CN104073505A - 利用pufa聚酮化合物合成酶系统在异源的生物体中产生多不饱和脂肪酸的方法 - Google Patents
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Abstract
本申请涉及利用PUFA聚酮化合物合成酶系统在异源的生物体中产生多不饱和脂肪酸的方法。本申请披露了新的酰基辅酶A合成酶和新的酰基转移酶、编码所述酰基辅酶A合成酶和酰基转移酶的核酸分子、包含所述核酸分子的重组核酸分子和重组宿主细胞、包含所述重组核酸分子和重组宿主细胞的经遗传修饰的生物体(微生物和植物)和得到和使用所述生物体的方法。除得自上述生物体的PUFA和油外，本申请还披露了其它修饰和得到和使用上述生物体的方法及包括上述PUFA和油的各种产物。
Description
本申请是申请日为2007年03月15日、中国申请号为200780017805.5、发明名称为“利用PUFA聚酮化合物合成酶系统在异源的生物体中产生多不饱和脂肪酸的方法”的发明申请的分案申请。
技术领域
本发明大体上涉及辅助蛋白(accessory protein)和靶标(target)在宿主生物体(host organism)中改进多不饱和脂肪酸(polyunsaturated fatty acid,PUFA)特别是长链PUFA(长链PUFA,LCPUFA)的产生的用途，所述宿主生物体已用产生上述PUFA的PKS样系统(即PUFA PKS系统或PUFA合成酶)进行遗传修饰。本发明也涉及已经遗传修饰为表达上述辅助蛋白或就上述靶标进行修饰的生物体(organism)及制备和使用上述生物体的方法。
背景技术
人们认为多不饱和脂肪酸(PUFA)可用于营养用途、药物用途、工业用途及其它目的。然而，当前供应的来自天然来源和化学合成的PUFA不足以满足商业需要。得自含油种子农作物(oil seed crop)的植物油是相对廉价的，并且没有与鱼油(fish oil)相关的污染问题。然而，在商业开发的植物油中发现的PUFA通常限于亚油酸(linoleic acid)(18个碳且在Δ9位和Δ12位具有2个双键即18:2Δ9,12)和亚麻酸(linolenic acid)(18:3Δ9,12,15)。在从亚油酸和亚麻酸合成脂肪酸时需要多种不同的去饱和酶(desaturase)和延长酶(elongase)，以形成较饱和且较长链的PUFA。因此，表达PUFA诸如EPA和二十二碳六烯酸(docosahexaenoic acid,DHA)的工程化植物宿主细胞为了实现合成而可能需要表达几种不同的酶。另外，为了产生可用量的上述PUFA，可能需要进行额外的工程化。因此，用于产生PUFA的另一种系统(其为聚酮化合物合成酶样系统(polyketide synthase-like system))的发现为植物或其它生物体(例如微生物)的遗传工程提供了具有重大意义的可替换方案，其使用“经典” 或“标准”脂肪酸合成途径的去饱和酶和延长酶。
已作出很多努力，以通过对内源性形成的脂肪酸进行修饰而在含油种子农作物植物中产生PUFA。用针对脂肪酸延长酶和去饱和酶的各种单独基因对这些植物进行遗传修饰(genetic modification)，由此已得到含有显著水平的PUFA诸如EPA但也含有显著水平的混合短链PUFA和较不饱和PUFA的叶子或种子(Qi等人,Nature Biotech.22:739(2004)、PCT公开号WO04/071467、Abbadi等人,Plant Cell16:1(2004))、Napier and Sayanova,Proceedings of the Nutrition Society(2005),64:387-393、Robert等人,Functional Plant Biology(2005)32:473-479或美国专利申请公开号2004/0172682)。
因此，本领域仍需要高效并且有效地在含油种子植物中形成大量的富含所期望PUFA的脂质(例如三酰甘油(TAG)和磷脂(PL))的方法。
作为与脂肪酸合成酶(FAS)系统相关的酶混合物，聚酮化合物合成酶(polyketide synthase,PKS)系统在本领域中是众所周知的，但其经常被高度地修饰，以得到典型地与脂肪酸相似性很少的特定产物。然而，现在已证明的是，聚酮化合物合成酶系统存在于能从乙酰辅酶A和丙二酰辅酶A合成多不饱和脂肪酸(PUFA)的海洋细菌(marine bacteria)和某些微观藻类(microalgae)中。本申请将这些系统称为PUFA PKS系统、用于产生PUFA的PKS样系统或PUFA合成酶系统，所有这些术语在本申请中可交换地使用。
美国专利号6,140,486详细描述了在希瓦氏菌属(Shewanella)和另一种海洋细菌即海产弧菌(Vibrio marinus)中合成PUFA的PUFA PKS途径。美国专利号6,566,583详细描述了在真核的破囊壶菌(Thraustochytrid)和裂殖壶菌属(Schizochytrium)中合成PUFA的PUFA PKS途径。美国专利申请公开号20020194641(公开于2002年12月19日)和PCT公开号WO2006/135866(公开于2006年12月21日)详细描述了在真核生物诸如破囊壶菌目(Thraustochytriales)的成员中合成PUFA的PUFA PKS途径，并且额外描述了裂殖壶菌属中的PUFA PKS系统，确定了破囊壶菌属(Thraustochytrium)中的PUFA PKS系统，及详细描述了这些系统的用途。美国专利申请公开号20040235127(公开于2004年11月25日)披露了对破囊壶菌属中PUFA PKS系统的详细结构描述，并且进一步详细描述了利用上述系统产生二十碳五烯酸(eicosapentaenoic acid)(C20:5,ω-3)(EPA)和其它PUFA的方法。美国专利申请公开号20050100995(公开于2005年5月12日)披露了对Shewanella olleyana和Shewanella japonica中PUFA PKS系统的结构描述和功能描述及上述系统的用途。这些申请也披露了用包含PUFA PKS途径的基因对生物体(包括微生物和植物)进行的遗传修饰和通过上述生物体生产PUFA。此外，PCT专利公开号WO05/097982描述了Ulkenia中的PUFA PKS系统，而美国专利申请公开号20050014231描述了来自Thraustochytrium aureum的PUFA PKS基因和蛋白质。在此将上述每项申请完整引入作为参考。
因此，已描述酶中PUFA合成酶家族的碱性结构域(basic domain)的结构和序列特征，并且已证明的是，PUFA合成酶能合成各种PUFA(例如二十碳五烯酸(EPA;C20:5n-3)、二十二碳六烯酸(DHA;22:6n-3)和二十二碳五烯酸(docosapentaenoic acid)(DPA n-6;C22:5n-6))。也已证明的是，PUFA产物可积累在宿主生物体磷脂(PL)中，并且在一些情况下可积累在中性脂质(例如三酰甘油(TAG))中。然而，就本本发明人所知道的而言，在本发明前尚未对将PUFA从酶转移到那些靶标点的精确机制进行定义。
既然在生物体中将PUFA转移到目标点的机制可能有助于提高在已经遗传修饰为产生上述PUFA的生物体中产生PUFA的效率和/或改进在已经遗传修饰为产生上述PUFA的生物体中产生PUFA的方法，所以本领域需要有关这种机制的信息。因此，本领域也需要改进的利用上述机制的产生PUFA的方法(包括在已经遗传修饰为产生上述PUFA的植物和微生物中产生PUFA的方法)。
发明内容
本发明的一个实施方案涉及经分离的核酸分子，其包含编码酰基辅酶A合成酶(acyl-CoA synthetase,ACoAS)的核酸序列，所述酰基辅酶A合成酶催化长链PUFA游离脂肪酸(long chain PUFA free fatty acid(FFA))转化成酰基辅酶A，其中所述核酸序列编码酰基辅酶A合成酶(ACoAS)，所述酰基辅酶A合成酶与具有选自以下的氨基酸序列的ACoAS至少60%相同：SEQ ID NO:83、SEQ ID NO:85、SEQ ID NO:87、SEQ ID NO:89、SEQ ID NO:91、SEQ ID NO:93、SEQ ID NO:95、SEQ ID NO:97和SEQ ID NO:99。在一个方面，所述核酸序列编码具有选自以下的氨基酸序列的酰基辅酶A合成酶(ACoAS)：SEQ ID NO:83、SEQ ID NO:85、SEQ ID NO:87、SEQ ID NO:89、SEQ ID NO:91、SEQ ID NO:93、SEQ ID NO:95、SEQ ID NO:97和SEQ ID NO:99。在一个方面，所述核酸序列编码选自以下的氨基酸序列：SEQ ID NO:83、SEQ ID NO:85和SEQ ID NO:97。在一个方面，所述核酸序列选自SEQ ID NO:82、SEQ ID NO:84、SEQ ID NO:86、SEQ ID NO:88、SEQ ID NO:90、SEQ ID NO:92、SEQ ID NO:94、SEQ ID NO:96和SEQ ID NO:98。
本发明的另一个实施方案涉及经分离的核酸分子，其包含编码以下蛋白质的核酸序列，所述蛋白质在形成磷脂(PL)或三酰甘油(TAG)时使用PUFA-CoA作为底物，其中所述蛋白质包含与选自以下的氨基酸序列至少60%相同的氨基酸序列：SEQ ID NO:102、SEQ ID NO:104、SEQ ID NO:107、SEQ ID NO:110和SEQ ID NO:113。在一个方面，所述核酸序列编码包含选自以下的氨基酸序列的蛋白质：SEQ ID NO:102、SEQ ID NO:104、SEQ ID NO:107、SEQ ID NO:110和SEQ ID NO:113。在一个方面，所述核酸序列编码包含选自以下的氨基酸序列的蛋白质：SEQ ID NO:102和SEQ ID NO:104。在一个方面，所述核酸序列选自SEQ ID NO:100、SEQ ID NO:102、SEQ ID NO:103、SEQ ID NO:105、SEQ ID NO:106、SEQ ID NO:108、SEQ ID NO:109、SEQ ID NO:111和SEQ ID NO:112。
本发明的另一个实施方案涉及经分离的蛋白质，其通过任意上述核酸分子来编码。
本发明的另一个实施方案涉及重组核酸分子，其包含任意上述核酸分子，并且可操作地(operatively)与表达控制序列(expression control sequence)相连。
本发明的另一个实施方案涉及重组宿主细胞，其包含任意上述重组核酸分子。在一个方面，所述宿主细胞为微生物。在另一个方面，所述宿主细胞为植物细胞。
本发明的另一个实施方案涉及经遗传修饰的生物体，其中所述生物体已经遗传修饰为表达任意上述核酸分子或它们的任意组合。在一个方面，所述生物体表达PUFA合成酶和磷酸泛酰巯基乙氨基转移酶(phosphopantetheinyl transferase,PPTase)。在一个方面，所述生物体已经遗传修饰为表达所述合成酶和所述PPTase。在一个方面，所述生物体含有额外的遗传修饰，以除去(delete)或钝化(inactivate)所述生物体表达的脂肪酸合成酶(FAS)。在一个方面，所述生物体含有额外的遗传修饰，以在所述生物体中就丙二酰辅酶A而言减少与PUFA合成酶的竞争或提高丙二酰辅酶A的水平。
另一个实施方案涉及经遗传修饰的生物体，其中所述生物体表达PUFA合成酶和磷酸泛酰巯基乙氨基转移酶(PPTase)，所述PUFA合成酶产生至少一种多不饱和脂肪酸(PUFA)，并且其中所述生物体含有遗传修饰，以表达一种或多种异源的(heterologous)酰基辅酶A合成酶(ACoAS)或其同源物(homologue)，其催化长链PUFA游离脂肪酸(FFA)转化成酰基辅酶A。在一个方面，所述生物体用以下核酸分子进行转化(transform)，所述核酸分子包含编码酰基辅酶A合成酶(ACoAS)或其同源物的核酸序列，所述酰基辅酶A合成酶(ACoAS)或其同源物来自内源性地表达PUFA合成酶的生物体。在一个方面，所述生物体用以下核酸分子进行转化，所述核酸分子包含编码酰基辅酶A合成酶(ACoAS)或其同源物的核酸序列，所述酰基辅酶A合成酶(ACoAS)或其同源物来自对隐甲藻(Crypthecodinium cohnii)，其中所述ACoAS或其同源物催化长链PUFA游离脂肪酸(FFA)转化成酰基辅酶A。在一个方面，所述生物体用以下核酸分子进行转化，所述核酸分子包含编码酰基辅酶A合成酶(ACoAS)或其同源物的核酸序列，所述酰基辅酶A合成酶(ACoAS)或其同源物来自破囊壶菌目微生物，其中所述ACoAS或其同源物催化长链PUFA游离脂肪酸(FFA)转化成酰基辅酶A。在一个方面，所述生物体用以下核酸分子进行转化，所述核酸分子包含编码酰基辅酶A合成酶(ACoAS)或其同源物的核酸序列，所述酰基辅酶A合成酶(ACoAS)或其同源物来自裂殖壶菌属，其中所述ACoAS或其同源物催化长链PUFA游离脂肪酸(FFA)转化成酰基辅酶A。在一个方面，所述生物体含有额外的遗传修饰，以除去或钝化所述生物体表达的脂肪酸合成酶(FAS)。在一个方面，所述生物体含有额外的遗传修饰，以在所述生物体中就丙二酰辅酶A而言减少与PUFA合成酶的竞争或提高丙二酰辅酶A的水平。在一个方面，所述生物体含有额外的遗传修饰，以表达一种或多种异源的蛋白质，所述蛋白质来自内源性地产生PUFA的生物体，其中所述蛋白质在形成磷脂(PL)或三酰甘油(TAG)时使用PUFA-CoA作为底物。
另一个实施方案涉及经遗传修饰的生物体，其中所述生物体对PUFA合成酶和磷酸泛酰巯基乙氨基转移酶(PPTase)进行表达，所述PUFA合成酶产生至少一种多不饱和脂肪酸(PUFA)，并且其中所述生物体含有遗传修饰，以除去或钝化所述生物体表达的脂肪酸合成酶(FAS)。在一个方面，所述生物体含有额外的遗传修饰，以在所述生物体中就丙二酰辅酶A而言减少与 PUFA合成酶的竞争或提高丙二酰辅酶A的水平。
另一个实施方案涉及经遗传修饰的生物体，其中所述生物体表达PUFA合成酶和磷酸泛酰巯基乙氨基转移酶(PPTase)，所述PUFA合成酶产生至少一种多不饱和脂肪酸(PUFA)，并且其中所述生物体含有遗传修饰，以在所述生物体中就丙二酰辅酶A而言减少与PUFA合成酶的竞争或提高丙二酰辅酶A的水平。在一个方面，所述生物体含有额外的遗传修饰，以除去或钝化所述生物体表达的脂肪酸合成酶(FAS)。
另一个实施方案涉及经遗传修饰的生物体，其中所述生物体表达PUFA合成酶和磷酸泛酰巯基乙氨基转移酶(PPTase)，所述PUFA合成酶产生至少一种多不饱和脂肪酸(PUFA)，其中所述生物体含有遗传修饰，以表达一种或多种异源的蛋白质，所述蛋白质来自内源性地产生PUFA的生物体，其中所述蛋白质在形成磷脂(PL)或三酰甘油(TAG)时使用PUFA-CoA作为底物。在一个方面，所述蛋白质为DAGAT或LPAAT。在一个方面，所述生物体用以下核酸分子进行转化，所述核酸分子包含编码以下蛋白质的核酸序列，所述蛋白质来自在形成磷脂(PL)或三酰甘油(TAG)时使用PUFA-CoA作为底物的破囊壶菌或Labyrinthulid。在一个方面，所述生物体用以下核酸分子进行转化，所述核酸分子包含编码以下蛋白质的核酸序列，所述蛋白质来自在形成磷脂(PL)或三酰甘油(TAG)时使用PUFA-CoA作为底物的裂殖壶菌属。在一个方面，所述生物体包含额外的修饰，以表达一种或多种异源的酰基辅酶A合成酶(ACoAS)或其同源物，其催化长链PUFA游离脂肪酸(FFA)转化成酰基辅酶A。在一个方面，所述生物体含有额外的遗传修饰，以除去或钝化所述生物体表达的脂肪酸合成酶(FAS)。在一个方面，所述生物体含有额外的遗传修饰，以在所述生物体中就丙二酰辅酶A而言减少与PUFA合成酶的竞争或提高丙二酰辅酶A的水平。
在一个实施方案中，本发明提供经遗传修饰的生物体，包括微生物、植物、植物部分或植物细胞，其中所述生物体已用PUFA合成酶和磷酸泛酰巯基乙氨基转移酶(PPTase)进行遗传修饰，所述PUFA合成酶产生至少一种多不饱和脂肪酸(PUFA)，并且其中所述生物体含有遗传修饰，以抑制选自KASII和KASIII的蛋白质的表达或活性。
在另一个实施方案中，本发明提供经遗传修饰的生物体，包括微生物、植物、植物部分或植物细胞，其中所述生物体已用PUFA合成酶和磷酸泛酰 巯基乙氨基转移酶(PPTase)进行修饰，所述PUFA合成酶产生至少一种多不饱和脂肪酸(PUFA)，并且其中编码所述PUFA合成酶或所述PPTase的至少一种核酸分子可操作地与编码由SEQ ID NO:81表示的质体靶向序列(plastid-targeting sequence)的核酸序列相连。
在另一个实施方案中，本发明提供经遗传修饰的生物体，包括微生物、植物、植物部分或植物细胞，其中所述生物体已用PUFA合成酶和磷酸泛酰巯基乙氨基转移酶(PPTase)进行遗传修饰，所述PUFA合成酶产生至少一种多不饱和脂肪酸(PUFA)，并且其中所述生物体含有遗传修饰，以抑制选自KASII和KASIII的蛋白质的表达或活性，并且其中所述生物体含有额外的遗传修饰，以表达一种或多种异源的酰基辅酶A合成酶(ACoAS)或其同源物，其催化长链PUFA游离脂肪酸(FFA)转化成酰基辅酶A。
在另一个实施方案中，本发明提供经遗传修饰的生物体，包括微生物、植物、植物部分或植物细胞，其中所述生物体已用PUFA合成酶和磷酸泛酰巯基乙氨基转移酶(PPTase)进行遗传修饰，所述PUFA合成酶产生至少一种多不饱和脂肪酸(PUFA)；其中编码所述PUFA合成酶或所述PPTase的至少一种核酸分子可操作地与编码质体靶向序列(包括但不限于由SEQ ID NO:81表示的序列)的核酸序列相连；或其中所述生物体含有额外的遗传修饰，以表达一种或多种异源的酰基辅酶A合成酶(ACoAS)或其同源物，其催化长链PUFA游离脂肪酸(FFA)转化成酰基辅酶A。
在一个实施方案中，本发明提供经遗传修饰的生物体，包括微生物、植物、植物部分或植物细胞，其中所述生物体已用PUFA合成酶和磷酸泛酰巯基乙氨基转移酶(PPTase)进行遗传修饰，所述PUFA合成酶产生至少一种多不饱和脂肪酸(PUFA)；其中所述生物体含有遗传修饰，以抑制蛋白质(例如选自KASII和KASIII的蛋白质)的表达或活性；其中所述生物体含有额外的遗传修饰，以表达一种或多种异源的蛋白质，所述蛋白质来自内源性地产生PUFA的生物体；并且其中所述蛋白质在形成磷脂(PL)或三酰甘油(TAG)时使用PUFA-CoA作为底物。
在另一个实施方案中，本发明提供经遗传修饰的生物体，包括微生物、植物、植物部分或植物细胞，其中所述生物体已用PUFA合成酶和磷酸泛酰巯基乙氨基转移酶(PPTase)进行遗传修饰，所述PUFA合成酶产生至少一种多不饱和脂肪酸(PUFA)；其中所述生物体含有遗传修饰，以抑制蛋白质(例 如选自KASII和KASIII的蛋白质)的表达或活性；其中所述生物体含有额外的遗传修饰，以表达一种或多种异源的蛋白质，所述蛋白质来自内源性地产生PUFA的生物体；其中所述蛋白质在形成磷脂(PL)或三酰甘油(TAG)时使用PUFA-CoA作为底物；并且其中所述生物体含有额外的遗传修饰，以表达一种或多种异源的酰基辅酶A合成酶(ACoAS)或其同源物，其催化长链PUFA游离脂肪酸(FFA)转化成酰基辅酶A。
在另一个实施方案中，本发明提供经遗传修饰的生物体，包括微生物、植物、植物部分或植物细胞，其中所述生物体已用PUFA合成酶和磷酸泛酰巯基乙氨基转移酶(PPTase)进行遗传修饰，所述PUFA合成酶产生至少一种多不饱和脂肪酸(PUFA)；其中编码所述PUFA合成酶或所述PPTase的至少一种核酸分子可操作地与编码质体靶向序列(包括但不限于由SEQ ID NO:81表示的序列)的核酸序列相连；其中所述生物体含有额外的遗传修饰，以表达一种或多种异源的蛋白质，所述蛋白质来自内源性地产生PUFA的生物体，其中所述蛋白质在形成磷脂(PL)或三酰甘油(TAG)时使用PUFA-CoA作为底物。
在另一个实施方案中，本发明提供经遗传修饰的生物体，包括微生物、植物、植物部分或植物细胞，其中所述生物体已用PUFA合成酶和磷酸泛酰巯基乙氨基转移酶(PPTase)进行遗传修饰，所述PUFA合成酶产生至少一种多不饱和脂肪酸(PUFA)；其中编码所述PUFA合成酶或所述PPTase的至少一种核酸分子可操作地与编码质体靶向序列(包括但不限于由SEQ ID NO:81表示的序列)的核酸序列相连；其中所述生物体含有额外的遗传修饰，以表达一种或多种异源的蛋白质，所述蛋白质来自内源性地产生PUFA的生物体，其中所述蛋白质在形成磷脂(PL)或三酰甘油(TAG)时使用PUFA-CoA作为底物；并且其中所述生物体含有额外的遗传修饰，以表达一种或多种异源的酰基辅酶A合成酶(ACoAS)或其同源物，其催化长链PUFA游离脂肪酸(FFA)转化成酰基辅酶A。
在一个实施方案中，本发明提供经遗传修饰的生物体，包括微生物、植物、植物部分或植物细胞，其中所述生物体已用PUFA合成酶和磷酸泛酰巯基乙氨基转移酶(PPTase)进行遗传修饰，所述PUFA合成酶产生至少一种多不饱和脂肪酸(PUFA)；其中所述生物体含有遗传修饰，以抑制蛋白质(例如选自KASII和KASIII的蛋白质)的表达或活性；并且其中所述生物体包含额 外的遗传修饰，以除去或钝化内源性脂肪酸合成酶(FAS)或与所述生物体表达的FAS相关的蛋白质。
在一个实施方案中，本发明提供经遗传修饰的生物体，包括微生物、植物、植物部分或植物细胞，其中所述生物体已用PUFA合成酶和磷酸泛酰巯基乙氨基转移酶(PPTase)进行遗传修饰，所述PUFA合成酶产生至少一种多不饱和脂肪酸(PUFA)；其中所述生物体含有遗传修饰，以抑制蛋白质(例如选自KASII和KASIII的蛋白质)的表达或活性；其中所述生物体包含额外的遗传修饰，以除去或钝化内源性脂肪酸合成酶(FAS)或与所述生物体表达的FAS相关的蛋白质；并且其中所述生物体含有额外的遗传修饰，以表达一种或多种异源的酰基辅酶A合成酶(ACoAS)或其同源物，其催化长链PUFA游离脂肪酸(FFA)转化成酰基辅酶A。
在一个实施方案中，本发明提供经遗传修饰的生物体，包括微生物、植物、植物部分或植物细胞，其中所述生物体已用PUFA合成酶和磷酸泛酰巯基乙氨基转移酶(PPTase)进行遗传修饰，所述PUFA合成酶产生至少一种多不饱和脂肪酸(PUFA)；其中所述生物体含有遗传修饰，以抑制蛋白质(例如选自KASII和KASIII的蛋白质)的表达或活性；其中所述生物体包含额外的遗传修饰，以除去或钝化内源性脂肪酸合成酶(FAS)或与所述生物体表达的FAS相关的蛋白质；其中所述生物体含有额外的遗传修饰，以表达一种或多种异源的蛋白质，所述蛋白质来自内源性地产生PUFA的生物体；并且其中所述蛋白质在形成磷脂(PL)或三酰甘油(TAG)时使用PUFA-CoA作为底物。
在一个实施方案中，本发明提供经遗传修饰的生物体，包括微生物、植物、植物部分或植物细胞，其中所述生物体已用PUFA合成酶和磷酸泛酰巯基乙氨基转移酶(PPTase)进行遗传修饰，所述PUFA合成酶产生至少一种多不饱和脂肪酸(PUFA)；其中所述生物体含有遗传修饰，以抑制蛋白质(例如选自KASII和KASIII的蛋白质)的表达或活性；其中所述生物体包含额外的遗传修饰，以除去或钝化内源性脂肪酸合成酶(FAS)或与所述生物体表达的FAS相关的蛋白质；其中所述生物体含有额外的遗传修饰，以表达一种或多种异源的酰基辅酶A合成酶(ACoAS)或其同源物，其催化长链PUFA游离脂肪酸(FFA)转化成酰基辅酶A；其中所述生物体含有额外的遗传修饰，以表达一种或多种异源的蛋白质，所述蛋白质来自内源性地产生PUFA的生物体；并且其中所述蛋白质在形成磷脂(PL)或三酰甘油(TAG)时使用 PUFA-CoA作为底物。在另一个实施方案中，本发明提供经遗传修饰的生物体，包括微生物、植物、植物部分或植物细胞，其中所述生物体已用PUFA合成酶和磷酸泛酰巯基乙氨基转移酶(PPTase)进行遗传修饰，所述PUFA合成酶产生至少一种多不饱和脂肪酸(PUFA)；其中编码所述PUFA合成酶或所述PPTase的至少一种核酸分子可操作地与编码质体靶向序列(包括但不限于由SEQ ID NO:81表示的序列)的核酸序列相连；并且其中所述生物体包含额外的遗传修饰，以除去或钝化内源性脂肪酸合成酶(FAS)或与所述生物体表达的FAS相关的蛋白质。
在另一个实施方案中，本发明提供经遗传修饰的生物体，包括微生物、植物、植物部分或植物细胞，其中所述生物体已用PUFA合成酶和磷酸泛酰巯基乙氨基转移酶(PPTase)进行遗传修饰，所述PUFA合成酶产生至少一种多不饱和脂肪酸(PUFA)；其中编码所述PUFA合成酶或所述PPTase的至少一种核酸分子可操作地与编码质体靶向序列(包括但不限于由SEQ ID NO:81表示的序列)的核酸序列相连；其中所述生物体包含额外的遗传修饰，以除去或钝化内源性脂肪酸合成酶(FAS)或与所述生物体表达的FAS相关的蛋白质；并且其中所述生物体含有额外的遗传修饰，以表达一种或多种异源的酰基辅酶A合成酶(ACoAS)或其同源物，其催化长链PUFA游离脂肪酸(FFA)转化成酰基辅酶A。
在另一个实施方案中，本发明提供经遗传修饰的生物体，包括微生物、植物、植物部分或植物细胞，其中所述生物体已用PUFA合成酶和磷酸泛酰巯基乙氨基转移酶(PPTase)进行遗传修饰，所述PUFA合成酶产生至少一种多不饱和脂肪酸(PUFA)；其中编码所述PUFA合成酶或所述PPTase的至少一种核酸分子可操作地与编码质体靶向序列(包括但不限于由SEQ ID NO:81表示的序列)的核酸序列相连；其中所述生物体包含额外的遗传修饰，以除去或钝化内源性脂肪酸合成酶(FAS)或与所述生物体表达的FAS相关的蛋白质；其中所述生物体含有额外的遗传修饰，以表达一种或多种异源的蛋白质，所述蛋白质来自内源性地产生PUFA的生物体；并且其中所述蛋白质在形成磷脂(PL)或三酰甘油(TAG)时使用PUFA-CoA作为底物。
在另一个实施方案中，本发明提供经遗传修饰的生物体，包括微生物、植物、植物部分或植物细胞，其中所述生物体已用PUFA合成酶和磷酸泛酰巯基乙氨基转移酶(PPTase)进行遗传修饰，所述PUFA合成酶产生至少一种 多不饱和脂肪酸(PUFA)；其中编码所述PUFA合成酶或所述PPTase的至少一种核酸分子可操作地与编码质体靶向序列(包括但不限于由SEQ ID NO:81表示的序列)的核酸序列相连；其中所述生物体包含额外的遗传修饰，以除去或钝化内源性脂肪酸合成酶(FAS)或与所述生物体表达的FAS相关的蛋白质；其中所述生物体含有额外的遗传修饰，以表达一种或多种异源的酰基辅酶A合成酶(ACoAS)或其同源物，其催化长链PUFA游离脂肪酸(FFA)转化成酰基辅酶A；并且其中所述生物体含有额外的遗传修饰，以表达一种或多种异源的蛋白质，所述蛋白质来自内源性地产生PUFA的生物体；并且其中所述蛋白质在形成磷脂(PL)或三酰甘油(TAG)时使用PUFA-CoA作为底物。
在一个实施方案中，本发明提供经遗传修饰的生物体，包括微生物、植物、植物部分或植物细胞，其中所述生物体已用PUFA合成酶和磷酸泛酰巯基乙氨基转移酶(PPTase)进行遗传修饰，所述PUFA合成酶产生至少一种多不饱和脂肪酸(PUFA)，并且其中所述生物体含有遗传修饰，以抑制蛋白质(例如选自KASII和KASIII的蛋白质)的表达或活性，其中所述生物体包含额外的遗传修饰，以在所述生物体中就丙二酰辅酶A而言减少与PUFA合成酶的竞争或提高丙二酰辅酶A的水平。
在一个实施方案中，本发明提供经遗传修饰的生物体，包括微生物、植物、植物部分或植物细胞，其中所述生物体已用PUFA合成酶和磷酸泛酰巯基乙氨基转移酶(PPTase)进行遗传修饰，所述PUFA合成酶产生至少一种多不饱和脂肪酸(PUFA)，并且其中所述生物体含有遗传修饰，以抑制蛋白质(例如选自KASII和KASIII的蛋白质)的表达或活性，其中所述生物体包含额外的遗传修饰，以在所述生物体中就丙二酰辅酶A而言减少与PUFA合成酶的竞争或提高丙二酰辅酶A的水平；并且其中所述生物体含有额外的遗传修饰，以表达一种或多种异源的酰基辅酶A合成酶(ACoAS)或其同源物，其催化长链PUFA游离脂肪酸(FFA)转化成酰基辅酶A。
在一个实施方案中，本发明提供经遗传修饰的生物体，包括微生物、植物、植物部分或植物细胞，其中所述生物体已用PUFA合成酶和磷酸泛酰巯基乙氨基转移酶(PPTase)进行遗传修饰，所述PUFA合成酶产生至少一种多不饱和脂肪酸(PUFA)，并且其中所述生物体含有遗传修饰，以抑制蛋白质(例如选自KASII和KASIII的蛋白质)的表达或活性，其中所述生物体包含额外的遗传修饰，以在所述生物体中就丙二酰辅酶A而言减少与PUFA合成酶的 竞争或提高丙二酰辅酶A的水平；其中所述生物体含有额外的遗传修饰，以表达一种或多种异源的蛋白质，所述蛋白质来自内源性地产生PUFA的生物体；并且其中所述蛋白质在形成磷脂(PL)或三酰甘油(TAG)时使用PUFA-CoA作为底物。
在一个实施方案中，本发明提供经遗传修饰的生物体，包括微生物、植物、植物部分或植物细胞，其中所述生物体已用PUFA合成酶和磷酸泛酰巯基乙氨基转移酶(PPTase)进行遗传修饰，所述PUFA合成酶产生至少一种多不饱和脂肪酸(PUFA)，并且其中所述生物体含有遗传修饰，以抑制蛋白质(例如选自KASII和KASIII的蛋白质)的表达或活性，其中所述生物体包含额外的遗传修饰，以在所述生物体中就丙二酰辅酶A而言减少与PUFA合成酶的竞争或提高丙二酰辅酶A的水平；并且其中所述生物体包含额外的遗传修饰，以除去或钝化内源性脂肪酸合成酶(FAS)或与所述生物体表达的FAS相关的蛋白质。
在一个实施方案中，本发明提供经遗传修饰的生物体，包括微生物、植物、植物部分或植物细胞，其中所述生物体已用PUFA合成酶和磷酸泛酰巯基乙氨基转移酶(PPTase)进行遗传修饰，所述PUFA合成酶产生至少一种多不饱和脂肪酸(PUFA)，并且其中所述生物体含有遗传修饰，以抑制蛋白质(例如选自KASII和KASIII的蛋白质)的表达或活性，其中所述生物体包含额外的遗传修饰，以在所述生物体中就丙二酰辅酶A而言减少与PUFA合成酶的竞争或提高丙二酰辅酶A的水平；其中所述生物体含有额外的遗传修饰，以表达一种或多种异源的酰基辅酶A合成酶(ACoAS)或其同源物，其催化长链PUFA游离脂肪酸(FFA)转化成酰基辅酶A；其中所述生物体含有额外的遗传修饰，以表达一种或多种异源的蛋白质，所述蛋白质来自内源性地产生PUFA的生物体；并且其中所述蛋白质在形成磷脂(PL)或三酰甘油(TAG)时使用PUFA-CoA作为底物。在一个实施方案中，本发明提供经遗传修饰的生物体，包括微生物、植物、植物部分或植物细胞，其中所述生物体已用PUFA合成酶和磷酸泛酰巯基乙氨基转移酶(PPTase)进行遗传修饰，所述PUFA合成酶产生至少一种多不饱和脂肪酸(PUFA)，并且其中所述生物体含有遗传修饰，以抑制蛋白质(例如选自KASII和KASIII的蛋白质)的表达或活性，其中所述生物体包含额外的遗传修饰，以在所述生物体中就丙二酰辅酶A而言减少与PUFA合成酶的竞争或提高丙二酰辅酶A的水平；其中所述生物体 含有额外的遗传修饰，以表达一种或多种异源的酰基辅酶A合成酶(ACoAS)或其同源物，其催化长链PUFA游离脂肪酸(FFA)转化成酰基辅酶A；并且其中所述生物体包含额外的遗传修饰，以除去或钝化内源性脂肪酸合成酶(FAS)或与所述生物体表达的FAS相关的蛋白质。
在一个实施方案中，本发明提供经遗传修饰的生物体，包括微生物、植物、植物部分或植物细胞，其中所述生物体已用PUFA合成酶和磷酸泛酰巯基乙氨基转移酶(PPTase)进行遗传修饰，所述PUFA合成酶产生至少一种多不饱和脂肪酸(PUFA)，并且其中所述生物体含有遗传修饰，以抑制蛋白质(例如选自KASII和KASIII的蛋白质)的表达或活性，其中所述生物体包含额外的遗传修饰，以在所述生物体中就丙二酰辅酶A而言减少与PUFA合成酶的竞争或提高丙二酰辅酶A的水平；其中所述生物体含有额外的遗传修饰，以表达一种或多种异源的蛋白质，所述蛋白质来自内源性地产生PUFA的生物体；并且其中所述蛋白质在形成磷脂(PL)或三酰甘油(TAG)时使用PUFA-CoA作为底物；并且其中所述生物体包含额外的遗传修饰，以除去或钝化内源性脂肪酸合成酶(FAS)或与所述生物体表达的FAS相关的蛋白质。
在一个实施方案中，本发明提供经遗传修饰的生物体，包括微生物、植物、植物部分或植物细胞，其中所述生物体已用PUFA合成酶和磷酸泛酰巯基乙氨基转移酶(PPTase)进行遗传修饰，所述PUFA合成酶产生至少一种多不饱和脂肪酸(PUFA)，并且其中所述生物体含有遗传修饰，以抑制蛋白质(例如选自KASII和KASIII的蛋白质)的表达或活性，其中所述生物体包含额外的遗传修饰，以在所述生物体中就丙二酰辅酶A而言减少与PUFA合成酶的竞争或提高丙二酰辅酶A的水平；其中所述生物体含有额外的遗传修饰，以表达一种或多种异源的酰基辅酶A合成酶(ACoAS)或其同源物，其催化长链PUFA游离脂肪酸(FFA)转化成酰基辅酶A；其中所述生物体含有额外的遗传修饰，以表达一种或多种异源的蛋白质，所述蛋白质来自内源性地产生PUFA的生物体；并且其中所述蛋白质在形成磷脂(PL)或三酰甘油(TAG)时使用PUFA-CoA作为底物；并且其中所述生物体包含额外的遗传修饰，以除去或钝化内源性脂肪酸合成酶(FAS)或与所述生物体表达的FAS相关的蛋白质。
在另一个实施方案中，本发明提供经遗传修饰的生物体，包括微生物、植物、植物部分或植物细胞，其中所述生物体已用PUFA合成酶和磷酸泛酰 巯基乙氨基转移酶(PPTase)进行遗传修饰，所述PUFA合成酶产生至少一种多不饱和脂肪酸(PUFA)，并且其中编码所述PUFA合成酶或所述PPTase的至少一种核酸分子可操作地与编码质体靶向序列(包括但不限于由SEQ ID NO:81表示的序列)的核酸序列相连，其中所述生物体包含额外的遗传修饰，以在所述生物体中就丙二酰辅酶A而言减少与PUFA合成酶的竞争或提高丙二酰辅酶A的水平。
在另一个实施方案中，本发明提供经遗传修饰的生物体，包括微生物、植物、植物部分或植物细胞，其中所述生物体已用PUFA合成酶和磷酸泛酰巯基乙氨基转移酶(PPTase)进行遗传修饰，所述PUFA合成酶产生至少一种多不饱和脂肪酸(PUFA)，并且其中编码所述PUFA合成酶或所述PPTase的至少一种核酸分子可操作地与编码质体靶向序列(包括但不限于由SEQ ID NO:81表示的序列)的核酸序列相连，其中所述生物体包含额外的遗传修饰，以在所述生物体中就丙二酰辅酶A而言减少与PUFA合成酶的竞争或提高丙二酰辅酶A的水平；并且其中所述生物体含有额外的遗传修饰，以表达一种或多种异源的酰基辅酶A合成酶(ACoAS)或其同源物，其催化长链PUFA游离脂肪酸(FFA)转化成酰基辅酶A。
在另一个实施方案中，本发明提供经遗传修饰的生物体，包括微生物、植物、植物部分或植物细胞，其中所述生物体已用PUFA合成酶和磷酸泛酰巯基乙氨基转移酶(PPTase)进行遗传修饰，所述PUFA合成酶产生至少一种多不饱和脂肪酸(PUFA)，并且其中编码所述PUFA合成酶或所述PPTase的至少一种核酸分子可操作地与编码质体靶向序列(包括但不限于由SEQ ID NO:81表示的序列)的核酸序列相连，其中所述生物体包含额外的遗传修饰，以在所述生物体中就丙二酰辅酶A而言减少与PUFA合成酶的竞争或提高丙二酰辅酶A的水平；其中所述生物体含有额外的遗传修饰，以表达一种或多种异源的蛋白质，所述蛋白质来自内源性地产生PUFA的生物体；并且其中所述蛋白质在形成磷脂(PL)或三酰甘油(TAG)时使用PUFA-CoA作为底物。
在另一个实施方案中，本发明提供经遗传修饰的生物体，包括微生物、植物、植物部分或植物细胞，其中所述生物体已用PUFA合成酶和磷酸泛酰巯基乙氨基转移酶(PPTase)进行遗传修饰，所述PUFA合成酶产生至少一种多不饱和脂肪酸(PUFA)，并且其中编码所述PUFA合成酶或所述PPTase的 至少一种核酸分子可操作地与编码质体靶向序列(包括但不限于由SEQ ID NO:81表示的序列)的核酸序列相连，其中所述生物体包含额外的遗传修饰，以在所述生物体中就丙二酰辅酶A而言减少与PUFA合成酶的竞争或提高丙二酰辅酶A的水平；并且其中所述生物体包含额外的遗传修饰，以除去或钝化内源性脂肪酸合成酶(FAS)或与所述生物体表达的FAS相关的蛋白质。
在另一个实施方案中，本发明提供经遗传修饰的生物体，包括微生物、植物、植物部分或植物细胞，其中所述生物体已用PUFA合成酶和磷酸泛酰巯基乙氨基转移酶(PPTase)进行遗传修饰，所述PUFA合成酶产生至少一种多不饱和脂肪酸(PUFA)，并且其中编码所述PUFA合成酶或所述PPTase的至少一种核酸分子可操作地与编码质体靶向序列(包括但不限于由SEQ ID NO:81表示的序列)的核酸序列相连，其中所述生物体包含额外的遗传修饰，以在所述生物体中就丙二酰辅酶A而言减少与PUFA合成酶的竞争或提高丙二酰辅酶A的水平；其中所述生物体含有额外的遗传修饰，以表达一种或多种异源的酰基辅酶A合成酶(ACoAS)或其同源物，其催化长链PUFA游离脂肪酸(FFA)转化成酰基辅酶A；其中所述生物体含有额外的遗传修饰，以表达一种或多种异源的蛋白质，所述蛋白质来自内源性地产生PUFA的生物体；并且其中所述蛋白质在形成磷脂(PL)或三酰甘油(TAG)时使用PUFA-CoA作为底物。
在另一个实施方案中，本发明提供经遗传修饰的生物体，包括微生物、植物、植物部分或植物细胞，其中所述生物体已用PUFA合成酶和磷酸泛酰巯基乙氨基转移酶(PPTase)进行遗传修饰，所述PUFA合成酶产生至少一种多不饱和脂肪酸(PUFA)，并且其中编码所述PUFA合成酶或所述PPTase的至少一种核酸分子可操作地与编码质体靶向序列(包括但不限于由SEQ ID NO:81表示的序列)的核酸序列相连，其中所述生物体包含额外的遗传修饰，以在所述生物体中就丙二酰辅酶A而言减少与PUFA合成酶的竞争或提高丙二酰辅酶A的水平；其中所述生物体含有额外的遗传修饰，以表达一种或多种异源的酰基辅酶A合成酶(ACoAS)或其同源物，其催化长链PUFA游离脂肪酸(FFA)转化成酰基辅酶A；并且其中所述生物体包含额外的遗传修饰，以除去或钝化内源性脂肪酸合成酶(FAS)或与所述生物体表达的FAS相关的蛋白质。
在另一个实施方案中，本发明提供经遗传修饰的生物体，包括微生物、 植物、植物部分或植物细胞，其中所述生物体已用PUFA合成酶和磷酸泛酰巯基乙氨基转移酶(PPTase)进行遗传修饰，所述PUFA合成酶产生至少一种多不饱和脂肪酸(PUFA)，并且其中编码所述PUFA合成酶或所述PPTase的至少一种核酸分子可操作地与编码质体靶向序列(包括但不限于由SEQ ID NO:81表示的序列)的核酸序列相连，其中所述生物体包含额外的遗传修饰，以在所述生物体中就丙二酰辅酶A而言减少与PUFA合成酶的竞争或提高丙二酰辅酶A的水平；其中所述生物体含有额外的遗传修饰，以表达一种或多种异源的蛋白质，所述蛋白质来自内源性地产生PUFA的生物体；并且其中所述蛋白质在形成磷脂(PL)或三酰甘油(TAG)时使用PUFA-CoA作为底物；并且其中所述生物体包含额外的遗传修饰，以除去或钝化内源性脂肪酸合成酶(FAS)或与所述生物体表达的FAS相关的蛋白质。
在另一个实施方案中，本发明提供经遗传修饰的生物体，包括微生物、植物、植物部分或植物细胞，其中所述生物体已用PUFA合成酶和磷酸泛酰巯基乙氨基转移酶(PPTase)进行遗传修饰，所述PUFA合成酶产生至少一种多不饱和脂肪酸(PUFA)，并且其中编码所述PUFA合成酶或所述PPTase的至少一种核酸分子可操作地与编码质体靶向序列(包括但不限于由SEQ ID NO:81表示的序列)的核酸序列相连，其中所述生物体包含额外的遗传修饰，以在所述生物体中就丙二酰辅酶A而言减少与PUFA合成酶的竞争或提高丙二酰辅酶A的水平；其中所述生物体含有额外的遗传修饰，以表达一种或多种异源的酰基辅酶A合成酶(ACoAS)或其同源物，其催化长链PUFA游离脂肪酸(FFA)转化成酰基辅酶A；其中所述生物体含有额外的遗传修饰，以表达一种或多种异源的蛋白质，所述蛋白质来自内源性地产生PUFA的生物体；并且其中所述蛋白质在形成磷脂(PL)或三酰甘油(TAG)时使用PUFA-CoA作为底物；并且其中所述生物体包含额外的遗传修饰，以除去或钝化内源性脂肪酸合成酶(FAS)或与所述生物体表达的FAS相关的蛋白质。在一些实施方案中，所述生物体含有遗传修饰，以抑制蛋白质KASII或KASIII的表达或活性。
在其它实施方案中，与不对KASII或KASIII进行所述抑制的情况相比，所述生物体产生水平提高的所述至少一种PUFA。
所述遗传修饰可包含用抑制KASII表达或活性的RNAi构建体(RNAi construct)或抑制KASIII表达或活性的RNAi构建体对所述生物体进行转化。 所述RNAi构建体可包含本申请用SEQ ID NO:122或SEQ ID NO:124表示的核酸序列。
在其它实施方案中，所述遗传修饰包含用抑制KASII表达或活性的反义核酸分子或抑制KASIII表达或活性的反义核酸分子对所述生物体进行转化。所述反义核酸分子可包含本申请用SEQ ID NO:123或SEQ ID NO:125表示的核酸序列。
在其中所述生物体含有额外的遗传修饰，以表达一种或多种异源的酰基辅酶A合成酶(ACoAS)或其同源物(其催化长链PUFA游离脂肪酸(FFA)转化成酰基辅酶A)的实施方案中，所述生物体可用包含编码酰基辅酶A合成酶(ACoAS)或其同源物的核酸序列的核酸分子进行转化，所述酰基辅酶A合成酶(ACoAS)或其同源物来自对隐甲藻，其中所述ACoAS或其同源物催化长链PUFA游离脂肪酸(FFA)转化成酰基辅酶A。在其它实施方案中，所述生物体用以下核酸分子进行转化，所述核酸分子包含编码酰基辅酶A合成酶(ACoAS)或其同源物的核酸序列，所述酰基辅酶A合成酶(ACoAS)来自裂殖壶菌属，所述同源物与来自裂殖壶菌属的编码ACoAS的氨基酸序列至少60%相同，其中所述ACoAS或其同源物催化长链PUFA游离脂肪酸(FFA)转化成酰基辅酶A。在其它实施方案中，所述生物体用以下核酸分子进行转化，所述核酸分子包含编码以下酰基辅酶A合成酶(ACoAS)的核酸序列，所述酰基辅酶A合成酶(ACoAS)与具有选自以下的氨基酸序列的ACoAS至少60%相同：SEQ ID NO:83、SEQ ID NO:85、SEQ ID NO:87、SEQ ID NO:89、SEQ ID NO:91、SEQ ID NO:93、SEQ ID NO:95、SEQ ID NO:97和SEQ ID NO:99。在其它实施方案中，所述生物体用以下核酸分子进行转化，所述核酸分子包含编码以下酰基辅酶A合成酶(ACoAS)的核酸序列，所述酰基辅酶A合成酶(ACoAS)具有选自以下的氨基酸序列：SEQ ID NO:83、SEQ ID NO:85、SEQ ID NO:87、SEQ ID NO:89、SEQ ID NO:91、SEQ ID NO:93、SEQ ID NO:95、SEQ ID NO:97和SEQ ID NO:99；更优选地，所述核酸分子包含编码以下酰基辅酶A合成酶(ACoAS)的核酸序列，所述酰基辅酶A合成酶(ACoAS)具有选自以下的氨基酸序列：SEQ ID NO:83、SEQ ID NO:85和SEQ ID NO:97。在其它实施方案中，所述生物体用以下核酸分子进行转化，所述核酸分子包含编码以下酰基辅酶A合成酶(ACoAS)的核酸序列，所述酰基辅酶A合成酶(ACoAS)具有以下氨基酸序列：SEQ ID NO:83或SEQ ID NO:85，并且所 述生物体还用以下核酸分子进行转化，所述核酸分子包含编码以下酰基辅酶A合成酶(ACoAS)的核酸序列，所述酰基辅酶A合成酶(ACoAS)具有以下氨基酸序列：SEQ ID NO:97。在其它实施方案中，所述生物体用包含选自以下的核酸序列的核酸分子进行转化：SEQ ID NO:82、SEQ ID NO:84、SEQ ID NO:86、SEQ ID NO:88、SEQ ID NO:90、SEQ ID NO:92、SEQ ID NO:94、SEQ ID NO:96和SEQ ID NO:98。
在其中所述生物体含有额外的遗传修饰，以表达一种或多种异源的蛋白质，所述蛋白质来自内源性地产生PUFA的生物体；并且其中所述蛋白质在形成磷脂(PL)或三酰甘油(TAG)时使用PUFA-CoA作为底物的一些实施方案中，所述生物体内源性地表达PUFA合成酶。在其它实施方案中，所述蛋白质为DAGAT或LPAAT。在其它实施方案中，所述生物体用以下核酸分子进行转化，所述核酸分子包含编码以下蛋白质的核酸序列，所述蛋白质来自破囊壶菌或Labyrinthulid，并且在形成磷脂(PL)或三酰甘油(TAG)时使用PUFA-CoA作为底物。在其它实施方案中，所述生物体用以下核酸分子进行转化，所述核酸分子包含编码以下蛋白质的核酸序列，所述蛋白质来自裂殖壶菌属，并且在形成磷脂(PL)或三酰甘油(TAG)时使用PUFA-CoA作为底物。在一些实施方案中，所述核酸序列编码以下蛋白质，所述蛋白质包含与选自以下的氨基酸序列至少60%相同的氨基酸序列：SEQ ID NO:102、SEQ ID NO:104、SEQ ID NO:107、SEQ ID NO:110和SEQ ID NO:113。在其它实施方案中，所述生物体用包含以下核酸序列的核酸分子进行转化，所述核酸序列编码包含选自以下的氨基酸序列的蛋白质：SEQ ID NO:102、SEQ ID NO:104、SEQ ID NO:107、SEQ ID NO:110和SEQ ID NO:113；更优选地，所述生物体用包含以下核酸序列的核酸分子进行转化，所述核酸序列编码包含选自以下的氨基酸序列的蛋白质：SEQ ID NO:102和SEQ ID NO:104。在其它实施方案中，所述生物体用以下核酸分子进行转化，所述核酸分子包含编码以下蛋白质的核酸序列，所述蛋白质包含氨基酸序列EQ ID NO:102，并且所述生物体用编码以下蛋白质的核酸序列进行转化，所述蛋白质包含氨基酸序列EQ ID NO:104。在其它实施方案中，所述生物体用包含选自以下的核酸序列的核酸分子进行转化：SEQ ID NO:100、SEQ ID NO:102、SEQ ID NO:103、SEQ ID NO:105、SEQ ID NO:106、SEQ ID NO:108、SEQ ID NO:109、SEQ ID NO:111和SEQ ID NO:112。其中，所述生物体用以下核酸分子进行 转化，所述核酸分子包含编码以下蛋白质的核酸序列，所述蛋白质来自对隐甲藻，其在形成磷脂(PL)或三酰甘油(TAG)时使用PUFA-CoA作为底物。在某些实施方案中，所述生物体用以下核酸分子进行转化，所述核酸分子包含与选自以下的核酸序列至少90%相同的核酸序列：SEQ ID NO:114、SEQ ID NO:115、SEQ ID NO:116、SEQ ID NO:117、SEQ ID NO:118、SEQ ID NO:119、SEQ ID NO:120和SEQ ID NO:121。
在任意上述实施方案中的一些实施方案中，所述PUFA合成酶包含至少一种来自破囊壶菌或Labyrinthulid的PUFA合成酶的功能域。在一些实施方案中，所述PUFA合成酶包含至少一种来自破囊壶菌目微生物的PUFA合成酶的功能域。在其它实施方案中，所述PUFA合成酶包含至少一种源于选自以下的生物体的PUFA合成酶的功能域：裂殖壶菌属、破囊壶菌属、Ulkenia和Labyrinthula。在其它实施方案中，所述PUFA合成酶包含至少一种源于选自以下的生物体的PUFA合成酶的功能域：裂殖壶菌属种(Schizochytrium sp.)American Type Culture Collection(ATCC)No.20888、破囊壶菌属23B ATCCNo.20892和任意这些微生物的突变体。在一些实施方案中，所述PUFA合成酶包含至少一种来自海洋细菌的PUFA合成酶的功能域。在其它实施方案中，所述PUFA合成酶包含至少一种源于选自以下的生物体的PUFA合成酶的功能域：希瓦氏菌属、Moritella和发光菌属(Photobacterium)。在其它实施方案中，所述PUFA合成酶由一种或多种包含以下结构域的蛋白质组成：
至少一个烯酰ACP还原酶(enoyl-ACP reductase,ER)结构域；
至少四个酰基载体蛋白(acyl carrier protein,ACP)结构域；
至少两个β-酮脂酰ACP合成酶(β-ketoacyl-ACP synthase,KS)结构域；
至少一个酰基转移酶(acyltransferase,AT)结构域；
至少一个β-酮脂酰ACP还原酶(β-ketoacyl-ACP reductase,KR)结构域；
至少两个FabA样β-羟酰ACP脱水酶(FabA-likeβ-hydroxyacyl-ACP dehydrase,DH)结构域；和
至少一个链长度因子(chain length factor,CLF)结构域；
至少一个丙二酰辅酶A:ACP酰基转移酶(malonyl-CoA:ACP acyltransferase,MAT)结构域。
在其它实施方案中，所述PUFA合成酶由一种或多种包含以下结构域的蛋白质组成：
两个烯酰ACP还原酶(ER)结构域；
八个或九个酰基载体蛋白(ACP)结构域；
两个β-酮脂酰ACP合成酶(KS)结构域；
一个酰基转移酶(AT)结构域；
一个酮还原酶(ketoreductase,KR)结构域；
两个FabA样β-羟酰ACP脱水酶(DH)结构域；
一个链长度因子(CLF)结构域；和
一个丙二酰辅酶A:ACP酰基转移酶(MAT)结构域。
在其它实施方案中，所述PUFA合成酶为细菌的PUFA合成酶，其在至少约25℃产生PUFA，并且其中所述PUFA合成酶由一种或多种包含以下结构域的蛋白质组成：
至少一个烯酰ACP还原酶(ER)结构域；
至少六个酰基载体蛋白(ACP)结构域；
至少两个β-酮脂酰ACP合成酶(KS)结构域；
至少一个酰基转移酶(AT)结构域；
至少一个酮还原酶(KR)结构域；
至少两个FabA样β-羟酰ACP脱水酶(DH)结构域；
至少一个链长度因子(CLF)结构域；
至少一个丙二酰辅酶A:ACP酰基转移酶(MAT)结构域；和
至少一个4’-磷酸泛酰巯基乙氨基转移酶(PPTase)结构域。
在一些实施方案中，所述PUFA合成酶包含一种或多种选自以下的序列：SEQ ID NO:1-32中的任意一种和SEQ ID NO:35-80中的任意一种。
在一些实施方案中，已对一种或多种编码所述PUFA合成酶的核酸序列进行优化，以改进所述PUFA合成酶在所述植物或植物细胞中的表达。在其它实施方案中，所述PUFA合成酶和所述PPTase的表达靶向于所述植物或植物细胞的质体。
在一些实施方案中，所述经遗传修饰的生物体为植物，并且所述植物为含油种子植物(oil seed plant)。在其它实施方案中，所述植物为双子叶植物。在其它实施方案中，所述植物选自但不限于：油菜、大豆、油菜子、亚麻子、玉米、红花、向日葵和烟草。
在其它实施方案中，所述经遗传修饰的生物体产生至少一种选自以下的 多不饱和脂肪酸(PUFA)：EPA(C20:5,n-3)、DHA(C22:6,n-3)、DPA(C22:5,n-6或n-3)、ARA(C20:4,n-6)、GLA(C18:3,n-6)和/或SDA(C18:4,n-3))及它们的任意组合。在一些实施方案中，所述经遗传修饰的生物体产生至少一种选自以下的多不饱和脂肪酸(PUFA)：DHA、EPA和DPA n-6。在其它实施方案中，所述经遗传修饰的生物体产生DHA和DPA n-6。在其它实施方案中，所述经遗传修饰的生物体产生ARA。
在一些实施方案中，所述经遗传修饰的生物体包含至少0.5%重量的所述至少一种PUFA。在其它实施方案中，除所述至少一种PUFA外，所述PUFA合成酶产生的全部脂肪酸的量占所述生物体产生的全部脂肪酸的量的少于约10%重量。在其它实施方案中，除所述至少一种PUFA外，所述PUFA合成酶产生的全部脂肪酸的量占所述生物体产生的全部脂肪酸的量的少于约5%重量。
在其它实施方案中，全部脂肪酸在所述植物、植物部分或植物细胞中的分布包含至少约0.5%重量的至少一种具有至少20个碳和四个或更多个碳-碳双键的多不饱和脂肪酸(PUFA)，并且其中全部脂肪酸在所述植物或植物部分中的分布就以下PUFA的总量而言含有少于5%的以下PUFA：γ-亚麻酸(GLA;18:3,n-6)、具有18个碳和四个碳-碳双键的PUFA、具有20个碳和三个碳-碳双键的PUFA和具有22个碳和两个或三个碳-碳双键的PUFA。
