JP2016039825A - ３−ヒドロキシプロピオン酸および他の生成物を生成するための方法 - Google Patents

３−ヒドロキシプロピオン酸および他の生成物を生成するための方法 Download PDF

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Abstract

【課題】３−ヒドロキシプロピオン酸および他の生成物を生成するための方法の提供。
【解決手段】本発明は、３−ヒドロキシプロピオン酸を含む化学生成物の生成のためにマロニル−ＣｏＡの利用が増加している、細菌株などの代謝改変された微生物株に関する。ある特定の実施形態では、上記細胞培養物は、脂肪酸合成酵素の阻害剤を含むか、または上記微生物は、その微生物の脂肪酸合成酵素経路における酵素活性の低減のために遺伝子改変されている。例えば、上記脂肪酸合成酵素の阻害剤は、チオラクトマイシン、トリクロサン、セルレニン、チエノジアザボリン、イソニアジドおよびそれらの類似体からなる群から選択してよい。
【選択図】なし

Description

関連出願への相互参照
本願は、２００９年９月２７日に出願された米国仮特許出願第６１／２４６，１４１号、２０１０年１月２７日に出願された米国仮特許出願第６１／２９８，８４４号、および２０１０年４月６日に出願された米国仮特許出願第６１／３２１，４８０号の利益を主張する。各出願の全体の内容は、それらの全体が本明細書中に参考として援用される。
発明の分野
本発明は、化学物質３−ヒドロキシプロピオン酸（３−ＨＰ）および３−ＨＰから作製される生成物を含み得る化学生成物の生成のためにマロニル−ＣｏＡの利用が増加している、細菌株などの代謝改変された微生物に関する。代謝改変された微生物は、３−ＨＰに対する耐性の増加を示すように適合され得る。また、例えば３−ＨＰ寛容原性複合体として同定される複合体の１つ以上の遺伝子改変を含む微生物の場合のように、１つ以上の３−ＨＰ生合成経路を提供するように遺伝子改変を行うことができる。
配列表
本出願は、ＥＦＳ−ＷｅｂによりＡＳＣＩＩフォーマットで提出され、本明細書にその全体が参照により組み込まれている配列表を含む。２０１０年９月２４日に創出された上記ＡＳＣＩＩコピーは、３４２４６７４４．ｔｘｔと命名され、２，２２８，８０８バイトのサイズである。
発明の背景
石油炭化水素の供給量が減少し、そのコストが極めて上昇していることがますます受け入れられるにつれ、化学物質および燃料を生成するための工業微生物系の開発および改良に対する関心が高まっている。このような工業微生物系は、いくつかの化学物質を生成するための石油炭化水素の使用に完全または部分的に取って代わる可能性がある。
このような手段により、抗生物質および抗マラリア医薬品から精密化学品、さらにはエタノールなどの燃料に及ぶ多数の化学物質が生成される。微生物発酵の商業目的としては、標的化学生成物の力価、生成速度および収率の増加が挙げられる。発酵イベントにおける全体的な比生産性（ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐｒｏｄｕｃｔｉｖｉｔｙ）が上昇すると、これは、生成速度および資本コストなどのその他の経済的要因に加えて、収率に正に影響し得る。
このような生産のためのある候補化学物質は、３−ヒドロキシプロピオン酸（「３−ＨＰ」、ＣＡＳ番号５０３−６６−２）であり、これは、広範囲の工業製品および消費者向け製品において用いられるポリマーのいくつかの基本構成単位に変換され得る。残念なことに、３−ＨＰを微生物により合成して商業的に実行可能な力価を達成するための以前の努力から、用いた微生物が、決定された商業的に実行可能な力価よりもはるかに低い３−ＨＰの濃度で阻害されるということが明らかにされた。
いくつかの化学生成物の収率および／または生産性を改善することにより、微生物発酵の経済的側面を改善することに対する関心が強いにもかかわらず、商業的に実行可能な発酵方法を採用し、発酵微生物細胞において所望の標的化学生成物への正味の変換を増加させる必要性が依然として残っている。より具体的には、いまだ解決されていない問題の中には、３−ヒドロキシプロピオン酸（３−ＨＰ）などの化学生成物の微生物生成経路にお
ける基質としてマロニル−ＣｏＡを有する、上記化学物質を生成するように適合された改変微生物において、例えば商業的に重要なレベルまで比生産性および容積生産性（ｖｏｌｕｍｅｔｒｉｃ ｐｒｏｄｕｃｔｉｖｉｔｙ）をどのように改善するかということが挙げられる。
発明の要旨
一実施形態によると、本発明は、アクリル酸ベースの消費者向け製品を製造するための方法であって、ｉ）炭素源と微生物細胞培養物とを組み合わせて３−ヒドロキシプロピオン酸を生成する工程であって、ａ）上記細胞培養物が、脂肪酸合成酵素の阻害剤を含むか、または上記微生物が、その微生物（ｏｒｇａｎｉｓｍ）の脂肪酸合成酵素経路における酵素活性の低減のために遺伝子改変されているか、またはｂ）上記微生物が、単機能性マロニル−ＣｏＡ還元酵素活性を有するポリペプチドをコードする異種核酸配列の導入により、上記微生物のマロニル−ＣｏＡ還元酵素（ｍｃｒ）経路における酵素活性の増加のために遺伝子改変されているか、またはｃ）上記３−ヒドロキシプロピオン酸が、乾燥重量基準の微生物細胞１グラム当たり１時間当たり０．０５グラムより多い比生産性で生成されるかまたは１リットル当たり１時間当たり０．５０グラムより多い容積生産性で生成される工程と、ｉｉ）上記３−ヒドロキシプロピオン酸をアクリル酸に変換する工程と、ｉｉｉ）上記アクリル酸を消費者向け製品に加工する工程とを含む方法を対象とする。様々な態様では、その炭素源は、約１．０×１０−１４以上の炭素１２に対する炭素１４の比を有する。
本発明は、例えば以下の項目を提供する。
（項目１）
アクリル酸ベースの消費者向け製品を製造するための方法であって、
ｉ）炭素源と微生物細胞培養物とを組み合わせて３−ヒドロキシプロピオン酸を生成する工程であって、
ａ）該細胞培養物が、脂肪酸合成酵素の阻害剤を含むか、もしくは該微生物が、該微生物の脂肪酸合成酵素経路における酵素活性の低減のために遺伝子改変されているか、またはｂ）該微生物が、単機能性マロニル−ＣｏＡ還元酵素活性を有するポリペプチドをコードする異種核酸配列の導入により、該微生物のマロニル−ＣｏＡ還元酵素（ｍｃｒ）経路における酵素活性の増加のために遺伝子改変されているか、または
ｃ）該３−ヒドロキシプロピオン酸が、乾燥重量基準の微生物細胞１グラム当たり１時間当たり０．０５グラムより多い比生産性もしくは１リットル当たり１時間当たり０．５０グラムより多い容積生産性で生成される
工程と、
ｉｉ）該３−ヒドロキシプロピオン酸をアクリル酸に変換する工程と、
ｉｉｉ）該アクリル酸を消費者向け製品に加工する工程と
を含む方法。
（項目２）
前記炭素源が、約１．０×１０ −１４ 以上の炭素１２に対する炭素１４の比を有する、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記炭素源が、主にグルコース、スクロース、フラクトース、デキストロース、ラクトースまたはそれらの組み合わせである、項目１に記載の方法。
（項目４）
前記炭素源が、５０％未満のグリセロールである、項目１に記載の方法。
（項目５）
前記細胞培養物が、脂肪酸合成酵素の阻害剤を含むか、または前記微生物が、該微生物の脂肪酸合成酵素経路における酵素活性の低減のために遺伝子改変されている、項目１に記載の方法。
（項目６）
脂肪酸合成酵素の前記阻害剤が、チオラクトマイシン、トリクロサン、セルレニン、チエノジアザボリン、イソニアジドおよびそれらの類似体からなる群から選択される、項目５に記載の方法。
（項目７）
前記微生物が、単機能性マロニル−ＣｏＡ還元酵素活性を有するポリペプチドをコードする異種核酸配列の導入により、該微生物のマロニル−ＣｏＡ還元酵素（ｍｃｒ）経路における酵素活性の増加のために遺伝子改変されている、項目１に記載の方法。
（項目８）
前記単機能性マロニル−ＣｏＡ還元酵素が、ＮＡＤＰＨ非依存性である、項目７に記載の方法。
（項目９）
前記３−ヒドロキシプロピオン酸が、乾燥重量基準の微生物細胞１グラム当たり１時間当たり０．０５グラムより多い比生産性で生成されるかまたは１リットル当たり１時間当たり０．０５グラムより多い容積生産性で生成される、項目１に記載の方法。
（項目１０）
前記細胞培養物が、遺伝子改変微生物を含む、項目９に記載の方法。
（項目１１）
前記遺伝子改変微生物が、該微生物の脂肪酸合成酵素経路における酵素活性の低減、該微生物のマロニル−ＣｏＡ還元酵素経路における酵素活性の増加、３−ヒドロキシプロピオン酸に対する耐性の増加、該微生物のＮＡＤＰＨ依存性トランスヒドロゲナーゼ経路における酵素活性の増加、細胞内重炭酸塩レベルの増加、該微生物のアセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼ経路における酵素活性の増加およびそれらの組み合わせから選択される形質について改変されている、項目１０に記載の方法。
（項目１２）
前記遺伝子改変微生物が、該微生物の脂肪酸合成酵素経路における酵素活性の低減について改変されている、項目１１に記載の方法。
（項目１３）
前記酵素活性の低減が、ベータ−ケトアシル−ＡＣＰ還元酵素、３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドラターゼ、エノイル−ＡＣＰ還元酵素およびチオエステラーゼからなる群から選択される酵素における酵素活性の低減である、項目１２に記載の方法。
（項目１４）
前記微生物の脂肪酸合成酵素経路における前記酵素活性の低減が、該脂肪酸合成酵素経路における酵素もしくはそのホモログをコードする配列に作動可能に連結した誘導性プロモーターをコードする異種核酸配列、または低減した活性を有する該脂肪酸合成酵素経路における酵素もしくはそのホモログをコードする異種核酸配列の導入により生じる、項目１２に記載の方法。
（項目１５）
前記脂肪酸合成酵素経路における前記酵素またはそのホモログが、温度感受性ベータ−ケトアシル−ＡＣＰ還元酵素活性または温度感受性エノイル−ＡＣＰ還元酵素活性を有するポリペプチドである、項目１４に記載の方法。
（項目１６）
前記遺伝子改変微生物が、該微生物のマロニル−ＣｏＡ還元酵素経路における酵素活性の増加について改変されている、項目１１に記載の方法。
（項目１７）
前記マロニル−ＣｏＡ還元酵素（ｍｃｒ）経路における酵素活性の前記増加が、二機能性マロニル−ＣｏＡ還元酵素の酵素活性または単機能性マロニル−ＣｏＡ還元酵素活性を有するポリペプチドをコードする異種核酸配列の導入により生じる、項目１６に記載の方法。
（項目１８）
前記異種核酸配列が、配列番号７８０〜７８９から選択される配列と少なくとも７０％の相同性を有する配列から選択される、項目１７に記載の方法。
（項目１９）
前記遺伝子改変微生物が、３−ヒドロキシプロピオン酸に対する耐性の増加について改変されている、項目１１に記載の方法。
（項目２０）
３−ヒドロキシプロピオン酸に対する耐性の前記増加が、３−ＨＰ寛容原性複合体（３ＨＰＴＧＣ）複合体の１つ以上の成分において生じるか、または３−ヒドロキシプロピオン酸に対する耐性の前記増加が、３ＨＰＴＧＣの群Ａおよび群Ｂのそれぞれの少なくとも１つの遺伝子改変を行うことに起因する、項目１９に記載の方法。
（項目２１）
前記１つ以上の成分が、ＣｙｎＳ、ＣｙｎＴ、ＡｒｏＧ、ＳｐｅＤ、ＳｐｅＥ、ＳｐｅＦ、ＴｈｒＡ、Ａｓｄ、ＣｙｓＭ、ＩｒｏＫ、ＩｌｖＡおよびそれらのホモログから選択される、項目２０に記載の方法。
（項目２２）
前記改変が、１つ以上の３ＨＰＴＧＣリプレッサー遺伝子の破壊である、項目２０に記載の方法。
（項目２３）
前記リプレッサー遺伝子が、ｔｙｒＲ、ｔｒｐＲ、ｍｅｔＪ、ｐｕｒＲ、ｌｙｓＲ、ｎｒｄＲおよびそれらのホモログから選択される、項目２２に記載の方法。
（項目２４）
前記微生物のＮＡＤＰＨ依存性トランスヒドロゲナーゼ経路における酵素活性の前記増加が、配列番号７７６または７７８から選択される配列と少なくとも７０％の相同性を有するポリペプチドをコードする異種核酸配列の導入により生じる、項目１１に記載の方法。
（項目２５）
細胞内重炭酸塩レベルの前記増加が、シアナーゼ活性および／またはカルボニックアンヒドラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする異種核酸配列の導入により生じる、項目１１に記載の方法。
（項目２６）
前記異種核酸配列が、配列番号３３７から選択される配列と少なくとも７０％の相同性を有する配列から選択される、項目２５に記載の方法。
（項目２７）
前記微生物のアセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼ経路における酵素活性の前記増加が、配列番号７６８〜７７５から選択される配列と少なくとも７０％の相同性を有するポリペプチドをコードする異種核酸配列の導入により生じる、項目１１に記載の方法。
（項目２８）
前記遺伝子改変細菌が、乳酸脱水素酵素、リン酸アセチルトランスフェラーゼ、ピルビン酸酸化酵素またはピルビン酸−ギ酸リアーゼおよびそれらの組み合わせの活性を減少させるようにさらに改変されている、項目１１に記載の方法。
（項目２９）
工程（ｉ）の後に、第３級アミンの存在下で前記細胞培養物から３−ヒドロキシプロピオン酸を抽出することにより、該培養物から３−ヒドロキシプロピオン酸を分離および／または精製する工程をさらに含む、項目１に記載の方法。
（項目３０）
前記３−ヒドロキシプロピオン酸が、乾燥重量基準の微生物細胞１グラム当たり１時間当たり０．０５グラムより多い比生産性で生成されるかまたは１リットル当たり１時間当たり０．５０グラムより多い容積生産性で生成される、項目２９に記載の方法。
（項目３１）
前記消費者向け製品が、おむつ、カーペット、塗料、接着剤およびアクリルガラスからなる群から選択される、項目１に記載の方法。
（項目３２）
前記消費者向け製品が、おむつである、項目３１に記載の方法。
（項目３３）
項目１〜３２のいずれか一項に従って生成される、生物学的に生成された３−ヒドロキシプロピオン酸。
（項目３４）
化学触媒を本質的に含まない、項目３３に記載の３−ヒドロキシプロピオン酸。
（項目３５）
前記化学触媒が、モリブデンベースの触媒および／またはバナジウムベースの触媒である、項目３４に記載の３−ヒドロキシプロピオン酸。
（項目３６）
約１．０×１０ −１４ 以上の炭素１２に対する炭素１４の比を有する、項目３３に記載の３−ヒドロキシプロピオン酸。
（項目３７）
約１０％未満の石油由来の炭素を含有する、項目３３に記載の３−ヒドロキシプロピオン酸。
（項目３８）
項目３３に記載の３−ヒドロキシプロピオン酸であって、その生成方法に関連付けられる残留量の有機物質を含有する、３−ヒドロキシプロピオン酸。
（項目３９）
前記３−ヒドロキシプロピオン酸の１ｐｐｍから１，０００ｐｐｍの間の量で残留量の有機物質を含有する、項目３８に記載の３−ヒドロキシプロピオン酸。
（項目４０）
項目３３〜３９の一項に記載の３−ヒドロキシプロピオン酸から生成されるアクリル酸。
（項目４１）
項目４０に記載のアクリル酸を用いて生成されるポリマー。
（項目４２）
項目４０に記載のアクリル酸を用いて製造される消費者向け製品。
（項目４３）
おむつ、カーペット、塗料、接着剤およびアクリルガラスから選択される、項目４２に記載の消費者向け製品。
（項目４４）
おむつである、項目４３に記載の消費者向け製品。
（項目４５）
項目４０に記載のアクリル酸のバイオ生産のための系であって、
バイオマスの糖化のためのタンクと、
糖化の生成物を、必要に応じて前発酵タンクを介して発酵タンクに送るためのラインと、微生物細胞培養に適する発酵タンクと、
該発酵タンクからの内容物を抽出容器および／または分離容器に吐出するためのラインと、
細胞培養廃棄物から３−ヒドロキシプロピオン酸を取り出すのに適する抽出容器および／または分離容器と、
３−ヒドロキシプロピオン酸を脱水容器に移送するためのラインと、
３−ヒドロキシプロピオン酸からアクリル酸への変換に適する脱水容器と
を含む系。
（項目４６）
１つ以上の前発酵タンク、蒸留カラム、遠心分離容器、逆抽出カラム、混合容器またはそれらの組み合わせをさらに含む、項目４５に記載の系。
（項目４７）
１年当たり少なくとも１トンのアクリル酸の最少生成能力を有する、項目４５に記載の系。
（項目４８）
０．０５ｇ／ｇＤＣＷ−ｈｒより大きい、０．０８ｇ／ｇＤＣＷ−ｈｒ、０．１ｇ／ｇＤＣＷ−ｈｒより大きい、０．１３ｇ／ｇＤＣＷ−ｈｒより大きい、０．１５ｇ／ｇＤＣＷ−ｈｒより大きい、０．１７５ｇ／ｇＤＣＷ−ｈｒより大きい、０．２ｇ／ｇＤＣＷ−ｈｒより大きい、０．２５ｇ／ｇＤＣＷ−ｈｒより大きい、０．３ｇ／ｇＤＣＷ−ｈｒより大きい、０．３５ｇ／ｇＤＣＷ−ｈｒより大きい、０．４ｇ／ｇＤＣＷ−ｈｒより大きい、０．４５ｇ／ｇＤＣＷ−ｈｒより大きいまたは０．５ｇ／ｇＤＣＷ−ｈｒより大きい速度から選択される比速度にて３−ヒドロキシプロピオネートを生成できる、遺伝子改変微生物。
（項目４９）
マロニル−ｃｏＡ還元酵素活性およびアセチル−ｃｏＡカルボキシラーゼ活性を増加させる遺伝子改変と、エノイル−ＡＣＰ還元酵素活性、乳酸脱水素酵素活性および酢酸キナーゼ活性を低減させる遺伝子改変とを含む、項目４８に記載の遺伝子改変微生物。
（項目５０）
マロニル−ｃｏＡ還元酵素活性およびアセチル−ｃｏＡカルボキシラーゼ活性を増加させる遺伝子改変と、エノイル−ＡＣＰ還元酵素活性、乳酸脱水素酵素活性およびアセチルリン酸トランスフェラーゼ活性を低減させる遺伝子改変とを含む、項目４８に記載の遺伝子改変微生物。
（項目５１）
マロニル−ｃｏＡ還元酵素活性およびアセチル−ｃｏＡカルボキシラーゼ活性を増加させる遺伝子改変と、エノイル−ＡＣＰ還元酵素活性、乳酸脱水素酵素活性、酢酸キナーゼ活性およびアセチルリン酸トランスフェラーゼ活性を低減させる遺伝子改変とを含む、項目４８に記載の遺伝子改変微生物。
（項目５２）
マロニル−ｃｏＡ還元酵素活性およびアセチル−ｃｏＡカルボキシラーゼ活性を増加させる遺伝子改変と、エノイル−ＡＣＰ還元酵素活性、乳酸脱水素酵素活性およびピルビン酸ギ酸リアーゼ活性を低減させる遺伝子改変とを含む、項目４８に記載の遺伝子改変微生物。
（項目５３）
マロニル−ｃｏＡ還元酵素活性およびアセチル−ｃｏＡカルボキシラーゼ活性を増加させる遺伝子改変と、エノイル−ＡＣＰ還元酵素活性、乳酸脱水素酵素活性およびピルビン酸酸化酵素活性を低減させる遺伝子改変とを含む、項目４８に記載の遺伝子改変微生物。（項目５４）
マロニル−ｃｏＡ還元酵素活性およびアセチル−ｃｏＡカルボキシラーゼ活性を増加させる遺伝子改変と、エノイル−ＡＣＰ還元酵素活性、乳酸脱水素酵素活性およびメチルグリオキサール合成酵素活性を低減させる遺伝子改変とを含む、項目４８に記載の遺伝子改変微生物。
（項目５５）
マロニル−ｃｏＡ還元酵素活性およびアセチル−ｃｏＡカルボキシラーゼ活性を増加させる遺伝子改変と、β−ケトアシル−ＡＣＰ合成酵素活性、乳酸脱水素酵素活性およびメチルグリオキサール合成酵素活性を増加させる遺伝子改変とを含む、項目４８に記載の遺伝子改変微生物。
（項目５６）
マロニル−ｃｏＡ還元酵素活性およびアセチル−ｃｏＡカルボキシラーゼ活性を増加させる遺伝子改変と、エノイル−ＡＣＰ還元酵素活性、グアノシン３’−二リン酸５’−三リン酸合成酵素活性およびグアノシン３’−二リン酸５’−二リン酸合成酵素活性を低減させる遺伝子改変とを含む、項目４８に記載の遺伝子改変微生物。
（項目５７）
ＮＡＤＨ／ＮＡＤＰＨトランスヒドロゲナーゼ活性を増加させるさらなる遺伝子改変が行われた、項目４８〜５６のいずれか一項に記載の遺伝子改変微生物。
（項目５８）
前記トランスヒドロゲナーゼ活性が、可溶性である、項目５７に記載の遺伝子改変微生物。
（項目５９）
前記トランスヒドロゲナーゼ活性が、膜結合性である、項目５７に記載の遺伝子改変微生物。
（項目６０）
シアナーゼ活性を増加させるさらなる遺伝子改変が行われた、項目４８〜５９のいずれか一項に記載の遺伝子改変微生物。
（項目６１）
カルボニックアンヒドラーゼ活性を増加させるさらなる遺伝子改変が行われた、項目４８〜６０のいずれか一項に記載の遺伝子改変微生物。
（項目６２）
ピルビン酸脱水素酵素活性を増加させるさらなる遺伝子改変が行われた、項目４８〜６０のいずれか一項に記載の遺伝子改変微生物。
（項目６３）
グアノシン３’−二リン酸５’−三リン酸合成酵素活性およびグアノシン３’−二リン酸５’−二リン酸合成酵素活性を減少させるさらなる遺伝子改変が行われた、項目４８〜６２のいずれか一項に記載の遺伝子改変微生物。
（項目６４）
通気環境におけるＮＡＤＨ／ＮＡＤ＋比を増加させる遺伝子改変が行われた、項目４８〜６３のいずれか一項に記載の遺伝子改変微生物。
（項目６５）
β−ケトアシル−ＡＣＰ合成酵素活性を減少させる遺伝子改変が行われた、項目４８〜６４のいずれか一項に記載の遺伝子改変微生物。
（項目６６）
３−ヒドロキシプロピオン酸還元酵素活性を減少させる遺伝子改変が行われた、項目４８〜６５のいずれか一項に記載の遺伝子改変微生物。
（項目６７）
ＮＡＤ＋依存３−ヒドロキシプロピオン酸脱水素酵素活性を減少させる遺伝子改変が行われた、項目４８〜６６のいずれか一項に記載の遺伝子改変微生物。
（項目６８）
ＮＡＤ＋依存３−ヒドロキシプロピオン酸脱水素酵素活性を減少させる遺伝子改変が行われた、項目４８〜６７のいずれか一項に記載の遺伝子改変微生物。
（項目６９）
３−ヒドロキシプロピオン酸に対する耐性を増加させる遺伝子改変が行われた、項目４８〜６８のいずれか一項に記載の遺伝子改変微生物。
（項目７０）
３−ヒドロキシプロピオン酸に対する耐性の増加をもたらす遺伝子改変が、３−ＨＰ寛容原性複合体における任意の酵素の活性を増加させる、項目４８〜６９のいずれか一項に記載の遺伝子改変微生物。
（項目７１）
３−ヒドロキシプロピオン酸に対する耐性の増加をもたらす遺伝子改変が、ピルビン酸脱水素酵素活性を増加させる、項目６９〜７０のいずれか一項に記載の遺伝子改変微生物。
（項目７２）
３−ヒドロキシプロピオン酸に対する耐性の増加をもたらす遺伝子改変が、シアナーゼ活性を増加させる、項目６９〜７０のいずれか一項に記載の遺伝子改変微生物。
（項目７３）
３−ヒドロキシプロピオン酸に対する耐性の増加をもたらす遺伝子改変が、カルボニックアンヒドラーゼ活性を増加させる、項目６９〜７０のいずれか一項に記載の遺伝子改変微生物。
（項目７４）
３−ヒドロキシプロピオン酸に対する耐性の増加をもたらす遺伝子改変が、アスパラギン酸キナーゼ活性を増加させる、項目６９〜７０のいずれか一項に記載の遺伝子改変微生物。
（項目７５）
３−ヒドロキシプロピオン酸に対する耐性の増加をもたらす遺伝子改変が、トレオニンデヒドラターゼ活性を増加させる、項目６９〜７０のいずれか一項に記載の遺伝子改変微生物。
（項目７６）
３−ヒドロキシプロピオン酸に対する耐性の増加をもたらす遺伝子改変が、２−デヒドロ−３−デオキシホスホヘプトン酸アルドラーゼ活性を増加させる、項目６９〜７０のいずれか一項に記載の遺伝子改変微生物。
（項目７７）
３−ヒドロキシプロピオン酸に対する耐性の増加をもたらす遺伝子改変が、システイン合成酵素活性を増加させる、項目６９〜７０のいずれか一項に記載の遺伝子改変微生物。（項目７８）
３−ヒドロキシプロピオン酸に対する耐性の増加をもたらす遺伝子改変が、リボース−リン酸ジホスホキナーゼ活性を増加させる、項目６９〜７０のいずれか一項に記載の遺伝子改変微生物。
（項目７９）
３−ヒドロキシプロピオン酸に対する耐性の増加をもたらす遺伝子改変が、リボヌクレオシド−二リン酸還元酵素活性を増加させる、項目６９〜７０のいずれか一項に記載の遺伝子改変微生物。
（項目８０）
３−ヒドロキシプロピオン酸に対する耐性の増加をもたらす遺伝子改変が、Ｌ−システインデスルフヒドラーゼ活性を増加させる、項目６９〜７０のいずれか一項に記載の遺伝子改変微生物。
（項目８１）
３−ヒドロキシプロピオン酸に対する耐性の増加をもたらす遺伝子改変が、リシンデカルボキシラーゼ活性を増加させるか、または３−ヒドロキシプロピオン酸に対する耐性の増加をもたらす遺伝子改変が、ホモシステイントランスメチラーゼ活性を増加させる、項目６９〜７０のいずれか一項に記載の遺伝子改変微生物。
（項目８２）
３−ヒドロキシプロピオン酸に対する耐性の増加をもたらす遺伝子改変が、ジヒドロ葉酸還元酵素活性を増加させる、項目６９〜７０のいずれか一項に記載の遺伝子改変微生物。
（項目８４）
３−ヒドロキシプロピオン酸に対する耐性の増加をもたらす遺伝子改変が、Ｎ−アセチルグルタミルリン酸還元酵素活性を増加させる、項目６９〜７０のいずれか一項に記載の遺伝子改変微生物。
（項目８５）
３−ヒドロキシプロピオン酸に対する耐性の増加をもたらす遺伝子改変が、アセチルグルタミン酸キナーゼ活性を増加させる、項目６９〜７０のいずれか一項に記載の遺伝子改変微生物。
（項目８６）
３−ヒドロキシプロピオン酸に対する耐性の増加をもたらす遺伝子改変が、アルギニノコハク酸リアーゼ活性を増加させる、項目６９〜７０のいずれか一項に記載の遺伝子改変微生物。
（項目８７）
３−ヒドロキシプロピオン酸に対する耐性の増加をもたらす遺伝子改変が、アセチルオルニチンデアセチラーゼ活性を増加させる、項目６９〜７０のいずれか一項に記載の遺伝子改変微生物。
（項目８８）
３−ヒドロキシプロピオン酸に対する耐性の増加をもたらす遺伝子改変が、コリスミ酸ムターゼ活性を増加させる、項目６９〜７０のいずれか一項に記載の遺伝子改変微生物。（項目８９）
３−ヒドロキシプロピオン酸に対する耐性の増加をもたらす遺伝子改変が、プレフェン酸脱水酵素活性を増加させる、項目６９〜７０のいずれか一項に記載の遺伝子改変微生物。
（項目９０）
３−ヒドロキシプロピオン酸に対する耐性の増加をもたらす遺伝子改変が、プレフェン酸脱水素酵素活性を増加させる、項目６９〜７０のいずれか一項に記載の遺伝子改変微生物。
（項目９１）
３−ヒドロキシプロピオン酸に対する耐性の増加をもたらす遺伝子改変が、２−デヒドロ−３−デオキシホスホヘプトン酸アルドラーゼ活性を増加させる、項目６９〜７０のいずれか一項に記載の遺伝子改変微生物。
（項目９２）
３−ヒドロキシプロピオン酸に対する耐性の増加をもたらす遺伝子改変が、Ｄ−３−ホスホグリセリン酸脱水素酵素活性を増加させる、項目６９〜７０のいずれか一項に記載の遺伝子改変微生物。
（項目９３）
水性培地中の炭素源と、項目４８〜９２のいずれか一項に記載の遺伝子改変微生物とを含む培養系であって、該遺伝子改変微生物が、０．０５ｇＤＣＷ／Ｌより多い量、０．１ｇＤＣＷ／Ｌ、１ｇＤＣＷ／Ｌより多い量、５ｇＤＣＷ／Ｌより多い量、１０ｇＤＣＷ／Ｌより多い量、１５ｇＤＣＷ／Ｌより多い量または２０ｇＤＣＷ／Ｌより多い量、から選択される量で存在する培養系。
（項目９４）
前記水性培地の容量が、５ｍＬより多い容量、１００ｍＬより多い容量、０．５Ｌより多い、１Ｌより多い容量、２Ｌより多い容量、１０Ｌより多い容量、２５０Ｌより多い容量、１０００Ｌより多い容量、１０，０００Ｌより多い容量、５０，０００Ｌより多い容量、１００，０００Ｌより多い容量または２００，０００Ｌより多い容量、から選択される、項目９３に記載の培養系。
（項目９５）
前記水性培地の容量が、２５０Ｌより多く、鋼容器内に含有されている、項目９３〜９４のいずれか一項に記載の培養系。
（項目９６）
前記炭素源が、デキストロース、スクロース、ペントース、ポリオール、ヘキソース、ヘキソースとペントースとの両方およびそれらの組み合わせから選択される、項目９３〜９５のいずれか一項に記載の培養系。
（項目９７）
前記水性培地のｐＨが、７．５未満である、項目９３〜９６のいずれか一項に記載の培養系。
（項目９８）
通気されている、項目９３〜９７のいずれか一項に記載の培養系。
（項目９９）
ｉ）５ｍｍｏｌ／Ｌ−ｈｒより大きく、２００ｍｍｏｌ／Ｌ−ｈｒ未満の酸素、
ｉｉ）５ｍｍｏｌ／Ｌ−ｈｒより大きく、１００ｍｍｏｌ／Ｌ−ｈｒ未満の酸素、
ｉｉｉ）５ｍｍｏｌ／Ｌ−ｈｒより大きく、８０ｍｍｏｌ／Ｌ−ｈｒ未満の酸素、およびｉｖ）５ｍｍｏｌ／Ｌ−ｈｒより大きく、５０ｍｍｏｌ／Ｌ−ｈｒ未満の酸素
から選択される酸素移送速度で通気されている、項目９８に記載の培養系。
（項目１００）
項目９３〜９９のいずれか一項に記載の培養系から得られる水性ブロスであって、
ｉ）５ｇ／Ｌより多い、１０ｇ／Ｌより多い、１５ｇ／Ｌより多い、２０ｇ／Ｌより多い、２５ｇ／Ｌより多い、３０ｇ／Ｌより多い、３５ｇ／Ｌより多い、４０ｇ／Ｌより多い、５０ｇ／Ｌより多い、６０ｇ／Ｌより多い、７０ｇ／Ｌより多い、８０ｇ／Ｌより多い、９０ｇ／Ｌより多い、または１００ｇ／Ｌより多い濃度から選択される濃度の３−ヒドロキシプロピオネート、および
ｉｉ）３０ｇ／Ｌ未満、２０ｇ／Ｌ未満、１０ｇ／Ｌ未満、５ｇ／Ｌ未満、１ｇ／Ｌ未満または０．５ｇ／Ｌ未満から選択される濃度の１，３−プロパンジオール
を含む水性ブロス。
（項目１０１）
２０ｇＤＣＷ／Ｌ未満のバイオマス、１５ｇＤＣＷ／Ｌ未満のバイオマス、１０ｇＤＣＷ／Ｌ未満のバイオマス、５ｇＤＣＷ／Ｌ未満のバイオマスまたは１ｇＤＣＷ／Ｌ未満のバイオマスから選択される量のバイオマスを含む、項目１００に記載の水性ブロス。
（項目１０２）
３−ＨＰ／スクシネート比（ｇ３−ＨＰ／ｇスクシネート）が、３より大きい、１０より大きい、３０より大きい、６０より大きい、１００より大きい、１５０より大きいまたは２００より大きい、項目１００に記載の水性ブロス。
（項目１０３）
３−ＨＰ／フマレート比（ｇ３−ＨＰ／ｇフマレート）が、３より大きい、１０より大きい、３０より大きい、６０より大きい、１００より大きい、１５０より大きいまたは２００より大きい、項目１００に記載の水性ブロス。
（項目１０４）
３−ＨＰ／グリセロール比（ｇ３−ＨＰ／ｇグリセロール）が、３より大きい、１０より大きい、３０より大きい、６０より大きい、１００より大きい、１５０より大きいまたは２００より大きい、項目１００に記載の水性ブロス。
（項目１０５）
３−ＨＰ／アセテート比（ｇ３−ＨＰ／ｇアセテート）が、１．５より大きい、３より大きい、１０より大きい、３０より大きい、６０より大きい、１００より大きい、１５０より大きいまたは２００より大きい、項目１００に記載の水性ブロス。
（項目１０６）
３−ＨＰ／アラニン比（ｇ３−ＨＰ／ｇアラニン）が、３より大きい、１０より大きい、３０より大きい、６０より大きい、１００より大きい、１５０より大きいまたは２００より大きい、項目１００に記載の水性ブロス。
（項目１０７）
３−ＨＰ／ベータ−アラニン比（ｇ３−ＨＰ／ｇベータ−アラニン）が、１．５より大きい、３より大きい、１０より大きい、３０より大きい、６０より大きい、１００より大きい、１５０より大きいまたは２００より大きい、項目１００に記載の水性ブロス。
（項目１０８）
３−ＨＰ／グルタメート比（ｇ３−ＨＰ／ｇグルタメート）が、３より大きい、１０より大きい、３０より大きい、６０より大きい、１００より大きい、１５０より大きいまたは２００より大きい、項目１００に記載の水性ブロス。
（項目１０９）
３−ＨＰ／グルタミン比（ｇ３−ＨＰ／ｇグルタミン）が、３より大きい、１０より大きい、３０より大きい、６０より大きい、１００より大きい、１５０より大きいまたは２００より大きい、項目１００に記載の水性ブロス。
（項目１１０）
３−ＨＰ／３−ヒドロキシプロピオンアルデヒド比（ｇ３−ＨＰ／ｇ３−ヒドロキシプロピオンアルデヒド）が、１．５より大きい、３より大きい、１０より大きい、３０より大きい、６０より大きい、１００より大きい、１５０より大きいまたは２００より大きい、項目１００に記載の水性ブロス。
（項目１１１）
３−ＨＰ／１，３−プロパンジオール比（ｇ３−ＨＰ／ｇ１，３−プロパンジオール）が、１．５より大きい、３より大きい、１０より大きい、３０より大きい、６０より大きい、１００より大きい、１５０より大きいまたは２００より大きい、項目１００に記載の水性ブロス。
（項目１１２）
３−ＨＰ／ラクテート比（ｇ３−ＨＰ／ｇラクテート）が、３より大きい、１０より大きい、３０より大きい、６０より大きい、１００より大きい、１５０より大きいまたは２００より大きい、項目１００に記載の水性ブロス。
本発明による炭素源は、主にグルコース、スクロース、フラクトース、デキストロース、ラクトースまたはそれらの組み合わせであってよい。代わりに、上記炭素源は、グリセロールである。
ある特定の実施形態では、上記細胞培養物は、脂肪酸合成酵素の阻害剤を含むか、または上記微生物は、その微生物の脂肪酸合成酵素経路における酵素活性の低減のために遺伝子改変されている。例えば、上記脂肪酸合成酵素の阻害剤は、チオラクトマイシン、トリクロサン、セルレニン、チエノジアザボリン、イソニアジドおよびそれらの類似体からなる群から選択してよい。
本発明の微生物は、単機能性マロニル−ＣｏＡ還元酵素活性を有するポリペプチドをコードする異種核酸配列の導入により、上記微生物のマロニル−ＣｏＡ還元酵素（ｍｃｒ）経路における酵素活性の増加のために遺伝子改変され得る。様々な実施形態では、上記単機能性マロニル−ＣｏＡ還元酵素は、ＮＡＤＰＨ非依存性である。
様々な実施形態では、上記３−ヒドロキシプロピオン酸は、本発明に従って、乾燥重量基準の微生物細胞１グラム当たり１時間当たり０．０５グラムより多い比生産性で生成されるかまたは１リットル当たり１時間当たり０．０５グラムより多い容積生産性で生成される。
上記細胞培養物が遺伝子改変微生物を含む実施形態が、本発明に含まれる。遺伝子改変微生物は、その微生物の脂肪酸合成酵素経路における酵素活性の低減、その微生物のマロニル−ＣｏＡ還元酵素経路における酵素活性の増加、３−ヒドロキシプロピオン酸に対する耐性の増加、その微生物のＮＡＤＰＨ依存性トランスヒドロゲナーゼ経路における酵素活性の増加、細胞内重炭酸塩レベルの増加、その微生物のアセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼ経路における酵素活性の増加およびそれらの組み合わせから選択される形質について改変され得る。例えば、上記遺伝子改変微生物は、その微生物の脂肪酸合成酵素経路における酵素活性の低減について改変され得る。代わりに、上記酵素活性の低減は、ベータ−ケトアシル−ＡＣＰ還元酵素、３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドラターゼ、エノイル−ＡＣＰ還元酵素およびチオエステラーゼからなる群から選択される酵素における酵素活性の低減である。様々な態様では、上記微生物の脂肪酸合成酵素経路における酵素活性の低減は、脂肪酸合成酵素経路における酵素もしくはそのホモログをコードする配列に作動可能に連結した誘導性プロモーターをコードする異種核酸配列、または低減した活性を有する上記脂肪酸合成酵素経路における酵素もしくはそのホモログをコードする異種核酸配列の導入を介して生じる。様々な態様では、上記脂肪酸合成酵素経路における酵素またはそのホモログは、温度感受性ベータ−ケトアシル−ＡＣＰまたは温度感受性エノイル−ＡＣＰ還元酵素活性を有するポリペプチドである。様々には、上記遺伝子改変微生物は、その微生物のマロニル−ＣｏＡ還元酵素経路における酵素活性の増加について改変されている。
ある特定の実施形態では、上記マロニル−ＣｏＡ還元酵素（ｍｃｒ）経路における酵素活性の増加は、二機能性マロニル−ＣｏＡ還元酵素の酵素活性または単機能性マロニル−ＣｏＡ還元酵素活性を有するポリペプチドをコードする異種核酸配列の導入により生じる。上記異種核酸配列は、配列番号７８０〜７８９から選択される配列と少なくとも７０％の相同性を有する配列から選択してよい。
様々な実施形態では、上記遺伝子改変微生物は、３−ヒドロキシプロピオン酸に対する耐性の増加について改変されている。３−ヒドロキシプロピオン酸に対する耐性の増加は、３−ＨＰ寛容原性複合体（３ＨＰＴＧＣ）複合体の１つ以上の成分において生じ得」るか、または３−ヒドロキシプロピオン酸に対する耐性の上記増加は、３ＨＰＴＧＣの群Ａおよび群Ｂのそれぞれの少なくとも１つの遺伝子改変を行うことに起因する。上記１つ以上の成分は、ＣｙｎＳ、ＣｙｎＴ、ＡｒｏＧ、ＳｐｅＤ、ＳｐｅＥ、ＳｐｅＦ、ＴｈｒＡ、Ａｓｄ、ＣｙｓＭ、ＩｒｏＫ、ＩｌｖＡおよびそれらのホモログから選択してよい。様々な実施形態では、上記改変は、１つ以上の３ＨＰＴＧＣリプレッサー遺伝子の破壊である。上記リプレッサー遺伝子は、ｔｙｒＲ、ｔｒｐＲ、ｍｅｔＪ、ｐｕｒＲ、ｌｙｓＲ、ｎｒｄＲおよびそれらのホモログから選択してよい。
上記微生物のＮＡＤＰＨ依存性トランスヒドロゲナーゼ経路における酵素活性の増加は、配列番号７７６または７７８から選択される配列と少なくとも７０％の相同性を有するポリペプチドをコードする異種核酸配列の導入により生じ得る。様々な実施形態では、上記細胞内重炭酸塩レベルの増加は、シアナーゼおよび／またはカルボニックアンヒドラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする異種核酸配列の導入により生じる。異種核酸配列は、配列番号３３７から選択される配列と少なくとも７０％の相同性を有する配列から選択してよい。
様々な実施形態では、上記微生物のアセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼ経路における酵素活性の増加は、配列番号７６８〜７７５から選択される配列と少なくとも７０％の相同性を有するポリペプチドをコードする異種核酸配列の導入により生じる。
上記遺伝子改変細菌は、乳酸脱水素酵素、リン酸（ｐｈｏｐｈａｔｅ）アセチルトランスフェラーゼ、ピルビン酸酸化酵素またはピルビン酸−ギ酸リアーゼおよびそれらの組み合わせの活性を減少させるようにさらに改変され得る。
本発明による方法は、第３級アミンの存在下で上記培養物から３−ヒドロキシプロピオン酸を抽出することにより、上記細胞培養物から３−ヒドロキシプロピオン酸を分離および／または精製する工程をさらに含み得る。様々には、３−ヒドロキシプロピオン酸は、乾燥重量基準の微生物細胞１グラム当たり１時間当たり０．０５グラムより多い比生産性で生成されるかまたは１リットル当たり１時間当たり０．５０グラムより多い容積生産性で生成される。
本発明の方法は、おむつ、カーペット、塗料、接着剤およびアクリルガラスなどの消費者向け製品の製造を含み得る。本発明は、本発明の方法に従って生成される、生物学的に生成された３−ヒドロキシプロピオン酸を含む。このような３−ヒドロキシプロピオン酸は、モリブデンおよび／またはバナジウムベースの触媒を含む化学触媒を本質的に含まなくてよい。本発明の方法に従って生成される３−ヒドロキシプロピオン酸は、約１．０×１０−１４以上の炭素１２に対する炭素１４の比を有し得る。様々な態様では、上記３−ヒドロキシプロピオン酸は、約１０％未満の石油由来の炭素を含有する。さらに、本発明による３−ヒドロキシプロピオン酸は、その生成方法に関連付けられる残留量の有機物質を含有し得る。様々な実施形態では、上記３−ヒドロキシプロピオン酸は、その３−ヒドロキシプロピオン酸の１ｐｐｍから１，０００ｐｐｍの間の量で残留量の有機物質を含有する。
本発明の方法に従って生成される場合のアクリル酸およびアクリル酸から生成されるポリマーも、本発明に含まれる。上記ポリマーから得られる商業製品および消費者向け製品を含む製品も包含される。例えば、おむつ、カーペット、塗料、接着剤およびアクリルガラスが包含される。
さらに、本発明は、請求項４０に記載のアクリル酸のバイオ生産（ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ）のための系であって、バイオマスの糖化のためのタンクと、糖化の生成物を、必要に応じて前発酵タンクを介して発酵タンクに送るためのラインと、微生物細胞培養に適する発酵タンクと、その発酵タンクからの内容物を抽出容器および／または分離容器に吐出するためのラインと、細胞培養廃棄物から３−ヒドロキシプロピオン酸を取り出すのに適する抽出容器および／または分離容器と、３−ヒドロキシプロピオン酸を脱水容器に移送するためのラインと、３−ヒドロキシプロピオン酸からアクリル酸への変換に適する脱水容器とを含む系を包含する。様々な実施形態では、上記系は、１つ以上の前発酵タンク、蒸留カラム、遠心分離容器、逆抽出カラム、混合容器またはそれらの組み合わせをさらに含む。様々な実施形態では、上記系は、１年当たり少なくとも１トンのアクリル酸の最少生成能力を有する。
０．０５ｇ／ｇＤＣＷ−ｈｒより大きい、０．０８ｇ／ｇＤＣＷ−ｈｒ、０．１ｇ／ｇＤＣＷ−ｈｒより大きい、０．１３ｇ／ｇＤＣＷ−ｈｒより大きい、０．１５ｇ／ｇＤＣＷ−ｈｒより大きい、０．１７５ｇ／ｇＤＣＷ−ｈｒより大きい、０．２ｇ／ｇＤＣＷ−ｈｒより大きい、０．２５ｇ／ｇＤＣＷ−ｈｒより大きい、０．３ｇ／ｇＤＣＷ−ｈｒより大きい、０．３５ｇ／ｇＤＣＷ−ｈｒより大きい、０．４ｇ／ｇＤＣＷ−ｈｒより大きい、０．４５ｇ／ｇＤＣＷ−ｈｒより大きいまたは０．５ｇ／ｇＤＣＷ−ｈｒより大きい速度から選択される比速度にて３−ヒドロキシプロピオネートを生成できる遺伝子改変微生物は、本発明の範囲内である。
上記遺伝子改変微生物は、マロニル−ｃｏＡ還元酵素活性およびアセチル−ｃｏＡカルボキシラーゼ活性を増加させる遺伝子改変と、エノイル−ＡＣＰ還元酵素活性、乳酸脱水素酵素活性および酢酸キナーゼ活性を低減させる遺伝子改変とを含み得る。様々には、上記微生物は、マロニル−ｃｏＡ還元酵素活性およびアセチル−ｃｏＡカルボキシラーゼ活性を増加させる遺伝子改変と、エノイル−ＡＣＰ還元酵素活性、乳酸脱水素酵素活性およびアセチルリン酸トランスフェラーゼ活性を低減させる遺伝子改変とを含む。さらに、上記微生物は、マロニル−ｃｏＡ還元酵素活性およびアセチル−ｃｏＡカルボキシラーゼ活性を増加させる遺伝子改変と、エノイル−ＡＣＰ還元酵素活性、乳酸脱水素酵素活性、酢酸キナーゼ活性およびアセチルリン酸トランスフェラーゼ活性を低減させる遺伝子改変とを含み得る。様々な態様では、上記微生物は、マロニル−ｃｏＡ還元酵素活性およびアセチル−ｃｏＡカルボキシラーゼ活性を増加させる遺伝子改変と、エノイル−ＡＣＰ還元酵素活性、乳酸脱水素酵素活性およびピルビン酸ギ酸リアーゼ活性を低減させる遺伝子改変とを含む。様々な実施形態では、上記微生物は、マロニル−ｃｏＡ還元酵素活性およびアセチル−ｃｏＡカルボキシラーゼ活性を増加させる遺伝子改変と、エノイル−ＡＣＰ還元酵素活性、乳酸脱水素酵素活性およびピルビン酸酸化酵素活性を低減させる遺伝子改変とを含む。マロニル−ｃｏＡ還元酵素活性およびアセチル−ｃｏＡカルボキシラーゼ活性を増加させる遺伝子改変と、エノイル−ＡＣＰ還元酵素活性、乳酸脱水素酵素活性およびメチルグリオキサール合成酵素活性を低減させる遺伝子改変とを含む微生物も含まれる。さらに、本発明による微生物は、マロニル−ｃｏＡ還元酵素活性およびアセチル−ｃｏＡカルボキシラーゼ活性を増加させる遺伝子改変と、β−ケトアシル−ＡＣＰ合成酵素活性を増加させる遺伝子改変と、乳酸脱水素酵素活性およびメチルグリオキサール合成酵素活性を減少させる遺伝子改変とを含んでよく、および／または微生物は、マロニル−ｃｏＡ還元酵素活性およびアセチル−ｃｏＡカルボキシラーゼ活性を増加させる遺伝子改変と、エノイル−ＡＣＰ還元酵素活性、グアノシン３’−二リン酸５’−三リン酸合成酵素活性およびグアノシン３’−二リン酸５’−二リン酸合成酵素活性を低減させる遺伝子改変とを含んでよい。また、いくつかの微生物では、エノイル−ＣｏＡ還元酵素は、エノイル−ＡＣＰ還元酵素活性についてそのようにする代わりにまたはそれに加えて低減される。
様々な実施形態では、ＮＡＤＨ／ＮＡＤＰＨトランスヒドロゲナーゼ活性を増加させるさらなる遺伝子改変が行われている。例えば、トランスヒドロゲナーゼ活性は、可溶性であってよく、膜結合性であってよく、シアナーゼ活性を増加させるさらなる遺伝子改変が行われてよく、カルボニックアンヒドラーゼ活性を増加させるさらなる遺伝子改変が行われてよく、かつ／またはピルビン酸脱水素酵素活性を増加させるさらなる遺伝子改変が行われてよい。
様々な実施形態では、グアノシン３’−二リン酸５’−三リン酸合成酵素活性およびグアノシン３’−二リン酸５’−二リン酸合成酵素活性を減少させるさらなる遺伝子改変が行われている。通気環境におけるＮＡＤＨ／ＮＡＤ＋比を増加させる遺伝子改変が行われた場合も含まれる。さらに、β−ケトアシル−ＡＣＰ合成酵素活性を減少させ、３−ヒドロキシプロピオン酸還元酵素活性を減少させ、ＮＡＤ＋依存３−ヒドロキシプロピオン酸脱水素酵素活性を減少させ、ＮＡＤ＋依存３−ヒドロキシプロピオン酸脱水素酵素活性を減少させ、３−ヒドロキシプロピオン酸に対する耐性を増加させ、３−ＨＰ寛容原性複合体における任意の酵素の活性を増加させ、ピルビン酸脱水素酵素活性を増加させ、シアナーゼ活性を増加させ、カルボニックアンヒドラーゼ活性を増加させ、アスパラギン酸キナーゼ活性を増加させ、トレオニンデヒドラターゼ活性を増加させ、２−デヒドロ−３−デオキシホスホヘプトン酸アルドラーゼ活性を増加させ、システイン合成酵素活性を増加させ、リボース−リン酸ジホスホキナーゼ活性を増加させ、リボヌクレオシド−二リン酸還元酵素活性を増加させ、Ｌ−システインデスルフヒドラーゼ活性を増加させ、リシンデカルボキシラーゼ活性を増加させ、ホモシステイントランスメチラーゼ活性を増加させ、ジヒドロ葉酸還元酵素活性を増加させ、Ｎ−アセチルグルタミルリン酸還元酵素活性を増加させ、アセチルグルタミン酸キナーゼ活性を増加させ、アルギニノコハク酸リアーゼ活性を増加させ、アセチルオルニチンデアセチラーゼ活性を増加させ、コリスミ酸ムターゼ活性を増加させ、プレフェン酸脱水酵素活性を増加させ、プレフェン酸脱水素酵素活性を増加させ、２−デヒドロ−３−デオキシホスホヘプトン酸アルドラーゼ活性を増加させ、かつ／またはＤ−３−ホスホグリセリン酸脱水素酵素活性を増加させる遺伝子改変が行われてよい。
様々な実施形態では、本発明は、水性培地中の炭素源と、請求項４８〜９２のいずれか一項に記載の遺伝子改変微生物とを含む培養系であって、上記遺伝子改変微生物が、０．０５ｇＤＣＷ／Ｌより多い、０．１ｇＤＣＷ／Ｌ、１ｇＤＣＷ／Ｌより多い、５ｇＤＣＷ／Ｌより多い、１０ｇＤＣＷ／Ｌより多い、１５ｇＤＣＷ／Ｌより多いまたは２０ｇＤＣＷ／Ｌより多いから選択される量で存在する、例えば上記水性培地の容量が５ｍＬより多い、１００ｍＬより多い、０．５Ｌより多い、１Ｌより多い、２Ｌより多い、１０Ｌより多い、２５０Ｌより多い、１０００Ｌより多い、１０，０００Ｌより多い、５０，０００Ｌより多い、１００，０００Ｌより多いまたは２００，０００Ｌより多いから選択される場合、および上記水性培地の容量が、２５０Ｌより多く、鋼容器に含有されている場合などの培養系を含む。
様々には、このような培養系のための炭素源は、デキストロース、スクロース、ペントース、ポリオール、ヘキソース、ヘキソースとペントースとの両方および、それらの組み合わせから選択され、上記水性培地のｐＨは、７．５未満であり、上記培養系は、例えばｉ）５ｍｍｏｌ／Ｌ−ｈｒより大きく、２００ｍｍｏｌ／Ｌ−ｈｒ未満の酸素、ｉｉ）５ｍｍｏｌ／Ｌ−ｈｒより大きく、１００ｍｍｏｌ／Ｌ−ｈｒ未満の酸素、ｉｉｉ）５ｍｍｏｌ／Ｌ−ｈｒより大きく、８０ｍｍｏｌ／Ｌ−ｈｒ未満の酸素、およびｉｖ）５ｍｍｏｌ／Ｌ−ｈｒより大きく、５０ｍｍｏｌ／Ｌ−ｈｒ未満の酸素から選択される酸素移送速度で通気されている。
様々な実施形態では、本発明は、請求項９３〜９９のいずれか一項に記載の培養系から得られる水性ブロスであって、ｉ）５ｇ／Ｌより多い、１０ｇ／Ｌより多い、１５ｇ／Ｌより多い、２０ｇ／Ｌより多い、２５ｇ／Ｌより多い、３０ｇ／Ｌより多い、３５ｇ／Ｌより多い、４０ｇ／Ｌより多い、５０ｇ／Ｌより多い、６０ｇ／Ｌより多い、７０ｇ／Ｌより多い、８０ｇ／Ｌより多い、９０ｇ／Ｌより多いまたは１００ｇ／Ｌより多い３−ヒドロキシプロピオネートから選択される濃度の３−ヒドロキシプロピオネート、およびｉｉ）３０ｇ／Ｌ未満、２０ｇ／Ｌ未満、１０ｇ／Ｌ未満、５ｇ／Ｌ未満、１ｇ／Ｌ未満または０．５ｇ／Ｌ未満から選択される濃度の１，３−プロパンジオールを含む水性ブロスである。いくつかの態様では、上記水性ブロスは、２０ｇＤＣＷ／Ｌ未満のバイオマス、１５ｇＤＣＷ／Ｌ未満のバイオマス、１０ｇＤＣＷ／Ｌ未満のバイオマス、５ｇＤＣＷ／Ｌ未満のバイオマスまたは１ｇＤＣＷ／Ｌ未満のバイオマスから選択される量のバイオマスを含む。代わりに、本発明による水性ブロスは、３−ＨＰ／スクシネート比（ｇ３−ＨＰ／ｇスクシネート）が、３より大きい、１０より大きい、３０より大きい、６０より大きい、１００より大きい、１５０より大きいまたは２００より大きいものである。様々な態様では、３−ＨＰ／フマレート比（ｇ３−ＨＰ／ｇフマレート）が、３より大きい、１０より大きい、３０より大きい、６０より大きい、１００より大きい、１５０より大きいもしくは２００より大きいか、または３−ＨＰ／グリセロール比（ｇ３−ＨＰ／ｇグリセロール）が、３より大きい、１０より大きい、３０より大きい、６０より大きい、１００より大きい、１５０より大きいもしくは２００より大きいか、または３−ＨＰ／アセテート比（ｇ３−ＨＰ／ｇアセテート）が、１．５より大きい、３より大きい、１０より大きい、３０より大きい、６０より大きい、１００より大きい、１５０より大きいもしくは２００より大きいか、または３−ＨＰ／アラニン比（ｇ３−ＨＰ／ｇアラニン）が、３より大きい、１０より大きい、３０より大きい、６０より大きい、１００より大きい、１５０より大きいもしくは２００より大きいか、または３−ＨＰ／ベータ−アラニン比（ｇ３−ＨＰ／ｇベータ−アラニン）が、１．５より大きい、３より大きい、１０より大きい、３０より大きい、６０より大きい、１００より大きい、１５０より大きいもしくは２００より大きいか、または３−ＨＰ／グルタメート比（ｇ３−ＨＰ／ｇグルタメート）が、３より大きい、１０より大きい、３０より大きい、６０より大きい、１００より大きい、１５０より大きいもしくは２００より大きいか、または３−ＨＰ／グルタミン比（ｇ３−ＨＰ／ｇグルタミン）が、３より大きい、１０より大きい、３０より大きい、６０より大きい、１００より大きい、１５０より大きいもしくは２００より大きいか、または３−ＨＰ／３−ヒドロキシプロピオンアルデヒド比（ｇ３−ＨＰ／ｇ３−ヒドロキシプロピオンアルデヒド（３−ｈｙｄｒｏｘｙｐｒｏｐｉｏａｌｄｅｈｙｄｅ））が、１．５より大きい、３より大きい、１０より大きい、３０より大きい、６０より大きい、１００より大きい、１５０より大きいもしくは２００より大きいか、または３−ＨＰ／１，３−プロパンジオール比（ｇ３−ＨＰ／ｇ１，３−プロパンジオール）が、１．５より大きい、３より大きい、１０より大きい、３０より大きい、６０より大きい、１００より大きい、１５０より大きいまたは２００より大きく、かつ／または３−ＨＰ／ラクテート比（ｇ３−ＨＰ／ｇラクテート）が、３より大きい、１０より大きい、３０より大きい、６０より大きい、１００より大きい、１５０より大きいもしくは２００より大きい。
本発明の新規な特徴を、特に本特許請求の範囲に示す。本発明の原理が利用されている説明のための実施形態を示す以下の詳細な記載および以下のような添付の図面を参照することにより、本発明の特徴および利点のよりよい理解が得られる。
図１は、本発明の態様、より具体的には３−ＨＰ生成に関連する微生物の代謝経路を、ある特定の酵素工程にて示すＥ．ｃｏｌｉの遺伝子名とともに示す図である（後者は例であり、限定することを意味しない）。 図２Ａは、本発明の態様に関連する微生物の代謝経路を、ある特定の酵素工程にて示すＥ．ｃｏｌｉの遺伝子名とともに示す図である（後者は例であり、限定することを意味しない）。 図２Ｂは、図２Ａでより一般的に示した脂肪酸合成酵素系の代表的な酵素変換および例示的なＥ．ｃｏｌｉ遺伝子をより詳細に示す図である。 図３は、カルボニックアンヒドラーゼポリペプチドを比較する、例示的な複数配列アラインメントを示す図である（カルボニックアンヒドラーゼポリペプチドのＣＬＵＳＴＡＬ ２．０．１２複数配列アラインメント）。 図４Ａは、例示的な配列アラインメント：ｆａｂＩｔｓ（ＪＰ１１１１（配列番号７６９））および野生型（ＢＷ２５１１３（配列番号８２７））Ｅ．ｃｏｌｉ ｆａｂＩ遺伝子のＤＮＡ配列の比較であり、ＤＮＡ変異：Ｃ７２２Ｔであることを示す図である。 図４Ｂは、例示的な配列アラインメント：ｆａｂＩｔｓ（ＪＰ１１１１（配列番号７７０）および野生型（ＢＷ２５１１３（配列番号８２８））Ｅ．ｃｏｌｉ ｆａｂＩ遺伝子のタンパク質配列の比較であり、アミノ酸−Ｓ２４１Ｆであることを示す図である。 図５は、実施例１１からのデータおよび結果を示す図である。 図６は、実施例１１からのデータおよび結果を示す図である。 図７は、実施例１１からのデータおよび結果を示す図である。 図８は、本発明の態様、より具体的には３−ＨＰ生成と関連付けられる複数遺伝子改変を有する微生物の代謝経路を、ある特定の酵素工程において示されるＥ．ｃｏｌｉの遺伝子名とともに示す図である（後者は例であり、限定することを意味しない）。 図９Ａ、シート１〜７は、Ｅ．ｃｏｌｉにおける３−ＨＰ寛容原性複合体（３ＨＰＴＧＣ）を一緒に含む、経路の生成物および酵素を示す代謝経路の構成部分の多重シート図である。シート１は、残りのシートの配置の全般的な模式図を示す。 図９Ａ、シート１〜７は、Ｅ．ｃｏｌｉにおける３−ＨＰ寛容原性複合体（３ＨＰＴＧＣ）を一緒に含む、経路の生成物および酵素を示す代謝経路の構成部分の多重シート図である。シート１は、残りのシートの配置の全般的な模式図を示す。 図９Ａ、シート１〜７は、Ｅ．ｃｏｌｉにおける３−ＨＰ寛容原性複合体（３ＨＰＴＧＣ）を一緒に含む、経路の生成物および酵素を示す代謝経路の構成部分の多重シート図である。シート１は、残りのシートの配置の全般的な模式図を示す。 図９Ａ、シート１〜７は、Ｅ．ｃｏｌｉにおける３−ＨＰ寛容原性複合体（３ＨＰＴＧＣ）を一緒に含む、経路の生成物および酵素を示す代謝経路の構成部分の多重シート図である。シート１は、残りのシートの配置の全般的な模式図を示す。 図９Ａ、シート１〜７は、Ｅ．ｃｏｌｉにおける３−ＨＰ寛容原性複合体（３ＨＰＴＧＣ）を一緒に含む、経路の生成物および酵素を示す代謝経路の構成部分の多重シート図である。シート１は、残りのシートの配置の全般的な模式図を示す。 図９Ａ、シート１〜７は、Ｅ．ｃｏｌｉにおける３−ＨＰ寛容原性複合体（３ＨＰＴＧＣ）を一緒に含む、経路の生成物および酵素を示す代謝経路の構成部分の多重シート図である。シート１は、残りのシートの配置の全般的な模式図を示す。 図９Ａ、シート１〜７は、Ｅ．ｃｏｌｉにおける３−ＨＰ寛容原性複合体（３ＨＰＴＧＣ）を一緒に含む、経路の生成物および酵素を示す代謝経路の構成部分の多重シート図である。シート１は、残りのシートの配置の全般的な模式図を示す。 図９Ｂ、シート１〜７は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓについての３ＨＰＴＧＣの多重シート図を示す。シート１は、残りのシートの配置の全般的な模式図を示す。 図９Ｂ、シート１〜７は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓについての３ＨＰＴＧＣの多重シート図を示す。シート１は、残りのシートの配置の全般的な模式図を示す。 図９Ｂ、シート１〜７は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓについての３ＨＰＴＧＣの多重シート図を示す。シート１は、残りのシートの配置の全般的な模式図を示す。 図９Ｂ、シート１〜７は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓについての３ＨＰＴＧＣの多重シート図を示す。シート１は、残りのシートの配置の全般的な模式図を示す。 図９Ｂ、シート１〜７は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓについての３ＨＰＴＧＣの多重シート図を示す。シート１は、残りのシートの配置の全般的な模式図を示す。 図９Ｂ、シート１〜７は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓについての３ＨＰＴＧＣの多重シート図を示す。シート１は、残りのシートの配置の全般的な模式図を示す。 図９Ｂ、シート１〜７は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓについての３ＨＰＴＧＣの多重シート図を示す。シート１は、残りのシートの配置の全般的な模式図を示す。 図９Ｃ、シート１〜７は、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅについての３ＨＰＴＧＣの多重シート図を示す。シート１は、残りのシートの配置の全般的な模式図を示す。 図９Ｃ、シート１〜７は、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅについての３ＨＰＴＧＣの多重シート図を示す。シート１は、残りのシートの配置の全般的な模式図を示す。 図９Ｃ、シート１〜７は、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅについての３ＨＰＴＧＣの多重シート図を示す。シート１は、残りのシートの配置の全般的な模式図を示す。 図９Ｃ、シート１〜７は、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅについての３ＨＰＴＧＣの多重シート図を示す。シート１は、残りのシートの配置の全般的な模式図を示す。 図９Ｃ、シート１〜７は、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅについての３ＨＰＴＧＣの多重シート図を示す。シート１は、残りのシートの配置の全般的な模式図を示す。 図９Ｃ、シート１〜７は、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅについての３ＨＰＴＧＣの多重シート図を示す。シート１は、残りのシートの配置の全般的な模式図を示す。 図９Ｃ、シート１〜７は、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅについての３ＨＰＴＧＣの多重シート図を示す。シート１は、残りのシートの配置の全般的な模式図を示す。 図９Ｄ、シート１〜７は、Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ ｎｅｃａｔｏｒ（以前のＲａｌｓｔｏｎｉａ ｅｕｔｒｏｐｈａ）についての３ＨＰＴＧＣの多重シート図を示す。シート１は、残りのシートの配置の全般的な模式図を示す。 図９Ｄ、シート１〜７は、Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ ｎｅｃａｔｏｒ（以前のＲａｌｓｔｏｎｉａ ｅｕｔｒｏｐｈａ）についての３ＨＰＴＧＣの多重シート図を示す。シート１は、残りのシートの配置の全般的な模式図を示す。 図９Ｄ、シート１〜７は、Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ ｎｅｃａｔｏｒ（以前のＲａｌｓｔｏｎｉａ ｅｕｔｒｏｐｈａ）についての３ＨＰＴＧＣの多重シート図を示す。シート１は、残りのシートの配置の全般的な模式図を示す。 図９Ｄ、シート１〜７は、Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ ｎｅｃａｔｏｒ（以前のＲａｌｓｔｏｎｉａ ｅｕｔｒｏｐｈａ）についての３ＨＰＴＧＣの多重シート図を示す。シート１は、残りのシートの配置の全般的な模式図を示す。 図９Ｄ、シート１〜７は、Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ ｎｅｃａｔｏｒ（以前のＲａｌｓｔｏｎｉａ ｅｕｔｒｏｐｈａ）についての３ＨＰＴＧＣの多重シート図を示す。シート１は、残りのシートの配置の全般的な模式図を示す。 図９Ｄ、シート１〜７は、Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ ｎｅｃａｔｏｒ（以前のＲａｌｓｔｏｎｉａ ｅｕｔｒｏｐｈａ）についての３ＨＰＴＧＣの多重シート図を示す。シート１は、残りのシートの配置の全般的な模式図を示す。 図９Ｄ、シート１〜７は、Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ ｎｅｃａｔｏｒ（以前のＲａｌｓｔｏｎｉａ ｅｕｔｒｏｐｈａ）についての３ＨＰＴＧＣの多重シート図を示す。シート１は、残りのシートの配置の全般的な模式図を示す。 図１０は、グリシン切断経路の図を示す。 図１１は、従来技術の参考文献からの、グルコースからピルベート、ピルベートからアセチル−ＣｏＡ、アセチル−ＣｏＡからマロニル−ＣｏＡ、マロニル−ＣｏＡから３−ＨＰまでの公知の３−ＨＰ生成経路のまとめを示す図である。 図１２は、従来技術の参考文献からの、グルコースからホスホエノールピルベート（ＰＥＰ）、ホスホエノールピルベートからオキサロアセテート（直接またはピルベートを介して）、オキサロアセテートからアスパルテート、アスパルテートからβ−アラニン、β−アラニンからマロネートセミアルデヒド、マロネートセミアルデヒドから３−ＨＰまでの公知の３−ＨＰ生成経路のまとめを示す図である。 図１３は、従来技術の参考文献からの公知の３−ＨＰ生成経路のまとめを示す図である。 図１４ＡおよびＢは、Ｅ．ｃｏｌｉにおける天然の混合発酵経路の模式図を示す。 図１５Ａ〜Ｏは、３−ＨＰに対する対照微生物応答のグラフのデータを示し、図１５Ｐは、３ＨＰＴＧＣの１遺伝子改変との比較を示す図である。 図１５Ａ〜Ｏは、３−ＨＰに対する対照微生物応答のグラフのデータを示し、図１５Ｐは、３ＨＰＴＧＣの１遺伝子改変との比較を示す図である。 図１５Ａ〜Ｏは、３−ＨＰに対する対照微生物応答のグラフのデータを示し、図１５Ｐは、３ＨＰＴＧＣの１遺伝子改変との比較を示す図である。 図１５Ａ〜Ｏは、３−ＨＰに対する対照微生物応答のグラフのデータを示し、図１５Ｐは、３ＨＰＴＧＣの１遺伝子改変との比較を示す図である。 図１５Ａ〜Ｏは、３−ＨＰに対する対照微生物応答のグラフのデータを示し、図１５Ｐは、３ＨＰＴＧＣの１遺伝子改変との比較を示す図である。 図１５Ａ〜Ｏは、３−ＨＰに対する対照微生物応答のグラフのデータを示し、図１５Ｐは、３ＨＰＴＧＣの１遺伝子改変との比較を示す図である。 図１５Ａ〜Ｏは、３−ＨＰに対する対照微生物応答のグラフのデータを示し、図１５Ｐは、３ＨＰＴＧＣの１遺伝子改変との比較を示す図である。 図１５Ａ〜Ｏは、３−ＨＰに対する対照微生物応答のグラフのデータを示し、図１５Ｐは、３ＨＰＴＧＣの１遺伝子改変との比較を示す図である。 図１６は、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ由来のｋｇｄ遺伝子によりコードされるアルファ−ケトグルタレートにより触媒される公知の化学反応を示す図である。 図１７は、新しい酵素機能である、ｋｇｄ遺伝子の改変により達成されることとなる、マロネートセミアルデヒドへのオキサロアセテートの脱炭酸を示す図である。 図１８は、ｋｇｄ変異体についての提案される選択アプローチを示す図である。 図１９は、図１８に示す提案される選択アプローチに関連するスクリーニングプロトコールを示す図である。 図２０は、ＩｒｏＫペプチド配列に関する比較を示す図である。 図２１は、ＨＰＬＣを用いて行った３−ＨＰについての検量線を示す図である。 図２２は、ＧＣ／ＭＳについて行った３−ＨＰについての検量線を示す図である。 図２３は、３−ＨＰについての酵素（ｅｎａｙｍａｔｉｃ）アッセイの代表的な標準曲線を示す図である。 図２４Ａ、ＢおよびＣは、バイオマスを、おむつなどの最終製品に変換する全体のプロセスの模式図を示す図である。 図２５ＡおよびＢは、バイオマスを、おむつなどの最終製品に変換する全体のプロセスの模式図を示す図である。
表も本明細書で示し、本明細書の一部である。
本発明は、様々な化学生成物の発酵による生成のために有用性を有する様々な生成方法および／または遺伝子改変微生物、容器内のこれらの微生物の集団を利用するこのような化学生成物を作製する方法、ならびにこれらの微生物および方法を採用する化学的生成のための系に関する。このような微生物が、発酵イベントまたは発酵サイクルの間に化学生成物を生成する場合の比生産性の増加が、本発明の利点に含まれる。本発明は、３−ヒドロキシプロピオン酸（３−ＨＰ）などの対象の化学生成物を、マロニル−ＣｏＡから脂肪酸アシル分子（これは、脂肪酸、例えば脂肪酸アシル−ＡＣＰ分子にその後変換され得る）への変換を調整するための１つ以上の手段を用いて生成するための生成技術および／または遺伝子改変微生物を提供する（ここで、その生成経路は、マロニル−ＣｏＡを基質として用いる酵素変換工程を含む）。マロニル−ＣｏＡから脂肪酸アシル−ＡＣＰ分子などの脂肪酸アシル分子への変換を調整するための手段は、微生物バイオマスへの炭素フローを、化学生成物への炭素フローと釣り合わせるために効果的であり、そして驚くべきことに、比生産性の割合の上昇の達成を与える。
本明細書で注目されるように、本発明の様々な態様は、マロニル−ＣｏＡから３−ＨＰまでの代謝経路を含む微生物細胞を対象とし、マロニル−ＣｏＡから脂肪酸アシル分子（これは、脂肪酸にその後変換され得る）への変換を調整する手段も提供される。よって、調整するための手段がこのような変換を減少させるように調整する場合、比率としてより大きい数のマロニル−ＣｏＡ分子が、１）生成され、かつ／または２）マロニル−ＣｏＡから３−ＨＰまでの代謝経路を介して変換される。様々な実施形態では、例えば、１）例えばカルボニックアンヒドラーゼを増加させることにより細胞内重炭酸塩レベルを増加させ、２）アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼおよびＮＡＤＰＨ依存性トランスヒドロゲナーゼの酵素活性を増加させるために、追加の遺伝子改変が行われ得る。
遺伝子改変微生物の集団による比生産性の予期せぬ増加が、その微生物がマロニル−ＣｏＡから選択された化学生成物までの微生物生成経路ならびに、その微生物の脂肪酸合成酵素系の選択された酵素（より具体的には、その脂肪酸伸長酵素）の酵素活性の低減をその中に有する方法および系において達成され得る。様々な実施形態では、このような微生物集団を含むバイオリアクタ容器への特定の補充物質（ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ）も、上記方法および系をさらに改善するために用いてよい。
さらに、ある化学生成物である３−ヒドロキシプロピオン酸（３−ＨＰ）について、生成経路についての遺伝子改変が提供され、それについての遺伝子改変および／または培養系の改変を行って３−ＨＰに対する微生物の耐性を増加させることができる寛容原性複合体が、記載される。さらに、カルボニックアンヒドラーゼおよび／もしくはシアナーゼの発現ならびに／または酵素活性を増加させるための遺伝子改変は、３−ＨＰ生成と３−ＨＰ耐性との両方を有利に改善するための二機能性を提供し得る。
様々な実施形態についてのその他の追加の遺伝子改変が、本明細書で開示される。
定義
本明細書および本特許請求の範囲で用いる場合、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈がそうでないことを明らかに命じていない限り、複数の言及を含む。つまり、例えば「発現ベクター」への言及は、単一の発現ベクターならびに同じ（例えば同じオペロン）であるかまたは異なっているかのいずれかの複数の発現ベクターを含み、「微生物」への言及は、単一の微生物ならびに複数の微生物を含む、などである。
本明細書で用いる場合、Ｅ．ｃｏｌｉ株についての乾燥細胞重量（ＤＣＷ）は、ベースラインＤＣＷのＯＤ６００の決定に基づいて、測定されたＯＤ６００値の０．３３倍として計算される。
本明細書で用いる場合、「酵素活性が低減された」、「酵素活性を低減する」などは、微生物細胞の酵素または単離酵素が、その同じ種の比較可能な細胞またはその天然酵素で測定される活性よりも低いレベルの活性を示すことを示すことを意味する。つまり、その酵素にとって公知の標準的な条件下で、示される基質（複数可）から示される生成物（複数可）への酵素変換は、天然（非改変）酵素による標準的な特定された条件下での同じ生化学的変換についての酵素活性よりも少なくとも１０パーセント小さい、少なくとも２０パーセント小さい、少なくとも３０パーセント小さい、少なくとも４０パーセント小さい、少なくとも５０パーセント小さい、少なくとも６０パーセント小さい、少なくとも７０パーセント小さい、少なくとも８０パーセント小さいまたは少なくとも９０パーセント小さい。この用語は、その酵素活性の消失も含み得る。酵素の酵素活性が低減された細胞は、当該技術において公知の任意の方法を用いて同定できる。例えば、酵素活性アッセイを用いて、酵素活性が低減された細胞を同定できる。例えば、Ｅｎｚｙｍｅ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ ２００７年を参照されたい。
用語「異種ＤＮＡ」、「異種核酸配列」などは、本明細書で用いる場合、以下の少なくとも１つが当てはまる核酸配列のことをいう：（ａ）核酸の配列が、所定の宿主微生物にとって外来である（すなわち、天然で見出されない）；（ｂ）上記配列が、所定の宿主微生物で天然に見出されるが、異常な（例えば予期されるより多い）量で見出され得る、または（ｃ）核酸の配列が、天然における互いの関係と同じ関係で見出されない２つ以上のサブ配列を含む。例えば、（ｃ）の場合に関して、組換え生成される異種核酸配列は、新しい機能的核酸を作製するように配置された無関係の遺伝子からの２つ以上の配列を有する。
用語「異種」は、用語「外因性」（後者の用語は、当該技術において一般的に用いられる）を含むことを意図する。異種核酸配列の導入の前に上記宿主微生物のゲノムについていう場合、上記酵素をコードする核酸配列が異種である（異種核酸配列がそのゲノムに導入されるか否かにかかわらず）。
本明細書で用いる場合、用語「遺伝子破壊」またはその文法的等価物（「酵素機能を破壊する」、「酵素機能の破壊」などを含む）は、コードされる遺伝子生成物を、そのように改変されていない微生物細胞におけるかまたは該微生物細胞からのポリペプチド活性と比較して低減されたポリペプチド活性を有するようにする微生物に対する遺伝子改変を意味することを意図する。上記遺伝子改変は、例えば、遺伝子全体の欠失、転写もしくは翻訳に要求される調節配列の欠失またはその他の改変、切断型遺伝子生成物（例えば酵素）をもたらす遺伝子の構成部分の欠失あるいはコードされる遺伝子生成物の活性を低減する（検出可能でない活性レベルまでを含む）任意の様々な変異ストラテジーによるものであり得る。破壊は、上記酵素をコードする核酸配列全体または一部の欠失を広く含むことができ、それらに限定されないが、その他の型の遺伝子改変、例えば停止コドンの導入、フレームシフト変異、上記遺伝子の構成部分の導入または除去および分解シグナルの導入、ｍＲＮＡ転写レベルおよび／または安定性に影響する遺伝子改変、ならびにその酵素をコードする遺伝子の上流のプロモーターまたはリプレッサーを変更することも含む。
様々な状況では、遺伝子破壊は、ＤＮＡ、そのＤＮＡからコードされるｍＲＮＡ、および対応するアミノ酸配列への任意の遺伝子改変であって、その結果としてポリペプチド活性の低減をもたらすことを意味すると理解される。多くの異なる方法を用いて、ポリペプチド活性が低減された細胞を作製できる。例えば、通常の変異誘発またはノックアウト技術を用いて、破壊された調節配列またはポリペプチドをコードする配列を有するように細胞を設計製作することができる。例えばＭｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｙｅａｓｔ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（１９９７年版）、Ａｄａｍｓら、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ（１９９８年）を参照されたい。遺伝子破壊のある特に有用な方法は、完全な遺伝子欠失である。なぜなら、これは、本発明の遺伝子改変微生物における遺伝子復帰の発生を低減または消失させるからである。よって、その生成物が酵素である遺伝子の破壊は、そのことにより酵素機能を破壊する。代わりに、アンチセンス技術を用いて、特定のポリペプチドの活性を低減できる。例えば、細胞は、ポリペプチドが翻訳されることを妨げるアンチセンス分子をコードするｃＤＮＡを含有するように設計製作できる。さらに、遺伝子サイレンシングを用いて、特定のポリペプチドの活性を低減できる。
用語「アンチセンス分子」は、本明細書で用いる場合、内因性ポリペプチドのコード鎖に相当する配列を含有する任意の核酸分子または核酸類似体（例えばペプチド核酸）を包含する。アンチセンス分子は、フランキング配列（例えば調節配列）も有し得る。つまり、アンチセンス分子は、リボザイムまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドであり得る。
本明細書で用いる場合、リボザイムは、分子がＲＮＡを切断することを条件として、限定することなく、ヘアピン、ハンマーヘッドまたは斧頭構造物を含む任意の一般的な構造を有し得る。
用語「低減」またはこのような句で用いられる場合の「低減する」およびその文法上の等価物は、このような変換（複数可）の完全な消失を包含することを意図する。
バイオ生産は、本明細書で用いる場合、好気、微好気または嫌気であり得る。
本明細書で用いる場合、「十分に相同な」との文言は、タンパク質またはその構成部分がそれぞれの酵素反応および／またはその他の機能を達成できるような本出願で提供されるアミノ酸配列のアミノ酸配列（配列番号／配列表を含む）と比較した場合に、最小限の数の同一または等価なアミノ酸残基を含むアミノ酸配列を有する上記タンパク質またはその構成部分のことをいう。特定のタンパク質またはその構成部分が十分に相同であるかは、当該技術において一般的に公知であるものなどの酵素活性のアッセイにより決定できる。
配列同一性および相同性についての記載および方法は、例示的であることを意図し、これらの概念は、当該技術においてよく理解されていると認識される。さらに、核酸配列を変化させてよく、それが酵素または所望の機能性を示すその他のポリペプチドをまだコードでき、このような変化が本発明の範囲内であることが認められる。
さらに核酸配列について、「ハイブリダイゼーション」は、２つの１本鎖ポリヌクレオチドが、非共有結合的に結合して、安定な２本鎖ポリヌクレオチドを形成するプロセスのことをいう。用語「ハイブリダイゼーション」は、３本鎖ハイブリダイゼーションのこともいうことがある。得られる（通常は）２本鎖のポリヌクレオチドは、「ハイブリッド」または「２重鎖」である。「ハイブリダイゼーション条件」は、典型的には、約１Ｍ未満、より一般的には約５００ｍＭ未満および約２００ｍＭ未満の塩濃度を含む。ハイブリダイゼーション温度は、５℃ほどの低い温度であってもよいが、典型的には２２℃より高く、より典型的には約３０℃より高く、しばしば約３７℃を超える。ハイブリダイゼーションは、ストリンジェント条件、すなわちプローブがその標的配列にハイブリダイズする条件の下で通常行われる。ストリンジェント条件は、配列依存的であり、異なる環境において異なる。より長い断片は、特定のハイブリダイゼーションについてより高いハイブリダイゼーション温度を要求することがある。塩基組成および相補鎖の長さ、有機溶媒の存在および塩基ミスマッチの程度を含む他の要因がハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに影響し得るので、パラメータの組み合わせは、いずれの１つ単独の絶対的尺度よりも重要である。一般的に、ストリンジェント条件は、規定されたイオン強度およびｐＨでの特定の配列についてのＴｍよりも約５℃低く選択される。例示的なストリンジェント条件は、ｐＨ７．０〜８．３および少なくとも２５℃の温度での少なくとも０．０１Ｍから１Ｍ以下のＮａイオン濃度（または他の塩）の塩濃度を含む。例えば、５×ＳＳＰＥの条件（７５０ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭリン酸Ｎａ、５ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ７．４）および２５〜３０℃の温度は、対立遺伝子特異的プローブハイブリダイゼーションに適する。ストリンジェント条件について、例えばＳａｍｂｒｏｏｋおよびＲｕｓｓｅｌｌおよびＡｎｄｅｒｓｏｎ「Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ」第１版、ＢＩＯＳ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ Ｌｉｍｉｔｅｄ（１９９９年）（ハイブリダイゼーションプロトコールについて本明細書に参照により組み込まれている）を参照されたい。「・・に特異的にハイブリダイズする」または「特異的に・・にハイブリダイズする」または同様の表現は、ストリンジェント条件の下で１つ以上の特定のヌクレオチド配列に実質的にまたはそれだけに分子が結合する、２重鎖を形成するまたはハイブリダイズすることをいう（その配列が複合体混合物（ｃｏｍｐｌｅｘ ｍｉｘｔｕｒｅ）（例えば全細胞の）ＤＮＡまたはＲＮＡに存在する場合）。
用語「同定された酵素機能性バリアント」は、酵素活性および対象の酵素の特異性を持つと決定されたが、このような対象の酵素とは異なるアミノ酸配列を有するポリペプチドを意味する。このような同定された酵素機能性バリアントをコードすると決定された対応する「バリアント核酸配列」を構築できる。遺伝子改変により３−ＨＰに対する耐性を増加させて、微生物における３ＨＰＴＧＣの酵素変換工程の１つ以上にて酵素変換を増加させるような特定の目的のために、１つ以上の遺伝子改変を行って、１つ以上の同定された３ＨＰＴＧＣ酵素機能性バリアント（複数可）をコードする１つ以上の異種核酸配列（複数可）を提供できる。つまり、このような核酸配列のそれぞれは、厳密には３ＨＰＴＧＣの酵素の公知のポリペプチドではないがそれでもなおこのような酵素の酵素活性を示すポリペプチドをコードする。このような核酸配列およびそれがコードするポリペプチドは、相同性または同一性の特定された限界内にはないことがあるが、細胞内においてそれを提供することにより、それでもなお所望の酵素活性および特異性を提供する。このようなバリアント核酸配列および同定された酵素機能性バリアントを得ることができることは、計算学的、予測的およびハイスループットな方法における進歩を含む生物情報学ならびにタンパク質工学および設計における現在の技術水準における最近の進歩により支持される。機能性バリアントは、より全般的には、酵素機能性バリアントおよびそれらをコードする核酸配列、ならびに元の（標的）配列の機能を示す非酵素ポリペプチドのバリアントを含む。
「対象のセグメント」の句の使用は、対象の遺伝子および任意のその他の核酸配列セグメントの両方を含むことを意味する。対象のセグメントを得るために用いられる方法の一例は、微生物の培養物を獲得することであり、ここで、その微生物のゲノムは、対象の遺伝子または核酸配列セグメントを含む。
遺伝子生成物、すなわち酵素の遺伝子改変について本特許請求の範囲を含む本明細書で言及する場合、遺伝子改変は、述べられる遺伝子生成物、すなわち酵素を通常コードする遺伝子などの核酸配列またはその遺伝子を含む核酸配列のものであると理解される。
いくつかの実施形態では、各切断型ポリペプチドは、各天然酵素をコードする核酸配列によりコードされるポリペプチドの全長の少なくとも約９０％、より具体的には各天然酵素をコードする核酸配列によりコードされるポリペプチドの全長の少なくとも９５％を有する。ポリペプチドの参照アミノ酸配列と少なくとも例えば９５％「同一」であるアミノ酸配列を有するポリペプチドに関して、本請求されるポリペプチドのアミノ酸配列が、本請求されるポリペプチド配列が上記ポリペプチドの参照アミノ酸の各々１００アミノ酸当たり５アミノ酸までの変更を含むことができる以外は、参照配列と同一であることを意図する。言い換えると、参照アミノ酸配列と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドを得るために、上記参照配列のアミノ酸残基の５％までが欠失もしくは別のアミノ酸で置換され得るか、または上記参照配列の全アミノ酸残基の５％までの数のアミノ酸が、その参照配列に挿入することができる。上記参照配列のこれらの変更は、上記参照アミノ酸配列のアミノ末端の位置もしくはカルボキシ末端の位置で生じることができるか、あるいは、これらの末端位置の間の任意の位置（上記参照配列の残基の間に個々別々に散在するかまたは上記参照配列内の１つ以上の隣接する基（ｇｒｏｕｐ）に散在する）で生じることができる。他の実施形態では、切断は、本明細書の他の場所で記載されるように、より実質的であり得る。
種およびその他の系統発生的同定は、微生物学の分野における当業者に公知の分類に従う。
本明細書で記載する方法および工程が、ある特定の順序で発生するある特定のイベントを示す場合、当業者は、ある特定の工程の順序を改変でき、このような改変が本発明の変形に従っていることを認識する。さらに、ある特定の工程は、可能である場合は並行プロセスにおいて同時に行ってよく、逐次的に行ってもよい。
本明細書で提供する予測的な実施例は、広く例示的で、いずれの様式でも限定しないことを意味する。このことは、３−ＨＰの分離および精製ならびに３−ＨＰから下流化合物への変換に関係する実施例にも当てはまる。なぜなら、本明細書に記載され本明細書に組み込まれている参考文献に開示されるものを含むこのような工程および変換への多数の可能なアプローチが存在するからである。
略語の意味は、次の通りである：「Ｃ」は、その使用から明確なように摂氏または摂氏℃を意味し、ＤＣＷは、乾燥細胞重量を意味し、「ｓ」は、秒（複数可）を意味し、「ｍｉｎ」は、分（複数可）を意味し、「ｈ」、「ｈｒ」または「ｈｒｓ」は、時間（複数可）を意味し、「ｐｓｉ」は、１平方インチ当たりのポンドを意味し、「ｎｍ」は、ナノメートルを意味し、「ｄ」は、日（複数可）を意味し、「μＬ」または「ｕＬ」または「ｕｌ」は、マイクロリットル（複数可）を意味し、「ｍＬ」は、ミリリットル（複数可）を意味し、「Ｌ」は、リットル（複数可）を意味し、「ｍｍ」は、ミリメートル（複数可）を意味し、「ｎｍ」はナノメートルを意味し、「ｍＭ」は、ミリモル濃度を意味し、「μＭ」または「ｕＭ」は、マイクロモル濃度を意味し、「Ｍ」は、モル濃度を意味し、「ｍｍｏｌ」は、ミリモル（複数可）を意味し、「μｍｏｌ」または「ｕＭｏｌ」は、マイクロモル（複数可）を意味し、「ｇ」は、グラム（複数可）を意味し、「μｇ」または「ｕｇ」は、マイクログラム（複数可）を意味し、「ｎｇ」は、ナノグラム（複数可）を意味し、「ＰＣＲ」は、ポリメラーゼ連鎖反応を意味し、「ＯＤ」は、光学濃度を意味し、「ＯＤ６００」は、６００ｎｍの光子波長で測定された光学濃度を意味し、「ｋＤａ」は、キロダルトンを意味し、「ｇ」は、重力定数を意味し、「ｂｐ」は、塩基対（複数可）を意味し、「ｋｂｐ」は、キロ塩基対（複数可）を意味し、「％ｗ／ｖ」は、重量／容量パーセントを意味し、「％ｖ／ｖ」は、容量／容量パーセントを意味し、「ＩＰＴＧ」は、イソプロピル−μ−Ｄ−チオガラクトピラノシドを意味し、「ＲＢＳ」は、リボソーム結合部位を意味し、「ｒｐｍ」は、毎分回転数を意味し、「ＨＰＬＣ」は、高性能液体クロマトグラフィーを意味し、「ＧＣ」は、ガスクロマトグラフィーを意味する。本明細書中で開示する場合、「３−ＨＰ」は、３−ヒドロキシプロピオン酸を意味し、「３ＨＰＴＧＣ」は、３−ＨＰ寛容原性複合体を意味する。また、１０＾５などは、１０５などを意味すると理解される。
Ｉ．炭素源
３−ＨＰについての生合成経路を有する組換え微生物とともに本発明において用いられるバイオ生産培地は、適切な炭素源または意図する代謝経路についての基質を含有しなければならない。適切な基質は、それらに限定されないが、グルコースおよびフラクトースなどの単糖、ラクトースもしくはスクロースなどのオリゴ糖、デンプンもしくはセルロースなどの多糖またはそれらの混合物、ならびにチーズホエー透過物、コーンスティープリカー、テンサイ糖蜜および大麦麦芽などの再生可能な供給材料からの未精製混合物を含み得る。さらに、炭素基質は、二酸化炭素、一酸化炭素またはメタノールなどの、重要な生化学的中間体への代謝変換が証明されている１炭素基質であってもよい。１および２炭素基質に加えて、メチロトローフ（ｍｅｔｈｙｌｏｔｒｏｐｈｉｃ）微生物は、メチルアミン、グルコサミンおよび代謝活性のための様々なアミノ酸などのいくつかのその他の炭素含有化合物を利用することも公知である。
上記の炭素基質およびそれらの混合物の全ては、本発明において炭素源として適切であることが企図されるが、炭素源として用いられる一般的な炭素基質は、グルコース、フラクトースおよびスクロースならびにこれらの糖のいずれかの混合物である。その他の適切な基質は、キシロース、アラビノース、その他のセルロースベースのＣ−５糖、高フラクトースコーンシロップならびに商業的に入手可能な様々なその他の糖および糖混合物を含む。スクロースは、サトウキビ、テンサイ、キャッサバ、バナナまたはその他の果物およびサトウモロコシなどの供給材料から得ることができる。グルコースおよびデキストロースは、トウモロコシ、コムギ、ライムギ、オオムギおよびオート麦などの穀粒を含むデンプンベースの供給材料の糖化により得ることができる。また、いくつかの実施形態では、上記炭素源の全てまたは構成部分は、グリセロールであってよい。代わりに、グリセロールは、追加の炭素源として除外されることがある。
１つの実施形態では、上記炭素源は、グルコース、フラクトース、スクロース、デキストロース、ラクトース、グリセロールおよびそれらの混合物から選択される。様々には、上記炭素源におけるこれらの成分の量は、約５０％より多い、約６０％より多い、約７０％より多い、約８０％より多い、約９０％より多いかもしくはそれより多く最大１００％まで、または本質的に上記炭素源の１００％であってよい。
さらに、メチロトローフ微生物は、メチルアミン、グルコサミンおよび代謝活性のための様々なアミノ酸などのいくつかのその他の炭素含有化合物を利用することが公知である。例えば、メチロトローフ酵母は、メチルアミンからの炭素を利用して、トレハロースまたはグリセロールを形成することが公知である（Ｂｅｌｌｉｏｎら、Ｍｉｃｒｏｂ． Ｇｒｏｗｔｈ Ｃ１ Ｃｏｍｐｄ．（Ｉｎｔ． Ｓｙｍｐ．）第７版（１９９３年）、４１５〜３２頁、編集者：Ｍｕｒｒｅｌｌ， Ｊ． Ｃｏｌｌｉｎ；Ｋｅｌｌｙ， Ｄｏｎ Ｐ．出版社；Ｉｎｔｅｒｃｅｐｔ， Ａｎｄｏｖｅｒ， ＵＫ）。同様に、Ｃａｎｄｉｄａの様々な種は、アラニンまたはオレイン酸を代謝する（Ｓｕｌｔｅｒら、Ａｒｃｈ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１５３巻：４８５〜４８９頁（１９９０年））。よって、本発明の実施形態で利用される炭素の供給源は、広い種類の炭素含有基質を包含し得ることが企図される。
さらに、発酵性糖は、例えば米国特許出願公開第２００７／００３１９１８Ａ１号（これは、本明細書に参照により組み込まれている）に記載されるように、前処理および糖化のプロセスにより、セルロース系バイオマスおよびリグノセルロース系バイオマスから得ることができる。バイオマスとは、任意のセルロース系材料またはリグノセルロース系材料のことをいい、セルロースを含み、必要に応じてヘミセルロース、リグニン、デンプン、オリゴ糖および／または単糖をさらに含む材料を含む。バイオマスは、タンパク質および／または脂質などの追加の成分も含んでよい。バイオマスは、単一の供給源に由来してよいか、またはバイオマスは、１より多い供給源に由来する混合物を含むことができる。例えば、バイオマスは、トウモロコシの穂軸とトウモロコシの茎と葉との混合物、または草と葉との混合物を含み得る。バイオマスは、それらに限定されないが、バイオエネルギー作物、農業残渣、市中の固形廃棄物、工業的固形廃棄物、紙製造からのスラッジ、庭の廃棄物、木材および林業廃棄物を含む。バイオマスの例は、それらに限定されないが、トウモロコシ穀粒、トウモロコシの穂軸、トウモロコシの皮などの作物残渣、トウモロコシの茎と葉、草、コムギ、コムギわら、オオムギ、オオムギわら、干し草、米わら、スイッチグラス、廃棄紙、サトウキビバガス、モロコシ、ダイズ、穀粒の製粉から得られる成分、木、枝、根、葉、木材チップ、のこくず、灌木および低木、野菜、果物、花ならびに動物堆肥を含む。このようなバイオマスのいずれも、バイオ生産方法または系において用いて、炭素源を提供できる。セルロース系バイオマスを、糖を含むより役に立つ利用できる炭素分子の混合物に分解するための様々なアプローチは、濃酸または希酸（例えば＜１％硫酸）の存在下で加熱すること；アンモニアで処理すること；イオン性の塩での処理；酵素による分解；およびこれらの組み合わせを含む。これらの方法は、通常、機械的分離および粉砕の後であり、適切な分離プロセスが後に続く。
様々な実施形態では、それらに限定されないが、スクロース、グルコース、キシロース、セルロースまたはヘミセルロースを含む広範囲の糖のいずれも、その中で限定培地（例えばそれらに限定されないが、Ｍ９最少培地、硫酸カリウム最少培地、酵母合成最少培地および多くのその他のものまたはこれらの変形物を含む最少塩培地）、３−ＨＰ生合成経路代替物の１つ以上を提供する微生物の接種材料および上記炭素源が組み合わされ得るリアクタ容器を含む工業的な系などにおいて微生物に与えられる。上記炭素源は、細胞に入り、周知で一般的な代謝経路により異化され、ホスホエノールピルベート（ＰＥＰ）を含む一般的な代謝中間体を産生する。（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｃｅｌｌ、第３版、Ｂ． Ａｌｂｅｒｔｓら、Ｇａｒｌａｎｄ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９９４年、４２〜４５頁、６６〜７４頁（糖の基本的な代謝異化経路の教示が参照により組み込まれている）；Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、第３版、Ｄ． Ｌ． ＮｅｌｓｏｎおよびＭ． Ｍ． Ｃｏｘ、Ｗｏｒｔｈ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、２０００年、５２７〜６５８頁（主要な代謝経路の教示が参照により組み込まれている）；ならびにＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、第４版、Ｌ． Ｓｔｒｙｅｒ、Ｗ． Ｈ． Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏ．、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９９５年、４６３〜６５０頁（これもまた主要な代謝経路の教示が参照により組み込まれている）を参照されたい。）
バイオベースの炭素は、限定することなくＡＳＴＭ Ｄ６８６６または様々なその他の技術を含む様々な方法に従って、石油ベースの炭素から区別できる。例えば、炭素１４と炭素１２の比は、バイオベースの炭素源と石油ベースの供給源とでは異なり、バイオベースの炭素源においてより高い炭素１４の比が見出される。様々な実施形態では、上記炭素源は石油ベースでないか、または主に石油ベースでない。様々な実施形態では、上記炭素源は、約５０％より多く非石油ベースであり、約６０％より多く非石油ベースであり、約７０％より多く非石油ベースであり、約８０％より多く非石油ベースであり、約９０％より多くまたはそれより多く非石油ベースである。様々な実施形態では、上記炭素源は、約１．０×１０−１４以上の炭素１２に対する炭素１４の比を有する。
様々な成分が、上記炭素源から除外され得る。例えば、いくつかの実施形態では、アクリル酸、１，４−ブタンジオールおよび／またはグリセロールは、上記炭素源から除外されるかまたは本質的に除外される。それ自体で、本発明のいくつかの実施形態による炭素源は、約５０％未満のグリセロール、約４０％未満のグリセロール、約３０％未満のグリセロール、約２０％未満のグリセロール、約１０％未満のグリセロール、約５％未満のグリセロール、約１％未満のグリセロールまたはそれ未満であってよい。例えば、上記炭素源は、グリセロールを本質的に含まなくてもよい。グリセロールを本質的に含まないとは、残留量で存在し得るいずれのグリセロールも、標的化合物の生成に実質的に寄与しないことを意味する。
ＩＩ．微生物
本明細書に記載され、請求される特徴は、本明細書で列挙する微生物またはこれもまた１つ以上の天然の、導入されたかまたは増強された３−ＨＰバイオ生産経路を含む別の適切な微生物から選択される微生物にもたらすことができる。つまり、いくつかの実施形態では、上記微生物は、内因性３−ＨＰ生成経路（これは、いくつかのこのような実施形態では、増強されていることがある）を含み、他の実施形態では、上記微生物は、内因性３−ＨＰ生成経路を含まない。
これらの遺伝子改変微生物のいろいろの種類は、１人以上の本発明者（複数可）のおよび／または本特許出願の所有者に譲渡されたその他の特許出願に記載され得るように、遺伝子改変および／またはその他の系の変更を含んでよい。
実施例は、ある特定の細菌および酵母微生物に対する具体的な改変および評価について記載する。本発明の範囲は、このような種により限定することを意味しないが、広範囲の適切な微生物に全般的に当てはめることができる。全般的に、本発明に用いられる微生物は、細菌、ラン藻類、糸状真菌および酵母から選択できる。
いくつかの実施形態について、３−ＨＰ寛容原性バイオ生産について初期に選択された微生物宿主も、グルコースを含む糖を高率に利用する。ほとんどの微生物は、炭水化物を利用できる。しかし、ある特定の環境微生物は、高い効率で炭水化物を利用できず、よって、グルコースまたはその他の炭水化物が主な添加された炭素源であることを意図するこのような実施形態のための、適切な宿主でない。
様々な種のゲノムが公知になっているので、本発明は、絶えず増加している範囲の適切な微生物に容易に用いることができる。さらに、遺伝子配列決定が比較的低コストであることに鑑みて、対象の種の遺伝子配列を容易に決定して、本発明の態様の適用をより容易に実現できるようにすることができる（公知のゲノム配列を有する微生物に対して遺伝子改変を適用することの容易さに基づいて）。
より具体的には、本明細書で記載する様々な基準に基づいて、本明細書で提供する耐性の態様を含む３−ＨＰのバイオ生産に適する微生物宿主は、それらに限定されないが、任意のグラム陰性微生物、より具体的にはＥ．ｃｏｌｉなどのＥｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ科のメンバーまたはＯｌｉｇｏｔｒｏｐｈａ ｃａｒｂｏｘｉｄｏｖｏｒａｎｓまたはＰｓｅｕｄｏｍｏｎｏｎａｓ ｓｐ．；任意のグラム陽性微生物、例えばＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｃｉｌｕｓ ｓｐ．もしくはＬａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．；酵母、例えばＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓもしくはＰｉｃｈｉａ ｓｔｉｐｉｔｉｓ；およびその他の群または微生物種を一般的に含み得る。より具体的には、３−ＨＰのバイオ生産に適する微生物宿主は、それらに限定されないが、属であるＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ、Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ、Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ、Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｐｉｃｈｉａ、Ｃａｎｄｉｄａ、ＨａｎｓｅｎｕｌａおよびＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓのメンバーを一般的に含む。特に対象となり得る宿主は、Ｏｌｉｇｏｔｒｏｐｈａ ｃａｒｂｏｘｉｄｏｖｏｒａｎｓ（例えばＯＭ５株）、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｅｕｔｒｏｐｈｕｓ（Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ ｎｅｃａｔｏｒ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｍａｃｅｒａｎｓ、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ
ｐｌａｎｔａｒｕｍ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃｉｕｍ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｇａｌｌｉｎａｒｉｕｍ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓおよびＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅを含む。
より具体的には、３−ＨＰのバイオ生産に適する微生物宿主は、それらに限定されないが、属であるＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ、Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ、Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ、Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｐｉｃｈｉａ、Ｃａｎｄｉｄａ、ＨａｎｓｅｎｕｌａおよびＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓのメンバーを一般的に含む。
特に対象となり得る宿主は、Ｏｌｉｇｏｔｒｏｐｈａ ｃａｒｂｏｘｉｄｏｖｏｒａｎｓ（例えばＯＭ５Ｔ株）、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ
ｅｕｔｒｏｐｈｕｓ（Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ ｎｅｃａｔｏｒ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ
ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｍａｃｅｒａｎｓ、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃｉｕｍ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｇａｌｌｉｎａｒｉｕｍ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓおよびＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅを含む。これらの種の任意の公知の株も、出発微生物として利用でき、任意の以下の種（それらの各株を含む）も同様に利用できる：Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ ｂａｓｉｌｅｎｓｉｓ、Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ ｃａｍｐｉｎｅｎｓｉｓ、Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ ｇｉｌａｒｄｉ、Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ ｌａｈａｒｓｉｓ、Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ ｍｅｔａｌｌｉｄｕｒａｎｓ、Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ ｏｘａｌａｔｉｃｕｓ、Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ ｐａｕｃｕｌｕｓ、Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ ｐｉｎａｔｕｂｏｎｅｎｓｉｓ、Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ ｒｅｓｐｉｒａｃｕｌｉおよびＣｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ ｔａｉｗａｎｅｎｓｉｓ。
いくつかの実施形態では、上記組換え微生物は、グラム陰性細菌である。いくつかの実施形態では、上記組換え微生物は、属であるＺｙｍｏｍｏｎａｓ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、ＡｌｃａｌｉｇｅｎｅｓおよびＫｌｅｂｓｉｅｌｌａから選択される。いくつかの実施形態では、上記組換え微生物は、種であるＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ ｎｅｃａｔｏｒ、Ｏｌｉｇｏｔｒｏｐｈａ
ｃａｒｂｏｘｉｄｏｖｏｒａｎｓおよびＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａから選択される。いくつかの実施形態では、上記組換え微生物は、Ｅ．ｃｏｌｉ株である。
いくつかの実施形態では、上記組換え微生物は、グラム陽性細菌である。いくつかの実施形態では、上記組換え微生物は、属であるＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ、Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ、ＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍおよびＢｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍから選択される。いくつかの実施形態では、上記組換え微生物は、種であるＢａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｍａｃｅｒａｎｓ、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃｉｕｍ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｇａｌｌｉｎａｒｉｕｍ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓおよびＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓから選択される。特定の実施形態では、組換え微生物は、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ株である。
いくつかの実施形態では、上記組換え微生物は、酵母である。いくつかの実施形態では、上記組換え微生物は、属であるＰｉｃｈｉａ、Ｃａｎｄｉｄａ、ＨａｎｓｅｎｕｌａおよびＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓから選択される。特定の実施形態において、上記組換え微生物は、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅである。
本開示に鑑みて、上記の微生物のいずれも、３−ＨＰ以外の化学生成物の生成に用いてよいことがさらに理解される。
上記宿主を遺伝子改変できることは、任意の組換え微生物の生成のために必須である。遺伝子移入技術の様式は、エレクトロポレーション、接合、形質導入または天然の形質転換によることがある。広範囲の宿主接合性プラスミドおよび薬剤耐性マーカーを利用可能である。クローニングベクターは、その宿主で機能できる抗生物質耐性マーカーの性質に基づいて、その宿主に合わせて作られる。
ＩＩＩ．培地および培養条件
本明細書で開示する型の１つから選択されるような適当な炭素源に加えて、バイオ生産培地は、適切なミネラル、塩、補因子、緩衝剤ならびに培養物の増殖および３−ＨＰ生成または本発明の下で作製されるその他の生成物の生成のために必要な酵素経路の促進に適する当業者に公知のその他の成分を含有しなければならない。
本発明の別の態様は、本発明の遺伝子改変微生物および必要に応じて補充物質を含む培地および培養条件に関係する。
典型的には、細胞を、約２５℃〜約４０℃の範囲の温度にて、適当な培地中で、および好熱微生物については７０℃までの温度で増殖させる。本発明における適切な増殖培地は、Ｌｕｒｉａ Ｂｅｒｔａｎｉ（ＬＢ）ブロス、Ｍ９最少培地、Ｓａｂｏｕｒａｕｄデキストロース（ＳＤ）ブロス、酵母培地（ＹＭ）ブロス、（Ｙｍｉｎ）酵母合成最少培地およびＭ９最少培地などの本明細書で記載する最少培地などの通常の商業的に調製された培地である。その他の限定増殖培地または合成増殖培地も用いてよく、特定の微生物の増殖のための適当な培地は、微生物学またはバイオ生産科学の当業者に公知である。様々な実施形態では、様々な成分を含まないかまたは様々な成分の添加が低レベルである、例えば１０、５、２もしくは１ｇ／Ｌ未満の、それらに限定されないが酵母エキス、ペプトン、トリプトン、大豆粉、コーンスティープリカーもしくはカゼインを含む複合窒素源を含む最少培地を開発して用いてよい。これらの最少培地は、ビオチン、ビタミンＢ１２およびビタミンＢ１２誘導体、チアミン、パントテナートならびにその他のビタミンを含むビタミン混合物が限定的に補充されていてもよい。最少培地は、２８、１７または２．５ｍＭ未満のリン酸塩、２５または４ｍＭ未満の硫酸塩および１３０または５０ｍＭ未満の全窒素を含有する限定された単純無機栄養源を有してもよい。
遺伝子改変微生物を用いる本発明の実施形態において用いられるバイオ生産培地は、意図する代謝経路に適する炭素基質を含有しなければならない。本明細書中の上記のように、適切な炭素基質は、一酸化炭素、二酸化炭素および様々な単糖およびオリゴ糖を含む。
バイオ生産に適するｐＨ範囲は、ｐＨ３．０〜ｐＨ１０．０の間であり、ｐＨ６．０〜ｐＨ８．０の間が、初期の条件について典型的なｐＨ範囲である。しかし、特定の実施形態についての実際の培養条件は、これらのｐＨ範囲により限定されることを意味しない。
バイオ生産は、かき混ぜを行うかもしくは行わない好気、微好気または嫌気条件下で行ってよい。
バイオ生産培地中で生成される３−ＨＰまたはその他の生成物（複数可）の量は、当該技術において公知のいくつかの方法、例えば高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、ガスクロマトグラフィー（ＧＣ）またはＧＣ／質量分析（ＭＳ）を用いて一般に決定できる。具体的な実施例についての具体的なＨＰＬＣ法が、本明細書に記載される。
ＩＶ．バイオ生産のリアクタおよび系
本発明による方法および／または組成物を利用する発酵系も、本発明の範囲内である。
本明細書に記載されかつ／または言及されるいずれの組換え微生物も、上記微生物が商業的に実行可能な操作で炭素源を３−ＨＰに変換する工業的なバイオ生産系に導入してよい。そのバイオ生産系は、このような組換え微生物を、炭素源基質および組換え微生物の増殖に適するバイオ生産培地とともにバイオリアクタ容器に導入し、バイオ生産系を、適切な温度範囲（およびその反応が好気または微好気であるならば溶存酸素濃度範囲）内に適切な時間維持して、３−ＨＰへの適切な分子の一部の所望の変換を得ることを含む。工業的なバイオ生産系およびそれらの操作は、化学工学およびバイオプロセス工学の技術における当業者に周知である。
バイオ生産は、かき混ぜを行うかもしくは行わない好気、微好気または嫌気条件下で行ってよい。好気、微好気および嫌気条件を達成するための微生物の培養および集団の操作は、当該技術において公知であり、栄養培地およびそのような微生物集団を含む液体培養物の溶存酸素レベルは、所望の好気、微好気または嫌気条件を維持または確認するために監視してよい。供給材料として合成ガスを用いる場合、好気、微好気または嫌気条件を利用してよい。糖を用いる場合、嫌気、好気または微好気条件を様々な実施形態で実行できる。
本明細書に記載されかつ／または言及されるいずれの組換え微生物も、その微生物が商業的に実行可能な操作で炭素源を３−ＨＰに、および必要に応じて様々な実施形態で３−ＨＰの１つ以上の下流化合物にも変換する工業的なバイオ生産系に導入してよい。上記バイオ生産系は、このような組換え微生物を、炭素源基質および組換え微生物の増殖に適するバイオ生産培地とともにバイオリアクタ容器に導入し、そのバイオ生産系を、適切な温度範囲（および反応が好気または微好気であるならば溶存酸素濃度範囲）内に適切な時間維持して、基質分子の構成部分から３−ＨＰへの所望の変換を得ることを含む。
様々な実施形態では、、合成ガス成分または糖が、例えば、その中で限定培地（例えばそれらに限定されないがＭ９最少培地、硫酸カリウム最少培地、酵母合成最少培地および多くのその他のものまたはこれらの変形物を含む最少塩培地）、本明細書で教示する生合成経路（複数可）の実施形態を提供する微生物の接種材料および上記炭素源が組み合わされ得るリアクタ容器を含む工業的な系において微生物に与えられる。上記炭素源は、細胞に入り、周知で一般的な代謝経路により異化され、ホスホエノールピルベート（ＰＥＰ）を含む一般的な代謝中間体が産生される。（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ
ｔｈｅ Ｃｅｌｌ、第３版、Ｂ． Ａｌｂｅｒｔｓら、Ｇａｒｌａｎｄ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９９４年、４２〜４５頁、６６〜７４頁（糖の基本的な代謝異化経路の教示が参照により組み込まれている）；Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、第３版、Ｄ． Ｌ． ＮｅｌｓｏｎおよびＭ． Ｍ． Ｃｏｘ、Ｗｏｒｔｈ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、２０００年、５２７〜６５８頁（主要な代謝経路の教示が参照により組み込まれている）；ならびにＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、第４版、Ｌ． Ｓｔｒｙｅｒ、Ｗ． Ｈ． Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏ．、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９９５年、４６３〜６５０頁（これもまた主要な代謝経路の教示が参照により組み込まれている）を参照されたい。）
工業的バイオ生産の型についてさらに、本発明の様々な実施形態では、バッチ型の工業的バイオリアクタを採用してよい。伝統的なバッチバイオリアクタ系は、その培地の組成が各バイオ生産イベントの開始時に確立され、そのバイオ生産イベントの終末で実質的に終了する期間の間に人工的な変更および追加に供されないことを意味する「閉鎖」であるとみなされる。つまり、上記バイオ生産イベントの開始時に、上記培地には、所望の１つの微生物または複数の微生物が接種され、バイオ生産は、その系に何も添加しないで生じることが許容される。典型的には、しかし、「バッチ」型のバイオ生産イベントは、炭素源の添加に関してバッチであり、ｐＨおよび酸素濃度などの因子の制御に対してしばしば試みがなされる。バッチ系において、その代謝産物およびその系のバイオマス組成は、バイオ生産イベントが停止するときまで常に変化する。バッチ培養において、細胞は、静止誘導期から高増殖対数期および最後には増殖速度が減らされるかまたは休止する定常期まで穏やかである。処理しなければ、定常期の細胞は最終的に死滅する。対数期の細胞は、一般的に、所望の最終生成物または中間体の生成の大半を担う。
標準的なバッチ系に対する変形は、流加培養系である。流加培養バイオ生産プロセスも本発明において適切であり、基質を含む栄養分が、バイオ生産が進行するにつれて漸増量で加えられる以外は典型的なバッチ系を含む。流加培養系は、異化代謝産物抑制が細胞の代謝を阻害する傾向にある場合およびその培地中に限定量の基質を有することが望まれる場合に有用である。流加培養系における実際の栄養分濃度の測定は、異なる時間での試料分析によるなど直接測定することができるか、またはｐＨ、溶存酸素およびＣＯ２などの廃ガスの分圧などの測定可能な因子の変化に基づいて推定できる。バッチおよび流加のアプローチは一般的であり、当該技術において周知であり、例は、Ｔｈｏｍａｓ Ｄ． Ｂｒｏｃｋ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ： Ａ Ｔｅｘｔｂｏｏｋ ｏｆ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、第２版（１９８９年）Ｓｉｎａｕｅｒ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ， Ｉｎｃ．、Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ， Ｍａｓｓ．、Ｄｅｓｈｐａｎｄｅ、Ｍｕｋｕｎｄ Ｖ．、Ａｐｐｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、３６巻：２２７頁、（１９９２年）ならびにＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌｓ、第２版、Ｊ． Ｅ． ＢａｉｌｅｙおよびＤ． Ｆ． Ｏｌｌｉｓ、ＭｃＧｒａｗ Ｈｉｌｌ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９８６年（バイオ生産についての一般的な教示について本明細書に参照により組み込まれている）において見出すことができる。
本発明の実施形態ではバッチ様式または流加様式で行うことができるが、本発明は、連続バイオ生産法に適合可能であることが企図される。連続バイオ生産は、バイオ生産限定培地がバイオリアクタに連続的に加えられ、等量の馴化培地が処理のために同時に除去される「開放」系であるとみなされる。連続バイオ生産は、一般的に、細胞が主に対数期増殖にある制御された密度範囲内にその培養物を維持する。２つの型の連続バイオリアクタ操作は、新鮮な培地が容器に供給され、等しい割合の容器内容物が同時に除去されるケモスタットを含む。このアプローチの制約は、細胞が失われ、高い細胞密度が一般的に達成できないということである。実際には、典型的に、流加培養プロセスを用いてさらにより高い細胞密度を得ることができる。別の連続バイオリアクタは、上記容器から除去される流れを、生存細胞をその容器に戻して再利用する分離技術に供すること以外はケモスタットアプローチと同様である灌流培養を利用する。この型の連続バイオリアクタ操作により、流加培養よりも著しく高い細胞密度が産生されることが示されており、連続的に操作することができる。連続バイオ生産は、工業的操作のために特に有利である。なぜなら、これは、排出、洗浄および次のバイオ生産イベントのための設備の準備に伴う停止時間がより短いからである。さらに、これは、蒸留などの下流ユニット操作を連続的に操作するために、これらをバッチ形態で運転するよりも典型的にはより経済的である。
連続バイオ生産により、細胞増殖または最終生成物濃度に影響する１つの因子または任意の数の因子の調整が可能になる。例えば、１つの方法は、炭素源または窒素レベルなどの制限栄養分を固定の割合に維持し、全てのその他のパラメータを適度に維持することを可能にする。別の系において、増殖に影響するいくつかの因子を連続的に変更し、培地の濁度により測定される細胞濃度を一定に保つことができる。連続バイオ生産プロセスについての栄養分および増殖因子を調整する方法ならびに生成物形成速度を最大限にするための技術は、工業微生物学の技術において周知であり、様々な方法は、Ｂｒｏｃｋ（既出）に詳述されている。
本発明の実施形態では、バッチプロセス、流加プロセスまたは連続プロセスを用いて実行できることおよび、任意の公知の様式のバイオ生産が適切であることが企図される。細胞は、全細胞触媒として不活性足場に固定化して、３−ＨＰ生成のための適切なバイオ生産条件に供することができるか、または培養容器などの容器内の液体培地中で培養できることが企図される。つまり、このようなプロセスおよびこれらのプロセスを用いるバイオ生産系において用いられる実施形態は、本発明の遺伝子改変微生物の集団、このような集団を該集団のための栄養分を含む培地中に含む培養系、および３−ＨＰとその後に３−ＨＰの下流生成物とを製造する方法を含む。
本発明の実施形態は、バイオ生産系において３−ＨＰを製造する方法を含み、この方法のいくつかは、このようなバイオ生産イベントの後に３−ＨＰを得ることを含み得る。例えば、３−ＨＰを製造する方法は、適切な栄養分を含む培地を培養容器中に提供する工程と、上記培養容器に、微生物が合成ガスおよび／または糖分子から３−ＨＰを生成するように本明細書に記載する遺伝子改変を含む遺伝子改変微生物の接種材料を提供する工程と、上記培養容器を、上記遺伝子改変微生物が３−ＨＰを生成するのに適する条件下に維持する工程とを含み得る。
３−ＨＰの生成のための工業的バイオ生産系を含むバイオ生産の方法および系において、３−ＨＰに対する耐性を（およびいくつかの実施形態では３−ＨＰバイオ生産も）、１つ以上の改変を欠く対照微生物に対して少なくとも２０パーセント増加させるのに効果的な１つ以上の態様を改変するように遺伝子操作された組換え微生物を生成して利用することは、本発明の範囲内である。
様々な実施形態では、本発明は、本明細書で記載するようなアクリル酸のバイオ生産のための系であって、バイオマスの糖化のためのタンクと、糖化の生成物を、必要に応じて前発酵タンクを介して発酵タンクに送るためのラインと、微生物細胞培養に適する発酵タンクと、上記発酵タンクからの内容物を抽出容器および／または分離容器に吐出するためのラインと、細胞培養廃棄物から３−ヒドロキシプロピオン酸を取り出すのに適する抽出容器および／または分離容器と、３−ヒドロキシプロピオン酸を脱水容器に移送するためのラインと、３−ヒドロキシプロピオン酸からアクリル酸への変換に適する脱水容器とを含む系を対象とする。様々な実施形態では、上記系は、１つ以上の前発酵タンク、蒸留カラム、遠心分離容器、逆抽出カラム、混合容器またはそれらの組み合わせを含む。
以下の出版された情報源は、これらの関連する技術における当業者のレベルを示すため、ならびに必要により、糖供給源からの３−ＨＰまたは本発明の下で生成されるその他の生成物（複数可）の工業的バイオ生産の方法およびこのような変換を達成するために本発明の任意の組換え微生物とともに用い得る工業的な系をどのようにして作製して使用するかを教示する開示を支持するためのそれらの各教示について、本明細書に参照により組み込まれている（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌｓ、第２版、Ｊ． Ｅ． ＢａｉｌｅｙおよびＤ． Ｆ． Ｏｌｌｉｓ、ＭｃＧｒａｗ Ｈｉｌｌ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９８６年、示された目的のために書物全体、および生物学的リアクタの設計について特に第９章、５３３〜６５７頁；Ｕｎｉｔ Ｏｐｅｒａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、第５版、Ｗ． Ｌ． ＭｃＣａｂｅら、ＭｃＧｒａｗ Ｈｉｌｌ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ １９９３年、示された目的、特にプロセスおよび分離技術分析のために書物全体；Ｅｑｕｉｌｉｂｒｉｕｍ Ｓｔａｇｅｄ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ、Ｐ． Ｃ． Ｗａｎｋａｔ、Ｐｒｅｎｔｉｃｅ Ｈａｌｌ、Ｅｎｇｌｅｗｏｏｄ Ｃｌｉｆｆｓ、ＮＪ ＵＳＡ、１９８８年、分離技術の教示のために書物全体）。一般的に、本開示に鑑みて、上記の方法および系のいずれも、３−ＨＰ以外の化学生成物の生成のために用い得ることがさらに認められる。
Ｖ．遺伝子改変、ヌクレオチド配列およびアミノ酸配列
本発明の実施形態は、宿主微生物への発現ベクターの導入から起こり得、ここでその発現ベクターは、宿主微生物で通常見出されるかまたは見出されない酵素をコードする核酸配列を含有する。
宿主細胞を遺伝子改変できることは、任意の遺伝子改変（組換え）微生物の生成について必須である。遺伝子移入技術の様式は、エレクトロポレーション、接合、形質導入または天然の形質転換によることがある。広範囲の宿主接合性プラスミドおよび薬剤耐性マーカーが利用可能である。クローニングベクターは、その宿主で機能できる抗生物質耐性マーカーの性質に基づいて、宿主生物に合わせて作られる。また、本明細書で開示するように、遺伝子改変（組換え）微生物は、そのゲノムＤＮＡへの改変を含む、プラスミド導入による以外の改変を含んでよい。
アミノ酸配列中のいくつかのアミノ酸を、タンパク質の構造または機能に対して著しく影響することなく変化させ得ることが、当該技術において長く認識されている。含まれるバリアントは、その示される酵素活性に著しく有害に影響しない限り、欠失、挿入、逆転、反復および型置換を構成できる。どのアミノ酸変化が表現型でサイレントである可能性があるかに関する手引きは、なかでも、Ｂｏｗｉｅ， Ｊ． Ｕ．ら、「Ｄｅｃｉｐｈｅｒｉｎｇ ｔｈｅ Ｍｅｓｓａｇｅ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ： Ｔｏｌｅｒａｎｃｅ ｔｏ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄ Ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎｓ」、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４７巻：１３０６〜１３１０頁（１９９０年）で見出すことができる。この参考文献には、このような教示が参照により組み込まれているが、このような教示は、当業者に一般的に公知でもある。
様々な実施形態では、本発明のポリヌクレオチド分子の発現により得られるポリペプチドは、３−ＨＰ耐性関連および生合成経路について本明細書で記載する遺伝子および／または核酸配列によりコードされる１つ以上のアミノ酸配列と少なくともおよそ５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有し得る。
任意の特定のポリペプチドが、本明細書で記載する任意のポリペプチド（本明細書で記載する特定の核酸配列に対応し得る）の任意の参照アミノ酸配列と少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるかという実際的な問題として、このような特定のポリペプチド配列は、Ｂｅｓｔｆｉｔプログラム（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐａｃｋａｇｅ、Ｕｎｉｘ（登録商標）用バージョン８、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐａｒｋ、５７５
Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒｉｖｅ、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓ．５３７１１）などの公知のコンピュータプログラムを用いて従来通り決定できる。Ｂｅｓｔｆｉｔまたは任意のその他の配列アラインメントプログラムを用いて特定の配列が本発明による参照配列と例えば９５％同一であるかを決定する場合、パラメータは、同一性のパーセンテージが参照アミノ酸配列の全長にわたって計算され、参照配列におけるアミノ酸残基の合計数の５％までの相同性におけるギャップが許容されるように設定される。
例えば、具体的な実施形態では、参照配列（クエリ配列、すなわち本発明の配列）と対象配列との間の同一性（グローバル配列アラインメントともいう）は、Ｂｒｕｔｌａｇらのアルゴリズムに基づくＦＡＳＴＤＢコンピュータプログラムを用いて決定できる（Ｃｏｍｐ． Ａｐｐ． Ｂｉｏｓｃｉ． ６巻：２３７〜２４５頁（１９９０年））。ＦＡＳＴＤＢアミノ酸アラインメントで用いられる、同一性が狭く解釈される特定の実施形態のための好ましいパラメータは、スコアリングスキーム＝ＰＡＭ（パーセント受容変異）０、ｋ−タプル＝２、ミスマッチペナルティ＝１、結合ペナルティ＝２０、無作為化割付群長＝０、カットオフスコア＝１、ウィンドウサイズ＝配列長、ギャップペナルティ＝５、ギャップサイズペナルティ＝０．０５、ウィンドウサイズ＝５００または対象アミノ酸配列長（いずれか短い方）である。この実施形態によると、上記対象配列が、内部欠失のためでなくＮ末端欠失またはＣ末端欠失のために上記クエリ配列より短いならば、結果に対して手動の修正を行って、ＦＡＳＴＤＢプログラムが、グローバルパーセント同一性を計算する場合に上記対象配列のＮ末端およびＣ末端の切断に相当しないという事実を考慮する。上記クエリ配列に対してＮ末端およびＣ末端で切断された対象配列について、上記パーセント同一性は、上記対象配列のＮ末端およびＣ末端に対して外側のクエリ配列の残基（これらは、対応する対象残基と一致しない／整列されない）の数を、上記クエリ配列の全塩基のパーセントとして計算することにより修正される。残基が一致する／整列されるかどうかの決定は、ＦＡＳＴＤＢ配列アラインメントの結果により決定される。このパーセンテージは、次いで、特定されたパラメータを用いてＦＡＳＴＤＢプログラムにより計算されるパーセント同一性から減じて、最終パーセント同一性スコアに到達する。この最終パーセント同一性スコアは、本実施形態の目的のために用いられるものである。上記クエリ配列と一致しない／整列されない対象配列のＮ末端残基およびＣ末端残基だけが、上記パーセント同一性スコアを手動で調整する目的のために考慮される。つまり、上記対象配列の最も遠いＮ末端残基およびＣ末端残基の外側のクエリ残基の位置だけが、この手動修正において考慮される。例えば、９０アミノ酸残基の対象配列を、１００残基のクエリ配列と整列させて、パーセント同一性を決定する。欠失は、上記対象配列のＮ末端で生じ、よって、ＦＡＳＴＤＢアラインメントは、Ｎ末端の最初の１０残基の一致／アラインメントを示さない。１０の対形成していない残基は、配列の１０％を占める（一致していないＮ末端残基およびＣ末端残基の数／クエリ配列の残基の総数）ので、１０％を、ＦＡＳＴＤＢプログラムにより計算されるパーセント同一性スコアから減じる。残りの９０残基が完全に一致するならば、上記最終パーセント同一性は、９０％である。別の例において、９０残基の対象配列を、１００残基のクエリ配列と比較する。今回、欠失は内部欠失であるので、上記クエリと一致しない／整列されない対象配列のＮ末端残基またはＣ末端残基は存在しない。この場合、ＦＡＳＴＤＢにより計算されるパーセント同一性は、手動で修正されない。ここでもまた、上記クエリ配列と一致しない／整列されない、ＦＡＳＴＤＢアラインメントにより表示されるように上記対象配列のＮ末端およびＣ末端の端の外側の残基の位置だけが手動で修正される。
より全般的には、制御配列に適合できる条件下でＥ．ｃｏｌｉなどの微生物においてコード配列の発現を誘導する１つ以上（数個）の制御配列に作動可能に連結した、酵素活性を有するポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチドを含む核酸構築物が、調製できる。上記単離ポリヌクレオチドは、上記ポリペプチドの発現をもたらすように操作してよい。上記ポリヌクレオチドの配列をベクターに挿入する前に操作することは、発現ベクターに依存して望まれるかまたは必要であることがある。組換えＤＮＡ法を利用してポリヌクレオチド配列を改変するための技術は、当該技術においてよく確立されている。
上記制御配列は、適当なプロモーター配列、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの発現のための宿主細胞により認識されるヌクレオチド配列であってよい。そのプロモーター配列は、上記ポリペプチドの発現を媒介する転写制御配列を含有する。上記プロモーターは、変異型、切断型およびハイブリッド型プロモーターを含む、選ばれた宿主細胞において転写活性を示す任意のヌクレオチド配列であってよく、その宿主細胞と同種または異種のいずれかの細胞外または細胞内ポリペプチドをコードする遺伝子から得ることができる。特にＥ．ｃｏｌｉ宿主細胞において上記核酸構築物の転写を誘導するための適切なプロモーターの例は、ｌａｃプロモーター（Ｇｒｏｎｅｎｂｏｒｎ、１９７６年、ＭｏＩ． Ｇｅｎ． Ｇｅｎｅｔ． １４８巻：２４３〜２５０頁）、ｔａｃプロモーター（ＤｅＢｏｅｒら、１９８３年、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ＵＳＡ ８０巻：２１〜２５頁）、ｔｒｃプロモーター（Ｂｒｏｓｉｕｓら、１９８５年、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６０巻：３５３９〜３５４１頁）、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼプロモーター（ＳｔｕｄｉｅｒおよびＭｏｆｆａｔｔ、１９８６年、Ｊ． ＭｏＩ． Ｂｉｏｌ． １８９巻：１１３〜１３０頁）、ファージプロモーターｐＬ（Ｅｌｖｉｎら、１９９０年、Ｇｅｎｅ ８７巻：１２３〜１２６頁）、ｔｅｔＡプロモーター（Ｓｋｅｒｒａ、１９９４年、Ｇｅｎｅ １５１巻：１３１〜１３５頁）、ａｒａＢＡＤプロモーター（Ｇｕｚｍａｎら、１９９５年、Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ． １７７巻：４１２１〜４１３０頁）およびｒｈａＰＢＡＤプロモーター（Ｈａｌｄｉｍａｎｎら、１９９８年、Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ． １８０巻：１２７７〜１２８６頁）である。その他のプロモーターは、「Ｕｓｅｆｕｌ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｆｒｏｍ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｂａｃｔｅｒｉａ」、Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ａｍｅｒｉｃａｎ、１９８０年、２４２巻：７４〜９４頁；ならびにＳａｍｂｒｏｏｋおよびＲｕｓｓｅｌｌ、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」、第３版、２００１年（１〜３巻）、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．に記載されている。
上記制御配列は、適切な転写終結配列、宿主細胞により認識されて転写を終結する配列でもあり得る。上記終結配列は、上記ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の３’末端に作動可能に連結している。Ｅ．ｃｏｌｉ細胞において機能的な任意のターミネーターを、本発明において用いてよい。宿主細胞の増殖に関してポ上記リペプチドの発現の調節を可能にする調節配列を付加することが望ましいこともある。調節系の例は、調節化合物の存在を含む、化学的もしくは物理的刺激に応答して遺伝子の発現をオンまたはオフにするものである。原核生物系における調節系は、ｌａｃ、ｔａｃおよびｔｒｐオペレーター系を含む。
本発明の様々な実施形態について、酵素または各経路のいずれかで同定される酵素の酵素活性の調節と、よって最終的にはそれらの活性とを変化させることを対象とするものを含む、様々な遺伝子操作を含む遺伝子操作が記載され得る。このような遺伝子改変は、選択されかつ／もしくは同定される培養条件下での酵素活性および／または選択性の変化をもたらす転写改変、翻訳改変および翻訳後改変、ならびに／あるいは３−ＨＰ生成に関連付けられる酵素のコピー数および／または変異体を増加させるような追加の核酸配列の提供を対象としてよい。このような遺伝子改変を達成するための具体的な方法およびアプローチは、当業者に周知であり、それらに限定されないが、内因性遺伝要素の発現を増加させること、リプレッサー遺伝子の機能性を減少させること、異種遺伝要素を導入すること、３−ＨＰを生成するための酵素変換工程を触媒するポリペプチドをコードする核酸配列のコピー数を増加させること、遺伝要素を変異させて、変異タンパク質が比酵素活性を増加するようにすること、過剰発現すること、過小発現すること、シャペロンを過剰発現すること、プロテアーゼをノックアウトすること、フィードバック阻害を変更もしくは改変すること、リプレッサーおよび／もしくは競合阻害剤に対し１つ以上の損なわれた結合位置を含む酵素バリアントを提供すること、リプレッサー遺伝子をノックアウトすること、ｍＲＮＡ安定性を改善するための進化、選択および／またはその他のアプローチ、ならびに効果的なレベルの改善を達成するための効果的なコピー数およびプロモーターを有するプラスミドの使用を含む。ランダム変異誘発を実施して、これらのまたはその他の述べられたアプローチのいずれかになり得る遺伝子改変をもたらしてよい。上記遺伝子改変は、さらに広くは、対象の核酸における１つ以上の核酸の付加（挿入を含む）、欠失（例えば変異による）および置換が含まれる。様々な実施形態では、遺伝子改変は、酵素比活性および／または酵素の代謝回転数の改善をもたらす。限定されることなく、変化は、以下の１つ以上により測定してよい：ＫＭ；Ｋｃａｔ；およびＫアビディティ。
様々な実施形態では、より効率的に機能するために、微生物は、１つ以上の遺伝子欠失を含んでよい。例えば、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて、乳酸脱水素酵素（ｌｄｈＡ）、リン酸アセチルトランスフェラーゼ（ｐｔａ）、ピルビン酸酸化酵素（ｐｏｘＢ）およびピルビン酸−ギ酸リアーゼ（ｐｆｌＢ）をコードする遺伝子は、破壊（欠失を含む）されてよい。欠失を含むこのような遺伝子破壊は、限定することを意味せず、様々な実施形態において様々な組み合わせで実行してよい。遺伝子欠失は、変異遺伝子欠失アプローチにより、かつ／またはこれらの酵素の１つ以上の発現が低減しているかまたは発現がない変異株から出発して、かつ／または当業者に公知のその他の方法により成し遂げることができる。遺伝子欠失は、それらに限定されないが、Ｇｅｎｅ Ｂｒｉｄｇｅｓ（Ｇｅｎｅ Ｂｒｉｄｇｅｓ ＧｍｂＨ、Ｄｒｅｓｄｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ、＜＜ｗｗｗ．ｇｅｎｅｂｒｉｄｇｅｓ．ｃｏｍ＞＞）により販売されるキットおよびその他の試薬を用いるＲＥＤ／ＥＴ法を含むいくつかの公知の具体的な方法のいずれかにより実現してよい。
より具体的には、後者の方法について、Ｒｅｄ／ＥＴ組換えの使用は、当業者に公知であり、Ｓｔｅｗａｒｔらに対して発行され、この方法についての教示について本明細書に参照することにより組み込まれている米国特許第６，３５５，４１２号および同第６，５０９，１５６号に記載されている。このような方法についての材料およびキットは、Ｇｅｎｅ Ｂｒｉｄｇｅｓ（Ｇｅｎｅ Ｂｒｉｄｇｅｓ ＧｍｂＨ、Ｄｒｅｓｄｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ、＜＜ｗｗｗ．ｇｅｎｅｂｒｉｄｇｅｓ．ｃｏｍ＞＞）から入手可能であり、その方法は、製造者の使用説明に従って進めることができる。この方法は、λファージからのリコンビナーゼにより行われる相同組換えにより標的遺伝子を選択マーカーで置き換えることを含む。λ−ｒｅｄリコンビナーゼを発現する宿主生物を、上記標的遺伝子と相同な末端領域（一般的に約５０ｂｐ、代わりに約３００ｂｐまで）に隣接した選択マーカーをコードする直鎖状ＤＮＡ生成物で形質転換する。上記マーカーは、次いで、ＦＬＰ−リコンビナーゼまたはＣｒｅなどの別のリコンビナーゼを保有するプラスミドベクターにより行われる別の組換え工程により除去できる。
微生物染色体ＤＮＡの一部の標的化された欠失または外来遺伝物質の微生物染色体への付加は、望ましくない代謝生成物の生成を低減または消失するように宿主細胞の代謝を変更するために実施してよい。このことは、この一般的な例において本明細書で記載するようなその他の遺伝子改変と組み合わせて用いてよい。この詳細な記載において、複数の実施形態および本発明を実施し得る具体的な例示の実施形態の説明により示される添付の図面に対して言及する。これらの実施形態は、当業者が本発明を実施できるように十分詳細に記載され、様々な開示される実施形態に対する改変が、当業者により行われ得ることが理解される。
さらに、３−ＨＰ生成について、このような遺伝子改変は、各３−ＨＰ生成経路内である特定の酵素変換工程を通じてより高い流動速度（ｆｌｕｘ ｒａｔｅ）を達成するように選びかつ／または選択してよく、よって、基本的および／または主な様式で全般的な細胞代謝に影響してよい。
アミノ酸「相同性」は、保存的置換、すなわちポリペプチド中の所定のアミノ酸を、同様の特徴をもつ別のアミノ酸で置換するものを含むことが認められる。保存的置換として典型的に見られるものは、以下の置き換えである：Ａｌａ、Ｖａｌ、ＬｅｕおよびＩｌｅなどの脂肪族アミノ酸の、別の脂肪族アミノ酸での置き換え；Ｓｅｒの、Ｔｈｒでの置き換えもしくはその逆；ＡｓｐもしくはＧｌｕなどの酸性残基の、別の酸性残基での置き換え；ＡｓｎもしくはＧｌｎなどのアミド基を有する残基の、アミド基を有する別の残基での置き換え；ＬｙｓもしくはＡｒｇなどの塩基性残基から別の塩基性残基への交換；ならびにＰｈｅもしくはＴｙｒなどの芳香族残基の、別の芳香族残基での置き換え。
本明細書で示される全ての核酸配列およびアミノ酸配列について、これらの配列の保存的に改変されたバリアントが含まれ、これらが本発明の様々な実施形態において本発明の範囲内であることが認められる。当業者の技能の範囲内に十分に含まれる保存改変バリアントおよびより広範囲に変化した配列を含み得る機能的に等価な核酸配列およびアミノ酸配列（機能性バリアント）ならびにこれらを含む微生物も、このような配列および／または微生物を含む方法ならびに系と同様に、本発明の様々な実施形態の範囲内である。様々な実施形態では、十分に相同なタンパク質またはその構成部分をコードする核酸配列は、本発明の範囲内である。より一般的には、本発明で採用される特定のアミノ酸配列をコードする核酸配列は、遺伝子コードの縮重により変化し得るが、それでもなお本発明の範囲内になる。以下の表は、アミノ酸のうちの類似性（保存的置換およびあまり保存的でない置換は、これらに基づくことがある）およびこの縮重を反映する様々なコドン重複性のまとめを示す。
表１
凡例：側基およびその他の関連する特性：Ａ＝酸性；Ｂ＝塩基性；Ａｌｉ＝脂肪族；Ａｍｉ＝アミン；Ａｒｏ＝芳香族；Ｎ＝非極性；ＰＵ＝極性非荷電；ＮＥＧ＝負に荷電；ＰＯＳ＝正に荷電。
また、本明細書で述べる特定の核酸配列およびコードされる各アミノ酸配列のバリアントおよび構成部分は、このような核酸配列バリアントおよび／または構成部分が、限定することなく、ヌクレオチド番号１で始まってヌクレオチド番号１５で終わる配列、ヌクレオチド番号２で始まってヌクレオチド番号１６で終わる配列、ヌクレオチド番号３で始まってヌクレオチド番号１７で終わる配列などを含む、本明細書で述べる核酸配列で示す任意の１５ヌクレオチドの配列と同一の１５ヌクレオチドの配列を含有する場合に、所望の機能性、例えば選択されたレベルでの酵素活性を示し得る。本発明は、１５ヌクレオチドを超える長さ（例えば１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０以上のヌクレオチド）であり、本明細書で述べる核酸配列に示す配列の任意の構成部分と同一であるヌクレオチド配列を含有する単離核酸も提供することが認められる。例えば、本発明は、限定することなく、ヌクレオチド番号１で始まってヌクレオチド番号２５で終わる配列、ヌクレオチド番号２で始まってヌクレオチド番号２６で終わる配列、ヌクレオチド番号３で始まってヌクレオチド番号２７で終わる配列などを含む、本明細書で述べる任意の１つ以上の（任意の群分けを含む）核酸配列に示す任意の２５ヌクレオチドの配列と同一の２５ヌクレオチドの配列を含有する単離核酸を提供する。追加の例は、限定することなく、５０以上のヌクレオチドの長さ（例えば１００、１５０、２００、２５０、３００以上のヌクレオチド）であり、本明細書で開示する配列のいずれかの任意の構成部分と同一であるヌクレオチド配列を含有する単離核酸を含む。このような単離核酸は、限定することなく、３−ＨＰ生成経路に関係するような考察および／または実施例のいずれか１つのセクションで示す核酸配列、脂肪酸合成酵素系または３−ＨＰ耐性の酵素をコードする核酸配列を含有する単離核酸を含み得る。例えば、本発明は、単一挿入、単一欠失、単一置換、複数挿入、複数欠失、複数置換またはそれらの任意の組み合わせ（例えば単一欠失と複数挿入）を含有する本明細書で列挙する核酸配列を含有する単離核酸を提供する。このような単離核酸分子は、本明細書で列挙する（すなわち配列表で）核酸配列と、少なくとも６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、９７、９８または９９パーセントの配列同一性を共有し得る。
追加の例は、限定することなく、５０以上のアミノ酸残基の長さ（例えば１００、１５０、２００、２５０、３００以上のアミノ酸残基）であり、本明細書で列挙するかまたはそうでなければ開示するアミノ酸配列の任意の構成部分と同一であるアミノ酸配列をコードする核酸配列を含有する単離核酸を含む。
さらに、本発明は、本明細書で列挙するかまたはそうでなければ開示するアミノ酸配列の変形を有するアミノ酸配列をコードする核酸配列を含有する単離核酸を提供する。例えば、本発明は、単一挿入、単一欠失、単一置換、複数挿入、複数欠失、複数置換またはそれらの任意の組み合わせ（例えば単一欠失と複数挿入）を含有する本明細書で列挙するかまたはそうでなければ開示するアミノ酸配列をコードする核酸配列を含有する単離核酸を提供する。このような単離核酸分子は、本明細書で列挙するかまたはそうでなければ開示するアミノ酸配列と、少なくとも６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、９７、９８または９９パーセントの配列同一性を共有するアミノ酸配列をコードする核酸配列を含有し得る。
保存的アミノ酸置換およびその他のアミノ酸置換についての基礎を与える特性の例は、表１に例示する。よって、当業者は、所望の機能性を示すアミノ酸配列バリアントを得るために多数の置換を行うことができる。ＢＬＡＳＴＰ、ＣＬＵＳＴＡＬＰおよびその他のアラインメントツールおよび比較ツールを用いて、より少ない置換を行うことができる（選択されたレベルまで活性を変更すること（これは、複数置換を必要とし得る）を対象とするのでなければ）高度に保存された領域を評価できる。活性部位またはその他の結合モチーフもしくは構造モチーフに関与しないことが認識されるかまたはそのように考えられている領域に、より多くの置換を行うことができる。表１に従って、例えば、必要に応じてサイズ／分子量を考慮して、列挙された配列の１つの極性非荷電（ＰＵ）アミノ酸を極性非荷電アミノ酸に置換してよい（すなわちセリンをトレオニンに代えて置換する）。どのアミノ酸変化が表現型サイレントである可能性があるかに関する手引きは、なかでも、Ｂｏｗｉｅ， Ｊ． Ｕ．ら、「Ｄｅｃｉｐｈｅｒｉｎｇ ｔｈｅ Ｍｅｓｓａｇｅ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ： Ｔｏｌｅｒａｎｃｅ ｔｏ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄ Ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎｓ」、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４７巻：１３０６〜１３１０頁（１９９０年）で見出すことができる。この参考文献には、このような教示が参照
により組み込まれているが、このような教示は、当業者に一般的に公知でもある。認識される保存アミノ酸置換は（各組のコロンの後に置換可能なアミノ酸が続く）：ａｌａ：ｓｅｒ；ａｒｇ：ｌｙｓ；ａｓｎ：ｇｌｎまたはｈｉｓ；ａｓｐ：ｇｌｕ；ｃｙｓ：ｓｅｒ；ｇｌｎ：ａｓｎ；ｇｌｕ：ａｓｐ；ｇｌｙ：ｐｒｏ；ｈｉｓ：ａｓｎまたはｇｌｎ；ｉｌｅ：ｌｅｕまたはｖａｌ；ｌｅｕ：ｉｌｅまたはｖａｌ；ｌｙｓ：ａｒｇまたはｇｌｎまたはｇｌｕ；ｍｅｔ：ｌｅｕまたはｉｌｅ；ｐｈｅ：ｍｅｔまたはｌｅｕまたはｔｙｒ；ｓｅｒ：ｔｈｒ；ｔｈｒ：ｓｅｒ；ｔｒｐ：ｔｙｒ；ｔｙｒ：ｔｒｐまたはｐｈｅ；ｖａｌ：ｉｌｅまたはｌｅｕを含む。
特定の種についてのコドンの好みおよびコドン使用の表を用いて、その特定の種のコドン使用の好みの利点を利用する単離核酸分子を設計製作することができることが注目される。例えば、本明細書で提供する単離核酸は、特定の対象の生物により優先的に使用されるコドンを有するように設計できる。多数のソフトウェアおよび配列決定サービスが、このような配列のコドン最適化のために利用可能である。
本発明は、本明細書で列挙するかまたはそうでなければ開示するアミノ酸配列の全体のアミノ酸配列を含有するポリペプチドを提供する。さらに、本発明は、本明細書で列挙するかまたはそうでなければ開示するアミノ酸配列の構成部分を含有するポリペプチドを提供する。例えば、本発明は、限定することなく、アミノ酸残基番号１で始まってアミノ酸残基番号１５で終わる配列、アミノ酸残基番号２で始まってアミノ酸残基番号１６で終わる配列、アミノ酸残基番号３で始まってアミノ酸残基番号１７で終わる配列などを含む、本明細書で列挙するかまたはそうでなければ開示するアミノ酸配列の任意の１５アミノ酸の配列と同一の１５アミノ酸の配列を含有するポリペプチドを提供する。本発明は、１５アミノ酸残基を超える長さ（例えば１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０以上のアミノ酸残基）であり、本明細書で列挙するかまたはそうでなければ開示するアミノ酸配列の任意の構成部分と同一であるアミノ酸配列を含有するポリペプチドも提供することが認められる。例えば、本発明は、限定することなく、アミノ酸残基番号１で始まってアミノ酸残基番号２５で終わる配列、アミノ酸残基番号２で始まってアミノ酸残基番号２６で終わる配列、アミノ酸残基番号３で始まってアミノ酸残基番号２７で終わる配列などを含む、本明細書で列挙するかまたはそうでなければ開示するアミノ酸配列の任意の２５アミノ酸の配列と同一の２５アミノ酸の配列を含有するポリペプチドを提供する。追加の例は、限定することなく、５０以上のアミノ酸残基の長さ（例えば１００、１５０、２００、２５０、３００以上のアミノ酸残基）であり、本明細書で列挙するかまたはそうでなければ開示するアミノ酸配列の任意の構成部分と同一であるアミノ酸配列を含有するポリペプチドを含む。さらに、上記のことから、１５ヌクレオチドの配列は、５アミノ酸の配列を提供し、よって、それよりあとのより長いアミノ酸配列が、本明細書で提供する配列と同一性を有する上記のヌクレオチド配列の長さにより規定され得ることが認められる。
さらに、本発明は、本明細書で列挙するかまたはそうでなければ開示するアミノ酸配列で示されるアミノ酸配列の変形を有するアミノ酸配列であるポリペプチドを提供する。例えば、本発明は、単一挿入、単一欠失、単一置換、複数挿入、複数欠失、複数置換またはそれらの任意の組み合わせ（例えば単一欠失と複数挿入）を含有する本明細書で列挙するかまたはそうでなければ開示するアミノ酸配列を含有するポリペプチドを提供する。このようなポリペプチドは、本明細書で列挙するかまたはそうでなければ開示するアミノ酸配列と、少なくとも６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、９７、９８または９９パーセントの配列同一性を共有するアミノ酸配列を含有できる。特定のバリアントのアミノ酸配列は、任意の数の変形および変形の型の任意の組み合わせを含んでよい。
本発明は、様々な実施形態では、本明細書で開示する任意のポリヌクレオチド配列およびポリペプチド配列の変形を有するアミノ酸配列を含む。一例として、変形は、配列番号５４４に示すカルボニックアンヒドラーゼ（Ｅ．ｃｏｌｉ ｃｙｎＴ）アミノ酸配列について例示される。図３は、ＢＬＡＳＴＰ比較において、低いＥ値に基づいて、比較的高い相同性を有した１１の他の種のカルボニックアンヒドラーゼと整列させたＥ．ｃｏｌｉカルボニックアンヒドラーゼのＣＬＵＳＴＡＬ複数配列アラインメントを示す。配列番号５４４は、示される５番目の配列である。複数の保存的置換およびあまり保存的でない置換が示され（すなわちそれぞれ「：」および「．」の称号により）、これらは、当業者による追加の改変を導き得る。つまり、配列番号５４４に示す配列の変形の例は、限定することなく、図３に示す配列の任意の変形を含む。このような変形は、図３に示され、つまり、配列番号５４４に示す配列の特定の位置でのアミノ酸残基（またはその欠如）と図３のその他の１１のアミノ酸配列のいずれかの同じ整列された位置でのアミノ酸残基（またはその欠如）との比較は、配列番号５４４に示す配列についての特定の変化の列挙を提供する。例えば、配列番号５４４の１４位の「Ｅ」グルタミン酸は、図３に示すように「Ｄ」アスパラギン酸または「Ｎ」アスパラギンに置換できる。配列番号５４４に示す配列は、任意の数の変形および変形の型の任意の組み合わせを含有できることが認められる。図３に示すアミノ酸配列は、カルボニックアンヒドラーゼ活性を有するポリペプチドであり得ることが注目される。
本明細書で示すように、バリアントアミノ酸配列を有するポリペプチドは、酵素活性を保持できる。このようなポリペプチドは、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を、部位特異的変異誘発または様々なＰＣＲ技術などの標準的な手順を用いて操作することにより生成できる。本明細書で注目されるように、１つの型の改変は、１つ以上のアミノ酸残基を、同様の化学的および／または生化学的特性を有するアミノ酸残基の代わりに置換することを含む。例えば、ポリペプチドは、１つ以上の保存的置換を含む、本明細書で列挙するかまたはそうでなければ開示するアミノ酸配列に示すアミノ酸配列を有することができる。
より実質的な変化は、あまり保存的でない置換を選択することにより、および／またはより重要であり得る配列の領域において、例えば、（ａ）置換の領域でのポリペプチド主鎖の構造、例えばシートもしくはヘリックス立体構造；（ｂ）標的部位でのポリペプチドの電荷もしくは疎水性；または（ｃ）側鎖の嵩高さを維持するそれらの効果においてより著しく異なる残基を選択することにより得ることができる。一般的に、ポリペプチド機能における最大の変化を生成すると予期される置換は、（ａ）親水性残基、例えばセリンまたはトレオニンが、疎水性残基、例えばロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、バリンもしくはアラニンを置換する（またはそれにより置換される）；（ｂ）システインまたはプロリンが、任意のその他の残基を置換する（またはそれにより置換される）；（ｃ）正の電荷を持った側鎖を有する残基、例えばリシン、アルギニンもしくはヒスチジンが、負の電荷を持った残基、例えばグルタミン酸もしくはアスパラギン酸を置換する（またはそれにより置換される）；または（ｄ）嵩高い側鎖を有する残基、例えばフェニルアラニンが、側鎖を有さないもの、例えばグリシンを置換する（またはそれにより置換される）というものである。これらのアミノ酸置換（またはその他の欠失もしくは付加）の効果は、酵素活性を有するポリペプチドについて、関連する天然ポリペプチドと同じ基質から関連する天然ポリペプチドと同じ生成物への変換をポリペプチドが触媒できることを分析することにより評価できる。よって、５、１０、２０、３０、４０、５０以下の保存的置換を有するポリペプチドが、本発明により提供される。
ポリペプチドおよびポリペプチドをコードする核酸は、標準的なＤＮＡ変異誘発技術、例えばＭ１３プライマー変異誘発により生成できる。これらの技術の詳細は、ＳａｍｂｒｏｏｋおよびＲｕｓｓｅｌｌ、２００１年で提供される。核酸分子は、その分子が導入される特定の生物のコドン使用の偏りに合うようにコード領域に変化を含有できる。
代わりに、上記コード領域は、核酸配列が実質的に変更されるが、それでもなお天然アミノ酸配列と同一または実質的に同様のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするような様式で、そのコード配列を変更するために、遺伝子コードの縮重を利用することにより変更できる。例えば、アラニンは、オープンリーディングフレームにおいて、ヌクレオチドコドントリプレットＧＣＴによりコードされる。上記遺伝子コードの縮重のために、３つのその他のヌクレオチドコドントリプレット（ＧＣＡ、ＧＣＣおよびＧＣＧ）もアラニンをコードする。つまり、上記オープンリーディングフレームの核酸配列は、この位置にて、これらの３つのコドンのいずれかに、コードされるポリペプチドのアミノ酸配列またはそのポリペプチドの特徴に影響することなく変更することができる。上記遺伝子コードの縮重に基づいて、核酸バリアントを、本明細書で開示する核酸配列から、本明細書で記載する標準的な変異誘発技術を用いて、または核酸配列の合成により、導くことができる。つまり、様々な実施形態について、本発明は、同じポリペプチドをコードするが、上記遺伝子コードの縮重によって核酸配列が変化している核酸分子を包含する。
本発明は、少なくとも約１２塩基の長さ（例えば少なくとも約１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、４０、５０、６０、１００、２５０、５００、７５０、１０００、１５００、２０００、３０００、４０００または５０００塩基の長さ）であり、ハイブリダイゼーション条件下で、本明細書で列挙するかまたはそうでなければ開示する配列を有する核酸のセンス鎖またはアンチセンス鎖とハイブリダイズする単離核酸も提供する。上記ハイブリダイゼーション条件は、中程度または高度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件であり得る。また、いくつかの実施形態では、上記微生物は、内因性３−ＨＰ生成経路（これは、いくつかのこのような実施形態では、増強されていることがある）を含み、他の実施形態では、上記微生物は、３−ＨＰ生成経路を含まないが、本明細書で記載する、３−ＨＰの生成をもたらす経路を完了する１つの酵素活性または複数の酵素活性を有するポリペプチドをコードする１つ以上の核酸配列を備える。いくつかの実施形態では、本明細書で開示する特定の配列またはその保存的改変バリアントは、本明細書で列挙する１つ以上の種および種の群またはその他の分類学上の群から選択されるような、選択された微生物に提供される。
ＶＩ．マロニル−ＣｏＡから脂肪酸合成から３−ＨＰへの再指向
遺伝子改変微生物などの本発明の構成物（ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ）は、マロニル−ＣｏＡが基質である化学生成物についての生成経路を含み、脂肪酸合成酵素系遺伝子の１つ以上によりコードされる酵素の活性を低減するための１つ以上の遺伝子改変も含み得る。上記構成物は、本発明の方法および系において用いることができる。
商業的な発酵の対象の多くの微生物におけるいくつかの化学生成物の微生物発酵に関して、マロニル−ＣｏＡは、通常の増殖条件下では脂肪酸およびリン脂質などのその誘導体（これらは、次いで、細胞膜でおよびその他の重要な細胞機能のために用いられる）に変換される代謝中間体である。例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉでは、上記脂肪酸合成酵素系は、ＩＩ型または解離脂肪酸合成酵素系である。この系において、脂肪酸生成経路の酵素は、別々の遺伝子によりコードされ、多くの重要な代謝経路に共通して、上流の酵素を阻害する下流の生成物によることを含んで、良好に調節されている。
様々な微生物では、脂肪酸合成系（すなわち経路または複合体）を介しての代謝中間体マロニル−ＣｏＡから脂肪酸への変換は、マロニル−ＣｏＡが唯一または主要に使用される。代替の化学生成物への生成経路が微生物に存在する場合、マロニル−ＣｏＡから脂肪酸へのこのような変換を低減することにより、その代替の化学生成物（例えば３−ＨＰ）の生成についての計量（ｍｅｔｒｉｃ）が改善され得ることが分かっている。例えば、多くの微生物細胞において、上記脂肪酸合成酵素系は、以下の酵素活性を有するポリペプチドを含む：マロニル−ＣｏＡ−アシルキャリアタンパク質（ＡＣＰ）トランスアシラーゼ；β−ケトアシル−ＡＣＰ合成酵素；β−ケトアシル−ＡＣＰ還元酵素；β−ヒドロキシアシル−ＡＣＰデヒドラターゼ；３−ヒドロキシアシル−（ａｃｐ）デヒドラターゼ；およびエノイル−アシルキャリアタンパク質還元酵素（エノイル−ＡＣＰ還元酵素）。様々な実施形態では、これらのポリペプチドの温度感受性の形態をコードする核酸配列を、天然酵素の代わりに導入でき、このような遺伝子改変微生物が、（これらの温度に影響されやすいポリペプチドが、タンパク質構造における変更または完全変性のために部分的または完全に不活化される）上昇した温度で培養される場合、３−ＨＰなどの生成物の増加が観察される。他の実施形態では、他の型の遺伝子改変を行って、これらのポリペプチドの１つ以上の酵素活性を別の方法で調整（例えば低くする）してよい。様々な実施形態では、このような遺伝子改変の結果は、マロニル−ＣｏＡから脂肪酸、全バイオマスへの変換の低減、および炭素源から３−ＨＰなどの化学生成物への変換のより大きい割合が得られるように、マロニル−ＣｏＡの利用をシフトすることである。様々な実施形態では、微生物により生成される化学生成物の比生産性が、予想外に高い。また、マロニル−ＣｏＡ生成を増加させるような追加の遺伝子改変を、ある特定の実施形態について行ってよい。
ある酵素、エノイル（アシルキャリアタンパク質）還元酵素（ＥＣ番号１．３．１．９、エノイル−ＡＣＰ還元酵素ともいう）は、マロニル−ＣｏＡからの脂肪酸生合成のために重要な酵素である。Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉにおいて、この酵素、ＦａｂＩは、遺伝子ｆａｂＩによりコードされる（「Ｅｎｏｙｌ−Ａｃｙｌ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ （ｆａｂＩ） Ｐｌａｙｓ ａ Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔ Ｒｏｌｅ ｉｎ Ｃｏｍｐｌｅｔｉｎｇ Ｃｙｃｌｅｓ ｏｆ Ｆａｔｔｙ Ａｃｉｄ Ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ」、Ｒｉｃｈａｒｄ Ｊ． ＨｅａｔｈおよびＣｈａｒｌｅｓ Ｏ． Ｒｏｃｋ、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７０巻：４４号、２６５３８〜２６５４３頁（１９９５年）（ｆａｂＩおよび脂肪酸合成酵素系のその論考について参照することにより組み込まれている）を参照されたい）。
本発明は、エノイル−ＡＣＰ還元酵素の酵素活性（これは、発酵イベントの間に調整されることがある）を有するポリペプチドをコードする核酸配列（ポリヌクレオチド）を備える微生物を利用してよい。例えば、温度感受性エノイル−ＡＣＰ還元酵素をコードする核酸配列を、天然エノイル−ＡＣＰ還元酵素の代わりに提供することにより、培養温度の上昇で酵素活性が低減し、次いで、マロニル−ＣｏＡの利用を所望の化学生成物の生成へシフトさせることができる。このような上昇した温度では、上記酵素は、その温度とがそうであるように、非許容性である（ｎｏｎ−ｐｅｒｍｉｓｓｉｖｅ）とみなされる。このような配列の１つは、Ｅ．ｃｏｌｉの変異体温度感受性ｆａｂＩ（ｆａｂＩＴＳ）（ＤＮＡについて配列番号７６９、タンパク質について配列番号７７０）である。
Ｅ．ｃｏｌｉ以外の種におけるエノイル−ＡＣＰ還元酵素についての核酸配列およびアミノ酸配列は、ＢＬＡＳＴＮおよびＢＬＡＳＴＰなどの公知のゲノミクスデータベースにおいて相同性検索を行うことにより容易に得られることが認められる。その他の種における相同体および機能的に等価な配列を得るためのアプローチは、本明細書に記載される。よって、本発明は、商業的な対象の多くの微生物種について当業者により実施できることが認められる。
それに限定されないが、天然エノイル−ＡＣＰまたはエノイル−ｃｏＡ還元酵素を、この酵素の誘導性プロモーターを含む核酸配列で置き換えて、初期の誘導の後に誘導がないようにして、エノイル−ＡＣＰまたはエノイル−ｃｏＡ還元酵素の酵素活性を、選択された細胞密度に到達した後に減少させることなどの当業者に公知の、温度感受性エノイル−ＡＣＰ還元酵素以外のアプローチを採用してよい。
いくつかの態様では、本発明の構成物、方法および系は、遺伝子改変微生物におけるマロニル−ＣｏＡの利用をシフトさせるが、これは、エノイル−アシルキャリアタンパク質還元酵素（エノイル−ＡＣＰ還元酵素）もしくはエノイル−コエンザイムＡ還元酵素（エノイル−ｃｏＡ還元酵素）、β−ケトアシル−ＡＣＰ合成酵素またはβ−ケトアシル−ｃｏＡ合成酵素マロニル−ＣｏＡ−ＡＣＰなどの脂肪酸合成酵素系の少なくとも１つの酵素を含んでおり、さらに微生物細胞における重炭酸塩レベルを増加させるためにカルボニックアンヒドラーゼをコードする核酸配列の少なくとも１つの遺伝子改変および／またはその培養培地への重炭酸塩および／もしくは炭酸塩の補充を含んでよく、かつアセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼおよびＮＡＤＰＨ依存性トランスヒドロゲナーゼの１つ以上の酵素活性を増加させるための１つ以上の遺伝子改変をさらに含んでよい。より一般的には、炭酸塩および／または重炭酸塩の添加は、発酵ブロス中の重炭酸塩のレベルを増加させるために用いてよい。
いくつかの態様では、本発明は、マロニル−ＣｏＡを３−ＨＰに変換するために効果的な３−ＨＰ生成経路を提供するか、完了するかまたは増強する少なくとも１つの遺伝子改変を含み、上記微生物細胞における重炭酸塩レベルを増加させるためのカルボニックアンヒドラーゼの遺伝子改変および／またはその培養培地への重炭酸塩および／もしくは炭酸塩の補充をさらに含んでよく、かつアセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼおよびＮＡＤＰＨ依存性トランスヒドロゲナーゼの１つ以上の酵素活性を増加させるための１つ以上の遺伝子改変をさらに含んでよい遺伝子改変微生物を含む。関連付けられる方法および系は、このような遺伝子改変微生物を利用する。
いくつかの態様では、本発明は、マロニル−ＣｏＡを３−ＨＰに変換するのに効果的な３−ＨＰ生成経路を提供するか、完了するかまたは増強する少なくとも１つの遺伝子改変を含み、エノイル−アシルキャリアタンパク質還元酵素（エノイル−ＡＣＰ還元酵素）もしくはエノイル−コエンザイムＡ還元酵素（エノイル−ｃｏＡ還元酵素）、β−ケトアシル−ＡＣＰ合成酵素もしくはβ−ケトアシル−ｃｏＡ合成酵素、マロニル−ＣｏＡ−ＡＣＰなどの脂肪酸合成酵素系の少なくとも１つの酵素の遺伝子改変をさらに含み、かつ上記微生物細胞における重炭酸塩レベルを増加させるためのカルボニックアンヒドラーゼの遺伝子改変および／またはその培養培地への重炭酸塩および／もしくは炭酸塩の補充をさらに含んでよく、かつアセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼおよびＮＡＤＰＨ依存性トランスヒドロゲナーゼの１つ以上の酵素活性を増加させるための１つ以上の遺伝子改変をさらに含んでよい遺伝子改変微生物を含む。関連付けられる方法および系は、このような遺伝子改変微生物を利用する。
様々な実施形態では、本発明は、選択された細胞密度の遺伝子改変微生物集団を容器内に提供する工程であって、上記遺伝子改変微生物が、マロニル−ＣｏＡから化学生成物を生成するための生成経路を含む、提供する工程と、上記遺伝子改変微生物の脂肪酸合成酵素経路の少なくとも１つの酵素の酵素活性を低減させる工程とを含む、化学生成物を作製する方法を対象とする。
様々な実施形態では、微生物宿主細胞においてエノイル−ＡＣＰ還元酵素の酵素活性を低減することにより、上昇した比生産性および容積生産性での３−ＨＰの生成がもたらされる。さらに他の実施形態では、微生物宿主細胞においてエノイル−ＣｏＡ還元酵素の酵素活性を低減することにより、上昇した比生産性および容積生産性での３−ＨＰの生成がもたらされる。
これらの酵素の酵素活性を低減するための遺伝子改変についての別のアプローチは、上記エノイル−ＡＣＰ還元酵素遺伝子（例えばＥ．ｃｏｌｉにおけるｆａｂＩ）などの１つのこのような酵素を促進する誘導性プロモーターを提供することである。このような例では、このプロモーターは、本明細書の方法の第１段階の間に誘導され（例えばイソプロピル−μ−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を用いて）、そのＩＰＴＧが消耗し、第２工程から除かれたかまたは希釈された後に、エノイル−ＡＣＰ還元酵素の酵素活性の低減が開始し得る。本明細書で記載し、かつ／または当業者に公知のような酵素発現および酵素活性を制御するその他のアプローチを用いてよい。
エノイル−ＣｏＡ還元酵素は、上記脂肪酸合成酵素系の重要な酵素とみなされるが、本明細書で列挙するようなこの系の酵素活性を示すポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（核酸配列）の任意の組み合わせに対して遺伝子改変を行ってよい。例えば、ＦａｂＢである、β−ケトアシル−アシルキャリアタンパク質合成酵素Ｉは、増殖ならびに飽和および不飽和の両方の脂肪酸の生合成に必須であるＥ．ｃｏｌｉにおける酵素である。ＦａｂＢの不活化は、脂肪酸伸長の阻害および細胞増殖の減退、ならびにマロニル−ＡＣＰのマロネート部分をアセチル−ＣｏＡに戻して再利用する無益回路の消失をもたらす。ＦａｂＦである、β−ケトアシル−アシルキャリアタンパク質合成酵素ＩＩは、飽和脂肪酸の合成および細胞における膜流動性の制御に要求される。両酵素は、セルレニンにより阻害される。
ＦａｂＦの過剰発現は、脂肪酸生合成の減退をもたらすと報告されている。ＦａｂＦは、ＦａｂＤである、マロニル−ＣｏＡ：ＡＣＰトランスアシラーゼとの会合についてＦａｂＢに勝ると提案されている。ＦａｂＢとＦａｂＤとの会合は、脂肪酸伸長を開始する縮合反応に要求される（Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ、１９９３年９月、５２２〜５４２頁、５７巻、３号；Ｋ． Ｍａｇｎｕｓｏｎら、「Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｆａｔｔｙ Ａｃｉｄ Ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ」、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ；Ｗ． Ｚｈａら、「Ｉｍｐｒｏｖｉｎｇ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｍａｌｏｎｙｌ−ＣｏＡ ｌｅｖｅｌ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ｖｉａ ｍｅｔａｂｏｌｉｃ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ」、Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ １１巻（２００９年）１９２〜１９８頁を参照されたい）。このような脂肪酸合成酵素の酵素を低減するための遺伝子改変の代替は、培養系に、１つ以上のこのような酵素の適切な阻害剤を提供することである。このアプローチは、独立して、または遺伝子改変アプローチと組み合わせて実行できる。セルレニン、チオラクトマイシンおよびトリクロサン（この列挙は限定しない）などの阻害剤または１つ以上の上記脂肪酸合成酵素系遺伝子によりコードされる酵素の活性を低減することを対象とする遺伝子改変を、単一または組み合わせて採用してよい。
特定の理論と結び付けられることなく、微生物におけるエノイル−ＡＣＰ還元酵素（および／または上記脂肪酸合成酵素系のその他の酵素）の酵素活性を低減することにより、上記酵素の上流の代謝中間体であるマロニル−ＣｏＡの蓄積および／または短絡を導き、このようなマロニル−ＣｏＡは、次いで、化学生成物に変換されることがある（これに対して上記微生物細胞は、マロニル−ＣｏＡを利用する代謝経路を含む）と考えられている。ある特定の本発明の構成物、方法および系では、エノイル−ＡＣＰ還元酵素（またはより一般的には上記脂肪酸合成酵素系のもの）の酵素活性の低減は、遺伝子改変微生物の十分な細胞密度に到達した後に発生するようにされる。この二相培養アプローチは、特定の生成速度を維持する細胞バイオマスにおける触媒の所望の量と、上記エノイル−ＡＣＰ還元酵素活性（および／または脂肪酸合成酵素系のその他の酵素の活性）が低減された後に細胞塊に向けられる炭素をより少なくすることに部分的に起因し得る収率とを釣り合わせる。このことは、マロニル−ＣｏＡの正味の利用のシフトをもたらし、よって、所望の化学生成物への炭素フラックスがより大きくなる。
本発明の様々な実施形態では、上記比生産性が上昇し、これは、全体的に迅速で効率的な微生物発酵の方法および系をもたらす。様々な実施形態では、上記容積生産性も実質的に上昇する。
様々な実施形態では、遺伝子改変微生物は、マロニル−ＣｏＡから所望の化学生成物である３−ヒドロキシプロピオン酸（３−ＨＰ）への変換を含む代謝経路を含む。これは、商業的な３−ＨＰ生成の経済的な側面のために非常に有利であると考えられ、明確な経済的利点を有する進歩であると考えられる。その他の化学生成物も、本明細書で開示する。
比生産性および容積生産性の両方のパラメータの改善は、予想外であり、当該技術における進歩である。
エノイル−ＡＣＰ還元酵素活性および／または上記脂肪酸合成酵素系のその他の酵素の低減は、本明細書で論じるように、いくつかの様式で達成できる。
マロニル−ＣｏＡから脂肪酸アシル−ＡＣＰ分子または脂肪酸アシル−ｃｏＡ分子および脂肪酸分子への変換を「調整するための手段」とは、以下のいずれか１つを意味する：１）微生物細胞において、上記脂肪酸合成酵素系酵素の１つ（例えば本明細書で述べるもの）の活性を有する少なくとも１つのポリペプチドをコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドを提供することであって、このようにコードされる上記ポリペプチドが、低減された酵素活性を有する（例えば、酵素活性を低くするための変異および／またはプロモーター置換などにより）か、または低減された酵素活性を有するように調整され得る（例えば、温度感受性、誘導性プロモーターなどにより）こと、２）微生物細胞または集団を含む容器に、１つ以上の上記脂肪酸合成酵素系酵素（例えば本明細書で述べるもの）の酵素活性を阻害する阻害剤を、１つ以上のこれらの酵素の酵素活性を低減するために効果的な供与量で提供すること。これらの手段は、互いに組み合わせて行ってよい。調整する手段が、例えば温度感受性脂肪酸合成酵素系ポリペプチド（例えばエノイル−ＡＣＰ還元酵素）を含む遺伝子改変微生物の集団を含む培養容器の温度を増加させることによるか、または阻害剤を加えることにより、発酵イベントの間の上記脂肪酸合成酵素系のより高い活性からより低い活性への変換を含む場合、このような脂肪酸合成酵素系の２つの様式、すなわち１つはその間により高い活性が存在する場合、２つ目は、その間により低い活性が存在する場合が想定される。そのより低い活性の様式の間に、マロニル−ＣｏＡから選択された化学生成物へのより大きい利用へのシフトが進行し得る。
注目した酵素活性（複数可）を低減するための調整が一旦働くと、そのように調整されたそれぞれの各酵素活性は、天然の非調整酵素活性（例えば細胞におけるまたは単離された）の活性と比較して、少なくとも１０、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも６０、少なくとも７０、少なくとも８０または少なくとも９０パーセント低減され得る。同様に、マロニル−ＣｏＡから脂肪酸アシル−ＡＣＰ分子または脂肪酸アシル−ｃｏＡ分子への変換は、非調整細胞またはその他の系におけるそのような変換と比較して、少なくとも１０、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも６０、少なくとも７０、少なくとも８０または少なくとも９０パーセント低減され得る。同じように、マロニル−ＣｏＡから脂肪酸分子への変換は、非調整細胞またはその他の系におけるそのような変換と比較して、少なくとも１０、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも６０、少なくとも７０、少なくとも８０または少なくとも９０パーセント低減され得る。ＶＩＩ．マロニル−ＣｏＡから３−ＨＰへの生成経路
様々な実施形態では、本発明の構成物、方法および系は、マロニル−ＣｏＡを対象の化学生成物へ変換する代謝生成経路を含むことに関与する。
一例として、３−ＨＰを、対象の化学生成物として選択する。
３−ＨＰ生成経路のための具体的な配列にさらに関して、Ｃ．ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓからのマロニル−ＣｏＡ還元酵素（ｍｃｒ）を、ＤＮＡ２．０のサービスにより遺伝子合成し、コドン最適化した。そのＦＡＳＴＡ配列は、配列番号７８３に示す（ｇｉ｜４２５６１９８２｜ｇｂ｜ＡＡＳ２０４２９．１｜マロニル−ＣｏＡ還元酵素（Ｃｈｌｏｒｏｆｌｅｘｕｓ ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ））。
Ｍｃｒは、ＮＣＢＩデータベースにおいてほとんど配列相同体を有さない。Ｂｌａｓｔ検索により、タンパク質全体を検索した場合に、８つの異なる配列が見出される。よって、積み重ねた配列比較の開発は、限定された情報を産生すると予期される。しかし、本発明の実施形態は、それでもなお、本明細書において配列番号７８４〜７９１として示され同定されるこれらの８つの配列のいずれかを含むことがあり、これらは、この酵素活性に関して二機能性であると予期されるが、二機能性であるとまだ確認されていない。その他の実施形態は、配列番号７８４〜７９１のいずれかの変異されたおよびその他のバリアント形態、ならびに選択された微生物に導入されて、そこで３−ＨＰ生成をもたらすかまたは増加するものなどのポリヌクレオチド（保存的置換およびその他の置換を有するバリアント形態を含む）を含み得る。
ＣＬＵＳＴＡＬ２．０．１１複数配列アラインメントの構成部分は、以下の表に示すように、各配列番号７８３〜７９１を有するこれらの８つの配列を同定する。
表２
マロニル−ＣｏＡは、以下の１つ以上を含む微生物において３−ＨＰに変換されることがある：
Ｃｈｌｏｒｏｆｌｅｘｕｓ ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓおよびその他の微生物種から得ることができるような二機能性マロニル−ＣｏＡ還元酵素。この関係における二機能性とは、上記マロニル−ＣｏＡ還元酵素が、マロニル−ＣｏＡからマロネートセミアルデヒドへの変換と、マロネートセミアルデヒドから３−ＨＰへの変換との両方を触媒することを意味する。
３−ＨＰ脱水素酵素と組み合わせた単機能性マロニル−ＣｏＡ還元酵素。単機能性とは、上記マロニル−ＣｏＡ還元酵素が、マロニル−ＣｏＡからマロネートセミアルデヒドへの変換を触媒することを意味する。
上記のポリペプチドのいずれも、ＮＡＤＨ依存性またはＮＡＤＰＨ依存性であってよく、当該技術において公知の方法を用いて、特定の酵素をいずれかの形態に変換してよい。より具体的には、ＷＯ２００２／０４２４１８で注目されているように、「補因子としてＮＡＤＰＨを用いるポリペプチドを、補因子としてＮＡＤＨを用いるポリペプチドに変換するために、他者により記載されるものなどの任意の方法を用いることができる（Ｅｐｐｉｎｋら、Ｊ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．、２９２巻（１号）：８７〜９６頁（１９９９年）、ＨａｌｌおよびＴｏｍｓｅｔｔ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、１４６巻（Ｐｔ６号）：１３９９〜４０６頁（２０００年）、ならびにＤｏｈｒら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．、９８巻（１号）：８１〜８６頁（２００１年））。」
限定されることなく、二機能性マロニル−ＣｏＡ還元酵素は、Ｃｈｌｏｒｏｆｌｅｘｕｓ ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓのマロニル−ＣｏＡ還元酵素（例えばＡＴＣＣ２９３６５から）およびその他の配列から選択してよい。これもまた限定されることなく、単機能性マロニル−ＣｏＡ還元酵素は、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ ｔｏｋｏｄａｉｉのマロニル−ＣｏＡ還元酵素（配列番号８２６）から選択してよい。Ｃ．ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓのマロニル−ＣｏＡ還元酵素に関して、その配列および他の種の配列も、この酵素活性について二機能性であり得る。
単機能性マロニル−ＣｏＡ還元酵素を微生物細胞に提供する場合、マロネートセミアルデヒドを３−ＨＰへ変換する３−ＨＰ脱水素酵素の酵素活性も提供してよい。本実施例に示すように、単機能性マロニル−ＣｏＡ還元酵素は、二機能性の単機能性マロニル−ＣｏＡの切断により得てよく、マロネートセミアルデヒドを３−ＨＰへ変換する酵素を有する株において組み合わせてよい。
別のマロニル−ＣｏＡ還元酵素が、Ｍｅｔａｌｌｏｓｐｈａｅｒａ ｓｅｄｕｌａにおいて公知であることも注目される（Ｍｓｅｄ＿７０９、マロニル−ＣｏＡ還元酵素／スクシニル−ＣｏＡ還元酵素として同定）。
上記の酵素活性を有するポリペプチドをコードする核酸配列を提供することにより、遺伝子改変微生物は、本発明の実施形態に従ってマロニル−ＣｏＡを３−ＨＰへ変換するための効果的な３−ＨＰ経路を含むことができる。
アミノトランスフェラーゼ（例えば２０１０年１月２８日に公開されたＷＯ２０１０／０１１８７４を参照されたい）を含むものなどのその他の３−ＨＰ経路も、本発明の遺伝子改変微生物の実施形態において提供され得る。
このセクションに組み込まれているが、本発明は、３−ヒドロキシプロピオン酸（３−ＨＰ）などの選択された化学生成物の生成について、増大した比生産性および容積生産性の計量を提供する。様々な実施形態では、３−ＨＰなどの化学生成物の生成は、増殖と関連しない。
様々な実施形態では、３−ＨＰの生成または代わりに本明細書で記載するようなその下流生成物の１つの生成は、例えば本明細書で開示する方法の１つを用いることにより、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも４０および少なくとも５０ｇ／リットルの力価に到達し得る。
本明細書で開示する進歩を認めることによって認識され得るように（これらは選択された化学生成物の商業的発酵に関連するので）、本発明の実施形態は、少なくとも１０、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも４５、少なくとも５０、少なくとも８０、少なくとも１００または少なくとも１２０グラムの３−ＨＰなどの化学生成物を最終（例えば使った）発酵ブロス１リットル当たり生成するのに効果的で、このことを本明細書で開示する比生産性および／または容積生産性の割合とともに達成する微生物（および対応する方法）を得るように、他の遺伝子改変および／または方法もしくは系の調整と組み合わせてよい。
いくつかの実施形態では、微生物による化学生成イベント（すなわち、微生物の培養集団を用いる発酵イベント）は、本明細書で記載するような遺伝子改変微生物を用いて進行し、ここで、上記比生産性は、乾燥重量基準の微生物細胞１グラム当たり１時間当たり生成される０．０１から０．６０グラムの間の３−ＨＰ（ｇ３−ＨＰ／ｇＤＣＷ−ｈｒ）である。様々な実施形態では、上記比生産性は、０．０１より多い、０．０５より多い、０．１０より多い、０．１５より多い、０．２０より多い、０．２５より多い、０．３０より多い、０．３５より多い、０．４０より多い、０．４５より多いまたは０．５０ｇの３−ＨＰ／ｇＤＣＷ−ｈｒより多い。比生産性は、特定の微生物による化学生成イベントにおいて２、４、６、８、１２または２４時間の期間にわたって評価してよい。より具体的には、３−ＨＰまたはその他の化学生成物についての上記比生産性は、０．０５から０．１０、０．１０から０．１５、０．１５から０．２０、０．２０から０．２５、０．２５から０．３０、０．３０から０．３５、０．３５から０．４０、０．４０から０．４５または０．４５から０．５０ｇの３−ＨＰ／ｇＤＣＷ−ｈｒの間、０．５０から０．５５または０．５５から０．６０ｇの３−ＨＰ／ｇＤＣＷ−ｈｒの間である。様々な実施形態は、このような生産性を実証する培養系を含む。
また、本発明の様々な実施形態では、達成される上記容積生産性は、１リットル当たり１時間当たり０．２５ｇの３−ＨＰ（またはその他の化学生成物）（ｇ（化学生成物）／Ｌ−ｈｒ）であってよく、０．２５ｇの３−ＨＰ（またはその他の化学生成物）／Ｌ−ｈｒより多くてよく、０．５０ｇの３−ＨＰ（またはその他の化学生成物）／Ｌ−ｈｒより多くてよく、１．０ｇの３−ＨＰ（またはその他の化学生成物）／Ｌ−ｈｒより多くてよく、１．５０ｇの３−ＨＰ（またはその他の化学生成物）／Ｌ−ｈｒより多くてよく、２．０ｇの３−ＨＰ（またはその他の化学生成物）／Ｌ−ｈｒより多くてよく、２．５０ｇの３−ＨＰ（またはその他の化学生成物）／Ｌ−ｈｒより多くてよく、３．０ｇの３−ＨＰ（またはその他の化学生成物）／Ｌ−ｈｒより多くてよく、３．５０ｇの３−ＨＰ（またはその他の化学生成物）／Ｌ−ｈｒより多くてよく、４．０ｇの３−ＨＰ（またはその他の化学生成物）／Ｌ−ｈｒより多くてよく、４．５０ｇの３−ＨＰ（またはその他の化学生成物）／Ｌ−ｈｒより多くてよく、５．０ｇの３−ＨＰ（またはその他の化学生成物）／Ｌ−ｈｒより多くてよく、５．５０ｇの３−ＨＰ（またはその他の化学生成物）／Ｌ−ｈｒより多くてよく、６．０ｇの３−ＨＰ（またはその他の化学生成物）／Ｌ−ｈｒより多くてよく、６．５０ｇの３−ＨＰ（またはその他の化学生成物）／Ｌ−ｈｒより多くてよく、７．０ｇの３−ＨＰ（またはその他の化学生成物）／Ｌ−ｈｒより多くてよく、７．５０ｇの３−ＨＰ（またはその他の化学生成物）／Ｌ−ｈｒより多くてよく、８．０ｇの３−ＨＰ（またはその他の化学生成物）／Ｌ−ｈｒより多くてよく、８．５０ｇの３−ＨＰ（またはその他の化学生成物）／Ｌ−ｈｒより多くてよく、９．０ｇの３−ＨＰ（またはその他の化学生成物）／Ｌ−ｈｒより多くてよく、９．５０ｇの３−ＨＰ（またはその他の化学生成物）／Ｌ−ｈｒより多くてよく、または１０．０ｇの３−ＨＰ（またはその他の化学生成物）／Ｌ−ｈｒより多くてよい。
いくつかの実施形態では、２４時間発酵（培養）期間にわたって測定される場合の比生産性は、微生物１グラムＤＣＷ（２４時間期間の最後における最終ＤＣＷに基づく）当たり０．０１、０．０５、０．１０、０．２０、０．５、１．０、２．０、３．０、４．０、５．０、６．０、７．０、８．０、９．０、１０．０、１１．０または１２．０グラムより多い化学生成物であってよい。
本発明の様々な態様および実施形態では、３−ＨＰ（しかしこれに限定されない）などの微生物の化学生成について発酵技術分野および商業的な経済的実行可能性を前進させる、微生物比生産性の実質的な増加がもたらされる。
別の様式で言うと、様々な実施形態では、上記比生産性は、０．０１ｇ化学生成物／ｇＤＣＷ−ｈｒを超え（少なくともこの量である）、０．０５ｇ化学生成物／ｇＤＣＷ−ｈｒを超え（少なくともこの量である）、０．１０ｇ化学生成物／ｇＤＣＷ−ｈｒを超え（少なくともこの量である）、０．１５ｇ化学生成物／ｇＤＣＷ−ｈｒを超え（少なくともこの量である）、０．２０ｇ化学生成物／ｇＤＣＷ−ｈｒを超え（少なくともこの量である）、０．２５ｇ化学生成物／ｇＤＣＷ−ｈｒを超え（少なくともこの量である）、０．３０ｇ化学生成物／ｇＤＣＷ−ｈｒを超え（少なくともこの量である）、０．３５ｇ化学生成物／ｇＤＣＷ−ｈｒを超え（少なくともこの量である）、０．４０ｇ化学生成物／ｇＤＣＷ−ｈｒを超え（少なくともこの量である）、０．４５ｇ化学生成物／ｇＤＣＷ−ｈｒを超え（少なくともこの量である）、０．５０ｇ化学生成物／ｇＤＣＷ−ｈｒを超え（少なくともこの量である）、０．６０ｇ化学生成物／ｇＤＣＷ−ｈｒを超える（少なくともこの量である）。
より一般的には、本明細書で記載する補充物と必要に応じて組み合わせた本明細書で記載する遺伝子改変物の様々な組み合わせに基づいて、３−ＨＰおよび本明細書で記載するその他の化学生成物についての比生産性の値は、０．０１ｇ化学生成物／ｇＤＣＷ−ｈｒを超えてよく、０．０５ｇ化学生成物／ｇＤＣＷ−ｈｒを超えてよく、０．１０ｇ化学生成物／ｇＤＣＷ−ｈｒを超えてよく、０．１５ｇ化学生成物／ｇＤＣＷ−ｈｒを超えてよく、０．２０ｇ化学生成物／ｇＤＣＷ−ｈｒを超えてよく、０．２５ｇ化学生成物／ｇＤＣＷ−ｈｒを超えてよく、０．３０ｇ化学生成物／ｇＤＣＷ−ｈｒを超えてよく、０．３５ｇ化学生成物／ｇＤＣＷ−ｈｒを超えてよく、０．４０ｇ化学生成物／ｇＤＣＷ−ｈｒを超えてよく、０．４５ｇ化学生成物／ｇＤＣＷ−ｈｒを超えてよく、０．５０ｇまたは０．６０化学生成物／ｇＤＣＷ−ｈｒを超えてよい。このような比生産性は、特定の微生物による化学生成イベントにおいて２、４、６、８、１２または２４時間の期間にわたって評価してよい。
本発明の実施形態により達成される改善は、本明細書で教示する特定の遺伝子改変の組み合わせを欠く（上記微生物集団を含む容器に加えられた、本明細書で教示する補充物質ありまたはなしの）適当な対照微生物と比較した、比生産性のパーセンテージ増加または容積生産性のパーセンテージ増加により決定してよい。特定の実施形態およびその群について、このような比生産性および／または容積生産性の改善は、このような適当な対照微生物の各比生産性および／または容積生産性に対して少なくとも１０、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも１００、少なくとも２００、少なくとも３００、少なくとも４００および少なくとも５００パーセントである。
本明細書および／または参照により組み込まれている引用参考文献の具体的な方法および教示は、本実施例に組み込まれ得る。また、３−ＨＰの生成または本明細書で記載するようなその下流生成物の１つの生成は、様々な実施形態では、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも４０および少なくとも５０ｇ／リットルの力価に到達し得る。
上記計量は、任意の構成物、例えば遺伝子改変微生物、方法、例えば３−ＨＰまたはその他の化学生成物を生成する方法、ならびに系、例えば本明細書で開示する遺伝子改変微生物および／もしくは方法を利用する発酵系のいずれにも用いることができる。
本明細書で提供するストラテジーおよび方法を用い、上記経路および経路の構成部分に関し相互関係があることの発見に基づく繰り返しの改善は、さらにより大きい３−ＨＰ生成および耐性ならびに３−ＨＰバイオ生産イベントの終結でのより上昇した３−ＨＰ力価を導き得ることが認められる。
任意の数のストラテジーが、３−ＨＰ生成経路で用いるために適する適切な改変酵素の開発を導き得る。マロニル−ＣｏＡ還元酵素に関して、すぐ上の表の配列によりコードされるような酵素を利用または改変して、微生物株における適切なレベルの３−ＨＰ生成能力を達成してよい。
ＶＩＩＩ．３−ＨＰに対する耐性の増加
いくつかの相互に関係する代謝経路の全てまたは構成部分を含む複合体が同定されており、ここでは、その３−ＨＰ寛容原性複合体（「３ＨＰＴＧＣ」）と命名されたこのような複合体の酵素の酵素活性を増加させる遺伝子改変が、３−ＨＰへの曝露に対する微生物の耐性を増加させることが証明されている。上記３ＨＰＴＧＣは、２０１０年１月２８日に公開されたＷＯ２０１０／０１１８７４に記載され、これは、３ＨＰＴＧＣ、ならびに３ＨＰ生成に関する遺伝子改変と、３ＨＰＴＧＣおよびその中の群に基づく耐性との組み合わせに関するその教示について、本出願に組み込まれている。
本明細書で記載し、詳述するように、本発明は、微生物ベースの工業的バイオ生産方法、系および構成物における所望の結果を達成するための、遺伝子改変を用いる変更、および／または培地の調整（例えば酵素変換生成物またはその他の特定の化学物質の添加）に広く関する。耐性の態様について、本発明は、その活性の増加（それをコードする核酸配列のコピー数の増加に基づく）が３−ＨＰに対する微生物の耐性の増加と相関する酵素を含むある特定の代謝経路の構成部分を含む３ＨＰＴＰＣの予期しなかった重要性の発見から生まれている。
上記３ＨＰＴＧＣの変更に関する実際のデータおよび／または予測的な実施例が、本明細書で示される。これらの実施例は、応用範囲の広さ（３−ＨＰ耐性の増加を証明する３ＨＰＴＧＣに関する多数のゲノム要素に基づく）および３−ＨＰに対する耐性の増加を達成するためのいくつかの具体的なアプローチを証明することを意図する。アプローチは、３−ＨＰ耐性における相加的なまたは相乗的な改善を達成するために組み合わせてよく、遺伝子的または非遺伝子的（例えば特定の化学物質を系に補充すること、または工業的な系への一般的な変更に関する）である変更を含んでよい。さらに、具体的な生成ストラテジーが開示され、例示される。
つまり、３−ＨＰ生成経路をもたらすこと、ならびにエノイル−ＡＣＰ還元酵素をコードする遺伝子（後者の酵素の酵素活性を制御することを可能にする）を含みかつ／または制御する核酸配列を提供することに関する上記の遺伝子改変、ならびに／あるいは本明細書で記載する脂肪酸合成酵素系のその他の改変に加えて、様々な実施形態では、遺伝子改変微生物に１つ以上の遺伝子改変を行って、３−ＨＰ（またはその他の化学生成物）に対するその耐性を増加させてよい。
よって、本発明のいくつかの実施形態では、遺伝子改変微生物は、１つ以上の３−ＨＰ生成経路を提供するか、完了するかまたは増強するための少なくとも１つの遺伝子改変、エノイル−ＡＣＰ還元酵素の酵素活性を提供するためのおよび／または所望の細胞密度にてそのような活性を低減するように制御できる脂肪酸合成酵素系のその他の改変を提供するための少なくとも１つの遺伝子改変、ならびに３−ＨＰに対する上記遺伝子改変微生物の耐性を増加させるための３ＨＰＴＧＣもしくはその１つ、２つもしくは３つ以上の群の少なくとも１つの遺伝子改変を含み得る。
よって、本発明の１つの態様は、３−ヒドロキシプロピオン酸（「３−ＨＰ」）生成を増加させるために効果的な少なくとも１つの遺伝子改変であって、３−ＨＰ生成レベルの増加が、野生型微生物における３−ＨＰ生成のレベルよりも大きい改変と、本明細書において３−ＨＰ寛容原性複合体（「３ＨＰＴＧＣ」）と同定される代謝複合体の少なくとも１つの遺伝子改変とを含む遺伝子改変微生物に関する。最少培地での培養などのある特定の条件下で、上記３ＨＰＴＧＣ遺伝子改変（複数可）は、未改変微生物において観察される毒性作用を示さないで３−ＨＰが相対的により高い濃度まで蓄積し得るような特定の培養条件下で、上記遺伝子改変微生物が３−ＨＰを生成することを可能にする。３−ＨＰ生成経路の少なくとも１つの遺伝子改変は、３−ＨＰ蓄積を改善することおよび／または野生型微生物で見出される３−ＨＰ生成経路に関し３−ＨＰ生成を改善することであってよいか、または３−ＨＰがバイオ生産されるように３−ＨＰを通常合成しない微生物における十分な酵素変換を提供することであってよい。このような遺伝子改変微生物の作製の方法も記載され、それは本発明のこの態様の一部である。
本発明の別の態様は、上記３ＨＰＴＧＣに関するコリスメート合成の構成部分、トレオニン／ホモシステイン合成の構成部分、ポリアミン合成の構成部分、リシン合成の構成部分およびヌクレオチド合成の構成部分の２つ以上からの少なくとも１つの遺伝子改変を含む遺伝子改変微生物に関する。複数の組み合わせの限定しない実施例は、本発明のこの態様の利点を例示する。追加の遺伝子改変は、上記３ＨＰＴＧＣの他の構成部分に属する。３−ＨＰをバイオ生産する能力は、適当な遺伝子改変によりいくつかの遺伝子改変微生物に付加できる。３−ＨＰ耐性の増加を達成する微生物を提供するための遺伝子改変を同定する方法およびそのような方法により作製される微生物は、本発明のこの態様に関する。
本発明の別の態様は、上記微生物についての上記３ＨＰＴＧＣの１つ以上の酵素変換工程にて酵素変換を増加させる、上記３ＨＰＴＧＣへの少なくとも１つの遺伝子改変を含む３−ヒドロキシプロピオン酸（「３−ＨＰ」）を生成できる遺伝子改変微生物であって、上記少なくとも１つの遺伝子改変により、その遺伝子改変を欠く対照微生物の３−ＨＰ耐性を上回って、３−ＨＰ耐性が増加した微生物に関する。このような遺伝子改変微生物を作製する方法も記載され、それは本発明のこの態様の一部である。
本発明の別の態様は、上記３ＨＰＴＧＣの特定の遺伝子改変（複数可）の様々なコアセットを含む遺伝子改変微生物に関する。様々な実施形態では、この態様は、上記３ＨＰＴＧＣに関するコリスメート合成の構成部分、トレオニン／ホモシステイン合成の構成部分、ポリアミン合成の構成部分、リシン合成の構成部分およびヌクレオチド合成の構成部分の１つ以上または２つ以上からの少なくとも１つの遺伝子改変を追加で含んでよい。このような遺伝子改変微生物を作製する方法も記載され、それは本発明のこの態様の一部である。
さらに、本発明は、３−ＨＰに対する微生物の耐性を改善するための使用方法を含み、それは３−ＨＰ生成能力（これが天然に存在するか、増強されているかかつ／または遺伝子改変により導入されているかにかかわらず）を有する微生物において使用される方法であり得る、。
また、本発明の別の態様は、上記３ＨＰＴＧＣの基質（すなわち反応物）および／または生成物（最初の変換工程以外の全てについての基質も上記３ＨＰＴＧＣの生成物であることに留意して本明細書において集合的に「生成物」）である１つ以上の補充物質を、微生物の培養物に提供して、３−ＨＰに対する該微生物の効果的な耐性を増加させることに関する。
本発明の別の態様は、本明細書においてＩｒｏＫと同定される短いポリペプチドをコードする遺伝要素を導入する遺伝子改変に関する。この短いポリペプチドをコードする遺伝要素の導入は、微好気条件下でＥ．ｃｏｌｉにおける３−ＨＰ耐性を改善することが証明されている。この遺伝子改変は、本発明のその他の遺伝子改変および／または補充物質添加と組み合わせてよい。
本発明の教示に従って３−ＨＰを作製する方法および３−ＨＰを作製する遺伝子改変微生物に関して、微生物に１つ以上の遺伝子改変を提供して、３−ＨＰに対する耐性を増加させてよい。つまり、配列番号００１〜１８９がこのセクションに組み込まれ、配列番号１９０〜６０３が、Ｅ．ｃｏｌｉ ３ＨＰＴＧＣの核酸配列（遺伝子、ＤＮＡ）およびコードされるアミノ酸配列（タンパク質）として示され、配列番号６０４〜７６６が、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ３ＨＰＴＧＣの核酸配列の配列として示される。
さらに、カルボニックアンヒドラーゼ（例えばＥ．ｃｏｌｉのｃｙｎＴ、ＤＮＡについて配列番号３３７およびタンパク質配列について配列番号５４４）の発現を増加させる特定の遺伝子改変は、３−ＨＰ生成と３−ＨＰ耐性との両方を有利に改善する二重機能様式で作用し得る。このことは、特に、マロニル−ＣｏＡ還元酵素が３−ＨＰ生成のために提供される場合にそうである。図１は二機能性マロニル−ＣｏＡ還元酵素を含むマロニル−ＣｏＡから３−ＨＰへの生成経路と、本明細書で記載するその他の酵素変換および経路を示す。カルボニックアンヒドラーゼは、それに限定することを意味するものではない。例えば、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて、ｃａｎおよびｙａｄＦと様々に称されるカルボニックアンヒドラーゼ２が公知であり、本発明の実施形態における遺伝子改変の使用は、このもしくはその他の遺伝子およびそれらがコードする酵素を用い得る。ｃａｎの配列は、配列番号７６７（ＥＧ１２３１９ ｃａｎ「カルボニックアンヒドラーゼ２モノマー」（相補体（１４２６７０．．１４２００８））Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ−１２ ｓｕｂｓｔｒ．ＭＧ１６５５）および配列番号７６８（ＥＧ１２３１９−ＭＯＮＯＭＥＲカルボニックアンヒドラーゼ２モノマー（補体（１４２６７０．．１４２００８））Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ−１２ ｓｕｂｓｔｒ．ＭＧ１６５５）として示される。
３−ＨＰ耐性を増加させるための遺伝子改変を、上記３ＨＰＴＧＣの特定の各構成部分に沿って行われる遺伝子改変によりさらに分類してよいことが認められる。例えば遺伝子改変は、上記３ＨＰＴＧＣの特定の構成部分に沿って酵素反応を触媒するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに対して行ってよく、よって、それぞれ、芳香族アミノ酸（ｔｙｒおよびｐｈｅ）、トリプトファン（ｔｒｐ）、ユビキノン−８、メナキノン、エンテロバクチン、テトラヒドロフォレート（群Ａシートの各酵素変換（およびその入力（ｉｎｐｕｔ））を参照されたい）、１つ以上の極性非荷電アミノ酸（ｇｌｙ、ｓｅｒ、ｃｙｓ、ホモシステイン）、イソロイシン、メチオニン（群Ｂシートの各酵素変換（およびその入力）を参照されたい）、グルタミン、アルギニン、プトレシン、スペルミジン、アミノプロピルカダベリン（群Ｃシートの各酵素変換（およびその入力）を参照されたい）、カダベリン（群Ｄシートの各酵素変換（およびその入力）を参照されたい）、イノシン−５−ホスフェート、キサントシン−５−ホスフェート、アデニロ−スクシネート、オロチジン−５’−ホスフェートおよびそれらから得られるモノ−、ジ−およびトリ−ホスフェートヌクレオシド（すなわちアデノシン、グアノシン、シトシン、ウリジン）（群Ｅシートの各酵素変換（およびその入力）を参照されたい）、グルタメート、スクシネート、スクシネートセミアルデヒド、オキサロアセテートおよびアスパルテート（群Ｆシートの点線に沿って示す反応を含む各酵素変換を参照されたい）の生成を増加させて、そのことにより３−ＨＰ耐性が、このような遺伝子改変（複数可）の結果として増加すると予期される。任意の構成部分または副構成部分（ｓｕｂ−ｐｏｒｔｉｏｎ）を、選択された微生物種における３−ＨＰ耐性を増加させるための遺伝子改変（複数可）のために選択してよい。
示したように、様々な実施形態では、このセクションに記載されるような遺伝子改変の組み合わせが、上記脂肪酸合成酵素系の調整に属する本発明の態様と組み合わせて実施される。
ＶＩＩＩＡ．ＳＣＡＬＥＳ技術
２０１０年１月２８日に公開されたＷＯ２０１０／０１１８７４に記載されるように、遺伝情報を得るために、初期の３−ＨＰ関連適合度データが、ＳＣＡＬＥＳ技術を用いて、ゲノムライブラリー集団からのクローンの適合度の評価により得られた。これらのクローンは、３−ＨＰ耐性の信頼できる試験であることが示されている、３−ＨＰ濃度の上昇を強制した選択的環境中で増殖した。
より具体的には、３−ＨＰ耐性の増加と関連する遺伝要素を同定するための潜在的に有用なデータを得るために、５つの代表的なＥ．ｃｏｌｉ Ｋ１２ゲノムライブラリーの最初の集団を、当業者に公知の方法により生成した。その５つのライブラリーはそれぞれ、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｋ１２遺伝子材料の５００、１０００、２０００、４０００、８０００塩基対（「ｂｐ」）の挿入物を含んでいた。Ｅ．ｃｏｌｉ Ｋ１２ゲノム全体を本質的に含むこれらのライブラリーのそれぞれで、ＭＡＣＨ１（商標）−Ｔ１（登録商標）Ｅ．ｃｏｌｉ細胞をそれぞれ形質転換し、微好気条件に相当する対数期中期まで培養した（ＯＤ６００約０．２）。バッチ移動時間（ｂａｔｃｈ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｔｉｍｅ）は様々であり、栄養分不足の選択環境を避けるため（すなわち、培養物が定常期に入ることを避けるため）に必要に応じてバッチ移動時間を調整した。代替のアプローチについて限定することを意味しないが、３−ＨＰの存在下での選択を、８つの一続きの移動バッチ（ｓｅｒｉａｌ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｂａｔｃｈ）に対して、６０時間にわたる３−ＨＰの漸減勾配で行った。より具体的には、その３−ＨＰ濃度は、一続きのバッチ１および２について２０ｇの３−ＨＰ／Ｌ、一続きのバッチ３および４について１５ｇの３−ＨＰ／Ｌ、一続きのバッチ５および６について１０ｇの３−ＨＰ／Ｌ、ならびに一続きのバッチ７および８について５ｇの３−ＨＰ／Ｌであった。一続きのバッチ７および８について、その培養物が定常期に近づいたときに、栄養分不足を避けるために培養培地を置き換えた。
試料を、選択における各バッチの間および各バッチの最終段階にて採取し、マイクロアレイ分析に供して、シグナル強度を同定した。アレイの前のライブラリーの調製、細胞培養物の形質転換についての個別の標準的な実験方法、およびＳＣＡＬＥＳ技術について用いたその他の標準的な実験方法ならびにデータ分析は、ＳａｍｂｒｏｏｋおよびＲｕｓｓｅｌｌ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第３版、２００１年（１〜３巻）、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．（以下、ＳａｍｂｒｏｏｋおよびＲｕｓｓｅｌｌ、２００１年）で教示される方法により確認されるように、当該技術において周知である。個別の方法の態様も、本実施例およびＳＣＡＬＥＳ技術の特許出願、２００５年９月２０日に出願された「Ｍｉｘｅｄ−Ｌｉｂｒａｒｙ Ｐａｒａｌｌｅｌ Ｇｅｎｅ Ｍａｐｐｉｎｇ Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ ｆｏｒ Ｇｅｎｏｍｅ Ｗｉｄｅ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｔｒａｉｔ Ｃｏｎｆｅｒｒｉｎｇ Ｇｅｎｅｓ」との表題の米国特許出願公開第２００６／００８４０９８Ａ１号（以下、「ＳＣＡＬＥＳ技術」）（これは、この技術のさらなる詳細を教示するために参照することにより本明細書に組み込まれている）においてより詳細に論じられている。
マイクロアレイ技術も、当該技術において周知である（例えば＜＜ｗｗｗ．ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ．ｃｏｍ＞＞を参照されたい）。３−ＨＰへの異なる曝露期間にてどのクローンがより優勢であるかのデータを得るために、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ Ｅ．ｃｏｌｉアンチセンス遺伝子チップアレイ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ、Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ、ＣＡ）を取り扱い、ＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘからのＥ．ｃｏｌｉ発現プロトコールに従って走査して、ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ．ｃｅｌファイルを生成した。３−ＨＰへの所定の曝露の後の強いマイクロアレイシグナルは、この遺伝子配列を含むプラスミドにより導入される遺伝子配列が３−ＨＰ耐性を与えることを示す。これらのクローンは、当該技術において公知の多数のマイクロアレイ分析により同定できる。
また、米国において出願しているとおり参照により組み込む目的のために、「Ａ ｇｅｎｏｍｉｃｓ ａｐｐｒｏａｃｈ ｔｏ ｉｍｐｒｏｖｅ ｔｈｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ａｎｄ ｄｅｓｉｇｎ ｏｆ ｓｔｒａｉｎ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎｓ」、Ｔ． Ｅ． Ｗａｒｎｅｃｋｅら、Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ １０巻（２００８年）１５４〜１６５頁は、ＳＣＡＬＥ適合度データが３−ＨＰに対する耐性の増加の代用と相関し、かつ代用として用いることができることを証明するそのさらなる具体的な教示について、本明細書に参照により組み込まれている。この結論は、受信者動作特性曲線（ｒｅｃｅｉｖｅｒ ｏｐｅｒａｔｏｒ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃ ｃｕｒｖｅ）（ＲＯＣ）曲線の標準的な使用に基づく。ＲＯＣ分析は、診断検査と、疾患の実際の存在または非存在とについての相関を評価するために、医療診断分野において日常的に用いられている。ＲＯＣ分析において良好に挙動する、医療の応用において世界的に用いられている現在の診断検査は、疾患の非存在または存在を同定するために日常的に用いられている。この分析は、３−ＨＰ耐性についての信頼できる試験として、適合度の値をもたらす異なる微生物増殖ベースの選択の感度および特異性を評価するために適合された。特に、３−ＨＰのレベルを漸減させる一続きのバッチ培養を用いる増殖ベースの選択は、３−ＨＰ耐性についての感度が高く特異性のある試験として同定された。結果として、計量では０のカットオフより大きい適合度を有するこの選択におけるクローンは、３−ＨＰに対する耐性を与えるクローンとして同定される。
以下の表は、本明細書で３−ＨＰに対する耐性を与えることが示される、適合度の値が上昇することが示された遺伝子（ライブラリーのベクターにより導入された）のいくつかを列挙する。
表３：ＳＣＡＬＥＳ適合度データ
ＶＩＩＩＢ．ＳＣＡＬＥＳ技術の分析
２０１０年１月２８日に公開されたＷＯ２０１０／０１１８７４にも記載されるように、３−ＨＰ耐性ＳＣＡＬＥｓデータの分析は、様々な同定された経路およびその構成部分の間に相互関係があることの理解を導いている。上記３ＨＰＴＧＣが、その全体で、適合度の値が上昇している遺伝子間に相互関係があることから推定されたことが注目される。上記３ＨＰＴＧＣの全ての酵素が、上記ＳＣＡＬＥＳデータにおいて、正の適合度の値を有することが示されたわけではない。このことは、このＳＣＡＬＥＳデータを得るために用いた商業的なアレイにおけるある特定の欠陥に帰すると考えられる。よって、ＳＣＡＬＥＳ遺伝要素データからそのようにして導かれなかったＥ．ｃｏｌｉ ３ＨＰＴＧＣのいくつかのメンバーは、上記３ＨＰＴＧＣを充足するように推定された。しかし、上記３ＨＰＴＧＣにおける酵素のほとんどは、正の適合度の値を有し、本明細書で示す補充物質と遺伝子改変物のデータとの組み合わせの全体的な適合度のデータは、上記３ＨＰＴＧＣが３−ＨＰ耐性と関連付けられるという推定および全体的な重要性の妥当性を証明する。
本明細書で記載するように、上記３ＨＰＴＧＣは、解糖経路、トリカルボン酸回路、グリオキシル酸経路およびペントースリン酸経路の構成部分を含む「上部区分」と、コリスミ酸スーパー経路、カルバモイルホスフェートからカルバメートへの経路、トレオニン／ホモシステインスーパー経路、ヌクレオチド合成経路およびポリアミン合成経路の全てまたは構成部分を含む「下部区分」とに分けられる。
様々な実施形態では、微生物は、微生物の３−ＨＰ生合成活性を含む工業的な系におけるように、３−ＨＰに対する耐性の上昇が達成できるように上記３ＨＰＴＧＣの１つ以上の酵素活性に影響するように遺伝子改変される。また、遺伝子改変を行って、上記３−ＨＰ寛容原性複合体についての１つ以上の遺伝子改変を含む微生物において１つ以上の３−ＨＰ生合成経路を提供および／または改善し、こうして、３−ＨＰ生成の増加をもたらしてよい。これらの後者の組換え微生物は、３−ＨＰ−ｓｙｎｔｈａ−寛容原性組換え微生物（「３ＨＰＳＡＴＧ」組換え微生物）ということがある。
Ｅ．ｃｏｌｉについての３ＨＰＴＧＣは、図９Ａ、シート１〜７に開示する（描かれた全体の３ＨＰＴＧＣを調べるためのこれらのシートの位置についての手引きは、図９Ａのシート１に示す）。図９、シート１〜７から観察できるように、上記３ＨＰＴＧＣは、以下のものの全てまたは様々な示された構成部分を含む：コリスミ酸スーパー経路、カルバモイル−ホスフェートからカルバメートへの経路、トレオニン／ホモシステインスーパー経路；ペントースリン酸経路の構成部分；ヌクレオチド合成経路；解糖／トリカルボン酸回路／グリオキシル酸バイパススーパー経路；およびポリアミン合成経路。コリスミ酸経路およびトレオニン経路は、スーパー経路として同定されることが注目される。なぜなら、これらは、それぞれ、いくつかのより小さい公知の経路を包含するからである。しかし、上記３ＨＰＴＧＣ全体はこれらおよびその他の経路またはその構成部分を含むが、コリスミ酸スーパー経路またはトレオニン／ホモシステインスーパー経路のいずれも通常伴わない。
より具体的には、シート１〜７を含む図９Ａは、群Ａ〜Ｅにさらに細分される下部区分と、群Ｆとして単純に同定される上部区分とに細分される。その下部区分の群は、以下のように同定される：コリスミ酸スーパー経路の示される主要な構成部分を含む群Ａすなわち「コリスミ酸」（シート３）；トレオニン／ホモシステイン経路の示される構成部分を含む群Ｂすなわち「トレオニン／ホモシステイン」（シート７）；アルギニン合成工程とカルバモイル−ホスフェートからカルバメートへの経路も含むポリアミン経路の示される構成部分を含む群Ｃすなわち「ポリアミン合成」（シート５）；リシン合成経路の示される構成部分を含む群Ｄすなわち「リシン合成」（シート６）；ヌクレオチド合成経路の示される構成部分を含む群Ｅすなわち「ヌクレオチド合成」（シート４）。群Ｆ（シート２）は、上記３ＨＰＴＧＣの上部区分を含み、解糖経路、トリカルボン酸回路およびグリオキシル酸バイパス経路と、ペントースリン酸経路の示される構成部分とを含む。
特定の遺伝子が、図９Ａ、シート１〜７における３ＨＰＴＧＣの酵素変換工程にて同定されることが注目される。これらの遺伝子は、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｋ１２株、ＭＧ１６５５亜株についてである。これらの核酸配列および対応するアミノ酸配列は、＜＜ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｓｉｔｅｓ／ｅｎｔｒｅｚ＞＞および代わりに＜＜ｗｗｗ．ｅｃｏｃｙｃ．ｏｒｇ＞＞で入手可能である。当業者に公知なように、いくつかの遺伝子は、単一プロモーターの制御下のオペロン内の染色体上で見出され得るか、またはその他の相互関係があることに依拠して見出すことができる。本明細書における核酸配列を、ｓｕｃＣＤまたはｃｙｎＴＳなどの組み合わせとして言及する場合、このことから、その核酸配列が、それぞれ、ｓｕｃＣとｓｕｃＤの両方、およびｃｙｎＴとｃｙｎＳの両方を含むことを意味する。追加の制御およびその他の遺伝要素も、このような核酸配列に存在してよく、これは、遺伝子改変に付加される場合に集合的に「遺伝要素」ということがあり、そしてそれは単一遺伝子を付加する遺伝子改変を含むことを意図する。
しかし、図９Ａ、シート１〜７に示すのと同じ機能を有する酵素をコードする同様に機能する遺伝子は、異なる種および株において容易に見出され、このような遺伝子ならびにこのようなその他の種および株の３ＨＰＴＧＣは、本発明の実施において利用できる。このことは、限定されることを意味しない以下の方法により達成できる。
Ｅ．ｃｏｌｉの３ＨＰＴＧＣ内の遺伝子のセットについて、タンパク質配列をＮＣＢＩから得た。Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおける同様に機能する遺伝子を同定するために、Ｅ．ｃｏｌｉ ３ＨＰＴＧＣで同定した遺伝子を用いて、＜＜ｗｗｗ．ｂｉｏｃｙｃ．ｏｒｇ＞＞での経路比較ツールを利用した。Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓについて、この注釈を付けたアプローチを部分的に用い、このアプローチにより得られなかった酵素または経路の構成部分は、相同性比較アプローチにより得た。相同性アプローチについて、Ｅ．ｃｏｌｉタンパク質およびＢａｃｉｌｌｕｓタンパク質配列の選択されたセット（４０９６配列）を用いる局所ｂｌａｓｔ（＜＜ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｔｏｏｌｓ／＞＞）（ｂｌａｓｔｐ）比較を、異なる閾値を用いて行った（＜＜ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｅｎｏｍｅｓ／ｌｐｒｏｋｓ．ｃｇｉ＞＞）。相同性情報を用いて（Ｅ−１０以下のＥ値を有する相同性一致）、残りの遺伝子および酵素を、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓの３ＨＰＴＧＣについて同定した。
また、後者の相同性アプローチをＣｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ ｎｅｃａｔｏｒについて用いたが、以下の表は、上記３ＨＰＴＧＣの酵素変換工程を触媒することが公知の酵素をコードするＥ．ｃｏｌｉ遺伝子との相同性が証明されているＣ．ｎｅｃａｔｏｒの遺伝要素についての相同性の関係のいくつかの例を示す。これは、Ｅ−１０未満のＥ値を有する相同配列の基準に基づく。この表は、比較により得られる多くの相同性（８５０を超える）のいくつかだけを示す。Ｃ．ｎｅｃａｔｏｒにおける相同配列の全てが、Ｃ．ｎｅｃａｔｏｒについての３ＨＰＴＧＣの酵素変換工程に適する所望の酵素をコードすると予期されるわけではない。しかし、所望の酵素反応物をコードすることが公知の遺伝要素の選択についての組み合わせの１つ以上により、最も適切な遺伝要素が、この種についての上記３ＨＰＴＧＣについて選択される。
表４：Ｃ．ｎｅｃａｔｏｒの遺伝要素についての相同性の関係
図９Ｂ、シート１〜７は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓについての３ＨＰＴＧＣを、図９Ｃ、シート１〜７は、酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅについての３ＨＰＴＧＣを、図９Ｄ、シート１〜７は、Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ ｎｅｃａｔｏｒについての３ＨＰＴＧＣを示す。後者についての酵素名を、所望の３ＨＰＴＧＣ酵素変換工程を触媒することが公知のＥ．ｃｏｌｉ酵素に対して比較した場合に、Ｅ−１０未満のＥ値を有するという基準を満たす相同配列の量の記載とともに示す。
上記のいずれかのアプローチ、および所定の微生物種の遺伝情報を得ることが現在存在することまたはそれが比較的容易で低費用であることに基づいて、上記のアプローチの一方または両方を採用して、選択された微生物種（そのゲノム配列が公知であるかまたは得られている）における関連する遺伝子および酵素を同定し、このような相同性が一致し、同定された遺伝子の選択された遺伝子改変の３−ＨＰ耐性における相対的な改善を評価し、そのことにより３−ＨＰに対する耐性が改善された選択された組換え微生物を生成することができる。
さらに、様々な微生物における代替経路が、上記３ＨＰＴＧＣの生成物を産出し、その生成または存在の増加は、３−ＨＰ耐性の増加をもたらすことが本明細書において証明されることが認められる。例えば、酵母の種において、群Ｄ内の生成物であるリシンへの代替経路が存在する。よって、その他の方法では関連する請求項（複数可）の範囲内に入るこのような微生物種について、このような代替経路の変更は本発明の範囲内である。つまり、様々な実施形態では、本発明は、図９Ａ〜Ｄに描く具体的な経路に限定されない。つまり、図９Ａ〜Ｄに示す生成物を産出する様々な経路およびその酵素は、本発明の範囲内であるとみなすことができる。
２つ以上の遺伝子が特定の酵素変換工程について示される場合、これらは、単一の多酵素複合体の成分であるか、またはそれらを制御するかもしくは異なって誘導する異なる制御因子を有する代替酵素を表し得ることが注目される。また、当業者に明確であるように、主要な反応物（すなわち基質）および生成物が、酵素変換工程について示される。このことは、既に混み合っている図での詳述を最小限にする。例えば、ＮＡＤ（Ｐ）（Ｈ）およびＡＤＰ／ＡＴＰなどの電子伝達体およびエネルギー移送分子は示されず、これら（および３ＨＰＴＧＣの図に示されないその他の小分子反応物）は、この用語が本明細書で用いられるようには３ＨＰＴＧＣの「生成物」とみなされない。また、少なくとも２つの工程について（ジヒドロネオプテリンホスフェートから７，８−ジヒドロ−Ｄ−ネオプテリンおよび１，４−ジヒドロキシ−２−ナフトイル−ＣｏＡから１，４−ジヒドロキシ−２−ナフトエート）、出願時にこの工程について酵素が同定されることが公知でないので、酵素は示さない。よって、いくつかの実施形態では、上記３ＨＰＴＧＣは、これらの工程についての酵素、核酸配列などを除くと理解され、かつ／またはそのように考慮される。また、本明細書で論じるように、本明細書で示す３ＨＰＴＧＣの酵素のいずれかまたはその関連する複合体もしくは構成部分の同定された酵素機能性バリアントをコードする核酸配列バリアント、ならびに本明細書で請求する構築物におけるそれらの使用、方法および系も本発明の範囲内に含まれる。
表３に示すいくつかの適合度データは、３ＨＰＴＧＣの図に示さないが、それでもなお、３−ＨＰ耐性を改善するための遺伝子改変（複数可）および／または補充を支持するとみなされる。例えば、ｇｃｖＨ、ｇｃｖＰおよびｇｃｖＴについての相対的に上昇した適合度のスコアは、グリシン切断系と関連付けられた。これらの酵素は、図１０に描くグリシン／５，１０−メチレン−テトラヒドロフォレート（「５，１０ｍＴＨＦ」）変換経路に関与する。図１０に示す向きで、３つの酵素触媒反応は、グリシン（３ＨＰＴＧＣ生成物、図９Ａ、シート４を参照されたい）の脱炭酸、テトラヒドロフォレート（「ＴＨＦ」）からの５，１０−メチレン−ＴＨＦの生成およびＮＡＤ＋からのＮＡＤＨの生成をもたらす。この複合体の５，１０−メチレン−ＴＨＦ生成物は、以下のものの一部である酵素触媒反応の反応物である：葉酸ポリグルタミル化；パントテン酸生合成；ホルミルＴＨＦ生合成；およびピリミジンデオキシリボヌクレオチドの新規生合成。全体として、表３に示すが図９、シート１〜７に示さない酵素およびその酵素触媒工程に関する微生物における遺伝子改変は、本発明の一部であるとみなされ（その他の種についてのそれらの機能的等価物と同様に）、ここで、そのような遺伝子改変は、３−ＨＰ耐性の増加をもたらす。
ＶＩＩＩＣ．３ＨＰＴＣＧの遺伝子改変および補充
本発明の様々な実施形態について、上記３ＨＰＴＣＧの任意の経路および経路の構成部分ならびに上記３−ＨＰバイオ生産経路のいずれかに対する遺伝子改変は、各経路のいずれかで同定される酵素または酵素の酵素活性の調節ならびにそれによって最終的にはその活性を変化させることに関するものを含む、様々な遺伝子操作を含むように記載され得る。このような遺伝子改変は、選択されたおよび／または同定された培養条件下での酵素活性および／または全体的な酵素変換速度の変化をもたらす転写改変、翻訳改変および翻訳後改変、ならびに／あるいは上記３ＨＰＴＧＣの酵素のコピー数および／または変異体を増加させるような追加の核酸配列（実施例のいくつかに示すような）を提供することを目的としてよい。
このような遺伝子改変を達成するための具体的な方法およびアプローチは、当業者に周知であり、それらに限定されないが、内因性遺伝要素の発現を増加させること、リプレッサー遺伝子の機能性を減少させること、異種遺伝要素を導入すること、上記３ＨＰＴＧＣの酵素変換工程を触媒するポリペプチドをコードする核酸配列のコピー数を増加させること、遺伝要素を変異させて、比酵素活性を増加させるように変異タンパク質を供給すること、過剰発現すること、過少発現すること、シャペロンを過剰発現すること、プロテアーゼをノックアウトすること、フィードバック阻害を変更もしくは改変すること、リプレッサーおよび／もしくは競合阻害剤についての１つ以上の損なわれた結合部位を含む酵素バリアントを提供すること、リプレッサー遺伝子をノックアウトすること、ｍＲＮＡ安定性を改善するための進化、選択および／またはその他のアプローチを含む。ランダム変異誘発を実施して、これらのまたはその他の述べられたアプローチのいずれかになり得る３ＨＰＴＧＣの遺伝子改変をもたらすことができる。上記遺伝子改変は、さらに広くは、対象の核酸における１つ以上の核酸の付加（挿入を含む）、欠失（例えば変異による）および置換になる。様々な実施形態では、遺伝子改変は、酵素比活性および／または酵素の代謝回転数の改善をもたらす。限定されることなく、変化は、以下の１つ以上により測定してよい：ＫＭ；Ｋｃａｔ；およびＫアビディティ。
このような遺伝子改変は、全体で、そのようにして改変された微生物の３−ＨＰ耐性を増加させるように、３ＨＰＴＧＣの少なくとも１つの酵素変換工程での酵素変換を増加させることを目的とする。また、図９Ａ〜Ｄに示す酵素変換工程は、例えば、図９Ａ〜Ｄの特定の酵素変換工程における、その遺伝子名に対応する酵素名を検索し、次いで、その他の種おいて、同じ名称および機能を有する酵素を同定することにより、当業者によって容易に同定される酵素により触媒され得る。後者は、各反応物（複数可）を、その酵素変換工程のための各生成物（複数可）に変換できる。＜＜ｗｗｗ．ｍｅｔａｃｙｃ．ｏｒｇ＞＞、＜＜ｗｗｗ．ｅｃｏｃｙｃ．ｏｒｇ＞＞、＜＜ｗｗｗ．ｂｉｏｃｙｃ．ｏｒｇ＞＞および＜＜ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｇｏｖ＞＞などの公のデータベースサイトは、このような類似の酵素を同定するための関連するツールを有する。
また、ＭＩＣ分析は、様々な３−ＨＰ濃度に特定の時間置かれた場合の微生物の増殖の差を示すための終点として本明細書において頻繁に用いられるが、これは、本発明の態様に基づいて微生物の耐性の差、例えば改善を決定するための唯一の適切な計量とはみなされない。限定することなく、その他の適切な測定アプローチは、増殖速度決定、誘導時間決定、特定の培養期間での培養物の光学濃度の変化、所定の期間における集団の倍加の数、および３−ＨＰ生成能力を含む微生物について、培養系における全体的な３−ＨＰ生成（ここでは、３−ＨＰが、上記３ＨＰＴＧＣの１つ以上の酵素変換工程において酵素変換を増加させる遺伝子改変を欠く対照微生物に対して阻害的なレベルまで蓄積する）を含み得る。このことは、生産性、収率または力価の増加をもたらし得る。
３−ＨＰ耐性の増加を評価するために有用な計量により、３−ＨＰに特定の期間曝露される一方で微生物または微生物培養物が増殖できることと関連付けることができる。このことは、様々な定量的および／または定性的分析ならびに終点により、特に本明細書で開示して論じる３−ＨＰ耐性関連遺伝子改変（複数可）および／または補充を欠く適当な対照との比較により決定できる。このような評価の期間は、それらに限定されないが、１２時間、２４時間、４８時間、７２時間、９６時間および９６時間を超える期間であってよい。３−ＨＰの曝露濃度を変化させることについて、３−ＨＰ耐性の改善をより明確に同定するために評価してよい。以下の段落では、本発明の教示を微生物および／または培養系に当てはめた場合に、その培養系において３−ＨＰの存在下で上記微生物の増殖および／または生存能力の差を証明するために用いることができるアプローチの非限定的な例を示す。
図１５Ａ〜Ｏは、異なる３−ＨＰ濃度に対する様々な対照微生物応答からのデータを示す。これらの図におけるデータは、最大増殖速度（μｍａｘ）における変化、光学濃度（「ＯＤ」）における変化および所定の期間、ここでは２４時間にわたる相対的倍加時間として様々に示す。
増殖速度、誘導時間および最大増殖速度の決定は、比較計量を発展させるための分析を一般的に用いる。図１５Ａ、１５Ｄ、１５Ｇ、１５Ｊおよび１５Ｍは、示される種について、示される好気または嫌気試験条件下で、２４時間の試験期間にわたる最大増殖速度の変化を実証する。増殖に対し毒性および／または阻害性であると考えられる対象の化学物質の濃度範囲についてこのデータを示す場合に、この表示は、本明細書において「トレラグラム」と呼ぶ。ここでは、増殖トレラグラムを、様々な量の３−ＨＰを含む増殖条件に供した微生物の比増殖速度を測定することにより作製する。
さらに、図１５Ｐは、対照微生物培養物の増殖トレラグラムを、ｃｙｎＴＳ（３ＨＰＴＧＣの群Ｃ中）の発現が増加するように遺伝子改変を行った微生物の増殖トレラグラムと比較する。Ｅ．ｃｏｌｉにおけるｃｙｎＴＳ遺伝子改変についての曲線は、各３−ＨＰ濃度について２４時間の評価期間にわたる３−ＨＰ濃度の増加とともに最大増殖速度の増加を示す。このことは、定性的な視覚的に観察可能な差を提供する。しかし、上記ｃｙｎＴＳ遺伝子改変についての曲線下の面積がより大きいことは、定量的な差も与え、このことは、３−ＨＰ耐性を改善することを意図する他の遺伝子改変との比較の目的のために用いることができる。このような曲線の評価は、遺伝子改変物および／または補充物質ならびにそれらの組み合わせのより効果的な同定を導くことができる。
図１５Ｂ、１５Ｅ、１５Ｈ、１５Ｋおよび１５Ｎは、異なる３−ＨＰ濃度に対する対照微生物の応答を証明し、ここでは、その計量として、２４時間での光学濃度（「ＯＤ」、６００ナノメートルで測定される）が用いられる。ＯＤ６００は、微生物培養物における細胞密度の従来の尺度である。好気条件下のＥ．ｃｏｌｉについて、図１５Ｂは、３０ｇ／Ｌ ３−ＨＰから開始して２４時間にて細胞密度の劇的な低減を証明する。図１５Ｄは、嫌気条件下のＥ．ｃｏｌｉについて相対的により鋭くより早期の下降を示す。
図１５Ｃ、１５Ｆ、１５Ｉ、１５Ｌおよび１５Ｏは、異なる３−ＨＰ濃度に対する対照微生物の応答を証明し、ここでは、２４時間の期間の間の細胞倍加の数が表示される。
上記は、３−ＨＰ耐性の改善を評価するための様々な方法の非限定的な記載として意図されたものである。一般的に、増殖および／または生存における証明可能な改善は、例えば３−ＨＰに対する耐性の増加を評価する方法とみなされる。
本発明の実施形態では、宿主微生物への発現ベクターの導入が生じ得、ここで、上記発現ベクターは、宿主微生物において通常見出されるかまたは通常見出されない酵素をコードする核酸配列を含有する。その異種核酸配列の導入の前の上記宿主微生物のゲノムに関して、その酵素をコードする核酸配列は、異種である（該異種核酸配列がそのゲノムに導入されているか否かにかかわらず）。
一般的に、本明細書で記載するアプローチの任意の１つ以上により、３−ＨＰに対する組換え微生物の耐性を増加させるための１つ以上の遺伝子改変を提供することは、本発明の範囲内である。つまり、各方法の結果の構成物、すなわち３−ＨＰに対する耐性の増加を得ることに向けて言及される１つ以上、２つ以上、３つ以上などの遺伝子改変を含む遺伝子改変微生物は、上記の代替およびその実施形態のいずれかの範囲内である。
また、選択された微生物を含む適切な培養容器内に、３ＨＰＴＧＣの中間物質または最終生成物（集合的に「生成物」）である１つ以上の補充物質を提供することは、本発明の範囲内である。表５は、３ＨＰＴＧＣおよび／または３−ＨＰ生成経路に対する１つ以上の遺伝子改変を含む遺伝子改変微生物を含む培養容器に添加し得る補充物質の非限定的な列挙を示す。例えば、限定されないが、リシン、メチオニンおよび重炭酸塩の１つ以上を提供してよい。このような補充物質の添加は、本明細書で記載する選択された微生物の遺伝子改変物と組み合わせてよい。
表５
補充物質に関してさらに、ポリアミン合成に関係する群Ｃについて、本実施例の結果は、Ｅ．ｃｏｌｉの３−ＨＰ耐性が、ポリアミンであるプトレシン、スペルミジンおよびカダベリンを培地に加えることにより増加したことを証明する。対照および補充物質が加えられた培地におけるＥ．ｃｏｌｉ Ｋ１２についての最小阻止濃度（ＭＩＣ）は、以下の通りであった。プトレシンを補充したＭ９最少培地において４０ｇ／Ｌ、スペルミジンを補充したＭ９最少培地において４０ｇ／Ｌ、カダベリンを補充したＭ９最少培地において３０ｇ／Ｌ。Ｍ９最少培地に加えた重炭酸ナトリウムについての最小阻止濃度（ＭＩＣ）は、３０ｇ／Ｌであった。３−ＨＰの１００ｇ／Ｌストック溶液におけるＥ．ｃｏｌｉ Ｋ１２についての最小阻止濃度（ＭＩＣ）は、２０ｇ／Ｌであった。
さらに、重炭酸ナトリウムを補充した対照ＭＩＣを超える増加を考慮して、カルボニックアンヒドラーゼの調節および／または遺伝子改変などの、対象の細胞に異種核酸配列を提供する（この核酸配列は、カルボニックアンヒドラーゼ活性を持つポリペプチドをコードする）ようなその他の変更は、３−ＨＰに対する耐性を増加させるために価値があるとみなされる（例えば３ＨＰＴＧＣのその他の変更と組み合わせて）。同様に、そして本明細書で示すその他のデータにより支持されるように、アルギニン、プトレシン、カダベリンおよびスペルミジンを導く３ＨＰＴＧＣ経路の構成部分に沿う酵素（複数可）の遺伝子改変（複数可）によるような酵素活性の変更は、３−ＨＰに対する耐性を増加させるために価値があるとみなされる（例えば上記３ＨＰＴＧＣのその他の変更と組み合わせて）。
補充の結果の評価は、培養培地への直接補充の有用性の証明、および本明細書のいくつかの実施例において示すような遺伝子改変経路により３−ＨＰ耐性を改善することの証明を提供することが認識される。３ＨＰＴＧＣの酵素変換工程の生成物の濃度を、例えば遺伝子改変により、補充および／または遺伝子改変（複数可）のいずれによるかにかかわらず増加することは、微生物および／またはそのような微生物が培養される培地における１つ以上の３ＨＰＴＧＣ生成物の細胞内濃度を増加させるために効果的であり得ることが認識される。
まとめると、適合度データならびに３ＨＰＴＧＣに属する遺伝子改変物および／または補充物質に関連付けられる実施例からその後得られたデータは、上記３ＨＰＴＧＣの経路に沿って酵素変換を増加させるためのこのような変更と、微生物細胞もしくは培養系における３−ＨＰ耐性の得られる機能的な増加との間の機能的関係の概念を支持する。このことは、全体としておよびその規定された群の中および群の間で上記３ＨＰＴＧＣについて観察可能である。
さらに、このセクションに組み込まれている表４７、４８、５０、５２、５３および５６は、非限定的な実施例である、補充物質添加、遺伝子改変、および補充物質添加と遺伝子改変との組み合わせを提供する。追加の補充、遺伝子改変およびそれらの組み合わせは、これらの実施例および対象の微生物において３−ＨＰに対する耐性の増加を達成することに向けられた遺伝子改変を同定する記載された方法を考慮して行ってよい。具体的な組み合わせは、そこにある５つの群（それぞれ補充物質添加および／または遺伝子改変を包含する）の２つ以上、３つ以上または４つ以上を包含する組み合わせを含む上記３ＨＰＴＧＣ下部区分のみを包含することができ、様々な実施形態におけるこれらのいずれも、上記３ＨＰＴＧＣ上部区分に関係する１つ以上の遺伝子改変または補充物質添加を含む。本実施例における主題は、既に存在していない限りはこの区分（ｓｅｃｔｉｏｎ）に組み込まれる。
これらの結果に基づいて、方法または構成物にかかわらず本発明の様々な実施形態では、遺伝子改変および／または上記３ＨＰＴＧＣの反応物の補充の結果として、上記３ＨＰＴＧＣに向かう変更（複数可）は、少なくとも１つの上記３ＨＰＴＧＣ遺伝子改変を欠く対照微生物の３−ＨＰ耐性より少なくとも５パーセント、少なくとも１０パーセント、少なくとも２０パーセント、少なくとも３０パーセントまたは少なくとも５０パーセント上回って３−ＨＰ耐性を増加させるために効果的であることが認識される。
その実施例により認められるように、本発明の遺伝子改変微生物のいずれも、例えば３−ＨＰの生成のために培養系に提供して利用してよい。いくつかの実施形態では、１つ以上の補充物質（これらは、上記３ＨＰＴＧＣ酵素変換工程の生成物である）を培養系に提供して、このような培養系における全体的な３−ＨＰ耐性をさらに増加させる。
微生物または培養系のいずれかの３−ＨＰに対する耐性の増加は、それらに限定されないが、本明細書で記載するものを含む、当業者に公知の任意の方法またはアプローチにより評価してよい。
上記３ＨＰＴＧＣ上部部分の遺伝子改変は、酵素変換工程のいずれも包含できる。１つの非限定的な例は、トリカルボン酸回路に関する。この回路の第１工程を触媒する酵素クエン酸合成酵素（Ｅ．Ｃ．２．３．３．１（以前の４．１．３．７））の存在および活性が、回路全体の速度を制御する（すなわち律速物質である）ことが公知である。よって、コピー数および／もしくは比活性ならびに／またはその他の関連する特徴を増加させる（例えばフィードバック阻害物質もしくはその他の制御分子の影響を低くする）ような微生物の遺伝子改変は、シトラーゼ（ｃｉｔｒａｓｅ）合成酵素の改変を含んでよい。クエン酸合成酵素についてのこのような変化を有効にするための方法は、上記３ＨＰＴＧＣのその他の酵素変換工程について本明細書で記載するアプローチを含む当該技術において公知であるような任意の数の実験室技術を利用してよい。さらに、いくつかの一般的に公知の技術は、米国特許第６，１１０，７１４号および同第７，２４７，４５９号（ともにＡｊｉｎｏｍｏｔｏ Ｃｏ．，Ｉｎｃ．に譲渡されている）（これらはともに、クエン酸合成酵素活性を増幅させることに関するそれらのそれぞれの教示が参照により本明細書に組み込まれている（特に、米国特許第６，１１０，７１４号の第３欄（ｃｏｌ．３）および第４欄ならびに実施例３および４と、米国特許第７，２４７，４５９号の第１１欄および第１２欄（特に実施例（１）および（２））））に記載されている。
様々な実施形態では、上記３ＨＰＴＧＣにおける酵素変換を増加させ、よって３−ＨＰに対する微生物の耐性を増加させることに関する、選択された遺伝子欠失を含むＥ．ｃｏｌｉ株が提供される。例えば、上記示される３ＨＰＴＧＣの群における経路の抑制を伴う以下の遺伝子を欠失させてよい：群Ａ−ｔｙｒＲ、ｔｒｐＲ；群Ｂ−ｍｅｔＪ；群Ｃ−ｐｕｒＲ；群Ｄ−ｌｙｓＲ；群Ｅ−ｎｒｄＲ。これらはＥ．ｃｏｌｉについてであり、この種およびその他の種において等価なリプレッサー遺伝子を同定して遺伝子改変することは、当業者に公知であり、当業者が決定できる。
核酸配列によって機能的酵素を正常にコードすることが、微生物細胞における機能的酵素の生成が低減または消失するように変更されている、遺伝子機能の破壊も有効にしてよい。破壊は、広く遺伝子欠失を含んでよく、それらに限定されないが、遺伝子改変（例えば停止コドンの導入、フレームシフト変異、その遺伝子の構成部分の導入または除去、分解シグナルの導入）、ｍＲＮＡ転写レベルおよび／または安定性への影響、ならびにポリペプチドをコードする遺伝子の上流のプロモーターまたはリプレッサーの変更も含む。いくつかの実施形態では、遺伝子破壊は、上記ＤＮＡ、そのＤＮＡによりコードされるｍＲＮＡおよび上記微生物細胞におけるコードされる遺伝子の酵素機能の少なくとも５０パーセントの低減をもたらすアミノ酸配列への任意の遺伝子改変を意味すると理解される。
さらに、本発明の完全な範囲および様々な実施形態について、上記の議論および実施例は、例示的であり限定しないことを意味することが認識される。遺伝子操作は、例えばフィードバック阻害ならびにＤＮＡ転写制御機構およびＲＮＡ翻訳制御機構の変更を含む制御の他の一面の低減、ｍＲＮＡ安定性の改善、ならびに改善の効果的なレベルを達成するために効果的なコピー数およびプロモーターを有するプラスミドの使用により、全体的な酵素機能の所望の変更を達成するために行ってよい。このような遺伝子改変は、上記３ＨＰＴＧＣ内の特定の基本的な経路を通してより高い流動速度を達成するために選びかつ／または選択してよく、よって、基本的および／または主要な様式で全般的な細胞代謝に影響し得る。よって、ある特定の代替において、遺伝子改変は、上記３ＨＰＴＧＣの他の構成部分に対してより選択的に行われる。
さらに、かかわりあう工程の場所および特性、フィードバック阻害ならびにその他の因子および拘束の分析に基づいて、様々な実施形態では、少なくとも１つの遺伝子改変を行って、３ＨＰＴＧＣの以下の酵素の１つについての全体的な酵素変換を増加させる：２−デヒドロ−３−デオキシホスホヘプトン酸アルドラーゼ（例えばａｒｏＦ、ａｒｏＧ、ａｒｏＨ）；シアナーゼ（例えばｃｙｎＳ）；カルボニックアンヒドラーゼ（例えばｃｙｎＴ）；システイン合成酵素Ｂ（例えばｃｙｓＭ）；トレオニンデアミナーゼ（例えばｉｌｖＡ）；オルニチンデカルボキシラーゼ（例えばｓｐｅＣ、ｓｐｅＦ）；アデノシルメチオニンデカルボキシラーゼ（例えばｓｐｅＤ）；およびスペルミジン合成酵素（例えばｓｐｅＥ）。遺伝子改変は、これらの酵素をコードする核酸配列のコピー数を増加させることと、フィードバック阻害、調節因子による制御が低減または消失した、基質に対する親和性が増加した、およびその他の改変を有する改変核酸配列を提供することとを含み得る。つまり、本発明の一態様は、これらの酵素の１つ以上を、３−ＨＰ耐性が増加するように流量（ｆｌｕｘ）を増加させ、かつ／または別の方法で上記３ＨＰＴＧＣを通しての反応のフローを改変するように１つ以上の３ＨＰＴＧＣ酵素変換工程での酵素変換を増加させる様式で遺伝子改変することである。ａｒｏＨおよびシアナーゼ（カルボニックアンヒドラーゼとともに）のそれぞれに関する遺伝子改変に属する実施例に加えて、以下の実施例が提供される。Ｅ．ｃｏｌｉにおいて、第２のカルボニックアンヒドラーゼの酵素が公知であることが注目される。これは、Ｃａｎおよびｙａｄｆのように様々に同定される。
本発明の様々な実施形態が、任意の１つ以上の指定された酵素変換工程、生成物添加および／または特定の酵素を除く、上記３ＨＰＴＧＣの遺伝子改変（本明細書で記載するように微生物において提供され得るように）および／またはその補充物質を含んでよいことも認識される。例えば、本発明の実施形態は、微生物における上記３ＨＰＴＧＣの遺伝子改変を含み得るが、群Ａもしくは群ＡとＢのもの、または上記３ＨＰＴＧＣの規定される１つ以上のメンバーのもの（これは上記３ＨＰＴＧＣメンバーのいずれのサブセットでもあり得る）を除く。
例えば、限定されることなく、改変３ＨＰＴＧＣは、アルギニンデカルボキシラーゼ（ａｄｉＡ、これは、リッチ培地中で低ｐＨにて嫌気条件下で過剰の基質の存在下で誘導されることが公知である）の分解性の形態以外の本明細書で描かれるような上記３ＨＰＴＧＣの全てのメンバー、またはこのような分解性アルギニンデカルボキシラーゼおよびその他の選択された酵素工程を除くその他のサブセットを含み得る。その他の改変３ＨＰＴＧＣ複合体も、様々な実施形態で実施してよい。ａｄｉＡの知られている誘導に基づいて、アルギニンデカルボキシラーゼの分解性の形態の使用は、好気条件下で実施されるような３−ＨＰ耐性の改善のための上記３ＨＰＴＧＣの範囲内であるとみなされない。
さらに、本発明の様々な非限定的態様は、それらに限定されないが、以下のものを含み得る：
３−ＨＰ耐性関連経路または３−ＨＰ生合成経路のいずれかの酵素のいずれかと少なくとも８５％のアミノ酸配列同一性を有するポリペプチドをコードする核酸配列を含む遺伝子改変（組換え）微生物であって、上記ポリペプチドが、各３−ＨＰ耐性関連経路酵素または３−ＨＰ生合成経路酵素の酵素反応を行うために効果的な酵素活性および特異性を有し、上記組換え微生物が、このような核酸配列を欠く適当な対照微生物よりも大きい３−ＨＰ耐性および／または３−ＨＰバイオ生産を示す微生物。
３−ＨＰ耐性関連経路または３−ＨＰ生合成経路のいずれかの酵素のいずれかと少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有するポリペプチドをコードする核酸配列を含む遺伝子改変（組換え）微生物であって、上記ポリペプチドが、各３−ＨＰ耐性関連経路酵素または３−ＨＰ生合成経路酵素の酵素反応を行うために効果的な酵素活性および特異性を有し、上記組換え微生物が、このような核酸配列を欠く適当な対照微生物よりも大きい３−ＨＰ耐性および／または３−ＨＰバイオ生産を示す微生物。
３−ＨＰ耐性関連経路または３−ＨＰ生合成経路のいずれかの酵素のいずれかと少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有するポリペプチドをコードする核酸配列を含む遺伝子改変（組換え）微生物であって、上記ポリペプチドが、各３−ＨＰ耐性関連経路酵素または３−ＨＰ生合成経路酵素の酵素反応を行うために効果的な酵素活性および特異性を有し、上記組換え微生物が、このような核酸配列を欠く適当な対照微生物よりも大きい３−ＨＰ耐性および／または３−ＨＰバイオ生産を示す微生物。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのポリペプチドは、３−ＨＰＴＧＣ経路および／または３−ＨＰ生合成経路の酵素の少なくとも１つと少なくとも９９％または１００％の配列同一性を有する。
本発明の一態様では、先行する段落における同一性の値は、ＦＡＳＴＤＢソフトウェアプログラムについて上に記載したパラメータ、またはデフォルトパラメータを用いるバージョン２．２．２などのＢＬＡＳＴＰもしくはＢＬＡＳＴＮを用いて決定する。さらに、本明細書で具体的に述べる全ての配列について、それらの保存的改変バリアントは、本発明に含まれることを意図することが理解される。本開示に従って、様々な実施形態では、本発明は、３−ＨＰ耐性関連経路、または経路の構成部分（すなわち上記３ＨＰＴＧＣのもの）、または本明細書で開示するその他の酵素（例えば３−ＨＰ生成経路のもの）のいずれかの酵素のいずれかの同定された酵素機能性バリアントであるポリペプチドをコードする異種核酸配列を含む遺伝子改変（例えば組換え）微生物であって、上記ポリペプチドが、各３−ＨＰ耐性関連酵素またはその他の酵素の酵素反応を行うために効果的な酵素活性および特異性を有し、上記組換え微生物が、このような核酸配列を欠く適当な対照微生物よりも大きい３−ＨＰ耐性またはその他の機能を示す微生物を企図する。本発明の関連する方法も、同定された酵素機能性バリアントおよびそれらをコードする核酸配列を目的とすることを意図する。実施形態は、その他の機能性バリアントも含み得る。
いくつかの実施形態では、本発明は、３−ヒドロキシプロピオン酸（「３−ＨＰ」）生成を増加させるために効果的な少なくとも１つの遺伝子改変であって、３−ＨＰ生成の増加したレベルが、野生型微生物における３−ＨＰ生成のレベルより大きい遺伝子改変と、３−ＨＰ寛容原性複合体（「３ＨＰＴＧＣ」）の少なくとも１つの遺伝子改変とを含む組換え微生物を企図する。いくつかの実施形態では、上記野生型微生物は、３−ＨＰを生成する。いくつかの実施形態では、上記野生型微生物は、３−ＨＰを生成しない。いくつかの実施形態では、上記組換え微生物は、少なくとも１つのプラスミドなどの少なくとも１つのベクターを含み、上記少なくとも１つのベクターは、少なくとも１つの異種核酸分子を含む。
本発明のいくつかの実施形態では、上記３ＨＰＴＧＣの上記少なくとも１つの遺伝子改変は、対照微生物の３−ＨＰ耐性を上回って上記組換え微生物の３−ＨＰ耐性を増加させるのに効果的であり、上記対照微生物は、上記少なくとも１つの３ＨＰＴＧＣ遺伝子改変を欠く。いくつかの実施形態では、上記組換え微生物の３−ＨＰ耐性は、対照微生物の３−ＨＰ耐性を上回って約５％、１０％または２０％増加する。いくつかの実施形態では、上記組換え微生物の３−ＨＰ耐性は、対照微生物の３−ＨＰ耐性を上回って約３０％、４０％、５０％、６０％、８０％または１００％増加する。
また、様々な実施形態では、上記３ＨＰＴＧＣの上記少なくとも１つの遺伝子改変は、上記３ＨＰＴＧＣの少なくとも１つの酵素の少なくとも１つの酵素変換を示す少なくとも１つのポリペプチドをコードし、上記組換え微生物は、上記３ＨＰＴＧＣの少なくとも１つの遺伝子改変を欠く対照微生物の３−ＨＰ耐性よりも少なくとも約５、１０、２０、３０、４０、５０、６０もしくは１００パーセント以上大きい３−ＨＰ耐性の増加を示す。このような耐性改善についての任意の評価は、最少培地における最小阻止濃度評価に基づいてよい。
いくつかの実施形態では、上記微生物は、上記３ＨＰＴＧＣの第１群の遺伝子改変とは異なる第２群の少なくとも１つの酵素の少なくとも１つの酵素変換を示す少なくとも１つのポリペプチドをコードする少なくとも１つの追加の遺伝子改変をさらに含み、上記組換え微生物は、上記３ＨＰＴＧＣの上記遺伝子改変の全てを欠く対照微生物の３−ＨＰ耐性よりも少なくとも約５、１０、２０、３０、４０、５０、６０もしくは１００パーセント以上大きい３−ＨＰ耐性の増加を示す。様々な実施形態では、上記少なくとも１つの追加の遺伝子改変は、上記群Ａ〜Ｆの２つ以上または３つ以上のそれぞれからの遺伝子改変をさらに含む。
例えば、上記遺伝子改変は、群Ａの少なくとも１つの遺伝子改変と群Ｂの少なくとも１つの遺伝子改変、群Ａの少なくとも１つの遺伝子改変と群Ｃの少なくとも１つの遺伝子改変、群Ａの少なくとも１つの遺伝子改変と群Ｄの少なくとも１つの遺伝子改変、群Ａの少なくとも１つの遺伝子改変と群Ｅの少なくとも１つの遺伝子改変、群Ｂの少なくとも１つの遺伝子改変と群Ｃの少なくとも１つの遺伝子改変、群Ｂの少なくとも１つの遺伝子改変と群Ｄの少なくとも１つの遺伝子改変、群Ｂの少なくとも１つの遺伝子改変と群Ｅの少なくとも１つの遺伝子改変、群Ｃの少なくとも１つの遺伝子改変と群Ｄの少なくとも１つの遺伝子改変、群Ｃの少なくとも１つの遺伝子改変と群Ｅの少なくとも１つの遺伝子改変、または群Ｄの少なくとも１つの遺伝子改変と群Ｅの少なくとも１つの遺伝子改変を含み得る。任意のこのような組み合わせは、群Ｆ遺伝子改変とともにさらに実施してよい。
いくつかの実施形態では、上記組換え微生物は、ｔｙｒＲ、ｔｒｐＲ、ｍｅｔＪ、ａｒｇＲ、ｐｕｒＲ、ｌｙｓＲおよびｎｒｄＲから選択される３ＨＰＴＧＣリプレッサー遺伝子の１つ以上の遺伝子破壊を含む。
いくつかの実施形態では、上記３ＨＰＴＧＣの上記少なくとも１つの遺伝子改変は、配列番号１２９（Ｉｒｏｋペプチド）の発現を増加させることを意味する。いくつかの実施形態では、上記組換え微生物は、Ｅ．ｃｏｌｉ株である。いくつかの実施形態では、上記組換え微生物は、Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ ｎｅｃａｔｏｒ株である。
いくつかの実施形態では、上記少なくとも１つの遺伝子改変は、３−ＨＰＴＧＣ経路、３−ＨＰ生合成経路および／または配列番号１２９（Ｉｒｏｋ）の酵素の少なくとも１つと少なくとも８５％のアミノ酸配列同一性を有する少なくとも１つのポリペプチドをコードする。
本発明のいくつかの実施形態は、培養系を企図する。いくつかの実施形態では、上記培養系は、本明細書で記載するような遺伝子改変微生物と培養培地とを含む。このような遺伝子改変微生物は、上記３ＨＰＴＧＣの単一の遺伝子改変または本明細書で記載する組み合わせのいずれかを含んでよく、３−ＨＰ生成経路の１つ以上の遺伝子改変を追加で含んでよい。いくつかの実施形態では、上記培養培地は、少なくとも約１ｇ／Ｌ、少なくとも約５ｇ／Ｌ、少なくとも約１０ｇ／Ｌ、少なくとも約１５ｇ／Ｌまたは少なくとも約２０ｇ／Ｌの３−ＨＰを含む。いくつかの実施形態では、上記培養培地は、本明細書で示される濃度など各濃度で３ＨＰＴＧＣ補充物質を含む。
いくつかの実施形態では、本発明は、遺伝子改変微生物を作製する方法であって、上記３−ヒドロキシプロピオン酸寛容原性複合体（「３ＨＰＴＧＣ」）の酵素変換工程において、対照微生物（上記少なくとも１つの遺伝子改変を欠く）の酵素変換より以上に上記遺伝子改変微生物（３−ＨＰを合成する）の酵素変換を増加させるための少なくとも１つの遺伝子改変を提供する工程を含む方法を企図する。いくつかの実施形態では、対照微生物は、３−ＨＰを合成する。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの遺伝子改変は、上記対照微生物の３−ＨＰ耐性を上回って上記遺伝子改変微生物の３−ＨＰ耐性を増加させる。
いくつかの実施形態では、上記遺伝子改変微生物の３−ＨＰ耐性は、上記対照微生物の３−ＨＰ耐性より少なくとも約５パーセント、少なくとも約１０パーセント、少なくとも約２０パーセント、少なくとも約３０パーセント、少なくとも約４０パーセント、少なくとも約５０パーセント、または少なくとも約１００パーセント上回る。いくつかの実施形態では、上記遺伝子改変微生物の３−ＨＰ耐性は、最少培地における最小阻止濃度評価に基づいて、上記対照微生物の３−ＨＰ耐性より約５０〜約３００パーセント上である。いくつかの実施形態では、遺伝子改変微生物は、ｔｙｒＲ、ｔｒｐＲ、ｍｅｔＪ、ａｒｇＲ、ｐｕｒＲ、ｌｙｓＲおよびｎｒｄＲから選択される３ＨＰＴＧＣリプレッサー遺伝子の１つ以上の遺伝子破壊をさらに含む。いくつかの実施形態では、上記対照微生物は、３−ＨＰを合成しない。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの遺伝子改変を提供する工程は、少なくとも１つのベクターを提供する工程を含む。いくつかの実施形態では、上記少なくとも１つのベクターは、少なくとも１つのプラスミドを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの遺伝子改変を提供する工程は、少なくとも１つの核酸分子を提供する工程を含む。いくつかの実施形態では、上記少なくとも１つの核酸分子は、異種である。いくつかの実施形態では、上記少なくとも１つの核酸分子は、配列番号１２９（Ｉｒｏｋ）をコードする。
いくつかの実施形態では、遺伝子改変は、表３におけるおよび／または本実施例で評価される適合度スコアが上昇したと同定された酵素変換工程にて酵素変換を増加させるように行われる。このような反応を触媒する酵素は多数あり、シアナーゼおよびカルボニックアンヒドラーゼを含む。
本発明の様々な実施形態は、任意の種についての上記３ＨＰＴＧＣの酵素変換工程を触媒する酵素のアミノ酸配列を対象とし得ることも認められる。より具体的には、図９Ａ〜Ｄについての３ＨＰＴＧＣのアミノ酸配列は、一般的に用いられる生物情報データベースの１つ以上（例えば＜＜ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｇｏｖ＞＞；＜＜ｗｗｗ．ｍｅｔａｃｙｃ．ｏｒｇ＞＞）から、その中の酵素変換工程についての各遺伝子を入力することにより容易に得ることができる。
ＩＸ．遺伝子改変の組み合わせ
米国仮特許出願第６１／２４６，１４１号（参照により組み込まれ、これに対する優先権を主張する）に記載されるように、遺伝子改変の様々な組み合わせを、本発明の様々な実施形態で実行してよい。これらは、以下の段落ならびに表６Ａ、６Ｂおよび７に記載され、特に、その初めの段落は、上記組み合わせで用い得るマロニル（ｍａｌｏｎｌｙｌ）−ＣｏＡ還元酵素（ｒｅｄｕｃｔａｃｅ）の様々な形態に関するものであることに留意する。
本発明の様々な実施形態は、本明細書で提供するマロニル−ＣｏＡ還元酵素の機能的等価物を発現するポリヌクレオチドを導入することによることを含む、マロニル−ＣｏＡ還元酵素の酵素活性を導入または増加させるための少なくとも１つの遺伝子改変を含む遺伝子改変微生物を含む。マロニル−ＣｏＡ還元酵素の酵素活性の機能的等価物は、マロニル−ＣｏＡからマロネートセミアルデヒドへの変換、マロネートセミアルデヒドから３−ＨＰへの変換、またはその両方のための酵素活性を増加できる。
いくつかの実施形態では、上記マロニル−ＣｏＡ還元酵素のアミノ酸配列は、配列番号７８３を含む。他の実施形態では、上記マロニル−ＣｏＡ還元酵素は、マロニル−ＣｏＡ還元酵素の酵素活性を示す配列番号７８３〜７９１のいずれかのバリアントを含む。
上記マロニル−ＣｏＡ還元酵素のアミノ酸配列は、配列番号７８３〜７９１のいずれか１つと少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる。
いくつかの実施形態では、少なくとも１つの遺伝子改変は、配列番号７８３〜７９１のいずれかの１つ、または配列番号７８３〜７９１のいずれかの機能的構成部分を含むアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを提供することを含む。様々な実施形態では、少なくとも１つの遺伝子改変は、配列番号７８３〜７９１のいずれかと少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを提供することを含む。
例示的な実施形態では、上記ポリヌクレオチドは、選択された微生物種についてコドンが最適化されて、配列番号７８３〜７９１のいずれか１つをコードする。様々な実施形態では、上記ポリヌクレオチドは、コドンが最適化されて、配列番号７８３〜７９１のいずれか１つと少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードする。上記ポリヌクレオチドは、例えばＥ．ｃｏｌｉについてコドンを最適化できる。
いくつかの実施形態では、マロニル−ＣｏＡ還元酵素遺伝子改変（複数可）をそのようにして持つ遺伝子改変微生物は、その遺伝子改変微生物において、表６Ａのタンパク質機能（グルコース輸送体機能（例えばｇａｌＰによる）、ピルビン酸脱水素酵素Ｅ１ｐ、ジヒドロリポアミドアセチルトランスフェラーゼおよびピルビン酸脱水素酵素Ｅ３）から選択されるタンパク質機能を増やすための少なくとも１つの遺伝子改変を追加で含む。ある特定の実施形態では、上記遺伝子改変微生物は、表６Ａのタンパク質機能から選択される２つ、３つまたは４つのタンパク質機能を増やすための少なくとも１つの遺伝子改変を含む。
いくつかの実施形態では、このような遺伝子改変微生物は、表６Ｂのタンパク質機能、乳酸脱水素酵素、ピルビン酸ギ酸リアーゼ、ピルビン酸酸化酵素、リン酸アセチルトランスフェラーゼ、（ＰＴＳの）ヒスチジルリン酸化可能タンパク質、（ＰＴＳの）ホスホリル転位タンパク質、および（ＰＴＳの）ポリペプチド鎖から選択されるタンパク質機能を減少させるための少なくとも１つの遺伝子改変を追加で含む。
様々な実施形態では、このような遺伝子改変微生物は、表６Ｂのタンパク質機能から選択される２つ、３つ、４つ、５つ、６つまたは７つのタンパク質機能の酵素活性を減少させるための少なくとも１つの遺伝子改変を含む。また、様々な実施形態では、少なくとも１つまたは１より多い遺伝子改変を行って、表７のタンパク質機能を、その中のコメントに従って改変する。
様々な実施形態では、表６Ａの１つ以上のタンパク質機能の増加と、表６Ａの１つ以上のタンパク質機能の低減との多くの可能な組み合わせが、少なくとも１つの遺伝子改変を含む上記遺伝子改変微生物において存在して、マロニル−ＣｏＡ還元酵素タンパク質機能（例えば酵素活性）を提供または増加できることが認められる。タンパク質機能は、独立して変化させることができ、本明細書の表６Ａ、６Ｂおよび７におけるタンパク質機能の遺伝子改変の任意の組み合わせ（すなわち全ての要因の（ｆｕｌｌ ｆａｃｔｏｒｉａｌ））が、教示し提供する方法により、上記遺伝子改変微生物内で調整できる。
いくつかの実施形態では、酵素活性を減少させるための少なくとも１つの遺伝子改変は、遺伝子破壊である。いくつかの実施形態では、酵素活性を減少させるための少なくとも１つの遺伝子改変は、遺伝子欠失である。
様々な実施形態では、所望の生成物として３−ヒドロキシプロピオン酸（３−ＨＰ）を得るために、上記遺伝子改変微生物は、マロネートセミアルデヒドを３−ＨＰへ変換するための効果的なタンパク質機能を含む。マロネートセミアルデヒドを３−ＨＰへ変換するための効果的なタンパク質機能は、上記微生物に本来備わっているものであり得るが、このことは必要ではない。
いくつかの実施形態では、マロネートセミアルデヒドを３−ＨＰへ変換するための効果的なタンパク質機能は、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａｓからのｍｍｓＢの天然形態もしくは変異形態またはその機能的等価物である。代わりにまたは追加で、このタンパク質機能は、ｙｄｆＧの天然形態もしくは変異形態またはその機能的等価物であり得る。
本発明のある特定の実施形態は、補因子ＮＡＤＰＨの利用可能性を増加させる遺伝子改変をさらに含み、これは、所望され得る場合、ＮＡＤＰＨ／ＮＡＤＰ＋比を増加できる。このような遺伝子改変の非限定的な例は、過剰発現されたｐｇｉ（変異形態でのＥ．Ｃ．５．３．１．９）、ｐｎｔＡＢ（Ｅ．Ｃ．１．６．１．２）、ｇａｐＡ（Ｅ．Ｃ．１．２．１．１２）：ｇａｐＮ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓからのＥ．Ｃ．１．２．１．９）置換／置き換え、およびｓｔｈＡ（Ｅ．Ｃ．１．６．１．２）などの可溶性トランスヒドロゲナーゼを破壊または改変すること、ならびに／またはｚｗｆ（Ｅ．Ｃ．１．１．１．４９）、ｇｎｄ（Ｅ．Ｃ．１．１．１．４４）およびｅｄｄ（Ｅ．Ｃ．４．２．１．１２）の１つ以上の遺伝子改変である。これらの遺伝子の配列は、ｗｗｗ．ｍｅｔａｃｙｃ．ｏｒｇ．で入手可能である。また、表６Ａ、６Ｂおよび７に示すＥ．ｃｏｌｉ遺伝子名についての遺伝子およびコードされるタンパク質についての配列は、米国仮特許出願第６１／２４６，１４１号（その全体がおよびそのような配列について本明細書に組み込まれている）に示され、ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｇｏｖおよびｗｗｗ．ｍｅｔａｃｙｃ．ｏｒｇまたはｗｗｗ．ｅｃｏｃｙｃ．ｏｒｇでも入手可能である。
いくつかの実施形態では、上記遺伝子改変は、３−ＨＰの微生物合成を、３−ＨＰを生成するための上記少なくとも１つの遺伝子改変を欠く対照微生物の速度または力価を上回って増加させる。いくつかの実施形態では、上記遺伝子改変は、３−ＨＰへの酵素変換を、上記遺伝子改変を欠く対照微生物の酵素変換の少なくとも約５パーセント、少なくとも約１０パーセント、少なくとも約２０パーセント、少なくとも約３０パーセントまたは少なくとも約５０パーセント上回って効果的に増加させる。
表６Ａ
表６Ｂ
表７
表７の教示に基づいて酵素機能を減少させること（ｄｅｓｃｒａｓｉｎｇ）に関してさらに、以下の酵素機能のいずれか１つまたは組み合わせを、具体的な実施形態において、本明細書で記載する他の遺伝子改変と組み合わせて減少してよい：β−ケトアシル−ＡＣＰ合成酵素Ｉ、３−オキソアシル−ＡＣＰ−合成酵素Ｉ；マロニル−ＣｏＡ−ＡＣＰトランスアシラーゼ；エノイルアシルキャリアタンパク質還元酵素；およびβ−ケトアシル−アシルキャリアタンパク質合成酵素ＩＩＩ。
よって、上記の様々なセクションに記載されるように、本発明のいくつかの構成物、方法および系は、３−ＨＰなどの選択された化学生成物への生成経路と、低減された活性を示す脂肪酸合成酵素系の酵素をコードする改変ポリヌクレオチドとの両方を含んで、マロニル−ＣｏＡの利用を、このような改変を欠く比較可能な（対照）微生物と比較して上記生成経路に向けてシフトする遺伝子改変微生物を提供することを含む。上記方法は、栄養培地が提供された容器内でこのような遺伝子改変微生物の集団を用いて化学生成物を生成する工程を含む。アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼおよび／またはＮＡＤＰＨ依存性トランスヒドロゲナーゼなどの他の酵素に対する本明細書で記載する他の遺伝子改変は、いくつかのこのような実施形態に存在し得る。これらの酵素活性を示すポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの追加のコピーを提供することにより、３−ＨＰ生成を増加させることが示されている。これらの各酵素活性を増加させるための他の手段は、当該技術において公知であり、本発明の様々な実施形態に用いてよい。Ｅ．ｃｏｌｉのこれらのポリヌクレオチドおよびポリペプチドについての配列番号は、アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼ（ａｃｃＡＢＣＤ、配列番号７７１〜７７８）；およびＮＡＤＰＨ依存性トランスヒドロゲナーゼ（配列番号７７９〜７８２）（Ｅ．ｃｏｌｉにおいてピリジンヌクレオチドトランスヒドロゲナーゼ、ｐｎｔＡＢとも呼ばれる）である。
また、限定されることなく、化学生成物を作製するいくつかの多段階方法（ｍｕｌｔｉ−ｐｈａｓｅ ｍｅｔｈｏｄ）の実施形態における第１工程は、培養容器またはバイオリアクタ容器などの容器内に、当業者に公知の最少培地などの栄養培地と、細菌などのこのような微生物の集団、より具体的にはＥ．ｃｏｌｉなどの科であるＥｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅのメンバーを提供するように遺伝子改変微生物の接種材料とを提供することにより例示でき、ここで、上記遺伝子改変微生物は、マロニル−ＣｏＡ分子を３−ＨＰ分子へ変換する代謝経路を含む。例えば、遺伝子改変は、酵素マロニル−ＣｏＡ還元酵素をその二機能性形態の１つでコードする遺伝子をコードするか、または単機能性マロニル−ＣｏＡ還元酵素とＮＡＤＨ依存性もしくはＮＡＤＰＨ依存性３−ヒドロキシプロピオン酸脱水素酵素（例えばＥ．ｃｏｌｉからのｙｄｆＧもしくはｍｍｓＢまたはＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａからのｍｍｓＢ）とをコードする遺伝子をコードする少なくとも１つの核酸配列を提供することを含み得る。いずれの場合でも、Ｅ．ｃｏｌｉ宿主細胞に提供する場合、これらの遺伝子改変は、マロニル−ＣｏＡを３−ＨＰへ変換する代謝経路を完了する。この接種材料は、細胞密度が、上記方法の次の工程を考慮する全体的な生産性の計量を満たす３−ＨＰの生産レベルに到達するのに適する細胞密度まで増加するように容器内で培養される。様々な代替の実施形態において、これらの遺伝子改変微生物の集団は、第１の準備容器（ｐｒｅｐａｒａｔｏｒｙ ｖｅｓｓｅｌ）において第１細胞密度まで培養され、次いで、選択された細胞密度を提供するように、上記記載の容器（ｔｈｅ ｎｏｔｅｄ ｖｅｓｓｅｌ）に移すことができる。多数の多容器培養ストラテジーが、当業者に公知である。このようないずれの実施形態も、上記方法の第１の記載される工程に従って選択された細胞密度を提供する。
また、限定されることなく、その後の工程は、２つのアプローチにより例示でき、これらも様々な実施形態で組み合わせて実施できる。第１のアプローチは、そのエノイル−ＡＣＰ還元酵素の酵素活性が制御され得るように上記遺伝子改変微生物に遺伝子改変を提供する。一例として、遺伝子改変は、天然のエノイル−ＡＣＰ還元酵素に代えて温度感受性変異体エノイル−ＡＣＰ還元酵素（例えばＥ．ｃｏｌｉにおけるｆａｂＩＴＳ）へ置換するように行ってよい。後者は、３０℃より上の温度にて酵素活性の低減を示すが、３０℃にて通常の酵素活性を示し得るので、培養温度を例えば３４℃、３５℃、３６℃、３７℃または４２℃にまで上昇させることにより、エノイル−ＡＣＰ還元酵素の酵素活性が低減する。このような場合、３０℃におけるよりも多くのマロニル−ＣｏＡが３−ＨＰまたは別の化学生成物に変換され、ここでは、マロニル−ＣｏＡから脂肪酸への変換は、より効果が低いエノイル−ＡＣＰ還元酵素によって妨害されない。
第２のアプローチについて、エノイル−ＡＣＰ還元酵素または上記脂肪酸合成酵素の別の酵素の阻害剤を加えて、マロニル−ＣｏＡから脂肪酸への変換を低減する。例えば、阻害剤セルレニンを、上記脂肪酸合成酵素系の１つ以上の酵素を阻害する濃度で加える。図２Ａは、関連する経路を示し、３つの阻害剤チオラクトマイシン、トリクロサンおよびセルレニンを、それらが阻害する酵素の隣に示す。丸で囲むＥ．ｃｏｌｉ遺伝子名は、温度感受性変異体が、その遺伝子によりコードされるポリペプチドについて入手可能であることを示す。図２Ｂは、より全般的に図２Ａに描いた脂肪酸合成酵素系の代表的な酵素変換および例示的なＥ．ｃｏｌｉ遺伝子のより詳細な図を示す。微生物の脂肪酸合成酵素の酵素の阻害剤のこの列挙は、限定することを意味しない。他の阻害剤（これらのいくつかは抗生物質として用いられる）は、当該技術において公知であり、それらに限定されないが、チエノジアザボリンなどのジアザボリン類およびイソニアジドを含む。
本発明の３−ＨＰ耐性の態様は、３−ＨＰを作製する任意の微生物で用いることができる（その微生物が天然に３−ＨＰを作製するかまたは任意の方法により遺伝子改変されて３−ＨＰを生成するかにかかわらず）。
工業的なバイオ生産における３−ＨＰの力価の上昇をもたらし得る本発明の３−ＨＰの生成の増加の態様について、上記遺伝子改変は、１つ以上の核酸配列を微生物に導入することを含み、ここで、上記１つ以上の核酸配列は、１つ以上の生成経路の酵素（または生成経路の酵素の酵素活性）をコードし、かつそれを発現する。様々な実施形態では、これらの改善を、それによって組み合わせて、３−ＨＰの工業的バイオ生産の生成の効率および効力を増加させ、その結果としてそれについてのコストを低くする。
いくつかの３−ＨＰ生成経路のいずれか１つ以上は、３−ＨＰ耐性を改善することを対象とする遺伝子改変との組み合わせにおけるなど、微生物において用いることができる。様々な実施形態では、遺伝子改変を行って、このような３−ＨＰ生成経路の１つ以上の実行のための酵素活性を提供する。いくつかの３−ＨＰ生成経路が当該技術において公知である。例えば、米国特許第６，８５２，５１７号は、炭素源としてのグリセロールからの３−ＨＰ生成経路を教示し、この経路のその教示が参照により組み込まれている。この参考文献は、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅからのｄｈａＢ遺伝子と、アルデヒド脱水素酵素の遺伝子とを発現する遺伝子構築物を提供することを教示する。これらは、グリセロールからの３−ＨＰの生成を触媒できると述べられている。しかし、いくつかの実施形態では、３−ＨＰのバイオ生産のための炭素源は、上記炭素源の主要な構成部分としてグリセロールを除外することが認識される。
ＷＯ２００２／０４２４１８は、いくつかの３−ＨＰ生成経路を教示する。このＰＣＴ公報には、そのような経路のその教示が参照により組み込まれている。また、グルコースからピルベート、ピルベートからアセチル−ＣｏＡ、アセチル−ＣｏＡからマロニル−ＣｏＡ、マロニル−ＣｏＡから３−ＨＰまでの３−ＨＰ生成経路をまとめたこの公報の図４４は、本明細書で示す。グルコースからホスホエノールピルベート（ＰＥＰ）、ホスホエノールピルベートからオキサロアセテート（直接またはピルベートを介して）、オキサロアセテートからアスパルテート、アスパルテートからβ−アラニン、β−アラニンからマロネートセミアルデヒド、マロネートセミアルデヒドから３−ＨＰまでの３−ＨＰ生成経路をまとめたこの公報の図５５は、本明細書で示す。様々な変換の代表的な酵素も、これらの図に示される。
２００８年８月２１日に公開され、本明細書に参照により組み込まれている米国特許出願公開第２００８／０１９９９２６号からの図１３は、本明細書で記載する３−ＨＰ生成経路およびその他の公知の天然の経路についてまとめている。天然で多くを見出すことができないことがある特定の代謝経路を発展させることに関してより全般的に、Ｈａｔｚｉｍａｎｉｋａｔｉｓらは、このことを「Ｅｘｐｌｏｒｉｎｇ ｔｈｅ ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ ｃｏｍｐｌｅｘ ｍｅｔａｂｏｌｉｃ ｎｅｔｗｏｒｋｓ」、Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ２１巻（８号）：１６０３〜１６０９頁（２００５年）で論じている。この論文には、代謝ネットワークの複雑さのその教示が参照により組み込まれている。
上記図にまとめた３−ＨＰ生成経路についてさらに、ＳｔｒａｕｓｓおよびＦｕｃｈｓ（「Ｅｎｚｙｍｅｓ ｏｆ ａ ｎｏｖｅｌ ａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃ ＣＯ２ ｆｉｘａｔｉｏｎ ｐａｔｈｗａｙ ｉｎ ｔｈｅ ｐｈｏｔｏｔｒｏｐｈｉｃ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ Ｃｈｌｏｒｏｆｌｅｘｕｓ ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ， ｔｈｅ ３−ｈｙｄｒｏｘｙｐｒｏｐｒｉｏｎａｔｅ ｃｙｃｌｅ」、Ｅｕｒ． Ｊ． Ｂｉｃｈｅｍ． ２１５巻、６３３〜６４３頁（１９９３年））は、３−ＨＰを生成する天然の細菌経路を同定した。当時、本著者らは、マロニル−ＣｏＡからマロネートセミアルデヒドへの変換は、ＮＡＤＰ依存性アシル化マロネートセミアルデヒド脱水素酵素によるものであり、マロネートセミアルデヒドから３−ＨＰへの変換は、３−ヒドロキシプロピオン酸脱水素酵素により触媒されると述べた。しかし、それ以来、少なくともＣｈｌｏｒｏｆｌｅｘｕｓ ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓについて、単一の酵素が両方の工程を触媒し得ることが認められるようになった（Ｍ． Ｈｕｇｌｅｒら、「Ｍａｌｏｎｙｌ−Ｃｏｅｎｚｙｍｅ Ａ Ｒｅｄｕｃｔａｓｅ ｆｒｏｍ Ｃｈｌｏｒｏｆｌｅｘｕｓ ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ， ａ
Ｋｅｙ Ｅｎｚｙｍｅ ｏｆ ｔｈｅ ３−Ｈｙｄｒｏｘｙｐｒｏｐｉｏｎａｔｅ Ｃｙｃｌｅ ｆｏｒ Ａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃ ＣＯ２ Ｆｉｘａｔｉｏｎ」、Ｊ． Ｂａｃｔｅｒ、１８４巻（９号）：２４０４〜２４１０頁（２００２年））。
よって、本発明の様々な実施形態の１つの生成経路は、マロニル−ＣｏＡからマロネートセミアルデヒド、マロネートセミアルデヒドから３−ＨＰへの変換を達成するマロニル−ＣｏＡ還元酵素の酵素活性を含む。本明細書の実施例で示すように、この酵素（または酵素活性）をもたらすポリペプチドをコードする核酸配列を微生物に導入することは、３−ＨＰ生合成の増加をもたらすために効果的である。
別の３−ＨＰ生成経路は、図１４Ｂ（図１４Ａは天然の混合発酵経路を示す）に示され、この段落および次の段落で説明する。これは、他の３−ＨＰ生成経路とともにまたは独立して用い得る３−ＨＰ生成経路である。組換え微生物においてこの生合成経路を確立するためのある可能性のある１つの手段は、オキサロ酢酸アルファ−デカルボキシラーゼ（ｏａｄ−２）酵素（またはそのような活性を有する各酵素もしくは関連する酵素）をコードする１つ以上の核酸配列を微生物に導入して発現させることである。限定することを意味しない本実施例に例示するように、酵素進化技術を、構造的に同様の基質について所望の触媒の役割を有する酵素に用いて、進化した（例えば変異した）酵素（およびそれをコードする対応する核酸配列（複数可））を得て、これが、微生物において所望の速度および特異性にて所望の触媒反応を示す。
つまり、本発明の様々な実施形態について、上記３ＨＰＴＣＧのいずれかの経路および上記３−ＨＰバイオ生産経路のいずれかに対する遺伝子操作は、各経路のいずれかで同定される酵素または酵素の酵素活性の調節と、よってその酵素または酵素の酵素活性の最終の活性を変化させることを対象とするものを含む、様々な遺伝子操作を含むと記載できる。そのような遺伝子改変は、選択されたおよび／または同定された培養条件下での酵素活性および／または選択性の変化をもたらす転写改変、翻訳改変および翻訳後改変を対象とすることができる。つまり、様々な実施形態では、より効率的に機能するために、微生物は、１つ以上の遺伝子欠失を含んでよい。例えば、Ｅ．ｃｏｌｉにおける具体的な実施形態について図１４Ｂにまとめるように、乳酸脱水素酵素（ｌｄｈＡ）、リン酸アセチルトランスフェラーゼ（ｐｔａ）、ピルビン酸酸化酵素（ｐｏｘＢ）およびピルビン酸−ギ酸リアーゼ（ｐｆｌＢ）をコードする遺伝子を欠失させてよい。このような遺伝子欠失は、具体的な実施形態について図１４Ｂの下にまとめる（これは、限定することを意味しない）。さらに、多機能性２−ケト−３−デオキシグルコン酸６−リン酸アルドラーゼおよび２−ケト−４−ヒドロキシグルタル酸アルドラーゼおよびオキサロ酢酸デカルボキシラーゼ（Ｅ．ｃｏｌｉにおいてｅｄａ）の酵素活性を低減するためのさらなる欠失またはその他の改変を様々な株に対して提供してよい。さらに後者について、多機能性２−ケト−３−デオキシグルコン酸６−リン酸アルドラーゼおよび２−ケト−４−ヒドロキシグルタル酸アルドラーゼおよびオキサロ酢酸デカルボキシラーゼ（Ｅ．ｃｏｌｉにおいてｅｄａ）の酵素活性のこのような低減と組み合わせた様々な実施形態では、さらなる遺伝子改変を行って、グルコース輸送体（例えばＥ．ｃｏｌｉにおいてｇａｌＰ）を増加させ、かつ／または（ＰＴＳの）熱安定性ヒスチジルリン酸化可能タンパク質（Ｅ．ｃｏｌｉにおいてｐｔｓＨ（ＨＰｒ））、（ＰＴＳの）ホスホリル転位タンパク質（Ｅ．ｃｏｌｉにおいてｐｔｓＩ）およびＰＴＳのポリペプチド鎖（Ｅ．ｃｏｌｉにおいてＣｒｒ）の１つ以上の活性を低減してよい。
遺伝子欠失は、変異遺伝子欠失アプローチ、および／またはこれらの酵素の１つ以上が低減されたかまたはそれを発現しない変異体株から開始すること、および／または当業者に公知のその他の方法により達成してよい。
本発明の態様は、選択された炭素源を３−ＨＰなどの化学生成物へ変換することについての全体的な微生物の効率を改善するための複数の遺伝子改変を提供することにも関係する。比生産性、容積生産性、力価および収率を、遺伝子改変のより基本的な組み合わせにわたって実質的に増加させるための、本実施例におけるような具体的な組み合わせが示される。
さらに図９の遺伝子改変について、適当な追加の遺伝子改変は、生成の計量のさらなる改善をもたらし得る。例えば、遺伝子改変株を図８に示す。この株は、３−ＨＰ生成（例えば上の第ＶＩＩセクションに記載したような）、３−ＨＰ耐性（以下に記載するような）および本明細書で開示するような追加の遺伝子改変（上記脂肪酸合成酵素系に関係する特定の遺伝子改変、限定されないが、第ＶＩセクションにおけるものを含む本明細書の他の場所でより一般的に開示するこのような改変を含む）についての遺伝子改変を含む。この図では、酵素機能は、示される酵素変換および／またはこのような酵素機能を有するタンパク質をコードする代表的なＥ．ｃｏｌｉ遺伝子識別子（ｍｃｒが非Ｅ．ｃｏｌｉマロニル−ＣｏＡ還元酵素を示すこと以外は）により示され、欠失は、各遺伝子識別子の前に標準の「Δ」で示し、増加した酵素活性は、下線で示す（改変についての追加の標的は、図の埋め込まれた表に示す通りであることに留意する）。括弧内の遺伝子は、これもまた各経路工程に沿って示す別の遺伝子によりコードされる酵素に代えての可能性のある置換物またはその酵素の補充物質である。また、ｆａｂＩＴＳの使用は、天然の非温度感受性遺伝子の置換を表す。これは、限定することを意味しない。他の場所に記載するように、脂肪酸アシル−ＡＣＰへの流量を制御して制限するためのいくつかのアプローチが存在する。
図８の実施形態は、いくつかの遺伝子改変の組み合わせを示すが、本発明の様々な実施形態では、これらの酵素機能の遺伝子改変の他の組み合わせを提供して、化学生成物のバイオ生産についての速度、力価および収率の増加の所望のレベルを達成してよい。
追加の遺伝子改変を、本発明の微生物株に提供してよい。多くのこのような改変は、特定の表現型を与えるために提供してよい。
一例として、多機能性２−ケト−３−デオキシグルコン酸６−リン酸アルドラーゼおよび２−ケト−４−ヒドロキシグルタル酸アルドラーゼおよびオキサロ酢酸デカルボキシラーゼ（Ｅ．ｃｏｌｉにおいてｅｄａ）の欠失は、様々な株で提供してよい。
例えば、スクロースを利用する能力を提供してよく、このことは、３−ＨＰまたはその他の化学生成物を生成するために利用できる供給材料の範囲を広げる。本明細書で記載する株などのＥ．ｃｏｌｉの一般的な実験室株および工業株は、単独炭素源としてスクロースを利用できない。スクロースおよび糖蜜などのスクロース含有供給材料は豊富にあり、微生物発酵による生成のための供給材料として頻繁に用いられるので、スクロースの取り込みおよび使用を可能にする適当な遺伝子改変を、本明細書で提供するようなその他の特徴を有する株において付加してよい。様々なスクロース取り込みおよび代謝系が、当該技術において公知である（例えば米国特許第６，９６０，４５５号）（そのような教示が参照により組み込まれている）。これらおよびその他のアプローチは、本発明の株に提供してよい。その実施例は、少なくとも２つのアプローチを提供する。
また、セルロースバイオマスもしくはその生成物などのより複雑な炭素源の分解について、そのような炭素源の取り込みおよび／または利用についての機能性を付加するための遺伝子改変を提供してよい。例えば、多数のセルラーゼおよびセルラーゼベースのセルロース分解系が研究され、特徴決定されている（例えばＢｅｇｕｉｎ， ＰおよびＡｕｂｅｒｔ， Ｊ−Ｐ（１９９４年）ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ． Ｒｅｖ．１３巻：２５〜５８頁；Ｏｈｉｍａ， Ｋ．ら（１９９７年）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． Ｇｅｎｅｔ．
Ｅｎｇ． Ｒｅｖ． １４巻：３６５４１４頁を参照されたい（そのような教示について本明細書に参照することにより組み込まれている））。
上記の遺伝子改変に加えて、様々な実施形態では、補因子ＮＡＤＰＨのプールおよび利用可能性ならびに／またはその結果としてＮＡＤＰＨ／ＮＡＤＰ＋比を増加させるための遺伝子改変も提供する。例えば、Ｅ．ｃｏｌｉについての様々な実施形態では、このことは、１つ以上の以下の遺伝子の活性を例えば遺伝子改変により増加することにより行ってよい：過剰発現されたｐｇｉ（変異形態で）、ｐｎｔＡＢ、ｇａｐＡ：ｇａｐＮ置換／置き換え、およびｓｔｈＡなどの可溶性トランスヒドロゲナーゼを破壊もしくは改変すること、ならびに／またはｚｗｆ、ｇｎｄおよびｅｄｄの１つ以上の遺伝子改変。
任意のこのような遺伝子改変は、このような機能性を有さない種または所望のレベル未満のこのような機能性を有する種に提供してよい。
より全般的に、そして遺伝子改変のために選択した微生物の特定の代謝経路に依存して、任意のサブ群の遺伝子改変を行って、アセテート、アセトイン、アセトン、アクリル酸、マレート、脂肪酸エチルエステル、イソプレノイド、グリセロール、エチレングリコール、エチレン、プロピレン、ブチレン、イソブチレン、エチルアセテート、ビニルアセテート、その他のアセテート、１，４−ブタンジオール、２，３−ブタンジオール、ブタノール、イソブタノール、ｓｅｃ−ブタノール、ブチレート、イソブチレート、２−ＯＨ−イソブチレート（ｉｓｏｂｕｔｒｙａｔｅ）、３−ＯＨ−ブチレート、エタノール、イソプロパノール、Ｄ−ラクテート、Ｌ−ラクテート、ピルベート、イタコネート、レブリネート、グルカレート、グルタレート、カプロラクタム、アジピン酸、プロパノール、イソプロパノール、フーゼルアルコールおよび１，２−プロパンジオール、１，３−プロパンジオール、フォルメート、フマル酸、プロピオン酸、コハク酸、吉草酸ならびにマレイン酸からなる群から選択される発酵生成物（複数可）の細胞による生成を低減させてよい。遺伝子欠失は、本明細書に全般的に開示されるようにして行ってよく、その他のアプローチを用いて、選択された発酵生成物の細胞による生成の所望の減少を達成してよい。
Ｘ．化学生成物３−ＨＰの分離および精製
３−ＨＰが化学生成物である場合、その３−ＨＰは、分離および精製の多くの方法が当技術分野で公知であり、以下の開示は、限定的なものではないことを考慮に入れて、以下の段落に記載のアプローチによって分離し、精製することができる。浸透圧ショック、超音波処理、均質化、および／または凍結融解サイクルを繰り返した後の濾過および／または遠心分離、その他の方法の間では、ｐＨの調整および熱処理などを使用して、インタクトな細胞から無細胞抽出物を生成することができる。これらの方法の任意の１つ以上を使用して、抽出工程として３−ＨＰを細胞から遊離させることもできる。
さらに、３−ＨＰを含むバイオ生産ブロスの一般的な処理に関しては、様々な方法を実施してバイオマスを取り出すこと、および／または培養ブロスおよびその成分から３−ＨＰを分離することができる。３−ＨＰを分離および／または濃縮する方法としては、様々な形態の、遠心分離、濾過、抽出、エステル化などの化学変換、蒸留（いくつかの反応−蒸留条件下でアクリル酸への脱水などの化学変換をもたらすことができる）、結晶化、クロマトグラフィー、およびイオン交換が挙げられる。さらに、必要に応じて、超音波処理、均質化、ｐＨの調整または加熱などによって細胞破裂を行って、３−ＨＰを細胞集団から遊離させることができる。３−ＨＰは、遠心分離、例えば溶媒抽出、反応抽出、水性二相抽出および溶媒二相抽出などの抽出を含めた液液分離、膜分離技術、蒸留、蒸発、イオン交換クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィーおよび結晶化の１つ以上の任意の組み合わせを含めた当技術分野で公知の方法によってさらに分離および／または精製することができる。上記の方法はいずれも、例えば、バイオ生産イベントから徐々に、または定期的に取り出すことができるようなバイオ生産ブロス（すなわち、好気条件下、嫌気条件下、または微好気条件下のいずれでも行なわれる、発酵ブロス）の構成部分に、またはバイオ生産イベントが終了したブロスに適用することができる。３−ＨＰの、本明細書に記載されるものなどの下流の生成物への変換は、分離および精製の後に、または、例えば、必要に応じて同様に一部において分離手段としての蒸留、薄膜蒸発、またはワイプフィルム（ｗｉｐｅｄ−ｆｉｌｍ）蒸発を用いて進行させることができる。
種々のこれらのアプローチのために、向流戦略、または逐次的なもしくは反復的な戦略、例えば多重パス抽出（ｍｕｌｔｉ−ｐａｓｓ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ）などを適用することができる。例えば、３−ＨＰを含む所与の水溶液を、アミンを含む非極性相を用いて繰り返し抽出して、複数反応抽出を実現することができる。
培養イベント（発酵イベント）が完了段階にある場合、消費されたブロスは、分離タンクに移送され得るか、または培養容器内に残すことができ、いずれの場合においても、上記微生物を死滅させるために、最低でも１時間の間、温度を少なくとも６０℃まで上昇させることができる。（あるいは、上記微生物を死滅させるための他のアプローチを実施することができる。）消費されたブロスとは、最初の栄養培地、上記微生物の接種から増殖した細胞（およびおそらく、上記接種物の元々の細胞をいくらか含む）、３−ＨＰ、および必要に応じて、上記最初の栄養培地を提供した後になされた液体の添加、例えば追加の炭素の供給源などを提供するための定期的な添加を含む最終の液体容積を意味する。上記消費されたブロスは、３−ＨＰ以外の有機酸、例えば、酢酸および／または乳酸などを含んでよいことに留意する。
次いで、遠心分離工程を実施して、そのバイオマスの固形物（例えば、微生物細胞）を濾過して取り除くことができる。これは、連続式遠心分離機またはバッチ式遠心分離機において実現することができ、固体の除去は、単一のパスで、または２回以上の一連の遠心分離後の累積で、少なくとも約８０％、８５％、９０％、または９５％であってよい。
任意選択の工程は、その遠心分離された液体を、微細濾過もしくは限外濾過などの濾過器を通して仕上げをすることになるか、または、その工程は珪藻土などの濾過助剤を加えるフィルタープレスもしくは他の濾過デバイスを含んでよい。これに対する、および上記遠心分離に対する代替的または補足的なアプローチは、上記細胞を綿状に固め、静置し、液体を抜き取る、または他の方法で除去する、綿状物によって細胞を除去することを含んでよい。綿状物（ｆｌｏｃｃｕｌｅｎｔ）を発酵ブロスに加えることができ、その後、しばらくの間材料を静置し、次いで、これに限定されないが、遠心分離を含めた分離を適用することができる。
そのような工程の後、さらなる処理のために、３−ＨＰを含み、固体を実質的に含まない消費されたブロスを得る。「固体を実質的に含まない」とは、その固体の９８％超、９９％超、または９９．５％超が除去されたことを意味する。
種々の実施形態では、この消費されたブロスは、Ｎａ、Ｃｌ、ＳＯ４、およびＰＯ４などの種々の塩のイオンを含む。一部の実施形態では、これらのイオンを、この消費されたブロスをイオン交換カラムに通すこと、または他の方法で、上記消費されたブロスを適切なイオン交換材料に接触させることによって除去することができる。本文書の本箇所および他の箇所において、「接触させること」は、明言された目的のために、当業者に公知の任意のやり方で、例えば、カラム中などで、関連する技術分野の当業者の十分にその能力の範囲内で決定される適切な条件下で接触させることを意味すると解釈される。一例として、これらは、陰イオン交換材料および陽イオン交換材料に逐次的に（任意の順序で）接触させるか、または混合した陰イオン／陽イオン材料に接触させることを含んでよい。この鉱物質除去工程では、上記３−ＨＰを除去することなく、そのような無機のイオンの大部分が除去されるべきである。これは、例えば、そのｐＨを低下させて３−ＨＰおよび類似した有機酸を十分にプロトン化させ、それにより、これらの酸は陰イオン交換材料に結合しないが、一方、そのようなｐＨにおいて荷電したままのＣｌおよびＳＯ４などの陰イオンを樹脂に結合させて溶液から除去することによって実現することができる。同様に、正に荷電したイオンを、陽イオン交換材料と接触させることによって除去する。そのようなイオンの除去は、溶液の伝導率の減少によって評価することができる。そのようなイオン交換材料は、当業者に公知の方法によって再生させることができる。
一部の実施形態では、上記消費されたブロス（例えば、先行する鉱物質除去工程後のものである必要はない）を、ｐＨ上昇に供し、その後、それをイオン交換カラムに通して、または他の方法で、このｐＨでイオンである有機酸が会合する、アミンなどのアニオン性基を含むイオン交換樹脂と接触させる。このｐＨ（６．５超、７．５超、８．５超、９．５超、１０．５超、またはそれよりも高いｐＨであってよい）でアミンとそのように会合しない他の有機物を、この段階で、例えば、ｐＨの高いすすぎ液で洗い流すことによって有機酸から分離することができる。その後、それよりも低いｐＨおよび／または塩含有量の高いすすぎ液で溶出することにより、上記有機酸を取り出すことができる。ｐＨが漸減勾配であり、かつ／または塩含有量が漸増勾配のすすぎ液で溶出することにより、３−ＨＰを他の有機酸からより明確に分離し、その後、さらなる処理を単純化することが可能になり得る。
有機酸を陰イオン交換樹脂に保持するこの後半の工程は、上記鉱物質除去工程の前に実施しても後に実施してもよい。しかし、以下の２つのアプローチが上記陰イオン交換樹脂工程の代替になる。
第１の代替のアプローチは、ここで、および以下の段落において例証されているように反応抽出（液液抽出の形態）を含む。上記鉱物質除去工程の前、または後の段階に存在してよい上記消費されたブロスを、ある量のＡｌａｍｉｎｅ３３６（登録商標）（Ｃｏｇｎｉｓ Ｃｏｒｐ．、Ｃｉｎｃｉｎｎａｔｉ、ＯＨ ＵＳＡ）などの第３級アミンと、低ｐＨで組み合わせる。Ａｌａｍｉｎｅ３３６または他の第３級アミンのための共溶媒を加えることができ、それらとしては、これらに限定されないが、アミンと組み合わせると分配係数を増加させる、ベンゼン、四塩化炭素、クロロホルム、シクロヘキサン、ジイソブチルケトン、エタノール、＃２燃料油、イソプロパノール、灯油、ｎ−ブタノール、イソブタノール、オクタノール、およびｎ−デカノールが挙げられる。相の分離が起こる期間、適切に混合した後、上記Ａｌａｍｉｎｅ３３６または他の第３級アミンと会合した３−ＨＰを含む非極性相を水相から分離する。
上記３−ＨＰ／第３級アミンよりも低い沸点を有する共溶媒を使用する場合、蒸留工程を使用してその共溶媒を除去し、それによって３−ＨＰ−第３級アミン複合体を非極性相中に残すことができる。
そのような蒸留工程があろうとなかろうと、取り去るまたは回収する工程を使用して、上記３−ＨＰを上記第３級アミンから分離することができる。無機塩、例えば、硫酸アンモニウム、塩化ナトリウム、もしくは炭酸ナトリウムなど、または塩基、例えば水酸化ナトリウムもしくは水酸化アンモニウムなどを上記３−ＨＰ／第３級アミンに加えてアミンプロトン化反応を逆転させ、水溶液（上記無機塩をもたらすためのビヒクルであってよい）を加えることによって第２の相をもたらす。適切に混合した後、結果として２つの相が生じ、これにより、第３級アミンを再生し、再使用すること、および水溶液中に上記３−ＨＰをもたらすことが可能になる。あるいは、上記アミンから上記３−ＨＰを回収するために塩または塩基を用いず熱水を使用することもできる。
上記のアプローチでは、相を分離すること、および３−ＨＰを水相に抽出することが、上記３−ＨＰを濃縮するために役立ち得る。それぞれの有機酸をクロマトグラフィーによって分離することも、そのような酸、例えば３−ＨＰなどを濃縮するために役立ち得ることに留意する。他の適切な同様のアプローチでは、第１級アミン、第２級アミンおよび第４級アミンを含んでよい非極性アミンを、第３級アミンの代わりに、および／または第３級アミンと組み合わせて使用することができる。
第２の代替のアプローチは、結晶化である。例えば、上記消費されたブロス（バイオマスの固形物を含まないものなど）を水酸化アンモニウムなどの強塩基と接触させ得、それにより３−ＨＰのアンモニウム塩の形成をもたらす。これを濃縮することができ、次いでアンモニウム−３−ＨＰ結晶を形成し、それを例えば濾過によって、水相から分離することができる。回収したら、アンモニウム−３−ＨＰ結晶を、硫酸などの酸を用いて処理することができ、したがって硫酸アンモニウムが再生され、したがって、３−ＨＰおよび硫酸アンモニウムが生じる。
また、種々の水性二相抽出法を利用して、発酵ブロスまたは後で得られた溶液から所望の化学生成物を分離および／または濃縮することができる。ポリマー、例えばデキストランおよびグリコールポリマー、例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）およびポリプロピレングリコール（ＰＰＧ）を水溶液に添加することにより、２つの水相の形成をもたらすことができることが公知である。そのような系では、所望の化学生成物を、１つの相に隔離し、細胞および他の化学物質を他の相に分配し、したがって有機溶媒を使用せずに分離することができる。このアプローチは、いくつかの化学生成物について実証されているが、化学生成物をポリマー溶液から回収することに付随する難題および低い選択性が認識されている（抽出物を回収する方法に関するその教示の全てが参照により組み込まれる「Ｅｘｔｒａｃｔｉｖｅ Ｒｅｃｏｖｅｒｙ ｏｆ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ ｆｒｏｍ Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ Ｂｒｏｔｈｓ」Ｊｏｏｎｇ Ｋｙｕｎ Ｋｉｍら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓ Ｅｎｇ．、１９９９年（４巻）１〜１１頁を参照されたい）。
種々の置換ならびに上記の工程およびプロセスの組み合わせを行って、比較的精製された３−ＨＰ溶液を得ることができる。また、２００３年３月１８日に発行され、そのような方法の開示に関して参照により本明細書に組み込まれている、米国特許第６，５３４，６７９号に開示されている分離および精製の方法を、特定の処理スキームに基づいて考察することができる。また、いくつかの培養イベントでは、上に開示されているアプローチの任意の組み合わせによるものを含め、液体容積の構成部分を定期的に取り出し、そのような構成部分（複数可）の処理を行って上記３−ＨＰを回収することができる。
言及した通り、溶媒抽出が別の代替である。これは、アルコール、エステル、ケトン、および種々の有機溶媒を含めたいくつもの溶媒および／または溶媒の組み合わせのいずれをも使用することができる。限定することなく、相を分離した後、蒸留工程または二次抽出を用いて、３−ＨＰを有機相から分離することができる。
以下の公開されたリソースは、これらの関連性のある技術分野における技術のレベルを示すために、および必要に応じて、３−ＨＰの産業上のバイオ生産、および同様に本発明の組換え微生物のいずれかを用いてそのような変換を実現するために使用することができる産業上のシステムをどのように行い、使用するかの方法を教示している開示を支持するために、それらのそれぞれの教示に関して参照により本明細書に組み込まれている（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌｓ、第２版、Ｊ． Ｅ． ＢａｉｌｅｙおよびＤ． Ｆ． Ｏｌｌｉｓ、ＭｃＧｒａｗ Ｈｉｌｌ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９８６年、示されている目的に関して書籍全体、および特に生物反応器の設計に関して、第９章、５３３〜６５７頁；Ｕｎｉｔ Ｏｐｅｒａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、第５版、Ｗ． Ｌ． ＭｃＣａｂｅら、ＭｃＧｒａｗ Ｈｉｌｌ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９９３年、示されている目的、および特にプロセスおよび分離技術の分析に関して書籍全体；Ｅｑｕｉｌｉｂｒｉｕｍ Ｓｔａｇｅｄ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ、Ｐ． Ｃ． Ｗａｎｋａｔ、Ｐｒｅｎｔｉｃｅ Ｈａｌｌ、Ｅｎｇｌｅｗｏｏｄ Ｃｌｉｆｆｓ、ＮＪ ＵＳＡ、１９８８年、分離技術の教示に関して書籍全体）。
ＸＩ．３−ＨＰのアクリル酸および下流の生成物への変換
本明細書で考察した通り、本明細書に記載の種々の実施形態は、特定の化学生成物、３−ヒドロキシプロピオン酸（３−ＨＰ）の生成に関する。この有機酸、３−ＨＰは、産業上の用途を有する種々の他の生成物、例えば、これらに限定されないが、アクリル酸、アクリル酸のエステル、および、「下流の生成物」と称される３−ＨＰから得られる他の化学物質に変換することができる。いくつかのアプローチの下で、上記３−ＨＰは、アクリル酸、アクリルアミド、および／または他の下流の化学生成物に変換することができ、ある場合には、その変換は分離工程および／または精製工程を伴う。そのような下流の生成物への多くの変換が本明細書に記載されている。本発明の方法は、３−ＨＰの下流の生成物を生成するための工程を含む。
３−ＨＰは、Ｃ３構成単位として、商業的に重要な中間体、産業上の最終製品、および消費者向け製品への種々の化学変換における大きな潜在性をもたらす。例えば、３−ＨＰは、アクリル酸、アクリレート（例えば、アクリル酸塩およびアクリル酸エステル）、１，３−プロパンジオール、マロン酸、エチル−３−ヒドロキシプロピオネート、エチルエトキシプロピオネート、プロピオラクトン、アクリルアミド、またはアクリロニトリルに変換することができる。
例えば、アクリル酸メチルは、３−ＨＰから、脱水、およびメチル基を付加する（例えば、メタノールを使用して）エステル化によって作製することができ；アクリルアミドは、３−ＨＰから、脱水反応およびアミド化反応によって作製することができ；アクリロニトリルは脱水反応およびニトリル部分の形成によって作製することができ；プロピオラクトン（ｐｒｏｐｒｉｏｌａｃｔｏｎｅ）は、３−ＨＰから、環形成内部エステル化反応（水分子の脱離）によって作製することができ；エチル−３−ＨＰは、３−ＨＰから、エタノールを用いたエステル化によって作製することができ；マロン酸は、３−ＨＰから、酸化反応によって作製することができ；１，３−プロパンジオールは、３−ＨＰから、還元反応によって作製することができる。また、３−ＨＰを脱水することによって最初に変換されるアクリル酸は、適切な化合物を用いてエステル化して、これらに限定されないが、アクリル酸メチル、アクリル酸エチル、アクリル酸メチル、アクリル酸２−エチルヘキシル、アクリル酸ブチル、およびアクリル酸ラウリルを含めたいくつもの商業的に重要なアクリル酸ベースのエステルを形成することができる。あるいは、３ＨＰをエステル化して、３ＨＰのエステルを形成し、次いで脱水してアクリル酸エステルを形成することができる。
さらに、３−ＨＰをオリゴマー形成または重合させて、ポリ（３−ヒドロキシプロピオネート）ホモポリマーを形成することができる、または１つ以上の他の単量体と共重合させて、種々の共重合体を形成することができる。３−ＨＰは単一の立体異性体しか有さないので、３−ＨＰの重合は、鎖の成長中に単量体の立体特異性によって複雑になることがない。これは、その重合中に考慮しなければならない２つの（Ｄ、Ｌ）立体異性体を有する（Ｓ）−２−ヒドロキシプロパン酸（乳酸としても公知である）とは対照的である。
さらに記載されるように、３−ＨＰは、（ｉ）実質的に、そのプロトン化された形態である３−ヒドロキシプロピオン酸として；（ｉｉ）実質的に、その脱プロトン化された形態である３−ヒドロキシプロピオネートとして；または（ｉｉｉ）プロトン化された形態と脱プロトン化された形態の混合物として出発して、誘導体に変換することができる。一般に、塩として存在する３−ＨＰに対する酸として存在する３−ＨＰの割合は、ｐＨ、溶液中の他のイオン種の存在、温度（酸の形態および塩の形態に関係する平衡定数を変化させる）に左右され、いくらかの程度で圧力に左右される。多くの化学変換は、上記３−ＨＰのいずれの形態からも行うことができ、一般には、全体的なプロセスの経済的側面から、下流での変換のための３−ＨＰの形態が要求される。
また、分離中の変換の例として、例えば本明細書において開示されている、アミンとしてＡｌａｍｉｎｅ３３６を使用する抽出工程におけるアミン塩の形態の３−ＨＰは、上記３−ＨＰのアミン塩を含む溶液を、酸化アルミニウムなどの脱水触媒と、温度を例えば１７０から１８０℃、または１８０から１９０℃、または１９０から２００℃に上昇させて接触させ、回収した蒸気相を低温凝縮器に通すことによってアクリル酸に変換することができる。３−ＨＰの濃度、有機アミン、共溶媒（もしあれば）、温度、流速、脱水触媒、および凝縮器の温度を含めた動作条件を評価し、商業目的のために改善する。３−ＨＰのアクリル酸への変換は、単回の変換イベントにおいて少なくとも８０パーセントを超える、または少なくとも９０パーセントを超えることが予想される。上記アミンは、必要に応じて、浄化した後に再使用することができる。本明細書において提供される他の脱水触媒を評価することができる。米国特許第７，１８６，８５６号に、たとえ本明細書における教示と異なる抽出塩分解（ｅｘｙｔａｃｔｉｖｅ ｓａｌｔ−ｓｐｌｉｔｔｉｎｇ）変換の一部としてでも、この変換アプローチに関するデータが開示されていることに留意する。しかし、米国特許第７，１８６，８５６号は、抽出塩分解を含めたその方法について参照により組み込まれ、抽出塩分解については、３−ＨＰを微生物発酵ブロスから抽出することができる種々のやり方をさらに示すために参照により組み込まれる。
さらに、本明細書において提供される通り作製し、必要に応じて、変換前に選択された純度に精製する、微生物宿主細胞によって合成する化学生成物が３−ＨＰである実施形態に関して、本発明の方法は、３−ＨＰから誘導される「下流の」化合物、例えば、重合した３−ＨＰ（ポリ３−ＨＰ）、アクリル酸、ポリアクリル酸（重合したアクリル酸、様々な形態での）、アクリル酸メチル、アクリルアミド、アクリロニトリル、プロピオラクトン、３−ＨＰエチル、マロン酸、および１，３−プロパンジオールを生成するためにも使用することができる。そのような下流での変換のために、一般に酵素的アプローチ、触媒的アプローチ（触媒を使用する化学変換プロセス）、熱的アプローチ、およびそれらの組み合わせ（所望の圧力を加えて反応を加速するいくつかの場合を含む）に入る多数のアプローチを使用することができる。
言及した通り、３−ＨＰから生成することができる重要な産業上の化学生成物はアクリル酸である。化学的に、３−ＨＰの炭素−炭素単結合の１つは、炭素−炭素二重結合に変換され、水分子を排除する脱水反応を受けなければならない。３−ＨＰの脱水は、原理上は、液相または気相において行うことができる。一部の実施形態では、上記脱水は、適切な均一系触媒または不均一系触媒の存在下で起こる。酸触媒およびアルカリ触媒はどちらも適切な脱水触媒である。脱水した後、アクリル酸を含有する相を得、適切な場合には、さらなる精製工程によって、例えば、蒸留方法、抽出方法、または結晶化方法、またはそれらの組み合わせによって、精製することができる。
３−ＨＰから脱水反応によってアクリル酸を作製することは、分離方式の一部であってよく、触媒として酸および／または金属イオンを含んでよい蒸留プロセスによるものを含めたいくつもの商業的な方法論によって実現することができる。より広範に、２００７年９月２０日に公開され、現在放棄されている米国特許出願公開第２００７／０２１９３９０Ａ１号は、３−ＨＰおよび他のβ−ヒドロキシカルボニル化合物の、アクリル酸および他の関連する下流の化合物への変換についてのその教示に関して本明細書に組み込まれる。この公報には、多数の触媒が列挙され、変換の例が提供され、それは本明細書に詳細に組み込まれる。同様に、３−ＨＰを脱水してアクリル酸を生成するための種々の特定の方法の中には、米国特許第２，４６９，７０１号（Ｒｅｄｍｏｎ）に記載の古い方法もある。この参照文献では、減圧下、硫酸またはリン酸などの脱水触媒の存在下で、３−ＨＰを１３０℃から１９０℃の間の温度に加熱することによってアクリル酸を調製するための方法が教示されている。米国特許出願公開第２００５／０２２２４５８Ａ１号（Ｃｒａｃｉｕｎら）も、３−ＨＰまたはその誘導体を加熱することによってアクリル酸を調製するためのプロセスを提供する。３−ＨＰの蒸気相脱水は、シリカの充填ビーズ、アルミナ、またはチタニアなどの脱水触媒の存在下で起こる。これらの特許公報は、３−ＨＰをアクリル酸に変換することについてのそれらの方法に関して参照により組み込まれる。
脱水触媒は、１つ以上の金属酸化物、例えば、Ａｌ２Ｏ３、ＳｉＯ２、またはＴｉＯ２などを含んでよい。一部の実施形態では、上記脱水触媒は、高表面積のＡｌ２Ｏ３または高表面積のシリカであり、そのシリカは実質的にＳｉＯ２である。高表面積とは、本発明の目的に関しては、少なくとも約５０ｍ２／ｇ、７５ｍ２／ｇ、１００ｍ２／ｇ、またはそれより多い表面領域を意味する。一部の実施形態では、上記脱水触媒は、ゼオライトなどのアルミノケイ酸塩を含んでよい。
例えば、そのような組み込まれた参考文献による例証を含め、３−ＨＰは、種々の特定の方法によって脱水してアクリル酸にすることができ、その方法のそれぞれは多くの場合１つ以上の脱水触媒を必要とする。特に明白に価値のある１つの触媒は、チタンであり、例えば酸化チタンＴｉＯ（２）の形態である。二酸化チタン触媒は、３−ＨＰを含む水溶液を蒸留する脱水系において提供することができ、そこでは、３−ＨＰを、例えば揮発で脱水し、アクリル酸に変換し、そのアクリル酸を蒸気相から凝縮させることによって回収する。
１つの特定の方法として、３−ＨＰの水溶液を、周囲大気圧において１７０℃から１９０℃の間の温度に維持した酸化チタン触媒を充填した反応器のカラムに通す。反応器のカラムから出た蒸気を低温凝縮器に通し、そこでアクリル酸を回収する。上記低温凝縮器は、流速および系の設計に基づいて効率的に凝縮させるために、３０℃以下、２℃以下、または任意の適切な温度まで冷却することができる。また、上記反応器のカラムの温度は、例えば周囲大気圧よりも低い圧力で運転する場合、もっと低くてもよい。２００７年９月２０日に公開され、現在放棄されている米国特許出願公開第２００７／０２１９３９０号の実施例１は、この方法のアプローチを使用する特異的なパラメータを提供することに留意する。言及した通り、この公報は、この教示に関して、および、３−ＨＰからアクリル酸への脱水反応において使用することができる触媒についてのその一覧表に関しても、参照により組み込まれる。
さらに脱水触媒に関しては、以下の表に３−ＨＰ（またはそのエステル）からアクリル酸（またはアクリル酸エステル）への脱水反応において使用することができるいくつもの触媒が要約されている（化学的クラスを含めて）。そのような触媒のいくつかは、固体の形態、液体の形態または気体の形態のいずれでも使用することができ、個々に、または任意の組み合わせで使用することができる。この触媒の一覧表は、限定的なものではなく、列挙されていない多くの特定の触媒を特定の脱水反応のために使用することができる。さらに限定することなく、触媒の選択は、特定の変換における溶液のｐＨおよび／または３−ＨＰの形態に応じてよく、したがって、３−ＨＰが酸性の形態である場合には酸触媒（ａｃｉｄｉｃ ｃａｔａｌｙｓｔ）を使用することができ、３−ＨＰのアンモニウム塩をアクリル酸に変換する場合は塩基触媒（ｂａｓｉｃ ｃａｔａｌｙｓｔ）を使用することができる。また、いくつかの触媒は、イオン交換樹脂の形態であってよい。
表８： 脱水触媒
これらの触媒の１つを使用する別の特定の方法に関しては、濃硫酸および３−ＨＰを含む水溶液は、別々に反応器に流し込み、１００ｍｍ Ｈｇの減圧下で１５０℃から１６５℃までに維持する。その反応器からの流れは、アクリル酸を含む溶液である。参照により本明細書に組み込まれている米国特許出願公開第２００９／００７６２９７号の実施例１に開示されているこの方法の特定の実施形態では、９５パーセントを超えるアクリル酸の収率が示されている。
この種類の脱水反応の当技術分野における広範囲の可能性のある触媒および知見に基づいて、多数の他の特異的な脱水方法を商業生産について評価し、実行することができる。
３−ＨＰの脱水は、脱水触媒がなくても起こる場合がある。例えば、その反応は、ガラス、セラミック、樹脂、磁器、プラスティック、金属粉または煉瓦粉の充填物（ｐａｃｋｉｎｇ）などの名目上不活性な充填物の存在下で蒸気相において行うことができ、それでもなおアクリル酸が妥当な収率および純度で形成される。上記触媒粒子は、その化学的性質が、一部の実施形態では、物質輸送が制限される、または動力学的に制限されるような大きさにすること、およびそのように形づくることができる。上記触媒は、粉末、ペレット、顆粒、ビーズ、押出し物などの形態をとってよい。必要に応じて触媒補強体（ｃａｔａｌｙｓｔ ｓｕｐｐｏｒｔ）を使用する場合、使用する補強体は、例えば、ペレット、球体、一体型チャネルなどの任意の物理的形態を想定することができる。上記補強体は、活性な金属種と共沈澱させることができる；または、上記補強体は、触媒金属種を用いて処理し、それから、そのまま使用することができる、または上述の形状に形成することができる；または、上記補強体は、上述の形状に形成し、それから触媒種で処理することができる。
３−ＨＰを脱水するための反応器は、多種多様なやり方で設計製作され動作させることができる。上記反応器の動作は、連続式、半連続式、またはバッチであってよい。実質的に連続的であり、定常状態にある動作が、動作および経済面での見通しから有利であることが理解される。フローパターンは、実質的にプラグフロー、実質的によく混合された、またはこれらの両極端の間のフローパターンであってよい。「反応器」は、実際に連続していてよい、または種々の配置のいくつかの反応器のネットワークであってよい。
例えば、限定することなく、アクリル酸は、３−ＨＰから、分離方式の一部であってよく、触媒として酸および／または金属イオンを含んでよい蒸留プロセスによるものを含めた、いくつもの商業的な方法論によって実現することができる脱水反応によって作製することができる。より広範に、２００７年９月２０日に公開され、現在放棄されている米国特許出願公開第２００７／０２１９３９０Ａ１号は、３−ＨＰおよび他のβ−ヒドロキシカルボニル化合物の、アクリル酸および他の関連する下流の化合物への変換についてのその教示に関して本明細書に組み込まれる。この公報では、多数の触媒が列挙され、変換の例が提供され、それは本明細書に詳細に組み込まれる。
例えば、そのような組み込まれた参考文献からの例証を含め、３−ＨＰは、種々の特定の方法によって脱水してアクリル酸にすることができ、その方法のそれぞれは多くの場合１つ以上の脱水触媒を必要とする。特に明白に価値のある１つの触媒はチタンであり、例えば酸化チタンＴｉＯ２の形態である。二酸化チタン触媒は、３−ＨＰを含む水溶液を蒸留する脱水系において提供することができ、そこでは、その３−ＨＰを、例えば揮発で脱水し、アクリル酸に変換し、そのアクリル酸を蒸気相から凝縮させることによって回収する。
１つの特定の方法として、３−ＨＰの水溶液を、周囲大気圧において１７０℃から１９０℃の間の温度に維持した酸化チタン触媒を充填した反応器のカラムに通す。上記反応器のカラムから出た蒸気を低温凝縮器に通し、そこでアクリル酸を回収する。上記低温凝縮器は、流速および系の設計に基づいて効率的に凝縮させるために、３０℃以下、２０℃以下、２℃以下、または任意の適切な温度まで冷却することができる。また、上記反応器のカラムの温度は、例えば周囲大気圧よりも低い圧力で運転する場合、もっと低くてもよい。２００７年９月２０日に公開され、現在放棄されている米国特許出願公開第２００７／０２１９３９０号の実施例１は、この方法のアプローチを使用する特異的なパラメータを提供することに留意する。言及した通り、この公報は、この教示に関して、および、３−ＨＰからアクリル酸への脱水反応において使用することができる触媒についてのその一覧表に関しても、参照により組み込まれる。
３−ＨＰの脱水によって得られるアクリル酸の結晶化は、最終の分離／精製工程の１つとして使用することができる。結晶化するための種々のアプローチは、当技術分野で公知であり、そこにはエステルの結晶化を含む。
上で言及した通り、一部の実施形態では、３−ＨＰの塩を、アクリル酸またはそのエステルもしくは塩に変換する。例えば、米国特許第７，１８６，８５６号（Ｍｅｎｇら）では、３−ＨＰのアンモニウム塩からアクリル酸を作製するためのプロセスが教示されており、このプロセスは、３−ＨＰのアンモニウム塩を、有機アミンまたは水と不混和性である溶媒の存在下で加熱して二相溶液を形成し、３−ＨＰが二相溶液の水相から有機相に移行し、アンモニアおよびアンモニウムカチオンが水相に残る条件下で、上記３−ＨＰの塩をそのそれぞれのイオン性構成物に分解する第１の工程を含む。次いで、上記有機相を逆抽出して上記３−ＨＰを分離し、その後、上記３−ＨＰを含有する溶液を脱水触媒の存在下で加熱してアクリル酸を生成する第２の工程が続く。米国特許第７，１８６，８５６号は、３−ＨＰの塩からアクリル酸を生成するためのその方法に関して参照により組み込まれる。この特許に開示されている特定のアプローチの種々の代替を、適切な抽出プロセスおよび変換プロセスについて開発することができる。
アクリル酸メチルは、３−ＨＰから、脱水、およびメチル基を付加する（例えばメタノールを使用して）エステル化によって作製することができ、アクリルアミドは、３−ＨＰから、脱水反応およびアミド化反応によって作製することができ、アクリロニトリルは、脱水反応およびニトリル部分の形成によって作製することができ、プロピオラクトンは、３−ＨＰから、環形成内部エステル化反応（水分子の脱離）によって作製することができ、エチル−３−ＨＰは、３−ＨＰから、エタノールを用いたエステル化によって作製することができ、マロン酸は、３−ＨＰから、酸化反応によって作製することができ、１，３−プロパンジオールは、３−ＨＰから、還元反応によって作製することができる。
マロン酸は、本明細書において生成されるような３−ＨＰの酸化から生成することができる。米国特許第５，８１７，８７０号（Ｈａａｓら）では、Ｒｕ、Ｒｈ、Ｐｄ、Ｏｓ、ＩｒまたはＰｔから選択される貴金属による３−ＨＰの接触酸化が開示されている。これらは、純粋な金属触媒または補強触媒であってよい。上記接触酸化は、懸濁反応器において懸濁触媒を使用して、または固定層反応器において固定層触媒を使用して行うことができる。上記触媒、好ましくは補強触媒が、固定層反応器に配置されている場合、後者は、トリクルベッド手順ならびに液相手順でも動作し得る。そのトリクルベッド手順では、出発材料の３−ＨＰ、ならびにその酸化生成物を含む水相、ｐＨを調整するための手段、および酸素または酸素を含有する気体は、並流または向流で送ることができる。液相手順では、その液相およびその気相を、並流で都合よく処理する。
十分に短い反応時間を実現するために、上記変換を、６以上、好ましくは少なくとも７、特に７．５から９の間のｐＨにおいて行う。好ましい実施形態に従って、上記酸化反応の間、アルカリまたはアルカリ土類の水酸化物溶液などの塩基を加えることによって、ｐＨを一定に、好ましくは７．５から９の間の範囲のｐＨに保つ。上記酸化を、少なくとも１０℃および最大で７０℃の温度において、有効に行う。酸素の流れは制限しない。上記懸濁方法では、その液相およびその気相を、勢いよく撹拌することによって接触させることが重要である。ほぼ定量的な収率でマロン酸を得ることができる。米国特許第５，８１７，８７０号は、３−ＨＰをマロン酸に酸化するためのその方法に関して参照により本明細書に組み込まれている。
１，３−プロパンジオールは、本明細書において生成される３−ＨＰに水素添加することで生成することができる。米国特許出願公開第２００５／０２８３０２９（Ｍｅｎｇら）は、液相において、特定の触媒の存在下で、３−ＨＰ、またはその酸のエステルまたは混合物に水素添加して１，３−プロパンジオールを調製するためのその方法に関して参照により本明細書に組み込まれている。可能性のある触媒としては、補強型または非補強型の、単独のルテニウム金属、またはルテニウムの化合物、またはモリブデン、タングステン、チタン、ジルコニウム、ニオブ、バナジウムまたはクロムから選択される少なくとも１つ、または複数の追加の金属（複数可）と組み合わせたルテニウム金属、またはルテニウムの化合物が挙げられる。上記ルテニウム金属もしくはその化合物、および／または上記追加の金属（複数可）もしくはその化合物を、補強型または非補強型の形態で利用することができる。補強型形態で利用する場合、補強触媒を調製する方法は重要ではなく、その方法は、上記補強体の含浸または上記補強体への沈着などの任意の技法であってよい。任意の適切な補強体を利用することができる。使用することができる補強体としては、これらに限定されないが、アルミナ、チタニア、シリカ、ジルコニア、炭素、カーボンブラック、グラファイト、ケイ酸塩、ゼオライト、アルミノケイ酸塩 ゼオライト、アルミノケイ酸塩粘土などが挙げられ得る。
上記水素添加プロセスは、液相において行うことができる。その液相としては、水、水素添加できない有機溶媒、例えば任意の脂肪族炭化水素または芳香族炭化水素、アルコール、エーテル、トルエン、デカリン、ジオキサン、ジグリム、ｎ−ヘプタン、ヘキサン、キシレン、ベンゼン、テトラヒドロフラン、シクロヘキサン、メチルシクロヘキサンなど、ならびに水と有機溶媒（複数可）の混合物が挙げられる。上記水素添加プロセスは、バッチで、半連続式で、または連続式で行うことができる。上記水素添加プロセスは、任意の適切な装置において行うことができる。例示的なそのような装置は、撹拌槽型反応器、トリクルベッド型反応器、高圧水素添加反応器などである。
上記水素添加プロセスは、一般に約２０℃から約２５０℃までの範囲、より詳細には約１００℃から約２００℃までの範囲の温度で行う。さらに、上記水素添加プロセスは、一般に、約２０ｐｓｉから約４０００ｐｓｉまでの圧力範囲で行う。上記水素添加プロセスにおいて利用する、水素を含有する気体は、必要に応じて、商業的に純粋な水素である。水素を含有する気体は、窒素、ガス状炭化水素、または炭素の酸化物、および類似した物質が、上記水素を含有する気体中に存在する場合に使用可能である。例えば、合成ガス（水素および一酸化炭素）由来の水素を使用することができ、そのような合成ガスは、潜在的に二酸化炭素、水、および種々の不純物をさらに含む。
当技術分野で公知の通り、生物学的方法を使用して３−ＨＰを１，３−プロパンジオールに変換することも可能である。例えば、１，３−プロパンジオールは、３−ＨＰ−ＣｏＡまたは３−ＨＰのいずれかから、酵素活性を有するポリペプチドを使用することによって創製することができる。これらのポリペプチドは、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏのいずれかで使用することができる。３−ＨＰ−ＣｏＡを１，３−プロパンジオールに変換する場合、酸化還元酵素活性または還元酵素活性を有するポリペプチド（例えば、酵素の１．１．１．−クラスの酵素）を使用することができる。あるいは、１，３−プロパンジオールを３−ＨＰから創製する場合、アルデヒド（ａｌｄｙｈｙｄｅ）脱水素酵素活性を有するポリペプチド（例えば、１．１．１．３４クラスの酵素）とアルコール脱水素酵素活性を有するポリペプチド（例えば、１．１．１．３２クラスの酵素）の組み合わせを使用することができる。
別の３−ＨＰの下流の生成物であるアクリロニトリルは、アクリル酸から、これらに限定されないが、化学品製造工業において公知の生成の一段階法であるソハイオ（Ｓｏｈｉｏ）アクリロニトリルプロセスを含めた種々の有機合成によって変換することができる。
また、付加反応により、カルボニルヒドロキシル基にアルキル基またはアリール基を有するアクリル酸またはアクリレートの誘導体を得ることができる。そのような付加は、例えば、アルカリ性条件下、必要に応じて塩基触媒の存在下で、水素、ハロゲン化水素、シアン化水素、またはマイケル付加によって化学的に触媒することができる。アルコール、フェノール、硫化水素、およびチオールが塩基性条件下で付加することが公知である。芳香族アミンまたは芳香族アミド、および芳香族炭化水素を酸性条件下で付加することができる。これらおよび他の反応は、アクリル酸およびその誘導体の変換反応についてのその教示に関して参照により組み込まれるＵｌｍａｎｎ’ｓ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、Ａｃｒｙｌｉｃ Ａｃｉｄ ａｎｄ Ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ、ＷｉｌｅｙＶＣＨ Ｖｅｒｌａｇ ＧｍｂＨ、Ｗｉｅｎｈａｍ
（２００５年）に記載されている。
本発明によって作製される３−ＨＰから得られるアクリル酸は、一部の実施形態では、同様に下流の生成物であると考えられているポリマーを含めた種々の化学物質にさらに変換することができる。アクリル酸エステルは、例えば、水が遊離する、アルコールを用いたエステル化縮合反応によって、アクリル酸から（または３−ＨＰから直接）形成することができる。この化学作用は、そのエステル化の教示に関して参照により組み込まれるＭｏｎｏｍｅｒｉｃ Ａｃｒｙｌｉｃ Ｅｓｔｅｒｓ、Ｅ． Ｈ． Ｒｉｄｄｌｅ、Ｒｅｉｎｈｏｌｄ、ＮＹ（１９５４年）に記載されている。形成されるエステルの中には、アクリル酸メチル、アクリル酸エチル、アクリル酸ｎ−ブチル、アクリル酸ヒドロキシプロピル、アクリル酸ヒドロキシエチル、アクリル酸イソブチル、およびアクリル酸２−エチルヘキシルがあり、これらおよび／または他のアクリル酸および／または他のアクリル酸エステルを、他の化合物と組み合わせることを含めて、種々の公知のアクリル酸ベースのポリマーを形成することができる。アクリルアミドは、アクリロニトリルの水和による化学合成で生成されるが、本明細書の変換では、アミド化によってアクリル酸をアクリルアミドに変換することができる。
本発明によって作製される３−ＨＰから得られるアクリル酸は、一部の実施形態では、同様に下流の生成物であると考えられているポリマーを含めた種々の化学物質にさらに変換することができる。アクリル酸エステルは、例えば、水が遊離する、アルコールを用いたエステル化縮合反応によって、アクリル酸から（または３−ＨＰから直接）形成することができる。この化学作用は、そのエステル化の教示に関して参照により組み込まれるＭｏｎｏｍｅｒｉｃ Ａｃｒｙｌｉｃ Ｅｓｔｅｒｓ、Ｅ． Ｈ． Ｒｉｄｄｌｅ、Ｒｅｉｎｈｏｌｄ、ＮＹ（１９５４年）に記載されている。形成されるエステルの中には、アクリル酸メチル、アクリル酸エチル、アクリル酸ｎ−ブチル、アクリル酸ヒドロキシプロピル、アクリル酸ヒドロキシエチル、アクリル酸イソブチル、およびアクリル酸２−エチルヘキシルがあり、これらおよび／または他のアクリル酸および／または他のアクリル酸エステルを、他の化合物と組み合わせることを含めて、種々の公知のアクリル酸ベースのポリマーを形成することができる。アクリルアミドは、アクリロニトリルの水和による化学合成で生成されるが、本明細書の変換では、アミド化によってアクリル酸をアクリルアミドに変換することができる。
アクリル酸の直接的なエステル化は、当業者に公知のエステル化の方法により、３−ＨＰを脱水して得たアクリル酸を、メタノール、エタノール、１−プロパノール、２−プロパノール、ｎ−ブタノール、ｔｅｒｔ−ブタノールまたはイソブタノールなどの１つ以上のアルコールと接触させ、少なくとも５０℃、７５℃、１００℃、１２５℃、または１５０℃の温度まで加熱することによって行うことができる。エステル化の間に形成される水は、例えば、適切な分離助剤を加えることによる共沸蒸留によって、または別の分離手段によってその反応混合物から除去することができる。当技術分野で公知の通り、９５％以上に至る変換を実現することができる。
いくつかの適切なエステル化触媒は、Ｄｏｗ Ｃｈｅｍｉｃａｌ（Ｍｉｄｌａｎｄ、Ｍｉｃｈｉｇａｎ ＵＳ）などから市販されている。例えば、Ａｍｂｅｒｌｙｓｔ（商標）１３１Ｗｅｔ Ｍｏｎｏｄｉｓｐｅｒｓｅゲル触媒は、水硬性（ｈｙｄｒａｕｌｉｃ）および反応性の特性を増強し、固定層反応器に適している。Ａｍｂｅｒｌｙｓｔ（商標）３９Ｗｅｔは、特に撹拌反応器およびスラリーループ反応器に適したマクロ孔質触媒（ｍａｃｒｏｒｅｔｉｃｕｌａｒ ｃａｔａｌｙｓｔ）である。Ａｍｂｅｒｌｙｓｔ（商標）４６は、マクロ多孔性触媒であり、生成するエーテル副産物が従来の触媒よりも少ない（ＲｏｈｍおよびＨａａｓに対する米国特許第５，４２６，１９９号に記載されており、この特許は、エステル化触媒の組成および選択で考慮すべき事柄についてのその教示に関して参照により組み込まれる）。
アクリル酸、および任意のそのエステルは、種々のポリマーにさらに変換することができる。重合は、十分なエネルギーの熱、光、他の放射線のいずれか、およびアゾ化合物または過酸化物などの遊離基を生成する化合物よって進行して、アクリル酸またはアクリル酸エステルの所望のポリマーが生成し得る。一例として、アクリル酸水溶液の温度を、重合が始まることが公知の温度に上昇させ（一部において、最初のアクリル酸の濃度に基づいて）、その反応が進行し、その反応の高い発熱性を考慮すると、このプロセスは、頻繁に熱除去を必要とする。多くの他の重合の方法が当技術分野で公知である。いくつかは、重合反応についてのその教示に関して参照により組み込まれるＵｌｍａｎｎ’ｓ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、Ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅｓ ａｎｄ Ｐｏｌｙ（Ａｃｒｙｌｉｃ Ａｃｉｄｓ）、ＷｉｌｅｙＶＣＨ Ｖｅｒｌａｇ ＧｍｂＨ、Ｗｉｅｎｈａｍ（２００５年）に記載されている。
例えば、アクリル酸の遊離基重合は、当業者に公知の重合方法によって行なわれ、水溶液または別の溶媒中のエマルションまたは懸濁液で行うことができる。多くの場合、重合を補助するために開始剤、例えば、これに限定されないが、有機過酸化物を加える。開始剤として使用することができる有機過酸化物のクラスの中には、ジアシル、ペルオキシジカーボネート、モノペルオキシカーボネート、ペルオキシケタール、ペルオキシエステル、ジアルキル、およびヒドロペルオキシドがある。別のクラスの開始剤は、アゾ開始剤であり、これは、アクリレートの重合ならびに他の単量体との共重合のために使用することができる。米国特許第５，４７０，９２８号；同第５，５１０，３０７号；同第６，７０９，９１９号；および同第７，６７８，８６９号では、有機過酸化物、アゾ化合物、および他の化学種を含めたいくつもの開始剤を使用する重合のための種々のアプローチが教示されており、これらの特許は、本明細書に記載のポリマーに適用可能なそのような教示に関して参照により組み込まれる。
したがって、さらに、架橋剤などのコモノマーが重合の間に存在することが可能性である。ある特定の実施形態では、本明細書において生成される、３−ＨＰを脱水して得たアクリル酸の遊離基重合を、少なくとも部分的に中和された形態で、かつ架橋剤の存在下で実施する。この重合により、ヒドロゲルをもたらし、次にそれを、公知の技法によって細かく砕き、すりつぶし、適切な場合には、表面修飾することができる。
ポリアクリル酸の重要な商業用途は、高吸収性ポリマー用である。ここで、Ｍｏｄｅｒｎ Ｓｕｐｅｒａｂｓｏｒｂｅｎｔ Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ＢｕｃｈｈｏｌｚおよびＧｒａｈａｍ（編集者）、Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ、１９９７年が、高吸収性ポリマーの成分、製造、性質および使用に関するその教示に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれる。高吸収性ポリマーは、第一に、おむつ、成人失禁用製品、女性の衛生用品、および類似した消費者向け製品用の水および水溶液の吸収剤として使用される。そのような消費者向け製品では、布、綿、紙の詰め物、およびセルロース繊維などの伝統的な吸収材料を高吸収性材料で置き換えることができる。高吸収性ポリマーは、わずかな機械的圧力下で、液体をその高吸収性ポリマーの重量の２５倍に至るまで吸収し、保持する。膨張したゲルは、その液体を固体、ゴム状態で保持し、液体が漏出するのを防ぐ。高吸収性ポリマー粒子を表面修飾して、より高度に架橋結合した殻を持つ殻構造を生成することができる。この技法により、吸収のバランス、負荷時の吸収、およびゲルブロッキングに対する抵抗性が改善される。高吸収性ポリマーは、農業、園芸、および医薬を含めた、消費者向け製品以外の分野における用途を有することが認識される。
高吸収性ポリマーは、アクリル酸（例えば、本明細書において提供される３−ＨＰから誘導されるアクリル酸など）および架橋剤から、溶液重合または懸濁重合によって調製される。典型的な方法としては、米国特許第５，１４５，９０６号；同第５，３５０，７９９号；同第５，３４２，８９９号；同第４，８５７，６１０号；同第４，９８５，５１８号；同第４，７０８、９９７号；同第５，１８０，７９８号；同第４，６６６，９８３号；同第４，７３４，４７８号；および同第５，３３１，０５９号が挙げられ、そのそれぞれが、高吸収性ポリマーに関するそれらの教示に関して参照により組み込まれる。
消費者向け製品の中で、おむつ、女性の衛生用品、および成人失禁用製品は、それ自身が、本発明に従って作製した３−ＨＰから変換されたアクリル酸から実質的に作製される高吸収性ポリマーを用いて作製される。
おむつ、および他の個人の衛生用品は、本出願の教示によってバイオ生産される３−ＨＰから作製されるアクリル酸から作製される高吸収性ポリマーを組み入れて生成することができる。以下に、そのような高吸収性ポリマーを組み入れる、おむつを作製するための一般的な手引きを提供する。上記高吸収性ポリマーを、まず、真空形成することができる吸収パッドに調製し、それに他の材料、例えば繊維状材料（例えば、木材パルプ）などを加える。次に、その吸収パッドを、織物、一般に不織布（例えば、ナイロンプラスティック、ポリエステルプラスティック、ポリエチレンプラスティック、およびポリプロピレンプラスティックの１つ以上から作製される）のシート（複数可）を用いて組み立てて、おむつを形成する。
より詳細には、１つの非限定的なプロセスにおいて、コンベヤーベルトの上部の複数の加圧ノズルにより高吸収性ポリマー粒子（例えば、約４００ミクロンサイズまたはそれより大きな）、繊維状材料、および／またはこれらの組み合わせを、上記コンベヤーベルトの指定の空間／間隔に吹き付ける。上記コンベヤーベルトには穴が形成されていて、下からの真空下におかれていることから、吹き付けられた材料は上記ベルト表面に向かって引かれ、平らなパッドが形成される。種々の実施形態では、繊維状材料をまず上記ベルト上に付け、次に繊維状材料および上記高吸収性ポリマー粒子の混合物を付け、次に繊維状材料を付け、したがって上記高吸収性ポリマーは上記パッドの中間に濃縮される。レべリングローラをベルト進路（ｂｅｌｔ ｐａｔｈ）の端に向けて使用して厚さが均一なパッドを得ることができる。その後、各パッドを、例えばそれを上記おむつ用に適切な形状に切り取るために、さらに加工することができる、または上記パッドは、複数のおむつ用に十分な長い巻物の形態であってよい。その後、上記パッドを、例えばコンベヤーベルト上で織物の上のシートと下のシート（一方は一般に液体透過性であり、他方は液体不透過性である）の間に挟み、これらを、例えば接着剤による接着、加熱または超音波溶着によって付け合わせ、おむつのサイズにした単位に切り分ける（前にそのように切っていない場合）。人にフィットするおよび身に着け易いように、弾性要素、テープのストリップなどの追加の特徴をもたらすことができる。
上記繊維状材料とポリマー粒子の比が、性能特性に影響を及ぼすことが公知である。一部の実施形態では、この比は、７５：２５から９０：１０の間である（おむつの製造についてのその教示に関して参照により組み込まれる米国特許第４，６８５，９１５号を参照されたい）。他の使い捨ての吸収性物品を、例えば、成人の失禁、女性の衛生（生理用ナプキン）、タンポン用に、同様の様式で構築することができる（例えば、生理用ナプキンの製造についてのそれらの教示に関して参照により組み込まれる、米国特許第５，００９，６５３号、同第５，５５８，６５６号、および同第５，８２７，２５５号を参照されたい）。
低分子量のポリアクリル酸は、化粧品および医薬調製物を含めた種々の適用のための水処理、凝集剤、および増粘剤としての用途を有する。これらの適用について、上記ポリマーは、特定の適用に応じて、架橋結合していなくてよい、または軽く架橋結合していてよい。その分子量は、一般には約２００ｇ／ｍｏｌから約１，０００，０００ｇ／ｍｏｌまでである。これらの低分子量のポリアクリル酸ポリマーの調製は、米国特許第３，９０４，６８５号；同第４，３０１，２６６号；同第２，７９８，０５３号；および同第５，０９３，４７２号に記載されており、そのそれぞれが、これらのポリマーを生成する方法についてのその教示に関して参照により組み込まれる。
アクリル酸は、少し挙げると、アクリルアミド、２−アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸、Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド、メタクリル酸、およびメタクリルアミドから選択される１つ以上の他の単量体と共重合させることができる。上記単量体の相対的な反応性が、微細構造、したがって上記ポリマーの物理特性に影響を及ぼす。コモノマーを３−ＨＰから得て、または他の方法で提供して、共重合体を生成することができる。Ｕｌｍａｎｎ’ｓ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、Ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅｓ ａｎｄ Ｐｏｌｙ（Ａｃｒｙｌｉｃ Ａｃｉｄｓ）、ＷｉｌｅｙＶＣＨ Ｖｅｒｌａｇ ＧｍｂＨ、Ｗｉｅｎｈａｍ（２００５年）、は、ポリマーおよび共重合体の加工についてのその教示に関して参照により本明細書に組み込まれている。
アクリル酸は、原理上、スチレン、ブタジエン、アクリロニトリル、アクリルエステル、マレイン酸、無水マレイン酸、塩化ビニル、アクリルアミド、イタコン酸などを含めた遊離基によって重合可能な単量体のほとんど全てと共重合し得る。最終用途の適用によって、一般には、性質に影響を及ぼす共重合体の組成が規定される。アクリル酸は、いくつもの任意選択の置換も有してよく、そのような置換をした後に、重合反応、または共重合反応のための単量体として使用することができる。一般的な法則として、アクリル酸（またはその共重合単量体の１つ）は、重合プロセスに干渉しない任意の置換基、例えば、アルキル、アルコキシ、アリール、ヘテロアリール、ベンジル、ビニル、アリル、ヒドロキシ、エポキシ、アミド、エーテル、エステル、ケトン、マレイミド、スクシンイミド、スルホキシド、グリシジルおよびシリルなどで置換することができる（さらに考察するために上で参照により組み込まれる米国特許第７，６７８，８６９号を参照されたい）。以下の段落に、共重合の適用のいくつかの非限定的な例を提供する。
アクリル酸およびそのエステルのポリマーおよび共重合体を含む塗料は、産業上のおよび消費者向け製品として広く使用されている。そのような塗料を作製するための技術の態様は、そのような塗料の製造についてのその教示に関して参照により組み込まれる米国特許第３，６８７，８８５号および同第３，８９１，５９１号に見出すことができる。一般に、アクリル酸およびそのエステルは、それらの間で形成することができる、または他の単量体、例えばアミド、メタクリレート、アクリロニトリル、ビニル、スチレンおよびブタジエンとホモポリマーまたは共重合体を形成することができる。塗料工業において「ビヒクル」（または「結合剤」）と称されるホモポリマーおよび／または共重合体の所望の混合物を、水溶液に加え、十分に撹拌してマイクロメートル未満のサイズのポリマー粒子を含む水性分散物を形成する。上記塗料は、これらの「ビヒクル」粒子がその水および任意の他の溶媒が蒸発するにしたがって合体することによって硬化する。上記水性分散物への他の添加剤は、条件、適用、意図された表面などに応じて、色素、充填剤（例えば、炭酸カルシウム、ケイ酸アルミニウム）、溶媒（例えば、アセトン、ベンゾール、アルコールなど、しかし、これらは、ある特定の非ＶＯＣ塗料においては見出されない）、増粘剤、および追加の添加剤などを含んでよい。多くの塗料では、上記ビヒクル構成部分の重量百分率は、約９パーセントから約２６パーセントまでにわたってよいが、他の塗料については、上記重量百分率は、この範囲を越えて変化し得る。
アクリルベースのポリマーは、塗料に加えて、多くのコーティングのために使用される。例えば、製紙用塗布剤ラテックスのために、０．１〜５．０％のアクリル酸を、スチレンおよびブタジエンと一緒に使用して、紙への結合を増強し、レオロジー、凍結融解の安定性およびせん断安定性を改変する。この関係において、米国特許第３，８７５，１０１号および同第３，８７２，０３７号は、そのようなラテックスについてのそれらの教示に関して参照により組み込まれる。アクリル酸ベースのポリマーは、多くのインク、特にＵＶ硬化性印刷用インクにおいても使用される。水処理のために、アクリルアミドおよび／またはアクリル酸ヒドロキシエチルを一般にアクリル酸と共重合させて低分子量の線状ポリマーを生成する。この関係において、米国特許第４，４３１，５４７号および同第４，０２９，５７７号は、そのようなポリマーについてのそれらの教示に関して参照により組み込まれる。アクリル酸の、マレイン酸またはイタコン酸との共重合体も、水処理の適用のために生成され、その教示に関して参照により組み込まれる米国特許第５，１３５，６７７号に記載されている。アクリル酸ナトリウム（氷アクリル酸のナトリウム塩）を、アクリルアミド（アミド化の化学作用によってアクリル酸から得ることができる）と共重合させて、水処理において凝集剤として使用されるアニオン性共重合体を作製することができる。
増粘剤のために、これらのコモノマーについての記載に関して参照により組み込まれる米国特許第４，２６８，６４１号および同第３，９１５，９２１号に記載などの種々のコモノマーを使用することができる。米国特許第５，１３５，６７７号には、アクリル酸と一緒に使用して水溶性ポリマーを生成することができるいくつものコモノマーが記載されており、この特許はそのような記載に関して参照により組み込まれる。
同様に言及した通り、下流の生成物へのいくつかの変換は酵素的に行うことができる。例えば、３−ＨＰは、３−ＨＰ−ＣｏＡに変換することができ、次にそれを、ポリヒドロキシ酸シンターゼ活性を有する酵素（ＥＣ２．３．１．−）を用いて、重合した３−ＨＰに変換することができる。また、１，３−プロパンジオールは、酸化還元酵素活性または還元酵素活性を有するポリペプチド（例えば、酵素のＥＣ１．１．１．−クラスの酵素）を使用して作製することができる。あるいは、３−ＨＰから１，３−プロパンジオールを創製する場合、（１）アルデヒド脱水素酵素活性を有するポリペプチド（例えば、１．１．１．３４クラスの酵素）および（２）アルコール脱水素酵素活性を有するポリペプチド（例えば、１．１．１．３２クラスの酵素）の組み合わせを使用することができる。リパーゼ活性を有するポリペプチドを使用して、エステルを形成することができる。これらのような酵素的な反応は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで、例えば無細胞抽出物を使用して、またはｉｎ ｖｉｖｏで行うことができる。
したがって、本発明の種々の実施形態、例えば、化学物質を作製する方法は、これらに限定されないが、本明細書に記載の化学物質、および組み込まれた参考文献に記載の化学物質を含めた（後者はこれを認める権限の範囲（ｊｕｒｉｓｄｉｃｔｉｏｎ）に関して）、微生物によって生成された３−ＨＰの任意のそのような言及した下流の生成物に変換する工程を含む。例えば、一実施形態では、本明細書における教示によって３−ＨＰ分子を作製し、その３−ＨＰ分子を重合した３−ＨＰ（ポリ３−ＨＰ）またはアクリル酸にさらに変換し、次に、アクリル酸などから、上記３−ＨＰ分子由来の、ポリアクリル酸（重合したアクリル酸、様々な形態で）、アクリル酸メチル、アクリルアミド、アクリロニトリル、プロピオラクトン、３−ＨＰエチル、マロン酸、１，３−プロパンジオール、アクリル酸エチル、アクリル酸ｎ−ブチル、アクリル酸ヒドロキシプロピル、アクリル酸ヒドロキシエチル、アクリル酸イソブチル、アクリル酸２−エチルヘキシル、およびアルキル付加またはアリール付加が行われる、かつ／またはハロゲン、芳香族アミンまたは芳香族アミド、および芳香族炭化水素が付加される、アクリル酸またはアクリル酸エステルのいずれか１つを生成する。
同様に言及した通り、下流の生成物へのいくつかの変換を酵素的に行うことができる。例えば、３−ＨＰは、３−ＨＰ−ＣｏＡに変換することができ、次にそれを、ポリヒドロキシ酸シンターゼ活性を有する酵素（ＥＣ２．３．１．−）を用いて、重合した３−ＨＰに変換することができる。また、１，３−プロパンジオールは、酸化還元酵素活性または還元酵素活性を有するポリペプチド（例えば、酵素のＥＣ１．１．１．−クラスの酵素）を使用して作製することができる。あるいは、３−ＨＰから１，３−プロパンジオールを創製する場合、（１）アルデヒド脱水素酵素活性を有するポリペプチド（例えば、１．１．１．３４クラスの酵素）および（２）アルコール脱水素酵素活性を有するポリペプチド（例えば、１．１．１．３２クラスの酵素）の組み合わせを使用することができる。リパーゼ活性を有するポリペプチドを使用して、エステルを形成することができる。これらのような酵素的な反応は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで、例えば無細胞抽出物を使用して、またはｉｎ ｖｉｖｏで行うことができる。
したがって、本発明の種々の実施形態、例えば、化学物質を作製する方法は、これらに限定されないが、本明細書に記載の化学物質、および組み込まれた参考文献に記載の化学物質を含めた（後者はこれを認める権限の範囲に関して）、微生物によって生成された３−ＨＰの任意のそのような言及した下流の生成物に変換する工程を含む。例えば、一実施形態では、本明細書における教示によって３−ＨＰ分子を作製し、上記３−ＨＰ分子を重合した３−ＨＰ（ポリ３−ＨＰ）またはアクリル酸にさらに変換し、次に、アクリル酸などから、３−ＨＰ分子由来のポリアクリル酸（重合したアクリル酸、様々な形態で）、アクリル酸メチル、アクリルアミド、アクリロニトリル、プロピオラクトン、３−ＨＰエチル、マロン酸、１，３−プロパンジオール、アクリル酸エチル、アクリル酸ｎ−ブチル、アクリル酸ヒドロキシプロピル、アクリル酸ヒドロキシエチル、アクリル酸イソブチル、アクリル酸２−エチルヘキシル、およびアルキル付加またはアリール付加が行われる、かつ／またはハロゲン、芳香族アミンまたは芳香族アミド、および芳香族炭化水素が付加される、アクリル酸またはアクリル酸エステルのいずれか１つを生成する。
アクリレートまたはアクリルアミドなどの下流の化合物を形成する反応は、適切な安定化剤またはポリマーが形成される可能性を低減させる阻害剤の使用と併せて行うことができる。例えば、米国特許出願公開第２００７／０２１９３９０Ａ１号を参照されたい。安定化剤および／または阻害剤としては、これらに限定されないが、例えば、フェノール化合物（例えば、ジメトキシフェノール（ＤＭＰ）またはジ−ｔｅｒｔ−ブチルフェノールなどのアルキル化されたフェノール化合物）、キノン（例えば、ｔ−ブチルヒドロキノンまたはヒドロキノンのモノメチルエーテル（ＭＥＨＱ））、および／または金属銅または金属銅塩（例えば、硫酸銅、塩化銅、または酢酸銅）が挙げられる。阻害剤および／または安定剤は、当業者に公知の通り、個々に、または組み合わせて使用することができる。また、種々の実施形態では、上記１つ以上の下流の化合物が約１００パーセントに至るモル濃度収率、または約７０パーセントから約９０パーセントまでにわたるモル濃度収率、または約８０パーセントから約１００パーセントまでにわたるモル濃度収率、または約９０パーセントから約１００パーセントまでにわたるモル濃度収率で回収される。そのような収率は、単一パス（バッチもしくは連続式）または特定のプロセスにおける反復的な分離工程および精製工程の結果であってよい。
アクリル酸および他の下流の生成物は、おむつ、織物、カーペット、塗料、接着剤、およびアクリルガラスを含めた消費財の製造など、製造における一次産品として有用である。
ＸＩＩ．３−ＨＰ以外の化学生成物の生成
３−ＨＰに関する開示は、限定的なものではなく、他の化学生成物を、そのような化学生成物の生成経路を含む微生物宿主細胞において本発明を使用することによってマロニルＣｏＡから生成することができることが理解される。本明細書に開示されている種々の教示および遺伝子改変の組み合わせを、適切に、３−ＨＰを作製する微生物、方法および系に適用することができる。
種々の実施形態では、マロニルＣｏＡから、上記選択された化学生成物、例えば本明細書に詳細に記載されている３−ＨＰへの代謝経路、およびマロニルＣｏＡの脂肪酸アシルＡＣＰ分子（その後は、脂肪酸に変換することができる）への変換を調節するための手段を含む微生物細胞も提供される。それから、この調節するための手段により、そのような変換が減少するように調節される場合、比例して、より多数のマロニルＣｏＡ分子が１）生成され、かつ／または２）マロニルＣｏＡから選択された化学生成物まで代謝経路を介して変換される。
マロニルＣｏＡから３−ＨＰへの代謝経路は、本明細書に開示されており、限定的なものであることを意味しない。３−ＨＰへの他の経路は、当技術分野で公知であり、本明細書に記載の耐性遺伝子改変の任意の組み合わせとの組み合わせを含めて、３−ＨＰを生成するために利用することができる。本明細書における例に示されているように、３ＨＰＴＧＣに関連するそのような遺伝子改変を加えることにより、有毒なレベルを下回る３−ＨＰレベルで比生産性が予想外に増加する。３−ＨＰを生成する任意の生成経路を、３−ＨＰＴＧＣの遺伝子改変と組み合わせて、本明細書に開示されている比生産性および／または容積生産性の計量を実現することができる。
３−ＨＰ以外の化学生成物についての他の代謝経路に関しては、マロニルＣｏＡから生成される化学生成物についての種々の代謝経路が特定の生物体に存在することが公知であり（例えば、＜＜ｗｗｗ．ｍｅｔａｃｙｃ．ｏｒｇ＞＞を参照されたい）、遺伝子組換え技法を使用して、選択された微生物細胞に、それぞれの代謝経路に沿って変換を触媒する種々のポリヌクレオチドをコードするポリヌクレオチドを提供することができる。遺伝子組換えの特定の方法が本明細書に開示されており、一般的な参考文献に教示されているそのような方法も、当業者に公知であり、本明細書においても言及され、したがって、遺伝子工学の当業者は、そのような微生物細胞を、これらの教示に基づいて合理的に構築することができる。あるいは、そのような代謝経路を含む野生型の微生物細胞を、本発明において、例えば本明細書において開示され、特許請求されている遺伝子改変および／または方法および系に使用するための出発細胞として利用することができる。
ＸＩＩＩ．開示されている実施形態は非限定的である 本明細書には本発明の種々の実施形態が示され、記載されているが、そのような実施形態は、単に例として提供されていることが強調される。本明細書の本発明から逸脱することなく、その種々の実施形態において多数の変形、変更および置換を行うことができる。具体的には、いかなる理由であれ、本明細書において一覧表、表に述べられている、またはその他の方法で本明細書に提示されている化合物、核酸配列、機能性酵素、代謝経路の酵素もしくは中間体を含めた特定のタンパク質を含めたポリペプチド、エレメント、または他の組成物、または濃度の群分け、または他の群分け（例えば、図に示されている代謝経路の酵素）のいずれについても、別段の明記のない限り、そのような群分けのそれぞれは、種々のサブセットの実施形態の基礎を提供し、それを規定する働きをするものとし、それらの最も広範な範囲内の上記サブセットの実施形態はそれぞれの述べられた群分けの１つ以上のメンバー（またはサブセット）を除いてそのような群分けのあらゆるサブセットを含む。さらに、任意の範囲が本明細書に記載されている場合、別段の明記のない限り、その範囲は、その中の全ての値およびその中の全ての部分範囲を包含する。
同様に、かつ、より一般的には、本明細書における開示、議論、実施例および実施形態に従って、従来の分子生物学、細胞生物学、微生物学、および組換えＤＮＡ技法を当技術分野の技術の範囲内で使用することができる。そのような技法は、文献において十分に説明されている。（例えば、ＳａｍｂｒｏｏｋおよびＲｕｓｓｅｌｌ、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」第３版、２００１年（１〜３巻）、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．；Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ、Ｒ． Ｉ． Ｆｒｅｓｈｎｅｙ編、１９８６年を参照されたい）。これらの公開されたリソースは、その中に見出される標準の実験室的方法についてのそれらのそれぞれの教示に関して、参照により本明細書に組み込まれている。最低でも、本明細書において上記参照が引用される場合に示され得る特定の教示および／または他の目的がそのように組み込まれる。特定の教示および／または他の目的が示されていない場合は、上記公開されたリソースは、上記参考文献の表題、要約、および／または概要の１つ以上によって示される教示（複数可）に関して詳細に組み込まれる。そのような詳細に同定された教示および／または他の目的がそのように関連しない可能性がある場合は、上記公開されたリソースは、本発明が属する技術分野の現状をより完全に記載するため、および／または、そのような教示を、当業者には一般に公知であるとおり、適用可能なものとして提供するために組み込まれる。しかし、本明細書において公開されたリソースを引用することは、そのようなものが本発明の先行技術であると承認するものと解釈されるべきではないことが特に明示される。また、組み込まれた公開されたリソースの１つ以上が本出願と異なる、または矛盾するイベント、これらに限定されないが、定義された用語、用語の使用、記載されている技法をなど含めたイベントにおいては、本出願が支配する。本実施例における主題は、既に存在していない限りはこのセクションに組み込まれる。
本明細書における実施例は、遺伝子改変および補充物質の追加の組み合わせのいくつかの例を提供するが、それに限定するものではない。以下の実施例は、実際の実施例および予測的な実施例の両方を含む。
別段の指定のない限り、温度は摂氏温度の単位であり、圧力は、海抜およそ５，３４０フィート（１，６２８メートル）における気圧またはそれに近い気圧である。外部の分析施設および合成施設において行われた研究は、海抜およそ５，３４０フィート（１，６２８メートル）における気圧またはそれに近い気圧で行われていないことに留意する。実施例１１Ａおよび１１Ｃは、示されている高さにない契約研究室において行われた。全ての試薬は、別段の指定のない限り、商業的に入手される。種および他の系統学的な同定は、微生物学の当業者に公知の分類に従う。
本明細書において、主要な供給者の名称および所在都市が提供される。さらに、Ｑｉａｇｅｎの製品に関しては、本明細書に記載の通り、ゲノムＤＮＡを調製するための方法においてＤＮｅａｓｙ（登録商標）Ｂｌｏｏｄ ａｎｄ Ｔｉｓｓｕｅ Ｋｉｔ、カタログ番号６９５０６を使用し；プラスミドＤＮＡを精製するためにＱＩＡｐｒｅｐ（登録商標）Ｓｐｉｎ（「ミニプレップ」）、カタログ番号２７１０６を使用し、ゲル抽出するためにＱＩＡｑｕｉｃｋ（登録商標）Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ、カタログ番号２８７０６を使用する。
（実施例１）
マロニルＣｏＡ還元酵素（ｍｃｒ）を発現するプラスミドの構築
Ｃｈｌｏｒｏｆｌｅｘｕｓ ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ由来のマロニルＣｏＡ還元酵素遺伝子のヌクレオチド配列を、商業的なＤＮＡ遺伝子合成の提供者であるＤＮＡ２．０（Ｍｅｎｌｏ Ｐａｒｋ、ＣＡ ＵＳＡ）のサービスに従いＥ．ｃｏｌｉに対してコドン最適化した。この遺伝子配列（配列番号８０３）には開始コドンの前にＥｃｏＲＩ制限酵素認識部位を組み入れ、その後ろにＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素認識部位を続けた。さらに、リボソーム結合部位を上記開始コドンの前に置いた。この遺伝子構築物はＤＮＡ２．０によって合成され、ｐＪ２０６ベクターの骨格（配列番号８０４）中に提供される。合成されたｍｃｒ遺伝子を含有するプラスミドＤＮＡ ｐＪ２０６を、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ（Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ ＵＳＡ）から得たＥｃｏＲＩ酵素およびＨｉｎｄＩＩＩ酵素を製造者の指示に従って用いて酵素による制限消化に供した。その消化混合物を、アガロースゲル電気泳動によって分離し、適切なＤＮＡ断片を共通の方法セクションに記載の通り回収した。ｐＫＫ２２３−ａｒｏＨを担持するＥ．ｃｏｌｉクローニング株を、ＢｏｕｌｄｅｒにあるＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ ＣｏｌｏｒａｄｏのＲｙａｎ Ｔ．Ｇｉｌｌ教授の研究室からの寄贈品として得た。上記プラスミドを担持するこの株の培養物を増殖させ、プラスミドＤＮＡを上記共通の方法セクションに記載の通り調製した。プラスミドＤＮＡを、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ（Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ ＵＳＡ）から得た制限エンドヌクレアーゼの、ＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩを製造者の指示に従って用いて消化した。この消化は、ａｒｏＨ読み枠をｐＫＫ２２３骨格から分離するのに役立った。その消化混合物を、アガロースゲル電気泳動によって分離し、ｐＫＫ２２３プラスミドの骨格に対応するＤＮＡ片を含有するアガロースゲルの薄片を上記共通の方法セクションに記載の通り回収した。
製造者の指示に従って、ｍｃｒ遺伝子に対応する精製されたＤＮＡ断片とｐＫ２２３ベクターの骨格をライゲーションし、そのライゲーション産物を形質転換し、電気穿孔した。生じた、ｐＫＫ２２３−ｍｃｒと称されるベクターの配列を、商業的な提供者によって実施される慣用の配列決定によって確認した（配列番号００３）。ｐＫＫ２２３−ｍｃｒは、アンピシリンに対する抵抗性を付与し、Ｅ．ｃｏｌｉ宿主においてＩＰＴＧによって誘導可能なＰｔａｃプロモーターの制御下にあるＣ．ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓのｍｃｒ遺伝子を含有する。
ｐＫＫ２２３において、Ｐｔａｃに加えて他のプロモーターの制御下でｍｃｒ遺伝子を発現させるために、合成のｍｃｒ遺伝子を他のプラスミドに移入した。プラスミドｐＴｒｃ−Ｐｔｒｃ−ｍｃｒは、ｐＴｒｃＨｉｓＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ；カタログ番号Ｖ３６０−２０）に基づき、ｍｃｒの発現をＩＰＴＧ誘導性のＰｔｒｃプロモーターによって誘導する。誘導因子非依存性ＰｔａｌＡプロモーターは、Ｅ．ｃｏｌｉ ｔａｌＡ遺伝子の上流の配列に基づく。このプロモーターのヌクレオチド配列を、配列番号８０５として列挙されている合成のｍｃｒ遺伝子の開始コドンＡＴＧのすぐに上流に置いた。
ＰｔａｌＡ：ｍｃｒ構築物を、ＰＣＲによってｐＳＣ−Ｂベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ、ＣＡ、ＵＳＡ）に組み入れ、それをＥ．ｃｏｌｉストックにおいて成長させ、そのプラスミドＤＮＡを本明細書の他の箇所に記載の方法に従って精製した。ｐＳＣ−Ｂ−ＰｔａｌＡ：ｍｃｒのＰｔａｌＡ：ｍｃｒ領域をプラスミドベクターｐＳＭＡＲＴ−ＨＣａｍｐ（Ｌｕｃｉｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｍｉｄｄｌｅｔｏｎ、ＷＩ、カタログ番号４００４１−２、ＧｅｎＢａｎｋ ＡＦ３９９７４２）に、ベクタープライマーＭ１３ＦおよびＭ１３Ｒを使用したＰＣＲによって移入した。ＰＣＲによって産生した断片を、製造者のプロトコールに従ってｐＳＭＡＲＴ−ＨＣａｍｐにクローニングし、ｍｃｒを発現するためにＩＰＴＧを用いた誘導を必要としないプラスミドであるｐＳＭＡＲＴ（ＨＣ）Ａｍｐ−ＰｔａｌＡ−ｍｃｒ（配列番号８０６）をもたらした。
（実施例２）
トランスヒドロゲナーゼ（ｐｎｔＡＢ）を発現するプラスミドの構築
ｔｐｉＡ遺伝子（ＰｔｐｉＡ）から得られた、誘導因子非依存性Ｅ．ｃｏｌｉプロモーターとピリジンヌクレオチドトランスヒドロゲナーゼ遺伝子であるｐｎｔＡＢ（配列番号７７９および配列番号７８１）の融合物を、ゲノムＥ．ｃｏｌｉ Ｋ１２のＤＮＡ由来のｔｐｉＡプロモーター領域およびｐｎｔＡＢ領域をポリメラーゼ連鎖反応によって増幅することによって創製した。ｐｎｔＡＢ遺伝子について、その領域を、ｐｎｔＡのタンパク質配列に対するイニシエーターＭｅｔを組み入れるＮｃｏＩ部位を含有するｐｎｔＡＢフォワードプライマーＧＧＧＡＡＣＣＡＴＧＧＣＡＡＴＴＧＧＣＡＴＡＣＣＡＡＧ（配列番号８０７、本明細書に開示されている全てのプライマーは人工的な配列であることに留意する）およびｐｎｔＡＢリバースプライマーＧＧＧＴＴＡＣＡＧＡＧＣＴＴＴＣＡＧＧＡＴＴＧＣＡＴＣＣ（配列番号８０８）を使用して増幅した。同様に、上記ＰｔｐｉＡ領域を、フォワードプライマーＧＧＧＡＡＣＧＧＣＧＧＧＧＡＡＡＡＡＣＡＡＡＣＧＴＴ（配列番号８０９）およびＮｃｏＩ制限酵素認識部位を含有するリバースプライマーＧＧＴＣＣＡＴＧＧＴＡＡＴＴＣＴＣＣＡＣＧＣＴＴＡＴＡＡＧＣ（配列番号８１０）を使用して増幅した。ポリメラーゼ連鎖反応の生成物を、Ｑｉａｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ、ＵＳＡ）からのＰＣＲ精製キットを製造者の説明書を用いて使用して精製した。精製した後、その生成物を、酵素ＮｃｏＩを用いた酵素による制限消化に供した。制限酵素は、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ（Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ ＵＳＡ）から得、製造者の指示に従って使用した。その消化混合物を、上記共通の方法セクションに記載の通り、アガロースゲル電気泳動によって分離し、ＵＶ透過照明の下で視覚化した。増幅したｐｎｔＡＢ遺伝子産物およびＰｔｐｉＡ産物に対応するＤＮＡ断片を含有するアガロースゲルの薄片をゲルから切り出し、Ｑｉａｇｅｎからのゲル抽出キットを製造者の指示に従って使用してＤＮＡを回収した。その回収された生成物をＴ４ ＤＮＡリガーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ、Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ ＵＳＡ）と、製造者の指示に従ってライゲーションした。
上記ライゲーション反応の結果、いくつかの異なる生成物がもたらされ得るので、ｐｎｔＡＢ遺伝子とライゲーションしたＰｔｐｉＡ断片に対応する所望の生成物をポリメラーゼ連鎖反応によって増幅し、２回目のゲル精製によって単離した。このポリメラーゼ連鎖反応について、フォワードプライマーはＧＧＧＡＡＣＧＧＣＧＧＧＧＡＡＡＡＡＣＡＡＡＣＧＴＴ（配列番号８０９）であり、リバースプライマーはＧＧＧＴＴＡＣＡＧＡＧＣＴＴＴＣＡＧＧＡＴＴＧＣＡＴＣＣ（配列番号８０８）であり、鋳型としてそのライゲーション混合物を使用した。上記消化混合物を、上記共通の方法セクションに記載の通り、アガロースゲル電気泳動によって分離し、ＵＶ透過照明の下で視覚化した。増幅したＰｔｐｉＡ−ｐｎｔＡＢ融合物に対応するＤＮＡ片を含有するアガロースゲルの薄片をゲルから切り取り、Ｑｉａｇｅｎからの標準のゲル抽出プロトコールおよび成分を製造者の指示に従って用いてＤＮＡを回収した。この抽出されたＤＮＡを、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｌａ Ｊｏｌｌａ、ＣＡ、ＵＳＡ）から得たＢｌｕｎｔ ＰＣＲ Ｃｌｏｎｉｎｇキットを製造者の説明書を用いて使用し、ｐＳＣ−Ｂベクターに挿入した。コロニーを、コロニーポリメラーゼ連鎖反応によってスクリーニングした。正確なサイズの挿入物を表しているコロニー由来のプラスミドＤＮＡを培養し、Ｑｉａｇｅｎからの標準のミニプレップのプロトコールおよび成分を製造者の指示に従って使用してミニプレップした。単離されたプラスミドを、制限消化によって検査し、配列決定によって確認した。この手順で生成した、配列決定され検証された単離されたプラスミドを、ｐＳＣ−Ｂ−ＰｔｐｉＡ：ｐｎｔＡＢと名付けた。
ｐＳＣ−Ｂ−ＰｔｐｉＡ：ｐｎｔＡＢのＰｔｐｉＡ：ｐｎｔＡＢ領域を、広宿主域の複製開始点およびクロラムフェニコール選択マーカーを提供するｐＢＴ−３ベクター（配列番号８１１）に移入した。この構築物を実現するために、ｐＢＴ−３ベクター由来の断片を、フォワードプライマーＡＡＣＧＡＡＴＴＣＡＡＧＣＴＴＧＡＴＡＴＣ（配列番号８１２）、およびリバースプライマーＧＡＡＴＴＣＧＴＴＧＡＣＧＡＡＴＴＣＴＣＴ（配列番号８１３）を使用し、鋳型としてｐＢＴ−３を使用してポリメラーゼ鎖を増幅させることによって生成した。その増幅生成物を、ＤｐｎＩを用いた処理に供して、メチル化された鋳型ＤＮＡを制限し、その混合物を、上記共通の方法セクションに記載の通り、アガロースゲル電気泳動によって分離し、ＵＶ透過照明の下で視覚化した。増幅したｐＢＴ−３ベクター生成物に対応するＤＮＡ断片を含有するアガロースゲルの薄片をゲルから切り取り、Ｑｉａｇｅｎからの標準のゲル抽出プロトコールおよび成分を製造者の指示に従って用いてＤＮＡを回収した。ｐＳＣ−Ｂ−ＰｔｐｉＡ：ｐｎｔＡＢ中のＰｔｐｉＡ：ｐｎｔＡＢ挿入物を、フォワードプライマーＧＧＡＡＡＣＡＧＣＴＡＴＧＡＣＣＡＴＧＡＴＴＡＣ（配列番号８１４）およびリバースプライマーＴＴＧＴＡＡＡＡＣＧＡＣＧＧＣＣＡＧＴＧＡＧＣＧＣＧ（配列番号８１５）を用いたポリメラーゼ連鎖反応を使用して増幅した。両方のプライマーは５’リン酸化した。
ＰＣＲ生成物を、上記共通の方法セクションに記載の通り、アガロースゲル電気泳動によって分離し、ＵＶ透過照明の下で視覚化した。増幅したＰｔｐｉＡ：ｐｎｔＡＢ挿入物に対応するＤＮＡ断片を含有するアガロースゲルの薄片をゲルから切除し、Ｑｉａｇｅｎからの標準のゲル抽出プロトコールおよび成分を製造者の指示に従って用いてＤＮＡを回収した。この挿入ＤＮＡを、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ（Ｂｅｄｆｏｒｄ、ＭＡ、ＵＳＡ）から得たＴ４ ＤＮＡリガーゼを製造者の指示に従って用いて本明細書に記載の通り調製したｐＢＴ−３ベクターにライゲーションした。ライゲーション混合物を、Ｌｕｃｉｇｅｎ Ｃｏｒｐから得たＥ．ｃｏｌｉ １０Ｇ細胞に、製造者の指示に従って形質転換した。コロニーを、コロニーポリメラーゼ連鎖反応によってスクリーニングした。正確なサイズの挿入物を表しているコロニー由来のプラスミドＤＮＡを培養し、Ｑｉａｇｅｎからの標準のミニプレップのプロトコールおよび成分を製造者の指示に従って使用して精製した。単離されたプラスミドを、制限消化によって検査し、配列決定によって確認した。この手順で生成した、配列決定され検証された単離されたプラスミドをｐＢＴ−３−ＰｔｐｉＡ：ｐｎｔＡＢ（配列番号８１６）と名付けた。
（実施例３）
アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼ（ａｃｃＡＢＣＤ）を発現するプラスミドの構築
Ｅ．ｃｏｌｉ由来のアセチル−ＣｏＡカルボキシルトランスフェラーゼ複合体の成分を発現することができる２つのオペロンを保有するプラスミド、を商業的なＤＮＡ遺伝子合成の提供者であるＤＮＡ２．０（Ｍｅｎｌｏ Ｐａｒｋ、ＣＡ ＵＳＡ）が構築した。この構築物には、Ｅ．ｃｏｌｉ ｔｐｉＡ遺伝子から得られた誘導因子非依存性プロモーターの制御下にあるａｃｃＡ遺伝子およびａｃｃＤ遺伝子のＤＮＡ配列、ならびにＥ．ｃｏｌｉ ｒｐｉＡ遺伝子から得られた誘導因子非依存性プロモーターの制御下にあるａｃｃＢ遺伝子およびａｃｃＣ遺伝子のＤＮＡ配列を組み入れた。リボソーム結合配列を各コード配列に先行させた。設計されたオペロンをｐＪ２５１ベクターの骨格中に提供し、ｐＪ２５１：２６３８５（配列番号８１７）と名付けた。
そのｐＪ２５１：２６３８５プラスミドのｔｐｉＡプロモーターをよりよい発現をもたらすように変化させた。この改変は、そのｐＪ２５１：２６３８５プラスミドを、フォワードプライマーＧＣＧＧＧＧＣＡＧＧＡＧＧＡＡＡＡＡＣＡＴＧ（配列番号８１８）およびリバースプライマーＧＣＴＴＡＴＡＡＧＣＧＡＡＴＡＡＡＧＧＡＡＧＡＴＧＧＣＣＧＣＣＣＣＧＣＡＧＧＧＣＡＧ（配列番号８１９）を用いて増幅することによって組み入れた。これらのプライマーのそれぞれは、５’リン酸化修飾を伴って合成した。生じたＰＣＲ生成物を、上記共通の方法セクションに記載の通り、アガロースゲル電気泳動によって分離し、適切なＤＮＡ断片を回収した。回収された生成物を、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ（Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ ＵＳＡ）から得たＴ４ ＤＮＡリガーゼを製造者の指示に従って用いて自己ライゲーションさせ、ＤｐｎＩで消化した。正確なサイズの挿入物を表しているコロニー由来のプラスミドＤＮＡを培養し、Ｑｉａｇｅｎからの標準のミニプレップのプロトコールおよび成分を製造者の指示に従って使用して精製した。単離されたプラスミドを、制限消化によって検査し、配列決定によって確認した。この手順で生成した、配列決定され検証された単離されたプラスミドを、ｐＪ２５１（２６３８５）−ＰｔｐｉＡ：ａｃｃＡＤ−ＰｒｐｉＡ：ａｃｃＢＣ（配列番号８２０）と名付けた。
（実施例４）
３−ＨＰ寛容原性複合体に関連する遺伝子を発現するプラスミドの構築
上記３ＨＰＴＧＣの酵素活性を示すポリペプチドを発現する遺伝子を含むプラスミドのためのプラスミド構築の例が、２０１０年１月２８日に公開されたＷＯ２０１０／０１１８７４から組み込まれる。３−ＨＰ耐性を増加させるために、特定の実施形態において多くの単一の上記３ＨＰＴＧＣの遺伝子改変または上記３ＨＰＴＧＣの遺伝子改変の組み合わせが提供され得るが、ごくわずかのみが本実施例において提供される。これは、限定的であることを示すものではない。
（実施例５）
３−ヒドロキシプロピオン酸を生成する特定の株の構築
以下の表に示されているそれぞれの組み合わせに従って、本明細書に記載のプラスミドをそれぞれの基本株に導入した。全てのプラスミドを、標準の方法を使用して、電気穿孔によって同時に導入した。形質転換された細胞を、抗生物質を補充した適切な培地で増殖させ、選択培地におけるそれらの適切な増殖に基づいてコロニーを選択した。ｍｃｒ発現プラスミドｐＫＫ２２３−ｍｃｒを、Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＦ４０（Ｈｆｒ、ｇａｒＢ１０、ｆｈｕＡ２２、ｏｍｐＦ６２７、ｆａｄＬ７０１、ｒｅｌＡ１、ｐｉｔＡ１０、ｓｐｏＴ１、ｒｒｎＢ−２、ｐｇｉ−２、ｍｃｒＢ１、ｃｒｅＣ５２７）またはＥ．ｃｏｌｉ ＪＰ１１１１（Ｈｆｒ、ｇａｌＥ４５（ＧａｌＳ）、ＬＡＭ−、ｆａｂＩ３９２（ｔｓ、温度感受性）、ｒｅｌＡ１、ｓｐｏＴ１、ｔｈｉ−１）に、上記共通の方法セクションに記載の通り形質転換した。当技術分野で公知の通り、上記ＤＦ４０株およびＪＰ１１１１株は、Ｙａｌｅ Ｃｏｌｉ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｓｔｏｃｋ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｎｅｗ
Ｈａｖｅｎ、ＣＴ ＵＳＡ）を含めた供給源から入手可能である、一般に入手可能なＥ．ｃｏｌｉ株である。これらのｍｃｒ形質転換体から、上記共通の方法セクションに記載の通り形質転換に対して適格な細胞を電気穿孔によって調製し、追加のプラスミドで形質転換することによって、複数の適合性のプラスミドを保有する株を構築した。その後、適切に組み合わせた抗生物質を含有する培地で形質転換体を選択した。
表９．株名および特性
（実施例６）
３−ヒドロキシプロピオン酸の生成
ＫＸ３＿０００１による３−ＨＰの生成を、流加（富栄養）またはＡＭ２（最小塩）培地において１００ｍＬ規模で実証した。培養を標準作業方法（ＳａｍｂｒｏｏｋおよびＲｕｓｓｅｌｌ、２００１年）によって冷凍ストックを１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを加えたＬＢ培地５０ｍＬに入れて開始し、３７℃で一晩、２２５ｒｐｍで回転させながら静止期になるまで増殖させた。この培養物５ｍｌを、１００ｍｌの、４０ｇ／Ｌのグルコース、１００μｇ／ｍＬのアンピシリン、１ｍＭのＩＰＴＧを加えた流加培地またはＡＭ２培地に、３連の２５０ｍｌのバッフルフラスコ中に移し、３７℃、２２５ｒｐｍでインキュベートした。これらの培養物による細胞の増殖および３−ＨＰの生成をモニターするために、６００ｎｍにおける光学濃度（ＯＤ６００、光路長１ｃｍ）を測定するために、指定の時点で試料（２ｍｌ）を取り出し、１２，０００ｒｐｍで５分間遠心分離することによってペレットにし、上記共通の方法セクション中の「３−ＨＰの生成についての培養物の分析」の下で記載されている通り、３−ＨＰの生成を分析するために上清を回収した。乾燥細胞重量（ＤＣＷ）を、ＯＤ６００を決定するためのベースラインのＤＣＷに基づいて、測定されたＯＤ６００値の０．３３倍として算出する。全てのデータは、３連の培養物の平均である。比較する目的で、２４時間の時点の平均データから比生産性を算出し、ＤＣＷ１ｇ当たりの、生成された３−ＨＰのｇとして表す。流加培地におけるＫＸ３＿００１株による３−ＨＰの生成が、以下の表に示されている。これらの条件下で、２４時間後の比生産性は、ＤＣＷ１ｇ当たり０．００４１ｇの３−ＨＰである。
表１０．流加培地におけるＫＸ３＿０００１による３−ＨＰの生成
（実施例７）
脂肪酸の合成を阻害することによってマロニルＣｏＡ前駆体プールを増加させることの、３−ＨＰの生成に対する影響
本明細書に記載の通り、ある特定の化学物質が、上記脂肪酸合成酵素系の種々の酵素を阻害することが公知であり、そのいくつかは、膜の維持および増殖、および微生物の増殖における脂肪酸の合成の役割を考慮して、抗生物質として使用される。これらの阻害剤には、ＫＡＳＩ β−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼを阻害するセルレニンがある（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉにおけるｆａｂＢ）。選択された化学生成物、ここでは３−ＨＰへの生成経路（ここでは、マロニルＣｏＡがその経路における基質である）を含む微生物におけるマロニルＣｏＡの利用を調節し、シフトさせるアプローチをさらに評価するために、培養中のセルレニンの添加について評価した。
マロニルＣｏＡの下流の経路は脂肪酸の生合成および３ＨＰの生成に限られている（マロニルＣｏＡを経由する後者への経路が細胞に存在する、または細胞においてもたらされる場合）。この実験は、３ＨＰの生成株におけるマロニルＣｏＡプールの使用を制御し、さらに３ＨＰの生成の速度を改善する方法を決定するように設計する。脂肪酸の生合成を阻害し、マロニルＣｏＡプールを調節することによって、この経路を通るフラックスが３ＨＰの生成に向かってシフトすることが仮定される。現在通用している３ＨＰの生成経路における、マロニルＣｏＡを通る、可能性のある炭素の流れの図が図９に示されている。脂肪酸の伸長を妨害し、かつマロン酸部分をアセチルＣｏＡプールに戻して再捕捉する無益回路を破壊する代表的な阻害剤が選択されている。
流加培地における、１０μｇ／ｍｌのセルレニンの存在下でのＫＸ３＿０００１株による生成が表１１に示されている。マロニルＣｏＡ前駆体の内部のプールは、上記阻害剤の存在下で増加し、したがって３−ＨＰの生成の増加をもたらすことが提唱されている。セルレニンがない場合の結果と比較することによって認めることができるように（表５）、どの時点においても実質的に多くの３−ＨＰが生成され、２４時間の時点の比生産性はＤＣＷ１ｇ当たり０．１２８ｇの３−ＨＰであり、セルレニンがない場合の結果と比較して３１倍増加する。
表１１．１０μｇ／ｍｌのセルレニンが存在する流加培地におけるＫＸ３＿０００１による３−ＨＰの生成
（実施例８）
温度感受性脂肪酸合成変異体を使用してマロニルＣｏＡ前駆体プールを増加させることの、３−ＨＰの生成に対する影響
内部のマロニルＣｏＡプールを増加させるための代替のアプローチは、化学阻害剤ではなく遺伝子突然変異を使用することである。脂肪酸を合成する機能をコードする遺伝子における不活化突然変異は、通常致死的であり、したがって入手できないが、温度感受性変異体などの条件付の変異体については記載されている（ｄｅ Ｍｅｎｄｏｚａ、Ｄ．、およびＣｒｏｎａｎ、Ｊ． Ｅ．、Ｊｒ．（１９８３年）Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ．
Ｓｃｉ．、８巻、４９〜５２頁）。例えば、ＪＰ１１１１株のエノイルＡＣＰ還元酵素をコードするｆａｂＩ遺伝子における温度感受性突然変異（遺伝子型ｆａｂＩ３９２（ｔｓ））は３０℃などの温度低減時に比較的正常な活性を有し、温度を上昇させて、例えば、３７℃から４２℃まで上昇させて培養した場合におそらく変性および不活化によって非許容になり、自身のエノイルＡＣＰ還元酵素として、この温度感受性変異体のみを含む微生物は、実質的により少ない脂肪酸およびリン脂質を生成する。これにより、増殖が減少する、または増殖が起こらない。しかし、マロニルＣｏＡからの、例えば３−ＨＰへの生成経路も含む遺伝子改変された微生物においてそのような変異体がもたらされる場合、培養温度を上昇させることを伴う有効な培養方法により、３−ＨＰの比生産性の増加がもたらされ得ることが仮定された。
流加培地中、３０℃の一定の温度におけるＪＸ３＿００７７株による３−ＨＰの生成、および培養物を３０℃から４２℃までの温度シフトに供したＪＸ３＿００７７株による３−ＨＰの生成が表１２に示されている。上記温度シフトは、上記エノイルＡＣＰ還元酵素を不活化し、したがって、今度は内部のマロニルＣｏＡプールを増加させる脂肪酸の蓄積を排除するように設計する。どの時点においても実質的により多い３−ＨＰが生成し、上記温度をシフトさせた培養物による２４時間の時点の比生産性はＤＣＷ１ｇ当たり１．１５ｇの３−ＨＰであり、３０℃で一定に維持した培養物によるＤＣＷ１ｇ当たり０．０１１ｇの３−ＨＰの比生産性に対して１００倍を超える増加である。上記エノイルＡＣＰ還元酵素が温度の上昇によって不活化される上記培養物によるこの生産性の増加は、マロニルＣｏＡの利用がシフトすることにより、３−ＨＰの生成が増加するという見解を支持する。
表１２．流加培地におけるＪＸ３＿００７７による３−ＨＰの生成
表１３に、ｍｃｒ遺伝子を保有するプラスミドに加えて、トランスヒドロゲナーゼ遺伝子を過剰発現するプラスミドを保有するＪＸ３＿００８７株による３−ＨＰの生成を示す。３０℃の一定温度で維持した培養物では、２４時間にＤＣＷ１ｇ当たり０．０８５ｇの３−ＨＰの比生産性が達成された。これは、過剰発現したトランスヒドロゲナーゼ遺伝子を保有しないＪＸ３＿００７７の比生産性よりも著しく高い（表７）。ＪＸ３＿００８７の温度をシフトさせた培養物の比生産性はＤＣＷ１ｇ当たり１．６８ｇの３−ＨＰであり、３０℃で一定に維持した、上記エノイルＡＣＰ還元酵素が不活化されなかった培養物の比生産性に対して２０倍増加した。
表１３．流加培地におけるＪＸ３＿００８７による３−ＨＰの生成
表１４に、ｍｃｒ遺伝子を保有するプラスミドに加えて、アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼ複合体をコードする遺伝子を過剰発現するプラスミドを保有するＪＸ３＿００９７株による３−ＨＰの生成を示す。３０℃の一定温度で維持した培養物では、２４時間にＤＣＷ１ｇ当たり０．００６８ｇの３−ＨＰの比生産性が達成された。この比生産性は、アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼが過剰発現していないＪＸ３＿００７７株によって達成された比生産性と同様である。ＪＸ３＿００９７の温度をシフトさせた培養物の比生産性は、ＤＣＷ１ｇ当たり０．２９ｇの３−ＨＰであり、３０℃で一定に維持した、上記エノイルＡＣＰ還元酵素が不活化されていない培養物の比生産性に対して４２倍増加した。
表１４．流加培地におけるＪＸ３＿００９７による３−ＨＰの生成
富栄養培地である流加培地は、脂肪酸前駆体としての働きをする成分を含有してよく、したがってマロニルＣｏＡの要求が低減し得る。したがって、最少培地であるＡＭ２におけるＪＰ１１１１から得られる株による３−ＨＰの生成を検証した。表１５に示されているように、ＡＭ２培地において、ＪＸ３＿００７７によって３−ＨＰが生成された。３０℃で一定に維持した培養物により、２４時間にＤＣＷ１ｇ当たり０．０２４ｇの３−ＨＰの比生産性が得られ、これは流加培地において得られた値のおよそ２倍であった。上記温度をシフトさせた培養物により、２４時間に渡ってＤＣＷ１ｇ当たり１．０４ｇの３−ＨＰの比生産性が達成され、３０℃で一定に維持した培養物の比生産性と比較して４４倍増加し、これにより、本発明者らが想定した通り、上記エノイルＡＣＰ還元酵素の条件付の不活化によって内部のマロニルＣｏＡプールが増加し、したがって３−ＨＰの生成が増加することが今一度示されている。
表１５．ＡＭ２培地におけるＪＸ３＿００７７による３−ＨＰの生成
ＡＭ２培地における、ｍｃｒ遺伝子を保有するプラスミドに加えて、トランスヒドロゲナーゼ遺伝子を過剰発現するプラスミドを保有したＪＸ３＿００８７株による３−ＨＰの生成が示されている。３０℃の一定温度で維持したＪＸ３＿００８７培養物では、２４時間にＤＣＷ１ｇ当たり０．０１８ｇの３−ＨＰの比生産性が達成された。流加培地において得られた結果と対照的に、この値は、ＡＭ２において、上記過剰発現したトランスヒドロゲナーゼ遺伝子を保有しないＪＸ３＿００７７株を用いて得られた比生産性よりも高くない（表１５）。ＪＸ３＿００８７の温度をシフトさせた培養物の比生産性は、ＤＣＷ１ｇ当たり０．５０ｇの３−ＨＰであり、３０℃で一定に維持した、上記エノイルＡＣＰ還元酵素が不活化されていない培養物の比生産性に対して２７倍増加した。
表１６．ＡＭ２におけるＪＸ３＿００８７による３−ＨＰの生成
表１７に、ＡＭ２培地における、ｍｃｒ遺伝子を保有するプラスミドに加えて、アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼ複合体をコードする遺伝子を過剰発現するプラスミドを保有するＪＸ３＿００９７株による３−ＨＰの生成を示す。３０℃の一定温度で維持した培養物では、２４時間にＤＣＷ１ｇ当たり０．０２１ｇの３−ＨＰの比生産性が達成された。この比生産性は、アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼが過剰発現していないＪＸ３＿００７７株によって達成された比生産性と同様である。ＪＸ３＿００９７の温度をシフトさせた培養物の比生産性は、２４時間にＤＣＷ１ｇ当たり０．９４ｇの３−ＨＰであり、３０℃で一定に維持した、上記エノイルＡＣＰ還元酵素が不活化されていない培養物の比生産性に対して４５倍増加した。
表１７．ＡＭ２におけるＪＸ３＿００９７．０による３−ＨＰの生成
同じ生物体内で、ｍｃｒ（マロニルＣｏＡ還元酵素）、ｐｎｔＡＢ（トランスヒドロゲナーゼ）、およびａｃｃＡＢＣＤ（アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼ複合体）を発現するプラスミドを組み合わせることの効果を、ＪＸ３＿００９８株を構築することによって試験した。上の表に、ＡＭ２培地におけるこの株による３−ＨＰの生成を示す。３０℃で一定に維持した培養物において、２４時間にＤＣＷ１ｇ当たり０．５４ｇの３−ＨＰの比生産性が得られ、これは、ｍｃｒを単独で保有する株、またはｍｃｒと、ｐｎｔＡＢもしくはａｃｃＡＢＣＤの両方ではなくいずれかを一緒に保有する株に対して２０倍を超える増加を表している。温度をシフトさせてエノイルＡＣＰ還元酵素を不活化することにより、２４時間にＤＣＷ１ｇ当たり２．０１ｇの３−ＨＰの比生産性がもたらされ、さらに３．８倍増加した。したがって、ｐｎｔＡＢの過剰発現とａｃｃＡＢＣＤの過剰発現の組み合わせに加えて温度感受性ｆａｂＩｔｓ対立遺伝子によるエノイルＡＣＰ還元酵素の不活化により、ｍｃｒ担持細胞による３−ＨＰの比生産性がおよそ５００倍増加する（２４時間に比生産性がＤＣＷ１ｇ当たり２．０１ｇの３−ＨＰ対ＤＣＷ１ｇ当たり０．００４１ｇの３−ＨＰ）。
表１８．ＡＭ２培地におけるＪＸ３＿００９８．０による３−ＨＰの生成
（実施例９）
ｆａｂＩｔｓ変異体の配列
ＪＰ１１１１株が保有するｆａｂＩｔｓ対立遺伝子における的確な配列の変化の性質を再確認した。この変化を確認することにより、温度感受性が異なる代替の株および野生型とｆａｂＩ３９２温度感受性対立遺伝子の中間の安定性を持つ変異体を産生するための標的変異誘発が可能になり、３０℃よりも高い一定温度で増殖させ、その一方で内部のマロニルＣｏＡプールの増加の利益をもたらすことが可能になる。野生型（ＢＷ２５１１３）Ｅ．ｃｏｌｉおよびＪＰ１１１１突然変異Ｅ．ｃｏｌｉの染色体のこのセグメントのＤＮＡ配列を確認するために、これらの株から染色体ＤＮＡを調製した。これらのＤＮＡを、以下のプライマーを用いたＰＣＲ反応の鋳型として使用した：
上記ＰＣＲのためのサーモサイクラー条件は：９５℃で１０分；以下を３０サイクル、９５℃で１０秒；４７℃から５８℃に上昇させて、３０秒；７２℃で１分；その後、７２℃で５分間の最終のインキュベーションであった。そのＰＣＲ生成物を、上記共通の方法セクションに記載の通り、アガロースゲルで分離し、適切なサイズの断片を回収し、プライマーを使用して配列決定した：
ｆａｂＩ３９２から得たＤＮＡ配列（配列番号７６９）と野生型株から得たＤＮＡ配列を比較することにより、野生型遺伝子の７２２位のＣがＴになっている対立遺伝子間の単一の差が示され（図４Ａ参照）、これによりコドン２４１のＳｅｒがＰｈｅに変化しているタンパク質がもたらされ（図４Ｂ参照）。これらの変化は、Ｂｅｒｇｌｅｒ、Ｈ．、Ｈｏｇｅｎａｕｅｒ、Ｇ．、およびＴｕｒｎｏｗｓｋｙ、Ｆ．、Ｊ． Ｇｅｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１３８巻：２０９３〜２１００頁（１９９２年）によって見出された変化と同一である。
上記コドン２４１での影響を受けた残基を同定することにより、このコドンにおける標的変異誘発、例えばＴｒｐ、Ｔｙｒ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、またはＳｅｒまたはＰｈｅ以外の他のアミノ酸などのアミノ酸残基への標的変異誘発が示され、それによりＪＰ１１１１において最初に単離されたｆａｂＩ３９２と性質が異なるｆａｂＩ対立遺伝子がもたらされ得る。コドン２４１の近くのコドンにおける標的変異誘発により、特性が変化した所望のｆａｂＩ変異体を得ることも意図することができる。
（実施例１０）
３−ＨＰ寛容原性複合体由来の遺伝子が過剰発現することの、３−ＨＰの生成に対する影響
ｍｃｒを発現するプラスミド（ｐＴｒｃ−Ｐｔｒｃ−ｍｃｒまたはｐＳＭＡＲＴ（ＨＣ）Ａｍｐ−ＰｔａｌＡ−ｍｃｒ）を、単独で、または、上記３−ＨＰ寛容原性複合体由来の代表的な遺伝子を保有する適合性のプラスミド（ｐＪ６１−ａｒｏＧ、ｐＪ６１−ｔｈｒＡ、ｐＡＣＹＣ１７７−ｃｙｎＴＳ、ｐＪ６１−ｃｙｎＴＳ）と一緒に保有する一連の株を構築した。表１９ではその株およびそれらの特性がカテゴリー化されている。
表１９．寛容原性複合体遺伝子を担持するプラスミドを保有する株の株名および特性
上記３−ＨＰ寛容原性複合体（３ＨＰＴＧＣ）由来の遺伝子を保有するプラスミドを持たない、およびそれを持つ、ｐＴｒｃ−Ｐｔｒｃ−ｍｃｒを保有する株による３−ＨＰの生成が表２０に示されている。培養物を３０℃で一定に維持したこと、および株を２４時間後のそれらの比生産性に基づいて評価したこと以外は、実施例６と同様に３−ＨＰの生成を行った。表２０に示されているように、ＪＸ３＿００７７株とＩＰＴＧ誘導性プラスミドの性質のみが異なるＪＸ３＿０１１８株の比生産性は、ＪＸ３＿００７７のＤＣＷ１ｇ当たり０．０１１ｇの３−ＨＰと比較して２４時間にＤＣＷ１ｇ当たり０．１９ｇの３−ＨＰであった。この、３０℃で一定に維持した培養物による比生産性が１７倍増加したことは、安定性およびｐＴｒｃ−Ｐｔｒｃ−ｍｃｒによるｍｃｒの発現が増加したことに起因し得る。
上記３−ＨＰ寛容原性複合体由来の遺伝子が発現することにより、３−ＨＰの生産性がさらに増加する。２４時間に比生産性は、ＪＸ３＿０１１０においてａｒｏＧが発現することにより、２．３倍増加し、ＪＸ３＿０１１１においてｔｈｒＡが発現することにより、２．２倍増加し、ＪＸ３＿０１１２においてｃｙｎＴＳが発現することにより、１０．６倍増加した。
表２０
同様の結果が、ｐＳＭＡＲＴ（ＨＣ）Ａｍｐ−ＰｔａｌＡ−ｍｃｒによって発現されるｍｃｒおよび上記３−ＨＰ寛容原性複合体由来の遺伝子を保有する追加のプラスミドを保有する株において得られた。培養物を３０℃で一定に維持したこと、および株をそれらの２４時間後の比生産性に基づいて評価したこと以外は、実施例６と同様に３−ＨＰの生成を行った。上記ｍｃｒ発現プラスミドを単独で保有する株（ＪＸ３＿０１０４）、または空の対照ベクターと一緒に保有する株（ＪＸ３＿０１１９）は、それぞれ、２４時間にＤＣＷ１ｇ当たり０．０６２ｇの３−ＨＰまたは０．０６８ｇの３−ＨＰの比生産性を有した。２４時間に比生産性は、ＪＸ３＿０１１９株と比較して、ＪＸ３＿０１１４においてａｒｏＧが発現することにより２．４倍増加し、ＪＸ３＿０１１５においてｔｈｒＡが発現することにより２．６倍増加し、ＪＸ３＿０１１６またはＪＸ３＿０１１７においてｃｙｎＴＳが発現することにより２．１倍増加した。したがって、上記３−ＨＰ寛容原性複合体由来の代表的な遺伝子が過剰発現することにより、これらの遺伝子の耐性の効果が最初に同定された際のものをはるかに下回る排出される３−ＨＰのレベルにおいてさえも、３−ＨＰの比生産性が著しく増加した。これは、予想外の有益な結果である。
表２１．ｐＳＭＡＲＴ（ＨＣ）Ａｍｐ−ＰｔａｌＡ−ｍｃｒおよび３−ＨＰ寛容原性複合体由来の遺伝子を担持するプラスミドを保有する株による３−ＨＰの生成
（実施例１１）
温度感受性脂肪酸合成変異体を使用してマロニルｃｏＡ前駆体プールを増加させることの、１Ｌの発酵３−ＨＰの容量生成に対する影響
４つの１Ｌ流加発酵実験を、ＪＸ３＿００９８株を使用して行った。簡単に述べると、種培養を開始し、ＬＢ培地（ルリアブロス（Ｌｕｒｉａ Ｂｒｏｔｈ））中で一晩増殖させ、それを使用して１ＬのＮｅｗ Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ発酵容器４つに接種した。その第１の容器は３０℃で限定ＡＭ２培地（ｄｅｆｉｎｅｄ ＡＭ２ ｍｅｄｉｕｍ）を含有し、ＯＤ６００ｎｍが２において、２ｍＭでＩＰＴＧ誘導を加え、グルコースが１ｇ／Ｌから２ｇ／Ｌの間に枯渇したら、追加のグルコース供給を開始した。標的のＯＤ１０において１時間にわたって温度を３７℃にシフトさせた。グルコースが１ｇ／Ｌを超える濃度で蓄積し始めるまで、＞３ｇ／Ｌ／時間の高いグルコース供給速度を維持し、その時点で供給速度を変化させて残留グルコースを１ｇ／Ｌから１０ｇ／Ｌの間に維持した。その第２の容器は３０℃で限定ＡＭ２培地を含有し、ＯＤ６００ｎｍが２において、２ｍＭでＩＰＴＧ誘導を加え、グルコースが０ｇ／Ｌまで枯渇したら追加のグルコース供給を開始した。標的のＯＤ１０において１時間にわたって温度を３７℃にシフトさせた。上記グルコース供給速度を３ｇ／Ｌ／時間以下に維持した。その第３の容器は３０℃で富栄養培地を含有し、ＯＤ６００ｎｍが２において、２ｍＭでＩＰＴＧ誘導を加え、グルコースが１〜２ｇ／Ｌまで枯渇したら追加のグルコース供給を開始した。標的のＯＤ１０において１時間にわたって温度を３７℃にシフトさせた。グルコースが１ｇ／Ｌを超える濃度で蓄積し始めるまで、＞３ｇ／Ｌ／時間の高いグルコース供給速度を維持し、その時点で供給速度を変化させて残留グルコースを１ｇ／Ｌから１０ｇ／Ｌの間に維持した。その第４の容器は３０℃で富栄養培地を含有し、ＯＤ６００ｎｍが２において、２ｍＭでＩＰＴＧ誘導を加え、グルコースが０ｇ／Ｌまで枯渇したら追加のグルコース供給を開始した。標的のＯＤ１０において１時間にわたって温度を３７℃にシフトさせた。上記グルコース供給速度を３ｇ／Ｌ／時間以下に維持した。
図５に増殖プロファイルが示されており、矢印は温度シフトの開始を示している。全ての発酵容器を、５０％ｖ／ｖの水酸化アンモニウム（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を制御添加することによってｐＨ＝７．４に維持した。全ての容器を、濾過された空気を散布して通気することによって溶存酸素が少なくとも２０％になるように維持した。光学濃度を測定するため、ならびに３−ＨＰ濃度についてＨＰＬＣ分析するために試料を取得した（共通の方法を参照されたい）。最大の容積生産性は、２．９９ｇ／Ｌ／時間に到達した。さらに、この図により、これらの４つの容器における、３〜４時間の平均バイオマス濃度と３〜４時間の平均容積生産性速度との間の相関が実証されている。
（実施例１１Ａ）
２５０リットルの発酵における３−ＨＰの生成
容量２５０リットルのステンレス鋼の発酵槽における２つの流加発酵の例を、その遺伝子型が本明細書の他の箇所に記載されているＢＸ３＿０２４０株を使用して行った。２段階の播種プロセスを使用して２５０Ｌの発酵槽用に種菌を産生した。その第１段階では、この株のグリセロールストック１ｍｌを振とうフラスコ中、１００ｍｌのＴＢ培地（Ｔｅｒｒｉｆｉｃ Ｂｒｏｔｈ）に播種し、ＯＤ６００が３から４の間になるまで３０℃でインキュベートした。その第２段階では、その振とうフラスコ培養物８５ｍｌを、ＴＢ培地８Ｌを含有する１４ＬのＮｅｗ Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ発酵槽に無菌的に移し、ＯＤ６００が５から６の間になるまで３０℃において、５００ｒｐｍで撹拌して増殖させた。その１４Ｌの発酵槽からの培養物を使用して、限定ＦＭ５培地（共通の方法セクションを参照されたい）を含有する２５０Ｌ容量のバイオリアクターに、３０℃で無菌的に接種し、接種後の容積を１５５Ｌにした。
上記第１の発酵では、ＩＰＴＧを、ＯＤ６００２０において最終濃度が２ｍＭになるように加えることによって、誘導をもたらした。上記発酵槽内の残留グルコースが１０〜１５ｇ／Ｌになったら、グルコース供給（７００ｇ／Ｌのグルコース溶液からなる）を開始した。その供給速度を調整して、発酵の最後の約６時間まで残留グルコースを１０ｇ／Ｌから１５ｇ／Ｌの間に維持し、３−ＨＰの回収を容易にするために、その時点で上記供給速度を低減させて回収時の残留グルコースが＜１ｇ／Ｌになるようにした。誘導の３時間後、１時間にわたって上記温度を３７℃にシフトさせた。その温度シフトを開始した時点で、溶存酸素（ＤＯ）の設定ポイントを、２０％の空気飽和からＤＯが２〜４％のの空気飽和の間に維持されたポイントに変更した。接種の４８時間後に発酵ブロスを回収した。最終ブロスの体積は、１６９．５リットルであった。
上記第２の発酵を、以下の違い以外は、上記の第１の発酵の例と同様に実行した：ＩＰＴＧを用いた誘導をＯＤ６００１５においてもたらし、残留グルコース（上記グルコース供給を始めた後）は３〜３０ｇ／Ｌの範囲にわたり、最終残留グルコース濃度が２５ｇ／Ｌになるように、接種の３８．５時間後に発酵ブロスを回収した。最終ブロスの体積は１６７リットルであった。
無水アンモニアガスを制御添加することによって、各発酵ブロスのｐＨをおよそ７．４に維持した。溶存酸素を、滅菌濾過した空気を散布して通気することによって所望のレベルに維持した。光学濃度を測定するため、ならびに３−ＨＰ濃度についてＨＰＬＣ分析するために試料を取得した。上記第１の発酵では、最大バイオマス濃度は１Ｌ当たりの乾燥細胞重量が１２．０ｇであり、回収時のバイオマス濃度は１Ｌ当たりの乾燥細胞重量が１１．４ｇであり、この発酵における最大の３−ＨＰの力価は２０．７ｇ／Ｌであった。上記第２の発酵では、上記最大バイオマス濃度は１Ｌ当たりの乾燥細胞重量が１０．２ｇであり、回収時のバイオマス濃度は１Ｌ当たりの乾燥細胞重量が９．５ｇであった。この発酵における最大の３−ＨＰの力価は２０．７ｇ／Ｌであった。
（実施例１１Ｂ）
１Ｌの発酵における、３−ＨＰの生成に対する増殖培地の影響
８つの１Ｌ流加発酵実験を、ＢＸ３＿０２４０株を使用して行った。種培養を、振とうフラスコ中４００ｍｌのＴＢ培地（Ｔｅｒｒｉｆｉｃ Ｂｒｏｔｈ）に接種した株のグリセロールストック１ｍｌから開始し、ＯＤ６００が５から６の間になるまで３０℃でインキュベートした。振とうフラスコ培養物を使用して１Ｌ容量のバイオリアクターのそれぞれに無菌的に接種して、接種後の各容器における体積を６５３ｍｌにした。
発酵槽１および２は、限定ＦＭ３培地を含有した。発酵槽３〜５は、限定ＦＭ４培地を含有した。発酵槽６〜８は、限定ＦＭ５培地を含有した。培地の組成は全て上記共通の方法セクションに列挙されている。各発酵槽内の最初の温度は３０℃であった。
ＩＰＴＧを、ＯＤ６００値１５〜１６において最終濃度が２ｍＭになるように加えることによって、誘導をもたらした。発酵槽内の残留グルコースが約１０ｇ／Ｌになったら、グルコース供給（ＦＭ３培地およびＦＭ５培地については５００ｇ／Ｌのグルコース溶液からなり、ＦＭ４については５００ｇ／Ｌのグルコースに加えて７５ｍＭのＭｇＳＯ４からなった）を開始した。上記供給速度を調整して残留グルコースを＞３ｇ／Ｌに維持した（発酵槽８は例外であり、上記残留グルコースは、その供給速度を増加させる前に一時的に０．１ｇ／Ｌに到達した）。誘導の３時間後、１時間にわたって上記温度を３７℃にシフトさせた。その温度シフトを開始した時点で、溶存酸素（ＤＯ）の設定ポイントを２０％の空気飽和から１％の空気飽和に変更した。接種した４８時間後に発酵を停止させた。
各発酵槽のブロスのｐＨを、ｐＨ滴定剤を制御添加することによっておよそ７．４のｐＨに維持した。ＦＭ３培地用のｐＨ滴定剤は５ＭのＮａＯＨであり、ＦＭ４およびＦＭ５用のｐＨ滴定剤は濃水酸化アンモニウムと水の５０：５０混合物であった。溶存酸素を、滅菌濾過した空気を散布することによって所望のレベルに維持した。光学濃度を測定するため、ならびに３−ＨＰ濃度についてＨＰＬＣ分析するために試料を取得した。各発酵槽における最大バイオマス濃度および回収時のバイオマス濃度ならびに最大の３−ＨＰの力価が以下の表２２に要約されている。
表２２
（実施例１１Ｃ）
１Ｌの発酵における、バッチリン酸塩濃度の３−ＨＰの生成に対する影響。
４つの１Ｌ流加発酵実験を、ＢＸ３＿０２４０株を使用して行った。種培養を、振とうフラスコ中、４００ｍｌのＴＢ培地（Ｔｅｒｒｉｆｉｃ Ｂｒｏｔｈ）に接種した株のグリセロールストック１ｍｌから開始し、ＯＤ６００が５から７の間になるまで、３０℃でインキュベートした。その振とうフラスコ培養物を使用して、１Ｌ容量のバイオリアクターのそれぞれに無菌的に接種し、接種後の各容器における体積を６５３ｍｌにした。
全ての発酵槽が限定ＦＭ５増殖培地を含有したが、それぞれにおいて、リン酸二水素カリウムおよびリン酸二カリウムの最初の濃度が異なった。各発酵槽におけるバッチ培地中のリン酸塩濃度が表２３に要約されている。そのＦＭ５培地の組成は上記共通の方法セクションに列挙されている。
表２３
各発酵槽内の最初の温度は、３０℃であった。ＩＰＴＧを、ＯＤ６００値が以下の値である場合に最終濃度が２ｍＭになるように加えることによって、誘導をもたらした：発酵槽１、１５．３；発酵槽２、１６．０；発酵槽３、１８．１；発酵槽４、１８．４。上記発酵槽内の残留グルコースが約１０ｇ／Ｌになったら、グルコース供給（ＦＭ３培地およびＦＭ５培地については５００ｇ／Ｌのグルコース溶液からなり、ＦＭ４については、５００ｇ／Ｌのグルコースに加えて７５ｍＭのＭｇＳＯ４からなった）を開始した。その供給速度を調整して、残留グルコースを＞６．５ｇ／Ｌに維持した。誘導の３時間後、温度を、１時間にわたって３７℃にシフトさせた．上記温度シフトを開始した時点で、溶存酸素（ＤＯ）の設定ポイントを２０％の空気飽和から１％の空気飽和に変更した。接種した４８時間後に発酵を停止させた。
各発酵槽のブロスのｐＨを、濃水酸化アンモニウムと水の５０：５０混合物を制御添加することによって７．４に維持した。滅菌濾過した空気を散布することによって溶存酸素を所望のレベルで維持した。光学濃度を測定するため、ならびに３−ＨＰの濃度についてＨＰＬＣ分析するために、試料を取得した。各発酵槽における最大バイオマス濃度および回収時のバイオマス濃度ならびに最大の３−ＨＰの力価が以下の表２４に要約されている。
表２４
（実施例１１Ｄ）
１Ｌの発酵における３−ＨＰの生成
２つの１Ｌ流加発酵実験を、ＢＸ３＿０２４０株を使用して行った。種培養を、振とうフラスコ中、１００ｍＬのＴＢ培地（Ｔｅｒｒｉｆｉｃ Ｂｒｏｔｈ）に接種した株のグリセロールストック１ｍｌから開始し、ＯＤ６００が５から６の間になるまで３０℃でインキュベートした。その振とうフラスコ培養物を使用して１Ｌ容量のバイオリアクターのそれぞれに無菌的に接種し（５％体積／体積）、接種後の各容器における体積を８００ｍＬにした。本実験で使用した発酵槽はＤａｓ Ｇｉｐ流加プロ並行発酵システム（ｐｒｏ
ｐａｒａｌｌｅｌ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ）（ＤＡＳＧＩＰ ＡＧ、Ｊｕｌｉｃｈ、Ｇｅｒｍａｎｙ、ＳＲ０７００ＯＤＬＳモデル）であった。この発酵システムは、溶存酸素（％ＤＯ）、ｐＨ、温度、撹拌、および供給をリアルタイムにモニターし制御することを含んだ。発酵槽１および２は、クエン酸を２．０ｇ／Ｌで加え、ＭｇＳＯ４を０．４０ｇ／Ｌで加えたこと以外は上記共通の方法セクションに示されているように作製した限定ＦＭ５培地を含有した。各発酵槽内の最初の温度は、３０℃であった。ＩＰＴＧを、ＯＤ６００値１７〜１９において最終濃度が２ｍＭになるように加えることによって、誘導をもたらし、これは、接種の１４．５時間後に対応した。上記発酵槽内の残留グルコースが約１ｇ／Ｌになったら、グルコース供給（５００ｇ／Ｌのグルコース溶液からなる）を開始した。その供給速度を調整して、残留グルコースを＞３ｇ／Ｌに維持した。誘導の３時間後、温度を、１時間にわたって３７℃にシフトさせた。その温度シフトを開始した時点で、気流および撹拌をそれぞれ１．０８ｖｖｍおよび１０００ｒｐｍに設定することによって、ＯＴＲを４０ｍｍｏｌ／Ｌ−ｈｒに設定した。２バールに圧縮した空気を空気の供給として使用した。各発酵槽のブロスのｐＨを、ｐＨ滴定剤を制御添加することによっておよそ７．４に維持した。ＩＰＴＧ誘導の２時間後、上記ｐＨ滴定剤を５０％のＮＨ４（ＯＨ）から７．４ＭのＮａＯＨに変更した。光学濃度を測定するため、ならびに３−ＨＰの濃度についてＨＰＬＣ分析するために、試料を取得した。各発酵槽における最大バイオマス濃度および回収時のバイオマス濃度ならびに最大の３−ＨＰの力価が以下の表２５に要約されている。
表２５
以下の表２６に、示した時間において、発酵ブロスにおいて得られた代謝生成物の濃度の概要を、時間を単位として提供する。
表２６（続き）
（実施例１１Ｅ）
１Ｌの発酵における３−ＨＰの生成
４つの１Ｌ流加発酵実験を、ＢＸ３＿０２４０株を使用して行った。種培養を、振とうフラスコ中、１００ｍＬのＴＢ培地（Ｔｅｒｒｉｆｉｃ Ｂｒｏｔｈ）に接種した株のグリセロールストック１ｍｌから開始し、ＯＤ６００が５から６の間になるまで３０℃でインキュベートした。上記振とうフラスコ培養物を使用して１Ｌ容量のバイオリアクターのそれぞれに無菌的に接種し（５％体積／体積）、接種後の各容器における体積を８００ｍｌにした。本実験で使用した発酵槽はＤａｓ Ｇｉｐ流加プロ並行発酵システム（ＤＡＳＧＩＰ ＡＧ、Ｊｕｌｉｃｈ、Ｇｅｒｍａｎｙ、ＳＲ０７００ＯＤＬＳモデル）であった。この発酵システムは、溶存酸素（％ＤＯ）、ｐＨ、温度、撹拌、および供給をリアルタイムにモニターし制御することを含んだ。全ての発酵槽が、クエン酸を２．０ｇ／Ｌで加え、ＭｇＳＯ４を０．４０ｇ／Ｌで加えたこと以外は上記共通の方法セクションに示されているように作製した限定ＦＭ５培地を含有した。各発酵槽内の最初の温度は、３０℃であった。ＩＰＴＧを、ＯＤ６００値１５〜１９において最終濃度が２ｍＭになるように加えることによって、誘導をもたらし、これは接種の１５．７５時間後という時間に対応した。上記発酵槽内の残留グルコースが約３ｇ／Ｌになったら、グルコース供給（５００ｇ／Ｌのグルコース溶液からなる）を開始した。その供給速度を調整して、残留グルコースを＞３ｇ／Ｌに維持した。誘導の３時間後、１時間にわたって温度を３７℃にシフトさせた。各発酵槽のブロスのｐＨを、ｐＨ滴定剤である５０％のＮＨ４（ＯＨ）を制御添加することによっておよそ７．４に維持した。温度シフトを開始した時点で、撹拌および気流を表２７に従って変化させることによって、ＯＴＲを各発酵槽に対して変更した。２バールに圧縮した空気を空気の供給として使用した。光学濃度を測定するため、ならびに３−ＨＰ濃度についてＨＰＬＣ分析するために試料を取得した。各発酵槽における最大バイオマス濃度および回収時のバイオマス濃度ならびに最大の３−ＨＰの力価が以下の表２７に要約されている。
表２７
（実施例１１Ｆ）
１．８Ｌの発酵における３−ＨＰの生成
１．８Ｌの流加発酵実験を、ＢＸ３＿０２４０株を使用して行った。種培養を、振とうフラスコ中、１０５ｍｌのＴＢ培地（Ｔｅｒｒｉｆｉｃ Ｂｒｏｔｈ）に接種した株のグリセロールストック１ｍｌから開始し、ＯＤ６００が５から７の間になるまで３０℃でインキュベートした。その振とうフラスコ培養物９０ｍｌを使用して、バッチ培地中のリン酸塩の濃度が、０．３３ｇ／ＬのＫ２ＨＰＯ４および０．１７ｇ／ＬのＫＨ２ＰＯ４であった以外はＦＭ５増殖培地である培地１．７１Ｌに無菌的に接種した。上記ＦＭ５培地の組成中の他の構成要素は上記共通の方法セクションに列挙されている通りである。発酵槽内の最初の温度は３０℃であった。ＩＰＴＧを、ＯＤ６００値が１５．４６である場合に最終濃度が２ｍＭになるように加えることによって、誘導をもたらした。上記発酵槽内の残留グルコースが約１０ｇ／Ｌになったら、グルコース供給（５００ｇ／Ｌのグルコース溶液からなる）を開始した。その供給速度を調整して、残留グルコースを＞６．５ｇ／Ｌに維持した。誘導の３時間後、温度を１時間にわたって３７℃にシフトさせた。上記温度シフトを開始した時点で、溶存酸素（ＤＯ）設定点を、２０％の空気飽和から１％の空気飽和に変更した。各発酵槽のブロスのｐＨを、濃水酸化アンモニウムと水の５０：５０混合物を制御添加することによって７．４に維持した。溶存酸素を、滅菌濾過した空気を散布することによって所望のレベルに維持した。光学濃度を測定するため、ならびに３−ＨＰ濃度についてＨＰＬＣ分析するために試料を取得した。最大の最終バイオマス濃度は、９．８４ｇ／Ｌであり、最大の３−ＨＰの力価は４８．４ｇ／Ｌであり、グルコースからの最終収率は、グルコース１ｇ当たり０．５３ｇの３−ＨＰであった。
（実施例１２）
３−ＨＰの生成をさらに評価するための株の構築
以下の表２８に示されているそれぞれの組み合わせに従って、本明細書に記載のプラスミド（例えば、実施例１を参照されたい）をそれぞれの株に導入した。全てのプラスミドを、標準の方法を使用して、電気穿孔によって同時に導入した。形質転換された細胞を、抗生物質を補充した適切な培地で増殖させ、選択培地におけるそれらの適切な増殖に基づいてコロニーを選択した。表２８に要約されている通り、ｍｃｒ発現プラスミドである、ｐＴｒｃ−ｐｔｒｃ−ｍｃｒまたはｐＡＣＹＣ（ｋａｎ）−ｐｔａｌＡ−ｍｃｒを、上記共通の方法セクションに記載の通りＧｅｎｅ Ｂｒｉｄｇｅｓ技術を使用して導入した追加の染色体の修飾を含むＥ．ｃｏｌｉのＢＷ２５１１３（Ｆ−、Δ（ａｒａＤ−ａｒａＢ）５６７、ΔｌａｃＺ４７８７（：：ｒｒｎＢ−３）、ｌａｍｂａ−、ｒｐｈ−１、Δ（ｒｈａＤ−ｒｈａＢ）５６８、ｈｓｄＲ５１４）から得られた２つの株へと形質転換した。ＢＸ＿０５９０株は、ｌｄｈＡ遺伝子、ｐｆｌＢ遺伝子、ｍｇｓＡ遺伝子、およびｐｏｘＢ遺伝子の追加の欠失を含む。ＢＸ＿０５９１株は、ＢＸ＿０５９０株の追加の欠失およびａｃｋ＿ｐｔａ遺伝子の追加の欠失を含む。その後に、形質転換体を、適切に組み合わせた抗生物質を含有する培地において選択した。
表２８
（実施例１２Ａ）
評価用の追加の株の構築
パート１：遺伝子欠失
本明細書の他の箇所に記載のとおりのＲｅｄ／ＥＴ組換えを使用する相同組換え方法を、Ｅ．ｃｏｌｉ株において遺伝子欠失させるために使用した。この方法は当業者に公知であり、Ｓｔｅｗａｒｔらに発行され、この方法のその教示に関して参照により本明細書に組み込まれている米国特許第６，３５５，４１２号および同第６，５０９，１５６号に記載されている。そのような方法のための材料およびキットは、Ｇｅｎｅ Ｂｒｉｄｇｅｓ（Ｇｅｎｅ Ｂｒｉｄｇｅｓ ＧｍｂＨ、Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ（以前はＤｒｅｓｄｅｎ）、Ｇｅｒｍａｎｙ、＜＜ｗｗｗ．ｇｅｎｅｂｒｉｄｇｅｓ．ｃｏｍ＞＞）から入手可能であり、この方法は、製造者の指示に従って進められた。この方法により、λファージ由来のリコンビナーゼによって成される相同組換えを介して標的遺伝子が選択マーカーで置き換えられる。λ−ｒｅｄリコンビナーゼを発現する宿主生物体を、標的遺伝子またはプロモーターの配列と相同な末端領域（一般に約５０ｂｐ、あるいは最大約３００ｂｐ）が隣接する選択マーカーをコードする直鎖ＤＮＡ産物で形質転換する。その後、そのマーカーは、ＦＬＰ−リコンビナーゼ、またはＣｒｅなどの別のリコンビナーゼを保有するプラスミドベクターによって成される別の組換え工程によって除去される。
特定の欠失を保有するＫｅｉｏ株を、以下に明記されている通りのプライマーを用いるＰＣＲを使用して増幅することにより特異的な欠失を構築した。そのＫｅｉｏ集団を、Ｏｐｅｎ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ、ＡＬ ＵＳＡ ３５８０６）から得た。個々のクローンは、Ｙａｌｅ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｓｔｏｃｋ Ｃｅｎｔｅｒ（Ｎｅｗ Ｈａｖｅｎ、ＣＴ ＵＳＡ ０６５２０）から購入することができる。これらの株は、それぞれ、欠失した遺伝子の代わりにカナマイシンマーカーを含有する。所望の欠失、例えばａｃｋＡ−ｐｔａがＫｅｉｏ株にない場合、上に記載の組換え方法によって、カナマイシン抵抗性マーカーを使用して欠失を構築して欠失した配列を置き換え、その後欠失を有するカナマイシン抵抗性クローンを選択した。ＰＣＲ生成物を上記の組換え方法を使用して標的の株に導入した。欠失の組み合わせを逐次的に生成して、この実施例の以下のパートに記載のとおりの株を得た。
表２９
表３１に、このパートの方法に従って欠失を含む遺伝子型を有する株を示す。
パート２：ｆａｂＩ突然変異を有するＢＷ＿５９５株およびＢＷ＿６５１株の構築
細胞が非許容温度（３７℃）で増殖する場合、Ｅ．ｃｏｌｉのＪＰ１１１１株におけるｆａｂＩｔｓ突然変異（Ｓｅｒ２４１→Ｐｈｅ）により、マロニルＣｏＡ濃度が著しく増加し、したがって、この温度でより多くの３−ＨＰが生成する。しかし、ＪＰ１１１１は、ＮＴＧ変異誘発の生成物であり、したがって未知の変異を有する可能性があり、ストリンジェンシー調節因子であるｒｅｌＡおよびｓｐｏＴに突然変異を保有し、Ｈｆｒ因子が存在することによってコンジュゲーション傾向が増強されているので、ＪＰ１１１１は試験的な規模および商業的な規模に移行するための理想的な株ではない。したがって上記ｆａｂＩｔｓ突然変異を、追加の突然変異、ΔｌｄｈＡ、ΔｐｆｌＢ、ΔｍｇｓＡ、ΔｐｏｘＢ、Δｐｔａ−ａｃｋを保有する、よく特徴付けられたＢＷ２３１１５から開発された株であるＢＸ＿５９１株に移動した。これらの突然変異は、上のパート１に記載の遺伝子欠失方法を逐次的に適用することによって起こった。
６００ｂｐの上流ＤＮＡ配列および下流ＤＮＡ配列を有するｆａｂＩｔｓ遺伝子をＪＰ１１１１のゲノムＤＮＡから、以下のプライマーを使用したＰＣＲによって単離した：
次いで、ＦＲＴ：：ｋａｎ：：ＦＲＴカセットを上記ｆａｂＩｔｓの下流のＳｍａＩ部位に挿入してプラスミドｐＳＭＡＲＴ（ＨＣ）ａｍｐ＿ｆａｂＩｔｓ＿ＦＲＴ：：ｋａｎ：：ＦＲＴを生成した。このプラスミドを鋳型ＤＮＡとして使用し、以下のプライマー：
の間の領域を、ＫＯＤ ＨＳ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｏｖａｇｅｎ）を使用してＰＣＲにおいて増幅した。その反応物をＤｐｎＩで処理してプラスミド鋳型を断片化し、その増幅断片を、ＤＮＡ Ｃｌｅａｎ ａｎｄ Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒキット（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｏｒａｎｇｅ、ＣＡ）を使用してゲル精製し、回収した。ＢＸ＿５９１株をｐＳＩＭ５（Ｄａｔｔａ、Ｓ．，ら、Ｇｅｎｅ、３７９巻：１０９〜１１５頁、２００６年）で形質転換し、このプラスミドに保有されるラムダｒｅｄ遺伝子の発現を、４２℃で１５分間インキュベートすることによって誘導した。
エレクトロコンピテント細胞を、標準の方法によって作製した。これらの細胞を、ｆａｂＩｔｓ＿ＦＲＴ：：ｋａｎ：：ＦＲＴカセットを担持する増幅断片で形質転換し、３０℃で３５μｇ／ｍｌのカナマイシンを含有するＬＢプレート上で形質転換体のコロニーを単離した。個々のコロニーを再画線によって精製し、液体培地中、３０℃でおよび４２℃で増殖させることによって温度感受性について試験した。野生型の親株と比較して、ｆａｂＩｔｓ対立遺伝子を担持する株は４２℃における増殖は不十分であったが、３０℃では匹敵する増殖を示した。ＦＲＴ：：ｋａｎ：：ＦＲＴマーカーが正確に挿入されたことを、コロニーＰＣＲによって検証し、ｆａｂＩｔｓｋａｎＲ株をＢＸ＿５９４と名付けた。
プラスミドにおいてｋａｎＲマーカーを使用することを可能にするために、ｆａｂＩｔｓに近接する染色体に組み入れられたマーカーを、ゼオシンに対する抵抗性をコードするＤＮＡ断片と交換した。そのｚｅｏＲ遺伝子を、プラスミドｐＪ４０２（ＤＮＡ２．０、Ｍｅｎｌｏ Ｐａｒｋ、ＣＡ）から、以下のプライマーを使用して、ＰＣＲによって増幅した：
その反応物を、上記の通りＤｐｎＩで処理し、ゲル精製した。ＢＸ＿５９４株をｐＫＤ４６で形質転換し（ＤａｔｓｅｎｋｏおよびＷａｎｎｅｒ、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ、９６巻：６６４０〜６６４５頁、２０００年）、このプラスミドに保有されるラムダｒｅｄ遺伝子を、Ｌ−アラビノースを２時間にわたって１ｍＭになるように添加することによって誘導した。エレクトロコンピテント細胞を、標準の方法によって作製した（例えば、ＳａｍｂｒｏｏｋおよびＲｕｓｓｅｌｌ、２００１年）。これらの細胞を、ｚｅｏＲ断片で形質転換し、形質転換体を、ＮａＣｌを伴わず、２５μｇ／ｍＬのゼオシンを伴って調合したＬＢプレート上で選択した。プレートを、アルミ箔に包むことによって暗所に保ち、３０℃でインキュベートした。この方法によって単離したゼオシン抵抗性カナマイシン感受性株をＢＸ＿５９５と名付けた。上記ｆａｂＩｔｓ対立遺伝子が保持されていることを、上記の通り増殖させることによって確認した。
ＢＸ＿６５１株を、ｆａｂＩｔｓ−ｚｅｏＲカセットをＢＸ＿５９５から、代謝に関わる遺伝子の突然変異を保有しないＢＷ２５１１３株に移動させることによって構築した。このカセットを保有するＤＮＡ断片を、ＢＸ＿５９５の染色体ＤＮＡ、およびプライマーＦＷ０４３（上記を参照されたい）および
を使用してＰＣＲによって得た。
そのＰＣＲ生成物を、ＤＮＡ Ｃｌｅａｎ ａｎｄ Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒキット（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｏｒａｎｇｅ、ＣＡ）を使用して精製し、濃縮した。ＢＷ２５１１３株を、ｐＲｅｄＤ／ＥＴ（Ｇｅｎｅ Ｂｒｉｄｇｅｓ ＧｍＢＨ、Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）で形質転換し、このプラスミドに保有されるラムダｒｅｄ遺伝子を、Ｌ−アラビノースを２時間にわたって５ｍＭになるように添加することによって誘導した。エレクトロコンピテント細胞を標準の方法によって作製し、ｆａｂＩｔｓ−ｚｅｏＲ ＤＮＡ断片で形質転換した。形質転換体を、上記の通りゼオシン上に播き、上記の通り３０℃および４２℃で増殖させることによって温度感受性対立遺伝子を担持するクローンを検証した。
パート３：染色体中の選択された遺伝子に対するプロモーターの置き換え
本明細書の他の箇所に記載の相同組換え方法を使用して、種々の遺伝子のプロモーターを置き換えた。言及した通り、Ｒｅｄ／ＥＴ組換えの使用は当業者に公知であり、Ｓｔｅｗａｒｔらに発行され、この方法についてのその教示に関して参照により本明細書に組み込まれている米国特許第６，３５５，４１２号および同第６，５０９，１５６号に記載されている。そのような方法のための材料およびキットは、Ｇｅｎｅ Ｂｒｉｄｇｅｓ（Ｇｅｎｅ Ｂｒｉｄｇｅｓ ＧｍｂＨ、Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ、＜＜ｗｗｗ．ｇｅｎｅｂｒｉｄｇｅｓ．ｃｏｍ＞＞）から入手可能であり、この方法は、製造者の指示に従って進めることができる。この方法は、標的遺伝子（または、この場合、プロモーター領域）を、λファージ由来のリコンビナーゼによって成される相同組換えを介して選択マーカーにより置き換えることを含む。λ−ｒｅｄリコンビナーゼを発現する宿主生物体を、上記標的遺伝子またはプロモーターの配列と相同な末端領域（一般に約５０ｂｐ、あるいは最大約３００ｂｐ）が隣接する選択マーカーをコードする直鎖ＤＮＡ産物で形質転換する。次いで、そのマーカーを、ＦＬＰ−リコンビナーゼ、またはＣｒｅなどの別のリコンビナーゼを保有するプラスミドベクターによって成される別の組換え工程によって除去することができる。この方法を製造者の指示に従って使用した。それぞれ、示されている対象遺伝子に対するネイティブなプロモーターを所望の交換プロモーターで置き換えるための組換えを実現するための末端配列を含む鋳型配列、および抗生物質マーカー配列は、外部の製造者（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ、ＩＡ）が合成した。これらの配列は、これらの遺伝子の前のネイティブなプロモーターをＴ５プロモーターで置き換えるように設計する。そのＴ５−ａｃｅＥＦカセット（配列番号８６３）は、ｌｏｘＰ部位が隣接するゼオシン抵抗性カセットも含む。Ｔ５−ｐｎｔＡＢカセット（配列番号８６４）、Ｔ５−ｕｄｈＡカセット（配列番号８６５）およびＴ５−ｃｙｎＴＳ（配列番号８６６）カセットは、それぞれ、ｌｏｘＰ部位が隣接するブラスチシジン抵抗性カセットを含む。また、Ｔ５−ｃｙｎＴＳ（配列番号８６６）は、Ｌａｍｂｅｒｔら、ＡＥＭ ７３巻（４号）１１２６〜１１３５頁と一致する修飾されたｌｏｘＰ部位を含む。
各カセットは、まず、プライマーＣＡＧＴＣＣＡＧＴＴＡＣＧＣＴＧＧＡＧＴＣ（配列番号８６１）、およびＡＣＴＧＡＣＣＡＴＴＴＡＡＡＴＣＡＴＡＣＣＴＧＡＣＣ（配列番号８６２）を使用してＰＣＲ生成物を産生するためのＰＣＲ増幅の鋳型として使用される。このＰＣＲ生成物を、電気穿孔（本明細書の他の箇所に記載のものなどの標準の方法を使用して）および上記のＧｅｎｅ ＢｒｉｄｇｅｓのＲｅｄ／ＥＴ組換え方法に従ったゲノムへの組換えのために使用する。形質転換した後、陽性の組換え体を、抗生物質のゼオシンまたはブラスチシジンを含有する培地で選択する。抵抗性マーカーを取り除くことは、標準の方法に従ってＣｒｅ−リコンビナーゼを発現させることによって実現される。表３１に、置き換えられたプロモーターを含む遺伝子型を有する株を示す。これらは、影響を受けた遺伝子（複数可）の前に「Ｔ５」を付けて示されている。
パート４：プラスミドの構築
以下の表に、下記の株において使用したプラスミドの構築が要約されている。そのプラスミドを作製するために、対象のそれぞれの遺伝子または遺伝子領域を、その遺伝子を保有する適切な供給源をＰＣＲ増幅し制限酵素（ＲＥ）消化すること、または直接制限酵素消化することのいずれかによって単離した。次いで、その単離した遺伝子を所望のベクターにライゲーションし、Ｅ．ｃｏｌｉ １０Ｇ（Ｌｕｃｉｇｅｎ、Ｍｉｄｄｌｅｔｏｎ、ＷＩ）コンピテント細胞へと形質転換し、制限酵素マッピングによってスクリーニングし、標準の分子生物学の手順を使用したＤＮＡ配列決定によって確認した（例えば、ＳａｍｂｒｏｏｋおよびＲｕｓｓｅｌｌ、２００１年）。
これらのプラスミドの中には、単機能性マロニルＣｏＡ還元酵素活性を含むものもあることに留意する。具体的には、Ｃ．ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ由来のマロニルＣｏＡ還元酵素の切断構成部分を、それぞれ、ｐＴＲＣ−ｐｔｒｃ−ｍｃｒ−ａｍｐ由来のコドン最適化されたマロニルＣｏＡ還元酵素のアミノ酸残基３６６および１２２０、ならびに４９６および１２２０をコードするヌクレオチド塩基に近接するＰＣＲプライマーを使用することによって構築した。また、Ｅｒｙｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ種由来のマロニルＣｏＡ還元酵素を別のプラスミドに組み入れた。他のプラスミドに関しては、これらを株に組み入れ、下記の通り評価した。
表３０
＊Ａ： Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ， Ｃａｒｌｓｂａｄ， ＣＡ； ＊Ｂ： Ｎｅｗ
Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ， Ｉｐｓｗｉｃｈ， ＭＡ； ＊ Ｃ： ＤＮＡ ２．０， Ｍｅｎｌｏ Ｐａｒｋ， ＣＡ。
パート５：ｐＡＣＹＣ−ｃａｔ−ａｃｃＡＢＣＤ−ＰＴ５−ｕｄｈＡのクローニング
ｐＡＣＹＣ−ｃａｔ−ａｃｃＡＢＣＤ−ｕｄｈＡにおけるｕｄｈＡの発現を誘導するＰｔａｌプロモーターを、より強力なＴ５プロモーターと置き換えた。ＢＸ＿００６３５株由来のゲノムＰＴ５−ｕｄｈＡ構築物を、プライマーＡＳ１１７０（ｕｄｈＡの３００ｂｐ上流）を使用して増幅した。ｕｄｈＡの配列については配列番号８８６を参照されたい。上で得られたＰＴ５−ｕｄｈＡのＰＣＲ断片をＰｍｅＩおよびＮｄｅＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ、Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ）で消化した。ベクターｐＡＣＹＣ−ｃａｔ−ａｃｃＡＢＣＤ−Ｐｔａｌ−ｕｄｈＡを同様にＳｗａＩおよびＮｄｅＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ）で消化した。２つの消化されたＤＮＡ断片をライゲーションし、形質転換してｐＡＣＹＣ−ｃａｔ−ａｃｃＡＢＣＤ−ＰＴ５−ｕｄｈＡ（配列番号８８７）を創製した。プラスミド消化物を使用して、正確な配列を確認した。このプラスミドを、表３１に示されている株に組み入れる。
パート６：株の構築
上記の方法によって作製した構築物を使用して、表３１に示されている、遺伝子型をもたらす株を生成し、示されている株名を与えた。これは、限定されるものではなく、他の株を、これらの方法を使用し、耐性について異なる遺伝子および遺伝子領域、および／または３−ＨＰの生成および脂肪酸合成酵素系を調節するための改変をもたらすことを含めた、本出願で提供される教示に従って作製することができる。後者に付け加えて、そのような株は、染色体を修飾すること、および／または非染色体性の導入、例えばプラスミドを導入することによって生成することができる。
後者に関しては、以下の表３８に示されているそれぞれの組み合わせに従って、上記のプラスミドをそれぞれの株に導入した。全てのプラスミドを、標準の方法を使用して、電気穿孔によって同時に導入した。形質転換された細胞を、抗生物質を補充した適切な培地で増殖させ、選択培地におけるそれらの適切な増殖に基づいてコロニーを選択した。
表３１
（実施例１２Ｂ）
対照Ｅ．ｃｏｌｉ細胞と比較して３−ＨＰの生成を増加させるための、マロニルＣｏＡ還元酵素（Ｍｃｒ）を他の遺伝子改変と組み合わせて含む遺伝子改変されたＥ．ｃｏｌｉ宿主細胞の調製（予測的）
遺伝子改変を行って、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｕｒｕｇｉｎｏｓ由来のものなどのｍｍｓＢを含むベクターを導入し、それをさらにＥ．ｃｏｌｉに対してコドン最適化する。ｇａｌＰおよびネイティブなｐｐｃまたは突然変異ｐｐｃを含むベクターも、当業者に公知の方法によって導入し（例えば、ＳａｍｂｒｏｏｋおよびＲｕｓｓｅｌｌ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第３版、２００１年（１〜３巻）、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．、「ＳａｍｂｒｏｏｋおよびＲｕｓｓｅｌｌ、２００１年」を参照されたい）、突然変異は、ＸＬ１−Ｒｅｄ変異誘発株を使用した方法によって、適切な材料を使用し、製造者の指示に従って行い（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ Ｊｏｌｌａ、ＣＡ ＵＳＡ）、標準のプロトコールの下で選択またはスクリーニングすることができることがさらに認識される。
同様に、Ｅ．ｃｏｌｉ遺伝子の酵素活性を所望の通り低減させる、または排除するために遺伝子改変を行う。これらの遺伝子改変は、Ｇｅｎｅ Ｂｒｉｄｇｅｓ（Ｇｅｎｅ Ｂｒｉｄｇｅｓ ＧｍｂＨ、Ｄｒｅｓｄｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ、ｗｗｗ．ｇｅｎｅｂｒｉｄｇｅｓ．ｃｏｍ）から供給されるキットを製造者の指示に従って用いてＲＥＤ／ＥＴ相同組換え方法を使用することによって実現される。
また、一部の実施形態では、ＮＡＤＰＨの細胞プールを増加させるために遺伝子改変を行う。本明細書では遺伝子改変のためのいくつかの標的の非限定的な例が提供される。これらは、ｐｇｉ（突然変異型で）、過剰発現したｐｎｔＡＢ、ｇａｐＡ：ｇａｐＮの置換／交換、ならびにｓｔｈＡなどの可溶性トランスヒドロゲナーゼの破壊または修飾、ならびにｚｗｆ、ｇｎｄ、およびｅｄｄの１つ以上の遺伝子改変である。
任意のそのような設計製作された実施形態のそのように遺伝子改変した微生物を評価し、それが、上記遺伝子改変を欠く対照Ｅ．ｃｏｌｉと比較して高い３−ＨＰの生産性を示すことが見出された。生産性は、同様の培養条件下で容積生産性（１時間当たりの３−ＨＰのグラム）などの標準の計量によって測定する。
（実施例１２Ｃ）
選択されたポリヌクレオチドの突然変異発生（予測的）
選択された遺伝子配列、例えば配列番号７８３〜７９１のいずれかをコードする核酸配列を、エラー誘発ＰＣＲ部位特異的変異誘発法を使用することによって、ネイティブなポリヌクレオチドまたは以前進化させた、かつ／またはコドン最適化したポリヌクレオチドの変異体ライブラリーを構築することから始める突然変異発生プロトコールに供する。
選択された遺伝子（これは、本明細書に開示されている任意のもの、例えば、アミノトランスフェラーゼまたはｍｍｓＢであってよい）の酵素活性を示すポリヌクレオチドを、Ｅ．ｃｏｌｉに適した発現系にクローニングする。この配列は、コドン最適化することができる。コドン最適化したポリヌクレオチドのクローニングおよびその適切な発現は、商業的な供給者から供給される遺伝子合成によって、標準の技法を使用して実現される。その遺伝子を、８アミノ酸のＣ末端タグを用いて合成し、親和性に基づくタンパク質精製を可能にする。標準の方法論を使用して遺伝子を得たら、その遺伝子を標準の技法を使用して発現系にクローニングする。
上記のポリヌクレオチドを含有するプラスミドを、標準の方法によって突然変異させ、変異体の大きなライブラリー（＞１０６）をもたらす。その変異体の配列をこれらのプラスミドから切り出し、発現ベクターに再度クローニングし、後でスクリーニングするための１０６個を超えるクローンの最終ライブラリーを作製する。これらの数により、上記ライブラリーが、配列がコードするあらゆるアミノ酸において突然変異を含有する確率が９９％を超えることが確実になる。突然変異ライブラリーを創製する方法のそれぞれが、Ｅ．ｃｏｌｉの変異誘発株への形質転換、エラープローンＰＣＲ、さらに、より多くの部位特異的な変異誘発（ｍｕａｇｅｎｅｓｉｓ）を含めた、それ独特の偏りを有することが認められている。
一部の実施形態では、様々な方法を考察することができ、いくつかを平行して探究することが可能である。そのような方法の１つは、正確なＤＮＡ複製に必要である特定の修復機構が欠損しており、プラスミドにおいて、野生型の突然変異率の５，０００倍の率で突然変異を生じ、適切な材料を使用し、製造者の指示に従って使用することができるＸＬ１−Ｒｅｄ変異誘発株の使用である（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ Ｊｏｌｌａ、ＣＡ ＵＳＡを参照されたい）。この技法または当業者に公知の他の技法を使用することができ、そこで、そのような変異体の集団を、例えば、ライブラリーにおいて、例えばスクリーニングまたは選択方法によって評価して、適切なまたは好都合な突然変異を有するクローンを同定することができる。
変異体ライブラリーの構築が上手くいくと、このライブラリーを活性の増加、例えばマロニルＣｏＡ還元酵素活性の増加についてスクリーニングすることが可能になる。スクリーニングプロセスを設計して、１０６個を超える変異体のライブラリー全体をスクリーニングする。これは、特定の酵素反応に適したスクリーニング方法によって行う。
（実施例１３）
実施例１２の株を使用した３−ＨＰの生成の評価
ＢＸ３＿０１９４による３−ＨＰの生成が、１００ｍＬ規模のＳＭ３（最少塩）培地において実証された。標準作業方法（ＳａｍｂｒｏｏｋおよびＲｕｓｓｅｌｌ、２００１年）によって冷凍ストックを１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを加えたＬＢ培地５０ｍＬ中に入れて培養を開始し、３７℃で一晩、２２５ｒｐｍで回転させながら静止期まで増殖させた。この培養物５ｍｌを、３連の２５０ｍｌのバッフルフラスコ中、４０ｇ／Ｌのグルコース、１００μｇ／ｍＬのアンピシリンおよび１ｍＭのＩＰＴＧを加えたＳＭ３培地１００ｍｌに移し、３７℃、２２５ｒｐｍでインキュベートした。これらの培養物による細胞の増殖および３−ＨＰの生成をモニターするために、６００ｎｍにおける光学濃度（ＯＤ６００、光路長１ｃｍ）を測定するために、指定の時点で試料（２ｍｌ）を抜き取り、１２，０００ｒｐｍで５分間遠心分離することによってペレットにし、上記共通の方法セクションにおける「３−ＨＰの生成についての培養物の分析」の下で記載されている通り、３−ＨＰの生成を分析するために上清を回収した。乾燥細胞重量（ＤＣＷ）を、ＯＤ６００を決定するためのベースラインのＤＣＷに基づいて、測定されたＯＤ６００値の０．３３倍として算出する。全てのデータは、３連の培養物の平均である。比較する目的で、２４時間の時点で平均したデータから比生産性を算出し、ＤＣＷ１ｇ当たりの、生成された３−ＨＰのｇとして表す。これらの条件下で、およそ１．０ｇ ＤＣＷに対応するＯＤ６００まで増殖する培養物において２４時間後に３−ＨＰは生成されない。ＳＭ３培地における、ＢＸ３＿０１９４株による３−ＨＰの生成が表３２に示されている。
表３２．ＳＭ３培地におけるＢＸ３＿０１９４による３−ＨＰの生成
ＳＭ３培地における、１０μｇ／ｍｌのセルレニンの存在下でのＢＸ３＿０１９４株による生成が、表３３に示されている。セルレニンの存在下で、脂肪酸合成酵素系の阻害物質、マロニルＣｏＡ前駆体の内部のプールが増加し、したがって３−ＨＰの生成が増加することが提唱されている。セルレニンがない場合の結果と比較することによって認めることができるように（表３２）、どの時点においても実質的に多い３−ＨＰが生成する。これらの条件下で、２４時間後の比生産性は、ＤＣＷ１ｇ当たり１．３ｇの３−ＨＰである。
表３３．１０μｇ／ｍｌのセルレニンが存在するＳＭ３培地におけるＢＸ３＿０１９４による３−ＨＰの生成
ＢＸ３＿０１９５による３−ＨＰの生成が、１００ｍＬ規模のＳＭ３（最少塩）培地において実証された。標準作業方法（ＳａｍｂｒｏｏｋおよびＲｕｓｓｅｌｌ、２００１年）によって冷凍ストックを１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを加えたＬＢ培地５０ｍＬ中に入れて培養を開始し、３７℃で一晩、２２５ｒｐｍで回転させながら静止期まで増殖させた。この培養物５ｍｌを、３連の２５０ｍｌのバッフルフラスコ中、４０ｇ／Ｌのグルコース、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンおよび１ｍＭのＩＰＴＧを加えたＳＭ３培地１００ｍｌに移し、３７℃、２２５ｒｐｍでインキュベートした。これらの培養物による細胞の増殖および３−ＨＰの生成をモニターするために、６００ｎｍにおける光学濃度（ＯＤ６００、光路長１ｃｍ）を測定するために、指定の時点で試料（２ｍｌ）を抜き取り、１２，０００ｒｐｍで５分間遠心分離することによってペレットにし、上記共通の方法セクションにおける「３−ＨＰの生成についての培養物の分析」の下で記載されている通り、３−ＨＰの生成を分析するために上清を回収した。乾燥細胞重量（ＤＣＷ）を、ＯＤ６００を決定するためのベースラインのＤＣＷに基づいて、測定されたＯＤ６００値の０．３３倍として算出する。全てのデータは、３連の培養物の平均である。比較する目的で、２４時間の時点で平均したデータから比生産性を算出し、ＤＣＷ１ｇ当たりの、生成された３−ＨＰのｇとして表す。これらの条件下で、およそ１．６５ｇ ＤＣＷに対応するＯＤ６００まで増殖している培養物において２４時間後に３−ＨＰは生成しない。ＳＭ３培地におけるＢＸ３＿０１９５株による３−ＨＰの生成が表３４に示されている。
表３４．ＳＭ３培地におけるＢＸ３＿０１９５による３−ＨＰの生成
ＳＭ３培地における、１０μｇ／ｍＬのセルレニンの存在下でのＢＸ３＿０１９５株による生成が表３５に示されている。セルレニンの存在下で、脂肪酸合成酵素系の阻害物質、マロニルＣｏＡ前駆体の内部のプールが増加し、したがって３−ＨＰの生成が増加することが提唱されている。セルレニンがない場合の結果と比較することによって認めることができるように（表３４）、どの時点においても実質的に多い３−ＨＰが生成する。これらの条件下で、２４時間後の比生産性は、ＤＣＷ１ｇ当たり０．５４ｇの３−ＨＰである。
表３５．１０μｇ／ｍｌのセルレニンが存在するＳＭ３培地におけるＢＸ３＿０１９５による３−ＨＰの生成
ＢＸ３＿０２０６による３−ＨＰの生成が、１００ｍＬ規模のＳＭ３（最少塩）培地において実証された。標準作業方法（ＳａｍｂｒｏｏｋおよびＲｕｓｓｅｌｌ、２００１年）によって、冷凍ストックを、３５μｇ／ｍＬのカナマイシンを加えたＬＢ培地５０ｍＬ中に入れて培養を開始し、３７℃で一晩、２２５ｒｐｍで回転させながら静止期まで増殖させた。この培養物５ｍｌを、３連の２５０ｍｌのバッフルフラスコ中、４０ｇ／Ｌのグルコースおよび３５μｇ／ｍｌのカナマイシンを加えたＳＭ３培地１００ｍｌに移し、３７℃、２２５ｒｐｍでインキュベートした。これらの培養物による細胞の増殖および３−ＨＰの生成をモニターするために、６００ｎｍにおける光学濃度（ＯＤ６００、光路長１ｃｍ）を測定するために、指定の時点で試料（２ｍｌ）を抜き取り、１２，０００ｒｐｍで５分間遠心分離することによってペレットにし、上記共通の方法セクションにおける「３−ＨＰの生成についての培養物の分析」の下で記載されている通り、３−ＨＰの生成を分析するために上清を回収した。乾燥細胞重量（ＤＣＷ）を、ＯＤ６００を決定するためのベースラインのＤＣＷに基づいて、測定されたＯＤ６００値の０．３３倍として算出する。全てのデータは、３連の培養物の平均である。比較する目的で、２４時間の時点で平均したデータから比生産性を算出し、ＤＣＷ１ｇ当たりの、生成された３−ＨＰのｇとして表す。これらの条件下で、２４時間後の比生産性は、ＤＣＷ１ｇ当たり０．０５ｇの３ＨＰである。ＳＭ３培地におけるＢＸ３＿０２０６株による３−ＨＰの生成が表３６に示されている。
表３６．ＳＭ３培地におけるＢＸ３＿０２０６による３−ＨＰの生成
ＳＭ３培地における、１０μｇ／ｍｌのセルレニンの存在下でのＢＸ３＿０２０６株による生成が表３７に示されている。セルレニンの存在下で、脂肪酸合成酵素系の阻害物質マロニルＣｏＡ前駆体の内部のプールが増加し、したがって３−ＨＰの生成が増加することが提唱されている。セルレニンがない場合の結果と比較することによって認めることができるように（表３６）、２４時間後に、実質的に多い３−ＨＰが生成する。これらの条件下で、２４時間後の比生産性は、ＤＣＷ１ｇ当たり０．２０ｇの３ＨＰであり、これはセルレニンがない場合の結果と比較しておよそ４０倍増加している。
表３７．１０μｇ／ｍＬのセルレニンが存在するＳＭ３培地におけるＢＸ３＿０１９５による３−ＨＰの生成
（実施例１３Ａ）
３−ＨＰの生成についての株の評価
以下の表に列挙されている生体触媒（株）における３−ＨＰの生成が、１００ｍＬ規模のＳＭ３（最少塩）培地において実証された。使用したＳＭ３は、上記共通の方法セクションの下に記載されているが、２００ｍＭのＭＯＰＳを補充した。培養は、標準作業方法（ＳａｍｂｒｏｏｋおよびＲｕｓｓｅｌｌ、２００１年）によって、抗生物質を含有するＬＢプレートの、示されている通り適切な抗生物質を加えたＴＢ培地５０ｍＬ中から開始し、３０℃で一晩、２５０ｒｐｍで回転させながら静止期まで増殖させた。この培養物５ｍｌを、３連の２５０ｍｌのバッフルフラスコ中、３０ｇ／Ｌのグルコース、抗生物質および１ｍＭのＩＰＴＧ（「誘導」の欄において「あり」と特定されている）を加えたＳＭ３培地１００ｍｌに移し、３０℃、２５０ｒｐｍでインキュベートした。フラスコを、４時間後に３７℃、２５０ｒｐｍにシフトさせた。これらの培養物による細胞の増殖および３−ＨＰの生成をモニターするために、６００ｎｍにおける光学濃度（ＯＤ６００、光路長１ｃｍ）を測定するために、２４時間の時点で試料（２ｍｌ）を抜き取り、１４０００ｒｐｍで５分間遠心分離することによってペレットにし、上記共通の方法セクションにおける「３−ＨＰの生成についての培養物の分析」の下で記載されている通り、３−ＨＰの生成を分析するために上清を回収した。３−ＨＰの力価および標準偏差は、ｇ／Ｌとして表されている。乾燥細胞重量（ＤＣＷ）を、ＯＤ６００を決定するごとのベースラインのＤＣＷに基づいて、測定されたＯＤ６００値の０．３３倍として算出する。全てのデータは、３連の培養物の平均である。比較する目的で、生成物対細胞比を２４時間にわたって平均したデータから算出し、ＤＣＷ１ｇ当たりの、生成された３−ＨＰのｇとして表す。比生産性を、生成の２０時間にわたって得られた細胞／生成物比から算出し、１時間当たり、ＤＣＷ１ｇ当たりの、生成された３−ＨＰのｇとして表す。
表３８
（実施例１３Ｂ）
炭酸塩の添加を用いたＢＸ３＿２４０株の評価
Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＸ３＿２４０（上記の方法によって作製した）における３−ＨＰの生成を、炭酸ナトリウムを添加した１００ｍＬ規模のＳＭ３（最少塩）培地において評価した。使用したＳＭ３は、上記共通の方法セクションの下に記載されており、それには処理剤として１０ｍＭ、２０ｍＭおよび５０ｍＭのＮａ２ＣＯ３を添加した。培養は、標準作業方法（ＳａｍｂｒｏｏｋおよびＲｕｓｓｅｌｌ、２００１年）によって、抗生物質を含有するＬＢプレートの、適切な抗生物質ｋａｎおよびｃａｔを加えたＴＢ培地５０ｍＬ中から開始し、３０℃で一晩、２５０ｒｐｍで回転させながら静止期まで増殖させた。この培養物５ｍｌを、３連の２５０ｍｌのバッフルフラスコ中、３０ｇ／Ｌのグルコース、抗生物質、示されている炭酸ナトリウム、０．１％の酵母抽出物および１ｍＭのＩＰＴＧを加えたＳＭ３培地１００ｍｌに移し、３０℃、２５０ｒｐｍでインキュベートした。フラスコを、４時間後に３７℃、２５０ｒｐｍにシフトさせた。これらの培養物による細胞の増殖および３−ＨＰの生成をモニターするために、６００ｎｍにおける光学濃度（ＯＤ６００、光路長１ｃｍ）を測定するために、２４時間、４８時間および６０時間の時点で試料（２ｍｌ）を抜き取り、１４０００ｒｐｍで５分間遠心分離することによってペレットにし、上記共通の方法セクションにおける「３−ＨＰの生成についての培養物の分析」の下で記載されている通り、３−ＨＰの生成を分析するために上清を回収した。３−ＨＰの力価および標準偏差は、ｇ／Ｌで表されている。乾燥細胞重量（ＤＣＷ）を、ＯＤ６００を決定するごとのベースラインのＤＣＷに基づいて、測定されたＯＤ６００値の０．３３倍として算出する。全てのデータは、３連の培養物の平均である。比較する目的で、生成物対細胞比を６０時間にわたって平均したデータから算出し、ＤＣＷ１ｇ当たりの、生成された３−ＨＰのｇとして表す。
３−ＨＰの力価は、９時間、１１時間、１５時間、１９時間、２４時間、４８時間および６０時間の時点で、それぞれ０．３２（＋／−０．０３）ｇ／Ｌ、０．８７（＋／−０．１０）ｇ／Ｌ、２．２４（＋／−０．０３）ｇ／Ｌ、４．１５（＋／−０．２７）ｇ／Ｌ、６．２４（＋／−０．５１）ｇ／Ｌ、７．５０（＋／−０．５５）ｇ／Ｌおよび８．０３（＋／−０．１４）ｇ／Ｌであった。バイオマス濃度は、９時間、１１時間、１５時間、１９時間、２４時間、４８時間および６０時間の時点で、それぞれ０．５４（＋／−０．０２）、０．７９（＋／−０．０３）、１．０３（＋／−０．０６）、１．１８（＋／−０．０４）、１．２０（＋／−０．１２）、１．７４（＋／−０．３０）および１．８４（＋／−０．２２）であった。最大の生成物対細胞比は、ＤＣＷ１ｇ当たり４．６ｇの３−ＨＰであった。
（実施例１４）
宿主細胞に対する遺伝子改変の一般的な例（予測的かつ非特異的）。
上記の特定の実施例に加えて、この実施例は、選択された微生物に対象の核酸配列を導入するための遺伝子改変の非限定的なアプローチについて記載するものである。この一般的な実施例の範囲内で代替物および変形物が提供される。この実施例の方法を行って、選択された微生物種において所望の遺伝子改変の組み合わせ、例えば、本明細書の複数のセクションに記載の遺伝子改変の組み合わせおよび、例えば他の細菌種および他の微生物種におけるそれらの機能的等価物を実現する。
対象の遺伝子または他の核酸配列のセグメントを、特定の種（本明細書に記載のＥ．ｃｏｌｉなど）において同定し、その遺伝子またはセグメントを含む核酸配列を得る。
対象のセグメントの末端の核酸配列、または対象のセグメントの末端に近接する核酸配列に基づいて、５’核酸プライマーおよび３’核酸プライマーを調製する。各プライマーを、そのような末端または近接する領域とハイブリダイズする十分なオーバーラップ区画を有するように設計する。そのようなプライマーは、その後にベクターを組み入れるため、またはゲノムを挿入するために使用することができるトランスポザーゼ挿入の制限消化のための酵素認識部位を含んでよい。これらの部位は、一般にはハイブリダイズしているオーバーラップ区画の外側にあるように設計する。プライマー配列を注文に応じて調製する多数の契約サービスが公知である（例えば、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ、ＩＡ ＵＳＡ）。
プライマーを設計し調製したら、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行って、所望の対象のセグメントを特に増幅する。この方法により、微生物のゲノムから分離した対象の領域の複数のコピーがもたらされる。上記微生物のＤＮＡ、プライマーおよび好熱性ポリメラーゼを、緩衝溶液でカリウムおよび二価カチオン（例えば、ＭｇまたはＭｎ）と、および十分な分量のデオキシヌクレオシド三リン酸分子と混ぜ合わせる。この混合物を、温度を増加および減少させる標準のレジメンに曝露させる。しかし、温度、成分、濃度およびサイクルの回数は、コピーされる配列の長さ、アニーリングの温度近似および公知の、または常套的な実験によって当業者に容易に習得される他の因子に応じて、反応に応じて変化させてよい。
代替の実施形態では、対象のセグメントは、微生物または他のＤＮＡの天然の供給源から得るのではなく、例えば、商業的なベンダーによって合成されてよく、ＰＣＲによって調製されてよい。
次いで、例えばアガロースゲル上で電気泳動によって核酸配列を精製し、分離する。必要に応じて、上記領域が精製されたら、それを、標準のＤＮＡ配列決定の方法論によって検証することができ、ベクターに導入することができる。通常当業者に公知のマーカーを含むいくつものベクターのいずれも使用することができ、そのような導入のために標準の方法論を常套的に使用する。一般に使用されるベクター系は、ｐＳＭＡＲＴ（Ｌｕｃｉｇｅｎ、Ｍｉｄｄｌｅｔｏｎ、ＷＩ）、ｐＥＴ Ｅ．ｃｏｌｉ ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ ＳＹＳＴＥＭ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）、ｐＳＣ−Ｂ ＳｔｒａｔａＣｌｏｎｅ Ｖｅｃｔｏｒ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）、ｐＲＡＮＧＥＲ−ＢＴＢベクター（Ｌｕｃｉｇｅｎ、Ｍｉｄｄｌｅｔｏｎ、ＷＩ）およびＴＯＰＯベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ、ＵＳＡ）である。同様に、次いで上記ベクターをいくつもの宿主細胞のいずれかに導入する。一般に使用される宿主細胞は、Ｅ．ｃｌｏｎｉ １０Ｇ（Ｌｕｃｉｇｅｎ、Ｍｉｄｄｌｅｔｏｎ、ＷＩ）、Ｅ．ｃｌｏｎｉ １０ＧＦ’（Ｌｕｃｉｇｅｎ、Ｍｉｄｄｌｅｔｏｎ、ＷＩ）、ＳｔｒａｔａＣｌｏｎｅ コンピテント細胞（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）、Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１、Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＷ２５１１３およびＥ．ｃｏｌｉ Ｋ１２ ＭＧ１６５５である。これらのベクターのいくつかは、プロモーター、例えば対象の配列を挿入する領域に近接する（例えば、複数のクローニング部位内）誘導性プロモーターを保有するが、他のベクター、例えばｐＳＭＡＲＴベクター（Ｌｕｃｉｇｅｎ、Ｍｉｄｄｌｅｔｏｎ、ＷＩ）は、プロモーターを伴わず、脱リン酸化された平滑断端を伴って提供される。そのようなプラスミドを含む細胞を培養することにより、プラスミドを複製すること、したがって対象のセグメントを複製することが可能になり、これは、多くの場合、対象のセグメントの発現に対応する。
種々のベクター系は、選択マーカー、例えば、限定条件下で増殖または生存するために必要であるタンパク質をコードする遺伝子を発現できる選択マーカーを含む。骨格ベクター配列に含有される一般的な選択マーカーとしては、抗生物質抵抗性に必要な１つ以上のタンパク質をコードする遺伝子、ならびに栄養要求性欠損を補完するため、または特定の培地において存在しない、または入手できない重要な栄養分を供給するために必要な遺伝子が挙げられる。ベクターは、対象の宿主細胞に適した複製系も含む。
次いで、対象のセグメントを含有するプラスミドを常套的な方法によって単離することができ、それは、対象の他の微生物宿主細胞に導入するために利用可能である。導入の種々の方法は、当技術分野で公知であり、ベクターを導入すること、またはゲノムを組み込むことを含んでよい。種々の代替の実施形態では、そのようなプラスミド以外の手段によって対象のＤＮＡセグメントを対象の宿主細胞に導入する場合、対象のＤＮＡセグメントを他のプラスミドＤＮＡから分離することができる。
一般的な予測的な実施例の工程はプラスミドの使用を伴うが、その代わりに当技術分野で公知の他のベクターを使用することができる。これらとしては、コスミド、ウイルス（例えば、バクテリオファージ、動物ウイルス、植物ウイルス）および人工染色体（例えば、酵母の人工染色体（ＹＡＣ）および細菌の人工染色体（ＢＡＣ））が挙げられる。
対象のセグメントを導入する宿主細胞を、特定の酵素工程に関する性能および／または対象の化合物の耐性またはバイオ生産について評価することができる。性能がよい遺伝子改変された宿主細胞の選択を行うことができ、全体的な性能、耐性、または対象の化学物質の生成もしくは蓄積について選択する。
この手順は、単一の遺伝子（または他の対象の核酸配列のセグメント）、または複数の遺伝子（別々のプロモーターまたは単一のプロモーターの制御下で）についての核酸配列を組み入れることができ、発現ベクターにおいて所望の異種性の核酸配列を創製するためにその手順を繰り返すことができ、次いで、例えば、本明細書に開示されている任意の代謝経路について、酵素変換工程の機能性に対する所望の相補体を有するように選択された微生物にその発現ベクターを供給することに留意する。しかし、多くのアプローチは、対象の配列の全部または一部を転写し、次いで転写されたｍＲＮＡを翻訳することによって発現させて、酵素などのポリペプチドを得ることに依拠するが、対象のある特定の配列は、そのような発現以外の手段によって効果を発揮し得ることに留意する。
これらのアプローチのために使用する特定の実験室的方法は、当技術分野で周知であり、当業者に公知の種々の参考文献、例えば、ＳａｍｂｒｏｏｋおよびＲｕｓｓｅｌｌ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第３版、２００１年（１〜３巻）、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．（以下、ＳａｍｂｒｏｏｋおよびＲｕｓｓｅｌｌ、２００１年）において認めることができる。
上記の代わりとして、上記宿主細胞のゲノムの核酸配列の欠失などの他の遺伝子改変を実施することもできる。これを実現するための１つの非限定的な方法は、Ｒｅｄ／ＥＴ組換えを使用することによるものであり、これは当業者に公知であり、また、Ｓｔｅｗａｒｔらに発行され、この方法についてのその教示に関して参照により本明細書に組み込まれている米国特許第６，３５５，４１２号および同第６，５０９，１５６号に記載されている。そのような方法のための材料およびキットは、Ｇｅｎｅ Ｂｒｉｄｇｅｓ（Ｇｅｎｅ
Ｂｒｉｄｇｅｓ ＧｍｂＨ、Ｄｒｅｓｄｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ、＜＜ｗｗｗ．ｇｅｎｅｂｒｉｄｇｅｓ．ｃｏｍ＞＞）から入手可能であり、この方法は、製造者の指示に従って進めることができる。ゲノムＤＮＡの標的欠失を実施して、宿主細胞の代謝を、望ましくない代謝産物の生成を低減させる、または排除するように変化させることができる。これは、本明細書において、この一般的な実施例に記載のような他の遺伝子改変と組み合わせて使用することができる。
（実施例１４Ａ）
３−ＨＰおよび他の生成物を生成するためのフィードストックとしてのスクロースの利用（部分的に予測的）
Ｅ．ｃｏｌｉの一般的な研究室および工業用の株、例えば本明細書に記載の株は、スクロースを唯一の炭素供給源として利用することができないが、この性質は、病原性のＥ．ｃｏｌｉ株を含めたいくつもの野生株に見出される。スクロースおよび糖蜜などのスクロースを含有するフィードストックは豊富であり、多くの場合、有機酸、アミノ酸、ビタミンおよび他の生成物を微生物発酵によって生成するためのフィードストックとして使用される。したがって、スクロースを利用することができる３−ＨＰ−生成株の別の誘導体により、３−ＨＰを生成するために利用することができるフィードストックの範囲が拡大するはずである。
種々のスクロースの取り込みおよび代謝系が当技術分野で公知であり（例えば、米国特許第６，９６０，４５５号）、そのような教示に関して参照により組み込まれる。本発明者らは、非ホスホトランスフェラーゼ系を介してスクロースを利用する能力を付与するｃｓｃ遺伝子を有するＥ．ｃｏｌｉ株の構築について記載するが、ここで上記ｃｓｃ遺伝子は、スクロース加水分解酵素をコードするｃｓｃＡ、スクロース透過酵素をコードするｃｓｃＢ、フルクトキナーゼをコードするｃｓｃＫ、リプレッサーをコードするｃｓｃＲを構成する。これらの遺伝子の配列は、ＮＣＢＩデータベースにおいて受託番号Ｘ８１４６１ＡＦ４７３５４４として注釈されている。Ｅ．ｃｏｌｉ遺伝子において極めて豊富であるコドンを利用して効率的に発現させることを可能にするために、ｃｓｃＢ、ｃｓｃＫおよびｃｓｃＡを含有するオペロンを設計し、商業的な合成ＤＮＡの提供者（ＤＮＡ２．０、Ｍｅｎｌｏ Ｐａｒｋ、ＣＡ）のサービスを使用して合成した。上記遺伝子のアミノ酸配列は、それぞれ、ｃｓｃＢ−配列番号８８８；ｃｓｃＡ−配列番号８８９；ｃｓｃｋ−配列番号８９０として記載されている。上記合成オペロンは、ａｄｈＥ遺伝子の即５’（上流）の６０塩基対のＥ．ｃｏｌｉゲノムの領域、上記ｃｓｃ遺伝子の発現を誘導するためのコンセンサス強力プロモーター、リボソーム結合部位を含有するがプロモーターを含有しない短い遺伝子間の領域を伴う、ｃｓｃＢ、ｃｓｃＫおよびｃｓｃＡのコード領域、ならびに上記ａｄｈＥ遺伝子の即３’（下流）の６０ｂｐからなる。上記ａｄｈＥ遺伝子に隣接している配列と相同なセグメントを使用して、上記ｃｓｃオペロン遺伝子をＥ．ｃｏｌｉ染色体に標的挿入するが、それにはａｄｈＥの欠失が伴う。全体の合成構築物のヌクレオチド配列は、配列番号８９１として示されている。上記合成ｃｓｃオペロンを、プラスミドｐ１５Ａに由来する複製開始点およびアンピシリンに対する抵抗性を付与する遺伝子を提供するプラスミドｐＪ２１４（ＤＮＡ２．０、Ｍｅｎｌｏ Ｐａｒｋ、ＣＡ）に構築する。このプラスミドをｐＳＵＣＲと称する。適切な宿主細胞、例えばＥ．ｃｏｌｉのＢＸ＿５９５株を、ｐＳＵＣＲおよびプラスミドｐＴｒｃ＿ｋａｎ＿ｍｃｒまたは他の適切なプラスミドで同時に形質転換し、形質転換された株を、アンピシリンおよびカナマイシンを含有するＬＢ培地プレート上で選択する。両方のプラスミドを保有する形質転換体を増殖させ、ＳＭ３培地中のグルコースが等濃度のスクロースと交換されている以外は実施例１３に記載の通り、振とうフラスコにおいて３−ＨＰの生成について評価する。
Ｅ．ｃｏｌｉがスクロースを利用することを可能にする機能を付与する遺伝子は、ホスホエノールピルビン酸依存性の炭水化物取り込みホスホトランスフェラーゼ系（ＰＴＳ）の遺伝子を保有する、天然の分離株ｐＵＲ４００（Ｃｏｗａｎ、Ｐ．Ｊ．、ら Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、１７３巻：７４６４〜７４７０頁、１９９１年）から得ることもできる。これらの遺伝子は、ＰＴＳ輸送複合体の酵素ＩＩ成分をコードするｓｃｒＡ、スクロース６−リン酸加水分解酵素をコードするｓｃｒＢ、フルクトキナーゼをコードするｓｃｒＫ、ポーリンをコードするｓｃｒＹからなる。これらの遺伝子は、上記の通り単離または合成し、プラスミドに組み入れ、プラスミドｐＴｒｃ＿ｋａｎ＿ｍｃｒまたは他の適切なプラスミドと同時に、適切な宿主細胞、例えばＥ．ｃｏｌｉのＢＸ＿５９５株に形質転換し、形質転換された株を、適切な抗生物質を含有するＬＢ培地プレートで選択することができる。両方のプラスミドを保有する形質転換体を増殖させ、ＳＭ３培地中のグルコースが等濃度のスクロースと交換されている以外は実施例１３に記載の通り、振とうフラスコにおいて３−ＨＰの生成について評価する。
（実施例１４Ｂ）
追加の株の構築および評価（予測的）
本明細書に記載の種々の遺伝エレメント（付加、欠失および修飾）の組み合わせを含むように生成された他の株を３−ＨＰの生成について評価し、商業規模の生成を含めた３−ＨＰの生成のために使用する。以下の表にいくつものこれらの株を例示している。
さらに、多機能性２−ケト−３−デオキシグルコン酸６−リン酸アルドラーゼおよび２−ケト−４−ヒドロキシグルタル酸アルドラーゼおよびオキサロ酢酸デカルボキシラーゼ（Ｅ．ｃｏｌｉにおけるｅｄａ）の酵素活性を低減させるためのさらなる欠失または他の修飾を、種々の株にもたらすことができる。後者に付け加えて、種々の実施形態では、そのような多機能性２−ケト−３−デオキシグルコン酸６−リン酸アルドラーゼおよび２−ケト−４−ヒドロキシグルタル酸アルドラーゼおよびオキサロ酢酸デカルボキシラーゼ（Ｅ．ｃｏｌｉにおけるｅｄａ）の酵素活性の低減と組み合わせて、さらなる遺伝子改変を行って、グルコーストランスポーター（例えばＥ．ｃｏｌｉにおけるｇａｌＰ）を増加させることおよび／または熱安定性の、ヒスチジルリン酸化能タンパク質（ｈｉｓｔｉｄｙｌ ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔａｂｌｅ ｐｒｏｔｅｉｎ）（ＰＴＳの）（Ｅ．ｃｏｌｉにおけるｐｔｓＨ（ＨＰｒ））、ホスホリル転移タンパク質（ＰＴＳの）（Ｅ．ｃｏｌｉにおけるｐｔｓＩ）およびＰＴＳのポリペプチド鎖（Ｅ．ｃｏｌｉにおけるＣｒｒ）の１つ以上の活性を減少させることができる。
これらの株を、フラスコ、または発酵槽のいずれかにおいて、上記の方法を使用して評価する。また、導入されたプラスミドを含む株を所定の程度に評価した後、プラスミド中の遺伝エレメントを、例えば本明細書に記載の方法ならびに当業者に公知の他の方法によって微生物ゲノムに導入することができることに留意する。
表３９
（実施例１５）
３−ＨＰの生成の予測的な実施例
上記のとおり、３−ＨＰの生成経路および他の遺伝子改変物を保有する遺伝子改変された微生物の種菌を培養容器に提供し、その培養容器には、栄養分を所望のバイオプロセスの培養期間に十分な濃度で含む液体培地も提供する。
最終ブロス（微生物細胞、大部分が「消費された」培地および３−ＨＰを含み、後者は、種々の実施形態では、１グラム／リットル、２グラム／リットル、５グラム／リットル、１０グラム／リットル、３０グラム／リットル、５０グラム／リットル、７５グラム／リットルまたは１００グラム／リットルを超える濃度を含む）を回収し、分離工程および精製工程に供して３−ＨＰを比較的精製された状態で得る。分離工程および精製工程は、種々の方法論を組み合わせたいくつものアプローチのいずれかによって進行し得、その種々の方法論には遠心分離、濃度、濾過、減圧蒸発、液／液相分離（例えばトリＣ８〜１０アルキルアミンであるＣＡＳ＃６８８１４−９５−９、Ａｌａｍｉｎｅ（登録商標）３３６（Ｃｏｇｎｉｓ、Ｃｉｎｃｉｎｎａｔｉ、ＯＨまたはＨｅｎｋｅｌ Ｃｏｒｐ．）などの第３級アミンとポリアミン−３−ＨＰ複合体を形成した後の分離を含めて）、メンブレン、蒸留および／または本明細書に組み込まれるこの特許出願において列挙されている他の方法論が含まれ得る。標準の分離工程および精製工程の原理および詳細は当技術分野で公知である、例えば、そのような教示に関して本明細書に組み込まれる「Ｂｉｏｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ」、Ｒｏｇｅｒ Ｇ． Ｈａｒｒｉｓｏｎら、Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ（２００３年）およびＭｅｍｂｒａｎｅ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｔｈｅ Ｒｅｃｏｖｅｒｙ ｏｆ Ｂｉｏｆｕｅｌｓ ａｎｄ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ−Ａｎ Ｕｐｄａｔｅ
Ｒｅｖｉｅｗ、Ｓｔｅｐｈｅｎ Ａ． Ｌｅｅｐｅｒ、９９〜１９４頁、Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｎｏｒｍａｎ Ｎ． ＬｉおよびＪｏｓｅｐｈ Ｍ． Ｃａｌｏ編、Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ（１９９２年）において。特定の方法論の組み合わせは、本明細書に記載のものから選択し、一部においては、最終ブロスにおける３−ＨＰおよび他の成分の濃度に基づく。
（実施例１６）
３−ＨＰの、特定の下流の化学物質への変換の予測的な実施例
例えば、実施例１３からの３−ＨＰを、環形成内部エステル化反応（水分子の脱離）によってプロピオラクトンの任意の１つ以上に、エタノールを用いたエステル化によってエチル−３−ＨＰに、酸化反応によってマロン酸に、および還元反応によって１，３−プロパンジオールに変換する。
これらの変換は、例えば、当業者に公知の有機合成反応によって進行する。３−ＨＰのこれらの変換はいずれも、制御条件下で化学合成反応によって進行して、副産物の形成は許容できるくらい低く、高変換率および高収率が実現され得る。
（実施例１７）
３−ＨＰからのバイオアクリル酸の生成の予測的な実施例
３−ＨＰを、例えば実施例１５に記載されている通り上記微生物のバイオ生産イベントから、比較的純粋な状態で得る。上記３−ＨＰを、例えば真空下、触媒の存在下で加熱することにより、脱水反応によってアクリル酸に変換する。より詳細には、酸または塩としての３−ＨＰの水溶液を、上のＸＩセクションからこの実施例に組み込まれた表８から選択される触媒を含む回転フラスコに加える。
回転および真空下で、温度を１００℃から１９０℃の間まで上昇させ、蒸気を凝縮器で回収する。アクリル酸を凝縮物として回収し、例えば本明細書に記載の分析手順によって定量化する。温度、温度の変化の速度、上記微生物のバイオ生産イベントから得られた３−ＨＰ溶液の純度、減圧（および圧力の変化の速度）、ならびに１種以上種の触媒の種類および濃度などのパラメータの種々の組み合わせを、いくつかの生成シナリオでは望ましくないアクリル酸の重合を含み得る、望ましくない副反応を伴わない高変換率という目的をもって評価する。
（実施例１８）
３−ＨＰからのバイオアクリル酸の生成の代替の予測的な実施例
３−ＨＰを、例えば実施例１５に記載されている通り上記微生物のバイオ生産イベントから、比較的純粋な状態で得る。上記３−ＨＰを、例えば真空下、触媒の存在下で、しかし、３−ＨＰからアクリル酸が形成された後のアクリル酸の制御重合に好都合な条件下で加熱することにより、脱水反応によってアクリル酸に変換する。温度、反応中に産生する熱の除去を含めた温度の変化の速度、上記微生物のバイオ生産イベントから得られた３−ＨＰ溶液の純度、減圧（および圧力の変化の速度）、ならびに１種以上種の触媒の種類および濃度および／または光への曝露などのパラメータの種々の組み合わせを、望ましくない副反応を伴わない高変換率という目的をもって評価する。そのように形成されたアクリル酸は、上記の開示された方法などの当技術分野で公知の方法によって分離し、精製することができる。
（実施例１９）
アクリル酸の、下流の生成物への変換の予測的な実施例
実施例１７のアクリル酸を、本明細書に記載のとおりの下流の生成物の１つ（つ以上）にさらに変換する。例えば、その変換方法は、アクリル酸メチルを生成するメタノールを用いたエステル化、または他のアクリル酸エステルのための、他のアルコールを用いた他のエステル化、アクリルアミドを生成するアミド化、アクリロニトリルを生成するニトリル部分の付加である。本明細書に記載のとおりの置換された下流の化合物を得るために、他の付加を所望の通り行う。
（実施例２０）
アクリル酸のポリアクリル酸への変換の予測的な実施例
実施例１７のアクリル酸を、アクリル酸を水溶液中で加熱し、その溶液を光に曝露させることによって重合反応を開始し、その後、重合の熱を除去することによって温度および反応速度を制御することにより、ポリアクリル酸にさらに変換する。
本明細書の特定の方法および教示および／または参照により組み込まれる引用された参考文献を、上記の実施例に組み込むことができる。また、本明細書に記載されるなどの３−ＨＰ、またはその下流の生成物の１つの生成は、種々の実施形態では、力価が少なくとも１ｇ／リットル、少なくとも２ｇ／リットル、少なくとも５ｇ／リットル、少なくとも１０ｇ／リットル、少なくとも２０ｇ／リットル、少なくとも３０ｇ／リットル、少なくとも４０ｇ／リットルおよび少なくとも５０ｇ／リットルに到達し得る。
（実施例２１）
発酵ブロスからの３−ＨＰの分離および反応抽出
発酵実験の終わりにあたって１０リットル発酵槽から得た発酵ブロスを、微生物を死滅させる工程として１時間にわたって６０℃まで加熱し、次いで、３−ＨＰ（サブセクションＩＩＩａ、上記共通の方法セクションに記載の方法によって生成した）をおよそ１リットル当たり１００グラムに調整し、ｐＨを、硫酸アンモニウムを用いておよそ７．０に調整した。１Ｍの塩化カルシウムを綿状物として加えて最終濃度を約８．２ｇ／Ｌに到達させた。その後、ｐＨを、硫酸を使用しておよそｐＨ２．０に調整した。その後この修飾された発酵ブロスの体積をおよそ３，２００ｇで５分間にわたって遠心分離して澄んだブロスおよびペレットを得、ペレットを廃棄した。
次いで、澄んだブロスの構成部分を、種々の共溶媒を含む第３級アミン非極性相と混合することによって反応抽出（ｒｅａｃｔｉｖｅ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ）に供した。混合した後、水相および非極性のアミン相を分離させ、非極性のアミン相を水相から取り出し、それをＨＰＬＣによる３−ＨＰ濃度についての分析に供した（上記共通の方法セクションの方法を参照されたい）。アミンには、上記のＡｌａｍｉｎｅ３３６およびトリペンチルアミンが含まれた。表４０に、それぞれ、その構成部分中の最初の３−ＨＰとラフィネート（抽出後の水相）中の３−ＨＰとの間の差に基づいて算出した、それぞれの非極性のアミン相溶液への単一パス抽出効率の概要を提供する。
表４０
Ａｌａｍｉｎｅ３３６を用いて、実質的に多いエマルションが形成され、相分離がトリペンチルアミン処理と比較して遅くなったことが留意された。それにもかかわらず、これらの第３級アミンは両方とも、３−ＨＰが水相から非極性相（すなわち、共溶媒を伴う第３級アミン）に抽出されることを実証した。本実施例で使用した共溶媒は、限定的なものではない；他の共溶媒、例えば、ペンタノール、ヘキサノール、ヘプタノール、オクタノール、ノナノール、デカノールを考察することができる。また、共溶媒としてトリペンチルアミンを用いてヘキサンを試験したが、そのデータは、この試料がそのＨＰＬＣ分析においてピークシフトが生じたので、有効であるとみなされなかったことに留意する。
さらに、本出願の他の箇所に記載され、当技術分野で一般に公知の通り、３−ＨＰを発酵ブロスから分離、抽出および精製するための他のアプローチがある。したがって、この実施例は、限定的なものではない。
上記３−ＨＰを非極性相である第３級アミン溶液から、逆抽出によって回収する例が実施例２２に提供される。
（実施例２２）
酸触媒を用いた３−ＨＰのアクリル酸への脱水
１リットル当たり約３５０グラムの３−ＨＰ（サブセクションＩＩＩａ、上記共通の方法セクションに記載の方法によって生成した）を含む水溶液およそ１５ｍＬを、フラスコ内で濃硫酸およそ１５ｍＬと混ぜ合わせた。そのフラスコをロータリーエバポレーター装置（Ｒｏｔｏｖａｐｏｒ Ｍｏｄｅｌ Ｒ−２１０、ＢＵＣＨＩ Ｌａｂｏｒｔｅｃｈｎｉｋ ＡＧ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）に取り付け、加熱浴中（ＢＵＣＣＨＩ、Ｍｏｄｅｌ Ｂ−４９１）、減圧下で（１０〜２０ｍｂａｒ）８０℃まで加熱し、冷却剤として冷水を用いて動作する凝縮装置の下で凝縮物を回収した。およそ５時間後に上記凝縮物を回収し、その体積を測定し、一定分量をＨＰＬＣ分析にかけた（共通の方法セクションを参照されたい）。上記フラスコ内の反応混合物の一定分量も、ＨＰＬＣ分析にかけた。ＨＰＬＣ分析により、上記凝縮物中１リットル当たりおよそ２４グラムのアクリル酸が得られ、一方１リットル当たりおよそ４．５グラムが上記フラスコの反応混合物に残ったことが示された。したがって、これらの条件下で３−ＨＰがアクリル酸を形成することが示された。この実施例は、限定的なものではない。
（実施例２３）
アクリル酸のポリアクリル酸への変換の予測的な実施例
例えば実施例２２で提供されるアクリル酸を、アクリル酸を水溶液中で加熱し、その溶液を光に曝露させることによって遊離基重合反応を開始し、その後、その重合の熱を除去することによって温度および反応速度を制御することにより、ポリアクリル酸にさらに変換する。
アクリル酸が約５０ｗｔ％の濃度で水に溶解するバッチ重合を利用する。単量体溶液を、その溶液中に窒素を通気させることによって脱酸素する。有機過酸化物などの遊離基開始剤を必要に応じて加え（光源による開始を補助するため）、温度を約６０℃にして重合を始める。
上記ポリマーの分子質量および分子質量分布を測定する。必要に応じて、密度、粘度、融解温度およびガラス転移温度を含めたポリマーの他の性質を決定する。本明細書の特定の方法および教示および／または参照により組み込まれる引用された参考文献を、上記の実施例に組み込むことができる。また、本明細書に記載されるなどの３−ＨＰ、またはその下流の生成物の１つの生成は、種々の実施形態では、力価が少なくとも１ｇ／リットル、少なくとも２ｇ／リットル、少なくとも５ｇ／リットル、少なくとも１０ｇ／リットル、少なくとも２０ｇ／リットル、少なくとも３０ｇ／リットル、少なくとも４０ｇ／リットルおよび少なくとも５０ｇ／リットルに到達し得る。
（実施例２４）
アクリル酸の、ポリアクリル酸への塊状重合の予測的な実施例
例えば実施例２２で提供されるアクリル酸を、塊状重合によってポリアクリル酸にさらに変換する。アクリル酸単量体、単量体可溶性開始剤および中和用塩基を重合反応器内で混ぜ合わせる。重合を開始し、温度を制御して所望の変換レベルを実現する。開始剤は、当技術分野で周知であり、上記の様々な有機過酸化物および他の化合物を含む。上記アクリル酸またはポリアクリル酸は、水酸化ナトリウムなどの塩基を用いて少なくとも部分的に中和する。
上記ポリマーの分子質量および分子質量分布を測定する。必要に応じて、密度、粘度、融解温度およびガラス転移温度を含めたポリマーの他の性質を決定する。
生成したポリアクリル酸は、おむつ、成人失禁用製品、女性の衛生用品および同様の消費者向け製品用の水および水溶液の吸収剤としての高吸収性ポリマーとして使用するため、ならびに農業、園芸および他の分野における可能性のある用途のためのものである。
（実施例２５）
高吸収性ポリマーの生成の予測的な実施例
例えば実施例２２で提供されるアクリル酸を、溶液重合によって高吸収性ポリアクリル酸にさらに変換する。アクリル酸単量体の水溶液（約２５〜３０ｗｔ％で）、開始剤、中和用塩基、抗酸化剤、架橋剤（トリメチロールプロパントリアクリレートなど）および必要に応じて、他の添加剤を重合反応器内で混ぜ合わせ、重合を開始する。中和するために使用することができる塩基としては、これらに限らないが、炭酸ナトリウム、水酸化ナトリウムおよび水酸化カリウムが挙げられる。
上記反応器の内容物を６０分間脱酸素する。上記重合反応の温度を最初の所望のレベルまで上昇させる。次いで、上記反応器を、実現されるべき所望の単量体の変換のために必要な期間にわたって所望の保持温度で維持する。生じた反応生成物は高粘度ゲルの形態で存在する。次いで、高粘度のゲル様反応生成物を薄膜または線維（ｓｔｒａｎｄ）に加工し、乾燥し、すりつぶして粒子にし、それを種々の粒子サイズの画分にスクリーニングまたは分類する。そのポリマーを乾燥させ、最終粒子サイズにすりつぶした後、それを、残留アクリル酸および他の化学物質、抽出可能な遠心分離能、せん断弾性係数および負荷時の吸収について分析する。分子質量、分子質量分布、密度、粘度、融解温度およびガラス転移温度を含めたポリマーの他の性質を測定することができる。そのポリマー粒子の表面に架橋コモノマーを加えることによって表面処理を実施することができる。
生成したポリアクリル酸は、おむつ、成人失禁用製品、女性の衛生用品および同様の消費者向け製品用の水および水溶液の吸収剤としての高吸収性ポリマーとして使用するため、ならびに農業、園芸および他の分野における可能性のある用途のためのものである。
（実施例２６）
高吸収性ポリマーの生成の代替の予測的な実施例
例えば実施例２２で提供されるアクリル酸を、懸濁重合によって高吸収性ポリアクリル酸にさらに変換する。水、アクリル酸単量体および中和用塩基を含む水相を、不活性な疎水性の液体を含む油相と混ぜ合わせ、必要に応じて、懸濁化剤をさらに提供する。上記水相および上記油相を、微細な単量体の液滴が形成される条件下で（約７５℃の温度を含めて）接触させる。重合を開始し、重合したポリアクリル酸の微小粒子を、遠心分離機を使用してその懸濁液から回収する。
次いで、上記ポリアクリル酸を乾燥させ、すりつぶして粒子にし、それを種々の粒子サイズの画分にスクリーニングまたは分類する。そのポリマーを乾燥させ、最終粒子サイズにすりつぶした後、それを、残留アクリル酸および他の化学物質、抽出可能な遠心分離能、せん断弾性係数および負荷時の吸収について分析する。分子質量、分子質量分布、密度、粘度、融解温度およびガラス転移温度を含めたポリマーの他の性質を測定することができる。
生成したポリアクリル酸は、おむつ、成人失禁用製品、女性の衛生用品および同様の消費者向け製品用の水および水溶液の吸収剤としての高吸収性ポリマーとして使用するため、ならびに農業、園芸および他の分野における可能性のある用途のためのものである。
（実施例２７）
アクリル酸の、アクリル酸メチルへの変換の予測的な実施例
例えば実施例２２で提供されるアクリル酸を、直接的な、触媒エステル化によってアクリル酸メチルに変換する。アクリル酸を、メタノールと接触させ、その混合物をエステル化触媒の存在下で約５０℃まで加熱する。エステル化の間に形成される水を蒸留によってその反応混合物から除去する。エステル化反応の進行を、上記混合物中のアクリル酸および／またはメタノールの濃度を測定することによってモニターする。
他の単量体と反応性であり、アクリル共重合体に強度および耐久性を与えるアクリル酸メチルは、革、紙、敷き物（ｆｌｏｏｒ ｃｏｖｅｒｉｎｇ）および織物用のコーティングに有用な単量体である。アクリル酸メチルを含有する樹脂は、エラストマー、接着剤、増粘剤、両性界面活性剤、繊維およびプラスティックとして製剤化することができる。アクリル酸メチルは、水処理材料の作製および化学合成において使用される単量体の生成においても使用される。
（実施例２８）
アクリル酸の、アクリル酸エチルへの変換の予測的な実施例
例えば、実施例１９で提供されるアクリル酸を、直接的な、触媒エステル化によってアクリル酸エチルに変換する。アクリル酸をエタノールと接触させ、その混合物をエステル化触媒の存在下で約７５℃まで加熱する。エステル化の間に形成される水を蒸留によってその反応混合物から除去する。エステル化反応の進行を、上記混合物中のアクリル酸および／またはエタノールの濃度を測定することによってモニターする。
アクリル酸エチルは、織物、接着剤および密封材において使用するためのホモポリマーおよび共重合体の生成において使用される。アクリル酸エチルは、共重合体、例えばアクリル酸およびその塩、エステル、アミド、メタクリレート、アクリロニトリル、マレアート、酢酸ビニル、塩化ビニル、塩化ビニリデン、スチレン、ブタジエンおよび不飽和ポリエステルの生成においても使用される。さらに、アクリル酸エチルは化学合成において使用される。
（実施例２９）
アクリル酸の、アクリル酸ブチルへの変換の予測的な実施例
例えば実施例２２で提供されるアクリル酸を直接的な、触媒エステル化によってアクリル酸ブチルに変換する。アクリル酸を１−ブタノールと接触させ、その混合物をエステル化触媒の存在下で約１００℃まで加熱する。エステル化の間に形成される水を蒸留によってその反応混合物から除去する。エステル化反応の進行を、上記混合物中のアクリル酸および／またはエタノールの濃度を測定することによってモニターする。
アクリル酸ブチルは、水性の工業用および建築用の塗料、エナメル、接着剤、充填材（ｃａｕｌｋ）および密封材および織物仕上げ剤において使用するためのホモポリマーおよび共重合体の生成に使用され、ホモポリマーおよび共重合体はメタクリレート、アクリロニトリル、マレアート、酢酸ビニル、塩化ビニル、塩化ビニリデン、スチレン、ブタジエンまたは不飽和ポリエステルと一緒に利用される。
（実施例３０）
アクリル酸の、エチルヘキシルアクリレートへの変換の予測的な実施例
例えば実施例２２で提供されるアクリル酸を直接的な、触媒エステル化によってエチルヘキシルアクリレートに変換する。アクリル酸を２−エチル−１−ヘキサノールと接触させ、その混合物をエステル化触媒の存在下で約１２０℃まで加熱する。エステル化の間に形成される水を蒸留によってその反応混合物から除去する。エステル化反応の進行を、上記混合物中のアクリル酸および／またはエタノールの濃度を測定することによってモニターする。
エチルヘキシルアクリレートは、充填材、被覆剤および圧感接着剤、塗料、革仕上げ剤および織物用および製紙用塗布剤のためのホモポリマーおよび共重合体の生成において使用される。
（実施例３１）
アクリル酸の、消費者向け製品を含めた最終製品への変換の予測的な実施例
実施例２４〜２７で提供されるような１つ以上のアクリレートを、接着剤、表面被覆剤、水性被覆剤、塗料、インク、革仕上げ剤、製紙用塗布剤、フィルム被覆剤（ｆｉｌｍ ｃｏａｔｉｎｇｓ）、可塑剤、または凝集剤の前駆体の１つ以上にさらに変換する。そのような最終製品への変換には、当技術分野で公知の方法を使用する。
（実施例３２）
アクリルベースの塗料の製造の予測的な実施例
アクリル酸、アクリル酸エチル、アクリル酸メチル、アクリル酸２−エチルヘキシル、アクリル酸ブチル、アクリル酸ラウリルまたは本明細書の他の箇所に記載されるとおり微生物によって生成された３−ＨＰから変換したアクリル酸から得られる他の共重合体の１つ以上を含む少なくとも１つの粒子の水不溶性の共重合体を含む水性分散物を、そのような成分を十分に撹拌しながら一緒に混合して上記共重合体の安定な分散物を形成することによって得る。上記共重合体の有する平均分子量は少なくとも５０，０００であり、０．５〜３．０ミクロンにわたる直径を有する共重合体粒子を伴い、水性分散物中の他の成分は、色素、充填剤（例えば、炭酸カルシウム、ケイ酸アルミニウム）、溶媒（例えば、アセトン、ベンゾール、アルコールなど、ただし、これらは、ある特定の非ＶＯＣ塗料においては見出されない）、増粘剤および条件、適用、意図された表面などに応じた追加の添加剤を含んでよい。
そのようなアクリルベースの塗料の変形物では、上記アクリルベースのポリマーに加えて、共重合体を加えることができる。そのような他の共重合体としては、これらに限定されないが、酢酸ビニル、フッ化ビニル、塩化ビニリデン、メタクリル酸、イタコン酸、マレイン酸およびスチレンを挙げることができる。
（実施例３３）
３−ＨＰの１，３−プロパンジオールへの変換の予測的な実施例
例えば実施例２２で提供されるアクリル酸を１，３−プロパンジオールに変換する。３−ＨＰを、液相において非補強（ｕｎｓｕｐｐｏｒｔｅｄ）ルテニウム触媒の存在下で水素化させて、１，３−プロパンジオールを調製する。上記液相は水およびシクロヘキサンを含む。撹拌槽反応器において、約１５０℃の温度および約１０００ｐｓｉの圧力で水素添加を連続的に行う。水素添加の進行を、上記反応器内の３−ＨＰおよび／または水素の濃度を測定することによってモニターする。
（実施例３４）
３−ＨＰのマロン酸への変換の予測的な実施例
例えば実施例２２で提供されるアクリル酸を、Ｒｈを含む補強触媒による３−ＨＰの接触酸化によってマロン酸に変換する。上記接触酸化は、トリクルベッド手順で動作する固定層反応器において行う。トリクルベッド手順では３−ＨＰ出発材料、ならびにその酸化生成物を含む水相およびｐＨを調整するための手段および酸素または酸素を含有する気体を、向流で送ることができる。十分に短い反応時間を実現するために、その変換を、ｐＨ約８において行う。酸化を、約４０℃の温度において行う。マロン酸はほぼ定量的な収率で得られる。
（実施例３５）
３ＨＰＴＧＣにおける遺伝因子のコピーの増加は、３−ＨＰに対する耐性を付与する
ＳＣＡＬＥｓ技法を使用する、３−ＨＰ曝露と関係するライブラリークローンの適合度についてのＳＣＡＬＥｓ評価からのデータは、多くの遺伝子および酵素についての３−ＨＰ耐性に関する関係について明らかな証拠を与える。このデータからおよび上記３ＨＰＴＧＣの他の構成部分からの適合度データを考慮して、上記３ＨＰＴＧＣの遺伝子もしくは酵素のいずれかの適切な改変および／またはそのような酵素の酵素活性を提供する核酸配列の提供（必ずしも酵素全体をコードするものではない）が、３−ＨＰ耐性の増加に至る酵素活性の改変をもたらし得るという大まかな見解が得られ得る。
上記３ＨＰＴＧＣにおける遺伝子によって付与される３−ＨＰ耐性を測定するために使用する方法を、以下のように概説する。
細菌、プラスミド、およびライブラリー構築
野生型Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ１２（ＡＴＣＣ＃２９４２５）を、ゲノムＤＮＡの調製のために使用した。精製ゲノムＤＮＡについての６つの試料は、３７℃で、異なるそれぞれの時間−１０、２０、３０、４０、５０、および６０分間、２つの平滑カッターＡｌｕＩおよびＲｓａＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ ＵＳＡ）を用いて消化し、次いで、１５分間、７０℃で熱不活化した。制限消化物を混合し、断片化されたＤＮＡは、アガロースゲル電気泳動を使用し、サイズに基づいて分離した。０．５、１、２、４、および８ｋｂを超えるサイズのそれぞれのＤＮＡ断片をゲルから切り取り、製造者の指示に従って、ゲル抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて精製した。ゲノムライブラリーは、製造者の指示に従って、ｐＳＭＡＲＴ−ＬＣＫＡＮベクター（Ｌｕｃｉｇｅｎ、Ｍｉｄｄｌｅｔｏｎ、ＷＩ ＵＳＡ）との、それぞれの精製断片化ＤＮＡのライゲーションによって構築した。次いで、それぞれのライゲーション産物は、Ｅ．Ｃｌｏｎｉ １０Ｇ Ｓｕｐｒｅｍｅ Ｅｌｅｃｔｒｏｃｏｍｐｅｔｅｎｔ Ｃｅｌｌｓ（Ｌｕｃｉｇｅｎ）に電気穿孔し、ＬＢ＋カナマイシン上にまいた。コロニーは、採取し、プラスミドＤＮＡは、製造者の指示に従って、Ｑｉａｇｅｎ ＨｉＳｐｅｅｄ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍｉｄｉ Ｋｉｔを使用して抽出した。それぞれのライブラリーの精製プラスミドＤＮＡは、電気穿孔によって、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ株Ｍａｃｈ１−Ｔ１（登録商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ ＵＳＡ）に導入した。それぞれのライブラリー−０．５、１．０、２．０、４．０、および＞８．０ｋｂのゲノムＤＮＡに相当するこれらの培養物は、組み合わせ、所望の密度まで、およそ０．５０のＯＤ６００まで３７℃でインキュベートした。この組み合わせたライブラリー培養混合物を、選択に使用した（本明細書におけるセクションを参照されたい、また、Ｌｙｎｃｈ，
Ｍ．、Ｗａｒｅｎｃｋｅ， ＴＥ、Ｇｉｌｌ， ＲＴ、ＳＣＡＬＥｓ： ｍｕｌｔｉｓｃａｌｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｌｉｂｒａｒｙ ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ． Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ、２００７年、４巻（８７〜９３頁）；Ｗａｒｎｅｃｋｅ， Ｔ．Ｅ．、Ｌｙｎｃｈ， Ｍ．Ｄ．、Ｋａｒｉｍｐｏｕｒ−Ｆａｒｄ， Ａ．、Ｓａｎｄｏｖａｌ， Ｎ．、Ｇｉｌｌ， Ｒ．Ｔ．、Ａ ｇｅｎｏｍｉｃｓ ａｐｐｒｏａｃｈ ｔｏ ｉｍｐｒｏｖｅ ｔｈｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ａｎｄ ｄｅｓｉｇｎ ｏｆ ｓｔｒａｉｎ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎｓ． Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、２００８年 １０巻（１５４〜１５６頁）もまた参照されたい）。ｐＳＭＡＲＴ−ＬＣＫＡＮ空ベクターを含有するＭａｃｈ１−Ｔ１（登録商標）は、全ての対照実験に使用した。増殖曲線は、ＭＯＰＳ最少培地において作製した（Ｎｅｉｄｈａｒｄｔ， Ｆ．、Ｃｕｌｔｕｒｅ ｍｅｄｉｕｍ ｆｏｒ ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａ． Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、１９７４年、１１９巻：７３６〜７４７頁を参照されたい）。抗生物質濃度は、２０ｕｇカナマイシン／ｍＬとした。
３−ＨＰの調製
３−ＨＰは、ＴＣＩ Ａｍｅｒｉｃａ（Ｐｏｒｔｌａｎｄ、ＯＲ）から得た。かなりのアクリル酸および２−オキシジプロピオン酸混在物が、ＨＰＬＣ分析を介して観察された。試料は、続いて、ジエチルエーテル抽出によって処理し、アクリル酸および２−オキシジプロピオン酸混入物の一部を除去した。次いで、試料は、７．０の最終ｐＨまで、１０Ｍ ＮａＯＨを用いて中和した。かなりの不溶物が、およそ３５ｇ／Ｌを超過した濃度において中性ｐＨで観察された。中和した試料は、４℃で、３０分間、４０００ｒｐｍで遠心分離した。その可溶性３−ＨＰ画分は、このように遠心分離した不溶物から単離し、作業用の原液の濃度および純度の最終の定量化のためにＨＰＬＣによってさらに分析した。作業用の原液は、本実施例において選択およびＭＩＣ評価のために使用した。
選択
本明細書において述べられるように、５つの代表的なゲノムライブラリーを、０．５、１、２、４、および８ｋｂの確定された挿入物サイズを有するＥ．ｃｏｌｉ Ｋ１２ゲノムＤＮＡから生成し、それぞれのライブラリーを、ＭＡＣＨ１（商標）−Ｔ１（登録商標）Ｅ．ｃｏｌｉに形質転換し、培養し、次いで、混合した。その混合物は、２本の１５ｍＬねじ蓋付き試験管に等分し、最終濃度は、１０Ｍ ＮａＯＨを用いてｐＨ７に中和した２０ｇ／Ｌ ３−ＨＰ（ＴＣＩ Ａｍｅｒｉｃａ）とした。その選択培養物の細胞密度は、それらが０．３〜０．４の最終ＯＤ６００に接近するとおりにモニターした。その元の選択培養物は、反復バッチ選択戦略の一部として、１５ｍＬ ＭＯＰＳ最少培地＋カナマイシン＋３−ＨＰの別のラウンドに接種するために続いて使用した。全体として、選択は、６０時間にわたる３−ＨＰの減少勾配のため、８つの一続きの移動バッチに対して実行した。特に、上記３−ＨＰの濃度は、一続きのバッチ１および２については２０ｇ ３−ＨＰ／Ｌとし、一続きのバッチ３および４については１５ｇ ３−ＨＰ／Ｌとし、一続きのバッチ５および６については１０ｇ ３−ＨＰ／Ｌとし、一続きのバッチ７および８については５ｇ ３−ＨＰ／Ｌとした。一続きのバッチ７および８については、その培養培地を、栄養分の不足を回避するために、その培養物が静止期に接近する場合に、交換した（本明細書において参照によって組み込まれるＷａｒｎｅｃｋｅ， Ｔ．Ｅ．、Ｌｙｎｃｈ， Ｍ．Ｄ．、Ｋａｒｉｍｐｏｕｒ−Ｆａｒｄ， Ａ．、Ｓａｎｄｏｖａｌ， Ｎ．、Ｇｉｌｌ， Ｒ．Ｔ．、Ａ ｇｅｎｏｍｉｃｓ ａｐｐｒｏａｃｈ ｔｏ ｉｍｐｒｏｖｅ ｔｈｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ａｎｄ ｄｅｓｉｇｎ ｏｆ ｓｔｒａｉｎ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎｓ． Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、２００８年 １０巻（１５４〜１５６頁）もまた参照されたい）。バッチ移動時間は、栄養不足の選択環境を回避するために必要に応じて調節した。試料は、それぞれのバッチの最終段階（ｃｕｌｍｉｎａｔｉｏｎ）で採取した。３−ＨＰを含有する反復バッチ培養物は、モニターし、６０時間の期間にわたって接種し、３−ＨＰの存在下で増殖の増加を示すクローンの濃度を増強させた。試料は、それぞれのバッチで、選択プレート（カナマイシンを有するＬＢ）上に、１ｍＬの選択した集団をまくことによって選択した。プラスミドＤＮＡは、それぞれの試料から抽出し、以前の研究（Ｌｙｎｃｈ， Ｍ．、Ｗａｒｅｎｃｋｅ， ＴＥ、Ｇｉｌｌ， ＲＴ、ＳＣＡＬＥｓ： ｍｕｌｔｉｓｃａｌｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｌｉｂｒａｒｙ ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ． Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ、２００７年、４巻（８７〜９３頁）を参照されたい）および製造者の指示に従って、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ Ｅ．ｃｏｌｉ Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）アレイ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ、Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ、ＣＡ）にハイブリダイズさせた。
データ分析
データ分析は、本明細書においておよびＬｙｎｃｈ， Ｍ．、Ｗａｒｅｎｃｋｅ， ＴＥ、Ｇｉｌｌ， ＲＴ、ＳＣＡＬＥｓ： ｍｕｌｔｉｓｃａｌｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｌｉｂｒａｒｙ ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ． Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ、２００７年、４巻（８７〜９３頁））においてもまた記載されるように、ＳＣＡＬＥｓに適切なソフトウェアを利用することによって完成させた。特異的なゲノムエレメント由来の適合度寄与は、先に記載されるように、上記選択した集団の画分としてのそれぞれの領域の富化物から計算した（Ｌｙｎｃｈ， Ｍ．、Ｗａｒｅｎｃｋｅ， ＴＥ、Ｇｉｌｌ， ＲＴ、ＳＣＡＬＥｓ： ｍｕｌｔｉｓｃａｌｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｌｉｂｒａｒｙ ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ． Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ、２００７年、４巻（８７〜９３頁））。手短かに言えば、上記選択においてそれぞれのバッチの最終段階で採取した試料由来のプラスミドＤＮＡは、上記に従って、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ Ｅ．ｃｏｌｉ Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）アレイにハイブリダイズさせ、これから得られたデータは、さらに分析した。それぞれのアレイについて、個々のプローブセットに対応するシグナル値は、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘデータファイルから抽出し、類似する親和性値に基づいてプローブセットに分配した（Ｎａｅｆ， Ｆ．およびＭａｇｎａｓｃｏ， Ｍ． Ｏ．、２００３年、Ｓｏｌｖｉｎｇ ｔｈｅ ｒｉｄｄｌｅ ｏｆ ｔｈｅ
ｂｒｉｇｈｔ ｍｉｓｍａｔｃｈｅｓ： ｌａｂｅｌｉｎｇ ａｎｄ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ｂｉｎｄｉｎｇ ｉｎ ｏｌｉｇｏｎｕｃｅｌｏｔｉｄｅ ａｒｒａｙｓ． Ｐｈｙｓ． Ｒｅｖ． Ｅ６８、０１１９０６）。それぞれのプローブのバックグラウンドシグナルは、従来のＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘアルゴリズム（ＭＡＳ ５．０）に従って減算した。非特異的なノイズは、完全マッチシグナルと完全マッチシグナルに対するミスマッチシグナルとの差異についてのロバスト回帰の切片として決定した。次いで、プローブシグナルは、最も近い２５のプローブシグナルについてｔｕｋｅｙ ｂｉ−ｗｅｉｇｈｔとしてゲノム位置にマッピングし、１０００ｂｐウィンドウ長の中間フィルターを適用することによってノイズを除去した。プローブの間のギャップは、線形補間によって埋めた。この連続的なシグナルは、Ｎ−ｓｉｅｖｅベースの分析を使用して、分解し、Ｌｙｎｃｈら（２００７年）によって詳細に記載されるように５００ｂｐの最小規模で再構築した。シグナルは、ライブラリーベクター骨格上にあり、かつチップに追加された全プラスミド濃度に対応するシグナルに相当するプライマーの全抑制因子（ｒｅｐｒｅｓｓｏｒ ｏｆ ｐｒｉｍｅｒ）（ＲＯＰ）シグナルによってさらに標準化した。
上記分析は、マイクロアレイシグナルを対応するライブラリークローンに分解し、ある期間にわたって特異的な領域の相対的な富化度を計算した。このように、ゲノム全域にわたる適合度（ｌｎ（Ｘｉ／Ｘｉ０））は、３−ＨＰの存在下における選択についての領域特異的な富化パターンに基づいて測定した。次いで、遺伝因子およびそれらの対応する適合度は、それらのＥｃｏＣｙｃ分類（ｅｃｏｃｙｃ．ｏｒｇ）に基づいて代謝経路によって分けた。この適合度マトリックスは、経路適合度（Ｗ）および上記選択した集団において見出された富化の度数の両方を計算するために使用した。
経路重複性は、経路適合度の最初の順位序列づけ、その後に続く第１の順位において同定された主要な経路への複数の経路と関連する遺伝因子についての特異的な割り当ておよび第２の経路由来の遺伝子特異的適合度値の続く除去によって同定した。
同様に、所与の遺伝因子における遺伝子は、以下のように、遺伝因子における近隣の遺伝子とは無関係に適合度を割り当てた：任意の遺伝子の適合度は、その遺伝子を含有した全てのクローンの適合度の合計として計算した。これには、遺伝子適合度の最初の順位序列づけが続き、その後に、複数の遺伝子と関連する遺伝因子について、最も高い順位を有する遺伝因子において同定された優性遺伝子への特異的な割り当てが続き、その後に遺伝因子における非優性遺伝子由来の適合度値の除去が続いた。
データは、従来のシグナル検出理論に従って、受信者動作特性（「ＲＯＣ」）の構築によってさらに分析した（Ｔ． Ｆａｗｃｅｔｔ、「Ａｎ ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ ＲＯＣ ａｎａｌｙｓｉｓ」、Ｐａｔｔｅｒｎ Ｒｅｃｏｇ． Ｌｅｔ． （２００６年）２７：８６１〜８７４頁）。データは、分析の標準的な方法を使用し、上記に従って、それぞれの遺伝因子についての適合度値および２０ｇ／Ｌ ３−ＨＰの存在下で測定した比増殖速度を使用して、４つの標準的なクラス−真陽性、偽陽性、真陰性、および偽陰性に従って分類し、０．１、１．０、１０、および２０の適合度についてのカットオフ値は、真陽性率および偽陽性率の範囲を最適化する目的で選んだ。クローンの遺伝因子に相当するデータポイントは、報告された適合度がカットオフ値よりも大きく、別々に測定した増殖速度が、陰性対照と比較した場合に著しく増加した場合、真陽性を示した。偽陽性は、カットオフ値よりも大きな報告された適合度を有したが、増殖速度は、陰性対照よりも著しく大きくなかった。クローンは、対応する適合度がカットオフ値未満であり、それが、増殖速度の著しい低減、つまり、陰性対照よりも著しく大きくない増殖速度をもたらした場合のみ、真陰性と指定し、偽陰性は、適合度スコアの低減を有するが、増殖速度の増加、つまり、陰性対照よりも著しく大きい増殖速度を実証するクローンを指す。
ＲＯＣ曲線は、偽陽性率（１−特異性）に対する真陽性率（感度）をプロットすることによって構築する（Ｔ． Ｅ． Ｗａｒｎｅｃｋｅら Ｍｅｔ． Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ １０巻（２００８年）：１５４〜１６５頁を参照されたい）。したがって、適合度の増加により同定されたクローン（およびそれらのそれぞれの遺伝因子）は、対照を超えて、３−ＨＰに対する耐性を付与することが確信をもって述べられてもよい。
結果
図９Ａ、シート１〜７は、Ｅ．ｃｏｌｉについて上記３ＨＰＴＧＣにおいて同定された遺伝子を図面で示す。さらに、表３は、上記３ＨＰＴＧＣにおける遺伝子のいくつかについて本明細書において計算したとおりの累積適合度値を示す。
３−ＨＰ寛容原性複合体はまた、グラム陽性細菌Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓについて、酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅについて、および細菌Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ ｎｅｃａｔｏｒについても発展させた。これらは、図９Ｂ〜Ｄ、シート１〜７においてそれぞれ表す。
（実施例３６）
３ＨＰＴＧＣ産物の追加、第１部
本実施例および上記３ＨＰＴＧＣの概念化に基づいて、上記３ＨＰＴＧＣの律速酵素変換産物（つまり酵素変換工程の産物（複数可））を加えることによって、微生物の３−ＨＰ耐性を増加させることが可能である。本実施例は、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて３−ＨＰ耐性を増加させるためのいくつかのそのような産物の追加を実証する。
細菌、プラスミド、および培地
野生型Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ１２（ＡＴＣＣ＃２９４２５）を、ゲノムＤＮＡの調製のために使用した。Ｍａｃｈ１−Ｔ１（登録商標）は、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ ＵＳＡ）から得た。
３−ＨＰの調製
３−ＨＰは、ＴＣＩ Ａｍｅｒｉｃａ（Ｐｏｒｔｌａｎｄ、ＯＲ）から得た。かなりのアクリル酸および２−オキシジプロピオン酸混在物が、ＨＰＬＣ分析を介して観察された。試料は、続いて、ジエチルエーテル抽出によって処理し、アクリル酸および２−オキシジプロピオン酸混入物の一部を除去した。次いで、試料は、７．０の最終ｐＨまで、１０Ｍ ＮａＯＨを用いて中和した。かなりの３−ＨＰの重合が、およそ３５ｇ／Ｌを超過した濃度において中性ｐＨで観察された。中和した試料は、４℃で、３０分間、４０００ｒｐｍで遠心分離した。その可溶性３−ＨＰ画分は、固体ポリマー産物から単離し、作業用の原液の濃度および純度の最終の定量化のためにＨＰＬＣによってさらに分析した。上記作業用の原液は、本実施例において選択、増殖速度、およびＭＩＣ評価のために使用した。
最小発育阻止濃度
市販で得た３−ＨＰ（ＴＣＩ Ａｍｅｒｉｃａ、Ｐｏｒｔｌａｎｄ、ＯＲ ＵＳＡ、本明細書における３−ＨＰの調製を参照されたい）を使用する最小発育阻止濃度（ＭＩＣ）は、９６ウェルプレートフォーマットにおいて微好気的に（ｍｉｃｒｏａｅｒｏｂｉｃａｌｌｙ）決定した。株の一晩培養物を５ｍｌのＬＢ（適切な場合、抗生物質を有する）中で増殖させた。ＭＯＰＳ最少培地を上部に充填し、かつ覆った１５ｍｌコニカルチューブに接種するために１ｖ／ｖ％を使用した。細胞が中間指数期（ｍｉｄ ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ ｐｈａｓｅ）に達した後、その培養物は、０．２００のＯＤ６００まで希釈した。上記細胞は、１：２０にさらに希釈し、１０ｕｌの一定分量を、それぞれのウェルに接種するために使用した（１ウェル当たり約１０４細胞）。そのプレートを配置し、多様な株の増殖、または５ｇ／Ｌの増分で０〜７０ｇ／Ｌに３−ＨＰ濃度を増加させた場合の多様な増殖条件ならびに２．４ｍＭチロシン（Ｓｉｇｍａ）、３．３ｍＭフェニルアラニン（Ｓｉｇｍａ）、１ｍＭトリプトファン（Ｓｉｇｍａ）、０．２ｍＭ ｐ−ヒドロキシ安息香酸ヒドラジド（ＭＰ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ）、０．２ｍＭ ｐ−アミノ安息香酸（ＭＰ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ）、０．２ｍＭ ２，３−ジヒドロキシ安息香酸（ＭＰ
Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ）、０．４ｍＭシキミ酸（Ｓｉｇｍａ）、２ｍＭ塩酸ピリドキシン（Ｓｉｇｍａ）、３５ｕＭホモセリン（Ａｃｒｏｓ）、４５ｕＭホモシステインチオラクトン塩酸塩（ＭＰ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ）、０．５ｍＭオキソブタノエート（Ｆｌｕｋａ）、５ｍＭトレオニン（Ｓｉｇｍａ）であることが特定される最適な補充濃度で補充したそれぞれの培地における増殖を測定した。最小発育阻止３−ＨＰ濃度（つまり、目に見える増殖がない最低の濃度）および目に見える細胞増殖（ＯＤ約０．１）に対応する最大の３−ＨＰ濃度を、２４時間（その期間を延長した場合に、データは、結果において実質的な変化を示さなかったが、２４〜２５時間）後に記録した。
結果
Ｅ．ｃｏｌｉ Ｍａｃｈ１−Ｔ１（登録商標）の３−ＨＰ耐性は、培地に補充物質を加えることによって増加した。本明細書において記載される補充により、以下のＭＩＣの増加がもたらされた：４０％（チロシン）、３３％（フェニルアラニン）、３３％（トリプトファン）、３３％（ｐ−ヒドロキシ安息香酸ヒドラジド）、７％（ｐ−アミノ安息香酸）、３３％（２，３−ジヒドロキシ安息香酸（２，３−ｄｉｄｙｒｏｘｙｂｅｎｚｏｉｃ
ａｃｉｄ））、０％（塩酸ピリドキシン）、３３％（ホモセリン）、６０％（ホモシステインチオラクトン塩酸塩）、７％（オキソブタノエート）、および３％（トレオニン）。
（実施例３７）
３ＨＰＴＧＣ産物の追加、第２部（３−ＨＰの新しい供給源の使用）
本実施例および上記３ＨＰＴＧＣの概念化に基づいて、上記３ＨＰＴＧＣの律速酵素変換産物（これらのうちの少なくともいくつかは、代わりに「中間体」と呼ばれてもよい）を加えることによって、微生物の３−ＨＰ耐性を増加させることが可能である。本実施例は、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて３−ＨＰ耐性を増加させるためのプトレシン、スペルミジン、カダベリン、および重炭酸ナトリウムの追加を実証する。この文脈において使用される「律速」の概念は、克服された場合に対象の微生物または系による３−ＨＰ耐性の増加を実証し得る仮定される制限を指す。非排他的なアプローチとして、そのような仮定される制限は、特定の酵素変換産物または他の化合物の追加に際しての３−ＨＰに対する耐性の増加の実証によるように、実験的に確認されてもよい。
細菌、プラスミド、および培地
野生型Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ１２（ＡＴＣＣ＃２９４２５）を、ゲノムＤＮＡの調製のために使用した。Ｍ９最少培地およびＥＺリッチ培地は、上記共通の方法セクションのサブセクションＩＩにおいて記載する。
３−ＨＰの調製
３−ＨＰは、上記共通の方法セクションのサブセクションＩＩＩにおいて記載されるようにベータプロピオラクトンから得た。
最小発育阻止濃度
Ｅ．ｃｏｌｉについての３−ＨＰの最小発育阻止濃度（ＭＩＣ）（本明細書における３−ＨＰの調製を参照されたい）は、９６ウェルプレートフォーマットにおいて好気的に決定した。株の一晩培養物を、振盪インキュベーターにおいて３７℃で５ｍｌのＬＢ（適切な場合、抗生物質を有する）中で増殖させた。１ｖ／ｖ％を、１０ｍＬのＭ９最少培地に接種するために使用した。細胞が中間指数期に達した後、その培養物は、０．２００のＯＤ６００まで希釈した。上記細胞は、１：２０にさらに希釈し、１０ｕｌの一定分量を、それぞれのウェルに接種するために使用した（１ウェル当たり約１０４細胞）。そのプレートを配置し、プトレシン（０．１ｇ／Ｌ、ＭＰ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ、Ｓａｎｔａ
Ａｎａ、ＣＡ ＵＳＡ）、カダベリン（０．１ｇ／Ｌ、ＭＰ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ）、またはスペルミジン（０．１ｇ／Ｌ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、ＵＳＡ）、または重炭酸ナトリウム（２０ｍＭ、Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ、ＰＡ ＵＳＡ）（括弧中の値は、培地中の最終濃度を示す）を補充したＭ９最少培地中で、多様な株の増殖、または１０ｇ／Ｌの増分で３−ＨＰ濃度を０〜１００ｇ／Ｌに増加させた場合の多様な増殖条件における増殖を測定した。最小発育阻止３−ＨＰ濃度（つまり、目に見える増殖がない最低の濃度）および目に見える細胞増殖（ＯＤ約０．１）に対応する最大の３−ＨＰ濃度を、２４時間（その期間を延長した場合に、データ（示さず）は、結果において実質的な変化を示さなかったが、２４〜２５時間）後に記録した。ＭＩＣ終点は、目に見える増殖がなかった化合物の最低の濃度とする。
結果
Ｅ．ｃｏｌｉの３−ＨＰ耐性は、培地にポリアミンのプトレシン、スペルミジン、およびカダベリンを加えることによって増加した。対照および補充培地におけるＥ．ｃｏｌｉ
Ｋ１２についての最小発育阻止濃度（ＭＩＣ）は、以下の通りであった：プトレシンを補充したＭ９最少培地において４０ｇ／Ｌ、スペルミジンを補充したＭ９最少培地において４０ｇ／Ｌ、カダベリン（ｃａｄａｖａｒｉｎｅ）を補充したＭ９最少培地において３０ｇ／Ｌ。Ｍ９最少培地に加えた重炭酸ナトリウムについての最小発育阻止濃度（ＭＩＣ）は、３０ｇ／Ｌであった。１００ｇ／Ｌ原液の３−ＨＰにおけるＥ．ｃｏｌｉ Ｋ１２についての最小発育阻止濃度（ＭＩＣ）は、２０ｇ／Ｌであった。
重炭酸ナトリウムを補充することにより対照のＭＩＣを上回る増加を示したことを考慮して、対象の細胞に、カルボニックアンヒドラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする異種核酸配列を提供するなどの、カルボニックアンヒドラーゼ（現在、図９Ａ１〜７に示していないが、ＨＣＯ３ −に直接関係する）の調節および／または遺伝子改変などの他の改変は、３−ＨＰに対する耐性を増加させるのに有効であると考えられる（上記３ＨＰＴＧＣの他の改変と組み合わせてなどのように）。同様に、また、本明細書において提供される他のデータによって支持されるように、アルギニン、プトレシン、カダベリン、およびスペルミジンに至る上記３ＨＰＴＧＣ経路の構成部分に沿った酵素（複数可）の遺伝子改変（複数可）によるなどの酵素活性の改変は、３−ＨＰに対する耐性を増加させるのに有効であると考えられる（上記３ＨＰＴＧＣの他の改変と組み合わせてなどのように）。
（実施例３８）
３−ＨＰ耐性の増加のためのａｒｏＨの遺伝子改変
コピーの増加のときに３−ＨＰに対する耐性を付与する遺伝因子としてのｔｙｒＡ−ａｒｏＦオペロンの同定に基づいて、この酵素活性をさらに検査した。野生型ａｒｏＦ遺伝子は、漸増濃度の最終産物チロシンおよびフェニルアラニンによって阻害される。しかしながら、この固有のフィードバック阻害制御を回避するために、上記ａｒｏＨ遺伝子のフィードバック抵抗性変異体を得て、以下のように細胞に導入した。
クローン構築
ＰＣＲは、上流ａｒｏＦｐプロモーターおよびｒｈｏ非依存性転写ターミネーターを含むように設計したプライマーを用いて、ａｒｏＦ−ｔｙｒＡ領域に対応するＥ．ｃｏｌｉ
Ｋ１２ゲノムＤＮＡを増幅させるために使用した。ｐＳＭＡＲＴ−カナマイシンベクターとの精製した断片化ＤＮＡのライゲーションは、製造者の指示に従って、ＣｌｏｎｅＳＭＡＲＴキット（Ｌｕｃｉｇｅｎ、Ｍｉｄｄｌｅｔｏｎ、ＷＩ ＵＳＡ）を用いて実行した。次いで、そのライゲーション産物は、ケミカルコンピテント（ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ
ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ）Ｍａｃｈ１−Ｔ１（登録商標）Ｅ．ｃｏｌｉ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ ＵＳＡ）に形質転換し、ＬＢ＋カナマイシン上にまき、２４時間３７℃でインキュベートした。陽性形質転換体の挿入を確認するために、プラスミドは、Ｑｉａｇｅｎ（Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）からのＱｉａｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ
ＭｉｎｉＰｒｅｐ Ｋｉｔを使用して、クローンから単離し、配列決定した（Ｍａｃｒｏｇｅｎ、Ｓｏｕｔｈ Ｋｏｒｅａ）。
野生型ａｒｏＨ遺伝子（ＣＢ２０２）および単一のアミノ酸変化（Ｇ１４９Ｄ）を介してトリプトファンフィードバック阻害に対する抵抗性を示す変異体バージョン（ＣＢ４４７）を含有するプラスミドは、Ｒａｙら（Ｒａｙ， Ｊ．Ｍ．、Ｃ． Ｙａｎｏｆｓｋｙ、およびＲ． Ｂａｕｒｅｌｅ、Ｍｕｔａｔｉｏｎａｌ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ ｃａｔａｌｙｔｉｃ ａｎｄ ｆｅｅｄｂａｃｋ ｓｉｔｅｓ ｏｆ ｔｈｅ ｔｒｙｐｔｏｐｈａｎ−ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ３−ｄｅｏｘｙ−Ｄ−ａｒａｂｉｎｏ−ｈｅｐｔｕｌｏｓａｎｔｅ−７−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ ｏｆ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ． Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、１９８８年、１７０巻（１２号）：５５００〜６頁）から得た。これらのプラスミドは、ｐｔａｃプロモーターおよびｒｒＮＢＴ１転写ターミネーターを含有するｐＫＫ２２３−３骨格ベクターを用いて構築した。ａｒｏＨ挿入ＤＮＡは、上記プロモーターおよびターミネーターの両方を含むように設計したプライマーを用いて従来のＰＣＲ法に従って増幅した。精製ＰＣＲ産物は、ｐＢＴ−１プラスミドとライゲーションし、エレクトロコンピテント（ｅｌｅｃｔｒｏｃｏｍｐｅｔｅｎｔ）Ｍａｃｈ１−Ｔ１（登録商標）に形質転換した（Ｌｙｎｃｈ， Ｍ．Ｄ．およびＲ．Ｔ． Ｇｉｌｌ、Ａ ｓｅｒｉｅｓ ｏｆ ｂｒｏａｄ ｈｏｓｔ ｒａｎｇｅ ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ ｓｔａｂｌｅ ｇｅｎｏｍｉｃ ｌｉｂｒａｒｙ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、２００６年、９４巻（１号）：１５１〜１５８頁）。結果として生じるプラスミド配列は、（配列番号００１）に示す。最適な誘発レベルは、最小発育阻止濃度アッセイによって０．００１ｍＭ ＩＰＴＧであると決定した。
ＭＩＣ比較
ＭＩＣ評価は、実施例３５で記載するように行った。ａｒｏＨ変異体を含むＭａｃｈ１−Ｔ１（登録商標）細胞培養物は、対照細胞培養物と、両方ともＭＯＰＳ最少培地中で比較した。
結果
ＭＩＣにおける増加倍数によって測定されるように、上記ａｒｏＨ変異体を含む細胞は、対照のＭＩＣよりも１．４倍大きなＭＩＣを示した。これは、４０パーセントの改善に相当する。したがって、本実施例は、３−ＨＰ耐性における上記３ＨＰＴＧＣの重要性についての知識に基づく、選択した細胞での３−ＨＰ耐性を増加させることについての、多くの可能な遺伝子改変アプローチのうちの１つを実証する。
（実施例３９）
３−ＨＰ耐性の増加のためのシアナーゼ導入による遺伝子改変
Ｅ．ｃｏｌｉ Ｋ１２由来のｃｙｎＴＳ遺伝子を含有するプラスミドクローンは、実施例３５において記載される選択物から得た。ｐＳＭＡＲＴ−ＬＣ−Ｋａｎ−ｃｙｎＴＳと呼ばれるこのプラスミドは、標準的な方法に従って単離し、精製した。（プラスミドの配列決定により最終配列（配列番号００２）を明らかにした）。精製プラスミドは、標準的な技術によってＥ．ｃｏｌｉ Ｋ１２に再形質転換し、ＭＩＣは、実施例３７において記載されるように測定した。
ｃｙｎＴＳ遺伝子を含有するプラスミドによる３−ＨＰ耐性の改善
Ｍ９最少培地中のＥ．ｃｏｌｉ Ｋ１２およびＥ．ｃｏｌｉ Ｋ１２＋ｐＳＭＡＲＴ−ＬＣ−Ｋａｎ−ｃｙｎＴＳについての３−ＨＰの最小発育阻止濃度（ＭＩＣ）は、それぞれ、３０ｇ／Ｌおよび５０ｇ／Ｌであった。したがって、３−ＨＰ耐性における増加を示すＭＩＣにおける６０パーセントを超える改善が、Ｅ．ｃｏｌｉ宿主細胞において上記３ＨＰＴＧＣのたった１つの遺伝子改変を含んだ本実施例において観察された。したがって、本実施例もまた、３−ＨＰ耐性における上記３ＨＰＴＧＣの重要性についての知識およびその知識の適切な使用に基づく、選択した細胞での３−ＨＰ耐性を増加させることについての、多くの可能な遺伝子改変アプローチのうちの１つを実証する。
（実施例４０）
オキサロ酢酸アルファデカルボキシラーゼ活性を含むタンパク質配列をコードする核酸配列の開発（部分的に予測）
広い基質範囲を有するいくつかの２−ケト酸デカルボキシラーゼは、先に特徴付けられた（Ｐｏｈｌ， Ｍ．、Ｓｐｒｅｎｇｅｒ， Ｇ．Ａ．、Ｍｕｌｌｅｒ， Ｍ．、Ａ ｎｅｗ ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅ ｏｎ ｔｈｉａｍｉｎｅ ｃａｔａｌｙｓｉｓ． Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１５巻（４号）、３３５〜３４２頁（２００４年））。特定に興味深いのは、精製され、特徴付けられたＭ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ由来の酵素、アルファケトグルタル酸デカルボキシラーゼである（Ｔｉａｎ， Ｊ．、Ｂｒｙｋ， Ｒ． Ｉｔｏｈ， Ｍ．、Ｓｕｅｍａｔｓｕ， Ｍ．、およびＣａｒｌ Ｎａｔｈａｎ， Ｃ． Ｖａｒｉａｎｔ ｔｒｉｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ ａｃｉｄ ｃｙｃｌｅ ｉｎ Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ： Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ａｌｐｈａ−ｋｅｔｏｇｌｕｔａｒａｔｅ ｄｅｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ． ＰＮＡＳ． ２００５年７月２６日 １０２巻（３０号）：１０６７０〜１０６７７頁；；Ｓｔｅｐｈａｎｏｐｏｕｌｏｓ， Ｇ．、Ｃｈａｌｌｅｎｇｅｓ ｉｎ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｍｉｃｒｏｂｅｓ ｆｏｒ ｂｉｏｆｕｅｌｓ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ． Ｓｃｉｅｎｃｅ、２００７年、３１５巻（５８１３号）：８０１〜８０４頁）。この酵素によって実行した反応を、図１６Ｂに表す（図１６Ａは、天然のｋｇｄ遺伝子によってコードされる酵素による主な公知の化学反応を示す）。上記天然のｋｇｄ遺伝子は、技術的困難または宿主株に対する毒性作用を伴わないで、先に、クローニングされ、Ｅ．ｃｏｌｉから発現され、精製されている（Ｔｉａｎ， Ｊ．、Ｂｒｙｋ， Ｒ． Ｉｔｏｈ， Ｍ．、Ｓｕｅｍａｔｓｕ， Ｍ．、ａｎｄ Ｃａｒｌ Ｎａｔｈａｎ， Ｃ． Ｖａｒｉａｎｔ ｔｒｉｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ ａｃｉｄ ｃｙｃｌｅ ｉｎ Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ： Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ａｌｐｈａ−ｋｅｔｏｇｌｕｔａｒａｔｅ ｄｅｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ． ＰＮＡＳ． ２００５年７月２６日、１０２巻（３０号）：１０６７０〜１０６７７頁；Ｓｔｅｐｈａｎｏｐｏｕｌｏｓ， Ｇ．、Ｃｈａｌｌｅｎｇｅｓ
ｉｎ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｍｉｃｒｏｂｅｓ ｆｏｒ ｂｉｏｆｕｅｌｓ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ． Ｓｃｉｅｎｃｅ，２００７年、３１５巻（５８１３号）：８０１〜８０４頁）。この酵素もまた、アルファケトグルタル酸デヒドロゲナーゼと関連しそうもないので、選択した。さらに興味深いのは、この酵素活性をアッセイするために好都合な比色法が開発されているということである。本明細書に提供するとおり、図１６Ｂに表す測定可能な酵素機能である、マロネートセミアルデヒドへのオキサロアセテートの脱炭酸を有するように上記ｋｇｄ酵素を進化させる。これを達成するための技術的な研究は、主として、所望のオキサロ酢酸アルファデカルボキシラーゼ活性を有するアルファケトグルタル酸デカルボキシラーゼの変異体に対する従来の選択およびスクリーニングに依存する。
第１の工程として、変異体ライブラリーは、選択またはスクリーニングに使用するｋｇｄ遺伝子から構築する。Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ由来のアルファケトグルタル酸デカルボキシラーゼについてのタンパク質配列は、商業的ＤＮＡ遺伝子合成供給者であるＤＮＡ ２．０（Ｍｅｎｌｏ Ｐａｒｋ、ＣＡ ＵＳＡ）からのサービスに従って、Ｅ．ｃｏｌｉ用にコドン最適化した。核酸配列は、親和性ベースのタンパク質精製を可能にするために８つのアミノ酸Ｎ末端タグを用いて合成した。この遺伝子配列は、遺伝子開始コドンとオーバーラップするＮｃｏＩ制限酵素認識部位を組み込み、ＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素認識部位を後続させた。さらに、シャインダルガルノ配列（つまりリボソーム結合部位）を開始コドンの前に配置し、ＥｃｏＲＩ制限酵素認識部位をその前においた。この遺伝子構築物は、ＤＮＡ ２．０によって合成され、ｐＪ２０６ベクター骨格中に提供された。
Ｅ．ｃｏｌｉにおけるアルファケトグルタル酸デカルボキシラーゼの発現のためのｐＫＫ２２３−ｋｇｄと呼ばれる環状プラスミドベースのクローニングベクターは、以下のように構築した。上記遺伝子合成されたｋｇｄ遺伝子を含有するプラスミドＤＮＡ ｐＪ２０６は、製造者の指示に従って、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ（Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ ＵＳＡ）から得た酵素ＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩを用いる酵素制限消化にかけた。消化混合物は、アガロースゲル電気泳動によって分離し、上記共通の方法セクションのサブセクションＩＩにおいて記載されるようにＵＶ透過照明下で視覚化した。ｋｇｄ遺伝子に対応するＤＮＡ片を含有するアガロースゲル切片は、ゲルから切り出し、ＤＮＡは、製造者の指示に従って、Ｑｉａｇｅｎからの標準的なゲル抽出プロトコールおよび成分を用いて回収した。ｐＫＫ２２３−ａｒｏＨを持つＥ．ｃｏｌｉクローニング株は、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｃｏｌｏｒａｄｏ ａｔ ＢｏｕｌｄｅｒのＲｙａｎ
Ｔ．Ｇｉｌｌ教授の研究室からの寄贈品として得た。上記プラスミドを持つこの株の培養物は、標準的な方法によって増殖させ、プラスミドＤＮＡは、製造者の指示に従って、Ｑｉａｇｅｎ（Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ ＵＳＡ）からの市販のミニプレップカラムによって調製した。プラスミドＤＮＡは、製造者の指示に従って、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ（Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ ＵＳＡ）から得た制限エンドヌクレアーゼＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩを用いて消化した。この消化は、ｐＫＫ２２３骨格からａｒｏＨリーディングフレームを分離する役目をした。その消化混合物は、アガロースゲル電気泳動によって分離し、上記共通の方法セクションのサブセクションＩＩにおいて記載されるようにＵＶ透過照明下で視覚化した。ｐＫＫ２２３プラスミドの骨格に対応するＤＮＡ片を含有するアガロースゲル切片は、ゲルから切り出し、ＤＮＡは、製造者の指示に従って、Ｑｉａｇｅｎ（Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ ＵＳＡ）からの標準的なゲル抽出プロトコールおよび成分を用いて回収した。
上記ｋｇｄ遺伝子に対応する精製ＤＮＡの片およびｐＫＫ２２３ベクター骨格を、ライゲーションし、そのライゲーション産物は、製造者の指示に従って電気穿孔を介して形質転換した。ｐＫＫ２２３−ｋｇｄ（配列番号００４）と呼ばれる、結果として生じるベクターの配列は、Ｍａｃｒｏｇｅｎ（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ ＵＳＡ）によって提供される商業サービスによって実行した慣用の配列決定によって確認した。ｐＫＫ２２３−ｋｇｄは、ベータラクタマーゼに対する抵抗性を付与し、ＩＰＴＧによってＥ．ｃｏｌｉ宿主において誘導性のｐｔａｃプロモーターの制御下にあるＭ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓのｋｇｄ遺伝子を含有する。
プラスミドｐＫＫ２２３−ｋｇｄは、増殖させ、精製ＤＮＡは、標準的な方法によって調製した。プラスミドは、製造者の指示に従って、ＸＬ１−Ｒｅｄケミカルコンピテント細胞（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、ＬａＪｏｌｌａ、ＣＡ）に導入し、ＬＢ＋１００マイクログラム／ｍＬアンピシリン上にまき、＞２４時間、３７℃でインキュベートした。元の形質転換容量の１／１０００を有する希釈培養物を、三連のＬＢ＋１００マイクログラム／ｍＬアンピシリン上でプレート培養した。１０００を超えるコロニーが得られ、形質転換当たりおよそ１０７突然変異細胞に相当した。コロニーは、プレートから穏やかに掻き集めてＴＢ培地中に採取した。その培養物は、ボルテックスによって直ちに再懸濁し、１ｍＬ冷凍保存培養物に等分し、１５％（ｖ／ｖ）の最終グリセロール濃度とした（ＳａｍｂｒｏｏｋおよびＲｕｓｓｅｌｌ、２００１年）。上記培養物の残りは、３０００ｒｐｍでの１５分間の遠心分離によってペレットにした。プラスミドＤＮＡは、ＨｉＳｐｅｅｄ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍｉｄｉ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）を使用して、製造者の指示に従って抽出した。それぞれの変異体ライブラリーからの精製プラスミドＤＮＡは、電気穿孔によって、Ｅ．ｃｏｌｉ １０ＧＦ’（Ｌｕｃｉｇｅｎ、Ｍｉｄｄｌｅｔｏｎ、ＷＩ ＵＳＡ）に導入した。形質転換効率および適切な形質転換体数（＞１０＾６）を決定するために、この形質転換の１／１０００容量を三連のＬＢ＋カナマイシン上でプレート培養した。
本明細書において記載される選択ベースのアプローチは、オキサロ酢酸アルファデカルボキシラーゼ活性を有するｋｇｄ変異体の迅速な同定を可能にする。Ｅ．ｃｏｌｉの入手可能な株、株ＡＢ３５４は、選択のための宿主として使用する（Ｂｕｎｃｈ， Ｐ． Ｋ．、Ｆ． Ｍａｔ−Ｊａｎ、Ｎ． Ｌｅｅ、およびＤ． Ｐ． Ｃｌａｒｋ． １９９７年、Ｔｈｅ ｌｄｈＡ ｇｅｎｅ ｅｎｃｏｄｉｎｇ ｔｈｅ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｖｅ ｌａｃｔａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ ｏｆ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ １４３巻：１８７〜１９５頁）。この栄養要求性Ｅ．ｃｏｌｉ株は、アスパラギン酸デカルボキシラーゼをコードするｐａｎＤにおいて突然変異を有する。この反応の産物、ベータアラニンは、パントテン酸の合成における必須の中間体、補酵素Ａに対する前駆体である。補酵素Ａ合成における遮断により、このＥ．ｃｏｌｉ株が、補充なしの最少培地で増殖できないようになる（Ｃｒｏｎｏａｎ， Ｊ．Ｅ．、Ｌｉｔｔｌｅ， Ｋ．Ｊ．、Ｊａｃｋｏｗｓｋｉ， Ｓ．；Ｇｅｎｅｔｉｃ ａｎｄ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ａｎａｌｙｓｅｓ ｏｆ Ｐａｎｔｏｔｈｅｎａｔｅ Ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ａｎｄ Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ． Ｊ． ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ、１４９巻（３号）、９１６〜９２２頁（１９８２年）；Ｃｒｏｎａｎ， Ｊ．Ｅ．、Ｂｅｔａ−Ａｌａｎｉｎｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｊ． ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ、１４１巻（３号）、１２９１〜１２９７頁（１９８０年））。Ｒ．ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ由来のｇａｂＴの発現は、Ｅ．ｃｏｌｉにベータアラニンアミノトランスフェラーゼ活性を付与する（Ｔｕｎｎｉｃｌｉｆｆ， Ｇ．；Ｎｇｏ， Ｔ．Ｔ．；Ｒｏｊｏ−Ｏｒｔｅｇａ， Ｊ．Ｍ．；Ｂａｒｂｅａｕ， Ａ．；Ｔｈｅ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｂｙ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ ａｎａｌｏｇｕｅｓ ｏｆ
ｇａｍｍａ−ａｍｉｎｏｂｕｔｙｒａｔｅ ａｍｉｎｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ ｆｒｏｍ ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｓｕｂｃｅｌｌｕｌａｒ
ｆｒａｃｔｉｏｎｓ ｏｆ ｒａｔ ｂｒａｉｎ Ｃａｎ． Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．
５５巻、４７９〜４８４頁（１９７７年））。この酵素は、ベータアラニンを生成するための基質としてマロネートセミアルデヒドを利用することができる。オキサロ酢酸アルファデカルボキシラーゼ活性を有する突然変異ｋｇｄ遺伝子に加えてｇａｂＴを発現するＥ．ｃｏｌｉ ＡＢ３５４の株（Ｅ．ｃｏｌｉ ＡＢ３５４＋ｇａｂＴ）は、代謝産物ベータアラニンを生成することができ、最少培地で増殖する能力が回復している。その選択の予測される結果を、図１８に表す。
上記ｋｇｄ遺伝子に類似して、コドンおよび発現最適化Ｒ．ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ ｇａｂＴ遺伝子は、遺伝子合成を介して商業的供給者ＤＮＡ ２．０（Ｍｅｎｌｏ Ｐａｒｋ、ＣＡ ＵＳＡ）から得られる。それを、続いて、発現プラスミドの中にクローニングする。
ｋｇｄ遺伝子の変異体ライブラリーは、ｇａｂＴ遺伝子を発現するＥ．ｃｏｌｉ株ＡＢ３５４に導入する。次いで、この集団を最少培地プレート上で増殖させる。所望のオキサロ酢酸アルファデカルボキシラーゼ活性を発現する個々の変異体が、これらの条件下でコロニーを形成する能力の回復を示すことが予測される。これらのクローンを単離し、それらが続いて発現する突然変異タンパク質を、オキサロ酢酸アルファデカルボキシラーゼ活性について選択する。
オキサロ酢酸アルファデカルボキシラーゼ活性についての変異体ｋｇｄライブラリーの構築選択の成功と共に、これらの変異体が所望の酵素活性を有することを確認することが必要である。したがって、オキサロ酢酸アルファデカルボキシラーゼ活性について陽性の変異体を、アルファデカルボキシラーゼ活性について確認する。これを達成するために、比色定量スクリーニングアプローチを、現在の標準的な方法から採用する。このアプローチを図１９に示す。このアプローチは、変異体酵素の発現および精製ならびにその精製酵素、その補因子（チアミンピロリン酸）、および適切な基質との反応を必要とする。タンパク質の発現および精製は、標準的な方法を用いて実行する。
（実施例４１）
Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＦ４０＋ｐＫＫ２２３＋ＭＣＲを使用する３−ＨＰの１リットル規模のバイオ生産
実施例１に従って生成したＥ．ｃｏｌｉ株ＤＦ４０＋ｐＫＫ２２３＋ＭＣＲを使用して、およそ１リットルの作業用容量のバッチ培養を、３−ＨＰの微生物のバイオ生産を評価するために行った。
Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＦ４０＋ｐＫＫ２２３＋ＭＣＲは、示される場合、２００μｇ／ｍＬアンピシリンを加えたＬＢ培地からなる５０ｍＬバッフルフラスコの中に、標準的な手段（ＳａｍｂｒｏｏｋおよびＲｕｓｓｅｌｌ、２００１年）によって冷凍保存物から接種し、２２５ｒｐｍで振盪させながら３７℃で一晩、静止期まで増殖させた。午前中に、この培養物を、示される場合、５％（ｗ／ｖ）グルコースおよび２００μｇ／ｍＬアンピシリンおよび１ｍＭ ＩＰＴＧを加えたＭ９最少培地を含む１Ｌバイオリアクター容器に接種するために（５％ｖ／ｖ）使用した。上記バイオリアクター容器は、適切なように、１０Ｍ ＮａＯＨまたは１Ｍ ＨＣｌの追加によって、ｐＨ６．７５に維持した。５Ｌ／分の速度での空気の連続的なスパージングによっておよび１００〜１０００ｒｐｍの間の上記バイオリアクター容器の撹拌速度の連続的な調整によって、そのバイオリアクター容器の溶存酸素含有率を、８０％の飽和度に維持した。これらのバイオ生産の評価は、少なくとも三連で行った。これらの培養物の増殖をモニターするために、細胞数に相関する光学濃度測定（６００ｎｍにおける、１ｃｍ光路長での吸収度）を、最初の１２時間、接種のときおよび接種後２時間毎に行なった。バイオ生産イベントの２日目に、光学濃度および他の測定のための試料を３時間毎に収集した。収集したそれぞれの試料について、細胞を遠心分離によってペレットにし、その上清を、上記共通の方法セクションにおける「３−ＨＰ生成についての培養物についての分析」によって記載されるように３−ＨＰ生成についての分析のために収集した。この１リットルのバイオ生産容量における３−ＨＰについての予備的な最終力価は、ＨＰＬＣ分析に基づいて０．７ｇ／Ｌ ３−ＨＰであると計算された。このＨＰＬＣ分析によって３−ＨＰと区別できないマロネートセミアルデヒドもしくは恐らく別のアルデヒドまたは恐らく、マロネートセミアルデヒドもしくは他のアルデヒドの分解産物の同時の生成がありそうなことが認められる。
（実施例４２）
耐性およびバイオ生産経路（予測の実施例）
３−ＨＰ耐性の増加をもたらし、かつ３−ＨＰバイオ生産をもたらすために核酸配列を作製し、組み込むことに関し、上記共通の方法セクションにおいて提供されるものを含む、当業者に公知の方法を使用して、また、本明細書における他の実施例からの特定の方法をも使用して、非改変微生物において見出されるレベルを超えて３−ＨＰ耐性および３−ＨＰ生成の両方を増加させる異種核酸配列を、選択した微生物に提供するために遺伝子改変を作製する。選択した微生物の中に組み合わせ、微生物において発現された場合に、３ＨＰＴＧＣの１つ以上の性質（ａｓｐｅｃｔ）を改変することによって、３−ＨＰに対する耐性を増加させる酵素（複数可）または他のポリペプチド（複数可）をコードする１つ以上の核酸配列を含むプラスミドまたは他のベクターまたはＤＮＡ配列（直接的な組み込みのための）を構築する。そのまたは異なるプラスミドまたは他のベクターまたはＤＮＡ配列（直接的な組み込みのための）は、選択した微生物において発現される場合に、３−ＨＰのバイオ生産をもたらす（または増加させる）酵素（複数可）または他のポリペプチド（複数可）をコードする１つ以上の核酸配列を含むように構築する。
プラスミドの場合には、そのプラスミド（複数可）を、形質転換を促進するのに適切な条件下で、選択した微生物と接触させ、形質転換微生物を、選択し、同定する。他のベクターまたはＤＮＡ配列（複数可）の場合には、これらは、当業者に周知の方法によって、上記選択した微生物に導入する。形質転換組換え微生物についての選択は、当業者に周知の方法に従って同様に行われてもよい。
第１の特定の結果として生ずる組換え微生物は、対照の非耐性改変微生物と比較して、増強された３−ＨＰ耐性およびバイオ生産能力を含み、３−ＨＰ耐性は、非耐性改変対照の耐性よりも少なくとも２０パーセント大きく、３−ＨＰバイオ生産は、非耐性改変対照の３−ＨＰバイオ生産よりも少なくとも２０パーセント大きい。３−ＨＰ耐性は、上記共通の方法セクションにおいて提供されるＭＩＣプロトコールに基づいて２４時間の最小発育阻止濃度（ＭＩＣ）評価によって評価する。３−ＨＰバイオ生産は、誘導期後少なくとも２４時間続くバッチ培養の比較に基づき、最終３−ＨＰ力価は、上記共通の方法セクションにおいて提供されるＨＰＬＣ方法を使用して決定する。
（実施例４３）
耐性改善の比較のための適切な計量の実証
増殖速度データは、細胞培養物において、一連の３−ＨＰ濃度にわたって、好気性および嫌気性の指定する条件下で以下の種について決定した。これは、対照と処理微生物の間の差異を評価するために使用されてもよい方法を実証する。これらのまたは他の方法は、本発明の様々な実施形態についての耐性の差異を実証するために使用されてもよい。
添付の図、図１５Ａ〜Ｏに示されるように、上記データは、多くの方法において評価され、提供されてもよい：「トレラグラム（ｔｏｌｅｒａｇｒａｍ）」（異なる３−ＨＰ濃度での増殖速度を示す）；評価期間にわたる光学濃度における変化；および評価期間にわたる細胞倍化の数。
これらは、ＭＩＣ評価の使用に加えて、微生物および培養系の耐性を含む、耐性における変化の評価に対する非限定的な方法およびアプローチを示すために提供される。
下記方法は、述べられる図中のデータを生成するために使用した。
好気性でのＥ．ｃｏｌｉ
野生型Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＷ２５１１３の一晩培養物を、５ｍＬ標準ＬＢ培地中で三連で増殖させた。１００ｕＬの一晩培養物を使用して、４７．７ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４、２２ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４、８．６ｍＭ ＮａＣｌ、１８．７ｍＭ ＮＨ４Ｃｌ、２ｍＭ ＭｇＳＯ４、０．１ｍＭ ＣａＣｌ２、および０．４％グルコースを含有するＭ９最少培地＋３ＨＰからなる三連で５ｍＬ試料に接種し、そこでは３ＨＰ濃度を０〜５０ｇ／Ｌの範囲とした。開始ＯＤ６００は、０．０２〜０．０８の範囲とした。培養物は、約２４時間３７℃でインキュベートし、ＯＤ６００は、最初の８時間、１〜２時間毎に記録し、最終のＯＤ６００は、約２４時間の時点で記録した。最大比増殖速度（μｍａｘ）は、評価期間のＯＤデータとの指数傾向線（ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ ｔｒｅｎｄ ｌｉｎｅ）の最適なフィットを決定することによって計算した。およそ２４時間にわたるＯＤ６００における特定の変化（Δ２４ｈｒＯＤ６００）は、ｔ＝２４時間およびｔ＝０の光学濃度における差異、Δ２４ｈｒＯＤ６００＝（ＯＤｔ＝２４）−（ＯＤｔ＝０）として計算した。特定の、倍化の数（Ｎｄ）は、式２Ｎ＝（ＯＤｔ＝２４）／（ＯＤｔ＝０）におけるＮについて解くことによって計算した。
嫌気性でのＥ．ｃｏｌｉ
野生型Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＷ２５１１３の一晩培養物を、５ｍＬ標準ＬＢ培地中で三連で増殖させた。１００ｕＬの一晩培養物を使用して、４７．７ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４、２２ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４、８．６ｍＭ ＮａＣｌ、１８．７ｍＭ ＮＨ４Ｃｌ、２ｍＭ ＭｇＳＯ４、０．１ｍＭ ＣａＣｌ２、および０．４％グルコースを含有するＭ９最少培地＋３ＨＰからなる三連の５ｍＬ試料に接種し、そこでは３ＨＰ濃度を０〜５０ｇ／Ｌの範囲とした。開始ＯＤ６００は、０．０２〜０．０８の範囲とした。培養物は、１０秒間ＣＯ２を散布し、密閉し、約２４時間３７℃でインキュベートした。ＯＤ６００は、最初の８時間の間、１〜２時間毎に記録し、最終のＯＤ６００は、約２４時間の時点で記録した。それぞれのデータポイントについて、上記試料を開き、サンプリングし、ＣＯ２を再散布し、もう一度密閉した。最大比増殖速度（μｍａｘ）は、評価期間のＯＤデータとの指数傾向線の最適なフィットを決定することによって計算した。およそ２４時間にわたるＯＤ６００における特定の変化（Δ２４ｈｒＯＤ６００）は、ｔ＝２４時間およびｔ＝０の光学濃度における差異、Δ２４ｈｒＯＤ６００＝（ＯＤｔ＝２４）−（ＯＤｔ＝０）として計算した。特定の、倍化の数（Ｎｄ）は、式２Ｎ＝（ＯＤｔ＝２４）／（ＯＤｔ＝０）におけるＮについて解くことによって計算した。
好気性でのＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ
野生型Ｂ．Ｓｕｂｔｉｌｉｓの一晩培養物を、５ｍＬ標準ＬＢ培地中で三連で増殖させた。１００ｕＬの一晩培養物を使用して、４７．７ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４、２２ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４、８．６ｍＭ ＮａＣｌ、１８．７ｍＭ ＮＨ４Ｃｌ、２ｍＭ ＭｇＳＯ４、０．１ｍＭ ＣａＣｌ２、０．４％グルコース、および１０ｍＭグルタメートを含有するＭ９最少培地＋３ＨＰ＋グルタメート補充の三連の５ｍＬ試料に接種し、そこでは３ＨＰ濃度を０〜５０ｇ／Ｌの範囲とした。開始ＯＤ６００は、０．０２〜０．０８の範囲とした。培養物は、約２４時間３７℃でインキュベートし、ＯＤ６００は、最初の８時間、１〜２時間毎に記録し、最終のＯＤ６００は、約２４時間の時点で記録した。最大比増殖速度（μｍａｘ）は、評価期間のＯＤデータとの指数傾向線の最適なフィットを決定することによって計算した。およそ２４時間にわたるＯＤ６００における特定の変化（Δ２４ｈｒＯＤ６００）は、ｔ＝２４時間およびｔ＝０の光学濃度における差異、Δ２４ｈｒＯＤ６００＝（ＯＤｔ＝２４）−（ＯＤｔ＝０）として計算した。特定の、倍化の数（Ｎｄ）は、式２Ｎ＝（ＯＤｔ＝２４）／（ＯＤｔ＝０）におけるＮについて解くことによって計算した。
好気性でのＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ
Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの一晩培養物は、１０ｇ／Ｌ酵母抽出物、２０ｇ／Ｌペプトン、および２％グルコースを含有する５ｍＬ標準ＹＰＤ培地中で三連で増殖させた。１００ｕＬの一晩培養物を使用して、３７．８ｍＭ（ＮＨ４）２ＳＯ４、８．１ｕＭ Ｈ３ＢＯ３、０．２５ｕＭ ＣｕＳＯ４、０．６ｕＭ ＫＩ、１．２５ｕＭ ＦｅＣｌ３、２．６５ｕＭ ＭｎＳＯ４、１ｕＭ Ｎａ２ＭｏＯ４、２．５ｕＭ ＺｎＳＯ４、６．２５ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４、０．８６ｍＭ Ｋ２ＨＰＯ４、４．１５ｍＭ ＭｇＳＯ４、１．７１ｍＭ ＮａＣｌ、０．９０ｍＭ ＣａＣｌ２、および２％グルコースを含有するＳＤ最少培地（ビタミンなし）＋３ＨＰからなる三連の５ｍＬ試料に接種し、そこでは３ＨＰ濃度を０〜５０ｇ／Ｌの範囲とした。開始ＯＤ６００は、０．０３〜０．０８の範囲とした。培養物は、１０秒間ＣＯ２を散布し、密閉し、約２４時間３０℃でインキュベートした。ＯＤ６００は、最初の８〜１２時間、１〜２時間毎に記録し、最終のＯＤ６００は、約２４時間の時点で記録した。最大比増殖速度（μｍａｘ）は、評価期間のＯＤデータとの指数傾向線の最適なフィットを決定することによって計算した。およそ２４時間にわたるＯＤ６００における特定の変化（Δ２４ｈｒＯＤ６００）は、ｔ＝２４時間およびｔ＝０の光学濃度における差異、Δ２４ｈｒＯＤ６００＝（ＯＤｔ＝２４）−（ＯＤｔ＝０）として計算した。特定の、倍化の数（Ｎｄ）は、式２Ｎ＝（ＯＤｔ＝２４）／（ＯＤｔ＝０）におけるＮについて解くことによって計算した。
嫌気性でのＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ
Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの一晩培養物は、１０ｇ／Ｌ酵母抽出物、２０ｇ／Ｌペプトン、および２％グルコースを含有する５ｍＬ標準ＹＰＤ培地中で三連で増殖させた。１００ｕＬの一晩培養物を使用して、３７．８ｍＭ（ＮＨ４）２ＳＯ４、８．１ｕＭ Ｈ３ＢＯ３、０．２５ｕＭ ＣｕＳＯ４、０．６ｕＭ ＫＩ、１．２５ｕＭ ＦｅＣｌ３、２．６５ｕＭ ＭｎＳＯ４、１ｕＭ Ｎａ２ＭｏＯ４、２．５ｕＭ ＺｎＳＯ４、６．２５ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４、０．８６ｍＭ Ｋ２ＨＰＯ４、４．１５ｍＭ ＭｇＳＯ４、１．７１ｍＭ ＮａＣｌ、０．９０ｍＭ ＣａＣｌ２、および２％グルコースを含有するＳＤ最少培地（ビタミンなし）＋３ＨＰからなる三連の５ｍＬ試料に接種し、そこでは３ＨＰ濃度を０〜５０ｇ／Ｌの範囲とした。開始ＯＤ６００は、０．０３〜０．０８の範囲とした。培養物は、１０秒間ＣＯ２を散布し、密閉し、約２４時間３０℃でインキュベートした。ＯＤ６００は、最初の８〜１２時間、１〜２時間毎に記録し、最終のＯＤ６００は、約２４時間の時点で記録した。それぞれのデータポイントについて、上記試料を開き、サンプリングし、ＣＯ２を再散布し、もう一度密閉した。最大比増殖速度（μｍａｘ）は、評価期間のＯＤデータとの指数傾向線の最適なフィットを決定することによって計算した。およそ２４時間にわたるＯＤ６００における特定の変化（Δ２４ｈｒＯＤ６００）は、ｔ＝２４時間およびｔ＝０の光学濃度における差異、Δ２４ｈｒＯＤ６００＝（ＯＤｔ＝２４）−（ＯＤｔ＝０）として計算した。特定の、倍化の数（Ｎｄ）は、式２Ｎ＝（ＯＤｔ＝２４）／（ＯＤｔ＝０）におけるＮについて解くことによって計算した。
（実施例４４）
３−ＨＰに対する微生物耐性を増加させることができるとして同定される、遺伝子の導入による遺伝子改変
１つからいくつかの遺伝子を含有する遺伝因子は、３−ＨＰ耐性にとって重要なものとして、ＳＣＡＬＥＳ ３−ＨＰ耐性データによって同定した。生物に対してより大きな耐性を与えるのに適切なこれらのエレメントの最適な組み合わせを開発するために、いくつかのこれらの遺伝因子は、異なる複製開始点および選択マーカーを含有する、一連の適合性のプラスミドにクローニングした。そのため、これらの適合性のプラスミドの組み合わせは、３−ＨＰ耐性に対する組み合わせの影響を評価するために細胞系に形質転換することができる。上記異なる複製開始点および選択マーカーを含有する親プラスミドベクターは、以下の表中に同定され、これは、個々のそのような親プラスミドベクターについて配列番号（配列番号００５〜０１２および１８３〜１８６）を提供する。これらのプラスミドは、本明細書において記載されるプラスミドを構築するために使用し、挿入物なしのこれらのプラスミドもまた、耐性ＭＩＣ試験のための対照細胞系を構築するために使用した。
表４１
方法Ａ：プラスミドの設計および遺伝子合成による寛容原性遺伝因子の構築
多くの同定した遺伝因子を含む単一のプラスミドは、複数の他のプラスミドを容易に構築することができる方法において構築した（これらのうちのいくつかは記載されるように構築した）。構成的Ｅ．ｃｏｌｉプロモーター、リボソーム結合部位、およびこれらの遺伝因子のオープンリーディングフレームを含むオペロンを、単一のプラスミド中に組み合わせ、これは、商業的ＤＮＡ遺伝子合成供給者であるＤＮＡ２．０（Ｍｅｎｌｏ Ｐａｒｋ、ＣＡ ＵＳＡ）からの遺伝子合成サービスによって生成した。タンパク質を生成するためのオープンリーディングフレームのそれぞれは、ＤＮＡ２．０のサービスに従ってコドン最適化した。さらに、制限酵素認識部位は、一連の制限消化およびセルフライゲーションを通してこれらのタンパク質の全ての組み合わせを発現することができるプラスミドを創製するためにそれぞれのオペロンおよび遺伝子の間に組み込んだ。この構築物の他の特徴は、最後のオペロンの後のｒｒｎＢターミネーター配列および株へのこれらのエレメントの将来のゲノムの組み込みのために、ＥＰＩＣＥＮＴＲＥ（Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）から得たＥＺ：：ＴＮ（商標）トランスポゾン系による使用のための、コード領域のそれぞれの末端に隣接するＡｆｅＩ制限酵素認識部位を含有するモザイク末端を含む。この構築プラスミドは、ｐＪ６１ベクター骨格中に提供した。ｐＪ６１：２５１３５と呼ばれる、結果として生じるベクターの配列は、配列番号０１２として提供する。
本明細書において記載される方法によって、上記３ＨＰＴＧＣの酵素変換工程を触媒する酵素をコードする様々な核酸配列を、ｐＪ６１：２５１３５プラスミドに導入した。以下の表中に示されるように、上記ｐＪ６１：２５１３５プラスミドは、ＰｍｌＩおよびＳｆｏＩの制限酵素認識部位の間に位置する改変Ｐｔｒｃプロモーター下で発現されるＣｙｎＳおよびＣｙｎＴ、ＳｆｏＩおよびＳｍａＩ制限酵素認識部位の間に位置するＰｔｐｉＡプロモーター下で発現されるＡｒｏＧ（配列番号０１３）、ＳｍａＩおよびＺｒａＩ制限酵素認識部位の間に位置する改変Ｐｔｒｃプロモーター下で発現されるＳｐｅＤ、ＳｐｅＥ、およびＳｐｅＦ（配列番号０１４）、ＺｒａＩおよびＨｐａＩ制限酵素認識部位の間に位置するＰｔａｌＡプロモーター下で発現されるＴｈｒＡ（配列番号０１５）、ＨｐａＩおよびＰｍｅＩ制限酵素認識部位の間に位置するＰｒｐｉＡプロモーター下で発現されるＡｓｄ（配列番号０１６）、ＰｍｅＩおよびＳｃａＩ制限酵素認識部位の間に位置するＰｐｇｋプロモーター下で発現されるＣｙｓＭ（配列番号０１７）、ＳｃａＩおよびＮａｅＩ制限酵素認識部位の間に位置するＰｔｐｉＡプロモーター下で発現されるＩｒｏＫ、ならびにＮａｅＩおよびＥｃｏＩＣＲＩ制限酵素認識部位の間に位置するＰｔａｌＡプロモーター下で発現されるＩｌｖＡ（配列番号０１８）についての遺伝子最適化配列を含有するように様々に改変した。これらの制限酵素認識部位のそれぞれは、上記ｐＪ６１：２５１３５プラスミド内で独特（ｕｎｉｑｕｅ）である。
表４２：Ｅ．ｃｏｌｉ耐性プラスミド構築
＊５’リン酸化
これらの単一のオペロンのそれぞれを含有するプラスミドのセットを生成するために、一連の制限およびセルフライゲーションを実行する。そのため、いかなるオペロンも、それに隣接する制限酵素認識部位の間のＤＮＡ配列ならびに上記プラスミドのタンパク質コード領域全体に隣接するＥｃｏＩＣＲＩ部位およびＰｍｌＩ部位の除去によって単離することができる。例えば、ＰｔｐｉＡプロモーター下で発現され、ＳｆｏＩおよびＳｍａＩの制限酵素認識部位の間に位置するＡｒｏＧポリペプチドを含むオペロンを含むプラスミドは、製造者の指示に従って、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ（Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ ＵＳＡ）から得たＰｍｌＩおよびＳｆｏＩを用いて上記ｐＪ６１：２５１３５プラスミドを最初に消化することによって生成した。次いで、結果として生じるＤＮＡは、製造者の指示に従って、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ（Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ ＵＳＡ）から得たＴ４ＤＮＡリガーゼを用いてセルフライゲーションし、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｋ１２に形質転換した。このＥ．ｃｏｌｉ Ｋ１２形質転換由来の個々のコロニーは、液体培養において増殖させ、個々のコロニー由来のプラスミドは、製造者の指示に従って、Ｑｉａｇｅｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐキット（Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ ＵＳＡ）を使用して単離した。その単離したプラスミドは、ＡｆｅＩを用いる制限消化によってスクリーニングし、的確なプラスミドは、制限およびセルフライゲーションの次のラウンドを実行した。第２のラウンドにおいて、これらのプラスミドは、製造者の指示に従って、それぞれ、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ（Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ ＵＳＡ）およびＰｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）から得たＳｍａＩおよびＥｃｏＩＣＲＩを用いて制限にかけた。次いで、結果として生じるＤＮＡは、製造者の指示に従って、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ（Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ ＵＳＡ）から得たＴ４ＤＮＡリガーゼを用いてセルフライゲーションし、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｋ１２に形質転換した。このＥ．ｃｏｌｉ Ｋ１２形質転換由来の個々のコロニーは、液体培養において増殖させ、個々のコロニー由来のプラスミドは、製造者の指示に従って、Ｑｉａｇｅｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐキット（Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ ＵＳＡ）を使用して単離した。その単離したプラスミドは、ＡｆｅＩを用いる制限消化によってスクリーニングし、配列決定によって検証した。
上記に列挙する対応する制限酵素認識部位を使用する類似する方法において、以下のプラスミドを創製した：ＮａｅＩおよびＥｃｏＩＣＲＩ制限酵素認識部位の間に位置するＰｔａｌＡプロモーター下で発現されるｐＪ６１−ＩｌｖＡ；ＰｍｅＩおよびＳｃａＩ制限酵素認識部位の間に位置するＰｐｇｋプロモーター下で発現されるｐＪ６１−ＣｙｓＭ；ＨｐａＩおよびＰｍｅＩ制限酵素認識部位の間に位置するＰｒｐｉＡプロモーター下で発現されるｐＪ６１−Ａｓｄ；ＺｒａＩおよびＨｐａＩ制限酵素認識部位の間に位置するＰｔａｌＡプロモーター下で発現されるｐＪ６１−ＴｈｒＡ；ＳｍａＩおよびＺｒａＩ制限酵素認識部位の間に位置するＰｔｒｃプロモーター下で発現されるｐＪ６１−ＳｐｅＤＥＦ；ＳｆｏＩおよびＳｍａＩ制限酵素認識部位の間に位置するＰｔｐｉＡプロモーター下で発現されるｐＪ６１−ＡｒｏＧ；ならびにＰｍｌＩおよびＳｆｏＩ制限酵素認識部位の間に位置するＰｔｒｃプロモーター下で発現されるｐＪ６１−ＣｙｎＴＳ。同様に、これらのオペロンのいかなる組み合わせも、類似する制限およびセルフライゲーション機構を介して得ることができる。
配列を検証したこれらのプラスミドは、３−ＨＰに対する耐性について試験されるとおりＢＷ２５１１３ Ｅ．ｃｏｌｉ細胞に形質転換した。さらに、これらのプラスミドは、ＡｆｅＩを用いて制限することができ、モザイク末端と共に個々のオペロンを含有する精製片は、製造者の説明書を使用して、ＥＰＩＣＥＮＴＲＥ（Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）から得たＥＺ：：ＴＮ（商標）トランスポゾン系を使用して、細胞系のゲノムに組み込むことができる。同様に、これらのオペロンは、発現のさらなる制御を提供するまたは様々な株または微生物における増殖のために、任意の様々なプラスミドに移動することができる。
方法Ｂ：他の研究所から得た、同定されたエレメントを含有するプラスミド
上記３ＨＰＴＧＣのマップの開発の後、文献調査により、いくつかの同定された遺伝子について以前の研究を同定した。上記３ＨＰＴＧＣにおいて同定されたエレメントについての野生型遺伝子または突然変異遺伝子のいずれかを含有するプラスミドについて、これらの報告書を作製した研究室に依頼した。そのように得た遺伝子およびそれらがコードするタンパク質は、配列番号によって同定される。
野生型ａｒｏＨ遺伝子およびａｒｏＨ変異体を含有するプラスミドは、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ ＶｉｒｇｉｎｉａのＢａｕｅｒｌｅ研究室からの寄贈品として提供された。これらの変異体は、Ｒａｙ ＪＭ、Ｙａｎｏｆｓｋｙ Ｃ、Ｂａｕｅｒｌｅ Ｒ．、Ｊ
Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ． １９８８年１２月；１７０巻（１２号）：５５００〜６頁 Ｍｕｔａｔｉｏｎａｌ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ ｃａｔａｌｙｔｉｃ ａｎｄ ｆｅｅｄｂａｃｋ ｓｉｔｅｓ ｏｆ ｔｈｅ ｔｒｙｐｔｏｐｈａｎ−ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ３−ｄｅｏｘｙ−Ｄ−ａｒａｂｉｎｏ−ｈｅｐｔｕｌｏｓｏｎａｔｅ−７−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ ｏｆ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉにおいて記載された。上記野生型遺伝子を含有するｐＫＫ２２３プラスミドと共に、１４９位でのグリシンからシステインへの突然変異、１４９位でのグリシンからアスパラギン酸への突然変異、および１８位でのプロリンからロイシンへの突然変異をコードする突然変異遺伝子を含有する３つのさらなるｐＫＫ２２３プラスミドを提供した。
突然変異ｍｅｔＥ遺伝子を含有するプラスミドは、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ ＭｉｃｈｉｇａｎのＭａｔｔｈｅｗｓ研究室からの寄贈品として提供された。この変異体は、Ｈｏｎｄｏｒｐ ＥＲ、Ｍａｔｔｈｅｗｓ ＲＧ． Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ． ２００９年５月；１９１巻（１０号）：３４０７〜１０頁．Ｅｐｕｂ ２００９年３月１３日．
Ｏｘｉｄａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｙｓｔｅｉｎｅ ６４５ ｏｆ ｃｏｂａｌａｍｉｎ−ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ ｃａｕｓｅｓ ａ
ｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ ｌｉｍｉｔａｔｉｏｎ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉにおいて記載された。このｐＫＫ２３３プラスミドは、６４５位でシステインからアラニンへの突然変異をコードするｍｅｔＥ遺伝子を持つ。
これらの遺伝子についてのコードタンパク質についての配列は、配列番号０２２〜０２６として提供される。
方法Ｃ：ｐＳＭＡＲＴ−ＬＣ−Ｋａｎベクターにおける耐性プラスミドの構築
３−ＨＰ耐性に対するそれらの影響について評価したいくつかの遺伝因子を、Ｌｕｃｉｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｍｉｄｄｌｅｔｏｎ ＷＩ、ＵＳＡ）から得たｐＳＭＡＲＴ−ＬＣ−ｋａｎベクター（配列番号０２７）において構築した。このベクターは、低コピー複製起点およびカナマイシン選択を提供する。これらのプラスミドは全て、類似する方法において創製し、その導入遺伝因子およびそれらがコードするタンパク質は、その中の方法Ｃセクション下の表４２中の配列番号によって同定される。方法Ｃ下の表４２中のそれぞれの列は、クローニングされたプラスミド内に含有されるタンパク質、あらゆるポリメラーゼ連鎖反応において使用されるプライマー、および新しいプラスミドを創製するために使用されるポリメラーゼ連鎖反応産物の配列についてのそれぞれの配列情報を含有する。
それぞれの場合において、同一の手順を、最終のプラスミドを創製するために使用した。列挙したプライマーは、製造者の説明書を使用し、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ ＵＳＡ）からのｐｆｘ ＤＮＡポリメラーゼおよび鋳型としてのゲノムＥ．ｃｏｌｉ Ｋ１２ ＤＮＡを使用して、正確な挿入物を増幅させるために使用した。５’末端または増幅ＤＮＡ産物は、製造者の説明書を使用して、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ（Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ ＵＳＡ）のＴ４ポリヌクレオチドキナーゼを使用してリン酸化した。この反応の結果として生じる産物は、アガロースゲル電気泳動によって分離し、予測されるサイズのバンドは、ゲルからそれを切り離し、Ｑｉａｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ ＵＳＡ）によって提供されるゲル抽出キットを使用して、ＤＮＡをゲル抽出することによって単離した。その抽出したリン酸化ＤＮＡは、次いで、ｐＳＭＡＲＴ−ＬＣ−Ｋａｎベクターに平滑末端ライゲーションし、製造者の説明書を使用して、１０Ｇ Ｅ．ｃｏｌｉ細胞に形質転換した。形質転換細胞は、リッチ培地において回収し、次いで、適切な選択のためにカナマイシンを含有するＬＢ寒天プレートでプレート培養した。コロニー増殖の後に、単一のコロニーをＬＢ培地で増殖させ、プラスミドＤＮＡは、Ｑｉａｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ ＵＳＡ）から得たミニプレップキットを使用して抽出した。単離プラスミドＤＮＡは、制限消化によってチェックし、配列決定し、他の実験における使用の前に検証した。
方法Ｄ：ｐＳＭＡＲＴ−ＨＣ−Ａｍｐベクターにおける耐性プラスミドの構築
３−ＨＰ耐性に対するそれらの影響について評価したいくつかの遺伝因子を、Ｌｕｃｉｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｍｉｄｄｌｅｔｏｎ ＷＩ、ＵＳＡ）から得たｐＳＭＡＲＴ−ＨＣ−Ａｍｐベクターにおいて構築した。このベクターは、高コピー複製起点およびアンピシリン選択を提供する。これらのプラスミドは全て、類似する方法において創製し、表４２中の方法Ｄとして同定される。表４２中のそれぞれの列は、クローニングされたプラスミド内に含有されるタンパク質、あらゆるポリメラーゼ連鎖反応において使用されるプライマー、および新しいプラスミドを創製するために使用されるポリメラーゼ連鎖反応産物の配列についての配列情報を含有する。
それぞれの場合において、同一の手順を、最終のプラスミドを創製するために使用した。列挙したプライマーは、製造者の説明書を使用し、ＥＭＤ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｇｉｂｂｓｔｏｗｎ、ＮＪ ＵＳＡ）からのＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼおよび鋳型としての、表４２の方法Ｂを用いて創製した個々の対応する遺伝子または遺伝因子についてのｐＫＫ２２３プラスミドを使用して、正確な挿入物を増幅させるために使用した。増幅ＤＮＡ産物の５’末端は、製造者の説明書を使用して、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ（Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ ＵＳＡ）のＴ４ポリヌクレオチドキナーゼを使用してリン酸化した。この反応の結果として生じる産物は、アガロースゲル電気泳動によって分離し、予測されるサイズのバンドは、ゲルからそれを切り離し、Ｑｉａｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ ＵＳＡ）によって提供されるゲル抽出キットを使用して、ＤＮＡをゲル抽出することによって単離した。抽出したリン酸化ＤＮＡは、次いで、ｐＳＭＡＲＴ−ＨＣ−ＡＭＰベクターに平滑末端ライゲーションし、製造者の説明書を使用して、１０Ｇ Ｅ．ｃｏｌｉ細胞に形質転換した。形質転換細胞は、リッチ培地において回収し、次いで、適切な選択のためにアンピシリンを含有するＬＢ寒天プレートでプレート培養した。コロニー増殖の後に、単一のコロニーをＬＢ培地で増殖させ、プラスミドＤＮＡは、Ｑｉａｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ ＵＳＡ）から得たミニプレップキットを使用して抽出した。単離プラスミドＤＮＡは、制限消化によってチェックし、配列決定し、他の実験における使用の前に検証した。
方法Ｅ：ｐＳＭＡＲＴ−ＨＣ−Ａｍｐベクターにおけるさらなる耐性プラスミドの構築
３−ＨＰ耐性に対するそれらの影響について評価したいくつかの遺伝因子を、Ｌｕｃｉｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｍｉｄｄｌｅｔｏｎ ＷＩ、ＵＳＡ）から得たｐＳＭＡＲＴ−ＨＣ−ＡＭＰベクターにおいて構築した。このベクターは、高コピー複製起点およびアンピシリン選択を提供する。これらのプラスミドは全て、類似する方法において創製し、表４２中の方法Ｅとして同定される。表４２中のそれぞれの列は、クローニングされたプラスミド内に含有されるタンパク質、あらゆるポリメラーゼ連鎖反応において使用されるプライマー、および新しいプラスミドを創製するために使用されるポリメラーゼ連鎖反応産物の配列についての配列情報を含有する。
それぞれの場合において、同一の手順を、最終のプラスミドを創製するために使用した。列挙したプライマーは、製造者の説明書を使用し、ＥＭＤ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｇｉｂｂｓｔｏｗｎ、ＮＪ ＵＳＡ）からのＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼおよび鋳型としてのゲノムＥ．ｃｏｌｉ Ｋ１２ ＤＮＡを使用して、正確な挿入物を増幅させるために使用した。上記プライマーの５’末端が既にリン酸化されていたので、他の処理は増幅産物に必要とされなかった。この反応の結果として生じる産物は、アガロースゲル電気泳動によって分離し、予測されるサイズのバンドは、ゲルからそれを切り離し、Ｑｉａｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ ＵＳＡ）によって提供されるゲル抽出キットを使用して、ＤＮＡをゲル抽出することによって単離した。抽出したリン酸化ＤＮＡは、次いで、ｐＳＭＡＲＴ−ＨＣ−Ａｍｐベクターに平滑末端ライゲーションし、製造者の説明書を使用して、１０Ｇ Ｅ．ｃｏｌｉ細胞に形質転換した。形質転換細胞は、リッチ培地において回収し、次いで、適切な選択のためにアンピシリンを含有するＬＢ寒天プレートでプレート培養した。コロニー増殖の後に、単一のコロニーをＬＢ培地で増殖させ、プラスミドＤＮＡは、Ｑｉａｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ ＵＳＡ）から得たミニプレップキットを使用して抽出した。単離プラスミドＤＮＡは、制限消化によってチェックし、配列決定し、他の実験における使用の前に検証した。
方法Ｆ：ｐＡＣＹＣ１７７（Ｋａｎのみ）ベクターにおける耐性プラスミドの構築
３−ＨＰ耐性に対するそれらの影響について評価したいくつかの遺伝因子を、ｐＡＣＹＣ１７７（Ｋａｎのみ）ベクターにおいて構築した。この骨格は、ＥＭＤ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｇｉｂｂｓｔｏｗｎ、ＮＪ ＵＳＡ）からのＫＯＤポリメラーゼを使用し、プライマーＣＰＭ００７５（５’−ＣＧＣＧＧＴＡＴＣＡＴＴＧＣＡＧＣＡＣ−３’）（配列番号１２３）およびプライマーＣＰＭ００１８（５’−ＧＣＡＴＣＧＧＣＴＣＴＴＣＣＧＣＧＴＣＡＡＧＴＣＡＧＣＧＴＡＡ−３’）（配列番号１２４）を使用して、ｐＡＣＹＣ１７７プラスミドの一部を増幅させることによって創製した。この反応の結果として生じる産物は、アガロースゲル電気泳動によって分離し、予測されるサイズのバンドは、ゲルからそれを切り離し、Ｑｉａｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ ＵＳＡ）によって提供されるゲル抽出キットを使用して、ＤＮＡをゲル抽出することによって単離した。このＤＮＡは、ｐＡＣＹＣ１７７（Ｋａｎのみ）と命名し、本明細書において創製した産物へのライゲーションのために保存した。このｐＡＣＹＣ１７７（Ｋａｎのみ）骨格ＤＮＡは、低コピー複製起点およびカナマイシン選択を提供する。これらのプラスミドは全て、類似する方法において創製し、表４２の方法Ｆとして同定される。表４２のそれぞれの列は、クローニングされたプラスミド内に含有されるタンパク質、あらゆるポリメラーゼ連鎖反応において使用されるプライマー、および新しいプラスミドを創製するために使用されるポリメラーゼ連鎖反応産物の配列についての配列情報を含有する。
それぞれの場合において、同一の手順を、最終のプラスミドを創製するために使用した。列挙したプライマーは、鋳型としての表４２の方法Ｂを用いて創製したそれぞれの対応する遺伝子（もしくは遺伝因子）についてのｐＫＫ２２３プラスミドまたはゲノムＥ．ｃｏｌｉ ＤＮＡのずれかと共に、製造者の説明書を使用し、ＥＭＤ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｇｉｂｂｓｔｏｗｎ、ＮＪ ＵＳＡ）からのＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼを使用して、正確な挿入物を増幅させるために使用した。５’末端または増幅ＤＮＡ産物は、製造者の説明書を使用して、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ（Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ ＵＳＡ）のＴ４ポリヌクレオチドキナーゼを使用してリン酸化した。この反応の結果として生じる産物は、アガロースゲル電気泳動によって分離し、予測されるサイズのバンドは、ゲルからそれを切り離し、Ｑｉａｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ ＵＳＡ）によって提供されるゲル抽出キットを使用して、ＤＮＡをゲル抽出することによって単離した。抽出したリン酸化ＤＮＡは、次いで、本明細書において記載されるｐＡＣＹＣ１７７（Ｋａｎのみ）骨格ＤＮＡに平滑末端ライゲーションし、製造者の説明書を使用して、１０Ｇ Ｅ．ｃｏｌｉ細胞に形質転換した。形質転換細胞は、リッチ培地において回収し、次いで、適切な選択のためにカナマイシンを含有するＬＢ寒天プレートでプレート培養した。コロニー増殖の後に、単一のコロニーをＬＢ培地で増殖させ、プラスミドＤＮＡは、Ｑｉａｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ ＵＳＡ）から得たミニプレップキットを使用して抽出した。単離プラスミドＤＮＡは、制限消化によってチェックし、配列決定し、他の実験における使用の前に検証した。
方法Ｇ：ｐＢＴ−３ベクターにおける耐性プラスミドの構築
３−ＨＰ耐性に対するそれらの影響について評価したいくつかの遺伝因子を、ｐＢＴ−３ベクターにおいて構築した。この骨格は、ＥＭＤ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｇｉｂｂｓｔｏｗｎ、ＮＪ ＵＳＡ）からのＫＯＤポリメラーゼを使用し、プライマーＰＢＴ−ＦＯＲ（５’−ＡＡＣＧＡＡＴＴＣＡＡＧＣＴＴＧＡＴＡＴＣ−３’）（配列番号１２５）およびプライマーＰＢＴ−ＲＥＶ（５’−ＧＡＡＴＴＣＧＴＴＧＡＣＧＡＡＴＴＣＴＣＴＡＧ−３’）（配列番号１２６）を使用して、ｐＢＴ−３プラスミドの一部を増幅させることによって創製した。この反応の結果として生じる産物は、アガロースゲル電気泳動によって分離し、予測されるサイズのバンドは、ゲルからそれを切り離し、Ｑｉａｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ ＵＳＡ）によって提供されるゲル抽出キットを使用して、ＤＮＡをゲル抽出することによって単離した。このＤＮＡは、ｐＢＴ−３骨格と命名し、本明細書において創製した産物へのライゲーションのために保存した。このｐＢＴ−３骨格ＤＮＡは、低コピー複製起点およびクロラムフェニコール選択を提供する。これらのプラスミドは全て、類似する方法において創製し、表４２の方法Ｇとして同定される。表４２のそれぞれの列は、クローニングされたプラスミド内に含有されるタンパク質、あらゆるポリメラーゼ連鎖反応において使用されるプライマー、および新しいプラスミドを創製するために使用されるポリメラーゼ連鎖反応産物の配列についての配列情報を含有する。
それぞれの場合において、同一の手順を、最終のプラスミドを創製するために使用した。列挙したプライマーは、鋳型としての表４２の方法Ｂを用いて創製したそれぞれの対応する遺伝子（もしくは遺伝因子）についてのｐＫＫ２２３プラスミドまたはゲノムＥ．ｃｏｌｉ ＤＮＡのいずれかと共に、製造者の説明書を使用し、ＥＭＤ Ｃｈｅｍｉｃａｌ
Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｇｉｂｂｓｔｏｗｎ、ＮＪ ＵＳＡ）からのＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼを使用して、正確な挿入物を増幅させるために使用した。５’末端または増幅ＤＮＡ産物は、製造者の説明書を使用して、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ（Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ ＵＳＡ）のＴ４ポリヌクレオチドキナーゼを使用してリン酸化した。この反応の結果として生じる産物は、アガロースゲル電気泳動によって分離し、予測されるサイズのバンドは、ゲルからそれを切り離し、Ｑｉａｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ ＵＳＡ）によって提供されるゲル抽出キットを使用して、ＤＮＡをゲル抽出することによって単離した。抽出したリン酸化ＤＮＡは、次いで、本明細書において記載されるｐＢＴ−３骨格ＤＮＡに平滑末端ライゲーションし、製造者の説明書を使用して、１０Ｇ Ｅ．ｃｏｌｉ細胞に形質転換した。形質転換細胞は、リッチ培地において回収し、次いで、適切な選択のためにクロラムフェニコールを含有するＬＢ寒天プレートでプレート培養した。コロニー増殖の後に、単一のコロニーをＬＢ培地で増殖させ、プラスミドＤＮＡは、Ｑｉａｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ ＵＳＡ）から得たミニプレップキットを使用して抽出した。単離プラスミドＤＮＡは、制限消化によってチェックし、配列決定し、他の実験における使用の前に検証した。
（実施例４５）
３−ＨＰ耐性に関係する新規なペプチドの評価
３−ＨＰ耐性を増加させるＩｒｏＫと呼ばれる新規な２１アミノ酸ペプチドを発見した。
方法：ＩｒｏＫ発現研究
ＥｃｏｒＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素認識部位が隣接するＩｒｏＫポリペプチド領域全体ならびにＲＢＳを含むプライマーは、発現研究（Ｏｐｅｒｏｎ、Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ、ＡＬ）から得た：
ＩｒｏＫペプチド領域および突然変異開始部位（ＡＴＧからＴＴＧ）を有するＲＢＳを含むプライマーは、翻訳の分析のために使用した：
２つのオリゴヌクレオチドは、１：１の比で加え、サーマルサイクラーにおいて標準的な方法に従ってアニーリングした。ｐＫＫ２２３−３発現ベクター（配列番号００８、Ｐｈａｒｍａｃｉａ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ．）との、アニールしたプライマー産物のライゲーションは、Ｔ４リガーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ．）を用いて実行し、一晩２５℃でインキュベートした。次いで、ライゲーション産物は、コンピテントＭＡＣＨ１（商標）−Ｔ１（登録商標）に電気穿孔し、ＬＢ＋アンピシリン（ａｍｐｉｃｉｌｌａｎ）上にまき、２４時間３７℃でインキュベートした。プラスミドは、単離し、精製ならびに続く制限消化および配列決定によって確認した（Ｍａｃｒｏｇｅｎ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ）。次いで、ＭＩＣを決定し、それは１ｍＭ ＩＰＴＧ誘導に対応した。
最小発育阻止濃度（ＭＩＣ）
最小発育阻止濃度（ＭＩＣ）は、９６ウェルプレートフォーマットにおいて微好気的に決定した。株の一晩培養物を５ｍＬのＬＢ（適切な場合、抗生物質を有する）中で増殖させた。１％（ｖ／ｖ）接種材料を、ＭＯＰＳ最少培地の１５ｍｌ培養物に導入した。細胞が中間指数期に達した後、その培養物は、０．２００のＯＤ６００まで希釈した。上記細胞は、１：２０にさらに希釈し、１０μＬの一定分量を、９６ウェルプレートのそれぞれのウェルに接種するために使用した（１ウェル当たり約１０４細胞）。そのプレートを配置し、多様な株の増殖、または５ｇ／Ｌの増分で０〜７０ｇ／Ｌに３−ＨＰ濃度を増加させた場合の多様な増殖条件における増殖を測定した。最小発育阻止３−ＨＰ濃度および目に見える細胞増殖（ＯＤ約０．１）に対応する最大の３−ＨＰ濃度を、２４時間後に記録した。
結果
２１アミノ酸（ＭＫＰＡＬＲＤＦＩＡＩＶＱＥＲＬＡＳＶＴＡ、配列番号１２９）から構成されるペプチドであるＩｒｏＫの効果を調査するために、天然の予測されるＲＢＳと共に、それをコードする配列を、誘導性発現ベクター（ｐＫＫ２２３−３）に組み込んだ。図２０は、３−ＨＰに対する耐性を増強するのに十分な、短い８７ｂｐ配列の発現の増加を示す（ＭＩＣにおける＞２倍の増加）。さらに、ＭＩＣが、乳酸、アクリル酸、および酢酸を含む、類似する分子の性質を有する他のいくつかの有機酸については変わらなかったので、耐性機構は、３−ＨＰによる増殖阻害に対して特異的のようである。付与される耐性のモードを分析するために、ほとんど同一の配列を、翻訳開始部位において単一の突然変異（ＡＴＧからＴＴＧに）を有する同じベクターに組み込むと、野生型Ｅ．ｃｏｌｉに等価なＭＩＣの減少がもたらされた（図２０）。この結果は、耐性の機構が、ＤＮＡまたはＲＮＡの段階に対して発揮される（ｍａｐｐｅｄ）というよりはむしろ、翻訳されたポリペプチドの発現に対して特異的であるということを意味する。
ＩｒｏＫペプチドをコードする核酸配列またはその適切なバリアントは、３−ＨＰ耐性をさらに増加させるために３ＨＰＴＧＣの１つ以上の遺伝子改変を含んでいてもよい微生物に提供されてよく、そしてまた、３−ＨＰ生成能力をも有していてもよい微生物に提供されてもよい。
（実施例４６）
Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＦ４０における３−ＨＰ生成のためのマロニル−ＣｏＡ還元酵素の遺伝子改変／導入 Ｃｈｌｏｒｏｆｌｅｘｕｓ ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ由来のマロニル−ｃｏＡ還元酵素遺伝子についてのヌクレオチド配列は、商業的ＤＮＡ遺伝子合成供給者であるＤＮＡ ２．０（Ｍｅｎｌｏ Ｐａｒｋ、ＣＡ ＵＳＡ）からのサービスに従って、Ｅ．ｃｏｌｉ用にコドン最適化した。この遺伝子配列は、開始コドンの前にＥｃｏＲＩ制限酵素認識部位を組み込み、ＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素認識部位が後続した。さらに、シャインダルガルノ（Ｓｈｉｎｅ Ｄｅｌｇａｒｎｏ）配列（つまりリボソーム結合部位）を開始コドンの前に配置し、ＥｃｏＲＩ制限酵素認識部位をその前においた。この遺伝子構築物は、ＤＮＡ
２．０によって合成され、ｐＪ２０６ベクター骨格中に提供された。合成ｍｃｒ遺伝子を含有するプラスミドＤＮＡ ｐＪ２０６は、製造者の指示に従って、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ（Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ ＵＳＡ）から得た酵素ＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩを用いる酵素制限消化にかけた。その消化混合物は、アガロースゲル電気泳動によって分離し、上記共通の方法セクションのサブセクションＩＩにおいて記載されるようにＵＶ透過照明下で視覚化した。ｍｃｒ遺伝子に対応するＤＮＡ片を含有するアガロースゲル切片は、ゲルから切り出し、ＤＮＡは、製造者の指示に従って、Ｑｉａｇｅｎ（Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ ＵＳＡ）からの標準的なゲル抽出プロトコールおよび成分を用いて回収した。ｐＫＫ２２３−ａｒｏＨを持つＥ．ｃｏｌｉクローニング株は、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｃｏｌｏｒａｄｏ ａｔ ＢｏｕｌｄｅｒのＲｙａｎ Ｔ．Ｇｉｌｌ教授の研究室からの寄贈品として得た。プラスミドを持つこの株の培養物は、標準的な方法によって増殖させ、プラスミドＤＮＡは、製造者の指示に従って、Ｑｉａｇｅｎ（Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ ＵＳＡ）からの市販のミニプレップカラムによって調製した。プラスミドＤＮＡは、製造者の指示に従って、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ（Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ ＵＳＡ）から得た制限エンドヌクレアーゼＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩを用いて消化した。この消化は、ｐＫＫ２２３骨格からａｒｏＨリーディングフレームを分離する役目をした。その消化混合物は、アガロースゲル電気泳動によって分離し、上記共通の方法セクションのサブセクションＩＩにおいて記載されるようにＵＶ透過照明下で視覚化した。ｐＫＫ２２３プラスミドの骨格に対応するＤＮＡ片を含有するアガロースゲル切片は、ゲルから切り出し、ＤＮＡは、製造者の指示に従って、Ｑｉａｇｅｎからの標準的なゲル抽出プロトコールおよび成分を用いて回収した。
ｍｃｒ遺伝子に対応する精製ＤＮＡの片およびｐＫ２２３ベクター骨格を、ライゲーションし、そのライゲーション産物は、製造者の指示に従って形質転換し、電気穿孔した。ｐＫＫ２２３−ｍｃｒ（配列番号１８９）と呼ばれる、結果として生じるベクターの配列は、Ｍａｃｒｏｇｅｎ（ＵＳＡ）によって提供される商業サービスによって実行した慣用の配列決定によって確認した。ｐＫＫ２２３−ｍｃｒは、ベータラクタマーゼに対する抵抗性を付与し、ＩＰＴＧによってＥ．ｃｏｌｉ宿主において誘導性のＰｔａｃプロモーターの制御下にｍｃｒ遺伝子を含有する。
発現クローンｐＫＫ２２３−ｍｃｒおよびｐＫＫ２２３対照は、標準的な方法を介して、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｋ１２およびＥ．ｃｏｌｉ ＤＦ４０の両方に形質転換した。（ＳａｍｂｒｏｏｋおよびＲｕｓｓｅｌｌ、２００１年）。
（実施例４７）
Ｅ．ｃｏｌｉ遺伝子欠失株の構築
以下の株は、Ｋｅｉｏコレクションから得た：ＪＷ１６５０（△ｐｕｒＲ）、ＪＷ２８０７（△ｌｙｓＲ）、ＪＷ１３１６（△ｔｙｒＲ）、ＪＷ４３５６（△ｔｒｐＲ）、ＪＷ３９０９（△ｍｅｔＪ）、ＪＷ０４０３（△ｎｒｄＲ）。Ｋｅｉｏコレクションは、Ｏｐｅｎ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ、ＡＬ ＵＳＡ ３５８０６）から得た。個々のクローンは、Ｙａｌｅ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｓｔｏｃｋ Ｃｅｎｔｅｒ（Ｎｅｗ Ｈａｖｅｎ、ＣＴ ＵＳＡ ０６５２０）から購入してもよい。これらの株は、それぞれ、欠失遺伝子の代わりにカナマイシンマーカーを含有する。Ｋｅｉｏコレクションおよびカナマイシンカセットの除去（ｃｕｒｉｎｇ）に関するより多くの情報については、Ｂａｂａ， Ｔら（２００６年）、Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ１２ ｉｎ−ｆｒａｍｅ， ｓｉｎｇｌｅ−ｇｅｎｅ ｋｎｏｃｋｏｕｔ ｍｕｔａｎｔｓ： ｔｈｅ Ｋｅｉｏ ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ． Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｄｏｉ：１０．１０３８／ｍｓｂ４１０００５０およびＤａｔｓｅｎｋｏ ＫＡおよびＢＬ Ｗａｎｎｅｒ（２０００年）、Ｏｎｅ−ｓｔｅｐ ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ ｇｅｎｅｓ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ−１２ ｕｓｉｎｇ ＰＣＲ ｐｒｏｄｕｃｔｓ． ＰＮＡＳ ９７巻、６６４０〜６６４５頁を参照されたい。これらの株は、標準的な方法によってエレクトロコンピテント（ｅｌｅｃｔｒｏｃｏｍｐｅｔｅｎｔ）にした。次いで、それぞれの株は、Ｄｒ．Ｒｙａｎ Ｇｉｌｌ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｃｏｌｏｒａｄｏ、Ｂｏｕｌｄｅｒ、ＣＯ ＵＳＡ）からの寄贈品であったプラスミドｐＣＰ２０を用いて標準的な電気穿孔法を介して形質転換した。形質転換は、２０μｇ／ｍＬクロラムフェニコールおよび１００μｇ／ｍＬアンピシリンを含有するＬｕｒｉａ Ｂｒｏｔｈ寒天プレートにまき、摂氏３０度で３６時間インキュベートした。クローンは、これらの形質転換（ｔｈｅｓｅ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ）から単離し、いかなる抗生物質をも欠く１０ｍＬのＭ９培地で一晩増殖させた。コロニーは、いかなる抗生物質をも欠くＬｕｒｉａ Ｂｒｏｔｈ寒天プレートに画線することによってこれらの培養物から単離した。コロニーは、抗生物質の、カナマイシン（２０μｇ／ｍＬ）、クロラムフェニコール（２０μｇ／ｍＬ）、およびアンピシリン（１００μｇ／ｍＬ）を含有するＬｕｒｉａブロス寒天プレート上での増殖がないことを確認することによって、カナマイシンマーカーならびにプラスミドｐＣＰ２０を失ったことを確認した。単離したクローンは、カナマイシンカセットを失ったことをコロニーＰＣＲによって確認した。ＰＣＲは、Ｌｕｃｉｇｅｎ（カタログ＃３００３３）（Ｍｉｄｄｌｅｔｏｎ、ＷＩ ＵＳＡ）から得たＥｃｏｎｏＴａｑ ＰＬＵＳ ＧＲＥＥＮ ２Ｘ ｍａｓｔｅｒ ＰＣＲ ｍｉｘを使用して実行した。ＰＣＲは、以下のサイクルを用いて、９６ウェル勾配ＲＯＢＯサイクラー（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ Ｊｏｌｌａ、ＣＡ ＵＳＡ ９２０３７）を使用して実行した：１）摂氏９５度で１０分、２）以下のサイクルを３０回、ａ）摂氏９５度で１分、ｂ）摂氏５２度で１分、ｂ）摂氏７２度で２分、続いて３）摂氏７２度で１０分間の１サイクル。クローンのそれぞれについてカナマイシンカセットの除去を確認するためのＰＣＲについて使用したプライマーを、以下の表に示す。プライマーは、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ、ＩＡ ＵＳＡ）から購入した。ＢＸ＿００３４１．０、ＢＸ＿００３４２．０、ＢＸ＿００３４５．０、ＢＸ＿００３４６．０、ＢＸ＿００３４８．０、およびＢＸ＿００３４９．０と呼ばれる結果として生じる欠落株（ｃｕｒｅｄ ｓｔｒａｉｎ）は、それぞれ、ＪＷ１３１６（△ｔｙｒＲ）、ＪＷ４３５６（△ｔｒｐＲ）、ＪＷ３９０９（△ｍｃｔＪ）、ＪＷ１６５０（△ｐｕｒＲ）、ＪＷ２８０７（△ｌｙｓＲ）、およびＪＷ０４０３（△ｎｒｄＲ）に対応する。
表４３
（実施例４８）
Ｅ．ｃｏｌｉ株の構築
表４４および４５におけるそれぞれの組み合わせに従って、プラスミドは、それぞれのベースの株に導入した。全てのプラスミドは、標準的な方法を使用して電気穿孔を介して同時に導入した。形質転換細胞は、抗生物質を補充した適切な培地で増殖させ、コロニーは、選択培地でのそれらの適切な増殖に基づいて選択した。
表４４：好気条件下でのＥ．ｃｏｌｉ遺伝子改変結果
表４５：嫌気条件下でのＥ．ｃｏｌｉ遺伝子改変結果
（実施例４９）
野生型Ｅ．ｃｏｌｉに対する３ＨＰＴＧＣ関連補充物質の評価
３ＨＰ耐性に対する補充の効果は、上記共通の方法セクションにおいて記載される方法を使用して、ＭＩＣ評価によって決定した。試験した補充物質を、表４６に列挙する。上記ＭＩＣ評価の結果は、好気条件については表４７および嫌気条件については表４８に提供する。単一および複数の補充物質の追加を含むこのデータは、２４時間のＭＩＣ評価に基づいて、これらの培養系における３−ＨＰ耐性における改善を実証する。
表４６：補充物質
表４７：好気条件下でのＥ．ｃｏｌｉ補充物質の結果
表４８：嫌気条件下でのＥ．ｃｏｌｉ補充物質の結果
（実施例５０）
３ＨＰＴＧＣ関連遺伝子改変Ｅ．ｃｏｌｉの評価
実施例５０は、２４時間の期間にわたる、増殖速度に基づくトレラグラムを使用する、対照との、３ＨＰＴＣの１つの遺伝子改変の直接的な比較を提供する。
３ＨＰ耐性に対する遺伝子改変の効果は、上記共通の方法セクションにおいて記載される方法を使用して、ＭＩＣ評価によって決定した。Ｅ．ｃｏｌｉにおいて試験した遺伝子改変およびそのＭＩＣ結果は、好気条件については表４４および嫌気条件については表４５に列挙する。単一および複数の遺伝子改変を含むこのデータは、２４時間のＭＩＣ評価に基づいて、これらの培養系における３−ＨＰ耐性における改善を実証する。
（実施例５１）
ＣｙｎＴＳ遺伝子改変とのトレラグラム比較
２４時間の期間のトレラグラム評価は、対照（野生型）Ｅ．ｃｏｌｉ（株ＢＷ２５１１３）を、ｃｙｎＴＳを導入するための遺伝子改変を含む遺伝子改変Ｅ．ｃｏｌｉ（株ＢＷ２５１１３）と比較するために行った。
結果は、これもまた示されたさらなる条件下で試験した対照株を示す図中に提供する。
曲線下面積に基づいて、ｃｙｎＴＳ処理は、対照に対して、様々な高い３−ＨＰ濃度で、３−ＨＰに対してより大きな耐性を示すことが実証される。
（実施例５２）
Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓへの耐性片の遺伝子改変／導入
Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓへの３−ＨＰ生成耐性片の創製のために、Ｅ．ｃｏｌｉ寛容原性複合体由来のいくつかの遺伝子を、ＢａｃｉｌｌｕｓシャトルベクターのｐＷＨ１５２０（配列番号０１０）（Ｂｏｃａ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ、ＦＬ ＵＳＡ）から得た）にクローニングした。このシャトルベクターは、誘導性Ｐｘｙｌキシロース誘導性プロモーターならびにＥ．ｃｏｌｉにおける増殖のためのアンピシリン抵抗性カセットおよびＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓにおける増殖のためのテトラサイクリン抵抗性カセットを持つ。これらの遺伝子についてのクローニング戦略を、表４９に示す。
表４９：Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ耐性プラスミド構築
方法Ａ
表４９においてクローニング方法Ａを指定したＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓにおいて試験するためにクローニングした耐性遺伝子は、類似する方法において創製した。ここで記載されるクローニング方法は、遺伝子をキシロース誘導性プロモーター下に配置する。それぞれの遺伝子は、上記表のそれぞれの列において列挙したそれらの対応するプライマーＡおよびプライマーＢを使用して、ポリメラーゼ連鎖反応によって増幅した。それぞれのセットのプライマーＡは、遺伝子の出発点およびＳｐｅＩ制限酵素認識部位に対して相同性を有する。プライマーＢは、遺伝子の終止コドンから下流の領域およびＢａｍＨＩ制限酵素認識部位に対して相同性を有する。ポリメラーゼ連鎖反応産物は、製造者の指示に従って、Ｑｉａｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ ＵＳＡ）から得たＰＣＲ精製キットを使用して精製した。次に、その精製産物は、製造者の指示に従って、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ（Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ ＵＳＡ）から得たＳｐｅＩおよびＢａｍＨＩを用いて消化した。その消化混合物は、アガロースゲル電気泳動によって分離し、上記共通の方法セクションのサブセクションＩＩにおいて記載されるようにＵＶ透過照明下で視覚化した。消化し、精製した耐性遺伝子に対応するＤＮＡ片を含有するアガロースゲル切片は、ゲルから切り出し、ＤＮＡは、製造者の指示に従って、Ｑｉａｇｅｎ（Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ ＵＳＡ）からの標準的なゲル抽出プロトコールおよび成分を用いて回収した。
このｐＷＨ１５２０シャトルベクターＤＮＡは、製造者の指示に従って、Ｑｉａｇｅｎ（Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ ＵＳＡ）からの標準的なミニプレップＤＮＡ精製キットを使用して単離した。結果として生じるＤＮＡは、製造者の指示に従って、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ（Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ ＵＳＡ）から得たＳｐｅＩおよびＳｐｈＩを用いて制限消化した。その消化混合物は、アガロースゲル電気泳動によって分離し、上記共通の方法セクションのサブセクションＩＩにおいて記載されるようにＵＶ透過照明下で視覚化した。消化されたｐＷＨ１５２０骨格産物に対応するＤＮＡ片を含有するアガロースゲル切片は、ゲルから切り出し、ＤＮＡは、製造者の指示に従って、Ｑｉａｇｅｎ（Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ ＵＳＡ）からの標準的なゲル抽出プロトコールおよび成分を用いて回収した。
消化し、精製した耐性遺伝子およびｐＷＨ１５２０ ＤＮＡ産物の両方は、製造者の指示に従って、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ（Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ ＵＳＡ）から得たＴ４リガーゼを使用して一緒にライゲーションした。次いで、そのライゲーション混合物は、製造者の指示に従って、Ｌｕｃｉｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｍｉｄｄｌｅｔｏｎ ＷＩ、ＵＳＡ）から得たケミカルコンピテント１０Ｇ Ｅ．ｃｏｌｉ細胞に形質転換し、選択のためにアンピシリンを増やしたＬＢプレートでプレート培養した。いくつかの結果として生じるコロニーは、培養し、それらのＤＮＡは、製造者の指示に従って、Ｑｉａｇｅｎ（Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ ＵＳＡ）からの標準的なミニプレップＤＮＡ精製キットを使用して単離した。回収したＤＮＡは、制限消化によってチェックし、続いてアガロースゲル電気泳動を行なった。正確なバンディングパターンを示すＤＮＡ試料は、ＤＮＡ配列決定によってさらに検証した。
（実施例５３）
Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓにおける３−ＨＰ生成のためのマロニル−ＣｏＡ還元酵素の遺伝子改変／導入
Ｂａｃｉｌｌｕｓ Ｓｕｂｔｉｌｉｓにおける３−ＨＰ生成経路の創製のために、商業的ＤＮＡ遺伝子合成供給者であるＤＮＡ２．０（Ｍｅｎｌｏ Ｐａｒｋ、ＣＡ ＵＳＡ）からの遺伝子合成サービスによって構築したＣｈｌｏｒｏｆｌｅｘｕｓ ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ由来のマロニル−ｃｏＡ還元酵素遺伝子についてのコドン最適化ヌクレオチド配列を、Ｂａｃｉｌｌｕｓ Ｓｕｂｔｉｌｉｓシャトルベクターに加えた。このシャトルベクター、ｐＨＴ０８（配列番号０１１）は、Ｂｏｃａ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｂｏｃａ
Ｒａｔｏｎ、ＦＬ ＵＳＡ）から得たものであり、誘導性Ｐｇｒａｃ ＩＰＴＧ誘導性プロモーターを持つ。
このｍｃｒ遺伝子配列は、ｍｃｒ遺伝子の開始部位およびＢａｍＨＩ制限酵素認識部位に対して相同性を有するプライマー１（５’ＧＧＡＡＧＧＡＴＣＣＡＴＧＴＣＣＧＧＴＡＣＧＧＧＴＣＧ−３’）（配列番号１４８）ならびにｍｃｒ遺伝子の終止コドンおよび平滑ライゲーションクローニングのためのリン酸化５’末端を含有するプライマー２（５’−Ｐｈｏｓ−ＧＧＧＡＴＴＡＧＡＣＧＧＴＡＡＴＣＧＣＡＣＧＡＣＣＧ−３’）（配列番号１４９）を用いるポリメラーゼ連鎖反応増幅によってｐＨＴ０８シャトルベクターへの挿入のために調製した。そのポリメラーゼ連鎖反応産物は、製造者の指示に従って、Ｑｉａｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ ＵＳＡ）から得たＰＣＲ精製キットを使用して精製した。次に、その精製産物は、製造者の指示に従って、Ｎｅｗ
Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ（Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ ＵＳＡ）から得たＢａｍＨＩを用いて消化した。その消化混合物は、アガロースゲル電気泳動によって分離し、上記共通の方法セクションのサブセクションＩＩにおいて記載されるようにＵＶ透過照明下で視覚化した。ｍｃｒ遺伝子に対応するＤＮＡ片を含有するアガロースゲル切片は、ゲルから切り出し、ＤＮＡは、製造者の指示に従って、Ｑｉａｇｅｎ（Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ
ＵＳＡ）からの標準的なゲル抽出プロトコールおよび成分を用いて回収した。
このｐＨＴ０８シャトルベクターＤＮＡは、製造者の指示に従って、Ｑｉａｇｅｎ（Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ ＵＳＡ）からの標準的なミニプレップＤＮＡ精製キットを使用して単離した。結果として生じるＤＮＡは、製造者の指示に従って、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ（Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ ＵＳＡ）から得たＢａｍＨＩおよびＳｍａＩを用いて制限消化した。その消化混合物は、アガロースゲル電気泳動によって分離し、上記共通の方法セクションのサブセクションＩＩにおいて記載されるようにＵＶ透過照明下で視覚化した。消化ｐＨＴ０８骨格産物に対応するＤＮＡ片を含有するアガロースゲル切片は、ゲルから切り出し、ＤＮＡは、製造者の指示に従って、Ｑｉａｇｅｎ（Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ ＵＳＡ）からの標準的なゲル抽出プロトコールおよび成分を用いて回収した。
消化し、精製したｍｃｒおよびｐＨＴ０８産物の両方は、製造者の指示に従って、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ（Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ ＵＳＡ）から得たＴ４リガーゼを使用して一緒にライゲーションした。次いで、そのライゲーション混合物は、製造者の指示に従って、Ｌｕｃｉｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｍｉｄｄｌｅｔｏｎ ＷＩ、ＵＳＡ）から得たケミカルコンピテント１０Ｇ Ｅ．ｃｏｌｉ細胞に形質転換し、選択のためにアンピシリンを増やしたＬＢプレートでプレート培養した。いくつかの結果として生じるコロニーは、培養し、それらのＤＮＡは、製造者の指示に従って、Ｑｉａｇｅｎ（Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ ＵＳＡ）からの標準的なミニプレップＤＮＡ精製キットを使用して単離した。回収したＤＮＡは、制限消化によってチェックし、続いてアガロースゲル電気泳動を行なった。正確なバンディングパターンを示すＤＮＡ試料は、ＤＮＡ配列決定によってさらに検証した。配列を検証したＤＮＡは、ｐＨＴ０８−ｍｃｒと命名し、次いで、Ｂｏｃａ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ、ＦＬ ＵＳＡ）から得た説明書を使用して、ケミカルコンピテントＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ細胞に形質転換した。ｐＨＴ０８−ｍｃｒプラスミドを持つＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ細胞は、クロラムフェニコールを増やしたＬＢプレート上で選択した。
ｐＨＴ０８−ｍｃｒを持つＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ細胞は、２２５ｒｐｍで振盪させながら、摂氏３７度でインキュベートして、２０ｕｇ／ｍＬクロラムフェニコールを補充した５ｍｌのＬＢ培地で一晩増殖させた。これらの培養物は、１．４７ｇ／Ｌグルタメート、０．０２１ｇ／Ｌトリプトファン、２０ｕｇ／ｍＬクロラムフェニコール、および１ｍＭ ＩＰＴＧを補充した７５ｍＬのＭ９最少培地に１％ｖ／ｖで接種するために使用した。次いで、これらの培養物は、摂氏３７度でインキュベートして、２５ｒｐｍにおいた２５０ｍＬバッフルＥｒｌｅｎｍｅｙｅｒフラスコ中で１８時間、増殖させた。１８時間後に、細胞は、ペレットにし、上清は、３−ＨＰについてＧＣＭＳ検出にかけた（共通の方法セクションＩＩＩｂにおいて記載される）。微量の３−ＨＰを、クオリファイアイオンを用いて検出した。
（実施例５４）
Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ株の構築
ｐＷＨ１５２０における耐性遺伝因子のためのプラスミドおよび生成プラスミド、ｐＨＴ０８−ｍｃｒを２つのＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ株に形質転換した。そのＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ亜種ｓｕｂｔｉｌｉｓ １６８株は、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｃｏｌｏｒａｄｏ ａｔ ＢｏｕｌｄｅｒのＲｙａｎ Ｔ．Ｇｉｌｌ教授の研究室からの寄贈品として得た。形質転換は、Ｂｏｃａ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ、ＦＬ ＵＳＡ）によるｐＨＴ０８シャトルベクターについての指示と共に提供されるＡｎａｇｎｏｓｔｏｐｏｕｌｏｓ ａｎｄ Ｓｐｉｚｉｚｅｎ（Ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｓ ｆｏｒ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｉｎ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ． Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ． ８１巻：７４１〜７４６頁（１９６１年））から開発された改変プロトコールを使用して実行した。
（実施例５５）
野生型Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓに対する３ＨＰＴＧＣ関連補充物質の評価
３ＨＰ耐性に対する補充の効果は、上記共通の方法セクションにおいて記載される方法を使用して、ＭＩＣ評価によって決定した。試験した補充物質を、補充物質の表中に列挙する。嫌気条件下でのＭＩＣ評価の結果は、表５０に提供する。
表５０：Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓの補充物質および好気条件下での遺伝子改変結果
＊ Ｍ９＋ｇｌｕ＋ｔｒｐは、Ｍ９最少＋グルタメート（１．４７ｇ／Ｌ）およびトリプトファン（０．０２１ｇ／Ｌ）を意味する。
＊＊ ３４時間後にＯＤ６００が減少し、０の読み取り値をもたらす対照ＢＳＸ＿０００３．０と比較して、遺伝子改変株は、２４時間後の増殖において陽性の変化を有した。
（実施例５６）
３ＨＰＴＧＣ関連補充物質なしおよびありの３ＨＰＴＧＣ関連遺伝子改変Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓの評価
Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓにおける補充および／または３ＨＰ耐性に対する遺伝子改変の効果は、上記共通の方法セクションにおいて記載される方法を使用して、ＭＩＣ評価によって決定した。試験した補充物質を、補充物質の表中に列挙する。Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓについての試験した遺伝子改変および好気条件下でのＭＩＣ結果を、表５０に提供する。単一の遺伝子改変ならびに単一および複数の補充物質の追加を含むこのデータは、ＯＤにおける変化に基づいて、この培養系での３−ＨＰ耐性における改善を実証する。
（実施例５７）
３ＨＰ生成のための酵母の好気経路（予測）
ＡＣＣ１に対して相同性の５’の２００ｂｐ、選択のためのＨｉｓ３遺伝子、Ａｄｈ１酵母プロモーター、ＭＣＲのクローニングためのＢａｍＨＩ部位およびＳｐｅＩ部位、ｃｙｃ１ターミネーター、酵母由来のＴｅｆ１プロモーター、ならびに酵母ＡＣＣ１オープンリーディングフレームに対して相同性の最初の２００ｂｐを含有する以下の構築物（配列番号１５０）は、遺伝子合成（ＤＮＡ ２．０）を使用して構築する。ＭＣＲオープンリーディングフレーム（配列番号１５１）を、ＢａｍＨＩ部位およびＳｐｅＩ部位にクローニングし、これにより、ａｄｈ１プロモーターによる構成的転写を可能にする。上記構築物へのＭＣＲのクローニングに続いて、遺伝因子（配列番号１５２）は、制限消化によってプラスミドから単離し、関連する酵母株に形質転換する。その遺伝因子は、酵母ＡＣＣ１の天然のプロモーターをノックアウトし、それを、ａｄｈ１プロモーターから発現されるＭＣＲと交換し、Ｔｅｆ１プロモーターは、それから、酵母ＡＣＣ１発現を駆動する。組込みは、ヒスチジンの非存在下における増殖によって選択する。陽性のコロニーは、ＰＣＲによって確認する。ＭＣＲの発現およびＡＣＣ１の発現の増加は、ＲＴ−ＰＣＲによって確認する。
酵母においてＭＣＲを発現するために利用することができる代替アプローチは、プラスミドからのＭＣＲの発現である。ＡＤＨ１プロモーター（配列番号４）の制御下にＭＣＲを含有する遺伝因子は、ＭＣＲ（配列番号１５４）を含有するプラスミドを作製する標準的な分子生物学技術を使用して、ｐＲＳ４２１（配列番号１５３）などの酵母ベクターにクローニングすることができる。次いで、プラスミドベースのＭＣＲは、異なる酵母株に形質転換することができる。
本開示に基づいて、酵母細胞における、マロニル−ＣｏＡ還元酵素活性をコードする配列を含む核酸構築物の導入に加えて、いくつかの実施形態では、さらなる遺伝子改変は、エノイル−ＣｏＡ還元酵素活性および／または他の脂肪酸合成酵素活性を減少させるためになされることに注目されたい。
（実施例５８）
３ＨＰに対する耐性の増加のための、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ遺伝因子のクローニング
酵母遺伝子は、〈〈ｂｉｏｃｙｃ．ｏｒｇ〉〉を使用して相同性および経路の比較によって同定し、それは図９Ｄ、シート１〜７において概説した。遺伝因子は、表５１におけるプライマーを使用して、ＰＣＲによって増幅した。酵母遺伝因子は、天然のプロモーターおよび３’非翻訳領域の、ＰＣＲ産物配列表５１を含有するように増幅した。ＰＣＲ産物は、ゲル電気泳動および、製造者の指示に従って、Ｑｉａｇｅｎゲル抽出（Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ ＵＳＡ、カタログ番号２８７０６）を使用した、ゲル精製によって単離した。ゲル精製酵母遺伝因子は、次いで、製造者の指示に従って、ｐＹｅｓ２．１−ｔｏｐｏベクター（配列番号１８３、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ、ＵＳＡ）にクローニングした。コロニーは、ＰＣＲによってスクリーニングし、次いで、Ｇｅｎｅｗｉｚによって配列決定した。
表５１：酵母耐性プライマー
（実施例５９）
Ｅ．ｃｏｌｉ／酵母シャトルベクターｐＲＳ４２３およびｐＲＳ４２５への酵母遺伝因子のサブクローニング
遺伝因子は、制限酵素ＰｖｕＩＩおよびＸｂａＩを用いる制限消化によってｐＹｅｓ２．１から切り取った。酵母遺伝因子を含有する制限断片は、ゲル電気泳動および、製造者の指示に従って、Ｑｉａｇｅｎゲル抽出（Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ ＵＳＡ、カタログ番号２８７０６）を使用した、ゲル精製によって単離した。骨格ベクターｐＲＳ４２３およびｐＲＳ４２５は、ＳｍａＩおよびＳｐｅＩ制限酵素を用いて消化し、ゲル精製した。酵母遺伝因子は、ｐＲＳ４２３およびｐＲＳ４２５（配列番号１８４および１８５）にライゲーションした。プラスミドは全て、ＰＣＲ分析および配列決定を使用してチェックした。
（実施例６０）
酵母株の構築
酵母株は、標準的な酵母形質転換を使用して構築し、栄養要求性マーカーの補完によって選択した。株は全て、Ｓ２８８Ｃバックグラウンドとする。一般的な酵母形質転換方法については、Ｇｉｅｔｚ， Ｒ．Ｄ．およびＲ．Ａ． Ｗｏｏｄｓ． （２００２年）「Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ Ｙｅａｓｔ ｂｙ ｔｈｅ Ｌｉａｃ／ＳＳ Ｃａｒｒｉｅｒ ＤＮＡ／ＰＥＧ Ｍｅｔｈｏｄ．」 Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ３５０巻：８７〜９６頁を参照されたい。
（実施例６１）
酵母における３ＨＰ耐性に対する補充物質および／または遺伝子改変の評価
補充および／または３ＨＰ耐性に対する遺伝子改変の効果は、本実施例において記載される方法を使用して、ＭＩＣ評価によって決定した。試験した補充物質は、好気および嫌気条件について表５２および５３においてそれぞれ列挙する。酵母において試験した遺伝子改変は、好気および嫌気条件について表５４および５５においてそれぞれ列挙する。ＭＩＣ評価の結果は、表５２〜５５において提供する。単一および複数の補充物質の追加ならびに遺伝子改変を含むこのデータは、本明細書において記載されるＭＩＣ評価に基づいて、これらの培養系における３−ＨＰ耐性における改善を実証する。
酵母の好気最小発育阻止濃度評価のための方法
最小発育阻止濃度（ＭＩＣ）は、９６ウェルプレートフォーマットにおいて好気的に決定した。そのプレートを配置し、それぞれの個々のウェルが、接種後に１００ｕＬの最終容量にした場合に、以下の成分レベルを有するようにセットアップした（ビタミンなしの合成最少グルコース培地（ＳＤ）標準培地に相当する）：２０ｇ／Ｌデキストロース、５ｇ／Ｌ硫酸アンモニウム、８５０ｍｇ／Ｌリン酸一カリウム、１５０ｍｇ／Ｌリン酸二カリウム、５００ｍｇ／Ｌ硫酸マグネシウム、１００ｍｇ／Ｌ塩化ナトリウム、１００ｍｇ／Ｌ塩化カルシウム、５００μｇ／Ｌホウ酸、４０μｇ／Ｌ硫酸銅、１００μｇ／Ｌヨウ化カリウム、２００μｇ／Ｌ塩化第二鉄、４００μｇ／Ｌ硫酸マンガン、２００μｇ／Ｌモリブデン酸ナトリウム、および４００μｇ／Ｌ硫酸亜鉛。培地の補充物質は、指定される場合、補充物質の表において報告されるレベルに従って加えた。株の一晩培養物は、ビタミンを有する５ｍＬ ＳＤ培地中で三連で増殖させた（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ３５０巻、１７頁（２００２年））。１％（ｖ／ｖ）接種材料を、ビタミンなしのＳＤ最少培地の５ｍｌ培養物に導入した。細胞が中間指数期に達した後、その培養物は、０．２００のＯＤ６００まで希釈した。上記細胞は、１：５にさらに希釈し、１０μＬの一定分量を、９６ウェルプレートのそれぞれのウェルに接種するために使用し（１ウェル当たり約１０４細胞）、１００ｕＬの総容量にした。そのプレートを配置し、多様な株の増殖、または５ｇ／Ｌの増分で０〜６０ｇ／Ｌに３−ＨＰ濃度を増加させた場合の多様な増殖条件における増殖を測定するために並べた。プレートは、３０℃で７２時間インキュベートした。最小発育阻止３−ＨＰ濃度および目に見える細胞増殖（ＯＤ約０．１）に対応する最大の３−ＨＰ濃度を、７２時間後に記録した。ＭＩＣ＞６０ｇ／Ｌである場合については、評価は、広範囲の３−ＨＰ濃度（５ｇ／Ｌの増分で０〜１００ｇ／Ｌ）を有するプレートにおいて実行した。
酵母の嫌気最小発育阻止濃度評価のための方法
最小発育阻止濃度（ＭＩＣ）は、９６ウェルプレートフォーマットにおいて嫌気的に決定した。プレートは、それぞれの個々のウェルが、接種後に１００ｕＬの最終容量にした場合に、以下の成分レベルを有するようにセットアップした（ビタミンなしの合成最少グルコース培地（ＳＤ）標準培地に相当する）：２０ｇ／Ｌデキストロース、５ｇ／Ｌ硫酸アンモニウム、８５０ｍｇ／Ｌリン酸一カリウム、１５０ｍｇ／Ｌリン酸二カリウム、５００ｍｇ／Ｌ硫酸マグネシウム、１００ｍｇ／Ｌ塩化ナトリウム、１００ｍｇ／Ｌ塩化カルシウム、５００ｕｇ／Ｌホウ酸、４０ｕｇ／Ｌ硫酸銅、１００ｕｇ／Ｌヨウ化カリウム、２００ｕｇ／Ｌ塩化第二鉄、４００ｕｇ／Ｌ硫酸マンガン、２００ｕｇ／Ｌモリブデン酸ナトリウム、および４００ｕｇ／Ｌ硫酸亜鉛。株の一晩培養物は、ビタミンを有する５ｍＬ ＳＤ培地中で三連で増殖させた（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ３５０巻、１７頁（２００２年））。１％（ｖ／ｖ）接種材料を、ビタミンなしのＳＤ最少培地の５ｍｌ培養物に導入した。細胞が中間指数期に達した後、その培養物は、０．２００のＯＤ６００まで希釈した。その細胞は、１：５にさらに希釈し、１０μＬの一定分量を、９６ウェルプレートのそれぞれのウェルに接種するために使用し（１ウェル当たり約１０４細胞）、１００ｕＬの総容量にした。そのプレートを配置し、多様な株の増殖、または５ｇ／Ｌの増分で０〜６０ｇ／Ｌに３−ＨＰ濃度を増加させた場合の多様な増殖条件における増殖を測定した。プレートは、３０℃で７２時間インキュベートした。最小発育阻止３−ＨＰ濃度および目に見える細胞増殖（ＯＤ約０．１）に対応する最大の３−ＨＰ濃度を、７２時間後に記録した。ＭＩＣ＞６０ｇ／Ｌである場合については、評価は、広範囲の３−ＨＰ濃度（５ｇ／Ｌの増分で０〜１００ｇ／Ｌ）を有するプレートにおいて実行した。プレートは、嫌気条件用のガス発生器を含有するバイオバッグ嫌気チャンバー内に密閉し、３０℃で７２時間インキュベートした。最小発育阻止３−ＨＰ濃度および目に見える細胞増殖（ＯＤ約０．１）に対応する最大の３−ＨＰ濃度を、７２時間後に記録した。ＭＩＣ＞６０ｇ／Ｌである場合については、評価は、広範囲の３−ＨＰ濃度（５ｇ／Ｌの増分で０〜１００ｇ／Ｌ）を有するプレートにおいて実行した。
表５２：好気条件下での酵母補充物質の結果
表５３：嫌気条件下での酵母補充物質の結果
表５４：好気条件下での酵母遺伝子改変結果
表５５：嫌気条件下での酵母遺伝子改変結果
表５６：好気条件下でのＣ．ｎｅｃａｔｏｒ補充物質の結果
（実施例６２）
Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ ｎｅｃａｔｏｒにおける３ＨＰＴＧＣ関連補充物質の評価
Ｃ．ｎｅｃａｔｏｒにおける３ＨＰ耐性に対する補充の効果は、上記共通の方法セクションにおいて記載される方法を使用して、ＭＩＣ評価によって決定した。試験した補充物質を、補充物質の表中に列挙する。
Ｃ．ｎｅｃａｔｏｒについての好気条件下でのＭＩＣ結果を、表５６に提供する。単一および複数の補充物質の追加を含むこのデータは、ＭＩＣ評価に基づいて、これらの培養系における３−ＨＰ耐性における改善を実証する。
（実施例６３）
３−ＨＰ生成遺伝子改変（複数可）と組み合わせた３ＨＰＴＧＣ耐性指向性遺伝子改変（複数可）のさらなる例
３−ＨＰを生成するための使用に適切な所望の遺伝子改変微生物を得るために耐性および３−ＨＰ生成遺伝子改変を組み合わせることの一般的な例を提供する実施例４２に加え、また、実施例４３に従う実施例を考慮し、また、本明細書におけるさらなる開示および当業者に公知の方法を考慮して（例えば、遺伝子改変のその方法について本実施例に組み込まれるＳａｍｂｒｏｏｋおよびＲｕｓｓｅｌｌ、２００１年）、本実施例は、３−ＨＰに対する耐性増加をもたらすための３ＨＰＴＧＣの１つ以上の遺伝子改変（本明細書において議論されるものなどの任意の計量によって評価されてもよい）および３−ＨＰ生成を増加させるための１つ以上の遺伝子改変（本明細書において開示されるものなどの３−ＨＰ生成経路など）を含むように遺伝子改変された微生物種を提供する。
そのように遺伝子改変された微生物は、培養系の酸素含量および培地の栄養分組成を含む変動条件下での、３−ＨＰに対する耐性およびその生成の両方について評価されてもよい。
本実施例の様々な態様では、遺伝子改変の複数のセットを作製し、３−ＨＰ耐性および３−ＨＰ生成の増加についての所望の特質および／または計量を含む、１つ以上の遺伝子改変微生物を同定するために比較する。
（実施例６４）
３ＨＰＴＧＣ遺伝子改変と組み合わせたＩｒｏｋ配列をコードする遺伝子改変の導入
実施例４５は、２１アミノ酸から構成されるペプチドであるＩｒｏｋおよびそれをコードするプラスミドをＥ．ｃｏｌｉ株に導入し、微好気条件下で評価した場合のその３−ＨＰ耐性改善効果を記載する。３ＨＰＴＧＣに関する本明細書における開示および当業者に公知の方法（例えば、遺伝子改変のその方法について本実施例に組み込まれるＳａｍｂｒｏｏｋおよびＲｕｓｓｅｌｌ、２００１年）を考慮して、微生物種は、総体として３−ＨＰに対する耐性増加をもたらすために、ＩｒｏＫペプチド配列をコードする核酸配列および３ＨＰＴＧＣの１つ以上の遺伝子改変を含むように遺伝子改変する。３−ＨＰ耐性におけるそのような増加は、本明細書において議論されるものなどの任意の計量によって評価されてもよい。
したがって、結果に基づいて、群Ａ〜Ｅの２つ以上の提示を含む様々な遺伝子改変の組み合わせは、３−ＨＰに対する所望の高い耐性を達成するために、微生物において評価され、使用されてもよい。上記の表は、これらの群からの組み合わせを含む特定の遺伝子改変の組み合わせの結果を示す。また、さらなる遺伝子改変は、群Ｆから提供されてもよい。本明細書において別記されるように、任意のそのような組み合わせは、１つ以上の：組換え微生物による３−ＨＰの合成および蓄積をもたらし、かつ／または増大させるための３−ＨＰバイオ生産経路ならびに３−ＨＰバイオ生産に、より多くの代謝資源（例えば炭素およびエネルギー）を向けるための欠失または他の改変ならびに脂肪酸合成酵素系へのフラックスを調整することに関する他の遺伝子改変を含んでいてもよい他の遺伝子改変と組み合わせられてもよい。
下記は、他の微生物種における本発明の実施に関する非限定的な一般的な予測の実施例である。
（一般的な予測の実施例６５）Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓにおける３−ＨＰ耐性および／またはバイオ生産の改善
ｐＲｈＢＲ１７およびｐＤＡ７１を含むが、これらに限定されない一連のＥ．ｃｏｌｉ−Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓシャトルベクターは、Ｒ．ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓにおける発現のために利用可能である（Ｋｏｓｔｉｃｈｋａら、Ａｐｐｌ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ６２巻：６１〜６８頁（２００３年））。さらに、一連のプロモーターは、Ｒ．ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓにおける異種遺伝子発現のために利用可能である（例えばＮａｋａｓｈｉｍａら、Ａｐｐｌ． Ｅｎｖｉｒｏｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ７０巻：５５５７〜５５６８頁（２００４年）およびＴａｏら、Ａｐｐｌ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ２００５年、ＤＯＩ １０．１００７／ｓ００２５３−００５−００６４を参照されたい）。Ｒ．ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓにおける染色体遺伝子の標的遺伝子破壊は、Ｔａｏら、前掲、およびＢｒａｎｓら（Ａｐｐｌ． Ｅｎｖｉｒｏｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ６６巻：２０２９〜２０３６頁（２０００年））によって記載される方法を使用して生成されてもよい。これらの公開される手段は、それぞれの示される教示および組成について参照によって組み込まれる。
本明細書において記載される、３−ＨＰ耐性の増加をもたらすのに必要とされる核酸配列は、必要に応じて３−ＨＰ生合成経路を提供するおよび／または改善するための核酸配列と共に、ｐＤＡ７１またはｐＲｈＢＲ７１に最初にクローニングし、Ｅ．ｃｏｌｉに形質転換する。次いで、上記ベクターは、Ｋｏｓｔｉｃｈｋａら、前掲によって記載されるように、電気穿孔によってＲ．ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓに形質転換される。上記組換え体は、グルコースを含有する合成培地で増殖させ、３−ＨＰに対する耐性および／またはそのバイオ生産は、当技術分野において公知のまたは本明細書において記載される方法を使用して追跡する。
（一般的な予測の実施例６６）Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓにおける３−ＨＰ耐性および／またはバイオ生産の改善
Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓにおいて複製するほとんどのプラスミドおよびシャトルベクターは、プロトプラスト形質転換または電気穿孔のいずれかによってＢ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓを形質転換するために使用する。３−ＨＰ耐性の改善のためにおよび／または３−ＨＰ生合成のために必要とされる核酸配列は、様々な供給源から単離し、適切なようにコドン最適化し、プラスミドｐＢＥ２０またはｐＢＥ６０誘導体にクローニングする（Ｎａｇａｒａｊａｎら、Ｇｅｎｅ １１４巻：１２１〜１２６頁（１９９２年））。Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓを形質転換するための方法は、当技術分野において公知である（例えばＦｌｅｍｉｎｇら Ａｐｐｌ． Ｅｎｖｉｒｏｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，６１巻（１１号）：３７７５〜３７８０頁（１９９５年）を参照されたい）。これらの公開される手段は、それらのそれぞれの示される教示および組成について参照によって組み込まれる。
Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓにおける発現のために構築したプラスミドは、次いで３−ＨＰ耐性の改善および必要に応じて３−ＨＰバイオ生産を実証する組換え微生物を生成するためにＢ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓに形質転換する。
（一般的な予測の実施例６７）Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｍａｃｅｒａｎｓにおける３−ＨＰ耐性および／またはバイオ生産の改善
プラスミドは、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓにおける発現のために本明細書において記載されるように構築し、プロトプラスト形質転換によって、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｍａｃｅｒａｎｓを形質転換し、３−ＨＰ耐性の改善および必要に応じて３−ＨＰバイオ生産を実証する組換え微生物を生成するために使用する。
（一般的な予測の実施例６８）Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ）ｅｕｔｒｏｐｈｕｓ（現在Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ ｎｅｃａｔｏｒと呼ばれる）における３−ＨＰ耐性および／またはバイオ生産の発現
Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｅｕｔｒｏｐｈｕｓにおける遺伝子発現および突然変異の作製のための方法は、当技術分野において公知である（例えばＴａｇｈａｖｉら、Ａｐｐｌ． Ｅｎｖｉｒｏｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、６０巻（１０号）：３５８５〜３５９１頁（１９９４年）を参照されたい）。この公開される手段は、その示される教示および組成について参照によって組み込まれる。３−ＨＰ耐性を改善することが同定された核酸配列および／または３−ＨＰ生合成のための核酸配列はいずれも、様々な供給源から単離し、適切なようにコドン最適化し、本明細書において記載される広範囲の宿主領域のベクターのいずれかにクローニングし、３−ＨＰ耐性の改善および必要に応じて３−ＨＰバイオ生産を実証する組換え微生物を生成するために電気穿孔する。Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓにおけるポリ（ハイドロキシブチレート）経路は、詳細に記載されており、Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｅｕｔｒｏｐｈｕｓゲノムを改変するための様々な遺伝学的技術は、公知であり、それらのツールは、３−ＨＰ寛容原性または必要に応じて３−ＨＰ−ｇｅｎａ−寛容原性組換え微生物を設計製作するために適用することができる。
一般的な予測の実施例６９：Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａにおける３−ＨＰ耐性および／またはバイオ生産の改善
Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａにおける遺伝子発現のための方法は、当技術分野において公知である（例えば、これらの教示が参照により本明細書において組み込まれるＢｅｎ−Ｂａｓｓａｔら、米国特許第６，５８６，２２９号を参照されたい）。３−ＨＰ耐性を改善することが同定された核酸配列および／または３−ＨＰ生合成のための核酸配列はいずれも、様々な供給源から単離し、適切なようにコドン最適化し、本明細書において記載される広範囲の宿主領域のベクターのいずれかにクローニングし、３−ＨＰ耐性の改善および必要に応じて３−ＨＰ生合成による生成を実証する組換え微生物を生成するために電気穿孔する。例えば、これらの核酸配列は、ｐＵＣＰ１８に挿入し、このライゲーションしたＤＮＡは、３−ＨＰ耐性の増加を示し、また必要に応じて、導入した核酸配列の少なくとも一部分から構成される３−ＨＰ生合成経路をも含む組換えＰ．ｐｕｔｉｄａ微生物を生成するために、エレクトロコンピテントＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ ＫＴ２４４０細胞に電気穿孔する。
（一般的な予測の実施例７０）Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍにおける３−ＨＰ耐性および／またはバイオ生産の改善
Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属は、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌａｌｅｓのファミリーに属し、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓおよびＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓの形質転換において使用される多くのプラスミドおよびベクターは、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓのために使用される。適切なベクターの非限定的な例は、ｐＡＭβ１およびその誘導体（Ｒｅｎａｕｌｔら、Ｇｅｎｅ １８３巻：１７５〜１８２頁（１９９６年）；およびＯ’Ｓｕｌｌｉｖａｎら、Ｇｅｎｅ １３７巻：２２７〜２３１頁（１９９３年））；ｐＭＢＢ１およびｐＨＷ８００、ｐＭＢＢ１の誘導体（Ｗｙｃｋｏｆｆら Ａｐｐｌ． Ｅｎｖｉｒｏｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ６２巻：１４８１〜１４８６頁（１９９６年））；ｐＭＧ１、接合性プラスミド（Ｔａｎｉｍｏｔｏら、Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ． １８４巻：５８００〜５８０４頁（２００２年））；ｐＮＺ９５２０（Ｋｌｅｅｒｅｂｅｚｅｍら、Ａｐｐｌ． Ｅｎｖｉｒｏｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ６３巻：４５８１〜４５８４頁（１９９７年））；ｐＡＭ４０１（Ｆｕｊｉｍｏｔｏら、Ａｐｐｌ． Ｅｎｖｉｒｏｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ６７巻：１２６２〜１２６７頁（２００１年））；ならびにｐＡＴ３９２（Ａｒｔｈｕｒら、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ． Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ． ３８巻：１８９９〜１９０３頁（１９９４年））を含む。Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ由来のいくつかのプラスミドもまた、報告されている（例えばｖａｎ Ｋｒａｎｅｎｂｕｒｇ Ｒ、Ｇｏｌｉｃ Ｎ、Ｂｏｎｇｅｒｓ Ｒ、Ｌｅｅｒ Ｒ Ｊ、ｄｅ Ｖｏｓ Ｗ Ｍ、Ｓｉｅｚｅｎ Ｒ Ｊ、Ｋｌｅｅｒｅｂｅｚｅｍ Ｍ． Ａｐｐｌ． Ｅｎｖｉｒｏｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ２００５年３月；７１巻（３号）：１２２３〜１２３０頁）。
（一般的な予測の実施例７１）Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃｉｕｍ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｇａｌｌｉｎａｒｉｕｍ、およびＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓにおける３−ＨＰ耐性および／またはバイオ生産の改善
Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ属は、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌａｌｅｓのファミリーに属し、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓおよびＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓの形質転換において使用される多くのプラスミドおよびベクターは、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓのために使用される。適切なベクターの非限定的な例は、ｐＡＭβ１およびその誘導体（Ｒｅｎａｕｌｔら、Ｇｅｎｅ １８３巻：１７５〜１８２頁（１９９６年）；およびＯ’Ｓｕｌｌｉｖａｎら、Ｇｅｎｅ １３７巻：２２７〜２３１頁（１９９３年））；ｐＭＢＢ１およびｐＨＷ８００、ｐＭＢＢ１の誘導体（Ｗｙｃｋｏｆｆら Ａｐｐｌ． Ｅｎｖｉｒｏｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ６２巻：１４８１〜１４８６頁（１９９６年））；ｐＭＧ１、接合性プラスミド（Ｔａｎｉｍｏｔｏら、Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ． １８４巻：５８００〜５８０４頁（２００２年））；ｐＮＺ９５２０（Ｋｌｅｅｒｅｂｅｚｅｍら、Ａｐｐｌ． Ｅｎｖｉｒｏｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ６３巻：４５８１〜４５８４頁（１９９７年））；ｐＡＭ４０１（Ｆｕｊｉｍｏｔｏら、Ａｐｐｌ． Ｅｎｖｉｒｏｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ６７巻：１２６２〜１２６７頁（２００１年））；ならびにｐＡＴ３９２（Ａｒｔｈｕｒら、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ． Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ． ３８巻：１８９９〜１９０３頁（１９９４年））を含む。Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ由来のｎｉｓＡ遺伝子を使用するＥ．ｆａｅｃａｌｉｓのための発現ベクターもまた、使用されてもよい（Ｅｉｃｈｅｎｂａｕｍら、Ａｐｐｌ．
Ｅｎｖｉｒｏｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ６４巻：２７６３〜２７６９頁（１９９８年）。さらに、Ｅ．ｆａｅｃｉｕｍ染色体における遺伝子交換のためのベクターが、使用される（Ｎａｌｌａａｐａｒｅｄｄｙら、Ａｐｐｌ． Ｅｎｖｉｒｏｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ７２巻：３３４〜３４５頁（２００６年））。
一般的な予測の実施例６５〜７１のそれぞれについては、以下の３−ＨＰバイオ生産比較が、それに組み込まれてもよい：共通の方法セクションのサブセクションＩＩＩにおいて記載される３−ＨＰについての分析方法を使用して、３−ＨＰは、それぞれの組換え微生物を用いて行われるそれぞれのバイオ生産イベントの終わりに当たって測定可能な量で得られる（各それぞれの一般的な予測の実施例に参照によって組み込まれるバイオ生産イベントのタイプを参照されたい）。その測定可能な量は、それぞれの一般的な予測の実施例においてそのように提供される機能的な３−ＨＰ経路を欠く適切なそれぞれの対照微生物を使用して対照バイオ生産イベントにおいて生成される３−ＨＰの量よりも実質的に大きい。耐性改善はまた、上記共通の方法セクションにおいて提供されるＭＩＣプロトコールの使用によるなど、任意の認識された比較測定技術によって評価されてもよい。
共通の方法セクション
このセクションにおける方法は全て、参照される場合、実施例への組み込みのために提供される。
サブセクションＩ．微生物種および株、培養物、ならびに増殖培地
必要に応じて利用されてもよい細菌の種は、以下の通りである。
Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓ（ＤＳＭＺ＃１１３９）は、真空乾燥培養物としてＧｅｒｍａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ（Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）から得られる。次いで、培養物は、ブレインハートインヒュージョン（ＢＨＩ）培地（ＲＰＩ Ｃｏｒｐ、Ｍｔ．Ｐｒｏｓｐｅｃｔ、ＩＬ、ＵＳＡ）に再懸濁させる。その再懸濁したＡ．ｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓ培養物の段階希釈物は、ＢＨＩ中に作製し、飽和するまで２５０ｒｐｍで３７℃で４８時間好気的に増殖させる。
Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓは、Ｇｉｌｌ研究所（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｃｏｌｏｒａｄｏ ａｔ Ｂｏｕｌｄｅｒ）からの寄贈品であり、活発に増殖している培養物として得られる。その活発に増殖しているＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ培養物の段階希釈物は、Ｌｕｒｉａ Ｂｒｏｔｈ（ＲＰＩ Ｃｏｒｐ、Ｍｔ．Ｐｒｏｓｐｅｃｔ、ＩＬ、ＵＳＡ）中に作製し、飽和するまで２５０ｒｐｍで３７℃で２４時間好気的に増殖させる。
Ｃｈｌｏｒｏｂｉｕｍ ｌｉｍｉｃｏｌａ（ＤＳＭＺ＃２４５）は、真空乾燥培養物としてＧｅｒｍａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ（Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）から得られる。次いで、培養物は、Ｐｆｅｎｎｉｇ培地ＩおよびＩＩ（＃２８および２９）を使用してＤＳＭＺ説明書によって記載されるように、再懸濁させる。Ｃ．ｌｉｍｉｃｏｌａは、一定のボルテックス下で２５℃で増殖させる。
Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ ｂｒａａｋｉｉ（ＤＳＭＺ＃３００４０）は、真空乾燥培養物としてＧｅｒｍａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ（Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）から得られる。次いで、培養物は、ブレインハートインヒュージョン（ＢＨＩ）培地（ＲＰＩ Ｃｏｒｐ、Ｍｔ．Ｐｒｏｓｐｅｃｔ、ＩＬ、ＵＳＡ）に再懸濁させる。その再懸濁したＣ．ｂｒａａｋｉｉ培養物の段階希釈物は、ＢＨＩ中に作製し、飽和するまで２５０ｒｐｍで３０℃で４８時間好気的に増殖させる。
Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ（ＤＳＭＺ＃７９２）は、真空乾燥培養物としてＧｅｒｍａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ（Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）から得られる。次いで、培養物は、ＤＳＭＺ説明書によって記載されるように、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ培地（＃４１１）に再懸濁させる。Ｃ．ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍは、飽和するまで、２５０ｒｐｍで３７℃で嫌気的に増殖させる。
Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｍｉｎｏｂｕｔｙｒｉｃｕｍ（ＤＳＭＺ＃２６３４）は、真空乾燥培養物としてＧｅｒｍａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ（Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）から得られる。次いで、培養物は、ＤＳＭＺ説明書によって記載されるように、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｍｉｎｏｂｕｔｙｒｉｃｕｍ培地（＃２８６）に再懸濁させる。Ｃ．ａｍｉｎｏｂｕｔｙｒｉｃｕｍは、飽和するまで、２５０ｒｐｍで３７℃で嫌気的に増殖させる。
Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｋｌｕｙｖｅｒｉ（ＤＳＭＺ＃５５５）は、活発に増殖している培養物として、Ｇｅｒｍａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ（Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ） から得られる。Ｃ．ｋｌｕｙｖｅｒｉ培養物の段階希釈物は、ＤＳＭＺ説明書によって記載されるようにＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｋｌｕｙｖｅｒｉ培地（＃２８６）中に作製する。Ｃ．ｋｌｕｙｖｅｒｉは、飽和するまで、２５０ｒｐｍで３７℃で嫌気的に増殖させる。
Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ ｍｅｔａｌｌｉｄｕｒａｎｓ（ＤＭＳＺ＃２８３９）は、真空乾燥培養物としてＧｅｒｍａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ（Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）から得られる。次いで、培養物は、ブレインハートインヒュージョン（ＢＨＩ）培地（ＲＰＩ Ｃｏｒｐ、Ｍｔ．Ｐｒｏｓｐｅｃｔ、ＩＬ、ＵＳＡ）に再懸濁させる。その再懸濁したＣ．ｍｅｔａｌｌｉｄｕｒａｎｓ培養物の段階希釈物は、ＢＨＩ中に作製し、飽和するまで２５０ｒｐｍで３０℃で４８時間好気的に増殖させる。
Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ ｎｅｃａｔｏｒ（ＤＳＭＺ＃４２８）は、真空乾燥培養物としてＧｅｒｍａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ（Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）から得られる。次いで、培養物は、ブレインハートインヒュージョン（ＢＨＩ）培地（ＲＰＩ Ｃｏｒｐ、Ｍｔ．Ｐｒｏｓｐｅｃｔ、ＩＬ、ＵＳＡ）に再懸濁させる。その再懸濁したＣ．ｎｅｃａｔｏｒ培養物の段階希釈物は、ＢＨＩ中に作製し、飽和するまで２５０ｒｐｍで３０℃で４８時間好気的に増殖させる。他のところで述べられるように、この種についての以前の名称は、Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｅｕｔｒｏｐｈｕｓおよびＲａｌｓｔｏｎｉａ ｅｕｔｒｏｐｈｕｓである。
Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ ｆｒｕｃｔｏｓｏｖｏｒａｎｓ（ＤＳＭＺ＃３６０４）は、真空乾燥培養物としてＧｅｒｍａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ（Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）から得られる。次いで、培養物は、ＤＳＭＺ説明書によって記載されるように、Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ ｆｒｕｃｔｏｓｏｖｏｒａｎｓ培地（＃６３）に再懸濁させる。Ｄ．ｆｒｕｃｔｏｓｏｖｏｒａｎｓは、飽和するまで、２５０ｒｐｍで３７℃で嫌気的に増殖させる。
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｃｒｏｏｋｓ（ＤＳＭＺ＃１５７６）は、真空乾燥培養物としてＧｅｒｍａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ（Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）から得られる。次いで、培養物は、ブレインハートインヒュージョン（ＢＨＩ）培地（ＲＰＩ Ｃｏｒｐ、Ｍｔ．Ｐｒｏｓｐｅｃｔ、ＩＬ、ＵＳＡ）に再懸濁させる。その再懸濁したＥ．ｃｏｌｉ Ｃｒｏｏｋｓ培養物の段階希釈物は、ＢＨＩ中に作製し、飽和するまで２５０ｒｐｍで３７℃で４８時間好気的に増殖させる。
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ１２は、Ｇｉｌｌ研究所（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｃｏｌｏｒａｄｏ ａｔ Ｂｏｕｌｄｅｒ）からの寄贈品であり、活発に増殖している培養物として得られる。その活発に増殖しているＥ．ｃｏｌｉ Ｋ１２培養物の段階希釈物は、Ｌｕｒｉａ Ｂｒｏｔｈ（ＲＰＩ Ｃｏｒｐ、Ｍｔ．Ｐｒｏｓｐｅｃｔ、ＩＬ、ＵＳＡ）中に作製し、飽和するまで２５０ｒｐｍで３７℃で２４時間好気的に増殖させる。
Ｈａｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓａｌｉｎａｒｕｍ（ＤＳＭＺ＃１５７６）は、真空乾燥培養物としてＧｅｒｍａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ（Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）から得られる。次いで、培養物は、ＤＳＭＺ説明書によって記載されるように、Ｈａｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ培地（＃９７）に再懸濁させる。Ｈ．ｓａｌｉｎａｒｕｍは、飽和するまで、２５０ｒｐｍで３７℃で好気的に増殖させる。
Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ（＃４３３５）は、活発に増殖している培養物としてＷＹＥＡＳＴ ＵＳＡ（Ｏｄｅｌｌ、ＯＲ、ＵＳＡ）から得られる。その活発に増殖しているＬ．ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ培養物の段階希釈物は、ブレインハートインフュージョン（ＢＨＩ）培地（ＲＰＩ Ｃｏｒｐ、Ｍｔ．Ｐｒｏｓｐｅｃｔ、ＩＬ、ＵＳＡ）中に作製し、飽和するまで２５０ｒｐｍで３０℃で２４時間好気的に増殖させる。
Ｍｅｔａｌｌｏｓｐｈａｅｒａ ｓｅｄｕｌａ（ＤＳＭＺ＃５３４８）は、活発に増殖している培養物として、Ｇｅｒｍａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ（Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）から得られる。Ｍ．ｓｅｄｕｌａ培養物の段階希釈物は、ＤＳＭＺ説明書によって記載されるようにＭｅｔａｌｌｏｓｐｈａｅｒａ培地（＃４８５）中に作製する。Ｍ．ｓｅｄｕｌａは、飽和するまで、２５０ｒｐｍで６５℃で好気的に増殖させる。
Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆｒｅｕｄｅｎｒｅｉｃｈｉｉ亜種ｓｈｅｒｍａｎｉｉ（ＤＳＭＺ＃４９０２）は、真空乾燥培養物としてＧｅｒｍａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ（Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）から得られる。次いで、培養物は、ＤＳＭＺ説明書によって記載されるように、ＰＹＧ培地（＃１０４）に再懸濁させる。Ｐ．ｆｒｅｕｄｅｎｒｅｉｃｈｉｉ亜種ｓｈｅｒｍａｎｉｉは、飽和するまで、２５０ｒｐｍで３０℃で嫌気的に増殖させる。
Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａは、Ｇｉｌｌ研究所（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｃｏｌｏｒａｄｏ ａｔ Ｂｏｕｌｄｅｒ）からの寄贈品であり、活発に増殖している培養物として得られる。その活発に増殖しているＰ．ｐｕｔｉｄａ培養物の段階希釈物は、Ｌｕｒｉａ Ｂｒｏｔｈ（ＲＰＩ Ｃｏｒｐ、Ｍｔ．Ｐｒｏｓｐｅｃｔ、ＩＬ、ＵＳＡ）中に作製し、飽和するまで２５０ｒｐｍで３７℃で２４時間好気的に増殖させる。
Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓ（ＤＳＭＺ＃６１７８）は、真空乾燥培養物としてＧｅｒｍａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ（Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）から得られる。次いで、培養物は、Ｌｕｒｉａ Ｂｒｏｔｈ（ＲＰＩ Ｃｏｒｐ、Ｍｔ．Ｐｒｏｓｐｅｃｔ、ＩＬ、ＵＳＡ）に再懸濁させる。Ｓ．ｍｕｔａｎｓは、飽和するまで、２５０ｒｐｍで３７℃で好気的に増殖させる。
以下の非限定的な株もまた、本実施例において出発株として使用されてもよい：ＤＦ４０ Ｈｆｒ（ＰＯ２Ａ）、ｇａｒＢ１０、ｆｈｕＡ２２、ｏｍｐＦ６２７（Ｔ２Ｒ）、ｆａｄＬ７０１（Ｔ２Ｒ）、ｒｅｌＡ１、ｐｉｔＡ１０、ｓｐｏＴ１、ｒｒｎＢ−２、ｐｇｉ−２、ｍｃｒＢ１、ｃｒｅＣ５１０、ＢＷ２５１１３ Ｆ−、Δ（ａｒａＤ−ａｒａＢ）５６７、ΔｌａｃＺ４７８７（：：ｒｒｎＢ−３）、＆ｌａｍｂｄａ−、ｒｐｈ−１、Δ（ｒｈａＤ−ｒｈａＢ）５６８、ｈｓｄＲ５１４、ＪＰ１１１ Ｈｆｒ（ＰＯ１）、ｇａｌＥ４５（ＧａｌＳ）、＆ｌａｍｂｄａ−、ｆａｂＩ３９２（ｔｓ）、ｒｅｌＡ１、ｓｐｏＴ１、ｔｈｉ−１。これらの株は、認識される遺伝子改変を有し、Ｙａｌｅ Ｃｏｌｉ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｓｔｏｃｋ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｎｅｗ Ｈａｖｅｎ、ＣＴ ＵＳＡ）などの公的な培養物供給源から入手可能である。これらの株から開発された株は、本実施例において記載される。
細菌増殖培養培地および関連する材料および条件は、以下の通りである。
流加培地は、１０ｇトリプトン、５ｇ酵母抽出物、１．５ｇ ＮａＣｌ、２ｇ Ｎａ２ＨＰＯ４．７Ｈ２Ｏ、１ｇ ＫＨ２ＰＯ４、および示されるグルコースを含有した（１リットル当たり）。
ＡＭ２培地は、２．８７ｇ Ｋ２ＨＰＯ４、１．５０ｇ ＫＨ２ＰＯ４、３．１３ｇ （ＮＨ４）２ＳＯ４、０．１５ｇ ＫＣｌ、１．５ｍＭ ＭｇＳＯ４、０．１Ｍ Ｋ＋ＭＯＰＳ ｐＨ ７．２、３０ｇグルコース、およびＭａｒｔｉｎｅｚら Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｌｅｔｔ ２９：３９７〜４０４頁（２００７年）において記載されるように調製される１ｍｌ微量ミネラルストックを含有した（１リットル当たり）。
最初のバッチ培地について発酵槽において使用したＡＭ２培地（実施例１１について）
発酵槽において使用されるＡＭ２培地についての微量金属原液
ＡＭ２容器についてのグルコース供給におけるグルコースの濃度：２００ｇ／Ｌグルコース
発酵槽の最初のバッチ培地において使用したリッチ培地（実施例１１について）
リッチ培地についてのさらなるグルコース供給のための栄養処方
Ｅ．ｃｏｌｉについてのＳＭ３最少培地（最終リン酸塩濃度＝２７．５ｍＭ；最終Ｎ濃度＝４７．４ｍＭ ＮＨ４ ＋）。
１リットル当たりの成分：７００ｍＬ ＤＩ水、１００ｍＬ １０×ＳＭ３塩、２ｍｌ
１Ｍ ＭｇＳＯ４、１ｍｌ １０００×微量ミネラルストック、６０ｍＬ ５００ｇ／Ｌグルコース、１００ｍＬ ０．１Ｍ ＭＯＰＳ（ｐＨ７．４）、０．１ｍＬの１Ｍ ＣａＣｌ２、１０００ｍＬまでのＤＩ水を用いる適量、および０．２μｍフィルター滅菌。
原液の調製：
１０×ＳＭ３塩（１Ｌ）の作製：８００ｍＬ ＤＩ水、２８．７ｇ Ｋ２ＨＰＯ４、１５ｇ ＫＨ２ＰＯ４、３１．３ｇ （ＮＨ４）２ＳＯ４、１．５ｇ ＫＣｌ、０．５ｇ クエン酸（無水）、および１０００ｍＬまでのＤＩ水を用いる適量。
１０００×微量ミネラルストック（１Ｌ）の作製：室温で５０ｍｌ分を保存する。
０．１２Ｍ ＨＣｌ中１リットル当たり（１０ｍｌの濃ＨＣｌを１リットルの水に希釈する）：２．４ｇ ＦｅＣＬ３．６Ｈ２Ｏ、０．１７ｇ ＣｏＣｌ２．６Ｈ２Ｏ、０．１５ｇ ＣｕＣｌ２．２Ｈ２Ｏ、０．３ｇ ＺｎＣｌ２、０．３ｇ ＮａＭｏＯ４．２Ｈ２Ｏ（モリブデン酸、二ナトリウム塩、二水和物）、０．０７ｇ Ｈ３ＢＯ３、および０．５ｇ ＭｎＣｌ２．４Ｈ２Ｏ。
１Ｍ ＭＯＰＳの作製：２０９．３ｇ ＭＯＰＳ、７００ｍｌの水に溶解。７０ｍｌ分を取り、５０％ＫＯＨを用いて所望のｐＨに調整し、１００ｍＬ最終容量に調整し、０．２μｍフィルター滅菌。
１Ｍ ＭｇＳＯ４の作製：１２０．３７ｇを１０００ｍＬ水に溶解。
５００ｇ／Ｌ（５０％）グルコース原液の作製：９００ｍＬ ＤＩ水、５００ｇグルコース、および１０００ｍｌまでの適量。
さらなる増殖培地の処方を以下のように概説する：
ＦＭ１０：微量金属原液処方：
１Ｌ Ｍ９最少培地の作製：
Ｍ９最少培地は、５×Ｍ９塩、１Ｍ ＭｇＳＯ４、２０％グルコース、１Ｍ ＣａＣｌ２、および滅菌脱イオン水を組み合わせることによって作製した。その５×Ｍ９塩は、１Ｌの最終容量まで、脱イオン水に以下の塩を溶解することによって作製する：６４ｇ Ｎａ２ＨＰＯ４・７Ｈ２Ｏ、１５ｇ ＫＨ２ＰＯ４、２．５ｇ ＮａＣｌ、５．０ｇ ＮＨ４Ｃｌ。その塩溶液は、２００ｍＬ一定分量に分け、液体サイクルで１５ｐｓｉで１５分間、オートクレーブ滅菌することによって殺菌した。ＭｇＳＯ４の１Ｍ溶液および１Ｍ ＣａＣｌ２は、別々に作製し、次いで、オートクレーブ滅菌によって殺菌した。グルコースは、それを０．２２μｍフィルターに通過させることによって濾過滅菌した。その成分は全て、１ＬのＭ９を作製するために以下のように組み合わせる：７５０ｍＬ滅菌水、２００ｍＬ ５×Ｍ９塩、１Ｍ ＭｇＳ０４の２ｍＬ、２０ｍＬ ２０％グルコース、０．１ｍＬ ＣａＣｌ２、１Ｌの最終容量まで適量。
ＥＺリッチ培地の作製：
培地成分は全て、ＴＥＫｎｏｖａ（Ｈｏｌｌｉｓｔｅｒ ＣＡ ＵＳＡ）から得、以下の容量で組み合わせた。１００ｍＬ １０×ＭＯＰＳ混合物、１０ｍＬ ０．１３２Ｍ Ｋ２ ＨＰＯ４、１００ｍＬ １０×ＡＣＧＵ、２００ｍＬ ５×補充物質ＥＺ、１０ｍＬ ２０％グルコース、５８０ｍＬ滅菌水。
サブセクションＩＩ：ゲル調製、ＤＮＡ分離、抽出、ライゲーション、および形質転換方法：
ＴＡＥ中１％アガロースを作製するために、分子生物学グレードのアガロース（ＲＰＩ
Ｃｏｒｐ、Ｍｔ．Ｐｒｏｓｐｅｃｔ、ＩＬ、ＵＳＡ）を１×ＴＡＥに加える。５０×ＴＡＥを得るため、９００ｍｌ蒸留Ｈ２Ｏに以下を加え：２４２ｇトリス塩基（ＲＰＩ Ｃｏｒｐ、Ｍｔ．Ｐｒｏｓｐｅｃｔ、ＩＬ、ＵＳＡ）、５７．１ｍｌ氷酢酸（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、ＵＳＡ）、１８．６ｇ ＥＤＴＡ（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ、ＰＡ ＵＳＡ）、さらなる蒸留水を用いて１Ｌに容量を調整する。１×ＴＡＥを得るために、９８０ｍＬの蒸留水に２０ｍＬの５０×ＴＡＥを加える。次いで、沸騰が生じるまで、そのアガロースＴＡＥ溶液を加熱し、アガロースを完全に溶解する。５０℃までその溶液を冷却させた後、１０ｍｇ／ｍＬ臭化エチジウム（Ａｃｒｏｓ Ｏｒｇａｎｉｃｓ、Ｍｏｒｒｉｓ Ｐｌａｉｎｓ、ＮＪ、ＵＳＡ）を１００ｍＬの１％アガロース溶液当たり５ｕｌの濃度で加える。一旦、臭化エチジウムを添加したら、その溶液を短時間混合し、試料分析あたり、適切な数のコームを有するゲル成型トレイ（Ｉｄｅａ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｃｏ．、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ、ＵＳＡ）に注ぐ。次いで、ＤＮＡ試料は、５×ＴＡＥローディングバッファーと適宜混合する。５×ＴＡＥローディングバッファーは、５×ＴＡＥ（本明細書において記載される５０×ＴＡＥから希釈）、２０％グリセロール（Ａｃｒｏｓ Ｏｒｇａｎｉｃｓ、Ｍｏｒｒｉｓ Ｐｌａｉｎｓ、ＮＪ、ＵＳＡ）、０．１２５％ブロモフェノールブルー（Ａｌｆａ Ａｅｓａｒ、Ｗａｒｄ Ｈｉｌｌ、ＭＡ、ＵＳＡ）からなり、蒸留水を用いて５０ｍＬに容量を調整する。次いで、ロードしたゲルは、２５〜３０分間、１２５ボルトの定電圧で、１×ＴＡＥを満たしたゲル装置（Ｉｄｅａ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ
Ｃｏ．、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ、ＵＳＡ）中で泳動する。この時点では、ゲルは、電圧を有するゲルボックスから取り出し、ＵＶトランスイルミネーター（ＦＯＴＯＤＹＮＥ Ｉｎｃ．、Ｈａｒｔｌａｎｄ、ＷＩ、ＵＳＡ）下で視覚化する。
次いで、ゲル抽出を通して単離したＤＮＡは、製造者の指示（Ｑｉａｇｅｎ（Ｖａｌｅｎｃｉａ ＣＡ ＵＳＡ））に従って、ＱＩＡｑｕｉｃｋゲル抽出キットを使用して抽出する。類似する方法は、当業者に公知である。
次いで、このように抽出したＤＮＡは、製造者の指示に従って、ｐＳＭＡＲＴ（Ｌｕｃｉｇｅｎ Ｃｏｒｐ、Ｍｉｄｄｌｅｔｏｎ、ＷＩ、ＵＳＡ）、ＳｔｒａｔａＣｌｏｎｅ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ Ｊｏｌｌａ、ＣＡ、ＵＳＡ）、またはｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯ ＴＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ、ＵＳＡ）にライゲーションされてもよい。これらの方法は、上記共通の方法の次のサブセクションに記載される。
ライゲーション方法：
ｐＳＭＡＲＴベクターへのライゲーションについて：
ゲル抽出したＤＮＡは、製造者の指示に従って、ＰＣＲＴｅｒｍｉｎａｔｏｒ（Ｌｕｃｉｇｅｎ Ｃｏｒｐ、Ｍｉｄｄｌｅｔｏｎ、ＷＩ、ＵＳＡ）を使用して平滑化する。次いで、５００ｎｇのＤＮＡを、２．５ｕＬ ４×ＣｌｏｎｅＳｍａｒｔベクタープレミックスに加え、１ｕｌ ＣｌｏｎｅＳｍａｒｔ ＤＮＡリガーゼ（Ｌｕｃｉｇｅｎ Ｃｏｒｐ、Ｍｉｄｄｌｅｔｏｎ、ＷＩ、ＵＳＡ）および蒸留水を加え、１０ｕｌの総容量にする。次いで、その反応物を、３０分間、室温に置き、次いで、１５分間、７０℃で熱不活化し、次いで、氷上に置く。Ｅ．ｃｌｏｎｉ １０Ｇケミカルコンピテント細胞（Ｌｕｃｉｇｅｎ Ｃｏｒｐ、Ｍｉｄｄｌｅｔｏｎ、ＷＩ、ＵＳＡ）を氷上で２０分間解凍する。４０ｕｌのケミカルコンピテント細胞を、微量遠心管の中に置き、１ｕｌの熱不活化ＣｌｏｎｅＳｍａｒｔライゲーションをその管に加える。全反応物を、ピペットチップを用いて短時間撹拌する。その連結反応物（ｌｉｇａｔｉｏｎ）および細胞は、３０分間、氷上でインキュベートし、次いで、その細胞は、４２℃で４５秒間、熱ショックを与え、次いで、２分間、氷上に戻す。９６０ｕｌの室温の回収培地（Ｌｕｃｉｇｅｎ Ｃｏｒｐ、Ｍｉｄｄｌｅｔｏｎ、ＷＩ、ＵＳＡ）を微量遠心管の中に置く。３７℃で１時間２５０ｒｐｍで管を振盪させる。使用するｐＳＭＡＲＴベクターに依存して適切な抗生物質を加えたＬｕｒｉａ Ｂｒｏｔｈプレート（ＲＰＩ Ｃｏｒｐ、Ｍｔ．Ｐｒｏｓｐｅｃｔ、ＩＬ、ＵＳＡ）に１００ｕｌの形質転換細胞をまく。３７℃で一晩、プレートをインキュベートする。
ＳｔｒａｔａＣｌｏｎｅへのライゲーションについて：
ゲル抽出したＤＮＡは、製造者の指示に従って、ＰＣＲＴｅｒｍｉｎａｔｏｒ（Ｌｕｃｉｇｅｎ Ｃｏｒｐ、Ｍｉｄｄｌｅｔｏｎ、ＷＩ、ＵＳＡ）を使用して平滑化する。次いで、２ｕｌのＤＮＡを、３ｕｌ ＳｔｒａｔａＣｌｏｎｅ Ｂｌｕｎｔ Ｃｌｏｎｉｎｇバッファーおよび１ｕｌ ＳｔｒａｔａＣｌｏｎｅ Ｂｌｕｎｔベクターミックスａｍｐ／ｋａｎ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ Ｊｏｌｌａ、ＣＡ、ＵＳＡ）に加え、合計６ｕｌにする。その反応物は、上下に穏やかにピペッティングすることによって混合し、３０分間、室温でその反応物をインキュベートし、次いで氷上に置く。２０分間、氷上でＳｔｒａｔａＣｌｏｎｅのケミカルコンピテント細胞（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ Ｊｏｌｌａ、ＣＡ、ＵＳＡ）からなる試験管を解凍する。ケミカルコンピテント細胞の上記試験管に１ｕｌのクローニング反応物を加え、ピペットチップを用いて穏やかに混合し、２０分間、氷上でインキュベートする。４５秒間、４２℃でその形質転換物に熱ショックを与え、次いで、２分間、氷上に置く。２５０ｕｌの予熱したＬｕｒｉａ Ｂｒｏｔｈ（ＲＰＩ Ｃｏｒｐ、Ｍｔ．Ｐｒｏｓｐｅｃｔ、ＩＬ、ＵＳＡ）を加え、２時間、３７℃で２５０ｒｐｍで振盪する。適切な抗生物質を加えたＬｕｒｉａ Ｂｒｏｔｈプレート（ＲＰＩ
Ｃｏｒｐ、Ｍｔ．Ｐｒｏｓｐｅｃｔ、ＩＬ、ＵＳＡ）に１００ｕｌの形質転換混合物をまく。３７℃で一晩、プレートをインキュベートする。
ｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯ ＴＡへのライゲーションについて：
１ｕｌ ＴＯＰＯベクター、１ｕｌ塩溶液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ、ＵＳＡ）、および３ｕｌゲル抽出ＤＮＡを微量遠心管に加える。３０分間、室温でその管をインキュベートし、次いで、氷上にその反応物を置く。反応あたり、ＴＯＰ１０Ｆ’ケミカルコンピテント細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ、ＵＳＡ）の１本の試験管を解凍する。その解凍したＴＯＰ１０Ｆ’細胞に１ｕｌの反応混合物を加え、ピペットチップを用いて細胞を穏やかにかき混ぜることによって混合し、２０分間、氷上でインキュベートする。４５秒間、４２℃でその形質転換物に熱ショックを与え、次いで、２分間、氷上に置く。２５０ｕｌの予熱したＳＯＣ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ、ＵＳＡ）を加え、１時間、３７℃で２５０ｒｐｍで振盪する。適切な抗生物質を加えたＬｕｒｉａ Ｂｒｏｔｈプレート（ＲＰＩ Ｃｏｒｐ、Ｍｔ．Ｐｒｏｓｐｅｃｔ、ＩＬ、ＵＳＡ）に１００ｕｌのその形質転換混合物をまく。３７℃で一晩、プレートをインキュベートする。
一般的な形質転換および関連する培養方法：
ケミカルコンピテント形質転換プロトコールは、製造者の指示またはＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ（ＳａｍｂｒｏｏｋおよびＲｕｓｓｅｌｌ、２００１年）に含有される文献に従って実行する。一般に、プラスミドＤＮＡまたはライゲーション産物は、ケミカルコンピテント細胞を有する溶液中で５〜３０分間氷上で冷却する。ケミカルコンピテント細胞は、バイオテクノロジーの分野において広く使用される産物であり、本サブセクションにおいて示されるものなどの複数のベンダーから入手可能である。冷却期間後、細胞には、一般に、振盪させずに４２℃で３０秒間熱ショックを与え、再度冷却し、Ｓ．Ｏ．Ｃ．などの２５０マイクロリットルのリッチ培地と組み合わせる。次いで、細胞は、１時間２５０ｒｐｍで振盪させながら、３７℃でインキュベートする。最後に、その細胞は、適切な抗生物質を含有する培地でプレート培養することによって形質転換の成功についてスクリーニングする。
その代わりに、選択した細胞は、当業者に公知のものなどの電気穿孔法によって形質転換されてもよい。
プラスミド形質転換のためのＥ．ｃｏｌｉ宿主株の選択は、プラスミド安定性、プラスミド適合性、プラスミドスクリーニング法、およびタンパク質発現などの因子を考慮することによって決定する。株のバックグラウンドは、本明細書において記載されるとおりプラスミドＤＮＡを単に精製し、任意の一般に使用されるクローニング株（例えばＤＨ５α、Ｔｏｐ１０Ｆ’、Ｅ．ｃｌｏｎｉ １０Ｇなど）などの、実験的な必要性によって決定されるなどの、所望のまたは別の方法で適切なＥ．ｃｏｌｉ宿主株にプラスミドを形質転換することによって、変更することができる。
プラスミドＤＮＡは、製造者の指示に従って、Ｑｉａｇｅｎ（Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ
ＵＳＡ）からの市販のミニプレップキットを使用して調製した。
サブセクションＩＩＩａ．３−ＨＰの調製
３−ＨＰ原液は以下のように調製した。β−プロピオラクトン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、ＵＳＡ）のバイアルを換気フード下で開き、ボトル内容物の全てを、２５ｍＬガラスピペットを続いて使用して、新しい容器に移した。そのバイアルは、５０ｍＬのＨＰＬＣグレード水を用いてすすぎ、このすすぎ液を新しい容器に注いだ。さらに２回すすぎ、それをその新しい容器に加えた。５ｍＬ β−プロピオラクトン当たり５０ｍＬ水の比に達するように、さらなるＨＰＬＣグレード水を、その新しい容器に加えた。その新しい容器は、しっかりとキャップし、７２時間、室温で換気フード中に置いた。７２時間後、その内容物は、遠心分離管に移し、４，０００ｒｐｍで１０分間、遠心分離した。次いで、その溶液は、微粒子を除去するために濾過し、必要に応じて、室温でロータリーエバポレーターの使用によって濃縮した。濃度についてのアッセイを行い、必要に応じて、標準的な濃度原液を作製するために希釈した。
サブセクションＩＩＩｂ．３−ＨＰ検出のためのＨＰＬＣ、ＧＣ／ＭＳ、および他の分析方法（３−ＨＰ生成についての培養物の分析）
３−ＨＰのＨＰＬＣ分析について、Ｗａｔｅｒｓクロマトグラフィーシステム（Ｍｉｌｆｏｒｄ、ＭＡ）は、以下からなった：６００Ｓ制御装置、６１６ポンプ、７１７プラスオートサンプラー、４８６調整可能ＵＶ検出器、および整列移動相脱気装置。さらに、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ外部カラムヒーターを使用し、データは、標準的なデスクトップコンピューターに連結したＳＲＩ（Ｔｏｒｒａｎｃｅ、ＣＡ）のアナログ−デジタル変換器を使用して、収集した。データは、ＳＲＩ Ｐｅａｋ Ｓｉｍｐｌｅソフトウェアを使用して分析する。Ｃｏｒｅｇｅｌ ６４Ｈイオン排除カラム（Ｔｒａｎｓｇｅｎｏｍｉｃ，Ｉｎｃ．、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ、ＣＡ）を使用する。そのカラム樹脂は、スルホン化ポリスチレンジビニルベンゼンであり、粒子サイズは１０μｍであり、カラム寸法は３００×７．８ｍｍである。その移動相は、０．０２Ｎの濃度まで脱イオン（１８ＭΩｃｍ）水を用いて希釈し、０．２μｍナイロンフィルターで真空濾過した硫酸（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ、ＰＡ ＵＳＡ）からなった。上記移動相の流速は、０．６ｍＬ／分とする。ＵＶ検出器は、２１０ｎｍの波長で作動させ、そのカラムは、６０℃まで加熱する。本明細書において記載されるものと同じ設備および方法は、関連する予測の実施例についての３−ＨＰ分析について使用される。３−ＨＰ標準物質（ＴＣＩ Ａｍｅｒｉｃａ、Ｐｏｒｔｌａｎｄ、ＯＲ）と共にこのＨＰＬＣ方法を使用する代表的な検量線を図１３に提供する。
以下方法を、３−ＨＰのＧＣ−ＭＳ分析のために使用する。酢酸エチルを用いる発酵培地の一回の抽出後に、可溶性モノマー３−ＨＰを、ＧＣ−ＭＳを使用して定量化する。一旦、上記３−ＨＰが酢酸エチル中に抽出されたら、その３−ＨＰ上の活性な水素は、ＧＣ分析用の揮発性の化合物を作製するために、Ｎ，Ｏ−ビス−（トリメチルシリル）トリフルオロアセトアミドを使用してトリメチルシリル基と交換する。公知の３−ＨＰ濃度の標準曲線は、実行の初めに作成し、公知の量のケトへキサン酸（１ｇ／Ｌ）は、さらなる内部標準としてのトロパ酸と共に、定量のための内部標準として作用するように、標準物質および試料の両方に加える。次いで、個々の試料の３−ＨＰ内容物は、３−ＨＰイオン（２１９）に対するケトへキサン酸イオン（ｍ／ｚ＝２４７）の比を検査することによってアッセイし、上記標準曲線と比較する。３−ＨＰは、実行の初めに３ＨＰ標準曲線を使用して定量化し、データは、ＨＰ Ｃｈｅｍｓｔａｔｉｏｎを使用して分析する。上記ＧＣ−ＭＳシステムは、Ｈｅｗｌｅｔｔ Ｐａｃｋａｒｄ モデル５８９０ ＧＣおよびＨｅｗｌｅｔｔ Ｐａｃｋａｒｄ モデル５９７２ ＭＳからなる。そのカラムは、Ｓｕｐｅｌｃｏ ＳＰＢ−１（６０ｍ×０．３２ｍｍ×０．２５μｍフィルム厚）とする。キャピラリー被覆剤は、非極性メチルシリコーンとする。そのキャリヤーガスは、１ｍＬ／分の流速のヘリウムとする。誘導体化される（ｄｅｒｉｖａｔｉｚｅｄ）３−ＨＰは、２つの類似する温度型（ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｒｅｇｉｍｅ）のどちらかを使用して、酢酸エチル抽出物中の他の成分から分離される。第１の温度勾配型では、カラム温度は、１分間の４０℃から開始し、次いで、２３５℃まで１０℃／分の速度で上昇し、次いで、３００℃まで５０℃／分の速度で上昇する。試料をより迅速に処理することが実証された第２の温度型では、カラム温度は、７０℃から開始して１分間保持され、２３５℃までの１０℃／分の増加が後続し、３００℃までの５０℃／分の増加が後続する。代表的な検量線を図２２に提供する。
３−ＨＰの検出のためのバイオアッセイもまた、様々な実施例において使用した。３−ＨＰ濃度のこの決定は、ｙｄｆＧ遺伝子（ＹＤＦＧタンパク質）によってコードされるＥ．ｃｏｌｉ ３−ＨＰデヒドロゲナーゼの活性に基づいて実行した。２００μｌの反応は、９６ウェルマイクロタイタープレート中で実行し、１００ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ ８．８、２．５ｍＭ ＭｇＣｌ２、２．６２５ｍＭ ＮＡＤＰ＋、３μｇ精製ＹＤＦＧ、および２０μｌ培養上清を含有した。培養上清は、細胞を取り出すために微量遠心管中での遠心分離（１４，０００ｒｐｍ、５分）によって調製した。３−ＨＰ（０．０２５〜２ｇ／ｌを含有）の標準曲線は、培養上清中の３−ＨＰの量を定量するために、並列反応において使用した。未接種培地は、試薬ブランクとして使用した。必要な場合、上記標準曲線内の３−ＨＰ濃度を有する溶液を得るために、培養上清を培地中で希釈した。
反応物は、１時間、３７℃でインキュベートし、１．４３ｍＭニトロブルーテトラゾリウム、０．１４３フェナジンメトサルフェート、および２．４％ウシ血清アルブミンを含有する２０μｌの発色剤をそれぞれの反応物に加えた。さらなる時間、３７℃で発色を進ませ、５８０ｎｍの吸収度を測定した。上記培養上清中の３−ＨＰ濃度の量は、同じマイクロタイタープレートで生成された標準曲線から得られた値と比較することによって定量する。酵素アッセイを用いて得られた結果は、検証し、上に記載される分析方法の１つによって得られるものと一致した。図２３は代表的な標準曲線を提供する。
サブセクションＩＶ．最小発育阻止濃度評価（ＭＩＣ）プロトコール
ＭＩＣ評価については、その最終結果は、ＨＰＬＣによる原液の分析によって決定された化学薬剤濃度において表現される（つまり、サブセクションＩＩＩｂを参照されたい）。
好気でのＥ．ｃｏｌｉ
最小発育阻止濃度（ＭＩＣ）は、９６ウェルプレートフォーマットにおいて好気的に決定した。プレートは、それぞれの個々のウェルが、接種後に１００ｕＬの最終容量にした場合に、以下の成分レベルを有するようにセットアップした（標準的なＭ９培地に相当する）：４７．７ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４、２２ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４、８．６ｍＭ ＮａＣｌ、１８．７ｍＭ ＮＨ４Ｃｌ、２ｍＭ ＭｇＳＯ４、０．１ｍＭ ＣａＣｌ２、および０．４％グルコース。培地の補充物質は、指定される場合、補充物質の表において報告されるレベルに従って加えた。株の一晩培養物を５ｍＬのＬＢ（適切な場合、抗生物質を有する）中で三連で増殖させた。１％（ｖ／ｖ）接種材料を、Ｍ９最少培地の５ｍｌ培養物に導入した。細胞が中間指数期に達した後、その培養物は、約０．２００（つまり０．１９５〜０．２０５）のＯＤ６００まで希釈した。上記細胞は、１：５０にさらに希釈し、１０μＬの一定分量を、９６ウェルプレートのそれぞれのウェルに接種するために使用し（１ウェル当たり約１０４細胞）、１００ｕＬの総容量にした。そのプレートを配置し、多様な株の増殖、または５ｇ／Ｌの増分で０〜６０ｇ／Ｌに３−ＨＰ濃度を増加させた場合の多様な増殖条件における増殖を測定した。プレートは、３７℃で２４時間インキュベートした。上記最小発育阻止３−ＨＰ濃度および目に見える細胞増殖（ＯＤ約０．１）に対応する最大の３−ＨＰ濃度を、２４時間後に記録した。ＭＩＣ＞６０ｇ／Ｌである場合については、評価は、広範囲の３−ＨＰ濃度（５ｇ／Ｌの増分で０〜１００ｇ／Ｌ）を有するプレートにおいて実行した。
嫌気でのＥ．ｃｏｌｉ
最小発育阻止濃度（ＭＩＣ）は、９６ウェルプレートフォーマットにおいて嫌気的に決定した。プレートは、それぞれの個々のウェルが、接種後に１００ｕＬの最終容量にした場合に、以下の成分レベルを有するようにセットアップした（標準的なＭ９培地に相当する）：４７．７ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４、２２ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４、８．６ｍＭ ＮａＣｌ、１８．７ｍＭ ＮＨ４Ｃｌ、２ｍＭ ＭｇＳＯ４、０．１ｍＭ ＣａＣｌ２、および０．４％グルコース。培地の補充物質は、指定される場合、補充物質の表において報告されるレベルに従って加えた。株の一晩培養物を５ｍＬのＬＢ（適切な場合、抗生物質を有する）中で三連で増殖させた。１％（ｖ／ｖ）接種材料を、Ｍ９最少培地の５ｍｌ培養物に導入した。細胞が中間指数期に達した後、その培養物は、約０．２００（つまり０．１９５〜０．２０５）のＯＤ６００まで希釈した。上記細胞は、１：５０にさらに希釈し、１０μＬの一定分量を、９６ウェルプレートのそれぞれのウェルに接種するために使用し（１ウェル当たり約１０４細胞）、１００ｕＬの総容量にした。そのプレートを配置し、多様な株の増殖、または５ｇ／Ｌの増分で０〜６０ｇ／Ｌに３−ＨＰ濃度を増加させた場合の多様な増殖条件における増殖を測定した。プレートは、嫌気条件用のガス発生器を含有するバイオバッグ嫌気チャンバー内に密閉し、３７℃で２４時間インキュベートした。最小発育阻止３−ＨＰ濃度および目に見える細胞増殖（ＯＤ約０．１）に対応する最大の３−ＨＰ濃度を、２４時間後に記録した。ＭＩＣ＞６０ｇ／Ｌである場合については、評価は、広範囲の３−ＨＰ濃度（５ｇ／Ｌの増分で０〜１００ｇ／Ｌ）を有するプレートにおいて実行した。
好気でのＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ
最小発育阻止濃度（ＭＩＣ）は、９６ウェルプレートフォーマットにおいて好気的に決定した。プレートは、それぞれの個々のウェルが、接種後に１００ｕＬの最終容量にした場合に、以下の成分レベルを有するようにセットアップした（標準的なＭ９培地＋補充グルタメートに相当する）：４７．７ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４、２２ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４、８．６ｍＭ ＮａＣｌ、１８．７ｍＭ ＮＨ４Ｃｌ、２ｍＭ ＭｇＳＯ４、０．１ｍＭ ＣａＣｌ２、１０ｍＭグルタメート、および０．４％グルコース。培地の補充物質は、指定される場合、補充物質の表において報告されるレベルに従って加えた。株の一晩培養物を５ｍＬのＬＢ（適切な場合、抗生物質を有する）中で三連で増殖させた。１％（ｖ／ｖ）接種材料を、Ｍ９最少培地＋グルタメートの５ｍｌ培養物に導入した。細胞が中間指数期に達した後、その培養物は、約０．２００（つまり０．１９５〜０．２０５）のＯＤ６００まで希釈した。上記細胞は、１：５０にさらに希釈し、１０μＬの一定分量を、９６ウェルプレートのそれぞれのウェルに接種するために使用し（１ウェル当たり約１０４細胞）、１００ｕＬの総容量にした。そのプレートを配置し、多様な株の増殖、または５ｇ／Ｌの増分で０〜６０ｇ／Ｌに３−ＨＰ濃度を増加させた場合の多様な増殖条件における増殖を測定した。プレートは、３７℃で２４時間インキュベートした。最小発育阻止３−ＨＰ濃度および目に見える細胞増殖（ＯＤ約０．１）に対応する最大の３−ＨＰ濃度を、２４時間後に記録した。ＭＩＣ＞６０ｇ／Ｌである場合については、評価は、広範囲の３−ＨＰ濃度（５ｇ／Ｌの増分で０〜１００ｇ／Ｌ）を有するプレートにおいて実行した。
好気でのＣ．ｎｅｃａｔｏｒ（Ｒ．ｅｕｔｒｏｐｈａ）
最小発育阻止濃度（ＭＩＣ）は、９６ウェルプレートフォーマットにおいて好気的に決定した。プレートは、それぞれの個々のウェルが、接種後に１００ｕＬの最終容量にした場合に、以下の成分レベルを有するようにセットアップした（ＦＧＮ培地に相当する）：２１．５ｍＭ Ｋ２ＨＰＯ４、８．５ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４、１８ｍＭ ＮＨ４Ｃｌ、１２ｍＭ ＮａＣｌ、７．３ｕＭ ＺｎＣｌ、０．１５ｕＭ ＭｎＣｌ２、４．８５ｕＭ Ｈ３ＢＯ３、０．２１ｕＭ ＣｏＣｌ２、０．４１ｕＭ ＣｕＣｌ２、０．５０ｕＭ ＮｉＣｌ２、０．１２ｕＭ Ｎａ２ＭｏＯ４、０．１９ｕＭ ＣｒＣｌ３、０．０６ｍＭ ＣａＣｌ２、０．５ｍＭ ＭｇＳＯ４、０．０６ｍＭ ＦｅＳＯ４、０．２％グリセロール、０．２％フルクトース。培地の補充物質は、指定される場合、補充物質の表において報告されるレベルに従って加えた。株の一晩培養物を５ｍＬのＬＢ（適切な場合、抗生物質を有する）中で三連で増殖させた。１％（ｖ／ｖ）接種材料を、ＦＧＮ培地の５ｍｌ培養物に導入した。細胞が中間指数期に達した後、その培養物は、約０．２００（つまり０．１９５〜０．２０５）のＯＤ６００まで希釈した。上記細胞は、１：５０にさらに希釈し、１０μＬの一定分量を、９６ウェルプレートのそれぞれのウェルに接種するために使用し（１ウェル当たり約１０４細胞）、１００ｕＬの総容量にした。そのプレートを配置し、多様な株の増殖、または５ｇ／Ｌの増分で０〜６０ｇ／Ｌに３−ＨＰ濃度を増加させた場合の多様な増殖条件における増殖を測定した。プレートは、３０℃で２４時間インキュベートした。最小発育阻止３−ＨＰ濃度および目に見える細胞増殖（ＯＤ約０．１）に対応する最大の３−ＨＰ濃度を、２４時間後に記録した。ＭＩＣ＞６０ｇ／Ｌである場合については、評価は、広範囲の３−ＨＰ濃度（５ｇ／Ｌの増分で０〜１００ｇ／Ｌ）を有するプレートにおいて実行した。
本明細書において記載される実施形態、変形物、配列、および図は、本発明の有用性および多用途性の指標を提供するはずである。本明細書において記載される特徴および利点の全てを提供するとは限らない他の実施形態もまた、本発明の精神および範囲から逸脱することなく利用されてもよい。そのような改変物および変形物は、本発明の範囲内にあると考えられる。

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  1. ３−ヒドロキシプロピオン酸および他の生成物を生成するための方法など。
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