CN111699245A - 用于生物合成参与三羧酸循环的化合物和衍生物及与其相关的化合物的方法和材料 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了用于产生参与TCA循环的化合物和/或其衍生物和/或与其相关的化合物的方法和材料。本发明还提供了根据这些方法和材料产生的产品。
Description
本专利申请要求2018年7月6日提交的美国临时申请序列号62/694,602和2018年2月1日提交的美国临时申请序列号62/624,874的优先权的权益，这两个临时申请中的每个的内容全文以引用方式并入本文。
技术领域
本发明涉及用于产生参与三羧酸循环(TCA循环)的化合物和/或其衍生物和/或与其相关的化合物的生物合成方法和材料。本发明还涉及由这些方法和材料生物合成或以其他方式涵盖的产品。
正在考虑用环境友好(例如，绿色化学品)和/或“清洁技术”解决方案来替代依赖于例如化石燃料和/或潜在毒性化学品的传统化学生产工艺，包括识别适用于制造此类化学物质的构件的工作。参见“Conservative evolution and industrial metabolism inGreen Chemistry”，Green Chem.,2018,20,2171-2191。
TCA(三羧酸)循环，也称为Krebs循环或柠檬酸循环，是需氧菌中心代谢的关键代谢途径，并且是各种生物体的主要生物化学中心。TCA循环包括九个由八种酶进行的生物化学反应，以从乙酰-CoA产生能量(参见图1)。TCA循环也有助于用于合成代谢的代谢前体的合成。据报道，微生物TCA循环的代谢工程适合于生产工业相关化学物质，诸如琥珀酸(Lee等人Appl Environ Microbiol.2005 71(12):7880-7)、富马酸(Xu等人BioresourTechnol.2013 148:91-6)、赖氨酸(Becker等人Appl Environ Microbiol.2009 75(24):7866-9)和1,4-丁二醇(Yim等人Nat Chem Biol.2011.7(7):445-52)。
衣康酸也是来源于TCA循环的化学物质。该化合物在工业上用于制造合成聚合物，诸如塑料、树脂和胶乳。衣康酸生产是基于在衣康酸曲霉(A.itaconicus)(KinoshitaActaPhytochim.1932 5:271-287)中进行的实验发现的，但目前该分子是使用土曲霉(Aspergillus terreus，A.terreus)在工业上生产的。在土曲霉中，鉴定了编码顺式乌头酸脱羧酶的基因cad1(Kanamsa等人Appl Microbiol Biotechnol.2008 80(2):223-9)。该酶将来自TCA循环的顺乌头酸转化为衣康酸(参见图1)。该基因的异源表达也使得能够在微生物中产生衣康酸，所述微生物包括酿酒酵母(S.cerevisiae)(Bazeck等人Appl MicrobiolBiotechnol.2014.98(19):8155-64)、解脂耶氏酵母(Y.lipolytica)(Bazeck等人MetabEng.2015.32:66-73)、谷氨酸棒杆菌(C.glutamicum)(Otten等人Metab Eng.2015.30:156-65)或大肠杆菌(E.coli)(Okamoto等人J Gen Appl Microbiol.2014.60(5):191-7，Vuoristo等人Appl Microbiol Biotechnol.2015.99(l):221-8，Harder等人MetabEng.2016.38:29-37)。
据报道，cad1在大肠杆菌中的表达导致可检测但低量的衣康酸(Li等人FungalGenet Biol.2011.48(6):602-11)。
另外的研究已报道衣康酸产生可通过代谢工程进一步改进。例如，研究已经显示，滴度可通过中断衣康酸前体顺式乌头酸下游的TCA循环的代谢通量而增加，这或通过缺失编码异柠檬酸脱氢酶的icd1(Okamoto等人J Gen Appl Microbiol.2014 60(5):191-7)或通过下调led活性并缺失编码琥珀酰-CoA合酶的sucCD和编码参与乙醛酸循环的异柠檬酸裂解酶的aceA两者(Harder等人Metab Eng.2016 38:29-37)(图1)。除了这些遗传修饰之外，据报道，来自大肠杆菌{acnB}或谷氨酸棒杆菌{acnA}的编码乌头酸水合酶的acn基因的过表达也导致产量的提高(Okamoto等人J Gen Appl Microbiol.2014 60(5):191-7；Vuoristo等人Appl Microbiol Biotechnol.2015.99(1):221-8)(图1)。谷氨酸棒杆菌柠檬酸合酶GltA的引入也增加衣康酸滴度(Vuoristo等人Appl Microbiol Biotechnol.201599(l):221-8；Harder等人Metab Eng.2016 38:29-37)(图1)。
还报道了通过TCA循环人为增加碳通量作为获得更大衣康酸产量的方法。丙酮酸激酶活性的失活(通过缺失pyk)已经允许增加草酰乙酸的回补通量(图1)(Harder等人Metab Eng.2016 38:29-37)。还已报道，当来自大肠杆菌中心代谢的碳通量被重新导向乙酰-CoA(衣康酸的前体)生产时，衣康酸水平更高。这通过缺失编码磷酸乙酰转移酶的pta或编码乳酸脱氢酶的ldhA来实现(图1)(Vuoristo等人Appl Microbiol Biotechnol.2015.99(1):221-8；Harder等人Metab Eng.2016 38:29-37)。
然而，已经报道了在大肠杆菌中产生衣康酸方面的挑战。例如，根据一些报道，在37℃生长期间没有检测到衣康酸的产生，这是由于CadA(从土曲霉基因cad1表达的蛋白质被称为CadA)的不溶性聚集体的形成导致其功能丧失(Yamamoto等人Bioengineered.20156(5):303-6)。据报道，通过在20℃或28℃下生产衣康酸(大肠杆菌细胞生长较差)，或者使用两步法，其中首先在37℃下产生生物质，然后在28℃下生产衣康酸，至少部分地避免了这一问题(Harder等人Biotechnol Bioeng.2018.115(1):156-164.)。
另外，当异源表达时，cad1似乎是一个瓶颈。据报道，仅含有cad1的大肠杆菌菌株产生相对低的量(80ppm衣康酸过夜)(Li等人Fungal Genet Biol.2011 48(6):602-11)。而且，从含有诱导型启动子诸如PLAC或PBAD的载体表达cad1不能产生足够水平的cad1，这表明需要强启动子(Yamamoto等人Bioengineered.2015 6(5):303-6)。继续尝试解决这些限制问题，并且包括过表达cad1的多个拷贝(Kim等人Sci Rep.2017 7:39768)并从更强和/或组成型载体表达cad1(Yamamoto等人Bioengineered.2015.6(5):303-6；Harder等人MetabEng.2016 38:29-37)。
据报道，通过缺失icd中断异柠檬酸脱氢酶活性导致大肠杆菌中的生长缺陷或对谷氨酸的营养缺陷型(Okamoto等人J Gen Appl Microbiol 2014.60(5):191-7、Yamamoto等人Bioengineered.2015 6(5):303-6)。
二十世纪六十年代，通过哺乳动物线粒体以及一些细菌诸如沙门氏菌属(Salmonella spp.)和假单胞菌属(Pseudomonas spp.)对衣康酸的降解有所描述(Brightman等人Journal of Bacteriology 1961 82(3):376-382；Martin等人Journal ofBacteriology 1961 82(6):905-908；以及Cooper RA&Kornberg HL BiochemicalJournal.1964 91(1):82-91)。此外，当在鼠疫耶尔森氏菌(Y.pestis)和铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)中鉴定了编码该过程中的三种酶的基因时，证实了完整的衣康酸盐降解途径(Sasikaran等人Nature Chemical Biology 2014 10:371-377)。这些基因也在土曲霉中被鉴定，土曲霉是用于衣康酸工业生产的物种(Chen等人Appl Microbiol Biotechnol2016 100:7541)。
需要生物合成材料和方法，包括参与TCA循环的化合物、其衍生物和与其相关的化合物的产量增加的生物体。
发明内容
本发明的一个方面涉及生物合成参与TCA循环的化合物和/或其衍生物和/或与其相关的化合物的方法。本发明的一种方法包括获得能够产生参与TCA循环的化合物和衍生物及与其相关的化合物的生物体，改变该生物体，并且在该改变的生物体中产生与未改变的生物体相比更多的参与TCA循环的化合物和衍生物及与其相关的化合物。在一个非限制性实施方案中，该生物体是钩虫贪铜菌(C.necator)或具有一种或多种与其相似特性的生物体。在一个非限制性实施方案中，生物体被改变以表达顺式乌头酸脱羧酶、柠檬酸合酶和/或乌头酸水合酶，或具有顺式乌头酸脱羧酶、柠檬酸合酶和/或乌头酸水合酶活性的多肽或低聚肽。
在一个非限制性实施方案中，生物体被改变以表达顺式乌头酸脱羧酶。在一个非限制性实施方案中，顺式乌头酸脱羧酶包含土曲霉CadA(SEQ ID NO:l)或表现出与SEQ IDNO:1中所示的氨基酸序列或其功能片段具有至少约50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或99.5％序列同一性的具有相似酶活性的多肽。在一个非限制性实施方案中，顺式乌头酸脱羧酶由包含土曲霉cad1(SEQ IDNO:2)的核酸序列或表现出与SEQ ID NO:2中所示的核酸序列或其功能片段具有至少约50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或99.5％序列同一性的编码具有相似酶活性的多肽的核酸序列编码。在一个非限制性实施方案中，顺式乌头酸脱羧酶是归类在EC 4.1.1.6中的cad1。