在其它实施方案中，全部脂肪酸在所述植物、植物部分或植物细胞中的分布包含至少约0.5%重量的至少一种具有至少20个碳和四个或更多个碳-碳双键的多不饱和脂肪酸(PUFA)，并且其中全部脂肪酸在所述植物或植物部分中的分布就以下每种PUFA而言含有少于1%的以下PUFA：γ-亚麻酸(GLA;18:3,n-6)、具有18个碳和四个碳-碳双键的PUFA、具有20个碳和三个碳-碳双键的PUFA和具有22个碳和两个或三个碳-碳双键的PUFA。
在其它实施方案中，全部脂肪酸在所述植物、植物部分或植物细胞中的分布包含至少约0.5%重量的至少一种具有至少20个碳和四个或更多个碳-碳双键的多不饱和脂肪酸(PUFA)，并且其中全部脂肪酸在所述植物或植物部分中的分布含有少于2%的γ-亚麻酸(GLA;18:3,n-6)和双高-γ-亚麻酸(dihomo-gamma-linolenic acid,DGLA或HGLA;20:3,n-6)。
在其它实施方案中，全部脂肪酸在所述经遗传修饰的生物体中的分布含有少于1%重量的γ-亚麻酸(GLA;18:3,n-6)和双高-γ-亚麻酸(DGLA或HGLA; 20:3,n-6)。
在其它实施方案中，全部脂肪酸在所述经遗传修饰的生物体中的分布包含至少约0.5%重量的至少一种具有至少20个碳和四个或更多个碳-碳双键的多不饱和脂肪酸(PUFA)，并且其中全部脂肪酸在所述植物或植物部分中的分布含有少于1%的γ-亚麻酸(GLA;18:3,n-6)。
在其它实施方案中，全部脂肪酸在所述经遗传修饰的生物体中的分布含有少于0.5%重量的γ-亚麻酸(GLA;18:3,n-6)。
本发明也提供由本发明的任意经遗传修饰的生物体得到的油。在一个实施方案中，本发明提供包含可检测量的DHA(二十二碳六烯酸(C22:6,n-3))和DPA(二十二碳五烯酸(C22:5,n-6)的油，其中DPA n-6与DHA的比例为1:1或大于1:1，其中所述植物油得自本发明的任意经遗传修饰的生物体。
在所述经遗传修饰的生物体为植物的情况下，本发明提供得自所述植物的种子。
本发明也提供包含本发明的任意油或种子的食品(food product)。
本发明也提供含有本发明的油的药品(pharmaceutical product)。
本发明也提供生产包含至少一种PUFA的油的方法，所述方法包括从本发明的种子回收油。
本发明也提供生产包含至少一种PUFA的油的方法，所述方法包括从本发明的任意经遗传修饰的生物体回收油。
本发明也提供生产至少一种多不饱和脂肪酸(PUFA)的方法，所述方法包括使本发明的任意遗传修饰的植物或微生物生长。
本发明还提供向个体提供含有至少一种PUFA的补品(supplement)或治疗品(therapeutic product)的方法，所述方法包括向所述个体提供本发明的经遗传修饰的生物体、本发明的种子、本发明的油、本发明的食品或本发明的药品。
本发明也提供得到上述经遗传修饰的生物体的方法，所述方法包括用一种或多种编码所述PUFA合成酶和所述PPTase的核酸分子对生物体进行转化，其中所述生物体含有遗传修饰，以抑制选自KASII和KASIII的蛋白质的表达或活性。
本发明也提供得到上述经遗传修饰的生物体的方法，所述方法包括用一种或多种编码所述PUFA合成酶和所述PPTase的核酸分子对生物体进行转 化，并且进一步对所述生物体进行遗传修饰，以抑制选自KASII和KASIII的蛋白质的表达或活性。
本发明也提供对生物体进行转化以表达PUFA的方法，所述方法包括用编码PUFA合成酶的核酸分子、编码磷酸泛酰巯基乙氨基转移酶(PPTase)的核酸分子和本申请描述的任意酰基辅酶A合成酶或酰基转移酶对生物体进行转化。在一个方面，所述生物体含有遗传修饰，以除去或钝化所述生物体表达的脂肪酸合成酶(FAS)。在一个方面，所述生物体含有遗传修饰，以在所述生物体中就丙二酰辅酶A而言减少与PUFA合成酶的竞争或提高丙二酰辅酶A的水平。例如，所述生物体可包括植物或微生物。
附图说明
图1的数字化图像(digitized image)显示了体外活性测定中对裂殖壶菌属菌株Ac66的不含有细胞的匀浆、源于裂殖壶菌属菌株Ac66的PUFA-S KO突变体的不含有细胞的匀浆和源于裂殖壶菌属菌株Ac66的FAS KO突变体的不含有细胞的匀浆进行的感光图像分析(phosphorimage analysis)。
图2的数字化图像显示了体外活性测定中对裂殖壶菌属FAS-KO菌株进行正相TLC分离的感光图像分析。反应按标示的时间进行。
图3的数字化图像显示了体外活性测定中对裂殖壶菌属FAS-KO菌株进行正相TLC分离的感光图像。使用标准测定组分，但改变NADH、NADPH和乙酰辅酶A组分(条带(lane)1—NADH/NADPH/乙酰辅酶A、条带2—NADPH/乙酰辅酶A、条带3—NADH/乙酰辅酶A、条带4—NADH/NADPH、条带5—无组分)。
图4的数字化图像显示了体外活性测定中对裂殖壶菌属FAS-KO菌株进行正相TLC分离的感光图像分析。反应进行10分钟，然后添加ATP和Mg2+。反应在底部标示的时间停止(”=秒、’=分钟)。
图5的数字化图像显示了体外活性测定中对裂殖壶菌属FAS-KO菌株进行正相TLC分离的感光图像分析。反应进行10分钟，添加ATP和Mg2+(样品1除外)，然后再继续孵育20min(条带3—2μL DMSO、条带4—4μL DMSO、条带5—25μM三氮菌素C(Triascin C)、条带6—100μM三氮菌素C、条带7—200μM三氮菌素C)。
图6A的数字图像(digital image)显示了对表达裂殖壶菌属Orf A、Orf B*、Orf C和HetI的大肠杆菌(E.coli)进行的FAME分析。显示了在匀浆、高速沉淀部分(P2)、上清部分(S1)和高速上清部分(S2)中的靶标PUFA。
图6B的数字图像显示了对与图6A所用大肠杆菌菌株相同的样品进行测定的结果，不同的是，所述脂质产物在进行TLC分离前仅用HIP进行提取(而不转化成FAME)。
图7为对照酵母的FAME分布和表达裂殖壶菌属Orf A、Orf B、Orf C和HetI的酵母的FAME分布。
图8为图1的酵母的FAME分布，其被放大以显示靶标PUFA的产生。
图9的柱状图显示了抑制FAS活性对单独表达裂殖壶菌属PUFA合成酶(sOrf A、sOrf B、Orf C)和HetI或联合表达裂殖壶菌属PUFA合成酶(sOrf A、sOrf B、Orf C)和HetI与酰基CoA合成酶的酵母的DHA分布(占总FAME的百分比)的影响。
图10的柱状图显示了抑制FAS活性对单独表达裂殖壶菌属PUFA合成酶(sOrf A、sOrf B、Orf C)和HetI或联合表达裂殖壶菌属PUFA合成酶(sOrf A、sOrf B、Orf C)和HetI与酰基CoA合成酶的酵母的DHA和DPAn6分布(占总FAME的百分比)的影响。
图11的FAME分布显示了抑制FAS活性(通过浅蓝菌素)、表达裂殖壶菌属PUFA合成酶(sOrf A、sOrf B、Orf C)和HetI及表达酰基CoA合成酶对酵母中产生DHA和DPAn6的组合影响。
图12显示了已敲除DAGAT基因的裂殖壶菌属的脂质分布。
图13为在种子发育(seed development)期间表达裂殖壶菌属Orf A、B*、C和HetI的野生型Arabidopsis和Arabidopsis株263(质体靶向的)的FAME分布。
图14为来自谱系1087-7(质体靶向)的Arabidopsis种子的FAME分布，所述Arabidopsis种子在种子发育期间表达靶向于质体的裂殖壶菌属Orf A、B*、C和HetI并且抑制FAS(KASIII反义物)。
图15为来自谱系1366的汇集的Arabidopsis种子的FAME分布，所述Arabidopsis种子在种子发育期间表达靶向于质体的裂殖壶菌属Orf A、B*、C和HetI、抑制FAS(KASII RNAi)并且表达ACS-1。
具体实施方式
本发明大体上提供蛋白质或靶标(本申请通常称为“辅助蛋白”或“辅助靶标(accessory target)”)和编码上述蛋白质的核酸分子，用于在已被遗传修饰来产生多不饱和脂肪酸(PUFA)特别是长链PUFA(LCPUFA)的宿主生物体中改进上述PUFA的产生。本发明也涉及已被遗传修饰来表达某些上述蛋白质的生物体，并且涉及制备和使用上述蛋白质和生物体的方法。本发明也涉及对产生PUFA(包括通过遗传修饰来产生PUFA)的生物体进行额外的遗传修饰，所述额外的遗传修饰可包括除去或钝化所述生物体中特定的基因或靶标。具体地，本发明涉及对表达PUFA PKS系统(内源性地表达或通过遗传操作(genetic manipulation)来表达)的生物体进行遗传修饰，以改进或提高所述生物体进行的PUFA产生和/或积累。例如，本发明也涉及对竞争底物的酶进行下调工程化，并且涉及对较高的酶活性进行工程化(诸如通过诱变或使酶靶向于质体细胞器及细胞溶胶)。
根据本发明，已对生物体进行遗传修饰，使之表达PUFA PKS系统(也称为PUFA合成酶系统，就生产PUFA而言，PUFA合成酶系统可与PUFA PKS系统或PKS样系统互换使用)，其中所述生物体不能天然地(在没有遗传修饰的情况下内源性地)表达上述系统或至少上述特定的PUFA PKS系统或其部分，而所述生物体用上述系统或至少上述特定的PUFA PKS系统或其部分进行遗传修饰，本申请根据所述生物体是用PUFA PKS系统进行修饰还是用所述生物体不能内源性表达的另一种蛋白质进行修饰将所述生物体称为“异源的”宿主生物体。本发明的遗传修饰也可用于在内源性地表达PUFA PKS系统的宿主生物体中改进PUFA的产生，其中所述生物体没有用不同的PUFAPKS系统或其部分进一步修饰。
更具体地，本发明人已发现并且在本申请中首次披露了裂殖壶菌属PUFA合成酶的脂肪酸产物(主要为DHA和DPA n-6)以游离脂肪酸(FFA)的形式从上述酶中释放，及释放机制对于所述酶来说是必须的。上述产物的释放机制据认为是所有破囊壶菌PUFA PKS(PUFA合成酶)酶系统的特征，并且可能是所有真核PUFA PKS系统(包括labyrinthulid系统)的特征。此外，本发明人使用裂殖壶菌属作为模型来证明DHA游离脂肪酸和DPA游离脂肪酸在内源性酰基辅酶A合成酶(ACoAS或ACS)或多种合成酶的作用下先后与辅酶A(CoA)发生酯化。这些活化形式的脂肪酸(酰基辅酶A)然后可作为PL和TAG形成酶的底物。
裂殖壶菌属的内源性酶可非常高效地将其PUFA合成酶的FFA产物转化成酰基辅酶A，然后使用这些酰基辅酶A合成PL和TAG。其证据为裂殖壶菌属油和PL部分中高水平的DHA和DPA积累。然而，抛开理论的束缚，本发明人相信存在于可将PUFA合成酶系统转化到其中的异源宿主中的ACoAS酶可能不会如PUFA合成酶供体生物体的ACoAS那样高效地进行上述反应。另外，在这些新的宿主生物体中形成PL和TAG的内源性酰基-转移酶可能不会高效地利用PUFA-CoA作为底物，特别是与得到所述PUFA合成酶的生物体相比。本发明人也提出就PUFA尤其是某些PUFA在宿主生物体的油和油部分中的积累而言，来自某些生物体的酰基转移酶与来自其它生物体的相似酶相比通常可能是更好的酶(例如来自一种生物体的酰基转移酶与来自另一种生物体的酰基转移酶相比可将更多的DHA-CoA单元转化成TAG)。因此，本发明人在本申请中披露了通过PUFA合成酶(PUFA PKS系统)或另一种酰基链生物合成系统(acyl chain biosynthesis system)产生其PUFA并且在其PL和TAG中积累高水平的PUFA的生物体如裂殖壶菌属但不限于裂殖壶菌属(例如破囊壶菌或另一种生物体特别是另一种真核生物体)可作为编码上述酶的基因的良好来源。
本发明人发现所述PUFA产物以FFA的形式从所述PUFA合成酶中释放，这表明就将所述系统转化到异源的宿主中而言既存在挑战也存在机会，并且提供了实际的机会来对异源的宿主生物体中PUFA的产生效率进行控制和改进。
作为解释，长链PUFA(LCPUFA)作为“标准”或“经典”PUFA生物合成途径(以下定义)的一部分中不会以FFA的形式出现。实际上，生物体只有在PUFA为外源性提供时才会遇到FFA形式的PUFA。例如，大肠杆菌如大多数细菌那样不能合成PUFA。这些生物体产生的16和18个碳的饱和或单不饱和脂肪酸在酰基载体蛋白(ACP)的基础上通过II型FAS系统来合成。所述酰基-ACP作为PL形成酶的底物。大肠杆菌可利用各种FFA作为外源性碳源。在这些FFA进入PLs或进入降解循环(degradation cycle)前将这些FFA转化成酰基辅酶A。FadD基因编码大肠杆菌中唯一已知的ACoAS酶，并且在以FFA作为唯一碳源的情况下，上述基因的突变可导致不能生长。
真核生物体通常利用I型脂肪酸合成酶(FAS)(或在高等植物中为II型FAS)来产生饱和脂肪酸(16和18个碳)。所述FAS系统的产物可以FFA(例如 动物FAS)或酰基辅酶A(例如真菌FAS)的形式来释放。对于植物，所述II型FAS位于质体中。在这种情况下，16或18个碳的脂肪酸通过所述II型FAS来产生，并且经常在上述脂肪酸与ACP连接时形成单一双键。所述酰基-ACP可作为底物，用于形成质体PL(plastidial PL)。对于那些注定要从质体输出的脂肪酸(用于在细胞质PL中使用或用于合成TAG)，酰基-ACP硫酯酶使硫酯键水解，以释放FFA。所述FFA然后从质体输出，并且同细胞质ACoAS转化成酰基辅酶A。这些酰基辅酶A作为PL和TAG合成酶的底物。
在真核生物体中合成长链PUFA(LCPUFA)的“标准”或“经典”途径涉及对中链饱和或单不饱和脂肪酸(例如上述FAS系统的产物)进行修饰。这些修饰包括延长步骤和去饱和步骤。延长反应的底物为脂肪酰基辅酶A(待延长的脂肪酸链)和丙二酰辅酶A(每步延长反应所增加的2个碳的来源)。延长酶反应的产物为在直链中增加2个碳的脂肪酰基辅酶A。在上述反应循环中通常不会出现游离脂肪酸(FFA)。去饱和酶通过在基于氧的反应中去掉2个氢而在先前存在的脂肪酸链中形成顺式双键。去饱和酶的底物为酰基辅酶A(在一些动物中)或与PL(例如磷脂酰胆碱(phosphotidylcholine))的甘油骨架发生酯化的脂肪酸。再次地，在上述反应机制中不会出现FFA。因此，在“标准”或“经典”LCPUFA合成途径中出现FFA的唯一机会是在从某些FAS系统中释放所述脂肪酸时。如上所述，这些脂肪酸典型地为16或18碳的脂肪酸，并且通常为饱和或单不饱和脂肪酸，而不是更长链的PUFA诸如EPA或DHA。上述产生长链PUFA的途径的一种结果是所述途径中的中间体经常发生积累，这通常代表了通过所述系统产生的大部分新的脂肪酸。
因此，根据本发明，产生PUFA的“标准”或“经典”途径为其中通过一系列延长反应和去饱和反应来修饰中链饱和脂肪酸(例如脂肪酸合成酶(FAS)系统的产物)的脂肪酸合成途径。延长反应的底物为脂肪酰基辅酶A(待延长的脂肪酸链)和丙二酰辅酶A(在每次延长反应期间增加的2个碳的来源)。延长酶反应的产物为在直链中增加2个碳的脂肪酰基辅酶A。去饱和酶通过在基于氧的反应中去掉2个氢而在先前存在的脂肪酸链中形成顺式双键。上述途径和参与上述途径中的基因在文献(例如参见背景技术)中是众所周知的。
通过PUFA PKS(PUFA合成酶)酶(以下详细描述)来合成长链PUFA的途径与上述“标准”途径有很大不同。所述PUFA合成酶利用丙二酰辅酶A作为碳源，并且在没有释放任何显著量的中间体的情况下产生最终的PUFA。在 合成期间使用不需要氧的机制来增加合适的顺式双键。在合成循环期间将NADPH用作还原剂。在至少破囊壶菌PUFA PKS系统中，所述酶释放FFA形式的PUFA产物，此内容由本发明人在本申请中首次披露。这种释放机制部分地由酶本身来决定。因此，从PUFA酶系统中释放FFA形式的LCPUFA是裂殖壶菌属PUFA PKS系统的独特特征，并且可能是所有真核PUFA合成酶系统诸如破囊壶菌(破囊壶菌)中的PUFA合成酶系统的特征。
因此，本发明人提出当在异源的宿主(例如不能内源性地表达上述特定PUFA PKS系统的宿主生物体)中表达PUFA PKS系统(PUFA合成酶系统)时，就对所期望的隔室(compartment)或脂质部分(lipid fraction)中PUFA的产生和积累进行优化而言要考虑的因素是上述宿主的内源性酰基辅酶A合成酶(ACoAS)(或多种酶)识别所引入的系统的FFA产物将其作为底物使之转化成相应的酰基辅酶A的能力。如上所述，由于可将PUFA PKS系统引入到其中的大多数异源的宿主生物体通常只有在PUFA经外源性提供时才会遇到FFA形式的PUFA，所以所述宿主生物体可能不具有处理FFA的最佳辅助蛋白，而所述FFA可能是通过宿主生物体在所期望的脂质部分或隔室中实现最佳产生和最佳积累的抑制因子。例如，众所周知的是，有几个家族的蛋白质具有ACoAS活性，并且这些酶对FFA底物的优先选择的特异性是非常高的。因此，存在于一些潜在宿主中的ACoAS可能不会高效地将长链PUFA FFA转化成酰基辅酶A，特别是当这些宿主在正常情况下不会遇到FFA形式的上述PUFA时。另外，宿主生物体可能不具有形成PL和TAG并且能利用PUFA-CoA作为底物的最佳酰基转移酶。最后，即使在内源性地表达PUFA PKS系统的宿主生物体中，本发明人也相信可使用本申请讨论的修饰方法来对所述生物体进行遗传修饰，以改进PUFA在所述生物体的油和油部分中的积累。
上述由本发明人披露的途径和发现提供了几种在异源的(或天然的)宿主中通过表达PUFA合成酶来产生PUFA的指导方针或策略：
1.基因优化：可能需要对所述基因序列进行优化，以与那些异源宿主的基因匹配，以便表达所述蛋白质。这在下述实施例中进行了说明，其中对编码来自裂殖壶菌属PUFA PKS系统的蛋白质的基因进行优化，以在细菌宿主及酵母中进行密码子选择(codon usage)。也发现的是，优化以在细菌中使用的基因可用于在植物中表达裂殖壶菌属PUFA PKS。以下描述了有关这些优 化基因的细节。
2.PPTase表达：本发明人已确定存在于大肠杆菌、酵母和植物中的内源性PPTase不能活化所述PUFA合成酶ACP结构域。本发明人先前已确定合适的可替换的PPTase，即来自念珠藻属(Nostoc)的HetI(披露在美国专利申请公开号20020194641中)，其可在以下宿主中使用，所述宿主的内源性PPTase不能活化所述PUFA合成酶ACP结构域。也披露了其它合适的PPTase，并且这些PPTase可容易地得到。以下描述和示范了PPTase在各种异源的宿主细胞中的用途。
3。对底物流(substrate flux)进行调节/对FAS进行抑制：PUFA合成酶利用丙二酰辅酶A作为延长反应的碳来源。FAS、细胞质脂肪酸延长反应和其它酶(例如查耳酮合成酶)也使用丙二酰辅酶A。PUFA合成酶与这些其它酶系统就丙二酰辅酶A发生竞争。这表明一种使经过PUFA合成酶途径的底物流增加的方法可提高PUFA合成酶途径对丙二酰辅酶A池(或多个池)(malonyl-CoA pool(s))的竞争。有多种可能的方法来提高对上述底物的竞争能力。这些方法包括但不局限于1)对竞争途径进行抑制，包括抑制FAS途径中的任何要素，例如通过降低上述途径中涉及的酶或亚单元(subunit)的表达水平(例如通过使用反义RNA、RNAi、共抑制或突变)，2)使PUFA合成酶在异源的宿主中表达，在所述异源的宿主中已使竞争途径减少或对其进行阻断(例如对于油菜已在细胞质中阻断了使脂肪酸延长的能力)，和/或3)使丙二酰辅酶A池增加(例如通过表达乙酰辅酶A羧化酶)。以下更详细地描述了这些策略的实例，并且在实施例中进行了说明。
4.表达酰基辅酶A合成酶：存在于裂殖壶菌属中的酶高效地将PUFA合成酶的游离脂肪酸产物转化成酰基辅酶A。存在于异源宿主中的酶可能不会以相似的效率进行这些反应，因为上述生物体通常不会遇到上述游离脂肪酸。例如，使高效地将各种PUFA合成酶的游离脂肪酸产物(例如DHA、DPA n-6、EPA或其它产物)转化成酰基辅酶A的酰基辅酶A合成酶在上述异源的宿主中表达，这可提高积累上述产物的能力。就此而言，通过PUFA合成酶途径来产生PUFA的裂殖壶菌属或其它生物体可作为编码上述酶的基因的良好来源(参见以下描述和实施例)。
5.酰基转移酶和相关酶的表达：存在于裂殖壶菌属中的酶高效地利用PUFA合成酶的酰基辅酶A形式的产物，合成PL和TAG分子。存在于异源 宿主中的酶可能不会以相似的效率进行这些反应，因为上述生物体通常不会遇到上述PUFA-CoA。例如，使能高效地将各种PUFA合成酶的酰基辅酶A产物(例如DHA-CoA、DPA n-6-CoA、EPA-CoA或其它产物)整合到PL或TAG分子中的PL或TAG合成酶在上述异源的宿主中表达，这可提高积累上述产物的能力。就此而言，通过PUFA合成酶途径来产生PUFA的裂殖壶菌属或其它生物体可作为编码上述酶的基因的良好来源(参见以下描述和实施例)。
6.细胞器特异性表达：本申请提出了其它方法，所述方法可用于使积累在异源宿主中的PUFA的量增加或使积累在异源宿主中的PUFA的分布改变。作为一个实例，可在所述宿主的各分开隔室中表达PUFA合成酶系统，由此通向各分开的丙二酰辅酶A池，这可使积累(例如在植物细胞的质体和细胞质中)增加。在以下实施例中也示范了这种策略。
因此，本发明提供了在异源的宿主生物体中解决PUFA产生和/或积累潜在抑制的方法，也提供了解决在利用PUFA PKS系统产生PUFA(通过遗传修饰或内源性地)的任何生物体中控制和提高PUFA产生的独特机会。具体地，本发明提供了各种靶标，其形式为蛋白质和编码该蛋白质的核酸分子，所述蛋白质可表达在已经遗传修饰为表达PUFA PKS系统及已进行本申请所述其它遗传修饰和策略的生物体中，以便提高或增加所述生物体的PUFA产生和/或积累，特别是在所述生物体的所期望的隔室或脂质部分中。本申请通常将上述靶标称为PUFA PKS系统的“辅助”靶标。本申请使用的靶标可表示核酸分子和/或其编码的蛋白质，如本申请描述的那样，所述蛋白质在宿主生物体中的表达或过度表达(overexpression)是期望的，及本申请使用的靶标可表示进行除去或钝化的靶标，或甚至可表示靶标细胞器(例如靶向于植物的质体)。换言之，靶标可以是针对产生PUFA的酶系统特别是PUFA PKS系统增加的要素或对产生PUFA的酶系统特别是PUFA PKS系统进行的任何修饰，其中确定所述靶标可用于增加或改进宿主生物体中脂肪酸的产生和/或积累。
PUFA PKS系统(PUFA合成酶)
因此，本发明提供了用于与PUFA PKS系统相关的辅助蛋白和其它靶标。本申请使用的PUFA PKS系统(其也可称为PUFA合成酶系统或PUFA合成酶)通常具有以下鉴定特征：(1)其产生PUFA特别是长链PUFA作为所述系统的天然产物；和(2)其包含几种多功能蛋白质，所述多功能蛋白质组装 成的复合物(complex)既对脂肪酸链进行重复加工，也进行非重复加工，包括在所选择的循环中进行反式-顺式异构化和烯酰基还原反应。另外，存在于PUFA合成酶中的ACP结构域需要通过接附辅因子(4-磷酸泛酰巯基乙胺)来活化。通过磷酸泛酰巯基乙氨基转移酶(PPTase)来接附上述辅因子。如果宿主生物体的内源性PPTase不能活化PUFA合成酶ACP结构域，则需要提供能发挥上述功能的PPTase。本发明人已确定念珠藻属种的HetI酶为活化PUFA合成酶ACP结构域的示范性和合适的PPTase。PUFA PKS系统或PUFA合成酶总体上指以下所有基因和其编码的产物，所述基因和其编码的产物在复合物中发挥作用，以在生物体中产生PUFA。因此，所述PUFA PKS系统具体地指其天然产物为PUFA的PKS系统。
更具体地，本申请使用的PUFA PKS系统产生多不饱和脂肪酸(PUFA)特别是长链PUFA(LCPUFA)作为产物。例如，内源性地(天然地)含有PUFA PKS系统的生物体使用上述系统来产生PUFA。根据本发明，PUFA为具有以下特征的脂肪酸：其碳链长度为至少16个碳，优选为至少18个碳，更优选为至少20个碳，更优选为22个或更多个碳，并且具有至少3个或更多个双键，优选为4个或更多个双键，更优选为5个或更多个双键，甚至更优选为6个或更多个双键，其中所有双键成顺式构型。本申请使用的长链多不饱和脂肪酸(LCPUFA)更特别地指碳链长度为18和更多个碳优选为20和更多个碳并且含有3个或更多个双键的脂肪酸。ω-6系列的LCPUFA包括γ-亚麻酸(C18:3)、双高γ-亚麻酸(di-homo-gamma-linolenic acid)(C20:3n-6)、花生四烯酸(arachidonic acid)(C20:4n-6)、肾上腺酸(adrenic acid)(也称为二十二碳四烯酸(docosatetraenoic acid)或DTA)(C22:4n-6)和二十二碳五烯酸(C22:5n-6)。ω-3系列的LCPUFA包括α-亚麻酸(C18:3)、二十碳三烯酸(eicosatrienoic acid)(C20:3n-3)、二十碳四烯酸(eicosatetraenoic acid)(C20:4n-3)、二十碳五烯酸(C20:5n-3)、二十二碳五烯酸(C22:5n-3)和二十二碳六烯酸(C22:6n-3)。LCPUFA也包括碳多于22个并且具有4个或更多个双键的脂肪酸，包括但不限于C28:8(n-3)。
本发明的PUFA PKS系统也包含几种多功能蛋白质(并且可包括单功能蛋白质，特别是就海洋细菌的PUFA PKS系统而言)，所述多功能蛋白质组装成的复合物既对脂肪酸链进行重复加工，也进行非重复加工，包括在所选择的循环中进行反式-顺式异构化和烯酰基还原反应。本申请也将这些蛋白 质称为核心PUFA PKS酶复合物或核心PUFA PKS系统。这些蛋白质含有的结构域和模体(motif)的一般功能在本领域中都是已知的，并且已就来自海洋细菌和真核生物体的各种PUFA PKS系统进行了详细描述(参见例如美国专利号6,140,486、美国专利号6,566,583、Metz等人,Science293:290-293(2001)、美国专利申请公开号20020194641、美国专利申请公开号20040235127、美国专利申请公开号20050100995和PCT公开号WO2006/135866)。据发现，所述结构域为单一蛋白质(即所述结构域和蛋白质是同义的)，或如上所述为单一蛋白质的两种或更多种(数种)结构域中的一种。
已对海洋细菌和破囊壶菌属成员的各种PUFA PKS系统的结构域构造和包含上述PUFA PKS系统的基因和蛋白质的结构特征和功能特征进行了详细描述(参见例如美国专利号6,140,486、美国专利6,566,583、Metz等人,Science293:290-293(2001)、美国专利申请公开号20020194641、美国专利申请公开号20040235127、美国专利申请公开号20050100995和PCT公开号WO2006/135866)。
可用于本发明的PUFA PKS系统及其蛋白质或结构域包括细菌和非细菌的PUFA PKS系统。非细菌的PUFA PKS系统为来自或源于不是细菌的生物体诸如真核生物或古细菌的PUFA PKS系统。根据细胞分化的程度将真核生物与原核生物分开，其中真核生物的分化程度比原核生物高。通常，原核生物不具有核膜，在细胞分裂期间不进行有丝分裂，仅具有一种染色体，在其细胞质中含有70S核糖体，不具有线粒体、内质网、叶绿体、溶酶体或高尔基体，并且可能具有鞭毛，如果存在鞭毛，则鞭毛含有单个原纤维(fibril)。相反地，真核生物具有核膜，在细胞分裂期间进行有丝分裂，具有多种染色体，在其细胞质中含有80S核糖体，具有线粒体、内质网、叶绿体(在藻类中)、溶酶体或高尔基体，并且可能具有鞭毛，如果存在鞭毛，则鞭毛含有多个原纤维。通常，细菌为原核生物，而藻类、真菌、原生生物、原生动物和高等植物为真核生物。根据本发明，可得到具有以下特征的经遗传修饰的植物：所述经遗传修饰的植物整合了非细菌的PUFA PKS功能域与细菌的PUFA PKS功能域及来自其它PKS系统的PKS功能域或蛋白质(I型重复的或模块的、II型或III型)或FAS系统。
优选地，本发明的PUFA PKS系统包含至少以下生物活性结构域(其通常包括在三种或更多种蛋白质中)：(a)至少一个烯酰ACP还原酶(ER)结构域； (b)多个酰基载体蛋白(ACP)结构域(例如至少来自一个到四个ACP结构域，优选来自至少五个ACP结构域，并且在一些实施方案中来自多至六个、七个、八个、九个、十个或多于十个ACP结构域)；(c)至少两个β-酮脂酰ACP合成酶(KS)结构域；(d)至少一个酰基转移酶(AT)结构域；(e)至少一个β-酮脂酰ACP还原酶(KR)结构域；(f)至少两个FabA样β-羟酰ACP脱水酶(DH)结构域；(g)至少一个链长度因子(CLF)结构域；和(h)至少一个丙二酰辅酶A:ACP酰基转移酶(MAT)结构域。在一个实施方案中，本发明的PUFA PKS系统也包含至少一个含有脱水酶(DH)保守活性位点模体(motif)的区域。
在优选的实施方案中，PUFA PKS系统包含至少以下生物活性结构域：(a)至少一个烯酰ACP还原酶(ER)结构域；(b)至少五个酰基载体蛋白(ACP)结构域；(c)至少两个β-酮脂酰ACP合成酶(KS)结构域；(d)至少一个酰基转移酶(AT)结构域；(e)至少一个β-酮脂酰ACP还原酶(KR)结构域；(f)至少两个FabA样β-羟酰ACP脱水酶(DH)结构域；(g)至少一个链长度因子(CLF)结构域；和(h)至少一个丙二酰辅酶A:ACP酰基转移酶(MAT)结构域。在一个实施方案中，本发明的PUFA PKS系统也包含至少一个含有脱水酶(DH)保守活性位点模体的区域或结构域，所述区域或结构域不是FabA样DH结构域的部分。上述结构域各自的结构特征和功能特征详细地记载在美国专利申请公开号20020194641、美国专利申请公开号20040235127、美国专利申请公开号20050100995和PCT公开号WO2006/135866中。
根据本发明，具有3-酮脂酰ACP合成酶(KS)生物活性(功能)的结构域或蛋白质以如下酶为特征，所述酶催化FAS(和PKS)延长反应循环的起始步骤。术语“β-酮脂酰ACP合成酶”可与术语“3-酮脂酰ACP合成酶”、“β-酮脂酰ACP合成酶”和“酮脂酰ACP合成酶”及相似的衍生术语互换使用。指定用于延长反应的酰基在所述酶的活性位点通过硫酯键与半胱氨酸残基相连。在多步骤反应中，所述酰基-酶与丙二酰基-ACP发生缩合，以形成酮酰基-ACP、CO2和游离酶。所述KS在延长循环中发挥重要作用，并且已在多种系统中显示出与反应循环中的其它酶相比具有较高的底物特异性。例如，大肠杆菌具有三种不同的KS酶—每种都在所述生物体的生理过程中发挥其本身特有的作用(Magnuson等人,Microbiol.Rev.57,522(1993))。在海洋细菌和本申请所述破囊壶菌(thraustochytrid)中描述的PUFA-PKS系统的两种KS结构域可能在PUFA的生物合成反应顺序中发挥不同的作用。KS作为一类酶已被很 好地表征。多种经证实的KS基因的序列是已知的，已鉴定活性位点模体，并且已确定其中几种的晶体结构。蛋白质(或蛋白质的结构域)与已知的KS序列具有同源性，所以可容易地鉴定所述蛋白质(或蛋白质的结构域)属于KS酶家族。
根据本发明，具有丙二酰辅酶A:ACP酰基转移酶(MAT)生物活性(功能)的结构域或蛋白质的特征为其将丙二酰基从丙二酰辅酶A转移到ACP。术语“丙二酰辅酶A:ACP酰基转移酶”可与“丙二酰基酰基转移酶”及相似的衍生术语互换使用。除活性位点模体(GxSxG)外，这些酶还在关键位置具有R和Q氨基酸的扩展模体(extended motif)，这使它们成为MAT酶(例如与下述AT结构域对比)。在一些PKS系统中，MAT结构域(而不是PUFA PKS结构域)可优先地将甲基丙二酸酯或乙基丙二酸酯(从相应的CoA酯)加载到ACP基团上，由此在直链碳链中引入支链。MAT结构域可通过其与已知的MAT序列具有同源性和其扩展模体的结构来识别。
根据本发明，具有酰基载体蛋白(ACP)生物活性(功能)的结构域或蛋白质的特征为小的多肽(通常长度为80至100个氨基酸)，所述小的多肽的功能是作为进行延长的脂肪酰基链的载体，通过硫酯键与上述蛋白质的辅因子共价相连。所述小的多肽以单个单元的形式存在，或作为较大蛋白质中的结构域。通过将CoA的磷酸泛酰巯基乙氨基转移到ACP的高度保守的丝氨酸残基来使所述ACP从无活性的脱辅基形式(apo-form)转化成具有完整功能的形式(functional holo-form)。酰基通过硫酯键在磷酸泛酰巯基乙氨基的游离端与ACP相连。ACP可通过用放射性的泛酰巯基乙胺进行标记和与已知的ACP具有序列同源性来鉴定。上述模体(LGIDS*)变体的存在也是ACP的特征。
根据本发明，具有酮还原酶活性(也称为3-酮脂酰ACP还原酶(KR)生物活性(功能))的结构域或蛋白质的特征在于其催化对3-酮酰基形式的ACP进行的基于吡啶-核苷酸的还原反应(pyridine-nucleotide-dependent reduction)。所述还原反应为全程脂肪酸生物合成延长循环(de novo fatty acid biosynthesis elongation cycle)中的第一还原步骤，并且为在聚酮化合物生物合成中经常进行的反应。术语“β-酮脂酰ACP还原酶”可与术语“酮还原酶”、“3-酮脂酰ACP还原酶”、“酮脂酰ACP还原酶”及相似的衍生术语互换使用。就烯酰基ACP还原酶(ER)家族、FAS的其它还原酶(而不是存在于PUFA PKS系统中的ER家族)和短链醇脱氢酶家族而言，观察到显著的序列相似性。对上述PUFA PKS区域进行的Pfam分析显示出其就核心区域而言与短链醇脱氢酶家族具有同源性。对相同区域进行的Blast分析显示出其就核心区域而言与已知的KR酶相匹配，并且扩展区域与来自其它特征化PUFA PKS系统的结构域具有同源性的扩展区域相匹配。
根据本发明，基于以下理论将结构域或蛋白质称为链长度因子(CLF)。最初将CLF描述成II型(解离的酶(dissociated enzymes))PKS系统的特征，并且假设其在确定延长循环的次数从而确定终产物的链长度时发挥作用。CLF氨基酸序列显示出与KS结构域的同源性(并且认为其与KS蛋白形成杂二聚体)，但它们缺乏活性位点半胱氨酸。CLF在PKS系统中的作用一直存在争议。新的证据(C.Bisang等人,Nature401,502(1999))暗示其在启动(提供待延长的初始酰基)PKS系统时发挥作用。就上述作用而言，认为CLF结构域使丙二酸酯(例如丙二酰基-ACP)发生脱羧，由此形成乙酸酯基团，该乙酸酯基团可被转移到KS活性位点。因此，上述乙酸酯作为可发生初始延长(缩合)反应的“启动”分子。已鉴定所述II型CLF的同源物为一些模块PKS系统中的“负载”结构域。在当前鉴定的所有PUFA PKS系统中都发现了具有CLF序列特征的结构域，并且在每种情况下都发现所述具有CLF序列特征的结构域为多结构域蛋白质的部分。
“酰基转移酶”或“AT”指一大类可催化不同酰基转移反应的酶。术语“酰基转移酶”可与术语“酰基转移酶”互换使用。在本申请所述PUFA PKS系统中鉴定的AT结构域彼此具有良好的同源性，并且与存在于当前检验的所有其它PUFA PKS系统中的结构域具有良好的同源性，但与一些已确定其特异性功能的酰基转移酶具有很差的同源性(例如与丙二酰辅酶A:ACP酰基转移酶(MAT)具有很差的同源性)。尽管与MAT具有很差的同源性，但不认为上述AT结构域的功能与MAT相同，因为所述AT结构域不具有上述酶的扩展模体结构特征(参见以上对MAT结构域的描述)。出于披露的目的，PUFA PKS系统中AT结构域的可能功能包括但不限于将脂肪酰基从ORFA ACP结构域转移到水中(即硫酯酶-以游离脂肪酸的形式释放脂肪酰基)，将脂肪酰基转移到接纳体诸如CoA，在各个ACP结构域之间转移所述酰基，或将脂肪酰基转移到亲脂性接纳体分子(lipophilic acceptor)(例如转移到溶血磷脂酸(lysophosphadic acid))。
根据本发明，上述结构域具有烯酰基还原酶(ER)生物活性。所述ER酶 对脂肪酰基-ACP中的反式双键(通过DH活性来引入)进行还原，这使那些碳完全饱和。PUFA-PKS中的ER结构域与最近表征的ER酶家族具有同源性(Heath等人,Nature406,145(2000))。Heath和Rock通过以下方法鉴定了这类新的ER酶：克隆来自肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)的重要基因，纯化上述基因表达的蛋白质，并且证明其在体外测定中具有ER活性。当前检验的所有PUFA PKS系统都含有至少一种与裂殖壶菌属ER结构域具有极高度序列同源性的结构域，该裂殖壶菌属ER结构域与上述肺炎链球菌ER蛋白质具有同源性。
根据本发明，具有脱水酶或脱水酶(DH)活性的蛋白质或结构域对脱水反应进行催化。本申请一般使用的DH活性通常指FabA样β-羟酰ACP脱水酶(DH)生物活性。FabA样β-羟酰ACP脱水酶(DH)生物活性从β-酮脂酰ACP中除去HOH，并且在碳链中初始地形成反式双键。术语“FabA样β-羟酰ACP脱水酶”可与术语“FabA样β-羟酰ACP脱水酶”、“β-羟酰ACP脱水酶”、“脱水酶”及相似的衍生术语互换使用。PUFA PKS系统的DH结构域与细菌的DH酶具有同源性(而不是与其它PKS系统的DH结构域具有同源性)，所述细菌的DH酶与细菌的FAS系统相关。细菌的DH的一个亚类即FabA样DH，其具有顺反异构酶活性(Heath等人,J.Biol.Chem.,271,27795(1996))。由于本申请所述DH结构域中的一种或本申请描述的所有DH结构域与FabA样DH蛋白质具有同源性，所以本申请所述DH结构域中的一种或本申请描述的所有DH结构域负责在PUFA PKS的产物中插入顺式双键。
可用于本发明的PUFA PKS蛋白也可具有不以FabA样(例如上述顺反活性与FabA样活性相关)为特征的脱水酶活性，本申请通常将其称为非FabA样DH活性或非FabA样β-羟酰ACP脱水酶(DH)生物活性。更具体地，在PKS系统的脱水酶结构域中发现了保守活性位点模体(长度为约13个氨基酸即L*xxHxxxGxxxxP；例如SEQ ID NO:70的氨基酸2504-2516所示；模体中的*表示L也可以是I)(Donadio S,Katz L.Gene.1992Feb1;111(1):51-60)。在迄今所有已知PUFA-PKS序列的相似区域中并且在本申请描述的PUFA PKS序列中发现了上述保守模体(本申请也将其称为脱水酶(DH)保守活性位点模体或DH模体)，但相信最近检测到的只有组氨酸(His)模体。上述保守模体处于PUFA-PKS序列的具有高度同源性的非特征化区域中。本申请提出的通过PUFA-PKS进行的PUFA生物合成需要非FabA样脱水反应，并且上 述模体可负责所述反应。
出于说明的目的，以下详细描述了几种PUFA PKS系统的结构。然而，应该理解的是，本发明不限于只使用这些PUFA PKS系统。
裂殖壶菌属PUFA PKS系统
在一个实施方案中，来自裂殖壶菌属的PUFA PKS系统包含至少以下生物活性结构域：(a)两个烯酰ACP还原酶(ER)结构域；(b)五个到十个或更多个酰基载体蛋白(ACP)结构域，并且在一个方面为九个ACP结构域；(c)两个β-酮脂酰ACP合成酶(KS)结构域；(d)一个酰基转移酶(AT)结构域；(e)一个β-酮脂酰ACP还原酶(KR)结构域；(f)两个FabA样β-羟酰ACP脱水酶(DH)结构域；(g)一个链长度因子(CLF)结构域；和(h)一个丙二酰辅酶A:ACP酰基转移酶(MAT)结构域。在一个实施方案中，本发明的裂殖壶菌属PUFA PKS系统也包含至少一个含有脱水酶(DH)保守活性位点模体的区域或结构域，所述脱水酶(DH)保守活性位点模体不是FabA样DH结构域的部分。这些结构域各自的结构特征和功能特征在本领域中通常是已知的(参见例如美国专利6,566,583、Metz等人,Science293:290-293(2001)、美国专利申请公开号20020194641和PCT公开号WO2006/135866)。
有三个可读框能形成上述核心裂殖壶菌属PUFA PKS系统。每个可读框的结构域结构如下。
裂殖壶菌属可读框A(Orf A)
本申请将Orf A的完整核酸序列表示为SEQ ID NO:1。Orf A为8730个核苷酸的序列(不包括终止密码子)，其编码2910个氨基酸的序列，本申请将所述2910个氨基酸的序列表示为SEQ ID NO:2。Orf A中具有十二个结构域：(a)一个β-酮脂酰ACP合成酶(KS)结构域；(b)一个丙二酰辅酶A:ACP酰基转移酶(MAT)结构域；(c)九个酰基载体蛋白(ACP)结构域；和(d)一个酮还原酶(KR)结构域。已对编码裂殖壶菌属种ATCC20888和ATCC20888的子菌株(daughter strain)(称为裂殖壶菌属种菌株N230D)的Orf A的基因组DNA克隆(质粒)进行了分离和测序。
就本发明人已知的最大范围而言，本申请称为JK1126的从裂殖壶菌属种ATCC20888分离的基因组克隆包含跨越SEQ ID NO:1的1位至8730位的核酸序列，并且编码SEQ ID NO:2的相应氨基酸序列。基因组克隆pJK1126(称为pJK1126Orf A基因组克隆，形式为含有裂殖壶菌属ATCC 20888“Orf A”基因的大肠杆菌质粒载体)在2006年6月8日保藏在American Type Culture Collection(ATCC),10801University Boulevard,Manassas,Va.20110-2209USA，并且ATCC保藏号为PTA-7648。本发明包括pJK1126Orf A基因组克隆的核酸序列和上述质粒编码的氨基酸序列。
就本发明人已知的最大范围而言，本申请称为pJK306Orf A基因组克隆和pJK320Orf A基因组克隆的从裂殖壶菌属种N230D一起分离出的两种基因组克隆(重叠克隆)包含SEQ ID NO:1的核酸序列，并且编码SEQ ID NO:2的氨基酸序列。基因组克隆pJK306(称为pJK306Orf A基因组克隆，形式为含有裂殖壶菌属种N230D Orf A基因5’部分(与pJK320有2.2kB重叠)的大肠杆菌质粒)在2006年6月8日保藏在American Type Culture Collection(ATCC),10801University Boulevard,Manassas,Va.20110-2209USA，并且ATCC保藏号为PTA-7641。本发明涵盖pJK306Orf A基因组克隆的核酸序列和由上述质粒编码的氨基酸序列。基因组克隆pJK320(称为pJK320Orf A基因组克隆，形式为含有裂殖壶菌属种N230D Orf A基因3’部分(与pJK306有2.2kB重叠)的大肠杆菌质粒)在2006年6月8日保藏在American Type Culture Collection(ATCC),10801University Boulevard,Manassas,Va.20110-2209USA，并且ATCC保藏号为PTA-7644。本发明包括pJK320Orf A基因组克隆的核酸序列和由上述质粒编码的氨基酸序列。
Orf A中的第一结构域为KS结构域，本申请也将其称为ORFA-KS，并且本申请将含有编码所述ORFA-KS结构域的序列的核酸序列表示为SEQ ID NO:7(SEQ ID NO:1的1位-1500位)。本申请将含有所述ORFA-KS结构域的氨基酸序列表示为SEQ ID NO:8(SEQ ID NO:2的1位-500位)。应该注意的是，所述ORFA-KS结构域含有活性位点模体即DXAC*(*表示酰基结合位点C215)。另外，在裂殖壶菌属KS区域端部的特征模体即GFGG存在于SEQ ID NO:2的上述结构域中，因此存在于SEQ ID NO:8中。
Orf A中的第二结构域为MAT结构域，本申请也将其称为ORFA-MAT，并且本申请将含有编码所述ORFA-MAT结构域的序列的核酸序列表示为SEQ ID NO:9(SEQ ID NO:1的1723位-3000位)。本申请将含有所述ORFA-MAT结构域的氨基酸序列表示为SEQ ID NO:10(SEQ ID NO:2的575位-1000位)。所述MAT结构域在93位包含天冬氨酸(aspartate)，并且在94位包含组氨酸(分别相应于SEQ ID NO:2的667位和668位)。应该注意的是， 所述ORFA-MAT结构域含有活性位点模体即GHS*XG(*表示酰基结合位点S706)，本申请将其表示为SEQ ID NO:11。
Orf A的结构域3-11为九个串联的ACP结构域，本申请也将其称为ORFA-ACP(所述序列中的第一结构域为ORFA-ACP1，第二结构域为ORFA-ACP2，第三结构域为ORFA-ACP3，依此类推)。第一ACP结构域即ORFA-ACP1包含在跨越SEQ ID NO:1(Orf A)的约3343位至约3600位的核酸序列中。本申请将包含编码ORFA-ACP1结构域的序列的核酸序列表示为SEQ ID NO:12(SEQ ID NO:1的3343位-3600位)。含有第一ACP结构域的氨基酸序列跨越SEQ ID NO:2的约1115位至约1200位。本申请将含有ORFA-ACP1结构域的氨基酸序列表示为SEQ ID NO:13(SEQ ID NO:2的1115位-1200位)。应该注意的是，所述ORFA-ACP1结构域含有活性位点模体即LGIDS*(*表示泛酰巯基乙胺结合模体S1157)，本申请用SEQ ID NO:14表示。
所有九个ACP结构域的核酸序列和氨基酸序列都是高度保守的，因此本申请没有用各自的序列标识符(sequence identifier)来表示每个结构域的序列。然而，基于本申请披露的信息，本领域技术人员可容易地确定逐一含有其它八个ACP结构域的序列。所有九个ACP结构域一起跨越Orf A中SEQ ID NO:1的约3283位至约6288位的区域，其相应于SEQ ID NO:2的约1095位氨基酸至约2096位氨基酸。本申请将编码含有所有九个结构域的完整ACP区域的核酸序列表示为SEQ ID NO:16。SEQ ID NO:16表示的区域包括各个ACP结构域之间的接头(linker)片段。在SEQ ID NO:16中，所述九个结构域的每个重复间隔(repeat interval)为约330个核苷酸(在相邻活性位点丝氨酸之间测量的氨基酸的实际数目为104至116个氨基酸)。上述九个ACP结构域各自含有泛酰巯基乙胺结合模体LGIDS*(本申请用SEQ ID NO:14表示)，其中S*为泛酰巯基乙胺结合位点丝氨酸(S)。所述泛酰巯基乙胺结合位点丝氨酸(S)位于每个ACP结构域序列的核心附近。在ACP结构域区域的各端部及在每个ACP结构域之间的是高度富含脯氨酸(P)和丙氨酸(A)的区域，据认为，所述区域是接头区域。例如，在ACP结构域1和2之间的是以下序列：APAPVKAAAPAAPVASAPAPA，本申请将其表示为SEQ ID NO:15。就SEQ ID NO:2的氨基酸序列而言，所述九个ACP结构域各自的活性位点丝氨酸残基(即泛酰巯基乙胺结合位点)的位置如下：ACP1=S1157； ACP2=S1266；ACP3=S1377；ACP4=S1488；ACP5=S1604；ACP6=S1715；ACP7=S1819；ACP8=S1930；和ACP9=S2034。如果ACP结构域的平均大小在不包括接头时为约85个氨基酸，而在包括接头时为约110个氨基酸，并且所述活性位点丝氨酸大概处于所述结构域的核心，则本领域技术人员可容易地确定九个ACP结构域在Orf A中各自的位置。
Orf A中的结构域12为KR结构域，本申请也将其称为ORFA-KR，并且本申请将含有编码所述ORFA-KR结构域的序列的核酸序列表示为SEQ ID NO:17(SEQ ID NO:1的6598位-8730位)。本申请将含有所述ORFA-KR结构域的氨基酸序列表示为SEQ ID NO:18(SEQ ID NO:2的2200位-2910位)。在所述KR结构域中的是与短链醛脱氢酶具有同源性的核心区域(KR为短链醛脱氢酶家族的成员)。上述核心区域跨越SEQ ID NO:1的约7198位至约7500位，其相应于SEQ ID NO:2的2400位氨基酸-2500位氨基酸。
裂殖壶菌属可读框B(Orf B)
本申请将Orf B的完整核酸序列表示为SEQ ID NO:3。Orf B为6177个核苷酸的序列(不包括终止密码子)，其编码2059个氨基酸的序列，本申请将所述2059个氨基酸的序列表示为SEQ ID NO:4。在Orf B中的是四个结构域：(a)一个酮脂酰ACP合成酶(KS)结构域；(b)一个链长度因子(CLF)结构域；(c)一个酰基转移酶(AT)结构域；和(d)一个烯酰ACP还原酶(ER)结构域。
已对编码裂殖壶菌属种ATCC20888和ATCC20888的子菌株(称为裂殖壶菌属种菌株N230D)的Orf B的基因组DNA克隆(质粒)进行了分离和测序。
就本发明人已知的最大范围而言，本申请称为pJK1129的从裂殖壶菌属种ATCC20888分离的基因组克隆包含SEQ ID NO:3的核酸序列，并且编码SEQ ID NO:4的氨基酸序列。基因组克隆pJK1129(称为pJK1129Orf B基因组克隆，形式为含有裂殖壶菌属ATCC20888“Orf B”基因的大肠杆菌质粒载体)在2006年6月8日保藏在American Type Culture Collection(ATCC),10801University Boulevard,Manassas,Va.20110-2209USA，并且ATCC保藏号为PTA-7649。本发明包括pJK1126Orf B基因组克隆的核酸序列和上述质粒编码的氨基酸序列。
就本发明人已知的最大范围而言，本申请称为pJK324Orf B基因组克隆的、从裂殖壶菌属种N230D分离的基因组克隆包含SEQ ID NO:3的核酸序列，并且编码SEQ ID NO:4的氨基酸序列。基因组克隆pJK324(称为pJK324 Orf B基因组克隆，形式为含有裂殖壶菌属种N230D Orf B基因序列的大肠杆菌质粒)在2006年6月8日保藏在American Type Culture Collection(ATCC),10801University Boulevard,Manassas,Va.20110-2209USA，并且ATCC保藏号为PTA-7643。本发明涵盖pJK324Orf B基因组克隆的核酸序列和上述质粒编码的氨基酸序列。
Orf B中的第一结构域为KS结构域，本申请也将其称为ORFB-KS，并且本申请将含有编码所述ORFB-KS结构域的序列的核酸序列表示为SEQ ID NO:19(SEQ ID NO:3的1位-1350位)。本申请将含有所述ORFB-KS结构域的氨基酸序列表示为SEQ ID NO:20(SEQ ID NO:4的1位-450位)。上述KS结构域在SEQ ID NO:20的371位包含缬氨酸(即SEQ ID NO:20的371位)。应该注意的是，所述ORFB-KS结构域含有活性位点模体即DXAC*(*表示酰基结合位点C196)。另外，在上述KS区域端部的特征模体即GFGG存在于SEQ ID NO:4的上述结构域中，因此存在于SEQ ID NO:20中。
Orf B中的第二结构域为CLF结构域，本申请也将其称为ORFB-CLF，并且本申请将含有编码所述ORFB-CLF结构域的序列的核酸序列表示为SEQ ID NO:21(SEQ ID NO:3的1378位-2700位)。本申请将含有所述ORFB-CLF结构域的氨基酸序列表示为SEQ ID NO:22(SEQ ID NO:4的460位-900位)。应该注意的是，所述ORFB-CLF结构域含有的KS活性位点模体，该模体不具有酰基结合半胱氨酸。
Orf B中的第三结构域为AT结构域，本申请也将其称为ORFB-AT，并且本申请将含有编码所述ORFB-AT结构域的序列的核酸序列表示为SEQ ID NO:23(SEQ ID NO:3的2701位-4200位)。本申请将含有所述ORFB-AT结构域的氨基酸序列表示为SEQ ID NO:24(SEQ ID NO:4的901位-1400位)。应该注意的是，所述ORFB-AT结构域含有的活性位点模体即GxS*xG(*表示酰基结合位点S1140)以酰基转移酶(AT)蛋白质为特征。
Orf B中的第四结构域为ER结构域，本申请也将其称为ORFB-ER，并且本申请将含有编码所述ORFB-ER结构域的序列的核酸序列表示为SEQ ID NO:25(SEQ ID NO:3的4648位-6177位)。本申请将含有所述ORFB-ER结构域的氨基酸序列表示为SEQ ID NO:26(SEQ ID NO:4的1550位-2059位)。
裂殖壶菌属可读框C(Orf C)
本申请将Orf C的完整核酸序列表示为SEQ ID NO:5。Orf C为4506个核苷酸的序列(不包括终止密码子)，其编码1502个氨基酸的序列，本申请将所述1502个氨基酸的序列表示为SEQ ID NO:6。在Orf C中的是三个结构域：(a)两个FabA样羟酰ACP脱水酶(DH)结构域；和(b)一个烯酰ACP还原酶(ER)结构域。已对编码裂殖壶菌属种ATCC20888和ATCC20888的子菌株(称为裂殖壶菌属种菌株N230D)的Orf C的基因组DNA克隆(质粒)进行了分离和测序。
