TWI732205B - 生產衣康酸的大腸桿菌轉殖株及其用途 - Google Patents

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Abstract

本發明提供一種大腸桿菌轉殖株、利用大腸桿菌轉殖株生產衣康酸的方法，及大腸桿菌轉殖株用於生產衣康酸的用途。

Description

生產衣康酸的大腸桿菌轉殖株及其用途
本發明是有關於一種大腸桿菌轉殖株、利用大腸桿菌轉殖株生產衣康酸的方法，及大腸桿菌轉殖株用於生產衣康酸的用途。
近來透過轉化生質原料而成的再生材料愈來愈受到注意。衣康酸(itaconate)是一種C5二羧酸(dicarboxylic acid)，具有雙官能基以及一個不飽和雙鍵，使其在高分子合成領域有相當多的應用。衣康酸已被美國能源部(US Department of Energy,DOE)認為是前12種有價值添加的以生物為基礎的化學物質。此外，衣康酸在成為各種不同以石油為基礎的化學物質(諸如丙烯酸(acrylic acid)及甲基丙烯酸(methacrylic acid))的再生替代品之持續性上扮演關鍵性角色，因而可減少仰賴以油為基礎的能源及長期環境損害。衣康酸具有下列化學式：
Figure 108112739-A0101-12-0001-1
 並且為許多產物(例如，聚丙烯纖維、橡膠、人工鑽石及鏡片)之必需前驅物，其廣泛地使用於化學工業上。傳統上，衣康酸是由土麴菌(Aspergillus terreus)中所分離出來。然而，土麴菌生長緩慢，且在產孢時期並無法形成衣康酸。因此，業界亟需一種可大量生產衣康酸的方法。
大腸桿菌(學名：Escherichia coli，通常簡寫：E.coli)是人和動物腸道中一種細菌，主要寄生於大腸內，約占腸道菌中的0.1%。大腸桿菌是一種兩端鈍圓、能運動、無芽孢的革蘭氏陰性短桿菌。
雖然目前本領域的研究人員已發現大腸桿菌可用來生產衣康酸。然而，大腸桿菌菌株中，為了累積生產衣康酸之前驅物，需要抑制檸檬酸循環中的重要基因icd(其編碼異檸檬酸去氫酶(isocitrate dehydrogenase))，抑制icd基因造成α-酮戊二酸(α-ketoglutaric acid,α-KG)與穀胺酸(glutamic acid)的營養缺陷株(auxotroph)，使得此一菌株在基礎培養基中無法生長及生產衣康酸。針對此一長期存在的問題，習知技術是透過額外添加蛋白質營養物(例如，酵母萃取物或穀胺酸)，以提供抑制icd基因之衣康酸生產菌株無法自行合成之生長必需胺基酸(亦即穀胺酸)，以幫助該菌株生長。
然而，額外添加蛋白質營養物給衣康酸生產菌株會造成整體生產成本提高。因此，若能開發出不需額外添加蛋白質營養物即可大量生產衣康酸的大腸桿菌，便可有機會降低衣康酸之生產成本，將可造福有此需求的廣大族群且對本技術領域帶來相當大的突破。
有鑑於此，本發明之目的為提供一種大腸桿菌(Escherichia coli)轉殖株，包含至少一表現質體，表現質體包括一D-木糖去氫酶(D-xylose dehydrogenase,XDH)基因、一D-木糖酸內酯酶(D-xylonolactonase,XL)基因、一2-酮-3-去氧-D-木糖酸脫水酶(2-keto-3-deoxy-D-xylonate dehydratase,KdxD)基因，及一2-酮戊二酸半醛去氫酶(2-ketoglutarate semialdehyde dehydrogenase,KGSADH)基因；其中該大腸桿菌轉殖株的一異檸檬酸去氫酶(isocitrate dehydrogenase,icd)基因被剔除。
本發明的另一目的為提供一種利用一大腸桿菌轉殖株生產衣康酸的方法，包含以下步驟：(a)將表現質體轉化於大腸桿菌的細胞中，得到大腸桿菌轉殖株；(b)提供一基質作為培養基，基質包含碳源、氮源、礦物質及維生素；以及(c)在一介於30℃至37℃的溫度及一介於20%至30%的溶氧下培養大腸桿菌轉殖株，並誘導大腸桿菌轉殖株生產衣康酸。
本發明的另一目的為提供一種大腸桿菌轉殖株用於生產衣康酸的用途。
在本發明的一實施例中，表現質體進一步包括一D-木糖酸脫水酶(D-xylonate dehydratase,XD)基因。
在本發明的一實施例中，XDH基因、XL基因、KdxD基因、KGSADH基因及XD基因是來自於伯克氏菌(Burkholderia xenovorans)。
在本發明的一實施例中，XDH基因、XL基因、XD基因、KdxD基因及KGSADH基因是依序由5’端至3’端被構築於表現質體。
在本發明的一實施例中，大腸桿菌為大腸桿菌BW25113菌株或XL-1 Blue菌株。
在本發明的一實施例中，大腸桿菌轉殖株透過一非磷酸化代謝途徑(nonphosphorylative metabolic pathway)將木糖轉化成α-酮戊二酸(α-ketoglutaric acid)。
