DE102016212497B4 - Mutanter Mikroorganismus, der ein Gen umfasst, das Methylmalonyl-CoA-Reductase codiert, und seine Verwendung - Google Patents

Mutanter Mikroorganismus, der ein Gen umfasst, das Methylmalonyl-CoA-Reductase codiert, und seine Verwendung Download PDF

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Abstract

Mutanter Mikroorganismus, der von einem Mikroorganismus abgeleitet ist, welcher die Fähigkeit hat, Succinyl-CoA aus einer Kohlenstoffquelle zu erzeugen, wobei der mutante Mikroorganismus Gene enthält, die die folgenden Enzyme codieren, und die Fähigkeit hat, 3-HIBA (3-Hydroxyisobuttersäure) zu erzeugen:(i) Methylmalonyl-CoA-Mutase (EC 5.4.99.2);(ii) Methylmalonyl-CoA-Epimerase (5.1.99.1);(iii) Methylmalonyl-CoA-Reductase (MMCR); und(iv) 3-Hydroxyisobutyrat-Dehydrogenase (EC 1.1.1.31), wobei das Enzym von (iii) ein Enzym ist, das Methylmalonyl-CoA-Reductase(MMCR)-Aktivität aufweist und aus Enzymen, die Malonyl-CoA-Reductase(MCR)-Aktivität aufweisen, ausgewählt ist, wobei das Enzym von (iii) eine Sequenz umfasst, die eine Sequenzhomologie von wenigstens 80 % zu der Sequenz aufweist, welche durch eine dargestellt wird, die aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus den SEQ ID Nr. 3 and 4 besteht und wobei das Enzym von (iii) eine Sequenz umfasst, die eine Sequenzhomologie von wenigstens 80% oder eine Sequenzähnlichkeit von wenigstens 80% mit der Sequenz aufweist, die durch SEQ ID Nr. 23 (IKVLGDAYDAKTVKEVTRILSEVKRNVPGTMDELTLSATTHRIA) dargestellt wird.

Description

  • Fachgebiet
  • Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf einen mutanten Mikroorganismus, der ein Gen enthält, das eine Methylmalonyl-CoA-Reductase codiert, die die Aktivität aufweist, Methylmalonyl-CoA in Methylmalonatsemialdehyd umzuwandeln, und auf die Verwendung des mutanten Mikroorganismus und insbesondere auf einen mutanten Mikroorganismus, in den ein Gen eingeführt wurde, das von einem Organismus des Reiches Archaea abgeleitete Methylmalonyl-CoA-Reductase codiert, und auf die Verwendung des mutanten Mikroorganismus.
  • Stand der Technik
  • Methacrylsäure und/oder Methylmethacrylsäure (oder Methylmethacrylat) ist eine Verbindung, die zur Herstellung von Polymeren, wie Beschichtungen, transparenten Kunststoffen oder Klebern, verwendet werden kann. Die Entwicklung von Verfahren zum Biosynthetisieren von Methacrylsäure und deren Anwendung ist im Gange. Zum Beispiel entwickelte Evonik ein Verfahren zum Synthetisieren von Methylmethacrylsäure aus zum Beispiel Ammoniak, Methan, Aceton oder Methanol über 2-HIBA (2-Hydroxybuttersäure) (Veresterung nach Dehydratisierung von 2-HIBA).
  • Als biologische Zwischenstufen, die in diese Methacrylsäure und/oder Methylmethacrylsäure (oder Methylmethacrylat) umgewandelt werden können, ist nicht nur 2-HIBA, sondern sind auch Itaconsäure, Isobuttersäure, Isobutylen, 3-HIBA und dergleichen bekannt.
  • Bezüglich der biologischen Synthese von Methylmethacrylsäure offenbart das US-Patent Nr. 8865439 einen Biosyntheseweg für Methylmethacrylsäure aus einer Kohlenstoffquelle über 3-HIBA und einen rekombinanten Mikroorganismus, der ein Gen enthält, das ein Enzym codiert, welches an dem Weg beteiligt ist.
  • Bekanntermaßen ist Methylmalonyl-CoA-Reductase im Biosyntheseweg von Methylmethacrylsäure zwingend erforderlich, um 3-HIBA, das die höchste theoretische Ausbeute aufweisen kann, effizient aus Glucose zu biosynthetisieren, wie in 1 gezeigt ist. Methylmalonyl-CoA-Reductase ist jedoch ein Enzym, das es in der Natur noch nicht gibt.
  • Um einen Stoffwechselweg für die Biosynthese von 3-HIBA, wie er in 1 gezeigt ist, aufzubauen, ist also ein Screening nach Methylmalonyl-CoA-Reductase, einem Enzym, das Methylmalonyl-CoA in Methylmalonatsemialdehyd umwandelt, ganz dringend erforderlich.
  • Vor diesem technischen Hintergrund haben die Erfinder ein Screening nach einem Enzym, das Methylmalonyl-CoA-Reductase-Aktivität aufweist, unter Enzymen (MCR), die Methylmalonyl-CoA in Methylmalonatsemialdehyd umwandeln, und einem das Enzym codierenden Gen durchgeführt, wodurch die vorliegende Erfindung zu Ende gebracht wurde.
  • WO 2008 / 145 737 A1 offenbart die Verwendung von gentechnisch veränderten Zellen zur Herstellung von 3-HIBA unter Verwendung einer Methylmalonyl-Coenzym A-Mutase (EC 5.4.99.2), Methylmalonyl-Coenzym A-Epimerase (EC 5.1.99.1), Methylmalonyl-Coenzym A-Hydrolase (EC 3.2.1.17) in Verbindung mit einer Aldehyd- Dehydrogenase (EC 1.2.1.3) oder einer Aldehyd-Oxidase (EC 1.2.3.1) und 3- Hydroxyisobutyrat-Dehydrogenase (EC 1.1.1.31).
  • WO 2011 / 157 573 A2 offenbart ein Enzym zur Herstellung von Methylmalonatsemialdehyd oder Malonatsemialdehyd beinhaltend Nukleinsäuren kodierende Sequenzen für dieses Enzym, Zellen, die mit diesen Nukleinsäuren transformiert werden, sowie die Verwendung dieses Enzyms. Weiterhin werden die Verwendung zur Herstellung von (S)- oder (R)-3- Hydroxyisobuttersäure und darauf basierende Polyhydroxyalkanoate, von Malonatsemialdehyd, von 3-Hydroxypropionsäure und von auf 3-Hydroxypropionsäure basierenden Polyhydroxyalkanoaten beschrieben.
  • WO 2014 / 039 879 A1 gentechnisch veränderte Mikroben, die eine exogene Polypeptid-codierende Region umfasst, wobei das Polypeptid eine Aktivität aufweist, die ausgewählt ist aus einer Acetyl/Propionyl-CoA-carboxylase, Malonyl/Succinyl-CoA-Reduktase und Malonat-Semialdehyd-Reduktase. In einer Ausführungsform ist der gentechnisch veränderte Mikroorganismus so modifiziert, dass sie Acetyl-CoA, molekularen Wasserstoff und Kohlendioxid zu 3-Hydroxypropionat, 4-Hydoxybutyrat, Acetyl-CoA oder einer Kombination davon in größeren Mengen umsetzt als eine Kontrollmikrobe, und wobei auch weitere Produkte erzeugt werden können.
  • Offenbarung der Erfindung
  • Technisches Problem
  • Es ist ein Ziel der vorliegenden Erfindung, einen mutanten Mikroorganismus bereitzustellen, in den ein MMCR (Methylmalonyl-CoA-Reductase) codierendes Gen eingeführt wurde, das die Fähigkeit hat, 3-HIBA (3-Hydroxyisobuttersäure) zu erzeugen, und die Verwendung des mutanten Mikroorganismus anzugeben.
  • Technische Lösung
  • Um das obige Ziel zu erreichen, stellt die vorliegende Erfindung einen mutanten Mikroorganismus bereit, der von einem Mikroorganismus abgeleitet ist, welcher die Fähigkeit hat, Succinyl-CoA aus einer Kohlenstoffquelle zu erzeugen, wobei der mutante Mikroorganismus Gene enthält, die die folgenden Enzyme codieren, und die Fähigkeit hat, 3-HIBA (3-Hydroxyisobuttersäure) zu erzeugen:
    • (i) Methylmalonyl-CoA-Mutase (EC 5.4.99.2);
    • (ii) Methylmalonyl-CoA-Epimerase (5.1.99.1);
    • (iii) Methylmalonyl-CoA-Reductase (MMCR); und
    • (iv) 3-Hydroxyisobutyrat-Dehydrogenase (EC 1.1.1.31),
    wobei das Enzym von (iii) ein Enzym ist, das Methylmalonyl-CoA-Reductase(MMCR)-Aktivität aufweist und aus Enzymen, die Malonyl-CoA-Reductase(MCR)-Aktivität aufweisen, ausgewählt ist, wobei das Enzym von (iii) eine Sequenz umfasst, die eine Sequenzhomologie von wenigstens 80 % zu der Sequenz aufweist, welche durch eine dargestellt wird, die aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus den SEQ ID Nr. 3 and 4 besteht und wobei das Enzym von (iii) eine Sequenz umfasst, die eine Sequenzhomologie von wenigstens 80% oder eine Sequenzähnlichkeit von wenigstens 80% mit der Sequenz aufweist, die durch SEQ ID Nr. 23 (IKVLGDAYDAKTVKEVTRILSEVKRNVPGTMDELTLSATTHRIA) dargestellt wird.
  • Die vorliegende Erfindung gibt auch ein Verfahren zur Herstellung von 3-HIBA an, das die folgenden Schritte umfasst:
    • Kultivieren des mutanten Mikroorganismus gemäß der vorliegenden Erfindung unter Bildung von 3-HIBA; und
    • Gewinnen des gebildeten 3-HIBA.
  • Vorteilhafte Wirkungen
  • Da MMCR in der Natur nicht vorkommt, war es unvermeidlich, den Stoffwechselweg von MMCR in herkömmlichen Verfahren zur Herstellung von 3-HIBA aus Kohlenstoffquellen einschließlich Glucose zu umgehen. Gemäß der vorliegenden Erfindung kann 3-HIBA jedoch durch einen kurzen Stoffwechselweg erzeugt werden, indem man ein Enzym verwendet, das MMCR-Aktivität aufweist und das aus Enzymen mit MCR-Aktivität ausgewählt ist. Gemäß der vorliegenden Erfindung erzeugtes 3-HIBA kann verwendet werden, um MAA (Methacrylsäure) und/oder MMA (Methylmethacrylsäure) zu erzeugen, was insofern vorteilhaft ist, als es umweltfreundlich und kosteneffektiv ist, da es im Unterschied zu MAA (Methacrylsäure) oder MMA (Methylmethacrylsäure), die durch herkömmliche chemische Verfahren hergestellt wurde, keine toxischen Substanzen, wie HCN, CAN oder Formamid, beinhaltet.
  • Kurzbeschreibung der Zeichnungen
    • 1 zeigt einen Stoffwechselweg zur Herstellung von 3-HIBA aus Glucose.
    • 2 zeigt die Ergebnisse des Klonierens von MMCR-Kandidaten-Genen durch PCR.
    • 3 zeigt die Ergebnisse des Einfügens von MMCR-Kandidaten-Genen in Vektoren durch Ligation.
    • 4 zeigt die Ergebnisse des Kultivierens von Stämmen, die mit MMCR-Kandidaten-Genen transformiert sind, und des Analysierens des Expressionsniveaus jedes Enzyms in den kultivierten Stämmen.
    • 5 zeigt die Ergebnisse des Messens der Titer von MMCR-Kandidaten unter Verwendung von Methylmalonyl-CoA als Reaktionssubstrat.
    • 6 zeigt die Ergebnisse einer MS-Analyse eines Reaktionsprodukts, das unter Verwendung von Methylmalonyl-CoA als Reaktionssubstrat erhalten wird.
    • 7 zeigt die Ergebnisse des Analysierens von Kulturen von 3-HIBA erzeugenden Stämmen durch HPLC zur Bestimmung der Produktion von 3-HIBA.
  • Bester Weg zur Durchführung der Erfindung
  • Wenn es nicht anders definiert ist, haben alle hier verwendeten technischen und wissenschaftlichen Ausdrücke dieselbe Bedeutung, wie sie ihnen der Fachmann, an den sich die Erfindung richtet, gewöhnlich beimisst. Im Allgemeinen sind die hier verwendete Nomenklatur und die experimentellen Verfahren, die im Folgenden beschrieben werden, solche, wie sie in der Technik wohlbekannt sind und gewöhnlich eingesetzt werden.
  • In einem Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung einen mutanten Mikroorganismus, der von einem Mikroorganismus abgeleitet ist, welcher die Fähigkeit hat, Succinyl-CoA aus einer Kohlenstoffquelle zu erzeugen, wobei der mutante Mikroorganismus Gene enthält, die die folgenden Enzyme codieren, und die Fähigkeit hat, 3-HIBA (3-Hydroxyisobuttersäure) zu erzeugen:
    • (i) Methylmalonyl-CoA-Mutase;
    • (ii) Methylmalonyl-CoA-Epimerase;
    • (iii) Methylmalonyl-CoA-Reductase (MMCR); und
    • (iv) 3-Hydroxyisobutyrat-Dehydrogenase,
    wobei das Enzym von (iii) ein Enzym ist, das Methylmalonyl-CoA-Reductase(MMCR)-Aktivität aufweist und aus Enzymen, die Malonyl-CoA-Reductase(MCR)-Aktivität aufweisen, ausgewählt ist.
  • In der vorliegenden Erfindung ist das Enzym von (iii) ein Enzym, das Methylmalonyl-CoA-Reductase(MMCR)-Aktivität aufweist und aus Enzymen, die Malonyl-CoA-Reductase(MCR)-Aktivität aufweisen, ausgewählt ist, wobei das Enzym von (iii) eine Sequenz umfasst, die eine Sequenzhomologie von wenigstens 80 % zu der Sequenz aufweist, welche durch eine dargestellt wird, die aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus den SEQ ID Nr. 3 and 4 besteht und wobei das Enzym von (iii) eine Sequenz umfasst, die eine Sequenzhomologie von wenigstens 80% oder eine Sequenzähnlichkeit von wenigstens 80% mit der Sequenz aufweist, die durch SEQ ID Nr. 23 (IKVLGDAYDAKTVKEVTRILSEVKRNVPGTM-DELTLSATTHRIA) dargestellt wird.
  • Unter den Enzymen ist die Methylmalonyl-CoA-Mutase (i) an der Umwandlung von Succinyl-CoA, das aus der Kohlenstoffquelle erzeugt wird, in (R)-Methylmalonyl-CoA beteiligt, und die Methylmalonyl-CoA-Epimerase (ii) ist an der Umwandlung von (R)-Methylmalonyl-CoA in (S)-Methylmalonyl-CoA beteiligt. Weiterhin ist die Methylmalonyl-CoA-Reductase (iii) an der Umwandlung von (S)-Methylmalonyl-CoA in Methylmalonatsemialdehyd beteiligt, und die 3-Hydroxyisobutyrat-Dehydrogenase (iv) ist an der Umwandlung von Methylmalonatsemialdehyd in 3-HIBA beteiligt. Ein spezieller Weg für die Synthese von 3-HIBA ist in 1 gezeigt.
  • Der Ausdruck „3-HIBA (3-Hydroxyisobuttersäure)“ bedeutet eine C4-Carbonsäure und kann eine Säureform (3-Hydroxyisobuttersäure), eine Baseform (3-Hydroxyisobutyrat) oder ein Gemisch davon umfassen. Der Ausdruck 3-HIBA kann sowohl (R)- als auch (S)-Stereoisomere umfassen. 3-HIBA kann als Zwischenprodukt zur Herstellung von MAA (Methacrylsäure) und/oder MMA (Methylmethacrylsäure) verwendet werden, ist aber nicht darauf beschränkt.
  • Da Methylmalonyl-CoA-Reductase, ein Enzym, das Methylmalonyl-CoA in Methylmalonatsemialdehyd umwandelt, in der Natur nicht vorkommt, war es unvermeidlich, den Stoffwechselweg von Methylmalonyl-CoA-Reductase in herkömmlichen Verfahren zur Herstellung von 3-HIBA aus Kohlenstoffquellen einschließlich Glucose zu umgehen. Das heißt, in den herkömmlichen Verfahren wurde 3-HIBA über ein Zwischenprodukt, wie Isobuttersäure oder 2-Methyl-1,3-propandiol, biosynthetisiert (Karsten Lang, Katja Buehler und Andreas Schmid, Multistep Synthesis of (S)-3-Hydroxyisobutyric acid from glucose using Pseudomonas taiwanensis VLB120 B83 T7 catalytic biofilms, Advanced Synthesis & Catalysis, 357(8), 1919-1927 (2015)).
  • Die Erfinder haben jedoch ein Enzym, das Methylmalonyl-CoA direkt in Methylmalonatsemialdehyd umwandelt, d.h. ein Enzym, das Methylmalonyl-CoA-Reductase(MMCR)-Aktivität aufweist, unter MCR-Enzymen identifiziert. Die Verwendung des identifizierten Enzyms ermöglicht die Produktion von 3-HIBA durch einen kurzen Stoffwechselweg.
  • Dabei kann es sich bei dem identifizierten Enzym um eine von einem Organismus des Reiches Archaea abgeleitete Methylmalonyl-CoA-Reductase handeln.
  • Die Erfinder haben verschiedene Enzyme aus Malonyl-CoA-Reductase(MCR)-Enzymen, die von einem Substrat für MMCR verschiedene Substrate verwenden, aber MMCR funktionell ähnlich sind, einem Screening unterzogen. Unter den einem Screening unterzogenen Enzymen wurde ein Enzym, das auch Methylmalonyl-CoA als Substrat verwenden kann, ausgewählt. Außerdem wurden die Veränderungen der Mengen von NADH und NADPH, die als Cofaktoren verwendet werden, nach der Reaktion mit Methylmalonyl-CoA durch Extinktion gemessen, und ein Enzym, das gegenüber Methylmalonyl-CoA reaktiv ist, wurde ausgewählt.
  • Als Ergebnis kann in einer Ausführungsform das Enzym, das gegenüber dem als Reaktionssubstrat verwendeten Methylmalonyl-CoA reaktiv ist, zum Beispiel eine Methylmalonyl-CoA-Reductase sein, die von einer oder mehreren Archaea-Spezies abgeleitet ist, die aus der Gruppe ausgewählt sind, die aus Candidatus Caldiarchaeum subterraneum, Sulfolobales archaeon Acd1 und Sulfolobus acidocaldarius Ron12/I besteht.
  • In der vorliegenden Erfindung wurde das Enzym, das gegenüber dem als Reaktionssubstrat verwendeten Methylmalonyl-CoA reaktiv ist, sequenziert. Als Ergebnis stellte sich heraus, dass das Enzym eine Sequenz umfasst, die zu wenigstens 80% homolog oder zu wenigstens 80% ähnlich einer Sequenz von SEQ ID Nr. 23 ist.
  • Auf der Grundlage dieses Ergebnisses kann das Enzym in einer Ausführungsform eine Sequenz umfassen, die eine Sequenzhomologie von wenigstens 80%, wenigstens 85%, wenigstens 90%, wenigstens 92%, wenigstens 93%, wenigstens 95%, wenigstens 97%, wenigstens 98%, wenigstens 99% oder 100% mit der durch SEQ ID Nr. 23 dargestellten Sequenz aufweist.
  • In einer anderen Ausführungsform kann das Enzym eine Sequenz umfassen, die eine Sequenzähnlichkeit von wenigstens 80%, wenigstens 85%, wenigstens 90%, wenigstens 92%, wenigstens 93%, wenigstens 95%, wenigstens 97%, wenigstens 98%, wenigstens 99% oder 100% mit der durch SEQ ID Nr. 23 dargestellten Sequenz aufweist.
  • Der hier verwendete Ausdruck „Homologie“ bezieht sich auf die prozentuale Identität zwischen zwei Aminosäure- oder Polynucleotid-Struktureinheiten zum Vergleich. Der Ausdruck „Ähnlichkeit“ bezieht sich auf den Grad, bis zu dem zwei Aminosäure- oder Polynucleotid-Sequenzen gemäß Bestimmung durch das Vergleichsfenster funktionell oder strukturell identisch sind. Die Sequenzhomologie oder -ähnlichkeit kann dadurch bestimmt werden, dass man Sequenzen mit Hilfe der Standard-Software miteinander vergleicht, zum Beispiel einem BLASTN oder BLASTX genannten Programm, das auf der Basis von BLAST (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 5873-5877, 1993) entwickelt wurde.
  • Die Methylmalonyl-CoA-Reductase kann eine Sequenz umfassen, die eine Sequenzhomologie von wenigstens 80%, vorzugsweise wenigstens 90%, wenigstens 92%, wenigstens 93%, wenigstens 95%, wenigstens 97%, wenigstens 98%, wenigstens 99% oder 100% mit der Sequenz aufweist, die durch wenigstens eine dargestellt wird, die aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus SEQ ID Nr. 3 und 4 besteht.
  • In einigen Fällen kann Methylmalonyl-CoA-Reductase gemäß der vorliegenden Erfindung auch mit Hilfe einer in der Technik bekannten Methode mutieren gelassen werden, um die Effizienz der Produktion von 3-HIBA zu erhöhen.
  • In einem anderen Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung einen mutanten Mikroorganismus, der die Fähigkeit hat, Methylmethacrylsäure zu erzeugen, und der neben den oben beschriebenen Genen (i) bis (iv) noch (v) ein Gen, das 3-Hydroxyisobutyrat-Dehydratase codiert, enthält. Die 3-Hydroxyisobutyrat-Dehydratase ist ein Enzym, das an der Umwandlung von 3-HIBA in Methylmethacrylsäure beteiligt ist.
  • Die Quellen und Sequenzen von Genen, die neben dem in der vorliegenden Erfindung verwendeten Enzym Methylmalonyl-CoA-Reductase auch Methylmalonyl-CoA-Mutase, Methylmalonyl-CoA-Epimerase und 3-Hydroxyisobutyrat-Dehydrogenase codieren, sind in der folgenden Tabelle 1 gezeigt. Tabelle 1: Enzymkandidaten, die an der Umwandlung in 3-HIBA beteiligt sind
    Enzym Gen-Name Sequenz-Id. Quelle SEQ ID Nr.
    Methylmalonyl-CoA-Mutase MCM Msed_0638 Msed_2055 Metallosphaera sedula 7,8
    Methylmalonyl-CoA-Epimerase MCE Msed_0639 Metallosphaera sedula 9
    Hydroxyisobutyrat-Dehydrogenase 3-HIBADH G_9075 Pseudomonas putida 10
  • Der hier verwendete Ausdruck „Mikroorganismus“ kann einen beliebigen Organismus, der zu den Domänen der Archaea, Bakterien oder Eukaryonten gehört, umfassen und kann jede Art von Prokaryonten oder Eukaryonten umfassen, zum Beispiel Archaea, Bakterien, Hefen oder Pilze. Zum Beispiel kann es sich bei dem Mikroorganismus, der in der vorliegenden Erfindung verwendet wird, um E. coli, S. cerevisiae, C. blankii oder C. rugosa handeln.
  • Das Gen, das das Enzym codiert, ist exogen. Der Ausdruck „exogen“ bedeutet, dass das Gen, das von Archaea abgeleitete MMCR (Methylmalonyl-CoA-Reductase) codiert, in den Wirtsmikroorganismus eingeführt wird. Die Einführung kann dadurch erreicht werden, dass man das MMCR-codierende Gen durch Einfügen in ein Material wie ein Plasmid, d.h. ein chromosomales oder nichtchromosomales genetisches Material, in das genetische Material des Wirtsmikroorganismus einführt.
  • Beispiele für eine Kohlenstoffquelle, die in der vorliegenden Erfindung verwendet werden kann, sind Kohlenhydrate, wie Glucose, Fructose, Saccharose, Lactose, Maltose, Stärke und Cellulose, Fette, wie Sojaöl, reguläres Sonnenblumenöl, Ricinusöl und Kokosöl, Fettsäuren, wie Palmitinsäure, Stearinsäure und Linolsäure, Alkohole, wie Glycerin und Ethanol, und organische Säuren, wie Essigsäure. Diese Kohlenstoffquellen können allein oder in Kombination verwendet werden.
  • In noch einem anderen Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung von 3-HIBA, das einen Schritt des Kultivierens des oben beschriebenen mutanten Mikroorganismus umfasst. Außerdem betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung von Methylmethacrylsäure, das einen Schritt des Kultivierens des oben beschriebenen mutanten Mikroorganismus umfasst.
  • Der mutante Mikroorganismus kann nach einem bekannten Verfahren bei einer Temperatur von 20-45 °C in Gegenwart einer Kohlenstoffquelle kultiviert werden. Als Kohlenstoffquelle, die in der Kultur verwendet wird, können die folgenden Kohlenstoffquellen allein oder in Kombination verwendet werden: (i) Kohlenhydrate einschließlich Monosacchariden, zum Beispiel Glucose, Saccharose, Lactose, Fructose, Maltose, Molasse, Stärke oder Cellulose; (ii) Öle und Fette, zum Beispiel Sojaöl, reguläres Sonnenblumenöl, Erdnussöl oder Kokosöl; (iii) Fettsäuren, zum Beispiel Palmitinsäure, Stearinsäure und Linolsäure; (iv) Alkohole, zum Beispiel Glycerin oder Methanol; (v) Aminosäuren, zum Beispiel L-Glutamat oder L-Valin; und (vi) organische Säuren, zum Beispiel Essigsäure. In einigen Fällen kann das Kulturmedium auch eine bekannte Stickstoffquelle, eine Phosphorquelle, ein zum Wachstum erforderliches Metallsalz, einen Vorläufer oder einen pH-Regulator umfassen.
  • Die durch die Kultur des mutanten Mikroorganismus exprimierte 3-HIBA oder Methylmethacrylsäure kann abgetrennt und gewonnen werden. Zum Beispiel kann die exprimierte 3-HIBA oder Methylmethacrylsäure dadurch aus dem Kulturmedium abgetrennt werden, dass man das Kulturmedium durch einen Filter leitet oder eine Zentrifuge oder eine Sedimentationsvorrichtung verwendet. Außerdem kann unter Verwendung eines zusätzlichen Osmose- oder Reinigungsverfahrens reine 3-HIBA oder Methylmethacrylsäure gewonnen werden.
  • Beispiele
  • Im Folgenden wird die vorliegende Erfindung ausführlicher unter Bezugnahme auf Beispiele beschrieben. Der Fachmann wird sich darüber im Klaren sein, dass diese Beispiele nur zu Veranschaulichungszwecken dienen und nicht so anzusehen sind, als beschränkten sie den Umfang der vorliegenden Erfindung. Somit wird der wesentliche Umfang der vorliegenden Erfindung durch die beigefügten Ansprüche und deren Äquivalente definiert.
  • Beispiel 1: Screening von MMCR
  • Unter Verwendung von Uniprot wurden verschiedene Enzyme einem Screening nach MCR(Malonyl-CoA-Reductase)-Enzymen unterzogen, die ein Substrat, das von einem Substrat für MMCR verschieden ist, verwenden, aber insofern funktionell ähnlich wie MMCR sind, als sie Malonyl-CoA in Malonatsemialdehyd umwandeln können. Unter den einem Screening unterzogenen Enzymen wurden Enzyme ausgewählt, die auch Methylmalonyl-CoA als Substrat verwenden können, und die Produkte der Enzyme wurden untersucht, wodurch ein Screening nach MMCR (Methylmalonyl-CoA-Reductase) erfolgte. Als MMCR-Kandidaten wurden Enzyme, die ähnliche Proteinsequenzen aufwiesen, dadurch ausgewählt, dass man von Sulfolobus tokodaii abgeleitete MCR-Enzyme mit bekannten Strukturen mit Hilfe von BLAST durchsuchte. Die Auswahl der Enzyme wurde unter Verwendung von Uniprot gemäß dem oben beschriebenen Verfahren durchgeführt, und als Ergebnis wurden zwei MCR-Enzyme und vier Aspartatsemialdehyd-Dehydrogenase-Enzyme erhalten, die MMCR-Aktivität aufweisen (Tabelle 2). Tabelle 2: MMCR-Kandidaten
    Gen-Name Sequenz-Id. Organismus Enzym SEQ ID Nr.
    MCRst Q96YK1 Sulfolobus tokodaii (Stamm DSM 16993) Malonyl-CoA-Reductase 1
    MCRms A4YEN2 Metallosphaera sedula (Stamm Malonyl-CoA-Reductase 2
    ATCC 51363)
    ASDcc E6N613_9ARCH Candidatus Caldiarchaeum subterraneum Aspa rtatsemialdehyd-Dehydrogenase 3
    ASDsar GI: 519043079 Sulfolobales archaeon Acd 1 Aspa rtatsemialdehyd-Dehydrogenase 4
    ASDsac1 M1IGV1_9CREN Sulfolobus acidocaldarius Ron 12/I Aspa rtatsemialdehyd-Dehydrogenase 5
    ASDsac2 M1J171_9CREN Sulfolobus acidocaldarius Ron 12/I Aspa rtatsemialdehyd-Dehydrogenase 6
  • Die in der obigen Tabelle 2 gezeigten MMCR-Kandidaten-Gene wurden durch PCR unter Verwendung der in Tabelle 3 gezeigten synthetisierten Primer unter den folgenden Bedingungen kloniert: 30 Zyklen, die jeweils aus 10 s bei 98°C, 5 s bei 55°C und 1 min bei 72°C bestehen. Die Ergebnisse des PCR sind in 2 gezeigt. Dann wurde jedes der PCR-Produkte unter Verwendung von T4-DNA-Ligase in einen pET21b-Vektor eingefügt (3). Wie in 3 gezeigt ist, wurden die gewünschten Konstrukte hergestellt. Mit den Konstrukten wurde der Expressionsstamm E. coli BL21(DE3) transformiert, wodurch Stämme aufgebaut wurden.
    Figure DE102016212497B4_0001
  • Jeder der aufgebauten Stämme (Transformanten) wurde bei 37°C und 200 U/min in LBA-Medium kultiviert. Als der OD-Wert bei 600 nm 0,5-0,8 erreichte, wurde 1 mM Isopropyl-1-thio-β-D-galactopyranosid (IPTG) zu dem Medium gegeben, und dann wurde jeder Stamm über Nacht bei 16°C kultiviert, wodurch jedes der in der obigen Tabelle 2 gezeigten MMCR-Enzyme exprimiert wurde. Die Ergebnisse der Expression sind in 4 gezeigt.
  • Jeder der kultivierten Stämme wurde zentrifugiert, um den Überstand zu entfernen, und dann wurden die Zellen aufgefangen und mit einem Ultraschallgerät lysiert, dann zentrifugiert, um den Überstand aufzufangen, wodurch Enzymlösungen hergestellt wurden. Die Konzentration des Enzyms in jeder Enzymlösung wurde quantitativ analysiert, indem man 30 Minuten lang bei 37°C eine Farbentwicklung mit Hilfe eines Pierce-BCA-Kits durchführte und dann die Extinktion bei 562 nm unter Verwendung eines Mikroplatten-Spektrophotometers maß. Die Ergebnisse der Analyse sind in der folgenden Tabelle 4 gezeigt. Tabelle 4: Ergebnisse der quantitativen Analyse von Proteinkonzentrationen in kultivierten Transformantenzellen
    Probe A562 Kon. (µg/ml) Verdünnungsfaktor (*5)
    Pet21b 0,659 573,674 2868,37
    ASDcc 0,636 548,696 2743,48
    MCRms 0,682 598,652 2993,26
    ASDsar 0,742 663,812 3319,06
    ASDsac1 0,741 662,726 3313,63
    ASDsac2 0,699 617,114 3085,57
    MCRst 0,718 637,748 3188,74
  • Jede der erhaltenen Enzymlösungen wurde in einem Medium, das die in der folgenden Tabelle 5 gezeigten Komponenten enthält, mit Methylmalonyl-CoA als Substrat reagieren gelassen, und dann wurden Veränderungen der Mengen von NADH und NADPH, die als Cofaktoren verwendet werden, durch Messen der Extinktion bei 365 nm mit einem Mikroplatten-Spektrophotometer analysiert, wodurch bestimmt wurde, ob die Enzyme gegenüber Methylmalonyl-CoA reaktiv sind. Tabelle 5
    Reagens Stammkonz. Arbeitskonz. Volumen (µl)
    Tris-HCl (pH 7) 100 mM 50 mM 100
    NAD(P)H 4 mM 0,4 mM 20
    MgCl2 10 mM 2 mM 40
    Zellextrakt 2x Verdünnung 20
    Methylmalonyl-CoA 3,0 mM* 0,3 mM 20
  • Die Geschwindigkeit des Verbrauchs von NADH und NADPH gegen die Menge des verwendeten Proteins wurde als Aktivität berechnet. Als Ergebnis zeigte sich, dass dann, wenn NADH als Cofaktor verwendet wurde, ASDcc, ASDsar und ASDsac1 Reaktivität mit Methylmalonyl-CoA zeigten (5).
  • Beispiel 2: Produktion von Methylmalonatsemialdehyd
  • Um die Methylmalonatsemialdehyd-Produktivität von ASDsac1, das unter den zunächst ausgewählten Enzymen die beste Leistung zeigte, zu untersuchen, ließ man ASDsac1 mit 0,5 g/l Methylmalonyl-CoA reagieren, und das Reaktionsprodukt wurde durch MS analysiert. Als Ergebnis zeigte sich, wie in 6 gezeigt ist, in dem Reaktionsprodukt von ASDsac1, dass Methylmalonatsemialdehyd erzeugt wurde.
  • Beispiel 3: Aufbau eines 3-HIBA produzierenden E.-coli-Stamms
  • ASDsac1, von dem bestätigt wurde, dass es Methylmalonatsemialdehyd erzeugt, wurde unter Verwendung eines Codonoptimierungs-Tools (http://sg.idtdna.com/ CodonOpt) optimiert, um seine Expression in E. coli zu optimieren, und wurde verwendet, um einen E.-coli-Stamm aufzubauen, der 3-HIBA produziert, wie in 1 gezeigt ist (siehe Tabelle 6).
  • Die in der folgenden Tabelle 6 gezeigten E.-coli-Gene des 3-HIBA-produzierenden Stoffwechselwegs wurden durch PCR unter Verwendung der in der folgenden Tabelle 7 gezeigten Primer unter den folgenden Bedingungen kloniert: 30 Zyklen, die jeweils aus 10 s bei 98°C, 5 s bei 55°C und 1 min bei 72°C bestehen. Jedes der PCR-Produkte wurde unter Verwendung von T4-DNA-Ligase in einen pET21b- und pET26b-Vektor eingefügt. Nachdem der Aufbau der gewünschten Konstrukte bestätigt war, wurde mit jedem der Konstrukte der Expressionsstamm E. coli BL21 (DE3) transformiert, wodurch Stämme aufgebaut wurden. Tabelle 6: Aufbau von 3-HIBA produzierenden E.-coli-Stämmen, die das ASDsac1-Gen enthalten
    pET21b (AmpR) pET26b (KanR)
    Methylmalonyl-CoA-Mutase α (EC: 5.4.99.2) Methylmalonyl-CoA-Mutase β (EC: 5.4.99.2) Methylmalonyl-CoA-Epimerase (EC:5.1.99.1) MMCR 3-Hydroxyisobutyrat-Dehydrogenase (EC 1.1.1.31)
    1 Kontrolle (nur Vektoren)
    2 E. coli (GI: 42945) P. freudenreichii (GI: 22022367) S. acidocaldarius E. coli (GI: 331077966)
    3 P. freudenreichii (GI: 45834) P. freudenreichii (GI: 581476) P. freudenreichii (GI: 22022367) S. acidocaldarius E. coli (GI: 331077966)
    Figure DE102016212497B4_0002
  • Beispiel 4: Produktion und Fermentation von 3-HIBA in E. coli
  • Für die Kultur der rekombinanten E.-coli-Stämme, die in Beispiel 3 aufgebaut wurden, wurden 30 ml 2xM9-Minimalmedium (Na2HPO4·2H2O, KH2PO4, NaCl, NH4Cl) in einen 250-ml-Kolben gegeben, und Glucose (10 g/l), 600 µl 100x-Spurenmetalllösung (5 g/l EDTA, 0,83 g/l FeCl3·6H2O, 84 mg/l ZnCl2, 13 mg/l CUCl2·2H2O, 10 mg/l CoCl2·2H2O, 10 mg/l H3BO3, 1,6 mg/l MnCl2·4H2O), 60 µg/l Vitamin B12, 1 mg/ml Biotin, 1 mg/ml Thiamin, 0,25 g/l MgSO4, 50 µg/ml Kanamycin und 100 µg/ml Ampicillin wurden hinzugefügt. Dann wurde jeder der Stämme bei 37°C in einem Inkubator in dem Medium kultiviert, und als die optische Dichte (OD) 0,8 erreichte, wurde die Expression des 3-HIBA produzierenden Gens durch 0,1 mM IPTG induziert.
  • Nach der Zugabe von IPTG wurde die Kulturtemperatur auf 30 °C geändert, und 5 g/l Natriumsuccinat als Substrat für die 3-HIBA-Produktion wurde weiterhin zu dem Medium gegeben, und danach wurde eine zusätzliche Kultur 72 Stunden lang bei 200 U/min durchgeführt. Nach 72 Stunden Kultur wurde ein Teil des Kulturprodukts aufgefangen, um die optische Dichte (OD) und die Produktion von 3-HIBA zu messen.
  • Beispiel 5: Analyse von 3-HIBA
  • Das nach 72 Stunden Kultur in Beispiel 4 erhaltene Kulturprodukt wurde zentrifugiert (4°C und 13 000 U/min während 10 min), um die Zellen zu entfernen. 40 ml der zellfreien Überstandsprobe wurden 124 Stunden lang mit einem Gefriertrocknungsverfahren unter Verwendung eines Gefriertrockners (ilShinBio-Base, Korea) getrocknet und dann in 2 ml destilliertem Wasser aufgelöst, wodurch 3 ml einer etwa 13-fach konzentrierten HPLC-Probe hergestellt wurden.
  • Unter Verwendung eines Agilent-1200-HPLC-Systems (Agilent, USA) mit einem Injektionsvolumen von 10 Litern wurde die Probe analysiert. Bei der HPLC wurde die Hypercarb-Säule (150 mm x 4,6 mm) (Thermo, USA) auf 30°C gehalten, und DIW (0,1% Schwefelsäure) und CAN (0,1% Schwefelsäure) wurden als mobile Phase mit einer Fließgeschwindigkeit von 1 ml/min verwendet. Außerdem wurde für die Analyse ein DAD-Detektor (Agilent, USA) verwendet.
  • Wie in 7 gezeigt ist, wiesen die Analyseergebnisse darauf hin, dass dann, wenn die in Beispiel 3 aufgebauten Stämme 2 und 3 72 Stunden lang kultiviert und auf ein Dreizehntel eingeengt wurden, 3-HIBA in Mengen von 69 ppm und 21 ppm produziert wurde.
  • Obwohl die vorliegende Erfindung ausführlich unter Bezugnahme auf ihre speziellen Merkmale beschrieben wurde, wird sich der Fachmann darüber im Klaren sein, dass diese Beschreibung nur für eine bevorzugte Ausführungsform gilt und den Umfang der vorliegenden Erfindung nicht einschränkt. Somit wird der wesentliche Umfang der vorliegenden Erfindung durch die beigefügten Ansprüche und deren Äquivalente definiert.
  • Es folgt ein Sequenzprotokoll als elektronisches Dokument. Dieses kann sowohl in DEPATISnet als auch im DPMAregister aufgerufen werden.

Claims (5)

  1. Mutanter Mikroorganismus, der von einem Mikroorganismus abgeleitet ist, welcher die Fähigkeit hat, Succinyl-CoA aus einer Kohlenstoffquelle zu erzeugen, wobei der mutante Mikroorganismus Gene enthält, die die folgenden Enzyme codieren, und die Fähigkeit hat, 3-HIBA (3-Hydroxyisobuttersäure) zu erzeugen: (i) Methylmalonyl-CoA-Mutase (EC 5.4.99.2); (ii) Methylmalonyl-CoA-Epimerase (5.1.99.1); (iii) Methylmalonyl-CoA-Reductase (MMCR); und (iv) 3-Hydroxyisobutyrat-Dehydrogenase (EC 1.1.1.31), wobei das Enzym von (iii) ein Enzym ist, das Methylmalonyl-CoA-Reductase(MMCR)-Aktivität aufweist und aus Enzymen, die Malonyl-CoA-Reductase(MCR)-Aktivität aufweisen, ausgewählt ist, wobei das Enzym von (iii) eine Sequenz umfasst, die eine Sequenzhomologie von wenigstens 80 % zu der Sequenz aufweist, welche durch eine dargestellt wird, die aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus den SEQ ID Nr. 3 and 4 besteht und wobei das Enzym von (iii) eine Sequenz umfasst, die eine Sequenzhomologie von wenigstens 80% oder eine Sequenzähnlichkeit von wenigstens 80% mit der Sequenz aufweist, die durch SEQ ID Nr. 23 (IKVLGDAYDAKTVKEVTRILSEVKRNVPGTMDELTLSATTHRIA) dargestellt wird.
  2. Mutanter Mikroorganismus gemäß Anspruch 1, wobei das Enzym von (iii) ein monofunktionelles Enzym, das Methylmalonyl-CoA-Reductase-Aktivität aufweist und Methylmalonyl-CoA in Methylmalonatsemialdehyd umwandelt, ist und aus Enzymen, die Malonyl-CoA-Reductase(MCR)-Aktivität aufweisen, ausgewählt ist.
  3. Mutanter Mikroorganismus gemäß Anspruch 1, wobei das Enzym, das Methylmalonyl-CoA-Reductase(MMCR)-Aktivität aufweist, unter den Enzymen, die Malonyl-CoA-Reductase(MCR)-Aktivität aufweisen, vom Reich der Archaea abgeleitet ist.
  4. Mutanter Mikroorganismus gemäß Anspruch 3, wobei das Enzym von (iii) von einer oder mehreren Archaea-Spezies abgeleitet ist, die aus der Gruppe ausgewählt sind, die aus Candidatus Caldiarchaeum subterraneum, Sulfolobales archaeon Acd1 und Sulfolobus acidocaldarius Ron12/I besteht.
  5. Verfahren zur Herstellung von 3-HIBA, das die folgenden Schritte umfasst: Kultivieren des mutanten Mikroorganismus gemäß Anspruch 1 unter Bildung von 3-HIBA; und Gewinnen des gebildeten 3-HIBA.
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