就本发明人已知的最大范围而言，本申请称为pJK1131的从裂殖壶菌属种ATCC20888分离的基因组克隆包含SEQ ID NO:5的核酸序列，并且编码SEQ ID NO:6的氨基酸序列。基因组克隆pJK1131(称为pJK1131Orf C基因组克隆，形式为含有裂殖壶菌属ATCC20888“Orf C”基因的大肠杆菌质粒载体)在2006年6月8日保藏在American Type Culture Collection(ATCC),10801University Boulevard,Manassas,Va.20110-2209USA，并且ATCC保藏号为PTA-7650。本发明涵盖pJK1131Orf C基因组克隆的核酸序列和上述质粒编码的氨基酸序列。
就本发明人已知的最大范围而言，本申请称为pBR002Orf C基因组克隆的从裂殖壶菌属种N230D分离的基因组克隆包含SEQ ID NO:5的核酸序列，并且编码SEQ ID NO:6的氨基酸序列。基因组克隆pBR002(当形式为含有裂殖壶菌属种N230D Orf C基因序列的大肠杆菌质粒载体时称为pBR002Orf C基因组克隆)在2006年6月8日保藏在American Type Culture Collection(ATCC),10801University Boulevard,Manassas,Va.20110-2209USA，并且ATCC保藏号为PTA-7642。本发明包括pBR002Orf C基因组克隆的核酸序列和上述质粒编码的氨基酸序列。
Orf C中的第一结构域为DH结构域，本申请也将其称为ORFC-DH1。其为Orf C中两种DH结构域中的一种，因此称为DH1。本申请将含有编码所述ORFC-DH1结构域的序列的核酸序列表示为SEQ ID NO:27(SEQ ID NO:5的1位-1350位)。本申请将含有所述ORFC-DH1结构域的氨基酸序列表示为SEQ ID NO:28(SEQ ID NO:6的1位-450位)。
Orf C中的第二结构域为DH结构域，本申请也将其称为ORFC-DH2。其为Orf C中两种DH结构域中的第二种，因此称为DH2。本申请将含有编码所述ORFC-DH2结构域的序列的核酸序列表示为SEQ ID NO:29(SEQ ID NO:5的1351位-2847位)。本申请将含有所述ORFC-DH2结构域的氨基酸序列表示为SEQ ID NO:30(SEQ ID NO:6的451位-949位)。上述DH结构域在SEQ ID NO:30的426位-440位包含氨基酸H-G-I-A-N-P-T-F-V-H-A-P-G-K-I(SEQ ID NO:6的876位-890位)。
Orf C中的第三结构域为ER结构域，本申请也将其称为ORFC-ER，并且本申请将含有编码所述ORFC-ER结构域的序列的核酸序列表示为SEQ ID NO:31(SEQ ID NO:5的2995位-4506位)。本申请将含有所述ORFC-ER结构域的氨基酸序列表示为SEQ ID NO:32(SEQ ID NO:6的999位-1502位)。
破囊壶菌属PUFA PKS系统
在一个实施方案中，破囊壶菌属PUFA PKS系统包含至少以下生物活性结构域：(a)两个烯酰ACP还原酶(ER)结构域；(b)五个到十个或更多个酰基载体蛋白(ACP)结构域，并且在一个方面为八个ACP结构域；(c)两个β-酮脂酰ACP合成酶(KS)结构域；(d)一个酰基转移酶(AT)结构域；(e)一个β-酮脂酰ACP还原酶(KR)结构域；(f)两个FabA样β-羟酰ACP脱水酶(DH)结构域；(g)一个链长度因子(CLF)结构域；和(h)一个丙二酰辅酶A:ACP酰基转移酶(MAT)结构域。在一个实施方案中，本发明的破囊壶菌属PUFA PKS系统也包含至少一个含有脱水酶(DH)保守活性位点模体的区域或结构域，所述脱水酶(DH)保守活性位点模体不是FabA样DH结构域的部分。这些结构域各自的结构特征和功能特征在本领域中通常是已知的(参见例如上述的美国专利公开号2004035127)。
有三个可读框能形成上述核心破囊壶菌属23B(Thraustochytrium23B)PUFA PKS系统。每个可读框的结构域结构如下。
破囊壶菌属23B可读框A(Orf A)
本申请将Th.23B(破囊壶菌属23B)Orf A的完整核酸序列表示为SEQ ID NO:38。Th.23B Orf A为8433个核苷酸的序列(不包括终止密码子)，其编码2811个氨基酸的序列，本申请将所述2811个氨基酸的序列表示为SEQ ID NO:39。SEQ ID NO:38编码Th.23B Orf A中的以下结构域：(a)一个β-酮脂酰ACP合成酶(KS)结构域；(b)一个丙二酰辅酶A:ACP酰基转移酶(MAT)结构域；(c)八个酰基载体蛋白(ACP)结构域；和(d)一个β-酮脂酰ACP还原酶(KR)结构域。
就本发明人已知的最大范围而言，本申请称为Th23BOrf A_pBR812.1 和Th23BOrf A_pBR811(Orf A基因组克隆)的、从破囊壶菌属23B一起分离出的两种基因组克隆(重叠克隆)包含SEQ ID NO:38的核酸序列，并且编码SEQ ID NO:39的氨基酸序列。基因组克隆Th23BOrf A_pBR812.1(称为Th23BOrf A_pBR812.1基因组克隆，形式为含有破囊壶菌属23B Orf A基因序列的大肠杆菌质粒载体)在2007年3月1日保藏在American Type Culture Collection(ATCC),10801University Boulevard,Manassas,Va.20110-2209USA，并且ATCC保藏号为______。本发明涵盖Th23BOrf A_pBR812.1(Orf A基因组克隆)的核酸序列和上述质粒编码的氨基酸序列。基因组克隆Th23BOrf A_pBR811(称为Th23BOrf A_pBR811基因组克隆，形式为含有破囊壶菌属23B Orf A基因序列的大肠杆菌质粒载体)在2007年3月1日保藏在American Type Culture Collection(ATCC),10801University Boulevard,Manassas,Va.20110-2209USA，并且ATCC保藏号为______。本发明包括Th23BOrf A_pBR811(Orf A基因组克隆)的核酸序列和上述质粒编码的氨基酸序列。
Th.23B Orf A中的第一结构域为KS结构域，本申请也将其称为Th.23BOrf A-KS，并且包含在跨越SEQ ID NO:38的约1位至约1500位的核酸序列中，本申请将其表示为SEQ ID NO:40。含有所述Th.23B KS结构域的氨基酸序列为SEQ ID NO:39中跨越SEQ ID NO:39的约1位至约500位的区域，本申请将其表示为SEQ ID NO:41。SEQ ID NO:39中的上述区域就Pfam而言相当于跨越SEQ ID NO:39的1位至约450位(即SEQ ID NO:41的1位至约450位)的FabB(β-酮脂酰ACP合成酶)。应该注意的是，所述Th.23B Orf A-KS结构域含有活性位点模体即DXAC*(*表示酰基结合位点C207)。另外，在Th.23B KS区域端部的特征模体即GFGG存在于SEQ ID NO:39的453位-456位(即SEQ ID NO:41的453位-456位)中。
Th.23B Orf A中的第二结构域为MAT结构域，本申请也将其称为Th.23B Orf A-MAT，并且包含在跨越SEQ ID NO:38的约1503位至约3000位的核酸序列中，本申请将其表示为SEQ ID NO:42。含有所述Th.23B MAT结构域的氨基酸序列为SEQ ID NO:39中跨越约501位至约1000位的区域，本申请用SEQ ID NO:43表示。SEQ ID NO:39中的上述区域就Pfam而言与跨越SEQ ID NO:39的约580位至约900位(SEQ ID NO:43的80位-400位)的FabD(丙二酰辅酶A:ACP酰基转移酶)相匹配。应该注意的是，所述Th.23B Orf A-MAT结构域含有活性位点模体即GHS*XG(*表示酰基结合位点S697)，其用SEQ ID NO:39的695位-699位表示。
Th.23B Orf A的结构域3-10为八个串联的ACP结构域，本申请也将其称为Th.23B Orf A-ACP(所述序列中的第一结构域为Orf A-ACP1，第二结构域为Orf A-ACP2，第三结构域为Orf A-ACP3，依此类推)。第一Th.23B ACP结构域即Th.23B Orf A-ACP1包含在跨越SEQ ID NO:38(Orf A)的约3205位至约3555位的核酸序列中，本申请将其表示为SEQ ID NO:44。含有第一Th.23B ACP结构域的氨基酸序列为SEQ ID NO:39中跨越SEQ ID NO:39的约1069位至约1185位的区域，本申请用SEQ ID NO:45表示。
Th.23B Orf A中的八个ACP结构域彼此相邻，并且可通过是否存在磷酸泛酰巯基乙胺结合位点模体即LGXDS*(用SEQ ID NO:46表示)来鉴定，其中所述S*为磷酸泛酰巯基乙胺结合位点。就SEQ ID NO:39而言，八个S*位点各自的氨基酸位置为1128(ACP1)、1244(ACP2)、1360(ACP3)、1476(ACP4)、1592(ACP5)、1708(ACP6)、1824(ACP7)和1940(ACP8)。所有八个Th.23B ACP结构域的核酸序列和氨基酸序列都是高度保守的，因此本申请没有用各自的序列标识符来表示每个结构域的序列。然而，基于本申请披露的信息，本领域技术人员可容易地确定SEQ ID NO:38和SEQ ID NO:39中含有其它七个ACP结构域中每一个的序列。
所有八个Th.23B ACP结构域一起跨越Th.23B Orf A中SEQ ID NO:38的约3205位至约5994位的区域，其相应于SEQ ID NO:39的约1069位氨基酸至约1998位氨基酸。本申请将编码含有所有八个结构域的完整ACP区域的核酸序列表示为SEQ ID NO:47。SEQ ID NO:47编码本申请用SEQ ID NO:48表示的氨基酸序列。SEQ ID NO:48包括各个ACP结构域之间的接头片段。在SEQ ID NO:48中，所述八个结构域的每个重复间隔为约116个氨基酸，并且相信每个结构域都由约116个以活性位点模体为核心的氨基酸组成(上述)。
Th.23B Orf A中的最后一个结构域为KR结构域，本申请也将其称为Th.23B Orf A-KR，其包含在跨越SEQ ID NO:38的约6001位至约8433位的核酸序列中，本申请用SEQ ID NO:49表示。含有所述Th.23B KR结构域的氨基酸序列为SEQ ID NO:39中跨越SEQ ID NO:39的约2001位至约2811位的区域，本申请用SEQ ID NO:50表示。SEQ ID NO:39中的上述区域就 Pfam而言与跨越SEQ ID NO:39的约2300位至约2550位(SEQ ID NO:50的300位-550位)的FabG(β-酮脂酰ACP还原酶)相匹配。
破囊壶菌属23B可读框B(Orf B)
本申请将Th.23B Orf B的完整核酸序列表示为SEQ ID NO:51，其为5805个核苷酸的序列(不包括终止密码子)，所述5805个核苷酸的序列编码1935个氨基酸的序列，本申请将所述1935个氨基酸的序列表示为SEQ ID NO:52。SEQ ID NO:51编码Th.23B Orf B中的以下结构域：(a)一个β-酮脂酰ACP合成酶(KS)结构域；(b)一个链长度因子(CLF)结构域；(c)一个酰基转移酶(AT)结构域；和(d)一个烯酰ACP还原酶(ER)结构域。
就本发明人已知的最大范围而言，本申请称为Th23BOrf B_pBR800(Orf B基因组克隆)的、从破囊壶菌属23B分离的基因组克隆包含SEQ ID NO:51的核酸序列，并且编码SEQ ID NO:52的氨基酸序列。基因组克隆Th23BOrf B_pBR800(称为Th23BOrf B_pBR800基因组克隆，形式为含有破囊壶菌属23B Orf B基因序列的大肠杆菌质粒载体)在2007年3月1日保藏在American Type Culture Collection(ATCC),10801University Boulevard,Manassas,Va.20110-2209USA，并且ATCC保藏号为______。本发明涵盖Th23BOrf B_pBR800(Orf B基因组克隆)的核酸序列和上述质粒编码的氨基酸序列。
Th.23B Orf B中的第一结构域为KS结构域，本申请也将其称为Th.23B Orf B-KS，其包含在跨越SEQ ID NO:51(Th.23B Orf B)的约1位至约1500位的核酸序列中，本申请将其表示为SEQ ID NO:53。含有所述Th.23B KS结构域的氨基酸序列为SEQ ID NO:52中跨越SEQ ID NO:52的约1位至约500位的区域，本申请将其表示为SEQ ID NO:54。SEQ ID NO:52中的上述区域就Pfam而言与跨越约1位至约450位(SEQ ID NO:54的1位-450位)的FabB(β-酮脂酰ACP合成酶)相匹配。应该注意的是，所述Th.23B Orf B-KS结构域含有活性位点模体即DXAC*，其中C*为酰基结合位点，并且其中所述C*处于SEQ ID NO:52的201位。另外，在所述KS区域端部的特征模体即GFGG存在于SEQ ID NO:52的434位氨基酸-437位氨基酸中。
Th.23B Orf B中的第二结构域为CLF结构域，本申请也将其称为Th.23B Orf B-CLF，其包含在跨越SEQ ID NO:51(Orf B)的约1501位至约3000位的核酸序列中，本申请将其表示为SEQ ID NO:55。含有所述CLF结构域的氨基酸序列为SEQ ID NO:52中跨越SEQ ID NO:52的约501位至约1000 位的区域，本申请将其表示为SEQ ID NO:56。SEQ ID NO:52中的上述区域就Pfam而言与跨越约550位至约910位(SEQ ID NO:56的50位-410位)的FabB(β-酮脂酰ACP合成酶)相匹配。虽然CLF与KS蛋白具有同源性，但其缺乏活性位点半胱氨酸，而在KS蛋白中，酰基与所述活性位点半胱氨酸相连。
Th.23B Orf B中的第三结构域为AT结构域，本申请也将其称为Th.23B Orf B-AT，其包含在跨越SEQ ID NO:51(Th.23B Orf B)的约3001位至约4500位的核酸序列中，本申请将其表示为SEQ ID NO:58。含有所述Th.23B AT结构域的氨基酸序列为SEQ ID NO:52中跨越SEQ ID NO:52的约1001位至约1500位的区域，本申请将其表示为SEQ ID NO:58。SEQ ID NO:52中的上述区域就Pfam而言与跨越约1100位至约1375位(SEQ ID NO:58的100位-375位)的FabD(丙二酰辅酶A:ACP酰基转移酶)相匹配。虽然所述PUFA合成酶的上述AT结构域与MAT蛋白具有同源性，但其缺乏所述MAT的扩展模体(关键的精氨酸残基和谷氨酰胺残基)，并且认为在丙二酰辅酶A的转移过程中不涉及所述AT结构域。存在酰基转移酶的GXS*XG模体，其中所述S*为酰基结合位点，其就SEQ ID NO:52而言处于1123位。
Th.23B Orf B中的第四结构域为ER结构域，本申请也将其称为Th.23BOrf B-ER，其包含在跨越SEQ ID NO:51(Orf B)的约4501位至约5805位的核酸序列中，本申请将其表示为SEQ ID NO:59。含有所述Th.23B ER结构域的氨基酸序列为SEQ ID NO:52中跨越SEQ ID NO:52的约1501位至约1935位的区域，本申请将其表示为SEQ ID NO:60。SEQ ID NO:52中的上述区域就Pfam而言与跨越约1501位至约1810位(SEQ ID NO:60的1位-310位)的与2-硝基丙烷双加氧酶相关的双加氧酶家族相匹配。由于上述结构域与最近表征的肺炎链球菌的ER酶具有同源性而可进一步预测上述结构域的功能是作为ER。
破囊壶菌属23B可读框C(Orf C)
本申请将Th.23B Orf C的完整核酸序列表示为SEQ ID NO:61，其为4410个核苷酸的序列(不包括终止密码子)，所述4410个核苷酸的序列编码1470个氨基酸的序列，本申请将所述1470个氨基酸的序列表示为SEQ ID NO:62。SEQ ID NO:61编码Th.23B Orf C中的以下结构域：(a)两个FabA样β-羟酰ACP脱水酶(DH)结构域，二者都与FabA蛋白(一种酶，其催化反 式2-癸烯酰基-ACP的合成和该产物向顺式3-癸烯酰基-ACP的可逆异构化)具有同源性；和(b)一个烯酰ACP还原酶(ER)结构域，其与裂殖壶菌属Orf B的ER结构域具有高度同源性。
就本发明人已知的最大范围而言，本申请称为Th23BOrf C_pBR709A(Orf C基因组克隆)的、从破囊壶菌属23B分离的基因组克隆包含SEQ ID NO:61的核酸序列，并且编码SEQ ID NO:62的氨基酸序列。基因组克隆Th23BOrf C_pBR709A(称为Th23BOrf C_pBR709A基因组克隆当形式，含有破囊壶菌属23B Orf C基因序列的大肠杆菌质粒载体)在2007年3月1日保藏在American Type Culture Collection(ATCC),10801University Boulevard,Manassas,Va.20110-2209USA，并且ATCC保藏号为______。本发明涵盖Th23BOrf C_pBR709A(Orf C基因组克隆)的核酸序列和上述质粒编码的氨基酸序列。
Th.23B Orf C中的第一结构域为DH结构域，本申请也将其称为Th.23BOrf C-DH1，其包含在跨越SEQ ID NO:61(Orf C)的约1位至约1500位的核酸序列中，本申请将其表示为SEQ ID NO:63。含有所述Th.23B DH1结构域的氨基酸序列为SEQ ID NO:62中跨越SEQ ID NO:62的约1位至约500位的区域，本申请将其表示为SEQ ID NO:64。如上所述，SEQ ID NO:62中的上述区域就Pfam而言与跨越约275位至约400位(SEQ ID NO:64的275位-400位)的FabA相匹配。
Th.23B Orf C中的第二结构域也是DH结构域，本申请也将其称为Th.23B Orf C-DH2，其包含在跨越SEQ ID NO:61(Orf C)的约1501位至约3000位的核酸序列中，本申请将其表示为SEQ ID NO:65。含有所述Th.23B DH2结构域的氨基酸序列为SEQ ID NO:62中跨越SEQ ID NO:62的约501位至约1000位的区域，本申请将其表示为SEQ ID NO:66。如上所述，SEQ ID NO:62中的上述区域就Pfam而言与跨越约800位至约925位(SEQ ID NO:66的300位-425位)的FabA相匹配。
Th.23B Orf C中的第三结构域为ER结构域，本申请也将其称为Th.23BOrf C-ER，其包含在跨越SEQ ID NO:61(Orf C)的约3001位至约4410位的核酸序列中，本申请将其表示为SEQ ID NO:67。含有所述Th.23B ER结构域的氨基酸序列为SEQ ID NO:62中跨越SEQ ID NO:62的约1001位至约1470位的区域，本申请将其表示为SEQ ID NO:68。如上所述，SEQ ID NO:62 中的上述区域就Pfam而言相当于跨越约1025位至约1320位(SEQ ID NO:68的25位-320位)的与2-硝基丙烷双加氧酶相关的双加氧酶。由于上述结构域与最近表征的肺炎链球菌的ER酶具有同源性而也可预测上述结构域的功能是作为ER。
Shewanella japonica PUFA PKS
有五个可读框能形成Shewanella japonica核心PUFA PKS系统及其上述的PPTase。每个可读框的结构域结构如下。
SEQ ID NO:69为Shewanella japonica黏粒3F3的核酸序列，并且发现其含有15个ORF(可读框)。与上述微生物中的PUFA PKS系统相关的ORF表征如下。
pfaA(SEQ ID NO:69的核苷酸10491-18854)编码PFAS A(SEQ ID NO:70)即具有以下结构域的PUFA PKS蛋白：β-酮酰基-合成酶(KS)(SEQ ID NO:69的核苷酸10575-12029，SEQ ID NO:70的氨基酸29-513)；丙二酰辅酶A:ACP酰基转移酶(MAT)(SEQ ID NO:69的核苷酸12366-13319，SEQ ID NO:70的氨基酸625-943)；六个串联的酰基载体蛋白(ACP)结构域(SEQ ID NO:69的核苷酸14280-16157，SEQ ID NO:70的氨基酸1264-1889)；β-酮脂酰ACP还原酶(KR)(SEQ ID NO:69的核苷酸17280-17684，SEQ ID NO:70的氨基酸2264-2398)；和所述PFAS A蛋白中在SEQ ID NO:70的氨基酸2399至2787之间的区域，其含有脱水酶(DH)保守活性位点模体LxxHxxxGxxxxP(SEQ ID NO:70的氨基酸2504-2516)，本申请将其称为DH-模体区域。
在PFAS A中，KS活性位点DXAC*位于SEQ ID NO:70的氨基酸226-229，其中所述C*为酰基结合位点。MAT活性位点即GHS*XG位于SEQ ID NO:70的氨基酸721-725，其中所述S*为酰基结合位点。ACP活性位点即LGXDS*在SEQ ID NO:70中位于以下位置：氨基酸1296-1300、氨基酸1402-1406、氨基酸1513-1517、氨基酸1614-1618、氨基酸1728-1732和氨基酸1843-1847，其中所述S*为磷酸泛酰巯基乙胺结合位点。在SEQ ID NO:70的氨基酸2399和2787之间，所述PFAS A也含有上述脱水酶(DH)保守活性位点模体LxxHxxxGxxxxP(SEQ ID NO:70的氨基酸2504-2516)。
pfaB(SEQ ID NO:69的核苷酸18851-21130)编码PFAS B(SEQ ID NO:71)即具有以下结构域的PUFA PKS蛋白：酰基转移酶(AT)(SEQ ID NO:69的核苷酸19982-20902，SEQ ID NO:71的氨基酸378-684)。
在PFAS B中，活性位点GXS*XG模体位于SEQ ID NO:71的氨基酸463-467，其中所述S*为酰基结合位点。
pfaC(SEQ ID NO:69的核苷酸21127-27186)编码PFAS C(SEQ ID NO:72)即具有以下结构域的PUFA PKS蛋白：KS(SEQ ID NO:69的核苷酸21139-22575，SEQ ID NO:72的氨基酸5-483)；链长度因子(CLF)(SEQ ID NO:69的核苷酸22591-23439，SEQ ID NO:72的氨基酸489-771)；和两个FabA3-羟酰ACP脱水酶，将其称为DH1(SEQ ID NO:69的核苷酸25408-25836，SEQ ID NO:72的氨基酸1428-1570)和DH2(SEQ ID NO:69的核苷酸26767-27183，SEQ ID NO:72的氨基酸1881-2019)。
在PFAS C中，KS活性位点DXAC*位于SEQ ID NO:72的氨基酸211-214，其中所述C*为酰基结合位点。
pfaD(SEQ ID NO:69的核苷酸27197-28825)编码PFAS D(SEQ ID NO:73)即具有以下结构域的PUFA PKS蛋白：烯酰基还原酶(ER)(SEQ ID NO:69的核苷酸27446-28687，SEQ ID NO:73的氨基酸84-497)。
pfaE(反向互补链(reverse complementary strand)上的SEQ ID NO:69的核苷酸6150-7061)编码PFAS E(SEQ ID NO:74)即4’-磷酸泛酰巯基乙氨基转移酶(PPTase)，其具有确定的结构域(SEQ ID NO:69的核苷酸6504-6944，SEQ ID NO:74的氨基酸40-186)。
Shewanella olleyana PUFA PKS
有五个可读框能形成Shewanella olleyan核心PUFA PKS系统及其上述的PPTase。每个可读框的结构域结构如下。
SEQ ID NO:75为Shewanella olleyana黏粒9A10的核酸序列，并且发现其含有17个ORF。与上述微生物中的PUFA PKS系统相关的ORF表征如下。
pfaA(SEQ ID NO:75的核苷酸17437-25743)编码PFAS A(SEQ ID NO:76)即具有以下结构域的PUFA PKS蛋白：β-酮酰基-合成酶(KS)(SEQ ID NO:75的核苷酸17521-18975，SEQ ID NO:76的氨基酸29-513)；丙二酰辅酶A:ACP酰基转移酶(MAT)(SEQ ID NO:75的核苷酸19309-20265，SEQ ID NO:76的氨基酸625-943)；六个串联的酰基载体蛋白(ACP)结构域(SEQ ID NO:75的核苷酸21259-23052，SEQ ID NO:76的氨基酸1275-1872)；β-酮脂酰ACP还原酶(KR)(SEQ ID NO:75的核苷酸24154-24558，SEQ ID NO:76的氨基酸2240-2374)；和所述PFAS A蛋白中在SEQ ID NO:76的氨基酸2241和2768 之间的区域，其含有脱水酶(DH)保守活性位点模体LxxHxxxGxxxxP(SEQ ID NO:76的氨基酸2480-2492)，本申请将其称为DH-模体区域。
在PFAS A中，KS活性位点DXAC*位于SEQ ID NO:76的氨基酸226-229，其中所述C*为酰基结合位点。MAT活性位点即GHS*XG位于SEQ ID NO:76的氨基酸721-725，其中所述S*为酰基结合位点。ACP活性位点即LGXDS*在SEQ ID NO:76中位于以下位置：氨基酸1307-1311、氨基酸1408-1412、氨基酸1509-1513、氨基酸1617-1621、氨基酸1721-1725和氨基酸1826-1830，其中所述S*为磷酸泛酰巯基乙胺结合位点。在SEQ ID NO:76的氨基酸2241和2768之间，所述PFAS A也含有上述脱水酶(DH)保守活性位点模体LxxHxxxGxxxxP(SEQ ID NO:76的氨基酸2480-2492)。
pfaB(SEQ ID NO:75的核苷酸25740-27971)编码PFAS B(SEQ ID NO:77)即具有以下结构域的PUFA PKS蛋白：酰基转移酶(AT)(SEQ ID NO:75的核苷酸26837-27848，SEQ ID NO:77的氨基酸366-703)。
在PFAS B中，活性位点GXS*XG模体位于SEQ ID NO:77的氨基酸451-455，其中所述S*为酰基结合位点。
pfaC(SEQ ID NO:75的核苷酸27968-34030)编码PFAS C(SEQ ID NO:78)即具有以下结构域的PUFA PKS蛋白：KS(SEQ ID NO:75的核苷酸27995-29431，SEQ ID NO:78的氨基酸10-488)；链长度因子(CLF)(SEQ ID NO:75的核苷酸29471-30217，SEQ ID NO:78的氨基酸502-750)；和两个FabA3-羟酰ACP脱水酶，将其称为DH1(SEQ ID NO:75的核苷酸32258-32686，SEQ ID NO:78的氨基酸1431-1573)和DH2(SEQ ID NO:75的核苷酸33611-34027，SEQ ID NO:78的氨基酸1882-2020)。
在PFAS C中，KS活性位点DXAC*位于SEQ ID NO:78的氨基酸216-219，其中所述C*为酰基结合位点。
pfaD(SEQ ID NO:75的核苷酸34041-35669)编码PFAS D(SEQ ID NO:79)即具有以下结构域的PUFA PKS蛋白：烯酰基还原酶(ER)(SEQ ID NO:75的核苷酸34290-35531，SEQ ID NO:79的氨基酸84-497)。
pfaE(反向互补链上的SEQ ID NO:75的核苷酸13027-13899)编码PFAS E(SEQ ID NO:80)即4’-磷酸泛酰巯基乙氨基转移酶(PPTase)，其具有确定的结构域(SEQ ID NO:75的核苷酸13369-13815，SEQ ID NO:80的氨基酸29-177)。
其它PUFA PKS序列(包括优化的PUFA PKS序列)
本发明包括用于在异源的宿主中表达PUFA PKS系统的各种优化序列，以下提供了所述优化序列的实例。本领域技术人员能得到优化的序列，特别是针对优选的密码子选择或为了在异源的宿主中更好地表达和发挥功能而进行优化的序列。
sOrf A
SEQ ID NO:35(称为sOrf A)表示编码来自裂殖壶菌属的Orf A的核酸序列(SEQ ID NO:1)，已将其重合成，用于对酵母中的密码子选择进行优化。SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:35各自编码SEQ ID NO:2。
sOrf B
SEQ ID NO:36(称为sOrf B)表示编码来自裂殖壶菌属的Orf B的核酸序列(SEQ ID NO:3)，已将其重合成，用于对酵母中的密码子选择进行优化。SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:36各自编码SEQ ID NO:4。
Orf B*
SEQ ID NO:37(称为Orf B*)表示编码来自裂殖壶菌属的Orf B的核酸序列(SEQ ID NO:3)，已在部分SEQ ID NO:3中将其重合成，用于在植物细胞中使用，并且其源于与为了对大肠杆菌中的密码子选择进行优化而最初开发的序列极相似的序列，也将该SEQ ID NO:37称为Orf B*。除重合成的BspHI(SEQ ID NO:3的核苷酸4415)至SacII片段(SEQ ID NO:3中的统一位点(unique site))外，两种形式的Orf B*(对于大肠杆菌和对于植物)都与SEQ ID NO:3相同。与Orf B的原始基因组序列(SEQ ID NO:3)相比，两种版本的Orf B*(大肠杆菌和植物)都在所述基因的起点(start)附近具有两处其它密码子修饰。首先，第四密码子即精氨酸(R)从所述基因组序列中的CGG变成Orf B*中的CGC。其次，第五密码子即天冬酰胺(N)从所述基因组序列中的AAT变成Orf B*中的AAC。为了有助于将上述基因克隆到植物载体中以得到SEQ ID NO:37，将PstI位点(CTGCAG)也工程化到大肠杆菌Orf B*序列的第20个碱基(从所述基因的起点数起)处。上述变化不会使编码的蛋白质的氨基酸序列发生改变。SEQ ID NO:37和SEQ ID NO:3(及就大肠杆菌而言的Orf B*形式)都编码SEQ ID NO:4。
用于改进PUFA产生和积累的辅助蛋白和额外靶标及策略
本发明的PUFA PKS系统用于在异源的宿主中产生和/或积累PUFA，或 在内源性宿主中改进PUFA的产生和/或积累，所述PUFA PKS系统优选地利用上述各种靶标或策略中的一种或多种来产生PUFA(参见上述六种指导方针和策略)。这些策略还包括对各种辅助蛋白的利用，本申请将所述辅助蛋白定义为蛋白质，该蛋白质被认为不是上述核心PUFA PKS系统的部分的蛋白质(即不是所述PUFA合成酶复合物本身的部分)，但就使用本发明的核心PUFA合成酶复合物来产生PUFA而言或至少就使用本发明的核心PUFA合成酶复合物来高效地产生PUFA生而言，所述辅助蛋白可能是必需的或就是必需的。这些策略也包括具有以下特征的各种遗传修饰：通过提高PUFA合成酶途径对丙二酰辅酶A池(或多个池)的竞争能力，使经过PUFA合成酶途径的底物流即丙二酰辅酶A流增加。以下描述了本发明的这些实施方案的变体。
磷酸泛酰巯基乙氨基转移酶(PPTase)
如以上就在异源的宿主中产生PUFA的一般指导方针和策略而讨论的那样，为了产生PUFA，PUFA PKS系统必须与以下辅助蛋白一起工作，所述辅助蛋白将4’-磷酸泛酰巯基乙氨基从辅酶A转移到酰基载体蛋白(ACP)结构域(或多个酰基载体蛋白(ACP)结构域)。因此，可认为PUFA PKS系统包括至少一个4’-磷酸泛酰巯基乙氨基转移酶(PPTase)结构域，或可认为上述结构域为所述PUFA PKS系统的辅助结构域或辅助蛋白。PPTase的结构特征和功能特征已详细地记载在例如美国专利申请公开号20020194641、美国专利申请公开号20040235127和美国专利申请公开号20050100995中。
根据本发明，具有4’-磷酸泛酰巯基乙氨基转移酶(PPTase)生物活性(功能)的结构域或蛋白质以该酶为特征，所述酶将4’-磷酸泛酰巯基乙氨基从辅酶A转移到酰基载体蛋白(ACP)。上述向ACP的固定丝氨酸残基进行的转移使无活性的脱辅基形式活化成完整形式。在聚酮化合物的合成和脂肪酸的合成中，磷酸泛酰巯基乙胺基团都与延长中的酰基链形成硫酯。所述PPTase为已在脂肪酸的合成、聚酮化合物的合成和非核糖体肽的合成中充分表征的酶家族。多种PPTase的序列是已知的，并且已确定晶体结构(例如Reuter K,Mofid MR,Marahiel MA,Ficner R.“Crystal structure of the surfactin synthetase-activating enzyme sfp:a prototype of the4’-phosphopantetheinyl transferase superfamily”EMBO J.1999Dec1;18(23):6823-31)，及对就活性而言重要的氨基酸残基进行了突变分析(Mofid MR,Finking R,Essen LO, Marahiel MA.“Structure-based mutational analysis of the 4’-phosphopantetheinyl transferases Sfp from Bacillus subtilis:carrier protein recognition and reaction mechanism”Biochemistry.2004年4月13日;43(14):4128-36)。PPTase中的这些固定并且高度保守的氨基酸包含在来自上述两种希瓦氏菌属菌株的pfaE ORF中。
先前已证明了能识别本申请描述的Orf A ACP结构域而将其作为底物的一种异源性PPTase，所述异源性PPTase为念珠藻属种PCC7120(先前称为鱼腥蓝细菌属种(Anabaena sp.)PCC7120)的HetI蛋白。HetI存在于念珠藻属的基因簇中，已知其负责长链羟基-脂肪酸的合成，所述长链羟基-脂肪酸为存在于上述生物体的异形胞的糖脂层中的组分(Black and Wolk,1994,J.Bacteriol.176,2282-2292和Campbell等人,1997,Arch.Microbiol.167,251-258)。HetI可能使存在于上述簇中的蛋白质Hgl E的ACP结构域活化。Hgl E的两个ACP结构域与在裂殖壶菌属Orf A中发现的ACP结构域具有高度序列同源性。SEQ ID NO:34表示念珠藻属HetI蛋白的氨基酸序列，并且为可与本发明描述的PUFA PKS系统(包括来自裂殖壶菌属和破囊壶菌属的PUFA PKS系统)一起使用的功能性PPTase。SEQ ID NO:34由SEQ ID NO:33编码。还没有鉴定出HetI的内源性起始密码子(在所述推定的蛋白质中没有甲硫氨酸)。在所述可读框的5’端附近有几种强效的可替换的起始密码子(例如TTG和ATT)。在所述序列中没有任何甲硫氨酸密码子(ATG)。然而，利用PCR以用甲硫氨酸密码子(ATG，作为NdeI限制性酶识别位点的部分)代替最远的5’强效的可替换的起始密码子(TTG)，并且在所述编码序列的3’端引入XhoI位点，从而完成对HetI表达构建体(expression construct)的构建，并且已证明所述编码的PPTase(SEQ ID NO:34)具有功能。
先前已证明了可识别本申请描述的Orf A ACP结构域而将其作为底物的另一种异源性PPTase，所述异源性PPTase为源于枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的sfp。已对sfp进行了充分的表征，并且由于其能识别很多种底物而被广泛地使用。基于公开的序列信息(Nakana,等人,1992,Molecular and General Genetics232:313-321)，先前通过将所述编码区域及上游和下游的侧翼DNA序列克隆到pACYC-184克隆载体中而得到了sfp的表达载体。上述构建体(construct)编码功能性PPTase，这一点由其能在大肠杆菌中与裂殖壶菌属Orf A、B*和C共表达而得到证明，这在合适的条件下使DHA积累在 那些细胞中(参见美国专利申请公开号20040235127)。
当根据本发明对生物体(例如微生物或植物)进行遗传修饰以表达PUFA PKS系统时，一些宿主生物体可内源性地表达PUFA PKS产生PUFA所需要一起工作的辅助蛋白(例如PPTase)。然而，一些生物体可用编码本申请所述一种或多种辅助蛋白的核酸分子进行转化，以使所述生物体能产生PUFA和/或提高生物体PUFA的产生，即使所述生物体内源性地产生同源的(homologous)辅助蛋白(即与宿主细胞的内源性辅助蛋白相比，一些异源性辅助蛋白可更有效或更高效地与所述经转化的PUFA合成酶蛋白一起工作)。本发明提供了已用包括辅助PPTase的本发明PUFA PKS系统进行遗传修饰的细菌、酵母和植物的实例。
因此，本发明的一个实施方案涉及经遗传修饰的宿主细胞或生物体(例如微生物或植物或其细胞)，其中所述宿主细胞或生物体已经遗传修饰为表达本申请描述的核心PUFA PKS系统，并且也表达本申请描述的PPTase。以上描述了合适的PPTase，并且本领域也描述了合适的PPTase。所述PPTase可在相同或不同的以下构建体上表达，所述构建体为编码核心PUFA PKS蛋白(或多种核心PUFA PKS蛋白)的一种或多种核酸分子。在实施例(参见实施例12和13)中说明了两个实施方案。在一个方面，所述PPTase为念珠藻属HetI(本申请用SEQ ID NO:33和34表示)。
在本发明的一个实施方案中，通过减少(抑制、下调或降低)宿主细胞或宿主生物体表达的内源性PPTase的表达或活性(例如以避免与根据此实施方案与PUFA PKS酶一起引入的PPTase发生竞争)来提高PUFA的产生和积累。可通过除去或钝化基因的任何合适方法(包括但不限于使用反义RNA、RNAi、共抑制或引入突变)来抑制内源性PPTase活性。
如本申请描述的那样，本发明包括表达外源性PPTase(单独表达或与抑制内源性PPTase组合进行)并结合PUFA合成酶的表达，单独利用上述两种表达或与本申请描述的任何一种或多种策略组合进行，以在异源性宿主中增加PUFA的产生和/或积累，所述策略例如为以下策略中的任何一种、两种、三种、四种或五种：密码子优化、细胞器靶向、提高PUFA合成酶对丙二酰辅酶A的竞争(例如通过抑制FAS)、表达酰基CoA合成酶和/或表达一种或多种酰基转移酶或相关酶。
对丙二酰辅酶A流进行调节/对FAS进行抑制
如上所述，脂肪酸合成酶系统(FAS)、细胞质脂肪酸延长反应和其它酶(例如查耳酮合成酶)也使用所述PUFA PKS系统(PUFA合成酶)的底物即丙二酰辅酶A。因此，所述PUFA合成酶与上述其它酶系统就丙二酰辅酶A发生竞争。因此，本发明的一个实施方案涉及通过提高PUFA合成酶对丙二酰辅酶A池(或多个池)的竞争能力来使经过PUFA合成酶途径的丙二酰辅酶A流增加的方法和遗传修饰。本申请提出的方法包括但不限于1)对竞争途径进行抑制，包括抑制FAS途径中的任何要素，例如通过降低上述途径中参与的酶或亚单元的表达水平(例如通过使用反义RNA、RNAi、共抑制或突变)，2)使PUFA合成酶在异源性宿主中表达，在所述异源性宿主中已使竞争途径减少或对其进行阻断(例如对于油菜已在细胞质中阻断了使脂肪酸延长的能力)，和/或3)使丙二酰辅酶A池增加(例如通过表达乙酰辅酶A羧化酶)。
更具体地，在一个方面，本发明也包括对产生PUFA的宿主生物体进行遗传修饰，特别是对表达异源PUFA PKS系统的宿主生物体进行遗传修饰，以除去或钝化基因(或多种基因)，或降低上述基因编码的酶的活性水平，所述酶可与PUFA PKS系统的PUFA产生和/或积累发生竞争或干扰PUFA PKS系统的PUFA产生和/或积累。例如，本发明人已发现，与保持正常FAS活性水平的宿主生物体相比，可通过降低已用PUFA PKS系统进行转化的宿主生物体中的FAS活性来改进PUFA的产生和积累(参见裂殖壶菌属中的示范性实验及实施例中就酵母和植物而详细描述的实验)。
在一个实施方案中，提出了抑制通过FAS途径产生脂肪酸的各种酶。多种酶可以是适于本发明的这个实施方案的靶标，并且示范了两种特别有用的靶标，并且以下进行了详细的描述。本发明人已证明在裂殖壶菌属中敲除FAS酶的能力(参见实施例)，并且上述策略可用于异源性宿主。在另一个实施方案中，本发明人已显示在酵母宿主中通过生物化学方法来抑制FAS系统的能力，与没有对FAS系统进行生物化学靶向的情况相比，所述抑制FAS能力在表达PUFA合成酶和PPTase的酵母中改进了PUFA的产生。某些其它宿主可接受相似的策略。
最后，在植物中，本发明人已证明的是，通过利用反义技术或RNAi技术来抑制KasII或KasIII而对FAS途径进行抑制，这在表达PUFA合成酶和PPTase的异源宿主中改进了PUFA的产生。尽管本发明不限于这些特定的靶标，但本发明的一个方面涉及对这些酶中的一种或两种进行抑制并结合 本申请描述的PUFA合成酶和PPTase的表达，上述策略单独进行或与本申请描述的其它策略组合进行，以在异源性宿主中增加PUFA的产生和/或积累，所述其它策略例如为密码子优化、细胞器靶向、酰基CoA合成酶的表达和/或一种或多种酰基转移酶或相关酶的表达。
在种子中，形式主要为三酰甘油(TAG)的脂质源于经过精加工酶途径(elaborate enyzymatic pathway)的同化产物。通常，经还原的碳(reduced carbon)从植物的其它部分经由韧皮部递送到种子。在植物种子中，TAG的生物合成在细胞内在不同的细胞器中进行(Ohrolgge and Browse,1995,Plant Cell7:957-970)。在质体中，通过II型可溶性脂肪酸合成酶(FAS)复合物将短碳链前体转化成长链脂肪酸(Slabas and Fawcett,1992,Plant Molecular Biology19:169-191)，所述II型可溶性脂肪酸合成酶(FAS)复合物反复地将C2单元加到脂肪酰基链，并且得到用于下一轮延长反应的链。经过八轮或九轮对C2单元进行缩合，得到使膜脂质具有特征的C16和C18脂肪酸。通过核编码的(nuclear encoded)、质体靶向的丙二酰辅酶A:ACP转酰酶(MCAT)得到初始的FAS活性，所述丙二酰辅酶A:ACP转酰酶将丙二酰基从丙二酰辅酶A转移到酰基载体蛋白(ACP)(Yasuno等人,2004,Journal of Biological Chemistry292:8242-8251)。这形成了底物即丙二酰基-ACP，所述丙二酰基-ACP提供了用于随后延长反应的C2单元。通过核编码的质体靶向的β-酮酰基-酰基载体蛋白合成酶III(KASIII)的催化活性来完成所述合成的下一步骤，在所述下一步骤中，丙二酰辅酶A与供体即丙二酰基-ACP发生缩合，得到丁酰基(C4)-ACP。ACP活化的酰基链的所有随后的延长反应都通过核编码的质体靶向的3-酮酰基-酰基载体蛋白合成酶I(KASI)和β-酮酰基-酰基载体蛋白合成酶II(KASII)同工酶来进行。KASI利用丁酰基(C4)-ACP至肉豆蔻酰基(C14)-ACP作为底物来催化将C4-ACP转化成C16-ACP的缩合反应，并且KASII利用棕榈酰基(C16)-ACP来完成最后的步骤，得到硬脂酰基(C18)-ACP(Carlsson等人,2002,Plant Journal29:761-770)。因此，可通过抑制或削弱KasIII或KasII的表达来抑制种子发育期间的脂肪酸生物合成。
在一个实施方案中，本发明包括用以下核酸分子对异源性宿主生物体或细胞进行转化，所述核酸分子包含靶向于宿主细胞中的KasII或KasIII的RNAi。在一个实施方案中，所述宿主细胞为植物细胞。在一个实施方案中，本发明包括用以下核酸分子对异源性宿主生物体或细胞进行转化，所述核酸 分子包含靶向于宿主细胞中的KasII或KasIII的反义物。在优选的实施方案中，所述宿主细胞为植物细胞。
在一个实施方案中，本发明包括用以下核酸分子对异源性宿主生物体或细胞进行转化，所述核酸分子包含用SEQ ID NO:122表示的核酸序列，如实施例13描述的那样，所述核酸序列为带有CHSA内含子的KASII RNAi。在一个实施方案中，本发明包括用以下核酸分子对异源性宿主生物体或细胞进行转化，所述核酸分子包含用SEQ ID NO:124表示的核酸序列，如实施例13描述的那样，所述核酸序列为带有CHSA内含子的KASIII RNAi。在一个实施方案中，本发明包括用以下核酸分子对异源性宿主生物体或细胞进行转化，所述核酸分子包含用SEQ ID NO:123表示的核酸序列，如实施例13描述的那样，所述核酸序列为KASII反义核酸序列。在一个实施方案中，本发明包括用以下核酸分子对异源性宿主生物体或细胞进行转化，所述核酸分子包含用SEQ ID NO:125表示的核酸序列，如实施例13描述的那样，所述核酸序列为KASIII反义核酸序列。
提高PUFA合成酶对丙二酰辅酶A池(或多个池)的竞争能力的其它方法包括在异源性宿主中表达所述PUFA合成酶，其中已减少或阻断竞争途径(例如对于油菜已在细胞质中阻断了使脂肪酸延长的能力)。可通过诸如耕作、繁殖或标记相关选择(marker assisted selection)那样的技术来选择其它合适的异源宿主(天然存在的生物体和/或通过选择、随机突变和筛选及/或靶向突变而得到的突变体)，以减少或阻断竞争途径诸如FAS途径等。其它酶诸如乙酰辅酶A羧化酶的表达也可增加所有酶系统可使用的丙二酰辅酶A池，由此改进经过所述PUFA PKS系统的流。
本发明涉及以下任何实施方案，所述实施方案在表达外源性PPTase及表达本申请描述的PUFA合成酶的情况下改进PUFA PKS系统使用丙二酰辅酶A的能力(单独改进或与抑制内源性PPTase组合进行)，单独利用所述实施方案或与本申请描述的任何一种或多种策略组合进行，以在异源性宿主中增加PUFA的产生和/或积累，所述策略例如为以下策略中的任何一种、两种、三种或四种：密码子优化、细胞器靶向、表达酰基CoA合成酶和/或表达一种或多种酰基转移酶或相关酶。
酰基辅酶A合成酶
本发明的另一个实施方案提供了催化长链PUFA游离脂肪酸(FFA)转化 成酰基辅酶A的酰基辅酶A合成酶(ACoAS)蛋白。
本发明人已确定通过PUFA PKS系统产生PUFA的内源性生产者即裂殖壶菌属具有一种或多种能将其PUFA PKS系统的FFA产物转化成酰基辅酶A的ACoAS。其证据为上述生物体的那些部分中高水平的PUFA积累。因此，内源性地含有PUFA PKS系统的裂殖壶菌属及其它生物体(例如其它破囊壶菌)或产生PUFA的其它真核生物(诸如Thalassiosira pseudonana或对隐甲藻)为编码以下酶的基因的优秀来源，所述酶可用于在异源性宿主中使表达的PUFA PKS系统的产物积累或增加所述产物的积累。
本发明人已在裂殖壶菌属中鉴定了九种编码以下蛋白质的核酸序列，所述蛋白质与具有已知或疑似的酰基辅酶A合成酶(ACoAS)活性的蛋白质具有同源性。本发明人相信这些序列中的一种或几种与以下基因相关，所述基因编码能将裂殖壶菌属PUFA合成酶的FFA产物转换成酰基辅酶A的ACoAS，并且本发明人已证明使用这些序列中的几种以在宿主生物体中增加PUFA的产生和/或积累的能力。同样地，就在表达裂殖壶菌属PUFA合成酶或另一种PUFA合成酶的异源宿主中增加PUFA的积累而言，上述序列可具有更大的用途。抛开理论的束缚，本发明人相信本发明人发现的ACoAS可用于在表达PUFA合成酶并且具有与裂殖壶菌属相似的产物分布的宿主中及在表达PUFA合成酶并且与裂殖壶菌属PUFA合成酶相比具有不同产物分布的宿主中增加PUFA的积累。实际上，本申请提供的实施例显示，来自裂殖壶菌属的几种ACoAS在已用裂殖壶菌属PUFA PKS系统进行遗传修饰的酵母菌株中能增加PUFA的积累，也能在已进行相似遗传修饰的植物中增加PUFA的积累。另外，当来自其它生物体的PUFA合成酶产生的EPA以FFA的形式存在时，期望所述裂殖壶菌属ACoAS能有效地识别上述EPA。而且，根据本发明披露的内容，可对编码其它生物体的ACoAS的基因进行鉴定，并且得到所述基因，用于在表达上述PUFA合成酶的异源宿主生物体中使用。本发明涵盖所有这些ACoAS蛋白和编码这些ACoAS蛋白的核酸及其同源物和生物活性片段。以下并且在实施例中详细地讨论了这些蛋白质和核酸分子。
本发明的一个实施方案涉及催化长链PUFA游离脂肪酸(FFA)转化成酰基辅酶A的经分离的酰基辅酶A合成酶(ACoAS)。在本发明的一个方面，所述分离的ACoAS源于内源性地表达PUFA PKS系统(PUFA合成酶)的生物 体。上述生物体包括但不限于破囊壶菌。在一个方面，所述分离的ACoAS源于裂殖壶菌属、破囊壶菌属或Ulkenia。在另一个方面，所述分离的ACoAS源于裂殖壶菌属ATCC20888或裂殖壶菌属种菌株N230D，后者为源于裂殖壶菌属ATCC20888的通过诱变和选择产生的菌株，用于改进油产生。在另一个方面，与任何PUFA PKS系统一起发挥功能以在宿主细胞或生物体中增加PUFA的产生和/或积累的任何ACoAS都可用于本发明。本发明不限于本申请描述的那些具体实施例。
在另一个方面，所述经分离的ACoAS由选自以下的任何一种的核酸序列编码：SEQ ID NO:82、84、86、88、90、92、94、96或98。在另一个方面，所述经分离的ACoAS由编码以下蛋白质的简并核酸序列(degenerate nucleic acid sequence)编码，所述蛋白质由选自以下的任何一种的核酸序列编码：SEQ ID NO:82、84、86、88、90、92、94、96或98。在另一个方面，所述经分离的ACoAS包含选自SEQ ID NO:83、85、87、89、91、93、95、97或99或任何上述氨基酸序列的同源物(以下描述)中任何一种的氨基酸序列，包括上述序列的任何生物活性片段或结构域。在优选的实施方案中，所述分离的ACoAS包含本申请用SEQ ID NO:83、85、87、89、91、93、95、97或99表示的氨基酸序列或这些氨基酸序列的同源物。在更优选的实施方案中，所述经分离的ACoAS包含本申请用SEQ ID NO:83、85、87、91或97表示的氨基酸序列或这些序列的同源物，其中SEQ ID NO:83、85或97是特别优选的。本发明也涵盖任何一种或多种酰基辅酶A合成酶的组合。
本发明包括表达一种或多种酰基辅酶A合成酶，本申请将所述一种或多种酰基辅酶A合成酶与本申请描述的PUFA合成酶和外源性PPTase(单独利用本申请描述的PUFA合成酶和外源性PPTase或与抑制内源性PPTase组合进行)一起进行了描述和示范说明，单独利用所述策略或与本申请描述的任何一种或多种策略组合进行，以在异源性宿主中增加PUFA的产生和/或积累，所述一种或多种策略例如为以下策略中的任何一种、两种、三种或四种：密码子优化、细胞器靶向、提高PUFA合成酶对丙二酰辅酶A的竞争(例如通过抑制FAS)和/或表达一种或多种酰基转移酶或相关酶。
酰基转移酶
就在上述异源性宿主中增加PUFA的产生和/或积累的另一种策略而言，本发明的另一个实施方案提供了在形成PL或TAG时利用PUFA-CoA作为 底物的额外的酰基转移酶蛋白(例如3-甘油-磷酸酯酰基转移酶(GPAT)、溶血磷脂酸酰基转移酶(LPAAT)和二酰基甘油酰基转移酶(DAGAT))或可使PUFA在PL或TAG中富集的其它酰基转移酶(例如磷脂:二酰基甘油酰基转移酶(PDAT))。本发明涵盖上述经分离的蛋白质及其同源物、编码上述蛋白质的核酸分子、表达上述蛋白质的经遗传修饰的生物体和特别是为了提高生物体中PUFA的产生和积累而使用上述蛋白质的各种方法。
