
本発明における好ましい前記TRXドメイン及び前記TRドメインとして、下記アミノ酸配列（Ａ）〜（Ｄ）からなる群より選ばれるいずれか１つのアミノ酸配列からなるTRXドメイン、及び下記アミノ酸配列（Ｅ）〜（Ｈ）からなる群より選ばれるいずれか１つのアミノ酸配列からなるTRドメインが挙げられる。

（Ａ）配列番号１の５２９位〜６２９位までのアミノ酸配列。
（Ｂ）アミノ酸配列（Ａ）との同一性が６０％以上であり、ＴＲＸ活性を有するＴＲＸドメインを構成するアミノ酸配列。
（Ｃ）配列番号３の５２５位〜６２５位までのアミノ酸配列。
（Ｄ）アミノ酸配列（Ｃ）との同一性が６０％以上であり、ＴＲＸ活性を有するＴＲＸドメインを構成するアミノ酸配列。
（Ｅ）配列番号１の１３７位〜４４８位までのアミノ酸配列。
（Ｆ）アミノ酸配列（Ｅ）との同一性が６０％以上であり、ＴＲ活性を有するＴＲドメインを構成するアミノ酸配列。
（Ｇ）配列番号３の１３４位〜４４５位までのアミノ酸配列。
（Ｈ）アミノ酸配列（Ｇ）との同一性が６０％以上であり、ＴＲ活性を有するＴＲドメインを構成するアミノ酸配列。

本発明で用いるTRTRXとしては、前記アミノ酸配列（Ａ）若しくは（Ｂ）からなるTRXドメインと、前記アミノ酸配列（Ｅ）若しくは（Ｆ）からなるTRドメインを有するタンパク質、前記アミノ酸配列（Ａ）若しくは（Ｂ）からなるTRXドメインと、前記アミノ酸配列（Ｇ）若しくは（Ｈ）からなるTRドメインを有するタンパク質、前記アミノ酸配列（Ｃ）若しくは（Ｄ）からなるTRXドメインと、前記アミノ酸配列（Ｅ）若しくは（Ｆ）からなるTRドメインを有するタンパク質、並びに、前記アミノ酸配列（Ｃ）若しくは（Ｄ）からなるTRXドメインと、前記アミノ酸配列（Ｇ）若しくは（Ｈ）からなるTRドメインを有するタンパク質、が好ましい。このうち、アミノ酸配列（Ａ）若しくは（Ｂ）からなるTRXドメインと、アミノ酸配列（Ｅ）若しくは（Ｆ）からなるTRドメインを有するタンパク質、並びに、アミノ酸配列（Ｃ）若しくは（Ｄ）からなるTRXドメインと、アミノ酸配列（Ｇ）若しくは（Ｈ）からなるTRドメインを有するタンパク質、がより好ましい。

また、本発明で用いるTRTRXとしては、下記タンパク質（Ｉ）〜（Ｌ）がより好ましい。ここで、タンパク質（Ｉ）及び（Ｊ）は、アミノ酸配列（Ａ）若しくは（Ｂ）からなるTRXドメインと、アミノ酸配列（Ｅ）若しくは（Ｆ）からなるTRドメインを有するタンパク質に含まれる。また、タンパク質（Ｋ）及び（Ｌ）は、アミノ酸配列（Ｃ）若しくは（Ｄ）からなるTRXドメインと、アミノ酸配列（Ｇ）若しくは（Ｈ）からなるTRドメインを有するタンパク質に含まれる。

（Ｉ）配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
（Ｊ）前記タンパク質（Ｉ）のアミノ酸配列と同一性が６０％以上のアミノ酸配列からなり、かつTRX活性及びTR活性を有するTRXドメイン及びTRドメインを含むタンパク質。
（Ｋ）配列番号３で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
（Ｌ）前記タンパク質（Ｋ）のアミノ酸配列と同一性が６０％以上のアミノ酸配列からなり、かつTRX活性及びTR活性を有するTRXドメイン及びTRドメインを含むタンパク質。

前述の、配列番号１で表されるアミノ酸配列と配列番号３で表されるアミノ酸配列について以下に説明する。

配列番号１のアミノ酸配列からなる前記タンパク質（Ｉ）は、ナンノクロロプシス・オセアニカ（Nannochloropsis oceanica）属に属する藻類であるナンノクロロプシス・オセアニカNIES-2145株由来のTRTRX（以下、「NoTRTRX」ともいう）である。
配列番号１の529位〜629位までのアミノ酸配列（前記アミノ酸配列（Ａ））からなるTRXドメインは、TRX活性を有する。また配列番号１の137位〜448位までのアミノ酸配列（前記アミノ酸配列（Ｅ））からなるTRドメインは、TR活性を有する。さらに、配列番号１のアミノ酸配列からなるタンパク質（前記タンパク質（Ｉ））はTRXドメイン及びTRドメイン（e-valueはそれぞれ1.51x10^-29、2.47x10^-136を示し、またそれぞれCGPCモチーフ配列、CAICモチーフ配列を有する）を有し、TRX活性及びTR活性を示す。

配列番号３のアミノ酸配列からなる前記タンパク質（Ｋ）は、ナンノクロロプシス・ガディタナ（Nannochloropsis gaditana）属に属する藻類であるナンノクロロプシス・ガディタナCCMP526株由来のTRTRX（以下、「NgTRTRX」ともいう）である。
配列番号３の525位〜625位までのアミノ酸配列（前記アミノ酸配列（Ｃ））からなるTRXドメインは、TRX活性を有する。また配列番号３の134位〜445位までのアミノ酸配列（前記アミノ酸配列（Ｇ））からなるTRドメインは、TR活性を有する。さらに、配列番号３のアミノ酸配列からなるタンパク質（前記タンパク質（Ｋ））はTRXドメイン及びTRドメイン（e-valueはそれぞれ3.04x10^-31、6.61x10^-134を示し、またそれぞれCGPCモチーフ配列、CAICモチーフ配列を有する）を有し、TRX活性及びTR活性を示す。

一般に、酵素タンパク質をコードしているアミノ酸配列は、必ずしも全領域の配列が保存されていなければ酵素活性を示さないというものではなく、アミノ酸配列が変化しても酵素活性に影響を与えない領域も存在することが知られている。このような酵素活性に必須でない領域においては、アミノ酸の欠失、置換、挿入又は付加といった変異が導入されても酵素本来の活性を維持することができる。本発明においても、このようにTRX活性若しくはTR活性が保持され、かつアミノ酸配列が一部変異したドメイン、若しくはタンパク質を用いることができる。

アミノ酸配列に変異を導入する方法としては、例えば、アミノ酸配列をコードする塩基配列に変異を導入する方法が挙げられる。変異を導入する方法としては、部位特異的な変異導入法が挙げられる。具体的な部位特異的変異の導入方法としては、Splicing overlap extension（SOE）PCR（Horton et al.，Gene 77，61−68，1989）を利用した方法、ＯＤＡ法（Hashimoto-Gotoh et al.，Gene，152，271-276，1995））、Kunkel法（Kunkel，T. A.，Proc. Natl. Acad. Sci. USA，1985，82，488）等が挙げられる。また、Site-Directed Mutagenesis System Mutan-SuperExpress Kmキット（タカラバイオ社）、Transformer TM Site-Directed Mutagenesisキット（Clontech社）、KOD-Plus-Mutagenesis Kit（東洋紡社）等の市販のキットを利用することもできる。また、ランダムな遺伝子変異を与えた後、適当な方法により酵素活性の評価及び遺伝子解析を行うことにより目的遺伝子を取得することもできる。

前記アミノ酸配列（Ｂ）において、TRXドメインのTRX活性の点から、前記アミノ酸配列（Ａ）との同一性は６０％以上であり、６５％以上が好ましく、７０％以上がより好ましく、７５％以上がより好ましく、８０％以上がより好ましく、８５％以上がより好ましく、９０％以上がより好ましく、９１％以上がより好ましく、９３％以上がより好ましく、９５％以上がより好ましく、９７％以上がより好ましく、９８％以上がより好ましく、９９％以上がさらに好ましい。
また、前記アミノ酸配列（Ｂ）として、前記アミノ酸配列（Ａ）の配列に、１又は複数個（例えば１個以上４０個以下、好ましくは１個以上３５個以下、より好ましくは１個以上３０個以下、より好ましくは１個以上２５個以下、より好ましくは１個以上２０個以下、より好ましくは１個以上１５個以下、より好ましくは１個以上１０個以下、より好ましくは１個以上９個以下、より好ましくは１個以上７個以下、より好ましくは１個以上５個以下、より好ましくは１個以上３個以下、より好ましくは１個又は２個、さらに好ましくは１個）のアミノ酸が欠失、置換、挿入、又は付加されており、TRX活性を有するTRXドメインを構成するアミノ酸配列が挙げられる。

前記アミノ酸配列（Ｄ）において、TRXドメインのTRX活性の点から、前記アミノ酸配列（Ｃ）との同一性は６０％以上であり、６５％以上が好ましく、７０％以上がより好ましく、７５％以上がより好ましく、８０％以上がより好ましく、８５％以上がより好ましく、９０％以上がより好ましく、９１％以上がより好ましく、９３％以上がより好ましく、９５％以上がより好ましく、９７％以上がより好ましく、９８％以上がより好ましく、９９％以上がさらに好ましい。
また、前記アミノ酸配列（Ｄ）として、前記アミノ酸配列（Ｃ）の配列に、１又は複数個（例えば１個以上４０個以下、好ましくは１個以上３５個以下、より好ましくは１個以上３０個以下、より好ましくは１個以上２５個以下、より好ましくは１個以上２０個以下、より好ましくは１個以上１５個以下、より好ましくは１個以上１０個以下、より好ましくは１個以上９個以下、より好ましくは１個以上７個以下、より好ましくは１個以上５個以下、より好ましくは１個以上３個以下、より好ましくは１個又は２個、さらに好ましくは１個）のアミノ酸が欠失、置換、挿入、又は付加されており、TRX活性を有するTRXドメインを構成するアミノ酸配列が挙げられる。

前記アミノ酸配列（Ｆ）において、TRドメインのTR活性の点から、前記アミノ酸配列（Ｅ）との同一性は６０％以上であり、６５％以上が好ましく、７０％以上がより好ましく、７５％以上がより好ましく、８０％以上がより好ましく、８５％以上がより好ましく、９０％以上がより好ましく、９１％以上がより好ましく、９３％以上がより好ましく、９５％以上がより好ましく、９７％以上がより好ましく、９８％以上がより好ましく、９９％以上がさらに好ましい。
また、前記アミノ酸配列（Ｆ）として、前記アミノ酸配列（Ｅ）の配列に、１又は複数個（例えば１個以上１２４個以下、好ましくは１個以上１０９個以下、より好ましくは１個以上９３個以下、より好ましくは１個以上７８個以下、より好ましくは１個以上６２個以下、より好ましくは１個以上４６個以下、より好ましくは１個以上３１個以下、より好ましくは１個以上２８個以下、より好ましくは１個以上２１個以下、より好ましくは１個以上１５個以下、より好ましくは１個以上９個以下、より好ましくは１個以上６個以下、さらに好ましくは１個以上３個以下）のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されており、TR活性を有するTRドメインを構成するアミノ酸配列が挙げられる。

前記アミノ酸配列（Ｈ）において、TRドメインのTR活性の点から、前記アミノ酸配列（Ｇ）との同一性は６０％以上であり、６５％以上が好ましく、７０％以上がより好ましく、７５％以上がより好ましく、８０％以上がより好ましく、８５％以上がより好ましく、９０％以上がより好ましく、９１％以上がより好ましく、９３％以上がより好ましく、９５％以上がより好ましく、９７％以上がより好ましく、９８％以上がより好ましく、９９％以上がさらに好ましい。
また、前記アミノ酸配列（Ｈ）として、前記アミノ酸配列（Ｇ）の配列に、１又は複数個（例えば１個以上１２４個以下、好ましくは１個以上１０９個以下、より好ましくは１個以上９３個以下、より好ましくは１個以上７８個以下、より好ましくは１個以上６２個以下、より好ましくは１個以上４６個以下、より好ましくは１個以上３１個以下、より好ましくは１個以上２８個以下、より好ましくは１個以上２１個以下、より好ましくは１個以上１５個以下、より好ましくは１個以上９個以下、より好ましくは１個以上６個以下、さらに好ましくは１個以上３個以下）のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されており、TR活性を有するTRドメインを構成するアミノ酸配列が挙げられる。

前記タンパク質（Ｊ）において、TRX活性及びTR活性の点から、前記タンパク質（Ｉ）のアミノ酸配列との同一性は６０％以上であり、６５％以上が好ましく、７０％以上がより好ましく、７５％以上がより好ましく、８０％以上がより好ましく、８５％以上がより好ましく、９０％以上がより好ましく、９１％以上がより好ましく、９３％以上がより好ましく、９５％以上がより好ましく、９７％以上がより好ましく、９８％以上がより好ましく、９９％以上がさらに好ましい。
また、前記タンパク質（Ｊ）として、前記タンパク質（Ｉ）のアミノ酸配列に、１又は複数個（例えば１個以上２５４個以下、好ましくは１個以上２２２個以下、より好ましくは１個以上１９０個以下、より好ましくは１個以上１５８個以下、より好ましくは１個以上１２７個以下、より好ましくは１個以上９４個以下、より好ましくは１個以上６３個以下、より好ましくは１個以上５７個以下、より好ましくは１個以上４４個以下、より好ましくは１個以上３１個以下、より好ましくは１個以上１９個以下、より好ましくは１個以上１２個以下、さらに好ましくは１個以上６個以下）のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されており、TRXドメイン及びTRドメインを有し、TRX活性及びTR活性を有するタンパク質が挙げられる。

前記タンパク質（Ｌ）において、TRX活性及びTR活性の点から、前記タンパク質（Ｋ）のアミノ酸配列との同一性は６０％以上であり、６５％以上が好ましく、７０％以上がより好ましく、７５％以上がより好ましく、８０％以上がより好ましく、８５％以上がより好ましく、９０％以上がより好ましく、９１％以上がより好ましく、９３％以上がより好ましく、９５％以上がより好ましく、９７％以上がより好ましく、９８％以上がより好ましく、９９％以上がさらに好ましい。
また、前記タンパク質（Ｌ）として、前記タンパク質（Ｋ）のアミノ酸配列に、１又は複数個（例えば１個以上２５３個以下、好ましくは１個以上２２１個以下、より好ましくは１個以上１８９個以下、より好ましくは１個以上１５８個以下、より好ましくは１個以上１２６個以下、より好ましくは１個以上９５個以下、より好ましくは１個以上６３個以下、より好ましくは１個以上５６個以下、より好ましくは１個以上４４個以下、より好ましくは１個以上３１個以下、より好ましくは１個以上１８個以下、より好ましくは１個以上１２個以下、さらに好ましくは１個以上６個以下）のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されており、TRXドメイン及びTRドメインを有し、TRX活性及びTR活性を有するタンパク質が挙げられる。

また、本発明で用いるTRTRXは、前述のTRXドメイン及びTRドメインを含むアミノ酸配列に、タンパク質の輸送に関与するシグナルペプチド、若しくはタンパク質の安定性を高める既知のアミノ酸配列等が付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であってもよい。さらに、本発明で使用するTRTRXとして、例えば前記タンパク質（Ｉ）〜（Ｌ）のアミノ酸配列のうちのＮ末端側の領域に存在すると推測される葉緑体移行シグナル配列を、宿主内で機能する他の葉緑体移行シグナル配列に変更したアミノ酸配列からなるタンパク質であってもよい。ChloroP（http://www.cbs.dtu.dk/services/ChloroP/）を用いた局在予測では、配列番号１の１位〜３５位のアミノ酸配列が葉緑体移行シグナル配列であると予測され、実際、配列番号１の１位〜１００位のアミノ酸配列をレポータータンパク質のＮ末端に付加させることで、レポータータンパク質を葉緑体に局在化させられることが本発明者により確認されている。さらに、ChloroP解析におけるCS-scoreが高いことから、配列番号３の１位〜４９位又は１位〜１１７位のアミノ酸配列もまた葉緑体移行シグナル配列であると予測される。

本発明に用いる、TRXドメイン及びTRドメインを有するTRTRXの全長に特に制限はないが、２，０００アミノ酸残基以下が好ましく、１，５００アミノ酸残基以下がより好ましく、１，０００アミノ酸残基以下がより好ましく、８００アミノ酸残基以下がより好ましく、７００アミノ酸残基以下がより好ましく、６５０アミノ酸残基以下がさらに好ましい。
また、前記TRXドメインの全長は、TRXドメイン及びTRドメインを有する観点から、２００アミノ酸残基以上が好ましく、３００アミノ酸残基以上がより好ましく、４００アミノ酸残基以上がさらに好ましい。

前述のTRXドメイン、TRドメイン、及びこれらを含むアミノ酸配列からなるタンパク質は、通常の化学的手法、遺伝子工学的手法等により得ることができる。例えば、前記TRTRXは、ナンノクロロプシス・オセアニカ、又はナンノクロロプシス・ガディタナ等、ゲノム上にTRTRX遺伝子を有する藻類から単離、精製等することで天然物由来のタンパク質を取得することができる。また、配列番号１又は３で表されるアミノ酸配列情報をもとに人工的に化学合成することで、前記TRXドメイン及び前記TRドメインを含むアミノ酸配列からなるタンパク質を得ることができる。あるいは、遺伝子組み換え技術により、組換えタンパク質として前記TRXドメイン及び前記TRドメインを含むアミノ酸配列からなるタンパク質を作製してもよい。
また本発明で用いるTRTRXは、１種でもよいし、２種以上のTRTRXを組合せて用いてもよい。また、TRTRXが有するTRXドメイン又はTRドメインも、１種でもよいし、２種以上のTRXドメイン又はTRドメインを組み合わせて用いてもよい。
ナンノクロロプシス等の藻類は、私的又は公的な研究所等の保存機関より入手することができる。例えば、ナンノクロロプシス・オセアニカNIES-2145株は、国立環境研究所（NIES）から入手することができる。また、ナンノクロロプシス・ガディタナCCMP526株は、National Center for Marine Algae and Microbiotaから入手することができる。

