JP6785769B2 - 脂質の製造方法 - Google Patents

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Description

本発明は、脂質の製造方法に関する。また、本発明は当該方法に用いるβ−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼ、これをコードする遺伝子、及び当該遺伝子の発現を促進させた形質転換体に関する。
脂肪酸は脂質の主要構成成分の１つであり、生体内においてグリセリンとのエステル結合により生成するトリアシルグリセロール等の脂質（油脂）を構成する。また、多くの動植物において脂肪酸はエネルギー源として貯蔵され利用される物質でもある。動植物内に蓄えられた脂肪酸や脂質は、食用又は工業用として広く利用されている。
例えば、炭素原子数１２〜１８前後の高級脂肪酸を還元して得られる高級アルコールの誘導体は、界面活性剤として用いられている。アルキル硫酸エステル塩やアルキルベンゼンスルホン酸塩等は陰イオン性界面活性剤として利用されている。また、ポリオキシアルキレンアルキルエーテルやアルキルポリグリコシド等は非イオン性界面活性剤として利用されている。そしてこれらの界面活性剤は、いずれも洗浄剤や殺菌剤等に利用されている。同じ高級アルコールの誘導体であるアルキルアミン塩やモノ又はジアルキル４級アミン塩等のカチオン性界面活性剤は、繊維処理剤、毛髪リンス剤、殺菌剤等に日常的に利用されている。また、ベンザルコニウム型４級アンモニウム塩は殺菌剤や防腐剤等に日常的に利用されている。さらに、植物油脂はバイオディーゼル燃料の原料としても利用されている。
また、炭素原子数が１８以上の長鎖脂肪酸、特に不飽和結合が複数導入された長鎖多価不飽和脂肪酸（以下、「ＰＵＦＡ」ともいう）の多くは、動物の生体内では合成できない必須脂肪酸であることが知られている。したがって、このようなＰＵＦＡは、栄養学的用途に特に有用であり、機能性食品などに用いられている。
植物の脂肪酸合成経路は葉緑体に局在する。葉緑体ではアセチル−ＡＣＰ（アシルキャリアプロテイン、acyl carrier protein）を出発物質とし、炭素鎖の伸長反応が繰り返され、最終的に炭素原子数１６又は１８のアシル−ＡＣＰ（脂肪酸残基であるアシル基とＡＣＰとからなる複合体）が合成される。この脂肪酸合成経路に関与する酵素のうち、β−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼ（β-Ketoacyl-ＡＣＰ synthase、以下「KAS」ともいう）はアシル基の鎖長制御に関与する酵素である。植物では、KAS I、KAS II、KAS III、KAS IV、のそれぞれ機能が異なる４種のKASが存在することが知られている。このうち、KAS IIIは鎖長伸長反応の開始段階で働き、炭素原子数２のアセチル−ＡＣＰ（又はアセチル−ＣｏＡ）を炭素原子数４のβ−ケトアシル−ＡＣＰに伸長する。それ以降の伸長反応には、KAS I、KAS II、及びKAS IVが関与する。KAS Iは主に炭素原子数１６のパルミトイル−ＡＣＰまでの伸長反応に関与し、KAS IIは主に炭素原子数１８のステアロイル−ＡＣＰまでの伸長反応に関与する。一方、KAS IVは炭素原子数６〜１４の中鎖アシル−ＡＣＰまでの伸長反応に関与するといわれている。
さらに、炭素原子数１８以上の長鎖脂肪酸、特にＰＵＦＡは、葉緑体外にて多数のデサチュラーゼ（Desaturase）やエロンガーゼ（Elongase）によって合成されると言われている。
前述のように、脂肪酸や脂質の利用は多岐にわたる。そのため、植物等の宿主において生体内での脂肪酸や脂質の生産性を向上させる試みが行われている。さらに、脂肪酸の用途や有用性はその炭素原子数（鎖長）や不飽和結合数（不飽和度）に依存するため、脂肪酸の炭素原子数や不飽和結合数を制御する試みも行われている。
一般的にＰＵＦＡの生産性向上には、デサチュラーゼやエロンガーゼの強化が有効であると考えられており、様々な生物からこれらの酵素群が同定されている（特許文献１参照）。例えば、次世代の油脂生産源として注目を集めている微細藻類の一種であるナンノクロロプシス（Nannochloropsis）属に属する藻類由来のデサチュラーゼやエロンガーゼが、長鎖脂肪酸の合成に使用できることが知られている（特許文献２及び３参照）。
このように、油糧生物において所望の長鎖脂肪酸（特にＰＵＦＡ）に富む脂質を効率的に産生させる方法に対しては、当技術分野における需要がある。
国際公開第２０１２／０５２４６８号 国際公開第２０１２／１４９４５７号 米国特許出願公開第２０１２／０２７７４１８号明細書
本発明は、下記タンパク質（Ａ）又は（Ｂ）をコードする遺伝子の発現を促進させた形質転換体を培養して脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質を生産させる、脂質の製造方法に関する。
（Ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
（Ｂ）前記タンパク質（Ａ）のアミノ酸配列と同一性が７０％以上のアミノ酸配列からなり、かつβ−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼ活性（以下、「KAS活性」ともいう）を有するタンパク質。
また本発明は、前記タンパク質（Ａ）又は（Ｂ）に関する
また本発明は、前記タンパク質（Ａ）又は（Ｂ）をコードする遺伝子に関する。
さらに本発明は、前記タンパク質（Ａ）又は（Ｂ）をコードする遺伝子の発現を促進させた形質転換体に関する。
本発明は、長鎖脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質の生産性を向上させる、脂質の製造方法に関する。
また本発明は、長鎖脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質の生産性を向上させた形質転換体に関する。
本発明者らは、長鎖脂肪酸の合成に関与する酵素として、藻類の１種であるナンノクロロプシス属の藻類のKASを新たに同定した。そして、このKASの微生物内での発現を促進させた結果、生産される長鎖脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質の生産性が有意に向上することを見出した。
本発明はこれらの知見に基づいて完成するに至ったものである。
本発明の脂質の製造方法によれば、長鎖脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質の生産性を向上させることができる。
また本発明の形質転換体は、長鎖脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質の生産性に優れる。
本発明の上記及び他の特徴及び利点は、下記の記載からより明らかになるであろう。
本明細書における「脂質」は、中性脂肪（トリアシルグリセロール等）、ろう、セラミド等の単純脂質；リン脂質、糖脂質、スルホ脂質等の複合脂質；及びこれらの脂質から誘導される、脂肪酸、アルコール類、炭化水素類等の誘導脂質を包含するものである。
また本明細書において、脂肪酸や、脂肪酸を構成するアシル基の表記において「Ｃｘ：ｙ」とあるのは、炭素原子数ｘで二重結合の数がｙであることを表す。「Ｃｘ」は炭素原子数ｘの脂肪酸やアシル基を表す。
さらに本明細書において、塩基配列及びアミノ酸配列の同一性は、Lipman-Pearson法（Science，1985，vol．227，p．1435-1441）によって計算される。具体的には、遺伝情報処理ソフトウェアGenetyx-Winのホモロジー解析（Search homology）プログラムを用いて、Unit size to compare（ktup）を2として解析を行うことにより算出される。
また本明細書において「ストリンジェントな条件」としては、例えばMolecular Cloning−A LABORATORY MANUAL THIRD EDITION［Joseph Sambrook，David W．Russell.，Cold Spring Harbor Laboratory Press］記載の方法が挙げられる。例えば、６×ＳＳＣ（１×ＳＳＣの組成：０．１５Ｍ塩化ナトリウム、０．０１５Ｍクエン酸ナトリウム、pH７．０）、０．５％ＳＤＳ、５×デンハート及び１００ｍｇ／ｍＬニシン精子ＤＮＡを含む溶液にプローブとともに６５℃で８〜１６時間恒温し、ハイブリダイズさせる条件が挙げられる。
さらに明細書において、遺伝子の「上流」とは、翻訳開始点からの位置ではなく、対象として捉えている遺伝子又は領域の5'側に続く領域を示す。一方、遺伝子の「下流」とは、対象として捉えている遺伝子又は領域の3'側に続く領域を示す。
前記タンパク質（Ａ）及び（Ｂ）（以下、「NoKASII」ともいう）はKASの１種であり、長鎖脂肪酸の合成に関与するタンパク質である。配列番号１のアミノ酸配列からなるタンパク質は、ナンノクロロプシス属に属する藻類であるナンノクロロプシス・オキュラータ（Nannochloropsis oculata）NIES2145株由来のKASの１つである。
KASは、脂肪酸合成経路においてアシル基の鎖長制御に関与する酵素である。植物の脂肪酸合成経路は一般的に葉緑体に局在する。葉緑体では、アセチル−ＡＣＰ（又はアセチル−ＣｏＡ）を出発物質とし、炭素鎖の伸長反応が繰り返され、最終的に炭素原子数１６又は１８のアシル−ＡＣＰが合成される。次いで、アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ（以下、単に「TE」ともいう）の作用によってアシル−ＡＣＰのチオエステル結合が加水分解され、遊離の脂肪酸が生成する。
脂肪酸合成の第一段階では、アセチル−ＡＣＰ（又はアセチル−ＣｏＡ）とマロニルＡＣＰとの縮合反応により、アセトアセチルＡＣＰが生成する。この反応をKASが触媒する。次いで、β−ケトアシル−ＡＣＰレダクターゼによりアセトアセチルＡＣＰのケト基が還元されてヒドロキシブチリルＡＣＰが生成する。続いて、β−ヒドロキシアシル−ＡＣＰデヒドラーゼによりヒドロキシブチリルＡＣＰが脱水され、クロトニルＡＣＰが生成する。最後に、エノイル−ＡＣＰレダクターゼによりクロトニルＡＣＰが還元されて、ブチリルＡＣＰが生成する。これら一連の反応により、アセチル−ＡＣＰからアシル基の炭素鎖が２個伸長されたブチリルＡＣＰが生成する。以下、同様の反応を繰り返すことで、アシル−ＡＣＰの炭素鎖が伸長し、最終的に炭素原子数１６又は１８のアシル−ＡＣＰが合成される。
前記タンパク質（Ａ）及び（Ｂ）はいずれも、β−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼ活性（以下、「KAS活性」ともいう）を有する。本明細書において「KAS活性」とは、アセチル−ＡＣＰ（又はアセチル−ＣｏＡ）やアシル−ＡＣＰと、マロニルＡＣＰとの縮合反応を触媒する活性を意味する。
タンパク質がKAS活性を有することは、例えば、宿主細胞内で機能するプロモーターの下流に前記タンパク質をコードする遺伝子を連結したＤＮＡを、脂肪酸分解系が欠損した宿主細胞へ導入し、導入した遺伝子が発現する条件下で細胞を培養し、宿主細胞内又は培養液中の脂肪酸組成の変化を常法により分析することで確認できる。あるいは、宿主細胞内で機能するプロモーターの下流に前記タンパク質をコードする遺伝子を連結したＤＮＡを宿主細胞へ導入し、導入した遺伝子が発現する条件下で細胞を培養した後、細胞の破砕液に対し、各種アシル−ＡＣＰを基質とした鎖長伸長反応を行うことにより確認できる。
KASはその基質特異性によってKAS I、KAS II、KAS III、又はKAS IVに分類される。KAS IIIは、炭素原子数２のアセチル−ＡＣＰ（又はアセチル−ＣｏＡ）を基質とし、炭素原子数２から４の伸長反応を触媒する。KAS Iは、主に炭素原子数４から１６の伸長反応を触媒し、炭素原子数１６のパルミトイル−ＡＣＰを合成する。KAS IIは、主に炭素原子数１８以上の長鎖アシル基への伸長反応を触媒し、長鎖アシル−ＡＣＰを合成する。KAS IVは主に炭素原子数６から１４の伸長反応を触媒し、中鎖アシル−ＡＣＰを合成する。
後述の実施例で示すように、前記タンパク質（Ａ）をコードする遺伝子の発現を促進した形質転換体では、炭素原子数１８や２０の長鎖脂肪酸の生産性が向上する。よって前記タンパク質（Ａ）及び（Ｂ）は、炭素原子数１８以上の長鎖β−ケトアシル−ＡＣＰ合成活性を有する、KAS II型のKASであると考えられる。また、ChloroP（http://www.cbs.dtu.dk/services/ChloroP/）を用いた局在予測より、前記タンパク質（Ａ）は葉緑体局在型のKASであり、Ｎ末端側のアミノ酸３３残基は葉緑体移行シグナル配列であると考えられる。なお本明細書において「長鎖β−ケトアシル−ＡＣＰ合成活性」とは、主に炭素原子数１６以上のアシル−ＡＣＰを基質とし、炭素原子数１８以上の長鎖アシル−ＡＣＰ合成の伸長反応を触媒する活性のことをいう。また本明細書において「長鎖」とは、アシル基の炭素原子数が１８以上、好ましくは炭素原子数が１８又は２０であることをいう。
