JPWO2015137449A1 - トリアシルグリセロール高生産性藻類の作製法 - Google Patents
トリアシルグリセロール高生産性藻類の作製法 Download PDFInfo
- Publication number
- JPWO2015137449A1 JPWO2015137449A1 JP2016507824A JP2016507824A JPWO2015137449A1 JP WO2015137449 A1 JPWO2015137449 A1 JP WO2015137449A1 JP 2016507824 A JP2016507824 A JP 2016507824A JP 2016507824 A JP2016507824 A JP 2016507824A JP WO2015137449 A1 JPWO2015137449 A1 JP WO2015137449A1
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- triacylglycerol
- gene
- producing
- algae
- genus
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
- C12P7/64—Fats; Fatty oils; Ester-type waxes; Higher fatty acids, i.e. having at least seven carbon atoms in an unbroken chain bound to a carboxyl group; Oxidised oils or fats
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
- C12N15/8242—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits
- C12N15/8243—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine
- C12N15/8247—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine involving modified lipid metabolism, e.g. seed oil composition
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8216—Methods for controlling, regulating or enhancing expression of transgenes in plant cells
- C12N15/8237—Externally regulated expression systems
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/10—Transferases (2.)
- C12N9/1025—Acyltransferases (2.3)
- C12N9/1029—Acyltransferases (2.3) transferring groups other than amino-acyl groups (2.3.1)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
- C12P7/64—Fats; Fatty oils; Ester-type waxes; Higher fatty acids, i.e. having at least seven carbon atoms in an unbroken chain bound to a carboxyl group; Oxidised oils or fats
- C12P7/6436—Fatty acid esters
- C12P7/6445—Glycerides
- C12P7/6463—Glycerides obtained from glyceride producing microorganisms, e.g. single cell oil
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y203/00—Acyltransferases (2.3)
- C12Y203/01—Acyltransferases (2.3) transferring groups other than amino-acyl groups (2.3.1)
- C12Y203/01085—Fatty-acid synthase (2.3.1.85)
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Oil, Petroleum & Natural Gas (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nutrition Science (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Description
〔1〕 藻類に以下の(1)〜(3)を含むコンストラクトを導入することを特徴とするトリアシルグリセロール高生産性藻類の作製法、
(1)トリアシルグリセロール合成酵素遺伝子、
(2)トリアシルグリセロール合成酵素遺伝子の上流に配置されるリン欠乏応答プロモーター、
(3)トリアシルグリセロール合成酵素遺伝子の下流に配置され、コンストラクトを導入しようとする藻類と同種の藻類に由来する遺伝子の3'非翻訳領域。