本発明において、TRTRXをコードする遺伝子を用いて、後述の方法に従いTRTRXの発現を促進することが好ましい。
本発明で用いることができるTRTRXをコードする遺伝子は、TRXドメイン及びTRドメインをコードするＤＮＡからなる塩基配列（好ましくは、前記アミノ酸配列（Ａ）〜（Ｄ）からなる群より選ばれるいずれか１つのアミノ酸配列をコードする塩基配列、及び前記アミノ酸配列（Ｅ）〜（Ｈ）からなる群より選ばれるいずれか１つのアミノ酸配列をコードする塩基配列）を有する遺伝子である。TRXドメイン及びTRドメインをコードするＤＮＡからなる塩基配列の具体例として、下記塩基配列（ａ）〜（ｄ）及び下記塩基配列（ｅ）〜（ｈ）が挙げられる。

（ａ）配列番号２の１５８５位〜１８８７位までの塩基配列。
（ｂ）塩基配列（ａ）との同一性が６０％以上であり、TRX活性を有するTRXドメインを構成するアミノ酸配列をコードする塩基配列。
（ｃ）配列番号４の１５７３位〜１８７５位までの塩基配列。
（ｄ）塩基配列（ｃ）との同一性が６０％以上であり、TRX活性を有するTRXドメインを構成するアミノ酸配列をコードする塩基配列。
（ｅ）配列番号２の４０９位〜１３４４位までの塩基配列。
（ｆ）塩基配列（ｅ）との同一性が６０％以上であり、TR活性を有するTRドメインを構成するアミノ酸配列をコードする塩基配列。
（ｇ）配列番号４の４００位〜１３３５位までの塩基配列。
（ｈ）塩基配列（ｇ）との同一性が６０％以上であり、TR活性を有するTRドメインを構成するアミノ酸配列をコードする塩基配列。

本発明で用いるTRTRX遺伝子としては、TRXドメインを構成するアミノ酸配列をコードする前記塩基配列（ａ）若しくは（ｂ）と、TRドメインを構成するアミノ酸配列をコードする前記塩基配列（ｅ）若しくは（ｆ）とを有する遺伝子、TRXドメインを構成するアミノ酸配列をコードする前記塩基配列（ａ）若しくは（ｂ）と、TRドメインを構成するアミノ酸配列をコードする前記塩基配列（ｇ）若しくは（ｈ）とを有する遺伝子、TRXドメインを構成するアミノ酸配列をコードする前記塩基配列（ｃ）若しくは（ｄ）と、TRドメインを構成するアミノ酸配列をコードする前記塩基配列（ｅ）若しくは（ｆ）とを有する遺伝子、並びに、TRXドメインを構成するアミノ酸配列をコードする前記塩基配列（ｃ）若しくは（ｄ）と、TRドメインを構成するアミノ酸配列をコードする前記塩基配列（ｇ）若しくは（ｈ）とを有する遺伝子、が好ましい。このうち、TRXドメインを構成するアミノ酸配列をコードする前記塩基配列（ａ）若しくは（ｂ）と、TRドメインを構成するアミノ酸配列をコードする前記塩基配列（ｅ）若しくは（ｆ）とを有する遺伝子、並びに、TRXドメインを構成するアミノ酸配列をコードする前記塩基配列（ｃ）若しくは（ｄ）と、TRドメインを構成するアミノ酸配列をコードする前記塩基配列（ｅ）若しくは（ｆ）とを有する遺伝子、がより好ましい。
また、本発明で用いるTRTRX遺伝子としては、下記ＤＮＡ（ｉ）〜（ｌ）がより好ましい。ここで、ＤＮＡ（ｉ）及び（ｊ）は、TRXドメインを構成するアミノ酸配列をコードする前記塩基配列（ａ）若しくは（ｂ）と、TRドメインを構成するアミノ酸配列をコードする前記塩基配列（ｅ）若しくは（ｆ）とを有する遺伝子に含まれる。また、ＤＮＡ（ｋ）及び（ｌ）は、TRXドメインを構成するアミノ酸配列をコードする前記塩基配列（ｃ）若しくは（ｄ）と、TRドメインを構成するアミノ酸配列をコードする前記塩基配列（ｇ）若しくは（ｈ）とを有する遺伝子に含まれる。

（ｉ）配列番号２で表される塩基配列からなるＤＮＡ。
（ｊ）前記ＤＮＡ（ｉ）の塩基配列と同一性が６０％以上の塩基配列からなり、かつTRX活性及びTR活性を有するTRXドメイン及びTRドメインを含むタンパク質をコードするＤＮＡ。
（ｋ）配列番号４で表される塩基配列からなるＤＮＡ。
（ｌ）前記ＤＮＡ（ｋ）の塩基配列と同一性が６０％以上の塩基配列からなり、かつTRX活性及びTR活性を有するTRXドメイン及びTRドメインを含むタンパク質をコードするＤＮＡ。

配列番号２で表される塩基配列からなる前記ＤＮＡ（ｉ）は、配列番号１のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子であり、ナンノクロロプシス・オセアニカNIES-2145株由来のTRTRX遺伝子（以下、「NoTRTRX遺伝子」ともいう）である。
配列番号４で表される塩基配列からなる前記ＤＮＡ（ｋ）は、配列番号３のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子であり、ナンノクロロプシス・ガディタナCCMP526株由来のTRTRX遺伝子（以下、「NgTRTRX遺伝子」ともいう）である。

前記塩基配列（ｂ）において、TRXドメインのTRX活性の点から、前記塩基配列（ａ）との同一性は６０％以上であり、６５％以上が好ましく、７０％以上がより好ましく、７５％以上がより好ましく、８０％以上がより好ましく、８５％以上がより好ましく、９０％以上がより好ましく、９１％以上がより好ましく、９３％以上がより好ましく、９５％以上がより好ましく、９７％以上がより好ましく、９８％以上がより好ましく、９９％以上がさらに好ましい。
また、前記塩基配列（ｂ）として、前記塩基配列（ａ）の配列に、１又は複数個（例えば１個以上１２１個以下、好ましくは１個以上１０６個以下、より好ましくは１個以上９０個以下、より好ましくは１個以上７５個以下、より好ましくは１個以上６０個以下、より好ましくは１個以上４５個以下、より好ましくは１個以上３０個以下、より好ましくは１個以上２７個以下、より好ましくは１個以上２１個以下、より好ましくは１個以上１５個以下、より好ましくは１個以上９個以下、より好ましくは１個以上６個以下、さらに好ましくは１個以上３個以下）の塩基が欠失、置換、挿入、又は付加されており、かつTRX活性を有するTRXドメインを構成するアミノ酸配列をコードする塩基配列も好ましい。

前記塩基配列（ｄ）において、TRXドメインのTRX活性の点から、前記塩基配列（ｃ）との同一性は６０％以上であり、６５％以上が好ましく、７０％以上がより好ましく、７５％以上がより好ましく、８０％以上がより好ましく、８５％以上がより好ましく、９０％以上がより好ましく、９１％以上がより好ましく、９３％以上がより好ましく、９５％以上がより好ましく、９７％以上がより好ましく、９８％以上がより好ましく、９９％以上がさらに好ましい。
また、前記塩基配列（ｄ）として、前記塩基配列（ｃ）の配列に、１又は複数個（例えば１個以上１２１個以下、好ましくは１個以上１０６個以下、より好ましくは１個以上９０個以下、より好ましくは１個以上７５個以下、より好ましくは１個以上６０個以下、より好ましくは１個以上４５個以下、より好ましくは１個以上３０個以下、より好ましくは１個以上２７個以下、より好ましくは１個以上２１個以下、より好ましくは１個以上１５個以下、より好ましくは１個以上９個以下、より好ましくは１個以上６個以下、さらに好ましくは１個以上３個以下）の塩基が欠失、置換、挿入、又は付加されており、かつTRX活性を有するTRXドメインを構成するアミノ酸配列をコードする塩基配列も好ましい。

前記塩基配列（ｆ）において、TRドメインのTR活性の点から、前記塩基配列（ｅ）との同一性は６０％以上であり、６５％以上が好ましく、７０％以上がより好ましく、７５％以上がより好ましく、８０％以上がより好ましく、８５％以上がより好ましく、９０％以上がより好ましく、９１％以上がより好ましく、９３％以上がより好ましく、９５％以上がより好ましく、９７％以上がより好ましく、９８％以上がより好ましく、９９％以上がさらに好ましい。
また、前記塩基配列（ｆ）として、前記塩基配列（ｅ）の配列に、１又は複数個（例えば１個以上３７４個以下、好ましくは１個以上３２７個以下、より好ましくは１個以上２８０個以下、より好ましくは１個以上２３４個以下、より好ましくは１個以上１８７個以下、より好ましくは１個以上１４０個以下、より好ましくは１個以上９３個以下、より好ましくは１個以上８４個以下、より好ましくは１個以上６５個以下、より好ましくは１個以上４６個以下、より好ましくは１個以上２８個以下、より好ましくは１個以上１８個以下、さらに好ましくは１個以上９個以下）の塩基が欠失、置換、挿入、又は付加されており、かつTR活性を有するTRドメインを構成するアミノ酸配列をコードする塩基配列も好ましい。

前記塩基配列（ｈ）において、TRドメインのTR活性の点から、前記塩基配列（ｇ）との同一性は６０％以上であり、６５％以上が好ましく、７０％以上がより好ましく、７５％以上がより好ましく、８０％以上がより好ましく、８５％以上がより好ましく、９０％以上がより好ましく、９１％以上がより好ましく、９３％以上がより好ましく、９５％以上がより好ましく、９７％以上がより好ましく、９８％以上がより好ましく、９９％以上がさらに好ましい。
また、前記塩基配列（ｈ）として、前記塩基配列（ｇ）の配列に、１又は複数個（例えば１個以上３７４個以下、好ましくは１個以上３２７個以下、より好ましくは１個以上２８０個以下、より好ましくは１個以上２３４個以下、より好ましくは１個以上１８７個以下、より好ましくは１個以上１４０個以下、より好ましくは１個以上９３個以下、より好ましくは１個以上８４個以下、より好ましくは１個以上６５個以下、より好ましくは１個以上４６個以下、より好ましくは１個以上２８個以下、より好ましくは１個以上１８個以下、さらに好ましくは１個以上９個以下）の塩基が欠失、置換、挿入、又は付加されており、かつTR活性を有するTRドメインを構成するアミノ酸配列をコードする塩基配列も好ましい。

前記ＤＮＡ（ｊ）において、TRX活性及びTR活性の点から、前記ＤＮＡ（ｉ）の塩基配列との同一性は６０％以上であり、６５％以上が好ましく、７０％以上がより好ましく、７５％以上がより好ましく、８０％以上がより好ましく、８５％以上がより好ましく、９０％以上がより好ましく、９１％以上がより好ましく、９３％以上がより好ましく、９５％以上がより好ましく、９７％以上がより好ましく、９８％以上がより好ましく、９９％以上がさらに好ましい。
また前記ＤＮＡ（ｊ）として、配列番号２で表される塩基配列において、１又は複数個（例えば１個以上７６３個以下、好ましくは１個以上６６７個以下、より好ましくは１個以上５７２個以下、より好ましくは１個以上４７７個以下、より好ましくは１個以上３８１個以下、より好ましくは１個以上２８６個以下、より好ましくは１個以上１９０個以下、より好ましくは１個以上１７１個以下、より好ましくは１個以上１３３個以下、より好ましくは１個以上９５個以下、より好ましくは１個以上５７個以下、より好ましくは１個以上３８個以下、さらに好ましくは１個以上１９個以下）の塩基が欠失、置換、挿入、又は付加されており、かつTRX活性及びTR活性を有するTRXドメイン及びTRドメインを含むタンパク質をコードする遺伝子も好ましい。
さらに前記ＤＮＡ（ｊ）として、前記ＤＮＡ（ｉ）と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつTRX活性及びTR活性を有するTRXドメイン及びTRドメインを含むタンパク質をコードする遺伝子も好ましい。

前記ＤＮＡ（ｌ）において、TRX活性及びTR活性の点から、前記ＤＮＡ（ｋ）の塩基配列との同一性は６０％以上であり、６５％以上が好ましく、７０％以上がより好ましく、７５％以上がより好ましく、８０％以上がより好ましく、８５％以上がより好ましく、９０％以上がより好ましく、９１％以上がより好ましく、９３％以上がより好ましく、９５％以上がより好ましく、９７％以上がより好ましく、９８％以上がより好ましく、９９％以上がさらに好ましい。
また前記ＤＮＡ（ｌ）として、配列番号４で表される塩基配列において、１又は複数個（例えば１個以上７６０個以下、好ましくは１個以上６６５個以下、より好ましくは１個以上５７０個以下、より好ましくは１個以上４７５個以下、より好ましくは１個以上３８０個以下、より好ましくは１個以上２８５個以下、より好ましくは１個以上１９０個以下、より好ましくは１個以上１７１個以下、より好ましくは１個以上１３３個以下、より好ましくは１個以上９５個以下、より好ましくは１個以上５７個以下、より好ましくは１個以上３８個以下、さらに好ましくは１個以上１９個以下）の塩基が欠失、置換、挿入、又は付加されており、かつTRX活性及びTR活性を有するTRXドメイン及びTRドメインを含むタンパク質をコードする遺伝子も好ましい。
さらに前記ＤＮＡ（ｌ）として、前記ＤＮＡ（ｋ）と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつTRX活性及びTR活性を有するTRXドメイン及びTRドメインを含むタンパク質をコードする遺伝子も好ましい。

変異としては、塩基の欠失、置換、付加、又は挿入が挙げられる。塩基配列に変異を導入する方法としては、例えば、部位特異的な変異導入法が挙げられる。具体的な部位特異的変異の導入方法としては、SOE-PCRを利用した方法、ＯＤＡ法、Kunkel法等が挙げられる。また、Site-Directed Mutagenesis System Mutan-SuperExpress Kmキット（タカラバイオ社）、Transformer TM Site-Directed Mutagenesisキット（Clontech社）、KOD-Plus-Mutagenesis Kit（東洋紡社）等の市販のキットを利用することもできる。また、ランダムな遺伝子変異を与えた後、適当な方法により酵素活性の評価及び遺伝子解析を行うことにより目的遺伝子を取得することもできる。

また、本発明で用いるTRTRX遺伝子は、前記TRXドメイン及びTRドメインをコードするＤＮＡに、タンパク質の輸送に関与するシグナルペプチド、又はタンパク質の安定性を高める既知のタンパク質をコードするＤＮＡが付加されたＤＮＡからなる遺伝子であってもよい。さらに、本発明で使用するTRTRX遺伝子として、例えば前記ＤＮＡ（ｉ）〜（ｌ）の塩基配列のうちの５’側の領域に存在すると推測される葉緑体移行シグナル配列をコードする塩基配列を、宿主内で機能する他の葉緑体移行シグナル配列をコードする塩基配列に変更した塩基配列からなるＤＮＡであってもよい。ChloroP（http://www.cbs.dtu.dk/services/ChloroP/）を用いた局在予測では、配列番号２の１位〜１０５位の塩基配列が葉緑体移行シグナル配列をコードしていると予測され、実際、配列番号２の１位〜３００位の塩基配列を、レポータータンパク質をコードする塩基配列の５’末端に付加させることで、レポータータンパク質を葉緑体に局在化させられることが本発明者により確認されている。また、ChloroP解析におけるCS-scoreが高いことから、配列番号４の１位〜１４７位又は１位〜３５１位の塩基配列も葉緑体移行シグナル配列をコードしていると予測される。

本発明に用いることができるTRTRX遺伝子の全長に特に制限はないが、６，０００塩基以下が好ましく、４，５００塩基以下がより好ましく、３，０００塩基以下がより好ましく、２，４００塩基以下がより好ましく、２，１００塩基以下がより好ましく、１，９００塩基以下がさらに好ましい。
また、前記TRXドメインをコードするＤＮＡの全長は、TRXドメインをコードするＤＮＡ及びTRドメインをコードするＤＮＡを有する観点から、６００塩基以上が好ましく、９００塩基以上がより好ましく、１，２００塩基以上がさらに好ましい。

前記TRXドメインをコードするＤＮＡ、TRドメインをコードするＤＮＡ、及びこれらのＤＮＡからなる塩基配列を有する遺伝子は、通常の遺伝子工学的手法により得ることができる。例えば、配列番号１又は３で表されるアミノ酸配列又は配列番号２又は４で表される塩基配列に基づいて、TRTRX遺伝子を人工的に合成できる。TRTRX遺伝子の合成は、例えば、インビトロジェン社等のサービスを利用することができる。また、ナンノクロロプシス・オセアニカ、又はナンノクロロプシス・ガディタナ等、ゲノム上にTRTRX遺伝子を有する藻類のゲノムからクローニングによって取得することもできる。例えば、Molecular Cloning-A LABORATORY MANUAL THIRD EDITION［Joseph Sambrook, David W. Russell, Cold Spring Harbor Laboratory Press（2001）］記載の方法等により行うことができる。また、使用する宿主の種類に応じて、配列番号２及び４で表される塩基配列の一部を最適化してもよい。例えば、Thermo Fisher Scientific社のGeneArt人工遺伝子合成サービスを利用することができる。
また本発明で用いるTRTRX遺伝子は、１種でもよいし、２種以上のTRTRX遺伝子を組合せて用いてもよい。また、TRTRX遺伝子が有するTRXドメイン又はTRドメインをコードするＤＮＡも、１種でもよいし、２種以上のTRXドメイン又はTRドメインをコードするＤＮＡを組み合わせて用いてもよい。

本発明の形質転換体は、前記TRTRX遺伝子を常法により宿主に導入することで得ることができる。具体的には、前記遺伝子を宿主細胞中で発現させることのできる組換えベクターや遺伝子発現カセットを調製し、これを宿主細胞に導入して宿主細胞を形質転換させることにより作製できる。本発明の形質転換体において、当該遺伝子の発現が促進されていることが好ましい。
各種宿主に導入するTRTRX遺伝子は、使用する宿主におけるコドン使用頻度にあわせてコドンを至適化されることが好ましい。各種生物が使用するコドンの情報は、Codon Usage Database（http://www.kazusa.or.jp/codon/）などから入手可能である。

また、本発明の形質転換体は、前記TRTRX遺伝子をゲノム上に有する宿主において、常法により当該遺伝子の発現調節領域を改変して、当該遺伝子の発現を促進させることで得ることができる。具体的には、当該宿主のゲノム上に存在するTRTRX遺伝子の上流に位置するプロモーター配列を、より高いプロモーター活性を示すものに置換すること等で作製できる。