在一个非限制性实施方案中，生物体被改变以表达柠檬酸合酶。在一个非限制性实施方案中，柠檬酸合酶包含谷氨酸棒杆菌或钩虫贪铜菌gltA(SEQ ID NO:3或5)或表现出与SEQ ID NO:3或5中所示的氨基酸序列或其功能片段具有至少约50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或99.5％序列同一性的具有相似酶活性的多肽。在一个非限制性实施方案中，柠檬酸合酶由包含谷氨酸棒杆菌或钩虫贪铜菌gltA(SEQ ID NO:4、6或7)的核酸序列或表现出与SEQ ID NO:4、6或7中所示的核酸序列或其功能片段具有至少约50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或99.5％序列同一性的编码具有相似酶活性的多肽的核酸序列编码。在一个非限制性实施方案中，柠檬酸合酶是归类在EC 2.3.3.16中的gltA。
在一个非限制性实施方案中，生物体被改变以表达乌头酸水合酶。在一个非限制性实施方案中，乌头酸水合酶包含钩虫贪铜菌AcnA或AcnB(SEQ ID NO:8或10)或表现出与SEQ ID NO:8或10中所示的氨基酸序列或其功能片段具有至少约50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或99.5％序列同一性的具有相似酶活性的多肽。在一个非限制性实施方案中，乌头酸水合酶由包含钩虫贪铜菌acnA或acnB(SEQ ID NO:9或11)的核酸序列或表现出与SEQ ID NO:9或11中所示的核酸序列或其功能片段具有至少约50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或99.5％序列同一性的编码具有相似酶活性的多肽或的核酸序列编码。在一个非限制性实施方案中，乌头酸水合酶是归类在EC 4.2.1.3中的AcnA或AcnB。
在一个非限制性实施方案中，核酸序列针对钩虫贪铜菌进行密码子优化。
在一个非限制性实施方案中，生物体被改变以表达如本文所公开的顺式乌头酸脱羧酶、柠檬酸合酶和/或乌头酸水合酶的酶中的两种或更多种。
在一个非限制性实施方案中，生物体被改变以表达如本文所公开的顺式乌头酸脱羧酶、柠檬酸合酶和乌头酸水合酶。
在一个非限制性实施方案中，生物体被进一步改变以使顺式乌头酸盐下游的代谢流失活。在一个非限制性实施方案中，异柠檬酸脱氢酶活性是失活的。在一个非限制性实施方案中，消除了基因icd1和/或icd2。
在一个非限制性实施方案中，生物体被调节以减少衣康酸的降解。在一个非限制性实施方案中，归类在EC:2.8.3.-中的Ict、归类在EC:4.2.1.-中的Ich、归类在EC:4.1.3.-中的Ccl和/或归类在EC:6.2.1.-中的Suc下调、缺失或突变。在一个非限制性实施方案中，表5中鉴定的基因下调、缺失或突变。
在一个非限制性实施方案中，生物体被进一步修饰以消除参与PHB生产的phaCAB和/或编码核酸内切酶的H16-A0006-9，从而提高转化效率。
本发明的另一方面涉及经改变以产生与未改变的生物体相比更多的参与TCA循环的化合物和/或衍生物及与其相关的化合物的生物体。在一个非限制性实施方案中，该生物体是钩虫贪铜菌或具有与其相似特性的生物体。在一个非限制性实施方案中，生物体被改变以表达编码如本文所公开的顺式乌头酸脱羧酶、柠檬酸合酶和/或乌头酸水合酶的基因。
在一个非限制性实施方案中，用针对钩虫贪铜菌密码子优化的核酸序列改变生物体。
在一个非限制性实施方案中，生物体被进一步改变以使顺式乌头酸盐下游的代谢流失活。在一个非限制性实施方案中，异柠檬酸脱氢酶活性是失活的。在一个非限制性实施方案中，消除了基因icd1和/或icd2。
在一个非限制性实施方案中，生物体被调节以减少衣康酸的降解。在一个非限制性实施方案中，归类在EC:2.8.3.-中的Ict、归类在EC:4.2.1.-中的Ich、归类在EC:4.1.3.-中的Ccl和/或归类在EC:6.2.1.-中的Suc下调、缺失或突变。在一个非限制性实施方案中，表5中鉴定的基因下调、缺失或突变。
在一个非限制性实施方案中，生物体被进一步修饰以消除参与PHB生产的phaCAB和/或编码核酸内切酶的HI 6-A0006-9，从而提高转化效率。
在一个非限制性实施方案中，生物体被改变以表达、过表达、不表达或表达较少的图1所示的一种或多种分子。在一个非限制性实施方案中，分子包含表现出与对应于图1中所示分子的氨基酸序列或其功能片段具有至少约50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或99.5％序列同一性的具有相似酶活性的多肽。
本发明的另一方面涉及由本文所公开的任何方法和/或改变的生物体产生的生物衍生的、基于生物的或发酵衍生的产品。此类产品包括包含至少一种生物衍生的、基于生物的或发酵衍生的化合物或它们的任何组合的组合物，以及包含这些生物衍生的、基于生物的或发酵衍生的组合物或化合物的生物衍生的、基于生物的或发酵衍生的塑料、树脂和橡胶状树脂、胶乳、洗涤剂、纸材、增稠剂、洗发剂、工业清洁剂和地毯背衬；通过模塑生物衍生的、基于生物的或发酵衍生的组合物或化合物或塑料、树脂和橡胶状树脂、胶乳、洗涤剂、纸材、增稠剂、洗发剂、工业清洁剂和地毯背衬获得的模塑物质；生物衍生的、基于生物的或发酵衍生的制剂，其包含生物衍生的、基于生物的或发酵衍生的组合物或化合物、聚合物、塑料、树脂和橡胶状树脂、胶乳、洗涤剂、纸材、增稠剂、洗发剂、工业清洁剂和地毯背衬，或生物衍生的、基于生物的或发酵衍生的模塑物质，或它们的任何组合；以及生物衍生的、基于生物的或发酵衍生的半固体或非半固体流，其包含生物衍生的、基于生物的或发酵衍生的组合物或化合物、塑料、树脂和橡胶状树脂、胶乳、洗涤剂、纸材、增稠剂、洗发剂、工业清洁剂和地毯背衬、模塑物质或制剂，或它们的任何组合。
本发明的另一方面涉及根据图1所示的示例性中心代谢生物合成的生物衍生的、基于生物的或发酵衍生的产品。
本发明的另一方面涉及本文所公开的改变的生物体的外源遗传分子。在一个非限制性实施方案中，外源遗传分子包含编码顺式乌头酸脱羧酶、柠檬酸合酶和/或乌头酸水合酶或它们的片段的密码子优化的核酸序列。在一个非限制性实施方案中，核酸序列针对钩虫贪铜菌进行密码子优化。在一个非限制性实施方案中，外源遗传分子包含编码顺式乌头酸脱羧酶的核酸序列。在一个非限制性实施方案中，核酸序列包含SEQ ID NO:2或表现出与SEQ ID NO:2中所示的核酸序列或其功能片段具有至少约50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或99.5％序列同一性的编码具有相似酶活性的多肽的核酸序列。在一个非限制性实施方案中，外源遗传分子包含编码柠檬酸合酶的核酸序列。在一个非限制性实施方案中，核酸序列包含SEQ ID NO:4、6或7或表现出与SEQ ID NO:4、6或7中所示的核酸序列或其功能片段具有至少约50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或99.5％序列同一性的编码具有相似酶活性的多肽的核酸序列。在一个非限制性实施方案中，外源遗传分子包含编码乌头酸水合酶的核酸序列。在一个非限制性实施方案中，外源遗传分子包含SEQ ID NO:9或11或表现出与SEQ ID NO:9或11中所示的核酸序列或其功能片段具有至少约50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或99.5％序列同一性的编码具有相似酶活性的多肽的核酸序列。外源遗传分子的另外的非限制性示例包括例如顺式乌头酸脱羧酶、柠檬酸合酶和/或乌头酸水合酶的表达构建体以及例如顺式乌头酸脱羧酶、柠檬酸合酶和/或乌头酸水合酶的合成操纵子。
本发明的另一方面涉及用于生物合成参与TCA循环的化合物、其衍生物和/或与其相关的化合物的手段和使用这些手段的方法。
附图说明
图1是衣康酸生物合成途径和开发用于大肠杆菌中更高产量的代谢工程策略的示例性示意图。与叉号相邻的基因指示基因缺失。虚线箭头表示基因的下调。带下划线的名称表示基因的异源表达(谷氨酸棒杆菌表达gltA和acnA，土曲霉表达cad1)。粗体的箭头和名称指示钩虫贪铜菌基因的过表达。
图2示出了在钩虫贪铜菌突变体ΔphaCABΔA0006-9Δicd1Δicd2背景(双突变体)中测定2中的各种构建体的衣康酸产量。结果以ppm/OD600表示。误差条代表平行测定的标准偏差。1.1：At cad1；2.1：At cad1、Cn acnA、Cn acnB；3.1：At cad1、Cg gltA；4.1：Atcad1、Cn gltA；5.4：At cad1、Cg gltA、Cn acnA、Cn acnB；6.1：At cad1、Cn gltA、Cn acnA、Cn acnB(At＝土曲霉；Cn＝钩虫贪铜菌并且Cg＝谷氨酸棒杆菌)。
图3示出了在钩虫贪铜菌突变体ΔphaCABΔA0006-9Δicd1Δicd2背景(双突变体)中在有谷氨酸的情况下(测定2)或无谷氨酸的情况下(测定3)生长后各种构建体的衣康酸产量。结果以ppm/OD600表示。误差条代表平行测定之间的标准偏差。1.1：At cad1；2.1：Atcad1、Cn acnA、Cn acnB；3.1：At cad1、Cg gltA；4.1：At cad1、Cn gltA；5.4：At cad1、CggltA、Cn acnA、Cn acnB；6.1：At cad1、Cn gltA、Cn acnA、Cn acnB。