KASの長鎖β−ケトアシル−ＡＣＰ合成活性については、例えば、宿主細胞内で機能するプロモーターの下流にタンパク質をコードする遺伝子を連結したＤＮＡを、脂肪酸分解系が欠損した宿主細胞へ導入し、導入した遺伝子が発現する条件下で細胞を培養して、宿主細胞又は培養液中の脂肪酸組成の変化を常法により分析することで確認できる。また、上記の系に後述するTEを共発現させ、TEのみを発現させた場合の脂肪酸組成と比較することにより確認できる。また、宿主細胞内で機能するプロモーターの下流にタンパク質をコードする遺伝子を連結したＤＮＡを、宿主細胞へ導入し、導入した遺伝子が発現する条件下で細胞を培養した後、細胞の破砕液に対し鎖長伸長反応を行うことにより確認できる。
前記タンパク質（Ｂ）において、KAS活性の点から、前記タンパク質（Ａ）のアミノ酸配列との同一性は７５％以上が好ましく、８０％以上がより好ましく、８５％以上がより好ましく、９０％以上がより好ましく、９２％以上がより好ましく、９５％以上がより好ましく、９８％以上がより好ましく、９９％以上がさらに好ましい。また、前記タンパク質（Ｂ）として、前記タンパク質（Ａ）のアミノ酸配列に、１又は複数個（例えば１個以上１４２個以下、好ましくは１個以上１１８個以下、より好ましくは１個以上９５個以下、より好ましくは１個以上７１個以下、より好ましくは１個以上４７個以下、より好ましくは１個以上３８個以下、より好ましくは１個以上２３個以下、より好ましくは１個以上９個以下、さらに好ましくは１個以上４個以下）のアミノ酸を欠失、置換、挿入又は付加したタンパク質が挙げられる。
アミノ酸配列に変異を導入する方法としては、例えば、アミノ酸配列をコードする塩基配列に変異を導入する方法が挙げられる。変異を導入する方法としては、部位特異的な変異導入法が挙げられる。具体的な部位特異的変異の導入方法としては、SOE-PCR反応を利用した方法、ＯＤＡ法、Kunkel法等が挙げられる。また、Site-Directed Mutagenesis System Mutan-SuperExpress Kmキット（タカラバイオ社）、Transformer TM Site-Directed Mutagenesisキット（Clonetech社）、KOD-Plus-Mutagenesis Kit（東洋紡社）等の市販のキットを利用することもできる。また、ランダムな遺伝子変異を与えた後、適当な方法により酵素活性の評価及び遺伝子解析を行うことにより目的遺伝子を取得することもできる。
前記タンパク質（Ａ）及び（Ｂ）は、通常の化学的手法、遺伝子工学的手法等により得ることができる。例えば、ナンノクロロプシス・オキュラータから単離、精製等することで天然物由来のタンパク質を取得することができる。また、配列番号１に示すアミノ酸配列情報をもとに人工的に化学合成することで、前記タンパク質（Ａ）及び（Ｂ）を得ることができる。あるいは、遺伝子組み換え技術により、組換えタンパク質として前記タンパク質（Ａ）及び（Ｂ）を作製してもよい。組換えタンパク質を作製する場合には、後述するβ−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼ遺伝子を用いることができる。
なお、ナンノクロロプシス・オキュラータ等の藻類は、私的又は公的な研究所等の保存機関より入手することができる。例えば、ナンノクロロプシス・オキュラータNIES-2145株は、国立環境研究所（NIES）から入手することができる。
前記タンパク質（Ａ）又は（Ｂ）をコードする遺伝子（以下、「KAS遺伝子」ともいう）の一例として、下記ＤＮＡ（ａ）又は（ｂ）からなる遺伝子（以下、「NoKASII遺伝子」ともいう）が挙げられる。

（ａ）配列番号２で表される塩基配列からなるＤＮＡ。
（ｂ）前記ＤＮＡ（ａ）の塩基配列と同一性が７０％以上の塩基配列からなり、かつβ−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼ活性を有する前記タンパク質（Ａ）又は（Ｂ）をコードするＤＮＡ。

配列番号２の塩基配列は、配列番号１のアミノ酸配列からなるタンパク質（ナンノクロロプシス・オキュラータNIES2145株由来のKAS）をコードする遺伝子の塩基配列である。
前記ＤＮＡ（ｂ）において、KAS活性の点から、前記ＤＮＡ（ａ）の塩基配列との同一性は７５％以上が好ましく、８０％以上がより好ましく、８５％以上がより好ましく、９０％以上がより好ましく、９２％以上がより好ましく、９５％以上がより好ましく、９８％以上がより好ましく、９９％以上がさらに好ましい。
また前記ＤＮＡ（ｂ）として、配列番号２で表される塩基配列において１又は複数個（例えば１個以上４２８個以下、好ましくは１個以上３５７個以下、より好ましくは１個以上２８５個以下、より好ましくは１個以上２１４個以下、より好ましくは１個以上１４２個以下、より好ましくは１個以上１１４個以下、より好ましくは１個以上７１個以下、より好ましくは１個以上２８個以下、さらに好ましくは１個以上１４個以下）の塩基が欠失、置換、挿入、又は付加されており、かつKAS活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡも好ましい。
さらに前記ＤＮＡ（ｂ）として、前記ＤＮＡ（ａ）と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつKAS活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡも好ましい。
前記KAS遺伝子の発現を促進させる方法としては、常法より適宜選択することができる。例えば、前記KAS遺伝子を宿主に導入する方法、前記KAS遺伝子をゲノム上に有する宿主において、当該遺伝子の発現調節領域（プロモーター、ターミネーター等）を改変する方法、などが挙げられる。
以下本明細書において、目的のタンパク質をコードする遺伝子の発現を促進させたものを「形質転換体」ともいい、目的のタンパク質をコードする遺伝子の発現を促進させていないものを「宿主」又は「野生株」ともいう。
本発明で用いる形質転換体は、宿主自体に比べ、長鎖脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質の生産性（長鎖脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質の生産量、生産される全脂肪酸中又は全脂質中に占める長鎖脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質の割合（比率））が有意に向上する。またその結果、当該形質転換体では、脂質中の脂肪酸組成が改変される。そのため、当該形質転換体を用いた本発明は、特定の炭素原子数の脂質、特に長鎖脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質、好ましくは炭素原子数１８以上の脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質、より好ましくは炭素原子数１８〜２２の脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質、より好ましくは炭素原子数１８〜２０の脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質、より好ましくは炭素原子数１８若しくは２０の脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質、より好ましくは炭素原子数１８若しくは２０の不飽和脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質、より好ましくはＣ１８：１、Ｃ１８：２、Ｃ１８：３、Ｃ２０：４若しくはＣ２０：５、又はこれを構成成分とする脂質、より好ましくは炭素原子数１８若しくは２０のＰＵＦＡ又はこれを構成成分とする脂質、より好ましくは炭素原子数２０のＰＵＦＡ又はこれを構成する脂質、より好ましくはＣ２０：４若しくはＣ２０：５、又はこれを構成する脂質、よりさらに好ましくはエイコサペンタエン酸（以下、「EPA」ともいう）又はこれを構成成分とする脂質、の生産に好適に用いることができる。
さらに本発明の形質転換体は、宿主と比較して、脂肪酸、及びそのエステル化合物を構成する脂肪酸エステルの総量に占める、長鎖脂肪酸量及びそのエステル化合物量の比率が向上する。前記長鎖脂肪酸は、炭素原子数１８以上の脂肪酸が好ましく、炭素原子数１８〜２２の脂肪酸がより好ましく、炭素原子数１８〜２０の脂肪酸がより好ましく、炭素原子数１８又は２０の脂肪酸がより好ましく、炭素原子数１８又は２０の不飽和脂肪酸がより好ましく、Ｃ１８：１、Ｃ１８：２、Ｃ１８：３、Ｃ２０：４又はＣ２０：５がより好ましく、炭素原子数１８若しくは２０のＰＵＦＡがより好ましく、炭素原子数２０のＰＵＦＡがより好ましく、Ｃ２０：４若しくはＣ２０：５がより好ましく、EPAがより好ましい。
なお、宿主や形質転換体の脂肪酸及び脂質の生産性については、実施例で用いた方法により測定することができる。
前記KAS遺伝子を宿主に導入して前記遺伝子の発現を促進させる方法について説明する。
前記KAS遺伝子は、通常の遺伝子工学的手法により得ることができる。例えば、配列番号１に示すアミノ酸配列又は配列番号２に示す塩基配列に基づいて、KAS遺伝子を人工的に合成できる。KAS遺伝子の合成は、例えば、インビトロジェン社等のサービスを利用することができる。また、ナンノクロロプシス・オキュラータからクローニングによって取得することもできる。例えば、Molecular Cloning−A LABORATORY MANUAL THIRD EDITION［Joseph Sambrook，David W．Russell，Cold Spring Harbor Laboratory Press（2001）］記載の方法等により行うことができる。また、実施例で用いたナンノクロロプシス・オキュラータNIES-2145は、国立環境研究所(NIES)より入手することができる。
本発明で好ましく用いることができる形質転換体は、前記KAS遺伝子を常法により前記宿主に導入することで得られる。具体的には、前記KAS遺伝子を宿主細胞中で発現させることのできる組換えベクターや遺伝子発現カセットを調製し、これを宿主細胞に導入して宿主細胞を形質転換させることにより作製できる。
形質転換体の宿主としては通常用いられるものより適宜選択することができる。本発明で用いることができる宿主としては、微生物（藻類や微細藻類を含む）、植物体、及び動物体が挙げられる。製造効率及び得られた脂質の利用性の点から、宿主は微生物又は植物体であることが好ましく、微生物であることがより好ましく、微細藻類であることがさらに好ましい。
前記微生物は原核生物、真核生物のいずれであってもよく、エシェリキア（Escherichia）属の微生物やバシラス（Bacillus）属の微生物、シネコシスティス（Synechocystis）属の微生物、シネココッカス（Synechococcus）属の微生物等の原核生物、又は酵母や糸状菌等の真核微生物を用いることができる。なかでも、脂質生産性の観点から、大腸菌（Escherichia coli）、枯草菌（Bacillus subtilis）、赤色酵母（Rhodosporidium toruloides）、又はモルチエレラ・エスピー（Mortierella sp．）が好ましく、大腸菌がより好ましい。
前記藻類や微細藻類としては、遺伝子組換え手法が確立している観点から、クラミドモナス（Chlamydomonas）属の藻類、クロレラ（Chlorella）属の藻類、ファエオダクティラム（Phaeodactylum）属の藻類、又はナンノクロロプシス属の藻類が好ましく、ナンノクロロプシス属の藻類がより好ましい。ナンノクロロプシス属の藻類の具体例としては、ナンノクロロプシス・オキュラータ、ナンノクロロプシス・ガディタナ（Nannochloropsis gaditana）、ナンノクロロプシス・サリナ（Nannochloropsis salina）、ナンノクロロプシス・オセアニカ（Nannochloropsis oceanica）、ナンノクロロプシス・アトムス（Nannochloropsis atomus）、ナンノクロロプシス・マキュラタ（Nannochloropsis maculata）、ナンノクロロプシス・グラニュラータ（Nannochloropsis granulata）、ナンノクロロプシス・エスピー（Nannochloropsis sp．）等が挙げられる。なかでも、脂質生産性の観点から、ナンノクロロプシス・オキュラータ、又はナンノクロロプシス・ガディタナが好ましく、ナンノクロロプシス・オキュラータがより好ましい。
前記植物体としては、種子に脂質を高含有する観点から、シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）、西洋アブラナ（Brassica napus）、アブラナ（Brassica rapa）、ココヤシ（Cocos nucifera）、パーム（Elaeis guineensis）、クフェア、ダイズ（Glycine max）、トウモロコシ（Zea mays）、イネ（Oryza sativa）、ヒマワリ（Helianthus annuus）、クスノキ（Cinnamomum camphora）、又はヤトロファ（Jatropha curcas）が好ましく、シロイヌナズナがより好ましい。