另外，本发明人也在本申请中披露了以下酶，所述酶可在形成PL或TAG时利用PUFA-CoA作为底物，因此为额外的辅助蛋白，其可在表达PUFA合成酶的异源宿主生物体中用于提高PUFA合成酶产生的PUFA的积累。候选酶包括但不限于3-甘油-磷酸酯酰基转移酶(GPAT)、溶血磷脂酸酰基转移酶(LPAAT)和二酰基甘油酰基转移酶(DAGAT)。本发明包括所有这些利用酰基辅酶A的蛋白质和编码所述蛋白质的核酸。例如，已鉴定裂殖壶菌属核酸序列，据信，其编码具有DAGAT活性的酶(参见例如ScDAGAT)。另外，已鉴定出对隐甲藻序列，相信其编码具有LPAAT或DAGAT活性的酶，以下对此进行了描述。本发明涵盖这些蛋白质、其生物活性同源物和核酸分子及其它酰基转移酶蛋白、其同源物和核酸分子，并且以下详细地讨论了具体的实施例。
本发明的另一个实施方案涉及在形成PL或TAG时利用PUFA-CoA作为底物的分离的蛋白质(例如3-甘油-磷酸酯酰基转移酶(GPAT)、溶血磷脂酸酰基转移酶(LPAAT)和二酰基甘油酰基转移酶(DAGAT))。优选的蛋白质包括选自GPAT、LPAAT和DAGAT中任何一种的酰基转移酶。在一个方面，所述分离的蛋白质源于内源性地表达PUFA PKS系统(PKS合成酶)或至少内源性地表达产生PUFA的生物合成途径的生物体。上述生物体包括但不限于破囊壶菌或对隐甲藻。在一个方面，所述经分离的酰基转移酶源于裂殖壶菌属、破囊壶菌属或Ulkenia。在另一个方面，所述分离的酰基转移酶源于裂殖壶菌属ATCC20888或裂殖壶菌属种菌株N230D。在另一个方面，所述酰基转移酶源于对隐甲藻。在另一个方面，与任何PUFA PKS系统一起工作以在宿主细胞或生物体中增加PUFA的产生和/或积累的任何酰基转移酶可用于本发明。本发明不限于本申请描述的那些具体实施例。
在另一个方面，所述经分离的酰基转移酶由选自以下的任何一种的核酸序列编码：SEQ ID NO:100、102、103、105、106、108、109、111、112或 114-121。在另一个方面，所述分离的酰基转移酶由编码以下蛋白质的简并核酸序列编码，所述蛋白质由选自以下的任何一种的核酸序列编码：SEQ ID NO:100、102、103、105、106、108、109、111、112或114-121。在另一个方面，所述经分离的酰基转移酶包含选自SEQ ID NO:101、104、107、110或113中任何一种的氨基酸序列或任何上述氨基酸序列的同源物(以下描述)，包括上述序列的任何生物活性片段或结构域。在优选的实施方案中，所述经分离的酰基转移酶包含本申请用SEQ ID NO:101、104、107、110或113表示的氨基酸序列或上述氨基酸序列的同源物。在更优选的实施方案中，所述经分离的酰基转移酶包含本申请用SEQ ID NO:101或104表示的氨基酸序列或上述序列的同源物，其中SEQ ID NO:101是特别优选的。本发明也涵盖本申请描述的酰基转移酶的组合，用于本发明。
在另一个方面，所述经分离的酰基转移酶包含选自SEQ ID NO:中任何一种的氨基酸序列或任何上述氨基酸序列的同源物(以下描述)，包括上述序列的任何生物活性片段或结构域。
本发明包括表达一种或多种酰基辅酶A合成酶，本申请将所述一种或多种酰基辅酶A合成酶与本申请描述的PUFA合成酶和外源性PPTase(单独利用本申请描述的PUFA合成酶和外源性PPTase或与抑制内源性PPTase组合进行)一起进行了描述和示范，单独利用所述策略或与本申请描述的任何一种或多种策略组合进行，以在异源性宿主中增加PUFA的产生和/或积累，所述一种或多种策略例如为以下策略中的任何一种、两种、三种或四种：密码子优化、细胞器靶向、提高PUFA合成酶对丙二酰辅酶A的竞争(例如通过抑制FAS)和/或表达酰基CoA合成酶。
细胞器特异性表达
就本申请描述的另一种策略而言，本发明的一个实施方案涉及使所述PUFA合成酶、所述PPTase和/或所述辅助蛋白的任何一种或多种的靶向表达和/或针对宿主的一种或多种细胞器的靶标遗传修饰。例如，在一个实施方案中，使所述PUFA合成酶系统和所述PPTase的表达靶向于植物的质体。在另一个实施方案中，使所述PUFA合成酶系统和所述PPTase的表达靶向于细胞溶胶。在另一个实施方案中，所使述PUFA合成酶系统和所述PPTase的表达靶向于植物的质体和细胞溶胶。在这些实施方案中的任何一个中，可使其它靶标靶向于所述质体或所述细胞溶胶。在一个方面，使酰基辅酶A 合成酶的表达靶向于所述细胞溶胶，并且在另一个实施方案中，使上述表达靶向于所述质体。在一个实施方案中，使一种酰基辅酶A合成酶靶向于所述细胞溶胶，并且使另一种酰基辅酶A合成酶靶向于所述质体。优选地，使酰基辅酶A合成酶在所述细胞溶胶中表达，以将DHA和/或DPA游离脂肪酸转化成酰基辅酶A，酰基转移酶反之可利用所述酰基辅酶A。通常以共翻译的方式(co-translationally)使酰基转移酶靶向于内质网。通过诸如遗传修饰来抑制宿主的一种或多种酶而抑制FAS系统，这可能定向于在其中表达PUFA合成酶的同一细胞器(或多种细胞器)。
质体靶向的一种示范性序列源于欧洲油菜(Brassica napus)酰基-ACP硫酯酶，本申请用SEQ ID NO:81表示所述编码的靶向肽的氨基酸序列。质体靶向的各种其它序列在本领域中是已知的，并且可用于其中异源性宿主为植物或植物细胞的实施方案中，并且其中期望能靶向于所述质体。
本发明包括用本申请描述的PUFA合成酶和外源性PPTase的表达(单独表达或与抑制内源性PPTase组合进行)进行细胞器靶向(例如靶向于植物的质体或叶绿体)的用途，单独利用所述策略或与本申请描述的任何一种或多种策略组合进行，以在异源性宿主中增加PUFA的产生和/或积累，所述一种或多种策略例如为以下策略中的任何一种、两种、三种或四种：密码子优化、提高PUFA合成酶对丙二酰辅酶A的竞争(例如通过抑制FAS)、表达一种或多种酰基辅酶A合成酶和/或表达一种或多种酰基转移酶或相关酶。
使基因产物(gene product)靶向于所述质体或叶绿体，这通过在各种蛋白质的氨基端发现的信号序列来控制，并且在转运得到成熟蛋白期间，使所述信号序列裂解(例如就叶绿体靶向而言，参见例如Comai等人,J.Biol.Chem.263:15104-15109(1988))。这些信号序列可与异源性基因产物融合，以使重要的异源产物进到所述叶绿体中(van den Broeck等人Nature313:358-363(1985))。可从编码以下蛋白质的cDNA中分离出合适的编码信号序列的DNA：RUBISCO蛋白、CAB蛋白、EPSP合成酶、GS2蛋白和已知定位于叶绿体的多种其它蛋白质。
在本发明的各种实施方案中，特别有利的是，将本发明使用的蛋白质定位于亚细胞隔室，例如定位于所述质体或叶绿体。可通过在蛋白质的氨基端包括叶绿体转运肽(chloroplast transit peptide,CTP)来使所述蛋白质靶向于所述叶绿体。相似地，可通过在蛋白质的N端包括质体转运肽或信号肽(plastid transit or signaling peptide)来使所述蛋白质靶向于所述质体。
将叶绿体靶向的天然存在的蛋白质合成为含有氨基端叶绿体靶向肽的更大前体蛋白，所述氨基端叶绿体靶向肽使所述前体靶向于所述叶绿体的转运器(import machinery)，这在本领域中是众所周知的。叶绿体靶向肽一般经位于叶绿体细胞器中的特异性内切酶裂解，由此将靶向的成熟的并且优选活化的酶从所述前体释放到叶绿体环境中。对适于使基因或基因产物靶向于植物细胞的叶绿体或质体的肽进行编码的序列的实例包括矮牵牛(petunia)EPSPS CTP、拟南介(Arabidopsis)EPSPS CTP2和内含子及本领域技术人员已知的其它实例。这些靶向序列将期望表达的蛋白质转移到该蛋白质最有效发挥功能的细胞结构中，或将期望表达的蛋白质转移到以下细胞区域中，在所述细胞区域中集中了发挥期望表型功能所需要的细胞加工(cellular process)。叶绿体靶向肽的具体实例在本领域中是众所周知的，并且包括拟南介(Arabidopsis thaliana)核酮糖二磷酸酯羧化酶小亚单元ats1A转运肽、拟南介EPSPS转运肽和玉米(Zea maize)核酮糖二磷酸酯羧化酶小亚单元转运肽。
例如在Van den Broeck等人,“Targeting of a foreign protein to chloroplasts by fusion to the transit peptide from the small subunit of ribulose 1,5-biphosphate carboxylase”,Nature,313:358-363(1985)中描述了优化的转运肽。例如在Michaelis等人(1982)Ann.Rev.Microbiol.36,425中披露了原核信号序列和真核信号序列。本发明可使用的转运肽的额外实例包括诸如在Von Heijne等人,Plant Mol.Biol.Rep.9:104-126(1991)、Mazur等人,Plant Physiol.85:1110(1987)和Vorst等人,Gene65:59(1988)中所述那样的叶绿体转运肽。Chen和Jagendorf(J.Biol.Chem.268:2363-2367(1993))已描述了将所述叶绿体转运肽用于转运异源性转基因。所使用的上述肽为来自皱叶烟草(Nicotiana plumbaginifolia)的rbcS基因的转运肽(Poulsen等人Mol.Gen.Genet.205:193-200(1986))。本申请已用于将异源性蛋白质定位于叶绿体的一种CTP源于欧洲油菜(Brassica napus)酰基-ACP硫酯酶。
将基因定位于叶绿体或质体的可替换方法包括对叶绿体或质体进行转化。可得到以下重组植物，在所述重组植物中，仅使叶绿体DNA发生改变，以合并本申请提出的分子。在叶绿体中发挥功能的启动子在本领域中是已知的(Hanley-Bowden等人,Trends in Biochemical Sciences12:67-70,1987)。例 如Daniell等人(美国专利号5,693,507;1997)和Maliga等人(美国专利号5,451,513;1995)已描述了得到含有其中已插入有异源DNA的叶绿体的细胞的方法和策略。
策略的组合
根据本发明，就异源宿主得到产生和积累一种或多种靶标PUFA而言，可使用本申请描述的用于改进所述宿主中PUFA产生和/或积累的策略中的任何一种或多种(任何组合)。实际上，所预期的是，策略的各种组合可具有加和作用或协同作用，并且与没有一种或多种上述策略相比，策略组合可改进PUFA的产生和/或积累。实际上，本发明的实施例提供了多种示范性策略，包括策略的各种组合，以在宿主生物体(异源性宿主和天然表达PUFA PKS系统的生物体)中产生PUFA。
本发明合适的经遗传修饰以产生PUFA的宿主细胞或生物体具有以下基本属性。所述宿主细胞或生物体表达PUFA PKS系统，所述PUFA PKS系统包括本申请描述的核心PUFA PKS酶和当与所述核心PUFA PKS酶一起使用时有效产生PUFA的PPTase。所述宿主细胞或生物体可内源性地产生所述PUFA PKS系统和/或所述PPTase，或所述PUFA PKS系统和/或所述PPTase在所述宿主中表达成异源性蛋白质(例如通过重组技术)。可针对密码子选择或为了更好地在所述宿主细胞或生物体中进行表达而对编码所述核心PUFA PKS酶和/或所述PPTase的核酸分子进行优化。可对所述宿主细胞或生物体进行额外的修饰，以表达一种、两种、三种或更多种酰基-CoA合成酶，包括本申请描述的任何酰基-CoA合成酶或本领域已知的其它酰基-CoA合成酶。可对所述宿主细胞或生物体进行额外的修饰，以表达一种、两种、三种或更多种酰基转移酶，包括本申请描述的任何酰基转移酶或本领域已知的其它酰基转移酶。可对所述宿主细胞或生物体进行额外的遗传修饰(或进行其它选择或处理(produce))，以提高所述PUFA PKS系统对所述底物即丙二酰辅酶A的竞争能力。在一个方面，这通过以下方法来实现：选择天然具有上述特征或由于天然突变、选择突变或靶向突变而具有上述特征的生物体或通过育种(breeding)或其它技术而具有上述特征的生物体。在另一个方面，这通过以下方法来实现：在与PUFA PKS就丙二酰辅酶A发生竞争的途径(或多个途径)(如FAS系统)中选择性地抑制一种或多种酶。在本发明的任何实施方案中，对所述PUFA PKS或辅助蛋白或修饰进行的靶向可以是细胞器特异 性的，诸如靶向于植物的质体。
与核心PUFA PKS系统和PPTase联用的一些优选组合包括但不限于(1)表达一种、两种或更多种酰基辅酶A合成酶；(2)对FAS进行抑制(例如通过抑制KASII或KASIII)；(3)使一种、两种或更多种酰基辅酶A合成酶的表达与对FAS的抑制(例如通过抑制KASII或KASIII)组合；(4)表达一种、两种或更多种酰基转移酶；(5)使一种、两种或更多种酰基辅酶A合成酶的表达、对FAS的抑制(例如通过抑制KASII或KASIII)和一种、两种或更多种酰基转移酶的表达组合进行。
本申请所示对植物进行的修饰的一些示范性组合(参见实施例13)包括表达PUFA PKS(例如来自裂殖壶菌属)和异源性PPTase(例如来自念珠藻属的HetI)及
(a)表达酰基辅酶A合成酶(示范的是ACS-1和ACS-2)；
(b)对FAS进行抑制(示范的是通过KASII RNAi、KASII反义物、KASIIIRNAi和KASIII反义物来进行抑制)；
(c)使酰基辅酶A合成酶的表达与对FAS的抑制组合进行(示范的是使ACS-1的表达与对FAS的抑制(通过KASII RNAi、KASII反义物、KASIIIRNAi和KASIII反义物之一)组合进行)；
(d)表达酰基转移酶(示范的是LPAAT-1)；
(e)使酰基转移酶的表达与酰基辅酶A合成酶的表达及与对FAS的抑制组合进行(示范的是使DAGAT-1的表达与ACS-1的表达组合进行和使DAGAT-1的表达或ACS-1的表达各自与对FAS的抑制(通过KASII RNAi或KASIII反义物)组合进行)；
(f)使酰基转移酶的表达与两种酰基辅酶A合成酶的表达及与对FAS的抑制组合进行(示范的是使DAGAT-1的表达与ACS-1和ACS-8的表达组合进行和使DAGAT-1的表达或ACS-1和ACS-8的表达各自与对FAS的抑制(通过KASII RNAi或KASIII反义物)组合进行)；
(g)使两种酰基转移酶的表达与酰基辅酶A合成酶的表达及与对FAS的抑制组合进行(示范的是使DAGAT-1和LPAAT-1的表达与ACS-1的表达组合进行和使DAGAT-1和LPAAT-1的表达或ACS-1的表达各自与对FAS的抑制(通过KASII RNAi或KASIII反义物)组合进行)；和
(h)使两种酰基转移酶的表达与两种酰基辅酶A合成酶的表达及与对 FAS的抑制组合进行(示范的是使DAGAT-1和LPAAT-1的表达与ACS-1和ACS-8的表达组合进行和使DAGAT-1和LPAAT-1的表达或ACS-1和ACS-8的表达各自与对FAS的抑制(通过KASII RNAi或KASIII反义物)组合进行)。
本发明涵盖使用这些修饰组合或本申请描述的任何其它修饰或修饰组合的任何植物或植物细胞。此外，本发明涵盖使用本申请描述的任何修饰或修饰组合的任何宿主细胞或生物体和得自上述细胞或生物体的任何产物(包括含有靶标PUFA的油)。如本申请描述的那样，本发明的所有实施方案都用于讨论任何经遗传修饰的生物体及产生和使用上述生物体的方法。
经遗传修饰的细胞和生物体及产生和使用所述细胞和生物体的方法
为了得到极高产率的一种或多种所期望的多不饱和脂肪酸或其它生物活性分子，可对生物体(优选为微生物或植物)进行遗传修饰，以改变微生物或植物中PUFA PKS系统的活性，特别是改变微生物或植物中PUFA PKS系统的终产物，或将PUFA PKS系统引入到所述微生物或植物中。本发明涉及改进或提高上述遗传修饰的有效性的方法，尤其涉及改进或提高PUFA PKS系统的终产物(优选为PUFA(或多种PUFA))的产生和/或积累的方法。
因此，本发明的一个实施方案涉及经遗传修饰的生物体，其中所述生物体表达PUFA PKS系统，并且其中所述生物体已被遗传修饰来表达本申请描述的辅助蛋白，用于改进通过所述宿主进行的PUFA(或所述PUFA PKS系统的其它生物活性产物)的产生和/或积累，和/或其中所述生物体已通过以下任何方法来遗传修饰，从而提高所述PUFA PKS在所述宿主中对底物的竞争能力(例如通过抑制FAS途径和本申请描述的其它竞争途径)，所述方法包括天然选择和突变。如果所述PUFA PKS系统就所述宿主而言是异源性，则所述生物体也优选地经遗传修饰为表达PPTase作为PUFA PKS的辅助蛋白，以上对此进行了详细的描述。在一个实施方案中，所述生物体已被遗传修饰来表达本申请描述的ACoAS，并且优选地表达以下ACoAS，优选地，所述ACoAS所源于的属、种或具体生物体与所述PUFA PKS系统所源于的生物体相同，或所述ACoAS能催化所述PUFA PKS系统产生的长链PUFA游离脂肪酸(FFA)转化成酰基辅酶A。在另一个实施方案中，所述生物体已经遗传修饰为表达在形成PL或TAG时使用PUFA-CoA作为底物的蛋白质。在另一个实施方案中，所述生物体已经遗传修饰为既表达上述ACoAS也表达在形成PL或TAG时使用PUFA-CoA作为底物的蛋白质。在一个实施方案 中，如果所述PUFA PKS系统就所述宿主而言是内源性的，则所述生物体可如以上描述的那样遗传修饰为表达异源性辅助蛋白，该异源性辅助蛋白改进或提高所述宿主生物体中PUFA(或所述PUFA PKS系统的另一种生物活性产物)的产生和/或积累，和/或所述生物体可经遗传修饰为使由所述生物体内源性表达的上述辅助蛋白的表达和/或生物活性增加、优化或提高(例如改进所述宿主中与内源性PUFA PKS系统一起工作的内源性ACoAS的表达或活性)。在一个实施方案中，所述生物体通过以下任何方法来遗传修饰，从而提高所述PUFA PKS在所述宿主中对底物的竞争能力(例如通过抑制FAS途径和本申请描述的其它竞争途径)，所述方法包括天然选择和突变、靶向突变或随机突变和筛选。在一个实施方案中，对所述生物体中的FAS途径进行抑制。在一个实施方案中，对所述生物体中的KASII和/或KASIII进行抑制。以上详细描述了本发明的这些实施方案。优选的经遗传修饰的生物体包括经遗传修饰的微生物和经遗传修饰的植物。
虽然本发明尤其可用于提高经遗传修饰为表达PUFA PKS系统的生物体(异源性宿主)中PUFA的产生和/或积累，但所述生物体可内源性地表达所述PUFA PKS系统。所述生物体表达的PUFA PKS系统可包括任何PUFA PKS系统，例如完全源于特定生物体的PUFA PKS系统(例如裂殖壶菌属PUFA PKS系统)及对以下蛋白质和/或结构域进行编码的“混合和匹配的(mixing and matching)”核酸序列产生的PUFA PKS系统，所述蛋白质和/或结构域来自不同的PUFA PKS系统(例如通过混合裂殖壶菌属PUFA PKS蛋白和/或结构域与来自例如破囊壶菌属、Ulkenia、希瓦氏菌属、Moritella和/或发光菌属等的PUFA PKS蛋白和/或结构域)，和/或来自不同的非PUFA PKS系统(例如I型模块的、I型重复的、II型或III型PKS系统)，其中来自不同生物体的蛋白质和/或结构域组合形成完整的功能性PUFA PKS系统。PUFA PKS系统(包括将来自不同生物体的PUFA PKS基因或蛋白质进行组合)详细记载在美国专利号6,140,486、美国专利6,566,583、Metz等人,Science293:290-293(2001)、美国专利申请公开号20020194641、美国专利申请公开号20040235127、美国专利申请公开号20050100995和PCT公开号WO2006/135866(上述)中。PUFA PKS基因和蛋白质也披露在PCT专利公开号WO05/097982和美国专利申请公开号20050014231中。在此将上述每篇文献披露的内容和其中描述的基因和蛋白质引入作为参考。
因此，本发明涵盖通过以下措施来对生物体进行遗传修饰的方法：对所述生物体中的至少一种核酸序列进行遗传修饰，所述核酸序列编码PUFA PKS系统(包括但不限于本申请具体描述的任何PUFA PKS系统)的至少一种功能域或蛋白质(或其生物活性片段或同源物)，和/或表达至少一种重组核酸分子，所述重组核酸分子包含对上述结构域或蛋白质进行编码的核酸序列。另外，所述方法包括通过以下措施来对所述生物体进行遗传修饰：对所述生物体中的至少一种核酸序列进行遗传修饰，所述核酸序列编码在形成PL或TAG时使用PUFA-CoA作为底物的ACoAS和/或蛋白质或至少一种功能域或蛋白质，和/或表达至少一种重组核酸分子，所述重组核酸分子包含对上述蛋白质(或多种蛋白质)进行编码的核酸序列。所述方法还可包括对所述生物体进行遗传修饰，以抑制与所述PUFA PKS就底物发生竞争的途径(诸如FAS系统)，包括但不限于对所述生物体中的KASII或KASIII进行抑制。在一个实施方案中，可针对密码子选择或为了在所述宿主中改进表达而对任何外源性引入的核酸序列进行优化。在一个实施方案中，可使任何引入的核酸序列靶向于所述生物体中的一种或多种细胞器。以上已详细描述了上述序列、对生物体进行遗传修饰的方法、特异性修饰及其组合的各种实施方案，并且本申请包括这些内容。典型地，所述方法用于得到产生特定生物活性分子或多种分子的特定经遗传修饰的生物体。优选地，所述经遗传修饰的生物体为经遗传修饰的微生物或经遗传修饰的植物。
优选地，本发明的经遗传修饰的生物体产生一种或多种多不饱和脂肪酸，包括但不限于EPA(C20:5,n-3)、DHA(C22:6,n-3)、DPA(C22:5,n-6或n-3)、ARA(C20:4,n-6)、GLA(C18:3,n-6)、ALA(C18:3,n-3)和/或SDA(C18:4,n-3))，更优选地产生一种或多种长链PUFA，包括但不限于EPA(C20:5,n-3)、DHA(C22:6,n-3)、DPA(C22:5,n-6或n-3)或DTA(C22:4,n-6)或它们的任意组合。在特别优选的实施方案中，本发明的经遗传修饰的植物产生一种或多种多不饱和脂肪酸，该多不饱和脂肪酸包括但不限于EPA(C20:5,n-3)、DHA(C22:6,n-3)和/或DPA(C22:5,n-6或n-3)或它们的任意组合。
根据本发明，经遗传修饰的生物体包括已利用重组技术或通过经典诱变和筛选技术进行修饰的生物体。本申请使用的使基因表达减少、使基因的功能降低或使基因产物(即所述基因编码的蛋白质)的功能降低的遗传修饰可以是对基因进行的钝化(完全或部分)、除去、干扰、阻断或下调。例如，对基 因进行的使由该基因编码的蛋白质的功能降低的遗传修饰可以是完全除去所述基因(即所述基因不存在因此所述蛋白质不存在)、使所述基因发生突变而使所述蛋白质的翻译不完全或不发生(例如不表达所述蛋白质)或使所述基因发生突变而降低或破坏所述蛋白质的天然功能(例如使酶活性或酶作用降低或不具有任何酶活性或酶作用的蛋白质进行表达)。使基因表达增加或功能提高的遗传修饰可以是对基因进行的扩增、过度产生、过度表达、活化、提高、增加或上调。
本发明对生物体进行的遗传修饰优选地影响所述生物体表达的PUFAPKS系统的活性，无论所述PUFA PKS系统是内源性的经遗传修饰的，还是内源性的并且将重组核酸分子引入到所述生物体中(任选地对所述内源性系统进行或不进行修饰)，或所述PUFA PKS系统完全通过重组技术来提供。与没有进行遗传修饰的情况相比(即与未修饰的野生型生物体或至少没有就PUFA合成进行修饰的生物体(即所述生物体可能具有不与PUFA合成相关的其它修饰)相比)，为了改变PUFA PKS系统的PUFA产生分布或表达上述系统的生物体的PUFA产生分布，可使所述宿主生物体产生的任何一种或多种PUFA(或所述PUFA PKS系统产生的其它生物活性分子)发生任何可检测或可测量的变化。与没有进行遗传修饰的情况相比，为了影响PUFA PKS系统的活性，可进行任何遗传修饰来使所述生物体表达的PUFA PKS系统发生任何可检测或可测量的变化或改变。所述PUFA PKS系统中可检测的变化或改变可包括但不限于与没有进行遗传修饰的内源性PUFA PKS系统相比，在修饰的PUFA PKS系统中使任何一种或多种结构域的表达和/或生物活性发生变化或改变(引入、提高或降低)；将PUFA PKS系统活性(即在进行遗传修饰前所述生物体不含有PKS系统或PUFA PKS系统)引入到生物体中，从而使所述生物体现在具有可测量/可检测的PUFA PKS系统活性。
应该注意的是，当提到使PUFA PKS系统中功能域或蛋白质的活性提高(包括使PUFA PKS系统中的辅助蛋白活性提高)，这是指在含有所述结构域或蛋白质的生物体(或所述结构域或蛋白质被引入到其中的生物体)中进行任何遗传修饰来提高所述结构域或蛋白质或系统的功能性，并且这可包括提高所述结构域或蛋白质或系统的活性(例如特异性活性或体内酶活性)、降低对所述结构域或蛋白质或系统的抑制或减少其降解，和使所述结构域或蛋白质或系统过度表达。例如，可利用与天然启动子相比使表达水平提高的启动子 来增加基因拷贝的数量和/或提高表达水平，或可通过遗传工程或经典诱变来使基因发生改变，以提高所述基因编码的结构域或蛋白质的活性。
相似地，当提到使PUFA PKS系统中功能域或蛋白质的活性降低(包括使PUFA PKS系统中的辅助蛋白活性提高)，这是指在含有上述结构域或蛋白质的生物体(或所述结构域或蛋白质被引入到其中的生物体)中进行任何遗传修饰来降低所述结构域或蛋白质的功能性，并且这可包括降低所述结构域或蛋白质的活性、提高对所述结构域或蛋白质的抑制或增加其降解，和减少或消除所述结构域或蛋白质的表达。例如，可通过以下方法来降低本发明的结构域或蛋白质的作用：阻断或减少所述结构域或蛋白质的产生，“敲除”编码所述结构域或蛋白质的基因或其部分，降低结构域或蛋白质活性，或抑制所述结构域或蛋白质的活性。阻断或减少结构域或蛋白质的产生，这可包括使编码所述结构域或蛋白质的基因受在生长介质中需要诱导化合物(inducing compound)存在的启动子的控制。可通过建立条件从而使所述诱导物从所述介质中消除来关闭编码所述结构域或蛋白质的基因的表达(因此关闭蛋白质合成的表达)。本发明人在实施例部分中显示了在破囊壶菌微生物中除去(敲除)靶标基因的能力。阻断或降低结构域或蛋白质的活性可包括使用与在美国专利号4,743,546中记载相似的切除(excision)技术措施，在此将该专利引入作为参考。为了使用上述措施，在特异性基因序列之间对编码重要蛋白质的基因进行克隆，所述特异性基因序列可从基因组中特异性地受控地切除基因。可通过例如使培养物的培养温度发生转变(美国专利号4,743,546)或通过一些其它物理或营养信号来促发切除。
遗传修饰的微生物
本申请使用的经遗传修饰的微生物可包括遗传修饰的细菌、原生生物、微观藻类、藻类、真菌或其它微生物。上述经遗传修饰的微生物具有以下基因组，针对所述微生物的正常(即野生型或天然存在)形式对其进行修饰(即突变或变化)，从而达到所期望的结果(即提高或改变PUFA PKS的活性和/或使利用所述PUFA PKS系统得到的所期望产物的产生和积累得到提高或改变)。可利用经典菌株发育(classical strain development)和/或分子遗传技术来对微生物进行遗传修饰。上述技术在本领域中是已知的，并且通常就微生物进行披露，例如在Sambrook等人,1989,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Labs Press中。在此将上述Sambrook等人完整引入作为 参考。遗传修饰的微生物可包括以下微生物，在所述微生物中已对核酸分子进行插入、除去或修饰(即例如通过对核酸进行插入、除去、代替(substitution)和/或翻转(inversion)来发生突变)，其方式使上述修饰在所述微生物中提供所期望的作用。
进行遗传修饰的合适宿主微生物的实例包括但不限于酵母(包括酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、卡尔酵母(Saccharomyces carlsbergensis)或其它酵母诸如念珠菌属(Candida)和克鲁维酵母属(Kluyveromyces))或其它真菌(例如丝状真菌诸如曲霉菌属(Aspergillus)、链孢霉属(Neurospora)、青霉菌属(Penicillium)等)。也可使用细菌细胞作为宿主。这些细菌包括但不限于大肠杆菌(Escherichia coli)，其可用于发酵过程(fermentation process)。可替换地并且仅作为实例，可使用诸如乳酸杆菌属(Lactobacillus)种或芽胞杆菌属(Bacillus)种那样的宿主作为宿主。
用于本发明的其它宿主包括来自以下属的微生物，所述属包括但不限于破囊壶菌科(Thraustochytriaceae)的破囊壶菌属、Japonochytrium属、Aplanochytrium属、Elina属和裂殖壶菌属及Labyrinthulaceae科的Labyrinthula属、Labyrinthuloides属和Labyrinthomyxa属。这些属中的优选种包括但不限于以下描述的任何种。破囊壶菌目的特别优选的菌株包括但不限于裂殖壶菌属种(S31)(ATCC20888)、裂殖壶菌属种(S8)(ATCC20889)、裂殖壶菌属种(LC-RM)(ATCC18915)、裂殖壶菌属种(SR21)、裂殖壶菌属种N230D、Schizochytrium aggregatum(Goldstein et Belsky)(ATCC28209)、Schizochytrium limacinum(Honda et Yokochi)(IFO32693)、破囊壶菌属种(23B)(ATCC20891)、Thraustochytrium striatum(Schneider)(ATCC24473)、Thraustochytrium aureum(Goldstein)(ATCC34304)、Thraustochytrium roseum(Goldstein)(ATCC28210)和Japonochytrium属种(L1)(ATCC28207)。
根据本发明，术语“破囊壶菌”指破囊壶菌目的任何成员，其包括破囊壶菌科，并且术语“labyrinthulid”指Labyrinthulales目的任何成员，其包括Labyrinthulaceae科。曾认为Labyrinthulaceae科的成员为破囊壶菌目的成员，但在对上述生物体的分类学进行的最新修订中，现在认为所述科为Labyrinthulales目的成员，并且认为Labyrinthulales目和破囊壶菌目都是Labyrinthulomycota门的成员。不断的发展使破囊壶菌和labyrinthulid的分类学频繁地修订。然而，分类学理论家现在通常将这些微生物与藻类或藻类样 原生生物置于Stramenopile lineage中。破囊壶菌和labyrinthulid的当前分类学设置可概括如下：
界：Stramenopila(Chromista)
门：Labyrinthulomycota
纲：Labyrinthulomycetes
目：Labyrinthulales
科：Labyrinthulaceae
目：破囊壶菌目
科：破囊壶菌科
然而，由于分类学的其它不确定因素，出于本发明的目的，最好认为本发明描述的菌株为包括以下生物体的破囊壶菌：目为破囊壶菌目，科为破囊壶菌科，属为破囊壶菌属(种为arudimentale、aureum、benthicola、globosum、kinnei、motivum、multirudimentale、pachydermum、proliferum、roseum、striatum)、Ulkenia属(种为amoeboidea、kerguelensis、minuta、profunda、radiata、sailens、sarkariana、schizochytrops、visurgensis、yorkensis)、裂殖壶菌属(种为aggregatum、limnaceum、mangrovei、minutum、octosporum)、Japonochytrium属(种为marinum)、Aplanochytrium属(种为haliotidis、kerguelensis、profunda、stocchinoi)、Althornia属(种为crouchii)或Elina属(种为marisalba、sinorifica)。应该注意的是，没有在评论杂质(peer-reviewed journal)中公开对Ulkenia属的原始描述，所以就上述属和设置在其中的种的正确性而言存在一些问题。出于本发明的目的，可认为在Ulkenia属中描述的种为破囊壶菌属的成员。
本发明作为Labyrinthulid描述的菌株包括以下生物体：目为Labyrinthulales，科为Labyrinthulaceae，属为Labyrinthula属(种为algeriensis、coenocystis、chattonii、macrocystis、macrocystis atlantica、macrocystis macrocystis、marina、minuta、roscoffensis、valkanovii、vitellina、vitellina pacifica、vitellina vitellina、zopfii)、Labyrinthuloides属(种为haliotidis、yorkensis)、Labyrinthomyxa属(种为marina)、Diplophrys属(种为archeri)、Pyrrhosorus属(种为marinus)、Sorodiplophrys属(种为stercorea)或Chlamydomyxa属(种为labyrinthuloides、montana)(虽然当前就Pyrrhosorus属、Sorodiplophrys属或Chlamydomyxa属的分类学设置而言没有达成共识)。
在本发明的一个实施方案中，微生物的内源性PUFA PKS系统和/或内 源性PUFA PKS辅助蛋白(例如ACoAS)通过例如经典诱变和选择技术和/或分子遗传技术(包括遗传工程技术)来进行遗传修饰。遗传工程技术可包括例如使用靶向重组载体以除去部分内源性基因或用异源性序列代替部分内源性基因。可引入到宿主基因组中的异源序列的实例包括以下序列，该序列编码至少一种来自另一种PKS系统的功能性PUFA PKS结构域或蛋白质，或甚至编码完整的PUFA PKS系统(例如与所述PUFA PKS系统相关的所有基因)。异源性序列也可包括以下序列，该序列编码来自PUFA PKS系统的天然结构域的经修饰的功能域(同源物)。可引入到宿主基因组中的其它异源性序列包括以下核酸分子，该核酸分子编码影响内源性PUFA PKS系统的活性的蛋白质诸如本申请描述的辅助蛋白。例如，可将编码ACoAS特别是编码以下ACoAS的核酸分子引入到宿主基因组中，所述ACoAS与和所述PUFA PKS系统一起工作的内源性ACoAS相比能在所述宿主中提高PUFA的产生和/或积累。
遗传修饰的植物
本发明的另一个实施方案涉及经遗传修饰的植物，其中所述植物已被遗传修饰来重组地表达本申请描述的PUFA PKS系统(包括PPTase)，并且其中所述植物已进一步经遗传修饰为表达本申请描述的辅助蛋白，以改进所述宿主进行的PUFA(或所述PUFA PKS系统的其它生物活性产物)的产生和/或积累，和/或对与所述PUFA PKS系统发生竞争的途径进行抑制(例如对FAS系统进行抑制)。优选地，上述辅助蛋白为ACoAS和/或在形成PL或TAG时使用PUFA-CoA作为底物的蛋白质(例如GPAT、LFAAT或DAGAT)。
本申请使用的经遗传修饰的植物可包括任何遗传修饰的植物，包括高等植物，特别是任何消耗性植物(consumable plant)或可用于产生本发明期望的生物活性分子(例如PUFA)的植物。本申请使用的“植物部分”包括植物的任何部分，包括但不限于种子(包括成熟的种子和未成熟的种子)、花粉、胚芽、花、果实、枝、叶、根、茎、外植体等。经遗传修饰的植物具有以下基因组，针对该基因组的正常形式(即野生型或天然存在)对其进行修饰(即突变或变化)，从而达到所期望的结果(即提高或改变PUFA PKS的活性和/或使利用所述PUFA PKS系统得到的所期望产物的产生和积累提高或改变)。可利用经典菌株发育(strain development)和/或分子遗传技术来对植物进行遗传修饰。在转基因植物的生产方法中，将编码所期望氨基酸序列的重组核酸分子合并 到所述植物的基因组中，这些方法在本领域中是已知的。能根据本发明进行遗传修饰的优选植物优选为适于供动物(包括人类)消耗的植物。
能根据本发明进行遗传修饰的优选植物(即植物宿主细胞)包括但不限于任何高等植物，包括双子叶植物和单子叶植物，特别是消耗性植物，包括农作植物，尤其是由于其含有油而使用的植物。上述植物可包括但不限于例如油菜、大豆、油菜子、亚麻子、玉米、红花、向日葵和烟草。因而，可选择任何植物物种或植物细胞。本申请使用的具体细胞和由其能长成或衍生出植物的细胞包括但不限于得自以下植物的细胞：油菜(Brassica rapa L.)、大豆(Glycine max)、油菜子(Brassica属种)、亚麻子/亚麻(flax)(Linum usitatissimum)、玉米(玉米)(Zea mays)、红花(Carthamus tinctorius)、向日葵(Helianthus annuus)、烟草(Nicotiana tabacum)、Arabidopsis thaliana、巴西坚果(Brazil nut)(Betholettia excelsa)、蓖麻子(castor bean)(Riccinus communis)、椰子(Cocus nucifera)、胡荽(coriander)(Coriandrum sativum)、棉花(Gossypium 属种)、落花生(groundnut)(Arachis hypogaea)、加州希蒙得木(jojoba)(Simmondsia chinensis)、芥菜(mustard)(Brassica属种和Sinapis alba)、油椰(oil palm)(Elaeis guineeis)、橄榄(olive)(Olea eurpaea)、稻子(rice)(Oryza sativa)、南瓜(squash)(Cucurbita maxima)、大麦(barley)(Hordeum vulgare)、小麦(Traeticum aestivum)和浮萍(duckweed)(Lemnaceae属种)。应该注意的是，根据本发明，可改变植物物种中的遗传背景(genetic background)。
可根据本发明对这些植物的植物谱系进行生产、选择或鉴定，所述植物的植物谱系经优化得到特别期望的特性，例如疾病抵抗性、植物转化容易度、油含量和或分布等。优选的植物谱系可通过植物繁殖或诸如标记物辅助的繁殖和耕作(marker assisted breeding and tilling)那样的方法来选择。应该注意的是，植物谱系在本申请提及的如下方面表现出调节活性：任何辅助蛋白、对途径的靶标抑制和/或所述PUFA PKS系统(PUFA合成酶)，这样的植物谱系是特别有用的。
在另一个实施方案中，可根据本发明使用植物细胞培养技术。在上述实施方案中，植物细胞没有生长成分化的植物，也没有按照普通的农业操作来种植，而是生长和保持在液体介质中。
其它优选的植物包括已知能产生以下化合物的那些植物或经遗传工程化为产生以下化合物的植物，所述化合物可用作药物、香料、营养素、功能 性食物成分或美容活性物。
如上所述，本发明的PUFA PKS合成酶不利用FAS系统的脂肪酸产物。相反地，所述PUFA PKS合成酶从小的前体分子(其与FAS和延长酶(丙二酰辅酶A)利用的小的前体分子相同)产生最终PUFA产物(主要PUFA产物)。因此，所述合成循环中释放的中间体的量不具有任何显著度，并且将所述PUFA产物(本申请也将其称为主要PUFA产物)高效地转移到脂质中的磷脂(PL)和三酰甘油(TAG)部分中。实际上，PUFA PKS系统可产生两种靶标或主要PUFA产物(例如来自裂殖壶菌属的PUFA PKS系统产生DHA和DPA n-6作为主要产物)，但DPA不是所述途径中形成DHA的中间体。相反地，DHA和DPA n-6各自是同一PUFA PKS系统中不同的产物。因此，PUFA PKS基因是在异源性宿主诸如植物中得到含有PUFA特别是长链PUFA(LCPUFA)的油的极好手段，其中所述油基本不含有(以下定义)所述中间体和不含有使所述“标准”PUFA途径产生的油污染的副产物(以下也定义)。
因此，本发明的目的是通过如本申请描述的那样对植物进行遗传操作来产生具有期望链长度和期望双键数目的多不饱和脂肪酸，及得到含油种子和得自上述含有这些PUFA的植物的油(即得自上述植物的含油种子)。本发明可产生的PUFA的实例包括但不限于DHA(二十二碳六烯酸(C22:6,n-3))、ARA(二十碳四烯酸或花生四烯酸(C20:4,n-6))、DPA(二十二碳五烯酸(C22:5,n-6或n-3))和EPA(二十碳五烯酸(C20:5,n-3))及它们的任意组合。通过本发明人利用能产生PUFA的聚酮化合物合成酶样系统而开发的经遗传修饰的植物，本发明可产生具有商业价值的脂质，其富含一种或多种期望(靶标或主要)的PUFA。
根据本发明，“主要PUFA”、“靶标PUFA”、“预期的PUFA”或“期望的PUFA”指特定的PUFA或多种PUFA，其为用于产生所述PUFA(或多种PUFA)的酶途径的预期或靶标产物。例如，当使用延长酶和去饱和酶来对FAS系统的产物进行调节时，可选择延长酶和去饱和酶的特定组合，所述延长酶和去饱和酶当一起使用时可产生靶标PUFA或期望的PUFA(例如DHA或EPA)。如上所述，当以占所述系统产生的全部脂肪酸的百分比表示时，就PUFA的量而言，所述标准途径产生的上述靶标PUFA或期望的PUFA实际上可能不是“主要”PUFA，这是因为所形成的中间体和副产物实际上可能是所述系统产生的产物的主要部分。然而，即使在上述情况下也可使用术语“主 要PUFA”来指所述系统使用的延长酶或去饱和酶产生的靶标PUFA或预期的PUFA产物。
当使用本发明优选的PUFA PKS系统时，源于特定生物体的给定PUFA PKS系统可产生特定的PUFA(或多种PUFA)，从而使从特定生物体选择的PUFA PKS系统可产生具体的靶标PUFA或主要PUFA。例如，可使用来自裂殖壶菌属的PUFA PKS系统来产生DHA和DPA n-6作为靶标或主要PUFA。在另一个方面，可使用来自各种希瓦氏菌属属种的PUFA PKS系统来产生EPA作为靶标或主要PUFA。应该注意的是，主要或靶标PUFA的比例随以下情况而变化：所选择的特定PUFA PKS系统和上述系统如何响应于上述系统在其中表达的具体条件。例如，也可使用来自破囊壶菌属23B(ATCC No.20892)的PUFA PKS系统来产生DHA和DPA n-6作为靶标或主要PUFA，并且在破囊壶菌属23B的情况下，DHA与DPA n-6的比例为约10:1(可以是约8:1至约40:1)，然而就裂殖壶菌属而言，所述比例通常为约2.5:1。因此，与裂殖壶菌属相比，即使靶标PUFA是相同的，也可通过使用破囊壶菌属的PUFA PKS系统或蛋白质或结构域来改变生物体产生的PUFA的比例。另外，如下所述，也可通过对来自不同PUFA PKS系统或PUFA PKS和PKS系统的蛋白质和结构域进行混合来对给定的PUFA PKS系统进行调节，或可对给定PUFA PKS系统的结构域或蛋白质进行调节，以改变靶标PUFA产物和/或比例。
根据本发明，当提到产生PUFA的酶系统的“中间体产物”或“副产物”，其是指当所述系统产生靶标或主要PUFA(或多种PUFA)时所述酶系统产生的任何产物，特别是脂肪酸产物，但这些产物不是主要或靶标PUFA(或多种PUFA)。在一个实施方案中，中间体和副产物可包括野生型植物或用作所述遗传修饰接受体(recipient)的母体植物(parent plant)所天然产生的非靶标脂肪酸，但现在将所述非靶标脂肪酸归类为中间体或副产物，这是因为与野生型植物或用作所述遗传修饰接受体的母体植物所产生的水平相比，当进行遗传修饰后，所述非靶标脂肪酸以较高的水平产生。如上所述，中间体和副产物在合成PUFA的标准途径中是特别显著的，但在PUFA PKS途径中的显著度是基本较低的。应该注意的是，一种酶系统的主要或靶标PUFA可以是另一种酶系统的中间体，在所述另一种酶系统中，主要或靶标产物是不同的PUFA，并且就产生PUFA的标准途径的产物而言，这是特别真实的，因为 所述PUFA PKS系统基本没有产生中间体。例如，当使用产生EPA的标准途径时，产生了显著量的脂肪酸诸如GLA、DGLA和SDA作为中间体产物(例如美国专利申请公开号2004/0172682记载了上述现象)。相似地，在美国专利申请公开号2004/0172682中也进行了报道，当使用产生DHA的标准途径时，除以上提及的脂肪酸外，还产生了显著量的ETA和EPA(值得注意的是所述EPA为以上第一实例中的靶标PUFA)，并且实际上，相对于全部脂肪酸产物，与靶标PUFA本身相比，所述ETA和EPA的量可能是显著更大。上述后一现象也记载在美国专利申请公开号2004/0172682中，其中当以占全部脂肪酸的百分比表示时，工程化为通过标准途径来产生DHA的植物所产生的EPA多于所述靶标DHA。
为了得到产率显著高的一种或多种所期望的多不饱和脂肪酸，可对植物进行遗传修饰，以将PUFA PKS系统引入到所述植物中。尚未知道植物是否内源性地含有PUFA PKS系统，因此本发明的PUFA PKS系统提供了生产具有独特脂肪酸产生能力的植物。本发明的特别优选的实施方案是对植物进行遗传工程化，以在所述植物中产生一种或多种PUFA，包括EPA、DHA、DPA(n-3或n-6)、ARA、GLA、SDA和其它PUFA，包括它们的任意组合。本发明提供了以各种比例和形式产生众多“设计者油(designer oil)”中任何一种的能力。而且，对本申请所述特定海洋生物体的PUFA PKS基因的披露提供了更容易地拓展PUFA产生范围的机会，并且提供了在用于大多数农作植物生长的温度范围内更成功地产生上述PUFA的机会。
因此，本发明的一个实施方案涉及经遗传修饰的植物或植物部分(例如其中所述植物已经遗传修饰为表达本申请描述的PUFA PKS系统)，所述植物或植物部分包括本申请描述的核心PUFA PKS酶复合物和PPTase，其中所述植物已进一步经遗传修饰为表达本申请描述的辅助蛋白，用于改进所述宿主进行的PUFA(或所述PUFA PKS系统的其它生物活性产物)的产生和/或积累，和/或其中所述植物已经遗传修饰为如本申请描述的那样对与所述PUFA PKS系统发生竞争的途径进行抑制(例如对FAS系统进行抑制)。优选地，上述辅助蛋白为ACoAS和/或在形成PL或TAG时使用PUFA-CoA作为底物从而使所述植物产生PUFA的蛋白质(例如GPAT、LFAAT或DAGAT)。
优选地，上述额外的遗传修饰为通过降低对丙二酰辅酶A池(或多个池)的竞争来使经过PUFA合成酶途径的流增加的任何修饰(天然发生、选择或 合成的)。有多种可能的方法来提高对上述底物的竞争能力。这些方法包括但不限于1)对竞争途径进行抑制，包括抑制FAS途径中的任何要素，例如通过降低上述途径中参与的酶或亚单元的表达水平(例如通过使用反义RNA、RNAi、共抑制或突变)，2)使PUFA合成酶在异源性宿主中表达，在所述异源性宿主中已使竞争途径减少或对其进行阻断(例如对于油菜已在细胞质中阻断了使脂肪酸延长的能力)，和/或3)使丙二酰辅酶A池增加(例如通过表达乙酰辅酶A羧化酶)。在一个实施方案中，在所述植物中对KASII和/或KASIII进行抑制(例如通过RNAi或反义物)。
如上所述，本发明可使用的经遗传修饰的植物已被遗传修饰来表达PUFA PKS系统。所述PUFA PKS系统可包括任何PUFA PKS系统，诸如记载在例如美国专利6,566,583、美国专利申请公开号20020194641、美国专利申请公开号20040235127、美国专利申请公开号20050100995和PCT公开号WO2006/135866中的任何PUFA PKS系统。所述PUFA PKS系统可选自但不限于在这些专利和专利出版物中鉴定和表征的任何具体的PUFA PKS系统，诸如来自以下生物体的PUFA PKS系统：裂殖壶菌属种American Type Culture Collection(ATCC)No.20888及其衍生的突变体菌株(例如菌株N230D)、破囊壶菌属23B ATCC No.20892及其衍生的突变体菌株、Shewanella olleyana Australian Collection of Antarctic Microorganisms(ACAM)菌株号644及其衍生的突变体菌株或Shewanella japonica ATCC菌株号BAA-316及其衍生的突变体菌株。
在一个实施方案中，所述PUFA PKS系统包含选自以上任何PUFA PKS系统的结构域，其中对所述结构域进行组合(混合或匹配)，以形成满足上述最低需要的完整PUFA PKS系统。所述植物也可进一步用另一种PKS系统的至少一种结构域或其生物活性片段来修饰，所述另一种PKS系统包括但不限于I型PKS系统(重复的或模块的)、II型PKS系统和/或III型PKS系统，其可代替PUFA PKS系统中的结构域。最后，可针对PUFA PKS系统的天然结构而对其任何结构域进行修饰，以调节或提高上述结构域在所述PUFA PKS系统中的功能(例如调节所述系统产生的PUFA的类型或其比例)。在上述专利和专利出版物中描述了对结构域进行混合以产生意想不到的PUFA PKS蛋白(chimeric PUFA PKS protein)。
优选地，具有任何上述特征的植物是已经遗传修饰为表达本申详细请描 述的PUFA PKS系统(PUFA合成酶)的植物(即所述PUFA PKS系统是在所述植物中产生靶标PUFA(或多种PUFA)的酶系统)。在一个实施方案中，所述植物已经遗传修饰为表达由来自破囊壶菌的PUFA PKS蛋白/结构域组成的PUFA PKS系统，所述破囊壶菌包括但不限于裂殖壶菌属、破囊壶菌属、Ulkenia属、Japonochytrium属、Aplanochytrium属、Althornia属或Elina属。在一个实施方案中，所述植物已经遗传修饰为表达由来自labrynthulid的PUFA PKS蛋白/结构域组成的PUFA PKS系统。在另一个实施方案中，所述植物已经遗传修饰为表达由来自海洋细菌的PUFA PKS蛋白/结构域组成的PUFA PKS系统，所述海洋细菌包括但不限于Shewanella japonica或Shewanella olleyana。在一个实施方案中，所述植物已经遗传修饰为表达由以下蛋白质/结构域组成的PUFA PKS系统：以上描述的裂殖壶菌属Orf A、B和C(包括其同源物或合成版本)及PPTase(例如HetI)(例如参见SEQ ID NO:1-32和SEQ ID NO:33及以上对裂殖壶菌属PUFA PKS系统的讨论)。在另一个实施方案中，所述植物已经遗传修饰为表达由以下蛋白质/结构域组成的PUFA PKS系统：以上描述的破囊壶菌属Orf A、B和C(包括其同源物或合成版本)及PPTase(例如HetI)(例如参见SEQ ID NO:38-68和SEQ ID NO:33及以上对破囊壶菌属PUFA PKS系统的讨论，也参见美国专利申请公开号20050014231)。在另一个实施方案中，所述植物已经遗传修饰为表达由以下蛋白质/结构域组成的PUFA PKS系统：其它破囊壶菌Orf A、B和C(包括其同源物或合成版本)及PPTase(例如HetI)(例如参见PCT专利公开号WO05/097982)。在另一个实施方案中，所述植物已经遗传修饰为表达由以下蛋白质/结构域组成的PUFA PKS系统：以上描述的来自海洋细菌(诸如希瓦氏菌属属)的PUFA PKS Orf(包括其同源物或合成版本)和PPTase(例如内源性希瓦氏菌属PPTase)(例如参见针对Shewanella japonica的SEQ ID NO:1-6和针对Shewanella olleyana的SEQ ID NO:7-12)。在另一个实施方案中，所述植物已经遗传修饰为表达来自上述PUFA PKS系统的结构域和蛋白质的任何组合(例如意想不到的PUFA PKS系统).