图4示出了在钩虫贪铜菌突变体ΔphaCABΔA0006-9Δicd1Δicd2背景(双突变体)中在OD600 0.35-0.5(测定2)或OD600 0.7-0.9(测定4)诱导后各种构建体的衣康酸产量。
图5示出了在菌株双突变体-1.1(DM-1.1；黑色条)、双突变体-3.1(DM-3.1；无填充条)和双突变体-4.1(DM 4.1；深灰色填充条)的补料分批培养过程中在4个时间点(tl至t4)的衣康酸滴定度。时间点为tl：诱导后17h，无进料；t2：进料后24小时；t3：进料后36h，中期进料，以及t4：运行结束(接种后66h)。在双突变体-I′A-pBAD(DM-lA-pBAD)中未检测到衣康酸滴定度。
图6示出了衣康酸降解的示例性途径。
图7示出了在0、24、48和72小时收集的样品的OD600测量值。在有或没有衣康酸(1g/L)以及存在(+)或不存在果糖(-)的情况下测量培养物的生长。
图8示出了在不同时间点在培养物中检测到的衣康酸水平。在不存在(灰色条)或存在(黑色条)1％果糖的情况下，在存在1g/L(1000ppm)衣康酸的情况下温育培养物0、24、48和72小时后，通过HPLC测量剩余滴度。在不存在果糖的情况下在24小时时获得的值由于不同平行测定获得的值之间非常大的差异而从该分析中去除。
具体实施方式
本发明提供了用于生物合成参与TCA循环的化合物和/或其衍生物和/或与其相关的化合物的方法，被改变以增加参与TCA循环的化合物、其衍生物和与其相关的化合物的生物合成的生物体，这些改变的生物体的外源遗传分子，以及通过任何这些方法和/或改变的生物体生物合成或以其他方式产生的生物衍生的、基于生物的或发酵衍生的产品。
在本发明的一个方面，通过改变生物体以表达顺式乌头酸脱羧酶、柠檬酸合酶和/或乌头酸水合酶，或具有顺式乌头酸脱羧酶、柠檬酸合酶和/或乌头酸水合酶活性的多肽或低聚肽，将生物体工程化或重定向以产生参与TCA循环的化合物以和衍生物及与其相关的化合物。根据本发明产生的生物体可用于生物合成较高水平的参与TCA循环的化合物、其衍生物和与其相关的化合物的方法中。
出于本发明的目的，所谓“参与TCA循环的化合物和衍生物及与其相关的化合物”意在涵盖衣康酸和其他C4酸以及它们的衍生物，诸如但不限于2-丙烯酸、琥珀酸和富马酸。出于本发明的目的，所谓“衍生物及与其相关的化合物”意在涵盖衍生自与参与衣康酸代谢的化合物相同的底物和/或酶促反应的化合物、这些酶促反应的副产物和具有相似化学结构的化合物，包括但不限于其中参与衣康酸代谢的化合物的一个或多个取代基被另选的取代基取代的结构类似物。
出于本发明的目的，所谓“较高水平的参与TCA循环的化合物”是指与未改变的相同生物体相比，本发明的改变的生物和方法能够产生增加水平的参与TCA循环的化合物和衍生物及与其相关的化合物。在一个非限制性实施方案中，水平增加2倍或更高。
对于含有羧酸基团的化合物诸如有机一元酸、羟基酸、氨基酸和二羧酸，当母体化合物中存在的酸性质子被金属离子例如碱金属离子、碱土金属离子或铝离子替代时，这些化合物可形成或转变成它们的离子盐形式；或与有机碱配位。可接受的有机碱包括乙醇胺、二乙醇胺、三乙醇胺、氨基丁三醇、N-甲基葡糖胺等。可接受的无机碱包括氢氧化铝、氢氧化钙、氢氧化钾、碳酸钠和/或碳酸氢钠、氢氧化钠、氨等。盐可按原样作为盐从体系中分离出来，或通过加入酸或用酸性离子交换树脂处理将pH降低到例如低于最低的pKa而转变成游离酸。
对于含有胺基团的化合物诸如但不限于有机胺、氨基酸和二胺，这些化合物可通过将酸性质子加成到胺以形成铵盐而形成或转变成它们的离子盐形式，所述铵盐与无机酸诸如盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、磷酸等形成；或与有机酸诸如碳酸、乙酸、丙酸、己酸、环戊烷丙酸、乙醇酸、丙酮酸、乳酸、丙二酸、琥珀酸、苹果酸、马来酸、富马酸、酒石酸、柠檬酸、苯甲酸、3-(4-羟基苯甲酰基)苯甲酸、肉桂酸、扁桃酸、甲磺酸、乙磺酸、1,2-乙二磺酸、2-羟基乙磺酸、苯磺酸、2-萘磺酸、4-甲基双环-[2.2.2]辛-2-烯-1-羧酸、葡庚糖酸、4,4'-亚甲基双-(3-羟基-2-烯-l-羧酸)、3-苯基丙酸、三甲基乙酸、叔丁基乙酸、月桂基硫酸、葡糖酸、谷氨酸、羟基萘甲酸、水杨酸、硬脂酸或粘康酸等形成。盐可按原样作为盐从体系中分离出来，或通过加入碱或用碱性离子交换树脂处理将pH升高到例如高于最高pKa而转变成游离胺。可接受的无机碱是本领域已知的，并且包括氢氧化铝、氢氧化钙、氢氧化钾、碳酸钠或碳酸氢钠、氢氧化钠等。
对于含有胺基团和羧酸基团两者的化合物诸如但不限于氨基酸，这些化合物可通过以下方法形成或转变成它们的离子盐形式：1)酸加成盐，与无机酸诸如盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、磷酸等形成；或与有机酸诸如碳酸、乙酸、丙酸、己酸、环戊烷丙酸、乙醇酸、丙酮酸、乳酸、丙二酸、琥珀酸、苹果酸、马来酸、富马酸、酒石酸、柠檬酸、苯甲酸、3-(4-羟基苯甲酰基)苯甲酸、肉桂酸、扁桃酸、甲磺酸、乙磺酸、1,2-乙二磺酸、2-羟基乙磺酸、苯磺酸、2-萘磺酸、4-甲基双环-[2.2.2]辛-2-烯-l-羧酸、葡庚糖酸、4,4'-亚甲基双-(3-羟基-2-烯-l-羧酸)、3-苯基丙酸、三甲基乙酸、叔丁基乙酸、月桂基硫酸、葡糖酸、谷氨酸、羟基萘甲酸、水杨酸、硬脂酸、粘康酸等形成。可接受的无机碱包括氢氧化铝、氢氧化钙、氢氧化钾、碳酸钠和/或碳酸氢钠、氢氧化钠等，或2)当母体化合物中存在的酸性质子被金属离子例如碱金属离子、碱土离子或铝离子提代时；或与有机碱配位。可接受的有机碱是本领域已知的，并且包括乙醇胺、二乙醇胺、三乙醇胺、三甲胺、N-甲基葡糖胺等。可接受的无机碱是本领域已知的，并且包括氢氧化铝、氢氧化钙、氢氧化钾、碳酸钠、氢氧化钠、氨等。盐可按原样从体系中分离出来，或通过加入酸或用酸性离子交换树脂处理将pH降低到例如低于pKa而转变成游离酸。在本发明的一个或多个方面，应当理解，氨基酸盐可分离为：i.在低pH下，作为铵(盐)-游离酸形式；ii.在高pH下，作为胺-羧酸盐形式；和/或iii.在中性或中等pH下，作为游离胺酸形式或两性离子形式。
在本发明的生物合成参与TCA循环的化合物和衍生物及与其相关的化合物的方法中，获得了能够生产参与TCA循环的化合物和衍生物及与其相关的化合物的生物体。然后改变该生物体以在该改变的生物体中产生与未改变的生物体相比更多的参与TCA循环的化合物和衍生物及与其相关的化合物。
在一个非限制性实施方案中，该生物体是钩虫贪铜菌(C.necator)或具有与其相似特性的生物体。该生物体的一个非限制性实施方案设置在万维网的lgcstandards-atcc上，其扩展名为.org/products/all/17699.aspx？geo_country＝gb#generalinformation。
钩虫贪铜菌(以前称为真养嗜酸氢菌(Hydrogenomonas eutrophus)、真养产碱杆菌、富养罗尔斯通氏菌和真养沃特氏菌(Alcaligenes eutropha,Ralstonia eutropha,andWautersia eutropha)是β变形菌类的革兰氏阴性带鞭毛的土壤细菌。这种氢氧化细菌能够在厌氧和有氧环境的界面处生长，并且易于在异养和自养生活方式之间适应。细菌的能量来源包括有机化合物和氢两者。钩虫贪铜菌的附加特性包括微需氧性、铜抗性(Makar,N.S.&Casida,L.E.Int.J.of Systematic Bacteriology 1987 37(4):323-326)、细菌捕食(Byrd等人Can J Microbiol 1985 31:1157-1163；Sillman,C.E.&Casida,L.E.Can JMicrobiol 1986 32:760-762；Zeph,L.E.&Casida,L.E.Applied and EnvironmentalMicrobiology 1986 52(4):819-823)和聚羟基丁酸酯(PHB)合成。此外，据报道，该细胞能够进行有氧和硝酸盐依赖性厌氧生长。可用于本发明的钩虫贪铜菌的非限制性示例是H16菌株的钩虫贪铜菌。在一个非限制性实施方案中，使用H16菌株的钩虫贪铜菌宿主，其中phaCAB基因座的至少一部分被敲除(ΔphaCAB)。
在另一个非限制性实施方案中，在本发明的方法中改变的生物体具有以上提及的钩虫贪铜菌特性中的一种或多种。
在另一个非限制性实施方案中，生物体选自罗尔斯通氏菌属、沃特氏菌属、贪铜菌属、产碱菌属、伯克霍尔德氏菌属或潘多拉菌属(Ralstonia,Wautersia,Cupriavidus,Alcaligenes,Burkholderia or Pandoraea)的成员。
对于本发明的方法，生物体被改变以表达顺式乌头酸脱羧酶、柠檬酸合酶和/或乌头酸水合酶。
在一个非限制性实施方案中，生物体被改变以表达顺式乌头酸脱羧酶。在一个非限制性实施方案中，顺式乌头酸脱羧酶包含土曲霉CadA(SEQ ID NO:l)或表现出与SEQ IDNO:1中所示的氨基酸序列或其功能片段具有至少约50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或99.5％序列同一性的具有相似酶活性的多肽。在一个非限制性实施方案中，顺式乌头酸脱羧酶由包含土曲霉cad1(SEQ IDNO:2)的核酸序列或表现出与SEQ ID NO:2中所示的核酸序列或其功能片段具有至少约50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或99.5％序列同一性的编码具有相似酶活性的多肽的核酸序列编码。在一个非限制性实施方案中，顺式乌头酸脱羧酶是归类在EC 4.1.1.6中的CadA。