また本発明の形質転換体は、光合成能の向上及び脂質生産性向上の観点から、前記TRTRXに加えて、脂肪酸(FA)合成経路やTAG合成経路に関わる少なくとも１種または２種以上のタンパク質の発現が促進されていることも好ましい。脂肪酸合成経路やTAG合成経路に関わるタンパク質としては、アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼ（以下、「ACC」ともいう）、アシルキャリアープロテイン（以下、「ACP」ともいう）、ホロ−ACPシンターゼ（ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼ）、ACP−マロニルトランスフェラーゼ（以下、「MAT」ともいう）、β-ケトアシル-ACPシンターゼ（以下、「KAS」ともいう）、β−ケトアシル−ACPレダクターゼ（以下、「KAR」ともいう）、ヒドロキシアシル−ACPデヒドラターゼ（以下、「HD」ともいう）、エノイル−ACPレダクターゼ（以下、「KAR」ともいう）、アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ（以下、「TE」ともいう）、アシル−CoAシンテターゼ（以下、「ACS」ともいう）、グリセロール−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（以下、「G3PDH」ともいう）、グリセロール−３−リン酸アシルトランスフェラーゼ（以下、「GPAT」ともいう）、リゾホスファチジン酸アシルトランスフェラーゼ（以下、「LPAAT」ともいう）、及びジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ（以下、「DGAT」ともいう）等のアシル基転移酵素（以下、「ATともいう」）、並びにホスファチジン酸ホスファターゼ（以下、「PAP」ともいう）、等が挙げられる。
光合成能の向上及び脂質生産性向上の観点から、前記TRTRXに加えて、ACC、ACP、KAS、TE、ACS、及びATから選ばれる少なくとも１種または２種以上のタンパク質の発現が促進されていることが好ましく、TE、ACS、及びATから選ばれる少なくとも１種または２種以上のタンパク質の発現が促進されていることがより好ましく、TE、ACS、及びDGATから選ばれる少なくとも１種または２種以上のタンパク質の発現が促進されていることがさらに好ましい。さらに、光合成能の向上及び脂質生産性向上の観点から、DGATの発現が促進されていることが好ましく、ACSかつDGATの発現が促進されていることがより好ましく、TE、ACS、かつDGATの発現が促進されていることがさらにより好ましい。

本発明で用いることができるTEは特に限定されず、アシル-ACPチオエステラーゼ活性（以下、「TE活性」ともいう）を有するタンパク質であればよい。ここで「TE活性」とは、アシル-ACPのチオエステル結合を加水分解する活性をいう。
TEは、KAS等の脂肪酸合成酵素によって合成されたアシル−ACPのチオエステル結合を加水分解し、遊離の脂肪酸を生成する酵素である。TEの作用によってACP上での脂肪酸合成が終了し、切り出された脂肪酸は多価不飽和脂肪酸の合成やTAG等の合成に供される。
そのため、前記TRTRXに加えてTEの発現を促進することで、脂質の製造に用いる形質転換体の脂質の生産性、特に脂肪酸の生産性を一層向上させることができる。

TEは、基質であるアシル−ＡＣＰを構成するアシル基（脂肪酸残基）の炭素原子数や不飽和結合数によって異なる反応性を示すことが知られている。よってTEは、生体内での脂肪酸組成を決定する重要なファクターであると考えられている。また、TEをコードする遺伝子を元来有していない宿主を用いる場合、TEをコードする遺伝子（以下、「TE遺伝子」ともいう）の発現を促進させることが好ましい。

本発明で用いることができるTEは、通常のTEや、それらと機能的に均等なタンパク質から、宿主の種類等に応じて適宜選択することができる。例えば、ナンノクロロプシス・オセアニカ由来のTE（配列番号３７、これをコードする遺伝子の塩基配列：配列番号３８）等が挙げられる。また、これと機能的に均等なタンパク質として、前記TEのアミノ酸配列との同一性が５０％以上（好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上）のアミノ酸配列からなり、かつTE活性を有するタンパク質も用いることができる。

タンパク質がTE活性を有することは、例えば、大腸菌等の宿主細胞内で機能するプロモーターの下流にTE遺伝子を連結したDNAを脂肪酸分解系が欠損した宿主細胞へ導入し、導入したTE遺伝子が発現する条件で培養して、宿主細胞又は培養液中の脂肪酸組成の変化をガスクロマトグラフィー解析等の方法を用いて分析することにより、確認することができる。
また、大腸菌等の宿主細胞内で機能するプロモーターの下流にTE遺伝子を連結したDNAを宿主細胞へ導入し、導入したTE遺伝子が発現する条件で細胞を培養した後、細胞の破砕液に対し、Yuanらの方法（Yuan L．et al.，Proc．Natl．Acad．Sci．USA，1995，vol．92(23)，p．10639-10643）によって調製した各種アシル-ACPを基質とした反応を行うことにより、TE活性を測定することができる。

本発明で用いることができるATは特に限定されず、アシルトランスフェラーゼ活性（以下、「AT活性」ともいう）を有するタンパク質であればよい。ここで「AT活性」とは、グリセロール３リン酸、リゾホスファチジン酸、ジアシルグリセロールなどのグリセロール化合物のアシル化を触媒する活性を意味する。
ATは、グリセロール３リン酸、リゾホスファチジン酸、ジアシルグリセロールなどのグリセロール化合物のアシル化を触媒するタンパク質である。遊離脂肪酸にＣｏＡが結合した脂肪酸アシルＣｏＡ、又はアシルＡＣＰは、各種ATによってグリセロール骨格へと取り込まれ、グリセロール１分子に対して脂肪酸３分子がエステル結合してなるTAGとして蓄積される。
そのため、前記TRTRXに加えてATの発現を促進することで、脂質の製造に用いる形質転換体の脂質の生産性、特に脂肪酸の生産性を一層向上させることができる。

ATは、基質である脂肪酸アシルＣｏＡ又は脂肪酸アシルＡＣＰを構成するアシル基（脂肪酸残基）の炭素原子数や不飽和結合数によって異なる反応特異性を示す複数のATが存在していることが知られている。よってATは、生体内での脂肪酸組成を決定する重要なファクターであると考えられている。また、ATをコードする遺伝子（以下、「AT遺伝子」ともいう）を元来有していない宿主を用いる場合、AT遺伝子の発現を促進させることが好ましい。

本発明で用いることができるATは、通常のATや、それらと機能的に均等なタンパク質から、宿主の種類等に応じて適宜選択することができる。例えば、ナンノクロロプシス・オセアニカ由来のDGAT（配列番号３３、これをコードする遺伝子の塩基配列：配列番号３４；又は配列番号７６、これをコードする遺伝子の塩基配列：配列番号７７）等が挙げられる。また、これらと機能的に均等なタンパク質として、前記DGATのアミノ酸配列との同一性が５０％以上（好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上）のアミノ酸配列からなり、かつAT活性を有するタンパク質も用いることができる。

本発明で用いることができるACSは、アシルCoAシンテターゼ活性（以下、「ACS活性」ともいう）を有するタンパク質であればよい。ここで「ACS活性」とは、遊離脂肪酸とCoAを結合させてアシル−CoAを生成する活性を意味する。
ACSは、生合成された脂肪酸（遊離脂肪酸）にCoAを付加し、アシル−CoAの生成に関与するタンパク質である。そのため、前記TRTRXに加えてACSの発現を促進することで、脂質の製造に用いる形質転換体の脂質の生産性、特に脂肪酸の生産性を一層向上させることができる。

本発明で用いることができるACSは、通常のACSや、それらと機能的に均等なタンパク質から、宿主の種類等に応じて適宜選択することができる。例えば、ナンノクロロプシス・オセアニカ由来のlong chain acyl-CoA synthetase（以下、単に「LACS」ともいう）（配列番号３５、これをコードする遺伝子（以下、「LACS遺伝子」ともいう）の塩基配列：配列番号３６）等が挙げられる。また、これらと機能的に均等なタンパク質として、前記ナンノクロロプシス・オセアニカ由来のLACSのアミノ酸配列との同一性が５０％以上（好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上）のアミノ酸配列からなり、かつACS活性を有するタンパク質も用いることができる。

また本発明の形質転換体は、光合成の向上及び脂質生産性向上の観点から、前記TRTRXに加えて、CBB回路に関わる少なくとも１種または２種以上のタンパク質の発現が促進されていることも好ましい。ＣＢＢ回路に関与するタンパク質としては、フルクトース-1,6-ビスリン酸アルドラーゼ（fructose 1,6-bisphosphate aldolase、以下、「FBA」ともいう）、トランスケトラーゼ（transketolase、以下、「TK」ともいう）、リボース-5-リン酸イソメラーゼ（以下、「RPI」ともいう）などのタンパク質が挙げられる。

本発明で用いることができるTKは特に限定されず、トランスケトラーゼ活性（以下、「TK活性」ともいう）を有するタンパク質であればよい。ここで「TK活性」とは、ケトースのケトール基をアルドースのアルデヒド基に転位する活性を意味する。
本明細書においてTKとは、ＣＢＢ回路において、フルクトース-6-リン酸とグリセルアルデヒド-3-リン酸から、エリスロース-4-リン酸及びキシルロース-5-リン酸を生成する反応、並びにセドヘプツロース-7-リン酸とグリセルアルデヒド-3-リン酸から、キシルロース-5-リン酸及びリボース-5-リン酸を生成する反応を触媒するタンパク質（酵素）である。このような反応を促進することで、ＣＢＢ回路が強化され、二酸化炭素から光合成産物などの生産を促進させることができる。そのため、前記TRTRXに加えてTKの発現を促進することで、形質転換体における光合成能を向上させることができ、結果として脂質の生産性の向上に繋がり得ると推察される。

本発明で用いることができるTKは、通常のTKや、それらと機能的に均等なタンパク質から、宿主の種類等に応じて適宜選択することができる。例えば、ナンノクロロプシス・オセアニカ由来のTK（配列番号２７、これをコードする遺伝子（以下、「TK遺伝子」ともいう）の塩基配列：配列番号２８）等が挙げられる。また、これと機能的に均等なタンパク質として、前記TKのアミノ酸配列との同一性が５０%以上、（好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上）のアミノ酸配列からなり、TK活性を示すタンパク質も用いることができる。

本発明で用いるタンパク質がTK活性を有することは、例えば、Plant Physiol. (1989) 90, 814-819記載の方法等で確認することができる。具体的には、目的のタンパク質を含有する溶液を常法により用意し、フルクトース-6-リン酸及びグリセルアルデヒド-3-リン酸と混和し、エリスロース-4-リン酸及びキシルロース-5-リン酸が生成されること、あるいはセドヘプツロース-7-リン酸及びグリセルアルデヒド-3-リン酸と混和し、キシルロース-5-リン酸及びリボース-5-リン酸が生成されること、を分析することで、確かめることができる。

本発明で用いることができるFBAは特に限定されず、フルクトース-1,6-ビスリン酸アルドラーゼ活性（以下、「FBA活性」ともいう）を有するタンパク質であればよい。ここで「FBA活性」とは、グリセルアルデヒド-3-リン酸とジヒドロキシアセトンリン酸とを縮合する活性、もしくはエリスロース-4-リン酸とジヒドロキシアセトンリン酸とを縮合する活性を意味する。
本明細書においてFBAとは、ＣＢＢ回路において、グリセルアルデヒド-3-リン酸とジヒドロキシアセトンリン酸から、フルクトース-1,6-ビスリン酸を生成する反応、並びにエリスロース-4-リン酸とジヒドロキシアセトンリン酸から、セドヘプツロース-1,7-ビスリン酸を生成する反応を触媒するタンパク質（酵素）である。このような反応を促進することで、ＣＢＢ回路が強化され、二酸化炭素から光合成産物などの生産を促進させることができる。そのため、前記TRTRXに加えてFBAの発現を促進することで、形質転換体における光合成能を向上させることができ、結果として脂質の生産性の向上に繋がり得ると推察される。

本発明で用いることができるFBAは、通常のFBAや、それらと機能的に均等なタンパク質から、宿主の種類等に応じて適宜選択することができる。例えば、ナンノクロロプシス・オセアニカ由来のFBA（配列番号２９、これをコードする遺伝子（以下、「FBA遺伝子」ともいう）の塩基配列：配列番号３０）等が挙げられる。また、これらと機能的に均等なタンパク質として、前記FBAのアミノ酸配列との同一性が５０%以上、（好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上）のアミノ酸配列からなり、FBA活性を示すタンパク質も用いることができる。

本発明で用いるタンパク質がFBA活性を有することは、例えば、Plant Physiol. (1989) 90, 814-819記載の方法等で確認することができる。具体的には、目的のタンパク質を含有する溶液を常法により用意し、グリセルアルデヒド-3-リン酸及びジヒドロキシアセトンリン酸と混和し、フルクトース-1,6-ビスリン酸が生成されること、あるいはエリスロース-4-リン酸及びジヒドロキシアセトンリン酸から、セドヘプツロース-1,7-ビスリン酸が生成されること、を分析することで、確かめることができる。

本発明で用いることができるRPIは特に限定されず、リボース-5-リン酸イソメラーゼ活性（以下、「RPI活性」ともいう）を有するタンパク質であればよい。ここで、「RPI活性」とは、アルドースのアルデヒド基をケト基に変換する活性を意味する。
本明細書においてRPIとは、リボース-5-リン酸をリブロース-5-リン酸に変換する反応を触媒するタンパク質（酵素）を意味する。このような反応を促進することで、ＣＢＢ回路が強化され、二酸化炭素から光合成産物などの生産を促進させることができる。そのため、前記TRTRXに加えてFBAの発現を促進することで、形質転換体における光合成能を向上させることができ、結果として脂質の生産性の向上に繋がり得ると推察される。

本発明で用いることができるRPIは、通常のRPIや、それと機能的に均等なタンパク質から、宿主の種類等に応じて適宜選択することができる。例えば、ナンノクロロプシス・オセアニカ由来のRPI（配列番号３１、これをコードする遺伝子（以下、「RPI遺伝子」ともいう）の塩基配列：配列番号３２）等が挙げられる。また、これと機能的に均等なタンパク質として、前記RPIのアミノ酸配列との同一性が５０%以上、（好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上）のアミノ酸配列からなり、RPI活性を示すタンパク質も用いることができる。

本発明で用いるタンパク質がRPI活性を有することは、例えば、The Plant Journal (2006) 48, 606-618記載の方法等で確認することができる。具体的には、目的のタンパク質を含有する溶液を常法により用意し、リボース-5-リン酸と混和してリブロース-5-リン酸が生成されること、を分析することで、確かめることができる。

前述のTE、AT、LACS、TK、FBA及びRPIのアミノ酸配列情報、並びにこれらをコードする遺伝子の配列情報等は、例えば、国立生物工学情報センター（National Center for Biotechnology Information, NCBI）などから入手することができる。
また、TE遺伝子、AT遺伝子、LACS遺伝子、TK遺伝子、FBA遺伝子又はRPI遺伝子の発現を促進させた形質転換体は、常法により作製できる。例えば、後述のTRTRX遺伝子の発現を促進させる方法と同様、前記各種遺伝子を宿主に導入する方法、前記各種遺伝子をゲノム上に有する宿主において当該遺伝子の発現調節領域を改変する方法、などにより形質転換体を作製することができる。

各種宿主に導入する遺伝子は、使用する宿主におけるコドン使用頻度にあわせてコドンを至適化されることが好ましい。各種生物が使用するコドンの情報は、Codon Usage Database（www.kazusa.or.jp/codon/）などから入手可能である。

なお本明細書において、目的のタンパク質をコードする遺伝子の発現を促進させたものを「形質転換体」ともいい、目的のタンパク質をコードする遺伝子の発現を促進させていないものを「宿主」又は「野生株」ともいう。

本発明で用いる形質転換体は、宿主自体に比べ、各脂肪酸量の総和（総脂肪酸量）が有意に向上する。
なお、宿主や形質転換体の脂肪酸及び脂質の生産性については、実施例で用いた方法により測定することができる。

本発明の形質転換体の作製方法について説明する。しかし本発明は、これに制限するものではない。

形質転換体の宿主としては通常用いられるものより適宜選択することができる。本発明で用いることができる宿主としては、微生物（微細藻類を含む藻類など）であることが好ましく、藻類であることがより好ましい。

本発明で用いる藻類や微細藻類としては、遺伝子組換え手法が確立している観点から、クラミドモナス（Chlamydomonas）属の藻類、クロレラ（Chlorella）属の藻類、ファエオダクティラム（Phaeodactylum）属の藻類、又はナンノクロロプシス（Nannochloropsis）属の藻類が好ましい。また、脂質生産性の観点から、不等毛植物門に属する藻類も好ましく、真正眼点藻綱に属する藻類がより好ましい。真正眼点藻綱に属する藻類の具体例としては、ナンノクロロプシス属の藻類、モノドプシス（Monodopsis）属の藻類、ビスケリア（Vischeria）属の藻類、クロロボトリス（Chlorobotrys）属の藻類、ゴニオクロリス（Goniochloris）等が挙げられる。なかでも、脂質生産性の観点から、ナンノクロロプシス属の藻類がより好ましい。ナンノクロロプシス属の藻類の具体例としては、ナンノクロロプシス・オセアニカ（Nannochloropsis oceanica）、ナンノクロロプシス・オキュラータ(Nannochloropsis oculata)、ナンノクロロプシス・ガディタナ、ナンノクロロプシス・サリナ（Nannochloropsis salina）、ナンノクロロプシス・リムネティカ（Nannochloropsis limnetica）、ナンノクロロプシス・グラニュラータ（Nannochloropsis granulata）、ナンノクロロプシス・エスピー（Nannochloropsis sp．）等が挙げられる。なかでも、脂質生産性の観点から、ナンノクロロプシス・オセアニカ、又はナンノクロロプシス・ガディタナが好ましく、ナンノクロロプシス・オセアニカがより好ましい。

遺伝子発現用プラスミド又は遺伝子発現カセットの母体となるベクター（プラスミド）としては、目的のタンパク質をコードする遺伝子を宿主に導入することができ、宿主細胞内で目的の遺伝子を発現させることができるベクターであればよい。例えば、使用する宿主の種類に応じたプロモーターやターミネーター等の発現調節領域を有するベクターであって、複製開始点や選択マーカー等を有するベクターを用いることができる。また、プラスミド等の染色体外で自立増殖・複製するベクターであってもよいし、染色体内に組み込まれるベクターであってもよい。