最后，如上所述，对所述植物进行的遗传修饰可包括引入一种或多种辅助蛋白，所述一种或多种辅助蛋白可与核心PUFA PKS酶复合物一起工作，以能够、有利于或提高所述植物进行的PUFA产生，和/或对所述植物进行的遗传修饰可包括以下遗传修饰，该遗传修饰通过如本申请描述的那样对 FAS系统进行任何抑制或使用本申请描述的可实现相同结果的其它策略来提高经过所述PUFA PKS系统的丙二酰辅酶A底物流。对所述植物进行的遗传修饰也可包括就优选的宿主密码子选择而对基因进行优化及使所述PUFA合成酶靶向于特定的细胞器(例如质体)。
优选地，所述植物为含油种子植物，其中所述含油种子和/或所述含油种子中的油含有所述PUFA PKS系统产生的PUFA。上述油含有可检测量的至少一种靶标或主要PUFA，其为所述PUFA PKS系统的产物。另外，上述油基本不含有中间体或副产物，所述中间体或副产物不是靶标或主要PUFA产物，并且不是野生型植物中的内源性FAS系统所天然产生的(即野生型植物通过FAS系统来产生一些短链或中链PUFA(诸如18个碳的PUFA)，但当用PUFA PKS系统进行遗传修饰时，在所述植物中产生新的或额外的脂肪酸)。换言之，与野生型植物(没有进行遗传修饰)或用作所述遗传修饰接受体的母体植物的全部脂肪酸分布相比，在已用PUFA PKS系统进行遗传修饰的植物所产生的全部脂肪酸的分布中，额外的脂肪酸(由所述遗传修饰产生的新脂肪酸或增加的脂肪酸)中的大部分包含所述PUFA PKS系统的靶标或预期的PUFA产物(即在所述经遗传修饰的植物所产生的全部脂肪酸中，额外或新脂肪酸中的大部分为靶标PUFA(或多种PUFA))。
此外，当提到在合成PUFA合成PUFA的系统“基本不含有”中间体或副产物或不含有显著量的中间体或副产物时，这意味着当引入或存在可产生PUFA的酶系统时，在所述经遗传修饰的植物(和/或植物部分和/或种子油部分)中产生的任何中间体或副产物脂肪酸(非靶标PUFA)(即不是由野生型植物或用作所述遗传修饰接受体的母体植物产生的)的量占所述植物产生的全部脂肪酸重量的少于约10%重量，更优选地少于约9%，更优选地少于约8%，更优选地少于约7%，更优选地少于约6%，更优选地少于约5%，更优选地少于约4%，更优选地少于约3%，更优选地少于约2%，更优选地少于约1%重量，并且更优选地少于约0.5%重量。
在优选的实施方案中，当提到在合成PUFA的系统“基本不含有”中间体或副产物或不含有显著量的中间体或副产物，这意味着当所述酶系统产生PUFA时，在所述遗传修饰的植物(和/或植物部分和/或种子油部分)中产生的任何中间体或副产物脂肪酸(即不是由野生型植物或用作所述遗传修饰(用于产生靶标PUFA)接受体的母体植物产生的)的量在所述植物产生的总额外脂 肪酸(将额外的脂肪酸定义为以下脂肪酸或脂肪酸水平，该脂肪酸不是由野生型植物或用作所述遗传修饰(用于产生靶标PUFA)接受体的母体植物天然产生的)中少于约10%重量，更优选地少于约9%，更优选地少于约8%，更优选地少于约7%，更优选地少于约6%，更优选地少于约5%，更优选地少于约4%，更优选地少于约3%，更优选地少于约2%，并且更优选地少于约1%。因此，与已经遗传修饰为通过标准途径来产生PUFA的植物的脂肪酸分布相比，当用PUFA PKS系统进行遗传修饰时，脂肪酸产物中的大部分可以是所述靶标或预期的脂肪酸产物。
当PUFA PKS系统的靶标产物为长链PUFA(诸如DHA、DPA(n-6或n-3)或EPA)时，在用上述PUFA PKS进行遗传修饰的植物的总脂质中的量不显著的中间体产物和副产物可包括但不限于γ-亚麻酸(GLA;18:3,n-6)、十八碳四烯酸(stearidonic acid)(STA或SDA;18:4,n-3)、双高-γ-亚麻酸(DGLA或HGLA;20:3,n-6)、花生四烯酸(ARA,C20:4,n-6)、二十碳三烯酸(ETA;20:3,n-9)和各种其它中间体或副产物诸如20:0、20:1(Δ5)、20:1(Δ11)、20:2(Δ8,11)、20:2(Δ11,14)、20:3(Δ5,11,14)、20:3(Δ11,14,17)、蜂蜜酸(mead acid)(20:3;Δ5,8,11)或20:4(Δ5,1,14,17)。另外，当靶标产物为特定的PUFA(诸如DHA)时，在所述遗传修饰的植物的总脂质中量不显著的中间体产物和副产物也包括其它PUFA，包括作为不同PUFA PKS系统的天然产物的其它PUFA，诸如上述实例中的EPA。应该注意的是，如果需要，本发明的PUFA PKS系统也可用于产生作为靶标PUFA的PUFA可包括GLA、SDA或DGLA的PUFA。
利用有关本申请所述PUFA PKS系统的遗传基础和结构域结构的知识，本发明人已设计并且得到对上述PUFA PKS系统进行编码的构建体，并且已成功地得到表达所述PUFA PKS系统的转基因植物。所述转基因植物产生含有PUFA的油，并且所述油基本不含有在标准PUFA途径中积累的中间体产物。本发明人也已证明的是，使用所述构建体以在另一种真核生物即酵母中产生PUFA，作为在得到转基因植物前的概念证实(proof-of-concept)实验。所述实例显示，用产生DHA和DPA n-6作为靶标PUFA的PUFA PKS系统进行转化的酵母和植物产生上述PUFA，作为所述植物和所述酵母的全部脂肪酸中的主要额外脂肪酸(即扣除(subtract)野生型植物中产生的脂肪酸)，并且所述实例还显示，在野生型植物或母体植物的脂肪酸中不存在的任何其它脂 肪酸实际上是检测不到的。以下详细描述了本发明的遗传修饰的植物及其部分和油的具体特征。
根据本发明，经遗传修饰的植物包括已利用重组技术修饰的植物，所述重组技术可与经典诱变技术和筛选技术组合进行。本申请使用的遗传修饰使基因表达减少，使基因的功能降低，或使基因产物(即所述基因编码的蛋白质)的功能降低，并且所述遗传修饰指对基因进行的钝化(完全或部分)、除去、干扰、阻断或下调。例如，对基因进行的使由使上述基因编码的蛋白质的功能降低的遗传修饰可以是完全除去所述基因(即所述基因不存在因此所述蛋白质不存在)、使所述基因发生突变而使所述蛋白质的翻译不完全或不发生(例如不表达所述蛋白质)或使所述基因发生突变而降低或破坏所述蛋白质的天然功能(例如表达蛋白质，该蛋白质的对酶活性或酶作用降低或不具有任何酶活性或酶作用)。使基因表达增加或功能提高的遗传修饰可以是对基因进行的扩增、过度产生、过度表达、活化、提高、增加或上调。
本发明对植物进行的遗传修饰使所述植物产生一种或多种PUFA。所述植物产生的PUFA的PUFA分布和比例无需与PUFA PKS系统所源于的生物体所产生的PUFA的PUFA分布和比例相同。
就得到的经遗传修饰的植物而言，对植物进行遗传工程化的方法在本领域中也是众所周知的。例如，已开发了对植物进行转化的多种方法，包括针对双子叶植物及单子叶植物的生物和物理转化方案(例如Goto-Fumiyuki等人,1999,Nature Biotech17:282-286)。参见例如Miki等人,“Procedures for Introducing Foreign DNA into Plants”in Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology,Glick,B.R.and Thompson,J.E.Eds.(CRC Press,Inc.,Boca Raton,1993)pp.67-88。另外，用于对植物细胞或组织进行转化和对植物进行再生(regeneration)的载体和体外培养方法是可得到的。参见例如Gruber等人,“Vectors for Plant Transformation”in Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology,Glick,B.R.and Thompson,J.E.Eds.(CRC Press,Inc.,Boca Raton,1993)pp.89-119。
使用最广的将表达载体引入到植物中的方法是基于土壤杆菌属(Agrobacterium)的天然转化系统。参见例如Horsch等人,Science227:1229(1985)。根癌土壤杆菌(A.tumefaciens)和发根土壤杆菌(A.rhizogenes)是使植物患病的土壤细菌，其使植物细胞发生遗传转化。根癌土壤杆菌和发 根土壤杆菌的Ti和Ri质粒分别携带使植物发生遗传转化的基因。参见例如Kado,C.I.,Crit.Rev.Plant.Sci.10:1(1991)。多篇参考文献描述了用于进行土壤杆菌属介导的基因转移的土壤杆菌属载体系统和方法，这些参考文献包括上述Gruber等人、上述Miki等人、Moloney等人,Plant Cell Reports8:238(1989)和美国专利号4,940,838和5,464,763。
另一种通常可使用的对植物进行转化的方法为微粒介导的转化，其中DNA携带在微粒的表面上。用生物射弹装置(biolistic device)将所述表达载体引入到植物组织中，所述生物射弹装置将所述微粒加速到足以穿透植物细胞壁和细胞膜的速度。参见Sanford等人,Part.Sci.Technol.5:27(1987)、Sanford,J.C.,Trends Biotech.6:299(1988)、Sanford,J.C.,Physiol.Plant79:206(1990)和Klein等人,Biotechnology10:268(1992)。将DNA物理递送到植物中的另一种方法为对靶标细胞进行超声处理。参见Zhang等人,Bio/Technology9:996(1991)。可替换地，脂质体融合或原生质球融合已用于将表达载体导入到植物中。参见Deshayes等人,EMBO J.,4:2731(1985)和Christou等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA84:3962(1987)。也已报道的是，利用CaCl2沉淀(CaCl2precipitation)、聚乙烯醇或聚L-鸟氨酸来将DNA直接摄取到原生质体中。参见Hain等人,Mol.Gen.Genet.199:161(1985)和Draper等人,Plant Cell Physiol.23:451(1982)。也已描述的是，对原生质体和完整细胞和组织进行电穿孔。参见Donn等人,In Abstracts of VIIth International Congress on Plant Cell and Tissue Culture IAPTC,A2-38,p.53(1990)、D’Halluin等人,Plant Cell 4:1495-1505(1992)和Spencer等人,Plant Mol.Biol.24:51-61(1994)。另外，在使用例如花浸方法学(flower dipping methodology)(Clough and Bent,1998,Plant J.16:735-743)来对植物进行转化时，可使用碳化硅晶须(silicone carbide whisker)(Kaepler等人,1990,Plant Cell Reports)。
确切的植物转化方法学可发生变化，这在一定程度上取决于就转化而选择的植物物种和就转化而选择的植物细胞类型(例如源于幼苗的细胞类型(诸如下胚轴和子叶(cotelydon)或胚组织)。
如上所述，在一个实施方案中，所选择的植物为红花。已在Baker and Dyer,Plant Cell Reports,1996,16:106-110中描述了得到红花转化体(transformant)的方法学。
在将遗传构建体引入到植物细胞中后，使植物细胞生长，并且一旦分化 出各种组织诸如枝和根时，得到成熟的植物。典型地，要生产多种植物。用于再生植物的方法对本领域技术人员来说是众所周知的，并且可在例如以下文献中发现所述方法：Plant Cell and Tissue Culture,1994,Vasil and Thorpe Eds.Kluwer Academic Publishers和Plant Cell Culture Protocols(Methods in Molecular Biology111,1999Hall Eds.Humana Press)。
因此，本发明包括利用来自某些海洋细菌的基因和任何破囊壶菌PUFA PKS系统或其它真核PUFA PKS系统对植物细胞进行遗传修饰的方法，并且本发明还可利用基因混合(gene mixing)来拓展或改变PUFA产物的范围，以包括EPA、DHA、DPA(n-3或n-6)、ARA、GLA、SDA和其它PUFA。得到产生分布发生变化的这些PUFA的方法不但包括将来自各种生物体的基因混合到破囊壶菌PUFA PKS基因中，而且包括对本发明披露的内源性破囊壶菌PUFA PKS基因进行遗传修饰的各种方法。有关破囊壶菌PUFA PKS系统和海洋细菌PUFA PKS系统的遗传基础和结构域结构的知识为设计新的经遗传修饰的并能产生各种PUFA分布的生物体提供了基础。可将在微生物(诸如破囊壶菌或大肠杆菌)中产生的新的PUFA PKS构建体进行分离，并且将其用于对植物进行转化，以使所述植物具有相似的PUFA产生性质。本发明包括的对PUFA PKS系统进行的特定修饰详细记载在例如美国专利申请公开号20020194641、美国专利申请公开号20040235127和美国专利申请公开号20050100995)中。
遗传修饰的植物优选地在发酵培养基中培养，或在合适的介质(诸如土壤)中生长。以上已详细讨论了合适或有效的发酵培养基。适于高等植物的生长介质包括适于植物的任何生长介质，包括但不限于土壤、沙子、支持根生长的任何其它特定介质(例如蛭石、珍珠岩等)或水培(hydroponic culture)及合适的光、水和对高等植物的生长进行优化的营养补剂。对本发明的遗传修饰的植物进行工程化，以通过所述PUFA PKS系统的活性来产生PUFA。可通过从所述植物提取化合物的纯化方法来回收所述PUFA。在优选的实施方案中，通过收集所述植物来回收所述PUFA。在特别优选的实施方案中，通过从所述植物(例如从含油种子)收集油来回收所述PUFA。所述植物也可按其天然状态被消耗，或进一步加工成消耗品(consumable product)。
优选地，本发明的经遗传修饰的植物产生一种或多种多不饱和脂肪酸，包括但不限于EPA(C20:5,n-3)、DHA(C22:6,n-3)、DPA(C22:5,n-6或n-3)、 ARA(C20:4,n-6)、GLA(C18:3,n-6)、ALA(C18:3,n-3)和/或SDA(C18:4,n-3))，更优选地产生一种或多种长链脂肪酸(LCPUFA)，包括但不限于EPA(C20:5,n-3)、DHA(C22:6,n-3)、DPA(C22:5,n-6或n-3)或DTA(C22:4,n-6)。在特别优选的实施方案中，本发明的经遗传修饰的植物产生一种或多种多不饱和脂肪酸，包括但不限于EPA(C20:5,n-3)、DHA(C22:6,n-3)和/或DPA(C22:5,n-6或n-3)。
因此，本发明的一个实施方案涉及植物，优选为含油种子植物，其中所述植物产生(例如就含油种子植物而言在其成熟的种子中或在含油种子植物的种子的油中)至少一种PUFA(靶标PUFA)，并且其中积累PUFA的植物或植物部分中的全部脂肪酸分布(例如就含油种子植物而言在其成熟的种子中或在含油种子植物的种子的油中)包含可检测量的上述PUFA或多种PUFA。优选地，靶标PUFA为至少20个碳的PUFA，并且包含至少3个双键，更优选为至少4个双键，甚至更优选为至少5个双键。此外，靶标PUFA优选为所述植物不会天然产生的PUFA(即没有进行遗传修饰的野生型植物或用作所述遗传修饰接受体的母体植物)。优选地，积累PUFA的植物或植物部分(包括所述植物的种子油)中的全部脂肪酸分布按全部脂肪酸的重量计包含至少0.1%的靶标PUFA(或多种PUFA)，更优选为至少约0.2%，更优选为至少约0.3%，更优选为至少约0.4%，更优选为至少约0.5%，更优选为至少约1%，更优选为至少约1.5%，更优选为至少约2%，更优选为至少约2.5%，更优选为至少约3%，更优选为至少约3.5%，更优选为至少约4%，更优选为至少约4.5%，更优选为至少约5%，更优选为至少约5.5%，更优选为至少约10%，更优选为至少约15%，更优选为至少约20%，更优选为至少约25%，更优选为至少约30%，更优选为至少约35%，更优选为至少约40%，更优选为至少约45%，更优选为至少约50%，更优选为至少约55%，更优选为至少约60%，更优选为至少约65%，更优选为至少约70%，更优选为至少约75%，并且按所述植物产生的全部脂肪酸的重量计更优选地包含多于75%的至少一种多不饱和脂肪酸(靶标PUFA或多种PUFA)，或包含0.1%至75%中任何百分比或大于75%(高至100%或约100%)且增量为0.1%的靶标PUFA(或多种PUFA)。除非另有说明，本申请一般使用的PUFA产生百分量是按所述生物体(植物)产生的全部脂肪酸的重量计(例如在一些情况下重量百分比是相对于由酶复合物(诸如PUFA PKS系统)产生的全部脂肪酸)。在一 个实施方案中，通过对脂肪酸甲酯(FAME)制品进行气相色谱(GC)分析来确定植物产生的全部脂肪酸，此时将植物产生的全部脂肪酸表示成重量百分比，但全部脂肪酸的确定方法不限于上述方法。
如上所述，上述植物(和/或植物部分或种子油部分)产生的全部脂肪酸的额外特征是，除产生靶标PUFA(或多种PUFA)的酶复合物所产生的靶标PUFA(或多种PUFA)外，所述植物产生的这些全部脂肪酸包含少于(或含有不多于)约10%重量的任何脂肪酸。优选地，除靶标PUFA(或多种PUFA)外，由产生靶标PUFA(或多种PUFA)的酶复合物所产生的任何脂肪酸(例如当用产生靶标PUFA(或多种PUFA)的酶或酶复合物对所述植物进行遗传修饰时)按所述植物产生的全部脂肪酸的重量计少于约9%，更优选地少于约8%，更优选地少于约7%，更优选地少于约6%，更优选地少于约5%，更优选地少于约4%，更优选地少于约3%，更优选地少于约2%，并且更优选地少于约1%。
在另一个实施方案中，除靶标PUFA(或多种PUFA)外，产生靶标PUFA(或多种PUFA)的酶复合物所产生的任何脂肪酸按在所述植物中产生靶标PUFA(或多种PUFA)的酶复合物所产生的全部脂肪酸的重量计(即这种测量方法限于产生靶标PUFA的酶复合物所产生的那些全部脂肪酸)少于(或含有不多于)约10%，更优选地少于约9%，更优选地少于约8%，更优选地少于约7%，更优选地少于约6%，更优选地少于约5%，更优选地少于约4%，更优选地少于约3%，更优选地少于约2%，更优选地少于约1%，并且更优选地少于约0.5%。
在本发明的这个实施方案的另一个方面，除靶标PUFA(或多种PUFA)或存在于野生型植物(没有进行遗传修饰)或用作所述遗传修饰接受体的母体植物中的PUFA外，由所述植物(和/或植物部分或种子油部分)产生的全部脂肪酸按所述植物产生的全部脂肪酸的重量计含有少于(或含有不多于)10%的具有18个或更多个碳的PUFA。在其它方面，除靶标PUFA(或多种PUFA)或存在于野生型植物(没有进行遗传修饰)或用作所述遗传修饰接受体的母体植物中的PUFA外，所述植物(和/或植物部分或种子油部分)产生的全部脂肪酸按所述植物产生的全部脂肪酸的重量计含有少于9%的具有18个或更多个碳的PUFA，或含有少于8%的具有18个或更多个碳的PUFA，或含有少于7%的具有18个或更多个碳的PUFA，或含有少于6%的具有18个或更多个 碳的PUFA，或含有少于5%的具有18个或更多个碳的PUFA，或含有少于4%的具有18个或更多个碳的PUFA，或含有少于3%的具有18个或更多个碳的PUFA，或含有少于2%的具有18个或更多个碳的PUFA，或含有少于1%的具有18个或更多个碳的PUFA。
在本发明的这个实施方案的另一个方面，除了所述植物(和/或植物部分或种子油部分)产生的全部脂肪酸按所述植物产生的全部脂肪酸的重量计含有少于(或含有不多于)10%的具有20个或更多个碳的PUFA。在其它方面，除靶标PUFA(或多种PUFA)或存在于野生型植物(没有进行遗传修饰)或用作所述遗传修饰接受体的母体植物中的PUFA外，所述植物(和/或植物部分或种子油部分)产生的全部脂肪酸按所述植物产生的全部脂肪酸的重量计含有少于9%的具有20个或更多个碳的PUFA，或含有少于8%的具有20个或更多个碳的PUFA，或含有少于7%的具有20个或更多个碳的PUFA，或含有少于6%的具有20个或更多个碳的PUFA，或含有少于5%的具有20个或更多个碳的PUFA，或含有少于4%的具有20个或更多个碳的PUFA，或含有少于3%的具有20个或更多个碳的PUFA，或含有少于2%的具有20个或更多个碳的PUFA，或含有少于1%的具有20个或更多个碳的PUFA。
在一个实施方案中，所述植物(和/或植物部分或种子油部分)中的全部脂肪酸按所述植物产生的全部脂肪酸的重量计含有少于约10%、更优选地少于约9%、更优选地少于约8%、更优选地少于约7%、更优选地少于约6%、更优选地少于约5%、更优选地少于约4%、更优选地少于约3%、更优选地少于约2%并且更优选地少于约1%的选自以下的任何一种或多种的脂肪酸：γ-亚麻酸(GLA;18:3,n-6)、十八碳四烯酸(STA或SDA;18:4,n-3)、双高-γ-亚麻酸(DGLA或HGLA;20:3,n-6)、花生四烯酸(ARA,C20:4,n-6)、二十碳三烯酸(ETA;20:3,n-9)和各种其它脂肪酸诸如20:0、20:1(Δ5)、20:1(Δ11)、20:2(Δ8,11)、20:2(Δ11,14)、20:3(Δ5,11,14)、20:3(Δ11,14,17)、蜂蜜酸(20:3;Δ5,8,11)或20:4(Δ5,1,14,17)。
在另一个实施方案中，在所述植物中产生长链PUFA的酶系统所产生的脂肪酸按所述植物产生的全部脂肪酸的百分比计含有少于约10%重量的选自以下的脂肪酸：γ-亚麻酸(GLA;18:3,n-6)、十八碳四烯酸(STA或SDA;18:4,n-3)、双高-γ-亚麻酸(DGLA或HGLA;20:3,n-6)、花生四烯酸(ARA,C20:4,n-6)、二十碳三烯酸(ETA;20:3,n-9)和各种其它脂肪酸诸如20:0、20:1(Δ5)、 20:1(Δ11)、20:2(Δ8,11)、20:2(Δ11,14)、20:3(Δ5,11,14)、20:3(Δ11,14,17)、mead acid(20:3;Δ5,8,11)或20:4(Δ5,1,14,17)，更优选地含有少于约9%、更优选地含有少于约8%、更优选地含有少于约7%、更优选地含有少于约6%、更优选地含有少于约5%、更优选地含有少于约4%、更优选地含有少于约3%、更优选地含有少于约2%并且更优选地含有少于约1%的选自以下的脂肪酸：γ-亚麻酸(GLA;18:3,n-6)、十八碳四烯酸(STA或SDA;18:4,n-3)、双高-γ-亚麻酸(DGLA或HGLA;20:3,n-6)、花生四烯酸(ARA,C20:4,n-6)、二十碳三烯酸(ETA;20:3,n-9)和各种其它脂肪酸诸如20:0、20:1(Δ5)、20:1(Δ11)、20:2(Δ8,11)、20:2(Δ11,14)、20:3(Δ5,11,14)、20:3(Δ11,14,17)、mead acid(20:3;Δ5,8,11)或20:4(Δ5,1,14,17)。
在另一个实施方案中，在所述植物中产生长链PUFA的酶系统所产生的脂肪酸按所述植物产生的全部脂肪酸的百分比计含有少于约10%重量的以下PUFA中的全部：γ-亚麻酸(GLA;18:3,n-6)、具有18个碳和四个碳-碳双键的PUFA、具有20个碳和三个碳-碳双键的PUFA和具有22个碳和两个或三个碳-碳双键的PUFA，更优选地含有少于约9%、更优选地含有少于约8%、更优选地含有少于约7%、更优选地含有少于约6%、更优选地含有少于约5%、更优选地含有少于约4%、更优选地含有少于约3%、更优选地含有少于约2%并且更优选地含有少于约1%的以下PUFA中的全部：γ-亚麻酸(GLA;18:3,n-6)、具有18个碳和四个碳-碳双键的PUFA、具有20个碳和三个碳-碳双键的PUFA和具有22个碳和两个或三个碳-碳双键的PUFA。
在另一个实施方案中，在所述植物中产生长链PUFA的酶系统所产生的脂肪酸按所述植物产生的全部脂肪酸的百分比计含有少于约10%重量的以下PUFA中的每一种：γ-亚麻酸(GLA;18:3,n-6)、具有18个碳和四个碳-碳双键的PUFA、具有20个碳和三个碳-碳双键的PUFA和具有22个碳和两个或三个碳-碳双键的PUFA，更优选地含有少于约9%、更优选地含有少于约8%、更优选地含有少于约7%、更优选地含有少于约6%、更优选地含有少于约5%、更优选地含有少于约4%、更优选地含有少于约3%、更优选地含有少于约2%并且更优选地含有少于约1%的以下PUFA中的每一种：γ-亚麻酸(GLA;18:3,n-6)、具有18个碳和四个碳-碳双键的PUFA、具有20个碳和三个碳-碳双键的PUFA和具有22个碳和两个或三个碳-碳双键的PUFA。
在另一个实施方案中，在所述植物中产生长链PUFA的酶系统所产生的 脂肪酸按所述植物产生的全部脂肪酸的百分比计含有少于约10%重量的以下PUFA中的任何一种或多种：γ-亚麻酸(GLA;18:3,n-6)、具有18个碳和四个碳-碳双键的PUFA、具有20个碳和三个碳-碳双键的PUFA和具有22个碳和两个或三个碳-碳双键的PUFA，更优选地含有少于约9%、更优选地含有少于约8%、更优选地含有少于约7%、更优选地含有少于约6%、更优选地含有少于约5%、更优选地含有少于约4%、更优选地含有少于约3%、更优选地含有少于约2%并且更优选地含有少于约1%的以下PUFA中的任何一种或多种：γ-亚麻酸(GLA;18:3,n-6)、具有18个碳和四个碳-碳双键的PUFA、具有20个碳和三个碳-碳双键的PUFA和具有22个碳和两个或三个碳-碳双键的PUFA。
在本发明的这个实施方案的一个方面，所述植物产生至少两种靶标PUFA，并且积累PUFA的植物或植物部分(包括源于含油种子的油)中的全部脂肪酸分布包含可检测量的这些PUFA。在这个实施方案中，所述PUFA各自优选为至少20个碳的PUFA，并且包含至少3个双键，更优选地包含至少4个双键，甚至更优选地包含至少5个双键。上述PUFA最优选地选自DHA、DPA n-6和EPA。在一个方面，所述植物产生DHA和DPA n-6，并且DHA与DPA n-6的比例为约1:10至约10:1，包括这之间的任何比例。在一个实施方案中，DHA与DPA的比例为约1:1至约3:1，并且在另一个实施方案中为约2.5:1。在一个实施方案中，所述植物产生DHA和EPA。
在本发明的这个实施方案的另一个方面，所述植物产生用图13或图14表示的全部脂肪酸分布。
本发明还包括本申请所述植物产生的任何种子及本申请所述植物或种子产生的任何油。本发明也包括使用本申请描述的植物、种子或油而得到的产物。
本发明的经遗传修饰的生物体的用途
本发明的一个实施方案为通过使本发明的经遗传修饰的生物体(例如微生物或植物)生长或对其进行培养(以上详细描述)来产生所期望的生物活性分子(也称为产物或化合物)的方法。优选地，所述生物活性分子为PUFA，更优选为LCPUFA。优选地，所述经遗传修饰的生物体为经遗传修饰的微生物或经遗传修饰的植物。上述方法包括例如以下步骤：分别在发酵培养基中对微生物或植物进行培养或在合适的环境诸如土壤中使微生物或植物生长， 所述微生物或植物具有本申请先前描述并且符合本发明的遗传修饰。以上描述了用于针对本发明的PUFA PKS系统而进行遗传修饰的优选宿主细胞和生物体。
本发明的一个实施方案为通过对本发明的经遗传修饰的微生物(以上详细描述)进行培养来产生所期望的PUFA的方法。上述方法包括以下步骤：在发酵培养基中并且在有效产生PUFA(或多种PUFA)的条件下对具有本申请先前描述并且符合本发明的经遗传修饰的微生物进行培养。合适或有效的培养基指以下任何培养基，在该培养基中，本发明的经遗传修饰的微生物当进行培养时能产生所期望的PUFA产物(或多种PUFA产物)。上述培养基通常为包含可同化(assimilable)的碳源、氮源和磷源的水性培养基。上述培养基也可包括合适的盐、矿物质、金属和其它营养素。可在常规发酵生物反应器中对本发明的任何微生物进行培养。可通过任何发酵方法来对所述微生物进行培养，所述发酵方法包括但不限于分批发酵、分批补料发酵、细胞循环发酵和连续发酵。本发明的针对破囊壶菌微生物的优选生长条件在本领域中是众所周知的，并且详细记载在例如美国专利号5,130,242、美国专利号5,340,742和美国专利号5,698,244中，在此将所述每篇专利完整引入作为参考。
可使用常规分离和纯化技术来从发酵培养基回收经遗传修饰的微生物产生的所期望PUFA(或多种PUFA)和/或其它生物活性分子。例如，可对所述发酵培养基进行过滤或离心，以除去微生物、细胞碎片和其它颗粒物质，并且可通过常规方法来从不含有细胞的上清回收产物，所述常规方法诸如为离子交换技术、色谱技术、萃取技术、溶剂提取技术、相分离技术、膜分离技术、电渗析技术、反渗透技术、蒸馏技术、化学衍生技术和结晶技术。可替换地，可在不从产物除去微生物组分的情况下使用产生PUFA(或多种PUFA)的微生物或其提取物和其各种部分。
优选地，所产生的PUFA的量大于微生物干燥重量的约5%，并且在一个方面，所述量大于微生物干燥重量的6%，在另一个方面，所述量大于微生物干燥重量的7%，在另一个方面，所述量大于微生物干燥重量的8%，在另一个方面，所述量大于微生物干燥重量的9%，在另一个方面，所述量大于微生物干燥重量的10%，及所述量大于微生物干燥重量的整数百分比，所述量至多大于微生物干燥重量的90%(例如15%、20%、30%、40%、50%和 之间的任何百分比)。
优选地，经遗传修饰的微生物产生的重要生物活性化合物的量大于微生物干燥重量的约0.05%，优选地大于微生物干燥重量的约0.1%，更优选地大于微生物干燥重量的约0.25%，更优选地大于微生物干燥重量的约0.5%，更优选地大于微生物干燥重量的约0.75%，更优选地大于微生物干燥重量的约1%，更优选地大于微生物干燥重量的约2.5%，更优选地大于微生物干燥重量的约5%，更优选地大于微生物干燥重量的约10%，更优选地大于微生物干燥重量的约15%，并且甚至更优选地大于微生物干燥重量的约20%。就脂质化合物而言，优选地，所产生的上述化合物的量大于微生物干燥重量的约5%。就其它生物活性化合物诸如抗生素或合成量较小的化合物而言，将按微生物干燥重量计具有上述化合物的那些菌株鉴定为可预测地含有上述新颖类型的PKS系统。在一些实施方案中，所述微生物分泌而不是积累特定的生物活性分子(化合物)。因此，通常从培养基回收上述生物活性分子，并且所产生的分子的浓度随微生物和培养规模而变化。
在产生本发明的所期望生物活性化合物的方法中，在发酵培养基中对经遗传修饰的植物进行培养，或在合适的生长介质诸如土壤中使经遗传修饰的植物生长。以上已详细讨论了合适或有效的发酵培养基。适于高等植物的生长介质包括适于植物的任何生长介质，包括但不限于土壤、沙子、支持根生长的任何其它特定介质(例如蛭石、珍珠岩等)或水培及合适的光、水和对高等植物的生长进行优化的营养补剂。对本发明的遗传修饰的植物进行工程化，以通过所述PUFA PKS系统的活性来产生显著量的所期望产物和本发明的其它异源性蛋白质(所述PUFA PKS系统的辅助蛋白)。可通过从所述植物提取化合物的纯化方法来回收所述化合物。在优选的实施方案中，通过收集所述植物来回收所述化合物。在这个实施方案中，所述植物可按其天然状态被消耗，或进一步加工成消耗品。
本发明还包括本申请描述的任何生物体或其部分(例如微生物及其制品或部分或植物、植物部分(例如含油种子)或其制品或部分)及本申请所述生物体产生的任何油。本发明也包括使用本申请描述的生物体、其部分或油来生产的任何产品。
本发明的一个实施方案涉及对含有至少一种脂肪酸的产品进行调节的方法，其包括向所述产品添加本发明的生物体、其部分或经遗传修饰的生物 体所产生的油(例如以下植物或微生物，该植物或微生物已用PUFA PKS系统进行遗传修饰，利用本申请描述的任何策略以改进PUFA的产生和/或积累，并且具有本申请描述的脂肪酸分布)。本发明也涵盖通过上述方法生产或通常含有本申请描述的任何生物体、其部分或来自所述生物体的油的任何产品。
优选地，所述产品选自食物、饮食补品、药物配方、人化动物乳(humanized aminal milk)和婴儿配方。合适的药物配方包括但不限于抗炎配方、化疗剂、活性赋形剂、骨质疏松药、抗抑郁药、抗惊厥药、anti-Heliobactor pylori drug、用于治疗神经变性疾病的药物、用于治疗变性肝疾病(degenerative liver disease)的药物、抗生素和降胆固醇配方。在一个实施方案中，所述产品用于治疗选自以下的病症：慢性炎症、急性炎症、胃肠道疾病、癌症、恶病质(cachexia)、心脏再狭窄(cardiac restenosis)、神经变性疾病、肝脏变性疾病、血脂疾病、骨质疏松、骨关节炎、自身免疫疾病、先兆子痫、早产、年龄相关黄斑病(age related maculopathy)、肺部疾病和过氧化物酶体病(peroxisomal disorder)。
合适的食品包括但不限于精致烘焙的点心(fine bakery wares)、面包和蛋卷(roll)、早餐谷物(breakfast cereal)、加工和未加工的奶酪(processed and unprocessed cheese)、调味品(condiment)(番茄酱(ketchup)、蛋黄酱(mayonnaise)等)、乳制品(dairy product)(牛奶(milk)、酸奶(yogurt))、布丁(pudding)和明胶点心(gelatine dessert)、碳酸饮料(carbonated drink)、茶、粉末饮料混合料(powdered beverage mixe)、加工的鱼产品(processed fish product)、基于水果的饮料(fruit-based drink)、口香糖、硬的糖果(hard confectionery)、冷冻的乳制品(frozen dairy product)、加工的肉制品(processed meat product)、坚果和基于坚果的涂抹酱(nut-based spread)、面食制品(pasta)、加工的禽制品(processed poultry product)、肉汁(gravy)和酱汁(sauce)、薯片(potato chip)和其它薄片(chip)或脆片(crisp)、巧克力和其它糖果、汤和汤混合料(soup mix)、基于大豆的制品(soya based product)(牛奶、饮料、冰淇淋、咖啡伴侣(whitener))、基于植物油的涂抹酱(vegetable oil-based spread)和基于蔬菜的饮料(vegetable-based drink)。
一般定义和指导方针
根据本发明，分离的蛋白质为已从其天然环境分离出来(即已接受人工 处理)的蛋白质或其片段(包括多肽或肽)，并且可包括例如纯化的蛋白质、部分纯化的蛋白质、重组产生的蛋白质和合成产生的蛋白质。同样地，“分离的”不反映所述蛋白质的纯化程度。优选地，以重组的方式得到本发明的分离的蛋白质。可按合成(例如化学方法诸如通过肽合成)或重组的方式得到分离的肽。
本申请使用的术语“脂质”包括磷脂、游离脂肪酸、脂肪酸的酯、三酰甘油、二酰基甘油酯、单酰基甘油酯、溶血磷脂、皂类、磷脂(phosphatide)、蜡(醇和脂肪酸的酯)、甾醇和甾醇酯、类胡萝卜素(carotenoid)、叶黄素(xanthophyll)(例如氧化类胡萝卜素(oxycarotenoid))、碳氢化合物和本领域技术人员已知的其它脂质。术语“多不饱和脂肪酸”和“PUFA”不但包括游离脂肪酸形式，而且也包括其它形式诸如TAG形式和PL形式。
例如，但提到来自具体生物体的特定蛋白质或源于具体生物体的特定蛋白质(诸如“裂殖壶菌属ACoAS”或“源于裂殖壶菌属的ACoAS”)是指来自例如裂殖壶菌属的ACoAS(包括天然ACoAS的同源物)或基于有关裂殖壶菌属天然ACoAS的结构(例如序列)的知识而以其它方式得到的ACoAS。换言之，裂殖壶菌属ACoAS包括以下任何ACoAS，所述ACoAS具有裂殖壶菌属天然ACoAS的结构和功能，或具有与裂殖壶菌属ACoAS足够相似的结构和功能，从而使所述ACoAS为裂殖壶菌属天然ACoAS的生物活性(即具有生物活性)同源物。同样地，裂殖壶菌属ACoAS可包括纯化的、部分纯化的、重组的、突变的/修饰的和合成的蛋白质。
根据本发明，术语“修饰”和“突变”可交换使用，特别是就对本申请所述蛋白质或肽的主要氨基酸序列(或核酸序列)进行修饰/突变而言。术语“修饰”也可用于描述对蛋白质或肽进行的翻译后修饰，包括但不限于甲基化、法尼基化(farnesylation)、羧甲基化、忙牛儿基忙牛儿基化(geranyl geranylation)、糖基化、磷酸化、乙酰化、肉豆蔻酰化(myristoylation)、异戊二烯基化(prenylation)、棕榈酸化(palmitation)和/或酰胺化。修饰也可包括例如使蛋白质或肽与另一种化合物复合。例如，如果所述修饰不同于在天然野生型蛋白质或肽进行的翻译后修饰，则可认为上述修饰为突变。
本申请使用的术语“同源物”用于指以下蛋白质或肽，通过对天然蛋白质或肽进行一种或多种较小的修饰或突变而使所述蛋白质或肽不同于天然蛋白质或肽(即“原型”或“野生型”蛋白质)，但所述蛋白质或肽保留了所述天然 形式的全部基础蛋白质和侧链结构(即所述同源物与野生型蛋白质基本相同)。上述变化包括但不限于一个或几个(例如1%或更少)氨基酸侧链的变化、一个或几个(例如1%或更少)氨基酸的变化(包括除去(例如所述蛋白质或肽的截短版本(truncated version))、插入和/或代替)、一个或几个(例如1%或更少)原子的立体化学变化和/或较小的衍生化(包括但不限于甲基化、法尼基化、忙牛儿基忙牛儿基化、糖基化、羧甲基化、磷酸化、乙酰化、肉豆蔻酰化、异戊二烯基化、棕榈酸化和/或酰胺化)。与天然存在的蛋白质或肽相比，同源物可具有提高、降低或基本相似的性质。以下详细描述了蛋白质的优选同源物。应该注意的是，同源物可包括合成得到的同源物、给定蛋白质或其结构域的天然等位变异体或来不同于所述参考序列所源于的生物体的生物体同源序列。
保守性代替(conservative substitution)通常包括以下代替：甘氨酸和丙氨酸；缬氨酸、异亮氨酸和亮氨酸；天冬氨酸、谷氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺；丝氨酸和苏氨酸；赖氨酸和精氨酸；及苯基丙氨酸和酪氨酸。也可基于保守的疏水性或亲水性(Kyte and Doolittle,J.Mol.Biol.157:105(1982))或基于呈现(assume)相似多肽二级结构的能力(the ability to assume similar polypeptide secondary structure)(Chou and Fasman,Adv.Enzymol.47:45(1978))来进行代替。
同源物可能是天然等位变异的结果或天然突变的结果。编码蛋白质的核酸的天然等位变异体为以下基因，该基因在基因组中处于与编码上述蛋白质的基因基本相同的基因座(或多个基因座)，但由于例如突变或重组引起的天然变异，所述基因具有相似但不相同的序列。与和等位变异体进行比较的基因所编码的蛋白质相比，等位变异体典型编码的蛋白质具有相似的活性。一类等位变异体可编码相同的蛋白质，但由于遗传密码的简并而具有不同的核酸序列。等位变异体也可在所述基因的5’或3’非翻译区域内(例如在调节控制区域(regulatory control region)内)包含变化(alteration)。等位变异体对于本领域技术人员来说是众所周知的。
也可使用本领域已知的用于产生蛋白质的技术来得到同源物，所述技术包括但不限于对分离的、天然存在的蛋白质进行直接的修饰、对蛋白质进行直接的合成或使用例如经典或重组DNA技术来引起随机诱变或靶标诱变而对编码所述蛋白质的核酸序列进行修饰。
与野生型蛋白质相比，对蛋白质同源物进行的修饰或突变与天然存在的(野生型)蛋白质相比可提高、降低或基本不改变所述同源物的基本生物活性。通常，蛋白质的生物活性或生物作用指根据体内(即在所述蛋白质的天然生理环境中)或体外(即在实验室条件下)测量或观察将所述蛋白质归类于天然形式的蛋白质所显示或发挥的任何功能(或多种功能)已在本申请的其它地方和本申请所参考的专利和申请中详细描述了PUFA PKS系统的生物活性和构成PUFA PKS系统的各种蛋白质/结构域。ACoAS的生物活性包括与底物结合，就本发明而言，优选地与PUFA的游离脂肪酸(FFA)结合，并且催化FFA向酰基辅酶A PUFA的转化反应。
与天然存在的蛋白质相比，在诸如同源物中，对蛋白质进行的修饰可得到与天然蛋白质具有相同的生物活性的蛋白质，或得到具有降低或提高的生物活性的蛋白质。可将使蛋白质表达减少或使蛋白质活性降低的修饰称为蛋白质的钝化(完全或部分)、下调或作用(或活性)降低。相似地，可将使蛋白质表达增加或使蛋白质活性提高的修饰称为蛋白质的扩增、过度产生、活化、增加、上调或作用(或活性)提高。应该注意的是，当提到具有野生型蛋白质的生物活性的同源物时，通常不一定意味着所述同源物就具有与野生型蛋白质相同的生物活性，特别是就生物活性的水平而言。相反地，同源物可发挥与野生型蛋白质相同的生物活性，但与野生型蛋白质相比，活性处于降低或提高的水平。蛋白质的功能域为能发挥生物功能(即具有生物活性)的结构域(即结构域可以是蛋白质的部分)。
检测蛋白质或测量蛋白质活性的方法包括但不限于测量所述蛋白质的转录、测量所述蛋白质的翻译、测量所述蛋白质的翻译后修饰、测量所述蛋白质的酶活性和/或测量所述蛋白质的活性引起的一种或多种产物的产生(例如PUFA的产生)。应该注意的是，本发明的分离的蛋白质(包括同源物)不一定必需具有野生型蛋白质的生物活性。例如，蛋白质可以是截短、突变或无活性的蛋白质。上述蛋白质可例如用于筛选测定或用于其它目的诸如抗体的产生。在优选的实施方案中，本发明的分离的蛋白质具有与野生型蛋白质相似的生物活性(虽然如上所述活性不一定相等)。
测量蛋白质表达水平的方法通常包括但不限于Western印迹、免疫印迹、酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射免疫测定(RIA)、免疫沉淀、表面等离振子共振(surface plasmon resonance)、化学发光、荧光极化(fluorescent polarization)、磷光、免疫组织化学分析、基质辅助激光解吸(matrix-assisted laser desorption)/电离飞行时间(ionization time-of-flight)(MALDI-TOF)质谱、微细胞计量术(microcytometry)、微阵列(microarray)、显微术(microscopy)、荧光激活细胞分类术(fluorescence activated cell sorting,FACS)和流式细胞计量术(flow cytometry)及基于蛋白质性质(包括但不限于酶活性或与其它蛋白质配体(partner)的相互作用)的测定。结合测定在本领域中也是众所周知的。例如，BIAcore机器可用于确定两种蛋白质的复合物的结合常数。当缓冲液经过芯片时，可通过监测折光率随时间的变化来确定所述复合物的解离常数(O’Shannessy等人Anal.Biochem.212:457(1993)和Schuster等人,Nature365:343(1993))。对一种蛋白质与另一种蛋白质的结合进行测量的其它合适的测定方法包括例如免疫测定诸如酶联免疫吸附测定(ELISA)和放射免疫测定(RIA)，或通过荧光、UV吸收、圆二色性或核磁共振(NMR)来监测蛋白质的波谱性质的变化或光学性质的变化，以对结合进行确定。
在本发明的一个方面，本发明的蛋白质(包括本申请所述特定蛋白质的同源物)包含以下氨基酸序列，所述氨基酸序列包括至少约100个来自参考蛋白的氨基酸序列的保守氨基酸，其中所述同源物的氨基酸序列具有本申请所述蛋白质的生物活性。在其它方面，所述蛋白质的氨基酸序列包含至少约200个来自参考蛋白的氨基酸序列的保守氨基酸，更优选为至少约300个保守氨基酸，更优选为至少约400个保守氨基酸，并且可包括500个或更多个保守氨基酸，至多为所述蛋白质的全长，包括为整数的任何增量(例如200、201、202、203等)。
根据本发明，就本申请描述的核酸或氨基酸序列而言，术语“连续的”或“相邻的”的意思是连接在未断开的序列中。例如，第一序列包含第二序列的30个连续的(或相邻的)氨基酸，其意思是第一序列包括由30个氨基酸残基组成的未断开的序列，所述未断开的序列与由第二序列中的30个氨基酸残基组成的未断开的序列100%相同。相似地，第一序列与第二序列“100%相同”，其意思是第一序列严密地与第二序列匹配，而在核苷酸或氨基酸之间没有任何间隙。
典型地，参考蛋白(诸如本申请描述的任何ACoAS蛋白)的同源物具有的氨基酸序列与参考蛋白(例如ACoAS蛋白)的氨基酸序列至少约50%相同，更优选地至少约55%相同，更优选地至少约60%相同，更优选地至少约65% 相同，更优选地至少约70%相同，更优选地至少约75%相同，更优选地至少约80%相同，更优选地至少约85%相同，更优选地至少约90%相同，更优选地至少约95%相同，更优选地至少约96%相同，更优选地至少约97%相同，更优选地至少约98%相同，并且更优选地至少约99%相同(或60%和99%之间的任何百分比且增量为整数百分比)。同源物优选地具有其所源于或相关的蛋白质或结构域(即具有参考氨基酸序列的蛋白质或结构域)的生物活性。就ACoAS同源物而言，所述同源物优选地具有ACoAS酶活性，更具体地具有催化长链PUFA游离脂肪酸(FFA)转化成酰基辅酶A的能力。就本申请描述的其它辅助蛋白而言，上述蛋白可具有例如在形成PL或TAG时利用PUFA-CoA作为底物的生物活性。
除非另有说明，本申请使用的百分比(%)相同指使用以下方法进行的同源性评价：(1)BLAST2.0Basic BLAST同源性搜索，其使用BLASTP用于搜索氨基酸，使用BLASTN用于搜索核酸，并且使用BLASTX用于搜索核酸和搜索在所有6个可读框中翻译的氨基酸，所有搜索的参数都是标准默认参数，其中通过默认参数来对待测序列(query sequence)进行过滤，以降低区域复杂性(记载在Altschul,S.F.,Madden,T.L.,,A.A.,Zhang,J.,Zhang,Z.,Miller,W.&Lipman,D.J.(1997)“Gapped BLAST and PSI-BLAST:a new generation of protein database search programs.”Nucleic Acids Res.25:3389中，在此将该文章完整引入作为参考)；(2)BLAST2校正(使用下述参数)；和/或(3)PSI-BLAST，其参数为标准默认参数(Position-Specific Iterated BLAST)。应该注意的是，由于BLAST2.0Basic BLAST和BLAST2的标准参数存在一些差异，所以使用BLAST2程序可能将两种具体的序列识别成具有显著的同源性，而BLAST2.0Basic BLAST使用所述序列之一作为待侧序列来进行的搜索可能确定另一种序列没有完全匹配。另外，PSI-BLAST提供了自动的易于使用的“分布”搜索版本，其就搜索序列同源物而言是灵敏的方法。所述程序首先进行Gapped BLAST数据库搜索。PSI-BLAST程序使用来自所反馈的任何显著校正结果的信息，以构建位置特异性评分矩阵(position-specific score matrix)，所述位置特异性评分矩阵代替所述待测序列用于下一轮数据库搜索。因此，应该理解的是，可通过上述程序中的任何一种来确定百分比相同性。
可使用记载在Tatusova and Madden,“Blast2sequences-a new tool for comparing protein and nucleotide sequences”,FEMS Microbiol Lett.174:247(1999)中披露的BLAST2序列来对两种具体的序列进行彼此校正，在此将所述文献完整引入作为参考。使用BLAST2.0算法在BLASTP或BLASTN中进行BLAST2序列校正，以在所述两种序列之间进行Gapped BLAST搜索(BLAST2.0)，其允许在所得到的校正结果中引入间隙(除去和插入)。出于使本申请清楚的目的，使用以下标准默认参数来进行BLAST2序列校正。
对于BLASTN，使用0BLOSUM62矩阵：
匹配加分=1
匹配扣分=-2
开放间隙(open gap)(5)和扩展间隙(extension gap)(2)扣分
gap x_dropoff(50)expect(10)字号(word size)(11)过滤器(filter)(开(on))。
对于BLASTP，使用0BLOSUM62矩阵：
开放间隙(11)和扩展间隙(1)扣分
gap x_dropoff(50)expect(10)字号(3)过滤器(开)。
在本发明的一个实施方案中，本发明的经分离的蛋白质或结构域包含记载在以下文献中的任何氨基酸序列或其任何生物活性片段或结构域，基本由记载在以下文献中的任何氨基酸序列或其任何生物活性片段或结构域组成，或由记载在以下文献中的任何氨基酸序列或其任何生物活性片段或结构域组成：美国专利6,566,583、Metz等人,Science293:290-293(2001)、美国专利申请公开号20020194641、美国专利申请公开号20040235127、美国专利申请公开号20050100995和2005年6月10日提交的美国临时申请号60/689,167。这些蛋白质为PUFA PKS系统的蛋白质，并且可与本申请描述的任何辅助蛋白一起使用。
在本发明的另一个实施方案中，具有本申请所述蛋白质(例如ACoAS蛋白)的生物活性的氨基酸序列包括以下氨基酸序列，所述氨基酸序列与本申请具体描述的天然蛋白质或多肽足够相似，并且编码所述氨基酸序列的核酸序列能在中度严格、高度严格或极高度严格的条件(以下描述)下与编码所述天然蛋白质或多肽的核酸分子进行杂交(即杂交成编码所述天然蛋白质或多肽的核酸链的互补体(complement))。优选地，具有本申请所述蛋白质的生物活性的氨基酸序列由以下核酸序列编码，该核酸序列在中度严格、高度严 格或极高度严格的条件下杂交成编码本申请所述任何氨基酸序列的核酸序列的互补体。推论互补序列的方法对于本领域技术人员来说是已知的。应该注意的是，由于氨基酸测序和核酸测序技术还不是完全无错的，所以本申请给出的序列最大程度地表示本发明包括的蛋白质的表观序列。
本申请使用的杂交条件指标准杂交条件，在所述标准杂交条件下，核酸分子用于确定相似的核酸分子。上述标准条件记载在例如Sambrook等人,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Labs Press(1989)中。在此将上述Sambrook等人完整引入作为参考(具体参见第9.31-9.62页)。另外，计算合适的杂交和洗涤条件以使杂交达到各种核酸错配程度的方程式记载在例如Meinkoth等人,Anal.Biochem.138,267(1984)和上述Meinkoth等人中，在此将该文献完整引入作为参考。
更具体地，本申请使用的中度严格的杂交和洗涤条件指可分离到与在杂交反应中用作探针的核酸分子具有至少约70%核酸序列相同的核酸分子的条件(即令核酸错配为约30%或更少的条件)。本申请使用的高度严格的杂交和洗涤条件指可分离到与在杂交反应中用作探针的核酸分子具有至少约80%核酸序列相同的核酸分子的条件(即令核酸错配为约20%或更少的条件)。本申请使用的极高度严格的杂交和洗涤条件指可分离到与在杂交反应中用作探针的核酸分子具有至少约90%核酸序列相同的核酸分子的条件(即令核酸错配为约10%或更少的条件)。如上所述，本领域技术人员可使用上述Meinkoth等人中的方程式来计算合适的杂交和洗涤条件，以实现这些特定的核酸错配水平。上述条件的变化可取决于是否形成DNA:RNA或DNA:DNA杂交体(hybrid)。DNA:DNA杂交体的解链温度(melting temperature)计算值比DNA:RNA杂交体解链温度计算值低10℃。在特定的实施方案中，用于DNA:DNA杂交体的严格杂交条件包括在离子强度为6×SSC(0.9M Na+)并且温度为约20℃至约35℃(较低严格)，更优选为约28℃至约40℃(较高严格)，甚至更优选为约35℃至约45℃(甚至更高严格)及合适的洗涤条件下进行杂交。在特定的实施方案中，用于DNA:RNA杂交体的严格杂交条件包括在离子强度为6×SSC(0.9M Na+)并且温度为约30℃至约45℃，更优选为约38℃至约50℃，甚至更优选地为约45℃至约55℃及相似严格的洗涤条件下进行杂交。这些值是基于对核苷酸多于约100个、甲酰胺为0%并且G+C含量为约40%的分子的解链温度进行计算得到的。可替换地，可凭经验来计 算Tm(解链温度)，这记载在上述Sambrook等人的第9.31至9.62页。通常，洗涤条件应该尽可能地严格，并且应该适于所选择的杂交条件。例如，杂交条件可包括对盐和温度条件进行组合，其中所述温度为约20-25℃，其低于特定杂交体的Tm计算值，并且洗涤条件通常包括对盐和温度条件进行组合，其中所述温度为约12-20℃，其低于特定杂交体的Tm计算值。适于与DNA:DNA杂交体一起使用的杂交条件的一个实例包括在离子强度为6×SSC(50%甲酰胺)并且温度为约42℃的条件下进行2-24小时杂交，接下来进行洗涤步骤，其包括在温度为室温并且离子强度为约2×SSC的条件下洗涤一次或多次，接下来再在温度较高和离子强度较低的条件下进行洗涤(例如在温度为约37℃并且离子强度为约0.1×-0.5×SSC的条件下洗涤至少一次，接下来在温度为约68℃并且离子强度为约0.1×-0.5×SSC的条件下洗涤至少一次)。
