CN112004934A - 用于生物合成制造碳基化学品的材料和方法 - Google Patents

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Abstract

本公开涉及用于体内产生某些碳基产物，例如碳链长度为C5‑C19的胺化脂族化合物的策略。具体地讲，使用丙氨酸、GABA(γ氨基丁酸)或6‑ACA作为氨基供体，并使用来自紫色色杆菌(Chromobacterium violaceum)的转氨酶由庚二酸半醛产生7‑氨基庚酸。

Description

用于生物合成制造碳基化学品的材料和方法
优先权声明
本申请要求提交于2018年3月30日的美国临时专利申请62/650,642的权益，该临时专利申请出于所有目的以引用方式并入本文。
技术领域
本公开涉及用于体内产生某些碳基产物，例如碳链长度为C5-C19的胺化脂族化合物的策略。在本发明的一些方面，通过改变由具有ω-转氨酶活性的多肽或其功能片段催化的转氨基反应的反应条件来增强碳链长度为C5-C19的胺化脂族化合物的体内产生。
背景技术
聚酰胺，诸如尼龙，可通过二胺与二羧酸的缩聚反应或者另选地通过内酰胺的缩聚反应来合成。尼龙6，6是普遍存在的由六亚甲基二胺(HMD)和己二酸反应产生的尼龙。尼龙6由己内酰胺的开环聚合反应产生。与尼龙6和尼龙6，6相比，尼龙7代表了具有增值特性的新型聚酰胺。然而，不存在经济上有利的石化途径来产生用于尼龙合成的中间体。
生物技术提供了经由生物催化产生这些中间体例如7-氨基庚酸(7-AHA)的另选方法。生物催化是生物催化剂诸如酶用于进行有机化合物的生物化学转化的用途。用于产生7-AHA的生物化学途径利用大肠杆菌(E.coli)中的生物素生物合成途径(Lin等人，“BiotinSynthesis Beings by Hijacking the Fatty Acid Synthesis Pathway”，Nat.Chem.Biol.，第6卷第9期：第682-688页，2010年)。生物素生物合成中的第一关键步骤是通过BioC对丙二酰ACP进行甲基化。由此产生的丙二酰-ACP甲酯随后用作脂肪酸生物合成途径的起始单元。
然后进行两轮脂肪酸伸长和还原以生成庚二酰-ACP甲酯。然后通过酯酶BioH去除甲基来生成庚二酰-ACP(图1)。
庚二酰-ACP是大肠杆菌中生物素途径的中间体，并且通过利用硫酯酶(TE)的作用从庚二酰-ACP释放庚二酸的合成代谢途径被转化为7-AHA，然后还原成由羧酸还原酶(CAR)催化的半醛，以及通过共转氨酶(ω-TAM)胺化该半醛以产生7-AHA的最终催化步骤。然后，转运蛋白例如LysE促进7-AHA从细胞的输出。参见图2。
ω-TAM是催化底物转化成产物的关键酶，例如使用氨基供体，通过催化庚二酸半醛上的酮基(＝O)与胺基(NH2)的交换，将庚二醛转化成7-AHA。参见图3。然而，它们在生物合成过程中的使用受到许多因素的阻碍，包括但不限于平衡热力学、产物抑制和不良的底物耐受性(Slabu等人，“Discovery，Engineering and Synthetic Application ofTransaminase Biocatalysts”，ACS Catalysis，第7卷，第8263-8284页，2017年)。考虑到这些因素，使用由ω-TAM催化的转氨基反应进行碳基产物的体内生物合成受到限制。
发明内容
本公开至少部分地基于以下发现：有可能构建利用ω-转氨酶产生碳链长度为C5-C19的胺化脂族化合物的生物化学途径。在一些方面，本公开涉及改变由ω-转氨酶催化的转氨基反应，以有利于产物形成。在一些方面，改变由ω-转氨酶催化的反应的反应条件以增加碳链长度为C5-C19的胺化脂族化合物的产量，诸如但不限于7-AHA和6-氨基己酸(6-AHA)生物合成途径内的某些碳基产物。
在一个实施方案中，本发明提供了用于增强体内生物合成的各种方法。在一些实施方案中，该方法包括：获得能够生物合成至少一种产物的至少一种生物体，该至少一种生物体未改变或被改变，其中该生物体利用具有ω-转氨酶活性的多肽来催化转氨基反应，其中该多肽或其功能片段与SEQ ID NO：1具有至少70％的同一性；以及在适于生物合成的条件下培养该生物体，其中该生物体生物合成该至少一种产物，其中该产物为碳链长度为C5-C19的胺化脂族化合物或其盐。
在一些实施方案中，产物为碳链长度为C6-C7的胺化脂族化合物或其盐。在一些实施方案中，产物为7-AHA或6-氨基己酸或其盐。在一些实施方案中，产物为氨基醇，诸如7-氨基庚醇或6-氨基己醇或其盐。在一些实施方案中，产物为二胺，诸如七亚甲基二胺或六亚甲基二胺或它们的盐。在一些实施方案中，总产物收率增加。
在一些实施方案中，反应由具有分类为EC 2.6.1.18、EC 2.6.1.19、EC 2.6.1.29、EC 2.6.1.48或EC 2.6.1.82的ω-转氨酶的活性的多肽或其功能片段催化。
在一些实施方案中，与尚未改变转氨基反应条件的生物体相比，改变转氨基反应条件以增加多肽或其功能片段的ω转氨基活性。
在一些实施方案中，改变转氨基反应的反应条件的步骤包括催化与具有ω-转氨酶活性的多肽或其功能片段的反应，该多肽或其功能片段相对于野生型ω-转氨酶包含一个或多个氨基酸置换，其中该一个或多个氨基酸置换位于占据与SEQ ID NO：1的位置2、13、15、16、20、87、134、288或345对应的位置的氨基酸处。
在一些实施方案中，该一种或多种氨基酸置换位于具有ω-转氨酶活性的多肽的小结合口袋(O形口袋)和/或大结合口袋(P形口袋)中。在一些实施方案中，相对于分类为EC2.6.1.18、EC 2.6.1.19、EC 2.6.1.29、EC 2.6.1.48或EC 2.6.1.82的野生型ω-转氨酶，该多肽具有增加的酶活性和/或改善的底物特异性。在一些实施方案中，野生型ω-转氨酶为紫色色杆菌(Chromobacterium violaceum)ω-转氨酶或紫色色杆菌样ω-转氨酶。在一些实施方案中，相对于野生型ω-转氨酶，多肽具有至少10％的酶活性增加。
在一些实施方案中，相对于野生型ω-转氨酶，多肽对于氨基供体具有降低的Km。在一些实施方案中，氨基供体是L-丙氨酸。在一些实施方案中，氨基供体的Km小于约4mmol-L-1。在一些实施方案中，相对于野生型ω-转氨酶，具有ω-转氨酶活性的多肽对于作为氨基供体的碳链长度为C5-C19的胺化脂族化合物具有增加的Km。在一些实施方案中，胺化脂族化合物具有C6-C7的碳链长度。在一些实施方案中，胺化脂族化合物为7-AHA或6-氨基己酸或其盐。在一些实施方案中，产物为氨基醇，诸如7-氨基庚醇或6-氨基己醇或其盐。在一些实施方案中，产物为二胺，诸如七亚甲基二胺或六亚甲基二胺或它们的盐。
在一些实施方案中，改变转氨基反应的反应条件的步骤包括环化。在一些实施方案中，改变的步骤包括产物的环化。在一些实施方案中，生物体利用具有丙酸梭菌(Clostridium propionicum)β-丙氨酸CoA转移酶活性的多肽来环化产物。在一些实施方案中，具有β-丙氨酸CoA的多肽将7-AHA转化为庚内酰胺，其中由ω-转氨酶与7-AHA的逆反应形成的庚二酸半醛的量减少。
在一些实施方案中，改变转氨基反应的反应条件的步骤包括增加生物体中细胞内氨基供体的水平。在一些实施方案中，将氨基供体外源引入生物体中。在一些实施方案中，生物体利用具有L-氨基酸脱氢酶活性的多肽来增加细胞中氨基供体的细胞内水平。在一些实施方案中，L-氨基酸脱氢酶为L-丙氨酸脱氢酶。
在一些实施方案中，改变转氨基反应的反应条件的步骤包括使用氨基供体，该氨基供体形成挥发性产物并驱动转氨基反应朝向产物形成。在一个实施方案中，氨基供体可为异丙胺。
在一些实施方案中，改变转氨基反应步骤的反应条件包括除去产物或以其他方式降低产物的可用性。在一些实施方案中，生物体利用具有氨基酸转运蛋白活性的多肽来除去产物或以其他方式降低产物的可用性。在一些实施方案中，具有氨基酸转运蛋白活性的多肽具有LysE氨基酸转运蛋白活性。
在一些实施方案中，由具有ω-转氨酶活性的多肽与碳链长度为C5-C19的胺化脂族化合物的逆反应形成的至少一种产物的量减少。在一些实施方案中，由ω-转氨酶与7-AHA的逆反应形成的庚二酸半醛的量减少。
在一些实施方案中，该方法还包括纯化产物。
在一些实施方案中，生物体是原核的。在一些实施方案中，生物体是真核的。在一些实施方案中，生物体是重组生物体。在一些实施方案中，该重组生物体包含至少一种外源核酸，该至少一种外源核酸编码具有图2所示的至少一种酶的活性的至少一种多肽。在一些实施方案中，该至少一种外源核酸编码至少一种具有ω-转氨酶活性、硫酯酶活性或羧酸还原酶活性的多肽。
在一些实施方案中，该重组生物体包含编码L-氨基酸脱氢酶的外源核酸。在一些实施方案中，L-氨基酸脱氢酶为L-丙氨酸脱氢酶。
在一些实施方案中，该重组生物体过表达一种或多种编码下列物质的基因：乙酰-CoA合成酶、β-丙氨酸CoA转移酶、6-磷酸葡糖酸脱氢酶、转酮醇酶、嘌呤核苷酸转氢酶、甘油醛-3P-脱氢酶、苹果酸酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、葡萄糖脱氢酶、果糖1，6二磷酸酶、L-丙氨酸脱氢酶、L-谷氨酸脱氢酶、甲酸脱氢酶、L-谷氨酰胺合成酶、二胺转运蛋白、二羧酸转运蛋白、氨基酸转运蛋白和/或多药转运蛋白。
在一些实施方案中，该重组生物体过表达编码氨基酸转运蛋白的基因。在一些实施方案中，该重组生物体过表达编码LysE转运蛋白的基因。
在一些实施方案中，与野生型生物体相比，该重组生物体产生增加水平的由庚二酸或庚二酸衍生物转化的7-AHA。在一些实施方案中，庚二酸衍生物包括庚二酰-ACP和庚二酸半醛。在一些实施方案中，庚二酸半醛被转氨基以产生7-AHA。在一些实施方案中，该重组生物体包含编码具有丙酸梭菌β-丙氨酸CoA转移酶活性的多肽的核酸，其中该多肽使产物环化。在一些实施方案中，具有β-丙氨酸CoA的多肽将7-AHA转化为庚内酰胺，其中由ω-转氨酶与7-AHA的逆反应形成的庚二酸半醛的量。
在一些实施方案中，改变转氨基反应的反应条件包括增加细胞内氨基供体的量、使产物环化和/或从细胞中除去产物。
在一些实施方案中，改变转氨基反应的反应条件包括增加细胞内氨基供体的量并环化产物。
在一些实施方案中，改变转氨基反应的反应条件包括增加细胞内氨基供体的量并从细胞中除去产物。
在一些实施方案中，改变转氨基反应的反应条件包括增加细胞内氨基供体的量、使产物环化并从细胞中除去产物。
在一些实施方案中，在有氧、厌氧或微需氧培养条件下对生物体进行培养策略。在一些实施方案中，在营养物质受限的条件下培养生物体。在一些实施方案中，补加至发酵的主要碳源来源于生物原料或非生物原料。在一些实施方案中，生物体对高浓度产物的耐受性通过在选择性环境中连续培养而改善。
在另一个实施方案中，本文提供了包含编码具有共转氨酶活性的多肽的外源核酸的重组生物体，其中该多肽或其功能片段与SEQ ID NO：1具有至少70％的同一性，并且其中与野生型生物体相比，该重组生物体产生增加水平的碳链长度为C5-C19的胺化脂族化合物。在一些实施方案中，该重组生物体是原核的。在一些实施方案中，该重组生物体是真核的。
在一些实施方案中，由重组生物体产生的胺化脂族化合物具有C6-C7的碳链长度。在一些实施方案中，由重组生物体产生的胺化脂族化合物为7-AHA或6-氨基己酸或其盐。在一些实施方案中，产物为氨基醇，诸如7-氨基庚醇或6-氨基己醇或其盐。在一些实施方案中，产物为二胺，诸如七亚甲基二胺或六亚甲基二胺或它们的盐。在一些实施方案中，外源核酸编码多肽，该多肽具有ω-转氨酶活性并且包含相对于野生型ω-转氨酶的一个或多个氨基酸置换，其中该一个或多个氨基酸置换位于占据与SEQ ID NO：1的位置2、13、15、16、20、87、134、288或345对应的位置的氨基酸或其功能片段处。
在一些实施方案中，该重组生物体包含至少一种外源核酸，该至少一种外源核酸编码具有图2所示的至少一种酶的活性的至少一种多肽。在一些实施方案中，该重组生物体包含至少一种外源核酸，该至少一种外源核酸编码至少一种具有ω-转氨酶活性、硫酯酶活性或羧酸还原酶活性的多肽。在一些实施方案中，该重组生物体还包含编码L-氨基酸脱氢酶的外源核酸。在一些实施方案中，该L-氨基酸脱氢酶为L-丙氨酸脱氢酶。在一些实施方案中，该重组生物体过表达一种或多种编码以下物质的基因：乙酰CoA合成酶、β-丙氨酸CoA转移酶、6-磷酸葡糖酸脱氢酶、转酮醇酶、嘌呤核苷酸转氢酶、甘油醛-3P-脱氢酶、苹果酸酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、葡萄糖脱氢酶、果糖1，6二磷酸酶、L-丙氨酸脱氢酶、L-谷氨酸脱氢酶、甲酸脱氢酶、L-谷氨酰胺合成酶、二胺转运蛋白、二羧酸转运蛋白、氨基酸转运蛋白和/或多药转运蛋白。在一些实施方案中，该重组生物体过表达编码氨基酸转运蛋白的基因。在某些实施方案中，该重组生物体过表达编码LysE转运蛋白的基因。
在另一个实施方案中，本文提供了提高己内酰胺产量的方法，该方法包括：培养宿主生物体，该宿主生物体包含(i)编码具有ω-转氨酶活性的多肽或其功能片段的核酸，其中该多肽与SEQ ID NO：1具有至少70％的同一性；以及(ii)在存在合适的底物或代谢中间体的情况下以及在适于将己二酸或己二酸衍生物转化为己内酰胺的条件下，编码具有β-丙氨酸CoA转移酶活性的多肽的核酸，以及纯化己内酰胺。
在一些实施方案中，具有ω-转氨酶活性的多肽或其功能片段相对于野生型ω-转氨酶具有一个或多个氨基酸置换，其中该一个或多个氨基酸置换位于占据与SEQ ID NO：1的位置2、13、15、16、20、87、134、288或345对应的位置的氨基酸或其功能片段处。在一些实施方案中，具有β-丙氨酸CoA转移酶活性的多肽将6-AHA转化为己内酰胺，其中由ω-转氨酶与6-AHA的逆反应形成的己二酸半醛的量。
在一些实施方案中，具有ω-转氨酶活性的多肽或其功能片段具有分类为EC2.6.1.18、EC 2.6.1.19、EC 2.6.1.29、EC 2.6.1.48或EC 2.6.1.82的ω-转氨酶活性。
在一些实施方案中，己二酸衍生物包括己二酰-ACP和己二酸半醛。在一些实施方案中，己二酸半醛被转氨基以产生6-AHA。在一些实施方案中，该宿主生物体是重组的。在一些实施方案中，该宿主生物体包含至少一种外源核酸，该至少一种外源核酸编码具有图9所示的至少一种酶的活性的至少一种多肽。
在另一个实施方案中，还提供了通过本文提供的方法中的任一种产生的碳链长度为C5-C19的生物衍生的胺化脂族化合物、庚内酰胺、己内酰胺或其盐。
在另一个实施方案中，还提供了包含由本文所述的生物衍生产物中的任一种产生的化学品的产品，其中该产品包括尼龙中间体、聚酯、药物、生物燃料、香料或食品添加剂。
在另一个实施方案中，还提供了生物衍生的、基于生物的或发酵衍生的产品，其中所述产品包含：i.组合物，所述组合物包含至少一种根据本文提供的方法中的任一种产生或生物合成的生物衍生的、基于生物的或发酵衍生的化合物或其盐；ii.生物衍生的、基于生物的或发酵衍生的聚合物，所述生物衍生的、基于生物的或发酵衍生的聚合物包含i.的所述生物衍生的、基于生物的或发酵衍生的组合物或化合物或它们的任何组合；iii.生物衍生的、基于生物的或发酵衍生的树脂，所述生物衍生的、基于生物的或发酵衍生的树脂包含i.的所述生物衍生的、基于生物的或发酵衍生的化合物或所述生物衍生的、基于生物的或发酵衍生的组合物或它们的任何组合，或者ii.的所述生物衍生的、基于生物的或发酵衍生的聚合物或它们的任何组合；iv.物质，所述物质通过模制ii.的所述生物衍生的、基于生物的或发酵衍生的聚合物或iii.的所述生物衍生的、基于生物的或发酵衍生的树脂或它们的任何组合获得；v.生物衍生的、基于生物的或发酵衍生的制剂，所述生物衍生的、基于生物的或发酵衍生的制剂包含i.的所述生物衍生的、基于生物的或发酵衍生的组合物，i.的所述生物衍生的、基于生物的或发酵衍生的化合物，ii.的所述生物衍生的、基于生物的或发酵衍生的聚合物，iii.的所述生物衍生的、基于生物的或发酵衍生的树脂，或者iv的所述生物衍生的、基于生物的或发酵衍生的物质，或者它们的任何组合；或者生物衍生的、基于生物的或发酵衍生的半固体或非半固体料流，所述生物衍生的、基于生物的或发酵衍生的半固体或非半固体料流包含i.的所述生物衍生的、基于生物的或发酵衍生的组合物，i.的所述生物衍生的、基于生物的或发酵衍生的化合物，ii.的所述生物衍生的、基于生物的或发酵衍生的聚合物，iii.的所述生物衍生的、基于生物的或发酵衍生的树脂，v.的所述生物衍生的、基于生物的或发酵衍生的制剂，或者iv.的所述生物衍生的、基于生物的或发酵衍生的模制物质，或者它们的任何组合。
附图说明
本专利申请包括以下附图。附图旨在示出组合物和方法的某些实施方案和/或特征，并且旨在补充组合物和方法的任何描述。附图不限制组合物和方法的范围，除非书面描述明确指示情况就是如此。
图1是由丙二酰-ACP产生庚二酰-ACP的示例性生物化学途径的示意图。
图2是由丙二酰-CoA产生7-AHA的示例性生物化学途径的示意图。
图3是示例性转氨基反应的示意图。
图4示出在IPTG诱导对应的转氨酶(TA)时生成的无细胞提取物(CFE)的SDS-PAGE分析。
图5示出在将表达9个所选择的TA的CFE与作为氨基供体的甲基苄胺、异丙胺、L-丙氨酸、L-谷氨酸盐、β-丙氨酸和γ-氨基丁酸温育1h之后，通过LC-MS测定的7-AHA水平。将300μL CFE与10mmol·L-1庚二酸半醛、50mmol·L-1氨基供体(相对于氨基受体过量5倍的氨基供体)和0.2mmol·L-1PLP温育1小时。通过用测定缓冲液替换氨基供体体积来包括每个TA的阴性对照样品。空载体对照(E.V.C.)CFE包括在确定天然TA活性的测定中。值以平均值±标准偏差(n＝3)表示。
图6示出从Ni-NTA琼脂糖树脂纯化获得的TA样品的SDS-PAGE分析。评估纯化的TA_11(左上)、TA_15(右上)、TA_17(左下)和TA-Cv(右下)的氨基供体特异性。将级分在200V下在BoltTM4％-12％Bis Tris Plug凝胶(15孔)上运行20分钟并用考马斯速溶蓝染色。
图7示出了将纯化的TA(上图)和诱导的CFE(下图)与L-丙氨酸、SAM和GABA温育1小时后测得的7-AHA和庚二酸水平，如通过LC-MS分析测定的。将300μL CFE或1.5μmol·L-1的纯化TA与5mmol·L-1庚二酸半醛、25mmol·L-1氨基供体(相对于氨基受体过量5倍的氨基供体)和0.1mmol·L-1PLP温育1小时。阴性对照样品(缓冲液和E.V.C.)包括在两种测定中。值以平均值±标准偏差(n＝3)表示。
图8示出了将庚二酸半醛与L-丙氨酸、6-ACA或两者并且在有(上图)或没有(下图)纯化的TA-Cv的情况下温育1小时后测得的L-丙氨酸、6-ACA和7-AHA水平，如通过HPLC分析测定的。将1.5μmol·L-1的纯化TA-Cv与5mmol·L-1庚二酸半醛、10mmol·L-1氨基供体和0.1mmol·L-1PLP温育1小时(上图)。通过用测定缓冲液(无进料)替换氨基供体来包括阴性对照样品。值以平均值±标准偏差(n＝3)表示。
图9是使用己二酸-CoA、己二酸酯或己二酸半醛作为中心前体，得到6-氨基己酸酯或己内酰胺的示例性生物化学途径的示意图。
具体实施方式
本文所引用的所有参考文献以及它们所引用的材料均据此全文以引用方式明确并入。
本公开所属领域的技术人员将想到本文示出的本公开的许多修改和其他实施方案，这些修改和其他实施方案具有前述描述和相关附图中呈现的教导的益处。因此，应当理解，本公开不限于所公开的特定实施方案，并且修改和其他实施方案旨在包括在所附权利要求的范围内。尽管本文采用了特定术语，但它们仅以一般性和描述性意义使用，而不是出于限制的目的。
单位、前缀和符号可用其SI认可的形式表示。除非另外指明，否则核酸以5′至3′取向从左往右书写；氨基酸序列分别以氨基至羧基的取向从左到右书写。数字范围包括限定该范围的数字。
定义
除非另有明确定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本公开所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。除非另有说明，否则本文所采用或设想的技术是本领域普通技术人员熟知的标准方法。除非另外指明，否则本公开的实施将采用微生物学、组织培养、分子生物学、化学、生物化学和重组DNA技术的常规技术，这些技术在本领域的技术范围内。材料、方法和实施例仅为例示性的而非限制性的。以下以举例说明的方式给出，而并非旨在限制本公开的范围。
在一些实施方案中，用于描述和要求保护本公开的某些实施方案的表示试剂的量、特性、反应条件和结果等的数字在某些情况下应理解为由术语“约”修饰。在一些实施方案中，说明书(权利要求书全文并入其中)中列出的数值参数均为近似值，这些近似值可根据试图通过特定实施方案获得的所需特性而变化。在一些实施方案中，应当根据所报告的有效数位的数量并通过应用惯常的四舍五入法来解释数值参数。尽管阐述本公开的一些实施方案的广泛范围的数值范围和参数为近似值，但在具体实施例中所列出的数值被实际精确地报告。本公开的一些实施方案中呈现的数值可能包含某些误差，这些误差不可避免地由存在于其相应测试测量中的标准偏差引起。本文对值的范围的表述仅旨在用作单独地指代落入该范围内的每个单独值的简略方法。除非本文另有说明，否则将每个单独的值并入说明书中，如同其在本文中被单独引用一样。