遺伝子発現用プラスミドベクター又は遺伝子発現カセットの母体となるベクター（プラスミド）としては、目的のタンパク質をコードする遺伝子を宿主に導入することができ、宿主細胞内で当該遺伝子を発現させることができるベクターであればよい。例えば、導入する宿主の種類に応じたプロモーターやターミネーター等の発現調節領域を有するベクターであって、複製開始点や選択マーカー等を有するベクターを用いることができる。また、プラスミド等の染色体外で自立増殖・複製するベクターであってもよいし、染色体内に組み込まれるベクターであってもよい。
本発明で好ましく用いることができる発現用ベクターとしては、微生物を宿主とする場合には、例えば、pBluescript（pBS） II SK(-)（Stratagene社製）、pSTV系ベクター（タカラバイオ社製）、pUC系ベクター（宝酒造社製）、pET系ベクター（タカラバイオ社製）、pGEX系ベクター（GEヘルスケア社製）、pCold系ベクター（タカラバイオ社製）、pHY300PLK（タカラバイオ社製）、pUB110（Mckenzie，T．et al.，1986，Plasmid 15（2），p．93-103）、pBR322（タカラバイオ社製）、pRS403（ストラタジーン社製）、及びpMW218/219（ニッポンジーン社製）が挙げられる。特に、宿主が大腸菌の場合は、pBluescript II SK(-)、又はpMW218/219が好ましく用いられる。
藻類又は微細藻類を宿主とする場合には、例えば、pUC19（タカラバイオ社製）、P66（Chlamydomonas Center）、P-322（Chlamydomonas Center）、pPha-T1（Yangmin Gong，et al.，Journal of Basic Microbiology，2011，vol．51，p．666-672参照）、及びpJET1（コスモ・バイオ社製）が挙げられる。特に、宿主がナンノクロロプシス属に属する藻類の場合は、pUC19、pPha-T1、又はpJET1が好ましく用いられる。また、宿主がナンノクロロプシス属に属する藻類の場合には、Oliver Kilian，et al.，Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，2011，vol．108(52)の記載の方法を参考にして、目的の遺伝子、プロモーター及びターミネーターからなるＤＮＡ断片（遺伝子発現カセット）を用いて宿主を形質転換することもできる。このＤＮＡ断片としては、例えば、PCRにより増幅したDNA断片や制限酵素で切断したDNA断片が挙げられる。
植物細胞を宿主とする場合には、例えば、pRI系ベクター（タカラバイオ社製）、pBI系ベクター（クロンテック社製）、及びIN3系ベクター（インプランタイノベーションズ社製）が挙げられる。特に、宿主がシロイヌナズナの場合は、pRI系ベクター又はpBI系ベクターが好ましく用いられる。
また、前記発現ベクターに組み込んだ目的のタンパク質をコードする遺伝子の発現を調整するプロモーターの種類も、使用する宿主の種類に応じて適宜選択することができる。本発明で好ましく用いることができるプロモーターとしては、lacプロモーター、trpプロモーター、tacプロモーター、trcプロモーター、T7プロモーター、SpoVGプロモーター、イソプロピルβ-D-1-チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）の添加によって誘導可能な誘導体に関するプロモーター、Rubiscoオペロン（rbc）、PSI反応中心タンパク質（psaAB）、PSIIのD1タンパク質（psbA）、カリフラワーモザイルウイルス35SRNAプロモーター、ハウスキーピング遺伝子プロモーター（例えば、チューブリンプロモーター、アクチンプロモーター、ユビキチンプロモーター等）、西洋アブラナ又はアブラナ由来Napin遺伝子プロモーター、植物由来Rubiscoプロモーター、ナンノクロロプシス属由来のビオラキサンチン／クロロフィルａ結合タンパク質遺伝子のプロモーター（VCP1プロモーター、VCP2プロモーター）（Oliver Kilian，et al.，Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，2011，vol．108(52)）、及びナンノクロロプシス属由来のオレオシン様タンパクＬＤＳＰ(lipid droplet surface protein)遺伝子のプロモーター（Astrid Vieler, et al., PLOS Genetics, 2012;8(11):e1003064. doi: 10.1371）が挙げられる。本発明で宿主としてナンノクロロプシスを用いる場合、ビオラキサンチン／クロロフィルａ結合タンパク質遺伝子のプロモーターや、ナンノクロロプシス属由来のオレオシン様タンパクＬＤＳＰ遺伝子のプロモーターを好ましく用いることができる。
また、目的のタンパク質をコードする遺伝子が組み込まれたことを確認するための選択マーカーの種類も、使用する宿主の種類に応じて適宜選択することができる。本発明で好ましく用いることができる選択マーカーとしては、アンピシリン耐性遺伝子、クロラムフェニコール耐性遺伝子、エリスロマイシン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、スペクチノマイシン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子、ブラストサイジンＳ耐性遺伝子、ビアラフォス耐性遺伝子、ゼオシン耐性遺伝子、パロモマイシン耐性遺伝子、及びハイグロマイシン耐性遺伝子等の薬剤耐性遺伝子が挙げられる。さらに、栄養要求性に関連する遺伝子の欠損等を選択マーカー遺伝子として使用することもできる。
目的のタンパク質をコードする遺伝子の前記ベクターへの導入は、制限酵素処理やライゲーション等の常法により行うことができる。
また、形質転換方法は、使用する宿主の種類に応じて常法より適宜選択することができる。例えば、カルシウムイオンを用いる形質転換方法、一般的なコンピテントセル形質転換方法、プロトプラスト形質転換法、エレクトロポレーション法、LP形質転換方法、アグロバクテリウムを用いた方法、パーティクルガン法等が挙げられる。宿主としてナンノクロロプシス属の藻類を用いる場合、Randor Radakovits, et al.，Nature Communications，DOI:10.1038/ncomms1688，2012等に記載のエレクトロポレーション法を用いて形質転換を行うこともできる。
目的遺伝子断片が導入された形質転換体の選択は、選択マーカー等を利用することで行うことができる。例えば、薬剤耐性遺伝子が、形質転換時に目的ＤＮＡ断片とともに宿主細胞中に導入された結果、形質転換体が獲得する薬剤耐性を指標に行うことができる。また、ゲノムを鋳型としたPCR法等によって、目的DNA断片の導入を確認することもできる。
前記KAS遺伝子をゲノム上に有する宿主において、当該遺伝子の発現調節領域を改変して、前記遺伝子の発現を促進させる方法について説明する。
「発現調節領域」とは、プロモーターやターミネーターを示し、これらの配列は一般に隣接する遺伝子の発現量（転写量、翻訳量）の調節に関与している。ゲノム上に前記KAS遺伝子を有する宿主においては、当該遺伝子の発現調節領域を改変して前記KAS遺伝子の発現を促進させることで、長鎖脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質の生産性を向上させることができる。
発現調節領域の改変方法としては、例えばプロモーターの入れ替えが挙げられる。ゲノム上に前記KAS遺伝子を有する宿主において、当該遺伝子のプロモーター（以下、「KASプロモーター」ともいう）を、より転写活性の高いプロモーターに入れ替えることで、前記KAS遺伝子の発現を促進させることができる。例えば、ゲノム上に前記KAS遺伝子を有する宿主の１つであるナンノクロロプシス・オキュラータNIES-2145株においては、配列番号２３に示す塩基配列からなるＤＮＡ配列の直下にNoKASII遺伝子が存在しており、配列番号２３に示す塩基配列からなるＤＮＡ配列中にプロモーター領域が存在している。この配列番号２３に示す塩基配列からなるＤＮＡ配列の一部又は全部をより転写活性の高いプロモーターに入れ替えることで、前記KAS遺伝子の発現を促進させることができる。
KASプロモーターの入れ替えに用いるプロモーターとしては特に限定されず、KASプロモーターよりも転写活性が高く、長鎖脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質の生産に適したものから適宜選択することができる。
宿主としてナンノクロロプシスを用いる場合には、チューブリンプロモーター、ヒートショックプロテインプロモーター、上述のビオラキサンチン／クロロフィルａ結合タンパク質遺伝子のプロモーター（VCP1プロモーター、VCP2プロモーター）、又はナンノクロロプシス属由来のオレオシン様タンパクＬＤＳＰ遺伝子のプロモーター（配列番号６）を好ましく用いることができる。長鎖脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質の生産性向上の観点から、ビオラキサンチン／クロロフィルａ結合タンパク質遺伝子のプロモーター又はＬＤＳＰ遺伝子のプロモーターがより好ましく、ＬＤＳＰ遺伝子のプロモーターがさらにより好ましい。
前述のプロモーターの改変は、相同組換えなどの常法に従い行うことができる。具体的には、標的とするプロモーターの上流、下流領域を含み、標的プロモーターに代えて別のプロモーターを含む直鎖状のDNA断片を構築し、これを宿主細胞に取り込ませ、宿主ゲノムの標的プロモーターの上流側と下流側とで２回交差の相同組換えを起こす。その結果、ゲノム上の標的プロモーターが別のプロモーター断片と置換され、プロモーターを改変することができる。
このような相同組換えによる標的プロモーターの改変方法は、例えば、Besher et al.，Methods in molecular biology，1995，vol．47，p．291-302等の文献を参考に行うことができる。特に、宿主がナンノクロロプシス属に属する藻類の場合、Oliver Kilian，et al.，Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，2011，vol．108(52)等の文献を参考にして、相同組換え法によりゲノム中の特定の領域を改変することができる。
本発明の形質転換体は、前記タンパク質（Ａ）又は（Ｂ）をコードする遺伝子に加えて、TEをコードする遺伝子（以下、「TE遺伝子」ともいう）の発現も促進されていることが好ましい。
前述したように、TEは、KAS等の脂肪酸合成酵素によって合成されたアシル−ＡＣＰのチオエステル結合を加水分解し、遊離の脂肪酸を生成する酵素である。TEの作用によってＡＣＰ上での脂肪酸合成が終了し、切り出された脂肪酸はＰＵＦＡの合成やトリアシルグリセロール（以下、「ＴＡＧ」ともいう）等の合成に供される。そのため、KAS遺伝子に加えてTE遺伝子の発現を促進することで、脂質の製造に用いる形質転換体の脂質の生産性、特に脂肪酸の生産性を一層向上させることができる。
本発明で用いることができるTEは、アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ活性（以下、「TE活性」ともいう）を有するタンパク質であればよい。ここで「TE活性」とは、アシル−ＡＣＰのチオエステル結合を加水分解する活性をいう。
TEは、基質であるアシル−ＡＣＰを構成するアシル基（脂肪酸残基）の炭素原子数や不飽和結合数によって異なる反応特異性を示す複数のTEが存在していることが知られている。よってTEはKASと同様、生体内での脂肪酸組成を決定する重要なファクターであると考えられている。また、TEをコードする遺伝子を元来有していない宿主を用いる場合、TEをコードする遺伝子、好ましくは長鎖アシル−ＡＣＰに対する基質特異性を有するTEをコードする遺伝子の導入が効果的である。このような遺伝子を導入することで、長鎖脂肪酸の生産性を一層向上させることができる。
本発明で用いることができるTEは、通常のTEや、それらと機能的に均等なタンパク質から、宿主の種類等に応じて適宜選択することができる。例えば、シロイヌナズナ由来FatA（配列番号２４）、シロイヌナズナ由来FatB（配列番号２５）、マンゴスチン（Garcinia mangostana）由来FatA（配列番号２６）、ナンノクロロプシス・ガディタナ由来TE（配列番号２７）、ナンノクロロプシス・オキュラータ由来TE（配列番号２８又は３０）、ナンノクロロプシス・グラニュラータ由来TE（配列番号２９）、大腸菌由来tesA（配列番号３１）などを用いることができる。長鎖アシル−ＡＣＰに対する基質特異性の観点から、シロイヌナズナ由来FatA、マンゴスチン由来FatAがより好ましい。
また、TE遺伝子の発現を促進させた形質転換体は、常法により作製できる。例えば、前述のKAS遺伝子の発現を促進させる方法と同様、TE遺伝子を宿主に導入する方法、TE遺伝子をゲノム上に有する宿主において当該遺伝子の発現調節領域を改変する方法、などにより形質転換体を作製することができる。