(1)トリアシルグリセロール合成酵素遺伝子、
(2)トリアシルグリセロール合成酵素遺伝子の上流に配置されるリン欠乏応答プロモーター、
(3)トリアシルグリセロール合成酵素遺伝子の下流に配置され、コンストラクトを導入しようとする藻類と同種の藻類に由来する遺伝子の3'非翻訳領域。
(1)トリアシルグリセロール合成酵素遺伝子、
(2)トリアシルグリセロール合成酵素遺伝子の上流に配置されるリン欠乏応答プロモーター。
(1)従来知られている藻類よりも、多くのTAGを蓄積する。
(2)TAG合成酵素遺伝子はリン欠乏応答プロモーターの制御下にあるので、通常培養時にこの遺伝子は強発現しない。このため、TAG蓄積のタイミングをコントロールすることができる。
(3)通常条件に比べて増殖効率は低下するものの、リン欠乏条件下でもある程度の細胞増殖は可能なので、細胞を増殖させながら、TAGを蓄積させることも可能である。
(4)蓄積されるTAG中の脂肪酸は、既に合成されている脂質(葉緑体の脂質など)に由来するものではなく、新たに合成されたものなので、有用な特殊脂肪酸の生産にも有用である。
〔実施例1〕
〔実験材料〕
(1)藻類株
真正眼点藻 Nannochloropsis NIES-2145 (以後N. 2145)を使用した。この藻類株は独立行政法人国立環境研究所(http://www.nies.go.jp/)から入手可能である。
(2)遺伝子名とprotein ID
遺伝子名とprotein ID(JGI Chlamydomonas reinhardtii 4.0)は以下の通りである。
DGTT4: PID190539
SQD2a: PID116277
CBLP: PID164254
(3)遺伝子配列
C. reinhardtii由来のSQD2aプロモーター(pCrSQD2a)の配列は、配列番号1に示す通りである。
(1)培養条件
C. reinhardtiiの培養にはTAP培地を通常培養の培地として使用した。
Na2EDTA ・ 2H2O 440 mg, FeCl3 ・ 6H2O 316 mg, CoSO4 ・ 7H2O 1.2 mg, ZnSO4 ・ 7H2O 2.1 mg, MnCl2 ・ 4H2O 18 mg, CuSO4 ・ 5H2O 0.7 mg, Na2MoO4 ・ 2H2O 0.7 mgをイオン交換水 100 mLへ溶解し、f/2 metalとして4℃に保存しておいた。NaNO3 7.5 mg, NaH2PO4 ・ 2H2O 0.6 mg, Vitamin B12 0.05 μg, Biotin 0.05 μg, Thiamine HCl 10 μg, Na2SiO3 ・ 9H2O 1 mg, f/2 metal 0.1 mLを人工海水 99.9 mLへ溶解し、フィルター滅菌してから液体f/2培地として使用した。プレート培地として使用する場合は NaNO3 7.5 mg, NaH2PO4 ・ 2H2O 0.6 mg, Vitamin B12 0.05 μg, Biotin 0.05 μg, Thiamine HCl 10 μg, Na2SiO3 ・ 9H2O 1 mg, f/2 metal 0.1 mlを2倍濃度の人工海水 50 mLに溶解し、フィルター滅菌しておき、別のフラスコでINA Agar 8 gをイオン交換水 50 mLに加えてオートクレーブしてから、培地に加えた。
Tris(hydroxymethyl)aminomethane 12.11gをイオン交換水 100 mLへ溶解し、HClでpH7.6にあわせたものを1 M Tris(pH7.6)とした。1 M Tris(pH7.6) 10 mL, NH4Cl 26.745 mg, NaNO3 7.5 mg, NaH2PO4・2H2O 3.0 mg, Vitamin B12 0.25 μg, Biotin 0.25 μg, Thiamine HCl 50 μg, Na2SiO3 ・ 9H2O 1 mg, f/2 metal 0.5 mLを50%濃度の人工海水へ溶解して全量100 mLとし、フィルター滅菌してから液体F2N50%SW培地として使用した。脂質合成遺伝子発現のコンストラクトを導入したN. 2145を用いた実験(図6〜15)では、F2N50%SW培地をコントロール培地、コントロール培地からNaH2PO4をのぞいたものをリン欠培地、コントロール培地からNaNO3、NH4Clをのぞいたものを窒素欠乏培地とした。
培養液100〜450 mLを800×g, 5分間遠心して、培養細胞を沈殿させ、イオン交換水1 mLに懸濁した後、-80℃に保存した。
脂質抽出液50 μLを薄層シリカプレートにスポットし、ヘキサン:ジエチルエーテル:酢酸=160:40:4の展開液で45分間展開した。0.001%プリムリンを用いて、UV照射下でTAGを確認した。TAGがのっている部分のシリカを削り取り、1mM ペンタデカン酸 100 μL, 5% 塩酸/メタノールを500 μLを添加し、懸濁した後、85℃, 1時間静置した。ヘキサン 500 μLを添加し、懸濁した後、800×g, 5分間スイングローターで遠心し、上層のメチルエステル化した脂肪酸を回収した。下層に再びヘキサン500 μLを添加し、懸濁した後、800×g, 5分間スイングローターで遠心し、上層を回収した。メチルエステル化した脂肪酸を乾燥させた後、ヘキサン60 μLに溶解し、ガスクロマトグラフィサンプルとした。ガスクロマトグラフィはSHIMADZU GC-2014にHR-SS-10 25m (length) × 0.25mm (i.d.) (Shinwa Chemical Industries, Ltd., Japan)を取り付けて行った。