本発明で好ましく用いることができる発現用ベクターとしては、例えば、pUC18（タカラバイオ社製）、pUC19（タカラバイオ社製）、pUC118（タカラバイオ社製）、P66（Chlamydomonas Center）、P-322（Chlamydomonas Center）、pPha-T1（Journal of Basic Microbiology, 2011, vol. 51, p. 666-672参照）、又はpJET1（コスモ・バイオ社製）が挙げられる。特に、宿主がナンノクロロプシス属に属する藻類の場合は、pUC18、pPha-T1、又はpJET1が好ましく用いられる。また、宿主がナンノクロロプシス属に属する藻類の場合には、Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2011, vol. 108(52)の記載の方法を参考にして、目的の遺伝子、プロモーター及びターミネーターからなるＤＮＡ断片（遺伝子発現カセット）を用いて宿主を形質転換することもできる。

また、前記発現ベクターに組み込んだ目的のタンパク質をコードする遺伝子の発現を調整するプロモーターの種類も、使用する宿主の種類に応じて適宜選択することができる。本発明で好ましく用いることができるプロモーターとしては、lacプロモーター、trpプロモーター、tacプロモーター、trcプロモーター、T7プロモーター、SpoVGプロモーター、イソプロピルβ-D-1-チオガラクトピラノシド（IPTG）の添加によって誘導可能な誘導体に関するプロモーター、RubisCOオペロン（rbc）、PSI反応中心タンパク質（psaA及びpsaB）、PSIIのD1タンパク質（psbA）、c-phycocyanin βサブユニット（cpcB）、カリフラワーモザイルウイルス35SRNAプロモーター、ハウスキーピング遺伝子プロモーター（例えば、チューブリンプロモーター、アクチンプロモーター、ユビキチンプロモーター等）、西洋アブラナ又はアブラナ由来Napin遺伝子プロモーター、植物由来RubisCOプロモーター、ナンノクロロプシス属由来のビオラキサンチン／クロロフィルａ結合タンパク質遺伝子のプロモーター（VCP1プロモーター、VCP2プロモーター）（Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2011, vol. 108(52)）、及びナンノクロロプシス属由来のオレオシン様タンパクLDSP（lipid droplet surface protein）遺伝子のプロモーター（PLOS Genetics, 2012; 8(11): e1003064. doi: 10. 1371）、ナンノクロロプシス属由来のグルタミン合成酵素遺伝子のプロモーター（GSプロモーター）、及びナンノクロロプシス属由来のアンモニウムトランスポーター遺伝子のプロモーター（AMTプロモーター）が挙げられる。本発明で宿主としてナンノクロロプシス属に属する藻類を用いる場合には、チューブリンプロモーター、ヒートショックプロテインプロモーター、ビオラキサンチン／クロロフィルａ結合タンパク質遺伝子のプロモーター（VCP1プロモーター、VCP2プロモーター）、ナンノクロロプシス属由来のオレオシン様タンパクＬＤＳＰ遺伝子のプロモーター、ACP（アシルキャリアープロテイン）遺伝子のプロモーター（ACPプロモーター）、デサチュラーゼ遺伝子のプロモーター、AT（アシルトランスフェラーゼ）遺伝子のプロモーター（ATプロモーター）、GSプロモーター、及びAMTプロモーターを好ましく用いることができる。また、ナンノクロロプシス属に属する藻類は一般に栄養（特に窒素）欠乏条件や強光条件において効率的に脂質を生産することが知られるため、これらの条件下で強く発現するプロモーターを用いることがより好ましい。栄養欠乏条件や強光条件において強く発現するという観点から、脂肪酸合成経路やTAG合成経路に関わる遺伝子のプロモーターや窒素同化に関わる遺伝子のプロモーターが好ましく、ＬＤＳＰ遺伝子のプロモーター、ACPプロモーター、デサチュラーゼ遺伝子のプロモーター、ATプロモーター、GSプロモーター、及びAMTプロモーターがより好ましく、ＬＤＳＰ遺伝子のプロモーター、GSプロモーター、及びAMTプロモーターがより好ましい。
また、目的のタンパク質をコードする遺伝子が組み込まれたことを確認するための選択マーカーの種類も、使用する宿主の種類に応じて適宜選択することができる。本発明で好ましく用いることができる選択マーカーとしては、アンピシリン耐性遺伝子、クロラムフェニコール耐性遺伝子、エリスロマイシン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、スペクチノマイシン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子、ブラストサイジンＳ耐性遺伝子、ビアラフォス耐性遺伝子、ゼオシン耐性遺伝子、パロモマイシン耐性遺伝子、ゲンタマイシン耐性遺伝子、及びハイグロマイシン耐性遺伝子等の薬剤耐性遺伝子が挙げられる。さらに、栄養要求性に関連する遺伝子の欠損等を選択マーカー遺伝子として使用することもできる。

目的のタンパク質をコードする遺伝子の前記ベクターへの導入は、制限酵素処理やライゲーション等の常法により行うことができる。
また、形質転換方法は、使用する宿主の種類に応じて常法より適宜選択することができる。例えば、カルシウムイオンを用いる形質転換方法、一般的なコンピテントセル形質転換方法、プロトプラスト形質転換法、エレクトロポレーション法、LP形質転換方法、アグロバクテリウムを用いた方法、パーティクルガン法等が挙げられる。宿主としてナンノクロロプシス属の藻類を用いる場合、Randor Radakovits, et al.，Nature Communications，DOI:10.1038/ncomms1688，2012等に記載のエレクトロポレーション法を用いて形質転換を行うこともできる。

目的遺伝子断片が導入された形質転換体の選択は、選択マーカー等を利用することで行うことができる。例えば、薬剤耐性遺伝子が、形質転換時に目的ＤＮＡ断片とともに宿主細胞中に導入された結果、形質転換体が獲得する薬剤耐性を指標に行うことができる。また、ゲノムを鋳型としたＰＣＲ法等によって、目的ＤＮＡ断片の導入を確認することもできる。

前記TRTRX遺伝子をゲノム上に有する宿主において、当該遺伝子の発現調節領域を改変して、当該遺伝子の発現を促進させる方法について説明する。
「発現調節領域」とは、プロモーター、ターミネーター、及び非翻訳領域を示し、これらの配列は一般に隣接する遺伝子の発現量（転写量、翻訳量）の調節に関与している。ゲノム上に前記TRTRX遺伝子を有する宿主においては、当該遺伝子の発現調節領域を改変して当該遺伝子の発現を促進させることで、脂肪酸の生産性を向上させることができる。

発現調節領域の改変方法としては、例えばプロモーターの入れ替えが挙げられる。ゲノム上に前記TRTRX遺伝子を有する宿主において、当該遺伝子のプロモーターを、より転写活性の高いプロモーターに入れ替えることで、当該遺伝子の発現を促進させることができる。
前記宿主としては、前述した生物種のうち、ゲノム上にTRTRX遺伝子を有するものを好適に用いることができる。

プロモーターの入れ替えに用いるプロモーターとしては特に限定されず、TRTRX遺伝子のプロモーターよりも転写活性が高く、脂肪酸の生産に適したものから適宜選択することができる。
宿主としてナンノクロロプシス属に属する藻類を用いる場合には、チューブリンプロモーター、ヒートショックプロテインプロモーター、ビオラキサンチン／クロロフィルａ結合タンパク質遺伝子のプロモーター（VCP1プロモーター、VCP2プロモーター）、及びナンノクロロプシス属由来のオレオシン様タンパクＬＤＳＰ遺伝子のプロモーター、GSプロモーター、及びAMTプロモーターを好ましく用いることができる。脂質の生産性向上の観点から、脂肪酸合成経路やTAG合成経路に関わる遺伝子のプロモーターや窒素同化に関わる遺伝子のプロモーターが好ましく、ＬＤＳＰ遺伝子のプロモーター、ACPプロモーター、デサチュラーゼ遺伝子のプロモーター、ATプロモーター、GSプロモーター、及びAMTプロモーターがより好ましく、ＬＤＳＰ遺伝子のプロモーターがより好ましい。

前述のプロモーターの改変は、相同組換えなどの常法に従い行うことができる。具体的には、標的とするプロモーターの上流、下流領域を含み、標的プロモーターに代えて別のプロモーターを含む直鎖状のＤＮＡ断片を構築し、これを宿主細胞に取り込ませ、宿主ゲノムの標的プロモーターの上流側と下流側とで２回交差の相同組換えを起こす。その結果、ゲノム上の標的プロモーターが別のプロモーター断片と置換され、プロモーターを改変することができる。
このような相同組換えによる標的プロモーターの改変方法は、例えば、Methods in molecular biology,1995, vol. 47, p. 291-302等の文献を参考に行うことができる。特に、宿主がナンノクロロプシス属に属する藻類の場合、Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2011, vol. 108(52)等の文献を参考にして、相同組換え法によりゲノム中の特定の領域を改変することができる。

本発明の形質転換体は、脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質の生産性、特に一定期間培養後の総脂肪酸量、が、前記TRTRX遺伝子の発現が促進されていない宿主と比較して向上している。したがって、本発明の形質転換体を適切な条件で培養し、次いで得られた培養物から脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質を回収すれば、脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質を効率よく製造することができる。
ここで「培養物」とは培養した後の培養液及び形質転換体をいう。

本発明の形質転換体の培養条件は、形質転換体の宿主に応じて適宜選択することができ、その宿主に対して通常用いられる培養条件を使用できる。また脂肪酸の生産効率の点から、培地中に、例えば脂肪酸生合成系に関与する前駆物質としてグリセロール、酢酸、又はグルコース等を添加してもよい。

本発明において前記藻類の培養に用いる培地は天然海水又は人工海水をベースにしたものを使用してもよいし、市販の培養培地を使用してもよい。具体的な培地としては、ｆ／２培地、ＥＳＭ培地、ダイゴＩＭＫ培地、Ｌ１培地、ＭＮＫ培地、等を挙げることができる。なかでも、脂質の生産性向上及び栄養成分濃度の観点から、ｆ／２培地、ＥＳＭ培地、又はダイゴＩＭＫ培地が好ましく、ｆ／２培地、又はダイゴＩＭＫ培地がより好ましく、ｆ／２培地がさらに好ましい。藻類の生育促進、脂肪酸の生産性向上のため、培地に、窒素源、リン源、金属塩、ビタミン類、微量金属等を適宜添加することができる。
培地に接種する形質転換体の量は適宜選択することができ、生育性の点から培地当り１〜５０％（vol/vol）が好ましく、１〜１０％（vol/vol）がより好ましい。培養温度は、藻類の増殖に悪影響を与えない範囲であれば特に制限されないが、通常、５〜４０℃の範囲である。藻類の生育促進、脂肪酸の生産性向上、及び生産コストの低減の観点から、好ましくは１０〜３５℃であり、より好ましくは１５〜３０℃である。
また藻類の培養は、光合成ができるよう光照射下で行うことが好ましい。光照射は、光合成が可能な条件であればよく、人工光でも太陽光でもよい。光照射時の光強度としては、藻類の生育促進、脂肪酸の生産性向上の観点から、好ましくは１〜４，０００μmol/m²/sの範囲、より好ましくは１０〜２，５００μmol/m²/sの範囲、より好ましくは１００〜２，５００μmol/m²/sの範囲、より好ましくは２００〜２，５００μmol/m²/sの範囲、より好ましくは２５０〜２，５００μmol/m²/sの範囲、より好ましくは３００〜２，５００μmol/m²/sの範囲である。また、光照射の間隔は、特に制限されないが、前記と同様の観点から、明暗周期で行うことが好ましく、２４時間のうち明期が好ましくは８〜２４時間、より好ましくは１０〜１８時間、さらに好ましくは１２時間である。
また藻類の培養は、光合成ができるように二酸化炭素を含む気体の存在下、又は炭酸水素ナトリウムなどの炭酸塩を含む培地で行うことが好ましい。気体中の二酸化炭素の濃度は特に限定されないが、生育促進、脂肪酸の生産性向上の観点から０．０３（大気条件と同程度）〜１０％が好ましく、より好ましくは０．０５〜５％、さらに好ましくは０．１〜３％、よりさらに好ましくは０．３〜１％である。炭酸塩の濃度は特に限定されないが、例えば炭酸水素ナトリウムを用いる場合、生育促進、脂肪酸の生産性向上の観点から０．０１〜５質量％が好ましく、より好ましくは０．０５〜２質量％、さらに好ましくは０．１〜１質量％である。
培養時間は特に限定されず、脂質を高濃度に蓄積する藻体が高い濃度で増殖できるように、長期間（例えば１５０日程度）行なってもよい。藻類の生育促進、脂肪酸の生産性向上、及び生産コストの低減の観点から、培養期間は、好ましくは３〜９０日間、より好ましくは７〜３０日間、さらに好ましくは１４〜２１日間である。なお、培養は、通気攪拌培養、振とう培養又は静置培養のいずれでもよく、通気性の向上の観点から、通気撹拌培養が好ましい。

培養物から脂質を採取する方法としては、常法から適宜選択することができる。例えば、前述の培養物から、ろ過、遠心分離、細胞の破砕、ゲルろ過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、クロロホルム／メタノール抽出法、ヘキサン抽出法、又はエタノール抽出法等により脂質成分を単離、回収することができる。より大規模な培養を行った場合は、培養物より油分を圧搾又は抽出により回収後、脱ガム、脱酸、脱色、脱蝋、脱臭等の一般的な精製を行い、脂質を得ることができる。このように脂質成分を単離した後、単離した脂質を加水分解することで脂肪酸を得ることができる。脂質成分から脂肪酸を単離する方法としては、例えば、アルカリ溶液中で７０℃程度の高温で処理をする方法、リパーゼ処理をする方法、又は高圧熱水を用いて分解する方法等が挙げられる。

本発明の製造方法において製造される脂質は、その利用性の点から、脂肪酸又は脂肪酸化合物を含んでいることが好ましく、炭素原子数が２以上２２以下の脂肪酸又はその脂肪酸エステル化合物を含んでいることがより好ましく、炭素原子数が４以上２２以下の脂肪酸又はその脂肪酸エステル化合物を含んでいることがより好ましく、炭素原子数が６以上２２以下の脂肪酸又はその脂肪酸エステル化合物を含んでいることがより好ましく、炭素原子数が８以上２２以下の脂肪酸又はその脂肪酸エステル化合物を含んでいることがより好ましく、炭素原子数が１０以上２２以下の脂肪酸又はその脂肪酸エステル化合物を含んでいることがより好ましく、炭素原子数が１２以上２０以下の脂肪酸又は脂肪酸エステル化合物を含んでいることがさらに好ましい。
脂質中に含まれる脂肪酸エステル化合物は、生産性の点から、単純脂質又は複合脂質が好ましく、単純脂質がさらに好ましく、TAGがさらにより好ましい。

本発明の製造方法により得られる脂肪酸は、食用として用いる他、可塑剤、化粧品等の乳化剤、石鹸や洗剤等の洗浄剤、繊維処理剤、毛髪リンス剤、又は殺菌剤や防腐剤として利用することができる。

上述した実施形態に関し、本発明はさらに以下の脂肪酸の製造方法、脂肪生産性の向上方法、藻類、形質転換体、及び形質転換体の作製方法を開示する。

＜１＞ＴＲＸドメイン及びＴＲドメインを有するタンパク質をコードする遺伝子の発現を促進させた藻類を培養し、脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質を生産させる、脂質の製造方法。

＜２＞ＴＲＸドメイン及びＴＲドメインを有するタンパク質をコードする遺伝子の発現を促進させ、藻類の細胞内で生産される脂肪酸の総量を向上させる、脂質生産性の向上方法。
＜３＞前記ＴＲＸドメイン及びＴＲドメインを有するタンパク質をコードする遺伝子を宿主に導入して、前記遺伝子の発現を促進させる、前記＜１＞又は＜２＞項に記載の方法。
＜４＞ＴＲＸドメイン及びＴＲドメインを有するタンパク質をコードする遺伝子を導入した藻類の形質転換体を培養して、脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質を生産させる、脂質の製造方法。
＜５＞ＴＲＸドメイン及びＴＲドメインを有するタンパク質をコードする遺伝子を宿主に導入して藻類の形質転換体を作製し、形質転換体の細胞内で生産される脂肪酸の総量を向上させる、脂質生産性の向上方法。

＜６＞前記藻類が、不等毛植物門に属する藻類、好ましくは真正眼点藻綱に属する藻類である、前記＜１＞〜＜５＞のいずれか１項記載の方法。
＜７＞前記真正眼点藻綱に属する藻類が、ナンノクロロプシス属に属する藻類である、前記＜６＞項記載の方法。
＜８＞前記ナンノクロロプシス属に属する藻類が、ナンノクロロプシス・オセアニカ、ナンノクロロプシス・オキュラータ、ナンノクロロプシス・ガディタナ、ナンノクロロプシス・サリナ、ナンノクロロプシス・リムネティカ、ナンノクロロプシス・グラニュラータ、ナンノクロロプシス・エスピー、からなる群より選ばれる少なくとも１つの藻類、好ましくはナンノクロロプシス・オセアニカ、である、前記＜７＞項記載の方法。