如在本说明书和所附权利要求中所使用的，单数形式“一个”、“一种”和“该”包括复数形式，除非上下文明确地另外指出。
“氨基酸”是指可掺入肽、多肽或蛋白质中的任何单体单元。如本文所用，术语“氨基酸”包括以下二十种天然或遗传编码的α-氨基酸：丙氨酸(Ala或A)、精氨酸(Arg或R)、天冬酰胺(Asn或N)、天冬氨酸(Asp或D)、半胱氨酸(Cys或C)、谷氨酰胺(Gin或Q)、谷氨酸(Glu或E)、甘氨酸(Gly或G)、组氨酸(His或H)、异亮氨酸(Ile或I)、亮氨酸(Leu或L)、赖氨酸(Lys或K)、甲硫氨酸(Met或M)、苯丙氨酸(Phe或F)、脯氨酸(Pro或P)、丝氨酸(Ser或S)、苏氨酸(Thr或T)、色氨酸(Trp或W)、酪氨酸(Tyr或Y)和缬氨酸(Val或V)。这二十种天然氨基酸的结构在例如Stryer等人，Biochemistry，第5版，Freeman and Company，2002年中显示。术语“氨基酸”还包括非天然氨基酸、经修饰的氨基酸(例如，具有经修饰的侧链和/或主链)和氨基酸类似物。
如本文所用，术语“生物衍生的”意指衍生自生物有机体或由生物有机体合成。生物衍生的化合物可被认为是可再生资源，因为它们可由生物有机体生成。这种生物有机体，特别是本文所公开的微生物有机体，可利用从农业、植物、细菌或动物来源获得的原料或生物质，诸如糖或碳水化合物。另选地，生物有机体可利用大气碳。如本文所用，术语“基于生物的”是指如上所述的产品，该产品完全或部分地由本发明的生物衍生化合物构成。基于生物的或生物衍生的产品与石油衍生的产品形成对比，其中这种产品衍生自或合成自石油或石化原料。
对于含有羧酸基团的化合物诸如有机一元酸、羟基酸、氨基酸和二元羧酸，当母体化合物中存在的酸性质子被金属离子例如碱金属离子、碱土金属离子或铝离子替代时，或与有机碱配位时，这些化合物可形成或转变成它们的离子盐形式。可接受的有机碱包括乙醇胺、二乙醇胺、三乙醇胺、氨基丁三醇、N-甲基葡糖胺等。可接受的无机碱包括氢氧化铝、氢氧化钙、氢氧化钾、碳酸钠、氢氧化钠等。盐可按原样作为盐从体系中分离，或通过加入酸或用酸性离子交换树脂处理，将pH降低至低于pKa，而转变成游离酸。
对于含有胺基团的化合物，诸如但不限于有机胺、氨基酸和二胺，这些化合物可通过将酸性质子加成到胺以形成铵盐而形成或转变成它们的离子盐形式，该铵盐是与无机酸诸如盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、磷酸等形成的；或与有机酸诸如乙酸、丙酸、己酸、环戊烷丙酸、乙醇酸、丙酮酸、乳酸、丙二酸、琥珀酸、苹果酸、马来酸、富马酸、酒石酸、柠檬酸、苯甲酸、3-(4-羟基苯甲酰基)苯甲酸、肉桂酸、扁桃酸、甲磺酸、乙磺酸、1，2-乙二磺酸、2-羟基乙磺酸、苯磺酸、2-萘磺酸、4-甲基双环-[2.2.2]辛-2-烯-1-羧酸、葡庚糖酸、4，4′-亚甲基双-(3-羟基-2-烯-1-羧酸)、3-苯基丙酸、三甲基乙酸、叔丁基乙酸、月桂基硫酸、葡糖酸、谷氨酸、羟基萘甲酸、水杨酸、硬脂酸或粘康酸形成。可接受的无机碱是本领域中已知的，并且包括氢氧化铝、氢氧化钙、氢氧化钾、碳酸钠、氢氧化钠等。盐可按原样作为盐从体系中分离，或通过加入碱或用碱性离子交换树脂处理，将pH升高至高于pKa，而转变成游离胺。
对于含有胺基团和羧酸基团两者的化合物诸如但不限于氨基酸，这些化合物可通过下列方式形成或转化成它们的离子盐形式：1)酸加成盐，该酸加成盐是与无机酸诸如盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、磷酸等形成的；或与有机酸诸如乙酸、丙酸、己酸、环戊烷丙酸、乙醇酸、丙酮酸、乳酸、丙二酸、琥珀酸、苹果酸、马来酸、富马酸、酒石酸、柠檬酸、苯甲酸、3-(4-羟基苯甲酰基)苯甲酸、肉桂酸、扁桃酸、甲磺酸、乙磺酸、1，2-乙二磺酸、2-羟基乙磺酸、苯磺酸、2-萘磺酸、4-甲基双环-[2.2.2]辛-2-烯-1-酸、羧酸、葡庚糖酸、4，4′-亚甲基双-(3-羟基-2-烯-l-羧酸)、3-苯基丙酸、三甲基乙酸、叔丁基乙酸、月桂基硫酸、葡糖酸、谷氨酸、羟基萘甲酸、水杨酸、硬脂酸、粘康酸形成。可接受的无机碱包括氢氧化铝、氢氧化钙、氢氧化钾、碳酸钠、氢氧化钠等，或2)母体化合物中存在的酸性质子由金属离子例如碱金属离子、碱土金属离子或铝离子替代；或与有机碱配位。可接受的有机碱是本领域中已知的，并且包括乙醇胺、二乙醇胺、三乙醇胺、氨基丁三醇、N-甲基葡糖胺等。可接受的无机碱是本领域中已知的，并且包括氢氧化铝、氢氧化钙、氢氧化钾、碳酸钠、氢氧化钠等。盐可按原样从体系中分离，或通过加入酸或用酸性离子交换树脂处理，将pH降低至低于pKa，而转变成游离酸。
术语“包含”、“具有”和“包括”是开放式连接动词。这些动词中的一个或多个的任何形式或时态，诸如“包含(comprises和comprising)”、“具有(has和having)”和“包括(includes和including)”也是开放式的。例如，“包含”、“具有”或“包括”一个或多个步骤的任何方法不限于仅拥有那些一个或多个步骤，并且还可涵盖其他未列出的步骤。类似地，“包含”、“具有”或“包括”一个或多个特征的任何组合物不限于仅拥有那些一个或多个特征，并且可涵盖其他未列出的特征。除非本文另外指明或与上下文明显矛盾，否则本文所述的所有方法都可以任何合适的顺序执行。相对于本文的某些实施方案提供的任何和所有示例或示例性语言(例如，“诸如”)的使用仅旨在更好地阐明本公开，并且不对以其他方式受权利要求保护的本公开的范围构成限制。说明书中的任何语言都不应理解为表示任何未要求保护的要素对于本公开的实施是必不可少的。
如本文所用，“基本上由...组成”意指在本文提供的多核苷酸或多肽序列中包括另外的序列，其中另外的序列不会实质上影响受权利要求书保护的多核苷酸或多肽序列的基本功能。一般来讲，关于组合物，术语“基本上由...组成”是指给定实施方案所需的那些要素，并且另外允许存在不会实质上影响本公开的该实施方案的基本特征和新颖特征或功能特征的要素。
如本文所用，术语“由...组成”是指如本文所述的组合物、方法及其相应的组分，其不包括在实施方案的该描述中未引用的任何要素。
术语“保守修饰的变体”适用于氨基酸和核酸序列两者。就特定核酸序列而言，保守修饰的变体指编码氨基酸序列的相同或保守修饰的变体的那些核酸。由于遗传密码的简并性，大量功能上相同的核酸编码任何给定的蛋白质。例如，密码子GCA、GCC、GCG和GCU全部编码氨基酸丙氨酸。因此，在丙氨酸由密码子指定的每个位置处，可将密码子更改为对应密码子中的任一个而不改变所编码的多肽。此类核酸变异是“沉默变异”，并且代表一种保守修饰的变异。本文中编码多肽的每种核酸序列还描述了该核酸的每种可能的沉默变异。普通技术人员将认识到，核酸中的每个密码子(AUG除外，其通常是甲硫氨酸的唯一密码子；一个例外是红色微球菌(Micrococcus rubens)，对于其GTG是甲硫氨酸密码子(Ishizuka等人，1993年，J.Gen，Microbiol.，第139卷，第425-432页))可被修饰以产生功能上相同的分子。因此，编码本公开多肽的核酸的每种沉默变异均隐含在每种所述多肽序列中并以引用方式并入本文。
关于氨基酸序列，技术人员将认识到对核酸、肽、多肽或蛋白质序列的单独置换、缺失或添加，当这些改变导致氨基酸被化学上类似的氨基酸置换时，这改变、添加或缺失编码序列中的单个氨基酸或一小部分氨基酸，从而该序列为“保守修饰的变体”。因此，可如此改变任何数目的氨基酸残基。保守修饰的变体通常提供与它们所衍生自的未经修饰的多肽序列等同的生物活性。提供功能上相似的氨基酸(本文也称为“等同氨基酸”)的保守置换表是本领域熟知的。
如本文所用，“密码子优化”是以改善其在真核细胞中的表达、G/C含量、RNA二级结构和翻译而不改变其编码的氨基酸序列的方式修饰核苷酸序列的过程。通常采用改变的密码子使用来改变翻译效率和/或优化编码序列以在所需宿主中表达，或优化异源序列中的密码子使用以在特定宿主中表达。可使用可商购获得的软件包(诸如可得自University ofWisconsin Genetics Computer Group的“Codon Preference”)对本公开的多核苷酸的编码区中的密码子使用进行统计分析。参见Devereaux等人，1984年，Nucleic Acids Res.，第12卷，第387-395页或Mac Vector 4.1(康涅狄格州纽黑文的伊士曼柯达公司(EastmanKodak Co.，New Haven，Conn.))。因此，本公开提供了本公开的多核苷酸中的至少一者的编码区的密码子使用频率特征。可用于确定密码子使用频率的多核苷酸的数目(每个氨基酸3个核苷酸)可为从3至本文所提供的本公开多核苷酸的数目的任何整数。任选地，多核苷酸将为全长序列。用于统计分析的序列的示例性数目可为至少1、5、10、20、50或100。
与另一序列(例如，区域、片段、核苷酸或氨基酸位置等)例如SEQ ID NO：1的“对应”是基于根据核苷酸或氨基酸位置编号进行编号的惯例，然后以最大化序列同一性百分比的方式比对序列。由于给定“对应区域”内的并非所有位置都需要相同，因此对应区域内的非匹配位置可被视为“对应位置”。
术语“衍生”涵盖术语“来源于”、“获得”或“可获自”和“分离自”。
“等同氨基酸”可基于其与它们所置换的氨基酸的结构同源性或基于在可能生成的各种变体之间的生物活性的比较测试的结果来确定。作为非限制性示例，下面的列表汇总了通常可能在不导致对应变体的生物活性的显著修饰的情况下进行的可能的置换：
1)丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、缬氨酸(V)、甘氨酸(G)和脯氨酸(P)；
2)天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)；
3)天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)；
4)精氨酸(R)、赖氨酸(K)、组氨酸(H)；
5)异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、缬氨酸(V)；和
6)苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)。
还可参见Creighton，Proteins，W.H.Freeman and Co.，1984年。
在进行此类改变/置换时，也可考虑氨基酸的亲水性指数。亲水性氨基酸指数在为蛋白质赋予相互作用的生物功能方面的重要性是本领域普遍理解的(Kyte和Doolittle，1982年，J Mol Biol.，第157卷第1期：第105-132页)。公认的是，氨基酸的相对亲水特性有助于所得蛋白质的二级结构，这继而限定了蛋白质与其他分子(例如，酶、底物、受体、DNA、抗体、抗原等)的相互作用。
本领域已知的是，某些氨基酸可被具有相似亲水性指数或评分的其他氨基酸置换，并且仍产生具有相似生物活性的蛋白质，即，仍获得生物功能等同的蛋白质。基于每种氨基酸的疏水性和带电特性，为其指定了亲水性指数(Kyte和Doolittle，出处同上)。这些是：异亮氨酸(+4.5)；缬氨酸(+4.2)；亮氨酸(+3.8)；苯丙氨酸(+2.8)；半胱氨酸/胱氨酸(+2.5)；甲硫氨酸(+1.9)；丙氨酸(+1.8)；甘氨酸(-0.4)；苏氨酸(-0.7)；丝氨酸(-0.8)；色氨酸(-0.9)；酪氨酸(-1.3)；脯氨酸(-1.6)；组氨酸(-3.2)；谷氨酸(-3.5)；谷氨酰胺(-3.5)；天冬氨酸(-3.5)；天冬酰胺(-3.5)；赖氨酸(-3.9)和精氨酸(-4.5)。在进行此类改变时，亲水性指数在+2内的氨基酸的置换是优选的；在+1内的那些是特别优选的，并且在+0.5内的那些是甚至更特别优选的。
在本领域还应当理解，可基于亲水性有效地进行类似氨基酸的置换。美国专利4,554,101，陈述了蛋白质的最大局部平均亲水性(如由其相邻氨基酸的亲水性决定的)与该蛋白质的生物学性质相关。
如在美国专利4,554,101中所详述，已将以下亲水性值指定给氨基酸残基；精氨酸(+3.0)；赖氨酸(+3.0)；天冬氨酸(+3.0.+0.1)；谷氨酸(+3.0.+0.1)；丝氨酸(+0.3)；天冬酰胺(+0.2)；谷氨酰胺(+0.2)；甘氨酸(0)；苏氨酸(-0.4)；脯氨酸(-0.5.+0.1)；丙氨酸(-0.5)；组氨酸(-0.5)；半胱氨酸(-1.0)；甲硫氨酸(-1.3)；缬氨酸(-1.5)；亮氨酸(-1.8)；异亮氨酸(-1.8)；酪氨酸(-2.3)；苯丙氨酸(-2.5)；色氨酸(-3.4)。
如本文所用，关于核酸(或蛋白)和宿主的术语“外源”是指并不会像自然界中存在的那样存在于该特定类型的细胞中(并且无法从其中获得)的核酸或由此类核酸编码的蛋白。因此，非天然存在的核酸一旦进入宿主就被认为对宿主是外源的。重要的是需注意，非天然存在的核酸可含有存在于自然界中的核酸亚序列或核酸序列的片段，前提是该核酸就整体而论不存在于自然界中。例如，在表达载体内含有基因组DNA序列的核酸分子是非天然存在的核酸，因此在被引入宿主中之后对于宿主细胞而言是外源的，因为核酸分子就整体而论(基因组DNA加上载体DNA)不存在于自然界中。因此，认为就整体而论不存在于自然界中的任何载体、自主复制质粒或病毒(例如，逆转录病毒、腺病毒或疱疹病毒)是非天然存在的核酸。因此，认为通过PCR或限制性内切核酸酶处理产生的基因组DNA片段以及cDNA是非天然存在的核酸，因为它们作为不存在于自然界中的单独分子存在。因此，任何含有在自然界中不存在的排列的启动子序列和多肽编码序列(例如cDNA或基因组DNA)的核酸是非天然存在的核酸。天然存在的核酸对于特定宿主微生物而言可以是外源的。
相比之下，如本文所用，关于核酸(例如，基因)(或蛋白)和宿主的术语“内源性的”是指会像自然界中存在的那样存在于该特定宿主中(并且可从其中获得)的核酸(或蛋白)。此外，“内源性表达”核酸(或蛋白)的细胞会像自然界中存在的相同特定类型的宿主那样表达该核酸(或蛋白)。此外，“内源性产生”或“内源性生产”核酸、蛋白或其他化合物的宿主会像自然界中存在的相同特定类型的宿主那样产生该核酸、蛋白或化合物。
如本文所用，酶分类(EC)编号(EC编号)由国际生物化学与分子生物学联盟(IUBMB)的命名委员会确立，其描述可见于万维网上的IUBMB酶命名网站。EC编号根据所催化的反应对酶进行分类。例如，在一些实施方案中，ω-转氨酶分类为EC 2.6.1.18、EC2.6.1.19、EC 2.6.1.29、EC 2.6.1.48或EC 2.6.1.82。在一些实施方案中，具有ω-转氨酶活性的多肽或其功能片段具有分类为EC 2.6.1.18、EC 2.6.1.19、EC 2.6.1.29、EC2.6.1.48或EC 2.6.1.82的酶的ω-转氨酶活性。在具体的实施方案中，ω-转氨酶将庚二酸半醛转化为7-AHA。
如本文所用，“表达”是指基于基因的核酸序列产生多肽的过程。该过程包括转录和翻译两者。
如本文所用，“表达载体”是指包含DNA序列的DNA构建体，该DNA序列可操作地连接到能够实现DNA在合适宿主中的表达的合适控制序列。此类控制序列可包括实现转录的启动子、任选的控制转录的操纵子序列、编码mRNA上合适的核糖体结合位点的序列或控制转录和翻译的终止的增强子和序列。
本文所述的多肽中的任一者的功能片段也可用于本公开的方法中。如本文所用，术语“功能片段”是指蛋白质的肽片段，该肽片段具有对应的成熟全长野生型蛋白质的活性的至少25％(例如，至少30％、40％、50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％、100％或甚至大于100％)。功能片段通常可(但不总是)由蛋白质的连续区域构成，其中该区域具有功能活性。
“基因”指参与产生多肽的DNA片段，包括编码区之前和之后的区域以及单个编码片段(外显子)之间的间插序列(内含子)。
“宿主菌株”、“宿主细胞”或“宿主生物体”意指包含编码根据本公开的多肽的多核苷酸的表达载体或DNA构建体的合适宿主。宿主细胞群也适用于进行本文所述的任何方法。具体地讲，宿主菌株可以是细菌细胞、哺乳动物细胞、昆虫细胞和其他克隆或“表达系统”。本文所述的宿主生物体或微生物可包括可被操纵的内源性途径，使得可产生所选择的碳基产物嵌段，例如碳链长度为C5-C19的胺化脂族化合物。在内源性途径中，宿主微生物天然表达催化途径内反应的所有酶。包含工程化途径的宿主微生物不天然表达催化途径内反应的所有酶，而是经工程化使得途径内的所有酶在宿主中表达。在一些实施方案中，宿主生物体包含外源性酶和内源性酶，使得途径内的所有酶在宿主中表达。
在本公开的一个实施方案中，“宿主细胞”是指由微生物菌株的细胞产生的细胞和原生质体。应当理解，此类术语旨在不仅指特定的受试细胞，还指此类细胞的子代。由于某些修饰可由于突变或环境影响而在后代中发生，因此此类子代实际上可能与亲本细胞不同，但仍然包括在本文所用的术语“宿主细胞”的范围内。
关于多核苷酸或蛋白质的“异源”是指在宿主细胞中不天然存在的多核苷酸或蛋白质/多肽。在一些实施方案中，蛋白质是商业上重要的工业蛋白质。该术语旨在涵盖由天然存在的基因、突变基因和/或合成基因编码的蛋白质。
在两种或更多种核酸或多肽序列的上下文中，术语“相同”或“同一性”百分比是指两种或更多种序列或亚序列，它们是相同的或具有相同的特定百分比的核苷酸或氨基酸残基(例如，60％同一性，任选地，在特定区域的65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％同一性)，当在比较窗口上进行比较和比对以获得最大的对应时，或通过使用以下序列比较算法之一或通过手动比对和视觉检查进行测量的指定区域。如果序列有至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％或至少55％相同，则这些序列彼此“实质上相同”。任选地，该同一性存在于长度为至少约50个核苷酸的区域上，或更典型地存在于长度为100至500个或1000个或更多个核苷酸的区域上。
如本文所用，“序列同一性百分比”是通过在比较窗口上比较两个最佳比对的序列来确定，其中与参考序列(不包含添加或缺失)相比，该序列在比较窗口中的部分可包含添加或缺失(即，空位)，以实现两个序列的最佳比对。该百分比通过如下方式计算：确定在两个序列中出现相同核酸碱基或氨基酸残基的位置的数目以得到匹配的位置的数目，将匹配的位置的数目除以比较窗口中位置的总数目，并将结果乘以100，以得到序列同一性百分比。
对于序列比较，通常一个序列充当参考序列，将测试序列与该参考序列进行比较。当使用序列比较算法时，将测试序列和参考序列输入计算机中，如有必要，指定子序列坐标，并指定序列算法程序参数。通常使用默认程序参数，或者可指定替代参数。然后，序列比较算法基于程序参数计算测试序列相对于参考序列的序列同一性百分比或相似性百分比。
本文所用的“比较窗口”包括对选自20至600个、通常约50至约200个、更通常约100至约150个的多个连续位置中的任一个的片段的引用，其中在将两个序列进行最佳比对后，可将序列与相同数量的连续位置的参考序列进行比较。用于比较的序列比对方法是本领域熟知的。用于比较的序列的最佳比对可，例如，通过Smith和Waterman的局部同源性算法(Adv.Appl.Math.，第2卷：第482页，1970年)，通过Needleman和Wunsch的同源比对算法(J.Mol.Biol.，第48卷：第443页，1970年)，通过Pearson和Lipman的相似性搜索方法(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，第85卷：第2444页，1988年)，通过这些算法的计算机化实现(例如，威斯康星遗传学软件包中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA，遗传学计算机组，威斯康星州麦迪逊的科学大道575号)或通过手动比对和目视检查(参见，例如Ausubel等人，CurrentProtocols in Molecular Biology(1995年增刊))进行。
当使用序列同一性百分比来指代蛋白质时，人们认识到不相同的残基位置通常差别在于保守氨基酸置换，其中氨基酸残基被置换为具有相似化学性质(例如，电荷或疏水性)的其他氨基酸残基，因此不会改变分子的功能性质。当序列差别在于保守置换时，可向上调整序列同一性百分比以校正置换的保守性质，并且该过程导致例如至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的“序列同源性”。用于进行该调节的手段是本领域的技术人员所熟知的。通常，这涉及将保守置换评分为部分错配而非完全错配，从而增加序列同一性百分比。因此，例如，在相同氨基酸的评分为1，非保守置换的评分为零的情况下，保守置换的评分在0到1之间。保守置换的评分例如根据Meyers和Miller，1988年，Computer Applic.Biol.Sci.，第4卷：第11-17页的算法进行计算，例如，如在程序PC/GENE(美国加利福尼亚州山景城Intelligenetics公司(Intelligenetics，Mountain View，Calif.，USA))中所实现的。
在将核酸序列插入细胞中的语境中，“引入”包括“转染”或“转化”或“转导”，并且包括提及将核酸序列掺入真核细胞或原核细胞，其中该核酸序列可掺入细胞的基因组中(例如，染色体、质粒、质体或线粒体DNA)、转化为自主复制子或瞬时表达(例如，转染的mRNA)。该术语还可指核酸序列从细胞外到细胞内的易位。在一些情况下，引入是指核酸从细胞外到细胞核内的易位。
就酶活性而言，“Kcat(s-1)”是酶的总催化速率，或每秒催化的酶反应的最大数目。该常数也称为酶的“转换数”或每单位时间每个酶位点转化为产物的底物分子数。“Km”是酶促反应以二分之一Vmax或其最大速率的二分之一发生时所需的底物浓度。
如本文所用，代谢工程化的微生物是通过将遗传物质引入所选择的宿主或亲本微生物中，从而修饰或改变微生物的细胞生理学和生物化学而产生的生物体。
术语“突变体”是指多肽和核酸两者。术语“突变体”可与术语“变体”或“合成的”互换使用。突变体或变体包括分别在亲本序列的氨基酸或核苷酸序列中的一个或多个位置处的改变、插入、置换、颠换、截短和/或倒位。在具有ω-TAM活性的合成多肽的语境中，突变型ω-TAM是指通常重组的多肽，该多肽相对于对应的ω-TAM(例如，野生型ω-TAM)包含一个或多个氨基酸修饰，例如，一个或多个置换。在一些实施方案中，本发明的突变型ω-TAM是非天然存在的。
如本文所用，“核苷酸序列”或“核酸序列”是指寡核苷酸序列或多核苷酸序列及其变体、同源物、片段和衍生物。核苷酸序列可以是基因组、合成或重组来源的，并且可以是双链的或单链的，无论是代表有义链还是反义链。如本文所用，术语“核苷酸序列”包括基因组DNA、cDNA、合成DNA和RNA。
术语“核酸”涵盖能够编码多肽的DNA、cDNA、RNA、异源双链体和合成分子。RNA包括mRNA、RNA、RNAi、siRNA、cRNA和自催化RNA。核酸可以是单链或双链的，并且可以是化学修饰。术语“核酸”和“多核苷酸”可互换使用。因为遗传密码是简并的，所以可使用不止一个密码子来编码特定氨基酸，并且本发明的组合物和方法涵盖编码特定氨基酸序列的核苷酸序列。核酸包含核苷酸序列，该核苷酸序列通常包括含有A、G、C、T或U碱基的核苷酸。然而，核苷酸序列可包括其他碱基，诸如但不限于肌苷、甲基胞嘧啶、甲基肌苷、甲基腺苷和/或硫尿苷，但不限于此。除非特别限制，否则该术语涵盖含有天然核苷酸的已知类似物的核酸，该已知类似物具有与参考核酸类似的结合特性并且以类似于天然存在的核苷酸的方式代谢。除非另外指明，否则特定核酸序列还隐含地涵盖其保守修饰的变体(例如，简并密码子置换)、等位基因、直系同源物、SNP和互补序列以及明确指明的序列。核酸可为或可包括例如染色体或染色体片段、载体(例如，表达载体)、表达盒、裸DNA或RNA聚合物或聚合酶链反应(PCR)的产物、寡核苷酸、探针和引物。除非另外指明，否则除了明确指明的任何序列之外，特定核酸序列还任选地包含或编码互补序列。
术语“可操作地连接”及其变体是指具有足够稳定性的化学融合或键合或缔合，以承受在所利用的核苷酸掺入方法中遇到的不同化合物的组合之间的条件；分子或其他实体，诸如但不限于：在突变型聚合酶和报告基因部分(例如，荧光染料或纳米粒子)之间；在核苷酸和报告基因部分(例如，荧光染料)之间；或在启动子和编码序列之间，如果其控制序列的转录的话。
“启动子”是参与结合RNA聚合酶以引发基因转录的调控序列。启动子可以为诱导型启动子或组成型启动子。本文所用的示例性启动子为T7启动子，其为诱导型启动子。
“周质标记”或“周质前导序列”是当连接到/存在于蛋白质/肽的N末端时，将蛋白质/肽引导至细菌周质的氨基酸序列，其中该序列通常通过信号肽酶移除。分泌到周质中的蛋白质/肽可增加重组表达的蛋白质/肽的稳定性。本文所公开的周质标签的示例提供为SEQ ID NO：2。(MKYLLPTAAAGLLLLAAQPAMAMG)。
“多肽”、“肽”和“蛋白质”在本文中可互换使用，是指氨基酸残基的聚合物。如本文所用，术语涵盖任何长度的氨基酸链，包括全长蛋白，其中氨基酸残基通过共价肽键连接。
当用于指生物体、细胞、核酸、蛋白质或载体时，“重组”表示该生物体、细胞、核酸、蛋白质或载体已通过引入“异源核酸”或蛋白质或改变天然核酸或蛋白质而被修饰，或者表示该细胞衍生自经如此修饰的细胞。因此，例如，重组细胞表达在天然(非重组)形式的细胞内不存在的基因，或表达原本异常表达、低表达或根本不表达的天然基因。重组核酸最初可在体外形成，一般来讲，通过由内切核酸酶操纵核酸来形成，内切核酸酶为通常在自然界中不存在的形式。因此，就本发明的目的而言，线性形式的分离的ω-TAM或通过连接通常不接合的DNA分子而在体外形成的表达载体均被认为是重组的。应当理解，一旦制备了重组核酸并将其重新引入宿主细胞中，其将以非重组方式复制，即，使用宿主细胞的体内细胞机制而非体外操纵；然而，出于本发明的目的，此类核酸一旦以重组方式产生，尽管随后以非重组方式复制，但仍被认为是重组的。重组蛋白可使用重组技术制备，即通过表达如上所述的重组核酸制备。重组蛋白通常通过至少一种或多种特征与天然存在的蛋白区分开。
“信号序列”或“信号肽”意指结合至蛋白质的N末端部分的氨基酸序列，其有利于成熟形式的蛋白质分泌到细胞外。信号序列的定义是功能性序列。细胞外蛋白的成熟形式缺乏在分泌过程期间被切断的信号序列。
“选择性标记”是指能够在宿主中表达的基因，该基因使得能够容易地选择含有所引入的核酸或载体的那些宿主。选择性标记的示例包括但不限于抗微生物剂(例如，潮霉素、博莱霉素或氯霉素)和/或赋予宿主细胞代谢优势诸如营养优势的基因。
“底物”是指酶结合并转化为产物的分子。庚二酸半醛是通过ω-TAM转化为7-AHA的底物的示例，例如本文所述的具有ω-TAM活性的任何多肽。
“在转录控制下”是本领域熟知的术语，其表示多核苷酸序列(通常为DNA序列)的转录取决于其可操作地连接至有助于转录的起始或促进转录的元件。
“处于翻译控制之下”是本领域熟知的术语，其表示在mRNA形成后发生的调控过程。
如本文所用，“转化的细胞”包括已通过使用重组DNA技术转化或转导的细胞。转化通常通过将一个或多个核苷酸序列插入细胞中来进行。插入的核苷酸序列可以是“异源核苷酸序列”，即对于待转化的细胞来说不是天然的序列，诸如融合蛋白。
如本文所用，关于细胞使用的“转化的”、“稳定转化的”、“转导的”和“转基因的”意指该细胞具有整合进其基因组中或作为附加型质粒的非天然(例如，异源)核酸序列，该附加型质粒经过多代得以维持。
如本文所用，术语“载体”是指能够转运与其连接的另一核酸的核酸分子。一种类型的载体是“质粒”，其是指可将另外的DNA片段连接到其中的环状双链DNA环。另一种类型的载体是病毒载体，其中可将额外的DNA片段连接到病毒基因组中。某些载体能够在它们所引入的宿主细胞中自主复制(例如，具有细菌复制起点的细菌载体和附加型哺乳动物载体)。其他载体(例如，非附加型哺乳动物载体)可在引入宿主细胞中时整合到宿主细胞的基因组中，从而与宿主基因组一起复制。此外，某些载体能够引导与它们可操作地连接的基因的表达。此类载体在本文中称为“重组表达载体”(或简称“表达载体”)。一般来讲，在重组DNA技术中有用的表达载体通常是质粒的形式。在本说明书中，“质粒”和“载体”可互换使用，因为质粒是最常用的载体形式。然而，受权利要求书保护的实施方案旨在包括起到等同功能的此类其他形式的表达载体，诸如病毒载体(例如，复制缺陷型逆转录病毒、腺病毒和腺相关病毒)。载体还包括克隆载体、穿梭载体、质粒、噬菌体颗粒、盒等。
在核苷酸序列或多肽序列的语境中，术语“野生型”是指该序列在自然界中存在时的主要或最常见等位基因。野生型序列也可称为无修饰的天然存在的典型或正常序列。
一般来讲，本公开提供了通过由具有ω-转氨酶活性的多肽催化的反应来增加碳通量的方法。还提供了用于增加一种或多种碳链长度为C5-C19的胺化脂族化合物或其盐的产量的酶、途径、培养策略和宿主生物体。
生物合成碳基产品的方法
本发明提供了一种增强体内生物合成的方法，包括：获得能够生物合成至少一种产物的至少一种生物体，该至少一种生物体未改变或被改变，其中该生物体利用具有ω-转氨酶活性的多肽来催化转氨基反应，其中该多肽或其功能片段与SEQ ID NO：1具有至少70％的同一性；和b)在适于生物合成的条件下培养该生物体，其中该生物体生物合成该至少一种产物，其中该产物为碳链长度为C5-C19的胺化脂族化合物或其盐。
在一些实施方案中，产物为碳链长度为C6-C7的胺化脂族化合物或其盐，例如7-AHA或6-氨基己酸或其盐。在一些实施方案中，产物为氨基醇，诸如7-氨基庚醇或6-氨基己醇或其盐。在一些实施方案中，产物为二胺，诸如七亚甲基二胺或六亚甲基二胺或它们的盐。
在一些实施方案中，转氨基反应由具有分类为EC 2.6.1.18、EC 2.6.1.19、EC2.6.1.29、EC 2.6.1.48或EC 2.6.1.82的ω-转氨酶的活性的多肽或其功能片段催化。
本文提供的任何方法可在一种或多种宿主生物体或细胞中进行。在一些实施方案中，宿主生物体在用于产生碳链长度为C5-C19的胺化脂族化合物的途径中表达具有至少一种酶的活性的一种或多种多肽。例如，在图2中提供的用于产生7-AHA的途径中具有至少一种酶的活性的一种或多种多肽可由生物体表达。在一些实施方案中，在图9中提供的用于产生6-AHA的途径中具有至少一种酶的活性的一种或多种多肽可在生物体中表达。
生物体可(a)在途径中天然表达具有一种或多种相关酶活性的多肽，(b)在途径中经遗传工程化以表达具有一种或多种相关酶活性的一种或多种多肽，或者(c)在途径中天然表达具有一种或多种相关酶活性的一种或多种多肽并且经遗传工程化以表达具有一种或多种相关酶活性的一种或多种多肽。生物体还可天然表达或经工程化以表达一种或多种多肽，该一种或多种多肽修饰生物体产生的产物。在本公开提供的方法中，所有步骤可在宿主细胞中进行，或者一些步骤可在细胞中进行而其他步骤可使用具有酶活性的提取多肽进行。
在本文提供的任何方法中，具有催化转氨基反应的ω-转氨酶活性的多肽可为与SEQ ID NO：1具有至少70％同一性的多肽或其功能片段。下文所示的SEQ ID NO：1是以Uniprot ID No.Q7NWG4示出的紫色色杆菌ω-转氨酶的氨基酸序列。应当理解，本文通过Uniprot ID No.或GenBank登录号标识的任何序列据此参考Unipro ID No.或GenBank登录号全文以引用方式并入。
SEQ ID NO：1
Figure BDA0002710330620000231
Figure BDA0002710330620000241
在一些实施方案中，多肽或功能片段与SEQ ID NO：1具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％的同一性。在某些实施方案中，具有ω-转氨酶活性的多肽与SEQID NO：1具有至少90％、95％、98％、98.1％、98.2％、98.3％、98.4％、98.5％、98.6％、98.7％、98.8％、98.9％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％或99.9％的序列同一性。在本文提供的任何方法中，具有ω-转氨酶活性的多肽可包含与SEQ ID NO：1具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％同一性的氨基酸序列、基本上由其组成或由其组成。
如上所述，多肽可由生物体天然表达或经工程化以表达具有ω-转氨酶活性的多肽。在工程化或改变的生物体中，编码具有ω-转氨酶活性的多肽的核酸可例如通过用包含核酸的表达盒或包含该表达盒的载体转化生物体或细胞而引入该生物体，该表达盒或载体可稳定地掺入或不稳定地掺入转化的生物体的基因组中。
可使用已建立的技术，包括但不限于电穿孔、磷酸钙沉淀、脂质体介导的转染、与纳米线或纳米管的接触、成球、PEG 1000介导的转化、基因枪、乙酸锂转化、氯化锂转化等，将编码本文所述多肽的任何核酸稳定地或瞬时地引入生物体诸如宿主细胞中。
对于稳定转化，受试核酸通常还将包括选择性标记，例如，几种熟知的选择性标记诸如新霉素抗性等中的任一种。
在某些实施方案中，具有ω-转氨酶活性的多肽或功能片段不包含表1中所示的任何酶的氨基酸序列。表1提供了酶的名称和酶的氨基酸序列的GenBank登录号。因此，本发明提供了一种增强体内生物合成的方法，包括：获得能够生物合成至少一种产物的至少一种生物体，该至少一种生物体未改变或被改变，其中该生物体利用具有ω-转氨酶活性的多肽来催化转氨基反应，其中该多肽或其功能片段与SEQ ID NO：1具有至少70％的同一性，其中该多肽不包含表1中所示的任何酶的氨基酸序列；以及b)在适于生物合成的条件下培养该生物体，其中该生物体生物合成该至少一种产物，其中该产物为碳链长度为C5-C19的胺化脂族化合物或其盐。还提供了增强体内生物合成的方法，其中该生物体不利用具有GenBank登录号BAK39753.1中所示氨基酸序列的酶或具有GenBank登录号BAK39753.1中所示氨基酸序列的酶的突变体来催化转氨基反应。
表1
Figure BDA0002710330620000251
Figure BDA0002710330620000261
Figure BDA0002710330620000271
已经发现，改变由具有ω-转氨酶活性的多肽催化的转氨基反应的反应条件增加了某些碳基产物的产生，例如碳链长度为C5-C19的胺化脂族化合物。因此，本文提供的任何方法可包括改变由具有ω-转氨酶活性的多肽催化的转氨酶反应的反应条件的步骤。
本文提供的任何方法中的转氨酶反应的反应条件可通过一种或多种模式改变，以与尚未改变转氨基反应条件的生物体相比增加具有ω-转氨酶活性的多肽或其片段的ω-转氨基活性。在一些实施方案中，改变反应条件以使转氨酶反应平衡偏移，有利于产物形成。在一些实施方案中，改变转氨基反应的反应条件导致总产物收率增加。在一些实施方案中，总产物收率的增加是碳链长度为C5-C19的胺化脂族化合的产生增加，例如碳链长度为C6-C7的胺化脂族化合物的总收率增加。在一些实施方案中，总产物收率的增加是7-AHA总收率的增加。
在一些实施方案中，总产物收率的增加比其中反应条件尚未改变的生物体中的产物收率大至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、200％、300％、400％或500％。
在一些实施方案中，改变反应条件的步骤包括催化与具有ω-转氨酶活性的多肽或其功能片段的反应，该多肽或其功能片段相对于野生型ω-转氨酶包含一个或多个氨基酸置换，其中该一个或多个氨基酸置换位于占据与SEQ ID NO：1的位置2、13、15、16、20、87、134、288或345对应的位置的氨基酸处。
在一些实施方案中，具有ω-转氨酶活性的多肽或其功能片段包含相对于野生型ω-转氨酶的一个或多个氨基酸置换，其中该一个或多个氨基酸置换位于占据与UniprotID No.K2KXB1中所示氨基酸序列的位置2、13、15、16、20、87、134、288或345对应的位置的氨基酸处。
在一些实施方案中，对应于位置2的氨基酸被缬氨酸(V)置换。在一些实施方案中，对应于位置13的氨基酸被丝氨酸(S)置换。在一些实施方案中，对应于位置15的氨基酸被丝氨酸(S)置换。在一些实施方案中，对应于位置16的氨基酸被丝氨酸(S)置换。在一些实施方案中，对应于位置134的氨基酸被天冬酰胺(N)置换。在一些实施方案中，对应于位置288的氨基酸被谷氨酰胺(Q)置换。在一些实施方案中，对应于位置345的氨基酸被精氨酸(R)置换。在一些实施方案中，一个或多个置换位于多肽的底物结合位点或底物进入位点中。例如，可置换底物结合位点中位置20和/或87处的氨基酸。例如，对应于位置20的氨基酸被酪氨酸(Y)置换。在一些实施方案中，对应于位置87的氨基酸被甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、丝氨酸(S)或苏氨酸(T)置换。
在一些实施方案中，野生型ω-转氨酶为被分类为EC 2.6.1.18、EC 2.6.1.19、EC2.6.1.29、EC 2.6.1.48或EC 2.6.1.82的ω-转氨酶。
在一些实施方案中，该一种或多种氨基酸置换位于具有ω-转氨酶活性的多肽的小结合口袋(O形口袋)和/或大结合口袋(P形口袋)中。
在一些实施方案中，相对于分类为EC 2.6.1.18、EC 2.6.1.19、EC 2.6.1.29、EC2.6.1.48或EC 2.6.1.82的野生型ω-转氨酶，该置换或突变的多肽具有增加的酶活性和/或改善的底物特异性。
在一些实施方案中，突变多肽相对于野生型ω-TAM的活性具有至少5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、200％、300％、400％或至少500％的酶活性的增加。
在某些实施方案中，酶活性是比活性，即突变多肽与特定底物例如庚二酸半醛反应的酶活性。在一些实施方案中，当多肽在本文所述的生物体中表达时，酶活性的增加导致碳链长度为C5-C19的胺化脂族化合物或其盐(例如，7-AHA或其盐)的总产物收率增加。
在一些实施方案中，相对于野生型ω-TAM的底物特异性，突变多肽的改善的底物特异性导致多肽能够在比野生型ω-TAM大的kcat(s-1)处将至少一种底物转化为至少一种产物。
在一些实施方案中，相对于野生型ω-TAM的活性，突变多肽的改善的底物特异性导致多肽能够在比野生型ω-TAM小的Km处将至少一种底物转化为至少一种产物。在一些实施方案中，改善的底物特异性是对庚二酸半醛改善的底物特异性。
在一些实施方案中，相对于野生型ω-转氨酶，突变多肽对于氨基供体具有降低的Km。在一些实施方案中，氨基供体是L-丙氨酸。在一些实施方案中，氨基供体(例如，L-丙氨酸)的Km小于约4mmol-L′1。在一些实施方案中，相对于野生型ω-转氨酶，具有ω-转氨酶活性的多肽对于作为氨基供体的碳链长度为C5-C19的胺化脂族化合物具有增加的Km。在一些实施方案中，具有ω-转氨酶活性的多肽对于碳链长度为C6-C7的胺化脂族化合物具有增加的Km。在一些实施方案中，具有ω-转氨酶活性的多肽对于7-AHA具有增加的Km。在一些实施方案中，野生型ω-转氨酶为紫色色杆菌ω-转氨酶或紫色色杆菌样ω-转氨酶，例如SEQ IDNO：1。
在一些实施方案中，对应于SEQ ID NO：1的位置2、13、15、16、20、87、134、288或345的一个或多个氨基酸的置换增加了酶活性和/或改善了底物特异性。应当理解，任何野生型ω-TAM可用所述氨基酸置换的任何组合进行突变，以获得具有增加的酶活性和/或改善的底物特异性的多肽。在一些实施方案中，突变型ω-TAM在占据与SEQ ID NO：1的位置2、13、15、16、20、87、134、288或345对应的位置的氨基酸处包含两个或更多个、三个或更多个、四个或更多个、五个或更多个、六个或更多个、七个或更多个、或八个或更多个置换。
如上所述，突变型ω-TAM可具有，例如相对于野生型ω-TAM，上文所述的一个或多个氨基酸置换，并且相对于分类为EC 2.6.1.18、EC 2.6.1.19、EC 2.6.1.29、EC 2.6.1.48或EC 2.6.1.82的野生型ω-TAM不受限制。在一些实施方案中，突变型ω-TAM具有一个或多个额外的修饰。蛋白质修饰包括氨基酸序列修饰。氨基酸序列中的修饰可作为等位基因变异(例如，由于遗传多态性)天然产生，可由于环境影响(例如，通过暴露于紫外线)产生，或者可通过人工干预(例如，通过克隆的DNA序列的诱变)产生，诸如诱导点、缺失、插入和置换突变体。编码ω-TAM的核酸的修饰可导致氨基酸序列的变化、提供沉默突变、修饰限制位点或提供其他特定突变。氨基酸序列修饰通常分为三类中的一类或多类：置换修饰、插入修饰或缺失修饰。插入包括氨基和/或末端融合以及单个或多个氨基酸残基的序列内插入。插入通常将是比氨基或羧基末端融合的插入更小的插入，例如，大约一至四个残基。缺失的特征在于从蛋白质序列移除一个或多个氨基酸残基。通常，在蛋白质分子内的任一位点缺失不超过约2至6个残基。氨基酸置换通常为单个残基，但可一次出现在多个不同的位置；插入通常将为大约1至10个氨基酸残基；并且缺失将在约1至30个残基的范围内。缺失或插入优选地在相邻对中进行，即缺失2个残基或插入2个残基。可将置换、缺失、插入或它们的任何组合进行组合以得到最终的构建体。置换修饰是其中至少一个残基已被移除并且在其位置中插入不同残基的那些。在一些实施方案中，进行保守或等同置换。保守置换导致氨基酸被化学上和/或功能上类似的氨基酸置换。通过已知的方法进行修饰，包括特定的氨基酸置换。
以举例的方式，通过对编码蛋白质的DNA中的核苷酸进行位点特异性诱变来进行修饰，从而产生编码修饰的DNA，然后在重组细胞培养物中表达该DNA。用于在具有已知序列的DNA中的预定位点处进行置换突变的技术是熟知的，例如PCR诱变、引物延伸或反向PCR诱变。
还提供了包含本文所述多肽中的任一种的融合多肽。多肽可融合至异源序列，例如但不限于被设计成有利于重组表达的蛋白质的表达、纯化和/或检测的标签或序列。非限制性示例包括周质标签、聚组氨酸标签、麦芽糖结合蛋白(MBP)、蛋白A、谷胱甘肽S-转移酶(GST)、荧光蛋白序列(例如GFP)，以及表位标签诸如myc、FLAG和血凝素标签。
在一些实施方案中，具有ω-TAM活性的多肽的氨基酸序列(例如，突变型ω-TAM)与野生型ω-TAM的氨基酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％的氨基酸序列同一性，并且具有酶活性。在某些实施方案中，具有ω-TAM的多肽的氨基酸序列(例如，突变型ω-TAM)与野生型ω-TAM具有至少90％、95％、98％、98.1％、98.2％、98.3％、98.4％、98.5％、98.6％、98.7％、98.8％、98.9％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％或99.9％的序列同一性，并且具有酶活性。在某些实施方案中，酶活性对庚二酸半醛转化为7-AHA具有特异性。
还提供了本文所述的任何突变多肽的衍生物。在一些实施方案中，衍生多肽是已例如通过与其他化学部分缀合或络合，通过翻译后修饰(例如，磷酸化、乙酰化等)、糖基化的修饰(例如，添加、移除或改变糖基化)和/或额外的氨基酸序列的添加/置换而被进一步改变的多肽，如本领域中所理解的。衍生物还包括如上所述的融合蛋白。实施方案所设想的其他衍生物包括但不限于对侧链的修饰、在肽或者蛋白质合成期间掺入非天然氨基酸和/或它们的衍生物，以及使用交联剂和对多肽及其片段施加构象限制的其他方法。
在一些方法中，改变反应条件的步骤包括环化，例如产物的环化。在某些实施方案中，改变反应条件包括使至少一种产物环化成内酰胺，例如使7-AHA环化成庚烷内酰胺。在一些实施方案中，生物体利用具有丙酸梭菌β-丙氨酸CoA转移酶活性的多肽来环化产物。在一些实施方案中，具有β-丙氨酸CoA的多肽将7-AHA转化为庚内酰胺，其中由ω-转氨酶与7-AHA的逆反应形成的庚二酸半醛的量减少。在一些实施方案中，由ω-转氨酶与7-AHA的逆反应形成的庚二酸半醛的量减少至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％。在一些实施方案中，产物的环化移除或以其他方式降低产物对于由具有ω-转氨酶活性的多肽催化的逆反应的可用性。该降低可为与产物在不环化产物的生物体中的可用性降低相比的降低。在一些实施方案中，降低为至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％。
在一些实施方案中，该方法还包括加工环化产物以获得碳链长度为C5-C19的胺化脂族化合物，例如7-AHA或6-氨基己酸或其盐。在一些实施方案中，产物为氨基醇，诸如7-氨基庚醇或6-氨基己醇或其盐。在一些实施方案中，产物为二胺，诸如七亚甲基二胺或六亚甲基二胺或它们的盐。
在一些实施方案中，改变反应条件的步骤包括增加生物体中细胞内氨基供体的水平。在一些实施方案中，将氨基供体外源引入生物体中。在一些实施方案中，生物体利用具有L-氨基酸脱氢酶活性的多肽来增加引入生物体的细胞中氨基供体的细胞内水平。在一些实施方案中，L-氨基酸脱氢酶为L-丙氨酸脱氢酶。在一些实施方案中，氨基供体的浓度增加至约4-10mmol L-1的浓度。
在一些实施方案中，改变反应条件的步骤包括除去产物或以其他方式降低产物的可用性。在一些实施方案中，生物体利用具有氨基酸转运蛋白活性的多肽来除去产物或以其他方式降低产物的可用性。例如但不旨在进行限制，生物体可天然表达或经工程化以表达表2中提供的具有氨基酸转运蛋白活性的多肽中的一种或多种，以除去产物或以其他方式降低产物的可用性。产物可用性的降低可以是与在不利用具有氨基酸转运蛋白活性的多肽来除去产物或以其他方式降低产物可用性的生物体中产物的可用性的降低相比的降低。在一些实施方案中，降低为至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％
表2
Figure BDA0002710330620000321
Figure BDA0002710330620000331
Figure BDA0002710330620000341
在一些实施方案中，具有氨基酸转运蛋白活性的多肽具有LysE氨基酸转运蛋白活性。
在一些实施方案中，生物体利用具有氨基酸转运蛋白活性的多肽来降低由具有ω-转氨酶活性的多肽与碳链长度为C5-C19的胺化脂族化合物的逆反应形成的至少一种产物的量。在一些实施方案中，当生物体利用具有氨基酸转运蛋白活性的多肽时，由ω-转氨酶与7-AHA的逆反应形成的庚二酸半醛的量减少。
在一些实施方案中，改变反应条件的步骤包括使用氨基供体，该氨基供体形成挥发性产物并驱动转氨基反应朝向产物形成。在一个实施方案中，挥发性产物可为异丙胺。
如上所述，本文提供的方法中的任一种可包括改变由本文所述的具有ω-TAM活性(包括野生型ω-TAM和经修饰的ω-TAM)的多肽中的任一个催化的转氨基反应的反应条件的步骤。
在一些实施方案中，改变反应条件包括增加细胞内氨基供体的量、使产物环化、使用异丙胺或等同化合物来驱动转氨基反应朝向产物形成和/或从细胞中除去产物。
在一些实施方案中，改变反应条件包括增加细胞内氨基供体的量并使产物环化。
在一些实施方案中，改变反应条件包括增加细胞内氨基供体的量并从细胞中除去产物。
在一些实施方案中，改变反应条件包括增加细胞内氨基供体的量、使产物环化、使用异丙胺或等同化合物来驱动转氨基反应朝向产物形成和从细胞中除去产物。
在一些实施方案中，该方法还包括纯化产物。
在一些实施方案中，生物体是原核生物。例如，原核生物可来自埃希氏杆菌属(Escherichia)，诸如大肠杆菌；来自梭菌属(Clostridia)，诸如扬氏梭菌(Clostridiumljungdahlii)、自产乙醇梭菌(Clostridium autoethanogenum)或科氏梭菌(Clostridiumkluyveri)；来自棒状杆菌属(Corynehacteria)，诸如谷氨酸棒状杆菌；来自贪铜菌属(Cupriavidus)，诸如钩虫贪铜菌(Cupriavidus necator)或耐金属贪铜菌(Cupriavidusmetallidurans)；来自假单胞菌属，诸如荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)、恶臭假单胞菌(Pseudomonasputida)或食油假单胞菌(Pseudomonas oleavorans)；来自代尔夫特菌属(Delftia)，诸如代尔夫特食酸菌(Delftia acidovorans)；来自芽孢杆菌属(Bacillus)，诸如枯草芽胞杆菌(Bacillus subtillis)；来自乳杆菌属(Lactobacillus)，诸如德氏乳酸杆菌(Lactobacillus delbrueckii)；或来自乳球菌属(Lactococcus)，诸如乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)。
在一些实施方案中，生物体是真核生物(例如，真菌诸如酵母)。例如，真核生物可来自曲霉真菌属(Aspergillus)，诸如黑曲霉(Aspergillus niger)；来自酵母菌属(Saccharomyces)，诸如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)；来自毕赤酵母属(Pichia)，诸如毕赤酵母(Pichiapastoris)；来自耶氏酵母属(Yarrowia)，诸如解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)；来自伊萨酵母属(Issatchenkia)，诸如东方伊萨酵母(Issathenkia orientalise)；来自德巴利酵母属(Debaryomyces)，诸如汉逊德巴利酵母(Debaryomyces hansenil)；来自酵母属(Arxula)，诸如Arxula adenoinivorans；或来自克鲁维酵母菌属(Kluyveromyces)，诸如乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)。
酵母或真菌物种的示例性物种包括选自以下的任何菌种：酵母目(Saccharomycetales)，酵母科(Saccaromycetaceae)，包括酵母属、克鲁维酵母属和毕赤酵母属；酵母目，双足囊菌科(Dipodascaceae)，包括耶氏酵母属(Yarrowia)；裂殖酵母目(Schizosaccharomycetales)，裂殖酵母科(Schizosaccaromycetaceae)，包括裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)；散囊菌目(Eurotiales)，发菌科(Trichocomaceae)，包括曲霉属；和毛霉目(Mucorales)，毛霉科(Mucoraceae)，包括根霉属(Rhizopus)。宿主酵母或真菌的非限制性物种包括酿酒酵母、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、乳酸克鲁维酵母、马克斯克鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus)、土曲霉(Aspergillus terreus)、黑曲霉(Aspergillus niger)、巴斯德毕赤酵母(Pichiapastoris)、少根根霉(Rhizopusarrhizus)、米根霉(Rhizopus oryzae)、解脂耶氏酵母等。大肠杆菌是特别有用的宿主生物体，因为它是适用于基因工程的充分表征的微生物。其他特别有用的宿主生物体包括酵母诸如酿酒酵母。应当理解，任何合适的微生物宿主生物体都可用于引入代谢和/或基因修饰以产生期望的产物。
在一些实施方案中，生物体是重组生物体。在一些实施方案中，该重组生物体包含至少一种外源核酸，该至少一种外源核酸编码具有图2所示的至少一种酶的活性的至少一种多肽。在一些实施方案中，具有图2所示的至少一种酶的活性的多肽具有ω-转氨酶、硫酯酶或羧酸还原酶的活性。
例如，本文所述的具有硫酯酶(TE)活性的多肽可与由tesB(参见GenBank登录号AAA24665.1)编码的大肠杆菌硫酯酶或由tesA或fatB(分别参见GenBank登录号ABJ63754.1和GenBank登录号CCC78182.1)编码的基因产物的氨基酸序列具有至少70％的序列同一性(例如至少75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％)。在一些实施方案中，具有硫酯酶活性的多肽分类为与分类为EC 3.1.2.-的酶具有至少70％的序列同一性(例如，至少75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％)的EC 3.1.2.-。在一些实施方案中，具有硫酯酶活性的多肽分类为3.1.2.14、EC 3.1.1.1、EC 3.1.1.2或EC 3.1.1.5。
在一些实施方案中，本文所述的具有羧酸还原酶活性的多肽可与海分支杆菌(Mycobacterium marinum)(参见Genbank登录号ACC40567.1)和耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis)(参见Genbank登录号ABK71854.1)、裙皱慢反应脂肪酸菌(Segniliparus rugosus)(参见Genbank登录号EFV11917.1)、耻垢分枝杆菌(参见Genbank登录号ABK75684.1)、马赛分枝杆菌(Hycobacterium massiliense)(参见Genbank登录号EIV11143.1)或圆形慢反应脂肪酸菌(Segniliparus rotundus)(参见Genbank登录号ADG98140.1)羧酸还原酶的氨基酸序列具有至少70％的序列同一性(例如，至少75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％)。在一些实施方案中，本文所述的具有羧酸盐的多肽分类为例如EC 1.2.99.6。在其他实施方案中，本文所述的具有羧酸盐的多肽可与分类为EC 1.2.99.66的羧酸盐还原酶的氨基酸序列具有至少70％的序列同一性(例如，至少75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％)。
在一些实施方案中，具有羧酸还原酶活性的多肽可以是car(例如，海分枝杆菌羧酸还原酶(参见UniProtKB登录号B2HN69)或艾阿华诺卡氏菌(Nocardia iowensis)羧酸还原酶(参见UniProtKB登录号Q6RKB1)的基因产物。在一些实施方案中，具有羧酸还原酶活性的多肽是fadD9(例如耻垢分枝杆菌脂肪酸-CoA连接酶(参见UniProtKB登录号A0QWI7))或耻垢分枝杆菌脂肪酸-CoA连接酶(参见UniProtKB登录号A0A0D6J1A6)的基因产物。
在一些实施方案中，羧酸还原酶可选自：耻垢分枝杆菌羧酸还原酶(参见UniProtKB登录号A0R484)；鸟分枝杆菌(Mycobacterium avium)羧酸还原酶(参见GenBank登录号WP_019730046.1)；裙皱慢反应脂肪酸菌羧酸还原酶(参见UniProtKB登录号E5XUS9)；分枝杆菌属(Mycobacterium)JS623羧酸还原酶(参见UniProtKB登录号L0IYJ8)；柏林半岛分枝杆菌(Mycobacterium heckeshornense)羧酸还原酶(参见UniProtKB登录号A0A0J8X8T4)；古地分枝杆菌I(Mycobacterium goodiiI)羧酸还原酶(参见UniProtKB登录号A0A0K0XCM7)；古地分枝杆菌(Mycobacterium goodii)羧酸还原酶(参见UniProtKB登录号A0A0K0X557)；胞内分枝杆菌(Mycobacterium intracellulare)羧酸还原酶(参见UniProtKB登录号H8ITF4)；马赛分枝杆菌羧酸还原酶(参见Genbank登录号EIV11143.1)；圆形慢反应脂肪酸菌(参见Genbank登录号D6Z860)；和圆形慢反应脂肪酸菌(参见UniProtKB登录号D6ZDT1)。
在一些实施方案中，羧酸还原酶可选自：耻垢分枝杆菌羧酸还原酶(参见UniProtKB登录号A0R484)；鸟分枝杆菌羧酸还原酶(参见GenBank登录号WP_019730046.1)；和裙皱慢反应脂肪酸菌羧酸还原酶(参见UniProtKB登录号E5XUS9)。
在一些实施方案中，羧酸还原酶可选自：分枝杆菌属JS623羧酸还原酶(参见UniProtKB登录号L0IYJ8)；柏林半岛分枝杆菌羧酸还原酶(参见UniProtKB登录号A0A0J8X8T)；古地分枝杆菌I(参见UniProtKB登录号A0A0K0XCM7)；古地分枝杆菌羧酸还原酶(参见UniProtKB登录号A0A0K0X557)；胞内分枝杆菌I(参见UniProtKB登录号H8ITF4)；以及耻垢分枝杆菌脂肪酸-CoA连接酶(参见UniProtKB登录号A0A0D6J1A6)。
在一些实施方案中，具有ω-转氨酶活性的多肽可与紫色色杆菌ω-转氨酶的氨基酸序列(参见Genbank登录号AAQ59697.1；Uniprot ID No.Q7NWG4(SEQ ID NO：1))具有至少70％的序列同一性(例如，至少750％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％)。
在一些实施方案中，该重组生物体包含编码L-氨基酸脱氢酶(例如，L-丙氨酸脱氢酶)的外源核酸。
在一些实施方案中，该重组生物体过表达一种或多种编码下列物质的基因：乙酰-CoA合成酶、β-丙氨酸CoA转移酶、6-磷酸葡糖酸脱氢酶、转酮醇酶、嘌呤核苷酸转氢酶、甘油醛-3P-脱氢酶、苹果酸酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、葡萄糖脱氢酶、果糖1，6二磷酸酶、L-丙氨酸脱氢酶、L-谷氨酸脱氢酶、甲酸脱氢酶、L-谷氨酰胺合成酶、二胺转运蛋白、二羧酸转运蛋白、氨基酸转运蛋白和/或多药转运蛋白。在一些实施方案中，该重组生物体过表达编码氨基酸转运蛋白(例如，表2所示的氨基酸转运蛋白中的任一种)的基因。在一些实施方案中，氨基酸转运蛋白为LysE转运蛋白。
在一些实施方案中，与野生型生物体相比，该重组生物体产生增加水平的由庚二酸或庚二酸衍生物转化的7-AHA。在一些实施方案中，庚二酸衍生物包括庚二酰-ACP和庚二酸半醛。在一些实施方案中，庚二酸半醛被转氨基以产生7-AHA。在一些实施方案中，该重组生物体包含编码具有丙酸梭菌β-丙氨酸CoA转移酶活性的多肽的核酸，其中该多肽使产物环化。在一些实施方案中，具有β-丙氨酸CoA的多肽将7-AHA转化为庚内酰胺，从而减少由ω-转氨酶与7-AHA的逆反应形成的庚二酸半醛的量。
在一些实施方案中，可在有氧、厌氧、微需氧或混合氧/脱氮培养条件下对生物体进行培养策略。可在营养物质受限的条件下培养生物体。可使用陶瓷中空纤维膜保留生物体，以在发酵期间维持高细胞密度。
补加至发酵的主要碳源可来源于生物原料或非生物原料。在一些实施方案中，生物原料为、包括或来源于选自以下中的至少一种：单糖、二糖、木质纤维素、半纤维素、纤维素、木质素、乙酰丙酸和甲酸、三甘油酯、甘油、脂肪酸、农业废物、浓缩酒糟或城市垃圾。
在一些实施方案中，非生物原料为或来源于选自以下中的至少一种：天然气、合成气、CO2/H2、甲醇、乙醇、苯甲酸盐、非挥发性残余物(NVR)或来自环己烷氧化过程的苛性碱洗液洗涤废物流或对苯二甲酸/间苯二甲酸混合物废物流。
在方法中的任一种中，生物体对高浓度的至少一种产物(例如，碳链长度为C5-C19的胺化脂族化合物)的耐受性可通过在选择性环境中连续培养来改善。
在本文提供的方法中的任一种中，可通过提供生物体(例如，本文所述的任何重组生物体)并将所提供的生物体与含有如上所述的合适碳源的培养基一起培养来产生一种或多种产物。一般来讲，培养基和/或培养条件可使得微生物生长至足够的密度并且有效地产生至少一种碳链长度为C5-C19的胺化脂族化合物。对于大规模生产过程，可使用任何方法，诸如别处所述的那些(Manual of Industrial Microbiology and Biotechnology，第2版，编辑：A.L.Demain和J.E.Davies，ASM Press；以及Principles of FermentationTechnology，P.F.Stanbury和A.Whitaker，Pergamon)。简而言之，用特定生物体接种含有合适培养基的大罐(例如，100加仑、200加仑、500加仑或更大的罐)。接种后，温育生物体以允许产生生物质。一旦达到期望的生物质，就可将含有生物体的发酵液转移到第二罐中。该第二罐可为任何尺寸。例如，第二罐可比第一罐更大、更小或尺寸相同。通常，第二罐大于第一罐，使得可将附加的培养基从第一罐添加到发酵液中。此外，该第二罐内的培养基可与第一罐中使用的培养基相同或不同。
一旦转移，就可温育生物体以允许产生碳链长度为C5-C19的胺化脂族化合物。一旦产生，就可使用任何方法分离碳链长度为C5-C19的胺化脂族化合物。例如，碳链长度为C5-C19的胺化脂族化合物可经由吸附方法从发酵液中选择性回收。就7-AHA而言，所得洗脱物可经由蒸发进一步浓缩，经由蒸发结晶和/或冷却结晶，并且经由离心回收晶体。
重组生物体
在另一个实施方案中，本文提供了包含编码具有共转氨酶活性的多肽的外源核酸的重组生物体，其中该多肽或其功能片段与SEQ ID NO：1具有至少70％的同一性，并且其中与野生型生物体相比，该重组生物体产生增加水平的碳链长度为C5-C19的胺化脂族化合物。在一些实施方案中，该重组生物体是原核的。在一些实施方案中，该重组生物体是真核的。
在一些实施方案中，由重组生物体产生的胺化脂族化合物具有C6-C7的碳链长度。在一些实施方案中，由重组生物体产生的胺化脂族化合物为7-AHA。在一些实施方案中，外源核酸编码多肽，该多肽具有ω-转氨酶活性、包含相对于野生型ω-转氨酶的一个或多个氨基酸置换，其中该一个或多个氨基酸置换位于占据与SEQ ID NO：1的位置2、13、15、16、20、87、134、288或345对应的位置的氨基酸或其功能片段处。
在一些实施方案中，该重组生物体包含至少一种外源核酸，该至少一种外源核酸编码具有图2所示的至少一种酶的活性的至少一种多肽。在一些实施方案中，该重组生物体包含至少一种外源核酸，该至少一种外源核酸编码至少一种具有ω-转氨酶活性、硫酯酶活性或羧酸还原酶活性的多肽。在一些实施方案中，该重组生物体还包含编码L-氨基酸脱氢酶的外源核酸。在一些实施方案中，L-氨基酸脱氢酶为L-丙氨酸脱氢酶。在一些实施方案中，该重组生物体过表达一种或多种编码以下物质的基因：乙酰CoA合成酶、β-丙氨酸CoA转移酶、6-磷酸葡糖酸脱氢酶、转酮醇酶、嘌呤核苷酸转氢酶、甘油醛-3P-脱氢酶、苹果酸酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、葡萄糖脱氢酶、果糖1，6二磷酸酶、L-丙氨酸脱氢酶、L-谷氨酸脱氢酶、甲酸脱氢酶、L-谷氨酰胺合成酶、二胺转运蛋白、二羧酸转运蛋白、氨基酸转运蛋白和/或多药转运蛋白。在一些实施方案中，该重组生物体过表达编码氨基酸转运蛋白的基因。在某些实施方案中，该重组生物体过表达编码LysE转运蛋白的基因。
本文所述的任何核酸均可例如通过用包含核酸的表达盒或包含该表达盒的载体转化生物体或细胞而引入该生物体，该表达盒或载体可使用上文所述的已建立的技术稳定地掺入或不稳定地掺入转化的生物体的基因组中。
可使用上述方法培养本文提供的任何重组生物体以产生碳链长度为C5-C19的胺化脂族化合物。
生物合成己内酰胺的方法
在另一个实施方案中，本文提供了提高己内酰胺产量的方法，该方法包括：培养宿主生物体，该宿主生物体包含(i)编码具有ω-转氨酶活性的多肽或其功能片段的核酸，其中该多肽与SEQ ID NO：1具有至少70％的同一性；以及(ii)在存在合适的底物或代谢中间体的情况下以及在适于将己二酸或己二酸衍生物转化为己内酰胺的条件下，编码具有β-丙氨酸CoA转移酶活性的多肽的核酸；以及纯化己内酰胺。
在一些实施方案中，具有ω-转氨酶活性的多肽或其功能片段相对于野生型ω-转氨酶具有一个或多个氨基酸置换，其中该一个或多个氨基酸置换位于占据与SEQ ID NO：1的位置2、13、15、16、20、87、134、288或345对应的位置的氨基酸或其功能片段处。在一些实施方案中，具有β-丙氨酸CoA转移酶活性的多肽将6-AHA转化为己内酰胺，其中由ω-转氨酶与6-AHA的逆反应形成的己二酸半醛的量由此减少。
在一些实施方案中，具有ω-转氨酶活性的多肽或其功能片段具有分类为EC2.6.1.18、EC 2.6.1.19、EC 2.6.1.29、EC 2.6.1.48或EC 2.6.1.82的ω-转氨酶活性。
在一些实施方案中，己二酸衍生物包括己二酰-ACP和己二酸半醛。在一些实施方案中，己二酸半醛被转氨基以产生6-AHA。在一些实施方案中，该宿主生物体是重组的。在一些实施方案中，该宿主生物体包含至少一种外源核酸，该至少一种外源核酸编码具有图9所示的至少一种酶的活性的至少一种多肽。
在一些实施方案中，宿主生物体被工程化以增加己二酸和/或乙酰CoA的细胞内水平。
上述培养方法中的任一种可用于产生己内酰胺的方法中。
产物
其他实施方案涉及由本文所公开的方法产生的生物衍生的或发酵衍生的产物，例如碳链长度为C5-C19的生物衍生的胺化脂族化合物，例如7-AHA。通过本文所公开的方法产生的其他生物衍生的或发酵衍生的产物包括但不限于图3所示途径的产物、图9所示途径的产物、庚内酰胺或己内酰胺。在相关实施方案中，还提供了包含化学品的产品，该化学品由使用本文所公开的方法产生的生物衍生产物中的任一种产生。在一些实施方案中，该产品包括尼龙中间体、聚酯、药物、生物燃料、香料或食品添加剂。
其他实施方案包括基于生物的或发酵衍生的产品，其中所述产品包含：i.组合物，所述组合物包含至少一种根据本文提供的方法中的任一种产生或生物合成的生物衍生的、基于生物的或发酵衍生的化合物或其盐；ii.生物衍生的、基于生物的或发酵衍生的聚合物，所述生物衍生的、基于生物的或发酵衍生的聚合物包含i.的所述生物衍生的、基于生物的或发酵衍生的组合物或化合物或它们的任何组合；iii.生物衍生的、基于生物的或发酵衍生的树脂，所述生物衍生的、基于生物的或发酵衍生的树脂包含i.的所述生物衍生的、基于生物的或发酵衍生的化合物或所述生物衍生的、基于生物的或发酵衍生的组合物或它们的任何组合，或者ii.的所述生物衍生的、基于生物的或发酵衍生的聚合物或它们的任何组合；iv.物质，所述物质通过模制ii.的所述生物衍生的、基于生物的或发酵衍生的聚合物或iii.的所述生物衍生的、基于生物的或发酵衍生的树脂或它们的任何组合获得；v.生物衍生的、基于生物的或发酵衍生的制剂，所述生物衍生的、基于生物的或发酵衍生的制剂包含i.的所述生物衍生的、基于生物的或发酵衍生的组合物，i.的所述生物衍生的、基于生物的或发酵衍生的化合物，ii.的所述生物衍生的、基于生物的或发酵衍生的聚合物，iii.的所述生物衍生的、基于生物的或发酵衍生的树脂，或者iv的所述生物衍生的、基于生物的或发酵衍生的物质，或者它们的任何组合；或者vi.生物衍生的、基于生物的或发酵衍生的半固体或非半固体料流，所述生物衍生的、基于生物的或发酵衍生的半固体或非半固体料流包含i.的所述生物衍生的、基于生物的或发酵衍生的组合物，i.的所述生物衍生的、基于生物的或发酵衍生的化合物，ii.的所述生物衍生的、基于生物的或发酵衍生的聚合物，iii.的所述生物衍生的、基于生物的或发酵衍生的树脂，v.的所述生物衍生的、基于生物的或发酵衍生的制剂，或者iv.的所述生物衍生的、基于生物的或发酵衍生的模制物质，或者它们的任何组合。
组合物
一些实施方案涉及包含一种或多种所公开的多肽或编码本文所述多肽的核酸的组合物。在一些实施方案中，该组合物包含一种或多种所公开的具有改善的酶活性和/或底物特异性的多肽。在一些实施方案中，该组合物包含一种或多种具有改善的将庚二酸半醛转化为7-AHA的比活性的多肽。
在一些实施方案中，该组合物由一种或多种所公开的多肽组成，该一种或多种多肽来自(1)商业供应商；(2)表达所述多肽的克隆基因；(3)复合发酵液(诸如由微生物菌株或任何其他宿主细胞在培养基中的生长产生的复合发酵液，其中所述菌株/宿主细胞将所公开的多肽分泌到培养基中；(4)如(3)中生长的菌株/宿主细胞的细胞裂解物；和/或(5)表达所公开多肽的任何其他宿主细胞材料。组合物中不同的所公开的多肽可从不同的来源获得。
实施方案
设想了以下实施方案。设想了特征和实施方案的所有组合。
实施方案1：一种用于改善胺化脂族化合物的生物合成的方法，所述方法包括：a)提供能够生物合成胺化脂族化合物的重组生物体；其中所述重组生物体已被工程化以包含一种或多种外源、经修饰或过表达的多肽；其中所述一种或多种多肽中的每一种多肽独立地编码胺化脂族化合物生物合成或输出途径的至少一种酶；并且其中所述一种或多种多肽中的至少一种多肽编码与SEQ ID NO：1具有至少70％同一性的ω-转氨酶或其功能片段；以及b)在适于所述重组生物体产生所述胺化脂族化合物或其盐的条件下培养所述重组生物体。
实施方案2：根据实施方案1所述的实施方案，其中所述重组生物体已被工程化以包含两种或更多种外源、经修饰或过表达的多肽；并且其中所述两种或更多种多肽各自独立地编码选自由以下项组成的组的至少一种酶：ω-转氨酶、硫酯酶、羧酸还原酶、乙酰-CoA合成酶、β-丙氨酸CoA转移酶、6-磷酸葡糖酸脱氢酶、转酮醇酶、嘌呤核苷酸转氢酶、甘油醛-3P-脱氢酶、苹果酸酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、葡萄糖脱氢酶、果糖1，6二磷酸酶、L-丙氨酸脱氢酶、L-谷氨酸脱氢酶、甲酸脱氢酶、L-谷氨酰胺合成酶、二胺转运蛋白、二羧酸转运蛋白、氨基酸转运蛋白和多药转运蛋白。
实施方案3：根据实施方案1或2所述的实施方案，其中所述胺化脂族化合物具有C5-C19的碳链长度。
实施方案4：根据实施方案3所述的实施方案，其中所述胺化脂族化合物具有C6-C7的碳链长度。
实施方案5：根据实施方案4所述的实施方案，其中所述胺化脂族化合物为7-氨基庚酸(7-AHA)。
实施方案6：根据实施方案5所述的实施方案，其中所述重组生物体产生来自庚二酸或其一种或多种衍生物的7-AHA。
实施方案7：根据实施方案6所述的实施方案，其中所述一种或多种庚二酸衍生物包括庚二酸半醛、1，7-庚二醇、7-羟基庚酸或7-羟基庚醛。
实施方案8：根据实施方案7所述的实施方案，其中所述7-AHA的产生包括庚二酸半醛的转氨基作用。
实施方案9：根据实施方案4所述的实施方案，其中所述胺化脂族化合物为6-氨基己酸(6-AHA)。
实施方案10：根据实施方案4所述的实施方案，其中所述胺化脂族化合物为脂族氨基醇。
实施方案11：根据实施方案10所述的实施方案，其中所述脂族氨基醇为7-氨基庚醇。
实施方案12：根据实施方案10所述的实施方案，其中所述脂族氨基醇为6-氨基庚醇。
实施方案13：根据实施方案4所述的实施方案，其中所述胺化脂族化合物为二胺。
实施方案14：根据实施方案13所述的实施方案，其中所述二胺为七亚甲基二胺。
实施方案15：根据实施方案13所述的实施方案，其中所述二胺为六亚甲基二胺。
实施方案16：根据实施方案1至15中的任何实施方案所述的实施方案，其中所述ω-转氨酶分类为EC 2.6.1.18、EC 2.6.1.19、EC 2.6.1.29、EC 2.6.1.48或EC 2.6.1.82。
实施方案17：根据实施方案1至16中的任何实施方案所述的实施方案，其中与未被工程化以包含所述一种或多种外源、经修饰或过表达的多肽的对应生物体的ω-转氨酶活性相比，所述重组生物体具有增加的ω-转氨酶活性。
实施方案18：根据实施方案1至17中的任何实施方案所述的实施方案，其中与未被工程化以包含所述一种或多种外源、经修饰或过表达的多肽的对应生物体的收率相比，所述重组生物体以更高的收率产生所述胺化脂族化合物或其盐。
实施方案19：根据实施方案1至18中的任何实施方案所述的实施方案，其中所述一种或多种多肽中的至少一种多肽编码相对于野生型ω-转氨酶具有一个或多个氨基酸置换的经修饰的ω-转氨酶，并且其中所述置换位于SEQ ID NO：1的位置2、13、15、16、20、87、134、288或345处。
实施方案20：根据实施方案19所述的实施方案，其中所述一个或多个氨基酸置换位于所述至少一种编码所述经修饰的ω-转氨酶的多肽的小结合口袋(O形口袋)和/或大结合口袋(P形口袋)中。
实施方案21：根据实施方案19或20所述的实施方案，其中相对于所述野生型ω-转氨酶，所述经修饰的ω-转氨酶对目标脂族醛具有增强的胺化速率和/或对所述目标脂族醛具有改善的底物特异性。
实施方案22：根据实施方案19至21中的任何实施方案所述的实施方案，其中所述野生型ω-转氨酶与紫色色杆菌(Chromobacterium violaceum)ω-转氨酶具有至少70％的序列同一性。
实施方案23：根据实施方案19至22中的任何实施方案所述的实施方案，其中相对于所述野生型ω-转氨酶，所述经修饰的ω-转氨酶具有至少10％的更大活性。
实施方案24：根据实施方案19至23中的任何实施方案所述的实施方案，其中相对于所述野生型ω-转氨酶对氨基供体的Km，所述经修饰的ω-转氨酶对氨基供体具有降低的Km。
实施方案25：根据实施方案24所述的实施方案，其中所述氨基供体为L-丙氨酸。
实施方案26：根据实施方案24或25所述的实施方案，其中所述经修饰的ω-转氨酶对所述氨基供体具有小于4mmol-L-1的Km。
实施方案27：根据实施方案19至26所述的实施方案，其中相对于所述野生型ω-转氨酶对所述胺化脂族化合物的Km，所述经修饰的ω-转氨酶对所述胺化脂族化合物具有增加的Km。
实施方案28：根据实施方案1至27中的任何实施方案所述的实施方案，其中所述一种或多种肽中的至少一种肽编码能够催化所述胺化脂族化合物转化为内酰胺的环化酶。
实施方案29：根据实施方案28所述的实施方案，其中所述环化酶与丙酸梭菌(Clostridium propionicum)β-丙氨酸CoA转移酶具有至少70％的序列同一性。
实施方案30：根据实施方案28或29所述的实施方案，其中所述环化酶能够催化7-AHA转化为庚内酰胺。
实施方案31：根据实施方案1至30中的任何实施方案所述的实施方案，其中所述培养包括向所述重组生物体引入氨基供体，所述氨基供体为所述胺化脂族化合物的前体。
实施方案32：根据实施方案31所述的实施方案，其中所述胺化脂族化合物在大气压和20℃至65℃的温度下在微生物发酵条件下为挥发性的。
实施方案33：根据实施方案32所述的实施方案，其中所述氨基供体包括异丙胺。
实施方案34：根据实施方案1至30中的任何实施方案所述的实施方案，其中所述一种或多种多肽中的至少一种多肽编码氨基供体合成酶，所述氨基供体合成酶能够催化氨基供体的合成，所述氨基供体为所述胺化脂族化合物的前体。
实施方案35：根据实施方案32所述的实施方案，其中所述氨基供体合成酶为L-氨基酸脱氢酶。
实施方案36：根据实施方案35所述的实施方案，其中所述氨基供体合成酶为L-丙氨酸脱氢酶。
实施方案37：根据实施方案1至36中的任何实施方案所述的实施方案，其中所述一种或多种多肽中的至少一种多肽编码氨基酸转运蛋白，所述氨基酸转运蛋白能够催化所述胺化脂族化合物从所述生物体的输出。
实施方案38：根据实施方案37所述的实施方案，其中所述转运蛋白为赖氨酸输出蛋白。
实施方案39：根据实施方案1至38中的任何实施方案所述的实施方案，其中与未被工程化以包含所述一种或多种外源、经修饰或过表达的多肽的对应生物体相比，在由所述ω-转氨酶催化的逆反应中由所述胺化脂族化合物形成的至少一种产物的量减少。
实施方案40：根据实施方案39所述的实施方案，其中所述至少一种产物包含庚二酸半醛，并且其中所述胺化脂族化合物为7-AHA。
实施方案41：根据实施方案1至40中的任何实施方案所述的实施方案，还包括：纯化所述胺化脂族化合物。
实施方案42：根据实施方案1至41中的任何实施方案所述的实施方案，其中所述重组生物体是原核的。
实施方案43：根据实施方案1至41中的任何实施方案所述的实施方案，其中所述重组生物体是真核的。
实施方案44：根据实施方案1至43中的任何实施方案所述的实施方案，其中所述培养在有氧条件下进行。
实施方案45：根据实施方案1至43中的任何实施方案所述的实施方案，其中所述培养在厌氧条件下进行。
实施方案46：根据实施方案1至43中的任何实施方案所述的实施方案，其中所述培养在微需氧条件下进行。
实施方案47：根据实施方案1至46中的任何实施方案所述的实施方案，其中所述培养在氮、磷酸盐、碳或氧营养物质受限的条件下进行。
实施方案48：根据实施方案1至47中的任何实施方案所述的实施方案，其中所述培养包括向所述重组生物体引入来源于生物原料的碳源。
实施方案49：根据实施方案1至47中的任何实施方案所述的实施方案，其中所述培养包括向所述重组生物体引入来源于非生物原料的碳源。
实施方案50：根据实施方案1至49中的任何实施方案所述的实施方案，还包括：通过在具有增加浓度的所述胺化脂族化合物的选择性环境中定向进化和连续培养的方法来改善所述重组生物体的耐受性。
实施方案51：一种用于改善胺化脂族化合物的生物合成的方法，所述方法包括：a)提供能够生物合成胺化脂族化合物的生物体，其中所述生物体包含至少一种多肽，所述至少一种多肽编码与SEQ ID NO：1具有至少70％同一性的ω-转氨酶或其功能片段；以及b)在适于所述重组生物体产生所述胺化脂族化合物或其盐的条件下培养所述重组生物体，其中所述培养包括向所述重组生物体引入氨基供体，所述氨基供体为所述胺化脂族化合物的前体。
实施方案52：根据实施方案51所述的实施方案，其中所述胺化脂族化合物在大气压和20℃至65℃的温度下在微生物发酵条件下为挥发性的。
实施方案53：根据实施方案52所述的实施方案，其中所述氨基供体包括异丙胺。
实施方案54：根据实施方案51至53中的任何实施方案所述的实施方案，其中所述胺化脂族化合物具有C5-C19的碳链长度。
实施方案55：根据实施方案54所述的实施方案，其中所述胺化脂族化合物具有C6-C7的碳链长度。
实施方案56：根据实施方案55所述的实施方案，其中所述胺化脂族化合物为7-氨基庚酸(7-AHA)。
实施方案57：根据实施方案56所述的实施方案，其中所述重组生物体产生来自庚二酸或其一种或多种衍生物的7-AHA。
实施方案58：根据实施方案57所述的实施方案，其中所述一种或多种庚二酸衍生物包括庚二酸半醛、1，7-庚二醇、7-羟基庚酸或7-羟基庚醛。
实施方案59：根据实施方案58所述的实施方案，其中所述7-AHA的产生包括庚二酸半醛的转氨基作用。
实施方案60：根据实施方案55中的任何实施方案所述的实施方案，其中所述胺化脂族化合物为6-氨基己酸。
实施方案61：根据实施方案55所述的实施方案，其中所述胺化脂族化合物为脂族氨基醇。
实施方案62：根据实施方案61所述的实施方案，其中所述脂族氨基醇为7-氨基庚醇。
实施方案63：根据实施方案61所述的实施方案，其中所述脂族氨基醇为6-氨基庚醇。
实施方案64：根据实施方案55所述的实施方案，其中所述胺化脂族化合物为二胺。
实施方案65：根据实施方案64所述的实施方案，其中所述二胺为七亚甲基二胺。
实施方案66：根据实施方案64所述的实施方案，其中所述二胺为六亚甲基二胺。
实施方案67：根据实施方案51至66中的任何实施方案所述的实施方案，其中所述ω-转氨酶分类为EC 2.6.1.18、EC 2.6.1.19、EC 2.6.1.29、EC 2.6.1.48或EC 2.6.1.82。
实施方案68：根据实施方案51至67中的任何实施方案所述的实施方案，其中所述ω-转氨酶与紫色色杆菌(Chromobacterium violaceum)ω-转氨酶具有至少70％的序列同一性。
实施方案69：根据实施方案51至68中的任何实施方案所述的实施方案，还包括：纯化所述胺化脂族化合物。
实施方案70：根据实施方案51至69中的任何实施方案所述的实施方案，其中所述重组生物体是原核的。
实施方案71：根据实施方案51至69中的任何实施方案所述的实施方案，其中所述重组生物体是真核的。
实施方案72：根据实施方案51至71中的任何实施方案所述的实施方案，其中所述培养在有氧条件下进行。
实施方案73：根据实施方案51至71中的任何实施方案所述的实施方案，其中所述培养在厌氧条件下进行。
实施方案74：根据实施方案51至71中的任何实施方案所述的实施方案，其中所述培养在微需氧条件下进行。
实施方案75：根据实施方案51至74中的任何实施方案所述的实施方案，其中所述培养在营养物质受限的条件下进行。
实施方案76：根据实施方案51至75中的任何实施方案所述的实施方案，其中所述培养包括向所述重组生物体引入来源于生物原料的碳源。
实施方案77：根据实施方案51至75中的任何实施方案所述的实施方案，其中所述培养包括向所述重组生物体引入来源于非生物原料的碳源。
实施方案78：根据实施方案51至77中的任何实施方案所述的实施方案，还包括：通过在选择性环境中连续培养来改善所述重组生物体对增加浓度的所述胺化脂族化合物的耐受性。
实施方案79：一种重组生物体，所述重组生物体经工程化以包含一种或多种外源、经修饰或过表达的多肽；其中所述一种或多种多肽中的每一种多肽独立地编码胺化脂族化合物生物合成或输出途径的至少一种酶；并且其中所述一种或多种多肽中的至少一种多肽编码与SEQ ID NO：1具有至少70％同一性的ω-转氨酶或其功能片段。
实施方案80：根据实施方案79所述的实施方案，其包含两种或更多种外源、经修饰或过表达的多肽；并且其中所述两种或更多种多肽各自独立地编码选自由以下项组成的组的至少一种酶：ω-转氨酶、硫酯酶、羧酸还原酶、乙酰-CoA合成酶、β-丙氨酸CoA转移酶、6-磷酸葡糖酸脱氢酶、转酮醇酶、嘌呤核苷酸转氢酶、甘油醛-3P-脱氢酶、苹果酸酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、葡萄糖脱氢酶、果糖1，6二磷酸酶、L-丙氨酸脱氢酶、L-谷氨酸脱氢酶、甲酸脱氢酶、L-谷氨酰胺合成酶、二胺转运蛋白、二羧酸转运蛋白、氨基酸转运蛋白和多药转运蛋白。
实施方案81：根据实施方案79或80所述的实施方案，其中所述ω-转氨酶分类为EC2.6.1.18、EC 2.6.1.19、EC 2.6.1.29、EC 2.6.1.48或EC 2.6.1.82。
实施方案82：根据实施方案79至81中的任何实施方案所述的实施方案，其中与未被工程化以包含所述一种或多种外源、经修饰或过表达的多肽的对应生物体的ω-转氨酶活性相比，所述重组生物体具有增加的ω-转氨酶活性。
实施方案83：根据实施方案79至82中的任何实施方案所述的实施方案的重组生物体，其中与未被工程化以包含所述一种或多种外源、经修饰或过表达的多肽的对应生物体的收率相比，所述重组生物体以更高的收率产生所述胺化脂族化合物或其盐。
实施方案84：根据实施方案79至83中的任何实施方案所述的实施方案，其中所述一种或多种多肽中的至少一种多肽编码相对于野生型ω-转氨酶具有一个或多个氨基酸置换的经修饰的ω-转氨酶，并且其中所述置换位于SEQ ID NO：1的位置2、13、15、16、20、87、134、288或345处。
实施方案85：根据实施方案84中的任何实施方案所述的实施方案，其中所述一个或多个氨基酸置换位于所述至少一种编码所述经修饰的ω-转氨酶的多肽的小结合口袋(O形口袋)和/或大结合口袋(P形口袋)中。
实施方案86：根据实施方案84或85所述的实施方案，其中相对于所述野生型ω-转氨酶，所述经修饰的ω-转氨酶具有增加的活性和/或改善的底物特异性。
实施方案87：根据实施方案84至86中的任何实施方案所述的实施方案，其中所述野生型ω-转氨酶与紫色色杆菌(Chromobacterium violaceum)ω-转氨酶具有至少70％的序列同一性。
实施方案88：根据实施方案84至87中的任何实施方案所述的实施方案，其中相对于所述野生型ω-转氨酶，所述经修饰的ω-转氨酶具有至少10％的更大活性。
实施方案89：根据实施方案84至88中的任何实施方案所述的实施方案，其中相对于所述野生型ω-转氨酶对氨基供体的Km，所述经修饰的ω-转氨酶对氨基供体具有降低的Km。
实施方案90：根据实施方案89所述的实施方案，其中所述氨基供体为L-丙氨酸。
实施方案91：根据实施方案89或90所述的实施方案，其中所述经修饰的ω-转氨酶对所述氨基供体具有小于4mmol-L-1的Km。
实施方案92：根据实施方案84至91中的任何实施方案所述的实施方案，其中相对于所述野生型ω-转氨酶对所述胺化脂族化合物的Km，所述经修饰的ω-转氨酶对所述胺化脂族化合物具有增加的Km。
实施方案93：根据实施方案79至92中的任何实施方案所述的实施方案，其中所述一种或多种肽中的至少一种肽编码能够催化所述胺化脂族化合物转化为内酰胺的环化酶。
实施方案94：根据实施方案93所述的实施方案，其中所述环化酶与丙酸梭菌(Clostridium propionicum)β-丙氨酸CoA转移酶具有至少70％的序列同一性。
实施方案95：根据实施方案93或94中的任何实施方案所述的实施方案，其中所述环化酶能够催化7-AHA转化为庚内酰胺。
实施方案96：根据实施方案79至95中的任何实施方案所述的实施方案，其中所述一种或多种多肽中的至少一种多肽编码氨基供体合成酶，所述氨基供体合成酶能够催化氨基供体的合成，所述氨基供体为所述胺化脂族化合物的前体。
实施方案97：根据实施方案96所述的实施方案，其中所述氨基供体合成酶为L-氨基酸脱氢酶。
实施方案98：根据实施方案97所述的实施方案，其中所述氨基供体合成酶为L-丙氨酸脱氢酶。
实施方案99：根据实施方案79至98中的任何实施方案所述的实施方案，其中所述一种或多种多肽中的至少一种多肽编码氨基酸转运蛋白，所述氨基酸转运蛋白能够催化所述胺化脂族化合物从所述生物体的输出。
实施方案100：根据实施方案99所述的实施方案，其中所述转运蛋白为赖氨酸输出蛋白。
实施方案101：根据实施方案79至100中的任何实施方案所述的实施方案，其中与未被工程化以包含所述一种或多种外源、经修饰或过表达的多肽的对应生物体相比，在由所述ω-转氨酶催化的逆反应中由所述胺化脂族化合物形成的至少一种产物的量减少。
实施方案102：根据实施方案101所述的实施方案，其中所述至少一种产物包含庚二酸半醛，并且其中所述胺化脂族化合物为7-AHA。
实施方案103：根据实施方案79至102中的任何实施方案所述的实施方案，其中所述重组生物体是原核的。
实施方案104：根据实施方案79至102中的任何实施方案所述的实施方案，其中所述重组生物体是真核的。
实施方案105：一种用于改善己内酰胺的生物合成的方法，所述方法包括：a)提供能够生物合成己内酰胺的重组生物体；其中所述重组生物体已被工程化以包含两种或更多种外源、经修饰或过表达的多肽；其中所述一种或多种多肽中的每一种多肽独立地编码己内酰胺生物合成或输出途径的至少一种酶；其中所述两种或更多种多肽中的至少一种多肽编码与SEQ ID NO：1具有至少70％同一性的ω-转氨酶或其功能片段；并且其中所述两种或更多种多肽中的至少一种多肽编码β-丙氨酸CoA转移酶；b)在适于所述重组生物体将己二酸或己二酸衍生物转化为己内酰胺的条件下培养所述重组生物体；以及c)纯化所述己内酰胺。
实施方案106：根据实施方案105所述的实施方案，其中所述两种或更多种多肽中的至少一种多肽编码相对于野生型ω-转氨酶具有一个或多个氨基酸置换的经修饰的ω-转氨酶，并且其中所述置换位于SEQ ID NO：1的位置2、13、15、16、20、87、134、288或345处。
实施方案107：根据实施方案105或106所述的实施方案，其中所述两种或更多种编码β-丙氨酸CoA转移酶的多肽中的至少一种多肽将6-AHA转化为己内酰胺。
实施方案108：根据实施方案105至107中的任何实施方案所述的实施方案，其中所述ω-转氨酶分类为EC 2.6.1.18、EC 2.6.1.19、EC 2.6.1.29、EC 2.6.1.48或EC2.6.1.82。
实施方案109：根据实施方案105至108中的任何实施方案所述的实施方案，其中所述己二酸衍生物包括己二酰-ACP和己二酸半醛。
实施方案110：根据实施方案109所述的实施方案，其中所述己二酸或己二酸衍生物向己内酰胺的转化包括己二酸半醛的转氨基作用以产生6-AHA。
实施方案111：一种通过根据实施方案1至78和105至110中的任何实施方案所述的实施方案产生的碳链长度为C5-C19的生物衍生的胺化脂族化合物、庚内酰胺、己内酰胺或其盐。
实施方案112：一种产品，所述产品包含由根据实施方案111所述的实施方案产生的化学品，其中所述产品包括尼龙中间体、聚酯、药物、生物燃料、香料或食品添加剂。
实施方案112：根据实施方案中的任何实施方案所述的实施方案，一种生物衍生的、基于生物的或发酵衍生的产品，其中所述产品包含：i.组合物，所述组合物包含至少一种根据权利要求1至78和105至110中任一项所述产生或生物合成的生物衍生的、基于生物的或发酵衍生的化合物或其盐；ii.生物衍生的、基于生物的或发酵衍生的聚合物，所述生物衍生的、基于生物的或发酵衍生的聚合物包含i.的所述生物衍生的、基于生物的或发酵衍生的组合物或化合物或它们的任何组合；iii.生物衍生的、基于生物的或发酵衍生的树脂，所述生物衍生的、基于生物的或发酵衍生的树脂包含i.的所述生物衍生的、基于生物的或发酵衍生的化合物或所述生物衍生的、基于生物的或发酵衍生的组合物或它们的任何组合，或者ii.的所述生物衍生的、基于生物的或发酵衍生的聚合物或它们的任何组合；iv.物质，所述物质通过模制ii.的所述生物衍生的、基于生物的或发酵衍生的聚合物或iii.的所述生物衍生的、基于生物的或发酵衍生的树脂或它们的任何组合获得；v.生物衍生的、基于生物的或发酵衍生的制剂，所述生物衍生的、基于生物的或发酵衍生的制剂包含i.的所述生物衍生的、基于生物的或发酵衍生的组合物，i.的所述生物衍生的、基于生物的或发酵衍生的化合物，ii.的所述生物衍生的、基于生物的或发酵衍生的聚合物，iii.的所述生物衍生的、基于生物的或发酵衍生的树脂，或者iv的所述生物衍生的、基于生物的或发酵衍生的物质，或者它们的任何组合；或者vi.生物衍生的、基于生物的或发酵衍生的半固体或非半固体料流，所述生物衍生的、基于生物的或发酵衍生的半固体或非半固体料流包含i.的所述生物衍生的、基于生物的或发酵衍生的组合物，i.的所述生物衍生的、基于生物的或发酵衍生的化合物，ii.的所述生物衍生的、基于生物的或发酵衍生的聚合物，iii.的所述生物衍生的、基于生物的或发酵衍生的树脂，v.的所述生物衍生的、基于生物的或发酵衍生的制剂，或者iv.的所述生物衍生的、基于生物的或发酵衍生的模制物质，或者它们的任何组合。
实施例
仅以举例说明的方式而非限制的方式提供以下实施例。本领域的技术人员将容易认识到可被改变或修改以产生基本上相同或类似的结果的各种非关键参数。
进行研究以确定TA反应的低性能是底物依赖性的(即给定的氨基供体未被特定的TA有效用尽)还是平衡依赖性的(即庚二酸半醛向7-AHA本身的转氨基作用本质上是低效的，而与所用的氨基供体或转氨酶无关，例如，因为不利的反应热力学)以开发用于优化该代谢步骤的策略。因此，对来自不同生物体的ω-TAM变体进行广泛筛选以鉴定促进导致7-AHA产生水平增加的较高反应速率的TA。
在这种广泛筛选中，仅14％的筛选的TA候选物(1229个中的172个)是活性的。该列表缩小至17个来自不同生物体的TA，其在正反应(庚二酸半醛+L-丙氨酸--＞7-AHA+丙酮酸)中需要高浓度的L-丙氨酸(Km≈4-10mmol·L-1)并表现出非常慢的动力学。
基于该数据，假设给定的氨基供体未被特定的TA有效用尽，或者庚二酸半醛向7-AHA本身的转氨基作用本质上是低效的，而与所用的氨基供体或TA无关。
生物信息学分析
为了测试是否能鉴定更好的氨基供体，并且在进行体外测定之前，进行了旨在减少待测转氨酶的数量同时维持酶特征的相同多样性的生物信息学分析和文献研究，所述酶特征诸如预测的氨基供体、Pfam结构域和PLP结合位点附近的氨基酸序列。Pfam保守结构域研究表明，所有TA候选物属于氨基转移酶III类组。虽然在初始筛选中鉴定的17个TA中有14个包含BioA保守结构域(E-值＝0)，这将表明S-腺苷甲硫氨酸(SAM)为优选的氨基供体，但它们都与天冬氨酸和/或4-氨基丁酸转氨酶具有超过60％的序列同一性。在文献中没有发现TA对特定氨基供体和氨基受体活性的明确数据。
为了在从TA原始列表中鉴定的九个TA中维持相同水平的多样性，添加了基于在PLP结合位点附近观察到的氨基酸序列的附加选择标准。在分析磷酸吡哆醛(PLP)结合序列的存在(通过基于TA-Cv晶体结构的多重比对鉴定)并丢弃对庚二酸半醛具有最高Km(由Invista提供的数据)(除了对照TA-Vf和TA-Cv)和与列表中任何其他TA具有大于60％同一性(基于ClustalW多重比对)的候选物后，候选TA酶的列表缩小至9，包括TA-Cv和TA-Vf(表3)。这九种TA在体外进一步使用无细胞提取物(CFE)或纯化的酶进行表征。
表3生物信息学分析和文献研究后所选择的TA的列表。基于预测的氨基供体、磷酸吡哆醛(PLP)结合位点附近的氨基酸序列、对庚二酸半醛的Km值和与Invista提供的其他TA的％同一性来选择TA。
Figure BDA0002710330620000551
用TA CFE进行的初始体外氨基供体筛选(II0517-N7SD-WP2/3-26)
在该初始测试中，在衍生自包含对应TA质粒的IPTG诱导的培养物的无细胞提取物中测定9个所选择的TA(表3)对不同氨基供体的活性。作为重组蛋白在无细胞提取物中表达的内部对照，进行SDS-PAGE分析(图4)。除了TA_002(INV0743)之外，所有所选择的TA在SDS-PAGE上显示与预测分子量匹配的清晰可见的表达。
基于生物信息学分析和文献研究，将在筛选测定中鉴定的17个TA聚类成5个主要组，并鉴定9种TA，每种TA都具有假定代表整个列表的生化特性。出于实际和经济原因，筛选这些TA对甲基苄胺、异丙胺、L-丙氨酸、L-谷氨酸、β-丙氨酸和γ-氨基丁酸的活性；SAM不包括在该初步测试中。将从表达每种所选择的TA之一的IPTG诱导的培养物中获得的CFE与10mmol·L-1庚二酸半醛、0.2mmol·L-1PLP和50mmol·L-1氨基供体(或缓冲液)一起温育。在温育1小时后评估7-AHA产生(图5)；从对照菌株获得的CFE也包括在测定中作为比较。
当γ-氨基丁酸和L-丙氨酸用作氨基供体时，空载体对照菌株表现出7-AHA的显著产量，表明内源TA能够将庚二酸半醛转化为预期产物。有趣的是，即使没有向CFE中添加氨基供体，该对照也显示出7-AHA的产生，尽管具有大的标准偏差。评估的CFE通常也可分为对所测试的氨基供体的高(TA-vf、TA_015、TA_016、TA_017和TA-Cv)和低(TA_011、TA_012、TA_013和TA_002)活性。TA_002的CFE在使用所有氨基供体的情况下表现出最低水平的7-AHA(图5)，这与其在SDS-PAGE上缺乏可见的表达(图1)一致。与对所选择的TA(显示与4-氨基丁酸转氨酶超过60％的序列相似性)进行的生物信息学分析一致，γ-氨基丁酸和甲基苄胺在所有测试的CFE中表现出最高的7-AHA产量，不同的是TA_017和TA-Cv的CFE在L-丙氨酸存在下显示较高的7-AHA收率。
用CFE和纯化的TA进行的体外氨基供体筛选(II0517-N7SD-WP2/3-66)
基于先前在空载体对照样品中显示出显著的7-AHA产量的CFE结果，对纯化的TA进行附加的体外测试以区分背景响应和TA活性。为了显示重现性，还同时重复CFE测试。为此，除了用作阳性对照的TA-Cv外，还用L-丙氨酸(其在先前的测试中对TA_017和TA-Cv表现出特别高的活性)、γ-氨基丁酸(其在所有TA中表现出高活性)和SAM(其基于生物信息学分析被预测为所有TA的氨基供体)筛选来自高活性组的2个TA(TA_15和TA_017)和来自低活性组的一个TA(TA_11)。
通过将CFE与Ni-NTA琼脂糖树脂一起温育，然后用递增浓度的咪唑洗涤和洗脱，生成每个TA的纯化重组蛋白级分。在用200mmol·L-1咪唑洗脱后，得到相对纯的和浓缩的TA级分(洗脱液2，泳道9；图6)。将这些洗脱级分透析过夜并用于随后的体外测定。将300gLCFE或1.5μmol·L-1的每种相应的纯化TA与5mmol·L-1庚二酸半醛、0.1mmol·L-1PLP和25mmol·L-1氨基供体(L-丙氨酸、SAM、GABA或无氨基供体)一起温育。在纯化的TA测定(无酶对照)和基于CFE的测定(空载体对照CFE)中均包括阴性对照。从反应开始1h，评估7-AHA和庚二酸的产量(图7)。
在使用纯化的TA的测定中检测到低水平的庚二酸(4％转化率)，表明庚二酸半醛在1h测定期间相对稳定。有趣的是，所有测试的TA均显示出对作为氨基供体的L-丙氨酸和GABA的活性。在所有测试的TA中观察到A≈1mmol L-1的7-AHA(20％转化率)。然而，用SAM进行酶温育时，没有产生7-AHA。这些结果显示使用CFE或纯化的TA的两个实验之间的良好匹配。考虑到在测试的不同TA和氨基供体之间7-AHA的相当收率，7-AHA途径中TA步骤的总体低性能似乎是由于不利的反应平衡，而不是与特定的酶相关联。
基于此，假设在先前的实验中观察到的低转化效率可能是由于产物回路，由此ω-TAM将7-AHA再循环回庚二酸半醛。与此一致，当L-丙氨酸或6-ACA用作TA-Cv的氨基供体时，检测到类似水平的7-AHA。
ω-TAM反应产物回路的评估
由ω-TAM催化的反应是可逆的，因为制得的7-AHA继而可用作逆反应中的氨基供体，从而再生庚二酸半醛。先前的结果已经证实了纯化的紫色色杆菌TA(TA-Cv)在正反应中对作为氨基供体的L-丙氨酸和GABA的活性。为了评估产物回路的出现，其中7-AHA用作氨基供体以在逆反应中再生庚二酸半醛，在将TA-Cv与庚二酸半醛(氨基受体)以及L-丙氨酸(氨基供体)、6-ACA(在逆反应中用作7-AHA的替代物)或两者一起温育1小时后测量7-AHA水平。当L-丙氨酸或6-ACA用作庚二酸半醛的独立氨基供体时，检测到类似水平的7-AHA(1-1.5mmol·L-1)，表明出现了其中6-ACA以相当的效率转氨基为庚二酸半醛的产物回路。此外，L-丙氨酸和6-ACA与庚二酸半醛的同时温育不进一步增加7-AHA产物形成，证实TA-Cv可使用两种底物作为氨基供体以用于转氨基反应，从而导致产物回路的出现。
ω-TAM反应产物回路的评估(II0517-N7SD-WP2/3-70)
由ω-TAM催化的反应是可逆的，因为制得的7-AHA继而可用作逆反应中的氨基供体，从而再生庚二酸半醛。先前的结果已经证实了纯化的TA-Cv在正反应中对作为氨基供体的L-丙氨酸和GABA的活性。为了评估产物回路的出现，其中7-AHA用作氨基供体以在逆反应中再生庚二酸半醛，在将TA-Cv与庚二酸半醛(氨基受体)以及L-丙氨酸(氨基供体)、6-ACA(在逆反应中用作7-AHA的替代物)或两者一起温育1小时后测量7-AHA水平。
如图8所示，当L-丙氨酸或6-ACA用作庚二酸半醛的独立氨基供体时，检测到类似水平的7-AHA(1-1.5mmol L-1)，表明出现了其中6-ACA以相当的效率转氨基为庚二酸半醛的产物回路。此外，L-丙氨酸和6-ACA与庚二酸半醛的同时温育不进一步增加7-AHA产物形成，证实TA-Cv可使用两种底物作为氨基供体以用于转氨基反应，从而导致产物回路的出现。
环化
除去所产生的7-AHA是使ω-TAM反应平衡偏移并防止观察到的导致庚二酸半醛向7-AHA的转化效率降低的产物回路的潜在策略。在最近的论文中，Chae等人(“Metabolicengineering of Escherichiacoli for the production of four-，five-and six-carbon lactams”，Metabolic Engineering，第41卷：第82-91页(2017年))报道了从相应ω-氨基酸产生六碳内酰胺(己内酰胺)的新的和有效的代谢途径的构建。当7-AHA用作底物时，该体系不产生任何庚内酰胺(七碳内酰胺)，可能是因为C7ω-氨基酰基-CoA通过连接胺和CoA官能团进行环化的机会较低。
该工作的目的是确定是否可使用6-ACA(7-AHA的6-碳等价物)环化为己内酰胺来使ω-TAM反应朝向体外产物的形成偏移。Chae等人已经表明，6-ACA向己内酰胺的转化为两步反应：丙酸梭菌β-丙氨酸CoA转移酶(CpACT)催化CoA转移至6-ACA，从而产生6-ACA-CoA；随后，活化的6-ACA发生自发环化，从而导致己内酰胺形成。因此，进行研究以确定是否可使用6-ACA(7-AHA的6-碳等价物)环化为己内酰胺来使ω-TAM反应朝向产物的形成偏移。
对于体外测定，通过测量与己二酸半醛和纯化的ω-TAM一起温育时己内酰胺的形成来评估纯化的CpACT活性和使ω-TAM反应偏移的能力。进行体外测试以确定重组CpACT是否具有活性以及该酶能够使ω-TAM反应的平衡偏移至何种程度。在这些研究中，CpACT具有活性并且能够在体外部分地使ω-TAM反应的平衡偏移。
对于体内测定，可在携带6-ACA途径(CAR、TAM、lysE、sfp)的底部部分以及CpACT的菌株中评估己内酰胺产生，这两者均在增加强度的组成型启动子(ProC或ProD)的控制下。构建的质粒可在对照ΔbioF和ΔbioFΔ12ADH(ΔybbO ΔyahK ΔahR ΔahdP ΔyqhD ΔyiaY ΔfucO ΔeutG ΔdkgA ΔyghZ ΔdkgB ΔydfG)两者的遗传背景中测试，以评估内源醇脱氢酶基因对产物形成的影响。可评估这些菌株相对于空载体对照的生长、CpACT表达水平和己内酰胺形成。

Claims (113)

1.一种用于改善胺化脂族化合物的生物合成的方法，所述方法包括：
a)提供能够生物合成胺化脂族化合物的重组生物体；其中所述重组生物体已被工程化以包含一种或多种外源、经修饰或过表达的多肽；其中所述一种或多种多肽中的每一种多肽独立地编码胺化脂族化合物生物合成或输出途径的至少一种酶；并且其中所述一种或多种多肽中的至少一种多肽编码与SEQ ID NO：1具有至少70％同一性的ω-转氨酶或其功能片段；以及
b)在适于所述重组生物体产生所述胺化脂族化合物或其盐的条件下培养所述重组生物体。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述重组生物体已被工程化以包含两种或更多种外源、经修饰或过表达的多肽；并且其中所述两种或更多种多肽各自独立地编码选自由以下项组成的组的至少一种酶：ω-转氨酶、硫酯酶、羧酸还原酶、乙酰-CoA合成酶、β-丙氨酸CoA转移酶、6-磷酸葡糖酸脱氢酶、转酮醇酶、嘌呤核苷酸转氢酶、甘油醛-3P-脱氢酶、苹果酸酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、葡萄糖脱氢酶、果糖1，6二磷酸酶、L-丙氨酸脱氢酶、L-谷氨酸脱氢酶、甲酸脱氢酶、L-谷氨酰胺合成酶、二胺转运蛋白、二羧酸转运蛋白、氨基酸转运蛋白和多药转运蛋白。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述胺化脂族化合物具有C5-C19的碳链长度。
4.根据权利要求3所述的方法，其中所述胺化脂族化合物具有C6-C7的碳链长度。
5.根据权利要求4所述的方法，其中所述胺化脂族化合物为7-氨基庚酸(7-AHA)。
6.根据权利要求5所述的方法，其中所述重组生物体产生来自庚二酸或其一种或多种衍生物的7-AHA。
7.根据权利要求6所述的方法，其中所述一种或多种庚二酸衍生物包括庚二酸半醛、1，7-庚二醇、7-羟基庚酸或7-羟基庚醛。
8.根据权利要求7所述的方法，其中所述7-AHA的产生包括庚二酸半醛的转氨基作用。
9.根据权利要求4所述的方法，其中所述胺化脂族化合物为6-氨基己酸(6-AHA)。
10.根据权利要求4所述的方法，其中所述胺化脂族化合物为脂族氨基醇。
11.根据权利要求10所述的方法，其中所述脂族氨基醇为7-氨基庚醇。
12.根据权利要求10所述的方法，其中所述脂族氨基醇为6-氨基庚醇。
13.根据权利要求4所述的方法，其中所述胺化脂族化合物为二胺。
14.根据权利要求13所述的方法，其中所述二胺为七亚甲基二胺。
15.根据权利要求13所述的方法，其中所述二胺为六亚甲基二胺。
16.根据权利要求1至15中任一项所述的方法，其中所述ω-转氨酶分类为EC2.6.1.18、EC 2.6.1.19、EC 2.6.1.29、EC 2.6.1.48或EC 2.6.1.82。
17.根据权利要求1至16中任一项所述的方法，其中与未被工程化以包含所述一种或多种外源、经修饰或过表达的多肽的对应生物体的ω-转氨酶活性相比，所述重组生物体具有增加的ω-转氨酶活性。
18.根据权利要求1至17中任一项所述的方法，其中与未被工程化以包含所述一种或多种外源、经修饰或过表达的多肽的对应生物体的收率相比，所述重组生物体以更高的收率产生所述胺化脂族化合物或其盐。
19.根据权利要求1至18中任一项所述的方法，其中所述一种或多种多肽中的至少一种多肽编码相对于野生型ω-转氨酶具有一个或多个氨基酸置换的经修饰的ω-转氨酶，并且其中所述置换位于SEQ ID NO：1的位置2、13、15、16、20、87、134、288或345处。
20.根据权利要求19所述的方法，其中所述一个或多个氨基酸置换位于所述至少一种编码所述经修饰的ω-转氨酶的多肽的小结合口袋(O形口袋)和/或大结合口袋(P形口袋)中。
21.根据权利要求19或20所述的方法，其中相对于所述野生型ω-转氨酶，所述经修饰的ω-转氨酶对目标脂族醛具有增强的胺化速率和/或对所述目标脂族醛具有改善的底物特异性。
22.根据权利要求19至21中任一项所述的方法，其中所述野生型ω-转氨酶与紫色色杆菌(Chromobacterium violaceum)ω-转氨酶具有至少70％的序列同一性。
23.根据权利要求19至22中任一项所述的方法，其中相对于所述野生型ω-转氨酶，所述经修饰的ω-转氨酶具有至少10％的更大活性。
24.根据权利要求19至23中任一项所述的方法，其中相对于所述野生型ω-转氨酶对氨基供体的Km，所述经修饰的ω-转氨酶对氨基供体具有降低的Km。
25.根据权利要求24所述的方法，其中所述氨基供体为L-丙氨酸。
26.根据权利要求24或25所述的方法，其中所述经修饰的ω-转氨酶对所述氨基供体具有小于4mmol-L-1的Km。
27.根据权利要求19至26中任一项所述的方法，其中相对于所述野生型ω-转氨酶对所述胺化脂族化合物的Km，所述经修饰的ω-转氨酶对所述胺化脂族化合物具有增加的Km。
28.根据权利要求1至27中任一项所述的方法，其中所述一种或多种肽中的至少一种肽编码能够催化所述胺化脂族化合物转化为内酰胺的环化酶。
29.根据权利要求28所述的方法，其中所述环化酶与丙酸梭菌(Clostridiumpropionicum)β-丙氨酸CoA转移酶具有至少70％的序列同一性。
30.根据权利要求28或29所述的方法，其中所述环化酶能够催化7-AHA转化为庚内酰胺。
31.根据权利要求1至30中任一项所述的方法，其中所述培养包括向所述重组生物体引入氨基供体，所述氨基供体为所述胺化脂族化合物的前体。
32.根据权利要求31所述的方法，其中所述胺化脂族化合物在大气压和20℃至65℃的温度下在微生物发酵条件下为挥发性的。
33.根据权利要求32所述的方法，其中所述氨基供体包括异丙胺。
34.根据权利要求1至30中任一项所述的方法，其中所述一种或多种多肽中的至少一种多肽编码氨基供体合成酶，所述氨基供体合成酶能够催化氨基供体的合成，所述氨基供体为所述胺化脂族化合物的前体。
35.根据权利要求32所述的方法，其中所述氨基供体合成酶为L-氨基酸脱氢酶。
36.根据权利要求35所述的方法，其中所述氨基供体合成酶为L-丙氨酸脱氢酶。
37.根据权利要求1至36中任一项所述的方法，其中所述一种或多种多肽中的至少一种多肽编码氨基酸转运蛋白，所述氨基酸转运蛋白能够催化所述胺化脂族化合物从所述生物体的输出。
38.根据权利要求37所述的方法，其中所述转运蛋白为赖氨酸输出蛋白。
39.根据权利要求1至38中任一项所述的方法，其中与未被工程化以包含所述一种或多种外源、经修饰或过表达的多肽的对应生物体相比，在由所述ω-转氨酶催化的逆反应中由所述胺化脂族化合物形成的至少一种产物的量减少。
40.根据权利要求39所述的方法，其中所述至少一种产物包含庚二酸半醛，并且其中所述胺化脂族化合物为7-AHA。
41.根据权利要求1至40中任一项所述的方法，还包括：
纯化所述胺化脂族化合物。
42.根据权利要求1至41中任一项所述的方法，其中所述重组生物体是原核的。
43.根据权利要求1至41中任一项所述的方法，其中所述重组生物体是真核的。
44.根据权利要求1至43中任一项所述的方法，其中所述培养在有氧条件下进行。
45.根据权利要求1至43中任一项所述的方法，其中所述培养在厌氧条件下进行。
46.根据权利要求1至43中任一项所述的方法，其中所述培养在微需氧条件下进行。
47.根据权利要求1至46中任一项所述的方法，其中所述培养在氮、磷酸盐、碳或氧营养物质受限的条件下进行。
48.根据权利要求1至47中任一项所述的方法，其中所述培养包括向所述重组生物体引入来源于生物原料的碳源。
49.根据权利要求1至47中任一项所述的方法，其中所述培养包括向所述重组生物体引入来源于非生物原料的碳源。
50.根据权利要求1至49中任一项所述的方法，还包括：
通过在具有增加浓度的所述胺化脂族化合物的选择性环境中定向进化和连续培养的方法来改善所述重组生物体的耐受性。
51.一种用于改善胺化脂族化合物的生物合成的方法，所述方法包括：
a)提供能够生物合成胺化脂族化合物的生物体，其中所述生物体包含至少一种多肽，所述至少一种多肽编码与SEQ ID NO：1具有至少70％同一性的ω-转氨酶或其功能片段；以及
b)在适于所述重组生物体产生所述胺化脂族化合物或其盐的条件下培养所述重组生物体，其中所述培养包括向所述重组生物体引入氨基供体，所述氨基供体为所述胺化脂族化合物的前体。
52.根据权利要求51所述的方法，其中所述胺化脂族化合物在大气压和20℃至65℃的温度下在微生物发酵条件下为挥发性的。
53.根据权利要求52所述的方法，其中所述氨基供体包括异丙胺。
54.根据权利要求51至53中任一项所述的方法，其中所述胺化脂族化合物具有C5-C19的碳链长度。
55.根据权利要求54所述的方法，其中所述胺化脂族化合物具有C6-C7的碳链长度。
56.根据权利要求55所述的方法，其中所述胺化脂族化合物为7-氨基庚酸(7-AHA)。
57.根据权利要求56所述的方法，其中所述重组生物体产生来自庚二酸或其一种或多种衍生物的7-AHA。
58.根据权利要求57所述的方法，其中所述一种或多种庚二酸衍生物包括庚二酸半醛、1，7-庚二醇、7-羟基庚酸或7-羟基庚醛。
59.根据权利要求58所述的方法，其中所述7-AHA的产生包括庚二酸半醛的转氨基作用。
60.根据权利要求55所述的方法，其中所述胺化脂族化合物为6-氨基己酸。
61.根据权利要求55所述的方法，其中所述胺化脂族化合物为脂族氨基醇。
62.根据权利要求61所述的方法，其中所述脂族氨基醇为7-氨基庚醇。
63.根据权利要求61所述的方法，其中所述脂族氨基醇为6-氨基庚醇。
64.根据权利要求55所述的方法，其中所述胺化脂族化合物为二胺。
65.根据权利要求64所述的方法，其中所述二胺为七亚甲基二胺。
66.根据权利要求64所述的方法，其中所述二胺为六亚甲基二胺。
67.根据权利要求51至66中任一项所述的方法，其中所述ω-转氨酶分类为EC2.6.1.18、EC 2.6.1.19、EC 2.6.1.29、EC 2.6.1.48或EC 2.6.1.82。
68.根据权利要求51至67中任一项所述的方法，其中所述ω-转氨酶与紫色色杆菌(Chromobacterium violaceum)ω-转氨酶具有至少70％的序列同一性。
69.根据权利要求51至68中任一项所述的方法，还包括：纯化所述胺化脂族化合物。
70.根据权利要求51至69中任一项所述的方法，其中所述重组生物体是原核的。
71.根据权利要求51至69中任一项所述的方法，其中所述重组生物体是真核的。
72.根据权利要求51至71中任一项所述的方法，其中所述培养在有氧条件下进行。
73.根据权利要求51至71中任一项所述的方法，其中所述培养在厌氧条件下进行。
74.根据权利要求51至71中任一项所述的方法，其中所述培养在微需氧条件下进行。
75.根据权利要求51至74中任一项所述的方法，其中所述培养在营养物质受限的条件下进行。
76.根据权利要求51至75中任一项所述的方法，其中所述培养包括向所述重组生物体引入来源于生物原料的碳源。
77.根据权利要求51至75中任一项所述的方法，其中所述培养包括向所述重组生物体引入来源于非生物原料的碳源。
78.根据权利要求51至77中任一项所述的方法，还包括：
通过在选择性环境中连续培养来改善所述重组生物体对增加浓度的所述胺化脂族化合物的耐受性。
79.一种重组生物体，所述重组生物体经工程化以包含一种或多种外源、经修饰或过表达的多肽；其中所述一种或多种多肽中的每一种多肽独立地编码胺化脂族化合物生物合成或输出途径的至少一种酶；并且其中所述一种或多种多肽中的至少一种多肽编码与SEQ IDNO：1具有至少70％同一性的ω-转氨酶或其功能片段。
80.根据权利要求79所述的重组生物体，其包含两种或更多种外源、经修饰或过表达的多肽；并且其中所述两种或更多种多肽各自独立地编码选自由以下项组成的组的至少一种酶：ω-转氨酶、硫酯酶、羧酸还原酶、乙酰-CoA合成酶、β-丙氨酸CoA转移酶、6-磷酸葡糖酸脱氢酶、转酮醇酶、嘌呤核苷酸转氢酶、甘油醛-3P-脱氢酶、苹果酸酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、葡萄糖脱氢酶、果糖1，6二磷酸酶、L-丙氨酸脱氢酶、L-谷氨酸脱氢酶、甲酸脱氢酶、L-谷氨酰胺合成酶、二胺转运蛋白、二羧酸转运蛋白、氨基酸转运蛋白和多药转运蛋白。
81.根据权利要求79或80所述的重组生物体，其中所述ω-转氨酶分类为EC 2.6.1.18、EC 2.6.1.19、EC 2.6.1.29、EC 2.6.1.48或EC 2.6.1.82。
82.根据权利要求79至81中任一项所述的重组生物体，其中与未被工程化以包含所述一种或多种外源、经修饰或过表达的多肽的对应生物体的ω-转氨酶活性相比，所述重组生物体具有增加的ω-转氨酶活性。
83.根据权利要求79至82中任一项所述的重组生物体，其中与未被工程化以包含所述一种或多种外源、经修饰或过表达的多肽的对应生物体的收率相比，所述重组生物体以更高的收率产生所述胺化脂族化合物或其盐。
84.根据权利要求79至83中任一项所述的重组生物体，其中所述一种或多种多肽中的至少一种多肽编码相对于野生型ω-转氨酶具有一个或多个氨基酸置换的经修饰的ω-转氨酶，并且其中所述置换位于SEQ ID NO：1的位置2、13、15、16、20、87、134、288或345处。
85.根据权利要求84所述的重组生物体，其中所述一个或多个氨基酸置换位于所述至少一种编码所述经修饰的ω-转氨酶的多肽的小结合口袋(O形口袋)和/或大结合口袋(P形口袋)中。
86.根据权利要求84或85所述的重组生物体，其中相对于所述野生型ω-转氨酶，所述经修饰的ω-转氨酶具有增加的活性和/或改善的底物特异性。
87.根据权利要求84至86中任一项所述的重组生物体，其中所述野生型ω-转氨酶与紫色色杆菌(Chromobacterium violaceum)ω-转氨酶具有至少70％的序列同一性。
88.根据权利要求84至87中任一项所述的重组生物体，其中相对于所述野生型ω-转氨酶，所述经修饰的ω-转氨酶具有至少10％的更大活性。
89.根据权利要求84至88中任一项所述的重组生物体，其中相对于所述野生型ω-转氨酶对氨基供体的Km，所述经修饰的ω-转氨酶对氨基供体具有降低的Km。
90.根据权利要求89所述的重组生物体，其中所述氨基供体为L-丙氨酸。
91.根据权利要求89或90所述的重组生物体，其中所述经修饰的ω-转氨酶对所述氨基供体具有小于4mmol-L-1的Km。
92.根据权利要求84至91中任一项所述的重组生物体，其中相对于所述野生型ω-转氨酶对所述胺化脂族化合物的Km，所述经修饰的ω-转氨酶对所述胺化脂族化合物具有增加的Km。
93.根据权利要求79至92中任一项所述的重组生物体，其中所述一种或多种肽中的至少一种肽编码能够催化所述胺化脂族化合物转化为内酰胺的环化酶。
94.根据权利要求93所述的重组生物体，其中所述环化酶与丙酸梭菌(Clostridiumpropionicum)β-丙氨酸CoA转移酶具有至少70％的序列同一性。
95.根据权利要求93或94所述的重组生物体，其中所述环化酶能够催化7-AHA转化为庚内酰胺。
96.根据权利要求79至95中任一项所述的重组生物体，其中所述一种或多种多肽中的至少一种多肽编码氨基供体合成酶，所述氨基供体合成酶能够催化氨基供体的合成，所述氨基供体为所述胺化脂族化合物的前体。
97.根据权利要求96所述的重组生物体，其中所述氨基供体合成酶为L-氨基酸脱氢酶。
98.根据权利要求97所述的重组生物体，其中所述氨基供体合成酶为L-丙氨酸脱氢酶。
99.根据权利要求79至98中任一项所述的重组生物体，其中所述一种或多种多肽中的至少一种多肽编码氨基酸转运蛋白，所述氨基酸转运蛋白能够催化所述胺化脂族化合物从所述生物体的输出。
100.根据权利要求99所述的重组生物体，其中所述转运蛋白为赖氨酸输出蛋白。
101.根据权利要求79至100中任一项所述的重组生物体，其中与未被工程化以包含所述一种或多种外源、经修饰或过表达的多肽的对应生物体相比，在由所述ω-转氨酶催化的逆反应中由所述胺化脂族化合物形成的至少一种产物的量减少。
102.根据权利要求101所述的重组生物体，其中所述至少一种产物包含庚二酸半醛，并且其中所述胺化脂族化合物为7-AHA。
103.根据权利要求79至102中任一项所述的重组生物体，其中所述重组生物体是原核的。
104.根据权利要求79至102中任一项所述的重组生物体，其中所述重组生物体是真核的。
105.一种用于改善己内酰胺的生物合成的方法，所述方法包括：
a)提供能够生物合成己内酰胺的重组生物体；其中所述重组生物体已被工程化以包含两种或更多种外源、经修饰或过表达的多肽；其中所述一种或多种多肽中的每一种多肽独立地编码己内酰胺生物合成或输出途径的至少一种酶；其中所述两种或更多种多肽中的至少一种多肽编码与SEQ ID NO：1具有至少70％同一性的ω-转氨酶或其功能片段；并且其中所述两种或更多种多肽中的至少一种多肽编码β-丙氨酸CoA转移酶；
b)在适于所述重组生物体将己二酸或己二酸衍生物转化为己内酰胺的条件下培养所述重组生物体；以及
c)纯化所述己内酰胺。
106.根据权利要求105所述的方法，其中所述两种或更多种多肽中的至少一种多肽编码相对于野生型ω-转氨酶具有一个或多个氨基酸置换的经修饰的ω-转氨酶，并且其中所述置换位于SEQ ID NO：1的位置2、13、15、16、20、87、134、288或345处。
107.根据权利要求105或106所述的方法，其中所述两种或更多种编码β-丙氨酸CoA转移酶的多肽中的至少一种多肽将6-AHA转化为己内酰胺。
108.根据权利要求105至107中任一项所述的方法，其中所述ω-转氨酶分类为EC2.6.1.18、EC 2.6.1.19、EC 2.6.1.29、EC 2.6.1.48或EC 2.6.1.82。
109.根据权利要求105至108中任一项所述的方法，其中所述己二酸衍生物包括己二酰-ACP和己二酸半醛。
110.根据权利要求109所述的方法，其中所述己二酸或己二酸衍生物向己内酰胺的转化包括己二酸半醛的转氨基作用以产生6-AHA。
111.一种通过根据权利要求1至78和105至110中任一项所述的方法产生的碳链长度为C5-C19的生物衍生的胺化脂族化合物、庚内酰胺、己内酰胺或其盐。
112.一种产品，所述产品包含由根据权利要求111所述的生物衍生产物产生的化学品，其中所述产品包括尼龙中间体、聚酯、药物、生物燃料、香料或食品添加剂。
113.一种生物衍生的、基于生物的或发酵衍生的产品，其中所述产品包含：
i.组合物，所述组合物包含至少一种根据权利要求1至78和105至110中任一项所述产生或生物合成的生物衍生的、基于生物的或发酵衍生的化合物或其盐；
ii.生物衍生的、基于生物的或发酵衍生的聚合物，所述生物衍生的、基于生物的或发酵衍生的聚合物包含i.的所述生物衍生的、基于生物的或发酵衍生的组合物或化合物或它们的任何组合；
iii.生物衍生的、基于生物的或发酵衍生的树脂，所述生物衍生的、基于生物的或发酵衍生的树脂包含i.的所述生物衍生的、基于生物的或发酵衍生的化合物或所述生物衍生的、基于生物的或发酵衍生的组合物或它们的任何组合，或者ii.的所述生物衍生的、基于生物的或发酵衍生的聚合物或它们的任何组合；
iv.物质，所述物质通过模制ii.的所述生物衍生的、基于生物的或发酵衍生的聚合物或iii.的所述生物衍生的、基于生物的或发酵衍生的树脂或它们的任何组合获得；
v.生物衍生的、基于生物的或发酵衍生的制剂，所述生物衍生的、基于生物的或发酵衍生的制剂包含i.的所述生物衍生的、基于生物的或发酵衍生的组合物，i.的所述生物衍生的、基于生物的或发酵衍生的化合物，ii.的所述生物衍生的、基于生物的或发酵衍生的聚合物，iii.的所述生物衍生的、基于生物的或发酵衍生的树脂，或者iv的所述生物衍生的、基于生物的或发酵衍生的物质，或者它们的任何组合；或者
vi.生物衍生的、基于生物的或发酵衍生的半固体或非半固体料流，所述生物衍生的、基于生物的或发酵衍生的半固体或非半固体料流包含i.的所述生物衍生的、基于生物的或发酵衍生的组合物，i.的所述生物衍生的、基于生物的或发酵衍生的化合物，ii.的所述生物衍生的、基于生物的或发酵衍生的聚合物，iii.的所述生物衍生的、基于生物的或发酵衍生的树脂，v.的所述生物衍生的、基于生物的或发酵衍生的制剂，或者iv.的所述生物衍生的、基于生物的或发酵衍生的模制物质，或者它们的任何组合。
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Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109312311A (zh) * 2016-03-17 2019-02-05 英威达纺织（英国）有限公司 具有改善的活性的多肽和变体、其相关的材料和方法
CN113583884A (zh) * 2021-08-21 2021-11-02 吉林农业大学 一种产γ-氨基丁酸的发酵培养基及生产方法
CN114763372A (zh) * 2021-01-13 2022-07-19 中国科学院天津工业生物技术研究所 具有l-脯氨酸外排功能的蛋白及其应用
CN115335391A (zh) * 2021-04-07 2022-11-11 Cj第一制糖株式会社 新支链氨基酸通透酶变体及使用其生产l-缬氨酸的方法

Families Citing this family (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP3775182A1 (en) 2018-03-30 2021-02-17 INVISTA Textiles (U.K.) Limited Materials and methods for biosynthetic manufacture of pimelic acid and utilization of synthetic polypeptides
EP3775241A1 (en) 2018-03-30 2021-02-17 INVISTA Textiles (U.K.) Limited Methods for controlling oxygen concentration during aerobic biosynthesis
WO2019191772A1 (en) 2018-03-30 2019-10-03 Invista North America S.A.R.L Materials and methods for biosynthetic manufacture of carbon-based chemicals
EP3788135A1 (en) 2018-05-02 2021-03-10 INVISTA Textiles (U.K.) Limited Materials and methods for controlling oxidation and reduction in biosynthetic pathways of species of the genera ralstonia and cupriavidus and organisms related thereto
US11702680B2 (en) 2018-05-02 2023-07-18 Inv Nylon Chemicals Americas, Llc Materials and methods for controlling PHA biosynthesis in PHA-generating species of the genera Ralstonia or Cupriavidus and organisms related thereto
WO2019213019A1 (en) 2018-05-02 2019-11-07 Invista North America S.A.R.L. Materials and methods for differential biosynthesis in species of the genera ralstonia and cupriavidus and organisms related thereto
WO2019213028A1 (en) 2018-05-02 2019-11-07 Invista North America S.A.R.L. Materials and methods for controlling regulation in biosynthesis in species of the genera ralstonia or cupriavidus and organisms related thereto

Citations (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20020192786A1 (en) * 1997-04-23 2002-12-19 Kaneka Corporation Producing optically active amino compounds
US20060228788A1 (en) * 2004-12-10 2006-10-12 Sachin Pannuri Thermostable omega-transaminases
JP2007185133A (ja) * 2006-01-12 2007-07-26 Daicel Chem Ind Ltd アミントランスアミナーゼ、および該アミントランスアミナーゼを利用した光学活性アミンの製造方法
US20140186904A1 (en) * 2012-12-31 2014-07-03 INVISTA North America S.á r.l. Methods Of Producing 7-Carbon Chemicals Via Methyl-Ester Shielded Carbon Chain Elongation
CN104328093A (zh) * 2013-11-26 2015-02-04 凯莱英医药集团（天津）股份有限公司 R型ω-转氨酶及其应用
CN104894148A (zh) * 2015-04-13 2015-09-09 浙江科技学院 一种ω-转氨酶突变体基因及其应用
US20150361458A1 (en) * 2014-06-16 2015-12-17 INVISTA North America S.á r.l. Methods, reagents and cells for biosynthesizing compound
US20160257976A1 (en) * 2013-05-06 2016-09-08 Korea Research Institute Of Bioscience And Biotechnology Biological Synthesis of 6-Aminocaproic Acid and Transgenic Microorganism Therefor
US20170159082A1 (en) * 2015-12-04 2017-06-08 Invista North America S.A.R.L. Methods and materials for producing 7-carbon monomers
US20170218406A1 (en) * 2016-02-01 2017-08-03 Invista North America S.A.R.L. Methods and Materials for Producing 7-Carbon Monomers
CN107109444A (zh) * 2014-11-14 2017-08-29 英威达技术有限责任公司 生产6‑碳单体的方法和材料
US20180023104A1 (en) * 2016-07-25 2018-01-25 Invista North America S.A.R.L. Materials and methods for directing carbon flux and increased production of carbon based chemicals
KR20180011297A (ko) * 2018-01-19 2018-01-31 씨제이제일제당 (주) 신규 트랜스아미나제 및 이를 이용한 아미노 화합물의 탈아민 방법

Family Cites Families (36)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4554101A (en) 1981-01-09 1985-11-19 New York Blood Center, Inc. Identification and preparation of epitopes on antigens and allergens on the basis of hydrophilicity
US6215027B1 (en) 1998-10-20 2001-04-10 Praxair Technology, Inc. Ballast gas use in liquid phase oxidation
KR20070015178A (ko) 2004-04-27 2007-02-01 백스터 인터내셔널 인코포레이티드 교반-탱크 반응기 시스템
US20060275858A1 (en) 2005-06-02 2006-12-07 Saucedo Victor M Optimization of Process Variables in Oxygen Enriched Fermentors Through Process Controls
WO2007046449A1 (ja) 2005-10-21 2007-04-26 Mitsubishi Gas Chemical Company, Inc. 固形の脱酸素剤組成物及びその製造方法
PT2032709T (pt) 2006-06-13 2021-03-22 Univ Chicago Sistema para a produção de metano a partir de co2
SG167566A1 (en) 2008-07-02 2011-01-28 Danisco Us Inc Compositions and methods for producing isoprene free of C5 hydrocarbons under decoupling conditions and/or safe operating ranges
CA2746696C (en) 2008-12-15 2020-07-14 Ebbe Busch Larsen U-shape and/or nozzle u-loop fermenter and method of fermentation
US8535919B2 (en) 2010-06-30 2013-09-17 Coskata, Inc. Process for converting gas stream comprising CO, CO2 and H2 to liquid products by fermentation
US9650653B2 (en) * 2011-06-30 2017-05-16 Invista North America S.A.R.L. Bioconversion process for producing nylon-7, nylon-7,7 and polyesters
CA2848574A1 (en) 2011-09-12 2013-03-21 Oakbio Inc. Chemoautotrophic conversion of carbon oxides in industrial waste to biomass and chemical products
US8349587B2 (en) 2011-10-31 2013-01-08 Ginkgo Bioworks, Inc. Methods and systems for chemoautotrophic production of organic compounds
WO2013090769A2 (en) 2011-12-14 2013-06-20 Kiverdi, Inc. Method and apparatus for growing microbial cultures that require gaseous electron donors, electron acceptors, carbon sources, or other nutrients
WO2013152051A2 (en) 2012-04-02 2013-10-10 Ls9, Inc. Improved production of fatty acid derivatives
US20130323714A1 (en) 2012-06-04 2013-12-05 Alan T. Cheng System and method for micro-aeration based fermentation
EP2674489A1 (en) 2012-06-15 2013-12-18 Evonik Industries AG Biotechnological 2-hydroxyisobutyric acid production
WO2014089436A1 (en) 2012-12-07 2014-06-12 Ginkgo Bioworks, Inc. Methods and systems for methylotrophic production of organic compounds
JP2016500261A (ja) 2012-12-12 2016-01-12 アールイージー ライフ サイエンシズ リミテッド ライアビリティ カンパニー 脂肪酸誘導体のａｃｐ媒介性生産方法
US9738911B2 (en) 2012-12-31 2017-08-22 Invista North America S.A.R.L. Methods of producing 7-carbon chemicals via pyruvate and succinate semialdehyde aldol condensation
EP2938731A2 (en) 2012-12-31 2015-11-04 Invista Technologies S.A R.L. Methods of producing 7-carbon chemicals via carbon chain elongation associated with cyclohexane carboxylate synthesis
EP2938730A2 (en) 2012-12-31 2015-11-04 Invista Technologies S.A R.L. Methods of producing 6-carbon chemicals via methyl-ester shielded carbon chain elongation
US9920336B2 (en) 2012-12-31 2018-03-20 Invista North America S.A.R.L. Methods of producing 7-carbon chemicals from long chain fatty acids via oxidative cleavage
BR112016002625A2 (pt) 2013-08-05 2017-09-12 Invista Tech Sarl método para sintetizar enzimaticamente isopreno e hospedeiro recombinante produtor de isopreno
BR112016029471A2 (pt) 2014-06-16 2017-10-24 Invista Tech Sarl método para biosintetizar éster de metil glutarato em um hospedeiro recombinante, método para preparar glutarato, célula hospedeira recombinante, hospedeiro recombinante, produto bioderivado, produto de base biológica ou produto derivado de fermentação e método para aumentar a atividade de um polipeptídeo tendo atividade carboxilato reductase sobre um ácido dicarboxílico c4-c8 substituído ou não-substituído
US10072150B2 (en) 2014-12-22 2018-09-11 INVISTA North America S.à r.l. Methods and materials for the production of monomers for nylon-4/polyester production
CN109415672A (zh) 2015-12-28 2019-03-01 味之素株式会社 气体搅拌式发酵装置
CA3017799A1 (en) 2016-03-19 2017-09-28 Kiverdi, Inc. Microorganisms and artificial ecosystems for the production of protein, food, and useful co-products from c1 substrates
US10801046B2 (en) 2016-07-25 2020-10-13 Invista North America S.A.R.L. Methods and materials for biosynthesizing multifunctional, multivariate molecules via carbon chain modification
EP3488006B1 (en) 2016-07-25 2023-06-07 INVISTA Textiles (U.K.) Limited Materials and methods utilizing biotin producing mutant hosts for the production of 7-carbon chemicals
CN110049953B (zh) 2016-12-09 2022-12-27 尼普生物股份有限公司 由醇利用细菌以微生物制造蛋白质和phb
EP3775182A1 (en) 2018-03-30 2021-02-17 INVISTA Textiles (U.K.) Limited Materials and methods for biosynthetic manufacture of pimelic acid and utilization of synthetic polypeptides
EP3775242A1 (en) 2018-03-30 2021-02-17 INVISTA Textiles (U.K.) Limited High hydrogen utilization and gas recycle
EP3775241A1 (en) 2018-03-30 2021-02-17 INVISTA Textiles (U.K.) Limited Methods for controlling oxygen concentration during aerobic biosynthesis
EP3775240A1 (en) 2018-03-30 2021-02-17 INVISTA Textiles (U.K.) Limited Method for controlling dissolved oxygen concentration in a continuous aerobic fermentation
WO2019191772A1 (en) 2018-03-30 2019-10-03 Invista North America S.A.R.L Materials and methods for biosynthetic manufacture of carbon-based chemicals
US11702680B2 (en) 2018-05-02 2023-07-18 Inv Nylon Chemicals Americas, Llc Materials and methods for controlling PHA biosynthesis in PHA-generating species of the genera Ralstonia or Cupriavidus and organisms related thereto

Patent Citations (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20020192786A1 (en) * 1997-04-23 2002-12-19 Kaneka Corporation Producing optically active amino compounds
US20060228788A1 (en) * 2004-12-10 2006-10-12 Sachin Pannuri Thermostable omega-transaminases
JP2007185133A (ja) * 2006-01-12 2007-07-26 Daicel Chem Ind Ltd アミントランスアミナーゼ、および該アミントランスアミナーゼを利用した光学活性アミンの製造方法
US20140186904A1 (en) * 2012-12-31 2014-07-03 INVISTA North America S.á r.l. Methods Of Producing 7-Carbon Chemicals Via Methyl-Ester Shielded Carbon Chain Elongation
US20160257976A1 (en) * 2013-05-06 2016-09-08 Korea Research Institute Of Bioscience And Biotechnology Biological Synthesis of 6-Aminocaproic Acid and Transgenic Microorganism Therefor
CN104328093A (zh) * 2013-11-26 2015-02-04 凯莱英医药集团（天津）股份有限公司 R型ω-转氨酶及其应用
EP3075856A1 (en) * 2013-11-26 2016-10-05 Asymchem Laboratories (Tianjin) Co., Ltd Omega-transaminase of r configuration and use thereof
US20150361458A1 (en) * 2014-06-16 2015-12-17 INVISTA North America S.á r.l. Methods, reagents and cells for biosynthesizing compound
CN107109444A (zh) * 2014-11-14 2017-08-29 英威达技术有限责任公司 生产6‑碳单体的方法和材料
CN104894148A (zh) * 2015-04-13 2015-09-09 浙江科技学院 一种ω-转氨酶突变体基因及其应用
US20170159082A1 (en) * 2015-12-04 2017-06-08 Invista North America S.A.R.L. Methods and materials for producing 7-carbon monomers
US20170218406A1 (en) * 2016-02-01 2017-08-03 Invista North America S.A.R.L. Methods and Materials for Producing 7-Carbon Monomers
US20180023104A1 (en) * 2016-07-25 2018-01-25 Invista North America S.A.R.L. Materials and methods for directing carbon flux and increased production of carbon based chemicals
KR20180011297A (ko) * 2018-01-19 2018-01-31 씨제이제일제당 (주) 신규 트랜스아미나제 및 이를 이용한 아미노 화합물의 탈아민 방법

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109312311A (zh) * 2016-03-17 2019-02-05 英威达纺织（英国）有限公司 具有改善的活性的多肽和变体、其相关的材料和方法
CN114763372A (zh) * 2021-01-13 2022-07-19 中国科学院天津工业生物技术研究所 具有l-脯氨酸外排功能的蛋白及其应用
CN115335391A (zh) * 2021-04-07 2022-11-11 Cj第一制糖株式会社 新支链氨基酸通透酶变体及使用其生产l-缬氨酸的方法
CN115335391B (zh) * 2021-04-07 2023-08-11 Cj第一制糖株式会社 新支链氨基酸通透酶变体及使用其生产l-缬氨酸的方法
CN113583884A (zh) * 2021-08-21 2021-11-02 吉林农业大学 一种产γ-氨基丁酸的发酵培养基及生产方法

Also Published As

Publication number Publication date
EP3775246A1 (en) 2021-02-17
US11203771B2 (en) 2021-12-21
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CN112004934B (zh) 2024-02-23
US20190352682A1 (en) 2019-11-21

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