本发明也包括以下融合蛋白，所述融合蛋白包括与一种或多种融合片段相连的本发明的任何蛋白质或其任何同源物或片段。适于与本发明一起使用的融合片段包括但不限于以下片段，所述片段可提高蛋白质的稳定性，提供其它想要的生物活性，和/或有助于蛋白质的纯化(例如通过亲和色谱)。合适的融合片段可以是任何大小的具有所期望功能的结构域，所述功能例如为提高蛋白质的稳定性、溶解度及生物活性和/或简化蛋白质的纯化。融合片段可与蛋白质的氨基端和/或羧基端相连，并且可容易地发生裂解，以便能直接回收想要的蛋白质。优选地，融合核酸分子对包括如上所述与本发明的蛋白质的羧基端和/或氨基端相连的融合片段的蛋白质进行编码，重组细胞用所述融合核酸分子进行转染，对所述重组细胞进行培养，由此得到融合蛋白。
在本发明的一个实施方案中，可用至少一个并且至多约20个额外的异源氨基酸制备得到本申请描述的任何氨基酸序列及上述序列的同源物，其中所述额外的异源氨基酸处于给定氨基酸序列的C末端和/或N末端的侧翼(flanking)。可将所得到的蛋白质或多肽称为“基本由给定的氨基酸序列组成”。根据本发明，所述异源性氨基酸为以下氨基酸序列，在天然条件下在给定氨基酸序列的侧翼没有发现(即在天然、体内的情况下没有发现)所述氨基酸序列即异源性氨基酸，或如果针对给定氨基酸序列所源于的生物体使用标准密码子选择来对天然序列中的上述核酸进行翻译，则所述异源性氨基酸不是由位于编码给定氨基酸序列的天然核酸序列(如其存在于基因中那样)的 侧翼的核酸编码。相似地，当与本申请的核酸序列一起使用时，短语“基本由…组成”指编码给定氨基酸序列的以下核酸序列，在所述核酸序列的侧翼可以是至少一个并且至多约60个额外的异源核酸，所述侧翼位于编码给定氨基酸序列的核酸序列的5’端和/或3’端。在天然基因中，在编码给定氨基酸序列的核酸序列(当其存在于基因中时)的侧翼没有天然发现(即在天然、体内的情况下没有发现)所述异源性核酸。
在一个方面，本发明的蛋白质或结构域和/或其同源物或片段的最小尺寸为足以产生所需生物活性的尺寸、就产生抗体而言足以作为抗原的尺寸或在体外测定中足以作为靶标的尺寸。在一个实施方案中，本发明的蛋白质的长度为至少约8个氨基酸(例如适于抗体表位(antibody epitope)或在测定中作为可检测的肽)、至少约25个氨基酸、至少约50个氨基酸、至少约100个氨基酸、至少约150个氨基酸、至少约200个氨基酸、至少约250个氨基酸、至少约300个氨基酸、至少约350个氨基酸、至少约400个氨基酸、至少约450个氨基酸、至少约500个氨基酸，依此类推，即8个氨基酸至本发明蛋白质或结构域全长之间的任何长度或更长的长度，其为整数个氨基酸(例如8个、9个、10个...25个、26个...500个、501个...)。除实际的限制外，对上述蛋白质的最大尺寸没有任何限制，即所述蛋白质可包括所述蛋白质、结构域部分，或其生物活性或可用片段，或全长蛋白质或结构域加上额外的序列(例如融合蛋白序列)(如果需要)。
本发明的另一个实施方案涉及包含以下核酸序列、基本由以下核酸序列组成或由以下核酸序列组成的经分离的核酸分子，所述核酸序列编码本申请描述的任何蛋白质(包括任何上述蛋白质的同源物或片段)，及涉及与上述核酸序列全互补的核酸序列。根据本发明，分离的核酸分子为已从其天然环境分离出来(即已接受人工处理)的核酸分子，其天然环境为在天然条件下发现所述核酸分子时其处于的基因组或染色体。同样地，“分离的”不一定反映所述核酸分子的纯化程度，但表示所述分子不包括在天然条件下发现所述核酸分子处于其中的完整基因组或完整染色体。分离的核酸分子可包括基因。包括基因的分离的核酸分子不是包括上述基因的染色体片段，但包括与所述基因相关的编码区域和调节区域，但不包括在天然条件下在同一染色体上发现的任何其它基因，而当所述核酸分子编码核心PUFA PKS蛋白时编码本申请所述PUFA PKS系统的其它蛋白质的其它基因除外。分离的核酸分子也可包 括特定的核酸序列，在其侧翼(即在所述序列的5’端和/或3’端)连有额外的核酸，所述额外的核酸在天然条件下通常没有位于所述特定核酸序列的侧翼(即异源性序列)。分离的核酸分子可包括DNA、RNA(例如mRNA)或DNA或RNA的衍生物(例如cDNA)。虽然短语“核酸分子”主要指物理意义上的核酸分子，而短语“核酸序列”主要指所述核酸分子上的核苷酸序列，但这两个短语可交换使用，尤其是就核酸分子或核酸序列能编码蛋白质或蛋白质的结构域而言更是如此。
优选地，使用重组DNA技术(例如聚合酶链反应(PCR)扩增或克隆)或化学合成来得到本发明的分离的核酸分子。分离的核酸分子包括天然的核酸分子及其同源物，包括但不限于天然的等位变异体和经修饰的核酸分子，其中已将核苷酸进行插入、除去、代替和/或倒置(invert)，从而使上述修饰提供想要的效果(例如保持、提高或降低所述蛋白质的活性)。以上已详细讨论了蛋白质同源物(例如由核酸同源物编码的蛋白质)。
可使用本领域技术人员已知的多种方法来得到核酸分子同源物(参见例如Sambrook等人,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Labs Press(1989))。例如，可使用各种技术来对核酸分子进行修饰，所述技术包括但不限于经典诱变技术和重组DNA技术诸如位点靶向诱变、对核酸分子进行化学处理以引起突变、对核酸片段进行限制性酶裂解、对核酸片段进行连接(ligation)、对核酸序列的所选区域进行PCR扩增和/或诱变、对寡核酸混合物进行合成和对混合物组进行连接以“构建”核酸分子的混合物及这些方法的组合。可通过针对核酸编码的蛋白质的功能进行筛选和/或通过与野生型基因进行杂交来从经修饰的核酸的混合物中选择核酸分子同源物。
本发明的核酸分子的最小尺寸为足以形成探针或寡核酸引发剂(primer)的尺寸，所述寡核酸引发剂能与本发明的核酸分子的互补序列形成稳定的杂交体(例如在中度严格、高度严格或极高度严格的条件下)，或本发明的核酸分子的最小尺寸为足以编码以下氨基酸序列的尺寸，该氨基酸序列具有本发明的蛋白质的生物活性。同样地，编码上述蛋白质的核酸分子的尺寸可取决于所述核酸的组成及所述核酸分子和互补序列之间的百分比同源性或百分比相同性，及取决于杂交条件本身(例如温度、盐浓度和甲酰胺浓度)。当所述核酸分子富含GC时，用作寡核酸引发剂或探针的核酸分子的最小长度通 常为至少约12个至约15个核苷酸，而当所述核酸分子富含AT时，所述最小长度为至少约15个至约18个碱基。除实际的限制外，对本发明的核酸分子的最大尺寸没有任何限制，因为所述核酸分子可包括足以编码蛋白质的生物活性片段或全长蛋白质的序列。
本发明的另一个实施方案包括以下重组核酸分子，所述重组核酸分子包含重组载体和编码以下蛋白质或肽的核酸序列，所述蛋白质或肽具有本申请描述的任何蛋白质的生物活性。这样的核酸序列如上所述。根据本发明，重组载体为工程化的(即人工产生的)核酸分子，其作为工具用于操纵所选择的核酸序列，或用于将上述核酸序列引入到宿主细胞中。因此，所述重组载体适于在以下情况下使用：如通过使所述核酸序列在宿主细胞中表达和/或将所述核酸序列递送到宿主细胞中以形成重组细胞而对所选择的核酸序列进行克隆、测序和/或其它操纵。上述载体通常含有以下异源性核酸序列，所述异源的核酸序列为在天然条件下在待克隆或待递送的核酸序列附近没有发现的核酸序列，虽然所述载体也可含有调节性核酸序列(例如启动子或非翻译区域)，所述调节性核酸序列在天然条件下在本发明的核酸分子附近被发现，或可用于表达本发明的核酸分子(以下详细描述)。所述载体可以是RNA或DNA，可以是原核或真核的，并且通常为质粒。可将所述载体固定为染色体外元件(extrachromosomal element)(例如质粒)，或可将其整合到重组生物体(例如微生物或植物)的染色体中。可使完整的载体保持在宿主细胞中的合适位置，或在某些条件下，可将质粒DNA除去而留下本发明的核酸分子。Jing整合的核酸分子可受染色体启动子的控制，受本身(native)或质粒启动子的控制，或受几种启动子组合的控制。可将所述核酸分子的一个或多个拷贝整合到所述染色体中。本发明的重组载体可含有至少一种可选择的标志(marker)。
在一个实施方案中，在本发明的重组核酸分子中使用的重组载体为表达载体。本申请使用的短语“表达载体”用于指适于产生被编码产物(例如重要蛋白质)的载体。在这个实施方案中，将编码待产生产物(例如PUFA PKS结构域或蛋白质)的核酸序列插入到所述重组载体中，以产生重组核酸分子。将编码待产生的蛋白质的核酸序列插入到所述载体中，其方式是使所述核酸序列与所述载体中的调节序列可操作地相连，所述调节序列使所述核酸序列能在所述重组宿主细胞中进行转录和翻译。
在另一个实施方案中，在本发明的重组核酸分子中使用的重组载体为靶向载体。本申请使用的短语“靶向载体”指用于将特定的核酸分子递送到重组宿主细胞中的载体，其中所述核酸分子用于除去、钝化或代替所述宿主细胞或微生物中的内源性基因或基因部分(即用于靶向基因破坏或敲除技术)。在本领域中也可将上述载体称为“敲除”载体。在这个实施方案的一个方面，部分载体，更典型地，插入到所述载体中的核酸分子(即插入体(insert))具有以下核酸序列，该核酸序列与所述宿主细胞中的靶标基因(即所靶向的待除去或钝化的基因)的核酸序列具有同源性。将所述载体插入体的核酸序列设计成与所述靶标基因相关，从而使所述靶标基因和插入体可发生同源重组(homologous recombination)，由此除去、钝化、削弱(即通过使至少部分内源性靶标基因突变或除去)或代替内源性靶标基因。本发明人先前已描述了使用这类重组载体以例如用重组基因代替内源性裂殖壶菌属基因，并且用于对破囊壶菌进行遗传转化的一般技术详细记载在美国专利申请号10/124,807(公开为美国专利申请公开号20030166207(公开于2003年9月4日))中。用于植物的遗传转化技术在本领域中是众所周知的。
典型地，重组核酸分子包括本发明的至少一种核酸分子，其可操作地与一种或多种表达控制序列相连。本申请使用的短语“重组分子”或“重组核酸分子”主要指可操作地与表达控制序列相连的核酸分子或核酸序列，但当核酸分子为本申请描述的重组分子时，短语“重组分子”或“重组核酸分子”可与短语“核酸分子”互换使用。根据本发明，短语“可操作地相连”指使核酸分子与表达控制序列(例如转录控制序列和/或翻译控制序列)相连，其方式使所述分子当转染(即转化、转导、转染、结合或传导)到宿主细胞中时可被表达。转录控制序列为对转录的起始、延长或终止进行控制的序列。特别重要的转录控制序列为对转录的起始进行控制的转录控制序列，诸如启动子、增强子、操纵子(operator)和阻抑子(repressor)序列。合适的转录控制序列包括可在所述重组核酸分子待导入其中的宿主细胞或生物体中发挥功能的任何转录控制序列。
本发明的重组核酸分子也可含有额外的调节序列，诸如翻译调节序列、复制的起点(origin of replication)和与所述重组细胞相容的其它调节序列。在一个实施方案中，本发明的重组分子(包括整合到所述宿主细胞染色体中的那些重组分子)也含有分泌信号(secretory signal)(即信号片段核酸序列)，以使 表达的蛋白质能从产生所述蛋白质的细胞中分泌出来。合适的信号片段包括在天然条件下与待表达蛋白质相关的信号片段或能引起本发明蛋白质分泌的任何异源信号片段。在另一个实施方案中，本发明的重组分子包含引导序列，以将表达的蛋白质递送并且插入到宿主细胞的膜中。合适的引导序列包括在天然条件下与所述蛋白质相关的引导序列或能将所述蛋白质递送并且插入到细胞膜中的任何异源前导序列。
本发明的一种或多种重组分子可用于产生被编码的本发明的产物(例如ACoAS)。在一个实施方案中，通过在有效产生所述蛋白质的条件下对本申请描述的核酸分子进行表达来产生被编码的产物。产生被编码蛋白质的优选方法是通过用一种或多种重组分子对宿主细胞进行转染，以形成重组细胞。适于转染的宿主细胞包括但不限于可进行转染的任何细菌细胞、真菌(例如酵母)细胞、原生生物细胞、微观藻类细胞、藻类细胞、昆虫细胞、植物细胞或动物细胞。在本发明的一个实施方案中，优选的宿主细胞为植物宿主细胞。宿主细胞可以是未转染的细胞或已用至少一种其它重组核酸分子进行转染的细胞。
根据本发明，术语“转染”用于指可将外源性核酸分子(即重组核酸分子)插入到细胞中的任何方法。当术语“转化”用于指将核酸分子插入到微生物细胞(诸如藻类、细菌和酵母)中或插入到植物细胞中时，该术语“转化”可与术语“转染”互换使用。在微生物和植物系统中，术语“转化”用于描述由于微生物或植物得到外源性核酸而引起的遗传变化，并且基本与术语“转染”同义。然而，在动物细胞中，转化具有第二层意思，即其可例如指在细胞发生癌化后细胞在培养时生长性质的变化。因此，为了避免混淆，就将外源性核酸导入到动物细胞中而言，优选地使用术语“转染”，并且本申请使用的术语“转染”通常包括对动物细胞进行的转染和对微生物细胞或植物细胞进行的转化，在这个意义上，其保留了将外源性核酸导入到细胞中的意思。因此，转染技术包括但不限于转化、颗粒轰击(particle bombardment)、扩散、主动转运、超声处理、电穿孔、微注射、脂转染、吸附、感染和原生质体融合。
本领域技术人员应该理解的是，重组DNA技术的使用可通过例如在宿主细胞中操纵核酸分子的拷贝数目来改进对转染核酸分子表达的控制，可提高对上述核酸分子进行转录的效率，提高对所得转录物进行翻译的效率，并且提高翻译后修饰的效率。另外，可对启动子序列进行遗传工程化，以与天 然启动子相比提高表达水平。可用于对核酸分子的表达进行控制的重组技术包括但不限于将所述核酸分子整合到一种或多种宿主细胞染色体中、将载体稳定序列加至质粒、对转录控制信号(例如启动子、操纵子、增强子)进行代替或修饰、对翻译控制信号(例如核糖体结合位点、Shine-Dalgarno序列)进行代替或修饰、对核酸分子进行修饰以相应于宿主细胞的密码子选择和除去使转录物不稳定的序列。
考虑所披露的内容，可用于产生生物活性分子的多种遗传修饰对于本领域技术人员来说是显而易见的，并且本申请先前以讨论了各种其它修饰。本发明包括与本申请所述PUFA PKS系统和/或辅助蛋白相关的任何遗传修饰，其引起所期望生物活性分子的产生。
根据本发明，生物活性分子包括具有生物活性并且可通过PUFA PKS系统来产生的任何分子(化合物、产物等)。上述生物活性分子可包括但不限于多不饱和脂肪酸(PUFA)、抗炎制剂、化疗剂、活性赋形剂、骨质疏松药、抗抑郁药、抗惊厥药、anti-Heliobactor pylori drug、用于治疗神经变性疾病的药物、用于治疗变性肝疾病的药物、抗生素和降胆固醇制剂。本发明的PUFA PKS系统的一个优点是使上述系统能以顺式构型引入碳-碳双键，并且使分子能每三个碳就包括一个双键。利用上述能力来产生各种化合物。
在此将本申请引用的每篇出版物、专利或专利申请完整引入作为参考。
出于说明的目的，提供了以下实施例，但并非意在限制本发明的范围。
实施例
对实施例的一般说明。已在海洋细菌物种和破囊壶菌物种中鉴定了编码PUFA合成酶的基因。已在大肠杆菌中表达了几套上述基因，并且当提供有合适的PPTase时，上述酶的特定PUFA产物可积累在上述细胞中。然而，就本发明人的知识而言，先前尚未披露从这些酶中释放所述PUFA的方法。所述释放机制涉及PUFA合成酶系统在异源宿主生物体中的表达。这也提供了进行以下努力的方向：对经过上述系统的碳流进行调节和对积累在异源或天然宿主生物体中的PUFA的最终量进行调节。在本申请中，本发明人显示，裂殖壶菌属PUFA合成酶(抛开理论的束缚，所有真核PUFA合成酶系统也可能如此，包括所有破囊壶菌PUFA PKS系统)的产物为游离脂肪酸，并且所述游离脂肪酸的释放是所述酶复合物本身特性之一。此外，在裂殖壶菌属 中，将所述PUFA FFA与CoA进行酯化，之后进到磷脂(PL)和三酰甘油(TAG)中。在以下实施例中描述的数据显示了在异源的宿主生物体中进行表达的策略和对PUFA在天然宿主生物体中的积累进行调节的策略。
实施例1
此实施例描述了用于生物化学研究的裂殖壶菌属FAS敲除菌株的产生。
裂殖壶菌属含有一个大的基因，其编码负责产生短链饱和脂肪酸的FAS酶(记载在美国专利申请公开号20050191679A1中)。使用记载在美国专利号7,001,772中的方法，得到了裂殖壶菌属FAS敲除(FAS-KO)构建体。基因组DNA中约10.0kB的EcoRV片段含有FAS Orf中的大部分(从位于推定的ATG起始密码子下游的约728bp至位于终止密码子下游的约680bp)，将所述EcoRV片段克隆到Stratagene Bluescript载体(pBSK)中，该载体位于多克隆区域的EcoRV位点。从所克隆的裂殖壶菌属DNA中除去约3.5kB的内部BglII片段，并且用来自pTubZeo11-2(其含有Zeocin抵抗盒(resistance cassette))的约1.1kB的BamHI片段进行代替(参见上述美国专利号7,001,772)。通过颗粒轰击将所述质粒(pJK878)导入到裂殖壶菌属的细胞壁缺陷菌株(称为Ac66)中。通过在含有Zeocin并且补充有棕榈酸的培养基上进行培养，对转化体进行初级选择。次级选择(在未补充有棕榈酸的培养基上不能生长)用于鉴定潜在的双交换事件(double crossover event)，其中部分FAS基因组区域已被Zeocin抵抗盒代替。PCR和Southern印迹分析用于确认所述转化体(标签的FAS-KO)之一是否具有期望的基因组结构。通过使上述菌株在补充有500μM棕榈酸的培养基中生长来维持上述菌株。相似的策略为将Zeocin抵抗盒插入到编码裂殖壶菌属PUFA合成酶亚单元的一种基因中，将所述策略用于对裂殖壶菌属Ac66菌株中的上述酶进行钝化。在这种情况下，所述培养基补充有500μM DHA。这些菌株的完整细胞和不含有细胞的提取物用于以下生物化学研究(参见以下实施例)。
实施例2
以下实施例描述了制备以下菌株的不含有细胞的提取物的通用方案：裂殖壶菌属Ac66、源于裂殖壶菌属Ac66的PUFA合成酶KO菌株和源于裂殖壶菌属Ac66的FAS-KO菌株。
从裂殖壶菌属的细胞壁缺陷菌株制备不含有细胞的匀浆(CFH)的方案的实例如下。使细胞生长在A50-3培养基中，然后稀释到M2B培养基中。 用于使所述KO菌株生长的培养基补充有合适的脂肪酸。使细胞在M2B培养基中生长成OD600nm为>约2.5并且<约5。通过在50mL塑料管中进行离心(台式离心机，约1200rpm×4分钟)，收集50mL培养基中的细胞。将上清滗出，然后将细胞重新悬浮在5mL缓冲液A(Buffer A)(100mM磷酸盐(pH为7.2)、10%(w/v)甘油、1mM EDTA和2mM DTT)中，然后如前所述那样进行离心。抛弃上清，然后将细胞重新悬浮在冰冷的5mL缓冲液A中。在冰上在管中对悬浮液进行超声处理(Ultrasonic Processor Model GE130(带有微梢(microtip))，脉冲为2秒，功率设定为约1瓦)，持续1.5分钟。通过显微术来检查所述样品，以确保所有细胞都被破碎。将所述CFH等分成200μL每份，加到带有盖子的0.5mL PCR管中，然后置于液氮中来进行冷冻。在使用前，将样品贮存在-74℃。
实施例3
此实施例描述了体外FAS和PUFA合成酶活性测定的通用条件。
针对FAS和PUFA合成酶活性的体外活性测定的方案的实例如下。对酶制品和缓冲液A(这两种组分的体积为90μL)及以下组分(以混合物(cocktail)(10μL)的形式添加)进行混合，使最终体积为100μL，得到在括号中指明的最终浓度：丙二酰辅酶A(50μM—无放射性的丙二酰辅酶A和丙二酰基-2-14C-CoA的混合物，其中放射性标记的最终浓度为0.65μCi/mL)、NADH(1mM)、NADPH(1mM)和乙酰辅酶A(10μM)。可基于特定实验的需要来对这些组分和额外的组分进行调节。在室温(约21℃)水浴中，所述测定反应在玻璃管中进行。孵育的时间取决于实验的需要。采用两种基于检查方案(work-up protocol)的方法中的一种使所述反应停止。就使用酸性方法来将脂肪酸转化成脂肪酸甲酯(FAME)而言，通过添加FAME试剂，使所述反应停止(参见以下)。就在不进行衍生化的情况下对脂质进行提取而言，通过添加125μL异丙醇:乙酸(4:1v/v)，使所述反应停止(参见以下)。
酸性FAME方案：通过添加2.0mL4%HCl的甲醇溶液及50μL甲苯，使所述反应停止，玻璃管用衬有Teflon的盖子密封，然后在100℃加热1小时。冷却至室温，添加1.0mL己烷和0.5mL水，涡旋，然后进行分离。如果需要，取出一部分用于液体闪烁计数(LSC)。将约600μL有机相转移到新的管中，然后在N2下除去溶剂。将残余物溶解在50μL己烷中，然后点样到硅胶60A TLC板(用己烷:二乙醚:乙酸=70:30:2进行展开)或硅胶G板(浸在 10%AgNO3/90%乙腈中)(在使用前在100℃活化30min)(用己烷:二乙醚:乙酸=70:20:2进行展开)上。使板风干，然后使用感光成像技术来检测放射性区域。
HIP方案—对未衍生化的脂质进行提取：如上所述，通过添加125μL异丙醇:乙酸(4:1v/v)，使所述反应停止，然后添加2mL己烷:异丙醇(3:2,v/v)，涡旋，然后添加1mL6.7%(w/v)硫酸钠，再次涡旋。分离各相。如果需要，取出部分有机(上层)相，用于LSC，然后将剩余物(约1.0mL)转移到新的管中。用氮气除去溶剂，然后将残余物溶解在50μL己烷中。将样品点样到硅胶60A TLC板上，然后用己烷:二乙醚:乙酸(70:30:2)进行展开。使板风干，然后使用感光成像技术来检测放射性区域。
实施例4
以下实施例描述了对FAS和PUFA合成酶活性进行的体外测定的结果。
制备裂殖壶菌属Ac66的CFH、源于裂殖壶菌属Ac66的PUFA合成酶KO菌株的CFH和源于裂殖壶菌属Ac66的FAS-KO菌株的CFH，然后如上所述，使用所述酸性FAME和含银(silver)TLC方案来对FAS和PUFA合成酶的活性进行测定。图1显示了上述测定的结果。TLC板的图像上的标记条带表示合并到FAME中的放射性(通过与标准品发生共迁移(co-migration)及通过HPLC分离来确认)。条带1和2显示了使用Ac66亲本菌株的提取物得到的分布。在这些条带中可观察到FAS的产物(14:0和16:0FAME)和PUFA合成酶的产物(DHA和DPA n-6)。在条带3和4中显示了当已对PUFA合成酶进行钝化时得到的分布。在这种情况下没有DHA和DPA n-6FAME。在条带5和6中显示了当对FAS进行钝化时得到的分布。在这种情况下没有出现源于FAS的脂肪酸即14:0和16:0及这些脂肪酸的衍生物。所述数据表明在上述FAS-KO菌株中，FAS的活性已被重度或完全地削弱。所述FAS-KO菌株用于进一步表征裂殖壶菌属的PUFA合成和积累途径。
实施例5
以下实施例描述了对裂殖壶菌属中的PUFA合成进行的额外表征，并且提供了裂殖壶菌属PUFA合成酶的初始产物为游离脂肪酸(FFA)的证据。
使用所述酸性方法来将体外测定反应的产物转化成FAME，这可用于确定从丙二酰辅酶A合并到脂肪酸残基中的放射性，但在进行上述衍生化前，上述脂肪酸不呈现分子形式。图2显示了对FAS-KO菌株进行的体外测定的时间过程(time course)的结果，其中使用上述HIP方案来提取脂质(即不将脂 肪酰基转化成甲酯)，然后使用正相TLC来进行分离。在右侧指明了TAG和游离脂肪酸(FFA)标准品在板上迁移的位置。在上述TLC系统中，没有很好地分开不同链长度和不同不饱和度的FFA。然而，由于所利用的菌株具有很低的FAS活性或不具有任何FAS活性，所以上述区域中的FFA可能源于PUFA合成酶系统。图3显示了支持这种观点的额外证据。本申请显示的是，体外测定期间FFA条带中放射性标记的出现取决于是否添加NADPH。相反地，NADH不支持所述反应。这种对NADPH(作为还原剂)的严格依赖性也是源于希瓦氏菌属SCRC2738的PUFA合成酶的特征(Metz等人,Science293:290-293(2001)的图2C)。在图2和3中，比FFA条带迁移稍快的放射性标记条带是明显的(标记为“未知”)。由于所述明显的条带不依赖于是否添加还原剂(NADH或NADPH—参见图3中的条带5)，所以其不可能与PUFA合成酶的活性相关。另外，在对其中PUFA合成酶已被钝化的菌株进行相似的分析(没有显示数据)时可检测到上述条带。图2和3中的数据暗示裂殖壶菌属PUFA合成酶的初始产物为FFA。在以FFA的形式释放其产物的FAS系统(诸如哺乳动物FAS)中，上述FFA然后与CoA酯化，之后进到PL或TAG中。在需要ATP和Mg2+的反应中，通过酰基辅酶A合成酶来对FFA进行活化。在体外反应的时间过程的后期，TAG部分中表现出的放射性应该与裂殖壶菌属中的上述途径相应(由样品中剩余的ATP引起)。进一步测验了此观点(参见以下)。
实施例6
以下实施例提供了支持在裂殖壶菌属的PUFA积累途径中涉及酰基辅酶A合成酶反应的证据。
图4显示了在来自裂殖壶菌属FAS-KO的样品中ATP(2.5mM)和Mg2+(10mM)的添加对体外测定产物的作用。将样品在标准反应混合物中孵育10分钟，然后添加ATP和Mg2+。在添加ATP和Mg2+后，在各个时间点使反应停止(即0=没有添加、10和30秒及1、3、10和30分钟)。可观察到的是，在时间过程中，与FFA条带相关的放射性标记减弱，而与TAG条带相关的放射性标记增强。与标有“未知”条带相关的放射性标记不受ATP添加的影响。这些数据表明就标记的FFA迁移到TAG部分中而言涉及需要ATP的反应(ATP requiring reaction)。
已将三氮菌素C表征为酰基辅酶A合成酶的特异性抑制剂，而所述酰 基辅酶A合成酶活化长链PUFA(Knoll等人,1995)。在对FAS-KO样品进行体外测定时，测验了三氮菌素C对产物分布的作用。在含有各种浓度三氮菌素C(0、25、100或200μM)的标准混合物中对样品进行孵育，持续10分钟，然后添加ATP和Mg2+。使反应再进行20分钟，然后停止，对脂质进行提取，然后使用所述HIP方案通过TLC来进行分离。图5显示了结果。以较高浓度添加的三氮菌素C阻断了FFA条带中放射性标记的丢失。这些结果表明在所述途径中有酰基辅酶A合成酶参与。
实施例7
以下实施例描述了对来自表达裂殖壶菌属Orf A、Orf B(Orf B*)、Orf C和念珠藻属HetI的大肠杆菌的提取物进行的体外测定。
在上述实施例中显示的数据表明，裂殖壶菌属中的PUFA被转化成游离脂肪酸形式，之后进到TAG和PL中。本申请提供的数据表明PUFA以游离脂肪酸的形式释放，该释放是PUFA合成酶活性的一部分。在pET载体中以人工操纵子的形式克隆裂殖壶菌属的天然Orf A(用SEQ ID NO:1表示的核酸序列)、Orf B(也称为Orf B*，用SEQ ID NO:37表示的核酸序列)和天然Orf C(用SEQ ID NO:5表示的核酸序列)，然后在大肠杆菌中进行表达，这记载在上述美国专利申请公开号20050100995中。将HetI克隆到基于pACYC的载体中，然后在上述大肠杆菌细胞中进行表达。使细胞生长成O.D.为约1，然后添加IPTG(最终浓度为1mM)，诱导产生T7聚合酶。在诱导约4小时后，收集细胞，用缓冲液A洗涤，然后通过两种途径借助French压力单元(pressure cell)来进行破碎。放弃匀浆等分液，然后对剩余物进行离心(5k×g×5min)，得到上清1(S1)。再次地，放弃等分液(aliquot)，然后将剩余物质以100,000×g离心1小时，得到高速沉淀(P2)部分和高速上清(S2)部分。将所述沉淀部分重新悬浮在缓冲液A中，使体积为最初置于离心管中的体积。使用上述通用方法(对脂质进行酸性FAME/银相TLC处理或对脂质进行HIP提取，接下来在正相TLC上进行分离)，对上述所有部分进行测定。图6A和6B显示了上述测定的结果。
酸性FAME分析(图6A)显示，所述体外测定的主要产物为DHA和DPAn-6。活性最高的部分为匀浆，而S1和P2部分中的活性相对较低。在S2部分中检测到的活性非常低。在本申请中重要的是，即使在CFH和S1部分中也只能检测到非常少的FAS系统产物(在图6A中箭头所指为16:0)。这可能 是当使用T7系统时由高水平表达的PUFA合成酶组分所引起。相反地，对来自含有编码希瓦氏菌属EPA合成酶的黏粒的大肠杆菌的提取物(CFH和S1)进行相似的测定，此时TLC板上的大部分放射性与FAS产物相关(Metz等人,Science293:290-293(2001)的图2B)。另外，内源性大肠杆菌FAS系统由几种单独的可溶性蛋白质组成，并且在高速离心后，在上清部分中保留了FAS活性(Metz等人,Science293:290-293(2001)的图2B)。相反地，图6A显示的PUFA合成酶活性在经高速离心后分布到沉淀部分中。
图6B中的数据显示了对图6A使用的同一大肠杆菌菌株样品进行测定的结果，不同的是，脂质产物仅用HIP进行提取(而不转化成FAME)，之后进行TLC分离。使用两个部分即CFH(所述图的左侧)和P2(所述图的右侧)。对在所述测定中使用的提取物的量进行调节，从而使在两种情况下合并到脂质中的放射性的量相等。也显示了以下结果，在该结果中，使测定混合物中的还原剂组分(NADH和/或NADPH)变化如下：条带1—仅NADPH、条带2—仅NADPH、条带3—NADH和NADPH及条带4—水(代替含有任何组分的原液(stock solution))。图6B中的数据显示，在TLC板上移动的大部分放射性标记与游离脂肪酸标准品发生共迁移。另外，主要(FFA)条带的出现取决于是否将NADPH加至测定混合物。在这些部分(尤其是P2部分)中对NADPH的需要和FAS活性的显著缺乏表明FFA为PUFA合成酶的产物。由于在大肠杆菌的上述菌株中仅表达三种来自裂殖壶菌属的基因(编码Orf A、B和C)(与HetI一起表达)，所以所述数据表明，PUFA从所述合成酶的释放是上述酶的内在性质，而不取决于其它硫酯酶。
各种数据(以上实施例已提供了所述数据的重要方面)表明了裂殖壶菌属中PUFA合成和积累的以下特征。负责DPA n-6和DHA的PUFA合成酶由Orf A、B和C编码，这记载在美国专利号6,566,583、Metz等人,Science293:290-293(2001)、美国专利申请公开号20020194641和PCT公开号WO2006/135866中。通过内源性PPTase来活化亚单元A的ACP结构域。所述合成反应使用丙二酰辅酶A作为碳源(可能需要或可能不需要乙酰辅酶A)，并且使用NADPH作为还原剂。从所述酶以FFA的形式释放PUFA产物，并且上述释放是所述酶本身的内在特征。在一种或多种内源性酰基辅酶A合成酶催化的依赖ATP的反应中，将所述FFA与CoA酯化。然后，PUFA-CoA作为PL和TAG合成酶的底物。
实施例8
以下实施例显示了编码裂殖壶菌属PUFA合成酶的基因(sOrf A、sOrf B和天然Orf C，参见以下)和HetI在面包酵母(baker’s yeast)中的表达。
使用得自Invitrogen的材料，在酵母中对裂殖壶菌属PUFA合成酶基因和HetI进行表达。酿酒酵母的INVsc1菌株与以下转化载体一起使用：pYESLeu(sOrf A，SEQ ID NO:35，编码SEQ ID NO:2)、pYES3/CT(sOrf B，SEQ ID NO:36，编码SEQ ID NO:4)、pYES2/CT(Orf C，SEQ ID NO:5，编码SEQ ID NO:6)和pYESHis(HetI，SEQ ID NO:33，编码SEQ ID NO:34)。对一些载体进行修饰，以满足具体的克隆需要。基于特定的实验使用合适的选择培养基。在各种情况下，将所述基因克隆在GAL1启动子后，并且按照Invitrogen提供的指导方针，通过将洗涤的细胞重新悬浮在含有半乳糖的培养基中来诱导表达。在转移到诱导培养基后，在30℃使细胞生长，然后在标示的时间进行收集(通过离心)。对细胞沉淀进行冷冻干燥，然后使用酸性甲醇来制备FAME，萃取到己烷中，然后通过GC(气相色谱)进行分析。
初级实验表明，天然形式的Orf A(SEQ ID NO:1)在酵母中的表达和稍有修饰的天然形式的Orf B(Orf B*、SEQ ID NO:37)在酵母中的表达不会产生期望大小的蛋白质(也没有检测到校正mRNA(correct mRNA))。相反地，在对天然形式的Orf C(SEQ ID NO:5)进行表达的细胞中检测到了期望大小的蛋白质。对编码Orf A和B的基因进行重合成，从而使它们的密码子选择与酵母耐受的密码子选择更一致(重合成由Blue Heron,Inc.进行)。本申请将这些合成的基因称为sOrf A(SEQ ID NO:35)和sOrf B(SEQ ID NO:36)。这些基因在酵母中的表达引起以下蛋白质的积累，所述蛋白质分别相应于期望尺寸的Orf A和B。
图7显示了对表达裂殖壶菌属PUFA合成酶系统(sOrf A、sOrf B、Orf C和HetI)的酵母细胞的脂肪酸分布和对照细胞(缺乏sOrf A基因)的脂肪酸分布进行的比较。在诱导约20小时后，收集细胞。可观察到的是，在表达完整PUFA合成酶系统的菌株的分布中已出现两个新的FAME峰。通过与可信的标准品比较洗脱时间并随后通过MS分析，将这两个峰鉴定为DPA n-6和DHA。如本发明人对裂殖壶菌属PUFA合成酶进行的表征所预测的那样，在所述分布中，除DHA和DPA n-6外，没有任何其它新的峰。
图8显示了图7的GC色谱图区域，其含有所述PUFA FAME。对照细 胞和表达PUFA合成酶的细胞都含有在DHA FAME附近洗脱的峰。已将其鉴定为C26:0FAME，并且(基于参考文献)其源于鞘脂。虽然它在DHA峰附近洗脱，但分辨率足以使它不干扰DHA的定量。在FAME分布中，DPA n-6峰与其它内源性酵母脂质良好地分离。在这个特定的实施例中，表达裂殖壶菌属PUFA合成酶系统的细胞积累2.4%DHA和2.0%DPA n-6(占总FAME的百分比)。DHA和DPA n-6的总量=在所述细胞中测量的脂肪酸的4.4%。在所述细胞中观察到的DHA与DPA n-6的比例为约1.2:1。
以上给出的结果显示了裂殖壶菌属PUFA合成酶在酵母中的表达，所述结果确认了先前申请提出的途径，及确认了有关可在酵母和植物中出现的脂肪酸分布变化的预测。
实施例9
以下实施例描述了表达裂殖壶菌属PUFA合成酶的酵母中PUFA的积累通过与特异性酰基辅酶A合成酶的共表达而增加。
本发明人已显示，在裂殖壶菌属中，通过内源性酰基辅酶A合成酶(ACoAS)，将其PUFA合成酶的FFA产物高效地转化成酰基辅酶A(参见以上实施例)。通过对EST数据库进行检验，本发明人鉴定了在将PUFA转化成相应的酰基辅酶A时可能涉及的9种推定的ACoAS。
简要地，本发明人已检查了由得自约20,000种质粒的序列组成的裂殖壶菌属EST数据库，所述约20,000种质粒从以下克隆分离，该克隆是针对与具有已知(或未知)ACoAS活性的蛋白质具有同源性的那些EST而从各种cDNA库挑选出来的。本发明人使用VectorNTI Program,Contig Express来将这些序列组装成重叠群(contig)(当可得到两个或更多个重叠序列时)，并且基于各个序列信息的特征而对这些序列进行编辑。以下概括了上述努力的结果。鉴定了八种不同的重叠群和一种单现基因(singlet)(在数据库中没有任何重叠序列)，它们是与ACoAS酶相关的候选对象，而所述ACoAS酶可高效地将PUFA合成酶的产物转化成相应的酰基辅酶A。使用EST数据库作为指导方针，得到了针对各个候选对象的完整编码区域序列，并且利用各种标准方法(例如对基因组DNA的亚克隆和源于基因组DNA的PCR产物进行测序)进行了鉴定。
编码裂殖壶菌属酰基辅酶A合成酶(ACS)的序列和推定的翻译：
1.长度=2004个核苷酸(不包括终止密码子)(SEQ ID NO:82)。预测其编 码668个氨基酸(SEQ ID NO:83)即73.5kDa的蛋白质。所述蛋白质序列与已知的ACS具有良好的同源性。最好的Blast匹配是与Thalassiosira pseudonanna的ACS(TplacA，登记号为AAW58006)，已对其进行表征，并且已知就DHA而言具有高的活性(Tonon等人,Plant Physiol.2005May;138(1):402-8)。SEQ ID NO:83的C端的三个氨基酸是SKL即与使蛋白质靶向于过氧化物酶体(peroxisome)相关的模体。上述C端模体也存在于上述Thalassiosira pseudonanna的ACS中。
2.ScACS-2(也称为ScACoAS-2或ACS-2)：长度=2340个(不包括终止密码子)核苷酸(SEQ ID NO:84)。预测其编码780个氨基酸(SEQ ID NO:85)即84.7kDa的蛋白质。所推定蛋白质的大部分与已知的ACS(包括人类实例即Lipidosin和Bubble Gum)具有良好的同源性。
3.ScACS-3(也称为ScACoAS-3或ACS-3)：长度=2526个(不包括终止密码子)核苷酸(SEQ ID NO:86)。预测其编码842个氨基酸(SEQ ID NO:87)即90.6kDa的蛋白质。所推定蛋白质的大部分(特别是核心的约700个氨基酸)与Bubble Gum型ACS蛋白具有良好的同源性。
4.ScACS-4(也称为ScACoAS-4或ACS-4)：长度=2037个(不包括终止密码子)核苷酸(SEQ ID NO:88)。预测其编码679个氨基酸(SEQ ID NO:89)即74.7kDa的蛋白质。所述蛋白质的大部分与已知的ACS蛋白(包括来自人类和其它哺乳动物的实例)具有良好的同源性。
5.ScACS-5(也称为ScACoAS-5或ACS-5)：长度=1734个核苷酸(不包括终止密码子)(SEQ ID NO:90)。预测其编码578个氨基酸(SEQ ID NO:91)即63.1kDa的蛋白质。所述蛋白质的大部分与已知的ACS蛋白具有良好的同源性。最好的Blast匹配是与细菌的ACS。SEQ ID NO:91的C端的三个氨基酸是SKL即与使蛋白质靶向于过氧化物酶体相关的模体。
6.ScACS-6(也称为ScACoAS-6或ACS-6)：长度=1806个(不包括终止密码子)核苷酸(SEQ ID NO:92)。预测其编码602个氨基酸(SEQ ID NO:93)即66.0kDa的蛋白质。所述蛋白质的大部分与已知的ACS蛋白具有良好的同源性。最好的Blast匹配是与细菌的ACS。SEQ ID NO:93的C端的三个氨基酸是SKL即与使蛋白质靶向于过氧化物酶体相关的模体。
7.ScACS-7(也称为ScACoAS-7或ACS-7)：长度=1920个(不包括终止密码子)核苷酸(SEQ ID NO:94)。预测其编码640个氨基酸(SEQ ID NO:95)即 70.4kDa的蛋白质。所述蛋白质的大部分与已知的ACS蛋白具有良好的同源性。最好的Blast匹配是与细菌的ACS。
8.ScACS-8(也称为ScACoAS-8或ACS-8)：长度=1893个(不包括终止密码子)核苷酸(SEQ ID NO:96)。预测其编码631个氨基酸(SEQ ID NO:97)即70.7kDa的蛋白质。最好的Blast匹配是与脂肪酸转运体蛋白家族(fatty acid transporter protein family)的成员，后者也可具有ACoAS活性。
9.ScACS-9(也称为ScACoAS-9或ACS-9)：长度=2950个(不包括终止密码子)核苷酸(SEQ ID NO:98)。预测其编码766个氨基酸(SEQ ID NO:99)即84.1kDa的蛋白质。所述蛋白质的大部分与已知的ACS蛋白具有良好的同源性。最好的Blast匹配是与动物的ACS。
本发明人相信，存在于PUFA合成酶的异源宿主中的酶可能不会高效地加工新的(对于上述生物体)PUFA游离脂肪酸(FFA)，并且本发明人相信，对合适的ACoAS(或多种ACoAS)进行共表达可增加PUFA在上述宿主中的积累。在含有编码裂殖壶菌属PUFA合成酶系统(例如sOrf A、sOrf B和nOrf C及HetI)的基因的酵母中分别表达上述两种裂殖壶菌属候选ACoAS(ScACS-1即SEQ ID NO:82/83和ScACS-2即SEQ ID NO:84/85)。
更具体地，使用4种载体来对在以上实施例中描述的酵母表达系统进行修饰，以适应第五ACoAS基因(即所述酵母也含有裂殖壶菌属PUFA合成酶系统的Orf A、B和C和PPTase(来自念珠藻属的HetI))的引入。可在其中对两种基因进行克隆的酵母表达载体(pESC载体)得自Stratagene。这些载体与上述pYES载体相似，并且与上述pYES载体相容。将两种基因即天然Orf C(nOrf C、SEQ ID NO:5)和HetI(SEQ ID NO:33)克隆到一个pESC载体中，而将sOrf A(SEQ ID NO:35)、sOrf B(SEQ ID NO:36)和第五基因(ScACS-1(SEQ ID NO:82)或ScACS-2(SEQ ID NO:84))克隆到pYES载体中。将所述四种载体引入到酵母中，并且通过将细胞重新悬浮在含有半乳糖的培养基中(如上所述)来对所述基因进行诱导。在30℃使细胞生长，并且在诱导18小时后收集细胞。表1概括了对这些细胞进行的FAME分析。对照细胞含有全部4种载体，但缺乏编码Orf A的基因。对任何一种ScACoAS进行共表达，这使DHA和DPA n-6的积累增加(约两倍于对照细胞中的量)。这确认了可通过以下方法来使异源的宿主中PUFA合成酶的产物的积累增加：对可更高效地利用上述产物的酶进行共表达。
表1
| 在30℃诱导18小时 | 对照(PUFA基因) | ScACS-1 | ScACS-2 |
| 脂肪酸 | FAME(面积%) | FAME(面积%) | FAME(面积%) |
| C14:0* | 1.7 | 1.8 | 2.0 |
| C14.1 | 0.5 | 0.5 | 0.6 |
| C15:0 | 0.5 | 0.5 | 0.5 |
| C16:0* | 17.1 | 16.5 | 15.5 |
| C16:1* | 40.7 | 38.8 | 38.5 |
| C18:0* | 4.7 | 4.3 | 4.2 |
| C18:1N9* | 23.8 | 22.4 | 21.9 |
| C18:1N7 | 1.3 | 1.0 | 1.0 |
| C24:0 | 0.1 | 0.1 | 0.1 |
| C22:5N6 | 1.3 | 2.5 | 3.1 |
| C26:0 | 1.7 | 1.6 | 1.6 |
| C22:6N3* | 2.0 | 3.8 | 3.9 |
| DHA+DPA n-6 | 3.3 | 6.3 | 7.0 |
在以下实验中，使用与上述相似的方法，也在含有编码裂殖壶菌属PUFA合成酶系统(例如sOrf A、sOrf B和nOrf C及HetI)的基因的酵母中对ScACS-3、ScACS-5、ScACS-6和ScACS-8进行了测验。与没有添加酰基辅酶A合成酶基因的情况相比，ScACS-3、ScACS-5或ScACS-8的各自表达都使酵母中DHA的产生增加(数据没有显示)。
如上所述，ScACS-8与脂肪酸转运体蛋白家族的成员具有同源性，后者也可具有ACS活性。应该相信的是，这些蛋白质与质膜相关，并且有助于将游离脂肪酸转运到细胞中，及有助于将游离脂肪酸转化成酰基辅酶A衍生物。当对PUFA合成酶系统进行表达时，上述家族的酶可具有特定的用途，在植物细胞的质体中，所述酶将其产物以游离脂肪酸的形式释放。相信质体的外包膜(outer envelope)源于质膜，并且靶向于质膜的蛋白质(诸如ScACS-8)也可靶向于质体的外包膜。在这种情况下，这些脂肪酸转运蛋白(诸如ScAC-8)可有助于从质体输出PUFA合成酶的游离脂肪酸产物，并且也可有助于将PUFA合成酶的游离脂肪酸产物转化成酰基辅酶A衍生物。以下描述了在表达裂殖壶菌属PUFA PKS系统的植物中提供上述酰基辅酶A合成酶的实验。
实施例10
以下实施例显示了表达裂殖壶菌属PUFA合成酶的酵母中PUFA水平的提高，所述酵母具有或不具有ScACoAS-1，并且在抑制FAS途径的浅蓝菌素的存在下生长。
PUFA合成酶和FAS都利用丙二酰辅酶A作为碳源，用于合成它们的脂肪酸产物。另外，来自两种系统的酰基辅酶A形式的脂肪酸都可作为合 成PL和TAG的酶的底物。如上所述，当PUFA合成酶和FAS存在于一种生物体中时，可对FAS系统进行下调或抑制，以利于PUFA的积累。对浅蓝菌素进行了深入的研究，其为脂肪酸合成中缩合反应的抑制剂。先前的工作表明，与FAS系统相比，PUFA合成酶相对而言对浅蓝菌素进行的抑制较不敏感。
本发明人测验了浅蓝菌素如何影响实施例8所述酵母菌株的脂肪酸分布，其作为降低FAS活性的概念模型(model of the concept)。在实施例9中描述的酵母也含有酰基辅酶A合成酶，也在上述系统中对所述酵母进行了测验，以确定所述两种策略是否累加地或协同地使PUFA的产生增加。
初始实验表明，当浅蓝菌素的浓度为4μM时，出现最大作用(即PUFA占全部脂肪酸分布的百分比增加)。在转移到半乳糖诱导培养基4小时后，添加浅蓝菌素。在转移到诱导培养基19小时后，收集细胞，冷冻干燥、制备FAME，然后通过GC进行分析。
测验的酵母菌株为：
含有PUFA合成酶基因(sOrf A、sOrf B、Orf C和HetI)的菌株5.5(在以上实施例8中描述)；和
含有菌株5.5的PUFA合成酶基因组及ScACoAS-1(SEQ ID NO:82)的菌株5.6(在以上实施例9中描述)。
在表2中，“0Cer”指没有添加浅蓝菌素，而“4μM Cer”指在转移到诱导培养基4小时后使培养基具有4μM浅蓝菌素。在存在或不存在浅蓝菌素的情况下，就脂肪酸的产生而对各个菌株进行评价，以评价对FAS途径进行的抑制如何影响PUFA的产生。表2显示了在GC分布中检测到的主要脂肪酸(也参见图11)。给出的值为占所检测全部脂肪酸的百分比。DHA和DPA n-6为裂殖壶菌属PUFA PKS系统的产物，它们是所述分布中仅有的PUFA。表2也显示了DHA及DPA n-6的总和。图9和10显示了所述酵母产生的DHA的量(图9)或所述酵母产生的DHA和DPA n-6的量(图10，白色柱为DHA，黑色柱为DHA+DPA n-6)(占总FAME的百分比)。
不具有PUFA合成酶基因的酵母细胞不能产生任何可检测的PUFA。在这项实验中，PUFA合成酶系统在酵母中的表达引起1.2%DHA的积累。引入ScACoAS-1基因(SEQ ID NO:82)，这使DHA的水平提高到4.1%。在4μM浅蓝菌素(对FAS系统进行抑制)的存在下，使仅具有PUFA合成酶系统的细 胞生长，这使DHA的水平提高到3.7%。使表达PUFA合成酶和ScACoAS-1基因的细胞在4μM浅蓝菌素中生长(即对酰基辅酶A合成酶的表达和FAS系统的抑制进行组合)，此时DHA的水平提高到占全部脂肪酸的8.2%。在所有样品中，DPA n-6的积累也相应地增加。表2也显示了样品中DHA及DPA n-6的总和，而最大量(占全部脂肪酸的14.5%)出现在生长在4μM浅蓝菌素中的菌株5.6中。可观察到的是，对ACoA合成酶基因进行表达和在浅蓝菌素的存在下生长，这两种策略是累加的。这些数据支持了本申请提出的本发明可在异源的宿主中增加PUFA的积累。
表2
| 脂肪酸 | 菌株5.5(0Cer) | 菌株5.5(4μM Cer) | 菌株5.6(0Cer) | 菌株5.6(4μM Cer) |
| C14:0 | 1.5 | 0.0 | 1.7 | 0.0 |
| C16:0 | 17.5 | 4.9 | 17.5 | 6.1 |
| C16:1 | 43.4 | 38.4 | 41.7 | 34.8 |
| C18:0 | 5.8 | 3.8 | 5.3 | 4.5 |
| C18:1N9 | 26.2 | 40.4 | 23.7 | 35.3 |
| C18:1N7 | 0.9 | 0.8 | 0.0 | 0.6 |
| C22:5N6 | 0.9 | 2.9 | 2.8 | 6.3 |
| C26:0 | 2.0 | 2.9 | 1.9 | 2.4 |
| C22:6N3 | 1.3 | 3.7 | 4.1 | 8.2 |
| DHA+DPA N6 | 2.1 | 6.6 | 6.9 | 14.5 |
实施例11
以下实施例描述了对其它辅助蛋白或靶标进行的鉴定，所述辅助蛋白或靶标用于在异源的宿主中使PUFA的产生和/或积累增加。
存在于裂殖壶菌属中的酶高效地利用PUFA合成酶的酰基辅酶A形式的产物来合成磷脂(PL)和三酰甘油(TAG)分子。然而，存在于异源宿主中的酶可能不会以相似的效率进行这些反应，因为上述生物体通常不会遇到上述PUFA-CoA。例如，一些PL或TAG合成酶高效地将各种PUFA合成酶的酰基辅酶A产物(例如DHA-CoA、DPA n-6-CoA、EPA-CoA或其它PUFA-CoA)整合到PL或TAG分子中，在上述异源的宿主中对所述PL或TAG合成酶进行表达，这可提高积累上述产物的能力。就此而言，通过PUFA合成酶途径来产生PUFA的裂殖壶菌属或其它生物体可作为编码上述酶的基因的良好来源。因此，本发明人提出使用在形成PL或TAG时利用PUFA-CoA作为底物的几种酰基转移酶蛋白(例如3-甘油-磷酸酯酰基转移酶(GPAT)、溶血磷脂酸酰基转移酶(LPAAT)和二酰基甘油酰基转移酶(DAGAT))或可在PL或TAG中富集PUFA的其它酰基转移酶(例如磷脂:二酰基甘油酰基转移酶 (PDAT))。以下描述了对几种上述酰基转移酶进行的鉴定。已在酵母和植物中对几个候选对象进行了测验。
DAGAT酶
本发明人已针对与具有已知(或未知)DAGAT活性的蛋白质具有同源性的那些EST而对裂殖壶菌属EST数据库进行了检查。本发明人将三个候选对象鉴定为可能与PUFA PKS系统一起使用的DAGAT酶，以下对其中一个进行了描述，并且已证明的是，在裂殖壶菌属中在将游离脂肪酸积累到TAG分子中时涉及这个候选对象：
裂殖壶菌属DAGAT(也称为DAGAT-1或ScDAGAT-1)—编码区域的长度=1518个核苷酸(不包括终止密码子)(SEQ ID NO:100)。预测其编码506个氨基酸(SEQ ID NO:101)即57.4kDa的蛋白质。所述蛋白质的三分之二(起始于约氨基酸170并且延续到C端)与鉴定为DAGAT2B型酶的蛋白质具有良好的同源性。对所述蛋白质序列的前三分之一(氨基酸1到170)进行的Blast分析没有显示与任何蛋白质具有显著的同源性，并且没有检测到任何Pfam匹配。
使用以上在实施例1中就裂殖壶菌属中的FAS而描述的敲除技术，本发明人相似地敲出了裂殖壶菌属菌株(称为B73-8)中的DAGAT基因(包含SEQ ID NO:100)。如在图13中显示的那样，对裂殖壶菌属中的DAGAT基因进行钝化显著地抑制了脂肪酸在TAG中的积累。具体地，对DAGAT进行的钝化使毫克FAME/克菌体量降低约80%，并且使TAG减少约90%。因此，本发明人得出结论，上述DAGAT是裂殖壶菌属中负责TAG合成的主要酶。
因此，可预测的是，在表达本申请所述PUFA PKS系统的宿主(例如酵母或植物)中上述核酸分子的表达可促进游离脂肪酸积累到PL或TAG中。以下描述了在转基因植物中表达上述基因的代表性实验。
LPAAT酶
本发明人也已针对与具有已知(或未知)LPAAT活性的蛋白质具有同源性的那些EST而对裂殖壶菌属EST数据库进行了检查。如上所述，本发明人将这些序列组装成重叠群(当可得到两个或更多个重叠序列时)，并且基于各个序列信息的特征而对这些序列进行编辑。以下概括了上述努力的结果。鉴定了三种不同的重叠群和一种单现基因(在数据库中没有任何重叠序列)， 它们是与LPAAT酶相关的特别良好的候选对象。应该认识到的是，这些序列编码的酶所具有的活性与推定的LPAAT活性相关，但不同于推定的LPAAT活性。在全部四种情况下都鉴定了推定的Orf(包括起始密码子和终止密码子)。应该认识到的是，当得到更多的数据时，可改变序列表征(sequence representation)(包括对内源性起始密码子的鉴定)的准确性.