＜９＞前記ＴＲＸドメインが、ＣＸＸＣモチーフ配列、好ましくはＣＧＰＣモチーフ配列を有するＴＲＸドメインである、前記＜１＞〜＜８＞のいずれか１項記載の方法。
＜１０＞前記ＴＲドメインが、ＣＸＸＣモチーフ配列、好ましくはＣＡＩＣモチーフ配列を有するＴＲドメインである、前記＜１＞〜＜９＞のいずれか１項記載の方法。
＜１１＞前記ＴＲＸドメイン及びＴＲドメインを有するタンパク質の全長が、好ましくは２，０００アミノ酸残基以下、より好ましくは１，５００アミノ酸残基以下、より好ましくは１，０００アミノ酸残基以下、より好ましくは８００アミノ酸残基以下、より好ましくは７００アミノ酸残基以下、さらに好ましくは６５０アミノ酸残基以下、である、前記＜１＞〜＜１０＞のいずれか１項記載の方法。
＜１２＞前記ＴＲＸドメイン及びＴＲドメインを有するタンパク質の全長が、２００アミノ酸残基以上、好ましくは３００アミノ酸残基以上、より好ましくは４００アミノ酸残基以上である、前記＜１＞〜＜１１＞のいずれか１項記載の方法。
＜１３＞前記ＴＲＸドメイン及びＴＲドメインを有するタンパク質をコードする遺伝子の全長が、好ましくは６，０００塩基以下、より好ましくは４，５００塩基以下、より好ましくは３，０００塩基以下、より好ましくは２，４００塩基以下、より好ましくは２，１００塩基以下、さらに好ましくは１，９００塩基以下、である、前記＜１＞〜＜１２＞のいずれか１項記載の方法。
＜１４＞前記ＴＲＸドメイン及びＴＲドメインを有するタンパク質をコードする遺伝子の全長が、６００塩基以上、好ましくは９００塩基以上、より好ましくは１，２００塩基以上である、前記＜１＞〜＜１３＞のいずれか１項記載の方法。

＜１５＞前記ＴＲＸドメインが、下記アミノ酸配列（Ａ）〜（Ｄ）からなる群より選ばれるいずれか１つのアミノ酸配列からなるドメインである、前記＜１＞〜＜１４＞のいずれか１項記載の方法。
（Ａ）配列番号１の５２９位〜６２９位までのアミノ酸配列。
（Ｂ）アミノ酸配列（Ａ）との同一性が６０％以上、好ましくは６５％以上、より好ましくは７０％以上、より好ましくは７５％以上、より好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９１％以上、より好ましくは９３％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、さらに好ましくは９９％以上、であり、ＴＲＸ活性を有するＴＲＸドメインを構成するアミノ酸配列。
（Ｃ）配列番号３の５２５位〜６２５位までのアミノ酸配列。
（Ｄ）アミノ酸配列（Ｃ）との同一性が６０％以上、好ましくは６５％以上、より好ましくは７０％以上、より好ましくは７５％以上、より好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９１％以上、より好ましくは９３％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、さらに好ましくは９９％以上、であり、ＴＲＸ活性を有するＴＲＸドメインを構成するアミノ酸配列。
＜１６＞前記アミノ酸配列（Ｂ）が、前記アミノ酸配列（Ａ）のアミノ酸配列に、１又は複数個、好ましくは１個以上４０個以下、より好ましくは１個以上３５個以下、より好ましくは１個以上３０個以下、より好ましくは１個以上２５個以下、より好ましくは１個以上２０個以下、より好ましくは１個以上１５個以下、より好ましくは１個以上１０個以下、より好ましくは１個以上９個以下、より好ましくは１個以上７個以下、より好ましくは１個以上５個以下、より好ましくは１個以上３個以下、より好ましくは１個又は２個、さらに好ましくは１個、のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されており、かつＴＲＸ活性を有するＴＲＸドメインを構成するアミノ酸配列である、前記＜１５＞項に記載の方法。
＜１７＞前記タンパク質（Ｄ）が、前記タンパク質（Ｃ）のアミノ酸配列に、１又は複数個、好ましくは１個以上４０個以下、より好ましくは１個以上３５個以下、より好ましくは１個以上３０個以下、より好ましくは１個以上２５個以下、より好ましくは１個以上２０個以下、より好ましくは１個以上１５個以下、より好ましくは１個以上１０個以下、より好ましくは１個以上９個以下、より好ましくは１個以上７個以下、より好ましくは１個以上５個以下、より好ましくは１個以上３個以下、より好ましくは１個又は２個、さらに好ましくは１個、のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されており、かつＴＲＸ活性を有するＴＲＸドメインを構成するアミノ酸配列である、前記＜１５＞項に記載の方法。
＜１８＞前記ＴＲＸドメインをコードするＤＮＡが、下記塩基配列（ａ）〜（ｄ）からなる群より選ばれるいずれか１つの塩基配列からなるＤＮＡである、前記＜１＞〜＜１７＞のいずれか１項記載の方法。
（ａ）配列番号２の１５８５位〜１８８７位までの塩基配列。
（ｂ）塩基配列（ａ）との同一性が６０％以上、好ましくは６５％以上、より好ましくは７０％以上、より好ましくは７５％以上、より好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９１％以上、より好ましくは９３％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、さらに好ましくは９９％以上であり、ＴＲＸ活性を有するＴＲＸドメインを構成するアミノ酸配列をコードする塩基配列。
（ｃ）配列番号４の１５７３位〜１８７５位までの塩基配列。
（ｄ）塩基配列（ｃ）との同一性が６０％以上、好ましくは６５％以上、より好ましくは７０％以上、より好ましくは７５％以上、より好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９１％以上、より好ましくは９３％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、さらに好ましくは９９％以上であり、ＴＲＸ活性を有するＴＲＸドメインを構成するアミノ酸配列をコードする塩基配列。
＜１９＞前記塩基配列（ｂ）が、前記塩基配列（ａ）の配列に、１若しくは複数個、好ましくは１個以上１２１個以下、好ましくは１個以上１０６個以下、より好ましくは１個以上９０個以下、より好ましくは１個以上７５個以下、より好ましくは１個以上６０個以下、より好ましくは１個以上４５個以下、より好ましくは１個以上３０個以下、より好ましくは１個以上２７個以下、より好ましくは１個以上２１個以下、より好ましくは１個以上１５個以下、より好ましくは１個以上９個以下、より好ましくは１個以上６個以下、さらに好ましくは１個以上３個以下、の塩基が欠失、置換、挿入、又は付加されており、かつＴＲＸ活性を有するＴＲＸドメインを構成するアミノ酸配列をコードする塩基配列である、前記＜１８＞記載の方法。
＜２０＞前記塩基配列（ｄ）が、前記塩基配列（ｃ）の配列に、１若しくは複数個、好ましくは１個以上１２１個以下、好ましくは１個以上１０６個以下、より好ましくは１個以上９０個以下、より好ましくは１個以上７５個以下、より好ましくは１個以上６０個以下、より好ましくは１個以上４５個以下、より好ましくは１個以上３０個以下、より好ましくは１個以上２７個以下、より好ましくは１個以上２１個以下、より好ましくは１個以上１５個以下、より好ましくは１個以上９個以下、より好ましくは１個以上６個以下、さらに好ましくは１個以上３個以下、の塩基が欠失、置換、挿入、又は付加されており、かつＴＲＸ活性を有するＴＲＸドメインを構成するアミノ酸配列をコードする塩基配列である、前記＜１８＞記載の方法。

＜２１＞前記ＴＲドメインが、下記アミノ酸配列（Ｅ）〜（Ｈ）からなる群より選ばれるいずれか１つのアミノ酸配列からなるドメインである、前記＜１＞〜＜２０＞のいずれか１項記載の方法。
（Ｅ）配列番号１の１３７位〜４４８位までのアミノ酸配列。
（Ｆ）アミノ酸配列（Ｅ）との同一性が６０％以上、好ましくは６５％以上、より好ましくは７０％以上、より好ましくは７５％以上、より好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９１％以上、より好ましくは９３％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、さらに好ましくは９９％以上、であり、ＴＲ活性を有するＴＲドメインを構成するアミノ酸配列。
（Ｇ）配列番号３の１３４位〜４４５位までのアミノ酸配列。
（Ｈ）アミノ酸配列（Ｇ）との同一性が６０％以上、好ましくは６５％以上、より好ましくは７０％以上、より好ましくは７５％以上、より好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９１％以上、より好ましくは９３％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、さらに好ましくは９９％以上、であり、ＴＲ活性を有するＴＲドメインを構成するアミノ酸配列。
＜２２＞前記タンパク質（Ｆ）が、前記タンパク質（Ｅ）のアミノ酸配列に、１又は複数個、好ましくは１個以上１２４個以下、好ましくは１個以上１０９個以下、より好ましくは１個以上９３個以下、より好ましくは１個以上７８個以下、より好ましくは１個以上６２個以下、より好ましくは１個以上４６個以下、より好ましくは１個以上３１個以下、より好ましくは１個以上２８個以下、より好ましくは１個以上２１個以下、より好ましくは１個以上１５個以下、より好ましくは１個以上９個以下、より好ましくは１個以上６個以下、さらに好ましくは１個以上３個以下、のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されており、かつＴＲ活性を有するＴＲドメインを構成するアミノ酸配列である、前記＜２１＞項に記載の方法。
＜２３＞前記タンパク質（Ｈ）が、前記タンパク質（Ｇ）のアミノ酸配列に、１又は複数個、好ましくは１個以上１２４個以下、好ましくは１個以上１０９個以下、より好ましくは１個以上９３個以下、より好ましくは１個以上７８個以下、より好ましくは１個以上６２個以下、より好ましくは１個以上４６個以下、より好ましくは１個以上３１個以下、より好ましくは１個以上２８個以下、より好ましくは１個以上２１個以下、より好ましくは１個以上１５個以下、より好ましくは１個以上９個以下、より好ましくは１個以上６個以下、さらに好ましくは１個以上３個以下、のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されており、かつＴＲ活性を有するＴＲドメインを構成するアミノ酸配列である、前記＜２１＞項に記載の方法。
＜２４＞前記ＴＲドメインをコードするＤＮＡが、下記塩基配列（ｅ）〜（ｈ）からなる群より選ばれるいずれか１つの塩基配列からなるＤＮＡである、前記＜１＞〜＜２３＞のいずれか１項記載の方法。
（ｅ）配列番号２の４０９位〜１３４４位までの塩基配列。
（ｆ）塩基配列（ｅ）との同一性が６０％以上、好ましくは６５％以上、より好ましくは７０％以上、より好ましくは７５％以上、より好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９１％以上、より好ましくは９３％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、さらに好ましくは９９％以上であり、ＴＲ活性を有するＴＲドメインを構成するアミノ酸配列をコードする塩基配列。
（ｇ）配列番号４の４００位〜１３３５位までの塩基配列。
（ｈ）塩基配列（ｇ）との同一性が６０％以上、好ましくは６５％以上、より好ましくは７０％以上、より好ましくは７５％以上、より好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９１％以上、より好ましくは９３％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、さらに好ましくは９９％以上であり、ＴＲ活性を有するＴＲドメインを構成するアミノ酸配列をコードする塩基配列。
＜２５＞前記塩基配列（ｆ）が、前記塩基配列（ｅ）の配列に、１若しくは複数個、好ましくは１個以上３７４個以下、好ましくは１個以上３２７個以下、より好ましくは１個以上２８０個以下、より好ましくは１個以上２３４個以下、より好ましくは１個以上１８７個以下、より好ましくは１個以上１４０個以下、より好ましくは１個以上９３個以下、より好ましくは１個以上８４個以下、より好ましくは１個以上６５個以下、より好ましくは１個以上４６個以下、より好ましくは１個以上２８個以下、より好ましくは１個以上１８個以下、さらに好ましくは１個以上９個以下、の塩基が欠失、置換、挿入、又は付加されており、かつＴＲ活性を有するＴＲドメインを構成するアミノ酸配列をコードする塩基配列である、前記＜２４＞記載の方法。
＜２６＞前記塩基配列（ｈ）が、前記塩基配列（ｇ）の配列に、１若しくは複数個、好ましくは１個以上３７４個以下、好ましくは１個以上３２７個以下、より好ましくは１個以上２８０個以下、より好ましくは１個以上２３４個以下、より好ましくは１個以上１８７個以下、より好ましくは１個以上１４０個以下、より好ましくは１個以上９３個以下、より好ましくは１個以上８４個以下、より好ましくは１個以上６５個以下、より好ましくは１個以上４６個以下、より好ましくは１個以上２８個以下、より好ましくは１個以上１８個以下、さらに好ましくは１個以上９個以下、の塩基が欠失、置換、挿入、又は付加されており、かつＴＲ活性を有するＴＲドメインを構成するアミノ酸配列をコードする塩基配列である、前記＜２４＞記載の方法。

＜２７＞前記ＴＲＸドメイン及びＴＲドメインを有するタンパク質が、下記タンパク質（Ｉ）〜（Ｌ）からなる群より選ばれるいずれか１つのタンパク質である、前記＜１＞〜＜２６＞のいずれか１項記載の方法。

（Ｉ）配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
（Ｊ）前記タンパク質（Ｉ）のアミノ酸配列と同一性が６０％以上、好ましくは６５％以上、より好ましくは７０％以上、より好ましくは７５％以上、より好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９１％以上、より好ましくは９３％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、さらに好ましくは９９％以上、のアミノ酸配列からなり、かつＴＲＸ活性及びＴＲ活性を有するＴＲＸドメイン及びＴＲドメインを含むタンパク質。
（Ｋ）配列番号３で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
（Ｌ）前記タンパク質（Ｋ）のアミノ酸配列と同一性が６０％以上、好ましくは６５％以上、より好ましくは７０％以上、より好ましくは７５％以上、より好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９１％以上、より好ましくは９３％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、さらに好ましくは９９％以上、のアミノ酸配列からなり、かつＴＲＸ活性及びＴＲ活性を有するＴＲＸドメイン及びＴＲドメインを含むタンパク質。
＜２８＞前記タンパク質（Ｊ）が、前記タンパク質（Ｉ）のアミノ酸配列に、１又は複数個、好ましくは１個以上２５４個以下、好ましくは１個以上２２２個以下、より好ましくは１個以上１９０個以下、より好ましくは１個以上１５８個以下、より好ましくは１個以上１２７個以下、より好ましくは１個以上９５個以下、より好ましくは１個以上６３個以下、より好ましくは１個以上５７個以下、より好ましくは１個以上４４個以下、より好ましくは１個以上３１個以下、より好ましくは１個以上１９個以下、より好ましくは１個以上１２個以下、さらに好ましくは１個以上６個以下、のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されており、ＴＲＸドメイン及びＴＲドメインを有し、ＴＲＸ活性及びＴＲ活性を有するタンパク質である、前記＜２７＞項に記載の方法。
＜２９＞前記タンパク質（Ｌ）が、前記タンパク質（Ｋ）のアミノ酸配列に、１又は複数個、好ましくは１個以上２５３個以下、好ましくは１個以上２２１個以下、より好ましくは１個以上１８９個以下、より好ましくは１個以上１５８個以下、より好ましくは１個以上１２６個以下、より好ましくは１個以上９４個以下、より好ましくは１個以上６３個以下、より好ましくは１個以上５６個以下、より好ましくは１個以上４４個以下、より好ましくは１個以上３１個以下、より好ましくは１個以上１８個以下、より好ましくは１個以上１２個以下、さらに好ましくは１個以上６個以下、のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されており、ＴＲＸドメイン及びＴＲドメインを有し、ＴＲＸ活性及びＴＲ活性を有するタンパク質である、前記＜２７＞項に記載の方法。
＜３０＞前記ＴＲＸドメイン及びＴＲドメインを有するタンパク質をコードする遺伝子が、下記ＤＮＡ（ｉ）〜（ｌ）からなる群より選ばれるいずれか１つのＤＮＡからなる遺伝子である、前記＜１＞〜＜２９＞のいずれか１項記載の方法。
（ｉ）配列番号２で表される塩基配列からなるＤＮＡ。
（ｊ）前記ＤＮＡ（ｉ）の塩基配列と同一性が６０％以上、好ましくは６５％以上、より好ましくは７０％以上、より好ましくは７５％以上、より好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９１％以上、より好ましくは９３％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、さらに好ましくは９９％以上、の塩基配列からなり、かつＴＲＸ活性及びＴＲ活性を有するＴＲＸドメイン及びＴＲドメインを含むタンパク質をコードするＤＮＡ。
（ｋ）配列番号４で表される塩基配列からなるＤＮＡ。
（ｌ）前記ＤＮＡ（ｋ）の塩基配列と同一性が６０％以上、好ましくは６５％以上、より好ましくは７０％以上、より好ましくは７５％以上、より好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９１％以上、より好ましくは９３％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、さらに好ましくは９９％以上、の塩基配列からなり、かつＴＲＸ活性及びＴＲ活性を有するＴＲＸドメイン及びＴＲドメインを含むタンパク質をコードするＤＮＡ。
＜３１＞前記ＤＮＡ（ｊ）が、前記ＤＮＡ（ｉ）の塩基配列に、１若しくは複数個、好ましくは１個以上７６３個以下、好ましくは１個以上６６７個以下、より好ましくは１個以上５７２個以下、より好ましくは１個以上４７７個以下、より好ましくは１個以上３８１個以下、より好ましくは１個以上２８６個以下、より好ましくは１個以上１９０個以下、より好ましくは１個以上１７１個以下、より好ましくは１個以上１３３個以下、より好ましくは１個以上９５個以下、より好ましくは１個以上５７個以下、より好ましくは１個以上３８個以下、さらに好ましくは１個以上１９個以下、の塩基が欠失、置換、挿入、若しくは付加された塩基配列からなり、かつＴＲＸ活性及びＴＲ活性を有するＴＲＸドメイン及びＴＲドメインを含むタンパク質をコードする遺伝子である、前記＜３０＞項記載の方法。
＜３２＞前記ＤＮＡ（ｌ）が、前記ＤＮＡ（ｋ）の塩基配列に、１若しくは複数個、好ましくは７６０個以下、好ましくは１個以上６６５個以下、より好ましくは１個以上５７０個以下、より好ましくは１個以上４７５個以下、より好ましくは１個以上３８０個以下、より好ましくは１個以上２８５個以下、より好ましくは１個以上１９０個以下、より好ましくは１個以上１７１個以下、より好ましくは１個以上１３３個以下、より好ましくは１個以上９５個以下、より好ましくは１個以上５７個以下、より好ましくは１個以上３８個以下、さらに好ましくは１個以上１９個以下、の塩基が欠失、置換、挿入、若しくは付加された塩基配列からなり、かつＴＲＸ活性及びＴＲ活性を有するＴＲＸドメイン及びＴＲドメインを含むタンパク質をコードする遺伝子である、前記＜３０＞項記載の方法。

＜３３＞前記藻類において、脂肪酸合成経路又はTAG合成経路に関わる少なくとも１種または２種以上のタンパク質の発現を促進させた、前記＜１＞〜＜３２＞のいずれか１項記載の方法。
＜３４＞前記脂肪酸合成経路又はTAG合成経路に関わる少なくとも１種または２種以上のタンパク質が、ACC、ACP、ホロ−ACPシンターゼ（ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼ）、MAT、KAS、KAR、HD、KAR、TE、ACS、G3PDH、AT(GPAT、LPAAT、及びDGAT等）、並びにPAPからなる群より選ばれる少なくとも１種または２種以上のタンパク質、好ましくはACC、ACP、KAS、TE、ACS、並びにAT(GPAT、LPAAT、及びDGAT等）からなる群より選ばれる少なくとも１種または２種以上のタンパク質、より好ましくはTE、ACS、並びにAT(GPAT、LPAAT、及びDGAT等）からなる群より選ばれる少なくとも１種または２種以上のタンパク質、さらに好ましくはTE、ACS、及びDGATからなる群より選ばれる少なくとも１種または２種以上のタンパク質、である、前記＜３３＞項記載の方法。
＜３５＞前記藻類において、DGAT、好ましくはACS及びDGAT、より好ましくはTE、ACS、及びDGATの発現が促進されている、前記＜１＞〜＜３４＞のいずれか１項記載の方法。
＜３６＞前記TEが、下記（Ｍ）又は（Ｎ）である、前記＜３４＞又は＜３５＞項記載の方法。
（Ｍ）配列番号３７で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
（Ｎ）前記タンパク質（Ｍ）のアミノ酸配列と同一性が５０％以上、より好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、のアミノ酸配列からなり、かつTE活性を有するタンパク質。
＜３７＞前記ACSが、下記（Ｏ）又は（Ｐ）である、前記＜３４＞〜＜３６＞のいずれか１項記載の方法。
（Ｏ）配列番号３５で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
（Ｐ）前記タンパク質（Ｏ）のアミノ酸配列と同一性が５０％以上、より好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、のアミノ酸配列からなり、かつACS活性を有するタンパク質。
＜３８＞前記ATが、下記（Ｑ）〜（Ｔ）からなる群より選ばれるいずれか１つのATである、前記＜３４＞〜＜３７＞のいずれか１項記載の方法。
（Ｑ）配列番号３３で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
（Ｒ）前記タンパク質（Ｑ）のアミノ酸配列と同一性が５０％以上、より好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、のアミノ酸配列からなり、かつAT活性を有するタンパク質。
（Ｓ）配列番号７６で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
（Ｔ）前記タンパク質（Ｓ）のアミノ酸配列と同一性が５０％以上、より好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、のアミノ酸配列からなり、かつAT活性を有するタンパク質。

＜３９＞前記藻類において、CBB回路に関わる少なくとも１種または２種以上のタンパク質の発現を促進させた、前記＜１＞〜＜３８＞のいずれか１項記載の方法。
＜４０＞前記CBB回路に関わる少なくとも１種または２種以上のタンパク質が、TK、FBA、及びRPIからなる群より選ばれる少なくとも１種または２種以上のタンパク質、である、前記＜３９＞項記載の方法。
＜４１＞前記藻類において、TK、好ましくはTK及びFBA、より好ましくはTK、FBA、及びRPIの発現が促進されている、前記＜１＞〜＜４０＞のいずれか１項記載の方法。
＜４２＞前記TKが、下記（Ｕ）又は（Ｖ）である、前記＜４０＞又は＜４１＞項記載の方法。
（Ｕ）配列番号２７で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
（Ｖ）前記タンパク質（Ｕ）のアミノ酸配列と同一性が５０％以上、より好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、のアミノ酸配列からなり、かつTK活性を有するタンパク質。
＜４３＞前記FBAが、下記（Ｗ）又は（Ｘ）である、前記＜４０＞〜＜４２＞のいずれか１項記載の方法。
（Ｗ）配列番号２９で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
（Ｘ）前記タンパク質（Ｗ）のアミノ酸配列と同一性が５０％以上、より好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、のアミノ酸配列からなり、かつFBA活性を有するタンパク質。
＜４４＞前記RPIが、下記（Ｙ）又は（Ｚ）である、前記＜４０＞〜＜４３＞のいずれか１項記載の方法。
（Ｙ）配列番号３１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
（Ｚ）前記タンパク質（Ｙ）のアミノ酸配列と同一性が５０％以上、より好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、のアミノ酸配列からなり、かつRPI活性を有するタンパク質。

＜４５＞前記脂質が、脂肪酸又はその脂肪酸エステル化合物、好ましくは炭素原子数が２以上２２以下の脂肪酸又はその脂肪酸エステル化合物、より好ましくは炭素原子数が４以上２２以下の脂肪酸又はその脂肪酸エステル化合物、より好ましくは炭素原子数が６以上２２以下の脂肪酸又はその脂肪酸エステル化合物、より好ましくは炭素原子数が８以上２２以下の脂肪酸又はその脂肪酸エステル化合物、より好ましくは炭素原子数が１０以上２２以下の脂肪酸又はその脂肪酸エステル化合物、さらに好ましくは炭素原子数が１２以上２０以下の脂肪酸又は脂肪酸エステル化合物、を含む、前記＜１＞〜＜４４＞のいずれか１項記載の方法。
＜４６＞前記遺伝子の発現が、栄養欠乏条件や強光条件において強く発現するプロモーター、より好ましくは脂肪酸合成経路やTAG合成経路に関わる遺伝子のプロモーター又は窒素同化に関わる遺伝子のプロモーター、より好ましくはＬＤＳＰ遺伝子のプロモーター、ACPプロモーター、デサチュラーゼ遺伝子のプロモーター、ATプロモーター、GSプロモーター、又はAMTプロモーター、さらにより好ましくはＬＤＳＰ遺伝子のプロモーター、GSプロモーター、又はAMTプロモーターによって促進されている、前記＜１＞〜＜４５＞のいずれか１項記載の方法。
＜４７＞前記藻類を、光強度が１〜４，０００μmol/m²/sの範囲、好ましくは１０〜２，５００μmol/m²/sの範囲、より好ましくは１００〜２，５００μmol/m²/sの範囲、より好ましくは２００〜２，５００μmol/m²/sの範囲、より好ましくは２５０〜２，５００μmol/m²/sの範囲、より好ましくは３００〜２，５００μmol/m²/sの範囲、の条件で培養する、前記＜１＞〜＜４６＞のいずれか１項記載の方法。
＜４８＞窒素源及びリン源の濃度を増強したｆ／２培地を用いて前記藻類を培養する、前記＜１＞〜＜４７＞のいずれか１項記載の方法。

＜４９＞ＴＲＸドメイン及びＴＲドメインを有するタンパク質をコードする遺伝子の発現を促進させ、細胞内で生産される脂肪酸の総量を向上させた、藻類。
＜５０＞ＴＲＸドメインおよびＴＲドメインを有するタンパク質をコードする遺伝子を宿主に導入してなる、藻類の形質転換体。
＜５１＞ＴＲＸドメインおよびＴＲドメインを有するタンパク質をコードする遺伝子を宿主に導入する、藻類の形質転換体の作製方法。
＜５２＞前記藻類が、不等毛植物門に属する藻類、好ましくは真正眼点藻綱に属する藻類である、前記＜４９＞〜＜５１＞のいずれか１項記載の藻類、藻類の形質転換体、又はその作製方法。
＜５３＞前記真正眼点藻綱に属する藻類が、ナンノクロロプシス属に属する藻類である、前記＜５２＞項記載の藻類、藻類の形質転換体、又はその作製方法。
＜５４＞前記ナンノクロロプシス属に属する藻類が、ナンノクロロプシス・オセアニカ、ナンノクロロプシス・オキュラータ、ナンノクロロプシス・ガディタナ、ナンノクロロプシス・サリナ、ナンノクロロプシス・リムネティカ、ナンノクロロプシス・グラニュラータ、ナンノクロロプシス・エスピー、からなる群より選ばれる少なくとも１つの藻類、好ましくはナンノクロロプシス・オセアニカ、である、前記＜５３＞項記載の藻類、藻類の形質転換体、又はその作製方法。
＜５５＞前記ＴＲＸドメインが、前記＜９＞及び＜１５＞〜＜２０＞のいずれか１項で規定するＴＲＸドメインである、前記＜４９＞〜＜５４＞のいずれか１項記載の藻類、藻類の形質転換体、又はその作製方法。
＜５６＞前記ＴＲドメインが、前記＜１０＞及び＜２１＞〜＜２６＞のいずれか１項で規定するＴＲドメインである、前記＜４９＞〜＜５５＞のいずれか１項記載の藻類、藻類の形質転換体、又はその作製方法。
＜５７＞前記ＴＲＸドメイン及びＴＲドメインを有するタンパク質が、前記＜１１＞、＜１２＞、及び＜２７＞〜＜２９＞のいずれか１項で規定するタンパク質である、前記＜４９＞〜＜５６＞のいずれか１項記載の藻類、藻類の形質転換体、又はその作製方法。
＜５８＞前記ＴＲＸドメイン及びＴＲドメインを有するタンパク質をコードする遺伝子が、前記＜１３＞、＜１４＞、及び＜３０＞〜＜３２＞のいずれか１項で規定するタンパク質である、前記＜４９＞〜＜５７＞のいずれか１項記載の藻類、藻類の形質転換体、又はその作製方法。

＜５９＞前記藻類において、脂肪酸合成経路又はTAG合成経路に関わる少なくとも１種または２種以上のタンパク質の発現が促進している、前記＜４９＞〜＜５８＞のいずれか１項記載の藻類、藻類の形質転換体、又はその作製方法。
＜６０＞前記脂肪酸合成経路又はTAG合成経路に関わる少なくとも１種または２種以上のタンパク質が、ACC、ACP、ホロ−ACPシンターゼ（ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼ）、MAT、KAS、KAR、HD、KAR、TE、ACS、G3PDH、AT(GPAT、LPAAT、及びDGAT等）、並びにPAPからなる群より選ばれる少なくとも１種または２種以上のタンパク質、好ましくはACC、ACP、KAS、TE、ACS、並びにAT(GPAT、LPAAT、及びDGAT等）からなる群より選ばれる少なくとも１種または２種以上のタンパク質、より好ましくはTE、ACS、並びにAT(GPAT、LPAAT、及びDGAT等）からなる群より選ばれる少なくとも１種または２種以上のタンパク質、さらに好ましくTE、ACS、及びDGATからなる群より選ばれる少なくとも１種または２種以上のタンパク質、である、前記＜５９＞項記載の藻類、藻類の形質転換体、又はその作製方法。
＜６１＞前記藻類において、DGAT、好ましくはACS及びDGAT、より好ましくはTE、ACS、及びDGATの発現が促進されている、前記＜４９＞〜＜６０＞のいずれか１項記載の藻類、藻類の形質転換体、又はその作製方法。
＜６２＞前記TEが前記＜３６＞項で規定するタンパク質である、前記＜６０＞又は＜６１＞記載の藻類、藻類の形質転換体、又はその作製方法。
＜６３＞前記ACSが前記＜３７＞項で規定するタンパク質である、前記＜６０＞〜＜６２＞のいずれか１項記載の藻類、藻類の形質転換体、又はその作製方法。
＜６４＞前記DGATが前記＜３８＞項で規定するタンパク質である、前記＜６０＞〜＜６３＞のいずれか１項記載の藻類、藻類の形質転換体、又はその作製方法。

＜６５＞前記藻類において、CBB回路に関わる少なくとも１種または２種以上のタンパク質の発現の発現が促進している、前記＜４９＞〜＜６４＞のいずれか１項記載の藻類、藻類の形質転換体、又はその作製方法。
＜６６＞前記CBB回路に関わる少なくとも１種または２種以上のタンパク質が、TK、FBA、及びRPIからなる群より選ばれる少なくとも１種または２種以上のタンパク質、である、前記＜６５＞項記載の藻類、藻類の形質転換体、又はその作製方法。
＜６７＞前記藻類において、TK、好ましくはTK及びFBA、より好ましくはTK、FBA、及びRPIの発現が促進されている、前記＜４９＞〜＜６６＞のいずれか１項記載の藻類、藻類の形質転換体、又はその作製方法。
＜６８＞前記TKが前記＜４２＞項で規定するタンパク質である、前記＜６６＞又は＜６７＞記載の藻類、藻類の形質転換体、又はその作製方法。
＜６９＞前記FBAが前記＜４３＞項で規定するタンパク質である、前記＜６６＞〜＜６８＞のいずれか１項記載の藻類、藻類の形質転換体、又はその作製方法。
＜７０＞前記RPIが前記＜４４＞項で規定するタンパク質である、前記＜６６＞〜＜６９＞のいずれか１項記載の藻類、藻類の形質転換体、又はその作製方法。
＜７１＞前記遺伝子の発現が、栄養欠乏条件や強光条件において強く発現するプロモーター、好ましくは脂肪酸合成経路やTAG合成経路に関わる遺伝子のプロモーター又は窒素同化に関わる遺伝子のプロモーター、より好ましくはＬＤＳＰ遺伝子のプロモーター、ACPプロモーター、デサチュラーゼ遺伝子のプロモーター、ATプロモーター、GSプロモーター、又はAMTプロモーター、さらに好ましくはＬＤＳＰ遺伝子のプロモーター、GSプロモーター、又はAMTプロモーターによって促進されている、前記＜４９＞〜＜７０＞のいずれか１項記載の藻類、藻類の形質転換体、又はその作製方法。

＜７２＞脂質を製造するための、前記＜４９＞〜＜７１＞のいずれか１項記載の藻類、藻類の形質転換体、又はその作製方法により作製された形質転換体の使用。
＜７３＞前記脂質が、脂肪酸又はその脂肪酸エステル化合物、好ましくは炭素原子数が２以上２２以下の脂肪酸又はその脂肪酸エステル化合物、より好ましくは炭素原子数が４以上２２以下の脂肪酸又はその脂肪酸エステル化合物、より好ましくは炭素原子数が６以上２２以下の脂肪酸又はその脂肪酸エステル化合物、より好ましくは炭素原子数が８以上２２以下の脂肪酸又はその脂肪酸エステル化合物、より好ましくは炭素原子数が１０以上２２以下の脂肪酸又はその脂肪酸エステル化合物、さらに好ましくは炭素原子数が１２以上２０以下の脂肪酸又は脂肪酸エステル化合物、を含む、前記＜７２＞項記載の使用。

以下、本発明を実施例に基づきさらに詳細に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。ここで、本実施例で用いたプライマーの塩基配列を表１及び表２に示す。

実施例１ NoTRTRX遺伝子発現用プラスミドの作製、ナンノクロロプシスへの形質転換、および形質転換体による脂質の製造
１．ゼオシン耐性遺伝子発現用プラスミドの構築
ゼオシン耐性遺伝子（配列番号５）、及び文献（Randor Radakovits, et al., Nature Communications, DOI:10.1038/ncomms1688, 2012）記載のナンノクロロプシス・ガディタナCCMP526株由来チューブリンプロモーター配列（配列番号６）を人工合成した。合成したＤＮＡ断片を鋳型として、表１に示す配列番号１０及び配列番号１１のプライマー対、配列番号１２及び配列番号１３のプライマー対を用いてＰＣＲを行い、ゼオシン耐性遺伝子及びチューブリンプロモーター配列をそれぞれ増幅した。また、ナンノクロロプシス・オセアニカNIES-2145株のゲノムＤＮＡを鋳型として、表１に示す配列番号１４及び配列番号１５のプライマー対を用いてＰＣＲを行い、ヒートショックプロテインターミネーター配列（配列番号７）を増幅した。さらに、プラスミドベクターpUC19（タカラバイオ社製）を鋳型として、表１に示す配列番号１６及び配列番号１７のプライマー対を用いたＰＣＲを行い、プラスミドベクターpUC19断片を増幅した。
これら４つの増幅断片をそれぞれ制限酵素DpnI（東洋紡株式会社製）にて処理し、High Pure PCR Product Purification Kit（Roche Applied Science社製)を用いて精製した。その後、得られた４つの断片をIn-Fusion HD Cloning Kit（Clontech社製）を用いて融合し、ゼオシン耐性遺伝子発現用プラスミドを構築した。なお、本発現プラスミドは、チューブリンプロモーター配列、ゼオシン耐性遺伝子、ヒートショックプロテインターミネーター配列の順に連結したインサート配列とpUC19ベクター配列からなる。

２．NoTRTRX遺伝子の取得、及びNoTRTRX遺伝子発現用プラスミドの構築
ナンノクロロプシス・オセアニカNIES-2145株の全ＲＮＡを抽出し、SuperScript（商標） III First-Strand Synthesis SuperMix for qRT-PCR（invitrogen社製）を用いて逆転写を行ってｃＤＮＡを得た。このｃＤＮＡを鋳型として、表１に示す配列番号２５及び配列番号２６のプライマー対を用いたＰＣＲにより、配列番号２の塩基配列からなるNoTRTRX遺伝子断片を取得した。また、ナンノクロロプシス・オセアニカNIES-2145株のゲノムＤＮＡを鋳型として、表１に示す配列番号１８及び配列番号１９のプライマー対、並びに配列番号２０及び配列番号２１のプライマー対を用いたＰＣＲを行い、ＬＤＳＰプロモーター配列断片（配列番号８）およびＶＣＰ１ターミネーター配列断片（配列番号９）を取得した。さらに、前記ゼオシン耐性遺伝子発現用プラスミドを鋳型として、表１に示す配列番号２２及び配列番号１７のプライマー対を用いたＰＣＲを行い、ゼオシン耐性遺伝子発現カセット（チューブリンプロモーター配列、ゼオシン耐性遺伝子、ヒートショックプロテインターミネーター配列）及びpUC19配列からなる断片を増幅した。
NoTRTRX遺伝子断片と、ＬＤＳＰプロモーター配列断片、ＶＣＰ１ターミネーター配列断片、ゼオシン耐性遺伝子発現カセット及びpUC19配列からなる断片とを、前述と同様の方法にて融合し、NoTRTRX遺伝子発現用プラスミドを構築した。なお、本発現プラスミドはＬＤＳＰプロモーター配列、NoTRTRX遺伝子、VCP1ターミネーター配列、チューブリンプロモーター配列、ゼオシン耐性遺伝子、ヒートショックプロテインターミネーター配列の順で連結したインサート配列とpUC19ベクター配列からなる。