さらに本発明の形質転換体は、前記タンパク質（Ａ）又は（Ｂ）をコードする遺伝子に加えて、デサチュラーゼをコードする遺伝子（以下、「デサチュラーゼ遺伝子」ともいう）、及びエロンガーゼをコードする遺伝子（以下、「エロンガーゼ遺伝子」ともいう）からなる群より選ばれる少なくとも１種の遺伝子の発現も促進されていることが好ましい。
前述したように、炭素原子数１８以上の長鎖脂肪酸、特にＰＵＦＡは、葉緑体外にて多数のデサチュラーゼやエロンガーゼによって合成されると言われている。そのため、KAS遺伝子に加えデサチュラーゼやエロンガーゼをコードする遺伝子の発現を促進することで、長鎖脂肪酸、特にＰＵＦＡの生産性を一層向上させることができる。
本発明で用いることができるデサチュラーゼやエロンガーゼは、通常のデサチュラーゼやエロンガーゼや、それらと機能的に均等なタンパク質から、宿主の種類等に応じて適宜選択することができる。例えば、特許文献１〜３記載のナンノクロロプシス由来デサチュラーゼ、エロンガーゼを好ましく用いることができる。
本発明で用いることができるデサチュラーゼとしては、Δ12-デサチュラーゼ（以下、「Δ12-DES」ともいう）、Δ6-デサチュラーゼ（以下、「Δ6-DES」ともいう）、ω3-デサチュラーゼ（以下、「ω3-DES」ともいう）、Δ5-デサチュラーゼ（以下、「Δ5-DES」ともいう）、Δ9-デサチュラーゼ（以下、「Δ9-DES」ともいう）が挙げられる。
なお本発明において、これらのデサチュラーゼを単独で用いてもよいし、２種以上を組合せて用いてもよい。
本明細書において「Δ12-DES」とは、オレイン酸のΔ12位に不飽和結合を導入し、リノール酸を生成する反応を触媒するタンパク質（酵素）を意味する。そして本明細書において「Δ12-デサチュラーゼ活性（以下、「Δ12-DES活性」ともいう）」とは、オレイン酸のΔ12位に不飽和結合を導入する活性を意味する。タンパク質がΔ12-DES活性を有することは、例えば、Δ12-DES合成遺伝子欠損株を用いた系により確認することができる。あるいは、宿主細胞内で機能するプロモーターの下流に前記タンパク質をコードする遺伝子を連結したＤＮＡをΔ12-DES合成遺伝子欠損株に導入し、リノール酸の生成を検討することで確認できる。あるいは、Δ12-DES又はこれを含有する細胞破砕液を調製し、オレイン酸、オレオイルＣｏＡなどを含む反応液と反応させ、常法に従いオレイン酸量の減少又はリノール酸量の増加を測定することで確認できる。
本発明で好ましく用いることができるΔ12-DESは、通常のΔ12-DESや、それらと機能的に均等なタンパク質から、宿主の種類等に応じて適宜選択することができる。例えば、ナンノクロロプシス・オキュラータ由来のΔ12-DES（以下、「NoΔ12-DES」ともいう）（配列番号３２）やナンノクロロプシス・ガディタナ由来のΔ12-DES（以下、「NgΔ12-DES」ともいう）（配列番号３４）等が挙げられる。また、これと機能的に均等なタンパク質として、NoΔ12-DESやNgΔ12-DESのアミノ酸配列との同一性が６０％以上（好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上）のアミノ酸配列からなり、かつΔ12-DES活性を有するタンパク質も用いることができる。NoΔ12-DESをコードする遺伝子としては、配列番号３３で表される塩基配列からなるＤＮＡからなる遺伝子、又は配列番号３３で表される塩基配列との同一性が６０％以上（好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上）の塩基配列からなり、かつΔ12-DES活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡからなる遺伝子が挙げられる。NgΔ12-DESをコードする遺伝子としては、配列番号３５で表される塩基配列からなるＤＮＡからなる遺伝子、又は配列番号３５で表される塩基配列との同一性が６０％以上（好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上）の塩基配列からなり、かつΔ12-DES活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡからなる遺伝子が挙げられる。
本明細書において「Δ6-DES」とは、リノール酸のΔ6位に不飽和結合を導入し、γ-リノレン酸を生成する反応を触媒するタンパク質（酵素）を意味する。そして本明細書において本明細書において「Δ6-デサチュラーゼ活性（以下、「Δ6-DES活性」ともいう）」とは、リノール酸のΔ6位に不飽和結合を導入する活性を意味する。タンパク質がΔ6-DES活性を有することは、例えば、Δ6-DES合成遺伝子欠損株を用いた系により確認することができる。あるいは、宿主細胞内で機能するプロモーターの下流に前記タンパク質をコードする遺伝子を連結したＤＮＡをΔ6-DES合成遺伝子欠損株に導入し、γ-リノレン酸の生成を検討することで確認できる。あるいは、Δ6-DES又はこれを含有する細胞破砕液を調製し、リノール酸、リノレオイルＣｏＡなどを含む反応液と反応させ、常法に従いリノール酸量の減少又はγ-リノレン酸量の増加を測定することで確認できる。
本発明で好ましく用いることができるΔ6-DESは、通常のΔ6-DESや、それらと機能的に均等なタンパク質から、宿主の種類等に応じて適宜選択することができる。例えば、ナンノクロロプシス・オキュラータ由来のΔ6-DES（以下、「NoΔ6-DES」ともいう）（配列番号３６）やナンノクロロプシス・ガディタナ由来のΔ6-DES（以下、「NgΔ6-DES」ともいう）（配列番号３８）等が挙げられる。また、これと機能的に均等なタンパク質として、NoΔ6-DESやNgΔ6-DESのアミノ酸配列との同一性が６０％以上（好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上）のアミノ酸配列からなり、かつΔ6-DES活性を有するタンパク質も用いることができる。NoΔ6-DESをコードする遺伝子としては、配列番号３７で表される塩基配列からなるＤＮＡからなる遺伝子、又は配列番号３７で表される塩基配列との同一性が６０％以上（好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上）の塩基配列からなり、かつΔ6-DES活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡからなる遺伝子が挙げられる。NgΔ6-DESをコードする遺伝子としては、配列番号３９で表される塩基配列からなるＤＮＡからなる遺伝子、又は配列番号３９で表される塩基配列との同一性が６０％以上（好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上）の塩基配列からなり、かつΔ6-DES活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡからなる遺伝子が挙げられる。
本明細書において「ω3-DES」とは、アラキドン酸のω3位に不飽和結合を導入し、EPAを生成する反応を触媒するタンパク質（酵素）を意味する。そして本明細書において本明細書において「ω3-デサチュラーゼ活性（以下、「ω3-DES活性」ともいう」」とは、アラキドン酸のω3位に不飽和結合を導入する活性を意味する。タンパク質がω3-DES活性を有することは、例えば、ω3-DES合成遺伝子欠損株を用いた系により確認することができる。あるいは、宿主細胞内で機能するプロモーターの下流に前記タンパク質をコードする遺伝子を連結したＤＮＡをω3-DES合成遺伝子欠損株に導入し、EPAの生成を検討することで確認できる。あるいは、ω3-DES又はこれを含有する細胞破砕液を調製し、アラキドン酸誘導体（ＣｏＡとのチオエステル化合物、グリセロールとのエステル化合物など）を含む反応液と反応させ、常法に従いアラキドン酸量の減少又はEPA量の増加を測定することで確認できる。
本発明で好ましく用いることができるω3-DESは、通常のω3-DESや、それらと機能的に均等なタンパク質から、宿主の種類等に応じて適宜選択することができる。例えば、ナンノクロロプシス・オキュラータ由来のω3-DES（以下、「Noω3-DES」ともいう）（配列番号４０）やナンノクロロプシス・ガディタナ由来のω3-DES（以下、「Ngω3-DES」ともいう）（配列番号４２）等が挙げられる。また、これと機能的に均等なタンパク質として、Noω3-DESやNgω3-DESのアミノ酸配列との同一性が６０％以上（好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上）のアミノ酸配列からなり、かつω3-DES活性を有するタンパク質も用いることができる。Noω3-DESをコードする遺伝子としては、配列番号４１で表される塩基配列からなるＤＮＡからなる遺伝子、又は配列番号４１で表される塩基配列との同一性が６０％以上（好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上）の塩基配列からなり、かつω3-DES活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡからなる遺伝子が挙げられる。Ngω3-DESをコードする遺伝子としては、配列番号４３で表される塩基配列からなるＤＮＡからなる遺伝子、又は配列番号４３で表される塩基配列との同一性が６０％以上（好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上）の塩基配列からなり、かつω3-DES活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡからなる遺伝子が挙げられる。
本明細書において「Δ5-DES」とは、ジホモ-γ-リノレン酸のΔ5位に不飽和結合を導入し、アラキドン酸を生成する反応を触媒するタンパク質（酵素）を意味する。そして本明細書において本明細書において「Δ5-デサチュラーゼ活性（以下、「Δ5-DES活性」ともいう」」とは、ジホモ-γ-リノレン酸のΔ5位に不飽和結合を導入する活性を意味する。タンパク質がΔ5-DES活性を有することは、例えば、Δ5-DES合成遺伝子欠損株を用いた系により確認することができる。あるいは、宿主細胞内で機能するプロモーターの下流に前記タンパク質をコードする遺伝子を連結したＤＮＡをΔ5-DES合成遺伝子欠損株に導入し、アラキドン酸の生成を検討することで確認できる。あるいは、Δ5-DES又はこれを含有する細胞破砕液を調製し、ジホモ-γ-リノレン酸誘導体（ＣｏＡとのチオエステル化合物、グリセロールとのエステル化合物など）を含む反応液と反応させ、常法に従いジホモ-γ-リノレン酸量の減少又はアラキドン酸量の増加を測定することで確認できる。
本発明で好ましく用いることができるΔ5-DESは、通常のΔ5-DESや、それらと機能的に均等なタンパク質から、宿主の種類等に応じて適宜選択することができる。例えば、ナンノクロロプシス・オキュラータ由来のΔ5-DES（以下、「NoΔ5-DES」ともいう）（配列番号４４）やナンノクロロプシス・ガディタナ由来のΔ5-DES（以下、「NgΔ5-DES」ともいう）（配列番号４６）等が挙げられる。また、これと機能的に均等なタンパク質として、NoΔ5-DESやNgΔ5-DESのアミノ酸配列との同一性が６０％以上（好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上）のアミノ酸配列からなり、かつΔ5-DES活性を有するタンパク質も用いることができる。NoΔ5-DESをコードする遺伝子としては、配列番号４５で表される塩基配列からなるＤＮＡからなる遺伝子、又は配列番号４５で表される塩基配列との同一性が６０％以上（好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上）の塩基配列からなり、かつΔ5-DES活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡからなる遺伝子が挙げられる。NgΔ5-DESをコードする遺伝子としては、配列番号４７で表される塩基配列からなるＤＮＡからなる遺伝子、又は配列番号４７で表される塩基配列との同一性が６０％以上（好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上）の塩基配列からなり、かつΔ5-DES活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡからなる遺伝子が挙げられる。
本明細書において「Δ9-DES」とは、ステアリン酸（以下、「C18:0」とも表記する）のΔ9位に不飽和結合を導入し、オレイン酸を生成する反応を触媒するタンパク質（酵素）を意味する。そして本明細書において本明細書において「Δ9-デサチュラーゼ活性（以下、「Δ9-DES活性」ともいう」」とは、ステアリン酸のΔ9位に不飽和結合を導入する活性を意味する。タンパク質がΔ9-DES活性を有することは、例えば、Δ9-DES合成遺伝子欠損株を用いた系により確認することができる。あるいは、宿主細胞内で機能するプロモーターの下流に前記タンパク質をコードする遺伝子を連結したＤＮＡをΔ9-DES合成遺伝子欠損株に導入し、オレイン酸の生成を検討することで確認できる。あるいは、Δ9-DES又はこれを含有する細胞破砕液を調製し、ステアリン酸、ステアロイルＣｏＡなどを含む反応液と反応させ、常法に従いステアリン酸量の減少又はオレイン量の増加を測定することで確認できる。