凍結細胞に3倍量以上のRNA抽出液と3倍量以上の酸性フェノールを加え、凍ったまま超音波破砕(超音波15秒、氷冷30秒)を4回行った。20000×g, 5分間, 4℃で遠心し、上清400〜500 μLを回収した。上清に酸性フェノール 300 μL, クロロホルム 300 μLを添加し、懸濁した後、14k rpm, 5分間, 4℃で遠心し、上清400〜500 μLを回収し、この操作を5回繰り返した。上清の1/10倍量の3 M 酢酸ナトリウム、1倍量のイソプロパノールを添加し、懸濁した後、20000×g, 5分間, 4℃で遠心した。沈殿物に70% エタノールを1 mL加え、20000×g,5分間, 4℃で遠心し、この操作を2回繰り返した後、沈殿物を乾燥させた。乾燥した沈殿を滅菌イオン交換水 400 μLに溶解した後、1 μg/μL以上の濃度の核酸であることを確認した。核酸 40 μLに10×DNase I Buffer 5 μL, DNase I 0.5 μL, 滅菌イオン交換水 4.5 μLを加え、37℃, 30分間静置した。酸性フェノール 50 μL, クロロホルム 50 μLを添加し、懸濁した後、20000×g,10分間, 4℃で遠心し、上清 35 μLを回収した。上清の1/10倍量の3 M 酢酸ナトリウム、1倍量のイソプロパノールを添加し、懸濁した後、20000×g,10分間, 4℃で遠心した。沈殿物に70% エタノール 150 μL加え、20000×g,10分間, 4℃で遠心し、この操作を2回繰り返した後、沈殿物を乾燥させた。乾燥した沈殿を滅菌イオン交換水 50 μLに溶解した後、1 μg/μL以上の濃度のRNAであることを確認した。
RNA 1 μgに10 mM dNTP 0.5 μL, 100 mM oligo dT18 0.25 μL, 100 mM random 6mer 0.25 μL, RNase free waterを適量(0 〜 5 μL)加えて全量を6 μLとし、65℃, 5分間処理した後、氷上に静置した。さらに5xcDNA Synthesis Buffer 2 μL, 0.1 M DTT 0.5 μL, RNase OUT 0.5μL, Thermo Script RT 0.5 μL, RNase free water 0.5 μLを添加し、50℃, 40分間, 60℃, 20分間, 85℃, 5分間 処理した。得られたcDNAは-20℃ に保管した。
2×SYBR Green (TAKARA) 12.5 μL, 10 μM primer_F 1 μL, 10 μM primer_R 1 μL, 5倍希釈したcDNA 2 μL, 滅菌イオン交換水 8.5 μLを懸濁し、反応に用いた。
Nanno_realRT_TUBf AGCATGGCATTGACTCCACC(配列番号7)
Nanno_realRT_TUBr AACGGCCTCGTTGTAGTACACG(配列番号8)
CrDGTT4_realRT_F GTTCGTGCAGTTCAGTGTGG(配列番号9)
CrDGTT4_realRT_R CGGGCAGAATCCGAACA(配列番号10)
C. reinhardtii C9株のゲノムを鋳型にPCR反応を行い、プロモーター領域pCrSQD2aを得た。得られた約1kbの配列をpMD20-T vector(TAKARA)またはpZErO-2(Invitrogen)へ導入した。
step1 94℃ 2分間
step2 94℃ 45秒間, 55℃ 30秒間, 71℃ 1分30秒間を40サイクル
step3 71℃ 5分間
プライマーは以下のものを使用した。
SQD2a_F2 CGGGATAGTTGTAGCTGTAG(配列番号11)
SQD2a_R2 CGAAGAGTTGAGGTGTGTGTTC(配列番号12)
リン欠乏時のC. reinhardtiiのcDNAを鋳型にPCR反応を行い、DGTT4遺伝子の全長を得た。得られた約1kbの配列をpMD20-T vector(TAKARA)またはpZErO-2(Invitrogen)へ導入した。
step1 94℃ 3分間
step2 94℃ 30秒間, 54℃ 30秒間, 72℃ 1分間を41サイクル
step3 72℃ 3分間
プライマーは以下のものを使用した。
DGTT4_F2 ATGCCGCTCGCAAAGCTGCG(配列番号13)
DGTT4_R2 CTACATTATGACCAGCTCCTC(配列番号14)
通常培地で2〜3×106 cells/mLになるまで培養したN. 2145株 500mLを4℃, 980×g, 10分間遠心し、細胞を沈殿させた。上清をのぞいた後、氷冷した375 mM Sorbitolで3回洗浄した。洗浄後の沈殿細胞を終濃度5×108 cells/mLになるように375 mM Sorbitolに懸濁した。濃縮細胞 200 μlに2〜10 μgのコンストラクトDNA, 10 mg/mL キャリアssDNA(Salmon Sperm)2 μLを添加した。細胞懸濁液をエレクトロポレーション用キュベット(2 mm幅)に入れ、11kV/cm, 時定数 12 msecで1回電圧をかけた。通常培地 1 mLをキュベットへ添加し、細胞を懸濁した後、15 mLチューブへ移した。さらに通常培地を4 mL添加し、全量を5 mLとした。10 μE/m2/sec, 23℃, 48 時間旋回培養し、0.4% INA Agar/f/2 5 mLを添加し、2 μg/μLゼオシンを添加したプレートに蒔いた。20〜30 μE/m2/sec, 23℃で静置し、14〜20日後に生えて来たコロニーを形質転換株として新しいゼオシン入りプレートへ植えついだ。
(1)TAG/膜脂質合成系の制御検討
