JP2023102179A - 脂質の製造方法 - Google Patents

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慎二 杉原
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達郎 尾崎
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Abstract

【課題】炭素原子数が２２の長鎖多価不飽和脂肪酸を生産させる脂質の製造方法、炭素原子数が２２の長鎖多価不飽和脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質の生産性を向上させた脂質の生産性の向上方法、炭素原子数が２２の長鎖多価不飽和脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質の生産性を向上させ生産される全脂肪酸又は全脂質中の脂肪酸の組成を改変する脂肪酸組成の改変方法、並びに炭素原子数が２２の長鎖多価不飽和脂肪酸の生産性を向上させた形質転換体を提供する。【解決手段】Δ５－エロンガーゼ及びΔ４－デサチュラーゼの発現を促進させたナンノクロロプシス（Nannochloropsis）属に属する藻類を培養し、炭素原子数２２の長鎖多価不飽和脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質を生産させる、脂質の製造方法。【選択図】なし

Description

本発明は、脂質の製造方法に関する。
脂肪酸は脂質の主要構成成分の１つであり、生体内においてグリセリンとのエステル結合により生成するトリアシルグリセロール等の脂質を構成する。また、多くの動植物において脂肪酸はエネルギー源として貯蔵され利用される物質でもある。動植物内に蓄えられた脂肪酸や脂質は、食用又は工業用として広く利用されている。
例えば、炭素原子数が１８以上の長鎖脂肪酸は炭素原子数や不飽和度によって化学的性質が異なり、様々な用途に用いられている。例えば、エイコサペンタエン酸（C20:5Δ5,8,11,14,17；eicosapentaenoic acid、以下「ＥＰＡ」ともいう）やドコサペンタエン酸（C22:5Δ7,10,13,16,19；docosapentaenoic acid、以下「ＤＰＡ」ともいう。なお、本明細書において「ＤＰＡ」とは、ｎ－３脂肪酸である。また、本明細書において、「ｎ－３脂肪酸」とは「ω３脂肪酸」脂肪酸を意味し、「ｎ－６脂肪酸」とは「ω６脂肪酸」脂肪酸を意味する。）、ドコサヘキサエン酸（C22:6Δ4,7,10,13,16,19；docosahexaenoic acid、以下、「ＤＨＡ」ともいう）といった長鎖多価不飽和脂肪酸（polyunsaturated fatty acid、以下、「ＰＵＦＡ」ともいう）の多くは、動物の生体内では合成できない必須脂肪酸であることが知られている。よってＰＵＦＡは栄養学的用途に特に有用であり、機能性食品などに用いられている。
一般に植物の脂肪酸合成経路は葉緑体に局在する。葉緑体ではアセチル－アシルキャリアプロテイン（acyl carrier protein、以下「ACP」ともいう）を出発物質とし、炭素鎖の伸長反応が繰り返され、最終的に炭素原子数が１８程度のアシル-ACP（脂肪酸残基であるアシル基とACPとからなる複合体）が合成される。合成されたアシル-ACPは、アシル-ACPチオエステラーゼによって遊離脂肪酸となり、小胞体に運ばれる。そして小胞体上で、遊離脂肪酸、アシル－ＣｏＡ、又は脂肪酸とグリセロールとのエステル化合物を基質とし、多数のデサチュラーゼ（Desaturase）やエロンガーゼ（Elongase）が作用する多段階反応によって、ＰＵＦＡが合成される。
前述のように、脂肪酸や脂質の利用は多岐にわたる。そのため、植物や細菌等の宿主において生体内での脂肪酸や脂質の生産性を向上させる試みが行われている。さらに、脂肪酸の用途や有用性はその炭素原子数（鎖長）や不飽和結合数（不飽和度）に依存するため、脂肪酸の炭素原子数や不飽和結合数を制御する試みも行われている。例えば、植物であるセイヨウアブラナのＴ－ＤＮＡ挿入変異株（NS-B50027-4株）は、全脂肪酸のうち、ＰＵＦＡであるＤＨＡを約１０％質量％と高含有することが報告されている（非特許文献１）。
また一般的にＰＵＦＡの生産性向上には、エロンガーゼの強化が有効であると考えられており、エロンガーゼをコードする遺伝子を導入した形質転換体を用いて様々なＰＵＦＡを製造する方法が提案されている。例えば、オストレオコッカス・タウリ（Ostreococcus tauri）由来のΔ５－エロンガーゼをコードする遺伝子を油糧酵母に導入して作製した形質転換体や、ピラミモナス・コルダタ（Pyramimonas cordata）由来のΔ５－エロンガーゼをコードする遺伝子を植物細胞に導入して作製した形質転換体を用いて、ＥＰＡ、ＤＰＡ、ＤＨＡなどのＰＵＦＡを製造することが知られている（特許文献１及び２参照）。また、トラウストキトリウム・エスピー（Thraustochytrium sp.）由来のΔ５－エロンガーゼをコードする遺伝子も知られている（特許文献３参照）。
また、次世代の油脂生産源として注目を集めている微細藻類の一種であるナンノクロロプシス（Nannochloropsis）属に属する藻類は、基本的に炭素原子数が２０のＥＰＡまでしか製造することができないが、ナンノクロロプシス属に属する藻類にサルシノクリシス・マリナ（Sarcinochrysis marina）由来のΔ５－エロンガーゼを導入することで、ＤＰＡなどのＰＵＦＡを合成できることが報告されている（特許文献４参照）。また、ナンノクロロプシス属に属する藻類の培養においてＰＵＦＡの生産性を向上させるために、油脂蓄積期の培養温度を低温にする試みがされている（非特許文献２）。
このように、藻類の脂質合成や蓄積のメカニズム、並びに藻類の脂質生産能力や脂質蓄積能力を応用した脂質生産技術について研究が始まっており、藻類において所望の炭素原子数を有するＰＵＦＡに富む脂質を効率的に産生させる方法に対しては、当技術分野における需要がある。
国際公開第２０１０／０５７２４６号 国際公開第２００６／０５２８７０号 国際公開第２０１０／１０１２２０号 特開２０１９－２１６６４３号公報
James R. Petrie, et al., Front. Plant Sci., 2020, Vol. 11, Article 727 Sirisuk, et al., Bioresource Technology, 2018, Vol. 270, pp. 504-511
本発明は、ナンノクロロプシス属に属する藻類において、炭素原子数が２２のＰＵＦＡを生産させる、脂質の製造方法を提供することを課題とする。
また本発明は、ナンノクロロプシス属に属する藻類において、炭素原子数が２２のＰＵＦＡ又はこれを構成成分とする脂質の生産性を向上させた、脂質の生産性の向上方法を提供することを課題とする。
また本発明は、ナンノクロロプシス属に属する藻類において炭素原子数が２２のＰＵＦＡ又はこれを構成成分とする脂質の生産性を向上させ、生産される全脂肪酸又は全脂質中の脂肪酸の組成を改変する、脂肪酸組成の改変方法を提供することを課題とする。
さらに本発明は、炭素原子数が２２のＰＵＦＡの生産性を向上させたナンノクロロプシス属に属する藻類の形質転換体を提供することを課題とする。
本発明者は上記課題に鑑み、鋭意検討を行った。
植物におけるＰＵＦＡの合成経路を、図１に示す。上記の通り、ナンノクロロプシス属に属する藻類は図１に記載の長鎖脂肪酸のうち、ＥＰＡなどのＰＵＦＡの生産性に優れる。しかし、ナンノクロロプシス属に属する藻類は、基本的には炭素原子数が２０までの脂肪酸の産生能しか有しておらず、ＤＰＡやＤＨＡなどの炭素原子数が２０を超える長鎖の脂肪酸は産生することができないか、できたとしても極微量しか産生できない。
そこで本発明者らは、ナンノクロロプシス属などの不等毛植物に属する藻類において、通常の条件下でも炭素原子数が２２のＰＵＦＡ及びこれを構成成分とする脂質の製造を可能とするタンパク質（酵素）の探索を行った。その結果、特定の生物種由来のΔ５－エロンガーゼ（以下、「Δ5-ELO」ともいう。）をコードする遺伝子、及び特定の生物種由来のΔ４－デサチュラーゼ（以下、「Δ4-DES」ともいう。）をコードする遺伝子をナンノクロロプシス属に属する藻類に導入することで、得られる形質転換体において炭素原子数が２２のＤＨＡを製造できることを初めて見出した。
本発明はこれらの知見に基づき完成されるに至ったものである。
本発明は、Δ5-ELO及びΔ4-DESの発現を促進させたナンノクロロプシス属に属する藻類を培養し、脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質を生産させる、脂質の製造方法に関する。
また本発明は、Δ5-ELO及びΔ4-DESの発現を促進させることにより、ナンノクロロプシス属に属する藻類の細胞内で生産される炭素原子数２２のＰＵＦＡ又はこれを構成成分とする脂質の生産性を向上させる、脂質の生産性の向上方法に関する。
さらに本発明は、Δ5-ELO及びΔ4-DESの発現が促進されている、ナンノクロロプシス属に属する藻類の形質転換体に関する。
本発明の脂質の製造方法によれば、ナンノクロロプシス属に属する藻類において、炭素原子数が２２のＰＵＦＡ又はこれを構成成分とする脂質の生産性を向上させることができる。
また本発明のナンノクロロプシス属に属する藻類の形質転換体は、炭素原子数が２２のＰＵＦＡ又はこれを構成成分とする脂質の生産性に優れる。
植物でのＰＵＦＡの一般的な合成経路を示す図である。
本明細書における「脂質」は、中性脂質（トリアシルグリセロール等）、ろう、セラミド等の単純脂質；リン脂質、糖脂質、スルホ脂質等の複合脂質；及びこれらの脂質から誘導される、脂肪酸（遊離脂肪酸）、アルコール類、炭化水素類等の誘導脂質を包含するものである。
一般に誘導脂質に分類される脂肪酸は、脂肪酸そのものを指し、「遊離脂肪酸」を意味する。本発明では単純脂質及び複合脂質分子中の脂肪酸部分を「脂肪酸残基」と表記する。そして、特に断りのない限り、「脂肪酸」は「遊離脂肪酸」と、塩又はエステル化合物等に含まれる「脂肪酸残基」の総称として用いる。
また本明細書において、「脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質」は、「遊離脂肪酸」と「当該脂肪酸残基を有する脂質」を総称して用いる。更に本明細書において、「脂肪酸組成」とは、前記遊離脂肪酸と脂肪酸残基とを合計した全脂肪酸（総脂肪酸）の分子数に対する各脂肪酸の分子数の割合を意味する。脂肪酸の重量（生産量）や脂肪酸組成は、実施例で用いた方法により測定できる。
さらに本明細書において、脂肪酸や、脂肪酸を構成するアシル基の表記において「Cx:y」とあるのは、炭素原子数がxであり、二重結合の数がyであることを表す。「Cx」は炭素原子数xの脂肪酸やアシル基を表す。
本明細書において、塩基配列及びアミノ酸配列の同一性は、Lipman-Pearson法（Science，1985，vol．227，p．1435-1441）によって計算される。具体的には、遺伝情報処理ソフトウェアGenetyx-Winのホモロジー解析（Search homology）プログラムを用いて、Unit size to compare（ktup）を2として解析を行うことにより算出される。
また本明細書において「ストリンジェントな条件」としては、例えばMolecular Cloning－A LABORATORY MANUAL THIRD EDITION［Joseph Sambrook，David W．Russell.，Cold Spring Harbor Laboratory Press］記載の方法が挙げられる。例えば、６×ＳＳＣ（１×ＳＳＣの組成：０．１５Ｍ塩化ナトリウム、０．０１５Ｍクエン酸ナトリウム、pH７．０）、０．５％ＳＤＳ、５×デンハート及び１００ｍｇ／ｍＬニシン精子ＤＮＡを含む溶液にプローブとともに６５℃で８～１６時間恒温し、ハイブリダイズさせる条件が挙げられる。
さらに明細書において、遺伝子の「上流」とは、翻訳開始点からの位置ではなく、対象として捉えている遺伝子又は領域の5'側に続く領域を示す。一方、遺伝子の「下流」とは、対象として捉えている遺伝子又は領域の3'側に続く領域を示す。
本明細書においてΔ5-ELOとは、炭素原子数が２２を超えるＰＵＦＡの合成に関与するタンパク質の１種であり、炭素原子数が２０のアラキドン酸（C20:4Δ5,8,11,14）やＥＰＡなどの脂肪酸から、炭素原子数が２２のドコサテトラエン酸（C22:4Δ7,10,13,16）やＤＰＡといった脂肪酸への伸長反応を触媒する脂肪酸伸長酵素である。そして、本明細書において「Δ５エロンガーゼ活性（以下、「Δ5-ELO活性」ともいう）」とは、炭素原子数２０の脂肪酸から、炭素原子数２２の脂肪酸への伸長サイクル（縮合、還元、脱水、還元）」のうち縮合反応を触媒する活性を意味する。この伸長サイクルが１周することにより炭素原子数２０の脂肪酸に２個の炭素原子が導入された炭素原子数２２の脂肪酸が生産される。
本発明のタンパク質がΔ5-ELO活性を有することは、例えば、酵母やナンノクロロプシス属に属する藻類等の宿主細胞内で機能するプロモーターの下流にΔ5-ELO遺伝子を連結したＤＮＡを宿主細胞に導入し、導入したΔ5-ELO遺伝子が発現する条件で培養して、宿主細胞又は培養液中の脂肪酸組成の変化をガスクロマトグラフィー解析等の方法を用いて分析することにより、確認することができる。
また、酵母やナンノクロロプシス属に属する藻類等の宿主細胞内で機能するプロモーターの下流にΔ5-ELO遺伝子を連結したＤＮＡを宿主細胞へ導入し、導入したΔ5-ELO遺伝子が発現する条件で細胞を培養した後、細胞の破砕液に対し、Yuanらの方法（Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1995, vol. 92(23), p. 10639-10643）によって調製したアシル-CoA、有利脂肪酸、または脂肪酸のグリセロールエステル化合物を基質とした反応を行うことにより、Δ5-ELO活性を測定することができる。
本発明で利用するΔ5-ELOは、Δ5-ELO活性を示すタンパク質（酵素）であれば特に制限はない。本発明における好ましいΔ5-ELOとしては、下記タンパク質（Ａ）～（Ｊ）が挙げられる。

（Ａ）配列番号６で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
（Ｂ）前記タンパク質（Ａ）のアミノ酸配列と同一性が６０％以上のアミノ酸配列からなり、かつΔ5-ELO活性を有するタンパク質。
（Ｃ）配列番号９で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
（Ｄ）前記タンパク質（Ｃ）のアミノ酸配列と同一性が６０％以上のアミノ酸配列からなり、かつΔ5-ELO活性を有するタンパク質。
（Ｅ）配列番号１２で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
（Ｆ）前記タンパク質（Ｅ）のアミノ酸配列と同一性が６０％以上のアミノ酸配列からなり、かつΔ5-ELO活性を有するタンパク質。
（Ｇ）配列番号１５で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
（Ｈ）前記タンパク質（Ｇ）のアミノ酸配列と同一性が６０％以上のアミノ酸配列からなり、かつΔ5-ELO活性を有するタンパク質。
（Ｉ）配列番号１８で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
（Ｊ）前記タンパク質（Ｉ）のアミノ酸配列と同一性が６０％以上のアミノ酸配列からなり、かつΔ5-ELO活性を有するタンパク質。
配列番号６のアミノ酸配列からなる前記タンパク質（Ａ）は、ピラミモナス（Pyramimonas）属に属する藻類であり、国立環境研究所（NIES）に保存されているピラミモナス・コルダタ由来のΔ5-ELOである。本発明の配列番号６のアミノ酸配列からなるタンパク質（前記タンパク質（Ａ））がΔ5-ELO活性を示すことは、後述の実施例で説明する。
配列番号９のアミノ酸配列からなる前記タンパク質（Ｃ）は、オストレオコッカス（Ostreococcus）属に属する藻類であるオストレオコッカス・タウリNIES-2673株由来のΔ5-ELOである。本発明の配列番号９のアミノ酸配列からなるタンパク質（前記タンパク質（Ｃ））がΔ5-ELO活性を示すことは、後述の実施例で説明する。
なお、オストレオコッカス・タウリNIES-2673株は、国立環境研究所（NIES）から入手することができる。
配列番号１２のアミノ酸配列からなる前記タンパク質（Ｅ）は、タラシオシーラ（Thalassiosira）属に属する藻類であり、ドイツゲッチンゲン大学藻類カルチャーコレクションに保存されているタラシオシーラ・シュードナナ（Thalassiosira pseudonana）SAG 1020-1b株由来のΔ5-ELOである。本発明の配列番号１２のアミノ酸配列からなるタンパク質（前記タンパク質（Ｅ））がΔ5-ELO活性を示すことは、後述の実施例で説明する。
配列番号１５のアミノ酸配列からなる前記タンパク質（Ｇ）は、フィスコミトレラ（Physcomitrella）属（ニセツリガネゴケ属）に属する植物であるフィスコミトレラ・パテンス（Physcomitrella patens）由来のΔ5-ELOである。本発明の配列番号１５のアミノ酸配列からなるタンパク質（前記タンパク質（Ｇ））がΔ5-ELO活性を示すことは、後述の実施例で説明する。
配列番号１８のアミノ酸配列からなる前記タンパク質（Ｉ）は、マーチャンティア（Marchantia）属に属する植物であるマーチャンティア・ポリモーファ（Marchantia polymorpha）由来のΔ5-ELOである。本発明の配列番号１８のアミノ酸配列からなるタンパク質（前記タンパク質（Ｉ））がΔ5-ELO活性を示すことは、後述の実施例で説明する。
一般に、酵素タンパク質をコードしているアミノ酸配列は、必ずしも全領域の配列が保存されていなければ酵素活性を示さないというものではなく、アミノ酸配列が変化しても酵素活性に影響を与えない領域も存在することが知られている。このような酵素活性に必須でない領域においては、アミノ酸の欠失、置換、挿入又は付加といった変異が導入されても酵素本来の活性を維持することができる。本発明においても、このように目的の酵素活性が保持され、かつ酵素タンパク質のアミノ酸配列が一部変異したタンパク質を用いることができる。
アミノ酸配列に変異を導入する方法としては、例えば、アミノ酸配列をコードする塩基配列に変異を導入する方法が挙げられる。変異を導入する方法としては、部位特異的な変異導入法が挙げられる。具体的な部位特異的変異の導入方法としては、Splicing overlap extension（SOE）PCR（Horton et al.，Gene 77，61－68，1989）を利用した方法、ＯＤＡ法（Hashimoto-Gotoh et al.，Gene，152，271-276，1995）、Kunkel法（Kunkel，T. A.，Proc. Natl. Acad. Sci. USA，1985，82，488）等が挙げられる。また、Site-Directed Mutagenesis System Mutan-SuperExpress Kmキット（タカラバイオ社）、Transformer TM Site-Directed Mutagenesisキット（Clontech社）、KOD-Plus-Mutagenesis Kit（東洋紡社）等の市販のキットを利用することもできる。また、ランダムな遺伝子変異を与えた後、適当な方法により酵素活性の評価及び遺伝子解析を行うことにより目的遺伝子を取得することもできる。
前記タンパク質（Ｂ）において、Δ5-ELO活性の点から、前記タンパク質（Ａ）のアミノ酸配列との同一性は６０％以上であり、６５％以上が好ましく、７０％以上がより好ましく、７５％以上がより好ましく、８０％以上がより好ましく、８５％以上がより好ましく、９０％以上がより好ましく、９３％以上がより好ましく、９５％以上がより好ましく、９７％以上がより好ましく、９８％以上がより好ましく、９９％以上がさらに好ましい。
また、前記タンパク質（Ｂ）として、前記タンパク質（Ａ）のアミノ酸配列に、１又は複数個（例えば１個以上１０６個以下、好ましくは１個以上９３個以下、より好ましくは１個以上８０個以下、より好ましくは１個以上６６個以下、より好ましくは１個以上５３個以下、より好ましくは１個以上４０個以下、より好ましくは１個以上２６個以下、より好ましくは１個以上１８個以下、より好ましくは１個以上１３個以下、より好ましくは１個以上８個以下、より好ましくは１個以上５個以下、さらに好ましくは１個以上２個以下）のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されており、かつΔ5-ELO活性を有するタンパク質が挙げられる。
前記タンパク質（Ｄ）において、Δ5-ELO活性の点から、前記タンパク質（Ｃ）のアミノ酸配列との同一性は６０％以上であり、６５％以上が好ましく、７０％以上がより好ましく、７５％以上がより好ましく、８０％以上がより好ましく、８５％以上がより好ましく、９０％以上がより好ましく、９３％以上がより好ましく、９５％以上がより好ましく、９７％以上がより好ましく、９８％以上がより好ましく、９９％以上がさらに好ましい。
また、前記タンパク質（Ｄ）として、前記タンパク質（Ｃ）のアミノ酸配列に、１又は複数個（例えば１個以上１２０個以下、好ましくは１個以上１０５個以下、より好ましくは１個以上９０個以下、より好ましくは１個以上７５個以下、より好ましくは１個以上６０個以下、より好ましくは１個以上４５個以下、より好ましくは１個以上３０個以下、より好ましくは１個以上２１個以下、より好ましくは１個以上１５個以下、より好ましくは１個以上９個以下、より好ましくは１個以上６個以下、さらに好ましくは１個以上３個以下）のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されており、かつΔ5-ELO活性を有するタンパク質が挙げられる。
前記タンパク質（Ｆ）において、Δ5-ELO活性の点から、前記タンパク質（Ｅ）のアミノ酸配列との同一性は６０％以上であり、６５％以上が好ましく、７０％以上がより好ましく、７５％以上がより好ましく、８０％以上がより好ましく、８５％以上がより好ましく、９０％以上がより好ましく、９３％以上がより好ましく、９５％以上がより好ましく、９７％以上がより好ましく、９８％以上がより好ましく、９９％以上がさらに好ましい。
また、前記タンパク質（Ｆ）として、前記タンパク質（Ｅ）のアミノ酸配列に、１又は複数個（例えば１個以上１４３個以下、好ましくは１個以上１２５個以下、より好ましくは１個以上１０７個以下、より好ましくは１個以上８９個以下、より好ましくは１個以上７１個以下、より好ましくは１個以上５３個以下、より好ましくは１個以上３５個以下、より好ましくは１個以上２５個以下、より好ましくは１個以上１７個以下、より好ましくは１個以上１０個以下、より好ましくは１個以上７個以下、さらに好ましくは１個以上３個以下）のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されており、かつΔ5-ELO活性を有するタンパク質が挙げられる。
前記タンパク質（Ｈ）において、Δ5-ELO活性の点から、前記タンパク質（Ｇ）のアミノ酸配列との同一性は６０％以上であり、６５％以上が好ましく、７０％以上がより好ましく、７５％以上がより好ましく、８０％以上がより好ましく、８５％以上がより好ましく、９０％以上がより好ましく、９３％以上がより好ましく、９５％以上がより好ましく、９７％以上がより好ましく、９８％以上がより好ましく、９９％以上がさらに好ましい。
また、前記タンパク質（Ｈ）として、前記タンパク質（Ｇ）のアミノ酸配列に、１又は複数個（例えば１個以上１３４個以下、好ましくは１個以上１１７個以下、より好ましくは１個以上１００個以下、より好ましくは１個以上８３個以下、より好ましくは１個以上６７個以下、より好ましくは１個以上５０個以下、より好ましくは１個以上３３個以下、より好ましくは１個以上２３個以下、より好ましくは１個以上１６個以下、より好ましくは１個以上１０個以下、より好ましくは１個以上６個以下、さらに好ましくは１個以上３個以下）のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されており、かつΔ5-ELO活性を有するタンパク質が挙げられる。
前記タンパク質（Ｊ）において、Δ5-ELO活性の点から、前記タンパク質（Ｉ）のアミノ酸配列との同一性は６０％以上であり、６５％以上が好ましく、７０％以上がより好ましく、７５％以上がより好ましく、８０％以上がより好ましく、８５％以上がより好ましく、９０％以上がより好ましく、９３％以上がより好ましく、９５％以上がより好ましく、９７％以上がより好ましく、９８％以上がより好ましく、９９％以上がさらに好ましい。
また、前記タンパク質（Ｊ）として、前記タンパク質（Ｉ）のアミノ酸配列に、１又は複数個（例えば１個以上１３９個以下、好ましくは１個以上１２１個以下、より好ましくは１個以上１０４個以下、より好ましくは１個以上８７個以下、より好ましくは１個以上６９個以下、より好ましくは１個以上５２個以下、より好ましくは１個以上３４個以下、より好ましくは１個以上２４個以下、より好ましくは１個以上１７個以下、より好ましくは１個以上１０個以下、より好ましくは１個以上６個以下、さらに好ましくは１個以上３個以下）のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されており、かつΔ5-ELO活性を有するタンパク質が挙げられる。
また、本発明で使用するΔ5-ELOは、前記タンパク質（Ａ）～（Ｊ）のアミノ酸配列に、タンパク質の輸送に関与するシグナルペプチド、又はタンパク質の安定性を高める既知のアミノ酸配列等が付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であってもよい。
前記タンパク質（Ａ）～（Ｊ）は、通常の化学的手法、遺伝子工学的手法等により得ることができる。例えば、ピラミモナス・コルダタ、オストレオコッカス・タウリ、タラシオシーラ・シュードナナ、フィスコミトレラ・パテンス、マーチャンティア・ポリモーファ等、ゲノム上にΔ5-ELOをコードする遺伝子（以下、「Δ5-ELO遺伝子」ともいう。）を有する藻類や植物から単離、精製等することで天然物由来のタンパク質を取得することができる。また、配列番号６、９、１２、１５及び１８で表されるアミノ酸配列情報をもとに人工的に化学合成することで、前記タンパク質（Ａ）～（Ｊ）を得ることができる。あるいは、遺伝子組み換え技術により、組換えタンパク質として前記タンパク質（Ａ）～（Ｊ）を作製してもよい。
また本発明で用いるΔ5-ELOは、１種でもよいし、２種以上のΔ5-ELOを組合せて用いてもよい。本発明において、Δ5-ELOとして、前記タンパク質（Ａ）～（Ｆ）からなる群より選ばれる少なくとも１種のタンパク質を用いることが好ましく、前記タンパク質（Ａ）、（Ｂ）、（Ｅ）、及び（Ｆ）からなる群より選ばれる少なくとも１種のタンパク質を用いることがより好ましい。
本発明において、Δ5-ELO遺伝子を用いて、後述の方法に従いΔ5-ELOの発現を促進することが好ましい。
本発明で用いることができるΔ5-ELO遺伝子（好ましくは、前記タンパク質（Ａ）～（Ｊ）をコードする遺伝子）の具体例として、下記ＤＮＡ（ａ）～（ｊ）からなる遺伝子が挙げられる。

（ａ）配列番号４で表される塩基配列からなるＤＮＡ。
（ｂ）前記ＤＮＡ（ａ）の塩基配列と同一性が６０％以上の塩基配列からなり、かつΔ5-ELO活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
（ｃ）配列番号７で表される塩基配列からなるＤＮＡ。
（ｄ）前記ＤＮＡ（ｃ）の塩基配列と同一性が６０％以上の塩基配列からなり、かつΔ5-ELO活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
（ｅ）配列番号１０で表される塩基配列からなるＤＮＡ。
（ｆ）前記ＤＮＡ（ｅ）の塩基配列と同一性が６０％以上の塩基配列からなり、かつΔ5-ELO活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
（ｇ）配列番号１３で表される塩基配列からなるＤＮＡ。
（ｈ）前記ＤＮＡ（ｇ）の塩基配列と同一性が６０％以上の塩基配列からなり、かつΔ5-ELO活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
（ｉ）配列番号１６で表される塩基配列からなるＤＮＡ。
（ｊ）前記ＤＮＡ（ｉ）の塩基配列と同一性が６０％以上の塩基配列からなり、かつΔ5-ELO活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
配列番号４で表される塩基配列からなる前記ＤＮＡ（ａ）は、配列番号６のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子であり、ピラミモナス・コルダタ由来のΔ5-ELO遺伝子である。
前記ＤＮＡ（ｂ）において、Δ5-ELO活性の点から、前記ＤＮＡ（ａ）の塩基配列との同一性は６０％以上であり、６５％以上が好ましく、７０％以上がより好ましく、７５％以上がより好ましく、８０％以上がより好ましく、８５％以上がより好ましく、９０％以上がより好ましく、９３％以上がより好ましく、９５％以上がより好ましく、９７％以上がより好ましく、９８％以上がより好ましく、９９％以上がさらに好ましい。
また前記ＤＮＡ（ｂ）として、配列番号４で表される塩基配列において、１又は複数個（例えば１個以上３２１個以下、好ましくは１個以上２８１個以下、より好ましくは１個以上２４１個以下、より好ましくは１個以上２０１個以下、より好ましくは１個以上１６０個以下、より好ましくは１個以上１２０個以下、より好ましくは１個以上８０個以下、より好ましくは１個以上５６個以下、より好ましくは１個以上４０個以下、より好ましくは１個以上２４個以下、より好ましくは１個以上１６個以下、さらに好ましくは１個以上８個以下）の塩基が欠失、置換、挿入、又は付加されており、かつΔ5-ELO活性を有するタンパク質をコードする遺伝子も好ましい。
さらに前記ＤＮＡ（ｂ）として、前記ＤＮＡ（ａ）と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつΔ5-ELO活性を有するタンパク質をコードする遺伝子も好ましい。
配列番号７で表される塩基配列からなる前記ＤＮＡ（ｃ）は、配列番号９のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子であり、オストレオコッカス・タウリNIES-2673株由来のΔ5-ELO遺伝子である。
前記ＤＮＡ（ｄ）において、Δ5-ELO活性の点から、前記ＤＮＡ（ｃ）の塩基配列との同一性は６０％以上であり、６５％以上が好ましく、７０％以上がより好ましく、７５％以上がより好ましく、８０％以上がより好ましく、８５％以上がより好ましく、９０％以上がより好ましく、９３％以上がより好ましく、９５％以上がより好ましく、９７％以上がより好ましく、９８％以上がより好ましく、９９％以上がさらに好ましい。
また前記ＤＮＡ（ｄ）として、配列番号７で表される塩基配列において、１又は複数個（例えば１個以上３６１個以下、好ましくは１個以上３１６個以下、より好ましくは１個以上２７０個以下、より好ましくは１個以上２２５個以下、より好ましくは１個以上１８０個以下、より好ましくは１個以上１３５個以下、より好ましくは１個以上９０個以下、より好ましくは１個以上６３個以下、より好ましくは１個以上４５個以下、より好ましくは１個以上２７個以下、より好ましくは１個以上１８個以下、さらに好ましくは１個以上９個以下）の塩基が欠失、置換、挿入、又は付加されており、かつΔ5-ELO活性を有するタンパク質をコードする遺伝子も好ましい。
さらに前記ＤＮＡ（ｄ）として、前記ＤＮＡ（ｃ）と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつΔ5-ELO活性を有するタンパク質をコードする遺伝子も好ましい。
配列番号１０で表される塩基配列からなる前記ＤＮＡ（ｅ）は、配列番号１２のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子であり、タラシオシーラ・シュードナナSAG 1020-1b株由来のΔ5-ELO遺伝子である。
前記ＤＮＡ（ｆ）において、Δ5-ELO活性の点から、前記ＤＮＡ（ｅ）の塩基配列との同一性は６０％以上であり、６５％以上が好ましく、７０％以上がより好ましく、７５％以上がより好ましく、８０％以上がより好ましく、８５％以上がより好ましく、９０％以上がより好ましく、９３％以上がより好ましく、９５％以上がより好ましく、９７％以上がより好ましく、９８％以上がより好ましく、９９％以上がさらに好ましい。
また前記ＤＮＡ（ｆ）として、配列番号１０で表される塩基配列において、１又は複数個（例えば１個以上４３０個以下、好ましくは１個以上３７６個以下、より好ましくは１個以上３２３個以下、より好ましくは１個以上２６９個以下、より好ましくは１個以上２１５個以下、より好ましくは１個以上１６１個以下、より好ましくは１個以上１０７個以下、より好ましくは１個以上７５個以下、より好ましくは１個以上５３個以下、より好ましくは１個以上３２個以下、より好ましくは１個以上２１個以下、さらに好ましくは１個以上１０個以下）の塩基が欠失、置換、挿入、又は付加されており、かつΔ5-ELO活性を有するタンパク質をコードする遺伝子も好ましい。
さらに前記ＤＮＡ（ｆ）として、前記ＤＮＡ（ｅ）と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつΔ5-ELO活性を有するタンパク質をコードする遺伝子も好ましい。
配列番号１３で表される塩基配列からなる前記ＤＮＡ（ｇ）は、配列番号１５のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子であり、フィスコミトレラ・パテンス由来のΔ5-ELO遺伝子である。
前記ＤＮＡ（ｈ）において、Δ5-ELO活性の点から、前記ＤＮＡ（ｇ）の塩基配列との同一性は６０％以上であり、６５％以上が好ましく、７０％以上がより好ましく、７５％以上がより好ましく、８０％以上がより好ましく、８５％以上がより好ましく、９０％以上がより好ましく、９３％以上がより好ましく、９５％以上がより好ましく、９７％以上がより好ましく、９８％以上がより好ましく、９９％以上がさらに好ましい。
また前記ＤＮＡ（ｈ）として、配列番号１３で表される塩基配列において、１又は複数個（例えば１個以上４０３個以下、好ましくは１個以上３５２個以下、より好ましくは１個以上３０２個以下、より好ましくは１個以上２５２個以下、より好ましくは１個以上２０１個以下、より好ましくは１個以上１５１個以下、より好ましくは１個以上１００個以下、より好ましくは１個以上７０個以下、より好ましくは１個以上５０個以下、より好ましくは１個以上３０個以下、より好ましくは１個以上２０個以下、さらに好ましくは１個以上１０個以下）の塩基が欠失、置換、挿入、又は付加されており、かつΔ5-ELO活性を有するタンパク質をコードする遺伝子も好ましい。
さらに前記ＤＮＡ（ｈ）として、前記ＤＮＡ（ｇ）と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつΔ5-ELO活性を有するタンパク質をコードする遺伝子も好ましい。
配列番号１６で表される塩基配列からなる前記ＤＮＡ（ｉ）は、配列番号１８のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子であり、マーチャンティア・ポリモーファ由来のΔ5-ELO遺伝子である。
前記ＤＮＡ（ｊ）において、Δ5-ELO活性の点から、前記ＤＮＡ（ｉ）の塩基配列との同一性は６０％以上であり、６５％以上が好ましく、７０％以上がより好ましく、７５％以上がより好ましく、８０％以上がより好ましく、８５％以上がより好ましく、９０％以上がより好ましく、９３％以上がより好ましく、９５％以上がより好ましく、９７％以上がより好ましく、９８％以上がより好ましく、９９％以上がさらに好ましい。
また前記ＤＮＡ（ｊ）として、配列番号１６で表される塩基配列において、１又は複数個（例えば１個以上４１８個以下、好ましくは１個以上３６６個以下、より好ましくは１個以上３１４個以下、より好ましくは１個以上２６１個以下、より好ましくは１個以上２０９個以下、より好ましくは１個以上１５７個以下、より好ましくは１個以上１０４個以下、より好ましくは１個以上７３個以下、より好ましくは１個以上５２個以下、より好ましくは１個以上３１個以下、より好ましくは１個以上２０個以下、さらに好ましくは１個以上１０個以下）の塩基が欠失、置換、挿入、又は付加されており、かつΔ5-ELO活性を有するタンパク質をコードする遺伝子も好ましい。
さらに前記ＤＮＡ（ｊ）として、前記ＤＮＡ（ｉ）と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつΔ5-ELO活性を有するタンパク質をコードする遺伝子も好ましい。
変異としては、塩基の欠失、置換、付加、又は挿入が挙げられる。塩基配列に変異を導入する方法としては、例えば、部位特異的な変異導入法が挙げられる。具体的な部位特異的変異の導入方法としては、SOE-PCRを利用した方法、ＯＤＡ法、Kunkel法等が挙げられる。また、Site-Directed Mutagenesis System Mutan-SuperExpress Kmキット（タカラバイオ社）、Transformer TM Site-Directed Mutagenesisキット（Clontech社）、KOD-Plus-Mutagenesis Kit（東洋紡社）等の市販のキットを利用することもできる。また、ランダムな遺伝子変異を与えた後、適当な方法により酵素活性の評価及び遺伝子解析を行うことにより目的遺伝子を取得することもできる。
また、本発明で使用するΔ5-ELO遺伝子として、前記ＤＮＡ（ａ）～（ｊ）の塩基配列にタンパク質の輸送に関与するシグナルペプチド、又はタンパク質の安定性を高める既知のアミノ酸配列等をコードするＤＮＡが付加された塩基配列からなる遺伝子であってもよい。
前記ＤＮＡ（ａ）～（ｊ）は、通常の遺伝子工学的手法により得ることができる。例えば、配列番号６、９、１２、１５及び１８で表されるアミノ酸配列又は配列番号４、７、１０、１３及び１６で表される塩基配列に基づいて、Δ5-ELO遺伝子を人工的に合成できる。Δ5-ELO遺伝子の合成は、例えば、インビトロジェン社等のサービスを利用することができる。また、Pyramimonas cordata、Ostreococcus tauri、Thalassiosira pseudonana、Physcomitrella patens、Marchantia polymorpha等、ゲノム上にΔ5-ELO遺伝子を有する藻類や植物のゲノムからクローニングによって取得することもできる。例えば、Molecular Cloning-A LABORATORY MANUAL THIRD EDITION［Joseph Sambrook, David W. Russell, Cold Spring Harbor Laboratory Press（2001）］記載の方法等により行うことができる。
また、使用する宿主の種類に応じて、配列番号４、７、１０、１３及び１６で表される塩基配列の一部を最適化してもよい。例えば、Thermo Fisher Scientific社のGeneArt人工遺伝子合成サービスを利用することができる。各種生物が使用するコドンの情報は、Codon Usage Database（www.kazusa.or.jp/codon/）などから入手可能である。なお、本発明において、コドン使用頻度をナンノクロロプシス・オセアニカ（Nannochloropsis oceanica）に最適化した配列番号４、７、１０、１３及び１６に示される塩基配列は、それぞれ配列番号５、８、１１、１４及び１７に示される塩基配列に対応する。
また本発明で用いるΔ5-ELO遺伝子は、１種でもよいし、２種以上のΔ5-ELO遺伝子を組合せて用いてもよい。本発明において、Δ5-ELO遺伝子として、前記ＤＮＡ（ａ）～（ｆ）のいずれか１つからなる遺伝子を用いることが好ましく、前記ＤＮＡ（ａ）、（ｂ）、（ｅ）、又は（ｆ）のいずれか１つからなる遺伝子を用いることがより好ましい。
本明細書においてΔ4-DESとは、ドコサテトラエン酸又はＤＰＡのΔ4位に不飽和結合を導入し、ドコサペンタエン酸（n-6）（C22:5Δ4,7,10,13,16）又はＤＨＡを生成する反応を触媒するタンパク質（酵素）を意味する。そして、本明細書において「Δ４デサチュラーゼ活性（以下、「Δ4-DES活性」ともいう）とは、ドコサテトラエン酸又はＤＰＡのΔ4位に不飽和結合を導入する活性を意味する。
本発明のタンパク質がΔ4-DES活性を有することは、例えば、Δ4-DES合成遺伝子欠損株を用いた系により確認することができる。あるいは、宿主細胞内で機能するプロモーターの下流にΔ4-DES遺伝子を連結したＤＮＡをΔ4-DES合成遺伝子欠損株に導入し、導入したΔ4-DES遺伝子が発現する条件で培養して、ドコサペンタエン酸（n-6）（C22:5Δ4,7,10,13,16）又はＤＨＡの生成を検討することで確認することができる。
また、酵母やナンノクロロプシス属に属する藻類等の宿主細胞内で機能するプロモーターの下流にΔ4-DES遺伝子を連結したＤＮＡを宿主細胞へ導入し、導入したΔ4-DES遺伝子が発現する条件で細胞を培養した後、細胞の破砕液に対し、Yuanらの方法（Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1995, vol. 92(23), p. 10639-10643）によって調製したアシル-CoA、有利脂肪酸、または脂肪酸のグリセロールエステル化合物を基質とした反応を行うことにより、Δ4-DES活性を測定することができる。
本発明で利用するΔ4-DESは、Δ4-DES活性を示すタンパク質（酵素）であれば特に制限はない。本発明における好ましいΔ4-DESとしては、下記タンパク質（Ｋ）～（Ｎ）が挙げられる。

（Ｋ）配列番号２７で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
（Ｌ）前記タンパク質（Ｋ）のアミノ酸配列と同一性が６０％以上のアミノ酸配列からなり、かつΔ4-DES活性を有するタンパク質。
（Ｍ）配列番号３０で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
（Ｎ）前記タンパク質（Ｍ）のアミノ酸配列と同一性が６０％以上のアミノ酸配列からなり、かつΔ4-DES活性を有するタンパク質。
配列番号２７のアミノ酸配列からなる前記タンパク質（Ｋ）は、パブロバ（Pavlova）属に属する藻類であるパブロバ・ルテリ（Pavlova lutheri）CCAP 931/1株由来のΔ4-DESである。本発明の配列番号２７のアミノ酸配列からなるタンパク質（前記タンパク質（Ｋ））がΔ4-DES活性を示すことは、後述の実施例で説明する。
なお、パブロバ・ルテリCCAP 931/1株は、Culture Collection of Algae and Protozoa(CCAP)から入手することができる。
前記タンパク質（Ｌ）において、Δ4-DES活性の点から、前記タンパク質（Ｋ）のアミノ酸配列との同一性は６０％以上であり、６５％以上が好ましく、７０％以上がより好ましく、７５％以上がより好ましく、８０％以上がより好ましく、８５％以上がより好ましく、９０％以上がより好ましく、９３％以上がより好ましく、９５％以上がより好ましく、９７％以上がより好ましく、９８％以上がより好ましく、９９％以上がさらに好ましい。
また、前記タンパク質（Ｌ）として、前記タンパク質（Ｋ）のアミノ酸配列に、１又は複数個（例えば１個以上１７８個以下、好ましくは１個以上１５５個以下、より好ましくは１個以上１３３個以下、より好ましくは１個以上１１１個以下、より好ましくは１個以上８９個以下、より好ましくは１個以上６６個以下、より好ましくは１個以上４４個以下、より好ましくは１個以上３１個以下、より好ましくは１個以上２２個以下、より好ましくは１個以上１３個以下、より好ましくは１個以上８個以下、さらに好ましくは１個以上４個以下）のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されており、かつΔ4-DES活性を有するタンパク質が挙げられる。
配列番号３０のアミノ酸配列からなる前記タンパク質（Ｍ）は、パブロバ属に属する藻類であるパブロバ・サリナ（Pavlova salina）由来のΔ4-DESである。本発明の配列番号３０のアミノ酸配列からなるタンパク質（前記タンパク質（Ｍ））がΔ4-DES活性を示すことは、後述の実施例で説明する。
前記タンパク質（Ｎ）において、Δ4-DES活性の点から、前記タンパク質（Ｍ）のアミノ酸配列との同一性は６０％以上であり、６５％以上が好ましく、７０％以上がより好ましく、７５％以上がより好ましく、８０％以上がより好ましく、８５％以上がより好ましく、９０％以上がより好ましく、９３％以上がより好ましく、９５％以上がより好ましく、９７％以上がより好ましく、９８％以上がより好ましく、９９％以上がさらに好ましい。
また、前記タンパク質（Ｎ）として、前記タンパク質（Ｍ）のアミノ酸配列に、１又は複数個（例えば１個以上１７８個以下、好ましくは１個以上１５６個以下、より好ましくは１個以上１３４個以下、より好ましくは１個以上１１１個以下、より好ましくは１個以上８９個以下、より好ましくは１個以上６７個以下、より好ましくは１個以上４４個以下、より好ましくは１個以上３１個以下、より好ましくは１個以上２２個以下、より好ましくは１個以上１３個以下、より好ましくは１個以上８個以下、さらに好ましくは１個以上４個以下）のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されており、かつΔ4-DES活性を有するタンパク質が挙げられる。
アミノ酸配列に変異を導入する方法としては、例えば、Δ5-ELOについて前述した方法が挙げられる。
また、本発明で使用するΔ4-DESとして、前記タンパク質（Ｋ）～（Ｎ）のアミノ酸配列に、タンパク質の輸送に関与するシグナルペプチド、又はタンパク質の安定性を高める既知のアミノ酸配列等が付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であってもよい。
前記タンパク質（Ｋ）～（Ｎ）は、通常の化学的手法、遺伝子工学的手法等により得ることができる。例えば、パブロバ・ルテリ、及びパブロバ・サリナ等、ゲノム上にΔ4-DESをコードする遺伝子（以下、「Δ4-DES遺伝子」ともいう）を有する藻類から単離、精製等することで天然物由来のタンパク質を取得することができる。また、配列番号２７及び３０で表されるアミノ酸配列情報をもとに人工的に化学合成することで、前記タンパク質（Ｋ）～（Ｎ）を得ることができる。あるいは、遺伝子組み換え技術により、組換えタンパク質として前記タンパク質（Ｋ）～（Ｎ）を作製してもよい。
また本発明で用いるΔ4-DESは、１種でもよいし、２種以上のΔ4-DESを組合せて用いてもよい。
本発明において、Δ4-DESをコードする遺伝子を用いて、後述の方法に従いΔ4-DESの発現を促進することが好ましい。
本発明で用いることができるΔ4-DES遺伝子（好ましくは、前記タンパク質（Ｋ）～（Ｎ）をコードする遺伝子）の具体例として、下記ＤＮＡ（ｋ）～（ｎ）からなる遺伝子が挙げられる。

（ｋ）配列番号２５で表される塩基配列からなるＤＮＡ。
（ｌ）前記ＤＮＡ（ｋ）の塩基配列と同一性が６０％以上の塩基配列からなり、かつΔ4-DES活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
（ｍ）配列番号２８で表される塩基配列からなるＤＮＡ。
（ｎ）前記ＤＮＡ（ｍ）の塩基配列と同一性が６０％以上の塩基配列からなり、かつΔ4-DES活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
配列番号２５で表される塩基配列からなる前記ＤＮＡ（ｋ）は、配列番号２７のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子であり、パブロバ・ルテリCCAP 931/1株由来のΔ4-DES遺伝子である。
前記ＤＮＡ（ｌ）において、Δ4-DES活性の点から、前記ＤＮＡ（ｋ）の塩基配列との同一性は６０％以上であり、６５％以上が好ましく、７０％以上がより好ましく、７５％以上がより好ましく、８０％以上がより好ましく、８５％以上がより好ましく、９０％以上がより好ましく、９３％以上がより好ましく、９５％以上がより好ましく、９７％以上がより好ましく、９８％以上がより好ましく、９９％以上がさらに好ましい。
また前記ＤＮＡ（ｌ）として、配列番号２５で表される塩基配列において、１又は複数個（例えば１個以上５３５個以下、好ましくは１個以上４６８個以下、より好ましくは１個以上４０１個以下、より好ましくは１個以上３３４個以下、より好ましくは１個以上２６７個以下、より好ましくは１個以上２００個以下、より好ましくは１個以上１３３個以下、より好ましくは１個以上９３個以下、より好ましくは１個以上６６個以下、より好ましくは１個以上４０個以下、より好ましくは１個以上２６個以下、さらに好ましくは１個以上１３個以下）の塩基が欠失、置換、挿入、又は付加されており、かつΔ4-DES活性を有するタンパク質をコードする遺伝子も好ましい。
さらに前記ＤＮＡ（ｌ）として、前記ＤＮＡ（ｋ）と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつΔ4-DES活性を有するタンパク質をコードする遺伝子も好ましい。
配列番号２８で表される塩基配列からなる前記ＤＮＡ（ｍ）は、配列番号３０のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子であり、パブロバ・サリナ由来のΔ4-DES遺伝子である。
前記ＤＮＡ（ｎ）において、Δ4-DES活性の点から、前記ＤＮＡ（ｍ）の塩基配列との同一性は６０％以上であり、６５％以上が好ましく、７０％以上がより好ましく、７５％以上がより好ましく、８０％以上がより好ましく、８５％以上がより好ましく、９０％以上がより好ましく、９３％以上がより好ましく、９５％以上がより好ましく、９７％以上がより好ましく、９８％以上がより好ましく、９９％以上がさらに好ましい。
また前記ＤＮＡ（ｎ）として、配列番号２８で表される塩基配列において、１又は複数個（例えば１個以上５３７個以下、好ましくは１個以上４７０個以下、より好ましくは１個以上４０３個以下、より好ましくは１個以上３３６個以下、より好ましくは１個以上２６８個以下、より好ましくは１個以上２０１個以下、より好ましくは１個以上１３４個以下、より好ましくは１個以上９４個以下、より好ましくは１個以上６７個以下、より好ましくは１個以上４０個以下、より好ましくは１個以上２６個以下、さらに好ましくは１個以上１３個以下）の塩基が欠失、置換、挿入、又は付加されており、かつΔ4-DES活性を有するタンパク質をコードする遺伝子も好ましい。
さらに前記ＤＮＡ（ｎ）として、前記ＤＮＡ（ｍ）と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつΔ4-DES活性を有するタンパク質をコードする遺伝子も好ましい。
塩基配列に変異を導入する方法としては、例えば、Δ5-ELOについて前述した方法が挙げられる。
また、本発明で使用するΔ4-DES遺伝子として、前記ＤＮＡ（ｋ）～（ｎ）の塩基配列にタンパク質の輸送に関与するシグナルペプチド、又はタンパク質の安定性を高める既知のアミノ酸配列等をコードするＤＮＡが付加された塩基配列からなる遺伝子であってもよい。
前記ＤＮＡ（ｋ）～（ｎ）は、通常の遺伝子工学的手法により得ることができる。例えば、配列番号２７又は３０で表されるアミノ酸配列又は配列番号２５又は２８で表される塩基配列に基づいて、Δ4-DES遺伝子を人工的に合成できる。Δ4-DES遺伝子の合成は、例えば、インビトロジェン社等のサービスを利用することができる。また、パブロバ・ルテリ、及びパブロバ・サリナ等、ゲノム上にΔ4-DES遺伝子を有する藻類のゲノムからクローニングによって取得することもできる。例えば、Molecular Cloning-A LABORATORY MANUAL THIRD EDITION［Joseph Sambrook, David W. Russell, Cold Spring Harbor Laboratory Press（2001）］記載の方法等により行うことができる。
また、使用する宿主の種類に応じて、配列番号２５又は２８で表される塩基配列の一部を最適化してもよい。例えば、Thermo Fisher Scientific社のGeneArt人工遺伝子合成サービスを利用することができる。なお、本発明において、コドン使用頻度をナンノクロロプシス・オセアニカに最適化した配列番号２５及び２８に示される塩基配列は、それぞれ配列番号２６及び２９に示される塩基配列に対応する。
また本発明で用いるΔ4-DES遺伝子は、１種でもよいし、２種以上のΔ4-DES遺伝子を組合せて用いてもよい。
さらに本発明に用いる宿主は、前記Δ5-ELO及びΔ4-DESに加えて、ACPの発現が促進されていることが好ましく、ACPをコードする遺伝子（以下単に、「ACP遺伝子」ともいう）の発現が促進されていることがより好ましい。
ACPは脂肪酸の生合成反応（脂肪酸の伸長反応）の足場（担体）として機能する。脂肪酸のアシル基は、ACPのセリン残基に結合したホスホパンテテイン基とチオエステル結合を形成する。この状態で脂肪酸が伸長される。
そのため、ACPの発現を促進することで、好ましくはACP遺伝子の発現を促進することで、脂質の生産性、特に脂肪酸の生産性を一層向上させることができる。
本発明において、「ACP活性」とは、脂肪酸のアシル基とチオエステル結合を形成することで脂肪酸の伸長反応の足場として機能する活性を意味する。
タンパク質がACP活性を有することは、例えば、ACP遺伝子欠損株に、宿主内で機能するプロモーターの下流に前記タンパク質をコードする遺伝子を連結したＤＮＡを導入し、脂肪酸合成能を相補させることで確認することができる。あるいは、宿主細胞内で機能するプロモーターの下流に前記タンパク質をコードする遺伝子を連結したＤＮＡを宿主細胞へ導入し、導入した遺伝子が発現する条件下で細胞を培養し、宿主細胞内又は培養液中の脂肪酸の生産量や組成の変化を常法により分析することで確認できる。あるいは、前記タンパク質を、Dall’aglio, et al., Biochemistry, 2011, vol. 50(25), p. 5704-5717等の文献を参考にして、補酵素A（CoA）と適当なACPシンターゼ（ACP synthase）（ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼ（phosphopantetheinyl transferase））と反応させ、ホスホパンテテイン基が結合したholo-ACPを形成させることで確認することができる。あるいは、Rock, Garwin, The Journal of Biological Chemistry, 1979, vol. 254(15), p. 7123-7128等の文献を参考にして、前記holo-ACPを脂肪酸及び適当なアシル-ACPシンセターゼ（acyl-ACP synthetase）と反応させ、アシル基が結合したacyl-ACPを形成させることで確認することができる。
本発明における好ましいACPとしては、ACP活性を示すタンパク質であれば特に制限はない。本発明における好ましいACPとしては、下記タンパク質（Ｏ）又は（Ｐ）が挙げられる。

（Ｏ）配列番号３１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質、好ましくは配列番号３１で表されるアミノ酸配列における２３～１４６番目のアミノ酸配列からなるタンパク質、より好ましくは前記ナンノクロロプシス属に属する藻類の細胞内で機能する葉緑体移行シグナル配列が配列番号３１で表されるアミノ酸配列における２３～１４６番目のアミノ酸配列のＮ末端側に付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質。
（Ｐ）前記タンパク質（Ｏ）のアミノ酸配列と同一性が６０％以上のアミノ酸配列からなり、かつアシルキャリアープロテイン活性（以下、「ACP活性」ともいう）を有するタンパク質。

配列番号３１のアミノ酸配列からなるタンパク質は、ナンノクロロプシス属に属する藻類であるナンノクロロプシス・オセアニカNIES2145株由来のACP（以下、「NoACP1」ともいう）である。
前記タンパク質（Ｐ）において、ACP活性の点から、前記タンパク質（Ｏ）のアミノ酸配列との同一性は６０％以上であり、６５％以上が好ましく、７０％以上がより好ましく、７５％以上がより好ましく、８０％以上がより好ましく、８５％以上がより好ましく、９０％以上がより好ましく、９３％以上がより好ましく、９５％以上がより好ましく、９７％以上がより好ましく、９８％以上がより好ましく、９９％以上がさらに好ましい。
また、前記タンパク質（Ｐ）として、前記タンパク質（Ｏ）のアミノ酸配列に、１又は複数個（例えば１個以上５８個以下、好ましくは１個以上５１個以下、より好ましくは１個以上４３個以下、より好ましくは１個以上３６個以下、より好ましくは１個以上２９個以下、より好ましくは１個以上２１個以下、より好ましくは１個以上１４個以下、より好ましくは１個以上１０個以下、より好ましくは１個以上７個以下、より好ましくは１個以上４個以下、より好ましくは１個以上２個以下、より好ましくは１個）のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されており、かつACPを有するタンパク質が挙げられる。
アミノ酸配列に変異を導入する方法としては、例えば、Δ5-ELOについて前述した方法が挙げられる。
さらに、ナンノクロロプシス属に属する藻類において、ACPは葉緑体に局在することが好ましい。例えば、ナンノクロロプシス属に属する藻類由来のACP遺伝子の塩基配列に、ナンノクロロプシス属に属する藻類の細胞内で機能する葉緑体移行シグナルをコードする塩基配列を付加した遺伝子の発現を促進することがより好ましい。このような葉緑体移行シグナルをコードする塩基配列としては、たとえば配列番号３３で示されるVCP1葉緑体移行シグナル断片などが挙げられる。あるいは、ナンノクロロプシス属に属する藻類由来のACPをコードする遺伝子を葉緑体ゲノム中に導入し、導入した遺伝子の発現を促進することがより好ましい。
前記タンパク質（Ｏ）及び（Ｐ）は、通常の化学的手法、遺伝子工学的手法等により得ることができる。例えば、ナンノクロロプシス・オセアニカから単離、精製等することで天然物由来のタンパク質を取得することができる。また、配列番号３１に示すアミノ酸配列情報をもとに人工的に化学合成することで、前記タンパク質（Ｏ）及び（Ｐ）を得ることができる。あるいは、遺伝子組み換え技術により、組換えタンパク質として前記タンパク質（Ｏ）及び（Ｐ）を作製してもよい。組換えタンパク質を作製する場合には、後述する、ACPをコードする遺伝子を用いることができる。
前記ACP（好ましくは前記タンパク質（Ｏ）又は（Ｐ））をコードする遺伝子（以下、「ACP遺伝子」ともいう）として、下記ＤＮＡ（ｏ）又は（ｐ）からなる遺伝子が挙げられる。

（ｏ）配列番号３２で表される塩基配列からなるＤＮＡ、好ましくは配列番号３２で表される塩基配列における６７～４４１番目の塩基配列からなるＤＮＡ、より好ましくは前記ナンノクロロプシス属に属する藻類の細胞内で機能する葉緑体移行シグナル配列をコードする塩基配列が配列番号３２で表される塩基配列における６７～４４１番目の塩基配列の５’末端側に付加された塩基配列からなるＤＮＡ。
（ｐ）前記ＤＮＡ（ｏ）の塩基配列と同一性が６０％以上の塩基配列からなり、かつACP活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。

配列番号３２の塩基配列は、配列番号３１のアミノ酸配列からなるタンパク質（NoACP）をコードする遺伝子（以下、「NoACP1遺伝子」ともいう）の塩基配列である。
前記ＤＮＡ（ｐ）において、ACP活性の点から、前記ＤＮＡ（ｏ）の塩基配列との同一性は６０％以上であり、６５％以上が好ましく、７０％以上がより好ましく、７５％以上がより好ましく、８０％以上がより好ましく、８５％以上がより好ましく、９０％以上がより好ましく、９３％以上がより好ましく、９５％以上がより好ましく、９７％以上がより好ましく、９８％以上がより好ましく、９９％以上がさらに好ましい。
また前記ＤＮＡ（ｐ）として、前記ＤＮＡ（ｏ）の塩基配列において１又は複数個（例えば１個以上１７６個以下、好ましくは１個以上１５４個以下、より好ましくは１個以上１３２個以下、より好ましくは１個以上１１０個以下、より好ましくは１個以上８８個以下、より好ましくは１個以上６６個以下、より好ましくは１個以上４４個以下、より好ましくは１個以上３０個以下、より好ましくは１個以上２２個以下、より好ましくは１個以上１３個以下、より好ましくは１個以上８個以下、より好ましくは１個以上４個以下）の塩基が欠失、置換、挿入、又は付加されており、かつACP活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡも好ましい。
さらに前記ＤＮＡ（ｐ）として、前記ＤＮＡ（ｏ）と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつACP活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡも好ましい。
塩基配列に変異を導入する方法としては、例えば、Δ5-ELO遺伝子について前述した方法が挙げられる。
さらに本発明に用いる宿主は、前記Δ5-ELO及びΔ4-DESに加えて、Δ１２－デサチュラーゼ（以下、「Δ12-DES」ともいう。）の発現が促進されていることが好ましく、Δ12-DESをコードする遺伝子（以下単に、「Δ12-DES遺伝子」ともいう）の発現が促進されていることがより好ましい。
本明細書において「Δ12-DES」とは、オレイン酸（C18:1Δ9）のΔ12位に不飽和結合を導入し、ω-6脂肪酸であるリノール酸（C18:2Δ9,12）を生成する反応を触媒するタンパク質（酵素）を意味する。そして本明細書において「Δ12-デサチュラーゼ活性（以下、「Δ12-DES活性」ともいう）」とは、オレイン酸のΔ12位に不飽和結合を導入する活性を意味する。
タンパク質がΔ12-DES活性を有することは、例えば、Δ12-DES合成遺伝子欠損株を用いた系により確認することができる。あるいは、宿主細胞内で機能するプロモーターの下流に前記タンパク質をコードする遺伝子を連結したＤＮＡをΔ12-DES合成遺伝子欠損株に導入し、リノール酸の生成を検討することで確認できる。あるいは、Δ12-DES又はこれを含有する細胞破砕液を調製し、オレイン酸、オレオイルＣｏＡなどを含む反応液と反応させ、常法に従いオレイン酸量の減少又はリノール酸量の増加を測定することで確認できる。
本発明における好ましいΔ12-DESとしては、下記タンパク質（Ｑ）又は（Ｒ）が挙げられる。
（Ｑ）配列番号３４で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
（Ｒ）前記タンパク質（Ｑ）のアミノ酸配列と同一性が６０％以上のアミノ酸配列からなり、かつΔ12-デサチュラーゼ活性を有するタンパク質。

配列番号３４のアミノ酸配列からなるタンパク質は、ナンノクロロプシス属に属する藻類であるナンノクロロプシス・オセアニカNIES2145株由来のΔ12-DES（以下、「NoΔ12-DES」ともいう）である。
前記タンパク質（Ｒ）において、Δ12-DES活性の点から、前記タンパク質（Ｑ）のアミノ酸配列との同一性は６０％以上であり、６５％以上が好ましく、７０％以上がより好ましく、７５％以上がより好ましく、８０％以上がより好ましく、８５％以上がより好ましく、９０％以上がより好ましく、９３％以上がより好ましく、９５％以上がより好ましく、９７％以上がより好ましく、９８％以上がより好ましく、９９％以上がさらに好ましい。
また、前記タンパク質（Ｒ）として、前記タンパク質（Ｑ）のアミノ酸配列に、１又は複数個（例えば１個以上１７５個以下、好ましくは１個以上１５３個以下、より好ましくは１個以上１３１個以下、より好ましくは１個以上１０９個以下、より好ましくは１個以上８７個以下、より好ましくは１個以上６５個以下、より好ましくは１個以上４３個以下、より好ましくは１個以上３０個以下、より好ましくは１個以上２１個以下、より好ましくは１個以上１３個以下、より好ましくは１個以上８個以下、より好ましくは１個以上４個以下）のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されており、かつΔ12-DESを有するタンパク質が挙げられる。
アミノ酸配列に変異を導入する方法としては、例えば、Δ5-ELOについて前述した方法が挙げられる。
前記タンパク質（Ｑ）及び（Ｒ）は、通常の化学的手法、遺伝子工学的手法等により得ることができる。例えば、ナンノクロロプシス・オセアニカから単離、精製等することで天然物由来のタンパク質を取得することができる。また、配列番号３４に示すアミノ酸配列情報をもとに人工的に化学合成することで、前記タンパク質（Ｑ）及び（Ｒ）を得ることができる。あるいは、遺伝子組み換え技術により、組換えタンパク質として前記タンパク質（Ｑ）及び（Ｒ）を作製してもよい。組換えタンパク質を作製する場合には、後述する、Δ12-DESをコードする遺伝子を用いることができる。
前記Δ12-DES（好ましくは前記タンパク質（Ｑ）又は（Ｒ））をコードする遺伝子（以下、「Δ12-DES遺伝子」ともいう）として、下記ＤＮＡ（ｑ）又は（ｒ）からなる遺伝子が挙げられる。

（ｑ）配列番号３５で表される塩基配列からなるＤＮＡ。
（ｒ）前記ＤＮＡ（ｑ）の塩基配列と同一性が６０％以上の塩基配列からなり、かつΔ12-DES活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。

配列番号３５の塩基配列は、配列番号３４のアミノ酸配列からなるタンパク質（NoΔ12-DES）をコードする遺伝子（以下、「NoΔ12-DES遺伝子」ともいう）の塩基配列である。
前記ＤＮＡ（ｒ）において、Δ12-DES活性の点から、前記ＤＮＡ（ｑ）の塩基配列との同一性は６０％以上であり、６５％以上が好ましく、７０％以上がより好ましく、７５％以上がより好ましく、８０％以上がより好ましく、８５％以上がより好ましく、９０％以上がより好ましく、９３％以上がより好ましく、９５％以上がより好ましく、９７％以上がより好ましく、９８％以上がより好ましく、９９％以上がさらに好ましい。
また前記ＤＮＡ（ｒ）として、前記ＤＮＡ（ｑ）の塩基配列において１又は複数個（例えば１個以上５２６個以下、好ましくは１個以上４６０個以下、より好ましくは１個以上３９５個以下、より好ましくは１個以上３２９個以下、より好ましくは１個以上２６３個以下、より好ましくは１個以上１９７個以下、より好ましくは１個以上１３１個以下、より好ましくは１個以上９２個以下、より好ましくは１個以上６５個以下、より好ましくは１個以上３９個以下、より好ましくは１個以上２６個以下、より好ましくは１個以上１３個以下）の塩基が欠失、置換、挿入、又は付加されており、かつΔ12-DES活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡも好ましい。
さらに前記ＤＮＡ（ｒ）として、前記ＤＮＡ（ｑ）と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつΔ12-DES活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡも好ましい。
塩基配列に変異を導入する方法としては、例えば、Δ5-ELO遺伝子について前述した方法が挙げられる。
さらに本発明に用いる宿主は、前記Δ5-ELO及びΔ4-DESに加えて、Δ６－デサチュラーゼ（以下、「Δ6-DES」ともいう。）の発現が促進されていることが好ましく、Δ6-DESをコードする遺伝子（以下単に、「Δ6-DES遺伝子」ともいう）の発現が促進されていることがより好ましい。
本明細書において「Δ6-DES」とは、リノール酸（C18:2Δ9,12）のΔ6位に不飽和結合を導入し、γ-リノレン酸（C18:3Δ6,9,12）を生成する反応を触媒するタンパク質（酵素）を意味する。そして本明細書において「Δ6-デサチュラーゼ活性（以下、「Δ6-DES活性」ともいう）」とは、リノール酸のΔ6位に不飽和結合を導入する活性を意味する。
タンパク質がΔ6-DES活性を有することは、例えば、Δ6-DES合成遺伝子欠損株を用いた系により確認することができる。あるいは、宿主細胞内で機能するプロモーターの下流に前記タンパク質をコードする遺伝子を連結したＤＮＡをΔ6-DES合成遺伝子欠損株に導入し、γ-リノレン酸の生成を検討することで確認できる。あるいは、Δ6-DES又はこれを含有する細胞破砕液を調製し、リノール酸、リノレオイルＣｏＡなどを含む反応液と反応させ、常法に従いリノール酸量の減少又はγ-リノレン酸量の増加を測定することで確認できる。
本発明における好ましいΔ6-DESとしては、下記タンパク質（Ｓ）又は（Ｔ）が挙げられる。
（Ｓ）配列番号３６で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
（Ｔ）前記タンパク質（Ｓ）のアミノ酸配列と同一性が６０％以上のアミノ酸配列からなり、かつΔ6-デサチュラーゼ活性を有するタンパク質。

配列番号３６のアミノ酸配列からなるタンパク質は、ナンノクロロプシス・オセアニカNIES2145株由来のΔ6-DES（以下、「NoΔ6-DES」ともいう）である。
前記タンパク質（Ｔ）において、Δ6-DES活性の点から、前記タンパク質（Ｓ）のアミノ酸配列との同一性は６０％以上であり、６５％以上が好ましく、７０％以上がより好ましく、７５％以上がより好ましく、８０％以上がより好ましく、８５％以上がより好ましく、９０％以上がより好ましく、９３％以上がより好ましく、９５％以上がより好ましく、９７％以上がより好ましく、９８％以上がより好ましく、９９％以上がさらに好ましい。
また、前記タンパク質（Ｔ）として、前記タンパク質（Ｓ）のアミノ酸配列に、１又は複数個（例えば１個以上１８９個以下、好ましくは１個以上１６５個以下、より好ましくは１個以上１４２個以下、より好ましくは１個以上１１８個以下、より好ましくは１個以上９４個以下、より好ましくは１個以上７１個以下、より好ましくは１個以上４７個以下、より好ましくは１個以上３３個以下、より好ましくは１個以上２３個以下、より好ましくは１個以上１４個以下、より好ましくは１個以上９個以下、より好ましくは１個以上４個以下）のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されており、かつΔ6-DESを有するタンパク質が挙げられる。
アミノ酸配列に変異を導入する方法としては、例えば、Δ5-ELOについて前述した方法が挙げられる。
前記タンパク質（Ｓ）及び（Ｔ）は、通常の化学的手法、遺伝子工学的手法等により得ることができる。例えば、ナンノクロロプシス・オセアニカから単離、精製等することで天然物由来のタンパク質を取得することができる。また、配列番号３６に示すアミノ酸配列情報をもとに人工的に化学合成することで、前記タンパク質（Ｓ）及び（Ｔ）を得ることができる。あるいは、遺伝子組み換え技術により、組換えタンパク質として前記タンパク質（Ｓ）及び（Ｔ）を作製してもよい。組換えタンパク質を作製する場合には、後述する、Δ6-DESをコードする遺伝子を用いることができる。
前記Δ6-DES（好ましくは前記タンパク質（Ｓ）又は（Ｔ））をコードする遺伝子（以下、「Δ6-DES遺伝子」ともいう）として、下記ＤＮＡ（ｓ）又は（ｔ）からなる遺伝子が挙げられる。

（ｓ）配列番号３７で表される塩基配列からなるＤＮＡ。
（ｔ）前記ＤＮＡ（ｓ）の塩基配列と同一性が６０％以上の塩基配列からなり、かつΔ6-DES活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。

配列番号３７の塩基配列は、配列番号３６のアミノ酸配列からなるタンパク質（NoΔ6-DES）をコードする遺伝子（以下、「NoΔ6-DES遺伝子」ともいう）の塩基配列である。
前記ＤＮＡ（ｔ）において、Δ6-DES活性の点から、前記ＤＮＡ（ｓ）の塩基配列との同一性は６０％以上であり、６５％以上が好ましく、７０％以上がより好ましく、７５％以上がより好ましく、８０％以上がより好ましく、８５％以上がより好ましく、９０％以上がより好ましく、９３％以上がより好ましく、９５％以上がより好ましく、９７％以上がより好ましく、９８％以上がより好ましく、９９％以上がさらに好ましい。
また前記ＤＮＡ（ｔ）として、前記ＤＮＡ（ｓ）の塩基配列において１又は複数個（例えば１個以上５７０個以下、好ましくは１個以上４９８個以下、より好ましくは１個以上４２７個以下、より好ましくは１個以上３５６個以下、より好ましくは１個以上２８５個以下、より好ましくは１個以上２１３個以下、より好ましくは１個以上１４２個以下、より好ましくは１個以上９９個以下、より好ましくは１個以上７１個以下、より好ましくは１個以上４２個以下、より好ましくは１個以上２８個以下、より好ましくは１個以上１４個以下）の塩基が欠失、置換、挿入、又は付加されており、かつΔ6-DES活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡも好ましい。
さらに前記ＤＮＡ（ｔ）として、前記ＤＮＡ（ｓ）と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつΔ6-DES活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡも好ましい。
塩基配列に変異を導入する方法としては、例えば、Δ5-ELO遺伝子について前述した方法が挙げられる。
さらに本発明に用いる宿主は、前記Δ5-ELO及びΔ4-DESに加えて、ω３－デサチュラーゼ（以下、「ω3-DES」ともいう。）の発現が促進されていることが好ましく、ω3-DESをコードする遺伝子（以下単に、「ω3-DES遺伝子」ともいう）の発現が促進されていることがより好ましい。
本明細書において「ω3-DES」とは、アラキドン酸又はドコサテトラエン酸のω3位に不飽和結合を導入し、ＥＰＡ又はＤＰＡを生成する反応を触媒するタンパク質（酵素）を意味する。そして本明細書において「ω3-デサチュラーゼ活性（以下、「ω3-DES活性」ともいう。）」とは、アラキドン酸又はドコサテトラエン酸のω3位に不飽和結合を導入する活性を意味する。
タンパク質がω3-DES活性を有することは、例えば、ω3-DES合成遺伝子欠損株を用いた系により確認することができる。あるいは、宿主細胞内で機能するプロモーターの下流に前記タンパク質をコードする遺伝子を連結したＤＮＡをω3-DES合成遺伝子欠損株に導入し、EPAの生成を検討することで確認できる。あるいは、ω3-DES又はこれを含有する細胞破砕液を調製し、アラキドン酸誘導体（ＣｏＡとのチオエステル化合物、グリセロールとのエステル化合物など）を含む反応液と反応させ、常法に従いアラキドン酸量の減少又はEPA量の増加を測定することで確認できる。
本発明における好ましいω3-DESとしては、下記タンパク質（Ｕ）又は（Ｖ）が挙げられる。
（Ｕ）配列番号３８で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
（Ｖ）前記タンパク質（Ｕ）のアミノ酸配列と同一性が６０％以上のアミノ酸配列からなり、かつω3-デサチュラーゼ活性を有するタンパク質。

配列番号３８のアミノ酸配列からなるタンパク質は、ナンノクロロプシス・オセアニカNIES2145株由来のω3-DES（以下、「Noω3-DES」ともいう）である。
前記タンパク質（Ｖ）において、ω3-DES活性の点から、前記タンパク質（Ｕ）のアミノ酸配列との同一性は６０％以上であり、６５％以上が好ましく、７０％以上がより好ましく、７５％以上がより好ましく、８０％以上がより好ましく、８５％以上がより好ましく、９０％以上がより好ましく、９３％以上がより好ましく、９５％以上がより好ましく、９７％以上がより好ましく、９８％以上がより好ましく、９９％以上がさらに好ましい。
また、前記タンパク質（Ｖ）として、前記タンパク質（Ｕ）のアミノ酸配列に、１又は複数個（例えば１個以上１６４個以下、好ましくは１個以上１４３個以下、より好ましくは１個以上１２３個以下、より好ましくは１個以上１０２個以下、より好ましくは１個以上８２個以下、より好ましくは１個以上６１個以下、より好ましくは１個以上４１個以下、より好ましくは１個以上２８個以下、より好ましくは１個以上２０個以下、より好ましくは１個以上１２個以下、より好ましくは１個以上８個以下、より好ましくは１個以上４個以下）のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されており、かつω3-DES活性を有するタンパク質が挙げられる。
アミノ酸配列に変異を導入する方法としては、例えば、Δ5-ELOについて前述した方法が挙げられる。
前記タンパク質（Ｕ）及び（Ｖ）は、通常の化学的手法、遺伝子工学的手法等により得ることができる。例えば、ナンノクロロプシス・オセアニカから単離、精製等することで天然物由来のタンパク質を取得することができる。また、配列番号３８に示すアミノ酸配列情報をもとに人工的に化学合成することで、前記タンパク質（Ｕ）及び（Ｖ）を得ることができる。あるいは、遺伝子組み換え技術により、組換えタンパク質として前記タンパク質（Ｕ）及び（Ｖ）を作製してもよい。組換えタンパク質を作製する場合には、後述する、ω3-DESをコードする遺伝子を用いることができる。
前記ω3-DES（好ましくは前記タンパク質（Ｕ）又は（Ｖ））をコードする遺伝子（以下、「ω3-DES遺伝子」ともいう）として、下記ＤＮＡ（ｕ）又は（ｖ）からなる遺伝子が挙げられる。

（ｕ）配列番号３９で表される塩基配列からなるＤＮＡ。
（ｖ）前記ＤＮＡ（ｕ）の塩基配列と同一性が６０％以上の塩基配列からなり、かつω3-DES活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。

配列番号３９の塩基配列は、配列番号３８のアミノ酸配列からなるタンパク質（Noω3-DES）をコードする遺伝子（以下、「Noω3-DES遺伝子」ともいう）の塩基配列である。
前記ＤＮＡ（ｖ）において、ω3-DES活性の点から、前記ＤＮＡ（ｕ）の塩基配列との同一性は６０％以上であり、６５％以上が好ましく、７０％以上がより好ましく、７５％以上がより好ましく、８０％以上がより好ましく、８５％以上がより好ましく、９０％以上がより好ましく、９３％以上がより好ましく、９５％以上がより好ましく、９７％以上がより好ましく、９８％以上がより好ましく、９９％以上がさらに好ましい。
また前記ＤＮＡ（ｖ）として、前記ＤＮＡ（ｕ）の塩基配列において１又は複数個（例えば１個以上４９３個以下、好ましくは１個以上４３１個以下、より好ましくは１個以上３６９個以下、より好ましくは１個以上３０８個以下、より好ましくは１個以上２４６個以下、より好ましくは１個以上１８４個以下、より好ましくは１個以上１２３個以下、より好ましくは１個以上８６個以下、より好ましくは１個以上６１個以下、より好ましくは１個以上３６個以下、より好ましくは１個以上２４個以下、より好ましくは１個以上１２個以下）の塩基が欠失、置換、挿入、又は付加されており、かつω3-DES活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡも好ましい。
さらに前記ＤＮＡ（ｖ）として、前記ＤＮＡ（ｕ）と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつω3-DES活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡも好ましい。
塩基配列に変異を導入する方法としては、例えば、Δ5-ELO遺伝子について前述した方法が挙げられる。
さらに本発明に用いる宿主は、前記Δ5-ELO及びΔ4-DESに加えて、Δ９－デサチュラーゼ（以下、「Δ9-DES」ともいう。）の発現が促進されていることが好ましく、Δ9-DESをコードする遺伝子（以下単に、「Δ9-DES遺伝子」ともいう）の発現が促進されていることがより好ましい。
本明細書において「Δ9-DES」とは、ステアリン酸（C18:0）のΔ9位に不飽和結合を導入し、オレイン酸を生成する反応を触媒するタンパク質（酵素）を意味する。そして本明細書において「Δ9-デサチュラーゼ活性（以下、「Δ9-DES活性」ともいう。）」とは、ステアリン酸のΔ9位に不飽和結合を導入する活性を意味する。
タンパク質がΔ9-DES活性を有することは、例えば、Δ9-DES合成遺伝子欠損株を用いた系により確認することができる。あるいは、宿主細胞内で機能するプロモーターの下流に前記タンパク質をコードする遺伝子を連結したＤＮＡをΔ9-DES合成遺伝子欠損株に導入し、オレイン酸の生成を検討することで確認できる。あるいは、Δ9-DES又はこれを含有する細胞破砕液を調製し、ステアリン酸誘導体（ＣｏＡとのチオエステル化合物、グリセロールとのエステル化合物など）を含む反応液と反応させ、常法に従いステアリン酸量の減少又はオレイン酸量の増加を測定することで確認できる。
本発明における好ましいΔ9-DESとしては、下記タンパク質（Ｗ）又は（Ｘ）が挙げられる。
（Ｗ）配列番号４０で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
（Ｘ）前記タンパク質（Ｗ）のアミノ酸配列と同一性が６０％以上のアミノ酸配列からなり、かつΔ9-デサチュラーゼ活性を有するタンパク質。

配列番号４０のアミノ酸配列からなるタンパク質は、ナンノクロロプシス・オセアニカNIES2145株由来のΔ9-DES（以下、「NoΔ9-DES」ともいう）である。
前記タンパク質（Ｘ）において、Δ9-DES活性の点から、前記タンパク質（Ｗ）のアミノ酸配列との同一性は６０％以上であり、６５％以上が好ましく、７０％以上がより好ましく、７５％以上がより好ましく、８０％以上がより好ましく、８５％以上がより好ましく、９０％以上がより好ましく、９３％以上がより好ましく、９５％以上がより好ましく、９７％以上がより好ましく、９８％以上がより好ましく、９９％以上がさらに好ましい。
また、前記タンパク質（Ｘ）として、前記タンパク質（Ｗ）のアミノ酸配列に、１又は複数個（例えば１個以上１４３個以下、好ましくは１個以上１２５個以下、より好ましくは１個以上１０７個以下、より好ましくは１個以上８９個以下、より好ましくは１個以上７１個以下、より好ましくは１個以上５３個以下、より好ましくは１個以上３５個以下、より好ましくは１個以上２５個以下、より好ましくは１個以上１７個以下、より好ましくは１個以上１０個以下、より好ましくは１個以上７個以下、より好ましくは１個以上３個以下）のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されており、かつΔ9-DES活性を有するタンパク質が挙げられる。
前記タンパク質（Ｗ）及び（Ｘ）は、通常の化学的手法、遺伝子工学的手法等により得ることができる。例えば、ナンノクロロプシス・オセアニカから単離、精製等することで天然物由来のタンパク質を取得することができる。また、配列番号４０に示すアミノ酸配列情報をもとに人工的に化学合成することで、前記タンパク質（Ｗ）及び（Ｘ）を得ることができる。あるいは、遺伝子組み換え技術により、組換えタンパク質として前記タンパク質（Ｗ）及び（Ｘ）を作製してもよい。組換えタンパク質を作製する場合には、後述する、Δ9-DESをコードする遺伝子を用いることができる。
前記Δ9-DES（好ましくは前記タンパク質（Ｗ）又は（Ｘ））をコードする遺伝子（以下、「Δ9-DES遺伝子」ともいう）として、下記ＤＮＡ（ｗ）又は（ｘ）からなる遺伝子が挙げられる。

（ｗ）配列番号４１で表される塩基配列からなるＤＮＡ。
（ｘ）前記ＤＮＡ（ｗ）の塩基配列と同一性が６０％以上の塩基配列からなり、かつΔ9-DES活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。

配列番号４１の塩基配列は、配列番号４０のアミノ酸配列からなるタンパク質（NoΔ9-DES）をコードする遺伝子（以下、「NoΔ9-DES遺伝子」ともいう）の塩基配列である。
前記ＤＮＡ（ｘ）において、Δ9-DES活性の点から、前記ＤＮＡ（ｗ）の塩基配列との同一性は６０％以上であり、６５％以上が好ましく、７０％以上がより好ましく、７５％以上がより好ましく、８０％以上がより好ましく、８５％以上がより好ましく、９０％以上がより好ましく、９３％以上がより好ましく、９５％以上がより好ましく、９７％以上がより好ましく、９８％以上がより好ましく、９９％以上がさらに好ましい。
また前記ＤＮＡ（ｘ）として、前記ＤＮＡ（ｗ）の塩基配列において１又は複数個（例えば１個以上４３２個以下、好ましくは１個以上３７８個以下、より好ましくは１個以上３２４個以下、より好ましくは１個以上２７０個以下、より好ましくは１個以上２１６個以下、より好ましくは１個以上１６２個以下、より好ましくは１個以上１０８個以下、より好ましくは１個以上７５個以下、より好ましくは１個以上５４個以下、より好ましくは１個以上３２個以下、より好ましくは１個以上２１個以下、より好ましくは１個以上１０個以下）の塩基が欠失、置換、挿入、又は付加されており、かつΔ9-DES活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡも好ましい。
さらに前記ＤＮＡ（ｘ）として、前記ＤＮＡ（ｗ）と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつΔ9-DES活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡも好ましい。
塩基配列に変異を導入する方法としては、例えば、Δ5-ELO遺伝子について前述した方法が挙げられる。
さらに本発明に用いる宿主は、前記Δ5-ELO及びΔ4-DESに加えて、Δ６－エロンガーゼ（以下、「Δ6-ELO」ともいう。）の発現が促進されていることが好ましく、Δ6-ELOをコードする遺伝子（以下単に、「Δ6-ELO遺伝子」ともいう）の発現が促進されていることがより好ましい。
本明細書において「Δ6-ELO」とは、γ－リノレン酸又はステアリドン酸（C18:4Δ6,9,12,15）から、ジホモ－γ－リノレン酸（C20:3Δ8,11,14）又はエイコサテトラエン酸（C20:4Δ8,11,14,17）への伸長反応を触媒するタンパク質（酵素）を意味する。そして本明細書において「Δ6-エロンガーゼ活性（以下、「Δ6-ELO活性」ともいう」）とは、炭素原子数１８の脂肪酸から、炭素原子数２０の脂肪酸への伸長反応を触媒する活性を意味する。
タンパク質がΔ6-ELO活性を有することは、例えば、Δ6-ELO合成遺伝子欠損株を用いた系により確認することができる。あるいは、宿主細胞内で機能するプロモーターの下流に前記タンパク質をコードする遺伝子を連結したＤＮＡをΔ6-ELO合成遺伝子欠損株に導入し、エイコサテトラエン酸の生成を検討することで確認できる。あるいは、Δ6-ELO又はこれを含有する細胞破砕液を調製し、γ－リノレン酸誘導体（ＣｏＡとのチオエステル化合物、グリセロールとのエステル化合物など）を含む反応液と反応させ、常法に従いγ－リノレン酸量の減少又はジホモ－γ－リノレン酸量の増加を測定することで確認できる。
本発明における好ましいΔ6-ELOとしては、下記タンパク質（Ｙ）又は（Ｚ）が挙げられる。
（Ｙ）配列番号４２で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
（Ｚ）前記タンパク質（Ｙ）のアミノ酸配列と同一性が６０％以上のアミノ酸配列からなり、かつΔ6-エロンガーゼ活性を有するタンパク質。

配列番号４２のアミノ酸配列からなるタンパク質は、ナンノクロロプシス・オセアニカNIES2145株由来のΔ6-ELO（以下、「NoΔ6-ELO」ともいう）である。
前記タンパク質（Ｚ）において、Δ6-ELO活性の点から、前記タンパク質（Ｙ）のアミノ酸配列との同一性は６０％以上であり、６５％以上が好ましく、７０％以上がより好ましく、７５％以上がより好ましく、８０％以上がより好ましく、８５％以上がより好ましく、９０％以上がより好ましく、９３％以上がより好ましく、９５％以上がより好ましく、９７％以上がより好ましく、９８％以上がより好ましく、９９％以上がさらに好ましい。
また、前記タンパク質（Ｚ）として、前記タンパク質（Ｙ）のアミノ酸配列に、１又は複数個（例えば１個以上１１０個以下、好ましくは１個以上９６個以下、より好ましくは１個以上８２個以下、より好ましくは１個以上６９個以下、より好ましくは１個以上５５個以下、より好ましくは１個以上４１個以下、より好ましくは１個以上２７個以下、より好ましくは１個以上１９個以下、より好ましくは１個以上１３個以下、より好ましくは１個以上８個以下、より好ましくは１個以上５個以下、より好ましくは１個以上２個以下）のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されており、かつΔ6-ELOを有するタンパク質が挙げられる。
アミノ酸配列に変異を導入する方法としては、例えば、Δ5-ELOについて前述した方法が挙げられる。
前記タンパク質（Ｙ）及び（Ｚ）は、通常の化学的手法、遺伝子工学的手法等により得ることができる。例えば、ナンノクロロプシス・オセアニカから単離、精製等することで天然物由来のタンパク質を取得することができる。また、配列番号４５に示すアミノ酸配列情報をもとに人工的に化学合成することで、前記タンパク質（Ｙ）及び（Ｚ）を得ることができる。あるいは、遺伝子組み換え技術により、組換えタンパク質として前記タンパク質（Ｙ）及び（Ｚ）を作製してもよい。組換えタンパク質を作製する場合には、後述する、Δ6-ELOをコードする遺伝子を用いることができる。
前記Δ6-ELO（好ましくは前記タンパク質（Ｙ）又は（Ｚ））をコードする遺伝子（以下、「Δ6-ELO遺伝子」ともいう）として、下記ＤＮＡ（ｙ）又は（ｚ）からなる遺伝子が挙げられる。

（ｙ）配列番号４３で表される塩基配列からなるＤＮＡ。
（ｚ）前記ＤＮＡ（ｙ）の塩基配列と同一性が６０％以上の塩基配列からなり、かつΔ6-ELO活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。

配列番号４３の塩基配列は、配列番号４２のアミノ酸配列からなるタンパク質（NoΔ6-ELO）をコードする遺伝子（以下、「NoΔ6-ELO遺伝子」ともいう）の塩基配列である。
前記ＤＮＡ（ｚ）において、Δ6-ELO活性の点から、前記ＤＮＡ（ｙ）の塩基配列との同一性は６０％以上であり、６５％以上が好ましく、７０％以上がより好ましく、７５％以上がより好ましく、８０％以上がより好ましく、８５％以上がより好ましく、９０％以上がより好ましく、９３％以上がより好ましく、９５％以上がより好ましく、９７％以上がより好ましく、９８％以上がより好ましく、９９％以上がさらに好ましい。
また前記ＤＮＡ（ｚ）として、前記ＤＮＡ（ｙ）の塩基配列において１又は複数個（例えば１個以上３３２個以下、好ましくは１個以上２９０個以下、より好ましくは１個以上２４９個以下、より好ましくは１個以上２０７個以下、より好ましくは１個以上１６６個以下、より好ましくは１個以上１２４個以下、より好ましくは１個以上８３個以下、より好ましくは１個以上５８個以下、より好ましくは１個以上４１個以下、より好ましくは１個以上２４個以下、より好ましくは１個以上１６個以下、より好ましくは１個以上８個以下）の塩基が欠失、置換、挿入、又は付加されており、かつΔ6-ELO活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡも好ましい。
さらに前記ＤＮＡ（ｚ）として、前記ＤＮＡ（ｙ）と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつΔ6-ELO活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡも好ましい。
塩基配列に変異を導入する方法としては、例えば、Δ5-ELO遺伝子について前述した方法が挙げられる
本発明の形質転換体は、前記Δ5-ELO遺伝子及びΔ4-DES遺伝子を常法により前記宿主に導入することで得ることができる。具体的には、前記遺伝子を宿主細胞中で発現させることのできる組換えベクターや遺伝子発現カセットを調製し、これを宿主細胞に導入して宿主細胞を形質転換させることにより作製できる。本発明の形質転換体において、当該遺伝子の発現が促進されていることが好ましい。
また、本発明の形質転換体は、前記Δ5-ELO遺伝子及びΔ4-DES遺伝子に加えて、好ましくは前記ACP遺伝子、並びに前記Δ5-ELO遺伝子及びΔ4-DES遺伝子以外の各デサチュラーゼ遺伝子及びエロンガーゼ遺伝子が導入されていることも好ましい。
また、本発明の形質転換体は、前記Δ5-ELO遺伝子及びΔ4-DES遺伝子をゲノム上に有する宿主において、常法により当該遺伝子の発現調節領域を改変して、当該遺伝子の発現を促進させることで得ることができる。具体的には、当該宿主のゲノム上に存在するΔ5-ELO遺伝子又はΔ4-DES遺伝子の上流に位置するプロモーター配列を、より高いプロモーター活性を示すものに置換すること等で作製できる。
なお本明細書において、目的のタンパク質をコードする遺伝子の発現を促進させたものを「形質転換体」ともいい、目的のタンパク質をコードする遺伝子の発現を促進させていないものを「宿主」又は「野生株」ともいう。
本発明で用いる形質転換体は、宿主自体に比べ、炭素原子数が２２のＰＵＦＡ及びこれを構成成分とする脂質の生産性が有意に向上する。またその結果、当該形質転換体では、脂質中の脂肪酸組成が改変される。そのため、当該形質転換体を用いた本発明は、特定の炭素原子数の脂肪酸及びこれを構成成分とする脂質、特に炭素原子数が２２のＰＵＦＡ及びこれを構成成分とする脂質、好ましくはＤＰＡ、ＤＨＡ及びこれを構成成分とする脂質、より好ましくはＤＨＡ及びこれを構成成分とする脂質の生産に好適に用いることができる。
また、炭素原子数が２２のＰＵＦＡの産生能を有さない宿主に前記Δ5-ELO遺伝子及びΔ4-DES遺伝子を導入することで、宿主に炭素原子数が２２のＰＵＦＡの産生能を付与することができる。
なお、宿主や形質転換体の脂肪酸及び脂質の生産性については、実施例で用いた方法により測定することができる。
本発明の形質転換体の作製方法について説明する。しかし本発明は、これに制限するものではない。
形質転換体の宿主としては通常用いられるものより適宜選択することができる。本発明で用いることができる宿主としては、ナンノクロロプシス属の藻類が挙げられる。製造効率及び得られた脂質の利用性の点から、宿主は微生物又は植物体であることが好ましく、微生物であることがより好ましく、微細藻類であることがさらに好ましい。
前記ナンノクロロプシス属の藻類の具体例としては、ナンノクロロプシス・オセアニカ、ナンノクロロプシス・オキュラータ（Nannochloropsis oculata）、ナンノクロロプシス・ガディタナ（Nannochloropsis gaditana）、ナンノクロロプシス・サリナ（Nannochloropsis salina）、ナンノクロロプシス・リムネティカ（Nannochloropsis limnetica）、ナンノクロロプシス・グラニュラータ（Nannochloropsis granulata）、ナンノクロロプシス・エスピー（Nannochloropsis sp．）等が挙げられる。なかでも、脂質生産性の観点から、ナンノクロロプシス・オセアニカ、又はナンノクロロプシス・ガディタナが好ましく、ナンノクロロプシス・オセアニカがより好ましい。
なお、ナンノクロロプシス・オセアニカ等の藻類は、私的又は公的な研究所等の保存機関より入手することができる。例えば、ナンノクロロプシス・オセアニカNIES-2145株は、国立環境研究所（NIES）から入手することができる。
遺伝子発現用プラスミド又は遺伝子発現カセットの母体となるベクター（プラスミド）としては、目的のタンパク質をコードする遺伝子を宿主に導入することができ、宿主細胞内で目的の遺伝子を発現させることができるベクターであればよい。例えば、使用する宿主の種類に応じたプロモーターやターミネーター等の発現調節領域を有するベクターであって、複製開始点や選択マーカー等を有するベクターを用いることができる。また、プラスミド等の染色体外で自立増殖・複製するベクターであってもよいし、染色体内に組み込まれるベクターであってもよい。
本発明で好ましく用いることができる発現用ベクターとしては、例えば、pUC18（タカラバイオ社製）、pUC19（タカラバイオ社製）、pUC118（タカラバイオ社製）、P66（Chlamydomonas Center）、P-322（Chlamydomonas Center）、pPha-T1（Journal of Basic Microbiology, 2011, vol. 51, p. 666-672参照）、又はpJET1（コスモ・バイオ社製）が挙げられる。特に、pUC18、pPha-T1、又はpJET1が好ましく用いられる。また、Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2011, vol. 108(52)の記載の方法を参考にして、目的の遺伝子、プロモーター及びターミネーターからなるＤＮＡ断片（遺伝子発現カセット）を用いて宿主を形質転換することもできる。
また、前記発現ベクターに組み込んだ目的のタンパク質をコードする遺伝子の発現を調整するプロモーターの種類も、使用する宿主の種類に応じて適宜選択することができる。本発明で好ましく用いることができるプロモーターとしては、ハウスキーピング遺伝子プロモーター（例えば、チューブリンプロモーター、アクチンプロモーター、ユビキチンプロモーター等）、ヒートショックプロテインプロモーター、ナンノクロロプシス属由来のビオラキサンチン／クロロフィルａ結合タンパク質遺伝子のプロモーター（VCP1プロモーター、VCP2プロモーター）（Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2011, vol. 108(52)）、ナンノクロロプシス属由来のオレオシン様タンパクLDSP（lipid droplet surface protein）遺伝子のプロモーター（LDSPプロモーター）（PLOS Genetics, 2012; 8(11): e1003064. doi: 10. 1371）、ACP遺伝子のプロモーター（ACPプロモーター）、デサチュラーゼ遺伝子のプロモーター、AT遺伝子のプロモーター（ATプロモーター）、ナンノクロロプシス属由来のグルタミン合成酵素遺伝子のプロモーター（GSプロモーター）、及びナンノクロロプシス属由来のアンモニウムトランスポーター遺伝子のプロモーター（AMTプロモーター）を好ましく用いることができる。また、ナンノクロロプシス属に属する藻類は一般に栄養（特に窒素）欠乏条件や強光条件において効率的に脂質を生産することが知られるため、これらの条件下で強く発現するプロモーターを用いることがより好ましい。栄養欠乏条件や強光条件において強く発現するという観点から、脂肪酸合成経路やTAG合成経路に関わる遺伝子のプロモーターや窒素同化に関わる遺伝子のプロモーターが好ましく、ＬＤＳＰ遺伝子のプロモーター、ACPプロモーター、デサチュラーゼ遺伝子のプロモーター、ATプロモーター、GSプロモーター、及びAMTプロモーターがより好ましく、ＬＤＳＰ遺伝子のプロモーター、GSプロモーター、及びAMTプロモーターがさらに好ましい。
また、目的のタンパク質をコードする遺伝子が組み込まれたことを確認するための選択マーカーの種類も、使用する宿主の種類に応じて適宜選択することができる。本発明で好ましく用いることができる選択マーカーとしては、アンピシリン耐性遺伝子、クロラムフェニコール耐性遺伝子、エリスロマイシン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、スペクチノマイシン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子、ブラストサイジンＳ耐性遺伝子、ビアラフォス耐性遺伝子、ゼオシン耐性遺伝子、パロモマイシン耐性遺伝子、ゲンタマイシン耐性遺伝子、及びハイグロマイシン耐性遺伝子等の薬剤耐性遺伝子が挙げられる。さらに、栄養要求性に関連する遺伝子の欠損等を選択マーカー遺伝子として使用することもできる。
目的のタンパク質をコードする遺伝子の前記ベクターへの導入は、制限酵素処理やライゲーション等の常法により行うことができる。
また、形質転換方法は、使用する宿主の種類に応じて常法より適宜選択することができる。例えば、カルシウムイオンを用いる形質転換方法、一般的なコンピテントセル形質転換方法、プロトプラスト形質転換法、エレクトロポレーション法、LP形質転換方法、アグロバクテリウムを用いた方法、パーティクルガン法等が挙げられる。宿主としてナンノクロロプシス属の藻類を用いる場合、Randor Radakovits, et al.，Nature Communications，DOI:10.1038/ncomms1688，2012等に記載のエレクトロポレーション法を用いて形質転換を行うこともできる。
目的遺伝子断片が導入された形質転換体の選択は、選択マーカー等を利用することで行うことができる。例えば、薬剤耐性遺伝子が、形質転換時に目的ＤＮＡ断片とともに宿主細胞中に導入された結果、形質転換体が獲得する薬剤耐性を指標に行うことができる。また、ゲノムを鋳型としたＰＣＲ法等によって、目的ＤＮＡ断片の導入を確認することもできる。
前記Δ5-ELO遺伝子及びΔ4-DES遺伝子をゲノム上に有する宿主において、当該遺伝子の発現調節領域を改変して、当該遺伝子の発現を促進させる方法について説明する。
「発現調節領域」とは、プロモーター、ターミネーター、及び非翻訳領域を示し、これらの配列は一般に隣接する遺伝子の発現量（転写量、翻訳量）の調節に関与している。ゲノム上に前記Δ5-ELO遺伝子及びΔ4-DES遺伝子を有する宿主においては、当該遺伝子の発現調節領域を改変して当該遺伝子の発現を促進させることで、炭素原子数が２２のＰＵＦＡの生産性を向上させることができる。
発現調節領域の改変方法としては、例えばプロモーターの入れ替えが挙げられる。ゲノム上に前記Δ5-ELO遺伝子及びΔ4-DES遺伝子などを有する宿主において、当該遺伝子のプロモーターを、より転写活性の高いプロモーターに入れ替えることで、当該遺伝子の発現を促進させることができる。
前記宿主としては、前述した生物種のうち、ゲノム上にΔ5-ELO遺伝子及びΔ4-DES遺伝子などを有するものを好適に用いることができる。
プロモーターの入れ替えに用いるプロモーターとしては特に限定されず、Δ5-ELO遺伝子及びΔ4-DES遺伝子のプロモーターよりも転写活性が高く、ＰＵＦＡの生産に適したものから適宜選択することができる。
例えば、チューブリンプロモーター、ヒートショックプロテインプロモーター、ビオラキサンチン／クロロフィルａ結合タンパク質遺伝子のプロモーター（VCP1プロモーター、VCP2プロモーター）、ナンノクロロプシス属由来のオレオシン様タンパクＬＤＳＰ遺伝子のプロモーター、ACPプロモーター、デサチュラーゼ遺伝子のプロモーター、ATプロモーター、GSプロモーター、及びAMTプロモーターを好ましく用いることができる。脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質の生産性向上の観点から、脂肪酸合成経路やTAG合成経路に関わる遺伝子のプロモーターや窒素同化に関わる遺伝子のプロモーターが好ましく、ＬＤＳＰ遺伝子のプロモーター、ACPプロモーター、デサチュラーゼ遺伝子のプロモーター、ATプロモーター、GSプロモーター、及びAMTプロモーターがより好ましく、ＬＤＳＰ遺伝子のプロモーター、GSプロモーター、及びAMTプロモーターがさらに好ましい。
前述のプロモーターの改変は、相同組換えなどの常法に従い行うことができる。具体的には、標的とするプロモーターの上流、下流領域を含み、標的プロモーターに代えて別のプロモーターを含む直鎖状のＤＮＡ断片を構築し、これを宿主細胞に取り込ませ、宿主ゲノムの標的プロモーターの上流側と下流側とで２回交差の相同組換えを起こす。その結果、ゲノム上の標的プロモーターが別のプロモーター断片と置換され、プロモーターを改変することができる。
このような相同組換えによる標的プロモーターの改変方法は、例えば、Methods in molecular biology,1995, vol. 47, p. 291-302等の文献を参考に行うことができる。特に、宿主がナンノクロロプシス属に属する藻類の場合、Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2011, vol. 108(52)等の文献を参考にして、相同組換え法によりゲノム中の特定の領域を改変することができる。
本発明の形質転換体は、炭素原子数が２２を超えるＰＵＦＡの生産性が、前記Δ5-ELO遺伝子及びΔ4-DES遺伝子などの発現がともに促進されていない宿主と比較して向上している。したがって、本発明の形質転換体を適切な条件で培養又は栽培し、次いで得られた培養物から炭素原子数が２２を超えるＰＵＦＡを回収すれば、炭素原子数が２２を超えるＰＵＦＡを効率よく製造することができる。
ここで「培養物」とは培養した後の培養液及び形質転換体をいう。
本発明の形質転換体の培養条件は、形質転換体の宿主に応じて適宜選択することができ、その宿主に対して通常用いられる培養条件を使用できる。また脂肪酸の生産効率の点から、培地中に、例えば脂肪酸生合成系に関与する前駆物質としてグリセロール、酢酸、又はグルコース等を添加してもよい。
前記培養に用いる培地は、天然海水又は人工海水をベースにしたものを使用してもよいし、市販の培養培地を使用してもよい。具体的な培地としては、ｆ／２培地、ＥＳＭ培地、ダイゴＩＭＫ培地、Ｌ１培地、ＭＮＫ培地、等を挙げることができる。なかでも、脂質の生産性向上及び栄養成分濃度の観点から、ｆ／２培地、ＥＳＭ培地、又はダイゴＩＭＫ培地が好ましく、ｆ／２培地、又はダイゴＩＭＫ培地がより好ましく、ｆ／２培地がさらに好ましい。藻類の生育促進、脂肪酸の生産性向上のため、培地に、窒素源、リン源、金属塩、ビタミン類、微量金属等を適宜添加することができる。
培地に接種する形質転換体の量は適宜選択することができ、生育性の点から培地当り１～５０％（vol/vol）が好ましく、１～１０％（vol/vol）がより好ましい。培養温度は、藻類の増殖に悪影響を与えない範囲であれば特に制限されないが、通常、５～４０℃の範囲である。藻類の生育促進、脂肪酸の生産性向上、及び生産コストの低減の観点から、好ましくは１０～３５℃であり、より好ましくは１５～３０℃である。
また前記培養は、光合成ができるよう光照射下で行うことが好ましい。光照射は、光合成が可能な条件であればよく、人工光でも太陽光でもよい。光照射時の光強度としては、藻類の生育促進、脂肪酸の生産性向上の観点から、好ましくは１～４，０００μmol/m2/sの範囲、より好ましくは１０～２，５００μmol/m2/sの範囲、より好ましくは１００～２，５００μmol/m2/sの範囲、より好ましくは２００～２，５００μmol/m2/sの範囲、より好ましくは２５０～２，５００μmol/m2/sの範囲、より好ましくは３００～２，５００μmol/m2/sの範囲である。また、光照射の間隔は、特に制限されないが、前記と同様の観点から、明暗周期で行うことが好ましく、２４時間のうち明期が好ましくは８～２４時間、より好ましくは１０～１８時間、さらに好ましくは１２時間である。
また前記培養は、光合成ができるように二酸化炭素を含む気体の存在下、又は炭酸水素ナトリウムなどの炭酸塩を含む培地で行うことが好ましい。気体中の二酸化炭素の濃度は特に限定されないが、生育促進、脂肪酸の生産性向上の観点から０．０３（大気条件と同程度）～１０％が好ましく、より好ましくは０．０５～５％、さらに好ましくは０．１～３％、よりさらに好ましくは０．３～１％である。炭酸塩の濃度は特に限定されないが、例えば炭酸水素ナトリウムを用いる場合、生育促進、脂肪酸の生産性向上の観点から０．０１～５質量％が好ましく、より好ましくは０．０５～２質量％、さらに好ましくは０．１～１質量％である。
培養時間は特に限定されず、脂質を高濃度に蓄積する藻体が高い濃度で増殖できるように、長期間（例えば１５０日程度）行なってもよい。藻類の生育促進、脂肪酸の生産性向上、及び生産コストの低減の観点から、培養期間は、好ましくは３～９０日間、より好ましくは７～３０日間、さらに好ましくは１４～２１日間である。なお、培養は、通気攪拌培養、振とう培養又は静置培養のいずれでもよく、通気性の向上の観点から、通気撹拌培養が好ましい。
培養物から脂質を採取する方法としては、常法から適宜選択することができる。例えば、前述の培養物から、ろ過、遠心分離、細胞の破砕、ゲルろ過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、クロロホルム／メタノール抽出法、ヘキサン抽出法、又はエタノール抽出法等により脂質成分を単離、回収することができる。より大規模な培養を行った場合は、培養物より油分を圧搾又は抽出により回収後、脱ガム、脱酸、脱色、脱蝋、脱臭等の一般的な精製を行い、脂質を得ることができる。このように脂質成分を単離した後、単離した脂質を加水分解することで脂肪酸を得ることができる。脂質成分から脂肪酸を単離する方法としては、例えば、アルカリ溶液中で７０℃程度の高温で処理をする方法、リパーゼ処理をする方法、又は高圧熱水を用いて分解する方法等が挙げられる。
本発明の製造方法において製造される脂質は、その利用性の点から、脂肪酸又は脂肪酸化合物を含んでいることが好ましく、脂肪酸又は脂肪酸エステル化合物を含んでいることがさらに好ましい。
脂質中に含まれる脂肪酸又は脂肪酸エステル化合物は、炭素原子数が２２のＰＵＦＡ又はその脂肪酸エステル化合物がより好ましく、ＤＰＡ若しくはＤＨＡ又はその脂肪酸エステル化合物がさらに好ましく、ＤＨＡ又はその脂肪酸エステル化合物がさらに好ましい。
脂肪酸エステル化合物は、生産性の点から、単純脂質又は複合脂質が好ましく、単純脂質がさらに好ましく、ＴＡＧがさらにより好ましい。
また、Δ5-ELO及びΔ4-DESの発現を促進させたナンノクロロプシス属に属する藻類の細胞内で生産される全脂肪酸中のＤＨＡの含有量（％ＴＦＡ）は、０．５質量％以上であることが好ましく、１．５質量％以上であることがより好ましく、３質量％以上であることがさらに好ましく、５質量％以上であることがさらに好ましく、８質量％以上であることがさらに好ましく、１０質量％以上であることがさらに好ましい。
また、本発明の製造方法により生産される脂質はトリアシルグリセロールを含むことが好ましい。また、前記トリアシルグリセロールはＤＨＡを０．５質量％以上含有することが好ましく、１．５質量％以上含有することがより好ましく、３質量％以上含有することがさらに好ましく、５質量％以上含有することがさらに好ましく、８質量％以上含有することがさらに好ましく、１０質量％以上含有することがさらに好ましい。
本発明の製造方法により得られる脂肪酸は、食用として用いる他、可塑剤、化粧品等の乳化剤、石鹸や洗剤等の洗浄剤、繊維処理剤、毛髪リンス剤、又は殺菌剤や防腐剤として利用することができる。
本発明は、Δ5-ELO遺伝子を含有する組換えベクター、及びΔ4-DES遺伝子を含有する組換えベクターを含んでなる、ナンノクロロプシス属に属する藻類の形質転換体の作製用キットも提供する。本発明のキットは、ＰＵＦＡ又はこれを構成成分とする脂質の生産性に優れた形質転換体の作製に使用することができる。本発明のキットは、ACP遺伝子を含有する組換えベクター、Δ12-DES遺伝子を含有する組換えベクター、Δ6-DES遺伝子を含有する組換えベクター、ω3-DES遺伝子を含有する組換えベクター、Δ9-DES遺伝子を含有する組換えベクター、及びΔ6-ELO遺伝子を含有する組換えベクターからなる群より選ばれる少なくとも１種の組換えベクターを含んでもよく、ACP遺伝子を含有する組換えベクター、Δ12-DES遺伝子を含有する組換えベクター、Δ6-DES遺伝子を含有する組換えベクター、ω3-DES遺伝子を含有する組換えベクター、Δ9-DES遺伝子を含有する組換えベクター、及びΔ6-ELO遺伝子を含有する組換えベクターを全て含んでもよい。
なお本発明のキットは、前記組換えベクターの他、宿主、前記ベクターで宿主を形質転換するために通常用いられる試薬、形質転換用緩衝液、形質転換体を選抜するための指標となる試薬等、形質転換体の作製の検出に必要な他の要素を含んでいてもよい。
上述した実施形態に関し、本発明はさらに以下の脂質の製造方法、脂質生産性の向上方法、脂質の組成の改変方法、形質転換体、形質転換体の製造方法を開示する。
＜１＞Δ5-ELO及びΔ4-DESの発現を促進させたナンノクロロプシス属に属する藻類を培養し、炭素原子数２２の長鎖多価不飽和脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質を生産させる、脂質の製造方法。
＜２＞Δ5-ELO及びΔ4-DESの発現を促進させることにより、ナンノクロロプシス属に属する藻類の細胞内で生産される炭素原子数２２の長鎖多価不飽和脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質の生産性を向上させる、脂質の生産性の向上方法。
＜３＞Δ5-ELO及びΔ4-DESの発現を促進させ、ナンノクロロプシス属に属する藻類の細胞内で生産される炭素原子数２２の長鎖多価不飽和脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質の生産性を向上させ、生産される全脂肪酸又は全脂質中の脂肪酸の組成を改変する、脂肪酸組成の改変方法。
＜４＞Δ5-ELOをコードする遺伝子及びΔ4-DESをコードする遺伝子の発現を前記ナンノクロロプシス属に属する藻類の細胞内で促進させ、Δ5-ELO及びΔ4-DESの発現を促進する、前記＜１＞～＜３＞のいずれか１項記載の方法。
＜５＞Δ5-ELOをコードする遺伝子及びΔ4-DESをコードする遺伝子を前記ナンノクロロプシス属に属する藻類に導入し、導入したΔ5-ELOをコードする遺伝子及びΔ4-DESをコードする遺伝子の発現を促進させる、前記＜１＞～＜４＞のいずれか１項記載の方法。
＜６＞前記Δ5-ELOが下記タンパク質（Ａ）～（Ｊ）からなる群より選ばれる少なくとも１種のタンパク質、好ましくは下記タンパク質（Ａ）～（Ｆ）からなる群より選ばれる少なくとも１種のタンパク質、より好ましくは下記タンパク質（Ａ）、（Ｂ）、（Ｅ）、及び（Ｆ）からなる群より選ばれる少なくとも１種のタンパク質である、前記＜１＞～＜５＞のいずれか１項に記載の方法。

（Ａ）配列番号６で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
（Ｂ）前記タンパク質（Ａ）のアミノ酸配列と同一性が６０％以上、好ましくは６５％以上、より好ましくは７０％以上、さらに好ましくは７５％以上、さらに好ましくは８０％以上、さらに好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９３％以上、さらに好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９７％以上、さらに好ましくは９８％以上、さらに好ましくは９９％以上、のアミノ酸配列からなり、かつΔ5-ELO活性を有するタンパク質。
（Ｃ）配列番号９で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
（Ｄ）前記タンパク質（Ｃ）のアミノ酸配列と同一性が６０％以上、好ましくは６５％以上、より好ましくは７０％以上、さらに好ましくは７５％以上、さらに好ましくは８０％以上、さらに好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９３％以上、さらに好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９７％以上、さらに好ましくは９８％以上、さらに好ましくは９９％以上、のアミノ酸配列からなり、かつΔ5-ELO活性を有するタンパク質。
（Ｅ）配列番号１２で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
（Ｆ）前記タンパク質（Ｅ）のアミノ酸配列と同一性が６０％以上、好ましくは６５％以上、より好ましくは７０％以上、さらに好ましくは７５％以上、さらに好ましくは８０％以上、さらに好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９３％以上、さらに好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９７％以上、さらに好ましくは９８％以上、さらに好ましくは９９％以上、のアミノ酸配列からなり、かつΔ5-ELO活性を有するタンパク質。
（Ｇ）配列番号１５で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
（Ｈ）前記タンパク質（Ｇ）のアミノ酸配列と同一性が６０％以上、好ましくは６５％以上、より好ましくは７０％以上、さらに好ましくは７５％以上、さらに好ましくは８０％以上、さらに好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９３％以上、さらに好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９７％以上、さらに好ましくは９８％以上、さらに好ましくは９９％以上、のアミノ酸配列からなり、かつΔ5-ELO活性を有するタンパク質。
（Ｉ）配列番号１８で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
（Ｊ）前記タンパク質（Ｉ）のアミノ酸配列と同一性が６０％以上、好ましくは６５％以上、より好ましくは７０％以上、さらに好ましくは７５％以上、さらに好ましくは８０％以上、さらに好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９３％以上、さらに好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９７％以上、さらに好ましくは９８％以上、さらに好ましくは９９％以上、のアミノ酸配列からなり、かつΔ5-ELO活性を有するタンパク質。
＜７＞前記タンパク質（Ｂ）が、前記タンパク質（Ａ）のアミノ酸配列に、１又は複数個、好ましくは１個以上１０６個以下、より好ましくは１個以上９３個以下、より好ましくは１個以上８０個以下、より好ましくは１個以上６６個以下、より好ましくは１個以上５３個以下、より好ましくは１個以上４０個以下、より好ましくは１個以上２６個以下、より好ましくは１個以上１８個以下、より好ましくは１個以上１３個以下、より好ましくは１個以上８個以下、より好ましくは１個以上５個以下、さらに好ましくは１個以上２個以下、のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつΔ5-ELO活性を有するタンパク質である、前記＜６＞項に記載の方法。
＜８＞前記タンパク質（Ｄ）が、前記タンパク質（Ｃ）のアミノ酸配列に、１又は複数個、好ましくは１個以上１０６個以下、より好ましくは１個以上１２０個以下、好ましくは１個以上１０５個以下、より好ましくは１個以上９０個以下、より好ましくは１個以上７５個以下、より好ましくは１個以上６０個以下、より好ましくは１個以上４５個以下、より好ましくは１個以上３０個以下、より好ましくは１個以上２１個以下、より好ましくは１個以上１５個以下、より好ましくは１個以上９個以下、より好ましくは１個以上６個以下、さらに好ましくは１個以上３個以下、のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつΔ5-ELO活性を有するタンパク質である、前記＜６＞項に記載の方法。
＜９＞前記タンパク質（Ｆ）が、前記タンパク質（Ｅ）のアミノ酸配列に、１又は複数個、好ましくは１個以上１４３個以下、より好ましくは１個以上１２５個以下、より好ましくは１個以上１０７個以下、より好ましくは１個以上８９個以下、より好ましくは１個以上７１個以下、より好ましくは１個以上５３個以下、より好ましくは１個以上３５個以下、より好ましくは１個以上２５個以下、より好ましくは１個以上１７個以下、より好ましくは１個以上１０個以下、より好ましくは１個以上７個以下、さらに好ましくは１個以上３個以下、のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつΔ5-ELO活性を有するタンパク質である、前記＜６＞項に記載の方法。
＜１０＞前記タンパク質（Ｈ）が、前記タンパク質（Ｇ）のアミノ酸配列に、１又は複数個、好ましくは１個以上１３４個以下、より好ましくは１個以上１１７個以下、より好ましくは１個以上１００個以下、より好ましくは１個以上８３個以下、より好ましくは１個以上６７個以下、より好ましくは１個以上５０個以下、より好ましくは１個以上３３個以下、より好ましくは１個以上２３個以下、より好ましくは１個以上１６個以下、より好ましくは１個以上１０個以下、より好ましくは１個以上６個以下、さらに好ましくは１個以上３個以下、のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつΔ5-ELO活性を有するタンパク質である、前記＜６＞項に記載の方法。
＜１１＞前記タンパク質（Ｊ）が、前記タンパク質（Ｉ）のアミノ酸配列に、１又は複数個、好ましくは１個以上１３９個以下、より好ましくは１個以上１２１個以下、より好ましくは１個以上１０４個以下、より好ましくは１個以上８７個以下、より好ましくは１個以上６９個以下、より好ましくは１個以上５２個以下、より好ましくは１個以上３４個以下、より好ましくは１個以上２４個以下、より好ましくは１個以上１７個以下、より好ましくは１個以上１０個以下、より好ましくは１個以上６個以下、さらに好ましくは１個以上３個以下、のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつΔ5-ELO活性を有するタンパク質である、前記＜６＞項に記載の方法。
＜１２＞前記Δ5-ELO、好ましくは前記タンパク質（Ａ）～（Ｊ）のいずれか１つ、をコードする遺伝子が、下記ＤＮＡ（ａ）～（ｊ）のいずれか１つからなる遺伝子、より好ましくは下記ＤＮＡ（ａ）～（ｆ）のいずれか１つからなる遺伝子、より好ましくは下記ＤＮＡ（ａ）、（ｂ）、（ｅ）、又は（ｆ）のいずれか１つからなる遺伝子である、前記＜１＞～＜１１＞のいずれか１項記載の方法。

（ａ）配列番号４で表される塩基配列からなるＤＮＡ。
（ｂ）前記ＤＮＡ（ａ）の塩基配列と同一性が６０％以上、好ましくは６５％以上、より好ましくは７０％以上、さらに好ましくは７５％以上、さらに好ましくは８０％以上、さらに好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９３％以上、さらに好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９７％以上、さらに好ましくは９８％以上、さらに好ましくは９９％以上、の塩基配列からなり、かつΔ5-ELO活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
（ｃ）配列番号７で表される塩基配列からなるＤＮＡ。
（ｄ）前記ＤＮＡ（ｃ）の塩基配列と同一性が６０％以上、好ましくは６５％以上、より好ましくは７０％以上、さらに好ましくは７５％以上、さらに好ましくは８０％以上、さらに好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９３％以上、さらに好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９７％以上、さらに好ましくは９８％以上、さらに好ましくは９９％以上、の塩基配列からなり、かつΔ5-ELO活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
（ｅ）配列番号１０で表される塩基配列からなるＤＮＡ。
（ｆ）前記ＤＮＡ（ｅ）の塩基配列と同一性が６０％以上、好ましくは６５％以上、より好ましくは７０％以上、さらに好ましくは７５％以上、さらに好ましくは８０％以上、さらに好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９３％以上、さらに好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９７％以上、さらに好ましくは９８％以上、さらに好ましくは９９％以上、の塩基配列からなり、かつΔ5-ELO活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
（ｇ）配列番号１３で表される塩基配列からなるＤＮＡ。
（ｈ）前記ＤＮＡ（ｇ）の塩基配列と同一性が６０％以上、好ましくは６５％以上、より好ましくは７０％以上、さらに好ましくは７５％以上、さらに好ましくは８０％以上、さらに好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９３％以上、さらに好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９７％以上、さらに好ましくは９８％以上、さらに好ましくは９９％以上、の塩基配列からなり、かつΔ5-ELO活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
（ｉ）配列番号１６で表される塩基配列からなるＤＮＡ。
（ｊ）前記ＤＮＡ（ｉ）の塩基配列と同一性が６０％以上、好ましくは６５％以上、より好ましくは７０％以上、さらに好ましくは７５％以上、さらに好ましくは８０％以上、さらに好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９３％以上、さらに好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９７％以上、さらに好ましくは９８％以上、さらに好ましくは９９％以上、の塩基配列からなり、かつΔ5-ELO活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
＜１３＞前記ＤＮＡ（ｂ）が、前記ＤＮＡ（ａ）の塩基配列に、１若しくは複数個、好ましくは１個以上３２１個以下、より好ましくは１個以上２８１個以下、より好ましくは１個以上２４１個以下、より好ましくは１個以上２０１個以下、より好ましくは１個以上１６０個以下、より好ましくは１個以上１２０個以下、より好ましくは１個以上８０個以下、より好ましくは１個以上５６個以下、より好ましくは１個以上４０個以下、より好ましくは１個以上２４個以下、より好ましくは１個以上１６個以下、さらに好ましくは１個以上８個以下、の塩基が欠失、置換、挿入、若しくは付加された塩基配列からなり、かつΔ5-ELO活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、又は前記ＤＮＡ（ａ）と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつΔ5-ELO活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡである、前記＜１２＞項記載の方法。
＜１４＞前記ＤＮＡ（ｄ）が、前記ＤＮＡ（ｃ）の塩基配列に、１若しくは複数個、好ましくは１個以上３６１個以下、より好ましくは１個以上３１６個以下、より好ましくは１個以上２７０個以下、より好ましくは１個以上２２５個以下、より好ましくは１個以上１８０個以下、より好ましくは１個以上１３５個以下、より好ましくは１個以上９０個以下、より好ましくは１個以上６３個以下、より好ましくは１個以上４５個以下、より好ましくは１個以上２７個以下、より好ましくは１個以上１８個以下、さらに好ましくは１個以上９個以下、の塩基が欠失、置換、挿入、若しくは付加された塩基配列からなり、かつΔ5-ELO活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、又は前記ＤＮＡ（ｃ）と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつΔ5-ELO活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡである、前記＜１２＞項記載の方法。
＜１５＞前記ＤＮＡ（ｆ）が、前記ＤＮＡ（ｅ）の塩基配列に、１若しくは複数個、好ましくは１個以上４３０個以下、より好ましくは１個以上３７６個以下、より好ましくは１個以上３２３個以下、より好ましくは１個以上２６９個以下、より好ましくは１個以上２１５個以下、より好ましくは１個以上１６１個以下、より好ましくは１個以上１０７個以下、より好ましくは１個以上７５個以下、より好ましくは１個以上５３個以下、より好ましくは１個以上３２個以下、より好ましくは１個以上２１個以下、さらに好ましくは１個以上１０個以下、の塩基が欠失、置換、挿入、若しくは付加された塩基配列からなり、かつΔ5-ELO活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、又は前記ＤＮＡ（ｅ）と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつΔ5-ELO活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡである、前記＜１２＞項記載の方法。
＜１６＞前記ＤＮＡ（ｈ）が、前記ＤＮＡ（ｇ）の塩基配列に、１若しくは複数個、好ましくは１個以上４０３個以下、より好ましくは１個以上３５２個以下、より好ましくは１個以上３０２個以下、より好ましくは１個以上２５２個以下、より好ましくは１個以上２０１個以下、より好ましくは１個以上１５１個以下、より好ましくは１個以上１００個以下、より好ましくは１個以上７０個以下、より好ましくは１個以上５０個以下、より好ましくは１個以上３０個以下、より好ましくは１個以上２０個以下、さらに好ましくは１個以上１０個以下、の塩基が欠失、置換、挿入、若しくは付加された塩基配列からなり、かつΔ5-ELO活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、又は前記ＤＮＡ（ｇ）と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつΔ5-ELO活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡである、前記＜１２＞項記載の方法。
＜１７＞前記ＤＮＡ（ｊ）が、前記ＤＮＡ（ｉ）の塩基配列に、１若しくは複数個、好ましくは１個以上４１８個以下、より好ましくは１個以上３６６個以下、より好ましくは１個以上３１４個以下、より好ましくは１個以上２６１個以下、より好ましくは１個以上２０９個以下、より好ましくは１個以上１５７個以下、より好ましくは１個以上１０４個以下、より好ましくは１個以上７３個以下、より好ましくは１個以上５２個以下、より好ましくは１個以上３１個以下、より好ましくは１個以上２０個以下、さらに好ましくは１個以上１０個以下、の塩基が欠失、置換、挿入、若しくは付加された塩基配列からなり、かつΔ5-ELO活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、又は前記ＤＮＡ（ｉ）と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつΔ5-ELO活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡである、前記＜１２＞項記載の方法。
＜１８＞前記Δ4-DESが下記タンパク質（Ｋ）～（Ｎ）からなる群より選ばれる少なくとも１種のタンパク質である、前記＜１＞～＜１７＞のいずれか１項記載の方法。

（Ｋ）配列番号２７で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
（Ｌ）前記タンパク質（Ｋ）のアミノ酸配列と同一性が６０％以上、好ましくは６５％以上、より好ましくは７０％以上、さらに好ましくは７５％以上、さらに好ましくは８０％以上、さらに好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９３％以上、さらに好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９７％以上、さらに好ましくは９８％以上、さらに好ましくは９９％以上、のアミノ酸配列からなり、かつΔ4-DES活性を有するタンパク質。
（Ｍ）配列番号３０で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
（Ｎ）前記タンパク質（Ｍ）のアミノ酸配列と同一性が６０％以上、好ましくは６５％以上、より好ましくは７０％以上、さらに好ましくは７５％以上、さらに好ましくは８０％以上、さらに好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９３％以上、さらに好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９７％以上、さらに好ましくは９８％以上、さらに好ましくは９９％以上、のアミノ酸配列からなり、かつΔ4-DES活性を有するタンパク質。
＜１９＞前記タンパク質（Ｌ）が、前記タンパク質（Ｋ）のアミノ酸配列に、１又は複数個、好ましくは１個以上１７８個以下、より好ましくは１個以上１５５個以下、より好ましくは１個以上１３３個以下、より好ましくは１個以上１１１個以下、より好ましくは１個以上８９個以下、より好ましくは１個以上６６個以下、より好ましくは１個以上４４個以下、より好ましくは１個以上３１個以下、より好ましくは１個以上２２個以下、より好ましくは１個以上１３個以下、より好ましくは１個以上８個以下、さらに好ましくは１個以上４個以下、のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつΔ4-DES活性を有するタンパク質である、前記＜１８＞項に記載の方法。
＜２０＞前記タンパク質（Ｎ）が、前記タンパク質（Ｍ）のアミノ酸配列に、１又は複数個、好ましくは１個以上１７８個以下、より好ましくは１個以上１５６個以下、より好ましくは１個以上１３４個以下、より好ましくは１個以上１１１個以下、より好ましくは１個以上８９個以下、より好ましくは１個以上６７個以下、より好ましくは１個以上４４個以下、より好ましくは１個以上３１個以下、より好ましくは１個以上２２個以下、より好ましくは１個以上１３個以下、より好ましくは１個以上８個以下、さらに好ましくは１個以上４個以下、のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつΔ4-DES活性を有するタンパク質である、前記＜１８＞項に記載の方法。
＜２１＞前記Δ4-DES、好ましくは前記タンパク質（Ｋ）～（Ｎ）のいずれか１つ、をコードする遺伝子が、下記ＤＮＡ（ｋ）～（ｎ）のいずれか１つからなる遺伝子である、前記＜１＞～＜２０＞のいずれか１項記載の方法。

（ｋ）配列番号２５で表される塩基配列からなるＤＮＡ。
（ｌ）前記ＤＮＡ（ｋ）の塩基配列と同一性が６０％以上、好ましくは６５％以上、より好ましくは７０％以上、さらに好ましくは７５％以上、さらに好ましくは８０％以上、さらに好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９３％以上、さらに好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９７％以上、さらに好ましくは９８％以上、さらに好ましくは９９％以上、の塩基配列からなり、かつΔ4-DES活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
（ｍ）配列番号２８で表される塩基配列からなるＤＮＡ。
（ｎ）前記ＤＮＡ（ｍ）の塩基配列と同一性が６０％以上、好ましくは６５％以上、より好ましくは７０％以上、さらに好ましくは７５％以上、さらに好ましくは８０％以上、さらに好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９３％以上、さらに好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９７％以上、さらに好ましくは９８％以上、さらに好ましくは９９％以上、の塩基配列からなり、かつΔ4-DES活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
＜２２＞前記ＤＮＡ（ｌ）が、前記ＤＮＡ（ｋ）の塩基配列に、１若しくは複数個、好ましくは１個以上５３５個以下、より好ましくは１個以上４６８個以下、より好ましくは１個以上４０１個以下、より好ましくは１個以上３３４個以下、より好ましくは１個以上２６７個以下、より好ましくは１個以上２００個以下、より好ましくは１個以上１３３個以下、より好ましくは１個以上９３個以下、より好ましくは１個以上６６個以下、より好ましくは１個以上４０個以下、より好ましくは１個以上２６個以下、さらに好ましくは１個以上１３個以下、の塩基が欠失、置換、挿入、若しくは付加された塩基配列からなり、かつΔ4-DES活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、又は前記ＤＮＡ（ｋ）と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつΔ4-DES活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡである、前記＜２１＞項記載の方法。
＜２３＞前記ＤＮＡ（ｎ）が、前記ＤＮＡ（ｍ）の塩基配列に、１若しくは複数個、好ましくは１個以上５３７個以下、より好ましくは１個以上４７０個以下、より好ましくは１個以上４０３個以下、より好ましくは１個以上３３６個以下、より好ましくは１個以上２６８個以下、より好ましくは１個以上２０１個以下、より好ましくは１個以上１３４個以下、より好ましくは１個以上９４個以下、より好ましくは１個以上６７個以下、より好ましくは１個以上４０個以下、より好ましくは１個以上２６個以下、さらに好ましくは１個以上１３個以下、の塩基が欠失、置換、挿入、若しくは付加された塩基配列からなり、かつΔ4-DES活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、又は前記ＤＮＡ（ｍ）と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつΔ4-DES活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡである、前記＜２１＞項記載の方法。
＜２４＞前記ナンノクロロプシス属に属する藻類において、ACPの発現、又はACP遺伝子の発現を促進させた、前記＜１＞～＜２３＞のいずれか１項記載の方法。
＜２５＞ACP遺伝子の発現を前記ナンノクロロプシス属に属する藻類の細胞内で促進させ、ACPの発現を促進する、前記＜２４＞項記載の方法。
＜２６＞ACP遺伝子を前記ナンノクロロプシス属に属する藻類に導入し、導入したACP遺伝子の発現を促進させる、前記＜２４＞又は＜２５＞項記載の方法。
＜２７＞前記ACPが下記タンパク質（Ｏ）又は（Ｐ）、である、前記＜２４＞～＜２６＞のいずれか１項記載の方法。

（Ｏ）配列番号３１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質、好ましくは配列番号３１で表されるアミノ酸配列における２３～１４６番目のアミノ酸配列からなるタンパク質、より好ましくは前記ナンノクロロプシス属に属する藻類の細胞内で機能する葉緑体移行シグナル配列が配列番号３１で表されるアミノ酸配列における２３～１４６番目のアミノ酸配列のＮ末端側に付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質。
（Ｐ）前記タンパク質（Ｏ）のアミノ酸配列と同一性が６０％以上、好ましくは６５％以上、より好ましくは７０％以上、さらに好ましくは７５％以上、さらに好ましくは８０％以上、さらに好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９３％以上、さらに好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９７％以上、さらに好ましくは９８％以上、さらに好ましくは９９％以上、のアミノ酸配列からなり、かつACP活性を有するタンパク質。
＜２８＞前記タンパク質（Ｐ）が、前記タンパク質（Ｏ）のアミノ酸配列に、１又は複数個、好ましくは１個以上５８個以下、より好ましくは１個以上５１個以下、さらに好ましくは１個以上４３個以下、さらに好ましくは１個以上３６個以下、さらに好ましくは１個以上２９個以下、さらに好ましくは１個以上２１個以下、さらに好ましくは１個以上１４個以下、さらに好ましくは１個以上１０個以下、さらに好ましくは１個以上７個以下、さらに好ましくは１個以上４個以下、さらに好ましくは１個以上２個以下、さらに好ましくは１個、のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたタンパク質であり、かつACP活性を有するタンパク質である、前記＜２７＞項記載の方法。
＜２９＞前記ACP、好ましくは前記タンパク質（Ｏ）又は（Ｐ）をコードする遺伝子が、下記ＤＮＡ（ｏ）又は（ｐ）からなる遺伝子である、前記＜２４＞～＜２８＞のいずれか１項記載の方法。

（ｏ）配列番号３２で表される塩基配列からなるＤＮＡ、好ましくは配列番号３２で表される塩基配列における６７～４４１番目の塩基配列からなるＤＮＡ、より好ましくは前記ナンノクロロプシス属に属する藻類の細胞内で機能する葉緑体移行シグナル配列をコードする塩基配列が配列番号３２で表される塩基配列における６７～４４１番目の塩基配列の５’末端側に付加された塩基配列からなるＤＮＡ。
（ｐ）前記ＤＮＡ（ｏ）の塩基配列と同一性が６０％以上、好ましくは６５％以上、より好ましくは７０％以上、さらに好ましくは７５％以上、さらに好ましくは８０％以上、さらに好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９３％以上、さらに好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９７％以上、さらに好ましくは９８％以上、さらに好ましくは９９％以上、の塩基配列からなり、かつACP活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
＜３０＞前記ＤＮＡ（ｐ）が、前記ＤＮＡ（ｏ）の塩基配列に、１若しくは複数個、好ましくは１個以上１７６個以下、より好ましくは１個以上１５４個以下、より好ましくは１個以上１３２個以下、より好ましくは１個以上１１０個以下、より好ましくは１個以上８８個以下、より好ましくは１個以上６６個以下、より好ましくは１個以上４４個以下、より好ましくは１個以上３０個以下、より好ましくは１個以上２２個以下、より好ましくは１個以上１３個以下、より好ましくは１個以上８個以下、より好ましくは１個以上４個以下、の塩基が欠失、置換、挿入、若しくは付加された塩基配列からなり、かつACP活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、又は前記ＤＮＡ（ｏ）と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつACP活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡである、前記＜２９＞項記載の方法。
＜３１＞ACP遺伝子が葉緑体ゲノムに導入され、導入した遺伝子の発現を促進させる、前記＜２４＞～＜３０＞のいずれか１項記載の方法。
＜３２＞前記ナンノクロロプシス属に属する藻類において、Δ12-DESの発現、又はΔ12-DES遺伝子の発現を促進させた、前記＜１＞～＜３１＞のいずれか１項記載の方法。
＜３３＞Δ12-DES遺伝子の発現を前記ナンノクロロプシス属に属する藻類の細胞内で促進させ、Δ12-DESの発現を促進する、前記＜３２＞項記載の方法。
＜３４＞Δ12-DES遺伝子を前記ナンノクロロプシス属に属する藻類に導入し、導入したΔ12-DES遺伝子の発現を促進させる、前記＜３２＞又は＜３３＞項記載の方法。
＜３５＞前記Δ12-DESが下記タンパク質（Ｑ）又は（Ｒ）、である、前記＜３２＞～＜３４＞のいずれか１項記載の方法。

（Ｑ）配列番号３４で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
（Ｒ）前記タンパク質（Ｑ）のアミノ酸配列と同一性が６０％以上、好ましくは６５％以上、より好ましくは７０％以上、さらに好ましくは７５％以上、さらに好ましくは８０％以上、さらに好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９３％以上、さらに好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９７％以上、さらに好ましくは９８％以上、さらに好ましくは９９％以上、のアミノ酸配列からなり、かつΔ12-DES活性を有するタンパク質。
＜３６＞前記タンパク質（Ｒ）が、前記タンパク質（Ｑ）のアミノ酸配列に、１又は複数個、好ましくは１個以上１７５個以下、好ましくは１個以上１５３個以下、より好ましくは１個以上１３１個以下、より好ましくは１個以上１０９個以下、より好ましくは１個以上８７個以下、より好ましくは１個以上６５個以下、より好ましくは１個以上４３個以下、より好ましくは１個以上３０個以下、より好ましくは１個以上２１個以下、より好ましくは１個以上１３個以下、より好ましくは１個以上８個以下、より好ましくは１個以上４個以下、のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたタンパク質であり、かつΔ12-DES活性を有するタンパク質である、前記＜３５＞項記載の方法。
＜３７＞前記Δ12-DES、好ましくは前記タンパク質（Ｑ）又は（Ｒ）をコードする遺伝子が、下記ＤＮＡ（ｑ）又は（ｒ）からなる遺伝子である、前記＜３２＞～＜３６＞のいずれか１項記載の方法。

（ｑ）配列番号３５で表される塩基配列からなるＤＮＡ。
（ｒ）前記ＤＮＡ（ｑ）の塩基配列と同一性が６０％以上、好ましくは６５％以上、より好ましくは７０％以上、さらに好ましくは７５％以上、さらに好ましくは８０％以上、さらに好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９３％以上、さらに好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９７％以上、さらに好ましくは９８％以上、さらに好ましくは９９％以上、の塩基配列からなり、かつΔ12-DES活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
＜３８＞前記ＤＮＡ（ｒ）が、前記ＤＮＡ（ｑ）の塩基配列に、１若しくは複数個、好ましくは１個以上５２６個以下、好ましくは１個以上４６０個以下、より好ましくは１個以上３９５個以下、より好ましくは１個以上３２９個以下、より好ましくは１個以上２６３個以下、より好ましくは１個以上１９７個以下、より好ましくは１個以上１３１個以下、より好ましくは１個以上９２個以下、より好ましくは１個以上６５個以下、より好ましくは１個以上３９個以下、より好ましくは１個以上２６個以下、より好ましくは１個以上１３個以下、の塩基が欠失、置換、挿入、若しくは付加された塩基配列からなり、かつΔ12-DES活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、又は前記ＤＮＡ（ｑ）と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつΔ12-DES活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡである、前記＜３７＞項記載の方法。
＜３９＞前記ナンノクロロプシス属に属する藻類において、Δ6-DESの発現、又はΔ6-DES遺伝子の発現を促進させた、前記＜１＞～＜３８＞のいずれか１項記載の方法。
＜４０＞Δ6-DES遺伝子の発現を前記ナンノクロロプシス属に属する藻類の細胞内で促進させ、Δ6-DESの発現を促進する、前記＜３９＞項記載の方法。
＜４１＞Δ6-DES遺伝子を前記ナンノクロロプシス属に属する藻類に導入し、導入したΔ6-DES遺伝子の発現を促進させる、前記＜３９＞又は＜４０＞項記載の方法。
＜４２＞前記Δ6-DESが下記タンパク質（Ｓ）又は（Ｔ）、である、前記＜３９＞～＜４１＞のいずれか１項記載の方法。

（Ｓ）配列番号３６で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
（Ｔ）前記タンパク質（Ｓ）のアミノ酸配列と同一性が６０％以上、好ましくは６５％以上、より好ましくは７０％以上、さらに好ましくは７５％以上、さらに好ましくは８０％以上、さらに好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９３％以上、さらに好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９７％以上、さらに好ましくは９８％以上、さらに好ましくは９９％以上、のアミノ酸配列からなり、かつΔ6-DES活性を有するタンパク質。
＜４３＞前記タンパク質（Ｔ）が、前記タンパク質（Ｓ）のアミノ酸配列に、１又は複数個、好ましくは１個以上１８９個以下、より好ましくは１個以上１６５個以下、より好ましくは１個以上１４２個以下、より好ましくは１個以上１１８個以下、より好ましくは１個以上９４個以下、より好ましくは１個以上７１個以下、より好ましくは１個以上４７個以下、より好ましくは１個以上３３個以下、より好ましくは１個以上２３個以下、より好ましくは１個以上１４個以下、より好ましくは１個以上９個以下、より好ましくは１個以上４個以下、のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたタンパク質であり、かつΔ6-DES活性を有するタンパク質である、前記＜４２＞項記載の方法。
＜４４＞前記Δ12-DES、好ましくは前記タンパク質（Ｓ）又は（Ｔ）をコードする遺伝子が、下記ＤＮＡ（ｓ）又は（ｔ）からなる遺伝子である、前記＜３９＞～＜４３＞のいずれか１項記載の方法。

（ｓ）配列番号３７で表される塩基配列からなるＤＮＡ。
（ｔ）前記ＤＮＡ（ｓ）の塩基配列と同一性が６０％以上、好ましくは６５％以上、より好ましくは７０％以上、さらに好ましくは７５％以上、さらに好ましくは８０％以上、さらに好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９３％以上、さらに好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９７％以上、さらに好ましくは９８％以上、さらに好ましくは９９％以上、の塩基配列からなり、かつΔ6-DES活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
＜４５＞前記ＤＮＡ（ｔ）が、前記ＤＮＡ（ｓ）の塩基配列に、１若しくは複数個、好ましくは１個以上５７０個以下、好ましくは１個以上４９８個以下、より好ましくは１個以上４２７個以下、より好ましくは１個以上３５６個以下、より好ましくは１個以上２８５個以下、より好ましくは１個以上２１３個以下、より好ましくは１個以上１４２個以下、より好ましくは１個以上９９個以下、より好ましくは１個以上７１個以下、より好ましくは１個以上４２個以下、より好ましくは１個以上２８個以下、より好ましくは１個以上１４個以下、の塩基が欠失、置換、挿入、若しくは付加された塩基配列からなり、かつΔ6-DES活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、又は前記ＤＮＡ（ｓ）と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつΔ6-DES活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡである、前記＜４４＞項記載の方法。
＜４６＞前記ナンノクロロプシス属に属する藻類において、ω3-DESの発現、又はω3-DES遺伝子の発現を促進させた、前記＜１＞～＜４５＞のいずれか１項記載の方法。
＜４７＞ω3-DES遺伝子の発現を前記ナンノクロロプシス属に属する藻類の細胞内で促進させ、ω3-DESの発現を促進する、前記＜４６＞項記載の方法。
＜４８＞ω3-DES遺伝子を前記ナンノクロロプシス属に属する藻類に導入し、導入したω3-DES遺伝子の発現を促進させる、前記＜４６＞又は＜４７＞項記載の方法。
＜４９＞前記ω3-DESが下記タンパク質（Ｕ）又は（Ｖ）、である、前記＜４６＞～＜４８＞のいずれか１項記載の方法。

（Ｕ）配列番号３８で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
（Ｖ）前記タンパク質（Ｕ）のアミノ酸配列と同一性が６０％以上、好ましくは６５％以上、より好ましくは７０％以上、さらに好ましくは７５％以上、さらに好ましくは８０％以上、さらに好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９３％以上、さらに好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９７％以上、さらに好ましくは９８％以上、さらに好ましくは９９％以上、のアミノ酸配列からなり、かつω3-デサチュラーゼ活性を有するタンパク質。
＜５０＞前記タンパク質（Ｖ）が、前記タンパク質（Ｕ）のアミノ酸配列に、１又は複数個、好ましくは１個以上１６４個以下、好ましくは１個以上１４３個以下、より好ましくは１個以上１２３個以下、より好ましくは１個以上１０２個以下、より好ましくは１個以上８２個以下、より好ましくは１個以上６１個以下、より好ましくは１個以上４１個以下、より好ましくは１個以上２８個以下、より好ましくは１個以上２０個以下、より好ましくは１個以上１２個以下、より好ましくは１個以上８個以下、より好ましくは１個以上４個以下、のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたタンパク質であり、かつω3-DES活性を有するタンパク質である、前記＜４９＞項記載の方法。
＜５１＞前記ω3-DES、好ましくは前記タンパク質（Ｕ）又は（Ｖ）をコードする遺伝子が、下記ＤＮＡ（ｕ）又は（ｖ）からなる遺伝子である、前記＜４６＞～＜５０＞のいずれか１項記載の方法。

（ｕ）配列番号３９で表される塩基配列からなるＤＮＡ。
（ｖ）前記ＤＮＡ（ｕ）の塩基配列と同一性が６０％以上、好ましくは６５％以上、より好ましくは７０％以上、さらに好ましくは７５％以上、さらに好ましくは８０％以上、さらに好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９３％以上、さらに好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９７％以上、さらに好ましくは９８％以上、さらに好ましくは９９％以上、の塩基配列からなり、かつω3-DES活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
＜５２＞前記ＤＮＡ（ｖ）が、前記ＤＮＡ（ｕ）の塩基配列に、１若しくは複数個、好ましくは１個以上４９３個以下、好ましくは１個以上４３１個以下、より好ましくは１個以上３６９個以下、より好ましくは１個以上３０８個以下、より好ましくは１個以上２４６個以下、より好ましくは１個以上１８４個以下、より好ましくは１個以上１２３個以下、より好ましくは１個以上８６個以下、より好ましくは１個以上６１個以下、より好ましくは１個以上３６個以下、より好ましくは１個以上２４個以下、より好ましくは１個以上１２個以下、の塩基が欠失、置換、挿入、若しくは付加された塩基配列からなり、かつω3-DES活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、又は前記ＤＮＡ（ｕ）と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつω3-DES活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡである、前記＜５１＞項記載の方法。
＜５３＞前記ナンノクロロプシス属に属する藻類において、Δ9-DESの発現、又はΔ9-DES遺伝子の発現を促進させた、前記＜１＞～＜５２＞のいずれか１項記載の方法。
＜５４＞Δ9-DES遺伝子の発現を前記ナンノクロロプシス属に属する藻類の細胞内で促進させ、Δ9-DESの発現を促進する、前記＜５３＞項記載の方法。
＜５５＞Δ9-DES遺伝子を前記ナンノクロロプシス属に属する藻類に導入し、導入したΔ9-DES遺伝子の発現を促進させる、前記＜５３＞又は＜５４＞項記載の方法。
＜５６＞前記Δ9-DESが下記タンパク質（Ｗ）又は（Ｘ）、である、前記＜５３＞～＜５５＞のいずれか１項記載の方法。

（Ｗ）配列番号４０で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
（Ｘ）前記タンパク質（Ｗ）のアミノ酸配列と同一性が６０％以上、好ましくは６５％以上、より好ましくは７０％以上、さらに好ましくは７５％以上、さらに好ましくは８０％以上、さらに好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９３％以上、さらに好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９７％以上、さらに好ましくは９８％以上、さらに好ましくは９９％以上、のアミノ酸配列からなり、かつΔ9-DES活性を有するタンパク質。
＜５７＞前記タンパク質（Ｘ）が、前記タンパク質（Ｗ）のアミノ酸配列に、１又は複数個、好ましくは１個以上１４３個以下、好ましくは１個以上１２５個以下、より好ましくは１個以上１０７個以下、より好ましくは１個以上８９個以下、より好ましくは１個以上７１個以下、より好ましくは１個以上５３個以下、より好ましくは１個以上３５個以下、より好ましくは１個以上２５個以下、より好ましくは１個以上１７個以下、より好ましくは１個以上１０個以下、より好ましくは１個以上７個以下、より好ましくは１個以上３個以下、のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたタンパク質であり、かつΔ9-DES活性を有するタンパク質である、前記＜５６＞項記載の方法。
＜５８＞前記Δ9-DES、好ましくは前記タンパク質（Ｗ）又は（Ｘ）をコードする遺伝子が、下記ＤＮＡ（ｗ）又は（ｘ）からなる遺伝子である、前記＜５３＞～＜５７＞のいずれか１項記載の方法。

（ｗ）配列番号４１で表される塩基配列からなるＤＮＡ。
（ｘ）前記ＤＮＡ（ｗ）の塩基配列と同一性が６０％以上、好ましくは６５％以上、より好ましくは７０％以上、さらに好ましくは７５％以上、さらに好ましくは８０％以上、さらに好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９３％以上、さらに好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９７％以上、さらに好ましくは９８％以上、さらに好ましくは９９％以上、の塩基配列からなり、かつΔ9-DES活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
＜５９＞前記ＤＮＡ（ｘ）が、前記ＤＮＡ（ｗ）の塩基配列に、１若しくは複数個、好ましくは１個以上４３２個以下、好ましくは１個以上３７８個以下、より好ましくは１個以上３２４個以下、より好ましくは１個以上２７０個以下、より好ましくは１個以上２１６個以下、より好ましくは１個以上１６２個以下、より好ましくは１個以上１０８個以下、より好ましくは１個以上７５個以下、より好ましくは１個以上５４個以下、より好ましくは１個以上３２個以下、より好ましくは１個以上２１個以下、より好ましくは１個以上１０個以下、の塩基が欠失、置換、挿入、若しくは付加された塩基配列からなり、かつΔ9-DES活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、又は前記ＤＮＡ（ｗ）と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつΔ9-DES活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡである、前記＜５８＞項記載の方法。
＜６０＞前記ナンノクロロプシス属に属する藻類において、Δ6-ELOの発現、又はΔ6-ELO遺伝子の発現を促進させた、前記＜１＞～＜５９＞のいずれか１項記載の方法。
＜６１＞Δ6-ELO遺伝子の発現を前記ナンノクロロプシス属に属する藻類の細胞内で促進させ、Δ6-ELOの発現を促進する、前記＜６０＞項記載の方法。
＜６２＞Δ6-ELO遺伝子を前記ナンノクロロプシス属に属する藻類に導入し、導入したΔ6-ELO遺伝子の発現を促進させる、前記＜６０＞又は＜６１＞項記載の方法。
＜６３＞前記Δ6-ELOが下記タンパク質（Ｙ）又は（Ｚ）、である、前記＜６０＞～＜６２＞のいずれか１項記載の方法。

（Ｙ）配列番号４２で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
（Ｚ）前記タンパク質（Ｙ）のアミノ酸配列と同一性が６０％以上、好ましくは６５％以上、より好ましくは７０％以上、さらに好ましくは７５％以上、さらに好ましくは８０％以上、さらに好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９３％以上、さらに好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９７％以上、さらに好ましくは９８％以上、さらに好ましくは９９％以上、のアミノ酸配列からなり、かつΔ6-ELO活性を有するタンパク質。
＜６４＞前記タンパク質（Ｚ）が、前記タンパク質（Ｙ）のアミノ酸配列に、１又は複数個、好ましくは１個以上１１０個以下、より好ましくは１個以上９６個以下、より好ましくは１個以上８２個以下、より好ましくは１個以上６９個以下、より好ましくは１個以上５５個以下、より好ましくは１個以上４１個以下、より好ましくは１個以上２７個以下、より好ましくは１個以上１９個以下、より好ましくは１個以上１３個以下、より好ましくは１個以上８個以下、より好ましくは１個以上５個以下、より好ましくは１個以上２個以下、のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたタンパク質であり、かつΔ6-ELO活性を有するタンパク質である、前記＜６３＞項記載の方法。
＜６５＞前記Δ6-ELO、好ましくは前記タンパク質（Ｙ）又は（Ｚ）をコードする遺伝子が、下記ＤＮＡ（ｙ）又は（ｚ）からなる遺伝子である、前記＜６０＞～＜６４＞のいずれか１項記載の方法。

（ｙ）配列番号４３で表される塩基配列からなるＤＮＡ。
（ｚ）前記ＤＮＡ（ｙ）の塩基配列と同一性が６０％以上、好ましくは６５％以上、より好ましくは７０％以上、さらに好ましくは７５％以上、さらに好ましくは８０％以上、さらに好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９３％以上、さらに好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９７％以上、さらに好ましくは９８％以上、さらに好ましくは９９％以上、の塩基配列からなり、かつΔ6-ELO活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
＜６６＞前記ＤＮＡ（ｚ）が、前記ＤＮＡ（ｙ）の塩基配列に、１若しくは複数個、好ましくは１個以上４３２個以下、より好ましくは１個以上３７８個以下、より好ましくは１個以上３２４個以下、より好ましくは１個以上２７０個以下、より好ましくは１個以上２１６個以下、より好ましくは１個以上１６２個以下、より好ましくは１個以上１０８個以下、より好ましくは１個以上７５個以下、より好ましくは１個以上５４個以下、より好ましくは１個以上３２個以下、より好ましくは１個以上２１個以下、より好ましくは１個以上１０個以下、の塩基が欠失、置換、挿入、若しくは付加された塩基配列からなり、かつΔ6-ELO活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、又は前記ＤＮＡ（ｙ）と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつΔ6-ELO活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡである、前記＜６５＞項記載の方法。
＜６７＞前記ナンノクロロプシス属に属する藻類が、ナンノクロロプシス・オセアニカ、ナンノクロロプシス・オキュラータ、ナンノクロロプシス・ガディタナ、ナンノクロロプシス・サリナ、ナンノクロロプシス・リムネティカ、ナンノクロロプシス・グラニュラータ、ナンノクロロプシス・エスピー、好ましくはナンノクロロプシス・オセアニカ又はナンノクロロプシス・ガディタナ、より好ましくはナンノクロロプシス・オセアニカである、前記＜１＞～＜６６＞のいずれか１項記載の方法。
＜６８＞前記炭素原子数２２の長鎖多価不飽和脂肪酸が、ＤＰＡ及び／又はＤＨＡ、好ましくはＤＨＡである、前記＜１＞～＜６７＞のいずれか１項記載の方法。
＜６９＞前記ナンノクロロプシス属に属する藻類の細胞内で生産される全脂肪酸中のＤＨＡの含有量（％ＴＦＡ）が０．５質量％以上、好ましくは１．５質量％以上、より好ましくは３質量％以上、さらに好ましくは５質量％以上、さらに好ましくは８質量％以上、さらに好ましくは１０質量％以上である、前記＜１＞～＜６８＞のいずれか１項記載の方法。
＜７０＞前記脂質が、トリアシルグリセロールを含む、前記＜１＞～＜６９＞のいずれか１項記載の方法。
＜７１＞前記トリアシルグリセロールが、ＤＨＡを０．５質量％以上、好ましくは１．５質量％以上、より好ましくは３質量％以上、さらに好ましくは５質量％以上、さらに好ましくは８質量％以上、さらに好ましくは１０質量％以上含有するトリアシルグリセロールである、前記＜７０＞に記載の方法。
＜７２＞Δ5-ELO及びΔ4-DESの発現、又はΔ5-ELOをコードする遺伝子及びΔ4-DESをコードする遺伝子の発現が促進されている、ナンノクロロプシス属に属する藻類の形質転換体。
＜７３＞Δ5-ELOをコードする遺伝子及びΔ4-DESをコードする遺伝子の発現が前記藻類の細胞内で促進され、Δ5-ELO及びΔ4-DESの発現が促進されている、前記＜７２＞項記載の形質転換体。
＜７４＞Δ5-ELOをコードする遺伝子及びΔ4-DESをコードする遺伝子、又はΔ5-ELOをコードする遺伝子を含有する組換えベクター及びΔ4-DESをコードする遺伝子を含有する組換えベクターを含んでなる、前記＜７２＞又は＜７３＞項記載の形質転換体。
＜７５＞Δ5-ELOをコードする遺伝子及びΔ4-DESをコードする遺伝子、又はΔ5-ELOをコードする遺伝子を含有する組換えベクター及びΔ4-DESをコードする遺伝子を含有する組換えベクターを、ナンノクロロプシス属に属する藻類に導入する、形質転換体の作製方法。
＜７６＞Δ5-ELOをコードする遺伝子を含有する組換えベクター、及びΔ4-DESをコードする遺伝子を含有する組換えベクターを含んでなる、ナンノクロロプシス属に属する藻類の形質転換体の作製用キット。
＜７７＞前記Δ5-ELOが前記タンパク質（Ａ）～（Ｊ）からなる群より選ばれる少なくとも１種のタンパク質、好ましくは前記タンパク質（Ａ）～（Ｆ）からなる群より選ばれる少なくとも１種のタンパク質、より好ましくは前記タンパク質（Ａ）、（Ｂ）、（Ｅ）、及び（Ｆ）からなる群より選ばれる少なくとも１種のタンパク質である、前記＜７２＞～＜７６＞のいずれか１項記載の形質転換体、その作製方法、又は形質転換体の作製用キット。
＜７８＞前記タンパク質（Ｂ）、（Ｄ）、（Ｆ）、（Ｈ）、（Ｊ）が、前記＜７＞～＜１１＞のいずれか１項で規定するタンパク質である、前記＜７７＞項記載の形質転換体、その作製方法、又は形質転換体の作製用キット。
＜７９＞前記Δ5-ELO、好ましくは前記タンパク質（Ａ）～（Ｊ）のいずれか１つ、より好ましくは前記タンパク質（Ａ）～（Ｆ）のいずれか１つ、さらにより好ましくは前記タンパク質（Ａ）、（Ｂ）、（Ｅ）、又は（Ｆ）のいずれか１つをコードする遺伝子が、前記＜１２＞～＜１７＞のいずれか１項で規定する遺伝子である、前記＜７２＞～＜７８＞のいずれか１項記載の形質転換体、その作製方法、又は形質転換体の作製用キット。
＜８０＞前記Δ4-DESが前記タンパク質（Ｋ）～（Ｎ）からなる群より選ばれる少なくとも１種のタンパク質である、前記＜７２＞～＜７９＞のいずれか１項記載の形質転換体、その作製方法、又は形質転換体の作製用キット。
＜８１＞前記タンパク質（Ｌ）又は（Ｎ）が、前記＜１９＞又は＜２０＞で規定するタンパク質である、前記＜８０＞項記載の形質転換体、その作製方法、又は形質転換体の作製用キット。
＜８２＞前記Δ4-DES、好ましくは前記タンパク質（Ｋ）～（Ｎ）のいずれか１つをコードする遺伝子が、前記＜２１＞～＜２３＞のいずれか１項で規定する遺伝子である、前記＜７２＞～＜８１＞のいずれか１項記載の形質転換体、その作製方法、又は形質転換体の作製用キット。
＜８３＞前記形質転換体において、ACPの発現、又はACP遺伝子の発現が促進されている、前記＜７２＞～＜８２＞のいずれか１項記載の形質転換体。
＜８４＞ACP遺伝子の発現が前記藻類の細胞内で促進され、ACPの発現が促進されている、前記＜８３＞項記載の形質転換体。
＜８５＞ACP遺伝子、又はACP遺伝子を含有する組換えベクターを含んでなる、前記＜８３＞又は＜８４＞項記載の形質転換体。
＜８６＞ACP遺伝子、又はACP遺伝子を含有する組換えベクターを、前記藻類に導入する、前記＜７２＞～＜８２＞のいずれか１項記載の形質転換体の作製方法。
＜８７＞ACP遺伝子を含有する組換えベクターを含む、前記＜７２＞～＜８２＞のいずれか１項記載の形質転換体の作製用キット。
＜８８＞前記ACPが前記タンパク質（Ｏ）又は（Ｐ）である、前記＜８３＞～＜８７＞のいずれか１項記載の形質転換体、その作製方法、又は形質転換体の作製用キット。
＜８９＞前記タンパク質（Ｐ）が、前記＜２８＞で規定するタンパク質である、前記＜８８＞項記載の形質転換体、その作製方法、又は形質転換体の作製用キット。
＜９０＞前記ACP、好ましくは前記タンパク質（Ｏ）又は（Ｐ）をコードする遺伝子が、前記＜２９＞又は＜３０＞で規定する遺伝子である、前記＜８３＞～＜８９＞のいずれか１項記載の形質転換体、その作製方法、又は形質転換体の作製用キット。
＜９１＞ACP遺伝子が、前記ナンノクロロプシス属に属する藻類の細胞内で機能する葉緑体移行シグナル配列をコードする塩基配列が付加された遺伝子である、前記＜８３＞～＜９０＞のいずれか１項記載の形質転換体、その作製方法、又は形質転換体の作製用キット。
＜９２＞ACP遺伝子が葉緑体ゲノムに導入され、導入した遺伝子の発現が促進されている、前記＜８３＞～＜９０＞のいずれか１項記載の形質転換体、その作製方法、又は形質転換体の作製用キット。
＜９３＞前記形質転換体において、Δ12-DESの発現、又はΔ12-DES遺伝子の発現が促進されている、前記＜７２＞～＜９２＞のいずれか１項記載の形質転換体。
＜９４＞Δ12-DES遺伝子の発現が前記藻類の細胞内で促進され、Δ12-DESの発現が促進されている、前記＜９３＞項記載の形質転換体。
＜９５＞Δ12-DES遺伝子、又はΔ12-DES遺伝子を含有する組換えベクターを含んでなる、前記＜９３＞又は＜９４＞項記載の形質転換体。
＜９６＞Δ12-DES遺伝子、又はΔ12-DES遺伝子を含有する組換えベクターを、前記藻類に導入する、前記＜７２＞～＜９２＞のいずれか１項記載の形質転換体の作製方法。
＜９７＞Δ12-DES遺伝子を含有する組換えベクターを含む、前記＜７２＞～＜９２＞のいずれか１項記載の形質転換体の作製用キット。
＜９８＞前記Δ12-DESが前記タンパク質（Ｑ）又は（Ｒ）である、前記＜７２＞～＜９７＞のいずれか１項記載の形質転換体、その作製方法、又は形質転換体の作製用キット。
＜９９＞前記タンパク質（Ｒ）が、前記＜３６＞で規定するタンパク質である、前記＜９９＞項記載の形質転換体、その作製方法、又は形質転換体の作製用キット。
＜１００＞前記Δ12-DES、好ましくは前記タンパク質（Ｑ）又は（Ｒ）をコードする遺伝子が、前記＜３７＞又は＜３８＞で規定する遺伝子である、前記＜７２＞～＜９９＞のいずれか１項記載の形質転換体、その作製方法、又は形質転換体の作製用キット。
＜１０１＞前記形質転換体において、Δ6-DESの発現、又はΔ6-DES遺伝子の発現が促進されている、前記＜７２＞～＜１００＞のいずれか１項記載の形質転換体。
＜１０２＞Δ6-DES遺伝子の発現が前記藻類の細胞内で促進され、Δ6-DESの発現が促進されている、前記＜１０１＞項記載の形質転換体。
＜１０３＞Δ6-DES遺伝子、又はΔ6-DES遺伝子を含有する組換えベクターを含んでなる、前記＜１０１＞又は＜１０２＞項記載の形質転換体。
＜１０４＞Δ6-DES遺伝子、又はΔ6-DES遺伝子を含有する組換えベクターを、前記藻類に導入する、前記＜７２＞～＜１００＞のいずれか１項記載の形質転換体の作製方法。
＜１０５＞Δ6-DES遺伝子を含有する組換えベクターを含む、前記＜７２＞～＜１００＞のいずれか１項記載の形質転換体の作製用キット。
＜１０６＞前記Δ6-DESが前記タンパク質（Ｓ）又は（Ｔ）である、前記＜７２＞～＜１０５＞のいずれか１項記載の形質転換体、その作製方法、又は形質転換体の作製用キット。
＜１０７＞前記タンパク質（Ｔ）が、前記＜４３＞で規定するタンパク質である、前記＜１０７＞項記載の形質転換体、その作製方法、又は形質転換体の作製用キット。
＜１０８＞前記Δ6-DES、好ましくは前記タンパク質（Ｓ）又は（Ｔ）をコードする遺伝子が、前記＜４４＞又は＜４５＞のいずれか１項で規定する遺伝子である、前記＜７２＞～＜１０７＞のいずれか１項記載の形質転換体、その作製方法、又は形質転換体の作製用キット。
＜１０９＞前記形質転換体において、ω3-DESの発現、又はω3-DES遺伝子の発現が促進されている、前記＜７２＞～＜１０８＞のいずれか１項記載の形質転換体。
＜１１０＞ω3-DES遺伝子の発現が前記藻類の細胞内で促進され、ω3-DESの発現が促進されている、前記＜１０９＞項記載の形質転換体。
＜１１１＞ω3-DES遺伝子、又はω3-DES遺伝子を含有する組換えベクターを含んでなる、前記＜１０９＞又は＜１１０＞項記載の形質転換体。
＜１１２＞ω3-DES遺伝子、又はω3-DES遺伝子を含有する組換えベクターを、前記藻類に導入する、前記＜７２＞～＜１０８＞のいずれか１項記載の形質転換体の作製方法。
＜１１３＞ω3-DES遺伝子を含有する組換えベクターを含む、前記＜７２＞～＜１０８＞のいずれか１項記載の形質転換体の作製用キット。
＜１１４＞前記ω3-DESが前記タンパク質（Ｕ）又は（Ｖ）である、前記＜７２＞～＜１１３＞のいずれか１項記載の形質転換体、その作製方法、又は形質転換体の作製用キット。
＜１１５＞前記タンパク質（Ｖ）が、前記＜５０＞で規定するタンパク質である、前記＜１１５＞項記載の形質転換体、その作製方法、又は形質転換体の作製用キット。
＜１１６＞前記ω3-DES、好ましくは前記タンパク質（Ｕ）又は（Ｖ）をコードする遺伝子が、前記＜５１＞又は＜５２＞のいずれか１項で規定する遺伝子である、前記＜７２＞～＜１１５＞のいずれか１項記載の形質転換体、その作製方法、又は形質転換体の作製用キット。
＜１１７＞前記形質転換体において、Δ9-DESの発現、又はΔ9-DES遺伝子の発現が促進されている、前記＜７２＞～＜１１６＞のいずれか１項記載の形質転換体。
＜１１８＞Δ9-DES遺伝子の発現が前記藻類の細胞内で促進され、Δ9-DESの発現が促進されている、前記＜１１７＞項記載の形質転換体。
＜１１９＞Δ9-DES遺伝子、又はΔ9-DES遺伝子を含有する組換えベクターを含んでなる、前記＜１１７＞又は＜１１８＞項記載の形質転換体。
＜１２０＞Δ9-DES遺伝子、又はΔ9-DES遺伝子を含有する組換えベクターを、前記藻類に導入する、前記＜７２＞～＜１１６＞のいずれか１項記載の形質転換体の作製方法。
＜１２１＞Δ9-DES遺伝子を含有する組換えベクターを含む、前記＜７２＞～＜１１６＞のいずれか１項記載の形質転換体の作製用キット。
＜１２２＞前記Δ9-DESが前記タンパク質（Ｗ）又は（Ｘ）である、前記＜７２＞～＜１２１＞のいずれか１項記載の形質転換体、その作製方法、又は形質転換体の作製用キット。
＜１２３＞前記タンパク質（Ｘ）が、前記＜５７＞で規定するタンパク質である、前記＜１２３＞項記載の形質転換体、その作製方法、又は形質転換体の作製用キット。
＜１２４＞前記Δ9-DES、好ましくは前記タンパク質（Ｗ）又は（Ｘ）をコードする遺伝子が、前記＜５８＞又は＜５９＞で規定する遺伝子である、前記＜７２＞～＜１２３＞のいずれか１項記載の形質転換体、その作製方法、又は形質転換体の作製用キット。
＜１２５＞前記形質転換体において、Δ6-ELOの発現、又はΔ6-ELO遺伝子の発現が促進されている、前記＜７２＞～＜１２４＞のいずれか１項記載の形質転換体。
＜１２６＞Δ6-ELO遺伝子の発現が前記藻類の細胞内で促進され、Δ6-ELOの発現が促進されている、前記＜１２５＞項記載の形質転換体。
＜１２７＞Δ6-ELO遺伝子、又はΔ6-ELO遺伝子を含有する組換えベクターを含んでなる、前記＜１２５＞又は＜１２６＞項記載の形質転換体。
＜１２８＞Δ6-ELO遺伝子、又はΔ6-ELO遺伝子を含有する組換えベクターを、前記藻類に導入する、前記＜７２＞～＜１２４＞のいずれか１項記載の形質転換体の作製方法。
＜１２９＞Δ6-ELO遺伝子を含有する組換えベクターを含む、前記＜７２＞～＜１２４＞のいずれか１項記載の形質転換体の作製用キット。
＜１３０＞前記Δ6-ELOが前記タンパク質（Ｙ）又は（Ｚ）である、前記＜７２＞～＜１２９＞のいずれか１項記載の形質転換体、その作製方法、又は形質転換体の作製用キット。
＜１３１＞前記タンパク質（Ｚ）が、前記＜６４＞で規定するタンパク質である、前記＜１３１＞項記載の形質転換体、その作製方法、又は形質転換体の作製用キット。
＜１３２＞前記Δ6-ELO、好ましくは前記タンパク質（Ｙ）又は（Ｚ）をコードする遺伝子が、前記＜６５＞又は＜６６＞で規定する遺伝子である、前記＜７２＞～＜１３１＞のいずれか１項記載の形質転換体、その作製方法、又は形質転換体の作製用キット。
＜１３３＞前記ナンノクロロプシス属に属する藻類が、ナンノクロロプシス・オセアニカ、ナンノクロロプシス・オキュラータ、ナンノクロロプシス・ガディタナ、ナンノクロロプシス・サリナ、ナンノクロロプシス・リムネティカ、ナンノクロロプシス・グラニュラータ、ナンノクロロプシス・エスピー、好ましくはナンノクロロプシス・オセアニカ又はナンノクロロプシス・ガディタナ、より好ましくはナンノクロロプシス・オセアニカである、前記＜７２＞～＜１３２＞のいずれか１項記載の形質転換体、その作製方法、又は形質転換体の作製用キット。
＜１３４＞脂質を製造するための、前記＜７２＞～＜１３３＞のいずれか１項記載の形質転換体、その作製方法により作製された形質転換体、又は形質転換体の作製用キットの使用。
＜１３５＞前記脂質が、炭素原子数２２以上のＰＵＦＡ又はその脂肪酸エステル化合物、好ましくはＤＰＡ及びＤＨＡ又はその脂肪酸エステル化合物、より好ましくはＤＨＡ又はその脂肪酸エステル化合物を含む、前記＜１３４＞項記載の使用。
以下、本発明を実施例に基づきさらに詳細に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。ここで、本実施例で用いるプライマーの塩基配列を表１及び２に示す。
Figure 2023102179000001
Figure 2023102179000002
調製例１ ナンノクロロプシス・オセアニカ由来アシルキャリアープロテイン（ＡＣＰ）遺伝子発現プラスミドの作製、ナンノクロロプシスの形質転換、及び形質転換体による脂質の製造
（１）ゼオシン耐性遺伝子発現用プラスミドの構築
ゼオシン耐性遺伝子（配列番号４４）、及び文献（Randor Radakovits, et al., Nature Communications, DOI:10.1038/ncomms1688, 2012）記載のナンノクロロプシス・ガディタナCCMP526株由来チューブリンプロモーター配列（配列番号４９）を人工合成した。合成したＤＮＡ断片を鋳型として、表１に示すプライマー５７（配列番号５７）及びプライマー５８（配列番号５８）のプライマー対、並びにプライマー５９（配列番号５９）及びプライマー６０（配列番号６０）のプライマー対を用いてＰＣＲを行い、ゼオシン耐性遺伝子及びチューブリンプロモーター配列をそれぞれ増幅した。また、ナンノクロロプシス・オセアニカ NIES2145株のゲノムを鋳型として、表１に示すプライマー６１（配列番号６１）及びプライマー６２（配列番号６２）のプライマー対を用いてＰＣＲを行い、ヒートショックプロテインターミネーター配列（配列番号５０）を増幅した。さらに、プラスミドベクターpUC19（タカラバイオ社製）を鋳型として、表１に示すプライマー６３（配列番号６３）及びプライマー６４（配列番号６４）のプライマー対を用いたＰＣＲを行い、プラスミドベクターpUC19を増幅した。これら４つの増幅断片をそれぞれ制限酵素DpnI（東洋紡株式会社製）にて処理し、High Pure PCR Product Purification Kit（Roche Applied Science社製)を用いて精製した。その後、得られた４つの断片をIn-Fusion HD Cloning Kit（Clontech社製）を用いて融合し、ゼオシン耐性遺伝子発現用プラスミドを構築した。なお、本発現プラスミドは、チューブリンプロモーター配列、ゼオシン耐性遺伝子、ヒートショックプロテインターミネーター配列の順に連結したインサート配列（ゼオシン耐性遺伝子発現カセット）とpUC19ベクター配列からなる。
（２）ナンノクロロプシス・オセアニカ由来ACP1遺伝子の取得、及び葉緑体移行シグナル連結ACP1遺伝子発現用プラスミドの構築
ナンノクロロプシス・オセアニカNIES2145株の全ＲＮＡを抽出し、SuperScript（商標） III First-Strand Synthesis SuperMix for qRT-PCR（invitrogen社製）を用いて逆転写を行ってｃＤＮＡを得た。このｃＤＮＡを鋳型として、表１に示すプライマー６５（配列番号６５）及びプライマー６６（配列番号６６）のプライマー対を用いたＰＣＲを行い、配列番号３２の塩基配列からなる遺伝子断片（以降、NoACP1遺伝子とも記載）を取得した。
また、ナンノクロロプシス・オセアニカNIES2145株のゲノムを鋳型として、表１に示すプライマー６７（配列番号６７）及びプライマー６８（配列番号６８）のプライマー対、並びにプライマー６９（配列番号６９）及びプライマー７０（配列番号７０）のプライマー対をそれぞれ用いたＰＣＲを行い、ＬＤＳＰプロモーター配列（配列番号５１）及びＶＣＰ１ターミネーター配列（配列番号５２）を取得した。さらに、前記ゼオシン耐性遺伝子発現プラスミドを鋳型として、表１に示すプライマー７１（配列番号７１）及びプライマー６４（配列番号６４）のプライマー対を用いたＰＣＲを行い、ゼオシン耐性遺伝子発現カセット及びpUC19配列からなる断片を増幅した。NoACP1遺伝子断片を、ＬＤＳＰプロモーター断片、ＶＣＰ１ターミネーター断片、ゼオシン耐性遺伝子発現カセット及びpUC19配列からなる断片と混和し、これら４つの増幅断片を、調製例１（１）と同様の方法にて融合してNoACP1遺伝子発現用プラスミドを構築した。なお、本発現プラスミドはＬＤＳＰプロモーター配列、NoACP1遺伝子、ＶＣＰ１ターミネーター配列、チューブリンプロモーター配列、ゼオシン耐性遺伝子、ヒートショックプロテインターミネーター配列の順で連結したインサート配列とpUC19ベクター配列からなる。
ナンノクロロプシス・オセアニカNIES2145株由来のｃＤＮＡを鋳型として、表１に示すプライマー７２（配列番号７２）及びプライマー７３（配列番号７３）に示すプライマー対を用いてＰＣＲを行い、配列番号３３の塩基配列からなるＶＣＰ１葉緑体移行シグナル断片を取得した。また、上記で作製したNoACP1遺伝子発現用プラスミドを鋳型として、表１に示すプライマー７４（配列番号７４）及びプライマー６８（配列番号６８）のプライマー対を用いてＰＣＲを行い、得られた増幅断片とＶＣＰ１葉緑体移行シグナル断片を上記と同様の方法にて連結し、葉緑体移行シグナル連結NoACP1遺伝子発現用プラスミド（ゼオシン耐性）を構築した。なお、本発現プラスミドはＬＤＳＰプロモーター配列、ＶＣＰ１葉緑体移行シグナル配列、ミトコンドリア移行シグナルを削除したNoACP1遺伝子（配列番号３２の６７～４４１位からなる配列）、ＶＣＰ１ターミネーター配列、チューブリンプロモーター配列、ゼオシン耐性遺伝子、ヒートショックプロテインターミネーター配列の順で連結したインサート配列とpUC19ベクター配列からなる。また、ＶＣＰ１葉緑体移行シグナルがナンノクロロプシス内でタンパク質を葉緑体に局在化させられることは、D. Moog, et al., Protist. 2015 Feb;166(1):161-71に示されている。
（３）ナンノクロロプシス・オセアニカ由来の各種遺伝子の取得、及び各種遺伝子発現用プラスミドの構築
ナンノクロロプシス・オセアニカNIES2145株由来のｃＤＮＡを鋳型として、表１に示すプライマー７５（配列番号７５）及びプライマー７６（配列番号７６）のプライマー対、プライマー７７（配列番号７７）及びプライマー７８（配列番号７８）のプライマー対、プライマー７９（配列番号７９）及びプライマー８０（配列番号８０）のプライマー対、プライマー８１（配列番号８１）及びプライマー８２（配列番号８２）のプライマー対、並びにプライマー８３（配列番号８３）及びプライマー８４（配列番号８４）のプライマー対、をそれぞれ用いたＰＣＲ反応により、配列番号３５の塩基配列からなる遺伝子（以降、「Δ12-DES遺伝子」ともいう）断片、配列番号３７の塩基配列からなる遺伝子（以降、「Δ6-DES遺伝子」ともいう）断片、配列番号３９の塩基配列からなる遺伝子（以降、「ω3-DES遺伝子」ともいう）断片、配列番号４１の塩基配列からなる遺伝子（以降、「Δ9-DES遺伝子」ともいう）断片、配列番号４３の塩基配列からなる遺伝子（以降、「Δ6-ELO遺伝子」ともいう）断片、をそれぞれ取得した。葉緑体移行シグナル連結ACP1遺伝子発現用プラスミドの構築方法と同様の方法で、各デサチュラーゼ遺伝子若しくはエロンガーゼ遺伝子断片と、ＬＤＳＰプロモーター断片、ＶＣＰ１ターミネーター断片、ゼオシン耐性遺伝子発現カセット並びにpUC19配列からなる断片を融合し、Δ12-DES遺伝子発現用プラスミド、Δ6-DES遺伝子発現用プラスミド、ω3-DES遺伝子発現用プラスミド、Δ9-DES遺伝子発現用プラスミド、Δ6-ELO遺伝子発現用プラスミド、をそれぞれ構築した。なお、本発現プラスミドはＬＤＳＰプロモーター配列、各デサチュラーゼ遺伝子若しくはエロンガーゼ遺伝子、ＶＣＰ１ターミネーター配列、チューブリンプロモーター配列、ゼオシン耐性遺伝子、並びにヒートショックプロテインターミネーター配列の順で連結したインサート配列とpUC19ベクター配列からなる。
ナンノクロロプシス・オセアニカNIES2145株のゲノムを鋳型として、表１に示すプライマー９１（配列番号９１）及びプライマー９２（配列番号９２）のプライマー対、並びにプライマー９３（配列番号９３）及びプライマー９４（配列番号９４）のプライマー対を用いたＰＣＲを行い、グルタミン合成酵素（ＧＳ）プロモーター配列（配列番号５３）及びＬＤＳＰターミネーター配列（配列番号５４）を取得した。
また、上記で構築したΔ12-DES遺伝子発現用プラスミド又はω3-DES遺伝子発現用プラスミドを鋳型として、表１に示すプライマー９５（配列番号９５）及びプライマー６４（配列番号６４）のプライマー対を用いたＰＣＲを行い、Δ12-DES遺伝子発現カセット若しくはω3-DES遺伝子発現カセット、ゼオシン耐性遺伝子発現カセット並びにpUC19ベクターを含む断片をそれぞれ取得した。さらに、上記で構築したΔ6-DES遺伝子発現用プラスミド又はΔ9-DES遺伝子発現用プラスミドを鋳型として、表１に示すプライマー８５（配列番号８５）及びプライマー８６（配列番号８６）のプライマー対を用いたＰＣＲ、プライマー８７（配列番号８７）及びプライマー８８（配列番号８８）のプライマー対を用いたＰＣＲをそれぞれ行い、Δ6-DES遺伝子断片及びΔ9-DES遺伝子断片を取得した。得られた断片を、ゼオシン耐性遺伝子発現用プラスミドの構築方法と同様の方法にて適宜融合し、Δ6-DES遺伝子＋Δ12-DES遺伝子発現用プラスミド、及びΔ9-DES遺伝子＋ω3-DES遺伝子発現用プラスミドを構築した。なお、本発現プラスミドはＧＳプロモーター配列、Δ6-DES遺伝子若しくはΔ9-DES遺伝子、ＬＤＳＰターミネーター配列、ＬＤＳＰプロモーター配列、Δ12-DES遺伝子若しくはω3-DES遺伝子、ＶＣＰ１ターミネーター配列、チューブリンプロモーター配列、ゼオシン耐性遺伝子、並びにヒートショックプロテインターミネーター配列の順で連結したインサート配列とpUC19ベクター配列からなる。
ナンノクロロプシス・オセアニカNIES2145株のゲノムを鋳型として、表１に示すプライマー９６（配列番号９６）及びプライマー９７（配列番号９７）のプライマー対、プライマー９８（配列番号９８）及びプライマー９９（配列番号９９）のプライマー対を用いたＰＣＲを行い、アシルキャリアープロテイン２（ＡＣＰ２）プロモーター配列（配列番号５５）及びΔ9-DESターミネーター配列（配列番号５６）を取得した。また、上記で構築したΔ9-DES遺伝子＋ω3-DES遺伝子発現用プラスミドを鋳型として、プライマー１００（配列番号１００）及びプライマー６４（配列番号６４）のプライマー対を用いたＰＣＲを行い、Δ9-DES遺伝子＋ω3-DES遺伝子発現カセット、ゼオシン耐性遺伝子発現カセット及びpUC19ベクターを含む断片を取得した。さらに、上記で構築したΔ6-ELO遺伝子発現用プラスミドを鋳型として、表１に示すプライマー８９（配列番号８９）及びプライマー９０（配列番号９０）のプライマー対を用いたＰＣＲを行い、Δ6-ELO遺伝子断片を取得した。得られた断片を、ゼオシン耐性遺伝子発現用プラスミドの構築方法と同様の方法にて融合し、Δ6-ELO遺伝子＋Δ9-DES遺伝子＋ω3-DES遺伝子発現用プラスミドを構築した。なお、本発現プラスミドはＡＣＰ２プロモーター配列、Δ6-ELO遺伝子、Δ9-DESターミネーター配列、ＧＳプロモーター配列、Δ9-DES遺伝子、ＬＤＳＰターミネーター配列、ＬＤＳＰプロモーター配列、ω3-DES遺伝子、ＶＣＰ１ターミネーター配列、チューブリンプロモーター配列、ゼオシン耐性遺伝子、ヒートショックプロテインターミネーター配列の順で連結したインサート配列とpUC19ベクター配列からなる。
（４）Δ6-DES遺伝子＋Δ12-DES遺伝子発現用プラスミド（パロモマイシン耐性）及びΔ6-ELO遺伝子＋Δ9-DES遺伝子＋ω3-DES遺伝子発現用プラスミド（ハイグロマイシン耐性）の構築
パロモマイシン耐性遺伝子（配列番号４５）及びハイグロマイシン耐性遺伝子（配列番号４６）を人工合成した。これらを鋳型として、表１に示すプライマー１０５（配列番号１０５）及びプライマー１０６（配列番号１０６）のプライマー対、プライマー１０７（配列番号１０７）及びプライマー１０８（配列番号１０８）のプライマー対を用いたＰＣＲをそれぞれ行い、パロモマイシン耐性遺伝子断片及びハイグロマイシン耐性遺伝子断片を取得した。また、前記のΔ6-DES遺伝子＋Δ12-DES遺伝子発現用プラスミド、Δ6-ELO遺伝子＋Δ9-DES遺伝子＋ω3-DES遺伝子発現用プラスミドをそれぞれ鋳型として、表１に示すプライマー６０（配列番号６０）及びプライマー６１（配列番号６１）のプライマー対を用いたＰＣＲを行った。得られた断片を、ゼオシン耐性遺伝子発現用プラスミドの構築方法と同様の方法にて適宜融合し、Δ6-DES遺伝子＋Δ12-DES遺伝子発現用プラスミド（パロモマイシン耐性）及びΔ6-ELO遺伝子＋Δ9-DES遺伝子＋ω3-DES遺伝子発現用プラスミド（ハイグロマイシン耐性）を構築した。
（５）各種遺伝子発現カセットのナンノクロロプシスへの導入、形質転換体の培養、培養液中の脂質の抽出、及び構成脂肪酸の分析
前記の葉緑体移行シグナル連結NoACP1遺伝子発現用プラスミド（ゼオシン耐性）、Δ6-DES遺伝子＋Δ12-DES遺伝子発現用プラスミド（パロモマイシン耐性）、及びΔ6-ELO遺伝子＋Δ9-DES遺伝子＋ω3-DES遺伝子発現用プラスミド（ハイグロマイシン耐性）を鋳型として、表１に示すプライマー１０４（配列番号１０４）、並びにプライマー１０１（配列番号１０１）、プライマー１０２（配列番号１０２）若しくはプライマー１０３（配列番号１０３）のプライマー対を用いたＰＣＲを行い、葉緑体移行シグナル連結NoACP1遺伝子発現用カセット（ゼオシン耐性）、Δ6-DES遺伝子＋Δ12-DES遺伝子発現用カセット（パロモマイシン耐性）及びΔ6-ELO遺伝子＋Δ9-DES遺伝子＋ω3-DES遺伝子発現用カセット（ハイグロマイシン耐性）をそれぞれ取得した。なお、本発現用カセットは、鋳型とした発現用プラスミドのpUC19ベクター配列以外の配列からなる。増幅した断片を、High Pure PCR Product Purification Kit（Roche Applied Science社製)を用いて精製した。なお、精製の際の溶出には、キットに含まれる溶出バッファーではなく、滅菌水を用いた。
約１×１０９細胞のナンノクロロプシス・オセアニカNIES2145株を、３８４ｍＭのソルビトール溶液で洗浄して塩を除去し、形質転換の宿主細胞として用いた。上記で増幅した葉緑体移行シグナル連結NoACP1遺伝子発現用カセット（ゼオシン耐性）を約５００ｎｇを宿主細胞に混和し、５０μＦ、５００Ω、２，２００ｖ／２ｍｍの条件でエレクトロポレーションを行った。ｆ／２液体培地（ＮａＮＯ３ ７５ｍｇ、ＮａＨ２ＰＯ４・２Ｈ２Ｏ ６ｍｇ、ビタミンＢ１２ ０．５μｇ、ビオチン ０．５μｇ、チアミン １００μｇ、Ｎａ２ＳｉＯ３・９Ｈ２Ｏ １０ｍｇ、Ｎａ２ＥＤＴＡ・２Ｈ２Ｏ ４．４ｍｇ、ＦｅＣｌ３・６Ｈ２Ｏ ３．１６ｍｇ、ＣｏＳＯ４・７Ｈ２Ｏ １２μｇ、ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ２１μｇ、ＭｎＣｌ２・４Ｈ２Ｏ １８０μｇ、ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ ７μｇ、Ｎａ２ＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏ ７μｇ／人工海水１Ｌ）にて２４時間回復培養を行った後に、２μｇ／ｍＬのゼオシン含有ｆ／２寒天培地に塗布し、２５℃、０．３％ＣＯ２雰囲気下、１２ｈ／１２ｈ明暗条件にて２～３週間培養した。得られたコロニーの中から、葉緑体移行シグナル連結ACP1遺伝子発現用カセットを含む株を選抜した。
続いて、選抜した葉緑体移行シグナル連結ACP1遺伝子発現用カセット導入株を親株として、上記と同様の方法でΔ6-DES遺伝子＋Δ12-DES遺伝子発現用カセット（パロモマイシン耐性）を導入した。なお、形質転換体の選抜は2μg/mLのゼオシン及び100μg/mLのパロモマイシン含有ｆ／２寒天培地にて行った。得られたコロニーの中から、葉緑体移行シグナル連結ACP1遺伝子発現用カセット及びΔ6-DES遺伝子＋Δ12-DES遺伝子発現用カセットを含む株を選抜した。
さらに、選抜した葉緑体移行シグナル連結ACP1遺伝子発現用カセット及びΔ6-DES遺伝子＋Δ12-DES遺伝子発現用カセット導入株を親株として、上記と同様の方法でΔ6-ELO遺伝子＋Δ9-DES遺伝子＋ω3-DES遺伝子発現用カセット（ハイグロマイシン耐性）を導入した。なお、形質転換体の選抜は500μg/mLのハイグロマイシン含有ｆ／２寒天培地にて行った。得られたコロニーの中から、葉緑体移行シグナル連結ACP1遺伝子発現用カセット、Δ6-DES遺伝子＋Δ12-DES遺伝子発現用カセット、及びΔ6-ELO遺伝子＋Δ9-DES遺伝子＋ω3-DES遺伝子発現用カセットを含む株（以下、「EPA株」とも記載する）を選抜した。
ナンノクロロプシス・オセアニカNIES2145株（以下、「野生株」とも記載する）及びEPA株を、ｆ／２培地の窒素濃度を５倍、リン濃度を５倍に増強した培地（以下、N5P5培地）２０ｍＬに播種し、２５℃、０．３％ＣＯ２雰囲気下、１２ｈ／１２ｈ明暗条件にて５日間振盪培養し、前々培養液とした。96穴プレート及びInfinite M200 PRO (TECAN社)を用いて750nmにおける濁度（以降、「OD750」ともいう）を測定した。１８ｍＬのN5P5培地に対し、OD750が終濃度0.1になるように前々培養液を播種し、同条件にて５日間培養し、前培養液とした。同様にしてOD750が終濃度0.1になるように前培養液をN5P5培地１８ｍＬに播種し、同条件にて２０日間の本培養を行った。
（６）ナンノクロロプシス培養液中の脂質の抽出及び構成脂肪酸の分析
培養液０．２５ｍＬに、内部標準として１ｍｇ/ｍＬのGlyceryl triheptadecanoate（シグマアルドリッチ社製）クロロホルム溶液を５０μＬ添加後、０．５ｍＬのクロロホルム及び１ｍＬのメタノールを培養液に添加して激しく攪拌後１０分間放置した。その後さらに、０．５ｍＬのクロロホルム及び０．５ｍＬの１．５％ＫＣｌを添加して攪拌後、３，０００ｒｐｍにて５分間間遠心分離を行い、パスツールピペットにてクロロホルム層（下層）を回収した。得られたクロロホルム層に窒素ガスを吹き付けて乾固し、５０μＬのクロロホルム及び０．５ｍＬの１４％三フッ化ホウ素溶液（シグマアルドリッチ社製）を添加し、８０℃にて３０分間恒温した。その後、ヘキサン０．５ｍＬ、飽和食塩水１ｍＬを添加し激しく撹拌し、室温にて１０分間放置後、上層であるヘキサン層を回収して脂肪酸エステルを得た。
得られた脂肪酸エステルをガスクロマトグラフィー解析に供した。測定条件を以下に示す。

分析装置：7890B（Agilent technology社製）
キャピラリーカラム：DB-WAX（10m×100μm×0.10μm、J＆W Scientific社製）
移動相：ヘリウム
オーブン温度：100℃ 保持0.5分→100～250℃（20℃/min昇温）→250℃保持10分（ポストラン：1分）
注入口温度：300℃
注入方法：スプリット注入（スプリット比：25：1）
注入量：5μＬ
洗浄バイアル：メタノール
検出方法：ＦＩＤ
検出器温度：300℃
また、脂肪酸エステルの同定は、同サンプルを同条件でガスクロマトグラフ質量分析解析に供することにより行った。
ガスクロマトグラフィー解析により得られた波形データのピーク面積より、各脂肪酸のメチルエステル量を定量した。各ピーク面積を、内部標準であるGlyceryl triheptadecanoate由来のC17脂肪酸メチルエステルのピーク面積と比較することで試料間の補正を行い、培養液１リットルあたりの各脂肪酸量を算出した。さらに、各脂肪酸量の総和を総脂肪酸量とし、総脂肪酸量に占める各脂肪酸量の割合を算出した。結果を表３に示す。それぞれの株について N=3で培養・脂質解析を行っており、その平均値と標準偏差を示した。
なお、以下の表において、「脂肪酸組成（％ＴＦＡ）」は総脂肪酸の重量に対する各脂肪酸の重量を示す。また、「Ｃｘ：ｙ」は、炭素原子数がｘで二重結合数がｙの脂肪酸を表す。
Figure 2023102179000003
表３から明らかなように、EPA株は野生株と比較して総脂肪酸に占めるEPA（C20:5(n-3)）の割合が大幅に上昇しており、EPAの生産性が向上していることが明らかとなった。
調製例２ Δ5-ELO遺伝子発現プラスミドの作製、ナンノクロロプシスの形質転換、及び形質転換体による脂質の製造
（１）pavELO遺伝子発現用プラスミドの構築
パブロバ・エスピー（Pavlova sp.）由来のΔ5-ELO（アミノ酸配列：配列番号３）をコードするΔ5-ELO遺伝子（塩基配列：配列番号１）について、コドン使用頻度をナンノクロロプシスに最適化した配列（配列番号２、以降「pavELO遺伝子」とも記載する。なお、配列番号２の塩基配列は、配列番号３のアミノ酸配列をコードする。）を人工合成した。合成したＤＮＡ断片を鋳型として、表２に示すプライマー１０９（配列番号１０９）及びプライマー１１０（配列番号１１０）のプライマー対を用いたＰＣＲを行い、pavELO遺伝子断片を増幅した。また、前記NoACP1遺伝子発現用プラスミドを鋳型として、表２に示すプライマー１４５（配列番号１４５）及びプライマー１４６（配列番号１４６）のプライマー対を用いたＰＣＲを行い、ＬＤＳＰプロモーター配列、ゼオシン耐性遺伝子発現カセット（チューブリンプロモーター配列、ゼオシン耐性遺伝子、ヒートショックプロテインターミネーター配列）、ＶＣＰ１ターミネーター配列及びpUC19配列からなる断片を増幅した。得られた断片をpavELO遺伝子断片と混和し、ゼオシン耐性遺伝子発現用プラスミドの構築方法と同様の方法にて融合してpavELO遺伝子発現用プラスミド（ゼオシン耐性）を構築した。なお、本発現プラスミドはＬＤＳＰプロモーター配列、pavELO遺伝子、ＶＣＰ１ターミネーター配列、チューブリンプロモーター配列、ゼオシン耐性遺伝子、ヒートショックプロテインターミネーター配列の順で連結したインサート配列とpUC19ベクター配列からなる。
（２）pavELO遺伝子発現用プラスミド（ビアラフォス耐性）の構築
前記のpavELO遺伝子発現用プラスミド（ゼオシン耐性）を鋳型として、表２に示すプライマー１４９（配列番号１４９）及びプライマー１５０（配列番号１５０）のプライマー対を用いたＰＣＲを行い、チューブリンプロモーター配列、pavELO遺伝子発現カセット（ＬＤＳＰプロモーター配列、pavELO遺伝子、ＶＣＰ１ターミネーター配列）、ヒートショックプロテインターミネーター配列及びpUC19配列からなる断片を増幅した。また、ビアラフォス耐性遺伝子（配列番号４７）を人工合成し、合成したＤＮＡ断片を鋳型として表２に示すプライマー１４３（配列番号１４３）及びプライマー１４４（配列番号１４４）のプライマー対を用いたＰＣＲを行い、ビアラフォス耐性遺伝子断片を増幅した。得られたビアラフォス耐性遺伝子断片を、前記にて作製したチューブリンプロモーター配列、pavELO遺伝子発現カセット（ＬＤＳＰプロモーター配列、pavELO遺伝子、ＶＣＰ１ターミネーター配列）、ヒートショックプロテインターミネーター配列及びpUC19配列からなる断片と連結し、pavELO遺伝子発現用プラスミド（ビアラフォス耐性）を構築した。なお、本発現プラスミドはＬＤＳＰプロモーター配列、pavELO遺伝子、ＶＣＰ１ターミネーター配列、チューブリンプロモーター配列、ビアラフォス耐性遺伝子、ヒートショックプロテインターミネーター配列の順で連結したインサート配列とpUC19ベクター配列からなる。
（３）pavELO遺伝子以外のΔ5-ELO遺伝子発現用プラスミド（ビアラフォス耐性）の構築
ピラミモナス・コルダタ由来のΔ5-ELO（アミノ酸配列：配列番号６）をコードするΔ5-ELO遺伝子（塩基配列：配列番号４）についてコドン使用頻度をナンノクロロプシスに最適化した配列（配列番号５、以降「PcELO遺伝子」とも記載する。なお、配列番号５の塩基配列は、配列番号６のアミノ酸配列をコードする。）、オストレオコッカス・タウリ由来のΔ5-ELO（アミノ酸配列：配列番号９）をコードするΔ5-ELO（遺伝子（塩基配列：配列番号７）についてコドン使用頻度をナンノクロロプシスに最適化した配列（配列番号８、以降「OtELO2遺伝子」とも記載する。なお、配列番号８の塩基配列は、配列番号９のアミノ酸配列をコードする。）、タラシオシーラ・シュードナナ由来のΔ5-ELO（アミノ酸配列：配列番号１２）をコードするΔ5-ELO遺伝子（塩基配列：配列番号１０）についてコドン使用頻度をナンノクロロプシスに最適化した配列（配列番号１１、以降「TpELO2遺伝子」とも記載する。なお、配列番号１１の塩基配列は、配列番号１２のアミノ酸配列をコードする。）、フィスコミトレラ・パテンス由来のΔ5-ELO（アミノ酸配列：配列番号１５）をコードするΔ5-ELO遺伝子（塩基配列：配列番号１３）についてコドン使用頻度をナンノクロロプシスに最適化した配列（配列番号１４、以降「PpELO1遺伝子」とも記載する。なお、配列番号１４の塩基配列は、配列番号１５のアミノ酸配列をコードする。）、マーチャンティア・ポリモーファ由来のΔ5-ELO（アミノ酸配列：配列番号１８）をコードするΔ5-ELO遺伝子（塩基配列：配列番号１６）についてコドン使用頻度をナンノクロロプシスに最適化した配列（配列番号１７、以降「MpELO2遺伝子」とも記載する。なお、配列番号１７の塩基配列は、配列番号１８のアミノ酸配列をコードする。）、スラウストキトリウム・エスピー（Thraustochytrium sp.）FJN-10株由来のΔ5-ELO（アミノ酸配列：配列番号２１）をコードするΔ5-ELO遺伝子（塩基配列：配列番号１９）についてコドン使用頻度をナンノクロロプシスに最適化した配列（配列番号２０、以降「FJNELO遺伝子」とも記載する。なお、配列番号２０の塩基配列は、配列番号２１のアミノ酸配列をコードする。）を、それぞれ人工合成した。合成したＤＮＡ断片を鋳型として、表２に示すプライマー１１３（配列番号１１３）及びプライマー１１４（配列番号１１４）のプライマー対、プライマー１１７（配列番号１１７）及びプライマー１１８（配列番号１１８）のプライマー対、プライマー１２１（配列番号１２１）及びプライマー１２２（配列番号１２２）のプライマー対、プライマー１２５（配列番号１２５）及びプライマー１２６（配列番号１２６）のプライマー対、プライマー１２９（配列番号１２９）及びプライマー１３０（配列番号１３０）のプライマー対、並びにプライマー１３３（配列番号１３３）及びプライマー１３４（配列番号１３４）のプライマー対を用いたＰＣＲを行い、各種Δ5-ELO遺伝子断片をそれぞれ増幅した。
また、前記FJNELO遺伝子の合成ＤＮＡ断片を鋳型として、表２に示すプライマー１３３（配列番号１３３）及びプライマー１３８（配列番号１３８）のプライマー対、プライマー１３４（配列番号１３４）及びプライマー１３７（配列番号１３７）のプライマー対を用いたＰＣＲを行い、スラウストキトリウム・エスピー ATCC26185株由来のΔ5-ELO（アミノ酸配列：配列番号２４）をコードするΔ5-ELO遺伝子（塩基配列：配列番号２２）についてコドン使用頻度をナンノクロロプシスに最適化した配列（配列番号２３、以降「ATCCELO遺伝子」とも記載する。なお、配列番号２３の塩基配列は、配列番号２４のアミノ酸配列をコードする。）の５’側及び３’側断片を増幅した。得られた各断片を、ゼオシン耐性遺伝子発現用プラスミドの構築方法と同様の方法にて融合し、ATCCELO遺伝子断片を得た。
また、前記pavELO遺伝子発現用プラスミド（ビアラフォス耐性）を鋳型として、表２に示すプライマー１４５（配列番号１４５）及びプライマー１４６（配列番号１４６）のプライマー対を用いたＰＣＲを行い、ＬＤＳＰプロモーター配列、ビアラフォス耐性遺伝子発現カセット（チューブリンプロモーター配列、ビアラフォス耐性遺伝子、ヒートショックプロテインターミネーター配列）、ＶＣＰ１ターミネーター配列及びpUC19配列からなる断片を増幅した。得られた断片と増幅した各種Δ5-ELO遺伝子断片とを、ゼオシン耐性遺伝子発現用プラスミドの構築方法と同様の方法にて適宜融合し、各種Δ5-ELO遺伝子発現用プラスミド（ビアラフォス耐性）をそれぞれ構築した。なお、本発現プラスミドはＬＤＳＰプロモーター配列、各種Δ5-ELO遺伝子、ＶＣＰ１ターミネーター配列、チューブリンプロモーター配列、ビアラフォス耐性遺伝子、ヒートショックプロテインターミネーター配列の順で連結したインサート配列とpUC19ベクター配列からなる。
（４）各種Δ5-ELO遺伝子発現カセットのEPA株への導入、形質転換体の培養、培養液中の脂質の抽出、及び構成脂肪酸の分析
前記の各種Δ5-ELO遺伝子発現用プラスミド（ビアラフォス耐性）を鋳型として、表２に示すプライマー１５１（配列番号１５１）及びプライマー１５３（配列番号１５３）のプライマー対を用いたＰＣＲを行い、各種Δ5-ELO遺伝子発現用カセット（ビアラフォス耐性）をそれぞれ取得した。なお、本発現用カセットは、ＬＤＳＰプロモーター配列、各種Δ5-ELO遺伝子、ＶＣＰ１ターミネーター配列、チューブリンプロモーター配列、ビアラフォス耐性遺伝子、ヒートショックプロテインターミネーター配列からなる。増幅した断片を用いて、前述の方法と同様の方法によりEPA株の形質転換を行った。なお、形質転換体の選抜は2μg/mLのゼオシン及び267μg/mLのビアラフォス含有ｆ／２寒天培地にて行った。得られたコロニーの中から、各種Δ5-ELO遺伝子発現用カセットを含むものをそれぞれ選抜した。得られた形質転換体を、12穴プレート（ＩＷＡＫＩ社製）に分注した３．３ｍＬのN5P5培地に播種し、２５℃、０．３％ＣＯ２雰囲気下、１２ｈ／１２ｈ明暗条件にて２１日間振盪培養した。
（５）ナンノクロロプシス培養液中の脂質の抽出及び構成脂肪酸の分析
前述の方法と同様の方法により、ナンノクロロプシスの培養液０．２５ｍＬから脂質の抽出及び脂肪酸エステルへの変換を行った。得られた脂肪酸エステルを前述の方法と同様の条件でガスクロマトグラフィー解析に供した。
ガスクロマトグラフィー解析により得られた波形データより、各脂肪酸メチルエステルのピーク面積の総和に対する、各脂肪酸メチルエステルのピーク面積の割合を算出した。結果を表４に示す。各形質転換体について独立した４～６ライン（親株であるEPA株はN=2）の培養・脂質解析を行っており、その平均値と標準偏差を示した。
なお、下記表４において、例えば「pavELO株」とあるのは、EPA株にpavELO遺伝子が導入された形質転換体を意味する。他の記載についても同様である。
Figure 2023102179000004
表４より、EPA株にΔ5-ELO遺伝子を導入した各形質転換体では、C22:5 (n-3)（以降「DPA」とも記載する）の生産性が向上することが明らかになった。特に、Δ5-ELO遺伝子としてPcELO遺伝子、OtELO2遺伝子、TpELO2遺伝子、PpELO1遺伝子、又はMpELO2遺伝子を導入した形質転換体において、総脂肪酸量に占めるDPA量の割合が高いことが明らかになった。
一方で、EPA株にΔ5-ELO遺伝子を導入した形質転換体であっても、C22:6 (n-3)は検出されなかった。
実施例１ Δ5-ELO遺伝子及びPlDES1遺伝子の共発現プラスミドの作製、ナンノクロロプシスの形質転換、並びに形質転換体による脂質の製造
（１）pavELO遺伝子＋PlDES1遺伝子発現用プラスミドの構築
パブロバ・ルテリ由来Δ4-DES（アミノ酸配列：配列番号２７）をコードするΔ4-DES遺伝子（塩基配列：配列番号２５）について、コドン使用頻度をナンノクロロプシスに最適化した配列（配列番号２６、以降「PlDES1遺伝子」とも記載する。なお、配列番号２６の塩基配列は、配列番号２７のアミノ酸配列をコードする。）を人工合成した。合成したＤＮＡ断片を鋳型として、表２に示すプライマー１３９（配列番号１３９）及びプライマー１４０（配列番号１４０）のプライマー対を用いたＰＣＲを行い、PlDES1遺伝子断片を増幅した。また、調製例２で作製したpavELO遺伝子発現用プラスミドを鋳型として、表２に示すプライマー１１１（配列番号１１１）及びプライマー１１２（配列番号１１２）のプライマー対を用いたＰＣＲを行い、pavELO遺伝子断片を増幅した。さらに、調製例１で作製したΔ6-DES遺伝子＋Δ12-DES遺伝子発現用プラスミドを鋳型として、表２に示すプライマー１４５（配列番号１４５）及びプライマー１４８（配列番号１４８）のプライマー対、並びにプライマー１４６（配列番号１４６）及びプライマー１４７（配列番号１４７）のプライマー対を用いたＰＣＲを行い、ＧＳプロモーター配列、ゼオシン耐性遺伝子発現カセット（チューブリンプロモーター配列、ゼオシン耐性遺伝子、ヒートショックプロテインターミネーター配列）、ＶＣＰ１ターミネーター配列及びpUC19配列からなる断片、並びにＬＤＳＰターミネーター配列及びＬＤＳＰプロモーター配列からなる断片をそれぞれ増幅した。得られた２種類の断片と、前記にて作製したPlDES1遺伝子断片及びpavELO遺伝子断片を調製例１と同様の方法にて融合し、pavELO遺伝子＋PlDES1遺伝子発現用プラスミド（ゼオシン耐性）を構築した。なお、本発現プラスミドはＧＳプロモーター配列、pavELO遺伝子、ＬＤＳＰターミネーター配列、ＬＤＳＰプロモーター配列、PlDES1遺伝子、ＶＣＰ１ターミネーター配列、チューブリンプロモーター配列、ゼオシン耐性遺伝子、ヒートショックプロテインターミネーター配列の順で連結したインサート配列とpUC19ベクター配列からなる。
（２）pavELO遺伝子＋PlDES1遺伝子発現用プラスミド（ビアラフォス耐性）の構築
前記のpavELO遺伝子＋PlDES1遺伝子発現用プラスミド（ゼオシン耐性）を鋳型として、表２に示すプライマー１４９（配列番号１４９）及びプライマー１５０（配列番号１５０）のプライマー対を用いたＰＣＲを行い、チューブリンプロモーター配列、PlDES1遺伝子発現カセット（ＬＤＳＰプロモーター配列、PlDES1遺伝子、ＶＣＰ１ターミネーター配列）、pavELO遺伝子発現カセット（ＧＳプロモーター配列、pavELO遺伝子、ＬＤＳＰターミネーター配列）、ヒートショックプロテインターミネーター配列及びpUC19配列からなる断片を増幅した。得られた断片と、調製例２で作製したビアラフォス耐性遺伝子断片を調製例１と同様の方法にて融合し、pavELO遺伝子＋PlDES1遺伝子発現用プラスミド（ビアラフォス耐性）を構築した。なお、本発現プラスミドはＧＳプロモーター配列、pavELO遺伝子、ＬＤＳＰターミネーター配列、ＬＤＳＰプロモーター配列、PlDES1遺伝子、ＶＣＰ１ターミネーター配列、チューブリンプロモーター配列、ビアラフォス耐性遺伝子、ヒートショックプロテインターミネーター配列の順で連結したインサート配列とpUC19ベクター配列からなる。
（３）pavELO遺伝子以外のΔ5-ELO遺伝子＋PlDES1遺伝子発現用プラスミド（ビアラフォス耐性）の構築
調製例２で作製したpavELO遺伝子以外のΔ5-ELO遺伝子発現用プラスミドを鋳型として、表２に示すプライマー１１５（配列番号１１５）及びプライマー１１６（配列番号１１６）のプライマー対、プライマー１１９（配列番号１１９）及びプライマー１２０（配列番号１２０）のプライマー対、プライマー１２３（配列番号１２３）及びプライマー１２４（配列番号１２４）のプライマー対、プライマー１２７（配列番号１２７）及びプライマー１２８（配列番号１２８）のプライマー対、プライマー１３１（配列番号１３１）及びプライマー１３２（配列番号１３２）のプライマー対、並びにプライマー１３５（配列番号１３５）及びプライマー１３６（配列番号１３６）のプライマー対を用いたＰＣＲを行い、各種Δ5-ELO遺伝子断片をそれぞれ増幅した。
また、前記pavELO遺伝子＋PlDES1遺伝子発現用プラスミド（ビアラフォス耐性）を鋳型として、表２に示すプライマー１４５（配列番号１４５）及びプライマー１４８（配列番号１４８）のプライマー対を用いたＰＣＲを行い、ＧＳプロモーター配列、ビアラフォス耐性遺伝子発現カセット（チューブリンプロモーター配列、ビアラフォス耐性遺伝子、ヒートショックプロテインターミネーター配列）、ＶＣＰ１ターミネーター配列及びpUC19配列からなる断片を増幅した。得られた断片を、前記にて作製した各種Δ5-ELO遺伝子断片、前記PlDES1遺伝子断片、並びにＬＤＳＰターミネーター配列及びＬＤＳＰプロモーター配列からなる断片を、調製例１と同様の方法にて融合し、各種Δ5-ELO遺伝子＋PlDES1遺伝子発現用プラスミド（ビアラフォス耐性）を構築した。なお、本発現プラスミドはＧＳプロモーター配列、各種Δ5-ELO遺伝子、ＬＤＳＰターミネーター配列、ＬＤＳＰプロモーター配列、PlDES1遺伝子、ＶＣＰ１ターミネーター配列、チューブリンプロモーター配列、ビアラフォス耐性遺伝子、ヒートショックプロテインターミネーター配列の順で連結したインサート配列とpUC19ベクター配列からなる。
（４）各種Δ5-ELO遺伝子及びPlDES1遺伝子発現カセットのEPA株への導入、形質転換体の培養、培養液中の脂質の抽出、及び構成脂肪酸の分析
前記の各種Δ5-ELO遺伝子＋PlDES1遺伝子発現用プラスミド（ビアラフォス耐性）を鋳型として、表２に示すプライマー１５２（配列番号１５２）及びプライマー１５３（配列番号１５３）のプライマー対を用いたＰＣＲを行い、各種Δ5-ELO遺伝子＋PlDES1遺伝子発現用カセット（ビアラフォス耐性）をそれぞれ取得した。なお、本発現用カセットは、ＧＳプロモーター配列、各種Δ5-ELO遺伝子、ＬＤＳＰターミネーター配列、ＬＤＳＰプロモーター配列、PlDES1遺伝子、ＶＣＰ１ターミネーター配列、チューブリンプロモーター配列、ビアラフォス耐性遺伝子、ヒートショックプロテインターミネーター配列からなる。増幅した断片を用いて、調製例１と同様の方法によりEPA株の形質転換を行った。なお、形質転換体の選抜は2μg/mLのゼオシン及び267μg/mLのビアラフォス含有ｆ／２寒天培地にて行った。得られたコロニーの中から、各種Δ5-ELO遺伝子＋PlDES1遺伝子発現用カセットを含むものを選抜した。得られたコロニーを、24穴プレート（ＩＷＡＫＩ社製）に分注した１．５～２ｍＬのN5P5培地（267μg/mLのビアラフォス含有）に播種し、２５℃、０．３％ＣＯ２雰囲気下、１２ｈ／１２ｈ明暗条件にて２０日間振盪培養した。
（５）ナンノクロロプシス培養液中の脂質の抽出及び構成脂肪酸の分析
調製例１と同様の方法により、ナンノクロロプシスの培養液０．２５ｍＬから脂質の抽出及び脂肪酸エステルへの変換を行った。得られた脂肪酸エステルを調製例１と同様の条件でガスクロマトグラフィー解析に供した。
ガスクロマトグラフィー解析により得られた波形データより、各脂肪酸メチルエステルのピーク面積の総和に対する、各脂肪酸メチルエステルのピーク面積の割合を算出した。結果を表５に示す。各形質転換体について独立した８～１２ライン（親株であるEPA株はN=2）の培養・脂質解析を行っており、その平均値と標準偏差を示した。
なお、下記表５において、例えば「pavELO+PIDES1株」とあるのは、EPA株にpavELO遺伝子及びPIDES1遺伝子が導入された形質転換体を意味する。他の記載についても同様である。
Figure 2023102179000005
表５より、EPA株ではC22:6 (n-3)（以降「DHA」とも記載する）が検出されないのに対し、EPA株にΔ5-ELO遺伝子及びPlDES1遺伝子を導入した各形質転換体では、DHAが生産されることが分かった。特に、PlDES1遺伝子に加えて、Δ5-ELO遺伝子としてPcELO遺伝子、OtELO2遺伝子、又はTpELO2遺伝子を導入した形質転換体において、総脂肪酸量に占めるDHA量の割合が顕著に高く、最大で10質量％以上ものDHAが生産されることが明らかになった。
（６）脂質の分画及び各脂質画分における脂肪酸組成の解析
EPA株及びDHA株（EPA株にTpELO2遺伝子＋PlDES1遺伝子発現カセットを導入した表５中の「TpELO2+PlDES1株」）を５０ｍＬフラスコに分注した２０ｍＬのN5P5培地に播種し、２５℃、０．３％ＣＯ２雰囲気下、１２ｈ／１２ｈ明暗条件にて１４日間振盪培養した。調製例１と同様の方法により、ナンノクロロプシスの培養液０．２５ｍＬから脂質の抽出を行い、得られた脂質をTLC分画に供した。分画したそれぞれの脂質画分から脂質を回収し、脂肪酸エステルへの変換及びガスクロマトグラフィー解析に供した。また、別途ナンノクロロプシスの培養液０．２５ｍＬから脂質の抽出を行い、得られた脂質を脂肪酸エステルへの変換及びガスクロマトグラフィー解析に供した。
ガスクロマトグラフィー解析により得られた波形データのピーク面積より、各脂肪酸のメチルエステル量を定量した。各ピーク面積を、内部標準であるGlyceryl triheptadecanoate由来のC17脂肪酸メチルエステルのピーク面積と比較することで試料間の補正を行い、培養液１リットルあたりの各脂肪酸量を算出した。さらに、TLC分画後のそれぞれの脂質画分から回収した脂質、及びTLC分画を行わずに抽出した全脂質について各脂肪酸量の総和を算出し、全脂質量に対する「ＴＡＧ」、「ＦＦＡ」、「ＤＡＧ」、「ＰＬ」画分の脂質量の割合を算出した。結果を表６に示す。それぞれの株について N=2で培養・脂質解析を行っており、その平均値と標準偏差を示した。
なお、以下の表において、「ＴＡＧ」はトリアシルグリセロールを、「ＦＦＡ」は遊離脂肪酸を、「ＤＡＧ」はジアシルグリセロールを、「ＰＬ」は極性脂質を表す。
また、それぞれの株の「ＴＡＧ」、「ＰＬ」画分において、各脂肪酸メチルエステルのピーク面積の総和に対する各脂肪酸メチルエステルのピーク面積の割合を算出した。結果を表７に示す。
なお、以下の表において、「EPA株_TAG」、「EPA株_PL」はEPA株から抽出した脂質の「ＴＡＧ」又は「ＰＬ」画分を、「DHA株_TAG」、「DHA株_PL」はDHA株から抽出した脂質の「ＴＡＧ」又は「ＰＬ」画分を表す。
Figure 2023102179000006
Figure 2023102179000007
表６及び表７から、DHA株は脂質として約80%をＴＡＧとして蓄積しており、さらにＴＡＧ中のDHAの割合が10％以上に到達することが明らかになった。また、DHA株において生産されるDPAやDHAなどの脂肪酸は、ＴＡＧだけでなくＰＬ画分にも６～８%の割合で局在することが明らかになった。
実施例２ Δ4-DES遺伝子発現プラスミドの作製、ナンノクロロプシスの形質転換、及び形質転換体による脂質の製造
（１）PlDES1遺伝子発現用プラスミド（ブラストシジン耐性）の構築
まず、実施例１で作製したPlDES1遺伝子断片及び調製例２で作製したＬＤＳＰプロモーター配列、ゼオシン耐性遺伝子発現カセット（チューブリンプロモーター配列、ゼオシン耐性遺伝子、ヒートショックプロテインターミネーター配列）、ＶＣＰ１ターミネーター配列及びpUC19配列からなる断片を連結し、PlDES1遺伝子発現用プラスミド（ゼオシン耐性）を構築した。なお、本発現プラスミドはＬＤＳＰプロモーター配列、PlDES1遺伝子、ＶＣＰ１ターミネーター配列、チューブリンプロモーター配列、ゼオシン耐性遺伝子、ヒートショックプロテインターミネーター配列の順で連結したインサート配列とpUC19ベクター配列からなる。
次に、前記にて作製したPlDES1遺伝子発現用プラスミド（ゼオシン耐性）を鋳型として、表２に示すプライマー１４９（配列番号１４９）及びプライマー１５０（配列番号１５０）のプライマー対を用いたＰＣＲを行い、チューブリンプロモーター配列、PlDES1遺伝子発現カセット（ＬＤＳＰプロモーター配列、PlDES1遺伝子、ＶＣＰ１ターミネーター配列）、ヒートショックプロテインターミネーター配列及びpUC19配列からなる断片を増幅した。また、ブラストシジン耐性遺伝子（配列番号４８）を人工合成し、合成したＤＮＡ断片を鋳型として表２に示すプライマー１５４（配列番号１５４）及びプライマー１５５（配列番号１５５）のプライマー対を用いたＰＣＲを行い、ブラストシジン耐性遺伝子断片を増幅した。得られたブラストシジン耐性遺伝子断片を、前記にて作製したチューブリンプロモーター配列、PlDES1遺伝子発現カセット（ＬＤＳＰプロモーター配列、PlDES1遺伝子、ＶＣＰ１ターミネーター配列）、ヒートショックプロテインターミネーター配列及びpUC19配列からなる断片と連結し、PlDES1遺伝子発現用プラスミド（ブラストシジン耐性）を構築した。なお、本発現プラスミドはＬＤＳＰプロモーター配列、PlDES1遺伝子、ＶＣＰ１ターミネーター配列、チューブリンプロモーター配列、ブラストシジン耐性遺伝子、ヒートショックプロテインターミネーター配列の順で連結したインサート配列とpUC19ベクター配列からなる。
（２）パブロバ・サリナ由来のΔ4-DES遺伝子発現用プラスミド（ブラストシジン耐性）の構築
パブロバ・サリナ由来のΔ4-DES（アミノ酸配列：配列番号３０）をコードするΔ4-DES遺伝子（塩基配列：配列番号２８）についてコドン使用頻度をナンノクロロプシスに最適化した配列（配列番号２９、以降「Psd4DES遺伝子」とも記載する。なお、配列番号２９の塩基配列は、配列番号３０のアミノ酸配列をコードする。）を人工合成した。合成したＤＮＡ断片を鋳型として、表２に示すプライマー１４１（配列番号１４１）及びプライマー１４２（配列番号１４２）のプライマー対を用いたＰＣＲを行い、Psd4DES遺伝子断片を増幅した。
また、前記PlDES1遺伝子発現用プラスミド（ブラストシジン耐性）を鋳型として、表２に示すプライマー１４５（配列番号１４５）及びプライマー１４６（配列番号１４６）のプライマー対を用いたＰＣＲを行い、ＬＤＳＰプロモーター配列、ブラストシジン耐性遺伝子発現カセット（チューブリンプロモーター配列、ブラストシジン耐性遺伝子、ヒートショックプロテインターミネーター配列）、ＶＣＰ１ターミネーター配列及びpUC19配列からなる断片を増幅した。得られた断片と、前記にて作製したPsd4DES遺伝子断片を調製例１と同様の方法にて融合し、Psd4DES遺伝子発現用プラスミド（ブラストシジン耐性）を構築した。なお、本発現プラスミドはＬＤＳＰプロモーター配列、Psd4DES遺伝子、ＶＣＰ１ターミネーター配列、チューブリンプロモーター配列、ブラストシジン耐性遺伝子、ヒートショックプロテインターミネーター配列の順で連結したインサート配列とpUC19ベクター配列からなる。
（３）各種Δ4-DES遺伝子発現カセットのDPA生産株への導入、形質転換体の培養、培養液中の脂質の抽出、及び構成脂肪酸の分析
前記各種Δ4-DES遺伝子発現用プラスミド（ブラストシジン耐性）を鋳型として、表２に示すプライマー１５１（配列番号１５１）及びプライマー１５３（配列番号１５３）のプライマー対を用いたＰＣＲを行い、各種Δ4-DES遺伝子発現用カセット（ブラストシジン耐性）をそれぞれ取得した。なお、本発現用カセットは、ＬＤＳＰプロモーター配列、各種Δ4-DES遺伝子、ＶＣＰ１ターミネーター配列、チューブリンプロモーター配列、ブラストシジン耐性遺伝子、ヒートショックプロテインターミネーター配列からなる。増幅した断片を用いて調製例１と同様の方法により、調製例２で作製したDPA株（EPA株にPcELO遺伝子発現カセットを導入した表４中の「PcELO株」）の形質転換を行った。なお、形質転換体の選抜は2μg/mLのゼオシン及び40μg/mLのブラストシジン含有ｆ／２寒天培地にて行った。得られたコロニーを、24穴プレート（ＩＷＡＫＩ社製）に分注した１．５～２ｍＬのN5P5培地（40μg/mLのブラストシジン含有）に播種し、２５℃、０．３％ＣＯ２雰囲気下、１２ｈ／１２ｈ明暗条件にて２１日間振盪培養した。
（４）ナンノクロロプシス培養液中の脂質の抽出及び構成脂肪酸の分析
調製例１と同様の方法により、ナンノクロロプシスの培養液０．２５ｍＬから脂質の抽出及び脂肪酸エステルへの変換を行った。得られた脂肪酸エステルを調製例１と同様の条件でガスクロマトグラフィー解析に供した。
ガスクロマトグラフィー解析により得られた波形データより、各脂肪酸メチルエステルのピーク面積の総和に対する、各脂肪酸メチルエステルのピーク面積の割合を算出した。結果を表８に示す。各形質転換体について独立した１２ライン（EPA株及びDPA株はN=2）の培養・脂質解析を行っており、その平均値と標準偏差を示した。
なお、下記表８において、例えば「PlDES1+PcELO株」とあるのは、DPA株にPlDES1遺伝子が導入された形質転換体を意味する。他の記載についても同様である。
Figure 2023102179000008
表８より、EPA株やDPA株では、DHAが検出されなかった。これに対し、DPA株にPIDES1遺伝子やPSd4DES遺伝子を導入したPlDES1+PcELO株及びPsd4DES+PcELO株では、DHAが生産されることが明らかとなった。

Claims (14)

  1. Δ５－エロンガーゼ及びΔ４－デサチュラーゼの発現を促進させたナンノクロロプシス（Nannochloropsis）属に属する藻類を培養し、炭素原子数２２の長鎖多価不飽和脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質を生産させる、脂質の製造方法。
  2. Δ５－エロンガーゼ及びΔ４－デサチュラーゼの発現を促進させることにより、ナンノクロロプシス（Nannochloropsis）属に属する藻類の細胞内で生産される炭素原子数２２の長鎖多価不飽和脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質の生産性を向上させる、脂質の生産性の向上方法。
  3. Δ５－エロンガーゼ及びΔ４－デサチュラーゼの発現を促進させ、ナンノクロロプシス（Nannochloropsis）属に属する藻類の細胞内で生産される炭素原子数２２の長鎖多価不飽和脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質の生産性を向上させ、生産される全脂肪酸又は全脂質中の脂肪酸の組成を改変する、脂肪酸組成の改変方法。
  4. 前記Δ５－エロンガーゼが下記タンパク質（Ａ）～（Ｊ）からなる群より選ばれる少なくとも１種のタンパク質である、請求項１～３のいずれか１項に記載の方法。

    （Ａ）配列番号６で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
    （Ｂ）前記タンパク質（Ａ）のアミノ酸配列と同一性が６０％以上のアミノ酸配列からなり、かつΔ５－エロンガーゼ活性を有するタンパク質。
    （Ｃ）配列番号９で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
    （Ｄ）前記タンパク質（Ｃ）のアミノ酸配列と同一性が６０％以上のアミノ酸配列からなり、かつΔ５－エロンガーゼ活性を有するタンパク質。
    （Ｅ）配列番号１２で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
    （Ｆ）前記タンパク質（Ｅ）のアミノ酸配列と同一性が６０％以上のアミノ酸配列からなり、かつΔ５－エロンガーゼ活性を有するタンパク質。
    （Ｇ）配列番号１５で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
    （Ｈ）前記タンパク質（Ｇ）のアミノ酸配列と同一性が６０％以上のアミノ酸配列からなり、かつΔ５－エロンガーゼ活性を有するタンパク質。
    （Ｉ）配列番号１８で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
    （Ｊ）前記タンパク質（Ｉ）のアミノ酸配列と同一性が６０％以上のアミノ酸配列からなり、かつΔ５－エロンガーゼ活性を有するタンパク質。
  5. 前記Δ４－デサチュラーゼが下記タンパク質（Ｋ）～（Ｎ）からなる群より選ばれる少なくとも１種のタンパク質である、請求項１～４のいずれか１項記載の方法。

    （Ｋ）配列番号２７で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
    （Ｌ）前記タンパク質（Ｋ）のアミノ酸配列と同一性が６０％以上のアミノ酸配列からなり、かつΔ４－デサチュラーゼ活性を有するタンパク質。
    （Ｍ）配列番号３０で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
    （Ｎ）前記タンパク質（Ｍ）のアミノ酸配列と同一性が６０％以上のアミノ酸配列からなり、かつΔ４－デサチュラーゼ活性を有するタンパク質。
  6. 前記ナンノクロロプシス（Nannochloropsis）属に属する藻類において、アシルキャリアープロテイン、Δ12-デサチュラーゼ、Δ６－デサチュラーゼ、ω３－デサチュラーゼ、Δ９－デサチュラーゼ、及びΔ６－エロンガーゼからなる群より選ばれる少なくとも１種のタンパク質の発現が促進されている、請求項１～５のいずれか１項記載の方法。
  7. 前記ナンノクロロプシス（Nannochloropsis）属に属する藻類が、ナンノクロロプシス・オセアニカ（Nannochloropsis oceanica）である、請求項１～６のいずれか１項記載の方法。
  8. 前記炭素原子数２２の長鎖多価不飽和脂肪酸がドコサヘキサエン酸である、請求項１～７のいずれか１項記載の方法。
  9. 前記脂質が、トリアシルグリセロールを含む、請求項１～８のいずれか１項記載の方法。
  10. Δ５－エロンガーゼ及びΔ４－デサチュラーゼの発現が促進されている、ナンノクロロプシス（Nannochloropsis）属に属する藻類の形質転換体。
  11. 前記Δ５－エロンガーゼが下記タンパク質（Ａ）～（Ｊ）からなる群より選ばれる少なくとも１種のタンパク質である、請求項１０に記載の形質転換体。

    （Ａ）配列番号６で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
    （Ｂ）前記タンパク質（Ａ）のアミノ酸配列と同一性が６０％以上のアミノ酸配列からなり、かつΔ５－エロンガーゼ活性を有するタンパク質。
    （Ｃ）配列番号９で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
    （Ｄ）前記タンパク質（Ｃ）のアミノ酸配列と同一性が６０％以上のアミノ酸配列からなり、かつΔ５－エロンガーゼ活性を有するタンパク質。
    （Ｅ）配列番号１２で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
    （Ｆ）前記タンパク質（Ｅ）のアミノ酸配列と同一性が６０％以上のアミノ酸配列からなり、かつΔ５－エロンガーゼ活性を有するタンパク質。
    （Ｇ）配列番号１５で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
    （Ｈ）前記タンパク質（Ｇ）のアミノ酸配列と同一性が６０％以上のアミノ酸配列からなり、かつΔ５－エロンガーゼ活性を有するタンパク質。
    （Ｉ）配列番号１８で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
    （Ｊ）前記タンパク質（Ｉ）のアミノ酸配列と同一性が６０％以上のアミノ酸配列からなり、かつΔ５－エロンガーゼ活性を有するタンパク質。
  12. 前記Δ４－デサチュラーゼが下記タンパク質（Ｋ）～（Ｎ）からなる群より選ばれる少なくとも１種のタンパク質である、請求項１０又は１１のいずれか１項記載の形質転換体。

    （Ｋ）配列番号２７で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
    （Ｌ）前記タンパク質（Ｋ）のアミノ酸配列と同一性が６０％以上のアミノ酸配列からなり、かつΔ４－デサチュラーゼ活性を有するタンパク質。
    （Ｍ）配列番号３０で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
    （Ｎ）前記タンパク質（Ｍ）のアミノ酸配列と同一性が６０％以上のアミノ酸配列からなり、かつΔ４－デサチュラーゼ活性を有するタンパク質。
  13. 前記ナンノクロロプシス（Nannochloropsis）属に属する藻類において、アシルキャリアープロテイン、Δ12-デサチュラーゼ、Δ６－デサチュラーゼ、ω３－デサチュラーゼ、Δ９－デサチュラーゼ、及びΔ６－エロンガーゼからなる群より選ばれる少なくとも１種のタンパク質の発現が促進されている、請求項１０～２１のいずれか１項記載の形質転換体。
  14. 前記ナンノクロロプシス（Nannochloropsis）属に属する藻類が、ナンノクロロプシス・オセアニカ（Nannochloropsis oceanica）である、請求項１０～１３のいずれか１項記載の形質転換体。
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