CN102695799A - 用于制备3-羟基丙酸和其它产物的方法 - Google Patents
用于制备3-羟基丙酸和其它产物的方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN102695799A CN102695799A CN2010800536926A CN201080053692A CN102695799A CN 102695799 A CN102695799 A CN 102695799A CN 2010800536926 A CN2010800536926 A CN 2010800536926A CN 201080053692 A CN201080053692 A CN 201080053692A CN 102695799 A CN102695799 A CN 102695799A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- mikrobe
- genetic modification
- hydroxy
- genetically modified
- propionic acid
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
- A61L15/00—Chemical aspects of, or use of materials for, bandages, dressings or absorbent pads
- A61L15/16—Bandages, dressings or absorbent pads for physiological fluids such as urine or blood, e.g. sanitary towels, tampons
- A61L15/22—Bandages, dressings or absorbent pads for physiological fluids such as urine or blood, e.g. sanitary towels, tampons containing macromolecular materials
- A61L15/24—Macromolecular compounds obtained by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds; Derivatives thereof
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P11/00—Preparation of sulfur-containing organic compounds
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
- C12M47/00—Means for after-treatment of the produced biomass or of the fermentation or metabolic products, e.g. storage of biomass
- C12M47/12—Purification
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
- C12N9/0008—Oxidoreductases (1.) acting on the aldehyde or oxo group of donors (1.2)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/10—Transferases (2.)
- C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P1/00—Preparation of compounds or compositions, not provided for in groups C12P3/00 - C12P39/00, by using microorganisms or enzymes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
- C12P7/40—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a carboxyl group including Peroxycarboxylic acids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
- C12P7/40—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a carboxyl group including Peroxycarboxylic acids
- C12P7/42—Hydroxy-carboxylic acids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
- C12P7/40—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a carboxyl group including Peroxycarboxylic acids
- C12P7/52—Propionic acid; Butyric acids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
- C12P7/62—Carboxylic acid esters
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y102/00—Oxidoreductases acting on the aldehyde or oxo group of donors (1.2)
- C12Y102/04—Oxidoreductases acting on the aldehyde or oxo group of donors (1.2) with a disulfide as acceptor (1.2.4)
- C12Y102/04001—Pyruvate dehydrogenase (acetyl-transferring) (1.2.4.1)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y207/00—Transferases transferring phosphorus-containing groups (2.7)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y301/00—Hydrolases acting on ester bonds (3.1)
- C12Y301/02—Thioester hydrolases (3.1.2)
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02E—REDUCTION OF GREENHOUSE GAS [GHG] EMISSIONS, RELATED TO ENERGY GENERATION, TRANSMISSION OR DISTRIBUTION
- Y02E50/00—Technologies for the production of fuel of non-fossil origin
- Y02E50/10—Biofuels, e.g. bio-diesel
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
- Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
- Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
- Y02P20/52—Improvements relating to the production of bulk chemicals using catalysts, e.g. selective catalysts
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Sustainable Development (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Materials Engineering (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Virology (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
- Polymers & Plastics (AREA)
- Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
- Low-Molecular Organic Synthesis Reactions Using Catalysts (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Paints Or Removers (AREA)
Abstract
本发明涉及经代谢工程改造的微生物菌株,如细菌菌株,其中对用于化学产物制备的丙二酰-CoA具有提高的利用率,所述化学产物包括3-羟基丙酸。
Description
相关申请的交叉引用
本申请要求2009年9月27日提交的第61/246,141号美国临时申请、2010年1月27日提交的第61/298,844号美国临时申请和2010年4月6日提交的第61/321,480号美国临时申请的优先权。各申请的全部内容均特此以引用的方式并入本文。
技术领域
本发明涉及经代谢工程改造的微生物,如细菌菌株,其中对用于化学产品制备的丙二酰-CoA具有提高的利用率,所述化学产品可包括化学品3-羟基丙酸(3-HP)和由3-HP制备的产品。所述经代谢工程改造的微生物可适应于表现出对3-HP提高的耐受性。另外,进行遗传修饰以提供一种或多种3-HP生物合成途径,如包含被鉴定为3-HP耐受发生复合体(toleragenic complex)的复合体的一种或多种遗传修饰的微生物。
序列表
本申请包含已经通过EFS-Web以ASCII格式提交的序列表并且其全文特此以引用的方式并入本文。创建于2010年9月24日的所述ASCII文件被命名为34246744.txt并且大小为2,228,808字节。
背景技术
随着石油烃产品供给下降并且其成本最终上升的情势日益为人所接受,开发和改善工业微生物系统导致化学品和燃料生产的兴趣有所增加。这些工业微生物系统可完全地或部分地取代石油烃产品对于某些化学品生产的应用。
许多化学品通过这样的方式进行制备,其范围从抗生素和抗疟疾药品到精细化学品到燃料如乙醇。微生物发酵的商业目标包括目标化学产物滴度、生产速度和产率的提高。当发酵事件中的整体单位生产率提高之时,除了生产速度和其它经济因素如资金成本以外,这还可以对产率有积极影响。
用于这类制备的一个候选化学品是3-羟基丙酸(“3-HP”,CAS第503-66-2号),其可被转化为广泛用于工业品和消费品的聚合物的大量基本构造模块。遗憾的是,以前用微生物合成3-HP来实现商业上可行滴度的尝试显示所使用的微生物被远低于已测定的商业可行滴度的3-HP浓度所抑制。
尽管存在对通过提高特定化学产品的产量和/或生产率来改善微生物发酵的经济性的强烈兴趣,对于使用商业上可行的发酵方法在发酵微生物细胞中提高向所需目标化学产品的净转化率仍然存在着需求。更特别地,有待解决的问题包括如何在经修饰的微生物中提高单位生产率和容积生产率,例如提高至有重要经济意义的水平,所述经修饰的微生物适应于在化学产品如3-羟基丙酸(3-HP)的微生物制备路径中以丙二酰-CoA作为底物制备该化学产品。
发明内容
根据一个实施方案,本发明涉及制备基于丙烯酸的消费品的方法,所述方法包括i)将碳源与微生物细胞培养物结合以制备3-羟基丙酸,其中a)所述细胞培养物包含脂肪酸合成酶的抑制剂或所述微生物经遗传修饰导致所述生物体脂肪酸合成酶途径中降低的酶活性;或b)其中所述微生物通过引入编码具有单功能丙二酰-CoA还原酶活性的多肽的外源核酸序列进行遗传修饰导致所述生物体的丙二酰-CoA还原酶(mcr)途径中提高酶活性;或c)以高于0.05克每克微生物细胞干重每小时的单位生产率或以高于0.50克每升每小时的容积生产率制备所述3-羟基丙酸;ii)将所述3-羟基丙酸转化成为丙烯酸;以及iii)将所述丙烯酸加工成为消费产品。在各个方面,所述碳源具有约1.0×10-14或更高的碳14与碳12比率。
根据本发明的所述碳源可以主要为葡萄糖、蔗糖、果糖、右旋糖、乳糖或其组合。或者,所述碳源是甘油。
在特定的实施方案中,所述细胞培养物包含脂肪酸合成酶的抑制剂或所述微生物经遗传修饰导致所述生物体脂肪酸合成酶途径中降低的酶活性。例如,脂肪酸合成酶的抑制剂可选自硫乳霉素、三氯生、浅蓝菌素、噻吩并二氮杂硼杂因(thienodiazaborine)、异烟肼及其类似物。
本发明的微生物可通过引入编码具有单功能丙二酰-CoA还原酶活性的多肽的异源核酸序列而进行遗传修饰以用于该生物体的丙二酰-CoA还原酶(mcr)途径中提高的酶活性。在各个实施方案中,所述单功能丙二酰-CoA还原酶是非NADPH依赖的。
在各个实施方案中,根据本发明,所述3-羟基丙酸以高于0.05克每克微生物干重每小时的单位生产率或以高于0.05克每升每小时的容积生产率进行制备。
本发明包括其中所述细胞培养物包含经遗传修饰的微生物的实施方案。所述经遗传修饰的微生物可经修饰以具有选自以下的性状:所述生物体的脂肪酸合成酶途径中降低的酶活性、所述生物体的丙二酰-CoA还原酶途径中具有提高的酶活性、对3-羟基丙酸升高的耐受性、所述生物体的NADPH依赖性转氢酶途径中升高的酶活性、提高的细胞内重碳酸盐水平、所述生物体的乙酰CoA羧化酶途径中提高的酶活性及其组合。例如,所述经遗传修饰的微生物可经修饰以在所述生物体的脂肪酸合成酶途径中具有降低的酶活性。或者,所述降低的酶活性是选自下列的酶的酶活性降低:β-酮脂酰基-ACP还原酶、3-羟脂酰-CoA脱水酶、烯酰基-ACP还原酶和硫酯酶。在各个不同方面,所述生物体的脂肪酸合成酶途径中降低的酶活性通过引入编码诱导型启动子的异源核酸序列而产生,所述启动子可操作地连接于编码所述脂肪酸合成酶途径中的酶或其同源物的序列,或者通过引入编码所述脂肪酸合成酶途径中具有降低活性的酶或其同源物的异源核酸序列而产生。在各个不同方面,所述脂肪酸合成酶途径中的酶或其同源物是具有温度敏感性β-酮脂酰基-ACP还原酶活性或温度敏感性烯酰基-ACP还原酶活性的多肽。在多种情况下,所述经遗传修饰的微生物经修饰以用于所述生物体的丙二酰-CoA还原酶途径中提高的酶活性。
在特定的实施方案中,丙二酰-CoA还原酶(mcr)途径中的酶活性的提高通过引入异源核酸序列而产生,所述异源核酸序列编码具有双功能丙二酰-CoA还原酶活性或单功能丙二酰-CoA还原酶活性的多肽。所述异源核酸序列可选自与选自SEQ ID NO.780-789的序列具有至少70%同源性的序列。
在各个实施方案中,所述遗传修饰的微生物经修饰以对3-羟基丙酸具有提高的耐受性。对3-羟基丙酸耐受性的提高可发生于所述3-HP耐受发生复合体(3HPTGC)复合物的一种或多种成分中,或者其中所述3-羟基丙酸耐受性的提高是由提供所述3HPTGC的A组和B组各自的至少一种遗传修饰而导致的。所述一种或多种成分可选自CynS、CynT、AroG、SpeD、SpeE、SpeF、ThrA、Asd、CysM、IroK、IlvA及其同源物。在各个实施方案中,所述修饰是一种或多种3HPTGC阻遏基因的破坏。所述阻遏基因可选自tyrR、trpR、metJ、purR、lysR、nrdR及其同源物。
所述生物体的NADPH依赖性转氢酶途径中酶活性的提高可通过引入编码多肽的异源核酸序列而产生,所述多肽与选自SEQ ID NO.776或778的序列具有至少70%的同源性。在各个实施方案中,所述提高的细胞内重碳酸盐水平通过引入编码具有氰酸酶和/或碳酸酐酶活性的多肽的异源核酸序列而产生。所述异源核酸序列可选自与选自SEQ ID NO.337的序列具有至少70%同源性的序列。
所述生物体的乙酰CoA羧化酶途径中酶活性的提高通过引入编码多肽的异源核酸序列而产生,所述多肽与选自SEQ ID NO.768-775的序列具有至少70%的同源性。
所述经遗传修饰的细菌可被进一步修饰以降低乳酸脱氢酶、磷酸乙酰转移酶、丙酮酸氧化酶或丙酮酸-甲酸裂解酶及其组合的活性。
本发明的方法可进一步包括通过在存在叔胺的情况下将3-羟基丙酸从所述培养物中提取而将3-羟基丙酸从所述细胞培养物中分离和/或纯化。在各种情况下,3-羟基丙酸以高于0.05克每克微生物细胞干重每小时的单位生产率或以高于0.50克每升每小时的容积生产率进行制备。
本发明的方法可包括生产消费产品,诸如尿布、地毯、涂料、粘合剂和丙烯酸玻璃。本发明包括生物制备的3-羟基丙酸,其中所述3-羟基丙酸根据本发明的方法制备。这些3-羟基丙酸可基本上不含化学催化剂(包括基于钼和/或钒的催化剂)。所述3-羟基丙酸根据本发明的方法进行制备,其可具有约1.0×10-14或更高的碳-14与碳-12比率。在各个方面,所述3-羟基丙酸包含低于约10%的源自石油的碳。另外,本发明的3-羟基丙酸可包含与其制备方法相关的残留量的有机物质。在各个实施方案中,所述3-羟基丙酸包含残留量的有机物质,其量介于所述3-羟基丙酸的百万分之1与百万分之1,000之间。
丙烯酸和由丙烯酸制备的聚合物(在根据本发明的方法进行生产的情况下)也包括在本发明之内。本发明还涵盖了由所述聚合物获得的产品,其包括商业产品和消费产品。例如,包括尿布、地毯、涂料、粘合剂和丙烯酸玻璃。
另外,本发明涵盖了用于生物生产根据权利要求40所述的丙烯酸的系统,所述系统包括:对生物质进行糖化的储罐;用于将糖化产物送至发酵罐的管线(任选地经过预发酵罐);适用于微生物细胞培养的发酵罐;用于从所述发酵罐将内容物排放至提取和/或分离容器的管线;适用于将3-羟基丙酸从细胞培养物废料中移除的提取和/或分离容器;用于将3-羟基丙酸转移至脱水容器的管线;以及适用于将3-羟基丙酸转化成为丙烯酸的脱水容器。在各个实施方案中,所述系统进一步包括一个或多个预发酵罐、蒸馏塔、离心容器、反萃取柱、混合容器或其组合。在各个实施方案中,所述系统具有每年至少1吨丙烯酸的最低产能。
经遗传修饰的微生物在本发明的范围之内,其中所述微生物能够以选自高于0.05g/gDCW-hr、0.08g/gDCW-hr、高于0.1g/gDCW-hr、高于0.13g/gDCW-hr、高于0.15g/gDCW-hr、高于0.175g/gDCW-hr、高于0.2g/gDCW-hr、高于0.25g/gDCW-hr、高于0.3g/gDCW-hr、高于0.35g/gDCW-hr、高于0.4g/gDCW-hr、高于0.45g/gDCW-hr或高于0.5g/gDCW-hr的速度的比速度产生3-羟基丙酸。
所述经遗传修饰的微生物可包含遗传修饰以提高丙二酰-CoA还原酶活性和乙酰CoA羧化酶活性,并且包含遗传修饰以降低烯酰基-ACP还原酶活性、乳酸脱氢酶活性和乙酸激酶活性。在各种情况下,所述微生物包含遗传修饰以提高丙二酰-CoA还原酶活性和乙酰CoA羧化酶活性,并且包含遗传修饰以降低烯酰基-ACP还原酶活性、乳酸脱氢酶活性和磷酸乙酰转移酶活性。另外,所述微生物可包含遗传修饰以提高丙二酰-CoA还原酶活性和乙酰CoA羧化酶活性,并且包含遗传修饰以降低烯酰基-ACP还原酶活性、乳酸脱氢酶活性、乙酸激酶活性和磷酸乙酰转移酶活性。在各个不同方面,所述微生物包含遗传修饰以提高丙二酰-CoA还原酶活性和乙酰CoA羧化酶活性,并且包含遗传修饰以降低烯酰基-ACP还原酶活性、乳酸脱氢酶活性和丙酮酸甲酸裂解酶活性。在各个实施方案中,所述微生物包含遗传修饰以提高丙二酰-CoA还原酶活性和乙酰CoA羧化酶活性,并且包含遗传修饰以降低烯酰基-ACP还原酶活性、乳酸脱氢酶活性和丙酮酸氧化酶活性。还包括包含遗传修饰以提高丙二酰-CoA还原酶活性和乙酰CoA羧化酶活性和包含遗传修饰以降低烯酰基-ACP还原酶活性、乳酸脱氢酶活性和甲基乙二醛合成酶活性的微生物。另外,本发明的微生物可包含遗传修饰以提高丙二酰-CoA还原酶活性和乙酰CoA羧化酶活性,并且包含遗传修饰以提高β-酮脂酰基-ACP合成酶活性以及降低乳酸脱氢酶活性和甲基乙二醛合成酶活性,和/或所述微生物可包含遗传修饰以提高丙二酰-CoA还原酶活性和乙酰CoA羧化酶活性,并且包含遗传修饰以降低烯酰基-ACP还原酶活性、鸟苷3′-二磷酸5′-三磷酸合成酶活性以及鸟苷3′-二磷酸5′-二磷酸合成酶活性。此外,在某些微生物中烯酰基-CoA还原酶活性被降低以替代附加于烯酰基-ACP还原酶活性的降低。
在各个实施方案中,进行进一步的遗传修饰,该修饰提高了NADH/NADPH转氢酶活性。例如,所述转氢酶活性可以是可溶的、可以是膜结合的、可以具有用于提高氰酸酶活性的进一步的遗传修饰、可以包含提高碳酸酐酶活性的进一步的遗传修饰和/或可以包含提高丙酮酸脱氢酶活性的进一步的遗传修饰。
在各个实施方案中,进行进一步的遗传修饰,该修饰降低鸟苷3′-二磷酸5′-三磷酸合成酶活性和鸟苷3′-二磷酸5′-二磷酸合成酶活性。进行通气环境中提高NADH/NAD+比率的遗传修饰的情况也包括在内。此外,可进行遗传修饰,所述遗传修饰降低β-酮脂酰基-ACP合成酶活性、降低3-羟基丙酸脱氢酶活性、降低NAD+依赖性3-羟基丙酸脱氢酶活性、降低NAD+依赖性3-羟基丙酸脱氢酶活性、提高对3-羟基丙酸的耐受性、提高3-HP耐受发生复合体中任何酶的活性、提高丙酮酸脱氢酶活性、提高氰酸酶活性、提高碳酸酐酶活性、提高天冬氨酸激酶活性、提高苏氨酸脱水酶活性、提高2-脱氢-3-脱氧磷酸庚糖酸醛缩酶活性、提高半胱氨酸合成酶活性、提高核糖磷酸二磷酸激酶活性、提高核糖核苷二磷酸还原酶活性、提高L-半胱氨酸脱巯基酶活性、提高赖氨酸脱羧酶活性、提高同型半胱氨酸甲基转移酶活性、提高二氢叶酸还原酶活性、提高N-乙酰谷氨酰磷酸还原酶活性、提高乙酰谷氨酸激酶活性、提高精氨基琥珀酸裂解酶活性、提高乙酰鸟氨酸脱乙酰基酶活性、提高分支酸变位酶活性、提高预苯酸脱水酶活性、提高预苯酸脱氢酶活性、提高2-脱氢-3-脱氧磷酸庚糖酸醛缩酶活性和/或提高D-3-磷酸甘油酸脱氢酶活性。
在各个实施方案中,本发明包括培养系统,所述培养系统包含处于水性介质中的碳源以及根据权利要求48-92中任意一项所述的遗传修饰的微生物,其中所述遗传修饰的生物体存在的量选自高于0.05gDCW/L、0.1gDCW/L、高于1gDCW/L、高于5gDCW/L、高于10gDCW/L、高于15gDCW/L或高于20gDCW/L,如当所述水性介质的体积选自高于5mL、高于100mL、高于0.5L、高于1L、高于2L、高于10L、高于250L、高于1000L、高于10,000L、高于50,000L、高于100,000L或高于200,000L时,以及如当所述水性介质的体积高于250L并且容纳于钢质容器中时。
在各种情况下,用于这种培养系统的碳源选自右旋糖、蔗糖、戊糖、多元醇、己糖、己糖和戊糖两者以及以上的组合,所述水性介质的pH低于7.5,所述培养系统是通气的,如以选自以下的氧转移速度进行通气:i)高于5毫摩尔/L-hr氧和低于200毫摩尔/L-hr氧;ii)高于5毫摩尔/L-hr氧和低于100毫摩尔/L-hr氧;iii)高于5毫摩尔/L-hr氧和低于80毫摩尔/L-hr氧气;以及iv)高于5毫摩尔/L-hr氧和低于50毫摩尔/L-hr氧。
在各个实施方案中,本发明是从根据权利要求93-99中任意一项所述的培养系统获得的水性培养液,其中所述水性培养液包含i)选自高于5g/L、高于10g/L、高于15g/L、高于20g/L、高于25g/L、高于30g/L、高于35g/L、高于40g/L、高于50g/L、高于60g/L、高于70g/L、高于80g/L、高于90g/L或高于100g/L的3-羟基丙酸的3-羟基丙酸某种浓度;以及ii)选自低于30g/L、低于20g/L、低于10g/L、低于5g/L、低于1g/L或低于0.5g/L的1,3-丙二醇浓度。在一些方面,所述水性培养液包含选自低于20gDCW/L生物质、低于15gDCW/L生物质、低于10gDCW/L生物质、低于5gDCW/L生物质或低于1gDCW/L生物质的生物质量。或者,本发明的水性培养液使得3-HP/琥珀酸比率(g 3-HP/g琥珀酸)高于3、高于10、高于30、高于60、高于100、高于150或高于200。在各个方面,3-HP/延胡索酸比率(g 3-HP/g延胡索酸)高于3、高于10、高于30、高于60、高于100、高于150或高于200,或3-HP/甘油比率(g 3-HP/g甘油)高于3、高于10、高于30、高于60、高于100、高于150或高于200,或3-HP/乙酸比率(g 3-HP/g乙酸)高于1.5、高于3、高于10、高于30、高于60、高于100、高于150或高于200,或3-HP/丙氨酸比率(g 3-HP/g丙氨酸)高于3、高于10、高于30、高于60、高于100、高于150或高于200,或3-HP/β-丙氨酸比率(g 3-HP/g β-丙氨酸)高于1.5、高于3、高于10、高于30、高于60、高于100、高于150或高于200,或3-HP/谷氨酸比率(g 3-HP/g谷氨酸)高于3、高于10、高于30、高于60、高于100、高于150或高于200,或3-HP/谷氨酰胺比率(g 3-HP/g谷氨酰胺)高于3、高于10、高于30、高于60、高于100、高于150或高于200,或3-HP/3-羟基丙醛比率(g 3-HP/g 3-羟基丙醛)高于1.5、高于3、高于10、高于30、高于60、高于100、高于150或高于200,或3-HP/1,3-丙二醇比率(g3-HP/g 1,3-丙二醇)高于1.5、高于3、高于10、高于30、高于60、高于100、高于150或高于200,和/或3-HP/乳酸比率(g 3-HP/g乳酸)高于3、高于10、高于30、高于60、高于100、高于150或高于200。
附图简要说明
本发明的新特征在权利要求中进行详细陈述。对本发明的特征和优点的更好了解可通过参考下文示例性实施方案的详细描述和附图而获得,这些实施方案应用了本发明的原理。附图如下:
图1描述了涉及本发明方面的微生物代谢途径,更具体来说涉及3-HP生产的微生物代谢途径,特定酶学步骤中标出了大肠杆菌的基因名称,后者是用于示例而非意在进行限定。
图2A描述了涉及本发明方面的微生物代谢途径,特定酶学步骤中标出了大肠杆菌的基因名,后者是用于示例而非意在进行限定。
图2B提供了所述脂肪酸合成酶系统的典型酶学转化以及示例性大肠杆菌基因的更为详尽的描述,其在图2A中进行了更概括的描述。
图3提供了示例性的多序列比对,其比较了碳酸酐酶多肽(碳酸酐酶多肽的CLUSTAL 2.0.12多序列比对)。
图4A提供了示例性的序列比对:fabIts(JP1111(SEQ ID No.:769))与野生型(BW25113(SEQ ID No.:827))大肠杆菌fabI基因DNA突变体C722T的DNA序列的比较。
图4B提供了示例性的序列比对:fabIts(JP1111(SEQ ID No.:770))与野生型(BW25113(SEQ ID No.:828))大肠杆菌fabI基因氨基酸-S241F的蛋白质序列的比较。
图5、6和7提供了来自实施例11的数据和结果。
图8描述了涉及本发明方面的具有多个遗传修饰的微生物的代谢途径,更具体来说涉及3-HP生产,特定酶学步骤中标出了大肠杆菌的基因名,后者是用于示例而非意在进行限定。
图9A,表单1-7是对代谢途径中的部分的多表单描述,其显示了途径产物和酶,所述诸部分合在一起组成了大肠杆菌中的3-HP耐受发生复合体(3HPTGC)。表单1提供了对其余表单排列设置的总体图示性描述。
图9B,表单1-7提供了枯草杆菌(Bacillus subtilis)的3HPTGC的多表单描述。表单1提供了对其余表单排列设置的总体图示性描述。
图9C,表单1-7提供了酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的3HPTGC的多表单描述。表单1提供了对其余表单排列设置的总体图示性描述。
图9D,表单1-7提供了钩虫贪铜菌(Cupriavidus necator)(先前称真氧产碱杆菌(Ralstonia eutropha))的3HPTGC的多表单描述。表单1提供了对其余表单排列设置的总体图示性描述。
图10提供了甘氨酸裂解途径的图示。
图11提供了来自现有技术参考文献的从葡萄糖到丙酮酸到乙酰CoA到丙二酰-CoA到3-HP的已知3-HP产生途径的概述。
图12提供了来自现有技术参考文献的从葡萄糖到磷酸烯醇丙酮酸(PEP)(直接或通过丙酮酸)到草酰乙酸到天冬氨酸到β-丙氨酸到丙二酸半醛到3-HP的已知3-HP产生途径的概述。
图13提供了来自现有技术参考文献的已知3-HP产生途径的概述。
图14A和B提供了大肠杆菌中的天然混合发酵途径的示意图。
图15A-O提供了对于3-HP的对照微生物反应的图示数据,并且图15P提供了与3HPTGC的一种遗传修饰的比较。
图16描述了由来自结核分枝杆菌(M.tuberculosis)的kgd基因所编码的α-酮戊二酸盐催化的已知化学反应。
图17描述了新的酶学功能,草酰乙酸到丙二酸半醛的脱羧化,其通过kgd基因的修饰实现。
图18显示对kgd突变体的建议选择方法。
图19显示涉及到图18所述的建议选择方法的筛选方案。
图20提供了涉及IroK肽序列的比较。
图21提供了使用HPLC获得的3-HP的校准曲线。
图22提供了使用GC/MS获得的3-HP的校准曲线。
图23提供了用于3-HP的酶学分析的典型标准曲线。
图24A、B和C以及图25A和B显示将生物质转化成为最终产物如尿布的全过程示意图。
本文还提供了表格并且其为本说明书的一部分。
具体实施方式
本发明涉及具有进行各种化学产品的发酵生产的效用的各种生产方法和/或遗传修饰的微生物,涉及利用这些微生物群体在容器中制备这些化学产品的方法,并且涉及利用这些微生物和方法进行化学生产的系统。本发明的益处包括当这些微生物在发酵事件或循环中产生化学产品时提高的单位生产率。本发明提供了生产技术和/或遗传修饰的微生物以利用一种或多种调控丙二酰-CoA向脂酰分子(其随后可被转化成为脂肪酸,例如脂酰基-ACP分子)的转化的手段产生如3-羟基丙酸(3-HP)的目标化学产物,其中所述的生产途径包括使用丙二酰-CoA作为底物的酶促转化步骤。用于调控丙二酰-CoA向脂酰分子如脂酰基-ACP分子的转化的手段有效地平衡向微生物生物质的碳流和向化学产物的碳流,并且出人意料地获得了升高的单位生产率。
正如本文所指出的,本发明的各个方面涉及微生物细胞(其包含从丙二酰-CoA到3-HP的代谢途径),和用于调控丙二酰-CoA向脂酰分子(其随后可被转化成为脂肪酸)的转化的手段。随后,当所述调控手段进行调控以降低这种转化的时候,按比例地较大量的丙二酰-CoA分子被1)产生和/或2)通过所述代谢途径从丙二酰-CoA转化成为3-HP。在各个实施方案中,可进行另外的遗传修饰,以例如,1)提高细胞内重碳酸盐水平,例如通过提高碳酸酐酶,2)提高乙酰CoA羧化酶和NADPH依赖性转氢酶的酶活性。
通过遗传修饰的微生物群体获得的预料不到的单位生产率的提高可以在其中该微生物具有从丙二酰-CoA到被选择的化学产物的微生物产生途径以及所述微生物的脂肪酸合成酶系统的选定酶(更特别是其脂肪酸延伸酶)的酶活性降低的方法和系统实现。在各个实施方案中,还可向包含这些微生物群体的生物反应器容器提供特定补充物以进一步改善所述方法和系统。
此外,对于一种化学产品-3-羟基丙酸(3-HP),提供了对产生途径的遗传修饰,并且描述了可对其进行遗传修饰和/或培养系统改进以提高微生物对3-HP的耐受性的耐受发生复合体。此外,用于提高碳酸酐酶和/或氰酸酶的表达和/或酶活性的遗传修饰可提供双重功能以有利地同时改善3-HP产生和3-HP耐受。
本文公开了用于各个实施方案的其它额外的遗传修饰。
定义
本说明书和权利要求中所使用的单数形式“一个”、“一种”和“该”包括了复数指代,除非上下文明确指明其它含义。因此,例如,一种“表达载体”的提法包含了单个表达载体以及多个表达载体,其为相同(如,相同的操纵子)或不同的;微生物的提法包括了单一微生物以及多个微生物;等等。
本文所使用的大肠杆菌菌株的细胞干重(DCW)计算为测定的OD600值的0.33倍,基于OD600测定的基线DCW。
本文所使用的“降低的酶活性”、“降低酶活性”等意在表明微生物细胞的酶或分离的酶与同物种的可比较细胞中或其天然酶所测定的活性相比表现出较低的活性水平。即,在已知的标准条件下该酶的所示底物向所示产物的酶促转化比天然(未修饰)的酶在标准的指定条件下的相同生化转化的酶活性低至少10、至少20、至少30、至少40、至少50、至少60、至少70、至少80或至少90%。该术语还包括该酶活性的消除。可通过本领域中任何已知的方法鉴定具有酶的降低酶活性的细胞。例如,酶活性分析可被用于鉴定具有降低的酶活性的细胞。例如,参见EnzymeNomenclature,Academic Press,Inc.,New York 2007。
本文所使用的术语“异源DNA”、“异源核酸序列”等指的是其中存在至少以下一种情况的核酸序列:(a)所述核酸序列对于给定宿主微生物是外源的(即,非宿主微生物中天然存在的);(b)所述序列在给定的宿主微生物是天然存在的,但以非天然的量(例如,高于预期)存在;或(c)所述核酸序列包含两个或更多个非以天然情况下相同的相互关系存在的子序列。例如,关于情况(c),重组产生的异源核酸序列具有两种或更多种来自非相关基因的序列,其经排列以产生新的功能核酸。
术语“异源”意在包含术语“外源”,后者在通常在本领域中使用。对于引入异源核酸序列之前的宿主微生物的基因组,编码所述酶的核酸序列是异源的(无论所述异源核酸序列是否被引入该基因组中)。
本文所使用的术语“基因破坏”或其语法上的等同词语(并包括“破坏酶功能”、“酶功能的破坏”等等)意指对微生物的遗传修饰,该修饰是被编码的基因产物与存在于或来自于未如此修饰的微生物细胞的多肽相比具有降低的多肽活性。遗传修饰可以是,例如,该完整基因的缺失、转录或翻译所需的调控序列的缺失或其它修饰、导致截短的基因产物(例如,酶)的部分基因的缺失或通过多种降低所编码基因产物活性的各种突变策略中的任何一种而进行。破坏可广义地包括编码酶的核酸序列的全部或部分的缺失,并且还包括但不限于其它类型的遗传修饰,例如引入终止密码子、移码突变、引入或去除基因的部分和引入降解信号、影响mRNA转录水平和/或稳定性的遗传修饰,以及改变编码酶的基因上游的启动子或阻遏物。
在各种情况中,基因破坏被用于指对DNA、所述DNA所编码的mRNA以及对应的氨基酸序列的任意遗传修饰,该修饰导致降低的多肽活性。多种不同的方法可被用于产生具有降低的多肽活性的细胞。例如,细胞可使用常规诱变或敲除技术进行工程改造以具有被破坏的调控序列或多肽编码序列。例如,参见Methods in Yeast Genetics(1997版),Adams等,Cold Spring Harbor Press(1998)。一种特别有用的基因破坏方法是全基因删除,因为其在本发明的遗传修饰的微生物中减少或消除遗传回复变异的出现。因此,对于其产物是酶的基因的破坏由此扰乱了酶学功能。或者,反义技术可被用于降低特定多肽的活性。例如,细胞可进行工程改造以包含编码反义分子的cDNA,该反义分子防止多肽被翻译。此外,基因沉默技术可被用于降低特定多肽的活性。
本文所使用的术语“反义分子”涵盖了包含对应于内源多肽编码链的序列的任何核酸分子或核酸类似物(如,肽核酸)。反义分子还可具有侧翼序列(如,调控序列)。因此,反义分子可以是核酶或反义寡核苷酸。
本文所使用的核酶可具有任意通用结构,,包括但不限于,发夹、锤头或斧头结构,只要所述分子切割RNA。
术语“降低”或“以降低”当以该用法或其语法上的等价物形式使用的时候意在包含这些转化的完全消除。
本文所使用的生物产生可以是需氧的、微需氧的或厌氧的。
本文所使用的语言“充分同源的”指的是蛋白质或其部分,其氨基酸序列包含了当与本申请中所提供的氨基酸序列(包括SEQ ID No./序列表)的某一氨基酸序列相比较时最低数目的相同或等同的氨基酸残基,如此以使所述蛋白质或其部分能够实现相应的酶学反应和/或其它功能。为测定是否特定的蛋白质或其部分充分同源,其可通过酶活性的分析进行测定,如本领域中公认的分析方法。
对于序列同一性和同源性的描述和方法用意是示例性的,并且应当了解这些概念在本领域中是众所周知的。此外,应当了解核酸序列可发生变化而仍然编码表现出所需功能性的酶或其它多肽,并且这样的变异处于本发明的范围内。
关于核酸序列,“杂交”指的是两条单链多核苷酸进行非共价结合以形成稳定的双链多核苷酸的过程。所述术语“杂交”还可指三链杂交。(通常情况下)所产生的双链多核苷酸是“杂合体”或“双链体”。“杂交条件”通常包括低于约1M的盐浓度,更通常低于约500mM以及低于约200mM。杂交温度可以低至5℃,但通常高于22℃,更通常高于约30℃并且通常超过约37℃。杂交通常在严格条件下进行,即在探针与靶亚序列杂交的条件。严格条件是序列依赖性的并且在不同情况下有所不同。对于特异性杂交,较大片段可能需要较高的杂交温度。由于其它因素可影响杂交的严格性,包括碱基组成和互补链长度、有机溶剂的存在和碱基错配的程度,参数的组合比任一单独参数的绝对测量值更为重要。一般,严格条件选择为比特异性序列在给定离子强度和pH下的Tm低约5℃。示例性的严格条件包括,至少0.01M到不超过1M Na离子浓度(或其它盐类)的盐浓度,从7.0到8.3的pH并且至少为25℃的温度。例如,5×SSPE(750mM NaCl,50mM磷酸钠,5mM EDTA,pH 7.4)和25-30℃的温度的条件适用于等位基因特异性探针杂交。对于严格条件,参见,例如Sambrook和Russell和Anderson “Nucleic Acid Hybridization”第一版,BIOS Scientific Publishers Limited(1999年),其以杂交方案通过引用的方式并入本文。“特异地杂交”或“与其特异性地杂交”等表述指的是在一种或多种特定的核苷酸序列处于复合混合物(如,总细胞)DNA或RNA中时分子在严格条件下基本上与或仅与该序列结合、双链化或杂交。
术语“确认的酶学功能变异体”指的是被测定拥有目标酶的酶活性以及特异性但是具有与该目标酶不同的氨基酸序列的多肽。可构建相应的“变体核酸序列”,其被测定为编码该确认的酶功能变异体。出于特定的目的,如通过提高微生物的3HPTGC的一种或多种酶促转化步骤中的酶促转化的遗传修饰而产生对3-HP的提高耐受性,可进行一种或多种遗传修饰以提供编码一种或多种确认的3HPTGC酶功能变异体的一种或多种异源核酸序列。即,这些核酸序列各自编码并非恰好是所述3HPTGC的某种酶的已知多肽的多肽,但是尽管如此,所述多肽表现出该酶的酶活性。这种核酸序列及其所编码的多肽可能不符合同源性或同一性的特定限制,尽管如此,其在细胞中的存在提供了所需的酶活性和特异性。获得这样的变异核酸序列和确认的酶功能变异体的能力得到在生物信息学和蛋白质工程和设计的现有技术中的最新进展的支持,其包括在计算、预测和高通量方法学上的进展。功能性变异体在更通常包括酶功能变异体以及编码它们的核酸序列,以及非酶多肽的变异体,其中所述变异体表现出源(目标)序列的功能。
短语“目的片段”的使用意在包括目的基因及任何其它目的核酸序列。用于获得目的片段的方法的一个实例是获得微生物的培养物,其中所述微生物的基因组包含该目的基因或目的核酸序列片段。
当本文中(包括权利要求)提及基因产物(即酶)的遗传修饰时,应当理解所述遗传修饰是通常编码基因产物(即酶)的核酸序列(例如或包括基因)的修饰。
在一些实施方案中,被截短的相应多肽具有编码相应原始酶的核酸序列所编码的多肽全长的至少约90%,且更特别地具有编码相应原始酶的核酸所编码的多肽全长的至少约95%。具有与多肽的参比氨基酸序列至少例如95%“同一”的氨基酸序列的多肽意指所述的多肽的氨基酸序列与所述参比序列一致,只是所述的多肽序列在所述多肽的参比氨基酸中的每100个氨基酸中可包括最多5个氨基酸改变。换言之,为获得具有与多肽的参比氨基酸序列至少具95%“同一”的氨基酸序列的多肽,所述参比序列中最多5%的氨基酸残基可被删除或以另一氨基酸替换,或者最多达所述参比序列的总氨基酸残基的5%的多个氨基酸可被插入所述参比序列中。对所述参比序列的这些改变可存在于所述参比氨基酸序列的氨基或羧基末端位置或这两个末端位置之间的任意位置,或者单个地散布于所述参比序列的残基之间或以一个或多个连续的组处于所述参比序列中。在其它实施方案中,根据本文它处所描述的,截短可能更为重要。
物种以及其它种系发生的标识是根据微生物领域中的技术人员已知的分类方法。
在本文所述的方法和步骤表示为以特定顺序发生的特定事件的情况中,本领域的技术人员应认识到特定步骤的顺序可被改变并且这样的改变与本发明的变化一致的。此外,特定的步骤在可能的情况下可以平行的进程同时进行,以及顺序进行。
本文提供的预测实施例意在具有广泛的示例作用并且不进行任何方式的限定。这适用于关于3-HP的分离和纯化以及3-HP向下游化合物的转化的实施例,因为这些步骤和转化存在大量的可能途径,包括本文所引用和并入的参考文献中公开的那些。
缩略语的含义如下:“C”指的是摄氏或摄氏度,如从其用法清楚地看出的。DCW指的是细胞干重,“s”指的是秒,“min”指的是分钟,“h”、“hr”或“hrs”指的是小时,“psi”指的是磅每平方英寸,“nm”指的是纳米,“d”指的是天,“μL”、“uL”或“ul”指的是微升,“mL”指的是毫升,“L”指的是升,“mm”指的是毫米,“nm”指的是纳米,“mM”指的是毫摩,“μM”或“uM”指的是微摩,“M”指的是摩,“mmol”指的是毫摩尔,“μmol”或“uMol”指的是微摩尔,“g”指的是克,“μg”或“ug”指的是微克,“ng”指的是纳克,“PCR”指的是聚合酶链反应,“OD”指的是光密度,“OD600”指的是在600nm光子波长下测量的光密度,“kDa”指的是千道尔顿,“g”指的是重力加速常数,“bp”指的是碱基对,“kbp”指的是千碱基对,“%w/v”指的是重量/体积百分比,“%v/v”指的是体积/体积百分比,“IPTG”指的是异丙基-μ-D-硫代半乳糖吡喃糖苷,“RBS”指的是核糖体结合位点,“rpm”指的是每分钟转数,“HPLC”指的是高效液相色谱,“GC”指的是气相色谱。如本文所公开使用的,“3-HP”指的是3-羟基丙酸并且“3HPTGC”指的是3-HP耐受发生复合体。另外,10^5及类似用法用于指105等。
I.碳源
在本发明中与具有3-HP的生物合成途径的重组微生物一起使用的生物生产培养基必须包含适用于所预期的代谢途径的碳源或底物。适当的底物可包括但不限于,单糖如葡萄糖和果糖、寡糖如乳糖或蔗糖、多糖如淀粉或纤维素或其混合物以及来自可再生原料的未纯化混合物,如奶酪乳清渗透物(cheese whey permeate)、玉米浆、甜菜糖浆和大麦芽。此外,所述碳底物还可以是已经证明代谢转化为关键生化中间体的单碳底物,如二氧化碳、一氧化碳或甲醇。除单碳和双碳底物之外,还已知甲基营养生物体利用多种其它含碳化合物,如甲胺、葡糖胺以及多种用于代谢活性的氨基酸。
尽管设想所有上述碳底物及其混合物作为碳源适用于本发明中,但用作碳源的常见碳底物是葡萄糖、果糖和蔗糖,以及任何这些糖的混合物。其它适合的底物包括木糖、阿拉伯糖、其它基于纤维素的C-5糖、高果糖玉米糖浆以及市售的各种其它糖类和糖混合物。蔗糖可获自如甘蔗、甜菜、木薯、香蕉或其它水果以及甜高粱的原料。葡萄糖和右旋糖可通过对基于淀粉的原料进行的糖化而获得,所述原料包括谷物,如玉米、小麦、黑麦、大麦和燕麦。另外,在一些实施方案中全部或部分碳源可以是甘油。或者,甘油可排除作为添加的碳源。
在一个实施方案中,碳源选自葡萄糖、果糖、蔗糖、右旋糖、乳糖、甘油及其混合物。在各种情况下,碳源中的这些组分的量可高于碳源的约50%、高于约60%、高于约70%、高于约80%、高于约90%或更高,最高达碳源的100%或基本为100%。
此外,已知甲基营养生物利用多种其它含碳化合物,如甲胺、葡糖胺以及多种用于代谢活性的氨基酸。例如,已知甲基营养酵母利用来自甲胺的碳以形成海藻糖或甘油(Bellion等,Microb.Growth C1 Compd.(Int.Symp.),第7版(1993年),415-32页。编辑:Murrell,J.Collin;Kelly,Don P.出版商:Intercept,Andover,UK)。类似地,各种假丝酵母(Candida)种代谢丙氨酸或油酸(Sulter等,Arch.Microbiol.153:485-489页(1990年))。因此,设想本发明的实施方案中使用的碳源可涵盖多种多样的含碳底物。
此外,可发酵糖类可通过例如,美国专利申请第2007/0031918A1号(其以引用的方式并入本文)中描述的预处理和糖化的过程获自纤维素和木质纤维素生物质。生物质指的是任何纤维素或木质纤维素材料并且包括包含纤维素并且任选地进一步包含半纤维素、木质素、淀粉、寡聚糖和/或单糖的材料。生物质还可包含另外的成分,如蛋白质和/或脂质。生物质可源自单一来源,或者生物质可包含源自超过一种来源的混合物;例如,生物质可包含玉米芯和玉米秸的混合物,或草和叶的混合物。生物质包括但不限于,生物能源作物、农业废物、城市固体废物、工业固体废物、造纸厂废渣、庭院垃圾、木材或林业废料。生物质的实例包括但不限于,玉米谷物、玉米芯、农作物废料如玉米苞皮、玉米秸、草料、小麦、小麦秸、大麦、大麦秸,干草、稻秆、柳枝、废纸、甘蔗渣、高粱、大豆、获自谷物磨坊的成分、树木、枝、根、叶、木屑、锯末、灌木和灌木丛、蔬菜、水果、花和动物粪便。任何这些生物质可被用于生物生产方法或系统中以提供碳源。用于将纤维素生物质降解成为更可得和可利用的碳分子(包括糖)的混合物的各种方法包括:在存在浓酸或稀酸(如,<1%的硫酸)的情况下进行加热;使用氨水进行处理;使用离子盐类进行处理;酶促降解;以及这些方法的组合。这些方法一般在机械分离和碾磨之后进行,并继之以适当的分离过程。
在各个实施方案中,多种糖类(包括但不限于蔗糖、葡萄糖、木糖、纤维素或半纤维素)中的任何糖被提供给微生物,诸如在包含反应器容器的工业系统中的微生物,所述反应器中可将确定的培养基(诸如最低盐培养基,包括但不限于M9基本培养基、硫酸钾基本培养基、酵母合成基本培养基和众多其它培养基或其变体)、提供一种或多种3-HP生物合成替代途径的微生物接种物以及碳源进行组合。所述碳源进入细胞并且通过众所周知的和常见的代谢途径进行分解代谢以产生包括磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)的常见代谢中间体(参见Molecular Biology of the Cell,第三版,B.Alberts等,Garland Publishing,New York,1994年,42-45页,66-74页,其关于糖类的基础分解代谢途径的教导以引用的方式并入本文;Principles of Biochemistry,第三版,D.L.Nelson与M.M.Cox,WorthPublishers,New York,2000年,527-658页,其关于主要代谢途径的教导以引用的方式并入本文;以及Biochemistry,第四版,L.Stryer,W.H.Freeman and Co.,New York,1995年,463-650页,其关于主要代谢途径的教导也以引用的方式并入本文。)
根据多种方法可将基于生物的碳与基于石油的碳区分开来,所述方法包括但不限于ASTM D6866,或各种其它技术。例如,碳-14和碳-14比率在基于生物的碳源与基于石油的碳源中有所不同,其中较高的碳-14比率见于基于生物的碳源中。在各个实施方案中,所述碳源不是基于石油的,或不是主要基于石油的。在各个实施方案中,所述碳源高于约50%是非基于石油的、高于约60%是非基于石油的、高于约70%是非基于石油的、高于约80%是非基于石油的、高于约90%或更高是非基于石油的。在各个实施方案中,所述碳源具有约1.0x10-14或更高的碳14与碳12比率。
各种组分可被排除于所述碳源之外。例如,在一些实施方案中,丙烯酸、1,4-丁二醇和/或甘油被从碳源中排除或基本排除。如此,根据本发明的一些实施方案的碳源可以是低于约50%甘油、低于约40%甘油、低于约30%甘油、低于约20%甘油、低于约10%甘油、低于约5%甘油、低于约1%甘油或更低。例如,碳源可基本上是不含甘油的。基本不含甘油指的是可能以残存在的任何甘油基本上不对目标化学化合物的产生做出贡献。
II.微生物
本文所述和所要求的特征可在选自本文列表的微生物中提供或在也包含一种或多种天然的、被引入的或增强的3-HP生物生产途径的其它适当微生物中提供。因此,在一些实施方案中,所述微生物包含内源3-HP产生途径(其在某些这样的实施方案中被增强),而在其它的实施方案中所述微生物不包含内源的3-HP产生途径。
多种这样的这些遗传修饰的微生物可包含遗传修饰和/或其它系统改变,其可能描述于一位或多位本发明人的其它专利申请中和/或转让给本专利申请的所有者的其它专利申请中。
实施例描述了对特定细菌和酵母微生物的具体修饰和评估。本发明的范围并非意在限于这些物种,而是一般适用于广泛的适当微生物。一般情况下,本发明所使用的微生物可选自细菌、蓝细菌、丝状真菌和酵母。
对于某些实施方案,最初选择用于3-HP耐受性生物产生的微生物宿主还应以高速率利用糖(包括葡萄糖)。大多数微生物能够利用碳水化合物。但是,特定的环境微生物无法高效地利用碳水化合物,并且因此对于这些计划以葡萄糖或其它碳水化合物作为主要添加碳源的实施方案不是适当的宿主。
由于各个物种的基因组已为人所知,本发明可容易地被应用于范围不断扩大的适当微生物。此外,考虑到相对低成本的基因测序,目的物种的基因序列可易于测定以使对本发明方面的应用更易达成(基于将遗传修饰应用于具有已知基因组序列的生物体的方便性)。
更特别地,根据本文所述的各种标准,用于包含本文提供的耐受性方面的3-HP生物产生的适当微生物宿主可包括但不限于,任何革兰氏阴性生物体,更特别地肠杆菌科的成员,如大肠杆菌,或食羧寡养菌(Oligotropha carboxidovorans),或假单胞菌属(Pseudomononas sp);任何革兰氏阳性微生物,如枯草杆菌、乳酸杆菌属(Lactobaccilus sp.)或乳球菌属(Lactococcus sp.);酵母,例如酿酒酵母、毕赤酵母(Pichiapastoris)或树干毕赤酵母(pichia stipitis);以及其它群或微生物种。更为特别的情况下,用于3-HP的生物产生的适当微生物宿主一般包括但不限于以下属的成员,梭状芽胞杆菌属(Clostridium)、发酵单孢菌属(Zymomonas)、埃希氏菌属(Escherichia)、沙门氏菌属(Salmonella)、红球菌属(Rhodococcus)、假单胞菌属(Pseudomonas)、芽孢杆菌属(Bacillus)、乳杆菌属(Lactobacillus)、肠球菌属(Enterococcus)、产碱菌属(Alcaligenes)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、类芽孢杆菌属(Paenibacillus)、节杆菌属(Arthrobacter)、棒杆菌属(Corynebacterium)、短杆菌属(Brevibacterium)、毕赤酵母属(Pichia)、假丝酵母属、汉逊酵母属(Hansenula)以及酵母属(Saccharomyces)。特别感兴趣的宿主包括:食羧寡养菌(如菌株OM5)、大肠杆菌、真养产碱菌(钩虫贪铜菌)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)、浸麻类芽孢杆菌(Paenibacillusmacerans)、红平红球菌(Rhodococcus erythropolis)、恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)、植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)、屎肠球菌(Enterococcus faecium)、鹑鸡肠球菌(Enterococcus gallinarium)、粪肠球菌(Enterococcus faecalis)、枯草杆菌和酿酒酵母。
更为特别的情况下,用于3-HP生产物生的适当微生物宿主一般包括但不限于,梭状芽胞杆菌属、发酵单孢菌属、埃希氏菌属、沙门氏菌属、红球菌属、假单胞菌属、芽孢杆菌属、乳杆菌属、肠球菌属、产碱菌属、克雷伯氏菌属、类芽孢杆菌属、节杆菌属、棒杆菌属、短杆菌属、毕赤酵母属、假丝酵母属、汉逊酵母属以及酵母属的成员。
特别感兴趣的宿主包括:食羧寡养菌(如菌株OM5T)、大肠杆菌、真养产碱菌(钩虫贪铜菌)、地衣芽孢杆菌、浸麻类芽孢杆菌、红平红球菌、恶臭假单胞菌、植物乳杆菌、屎肠球菌、鹑鸡肠球菌、粪肠球菌、枯草杆菌和酿酒酵母。另外,这些菌种中的任意已知菌株可被用作为起始微生物,下列菌种包括其各自的菌种也可被使用:Cupriavidus basilensis、Cupriavidus campinensis、Cupriavidus gilardi、Cupriavidus laharsis、耐金属贪铜菌(Cupriavidus metallidurans)、Cupriavidus oxalaticus、Cupriaviduspauculus、Cupriavidus pinatubonensis、Cupriavidus respiraculi和台湾贪铜菌(Cupriavidus taiwanensis)。
在一些实施方案中,所述重组微生物是革兰氏阴性菌。在一些实施方案中,所述重组微生物选自发酵单孢菌属、埃希氏菌属、假单胞菌属、产碱菌属以及克雷伯氏菌属。在一些实施方案中,所述重组微生物选自大肠杆菌、钩虫贪铜菌、食羧寡养菌和恶臭假单胞菌种。在一些实施方案中,所述重组微生物是大肠杆菌菌株。
在一些实施方案中,所述重组微生物是革兰氏阳性菌。在一些实施方案中,所述重组微生物选自梭状芽胞杆菌属、沙门氏菌属、红球菌属、芽孢杆菌属、乳杆菌属、肠球菌属、类芽孢杆菌属、节杆菌属、棒杆菌属和短杆菌属。在一些实施方案中,所述重组微生物选自菌种地衣芽孢杆菌、浸麻类芽孢杆菌、红平红球菌、植物乳杆菌、粪肠球菌、鹑鸡肠球菌、粪肠球菌和枯草杆菌。在特定的实施方案中,所述重组微生物是枯草杆菌菌株。
在一些实施方案中,所述重组微生物是酵母。所述重组微生物选自毕赤酵母属、假丝酵母属、汉逊酵母属以及酵母属。在特定的实施方案中,所述重组微生物是酿酒酵母。
进一步了解的是,根据本公开,上述的任何微生物中可被用于3-HP以外的其它化学产物的生产。
对所述宿主进行遗传修饰的能力对于任何重组微生物的产生都是关键的。基因转移技术的模式可以是通过电穿孔、接合、转导或自然转化。可获得广泛的宿主接合质粒和药物抗性标记物。针对可在宿主中发挥作用的抗生素抗性标记物的特性而对生物体进行克隆载体的改造。
III.培养基和培养条件
除适当的碳源例如诸如选自本文公开的类型之一以外,生物生产培养基必须包含本领域的技术人员所知适用于所述培养物的生长以及促进对3-HP生产和本发明所制备的其它产物所必需的酶学途径的适当矿物质、盐类、辅因子、缓冲剂和其它组分。
本发明的另一个方面涉及培养基和培养条件,其包含本发明的遗传修饰的微生物并且任选地包含补充物。
细胞一般情况下在约25℃到约40℃的温度范围内生长于适当的培养基中,并且对于嗜热性微生物温度最高达70℃。本发明中的适当生长培养基是常见的商业制备的培养基,如Luria Bertani(LB)液体培养基、M9基本培养基、沙氏葡萄糖(SD)液体培养基、酵母培养基(YM)液体培养基、(Ymin)酵母合成基本培养基以及本文所述的基本培养基如M9最低培养基。还可使用其它确定或合成生长培养基,并且用于所述特定微生物的生长的适当培养基应为微生物或者生物生产科学领域中的技术人员所知的。在各个实施方案中,可开发并使用不包含或者具有低水平的各种成分添加,例如低于10、5、2或1g/L的复合氮源(其包括但不限于酵母提取物、蛋白胨、胰蛋白胨、大豆粉、玉米浆或酪胨),的基本培养基。这些基本培养基还可具有有限的维生素混合物的补充,其包括生物素、维生素B12及维生素B12衍生物、硫胺、泛酸酯及其它维生素。基本培养基还可具有有限的简单无机营养源,其包含低于28、17或2.5mM的磷酸盐、低于25或4mM的硫酸盐,以及低于130或50mM的总氮。
在本发明的实施方案中与遗传修饰的微生物一起使用的生物生产培养基必须包含适用于预期的代谢途径的碳源。根据上文所述,适当的碳源包含一氧化碳、二氧化碳和各种单体和寡聚糖类。
用于所述生物生产的适当pH范围介于pH 3.0与pH 10.0之间,其中pH 6.0到pH 8.0是初始条件的典型pH范围。但是,用于特定实施方案的实际培养条件并不应受这些pH范围的限制。
生物生产可在需氧的、微需氧的或厌氧的条件下通过搅拌或不通过搅拌而进行。
3-HP或在生物生产培养基中生产的其它产物的量可以使用本领域已知的多种方法进行测定,例如,高效液相色谱(HPLC)、气相色谱(GC)或GC/质谱(MS)。本文中提供了用于特定实施例的特定HPLC方法。
IV.生物生产反应器和系统
利用了本发明的方法和/或组合物的发酵系统也在本发明的范围之内。
本文所述和/或所指的任何重组微生物可被引入工业生物生产系统之中,其中所述微生物在可商业实施的运行过程中将碳源转化成为3-HP。所述生物生产系统包含将这种重组微生物与碳源底物和适于所述重组微生物生长的生物生产培养基一起引入生物反应器容器中,以及将所述生物生产系统维持于适当的温度范围(以及,在所述反应是需氧的或微需氧的情况下,溶解氧浓度范围)内适当的时间以获得所需的部分所述底物分子向3-HP的转化。工业生物生产系统和及它们的运行为化学工程和生物过程工程领域的技术人员所熟知的。
生物生产可在需氧的、微需氧的或厌氧的条件下在搅拌或不搅拌条件下进行。为实现需氧的、微需氧的或厌氧的条件而对培养物和微生物群体进行的操作在本领域中是已知的,且包含营养培养基和这些微生物群体的液体培养基的溶解氧水平可进行监测以维持或证实所需的需氧、微需氧或厌氧条件。当使用合成气作为进料的时候,可使用需氧、微量需氧或厌氧条件。当使用糖类的时候,在各个实施方案中可以实施厌氧、需氧或微需氧条件。
本文所述和/或所指的任何重组微生物可被引入工业生物生产系统之中,其中所述微生物在可商业实施的运行过程中将碳源转化成为3-HP,并且还在各个实施方案中任选地转化成为3-HP的一种或多种下游化合物。所述生物生产系统包含将这种重组微生物与碳源底物和适于所述重组微生物生长的生物生产培养基一起引入生物反应器容器中,以及将所述生物生产系统维持于适当的温度范围(以及,在所述反应是需氧的或微量需氧的情况下,溶解氧浓度范围)之内适当的时间以获得所需的部分所述底物分子向3-HP的转化。
在各个实施方案中,合成气组分或糖类被提供给微生物,诸如包含反应器容器的工业系统中的微生物,所述反应器容器中将限定培养基(诸如最低盐类培养基,其包括但不限于M9基本培养基、硫酸钾基本培养基、酵母合成基本培养基和众多其它培养基或其变体)、提供本文所教导的生物合成途径的实施方案的微生物接种物以及碳源进行了组合。所述碳源进入细胞并且通过众所周知的和常见的代谢途径进行分解代谢以产生包含磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)在内的常见代谢中间体(参见Molecular Biologyof the Cell,第三版,B.Alberts等,Garland Publishing,New York,1994年,42-45页,66-74页,其关于糖基础分解代谢途径的教导以引用的方式并入本文;Principles of Biochemistry,第三版,D.L.Nelson与M.M.Cox,Worth Publishers,New York,2000年,527-658页,其关于主要代谢途径的教导以引用的方式并入本文;以及Biochemistry,第四版,L.Stryer,W.H.Freeman and Co.,New York,1995年,463-650页,其关于主要代谢途径的教导也以引用的方式并入本文)。
除工业生物生产的类型以外,本发明的各个实施方案可使用批类型的工业生物反应器。经典的批式生物反应器系统被认为是“封闭”的,意为培养基的成分在各自生物生产事件开始之前被确定并且在生物生产事件基本结束止的时间段内不进行人工的改动和添加。因此,在生物生产事件开始之时以所需的一种或多种生物体对所述培养基进行接种,并且使生物生产得以在不对该系统进行任何添加的情况下进行。然而,一般情况下,“批式”类型的生物生产事件对于碳源添加是成批进行的并且通常在诸如pH和氧浓度的因素控制下进行尝试。在批式系统中,系统的代谢物和生物质组成平稳地变化直至所述生物生产事件被终止。在批培养物中,细胞和缓通过静止停滞期(static lag phase)直至高生长对数期,并最终达到静止期,该期之中生长速率消退或停止上升。在不进行处理的情况下,静止期的细胞将最终死亡。处于对数期的细胞通常负责产生大部分所需终产物或中间体。
在标准批式系统上进行的改变是补料分批系统。补料分批生物生产过程也适用于本发明并且其包含典型的批式系统,其不同之处在于营养物(包括底物)在生物生产进程之中按增量加入。当代谢物阻遏倾向于抑制所述细胞的代谢时和期望在所述培养基中含有限量的底物的情况下,补料分批系统是有用的。补料分批系统中的实际营养物浓度的度量可被直接进行测量,例如通过不同时间的样品分析,或者可根据诸如pH、溶解氧和废气(如CO2)的分压的可测量因素的变化而估测。分批和补料分批方法是常见的并且在本领域是为人所熟知的,其实例可见于Thomas D.Brock在Biotechnology:A Textbook of Industrial Microbiology,第二版(1989年)Sinauer Associates,Inc.,Sunderland,Mass.,Deshpande,Mukund V.,Appl.Biochem.Biotechnol.,36:227,(1992年),以及Biochemical EngineeringFundamentals,第二版,J.E.Bailey and D.F.Ollis,McGraw Hill,New York,1986年,其关于生物生产的一般指导以引用的方式并入本文。
尽管本发明的实施方案可以批式或补料分批模式进行实施,应了解本发明可经适应于连续的生物生产方法。连续生物生产被认为是“开放”系统,其中为限定的生物生产培养基被连续地向生物反应器添加并且同时除去等量的条件化培养基以用于加工。连续的生物生产通常将培养物维持于受控的密度范围内,其中细胞主要处于对数期生长之中。两种类型的连续生物反应器运行包括恒化器,其中新鲜的培养基被补入容器中并同步除去等比率的容器内容物。该方法的限制在于细胞受损失并且高细胞密度通常是不可得的。实际上,一般情况下使用补料分批过程可获得高得多的细胞密度。另一种连续生物反应器利用了灌注培养,其类似物恒化器方法,不同之处在于从容器中除去的流被用于将活细胞重循环到所述容器的分离工艺。已经显示该类型的连续生物反应器产生比补料分批显著提高的细胞密度并且可连续地运行。连续的生物生产对于工业运行特别有利,因为其具有与为进行下一生物生产事件而对该设备排空、清洗和预备相关的更短停机时间。进一步,连续运行如分馏这样的下游单元操作一般比在分批模式下运行更为经济。
连续生物生产允许对影响细胞生长或终产物浓度的一种因素或多种因素的调控。例如,一种方法将限制性营养物(如碳源或氮水平)维持于固定比率并且允许所有其它参数适度。在其它的系统中,影响生长的多种因素可被连续地改变而根据培养物浊度测定的细胞浓度保持恒定。调控营养物和生长因素以用于连续生物生产过程的方法以及用于最大化产物形成速度的技术在工业微生物领域中是为人所熟知的,并且在上述Brock的文献中详细描述了多种方法。
据预期本发明的实施方案可使用分批、补料分批或连续过程中的任意方法而实施,并且任何已知的生物生产模式都是适合的。据预期细胞可被固定于作为全细胞催化剂的惰性支架上并且被用于适用于3-HP生产的生物生产条件或者在诸如培养器的容器内被培养于液体培养基中。因此,用于这些过程的以及利用这些过程的生物生产系统中的实施方案包括本发明的遗传修饰的微生物群体、包含处于包含用于该群体的营养物的培养基中的该群体的培养系统以及制备3-HP和因此制备3-HP的下游产物的方法。
本发明的实施方案包括在生物生产系统中制备3-HP的方法,所述方法中的一些可包括在该生物生产事件之后获取3-HP。例如,制备3-HP的方法可包括:向培养容器提供包含适当营养物的培养基;向该培养容器提供遗传修饰的微生物的接种物,所述微生物包含本文所述的遗传修饰,例如从合成气和/或糖分子产生3-HP的微生物;以及将所述培养容器维持于适用于所述遗传修饰的微生物生产3-HP的条件下。
处于本发明的范围之内的是产生重组微生物和用于生物生产方法和系统(包括用于3-HP生产的工业生物生产系统)中,所述微生物经基因工程改造以改变一种或多种多个方面,以与缺乏所述一种或多种修饰的对照微生物相比有效地提高对3-HP的耐受性(以及在一些实施方案中提高3-HP的生物生产)至少20%。
在各个实施方案中,本发明针对根据本文所述用于丙烯酸生物生产的系统,所述系统包括:对生物质进行糖化的储罐;用于将糖化产物送至发酵罐的管线,其任选地经过预发酵罐;适用于微生物细胞培养的发酵罐;用于从所述发酵罐将内容物排放至提取和/或分离容器的管线;适用于将3-羟基丙酸从细胞培养物废料中移除的提取和/或分离容器;用于将3-羟基丙酸转移至脱水容器的管线;以及适用于将3-羟基丙酸转化成为丙烯酸的脱水容器。在各个实施方案中,所述系统包括一个或多个预发酵罐、蒸馏塔、离心容器、反萃取柱、混合容器或其组合。
下列公开资源以引用的方式并入本文,其相应教导表明其各自领域中的技术水平,并且根据需要支持教导如何形成和利用从糖源工业生物生产3-HP或本发明产生的其它产物的方法,以及可被用于通过本发明的任意重组微生物获得该转化的工业系统的公开(Biochemical EngineeringFundamentals,第二版,J.E.Bailey和D.F.Ollis,McGraw Hill,New York,1986年,全书用于所指明的用途并且第9章特别用于生物反应器设计;Unit Operations of Chemical Engineering,第5版,W.L.McCabe等,McGrawHill,New York 1993年,全书用于所指明的用途并且特别用于加工和分离技术分析;Equilibrium Staged Separations,P.C.Wankat,Prentice Hall,Englewood Cliffs,NJ USA,1988年,全书用于分离技术指导)。基本上,进一步了解的是,根据本公开,任意上述方法和系统可被用于3-HP以外的化学产物的生产。
V.遗传修饰、核酸序列和氨基酸序列
本发明的实施方案可源自表达载体向宿主微生物中的引入,其中所述表达载体包含编码酶的核酸序列,该酶正常情况下存在或不存在于宿主微生物中。
对宿主进行遗传修饰的能力对于任何遗传修饰(重组)的微生物的产生都是关键的。基因转移技术的模式可以是电穿孔、接合、转导或自然转化。存在广泛的宿主接合质粒和药物抗性标记物。根据可在宿主中发挥作用的抗生素抗性标记物的性质针对宿主生物体进行克隆载体的改造。此外,根据本文公开,遗传修饰(重组)的微生物可包含由质粒引入的以外的修饰,包括对其基因组DNA的修饰。
本领域中早已认识到,可对氨基酸序列中的某些氨基酸进行改变而对该蛋白质结构或功能无显著影响。包括的变异体可由缺失、插入、倒置、重复和类型置换组成,只要所表示的酶活性未受到显著的不良影响。关于哪种氨基酸变化很可能为表型沉默的指导可见于特别是,Bowie,J.U.等,“Deciphering the Message in Protein S equences:Tolerance to Amino AcidSubstitutions,”Science 247:1306-1310页(1990年)。该文献关于这些教导以引用的方式并入本文,但其通常也是为本领域的技术人员所知的。
在各个实施方案中,通过本发明的寡聚核苷酸分子的表达而获得的多肽可具有与本文关于3-HP耐受性相关的和生物合成的途径的描述中的基因和/或核酸序列所编码的一种或多种氨基酸序列至少约50%、60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%的一致性。
作为实际的问题,无论任意特定的多肽与本文所述的任何多肽(其可对应于本文所述的特定核酸序列)的任何参照氨基酸序列是否具有至少50%、60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%的同一性,这样的特定多肽序列可使用已知的计算机程序(如Bestfit程序)常规地确定(Wisconsin Sequence Analysis Package,用于Unix的版本8,Genetics Computer Group,University Research Park,575 Science Drive,Madison,Wis.53711)。当使用Bestfit或任何其它序列比对程序以确定特定序列与本发明的参照序列是否具有,例如,95%的同一性的时候,对参数进行设定以使同一性百分比根据所述参照氨基酸序列的全长进行计算并且允许同源性间隙(gaps in homology)最高达该参照序列的氨基酸残基总数的5%。
例如,在特定的实施方案中,参照序列(查询序列,即本发明的序列)和受指序列之间的同一性,亦称为全局序列比对(global sequencealignment),可使用基于Brutlag等(Comp.App.Biosci.6:237-245(1990年))的算法的FASTDB计算机程序进行确定。对同一性进行狭义理解的特定实施方案所优选的用于FASTDB氨基酸比对的参数是:评分方案=PAM(百分接受突变)0,k-tuple=2,错配罚分=1,接合罚分(JoiningPenalty)=20,随机化组长度=0,截止罚分(Cutoff Score)=1,窗口大小=序列长度,空位罚分=5,空位大小罚分=0.05,窗口大小=500或被比对氨基酸序列长度,取二者之较小值。根据该实施方案,如果所述序列由于N-或C-末端缺失而非由于内部缺失短于所述查询序列,则考虑到FASTDB在计算全局百分同一性的时候不计入N-或C-末端缺失的事实而对所述结果进行人工校正。对于相对于查询序列在N-和C-末端截短的所述序列,通过计算侧向于所述序列的N-和C-末端的残基(其不与对应的比对残基匹配/对准)的数目占该查询序列总碱基的百分比而校正百分同一性。对残基是否匹配/对准的确定可根据FASTDB序列比对的结果而进行。随后将该百分比从通过FASTDB程序使用指定的参数而计算的百分同一性减去而获得最终百分同一性。该最终百分同一性得分是用于本实施方案的目的。只有与所比对序列的N-和C-末端的残基(其不与所对比序列匹配/对准)被考虑用于人工调整百分同一性得分的目的。即,只有在所比对序列的N-和C-最末端残基之外的查询残基位置被考虑用于该人工校正。例如,将90个氨基酸残基的比对序列与100个残基的查询序列进行比对以测定百分同一性。缺失发生在比对序列的N-末端,因此FASTDB比对不显示N-末端前10个残基的匹配/比对。这10个未配对残基占该序列的10%(N-和C-末端不匹配残基数/查询序列的总残基数),因此从FASTDB程序所计算出的百分同一性得分中减去10%。如果剩下的90个残基被完美匹配,则最终百分同一性应为90%。在另一个实例中,将90个残基的对比序列与100个残基的查询序列进行对比。这一次缺失是内部缺失,因此在比对序列的N-或C-末端不存在与查询序列不匹配/对准的残基。在此情况下,不对通过FASTDB计算出的百分同一性进行人工校正。再次重申,如FASTDB比对中显示的,仅仅对比对序列的N-和C-末端之外的与查询序列不匹配/对准的残基位置进行人工校正。
更一般的情况下,可制备包含编码具有酶活性的多肽的分离多聚核苷酸的核酸构建体,该分离多聚核苷酸可操作地连接于一种或多种(数种)控制序列,所述控制序列在处于适合该控制序列的条件下在诸如大肠杆菌的微生物中指导所述编码序列的表达。可对所述分离的多聚核苷酸进行操作以提供所述多肽的表达。所述多聚核苷酸序列在其插入载体之前所进行的操作可以是有利的或者必要的,这取决于表达载体。使用重组DNA方法修饰多核苷酸序列的技术在本领域中已被充分确立。
所述控制序列可以是适当的启动子序列,为被宿主细胞识别以用于编码本发明多肽的多核苷酸表达的核苷酸序列。所述启动子序列包含转录控制序列,其介导所述多肽的表达。所述启动子可以是在选择的宿主细胞内显示转录活性的任何核苷酸序列,其包括突变、截短和杂合启动子,并且其可获自与宿主细胞同源或者异源的编码细胞外或细胞内多肽的基因。适用于指导所述核酸构建体转录的启动子,尤其是在大肠杆菌宿主细胞内,的实例是,lac启动子(Gronenborn,1976年,MoI.Gen.Genet.148:243-250页)、tac启动子(DeBoer等,1983年,Proceedings ofthe National Academyof Sciences USA 80:21-25页)、trc启动子(Brosius等,1985年,J.Biol.Chem.260:3539-3541页)、T7RNA聚合酶启动子(Studier和Moffatt,1986年,J.MoI.Biol.189:113-130页)、噬菌体启动子pL(Elvin等,1990年,Gene 87:123-126页)、tetA启动子(Skerra,1994年,Gene 151:131-135页)、araBAD启动子(Guzman等,1995年,J.Bacteriol.177:4121-4130页)和rhaPBAD启动子(Haldimann等,1998年,J.Bacteriol.180:1277-1286页)。其它启动子在Scientific American的“Useful proteins fromrecombinant bacteria”,1980年,242:74-94;和在Sambrook与Russell的“Molecular Cloning:A Laboratory Manual,”2001年第三版(1-3卷),Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.中均有描述。
所述控制序列还可以是适当的转录终止子序列,其是宿主细胞所识别以终止转录的序列。所述终止子序列可操作地连接于编码多肽的核苷酸序列的3′-末端。本发明中可使用在大肠杆菌细胞中具功能性的任意终止子。也可能希望添加允许相对于宿主细胞生长调控多肽表达的调控序列。调控系统的实例是导致所述基因的表达响应于化学或物理刺激而开启或关闭的系统,所述刺激包括调控性化合物的存在。原核系统中的调控系统包括lac、tac和trp操纵子系统。
对于本发明的各个实施方案,基因操作可被描述为包括各种基因操作,其包括改变任何相应途径中鉴定的酶或酶活性的调控并因此改变其最终活性的基因操作。这些遗传修饰可针对导致选定和/或鉴定的培养条件下的酶活性和/或选择性的变化的转录、翻译或翻译后修饰,和/或针对提供另外的核酸序列,例如,以增加3-HP生产相关的酶的拷贝数目和/或突变体。实施这类遗传修饰的具体方法学和途径为本领域的技术人员所公知的,并且包括但不限于:提高内源基因元件的表达;降低阻遏基因的功能性;引入外源基因元件;提高编码对产生3-HP的酶学转化步骤进行催化的多肽的核酸序列的拷贝数;对基因元件进行突变以提供突变蛋白质从而提高特定的酶活性;过表达;低表达;过表达分子伴侣;敲除蛋白酶;改变或修饰反馈抑制;提供包含一种或多种受损的抑制子和/或竞争性抑制剂结合位点的酶变异体;敲除阻遏基因;进化、选择和/或其它用于提高mRNA稳定性的途径,以及对具有实现有效改善水平的有效拷贝数和启动子的质粒的使用。可进行随机诱变发生以提供遗传修饰,所述遗传修饰可属于这些或另外所述的任何途径。所述遗传修饰进一步广泛地属于在目的核酸中的一个或多个核酸的添加(包括插入)、缺失(如,通过突变)以及置换。在各个实施方案中,遗传修饰产生了酶的改善酶的比活性和/或周转数。非进行限制,该变化可通过以下的一种或多种进行测量:KM;Kcat和K亲和。
在各个实施方案中,为更有效地发挥功能,微生物可包含一种或多种基因删除。例如,在大肠杆菌中,可对编码乳酸脱氢酶(ldhA)、磷酸乙酰转移酶(pta)、丙酮酸氧化酶(poxB)和丙酮酸-甲酸裂解酶(pflB)进行破坏(包括删除)。这些基因破坏(包括删除)并非是限制性的,而是可以在各个实施方案中以各种组合进行实施。基因删除可通过突变性基因删除途径而获得,和/或从具有一种或多种这些酶的表达降低或无表达的突变体菌株开始而获得,和/或通过本领域的技术人员所知的其它方法而获得。基因删除可通过多种已知的特定方法中的任意方法而完成,其包括但不限于使用Gene Bridges(Gene Bridges GmbH,Dresden,Germany,<<www.genebridges.com>>)所销售的试剂盒和其它试剂进行的RED/ET方法。
特别地有关后一方法,Red/ET重组的使用为本领域的普通技术人员所知并且在Stewart等的美国专利第6,355,412号和第6,509,156号中有所描述,其对于该方法的教导以引用的方式并入本文。这些方法的材料和试剂盒可来自Gene Bridges(Gene Bridges GmbH,Dresden,Germany,<<www.genebridges.com>>),并且所述方法可遵循制造商的说明而进行。所述方法涉及可选择标记物通过以来自λ-噬菌体的重组酶实施的同源重组而对靶基因的替换。表达λ-red重组酶的宿主生物体使用编码可选择标记物的线性DNA产物进行转化,所述可选择标记物侧邻与所述靶基因同源的末端区域(一般~50bp,或者最高达约~300bp)。所述标记物可随后通过另一重组步骤而去除,该步骤通过携带FPL-重组酶或诸如Cre这样的另一重组酶的质粒而进行。
可进行微生物染色体DNA的靶向删除或外源基因物质向微生物染色体的添加用以改变宿主细胞的代谢,从而降低或者消除不良代谢产物的产生。这可结合其它遗传修饰使用,诸如本文在该基本实例中所描述的遗传修饰。在本详述中,参考了多个实施方案以及附图,其中可实施本发明的特定示例性实施方案以示例性的方式给出。这些实施方案以充分的细节进行了描述以使本领域的技术人员得以实施本发明,应当了解技术人员可对多种公开的实施方案加以调整。
另外,为进行3-HP的生产,这些遗传修饰可被选定和/或被筛选以实现相应酶学转化步骤中相应3-HP生产途径中通过特定酶学转化步骤的高流速,并且因此可以影响基础或主要途径中的一般细胞代谢。
应当了解氨基酸“同源性”包括保守置换,即,以具有类似特性的另一种氨基酸对多肽中的给定氨基酸进行的替换。下列置换一般被视为保守置换:以如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸的脂肪族氨基酸替代另一脂肪族氨基酸;以苏氨酸替代丝氨酸或相反;以如天冬氨酸和谷氨酸的酸性残基替代另一酸性残基;以如天冬酰胺和谷氨酰胺的携带酰胺基团的残基替代另一携带酰胺基团的残基;如赖氨酸和精氨酸的碱性残基替代另一碱性残基;和如苯丙氨酸和酪氨酸的芳香残基替代另一芳香残基。
对于本文提供的所有核酸和氨基酸序列,应当了解包括这些序列的保守修饰的变异体并且在本发明的各个实施方案中处于本发明的范围之内。功能上等同的核酸和氨基酸序列(功能变异体)(其可包含保守修饰的变异体以及处于本领域普通技术人员的技能范围内的更为广泛地变化的序列)及包含这些序列的微生物也处于本发明的各个实施方案的范围之内,同样处于本发明的各个实施方案的范围之内的还有包含这些序列和/或微生物的方法和系统。在各个实施方案中,编码充分同源的蛋白质或其部分的核酸处于本发明的范围之内。更一般的情况下,编码本发明所使用的特定氨基酸序列的核酸序列可由于遗传密码的简并性而有所变化,而且尽管如此其仍属于本发明的范围之内。下表提供了氨基酸之间的相似性的总结,保守性和较低保守性的置换可基于该氨基酸之间的相似性,下表还提供了反映这种简并性的各种密码子冗余性。
表1
氨基酸 | 相关性 | DNA密码子 |
丙氨酸 | N,Ali | GCT,GCC,GCA,GCG |
脯氨酸 | N | CCT,CCC,CCA,CCG |
缬氨酸 | N,Ali | GTT,GTC,GTA,GTG |
亮氨酸 | N,Ali | CTT,CTC,CTA,CTG,TTA,TTG |
异亮氨酸 | N,Ali | ATT,ATC,ATA |
甲硫氨酸 | N | ATG |
苯丙氨酸 | N,Aro | TTT,TTC |
色氨酸 | N | TGG |
甘氨酸 | PU | GGT,GGC,GGA,GGG |
丝氨酸 | PU | TCT,TCC,TCA,TCG,AGT,AGC |
苏氨酸 | PU | ACT,ACC,ACA,ACG |
天冬酰胺 | PU,Ami | AAT,AAC |
谷氨酰胺 | PU,Ami | CAA,CAG |
半胱氨酸 | PU | TGT,TGC |
天冬氨酸 | NEG,A | GAT,GAC |
谷氨酸 | NEG,A | GAA,GAG |
精氨酸 | POS,B | CGT,CGC,CGA,CGG,AGA,AGG |
赖氨酸 | POS,B | AAA,AAG |
组氨酸 | POS | CAT,CAC |
酪氨酸 | Aro | TAT,TAC |
终止密码子 | TAA,TAG,TGA |
說明:侧基及其它相关属性:A=酸性;B=碱性;Ali=脂族;Ami=胺;Aro=芳香族;N=非极性;PU=极性不带电;NEG=带负电;POS=带正电。
此外,本文提及的特定核酸序列的变异体和部分以及相应的编码的氨基酸序列在这些核酸序列变异体和/或部分包含与本文提及的核酸序列中的任何15个核苷酸的序列(包括但不限于,始于第1号核苷酸并终于第15号核苷酸的序列、始于第2号酸核苷并终于第16号核苷酸的序列、始于第3号核苷酸并终于第17号核苷酸的序列,以此类推)一致的15个核苷酸的序列时可表现出所需的功能性,例如选定水平的酶活性。应当了解本发明还提供了分离的核酸,其包含长度超过15个核苷酸(如,16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30或更多核苷酸)并且与本文提及的核酸序列中的序列任意部分一致的核苷酸序列。例如,本发明提供了包含与本文提及的任何一种或多种(包括任意组合的)核酸序列中给出的任意25个核苷酸的序列(其包括但不限于,始于第1号核苷酸并终于第25号核苷酸的序列、始于第2号核苷酸并终于第26号核苷酸的序列、始于第3号核苷酸并终于第27号核苷酸的序列,以此类推)一致的25个核苷酸的序列的分离核酸。另外的实例包括但不限于,包含长为50或更多核苷酸(如,100、150、200、250、300或更多核苷酸)并且与本文公开的任意序列的任何部分一致的核苷酸序列的分离核酸。这些分离的核酸可包括但不限于,包含在讨论和/或实施例中的任一部分中所示的核酸序列的那些分离的核酸,例如,涉及3-HP产生途径,编码所述脂肪酸合成酶系统的酶或3-HP耐受性的核酸序列。例如,本发明提供了包含本文所列的核酸序列的分离的核酸,该序列包单个插入、单个缺失、单个置换、多个插入、多个缺失、多个置换或其任意组合(例如单个缺失与多个插入)。这些分离的核酸分子可以与本文所列(即,序列表中)的核酸序列具有至少60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%或99%的序列同一性。
另外的实例包括但不限于,包含编码长为50或更多个氨基酸残基(如,100、150、200、250、300或更多个氨基酸残基)并且与本文所列或其它方式公开的氨基酸序列的任意部分一致的氨基酸序列的核酸序列的分离核酸。
另外,本发明提供了分离的核酸,其包含编码具有对本文所列或其它方式公开的氨基酸序列的变异的氨基酸序列的核酸序列。例如,本发明提供了分离的核酸,其包含编码含有单个插入、单个缺失、单个置换、多个插入、多个缺失、多个置换或其任意组合(例如单个缺失与多个插入)的本文所列或其它方式公开的氨基酸序列的核酸序列。这些分离的核酸分子可包含编码与本文所列或其它方式公开的氨基酸序列具有至少60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%或99%的序列同一性的氨基酸序列的核酸序列。
提供了保守性或其它氨基酸置换基础的特性的实例被示例于表1中。因此,本领域的技术人员可进行大量替换以获得表现出所需功能性的氨基酸序列变异体。可使用BLASTP、CLUSTALP和其它比对和比较工具以评估高度保守的区域,该区域可进行较少的置换(除非意图将活性改变至选定水平,这可能需要多个置换)。更多的置换可在被公认为或据信为不参与活性位点或其它结合或结构基序的区域中进行。根据表1,例如,可以以一种极性不带电(PU)氨基酸替换所列的序列中的极性不带电氨基酸,任选地对大小/分子量加以考虑(即,以丝氨酸替换苏氨酸)。关于哪种氨基酸改变有可能为表型沉默的指导可特别地见于,Bowie,J.U.等,“Deciphering the Message in Protein Sequences:Tolerance to Amino AcidSubstitutions,”Science 247:1306-1310页(1990年)中。该文献关于这些教导以引用的方式并入本文,但其通常也是为本领域的技术人员所知的。公认的保守性氨基酸置换包括(可替换氨基酸遵循密码子组中的各个密码子):丙氨酸:丝氨酸;精氨酸:赖氨酸;天冬酰胺:谷氨酰胺或组氨酸;天冬氨酸:谷氨酸;半胱氨酸:丝氨酸;谷氨酰胺:天冬酰胺;谷氨酸:天冬氨酸;甘氨酸:脯氨酸;组氨酸:天冬酰胺或谷氨酰胺:异亮氨酸;亮氨酸或缬氨酸:亮氨酸;异亮氨酸或缬氨酸;赖氨酸:精氨酸或谷氨酰胺或谷氨酸;甲硫氨酸:亮氨酸或异亮氨酸;苯丙氨酸:甲硫氨酸或亮氨酸或酪氨酸;丝氨酸:苏氨酸;苏氨酸:丝氨酸;色氨酸:酪氨酸;酪氨酸:色氨酸眼或苯丙氨酸;缬氨酸:异亮氨酸或亮氨酸。
应注意特定物种的密码子偏倚性和密码子使用表可被用于对分离核酸分子进行工程改造,其利用了该特定物种的密码子使用偏倚性。例如,本文提供的分离核酸可被设计以具有特定目的生物体所偏好使用的密码子。有多种软件和测序服务可用于这种序列的密码子优化。
本发明提供了包含本文所列或其它方式公开的氨基酸序列的整个氨基酸序列的多肽。此外,本发明提供了包含本文所列或其它方式公开的氨基酸序列的一部分的多肽。例如,本发明提供了包含15个氨基酸的序列的多肽,该序列与本文所列或其它方式公开的氨基酸序列的任意15个氨基酸的序列(包括但不限于,始于第1号氨基酸残基并终于第15号氨基酸残基的序列、始于第2号氨基酸残基并终于第16号氨基酸残基的序列、始于第3号氨基酸残基并终于第17号氨基酸残基的序列,以此类推)相一致。应当了解,本发明还提供了包含长度超过15个氨基酸残基(如,16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30或更多个氨基酸残基)并且与本文所列或其它方式公开的氨基酸序列中的任意部分一致的氨基酸序列的多肽,例如,本发明提供了包含与本文所列或其它方式公开的氨基酸序列的任意25个氨基酸的序列(包括但不限于,始于第1号氨基酸残基并终于第25号氨基酸残基的序列、始于第2号氨基酸残基并终于第26号氨基酸残基的序列、始于第3号氨基酸残基并终于第27号氨基酸残基的序列,以此类推)相一致的25个氨基酸的序列的多肽。另外的实例包括但不限于,包含长度为50或更多个氨基酸残基(如,100、150、200、250、300或更多个氨基酸残基)并且与本文所列或其它方式公开的氨基酸序列的任意部分一致的氨基酸序列的多肽。另外应当了解,根据上文,15个核苷酸的序列提供5个氨基酸的序列,因此,之后的并且更长的氨基酸序列可通过具有与本文提供的序列的同一性的上述核苷酸序列长度进行定义。
此外,本发明提供了其氨基酸序列具有对本文所列或其它方式公开的氨基酸序列的变异的多肽。例如,本发明提供了包含含有单个插入、单个缺失、单个置换、多个插入、多个缺失、多个置换或其任意组合(例如单个缺失与多个插入)的本文所列或其它方式公开的氨基酸序列的多肽。这些多肽可包含与本文所列或其它方式公开的氨基酸序列具有至少60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%或99%的序列同一性的氨基酸序列。特定的变异体氨基酸序列可包含多个变异以及变异类型的任意组合。
在各个实施方案中,本发明包括具有对本文公开的任意多核苷酸或多肽序列的变异的氨基酸序列。例如,对SEQ ID NO:544中所示的碳酸酐酶(大肠杆菌cynT)氨基酸序列的变异作为示例被提出。图3提供了所述大肠杆菌碳酸酐酶与其它11个物种的碳酸酐酶之间的CLUSTAL多序列比对,该11个物种的碳酸酐酶根据低E值在BLASTP比较中具有相对高同源性。SEQ ID NO:544是所显示的第五个序列。多同源性和低同源性置换被示出(即,分别通过“:”和“.”标记),其可导致本领域技术人员进行的额外的修饰。因此,SEQ ID NO:544中所示的序列变异的实例包括但不限于,图3中所示的任意序列变异。这些变异提供于图3中,其中SEQ ID NO:544中所示序列的特定位置处氨基酸残基(或其缺失)与在图3中的其它十一个氨基酸序列中的任意一个的相同比对位置处的氨基酸残基(或其缺失)的比较提供了SEQ ID NO:544所示的序列的特定变异的列表。例如,根据图3所示位于SEQ ID NO:544的第14位的“E”谷氨酸可被替换为“D”天冬氨酸或“N”天冬酰胺。应当了解,SEQ ID NO:544所示的序列可包含多种变异以及变异类型的任意组合。应注意到,图3中提供的氨基酸序列可以是具有碳酸酐酶活性的多肽。
根据本文所示,具有变异氨基酸序列的多肽可保持酶活性。这些多肽可使用诸如定点诱变或各种PCR技术的标准方法通过对编码多肽的核酸序列进行操作而产生。根据本文所述,一种类型的修饰包括了一个或多个氨基酸残基对具有类似化学和/或生化特性的氨基酸残基的置换。例如,多肽可具有本文所列或以其它方式公开的氨基酸序列中的氨基酸序列,其包含一个或多个保守置换。
更实质的改变可通过选择具较低保守性的置换和/或处于更为关键性的序列区域中而获得,例如选择更为明显地不同于保持以下特性的效应的残基:(a)在该置换区域内的多肽骨架的结构,例如,作为折叠片和螺旋构象;(b)多肽在靶位点的电荷或疏水性;或(c)侧链主体。通常预期在多肽功能上产生最大变化的置换是以下那些情况:(a)亲水残基如丝氨酸或苏氨酸置换(或被置换为)疏水残基如亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、缬氨酸或丙氨酸;(b)半胱氨酸或脯氨酸置换(或被置换为)任何其它残基;(c)具有电正性侧链的残基如赖氨酸、精氨酸或组氨酸置换(或被置换为)电负性残基如谷氨酸或天冬氨酸;或(d)具有大侧链的残基如苯丙氨酸置换(或被置换为)不具侧链的残基,如甘氨酸。可评估这些氨基酸置换(或其它的缺失或添加)对具有酶活性的多肽的效果,该评估通过分析所述多肽催化与相关天然多肽相同的底物转化为与相关天然多肽相同的产物的能力而进行。因此,本发明提供了具有5、10、20、30、40、50或更少保守置换的多肽。
多肽和编码多肽的核酸可通过标准的DNA诱变技术而产生,例如,M13引物诱变。这些技术的细节提供于Sambrook和Russell,2001年中。核酸分子可包含编码区域的变化以适合于分子将引入其中的特定生物体的密码子使用偏倚性。
或者,可利用遗传密码的简并性改变编码区域以改变所述编码序列而使得尽管所述核酸序列发生较大改变,但其仍然编码具有与天然氨基酸序列相同或者基本类似的氨基酸序列的多肽。例如,在该开放读码框架中丙氨酸由核苷酸密码子三联体GCT所编码。由于遗传密码的简并性,三种另外的核苷酸密码子三联体-GCA、GCC和GCG-也编码丙氨酸。因此,开放读码框架的核酸序列可在该位置被改变成这三种密码子中的任意一个而不影响被编码多肽的氨基酸序列或该多肽的特征。根据遗传密码的简并性,可根据本文所述使用标准的DNA诱变技术从本发明所公开的核酸序列产生核酸变异体,或通过核酸序列的合成而产生。因此,对于各个实施方案,本发明涵盖了编码相同多肽但由于遗传密码的简并性而在核酸序列上有所变化的核酸分子。
本发明还提供了分离的核酸分子,其至少长约12个碱基(如,至少长约13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、50、60、100、250、500、750、1000、1500、2000、3000、4000或5000个碱基)并且在杂交条件下与具有本文所列或以其它方式公开的序列的核酸正义链或反义链杂交。所述杂交条件可以是中度或高度严格杂交条件。此外,在一些实施方案中微生物包含内源3-HP产生途径(其可在一些这样的实施方案中被增强),而在其它实施方案中微生物不包含3-HP产生途径但被提供编码具有一种或多种完成本文所述途径的酶活性的多肽的一种或多种核酸序列,从而导致3-HP的产生。在一些实施方案中,本文所公开的特定序列或其保守修饰变异体被提供给选择的微生物,诸如选自本文所列的一种或多种物种或物种群体或者其它分类学组。
VI.丙二酰-CoA从脂肪酸合成向3-HP的重定向
本发明的组合物,诸如遗传修饰的微生物,包含其中丙二酰-CoA作为底物的化学产物产生途径,并且还可包含一种或多种遗传修饰以降低由一种或多种脂肪酸合成酶系统基因所编码的酶的活性。所述组合物可用于本发明的方法和系统中。
对于多种化学产物在众多商业发酵用途的微生物中的微生物发酵,丙二酰-CoA是在正常的生长条件下被转化成为随后被用于细胞膜和其它关键细胞功能的脂肪酸及其衍生物(如磷脂)的代谢中间体。例如,在大肠杆菌中,所述脂肪酸合成酶系统是II型或解离的脂肪酸合成酶系统。在该系统中,脂肪酸产生途径的酶由不同基因所编码,并且与众多关键代谢途径一样,其受到良好调控,包括下游产物抑制上游酶。
在各个实施方案中,代谢中间体丙二酰-CoA通过脂肪酸合成系统(即,途径或复合体)向脂肪酸的转化是丙二酰-CoA的唯一或主要用途。经测定,当在微生物中存在指向替代化学产物的产生途径时,丙二酰-CoA向脂肪酸的这种转化的降低可改善该替代化学产物(如,3-HP)产生的量度。例如,在多种微生物细胞中所述脂肪酸合成酶系统包含具有下列酶活性的多肽:丙二酰-CoA-酰基载体蛋白(ACP)酰基转移酶;β-酮脂酰基-ACP合成酶;β-酮脂酰基-ACP还原酶;β-羟酰基-ACP脱水酶;3-羟酰基-(ACP)脱水酶;以及烯酰基-酰基载体蛋白还原酶(烯酰基-ACP还原酶)。在各个实施方案中,编码这些多肽的温度敏感形式的核酸序列可被引入以替换天然酶,并且当这样的经遗传修饰的微生物在提高的温度下(在该温度下这些不耐热的多肽由于蛋白质结构的改变或完全变性而部分地或完全地失活)进行培养的时候,观察到了诸如3-HP这样的产物的增加。在其它实施方案中,可进行其它类型的遗传修饰以另外地调控(如降低)这些多肽的一种或多种的酶活性。在各个实施方案中,这样的遗传修饰的结果是变换了丙二酰-CoA的利用以使得存在丙二酰-CoA向脂肪酸的转化、总体生物质的减少以及按比例地增加碳源向如3-HP这样的化学产物的转化。在各个实施方案中,通过微生物产生的化学产物的比生产率高得出人意料。此外,对于特定的实施方案可进行另外的遗传修饰,诸如用于提高丙二酰-CoA产生的遗传修饰。
一种酶,烯酰基(酰基载体蛋白)还原酶(EC No.1.3.1.9,亦称为烯酰基-ACP还原酶),是用于由丙二酰-CoA生物合成脂肪酸的关键酶。在大肠杆菌中该酶(FabI)由基因fabI所编码(参见,“Enoyl-Acyl CarrierProtein(fabI)Plays a Determinant Role in Completing Cycles of Fatty AcidElongation in Escherichia coli”,Richard J.Heath和Charles O.Rock,J.Biol.Chem.270:44,26538-26543页(1995年),其关于fabI和脂肪酸合成酶系统的讨论以引用的形式并入本文)。
本发明可利用具有编码多肽的核酸序列(多核苷酸)的微生物,所述多肽具有可在发酵事件中受到调控的烯酰基-ACP还原酶活性。例如,编码温度敏感型烯酰基-ACP还原酶的核酸序列可被提供以取代天然烯酰基-ACP还原酶,从而使得提高的培养温度导致降低的酶活性,这随后引起丙二酰-CoA的利用转向所需化学产物的产生。在这种提高的温度下,酶被认为就该温度而言是不容许的。一种这样的序列是大肠杆菌的突变温度敏感性fabI(fabITS),对于DNA为SEQ ID NO:769,对于蛋白质为SEQID NO:770。
应当了解大肠杆菌以外的物种中烯酰基-ACP还原酶的核酸和氨基酸序列可通过在已知基因组数据库中进行的同源性搜索(如BLASTN和BLASTP)而容易地获得。获得其它物种中的同源物和功能等同序列的途径在本文中有所描述。因此,应当了解本领域的技术人员可将本发明实施于具有商业价值的多种微生物物种。
可根据本领域的技术人员所知使用除温度敏感型的烯酰基-ACP还原酶之外的其它方法,例如但不限于,将天然烯酰基-ACP或烯酰基-CoA还原酶替换成包含用于该酶的诱导型启动子的核酸序列,从而可在初始诱导后继之以无诱导,由此在达到选定的细胞密度之后降低烯酰基-ACP或烯酰基-CoA还原酶的酶活性。
在一些方面,本发明的组合物、方法和系统在遗传修饰的微生物中变换了丙二酰-CoA的利用,该微生物包含脂肪酸合成酶系统的至少一种酶,诸如烯酰基-酰基载体蛋白还原酶(烯酰基-ACP还原酶)或烯酰基辅酶A还原酶(烯酰基-CoA还原酶)、β-酮脂酰基-ACP合成酶或β-酮脂酰基-CoA合成酶,丙二酰-CoA-ACP,并且可进一步包含编码碳酸酐酶的核酸序列的至少一种遗传修饰以提高微生物细胞中的重碳酸盐水平和/或对其培养基的重碳酸盐和/或碳酸盐的补充,并且可进一步包含一种或多种遗传修饰以提高乙酰CoA羧化酶和NADPH依赖性转氢酶中的一种或多种酶的酶活性。更一般的情况下,碳酸盐和/或重碳酸盐的添加可被用于提高发酵液体培养基中的重碳酸盐水平。
在一些方面,本发明包含了遗传修饰的微生物,所述微生物包含至少一种提供、完成或者增强有效地将丙二酰-CoA转化成为3-HP的3-HP产生途径的遗传修饰,且进一步包含碳酸酐酶的遗传修饰以提高微生物细胞内的重碳酸盐水平或对其培养基的重碳酸盐和/或碳酸盐补充,并且可进一步包含一种或多种遗传修饰以提高乙酰CoA羧化酶和NADPH依赖性转氢酶中的一种或多种酶的酶活性。相关的方法和系统使用了这些遗传修饰的微生物。
在一些方面,本发明包含遗传修饰的微生物,所述微生物包含至少一种提供、完成或者增强有效地将丙二酰-CoA转化成为3-HP的3-HP产生途径的遗传修饰,并且进一步包含脂肪酸合成酶系统的至少一种酶的遗传修饰,如烯酰基-酰基载体蛋白还原酶(烯酰基-ACP还原酶)或烯酰基-辅酶A还原酶(烯酰基-CoA还原酶)、β-酮脂酰基-ACP合成酶或β-酮脂酰基-CoA合成酶、丙二酰-CoA-ACP,并且可进一步包含碳酸酐酶的遗传修饰以提高微生物细胞内的重碳酸盐水平或对其培养基的重碳酸盐和/或碳酸盐补充,并且可进一步包含一种或多种遗传修饰以提高乙酰CoA羧化酶和NADPH依赖性转氢酶中的一种或多种酶的酶活性。相关的方法和系统使用了这些遗传修饰的微生物。
在各个实施方案中,本发明涉及制备化学产物的方法,其包括:在容器中提供遗传修饰的微生物群体的选定细胞密度,其中所述遗传修饰的微生物包含用于从丙二酰-CoA产生化学产物的产生途径;以及降低所述经遗传修饰的微生物的脂肪酸合成酶途径中的至少一种酶的酶活性。
在各个实施方案中,降低微生物宿主细胞中的烯酰基-ACP还原酶的酶活性导致3-HP以提高的单位生产率和容积生产率产生。在再另外的实施方案中,降低微生物宿主细胞中的烯酰基-CoA还原酶的酶活性导致3-HP以提高的单位和容积生产率产生。
进行遗传修饰以降低这些酶的酶活性的另一种方法是提供对一种这样的酶如烯酰基-ACP还原酶(如,大肠杆菌中的fabI)进行转录启动的诱导型启动子。在这样的实例中,该启动子可以在本文方法的第一阶段被诱导(如使用异丙基-μ-D-硫代半乳糖吡喃糖苷(IPTG)),且在IPTG被耗尽、去除或稀释之后,可开始进行降低烯酰基-ACP还原酶酶活性的第二步。其它方法可被应用于控制酶的表达和活性,诸如本文所述的方法和/或本领域技术人员所知的方法。
尽管烯酰基-CoA还原酶被认为是脂肪酸合成酶系统的重要的酶,遗传修饰还可对于编码表现出该系统的酶活性的多肽(如本文所列的)的多核苷酸(核酸序列)的任意组合进行。例如,FabB,β-酮脂酰基-酰基载体蛋白合成酶I,是大肠杆菌中对于生长以及饱和和不饱和脂肪酸的生物合成关键的酶。FabB的失活导致脂肪酸延伸的抑制和减慢的细胞生长,以及消除将丙二酰基-ACP的丙二酸部分重循环至乙酰-CoA的无效循环。FabF,β-酮脂酰基-酰基载体蛋白合成酶II,在细胞中是饱和脂肪酸合成和控制膜流动性所需要的。这两种酶均被浅蓝菌素所抑制。
据报道FabF的过表达导致减少的脂肪酸生物合成。FabF被认为超过FabB而与丙二酰-CoA:ACP乙酰转移酶FabD竞争结合。FabB与FabD的结合是起动脂肪酸延伸的缩合反应所需的(参见Microbiological Reviews,1993年9月,57卷522-542页,No.3;K.Magnuson等,“Regulation of FattyAcid Biosynthesis in Escherichia coli,”American Society for Microbiology;W.Zha等,“Improving cellular malonyl-CoA level in Escherichia coli viametabolic engineering,”Metabolic Engineering 11(2009年)192-198页)。一种降低这类脂肪酸合成酶的遗传修饰的替代方法是向培养系统中提供一种或多种这些酶的适当抑制剂。该方法可独立实施或与遗传修饰方法进行组合实施。诸如浅蓝菌素、硫乳霉素和三氯生(本列表不是限制性的)的抑制剂或用于降低由一种或多种脂肪酸合成酶系统基因所编码的酶的活性的遗传修饰可单独或组合使用。
不期望受限于特定的理论,据认为在微生物中降低烯酰基-ACP还原酶(和/或脂肪酸合成酶系统的其它酶)的酶活性导致了该酶的上游代谢中间体丙二酰-CoA的累积和/或分流,并且该丙二酰-CoA可随后被转化成为微生物细胞包含利用了丙二酰-CoA的针对其的代谢途径的化学产物。在本发明的特定的组合物、方法和系统中,使得烯酰基-ACP还原酶的(或在更一般的情况下,脂肪酸合成酶系统的)酶活性的降低在遗传修饰的微生物达到充分的细胞密度之后发生。这一两阶段培养方法获得了支持特定生产率的细胞生物质中的理想催化剂量与产率之间的平衡,这可部分地归因于在所述烯酰基-ACP还原酶活性(和/或脂肪酸合成酶系统的其它酶的活性)被降低之后更少的碳被导向细胞物质。这导致了丙二酰-CoA净利用的转向,由此提供朝向所需化学产物的更高碳流。
在本发明的各个实施方案中,单位生产率提高并且这产生了整体上迅速而有效的微生物发酵方法和系统。在各个实施方案中,容积生产率也显著地提高。
在各个实施方案中,遗传修饰的微生物包含包括丙二酰-CoA向所需化学产物3-羟基丙酸(3-HP)的转化的代谢途径。这被认为对于商业3-HP生产经济是颇为有利的,并且被认为是具有明显经济效益的进步。本文还公开了其它化学产物。
在单位生产率和容积生产率参数上的改善是出人意料的并且属于本领域的进步。
根据本文的讨论,烯酰基-ACP还原酶活性和/或脂肪酸合成酶系统的其它酶的降低可通过多种方式实现。
丙二酰-CoA向脂酰基-ACP或脂酰-CoA分子或向脂肪酸分子转化的“调控手段”指的是下列任何一种:1)在微生物细胞中提供至少一种多核苷酸,其编码至少一种具有脂肪酸合成酶系统(如本文所述的)中的一种酶的活性的多肽,其中如此编码的多肽具有(诸如通过突变和/或启动子替换等等以降低酶活性)或可经调控而具有(诸如通过温度敏感性、诱导型启动子等)降低的酶活性;2)向包含微生物细胞或群体的容器提供抑制剂,所述抑制剂抑制一种或多种脂肪酸合成酶系统的酶(如本文所述的)的酶活性,其剂量有效地降低这些酶的一种或多种的酶活性。这些手段可互相组合提供。当用于调控的手段涉及在发酵事件过程中从脂肪酸合成酶系统的较高活性向较低活性的转化时,例如通过提高包含遗传修饰的微生物群体(其包含温度敏感性脂肪酸合成酶系统多肽(如烯酰基-ACP还原酶))的培养器的温度或通过添加抑制剂,设想存在两种模式—一种模式期间这种脂肪酸合成酶系统具有较高活性,而第二种模式期间其具有较低活性。在较低活性模式过程中,可发生丙二酰-CoA的较大利用向选定的化学产物的转向。
一旦所述调控有效地降低所述的一种或多种酶活性,与天然的未调控酶活性(如在细胞中或分离的)相比,如此调控的各相应酶活性可减少至少百分之10、至少百分之20、至少百分之30、至少百分之40、至少百分之50、至少百分之60、至少百分之70、至少百分之80或至少百分之90。类似地,与在非调控的细胞中或其它系统中的这种转化相比,丙二酰-CoA向脂酰基-ACP或脂酰基-CoA分子的转化可减少至少百分之10、至少百分之20、至少百分之30、至少百分之40、至少百分之50、至少百分之60、至少百分之70、至少百分之80或至少百分之90。同样地,与在非调控的细胞或其它系统中的这种转化相比,丙二酰-CoA向脂肪酸分子的转化可减少至少百分之10、至少百分之20、至少百分之30、至少百分之40、至少百分之50、至少百分之60、至少百分之70、至少百分之80或至少百分之90。
VII.从丙二酰-CoA至3-HP的产生途径
在各个实施方案中,本发明的组合物、方法和系统涉及包括将丙二酰-CoA转化成为目的化学产物的代谢产生途径。
作为一个实例,3-HP被选择作为所述目的化学产物。
进一步关于3-HP产生途径的具体序列,对来自橙色绿屈挠菌(C.aurantiacus)的丙二酰-CoA还原酶(mcr)进行了基因合成并通过DNA 2.0的服务进行密码子优化。FASTA序列显示于SEQ ID NO:783中(gi|42561982|gb|AAS20429.1|丙二酰-CoA还原酶(橙色绿曲挠菌))。
Mcr在NCBI数据库中有非常少的序列同源物。当对全蛋白质进行检索时,Blast检索找到了8种不同的序列。因此,预期垛叠序列比较的进行只产生有限的信息。但是,尽管如此本发明的实施方案可包含这八种序列(其在本文出示并标识为SEQ ID No:784至791)中的任一序列,其预计对于该酶活性是双功能的,但未经证实。其它的实施方案可包含SEQ IDNo:784至791中任一序列的突变的或其它变异体形式,以及多核苷酸(包括具有保守或其它置换的变异体形式),如被引入选定微生物以在其中提供或提高3-HP产生的那些。
如下表所示,CLUSTAL 2.0.11多序列比对将这八个序列标为相应的SEQ ID No:783-791。
表2
丙二酰-CoA在包含下列一种或多种的微生物中可被转化成为3-HP:
双功能丙二酰-CoA还原酶,如,可获自橙色绿屈挠菌和其它微生物种。与此相关的双功能指的是丙二酰-CoA还原酶催化丙二酰CoA向丙二酸半醛的转化和丙二酸半醛向3-HP的转化。
单功能丙二酰-CoA还原酶与3-HP脱氢酶组合。单功能指的是丙二酰-CoA还原酶催化丙二酰-CoA向丙二酸半醛的转化。
上述多肽中任一种可以是NADH-或NADPH依赖的,并且本领域已知的方法可被用于将特定的酶转化为任一形式。更特别地,如在WO2002/042418中指出的,“可使用任意方法将以NADPH用作辅因子的多肽转化成以NADH作为辅因子的多肽,诸如其它文献所描述的方法(Eppink等,J Mol.Biol.,292(1):87-96页(1999年),Hall和Tomsett,Microbiology,146(Pt 6):1399-406页(2000年),以及Dohr等,Proc.Natl.Acad.Sci.,98(1):81-86页(2001年))”
并非进行限制,双功能丙二酰-CoA还原酶可选自橙色绿屈挠菌(如来自ATCC 29365)的丙二酰-CoA还原酶以及其它序列。同样并非进行限制,单功能丙二酰-CoA还原酶可选自Sulfolobus tokodaii的丙二酰-CoA还原酶(SEQ ID NO:826)。关于橙色绿屈挠菌的丙二酰-CoA还原酶,该序列以及其它种的序列对于此酶活性也可以是双功能的。
当在微生物细胞中提供单功能丙二酰-CoA还原酶时,还可提供3-HP脱氢酶酶活性以将丙二酸半醛转化成为3-HP。根据实施例中所显示的,可通过对双功能单功能丙二酰-CoA进行截短并在具有将丙二酸半醛转化成为3-HP的酶的菌株中进行结合而获得单功能丙二酰-CoA还原酶。
另外,注意到在勤奋金属球菌(Metallosphaera sedula)中已知有另一种丙二酰-CoA还原酶(Msed_709,鉴定为丙二酰-CoA还原酶/琥珀酰-CoA还原酶)。
通过提供编码具有上述酶活性的多肽的核酸序列,根据本发明的实施方案遗传修饰的微生物可包含有效的3-HP途径以将丙二酰-CoA转化成为3-HP。
其它的3-HP途径,如包含转氨酶的3-HP途径(参见,例如,公开于2010年1月28日的WO 2010/011874),也可在本发明的遗传修饰微生物的实施方案中提供。
并入本部分的是,本发明提供了针对选定化学产物如3-羟基丙酸(3-HP)的提高的单位生产率和容积生产率量度。在各个实施方案中,化学产物如3-HP的产生不与生长相关联。
在各个实施方案中,例如通过使用本文所公开的一种方法,3-HP的产生或替代情况下它的一种下游产物(如本文所述)的产生可达到至少1、至少2、至少5、至少10、至少20、至少30、至少40和至少50g/升的滴度。
通过了解本文所公开的关于选定化学产物的商业发酵的进展可认识到,本发明的实施方案可结合其它的遗传修饰和/或方法或系统调控,从而获得有效产生至少10、至少20、至少30、至少40、至少45、至少50、至少80、至少100或至少120克化学产物(如3-HP)每升最终(如,用过的)发酵液体培养基而同时以本文公开的单位和/或容积生产率实现这种产生的微生物(及相应方法)。
在一些实施方案中,微生物化学生产事件(即,使用培养的微生物群体进行的发酵事件)使用根据本文所述的遗传修饰的微生物进行,其中单位生产率介于每小时每克微生物细胞干重0.01至0.60克产生的3-HP(g3-HP/g DCW-hr)之间。在各个实施方案中,单位生产率高于0.01、高于0.05、高于0.10、高于0.15、高于0.20、高于0.25、高于0.30、高于0.35、高于0.40、高于0.45或高于0.50g 3-HP/g DCW-hr。在特定的微生物化学生产事件中可在2、4、6、8、12或24小时期间评估单位生产率。更特别的情况下,3-HP或其它化学产物的单位生产率介于0.05与0.10g 3-HP/gDCW-hr之间、0.10与0.15g 3-HP/g DCW-hr之间、0.15与0.20g 3-HP/gDCW-hr之间、0.20与0.25g 3-HP/g DCW-hr之间、0.25与0.30g 3-HP/gDCW-hr之间、0.30与0.35g 3-HP/g DCW-hr之间、0.35与0.40g 3-HP/gDCW-hr之间、0.40与0.45g 3-HP/g DCW-hr之间,或0.45与0.50g 3-HP/gDCW-hr之间,0.50与0.55g 3-HP/g DCW-hr之间,或0.55与0.60g 3-HP/gDCW-hr之间。各个实施方案包括了表现出这样的生产率的培养系统。
另外,在本发明的各个实施方案中,获得的容积生产率可为0.25g3-HP(或其它化学产物)每升每小时(g(化学产物)/L-hr)、可高于0.25g 3-HP(或其它化学产物)/L-hr、可高于0.50g 3-HP(或其它化学产物)/L-hr、可高于1.0g 3-HP(或其它化学产物)/L-hr、可高于1.50g 3-HP(或其它化学产物)/L-hr、可高于2.0g 3-HP(或其它化学产物)/L-hr、可高于2.50g 3-HP(或其它化学产物)/L-hr、可高于3.0g 3-HP(或其它化学产物)/L-hr、可高于3.50g 3-HP(或其它化学产物)/L-hr、可高于4.0g 3-HP(或其它化学产物)/L-hr、可高于4.50g 3-HP(或其它化学产物)/L-hr、可高于5.0g 3-HP(或其它化学产物)/L-hr、可高于5.50g 3-HP(或其它化学产物)/L-hr、可高于6.0g 3-HP(或其它化学产物)/L-hr、可高于6.50g 3-HP(或其它化学产物)/L-hr、可高于7.0g 3-HP(或其它化学产物)/L-hr、可高于7.50g 3-HP(或其它化学产物)/L-hr、可高于8.0g 3-HP(或其它化学产物)/L-hr、可高于8.50g 3-HP(或其它化学产物)/L-hr、可高于9.0g 3-HP(或其它化学产物)/L-hr、可高于9.50g 3-HP(或其它化学产物)/L-hr或可高于10.0g 3-HP(或其它化学产物)/L-hr。
在一些实施方案中,在24小时发酵(培养)期间测量的单位生产率可高于0.01、0.05、0.10、0.20、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0或12.0克化学产物每克微生物DCW(基于24小时期间结束时的最终DCW)。
在本发明的各个方面和实施方案中,在微生物单位生产率上产生了显著提高,其推动了发酵技术和如3-HP(但不限于此)的微生物化学生产的商业经济可行性。
换言之,在各个实施方案中,所述单位生产率超过(至少为)0.01g化学产物/g DCW-hr、超过(至少为)0.05g化学产物/g DCW-hr、超过(至少为)0.10g化学产物/g DCW-hr、超过(至少为)0.15g化学产物/g DCW-hr、超过(至少为)0.20g化学产物/g DCW-hr、超过(至少为)0.25g化学产物/g DCW-hr、超过(至少为)0.30g化学产物/g DCW-hr、超过(至少为)0.35g化学产物/g DCW-hr、超过(至少为)0.40g化学产物/g DCW-hr、超过(至少为)0.45g化学产物/g DCW-hr、超过(至少为)0.50g化学产物/g DCW-hr、超过(至少为)0.60g化学产物/g DCW-hr。
更一般的情况下,基于本文所述的遗传修饰的各种组合,任选地结合本文所述的补充,3-HP和本文所述的其它化学产物的单位生产率值可超过0.01g化学产物/g DCW-hr,可超过0.05g化学产物/g DCW-hr,可超过0.10g化学产物/g DCW-hr,可超过0.15g化学产物/g DCW-hr,可超过0.20g化学产物/g DCW-hr,可超过0.25g化学产物/g DCW-hr,可超过0.30g化学产物/g DCW-hr,可超过0.35g化学产物/g DCW-hr,可超过0.40g化学产物/g DCW-hr,可超过0.45g化学产物/g DCW-hr,和可超过0.50g或0.60化学产物/g DCW-hr。在特定的微生物化学生产事件中可在2、4、6、8、12或24小时期间内评估该单位生产率。
通过本发明的实施方案获得的改善可通过与缺乏本文所教导的特定遗传修饰组合的对照微生物(存在或不存在本文所教导的向包含微生物群体的容器中的补充的情况下)相比较,单位生产率的提高百分比或容积生产率的提高百分比而确定。对于特定的实施方案及其组,这些单位生产率和/或容积生产率提高超过这种适当对照微生物的相应单位生产率和/或容积生产率至少百分之10、至少百分之20、至少百分之30、至少百分之40、至少百分之50、至少百分之100、至少百分之200、至少百分之300、至少百分之400以及至少百分之500。
本说明书以及以引用的方式并入的引用文献的具体方法和教导可被引入实施例中。另外,在各个实施方案中,3-HP或它的下游产物之一(如本文所述下游产物)的产生可达到至少1、至少2、至少5、至少10、至少20、至少30、至少40和至少50g/升的滴度。
所述度量值可适用于利用本文所公开的遗传修饰的微生物和/或方法的任何组合物(如遗传修饰的微生物)、方法(如生产3-HP或其它化学产物的方法)以及系统(如发酵系统)。
应当了解,使用本文提供的策略和方法以及根据对所述途径和途径部分之间的相互关系的发现而进行的反复改进可产生甚至更高的3-HP产量和耐受性以及在3-HP生物生产事件完成时进一步提高的3-HP滴度。
多种策略可导致产生适当修饰的适用于3-HP产生途径的酶。关于丙二酰-CoA还原酶,可使用或修饰如紧接上文表中的序列所编码的酶以在微生物菌株中获得适当水平的3-HP生产能力。
VIII.提高对3-HP的耐受性
已经鉴定了包含大量互相关联的代谢途径的全部或一部分的复合体,其中提高名为3-HP耐受发生复合体(“3HPTGC”)的该复合体的酶的酶活性的遗传修饰显示为提高微生物对3-HP暴露的耐受性。所述3HPTGC在公开于2010年1日28日的WO 2010/011874中有所描述,其对于所述3HPTGC以及关于3HP产生的遗传修饰的组合及基于3HPTGC和其中的组的3-HP耐受性的教导以引用的方式并入本申请。
根据本文所述以及详细讨论的,本发明广泛地涉及使用遗传修饰进行的改变和/或培养基调控(如,酶促转化产物或其它特定化学品的添加)以在基于微生物的工业生物生产方法、系统和组合物中获得所需的结果。关于所述耐受性方面,本发明源于发现包含特定的代谢途径部分(其包含提高的活性(基于其中编码的核酸序列的增加的拷贝数)与微生物对3-HP的耐受性提高相关的酶类)的3HPTPC的出人意料的重要性。
本文提供了涉及3HPTPC改变的实际数据和/或预测实施例。这些实例意图证明应用的广泛(基于与显示提高的3-HP耐受性的3HPTGC相关的基因组元件的巨大数量)以及用于获得3-HP耐受性提高的一些特定途径。途径可进行组合以获得3-HP耐受性的额外改善或协同改善,并且可包括遗传性或非遗传性的改变(如,涉及以特定化学品进行的系统补充,或对工业系统的一般改变)。另外,对具体的产生策略进行了公开和举例说明。
因此,除上述的用于提供3-HP产生途径和提供包含和/或控制编码烯酰基-ACP还原酶的基因的核酸序列以实现对该酶的酶活性的控制的遗传修饰和/或如本文描述的脂肪酸合成酶系统的其它修饰之外,在各个实施方案中还对遗传修饰的微生物进行了一种或多种遗传修饰以提高其对3-HP(或其它化学产物)的耐受性。
因此,在本发明的一些实施方案中,遗传修饰的微生物可包含至少一种遗传修饰以提供、完成或增强一种或多种3-HP产生途径,至少一种遗传修饰以提供烯酰基-ACP还原酶和/或可经控制以在所需的细胞密度下降低该活性的脂肪酸合成酶系统的其它修饰,和3HPTGC或其一个、两个或三个或更多个组的至少一种遗传修饰以提高所述遗传修饰的微生物对3-HP的耐受性。
因此,本发明的一个方面涉及遗传修饰的微生物,其包含至少一种有效地提高3-羟基丙酸(“3-HP”)产生的遗传修饰(其中所述提高的3-HP产生水平高于野生型微生物中3-HP产生水平),和包含本文中鉴定为3-HP耐受发生复合体(“3HPTGC”)的代谢复合体的至少一种遗传修饰。在特定的条件下,如在基本培养基中的培养,所述3HPTGC遗传修饰使所述遗传修饰的微生物能够在特定的培养条件下产生3-HP,从而使3-HP可积累至相对较高的浓度而不出现在非修饰微生物中所观察到的毒性效应。3-HP产生途径的至少一种遗传修饰可用于提高3-HP的积累和/或改善野生型微生物中可见的3-HP产生途径的生产,或用于在正常情况下不合成3-HP的微生物中提供充分的酶促转化因而使3-HP被生物生产。产生这样的遗传修饰的微生物的方法也被描述并且是本发明的该方面的一部分。
本发明的另一个方面涉及遗传修饰的微生物,所述微生物包含至少一种来自3HPTGC的分支酸、苏氨酸/同型半胱氨酸、多胺合成,赖氨酸合成以及核苷合成部分的两种或更多种的遗传修饰。多种组合的非限制性实施例例示了本发明的该方面的优点。另外的遗传修饰涉及所述3HPTGC的其它部分。通过适当的遗传修饰可向一些遗传修饰的微生物添加生物生产3-HP的能力。鉴定遗传修饰以提供获得提高的3-HP耐受性的微生物的方法以及通过这些方法制备的微生物与本发明的这一方面相关。
本发明的另一方面涉及能够产生3-羟基丙酸(“3-HP”)的遗传修饰的微生物,所述微生物包含3HPTGC的至少一种遗传修饰,该修饰在微生物的3HPTGC的一个或多个酶促转化步骤中提高了酶促转化,并且其中所述至少一种遗传修饰使所述遗传修饰的微生物的3-HP耐受性提高超过缺乏该遗传修饰的对照微生物的3-HP耐受性。产生这样的遗传修饰的微生物的方法也被描述并且是本发明的该方面的一部分。
本发明的另一方面涉及遗传修饰的微生物,其包含对3HPTGC的特定遗传修饰的多种核心集(core set)。在各个实施方案中,本方面可另外包含来自于所述3HPTGC的分支酸、苏氨酸/同型半胱氨酸、多胺合成、赖氨酸合成以及核苷酸合成部分中的一种或多种或者两种或更多种的至少一种遗传修饰。产生这样的经遗传修饰的微生物的方法也被描述并且是本发明的该方面的一部分。
此外,本发明包括了用于改善微生物对3-HP耐受性的方法,其可在具有3-HP生产能力(无论后者能力是天然存在的还是通过遗传修饰而增强和/或引入的)的微生物中。
此外,本发明的另一方面涉及向微生物培养中提供了一种或多种补充物以提高该微生物对3-HP的有效耐受性,所述补充物是3HPTGC的底物(即反应物)和/或产物(本文统称为“产物”,注意除起始步骤之外的所有步骤中的底物亦为3HPTGC的产物)。
本发明的另一个方面涉及用以引入编码本文称为IroK的短多肽的遗传元件的遗传修饰。编码这一短多肽的遗传元件的引入被显示为在微需氧条件下改善大肠杆菌的3-HP耐受性。该遗传修饰可以与本发明的其它遗传修饰和/或补充物添加进行组合。
关于根据本发明的教导而制备3-HP的方法以及制备3-HP的遗传修饰的微生物,可对微生物提供一种或多种遗传修饰以提高对3-HP的耐受性。即,SEQ ID NO:001至189被并入本部分,SEQ ID NO:190至603被提供作为核酸序列(基因,DNA)以及编码大肠杆菌3HPTGC的氨基酸序列(蛋白质),并且SEQ ID NO:604至766被提供作为酿酒酵母3HPTGC的核酸序列的序列。
更进一步,用于提高碳酸酐酶(如,大肠杆菌cynT,DNA为SEQ IDNO:337并且蛋白质序列为SEQ ID NO:544)表达的特定遗传修饰可以以双功能方式发挥作用以有利地同时改善3-HP产生和3-HP耐受。当丙二酰-CoA还原酶被提供用于3-HP产生时尤为如此。图1显示了包含双功能丙二酰-CoA还原酶的从丙二酰-CoA到3-HP的产生途径,以及本文所述的其它酶促转化和途径。碳酸酐酶并不意图是限制性的。例如,在大肠杆菌中被不同地命名为can和yadF的碳酸酐酶2是已知的,并且在本发明的实施方案中的遗传修饰的使用可利用该基因或其它基因以及它们所编码的酶。can的序列被提供为SEQ ID NO:767(EG12319 can″carbonicanhydrase 2 monomer″(complement(142670..142008))Escherichia coli K-12substr.MG1655)和SEQ ID NO:768(EG12319-MONOMER carbonicanhydrase 2 monomer(complement(142670..142008))Escherichia coli K-12substr.MG1655)。
另外,应当了解用于提高3-HP耐受性的遗传修饰可根据对3HPTGC特定相应部分所进行的遗传修饰而被进一步分类。例如,可对编码催化所述3HPTGC的特定部分的酶促反应的酶的多核苷酸进行遗传修饰并且该遗传修饰由此预期分别提高芳香氨基酸(酪氨酸和苯丙氨酸)、色氨酸(Trp)、泛醌-8、甲基萘醌、肠菌素、四氢叶酸(参见A组表单(以及其输入信息)的相应酶促转化)、一种或多种极性不带电氨基酸(甘氨酸、丝氨酸、半胱氨酸、同型半胱氨酸)、异亮氨酸、甲硫氨酸(参见B组表单(以及其输入信息)的相应酶促转化)、谷氨酰胺、精氨酸、腐胺、亚精胺、氨基丙基尸胺(参见C组表单(以及其输入信息)的相应酶促转化)、尸胺(参见D组表单(以及其输入信息)的酶促转化)、肌醇-5-磷酸、黄苷-5-磷酸、腺苷酸基-琥珀酸、乳清苷-5′-磷酸以及可从此获得的任一种单-、二-和三-磷酸核苷(即,腺苷、鸟苷、胞苷、尿苷)(参见E组表单(以及其输入信息)的相应酶促转化)、谷氨酸、琥珀酸、琥珀酸半醛、草酰乙酸和天冬氨酸(参见F组表单的相应酶促转化,包括沿虚线显示的反应)的产量,由此而使3-HP耐受性由于这些遗传修饰而提高。可选择任意部分或亚部分用于遗传修饰以在选择的微生物种中提高对3-HP的耐受性。
如所说明的,在各个实施方案中,在本部分中所述的遗传修饰的组合结合本发明涉及对脂肪酸合成酶系统的调控的方面而实施。
VIIIA.SCLAES技术
根据公开于2010年1月28日的WO 2010/011874中所述,为获得遗传信息,通过使用SCALES技术对来自基因组文库群的克隆的适合度(fitness)进行评估而获得初始3-HP相关适合度数据。这些克隆通过3-HP的升高浓度而施加的选择性环境(其被证明是可靠的3-HP耐受性测试)中生长。
更特别地,为获得可用于鉴别与提高的3-HP耐受性相关的遗传元件的数据,通过本领域的技术人员所知的方法产生了五个代表性大肠杆菌K12基因组文库的起始群。这五个文库分别包含大肠杆菌K12遗传物质的500、1000、2000、4000、8000个碱基对(“bp”)的插入序列。基本包含完整大肠杆菌K12基因组的这些文库各自分别地转化进入MACH1TM-T1大肠杆菌细胞中并且培养至与微需氧条件相对应的中指数期(OD600~0.2)。批转移次数是可变的并且根据所需进行调整以避免营养物受限的选择环境(即,避免培养物进入静止期)。尽管并非意味着限制替代性信息途径,在存在3-HP情况下进行的选择在60小时期间在8个系列转移批次上以3-HP的下降梯度进行。更特别地,所述3-HP浓度对于系列批次1和2为20g 3-HP/L,对于系列批次3和4为15g 3-HP/L,对于系列批次5和6为10g 3-HP/L,对于系列批次7和8为5g 3-HP/L。对于系列批次7和8,培养基在培养物接近静止期时进行更换以避免营养物限制。
在选择中各个批次达到顶峰期间和顶峰处提取样品并且进行识别信号强度的微阵列分析。在阵列和数据分析之前的用于制备文库、转化细胞培养物的各标准实验室方法以及其它用于SCALES技术的标准实验室方法在本领域是为人所熟知的,例如受到Sambrook和Russell,MolecularCloning:A Laboratory Manual,2001年第三版(第1-3卷),Cold SpringHarbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.(此后称为Sambrook和Russell,2001年)中教导的方法支持。各个方法的方面也被更为详尽地描述于实施例中以及SCALES技术的专利申请,2005年9月20日提交的题为“Mixed-Library Parallel Gene Mapping Quantitation MicroarrayTechnique for Genome Wide Identification of Trait Conferring Genes”的美国专利公开第2006/0084098A1号中(此后称为“SCALES技术”),其以引用的方式并入本文用于教导该技术的额外细节。
微阵列技术在该领域中也是为人所熟知的(参见,例如<<www.affymetrix.com>>)。为获得关于在对3-HP的不同暴露期间哪一克隆更具优势的数据,Affymetrix大肠杆菌反义基因芯片阵列(Affymetrix,Santa Clara,CA)根据来自Affymetrix的大肠杆菌表达方案进行了操作和扫描以生成affymetrix.cel文件。在对3-HP的给定暴露后出现的强微阵列信号表明通过包含基因序列的质粒引入的这一基因序列赋予了3-HP耐受性。可通过本领域已知的大量微阵列分析而鉴定这些克隆。
另外,出于应用于美国的以引用的方式并入的目的,“A genomicsapproach to improve the analysis and design of strain selections,”T.E.Warnecke等,Metabolic Engineering 10(2008)154-165页中表明SCALES适合度数据与3-HP的耐受性提高相关联并可被用作3-HP的耐受性提高的代表(surrogate)的额外的具体教导被以引用的方式并入本文。这一结论基于受试者工作特征(ROC)曲线的标准应用。ROC分析在医学诊断领域被常规地用于评估诊断测试与疾病的实际存在与否之间的关联。目前全世界在医疗应用中使用的在ROC分析中表现良好的诊断测试被常规地用于鉴定疾病的存在与否。该分析适应于评估基于不同微生物生长的敏感性和特异性的选择,从而产生作为3-HP耐受性的可靠测试的适合度值。特别地,使用具有趋降水平3-HP的系列批培养物的基于生长的选择被确信认为用于3-HP耐受性的敏感性和特异性测试。因此,在该选择中具有高于声价十倍截止值0的适合度量度的克隆被鉴定为产生对3-HP耐受性的克隆。
下表列出一些显示为具有升高的适合度值的基因,这在本此表示赋予对3-HP的耐受性。
表3:SCALES适合度数据
基因 | 累计适合度 | 基因 | 累计适合度 | 基因 | 累计适合度 | ||
aceE | 11.2 | cysM | 26.63 | ilvC | 2.61 | ||
aceF | 8.39 | eno | 6.98 | ilvD | 1.6 | ||
ackA | 2.36 | entA | 1.58 | ilvE | 0.94 | ||
acnA | 3.58 | entB | 0.93 | ilvH | 1.18 | ||
acnB | 3.18 | entC | 1.26 | ilvI | 1.77 | ||
adhE | 3.68 | entD | 1 | ilvM | 1.02 | ||
adiA | 1.95 | entE | 1.03 | ilvN | 1.53 |
adk | 2.18 | entF | 1.03 | kbl | 3.11 | ||
aldA | 1.83 | fbaA | 2.87 | itaE | 1.14 | ||
argA | 3.94 | fbaB | 2.28 | lysC | 1.97 | ||
argB | 8.94 | folA | 15.07 | malY | 2.58 | ||
argC | 4.02 | folB | 0.57 | menA | 3.2 | ||
argD | 2.87 | folC | 1.72 | menB | 0.86 | ||
argE | 2.15 | folD | 8.54 | menC | 0.92 | ||
argF | 2.04 | folE | 1.08 | menD | 2.33 | ||
argG | 2.62 | folK | 1.73 | menE | 3.06 | ||
argH | 8.06 | folP | 2.45 | menF | 3.09 | ||
argI | 4.06 | fumA | 3.84 | metA | 1.56 | ||
aroA | 2.31 | fumB | 2.51 | metB | 1.83 | ||
aroB | 8.68 | fumC | 1.86 | metC | 6.08 | ||
aroC | 1.95 | gabD | 1.83 | metE | 2.46 | ||
aroD | 1.93 | gabT | 1.41 | metH | 2.44 | ||
aroE | 8.44 | gapA | 3.03 | metK | 3.35 | ||
aroF | 6.24 | gcvH | 5.9 | metL | 2.97 | ||
aroG | 2.26 | gcvP | 7.91 | mhpF | 1.44 | ||
aroH | 1.61 | gcvT | 1.78 | ndk | 1.66 | ||
aroK | 4 | gdhA | 2.84 | nrdA | 2.01 | ||
aroL | 1.63 | gldA | 2.08 | nrdB | 1.81 | ||
asd | 2.96 | glk | 1.17 | nrdD | 2.79 | ||
aspC | 2.82 | glnA | 1.34 | nrdE | 1.91 | ||
astC | 2.29 | gltA | 6.37 | nrdF | 1.25 | ||
carA | 0.89 | glyA | 5.06 | pabA | 2.33 | ||
carB | 1.17 | gmk | 1.86 | pabB | 1.92 | ||
cynS | 4.83 | gnd | 1.69 | thrA | 2.79 | ||
cysE | 1.19 | gpmA | 2.01 | thrB | 0.96 | ||
cysK | 2.41 | guaA | 3.65 | thrC | 1.51 | ||
pabC | 1.75 | guaB | 2.63 | pheA | 6.7 |
pfkA | 1.78 | ilvA | 12.21 | pta | 2.7 | ||
pflB | 2.83 | ilvB | 2.7 | purA | 5.1 | ||
purB | 3.65 | rpiA | 1.85 | trpC | 1.56 | ||
purC | 1.78 | sdaA | 1.62 | trpD | 2.48 | ||
purD | 1.32 | sdaB | 1.22 | trpE | 2.85 | ||
purE | 1.82 | serA | 3.11 | tynA | 2.36 | ||
purF | 2.04 | serB | 2.46 | tyrA | 9.1 | ||
purH | 1.66 | serC | 2.15 | tyrB | 1.49 | ||
purK | 2.65 | speA | 2.09 | ubiA | 1.51 | ||
purL | 4.83 | speB | 1.66 | ubiB | 2.09 | ||
purM | 3.13 | speC | 1.52 | ubiC | 2.4 | ||
purN | 2.94 | speD | 3.43 | ubiD | 0.91 | ||
purT | 3.73 | talA | 1.24 | ubiE | 1.02 | ||
puuE | 1.53 | talB | 4.78 | ubiF | 1.78 | ||
pyrB | 6.36 | tdcB | 1.87 | ubiG | 3.17 | ||
pyrC | 14.48 | tdcD | 1.64 | ubiH | 5.35 | ||
pyrD | 2.26 | tdcE | 1.16 | ubiX | 1.72 | ||
pyrE | 1.03 | tdh | 1.38 | ydcW | 0.89 | ||
pyrF | 1.38 | tktA | 1.89 | ydiB | 0.87 | ||
pyrG | 2.23 | tktB | 1.21 | ygjG | 2.51 | ||
pyrH | 1.78 | trpA | 2.45 | yneI/sad | 4.18 | ||
pyrI | 0.83 | trpB | 1.93 | ||||
rpe | 2.06 |
VIIIB.SCALES技术分析
根据公开于2010年1月28日的WO 2010/011874中的描述,所述3-HP耐受性SCALES数据的分析已经导致对各种被鉴定的途径及其部分间的相互关系的理解。可以注意到,3HPTGC整体由具有升高的适合度值的基因之间的相互关系推导出来。并非3HPTGC中的每一个酶在所述SCALES数据中显示具有正适合度值。这可能是由用于获得该SCALES数据的商业阵列中的特定缺陷所导致。因此,大肠杆菌3HPTGC的一些并非源于SCALES遗传元件数据的成员是经推导而填充到3HPTGC中的。但是,注意到在3HPTGC中的大多数酶具有正适合度值,并且总体适合度数据与本文提供的补充物和遗传修饰数据相结合证实了推导的有效性和3HPTGC与3-HP耐受性相关的总体显著性。
根据本文所述,3HPTGC被分为包含糖酵解途径、三羧酸循环、乙醛酸途径以及己糖磷酸途径一部分的“上区(upper section)”,以及包含全部或部分的分支酸超途径、氨基甲酰-磷酸到氨基甲酸途径、苏氨酸/同型半胱氨酸超途径、核苷酸合成途径和多胺合成途径的“下区(lowersection)”。
在各个实施方案中,微生物进行遗传修饰而影响3HPTGC的一种或多种酶活性,从而可以获得升高的3-HP耐受性,例如在包含微生物3-HP生物合成活性的工业系统中。另外,可进行遗传修饰以在包含对3-HP耐受发生复合体的一种或多种遗传修饰的微生物中提供和/或改善一种或多种3-HP生物合成途径,由此提供提高的3-HP产量。后面这些重组微生物可被称为3-HP合成-耐受重组微生物(“3HPSATG”重组微生物)。
图9A表单1-7(在图9A表单1中提供了用于对这些表单进行定位以查阅整个所示3HPTGC的指导)公开了大肠杆菌的3HPTGC。如在图9A表单1-7可观察到的,3HPTGC包含以下全部或各种标明的部分:分支酸超途径、氨基-甲酰磷酸到氨基甲酸的途径、苏氨酸/同型半胱氨酸超途径;戊糖磷酸途径的一部分;核苷酸合成途径;糖酵解/三羧酸循环/乙醛酸旁路超途径;以及多胺合成途径。注意到,所述分支酸途径和苏氨酸途径被确认为超途径,因为他们分别涵盖了许多的已知较小途径。但是,整个3HPTGC包含这些以及其它途径或其部分,所述其它途径正常情况下与分支酸超途径或苏氨酸/同型半胱氨酸超途径不相关。
更特别的情况下,包含表单1-7的图9A被细分成下区和上区,所述下区被进一步细分成A-E组,上区被简单标识为F组。下区的组被标识如下:A组,或“分支酸”,包含被标明的分支酸超途径的主要部分(表单3);B组,或“苏氨酸/同型半胱氨酸”,包含所述苏氨酸/同型半胱氨酸超途径的标明部分(表单7);C组,或“多胺合成”,包含所述多胺途径的标明部分,其包括精氨酸合成步骤和氨基甲酰-磷酸到氨基甲酸的途径(表单5);D组,或“赖氨酸合成”,包含所述赖氨酸合成途径的标明部分(表单6);E组,或“核苷酸合成”,包含所述核苷酸合成途径的标明部分(表单4)。F组(表单2)包含3HPTGC的上区并且包括糖酵解途径、三羧酸循环和乙醛酸旁路途径,以及己糖磷酸途径的标明部分。
注意到,在图9A表单1-7中3HPTGC的酶促转化步骤得标明了特定的基因。这些基因是大肠杆菌菌株K12,亚株MG1655的基因;它们的核酸及相应的氨基酸序列可获自<<http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez>>或者<<www.ecocyc.org>>。正如本领域的技术人员所知的,一些基因在染色体中可在处于单一启动子控制下的操纵子内或具有其它的相互关系。当核酸序列在本文中以组合提及的时候,诸如sucCD或cynTS,这指的是所述核酸序列分别包含sucC和sucD两者和包含cynT和cynS两者。另外的控制和其它遗传元件也可处于这样的核酸序列中,当其被添加于遗传修饰中时可统称为“遗传元件”,并且其被意在包括添加单一基因的遗传修饰。
但是,类似的功能性基因易于在不同种和菌株中被发现,其编码具有与图9A表单1-7所示相同功能的酶,并且这样的基因及这样的其它种和菌株的3HPTGC可被用于本发明的实施中。这可通过下列方法获得,其并非被用于进行限制。
对于大肠杆菌的3HPTGC内的基因集,蛋白质序列从NCBI获得。为在酿酒酵母中鉴定类似功能的基因,使用大肠杆菌3HPTGC中所鉴定的基因应用<<www.biocyc.org>>的途径比较工具。对于枯草杆菌,部分地使用所注明的方式,并且非经该方式获得的酶或途径部分通过同源性比较方式获得。对于所述同源性方式,使用不同的阈值进行选定的大肠杆菌蛋白质和芽孢杆菌属蛋白质序列集(4096个序列)的本地blast(<<www.ncbi.nlm.nih.gov/Tools/>>)(blastp)比较(<<www.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/lproks.cgi>>)。利用同源性信息(具有E-10或更低E值的同源性匹配)对枯草杆菌的3HPTGC进行了其余基因和酶的鉴定。
另外,后一同源性方式被用于钩虫贪铜菌,下表提供了与编码已知催化3HPTGC的酶促转化步骤的酶的大肠杆菌基因具有证明的同源性的钩虫贪铜菌遗传元件的同源性关系的一些实例。这是基于E值低于的E-10的同源性序列标准。该表仅仅提供了通过该比较而获得的众多同源物(超过850个)中的小部分。并非钩虫贪铜菌中的全部同源序列预期编码适于钩虫贪铜菌3HPTGC的酶促转化步骤的所需的酶。但是,通过一种或多种已知编码所需酶促反应的遗传元件的选择组合,对于该种的3HPTGC选择最相关的遗传元件。
表4:钩虫贪铜菌的遗传元件的同源性关系
图9B表单1-7显示了枯草杆菌的3HPTGC,图9C表单1-7显示了酵母菌酿酒酵母的3HPTGC,且图9D表单1-7显示了钩虫贪铜菌的3HPTGC。显示了后者的酶名称以及在与已知催化所需的3HPTGC酶促转化步骤的大肠杆菌酶进行比较时满足E值低于E-10的标准的同源性序列量的指示。
根据上述方法中的任一种,以及给定微生物种的基因组信息的已然存在或获取该信息的相对简易性和低成本,上述方法中的一种或两种可被用于在选定的微生物种(其基因组序列已知或已获得)中鉴定相关基因和酶、评估这些同源匹配的和鉴定的酶的所选择遗传修饰对于3-HP耐受性的相对改善,并且因此产生包含对3-HP的更高耐受性的重组选定微生物。
另外,应当了解,各种微生物中的替代性途径可能产生3HPTGC的产物,其增加的产生或存在在本文中被证明会引起3-HP耐受性的增加。例如,在酵母物种中,具有赖氨酸(组D中的产物)的替代性途径。因此,此类替代性途径的改变包含在本发明的范围内,因为此类微生物物种也落在相关权利要求的范围内。因此,在各实施方式中,本发明不限于图9A-D所描述的具体途径。也就是说,产生如图9A-D所示产物的多种途径及其酶也被认为落在本发明的范围内。。
注意到,当特定酶促转化步骤显示出两种或更多种基因时,这些可能是单一的多酶复合物的成分,或者可以表示替代性酶,所述替代性酶具有控制它们的不同控制因子,或者有差别地被诱导。另外,如本领域技术人员所明白的,对于酶促转化步骤仅显示了主要的反应物(即底物)和产物。这是为了使原本已经拥挤不堪的图中的细节最简化。例如,没有显示电子载体和能量转移分子,例如NAD(P)(H)和ADP/ATP,这些(以及3HPTGC图中没有显示的其它小分子反应物)不被认为是3HPTGC的“产物”(如本文所用的术语)。另外,对于至少两个步骤(二氢新喋呤磷酸至7,8-二氢-D-新喋呤,和1,4-二羟基-2-萘甲酰-CoA至1,4-二羟基-2-萘甲酸)没有显示酶,因为在申请本专利时,对于该步骤尚未有已知鉴定的酶。因此,在一些实施方式中,3HPTGC应理解为和/或认为不包括对于这些步骤的酶、核酸序列等。另外,如下文所讨论,本发明范围内还包括核酸序列变异体,其编码3HPTGC或本文所示的相关复合物或其部分的任意酶的所鉴定的酶功能变异体,并包括其在本文要求保护的构建体、方法和系统中的用途。
表3中提供的一些适合度数据没有反映在3HPTGC的图中,但也认为支持改善3-HP的耐受性的遗传修饰和/或补充。例如,对于gcvH、gcvP和gcvT而言,相对升高的适合度评分与甘氨酸切割系统相关。这些酶参与甘氨酸/5,10-亚甲基-四氢叶酸(“5,10mTHF”)转化途径,如图10所示。沿图10所示的方向,3个酶催化的反应引起甘氨酸(3HPTGC的产物,见图9A,表单4)的脱羧、从四氢叶酸(THF)产生5,10-亚甲基-THF、以及从NAD+产生NADH。该复合物的5,10-亚甲基-THF产物是下列一部分的酶催化反应的反应物:叶酸多谷氨酰化;泛酸生物合成;甲酰基THF生物合成;以及嘧啶脱氧核糖核苷酸的从新合成。总体而言,在表3中显示但在图9表单1-7中未反映的酶及其酶促催化步骤被认为是本发明的一部分(以及针对其它物种的它们的功能等同物),其中这些遗传修饰导致3-HP耐受性的提高。
VIIIC.3HPTCG的遗传修饰和补充
对于本发明的各种实施方式,对3HPTGC的任意途径和途径部分以及任意的3-HP生物生产途径所做的遗传修饰可以描述为包括各种遗传操作,包括那些旨在改变在任一个相应途径中鉴定的酶或酶活性的调节,并由此最终改变其活性的遗传操作。此类遗传修饰可以涉及转录、翻译和翻译后修饰,它们引起在选定的和/或鉴定的培养条件下的酶活性和/或总体酶促转化率的改变,和/或旨在提供另外的核酸序列(如一些实施例中所提供的)以便增加3HPTGC的酶的拷贝数和/或突变体。
实现此类遗传修饰的具体方法和方式是本领域技术人员熟知的,包括但不限于:增加内源性遗传元件的表达;降低阻遏基因的功能;导入异源遗传元件;增加编码催化3HPTGC的酶促转化步骤的多肽的核酸序列的拷贝数;使遗传元件突变以提供突变的蛋白从而增加特异性酶活性;过表达;低表达;伴侣分子(chaperone)过表达;敲除蛋白酶;改变或修饰反馈抑制;提供包含阻遏物和/或竞争性抑制剂的一个或多个破坏的结合位点的酶变异体;敲除阻遏基因;改善mRNA稳定性的进化、选择和/或其它方法。可以实施随机诱变以提供3HPTGC的遗传修饰,其可以包含在这些或其它指明的方法中。所述遗传修饰可进一步广泛地包括目标核酸中的一个或多个核酸的添加(包括插入)、缺失(例如通过突变)和置换。在各种实施方式中,遗传修饰引起改善的酶比活性和/或酶的周转数。不被限制地讲,可以通过KM、Kcat和K亲和中的一项或多项来测定变化情况。
此类遗传修饰总体上旨在增加3HPTGC的至少一个酶促转化步骤中的酶促转化,以便增强如此修饰的微生物的3-HP耐受性。另外,图9A-D中显示的酶促转化步骤可以由本领域技术人员容易地鉴定的酶所催化,例如通过检索对应于图9A-D中特定酶促转化步骤的基因名称的酶名称,然后在例如其它物种中鉴定具有相同名称和功能的酶。后者将能够把该酶促转化步骤的相应反应物转化为相应的产物。公共数据库站点例如www.metacyc.org,www.ecocyc.org,www.biocyc.org和www.ncbi.gov具有鉴定此类类似酶的相关工具。
另外,虽然本文中经常使用MIC分析作为指示在不同的3-HP浓度中放置指定时间的微生物生长中的差异的终点,但是其绝不意图被认为是测定基于本发明的方面的微生物耐受性差异(例如改善)的唯一合适度量。非限制地,其它合适的测量方法可以包括生长速率测定、延迟时间测定、指定的培养时间段的培养物光密度的变化、在给定时间段内群体的加倍次数,及对于具有3-HP产生能力的微生物而言,培养系统中的总体3-HP产量,在所述系统中3-HP积累至对于不具有那些增加3HPTGC的一个或多个酶促转化步骤中的酶促转化的遗传修饰的对照微生物而言具有抑制性的水平。这可能导致增加的生产率、产量或滴度。
一般认识到,用于测定3-HP耐受性增加的量度可以与微生物或微生物培养物在暴露于3-HP中指定时间段内的情况下生长的能力相关。这可以通过各种定量和/或定性分析和终点来测定,尤其是通过与合适的对照(其不含如本文公开和讨论的与3-HP耐受性相关的遗传修饰和/或补充)相比较。用于此类测定的时间段可以是但不限于:12小时;24小时;48小时;72小时;96小时;和超过96小时的时间段。可以评定3-HP的变化暴露浓度以更清晰地确定3-HP耐受性的改善。下面的段落提供了可用于表明微生物在其培养系统中存在3-HP时的生长和/或存活能力上的差异(当把本发明的教导应用于所述微生物和/或所述培养系统时)的方法的非限制性实例。
图15A-O提供了来自响应于不同的3-HP浓度的各个对照微生物的数据。这些图中的数据各个不同地显示为:最大生长速率(μmax)的改变、光密度(“OD”)的改变和在给定时间段(此处为24小时)内的相对加倍次数。
测定生长速率、延迟时间和最大生长速率是普遍使用的用于进行比较型度量的分析。图15A、15D、15G、15J和15M显示了在标明的需氧或厌氧测试条件下所示物种在24小时的测试时间段内的最大生长速率的变化。当表示在目标化学物质(其被认为对于生长具有毒性和/或抑制性)的一个浓度范围内的这一数据时,这种表示在本文中被称作“耐受图(toleragram)”。在此,通过测定在经受包括可变量的3-HP的生长条件的微生物的比生长速率来产生生长耐受图。
此外,图15P比较了对照微生物培养物与其中进行了遗传修饰以增加cynTS(其在3HPTGC的组C中)表达的微生物的生长耐受图。大肠杆菌中cynTS遗传修饰的曲线显示出,对于各3-HP浓度在24小时的测试期内,最大生中速率随着3-HP浓度的增加而增大。这提供了定性的视觉可见的差异。然而,cynTS遗传修饰的较大曲线下面积提供了定量的差异,其可用于与其它旨在改善3-HP耐受性的遗传修饰进行比较的目的。此类曲线的评估可以导致更有效地鉴定遗传修饰和/或补充,及其组合。
图15B、15E、15H、15K和15N显示了对照微生物对不同的3-HP浓度的反应,其中使用的度量是24小时的光密度(“OD”,在600nm测定)。OD600是微生物培养物中细胞密度的常规度量。对于在需氧条件下的大肠杆菌,图15B显示了,从30g/L的3-HP开始,在24小时内细胞密度的急剧降低。图15D显示了在厌氧条件下,大肠杆菌相对更剧烈和更早的下降。
图15C、1F、15I、15L和15O显示了对照微生物对不同的3-HP浓度的反应,其中显示了在24小时的时间段内的细胞加倍次数。
以上旨在作为评估3-HP耐受性改善的多种方法的非限制性描述。一般地,生长和/或存活上的可显示的改善被认为是评估耐受性例如3-HP耐受性的增强的方法。
本发明的实施方式可以产生于将表达载体导入宿主微生物,其中所述表达载体含有编码是或者不是正常存在于宿主微生物中的酶的核酸序列。所以,就导入异源核酸序列之前的宿主微生物的基因组而言,编码所述酶的核酸序列是异源的(不论所述异源核酸序列是否被导入该基因组中)。
一般地,通过本文描述的一种或多种方法提供一种或多种遗传修饰以增加重组微生物对3-HP的耐受性是在本发明范围内的。因此,相应方法的组合结果(即,包含所述用于获得增强的3-HP耐受性的一个或多个、两个或更多个、三个或更多个等的遗传修饰的遗传修饰微生物)也在任何上述替代方式及其实施方式的范围内。
另外,在本发明的范围内还提供了在合适的培养容器(其含有所选的微生物)中的一种或多种补充物,所述补充物是3HPTGC的中间体或终产物(合称“产物”)。表5给出了可以添加到含有遗传修饰的微生物(其包含对3HPTGC和/或3-HP产生途径所做的一个或多个遗传修饰)的培养容器中的补充物的非限制性列表。例如,但不是意在限制,可以提供赖氨酸、甲硫氨酸和重碳酸盐中的一种或多种。这种补充物添加可以与所选微生物的遗传修饰(如本文所描述的)结合。
表5:
进一步对于补充物,关于涉及多胺合成的C组,实施例的结果证明:通过向培养基中添加聚胺:腐胺、亚精胺和尸胺,大肠杆菌的3-HP耐受性增加。对照和补充的培养基中大肠杆菌K12的最小抑制浓度(MIC)如下:在补充了腐胺的M9基本培养基中是40g/L;在补充了亚精胺的M9基本培养基中是40g/L;在补充了尸胺的M9基本培养基中是30g/L。在添加了碳酸氢钠的M9基本培养基中,最小抑制浓度(MIC)是30g/L。在100g/L原液3-HP中,大肠杆菌K12的最小抑制浓度(MIC)是20g/L。
另外,鉴于在碳酸氢钠的补充情况下相对于对照的MIC增加,其它改变,例如碳酸酐酶的调节和/或遗传修饰(例如向目标细胞中提供异源核酸序列,其中该核酸序列编码具有碳酸酐酶活性的多肽)被认为对于增加3-HP耐受性具有作用(例如与3HPTGC的其它改变结合)。类似地,并且如本文提供的其它数据所支持,酶活性的改变(例如,通过对3HPTGC途径部分(其产生精氨酸、腐胺、尸胺、和亚精胺)中的酶进行的遗传修饰)被认为对于增加3-HP耐受性具有作用(例如与3HPTGC的其它改变结合)。
应认识到补充评价的结果提供了关于直接向培养基中添加补充物的应用,以及关于通过遗传修饰途径(例如本文一些实施例中提供的)改善3-HP耐受性的应用的证据。应认识到,增加3HPTGC酶促转化步骤的产物的浓度(例如通过遗传修饰,无论是通过补充和/或遗传修饰)可以有效增加微生物中和/或培养此微生物的培养基中的一种或多种3HPTGC产物的细胞内浓度。
总而言之,所述适合度数据和随后从涉及与3HPTGC相关的遗传修饰和/或补充物的实施例中获得的数据支持用于提高3HPTGC途径的酶促转化的改变与在微生物细胞或培养系统中所产生的3-HP耐受性的功能性提高之间的功能相关性的概念。这可以在作为整体的3HPTGC中以及在其定义的组内和组间看出来。
另外,并入本部分的表6-9、11和13-17,提供了非限制性的补充物添加、遗传修饰和补充物添加与遗传修饰组合的实例。根据这些实例和所描述的在目标微生物中鉴定用于实现升高的3-HP耐受性的遗传修饰的方法,可以进行另外的补充、遗传修饰及其组合。特定组合可以仅涉及3HPTGC的下区,包括涉及其中5个组的两个或更多个、三个或更多个、或四个或更多个组(各涉及补充物添加和/或遗传修饰)的组合,在各种实施方式中,其中的任一个还包括关于3HPTGC上区的一个或多个遗传修饰或补充物添加。实施例中所述的早前未出现的内容并入本部分。
基于这些结果,可以理解在本发明的各种实施方式中,无论是方法还是组合物,作为3HPTGC的遗传修饰和/或其反应物的补充的结果,相对于不含所述至少一个3HPTGC遗传修饰的对照微生物的3-HP耐受性,针对3HPTGC的改变有效增加3-HP耐受性至少5%,至少10%,至少20%,至少30%或至少50%。
通过所述实例可了解,可以在培养系统中提供并利用本发明的任何经遗传修饰的微生物,例如用于产生3-HP。在一些实施方式中,向培养系统中提供一种或多种添加物(其为3HPTGC酶促转化步骤的产物)以进一步增加此类培养系统中的总体3-HP耐受性。
可以通过本领域技术人员已知的任何方法或方式(包括但不限于本文描述的那些)来测定无论是微生物还是培养系统的3-HP的耐受性增加。
3HPTGC上部分的遗传修饰可以包括任何酶促转化步骤。一个非限制性实例涉及三羧酸循环。已知柠檬酸合成酶(E.C.2.3.3.1[以前是4.1.3.7])(其催化该循环中的第一个步骤)的存在和活性控制总体循环的速率(即是限速酶)。因此,微生物的遗传修饰,例如增加拷贝数和/或比活性和/或其它相关特性(例如降低反馈抑制剂或其它控制分子的效应)可以包括柠檬酸合成酶的修饰。实现柠檬酸合成酶的此类改变的途径可以利用多种实验室技术,例如本领域已知的,包括本文描述的用于3HPTGC的其它酶促转化步骤的技术。另外,在美国专利号6,110,714和7,247,459中描述了几种普遍已知的技术,这两项专利皆转让给Ajinomoto Co.,Inc.,其中关于增大柠檬酸合成酶活性的相应教导通过引用并入本文(具体而言,美国专利6,110,714的第3和4栏及实施例3和4;美国专利7,247,459的第11和12栏,具体是实施例(1)和(2))。
在各种实施方式中,提供了包含选定的基因缺失的大肠杆菌菌株,所述基因缺失旨在增加3HPTGC中的酶促转化并因此增加微生物对3-HP的耐受性。例如,可以缺失下列与指明的3HPTGC组中的途径阻遏相关的基因:组A-tyrR,trpR;组B-metJ;组C-purR;组D-lysR;组E-nrdR。这些是对大肠杆菌而言的,且在该物种和其它物种中鉴定并遗传修饰等同的阻遏基因是本领域技术人员已知并可以确定的。
也可以实现基因功能的破坏,其中,改变核酸序列对于功能性酶的正常编码,从而减少或消除微生物细胞中该功能性酶的产生。破坏可以广泛地包括基因缺失,且也可以包括但不限于基因修饰(例如,引入终止密码子、移码突变、引入或除去基因的部分、引入降解信号)、影响mRNA转录水平和/或稳定性及改变编码多肽的基因上游的启动子或阻遏物。在一些实施方式中,基因破坏是指对于DNA、由DNA编码的mRNA和氨基酸序列的任意遗传修饰,所述遗传修饰引起微生物细胞中编码基因的酶功能至少50%的降低。
另外,就本发明的完整范围和对于各个实施方式而言,可以认识到以上讨论和实施例是示例性的,而不是限制性的。可以进行遗传操作以实现在总体酶功能上想要的改变,例如通过减少反馈抑制和其它控制因素,包括DNA转录和RNA翻译控制机制的改变、改善的mRNA稳定性,以及使用具有有效的拷贝数和启动子以达到有效改善水平的质粒。可以筛选和/或选择此类遗传修饰以实现经过3HPTGC内的特定基本途径的较高流率,并且这可以影响基础的和/或主要的途径中的一般细胞机制。因此,在一些替代方式中,对3HPTGC的其它部分进行更有选择性的遗传修饰。
另外,基于关键步骤的位置和特性、反馈抑制和其它因素和限制的分析,在各种实施方式中,进行至少一个遗传修饰以增加3HPTGC的下列酶之一的总体酶促转化:2-脱氢-3-脱氧磷酸庚糖酸醛缩酶(例如,aroF,aroG,aroH);氰酸酶(例如,cynS);碳酸酐酶(例如,cynT);半胱氨酸合成酶B(例如,cysM);苏氨酸脱氨酶(例如,ilvA);鸟氨酸脱羧酶(例如,speC,speF);腺苷甲硫氨酸脱羧酶(例如,speD)和亚精胺合成酶(例如,speE)。遗传修饰可以包括增加编码这些酶的核酸序列的拷贝数和提供具有减少的或消除的反馈抑制、调节剂的控制、对底物的亲和性增加和其它修饰的修饰核酸序列。因此,本发明的一个方面是以增加一个或多个3HPTGC酶促转化步骤的酶促转化的方式对这些酶中的一种或多种进行遗传修饰,以便增加流量和/或以另外的方式改变流经3HPTGC的反应流,从而提高3-HP耐受性。除了分别与涉及aroH和氰酸酶(与碳酸酐酶)的遗传修饰相关的实施例以外,提供了以下实例。注意到,在大肠杆菌中,已知有第二种碳酸酐酶。其在不同情况下被确定为Can和yadf。
另外,应当了解,另外,认识到,本发明的各种实施方式可以包括排除任一个或多个指定的酶促转化步骤、产物添加和/或特定酶的3HPTGC的遗传修饰(根据本文所述可在微生物中提供)和/或其补充物。例如,本发明的一个实施方式可以包括微生物中3HPTGC的遗传修饰,但排除3HPTGC的组A、或组A和B或者3HPTGC的其个或多个确定成员(其可以是3HPTGC成员的任意子集)的遗传修饰。
例如,非受限制的,经修饰的3HPTGC可包含根据本文所述的3HPTGC全部成员,除降解形式的精氨酸脱羧酶(adiA,其已知在厌氧条件下存在过量底物时在低pH的丰富培养基中被诱导)之外,或除该降解型精氨酸脱羧酶和其它选定酶步骤之外的其它亚组。其它修饰的3HPTGC复合体也可在各个实施方案中进行实施。根据adiA所指明的诱导,精氨酸脱羧酶的降解形式不考虑在如需氧条件下进行实施的对3-HP耐受性改善的3HPTGC范围之内。
而且,本发明的各个非限制性方面可包括但不限于:
经遗传修饰的(重组的)微生物,其包含编码多肽的核酸序列,所述多肽与任意3-HP耐受性相关的或生物合成途径中的任意酶具有至少85%的氨基酸序列同一性,其中所述多肽具有有效进行相应3-HP耐受性相关的或生物合成途径酶的酶反应的酶活性和特异性,并且相对于缺乏所述核酸序列的合适的对照微生物,所述重组微生物显示更高的3-HP耐受性和/或3-HP生物产生。
经遗传修饰的(重组的)微生物,其包含编码多肽的核酸序列,所述多肽与任意3-HP耐受性相关的或生物合成途径中的任意酶具有至少90%的氨基酸序列同一性,其中所述多肽具有有效进行相应3-HP耐受性相关的或生物合成途径酶的酶反应的酶活性和特异性,并且相对于缺乏所述核酸序列的合适的对照微生物,所述重组微生物显示更高的3-HP耐受性和/或3-HP生物产生。
经遗传修饰的(重组的)微生物,其包含编码多肽的核酸序列,所述多肽与任意3-HP耐受性相关的或生物合成途径中的任意酶具有至少95%的氨基酸序列同一性,其中所述多肽具有有效进行相应3-HP耐受性相关的或生物合成途径酶的酶反应的酶活性和特异性,并且相对于不含所述核酸序列的合适的对照微生物,所述重组微生物显示更高的3-HP耐受性和/或3-HP生物产生。在一些实施方式中,该至少一个多肽与3-HPTGC途径和/或3-HP生物合成途径中的至少一种酶具有至少99%或100%的序列同一性。。
在本发明的一个方面,前述段落中的同一性值是通过使用如上所述的用于FASTDB软件程序或BLASTP或BLASTN(如版本2.2.2)以默认参数来确定的。另外,对于本文具体提及的全部序列,应当了解,其保守修饰的变异体意在被包含于本发明之中。根据本申请,在各个实施方案中,本发明涉及经遗传修饰的(例如重组的)微生物,其包含编码多肽的异源核酸序列,所述多肽是任意3-HP耐受性相关的(即3HPTGC的)途径或途径部分中的任意酶或(例如3-HP产生途径的)本文公开的其它酶的鉴定的酶功能变异体,其中所述多肽具有有效进行相应3-HP耐受性相关的酶或其它酶的酶反应的酶活性和特异性,从而相对于缺乏所述核酸序列的合适的对照微生物,所述重组微生物显示更高的3-HP耐受性或其它功能。本发明的相关方法还意在涉及鉴定的酶功能变异体和编码它们的核酸序列。实施方案还包含其它的功能性变异体。
在一些实施方式中,本发明涉及重组微生物,其包含至少一个遗传修饰以有效增加3-羟基丙酸(“3-HP”)产生,其中3-HP产生的增加的水平高于野生型微生物中的3-HP产生水平;以及3-HP耐受发生复合物(“3HPTGC”)的至少一个遗传修饰。在一些实施方式中,所述野生型微生物产生3-HP。在一些实施方式中,所述野生型微生物不产生3-HP。在一些实施方式中,所述重组微生物包含至少一个载体,例如至少一个质粒,其中所述至少一个载体包含至少一个异源核酸分子。
在本发明的一些实施方式中,所述3HPTGC的该至少一个遗传修饰有效地将重组微生物的3-HP耐受性增加至对照微生物的3-HP耐受性之上,其中所述对照微生物缺乏所述至少一个3HPTGC遗传修饰。在一些实施方式中,重组微生物的3-HP耐受性比对照微生物的3-HP耐受性增加大约5%、10%或20%。在一些实施方式中,重组微生物的3-HP耐受性比对照微生物的3-HP耐受性增加大约30%、40%、50%、60%、80%或100%。
另外,在各种实施方式中,所述3HPTGC的该至少一个遗传修饰编码至少一个多肽,其显示3HPTGC的至少一种酶的至少一种酶促转化,其中所述重组微生物显示出比缺乏所述3HPTGC的至少一个遗传修饰的对照微生物的3-HP耐受性高至少大约5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%或100%或更高的增加的3-HP耐受性。此类耐受性改善的任何评估可以基于基本培养基中的最小抑制浓度评估。
在一些实施方式中,微生物还包含至少一个另外的遗传修饰,其编码至少一个多肽,所述多肽显示出不同于3HPTGC第一组的遗传修饰的第二组的至少一种酶的至少一种酶促转化,其中所述重组微生物显示出比缺乏3HPTGC的所有所述遗传修饰的对照微生物的3-HP耐受性高至少大约5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%或100%或更高的增加的3-HP耐受性。在各种实施方式中,所述至少一个另外的遗传修饰还包括来自A-F组的各两个或更多个、或三个或更多个的遗传修饰。
例如,所述遗传修饰可以包含:A组的至少一个遗传修饰和B组的至少一个遗传修饰,A组的至少一个遗传修饰和C组的至少一个遗传修饰,A组的至少一个遗传修饰和D组的至少一个遗传修饰,A组的至少一个遗传修饰和E组的至少一个遗传修饰,B组的至少一个遗传修饰和C组的至少一个遗传修饰,B组的至少一个遗传修饰和D组的至少一个遗传修饰,B组的至少一个遗传修饰和E组的至少一个遗传修饰,C组的至少一个遗传修饰和D组的至少一个遗传修饰,C组的至少一个遗传修饰和E组的至少一个遗传修饰,或D组的至少一个遗传修饰和E组的至少一个遗传修饰。任意此类组合可以进一步与F组的遗传修饰一起实施。
在一些实施方式中,重组微生物包含选自tyrR、trpR、metJ、argR、purR、lysR和nrdR的3HPTGC阻遏基因的一个或多个基因破坏。
在一些实施方式中,3HPTGC的该至少一个遗传修饰包括增加SEQ IDNO:129(Irok肽)的表达的手段。在一些实施方式中,重组微生物是大肠杆菌菌株。在一些实施方式中,重组微生物是钩虫贪铜菌菌株。
在一些实施方式中,该至少一个遗传修饰编码与3HPTGC途径、3-HP生物合成途径的至少一种酶和/或SEQ ID NO:129(Irok)具有至少85%氨基酸序列同一性的至少一种多肽。
本发明的一些实施方式涉及培养系统。在一些实施方式中,所述培养系统包含本文描述的遗传修饰的微生物和培养基。此类遗传修饰的微生物可以包含3HPTGC的单一遗传修饰,或本文描述的任意组合,并可以另外包含3-HP产生途径的一个或多个遗传修饰。在一些实施方式中,所述培养基包含至少大约1g/L,至少大约5g/L,至少大约10g/L,至少大约15g/L,或至少大约20g/L的3-HP。在一些实施方式中,所述培养系统包含例如本文所示的相应浓度的3HPTGC补充物。
在一些实施方式中,本发明涉及制备经遗传修饰的微生物的方法,包括在3-羟基丙酸耐受发生复合物(“3HPTGC”)的酶促转化步骤处提供至少一个遗传修饰以使所述经遗传修饰的微生物的酶促转化相对于对照微生物的酶促转化升高,其中所述对照微生物缺乏所述至少一个遗传修饰,其中所述经遗传修饰的微生物合成3-HP。在一些实施方式中,所述对照微生物合成3-HP。在一些实施方式中,所述至少一个遗传修饰使所述经遗传修饰的微生物的3-HP耐受性相对于对照微生物的3-HP耐受性升高。
在一些实施方式中,经遗传修饰的微生物的3-HP耐受性比对照微生物的3-HP耐受性高至少大约5%,至少大约10%,至少大约20%,至少大约30%,至少大约40%,至少大约50%,或至少大约100%。在一些实施方式中,基于在基本培养基上进行的最小抑制浓度评估,经遗传修饰的微生物的3-HP耐受性比对照微生物的3-HP耐受性高大约50%至大约300%。在一些实施方式中,经遗传修饰的微生物还包含选自tyrR、trpR、metJ、argR、purR、lysR和nrdR的3HPTGC阻遏基因的一个或多个基因破坏。在一些实施方式中,对照微生物不合成3-HP。在一些实施方式中,提供至少一个遗传修饰包括提供至少一种载体。在一些实施方式中,所述至少一种载体包括至少一个质粒。在一些实施方式中,提供至少一个遗传修饰包括提供至少一个核酸分子。在一些实施方式中,所述至少一个核酸分子是异源的。在一些实施方式中,所述至少一个核酸分子编码SEQ IDNO:129(Irok)。
在一些实施方式中,进行遗传修饰以增加鉴定为具有表3中的升高的适合度评分和/或在实施例中评估的酶促转化步骤的酶促转化。催化此类反应的酶是众多的,并包括氰酸酶和碳酸酐酶。
另外,认识到,本发明的各种实施方式可以涉及催化任何物种的3HPTGC的酶促转化步骤的酶的氨基酸序列。更具体地,图9A-D的3HPTGC的氨基酸序列可以从一个或多个通常使用的生物信息学数据库(例如,www.ncbi.gov;www.metacyc.org),通过在其中输入酶促转化步骤的相应基因而容易地获得。
IX.遗传修饰的组合
根据美国专利临时申请第61/246,141号中的描述,遗传修饰的各种组合可在本发明的各个实施方案中实施,该临时申请以引用的方式并入本文并且对其要求了优先权。这些组合被描述于下文段落以及表6A、6B和7之中,注意最先的段落涉及可被用于所述组合之中的丙二酰-CoA还原酶的各种形式。
本发明的各个实施方案包含经遗传修饰的微生物,所述微生物包含至少一种遗传修饰以引入或提高丙二酰-CoA还原酶酶活性,其包括通过引入表达本文提供的丙二酰-CoA还原酶功能等同物的多核苷酸。丙二酰-CoA还原酶酶活性的功能等同物能够提高用于将丙二酰-CoA转化成为丙二酸半醛、将丙二酸半醛转化成为3-HP,或者用于这两者的酶活性。
在一些实施方案中,所述丙二酰-CoA还原酶的氨基酸序列包含SEQID NO:783。在其它的实施方案中,所述丙二酰-CoA还原酶包含SEQ IDNo:783至791中任一序列的变异体,其表现出丙二酰-CoA还原酶的酶活性。
所述丙二酰-CoA还原酶的氨基酸序列可包含与SEQ ID NO:783至791中任意一个序列具有至少50%、60%、70%、80%、85%、90%、92%、95%、96%、97%、98%或99%的序列同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中,至少一种遗传修饰包含提供编码氨基酸序列的多核苷酸,所述氨基酸序列包含SEQ ID NO:783到791中任意序列或其功能部分。在各个实施方案中,至少一种遗传修饰包含提供编码氨基酸序列的多核苷酸,所述氨基酸序列与SEQ ID NO:783至791中任意序列具有至少50%、60%、70%、80%、85%、90%、92%、95%、96%、97%、98%或99%的序列同一性。
在示例性的实施方案中,所述多核苷酸对于选定的微生物种进行密码子优化以编码与SEQ ID NO:783至791中的任一序列。在各个实施方案中,所述多核苷酸进行密码子优化以编码氨基酸序列,所述氨基酸序列与SEQ ID NO:783至791中任一序列具有至少50%、60%、70%、80%、85%、90%、92%、95%、96%、97%、98%或99%的序列同一性。所述多核苷酸可对于例如,大肠杆菌进行密码子优化。
在一些实施方案中,所述经遗传修饰而因此具有丙二酰-CoA还原酶遗传修饰的微生物另外包含至少一种遗传修饰以在所述经遗传修饰的微生物中提高选自表6A的蛋白质功能(葡萄糖转运体功能(诸如通过galP)、丙酮酸脱氢酶E1p、二氢硫辛酰胺乙酰转移酶以及丙酮酸脱氢酶E3)的蛋白质功能。在特定的实施方案中,所述经遗传修饰的微生物包含至少一种遗传修饰以提高选自表6A的蛋白质功能中的两种、三种或四种蛋白质功能。
在一些实施方案中,这些经遗传修饰的微生物另外还包含至少一种遗传修饰以降低选自表6B的蛋白质功能,乳酸脱氢酶、丙酮酸甲酸裂解酶、丙酮酸氧化酶、磷酸乙酰转移酶、(PTS的)可组氨酰磷酸化蛋白质、(PTS的)磷酰转移蛋白和(PTS的)多肽链。
在各个实施方案中,这些经遗传修饰的微生物包含至少一种遗传修饰以降低选自表6B的蛋白质功能中的两种、三种、四种、五种、六种或七种蛋白质功能的酶活性。此外,在各个实施方案中,进行了至少一种或超过一种遗传修饰以根据表中的注释对表7的蛋白质功能进行改变。
应当了解,在各个实施方案中,在经遗传修饰的微生物中表6A的一种或多种蛋白质功能的提高与表6A的一种或多种蛋白质功能的降低可以存在众多可能的组合,所述遗传修饰的微生物包含至少一种遗传修饰以提供或提高丙二酰-CoA还原酶蛋白质功能(即,酶活性)。蛋白质功能可独立地变化,并且本文表6A、6B和表7中的蛋白质功能的遗传修饰的任意组合(即,全因子的(full factorial))可通过所教导的方法进行调整并且被提供到所述的经遗传修饰的微生物中。
在一些实施方案中,用于降低酶活性的至少一种遗传修饰是基因破坏。在一些实施方案中,用于降低酶活性的至少一种遗传修饰是基因缺失。
在各个实施方案中,为获得作为所需产物的3-羟基丙酸(3-HP),所述经遗传修饰的微生物包含有效地将丙二酸半醛转化成为3-HP的蛋白质功能。有效地将丙二酸半醛转化成为3-HP的蛋白质功能对所述微生物可以是天然的,但这绝非必需的。
在一些实施方案中,有效地将丙二酸半醛转化成为3-HP的蛋白质功能是来自绿脓杆菌的天然或突变形式的mmsB或其功能等同物。在替代的情况下,或者附加地,该蛋白质功能可以是天然或突变形式的ydgG或其功能等同物。
本发明的特定的实施方案另外还包含遗传修饰以提高辅因子NADPH的可得量,其可根据可能需要而提高NADPH/NADP+比率。这些遗传修饰的非限制性实例是pgi(E.C.5.3.1.9,突变形式)、pntAB(E.C.1.6.1.2)(过表达的)、gapA(E.C.1.2.1.12):gapN(E.C.1.2.1.9,来自变异链球菌)替换/置换,以及破坏或修饰诸如sthA(E.C.1.6.1.2)的可溶性转氢酶,和/或zwf(E.C.1.1.1.49)、gnd(E.C.1.1.1.44)和edd(E.C.4.2.1.12)中一种或多种的遗传修饰。这些基因的序列可自www.metacyc.org获得。此外,表6A、6B和表7中所示的大肠杆菌基因名的基因和所编码的蛋白质的序列被提供于美国专利临时申请第61/246,141号之中,该申请全文以及这些序列以引用的方式并入本文,并且还可自www.ncbi.gov以及www.metacyc.org或www.ecocyc.org获得。
在一些实施方案中,所述遗传修饰提高3-HP的微生物合成使之超过缺乏所述至少一种产生3-HP的遗传修饰的对照微生物的速度或滴度。在一些实施方案中,所述遗传修饰有效地提高生成3-HP的酶促转化使之超过缺乏所述遗传修饰的对照微生物的酶促转化至少约百分之5、至少约百分之10、至少约百分之20、至少约百分之30或至少约百分之50。
表6A
表6B
表7
进一步关于根据表7教导降低酶功能,下列酶功能的任意一种或组合可结合本文所述的其它遗传修饰在特定的实施方案中被降低:β-酮脂酰基-ACP合成酶I,3-氧酰基-ACP合成酶I;丙二酰-CoA-ACP乙酰转移酶;烯酰基酰基载体蛋白还原酶;以及β-酮脂酰基-酰基载体蛋白合成酶III。
因此,根据上文各个部分所描述的,本发明的一些组合物、方法和系统包括提供经遗传修饰的微生物,该微生物包含对选定化学产物(如3-HP)的产生途径以及编码表现出降低活性的脂肪酸合成酶系统的酶的修饰多核苷酸,从而与缺乏该修饰的可比较(对照)微生物相比,使丙二酰-CoA的利用朝向所述生产途径转向。所述方法涉及在被提供营养培养基的容器中使用这些经遗传修饰的微生物群体产生所述化学产物。一些这样的实施方案中可存在本文所述的对其它酶的其它遗传修饰,如对乙酰CoA羧化酶和/或NADPH依赖性转氢酶的遗传修饰。提供编码表现出这些酶活性的多肽的多核苷酸的额外拷贝显示为提高3-HP产生。提高这些相应酶活性的其它方式在本领域中是已知的,并且可被应用于本发明的各个实施方案。大肠杆菌的这些多核苷酸和多肽的SEQ ID NO是:乙酰-CoA羧化酶(accABCD,SEQ ID NO:771-778);以及NADPH依赖性转氢酶(SEQID NO:779-782),其亦称为嘧啶核苷酸转氢酶,大肠杆菌中的pntAB。
此外,非限制地,制备化学产物的一些多阶段方法实施方案中的第一步可以例示为,向容器(如培养器或生物反应器容器)中提供营养培养基,例如本领域的技术人员所知的基本培养基,和遗传修饰的微生物的接种物以提供这些微生物的群体,例如细菌,且在更为特定的情况下是肠杆菌科的成员,例如大肠杆菌,其中经遗传修饰的微生物包含将丙二酰-CoA转化成为3-HP分子的代谢途径。例如,遗传修饰可包括提供编码基因(其编码其双功能形式之一的丙二酰-CoA还原酶)或者编码单功能丙二酰-CoA还原酶和NADH-或NADPH依赖性3-羟基丙酸脱氢酶(如,来自大肠杆菌的ydfG或mmsB,或来自绿脓杆菌的mmsB)的基因的至少一种核酸序列。在任一情况下,当在大肠杆菌宿主细胞中提供的时候,这些遗传修饰完成将丙二酰-CoA转化成为3-HP的代谢途径。该接种物被培养于所述容器中,从而使细胞密度增加达到适于获得3-HP的某种产生水平的细胞密度,所述产生水平符合考虑所述方法的下一步骤的总体生产率度量。在各种替代的实施方案中,这些经遗传修饰的微生物的群体可在第一个制备容器中被培养至第一细胞密度,并且随后被转移至所述容器以提供被选定的细胞密度。大量的多容器培养策略为本领域的技术人员所知。任何这样的实施方案根据本方法中所述的第一步提供所选的细胞密度。
同样非限制地,随后的步骤可通过两种方式举例说明,其还可在各个实施方案中结合实施。第一方式向所述经遗传修饰的微生物提供遗传修饰从而使其烯酰基-ACP还原酶活性可受到控制。作为一个实例,可进行遗传修饰以将天然烯酰基-ACP还原酶替换为温度敏感性突变体烯酰基-ACP还原酶(如,大肠杆菌中的fabITS)。后者可在高于30℃的温度下表现出降低的酶活性但在30℃下表现出正常的酶活性,从而通过提高培养温度至,例如,34℃、35℃、36℃、37℃或甚至42℃,降低烯酰基-ACP还原酶的酶活性。在该情况下,高于30℃下更多的丙二酰-CoA被转化成为3-HP或其它化学产物,其中丙二酰-CoA向脂肪酸的转化不受较低效能的烯酰基-ACP还原酶的阻碍。
对于第二种方式,烯酰基-ACP还原酶或另一种脂肪酸合成酶的酶的抑制剂被加入以降低丙二酰-CoA向脂肪酸的转化。例如,抑制剂浅蓝菌素被以抑制所述脂肪酸合成酶系统的一种或多种酶的浓度加入。图2A描述了相关途径并且显示了三种抑制剂—硫乳霉素、三氯生和浅蓝菌素,其位于它们所抑制的酶的旁边。加圈的大肠杆菌基因名表示对该基因所编码的多肽存在温度敏感性突变体。图2B提供了在图2A中进行了总体描述的所述脂肪酸合成酶系统的典型酶促转化以及示例性大肠杆菌基因的更为详尽的描述。微生物脂肪酸合成酶诸酶的抑制剂的该列表并非意在进行限制。其它抑制剂(其中的一些被用作为抗生素)在本领域中是已知的并且包括但不限于,如噻吩并二氮杂硼杂因(thienodiazaborine)的二氮杂硼杂因以及异烟肼。
本发明的3-HP耐受性方面可被用于任何制备3-HP的微生物,无论该微生物天然地产生3-HP或是通过任何方法进行遗传修饰以产生3-HP。
关于本发明的3-HP产生提高方面(其在工业生物生产中导致3-HP的滴度提高),遗传修饰包括向微生物中引入一种或多种核酸序列,其中所述一种或多种核酸序列编码并表达一种或多种产生途径的酶(或产生途径的酶的酶活性)。在各个实施方案中,这些改善因而结合以提高3-HP的工业生物生产的效率和效能,并且因此降低其成本。
多种3-HP产生途径中的一种或多种可被用于微生物中,例如结合用于改善对3-HP的耐受性的遗传修饰。在各个实施方案中,进行遗传修饰以提供酶活性用于实施一种或多种这些3-HP产生途径。本领域中已知几种3-HP产生途径。例如,美国专利第6852517号教导以甘油作为碳源的3-HP产生途径,并且其关于该途径的教导以引用的方式并入本文。这一引用文献教导了提供表达来自肺炎克氏菌的dhaB基因以及乙醛脱氢酶的基因的基因构建体。它们据称能够催化从甘油产生3-HP。然而,已经认识到,在一些实施方案中用于3-HP的生物产生的碳源将甘油排除于碳源的主要部分之外。
WO 2002/042418教导了几种3-HP产生途径。这一PCT公开文献关于对这些途径的教导以引用的方式并入本文。此外,该公开文献的图44在本文中提供,其总结了从葡萄糖到丙酮酸到乙酰-CoA再到丙二酰-CoA直至3-HP的3-HP产生途径。该公开文献的图55在本文中提供,其总结了从葡萄糖到磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)(直接或通过丙酮酸)到草酰乙酸再到天冬氨酸到β-丙氨酸到丙二酸半醛直至3-HP的3-HP产生途径。这些图中还显示了对于各种转化的代表性酶。
来自公开于2008年8月21日出版的美国专利公开第US2008/0199926号的图13总结了本文所述的3-HP产生途径以及其它已知天然途径,其以引用的方式并入本文。更一般地,关于对很可能天然情况下不存在的特定代谢途径的开发,Hatzimanikatis等在“Exploring the diversity of complexmetabolic networks,”Bioinformatics 21(8):1603-1609页(2005年)中进行了讨论。本文章对于代谢网路的复杂性的教导以引用的方式并入本文。
除这些图中总结的3-HP产生途径外,Strauss和Fuchs(“Enzymes ofa novel autotrophic CO2 fixation pathway in the phototrophic bacteriumChloroflexus aurantiacus,the 3-hydroxyproprionate cycle,”Eur.J.Bichem.215,633-643页(1993年))鉴定了产生3-HP的天然细菌途径。那时,该作者提到丙二酰-CoA向丙二酸半醛的转化是通过NADP依赖性乙酰化丙二酸半醛脱氢酶而进行且丙二酸半醛向3-HP的转化由3-羟基丙酸脱氢酶所催化。然而,从那时开始已经了解到,至少对于橙色绿屈挠菌,一种单一酶可催化两个步骤(M.Hugler等,“Malonyl-Coenzyme A Reductasefrom Chloroflexus aurantiacus,a Key Enzyme of the 3-HydroxypropionateCycle for Autotrophic CO2 Fixation,”J.Bacter,184(9):2404-2410页(2002年))。
因此,本发明的各个实施方案的一种产生途径包含丙二酰-CoA还原酶活性,其实现了丙二酰-CoA向丙二酸半醛再到3-HP的转化。根据本文一个实例中所提供的,向微生物中引入编码提供该酶(或酶活性)的多肽的核酸序列有效地提供提高的3-HP生物合成。
另一种3-HP产生途径在图14B中提供(图14A显示了天然的混合发酵途径)并在本段和随后段落中进行讨论。这是可被与其它3-HP产生途径一起使用或独立于其它3-HP产生途径使用的3-HP途径。在重组微生物中建立该生物合成途径的一种可能的途径,将编码草酰乙酸α-脱羧酶(oad-2)(或具有该活性的对应或相关的酶)的一种或多种核酸序列引入微生物中并且进行表达。根据实施例(但其非意味着限制)中例示说明的,酶进化技术被应用于对结构上类似的底物具有所需催化功能的酶,从而获得进化的(如,突变的)酶(以及编码该酶的对应核酸序列),其在微生物中以所需的速度和特异性表现出所需的催化反应。
因此,对于本发明的各个实施方案,对所述3HPTGC的任意途径和3-HP生物产生途径的任一途径进行的遗传操作可被描述为包括各种遗传操作,包括用于改变在任意相应途径中鉴定的酶或酶的酶活性的调控并因此而改变最终活性的遗传操作。这些遗传修饰可被用于转录、翻译或翻译后修饰,其在被选定和/或被确定的培养条件下导致酶活性和/或选择性的变化。因此,在各个实施方案中,为更有效地发挥功能,微生物可包含一种或多种基因缺失。例如,根据图14B中对大肠杆菌的特定实施方案的总结,可删除编码乳酸脱氢酶(ldhA)、磷酸乙酰转移酶(pta)、丙酮酸氧化酶(poxB)和丙酮酸-甲酸裂解酶(pflB)的基因。这些基因缺失在表14B的底部针对特定的实施方案进行了总结,其并非用于进行限制。此外,可对各种菌株提供用于降低多功能2-酮-3-脱氧葡糖酸6-磷酸醛缩酶和2-酮-4-羟基戊二酸醛缩酶和草酰乙酸脱羧酶(大肠杆菌中的eda)的酶活性的进一步缺失或其它修饰。除后者之外,在各个实施方案中,与多功能2-酮-3-脱氧葡糖酸6-磷酸醛缩酶和2-酮-4-羟基戊二酸醛缩酶和草酰乙酸脱羧酶(大肠杆菌中的eda)的酶活性的这种降低相结合,还可进行进一步的遗传修饰以提高葡萄糖转运体(例如,大肠杆菌中的galP)和/或降低热稳定、组氨酰可磷酸化蛋白质(PTS的)(大肠杆菌中的ptsH(Hpr))、磷酰转移蛋白(PTS的)(大肠杆菌中的ptsI)以及PTS的多肽链(大肠杆菌中的Crr)中的一种或多种的活性。
基因缺失可通过突变性基因删除途径而获得,和/或从具有一种或多种这些酶的表达降低或无表达的突变株开始而获得,和/或通过本领域的技术人员所知的其它方法而获得。
本发明的方法还涉及提供多种遗传修饰以提高微生物在将选定碳源向诸如3-HP这样的化学产物进行转化中的总体效率。特定的组合(如在实施例中)显示提高单位生产率、容积生产率、滴度和产量显著高于遗传修饰的更基础的组合。
除图9的遗传修饰之外,适当的额外遗传修饰还可提供进一步改善的生产量度。例如,在图8中描述了经遗传修饰的菌株。该菌株包含用于3-HP产生(如,上文第VII节所描述的)、3-HP耐受性(如,下文所描述的)的遗传修饰以及根据本文所述的额外遗传修饰(包括涉及脂肪酸合成酶系统的特定遗传修饰,并非进行限制,这些修饰在包括第VI节在内的本文其它部分中被更为一般地公开)。在该图中酶的功能通过所标出的酶促转化和/或编码具有这些酶的功能的代表性大肠杆菌基因标识符(除mcr所示为非大肠杆菌的丙二酰-CoA还原酶之外)进行表示,缺失通过相应基因标识前的标准“Δ”进行显示,并且提高的酶活性通过下划线进行显示(注意用于修饰的额外目标在该图内嵌的表中显示)。括号中的基因是对另一种基因所编码的酶的可能替代物或补充物,所述另一种基因也沿相应的途径步骤进行显示。此外,fabITS的使用表示对天然非温度敏感型基因的替换。这并非意在进行限制;根据另外所描述的,有多种途径以控制和限制朝向酰基-ACP的能通。
图8的实施方案描述了组合的多种遗传修饰,但是在本发明的各个实施方案中可提供这些酶功能的遗传修饰的其它组合以获得关于化学产物生物产生的所需水平的提高的速度、滴度和产量。
另外的遗传修饰可被提供于本发明的微生物菌株中。可提供多种这样的修饰以产生特定的表型。
作为一个实例,可向各种菌株提供多功能2-酮-3-脱氧葡糖酸6-磷酸醛缩酶和2-酮-4-羟基戊二酸醛缩酶和草酰乙酸脱羧酶(大肠杆菌中的eda)的删除。
例如,可提供利用蔗糖的能力,并且这将对可被用于产生3-HP或其它化学产物的原料范围进行扩展。常用的大肠杆菌实验室和工业菌株,诸如本文所述的菌株,不能将蔗糖作为唯一碳源加以利用。因为蔗糖以及如糖浆的含蔗糖原料丰富并且通常作为原料被用于通过微生物发酵而进行的生产,可在具有本文所述的其它特征的菌种中添加适当的遗传修饰以允许实现蔗糖的摄取和利用。本领域中已知各种蔗糖摄取和代谢系统(如,美国专利第6,960,455号),该文中的这些教导以引用的方式并入本文。可在本发明的菌株中提供这些和其它方式。实施例提供了至少两种方式。
此外,可提供遗传修饰以添加用于降解更复杂的碳源(如纤维素生物质或其产物)的功能,以及用于摄取和/或利用这些碳源的功能。例如,多种纤维素酶和基于纤维素酶的纤维素降解系统已经受到研究和鉴定(参见,例如,Beguin,P和Aubert,J-P(1994年)FEMS Microbial.Rev.13:25-58;Ohima,K.等,(1997年)Biotechnol.Genet.Eng.Rev.14:365414)。
除上述遗传修饰之外,在各个实施方案中,还提供了遗传修饰以增加辅因子NADPH的池和可用性和/或因此提高NADPH/NADP+比率。例如,在关于大肠杆菌的各种实施方案中,这可通过提高下列基因的一种或多种的活性(例如通过遗传修饰)实施-pgi(突变形式)、pntAB、过表达的、gapA:gapN替换/置换,以及破坏或修饰可溶性转氢酶如sthA,和/或zwf、gnd和edd中的一种或多种的遗传修饰。
可对不具该功能或具低于所需水平的该功能的物种提供任何这类遗传修饰。
更一般的情况下,并且根据选择用于进行遗传修饰的微生物的特定代谢途径,可进行任意亚组的遗传修饰以降低发酵产物的细胞产生,所述发酵产物选自乙酸、乙偶姻、丙酮、丙烯酸、苹果酸、脂肪酸乙酯、类异戊二烯、甘油、乙二醇、乙烯、丙烯、丁烯、异丁烯、乙酸乙酯、乙酸乙烯酯、其它乙酸盐、1,4-丁二醇、2,3-丁二醇、丁醇、异丁醇、仲丁醇、丁酸、异丁酸、2-OH-异丁酸、3-OH-异丁酸、乙醇、异丙醇、D-乳酸、L-乳酸、丙酮酸、衣康酸、乙酰丙酸、葡萄糖二酸、戊二酸、己内酰胺、己二酸、丙醇、异丙醇、杂醇以及1,2-丙二醇、1,3-丙二醇、甲酸、富马酸、丙酸、琥珀酸、戊酸和马来酸。基因缺失可根据本文一般地公开的内容进行,并且其它方式也可用于实现所需的选定发酵产物的细胞产生降低。
X.所述化学产物3-HP的分离和纯化
当3-HP为化学产物时,3-HP可通过以下段落中描述的方式进行分离和纯化,考虑到分离和纯化的多种方法在本领域中是已知的并且下列公开内容并不意在进行限制。渗透压震扰、超声、匀浆和/或反复冻融循环之后进行过滤和/或离心,其它方法如pH调节和热处理,均可被用于从完整细胞产生无细胞提取物。这些方法中的任何一种或多种也可作为提取步骤用于将3-HP从细胞中释放。
除对包含3-HP的生物生产液体培养基进行一般加工之外,各种方法还可被用于除去生物质和/或将3-HP与培养液体及其成份分离。用于分离和/或浓缩3-HP的方法包括各种形式的离心、过滤、萃取、化学转化如酯化、蒸馏(在一些反应性蒸馏条件下其可导致化学转化,如对丙烯酸的脱水)、结晶、层析以及离子交换。此外,可根据需要进行细胞破裂以从细胞物质中释放3-HP,诸如通过超声、匀浆、pH调节或加热。3-HP可通过本领域已知的方法进行进一步的分离和/或纯化,所述方法包括离心、液-液分离(包括萃取如溶剂萃取、反应性萃取、两相水基萃取和两相溶液萃取)、膜分离技术、蒸馏、蒸发、离子交换层析、吸收层析、反相层析和结晶中的一种或多种的任何组合。上述方法中任一种可被应用于生物生产液体培养基(即,发酵液体培养基,无论在需氧、厌氧还是微需氧条件下制得)的一部分(例如可从生物生产事件中逐渐或定期除去的液体培养基),或者可应用于生物生产事件结束时的液体培养基。3-HP向下游产物的转化,诸如向本文所述的下游产物的转化,可在分离和纯化之后进行,或者,使用诸如蒸馏、薄膜蒸发或刮膜蒸发这样的方法部分地作为分离手段进行。
对于各种这些手段,可应用逆流策略(counter-current strategy),或顺序或迭代策略,如多行程萃取(multi-pass extractions)。例如,给定的包含3-HP的水溶液可反复地使用包含胺的非极性相进行萃取以实现多重反应性萃取。
当培养事件(发酵事件)在完成的时点,用过的液体培养基可转移至分离罐或保留于培养容器中,在任一情况下温度可被升高到至少60℃维持最少1小时以杀死微生物。(或者可实施其它方式以杀死所述微生物。)用过的液体培养基指的是包含初始营养培养基、生长自微生物接种物的细胞(并且可能包含所述接种物的一些源细胞)、3-HP以及任选地在提供初始营养培养基之后加入的液体添加物(例如进行定期加入以提供另外的碳源等等)的最终液体体积。应当注意到,用过的液体培养基可包含除3-HP以外的有机酸,诸如乙酸和/或乳酸。
随后可实施离心步骤以滤去生物质固体(如,微生物细胞)。其可通过连续或分批离心而实施,并且固体去除可以是单次或者两次或更多次系列离心之后累计至少约80%、85%、90%或95%。
任选的步骤是通过滤器对经离心的液体进行精炼,如微滤或超滤,或可包含压滤机或其它过滤设备,向其中添加过滤助剂,诸如硅藻土。该步骤及离心的替代性或补充方式可包括通过絮凝剂(flocculent)去除细胞,其中细胞成絮并且使其沉降,并且将液体抽出或以其它方式去除。絮凝剂可被加入发酵液体培养基中,在此之后进行一段时间的物质沉降,并且随后可应用分离方法,其包括但不限于离心。
在这些步骤之后,包含3-HP并且基本不含固体的用过的液体培养基被获得用于进一步加工。“基本上不含固体”指的是超过98%、99%或99.5%的固体已被除去。
在各个实施方案中,该用过的液体培养基包含各种盐离子,诸如Na、Cl、SO4和PO4。在一些实施方案中,这些离子可通过将所述用过的液体培养基通过离子交换柱而除去,或者另外地将所述用过的液体培养基接触适当的离子交换材料而除去。本文的此处与它处,“接触”用于指出于所述目的通过本领域的技术人员所知的任何方法在适当的条件下进行接触,例如,在柱子中进行,所述适当条件的确定是完全处于相关领域的普通技术人员能力范围之内的。仅举一例,这些可包含与阳离子和阴离子交换材料进行的(以任何次序)或与混合的阴离子/阳离子材料进行的顺序接触。该除盐步骤应当除去大多数这样的无机离子而不除去3-HP。这可例如通过充分地降低pH使3-HP和类似的有机酸质子化以使这些酸不结合于阴离子交换材料,而在该pH下保持带电的阴离子如Cl和SO4通过结合树脂从该溶液中除去而实现。类似地,带正电的离子通过接触阳离子交换材料而被除去。这样的离子去除可通过溶液电导率的降低而评估。这类离子交换材料可通过本领域的技术人员所知的方法进行再生。
在一些实施方案中,用过的液体培养基(例如但非必然,前述除盐步骤之后)进行pH提升,在此之后该用过的液体培养基通过离子交换柱,或以另外的方式接触离子交换树脂(其包含阴离子基团,诸如胺类),该pH下离子化的有机酸可与之结合。在该阶段,在该pH下(其可为高于6.5、高于7.5、高于8.5、高于9.5、高于10.5或更高的pH)不与胺结合的其它有机物可与有机酸中分离,例如通过以升高pH的清洗剂进行冲洗。此后使用较低pH和/或升高盐含量的清洗剂进行的洗脱可除去有机酸。使用趋降的pH和/或趋升的盐含量的清洗剂梯度可使3-HP与其它有机酸更明确地分离,从而简化了进一步的加工。
有机酸的阴离子交换树脂保留的这后一步骤可在所述除盐步骤之前或之后进行。然而,下列两种方式对于阴离子交换树脂步骤是替代性的。
第一种替代性方式包括反应性萃取(一种液-液萃取形式),其在本段和后续段落进行例示说明。可处于上述除盐步骤之前或之后的用过的液体培养基在低pH下与一定量的叔胺如Alamine336(Cognis Corp.,Cincinnati,OH USA)结合。所述Alamine336或其它叔胺的共溶剂可被加入,并且其包括但不限于苯、四氯化碳、氯仿、环己烷、二异丁基甲酮、乙醇、2号燃料油、异丙醇、煤油、n-丁醇、异丁醇、辛醇以及n-癸醇,其在与胺结合时可提高分配系数。当进行一段时间的适当混合以使相分离发生后,将包含与Alamine336或其它叔胺结合的3-HP的非极性相与水相分离。
当使用沸点低于3-HP/叔胺的共溶剂时,可使用蒸馏步骤以除去该共溶剂,由此使3-HP-叔胺复合物存留于非极性相内。
无论是否进行这一蒸馏步骤,可使用洗提或回收步骤以将3-HP与叔胺进行分离。向3-HP/叔胺中加入无机盐,诸如硫酸铵、氯化钠或碳酸钠,或加入碱,诸如氢氧化钠或氢氧化铵,以逆转胺质子化反应,并且通过加入水溶液(其可为提供无机盐的介质)而提供第二相。在适当的混合之后,产生了两相并且这使叔胺得以再生和重复使用,并且提供了处于水溶液中的3-HP。或者,不含盐或碱的热水也可被用于从胺回收3-HP。
在上文的方式中,3-HP的相分离和萃取到水相中可用于浓缩3-HP。应当了解,相应有机酸的层析分离也可用于浓缩这些酸,如3-HP。在类似的方式中,其它适当的非极性胺(其可包括伯胺、仲胺和季胺)可被用于替代叔胺和/或与之结合。
第二种替代性方式是结晶。例如,用过的液体培养基(例如,不含生物材料固体)可接触强碱如氢氧化铵,其导致形成3-HP的铵盐。其可进行浓缩,并且随后铵-3-HP晶体形成并可从水相中分离,例如通过过滤进行分离。一旦被收集,铵-3-HP晶体用酸处理,诸如硫酸,从而使硫酸铵被再生,因而产生3-HP和硫酸铵。
此外,各种水性两相萃取方法可被用于从发酵液体培养基或随后获得的溶液中分离和/或浓缩所需的化学产物。已知向水溶液中添加聚合物如葡聚糖和二醇聚合物,例如聚乙二醇(PEG)和聚丙二醇(PPG),可导致两个水相的形成。在这样的系统中,所需的化学产物可偏析到一相中而细胞和其它化学物质分配进入另一相,由此提供了不使用有机溶剂的分离。该方式对于一些化学产物已经进行证明,但公认存在将化学产物从聚合物溶液中分离的困难以及低选择性(参见,“Extractive Recovery of Productsfrom Fermentation Broths,”Joong Kyun Kim等,Biotechnol.BioprocessEng.,1999年(4)1-11页,其关于萃取回收方法的全部教导以引用的方式并入本文)。
可实施上述步骤和过程的各种替代和组合以获得相对纯化的3-HP溶液。此外,在于2003年3月18日授权的US 6,534,679中公开的分离和纯化方法可根据特定的加工方案而加以考虑,该文献关于这些方法的公开内容以引用的方式并入本文。此外,在一些培养事件中,可实施对部分液体体积的定期去除,并且可对这些部分进行加工以回收3-HP,包括通过上文所公开的方式的任意组合。
如指出的,溶剂萃取是另一种替代方案。该方案可使用多种溶剂和/或其组合中的任一种,包括醇类、酯类、酮类和各种有机溶剂。非进行限制,在相分离之后可使用蒸馏步骤或二次萃取以将3-HP与有机相分离。
下列的公开资源其相应教导以引用的方式并入本文以表明相应领域中的技术水平,以及根据需要支持教导如何完成和使用3-HP工业生物生产方法,以及可被用于通过本发明的任意重组微生物而获得该转化的工业系统的公开(Biochemical Engineering Fundamentals,第二版J.E.Bailey和D.F.Ollis,McGraw Hill,New York,1986年,全书用于所指明的用途并且第9章533-657页特别用于生物反应器设计;Unit Operations ofChemical Engineering,第5版,W.L.McCabe等,McGraw Hill,New York1993年,全书用于所指明的用途并且特别用于加工和分离技术分析;Equilibrium Staged Separations,P.C.Wankat,Prentice Hall,EnglewoodCliffs,NJ USA,1988年,全书用于分离技术的教导)。
XI.3-HP向丙烯酸和下游产物的转化
根据本文所讨论的,本文所述的各个实施例涉及特定化学产物3-羟基丙酸(3-HP)的生产。该有机酸3-HP可被转化成为各种具有工业用途的其它产物,例如但不限于,丙烯酸、丙烯酸酯以及其它从3-HP获得的化学物质,其称为“下游产物”。通过某些方式,3-HP可被转化成为丙烯酸、丙烯酰胺和/或其它下游化学产物,在一些情况下所述转化与分离和/或纯化步骤结合。本文描述了向这些下游产物的多种转化。本发明的方法包括制备3-HP的下游产物的步骤。
作为C3构造模块,3-HP在向商业上重要的中间体、工业末端产品以及消费产品的多种化学转化中颇具潜力。例如,3-HP可被转化成为丙烯酸、丙烯酸酯(如丙烯酸盐和丙烯酸酯)、1,3-丙二醇、丙二酸、乙基-3-羟基丙酸、乙氧基丙酸乙酯、丙内酯、丙烯酰胺或丙烯腈。
例如,丙烯酸甲酯可通过脱水和酯化从3-HP进行制备(后者是甲基基团的添加,如使用甲醇);丙烯酰胺可通过脱水和酰胺化反应从3-HP进行制备;丙烯腈可通过脱水反应并且形成腈基团而进行制备;丙内酯可通过成环内酯化反应(消去一个水分子)从3-HP进行制备;乙基-3-HP可通过使用乙醇进行的酯化从3-HP进行制备;丙二酸可通过氧化反应而从3-HP进行制备;并且1,3-丙二醇可通过还原反应而从3-HP进行制备。此外,丙烯酸(其首先通过脱水从3-HP转化)可以使用适当的化合物进行酯化以形成大量商业上重要的基于丙烯酸的酯,其包括但不限于,丙烯酸甲酯、丙烯酸乙酯、甲基丙烯酸酯、丙烯酸-2-乙基己酯、丙烯酸丁酯以及丙烯酸月桂酯。或者,可对3-HP进行酯化以形成3-HP的酯并且随后进行脱水以形成所述丙烯酸酯。
此外,可对3-HP进行寡聚化或多聚化以形成聚(3-羟基丙酸)同聚物或与一种或多种其它单体进行共聚化而形成各种共聚物。由于3-HP仅仅具有单一立体异构体,3-HP的聚合反应在链增长过程中不会被单体的立体特异性所复杂化。这与(S)-2-羟基丙酸(亦称为乳酸)相反,该分子具有在其聚合期间必须将其考虑在内的两种(D,L)立体异构体。
正如即将进行的进一步描述,3-HP可被转化成为衍生物,其(i)基本上以3-羟基丙酸的质子化形式;(ii)基本上以3-羟基丙酸的去质子化形式;(iii)以质子化和去质子化的混合形式开始。一般地,以酸与以盐存在的3-HP的比率取决于pH、溶液中其它离子物质的存在、温度(其改变与酸和盐形式相关的平衡常数),并且在一定程度上取决于压力。可从所述3-HP的任一形成进行多种化学转化,并且总体加工经济性一般决定了用于下游转化的3-HP的形式。
此外,作为在分离期间进行的转化的例子,胺盐形式的3-HP,诸如在使用Alamine 336作为胺进行的本文所公开的萃取步骤中的3-HP,可通过在升高的温度下,例如170至180℃或180至190℃或190至200℃,将包含所述3-HP胺盐的溶液接触脱水催化剂如氧化铝并且将所收集的蒸气相通过低温冷凝器而转化成为丙烯酸。包括3-HP浓度、有机胺、共溶剂(如果存在)、温度、流速、脱水催化剂以及冷凝器温度在内的操作条件进行评估并且用于商业目的而改善。在单一转化事件中,3-HP向丙烯酸的转化预计超过至少百分之80或至少百分之90。胺可被再利用,任选地在清理之后再利用。可对本文所提供的其它的脱水催化剂进行评估。应当注意,美国专利第7,186,856号公开了有关该转化方式的数据,尽管其作为萃取式盐解(extractive salt-splitting)转化的一部分有异于本文的教导。然而,美国专利第7,186,856号其方法以引用的方式并入本文,包括萃取式盐解,后者进一步显示了可将3-HP从微生物发酵液体培养基中萃取的各种方式。
进一步对于通过微生物宿主细胞所合成的化学产物是3-HP的实施方案,所述3-HP根据本文所述而制备并且在转化前任选地纯化至选定纯度,本发明的方法还可被用于产生源自于3-HP的“下游化合物”,诸如聚合3-HP(聚-3-HP)、丙烯酸、聚丙烯酸(各种形式的聚合丙烯酸)、丙烯酸甲酯、丙烯酰胺、丙烯腈、丙内酯、3-HP乙酯、丙二酸和1,3-丙二醇。多种方式可被用于这些下游转化,其基本属于酶学、催化(使用催化剂进行的化学转化过程)、热处理及其组合(包括其中施加所需压力用于加速反应的一些方式)。
根据指出的,可从3-HP进行制备的重要的工业化学产物是丙烯酸。在化学上,3-HP中的碳-碳单键之一必须进行脱水反应,从而转化成为碳-碳双键并除去水分子。3-HP的脱水原则上可在液相或气相中进行。在一些实施方案中,脱水在存在适当的均质或异质催化剂的情况下进行。适当的脱水催化剂是酸和碱催化剂。在脱水之后,可获得包含丙烯酸的相并在适当的情况下通过进一步纯化步骤对其进行纯化,例如通过蒸馏方法、萃取方法或结晶方法或其组合。
通过脱水反应从3-HP制备丙烯酸可通过多种商业方法实施(包括通过蒸馏加工在内),其可以是分离方案的一部分并且可以包含酸和/或金属离子作为催化剂。更为广泛的情况下,公开于2007年9月20日如今已被放弃的美国专利公开号第2007/0219390A1号中对于3-HP以及其它β-羟基羰基化合物向丙烯酸和其它相关下游化合物的转化的教导被并入本文。这一公开文献列出了大量的催化剂并且提供了转化的实施例,这些被特别地并入本文。各种对3-HP进行脱水以制备丙烯酸的特定方法中还包括较旧的方法,其描述于美国专利第2,469,701号(Redmon)中。这一文献教导了用于丙烯酸的制备方法,该方法通过在存在脱水催化剂如硫酸或磷酸的情况下在降低的压力下将3-HP加热至130与190℃之间而进行。美国专利公开号第2005/0222458A1号(Craciun等)还提供了用于通过加热3-HP或其衍生物而制备丙烯酸的方法。3-HP的气相脱水发生于存在脱水催化剂的情况下,诸如硅石、氧化铝或二氧化钛的填充床。这些专利公开文献涉及3-HP向丙烯酸的转化的方法以引用的方式并入本文。
脱水催化剂可包含一种或多种金属氧化物,诸如Al2O3、SiO2或TiO2。在一些实施方案中,脱水催化剂是高表面积Al2O3或高表面积硅石,其中所述硅石基本上是SiO2。用于本发明目的的高表面积指的是至少约为50、75、100m2/g或更高的表面积。在一些实施方案中,所述脱水催化剂可以包括铝硅酸盐,诸如沸石。
例如,包括这些并入的文献进行的举例说明,3-HP通过各种特定方法进行脱水以生成丙烯酸,各方法通常涉及一种或多种脱水催化剂。具有特定表观值的一种催化剂是钛,诸如氧化钛TiO(2)的形式的钛。二氧化钛催化剂可在包含3-HP的水溶液进行蒸馏的脱水系统中提供,其中3-HP脱水(如在挥发时)以转化成为丙烯酸,并且丙烯酸通过冷凝从气相中进行收集。
仅作为一种特定的方法,3-HP的水溶液通过填充氧化钛催化剂的反应器柱,其被维持在温度介于170与190℃之间并且在常压之下。从所述反应器柱中离去的蒸气通过低温冷凝器,在该处丙烯酸被收集。所述低温冷凝器可被冷却至30℃或更低,2℃或更低,或处于根据流速和系统设计而适用进行有效冷凝的温度下。此外,反应器柱温度可以更低,例如当在低于常压的压力下运转时。应当注意,公开于2007年9月20日如今已被放弃的美国专利公开号第2007/0219390号的实施例1提供了使用本方法的方式的具体参数。根据所指出的,该公开文献对可被用于使3-HP成为丙烯酸的脱水反应的催化剂的教导和列举以引用的方式并入本文。
进一步关于脱水催化剂,下表总结了可被用于从3-HP(或其酯)生产丙烯酸(或丙烯酸酯)的脱水反应中的大量催化剂(包括化学类别)。这些催化剂可被单独使用或组合使用,其中一些催化剂可以固体、液体或气体形式中的任一形式被使用。本催化剂列表并不用于进行限制,而是未列出的众多特定催化剂也可被用于特定的脱水反应。此外并非进行限制,催化剂的选择可根据特定转化中的溶液pH和/或3-HP的形式,从而使酸性催化剂可在3-HP处于酸形式时被使用,并且碱性催化剂可在将3-HP的铵盐转化为丙烯酸时使用。此外,一些催化剂可以离子交换树脂的形式使用。
表8:脱水催化剂
关于使用这些催化剂之一的另一种特定的方法,浓硫酸和包含3-HP的水溶液独立地流入维持于150到165℃的温度处于100mmHg的低压之下的反应器中。从所述反应器中流出的为包含丙烯酸的溶液。在US2009/0076297的实施例1中公开的该方法的特定的实施方案显示了丙烯酸产率超过95%,其以引用的方式并入本文。
根据广泛的可能催化剂和该类型脱水反应领域的知识,大量其它具体脱水方法可被评估并且实施用于商业生产。
3-HP的脱水还可在无脱水催化剂的情况下进行。例如,所述反应可在存在所谓惰性填料诸如玻璃、陶瓷、树脂、瓷、塑料、金属或砖粉填料的情况下进行,并且仍然以合理的产率和纯度形成丙烯酸。催化剂颗粒可经大小调节(sized)和配置以使该化学反应在一些实施方案中是质量传送限制的或者动力学限制的。所述催化剂可以是粉末、丸状、颗粒、微珠、挤出物等等形式。当任选地使用催化剂载体之时,所述载体可以呈现任何物理形式,诸如丸状、球形、整体通道(monolithic channels)等等。载体可以与活性金属物质进行共沉淀;或者载体可用催化金属物质处理并且随后原样使用或形成上述的形状;或者载体可形成上述形状再随后用催化物质进行处理。
用于3-HP脱水的反应器可进行工程改造并且以多种方式运行。反应器运行可以是连续的、半连续的或分批的。据发现基本连续并且处于稳态的运行从操作和经济前景来看是有利的。流型(flow pattern)可以基本上是塞式流(plug flow),基本上混匀的或者介于这些极端情况之间的流型。“反应器”可实际为以各种不同配置的一系列或成网络的多个反应器。
例如,并非进行限制,通过脱水反应可从3-HP制备丙烯酸,所述脱水反应可通过包括通过蒸馏工艺在内的多种商业方法实施,其可以是分离方案的一部分并且可以包含酸和/或金属离子作为催化剂。更为广泛的情况下,公开于2007年9月20日而如今已被放弃的美国专利公开号第2007/0219390A1号中对于3-HP以及其它β-羟基羰基化合物向丙烯酸和其它相关下游化合物的转化的教导被并入本文。这一公开文献列举了大量的催化剂并且提供了转化的实例,这些被特别地并入本文。
例如,包括这些并入引用文献进行的举例描述,3-HP通过多种特定方法进行脱水以生成丙烯酸,各方法通常涉及一种或多种脱水催化剂。具有特定表观值的一种催化剂是钛,诸如氧化钛TiO2形式的钛。二氧化钛催化剂可在对包含3-HP的水溶液进行蒸馏的脱水系统中提供,其中3-HP被转化成为丙烯酸,诸如在挥发时,并且所述丙烯酸通过冷凝从气相中进行收集。
仅作为一种特定的方法,3-HP的水溶液通过填充氧化钛催化剂的反应器柱,其被维持在170与190℃之间的温度并且在常压之下。从所述反应器柱中离去的蒸气被通过低温冷凝器,在该处丙烯酸被收集。所述低温冷凝器被冷却至30℃或更低、20℃或更低,2℃或更低,或处于根据流速和系统设计而适用进行有效冷凝的温度下。此外,所述反应器柱温度可以更低,例如当在低于常压的压力下运转之时。应当注意,公开于2007年9月20日如今已被放弃的美国专利公开号第2007/0219390号的实施例1提供了使用本方法的方式的具体参数。根据指出的,该公开文献对可被用于使3-HP成为丙烯酸的脱水反应中的催化剂的教导和列表以引用的方式并入本文。
对通过3-HP的脱水而获得的丙烯酸的结晶可被用作为最终的分离/纯化步骤之一。本领域中已知各种结晶的方式,包括酯的结晶。
如上文所指出的,在一些实施方案中,3-HP的盐被转化成为丙烯酸或其酯或盐。例如,美国专利第7,186,856号(Meng等)教导了从3-HP的铵盐制备丙烯酸的方法,该过程涉及在存在有机胺或不与水混溶的溶剂的情况下对3-HP的铵盐进行加热的第一步,从而形成两相溶液并且在将3-HP从溶液的水相转移至有机相中的条件下将3-HP盐分成相应离子成分,从而将氨和铵阳离子留在水相之中。随后对所述有机相进行反萃取以分离3-HP,随后进行在存在脱水催化剂的情况下加热包含3-HP的溶液以产生丙烯酸的第二步。美国专利第7,186,856号用于从3-HP的盐制备丙烯酸的方法以引用的方式并入本文。该专利所公开的特定方式的各种替代方式可被开发用于适当的萃取和转化过程。
丙烯酸甲酯可通过脱水化和酯化从3-HP进行制备,后者是进行甲基基团的添加(诸如使用甲醇),丙烯酰胺可通过脱水和酰胺化反应从3-HP进行制备,丙烯腈可通过脱水反应并且形成腈基团而进行制备;丙内酯可通过成环内酯化反应(消去水分子)从3-HP进行制备,乙基-3-HP可通过与乙醇的酯化从3-HP进行制备,丙二酸可通过氧化反应而从3-HP进行制备,并且1,3-丙二醇可通过还原反应而从3-HP进行制备。
通过对根据本文制备的3-HP进行的氧化可制备丙二酸。美国专利第5,817,870号(Haas等)公开了通过选自Ru、Rh、Pd、Os、Ir或Pt的贵金属进行的3-HP催化氧化。这些可以是纯金属催化剂或载体催化剂。催化氧化可在悬浮式反应器中使用悬液催化剂进行或者在固定床反应器中使用固定床催化剂进行。如果催化剂,优选地载体催化剂,被置于固定床反应器中,后者可在滴流床过程中运行,也可在流体相过程中运行。在滴流床过程中,包含所述3-HP起始物的水相,以及氧化产物和用于pH调节的手段及氧气或含氧气体可以平行流或逆流的方式实施。在液相过程中,液相和气相可方便地以平行流实施。
为获得足够短的反应时间,该转化在pH等于或高于6下进行,优选的情况下至少为7并且特别是介于7.5与9之间。根据优选的实施方案,通过加入碱,诸如加入碱金属氢氧化物或碱土金属氢氧化物溶液,在所述氧化反应期间pH被保持恒定,优选地介于7.5与9的pH范围之内。氧化有利地在至少10℃最高70℃的温度下进行。氧气流不受限制。在悬浮方法中,液相和气相通过剧烈搅拌进行接触是很重要的。丙二酸可以以接近定量产率(quantitative yields)获得。美国专利第5,817,870号关于氧化3-HP以生成丙二酸的方法以引用的方式并入本文。
通过对根据本文制备的3-HP进行的氢化可制备1,3-丙二醇。美国专利第2005/0283029号(Meng等)关于在特定催化剂存在的情况下对3-HP或该酸的酯或混合物在液相中进行氢化以制备1,3-丙二醇的方法以引用的方式并入本文。可能的催化剂包括钌金属或钌的化合物,加载的或未加载的,单独使用或结合至少一种或多种另外的金属,其选自钼、钨、钛、锆、铌、钒或铬。钌金属或其化合物,和/或另外的金属或其化合物,可以以加载或未加载的形式进行使用。如果以加载的形式使用,制备加载催化剂的方法并非关键并且可以是任意技术,例如载体的浸渍或在载体上沉积。任何适当的载体均可使用。可被使用的载体包括但不限于,氧化铝、二氧化钛、硅石、氧化锆、碳、碳黑、石墨、硅酸盐、沸石、铝硅酸盐沸石、硅铝酸盐粘土等等。
所述氢化过程可以在液相中进行。所述液相包括水、非可氢化的有机溶剂,如任何脂肪烃或芳香烃、醇类、醚类、甲苯、十氢化萘、二氧杂环己烷、二甘醇二甲醚、n-庚烷、己烷、二甲苯、苯、四氢呋喃、环己烷、甲基环己烷等,以及水和有机溶剂的混合物。氢化过程可以分批、半连续或连续地进行。所述氢化过程可以在任何适当的设备中进行。示例性的这种设备为搅拌的罐式反应器、滴流床反应器、高压氢化反应器等等。
氢化过程一般在介于约20与约250℃之间进行,更为特定的情况下介于约100与约200℃之间。此外,所述氢化过程一般在介于约20psi与约4000psi之间的压力下进行。所述氢化过程中使用的含氢气体任选地是商用纯氢。如果氮气、气态烃或碳的氧化物及类似物质存在于含氢气体中,含氢气体是可用的。例如,可以使用来自合成气(氢和一氧化碳)的氢,该合成气潜在地进一步包括二氧化碳、水和各种杂质。
根据本领域所知的,使用生物方法将3-HP转化成为1,3-丙二醇也是可能的。例如,通过使用具有酶活性的多肽可从3-HP-CoA或3-HP产生1,3-丙二醇。这些多肽可体外或体内使用。当将3-HP-CoA转化成为1,3-丙二醇之时,可使用具有氧化还原酶活性或还原酶活性的多肽(如,来自1.1.1酶类的酶)。或者,当从3-HP产生1,3-丙二醇时,可使用具有醛脱氢酶活性(如,来自1.1.1.34类别的酶)的多肽与具有醇脱氢酶活性(如,来自1.1.1.32类别的酶)的多肽的组合。
另一种3-HP的下游产品,丙烯腈,可通过各种有机合成从丙烯酸进行转化而成,所述有机合成包括但不限于Sohio丙烯腈过程,其为化学制造业已知的单步骤生产方法。
此外,加成反应也可产生丙烯酸或在羰基羟基基团处具有烷基或芳基的丙烯酸酯衍生物。这些加成反应可进行化学催化,诸如通过氢气、卤化氢、氢氰酸,或碱条件下的迈克尔加成反应,其任选地在碱催化剂存在下进行。醇类、酚类、硫化氢和硫醇类已知在碱性条件下加入。芳香胺或酰胺以及芳香烃可在酸性条件下加入。这些和其它反应被描述于Ulmann’sEncyclopedia of Industrial Chemistry,Acrylic Acid and Derivatives,WileyVCH Verlag GmbH,Wienham(2005年),其对于丙烯酸及其衍生物的转化反应的教导以引用的方式并入本文。
由通过本发明制备的3-HP获得的丙烯酸可被进一步转化成为各种化学品,包括聚合物,其在一些实施方案中也被认为是下游产物。丙烯酸酯可由丙烯酸形成(或直接由3-HP形成),诸如通过与醇进行的缩合酯化反应,从而释放水。该化学过程被描述于Monomeric Acrylic Esters,E.H.Riddle,Reinhold,NY(1954年)之中,其关于酯化的教导以引用的方式并入本文。形成的酯类包括丙烯酸甲酯、丙烯酸乙酯、丙烯酸正丁酯、丙烯酸羟丙基酯、丙烯酸羟乙基酯、丙烯酸异丁酯以及丙烯酸2-乙基己基酯,这些和/或其它丙烯酸和/或其它丙烯酸酯可进行组合,包括与其它化合物进行组合,从而形成各种已知的基于丙烯酸的聚合物。尽管丙烯酰胺通过丙烯腈的水合反应而在化学合成中制备,本文中的转化可通过酰胺化将丙烯酸转化成为丙烯酰胺。
从通过本发明制备的3-HP获得的丙烯酸可被进一步转化成为各种化学品,包括聚合物,其在一些实施方案中也被认为是下游产物。丙烯酸酯可由丙烯酸形成(或直接由3-HP形成),诸如通过与醇进行的缩合酯化反应,从而释放水。该化学过程被描述于Monomeric Acrylic Esters,E.H.Riddle,Reinhold,NY(1954年)之中,其关于酯化的教导以引用的方式并入本文。形成的酯类包括丙烯酸甲酯、丙烯酸乙酯、丙烯酸正丁酯、丙烯酸羟丙基酯、丙烯酸羟乙基酯、丙烯酸异丁酯以及丙烯酸2-乙基己基酯,且这些和/或其它丙烯酸和/或其它丙烯酸酯可进行组合,包括与其它化合物进行组合,从而形成各种已知的基于丙烯酸的聚合物。尽管丙烯酰胺通过丙烯腈的水合反应在化学合成之中制备,本文中的转化可通过酰胺化将丙烯酸转化成为丙烯酰胺。
丙烯酸的直接酯化可通过本领域的技术人员所知的酯化方法而进行,其通过将获自3-HP水合反应的丙烯酸与一种或多种醇接触,诸如甲醇、乙醇、1-丙醇、2-丙醇、n-丁醇、叔丁醇或异丁醇,并且加热至至少50、75、100、125或150℃的温度。酯化过程中形成的水可从反应混合物中除去,诸如通过添加适当的分离助剂进行的共沸蒸馏或通过另一分离手段而除去。根据本领域所知,可实现高达95%或更高的转化。
几种适当的酯化催化剂可由市售购得,例如购自Dow Chemical(Midland,Michigan US)。例如,AmberlystTM 131Wet Monodisperse凝胶催化剂产生增强的水动力学和反应性特性并且适于固定床反应器。AmberlystTM 39Wet是特别适用于搅拌式和浆态环流反应器的大网格催化剂。AmberlystTM 46是大孔径催化剂,其与传统催化剂相比其产生较少的醚副产物(根据Rohm和Haas的美国专利第5,426,199号中的描述,该专利对于酯化催化剂组合物和选择考虑的教导以引用的方式并入本文)。
丙烯酸及其任意酯类可被进一步转化成为各种聚合物。聚合可通过热、光、其它具有充分能量的辐射以及产生自由基的化合物如偶氮化合物与过氧化物进行而产生所需的丙烯酸和丙烯酸酯聚合物。作为一个实例,丙烯酸水溶液的温度升高至已知起始聚合反应的温度(其部分地取决于初始丙烯酸浓度),从而所述反应进行,考虑到反应的高放热性,所述过程通常涉及除热。本领域已知许多的其它聚合方法。一些方法被描述于Ulmann’s Encyclopedia of Industrial Chemistry,Polyacrylamides andPoly(Acrylic Acids),WileyVCH Verlag GmbH,Wienham(2005年),其对于聚合反应的教导以引用的方式并入。
例如,丙烯酸的自由基聚合通过技术人员所知的聚合方法而进行,并且可以处于水溶液或另一溶剂的乳液或悬液中进行。引发剂,例如但不限于有机过氧化物,通常被加入以帮助聚合。可被用作为引发剂的有机过氧化物的类别包括二酰基化合物、过氧二碳酸酯、一过氧碳酸酯、过氧缩酮、过酸酯、二烷基化物和氢过氧化物。另一类引发剂是偶氮引发剂,其可被用于丙烯酸酯聚合以及与其它单体的共聚合。美国专利第5,470,928号;第5,510,307号;第6,709,919号和第7,678,869号教导了各种使用包括有机过氧化物、偶氮化合物和其它化学类型的多种引发剂进行的聚合的方式,并且适用于本文所述的聚合物的这些教导以引用的方式被并入。
因此,在聚合期间还可能存在共聚单体,诸如交联剂。在特定的实施方案中实施了根据本文产生的自3-HP的水合反应获得的丙烯酸的自由基聚合反应,至少部分地以中和形式和交联剂存在下。该聚合反应可产生水凝胶,其可随后通过已知技术被粉碎、研磨并且在适当的情况下进行表面修饰。
丙烯酸的重要的商业用途是用于超吸收聚合物。本发明特此将ModernSuperabsorbent Polymer Technology,Buchholz和Graham(编辑),Wiley-VCH,1997年的全文针对其关于超吸收聚合物成分、制造、特征和用途的教导以引用的方式并入。超吸收聚合物主要作为水和水溶液的吸收剂被用于尿布、成人失禁产品、女性卫生产品和类似的消费产品。在这样的消费产品中,超吸收材料可替代传统的吸收剂材料如布料、棉花、纸填料和纤维素纤维。超吸收聚合物吸收并在轻微的机械压力之下保留最高达其重量25倍的液体。溶胀凝胶以固体的弹性状态保持液体并且防止液体泄漏。超吸收聚合物颗粒可经表面修饰以产生壳状结构,使得壳更高度地交联。该技术改善了吸收的平衡、负荷下吸收以及对凝胶堵塞的抗性。据认为超吸收聚合物在消费产品之外的领域中具有用途,包括农业、园艺和医药领域。
超吸收聚合物由丙烯酸(诸如源自于本文所提供的3-HP的丙烯酸)和交联剂通过溶液或悬浮聚合进行制备。示例性的方法包括美国专利第5,145,906号;第5,350,799号;第5,342,899号;第4,857,610号;第4,985,518号;第4,708,997号;第5,180,798号;第4,666,983号;第4,734,478号;第5,331,059号,各文献关于超吸收聚合物的教导均以引用的方式并入本文。
这些消费产品中,尿布、女性卫生产品和成人失禁产品由超吸收聚合物所制成,所述超吸收聚合物基本由根据本发明制备的3-HP所转化的丙烯酸进行制备。
可制造加入了由丙烯酸制备的超吸收聚合物的尿布和其它个人卫生产品,所述丙烯酸由根据本发明的教导生物生产的3-HP制备。下文提供了对加入了该超吸收聚合物的尿布进行制造的一般指导。所述超吸收聚合物首先被制备成吸收垫,所述吸收垫可以是真空形成的,并且在其中添加了其他材料如纤维材料(如木浆)。所述吸收垫随后与织物片进行组装以形成尿布,所述织物片通常为无纺织物(如,由尼龙、聚酯、聚乙烯和聚丙烯塑料制成)。
更特别的情况下,在一种非限制的方法中,在传送带上方的多个加压喷嘴将超吸收聚合物颗粒(如,约400微米大小或更大)、纤维材料和/或这些材料的组合以指定的空隙/间隔喷射于所述传送带上。传送带是穿孔的并且其下方处于真空下,从而被喷射的材料被吸向传送带表面以形成平垫。在各个实施方案中,纤维材料被首先施于传送带上,继之以纤维材料和超吸收聚合物颗粒的混合物,随后是纤维材料,从而使所述超吸收聚合物被集中于垫片的中央。可朝向传送带路径的末端使用矫直辊以产生厚度均匀的垫片。随后可对各个垫片进一步加工,从而将其切割成用于尿布的适当形状,或所述垫片可以呈足以用于多个尿布的长卷形式。之后,所述垫片被夹在顶片和底片织物(一个基本是液体可透过的,而另一个是液体不能透过的)之间,例如在传送带上,并且这些被结合在一起,例如通过胶水、加热或超声熔接,并且被切割成为尿布大小的单位(如果此前未经如此切割)。还可提供另外的特征,诸如弹性成分、胶条等等,以用于个人穿着的适体和便利。
纤维材料与聚合物颗粒的比率已知实现性能特性。在一些实施方案中,所述比率介于75∶25与90∶10之间(参见美国专利第4,685,915号,其对于尿布制造的教导以引用的方式并入本文)。其它的一次性吸收成品可以以类似的方式构建,诸如用于成人失禁、女性卫生(卫生巾)、卫生棉塞等(参见,例如美国专利第5,009,653号、第5,558,656号和第5,827,255号,其对于卫生巾制造的教导以引用的方式并入本文)。
低分子量据丙烯酸用于包括化妆品和药用制剂在内的多种应用的水处理、絮凝剂和增稠剂的用途。对于这些应用,聚合物可以是非交联的或轻度交联的,取决于具体的应用。分子量一般介于约200与约1,000,000g/mol之间。这些低分子量聚丙烯酸聚合物的制备被描述于美国专利第3,904,685号;第4,301,266号;第2,798,053号和第5,093,472号之中,各专利文献涉及制备这些聚合物的方法的教导以引用的方式并入本文。
丙烯酸可与一种或多种其它单体进行共聚合,所述其它单体选自丙烯酰胺、2-丙烯酰胺基-2-甲基丙磺酸、N,N-二甲基丙烯酰胺、N-异丙基丙烯酰胺、甲基丙烯酸以及甲基丙烯酰胺,以上仅为数例。单体的相对反应性影响微结构并且由此而影响所述聚合物的物理特性。共聚单体可源于3-HP或以其它方式提供,以产生共聚物。Ulmann’s Encyclopedia of IndustrialChemistry,Polyacrylamides and Poly(Acrylic Acids),WileyVCH VerlagGmbH,Wienham(2005年)对聚合物和共聚物加工的教导以引用的方式并入本文。
丙烯酸原则上可与几乎任何可自由基聚合的单体进行共聚合,包括苯乙烯、丁二烯、丙烯腈、丙烯酸酯、马来酸、马来酸酐、氯乙烯、丙烯酰胺、衣康酸等等。最终用途一般决定了共聚物的组成,该组成影响性能。丙烯酸还可在其上具有多种任选的取代,并且经这样取代之后被用作为聚合或共聚反应的单体。作为一般原则,丙烯酸(或其共聚合单体之一)可以不干扰聚合过程的任意取代基取代,诸如烷基、烷氧基、芳基、杂芳基、苯甲基、乙烯基、烯丙基、羟基、环氧基、酰胺基、醚、酯、酮、马来酰亚胺、琥珀酰亚胺、亚砜、缩水甘油基和甲硅烷基(参见,美国专利第7,678,869号,其进一步的讨论已在上文以引用的方式并入)。下文段落提供了共聚合应用的几个非限制性实例。
包含丙烯酸及其酯的聚合物和共聚物的涂料被广泛用作为工业和消费产品。用于制造这些涂料的技术的方面可见于美国专利第3,687,885号和第3,891,591号,其对于该类涂料制造的教导以引用的方式并入本文。一般地,丙烯酸及其酯可自身或与其它单体(如酰胺、甲基丙烯酸酯、丙烯腈、乙烯、苯乙烯和丁二烯)形成同聚物或共聚物。同聚物和/或共聚物的所需混合物,涂料工业称之为“媒介(vehicle)”(“粘合剂(binder)”),被加入水性溶液中并进行充分搅拌以形成包含亚微米大小的聚合物颗粒的水性分散物。涂料通过这些“媒介”颗粒随着水和其它溶剂的挥发而发生聚结而固化。其它对于水性分散物的添加剂可包括色素、填料(如碳酸钙、硅酸铝)、溶剂(如丙酮、粗苯、醇类等,尽管这些不见于特定的无VOC涂料)、增稠剂以及根据情况、用途、预期表面等等的额外添加剂。在多种涂料中,媒介部分的重量百分比可介于约百分之9与约百分之26之间,但对于其它涂料所述重量百分比可超过该范围。
基于丙烯酸的聚合物除涂料外还被用于多种涂层。例如,对于纸涂层乳胶,可将0.1-5.0%的丙烯酸与苯乙烯和丁二烯一同使用以增强对纸的粘合并且调整流变性、冻融稳定性和剪切稳定性。在此情况下,美国专利第3,875,101号和第3,872,037号关于这些乳胶的教导以引用的方式并入本文。基于丙烯酸酯的聚合物还可在多种墨水中使用,特别是可UV固化的打印墨水。对于水处理,丙烯酰胺和/或丙烯酸羟乙基酯通常与丙烯酸共聚合以产生低分子量线性聚合物。在此情况下,美国专利第4,431,547号和第4,029,577号关于这些聚合物的教导以引用的方式并入本文。还可产生丙烯酸与马来酸或衣康酸的共聚物用于水处理应用,其如美国专利第5,135,677号中描述的,该教导以引用的方式并入本文。丙烯酸钠(冰丙烯酸的钠盐)可以与丙烯酰胺(其可经酰胺化化学作用源自丙烯酸)进行共聚合以制备阴离子共聚物,其在水处理中被用作为絮凝剂。
对于增稠剂可使用多种共聚单体,诸如美国专利第4,268,641号和第3,915,921号中所描述的,其对于这些共聚单体的描述以引用的方式并入本文。美国专利第5,135,677号描述了可与丙烯酸一起使用以产生水溶性聚合物的多种共聚单体,并且其中的这些描述以引用的方式并入本文。
同样如指出的,向下游产物的一些转化可酶促进行。例如,3-HP可被转化成为3-HP-CoA,随后可使用具有多羟酸合成酶活性的酶(EC2.3.1.-)将其转化成为聚合3-HP。此外,1,3-丙二醇可使用具有氧化还原酶活性或还原酶活性(如,EC 1.1.1.-酶类中的酶)的多肽进行制备。或者,当从3-HP产生1,3-丙二醇时,可使用(1)具有醛脱氢酶活性(如,来自1.1.1.34类的酶)的多肽与(2)具有醇脱氢酶活性(如,来自1.1.1.32类的酶)的多肽的组合。具有脂肪酶活性的多肽可被用于形成酯类。诸如这样的酶促反应可在体外进行,例如使用无细胞提取物进行,或在体内进行。
因此,本发明的一些实施方案,诸如制备化学物质的方法,包括向微生物产生的3-HP的任意所述下游产物的转化步骤,包括但不限于本文所述的以及并入的引用文献中的化学物质(后者在法规允许的情况下)。例如,一个实施方案是根据本文教导制备3-HP分子并且进一步将所述3-HP分子转化成为聚合的3-HP(聚-3-HP)或丙烯酸,并且例如从丙烯酸开始,由所述3-HP分子制备聚丙烯酸(各种形式的聚合丙烯酸)、丙烯酸甲酯、丙烯酰胺、丙烯腈、丙内酯、3-HP乙基酯、丙二酸、1,3-丙二醇、丙烯酸乙酯、丙烯酸正丁酯、丙烯酸羟丙基酯、丙烯酸羟乙基酯、丙烯酸异丁酯、丙烯酸-2-乙基己酯以及加入了烷基或芳基的和/或加入了卤素、芳香胺或酰胺以及芳香烃的丙烯酸或丙烯酸酯中的任一种。
同样如指出的,向下游产物的一些转化可通过酶促进行。例如,3-HP可被转化成为3-HP-CoA,随后可使用具有多羟酸合成酶活性的酶(EC2.3.1.-)将其转化成为聚合3-HP。此外,1,3-丙二醇可使用具有氧化还原酶活性或还原酶活性(如,EC 1.1.1.-酶类中的酶)的多肽进行制备。或者,当从3-HP产生1,3-丙二醇时,可使用(1)具有醛脱氢酶活性(如,来自1.1.1.34类的酶)的多肽与(2)具有醇脱氢酶活性(如,来自1.1.1.32类的酶)的多肽的组合。具有脂肪酶活性的多肽可被用于形成酯。诸如这样的酶促反应可在体外进行,例如使用无细胞提取物进行,或在体内进行。
因此,本发明的一些实施方案,诸如制备化学物质的方法,包括向微生物产生的3-HP的任意所述下游产物的转化步骤,包括但不限于本文所述的以及并入的引用文献中的化学物质(后者在法规允许的情况下)。例如,一个实施方案是根据本文教导制备3-HP分子并且进一步将所述3-HP分子转化成为聚合的3-HP(聚-3-HP)或丙烯酸,并且例如从丙烯酸开始,由3-HP分子制备聚丙烯酸(各种形式的聚合丙烯酸)、丙烯酸甲酯、丙烯酰胺、丙烯腈、丙内酯、3-HP乙酯、丙二酸、1,3-丙二醇、丙烯酸乙酯、丙烯酸正丁酯、丙烯酸羟丙基酯、丙烯酸羟乙基酯、丙烯酸异丁酯、丙烯酸-2-乙基己酯以及加入烷基或芳基的和/或加入卤素、芳香胺或酰胺以及芳香烃的丙烯酸或丙烯酸酯中的任一种。
形成下游化合物诸如丙烯酸或丙烯酰胺的反应可结合使用对降低聚合物形成可能性的适当的稳定剂或抑制剂而进行。参见,例如美国专利公开号第2007/0219390A1号。稳定剂和/或抑制剂包括但不限于,例如,酚类化合物(如,二甲氧基苯酚(DMP)或烷基化酚类化合物如二叔丁基苯酚)、醌类(如,叔丁基对苯二酚或氢醌单甲基醚(MEHQ))和/或金属铜或铜盐(如,硫酸铜、氯化铜或醋酸铜)。根据本领域的技术人员所知,抑制剂和/或稳定剂可单独使用或组合使用。另外,在各个实施方案中,一种或多种下游化合物以最高达约百分之100的摩尔产率、或范围介于约百分之70至约百分之90之间的摩尔产率、或范围介于约百分之80至约百分之100之间的摩尔产率、或范围介于约百分之90至约百分之100之间的摩尔产率被回收。这样的产率可以是特定过程中的单轮的(分批的或连续的)或反复的分离和纯化步骤的结果。
丙烯酸和其它下游产物作为制造过程中的商品是有用的,诸如消费品的制造中,所述消费品包括尿布、织物、地毯、涂料、粘合剂和丙烯酸玻璃。
XII.3-HP之外的化学产物的产生
关于3-HP的公开内容并非用于进行限制,应当了解通过使用本发明可在微生物宿主细胞中由丙二酰-CoA产生其它化学产物,所述微生物宿主细胞包含生成这些化学产物的产生途径。本文公开的遗传修饰的各种教导和组合可根据适当的情况应用于制备3-HP的微生物、方法和系统。
在各个实施方案中,微生物细胞包含从丙二酰-CoA到选定的化学产物如本文特别描述的3-HP的代谢途径,并且还提供了用于调控丙二酰-CoA向酰基-ACP分子(其可随后转化成为脂肪酸)转化的手段。随后,当所述调控手段进行调控以降低这样的转化的时候,成比例提高量的丙二酰-CoA分子被1)产生和/或2)通过代谢途径从丙二酰-CoA转化成为所述被选定的化学产物。
从丙二酰-CoA到3-HP的代谢途径在本文中公开并且并非意图用于进行限制。本领域已知其它生成3-HP的途径并且其被用于产生3-HP,包括结合根据本文所述的耐受性遗传修饰的任意组合。根据本文的实例所示,与3HPTGC相关的这些遗传修饰的添加出人意料地在低于毒性水的3-HP水平上提高了单位生产率。产生3-HP的任何产生途径可结合所述3HPTGC的遗传修饰并且获得本文所公开的单位和/或容积生产率。
关于用于3-HP之外的化学产物的其它代谢途径,在特定生物体中已知存在用于从丙二酰-CoA产生的化学产物的各种代谢途径(例如,参见<<www.metacyc.org>>),并且遗传重组技术可被用于向选定的微生物细胞提供编码各种多肽的多核苷酸,所述多肽催化沿对应的代谢途径的转化过程。本文公开了基因重组的特定方法,并且教导这些方法的基本文献也为本领域的技术人员所知并且被引用于本文中,从而使遗传工程领域的技术人员可根据这些教导合理地构建这样的微生物细胞。或者,包含这些代谢途径的野生型微生物细胞可被用作为起始细胞用于本发明,诸如用于本文所公开和要求保护的遗传修饰和/或方法和系统。
XIII.所公开的实施方案是非限制性的
尽管本发明的各个实施方案已在本文中被出示并且进行描述,应强调的是这些实施方案仅仅通过实例的形式给出。可进行大量的改动、变化和替换而不偏离在本文中以各种实施方案形式描述的本发明。特别地,并且出于任何理由,对于化合物、核酸序列、包括特定蛋白质(包括功能性的酶)的多肽、代谢途径酶或中间体、元件或其它组成的任意分组、或本文中所述的或在本文表单、表格或其它分组(诸如附图中显示的代谢途径酶)中给出的浓度,除非明确地另行说明,否则应认为各个这些分组提供了各个亚集实施方案的基础并且用于对其进行识别,所述亚集实施方案在其最为广义的范围内包含排除对应的所述分组的一个或多个成员(或亚集)的这些分组的每一个亚组。进一步,当本文描述任意范围之时,除非明确地另行说明,该范围包含其中的全部数值及其全部亚范围。
此外,并且更一般的情况下,根据本文的公开内容、讨论、实例和实施方案,可能存在被使用的属于本领域技能之内的常规分子生物学、细胞生物学、微生物学和重组DNA技术。这些技术在文献中被完全地进行阐明。(参见,例如,Sambrook和Russell,“Molecular Cloning:A LaboratoryManual,”2001年第3版(第1-3卷),Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.;Animal Cell Culture,R.I.Freshney编,1986年。)这些公开资源以见于其中的标准实验室方法的各相应教导以引用的方式并入本文。这些并入至少是用于本文对其进行引用之时可能说明的特定教导和/或其它目的。如果特定的教导和/或其它目的未予说明,则所述公开资源被特别地并入以该引用文献的一个或多个标题、摘要和/或概述所表明的教导。如果具备如此相关性的特定指明的教导和/或其它目的并不存在,则所述公开资源被并入用于更为完备地描述本发明所涉及的领域的状态,和/或在可能适用的情况下用于提供本领域的技术人员一般所了解的这类教导。然而,特此说明本文对公开资源的引用不应被理解成为承认其为是本发明的现有技术。此外,如果所述并入公开资源的一种或多种不同于或有悖于本申请,包括但不限于定义的术语、术语的使用、所描述的技术等等,则以本发明为准。实施例中的主题以前文未有的程度被并入本切中。
实施例
本文实施例提供了遗传修饰和补充物添加的组合的一些实施例,其并非用于进行限制。下列实施例包括实际实施例和预测实施例。
除非另行说明,温度是摄氏度并且压力是处于或近于海拔5,340英尺(1,628米)处的大气压。应当了解,在外部分析和合成设施中完成的工作并非在处于或近于海拔约5,340英尺(1,628米)之处的大气压下进行的。实施例11A和11C在订约实验室完成,并非处于所标明的海拔下。除非另行说明,所有试剂均为购得。物种以及其它的系统发生标识是根据微生物领域中的技术人员已知的分类方法。
本文提供了主要供应商的名称和城市地址。此外,根据本文所述,对于Qiagen产品,DNeasyBlood and Tissue Kit,目录号第69506号,被用于基因组DNA的制备;QIAprepSpin(“mini Prep”),目录号第27106号,被用于质粒DNA纯化,并且QIAquickGel Extraction Kit,目录号第28706号,被用于凝胶提取。
实施例1:表达丙二酰-CoA还原酶(mcr)的质粒的构建
根据由商业DNA基因合成提供商DNA2.0(Menlo Park,CA USA)提供的服务,来自橙色绿屈挠菌的丙二酰-CoA还原酶基因的核酸序列针对大肠杆菌进行密码子优化。该基因序列(SEQ ID NO:803)在其起始密码子之前整合EcoRI限制性位点并且之后融合HindIII限制性位点。此外,在起始密码子前置入了一个核糖体结合位点。此基因构建体由DNA2.0合成并且提供于pJ206载体骨架(SEQ ID NO:804)中。使用获自New EnglandBioLabs(Ipswich,MA USA)的EcoRI和HindIII酶根据制造商的说明对包含所述合成mcr基因的质粒DNA pJ206进行酶限制性消化。通过琼脂糖凝胶电泳对消化混合物进行分离并且根据常用方法部分的描述回收适当的DNA片段。携带pKK223-aroH的大肠杆菌克隆菌株由Boulder的Universityof Colorado的Ryan T Gill教授赠送。携带所述质粒的这一菌株的培养物生长并且根据常用方法部分的描述制备质粒DNA。使用获自New EnglandBioLabs(Ipswich,MA USA)的限制性内切酶EcoRI和HindIII根据制造商的说明对质粒DNA进行消化。该消化用于将aroH阅读框从pKK223骨架中分离。消化混合物通过琼脂糖凝胶电泳进行分离,并且根据常用方法部分的描述对包含对应于所述pKK223质粒骨架的DNA片段的琼脂糖凝胶切块进行回收。
对应于mcr基因和pK233载体骨架的纯化的DNA片段被连接并且根据制造商的说明对连接产物进行转化和电穿孔。所产生的名为pKK223-mcr的载体的序列通过由商业提供商进行的常规测序进行确认(SEQ ID NO:003)。pKK223-mcr赋予对氨苄青霉素的抗性并且包含橙色绿屈挠菌的mcr基因,所述基因处于可在大肠杆菌宿主中以IPTG诱导的Ptac启动子控制之下。
为对处于pKK223上的Ptac之外的其它启动子调控之下的mcr基因进行表达,合成mcr基因被转移至其它质粒。质粒pTrc-Ptrc-mcr基于pTrcHisA(Invitrogen,Carlsbad,CA;目录号V360-20),并且mcr的表达由IPTG可诱导的Ptrc启动子进行控制。非诱导物依赖的PtalA启动子基于大肠杆菌talA基因上游的序列。置于合成mcr基因的起始ATG密码子的紧邻上游处的该启动子的核苷酸序列被列为SEQ ID NO:805。
通过PCR将PtalA:mcr构建体引入pSC-B载体(Stratagene Corporation,La Jolla,CA,USA)中,其在大肠杆菌母菌中扩增,质粒DNA根据本文它处所述的方法进行纯化。通过使用载体引物M13F和M13R进行的PCR将pSC-B-PtalA:mcr中的PtalA:mcr区转移至质粒载体pSMART-HCamp(Lucigen Corporation,Middleton,WI,目录号40041-2,GenBankAF399742)。通过PCR产生的片段根据制造商的方案被克隆到pSMART-HCamp中,得到质粒pSMART(HC)Amp-PtalA-mcr(SEQ ID NO:806),其中mcr表达不需要IPTG的诱导。
实施例2:表达转氢酶(pntAB)的质粒的构建
源于tpiA基因的非诱导物依赖的大肠杆菌启动子(PtpiA)与吡啶核苷酸转氢酶基因pntAB(SEQ ID NO:779和SEQ ID NO:781)的融合通过使用聚合酶链反应从基因组大肠杆菌K12DNA扩增tpiA启动子区域和pntAB区域而产生。对于所述pntAB基因,使用包含并入pntA蛋白质序列的起始Met的NcoI位点的pntAB正向引物GGGAACCATGGCAATTGGCATACCAAG(SEQ ID NO:807,注意本文公开的全部引物均为人工序列)和pntAB反向引物GGGTTACAGAGCTTTCAGGATTGCATCC(SEQ ID NO:808)对该区域进行了扩增。类似地,所述PtpiA区域使用正向引物GGGAACGGCGGGGAAAAACAAACGTT(SEQ ID NO:809)和包含NcoI限制性位点的反向引物GGTCCATGGTAATTCTCCACGCTTATAAGC(SEQ ID NO:810)进行了扩增。使用来自Qiagen Corporation(Valencia,CA,USA)的PCR纯化试剂盒根据制造商的说明对聚合酶链反应产物进行纯化。在纯化之后,使用NcoI酶对所述产物进行酶限制性消化。限制性酶获自New England BioLabs(Ipswich,MA USA),并且根据制造商的说明进行使用。通过琼脂糖凝胶电泳对消化混合物进行分离并且根据常用方法部分的描述在UV透射下进行可视化。包含对应于扩增的pntAB基因产物和PtpiA产物的DNA片段的琼脂糖凝胶切块从该凝胶切下并且使用来自Qiagen的凝胶提取试剂盒根据制造商的说明回收所述DNA。根据制造商的说明使用T4DNA连接酶(New England BioLabs,Ipswich,MA USA)将回收的产物连接在一起。
由于连接反应可导致几种不同的产物,对连接于pntAB基因的对应于PtpiA片段的所需产物通过聚合酶链反应进行扩增并且通过第二次凝胶纯化进行分离。为进行该聚合酶链反应,正向引物为GGGAACGGCGGGGAAAAACAAACGTT(SEQ ID NO:809),并且反向引物为GGGTTACAGAGCTTTCAGGATTGCATCC(SEQ ID NO:808),并且连接混合物被用作为模板。通过琼脂糖凝胶电泳对消化混合物进行分离并且根据常用方法部分的描述在UV透射下进行可视化。将包含对应于所述扩增的PtpiA-pntAB融合的DNA片段的琼脂糖凝胶块从凝胶切下并且使用来自Qiagen的标准凝胶提取方案和成分根据制造商的说明回收DNA。使用获自Stratagene Corporation(La Jolla,CA,USA)的Blunt PCRCloning试剂盒按照该制造商的说明将这一提取的DNA插入pSC-B载体中。通过集落聚合酶链反应对菌落进行筛选。来自显示出正确大小的插入片段的菌落的质粒DNA被培养并且使用来自Qiagen的标准微量制备方案和成分根据该制造商的说明进行微量制备(miniprep)。分离的质粒通过限制性消化进行检验并且通过测序证实。以该过程产生的经测序确认的分离质粒被命名为pSC-B-PtpiA:pntAB。
将pSC-B-PtpiA:pntAB中的PtpiA:pntAB区域转移至pBT-3载体(SEQ IDNO:811),该载体提供了广泛宿主范围复制起点以及氯霉素选择标记。为获得该构建体,通过聚合酶链反应使用正向引物AACGAATTCAAGCTTGATATC(SEQ ID NO:812)和反向引物GAATTCGTTGACGAATTCTCT(SEQ ID NO:813)以pBT-3为模板产生来自pBT-3载体的片段。使用DpnI对扩增产物进行处理以限制甲基化模板DNA,并且混合物通过琼脂糖凝胶电泳进行分离并且根据常用方法部分的描述在UV透射下进行可视化。将包含对应于所扩增的pBT-3载体产物的DNA片段的琼脂糖凝胶块从凝胶切下并且使用来自Qiagen的标准凝胶提取方案和成分根据制造商的说明回收DNA。使用以正向引物GGAAACAGCTATGACCATGATTAC(SEQ ID NO:814)和反向引物TTGTAAAACGACGGCCAGTGAGCGCG(SEQ ID NO:815)进行聚合酶链反应扩增pSC-B-PtpiA:pntAB中的PtpiA:pntAB插入片段。两种引物均被5′-磷酸化。
通过琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行分离并且根据常用方法部分的描述在UV透射下进行可视化。将包含对应于扩增的PtpiA:pntAB插入片段的DNA片段的琼脂糖凝胶块从凝胶中切下并且使用来自Qiagen的标准凝胶提取方案和成分根据制造商的说明回收DNA。使用获自New EnglandBiolabs(Bedford,MA,USA)的T4DNA连接酶根据该制造商的说明将该插入DNA连接到根据本文所述而制备的pBT-3载体中。根据制造商的说明将连接混合物转化进入获自Lucigen Corp的大肠杆菌10G细胞中。通过集落聚合酶链反应对菌落进行筛选。来自显示出正确大小的插入片段的菌落的质粒DNA被培养并且使用来自Qiagen的标准微量制备方案和成分根据该制造商的说明进行纯化。分离的质粒通过限制性消化进行检验并且通过测序确认。以该过程产生的经测序确认的分离质粒被命名为pBT-3-PtpiA:pntAB(SEQ ID NO:816)。
实施例3:表达乙酰CoA羧化酶(accABCD)的质粒的构建
携带可以表达大肠杆菌的乙酰CoA羧基转移酶复合体的成分的两个操纵子的质粒由商业DNA基因合成提供商DNA2.0(Menlo Park,CA USA)所构建。该构建体整合了处于源自大肠杆菌tpiA基因的非诱导物依赖的启动子控制之下的accA和accD基因的DNA序列,以及处于源自大肠杆菌rpiA基因的非诱导物依赖的启动子控制之下的accB和accC基因的DNA序列。各个编码序列之前均具有核糖体结合序列。设计的操纵子在pJ251载体骨架之中提供并且命名为pJ251:26385(SEQ ID NO:817)。
pJ251:26385质粒的tpiA启动子被改造以提供更高的表达。该修饰通过使用正向引物GCGGGGCAGGAGGAAAAACATG(SEQ ID NO:818)和反向引物GCTTATAAGCGAATAAAGGAAGATGGCCGCCCCGCAGGGCAG(SEQID NO:819)扩增质粒而引入。这些引物各以5′-磷酸化修饰合成。通过琼脂糖凝胶电泳对所产生的PCR产物进行分离并且根据常用方法部分的描述回收适当的DNA片段。根据制造商的说明,使用获自New EnglandBiolabs(Bedford,MA,USA)的T4DNA连接酶对被回收的产物进行自连接并且使用DpnI进行消化。来自显示出正确大小的插入片段的菌落的质粒DNA被培养并且使用来自Qiagen的标准微量制备方案和成分根据制造商的说明进行纯化。分离的质粒通过限制性消化进行检验并且通过测序确认。以该过程产生的经测序确认的分离质粒被命名为pJ251(26385)-PtpiA:accAD-PrpiA:accBC(SEQ ID NO:820)。
实施例4:表达与3-HP耐受发生复合体相关基因的质粒的构建
用于包含表达多肽(其表现3HPTGC的酶活性)的基因的质粒的质粒构建实例由公开于2010年1月28日的WO 2010/011874并入。虽然3HPTGC的多种单一遗传修饰和遗传修饰的组合可被提供于特定的实施方案中以提高对3-HP的耐受性,但是实施例中仅仅提供了少量几种。这并非意在进行限制。
实施例5:产生3-羟基丙酸的特定菌株的构建
根据在下表中所示的相应组合,本文所述的质粒被引入相应基本菌株中。所有质粒使用标准方法通过电穿孔被同时引入。转化的细胞生长于具有抗生素补充的适当的培养基中并且根据其在选择培养基上的适当生长对菌落进行选择。根据常用方法部分的描述将mcr表达质粒pKK223-mcr转化到大肠杆菌DF40(Hfr,garB10,fhuA22,ompF627,fadL701,relA1,pitA10,spoT1,rrnB-2,pgi-2,mcrB1,creC527)或大肠杆菌JP1111(Hfr,galE45(GalS),LAM-,fabI392(ts,温度敏感的))中。根据本领域所知的,菌株DF40和JP1111是通常可获得的大肠杆菌菌株,可获自包括Yale ColiGenetic Stock Collection(New Haven,CT USA)的来源。通过根据常用方法部分中的描述以电穿孔制备转化感受态的细胞并且使用另外的质粒进行转化,由这些mcr转化体构建了携带多种相容性质粒的菌株。随后在包含适当抗生素组合的培养基上选择转化体。
表9.菌株名称与特征
实施例6:3-羟基丙酸的产生
KX3_0001的3-HP产生在补料分批(丰富)或AM2(基本盐)培养基中以100-mL的规模进行。通过标准方法(Sambrook和Russell,2001年)从冷冻储存株开始在添加100μg/mL氨苄青霉素的50mL的LB培养基中进行培养并且在37℃下使用225rpm的转速过夜培养至静止期。5毫升的该培养物一式三份转移至250-ml振荡培养瓶内的添加40g/L葡萄糖、100μg/mL氨苄青霉素、1mM IPTG的100ml的补料分批或AM2培养基中,并且在37℃、225rpm下孵育。为监测细胞生长和这些培养物的3-HP产生,在指定时间点进行取样(2ml)以用于600nm下的光密度测量(OD600,1cm光程)并且通过在12,000rpm下离心5分钟进行沉淀和收集上清液用于根据常用方法部分中的“3-HP产生的培养物分析”的描述进行3-HP产生分析。干细胞重量(DCW)以0.33乘以其测定的OD600值而进行计算,其基于基线DCW对OD600的测定。所有的数据为三次培养的平均值。出于比较的目的,单位生产率从24小时时间点的平均值进行计算并且以每gDCW产生的g 3-HP的方式表示。在补料分批培养基中菌株KX3_0001的3-HP产生在下表中出示。在这些条件下,24h后的单位生产率为0.0041g3-HP每g DCW。
表10.在补料分批培养基中菌株KX3_0001的3-HP产生
时间(hr) | 3HP(g/L) | OD600 |
0 | 0.002 | 0.118 |
3 | 0.002 | 0.665 |
4 | 0.005 | 1.44 |
6 | 0.008 | 2.75 |
8 | 0.009 | 3.35 |
24 | 0.008 | 5.87 |
实施例7:通过脂肪酸合成的抑制提高丙二酰-CoA前体池对3-HP产生的影响
根据本文所述,已知特定的化学物质抑制脂肪酸合成酶系统的各种酶,考虑到脂肪酸合成在细胞膜维持和生长中以及微生物生长中的作用,其中一些化学物质被用作为抗生素。这些抑制剂中包括浅蓝菌素,其抑制KASIβ-酮脂酰基-ACP合成酶(例如,大肠杆菌中的fabB)。为进一步评估用于在包含选定化学产物(此处为3-HP)的产生途径(其中丙二酰-CoA是该途径的底物)的微生物中调控和改变丙二酰-CoA利用的方式,对在培养过程中浅蓝菌素的添加进行了测定。
丙二酰-CoA的下游途径限制于脂肪酸生物合成和3-HP产生(当细胞中存在或被提供通过丙二酰-CoA达到后者的途径时)。该实验被设计用于确定如何控制丙二酰-CoA池在3-HP生产菌株中的使用和进一步改善3-HP产生速度。据假设,通过抑制脂肪酸生物合成和调控丙二酰-CoA池,通过该途径的物质流将被改变为朝向3-HP的产生。图9中显示了当前3-HP产生途径中通过丙二酰-CoA的可能碳流的示意图。已选择了代表性的抑制剂,其干扰脂肪酸的延伸和破坏将丙二酸部分重新捕获回到该乙酰-CoA库的无用循环。
KX3_0001菌株在补料分批培养基中存在10μg/ml浅蓝菌素的情况下进行的生产在表11中出示。存在抑制剂的情况下,丙二酰-CoA前体的内部池被认为提高,从而导致了3-HP产生的提高。通过与无浅蓝菌素所得的结果进行比较可观察到(表5),在每个时间点产生了显著增加的3-HP,并且24h时的单位生产率为0.128g 3-HP每g DCW,相对于无浅蓝菌素的结果是31倍的提高。
表11.KX3_0001菌株在补料分批培养基中和存在10μg/ml浅蓝菌素的情况下的3-HP产生
3HP(g/L) | OD600 |
0.002 | 0.118 |
0.002 | 0.724 |
0.020 | 1.59 |
0.060 | 2.80 |
0.090 | 3.45 |
0.200 | 4.73 |
实施例8:使用温度敏感的脂肪酸合成突变体增加丙二酰-CoA前体池对3-HP产生的影响
用于提高内部丙二酰-CoA池的替代性方法是使用基因突变而非化学抑制剂。尽管编码脂肪酸合成功能的基因中的失活突变通常是致死的并且因此还没有可获得的、条件突变体诸如温度敏感的突变体被描述(deMendoza,D.和Cronan,J.E.,Jr.(1983年)Trends Biochem.Sci.,8,49-52页)。例如,JP1111菌株的编码烯酰基-ACP还原酶的fabI基因中的温度敏感性突变(基因型fabI392(ts))在降低的温度下如30℃具有相对正常的活性,并且在升高的温度下变为非许可的(很可能通过变性和失活所致),如当在37至42℃下培养时,仅包含此温度敏感性突变体作为其烯酰基-ACP还原酶的微生物将产生显著更少的脂肪酸和磷脂。这导致了降低的生长或不生长。但是,据推测当这些突变体被提供于还包含从丙二酰-CoA至例如3-HP的生产途径的经遗传修饰的微生物时,涉及提高的培养温度的有效培养方法可导致提高的3-HP单位生产率。
表12显示了JX3_0077菌株在30℃的恒定温度下的补料分批培养中和经受从30℃到42℃的温度变化的培养中的3-HP产生。所述温度变化被设计用于灭活烯酰基-ACP还原酶,因此消除了脂肪酸的积累,其随之提高了内部丙二酰-CoA池。在每个时间点产生了显著更多的3-HP,并且温度变化的培养的单位生产率在24h时为1.15g 3-HP每g DCW,其相对于维持于恒定的30℃下的培养所得的0.011g 3-HP每g DCW单位生产率提高了超过100倍。通过其中以升高的温度灭活烯酰基-ACP还原酶的培养物所得的提高的3-HP生产率支持了丙二酰-CoA的利用改变导致了提高的3-HP生产的观点。
表12.在补料分批培养基中JX3_0077的3-HP产生
表13显示了JX3_0087菌株的3-HP产生,该菌株除携带mcr基因的质粒外还携带过表达转氢酶基因的质粒。在维持于30℃的恒定温度下的培养中,在24h获得0.085g 3-HP每g DCW的单位生产率。这显著高于不携带过表达转氢酶基因的质粒的JX3_0077的单位生产率(表7)。JX3_0087的温度变化培养的单位生产率是1.68g 3-HP每g DCW,其相对于维持于恒定的30℃下的其中烯酰基-ACP还原酶未被灭活的培养的单位生产率提高了20倍。
表13.在补料分批培养基中JX3_0087的3-HP产生
表14显示了菌株JX3_0097的3-HP产生,该菌株除携带mcr基因的质粒外还携带过表达编码乙酰CoA羧化酶复合体基因的质粒。在维持于30℃的恒定温度下的培养中,在24h获得0.0068g 3-HP每g DCW的单位生产率。该单位生产率类似于其中未过表达乙酰CoA羧化酶的JX3_0077菌株所得的单位生产率。JX3_0097的温度变化培养的单位生产率是0.29g 3-HP每g DCW,其相对于维持于恒定的30℃下的其中烯酰基-ACP还原酶未被灭活的培养物的单位生产率提高了42倍。
表14.在补料分批培养基中JX3_0097的3-HP产生
补料分批培养基(其是丰富培养基)可包含用作脂肪酸前体的成分并且因此可降低对丙二酰-CoA的需求。因此,验证了通过源自JP1111的菌株在基础培养基AM2中的3-HP产生。根据表15所示,在AM2培养基中JX3_0077产生了3-HP。通过恒定维持于30℃下的培养物在24h获得了0.024g 3-HP每g DCW的单位生产率,约为补料分批培养基中所获值的两倍。温度变化培养物在24h时间内获得了1.04g 3-HP每g DCW的单位生产率,与恒定维持于30℃的培养物相比有44倍的提高,再一次表明烯酰基-ACP还原酶的条件灭活提高了内部丙二酰-CoA池并且因此提高了3-HP产生,正如发明者所预见的。
表15.在AM2培养基中JX3_0077的3-HP产生
显示了在AM2培养基中JX3_0087菌株的3-HP产生,该菌株除携带mcr基因的质粒外还携带过表达转氢酶基因的质粒。在维持于30℃的恒定温度下的JX3_0087培养物中,在24h获得0.018g 3-HP每g DCW的单位生产率。与在补料分批培养基中所得的结果相反,该值并不高于在AM2中使用不携带过表达转氢酶基因的JX3_0077菌株获得的单位生产率(表15)。JX3_0087的温度变化培养物的单位生产率是0.50g 3-HP每g DCW,其相对于通过维持于恒定的30℃下的其中烯酰基-ACP还原酶未被灭活的培养物的单位生产率提高了27倍。
表16.在AM2中JX3_0087的3-HP产生
表17显示了在AM2培养基中JX3_0097菌株的3-HP产生,该菌株除携带mcr基因的质粒外还带有过表达编码乙酰CoA羧化酶复合体基因的质粒。在维持于30℃的恒定温度下的培养中,在24h获得0.021g 3-HP每g DCW的单位生产率。该单位生产率类似于其中未过表达乙酰CoA羧化酶的JX3_0077菌株所得的单位生产率。JX3_0097的温度变化培养物在24h的单位生产率是0.94g 3-HP每g DCW,其相对于维持于恒定的30℃下的其中烯酰基-ACP还原酶未被灭活的培养物的单位生产率提高了45倍。
表17.在AM2中JX3_0097.0的3-HP产生
通过构建JX3_0098菌株测试了将表达mcr(丙二酰-CoA还原酶)、pntAB(转氢酶)和accABCD(乙酰-CoA羧化酶)的质粒在相同生物体中结合的效应。上表显示了在AM2培养基中该菌株的3-HP产生。在恒定维持于30℃的培养物中在24h获得了0.54g 3-HP每g DCW的单位生产率,其相对于仅携带mcr菌株或携带mcr与pntAB或accABCD任一但非同时结合两者的菌株具有>20倍的提高。变化温度以灭活烯酰基-ACP还原酶在24h导致了2.01g 3-HP每g DCW的单位生产率,其为3.8倍的进一步提高。因此,pntAB和accABCD的过表达的结合,加上烯酰基-ACP还原酶通过温度敏感性fabIts等位基因的灭活,在携带mcr细胞的3-HP单位生产率上导致了约500倍的提高(在24h时,2.01对比0.0041g 3-HP每g DCW的单位生产率)。
表18.在AM2培养基中JX3_0098.0的3-HP产生
实施例9:fabIts突变的序列
对JP1111菌株所携带的fabIts等位基因中确切序列变化的特征进行了再度确认。该变化的确认使得靶向诱变能够产生具有不同温度敏感性的替代菌株以及介于野生型和fabI392温度敏感性等位基因之间的中等稳定性的突变体,其允许在高于30℃的恒定温度下生长而同时提供提高的内部丙二酰-CoA池的优点。为确认野生型(BW25113)以及所述JP1111突变体大肠杆菌染色体的这一片段的DNA序列,从这些菌株中制备了染色体DNA。这些DNA在PCR反应中被用作为模板,所使用的引物为:
FW043 ATGGGTTTTCTTTCCGG SEQ ID NO:821
FW047 TTATTTCAGTTCGAGTTCG SEQ ID NO:822
用于PCR的热循环仪条件为:95℃,10分钟;进行30个循环的95℃,10秒;47℃升高至58℃,30秒;72℃,1分钟;之后为72℃最终孵育5分钟。PCR产物在琼脂糖凝胶上进行分离并且根据常用方法部分的描述回收适当大小的片段并且使用以下引物测序:
FW044 CTATCCATCGCCTACGGTATC SEQ ID NO:823
FW045 CGTTGCAATGGCAAAAGC SEQ ID NO:824
FW046 CGGCGGTTTCAGCATTGC SEQ ID NO:825
获自fabI392的DNA序列(SEQ ID NO:769)与野生型菌株的DNA序列之间的比较揭示了在野生型基因第722位上的C变成为T的等位基因间的单一差异(见图4A),其导致了密码子241的丝氨酸成为苯丙氨酸的蛋白质变化(见图4B)。这些变化与Bergler,H.,Hogenauer,G.和Turnowsky,F.,J.Gen.Microbiol.138:2093-2100页(1992年)的发现一致。
密码子241的受影响残基的鉴定显示,在该密码子处的靶向诱变,例如突变成为如色氨酸、酪氨酸、组氨酸、异亮氨酸或不同于丝氨酸或苯丙氨酸的其它氨基酸残基,可产生具有与JP1111中原本分离的fabI392的不同特性的fabI等位基因。在密码子241附近的密码子上的靶向诱变也可考虑用于获得具有改变特性的所需fabI突变体。
实施例10:3-HP耐受发生复合体的基因的过表达对3-HP产生的影响
一系列的菌株被构建以携带单独表达mcr的质粒(pTrc-Ptrc-mcr或pSMART(HC)Amp-PtalA-mcr)或与携带来自3-HP耐受发生复合体的代表基因的相容质粒一同表达mcr的质粒(pJ61-aroG、pJ61-thrA、pACYC177-cynTS、pJ61-cynTS)。表19对所述菌株及它们的特征进行了分类。
表19.携带带有耐受发生复合体基因的质粒的菌株的菌株名称和菌株特征
菌株名称 | 宿主 | 质粒 |
JX3_0118 | JP1111 | pTrc-Ptrc-mcr |
JX3_0110 | JP1111 | pTrc-Ptrc-mcr+pJ61-aroG |
JX3_0111 | JP1111 | pTrc-Ptrc-mcr+pJ61-thrA |
JX3_0112 | JP1111 | pTrc-Ptrc-mcr+pACYC177-cynTS |
JX3_0113 | JP1111 | pTrc-Ptrc-mcr+pJ61-cynTS |
JX3_0104 | JP1111 | pSMART(HC)Amp-PtalA-mcr |
JX3_0114 | JP1111 | pSMART(HC)Amp-PtalA-mcr+pJ61-aroG |
JX3_0119 | JP1111 | pSMART(HC)Amp-PtalA-mcr+p15A空载体 |
JX3_0115 | JP1111 | p SMART(HC)Amp-PtalA-mcr+pJ61-thrA |
JX3_0116 | JP1111 | pSMART(HC)Amp-PtalA-mcr+pACYC177-cynTS |
JX3_0117 | JP1111 | pSMART(HC)Amp-PtalA-mcr+pJ61-cynTS |
JX3_0119 | JP1111 | pSMART(HC)Amp-PtalA-mcr+p15A空载体 |
表20中显示了携带pTrc-Ptrc-mcr而具有或不具有携带3-HP耐受发生复合体(3HPTGC)的基因的质粒的菌株的3-HP产生。除培养物被维持于恒定的30℃下之外,3-HP产生根据实施例6实施,并且菌株根据它们在24小时后的单位生产率进行评估。根据表20中所示,与JX3_0077菌株的区别仅在于IPTG诱导型质粒特征的JX3_0118菌株的单位生产率在24h为0.19g 3-HP/g DCW,与JX3_0077的0.011g 3-HP每g DCW形成对比。维持于恒定30℃的培养物的单位生产率的这一17倍的提高归因于pTrc-Ptrc-mcr的提高的稳定性和mcr表达。
3-HP耐受发生复合体的基因的表达进一步提高了3-HP的生产率。在24小时单位生产率上,aroG在JX3_0110中的表达导致了2.3倍的提高,thrA在JX3_0111中的表达导致了2.2倍的提高,并且cynTS在JX3_0112中的表达导致了10.6倍的提高。
表20.
携带通过pSMART(HC)Amp-PtalA-mcr表达的mcr以及携带来自3-HP耐受发生复合体基因的质粒的菌株获得了类似的结果。除培养物被维持于恒定的30℃下之外,3-HP产生根据实施例6实施,并且菌株根据它们在24小时后的单位生产率进行评估。仅携带mcr表达质粒的菌株(JX3_0104)或具有空对照载体的菌株(JX3_0119)在24小时分别具有0.062或0.068g 3-HP每g DCW的单位生产率。与JX3_0119菌株相比,在24小时的单位生产率上aroG在JX3_0114中的表达导致了2.4倍的提高,thrA在JX3_0115中的表达导致了2.6倍的提高,并且cynTS在JX3_0116或JX3_0117中的表达导致了2.1倍的提高。因此,来自3-HP耐受发生复合体的代表性基因的过表达显著地提高了3-HP的单位生产率,甚至是在分泌的3-HP水平远低于最初对这些基因的耐受效果进行鉴定时的水平的情况下。这是一个出乎预料的有利结果。
表21.携带pSMART(HC)Amp-PtalA-mcr和带有来自3-HP耐受发生复合体的基因的质粒的菌株进行的3-HP产生
实施例11:使用温度敏感性脂肪酸合成突变体提高丙二酰-CoA前体池对1L发酵中3-HP容积产率的影响。
使用JX3_0098菌株进行了四组1L补料分批发酵实验。简而言之,种培养物在LB培养基(Luria液体培养基)中起始并生长过夜并且用于接种四个1L的New Brunswick发酵罐。第一个发酵罐30℃下包含限定AM2培养基,在OD600nm为2的时候以2mM添加IPTG诱导,当葡萄糖被耗减至1-2g/L之时开始另外的葡萄糖补料。达到目标OD 10时1小时内将温度变化至37℃。高葡萄糖补料速度被维持于>3g/L/hr直至葡萄糖开始积累至浓度高于1g/L,在此时改变补料速度以维持残余葡萄糖介于1与10g/L之间。第二个发酵罐30℃下包含限定的AM2培养基,在OD600nm为2的时候以2mM添加IPTG诱导,当葡萄糖被耗减至0g/L时开始另外的葡萄糖补料。达到目标OD 10时1小时内将温度变化至37℃。所述葡萄糖补料速度被维持于低于或等于3g/L/hr。第三个发酵罐30℃下包含丰富培养基,在OD600nm为2时以2mM添加IPTG诱导,当葡萄糖被耗减至1-2g/L时开始另外的葡萄糖补料。达到目标OD 10时1小时内将温度变化至37℃。高葡萄糖补料速度被维持于>3g/L/hr直至葡萄糖开始积累至浓度高于1g/L,在此时改变补料速度以维持残余葡萄糖介于1与10g/L之间。第四个发酵罐30℃下包含丰富培养基,在OD600nm为2的时候以2mM添加IPTG诱导,当葡萄糖被耗减至0g/L时开始另外的葡萄糖补料。达到目标OD 10时1小时内将温度变化至37℃。葡萄糖补料速度被维持于低于或等于3g/L/hr。
图5中显示了生长曲线,箭头标出了温度变化的起始。通过50%v/v的氢氧化铵(Fisher Scientific)的受控添加将所有的发酵罐维持于pH=7.4。通过以喷射过滤空气进行的通气将所有的发酵罐维持于至少20%的溶解氧。进行取样以用于光密度测量以及对3-HP浓度的HPLC分析。(参考常用方法)。最大容积生产率达2.99g/L/hr。此外,该图显示了在这4个发酵罐中3-4小时平均生物质浓度与3-4小时平均容积生产率之间的相关性。
实施例11A:在250升发酵中的3-HP产生
使用BX3_0240菌株在250升体积不锈钢发酵器中实施了两个补料分批发酵的实施例,所述菌株的基因型在本文它处有所描述。使用了两阶段接种过程以产生用于所述250L发酵器的接种物。在第一阶段,菌株的1ml甘油母液被接种到振荡摇瓶内的100ml的TB培养基(Terrific Broth)中并且在30℃下孵育直至OD600介于3与4之间。在第二阶段,85ml的所述振荡摇瓶培养物被经无菌转移至包含8L TB培养基的14L NewBrunswick发酵器中并且生长于30℃和500rpm搅拌下直至OD600介于5与6之间。来自所述14L发酵器的培养物被用于在30℃下对包含FM5限定培养基(参见常用方法部分)的250L体积生物反应器进行无菌接种,从而使接种后体积为155L。
在第一发酵中,通过在OD600为20时加入IPTG至最终浓度2mM而进行诱导。当发酵器的残余葡萄糖为10-15g/L时开始葡萄糖补料(由700g/L葡萄糖溶液组成)。补料速度经调整以维持残余葡萄糖介于10与15g/L之间直至发酵的最后6小时,此时补料速度被降低以使收获时的残余葡萄糖为<1g/L以方便3-HP回收。诱导后三个小时,在1小时内将所述温度变化至37℃。在开始温度变化之时,将溶解氧(DO)设定点由20%空气饱和度变维持DO介于2-4%空气饱和度之间的点。在接种后48小时收获发酵液体培养基。最终液体培养基体积为169.5升。
第二发酵除以下差别以外与上述第一发酵相同地运行:在OD600为15之时进行IPTG诱导,残余葡萄糖(葡萄糖补料开始之后)介于3-30g/L之间,以及发酵液体培养基在接种之后38.5小时收获以使最终残余葡萄糖浓度为25g/L。最终液体培养基体积为167升。
通过无水氨气的受控添加将各发酵液体培养基维持于pH约7.4。通过以喷射过滤除菌空气进行的通气维持溶解氧于所需水平。进行取样以用于光密度测量以及对3-HP浓度的HPLC分析。在第一发酵中,最大生物质浓度是12.0g干细胞重/L并且生物质浓度在收获之时为11.4g干细胞重/L。该发酵中的最大3-HP滴度为20.7g/L。在第二发酵中,最大生物质浓度是10.2g干细胞重/L并且生物质浓度在收获之时为9.5g干细胞重/L。该发酵中的最大3-HP滴度为20.7g/L。
实施例11B:1L发酵中生长培养基对3-HP产生的影响。
使用BX3_0240菌株进行了八个1L补料分批发酵实验。种培养起始于将1ml菌株的甘油母液接种到振荡摇瓶内的400ml的TB培养基(Terrific Broth)中并且在30℃下孵育直至OD600介于5与6之间。摇瓶培养物被用于无菌接种各个1L体积生物发酵器从而使各容器中的接种后体积为653ml。
发酵器1和2包含FM3限定培养基。发酵器3-5包含FM4限定培养基。发酵器6-8包含FM5限定培养基。所有培养基配方被列于常用方法部分之中。在各发酵器中,起始温度为30℃。
通过在OD600值为15-16之时加入IPTG至最终浓度2mM而进行诱导。当发酵器中的残余葡萄糖为约10g/L之时开始葡萄糖补料(对于FM3和FM5其由500g/L葡萄糖溶液组成,而对于FM4其由500g/L葡萄糖加75mM MgSO4组成)。补料速度经调整以维持残余葡萄糖>3g/L(发酵器8除外,该发酵器中残余葡萄糖在提高补料速度之前临时达到0.1g/L)。诱导后三个小时,在1小时内将温度变化至37℃。在开始温度变化之时,将溶解氧(DO)设定点由20%空气饱和度变至1%空气饱和度。在接种后48小时终止发酵。
通过pH滴定剂的受控添加而将各发酵器的液体培养基维持于pH约7.4。对于FM3培养基pH滴定剂为5M NaOH,而对于FM4和FM5其为浓氢氧化铵与水的50∶50混合物。通过以无菌过滤的空气进行喷射将溶解氧维持于所需水平。进行取样以用于光密度测量以及对3-HP浓度的HPLC分析。下文表22中总结了各发酵器中的最大生物质浓度和收获之时的生物质浓度以及最大3-HP滴度。
表22
实施例11C:1L发酵中批次磷酸盐浓度对3-HP产生的影响。
使用BX3_0240菌株进行了四个1L补料分批发酵实验。种培养起始于将菌株的1ml甘油原液接种到振荡摇瓶内的400mlTB培养基(TerrificBroth)之中并且在30℃下孵育直至OD600介于5与7之间。摇瓶培养物被用于无菌接种各个1L体积生物发酵器从而使各容器中的接种后体积为653ml。
所有的发酵器均包含FM5限定培养基,但各具有不同初始浓度的磷酸一氢钾和磷酸二氢钾。表23中总结了在各发酵器中批培养基中的磷酸盐浓度。FM5培养基配方被列于常用方法部分之中。
表23
在各发酵器中,起始温度为30℃。当OD600值为以下值时通过加入IPTG至终浓度2mM进行诱导:发酵器1,15.3;发酵器2,16.0;发酵器3,18.1;发酵器4,18.4。当发酵器中的残余葡萄糖为约10g/L之时开始葡萄糖补料(对于FM3和FM5其由500g/L葡萄糖溶液组成,而对于FM4其由500g/L葡萄糖加75mM MgSO4组成)。对补料速度进行调整以维持残余葡萄糖>6.5g/L。诱导后三个小时,在1小时内将温度变化至37℃。在开始温度变化之时,将溶解氧(DO)设定点由20%空气饱和度变至1%空气饱和度。在接种后48小时终止发酵。
通过浓氢氧化铵和水的50∶50混合物的受控添加而将各发酵器的液体培养基维持于pH 7.4。通过以无菌过滤空气进行喷射将溶解氧维持于所需水平。进行取样以用于光密度测量以及对3-HP浓度的HPLC分析。下文表24中总结了各发酵器中的最大生物质浓度和收获时的生物质浓度以及最大3-HP滴度。
表24:
实施例11D:1L发酵中的3-HP产生
使用BX3_0240菌株进行了两个1L补料分批发酵实验。种培养起始于将菌株的1ml甘油原液接种到振荡摇瓶内的100ml的TB培养基(Terrific Broth)之中并且在30℃下孵育直至OD600介于5与6之间。摇瓶培养物被用于无菌接种各个1L体积生物发酵器进行(5%体积/体积)从而使各容器中的接种后体积为800ml。该实验中所使用的发酵器是DasGip fed-batch pro parallel发酵系统(DASGIP AG,Julich,Germany,SR0700ODLS型)。所述包括溶解氧(%DO)、pH、温度、搅拌和补料的实时监测和控制。发酵器1和2包含FM5限定培养基,其根据常用方法部分所示进行制备,除柠檬酸以2.0g/L添加和MgSO4以0.40g/L添加以外。在各发酵器中,起始温度为30℃。在OD600值为17-19之时(其对应于接种后14.5小时的时间),通过加入IPTG至最终浓度2mM而进行诱导。当发酵器中的残余葡萄糖为约1g/L之时开始葡萄糖补料(由500g/L葡萄糖溶液组成)。对补料速度进行调整以维持残余葡萄糖>3g/L。诱导后三个小时,在1小时内将温度变化至37℃。在开始温度变化之时,通过分别设定气流和搅拌为1.08vvm和1000rpm而将OTR设定为40mmol/L-hr。使用2巴的压缩空气作为空气进料。通过pH滴定剂的受控添加而将各发酵器的液体培养基维持于pH约7.4。IPTG诱导之后两小时,将pH滴定剂由50%NH4(OH)改成7.4M NaOH。进行取样以用于光密度测量以及对3-HP浓度的HPLC分析。下文表25中总结了各发酵器中的最大生物质浓度和收获时的生物质浓度以及最大3-HP滴度。
表25
下文表26提供了在标出的小时时间处自发酵液体培养基获得的代谢产物浓度的总结。
重复 | 时间(小时) | 3-HP(g/L) | 丙酮酸(g/L) | 琥珀酸(g/L) | 乳酸(g/L) |
1 | 0 | 0 | 0.341 | 0.328 | 0 |
1 | 45 | 35.128 | 5.596 | 0 | 0 |
1 | 69 | 36.05 | 9.179 | 0 | 0 |
2 | 0 | 0 | 0.346 | 0.376 | 0 |
2 | 45 | 31.188 | 8.407 | 0 | 0 |
2 | 69 | 35.139 | 13.143 | 0 | 0 |
表26(续)
富马酸(g/L) | 谷氨酸(g/L) | 谷氨酰胺(g/L) | 甘油(g/L) | 丙氨酸(g/L) |
0.002 | 0.006 | 0 | 0.563 | 0.139 |
0.013 | 0.959 | 0 | 0.160 | 0.104 |
0.003 | 1.77 | 0 | 0.244 | 0.075 |
0.002 | 0.893 | 0.075 | 0.471 | 0.109 |
0.004 | 0.796 | 0 | 0.347 | 0.084 |
0.011 | 1.23 | 0 | 0.481 | 0.077 |
实施例11E:1L发酵中的3-HP生产
使用BX3_0240菌株进行了四个1L补料分批发酵实验。种培养起始于将菌株的1ml甘油原液接种到振荡摇瓶内的100ml的TB培养基(Terrific Broth)之中并且在30℃下孵育直至OD600介于5与6之间。摇瓶培养物被用于无菌接种各个1L体积生物发酵器(5%体积/体积)从而使各容器中的接种后体积为800ml。该实验中所使用的发酵器是Das Gipfed-batch pro parallel发酵系统(DASGIP AG,Julich,Germany,SR0700ODLS型)。所述发酵系统包括溶解氧(%DO)、pH、温度、搅拌和补料的实时监测和控制。所有发酵器均包含FM5限定培养基,其根据常用方法部分所示进行制备,除柠檬酸以2.0g/L添加和MgSO4以0.40g/L添加以外。在各发酵器中,起始温度为30℃。在OD600值为15-19之时(其对应于接种后15.75小时的时间),通过加入IPTG至最终浓度2mM而进行诱导。当发酵器中的残余葡萄糖为约3g/L之时开始葡萄糖补料(由500g/L葡萄糖溶液组成)。对补料速度进行调整以维持残余葡萄糖>3g/L。诱导后三个小时,在1小时内将温度变化至37℃。通过pH滴定剂50%NH4(OH)的受控添加而将各发酵器的液体培养基维持于pH约7.4。在开始温度变化之时,通过根据表27改变搅拌和气流而对各发酵器进行OTR变化。使用2巴的压缩空气作为空气进料。进行取样以用于光密度测量以及对3-HP浓度的HPLC分析。下文表27中总结了各发酵器中的最大生物质浓度和收获之时的生物质浓度以及最大3-HP滴度。
表27
实施例11F:1.8L发酵中的3-HP产生
使用BX3_0240菌株进行了1.8L补料分批发酵实验。种培养起始于将菌株的1ml甘油原液接种到振荡摇瓶内的105ml的TB培养基(TerrificBroth)之中并且在30℃下孵育直至OD600介于5与7之间。90ml的摇瓶培养物被用于无菌接种1.71L的FM5生长培养基,除批培养基中磷酸盐浓度为0.33g/L K2HPO4和0.17g/L KH2PO4之外。FM5生长培养基配方中的其它成份如常用方法部分所列。发酵器中的初始温度是30℃。通过在OD600值为15.46之时加入IPTG至最终浓度2mM而进行诱导。当发酵器中的残余葡萄糖为约10g/L之时开始葡萄糖补料(由500g/L葡萄糖溶液组成)。对补料速度进行调整以维持残余葡萄糖>6.5g/L。诱导后三个小时,在1小时内将温度变化至37℃。在开始温度变化之时,将溶解氧(DO)设定点由20%空气饱和度变至1%空气饱和度。通过浓氢氧化铵和水的50∶50混合物的受控添加而将各发酵器的液体培养基维持于pH 7.4。通过以无菌过滤空气进行喷射将溶解氧维持于所需水平。进行取样以用于光密度测量以及对3-HP浓度的HPLC分析。最大的终末生物质浓度是9.84g/L,最大3-HP滴度是48.4g/L,具有从葡萄糖开始的0.53g 3-HP/g葡萄糖的最终产率。
实施例12:用于3-HP产生进一步评估的菌种构建
根据在下表28中所示的相应组合,本文所述的质粒(例如,参见实施例1)被引入相应的菌株之中。全部质粒使用标准方法通过电穿孔被同时引入。被转化的细胞生长于具有抗生素补充的适当培养基中并且根据其在选择培养基上的适当生长而对菌落进行选择。根据表28中所总结的,mcr表达质粒pTrc-ptrc-mcr或pACYC(kan)-ptalA-mcr被转化进入源自大肠杆菌BW25113的两个菌株(F-,Δ(araD-araB)567,ΔlacZ4787(::rrnB-3),lamba-,rph-1,Δ(rhaD-rhaB)568,hsdR514),这些菌株包含根据常用方法部分所述使用Gene Bridges技术引入的额外的染色体修饰。BX_0590菌株包含额外的ldhA、pflB、mgsA和poxB基因的缺失。BX_0591菌株包含BX_0590菌株的额外缺失以及ack_pta基因的额外缺失。随后在包含适当抗生素组合的培养基中选择转化体。
表28
菌株名称 | 宿主 | 质粒 |
BX3_0194 | BX_0590 | PTrc-ptrc-mcr |
BX3_0195 | BX_0591 | PTrc-ptrc-mcr |
BX3_0206 | BX_0590 | pACYC(kan)-ptalA-mcr |
实施例12A:用于评估的额外菌株的构建
第1部分:基因缺失
根据本文它处所述,使用Red/ET重组的同源重组方法被用于在大肠杆菌菌株中的基因删除。该方法为本领域的普通技术人员所知并且在授予Stewart等的美国专利第6,355,412号和第6,509,156号中有所描述,其以引用的方式将对于该方法的教导并入本文。用于这些方法的材料和试剂盒可来自Gene Bridges(Gene Bridges GmbH,Heidelberg(以前为Dresden),Germany,<<www.genebridges.com>>),并且所述方法遵循制造商的说明而进行。所述方法使用选择标记通过以来自λ-噬菌体的重组酶进行的同源重组而替换靶基因。表达λ-red重组酶的宿主生物体使用侧邻与靶基因或启动子序列同源的末端区域(一般~50bp,或者最高达约~300bp)的编码选择标记的线性DNA产物转化。所述标记后通过携带FPL-重组酶或如Cre的另一重组酶的质粒进行另一重组步骤而去除。
特定的缺失由携带特定缺失的Keio菌株中通过使用PCR利用下文所明确的引物进行的扩增构建。Keio标本获自Open Biosystems(Huntsville,AL USA 35806)。单个克隆可购自Yale Genetic Stock Center(New Haven,CT USA 06520)。这些菌株各包含卡那霉素标记以取代缺失基因。在Keio菌株中不存在所需缺失的情况下,例如ackA-pta,缺失通过上述重组方法使用卡那霉素抗性标记替换删除的序列,继之以对具有所述缺失的卡那霉素抗性克隆进行选择而构建。使用上述重组方法将PCR产物引入靶向菌株中。缺失的组合被顺序产生以获得本实施例以下部分所述的菌株。
表29
表31显示了具有包含根据本部分的方法的缺失的基因型的菌株。
第2部分:具有fabI突变的BW_595和BW_651菌株的构建
大肠杆菌菌株JP1111中的fabIts突变(Ser241→Phe)当细胞生长于所述非容许温度(37℃)下时显著地提高了丙二酰-CoA浓度并且因此在该温度下产生了更多的3-HP。但是,JP1111并非用于过渡到先导和商业规模的理想菌株,这是因为它是NTG诱变的产物并且因此可带有未知突变,它携带严格性调控因子relA和spoT中的突变并且由于Hfr因子的存在而具有增强的结合倾向。因此fabIts突变被移入从充分表征的BW23115(其携带额外的突变ΔldhA、ΔpflB、ΔmgsA、ΔpoxB、Δpta-ack)开发的BX_591菌株。通过顺序应用上文第1部分所述的基因删除方法而产生这些突变。
通过PCR从JP1111基因组DNA中分离具有600bp的上游和下游DNA序列的fabIts基因,所述PCR使用的引物为:
SEQ ID NO:855 FW056:5′-CCAGTGGGGAGCTACATTCTC;以及
SEQ ID NO:856 FW057:5′-CGTCATTCAGATGCTGGCGCGATC。
随后将FRT::kan::FRT盒插入fabIts下游的SmaI位点以生成质粒pSMART(HC)amp_fabIts_FRT::kan::FRT。该质粒被用作为模板DNA,并且下列引物之间的区域:
SEQ ID NO:857 FW043:5′-ATGGGTTTTCTTTCCGG;以及
FW057(SEQ ID NO:856)
在使用KOD HS DNA聚合酶(Novagen)的PCR中进行扩增。使用DpnI处理反应物以裂解质粒模板并且使用DNA Clean and Concentrator试剂盒(Zymo Research,Orange,CA)对扩增片段进行凝胶纯化和回收。使用pSIM5(Datta,S.等,Gene 379:109-115页,2006年)转化BX_591菌株并且通过在42℃下孵育15分钟而诱导该质粒上所携带的λred基因的表达。
通过标准方法制备电感受态细胞。使用携带fabIts_FRT::kan::FRT盒的扩增片段转化这些细胞并且在30℃下包含35μg/ml卡那霉素的LB平板上分离转化体菌落。单个菌落通过重划线进行纯化并且通过在30℃和42℃下在液体培养基中生长而对其进行温度敏感性测试。与野生型亲本菌株相比,携带fabIts等位基因的菌株在42℃生长不良但是在30℃表现出相当的生长。通过集落PCR验证FRT::kan::FRT标记的正确插入,并且fabItskanR菌株被命名为BX_594。
为允许使用质粒上的kanR标记,整合进入所述染色体与fabIts相邻的标记被替换为编码博莱霉素抗性的DNA片段。通过PCR从质粒pJ402(DNA 2.0,Menlo Park,CA)扩增zeoR基因,使用的引物为:
SEQ ID NO:858 HL018:
5′-CAGGTTTGCGGCGTCCAGCGGTTATGTAACTACTATTCGGCGCGACTTACGCCGCTCCCCGCTCGCGATAATGTGGTAGC;以及
SEQ ID NO:859 HL019:
5′-AATAAAACCAATGATTTGGCTAATGATCACACAGTCCCAGGCAGTAAGACCGACGTCATTCTATCATGCCATACCGCGAA。
反应物使用DpnI进行处理并且如上所述凝胶纯化。使用pKD46转化菌株BX_594(Datsenko和Wanner,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 96:6640-6645页,2000年)并且通过加入1mM的L-阿拉伯糖对该质粒上携带的λred基因进行2小时诱导。通过标准方法制备电感受态细胞(Sambrook和Russell,2001年)。使用zeoR片段转化这些细胞并且在不含NaCl并且具有25μg/ml博莱霉素的LB平板上选择转化体。平板通过包裹在铝箔中而保持在黑暗中并且于30℃下孵育。通过该方法分离出的博莱霉素抗性、卡那霉素敏感菌株被命名为BX_595。fabIts等伴基因的保持如上所述通过生长进行确认。
通过将fabIts-zeoR盒从BX_595转移至不携带代谢基因突变的BW25113菌株而构建了BX_651菌株。通过PCR使用BX_595基因组DNA和引物FW043(参见上文)以及
SEQ ID NO:860 FW65:5′-GAGATAAGCCTGAAATGTCGC
获得携带该盒的DNA片段。
使用DNA Clean and Concentrator试剂盒(Zymo Research,Orange,CA)纯化和浓缩PCR产物。用pRedD/ET(Gene Bridges GmBH,Heidelberg,Germany)转化BW25113菌株并且通过加入5mM的L-阿拉伯糖对该质粒上携带的λred基因进行2小时诱导。电感受态细胞通过标准方法制备并且使用fabIts-zeoRDNA片段进行转化。根据上文所述将转化体接种于博莱霉素平板上,并且如上所述通过在30℃和42℃下的生长验证携带温度敏感等位基因的克隆。
第3部分:对染色体中选定基因的启动子置换
本文它处所述的同源重组方法被用于置换各种基因的启动子。根据指出的,Red/ET重组的使用为本领域的普通技术人员所知并且在授予Stewart等的美国专利第6,355,412号和第6,509,156号中有所描述,其对于该方法的教导以引用的方式并入本文。这些方法的材料和试剂盒可来自Gene Bridges(Gene Bridges GmbH,Heidelberg,Germany,<<www.genebridges.com>>),并且所述方法可遵循制造商的说明而进行。所述方法涉及选择标记通过以来自λ-噬菌体的重组酶实施的同源重组而替换靶基因(或在此情况下,启动子区域)。表达λ-red重组酶的宿主生物体使用侧邻与所述靶基因或启动子序列同源的末端区域(一般~50bp,或者最高达约~300bp)的编码选择标记的线性DNA产物进行转化。所述标记可随后通过用携带FPL-重组酶或诸如Cre的另一重组酶的质粒进行的另一重组步骤而去除。该方法根据制造商的说明使用。各包含末端序列、所需的替代启动子和抗生素标记序列的模板序列由外部制造商(Integrated DNA Technologies,Coralville,IA)合成,所述末端序列用于实现重组以替换所示的目的基因的天然启动子。这些序列被设计用于将这些基因前方的天然启动子替换为T5启动子。T5-aceEF盒(SEQ ID NO:863)还包含loxP位点侧邻的博莱霉素抗性盒。T5-pntAB(SEQ ID NO:864)、T5-udhA(SEQ ID NO:865)和T5-cynTS(SEQ ID NO:866)盒各包含loxP位点侧邻的灭瘟素抗性盒。此外,T5-cynTS(SEQ ID NO:866)根据Lambert等,AEM 73(4)第1126-1135页包含修饰的loxP位点。
各盒首先被用作PCR扩增的模板以生成PCR产物,使用引物CAGTCCAGTTACGCTGGAGTC(SEQ ID NO:861)和ACTGACCATTTAAATCATACCTGACC(SEQ ID NO:862)。如上所述,按照Gene Bridges的Red/ET重组方法将该PCR产物用于电穿孔(使用本文它处所述的标准方法)和重组进入基因组。在转化之后,在包含博莱霉素和灭瘟素抗生素的培养基上选择转化阳性重组体。根据标准方法通过Cre-重组酶的表达而完成抗性标记的消除。表31显示具有包含替换启动子的基因型的菌株。这些菌株被显示为“T5”后跟受影响的基因。
第4部分:质粒的构建
下表总结了用于下文所述菌株中的质粒的构建。为制备质粒,通过PCR扩增和限制性酶(RE)消化或对携带基因的适当来源进行直接限制性酶消化而分离相应的目的基因或基因区域。被分离的基因随后使用标准分子生物学方法(如,Sambrook和Russell,2001年)连接进入所需载体,转化进入大肠杆菌10G(Lucigen,Middleton,WI)感受态细胞,通过限制性作图分析进行筛选并且通过DNA测序进行确认。
应当注意,这些质粒中包括包含单功能丙二酰-CoA还原酶活性的质粒。特别地,通过使用来自pTRC-ptrc-mcr-amp的分别邻接于编码密码子优化的丙二酰-CoA还原酶的氨基酸残基366和1220以及氨基酸残基496和1220的核苷酸碱基的PCR引物构建了来自橙色绿屈挠菌的丙二酰-CoA还原酶的截短部分。此外,来自赤杆菌属的丙二酰-CoA还原酶被整合到另一质粒中。对于其它质粒,其根据下文描述被引入菌株中并且进行评估。
表30
*A:Invitrogen,Carlsbad,CA;*B:New England Biolabs,Ipswich,MA;*C:DNA 2.0,Menlo Park,CA
第5部分:pACYC-cat-accABCD-PT5-udhA的克隆。
驱动pACYC-cat-accABCD-udhA中的udhA的表达的PtalA启动子被替换为更强的T5启动子。使用引物1170(udhA上游300bp)扩增来自BX_00635菌株的基因组PT5-udhA构建体。udhA的序列参见SEQ ID NO:886。使用PmeI和NdeI(New England BioLabs,Ipswich,MA)消化上文所获得的PT5-udhA的PCR片段。使用SwaI和NdeI(New England BioLabs,Ipswich,MA)对载体pACYC-cat-accABCD-Ptal-udhA进行类似地消化。两种被消化的DNA片段被连接和转化以产生pACYC-cat-accABCD-PT5-udhA(SEQ ID NO:887)。使用质粒消化以确认正确序列。该质粒被并入表31所示的菌株中。
第6部分:菌株构建
使用通过上述方法制备的构建体,根据所标出的菌株名称产生表31中所示的提供所述基因型的菌株。这并非用于进行限制,并且使用这些方法并遵循本申请中提供的教导可制备其它菌株,包括提供用于耐受性和/或3-HP产生的不同基因和基因区域以及用于调控脂肪酸合成酶系统的修饰。进一步对于后者,可通过染色体修饰和/或引入非染色体引入物如质粒而产生这样的菌株。
对于后者,根据在下文表38中所示的相应组合,上文所述的质粒被引入相应的菌株之中。全部质粒使用标准方法通过电穿孔被同时引入。转化的细胞生长于具有抗生素补充的适当的培养基上并且根据其在选择培养基上的适当生长而对菌落进行选择。
表31
实施例12B:制备包含与对照大肠杆菌细胞相比提高3-HP产生的其它遗传修饰结合的丙二酰-CoA还原酶(Mcr)的遗传修饰的大肠杆菌宿主细胞(预测的)
进行了遗传修饰以引入包含如来自铜绿假单胞菌(Pseudomonasauruginos)的mmsB的载体,其进一步对大肠杆菌进行密码子优化。包含galP和天然或突变ppc的载体也可通过本领域的技术人员所知的方法被引入(参见,例如Sambrook和Russell,Molecular Cloning:A LaboratoryManual,2001年第3版(第1-3卷),Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.,“Sambrook和Russell,2001年”),此外公认的是可通过使用XL1-Red突变体菌株的方法,其使用适当的材料根据制造商的说明(Stratagene QuikChange Mutagenesis Kit,Stratagene,La Jolla,CA USA)进行突变并在标准方案中进行选择或筛选。
此外,可进行遗传修饰以按照所需降低或消除大肠杆菌基因的酶活性。通过使用RED/ET同源重组方法以Gene Bridges(Gene Bridges GmbH,Dresden,Germany,www.genebridges.com)提供的试剂盒按照制造商的说明实现这些遗传修饰。
此外,在一些实施方案中进行遗传修饰以提高NADPH细胞池。本文提供了用于遗传修饰的一些靶标的非限定性实例。这些是pgi(突变形式)、pntAB、过表达的、gapA:gapN替换/置换,以及破坏或修饰可溶性转氢酶如sthA,以及zwf、gnd和edd中的一种或多种的遗传修饰。
任何这些工程化实施方案的如此遗传修饰的微生物进行评估并且发现与缺乏所述遗传修饰的对照大肠杆菌相比表现出更高的3-HP生产率。生产率通过标准度量进行测量,诸如在类似培养条件下的容积生产率(克3-HP/小时)。
实施例12C:选定多核苷酸的突变发生(预测的)
选定的基因序列,诸如编码SEQ ID No:783-791中任意一个的核酸序列,被用于突变发生方案,其通过使用错误诱导PCR定点诱变方法构建天然或此前进化的和/或密码子优化的多核苷酸的突变体文库。
表现选定基因(其可以是本文公开的任意基因,如转氨酶或mmsB)的酶活性的多核苷酸被克隆到用于大肠杆菌的适当表达系统中。该序列可进行密码子优化。对密码子优化的多核苷酸的克隆及其适当的表达应通过商业供应商所提供的基因合成使用标准技术而完成。基因应以八个氨基酸C-末端标签合成以使得能够实现基于亲和性的蛋白质纯化。一旦使用标准方法获得,基因应使用标准技术克隆到表达系统中。
包含上述多核苷酸的质粒应通过标准方法进行突变,从而产生大的突变体文库(>106)。突变体序列应从这些质粒中切下并且再克隆到表达载体中,从而产生超过106个克隆的最终文库以用于随后的筛选。这些数量保证了所述文库在序列所编码的每一个氨基酸上包含突变的可能性超过99%。据了解创建突变文库的各方法具有其自身的偏向,包括转化到大肠杆菌的突变器菌株中、易错PCR,以及另外的更多的定点诱变。
在一些实施方案中,可考虑各种方法并且可能平行地采用几种方法。一种这样的方法是XL1-Red突变器菌株的使用,其在DNA精确复制所必需的几种修复机制上存在缺陷并且在质粒中以5,000倍于野生型突变率的速度产生突变,其可使用适当的材料根据制造商的说明(参见StratageneQuikChange Mutagenesis Kit,Stratagene,La Jolla,CA USA)使用。可使用该技术或本领域的技术人员所知的其它技术并且随后评估这些突变体的群体,如文库中的群体,诸如通过筛选或选择方法,从而鉴定具有适当或有利的突变的克隆。
随着突变体文库的成功构建,有可能对该文库进行提高的活性的筛选,诸如提高的丙二酰-CoA还原酶活性。所述筛选过程应被设计以筛选超过106个突变体的整个文库。这通过适用于特定酶促反应的筛选方法而完成。
实施例13:使用实施例12的菌株对3-HP产生的评估:
BX3_0194的3-HP产生在SM3(基本盐)培养基中以100-mL的规模进行。通过标准方法(Sambrook和Russell,2001年)从冷冻原液开始在添加100μg/mL氨苄青霉素的50mL的LB培养基进行培养并且在37℃下使用225rpm的转速培养过夜至静止期。5毫升的该培养物被一式三份转移至250-ml振荡培养瓶内的添加40g/L葡萄糖、100μg/mL氨苄青霉素和1mM IPTG的100ml SM3培养基中,并且在37℃,225rpm下孵育。为监测这些培养物的细胞生长和3-HP产生,在指定时间点抽取样品(2ml)以用于600nm下的光密度测量(OD600,1cm光程)并且通过在12,000rpm下离心5分钟进行沉淀并收集上清液用于根据常用方法部分中的“3-HP产生的培养物的分析”的描述进行3-HP产生的分析。干细胞重(DCW)以0.33乘以其测定的OD600值而进行计算,其基于基线DCW对OD600的测定。所有的数据为三次培养的平均值。出于比较的目的,单位生产率从24小时时间点的平均值进行计算并且以每g DCW产生的g 3-HP的方式表示。在这些条件下,24小时之后在生长至对应于大约1.0g DCW的OD600的培养物中无3-HP产生。表32显示了在SM3培养基中BX3_0194菌株的3-HP产生。
表32.在SM3培养基中BX3_0194的3-HP产生
时间(小时) | 3HP(g/L) | OD600 |
4 | 0 | 1.3 |
6 | 0 | 2.3 |
8 | 0 | 2.8 |
24 | 0 | 3.4 |
表33中显示了BX3_0194菌株在SM3培养基中存在10μg/ml浅蓝菌素的情况下进行的生产。存在浅蓝菌素(脂肪酸合成酶系统的一种抑制剂)的情况下,丙二酰-CoA前体的内部库被认为有所提高,从而导致了3-HP产生的提高。通过与无浅蓝菌素(表32)的结果比较可观察到,在每个时间点产生了显著更多的3-HP。在这些条件下,24h后的单位生产率为1.3g 3-HP每g DCW。
表33.BX3_0194菌株在SM3培养基中和存在10μg/ml浅蓝菌素的情况下的3-HP产生
时间(小时) | 3-HP(g/L) | OD600 |
4 | 0.003 | 1.3 |
6 | 0.14 | 2.6 |
8 | 0.43 | 3.1 |
24 | 1.43 | 3.3 |
BX3_0195的3-HP产生在SM3(基本盐)培养基中以100-mL的规模进行。通过标准方法(Sambrook和Russell,2001年)从冷冻原液开始在添加100μg/mL氨苄青霉素的50mLLB培养基开始培养并且在37℃下使用225rpm的转速培养过夜至静止期。5毫升的该培养物被一式三份转移至250-ml振荡培养瓶内的添加40g/L葡萄糖、100μg/mL氨苄青霉素和1mMIPTG的100ml SM3培养基中,并且在37℃,225rpm下孵育。为监测这些培养物的细胞生长和3-HP产生,在指定时间点抽取样品(2ml)以用于600nm下的光密度测量(OD600,1cm光程)并且通过在12,000rpm下离心5分钟进行沉淀并收集上清液用于根据常用方法部分中的“3-HP产生的培养物的分析”的描述进行3-HP产生分析。干细胞重(DCW)以0.33乘以测定的OD600值而进行计算,其基于基线DCW对OD600的测定。所有的数据为三次培养的平均值。出于比较的目的,单位生产率由24小时时间点的平均值进行计算并且以每g DCW产生的g 3-HP的方式表示。在这些条件下,24小时之后在生长至对应于大约1.65g DCW的OD600的培养物中无3-HP产生。表34显示了在SM3培养基中菌株BX3_0195的3-HP产生。
表34.在SM3培养基中BX3_0195的3-HP产生
时间(小时) | 3HP(g/L) | OD600 |
4 | 0 | 0.92 |
6 | 0 | 1.35 |
8 | 0 | 2.36 |
24 | 0 | 5.00 |
表35中显示了BX3_0195菌株在SM3培养基中存在10μg/ml浅蓝菌素的情况下进行的生产。存在浅蓝菌素(脂肪酸合成酶系统的一种抑制剂)的情况下,丙二酰-CoA的内部库被认为有所提高,从而导致了3-HP产生的提高。通过与无浅蓝菌素(表34)的结果比较可观察到,在每个时间点产生了显著更多的3-HP。在这些条件下,24h后的单位生产率为0.54g3-HP每g DCW。
表35.BX3_0195菌株在SM3培养基中和存在10μg/ml浅蓝菌素的情况下的3-HP产生
时间(小时) | 3-HP | OD600 |
(g/L) | ||
4 | 0.003 | 0.97 |
6 | 0.07 | 1.57 |
8 | 0.31 | 2.36 |
24 | 1.17 | 6.59 |
BX3_0206的3-HP产生在SM3(基本盐)培养基中以100-mL的规模进行展示。通过标准方法(Sambrook和Russell,2001年)从冷冻原液在添加35μg/mL卡那霉素的50mL的LB培养基中开始培养并且在37℃下使用225rpm的转速培养过夜至静止期。5毫升的该培养物一式三份被转移至250-ml振荡培养瓶内的添加40g/L葡萄糖和35μg/mL卡那霉素的100ml SM3培养基中,并且在37℃,225rpm下孵育。为监测这些培养物的细胞生长和3-HP产生,在指定时间点抽取样品(2ml)以用于600nm下的光密度测量(OD600,1cm光程)并且通过在12,000rpm下离心5分钟进行沉淀并收集上清液用于根据常用方法部分中的“3-HP产生的培养物的分析”的描述进行3-HP产生分析。干细胞重(DCW)以0.33乘以测定的OD600值而进行计算,其基于基线DCW对OD600的测定。所有的数据为三次培养的平均值。出于比较的目的,单位生产率从24小时时间点的平均值进行计算并且以每g DCW产生的g 3-HP的方式表示。在这些条件下,24h后的单位生产率为0.05g 3-HP每g DCW。表36显示了在SM3培养基中菌株BX3_0206的3-HP产生。
表36.在SM3培养基中BX3_0206的3-HP产生
时间(小时) | 3HP(g/L) | OD600 |
24 | 0.01 | 6.5 |
表37中显示了BX3_0206菌株在SM3培养基中存在10μg/ml浅蓝菌素的情况下进行的生产。存在浅蓝菌素(脂肪酸合成酶系统的一种抑制剂)的情况下,丙二酰-CoA的内部库被认为有所提高,从而导致了3-HP产生的提高。通过与无浅蓝菌素(表36)的结果比较可观察到,在24小时之后产生了显著更多的3-HP。在这些条件下,24小时之后的单位生产率是0.20g 3-HP每g DCW,其相对于无浅蓝菌素的结果是约40倍的提高。
表37.BX3_0195菌株在SM3培养基中和存在10μg/ml浅蓝菌素的情况下进行的3-HP产生
时间(小时) | 3HP(g/L) | OD600 |
24 | 0.43 | 6.4 |
实施例13A:用于3-HP产生的菌株的评估
在列于下表中的生物催化剂(菌株)中的3-HP产生在SM3(基本盐)培养基中以100-mL的规模进行。所使用的SM3被描述于常用方法部分,但是补充以200mM MOPS。通过标准方法(Sambrook和Russell,2001年)从包含抗生素的LB平板在添加所示的适当抗生素的50mL的TB培养基中开始培养并在30℃下使用250rpm的转速进行培养过夜至静止期。5毫升的该培养物一式三份地被转移至250-ml振荡培养瓶内的添加30g/L葡萄糖、抗生素和1mM IPTG(在“诱导”栏中标为“是”)的100ml SM3培养基中,并且在30℃,225rpm下孵育。4小时之后培养瓶被变至37℃,250rpm。为监测这些培养物的细胞生长和3-HP产生,在24小时抽取样品(2ml)以用于600nm下的光密度测量(OD600,1cm光程)并且通过在14000rpm下离心5分钟进行沉淀并收集上清液用于根据常用方法部分中的“3-HP产生的培养物的分析”的描述进行3-HP产生的分析。3-HP滴度和标准差以g/L表示。干细胞重(DCW)以0.33乘以测定的OD600值而进行计算,其基于通过OD600测定的基线DCW。所有的数据为三次培养的平均值。出于比较的目的,产物对细胞的比率从24小时的平均数据进行计算并且以每g DCW产生的g 3-HP的方式表示。从20小时生产获得的细胞/产物比率计算单位生产率并且以每小时每g DCW产生的g3-HP的方式表示。
实施例13B:具有碳酸盐添加的BX3_240菌株的评估
大肠杆菌BX3_240(通过上述方法制备)中的3-HP产生在具有添加的碳酸钠的SM3(基本盐)培养基中以100-mL的规模进行评估。所使用的SM3被描述于常用方法部分,向其中加入了10mM、20mM和50mM的Na2CO3作为处理。通过标准方法(Sambrook和Russell,2001年)从包含抗生素的LB平板到添加所示的适当抗生素kan和cat的50mL的TB培养基中开始培养并在30℃下使用250rpm的转速培养过夜至静止期。5毫升的该培养物一式三份被转移至250-ml振荡培养瓶内的添加30g/L葡萄糖、抗生素、所标明的碳酸钠、0.1%酵母提取物和1mM IPTG的100ml SM3培养基中,并且在30℃,225rpm下孵育。4小时之后培养瓶被变化至37℃,250rpm。为监测这些培养物的细胞生长和3-HP产生,在24、48和60小时进行取样(2ml)以用于600nm下的光密度测量(OD600,1cm光程)并且通过在14000rpm下离心5分钟进行沉淀并收集上清液用于根据常用方法部分中的“3-HP产生的培养物的分析”的描述进行3-HP产生分析。3-HP滴度和标准差以g/L表示。干细胞重(DCW)以0.33乘以测定的OD600值而进行计算,其基于通过OD600测定的基线DCW。所有的数据为三重培养的平均值。出于比较的目的,产物对细胞的比率由60小时的平均数据进行计算并且以每g DCW产生的g 3-HP的方式表示。
在9、11、15、19、24、48和60小时,3-HP滴度分别为0.32(+/-0.03)、0.87(+/-0.10)、2.24(+/-0.03)、4.15(+/-0.27)、6.24(+/-0.51)、7.50(+/-0.55)和8.03(+/-0.14)g/L。在9、11、15、19、24、48和60小时,生物质浓度分别为0.54(+/-0.02)、0.79(+/-0.03)、1.03(+/-0.06)、1.18(+/-0.04)、1.20(+/-0.12)、1.74(+/-0.30)和1.84(+/-0.14)g/L。最大产物-细胞比率为4.6g 3-HP/g DCW。
实施例14:对宿主细胞的遗传修饰的一般性实施例(预测和非特定的)
除上文特定的实施例之外,本实施例被用于描述用于选定微生物的遗传修饰以引入目的核酸序列的非限制性的方式。在本一般性实施例中提供了替代和变化方式。本实施例的方法被实施用于在选定的微生物物种中获得所需遗传修饰的组合,诸如根据本节所述的遗传修饰的组合,以及它们的功能等同物,诸如在其它细菌和其它微生物物种中的等同物。
基因或其它目的核酸序列片段在特定的物种(诸如本文所述的大肠杆菌)中被鉴定并且获得了包含该基因或片段的核酸序列。
根据处于所述目的片段末端或邻接于该末端的核酸序列制备了5′和3′核酸引物。各引物被设计以具有与这些末端和邻接区域杂交的足够的重叠区段。这些引物可包含酶识别位点以用于转座酶插入的限制性消化,其可被用于随后的载体整合或基因组插入。这些位点一般被设计位于杂交重叠区段之外。已知根据订单制备引物序列的众多签约服务商(如,IntegratedDNA Technologies,Coralville,IA USA)。
一旦引物被设计和制备,进行聚合酶链反应(PCR)以特异性地扩增所需目的片段。该方法产生了从微生物基因组分离的多拷贝目的区域。微生物DNA、引物和嗜热聚合酶于包含钾和二价阳离子(如,Mg或Mn)以及具有足量脱氧核糖核苷三磷酸分子的缓冲溶液中组合。该混合物接受温度上升和下降的标准方案。然而,可根据反应根据待复制序列的长度、退火温度近似值和本领域的技术人员已知或易于通过常规实验获知的其它因素而对温度、成分、浓度和循环次数加以变化。
在替代实施方案中,目的片段可被合成,诸如由商业供应商而合成,并且通过PCR而制备,而非获自微生物或DNA的其它天然来源。
核酸序列随后被纯化和分离,例如在琼脂糖凝胶上通过电泳进行。任选地,一旦所述区域被纯化,其便可通过标准DNA测序方法进行验证并且可被引入载体之中。可使用通常包含本领域的技术人员所知的标记的多种载体中的任一种,并且标准的方法常规地应用于这样的引入。常用的载体系统为pSMART(Lucigen,Middleton,WI)、pET大肠杆菌表达系统(E.coli EXPRESSION SYSTEM)(Stratagene,La Jolla,CA)、pSC-BStrataClone载体(Stratagene,La Jolla,CA)、pRANGER-BTB载体(Lucigen,Middleton,WI)和TOPO载体(Invitrogen Corp,Carlsbad,CA,USA)。类似地,载体随后被引入多种宿主细胞中的任一种。常用的宿主细胞是E.cloni 10G(Lucigen,Middleton,WI)、E.cloni 10GF’(Lucigen,Middleton,WI)、StrataClone感受态细胞(Stratagene,La Jolla,CA)、大肠杆菌BL21、大肠杆菌BW25113和大肠杆菌K12 MG1655。这些载体中的一些具有启动子,诸如诱导型启动子,其邻接于目的序列被插入(诸如插入多克隆位点中)的区域,而其它载体诸如pSMART载体(Lucigen,Middleton,WI)不具有启动子而具有脱磷酸化平端。这些质粒负载细胞的培养允许质粒复制并且因此允许目的片段的复制,其通常对应于所述目的片段的表达。
多种载体系统包含选择标记,诸如编码在限定条件下生长或存活所需的蛋白质的可表达基因。包含于骨架载体序列上的常见选择标记包括编码抗生素抗性所需的一种或多种蛋白质的基因以及编码对营养缺陷型缺陷进行补偿或者提供在特定培养基中不存在或无法获得的关键性营养物所需的基因。载体还包含适用于目的宿主细胞的复制系统。
包含目的片段的质粒可随后通过常规方法分离并且可用于向其它目的微生物宿主细胞中引入。本领域已知各种引入方法并且其可包括载体引入或基因组整合。在多各替代实施方案中,目的DNA片段可自其它质粒DNA分离,如果前者将通过该质粒以外的方式引入目标宿主细胞的话。
尽管一般性预测实施例的步骤涉及质粒的使用,但本领域所知的其它载体可被替代地使用。它们包括粘粒、病毒(如,细菌噬菌体、动物病毒、植物病毒)以及人工染色体(如,酵母人工染色体(YAC)和细菌人工染色体(BAC))。
引入了目的片段的宿主细胞可被评估其关于特定酶学步骤和/或目的化学化合物的耐受性和生物产生的性能。可通过选择整体性能、目的化学物质的耐受性或产量或积累而选择对性能更优的遗传修饰宿主细胞。
根据指出的,该过程可并入单个基因(或其它目的核酸序列片段)或多基因(处于不同的启动子或单一启动子控制之下)的核酸序列,并且该过程可被重复以产生表达载体中所需的异源核酸序列,其随后被应用于选定的微生物以具有,例如,本文公开的任何代谢途径的酶促转化步骤功能性的所需的补充。然而,注意到,尽管多种方式依赖于通过全部或部分目的序列的转录以及随后转录的mRNA的翻译以产生多肽如酶而进行的表达,特定目的序列可通过这样的表达以外的方式发挥效用。
用于这些方式的特定实验室方法在本领域中广为人知并且可见于本领域的技术人员所知的各种参考文献,诸如Sambrook和Russell,MolecularCloning:A Laboratory Manual,2001年第3版(第1-3卷),Cold Spring HarborLaboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.(此后称为“Sambrook和Russell,2001年”)。
作为以上的替代方式,也可实施其它的遗传修饰,诸如宿主细胞基因组的核酸序列的缺失。一种用于实现这一方式的非限制性方法是通过Red/ET重组的使用,其为本领域的普通技术人员所知并且在授予Stewart等的美国专利第6,355,412号和第6,509,156号中有所描述,其对于该方法的教导以引用的方式并入本文。这一方法的材料和试剂盒可得自GeneBridges(Gene Bridges GmbH,Dresden,Germany,<<www.genebridges.com>>),并且所述方法可遵循制造商的说明而进行。可实现基因组DNA的靶向缺失以改变宿主细胞的代谢从而降低或消除不需要的代谢产物的产生。这可结合其它遗传修饰使用,诸如本文在一般性实施例中所描述的遗传修饰。
实施例14A.蔗糖作为产生3-HP和其它产物的原料的用途(部分预测的)
大肠杆菌的常用实验室和工业菌株,诸如本文所描述的菌株,不能利用蔗糖作为唯一的碳源,尽管在包括病原性大肠杆菌菌株在内的多种野生型菌株中可发现这一能力。蔗糖以及含蔗糖原料(如糖浆)存量丰富并且通常作为原料被用于通过微生物发酵而产生有机酸、氨基酸、维生素和其它产物。因此,能够利用蔗糖的3-HP产生菌株的进一步衍生体可拓宽可用于生产3-HP的原料范围。
本领域中已知各种蔗糖摄取和代谢系统(如,美国专利第6,960,455号),该文中的这些教导以引用的方式并入本文。我们描述了携带有赋予通过非磷酸转移酶系统利用蔗糖能力的csc基因的大肠杆菌菌株的构建,其中所述csc基因由编码蔗糖水解酶的cscA、编码蔗糖透性酶的cscB、编码果糖激酶的cscK和编码阻遏物的cscR组成。这些基因的序列在NCBI数据库中以登录号X81461 AF473544注录。为使得能够利用大肠杆菌基因组高度丰富的密码子进行有效表达,包含cscB、cscK和cscA的操纵子被设计并且使用商业合成DNA提供商(DNA 2.0,Menlo Park,CA)的服务进行合成。所述基因的氨基酸序列被分别示为,cscB-SEQ ID No.888;cscA-SEQ ID No.889;csck-SEQ ID No.890。合成的操纵子由大肠杆菌基因组紧邻adhE基因5’(上游)的区域的60bp,驱动csc基因表达的共有强启动子,cscB、cscK和cscA的编码区域(其具有包含核糖体结合位点但无启动子的短基因间区域),以及紧邻adhE基因3’(下游)的60bp组成。与adhE基因侧翼序列同源的片段将被用于csc操纵子基因向大肠杆菌基因组的靶向插入,同时删除adhE。整个合成构建体的核苷酸序列如SEQ ID No.891显示。合成的csc操纵子构建于质粒pJ214(DNA 2.0,MenloPark,CA)中,该质粒提供源自质粒p15A的复制起点以及赋予氨苄青霉素抗性的基因。这一质粒被命名为pSUCR。用pSUCR和质粒pTrc_kan_mcr或其它适当质粒同时对适当的宿主细胞如大肠杆菌BX_595菌株进行转化,并且在包含氨苄青霉素和卡那霉素的LB培养基平板上选择被转化的菌株。除将SM3培养基中的葡萄糖替换成等浓度的蔗糖之外,携带两种质粒的转化体根据实施例13中所述在振荡摇瓶中生长并且进行3-HP产生的评估。
赋予大肠杆菌能够利用蔗糖的功能的基因还可获自天然分离物pUR400(Cowan,P.J.等,J.Bacteriol.173:7464-7470页,1991年),其携带磷酸烯醇式丙酮酸依赖的碳水化合物摄取磷酸转移酶系统(PTS)。这些基因由编码PTS转运复合体的酶II成分的scrA、编码蔗糖-6磷酸水解酶的scrB、编码果糖激酶的scrK以及编码孔蛋白(porin)的scrY组成。这些基因可如上所述被分离或合成,整合到质粒上并且与质粒pTrc_kan_mcr或其它适当的质粒同时转化到适当的宿主细胞如大肠杆菌BX_595菌株中,并且在包含适当抗生素的LB培养基平板上选择转化的菌株。除将SM3培养基中的葡萄糖替换成等浓度的蔗糖之外,携带两种质粒的转化体根据实施例13所述在振荡摇瓶中生长并且进行3-HP产生的评估。
实施例14B:另外的菌株的构建与评估(预测的)
产生了包含本文所述遗传元件(添加、缺失和修饰)的各种组合的其它菌株,其进行3-HP产生的评估并用于3-HP产生,包括商业规模的生产。下表显示了多种这样的菌株。
此外,可对各种菌株提供用于降低多功能2-酮-3-脱氧葡糖酸6-磷酸醛缩酶和2-酮基-4-羟基戊二酸醛缩酶和草酰乙酸脱羧酶(大肠杆菌中的eda)的酶活性的进一步缺失或其它修饰。除后者之外,在各个实施方案中,与多功能2-酮-3-脱氧葡糖酸6-磷酸醛缩酶和2-酮基-4-羟基戊二酸醛缩酶和草酰乙酸脱羧酶(大肠杆菌中的eda)的酶活性的这种降低相结合,还可进行进一步的遗传修饰用于提高葡萄糖转运体(例如,大肠杆菌中的galP)和/或降低热稳定、组氨酰可磷酸化蛋白质(PTS的)(大肠杆菌中的ptsH(Hpr))、磷酰转移蛋白(PTS的)(大肠杆菌中的ptsI)以及PTS的多肽链(大肠杆菌中的Crr)中的一种或多种的活性。
这些菌株使用上文所述的方法在培养瓶或发酵器中进行评估。此外,注意到,在对包含引入质粒的菌株进行给定程度的评估之后,质粒中的遗传元件可被引入微生物基因组中,诸如通过本文所述的方法以及本领域的技术人员所知的其它方法。
表39
实施例15:3-HP产生的预测实施例
上文所述的具有3-HP产生途径和其它遗传修饰的经遗传修饰的微生物的接种物被提供到培养罐中,该培养罐还提供了包含营养物的液体培养基,所述营养物的浓度对于所需生物过程培养期是充足的。
最终的培养液(包含微生物细胞、大体“耗尽的”培养基和3-HP,在各个不同的实施方案中后者浓度超过1、2、5、10、30、50、75或100克/升)被收集并且进行分离和纯化步骤从而以相对纯化的状态获得3-HP。分离和纯化步骤可通过结合各种方法的众多方式中的任一种进行,所述方法包括离心、浓缩、过滤、减压蒸发、液/液相分离(包括在形成多胺-3-HP复合物后,如与叔胺如CAS#68814-95-9的Alamine336(三-C8-10烷基胺)(Cognis,Cincinnati,OH or Henkel Corp.)的复合物)、膜、蒸馏和/或本专利申请中提及的并入本文的其它方法。标准的分离和纯化步骤的原理和细节在本领域中是已知的,例如,在“Bioseparations Science andEngineering,”Roger G.Harrison等,Oxford University Press(2003年),以及Membrane Separations in the Recovery of Biofuels and Biochemicals-An Update Review,Stephen A.Leeper,由Norman N.Li和Joseph M.Calo所编辑的Separation and Purification Technology中第99-194页,MarcelDekker(1992年)中,这些教导以引用的方式并入本文。方法的特定组合选自本文所述的那些,并且部分地基于最终培养液中的3-HP和其它组分的浓度。
实施例16:将3-HP转化为特定下游化学物质的预测实施例
3-HP,诸如来自实施例13的3-HP,通过成环内酯化反应(消去水分子)转化成为任意一种或多种丙内酯,通过与乙醇的酯化转化成为乙基-3-HP,通过氧化反应而转化成为丙二酸,并且通过还原反应而转化成为1,3-丙二醇。
这些转化通过诸如本领域的技术人员所知的有机合成反应而进行。3-HP的这些转化中的任一种可通过处于受控条件下的化学合成进行从而获得高转化速度和产率,其具有可接受的低副产物形成。
实施例17:3-HP的生物丙烯酸生产的预测实施例
3-HP以相对纯的状态从微生物生物生产事件获得,诸如根据实施例15中所述。3-HP通过脱水反应而被转化成为丙烯酸,如在真空下存在催化剂的情况下通过加热进行脱水反应。更特别的情况下,酸或盐形式的3-HP的水溶液被添加至具有选自表8的催化剂的可旋转烧瓶中,表8从上文第XI节被并入本实施例中。
在旋转和真空条件下温度被升高至介于100与190℃,蒸气收集于冷凝器中。丙烯酸作为冷凝物被收集并且定量,诸如通过本文所述的分析过程进行。以无不希望的副反应的情况下获得高转化率的目标评估参数的多种组合,诸如温度、温度变化速度、源自微生物生物产生事件的3-HP溶液的纯度、减低的压力(和压力变化速度)以及一种或多种催化剂的类型和浓度,所述副反应在一些生产条件下可包括不希望的丙烯酸聚合。
实施例18:3-HP的生物丙烯酸产生的替代预测实施例
3-HP以相对纯的状态获自微生物生物生产事件,诸如根据实施例15所述。3-HP通过脱水反应转化成为丙烯酸,诸如在真空下存在催化剂的情况下通过加热进行,但是处于有利于3-HP形成丙烯酸之后控制丙烯酸聚合的条件下。以不存在不希望的副反应的条件下获得高转化速度为目标评估参数的各种组合,诸如温度、温度变化速度、源自微生物生物生产事件的3-HP溶液的纯度、减低的压力(和压力变化速度)以及一种或多种催化剂的类型和浓度和/或光暴露。这样形成的丙烯酸可通过本领域已知的方法进行分离和纯化,诸如上文公开的方法(同上)。
实施例19:丙烯酸向下游产物转化的预测实施例
实施例17的丙烯酸被进一步转化成为一种(或多种)根据本文所述的下游产物。例如,转化方法是用甲醇的酯化以制备丙烯酸甲酯或者用其它醇的酯化以获得其它丙烯酸酯、酰胺化以产生丙烯酰胺、添加腈部分以产生丙烯腈。根据所需进行其它添加以获得本文所述的取代的下游化合物。
实施例20:丙烯酸向聚丙烯酸转化的预测实施例
通过在水溶液中加热所述丙烯酸并且通过将溶液暴露于光照而引发聚合反应,并且之后通过除去聚合反应的热量而控制温度和反应速度,从而将实施例17的丙烯酸进一步转化成为聚丙烯酸。
本说明书的具体方法和教导以及以引用的方式并入的引用文献可并入上述实施例中。另外,在各个实施方案中,3-HP或其下游产物(诸如本文所述下游产物)之一的产生可达到至少1、至少2、至少5、至少10、至少20、至少30、至少40和至少50g/升的滴度。
实施例21:3-HP从发酵液体中分离和反应性萃取
在发酵实验结束时自10升发酵器获得的发酵液加热至60℃一小时以作为微生物杀灭步骤,随后被调节至约100克每升的3-HP(根据常用方法部分IIIa小节所述的方法制备),并且使用硫酸铵将pH调至约7.0。加入1M氯化钙以达到约8.2g/L的终浓度作为絮凝剂。之后使用硫酸将pH调节至约2.0的pH。之后将一定体积的该经变性的发酵液以约3,200g离心5分钟以产生澄清培养液和沉淀,沉淀物随后被丢弃。
澄清培养液的部分随后通过与包含各种共溶剂的叔胺非极性相混合而进行反应性萃取。混合之后,使得水相和胺非极性相分离,并且将胺非极性相从水相除去,水相通过HPLC(参见常用方法部分中的方法)进行3-HP浓度的分析。胺包括上文所述的Alamine 336以及三戊胺。表40提供了相应胺非极性相溶液中的单轮萃取效率的总结,各自分别根据该部分中的初始3-HP与残余液(萃取之后的水相)中的3-HP之间的差异而进行计算。
表40
注意到,与三戊胺处理相比,使用Alamine 336具有显著更多的乳液形成并且相分离较慢。尽管如此,这两种叔胺均表明3-HP从水相中被萃取至非极性相(即,包含共溶剂的叔胺)中。本实施例中使用的共溶剂并非用于进行限制;可考虑其它共溶剂,如,戊醇、己醇、庚醇、辛醇、壬醇、癸醇。此外,应注意己烷作为与三戊胺的共溶剂进行了测试,但是数据被认为无效,因为该样品在HPLC分析中导致峰位移。
此外,根据本申请它处所述以及本领域的一般所知,存在其它方式用于3-HP从发酵液的分离、萃取和纯化。因此,本实施例并不意图用于进行限制。
通过反萃取从非极性相叔胺溶液中回收3-HP的实施例提供于实施例22中。
实施例22:使用酸催化剂进行的形成丙烯酸的3-HP脱水
在烧瓶中将包含约350克3-HP每升的约15mL水溶液(通过常用方法部分IIIa小节中所述的方法制备)与约15mL浓硫酸组合。烧瓶被连接于旋转蒸发设备(Rotovapor Model R-210,BUCHI Labortechnik AG,Switzerland),在减压(10至20mbar)下在加热浴(BUCCHI,Model B-491)中加热至80C,并且在以冷水作为冷凝剂操作的冷凝设备下收集冷凝物。约5小时后,收集冷凝物,测量其体积并且将等分试样用于HPLC分析(参见常用方法部分)。烧瓶中反应混合物的等分试样也被用于HPLC分析。HPLC分析表明,在冷凝物中获得约24克每升的丙烯酸,而烧瓶中的反应混合物中剩余约4.5克每升。因此,3-HP表明在这些条件下形成丙烯酸。该实施例并非用于进行限制。
实施例23:丙烯酸向聚丙烯酸转化的预测实施例
通过在水溶液中加热丙烯酸并且通过将溶液暴露于光照而引发聚合反应,并且之后通过除去聚合反应的热量而控制温度和反应速度,从而将丙烯酸,诸如实施例22中提供的丙烯酸,进一步转化成为聚丙烯酸。
使用了批式聚合,其中丙烯酸以约50重量%的浓度溶于水中。通过经溶液吹入氮气对单体溶液进行脱氧处理。自由基引发剂如有机过氧化物任选地加入(以辅助通过光源的引发)并且使温度达到约60℃以开始聚合。
对聚合物的分子量和分子量分布进行测量。任选地,对其它聚合物特性包括密度、粘度、熔融温度和玻璃化转变温度进行测定。
本说明书的具体方法和教导以及以引用的方式并入的提及的参考文献可并入上述实施例中。另外,在各个实施方案中,3-HP或它的下游产物(诸如本文所述下游产物)之一的产生可达到至少1、至少2、至少5、至少10、至少20、至少30、至少40和至少50g/升的滴度。
实施例24:丙烯酸向聚丙烯酸的本体聚合的预测实施例
丙烯酸,诸如实施例22中提供的丙烯酸,被进一步通过本体聚合转化成为聚丙烯酸。丙烯酸单体、单体可溶引发剂和中和碱在聚合反应器中组合。聚合被引发并且对温度进行控制以获得所需的转化水平。引发剂在本领域中广为人知并且包括广泛的有机过氧化物和其它化合物,诸如上文所讨论的化合物。丙烯酸和聚丙烯酸使用诸如氢氧化钠的碱至少部分地进行中和。
对聚合物的分子量和分子量分布进行测量。任选地,对其它聚合物特性包括密度、粘度、熔融温度和玻璃化转变温度进行测定。
所产生的丙烯酸意图用作超吸收聚合物,用作用于尿布、成人失禁产品、妇女卫生产品以及类似消费产品的水和水溶液吸收剂,以及用于在农业、园艺业和其它领域中的可能用途。
实施例25:产生超吸收聚合物的预测实施例
丙烯酸,诸如实施例22中提供的丙烯酸,被进一步通过溶液聚合转化成为超吸收聚丙烯酸。丙烯酸单体的水溶液(约25-30重量%)、引发剂、中和碱、抗氧化剂、交联剂(诸如三羟甲基丙烷三丙烯酸酯)以及任选的其它添加剂在聚合反应器中组合并且引发聚合。可被用于中和的碱包括但不限于碳酸钠、氢氧化钠和氢氧化钾。
反应器内容物进行60分钟的除氧处理。使得聚合反应的温度被提高至引发所需水平。反应器随后被维持于所需保持温度下持续获得所需单体转化所需的时间长度。所产生的反应产物为高粘度凝胶的形式。该高粘度凝胶样反应产物随后被加工成薄膜或胶绳,干燥并研磨成为颗粒,其过筛和分类成为各种不同颗粒大小的部分。在聚合物被干燥和研磨成为最终颗粒大小之后,对残余丙烯酸和其它化学物质、可提取离心容量(extractablecentrifuge capacity)、剪切模量和负荷下吸收进行分析。可测量其它聚合物特性,包括分子量、分子量分布、密度、粘度、熔融温度和玻璃化转变温度。可通过向聚合物颗粒的表面加入交联共聚单体而进行表面处理。
所产生的聚丙烯酸意在用作超吸收聚合物,用作用于尿布、成人失禁产品、妇女卫生产品以及类似消费产品的水和水溶液吸收剂,以及用于在农业、园艺业和其它领域中的可能用途。
实施例26:超吸收聚合物生产的替代预测实施例
丙烯酸,诸如实施例22中提供的丙烯酸,进一步通过悬浮聚合转化成为超吸收聚丙烯酸。包含水、丙烯酸单体和中和碱的水相与包含惰性疏水液体的油相结合,并且任选地进一步提供了悬浮剂。水相和油相在使得形成细单体液滴的条件(包括约75℃的温度)下进行接触。聚合被引发,并且使用离心从悬液中回收聚丙烯酸的聚合微粒。
聚丙烯酸随后被干燥并且研磨成为颗粒,所述颗粒过筛和分类成为各种不同颗粒大小的部分。在聚合物被干燥和研磨成为最终颗粒大小之后,对残余丙烯酸和其它化学物质、可萃取离心容量、剪切模量和负荷下吸收进行分析。可测量其它聚合物特性,包括分子量、分子量分布、密度、粘度、熔融温度和玻璃化转变温度。
所产生的聚丙烯酸意在用作超吸收聚合物,用作用于尿布、成人失禁产品、妇女卫生产品以及类似消费产品的水和水溶液吸收剂,以及用于在农业、园艺业和其它领域中的可能用途。
实施例27:丙烯酸向丙烯酸甲酯转化的预测实施例
丙烯酸,诸如实施例22中提供的丙烯酸,通过直接的、催化的酯化而转化为丙烯酸甲酯。丙烯酸与甲醇接触,并且混合物在酯化催化剂存在下加热至约50℃。通过蒸馏从反应混合物中除去酯化过程中形成的水。通过测量混合物中丙烯酸和/或甲醇的浓度而监测酯化反应的进程。
由于与其它单体的反应性以及向丙烯酸共聚物提供强度和耐久性,丙烯酸甲酯是用于皮革、纸张、地板表层和织物的涂层的有用的单体。包含丙烯酸甲酯的树脂可配制成为弹性体、粘合剂、增稠剂、两性表面活性剂、纤维和塑料。丙烯酸甲酯还用于生产制备水处理材料所用的单体和用于化学合成。
实施例28:丙烯酸向丙烯酸乙酯转化的预测实施例
丙烯酸,诸如实施例19中提供的丙烯酸,通过直接的、催化的酯化而转化成为丙烯酸乙酯。丙烯酸与乙醇接触,并且混合物在酯化催化剂存在下被加热至约75℃。通过蒸馏从反应混合物中除去酯化过程中形成的水。通过测量混合物中丙烯酸和/或乙醇的浓度监测酯化反应的进程。
丙烯酸乙酯被用于生产同聚物和共聚物(其被用于织物、粘合剂和密封剂中)。丙烯酸乙酯还用于生产共聚物,例如丙烯酸及其盐、酯、酰胺、甲基丙烯酸酯、丙烯腈、马来酸酯、乙酸乙烯酯、氯乙烯、偏二氯乙烯、苯乙烯、丁二烯以及不饱和聚酯。此外,丙烯酸乙酯用于化学合成中。
实施例29:丙烯酸向丙烯酸丁酯转化的预测实施例
丙烯酸,诸如实施例22中提供的丙烯酸,通过直接的、催化的酯化而转化成为丙烯酸丁酯。丙烯酸与1-丁醇接触,并且混合物在酯化催化剂存在下被加热至约100℃。通过蒸馏从反应混合物中除去酯化过程中形成的水。通过测量混合物中丙烯酸和/或乙醇的浓度而监测酯化反应的进程。
丙烯酸丁酯被用于生产同聚物和共聚物(其用于水基工业和农业涂料、搪瓷、粘合剂、填缝剂和密封剂以及织物整理剂,从而利用其与甲基丙烯酸酯、丙烯腈、马来酸酯、乙酸乙烯酯、氯乙烯、偏二氯乙烯、苯乙烯、丁二烯或不饱和聚酯的同聚物或共聚物。
实施例30:丙烯酸向丙烯酸乙基己基酯转化的预测实施例
丙烯酸,诸如实施例22中提供的丙烯酸,通过直接的、催化的酯化而转化成为丙烯酸乙基己基酯。丙烯酸接触2-乙基-1-己醇,并且混合物在酯化催化剂存在下被加热至约120℃。通过蒸馏从反应混合物中除去酯化过程中形成的水。通过测量混合物中丙烯酸和/或乙醇的浓度而监测酯化反应的进程。
丙烯酸乙基己基酯被用于生产同聚物和共聚物(其用于填缝剂、涂层和压敏粘合剂、涂料、皮革涂饰剂以及织物和纸张涂层)。
实施例31:丙烯酸酯转化为终产品(包括消费产品)的预测实施例
如实施例24-27中提供的一种或多种丙烯酸酯被进一步转化成为一种或多种粘合剂、表面涂层、水基涂层、涂料、墨水、皮革涂饰剂、纸张涂层、胶皮涂层、塑化剂或絮凝剂前体。这些向终产品的转化使用了本领域已知的方法。
实施例32:基于丙烯酸的涂料制造的预测实施例
包含至少一种颗粒状水溶共聚物(包括丙烯酸、丙烯酸乙酯、丙烯酸甲酯、丙烯酸-2-乙基己酯、丙烯酸丁酯、丙烯酸月桂酯或如本文其它地方所述由微生物制备的3-HP转化而来的丙烯酸获得的其它共聚物中的一种或多种)的水性分散体通过将这些成分在充分搅拌下混合在一起而获得,以形成共聚物的稳定分散体。所述共聚物具有至少50,000的平均分子量,共聚物颗粒具有介于0.5约3.0微米之间的直径。水性分散体中的其它成分可包括色素、填料(如碳酸钙、硅酸铝)、溶剂(如丙酮、苯、醇类等,尽管这些在特定的无VOC涂料中不存在)、增稠剂以及取决于状态、用途、预期表面等等的额外添加剂。
在这些基于丙烯酸的涂料的变型中,除基于丙烯酸的聚合物之外还加入了共聚物。这样的其它共聚物可包括但不限于,乙酸乙烯酯、氯乙烯、偏二氯乙烯、甲基丙烯酸、衣康酸、马来酸和苯乙烯。
实施例33:3-HP向1,3-丙二醇转化的预测实施例
丙烯酸,诸如实施例22中提供的丙烯酸,被转化成为1,3-丙二醇。3-HP在非载体钌催化剂存在下在液相中氢化以制备1,3-丙二醇。液相包括水和环己烷。氢化在搅拌罐反应器中在约150℃的温度下和约1000psi的压力下连续地进行。通过测量反应器中的3-HP和/或氢浓度而监测氢化反应的进程。
实施例34:3-HP向丙二酸转化的预测实施例。
丙烯酸,诸如实施例22中提供的丙烯酸,通过以包含Rh的载体催化剂进行的3-HP催化氧化而被转化成为丙二酸。所述催化氧化在以滴流床过程运行的固定床反应器中进行。在所述滴流床过程中,包含3-HP起始原料的水相,及它的氧化产物和用于pH调节的手段以及氧气或含氧气体可被以逆流方式引导。为获得足够短的反应时间,转化在约8的pH下进行。所述氧化在约40℃的温度下进行。丙二酸以接近定量产率获得。
实施例35:3HPTGC中遗传元件拷贝增加赋予对3-HP的耐受性。
使用SCALE技术,来自于与3-HP暴露相关的文库克隆适合度的SCALE评估的数据提供了关于多个基因和酶的3-HP耐受性的相关性的证据。从该数据来看以及根据来自3HPTGC的其它部分的适合度数据,可以获得以下主要观点:3HPTGC的任意基因或酶的适当修饰和/或提供核酸序列(所述核酸序列提供此类酶的酶活性,但不一定编码整个酶)可以产生改变的酶活性,该改变的酶活性引起增强的3-HP耐受性。
用于测定由3HPTGC中的基因赋予的3-HP耐受性的方法总结如下。
细菌、质粒和文库构建
野生型大肠杆菌K12(ATCC#29425)用于制备基因组DNA。在37℃以两种平端切割酶AluI和RsaI(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)将纯化的基因组DNA的6个样品消化不同的相应时间-10、20、30、40、50和60分钟,然后在70℃热灭活15分钟。混合限制性消化物,使用琼脂糖凝胶电泳基于大小分离片段化的DNA。从胶上切下0.5、1、2、4和大于8kb大小的相应DNA片段,并根据生产商的说明书使用凝胶提取试剂盒(Quagen)进行纯化。根据生产商的说明书,通过将各个纯化的片段化DNA与pSMART-LCKAN载体(Lucigen,Middleton,WI USA)连接而构建基因组文库。然后将各个连接产物电穿孔导入E.cloni 10G超电感受态细胞(Lucigen)中并接种在LB+卡那霉素上。收获菌落,并根据生产商的说明书,使用Quiagen HiSpeed Plasmid Midi试剂盒提取质粒DNA。将各个文库的纯化的质粒DNA通过电穿孔导入大肠杆菌菌株Mach1-T1(Invitrogen,Carlsbad,CA USA)中。将这些培养物(它们代表各个文库-0.5、1.0、2.0、4.0和>8.0kb的基因组DNA)组合并在37℃下温育至想要的密度,达到大约0.50的OD600。该组合的文库培养混合物用于选择。(参见本文章节,且另参见Lynch,M.,Warencke,TE,Gill,RT,SCALEs:multiscale analysis oflibrary enrichment.Nature Methods,2007.4(87-93);Warnecke,T.E.,Lynch,M.D.,Karimpour-Fard,A.,Sandoval,N.,Gill,R.T.,A genomics approach toimprove the analysis and design of strain selections.Metabolic Engineering,200810(154-156))。含有pSMART-LCKAN空载体的Mach1-T1R用于所有的对照研究。在MOPS基本培养基中建立生长曲线(参见Neidhardt,F.,Culture medium for enterobacteria.J Bacteriol,1974.119:p.736-747.)。抗生素浓度是20ug卡那霉素/mL。
3-HP的制备
3-HP自TCI America(Portland,OR)获得。通过HPLC分析观察到显著的丙烯酸和2-氧二丙酸污染物。然后样品通过二乙醚萃取处理,以除去丙烯酸和一部分2-氧二丙酸污染物。然后用10M NaOH将样品中和至最终pH 7.0。在中性pH下观察到相当多的不溶性物质,浓度超过大约35g/L。将中和的样品在4℃以4000rpm离心30分钟。可溶性3-HP部分与如此离心的不溶性物质分离,并通过HPLC进一步分析以最终定量工作原液的浓度和纯度。工作原液用于本实施例中的选择和MIC评估。
选择
如上所述,从大肠杆菌K12基因组DNA中产生了5个代表性基因组文库,其具有确定的插入序列大小:0.5、1、2、4和8kb,将各个文库转化进入MACH1TM-T1大肠杆菌中,培养,然后混合。将混合物以终浓度20g/L的3-HP(TCI America)等分到两个15mL带螺旋帽的试管中,使用10M NaOH中和至pH 7。监测选择培养物的细胞密度,它们达到最终0.3-0.4的OD600。然后原始选择培养物用于接种另一轮的15mL MOPS基本培养基+卡那霉素+3-HP,作为重复的批式选择策略的一部分。总体上,在60小时的时间内,在8个具有渐减3-HP梯度的连续转移批次中进行选择。更具体而言,对于系列批1和2,3-HP浓度是20g 3-HP/L;对于系列批3和4,3-HP浓度是15g 3-HP/L;对于系列批5和6,3-HP浓度是10g 3-HP/L;对于系列批7和8,3-HP浓度是5g 3-HP/L。对于系列批7和8,随着培养物到达静止期更换培养基以避免营养物限制(另外参见,Warnecke,T.E.,Lynch,M.D.,Karimpour-Fard,A.,Sandoval,N.,Gill,R.T.,Agenomics approach to improve the analysis and design of strain selections.Metabolic Engineering,200810(154-156),通过引用并入本文)。按照需要调整批转移次数以避免营养物限制的选择环境。在各个批的顶点获取样品。监测含有3-HP的重复批培养物,并在60小时的时间内接种以增强在存在3-HP的情况下显示出增加的生长的克隆的浓度。对于各个批,通过将1mL的选择群体涂板于选择平板(LB+卡那霉素)上而获取样品。从各个样品中提取质粒DNA,并根据之前的工作(参见Lynch,M.,Warencke,TE,Gill,RT,SCALEs:multiscale analysis of library enrichment.Nature Methods,2007.4(87-93))和生产商的说明书与Affymetrix大肠杆菌反义GeneChip阵列(Affymetrix,Santa Clara,CA)杂交。
数据分析
如本文以及Lynch,M.,Warencke,TE,Gill,RT,SCALEs:multiscaleanalysis of library enrichment.Nature Methods,2007.4(87-93)中描述的使用适合于SCALE的软件完成数据分析。按照之前的描述(Lynch,M.,Warencke,TE,Gill,RT,SCALEs:multiscale analysis of library enrichment.Nature Methods,2007.4(87-93)),从作为选择群体的一部分的各个区域的富集来计算来自具体基因组元件的适合度贡献。简而言之,按照上文所述将来自于选择中各个批的顶点处获取的样品的质粒DNA与Affymetrix大肠杆菌反义GeneChip阵列杂交,并进一步分析由此获得的数据。对于各阵列,从Affymetrix数据文件中提取对应于单个探针集的信号值,并基于相似的亲和值分配入探针集中(Naef,F.和Magnasco,M.O.,2003,Solving theriddle of the bright mismatches:labeling and effective binding inoligonucelotide arrays.Phys.Rev.E 68,011906)。对于各个探针,根据常规的Affymetriz算法(MAS 5.0)减去背景信号。非特异性噪声确定为:完全匹配的信号与错配的信号的差异针对完全匹配信号的稳健回归的截距。然后,将探针信号映射到基因组位置作为最接近的25个探针信号的tukeybi-weight,并通过应用具有1000bp窗口长度的中值滤波器去除噪声。通过线性内插填充探针之间的空隙。使用基于N-筛的分析分解该连续信号,并在500bp的最小尺度上重建,如Lynch等人(2007)所详述的。进一步通过引物总阻遏物(repressor of primer,ROP)信号对信号进行标准化,ROP信号是在文库载体骨架上并代表对应于添加到芯片上的总质粒浓度的信号。
该分析将微阵列信号分解为相应的文库克隆,并计算特定区域随着时间的相对富集。按照这种方式,基于在存在3-HP的情况下进行的选择中的区域特异性富集模式测定全基因组的适合度(ln(Xi/Xi0))。然后,通过基于它们的EcoCyc分类(ecocyc.org)按照代谢途径将遗传元件及其相应的适合度分离开。该适合度矩阵用于计算在选择群体中发现的途径适合度(W)和富集频率。
通过以下步骤鉴定途径冗余:对途径适合度进行初始等级排序、然后将与多个途径相关的遗传元件特异性地分配给第一等级中鉴定的主要途径,然后从次级途径中移除该基因特异性适合度值。
类似地,按照如下所述给定遗传元件中基因赋予与遗传元件中的相邻基因无关的适合度:任意基因的适合度计算为包含该基因的所有克隆的适合度之和。然后将基因适合度进行初步等级排序,然后将与多个基因相关的遗传元件特异性分配给具有最高等级的遗传元件中鉴定的显性基因,然后从遗传元件中的非显性基因移除该适合度值。
根据传统的信号检测理论(T.Fawcett,“An introduction to ROCanalysis,”Pattern Recog.Let.(2006)27:861-874),通过构建受试者工作特性(“ROC”)进一步分析数据。使用如上所述的相应遗传元件的适合度值以及在存在20g/L 3-HP的情况下所测定的比生长速率,使用标准分析方法,根据4个标准类别—真阳性、假阳性、真阴性、假阴性来归类数据,并选择0.1、1.0、10和20的适合度截止值以尝试优化真阳性和假阳性率的范围。如果报告的适合度大于截止值,并且单独测定的生长速率显著高于阴性对照,则将代表克隆的遗传元件的数据点标记为真阳性。假阳性具有高于截止值的报告适合度,但是生长速率不显著高于阴性对照的生长速率。只有当相应的适合度小于截止值并且产生显著降低的生长速率(即不显著高于阴性对照的生长速率)时,将克隆指定为真阴性;且假阴性是指具有降低的适合度评分但是显示出增加的生长速率(即显著高于阴性对照的生长速率)的克隆。
通过将真阳性率(灵敏度)相对于假阳性率(1-特异性)作图来构建ROC曲线(参见T.E.Warnecke等人,Met.Engineering 10(2008):154-165)。因此,可以有信心地说:鉴定为具有增加的适合度的克隆(及其相应的遗传元件)赋予高于对照的3-HP耐受性。
结果
图9A表单1-7以图形的形式显示了对于大肠杆菌在3HPTGC中鉴定的基因。此外,表3给出了3HPTGC中的一些基因如上所述计算的累积适合度值。
还针对革兰氏阳性细菌枯草杆菌、针对酵母酿酒酵母、针对细菌钩虫贪铜菌开发了3-HP耐受发生复合体。这些复合体分别显示于图9B-D表单1-7。
实施例36:3HPTGC产物的加入,第1部分
根据实施例以及3HPTGC的概念化,有可能通过添加3HPTGC的限制性酶促转化产物(即酶促转化步骤的产物)来增加微生物的3-HP耐受性。该实施例证明了添加一些此类产物以增加大肠杆菌的3-HP耐受性。
细菌、质粒和培养基
野生型大肠杆菌K12(ATCC#29425)用于制备基因组DNA。Mach1-T1R获自Invitrogen(Carlsbad,CA USA)。
3-HP的制备
3-HP获自TCI America(Portland,OR)。通过HPLC分析观察到显著的丙烯酸和2-氧二丙酸污染物。然后通过二乙醚萃取处理样品,以除掉丙烯酸和一部分2-氧二丙酸污染物。然后以10M NaOH将样品中和至最终pH7.0。在中性pH下观察到显著的3-HP聚合,浓度超过大约35g/L。将中和的样品在4℃以4000rpm离心30分钟。可溶性3-HP部分与固体聚合物产物分离,并通过HPLC进一步分析以最终定量工作原液的浓度和纯度。工作原液用于本实施例中的选择、生长速率和MIC评估。
最小抑制浓度
使用商售的3-HP(TCI America,Portland,OR USA,参见本文中3-HP的制备),以96孔板的形式中在微需氧条件下测定最小抑制浓度(MIC)。使菌株的过夜培养物在5ml LB(视需要添加抗生素)中生长。按照1v/v%接种15ml锥形管,以MOPS基本培养基填充至顶部并加盖。当细胞达到指数中期后,将培养物稀释至OD600为0.200。进一步按1∶20稀释细胞,将10ul的等分试样用于接种各个孔(~104个细胞/孔)。将平板排列以测量在渐增的3-HP浓度(0-70g/L,增量5g/L)以及补充了最佳补充物浓度的培养基中不同菌株的生长或生长状况,最佳补充物浓度确定为:2.4mM酪氨酸(Sigma),3.3mM苯丙氨酸(Sigma),1mM色氨酸(Sigma),0.2mM对羟基苯甲酰肼(MP Biomedicals),0.2mM对氨基苯甲酸(MPBiomedicals),0.2mM 2,3-二羟基苯甲酸(MP Biomedicals),0.4mM莽草酸(Sigma),2mM维生素B6(Sigma),35uM高丝氨酸(Acros),45uM高半胱氨酸硫内酯盐酸盐(MP Biomedicals),0.5mM氧代丁酸(Fluka),5mM苏氨酸(Sigma)。在24小时后(24至25小时之间,虽然数据(未显示)表明:当时间延长时,结果没有实质性变化)记录最小的抑制性3-HP浓度(即,没有可见生长的最低浓度)和对应于可见细胞生长(OD~0.1)的最大3-HP浓度。
结果
通过向培养基中添加补充物增强了大肠杆菌Mach1-T1R的3-HP耐受性。以上描述的补充导致下列MIC增加:40%(酪氨酸),33%(苯丙氨酸),33%(色氨酸),33%(对羟基苯甲酰肼),7%(对氨基苯甲酸),33%(2,3-二羟基苯甲酸),0%(维生素B6),33%(高丝氨酸),60%(高半胱氨酸硫内酯盐酸盐),7%(氧代丁酸)和3%(苏氨酸)。
实施例37:3HPTGC产物的添加,第2部分(使用新3-HP源)
基于实施例以及3HPTGC的概念化,有可能通过添加3HPTGC的限制性酶促转化产物(其中至少一些可以替代性地称作“中间体”)来增加微生物的3-HP耐受性。该实施例证明添加腐胺、亚精胺、尸胺和碳酸氢钠增加了大肠杆菌的3-HP耐受性。上下文中使用的“限制性”的概念是指假设的限制,即,如果克服的话,可以显示目标微生物或系统的增强的3-HP耐受性。作为非排它的方式,可以通过实验方式确认此类假设的限制,如通过添加特定的酶促转化产物或其它化合物时显示3-HP耐受性的增加。
细菌、质粒和培养基
野生型大肠杆菌K12(ATCC#29425)被用于基因组DNA的制备。M9基本培养基和EZ丰富培养基描述于常用方法部分的第II小节。
3-HP的制备
3-HP根据常用方法部分的第III节而从β-丙内酯获得。
最小抑制浓度
以96孔板的形式在有氧条件下测定大肠杆菌的3-HP(参见本文3-HP的制备)最小抑制浓度(MIC)。使菌株的过夜培养物在5ml LB(视需要添加抗生素)中在37℃摇动温育箱中生长。按照1v/v%接种10ml M9基本培养基。当细胞达到指数中期后,将培养物稀释至OD600为0.200。进一步按1∶20稀释细胞,将10ul的等分试样用于接种各个孔(~104个细胞/孔)。平板进行排列以在渐增的3-HP浓度(0-100g/L,增量10g/L),在补充了以下物质的M9基本培养基中,测定不同菌株的生长或生长状况:腐胺(0.1g/L,MP Biomedicals,Santa Ana,CA USA),尸胺(0.1g/L,MPBiomedicals)或亚精胺(0.1g/L,Sigma-Aldrich,St.Louis,MO,USA)或碳酸氢钠(20mM,Fisher Scientific,Pittsburgh,PA USA)(括号中的数值表示其在培养基中的终浓度)。在24小时后(24至25小时之间,虽然数据(未显示)表明:当时间段延长时,结果没有实质性变化)记录最小抑制性3-HP浓度(即,没有可见生长时的最低浓度)和对应于可见的细胞生长(OD~0.1)的最大3-HP浓度。MIC终点是没有可见生长时的化合物的最低浓度。
结果
通过向培养基中添加多胺:腐胺、亚精胺和尸胺,增强了大肠杆菌的3-HP耐受性。对于对照和补充培养基中的大肠杆菌K12的最小抑制浓度(MIC)如下:在补充了腐胺的M9基本培养基中是40g/L,在补充了亚精胺的M9基本培养基中是40g/L,在补充了尸胺的M9基本培养基中是30g/L。对于M9基本培养基中添加碳酸氢钠,最小抑制浓度(MIC)是30g/L。对于100g/L原液3-HP中的大肠杆菌K12,最小抑制浓度(MIC)是20g/L。
鉴于使用碳酸氢钠补充获得了相对于对照的MIC的增加,认为其它改变(例如碳酸酐酶的调节和/或遗传修饰(未在图9A 1-7中显示,但是与HCO3-直接相关),例如向目标细胞提供异源核酸序列,其中所述核酸序列编码具有碳酸酐酶活性的多肽)对于增加3-HP耐受性是有价值的(例如与3HPTGC的其它改变结合)。类似地,并如本文提供的其它数据所支持的,认为酶活性的改变(例如导致产生精氨酸、腐胺、尸胺和亚精胺的3HPTGC途径部分中的酶的遗传修饰)对于增加3-HP耐受性是有价值的(例如与3HPTGC的其它改变结合)。
实施例38:用于提高的3-HP耐受性的aroH遗传修饰
基于增加的拷贝数的tyrA-aroF操纵子被鉴定为赋予3-HP耐受性的遗传元件,进一步检验了该酶的活性。通过增加终产物酪氨酸和苯丙氨酸的浓度抑制野生型aroF基因。但是,为了绕过这一内在反馈抑制控制,获得了aroH基因的反馈抗性突变体,并按照下文所述将其导入细胞。
克隆构建
使用设计为包括上游aroFp启动子和rho非依赖性转录终止子的引物,使用PCR扩增大肠杆菌K12基因组DNA的对应于aroF-tyrA的区域。使用CloneSMART试剂盒(Lucigen,Middleton,WI USA),根据生产商的说明书将纯化的、片段化的DNA与pSMART-卡那霉素载体连接。然后将连接产物转化进入化学感受态Mach1-T1R大肠杆菌细胞(Invitrogen,Carlsbad,CA USA),接种于LB+卡那霉素上,并在37℃下温育24小时。为了确认阳性转化体的插入,使用来自Qiagen(Valencia,CA)的Qiaprep SpinMiniPrep试剂盒从克隆分离质粒,并测序(Macrogen,South Korea)。
从Ray等人(Ray,J.M.,C.Yanofsky和R.Baurele,Mutational analysisof the catalytic and feedback sites of the tryptophan-sensitive3-deoxy-D-arabino-heptulosante-7-phosphate synthase of Escherichia coli.JBacteriol,1988.170(12):p.5500-6.)获得含有野生型aroH基因的质粒(CB202)和显示出对色氨酸反馈抑制的抗性的突变形式(CB447)(通过单一的氨基酸改变(G149D))。将这些质粒与含有ptac启动子和rrNBT1转录终止子的pKK223-3骨架质粒构建在一起。使用设计为包括启动子和终止子的引物,根据传统PCR方法扩增aroH插入DNA。将纯化的PCR产物与pBT-1质粒连接并转化进入电感受态的Mach1-T1(Lynch,M.D.和R.T.Gill,A series of broad host range vectors for stable genomic libraryconstruction.Biotechnology and Bioengineering,2006.94(1):p.151-158)。得到的质粒序列显示于SEQ ID NO:001中。通过最小抑制浓度分析测定的最佳诱导水平是0.001mM IPTG。
MIC比较
结果
如MIC倍数增加所测定的,包含aroH突变体的细胞的MIC比对照MIC高1.4倍。这代表40%的改善。因此,该实施例证明,基于关于3HPTGC在3-HP耐受性中的重要意义的认识,在选择的细胞中增加3-HP耐受性的很多可能的遗传修饰方式中的一种。
实施例39:用于提高的3-HP耐受性的通过氰酸酶引入的遗传修饰
从实施例35中描述的选择获得包含来自大肠杆菌K12的cynTS基因的质粒克隆。根据标准方法分离并纯化被称作pSMART-LC-Kan-cynTS的这一质粒。(质粒的测序显示最终序列(SEQ ID NO:002))。通过标准技术将纯化的质粒重转化进入大肠杆菌K12,并按照以上实施例37的描述测定MIC。
通过含有cynTS基因的质粒改善3-HP耐受性。
在M9基本培养基中,对于大肠杆菌K12和大肠杆菌K12+pSMART-LC-Kan-cynTS的3-HP最小抑制浓度(MIC)分别是30g/L和50g/L。因此,在该实施例中(其在大肠杆菌宿主细胞中仅含有3HPTGC的一个遗传修饰)观察到MIC的超过60%的改善,代表3-HP耐受性的增加。因此,本实施例再次证明,基于关于3HPTGC在3-HP耐受性中的重要意义的认识和合理使用该知识,在选择的细胞中增加3-HP耐受性的很多可能的遗传修饰方式中的一种。
实施例40:编码包含草酰乙酸α脱羧酶活性的蛋白质序列的核酸序列的开发(部分预测的)
以前已经鉴定了几种具有广谱底物范围的2-酮酸脱羧酶(Pohl,M.,Sprenger,G.A.,Muller,M.,A new perspective on thiamine catalysis.CurrentOpinion in Biotechnology,15(4),335-342(2004))。其中特别感兴趣的是来自结核分枝杆菌的酶,α-酮戊二酸脱羧酶,该酶已被纯化并表征(Tian,J.,Bryk,R.Itoh,M.,Suematsu,M.和Carl Nathan,C.Variant tricarboxylic acidcycle in Mycobacterium tuberculosis:Identification of alpha-ketoglutaratedecarboxylase.PNAS.July 26,2005vol.102(30):10670-10677;;Stephanopoulos,G.,Challenges in engineering microbes for biofuelsproduction.Science,2007.315(5813):801-804)。该酶所完成的反应图示于图16B中(图16A显示了天然kgd基因编码的酶的主要已知化学反应)。以前已经从大肠杆菌克隆、表达并纯化了天然kgd基因,其无技术难度或对宿主菌株没有毒性效应(Tian,J.,Bryk,R.Itoh,M.,Suematsu,M.和CarlNathan,C.Variant tricarboxylic acid cycle in Mycobacterium tuberculosis:Identification of alpha-ketoglutarate decarboxylase.PNAS.July 26,2005 vol.102(30):10670-10677;Stephanopoulos,G.,Challenges in engineeringmicrobes for biofuels production.Science,2007.315(5813):801-804)。该酶被选择也是因为它不太可能与α-酮戊二酸脱氢酶关联。另外感兴趣的是已经开发用来测定该酶活性的方便的比色方法。如本文中提供的,kgd酶进化以具有可测量的如图16B所示的酶功能:将草酰乙酸脱羧为丙二酸半醛。达到这一点的技术工作在很大程度上依赖于传统选择和筛选具有想要的草酰乙酸α-脱羧酶活性的α-酮戊二酸脱羧酶的突变体。
作为第一步,构建用于选择和筛选的kgd基因的突变体文库。根据商业的DNA基因合成提供商DNA 2.0(Menlo Park,CA USA)的服务,将来自结核分枝杆菌的α-酮戊二酸脱羧酶的蛋白序列针对大肠杆菌进行密码子优化。合成具有8个氨基酸的N-末端标签的核酸序列,以能够进行基于亲和性蛋白纯化。该基因序列引入NcoI限制性位点(其与基因的起始密码子重叠),随后是HindIII限制性位点。此外,将Shine Delgarno序列(即核糖体结合位点)置于前方为EcoRI限制性位点的起始密码子之前。由DNA 2.0合成该基因构建体,并提供于pJ206载体骨架中。
按照下文所述,构建基于环状质粒的克隆载体,其被称为pKK223-kgd,用于在大肠杆菌中表达α-酮戊二酸脱羧酶。根据生产商的说明书,使用来自New England BioLabs(Ipswich,MA USA)的酶EcoRI和HindIII,将含有基因合成的kgd基因的质粒DNA pJ206进行限制性酶消化。按照“常用方法部分”中第II小节的描述,通过琼脂糖凝胶电泳分离消化混合物,并在UV透射下可视化。从凝胶上切下包含对应于kgd基因的DNA片段的琼脂糖凝胶条,并根据生产商的说明书,使用标准凝胶提取方案和来自Qiagen的组分回收DNA。携带pKK223-aroH的大肠杆菌克隆菌株由Boulder的University of Colorado的Ryan T.Gill教授的实验室惠赠。根据标准方法使携带该质粒的该菌株的培养物生长,并根据生产商的说明书,使用来自Qiagen(Valencia,CA USA)的商售微量制备柱制备质粒DNA。根据生产商的说明书,使用获自New England BioLabs(Ipswich,MAUSA)的限制性内切酶EcoRI和HindIII消化质粒DNA。该消化是为了从pKK223骨架中分离aroH阅读框。按照“常用方法部分”中第II小节的描述,通过琼脂糖凝胶电泳分离消化混合物,并在UV透射下可视化。从凝胶上切下包含对应于pKK223质粒骨架的DNA片段的琼脂糖凝胶条并根据生产商的说明书,使用标准凝胶提取方案和来自Qiagen(Valencia,CAUSA)的组分回收DNA。
将对应于kgd基因的纯化DNA的片段与pKK223骨架连接,且连接产物根据生产商的说明书通过电穿孔转化。得到的载体(命名为pKK223-kgd)的序列通过Macrogen(Rockville,MD USA)提供的商业服务通过常规测序确认(SEQ ID NO:004)。pKK223-kgd赋予对β-内酰胺酶的抗性,并包含在可以通过IPTG在大肠杆菌宿主中诱导的ptac启动子控制之下的结核分枝杆菌的kgd基因。
通过标准方法扩增质粒pKK223-kgd并制备纯化的DNA。根据生产商的说明书,将质粒导入XL1-Red化学感受态细胞(Stratagene,LaJolla,CA)中,接种至LB+100μg/mL氨苄青霉素,并在37℃下温育超过24小时。以1/1000原始转化体积稀释的培养物接种于LB+100μg/mL氨苄青霉素上,一式三份。获得了超过1000个菌落,其对应于大约107个突变细胞/转化。通过将板轻轻地刮入TB培养基中收集菌落。立即通过旋涡将培养物重悬,并等分进入1mL的具有15%(v/v)的甘油终浓度的冷冻原液培养物中(Sambrook和Russell,2001)。通过以3000rpm离心15分钟使剩余的培养物沉淀。根据生产商的说明书,使用HiSpeed Plasmid Midi Kit(Qiagen,Valencia,CA)提取质粒DNA。将来自各突变体文库的纯化的质粒DNA通过电穿孔导入大肠杆菌10GF’(Lucigen,Middleton,WI USA)中。将该转化的1/1000体积接种于LB+卡那霉素上,一式三份,以确定转化效率和足够的转化体数目(>10^6)。
本文描述的基于选择的方式允许迅速鉴定具有草酰乙酸α-脱羧酶活性的kgd突变体。可用的大肠杆菌菌株AB354作为用于选择的宿主(Bunch,P.K.,F.Mat-Jan,N.Lee和D.P.Clark.1997.The ldhA gene encoding thefermentative lactate dehydrogenase of Escherichia coli.Microbiology143:187-195)。该营养缺陷型大肠杆菌菌株具有编码天冬氨酸脱羧酶的panD中的突变。该反应的产物β-丙氨酸是合成泛酸(辅酶A的前体)的必要中间体。辅酶A合成的阻断使得该大肠杆菌菌株不能在无补充的基本培养基上生长(Cronoan,J.E.,Little,K.J.,Jackowski,S.;Genetic andBiochemical Analyses of Pantothenate Biosynthesis in Escherichia coli andSalmonella typhimurium.J.of Bacteriology,149(3),916-922(1982);Cronan,J.E.,Beta-Alanine Synthesis in Escherichia coli J.of Bacteriology,141(3),1291-1297(1980))。来自褐家鼠(R.norvegicus)的gabT的表达赋予大肠杆菌β-丙氨酸氨基转移酶活性(Tunnicliff,G.;Ngo,T.T.;Rojo-Ortega,J.M.;Barbeau,A.;The inhibition by substrate analogues of gamma-aminobutyrateaminotransferase from mitochondria of different subcellular fractions of ratbrain Can.J.Biochem.55,479-484(1977))。该酶可以利用丙二酸半醛作为底物以产生β-丙氨酸。除具有草酰乙酸α-脱羧酶活性的突变kgd基因外还表达gabT的大肠杆菌AB354菌株(大肠杆菌AB354+gabT)能够产生代谢物β-丙氨酸,并恢复在基本培养基上生长的能力。该选择的预期结果显示于图18中。
与kgd基因类似,通过商业供应商DNA 2.0(Menlo Park,CA USA)的基因合成,获得了密码子和表达优化的褐家鼠gabT基因。然后将其克隆到表达质粒中。
将kgd基因的突变体文库导入表达gabT基因的大肠杆菌菌株AB354。然后使该群体在基本培养基平板上生长。预期表达想要的草酰乙酸α-脱羧酶活性的单个突变体显示出在这些条件下形成菌落的恢复的能力。分离这些克隆,然后针对草酰乙酸α-脱羧酶活性选择它们所表达的突变体蛋白。
通过对于草酰乙酸α-脱羧酶活性成功构建突变体kgd文库的选择,有必要确认这些突变体具有需要的酶活性。因此,确认了对于草酰乙酸α-脱羧酶活性呈阳性的突变体的α-脱羧酶活性。为此,从目前的标准方法中选取比色筛选方式。该方式阐释于图19中。该方式需要表达并纯化突变体酶及与纯化的酶、其辅因子(焦磷酸硫胺素)和合适的底物反应。根据标准方法进行蛋白质表达和纯化。
实施例41:使用大肠杆菌DF40+pKK223+MCR进行的一升规模的3-HP生物生产
使用按照实施例1产生的大肠杆菌菌株DF40+pKK223+MCR,进行大约1升工作体积的批式培养以测定3-HP的微生物生物产生。
通过标准步骤(Sambrook和Russell,2001)将大肠杆菌DF40+pKK223+MCR从冷冻原液接种至50mL的摇瓶中的LB培养基+200μg/mL氨苄青霉素(在标示的情况下),并在37℃以225rpm摇动生长过夜至静止期。在早晨,将该培养物用于接种(5%v/v)包含M9基本培养基+5%(w/v)葡萄糖+200μg/mL氨苄青霉素+1mM IPTG(在标示的情况下)的1升生物反应器容器中。通过加入10M NaOH或1M HCl(如果需要)将生物反应器容器保持在pH 6.75。通过以5L/分钟的速率持续通入空气并通过持续地将生物反应器容器的搅拌速率调整在100至1000rpm之间,将生物反应器容器的溶解氧含量维持在80%饱和度。这些生物产生评估至少以一式三份进行。为监测这些培养物的生长,在接种时和接种后每2个小时(前12个小时)测定光密度值(在600nm的吸光度,1cm光程),该光密度对应于细胞数目。在生物生产事件的第2天,每3个小时收集样品以测定光密度和其它测量值。对于收集的各个样品,通过离心使细胞沉淀,并收集上清液以分析3-HP的生产,如下文常用方法部分中“3-HP产生的培养物分析”中所描述的。基于HPLC分析计算该1升的生物生产体积中的初步3-HP终滴度为0.7g/L的3-HP。应认识到,很可能同时产生丙二酸半醛或可能的另一种醛,或可能产生丙二酸半醛或其它醛的降解产物,它们不能通过这种HPLC分析与3-HP区分开。
实施例42:耐受加生物生产讨论(预测实施例)
使用本领域技术人员已知的方法,包括下文“常用方法部分”提供的那些方法,以及使用来自本文的其它实施例的关于制备和引入核酸序列以提供增强的3-HP耐受性和提供3-HP生物生产的特定方法,对选择的微生物进行遗传修饰以提供异源核酸序列,其使3-HP耐受性和3-HP产量提高至高于非修饰的微生物中发现的水平。构建质粒或其它载体或DNA序列(用于直接引入),其包含一个或多个编码酶或其它多肽的核酸序列,当该酶或其它多肽组合进入所选的微生物并在其中表达时,通过修饰3HPTGC的一个或多个方面而增强3-HP耐受性。构建上述的或不同的质粒或其它载体或DNA序列(用于直接引入)以包含一个或多个编码酶或其它多肽的核酸序列,当该酶或其它多肽在所选的微生物中表达时,提供(或增加)3-HP的生物产生。
在质粒的情况下,使质粒与所选的微生物在适合于促进转化的条件下接触,并选择和鉴定转化的微生物。在其它载体或DNA序列的情况下,通过本领域技术人员熟知的方法将这些导入所选的微生物中。可以根据本领域技术人员熟知的方法类似地选择转化的重组微生物。
第一种特别得到的重组微生物包含相对于对照非耐受性修饰的微生物而言增强的3-HP耐受性和生物产生能力,其中3-HP耐受性比非耐受性修饰的对照的耐受性高至少20%,且3-HP生物产生比非耐受性修饰的对照的3-HP生物产生高至少20%。通过基于“常用方法部分”中提供的MIC方案的24-小时最小抑制浓度(MIC)评估法测定3-HP耐受性。3-HP生物产生是基于对数期之后持续至少24小时的批式培养物比较,且使用“常用方法部分”中提供的HPLC方法测定最终的3-HP滴度。
实施例43:用于耐受性改善比较的适当度量的证明
在指定的条件(需氧和厌氧)下,在细胞培养物中的宽范围3-HP浓度下,测定了以下物种的生长速率数据。这显示了可用于评定对照和处理微生物之间的差异的方法。这些或其它方法可用于证明本发明的各种实施方式的耐受性差异。
如附图15A-O所示,可以按照多种方式评估和显示数据:“耐受图”(显示在不同3-HP浓度时的生长速率);在评估期内的光密度改变;和评估期内的细胞加倍数。
除了使用MIC评估之外,提供了这些方式表示非限制性方法和方式评测定耐受性的变化,包括微生物和培养系统的耐受性。
以下方法用于产生指明附图中的数据。
大肠杆菌需氧
使野生型大肠杆菌BW25113的过夜培养物一式三份地生长于5mL的标准LB培养基中。100uL的过夜培养物用于一式三份地接种5mL的M9基本培养基+3HP的样品,其中含有47.7mM Na2HPO4,22mM KH2PO4,8.6mM NaCl,18.7mM NH4Cl,2mM MgSO4,0.1mMCaCl2和0.4%葡萄糖,3HP的浓度介于0-50g/L范围内。起始的OD600介于0.02-0.08范围内。将培养物在37℃下温育大约24小时,且每1-2小时记录OD600(前8个小时),在大约24小时记录最终的OD600。通过测定评估期内指数趋势线与OD数据的最佳拟合来计算最大比生长速率(μmax)。在大约24小时的时间内OD600的具体变化(Δ24hrOD600)计算为:t=24hr和t=0时光密度的差异,Δ24hrOD600=(ODt=24)-(ODt=0)。通过解出方程式2N=(ODt=24)/(ODt=0)中的N来计算具体加倍次数(Nd)。
大肠杆菌厌氧
使野生型大肠杆菌BW25113的过夜培养物一式三份地生长于5mL的标准LB培养基中。100uL的过夜培养物用于一式三份地接种5mL的M9基本培养基+3-HP的样品,其中含有47.7mM Na2HPO4,22mM KH2PO4,8.6mM NaCl,18.7mM NH4Cl,2mM MgSO4,0.1mMCaCl2和0.4%葡萄糖,3HP的浓度介于0-50g/L范围内。起始OD600介于0.02-0.08的范围内。培养物用CO2喷射,持续10秒,密封并在37℃下温育大约24小时。每1-2小时记录OD600(前8个小时),在大约24小时记录最终的OD600。对于各个数据点,打开样品、取样、重新通入CO2,然后再次密封。通过测定评估期内指数趋势线与OD数据的最佳拟合来计算最大比生长速率(μmax)。在大约24小时的时间内OD600的具体变化(Δ24hrOD600)计算为:t=24hr和t=0时光密度的差异,Δ24hrOD600=(ODt=24)-(ODt=0)。通过解出方程式2N=(ODt=24)/(ODt=0)中的N来计算具体加倍次数(Nd)。
枯草杆菌需氧
使野生型枯草杆菌的过夜培养物一式三份地生长于5mL的标准LB培养基中。100uL的过夜培养物用于一式三份地接种5mL的M9基本培养基+3HP+谷氨酸补充的样品,其中含有47.7mM Na2HPO4,22mM KH2PO4,8.6mM NaCl,18.7mM NH4Cl,2mM MgSO4,0.1mMCaCl2,0.4%葡萄糖和10mM谷氨酸,3HP的浓度介于0-50g/L范围内。起始OD600介于0.02-0.08范围内。将培养物在37℃温育大约24小时,每1-2小时记录OD600(前8个小时),在大约24小时记录最终的OD600。通过测定评估期内指数趋势线与OD数据的最佳拟合来计算最大比生长速率(μmax)。在大约24小时的时间内OD600的具体变化(Δ24hrOD600)计算为:t=24hr和t=0时光密度的差异,Δ24hrOD600=(ODt=24)-(ODt=0)。通过在方程式2N=(ODt=24)/(ODt=0)中解出N来计算具体加倍次数(Nd)。
酿酒酵母需氧
使酿酒酵母的过夜培养物一式三份地生长于5mL的标准YPD培养基(含有10g/L酵母提取物、20g/L蛋白胨和2%葡萄糖)中。100uL的过夜培养物用于一式三份地接种5mL的SD基本培养基(不含维生素)+3-HP的样品,其中含有37.8mM(NH4)2SO4,8.1uM H3BO3,0.25uM CuSO4,0.6uM KI,1.25uM FeCl3,2.65uM MnSO4,1uM Na2MoO4,2.5uM ZnSO4,6.25mM KH2PO4,0.86mM K2HPO4,4.15mM MgSO4,1.71mM NaCl,0.90mM CaCl2和2%葡萄糖,3HP的浓度介于0-50g/L范围内。起始的OD600介于0.03-0.08范围内。培养物通入CO2,持续10秒,密封并在30℃温育大约24小时。每1-2小时记录OD600(前8-12个小时),在大约24小时记录最终的OD600。通过测定评估期内指数趋势线与OD数据的最佳拟合来计算最大比生长速率(μmax)。在大约24小时的时间内OD600的具体变化(Δ24hrOD600)计算为:t=24hr和t=0时光密度的差异,Δ24hrOD600=(ODt=24)-(ODt=0)。通过在方程式2N=(ODt=24)/(ODt=0)中解出N来计算具体加倍次数(Nd)。
酿酒酵母厌氧
使酿酒酵母的过夜培养物一式三份地生长于5mL的标准YPD培养基(含有10g/L酵母提取物、20g/L蛋白胨和2%葡萄糖)中。100uL的过夜培养物用于一式三份地接种5mL的SD基本培养基(不含维生素)+3HP的样品,其中含有37.8mM(NH4)2SO4,8.1uM H3BO3,0.25uMCuSO4,0.6uM KI,1.25uM FeCl3,2.65uM MnSO4,1uM Na2MoO4,2.5uM ZnSO4,6.25mM KH2PO4,0.86mM K2HPO4,4.15mM MgSO4,1.71mM NaCl,0.90mM CaCl2和2%葡萄糖,3HP的浓度介于0-50g/L范围内。起始的OD600介于0.03-0.08范围内。培养物通入CO2,持续10秒,密封并在30℃温育大约24小时。每1-2小时记录OD600(前8-12个小时),在大约24小时记录最终的OD600。对于各个数据点,打开样品、取样、重新通入CO2,然后再次密封。通过测定评估期内指数趋势线与OD数据的最佳拟合来计算最大比生长速率(μmax)。在大约24小时的时间内OD600的具体变化(Δ24hrOD600)计算为:t=24hr和t=0时光密度的差异,Δ24hrOD600=(ODt=24)-(ODt=0)。通过在方程式2N=(ODt=24)/(ODt=0)中解出N来计算具体加倍次数(Nd)。
实施例44:通过引入鉴定为能够提高微生物的3-HP耐受性的基因的遗传修饰
已经通过SCALES 3-HP耐受性数据鉴定含有一至数个基因的遗传元件为对于3-HP耐受性具有重要意义。为了开发适合于赋予生物体更强的耐受性的这些元件的最佳组合,将多个这些遗传元件克隆进入一系列含有不同的复制起点和选择标记的相容的质粒中。因此,可以将这些相容质粒的组合转化进入细胞系中以便测定对于3-HP耐受性的组合影响。含有不同复制起点和选择标记的亲本质粒载体标识于下表中,其提供了各个此类亲本质粒载体的SEQ ID号(SEQ ID NO:005-012和183-186)。这些质粒用于构建以下描述的质粒,且不含插入序列的这些质粒也用于构建用于耐受性MIC测试的对照细胞系。
表41
载体 | 序列 |
pSMART-HC-Amp | SEQID.005 |
pSMART-LC-Kan | SEQID.006 |
pBT-3 | SEQID.007 |
pKK223-3 | SEQID.008 |
pACYC177(仅kan) | SEQID.009 |
pWH1520 | SEQID.010 |
pHT08 | SEQID.011 |
pJ61:25125 | SEQID.012 |
pYes2.1-topo | SEQID.183 |
pRS423 | SEQID.184 |
pRS425 | SEQID.185 |
pJ251 | SEQID.186 |
方法A:质粒设计和通过基因合成的耐受遗传元件的构建
将含有多个鉴定的遗传元件的单一质粒以以下方式构建:可以容易地构建多种其它质粒(其中一些按照以下描述来构建)。这些操纵子(包括组成型大肠杆菌启动子、核糖体结合位点和这些遗传元件的开放区域框)组合在单一质粒中,其根据商业DNA基因合成提供者DNA 2.0(Menlo Park,CA USA)的基因合成服务来产生。根据DNA2.0的服务,将用于产生蛋白质的各个开放阅读框进行密码子优化。另外,在各个操纵子和基因之间引入限制性位点,以产生能够通过一系列限制性消化和自我连接而表达这些蛋白质的所有组合的质粒。该构建体的其它特征包括在最终操纵子之后的rrnB终止子序列和包含用于将来将这些遗传元件基因组整合到菌株中的AfeI限制性位点的嵌合(mosaic)末端,该AfeI限制性位点侧邻用于获自EPICENTRE(Madison,Wisconsin)的EZ::TNTM转位子系统的各编码区末端。在pJ61载体骨架中提供该构建的质粒。得到的载体(命名为pJ61:25135)的序列提供为SEQ ID NO:012。
通过本文描述的方法,将各个编码催化3HPTGC的酶促转化步骤的酶的核酸序列导入pJ61:25135质粒中。如下表中所示,对pJ61:25135质粒进行不同的修饰以包含在修饰的Ptrc启动子(位于PmII和SfoI限制性位点之间)控制下表达的CynS和CynT的基因优化的序列,在PtpiA启动子(位于SfoI和SmaI限制性位点之间)控制下表达的AroG(SEQ ID NO:013),在修饰的Ptrc启动子(位于SmaI和ZraI限制性位点之间)控制下表达的SpeD、SpeE和SpeF(SEQ ID NO:014),在PtalA启动子(位于ZraI和HpaI限制性位点之间)控制下表达的ThrA(SEQ ID NO:015),在PrpiA启动子(位于HpaI和PmeI限制性位点之间)控制下表达的Asd(SEQ ID NO:016),在Ppgk启动子(位于PmeI和ScaI限制性位点之间)控制下表达的CysM(SEQ ID NO:017),在PtpiA启动子(位于ScaI和NaeI限制性位点之间)控制下表达的IroK,和在PtalA启动子(位于NaeI和EcoICRI限制性位点之间)控制下表达的IlvA(SEQ ID NO:018)。在pJ61:25135质粒内,这些限制性位点各自是独一的。
为了产生一组含有这些单一操纵子中的各个操纵子的质粒,进行一系列限制性消化和自连接。如此,可以通过除去操纵子侧邻的限制性位点之间的DNA序列以及侧邻质粒的整个蛋白编码区的EcoICRI和PmII位点而分离任意操纵子。例如,根据生产商的说明书,通过首先使用获自NewEngland BioLabs(Ipswich,MA USA)的PmII和SfoI消化pJ61:25135质粒,产生包含含有AroG多肽的操纵子的质粒,所述操纵子在PtpiA启动子的控制下表达且位于SfoI和SmaI限制性位点之间。然后,根据生产商的说明书,使用获自New England BioLabs(Ipswich,MA USA)的T4DNA连接酶,使得到的DNA自连接,并转化进入大肠杆菌K12。使来自该大肠杆菌K12转化的单个菌落生长于液体培养基中,并根据生产商的说明书,使用Qiagen微量制备试剂盒(Valencia,CA USA)从单个菌落分离质粒。通过使用AfeI限制性消化来筛选分离的质粒,将正确的质粒进行下一轮限制性消化和自连接。在第二轮中,根据生产商的说明书,分别使用获自NewEngland BioLabs(Ipswich,MA USA)和Promega Corporation(Madison,Wisconsin)的SmaI和EcoICRI将这些质粒进行限制性消化。然后,根据生产商的说明书,使用获自New England BioLabs(Ipswich,MA USA)的T4DNA连接酶使得到的DNA自连接,并转化进入大肠杆菌K12。使来自该大肠杆菌K12转化的的单个菌落生长于液体培养基中,并根据生产商的说明书,使用Qiagen微量制备试剂盒(Valencia,CA USA)从单个菌落分离质粒。通过使用AfeI限制性消化来筛选分离的质粒,并通过测序验证。
按照类似的方式,使用相应的上述列出的限制性位点产生以下质粒:在PtalA启动子(位于NaeI和EcoICRI限制性位点之间)控制下表达的pJ61-IlvA;在Ppgk启动子(位于PmeI和ScaI限制性位点之间)控制下表达的pJ61-CysM;在PrpiA启动子(位于HpaI和PmeI限制性位点之间)控制下表达的pJ61-Asd;在PtalA启动子(位于ZraI和HpaI限制性位点之间)控制下表达的pJ61-ThrA;在Ptrc启动子(位于SmaI和ZraI限制性位点之间)控制下表达的pJ61-SpeDEF;在PtpiA启动子(位于SfoI和SmaI限制性位点之间)控制下表达的pJ61-AroG;和在Ptrc启动子(位于PmlI和SfoI限制性位点之间)控制下表达的pJ61-CynTS。同样的,可以通过类似的限制性消化和自连接方案获得这些操纵子的任意组合。
将这些序列验证的质粒转化进入如用于3-HP耐受性测试的BW25113大肠杆菌细胞。此外,可以使用AfeI限制性消化这些质粒,并可以使用生产商的说明使用获自EPICENTRE(Madison,Wisconsin)的EZ::TNTM转位子系统将含有具嵌合末端的单个操纵子的纯化片段引入细胞系的基因组中。同样,可以将这些操纵子移至多种质粒以提供另外的表达控制或用于在多种菌株或生物体中扩增。。
方法B:从其它实验室接收的包含鉴定的元件的质粒
开发出3HPTGC的图谱之后,文献综述确认关于数个鉴定的基因的前人工作。向作出这些报告的实验室发出关于含有在3HPTGC中鉴定的元件的野生型或突变基因的质粒的请求。由此获得的基因及其编码的蛋白通过序列编号识别。
含有野生型aroH基因和aroH突变体的质粒由University of Virginia的Bauerle实验室惠赠。这些突变体的描述见于Ray JM,Yanofsky C,Bauerle R.,J Bacteriol.1988 Dec;170(12):5500-6.Mutational analysis of thecatalytic and feedback sites of the tryptophan-sensitive3-deoxy-D-arabino-heptulosonate-7-phosphate synthase of Escherichia coli。与含有野生型基因的pKK223质粒一起,提供了另外3个pKK223质粒,它们包含编码149位的甘氨酸至半胱氨酸突变、149位的甘氨酸至天冬氨酸突变和18位的脯氨酸至亮氨酸突变的突变基因。
含有突变metE基因的质粒由University of Michigan的Matthews实验室惠赠。该突变体的描述见于Hondorp ER,Matthews RG.J Bacteriol.2009 May;191(10):3407-10.Epub 2009 Mar 13.Oxidation of cysteine 645 ofcobalamin-independent methionine synthase causes a methionine limitation inEscherichia coli。该pKK233质粒携带编码645位的半胱氨酸至丙氨酸突变的metE基因。
这些基因编码蛋白的序列提供为SEQ ID NO:022至026。
方法C:耐受质粒在pSMART-LC-Kan载体中的构建
在获自Lucigen Corporation(Middleton WI,USA)的pSMART-LC-kan载体(SEQ ID NO:027)中构建数种遗传元件(评定它们对3-HP耐受性的影响)。该载体提供低拷贝复制起点和卡那霉素选择。所有这些质粒以相似的方法产生,导入的遗传元件及其编码的蛋白以序列编号显示于其中方法C节的表42中。在表42中每一行(在“方法C”下面)含有克隆的质粒中包含的蛋白的相应序列信息、用于任何聚合酶链式反应的引物和用于产生新质粒的聚合酶链式反应产物的序列。
在各种情况中,使用相同的程序来产生最终的质粒。使用生产商的说明,使用来自Invitrogen Corporation(Carlsbad,CA USA)的pfx DNA聚合酶和作为模板的大肠杆菌K12基因组DNA,使用所列的引物扩增正确的插入序列。使用生产商的说明,使用获自New England Biolabs(Ipswich,MAUSA)的T4多核苷酸激酶将扩增的DNA产物的5’末端磷酸化。通过琼脂糖凝胶电泳分离该反应得到的产物,通过将其从凝胶上切下分离具有预期大小的带,并使用Qiagen Corporation(Valencia,CA USA)提供的凝胶提取试剂盒从凝胶中提取DNA。然后,使用生产商的说明,将提取的磷酸化的DNA平端连接到pSMART-LC-Kan载体中并转化进入10G大肠杆菌细胞。使转化的细胞在丰富培养基中恢复,然后接种至LB琼脂平板上,其中含有卡那霉素用于适当选择。长出菌落之后,使单一的菌落生长于LB培养基中,并使用获自Qiagen Corporation(Valencia,CA USA)的微量制备试剂盒提取质粒DNA。通过限制性消化检查分离的质粒DNA,且在用于其它实验之前通过测序进行验证。
方法D:耐受性质粒在pSMART-HC-Amp载体中的构建
在获自Lucigen Corporation(Middleton WI,USA)的pSMART-HC-AMP载体中构建数种遗传元件(评定它们对3-HP耐受性的影响)。该载体提供高拷贝复制起点和氨苄青霉素选择。所有这些质粒以相似的方法产生,并如表42中的方法D所标识。在表42中各行含有克隆的质粒中包含的蛋白质序列信息、用于任何聚合酶链式反应的引物和用于产生新质粒的聚合酶链式反应产物的序列。
在各种情况中,使用相同的程序来产生最终的质粒。使用生产商的说明,使用来自EMD Chemical Corporation(Gibbstown,NJ USA)的KOD DNA聚合酶和作为模板的各相应的基因或遗传元件的pKK223质粒(通过表42的方法B产生),使用所列的引物扩增正确的插入序列。使用生产商的说明,使用获自New England Biolabs(Ipswich,MA USA)的T4多核苷酸激酶将扩增的DNA产物的5’末端磷酸化。通过琼脂糖凝胶电泳分离该反应得到的产物,通过将其从凝胶上切下分离具有预期大小的带,并使用Qiagen Corporation(Valencia,CA USA)提供的凝胶提取试剂盒从凝胶中提取DNA。然后,使用生产商的说明,将提取的磷酸化的DNA平端连接进入pSMART-HC-AMP载体并转化进入10G大肠杆菌细胞。使转化的细胞在丰富培养基中恢复,然后接种至LB琼脂平板上,其中含有氨苄青霉素用于适当选择。长出菌落之后,使单一的菌落生长于LB培养基中,并使用获自Qiagen Corporation(Valencia,CA USA)的微量制备试剂盒提取质粒DNA。通过限制性消化检查分离的质粒DNA,并在用于其它实验之前通过测序进行验证。
方法E:在pSMART-HC-Amp载体中的另外的耐受性质粒构建
在获自Lucigen Corporation(Middleton WI,USA)的pSMART-HC-AMP载体中构建数种遗传元件(评定它们对3-HP耐受性的影响)。该载体提供高拷贝复制起点和氨苄青霉素选择。所有这些质粒以相似的方法产生,并如表42中的方法E所标识的。在表42中各行含有克隆的质粒中包含的蛋白质序列信息、用于任何聚合酶链式反应的引物和用于产生新质粒的聚合酶链式反应产物的序列。
在各种情况中,使用相同的程序来产生最终的质粒。使用生产商的说明,使用来自EMD Chemical Corporation(Gibbstown,NJ USA)的KOD DNA聚合酶和作为模板的大肠杆菌K12基因组DNA,使用所列的引物扩增正确的插入序列。由于引物的5’末端已经是磷酸化的,所以无需对扩增产物进行其它处理。通过琼脂糖凝胶电泳分离该反应得到的产物,通过将其从凝胶上切下分离具有预期大小的带,并使用Qiagen Corporation(Valencia,CA USA)提供的凝胶提取试剂盒从凝胶中提取DNA。然后,使用生产商的说明,将提取的磷酸化的DNA平端连接进入pSMART-HC-Amp载体并转化进入10G大肠杆菌细胞。使转化的细胞在丰富培养基中恢复,然后接种至LB琼脂平板上,其中含有氨苄青霉素以用于适当选择。长出菌落之后,使单一的菌落生长于LB培养基中,并使用获自Qiagen Corporation(Valencia,CA USA)的微量制备试剂盒提取质粒DNA。通过限制性消化检查分离的质粒DNA,并在用于其它实验之前通过测序进行验证。
方法F:在pACYC177(仅kan)载体中的耐受性质粒构建
在pACYC177(仅Kan)载体中构建数种遗传元件(评定它们对3-HP耐受性的影响)。通过使用引物CPM0075(5’-CGCGGTATCATTGCAGCAC-3’)(SEQ ID NO:123)和引物CPM0018(5’-GCATCGGCTCTTCCGCGTCAAGTCAGCGTAA-3’)(SEQ ID NO:124),使用来自EMD Chemical Corporation(Gibbstown,NJ USA)的KOD聚合酶扩增pACYC177质粒的一部分,从而产生该骨架。通过琼脂糖凝胶电泳分离该反应得到的产物,通过将其从凝胶上切下分离具有预期大小的带,并使用Qiagen Corporation(Valenci a,CA USA)提供的凝胶提取试剂盒从凝胶中提取DNA。该DNA命名为pACYC177(仅Kan),并保留用于连接至本文中产生的产物。该pACYC177(仅Kan)骨架DNA提供低拷贝复制起点和卡那霉素选择。所有这些质粒以相似的方法产生,并如表42中的方法F标识的。在表42中各行含有克隆的质粒中包含的蛋白质序列信息、用于任何聚合酶链式反应的引物和用于产生新质粒的聚合酶链式反应产物的序列。
在各种情况中,使用相同的程序来产生最终的质粒。使用生产商的说明,使用来自EMD Chemical Corporation(Gibbstown,NJ USA)的KOD DNA聚合酶和作为模板的针对各相应的基因(或遗传元件)的pKK223质粒(通过表42的方法B产生)或大肠杆菌基因组DNA,使用所列的引物扩增正确的插入序列。使用生产商的说明,使用获自England Biolabs(Ipswich,MAUSA)的T4多核苷酸激酶将扩增的DNA产物的5’末端磷酸化。通过琼脂糖凝胶电泳分离该反应得到的产物,通过将其从凝胶上切下分离具有预期大小的带,并使用Qiagen Corporation(Valencia,CA USA)提供的凝胶提取试剂盒从凝胶中提取DNA。然后,使用生产商的说明,将提取的磷酸化的DNA平端连接进入本文描述的pACYC177(仅Kan)骨架DNA中并转化进入10G大肠杆菌细胞。使转化的细胞在丰富培养基中恢复,然后接种至LB琼脂平板上,其中含有卡那霉素用于适当选择。长出菌落之后,使单一的菌落生长于LB培养基中,并使用获自Qiagen Corporation(Valencia,CA USA)的微量制备试剂盒提取质粒DNA。通过限制性消化检查分离的质粒DNA,并在用于其它实验之前通过测序进行验证。
方法G:在pBT-3载体中的耐受性质粒构建
在pBT-3载体中构建数种遗传元件(评定它们对3-HP耐受性的影响)。通过使用引物PBT-FOR(5’-AACGAATTCAAGCTTGATATC-3’)(SEQID NO:125)和引物PBT-REV(5’-GAATTCGTTGACGAATTCTCTAG-3’)(SEQ ID NO:126),使用来自EMD Chemical Corporation(Gibbstown,NJUSA)的KOD聚合酶扩增pBT-3质粒的一部分,从而产生该骨架。通过琼脂糖凝胶电泳分离该反应得到的产物,通过将其从凝胶上切下分离具有预期大小的带,并使用Qiagen Corporation(Valencia,CA USA)提供的凝胶提取试剂盒从凝胶中提取DNA。该DNA命名为pBT-3骨架,并保留用于连接至本文产生的产物。该pBT-3骨架DNA提供低拷贝复制起点和氯霉素选择。所有这些质粒以相似的方法产生,并如表42中的方法G所标识。在表42中各行含有克隆的质粒中包含的蛋白质序列信息、用于任何聚合酶链式反应的引物和用于产生新质粒的聚合酶链式反应产物的序列。
在各种情况下,使用相同的程序来产生最终的质粒。使用生产商的说明,使用来自EMD Chemical Corporation(Gibbstown,NJ USA)的KOD DNA聚合酶和作为模板的针对各相应的基因(或遗传元件)的pKK223质粒(通过表42的方法B产生)或大肠杆菌基因组DNA,使用所列的引物扩增正确的插入序列。使用生产商的说明,使用获自New England Biolabs(Ipswich,MA USA)的T4多核苷酸激酶将扩增的DNA产物的5’末端磷酸化。通过琼脂糖凝胶电泳分离该反应得到的产物,通过将其从凝胶上切下分离具有预期大小的带,并使用Qiagen Corporation(Valencia,CA USA)提供的凝胶提取试剂盒从凝胶中提取DNA。然后,使用生产商的说明,将提取的磷酸化的DNA平端地连接进入本文描述的pBT-3骨架DNA中并转化进入10G大肠杆菌细胞。使转化的细胞在丰富培养基中恢复,然后接种至LB琼脂平板上,其中含有氯霉素以用于适当选择。长出菌落之后,使单一的菌落生长于LB培养基中,并使用获自Qiagen Corporation(Valencia,CAUSA)的微量制备试剂盒提取质粒DNA。通过限制性消化检查分离的质粒DNA,并在用于其它实验之前通过测序进行验证。
实施例45:与3-HP耐受性相关的新型肽的评估
一种名为IroK的新型21个氨基酸的肽被发现提高3-HP耐受性。
方法:IroK表达研究
包括整个IroK多肽区域以及EcoRI和HindIII限制性位点侧邻的RBS的引物被获得以用于表达研究(Operon,Huntsville,AL):
(5′-AATTCGTGGAAGAAAGGGGAGATGAAGCCGGCATTACGCGATTTCATCGCCATTGTGCAGGAACGTTTGGCAAGCGTAACGGCATAA-3′(SEQ ID NO:127),
5′-AGCTTTATGCCGTTACGCTTGCCAAACGTTCCTGCACAATGGCGATGAAATCGCGTAATGCCGGCTTCATCTCCCCTTTCTTCCACG-3’)(SEQID NO:128)
包含IroK肽区域和RBS并具有突变起始位点(ATG变成TTG)的引物被用于翻译分析:
(5′-AATTCGTGGAAGAAAGGGGAGTTGAAGCCGGCATTACGCGATTTCATCGCCATTGTGCAGGAACGTTTGGCAAGCGTAACGGCATAA-3′(SEQ ID NO:187),
5′-AGCTTTATGCCGTTACGCTTGCCAAACGTTCCTGCACAATGGCGATGAAATCGCGTAATGCCGGCTTCAACTCCCCTTTCTTCCACG-3’)(SEQID NO:188)
将两个寡核苷酸按1∶1的比例添加,并根据标准方法在热循环仪中退火。使用T4连接酶(Invitrogen,Carlsbad,CA.)将退火的引物产物与pKK223-3表达载体(SEQ ID NO:008,Pharmacia,Piscataway,NJ.)连接,并在25℃温育过夜。然后将连接产物电穿孔进入感受态MACH1TM-T1R中,并接种于LB+氨苄青霉素上,并在37℃温育24小时。分离质粒并通过纯化和随后的限制性消化和测序(Macrogen,Rockville,MD)进行验证。然后测定对应于1mM IPTG诱导的MIC。
最小抑制浓度(MIC)
在微需氧条件下以96孔板的形式测定最小抑制浓度(MIC)。使菌株的过夜培养物在5ml LB(如需要添加抗生素)中生长。将1%(v/v)接种物引入15ml的MOPS基本培养基中。当细胞达到指数中期后,将培养物稀释至OD600为0.200。进一步按1∶20稀释细胞,将10μl的等分试样用于接种96孔板的各孔(~104个细胞/孔)。平板进行排列以在渐增的3-HP浓度(0-70g/L,增量5g/L)中测定不同菌株的生长或生长状况。在24小时后记录最小抑制性3-HP浓度和对应于可见细胞生长(OD~0.1)的最大3-HP浓度。
结果
为了研究IroK,由21个氨基酸组成的肽(MKPALRDFIAIVQERLASVTA,SEQ ID NO:129),的效应,将编码它的序列与天然预测的RBS一起引入可诱导表达载体(pKK223-3)中。图20显示了短的87bp的序列的增加的表达,其足以增强3-HP耐受性(MIC>2倍的增加)。另外,耐受性机制表现为对于3-HP生长抑制是特异性的,因为对于数种具有类似分子组成的其它有机酸(包括乳酸、丙烯酸和乙酸)而言,MIC保持不变。在试图剖析赋予的耐受性模式的尝试中,将几乎一样的序列引入在翻译起始位点具有单一突变(ATG至TTG)的相同载体中,从而得到等同于野生型大肠杆菌MIC的降低的MIC(图20)。这个结果暗示耐受性机制对于翻译的多肽的表达是特异性的,而不是反映在DNA或RNA水平上。
可以向微生物提供编码IroK肽的核酸序列或其合适的变异体,所述微生物可以包含3HPTGC的一个或多个遗传修饰以进一步增强3-HP耐受性,且还可以具有3-HP产生能力。
实施例46:用于在大肠杆菌FD40中3-HP产生的丙二酰-CoA还原酶的遗传修饰/引入
根据商业DNA基因合成提供者DNA 2.0(Menlo Park,CA USA)的服务,将来自橙色绿屈挠菌的丙二酰-CoA还原酶基因的核苷酸序列针对大肠杆菌进行密码子优化。该基因序列在起始密码子之前引入EcoRI限制性位点,其后是HindIII限制性位点。此外,将Shine Delgarno序列(即核糖体结合位点)置于前置EcoRI限制性位点的起始密码子之前。由DNA 2.0合成该基因构建体,并提供于pJ206载体骨架中。根据生产商的说明书,使用获自New England BioLabs(Ipswich,MA USA)的酶EcoRI和HindIII将含有合成的mcr基因的质粒DNA pJ206进行限制性酶消化。按照“常用方法部分”中第II小节的描述,通过琼脂糖凝胶电泳分离消化混合物,并在UV透射下可视化。从凝胶上切下包含对应于mcr基因的DNA片段的琼脂糖凝胶条并根据生产商的说明书,使用标准凝胶提取步骤和来自Qiagen(Valencia,CA USA)的组分回收DNA。携带pKK223-aroH的大肠杆菌克隆菌株由Boulder的University of Colorado的Ryan T.Gill教授的实验室惠赠。根据标准方法使携带质粒的该菌株的培养物生长,并根据生产商的说明书使用来自Qiagen(Valencia,CA USA)的商售微量制备柱制备质粒DNA。根据生产商的说明书,使用获自New England BioLabs(Ipswich,MAUSA)的限制性内切酶EcoRI和HindIII消化质粒DNA。该消化是为了从pKK223骨架中分离aroH阅读框。按照“常用方法部分”中第II小节的描述,通过琼脂糖凝胶电泳分离消化混合物,并在UV透射下可视化。从凝胶上切下包含对应于pKK223质粒骨架的DNA片段的琼脂糖凝胶条并根据生产商的说明书使用标准凝胶提取步骤和来自Qiagen的组分回收DNA。
将对应于mcr基因和pKK223载体骨架的纯化的DNA片段连接,且连接产物根据生产商的说明书转化和电穿孔。得到的载体(命名为pKK223-mcr)的序列(SEQ ID NO:189)通过Macrogen(USA)提供的商业服务进行常规测序确认。pKK223-mcr赋予对β-内酰胺酶的抗性,并包含mcr基因,该基因在可以通过IPTG在大肠杆菌宿主中诱导的Ptac启动子的控制之下。
通过标准方法(Sambrook和Russell,2001),将表达克隆pKK223-mcr和pKK223对照转化进入大肠杆菌K12和大肠杆菌DF40中。
实施例47:大肠杆菌基因缺失菌株的构建
下列菌株获自Keio收藏:JW1650(ΔpurR)、JW2807(ΔlysR)、JW1316(ΔtyrR)、JW4356(ΔtrpR)、JW3909(ΔmetJ)、JW0403(ΔnrdR)。Keio收藏获自Open Biosystems(Huntsville,AL USA 35806)。单个克隆可以从Yale Genetic Stock Center(New Haven,CT USA 06520)购买。这些菌株各在缺失基因的位置包含卡那霉素标志物。关于涉及Keio收藏和卡那霉素盒消除的更多信息,请参见:Baba,T等人(2006).Construction ofEscherichia coli K12 in-frame,single-gene knockout mutants:the Keiocollection.Molecular Systems Biology doi:10.1038/msb4100050及DatsenkoKA和BL Wanner(2000).One-step inactivation of chromosomal genes inEscherichia coli K-12 using PCR products.PNAS 97,6640-6645。通过标准方法使这些菌株成为电感受态的。然后通过标准电穿孔方法以质粒pCP20转化各个菌株,该质粒由Ryan Gill博士(University of Colorado,Boulder,COUSA)惠赠。将转化物接种于含有20μg/mL氯霉素和100μg/mL氨苄青霉素的LB琼脂板上,并在30摄氏度温育36小时。从这些转化中分离克隆,并在10mL不含任何抗生素的M9培养基中生长过夜。通过在不含任何抗生素的LB琼脂平板上划线,从这些培养物中分离菌落。通过在含有抗生素卡那霉素(20μg/mL)、氯霉素(20μg/mL)和氨苄青霉素(100μg/mL)的LB琼脂板上确认不生长而确认菌落已丧失卡那霉素标志物以及质粒pCP20。通过集落PCR确认分离的克隆已丧失卡那霉素盒。使用获自Lucigen,(Catalog#30033)(Middleton,WI USA)的EconoTaq PLUS GREEN 2X PCR主混合物进行PCR。使用96孔梯度ROBOcycler(Stratagene,La Jolla,CAUSA 92037)进行PCR,其具有以下循环:1)95摄氏度,10分钟;2)30个下列循环:a)95摄氏度,1分钟,b)52摄氏度,1分钟,b)72摄氏度,2分钟;然后是3)一个循环:72摄氏度,10分钟。在下表中提供了用于确认各克隆的卡那霉素盒移除的PCR的引物。引物购自Integrated DNATechnologies(Coralville,IA USA)。得到的消除后菌株,称作BX_00341.0、BX_00342.0、BX_00345.0、BX_00346.0、BX_00348.0和BX_00349.0,分别对应于JW1316(ΔtyrR)、JW4356(ΔtrpR)、JW3909(ΔmetJ)、JW1650(ΔpurR)、JW2807(ΔlysR)和JW0403(ΔnrdR)。
表43
Keio克隆编号 | 基因缺失 | 正向引物 | 反向引物 |
JW1650 | purR | SEQ ID:130 | SEQ ID:131 |
JW2807 | lysR | SEQ ID:132 | SEQ ID:133 |
JW1316 | tyrR | SEQ ID:134 | SEQ ID:135 |
JW4356 | trpR | SEQ ID:136 | SEQ ID:137 |
JW3909 | metJ | SEQ ID:138 | SEQ ID:139 |
JW0403 | nrdR | SEQ ID:140 | SEQ ID:141 |
实施例48:大肠杆菌菌株构建
根据在表44和45中所示的相应组合,质粒被引入相应的基础菌株中。全部质粒使用标准方法通过电穿孔同时引入。被转化的细胞生长于具有抗生素补充的适当培养基中并且根据其在选择培养基上的适当生长而对菌落进行选择。
实施例49:3HPTGC相关补充物对于野生型大肠杆菌的评估
使用“常用方法部分”描述的方法,通过MIC评估来测定补充对3-HP耐受性的影响。测试的补充物列举于表46中。表47中提供了有需条件下的MIC评估的结果,和表48提供了厌氧条件下的MIC评估的结果。该数据(包括单一和多补充物添加)表明了基于24-小时的MIC评估在这些培养系统中的3-HP耐受性的改善。
表46:补充物
实施例50:3HPTGC相关遗传修饰的大肠杆菌的评估
实施例50提供了24小时期间内使用基于生长速度的耐受图的3HPTGC的一种遗传修饰与对照之间的直接比较。
使用“常用方法部分”中描述的方法,通过MIC评估来测定遗传修饰对3-HP耐受性的影响。在大肠杆菌中测试的遗传修饰及其MIC结果列举于表44(有氧条件)和表45(无氧条件)中。该数据(包括单一和多遗传修饰)表明基于24-小时的MIC评估,这些培养系统中3-HP耐受性的改善。
实施例51:与CynTS遗传修饰的耐受图比较
进行24小时的耐受图评估,以比较对照(野生型)大肠杆菌(菌株BW25113)和含有遗传修饰以导入cynTS的遗传修饰大肠杆菌(菌株BW25113)。
结果显示于附图中,其显示了也在指定的附加条件下测试的对照菌株。
基于曲线下面积,cynTS处理证明相对于对照在各个升高的3-HP浓度下显示出更高的3-HP耐受性。
实施例52:枯草杆菌中耐受性片段的遗传修饰/引入
为了在枯草杆菌中产生3-HP产生耐受性片段,将来自大肠杆菌耐受发生复合体的数种基因克隆到获自Boca Scientific(Boca Raton,FL USA)的芽孢杆菌穿梭质粒pWH1520(SEQ ID NO:010)中。该穿梭质粒携带诱导型Pxyl木糖-可诱导的启动子,以及用于在大肠杆菌中扩增的氨苄青霉素抗性盒和用于在枯草杆菌中扩增的四环素抗性盒。这些基因的克隆策略显示于表49中。
表49:枯草杆菌耐受性质粒构建
方法A
按照相似的方式产生用于在枯草杆菌中测试的克隆的耐受性基因(称作克隆方法A,见表49中)。这里描述的克隆方法将基因置于木糖-可诱导启动子之下。使用它们相应的引物A和引物B(列举于表的各行中),通过聚合酶链式反应扩增各个基因。各个组的引物A具有与基因的起始的同源性和SpeI限制性位点。引物B具有与基因终止密码子下游的区域的同源性和BamHI限制性位点。根据生产商的说明书,使用获自QiagenCorporation(Valencia,CA USA)的PCR纯化试剂盒纯化聚合酶链式反应的产物。接下来,根据生产商的说明书,使用获自New England BioLabs(Ipswich,MA USA)的SpeI和BamHI消化纯化的产物。按照“常用方法部分”中第II小节的描述,通过琼脂糖凝胶电泳分离消化混合物,并在UV透射下可视化。从凝胶上切下含有对应于消化的和纯化的耐受性基因的DNA片段的琼脂糖凝胶条并根据生产商的说明书,使用来自Qiagen(Valencia,CA USA)的标准凝胶提取方案和组分回收DNA。
根据生产商的说明书,使用来自Qiagen(Valencia,CA USA)的标准微量制备DNA纯化试剂盒分离该pWH1520穿梭载体DNA。根据生产商的说明书,使用获自New England BioLabs(Ipswich,MA USA)的SpeI和SphI限制性消化得到的DNA。按照“常用方法部分”中第II小节的描述,通过琼脂糖凝胶电泳分离消化混合物,并在UV透射下可视化。从凝胶上切下包含对应于消化的pWH1520骨架产物的DNA片段的琼脂糖凝胶条并根据生产商的说明书,使用来自Qiagen(Valencia,CA USA)的标准凝胶提取方案和组分回收DNA。
根据生产商的说明书,使用获自New England BioLabs(Ipswich,MAUSA)的T4连接酶将消化的和纯化的耐受性基因与pWH1520 DNA产物连接。然后,根据生产商的说明书,将连接混合物转化到获自LucigenCorporation(Middleton WI,USA)的化学感受态10G大肠杆菌细胞中,并接种补充了氨苄青霉素以进行选择的LB平板。将得到的数个菌落进行培养,并根据生产商的说明书,使用来自Qiagen(Valencia,CA USA)的标准的微量制备DNA纯化试剂盒分离其DNA。通过限制性消化、之后通过琼脂糖凝胶电泳检验回收的DNA。进一步通过DNA测序验证显示出正确的条带图的DNA样品。
实施例53:在枯草杆菌中用于3-HP产生的丙二酰-CoA还原酶的遗传修饰/引入
为了在枯草杆菌中建立3-HP产生途径,将来自橙色绿屈挠菌的丙二酰-CoA还原酶基因的密码子优化的核苷酸序列(由商业DNA基因合成提供者DNA 2.0(Menlo Park,CA USA)的基因合成服务构建)加入到枯草杆菌穿梭载体中。该穿梭载体pHT08(SEQ ID NO:011)获自Boca Scientific(Boca Raton,FL USA)并携带诱导型Pgrac IPTG-可诱导启动子。
使用引物1(5’GGAAGGATCCATGTCCGGTACGGGTCG-3’)(SEQID NO:148)(其含有与mcr基因起始处的同源性以及BamHI限制性位点)和引物2(5’-Phos-GGGATTAGACGGTAATCGCACGACCG-3’)(SEQ IDNO:149)(其含有mcr基因的终止密码子以及磷酸化的5’末端以进行平端连接克隆),通过聚合酶链式反应制备用于插入pHT08穿梭载体中的该mcr基因序列。根据生产商的说明书,使用获自Qiagen Corporation(Valencia,CA USA)的PCR纯化试剂盒纯化聚合酶链式反应的产物。接下来,根据生产商的说明书,使用获自New England BioLabs(Ipswich,MA USA)的BamHI消化纯化的产物。按照“常用方法部分”中第II小节的描述,通过琼脂糖凝胶电泳分离消化混合物,并在UV透射下可视化。从凝胶上切下含有对应于mcr基因的DNA片段的琼脂糖凝胶条并根据生产商的说明书,使用来自Qiagen(Valencia,CA USA)的标准凝胶提取方案和组分回收DNA。
根据生产商的说明书,使用来自Qiagen(Valencia,CA USA)的标准微量制备DNA纯化试剂盒分离该pHT08穿梭载体DNA。根据生产商的说明书,使用获自New England BioLabs(Ipswich,MA USA)的BamHI和SmaI限制性消化得到的DNA。按照“常用方法部分”中第II小节的描述,通过琼脂糖凝胶电泳分离消化混合物,并在UV透射下可视化。从凝胶上切下包含对应于消化的pHT08骨架产物的DNA片段的琼脂糖凝胶条并根据生产商的说明书,使用标准凝胶提取步骤和来自Qiagen(Valencia,CA USA)的组分回收DNA。
根据生产商的说明书,使用获自New England BioLabs(Ipswich,MAUSA)的T4连接酶将消化的和纯化的mcr和pHT08产物连接。然后,根据生产商的说明书,将连接混合物转化进入获自Lucigen Corporation(Middleton WI,USA)的化学感受态10G大肠杆菌细胞,并接种补充用于选择的氨苄青霉素的LB平板。将得到的数个菌落进行培养,并根据生产商的说明书,使用来自Qiagen(Valencia,CA USA)的标准微量制备DNA纯化试剂盒分离其DNA。通过限制性消化、接着琼脂糖凝胶电泳检验回收的DNA。进一步通过DNA测序验证显示出正确的条带图谱的DNA样品。经过序列验证的DNA被命名为pHT08-mcr,且然后通过获自BocaScientific(Boca Raton,FL USA)的指导,将其转化进入化学感受态的枯草杆菌细胞。在增加了氯霉素的LB平板上选择携带pHT08-mcr质粒的枯草杆菌细胞。
使携带pHT08-mcr的枯草杆菌细胞在补充20ug/mL氯霉素的5mL LB培养基上生长过夜,以225rpm摇动并在37摄氏度下温育。这些培养物用于接种(1%v/v)75mL M9基本培养基(其中补充了1.47g/L谷氨酸,0.021g/L色氨酸,20ug/mL氯霉素和1mM IPTG)。然后使这些培养物在250mL的erylenmeyer摇瓶中以25rpm生长18小时,在37摄氏度下温育。18小时后,使细胞沉淀,通过GC_MS检测上清液的3-HP(如“常用方法部分”IIIb所描述)。使用定性离子(qualifier ion)检测痕量的3-HP。
实施例54:枯草杆菌菌株构建
将pWH1520中的耐受性遗传元件的质粒和生产质粒pHT08-mcr转化到两个枯草杆菌菌株中。枯草杆菌枯草亚种168菌株由Boulder的University of Colorado的Ryan T.Gill教授惠赠。使用由Anagnostopoulos和Spizizen(Requirements for transformation in Bacillus subtilis.J.Bacteriol.81:741-746(1961))开发的改良方案进行转化,如Boca Scientific(BocaRaton,FL USA)为pHT08穿梭载体所提供的指引。
实施例55:野生型枯草杆菌上的3HPTGC相关补充物的评估
使用“常用方法部分”描述的方法,通过MIC评估来测定补充对3-HP耐受性的影响。测试的补充物列举于补充物表中。表50提供了厌氧条件下MIC评估的结果。
实施例56:3HPTGC相关遗传修饰的枯草杆菌在不存在和存在3HPTGC相关补充物的情况下的评估
使用“常用方法部分”描述的方法,通过MIC评估来测定补充和/或遗传修饰对枯草杆菌中3-HP耐受性的影响。测试的补充物列举于补充物表中。在需氧条件下,枯草杆菌的所测试遗传修饰和MIC结果显示于表50中。该数据(包括单一遗传修饰及单一和多补充物添加)证明了该培养系统中基于OD值变化的3-HP耐受性的改善。
实施例57:用于3-HP产生的酵母需氧途径(预测的)
使用基因合成(DNA 2.0)构建以下构建体(SEQ ID NO:150),其含有:与ACC1的200bp的5’同源序列、用于选择的His3基因、Adh1酵母启动子、用于MCR克隆的BamHI和SpeI位点、cyc1终止子、来自酵母的Tef1启动子和与酵母ACC1开放阅读框的前200bp的同源序列。MCR开放阅读框(SEQ ID NO:151)被克隆到BamHI和SpeI位点中,这允许adh1启动子的组成型转录。将MCR克隆进入该构建体之后,通过限制性消化从质粒中分离遗传元件(SEQ ID NO:152),并转化到相关的酵母菌株中。该遗传元件将敲除酵母ACC1的天然启动子,并将其替换为表达由adh1启动子表达的MCR,因而Tef1启动子现驱动ACC1表达。通过在不含组氨酸的条件下生长来选择整合。通过PCR确认阳性菌落。通过RT-PCR确认MCR的表达和ACC1的表达增加。
可用于在酵母中表达MCR的替代性方式是从质粒表达MCR。可以使用标准分子生物学技术,将含有ADH1启动子(SEQ ID NO:4)控制下的MCR的遗传元件克隆进入酵母载体,例如pRS421(SEQ ID NO:153),从而产生含有MCR的质粒(SEQ ID NO:154)。然后可以将基于质粒的MCR转化到不同的酵母菌株中。
根据本公开,注意到,除在酵母细胞中引入包含编码丙二酰-CoA还原酶活性的核酸构建体之外,在一些实施方案中还进行了另外的遗传修饰以降低烯酰基-CoA还原酶活性和/或其它脂肪酸合成酶活性。
实施例58:用于3-HP耐受性提高的酿酒酵母遗传元件的克隆
通过使用《《biocyc.org》》的同源性和途径比较鉴定酵母基因,如图9D表单1-7所概述的。使用表51中的引物通过PCR扩增遗传元件。将酵母遗传元件扩增以包含天然启动子和3’非翻译区,PCR产物序列见表51。根据生产商的说明书,使用Qiagen凝胶提取(Valencia,CA USA,Cat.No.28706)通过凝胶电泳和凝胶纯化分离PCR产物。然后,根据生产商的说明书,将凝胶纯化的酵母遗传元件克隆进入pYes2.1-topo载体(SEQ IDNO:183,Invitrogen Corp,Carlsbad,CA,USA)中。通过PCR筛选菌落,然后由Genewiz测序。
表51:酵母耐受性引物
基因 | 引物A | 引物B |
spe3 | SEQ ID 0155 | SEQ ID 0156 |
hom2 | SEQ ID 0157 | SEQ ID 0158 |
MET6 | SEQ ID 0159 | SEQ ID 0160 |
ILV2 | SEQ ID 0161 | SEQ ID 0162 |
ILV6 | SEQ ID 0163 | SEQ ID 0164 |
THR1 | SEQ ID 0165 | SEQ ID 0166 |
SER2 | SEQ ID 0167 | SEQ ID 0168 |
SER3 | SEQ ID 0169 | SEQ ID 0170 |
ARG2 | SEQ ID 0171 | SEQ ID 0172 |
RNR1 | SEQID 0173 | SEQ ID 0174 |
aro3 | SEQID 0175 | SEQ ID 0176 |
ARO7 | SEQID 0177 | SEQ ID 0178 |
TYR1 | SEQID 0179 | SEQ ID 0180 |
TRP1 | SEQID 0181 | SEQ ID 0182 |
实施例59:亚克隆酵母遗传元件到大肠杆菌/酵母穿梭载体pRS423和pRS425中
通过使用限制性酶PvuII和XbaI的限制性消化从pYes2.1切除遗传元件。根据生产商的说明书,使用Qiagen凝胶提取(Valencia,CA USA,Cat.No.28706)通过凝胶电泳和凝胶纯化分离包含酵母遗传元件的限制性片段。使用限制性酶SmaI和SpeI消化骨架载体pRS423和pRS425,并进行凝胶纯化。将酵母遗传元件连接到pRS423和pRS425(SEQ ID NO:184和185)中。所有的质粒通过PCR分析和测序检验。
实施例60:酵母菌株构建
使用标准的酵母转化构建酵母菌株,并通过营养缺陷型标志物的补偿进行选择。所有的菌株为S288C背景。关于一般酵母转化方法,参见Gietz,R.D.和R.A.Woods.(2002)TRANSFORMATION OF YEAST BY THELiac/SS CARRIER DNA/PEG METHOD.Methods in Enzymology 350:87-96。
实施例61:在酵母中补充物和/或遗传修饰对于3-HP耐受性的评估
使用本实施例中描述的方法通过MIC评估测定补充和/或遗传修饰对于3-HP耐受性的影响。对于需氧和厌氧条件下测试的补充物分别列举于表52和表53中。对于需氧和厌氧条件下在酵母中测试的遗传修饰分别列举于表54和表55中。MIC评估的结果提供于表52-55中。该数据(其包括单一和多补充物添加和遗传修饰)证明了在这些培养系统中基于本文所述的MIC评估的3-HP耐受性改善。
用于酵母需氧最小抑制浓度评估的方法
以96孔板的形式在需氧条件下测定最小抑制浓度(MIC)。将平板设定为:当各单个孔在接种后达到100uL的终体积时,具有下列成分水平(对应于不含维生素的合成基本葡萄糖培养基(SD)标准培养基):20g/L右旋糖、5g/L硫酸铵、850mg/L磷酸二氢钾、150mg/L磷酸氢二钾、500mg/L硫酸镁、100mg/L氯化钠、100mg/L氯化钙、500μg/L硼酸、40μg/L硫酸铜、100μg/L碘化钾、200μg/L氯化铁、400μg/L硫酸锰、200μg/L钼酸钠和400μg/L硫酸锌。使菌株的过夜培养物在5ml含有维生素的SD培养基(Methods in Enzymology vol.350,page 17(2002))中生长,一式三份。将1%(v/v)接种物引入5ml不含维生素的SD基本培养基的培养物中。当细胞达到指数中期后,将培养物稀释至OD600为0.200。进一步按1∶5稀释细胞,并将10μl的等分试样用于接种96孔板的各个孔(~104个细胞/孔)至总体积为100uL。在渐增的3-HP浓度(0至60g/L,增量5g/L)中测定不同菌株的生长或生长状况。平板在30℃温育72小时。在72小时后记录最小抑制性3-HP浓度和对应于可见的细胞生长(OD~0.1)的最大3-HP浓度。对于MIC>60g/L的情况,在具有延伸的3-HP浓度(0-100g/L,增量5g/L)的平板中进行评定。
用于酵母厌氧最小抑制浓度评估的方法
以96孔板的形式在厌氧条件下测定最小抑制浓度(MIC)。将平板设定为:当各单个孔在接种后达到100uL的终体积时,具有下列成分水平(对应于不含维生素的合成基本葡萄糖培养基(SD)标准培养基):20g/L右旋糖、5g/L硫酸铵、850mg/L磷酸二氢钾、150mg/L磷酸氢二钾、500mg/L硫酸镁、100mg/L氯化钠、100mg/L氯化钙、500μg/L硼酸、40μg/L硫酸铜、100μg/L碘化钾、200μg/L氯化铁、400μg/L硫酸锰、200μg/L钼酸钠和400μg/L硫酸锌。使菌株的过夜培养物在5ml含有维生素的SD培养基(Methods in Enzymology vol.350,page 17(2002))中生长,一式三份。将1%(v/v)接种物引入5ml不含维生素的SD基本培养基的培养物。当细胞达到指数中期后,将培养物稀释至OD600为0.200。进一步按1∶5稀释细胞,并将10μl的等分试样用于接种96孔板的各个孔(~104个细胞/孔)至总体积为100uL。在渐增的3-HP浓度(0至60g/L,增量5g/L)中测定不同菌株的生长或生长状况。在30℃温育平板72小时。在72小时后记录最小抑制性3-HP浓度和对应于可见的细胞生长(OD~0.1)的最大3-HP浓度。对于MIC>60g/L的情况,在具有延伸的3-HP浓度(0-100g/L,增量5g/L)的平板中进行评定。将平板密封在含有用于厌氧条件的气体发生器的生物袋厌氧室中,并在30℃下温育72小时。在72小时后记录最小抑制性3-HP浓度和对应于可见的细胞生长(OD~0.1)的最大3-HP浓度。对于MIC>60g/L的情况,在具有延伸的3-HP浓度(0-100g/L,增量5g/L)的平板中进行评定。
实施例62:在钩虫贪铜菌中对3HPTGC相关补充物的评估
使用“常用方法部分”描述的方法,通过MIC评估来确定补充对钩虫贪铜菌中3HP耐受性的影响。测试的补充物列举于补充物表中。
钩虫贪铜菌在需氧条件下的MIC结果提供于表56中。该数据(其包括单一和多补充物添加)证明了这些培养系统中基于MIC评估的3-HP耐受性的改善。
实施例63:针对3HPTGC耐受性的遗传修饰与3-HP产生遗传修饰结合的另外的实施例
除了实施例42(其提供了组合耐受性和3-HP产生遗传修饰以获得想要的适合用于产生3-HP的遗传修饰的微生物的一般性实例)之外,并根据实施例43之后的实施例和考虑到本文中另外的公开内容以及本领域技术人员已知的方法(例如,Sambrook和Russell,2001,其关于遗传修饰的方法通过引用并入本实施例),本实施例提供了经遗传修饰以包含提供增强的3-HP耐受性(其可通过任何度量来测定,如本文讨论的那些)的3HPTGC的一个或多个遗传修饰和增加3-HP产生的一个或多个遗传修饰(例如3-HP产生途径的遗传修饰,如本文公开的那些)的微生物物种。
可以在不同的条件(包括培养系统的氧含量和培养基的营养物组成)下,可以就3-HP耐受性和3-HP的产生来评估如此遗传修饰的微生物。
在本实施例的各个不同方面,进行遗传修饰的多个集合,并进行比较以鉴定包含想要的增强3-HP耐受性和产生的特性和/或量度的一种或多种遗传修饰的微生物。
实施例64:与3HPTGC遗传修饰结合的编码Irok序列的遗传修饰的引入
实施例45描述了Irok肽(由21个氨基酸组成的肽)以及当把编码该肽的质粒导入大肠杆菌菌株并在微需氧条件下评估时该肽的3-HP耐受性改善效应。考虑到本文中关于3HPTGC的公开以及本领域技术人员已知的方法(例如,Sambrook和Russell,2001,其关于遗传修饰的方法通过引用并入本实施例中),对微生物物种进行了遗传修饰以包含编码IroK肽序列的核酸序列和3HPTGC的一个或多个遗传修饰,共同地提供增强的3-HP耐受性。可以通过任何量度评定这种3-HP耐受性的增强,如本文讨论的那些。
因此,基于该结果,可以评估包括来自组A-E的两个或更多个组的代表的各种遗传修饰组合,并应用于微生物中以达到想要的增强的3-HP耐受性。以上表格显示了包括来自这些组的组合的特定遗传修饰组合的结果。另外,可以从组F提供另外的遗传修饰。如本文其它地方所描述的,可以将任意此类组合与可以包括下列一个或多个的其它遗传修饰结合:3-HP生物产生途径以提供和/或增加重组微生物的3-HP合成和积累,缺失或其它修饰以指引更多的代谢资源(例如碳和能量)进入3-HP的生物产生,以及针对调节物流进入脂肪酸合成酶系统的其它遗传修饰。
以下是针对在其它微生物物种中实施本发明的非限制性的一般性预测实施例。
一般性预测实施例65:在红平红球菌中3-HP耐受性和/或生物产生的改善
可以获得一系列大肠杆菌-红球菌穿梭质粒以在红平红球菌中表达,包括但不限于pRhBR17和pDA71(Kostichka等人,Appl.Microbiol.Biotechnol.62:61-68(2003))。另外,可以获得用于在红平红球菌中的异源基因表达的一系列启动子(参见,例如,Nakashima等人,Appl.Environ.Microbiol.70:5557-5568(2004)和Tao等人,Appl.Microbiol.Biotechnol.2005,DOI10.1007/s00253-005-0064)。可以使用Tao等人(同上)和Brans等人(Appl.Environ.Microbiol.66:2029-2036(2000))描述的方法产生红平红球菌中染色体基因的靶向基因破坏。这些公开的资源中相应指明的教导和组合物通过引用并入。
最初将提供增强的3-HP耐受性所需的核酸序列(如本文所述),任选地与提供和/或改善3-HP生物合成途径的核酸序列一起,克隆进入pDA71或pRhBR71,并转化进入大肠杆菌。然后将载体通过电穿孔转化进入红平红球菌,如Kostichka等人(同上)所述。使重组体在含有葡萄糖的合成培养基中生长,并使用本领域已知的或本文描述的方法监视3-HP耐受性和/或生物产生。
一般性预测实施例66:在地衣芽孢杆菌中3-HP耐受性和/或生物产生的改善
大多数在枯草杆菌中复制的质粒和穿梭载体用于通过原生质转化或电穿孔法转化地衣芽孢杆菌。用于改善3-HP耐受性和/或3-HP生物合成所需的核酸序列分离自各种来源,按需要进行密码子优化,并克隆进入质粒pBE20或pBE60衍生物(Nagarajan等人,Gene 114:121-126(1992))。转化地衣芽孢杆菌的方法是本领域已知的(例如,参见Fleming等人,Appl.Environ.Microbiol.,61(11):3775-3780(1995))。这些公开的资源中相应指明的教导和组合物通过引用并入。
将构建用于在枯草杆菌中表达的质粒转化进入地衣芽孢杆菌以产生重组微生物,其然后显示出增强的3-HP耐受性和任选的3-HP生物产生。
一般性预测实施例67:在浸麻芽孢杆菌中3-HP耐受性和/或生物产生的改善
根据本文所述构建用于枯草杆菌中表达的质粒并且用于通过原生质体转化来转化浸麻芽孢杆菌以产生表现出改善的3-HP耐受性以及任选的3-HP产生的重组微生物。
一般性预测实施例68:真氧产碱杆菌(雷尔氏菌(Ralstonia))(现称为钩虫贪铜菌)中3-HP耐受性和/或生物产生的表达
真养产碱杆菌中基因表达和产生突变的方法是本领域已知的(参见,例如Taghavi等人,Appl.Environ.Microbiol.,60(10):3585-3591(1994))。该公开资源中的指明的教导和组合物通过引用并入。从各个来源分离鉴定为改善3-HP耐受性和/或用于3-HP生物合成的任何核酸序列,按需要进行密码子优化,并克隆进入如上所述的广泛宿主范围的载体中的任一种,电穿孔以产生重组微生物,其显示出改善的3-HP耐受性和任选的3-HP生物产生。产碱杆菌中的聚(羟基丁酸)途径已进行了详细描述,多种修饰真养产碱杆菌基因组的遗传技术是已知的,且这些工具可应用于工程化改造3-HP耐受性的或任选地3-HP-gena-耐受性的重组微生物。
一般性预测实施例69:在恶臭假单胞菌中3-HP耐受性和/或生物产生的改善
恶臭假单胞菌中的基因表达方法是本领域已知的(参见,例如Ben-Bassat等人,美国专利No.6,586,229,其中的这些教导通过引用并入本文)。从各个来源分离鉴定为改善3-HP耐受性和/或用于3-HP生物合成的任意核酸序列,按需要进行密码子优化,并克隆进入如本文所述的广泛多种范围的宿主载体的任一种中,电穿孔以产生显示出改善的3-HP耐受性和任选的3-HP生物产生的重组微生物。例如,将这些核酸序列插入pUCP18中,并将该连接的DNA电穿孔进入电感受态的恶臭假单胞菌KT2440细胞以产生重组的恶臭假单胞菌微生物,其显示出增强的3-HP耐受性,并任选也包含至少部分地由导入的核酸序列组成的3-HP生物合成途径。
一般性预测实施例70:在植物乳杆菌中3-HP耐受性和/或生物产生的改善
乳杆菌属属于乳杆菌科,且用于转化枯草杆菌和链球菌的很多质粒和载体都用于乳杆菌。合适的载体的非限制性实例包括pAM β1及其衍生物(Renault等人,Gene 183:175-182(1996);和O′Sullivan等人,Gene 137:227-231(1993));pMBB1和pHW800(pMBB1的衍生物)(Wyckoff等人,Appl.Environ.Microbiol 62:1481-1486(1996));pMG1(接合质粒)(Tanimoto等人,J.Bacteriol.184:5800-5804(2002));pNZ9520(Kleerebezem等人,Appl.Environ.Microbiol.63:4581-4584(1997));pAM401(Fujimoto等人,Appl.Environ.Microbiol.67:1262-1267(2001));和pAT392(Arthur等人,Antimicrob.Agents Chemother.38:1899-1903(1994))。还报道了数个来自植物乳杆菌的质粒(例如vanKranenburg R,Golic N,Bongers R,Leer R J,de Vos W M,Siezen R J,Kleerebezem M.Appl.Environ.Microbiol.2005March;71(3):1223-1230)。
一般性预测实施例71:在屎肠球菌、鹑鸡肠球菌和粪肠球菌中3-HP耐受性和/或生物产生的改善
肠球菌属属于乳杆菌科,且很多用于转化乳杆菌、枯草杆菌和链球菌的质粒和载体都用于肠球菌。合适的载体的非限制性实例包括pAM β1及其衍生物(Renault等人,Gene 183:175-182(1996);和O′Sullivan等人,Gene137:227-231(1993));pMBB1和pHW800(pMBB1的衍生物)(Wyckoff等人,Appl.Environ.Microbiol.62:1481-1486(1996));pMG1(结合质粒)(Tanimoto等人,J.Bacteriol.184:5800-5804(2002));pNZ9520(Kleerebezem等人,Appl.Environ.Microbiol.63:4581-4584(1997));pAM401(Fujimoto等人,Appl.Environ.Microbiol.67:1262-1267(2001));和pAT392(Arthur等人,Antimicrob.Agents Chemother.38:1899-1903(1994))。还可以使用用于粪肠球菌的表达载体(使用来自乳球菌的nisA基因)(Eichenbaum等人,Appl.Environ.Microbiol.64:2763-2769(1998)。另外,使用用于在屎肠球菌染色体中进行基因置换的载体(Nallaapareddy等人,Appl.Environ.Microbiol.72:334-345(2006))。
对于一般性预测性实施例65-71中的每一个,可以向其中引入下列3-HP生物产生的比较:使用3-HP的分析方法,例如以下“常用方法部分”中第III小节描述的方法,在以相应重组微生物进行的相应生物产生事件结束时以可测定量获得3-HP(参见通过引用并入各相应一般性预测实施例中的生物产生事件的类型)。该可测定量显著大于使用适当的不含功能性3-HP途径(如相应一般性预测性实施例中所提供)的相应对照微生物的对照生物产生事件中产生的3-HP的量。还可以通过任何公认的比较测量技术来测定耐受性的改善,例如使用“常用方法部分”提供的MIC方案。
常用方法部分
本部分中的所有方法被提供以并入所指的实施例之中。
第I小节.微生物物种和菌株、培养物及生长培养基
可能根据需要使用的细菌种如下:
醋酸钙不动杆菌(Acinetobacter calcoaceticus)(DSMZ#1139)以真空干燥培养物的形式获自German Collection of Microorganisms and Cell Cultures(Braunschweig,Germany)。然后将培养物重悬于Brain Heart Infusion(BHI)液体培养基(RPI Corp,Mt.Prospect,IL,USA)中。将重悬的醋酸钙不动杆菌培养物的系列稀释物置于BHI中,并允许其在有氧条件下在37℃以250rpm生长48小时直至饱和。
枯草杆菌由Gill实验室(University of Colorado at Boulder)惠赠,且以活跃生长的培养物的形式获得。将活跃生长的枯草杆菌培养物的系列稀释物置于Luria Broth(RPI Corp,Mt.Prospect,IL,USA)中,并允许其在有氧条件下在37℃以250rpm生长24小时直至饱和。
泥生绿菌(Chlorobium limicola)(DSMZ#245)以真空干燥培养物的形式获自German Collection of Microorganisms and Cell Cultures(Braunschweig,Germany)。然后按照DSMZ说明所述,将培养物重悬于Pfennig’s Medium I和II(#28和29)中。泥生绿菌在25℃在恒定漩涡情况下生长。
布氏柠檬酸杆菌(Citrobacter braakii)(DSMZ#30040)以真空干燥培养物的形式获自German Collection of Microorganisms and Cell Cultures(Braunschweig,Germany)。然后将培养物重悬于Brain Heart Infusion(BHI)液体培养基(RPI Corp,Mt.Prospect,IL,USA)中。将重悬的布氏柠檬酸杆菌培养物的系列稀释物置于BHI中,并允许其在有氧条件下在30℃以250rpm生长48小时直至饱和。
丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)(DSMZ#792)以真空干燥培养物的形式获自German Collection of Microorganisms and Cell Cultures(Braunschweig,Germany)。然后按照DSMZ说明所述,将培养物重悬于丙酮丁醇梭菌培养基(#411)中。丙酮丁醇梭菌在厌氧条件下在37℃以250rpm生长直至饱和。
氨基丁酸梭菌(Clostridium aminobutyricum)(DSMZ#2634)以真空干燥培养物的形式获自German Collection of Microorganisms and Cell Cultures(Braunschweig,Germany)。然后按照DSMZ说明所述,将培养物重悬于氨基丁酸梭菌培养基(#286)中。氨基丁酸梭菌在厌氧条件下在37℃以250rpm生长直至饱和。
克氏梭菌(Clostridium kluyveri)(DSMZ#555)以活跃生长的培养物的形式获自German Collection of Microorganisms and Cell Cultures(Braunschweig,Germany)。按照DSMZ说明所述,将克氏梭菌培养物的系列稀释物置于克氏梭菌培养基(#286)中。克氏梭菌在厌氧条件下在37℃以250rpm生长直至饱和。
耐金属贪铜菌(Cupriavidus metallidurans)(DMSZ#2839)以真空干燥培养物的形式获自German Collection of Microorganisms and Cell Cultures(Braunschweig,Germany)。然后将培养物重悬于Brain Heart Infusion(BHI)液体培养基(RPI Corp,Mt.Prospect,IL,USA)中。将重悬的耐金属贪铜菌培养物的系列稀释物置于BHI中,并允许其在有氧条件下在30℃以250rpm生长48小时直至饱和。
钩虫贪铜菌(DSMZ#428)以真空干燥培养物的形式获自GermanCollection of Microorganisms and Cell Cultures(Braunschweig,Germany)。然后将培养物重悬于Brain Heart Infusion(BHI)液体培养基(RPI Corp,Mt.Prospect,IL,USA)中。将重悬的钩虫贪铜菌培养物的系列稀释物置于BHI中,并允许其在有氧条件下在30℃以250rpm生长48小时直至饱和。如其它地方所指出的,该物种之前的名称是真养产碱杆菌和真养雷尔氏菌(Ralstoniaeutrophus)。
食果糖脱硫弧菌(Desulfovibrio fructosovorans)(DSMZ#3604)以真空干燥培养物的形式获自German Collection of Microorganisms and CellCultures(Braunschweig,Germany)。然后按照DSMZ说明所述,将培养物重悬于食果糖脱硫弧菌培养基(#63)中。食果糖脱硫弧菌在厌氧条件下在37℃以250rpm生长直至饱和。
大肠杆菌Crooks(DSMZ#1576)以真空干燥培养物的形式获自German Collection of Microorganisms and Cell Cultures(Braunschweig,Germany)。然后将培养物重悬于Brain Heart Infusion(BHI)液体培养基(RPI Corp,Mt.Prospect,IL,USA)中。将重悬的大肠杆菌Crooks培养物的系列稀释物置于BHI中,并允许其在有氧条件下在37℃以250rpm生长48小时直至饱和。
大肠杆菌K12由Gill实验室(Boulder的University of Colorado)惠赠,并以活跃生长的培养物的形式获得。将活跃生长的大肠杆菌K12培养物的系列稀释物置于Luria Broth(RPI Corp,Mt.Prospect,IL,USA)中,并允许其在有氧条件下在37℃以250rpm生长24小时直至饱和。
盐生盐杆菌(Halobacterium salinarum)(DSMZ#1576)以真空干燥培养物的形式获自German Collection of Microorganisms and Cell Cultures(Braunschweig,Germany)。然后按照DSMZ说明所述,将培养物重悬于盐杆菌培养基(#97)中。盐生盐杆菌在有氧条件下在37℃以250rpm生长直至饱和。
德氏乳杆菌(Lactobacillus delbrueckii)(#4335)以活跃生长的培养物的形式得自WYEAST USA(Odell,OR,USA)。将活跃生长的德氏乳杆菌培养物的系列稀释物置于Brain Heart Infusion(BHI)液体培养基(RPI Corp,Mt.Prospect,IL,USA)中,并允许其在有氧条件下在30℃以250rpm生长24小时直至饱和。
勤奋金属球菌(Metallosphaera sedula)(DSMZ#5348)以活跃生长的培养物形式获自German Collection of Microorganisms and Cell Cultures(Braunschweig,Germany)。按照DSMZ说明所述,将勤奋金属球菌培养物的系列稀释物置于金属球菌培养基(#485)中。勤奋金属球菌在有氧条件下在65℃以250rpm生长直至饱和。
费氏丙酸杆菌谢氏亚种(Propionibacterium freudenreichii subsp.shermanii)(DSMZ#4902)以真空干燥培养物的形式获自GermanCollection of Microorganisms and Cell Cultures(Braunschweig,Germany)。然后按照DSMZ说明所述,将培养物重悬于PYG-培养基(#104)中。费氏丙酸杆菌谢氏亚种在无氧条件下在30℃以250rpm生长直至饱和。
恶臭假单胞菌由Gill实验室(Boulder的University of Colorado)惠赠,以活跃生长的培养物形式获得。将活跃生长的恶臭假单胞菌培养物的系列稀释物置于Luria Broth(RPI Corp,Mt.Prospect,IL,USA)中,并允许其在有氧条件下在37℃以250rpm生长24小时直至饱和。
变异链球菌(DSMZ#6178)以真空干燥培养物的形式获自GermanCollection of Microorganisms and Cell Cultures(Braunschweig,Germany)。然后将培养物重悬于Luria Broth(RPI Corp,Mt.Prospect,IL,USA)中。变异链球菌有氧条件下在37℃以250rpm生长直至饱和。
下列非限制性菌株也可被用作为实施例中的起始菌株:DF40Hfr(PO2A),garB 10,fhuA22,ompF627(T2R),fadL701(T2R),relA1,pitA10,spoT1,rrnB-2,pgi-2,mcrB1,creC510,BW25113F-,Δ(araD-araB)567,ΔlacZ4787(::rrnB-3),&lambda-,rph-1,Δ(rhaD-rhaB)568,hsdR514,JP111Hfr(PO1),galE45(GalS),&lambda-,fabI392(ts),relA1,spoT1,thi-1。这些菌株具有公认的遗传修饰并且可获自公开培养物来源,诸如Yale Coli GeneticStock Collection(New Haven,CT USA)。由这些菌株而开发的菌株描述于实施例中。
细菌生长培养基及相关材料和条件如下:
补料分批培养基包含(每升):10g胰蛋白胨、5g酵母提取物、1.5g NaCl、2g Na2HPO4·7H2O、1g KH2PO4和标明浓度的葡萄糖。
AM2培养基包含(每升):2.87g K2HPO4、1.50g KH2PO4、3.13g(NH4)2SO4、0.15g KCl、1.5mM MgSO4、0.1M K+MOPS pH 7.2、30g葡萄糖和1ml微量矿物质原液,其根据Martinez等,Biotechnol Lett 29:397-404页(2007年)中的描述进行制备。
在发酵器中用于初始批培养基(用于实施例11)的AM2培养基
K2HPO4 | 2.87g/L |
KH2PO4 | 1.50g/L |
(NH4)2SO4 | 3.13g/L |
KCl | 0.15g/L |
葡萄糖 | 6.0g/L |
MgSO4 | 0.18g/L |
AM2微量金属原液 | 1.0ml/L |
泛酸钙 | 0.005g/L |
氨苄青霉素 | 0.1g/L |
卡那霉素 | 0.02g/L |
氯霉素 | 0.02g/L |
用于发酵器中的AM2培养基的微量金属原液
浓HCl | 10.0ml/L |
FeCl3·6H2O | 2.4g/L |
CoCl2·6H2O | 0.17g/L |
CuCl2·2H2O | 0.15g/L |
ZnCl2 | 0.3g/L |
Na2MoO4·2H2O | 0.3g/L |
H3BO3 | 0.07g/L |
MnCl2·4H2O | 0.5g/L |
用于AM2容器的葡萄糖补料中的葡萄糖浓度:200g/L葡萄糖
用于发酵器初始批培养基(用于实施例11)中的丰富培养基
胰蛋白胨 | 10g/L |
酵母提取物 | 5g/L |
葡萄糖 | 4g/L |
Na2HPO4·7H2O | 2g/L |
KH2PO4 | 1g/L |
MgSO4 | 2g/L |
氨苄青霉素 | 0.1g/L |
卡那霉素 | 0.02g/L |
氯霉素 | 0.02g/L |
用于丰富培养基的额外葡萄糖补料的补料配方
葡萄糖 | 200g/L |
(NH4)2SO4 | 30g/L |
KH2PO4 | 7.5g/L |
柠檬酸 | 3g/L |
MgSO4 | 2.93g/L |
FeSO4·7H2O | 0.05g/L |
用于大肠杆菌的SM3基本培养基(最终磷酸盐浓度=27.5mM;最终N浓度=47.4mM NH4 +)。
每升成分:700mL去离子水、100mL 10X SM3盐、2ml1M MgSO4、1ml 1000X微量金属原液、60mL 500g/L葡萄糖、100mL 0.1M MOPS(pH7.4)、0.1mL的1M CaCl2,去离子水加至1000mL,并且0.2μm过滤消毒。
原液制备:
为制备10X SM3盐(1L):800mL去离子水、28.7g K2HPO、15g KH2PO4、31.3g(NH4)2SO4、1.5g KCl、0.5g柠檬酸(无水),并且去离子水加至1000mL。
为制备1000X微量金属原液(1L):以50-ml份保存于室温下。
在0.12M HCl(将10ml浓盐酸稀释于1升水中)中每升:2.4gFeCL3·6H2O、0.17g CoCl2·6H2O、0.15g CuCl2·2H2O、0.3g ZnCl2、0.3gNaMoO4·2H2O(二水合钼酸二钠盐)、0.07g H3BO3和0.5g MnCl2·4H2O。
为制备1M MOPS:209.3g MOPS,溶解于700ml水中。取70-ml份并使用50%KOH调节至所需pH,调节至终体积100mL,并且0.2μm过滤消毒。
为制备1M MgSO4:将120.37g溶解于1000mL水中。
为制备500g/L(50%)葡萄糖原液:900mL去离子水,500g葡萄糖并且加至1000mL。
另外的生长培养基配方总结为:
成份 | FM3中浓度 | FM4中浓度 | FM5中浓度 | |
1 | K2HPO4 | 2.63g/L | 13.4g/L | 2.63g/L |
2 | KH2PO4 | 1.38g/L | 3g/L | 1.38g/L |
3 | (NH4)2SO4 | 13.88g/L | 3g/L | 3g/L |
4 | NaCl | ------- | 0.5g/L | ------- |
5 | 柠檬酸·H2O | 2.19g/L | 1.1g/L | 2.19g/L |
6 | 酵母提取物 | 1.25g/L | 1g/L | 1g/L |
7 | 消泡剂204 | 0.1ml/L | 0.1ml/L | 0.1ml/L |
8 | 葡萄糖 | 30g/L | 30g/L | 30g/L |
9 | MgSO4·7H2O | 0.82g/L | 0.48g/L | 0.82g/L |
10 | FM10微量金属原液 | 1.5ml/L | 2ml/L | 2ml/L |
11 | 卡那霉素 | 35mg/L | 35mg/L | 35mg/L |
12 | 氯霉素 | 20mg/L | 20mg/L | 20mg/L |
FM10:微量金属原液配方
成份 | 浓度 |
浓HCl | 10.0ml/L |
CaCl2·2H2O | 49g/L |
FeCl3·6H2O | 9.7g/L |
CoCl2·6H2O | 0.4g/L |
CuCl2·2H2O | 2.7g/L |
ZnCl2 | 0.2g/L |
Na2MoO4·2H2O | 0.24g/L |
H3BO3 | 0.07g/L |
MnCl2·4H2O | 0.36g/L |
为制备1L M9基本培养基:
M9基本培养基通过将5X M9盐、1M MgSO4、20%葡萄糖、1M CaCl2和无菌去离子水进行混合而制备。所述5X M9盐通过将下列盐溶解于去离子水至1L终体积而制备:64g Na2HPO4·7H2O、15g KH2PO4、2.5g NaCl、5.0g NH4Cl。盐溶液被分成200mL等分试样并且通过在15psi下以液体循环进行15分钟高压灭菌而消毒。MgSO4的1M溶液和1M CaCl2被单独制备,随后通过高压灭菌进行消毒。葡萄糖通过0.22μm过滤器而进行过滤消毒。所有成分如下结合以制备1L的M9:750mL无菌水、200mL 5X M9盐、2mL的1M MgSO4、20mL 20%葡萄糖、0.1mL CaCl2,调节至1L终体积。
为制备EZ丰富培养基:
所有培养基成分均获自TEKnova(Hollister CA USA)并且以下列体积混合。100mL 10X MOPS混合物、10mL 0.132M K2HPO4、100mL 10X ACGU、200mL 5X补充物EZ、10mL 20%葡萄糖、580mL无菌水。
第II小节:凝胶制备、DNA分离、提取、连接和转化方法:
将分子生物学级别的琼脂糖(RPI Corp,Mt.Prospect,IL,USA)加入到1x TAE中以制备TAE中的1%琼脂糖。为了获得50x TAE,将下列物质加入到900mL蒸馏H2O中:242g Tris碱(RPI Corp,Mt.Prospect,IL,USA)、57.1ml冰醋酸(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO,USA)和18.6g EDTA(Fisher Scientific,Pittsburgh,PA USA),并使用另外的蒸馏水调整体积至1L。为了获得1x TAE,将20mL 50x TAE加至980mL蒸馏水中。然后将琼脂糖-TAE溶液加热至沸腾发生并且琼脂糖完全溶解。使溶液冷却至50℃,然后加入10mg/mL溴化乙啶(Acros Organics,Morris Plains,NJ,USA),浓度是5ul/100mL 1%琼脂糖溶液。一旦加入溴化乙啶,短暂混合溶液并倒入具有每个样品分析合适数目的梳子(Idea Scientific Co.,Minneapolis,MN,USA)的凝胶浇铸托盘中。然后相应地将DNA样品与5X TAE上样缓冲液混合。5X TAE上样缓冲液由下列组成:5X TAE(从上述的50X TAE稀释而来),20%甘油(Acros Organics,Morris Plains,NJ,USA),0.125%溴酚蓝(Alfa Aesar,Ward Hill,MA,USA),并使用蒸馏水调整体积至50mL。然后在填充有1X TAE的凝胶装备(Idea Scientific Co.,Minneapolis,MN,USA)中,在125伏的恒定电压下跑胶25-30分钟。此时,将凝胶从具有电压的胶盒移除,并在UV透射仪(FOTODYNE Inc.,Hartland,WI,USA)下可视化。
然后根据生产商(Qiagen(Valencia CA USA))的说明书,使用QIAquick Gel Extraction Kit提取通过凝胶提取分离的DNA。类似的方法是本领域技术人员已知的。
然后可以根据生产商的说明书,将由此提取的DNA连接进入pSMART(Lucigen Corp,Middleton,WI,USA)、StrataClone(Stratagene,LaJolla,CA,USA)或pCR2.1-TOPO TA(Invitrogen Corp,Carlsbad,CA,USA)。这些方法在“常用方法”的下一小节中描述。
连接方法:
用于连接到pSMART载体中:
根据生产商的说明书,使用PCRTerminator(Lucigen Corp,Middleton,WI,USA)将凝胶提取的DNA平端化。然后,将500ng的DNA加入至2.5uL 4xCloneSmart载体预混合物中,加入1ul CloneSmart DNA连接酶(Lucigen Corp,Middleton,WI,USA)和蒸馏水达到总体积10ul。然后使反应物在室温静置30分钟,然后在70℃加热灭活15分钟,然后置于冰上。将大肠杆菌10G化学感受态细胞(Lucigen Corp,Middleton,WI,USA)在冰上解冻20分钟。将40ul化学感受态细胞置于微量离心管中,向管中加入1ul热灭活的CloneSmartLigation。使用移液枪尖短暂搅拌整个反应物。将连接物和细胞在冰上温育30分钟,然后将细胞在42℃热休克45秒,然后放回至冰上2分钟。向离心管中加入960ul室温的回收培养基(Lucigen Corp,Middleton,WI,USA)。在37℃以250rpm摇动管1个小时。将100ul转化的细胞接种于添加合适的抗生素(取决于所用的pSMART载体)的LB平板(RPI Corp,Mt.Prospect,IL,USA)上。在37℃温育平板过夜。
用于连接到StrataClone中:
根据生产商的说明书,使用PCRTerminator(Lucigen Corp,Middleton,WI,USA)将凝胶提取的DNA平端化。然后,将2ul的DNA加入至3ul StrataCloneBlunt Cloning缓冲液和1ul StrataClone Blunt vector mix amp/kan(Stratagene,La Jolla,CA,USA)达到总体积6ul。通过轻轻地上下吸打来混合反应物,并在室温下温育反应物30分钟,然后置于冰上。将一管StrataClone化学感受态细胞(Stratagene,La Jolla,CA,USA)在冰上解冻20分钟。将1ul克隆反应物加入至含有化学感受态细胞的管中,然后使用移液枪尖轻轻混合,并在冰上温育20分钟。将转化物在42℃热休克45秒,然后置于冰上2分钟。加入250ul预热的Luria Broth(RPI Corp,Mt.Prospect,IL,USA),并以250rpm在37℃摇动2小时。将100ul转化混合物接种于添加合适的抗生素的LB平板(RPI Corp,Mt.Prospect,IL,USA)上。在37℃温育平板过夜。
用于连接到pCR2.1-TOPO TA中:
将1ul TOPO载体、1ul盐溶液(Invitrogen Corp,Carlsbad,CA,USA)和3ul凝胶提取的DNA加入至微量离心管中。使得管在室温下温育30分钟,然后将反应物置于冰上。每个反应解冻1管TOP10F’化学感受态细胞(InvitrogenCorp,Carlsbad,CA,USA)。将1ul反应混合物加至解冻的TOP10F’细胞中,并通过使用移液枪尖涡漩细胞轻轻混合和在冰上温育20分钟。将转化物在42℃热休克45秒,然后置于冰上2分钟。加入250ul预热的SOC培养基(Invitrogen Corp,Carlsbad,CA,USA),并以250rpm在37℃摇动1小时。将100ul转化混合物接种于添加合适抗生素的LB平板(RPI Corp,Mt.Prospect,IL,USA)上。在37℃温育平板过夜。
一般转化和相关培养方法:
根据生产商的说明书或根据Molecular Cloning(Sambrook和Russell,2001)中包含的文献进行化学感受态转化程序。一般地,将质粒DNA或连接产物在含有化学感受态细胞的溶液中在冰上冷冻5至30分钟。化学感受态细胞是生物技术领域中广泛使用的产品,且可以从多个供应商获得,例如本小节中指明的那些。冷冻时间后,一般将细胞在不摇动的情况下在42℃热休克30秒,重新冷冻,并与250ul的丰富培养基例如S.O.C混合。然后将细胞在37℃温育,同时以250rpm摇动1小时。最后,通过接种于含有合适的抗生素的培养基中筛选成功转化的细胞。
或者,可以通过电穿孔方法例如本领域技术人员已知的那些来转化选择的细胞。
用于质粒转化的大肠杆菌宿主菌株的选择是通过考虑如质粒稳定性、质粒相容性、质粒筛选方法和蛋白表达的因素确定的。可以通过简单地纯化质粒DNA(如上文所述)并将质粒转化进入想要的或其它情况下合适的大肠杆菌宿主菌株(如通过实验需要确定的那些,例如任何通常使用的克隆菌株如DH5α,Top 10F’,大肠杆菌10G等)来改变菌株背景。
根据制造商的说明使用来自Qiagen(Valencia,CA USA)的商业化微量制备试剂盒制备质粒DNA。
第IIIa小节.3-HP的制备
按照如下所述制备3-HP原液。在通风橱中打开小瓶β-丙内酯(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO,USA),并使用25-mL的玻璃移液管将瓶中全部内容物顺序转移至新容器中。使用50mL HPLC级水冲洗该瓶,并将冲洗液倒入该新容器中。再进行两次冲洗并加入新溶液中。向该新容器中加入另外的HPLC级水以达到50mL水/5mL β-丙内酯的比例。将该新容器紧密地加盖,并在室温下保持在通风橱中72小时。72小时后,将内容物转移至离心管中,以4,000rpm离心10分钟。然后将溶液过滤以除去颗粒,且如果需要,在室温下使用旋转蒸发器进行浓缩。进行浓度测定,且如果需要,进行稀释以制备标准浓度的原液。。
第IIIb小节.用于3-HP检测的HPLC、GC/MS和其它分析方法(培养物的3-HP产生分析)
对于3-HP的HPLC分析,Waters色谱系统(Milford,MA)由下列组成:600S控制器、616泵、717Plus自动进样器、486可调UV检测器和在线流动相脱气装置。此外,使用Eppendorf外部柱加热器,和使用连接至标准台式电脑的SRI(Torrance,CA)模/数转换器来收集数据。使用SRI Peak Simple软件分析数据。使用了Coregel 64H离子排除柱(Transgenomic,Inc.,San Jose,CA)。柱树脂是磺化的聚苯乙烯二乙烯苯,颗粒尺寸为10μm,柱尺寸为300x 7.8mm。流动相由以去离子(18MΩcm)水稀释至0.02N的浓度并通过0.2μm的尼龙过滤器真空过滤的硫酸(Fisher Scientific,Pittsburgh,PA USA)组成。流动相的流速是0.6mL/分钟。UV检测器以210nm的波长运行,且将柱加热至60℃。本文描述的相同设备和方法用于相关的预测实施例的3-HP分析。使用该HPLC方法利用3-HP标准物(TCI America,Portland,OR)建立的代表性校准曲线显示于图13中。
以下方法用于3-HP的GC-MS分析。以乙酸乙酯单次萃取发酵培养基之后,使用GC-MS定量可溶性单体3-HP。一旦3-HP被萃取进入乙酸乙酯,使用N,O-双(三甲基甲硅烷基)三氟乙酰胺将3-HP上的活性氢原子替换为三甲基甲硅烷基基团从而使该化合物可挥发以用于GC分析。在运行开始时准备已知3-HP浓度的标准曲线并将已知量的氧代己酸(1g/L)加入标准品和样品之中以用作为定量的内标,以托品酸作为另外的内标。随后通过检验氧代己酸离子(m/z=247)与3-HP离子(219)的比率而检定单个样品中的3-HP含量并将其与标准曲线进行比较。使用运行开始时的3-HP标准曲线对3-HP进行定量并且数据使用HP Chemstation进行分析。GC-MS系统由Hewlett Packard5890型GC和Hewlett Packard 5972型MS组成。柱为Supelco SPB-1(60m×0.32mm×0.25μm膜厚)。毛细涂层为非极性甲基硅酮。载气是流速为1mL/min的氦气。使用两种类似的温度方案中的任一种衍生化的3-HP与乙酸乙酯萃取物中的其它成分分离。在第一种温度梯度方案中,柱温以40℃下1分钟开始,随后以10℃/分钟的速度升高至235℃,并且随后以50℃/分钟的速度升高至300℃。在证明为更快地处理样品的第二种温度方案中,柱温以70℃下保持1分钟开始,继之以10℃/分钟的升温至235℃,随后以50℃/分钟升温至300℃。图22中提供了代表性校准曲线。
在各个实施例中还使用了用于3-HP检测的生物分析。3-HP浓度的这一测定基于ydfG基因所编码的大肠杆菌3-HP脱氢酶(YDFG蛋白)的活性而实施。200-μl的反应在96孔微滴定板中进行,并且包含100mM Tris-HCl,pH8.8、2.5mM MgCl2、2.625mM NADP+、3μg纯化YDFG以及20μl培养上清液。通过在微型离心机中离心(14,000rpm,5min)除去细胞而制备培养上清液。3-HP的标准曲线(包含从0.025到2g/L)用于平行反应以对培养上清液的3-HP量进行定量。非接种培养基被用作为试剂空白。在必要的情况下,培养上清液于培养基中稀释以获得具有处于标准曲线浓度之内的3-HP浓度的溶液。
反应物在37℃下孵育1小时,并且向各反应物中加入包含1.43mM硝基蓝四氮唑、0.143吩嗪甲基硫酸酯和2.4%牛血清白蛋白的20μl显色剂。使得在37℃下进行显色另外一小时并且测量580nm下的吸光度。通过与由产生于相同微滴度板上的标准曲线获得的值进行比较而对培养上清液中的3-HP浓度定量。以酶学分析所获得的结果进行验证以匹配获自上述分析方法之一的结果。图23提供了代表性标准曲线。
第IV小节.最小抑制浓度评估(MIC)方案
对于MIC评估,最终结果被表示为通过HPLC(即,参见第IIIb小节)的原液分析而测定的化学物质浓度。
大肠杆菌需氧
以96孔板的形式在需氧条件下测定最小抑制浓度(MIC)。将平板设置为:当各单个孔在接种后达到100uL终体积时,具有下列成分水平(对应于标准M9培养基):47.7mM Na2HPO4,22mM KH2PO4,8.6mM NaCl,18.7mMNH4Cl,2mM MgSO4,0.1mM CaCl2和0.4%葡萄糖。在指定的情况下,根据补充物表中报告的水平添加培养基补充物。使菌株的过夜培养物一式三份在5mL LB(按需要添加抗生素)中生长。将1%(v/v)接种物引入5ml的M9基本培养基的培养物中。当细胞达到指数中期后,将培养物稀释至OD600为大约0.200(即0.195-0.205)。进一步按1∶50稀释细胞,并将10μL的等分试样用于接种96孔板的各孔(~104个细胞/孔)至100uL的总体积。板进行排列以在渐增的3-HP浓度(0至60g/L,增量5g/L)中测定不同菌株的生长或生长状况。将板在37℃下温育24小时。在24小时后记录最小抑制性3-HP浓度和对应于可见的细胞生长(OD~0.1)的最大3-HP浓度。对于MIC>60g/L的情况,在具有延伸的3-HP浓度(0-100g/L,增量5g/L)的平中进行测定。
大肠杆菌厌氧
以96孔板的形式在厌氧条件下测定最小抑制浓度(MIC)。将平板设置为:当各单个孔在接种后达到100uL终体积时,具有下列成分水平(对应于标准M9培养基):47.7mM Na2HPO4,22mM KH2PO4,8.6mM NaCl,18.7mMNH4Cl,2mM MgSO4,0.1mM CaCl2和0.4%葡萄糖。在指明的情况下,根据补充物表中报告的水平添加培养基补充物。使菌株的过夜培养物一式三份在5mL LB(按需要添加抗生素)中生长。将1%(v/v)接种物引入5ml M9基本培养基的培养物中。当细胞达到指数中期后,将培养物稀释至OD600为大约0.200(即0.195-0.205)。进一步按1∶50稀释细胞,且10μL的等分试样用于接种96孔板的各孔(~104个细胞/孔)至100uL的总体积。板进行排列以在渐增的3-HP浓度(0至60g/L,增量5g/L)测定不同菌株的生长或生长状况。将板密封在含有用于厌氧条件的气体发生器的生物袋无氧室中,并在37℃下温育24小时。在24小时后记录最小抑制性3-HP浓度和对应于可见的细胞生长(OD~0.1)的最大3-HP浓度。对于MIC>60g/L的情况,在具有延伸的3-HP浓度(0-100g/L,增量5g/L)的板中进行测定。
枯草杆菌需氧
以96孔板的形式在需氧条件下测定最小抑制浓度(MIC)。将板设置为:当各单个孔在接种后达到100uL的终体积时,具有下列成分水平(对应于标准的M9培养基+补充的谷氨酸):47.7mM Na2HPO4,22mM KH2PO4,8.6mM NaCl,18.7mM NH4Cl,2mM MgSO4,0.1mM CaCl2,10mM谷氨酸和0.4%葡萄糖。在指定的情况中根据补充物表中报告的水平添加培养基补充物。使菌株的过夜培养物一式三份在5mL LB(按需要添加抗生素)中生长。将1%(v/v)接种物引入5ml M9基本培养基+谷氨酸的培养物中。当细胞达到指数中期后,将培养物稀释至OD600为大约0.200(即0.195-0.205)。进一步按1∶50稀释细胞,且10μL的等分试样用于接种96孔板的各孔(~104个细胞/孔)至100uL的总体积。板进行排列以在渐增的3-HP浓度(0至60g/L,增量5g/L)中测定不同菌株的生长或生长状况。将板在37℃下温育24小时。在24小时后记录最小抑制性3-HP浓度和对应于可见的细胞生长(OD~0.1)的最大3-HP浓度。对于MIC>60g/L的情况,在具有延伸的3-HP浓度(0-100g/L,增量5g/L)的板中进行测定。
钩虫贪铜菌(真氧产碱杆菌)需氧
以96孔板的形式在需氧条件下测定最小抑制浓度(MIC)。将板设置为:当各单个孔在接种后达到100uL终体积时,具有下列成分水平(对应于FGN培养基):21.5mM K2HPO4,8.5mM KH2PO4,18mM NH4Cl,12mM NaCl,7.3uM ZnCl,0.15uM MnCl2,4.85uM H3BO3,0.21uM CoCl2,0.41uM CuCl2,0.50uM NiCl2,0.12uM Na2MoO4,0.19uM CrCl3,0.06mM CaCl2,0.5mMMgSO4,0.06mM FeSO4,0.2%甘油,0.2%果糖。在指定的情况下,根据补充物表中报告的水平添加培养基补充物。使菌株的过夜培养物一式三份在5mLLB(按需要添加抗生素)中生长。将1%(v/v)接种物引入FGN培养基的5ml培养物中。当细胞达到指数中期后,将培养物稀释至OD600为大约0.200(即0.195-0.205)。进一步按1∶50稀释细胞,且10μL的等分试样用于接种96孔板的各个孔(~104个细胞/孔)至100uL的总体积。板进行排列以在渐增的3-HP浓度(0至60g/L,增量5g/L)中测定不同菌株的生长或生长状况。将板在30℃下温育24小时。在24小时后记录最小抑制性3-HP浓度和对应于可见的细胞生长(OD~0.1)的最大3-HP浓度。对于MIC>60g/L的情况,在具有延伸的3-HP浓度(0-100g/L,增量5g/L)的板中进行测定。
本文所述的实施方式、变化、顺序以及本文描述的附图应提供对本发明用途和多能性的指示。还可使用并未提供本文所述的全部特征和优点的其它实施方案而不脱离本发明的精神和范围。这样的修饰和变化被认为处于本发明的范围之内。
Claims (111)
1.一种用于制备基于丙烯酸的消费产品的方法,所述方法包括
i)将碳源与微生物细胞培养物结合用以制备3-羟基丙酸,其中
a)所述细胞培养物包含脂肪酸合成酶的抑制剂或所述微生物经遗传修饰导致所述生物体脂肪酸合成酶途径中降低的酶活性;或
b)其中所述微生物通过引入编码具有单功能丙二酰-CoA还原酶活性的多肽的外源核酸序列进行遗传修饰导致所述生物体的丙二酰-CoA还原酶(mcr)途径中提高的酶活性;或
c)所述3-羟基丙酸以高于0.05克每克微生物细胞干重每小时的单位生产率或以高于0.50克每升每小时的容积生产率产生;
ii)将所述3-羟基丙酸转化成为丙烯酸;以及
iii)将所述丙烯酸加工成为消费产品。
2.根据权利要求1所述的方法,其中所述碳源具有约1.0×10-14或更高的碳14与碳12比率。
3.根据权利要求1所述的方法,其中所述碳源主要是葡萄糖、蔗糖、果糖、右旋糖、乳糖或其组合。
4.根据权利要求1所述的方法,其中所述碳源是低于50%的甘油。
5.根据权利要求1所述的方法,其中所述细胞培养物包含脂肪酸合成酶的抑制剂或所述微生物经遗传修饰导致所述生物体脂肪酸合成酶途径中降低的酶活性。
6.根据权利要求5所述的方法,其中所述脂肪酸合成酶抑制剂选自硫乳霉素、三氯生、浅蓝菌素、噻吩并二氮杂硼杂因、异烟肼及其类似物。
7.根据权利要求1所述的方法,其中所述微生物通过引入编码具有单功能丙二酰-CoA还原酶活性的多肽的外源核酸序列进行遗传修饰导致所述生物体的丙二酰-CoA还原酶(mcr)途径中提高的酶活性。
8.根据权利要求7所述的方法,其中所述单功能丙二酰-CoA还原酶是非NADPH依赖的。
9.根据权利要求1所述的方法,其中以高于0.05克每克微生物细胞干重每小时的单位生产率或以高于0.05克每升每小时的容积生产率制备所述3-羟基丙酸。
10.根据权利要求9所述的方法,其中所述细胞培养物包含经遗传修饰的微生物。
11.根据权利要求10所述的方法,其中所述经遗传修饰的微生物可经修饰以具有选自以下的性状:所述生物体的脂肪酸合成酶途径中降低的酶活性、所述生物体的丙二酰-CoA还原酶途径中提高的酶活性、对3-羟基丙酸提高的耐受性、所述生物体的NADPH依赖性转氢酶途径中提高的酶活性、提高的细胞内重碳酸盐水平、所述生物体的乙酰CoA羧化酶途径中提高的酶活性及其组合。
12.根据权利要求11所述的方法,其中所述经遗传修饰的微生物经修饰导致所述生物体脂肪酸合成酶途径中降低的酶活性。
13.根据权利要求12所述的方法,其中所述降低的酶活性是选自以下的酶的酶活性降低:β-酮脂酰基-ACP还原酶、3-羟脂酰CoA脱水酶、烯酰基-ACP还原酶和硫酯酶。
14.根据权利要求12所述的方法,其中所述生物体的脂肪酸合成酶途径中所述降低的酶活性通过引入编码诱导型启动子的异源核酸序列而产生,所述启动子可操作地连接于编码所述脂肪酸合成酶途径中的酶或其同源物的序列,或者通过引入编码所述脂肪酸合成酶途径中具有降低活性的酶或其同源物的异源核酸序列而产生。
15.根据权利要求14所述的方法,其中所述脂肪酸合成酶途径中的酶或其同源物是具有温度敏感性β-酮脂酰基-ACP还原酶或温度敏感性烯酰基-ACP还原酶活性的多肽。
16.根据权利要求11所述的方法,其中经遗传修饰的微生物经修饰导致所述生物体丙二酰-CoA还原酶途径中提高的酶活性。
17.根据权利要求16所述的方法,其中所述丙二酰-CoA还原酶(mcr)途径中的酶活性的所述提高通过引入编码具有双功能丙二酰-CoA还原酶活性或单功能丙二酰-CoA还原酶活性的多肽的异源核酸序列而产生。
18.根据权利要求17所述的方法,其中所述异源核酸序列选自与选自SEQ ID NO.780-789的序列具有至少70%同源性的序列。
19.根据权利要求11所述的方法,其中所述经遗传修饰的微生物经修饰导致对3-羟基丙酸的提高的耐受性。
20.根据权利要求19所述的方法,其中所述对3-羟基丙酸耐受性的提高发生于3-HP耐受发生复合体(3HPTGC)复合物的一种或多种组分中,或者其中所述对3-羟基丙酸耐受性的提高由提供所述3HPTGC的A组和B组各自的至少一种遗传修饰而导致。
21.根据权利要求20所述的方法,其中所述一种或多种组分选自CynS、CynT、AroG、SpeD、SpeE、SpeF、ThrA、Asd、CysM、IroK、IlvA及其同源物。
22.根据权利要求20所述的方法,其中所述修饰是对一种或多种3HPTGC阻遏基因的破坏。
23.根据权利要求22所述的方法,其中所述阻遏基因选自tyrR、trpR、metJ、purR、lysR、nrdR及其同源物。
24.根据权利要求11所述的方法,其中所述生物体NADPH依赖性转氢酶途径中提高的酶活性通过引入编码与选自SEQ ID NO.776或778的序列具有至少70%同源性的多肽的异源核酸序列而产生。
25.根据权利要求11所述的方法,其中所述提高的细胞内重碳酸盐水平通过引入编码具有氰酸酶和/或碳酸酐酶活性的多肽的异源核酸序列而产生。
26.根据权利要求25所述的方法,其中所述异源核酸序列选自与选自SEQ ID NO.337的序列具有至少70%同源性的序列。
27.根据权利要求11所述的方法,其中所述生物体乙酰CoA羧化酶途径中提高的酶活性通过引入编码与选自SEQ ID NO.768-775的序列具有至少70%同源性的多肽的异源核酸序列而产生。
28.根据权利要求11所述的方法,其中所述经遗传修饰的细菌被进一步修饰以降低乳酸脱氢酶、磷酸乙酰转移酶、丙酮酸氧化酶或丙酮酸甲酸裂解酶及其组合的活性。
29.根据权利要求1所述的方法,其中在步骤(i)后,所述方法进一步包括通过在存在叔胺的情况下将3-羟基丙酸从所述培养物中提取而将3-羟基丙酸从所述细胞培养物中分离和/或纯化。
30.根据权利要求29所述的方法,其中所述3-羟基丙酸以高于0.05克每克微生物细胞干重每小时的单位生产率或以高于0.50克每升每小时的容积生产率产生。
31.根据权利要求1所述的方法,其中所述消费产品选自尿布、地毯、涂料、粘合剂和丙烯酸玻璃。
32.根据权利要求31所述的方法,其中所述消费产品是尿布。
33.生物产生的3-羟基丙酸,其中所述3-羟基丙酸根据权利要求1-32中任一项产生。
34.根据权利要求33所述的3-羟基丙酸,其中所述3-羟基丙酸基本上不含化学催化剂。
35.根据权利要求34所述的3-羟基丙酸,其中所述化学催化剂是基于钼和/或钒的催化剂。
36.根据权利要求33所述的3-羟基丙酸,其中所述3-羟基丙酸具有约1.0×10-14或更高的碳14与碳12比率。
37.根据权利要求33所述的3-羟基丙酸,其中所述3-羟基丙酸包含低于约10%的源自石油的碳。
38.根据权利要求33所述的3-羟基丙酸,其中所述3-羟基丙酸包含与其制备方法相关的残留量的有机物质。
39.根据权利要求38所述的3-羟基丙酸,其中所述3-羟基丙酸包含其量介于所述3-羟基丙酸的百万分之1与百万分之1,000之间的残留量有机物质。
40.一种丙烯酸,其由根据权利要求33-39中任一项的3-羟基丙酸制备。
41.一种聚合物,其使用根据权利要求40的丙烯酸制备。
42.一种消费产品,其使用根据权利要求40的丙烯酸制备。
43.根据权利要求42所述的消费产品,其中所述消费产品选自尿布、地毯、涂料、粘合剂和丙烯酸玻璃。
44.根据权利要求43所述的消费产品,其中所述消费产品是尿布。
45.一种用于生物生产权利要求40的丙烯酸的系统,所述系统包括:
对生物质进行糖化的罐;
用于将糖化产物输送至发酵罐的管线,任选地经过预发酵罐输送;
适用于微生物细胞培养的发酵罐;
用于从所述发酵罐将内容物排放至提取和/或分离容器的管线;
适用于将3-羟基丙酸从细胞培养物废料中移除的提取和/或分离容器;
用于将3-羟基丙酸转移至脱水容器中的管线;以及
适用于将3-羟基丙酸转化成为丙烯酸的脱水容器。
46.根据权利要求45所述的系统,其进一步包括一个或多个预发酵罐、蒸馏塔、离心容器、反萃取柱、混合容器或其组合。
47.根据权利要求45所述的系统,其中所述系统具有至少每年1吨丙烯酸的最低产能。
48.一种经遗传修饰的微生物,其中所述微生物能够以选自高于0.05g/gDCW-hr、0.08g/gDCW-hr、高于0.1g/gDCW-hr、高于0.13g/gDCW-hr、高于0.15g/gDCW-hr、高于0.175g/gDCW-hr、高于0.2g/gDCW-hr、高于0.25g/gDCW-hr、高于0.3g/gDCW-hr、高于0.35g/gDCW-hr、高于0.4g/gDCW-hr、高于0.45g/gDCW-hr或高于0.5g/gDCW-hr的速率的比速率产生3-羟基丙酸。
49.根据权利要求48所述的经遗传修饰的微生物,所述微生物包含提高丙二酰-CoA还原酶活性和乙酰CoA羧化酶活性的遗传修饰,和降低烯酰基-ACP还原酶活性、乳酸脱氢酶活性和乙酸激酶活性的遗传修饰。
50.根据权利要求48所述的经遗传修饰的微生物,所述微生物包含提高丙二酰-CoA还原酶活性和乙酰CoA羧化酶活性的遗传修饰,和降低烯酰基-ACP还原酶活性、乳酸脱氢酶活性和乙酰磷酸转移酶活性的遗传修饰。
51.根据权利要求48所述的经遗传修饰的微生物,所述微生物包含提高丙二酰-CoA还原酶活性和乙酰CoA羧化酶活性的遗传修饰,和降低烯酰基-ACP还原酶活性、乳酸脱氢酶活性、乙酸激酶活性和乙酰磷酸转移酶活性的遗传修饰。
52.根据权利要求48所述的经遗传修饰的微生物,所述微生物包含提高丙二酰-CoA还原酶活性和乙酰CoA羧化酶活性的遗传修饰,和降低烯酰基-ACP还原酶活性、乳酸脱氢酶活性和丙酮酸甲酸裂解酶活性的遗传修饰。
53.根据权利要求48所述的经遗传修饰的微生物,所述微生物包含提高丙二酰-CoA还原酶活性和乙酰CoA羧化酶活性的遗传修饰,和降低烯酰基-ACP还原酶活性、乳酸脱氢酶活性和丙酮酸氧化酶活性的遗传修饰。
54.根据权利要求48所述的经遗传修饰的微生物,所述微生物包含提高丙二酰-CoA还原酶活性和乙酰CoA羧化酶活性的遗传修饰,和降低烯酰基-ACP还原酶活性、乳酸脱氢酶活性和甲基乙二醛合成酶活性的遗传修饰。
55.根据权利要求48所述的经遗传修饰的微生物,所述微生物包含提高丙二酰-CoA还原酶活性和乙酰CoA羧化酶活性的遗传修饰,和提高β-酮脂酰基-ACP合成酶活性、乳酸脱氢酶活性和甲基乙二醛合成酶活性的遗传修饰。
56.根据权利要求48所述的经遗传修饰的微生物,所述微生物包含提高丙二酰-CoA还原酶活性和乙酰CoA羧化酶活性的遗传修饰,和降低烯酰基-ACP还原酶活性、鸟苷3′-二磷酸5′-三磷酸合成酶活性和鸟苷3′-二磷酸5′-二磷酸合成酶活性的遗传修饰。
57.根据权利要求48-56中任一项所述的经遗传修饰的微生物,其中进行了提高NADH/NADPH转氢酶活性的进一步的遗传修饰。
58.根据权利要求57所述的经遗传修饰的微生物,其中所述转氢酶活性是可溶的。
59.根据权利要求57所述的经遗传修饰的微生物,其中所述转氢酶活性是膜结合的。
60.根据权利要求48-59中任一项所述的经遗传修饰的微生物,其中进行了提高氰酸酶活性的进一步的遗传修饰。
61.根据权利要求48-60中任一项所述的经遗传修饰的微生物,其中进行了提高碳酸酐酶活性的进一步的遗传修饰。
62.根据权利要求48-60中任一项所述的经遗传修饰的微生物,其中进行了提高丙酮酸脱氢酶活性的进一步的遗传修饰。
63.据权利要求48-62中任一项所述的经遗传修饰的微生物,其中进行了降低鸟苷3′-二磷酸5′-三磷酸合成酶活性和鸟苷3′-二磷酸5′-二磷酸合成酶活性的进一步的遗传修饰。
64.根据权利要求48-63中任一项所述的经遗传修饰的微生物,其中进行了提高通气环境中NADH/NAD+比率的遗传修饰。
65.根据权利要求48-64中任一项所述的经遗传修饰的微生物,其中进行了降低β-酮脂酰基-ACP合成酶活性的遗传修饰。
66.根据权利要求48-65中任一项所述的经遗传修饰的微生物,其中进行了降低3-羟基丙酸还原酶活性的遗传修饰。
67.根据权利要求48-66中任一项所述的经遗传修饰的微生物,其中进行了降低NAD+依赖性3-羟基丙酸脱氢酶活性的遗传修饰。
68.根据权利要求48-67中任一项所述的经遗传修饰的微生物,其中进行了降低NAD+依赖性3-羟基丙酸脱氢酶活性的遗传修饰。
69.根据权利要求48-68中任一项所述的经遗传修饰的微生物,其中进行了提高对3-羟基丙酸的耐受性的遗传修饰。
70.根据权利要求48-69中任一项所述的经遗传修饰的微生物,其中导致对3-羟基丙酸的耐受性提高的所述遗传修饰提高了3-HP耐受发生复合体中任何酶的活性。
71.根据权利要求69-70中任一项所述的经遗传修饰的微生物,其中导致对3-羟基丙酸的耐受性提高的所述遗传修饰提高了丙酮酸脱氢酶活性。
72.根据权利要求69-70中任一项所述的经遗传修饰的微生物,其中导致对3-羟基丙酸的耐受性提高的所述遗传修饰提高了氰酸酶活性。
73.根据权利要求69-70中任一项所述的经遗传修饰的微生物,其中导致对3-羟基丙酸的耐受性提高的所述遗传修饰提高了碳酸酐酶活性。
74.根据权利要求69-70中任一项所述的经遗传修饰的微生物,其中导致对3-羟基丙酸的耐受性提高的所述遗传修饰提高了天冬氨酸激酶活性。
75.根据权利要求69-70中任一项所述的经遗传修饰的微生物,其中导致对3-羟基丙酸的耐受性提高的所述遗传修饰提高了苏氨酸脱水酶活性。
76.根据权利要求69-70中任一项所述的经遗传修饰的微生物,其中导致对3-羟基丙酸的耐受性提高的所述遗传修饰提高了2-脱氢-3-脱氧磷酸庚糖酸醛缩酶活性。
77.根据权利要求69-70中任一项所述的经遗传修饰的微生物,其中导致对3-羟基丙酸的耐受性提高的所述遗传修饰提高了半胱氨酸合成酶活性。
78.根据权利要求69-70中任一项所述的经遗传修饰的微生物,其中导致对3-羟基丙酸的耐受性提高的所述遗传修饰提高了核糖-磷酸二磷酸激酶活性。
79.根据权利要求69-70中任一项所述的经遗传修饰的微生物,其中导致对3-羟基丙酸的耐受性提高的所述遗传修饰提高了核糖核苷-二磷酸还原酶活性。
80.根据权利要求69-70中任一项所述的经遗传修饰的微生物,其中导致对3-羟基丙酸的耐受性提高的所述遗传修饰提高了L-半胱氨酸脱巯基酶活性。
81.根据权利要求69-70中任一项所述的经遗传修饰的微生物,其中导致对3-羟基丙酸的耐受性提高的所述遗传修饰提高了赖氨酸脱羧酶活性,或者其中导致对3-羟基丙酸的耐受性提高的所述遗传修饰提高了同型半胱氨酸甲基转移酶活性。
82.根据权利要求69-70中任一项所述的经遗传修饰的微生物,其中导致对3-羟基丙酸的耐受性提高的所述遗传修饰提高了二氢叶酸还原酶活性。
84.根据权利要求69-70中任一项所述的经遗传修饰的微生物,其中导致对3-羟基丙酸的耐受性提高的所述遗传修饰提高了N-乙酰谷氨酰磷酸还原酶活性。
85.根据权利要求69-70中任一项所述的经遗传修饰的微生物,其中导致对3-羟基丙酸的耐受性提高的所述遗传修饰提高了乙酰谷氨酸激酶活性。
86.根据权利要求69-70中任一项所述的经遗传修饰的微生物,其中导致对3-羟基丙酸的耐受性提高的所述遗传修饰提高了精氨基琥珀酸裂解酶活性。
87.根据权利要求69-70中任一项所述的经遗传修饰的微生物,其中导致对3-羟基丙酸的耐受性提高的所述遗传修饰提高了乙酰鸟氨酸脱乙酰基酶活性。
88.根据权利要求69-70中任一项所述的经遗传修饰的微生物,其中导致对3-羟基丙酸的耐受性提高的所述遗传修饰提高了分支酸变位酶活性。
89.根据权利要求69-70中任一项所述的经遗传修饰的微生物,其中导致对3-羟基丙酸的耐受性提高的所述遗传修饰提高了预苯酸脱水酶活性。
90.根据权利要求69-70中任一项所述的经遗传修饰的微生物,其中导致对3-羟基丙酸的耐受性提高的所述遗传修饰提高了预苯酸脱氢酶活性。
91.根据权利要求69-70中任一项所述的经遗传修饰的微生物,其中导致对3-羟基丙酸的耐受性提高的所述遗传修饰提高了2-脱氢-3-脱氧磷酸庚糖酸醛缩酶活性。
92.根据权利要求69-70中任一项所述的经遗传修饰的微生物,其中导致对3-羟基丙酸的耐受性提高的所述遗传修饰提高了D-3-磷酸甘油酸脱氢酶活性。
93.一种包含处于水性介质中的碳源以及根据权利要求48-92中任一项的经遗传修饰的微生物的培养系统,其中所述经遗传修饰微生物以选自高于0.05gDCW/L、0.1gDCW/L、高于1gDCW/L、高于5gDCW/L、高于10gDCW/L、高于15gDCW/L或高于20gDCW/L的量存在。
94.根据权利要求93所述的培养系统,其中所述水性介质的体积选自高于5mL、高于100mL、高于0.5L、高于1L、高于2L、高于10L、高于250L、高于1000L、高于10,000L、高于50,000L、高于100,000L或高于200,000L。
95.根据权利要求93-94中任一项所述的培养系统,其中所述水性介质的体积高于250L并且容纳于钢质容器中。
96.根据权利要求93-95中任一项所述的培养系统,其中所述碳源选自右旋糖、蔗糖、戊糖、多元醇、己糖、己糖和戊糖两者,及其组合。
97.根据权利要求93-96中任一项所述的培养系统,其中所述水性介质的pH低于7.5。
98.根据权利要求93-97中任一项所述的培养系统,其中所述培养系统是通气的。
99.根据权利要求98所述的培养系统,其中所述培养系统通气以具有选自以下的氧转移速度
i)高于5毫摩尔/L-hr的氧和低于200毫摩尔/L-hr的氧;
ii)高于5毫摩尔/L-hr的氧和低于100毫摩尔/L-hr的氧;
iii)高于5毫摩尔/L-hr的氧和低于80毫摩尔/L-hr的氧;和
iv)高于5毫摩尔/L-hr的氧和低于50毫摩尔/L-hr的氧。
100.一种由根据权利要求93-99中任一项的培养系统获得的水性培养液,其中所述水性培养液包含
i)选自高于5g/L、高于10g/L、高于15g/L、高于20g/L、高于25g/L、高于30g/L、高于35g/L、高于40g/L、高于50g/L、高于60g/L、高于70g/L、高于80g/L、高于90g/L或高于100g/L的3-羟基丙酸的浓度的3-羟基丙酸;以及
ii)选自低于30g/L、低于20g/L、低于10g/L、低于5g/L、低于1g/L或低于0.5g/L的浓度的1,3-丙二醇。
101.根据权利要求100的水性培养液,其中所述水性培养液包含选自低于20gDCW/L生物质、低于15gDCW/L生物质、低于10gDCW/L生物质、低于5gDCW/L生物质或低于1gDCW/L生物质的量的生物质。
102.根据权利要求100的水性培养液,其中3-HP/琥珀酸比率(g3-HP/g琥珀酸)高于3、高于10、高于30、高于60、高于100、高于150或高于200。
103.根据权利要求100的水性培养液,其中3-HP/延胡索酸比率(g3-HP/g延胡索酸)高于3、高于10、高于30、高于60、高于100、高于150或高于200。
104.根据权利要求100的水性培养液,其中3-HP/甘油比率(g 3-HP/g甘油)高于3、高于10、高于30、高于60、高于100、高于150或高于200。
105.根据权利要求100的水性培养液,其中3-HP/乙酸比率(g 3-HP/g乙酸)高于1.5、高于3、高于10、高于30、高于60、高于100、高于150或高于200。
106.根据权利要求100的水性培养液,其中所述3-HP/丙氨酸比率(g 3-HP/g丙氨酸)高于3、高于10、高于30、高于60、高于100、高于150或高于200。
107.根据权利要求100的水性培养液,其中3-HP/β-丙氨酸比率(g3-HP/g β-丙氨酸)高于1.5、高于3、高于10、高于30、高于60、高于100、高于150或高于200。
108.根据权利要求100的水性培养液,其中3-HP/谷氨酸比率(g3-HP/g谷氨酸)高于3、高于10、高于30、高于60、高于100、高于150或高于200。
109.根据权利要求100的水性培养液,其中3-HP/谷氨酰胺比率(g3-HP/g谷氨酰胺)高于3、高于10、高于30、高于60、高于100、高于150或高于200。
110.根据权利要求100的水性培养液,其中3-HP/3-羟基丙醛比率(g3-HP/g 3-羟基丙醛)高于1.5、高于3、高于10、高于30、高于60、高于100、高于150或高于200。
111.根据权利要求100的水性培养液,其中3-HP/1,3-丙二醇比率(g1,3-HP/g 1,3-丙二醇)高于1.5、高于3、高于10、高于30、高于60、高于100、高于150或高于200。
112.根据权利要求100的水性培养液,其中3-HP/乳酸比率(g1,3-HP/g乳酸)高于1.5、高于3、高于10、高于30、高于60、高于100、高于150或高于200。
Applications Claiming Priority (7)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US24614109P | 2009-09-27 | 2009-09-27 | |
US61/246,141 | 2009-09-27 | ||
US29884410P | 2010-01-27 | 2010-01-27 | |
US61/298,844 | 2010-01-27 | ||
US32148010P | 2010-04-06 | 2010-04-06 | |
US61/321,480 | 2010-04-06 | ||
PCT/US2010/050436 WO2011038364A1 (en) | 2009-09-27 | 2010-09-27 | Method for producing 3-hydroxypropionic acid and other products |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN102695799A true CN102695799A (zh) | 2012-09-26 |
Family
ID=43127955
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN2010800536926A Pending CN102695799A (zh) | 2009-09-27 | 2010-09-27 | 用于制备3-羟基丙酸和其它产物的方法 |
Country Status (11)
Country | Link |
---|---|
US (5) | US8883464B2 (zh) |
EP (1) | EP2480673B1 (zh) |
JP (4) | JP2013505727A (zh) |
KR (1) | KR20140015136A (zh) |
CN (1) | CN102695799A (zh) |
AU (1) | AU2010298004B2 (zh) |
BR (1) | BR112012006801A2 (zh) |
CA (1) | CA2775390C (zh) |
GB (2) | GB2487866A (zh) |
MX (1) | MX2012003604A (zh) |
WO (1) | WO2011038364A1 (zh) |
Cited By (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN103805641A (zh) * | 2014-01-24 | 2014-05-21 | 武汉大学 | 一种在微生物体内固定二氧化碳生产3-羟基丙酸、丙烯酸和丙酸的方法 |
CN104946576A (zh) * | 2015-04-27 | 2015-09-30 | 中国科学院过程工程研究所 | 大肠杆菌基因工程菌及其构建方法和在生产丙酮酸中的应用 |
CN105051189A (zh) * | 2013-01-16 | 2015-11-11 | Reg生命科学有限责任公司 | 具有改善特性的酰基-acp还原酶 |
CN106350474A (zh) * | 2015-07-13 | 2017-01-25 | Sk新技术株式会社 | 包含编码甲基丙二酰‑CoA还原酶的基因的突变微生物及其用途 |
WO2018188617A1 (zh) * | 2017-04-14 | 2018-10-18 | 中国科学院微生物研究所 | 产3-羟基丙酸的重组菌及其制备方法与应用 |
CN113278537A (zh) * | 2021-06-15 | 2021-08-20 | 天津科技大学 | 系列低产高级醇酿酒酵母及其构建方法与应用 |
CN115216194A (zh) * | 2022-08-24 | 2022-10-21 | 中国科学院兰州化学物理研究所 | 一种包埋花椒粉碎物自抛光防污涂料及其制备方法和应用 |
Families Citing this family (75)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US8048624B1 (en) | 2007-12-04 | 2011-11-01 | Opx Biotechnologies, Inc. | Compositions and methods for 3-hydroxypropionate bio-production from biomass |
US8647642B2 (en) | 2008-09-18 | 2014-02-11 | Aviex Technologies, Llc | Live bacterial vaccines resistant to carbon dioxide (CO2), acidic PH and/or osmolarity for viral infection prophylaxis or treatment |
CN102695799A (zh) * | 2009-09-27 | 2012-09-26 | Opx生物工艺学公司 | 用于制备3-羟基丙酸和其它产物的方法 |
US8809027B1 (en) | 2009-09-27 | 2014-08-19 | Opx Biotechnologies, Inc. | Genetically modified organisms for increased microbial production of 3-hydroxypropionic acid involving an oxaloacetate alpha-decarboxylase |
BR112012009658B1 (pt) * | 2009-10-29 | 2018-06-19 | Kochi University | Método para a sintetização de ácido carboxílico insaturado e/ou seu derivado |
WO2011063363A2 (en) * | 2009-11-20 | 2011-05-26 | Opx Biotechnologies, Inc. | Production of an organic acid and/or related chemicals |
CA2788811A1 (en) | 2010-02-11 | 2011-08-18 | Metabolix, Inc. | Process for gamma-butyrolactone production |
CA2818499A1 (en) | 2010-11-22 | 2012-06-07 | Novozymes, Inc. | Compositions and methods for 3-hydroxypropionic acid production |
EP3385388A1 (en) * | 2011-03-22 | 2018-10-10 | OPX Biotechnologies Inc. | Microbial production of chemical products and related compositions, methods and systems |
BR112014005352A2 (pt) * | 2011-09-08 | 2017-03-28 | Genomatica Inc | organismos eucarióticos e métodos para aumentar a disponibilidade de acetil-coa citosólico e para produzir 1,3-butanodiol |
DK2751261T3 (en) * | 2011-09-30 | 2018-12-10 | Novozymes Inc | Dehydrogenase variants and polynucleotides encoding them |
DE102012004497A1 (de) | 2012-03-06 | 2013-09-12 | Gea Mechanical Equipment Gmbh | Verfahren und Anlage zur Aufarbeitung von Rohgülle und/oder Gärresten aus der Biogaserzeugung |
JPWO2013137277A1 (ja) * | 2012-03-14 | 2015-08-03 | 株式会社日本触媒 | 3−ヒドロキシプロピオン酸の製造方法、遺伝子組換え微生物、並びに前記方法を利用したアクリル酸、吸水性樹脂、アクリル酸エステル、およびアクリル酸エステル樹脂の製造方法 |
CN104364358A (zh) * | 2012-04-09 | 2015-02-18 | Bp生物燃料英国有限公司 | 用于生产生物燃料和其他可再生材料的低多糖微生物 |
DE102012207921A1 (de) | 2012-05-11 | 2013-11-14 | Evonik Industries Ag | Mehrstufiges Syntheseverfahren mit Synthesegas |
BR112014030203B1 (pt) | 2012-06-08 | 2021-10-13 | Cj Cheiljedang Corporation | Processo para produção de produtos de ácido acrílico de base biológica |
US20130345470A1 (en) * | 2012-06-20 | 2013-12-26 | Opx Biotechnologies, Inc. | Purification of 3-Hydroxypropionic Acid from Crude Cell Broth and Production of Acrylamide |
WO2013192451A1 (en) * | 2012-06-20 | 2013-12-27 | Opx Biotechnologies, Inc. | Dehydration of 3-hydroxypropionic acid to acrylic acid |
US20140051136A1 (en) | 2012-08-10 | 2014-02-20 | Opx Biotechnologies, Inc. | Micoorganisms and Methods for the Production of Fatty Acids and Fatty Acid Derived Products |
US9365875B2 (en) | 2012-11-30 | 2016-06-14 | Novozymes, Inc. | 3-hydroxypropionic acid production by recombinant yeasts |
US20150044746A1 (en) * | 2013-03-15 | 2015-02-12 | Opx Biotechnologies, Inc. | Method of enhanced bioproduction |
BR112015023474B1 (pt) | 2013-03-15 | 2020-10-06 | Cargill, Incorporated | Método para recuperar uma composição enriquecida em ácido 3-hidroxipropiônico |
US9499465B2 (en) | 2013-03-15 | 2016-11-22 | Board Of Trustees Of Michigan State University | Synthesis of biobased and substituted terephthalic acids and isophthalic acids |
WO2014145334A1 (en) * | 2013-03-15 | 2014-09-18 | Opx Biotechnologies, Inc. | Acetyl-coa carboxylase mutations |
CA2905602A1 (en) * | 2013-03-15 | 2014-09-18 | Sarah M. Hoyt | Flash evaporation for product purification and recovery |
WO2014146026A1 (en) | 2013-03-15 | 2014-09-18 | Opx Biotechnologies, Inc. | Bioproduction of chemicals |
US10077455B2 (en) | 2013-06-14 | 2018-09-18 | Technical University Of Denmark | 3HP tolerance |
WO2014210535A2 (en) * | 2013-06-28 | 2014-12-31 | Metabolix, Inc. | Genetically engineered methylotrophs for the production of pha biopolymers and c3, c4, and c5 biochemicals from methanol or methane as sole carbon feedstock |
JP6603658B2 (ja) * | 2013-07-19 | 2019-11-06 | カーギル インコーポレイテッド | 脂肪酸及び脂肪酸誘導体の製造のための微生物及び方法 |
US11408013B2 (en) | 2013-07-19 | 2022-08-09 | Cargill, Incorporated | Microorganisms and methods for the production of fatty acids and fatty acid derived products |
US9688977B2 (en) * | 2013-08-05 | 2017-06-27 | Greenlight Biosciences, Inc. | Engineered phosphoglucose isomerase proteins with a protease cleavage site |
KR20150018227A (ko) * | 2013-08-09 | 2015-02-23 | 삼성전자주식회사 | 외인성 푸마라아제 유전자를 포함하는 코리네박테리움 및 이를 이용한 c4 디카르복실산의 생산 방법 |
EP3057931B1 (en) | 2013-10-17 | 2019-03-06 | Dow Global Technologies LLC | Ammonium bisulfate catalyzed dehydration of beta-hydroxy acids |
CA2948382A1 (en) | 2014-06-11 | 2016-04-07 | Duke University | Compositions and methods for rapid and dynamic flux control using synthetic metabolic valves |
BR112017004069B1 (pt) | 2014-08-29 | 2024-02-06 | Sk Innovation Co., Ltd | Levedura recombinante produzindo ácido 3-hidroxipropiônico e método para produzir ácido 3-hidroxipropiônico usando o mesmo |
EP2993228B1 (en) | 2014-09-02 | 2019-10-09 | Cargill, Incorporated | Production of fatty acid esters |
WO2016036872A1 (en) * | 2014-09-03 | 2016-03-10 | Ciris Energy, Inc. | Production of 3-hydroxypropionic acid from carbonaceous material |
MX2017007215A (es) * | 2014-12-02 | 2018-01-30 | Archer Daniels Midland Co | Procedimiento para la elaborar acido acrilico a partir de dextrosa. |
EP3297666B1 (en) | 2015-05-22 | 2019-07-03 | Consejo Superior De Investigaciones Científicas | Molecular adjuvant and vaccine |
WO2016196962A1 (en) * | 2015-06-04 | 2016-12-08 | Bioamber Inc. | Biobased production of functionalized alpha-substituted acrylates and c4-dicarboxylates |
MY194187A (en) | 2015-06-11 | 2022-11-18 | Noroo Ic Co Ltd | Promoter system inducing expression by 3-hydroxypropionic acid and method for biological production of 3-hydroxypropionic acid using same |
WO2016200239A1 (ko) * | 2015-06-11 | 2016-12-15 | 부산대학교 산학협력단 | 3-하이드록시프로피온산에 의해 발현이 유도되는 프로모터 시스템 및 이를 이용한 3-하이드록시프로피온산의 생물학적 생산방법 |
US11208649B2 (en) | 2015-12-07 | 2021-12-28 | Zymergen Inc. | HTP genomic engineering platform |
US11293029B2 (en) | 2015-12-07 | 2022-04-05 | Zymergen Inc. | Promoters from Corynebacterium glutamicum |
US9988624B2 (en) | 2015-12-07 | 2018-06-05 | Zymergen Inc. | Microbial strain improvement by a HTP genomic engineering platform |
KR102547252B1 (ko) * | 2016-01-08 | 2023-06-23 | 에스케이이노베이션 주식회사 | 유기물질 기상탈수반응 원료의 제조방법 |
KR101828551B1 (ko) * | 2016-01-11 | 2018-02-13 | 한국과학기술원 | 말론산 생성능을 가지는 재조합 변이미생물 및 이를 이용한 말론산의 제조방법 |
US11103547B2 (en) * | 2016-02-04 | 2021-08-31 | Yissum Research Development Company Of The Hebrew University Of Jerusalem Ltd. | Methods for disrupting biofilms |
EP3416941A4 (en) | 2016-02-19 | 2019-10-16 | Alliance for Sustainable Energy, LLC | SYSTEMS AND METHODS FOR PRODUCING NITRILES |
WO2017223569A1 (en) * | 2016-06-24 | 2017-12-28 | The Regents Of The University Of California | Host cells and methods for producing hydroxytyrosol |
KR102345898B1 (ko) | 2016-06-30 | 2022-01-03 | 지머젠 인코포레이티드 | 글루코오스 투과 효소 라이브러리를 생성하는 방법 및 이의 용도 |
US10544390B2 (en) | 2016-06-30 | 2020-01-28 | Zymergen Inc. | Methods for generating a bacterial hemoglobin library and uses thereof |
US11180535B1 (en) | 2016-12-07 | 2021-11-23 | David Gordon Bermudes | Saccharide binding, tumor penetration, and cytotoxic antitumor chimeric peptides from therapeutic bacteria |
US11129906B1 (en) | 2016-12-07 | 2021-09-28 | David Gordon Bermudes | Chimeric protein toxins for expression by therapeutic bacteria |
US20190323019A1 (en) * | 2016-12-21 | 2019-10-24 | Yi-Hua Hsu | Composition for editing a nucleic acid sequence and method using the same |
EP3577227A4 (en) | 2017-02-02 | 2020-12-30 | Cargill Inc. | GENETICALLY MODIFIED CELLS PRODUCING C6-C10 FATTY ACID DERIVATIVES |
CN108728469B (zh) * | 2017-04-14 | 2022-03-01 | 中国科学院微生物研究所 | 重组大肠杆菌工程菌的构建及其在生产β-丙氨酸中的应用 |
KR102418589B1 (ko) * | 2018-01-10 | 2022-07-06 | 주식회사 엘지화학 | 3-하이드록시프로피온산 회수 방법 |
US20190233853A1 (en) * | 2018-02-01 | 2019-08-01 | Invista North America S.A.R.L. | Methods and materials for the biosynthesis of beta hydroxy acids and/or derivatives thereof and/or compounds related thereto |
WO2019152754A1 (en) * | 2018-02-01 | 2019-08-08 | Invista North America S.A.R.L. | Methods and materials for the biosynthesis of beta hydroxy acids and derivatives and compounds related thereto |
KR102419608B1 (ko) * | 2018-02-08 | 2022-07-08 | 주식회사 엘지화학 | 고농도 3-하이드록시프로피온산 수용액의 제조 방법 |
KR102519456B1 (ko) * | 2018-03-15 | 2023-04-06 | 주식회사 엘지화학 | 미생물을 이용한 폴리(3-하이드록시프로피오네이트-b-락테이트) 블록공중합체 |
KR102140596B1 (ko) | 2018-04-17 | 2020-08-04 | 에스케이이노베이션 주식회사 | 유기산 내성 효모 유래 신규 프로모터 및 이를 이용한 목적유전자의 발현방법 |
RU2687135C1 (ru) * | 2018-10-02 | 2019-05-07 | Общество с ограниченной ответственностью "ГИПРОБИОСИНТЕЗ" | Штамм гетеротрофных бактерий Cupriavidus gilardii - ассоциант для получения микробной белковой массы |
BR112021011629A2 (pt) | 2018-12-18 | 2021-09-08 | Braskem S.A. | Via de coprodução de derivados de 3-hp e acetil-coa a partir de malonato semialdeído |
CN109593697B (zh) * | 2018-12-18 | 2022-07-12 | 江苏师范大学 | 一种产3-羟基丙酸的重组假单胞菌及其构建方法 |
BR112021011954A2 (pt) * | 2018-12-18 | 2021-10-13 | Alderys | Leveduras que produzem semi-aldeído malônico |
CN114008070A (zh) * | 2019-06-21 | 2022-02-01 | 因思科瑞普特公司 | 导致大肠杆菌赖氨酸产量增加的全基因组合理设计的突变 |
KR20210041903A (ko) | 2019-10-08 | 2021-04-16 | 에스케이이노베이션 주식회사 | 락테이트 대사 및 알코올 생성이 억제된 재조합 내산성 효모 및 이를 이용한 젖산의 제조방법 |
KR20210158676A (ko) | 2020-06-24 | 2021-12-31 | 에스케이이노베이션 주식회사 | 젖산 생산능이 증가된 재조합 내산성 효모 |
EP4328216A1 (en) * | 2021-11-29 | 2024-02-28 | LG Chem, Ltd. | Crystal of 3-hydroxypropionic acid salt, method for producing same, and process for recovering 3-hydroxypropionic acid |
WO2023096366A1 (ko) * | 2021-11-29 | 2023-06-01 | 주식회사 엘지화학 | 3-하이드록시프로피온산의 회수 공정 및 3-하이드록시프로피온산 포함 슬러리 조성물 |
WO2023096457A1 (ko) * | 2021-11-29 | 2023-06-01 | 주식회사 엘지화학 | 알카리 금속염의 수화물 및 3-하이드록시프로피온산의 회수 공정 |
US20240141394A1 (en) * | 2021-11-29 | 2024-05-02 | Lg Chem, Ltd. | Process of recovering 3-hydroxypropionic acid and slurry composition comprising 3-hydroxypropionic acid |
CN116732081B (zh) * | 2023-08-07 | 2023-12-29 | 中国科学院天津工业生物技术研究所 | 一种提高枯草芽孢杆菌合成七烯甲萘醌的方法、获得重组菌株及其应用 |
Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20070245431A1 (en) * | 2006-03-15 | 2007-10-18 | Martek Biosciences Corporation | Polyunsaturated fatty acid production in heterologous organisms using pufa polyketide synthase systems |
US20080076167A1 (en) * | 2000-11-20 | 2008-03-27 | Cargill, Incorporated | 3-hydroxypropionic acid and other organic compounds |
Family Cites Families (168)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US2408889A (en) | 1946-10-08 | Production of organic compounds | ||
US2469701A (en) | 1946-02-13 | 1949-05-10 | American Cyanamid Co | Preparation of acrylic acid |
US2464768A (en) | 1946-02-13 | 1949-03-15 | American Cyanamid Co | Preparation of esters of acrylic acid |
US2798053A (en) | 1952-09-03 | 1957-07-02 | Goodrich Co B F | Carboxylic polymers |
US3904685A (en) | 1973-07-20 | 1975-09-09 | Celanese Corp | Polyacrylic acid having high chelation value and its production |
US3915921A (en) | 1974-07-02 | 1975-10-28 | Goodrich Co B F | Unsaturated carboxylic acid-long chain alkyl ester copolymers and tri-polymers water thickening agents and emulsifiers |
US4029577A (en) | 1975-11-17 | 1977-06-14 | Betz Laboratories, Inc. | Polymers for use in water treatment |
DE2757329C2 (de) | 1977-12-22 | 1980-02-07 | Basf Ag, 6700 Ludwigshafen | Verfahren zur Herstellung von Polymerisaten der Acrylsäure oder Methacrylsäure |
US4268641A (en) | 1979-04-24 | 1981-05-19 | Union Carbide Corporation | Acrylic acid-acrylate copolymer thickening agents |
US4431547A (en) | 1981-08-24 | 1984-02-14 | Nalco Chemical Company | Use of acrylamide/acrylic acid copolymers for prevention of fouling by Ca3 (PO4)2 |
US4985518A (en) | 1981-10-26 | 1991-01-15 | American Colloid Company | Process for preparing water-absorbing resins |
JPS58180233A (ja) | 1982-04-19 | 1983-10-21 | Nippon Shokubai Kagaku Kogyo Co Ltd | 吸収剤 |
US4685915A (en) | 1984-04-06 | 1987-08-11 | The Procter & Gamble Company | Disposable diaper having density and basis weight profiled absorbent core |
US4734478A (en) | 1984-07-02 | 1988-03-29 | Nippon Shokubai Kagaku Kogyo Co., Ltd. | Water absorbing agent |
US4708997A (en) | 1985-07-22 | 1987-11-24 | The Dow Chemical Company | Suspending agent for the suspension polymerization of water-soluble monomers |
DE3544770A1 (de) | 1985-12-18 | 1987-06-19 | Stockhausen Chem Fab Gmbh | Verfahren und vorrichtung zum kontinuierlichen herstellen von polymerisaten und copolymerisaten der acrylsaeure und/oder methacrylsaeure |
US5009653A (en) | 1988-03-31 | 1991-04-23 | The Procter & Gamble Company | Thin, flexible sanitary napkin |
US5135677A (en) | 1988-04-11 | 1992-08-04 | Nippon Shokubai Co., Ltd. | Process for producing acid-type maleic acid polymer and water-treating agent and detergent additive containing said polymer |
US4952505A (en) | 1988-08-08 | 1990-08-28 | Florida State University | Fermentation of trichoderma reesei and apparatus therefor |
IT1229506B (it) | 1989-01-26 | 1991-09-03 | Sigma Prodotti Chimici Srl | Polimero dell'acido acrilico esente da solventi residui e procedimento per la sua preparazione. |
US5252474A (en) | 1989-03-31 | 1993-10-12 | Merck & Co., Inc. | Cloning genes from Streptomyces avermitilis for avermectin biosynthesis and the methods for their use |
US5145906A (en) | 1989-09-28 | 1992-09-08 | Hoechst Celanese Corporation | Super-absorbent polymer having improved absorbency properties |
JP2938920B2 (ja) | 1990-01-31 | 1999-08-25 | 住友精化株式会社 | 吸水性樹脂の製造方法 |
US5350799A (en) | 1990-05-31 | 1994-09-27 | Hoechst Celanese Corporation | Process for the conversion of fine superabsorbent polymer particles into larger particles |
US5342899A (en) | 1991-05-16 | 1994-08-30 | The Dow Chemical Company | Process for recycling aqueous fluid absorbents fines to a polymerizer |
DE4138408A1 (de) | 1991-11-22 | 1993-05-27 | Cassella Ag | Hydrophile, hochquellfaehige hydrogele |
CA2083346A1 (en) | 1991-12-13 | 1993-06-14 | Eric G. Lundquist | A catalyzed esterification process |
US5142023A (en) | 1992-01-24 | 1992-08-25 | Cargill, Incorporated | Continuous process for manufacture of lactide polymers with controlled optical purity |
US5827255A (en) | 1992-07-27 | 1998-10-27 | The Procter & Gamble Company | Sanitary napkin comprising an absorbent core having a density gradient |
US5405913A (en) | 1993-03-22 | 1995-04-11 | The University Of Akron | Free radical copper(II)-enolate polymerization initiators |
US5510307A (en) | 1993-04-08 | 1996-04-23 | Isp Investments Inc. | Free radical initiator delivery system |
US5510526A (en) | 1993-06-29 | 1996-04-23 | Cargill, Incorporated | Lactic acid production, separation and/or recovery process |
CZ289051B6 (cs) | 1993-08-24 | 2001-10-17 | Ajinomoto Co. Inc. | Mutanta karboxylázy fosfoenolpyrohroznanu, kódový řetězec pro tuto mutantu, produkční mikroorganismus a způsob výroby aminokyseliny |
US5487987A (en) | 1993-09-16 | 1996-01-30 | Purdue Research Foundation | Synthesis of adipic acid from biomass-derived carbon sources |
US5558656A (en) | 1993-12-20 | 1996-09-24 | The Procter & Gamble Company | Sanitary napkin having an internal shaping component |
US5723639A (en) | 1995-10-16 | 1998-03-03 | University Of Chicago | Esterification of fermentation-derived acids via pervaporation |
DE19629372A1 (de) | 1996-07-20 | 1998-01-22 | Degussa | Verfahren zur Herstellung von Malonsäure oder einem Salz derselben |
WO1998021339A1 (en) | 1996-11-13 | 1998-05-22 | E.I. Du Pont De Nemours And Company | Method for the production of 1,3-propanediol by recombinant organisms |
SK285201B6 (sk) | 1996-12-05 | 2006-08-03 | Ajinomoto Co., Inc. | Rekombinantná DNA, autonómne reprodukovaná v bunkách koryneformnej baktérie, koryneformná baktéria a spôsob výroby L-lyzínu, vektor pVK7 |
US6087140A (en) * | 1997-02-19 | 2000-07-11 | Wisconsin Alumni Research Foundation | Microbial production of 1,2-propanediol from sugar |
US7125938B2 (en) | 1997-03-11 | 2006-10-24 | Carnegie Mellon University | Atom or group transfer radical polymerization |
US6566583B1 (en) | 1997-06-04 | 2003-05-20 | Daniel Facciotti | Schizochytrium PKS genes |
BE1011197A3 (fr) | 1997-06-06 | 1999-06-01 | Brussels Biotech En Abrege Bb | Procede de purification d'acide lactique. |
US6229046B1 (en) | 1997-10-14 | 2001-05-08 | Cargill, Incorported | Lactic acid processing methods arrangements and products |
KR100250830B1 (ko) | 1997-12-09 | 2000-04-01 | 성재갑 | 자가분해에 의해 폴리하이드록시알킨산으로부터 광학활성을 가진 단량체 하이드록시카르복실산의 제조방법 |
JP4913929B2 (ja) | 1998-06-12 | 2012-04-11 | 味の素株式会社 | 核酸系物質の製造法 |
WO2000008198A1 (en) | 1998-08-04 | 2000-02-17 | Metabolix, Inc. | Polyhydroxyalkanoate production from polyols |
RU2203269C2 (ru) | 1998-10-30 | 2003-04-27 | Каталитик Дистиллейшн Текнолоджиз | Получение амидов и/или кислот из нитрилов |
EP0999238B1 (en) | 1998-11-05 | 2008-07-09 | Nippon Shokubai Co., Ltd. | Water-absorbing agent and production process therefor |
US6410301B1 (en) | 1998-11-20 | 2002-06-25 | Kosan Biosciences, Inc. | Myxococcus host cells for the production of epothilones |
JP2002540090A (ja) | 1999-03-22 | 2002-11-26 | ピユラク・バイオケム・ベー・ブイ | 乳酸を産業規模で精製する方法 |
US6750049B1 (en) | 1999-03-23 | 2004-06-15 | Board Of Trustees Operating Michigan State University | Synthesis of 1,2,3,4-tetrahydroxybenzenes and 1,2,3-trihydroxybenzenes using myo-inositol-1-phosphate synthase and myo-inositol 2-dehydrogenase |
US6852517B1 (en) | 1999-08-30 | 2005-02-08 | Wisconsin Alumni Research Foundation | Production of 3-hydroxypropionic acid in recombinant organisms |
EP1124979B1 (en) | 1999-08-30 | 2006-08-30 | Wisconsin Alumni Research Foundation | Production of 3-hydroxypropionic acid in recombinant organisms |
ATE319848T1 (de) | 1999-10-25 | 2006-03-15 | Kosan Biosciences Inc | Herstellung von polyketiden |
US6531291B1 (en) | 1999-11-10 | 2003-03-11 | The Trustees Of Columbia University In The City Of New York | Antimicrobial activity of gemfibrozil and related compounds and derivatives and metabolites thereof |
WO2001038284A1 (en) | 1999-11-24 | 2001-05-31 | Cargill Dow Llc | Improved lactic acid processing; methods; arrangements; and, products |
NL1013682C2 (nl) | 1999-11-26 | 2001-05-30 | Purac Biochem Bv | Werkwijze en inrichting voor het zuiveren van een waterige oplossing van melkzuur. |
US6613553B1 (en) * | 2000-02-04 | 2003-09-02 | St. Jude Children's Research Hospital | Enoyl reductases and methods of use thereof |
RU2212447C2 (ru) | 2000-04-26 | 2003-09-20 | Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" | Штамм escherichia coli - продуцент аминокислоты (варианты) и способ получения аминокислот (варианты) |
US20020164729A1 (en) | 2000-07-21 | 2002-11-07 | Skraly Frank A. | Production of polyhydroxyalkanoates from polyols |
CA2322105A1 (en) | 2000-10-23 | 2002-04-23 | Plant Bioscience Limited | Antibiotic production (ii) |
US6623944B2 (en) | 2001-03-14 | 2003-09-23 | Degussa Ag | Process for preparation of D-pantothenic acid and/or salts thereof |
MXPA03010183A (es) | 2001-05-07 | 2004-03-16 | Cargill Inc | Proceso para preparar acidos carboxilicos y derivados de los mismos. |
US6723799B2 (en) | 2001-08-24 | 2004-04-20 | E I. Du Pont De Nemours And Company | Acid-dyeable polymer compositions |
EP1483378B1 (en) | 2001-11-02 | 2013-01-02 | Rice University | Recycling system for manipulation of intracellular nadh availability |
US6933404B2 (en) | 2001-12-18 | 2005-08-23 | Metabolix Inc. | Methods of making intermediates from polyhydroxyalkanoates |
ES2329778T3 (es) | 2002-01-18 | 2009-12-01 | Novozymes A/S | 2,3-aminomutasa de alanina. |
US6709919B2 (en) | 2002-05-15 | 2004-03-23 | Taiwan Semiconductor Manufacturing Company | Method for making auto-self-aligned top electrodes for DRAM capacitors with improved capacitor-to-bit-line-contact overlay margin |
US7314974B2 (en) | 2002-02-21 | 2008-01-01 | Monsanto Technology, Llc | Expression of microbial proteins in plants for production of plants with improved properties |
EP1487775A2 (en) | 2002-03-25 | 2004-12-22 | Cargill, Incorporated | Methods of manufacturing derivatives of beta-hydroxycarboxylic acids |
EP2431475B1 (en) | 2002-05-10 | 2019-07-10 | Tepha, Inc. | Bioabsorbable polymer containing 2-hydroxyacid monomers |
US7826975B2 (en) | 2002-07-10 | 2010-11-02 | The Penn State Research Foundation | Method for redesign of microbial production systems |
US8027821B2 (en) | 2002-07-10 | 2011-09-27 | The Penn State Research Foundation | Method for determining gene knockouts |
AU2003205041A1 (en) | 2002-07-12 | 2004-01-29 | Ajinomoto Co., Inc. | Method for producing target substance by fermentation |
GB0218019D0 (en) | 2002-08-05 | 2002-09-11 | Ciba Spec Chem Water Treat Ltd | Production of a fermentation product |
AU2003287028B2 (en) | 2002-10-04 | 2008-09-04 | E.I. Du Pont De Nemours And Company | Process for the biological production of 1,3-propanediol with high yield |
WO2004041421A2 (en) | 2002-11-01 | 2004-05-21 | Cargill, Incorporated | Process for preparation of 1,3-propanediol |
US20040152159A1 (en) | 2002-11-06 | 2004-08-05 | Causey Thomas B. | Materials and methods for the efficient production of acetate and other products |
US20060270013A1 (en) | 2003-02-18 | 2006-11-30 | Michel Chateau | Method for the production of evolved microorganisms which permit the generation or modification of metabolic pathways |
US7141154B2 (en) | 2003-03-06 | 2006-11-28 | Uchicago Argonne Llc | Single-stage separation and esterification of cation salt carboxylates using electrodeionization |
DE10314618A1 (de) | 2003-04-01 | 2004-10-14 | Degussa Ag | Verfahren zur Herstellung von L-Aminosäuren unter Verwendung von Stämmen der Familie Enterobacteriaceae |
US20040225116A1 (en) | 2003-05-08 | 2004-11-11 | Payne Mark S. | Nucleic acid fragments encoding nitrile hydratase and amidase enzymes from comamonas testosteroni 5-MGAM-4D and recombinant organisms expressing those enzymes useful for the production of amides and acids |
US7090008B2 (en) | 2003-05-29 | 2006-08-15 | Sensor Highway Limited | System to connect conduit sections in a subterranean well |
WO2005003074A1 (en) | 2003-06-26 | 2005-01-13 | Cargill, Incorporated | Process for separating and recovering 3-hydroxypropionic acid and acrylic acid |
FR2862068B1 (fr) | 2003-11-06 | 2007-10-12 | Metabolic Explorer Sa | Souches de microorganismes optimisees pour des voies de biosyntheses consommatrices de nadph |
US7326557B2 (en) | 2003-11-14 | 2008-02-05 | Rice University | Increasing intracellular NADPH availability in E. coli |
US7700319B2 (en) | 2003-12-04 | 2010-04-20 | Novozymes A/S | Production of 3-hydroxypropionic acid using beta-alanine/pyruvate aminotransferase |
US7186214B2 (en) | 2004-02-12 | 2007-03-06 | Medtronic, Inc. | Instruments and methods for accessing an anatomic space |
WO2005093060A1 (ja) | 2004-03-26 | 2005-10-06 | Nippon Shokubai Co., Ltd. | 1,3−プロパンジオール及び/又は3−ヒドロキシプロピオン酸を製造する方法 |
WO2005095320A1 (en) | 2004-04-02 | 2005-10-13 | Ciba Specialty Chemicals Water Treatments Limited | Preparation of acrylic acid derivatives from alpha or beta-hydroxy carboxylic acids |
CA2562176A1 (en) | 2004-04-28 | 2005-11-10 | Icos Corporation | Arylphenylamino-, arylphenylamide-, and arylphenylether-sulfide derivatives |
US20050272135A1 (en) | 2004-06-02 | 2005-12-08 | The University Of Chicago | Processs for production and purification of fermentation derived organic acids |
US7652167B2 (en) | 2004-07-19 | 2010-01-26 | Board Of Trustees Of Michigan State University | Process for production of organic acid esters |
EP2292750A3 (en) | 2004-07-30 | 2011-12-21 | Novozymes A/S | Alanine 2, 3 aminomutases |
US7148051B2 (en) | 2004-08-16 | 2006-12-12 | E. I. Du Pont De Nemours And Company | Production of 3-hydroxycarboxylic acid using nitrilase |
US7223567B2 (en) | 2004-08-27 | 2007-05-29 | Rice University | Mutant E. coli strain with increased succinic acid production |
US7987056B2 (en) | 2004-09-20 | 2011-07-26 | The Regents Of The University Of Colorado, A Body Corporate | Mixed-library parallel gene mapping quantitative micro-array technique for genome-wide identification of trait conferring genes |
WO2006044290A2 (en) | 2004-10-12 | 2006-04-27 | Board Of Trustees Of Michigan State University | Biosynthesis of philoroglucinol and preparation of 1,3-dihydroxybenzene therefrom |
TWI529181B (zh) | 2005-02-28 | 2016-04-11 | 贏創德固賽有限責任公司 | 以可更新原料為基之吸水聚合物結構及其生產的方法 |
US7524660B2 (en) | 2005-05-05 | 2009-04-28 | E.I. Du Pont De Nemours And Company | Utilization of fructose in microbial production strains |
US7772444B2 (en) | 2005-05-19 | 2010-08-10 | E. I. Du Pont De Nemours And Company | Method for the production of resveratrol in a recombinant oleaginous microorganism |
KR20080036608A (ko) | 2005-07-18 | 2008-04-28 | 바스프 에스이 | 메티오닌 생산 재조합 미생물 |
WO2007030830A2 (en) | 2005-09-09 | 2007-03-15 | Genomatica, Inc. | Methods and organisms for the growth-coupled production of succinate |
DE102005048818A1 (de) | 2005-10-10 | 2007-04-12 | Degussa Ag | Mikrobiologische Herstellung von 3-Hydroxypropionsäure |
WO2007047680A2 (en) | 2005-10-14 | 2007-04-26 | Cargill, Incorporated | Increasing the activity of radical s-adenosyl methionine (sam) enzymes |
US8535916B2 (en) | 2006-02-13 | 2013-09-17 | Ls9, Inc. | Modified microorganisms and uses therefor |
CN101473038B (zh) | 2006-03-15 | 2014-05-28 | Dsmip资产公司 | 含有多不饱和脂肪酸的植物种子油 |
US20070219390A1 (en) | 2006-03-15 | 2007-09-20 | Battelle Memorial Institute | Method and apparatus for conversion of beta-hydroxy carbonyl compounds |
US7687661B2 (en) | 2006-03-15 | 2010-03-30 | Battelle Memorial Institute | Method for conversion of β-hydroxy carbonyl compounds |
CA2650773C (en) | 2006-05-19 | 2014-12-02 | Jay D. Keasling | Microorganisms transformed with acetyl-coa carboxylase and wax synthase for production of fatty acid derivatives |
US8110670B2 (en) | 2006-05-19 | 2012-02-07 | Ls9, Inc. | Enhanced production of fatty acid derivatives |
DE102006025821A1 (de) * | 2006-06-02 | 2007-12-06 | Degussa Gmbh | Ein Enzym zur Herstellung von Mehylmalonatsemialdehyd oder Malonatsemialdehyd |
DE102006039203B4 (de) * | 2006-08-22 | 2014-06-18 | Evonik Degussa Gmbh | Verfahren zur Herstellung von durch Kristallisation gereinigter Acrylsäure aus Hydroxypropionsäure sowie Vorrichtung dazu |
US8906667B2 (en) | 2006-08-29 | 2014-12-09 | William Marsh Rice University | Increasing NADPH-dependent products |
CN101528918B (zh) | 2006-08-30 | 2012-09-26 | 诺沃奇梅兹A/S | 生产3-羟基丙酸的β-丙氨酸/α-酮戊二酸氨基转移酶 |
BRPI0719792A2 (pt) | 2006-10-04 | 2015-04-07 | Cargill Inc | Ácidos carboxílicos preparados usando um processo de divisão da molécula de sal |
CN101903513B (zh) | 2007-01-12 | 2013-08-21 | 科罗拉多大学董事会法人 | 增强微生物对产生的有机化学物质的耐受性的组合物和方法 |
WO2008091627A2 (en) | 2007-01-22 | 2008-07-31 | Genomatica, Inc. | Methods and organisms for growth-coupled production of 3-hydroxypropionic acid |
NZ578813A (en) | 2007-02-09 | 2012-04-27 | Zeachem Inc | Energy efficient methods to produce alcohols and carboxylic acids |
US8110093B2 (en) | 2007-03-14 | 2012-02-07 | Ls9, Inc. | Process for producing low molecular weight hydrocarbons from renewable resources |
EP2149608A4 (en) | 2007-04-16 | 2013-02-20 | Ajinomoto Kk | PROCESS FOR PRODUCING AN ORGANIC ACID |
KR20100031525A (ko) | 2007-06-01 | 2010-03-22 | 에보니크 룀 게엠베하 | 메타크릴산 또는 메타크릴산 에스테르의 제조 방법 |
US8198055B2 (en) | 2007-06-08 | 2012-06-12 | Coskata, Inc. | Process for converting syngas to liquid products with microorganisms on two-layer membrane |
JP2010263790A (ja) | 2007-09-04 | 2010-11-25 | Ajinomoto Co Inc | アミノ酸生産微生物及びアミノ酸の製造法 |
KR20090026230A (ko) | 2007-09-09 | 2009-03-12 | 김건 | 임베디드 시스템의 범용 고속 실시간 모니터링 장치 |
US20090191599A1 (en) | 2007-09-10 | 2009-07-30 | Joule Biotechnologies, Inc. | Engineered light-harvesting organisms |
JP2009067775A (ja) | 2007-09-17 | 2009-04-02 | Rohm & Haas Co | ヒドロキシカルボン酸、またはその塩を、不飽和カルボン酸および/またはそのエステルに変換する方法 |
CN101802208B (zh) | 2007-09-27 | 2016-05-18 | Reg生命科学有限责任公司 | 通过提取式发酵减少原料中杂质的毒性作用 |
MX2010005061A (es) | 2007-11-10 | 2010-09-09 | Joule Unltd Inc | Organismos hiperfotosinteticos. |
US8048624B1 (en) | 2007-12-04 | 2011-11-01 | Opx Biotechnologies, Inc. | Compositions and methods for 3-hydroxypropionate bio-production from biomass |
US8518678B2 (en) | 2007-12-21 | 2013-08-27 | Butamax(Tm) Advanced Biofuels Llc | Strain comprising increased expression of a CFA coding region for butanol production |
WO2009085278A1 (en) | 2007-12-21 | 2009-07-09 | Ls9, Inc. | Methods and compositions for producing olefins |
WO2009089457A1 (en) * | 2008-01-11 | 2009-07-16 | Novozymes A/S | Methods for producing 3-hydroxypropionic acid and compounds thereof |
EP2245137B1 (en) | 2008-01-22 | 2017-08-16 | Genomatica, Inc. | Methods and organisms for utilizing synthesis gas or other gaseous carbon sources and methanol |
WO2009111513A1 (en) | 2008-03-03 | 2009-09-11 | Joule Biotechnologies, Inc. | Engineered co2 fixing microorganisms producing carbon-based products of interest |
US8598378B2 (en) | 2008-03-14 | 2013-12-03 | University Of Hawaii | Methods and compositions for extraction and transesterification of biomass components |
CN102027109B (zh) | 2008-05-16 | 2016-01-06 | Reg生命科学有限责任公司 | 产生碳氢化合物的方法和组合物 |
EP2288710B1 (en) | 2008-05-23 | 2014-06-18 | E. I. du Pont de Nemours and Company | DGAT genes from oleaginous organisms for increased seed storage lipid production and altered fatty acid profiles in in oilseed plants |
EP2283135A1 (en) | 2008-06-04 | 2011-02-16 | ButamaxTM Advanced Biofuels LLC | Deletion mutants for the production of isobutanol |
DE102008002309A1 (de) | 2008-06-09 | 2009-12-10 | Evonik Degussa Gmbh | Verfahren zur Herstellung von L-Aminosäuren unter Verwendung von verbesserten Stämmen der Familie Enterobacteriaceae |
BRPI0915017B1 (pt) | 2008-06-09 | 2018-12-26 | Lanzatech New Zealand Ltd | método para produzir 2,3-butanodiol pela fermentação microbiana de um substrato gasoso compreendendo co |
US20100021978A1 (en) | 2008-07-23 | 2010-01-28 | Genomatica, Inc. | Methods and organisms for production of 3-hydroxypropionic acid |
CN102317436B (zh) | 2008-07-23 | 2014-06-25 | Opx生物工艺学公司 | 用于增加微生物对3-羟基丙酸(3-hp)的耐受性以及增加3-羟基丙酸产量的方法、系统和组合物 |
US20160362710A9 (en) | 2008-08-18 | 2016-12-15 | REG Life Sciences, LLC | Systems and methods for production of mixed fatty esters |
WO2010031083A2 (en) | 2008-09-15 | 2010-03-18 | Opx Biotechnologies, Inc. | Methods, systems and compositions related to reduction of conversions of microbially produced 3-hydroxypropionic acid (3-hp) to aldehyde metabolites |
EP2352824B1 (en) | 2008-10-07 | 2015-09-02 | REG Life Sciences, LLC | Method and compositions for producing fatty aldehydes |
WO2010068944A2 (en) | 2008-12-12 | 2010-06-17 | Celexion, Llc | Biological synthesis of difunctional alkanes from carbohydrate feedstocks |
EP3564345A1 (en) | 2008-12-23 | 2019-11-06 | REG Life Sciences, LLC | Methods and compositions related to thioesterase enzymes |
EP2417246A4 (en) | 2009-04-10 | 2015-11-04 | Reg Life Sciences Llc | PRODUCTION OF FATTY ACID DERIVATIVES |
WO2010126891A1 (en) | 2009-04-27 | 2010-11-04 | Ls9, Inc. | Production of fatty acid esters |
US20110144377A1 (en) | 2009-06-16 | 2011-06-16 | E. I. Du Pont Nemours And Company | Process for the biological production of 3-hydroxypropionic acid with high yield |
US8809027B1 (en) | 2009-09-27 | 2014-08-19 | Opx Biotechnologies, Inc. | Genetically modified organisms for increased microbial production of 3-hydroxypropionic acid involving an oxaloacetate alpha-decarboxylase |
CN102695799A (zh) * | 2009-09-27 | 2012-09-26 | Opx生物工艺学公司 | 用于制备3-羟基丙酸和其它产物的方法 |
WO2011063363A2 (en) | 2009-11-20 | 2011-05-26 | Opx Biotechnologies, Inc. | Production of an organic acid and/or related chemicals |
WO2011063304A1 (en) | 2009-11-20 | 2011-05-26 | Opx Biotechnologies, Inc. | Methods, systems, and compositions for microbial bio-production of biomolecules using syngas components, or sugars, as feedstocks |
BR112012013158A2 (pt) | 2009-12-02 | 2016-03-01 | Univ Michigan State | método de produção de um éster alquílico de um ácido carboxílico e método para o isolamento de succinato de dietila |
US8530221B2 (en) | 2010-01-14 | 2013-09-10 | Ls9, Inc. | Production of branched chain fatty acids and derivatives thereof in recombinant microbial cells |
WO2011094457A1 (en) | 2010-01-27 | 2011-08-04 | Opx Biotechnologies, Inc. | Microorganism production of high-valve chemical products, and related compositions, methods and systems |
US8859259B2 (en) | 2010-02-14 | 2014-10-14 | Ls9, Inc. | Surfactant and cleaning compositions comprising microbially produced branched fatty alcohols |
US10138504B2 (en) | 2010-08-06 | 2018-11-27 | Lallemand Hungary Liquidity Management Llc | Production of malonyl-CoA derived products via anaerobic pathways |
US8372610B2 (en) | 2010-09-15 | 2013-02-12 | Ls9, Inc. | Production of odd chain fatty acid derivatives in recombinant microbial cells |
WO2012054400A1 (en) | 2010-10-18 | 2012-04-26 | Zeachem, Inc. | Recovery of organic acid using a complex extraction solvent |
US20120264902A1 (en) | 2011-04-18 | 2012-10-18 | The Regents Of The University Of Colorado, A Body Corporate | Methods, Systems and Compositions for Increased Microorganism Tolerance to and Production of 3-Hydroxypropionic Acid (3-HP) |
US20130345470A1 (en) | 2012-06-20 | 2013-12-26 | Opx Biotechnologies, Inc. | Purification of 3-Hydroxypropionic Acid from Crude Cell Broth and Production of Acrylamide |
JP6063585B2 (ja) | 2013-01-16 | 2017-01-18 | アールイージー ライフ サイエンシズ リミテッド ライアビリティ カンパニー | 改良された特性を有するアシル−acpレダクターゼ |
CA2905602A1 (en) | 2013-03-15 | 2014-09-18 | Sarah M. Hoyt | Flash evaporation for product purification and recovery |
WO2014146026A1 (en) * | 2013-03-15 | 2014-09-18 | Opx Biotechnologies, Inc. | Bioproduction of chemicals |
-
2010
- 2010-09-27 CN CN2010800536926A patent/CN102695799A/zh active Pending
- 2010-09-27 BR BR112012006801A patent/BR112012006801A2/pt not_active Application Discontinuation
- 2010-09-27 EP EP10819620.5A patent/EP2480673B1/en active Active
- 2010-09-27 WO PCT/US2010/050436 patent/WO2011038364A1/en active Application Filing
- 2010-09-27 JP JP2012531103A patent/JP2013505727A/ja not_active Ceased
- 2010-09-27 MX MX2012003604A patent/MX2012003604A/es not_active Application Discontinuation
- 2010-09-27 US US13/498,468 patent/US8883464B2/en active Active
- 2010-09-27 GB GB1207409.2A patent/GB2487866A/en not_active Withdrawn
- 2010-09-27 KR KR1020127010712A patent/KR20140015136A/ko not_active Application Discontinuation
- 2010-09-27 CA CA2775390A patent/CA2775390C/en active Active
- 2010-09-27 GB GB1016137A patent/GB2473755B/en active Active
- 2010-09-27 AU AU2010298004A patent/AU2010298004B2/en not_active Ceased
-
2013
- 2013-03-19 JP JP2013056264A patent/JP2013128494A/ja not_active Withdrawn
- 2013-06-12 US US13/916,534 patent/US9388419B2/en active Active
-
2014
- 2014-12-18 US US14/575,927 patent/US9428778B2/en active Active
-
2015
- 2015-12-10 JP JP2015241185A patent/JP6271494B2/ja active Active
- 2015-12-10 JP JP2015241186A patent/JP2016039825A/ja active Pending
-
2016
- 2016-05-27 US US15/167,439 patent/US10100342B2/en active Active
-
2018
- 2018-10-12 US US16/159,135 patent/US20190119708A1/en not_active Abandoned
Patent Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20080076167A1 (en) * | 2000-11-20 | 2008-03-27 | Cargill, Incorporated | 3-hydroxypropionic acid and other organic compounds |
US20070245431A1 (en) * | 2006-03-15 | 2007-10-18 | Martek Biosciences Corporation | Polyunsaturated fatty acid production in heterologous organisms using pufa polyketide synthase systems |
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
BIRGIT ALBER ET AL.: "Malonyl-Coenzyme A Reductase in the Modified 3-Hydroxypropionate Cycle for Autotrophic Carbon Fixation in Archaeal Metallosphaera and Sulfolobus spp.", 《JOURNAL OF BACTERIOLOGY》 * |
Cited By (15)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN105051189A (zh) * | 2013-01-16 | 2015-11-11 | Reg生命科学有限责任公司 | 具有改善特性的酰基-acp还原酶 |
CN105051189B (zh) * | 2013-01-16 | 2019-08-06 | Reg生命科学有限责任公司 | 具有改善特性的酰基-acp还原酶 |
CN103805641B (zh) * | 2014-01-24 | 2016-05-11 | 武汉大学 | 一种在微生物体内固定二氧化碳生产3-羟基丙酸、丙烯酸和丙酸的方法 |
CN103805641A (zh) * | 2014-01-24 | 2014-05-21 | 武汉大学 | 一种在微生物体内固定二氧化碳生产3-羟基丙酸、丙烯酸和丙酸的方法 |
CN105802984A (zh) * | 2014-01-24 | 2016-07-27 | 武汉大学 | 一种微生物生产丙酸的方法 |
CN104946576B (zh) * | 2015-04-27 | 2018-03-23 | 中国科学院过程工程研究所 | 大肠杆菌基因工程菌及其构建方法和在生产丙酮酸中的应用 |
CN104946576A (zh) * | 2015-04-27 | 2015-09-30 | 中国科学院过程工程研究所 | 大肠杆菌基因工程菌及其构建方法和在生产丙酮酸中的应用 |
CN106350474A (zh) * | 2015-07-13 | 2017-01-25 | Sk新技术株式会社 | 包含编码甲基丙二酰‑CoA还原酶的基因的突变微生物及其用途 |
CN106350474B (zh) * | 2015-07-13 | 2019-12-27 | Sk新技术株式会社 | 包含编码甲基丙二酰-CoA还原酶的基因的突变微生物及其用途 |
WO2018188617A1 (zh) * | 2017-04-14 | 2018-10-18 | 中国科学院微生物研究所 | 产3-羟基丙酸的重组菌及其制备方法与应用 |
CN108728471A (zh) * | 2017-04-14 | 2018-11-02 | 中国科学院微生物研究所 | 产3-羟基丙酸的重组菌及其制备方法与应用 |
CN108728471B (zh) * | 2017-04-14 | 2020-01-31 | 中国科学院微生物研究所 | 产3-羟基丙酸的重组菌及其制备方法与应用 |
US11155839B2 (en) | 2017-04-14 | 2021-10-26 | Institute Of Microbiology, Chinese Academy Of Sciences | Recombinant bacteria for producing 3-hydroxy propionic acid, preparation method therefor, and applications thereof |
CN113278537A (zh) * | 2021-06-15 | 2021-08-20 | 天津科技大学 | 系列低产高级醇酿酒酵母及其构建方法与应用 |
CN115216194A (zh) * | 2022-08-24 | 2022-10-21 | 中国科学院兰州化学物理研究所 | 一种包埋花椒粉碎物自抛光防污涂料及其制备方法和应用 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
BR112012006801A2 (pt) | 2018-04-10 |
GB201016137D0 (en) | 2010-11-10 |
GB2473755A (en) | 2011-03-23 |
GB2473755B (en) | 2011-09-07 |
GB2487866A (en) | 2012-08-08 |
JP2016036346A (ja) | 2016-03-22 |
KR20140015136A (ko) | 2014-02-06 |
GB201207409D0 (en) | 2012-06-13 |
MX2012003604A (es) | 2012-09-12 |
JP2013128494A (ja) | 2013-07-04 |
EP2480673A4 (en) | 2014-10-08 |
JP2016039825A (ja) | 2016-03-24 |
JP2013505727A (ja) | 2013-02-21 |
US20170114377A1 (en) | 2017-04-27 |
US20130071893A1 (en) | 2013-03-21 |
EP2480673A1 (en) | 2012-08-01 |
US8883464B2 (en) | 2014-11-11 |
EP2480673B1 (en) | 2018-05-23 |
US20190119708A1 (en) | 2019-04-25 |
CA2775390C (en) | 2021-06-29 |
WO2011038364A1 (en) | 2011-03-31 |
CA2775390A1 (en) | 2011-03-31 |
US9388419B2 (en) | 2016-07-12 |
US10100342B2 (en) | 2018-10-16 |
US20140045231A1 (en) | 2014-02-13 |
US9428778B2 (en) | 2016-08-30 |
JP6271494B2 (ja) | 2018-01-31 |
AU2010298004B2 (en) | 2016-02-25 |
US20150344916A1 (en) | 2015-12-03 |
AU2010298004A1 (en) | 2012-04-26 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN102695799A (zh) | 用于制备3-羟基丙酸和其它产物的方法 | |
CN102317436B (zh) | 用于增加微生物对3-羟基丙酸(3-hp)的耐受性以及增加3-羟基丙酸产量的方法、系统和组合物 | |
AU2011210852B2 (en) | Microorganism production of high-value chemical products, and related compositions, methods and systems | |
EP2689020B1 (en) | Microbial production of chemical products and related compositions, methods and systems | |
US20120264902A1 (en) | Methods, Systems and Compositions for Increased Microorganism Tolerance to and Production of 3-Hydroxypropionic Acid (3-HP) | |
US20110125118A1 (en) | Production of an Organic Acid and/or Related Chemicals | |
US20180312886A1 (en) | Microbial production of chemical products and related compositions, methods and systems | |
WO2013043758A2 (en) | Compositions and methods regarding direct nadh utilization to produce 3-hydroxypropionic acid, derived chemicals and further derived products |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
REG | Reference to a national code |
Ref country code: HK Ref legal event code: DE Ref document number: 1176963 Country of ref document: HK |
|
AD01 | Patent right deemed abandoned |
Effective date of abandoning: 20161116 |
|
C20 | Patent right or utility model deemed to be abandoned or is abandoned |