モデル藻類C. reinhardtiiでの脂質蓄積に関する知見として、窒素欠乏条件下で脂質が蓄積すること、脂質の中では貯蔵脂質であるTAGが蓄積すること、飽和脂肪酸の割合が増えることが報告されている(BMC Biotechnol. 2011; 11: 7.)。本発明者は対数増殖期の細胞をリン欠乏条件下におくと脂質蓄積がおこることを見出した(特開2014-049651)。超微細藻類であり、オイル高生産能がある真正眼点藻N. 2145でも同様にリン欠条件下での脂質蓄積を調べた。
C. reinhardtiiでの脂質蓄積の結果をふまえ、増殖が盛んな対数増殖期 (1×107 cells/mL) のN. 2145を用いて窒素欠乏条件、リン欠乏条件の比較を行った。
Diacylglycerol acyltransferase (DGAT)はTAG生合成の最終ステップを触媒する酵素である。DGATは動物、植物に広く存在する酵素であり、DGAT1, DGAT2の2種類が報告されている。
図5のコンストラクトをN. 2145へ形質転換し、ゼオシンで選抜後、control株とF株については形質転換株を20〜30株得た。R株は4株得られた。リン欠乏条件5日目の形質転換株から回収したRNAを用いて、定量RT-PCRを行い、CrDGTT4遺伝子の発現上昇が確認された株をさらに選抜した。野生株、control株、R株ではCrDGTT4遺伝子発現上昇は確認されなかった(図6)。このことから、プロモーターpCrSQD2aとN.2145由来の3'UTRの組み合わせは間に挟んだ遺伝子の発現上昇に有効であると考えられる。
リン欠乏に応答するN. 2145由来のプロモーター候補を探すために、栄養欠乏条件4日目、6日目の細胞からRNAを回収し、定量RT-PCR法を行った。C. reinhardtiiではリン欠乏条件下でSQD2aの発現上昇が見られたので、N. 2145の相同遺伝子であるSQD2A,SQD2B,SQD2Cの遺伝子発現を調べた。また、先行論文(Plant Physiology, April 2012, Vol. 158, pp. 1562-1569)から、LDSP(lipid droplet surface protein)の高発現が予想され、LPATについても本発明者の所属する研究室の先行研究より高発現が予想されたので、遺伝子発現を調べた。このとき、アクチンの発現をコントロールとした。
使用したプライマー配列は以下の通りである。
NannoACTr: 5-GAACGTCTCAAACATAATCTGG-3(配列番号17)
NannoSQD2A_realRT_F:5-TCCCTTGCTTACTGCTCTGG-3(配列番号18)
NannoSQD2A_realRT_R:5-GATTCGCGTAGCCGCTTA-3(配列番号19)
NannoSQD2B_realRT_F:5-CTTAATACGACCACACACGTCCTC-3(配列番号20)
NannoSQD2B_realRT_R:5-TGATACGCCTCCGCACTTT-3(配列番号21)
NannoSQD2C_realRT_F:5-CCACGACTGCCGAATGA-3(配列番号22)
NannoSQD2C_realRT_R:5-TGCTAGTGGACCCTTGTTGG-3(配列番号23)
qRT_LPATY_L:5-gcttgtcgagtacccattcat-3(配列番号24)
qRT_LPATY_:5-cagcagcccaaagaggttc-3(配列番号25)
qRT_LDSP_L:5-gtgcctttcgacctctcg-3(配列番号26)
qRT_LDSP_R:5-ggcacaaaaagatcctagcaa-3(配列番号27)
NannoACTf: 5-ACCTTCTACAACGAGCTGC-3(配列番号47)
NannoACTr: 5-GAACGTCTCAAACATAATCTGG-3(配列番号48)
CrDGTT4_realRT_F:5-GTTCGTGCAGTTCAGTGTGG-3(配列番号49)
CrDGTT4_realRT_R:5-CGGGCAGAATCCGAACA-3(配列番号50)
N. 2145由来のDGAT2A遺伝子の配列は、配列番号28に示す通りである。
N. 2145由来のDGAT2B遺伝子の配列は、配列番号29に示す通りである。
N. 2145由来のDGAT2C遺伝子の配列は、配列番号30に示す通りである。
N. 2145由来のDGAT2D遺伝子の配列は、配列番号31に示す通りである。
N. 2145由来のDGAT2E遺伝子の配列は、配列番号32に示す通りである。
N. 2145由来のDGAT2F遺伝子の配列は、配列番号33に示す通りである。
N. 2145由来のDGAT2G遺伝子の配列は、配列番号34に示す通りである。
N. 2145由来のDGAT2H遺伝子の配列は、配列番号35に示す通りである。
N. 2145由来のDGAT2I遺伝子の配列は、配列番号36に示す通りである。
N. 2145由来のDGAT2J遺伝子の配列は、配列番号37に示す通りである。
N. 2145由来のDGAT2K遺伝子の配列は、配列番号38に示す通りである。
N. 2145由来のSQD2A遺伝子の配列は、配列番号39に示す通りである。
N. 2145由来のSQD2B遺伝子の配列は、配列番号40に示す通りである。
N. 2145由来のSQD2C遺伝子の配列は、配列番号41に示す通りである。
N. 2145由来のLPAT-Y遺伝子の配列は、配列番号42に示す通りである。
N. 2145由来のLDSP遺伝子の配列は、配列番号43に示す通りである。
N. 2145由来のLPAT-Y遺伝子のプロモーターの配列は、配列番号44に示す通りである。
N. 2145由来のSQD2A遺伝子のプロモーターの配列は、配列番号45に示す通りである。
N. 2145由来のSQD2B遺伝子のプロモーターの配列は、配列番号15に示す通りである。
N. 2145由来のLDSP遺伝子のプロモーターの配列は、配列番号46に示す通りである。