通过对EST数据库进行分析而鉴定的裂殖壶菌属LPAAT候选对象：
1.ScLPAAT-1重叠群：长度=1478个核苷酸(SEQ ID NO:102)。其似乎包括全长为927个核苷酸的Orf(包括终止密码子、ScLPAAT-1CDS、SEQ ID NO:103)。通过翻译CDS(SEQ ID NO:104)而进行的Blast搜索显示，所编码蛋白质的大部分与已知或推定的酰基转移酶蛋白具有良好的同源性。最好的匹配是与来自Arabidopsis的蛋白质。Pfam分析表明，大的保守的核心结构域与PlsC(1-酰基-sn-甘油-3-磷酸酯酰基转移酶即LPAAT)家族相关。
2.ScLPAAT-2重叠群：长度=2112个核苷酸(SEQ ID NO:105)。其似乎包括全长为1140个核苷酸的Orf(包括终止密码子、ScLPAAT-2CDS、SEQ ID NO:106)。通过翻译CDS而进行的Blast搜索(SEQ ID NO:107)显示，所编码蛋白质的大部分与已知或推定的酰基转移酶蛋白具有良好的同源性。最好的匹配是与来自Arabidopsis的蛋白质。Pfam分析表明，大的保守的核心结构域与PlsC(1-酰基-sn-甘油-3-磷酸酯酰基转移酶即LPAAT)家族相关。
3.ScLPAAT-3重叠群：长度=1862个核苷酸(SEQ ID NO:108)。其似乎包括全长为1323个核苷酸的Orf(包括终止密码子、ScLPAAT-3CDS、SEQ ID NO:109)。通过翻译CDS而进行的Blast搜索(SEQ ID NO:110)显示，所编码蛋白质的核心部分与已知和推定的酰基转移酶具有良好的同源性。最好的匹配是与来自哺乳动物的蛋白质。Pfam分析表明，大的保守的核心结构域与PlsC(1-酰基-sn-甘油-3-磷酸酯酰基转移酶即LPAAT)家族相关。
4.ScLPAAT-4单现基因：长度=794个核苷酸(SEQ ID NO:111)。其似乎包括全长为756个核苷酸的Orf(包括终止密码子、ScLPAAT-4CDS、SEQ ID NO:112)。通过翻译CDS而进行的Blast搜索(SEQ ID NO:113)显示，所编码蛋白质的大部分与已知和推定的酰基转移酶具有良好的同源性。最好的匹配是与来自鸟类和哺乳动物的蛋白质。Pfam分析表明，大的保守的核心结构域与PlsC(1-酰基-sn-甘油-3-磷酸酯酰基转移酶即LPAAT)家族相关。
已在酵母和植物中对ScLPAAT-1进行了克隆表达。
其它DAGAT或LPAAT酶
本发明人也已针对与具有已知或未知DAGAT或LPAAT活性的蛋白质具有同源性的那些EST而对对隐甲藻EST数据库进行了检验。以下概括了上述努力的结果。
A)通过对EST数据库进行分析而鉴定的对隐甲藻DAGAT候选对象：
1.CA5_PTA.838.C：长度=817个核苷酸(SEQ ID NO:114)，上述序列中的至少274个核苷酸与记载在PCT公开号WO2004/087902中的Crypthecodinium酰基转移酶序列具有良好的同源性；
2.CA5_PTA.131.C1：长度=850个核苷酸(SEQ ID NO:115)；
3.CA12_cot10_003a_h10：长度=663个核苷酸(SEQ ID NO:116)；
4.CA12_cot10_001a_h02：长度=807个核苷酸(SEQ ID NO:117)；
5.CA12_cot10_005b_g12：长度=765个核苷酸(SEQ ID NO:118)；
6.CA12_cot50_005c_d07：长度=782个核苷酸(SEQ ID NO:119)。
B)通过对EST数据库进行分析而鉴定的对隐甲藻LPAAT候选对象：
1.CA12_cot10_003a_e11：长度=793个核苷酸(SEQ ID NO:120)；
2.CA12_PTA.739.C1：长度=744个核苷酸(SEQ ID NO:121)。
在这个实施例中描述的任何一种或多种核酸分子可用于对任何宿主细胞进行转化(包括产生本申请描述的任何经遗传修饰的生物体(例如植物或微生物))，以进一步提高PUFA在生物体中特别是在表达PUFA PKS系统的生物体中的积累。当在通过经典或标准脂肪酸合成酶途径来产生PUFA的宿主生物体中进行表达时，这些酶也可具有用途。上述构建体可与PUFA PKS系统一起使用，或如本申请描述的那样，与在宿主生物体中提高PUFA产生和积累的其它策略组合进行(例如与酰基辅酶A合成酶的表达组合进行或与对FAS途径的抑制组合进行)。相信记载在PCT公开号WO2004/087902中的其它酰基转移酶序列也可用于本发明，并且在此将这些序列完整引入作为参考。
实施例12
以下实施例描述了编码裂殖壶菌属PUFA合成酶的基因(Orf A、Orf B*和Orf C)和HetI在Arabidopsis中表达和在基本没有任何可检测的中间体或副产物的情况下靶标PUFA即DHA和DPA n-6的产生。
将裂殖壶菌属Orf A(用SEQ ID NO:1表示的核酸序列)、Orf B*(用SEQ ID NO:37表示的核酸序列)和Orf C(用SEQ ID NO:5表示的核酸序列)及HetI(用SEQ ID NO:33表示的核酸序列)克隆(分别或以各种组合(包括全部4种基因在一个超级构建体(superconstruct)上))到合适的二元载体(binary vector)中，以将所述基因导入到植物中。以下(三种表达构建体)及在实施例13中(用于4127的一种“超级构建体”)描述了上述构建体和载体的实例。
对5720进行构建：Orf B*(质体表达)
在亚麻核丝(flax linin)启动子/终止子(美国专利号6,777,591)的控制下，将Orf B*(编码SEQ ID NO:4)限制性地克隆到表达盒中。所述核丝启动子在种子发育期间控制转基因(或多种转基因)的时间特异性(specific-terporal)和组织特异性(specific-tissue)表达。直接位于裂殖壶菌属Orf B*上游和在裂殖壶菌属Orf B*框架内的是源于Brassica napus酰基-ACP硫酯酶(PT-信号肽)的质体靶向序列，以使Orf B*靶向于质体。植物二元载体也含有现成的大肠杆菌磷酸甘露糖异构酶基因(Miles and Guest,1984,Gene32:41-48)，其受在左右边缘序列之间的来自Petroselinum crispum的泛素启动子/终止子的驱动(Kawalleck等人,1993,Plant Mol.Bio.,21:673-684)，以进行正向选择(Haldrup等人,1998,Plant Mol.Biol.37:287-296)。
对4107进行构建：HetI和Orf C(质体表达)
在亚麻核丝启动子/终止子(美国专利号6,777,591)的控制下，将裂殖壶菌属Orf C(用SEQ ID NO:5表示的核酸序列)及HetI(用SEQ ID NO:33表示的核酸序列)克隆到表达盒中。所述核丝启动子在种子发育期间控制转基因(或多种转基因)的时间特异性和组织特异性表达。直接位于裂殖壶菌属Orf C和HetI上游和在裂殖壶菌属Orf C和HetI框架内的是源于Brassica napus酰基-ACP硫酯酶(PT-信号肽)的质体靶向序列，以使PUFA合成酶和PPTase靶向于质体。然后，将两种表达盒组装到一个植物二元载体中，所述植物二元载体含有使宿主植物耐受膦丝菌素(phosphinothricine)的pat基因(Wohlleben等人,1988,Gene70:25-37)，所述pat基因受在左右边缘序列之间的来自Petroselinum crispum的泛素启动子/终止子的驱动(Kawalleck等人,1993,Plant Mol.Bio.,21:673-684)。
对4757进行构建：Orf A(质体表达)
在亚麻核丝启动子/终止子(美国专利号6,777,591)的控制下，将裂殖壶菌属Orf A(用SEQ ID NO:1表示的核酸序列)克隆到表达盒中。所述核丝启 动子在种子发育期间控制转基因(或多种转基因)的时间特异性和组织特异性表达。直接位于裂殖壶菌属Orf A上游和在裂殖壶菌属Orf A框架内的是源于Brassica napus酰基-ACP硫酯酶(PT-信号肽)的质体靶向序列，以使PUFA合成酶和PPTase靶向于质体。使所述表达盒包含在植物二元载体中，所述植物二元载体含有使宿主植物耐受卡那霉素的nptII基因，所述nptII基因受在左右边缘序列之间的MAS启动子/终止子的驱动。
在一个实施例中，如上所述，将转基因克隆到以下三个不同的表达盒中：称为5720的构建体(含有编码SEQ ID NO:4的Orf B*)、称为4107的构建体(含有编码SEQ ID NO:6的Orf C和编码SEQ ID NO:34的HetI)和称为4757的构建体(含有编码SEQ ID NO:2的Orf A)。在每个构建体中对基因进行克隆。为了将所述蛋白质引导到质体，使编码来自Brassica napus酰基-ACP硫酯酶的质体靶向序列的额外5’序列直接位于Orf A、B*、C和HetI的上游。所编码的靶向肽的氨基酸序列为MLKLSCNVTNHLHTFSFFSDSSLFIPVNRRTLAVS(SEQ ID NO:81)。在框架内，将编码上述肽的核酸序列与各个PUFA合成酶Orf的起始甲硫氨酸密码子及HetI的工程化起始密码子(ATG)放置在一起。在其它构建体中，在使PUFA合成酶的定位靶向于植物细胞的细胞质的情况下，没有将任何编码额外蛋白质的序列置于所述Orf的5’端。
使用标准方法将所述基因导入到Arabidopsis中(将花浸到含有合适载体的土壤杆菌属菌株的混悬液中，这记载在Clough等人,1998,Plant J.16:735-743中)。所述方法详细记载在以下实施例13中。将得自上述植物的种子置于选择性培养基上，并且使之发芽。使一些植物生长至成熟，并且对种子的PUFA含量进行分析。基于PUFA含量，使上述一些种子生长成下一代。对从上述植物汇集的种子的脂肪酸含量进行分析。源于这些转基因植物的靶标PUFA为二十二碳六烯酸(DHA)和二十二碳五烯酸(DPA n-6)，它们是裂殖壶菌属PUFA PKS系统产生的主要PUFA，用于对植物进行转化的基因源于所述裂殖壶菌属PUFA PKS系统。
图13显示了对一个示范性转基因植物谱系进行的一项示范性脂肪酸分析的结果。图13的上半部分显示了野生型Arabidopsis种子的典型脂肪酸分布，其通过对从汇集的种子样品制备的FAME进行GC分离和FID检测来表示。主要的脂肪酸为16:0、18:0、16:1、18:1、20:1、20:2和22:1。在来自野 生型种子的样品中没有任何DHA或DPA n-6。
图13的下半部分显示了从以下一个示范性转基因Arabidopsis谱系(谱系263)汇集的种子样品的脂肪酸分布，所述示范性转基因Arabidopsis谱系(谱系263)表达裂殖壶菌属PUFA合成酶基因和HetI基因，其中如上所述，所述裂殖壶菌属PUFA合成酶基因和HetI基因通过三个不同的表达盒(5720、4107和4757)来导入，并且所有所述表达盒都靶向于质体。就谱系263的脂肪酸分布而言，可容易地观察到，在转基因植物种子的分布中存在两个FAME峰，而在野生型种子的分布中不存在这两个峰。这两个峰的洗脱行为正好相应于可信的DHA和DPA n-6的洗脱行为(使用从裂殖壶菌属油制备的FAME作为标准品及使用从NuCheck Prep商购的DHA标准品)。在这个特定的实施例中，DHA峰占总FAME计算值的0.8%，而DPA n-6峰占1.7%。新的PUFA的总和占总FAME的2.5%。
对其它转基因植物谱系进行的实验得到了相似的结果。例如，用与263谱系相同的构建体和方式进行转化的另一个转基因谱系(称为269)产生了占总FAME计算值约0.75%的DHA和占总FAME计算值1.41%的DPA n-6(数据没有显示)。
而且，使用上述相同核酸分子得到的多种其它转基因Arabidopsis植物也产生了靶标PUFA，不论它们是否使用在不同构建体、组合构建体或单一超级构建体上提供PUFA PKS基因和HetI PPTase的构建体来得到(以下在实施例13中显示了数据)。
另外，使PUFA PKS基因靶向于细胞溶胶的转基因植物都表达靶标PUFA(数据没有详细显示)。例如，借助如上所述的三个不同表达盒(不具有质体靶向序列)来导入而在细胞溶胶中表达裂殖壶菌属PUFA PKS及HetI的植物谱系按占总FAME的百分比计产生了约0.45%DHA和约0.8%DPA。在另一个实施例中，借助单一超级构建体(与以下实施例13描述的超级构建体相似)来导入而在细胞溶胶中表达裂殖壶菌属PUFA PKS及HetI的植物谱系按占总FAME的百分比计产生了约0.2-0.3%DHA和约0.5%DPA。
在图13显示的种子脂肪酸分布中出现了DHA和DPA n-6(并且在其它转基因谱系中也观察到，以上描述了其中一些其它转基因谱系)，这表明当在植物细胞中表达时，导入的裂殖壶菌属PUFA合成酶系统发挥功能，并且可使所述蛋白质靶向于质体。另外，本发明人已确认，也可使所述蛋白质靶 向于细胞溶胶或既靶向于质体又靶向于细胞溶胶，并且所述蛋白质产生PUFA。当通过其它宿主(例如大肠杆菌和酵母)的生物化学数据和异源表达数据来进行预测时，在转基因植物种子的分布中检测到的新脂肪酸只有DHA和DPA n-6(即所述脂肪酸分布基本不含有由PUFA产生酶系统产生的污染性中间体或副产物)，这进一步表明本申请的PUFA PKS系统优于在植物中产生PUFA的标准途径酶。
实施例13(a)-13(j)
以下实施例描述了本申请所述用于在植物中增加PUFA产生和/或积累的各种策略的使用(包括策略的组合)。
具体地，以下实施例描述了编码裂殖壶菌属PUFA合成酶(nOrf A、Orf B*和nOrf C)及HetI的基因在Arabidopsis种子中的表达，所述表达单独进行，或与提高PUFA产生和积累的其它辅助蛋白和/或遗传修饰策略组合进行。具体地，在植物中单独对裂殖壶菌属PUFA合成酶和HetI进行表达或使它们与以下基因组合表达：(1)编码酰基辅酶A合成酶(ACS)的基因或(2)意在抑制内源性FAS活性的遗传元件(genetic element)。另外，显示了使裂殖壶菌属PUFA合成酶和HetI的使用与ACS基因的表达和意在抑制内源性FAS活性的遗传元件的表达组合进行的实施例。最后，以下描述了单独表达酰基转移酶(包括DAGAT和/或LPAAT)或使之与一种或多种酰基辅酶A合成酶和意在抑制内源性FAS活性的遗传元件组合表达的实施例。在此概括的策略显示了将先前实施例描述的任何概念用于植物的能力。
实施例13(a)-(j)的材料和方法
(1)构建体
对构建体4127进行构建：PT-信号肽:nORFA、PT-信号肽:nORFB*、PT-信号肽:HetI和PT-信号肽:nORFC(对裂殖壶菌属PUFA合成酶及HetI进行质体靶向表达)
在亚麻核丝启动子/终止子(参见涉及所述启动子/终止子的美国专利号6,777,591)的控制下，将裂殖壶菌属天然的Orf A(nOrf A，用SEQ ID NO:1表示并且编码SEQ ID NO:2)、合成的(重合成的)Orf B*(Orf B*，用SEQ ID NO:37表示并且编码SEQ ID NO:4)和天然的Orf C(nOrf C，用SEQ ID NO:5表示并且编码SEQ ID NO:6)及来自念珠藻属的HetI(用SEQ ID NO:33表示并且编码SEQ ID NO:34)克隆到表达盒中。所述核丝启动子在种子发育期间 控制转基因(或多种转基因)的时间特异性和组织特异性表达。直接位于裂殖壶菌属Orf A、B*、C和HetI上游和在裂殖壶菌属Orf A、B*、C和HetI框架内的是源于Brassica napus酰基-ACP硫酯酶的质体靶向序列(本申请将其称为PT-信号肽，其氨基酸序列用SEQ ID NO:81表示)(也在实施例12中进行了描述)，以使PUFA合成酶和PPTase靶向于质体。然后，将全部四个表达盒组装到一个植物二元载体中，所述植物二元载体含有使宿主植物耐受膦丝菌素的pat基因(Wohlleben等人,1988,Gene70:25-37)，所述pat基因受在左右边缘序列之间的来自Petroselinum crispum的泛素启动子/终止子的驱动(Kawalleck等人,1993,Plant Mol.Bio.,21:673-684)。
对5723进行构建：ACS-1(细胞溶胶表达)
为了表达酰基辅酶A合成酶，构建了另一个植物二元载体来表达裂殖壶菌属ACS-1(SEQ ID NO:82，编码SEQ ID NO:83)的核酸序列。对在5’和3’端具有合适工程化限制性位点的ACS-1进行亚克隆和测序。然后，在亚麻核丝启动子/终止子(美国专利号6,777,591)的控制下，将ACS-1限制性地克隆到表达盒中，然后导入到植物二元载体中，所述植物二元载体含有大肠杆菌磷酸甘露糖异构酶基因(Miles and Guest,1984,Gene32:41-48)，所述大肠杆菌磷酸甘露糖异构酶基因受在左右边缘序列之间的来自Petroselinum crispum的泛素启动子/终止子(Kawalleck等人,1993,Plant Mol.Bio.,21:673-684)的驱动，以进行正向选择(Haldrup等人,1998,Plant Mol.Biol.37:287-296)。
也得到了分别用于表达本申请称为ACS-2(SEQ ID NO:84/85)和ACS-8(SEQ ID NO:96/97)的酰基辅酶A合成酶的相似构建体即5724和5730。在一个方面，如下所述，对酰基辅酶A合成酶序列与编码DAGAT(SEQ ID NO:100/101)和/或LPAAT(SEQ ID NO:102/103/104)的核酸分子进行组合。
对5727进行构建：带有CHSA内含子的KASII RNAi(对带有内含子的KASII RNAi进行细胞溶胶表达)
为了抑制FAS，构建了另一个植物二元载体来削弱KASII的表达。在这种情况下，通过带有源于矮牵牛查耳酮合成酶A(CHSA)基因的插入内含子的RNA干扰物(RNAi)(McGinnis等人,2005,Methods in Enzymology392:1-24和Koes等人,1989,Gene81:245-257)对由At1g74960基因座编码的核编码KASII转录物的499bp区域(Carlsson等人,2002,Plant J.29:761-770) 进行靶向。在植物二元载体的核丝启动子/终止子(美国专利号6,777,591)之间，将带有CHSA内含子的KASII RNAi(用SEQ ID NO:122表示)克隆到植物二元载体中，所述植物二元载体含有大肠杆菌磷酸甘露糖异构酶基因(Miles and Guest,1984,Gene32:41-48)，所述大肠杆菌磷酸甘露糖异构酶基因受在左右边缘序列之间的来自Petroselinum crispum的泛素启动子/终止子的驱动(Kawalleck等人,1993,Plant Mol.Bio.,21:673-684)，以进行正向选择(Haldrup等人,1998,Plant Mol.Biol.37:287-296)。
对5729进行构建：KASIII反义RNA(对KASIII反义RNA进行细胞溶胶表达)
为了抑制FAS，构建了另一个植物二元载体来削弱KASIII的表达。在这种情况下，对源于At1g62640基因座编码的核编码转录物的1210bp反义KASIII序列(Yamada等人,2002,GenBank Accession AY091275)进行靶向。在植物二元载体的核丝启动子/终止子(美国专利号6,777,591)之间，将KASIII反义序列(本申请用SEQ ID NO:125表示)克隆到植物二元载体中，所述植物二元载体含有磷酸甘露糖异构酶基因(Miles and Guest,1984,Gene32:41-48)，所述磷酸甘露糖异构酶基因受在左右边缘序列之间的来自Petroselinum crispum的泛素启动子/终止子的驱动(Kawalleck等人,1993,Plant Mol.Bio.,21:673-684)，以进行正向选择(Haldrup等人,1998,Plant Mol.Biol.37:287-296)。
对5731进行构建：ACS-1和带有内含子的KASII RNAi(细胞溶胶表达)
为了将酰基辅酶A合成酶的表达与对FAS的抑制组合进行，构建了另一个植物二元载体来削弱KASII的表达并且来表达裂殖壶菌属ACS-1的核酸序列(SEQ ID NO:82，编码SEQ ID NO:83)。对于上述构建体，在亚麻核丝启动子/终止子(美国专利号6,777,591)的控制下，使ACS-1和带有内含子的KASII RNAi的二重表达盒在植物二元载体中进行表达，所述植物二元载体含有大肠杆菌磷酸甘露糖异构酶基因(Miles and Guest,1984,Gene32:41-48)，所述大肠杆菌磷酸甘露糖异构酶基因受在左右边缘序列之间的来自Petroselinum crispum的泛素启动子/终止子的驱动(Kawalleck等人,1993,Plant Mol.Bio.,21:673-684)，以进行正向选择(Haldrup等人,1998,Plant Mol.Biol.37:287-296)。
对5732进行构建：ACS-1和反义KASII(细胞溶胶表达)
为了将酰基辅酶A合成酶的表达与对FAS的抑制组合进行，构建了另一个植物二元载体来削弱KASII的表达并且来表达裂殖壶菌属ACS-1的核酸序列(SEQ ID NO:82，编码SEQ ID NO:83)。对于上述构建体，在亚麻核丝启动子/终止子(美国专利号6,777,591)的控制下，使ACS-1和带有内含子的KASII反义物(本申请用SEQ ID NO:123表示的KASII反义序列)的二重表达盒在植物二元载体中进行表达，所述植物二元载体含有大肠杆菌磷酸甘露糖异构酶基因(Miles and Guest,1984,Gene32:41-48)，所述大肠杆菌磷酸甘露糖异构酶基受在左右边缘序列之间的来自Petroselinum crispum的泛素启动子/终止子的驱动(Kawalleck等人,1993,Plant Mol.Bio.,21:673-684)，以进行正向选择(Haldrup等人,1998,Plant Mol.Biol.37:287-296)。
对5733进行构建：ACS-1和KASIII RNAi(细胞溶胶表达)
为了将酰基辅酶A合成酶的表达与对FAS的抑制组合进行，构建了另一个植物二元载体来削弱KASIII的表达并且来表达裂殖壶菌属ACS-1的核酸序列(SEQ ID NO:82，编码SEQ ID NO:83)。对于上述构建体，在亚麻核丝启动子/终止子(美国专利号6,777,591)的控制下，使ACS-1和KASIII RNAi(本申请用SEQ ID NO:124表示的KASIII RNAi序列)的二重表达盒在植物二元载体中进行表达，所述植物二元载体含有大肠杆菌磷酸甘露糖异构酶基因(Miles and Guest,1984,Gene32:41-48)，所述大肠杆菌磷酸甘露糖异构酶基因受在左右边缘序列之间的来自Petroselinum crispum的泛素启动子/终止子的驱动(Kawalleck等人,1993,Plant Mol.Bio.,21:673-684)，以进行正向选择(Haldrup等人,1998,Plant Mol.Biol.37:287-296)。
对5734进行构建：ACS-1和KASIII反义RNA(细胞溶胶表达)
为了将酰基辅酶A合成酶的表达与对FAS的抑制组合进行，构建了另一个植物二元载体来削弱KASIII的表达并且来表达裂殖壶菌属ACS-1的核酸序列(SEQ ID NO:82，编码SEQ ID NO:83)。对于上述构建体，在亚麻核丝启动子/终止子(美国专利号6,777,591)的控制下，使ACS-1和KASIII反义物的二重表达盒在植物二元载体中进行表达，所述植物二元载体含有大肠杆菌磷酸甘露糖异构酶基因(Miles and Guest,1984,Gene32:41-48)，所述大肠杆菌磷酸甘露糖异构酶基因受在左右边缘序列之间的来自Petroselinum crispum的泛素启动子/终止子的驱动(Kawalleck等人,1993,Plant Mol.Bio.,21:673-684)，以进行正向选择(Haldrup等人,1998,Plant Mol.Biol. 37:287-296)。
对4793进行构建：DAGAT
为了表达DAGAT，构建了另一个植物二元载体来表达裂殖壶菌属DAGAT-1的核酸序列(SEQ ID NO:100，编码SEQ ID NO:101)。在亚麻核丝启动子/终止子(美国专利号6,777,591)的控制下，将裂殖壶菌属DAGAT(用SEQ ID NO:100表示的核酸序列)克隆到表达盒中。所述核丝启动子在种子发育期间控制转基因(或多种转基因)的时间特异性和组织特异性表达。使所述表达盒包含在植物二元载体中，所述植物二元载体含有使宿主植物耐受卡那霉素的nptII基因，所述nptII基因受在左右边缘序列之间的MAS启动子/终止子的驱动。
对4794进行构建：DAGAT和ACS-8
为了表达DAGAT和酰基辅酶A合成酶，构建了另一个植物二元载体来表达(1)裂殖壶菌属DAGAT的核酸序列(SEQ ID NO:100，编码SEQ IDNO:101和(2)裂殖壶菌属ACS-8的核酸序列(SEQ ID NO:96，编码SEQ IDNO:97)。对于上述构建体，在亚麻核丝启动子/终止子(美国专利号6,777,591)的控制下，使ACS-8和DAGAT的二重表达盒在植物二元载体中进行表达，所述植物二元载体含有使宿主植物耐受卡那霉素的nptII基因，所述nptII基因受在左右边缘序列之间的MAS启动子/终止子的驱动。
对4795进行构建：LPAAT和DAGAT
为表达LPAAT和DAGAT，构建了另一个植物二元载体来表达(1)裂殖壶菌属LPAAT的核酸序列(SEQ ID NO:103，编码SEQ ID NO:104)和(2)裂殖壶菌属DAGAT-1的核酸序列(SEQ ID NO:100，编码SEQ ID NO:101)。对于上述构建体，在亚麻核丝启动子/终止子(美国专利号6,777,591)的控制下，使LPAAT和DAGAT的二重表达盒在植物二元载体中进行表达，所述植物二元载体含有使宿主植物耐受卡那霉素的nptII基因，所述nptII基因受在左右边缘序列之间的MAS启动子/终止子的驱动。
对4796进行构建：ACS-8、LPAAT和DAGAT
为了表达酰基辅酶A合成酶、LPAAT和DAGAT，构建了另一个植物二元载体来表达(1)裂殖壶菌属LPAAT的核酸序列(SEQ ID NO:103，编码SEQ ID NO:8104)、(2)裂殖壶菌属DAGAT-1的核酸序列(SEQ ID NO:100，编码SEQ ID NO:101)和(3)裂殖壶菌属ACS-8的核酸序列(SEQ ID NO:96，编 码SEQ ID NO:97)。对于上述构建体，在亚麻核丝启动子/终止子(美国专利号6,777,591)的控制下，使ACS-8、LPAAT和DAGAT的三重表达盒在植物二元载体中进行表达，所述植物二元载体含有使宿主植物耐受卡那霉素的nptII基因，所述nptII基因受在左右边缘序列之间的MAS启动子/终止子的驱动。
(2)对Arabidopsis进行转化
通过诊断用限制性酶切消化(restriction digest)和序列分析，确认了各种植物二元载体的完整性。然后，分离的质粒通过电穿孔(25μF,2.5kV,200Ω)来对有能力的土壤杆菌属菌株EH101(Hood等人,1986,J.Bacteriol.144:732-743)进行转化。将重组土壤杆菌属置于AB-大观霉素(spectinomycin)/卡那霉素(20×AB盐、2M葡萄糖、0.25mg/ml FeSO4·7H2O、1M MgSO4和1MCaCl2)上，并且一个菌落用于接种5mL AB-大观霉素/卡那霉素液体培养基。使这些培养物在28℃生长过夜。然后，通过花浸方法(Clough等人,1998,Plant J.16:735-743)，使用含有4127质粒的重组Agrobacteria来对野生型C24Arabidopsis thalian植物进行转化。将得自这些植物的种子置于含有膦丝菌素的选择性培养基上，并且使之发芽。将鉴定为阳性的幼苗转移到土壤中，并且使之生长至成熟，此后对种子的PUFA含量进行分析。
对于含有其它质粒(5723、5724、5730、5727、5729、5731、5732、5733、5734、4793、4794、4795和/或4796)的重组土壤杆菌属，通过花浸方法(Clough等人,1998,Plant J.16:735-743)，对转基因4127-谱系150Arabidopsis thalian植物进行再次转化。将得自这些植物的种子置于含有膦丝菌素和甘露糖的选择性培养基上，进行双重选择，或在合适的情况下，置于含有膦丝菌素、甘露糖和卡那霉素的选择性培养基上或置于含有膦丝菌素和卡那霉素的选择性培养基上，进行三重选择，并且使之发芽。将鉴定为阳性的幼苗转移到土壤中，并且使之生长至成熟，此后对种子的PUFA含量进行分析。
实施例13a
此实施例描述了DHA和DPA n-6在转基因Arabidopsis thaliana种子中的产生，所述转基因Arabidopsis thaliana种子在超级构建体(4127)上对裂殖壶菌属PUFA合成酶(Orf A、Orf B*和Orf C)及HetI进行表达。
对从表达裂殖壶菌属PUFA合成酶(Orf A、Orf B*和Orf C)及HetI(构建体4127)的Arabidopsis植物汇集的种子进行的GC-FAME分析显示了脂肪酸 含量中显著水平的靶标PUFA即DHA n-3和DPA n-6。如在表3中显示的那样，一个特定的谱系(4127-谱系150)显示了0.6%DHA n-3和0.7%DPA n-6，即裂殖壶菌属PUFA的总含量为1.3%。如预测的那样，来自野生型(C24)背景的对照种子不含有任何可检测水平的DHA n-3或DPA n-6。随后通过SDS-PAGE和Western印迹而对4127-谱系150进行的表达分析显示，重组种子表达的Orf A、Orf B*、Orf C和HetI正确地靶向于质体(数据没有显示)。此外，对T2代至对T4代进行的分析表明上述表型是稳定的，当针对PUFA在植物中的产生和/或积累是否增加而对本申请描述的各种策略(包括策略的组合)进行评价时，所述表型作为阳性对照，用于确定DHA的水平和裂殖壶菌属PUFA的水平是否变化。
表3.以下两种种子中的DHA和DPA水平的对比：成熟的野生型Arabidopsis种子和表达裂殖壶菌属PUFA合成酶及HetI(质体靶向的)的转基因种子，其中收集的T2和T4种子群选自膦丝菌素阳性植物。通过GC分离和FID检测，确定了%DHA n-3和%DPA n-6(占总FAME计算值的百分比)。
实施例13b
此实施例描述了DHA n-3和DPA n-6在转基因Arabidopsis thaliana种子中的产生，所述转基因Arabidopsis thaliana种子表达裂殖壶菌属PUFA合成酶(Orf A、Orf B*和Orf C)和HetI(4127)及裂殖壶菌属ScACS-1基因(5723)或ScACS-2基因(5724)。
通过如上所述的土壤杆菌属介导的转化，将ScACS-1构建体(5723)或ScACS-2构建体(5724)导入到源于4127-谱系150的植物(参见实施例13a)中。在膦丝菌素和甘露糖的存在下对重组植物进行选择，然后收集种子，并且通过对从汇集的种子制备的FAME进行GC分离和FID检测来分析脂肪酸分布。
例如，表达裂殖壶菌属PKS和HetI及ACS-1的一个特定谱系(4127/5723-谱系514)在全部脂肪酸分布中显示了1.5%DHA和0.9%DPA n-6，即裂殖壶 菌属PUFA的总含量为2.4%(表4)。这表明，与4127-谱系150阳性对照相比，DHA n-3的含量增加了2.5倍。在表达裂殖壶菌属PKS和HetI及ACS-2的谱系(4127/5724-谱系552)中观察到相似的结果，这表明，与阳性对照相比，DHA n-3的含量增加了1.8倍。此外，观察到的是，DHA与DPA的比例从4127-谱系150T2代中的约0.85:1.0或4127-谱系150T4代中的1.0:1.0变为ACS-1谱系中的1.7:1.0和ACS-2谱系中的1.2:1.0。在所分析的所有转基因种子中，在分布中检测到的新脂肪酸只有DHA n-3或DPA n-6。
表4.就汇集的种子而言以下三种种子中的DHA n-3和DPA n-6水平的对比：成熟的野生型Arabidopsis种子、表达裂殖壶菌属PUFA合成酶及HetI(质体靶向)的转基因Arabidopsis种子和将裂殖壶菌属PUFA合成酶及HetI(质体靶向)的表达与裂殖壶菌属ACS-1或ACS-2的表达组合进行的转基因种子。通过GC分离和FID检测，确定了%DHA n-3和%DPA n-6(占总FAME计算值的百分比)。
实施例13c
此实施例描述了DHA和DPA n-6在转基因Arabidopsis thaliana种子中的产生，所述转基因Arabidopsis thaliana种子表达裂殖壶菌属PUFA合成酶(Orf A、Orf B*和Orf C)及HetI，并且与使用RNA干扰物(RNAi)来削弱KASII而对FAS进行抑制结合。
通过如上所述的土壤杆菌属介导的转化，将带有内含子的KASIIRNAi(构建体5727)导入到源于4127-谱系150的植物中。在膦丝菌素和甘露糖的存在下对重组植物进行选择，然后收集种子，并且通过对从汇集的种子制备的FAME进行GC分离和FID检测来分析脂肪酸分布。
例如，一个特定的谱系(4127/5727-谱系1097)在全部脂肪酸分布中显示了1.3%DHA n-3和1.2%DPA n-6，即裂殖壶菌属PUFA的总含量为2.5%(表5)。其显示，与4127-谱系150阳性对照相比，DHA的含量增加了2.1倍以上。随后，通过GC分离和FID检测，分别对来自4127/5727-谱系1097的单个种子进行了分析(按总FAME计算值计)。
在进行上述分析后，观察到的是，上述群中的种子在脂肪酸分布中显示了高达2.0%的DHA n-3和高达1.6%的DPA n-6，即裂殖壶菌属PUFA的总含量为3.6%(表5)。其显示，与4127-谱系150阳性对照相比，DHA的含量增加了3.3倍，并且裂殖壶菌属PUFA的含量增加了3倍。此外，观察到的是，DHA与DPA的比例从4127-谱系150T2代中的0.85:1.0或4127-谱系150T4代中的1.0:1.0变为FAS抑制谱系中的1.25:1.0或更大。就%DHA n-3、%DPA n-6和总%(DHA+DPA)而言，单个种子平均值与收集的样品一致，并且上述群中的差异可归结于重组4127和5727基因座在共转化的种子中发生分离。在所分析的所有转基因种子中，在分布中检测到的新型脂肪酸只有DHA n-3或DPA n-6。
表5.就汇集的种子和单个种子而言以下三种种子中的DHA和DPA水平的对比：成熟的野生型Arabidopsis种子、表达裂殖壶菌属PUFA合成酶及HetI(质体靶向)的转基因Arabidopsis种子和将裂殖壶菌属PUFA合成酶及HetI(质体靶向)的表达与对KASII的削弱组合进行的转基因种子。通过GC分离和FID检测，确定了%DHA n-3和%DPA n-6(占总FAME计算值的百分比)。
实施例13d
此实施例描述了DHA和DPA n-6在转基因Arabidopsis thaliana种子中的产生，所述转基因Arabidopsis thaliana种子表达裂殖壶菌属PUFA合成酶(Orf A、Orf B*和Orf C)及HetI，并且与使用反义RNA来削弱KASIII而对FAS进行抑制结合。
通过如上所述的土壤杆菌属介导的转化将KASIII反义构建体(5129)导入到源于4127-谱系150的植物中。在膦丝菌素和甘露糖的存在下对重组植物进行选择，然后收集种子，并且通过对从汇集的种子制备的FAME进行GC分离和FID检测来分析脂肪酸分布。
例如，一个特定的谱系(4127/5729-谱系1087)在全部脂肪酸分布中显示了1.7%DHA n-3和1.2%DPA n-6，即裂殖壶菌属PUFA的总含量为2.9%(表6)。其显示，与4127-谱系150阳性对照相比，DHA的含量增加了2.8倍。
随后，通过GC分离和FID检测，分别对来自4127/5729-谱系1087的单个种子进行了分析(按总FAME计算值计)。在进行上述分析后，观察到的是，上述群中的种子在脂肪酸分布中显示了高达2.4%的DHA n-3和高达1.8%的DPA n-6，即裂殖壶菌属PUFA的总含量为4.2%(表6)。其显示，与4127-谱系150阳性对照相比，DHA的含量增加了4倍，并且裂殖壶菌属PUFA的含量增加了3.2倍。此外，观察到的是，DHA与DPA的比例从4127-谱系150T2代中的0.85:1.0或4127-谱系150T4代中的1.0:1.0变为FAS抑制谱系中的1.33:1.0或更大。就%DHA n-3、%DPA n-6和总%(DHA+DPA)而言，单个种子平均值与收集的样品一致，并且上述群中的差异可归结于重组4127和5729基因座在共转化的种子中发生分离。如基于先前在大肠杆菌和酵母中观察到的生物化学数据和异源表达数据而预测的那样，在所分析的所有转基因种子中，在分布中检测到的新型脂肪酸只有DHA n-3或DPA n-6。图14显示了对种子样品1087-7进行分析而得到的GC-FAME色谱图。
表6.就汇集的种子和单个种子而言以下三种种子中的DHA和DPA水平的对比：成熟的野生型Arabidopsis种子、表达裂殖壶菌属PUFA合成酶 及HetI(质体靶向)的转基因Arabidopsis种子和将裂殖壶菌属PUFA合成酶及HetI(质体靶向)的表达与对KASIII的削弱组合进行的转基因种子。通过GC分离和FID检测，确定了%DHA n-3和%DPA n-6(占总FAME计算值的百分比)。
实施例13e
此实施例描述了DHA和DPA n-6在转基因Arabidopsis thaliana种子中的产生，所述转基因Arabidopsis thaliana种子表达裂殖壶菌属PUFA合成酶(Orf A、Orf B*和Orf C)及HetI，表达ScACS-1基因，并且使用反义RNA来削弱KASIII而对FAS进行抑制。
通过如上所述的土壤杆菌属介导的转化，使用构建体5731来将ScACS-1及KASII RNAi导入到源于4127-谱系150的植物中。在膦丝菌素和甘露糖的存在下对重组植物进行选择，然后收集种子，并且通过对从汇集的种子制备的FAME进行GC分离和FID检测来分析脂肪酸分布。
例如，一个谱系(4127/5731-谱系1366)在全部脂肪酸分布中显示了1.9%DHA和1.9%DPA n-6，即裂殖壶菌属PUFA的总含量为3.8%(表7)。其显示，与4127-谱系150阳性对照相比，DHA的含量增加了3.2倍，当与来自实施例13b和13c(表4和5)分别描述的汇集种子群的DHA含量进行比较 时，与在4127/5723-谱系514中观察到的单独使用的ACS-1策略相比，DHA的含量增加了1.3倍，而与在4127/5727-谱系1097中观察到的单独使用的KASII RNAi削弱策略相比，DHA的含量增加了1.5倍，
可预测的是，在上述群的单个种子中观察到较高水平的DHA含量，这反映了4127和5731基因座在汇集的种子中发生分离。如基于先前在大肠杆菌和酵母中观察到的生物化学数据和异源表达数据而预测的那样，在所分析的所有转基因种子中，在分布中检测到的新脂肪酸只有DHA n-3或DPA n-6。图15显示了对汇集的种子样品4127/5731-谱系1366进行分析而得到的GC-FAME色谱图。
表7.就汇集的种子而言以下三种种子中的DHA n-3和DPA n-6水平的对比：成熟的野生型Arabidopsis种子、表达裂殖壶菌属PUFA合成酶及HetI(质体靶向)的转基因Arabidopsis种子和将裂殖壶菌属PUFA合成酶及HetI(质体靶向)的表达与裂殖壶菌属ACS-1的表达和对FAS的抑制组合进行的转基因种子。通过GC分离和FID检测，确定了%DHA n-3和%DPA n-6(占总FAME计算值的百分比)。
实施例13f
此实施例描述了DHA和DPA n-6在转基因Arabidopsis thaliana种子中的产生，所述转基因Arabidopsis thaliana种子表达裂殖壶菌属PUFA合成酶(Orf A、Orf B*和Orf C)及HetI，并且表达裂殖壶菌属LPAAT。
通过如上所述的土壤杆菌属介导的转化，将LPAAT构建体(5725)导入到源于4127-谱系150的植物中。在膦丝菌素和甘露糖的存在下对重组植物进行选择，然后收集种子，并且通过对从汇集的种子制备的FAME进行GC分离和FID检测来分析脂肪酸分布。
可预测的是，来自这些植物的种子可产生靶标PUFA(DHA和DPA n-6)。也可预测的是，与表达PUFA PKS而没有添加LPAAT构建体的植物相比，DHA和/或DPA n-6的产生水平得以提高。
实施例13g
此实施例描述了DHA和DPA n-6在转基因Arabidopsis thaliana种子中的产生，所述转基因Arabidopsis thaliana种子表达裂殖壶菌属PUFA合成酶(Orf A、Orf B*和Orf C)及HetI，表达裂殖壶菌属DAGAT和ACS-1，并且与使用RNAi来削弱KASII而对FAS进行抑制结合或与使用反义物来削弱KASIII而对FAS进行抑制结合。
通过如上所述的土壤杆菌属介导的转化，将DAGAT构建体(4793)导入到源于5731(对ACS-1的表达和FAS的抑制(通过KASII RNAi)进行组合)的植物中。基于5734背景(对ACS-1的表达和FAS的抑制(通过KASIII反义物)进行组合)，得到了相似的植物。在膦丝菌素和甘露糖的存在下对重组植物进行选择，然后收集种子，并且通过对从汇集的种子制备的FAME进行GC分离和FID检测来分析脂肪酸分布。
可预测的是，来自这些植物的种子可产生靶标PUFA(DHA和DPA n-6)。也可预测的是，与表达PUFA PKS而没有添加DAGAT构建体并且没有对FAS进行抑制的植物相比，DHA和/或DPA n-6的产生水平得以提高。
实施例13h
此实施例描述了DHA和DPA n-6在转基因Arabidopsis thaliana种子中的产生，所述转基因Arabidopsis thaliana种子表达裂殖壶菌属PUFA合成酶(Orf A、Orf B*和Orf C)及HetI，表达裂殖壶菌属DAGAT和ACS-8，表达裂殖壶菌属ACS-1，并且与使用RNAi来削弱KASII而对FAS进行抑制结合或与使用反义物来削弱KASIII而对FAS进行抑制结合。
通过如上所述的土壤杆菌属介导的转化，将DAGAT/ACS-8构建体(4794)导入到源于5731(对ACS-1的表达和FAS的抑制(通过KASII RNAi)进行组合)的植物中。基于5734背景(对ACS-1的表达和FAS的抑制(通过KASIII反义物)进行组合)，得到了相似的植物。在膦丝菌素和甘露糖的存在下对重组植物进行选择，然后收集种子，并且通过对从汇集的种子制备的FAME进行GC分离和FID检测来分析脂肪酸分布。
可预测的是，来自这些植物的种子可产生靶标PUFA(DHA和DPA n-6)。 也可预测的是，与表达PUFA PKS而没有添加DAGAT/ACS-8构建体和ACS-1构建体并且没有对FAS进行抑制的植物相比，DHA和/或DPA n-6的产生水平得以提高。
实施例13i
此实施例描述了DHA和DPA n-6在转基因Arabidopsis thaliana种子中的产生，所述转基因Arabidopsis thaliana种子表达裂殖壶菌属PUFA合成酶(Orf A、Orf B*和Orf C)及HetI，表达裂殖壶菌属LPAAT和裂殖壶菌属DAGAT，表达裂殖壶菌属ACS-1，并且与使用RNAi来削弱KASII而对FAS进行抑制结合或与使用反义物来削弱KASIII而对FAS进行抑制结合。
通过如上所述的土壤杆菌属介导的转化，将DAGAT/LPAAT构建体(4795)导入到源于5731(对ACS-1的表达和FAS的抑制(通过KASII RNAi)进行组合)的植物中。基于5734背景(对ACS-1的表达和FAS的抑制(通过KASIII反义物)进行组合)，得到了相似的植物。在膦丝菌素和甘露糖的存在下对重组植物进行选择，然后收集种子，并且通过对从汇集的种子制备的FAME进行GC分离和FID检测来分析脂肪酸分布。
可预测的是，来自这些植物的种子可产生靶标PUFA(DHA和DPA n-6)。也可预测的是，与表达PUFA PKS的而没有添加DAGAT/LPAAT构建体和ACS-1构建体并且没有对FAS进行抑制植物相比，DHA和/或DPA n-6的产生水平得以提高。
实施例13j
此实施例描述了DHA和DPA n-6在转基因Arabidopsis thaliana种子中的产生，所述转基因Arabidopsis thaliana种子表达裂殖壶菌属PUFA合成酶(Orf A、Orf B*和Orf C)及HetI，表达裂殖壶菌属LPAAT、裂殖壶菌属DAGAT和裂殖壶菌属ACS-8，表达裂殖壶菌属ACS-1，并且与使用RNAi来削弱KASII而对FAS进行抑制结合或使用反义物来削弱KASIII而对FAS进行抑制结合。
通过如上所述的土壤杆菌属介导的转化，将DAGAT/LPAAT/ACS-8构建体(4796)导入到源于5731(对ACS-1的表达和FAS的抑制(通过KASII RNAi)进行组合)的植物中。基于5734背景(对ACS-1的表达和FAS的抑制(通过KASIII反义物)进行组合)，得到了相似的植物。在膦丝菌素和甘露糖的存在下对重组植物进行选择，然后收集种子，并且通过对从汇集的种子制备的 FAME进行GC分离和FID检测来分析脂肪酸分布。
可预测的是，来自这些植物的种子可产生靶标PUFA(DHA和DPA n-6)。也可预测的是，与表达PUFA PKS而没有添加DAGAT/LPAAT/ACS-8构建体和ACS-1构建体并且没有对FAS进行抑制的植物相比，DHA和/或DPA n-6的产生水平得以提高。
在此将美国临时申请号60/784,616和2006年3月15日提交的美国临时申请号60/783,205各自披露的全部内容引入作为参考。
尽管已详细描述了本发明的各种实施方案，但显而易见的是，本领域技术人员可对上述实施方案进行修改和调整。然而，上述修改和调整在本发明的范围内。
本发明涉及下述各项。
1.分离的核酸分子，其包含对催化长链PUFA游离脂肪酸(FFA)转化成酰基辅酶A的酰基辅酶A合成酶(ACoAS)进行编码的核酸序列，其中所述核酸序列编码与具有选自以下的氨基酸序列的酰基辅酶A合成酶至少60%相同的酰基辅酶A合成酶(ACoAS)：SEQ ID NO:83、SEQ ID NO:85、SEQ ID NO:87、SEQ ID NO:89、SEQ ID NO:91、SEQ ID NO:93、SEQ ID NO:95、SEQ ID NO:97和SEQ ID NO:99。
2.项1的分离的核酸分子，其中所述核酸序列编码具有选自以下的氨基酸序列的酰基辅酶A合成酶(ACoAS)：SEQ ID NO:83、SEQ ID NO:85、SEQ ID NO:87、SEQ ID NO:89、SEQ ID NO:91、SEQ ID NO:93、SEQ ID NO:95、SEQ ID NO:97和SEQ ID NO:99。
3.项1的分离的核酸分子，其中所述核酸序列编码选自以下的氨基酸序列：SEQ ID NO:83、SEQ ID NO:85和SEQ ID NO:97。
4.项1的分离的核酸分子，其中所述核酸序列选自SEQ ID NO:82、SEQ ID NO:84、SEQ ID NO:86、SEQ ID NO:88、SEQ ID NO:90、SEQ ID NO:92、SEQ ID NO:94、SEQ ID NO:96和SEQ ID NO:98。
5.分离的核酸分子，其包含对在形成磷脂(PL)或三酰甘油(TAG)时使用PUFA-CoA作为底物的蛋白质进行编码的核酸序列，其中所述蛋白质包含与选自以下的氨基酸序列至少60%相同的氨基酸序列：SEQ ID NO:102、SEQ ID NO:104、SEQ ID NO:107、SEQ ID NO:110和SEQ ID NO:113。
6.项5的分离的核酸分子，其中所述核酸序列对包含选自以下的氨基酸序列的蛋白质进行编码：SEQ ID NO:102、SEQ ID NO:104、SEQ ID NO:107、SEQ ID NO:110和SEQ ID NO:113。
7.项5的分离的核酸分子，其中所述核酸序列对包含选自以下的氨基酸序列的蛋白质进行编码：SEQ ID NO:102和SEQ ID NO:104。
8.项5的分离的核酸分子，其中所述核酸序列选自SEQ ID NO:100、SEQ ID NO:102、SEQ ID NO:103、SEQ ID NO:105、SEQ ID NO:106、SEQ ID NO:108、SEQ ID NO:109、SEQ ID NO:111和SEQ ID NO:112。
9.由项1至8中任一项的核酸分子编码的分离的蛋白质。
10.重组核酸分子，其包含可操作地与表达控制序列相连的项1至8中任一项的核酸分子。
11.重组宿主细胞，其包含项10的重组核酸分子。
12.项11的重组宿主细胞，其中所述宿主细胞为微生物。
13.项11的重组宿主细胞，其中所述宿主细胞为植物细胞。
14.经遗传修饰的生物体，其中所述生物体已被遗传修饰来表达项1至8中任一项的分离的核酸分子。
15.经遗传修饰的生物体，其中所述生物体已被遗传修饰来表达项1至4中任一项的至少一种分离的核酸分子。
16.经遗传修饰的生物体，其中所述生物体已被遗传修饰来表达项5至8中任一项的至少一种分离的核酸分子。
17.经遗传修饰的生物体，其中所述生物体已被遗传修饰来表达项1至4中任一项的至少一种分离的核酸分子和项5至8中任一项的至少一种分离的核酸分子。
18.经遗传修饰的生物体，其中所述生物体已被遗传修饰来表达项3的至少一种分离的核酸分子和项7的至少一种分离的核酸分子。
19.项14至18中任一项的经遗传修饰的生物体，其中所述生物体表达PUFA合成酶和磷酸泛酰巯基乙氨基转移酶(PPTase)。
20.项19的经遗传修饰的生物体，其中所述生物体已被遗传修饰来表达所述合成酶和所述磷酸泛酰巯基乙氨基转移酶。
21.经遗传修饰的生物体，其中所述生物体对PUFA合成酶和磷酸泛酰巯基乙氨基转移酶(PPTase)进行表达，所述PUFA合成酶产生至少一种多不 饱和脂肪酸(PUFA)，并且其中所述生物体含有对一种或多种催化长链PUFA游离脂肪酸(FFA)转化成酰基辅酶A的异源性酰基辅酶A合成酶(ACoAS)或其同源物进行表达的遗传修饰。
22.项21的经遗传修饰的生物体，其中所述生物体用以下核酸分子进行转化，所述核酸分子包含对来自内源性地表达PUFA合成酶的生物体的酰基辅酶A合成酶(ACoAS)或其同源物进行编码的核酸序列。
23.项21的经遗传修饰的生物体，其中所述生物体用以下核酸分子进行转化，所述核酸分子包含对来自对隐甲藻的酰基辅酶A合成酶(ACoAS)或其同源物进行编码的核酸序列，其中所述ACoAS或其同源物催化长链PUFA游离脂肪酸(FFA)转化成酰基辅酶A。
24.项21的经遗传修饰的生物体，其中所述生物体用以下核酸分子进行转化，所述核酸分子包含对来自破囊壶菌目微生物的酰基辅酶A合成酶(ACoAS)或其同源物进行编码的核酸序列，其中所述ACoAS或其同源物催化长链PUFA游离脂肪酸(FFA)转化成酰基辅酶A。
25.项21的经遗传修饰的生物体，其中所述生物体用以下核酸分子进行转化，所述核酸分子包含对来自裂殖壶菌属的酰基辅酶A合成酶(ACoAS)或其同源物进行编码的核酸序列，其中所述ACoAS或其同源物催化长链PUFA游离脂肪酸(FFA)转化成酰基辅酶A。
26.项21的经遗传修饰的生物体，其中所述生物体用项1至4中任一项的核酸分子进行转化。
27.项21至26中任一项的经遗传修饰的生物体，其中所述生物体含有对由所述生物体表达的脂肪酸合成酶(FAS)进行除去或钝化的额外的遗传修饰。
28.项21至27中任一项的经遗传修饰的生物体，其中所述生物体含有在所述生物体中就丙二酰辅酶A而言减少与PUFA合成酶的竞争或提高丙二酰辅酶A的水平的额外的遗传修饰。
29.项21至28中任一项的经遗传修饰的生物体，其中所述生物体含有对一种或多种来自内源性地产生PUFA的生物体的异源性蛋白质进行表达的额外的遗传修饰，其中所述蛋白质在形成磷脂(PL)或三酰甘油(TAG)时使用PUFA-CoA作为底物。
30.经遗传修饰的生物体，其中所述生物体对PUFA合成酶和磷酸泛酰 巯基乙氨基转移酶(PPTase)进行表达，所述PUFA合成酶产生至少一种多不饱和脂肪酸(PUFA)，并且其中所述生物体含有由对所述生物体表达的脂肪酸合成酶(FAS)进行除去或钝化的遗传修饰。
31.项30的经遗传修饰的生物体，其中所述生物体含有在所述生物体中就丙二酰辅酶A而言减少与PUFA合成酶的竞争或提高丙二酰辅酶A的水平的额外的遗传修饰。
32.经遗传修饰的生物体，其中所述生物体对PUFA合成酶和磷酸泛酰巯基乙氨基转移酶(PPTase)进行表达，所述PUFA合成酶产生至少一种多不饱和脂肪酸(PUFA)，并且其中所述生物体含有在所述生物体中就丙二酰辅酶A而言减少与PUFA合成酶的竞争或提高丙二酰辅酶A的水平的遗传修饰。
33.项32的经遗传修饰的生物体，其中所述生物体含有对所述生物体表达的脂肪酸合成酶(FAS)进行除去或钝化的额外的遗传修饰。
34.经遗传修饰的生物体，其中所述生物体对PUFA合成酶和磷酸泛酰巯基乙氨基转移酶(PPTase)进行表达，所述PUFA合成酶产生至少一种多不饱和脂肪酸(PUFA)，其中所述生物体含有对一种或多种来自内源性地产生PUFA的生物体的异源性蛋白质进行表达的遗传修饰，其中所述蛋白质在形成磷脂(PL)或三酰甘油(TAG)时使用PUFA-CoA作为底物。
35.项34的经遗传修饰的生物体，其中所述蛋白质为DAGAT或LPAAT。
36.项34的经遗传修饰的生物体，其中所述生物体用以下核酸分子进行转化，所述核酸分子包含对来自破囊壶菌或Labyrinthulid的、在形成磷脂(PL)或三酰甘油(TAG)时使用PUFA-CoA作为底物的蛋白质进行编码的核酸序列。
37.项34的经遗传修饰的生物体，其中所述生物体用以下核酸分子进行转化，所述核酸分子包含对来自裂殖壶菌属的、在形成磷脂(PL)或三酰甘油(TAG)时使用PUFA-CoA作为底物的蛋白质进行编码的核酸序列。
38.项34的经遗传修饰的生物体，其中所述生物体用项5至8中任一项的核酸分子进行转化。
39.项34至39中任一项的经遗传修饰的生物体，其中所述生物体包含对一种或多种催化长链PUFA游离脂肪酸(FFA)转化成酰基辅酶A的异源性酰基辅酶A合成酶(ACoAS)或其同源物进行表达的额外的修饰。
40.项34至40中任一项的经遗传修饰的生物体，其中所述生物体含有对由所述生物体表达的脂肪酸合成酶(FAS)进行除去或钝化的额外的遗传修饰。
41.项34至41中任一项的经遗传修饰的生物体，其中所述生物体含有在所述生物体中就丙二酰辅酶A而言减少与PUFA合成酶的竞争或提高丙二酰辅酶A的水平的额外的遗传修饰。
42.项21至42中任一项的经遗传修饰的生物体，其中所述PUFA合成酶包含至少一种来自破囊壶菌或Labyrinthulid的PUFA合成酶的功能域。
43.项21至42中任一项的经遗传修饰的生物体，其中所述PUFA合成酶包含至少一种来自破囊壶菌目微生物的PUFA合成酶的功能域。
44.项21至42中任一项的经遗传修饰的生物体，其中所述PUFA合成酶包含至少一种来自选自以下的生物体的PUFA合成酶的功能域：裂殖壶菌属、破囊壶菌属、Ulkenia和Labyrinthula。
45.项21至42中任一项的经遗传修饰的生物体，其中所述PUFA合成酶包含至少一种来自裂殖壶菌属的PUFA合成酶的功能域。
46.项21至42中任一项的经遗传修饰的生物体，其中所述PUFA合成酶包含至少一种来自选自以下的生物体的PUFA合成酶的功能域：裂殖壶菌属种American Type Culture Collection(ATCC)No.20888、破囊壶菌属23B ATCC No.20892和任何所述微生物的突变体。
47.项21至42中任一项的经遗传修饰的生物体，其中所述PUFA合成酶包含至少一种来自海洋细菌的PUFA合成酶的功能域。
48.项21至42中任一项的经遗传修饰的生物体，其中所述PUFA合成酶包含至少一种来自选自以下的生物体的PUFA合成酶的功能域：希瓦氏菌属、Moritella和发光菌属。
49.项21至42中任一项的经遗传修饰的生物体，其中所述PUFA合成酶由一种或多种包含以下结构域的蛋白质组成：
a)至少一个烯酰ACP还原酶(ER)结构域；
b)至少四个酰基载体蛋白(ACP)结构域；
c)至少两个β-酮脂酰ACP合成酶(KS)结构域；
d)至少一个酰基转移酶(AT)结构域；
e)至少一个β-酮脂酰ACP还原酶(KR)结构域；
f)至少两个FabA样β-羟酰ACP脱水酶(DH)结构域；
g)至少一个链长度因子(CLF)结构域；和
h)至少一个丙二酰辅酶A:ACP酰基转移酶(MAT)结构域。
50.项21至42中任一项的经遗传修饰的生物体，其中所述PUFA合成酶由一种或多种包含以下结构域的蛋白质组成：
a)两个烯酰ACP还原酶(ER)结构域；
b)八个或九个酰基载体蛋白(ACP)结构域；
c)两个β-酮脂酰ACP合成酶(KS)结构域；
d)一个酰基转移酶(AT)结构域；
e)一个酮还原酶(KR)结构域；
f)两个FabA样β-羟酰ACP脱水酶(DH)结构域；
g)一个链长度因子(CLF)结构域；和
h)一个丙二酰辅酶A:ACP酰基转移酶(MAT)结构域。
51.项21至42中任一项的经遗传修饰的生物体，其中所述PUFA合成酶为在至少约25℃的温度产生PUFA的细菌PUFA合成酶，并且其中所述PUFA合成酶由一种或多种包含以下结构域的蛋白质组成：
a)至少一个烯酰ACP还原酶(ER)结构域；
b)至少六个酰基载体蛋白(ACP)结构域；
c)至少两个β-酮脂酰ACP合成酶(KS)结构域；
d)至少一个酰基转移酶(AT)结构域；
e)至少一个酮还原酶(KR)结构域；
f)至少两个FabA样β-羟酰ACP脱水酶(DH)结构域；
g)至少一个链长度因子(CLF)结构域；
h)至少一个丙二酰辅酶A:ACP酰基转移酶(MAT)结构域；和
i)至少一个4’-磷酸泛酰巯基乙氨基转移酶(PPTase)结构域。
52.项21至42中任一项的经遗传修饰的生物体，其中所述PUFA合成酶包含一种或多种选自以下的序列或由一种或多种选自以下的序列编码：SEQ ID NO:1-32中的任何一种和SEQ ID NO:35-80中的任何一种。
53.项21至52中任一项的经遗传修饰的生物体，其中一种或多种编码所述PUFA合成酶的核酸序列已被优化成改进所述PUFA合成酶在所述生物体中的表达。
54.项21至53中任一项的经遗传修饰的生物体，其中所述生物体产生至少一种选自以下的多不饱和脂肪酸(PUFA)：EPA(C20:5,n-3)、DHA(C22:6,n-3)、DPA(C22:5,n-6或n-3)、ARA(C20:4,n-6)、GLA(C18:3,n-6)和/或SDA(C18:4,n-3))。
55.项21至53中任一项的经遗传修饰的生物体，其中所述生物体产生至少一种选自以下的多不饱和脂肪酸(PUFA)：DHA、EPA和DPA n-6。
56.项21至53中任一项的经遗传修饰的生物体，其中所述生物体产生DHA和DPA n-6。
57.项21至53中任一项的经遗传修饰的生物体，其中所述生物体产生ARA。
58.项21至53中任一项的经遗传修饰的生物体，其中所述生物体中的全部脂肪酸分布包含至少0.5%重量的、由所述PUFA合成酶产生的至少一种PUFA。
59.项21至58中任一项的经遗传修饰的生物体，其中所述生物体为微生物。
60.项59的经遗传修饰的生物体，其中所述微生物内源性地表达PUFA PKS系统。
61.项59的经遗传修饰的生物体，其中所述微生物选自破囊壶菌目微生物和海洋细菌。
62.项59的经遗传修饰的生物体，其中所述微生物已被遗传修饰来表达所述PUFA PKS系统。
63.项59的经遗传修饰的生物体，其中所述微生物为酵母或细菌。
64.项21至53中任一项的经遗传修饰的生物体，其中所述生物体为植物或植物细胞。
65.项64的经遗传修饰的生物体，其中使所述PUFA合成酶和所述PPTase的表达靶向于所述植物或植物细胞的质体。
66.项64的经遗传修饰的生物体，其中所述植物为含油种子植物。
67.项64的经遗传修饰的生物体，其中所述植物为双子叶植物。
68.项64的经遗传修饰的生物体，其中所述植物选自油菜、大豆、油菜子、亚麻子、玉米、红花、向日葵和烟草。
69.项64的经遗传修饰的生物体，其中除所述至少一种PUFA外，由 所述PUFA合成酶产生的全部脂肪酸的量占所述植物或植物细胞产生的全部脂肪酸的量的少于约10%重量。
70.项64的经遗传修饰的生物体，其中除所述至少一种PUFA外，所述PUFA合成酶产生的全部脂肪酸的量占所述植物或植物细胞产生的全部脂肪酸的量的少于约5%重量。
71.项64的经遗传修饰的生物体，其中所述全部脂肪酸在所述植物、植物部分或植物细胞中的分布包含至少约0.5%重量的至少一种具有至少20个碳和四个或更多个碳-碳双键的多不饱和脂肪酸(PUFA)，并且其中所述全部脂肪酸在所述植物或植物部分中的分布就以下PUFA的总量而言含有少于5%的以下PUFA：γ-亚麻酸(GLA;18:3,n-6)、具有18个碳和四个碳-碳双键的PUFA、具有20个碳和三个碳-碳双键的PUFA和具有22个碳和两个或三个碳-碳双键的PUFA。
72.项64的经遗传修饰的生物体，其中所述全部脂肪酸在所述植物、植物部分或植物细胞中的分布包含至少约0.5%重量的至少一种具有至少20个碳和四个或更多个碳-碳双键的多不饱和脂肪酸(PUFA)，并且其中所述全部脂肪酸在所述植物或植物部分中的分布就以下每种PUFA而言含有少于1%的以下PUFA：γ-亚麻酸(GLA;18:3,n-6)、具有18个碳和四个碳-碳双键的PUFA、具有20个碳和三个碳-碳双键的PUFA和具有22个碳和两个或三个碳-碳双键的PUFA。
73.项64的经遗传修饰的生物体，其中所述全部脂肪酸在所述植物、植物部分或植物细胞中的分布包含至少约0.5%重量的至少一种具有至少20个碳和四个或更多个碳-碳双键的多不饱和脂肪酸(PUFA)，并且其中所述总脂肪酸在所述植物或植物部分中的分布含有少于2%的γ-亚麻酸(GLA;18:3,n-6)和双高-γ-亚麻酸(DGLA或HGLA;20:3,n-6)。
74.项73的经遗传修饰的生物体，其中所述全部脂肪酸在所述植物、植物部分或植物细胞中的分布含有少于1%重量的γ-亚麻酸(GLA;18:3,n-6)和双高-γ-亚麻酸(DGLA或HGLA;20:3,n-6)。
75.项64的经遗传修饰的生物体，其中所述全部脂肪酸在所述植物、植物部分或植物细胞中的分布包含至少约0.5%重量的至少一种具有至少20个碳和四个或更多个碳-碳双键的多不饱和脂肪酸(PUFA)，并且其中所述全部脂肪酸在所述植物或植物部分中的分布含有少于1%的γ-亚麻酸(GLA; 18:3,n-6)。
76.项64的经遗传修饰的生物体，其中所述全部脂肪酸在所述植物、植物部分或植物细胞中的分布含有少于0.5%重量的γ-亚麻酸(GLA;18:3,n-6)。
77.得自项21至76中任一项的经遗传修饰的生物体的油。
78.生产包含至少一种多不饱和脂肪酸(PUFA)的油的方法，其包括使项21至76中任一项的生物体生长。
79.通过项78的方法来生产的油。
80.一种植物油，其包含可检测量的DHA(二十二碳六烯酸(C22:6,n-3))和DPA(二十二碳五烯酸(C22:5,n-6))，其中DPA n-6与DHA的比例为1:1或大于1:1，其中所述植物油得自项64至76中任一项的植物或植物细胞。
81.得自项64至76中任一项的植物的种子。
82.项77、79或80中任一项的油，其中所述油含有至少一种选自以下的多不饱和脂肪酸(PUFA)：EPA(C20:5,n-3)、DHA(C22:6,n-3)、DPA(C22:5,n-6或n-3)、ARA(C20:4,n-6)、GLA(C18:3,n-6)和/或SDA(C18:4,n-3))。
83.项77、79或80中任一项的油，其中所述油含有至少一种选自以下的多不饱和脂肪酸(PUFA)：EPA(C20:5,n-3)、DHA(C22:6,n-3)、DPA(C22:5,n-6或n-3)或DTA(C22:4,n-6)。
84.项77、79或80中任一项的油，其中所述油含有至少一种选自以下的多不饱和脂肪酸(PUFA)：EPA(C20:5,n-3)、DHA(C22:6,n-3)和/或DPA(C22:5,n-6或n-3)。
85.一种食品，其含有项77、79或80中任一项的油或项81的种子。
86.一种药品，其含有项77、79或80中任一项的油。
87.生产包含至少一种PUFA的油的方法，所述方法包括从项81的种子回收油。
88.生产包含至少一种PUFA的油的方法，所述方法包括从项21至76中任一项的经遗传修饰的生物体回收油。
89.生产至少一种多不饱和脂肪酸(PUFA)的方法，所述方法包括使项21至76中任一项的经遗传修饰的生物体生长。
90.生产至少一种多不饱和脂肪酸(PUFA)的方法，所述方法包括从项21至76中任一项的经遗传修饰的生物体得到或回收所述PUFA。
91.向个体提供含有至少一种PUFA的补品或治疗品的方法，所述方法包括向所述个体提供项21至76中任一项的经遗传修饰的生物体或其部分、项81的种子、项77、79或80的油、项85的食品或项86的药品。
92.将生物体转化以表达PUFA的方法，所述方法包括用编码PUFA合成酶的核酸分子、编码磷酸泛酰巯基乙氨基转移酶(PPTase)的核酸分子和项1至8中任一项的至少一种核酸分子对生物体进行转化。
93.项92的方法，其中所述生物体含有对由所述生物体表达的脂肪酸合成酶(FAS)进行除去或钝化的遗传修饰。
94.项92的方法，其中所述生物体含有在所述生物体中就丙二酰辅酶A而言减少与PUFA合成酶的竞争或提高丙二酰辅酶A的水平的遗传修饰。
95.项92的方法，其中所述生物体为植物。
96.项92的方法，其中所述生物体为微生物。
生物材料的保藏
以下生物材料已经保藏于美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection,ATCC)(Rockville,MD20852,USA)：
保藏物 保藏日期ATCC保藏编号
裂殖壶菌属种S31(Schizochytrium sp.,S31) 1998年8月5日 20888
裂殖壶菌属种S8(Schizochytrium sp.,S8) 1998年8月5日 20889
破囊壶菌属种12B(Thraustochytrid sp.,12B) 1998年8月5日 20890
破囊壶菌属种U42-2(Thraustochytrid sp.,U42-2) 1998年8月5日 20891
破囊壶菌属种23B(Thraustochytrid sp.,23B) 1998年8月5日 20892
以下生物材料已经保藏于美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection,ATCC)(Manassas,Virginia20110-2209,USA)：
保藏物 保藏日期 保藏编号
Shewanella japonica,菌株KMM3299 2001年7月3日 ATCC BBA-316
以下生物材料已经保藏于澳大利亚南极微生物保藏中心(Australian Collection of Antarctic Microorganisms,ACAM)(Hobart,Tasmania7001,Australia)：
保藏物 保藏日期 保藏编号
Shewanella olleyana 2002年1月27日 ACAM 644T
以下生物材料已经保藏于美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection,ATCC)(Manassas,VA20110-2209,USA)：
保藏物 保藏日期 保藏编号
来自裂殖壶菌属种(Schizochytrium sp.)N230D的
pJK306 OrfA基因组克隆 2006年6月8日 PTA-7641
来自裂殖壶菌属种(Schizochytrium sp.)N230D的
pBR002 OrfC基因组克隆 2006年6月8日 PTA-7642
来自裂殖壶菌属种(Schizochytrium sp.)N230D的
pJK324 OrfB基因组克隆 2006年6月8日 PTA-7643
来自裂殖壶菌属种(Schizochytrium sp.)N230D的
pJK320 OrfA基因组克隆 2006年6月8日 PTA-7644
cDNA克隆LIB3033-046-D2 2006年6月8日 PTA-7645
以下生物材料已经保藏于美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection,ATCC)(Manassas,VA20110-2209,USA)：
保藏物 保藏日期 保藏编号
cDNA克隆LIB3033-047-B5 2006年6月8日 PTA-7646
cDNA克隆LIB81-042-B9 2006年6月8日 PTA-7647
来自裂殖壶菌属(Schizochytrium)ATCC20888的
pJK1126OrfA基因组克隆 2006年6月8日 PTA-7648
来自裂殖壶菌属(Schizochytrium)ATCC20888的
pJK1129OrfB基因组克隆 2006年6月8日 PTA-7649
来自裂殖壶菌属(Schizochytrium)ATCC20888的
pJK1131 OrfC基因组克隆 2006年6月8日 PTA-7650
以下生物材料已经保藏于美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection,ATCC)(Manassas,VA20110-2209,USA)：
保藏物 保藏日期 保藏编号
大肠杆菌(E.coli)质粒载体Th23OrfB_pBR800 2007年3月1日 PTA-8227
大肠杆菌(E.coli)质粒载体Th23BOrfC_pBR709A 2007年3月1日 PTA-8228
大肠杆菌(E.coli)质粒载体pThOrfC_synPS 2007年3月1日 PTA-8229
以下生物材料已经保藏于美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection,ATCC)(Manassas,VA20110-2209,USA)：
保藏物 保藏日期 保藏编号
大肠杆菌(E.coli)质粒载体pDS49 2007年3月1日 PTA-8230
大肠杆菌(E.coli)质粒载体Th23BOrfA_pBR811 2007年3月1日 PTA-8231
大肠杆菌(E.coli)质粒载体Th23BOrfA_pBR812.1 2007年3月1日 PTA-8232
Claims (9)
1.分离的核酸分子，其包含对催化长链PUFA游离脂肪酸(FFA)转化成酰基辅酶A的酰基辅酶A合成酶(ACoAS)进行编码的核酸序列，其中所述核酸序列编码与具有选自以下的氨基酸序列的酰基辅酶A合成酶至少60%相同的酰基辅酶A合成酶(ACoAS)：SEQ ID NO:83、SEQ ID NO:85、SEQ IDNO:87、SEQ ID NO:89、SEQ ID NO:91、SEQ ID NO:93、SEQ ID NO:95、SEQ ID NO:97和SEQ ID NO:99。
2.分离的核酸分子，其包含对在形成磷脂(PL)或三酰甘油(TAG)时使用PUFA-CoA作为底物的蛋白质进行编码的核酸序列，其中所述蛋白质包含与选自以下的氨基酸序列至少60%相同的氨基酸序列：SEQ ID NO:102、SEQID NO:104、SEQ ID NO:107、SEQ ID NO:110和SEQ ID NO:113。
3.重组核酸分子，其包含可操作地与表达控制序列相连的权利要求1或2的核酸分子。
4.重组宿主细胞，其包含权利要求3的重组核酸分子。
5.经遗传修饰的生物体，其中所述生物体已被遗传修饰来表达权利要求1或2的分离的核酸分子。
6.经遗传修饰的生物体，其中所述生物体对PUFA合成酶和磷酸泛酰巯基乙氨基转移酶(PPTase)进行表达，所述PUFA合成酶产生至少一种多不饱和脂肪酸(PUFA)，并且其中所述生物体含有对一种或多种催化长链PUFA游离脂肪酸(FFA)转化成酰基辅酶A的异源性酰基辅酶A合成酶(ACoAS)或其同源物进行表达的遗传修饰。
7.经遗传修饰的生物体，其中所述生物体对PUFA合成酶和磷酸泛酰巯基乙氨基转移酶(PPTase)进行表达，所述PUFA合成酶产生至少一种多不饱和脂肪酸(PUFA)，并且其中所述生物体含有由对所述生物体表达的脂肪酸合成酶(FAS)进行除去或钝化的遗传修饰。
8.经遗传修饰的生物体，其中所述生物体对PUFA合成酶和磷酸泛酰巯基乙氨基转移酶(PPTase)进行表达，所述PUFA合成酶产生至少一种多不饱和脂肪酸(PUFA)，并且其中所述生物体含有在所述生物体中就丙二酰辅酶A而言减少与PUFA合成酶的竞争或提高丙二酰辅酶A的水平的遗传修饰。
9.经遗传修饰的生物体，其中所述生物体对PUFA合成酶和磷酸泛酰巯基乙氨基转移酶(PPTase)进行表达，所述PUFA合成酶产生至少一种多不饱和脂肪酸(PUFA)，其中所述生物体含有对一种或多种来自内源性地产生PUFA的生物体的异源性蛋白质进行表达的遗传修饰，其中所述蛋白质在形成磷脂(PL)或三酰甘油(TAG)时使用PUFA-CoA作为底物。
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Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US9540666B2 (en) | 2009-03-19 | 2017-01-10 | Dsm Ip Assets B.V. | Polyunsaturated fatty acid synthase nucleic acid molecules and polypeptides, compositions, and methods of making and uses thereof |
Families Citing this family (87)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6566583B1 (en) * | 1997-06-04 | 2003-05-20 | Daniel Facciotti | Schizochytrium PKS genes |
| US20070244192A1 (en) * | 1999-01-14 | 2007-10-18 | Martek Biosciences Corporation | Plant seed oils containing polyunsaturated fatty acids |
| US7211418B2 (en) | 1999-01-14 | 2007-05-01 | Martek Biosciences Corporation | PUFA polyketide synthase systems and uses thereof |
| US8003772B2 (en) | 1999-01-14 | 2011-08-23 | Martek Biosciences Corporation | Chimeric PUFA polyketide synthase systems and uses thereof |
| US7217856B2 (en) * | 1999-01-14 | 2007-05-15 | Martek Biosciences Corporation | PUFA polyketide synthase systems and uses thereof |
| US7247461B2 (en) * | 1999-01-14 | 2007-07-24 | Martek Biosciences Corporation | Nucleic acid molecule encoding ORFA of a PUFA polyketide synthase system and uses thereof |
| TWI324181B (en) | 2001-04-16 | 2010-05-01 | Martek Biosciences Corp | Product and process for transformation of thraustochytriales microorganisms |
| ES2529572T3 (es) | 2004-04-22 | 2015-02-23 | Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation | Síntesis de ácidos grasos poliinsaturados de cadena larga por células recombinantes |
| PL1756280T3 (pl) | 2004-04-22 | 2015-04-30 | Commw Scient Ind Res Org | Synteza długołańcuchowych wielonienasyconych kwasów tłuszczowych w komórkach rekombinowanych |
| EP2001277B9 (en) * | 2006-03-15 | 2014-11-26 | DSM IP Assets B.V. | Polyunsaturated fatty acid production in heterologous organisms using pufa polyketide synthase systems |
| RU2009111266A (ru) | 2006-08-29 | 2010-10-10 | Коммонвелт Сайентифик энд Индастриал Рисерч Организейшн (AU) | Синтез жирных кислот |
| CN101903513B (zh) * | 2007-01-12 | 2013-08-21 | 科罗拉多大学董事会法人 | 增强微生物对产生的有机化学物质的耐受性的组合物和方法 |
| EP3546588A3 (en) | 2007-06-01 | 2019-12-18 | Corbion Biotech, Inc. | Recombinant microalgal cell and method of producing lipids using said cell |
| US8048624B1 (en) | 2007-12-04 | 2011-11-01 | Opx Biotechnologies, Inc. | Compositions and methods for 3-hydroxypropionate bio-production from biomass |
| WO2009097331A1 (en) * | 2008-01-28 | 2009-08-06 | The Board Of Regents Of The University Of Oklahoma | Very long chain polyunsaturated fatty acids, methods of production, and uses |
| WO2010019813A2 (en) * | 2008-08-13 | 2010-02-18 | Sapphire Energy, Inc. | Production of fatty actds by genetically modified photosynthetic organisms |
| WO2010033921A2 (en) * | 2008-09-19 | 2010-03-25 | President And Fellows Of Harvard College | Photoautotrophic adipogenesis technology (phat) |
| CN102317459A (zh) | 2008-11-18 | 2012-01-11 | 联邦科学技术研究组织 | 产生ω-3脂肪酸的酶和方法 |
| CA2745129C (en) | 2008-11-28 | 2019-05-07 | Solazyme, Inc. | Production of tailored oils in heterotrophic microorganisms |
| EP2379703A4 (en) * | 2008-12-19 | 2013-01-23 | Alpha J Res Ltd Partnership | OPTIMIZED PREPARATION OF ALGAE PRODUCTS BY DECONTROLLING CELL PROLIFERATION AND PRODUCTION OF ALGAE PRODUCT |
| TW201028472A (en) * | 2009-01-13 | 2010-08-01 | Alpha J Res Ltd Partnership | Use of plant growth regulators to enhance algae growth for the production of added value products |
| CN102648207A (zh) | 2009-03-16 | 2012-08-22 | 马太克生物科学公司 | 在网粘菌门微生物中产生蛋白质 |
| JP2012529277A (ja) | 2009-06-08 | 2012-11-22 | ロザムステッド リサーチ リミテッド | 新規の脂肪酸伸長成分およびその使用 |
| WO2011002802A2 (en) * | 2009-06-30 | 2011-01-06 | Solae, Llc | Omega-3 fatty acid enriched baked foods and bar compositions |
| CN102695799A (zh) | 2009-09-27 | 2012-09-26 | Opx生物工艺学公司 | 用于制备3-羟基丙酸和其它产物的方法 |
| US8809027B1 (en) | 2009-09-27 | 2014-08-19 | Opx Biotechnologies, Inc. | Genetically modified organisms for increased microbial production of 3-hydroxypropionic acid involving an oxaloacetate alpha-decarboxylase |
| JP5838473B2 (ja) * | 2009-12-28 | 2016-01-06 | サノフィ ワクチン テクノロジーズ エス．エー．エス． | 微細藻類におけるヘマグルチニン−ノイラミニダーゼタンパク質の産生方法 |
| IN2012DN06277A (zh) * | 2009-12-28 | 2015-09-25 | Dsm Ip Assets Bv | |
| EP2519332B1 (en) | 2009-12-30 | 2014-03-05 | BASF Pharma (Callanish) Limited | Simulated moving bed chromatographic separation process for the purification of polyunsaturated fatty acids |
| UY33171A (es) * | 2010-01-07 | 2011-07-29 | Basf Agro B V Arnhem Nl | Plantas tolerantes a herbicidas |
| IN2012DN06617A (zh) * | 2010-01-27 | 2015-10-23 | Opx Biotechnologies Inc | |
| BR112012019295A2 (pt) | 2010-02-01 | 2018-06-12 | Suntory Holdings Limited | polinucleotídeo, proteína, vetor, transformante não humano, não humano, método para a produção de uma composição de lipídio ou ácido graxo, e, produto alimentício, farmacêutico, cosmético ou saponáceo. |
| US8372465B2 (en) | 2010-02-17 | 2013-02-12 | Bunge Oils, Inc. | Oil compositions of stearidonic acid |
| TW201144442A (en) * | 2010-05-17 | 2011-12-16 | Dow Agrosciences Llc | Production of DHA and other LC-PUFAs in plants |
| US11236351B2 (en) * | 2010-05-17 | 2022-02-01 | Dow Agrosciences Llc | Production of DHA and other LC PUFAs in plants |
| AU2011257983B2 (en) | 2010-05-28 | 2016-02-11 | Corbion Biotech, Inc. | Food compositions comprising tailored oils |
| AU2011269059B2 (en) * | 2010-06-25 | 2016-01-28 | Basf Plant Science Company Gmbh | Acyltransferases and uses therof in fatty acid production |
| AU2013202057B2 (en) * | 2010-06-25 | 2016-01-28 | Basf Plant Science Company Gmbh | Acyltransferases and uses therof in fatty acid production |
| MX354145B (es) | 2010-11-03 | 2018-02-14 | Terravia Holdings Inc | Aceites microbianos con puntos de fluidez reducidos, fluidos dielectricos producidos a partir de estos y metodos relacionados. |
| BR112013019699A2 (pt) | 2011-02-02 | 2017-12-19 | Solazyme Inc | método de produção de um óleo natural, óleo natural, produto, célula recombinante, célula de microrganismo, e, alimento |
| CN102250864B (zh) * | 2011-05-03 | 2013-03-20 | 中国农业大学 | 亚油酸异构酶在脱氢和异构方面的双重用途 |
| CA2834698A1 (en) | 2011-05-06 | 2012-11-15 | Solazyme, Inc. | Genetically engineered microorganisms that metabolize xylose |
| GB201111595D0 (en) | 2011-07-06 | 2011-08-24 | Equateq Ltd | Improved process |
| GB201111594D0 (en) | 2011-07-06 | 2011-08-24 | Equateq Ltd | New improved process |
| TW201307553A (zh) * | 2011-07-26 | 2013-02-16 | Dow Agrosciences Llc | 在植物中生產二十二碳六烯酸（ｄｈａ）及其他長鏈多元不飽和脂肪酸（ｌｃ－ｐｕｆａ）之技術 |
| KR101437308B1 (ko) * | 2011-08-04 | 2014-09-03 | 산토리 홀딩스 가부시키가이샤 | 지방산 쇄 길이 연장 촉진 활성을 갖는 단백질, 이것을 코드하는 유전자 및 그 용도 |
| JPWO2013077420A1 (ja) * | 2011-11-25 | 2015-04-27 | 独立行政法人農業生物資源研究所 | 植物の形質転換体、植物の形質転換方法、並びに該方法に用いられるベクター |
| BR112014025719A8 (pt) | 2012-04-18 | 2017-10-03 | Solazyme Inc | Óleos customizados |
| US9719114B2 (en) | 2012-04-18 | 2017-08-01 | Terravia Holdings, Inc. | Tailored oils |
| DE102012207921A1 (de) | 2012-05-11 | 2013-11-14 | Evonik Industries Ag | Mehrstufiges Syntheseverfahren mit Synthesegas |
| NZ631702A (en) | 2012-06-15 | 2017-01-27 | Grains Res & Dev Corp | Production of long chain polyunsaturated fatty acids in plant cells |
| CN104718282A (zh) * | 2012-08-10 | 2015-06-17 | Opx生物工艺学公司 | 用于生产脂肪酸和脂肪酸衍生产物的微生物及方法 |
| GB201300354D0 (en) * | 2013-01-09 | 2013-02-20 | Basf Pharma Callanish Ltd | Multi-step separation process |
| US9809804B2 (en) | 2013-01-23 | 2017-11-07 | Iowa State University Research Foundation, Inc. | Materials and methods for characterizing and using KASIII for production of bi-functional fatty acids |
| US10184140B2 (en) | 2013-01-23 | 2019-01-22 | Iowa State University Research Foundation, Inc. | Materials and methods for production of bi-functional fatty acids in recombinant bacteria |
| US9567615B2 (en) | 2013-01-29 | 2017-02-14 | Terravia Holdings, Inc. | Variant thioesterases and methods of use |
| US9816079B2 (en) | 2013-01-29 | 2017-11-14 | Terravia Holdings, Inc. | Variant thioesterases and methods of use |
| US9290749B2 (en) | 2013-03-15 | 2016-03-22 | Solazyme, Inc. | Thioesterases and cells for production of tailored oils |
| US10047383B2 (en) | 2013-03-15 | 2018-08-14 | Cargill, Incorporated | Bioproduction of chemicals |
| US9783836B2 (en) | 2013-03-15 | 2017-10-10 | Terravia Holdings, Inc. | Thioesterases and cells for production of tailored oils |
| CA2905602A1 (en) | 2013-03-15 | 2014-09-18 | Sarah M. Hoyt | Flash evaporation for product purification and recovery |
| US11408013B2 (en) | 2013-07-19 | 2022-08-09 | Cargill, Incorporated | Microorganisms and methods for the production of fatty acids and fatty acid derived products |
| EP3022310B1 (en) | 2013-07-19 | 2019-10-16 | Cargill, Incorporated | Microorganisms and methods for the production of fatty acids and fatty acid derived products |
| SG10201802834YA (en) | 2013-10-04 | 2018-05-30 | Terravia Holdings Inc | Tailored oils |
| KR20160126969A (ko) | 2013-11-01 | 2016-11-02 | 코나겐 인크. | 아실-CoA의 생합성 제조를 위한 아실-CoA 신테타제의 사용 방법 |
| TW201525136A (zh) | 2013-11-26 | 2015-07-01 | Dow Agrosciences Llc | 利用破囊壺菌ＰＵＦＡ合成酶於油籽作物中生成ω－３長鏈多不飽和脂肪酸 |
| BR112016012371B1 (pt) | 2013-12-05 | 2023-03-28 | Genomatica, Inc | Célula bacteriana recombinante para a produção de uma amina graxa, cultura de células e método de produção de uma amina graxa |
| US9725399B2 (en) | 2013-12-18 | 2017-08-08 | Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation | Lipid comprising long chain polyunsaturated fatty acids |
| ES2721269T3 (es) | 2014-01-28 | 2019-07-30 | Dsm Ip Assets Bv | Factores para la producción y acumulación de ácidos grasos poliinsaturados (PUFA) obtenidos con PUFA sintasas |
| KR102527795B1 (ko) | 2014-06-27 | 2023-05-02 | 커먼웰쓰 사이언티픽 앤 인더스트리알 리서치 오거니제이션 | 도코사펜타에노산을 포함하는 지질 |
| CN106574255A (zh) | 2014-07-10 | 2017-04-19 | 泰拉瑞亚控股公司 | 酮脂酰acp合酶基因及其用途 |
| WO2016014968A1 (en) | 2014-07-24 | 2016-01-28 | Solazyme, Inc. | Variant thioesterases and methods of use |
| EP2993228B1 (en) | 2014-09-02 | 2019-10-09 | Cargill, Incorporated | Production of fatty acid esters |
| CN107208103A (zh) | 2014-09-18 | 2017-09-26 | 泰拉瑞亚控股公司 | 酰基‑acp硫酯酶及其突变体 |
| US10570427B2 (en) * | 2014-10-31 | 2020-02-25 | Lanzatech New Zealand Limited | Fermentation process for the production of lipids |
| WO2016137897A1 (en) * | 2015-02-24 | 2016-09-01 | William Marsh Rice University | Kasiii-free fa synthesis |
| US10793837B2 (en) | 2015-06-06 | 2020-10-06 | Dsm Ip Assets B.V | Production of polyunsaturated fatty acids (PUFAs) using a novel modular docosahexaenoic acid (DHA) synthase |
| WO2017117425A1 (en) * | 2015-12-31 | 2017-07-06 | Synthetic Genomics, Inc. | Expression of type i fatty acid synthase genes in eukaryotic algae |
| WO2017120473A1 (en) | 2016-01-07 | 2017-07-13 | Conagen Inc. | Methods of making capsinoids by biosynthetic processes |
| AU2017299615A1 (en) | 2016-07-19 | 2019-01-17 | Conagen Inc. | Method for the microbial production of specific natural capsaicinoids |
| CN110494566A (zh) | 2017-02-02 | 2019-11-22 | 嘉吉公司 | 产生c6-c10脂肪酸衍生物的经遗传修饰的细胞 |
| WO2019023524A2 (en) | 2017-07-27 | 2019-01-31 | University Of Florida Research Foundation, Incorporated | CYANOBACTERIAL HOSTS AND METHODS FOR PRODUCING CHEMICALS |
| KR102318983B1 (ko) * | 2018-02-21 | 2021-11-01 | 경상북도 | 신규한 1-octen-3-ol을 생산하는 형질전환 효모 및 그 제조방법 |
| WO2019164294A1 (ko) * | 2018-02-21 | 2019-08-29 | 경상북도 | 신규한 1-octen-3-ol을 생산하는 형질전환 효모 및 그 제조방법 |
| CN112661821B (zh) * | 2021-01-21 | 2022-04-12 | 江南大学 | 一种柠檬酸转运蛋白及其在脂质合成中的应用 |
| WO2023076901A2 (en) * | 2021-10-25 | 2023-05-04 | Purdue Research Foundation | Heterodimeric benzaldehyde synthase, methods of producing, and uses thereof |
| WO2023144707A1 (en) | 2022-01-25 | 2023-08-03 | Dsm Ip Assets B.V. | Media refinement and nutrient feeding approaches to increase polyunsaturated fatty acid production |
Family Cites Families (54)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB8317248D0 (en) * | 1983-06-24 | 1983-07-27 | Wyeth John & Brother Ltd | Fat compositions |
| US5246841A (en) * | 1986-12-26 | 1993-09-21 | Sagami Chemical Research Center | Microbial process for production of eicosapentaenoic acid |
| US5130242A (en) * | 1988-09-07 | 1992-07-14 | Phycotech, Inc. | Process for the heterotrophic production of microbial products with high concentrations of omega-3 highly unsaturated fatty acids |
| US5340742A (en) * | 1988-09-07 | 1994-08-23 | Omegatech Inc. | Process for growing thraustochytrium and schizochytrium using non-chloride salts to produce a microfloral biomass having omega-3-highly unsaturated fatty acids |
| US5601860A (en) * | 1990-11-30 | 1997-02-11 | American Home Products Corporation | Corandomized fat compositions for infant formulas |
| US5639790A (en) * | 1991-05-21 | 1997-06-17 | Calgene, Inc. | Plant medium-chain thioesterases |
| WO1993011245A1 (en) * | 1991-12-04 | 1993-06-10 | E.I. Du Pont De Nemours And Company | Fatty acid desaturase genes from plants |
| WO1993023545A1 (en) | 1992-05-15 | 1993-11-25 | Sagami Chemical Research Center | Gene which codes for eicosapentaenoic acid synthetase group and process for producing eicosapentaenoic acid |
| US5683898A (en) * | 1992-05-15 | 1997-11-04 | Sagami Chemical Research Center | Gene coding for eicosapentaenoic acid synthesizing enzymes and process for production of eicosapentaenoic acid |
| US5798259A (en) * | 1992-05-15 | 1998-08-25 | Sagami Chemical Research Center | Gene coding for eicosapentaenoic acid synthesizing enzymes and process for production of eicosapentaenoic acid |
| US5310242A (en) | 1992-09-28 | 1994-05-10 | Golder Kimberly A | Portable infant seat |
| US6372965B1 (en) * | 1992-11-17 | 2002-04-16 | E.I. Du Pont De Nemours And Company | Genes for microsomal delta-12 fatty acid desaturases and hydroxylases from plants |
| DE4323727A1 (de) | 1993-07-15 | 1995-03-09 | Boehringer Mannheim Gmbh | Verfahren zur Identifizierung von menschlichen und tierischen Zellen mit der Fähigkeit zu unbegrenzter Proliferation oder zur Tumorbildung |
| US5672491A (en) * | 1993-09-20 | 1997-09-30 | The Leland Stanford Junior University | Recombinant production of novel polyketides |
| EP0831149A4 (en) | 1995-01-13 | 2000-12-06 | Sagami Chem Res | GENES CODING FOR THE GROUP OF ENZYMES FOR BIOSYNTHESIS OF EICOSAPENTIC ACID AND METHOD FOR PRODUCING EICOSAPENTIC ACID |
| US6582941B1 (en) | 1995-04-17 | 2003-06-24 | Japan As Represented By Director-General Of Agency Of Industrial Science And Technology | Microorganisms capable of producing highly unsaturated fatty acids and process for producing highly unsaturated fatty acids by using the microorganisms |
| AR006830A1 (es) * | 1996-04-26 | 1999-09-29 | Du Pont | Aceite de soja con alta estabilidad oxidativa |
| AU727694B2 (en) | 1996-07-10 | 2000-12-21 | Sagami Chemical Research Center | Process for producing icosapentaenoic acid by genetic recombination |
| US6033883A (en) * | 1996-12-18 | 2000-03-07 | Kosan Biosciences, Inc. | Production of polyketides in bacteria and yeast |
| SA98190002B1 (ar) * | 1997-03-28 | 2006-06-20 | ذي يونيفيرسيتي اوف تننيسي ريسيرش كوربوريشن | استخدام أحماض دهنية تحتوي على عدة روابط غير مشبعة polyunsaturated fatty acids لتقليل حدوث الالتهاب المعوي القولوني الناخر incidence of necrotizing enterocolitis |
| US6432684B1 (en) * | 1997-04-11 | 2002-08-13 | Abbott Laboratories | Human desaturase gene and uses thereof |
| PT1598422E (pt) | 1997-04-11 | 2013-04-03 | Abbott Lab | Métodos e composições para síntese de ácidos gordos poliinsaturados de cadeia longa em plantas |
| US6051754A (en) * | 1997-04-11 | 2000-04-18 | Abbott Laboratories | Methods and compositions for synthesis of long chain poly-unsaturated fatty acids in plants |
| IL133272A0 (en) * | 1997-06-04 | 2001-04-30 | Calgene Llc | Production of polyunsaturated fatty acid by expression of polyketide-like synthesis genes in plants |
| US6566583B1 (en) * | 1997-06-04 | 2003-05-20 | Daniel Facciotti | Schizochytrium PKS genes |
| US6013665A (en) * | 1997-12-16 | 2000-01-11 | Abbott Laboratories | Method for enhancing the absorption and transport of lipid soluble compounds using structured glycerides |
| US6677145B2 (en) * | 1998-09-02 | 2004-01-13 | Abbott Laboratories | Elongase genes and uses thereof |
| US7217856B2 (en) * | 1999-01-14 | 2007-05-15 | Martek Biosciences Corporation | PUFA polyketide synthase systems and uses thereof |
| US20070244192A1 (en) | 1999-01-14 | 2007-10-18 | Martek Biosciences Corporation | Plant seed oils containing polyunsaturated fatty acids |
| US7211418B2 (en) * | 1999-01-14 | 2007-05-01 | Martek Biosciences Corporation | PUFA polyketide synthase systems and uses thereof |
| US7247461B2 (en) * | 1999-01-14 | 2007-07-24 | Martek Biosciences Corporation | Nucleic acid molecule encoding ORFA of a PUFA polyketide synthase system and uses thereof |
| US7271315B2 (en) | 1999-01-14 | 2007-09-18 | Martek Biosciences Corporation | PUFA polyketide synthase systems and uses thereof |
| US8003772B2 (en) * | 1999-01-14 | 2011-08-23 | Martek Biosciences Corporation | Chimeric PUFA polyketide synthase systems and uses thereof |
| CA2411247A1 (en) | 2000-06-08 | 2001-12-13 | Miami University | Fatty acid elongase 3-ketoacyl coa synthase polypeptides |
| US20040010817A1 (en) | 2000-07-21 | 2004-01-15 | Washington State University Research Foundation | Plant acyl-CoA synthetases |
| DK1322752T3 (da) | 2000-09-28 | 2010-07-19 | Bioriginal Food & Science Corp | FAD4, FAD5, FAD5-2, og FAD6-medlemmer af fedtsyredesaturasefamilien og anvendelser deraf |
| TWI324181B (en) * | 2001-04-16 | 2010-05-01 | Martek Biosciences Corp | Product and process for transformation of thraustochytriales microorganisms |
| TWI426127B (zh) | 2001-04-16 | 2014-02-11 | Dsm Ip Assets Bv | 多不飽和脂肪酸（ｐｕｆａ）聚乙醯合成酶系統及其用途（三） |
| EP1390507A2 (en) | 2001-05-21 | 2004-02-25 | Ecopia Biosciences Inc. | Genes and proteins involved in the biosynthesis of enediyne ring structures |
| US20040005672A1 (en) | 2002-02-22 | 2004-01-08 | Santi Daniel V. | Heterologous production of polyketides |
| GB2385852A (en) * | 2002-02-27 | 2003-09-03 | Rothamsted Ex Station | Delta 6-desaturases from Primulaceae |
| EP1487985B1 (en) * | 2002-03-16 | 2011-01-12 | The University Of York | Transgenic plants expressing enzymes involved in fatty acid biosynthesis |
| US20040172682A1 (en) | 2003-02-12 | 2004-09-02 | Kinney Anthony J. | Production of very long chain polyunsaturated fatty acids in oilseed plants |
| EP1623008B1 (en) | 2003-03-26 | 2014-07-30 | DSM IP Assets B.V. | Pufa polyketide synthase systems and uses thereof |
| EP2390313B1 (de) | 2003-03-31 | 2016-05-11 | University Of Bristol | Neue pflanzliche Acyltransferase spezifisch für langkettige mehrfach ungesättigte Fettsäuren |
| US7125672B2 (en) | 2003-05-07 | 2006-10-24 | E. I. Du Pont De Nemours And Company | Codon-optimized genes for the production of polyunsaturated fatty acids in oleaginous yeasts |
| US7208590B2 (en) * | 2003-07-15 | 2007-04-24 | Abbott Laboratories | Genes involved in polyketide synthase pathways and uses thereof |
| DE102004017370A1 (de) * | 2004-04-08 | 2005-10-27 | Nutrinova Nutrition Specialties & Food Ingredients Gmbh | PUFA-PKS Gene aus Ulkenia |
| DE102004060340A1 (de) | 2004-07-16 | 2006-02-09 | Basf Plant Science Gmbh | Verfahren zur Erhöhung des Gehalts an mehrfach ungesättigten langkettigen Fettsäuren in transgenen Organismen |
| US8362319B2 (en) | 2004-09-20 | 2013-01-29 | Basf Plant Science Gmbh | Arabidopsis genes encoding proteins involved in sugar and lipid metabolism and methods of use |
| GB0421937D0 (en) * | 2004-10-02 | 2004-11-03 | Univ York | Acyl CoA synthetases |
| WO2006135866A2 (en) * | 2005-06-10 | 2006-12-21 | Martek Biosciences Corporation | Pufa polyketide synthase systems and uses thereof |
| EP2001277B9 (en) | 2006-03-15 | 2014-11-26 | DSM IP Assets B.V. | Polyunsaturated fatty acid production in heterologous organisms using pufa polyketide synthase systems |
| FR2904328B1 (fr) * | 2006-07-27 | 2008-10-24 | St Microelectronics Sa | Depot par adsorption sous un champ electrique |
-
2007
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-
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- 2013-10-22 JP JP2013219079A patent/JP2014087338A/ja not_active Withdrawn
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US9540666B2 (en) | 2009-03-19 | 2017-01-10 | Dsm Ip Assets B.V. | Polyunsaturated fatty acid synthase nucleic acid molecules and polypeptides, compositions, and methods of making and uses thereof |
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| JP5551584B2 (ja) | キメラｐｕｆａポリケチドシンターゼシステムおよびその使用 | |
| US20070244192A1 (en) | Plant seed oils containing polyunsaturated fatty acids | |
| CN101437950A (zh) | Pufa聚酮合酶系统及其用途 | |
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| AU2013251201A1 (en) | Polyunsaturated fatty acid production in heterologous organisms using pufa polyketide synthase systems |
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