３．NoTRTRX遺伝子発現カセットのナンノクロロプシスへの導入、及び形質転換体の培養
前記NoTRTRX遺伝子発現用プラスミドを鋳型として、表１に示す配列番号２３及び配列番号２４のプライマー対を用いたＰＣＲを行い、NoTRTRX遺伝子発現カセット（ＬＤＳＰプロモーター配列、NoTRTRX遺伝子、VCP1ターミネーター配列、チューブリンプロモーター配列、ゼオシン耐性遺伝子、ヒートショックプロテインターミネーター配列からなるＤＮＡ断片）を増幅した。

増幅した断片を、High Pure PCR Product Purification Kit（Roche Applied Science社製)を用いて精製した。なお、精製の際の溶出には、キットに含まれる溶出バッファーではなく、滅菌水を用いた。
約１０^９細胞のナンノクロロプシス・オセアニカNIES-2145株を、３８４ｍＭのソルビトール溶液で洗浄して塩を除去し、形質転換の宿主細胞として用いた。上記で増幅したNoTRTRX遺伝子発現カセット約５００ｎｇをそれぞれ宿主細胞に混和し、５０μＦ、５００Ω、２，２００ｖ／２ｍｍの条件でエレクトロポレーションを行った。ｆ／２液体培地（ＮａＮＯ_３ ７５ｍｇ、ＮａＨ_２ＰＯ_４・２Ｈ_２Ｏ ６ｍｇ、ビタミンＢ１２ ０．５μｇ、ビオチン ０．５μｇ、チアミン １００μｇ、Ｎａ_２ＳｉＯ_３・９Ｈ_２Ｏ １０ｍｇ、Ｎａ_２ＥＤＴＡ・２Ｈ_２Ｏ ４．４ｍｇ、ＦｅＣｌ_３・６Ｈ_２Ｏ ３．１６ｍｇ、ＣｏＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ １２μｇ、ＺｎＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ ２１μｇ、ＭｎＣｌ_２・４Ｈ_２Ｏ １８０μｇ、ＣｕＳＯ_４・５Ｈ_２Ｏ ７μｇ、Ｎａ_２ＭｏＯ_４・２Ｈ_２Ｏ ７μｇ／人工海水１Ｌ）にて２４時間回復培養を行った後に、２μｇ／ｍＬのゼオシン含有ｆ／２寒天培地に塗布し、２５℃、０．３％ＣＯ_２雰囲気下、１２ｈ／１２ｈ明暗条件にて２〜３週間培養した。得られたコロニーの中から、NoTRTRX遺伝子発現カセットを含むもの（NoTRTRX遺伝子導入株）をＰＣＲ法によりそれぞれ選抜した。選抜した株を、ｆ／２培地の窒素濃度を１５倍、リン濃度を５倍に増強した培地（以下、「Ｎ１５Ｐ５培地」ともいう）２０ｍＬに播種し、２５℃、０．３％ＣＯ_２雰囲気下、１２ｈ／１２ｈ明暗条件にて３週間振盪培養した。
この培養液２ｍＬを、ｆ／２培地の窒素濃度を５倍、リン濃度を５倍に増強した培地（以下、「Ｎ５Ｐ５培地」ともいう）１８ｍＬに植継ぎ、２５℃、０．３％ＣＯ_２雰囲気下、光強度約１００μmol/m²/s、１２ｈ／１２ｈ明暗条件にて５日間振盪培養し、前々培養液とした。96穴プレート及びInfinite M200 PRO (TECAN社)を用いて750 nm における濁度（以下、「OD₇₅₀」ともいう）を測定した。１８ｍＬのN5P5培地に対し、OD₇₅₀が終濃度0.1になるように前々培養液を播種し、同様の条件にて５日間培養し、前培養液とした。なお、光強度に関しては通常の光条件（１００μmol/m²/s）で行った。同様にしてOD₇₅₀が終濃度0.1になるように前培養液をN5P5培地１８ｍＬに播種し、前培養と同じ条件にて本培養を行った。なお、陰性対照として、野生株であるNIES-2145株についても同様に実験を行った。野生株についてＮ＝２で、NoTRTRX遺伝子導入株については独立した８ラインについて培養を行った。

４．ナンノクロロプシス培養液中の脂質の抽出及び構成脂肪酸の分析
本培養開始後、経時的にサンプリングを行い、以下の方法にて脂質抽出を行った。
培養液０．２５ｍＬに、内部標準として１ｍｇ/ｍＬのGlyceryl triheptadecanoate（シグマアルドリッチ）クロロホルム溶液を５０μＬ添加後、０．５ｍＬのクロロホルム及び１ｍＬのメタノールを培養液に添加して激しく攪拌後１０分間放置した。その後さらに、０．５ｍＬのクロロホルム及び０．５ｍＬの１．５％ＫＣｌを添加して攪拌後、３，０００ｒｐｍにて５分間遠心分離を行い、パスツールピペットにてクロロホルム層（下層）を回収した。得られたクロロホルム層に窒素ガスを吹き付けて乾固し、５０μＬのクロロホルムに再溶解した。０．５ｍＬの１４％三フッ化ホウ素溶液（SIGMA社製）を添加し撹拌した後に、８０℃にて３０分間恒温した。その後、ヘキサン０．５ｍＬ、飽和食塩水０．５ｍＬを添加し激しく撹拌し、室温にて１０分間放置後、上層であるヘキサン層を回収して脂肪酸エステルを得た。

得られた脂肪酸エステルをガスクロマトグラフィー解析に供した。測定条件を以下に示す。
＜ガスクロマトグラフィー条件＞
分析装置：7890A （Agilent technology）
キャピラリーカラム：ＤＢ−１ ＭＳ ３０ｍ×２００μｍ×０．２５μｍ（J＆W Scientific）
移動相：高純度ヘリウム
オーブン温度：150℃ 保持 0.5 分 → 150〜220℃（40℃/min昇温）→ 220〜320℃（20℃/min 昇温）→ 320℃保持 2 分（ポストラン 2 分）
注入口温度：300℃
注入方法：スプリット注入（スプリット比：７５：１）
注入量：１μＬ
洗浄バイアル：メタノール・クロロホルム
検出方法：ＦＩＤ
検出器温度：300℃

また、脂肪酸メチルエステルの同定は、各種脂肪酸メチルエステル標品を同条件にてガスクロマトグラフィーに供し、そのリテンションタイムを比較することにより行った。また、必要に応じてガスクロマトグラフ質量分析解析による同定を行った。
ガスクロマトグラフィー解析により得られた波形データのピーク面積より、各脂肪酸のメチルエステル量を定量した。各ピーク面積を、内部標準由来のＣ１７脂肪酸メチルエステルのピーク面積と比較することで試料間の補正を行い、培養液１リットルあたりの各脂肪酸量を算出した。さらに、各脂肪酸量の総和を総脂肪酸量とした。なお、本実施例でいう「総脂肪酸量」とは、Ｃ１２：０量、Ｃ１４：０量、Ｃ１６：１量、Ｃ１６：０量、Ｃ１８：ｎ量、Ｃ２０：ｎ量の合計を意味する。また、「ｎ」は０〜５の整数を表し、「Ｃｘ：ｎ」とは、Ｃｘ：０、Ｃｘ：１、Ｃｘ：２、Ｃｘ：３、Ｃｘ：４、及びＣｘ：５の脂肪酸量の総和を表す。
結果を表３に示す。なお、以下の表において野生株は「ＷＴ」と記載し、NoTRTRX遺伝子導入株は「TRTRX」と記載した。表３に記載の日数は培養日数を示し、「TFA yield」は総脂肪酸量を示す。

表３から明らかなように、NoTRTRX遺伝子を導入した株（以下、「NoTRTRX株」ともいう）は野生株と比較して、脂肪酸の生産性が増加する傾向が見られた。この結果より、NoTRTRX遺伝子の発現を促進することで脂質の生産性が向上することが示唆された。

実施例２ NoTRTRX株ライン１１の再培養、脂質の解析
野生株及びNoTRTRX株ライン１１について、再度実施例１と同様の方法にて前々培養、前培養、本培養を行った。なお、光強度は通常の光条件（１００μmol/m²/s）、強光条件（３００μmol/m²/s）の２条件で行った（前々培養は通常の光条件のみで行い、前培養から２条件で行った）。通常光条件での培養結果を表４、強光条件での培養結果を表５に示す。なお、総脂肪酸量（表中の「TFA yield」）は平均値±標準偏差の形式で表示した。表４及び５に記載の日数は培養日数を示し、「TFA yield」は総脂肪酸量を示す。

表４、表５から明らかなように、NoTRTRX株ライン１１は、野生株と比較して脂肪酸の生産性が大きく向上していることが明らかになった。また、生産性向上効果は強光条件においてより顕著であった。

実施例３ TAG合成経路、脂肪酸(FA)合成経路、CBB回路遺伝子、及びNoTRTRX遺伝子を導入したナンノクロロプシスの形質転換体の作製、および形質転換体による脂質の製造
１．TAG合成経路遺伝子(DGAT及びLACS遺伝子)発現用プラスミドの構築
実施例１の２．で調製したナンノクロロプシス・オセアニカNIES-2145株由来のｃＤＮＡを鋳型として、表２に示す配列番号７１及び７２のプライマー対を用いてＰＣＲを行い、LACS遺伝子断片（塩基配列：配列番号３６、アミノ酸配列：配列番号３５）を増幅した。上記増幅断片を用いて、実施例１の２．と同様の方法でLACS遺伝子発現用プラスミドを構築した。なお、本発現プラスミドはＬＤＳＰプロモーター配列、LACS遺伝子、VCP1ターミネーター配列、チューブリンプロモーター配列、ゼオシン耐性遺伝子、ヒートショックプロテインターミネーター配列の順で連結したインサート配列とpUC19ベクター配列からなる。
上記ナンノクロロプシス・オセアニカNIES-2145株由来のｃＤＮＡを鋳型として、表２に示す配列番号６９及び配列番号７０のプライマー対を用いたＰＣＲにより、DGAT遺伝子断片（塩基配列：配列番号３４、アミノ酸配列：配列番号３３）を取得した。また、実施例１の１．で調製したナンノクロロプシス・オセアニカNIES-2145株のゲノムＤＮＡを鋳型として、表２に示す配列番号５２及び配列番号５３のプライマー対、並びに配列番号５４及び配列番号５５のプライマー対を用いたＰＣＲを行い、GSプロモーター配列断片（配列番号４２）、及びＬＤＳＰターミネーター配列断片（配列番号４３）をそれぞれ取得した。さらに、前記LACS遺伝子発現用プラスミドを鋳型として、表１に示す配列番号１７及び表２に示す配列番号５６のプライマー対を用いたＰＣＲを行い、LACS遺伝子発現カセット（ＬＤＳＰプロモーター配列、LACS遺伝子、VCP1ターミネーター配列）、ゼオシン耐性遺伝子発現カセット（チューブリンプロモーター配列、ゼオシン耐性遺伝子、ヒートショックプロテインターミネーター配列）及びpUC19配列からなる断片（LACS遺伝子発現用プラスミド断片）を増幅した。
DGAT遺伝子断片と、GSプロモーター配列断片、ＬＤＳＰターミネーター配列断片、LACS遺伝子発現用プラスミド断片とを、前述と同様の方法にて融合し、TAG合成経路遺伝子(DGAT及びLACS遺伝子)発現用プラスミドを構築した。なお、本発現プラスミドはＧＳプロモーター配列、DGAT遺伝子、ＬＤＳＰターミネーター配列、ＬＤＳＰプロモーター配列、LACS遺伝子、VCP1ターミネーター配列、チューブリンプロモーター配列、ゼオシン耐性遺伝子、ヒートショックプロテインターミネーター配列の順で連結したインサート配列とpUC19ベクター配列からなる。

２．脂肪酸(FA)合成経路遺伝子(TE遺伝子)発現用プラスミドの構築
実施例１の２．で調製したナンノクロロプシス・オセアニカNIES-2145株由来のｃＤＮＡを鋳型として、表２に示す配列番号７３及び７４のプライマー対を用いてＰＣＲを行い、TE遺伝子断片（塩基配列：配列番号３８、アミノ酸配列：配列番号３７）を増幅した。上記増幅断片を用いて、実施例１の２．と同様の方法でTE遺伝子発現用プラスミド（ゼオシン耐性）を構築した。なお、本発現プラスミドはＬＤＳＰプロモーター配列、TE遺伝子、VCP1ターミネーター配列、チューブリンプロモーター配列、ゼオシン耐性遺伝子、ヒートショックプロテインターミネーター配列の順で連結したインサート配列とpUC19ベクター配列からなる。
構築したTE遺伝子発現用プラスミド（ゼオシン耐性）を鋳型として、表１に示す配列番号１３及び配列番号１４のプライマー対を用いてＰＣＲを行い、TE遺伝子発現用プラスミド断片を増幅した。また、パロモマイシン耐性遺伝子（配列番号３９）を人工合成した。合成したパロモマイシン耐性遺伝子のＤＮＡ断片を鋳型として、表２に示す配列番号４６及び配列番号４７のプライマー対を用いてＰＣＲを行い、パロモマイシン耐性遺伝子断片を増幅した。これら２つの断片を実施例１と同様の方法にて融合し、TE遺伝子発現用プラスミド（パロモマイシン耐性）を構築した。なお、本発現用プラスミドはＬＤＳＰプロモーター配列、TE遺伝子、VCP1ターミネーター配列、チューブリンプロモーター配列、パロモマイシン耐性遺伝子、ヒートショックプロテインターミネーター配列の順で連結したインサート配列とpUC19ベクター配列からなる。

３．CBB回路遺伝子（RPI、TK及びFBA遺伝子）発現用プラスミドの構築
実施例１の２．で調製したナンノクロロプシス・オセアニカNIES-2145株由来のｃＤＮＡを鋳型として、表２に示す配列番号６５及び配列番号６６のプライマー対、並びに配列番号６３及び配列番号６４のプライマー対を用いてＰＣＲを行い、TK遺伝子断片（塩基配列：配列番号２８、アミノ酸配列：配列番号２７）、及びFBA遺伝子断片（塩基配列：配列番号３０、アミノ酸配列：配列番号２９）をそれぞれ増幅した。上記増幅断片を用いて、実施例３の１．と同様の方法で、TK及びFBA遺伝子発現用プラスミドを構築した。なお、本発現プラスミドはＧＳプロモーター配列、TK遺伝子、ＬＤＳＰターミネーター配列、ＬＤＳＰプロモーター配列、FBA遺伝子、VCP1ターミネーター配列、チューブリンプロモーター配列、ゼオシン耐性遺伝子、ヒートショックプロテインターミネーター配列の順で連結したインサート配列とpUC19ベクター配列からなる。
上記ナンノクロロプシス・オセアニカNIES-2145株由来のｃＤＮＡを鋳型として、表２に示す配列番号６７及び配列番号６８のプライマー対を用いたＰＣＲにより、RPI遺伝子断片（塩基配列：配列番号３２、アミノ酸配列：配列番号３１）を取得した。また、実施例１の１．で調製したナンノクロロプシス・オセアニカNIES-2145株のゲノムＤＮＡを鋳型として、表２に示す配列番号５７及び配列番号５８のプライマー対、並びに配列番号５９及び配列番号６０のプライマー対を用いたＰＣＲを行い、AMTプロモーター配列断片（配列番号４４）、及びdesaturase（DES）ターミネーター配列断片（配列番号４５）をそれぞれ取得した。さらに、前記TK及びFBA遺伝子発現用プラスミドを鋳型として、表１に示す配列番号１７及び表２に示す配列番号６１のプライマー対を用いたＰＣＲを行い、TK遺伝子発現カセット（GSプロモーター配列、TK遺伝子、ＬＤＳＰターミネーター配列）、FBA遺伝子発現カセット（ＬＤＳＰプロモーター配列、FBA遺伝子、VCP1ターミネーター配列）、ゼオシン遺伝子発現カセット（チューブリンプロモーター配列、ゼオシン耐性遺伝子、ヒートショックプロテインターミネーター配列）及びpUC19配列からなる断片（TK及びFBA遺伝子発現用プラスミド断片）を増幅した。
RPI遺伝子断片と、AMTプロモーター配列断片、DESターミネーター配列断片、TK及びFBA遺伝子発現用プラスミド断片とを、前述と同様の方法にて融合し、CBB回路遺伝子（RPI、TK及びFBA遺伝子）発現用プラスミド（ゼオシン耐性）を構築した。なお、本発現用プラスミドはAMTプロモーター配列、RPI遺伝子、DESターミネーター配列、ＧＳプロモーター配列、TK遺伝子、ＬＤＳＰターミネーター配列、ＬＤＳＰプロモーター配列、FBA遺伝子、VCP1ターミネーター配列、チューブリンプロモーター配列、ゼオシン耐性遺伝子、ヒートショックプロテインターミネーター配列の順で連結したインサート配列とpUC19ベクター配列からなる。

構築したCBB回路遺伝子発現用プラスミド（ゼオシン耐性）を鋳型として、表１に示す配列番号１３及び配列番号１４のプライマー対を用いてＰＣＲを行い、CBB回路遺伝子発現用プラスミド断片を増幅した。また、ハイグロマイシン耐性遺伝子（配列番号４０）を人工合成した。合成したハイグロマイシン耐性遺伝子のＤＮＡ断片を鋳型として、表２に示す配列番号４８及び配列番号４９のプライマー対を用いてＰＣＲを行い、ハイグロマイシン耐性遺伝子断片を増幅した。これら２つの断片を実施例１と同様の方法にて融合し、CBB回路遺伝子発現用プラスミド（ハイグロマイシン耐性）を構築した。なお、本発現用プラスミドはAMTプロモーター配列、RPI遺伝子、DESターミネーター配列、ＧＳプロモーター配列、TK遺伝子、ＬＤＳＰターミネーター配列、ＬＤＳＰプロモーター配列、FBA遺伝子、VCP1ターミネーター配列、チューブリンプロモーター配列、ハイグロマイシン耐性遺伝子、ヒートショックプロテインターミネーター配列の順で連結したインサート配列とpUC19ベクター配列からなる。