Claims (19)
- 藻類に以下の(1)〜(3)を含むコンストラクトを導入することを特徴とするトリアシルグリセロール高生産性藻類の作製法、
(1)トリアシルグリセロール合成酵素遺伝子、
(2)トリアシルグリセロール合成酵素遺伝子の上流に配置されるリン欠乏応答プロモーター、
(3)トリアシルグリセロール合成酵素遺伝子の下流に配置され、コンストラクトを導入しようとする藻類と同種の藻類に由来する遺伝子の3'非翻訳領域。 - リン欠乏応答プロモーターが、SQD2遺伝子のプロモーターであることを特徴とする請求項1に記載のトリアシルグリセロール高生産性藻類の作製法。
- トリアシルグリセロール合成酵素遺伝子が、DGAT2遺伝子であることを特徴とする請求項1又は2に記載のトリアシルグリセロール高生産性藻類の作製法。
- トリアシルグリセロール合成酵素遺伝子が、DGTT4遺伝子であることを特徴とする請求項1又は2に記載のトリアシルグリセロール高生産性藻類の作製法。
- 藻類が、ナンノクロロプシス属、クラミドモナス属、シュードコリシスチス属、フェオダクチラム属、オステレオコックス属、シアニディオシゾン属、クレブソルミディウム属、クロロキブス属、スピロギラ属、カラ属、コレオケーテ属、クロレラ属、又はフィスチュリフェラ属に属する藻類であることを特徴とする請求項1乃至4のいずれか一項に記載のトリアシルグリセロール高生産性藻類の作製法。
- 藻類が、ナンノクロロプシス属に属する藻類であることを特徴とする請求項1乃至4のいずれか一項に記載のトリアシルグリセロール高生産性藻類の作製法。
- 以下の(1)〜(3)を含むコンストラクトが導入されていることを特徴とするトリアシルグリセロール高生産性藻類、
(1)トリアシルグリセロール合成酵素遺伝子、
(2)トリアシルグリセロール合成酵素遺伝子の上流に配置されるリン欠乏応答プロモーター、
(3)トリアシルグリセロール合成酵素遺伝子の下流に配置され、コンストラクトを導入しようとする藻類と同種の藻類に由来する遺伝子の3'非翻訳領域。 - リン欠乏応答プロモーターが、SQD2遺伝子のプロモーターであることを特徴とする請求項7に記載のトリアシルグリセロール高生産性藻類。
- トリアシルグリセロール合成酵素遺伝子が、DGAT2遺伝子であることを特徴とする請求項7又は8に記載のトリアシルグリセロール高生産性藻類。
- トリアシルグリセロール合成酵素遺伝子が、DGTT4遺伝子であることを特徴とする請求項7又は8に記載のトリアシルグリセロール高生産性藻類。
- 藻類が、ナンノクロロプシス属、クラミドモナス属、シュードコリシスチス属、フェオダクチラム属、オステレオコックス属、シアニディオシゾン属、クレブソルミディウム属、クロロキブス属、スピロギラ属、カラ属、コレオケーテ属、クロレラ属、又はフィスチュリフェラ属に属する藻類であることを特徴とする請求項7乃至10のいずれか一項に記載のトリアシルグリセロール高生産性藻類。
- 藻類が、ナンノクロロプシス属に属する藻類であることを特徴とする請求項7乃至10のいずれか一項に記載のトリアシルグリセロール高生産性藻類。
- 請求項7乃至12のいずれか一項に記載のトリアシルグリセロール高生産性藻類をリン欠乏条件下で培養し、藻類細胞中にトリアシルグリセロールを蓄積させ、蓄積したトリアシルグリセロールを採取することを特徴とするトリアシルグリセロールの製造方法。
- 藻類に以下の(1)及び(2)を含むコンストラクトを導入することを特徴とするトリアシルグリセロール高生産性藻類の作製法、
(1)トリアシルグリセロール合成酵素遺伝子、
(2)トリアシルグリセロール合成酵素遺伝子の上流に配置されるリン欠乏応答プロモーター。 - リン欠乏応答プロモーターが、SQD2遺伝子のプロモーターであることを特徴とする請求項14に記載のトリアシルグリセロール高生産性藻類の作製法。
- トリアシルグリセロール合成酵素遺伝子が、DGAT2遺伝子であることを特徴とする請求項14又は15に記載のトリアシルグリセロール高生産性藻類の作製法。
- トリアシルグリセロール合成酵素遺伝子が、DGTT4遺伝子であることを特徴とする請求項14又は15に記載のトリアシルグリセロール高生産性藻類の作製法。
- 藻類が、ナンノクロロプシス属、クラミドモナス属、シュードコリシスチス属、フェオダクチラム属、オステレオコックス属、シアニディオシゾン属、クレブソルミディウム属、クロロキブス属、スピロギラ属、カラ属、コレオケーテ属、クロレラ属、又はフィスチュリフェラ属に属する藻類であることを特徴とする請求項14乃至17のいずれか一項に記載のトリアシルグリセロール高生産性藻類の作製法。
- 藻類が、ナンノクロロプシス属に属する藻類であることを特徴とする請求項14乃至17のいずれか一項に記載のトリアシルグリセロール高生産性藻類の作製法。
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2014049651 | 2014-03-13 | ||
JP2014049651 | 2014-03-13 | ||
PCT/JP2015/057302 WO2015137449A1 (ja) | 2014-03-13 | 2015-03-12 | トリアシルグリセロール高生産性藻類の作製法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPWO2015137449A1 true JPWO2015137449A1 (ja) | 2017-04-06 |
JP6537146B2 JP6537146B2 (ja) | 2019-07-03 |
Family
ID=54071886