在一个非限制性实施方案中，生物体被改变以表达柠檬酸合酶。在一个非限制性实施方案中，柠檬酸合酶包含谷氨酸棒杆菌或钩虫贪铜菌gltA(SEQ ID NO:3或5)或表现出与SEQ ID NO:3或5中所示的氨基酸序列或其功能片段具有至少约50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或99.5％序列同一性的具有相似酶活性的多肽。在一个非限制性实施方案中，柠檬酸合酶由包含谷氨酸棒杆菌或钩虫贪铜菌gltA(SEQ ID NO:4、6或7)的核酸序列或表现出与SEQ ID NO:4、6或7中所示的核酸序列或其功能片段具有至少约50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或99.5％序列同一性的编码具有相似酶活性的多肽的核酸序列编码。在一个非限制性实施方案中，柠檬酸合酶是归类在EC2.3.3.16中的GltA。
在一个非限制性实施方案中，生物体被改变以表达乌头酸水合酶。在一个非限制性实施方案中，乌头酸水合酶包含钩虫贪铜菌AcnA或AcnB(SEQ ID NO:8或10)或表现出与SEQ ID NO:8或10中所示的氨基酸序列或其功能片段具有至少约50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或99.5％序列同一性的具有相似酶活性的多肽，在一个非限制性实施方案中，乌头酸水合酶由包含钩虫贪铜菌acnA或acnB(SEQ ID NO:9或11)的核酸序列或表现出与SEQ ID NO:9或11中所示的核酸序列或其功能片段具有至少约50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或99.5％序列同一性的编码具有相似酶活性的多肽的核酸序列编码。在一个非限制性实施方案中，乌头酸水合酶是归类在EC 4.2.1.3中的AcnA或AcnB。
在一个非限制性实施方案中，核酸序列针对钩虫贪铜菌进行密码子优化。
在一个非限制性实施方案中，生物体被改变以表达如本文所公开的顺式乌头酸脱羧酶、柠檬酸合酶和/或乌头酸水合酶的酶中的两种或更多种。
在一个非限制性实施方案中，生物体被改变以表达如本文所公开的顺式乌头酸脱羧酶、柠檬酸合酶和乌头酸水合酶。
在一个非限制性实施方案中，生物体被进一步改变以使顺式乌头酸盐下游的代谢流失活。在一个非限制性实施方案中，异柠檬酸脱氢酶活性是失活的。在一个非限制性实施方案中，消除了基因icd1和/或icd2。在一些实施方案中，缺失基因pta、pyk和/或ldhA。
衣康酸盐首先通过琥珀酰-CoA：衣康酰-CoA转移酶(let，EC:2.8.3.-2.8.3.22)使用琥珀酰-CoA作为供体转化成衣康酰-CoA。然后通过衣康酰-CoA水合酶(Ich，EC:4.2.1.564.2.1.-)将衣康酰-CoA水合成(S)-柠苹酰-CoA。最后，(S)-柠苹酰-CoA被(S)-柠苹酰-CoA裂解酶(Ccl，EC：4.1.3.25)裂解成乙酰-CoA和丙酮酸盐(参见图7)。因此，在一个非限制性实施方案中，生物体被调节以减少衣康酸的降解。在一个非限制性实施方案中，归类在EC:2.8.3.-中的Ict、归类在EC:4.2.1.-中的Ich、归类在EC:4.1.3.-中的Ccl和/或归类在EC:6.2.1.-中的Suc下调、缺失或突变。在一个非限制性实施方案中，let被归类为EC:2.8.3.22。在一个非限制性实施方案中，Ich被归类为EC:4.2.1.56。在一个非限制性实施方案中，Ccl被归类为EC:4.1.3.25。在一个非限制性实施方案中，Suc被归类为EC:6.2.1.5。在一个非限制性实施方案中，表5中鉴定的基因下调、缺失或突变。
在一个非限制性实施方案中，生物体被进一步修饰以消除参与PHB生产的phaCAB和/或编码内切核酸酶的H16-A0006-9，从而提高转化效率，如美国专利申请序列号15/717,216中所述，该专利申请的教导内容以引用方式并入本文。
在本发明的方法中，改变的生物体随后经受其中产生参与TCA循环的化合物和衍生物及与其相关的化合物的条件。
在一个非限制性实施方案中，在发酵期间添加谷氨酸。
在本文所述的方法中，可使用需要厌氧、微氧或有氧培养的发酵策略。发酵策略可能需要营养物质限制，诸如氮、磷酸盐或氧限制。
在营养物质限制的条件下，在许多细菌中发生称为溢流代谢(也称为能量溢出、解耦或溢出)的现象(Russell,J.B.Journal of Molecular Microbiology andBiotechnology 2007 13till)。在其中碳源和限制细胞生长的其他营养物质(例如磷、氮和/或氧)相对过量的生长条件下，溢流代谢导致使用该过量能量(或碳)不是用于生物质形成，而是用于代谢物(通常为有机酸)的排泄。在钩虫贪铜菌中，发生了溢流代谢的改性形式，其中过量的碳在细胞内沉入储藏碳水化合物聚羟基丁酸酯(PHB)中。在缺乏PHB合成的钩虫贪铜菌菌株中，这种溢流代谢可导致细胞外溢流代谢物的产生。在PHB缺陷型钩虫贪铜菌菌株中检测到的代谢物范围包括乙酸盐、丙酮、丁酸盐、顺式乌头酸盐、柠檬酸盐、乙醇、延胡索酸盐、3-羟基丁酸盐、丙-2-醇、苹果酸盐、甲醇、2-甲基-丙酸盐、2-甲基-丁酸盐、3-甲基-丁酸盐、2-氧代戊二酸盐、内消旋-2,3-丁二醇、乙偶姻、DL-2,3-丁二醇、2-甲基丙-l-醇、丙-l-醇、乳酸盐、2-氧代-3-甲基丁酸盐、2-氧代-3-甲基戊酸盐、丙酸盐、琥珀酸盐、甲酸和丙酮酸盐。在特定发酵中产生的溢流代谢物的范围可取决于所应用的限制(例如氮、磷酸盐、氧)、限制的程度和所提供的碳源(Schlegel,H.G.&Vollbrecht,D.Journal ofGeneral Microbiology 1980 117:475-481；Steinbüchel,A.&Schlegel,H.G.ApplMicrobiol Biotechnol 1989 31:168；Vollbrecht等人Eur J Appl MicrobiolBiotechnol 1978 6:145-155；Vollbrecht等人European J.Appl.Microbiol.Biotechnol.1979 7:267；Vollbrecht,D.&Schlegel,H.G.European J.Appl.Microbiol.Biotechnol.1978 6:157；Vollbrecht,D.&Schlegel,H.G.European J.Appl.Microbiol.Biotechnol.1979 7:259)。
因此，在限定的发酵条件下应用合适的营养物质限制可导致通过特定代谢节点的通量增加。将该知识应用于经基因修饰以通过相同代谢节点产生期望化学产物的钩虫贪铜菌菌株可导致期望产物的产量增加。
可采用使用陶瓷中空纤维膜的细胞保留策略以在发酵期间实现和维持高细胞密度。进料至发酵的主要碳源可来源于生物或非生物原料。生物原料可为或可来源于单糖、二糖、木质纤维素、半纤维素、纤维素、纸浆废物、黑液、木质素、乙酰丙酸和甲酸、甘油三酯、甘油、脂肪酸、农业废液、稀釜馏物、浓缩的蒸馏器可溶物或城市废物(诸如果皮/纸浆)。非生物原料可为或可来源于天然气、合成气、CO2/H2、CO、H2、O2、甲醇、乙醇、非挥发性残余物(NVR)、来自环己烷氧化过程的苛性碱洗液洗涤废物流或来自化学工业(诸如但不限于炭黑工业或氢精炼工业或石油化学工业)的废物流，非限制性示例为PTA-废物流。
在一个非限制性实施方案中，生产方法的酶促转化中的至少一种包括在改变的钩虫贪铜菌宿主或罗尔斯通氏菌属、沃特氏菌属、贪铜菌属、产碱菌属、伯克霍尔德氏菌属或潘多拉菌属的成员以及具有上述钩虫贪铜菌特性中的一种或多种的其他生物体中的气体发酵。该实施方案中，气体发酵可包括天然气、合成气、CO2/H2、CO、H2、O2、甲醇、乙醇、非挥发性残余物、来自环己烷氧化过程的苛性碱洗液、或来自化学工业(诸如但不限于炭黑工业或氢精炼工业或石油化学工业)的废物流中的至少一种。在一个非限制性实施方案中，气体发酵包含CO2/H2。
本发明的方法还可包括回收产生的参与TCA循环的化合物或衍生物或与其相关的化合物。一旦产生，任何方法都可用于分离参与TCA循环的一种或多种化合物衍生物或与其相关的化合物。
本发明还提供了与未改变的生物体相比能够生物合成增加量的参与TCA循环的化合物和衍生物及与其相关的化合物的改变的生物体。在一个非限制性实施方案中，本发明的改变的生物体是能够产生参与TCA循环的化合物和衍生物及与其相关的化合物的经遗传工程改造的钩虫贪铜菌菌株。在另一个非限制性实施方案中，待改变的生物体选自罗尔斯通氏菌属、沃特氏菌属、贪铜菌属、产碱菌属、伯克霍尔德氏菌属或潘多拉菌属的成员以及具有上述钩虫贪铜菌特性中的一种或多种的其他生物体。在一个非限制性实施方案中，本发明涉及能够经由顺式乌头酸脱羧酶、柠檬酸合酶和/或乌头酸水合酶途径产生参与TCA循环的化合物和衍生物及与其相关的化合物的改变的生物体的基本上纯的培养物。
如本文所用，改变的生物体的“基本上纯的培养物”是该微生物的这种培养物，其中培养物中活细胞总数的小于约40％(即，小于约35％、30％、25％、20％、15％、10％、5％、2％、1％、0.5％、0.25％、0.1％、0.01％、0.001％、0.0001％、或甚至更少)是除改变的微生物之外的活细胞，例如细菌、真菌(包括酵母)、支原体或原生动物细胞。术语“约”在此上下文中意指相关百分比可为高于或低于指定百分比的15％。因此，例如，约20％可为17％至23％。这种改变的微生物的培养物包括细胞和生长、储存或运输培养基。培养基可为液体、半固体(例如，凝胶状培养基)或冷冻的。培养物包括在液体中或在半固体培养基中/上生长或者在储存或运输培养基(包括冷冻储存或运输培养基)中储存或运输的细胞。培养物在培养容器或储存容器或底物(例如培养皿、烧瓶或管或储存小瓶或管)中。
在一个非限制性实施方案中，本发明的改变的生物体包含至少一个编码酶的基因组整合的合成操纵子。
在一个非限制性实施方案中，改变的生物体通过整合编码顺式乌头酸脱羧酶、柠檬酸合酶和/或乌头酸水合酶的合成操纵子来产生。
在一个非限制性实施方案中，顺式乌头酸脱羧酶来自土曲霉。在一个非限制性实施方案中，顺式乌头酸脱羧酶包含土曲霉CadA(SEQ ID NO:l)或表现出与SEQ ID NO:1中所示的氨基酸序列或其功能片段具有至少约50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或99.5％序列同一性的具有相似酶活性的多肽。在一个非限制性实施方案中，顺式乌头酸脱羧酶由包含土曲霉cad1(SEQ ID NO:2)的核酸序列或表现出与SEQ ID NO:2中所示的核酸序列或其功能片段具有至少约50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或99.5％序列同一性的编码具有相似酶活性的多肽的核酸序列编码。在一个非限制性实施方案中，顺式乌头酸脱羧酶是归类在EC 4.1.1.6中的CadA。
在一个非限制性实施方案中，柠檬酸合酶来自谷氨酸棒杆菌或钩虫贪铜菌。在一个非限制性实施方案中，柠檬酸合酶包含谷氨酸棒杆菌或钩虫贪铜菌gltA(SEQ ID NO:3或5)或表现出与SEQ ID NO:3或5中所示的氨基酸序列或其功能片段具有至少约50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或99.5％序列同一性的具有相似酶活性的多肽。在一个非限制性实施方案中，柠檬酸合酶由包含谷氨酸棒杆菌或钩虫贪铜菌gltA(SEQ ID NO:4、6或7)的核酸序列或表现出与SEQ ID NO:4、6或7中所示的核酸序列或其功能片段具有至少约50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或99.5％序列同一性的编码具有相似酶活性的多肽的核酸序列编码。在一个非限制性实施方案中，柠檬酸合酶是归类在EC2.3.3.16中的GltA。
在一个非限制性实施方案中，乌头酸水合酶来自钩虫贪铜菌。在一个非限制性实施方案中，乌头酸水合酶包含钩虫贪铜菌AcnA或AcnB(SEQ ID NO:8或10)或表现出与SEQID NO:8或10中所示的氨基酸序列或其功能片段具有至少约50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或99.5％序列同一性的具有相似酶活性的多肽。在一个非限制性实施方案中，乌头酸水合酶由包含钩虫贪铜菌acnA或acnB(SEQ ID NO:9或11)的核酸序列或表现出与SEQ ID NO:9或11中所示的核酸序列或其功能片段具有至少约50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或99.5％序列同一性的编码具有相似酶活性的多肽或的核酸序列编码。在一个非限制性实施方案中，乌头酸水合酶是归类在EC 4.2.1.3中的AcnA或AcnB。
在一个非限制性实施方案中，核酸序列针对钩虫贪铜菌进行密码子优化。
在一个非限制性实施方案中，生物体被改变以表达如本文所公开的顺式乌头酸脱羧酶、柠檬酸合酶和/或乌头酸水合酶的酶中的两种或更多种。
在一个非限制性实施方案中，生物体被改变以表达如本文所公开的顺式乌头酸脱羧酶、柠檬酸合酶和乌头酸水合酶。
在一个非限制性实施方案中，生物体被进一步改变以使顺式乌头酸盐下游的代谢流失活。在一个非限制性实施方案中，异柠檬酸脱氢酶活性是失活的。在一个非限制性实施方案中，消除了基因icd1和/或icd2。在一些实施方案中，缺失基因pta、pyk和/或ldhA。
在一个非限制性实施方案中，生物体被调节以减少衣康酸的降解。在一个非限制性实施方案中，归类在EC:2.8.3.-中的Ict、归类在EC:4.2.1.-中的Ich、归类在EC:4.1.3.-中的Ccl和/或归类在EC:6.2.1.-中的Suc下调、缺失或突变。在一个非限制性实施方案中，let被归类为EC:2.8.3.22。在一个非限制性实施方案中，Ich被归类为EC:4.2.1.56。
在一个非限制性实施方案中，Ccl被归类为EC:4.1.3.25。在一个非限制性实施方案中，Suc被归类为EC:6.2.1.5。在一个非限制性实施方案中，表5中鉴定的基因下调、缺失或突变。
在一个非限制性实施方案中，生物体被进一步修饰以消除参与PHB生产的phaCAB和/或编码核酸内切酶的H16-A0006-9，从而提高转化效率。
如本文所公开的两个氨基酸序列之间的百分比同一性(和/或同源性)可如下测定。首先，使用来自包含BLASTP 2.0.14版的独立BLAST版本的BLAST 2Sequences(B12seq)程序对氨基酸序列进行比对。该独立版本的BLAST可从美国政府的国家生物技术信息中心网站(www，扩展名为ncbi.nlm.nih.gov)获得。解释如何使用Bl2seq程序的说明可见于BLASTZ随附的REME文件中。B12seq使用BLASTP算法进行两个氨基酸序列之间的比较。为了比较两个氨基酸序列，Bl2seq的选项如下设置：-i被设定为包含待比较的第一氨基酸序列的文件(例如，C:\seql.txt)；-j被设定为包含待比较的第二氨基酸序列的文件(例如，C:\seq2.txt)；-p被设定为blastp；-o被设定为任何期望的文件名(例如，C:\output.txt)；并且所有其他选项留在其默认设置下。例如，可使用以下命令来生成包含两个氨基酸序列之间的比较的输出文件：C:\Bl2seq-i c:\seql.txt-j c:\seq2.txt-p blastp-o c:\output.txt。如果两个比较序列具有同源性(同一性)，则指定的输出文件将那些同源性区域作为比对序列呈现。如果两个比较序列不具有同源性(同一性)，则指定的输出文件将不呈现比对的序列。对于核酸序列可遵循相似的程序，不同的是使用blastn。
一旦进行了比对，通过对两个序列中存在相同氨基酸残基的位置的数目进行计数来确定匹配的数目。同一性百分比(同源性)通过将匹配的数目除以全长多肽氨基酸序列的长度然后将所得值乘以100来确定。需注意，百分比同一性(同源性)值四舍五入至最接近的十分之一。例如，90.11、90.12、90.13和90.14被向下舍入到90.1，而90.15、90.16、90.17、90.18和90.19被向上舍入到90.2。还需注意，长度值将始终为整数。
应当理解，许多核酸可编码具有特定氨基酸序列的多肽。遗传代码的简并性是本领域众所周知的；即对于许多氨基酸，存在多于一个充当氨基酸密码子的核苷酸三联体。例如，可修饰给定酶的编码序列中的密码子，使得使用特定物种(例如细菌或真菌)的适当密码子偏好表获得在该物种中的最佳表达。
本文所述的任何多肽或核酸序列的功能片段也可用于本文所公开的方法和生物体。如本文所用，术语“功能片段”是指多肽的肽片段或编码多肽的肽片段的核酸序列片段，其具有对应成熟的全长多肽的至少约25％(例如，至少约30％、40％、50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％、100％、或甚至大于100％)的活性。功能片段通常可以但不总是由多肽的连续区域组成，其中该区域具有功能活性。
功能片段的长度可在初始序列的约10％至最多99％(包括其间的所有百分比)的范围内。
本文档还提供(i)在本文档的方法中使用的酶的功能变体和(ii)上述功能片段的功能变体。酶和功能片段的功能变体可包含相对于对应野生型序列的添加、缺失或取代。具有取代的酶通常具有不超过50个(例如不超过一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个、12个、15个、20个、25个、30个、35个、40个或50个)氨基酸取代(例如保守取代)。这适用于本文所述的任何酶和功能片段。保守取代是用一个氨基酸取代具有相似特性的另一个氨基酸。保守取代包括以下组内的取代：缬氨酸、丙氨酸和甘氨酸；亮氨酸、缬氨酸和异亮氨酸；天冬氨酸和谷氨酸；天冬酰胺和谷氨酰胺；丝氨酸、半胱氨酸和苏氨酸；赖氨酸和精氨酸；以及苯丙氨酸和酪氨酸。非极性疏水性氨基酸包括丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和甲硫氨酸。极性中性氨基酸包括甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺。带正电的(碱性)氨基酸包括精氨酸、赖氨酸和组氨酸。带负电的(酸性)氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸。上述极性、碱性或酸性组的一个成员被相同组的另一个成员的任何取代可被认为是保守取代。相比之下，非保守取代是用一个氨基酸取代具有相异特征的另一个氨基酸。
缺失变体可缺少(两个或更多个氨基酸的)一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个或20个氨基酸片段或非连续的单个氨基酸。添加物(添加变体)包括含有以下的融合蛋白：(a)本文所述的任何酶或其片段；和(b)内部或末端(C或N)无关或异源氨基酸序列。在此类融合蛋白的上下文中，术语“异源氨基酸序列”是指除(a)之外的氨基酸序列。异源序列可以是例如用于纯化重组蛋白的序列(例如FLAG、聚组氨酸(例如六组氨酸、血凝素(HA)、谷胱甘肽-S-转移酶(GST)或麦芽糖结合蛋白(MBP))。异源序列也可以是用作可检测标记的蛋白质，例如荧光素酶、绿色荧光蛋白(GFP)或氯霉素乙酰转移酶(CAT)。在一些实施方案中，融合蛋白包含来自另一蛋白的信号序列。在某些宿主细胞(例如酵母宿主细胞)中，可通过使用异源信号序列来增加靶蛋白的表达和/或分泌。在一些实施方案中，融合蛋白可含载体(例如KLH)(有可用于例如引发用于抗体生成的免疫应答)或ER或高尔基体保留信号。异源序列可具有不同的长度，并且在一些情况下可以是比异源序列所附接的全长靶蛋白更长的序列。
也可破坏经改变以用于本发明的生物体的内源基因以防止形成不期望的代谢物或防止通过作用于中间体的其他酶而损失途径中的此类中间体。在一个非限制性实施方案中，生物体被进一步改变以使顺式乌头酸盐下游的代谢流失活。在一个非限制性实施方案中，异柠檬酸脱氢酶活性是失活的。在一个非限制性实施方案中，消除了基因icd1和/或icd2。在一些实施方案中，缺失基因pta、pyk和/或IdhA。在一个非限制性实施方案中，生物体被进一步修饰以消除参与PHB生产的phaCAB和/或编码核酸内切酶的H16-A0006-9，从而提高转化效率。
因此，如本文所述，改变的生物体可包括编码如本文所述的顺式乌头酸脱羧酶、柠檬酸合酶和/或乌头酸水合酶的外源核酸，以及对内源基因的修饰。
如本文所用，关于核酸(或蛋白质)和生物体的术语“外源”是指如在自然界中发现的该特定类型的细胞中不存在(并且不能从其获得)的核酸或由此类核酸编码的蛋白质。因此，非天然存在的核酸一旦进入宿主或生物体或者被宿主或生物体利用，就被认为对宿主或生物体是外源的。重要的是应注意，非天然存在的核酸可含有在自然界中发现的核酸亚序列或核酸序列的片段，前提条件是该核酸整体不存在于自然界中。例如，在表达载体内含有基因组DNA序列的核酸分子是非天然存在的核酸，因此一旦引入宿主中就对宿主细胞是外源的，因为该核酸分子整体(基因组DNA加载体DNA)不存在于自然界中。因此，作为整体不存在于自然界中的任何载体、自主复制质粒或病毒(例如，逆转录病毒、腺病毒或疱疹病毒)被认为是非天然存在的核酸。由此可见，通过PCR或限制性内切核酸酶处理产生的基因组DNA片段以及cDNA被认为是非天然存在的核酸，因为它们作为自然界中不存在的单独分子存在。还有，任何含有以在自然界中未发现的排列的启动子序列和多肽编码序列(例如cDNA或基因组DNA)的核酸是非天然存在的核酸。天然存在的核酸对于特定的宿主微生物可以是外源的。例如，一旦将从酵母x细胞分离的整个染色体引入酵母y细胞中，该染色体就是相对于酵母y细胞的外源核酸。
相比之下，如本文所用，关于核酸(例如，基因)(或蛋白质)和宿主的术语“内源的”是指如在自然界中发现的该特定宿主中确实存在(并且能够从其获得)的核酸(或蛋白质)。此外，“内源性表达”核酸(或蛋白质)的细胞表达该核酸(或蛋白质)，如同在自然界中发现的相同特定类型的宿主一样。此外，“内源性产生”(“endogenously producing”或“endogenously produces”)核酸、蛋白质或其他化合物的宿主产生该核酸、蛋白质或化合物，如同在自然界中发现的相同特定类型的宿主一样。
本发明还提供了本文所公开的非天然存在的生物体的外源遗传分子，诸如但不限于密码子优化的核酸序列、表达构建体和/或合成操纵子。
在一个非限制性实施方案中，外源遗传分子包含编码顺式乌头酸脱羧酶、柠檬酸合酶和/或乌头酸水合酶的密码子优化的核酸序列。在一个非限制性实施方案中，核酸序列针对钩虫贪铜菌进行密码子优化。
在一个非限制性实施方案中，外源遗传分子包含编码顺式乌头酸脱羧酶的核酸序列。在一个非限制性实施方案中，核酸序列包含SEQ ID NO:2或表现出与SEQ ID NO:2中所示的核酸序列或其功能片段具有至少约50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或99.5％序列同一性的编码具有相似酶活性的多肽的核酸序列。
在一个非限制性实施方案中，外源遗传分子包含编码柠檬酸合酶的核酸序列。在一个非限制性实施方案中，核酸序列包含SEQ ID NO:4、6或7或表现出与SEQ ID NO:4、6或7中所示的核酸序列或其功能片段具有至少约50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或99.5％序列同一性的编码具有相似酶活性的多肽的核酸序列。
在一个非限制性实施方案中，外源遗传分子包含编码乌头酸水合酶的核酸序列。在一个非限制性实施方案中，外源遗传分子包含SEQ ID NO:9或11或表现出与SEQ ID NO:9或11中所示的核酸序列或其功能片段具有至少约50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或99.5％序列同一性的编码具有相似酶活性的多肽的核酸序列。
外源遗传分子的另外的非限制性示例包括例如顺式乌头酸脱羧酶、柠檬酸合酶和/或乌头酸水合酶的表达构建体以及例如顺式乌头酸脱羧酶、柠檬酸合酶和/或乌头酸水合酶的合成操纵子。
本发明还提供了参与TCA循环的化合物和衍生物及与其相关的化合物，所述衍生物及与其相关的化合物根据本文所述的任何方法生物衍生自改变的生物体。
此外，本发明涉及用于生物合成参与TCA循环的化合物、其衍生物和/或与其相关的化合物的手段和使用这些手段的方法。此类手段的非限制性示例包括如本文所述的改变的生物体和外源遗传分子以及如图1所示的任何分子。
此外，本发明提供了使用本文所公开的方法和/或改变的生物体产生的生物衍生的、基于生物的或发酵衍生的产品。在一个非限制性实施方案中，生物衍生的、基于生物的或发酵衍生的产品根据图1所示的示例性中心代谢产生。此类产品的示例包括但不限于包含至少一种生物衍生的、基于生物的或发酵衍生的化合物或它们的任何组合的组合物，以及包含生物衍生的、基于生物的或发酵衍生的化合物或组合物、它们的组合或产品中的一者或多者的塑料、树脂和橡胶状树脂、胶乳、洗涤剂、纸材、增稠剂、洗发剂、工业清洁剂和地毯背衬、模塑物质、制剂和半固体或非半固体流。
构建了六种不同的基因组合并将其转移到两种钩虫贪铜菌背景中，即野生型菌株，其中TCA循环是完整的，以及双突变体ΔphaCABΔA0006-9ΔicdlΔicd2，其中衣康酸前体的TCA循环下游的代谢通量已经被中断。在管中或在发酵条件下生长后评估由这些菌株产生的衣康酸水平。
评估了过表达乌头酸水合酶的构建体中通过柠檬酸盐向衣康酸的代谢流的改善。当以果糖作为碳源培养钩虫贪铜菌时，已检测到acnA和acnB被表达(表1)。因此，选择这两种基因来测试它们的过表达对衣康酸生产的影响。
除了cad1之外，还评估了钩虫贪铜菌和谷氨酸棒杆菌gltA的过表达对衣康酸生产的影响。
此外，如研究已证实，在TCA循环中使顺式乌头酸盐下游的代谢流失活导致衣康酸滴定度提高(Okamoto等人J Gen Appl Microbiol.2014.60(5):191-7、Harder等人MetabEng.2016.38:29-37)，生成具有编码异柠檬酸脱氢酶的基因的敲除菌株并评估其衣康酸生产。具体地，生成双突变体Δicd1Δicd2(全基因型ΔphaCABΔA0006-9Δicd1Δicd2)。
表1提供了TCA循环相关酶活性的表达水平。具有最高表达的基因以粗体示出。表达单位对应于相对表达单位，相对表达单位是归一化为具有平均3次生物平行测定的每个样本的标测读数的总数量的表达。DF和DDF是指分别以果糖作为唯一碳源生长的菌株ΔphaCAB和ΔphaCABΔpimACD。
表1
表2示出了用于本发明的遗传构建体的装配中的基因。所有构建体使用标准程序克隆装配，诸如例如Green和Sambrook，Molecular Cloning,A Laboratory Manual，2014年11月18日中所述。
表2
At：土曲霉，Cg：谷氨酸棒杆菌，Cn：钩虫贪铜菌
| 基因 | 来源 | GenBank或Uniprot编号 | 密码子优化的 |
| cad1 | 土曲霉 | B3IUN8 | 钩虫贪铜菌 |
| gltA | 钩虫贪铜菌 | WP_010814621.1 | 钩虫贪铜菌 |
| gltA | 谷氨酸棒杆菌 | NP_600058.1 | 钩虫贪铜菌 |
| acnB | 钩虫贪铜菌 | WP_010810392.1 | 钩虫贪铜菌 |
| ancA | 钩虫贪铜菌 | WP_011615748.1 | 钩虫贪铜菌 |
用于本发明方法的基因的各种组合的列表包括在表3中。
表3
At：土曲霉，Cg：谷氨酸棒杆菌，Cn：钩虫贪铜菌
注：RBS是核糖体结合位点；-rrnBTl是终止子序列。
表3中的基因型描述了用于转化钩虫贪铜菌wt的构建体，其中TCA循环是功能性的，并且在双突变体Δicd1Δicd2中使用标准程序通过电穿孔进行转化。
本发明的细菌菌株的列表提供于表4中。数字1.1、1.2、1.3、1.4、5.4和6.1是指表3中的质粒。
表4
| 本研究中提及的菌株 | 宿主 | 基因型 |
| wt | 钩虫贪铜菌H16 | ΔphaCABΔH16_A0006-9 |
| 双突变体 | 钩虫贪铜菌H16 | ΔphaCABΔH16_A0006-9Δicd1Δicd2 |
| wt-1.1 | 钩虫贪铜菌H16 | ΔphaCABΔH16_A0006-9 1.1 |
| wt-2.1 | 钩虫贪铜菌H16 | ΔphaCABΔH16_A0006-9 2.1 |
| wt-3.1 | 钩虫贪铜菌H16 | ΔphaCABΔH16_A0006-9 3.1 |
| wt-4.1 | 钩虫贪铜菌H16 | ΔphaCABΔH16_A0006-9 4.1 |
| wt-5.4 | 钩虫贪铜菌H16 | ΔphaCABΔH16_A0006-9 5.4 |
| wt-6.1 | 钩虫贪铜菌H16 | ΔphaCABΔH16_A0006-9 6.1 |
| wt-1ApBAD | 钩虫贪铜菌H16 | ΔphaCABΔH16_A0006-9 1A-BAD |
| 双突变体-1.1 | 钩虫贪铜菌H16 | ΔphaCABΔH16_A0006-9Δicd1Δicd2 1.1 |
| 双突变体-2.1 | 钩虫贪铜菌H16 | ΔphaCABΔH16_A0006-9Δicd1Δicd2 2.1 |
| 双突变体-3.1 | 钩虫贪铜菌H16 | ΔphaCABΔH16_A0006-9Δicd1Δicd2 3.1 |
| 双突变体-4.1 | 钩虫贪铜菌H16 | ΔphaCABΔH16_A0006-9Δicd1Δicd2 4.1 |
| 双突变体-5.1 | 钩虫贪铜菌H16 | ΔphaCABΔH16_A0006-9Δicd1Δicd2 5.4 |
| 双突变体-6.1 | 钩虫贪铜菌H16 | ΔphaCABΔH16_A0006-9Δicd1Δicd2 6.1 |
| 双突变体-1ApBAD | 钩虫贪铜菌H16 | ΔphaCABΔH16_A0006-9Δicd1 Δicd2 1A-pBAD |
如实施例中所述进行衣康酸产生测定，并且结果示于图2、图3、图4和图5中。在诱导型pBAD启动子下，检测携带编码乌头酸脱羧酶的土曲霉cad1基因自身或与其他TCA循环基因(包括编码柠檬酸合酶的谷氨酸棒杆菌gltA基因)组合的菌株的衣康酸生产。对于最佳生产菌株获得的峰值滴度，在管测定中诱导后48小时达到30ppm-100ppm，并且在补料分批条件中诱导后60小时达到300ppm-500ppm。此外，评估向其中添加谷氨酸对衣康酸产生诱导的培养基或细胞密度的影响。在补料分批条件下，衣康酸滴度大于100ppm的测量结果指示在钩虫贪铜菌中通过TCA循环的碳通量。
以下部分提供了本发明的方法和材料的进一步说明。这些实施例仅是说明性的，并且不旨在限制本发明的范围。
实施例
生物测定
图7描述了用于测量非挥发性产物的钩虫贪铜菌菌株生物测定的标准代表性工作流程。在衣康酸生产的测定中，通常将每种菌株的3种预培养物在30℃下在10ml补充有卡那霉素(300μg/ml)的TSB中生长24小时，并且合并在一起，然后将细胞离心，并将沉淀的细胞重悬于1.5ml基本培养基中。对于在谷氨酸存在下生长进行的测定(测定2和4)，还将1.5g/1(最终浓度)的谷氨酸添加到预培养物和培养物中。然后将重悬于基本培养基中的合并细胞用于接种三个独立的培养物。
对于测定2和3，在OD600在0.2至0.3之间而不是在0.4至0.5之间时接种培养物。它们也在OD600在0.35至0.5之间而不是在0.7至0.9之间时被诱导。在诱导后24小时和48小时收集二ml的每种培养物。测量OD6oo，并且将样品保持在4℃或-20℃下，然后处理以用于LC-MS分析。
衣康酸生产的测量
将在24小时和48小时收集的样品离心，并且使澄清的上清液经受LC-MS分析以检测衣康酸
通过液相色谱-质谱(LC-MS)测定样品的细胞外衣康酸浓度。离心发酵液样品，并且将所得的上清液在90％LC-MS级乙腈/10％LC-MS级水中稀释10至1000倍，这取决于预期的分析物浓度。
LC-MS使用与Agilent 6530系列Q-TOF质谱仪偶联的Agilent Technologies(Santa Clara,CA,USA)1290系列Infinity HPLC系统进行。按照制造商的说明使用BEHAmide UPLC柱：2.1mm直径×50mm长度×1.7μm粒度(Waters,Milford,MA,USA)。
外标曲线用于定量。在基质匹配溶液(通常为空白培养基)中构建0.01、0.02、0.05、0.1、0.2、0.5、1、2、5和10μg/ml的校准水平，所述基质匹配溶液在乙腈中稀释至与样品相同的水平。使用Agilent MassHunter定量分析软件，通过针对校准曲线的样品响应的内插法测定浓度。不可能通过色谱法分离柠檬酸和异柠檬酸，因此这两种化合物的结果以单一值给出。
在管中进行生物测定后，在以果糖作为碳源的补料分批条件下，在Ambr15f中进一步筛选证实生产的菌株。在生长的分批和进料部分的过程中收集样品，并且通过LC-MS评估衣康酸水平。
原则上，这种筛选方法允许在严格控制下在高细胞密度培养物中定量生产能力，代表了途径在简单、可规模化的过程中实现高滴度的可能性。
种子菌株
首先将10ml培养物与合适的抗生素一起温育。将10ml培养物用作后续发酵补料分批培养的直接种菌。
发酵条件
Sartorius Ambrl5f平台用于以补料分批操作模式筛选途径菌株。该系统允许控制多个变量，诸如溶解氧和pH。通常，将工艺条件标准化并按照制造商的说明运行。
用于分析的样品制备
样品体积通常为500μl，其中100μl用于OD600测定，并且400μl处理用于分析。将样品以2000g离心30分钟，并且将上清液通过0.2μm过滤器过滤。然后通过LC-MS分析澄清的上清液的衣康酸含量。
由钩虫贪铜菌引起的衣康酸降解
测试菌株钩虫贪铜菌H16ΔphaCABΔA0006-9Δicd1Δicd2(双突变体)降解衣康酸和使用衍生自降解的衣康酸的碳作为唯一碳源的能力。用基本培养基中的菌株预培养物接种10ml补充有1g/1衣康酸、有或没有果糖(1％)的基本培养基，初始OD600约为0.4。还包括不含衣康酸的阴性对照。在0、24、48和72小时收集一毫升样品。对于每个样品，在每个时间点测量OD600，并通过HPLC-RID分析衣康酸的滴度。对每种条件一式三份地进行实验。
结果示于图7和图8中。菌株钩虫贪铜菌H16ΔphaCABΔA0006-9Δicd1Δicd2能够在以衣康酸作为唯一碳源的培养基中生长，达到约1的OD600(图7)。此外，在果糖的存在下，菌株培养物达到比仅在果糖的存在下更高的OD600，这表明该菌株能够使用衣康酸作为碳源(图7)。
这些观察通过培养物温育0、24、48和72小时后衣康酸滴度的HPLC分析来确认(图8)。在培养基中存在和不存在果糖的情况下，培养物中存在的衣康酸的量随时间减少，这表明该菌株能够降解衣康酸并且在不存在果糖时可使用该化合物作为唯一碳源。
参与钩虫贪铜菌H16中衣康酸降解的潜在基因的测定
使用tblastn(NCBI tblastn，参见万维网的https：，扩展名为blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi？PROGRAM＝tblastn&PAGE_TYPE＝BlastSearc h&LINK_LOC＝blasthome)，使用在铜绿假单胞菌(分别由PA0882、PA0878和PA0883编码)和在鼠疫耶尔森氏菌(分别由Y2385、Y2384和Y2383编码)中鉴定的蛋白质let、Ich和Ccl的序列在钩虫贪铜菌H16基因组中搜索同源物。与铜绿假单胞菌蛋白质具有至少30％的同一性和相似性以及至少90％覆盖率的潜在同源物列于表1中。基因H16_B0682、H16_B0679、H16_B0680被鉴定为分别编码let、ich和ccl活性的潜在候选者，如先前Sasikaran等人所述。(Nature Chemical Biology 2014 10:371-377)。也鉴定了若干另外的基因作为潜在候选者(参见表5)。
表5：分别编码let、Ich和Ccl的铜绿假单胞菌PA0882、PA078、PA0883的推定钩虫贪
铜菌H16同源物
以粗体*示出的基因对应于先前由Sasikaran等人鉴定的基因。(Nature ChemicalBiology 2014 10:371-377)。
另外，衣康酸可通过由sucC(H16_A0547)和sucD(H16_A0548)编码的遍在琥珀酰-CoA合酶(Suc，EC:6.2.1.5)转化为衣康酰-CoA。
序列表中序列的序列信息
表6
Claims (61)
1.一种用于生物合成参与TCA循环的化合物、其衍生物和/或与其相关的化合物的方法，所述方法包括：
获得能够产生参与所述TCA循环的化合物、其衍生物和/或与其相关的化合物的生物体；
改变所述生物体；以及
通过改变的所述生物体产生与未改变的所述生物体相比更多的参与所述TCA循环的化合物和/或其衍生物和/或与其相关的化合物。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述生物体是钩虫贪铜菌或具有与其相似特性的生物体。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述生物体被改变以表达顺式乌头酸脱羧酶、柠檬酸合酶和/或乌头酸水合酶，或具有顺式乌头酸脱羧酶、柠檬酸合酶和/或乌头酸水合酶活性的多肽或其片段。
4.根据权利要求3所述的方法，其中所述生物体被改变以表达下述的两种或更多种：顺式乌头酸脱羧酶、柠檬酸合酶和/或乌头酸水合酶的酶，或具有顺式乌头酸脱羧酶、柠檬酸合酶和/或乌头酸水合酶活性的多肽或其片段。
5.根据权利要求3所述的方法，其中所述生物体被改变以表达顺式乌头酸脱羧酶、柠檬酸合酶和乌头酸水合酶，或具有顺式乌头酸脱羧酶、柠檬酸合酶和乌头酸水合酶活性的多肽或其片段。
6.根据权利要求3所述的方法，其中所述顺式乌头酸脱羧酶来自土曲霉。
7.根据权利要求3所述的方法，其中所述顺式乌头酸脱羧酶包含SEQ ID NO:1或表现出与SEQ ID NO:1中所示的氨基酸序列或其功能片段具有至少约50％序列同一性的具有相似酶活性的多肽。
8.根据权利要求3所述的方法，其中所述顺式乌头酸脱羧酶由包含SEQ ID NO:2的核酸序列或表现出与SEQ ID NO:2中所示的核酸序列或其功能片段具有至少约50％序列同一性的编码具有相似酶活性的多肽的核酸序列编码。
9.根据权利要求3所述的方法，其中所述柠檬酸合酶来自谷氨酸棒杆菌或钩虫贪铜菌。
10.根据权利要求3所述的方法，其中所述柠檬酸合酶包含SEQ ID NO:3或5或表现出与SEQ ID NO:3或5中所示的氨基酸序列或其功能片段具有至少约50％序列同一性的具有相似酶活性的多肽。
11.根据权利要求3所述的方法，其中所述柠檬酸合酶由包含SEQ ID NO:4、6或7的核酸序列或表现出与SEQ ID NO:4、6或7中所示的核酸序列或其功能片段具有至少约50％序列同一性的编码具有相似酶活性的多肽的核酸序列编码。
12.根据权利要求3所述的方法，其中所述乌头酸水合酶来自钩虫贪铜菌。
13.根据权利要求3所述的方法，其中所述乌头酸水合酶包含SEQ ID NO:8或10或表现出与SEQ ID NO:8或10中所示的氨基酸序列或其功能片段具有至少约50％序列同一性的具有相似酶活性的多肽。
14.根据权利要求3所述的方法，其中所述乌头酸水合酶由包含SEQ ID NO:9或11的核酸序列或表现出与SEQ ID NO:9或11中所示的核酸序列或其功能片段具有至少约50％序列同一性的编码具有相似酶活性的多肽的核酸序列编码。
15.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述生物体被进一步改变以使顺式乌头酸盐下游的代谢流失活。
16.根据权利要求15所述的方法，其中异柠檬酸脱氢酶活性是失活的。
17.根据权利要求15所述的方法，其中消除了基因icd1和/或icd2。
18.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述生物体被调节以减少衣康酸的降解。
19.根据权利要求18所述的方法，其中编码归类在EC:2.8.3.-中的Ict、归类在EC:4.2.1.-中的Ich、归类在EC:4.1.3.-中的Ccl和/或归类在EC:6.2.1.-中的Suc的基因被下调、缺失或突变。
20.根据权利要求18所述的方法，其中表5中鉴定的基因被下调、缺失或突变。
21.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述生物体被进一步改变以消除参与PHB生产的phaCAB和/或编码核酸内切酶的H16-A0006-9，从而提高转化效率。
22.根据权利要求8、11或14所述的方法，其中所述核酸序列针对钩虫贪铜菌进行密码子优化。
23.一种与未改变的生物体相比能够产生更多的参与TCA循环的化合物、其衍生物和/或与其相关的化合物的改变的生物体。
24.根据权利要求23所述的改变的生物体，所述改变的生物体是钩虫贪铜菌或具有与其相似特性的生物体。
25.根据权利要求23所述的改变的生物体，所述改变的生物体表达顺式乌头酸脱羧酶、柠檬酸合酶和/或乌头酸水合酶。
26.根据权利要求23所述的改变的生物体，所述改变的生物体表达顺式乌头酸脱羧酶、柠檬酸合酶和/或乌头酸水合酶的酶中的两种或更多种。
27.根据权利要求23所述的改变的生物体，所述改变的生物体表达顺式乌头酸脱羧酶、柠檬酸合酶和乌头酸水合酶。
28.根据权利要求25所述的改变的生物体，其中所述顺式乌头酸脱羧酶来自土曲霉。
29.根据权利要求25所述的改变的生物体，其中所述顺式乌头酸脱羧酶包含SEQ IDNO:1或表现出与SEQ ID NO:1中所示的氨基酸序列或其功能片段具有至少约50％序列同一性的具有相似酶活性的多肽。
30.根据权利要求25所述的改变的生物体，其中所述顺式乌头酸脱羧酶由包含SEQ IDNO:2的核酸序列或表现出与SEQ ID NO:2中所示的核酸序列或其功能片段具有至少约50％序列同一性的编码具有相似酶活性的多肽的核酸序列编码。
31.根据权利要求25所述的改变的生物体，其中所述柠檬酸合酶来自谷氨酸棒杆菌或钩虫贪铜菌。
32.根据权利要求25所述的改变的生物体，其中所述柠檬酸合酶包含SEQ ID NO:3或5或表现出与SEQ ID NO:3或5中所示的氨基酸序列或其功能片段具有至少约50％序列同一性的具有相似酶活性的多肽。
33.根据权利要求25所述的改变的生物体，其中所述柠檬酸合酶由包含SEQ ID NO:4、6或7的核酸序列或表现出与SEQ ID NO:4、6或7中所示的核酸序列或其功能片段具有至少约50％序列同一性的编码具有相似酶活性的多肽的核酸序列编码。
34.根据权利要求25所述的改变的生物体，其中所述乌头酸水合酶来自钩虫贪铜菌。
35.根据权利要求25所述的改变的生物体，其中所述乌头酸水合酶包含SEQ ID NO:8或10或表现出与SEQ ID NO:8或10中所示的氨基酸序列或其功能片段具有至少约50％序列同一性的具有相似酶活性的多肽。
36.根据权利要求25所述的改变的生物体，其中所述乌头酸水合酶由包含SEQ ID NO:9或11的核酸序列或表现出与SEQ ID NO:9或11中所示的核酸序列或其功能片段具有至少约50％序列同一性的编码具有相似酶活性的多肽的核酸序列编码。
37.根据权利要求23至36中任一项所述的改变的生物体，其中所述生物体被进一步改变以使顺式乌头酸盐下游的代谢流失活。
38.根据权利要求37所述的改变的生物体，其中异柠檬酸脱氢酶活性是失活的。
39.根据权利要求37所述的改变的生物体，其中消除了基因icd1和/或icd2。
40.根据权利要求23至39中任一项所述的改变的生物体，其中所述生物体被调节以减少衣康酸的降解。
41.根据权利要求40所述的改变的生物体，其中归类在EC:2.8.3.-中的Ict、归类在EC:4.2.1.-中的Ich、归类在EC:4.1.3.-中的Ccl和/或归类在EC:6.2.1.-中的Suc被下调、缺失或突变。
42.根据权利要求40所述的改变的生物体，其中表5中鉴定的基因被下调、缺失或突变。
43.根据权利要求20至42中任一项所述的改变的生物体，其中所述生物体被进一步改变以消除参与PHB生产的phaCAB和/或编码核酸内切酶的H16-A0006-9，从而提高转化效率。
44.根据权利要求30、33或36所述的改变的生物体，其中所述核酸序列针对钩虫贪铜菌进行密码子优化。
45.一种由根据权利要求1至22中任一项所述的方法或根据权利要求23至44中任一项所述的改变的生物体产生的生物衍生的、基于生物的或发酵衍生的产品，其中所述产品包含：
(i)组合物，所述组合物包含至少一种生物衍生的、基于生物的或发酵衍生的化合物或它们的任何组合；
(ii)包含(i)的所述生物衍生的、基于生物的或发酵衍生的组合物或化合物、或它们的任何组合的生物衍生的、基于生物的或发酵衍生的塑料、树脂和橡胶状树脂、胶乳、洗涤剂、纸材、增稠剂、洗发剂、工业清洁剂或地毯背衬；
(iii)模塑物质，所述模塑物质通过模塑(i)的所述生物衍生的、基于生物的或发酵衍生的组合物或化合物或(ii)的所述生物衍生的、基于生物的或发酵衍生的塑料、树脂和橡胶状树脂、胶乳、洗涤剂、纸材、增稠剂、洗发剂、工业清洁剂或地毯背衬、或它们的任何组合获得；
(iv)生物衍生的、基于生物的或发酵衍生的制剂，所述制剂包含(i)的所述生物衍生的、基于生物的或发酵衍生的组合物或化合物、(ii)的所述生物衍生的、基于生物的或发酵衍生的塑料、树脂和橡胶类树脂、胶乳、洗涤剂、纸材、增稠剂、洗发剂、工业清洁剂或地毯背衬、或(iii)的所述生物衍生的、基于生物的或发酵衍生的模塑物质、或它们的任何组合；或者
(v)生物衍生的、基于生物的或发酵衍生的半固体或非半固体流，所述半固体或非半固体流包含(i)的所述生物衍生的、基于生物的或发酵衍生的组合物或化合物、(ii)的所述生物衍生的、基于生物的或发酵衍生的塑料、树脂和橡胶状树脂、胶乳、洗涤剂、纸材、增稠剂、洗发剂、工业清洁剂或地毯背衬、(iii)的所述生物衍生的、基于生物的或发酵衍生的制剂、或(iv)的所述生物衍生的、基于生物的或发酵衍生的模塑物质、或它们的任何组合。
46.一种根据图1中所示的中心代谢产生的生物衍生的、基于生物的或发酵衍生的产品。
47.一种根据权利要求23至42中任一项所述的改变的生物体的外源遗传分子。
48.根据权利要求47所述的外源遗传分子，所述外源遗传分子包含密码子优化的核酸序列。
49.根据权利要求48所述的外源遗传分子，所述外源遗传分子针对钩虫贪铜菌进行密码子优化。
50.根据权利要求47所述的外源遗传分子，所述外源遗传分子包含编码顺式乌头酸脱羧酶的核酸序列。
51.根据权利要求47所述的外源遗传分子，所述外源遗传分子包含含有SEQ ID NO:2的核酸序列或表现出与SEQ ID NO:2中所示的核酸序列或其功能片段具有至少约50％序列同一性的编码具有相似酶活性的多肽的核酸序列。
52.根据权利要求47所述的外源遗传分子，所述外源遗传分子包含编码柠檬酸合酶的核酸序列。
53.根据权利要求47所述的外源遗传分子，所述外源遗传分子包含SEQ ID NO:4、6或7或表现出与SEQ ID NO:4、6或7中所示的核酸序列或其功能片段具有至少约50％序列同一性的编码具有相似酶活性的多肽的核酸序列。
54.根据权利要求47所述的外源遗传分子，所述外源遗传分子包含编码乌头酸水合酶的核酸序列。
55.根据权利要求47所述的外源遗传分子，所述外源遗传分子包含SEQ ID NO:9或11或表现出与SEQ ID NO:9或11中所示的核酸序列或其功能片段具有至少约50％序列同一性的编码具有相似酶活性的多肽的核酸序列。
56.根据权利要求47所述的外源遗传分子，所述外源遗传分子包含顺式乌头酸脱羧酶、柠檬酸合酶和/或乌头酸水合酶的表达构建体。
57.根据权利要求47所述的外源遗传分子，所述外源遗传分子包含顺式乌头酸脱羧酶、柠檬酸合酶和/或乌头酸水合酶的合成操纵子。
58.一种用于生物合成参与TCA循环的化合物、其衍生物和/或与其相关的化合物的方法，所述方法包括提供能够生产参与所述TCA循环的化合物、其衍生物和/或与其相关的化合物的手段，以及用所述手段产生参与所述TCA循环的化合物、其衍生物和/或与其相关的化合物。
59.一种用于生物合成参与TCA循环的化合物和其衍生物以及与其相关的化合物的方法，所述方法包括：
用于执行以下功能的步骤：改变能够产生参与TCA循环的化合物、其衍生物和/或与其相关的化合物的生物体，使得所述改变的生物体产生与对应的未改变的生物体相比更多的参与所述TCA循环的化合物、其衍生物和/或化合物；和
用于执行以下功能的步骤：在所述改变的生物体中产生参与所述TCA循环的化合物、其衍生物和/或与其相关的化合物。
60.一种用于生物合成参与TCA循环的化合物和其衍生物以及与其相关的化合物的方法，所述方法包括：
用于执行以下功能的步骤：改变能够产生参与所述TCA循环的化合物、其衍生物和/或与其相关的化合物的生物体，使得所述改变的生物体产生与对应的未改变的生物体相比更多的参与所述TCA循环的化合物、其衍生物和/或化合物。
61.一种用于生物合成参与TCA循环的化合物和其衍生物以及与其相关的化合物的方法，所述方法包括：
用于执行以下功能的步骤：在能够产生参与所述TCA循环的化合物、其衍生物和/或与其相关的化合物的生物体中产生参与所述TCA循环的化合物、其衍生物和/或与其相关的化合物，其中所述生物体已被改变使得其产生与对应的未改变的生物体相比更多的参与所述TCA循环的化合物、其衍生物和/或化合物。
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