４．TAG合成経路、FA合成経路、およびCBB回路遺伝子を導入したナンノクロロプシスの形質転換体の作製、及び形質転換体の培養
前記TAG合成経路遺伝子発現用プラスミド、FA合成経路遺伝子発現用プラスミド（パロモマイシン耐性）、及びCBB回路遺伝子発現用プラスミド（ハイグロマイシン耐性）を鋳型として、表１に示す配列番号２４及び表２に示す配列番号７５のプライマー対、表１に示す配列番号２４及び配列番号２３のプライマー対、並びに表１に示す配列番号２４及び表２に示す配列番号６２のプライマー対を用いたＰＣＲを行い、TAG合成経路遺伝子発現カセット（ＧＳプロモーター配列、DGAT遺伝子、ＬＤＳＰターミネーター配列、ＬＤＳＰプロモーター配列、LACS遺伝子、VCP1ターミネーター配列、チューブリンプロモーター配列、ゼオシン耐性遺伝子、ヒートショックプロテインターミネーター）、FA合成経路遺伝子発現カセット（ＬＤＳＰプロモーター配列、TE遺伝子、VCP1ターミネーター配列、チューブリンプロモーター配列、パロモマイシン耐性遺伝子、ヒートショックプロテインターミネーター）、並びにCBB回路遺伝子発現カセット（ＡＭＴプロモーター配列、RPI遺伝子、ＤＥＳターミネーター、ＧＳプロモーター配列、TK遺伝子、ＬＤＳＰターミネーター配列、ＬＤＳＰプロモーター配列、FBA遺伝子、VCP1ターミネーター配列、チューブリンプロモーター配列、ハイグロマイシン耐性遺伝子、ヒートショックプロテインターミネーター）を増幅した。得られた増幅断片を、実施例１の３．と同様の方法で精製した。
上記の精製したTAG合成経路遺伝子発現カセットを、実施例１の３．と同様の方法でナンノクロロプシス・オセアニカNIES-2145株に導入して抗生物質耐性を有する株を選抜し、TAG合成経路遺伝子発現カセットが導入された形質転換体（TAG合成経路遺伝子導入株）を作製した。次いで、得られたTAG合成経路遺伝子導入株を宿主として、前述と同様の方法でFA合成経路遺伝子発現カセットを導入して抗生物質耐性を有する株を選抜し、FA合成経路遺伝子発現カセットが導入された形質転換体（TAG合成経路遺伝子/FA合成経路遺伝子導入株）を作製した。さらに、TAG合成経路遺伝子/FA合成経路遺伝子導入株を宿主として、前述と同様の方法でCBB回路遺伝子発現カセットを導入して抗生物質耐性を有する株を選抜し、CBB回路遺伝子発現カセットが導入された形質転換体（TAG合成経路遺伝子/FA合成経路遺伝子/CBB回路遺伝子導入株（以下、「TAG/FA/CBB遺伝子導入株」ともいう））を作製した。なお、各形質転換体の選抜は終濃度２μg/mLのゼオシン、終濃度100μg/mLのパロモマイシン、終濃度500μg/mLのハイグロマイシンをそれぞれ用いた。

５．NoTRTRX遺伝子発現用プラスミド（ビアラフォス耐性）の構築
ビアラフォス耐性遺伝子（配列番号４１）を人工合成した。合成したＤＮＡ断片を鋳型として、表２に示す配列番号５０及び配列番号５１のプライマー対を用いたＰＣＲを行い、ビアラフォス耐性遺伝子断片を増幅した。また、実施例１の２．で調製したNoTRTRX遺伝子発現用プラスミド（ゼオシン耐性）を鋳型として、表１に記載の配列番号１３及び配列番号１４のプライマー対を用いたＰＣＲを行い、ゼオシン耐性遺伝子を除いたプラスミド断片を増幅した。これらの増幅断片をそれぞれ制限酵素DpnI（東洋紡株式会社製）にて処理し、High Pure PCR Product Purification Kit（Roche Applied Science社製)を用いて精製した。
精製した上記増幅断片を前述と同様の方法にて融合し、NoTRTRX遺伝子発現用プラスミド（ビアラフォス耐性）を構築した。なお、本発現プラスミドはＬＤＳＰプロモーター配列、NoTRTRX遺伝子、VCP1ターミネーター配列、チューブリンプロモーター配列、ビアラフォス耐性遺伝子、ヒートショックプロテインターミネーター配列の順で連結したインサート配列とpUC19ベクター配列からなる。

６．NoTRTRX遺伝子発現カセット（ビアラフォス耐性）のTAG/FA/CBB遺伝子導入株への導入、形質転換体の培養、培養液中の脂質の抽出、及び構成脂肪酸の分析
前記NoTRTRX遺伝子発現用プラスミド（ビアラフォス耐性）を鋳型として、表１に示す配列番号２３及び配列番号２４のプライマー対を用いたＰＣＲを行い、NoTRTRX遺伝子発現カセット（ビアラフォス耐性）（ＬＤＳＰプロモーター配列、NoTRTRX遺伝子、VCP1ターミネーター配列、チューブリンプロモーター配列、ビアラフォス耐性遺伝子、ヒートショックプロテインターミネーター配列からなるＤＮＡ断片）を増幅した。
得られた増幅断片を、実施例１の３．と同様の方法で精製し、実施例３の４．と同様の方法により、TAG/FA/CBB遺伝子導入株に導入して抗生物質耐性を有する株を選抜し、TAG合成経路遺伝子/FA合成経路遺伝子/CBB回路遺伝子/NoTRTRX遺伝子導入株（以下、「TAG/FA/CBB/TRTRX遺伝子導入株」ともいう）を作製した。なお、形質転換体の選抜には、終濃度750μg/mLのビアラフォスを用いた。
得られたTAG/FA/CBB/TRTRX遺伝子導入株及び実施例３の４．で作製したTAG/FA/CBB遺伝子導入株を、実施例２と同様の方法（強光条件）で培養し、実施例１と同様の方法で脂質の抽出及び構成脂肪酸の分析を行った。なお、TAG/FA/CBB遺伝子導入株はＮ＝４で、TAG/FA/CBB/TRTRX遺伝子導入株は独立した２ラインについて培養を行った。
結果を表６に示す。なお、以下の表においてTAG/FA/CBB遺伝子導入株は「TAG/FA/CBB」と、TAG/FA/CBB/TRTRX遺伝子導入株は「TAG/FA/CBB/TRTRX」と記載した。また、TAG/FA/CBB遺伝子導入株については平均値±標準偏差の形式で表示し、TAG/FA/CBB/TRTRX遺伝子導入株については独立２ライン（line1、line2）のそれぞれの結果を表示した。

表６から明らかなように、TAG合成経路、FA合成経路、CBB回路遺伝子に加えてNoTRTRX遺伝子を導入した形質転換体（TAG/FA/CBB/TRTRX遺伝子導入株）では、TAG合成経路、FA合成経路、及びCBB回路遺伝子のみを導入した形質転換体（TAG/FA/CBB遺伝子導入株）と比較して、脂肪酸の生産性がより一層向上した。

以上のように、TRXドメイン及びTRドメインを有するタンパク質の発現を促進させることで、脂質の生産性が向上した形質転換体を得ることができる。よって、この形質転換体を用いることで、脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質の生産性を向上させる、脂質の製造方法を提供することができる。

本発明をその実施態様とともに説明したが、我々は特に指定しない限り我々の発明を説明のどの細部においても限定しようとするものではなく、添付の請求の範囲に示した発明の精神と範囲に反することなく幅広く解釈されるべきであると考える。

本願は、２０１８年１０月１日に日本国で特許出願された特願２０１８−１８６６８４に基づく優先権を主張するものであり、これはここに参照してその内容を本明細書の記載の一部として取り込む。

Claims (14)

1. チオレドキシンドメイン及びチオレドキシン・レダクターゼドメインを有するタンパク質をコードする遺伝子の発現を促進させた藻類を培養し、脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質を生産させる、脂質の製造方法。
2. チオレドキシンドメイン及びチオレドキシン・レダクターゼドメインを有するタンパク質をコードする遺伝子の発現を促進させ、藻類の細胞内で生産される脂肪酸の総量を向上させる、脂質生産性の向上方法。
3. 前記藻類がナンノクロロプシス属に属する藻類である、請求項１又は２に記載の方法。
4. 前記チオレドキシンドメインが、下記アミノ酸配列（Ａ）若しくは（Ｂ）又は下記アミノ酸配列（Ｃ）若しくは（Ｄ）のアミノ酸配列からなるドメインであり、前記チオレドキシン・レダクターゼドメインが、下記アミノ酸配列（Ｅ）若しくは（Ｆ）又は下記アミノ酸配列（Ｇ）若しくは（Ｈ）のアミノ酸配列からなるドメインである、請求項１〜３のいずれか１項記載の方法。
   
   （Ａ）配列番号１の５２９位〜６２９位までのアミノ酸配列。
   （Ｂ）アミノ酸配列（Ａ）との同一性が６０％以上であり、チオレドキシン活性を有するチオレドキシンドメインを構成するアミノ酸配列。
   （Ｃ）配列番号３の５２５位〜６２５位までのアミノ酸配列。
   （Ｄ）アミノ酸配列（Ｃ）との同一性が６０％以上であり、チオレドキシン活性を有するチオレドキシンドメインを構成するアミノ酸配列。
   （Ｅ）配列番号１の１３７位〜４４８位までのアミノ酸配列。
   （Ｆ）アミノ酸配列（Ｅ）との同一性が６０％以上であり、チオレドキシン・レダクターゼ活性を有するチオレドキシン・レダクターゼドメインを構成するアミノ酸配列。
   （Ｇ）配列番号３の１３４位〜４４５位までのアミノ酸配列。
   （Ｈ）アミノ酸配列（Ｇ）との同一性が６０％以上であり、チオレドキシン・レダクターゼ活性を有するチオレドキシン・レダクターゼドメインを構成するアミノ酸配列。
5. 前記チオレドキシンドメイン及びチオレドキシン・レダクターゼドメインを有するタンパク質が、下記タンパク質（Ｉ）〜（Ｌ）からなる群より選ばれるいずれか１つのタンパク質である、請求項１〜４のいずれか１項記載の方法。
   
   （Ｉ）配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
   （Ｊ）前記タンパク質（Ｉ）のアミノ酸配列と同一性が６０％以上のアミノ酸配列からなり、かつチオレドキシン活性及びチオレドキシン・レダクターゼ活性を有するチオレドキシンドメイン及びチオレドキシン・レダクターゼドメインを含むタンパク質。
   （Ｋ）配列番号３で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
   （Ｌ）前記タンパク質（Ｋ）のアミノ酸配列と同一性が６０％以上のアミノ酸配列からなり、かつチオレドキシン活性及びチオレドキシン・レダクターゼ活性を有するチオレドキシンドメイン及びチオレドキシン・レダクターゼドメインを含むタンパク質。
6. 前記藻類において、トリアシルグリセロール合成経路、脂肪酸合成経路、カルビン回路に関わる１種又は２種以上のタンパク質の発現を促進させた、請求項１〜５のいずれか１項記載の方法。
7. 前記藻類において、下記タンパク質（Ｏ）又は（Ｐ）、下記タンパク質（Ｑ）〜（Ｔ）からなる群より選ばれるいずれか１つ、下記タンパク質（Ｍ）又は（Ｎ）、下記タンパク質（Ｕ）又は（Ｖ）、下記タンパク質（Ｗ）又は（Ｘ）、並びに下記タンパク質（Ｙ）又は（Ｚ）の発現が促進されている、請求項１〜６のいずれか１項記載の方法。
   
   （Ｍ）配列番号３７で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
   （Ｎ）前記タンパク質（Ｍ）のアミノ酸配列と同一性が５０％以上のアミノ酸配列からなり、かつアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ活性を有するタンパク質。
   （Ｏ）配列番号３５で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
   （Ｐ）前記タンパク質（Ｏ）のアミノ酸配列と同一性が５０％以上のアミノ酸配列からなり、かつアシル−CoAシンテターゼ活性を有するタンパク質。
   （Ｑ）配列番号３３で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
   （Ｒ）前記タンパク質（Ｑ）のアミノ酸配列と同一性が５０％以上のアミノ酸配列からなり、かつアシル基転移酵素活性を有するタンパク質。
   （Ｓ）配列番号７６で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
   （Ｔ）前記タンパク質（Ｓ）のアミノ酸配列と同一性が５０％以上のアミノ酸配列からなり、かつアシル基転移酵素活性を有するタンパク質。
   （Ｕ）配列番号２７で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
   （Ｖ）前記タンパク質（Ｕ）のアミノ酸配列と同一性が５０％以上のアミノ酸配列からなり、かつトランスケトラーゼ活性を有するタンパク質。
   （Ｗ）配列番号２９で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
   （Ｘ）前記タンパク質（Ｗ）のアミノ酸配列と同一性が５０％以上のアミノ酸配列からなり、かつフルクトース-1,6-ビスリン酸アルドラーゼ活性を有するタンパク質。
   （Ｙ）配列番号３１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
   （Ｚ）前記タンパク質（Ｙ）のアミノ酸配列と同一性が５０％以上のアミノ酸配列からなり、かつリボース-5-リン酸イソメラーゼ活性を有するタンパク質。
8. チオレドキシンドメイン及びチオレドキシン・レダクターゼドメインを有するタンパク質をコードする遺伝子の発現が促進している藻類。
9. チオレドキシンドメイン及びチオレドキシン・レダクターゼドメインを有するタンパク質をコードする遺伝子の発現を促進した藻類の形質転換体。
10. 前記藻類がナンノクロロプシス属に属する藻類である、請求項８又は９に記載の藻類又は藻類の形質転換体。
11. 前記チオレドキシンドメインが、下記アミノ酸配列（Ａ）若しくは（Ｂ）又は下記アミノ酸配列（Ｃ）若しくは（Ｄ）のアミノ酸配列からなるドメインであり、前記チオレドキシン・レダクターゼドメインが、下記アミノ酸配列（Ｅ）若しくは（Ｆ）又は下記アミノ酸配列（Ｇ）若しくは（Ｈ）のアミノ酸配列からなるドメインである、請求項８〜１０のいずれか１項記載の藻類又は藻類の形質転換体。
    
    （Ａ）配列番号１の５２９位〜６２９位までのアミノ酸配列。
    （Ｂ）アミノ酸配列（Ａ）との同一性が６０％以上であり、チオレドキシン活性を有するチオレドキシンドメインを構成するアミノ酸配列。
    （Ｃ）配列番号３の５２５位〜６２５位までのアミノ酸配列。
    （Ｄ）アミノ酸配列（Ｃ）との同一性が６０％以上であり、チオレドキシン活性を有するチオレドキシンドメインを構成するアミノ酸配列。
    （Ｅ）配列番号１の１３７位〜４４８位までのアミノ酸配列。
    （Ｆ）アミノ酸配列（Ｅ）との同一性が６０％以上であり、チオレドキシン・レダクターゼ活性を有するチオレドキシン・レダクターゼドメインを構成するアミノ酸配列。
    （Ｇ）配列番号３の１３４位〜４４５位までのアミノ酸配列。
    （Ｈ）アミノ酸配列（Ｇ）との同一性が６０％以上であり、チオレドキシン・レダクターゼ活性を有するチオレドキシン・レダクターゼドメインを構成するアミノ酸配列。
12. 前記チオレドキシンドメイン及びチオレドキシン・レダクターゼドメインを有するタンパク質が、下記タンパク質（Ｉ）〜（Ｌ）からなる群より選ばれるいずれか１つのタンパク質である、請求項８〜１１のいずれか１項記載の藻類又は藻類の形質転換体。
    
    （Ｉ）配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
    （Ｊ）前記タンパク質（Ｉ）のアミノ酸配列と同一性が６０％以上のアミノ酸配列からなり、かつチオレドキシン活性及びチオレドキシン・レダクターゼ活性を有するチオレドキシンドメイン及びチオレドキシン・レダクターゼドメインを含むタンパク質。
    （Ｋ）配列番号３で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
    （Ｌ）前記タンパク質（Ｋ）のアミノ酸配列と同一性が６０％以上のアミノ酸配列からなり、かつチオレドキシン活性及びチオレドキシン・レダクターゼ活性を有するチオレドキシンドメイン及びチオレドキシン・レダクターゼドメインを含むタンパク質。
13. トリアシルグリセロール合成経路、脂肪酸合成経路、カルビン回路に関わる１種又は２種以上のタンパク質の発現が促進している、請求項８〜１２のいずれか１項記載の藻類又は藻類の形質転換体。
14. 下記タンパク質（Ｏ）又は（Ｐ）、下記タンパク質（Ｑ）〜（Ｔ）からなる群より選ばれるいずれか１つ、下記タンパク質（Ｍ）又は（Ｎ）、下記タンパク質（Ｕ）又は（Ｖ）、下記タンパク質（Ｗ）又は（Ｘ）、並びに下記タンパク質（Ｙ）又は（Ｚ）の発現が促進している、請求項８〜１３のいずれか１項記載の藻類又は藻類の形質転換体。
    
    （Ｍ）配列番号３７で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
    （Ｎ）前記タンパク質（Ｍ）のアミノ酸配列と同一性が５０％以上のアミノ酸配列からなり、かつアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ活性を有するタンパク質。
    （Ｏ）配列番号３５で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
    （Ｐ）前記タンパク質（Ｏ）のアミノ酸配列と同一性が５０％以上のアミノ酸配列からなり、かつアシル−CoAシンテターゼ活性を有するタンパク質。
    （Ｑ）配列番号３３で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
    （Ｒ）前記タンパク質（Ｑ）のアミノ酸配列と同一性が５０％以上のアミノ酸配列からなり、かつアシル基転移酵素活性を有するタンパク質。
    （Ｓ）配列番号７６で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
    （Ｔ）前記タンパク質（Ｓ）のアミノ酸配列と同一性が５０％以上のアミノ酸配列からなり、かつアシル基転移酵素活性を有するタンパク質。
    （Ｕ）配列番号２７で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
    （Ｖ）前記タンパク質（Ｕ）のアミノ酸配列と同一性が５０％以上のアミノ酸配列からなり、かつトランスケトラーゼ活性を有するタンパク質。
    （Ｗ）配列番号２９で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
    （Ｘ）前記タンパク質（Ｗ）のアミノ酸配列と同一性が５０％以上のアミノ酸配列からなり、かつフルクトース-1,6-ビスリン酸アルドラーゼ活性を有するタンパク質。
    （Ｙ）配列番号３１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
    （Ｚ）前記タンパク質（Ｙ）のアミノ酸配列と同一性が５０％以上のアミノ酸配列からなり、かつリボース-5-リン酸イソメラーゼ活性を有するタンパク質。