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2016507824A Active JP6537146B2 (ja) | 2014-03-13 | 2015-03-12 | トリアシルグリセロール高生産性藻類の作製法 |
Country Status (4)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US9944958B2 (ja) |
JP (1) | JP6537146B2 (ja) |
AU (1) | AU2015227693B2 (ja) |
WO (1) | WO2015137449A1 (ja) |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2021078379A (ja) * | 2019-11-15 | 2021-05-27 | 国立大学法人東京工業大学 | Δ4デサチュレースによるドコサヘキサエン酸合成 |
JPWO2020071265A1 (ja) * | 2018-10-01 | 2021-09-02 | 花王株式会社 | 脂質の製造方法 |
Families Citing this family (8)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP6953127B2 (ja) | 2016-12-07 | 2021-10-27 | 花王株式会社 | 相同組換えが生じた形質転換体の取得確率を向上させる方法 |
CN108220306B (zh) * | 2016-12-09 | 2021-08-27 | 中国科学院青岛生物能源与过程研究所 | 具有三脂酰甘油合成功能的基因及其在理性调控产油微藻三脂酰甘油含量或饱和度中的应用 |
WO2019074876A1 (en) * | 2017-10-09 | 2019-04-18 | Board Of Supervisors Of Louisiana State University And Agricultural And Mechanical College | ALGAE BIOPLASTICS AND METHODS OF MAKING |
CN108424912B (zh) * | 2018-02-01 | 2021-07-13 | 山西省农业科学院作物科学研究所 | 玉米低磷胁迫诱导表达的启动子及其应用 |
CA3108798A1 (en) * | 2018-08-08 | 2020-02-13 | Board Of Trustees Of Michigan State University | Improved production of terpenoids using enzymes anchored to lipid droplet surface proteins |
JP7495080B2 (ja) * | 2018-09-07 | 2024-06-04 | 国立大学法人広島大学 | 微生物及びトリアシルグリセロールの製造方法 |
CN113652439A (zh) * | 2020-05-12 | 2021-11-16 | 中国科学院青岛生物能源与过程研究所 | 一种微拟球藻遗传转化体系及合成甘油三酯的基因和应用 |
CN115747184A (zh) * | 2022-08-04 | 2023-03-07 | 中国科学院青岛生物能源与过程研究所 | 一种提高微藻中链甘油三酯产率的方法 |
Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2001512977A (ja) * | 1997-02-24 | 2001-08-28 | パフォーマンス プランツ,インコーポレイテッド | リン酸欠乏誘導性プロモーター |
WO2011156520A2 (en) * | 2010-06-09 | 2011-12-15 | Green Pacific Biologicals, Inc. | Compositions and methods for increasing oil production and secretion |
JP2014068638A (ja) * | 2012-10-02 | 2014-04-21 | Tokyo Institute Of Technology | トリアシルグリセロール高生産性藻類の作製方法 |
WO2015029997A1 (ja) * | 2013-08-29 | 2015-03-05 | 国立大学法人東京工業大学 | 融合遺伝子、ベクター、トランスジェニック植物、植物油脂の製造方法、トランスジェニック植物の作出方法、およびトランスジェニック植物の作出用キット |
Family Cites Families (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP5835791B2 (ja) | 2010-05-28 | 2015-12-24 | 国立大学法人東京工業大学 | 植物油脂の製造方法 |
-
2015
- 2015-03-12 JP JP2016507824A patent/JP6537146B2/ja active Active
- 2015-03-12 AU AU2015227693A patent/AU2015227693B2/en active Active
- 2015-03-12 WO PCT/JP2015/057302 patent/WO2015137449A1/ja active Application Filing
- 2015-03-12 US US15/125,485 patent/US9944958B2/en active Active