在本發明的一實施例中，該大腸桿菌染色體的一木糖異構酶(xylose isomerase)基因xylA、一2-去氫-3-去氧-D-戊糖酸醛縮酶(2-dehydro-3-deoxy-D-pentonate aldolase)基因yjhH及一2-酮-3-去氧葡糖酸醛縮酶(2-keto-3-deoxygluconate aldolase)基因yagE被剔除。
在本發明的一實施例中，大腸桿菌轉殖株具有檸檬酸合成酶(citrate synthase,gltA)、烏頭酸酶B(aconitase B,acn B)及丙酮酸羧酶(pyruvate carboxylase,pyc)。
在本發明的一實施例中，大腸桿菌轉殖株會產生衣康酸(itaconate)。
在本發明的一實施例中，大腸桿菌轉殖株生產衣康酸時，無需額外添加酵母菌萃取物或穀胺酸。
在本發明的一實施例中，大腸桿菌轉殖株每24小時會產生1.2g/L至2.2g/L的衣康酸。
在本發明的一實施例中，大腸桿菌轉殖株每90小時會產生19g/L至21g/L的衣康酸。
在本發明的一實施例中，該方法是在一補充有甘油及銨鹽的環境下進行。
在本發明的一實施例中，該方法是在一介於2g/L至10g/L的初始木糖濃度下進行。
綜上所述，本發明大腸桿菌轉殖株之功效在於：透過建構異源代謝途徑，伯克氏菌之非磷酸化代謝途徑於大腸桿菌中，使菌株能夠自行轉化合成α-酮戊二酸(α-ketoglutaric acid)，進一步透過代謝木糖合成穀胺酸。此外，在無額外提供蛋白質營養源之培養基中，本發明大腸桿菌轉殖株之生長自原先細胞濃度為OD600 0.296(36小時)(經基因組合的優化前)透過基因組合的優化，更能將細胞生長情形優化至OD600 1.62(36小時)(經基因組合的優化後)，同時利用甘油及木糖能夠提升衣康酸產量以及優化細胞生長，並藉由剔除非磷酸化代謝途徑之競爭途徑，衣康酸產量可以達1.2g/L(24小時)。本發明實驗結果證實降低培養基中木糖之起始濃度能夠提升衣康酸產量達2.2g/L(24小時)，而結合上述之優化條件於1公升發酵槽(即生物反應槽)進行製程放大可以使衣康酸產量達到20.01g/L(90小時)、0.62(g衣康酸/g甘油)轉化率以及0.24g/L/小時產率在基礎培養基中。
以下將進一步說明本發明的實施方式，下述所列舉的實施例係用以闡明本發明，並非用以限定本發明之範圍，任何熟習此技藝者，在不脫離本發明之精神和範圍內，當可做些許更動與潤飾，因此本發明之保護範圍當視後附之申請專利範圍所界定者為準。
圖1是本發明大腸桿菌轉殖株透過與內源α-酮戊二酸生合成分離的途徑來生產衣康酸之示意圖，其中α-KG表示α-酮戊二酸；OAA表示草醯乙酸(oxaloacetate)；MAL表示蘋果酸(malate)；SUC表示琥珀酸(succinate)；acnB表 示烏頭酸酶B(aconitase B)；cad表示順烏頭酸脫羧酶(cis-aconitate decarboxylase)；pyc表示丙酮酸羧酶(pyruvate carboxylase)；gltA表示檸檬酸合成酶(citrate synthase)；icd表示異檸檬酸去氫酶(isocitrate dehydrogenase)基因；xylA表示木糖異構酶(xylose isomerase)基因；yjhH表示2-去氫-3-去氧-D-戊糖酸醛縮酶(2-dehydro-3-deoxy-D-pentonate aldolase)基因；yagE表示2-酮-3-去氧葡糖酸醛縮酶(2-keto-3-deoxygluconate aldolase)基因；XDH表示D-木糖去氫酶(D-xylose dehydrogenase)基因；XL表示D-木糖酸內酯酶(D-xylonolactonase)基因；XD表示D-木糖酸脫水酶(D-xylonate dehydratase)基因；KdxD表示2-酮-3-去氧-D-木糖酸脫水酶(2-keto-3-deoxy-D-xylonate dehydratase)基因；KGSADH表示2-酮戊二酸半醛去氫酶(2-ketoglutarate semialdehyde dehydrogenase)基因。
圖2是利用本發明大腸桿菌轉殖株構築非磷酸化途徑的基因組合之示意圖，其中KGSADH表示編碼2-酮戊二酸半醛去氫酶(2-ketoglutarate semialdehyde dehydrogenase,KGSADH)的基因；KdxD表示編碼2-酮-3-去氧-D-木糖酸脫水酶(2-keto-3-deoxy-D-xylonate dehydratase,KdxD)的基因；XD表示編碼D-木糖酸脫水酶的基因；XL表示編碼D-木糖酸內酯酶(D-xylonolactonase,XL)的基因；XDH表示編碼D-木糖去氫酶(D-xylose dehydrogenase,XDH)的基因；Cad表示編碼順烏頭酸脫羧酶(cis-aconitate decarboxylase)的基因；pyc表示編碼丙酮酸羧酶(pyruvate carboxylase)的基因；gltA表示編碼檸檬酸合成酶(citrate synthase)的基因。