本発明で好ましく用いることができるΔ9-DESは、通常のΔ9-DESや、それらと機能的に均等なタンパク質から、宿主の種類等に応じて適宜選択することができる。例えば、ナンノクロロプシス・オキュラータ由来のΔ9-DES（以下、「NoΔ9-DES」ともいう）（配列番号４８）やナンノクロロプシス・ガディタナ由来のΔ9-DES（以下、「NgΔ9-DES」ともいう）（配列番号５０）等が挙げられる。また、これと機能的に均等なタンパク質として、NoΔ9-DESやNgΔ9-DESのアミノ酸配列との同一性が６０％以上（好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上）のアミノ酸配列からなり、かつΔ9-DES活性を有するタンパク質も用いることができる。NoΔ9-DESをコードする遺伝子としては、配列番号４９で表される塩基配列からなるＤＮＡからなる遺伝子、又は配列番号４９で表される塩基配列との同一性が６０％以上（好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上）の塩基配列からなり、かつΔ9-DES活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡからなる遺伝子が挙げられる。NgΔ9-DESをコードする遺伝子としては、配列番号５１で表される塩基配列からなるＤＮＡからなる遺伝子、又は配列番号５１で表される塩基配列との同一性が６０％以上（好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上）の塩基配列からなり、かつΔ9-DES活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡからなる遺伝子が挙げられる。
また、これらデサチュラーゼ遺伝子やエロンガーゼ遺伝子の発現を促進させた形質転換体は、常法により作製できる。例えば、前述のKAS遺伝子の発現を促進させる方法と同様、デサチュラーゼ又はエロンガーゼをコードする遺伝子を宿主に導入する方法、デサチュラーゼ又はエロンガーゼをコードする遺伝子をゲノム上に有する宿主において当該遺伝子の発現調節領域を改変する方法、などにより形質転換体を作製することができる。
本発明の形質転換体は、長鎖脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質の生産性が、前記タンパク質（Ａ）又は（Ｂ）をコードする遺伝子の発現が促進されていない宿主と比較して向上している。したがって、本発明の形質転換体を適切な条件で培養し、次いで得られた培養物又は生育物から長鎖脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質を回収すれば、長鎖脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質を効率のよく製造することができる。ここで「培養物」とは培養した後の培養液及び形質転換体をいい、「生育物」とは生育した後の形質転換体をいう。
本発明の形質転換体の培養条件は、宿主に応じて適宜選択することができ、その宿主に対して通常用いられる培養条件を使用できる。また脂肪酸の生産効率の点から、培地中に、例えば脂肪酸生合成系に関与する前駆物質としてグリセロール、酢酸、又はグルコース等を添加してもよい。
宿主として大腸菌を用いる場合、大腸菌の培養は、例えば、ＬＢ培地又はOvernight Express Instant TB Medium（Novagen社）で、３０〜３７℃、０．５〜１日間培養することができる。
また、宿主としてシロイヌナズナを用いる場合、シロイヌナズナの培養は、例えば、土壌で温度条件２０〜２５℃、白色光を連続照射又は明期１６時間・暗期８時間等の光条件下で１〜２か月間栽培することができる。
宿主として藻類を用いる場合、培地は天然海水又は人工海水をベースにしたものを使用してもよいし、市販の培養培地を使用してもよい。具体的な培地としては、ｆ／２培地、ＥＳＭ培地、ダイゴＩＭＫ培地、Ｌ１培地、ＭＮＫ培地、等を挙げることができる。なかでも、脂質の生産性向上及び栄養成分濃度の観点から、ｆ／２培地、ＥＳＭ培地、又はダイゴＩＭＫ培地が好ましく、ｆ／２培地、又はダイゴＩＭＫ培地がより好ましく、ｆ／２培地がさらに好ましい。藻類の生育促進、脂肪酸の生産性向上のため、培地に、窒素源、リン源、金属塩、ビタミン類、微量金属等を適宜添加することができる。
培地に接種する形質転換体の量は適宜選択することができ、生育性の点から培地当り１〜５０％（vol/vol）が好ましく、１〜１０％（vol/vol）がより好ましい。培養温度は、藻類の増殖に悪影響を与えない範囲であれば特に制限されないが、通常、５〜４０℃の範囲である。藻類の生育促進、脂肪酸の生産性向上、及び生産コストの低減の観点から、好ましくは１０〜３５℃であり、より好ましくは１５〜３０℃である。
また藻類の培養は、光合成ができるよう光照射下で行うことが好ましい。光照射は、光合成が可能な条件であればよく、人工光でも太陽光でもよい。光照射時の照度としては、藻類の生育促進、脂肪酸の生産性向上の観点から、好ましくは１００〜５００００ルクスの範囲、より好ましくは３００〜１００００ルクスの範囲、さらに好ましくは１０００〜６０００ルクスの範囲である。また、光照射の間隔は、特に制限されないが、前記と同様の観点から、明暗周期で行うことが好ましく、２４時間のうち明期が好ましくは８〜２４時間、より好ましくは１０〜１８時間、さらに好ましくは１２時間である。
また藻類の培養は、光合成ができるように二酸化炭素を含む気体の存在下、又は炭酸水素ナトリウムなどの炭酸塩を含む培地で行うことが好ましい。気体中の二酸化炭素の濃度は特に限定されないが、生育促進、脂肪酸の生産性向上の観点から０．０３（大気条件と同程度）〜１０％が好ましく、より好ましくは０．０５〜５％、さらに好ましくは０．１〜３％、よりさらに好ましくは０．３〜１％である。炭酸塩の濃度は特に限定されないが、例えば炭酸水素ナトリウムを用いる場合、生育促進、脂肪酸の生産性向上の観点から０．０１〜５質量％が好ましく、より好ましくは０．０５〜２質量％、さらに好ましくは０．１〜１質量％である。
培養時間は特に限定されず、脂質を高濃度に蓄積する藻体が高い濃度で増殖できるように、長期間（例えば１５０日程度）行なってもよい。藻類の生育促進、脂肪酸の生産性向上、及び生産コストの低減の観点から、培養期間は、好ましくは３〜９０日間、より好ましくは３〜３０日間、さらに好ましくは７〜３０日間である。なお、培養は、通気攪拌培養、振とう培養又は静置培養のいずれでもよく、通気性の向上の観点から、通気撹拌培養又は振とう培養が好ましく、通気撹拌培養がより好ましい。
培養物又は生育物から脂質を採取する方法としては、常法から適宜選択することができる。例えば、前述の培養物又は生育物から、ろ過、遠心分離、細胞の破砕、ゲルろ過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、クロロホルム／メタノール抽出法、ヘキサン抽出法、又はエタノール抽出法等により脂質成分を単離、回収することができる。より大規模な培養を行った場合は、培養物又は生育物より油分を圧搾又は抽出により回収後、脱ガム、脱酸、脱色、脱蝋、脱臭等の一般的な精製を行い、脂質を得ることができる。このように脂質成分を単離した後、単離した脂質を加水分解することで脂肪酸を得ることができる。脂質成分から脂肪酸を単離する方法としては、例えば、アルカリ溶液中で７０℃程度の高温で処理をする方法、リパーゼ処理をする方法、又は高圧熱水を用いて分解する方法等が挙げられる。
本発明の製造方法において製造される脂質は、その利用性の点から、脂肪酸又は脂肪酸化合物を含んでいることが好ましく、脂肪酸又は脂肪酸エステル化合物を含んでいることがさらに好ましい。
脂質中に含まれる脂肪酸又は脂肪酸エステル化合物は、界面活性剤等への利用性や栄養学的観点から、長鎖脂肪酸又はそのエステル化合物が好ましく、炭素原子数１８以上の脂肪酸又はそのエステル化合物がより好ましく、炭素原子数１８〜２２の脂肪酸又はそのエステル化合物がより好ましく、炭素原子数１８〜２０の脂肪酸又はそのエステル化合物がより好ましく、炭素原子数１８若しくは２０の脂肪酸又はそのエステル化合物がさらに好ましく、炭素原子数１８若しくは２０の不飽和脂肪酸又はそのエステル化合物がさらに好ましく、Ｃ１８：１、Ｃ１８：２、Ｃ１８：３、Ｃ２０：４若しくはＣ２０：５、又はそのエステル化合物がより好ましく、炭素原子数１８若しくは２０のＰＵＦＡ又はそのエステル化合物がより好ましく、炭素原子数２０のＰＵＦＡ又はそのエステル化合物がより好ましく、Ｃ２０：４若しくはＣ２０：５、又はそのエステル化合物がより好ましく、EPA又はそのエステル化合物がより好ましい。
脂肪酸エステル化合物は、生産性の点から、単純脂質又は複合脂質が好ましく、単純脂質がさらに好ましく、トリアシルグリセロールがさらにより好ましい。
本発明の製造方法により得られる脂質は、食用として用いる他、可塑剤、化粧品等の乳化剤、石鹸や洗剤等の洗浄剤、繊維処理剤、毛髪リンス剤、又は殺菌剤や防腐剤として利用することができる。
上述した実施形態に関し、本発明はさらに以下の脂質の製造方法、脂質生産性の向上方法、生産される脂肪酸の組成を改変する方法、タンパク質、遺伝子、組換えベクター、生物、形質転換体、及び形質転換体の作製方法を開示する。
＜１＞下記タンパク質（Ａ）又は（Ｂ）をコードする遺伝子の発現を促進させた形質転換体を培養し、脂肪酸、好ましくは長鎖脂肪酸、より好ましくは炭素原子数１８以上の脂肪酸、より好ましくは炭素原子数１８〜２２の脂肪酸、より好ましくは炭素原子数１８〜２０の脂肪酸、より好ましくは炭素原子数１８若しくは２０の脂肪酸、より好ましくは炭素原子数１８若しくは２０の不飽和脂肪酸、より好ましくはＣ１８：１、Ｃ１８：２、Ｃ１８：３、Ｃ２０：４若しくはＣ２０：５、より好ましくは炭素原子数１８若しくは２０のＰＵＦＡ、より好ましくは炭素原子数２０のＰＵＦＡ、より好ましくはＣ２０：４若しくはＣ２０：５、より好ましくはEPA、又はこれを構成成分とする脂質を生産させる、脂質の製造方法。
（Ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
（Ｂ）前記タンパク質（Ａ）のアミノ酸配列と同一性が７０％以上、好ましくは７５％以上、より好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９２％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９８％以上、さらに好ましくは９９％以上、のアミノ酸配列からなり、かつKAS活性を有するタンパク質。
＜２＞前記タンパク質（Ａ）又は（Ｂ）をコードする遺伝子の発現を促進させ、形質転換体の細胞内で生産される長鎖脂肪酸、好ましくは炭素原子数１８以上の脂肪酸、より好ましくは炭素原子数１８〜２２の脂肪酸、より好ましくは炭素原子数１８〜２０の脂肪酸、より好ましくは炭素原子数１８若しくは２０の脂肪酸、より好ましくは炭素原子数１８若しくは２０の不飽和脂肪酸、より好ましくはＣ１８：１、Ｃ１８：２、Ｃ１８：３、Ｃ２０：４若しくはＣ２０：５、より好ましくは炭素原子数１８若しくは２０のＰＵＦＡ、より好ましくは炭素原子数２０のＰＵＦＡ、より好ましくはＣ２０：４若しくはＣ２０：５、より好ましくはEPA、又はこれを構成成分とする脂質の生産性を向上させる、脂質生産性の向上方法。
＜３＞前記タンパク質（Ａ）又は（Ｂ）をコードする遺伝子の発現を促進させて、形質転換体の細胞内で生産される長鎖脂肪酸、好ましくは長鎖脂肪酸、より好ましくは炭素原子数１８以上の脂肪酸、より好ましくは炭素原子数１８〜２２の脂肪酸、より好ましくは炭素原子数１８〜２０の脂肪酸、より好ましくは炭素原子数１８若しくは２０の脂肪酸、より好ましくは炭素原子数１８若しくは２０の不飽和脂肪酸、より好ましくはＣ１８：１、Ｃ１８：２、Ｃ１８：３、Ｃ２０：４若しくはＣ２０：５、より好ましくは炭素原子数１８若しくは２０のＰＵＦＡ、より好ましくは炭素原子数２０のＰＵＦＡ、より好ましくはＣ２０：４若しくはＣ２０：５、より好ましくはEPA、又はこれを構成成分とする脂質の生産性を向上させ、生産される全脂肪酸中又は全脂質中の脂肪酸又は脂質の組成を改変する、脂質の組成の改変方法。
＜４＞前記タンパク質（Ａ）又は（Ｂ）をコードする遺伝子の発現を促進させた形質転換体を培養し、脂肪酸、及びそのエステル化合物を構成する脂肪酸エステルの総量に占める、長鎖脂肪酸（好ましくは炭素原子数１８以上の脂肪酸、より好ましくは炭素原子数１８〜２２の脂肪酸、より好ましくは炭素原子数１８〜２０の脂肪酸、より好ましくは炭素原子数１８若しくは２０の脂肪酸、より好ましくは炭素原子数１８若しくは２０の不飽和脂肪酸、より好ましくはＣ１８：１、Ｃ１８：２、Ｃ１８：３、Ｃ２０：４若しくはＣ２０：５、より好ましくは炭素原子数１８若しくは２０のＰＵＦＡ、より好ましくは炭素原子数２０のＰＵＦＡ、より好ましくはＣ２０：４若しくはＣ２０：５、より好ましくはEPA）量及びそのエステル化合物量の比率を向上させる方法。
＜５＞前記タンパク質（Ａ）又は（Ｂ）をコードする遺伝子を宿主に導入して前記遺伝子の発現を促進させる、前記＜１＞〜＜４＞のいずれか１項記載の方法。
＜６＞前記タンパク質（Ａ）又は（Ｂ）をコードする遺伝子を導入した形質転換体を培養し、脂肪酸、好ましくは長鎖脂肪酸、より好ましくは炭素原子数１８以上の脂肪酸、より好ましくは炭素原子数１８〜２２の脂肪酸、より好ましくは炭素原子数１８〜２０の脂肪酸、より好ましくは炭素原子数１８若しくは２０の脂肪酸、より好ましくは炭素原子数１８若しくは２０の不飽和脂肪酸、より好ましくはＣ１８：１、Ｃ１８：２、Ｃ１８：３、Ｃ２０：４若しくはＣ２０：５、より好ましくは炭素原子数１８若しくは２０のＰＵＦＡ、より好ましくは炭素原子数２０のＰＵＦＡ、より好ましくはＣ２０：４若しくはＣ２０：５、より好ましくはEPA、又はこれを構成成分とする脂質を生産させる、脂質の製造方法。
＜７＞前記タンパク質（Ａ）又は（Ｂ）をコードする遺伝子を宿主に導入して形質転換体を作製し、形質転換体の細胞内で生産される長鎖脂肪酸、好ましくは炭素原子数１８以上の脂肪酸、より好ましくは炭素原子数１８〜２２の脂肪酸、より好ましくは炭素原子数１８〜２０の脂肪酸、より好ましくは炭素原子数１８若しくは２０の脂肪酸、より好ましくは炭素原子数１８若しくは２０の不飽和脂肪酸、より好ましくはＣ１８：１、Ｃ１８：２、Ｃ１８：３、Ｃ２０：４若しくはＣ２０：５、より好ましくは炭素原子数１８若しくは２０のＰＵＦＡ、より好ましくは炭素原子数２０のＰＵＦＡ、より好ましくはＣ２０：４若しくはＣ２０：５、より好ましくはEPA、又はこれを構成成分とする脂質の生産性を向上させる、脂質生産性の向上方法。
＜８＞前記タンパク質（Ａ）又は（Ｂ）をコードする遺伝子を導入して形質転換体を作製し、形質転換体の細胞内で生産される長鎖脂肪酸、好ましくは炭素原子数１８以上の脂肪酸、より好ましくは炭素原子数１８〜２２の脂肪酸、より好ましくは炭素原子数１８〜２０の脂肪酸、より好ましくは炭素原子数１８若しくは２０の脂肪酸、より好ましくは炭素原子数１８若しくは２０の不飽和脂肪酸、より好ましくはＣ１８：１、Ｃ１８：２、Ｃ１８：３、Ｃ２０：４若しくはＣ２０：５、より好ましくは炭素原子数１８若しくは２０のＰＵＦＡ、より好ましくは炭素原子数２０のＰＵＦＡ、より好ましくはＣ２０：４若しくはＣ２０：５、より好ましくはEPA、又はこれを構成成分とする脂質の生産性を向上させ、生産される全脂肪酸中又は全脂質中の脂肪酸又は脂質の組成を改変する、脂質の組成の改変方法。
＜９＞前記タンパク質（Ａ）又は（Ｂ）をコードする遺伝子を導入した形質転換体を培養し、脂肪酸、及びそのエステル化合物を構成する脂肪酸エステルの総量に占める、長鎖脂肪酸（好ましくは炭素原子数１８以上の脂肪酸、より好ましくは炭素原子数１８〜２２の脂肪酸、より好ましくは炭素原子数１８〜２０の脂肪酸、より好ましくは炭素原子数１８若しくは２０の脂肪酸、より好ましくは炭素原子数１８若しくは２０の不飽和脂肪酸、より好ましくはＣ１８：１、Ｃ１８：２、Ｃ１８：３、Ｃ２０：４若しくはＣ２０：５、より好ましくは炭素原子数１８若しくは２０のＰＵＦＡ、より好ましくは炭素原子数２０のＰＵＦＡ、より好ましくはＣ２０：４若しくはＣ２０：５、より好ましくはEPA）量及びそのエステル化合物量の比率を向上させる方法。
＜１０＞前記タンパク質（Ｂ）が、前記タンパク質（Ａ）のアミノ酸配列に、１又は複数個、好ましくは１個以上１４２個以下、より好ましくは１個以上１１８個以下、より好ましくは１個以上９５個以下、より好ましくは１個以上７１個以下、より好ましくは１個以上４７個以下、より好ましくは１個以上３８個以下、より好ましくは１個以上２３個以下、より好ましくは１個以上９個以下、さらに好ましくは１個以上４個以下、のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたタンパク質である、前記＜１＞〜＜９＞のいずれか１項記載の方法。
＜１１＞前記タンパク質（Ｂ）が、前記タンパク質（Ａ）のアミノ酸配列と同一性が９２％以上のアミノ酸配列からなり、かつKAS活性を有するタンパク質である、前記＜１＞〜＜１０＞のいずれか１項記載の方法。
＜１２＞前記タンパク質（Ａ）又は（Ｂ）をコードする遺伝子が、下記ＤＮＡ（ａ）又は（ｂ）からなる遺伝子である、前記＜１＞〜＜１１＞のいずれか１項記載の方法。
（ａ）配列番号２で表される塩基配列からなるＤＮＡ。
（ｂ）前記ＤＮＡ（ａ）の塩基配列と同一性が７０％以上、好ましくは７５％以上、より好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９２％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９８％以上、さらに好ましくは９９％以上、の塩基配列からなり、かつKAS活性を有する前記タンパク質（Ａ）又は（Ｂ）をコードするＤＮＡ。
＜１３＞前記ＤＮＡ（ｂ）が、前記ＤＮＡ（ａ）の塩基配列に、１若しくは複数個、好ましくは１個以上４２８個以下、より好ましくは１個以上３５７個以下、より好ましくは１個以上２８５個以下、より好ましくは１個以上２１４個以下、より好ましくは１個以上１４２個以下、より好ましくは１個以上１１４個以下、より好ましくは１個以上７１個以下、より好ましくは１個以上２８個以下、よりさらに好ましくは１個以上１４個以下、の塩基が欠失、置換、挿入、若しくは付加された塩基配列からなり、かつKAS活性を有する前記タンパク質（Ａ）又は（Ｂ）をコードするＤＮＡ、又は前記ＤＮＡ（ａ）と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつKAS活性を有する前記タンパク質（Ａ）又は（Ｂ）をコードするＤＮＡである、前記＜１＞〜＜１２＞のいずれか１項記載の方法。
＜１４＞前記タンパク質（Ａ）及び（Ｂ）が、長鎖β−ケトアシル−ＡＣＰ合成活性を有するKASである、前記＜１＞〜＜１３＞のいずれか１項記載の方法。
＜１５＞前記形質転換体において、TEをコードする遺伝子の発現を促進させた、前記＜１＞〜＜１４＞のいずれか１項記載の方法。
＜１６＞前記形質転換体において、デサチュラーゼをコードする遺伝子の発現を促進させた、前記＜１＞〜＜１５＞のいずれか１項記載の方法。
＜１７＞デサチュラーゼをコードする遺伝子を前記形質転換体に導入した、前記＜１＞〜＜１６＞のいずれか１項記載の方法。
＜１８＞前記デサチュラーゼが、Δ12-DES、Δ6-DES、ω3-DES、Δ5-DES、及びΔ9-DESからなる群より選ばれる少なくとも１つのデサチュラーゼである、前記＜１６＞又は＜１７＞項記載の方法。
＜１９＞前記Δ12-DESが、配列番号３２若しくは３４で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質、又は配列番号３２若しくは３４で表されるアミノ酸配列と同一性が６０％以上、好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、のアミノ酸配列からなり、かつΔ12-DES活性を有するタンパク質である、前記＜１８＞項記載の方法。
＜２０＞前記Δ12-DESをコードする遺伝子が、配列番号３３若しくは３５で表される塩基配列からなるＤＮＡからなる遺伝子、又は配列番号３３若しくは３５で表される塩基配列との同一性が６０％以上、好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、の塩基配列からなり、かつΔ12-DES活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡからなる遺伝子である、前記＜１８＞又は＜１９＞項記載の方法。
＜２１＞前記Δ6-DESが、配列番号３６若しくは３８で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質、又は配列番号３６若しくは３８で表されるアミノ酸配列と同一性が６０％以上、好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、のアミノ酸配列からなり、かつΔ6-DES活性を有するタンパク質である、前記＜１８＞〜＜２０＞のいずれか１項記載の方法。
＜２２＞前記Δ6-DESをコードする遺伝子が、配列番号３７若しくは３９で表される塩基配列からなるＤＮＡからなる遺伝子、又は配列番号３７若しくは３９で表される塩基配列との同一性が６０％以上、好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、の塩基配列からなり、かつΔ6-DES活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡからなる遺伝子である、前記＜１８＞〜＜２１＞のいずれか１項記載の方法。
＜２３＞前記ω3-DESが、配列番号４０若しくは４２で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質、又は配列番号４０若しくは４２で表されるアミノ酸配列と同一性が６０％以上、好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、のアミノ酸配列からなり、かつω3-DES活性を有するタンパク質である、前記＜１８＞〜＜２２＞のいずれか１項記載の方法。
＜２４＞前記ω3-DESをコードする遺伝子が、配列番号４１若しくは４３で表される塩基配列からなるＤＮＡからなる遺伝子、又は配列番号４１若しくは４３で表される塩基配列との同一性が６０％以上、好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、の塩基配列からなり、かつω3-DES活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡからなる遺伝子である、前記＜１８＞〜＜２３＞のいずれか１項記載の方法。
＜２５＞前記Δ5-DESが、配列番号４４若しくは４６で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質、又は配列番号４４若しくは４６で表されるアミノ酸配列と同一性が６０％以上、好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、のアミノ酸配列からなり、かつΔ5-DES活性を有するタンパク質である、前記＜１８＞〜＜２４＞のいずれか１項記載の方法。
＜２６＞前記Δ5-DESをコードする遺伝子が、配列番号４５若しくは４７で表される塩基配列からなるＤＮＡからなる遺伝子、又は配列番号４５若しくは４７で表される塩基配列との同一性が６０％以上、好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、の塩基配列からなり、かつΔ5-DES活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡからなる遺伝子である、前記＜１８＞〜＜２５＞のいずれか１項記載の方法。
＜２７＞前記Δ9-DESが、配列番号４８若しくは５０で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質、又は配列番号４８若しくは５０で表されるアミノ酸配列と同一性が６０％以上、好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、のアミノ酸配列からなり、かつΔ9-DES活性を有するタンパク質である、前記＜１８＞〜＜２６＞のいずれか１項記載の方法。
＜２８＞前記Δ9-DESをコードする遺伝子が、配列番号４９若しくは５１で表される塩基配列からなるＤＮＡからなる遺伝子、又は配列番号４９若しくは５１で表される塩基配列との同一性が６０％以上、好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、の塩基配列からなり、かつΔ9-DES活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡからなる遺伝子である、前記＜１８＞〜＜２７＞のいずれか１項記載の方法。
＜２９＞前記形質転換体において、エロンガーゼをコードする遺伝子の発現を促進させた、前記＜１＞〜＜２８＞のいずれか１項記載の方法。
＜３０＞前記形質転換体が微生物又は植物である、前記＜１＞〜＜２９＞のいずれか１項記載の方法。
＜３１＞前記微生物が微細藻類、好ましくはナンノクロロプシス属に属する藻類、より好ましくはナンノクロロプシス・オキュラータ、である、前記＜３０＞項記載の方法。
＜３２＞前記微生物が大腸菌である、前記＜３０＞項記載の方法。
＜３３＞前記植物がシロイヌナズナである、前記＜３０＞項記載の方法。
＜３４＞前記脂質が、長鎖脂肪酸又はそのエステル化合物、好ましくは炭素原子数１８以上の脂肪酸又はそのエステル化合物、より好ましくは炭素原子数１８〜２２の脂肪酸又はそのエステル化合物、より好ましくは炭素原子数１８〜２０の脂肪酸又はそのエステル化合物、より好ましくは炭素原子数１８若しくは２０の脂肪酸又はそのエステル化合物、より好ましくは炭素原子数１８若しくは２０の不飽和脂肪酸又はそのエステル化合物、より好ましくはＣ１８：１、Ｃ１８：２、Ｃ１８：３、Ｃ２０：４若しくはＣ２０：５、又はそのエステル化合物、より好ましくは炭素原子数１８若しくは２０のＰＵＦＡ又はそのエステル化合物、より好ましくは炭素原子数２０のＰＵＦＡ又はそのエステル化合物、より好ましくはＣ２０：４若しくはＣ２０：５又はそのエステル化合物、よりさらに好ましくはEPA又はそのエステル化合物、を含む、前記＜１＞〜＜３３＞のいずれか１項記載の方法。
＜３５＞前記長鎖脂肪酸が長鎖多価不飽和脂肪酸である、前記＜１＞〜＜３４＞のいずれか１項記載の方法。
＜３６＞前記＜１＞〜＜３５＞のいずれか１項で規定した、前記タンパク質（Ａ）又は（Ｂ）。
＜３７＞前記＜３６＞項記載のタンパク質をコードする遺伝子。
＜３８＞前記＜１＞〜＜３５＞のいずれか１項で規定した、前記ＤＮＡ（ａ）又は（ｂ）からなる遺伝子。
＜３９＞前記＜３７＞又は＜３８＞項記載の遺伝子を含有する、組換えベクター。
＜４０＞前記＜３７＞又は＜３８＞項記載の遺伝子の発現を促進させた形質転換体。
＜４１＞長鎖脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質の生産性が、宿主と比較して向上している、前記＜４０＞項記載の形質転換体。
＜４２＞前記＜３７＞若しくは＜３８＞項記載の遺伝子、又は前記＜３９＞項記載の組換えベクターを宿主に導入してなる、形質転換体。
＜４３＞前記＜３７＞若しくは＜３８＞項記載の遺伝子、又は前記＜３９＞項記載の組換えベクターを宿主に導入する、形質転換体の作製方法。
＜４４＞TEをコードする遺伝子の発現を促進させた、前記＜４０＞〜＜４３＞のいずれか１項記載の形質転換体又はその作製方法。
＜４５＞デサチュラーゼをコードする遺伝子の発現を促進させた、前記＜４０＞〜＜４４＞のいずれか１項記載の形質転換体又はその作製方法。
＜４６＞デサチュラーゼをコードする遺伝子を形質転換体に導入した、前記＜４０＞〜＜４５＞のいずれか１項記載の形質転換体又はその作製方法。
＜４７＞前記デサチュラーゼが、Δ12-DES、Δ6-DES、ω3-DES、Δ5-DES、及びΔ9-DESからなる群より選ばれる少なくとも１つのデサチュラーゼである、前記＜４５＞又は＜４６＞項記載の形質転換体又はその作製方法。
＜４８＞前記デサチュラーゼ、又はデサチュラーゼをコードする遺伝子が、前記＜１９＞〜＜２８＞項のいずれか１項で規定したデサチュラーゼ、又はデサチュラーゼをコードする遺伝子、である、前記＜４５＞〜＜４７＞のいずれか１項記載の形質転換体又はその作製方法。
＜４９＞エロンガーゼをコードする遺伝子の発現を促進させた、前記＜４０＞〜＜４８＞のいずれか１項記載の形質転換体又はその作製方法。
＜５０＞前記形質転換体又は宿主が微生物又は植物である、前記＜４０＞〜＜４９＞のいずれか１項記載の形質転換体又はその作製方法。
＜５１＞前記微生物が微細藻類、好ましくはナンノクロロプシス属に属する藻類、より好ましくはナンノクロロプシス・オキュラータ、である、前記＜５０＞項記載の形質転換体又はその作製方法。
＜５２＞前記微生物が大腸菌である、前記＜５０＞項記載の形質転換体又はその作製方法。
＜５３＞前記植物がシロイヌナズナである、前記＜５０＞項記載の形質転換体又はその作製方法。
＜５４＞脂質を製造するための、前記＜３６＞〜＜５３＞のいずれか１項記載のタンパク質、遺伝子、組換えベクター、形質転換体、又は形質転換体の作製方法により得られた形質転換体の使用。
＜５５＞前記脂質が、長鎖脂肪酸又はそのエステル化合物、好ましくは炭素原子数１８以上の脂肪酸又はそのエステル化合物、より好ましくは炭素原子数１８〜２２の脂肪酸又はそのエステル化合物、より好ましくは炭素原子数１８〜２０の脂肪酸又はそのエステル化合物、より好ましくは炭素原子数１８若しくは２０の脂肪酸又はそのエステル化合物、より好ましくは炭素原子数１８若しくは２０の不飽和脂肪酸又はそのエステル化合物、より好ましくはＣ１８：１、Ｃ１８：２、Ｃ１８：３、Ｃ２０：４若しくはＣ２０：５、又はそのエステル化合物、より好ましくは炭素原子数１８若しくは２０のＰＵＦＡ又はそのエステル化合物、より好ましくは炭素原子数２０のＰＵＦＡ又はそのエステル化合物、より好ましくはＣ２０：４若しくはＣ２０：５又はそのエステル化合物、よりさらに好ましくはEPA又はそのエステル化合物、を含む、前記＜５４＞項記載の使用。
＜５６＞前記長鎖脂肪酸が長鎖多価不飽和脂肪酸である、前記＜５５＞項記載の使用。
以下、本発明を実施例に基づきさらに詳細に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。ここで、本実施例で用いるプライマーの塩基配列を表１に示す。
Figure 0006785769
実施例１ NoKASII遺伝子をナンノクロロプシス・オキュラータに導入した形質転換体の作製、及び形質転換体による脂肪酸の生産
（１）ゼオシン耐性遺伝子発現用プラスミドの構築
ゼオシン耐性遺伝子（配列番号３）、及び文献（Randor Radakovits，et al.，Nature Communications，DOI:10.1038/ncomms1688，2012）に記載されている、ナンノクロロプシス・ガディタナCCMP526株由来のチューブリンプロモーター配列（配列番号４）を人工合成した。
合成したＤＮＡ断片を鋳型として、表１に示すプライマー番号８及びプライマー番号９のプライマー対、並びにプライマー番号１０及びプライマー番号１１のプライマー対をそれぞれ用いてPCRを行い、ゼオシン耐性遺伝子及びチューブリンプロモーター配列をそれぞれ増幅した。
また、ナンノクロロプシス・オキュラータNIES2145株のゲノムを鋳型として、表１に示すプライマー番号１２及びプライマー番号１３のプライマー対を用いてPCRを行い、ヒートショックプロテインターミネーター配列（配列番号５）を増幅した。
さらに、プラスミドベクターpUC19（タカラバイオ社製）を鋳型として、表１に示すプライマー番号１４及びプライマー番号１５のプライマー対を用いたPCRを行い、プラスミドベクターpUC19を増幅した。
これら４つの増幅断片をそれぞれ制限酵素DpnI（東洋紡株式会社製）にて処理し、High Pure PCR Product Purification Kit（Roche Applied Science社製)を用いて精製した。その後、得られた４つの断片をIn-Fusion HD Cloning Kit（Clontech社製）を用いて融合し、ゼオシン耐性遺伝子発現用プラスミドを構築した。
なお、本発現プラスミドは、チューブリンプロモーター配列、ゼオシン耐性遺伝子、ヒートショックプロテインターミネーター配列の順に連結したインサート配列と、pUC19ベクター配列からなる。
（２）NoKASII遺伝子の取得、及びNoKASII遺伝子発現用プラスミドの構築
ナンノクロロプシス・オキュラータNIES2145株（独立行政法人国立環境研究所(NIES)より入手）の全ＲＮＡを抽出し、SuperScript（商標）III First-Strand Synthesis SuperMix for qRT-PCR（invitrogen社製）を用いて逆転写を行ってcDNAを得た。このcDNAを鋳型として、表１に示すプライマー番号１６及びプライマー番号１７のプライマー対を用いたPCRにより、配列番号２に示す塩基配列からなる遺伝子断片を取得した。
また、ナンノクロロプシス・オキュラータNIES2145株のゲノムを鋳型として、表１に示すプライマー番号１８及びプライマー番号１９のプライマー対、並びにプライマー番号２０及びプライマー番号２１のプライマー対をそれぞれ用いたPCRを行い、ＬＤＳＰのプロモーター配列（配列番号６）及びＶＣＰ１（violaxanthin/chlorophyll a-binding protein 1）のターミネーター配列（配列番号７）を取得した。
さらに、前述のゼオシン耐性遺伝子発現用プラスミドを鋳型として、表１に示すプライマー番号２２及びプライマー番号１５のプライマー対を用いたPCRを行い、ゼオシン耐性遺伝子発現カセット（チューブリンプロモーター配列、ゼオシン耐性遺伝子、ヒートショックプロテインターミネーター配列）及びpUC19ベクター配列からなる断片を増幅した。
これら４つの増幅断片を、前述の方法と同様の方法にて融合し、NoKASII遺伝子発現用プラスミドを構築した。
なお、本発現プラスミドは、ＬＤＳＰプロモーター配列、NoKASII遺伝子、VCP1ターミネーター配列、チューブリンプロモーター配列、ゼオシン耐性遺伝子、ヒートショックプロテインターミネーター配列の順で連結したインサート配列と、pUC19ベクター配列からなる。
（３）NoKASII遺伝子発現カセットのナンノクロロプシスへの導入
前記NoKASII遺伝子発現用プラスミドを鋳型として、表１に示すプライマー番号１３及びプライマー番号１８のプライマー対を用いたPCRを行い、NoKASII遺伝子発現カセット（ＬＤＳＰプロモーター配列、NoKASII遺伝子、VCP1ターミネーター配列、チューブリンプロモーター配列、ゼオシン耐性遺伝子、ヒートショックプロテインターミネーター配列からなるＤＮＡ断片）を増幅した。
増幅したＤＮＡ断片を、High Pure PCR Product Purification Kit（Roche Applied Science社製）を用いて精製した。なお、精製の際の溶出には、キットに含まれる溶出バッファーではなく、滅菌水を用いた。
約1×109細胞のナンノクロロプシス・オキュラータNIES2145株（独立行政法人国立環境研究所(NIES)より入手）を、384mMのソルビトール溶液で洗浄して塩を完全に除去し、形質転換の宿主細胞として用いた。上記で増幅したNoKASII遺伝子発現カセット約500ngを宿主細胞と混和し、50μF、500Ω、2,200v/2mmの条件でエレクトロポレーションを行った。
ｆ／２液体培地（NaNO3 75mg、NaH2PO4・2H2O 6mg、ビタミンB12 0.5μg、ビオチン 0.5μg、チアミン 100μg、Na2SiO3・9H2O 10mg、Na2EDTA・2H2O 4.4mg、FeCl3・6H2O 3.16mg、FeCl3・6H2O 12μg、ZnSO4・7H2O 21μg、MnCl2・4H2O 180μg、CuSO4・5H2O 7μg、Na2MoO4・2H2O 7μg／人工海水1L）にて１日間回復培養を行った。その後に、2μg/mLのゼオシン含有ｆ／２寒天培地に塗布し、25℃、0.3%CO2雰囲気下、12h/12h明暗条件にて3週間培養した。得られたコロニーの中から、NoKASII遺伝子発現カセットを含むナンノクロロプシス・オキュラータ株をPCR法により選抜した（独立した２ラインを取得）。
（４）形質転換体の培養、培養液中の脂質の抽出、及び構成脂肪酸の分析
選抜した株を、ｆ／２培地の窒素濃度を１５倍、リン濃度を5倍に増強した培地（以下、「Ｎ１５Ｐ５培地」という）20mLに播種し、25℃、0.3%CO2雰囲気下、12h/12h明暗条件にて４週間振盪培養し、前培養液とした。前培養液2mLを、Ｎ１５Ｐ５培地18mLに植継ぎ、25℃、0.3%CO2雰囲気下、12h/12h明暗条件にて３週間振盪培養した。なお、陰性対照として、野生株であるナンノクロロプシス・オキュラータNIES2145株についても同様に実験を行った。
培養液1mLに、内部標準として1mg/mLの7-ペンタデカノン50μLを添加後、クロロホルム0.5mL、及びメタノール1mLを培養液に添加して激しく攪拌し、10分間放置した。その後さらに、クロロホルム0.5mL及び1.5%KCl 0.5mLを添加して攪拌し、3,000rpmにて5分間間遠心分離を行い、パスツールピペットにてクロロホルム層（下層）を回収した。
得られたクロロホルム層に窒素ガスを吹き付けて乾固し、14%三フッ化ホウ素−メタノール溶液（SIGMA社製）1mLを添加し、80℃にて30分間恒温した。その後、ヘキサン0.5mL、飽和食塩水1mLを添加して激しく撹拌し、室温にて10分間放置し、上層であるヘキサン層を回収して脂肪酸メチルエステルを得た。
下記に示す測定条件下で、得られた脂肪酸メチルエステルをガスクロマトグラフィー解析に供した。
＜ガスクロマトグラフィー条件＞
分析装置：7890A（Agilent technology社製）
キャピラリーカラム：DB-WAX（10m×100μm×0.10μm、J＆W Scientific社製）
移動相：高純度ヘリウム
オーブン温度：100℃ 保持0.5分→100〜250℃（20℃/min昇温）→250℃保持3分（ポストラン：1分）
注入口温度：300℃
注入方法：スプリット注入（スプリット比：50：1）
注入量：5μＬ
洗浄バイアル：メタノール
検出方法：ＦＩＤ
検出器温度：350℃
脂肪酸メチルエステルの同定は、同サンプルを同条件でガスクロマトグラフ質量分析解析に供することにより行った。
ガスクロマトグラフィー解析により得られた波形データのピーク面積より、各脂肪酸のメチルエステル量を定量した。各ピーク面積を、内部標準である7-ペンタデカノンのピーク面積と比較することで試料間の補正を行い、培養液1Lあたりの各脂肪酸量を算出した。さらに、各脂肪酸量の総和を総脂肪酸量とし、総脂肪酸量に占める各脂肪酸量の割合を算出した。
その結果（各脂肪酸量の割合、及びＣ２０：５生産量）を表２に示す。なお、以下の表において、「脂肪酸組成（％ＴＦＡ）」は総脂肪酸の重量に対する各脂肪酸量の割合（重量パーセント）を示す。
Figure 0006785769
表２から明らかなように、NoKASII遺伝子発現カセットを導入し、NoKASII遺伝子を強制的に発現させた形質転換体２株（NoKASII_line1、NoKASII_line2）はいずれも、野生株（NIES2145）と比べ、生産された全脂肪酸の総量に対する、長鎖脂肪酸（Ｃ１８脂肪酸、及びＣ２０脂肪酸）の含有率が有意に増加した。特に、Ｃ１８：１、Ｃ１８：２、Ｃ１８：３、Ｃ２０：４、Ｃ２０：５（EPA）の含有率がより一層増加していた。
また、Ｃ２０：５生産量の結果から、NoKASII_line1、NoKASII_line2のいずれの株においても、野生株と比較してEPAの生産性が向上していた。
（５）ＴＡＧの分画、及びＴＡＧ中の構成脂肪酸の分析
前述の培養液1mLに、クロロホルム0.5mL、及びメタノール1mLを添加して激しく攪拌し、10分間放置した。その後さらに、クロロホルム0.5mL及び1.5%ＫＣｌ 0.5mLを添加して攪拌し、3,000rpmにて5分間間遠心分離を行い、パスツールピペットにてクロロホルム層（下層）を回収した。得られたクロロホルム層に窒素ガスを吹き付けて乾固し、クロロホルム20μLに溶解した。
このようにして得られた脂質抽出液全量、及び３種類の標準溶液｛トリミリスチン（和光純薬工業社製）、ジオレイン酸グリセロール（和光純薬工業社製）、オレイン酸（和光純薬工業社製）、10mg/mLクロロホルム溶液｝3μLをそれぞれTLCプレートシリカゲル60F254（メルク社製）上にスポットし、TLC展開槽DT-150（三菱化学メディエンス社製）を用い、展開溶媒（ヘキサン:ジエチルエーテル:ギ酸＝42：28：0.3（体積比））で約15分展開した。展開後プレートを乾燥させ、メタノールに溶解させた0.1%プリムリン（和光純薬工業社製）を噴霧して乾燥させた後、ハンデイ型UVランプUVL-21（相互理化学硝子製作所社製）でＴＡＧ画分を検出した。
爪楊枝を用いてＴＡＧ画分を掻き取り、14%三フッ化ホウ素−メタノール溶液（SIGMA社製）1mLを添加し、80℃にて30分間恒温した。その後、ヘキサン0.5mL、飽和食塩水1mLを添加し激しく撹拌し、室温にて10分間放置後、上層であるヘキサン層を回収して脂肪酸メチルエステルを得た。
前述の方法と同様の方法にて、得られた脂肪酸メチルエステルをガスクロマトグラフィー解析に供した。その結果を脂肪酸組成として表３に示す。
Figure 0006785769
表３から明らかなように、NoKASII遺伝子発現カセットを導入し、NoKASII遺伝子を強制的に発現させた形質転換体２株（NoKASII_line1, NoKASII_line2）はいずれも、野生株（NIES2145）と比べ、ＴＡＧ中の長鎖脂肪酸（Ｃ１８脂肪酸、及びＣ２０脂肪酸）の含有率が有意に増加した。特に、Ｃ１８：１、Ｃ１８：２、Ｃ１８：３、Ｃ２０：４、Ｃ２０：５（EPA）の含有率がより一層増加していた。なかでも、Ｃ２０：４及びＣ２０：５などのＰＵＦＡの含有率の増加が特に顕著であった。
さらに、ナンノクロロプシス・オキュラータは生育期にEPAを生産するものの、油脂蓄積期ではEPAは生産されない。よって、蓄積脂質であるＴＡＧ中には、EPAは約4%程度しか存在しないことが知られている。これに対して、NoKASII遺伝子を強制的に発現させた形質転換体ではTAG中にもEPAが多く取り込まれ、EPAの含有率が最大で19.5%にまで達した。
実施例２ NoKASII遺伝子及びデサチュラーゼ遺伝子をナンノクロロプシス・オキュラータに導入した形質転換体の作製、及び形質転換体による脂肪酸の生産
（１）デサチュラーゼ遺伝子の取得、及びデサチュラーゼ遺伝子発現用プラスミド（ゼオシン耐性）の構築
実施例１で取得したナンノクロロプシス・オキュラータNIES2145株のcDNAを鋳型として、表１に示すプライマー番号５２及びプライマー番号５３のプライマー対、並びにプライマー番号５４及びプライマー番号５５のプライマー対、をそれぞれ用いたPCRを行い、配列番号３３に示す塩基配列からなる遺伝子断片、及び配列番号４１に示す塩基配列からなる遺伝子断片、をそれぞれ取得した。
得られた増幅断片を、実施例１と同様の方法で、ＬＤＳＰプロモーター配列、VCP1ターミネーター配列、及びゼオシン耐性遺伝子発現カセットと融合し、NoΔ12-DES遺伝子発現用プラスミド及びNoω3-DES遺伝子発現用プラスミドをそれぞれ構築した。なお、本発現プラスミドは、ＬＤＳＰプロモーター配列、各デサチュラーゼ遺伝子、VCP1ターミネーター配列、チューブリンプロモーター配列、ゼオシン耐性遺伝子、ヒートショックプロテインターミネーター配列の順で連結したインサート配列と、pUC19ベクター配列からなる。
（２）デサチュラーゼ遺伝子発現用プラスミド（パロモマイシン耐性）の構築
人工合成したパロモマイシン耐性遺伝子（配列番号５６）を鋳型として、表１に示すプライマー番号５７及びプライマー番号５８のプライマー対を用いてPCRを行い、パロモマイシン耐性遺伝子断片を増幅した。
また、前記NoΔ12-DES遺伝子発現用プラスミド及びNoω3-DES遺伝子発現用プラスミドをそれぞれ鋳型として、表４に示すプライマー番号５９及びプライマー番号６０のプライマー対を用いたPCRを行った。得られた増幅断片をそれぞれパロモマイシン耐性遺伝子断片と融合し、NoΔ12-DES遺伝子発現用プラスミド（パロモマイシン耐性）及びNoω3-DES遺伝子発現用プラスミド（パロモマイシン耐性）をそれぞれ構築した。なお、本発現用プラスミドは、LDSPプロモーター配列、各デサチュラーゼ遺伝子、VCP1ターミネーター配列、チューブリンプロモーター配列、パロモマイシン耐性遺伝子、ヒートショックプロテインターミネーター配列の順で連結したインサート配列と、pUC19ベクター配列からなる。
（３）デサチュラーゼ遺伝子発現用プラスミド（パロモマイシン耐性）のNoKASII遺伝子導入株への導入
前記NoΔ12-DES遺伝子発現用プラスミド（パロモマイシン耐性）及びNoω3-DES遺伝子発現用プラスミド（パロモマイシン耐性）をそれぞれ鋳型として、表１に示すプライマー番号１３及びプライマー番号１８のプライマー対を用いたPCRを行い、デサチュラーゼ遺伝子発現カセット（ＬＤＳＰプロモーター配列、各デサチュラーゼ遺伝子、VCP1ターミネーター配列、チューブリンプロモーター配列、パロモマイシン耐性遺伝子、ヒートショックプロテインターミネーター配列からなるＤＮＡ断片）を増幅した。
増幅したＤＮＡ断片を、実施例１と同様の方法でそれぞれ精製し、実施例１で作製した形質転換体NoKASII_line2（以降、「NoKASII遺伝子導入株」ともいう）に、精製した断片をエレクトロポレーションによりそれぞれ導入した。
実施例１と同様の方法にて回復培養を行った後、2μg/mLゼオシン及び100μg/mLパロモマイシン含有ｆ／２寒天培地に塗布し、25℃、0.3%CO2雰囲気下、12h/12h明暗条件にて２〜３週間培養した。得られたコロニーの中から、各種デサチュラーゼ遺伝子発現カセットを含むナンノクロロプシス・オキュラータ株を選抜した。
（４）形質転換体の培養、脂質の抽出、及び構成脂肪酸の分析
選抜した株を、Ｎ１５Ｐ５培地20mLに播種し、25℃、0.3%CO2雰囲気下、12h/12h明暗条件にて３〜４週間振盪培養し、前培養液とした。前培養液2mLをｆ／２培地の窒素濃度を５倍、リン濃度を5倍に増強した培地（以下、「Ｎ５Ｐ５培地」という）18mLに植継ぎ、25℃、0.3%CO2雰囲気下、12h/12h明暗条件にて１０日間振盪培養した。なお、陰性対照として、野生株及びNoKASII遺伝子導入株についても同様の実験を行った。
得られた培養液について、実施例１と同様の方法にて脂質の抽出及び構成脂肪酸の分析を行った。その結果を表４に示す。
Figure 0006785769
表４から明らかなように、NoKASII遺伝子及びNoΔ12-DES遺伝子を導入した株（NoKASII + NoΔ12-DES）では、野生株（NIES2145）と比べ、C18:1の割合が減少し、C18:2、C18:3、C20:3、C20:4、及びC20:5の割合が向上していた。さらに、NoKASII遺伝子導入株（NoKASII）にNoΔ12-DES遺伝子を導入することで、C20:4及びC20:5の割合がより一層向上していた。
また、NoKASII遺伝子及びNoω3-DES遺伝子を導入した株（NoKASII + Noω3-DES）では、野生株（NIES2145）と比べ、C20:4の割合が減少し、C20:5の割合が向上していた。さらに、NoKASII遺伝子導入株（NoKASII）にNoω3-DES遺伝子を導入することで、C20:5の割合がより一層向上していた。
これらの結果より、NoKASII遺伝子に加えデサチュラーゼ遺伝子の発現を促進することで、ＰＵＦＡの生産性がより一層向上することが明らかになった。
以上のように、本発明で規定するKAS遺伝子の発現を促進させることで、長鎖脂肪酸の生産性を向上させた形質転換体を作製することができる。そしてこの形質転換体を培養することで、長鎖脂肪酸の生産性を向上させることができる。
本発明をその実施態様とともに説明したが、我々は特に指定しない限り我々の発明を説明のどの細部においても限定しようとするものではなく、添付の請求の範囲に示した発明の精神と範囲に反することなく幅広く解釈されるべきであると考える。
本願は、2015年8月5日に日本国で特許出願された特願2015-154771に基づく優先権を主張するものであり、これはここに参照してその内容を本明細書の記載の一部として取り込む。

Claims (13)

  1. 下記タンパク質（Ａ）又は（Ｂ）をコードする遺伝子の発現を促進させた、微細藻類又は大腸菌の形質転換体を培養し、脂肪酸、又はそのエステル化合物を構成する脂肪酸エステルの総量に占める、長鎖脂肪酸又はそのエステル化合物量の比率を向上させる方法。
    （Ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
    （Ｂ）前記タンパク質（Ａ）のアミノ酸配列と同一性が９０％以上のアミノ酸配列からなり、かつβ−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼ活性を有するタンパク質。
  2. 前記タンパク質（Ａ）又は（Ｂ）をコードする遺伝子を微細藻類又は大腸菌に導入して前記遺伝子の発現を促進させる、請求項１に記載の方法。
  3. 下記タンパク質（Ａ）又は（Ｂ）をコードする遺伝子を導入した、微細藻類又は大腸菌の形質転換体を培養し、炭素原子数が２０の長鎖脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質を生産させる、脂質の製造方法。
    （Ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
    （Ｂ）前記タンパク質（Ａ）のアミノ酸配列と同一性が９０％以上のアミノ酸配列からなり、かつβ−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼ活性を有するタンパク質。
  4. 前記脂質がトリアシルグリセロールである、請求項３に記載の方法。
  5. 前記長鎖脂肪酸が長鎖多価不飽和脂肪酸である、請求項１〜４のいずれか１記載の方法。
  6. デサチュラーゼをコードする遺伝子を前記形質転換体に導入した、請求項１〜５のいずれか１項記載の方法。
  7. 前記タンパク質（Ｂ）が、前記タンパク質（Ａ）のアミノ酸配列と同一性が９２％以上のアミノ酸配列からなり、かつβ−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼ活性を有するタンパク質である、請求項１〜６のいずれか１項記載の方法。
  8. 前記微細藻類がナンノクロロプシス（Nannochloropsis）属に属する藻類である、請求項１〜７のいずれか１項記載の方法。
  9. 下記タンパク質（Ａ）若しくは（Ｂ）をコードする遺伝子、又は下記ＤＮＡ（ａ）若しくは（ｂ）からなる遺伝子を、微細藻類若しくは大腸菌に導入してなる、形質転換体。
    （Ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
    （Ｂ）前記タンパク質（Ａ）のアミノ酸配列と同一性が９２％以上のアミノ酸配列からなり、かつβ−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼ活性を有するタンパク質。
    （ａ）配列番号２で表される塩基配列からなるＤＮＡ。
    （ｂ）前記ＤＮＡ（ａ）の塩基配列と同一性が８５％以上の塩基配列からなり、かつβ−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼ活性を有する前記タンパク質（Ａ）又は（Ｂ）をコードするＤＮＡ。
  10. デサチュラーゼをコードする遺伝子を導入した、請求項９記載の形質転換体。
  11. 前記微細藻類がナンノクロロプシス（Nannochloropsis）属に属する藻類である、請求項９又は１０記載の形質転換体。
  12. 前記遺伝子の導入により、生産される、脂肪酸、及びそのエステル化合物を構成する脂肪酸エステルの総量に占める、長鎖脂肪酸又はそのエステル化合物量の比率が向上している、請求項９〜１１のいずれか１項記載の形質転換体。
  13. 請求項３〜８のいずれか１項記載の脂質の製造方法に用いるための、請求項９〜１２のいずれか１項記載の形質転換体。
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