Patent Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2001512977A (ja) * | 1997-02-24 | 2001-08-28 | パフォーマンス プランツ,インコーポレイテッド | リン酸欠乏誘導性プロモーター |
WO2011156520A2 (en) * | 2010-06-09 | 2011-12-15 | Green Pacific Biologicals, Inc. | Compositions and methods for increasing oil production and secretion |
JP2014068638A (ja) * | 2012-10-02 | 2014-04-21 | Tokyo Institute Of Technology | トリアシルグリセロール高生産性藻類の作製方法 |
WO2015029997A1 (ja) * | 2013-08-29 | 2015-03-05 | 国立大学法人東京工業大学 | 融合遺伝子、ベクター、トランスジェニック植物、植物油脂の製造方法、トランスジェニック植物の作出方法、およびトランスジェニック植物の作出用キット |
Non-Patent Citations (4)
Title |
---|
CAKMAK Z. E. ET AL.: "Induction of triacylglycerol production in Chlamydomonas reinhardtii: comparative analysis of differ", BIORESOUR. TECHNOL., vol. vol.155, JPN6015023221, 31 December 2013 (2013-12-31), pages 379 - 87 * |
LA RUSSA M. ET AL.: "Functional analysis of three type-2 DGAT homologue genes for triacylglycerol production in the green", J. BIOTECHNOL., vol. 162, no. 1, JPN6015023220, 2012, pages 13 - 20, XP028946462, DOI: doi:10.1016/j.jbiotec.2012.04.006 * |
PHYTOCHEMISTRY, 2006, VOL.67, PP.696-701, JPN6016017016 * |
生物工学, 2011, VOL.90, NO.7, PP.392-395, JPN6016017019 * |
Cited By (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPWO2020071265A1 (ja) * | 2018-10-01 | 2021-09-02 | 花王株式会社 | 脂質の製造方法 |
US11999988B2 (en) | 2018-10-01 | 2024-06-04 | Kao Corporation | Method of increasing lipid productivity in nannochloropsis by introducing a gene encoding both a thioredoxin domain and a thioredoxin reductase domain |
JP2021078379A (ja) * | 2019-11-15 | 2021-05-27 | 国立大学法人東京工業大学 | Δ4デサチュレースによるドコサヘキサエン酸合成 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
WO2015137449A1 (ja) | 2015-09-17 |
US9944958B2 (en) | 2018-04-17 |
JP6537146B2 (ja) | 2019-07-03 |
AU2015227693A1 (en) | 2016-10-20 |
US20170073711A1 (en) | 2017-03-16 |
AU2015227693B2 (en) | 2021-01-07 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP6537146B2 (ja) | トリアシルグリセロール高生産性藻類の作製法 | |
Wei et al. | Enhancing photosynthetic biomass productivity of industrial oleaginous microalgae by overexpression of RuBisCO activase | |
Courchesne et al. | Enhancement of lipid production using biochemical, genetic and transcription factor engineering approaches | |
JP7261815B2 (ja) | ネルボン酸を生産する組換え酵母菌株およびその使用 | |
US9957514B2 (en) | Transformation of duckweed and uses thereof | |
CN102559727A (zh) | 表达载体及应用微藻产生油脂的方法 | |
Úbeda-Mínguez et al. | Tools for microalgal biotechnology: development of an optimized transformation method for an industrially promising microalga—Tetraselmis chuii | |