圖3是本發明大腸桿菌轉殖株之不同操縱子結構的生長曲線圖，其中Bw25113 Δicd+pKL5+pKL6表示將pKL5以及pKL6兩質體轉殖入該大腸桿菌菌株之表現型；Bw25113 Δicd+pKL7+pKL8表示將pKL7以及pKL8兩質體轉殖入該大腸桿菌菌株之表現型。
圖4A是本發明大腸桿菌轉殖株剔除株Bw25113 Δicd ΔxylA ΔyjhH ΔyagE在補充有銨鹽((NH4)2SO4)的環境下生產衣康酸的功效之數據圖，其中C表示僅補充5g/L甘油及木糖；C-2g/LN表示補充5g/L甘油、木糖及2g/L(NH4)2SO4；C-8g/LN表示補充5g/L甘油、木糖及8g/L(NH4)2SO4。
圖4B是本發明大腸桿菌轉殖株剔除株Bw25113 Δicd ΔxylA ΔyjhH ΔyagE在補充有銨鹽((NH4)2SO4)的環境下的細胞密度之數據圖，其中C表示僅補充5 g/L甘油及木糖；C-2g/LN表示補充5g/L甘油、木糖及2g/L(NH4)2SO4；C-8g/LN表示補充5g/L甘油、木糖及8g/L(NH4)2SO4。
圖4C是本發明大腸桿菌轉殖株剔除株Bw25113 Δicd ΔxylA ΔyjhH ΔyagE在補充有銨鹽((NH4)2SO4)的環境下的木糖消耗量之數據圖，其中C表示僅補充5g/L甘油及木糖；C-2g/LN表示補充5g/L甘油、木糖及2g/L(NH4)2SO4；C-8g/LN表示補充5g/L甘油、木糖及8g/L(NH4)2SO4。
圖4D是本發明大腸桿菌轉殖株剔除株Bw25113 Δicd ΔxylA ΔyjhH ΔyagE在補充有銨鹽((NH4)2SO4)的環境下的甘油消耗量之數據圖，其中C表示僅補充5g/L甘油及木糖；C-2g/LN表示補充5g/L甘油、木糖及2g/L(NH4)2SO4；C-8g/LN表示補充5g/L甘油、木糖及8g/L(NH4)2SO4。
圖5A是在2階段發酵下甘油及木糖消耗量的數據圖。
圖5B是在1階段發酵下甘油及木糖消耗量的數據圖。
圖6A是在2階段發酵下衣康酸及乙酸的產量之數據圖。
圖6B是在1階段發酵下衣康酸及乙酸的產量之數據圖。
圖7是在30℃溫度及30%溶氧環境下的衣康酸與乙酸產量之數據圖。
圖8是藉由蘋果酸去氫酶(其由maeA及maeB基因編碼)催化將蘋果酸生成丙酮酸的葡萄糖新生反應之示意圖。
圖9是不同木糖初始濃度對於衣康酸生產之影響的數據圖。
圖10是本發明大腸桿菌轉殖株在生物反應槽中大量生產衣康酸的功效之數據圖。
圖11是本發明ΔmaeA ΔmaeB基因雙剔除菌株對於衣康酸生產及乙酸累積的影響之數據圖，其中Bw25113 Δicd ΔxylA ΔyjhH ΔyagE+pKL5+pKL6表示maeA及maeB基因未被剔除的大腸桿菌菌株；Bw25113 Δicd ΔxylA ΔyjhH ΔyagE ΔmaeA ΔmaeB+pKL5+pKL6表示maeA及maeB基因雙剔除的大腸桿菌菌株。
定義
本文中所使用數值為近似值，所有實驗數據皆表示在20%的範圍內，較佳為在10%的範圍內，最佳為在5%的範圍內。
如本文中所使用的，用語“表現質體(expression plasmid)”與“表現載體(expression vector)”可交換使用，並且意指任一種重組型表現系統，它可於活體外(in vitro)或活體內(in vivo)，在任一種勝任的宿主細胞(competent host cell)內構成地(constitutively)或誘導地(inducibly)表現一被選定的核酸序列。該表現質體可為一線性或環形表現系統，且涵蓋保持游離基因(episomal)形式或是被整合至宿主細胞的基因組內的表現系統。該重組型表現系統可具有或不具有自我複製的能力，它可能只會驅使宿主細胞的短暫表現。
依據本發明，α-酮戊二酸(α-ketoglutaric acid)是非磷酸化代謝途徑(nonphosphorylative metabolic pathway)的終產物(end product)，並且對大腸桿菌的生長是必需的。傳統上，將icd基因去活化會使大腸桿菌成為α-酮戊二酸與穀胺酸的營養缺陷株。透過非磷酸化代謝途徑拯救(rescuing)α-酮戊二酸營養缺陷株成為一種發現新的功能性基因簇(gene cluster)的技術手段。
實施例1. 本發明大腸桿菌轉殖株透過與內源α-酮戊二酸生合成分離的途徑來生產衣康酸
在本實施例及下面實施例中，除非另外指明，所有化學品及試劑是購自於Sigma-Aldrich(Saint Louis,MO)。KOD DNA聚合酶及KOD Xtreme DNA聚合酶是購自於EMD Chemicals(San Diego,CA)。所有的寡核苷酸是由IDT(新加坡)合成。
所有的菌株、表現質體及其基因型顯示於表1，所有的基因片段是藉由表2所列的對應引子進行擴增。所有表現質體是藉由使用經純化的片段之Gibson DNA裝配(Gibson DNA assembly)進行構築(參見Gibson,D.G.,et al.,Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases.Nat Methods,2009.6(5)：p.343-5)。所有表現質體是於XL-1 Blue菌株(Stratagene)中進行增殖。icd基因、xylA基因、yagE基因、yjhH基因、maeA基因maeB基因的刪除是利用Keio收集菌株(collection strain)作為供給者(donor)藉由P1轉導(P1 transduction)來執行(參見Baba,T.,et al.,Construction of Escherichia coli K-12 in-frame,single-gene knockout mutants：the Keio collection.Mol Syst Biol,2006.2：p.20060008)。將kanR插入至目標基因區域是參見Datsenko,K.A.and B.L. Wanner,One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products.Proc Natl Acad Sci U S A,2000.97(12)：p.6640-5來移除。
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關於在非磷酸化途徑的表現下生產衣康酸的培養基與培養條件如下：從LB培養盤挑選單一菌落，接種至含有2mL的LB培養基及適當抗生素(50μg/mL康那黴素(kanamycin)及50μg/mL奇黴素(spectinomycin))的試管中，然後在37℃的旋轉搖動器(rotary shaker)(250rpm)中培養過夜。接著，將1%(v/v)培養物接種至含有20mL的M9培養基(每1L水含有12.8g的Na2HPO4．7 H2O、3g的KH2PO4、0.5g的NaCl、1g的NH4Cl、1mmol MgSO4、1mg的維生素B1及0.1mmol CaCl2)、1000x微量金屬混合物A5(trace metal mix A5)(每1L水含有2.86g的H3BO3、1.81g的MnCl2．4 H2O、0.222g的ZnSO4．7 H2O、0.39g的Na2MoO4．2 H2O、0.079g的CuSO4．5 H2O及0.049g的Co(NO3)2．6 H2O)、10g/L甘油、木糖(不同測試濃度分別為2、5、10及20g/L)及適當抗生素之具有螺旋帽蓋的250mL錐形瓶中。之後，將培養物置於37℃的旋轉搖動器(250rpm)中生長至OD600達0.3~0.4，接而以0.1mM IPTG誘導。經誘導的培養物生長於30℃的旋轉搖動器(250rpm)中，接而取出樣品並進行離心以供HPLC分析。
之後，取0.02mL的樣品並將之施用於配備有自動注射器(auto-sampler)(Agilent Technologies)的Agilent Technologies 1260 infinity HPLC儀及Agilent Hi-Plex H管柱(5mM H2SO4、0.6mL/分鐘、管柱溫度50℃)。接著，使用光電二極體陣列偵測器(photodiode array detector)於210nm或254nm下偵測有機酸，並使用折射係數(RI偵測器)偵測木糖及甘油。之後，藉由外推法(extrapolation)由標準曲線(standard curve)測定濃度。
關於優化衣康酸生產途徑基因的衣康酸生產實驗，添加5g/L酵母菌萃取物及20g/L葡萄糖。關於銨鹽實驗，每12小時調整培養基的pH值，並提供5g/L木糖及5g/L甘油(伴隨不同量的銨鹽)。關於生長曲線實驗，使用與在非磷酸化途徑的表現下生產衣康酸實驗相同的培養基(亦即M9培養基)以及碳源，培養溫度維持在37℃。
在本實施例中，為了有效率地生產衣康酸，icd基因的去活化(或者剔除(knockout))是必要的策略。在傳統上，icd基因的去活化會伴隨需對穀胺酸營養缺陷株，需要額外添加營養物(諸如酵母菌萃取物及穀胺酸)之問題，如此會妨礙衣康酸生產的商業化。為了在icd基因去活化的大腸桿菌中將衣康酸生產與內源α-酮戊二酸生合成途徑分離，本發明利用非磷酸化代謝途徑將木糖轉化成α-酮戊二酸，俾以解決穀胺酸營養缺陷株的問題。針對衣康酸生產，本發明選擇性過量表現順烏頭酸脫羧酶(cis-aconitate decarboxylase,CAD)基因(來自土麴菌(Aspergillus terreus))、檸檬酸合成酶(citrate synthase,gltA)基因(來自大腸桿菌)及丙酮酸羧酶(pyruvate carboxylase,pyc)基因(來自穀胺酸棒狀桿菌(Corynebacterium glutamicum,CG))，並且透過基因刪除完全阻斷icd基因表現，俾以有效率地生產衣康酸。
對於非磷酸化代謝途徑，本發明用來自伯克氏菌(Burkholderia xenovorans)的基因簇將木糖轉化成α-酮戊二酸。木糖異構酶(xylose isomerase,XylA)基因、2-酮-3-去氧葡糖酸醛縮酶(2-keto-3-deoxygluconate aldolase,yagE)基因及2-去氫-3-去氧-D-戊糖酸醛縮酶(2-dehydro-3-deoxy-D-pentonate aldolase,yjhH)基因被進一步去活化，以減少大腸桿菌內源代謝途徑與目標代謝途徑對中間代謝物之競爭。衍生自生質燃料生產工業的甘油是一種大量的副產物，因此成為生物轉化碳源的候選物。此外，甘油同化途徑(glycerol assimilation pathway)相較於利用葡萄糖及木糖將產生更多能量(以三磷酸腺苷(adenosine triphosphate,ATP)的形式。木糖在木質纖維水解物(lignocellulosic hydrolysate)中作為主要糖類。本發明大腸桿菌轉殖株透過與內源α-酮戊二酸(α-KG)生合成分離的途徑來生產衣康酸之示意圖顯示於圖1。
圖1是本發明大腸桿菌轉殖株透過與內源α-酮戊二酸生合成分離的途徑來生產衣康酸之示意圖。由圖1可見，本發明大腸桿菌轉殖株(icd基因被去活化)，透過非磷酸化代謝途徑(表現XDH基因、XL基因、XD基因、KdxD基因及KGSADH基因)將木糖轉化成α-酮戊二酸(α-KG)，而與傳統透過內源α-酮戊二酸生合成的途徑不同，藉此不需額外添加蛋白質營養物(例如酵母萃取物或穀胺酸)即可生產衣康酸。
實施例2. 利用本發明大腸桿菌轉殖株構築非磷酸化途徑
剔除icd基因會使細胞喪失將異檸檬酸轉化成α-酮戊二酸(α-KG)的能力，故細胞需要額外補充α-酮戊二酸。圖2是利用本發明大腸桿菌轉殖株構築非磷酸化途徑的基因組合之示意圖。由圖2可見，本發明運用伯克氏菌的基因簇並進一步優化操縱子結構以供增進細胞生長。特別地，XDH基因的表現藉由高表現量之質體進行表現，以提升該基因於菌株內之表現。
圖3是本發明大腸桿菌轉殖株之不同操縱子結構的生長曲線圖。本實施例的結果顯示，利用本發明大腸桿菌轉殖株構築非磷酸化途徑在無外源補充α-酮戊二酸的情況下可增進細胞生長至OD600在36小時內達1.6。
實施例3. 依據本發明衣康酸途徑及非磷酸化途徑的表現決定衣康酸生產培養條件
為了增進代謝途徑的效率，可藉由封阻競爭途徑來達成。因此，將大腸桿菌中的原生木糖異構酶(xylose isomerase,xylA)、2-去氫-3-去氧-D-戊糖酸醛縮酶(2-dehydro-3-deoxy-D-pentonate aldolase,yjhH)及2-酮-3-去氧葡糖酸醛縮酶(2-keto-3-deoxygluconate aldolase,yagE)封阻(非磷酸化代謝的競爭途徑之刪除請參見圖1)，藉此構築大腸桿菌轉殖株剔除株Bw25113 Δicd ΔxylA ΔyjhH ΔyagE以進行下面的實驗。
已有研究人員指出補充銨鹽作為氮源可累積更多細胞質量(cell mass)(參見Harder,B.J.,K.Bettenbrock,and S.Klamt,Temperature-dependent dynamic control of the TCA cycle increases volumetric productivity of itaconic acid production by Escherichia coli.Biotechnol Bioeng,2018.115(1)：p.156-164)。細胞質量與衣康酸產量(克/公升)為正相關，能夠累積較多活化的轉殖菌株，便可提升衣康酸之產量。因此，本發明探討補充銨鹽對於衣康酸生產的影響，細胞質量與衣康酸產量(克/公升)為正相關，能夠累積較多活化的轉殖菌株，便可提升衣康酸之產量，結果顯示於圖4A~圖4D。
圖4A是本發明大腸桿菌轉殖株剔除株Bw25113 Δicd ΔxylA ΔyjhH ΔyagE在補充有銨鹽((NH4)2SO4)的環境下生產衣康酸的功效之數據圖。圖4B是本發明大腸桿菌轉殖株剔除株Bw25113 Δicd ΔxylA ΔyjhH ΔyagE在補充有銨鹽((NH4)2SO4)的環境下的細胞密度之數據圖。圖4C是本發明大腸桿菌轉殖 株剔除株Bw25113 Δicd ΔxylA ΔyjhH ΔyagE在補充有銨鹽((NH4)2SO4)的環境下的木糖消耗量之數據圖。圖4D是本發明大腸桿菌轉殖株剔除株Bw25113 Δicd ΔxylA ΔyjhH ΔyagE在補充有銨鹽((NH4)2SO4)的環境下的甘油消耗量之數據圖。由圖4A及圖4B可見，補充或未補充銨鹽會產生顯著差異(圖中“C”組表示未補充銨鹽，其餘組表示有補充銨鹽)。額外補充銨鹽的情況下會產生較高的細胞質量及較高的衣康酸產量，且可延長衣康酸的生產。然而，無論是2g/L(NH4)2SO4或8g/L(NH4)2SO4，銨鹽的補充量並無太大差異。此外，僅補充甘油及木糖作為碳源會導致較低的甘油消耗量但幾乎與補充銨鹽組有相同的木糖消耗量(參見圖4C及圖4D)，這可能是由於限量的氮源導致α-酮戊二酸的累積(氮源為將α-酮戊二酸轉化成穀胺酸的代謝途徑中之輔因子，因此若沒有補充氮源，便有可能導致該代謝途徑轉換效率下降，同時累積α-酮戊二酸)。因此，衍生自中心代謝的碳通量的甘油無法進入TCA循環而導致較低的甘油消耗。
實施例4. 本發明大腸桿菌轉殖株在生物反應槽中大規模生產衣康酸的效用評估
結合前面實施例設計出衣康酸的協同基因操縱子(synergistic operon)及非磷酸化途徑，透過基質的共同利用及額外補充銨鹽來優化衣康酸生產，本發明藉由可恆定控制pH、溫度及溶氧(dissolved oxygen,DO)的1L生物反應槽來大規模生產衣康酸。本發明大腸桿菌中產生衣康酸的順烏頭酸脫羧酶(Cad)蛋白質喜好摺疊(folding)及在較低溫度下作用，因此，首先測試2種不同的培養溫度及20%溶氧。第一種條件下，起始溫度為37℃及當OD600達至大約0.6時轉換至30℃，此稱為2階段發酵(two-stage fermentation)。第二種條件下，整個生產過程維持在30℃，此稱為1階段發酵(one-stage fermentation)。結果顯示於圖5A、圖5B、圖6A及圖6B。圖5A是在2階段發酵下甘油及木糖消耗量的數據圖。圖5B是在1階段發酵下甘油及木糖消耗量的數據圖。圖6A是在2階段發酵下衣康酸及乙酸的產量之數據圖。圖6B是在1階段發酵下衣康酸及乙酸的產量之數據圖。由圖5A及圖5B可見，2階段發酵在前16小時會有較快的生長，這可能是因為較高的培養溫度造成；與2階段發酵相較下，1階段發酵會消耗大約4倍的甘油，這可能是因為Cad蛋白質在較低溫度下會有正確的摺疊(參見圖5A、圖5B、圖6A及圖6B)。甘油消耗也反映在衣康酸產量上。意外地，與甘油相較下，大 量的木糖被消耗。雖然顯著的消耗差異未顯示於前面的實驗中，結果顯示本發明菌株的碳源較偏好糖類，特別是木糖勝過甘油。
由於有效率地生產衣康酸需要大量氧氣，溶氧增加至30%溶氧，結果顯示於圖7。圖7是在30℃溫度及30%溶氧環境下的衣康酸與乙酸產量之數據圖。由圖7可見，本發明透過增加溶氧量在100小時內將衣康酸產量達至12.49g/L。然而，也檢測到100小時內產生14g/L的乙酸。大量的乙酸會改變大腸桿菌的pH及滲透壓，為了進一步優化衣康酸生產，乙酸形成會是發酵過程的主要障礙。
實施例5. 將碳通量引入生產衣康酸的策略
由前面的實驗結果可知，木糖被大量消耗勝過甘油，這表示木糖會被轉化成乙酸。木糖被同化而形成α-酮戊二酸。α-酮戊二酸接著參與後續TCA循環的反應。當α-酮戊二酸轉化成蘋果酸或草醯乙酸時，有多種酵素可催化葡萄糖新生反應(gluconeogenesis reaction)以將TCA循環中間產物轉換成中心代謝物(central metabolite)，諸如丙酮酸及磷酸烯醇丙酮酸(phosphoenolpyruvate)。因此，這些木糖衍生的中心代謝物可被進一步引入乙酸生合成。假設木糖超量而透過葡萄糖新生途徑形成乙酸，為了封阻這些途徑，本發明抑制木糖的碳通量俾以降低乙酸產生。已有研究人員指出在大腸桿菌的icd基因被刪除之後會產生內生蛋白質表現差異。蘋果酸去氫酶(malate dehydrogenase,mae)被上升調節大約21倍，這可證實透過葡萄糖新生途徑產生木糖超量的假設。圖8是藉由蘋果酸去氫酶(其由maeA及maeB基因編碼)催化將蘋果酸生成丙酮酸的葡萄糖新生反應之示意圖。由圖8可見，大腸桿菌中有2種蘋果酸去氫酶maeA及maeB。
為了避免TCA循環中間產物累積，本案嘗試調節非磷酸化途徑效率。未採取基因修飾的調節，而是藉由降低木糖在培養基中的初始濃度，藉此調節途徑效率，結果顯示於圖9。圖9是不同木糖初始濃度對於衣康酸生產之影響的數據圖。由圖9可見，2g/L木糖初始濃度相較於其他木糖初始濃度可提升衣康酸產量。
實施例6. 本發明大腸桿菌轉殖株可在1L生物反應槽中大量生產衣康酸
在本實施例中，衣康酸是在有攪拌槽的1L生物反應槽(Major science)中生產。從LB培養盤挑選單一菌落，接而接種至含有2mL的LB培養基及適當抗生素(50μg/mL康那黴素及50μg/mL奇黴素)的試管中，然後在37℃的旋轉搖動器(250rpm)中培養過夜。接著，將1%(v/v)培養物接種至25mL的LB中並於37℃下培養24小時，接而進行離心以分離LB與細胞，然後使用過濾水再懸浮至相同體積。之後，將10%(v/v)培養物接種至含有M9培養基(每1L水含有12.8g的Na2HPO4．7 H2O、3g的KH2PO4、0.5g的NaCl、1g的NH4Cl、1mmol MgSO4、1mg的維生素B1及0.1mmol CaCl2)、1000x微量金屬混合物A5(每1L水含有2.86g的H3BO3、1.81g的MnCl2．4 H2O、0.222g的ZnSO4．7 H2O、0.39g的Na2MoO4．2 H2O、0.079g的CuSO4．5 H2O及0.049g的Co(NO3)2．6 H2O)、20g/L甘油、5g/L木糖、0.1mM IPTG及適當抗生素之0.7L生物反應槽中。接著，藉由提升攪拌器速度(從550rpm至700rpm)將空氣飽和度維持在20%或30%的溶氧。通氣量(aeration)設定至1vvm(每分鐘每體積的液體之氣體體積)。藉由自動添加5N NaOH將pH維持在7。木糖儲備溶液(stock)濃度為300g/L，甘油濃度為600g/L，及硫酸銨(ammonium sulfate)濃度為40g/L。
結合前面全部的優化過程，包括1階段發酵(維持在30℃)以供Cad有較佳的蛋白質摺疊，控制培養環境在高氧水平(30%溶氧)，提供銨鹽以延長衣康酸生產及降低初始木糖濃度。本實施例的結果顯示於圖10。圖10是本發明大腸桿菌轉殖株(Bw25113 Δicd ΔxylA ΔyjhH ΔyagE+pKL7+pKL8)在生物反應槽中大量生產衣康酸的功效之數據圖。由圖10可見，結合全部的優化條件，本發明大腸桿菌轉殖株成功在90小時內生產20.01g/L衣康酸，產率(yield)為0.62g衣康酸/g甘油，生產力(productivity)為0.24g/L/小時。最重要的是，86%的高產率的衣康酸生產與少量作為副產物的乙酸(3.7g/L)。
比較例 ΔmaeA ΔmaeB基因雙剔除菌株對於衣康酸生產及乙酸累積的影響
本發明接著構築maeA及maeB基因雙剔除菌株(Bw25113 Δicd ΔxylA ΔyjhH ΔyagE ΔmaeA ΔmaeB)用於衣康酸生產試驗，結果顯示於圖11。
圖11是本發明ΔmaeA ΔmaeB基因雙剔除菌株對於衣康酸生產及乙酸累積的影響之數據圖。由圖11可見，這2種基因的去活化導致乙酸增加 及衣康酸產量降低。此結果可能是由於TCA循環中間產物的累積而妨礙來自中心代謝物(諸如可輕易引入乙酸的乙醯輔酶A)的碳通量進入。
綜上所述，本發明大腸桿菌轉殖株確實可透過建構異源代謝途徑，使用伯克氏菌之非磷酸化代謝途徑於大腸桿菌中，使菌株能夠自行轉化合成α-酮戊二酸，進一步透過代謝木糖合成穀胺酸。此外，在無額外提供蛋白質營養源之培養基中，本發明大腸桿菌轉殖株能夠生長自細胞濃度達OD600 0.296(36小時)透過基因組合的優化，更能將細胞生長情形優化至OD600 1.62(36小時)，同時利用甘油及木糖能夠提升衣康酸產量以及優化細胞生長，並藉由剔除非磷酸化代謝途徑之競爭途徑，衣康酸產量可以達1.2g/L(24小時)。降低培養基中木糖之起始濃度能夠提升衣康酸產量達2.2g/L(24小時)，而結合上述之優化條件於1公升發酵槽(即生物反應槽)進行製程放大可以使衣康酸產量達到20.01g/L(90小時)、0.62(g衣康酸/g甘油)轉化率以及0.24g/L/小時產率在基礎培養基中，並於24小時達到1.4g/L的衣康酸產量(利用搖瓶培養於無額外添加蛋白質營養源之基礎培養基中)。
以上所述僅為舉例性，而非為限制性者。任何未脫離本發明之精神與範疇，而對其進行之等效修改或變更，均應包含於後附之申請專利範圍中。
<110> 國立清華大學、長春人造樹脂廠股份有限公司、長春石油化學股份有限公司、大連化學工業股份有限公司
<120> 生產衣康酸的大腸桿菌轉殖株及其用途
<160> 28
<170> PatentIn version 3.5
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<210> 20
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<212> DNA
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<213> 人工序列
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Claims (14)

  1. 一種大腸桿菌(Escherichia coli)轉殖株，包含至少一表現質體，該表現質體包括一D-木糖去氫酶(D-xylose dehydrogenase,XDH)基因、一D-木糖酸內酯酶(D-xylonolactonase,XL)基因、一2-酮-3-去氧-D-木糖酸脫水酶(2-keto-3-deoxy-D-xylonate dehydratase,KdxD)基因，及一2-酮戊二酸半醛去氫酶(2-ketoglutarate semialdehyde dehydrogenase,KGSADH)基因；其中該大腸桿菌轉殖株的一異檸檬酸去氫酶(isocitrate dehydrogenase,icd)基因被剔除，該表現質體進一步包括一D-木糖酸脫水酶(D-xylonate dehydratase,XD)基因，該XDH基因、該XL基因、該KdxD基因、該KGSADH基因及該XD基因是來自於伯克氏菌(Burkholderia xenovorans)，該XDH基因、該XL基因、該XD基因、該KdxD基因及該KGSADH基因是依序由5’端至3’端被構築於該表現質體，該大腸桿菌轉殖株會產生衣康酸(itaconate)，及該大腸桿菌轉殖株產生衣康酸時，無需額外添加酵母菌萃取物或穀胺酸；該表現質體包括pKL07及pKL08。
  2. 如申請專利範圍第1項所述之大腸桿菌轉殖株，其中該大腸桿菌為大腸桿菌BW25113菌株或XL-1 Blue菌株。
  3. 如申請專利範圍第1項所述之大腸桿菌轉殖株，其透過一非磷酸化代謝途徑(nonphosphorylative metabolic pathway)將木糖轉化成α-酮戊二酸(α-ketoglutaric acid)。
  4. 如申請專利範圍第1項所述之大腸桿菌轉殖株，其中該大腸桿菌染色體的一木糖異構酶(xylose isomerase)基因xylA、一2-去氫-3-去氧-D-戊糖酸醛縮酶(2-dehydro-3-deoxy-D-pentonate aldolase)基因yjhH及一2-酮-3-去氧葡糖酸醛縮酶(2-keto-3-deoxygluconate aldolase)基因yagE被剔除。
  5. 如申請專利範圍第1項所述之大腸桿菌轉殖株，其具有檸檬酸合成酶(citrate synthase,gltA)、烏頭酸酶B(aconitase B,acn B)及丙酮酸羧酶(pyruvate carboxylase,pyc)。
  6. 一種利用如申請專利範圍第1項至第5項中任一項所述之大腸桿菌轉殖株以生產衣康酸的方法，包含以下步驟：(a)將該表現質體轉化於該大腸桿菌的細胞中，得到該大腸桿菌轉殖株；(b)提供一基質作為一培養環境，該基質包含碳源、氮源、礦物質及維生素；以及(c)在一介於30℃至37℃的溫度及一介於20%至30%的溶氧下培養該大腸桿菌轉殖株，並誘導該大腸桿菌轉殖株生產衣康酸。
  7. 如申請專利範圍第6項所述之方法，其中該步驟(b)的碳源包含一甘油，且該氮源為一銨鹽。
  8. 如申請專利範圍第7項所述之方法，其中該步驟(b)的碳源進一步包含一木糖，且初始木糖濃度介於2g/L至10g/L。
  9. 如申請專利範圍第6項所述之方法，其中該大腸桿菌轉殖株每24小時會產生1.2g/L至2.2g/L的衣康酸。
  10. 如申請專利範圍第6項所述之方法，其中該大腸桿菌轉殖株每90小時會產生19g/L至21g/L的衣康酸。
  11. 如申請專利範圍第6項所述之方法，其生產衣康酸時，無需額外添加酵母菌萃取物或穀胺酸。
  12. 一種如申請專利範圍第1項至第5項中任一項所述之大腸桿菌轉殖株用於生產衣康酸的用途。
  13. 如申請專利範圍第12項所述之用途，其中該大腸桿菌轉殖株每24小時會產生1.2g/L至2.2g/L的衣康酸。
  14. 如申請專利範圍第12項所述之用途，其中該大腸桿菌轉殖株每90小時會產生19g/L至21g/L的衣康酸。
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Chang P et al., "Engineering efficient production of itaconic acid from diverse substrates in Escherichia coli", Journal of Biotechnology, Volume 249, Pages 73-81, 2017/05/10
Chang P et al., "Engineering efficient production of itaconic acid from diverse substrates in Escherichia coli", Journal of Biotechnology, Volume 249, Pages 73-81, 2017/05/10 劉維喜等人 「微生物木糖代謝途徑改造製備生物基化學品」 生物工程學報, 29(8): 1161−1172, 2013/08/25 *
劉維喜等人 「微生物木糖代謝途徑改造製備生物基化學品」 生物工程學報, 29(8): 1161−1172, 2013/08/25

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