JP2007521837A (ja) | シゾチトリウム脂肪酸合成酵素(fas)ならびにそれに関連した製品および方法 | |
Rasala et al. | Genetic engineering to improve algal biofuels production | |
JP5988212B2 (ja) | トリアシルグリセロール高生産性藻類の作製方法 | |
Rawat et al. | Current perspectives on integrated approaches to enhance lipid accumulation in microalgae | |
JP6818193B2 (ja) | 中性脂質の製造方法、トランスジェニック植物及びキット | |
JP2014527803A (ja) | トリアシルグリセロール(tag)リパーゼの遺伝子操作による微細藻類における脂質含量の増大 | |
Zhang et al. | Manipulation of triacylglycerol biosynthesis in Nannochloropsis oceanica by overexpressing an Arabidopsis thaliana diacylglycerol acyltransferase gene | |
BERLINER | Protoplasts of nonvascular plants | |
Korkhovoy et al. | Genetically engineered microalgae for enhanced biofuel production | |
Gan et al. | Genetic and metabolic engineering of microalgae | |
Fathy et al. | Overexpressing key enzymes in lipogenesis to boost microalgae cellular oil content for biofuel production: a mini-review | |
Dai et al. | Dual roles of two malic enzymes in lipid biosynthesis and salt stress response in Dunaliella salina | |
US10370687B2 (en) | Genetically modified strain of eukaryotic microalga having improved triglyceride productivity, and use thereof | |
Schuhmann et al. | Physiology, biochemistry and genetics of microalgal growth and lipid production. | |
Zhang et al. | Association of triacylglyceride content and transcript abundance of genes involving in lipid synthesis of nitrogen deficient Phaeodactylum tricornutum | |
Kumari et al. | Genetic engineering tools for enhancing lipid production in microalgae | |
WO2015182110A1 (ja) | 藻類及びその製造方法、並びに該藻類を用いたバイオマスの製造方法 | |
Eman et al. | Overexpressing key enzymes in lipogenesis to boost microalgae cellular oil content for biofuel production, A mini-review |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20180124 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20181204 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20190118 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20190521 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20190531 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 6537146 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
S111 | Request for change of ownership or part of ownership |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313113 |
|
R350 | Written notification of registration of transfer |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R350 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |