KR20180011297A - 신규 트랜스아미나제 및 이를 이용한 아미노 화합물의 탈아민 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 트랜스아미나제 활성을 가지는 신규 분리된 폴리펩티드 및 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 미생물, 및 상기 폴리펩티드 또는 상기 미생물을 이용하여 아미노 화합물을 탈아민화시키는 방법에 관한 것이다.

Description

신규 트랜스아미나제 및 이를 이용한 아미노 화합물의 탈아민 방법 {Novel transaminases and method for deamination of amino compound using thereof}

본 발명은 트랜스아미나제 활성을 가지는 신규 분리된 폴리펩티드 및 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 미생물, 및 상기 폴리펩티드 또는 상기 미생물을 이용하여 아미노 화합물을 탈아민화시키는 방법에 관한 것이다.

아디프산(adipic acid)은 (CH₂)₄(COOH)₂의 분자식을 갖는 디카르복실산(dicarboxylic acid) 화합물이다. 아디프산은 나일론 수지원료, 플라스틱 가소제, 염료·의약품 등의 원료로서 널리 사용되고 있으며, 특히 나일론 6,6과 같은 폴리아미드의 제조에 중요한 중간 생성물로서, 상업적 가치가 매우 높다.

아디프산은 주로 석유화합물을 원료물질로 두 단계의 공정을 거치는 화학적 방법으로 생산한다. 구체적으로 시작물질인 페놀, 싸이클로헥산, 싸이클로헥센, 벤젠 등의 고리형 화합물을 싸이클로헥사논 또는 싸이크로헥사놀로 명명되는 케톤-알코올 오일 (ketone-alcohol oil, KA oil)로 전환시킨 다음 그 후 질산을 이용한 산화공정을 통해 아디프산을 생산한다. 이 화학적 공정은 고효율성 및 경제성을 지녔으나, 벤젠을 원료로 사용하고 막대한 양의 질소 산화물을 부산물로 발생시키는 문제점이 있다. 이러한 문제점과 더불어 최근 강화되는 환경규제로 인해 아디프산의 생산에 있어서 친환경적 공정의 필요성이 대두되었으며, 이에 따라 아디프산을 미생물을 통해 생산하려는 노력이 시작되고 있다. 그러나 아디프산 생산의 중간체로 사용될 수 있는 6-아미노카프로산의 정확한 생합성 또는 생분해 경로는 아직까지 알려져 있지 않다. 6-아미노카프로산의 6-아민 그룹을 제거하고 케톤기가 도입되면 아디페이트 세미알데하이드 (adipate semialdehyde)가 되며, 알데하이드 디하이드로게나제 (aldehyde dehydrogenase)의 반응을 통해 아디프산을 합성할 수 있을 것으로 예상된다 (Guerrillot L. et al., Eur J Biochem., 1977, 81(1):185-92; Vandecasteele, J.P. et al., Methods Enzymol., 1982, 89: 484-490). 같은 수의 탄소로 이루어진 6-아미노카프로산으로부터 아디프산으로의 효소 전환 반응은 상업적 가치뿐만 아니라 신규 기술로서 가능성이 높게 평가되나, 실제 반응에 관여할 수 있는 효소 또는 미생물 역시 공지되지 않았다.

이에, 본 발명자들은 6-아미노카프로산을 탈아민하는 방법을 연구하던 중 탈아민 활성을 가지는 신규 미생물을 분리하고, 이로부터 신규 효소를 발견함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 일 목적은 트랜스아미나제 활성을 가지는 신규 분리된 폴리펩티드를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 신규 폴리펩티드를 발현하도록 형질전환된 미생물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 트랜스아미나제 활성을 갖는 폴리펩티드를 이용하여, 아미노 화합물을 탈아민화시키는 방법 및 세미알데히드 화합물을 아미노 화합물로 전환시키는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 일 양태는 서열번호 7의 아미노산 서열 또는 이와 75% 이상의 상동성을 가지는 아미노산 서열을 포함하며, 트랜스아미나제 활성을 가지는 분리된 폴리펩티드를 제공한다.

본 발명에서 용어, "트랜스아미나제(transaminase) 활성을 가지는 폴리펩티드"는 아미노산과 α-케토산 사이의 가역적인 아미노기 전이 반응을 촉매하는 활성을 갖는 폴리펩티드를 의미한다. 상기 트랜스아미나제는 아미노트랜스퍼라제(aminotransferase)로 명명될 수 있다.

본 발명에서 용어, "폴리펩티드"는 아미노산의 중합체를 의미하며, 보통 소수의 아미노산이 연결된 형태를 펩티드라 부르고 많은 아미노산이 연결되면 단백질로 부른다. 단백질을 이루고 있는 약 20 종류의 아미노산들이 화학결합을 통해 서로 연결되어 폴리펩티드를 만든다. 본 발명의 트랜스아미나제 활성을 가지는 폴리펩티드는 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 또한 상기 폴리펩티드는 서열번호 7의 아미노산 서열과 75% 이상, 80%이상, 구체적으로는 90%이상, 보다 구체적으로는 95%이상, 보다 더욱 구체적으로는 99%이상의 서열 상동성을 가지는 아미노산 서열로서, 예를 들어 서열번호 9, 서열번호 11, 서열번호 13, 서열번호 15 또는 서열번호 17의 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 또한 상기 폴리펩티드는 본 발명의 트랜스아미나제의 아미노기 전이 반응을 촉매하는 활성을 갖는 폴리펩티드의 아미노산 서열이라면 제한 없이 포함할 수 있다. 또한, 상기 폴리펩티드와 생물학적으로 동일하거나 상응하는 활성을 지니는 한, 그의 변이체 또는 유사체 등을 모두 포함할 수 있다.

본 발명에서 용어, "상동성"은 주어진 폴리펩티드 서열 또는 폴리뉴클레오티드 서열과 일치하는 정도를 의미하며 백분율로 표시될 수 있다. 본 명세서에서, 주어진 폴리펩티드 서열 또는 폴리뉴클레오티드 서열과 동일하거나 유사한 활성을 갖는 그의 상동성 서열이 "% 상동성"으로 표시된다. 예를 들면, 점수(score), 동일성(identity) 및 유사도(similarity) 등의 매개 변수(parameter)들을 계산하는 표준 소프트웨어, 구체적으로 BLAST 2.0를 이용하거나, 정의된 엄격한 조건하에서 써던 혼성화 실험에 의해 서열을 비교함으로써 확인할 수 있으며, 정의되는 적절한 혼성화 조건은 당업자에게 잘 알려진 방법으로 결정될 수 있다.

상기 트랜스아미나제 활성을 갖는 폴리펩티드는 슈도모나스 스투체리(Pseudomonas stutzeri)로부터 유래된 것일 수 있다. 구체적으로 상기 폴리펩티드는 슈도모나스 스투체리(Pseudomonas stutzeri) CJ-MKB (KCCM11587P)로부터 유래된 것일 수 있다. 일 실시예에서 본 발명자들은 6-아미노카프로산을 질소원으로 고정화시키는 신규 균주인 슈도모나스 스투체리 CJ-MKB를 분리하고, 이로부터 신규한 트랜스아미나제를 수득하였다.

본 발명의 트랜스아미나제 활성을 갖는 폴리펩티드는 아미노 화합물을 탈아민시킬 수 있다. 상기 아미노 화합물은 구체적으로 N-아세틸 오르니틴, 감마아미노부티르산(4-아미노부티르산), 5-아미노발레르산 및 6-아미노카프로산으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 더욱 구체적으로 상기 아미노 화합물은 5-아미노발레르산 또는 6-아미노카프로산일 수 있다. 종래 공지된 N-아세틸오르니틴 트랜스아미나제는 기질로서 N-아세틸 오르니틴 및 N-숙시닐-L-2-아미노-6-옥소피멜레이트 (N-succinyl-L-2-amino-6-oxopimelate)를 사용하는 것은 알려져 있으나, 감마아미노부티르산, 5-아미노발레르산 또는 6-아미노카프로산 등을 기질로 사용하는지 여부에 대해서는 전혀 알려지지 않았다 (Rajaram V, Ratna Prasuna P, Savithri HS, Murthy MR. Structure of biosynthetic N-acetylornithine aminotransferase from Salmonella typhimurium: studies on substrate specificity and inhibitor binding, Proteins, 2008, 70(2):429-441). 그러나 본 발명의 폴리펩티드는 N-아세틸 오르니틴 이외에도 감마아미노부티르산, 5-아미노발레르산 또는 6-아미노카프로산을 기질로 사용하여 이들의 탈아민화 반응을 촉매할 수 있다. 일 실시예에서 본 발명의 폴리펩티드에 의해 N-아세틸 오르니틴, 감마아미노부티르산, 5-아미노발레르산 또는 6-아미노카프로산이 탈아민화되어 글루타메이트가 생성되는 것을 확인할 수 있다.

본 발명의 다른 양태는 상기 트랜스아미나제 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.

본 발명에서 용어, "폴리뉴클레오티드"란 뉴클레오티드 단위체(monomer)가 공유결합에 의해 길게 사슬모양으로 이어진 뉴클레오티드의 중합체(polymer)로, 일반적으로 일정한 길이 이상의 DNA(deoxyribonucleic acid)나 RNA(ribonucleic acid) 가닥을 의미한다.

상기 폴리뉴클레오티드는 서열번호 7의 폴리펩티드 또는 이와 75% 이상의 상동성을 가지는 폴리펩티드들을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것일 수 있다. 구체적으로 상기 폴리뉴클레오티드는 서열번호 4의 염기서열을 포함하는 것일 수 있다. 또한 상기 폴리뉴클레오티드는 서열번호 4의 염기서열과 80%이상, 구체적으로는 90%이상, 보다 구체적으로는 95%이상, 보다 더욱 구체적으로는 99% 이상의 상동성을 나타내는 서열로서, 본 발명의 트랜스아미나제 활성을 갖는 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열이라면 제한없이 포함할 수 있다. 또한, 유전 암호의 축퇴성(genetic code degeneracy)에 기인하여 동일 아미노산 서열을 코딩하는 상기 뉴클레오티드 서열들의 변이체 또한 본 발명에 포함할 수 있다.

본 발명의 또 다른 양태는 상기 트랜스아미나제 활성을 가지는 폴리펩티드를 발현하도록 형질전환된 미생물을 제공한다. 구체적으로, 상기 미생물은 트랜스아미나제 활성을 가지는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 발현되도록 형질전환된 미생물, 더욱 구체적으로는 상기 폴리뉴클레티드가 발현 벡터에 작동가능하게 연결된 재조합 벡터에 의해 형질전환된 미생물일 수 있다.

상기 폴리펩티드 및 상기 폴리뉴클레오티드는 각각 상기한 바와 같다.

본 발명에서 용어, "작동 가능하게 연결"이란 본 발명의 트랜스아미나제 활성을 가지는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 전사를 개시 및 매개하도록 하는 프로모터 서열과 상기 유전자 서열이 기능적으로 연결되어 있는 것을 의미한다. 발현 벡터와의 작동가능한 연결은 당업계의 공지된 유전자 재조합 기술을 이용하여 제조할 수 있으며, 부위-특이적 DNA 절단 및 연결은 당업계의 절단 및 연결 효소 등을 사용하여 제작할 수 있다.

본 발명의 용어 "발현 벡터"는 적합한 숙주 내에서 목적 단백질을 발현시킬 수 있도록 적합한 조절 서열에 작동 가능하게 연결된 상기 목적 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 염기서열을 함유하는 DNA 제조물을 의미한다. 상기 조절 서열은 전사를 개시할 수 있는 프로모터, 그러한 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보좀 결합 부위를 코딩하는 서열, 및 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열을 포함한다. 벡터는 적당한 숙주 내로 형질전환된 후, 숙주 게놈과 무관하게 복제되거나 기능할 수 있으며, 게놈 그 자체에 통합될 수 있다. 본 발명에서 사용되는 벡터는 숙주 중에서 복제 가능한 것이면 특별히 한정되지 않으며 당업계에 알려진 임의의 벡터를 이용할 수 있다. 통상 사용되는 벡터의 예로는 천연 상태이거나 재조합된 상태의 플라스미드, 코스미드, 바이러스 및 박테리오파지를 들 수 있으며, 이에 한정되지 않는다. 상기 제조된 트랜스아미나제 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터를 숙주 세포에 형질전환(transformation) 또는 형질감염(transfection) 시킴으로써, 목적하는 트랜스아미나제 활성을 갖는 폴리펩티드를 당해 숙주 세포에서 발현시킬 수 있게 된다.

본 발명에서 용어, "형질전환"은 표적 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 숙주 세포 내에 도입하여 숙주 세포 내에서 상기 폴리뉴클레오티드가 암호화하는 단백질이 발현할 수 있도록 하는 것을 의미한다. 형질전환된 폴리뉴클레오티드는 숙주 세포 내에 발현될 수 있기만 한다면, 숙주세포의 염색체 내에 삽입되어 위치하거나 염색체 외에 위치하든지 상관없이 이들 모두를 포함한다. 상기 세포 내로 본 발명의 벡터를 형질전환시키는 방법은 염기를 세포 내로 도입하는 어떤 방법도 포함되며, 당 분야에서 공지된 바와 같이 적합한 표준 기술을 선택하여 수행할 수 있다. 일렉트로포레이션(electroporation), 칼슘 포스페이트 공동-침전(calcium phosphate co-precipitation), 레트로바이러스 감염(retroviral infection), 미세주입법(microinjection), DEAE-덱스트란(DEAE-dextran), 양이온 리포좀(cationic liposome) 법 등이 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에서 용어, "형질전환된 미생물"은 상기 트랜스아미나제 활성을 갖는 폴리펩티드를 발현할 수 있는 미생물이라면, 원핵 미생물 및 진핵 미생물 어느 것이나 포함된다. 상기 미생물은 예를 들면 에스케리키아(Escherichia) 속, 어위니아(Erwinia) 속, 세라티아(Serratia) 속, 프로비덴시아(Providencia) 속, 코리네박테리움(Corynebacterium) 속 또는 브레비박테리움(Brevibacterium)속에 속하는 미생물 균주일 수 있다. 상기 미생물은 구체적으로 에스케리키아(Escherichia) 속 미생물일 수 있으며, 더욱 구체적으로는 대장균일 수 있다.

본 발명의 또 다른 양태는 상기 트랜스아미나제 활성을 갖는 폴리펩티드 또는 이를 발현하는 미생물을 아미노 화합물이 함유된 용액에 첨가하는 단계를 포함하는, 아미노 화합물을 탈아민화시키는 방법을 제공한다.

상기 방법에 있어서, 상기 트랜스아미나제 활성을 갖는 폴리펩티드는 상기한 바와 같다.

상기 방법에 있어서, 상기 트랜스아미나제 활성을 갖는 폴리펩티드를 발현하는 미생물은 본 발명의 트랜스아미나제 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된 미생물일 수 있다. 상기 형질전환된 미생물은 상기한 바와 같다. 상기 미생물은 미생물의 배양물 또는 미생물의 분쇄액(;ysate)의 형태로 아미노 화합물이 함유된 용액에 가해질 수 있다.

상기 아미노 화합물은 예를 들면 N-아세틸 오르니틴, 감마아미노부티르산, 5-아미노발레르산 및 6-아미노카프로산으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 또한 상기 아미노 화합물은 구체적으로는 감마아미노부티르산, 5-아미노발레르산, 또는 6-아미노카프로산일 수 있다.

상기 아미노 화합물이 함유된 용액은 파이루베이트(pyruvate), 옥살로아세테이트(oxaloacetate) 및 α-케토글루타레이트(α-ketoglutarate)로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상, 및 피리독살포스페이트를 포함할 수 있다. 상기 피리독살 포스페이트는 본 발명의 폴리펩티드의 트랜스아미나제의 반응에서 조효소로서 요구될 수 있다. 또한 상기 파이루베이트, 옥살로아세테이트 및 α-케토글루타레이트는 반응에서 아미노기로부터 이탈된 아미노기를 받아들이는 아민 받개(amine acceptor)로서 이용될 수 있다.

또한 상기 아미노 화합물을 탈아민화시키는 방법은 상기 반응물로부터 아미노기가 제거된 화합물을 회수하는 단계를 더 포함할 수 있다. 상기 아미노기가 제거된 화합물은 구체적으로는 N-아세틸글루타메이트5-세미알데하이드, 숙시네이트 세미알데하이드, 글루타레이트 세미알데하이드 및 아디페이트 세미알데하이드로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 세포 또는 배양물로부터 아미노기가 제거된 화합물을 회수하는 방법은 배양방법에 따라 당해 분야에 공지된 적합한 방법을 이용하여 배양물로부터 생산된 아미노기가 제거된 화합물을 수집 또는 회수할 수 있다. 예를 들면 원심분리, 여과, 음이온 교환 크로마토그래피, 결정화 및 HPLC 등이 사용될 수 있으나, 이들 예에 한정되지 않는다.

본 발명의 또 다른 양태는 상기 트랜스아미나제 활성을 갖는 폴리펩티드 또는 이를 발현하는 미생물을 세미알데하이드 화합물이 함유된 용액에 첨가하는 단계를 포함하는, 아미노 화합물을 생산하는 방법을 제공한다.

상기 방법에 있어서, 상기 트랜스아미나제 활성을 갖는 폴리펩티드는 상기한 바와 같다. 상기 트랜스아미나제 활성을 갖는 폴리펩티드는 아미노 화합물의 탈아민화반응의 역반응에 대해서도 촉매 활성을 가지고 있어, 세미알데하이드 화합물을 아미노 화합물로 전환시킬 수 있다. 상기 세미알데하이드 화합물은 N-아세틸글루타메이트5-세미알데하이드, 숙시네이트 세미알데하이드, 글루타레이트 세미알데하이드 및 아디페이트 세미알데하이드로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 아미노 화합물 생산 방법에 있어서, 상기 세미알데하이드 화합물이 함유된 용액은 글루타메이트 또는 아스파테이트, 및 피리독살포스페이트를 추가로 포함할 수 있다.

또한 상기 아미노 화합물의 생산 방법은 상기 용액으로부터 생산된 아미노 화합물을 회수하는 단계를 더 포함할 수 있다. 상기 아미노 화합물은 N-아세틸 오르니틴, 감마아미노부티르산, 5-아미노발레르산 및 6-아미노카프로산으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 상기 아미노 화합물을 회수하는 방법은 당해 분야에 공지된 적합한 방법을 이용할 수 있다.

상기 아미노 화합물을 탈아민화시키는 방법은 아디프산의 생산 방법에 이용될 수 있다. 상기 아디프산의 생산 방법은 아미노 화합물로서 6-아미노카프로산을 포함하는 용액에 본 발명의 트랜스아미나제 또는 이를 포함하는 미생물의 분쇄액을 가하여 반응시킨 다음, 상기 6-아미노카프로산으로부터 전환된 아디페이트 세미알데하이드로부터 적합한 통상의 기술자에게 공지의 방법을 이용하여 아디프산을 합성할 수 있다. 상기 아디페이트 세미알데하이드로부터 아디프산의 합성은 바람직하게는 알데하이드 디하이드로게나제(aldehyde dehydrogenase) 반응에 의한 것일 수 있다.

본 발명의 트랜스아미나제 활성을 갖는 폴리펩티드를 최초로 발굴하였다. 또한, 상기 펩티드를 이용하여 아미노 화합물을 탈아민화시키는 방법은 아디프산의 바이오 기반의 생산 방법에서 이용할 수 있다. 이는 종래에 화학적 방법으로 생산하던 아디프산 생산에 있어서, 신규한 경로를 이용하여 바이오 기반으로 아디프산을 생산할 수 있는 기반을 마련해준 것에 의의가 있다.

도 1은 6-아미노카프로산을 질소원으로 사용한 최소 배지를 이용하여 선별된 균주가 바이오 필름을 형성하는 것을 보여주는 사진이다. 구체적으로 단일 콜로니를 배양한 후 이를 원심분리하여 수득한 결과물 및 이 결과물을 증류수를 이용하여 바이오필름과 균주로 분리시킨 것이다.
도 2는 5-아미노발레르산, 6-아미노카프로산, 알파-케토글루타르산, 피리독살 포스페이트의 다양한 농도 및 각각의 기질의 유무에 따른 글루타메이트의 생성 및 기질의 분해 정도를 TLC 상에서 비교한 결과를 나타낸다,
[5AVA: 10mM 5-아미노발레르산 (standard); 1: 20mM 6-아미노카프로산 (standard); 2: 슈도모나스 스투체리 CJ-MKB + 20mM 6-아미노카프로산; 3: 슈도모나스 스투체리 CJ-MKB + 10mM 6-아미노카프로산 및 20mM 5-아미노발레르산; 4: 슈도모나스 스투체리 CJ-MKB + 20mM 6-아미노카프로산, 10mM 알파-케토글루타레이트 및 0.1mM 피리독살-포스페이트; 4-1: 슈도모나스 스투체리 CJ-MKB + 20mM 6-아미노카프로산 및 10mM 알파-케토글루타레이트; 5: 슈도모나스 스투체리 CJ-MKB + 10mM 6-아미노카프로산, 20mM 5-아미노발레르산, 10mM 알파-케토글루타레이트 및 0.1mM 피리독살-포스페이트; 5-1: 슈도모나스 스투체리 CJ-MKB + 10mM 6-아미노카프로산, 20mM 5-아미노발레르산 및 10mM 알파-케토글루타레이트; 6: 슈도모나스 스투체리 CJ-MKB + 20mM 6-아미노카프로산 및 20mM 글루타메이트; E: 10mM 글루타메이트 (standard)].
도 3은 본 발명의 트랜스아미나제 활성을 갖는 폴리펩티드의 유전자로 형질전환된 대장균 균주로부터 가용성 단백질로 과발현되는 것을 보여주는 SDS-PAGE 젤 사진이다, [T: 세포 분쇄액 (cell lysate); S: 가용성 단백질 (soluble protein)].
도 4는 본 발명의 트랜스아미나제 활성을 갖는 폴리펩티드가 과발현된 대장균의 분쇄액을 이용하여 아미노 화합물에 대한 반응성을 TLC를 통해 나타낸 결과이다,
[1: 과발현된 pETDuet1(공벡터)과 4-아미노부티르산의 반응; 2: 과발현된 본 발명의 트랜스아미나제 활성을 갖는 폴리펩티드와 4-아미노부티르산의 반응; 4: 과발현된 pETDuet1과 6-아미노카프로산의 반응; 5: 과발현된 본 발명의 트랜스아미나제 활성을 갖는 폴리펩티드와 6-아미노카프로산의 반응; 7: 과발현된 pETDuet1과 N-아세틸오르니틴의 반응; 8: 과발현된 본 발명의 트랜스아미나제 활성을 갖는 폴리펩티드와 N-아세틸오르니틴의 반응; 및 10: 글루타메이트 (standard)].
도 5는 6-아미노카프로산의 농도를 증가시켜 본 발명의 트랜스아미나제 활성을 갖는 폴리펩티드에 의한 전환 반응에서 생성되는 글루타메이트의 생성량을 TLC를 통해 나타낸 결과이다,
[C: 과발현된 pETDuet1과 6-아미노카프로산의 반응; D: 과발현된 본 발명의 트랜스아미나제 활성을 갖는 폴리펩티드와 6-아미노카프로산의 반응 및 E: 10mM 글루타메이트 (standard)].
도 6은 5종의 슈도모나스 균주로부터 얻은 N-아세틸오르니틴 트랜스아미나제 및 본 발명의 트랜스아미나제 활성을 갖는 폴리펩티드를 대장균에서 과발현시킨 결과를 보여주는 SDS-PAGE 젤 사진이다.
도 7은 5종의 슈도모나스 균주 유래의 N-아세틸오르니틴 트랜스아미나제 및 본 발명의 트랜스아미나제 활성을 갖는 폴리펩티드와 6-아미노카프로산의 반응 1시간 후 LC-MASS를 이용하여 6-아미노카프로산 감소 정도를 분석한 그래프이다.
도 8은 도 7과 동일한 샘플을 시프 시약(Schiff's reagent)을 통해 알데하이드 생성정도를 상대적인 활성값으로 비교한 결과를 나타낸다.
도 9는 5종의 슈도모나스 균주 유래의 N-아세틸오르니틴 트랜스아미나제 및 본 발명의 트랜스아미나제 활성을 갖는 폴리펩티드와 N-아세틸오르니틴의 반응 후 LC-MASS를 이용하여 N-아세틸오르니틴의 감소 정도를 분석한 그래프이다.
도 10은 5종의 슈도모나스 균주 유래의 N-아세틸오르니틴 트랜스아미나제 및 본 발명의 트랜스아미나제 활성을 갖는 폴리펩티드와 감마아미노부티르산의 반응 후 LC-MASS를 이용하여 감마아미노부티르산의 감소 정도를 분석한 그래프이다.
도 11은 5종의 슈도모나스 균주 유래의 N-아세틸오르니틴 트랜스아미나제 및 본 발명의 트랜스아미나제 활성을 갖는 폴리펩티드와 5-아미노발레르산의 반응 후 LC-MASS를 이용하여 5-아미노발레르산의 감소 정도를 분석한 그래프이다.
도 12는 본 발명의 트랜스아미나제 활성을 갖는 폴리펩티드의 역반응을 평가를 위해 6-아미노카프로산으로 반응시킨 후, 다시 역반응을 유도하여 시프 시약(Schiff's reagent)을 통해 상대적인 효소 활성을 비교한 결과를 나타낸다.

이하 본 발명을 실시예에 의해 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것은 아니다.

실시예 1: 6-아미노카프로산을 질소원으로 사용하는 미생물 동정

1) 6-아미노카프로산을 질소원으로 사용하는 미생물 선별 및 16S rRNA 분석

질소원을 6-아미노카프로산(6-ACA)으로 고정시키고 계대배양 방법을 통해서 6-아미노카프로산을 탈아민시킬 수 있는 신규 균주 슈도모나스 스투체리(Pseudomonas stutzeri) CJ-MKB를 선별하였다. 선별을 위해 미생물이 배양될 수 있는 최소 배지를 하기 표 1의 조성과 같이 제조하였고, 균주 배양에 필요한 질소원으로 6-아미노카프로산을 사용하였다.

배지 조성	최종 농도
Na2HPO4·H2O	15.1 mM
KH2PO4	22 mM
NaCl	8.6 mM
6-아미노카프로산	20 mM
MgSO4	1 mM
CaCl2	100 mM
(NH4)6Mo7O24·H2O	3 nM
H3BO3	400 nM
CoCl2·H2O	30 nM
CuSo4·H2O	10 nM
MnCl2·H2O	80 nM
ZnSO4·H2O	10 nM
FeSO4·H2O	1 mM
글루코스	11.1 mM

구체적으로, 서울특별시 가양동에 소재한 씨제이제일제당㈜ 김포공장의 토양샘플을 표 1의 조성을 갖는 배지를 이용하여 37℃, 200rpm 조건에서 배양하였다. 배양된 후보 균주들은 초기 접종 광학밀도 (OD600)를 0.05로 맞춰 동일한 배지, 37℃, 200rpm 조건에서 광학밀도가 0.5에 도달할 때까지 배양하였다. 5 차례의 계대 배양을 통해 표 1의 조성을 갖는 배지에서 배양되는 미생물을 선별할 수 있었다. 선별된 미생물을 일차적으로 'CJ-MKB'라 명명하고, 신규 미생물임을 확인하기 위해 다음의 실험을 진행하였다.

액체 배지에서 배양된 CJ-MKB 균주를 M9 아가 플레이트에 도말하여 콜로니들을 확보하였다. 얻어진 콜로니는 25 mg/ml 농도의 앰피실린에 대하여 저항성을 가졌다. 그리고 콜로니 주변으로 옅은 색의 바이오 필름(biofilm)이 형성되는 것을 확인하였다. 두 개의 콜로니를 선택하여 M9 액체 배지에 재배양하고 상용화된 genomic DNA prep kit를 이용하여 유전체(genomic DNA)를 각각 추출하였다. 얻어진 유전체의 동정을 위해 16S ribosomal RNA(16S rRNA)의 서열을 분석하였다. 미생물 16S rRNA의 서열 분석에서 보편적으로 사용되는 프라이머 27F (AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG; 서열번호 18) 및 프라이머 1492R (GGT TAC CTT GTT ACG ACT T; 서열번호 19)를 이용하여, CJ-MKB 유전체의 16S rRNA가 서열 번호 1의 염기 서열을 가지는 것을 확인하였다.

미국국립생물정보센터(National Center for Biotechnology Information, NCBI)에서 제공되는 BLAST 프로그램을 이용하여 서열 번호 1과 높은 핵산 상동성을 가지는 균주를 검색하였다 (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi℃PROGRAM=blastn&PAGE_TYPE=BlastSearch&LINK_LOC=blasthome). 그 결과, 슈도모나스 스투체리 NBRIS11 균주 (Pseudomonas stutzeri strain NBRIS11), 감마 프로테오박테리움 BP44-iso8 (Gamma proteobacterium BP44-iso8), 언컬처드 박테리움 클론 9(Uncultured bacterium clone 9), 에스케리키아 콜리 BM0446 균주(Escherichia coli strain BM0446), 및 엔테로박테리아세애 박테리움 BM005 (Enterobacteriaceae bacterium BM005)의 16S rRNA 와 각각 동일한 서열을 가지는 것으로 확인되었다.

확인된 미생물들 중 여러 슈도모나스 종 미생물들이 엑소폴리사카라이드(exopolysaccharide)를 만들어 바이오-필름(bio-flim)을 형성하는 것으로 알려져 있으며, 또한 슈도모나스 종 미생물은 페니실린과 같은 베타-락탐 계열의 항생제에 대한 저항성을 가지고 있다. CJ-MKB 균주의 16S rRNA의 서열 정보와 배양 중에 보여지는 바이오필름, 앰피실린에 대한 저항성을 가지는 것을 고려해 볼 때, 선별된 균주가 슈도모나스 계열의 미생물일 확률이 높을 것으로 예상되었다. 25mg/ml 농도의 앰피실린을 함유한 M9 배지 아가 플레이트에서 얻어진 단일 콜로니를 LB 브로스로 배양하고, 13,000 rpm으로 1분 동안 원심분리하여 배양된 균주를 수득할 수 있었다 (도 1). 수득한 균주에 증류수를 넣고 가볍게 흔들어 주면, 바이오필름과 균주가 쉽게 분리된다.

2) 산화환원효소의 염기서열 분석

선별된 균주가 슈도모나스 속 미생물인지 여부를 확인하기 위해 슈도모나스 종에 존재하는 산화환원효소(oxidoreductase)의 염기서열을 신규 균주 CJ-MKB가 갖고 있는지 분석하였다. 이를 위해 새롭게 디자인한 프라이머 NCPPB 5P (ATGAGCAAGACTAACGAATCCC; 서열번호 20) 및 프라이머 NCPPB 3P (TCCAGAATGGCCAGCCCGCG; 서열번호 21)를 이용하여 서열 분석을 진행하였다. 그 결과 서열번호 2의 염기서열을 가지는 것을 확인하였다.

서열번호 2의 염기서열을 NCBI BLAST로 분석해본 결과, 서열번호 2가 공지된 슈도모나스 스투체리 A1501 균주의 산화환원효소의 몰리브도프테린-결합(molybdopterin-binding) 서열과 동일한 서열을 가지는 것을 확인함으로써, 선별된 신규 균주 CJ-MKB는 슈도모나스 속 미생물임을 확인하였다.

3) 트랜스아미나아제의 염기서열 분석

상동성이 확인된 핵산 서열은 714 개의 짧은 서열이므로, 미생물의 종속을 정확히 분류할 수 없었다. 이에 추가적인 단백질 핵산 서열을 분석하여 종속을 확인하였다. 미생물이 6-ACA를 질소원으로 사용하는 경우, 이의 효소 전환반응에 관여할 것으로 예상되는 트랜스아미나아제 중 N-아세틸오르니틴 트랜스아미나제 또는 4-아미노부티레이트 트랜스아미나제가 특이적일 것으로 예상하고, 상기 두 효소 활성을 갖는 단백질의 염기서열을 확인하였다.

구체적으로, 슈도모나스 스투체리 A1501과 선별된 균주 CJ-MKB의 게놈(genome)에 존재하는 N-아세틸오르니틴 트랜스아미나제의 염기 서열을 비교 분석하기 위하여 argD_F2 (5' 프라이머: ATTTAAGGATCCGTCCGCCCCGCACACCCCGG; 서열번호 22) 및 argD_R2 (3' 프라이머: ATTTAAGAGCTCTCAGGCCTGGGTCAGCGTC; 서열번호 23)를 사용하여 PCR 수행에 의해 핵산 서열을 분석하였다. 그 결과 슈도모나스 스투체리 A1501과 신규 미생물의 N-아세틸오르니틴 트랜스아미나제가 각각 서열번호 3 및 서열번호 4의 염기 서열을 가지는 것을 확인하였다.

또한 동일한 방법으로 슈도모나스 스투체리 A1501과 선별된 균주의 4-아미노부티레이트 트랜스아미나제의 염기서열을 비교분석하기 위하여 gabT_F (5' 프라이머: ATTTAACATATGCAACGCCGTGTCGCCGCCGTTCC; 서열번호 24)와 gabT_R (3' 프라이머: ATTTAAGAATTCTCAGGTCAGCTCGTCGAAACACT; 서열번호 25)를 이용하여 PCR을 수행하였다. 그 결과 각각 서열번호 5 및 서열번호 6의 염기 서열을 가지는 것을 확인하였다.

슈도모나스 스투체리 A1501과 선별된 균주의 N-아세틸오르니틴 트랜스아미나제 염기 서열을 비교 분석하기 위해 다중서열정렬(Multiple sequence alignment)을 이용하였다. 그 결과, 1,221개의 핵산 서열 중 13개의 핵산이 다른 것으로 확인되었다 (핵산 상동성: 98.9353%). 또한 동일한 방법으로 슈도모나스 스투체리 A1501과 신규 균주의 4-아미노부티레이트 트랜스아미나제의 핵산 서열을 비교 분석한 결과 1,257개의 핵산 서열 중 21개의 핵산이 다른 것으로 확인되었다 (핵산 상동성: 98.3294%)

결론적으로 선별된 균주 슈도모나스 스투체리 CJ-MKB (Pseudomonas stutzeri CJ-MKB)는 현재까지 알려진 미생물 유전체 서열 중에 슈도모나스 스투체리 A1501와 가장 높은 상동성을 가지며, 새로운 균주임이 확인되었다. 이에 따라 선별된 균주를 2014년 10월 22일자로 한국미생물보존센터에 기탁하여 수탁번호 KCCM11587P를 부여받았다.

실시예 2: 슈도모나스 스투체리 CJ- MKB 의 탈아민 반응성 확인

슈도모나스 스투체리 CJ-MKB의 5-아미노발레르산 및 6-아미노카프로산 탈아민화 반응성 평가를 수행하였다. 트랜스아미나제의 반응은 아민기와 케톤기의 치환 반응이므로, 반응 결과물은 박층 크로마토그래피(TLC)를 이용한 물질 분리 후, 닌하이드린 (ninhydrin)의 아민기 발색 반응을 통해서 기질 및 생성물을 쉽게 확인할 수 있다. 슈도모나스 스투체리 CJ-MKB의 트랜스아미나제 활성 확인을 위해 전세포 반응을 진행하였다. 슈도모나스 스투체리 CJ-MKB를 배양하여 광학밀도가 0.7에 도달하였을 때, 새로운 M9 배지에 계대 배양하였으며, 6-아미노카프로산과 5-아미노발레르산을 질소원으로 고정시키고 배양을 진행하였다. 상기 배지에 필요한 알파-케토글루타레이트와 피리독살-포스페이트를 넣어주고, 5-아미노발레르산 및 6-아미노카프로산의 탈아민 정도 확인을 위해 TLC를 수행하였다. 반응 부피는 100 ㎕ 였으며, 5-아미노발레르산, 6-아미노카프로산, 알파-케토글루타레이트, 피리독살-포스페이트의 다양한 농도 및 각각의 기질 유무에 따른 글루타메이트 (glutamate) 의 생성 및 기질의 분해 정도를 TLC 상에서 비교하였다. TLC 전개가 끝나고, 3% 닌하이드린 용액으로 아민기가 존재하는 물질을 발색시켰다. TLC 결과를 통해서 5-아미노발레르산, 6-아미노카프로산이 소멸되고, 글루타메이트가 생성되는 것을 확인할 수 있었다 (도 2 참조).

도 2의 97 h reaction, lane 4에서 나타난 바와 같이, 배지에 20 mM 6-아미노카프로산, 10 mM 알파-케토글루타레이트, 0.1 mM의 피리독살포스페이트를 첨가해준 균주가 97 시간 이전에 6-아미노카프로산을 모두 반응시키는 것을 확인할 수 있었다. 트랜스아미나제 반응이 충족되었을 때와 비교하면 반응 속도가 느리지만, 피리독살포스페이트가 없는 조건에서도 6-아미노카프로산이 감소하는 것이 TLC 상에서 확인되었다 (도 2의 97 h reaction lane 4-1). 5-아미노발레르산 및 6-아미노카프로산이 동시에 존재하는 경우에는 6-아미노카프로산의 감소가 확인되지 않았다 (도 2의 97 h reaction, lane 5, 및 5-1). 이를 통해 슈도모나스 스투체리 CJ-MKB를 최소배지 조건에서 배양할 때, 6-아미노카프로산과 5-아미노발레르산이 질소원으로 경쟁 반응하는 것으로 평가되었다.

이 실험 결과로부터 슈도모나스 스투체리 CJ-MKB가 6-아미노카프로산을 단일 질소원으로 사용할 수 있으며, 알파-케토 글루타레이트 및 피리독살포스페이트 존재 하에서 5-아미노발레르산 및 6-아미노카프로산 탈아민화 반응을 가속화시키는 것을 확인할 수 있었다 (도 2). 한편 도 2의 24h reaction, lane5와 72h reaction, lane 4에서 적은 양의 글루타메이트가 확인되었지만, 지속적으로 축적되지는 않는 것으로 나타났다. 이는 6-아미노카프로산의 반응과 더불어 글루타메이트가 생성되지만, 글루타메이트 대부분이 아민 공급원으로 사용되기 때문에 세포 내에서 축적되지 않고 빠르게 전환되는 것으로 평가된다.

실시예 3: 대장균 균주에서 본 발명의 신규 트랜스아미나제 활성을 갖는 폴리펩티드의 과발현 유도 및 이의 반응성 평가

1) 대장균에서의 슈도모나스 스투체리 CJ- MKB 균주 유래 트랜스아미나제 활성을 갖는 폴리펩티드 과발현 유도

실시예 1에서 선별 및 동정된 신규 슈도모나스 스투체리 CJ-MKB 균주로부터 탈아민반응에 관여할 것으로 예상된 트랜스아미나제로 추정되는 효소의 활성을 확인하고자 하기 실험을 진행하였다. 서열분석을 통해 상기 슈도모나스 스투체리 CJ-MKB의 트랜스아미나제를 코딩하는 유전자 ("이하 "argD"라 지칭함)의 염기서열을 확인하였다 (서열번호 4).

발현 및 정제를 위하여 argD 유전자 염기 서열의 5-말단에 His-tag을 추가하여 발현하도록 클로닝하였다. 구체적으로, 대장균 발현 벡터 pETDuet1 (Merck Millipore, Darmstadt, 독일)에 재조합된 슈도모나스 스투체리 CJ-MKB 유래 argD를 대장균 Rosetta에 넣고 형질전환된 균주를 제작하였다. 만들어진 균주를 3 mL의 LB 용액 배지에 50 mg/ml 농도의 앰피실린을 넣고 37 ℃에서 12시간 배양하였다. 배양된 균주를 항생제를 포함한 50 mL LB에 넣고 37 ℃에서 배양하여 광학광도 (600 nm 파장)가 0.8이 되면, 발현을 유도하고 18 ℃에서 48시간 배양하였다. 배양된 균주를 세척하고 소니케이터를 이용하여 세포를 분쇄하였다. 분쇄 후 과발현되는 가용성 단백질을 SDS-PAGE 젤 결과를 통해서 확인하였다 (도 3).

상기 형질전환된 대장균 Rosetta를 '대장균 로제타 CC04-0057'로 명명하고, 2014년 10월 22일자로 한국미생물보존센터에 기탁하여 수탁번호 KCCM11588P를 부여받았다.

2) 본 발명의 트랜스아미나제 활성을 갖는 폴리펩티드가 과발현된 대장균 분쇄액의 탈아민 반응성 평가

실시예 3-1의 N-아세틸오르니틴 트랜스아미나제가 과발현된 대장균 분쇄액을 이용하여 아미노화합물 (감마아미노부티르산, 6-아미노카프로산, 및 N-아세틸오르니틴) 각각에 대한 반응성을 평가하였다. 10 mM 상기 아미노화합물 각 3종, 10 mM의 알파케토글루타레이트 및 0.1 mM 피리독살-포스페이트를 넣고 과발현된 N-아세틸오르니틴 트랜스아미나제의 활성을 평가하였다. 과발현이 유도된 대장균 분쇄액(cell lysate) 50 ㎕과 기질들을 첨가하고 50 mM HEPES 완충액 (pH 8.0)으로 채워 100 ㎕의 부피로 반응을 진행하였다. 37 ℃에서 30분 반응 후, 6-아미노카프로산의 탈아민 반응 정도를 TLC로 확인하였다 (도 4).

과발현된 N-아세틸오르니틴 트랜스아미나제는 본래 기질로 알려진 N-아세틸오르니틴에 대해서 높은 반응성을 보이는 것으로 관찰되었다 (도 4의 lane 8). 구체적으로 N-아세틸오르니틴이 크게 감소하고, 트랜스아미나제의 공동반응물인 글루타메이트가 확연히 증가되는 것을 확인할 수 있었다. 또한 6-아미노카프로산을 기질로 반응이 진행되었을 때, 글루타메이트가 생성되는 것을 육안으로 확인할 수 있었다 (도 4의 lane 5).

또한 상기 반응성 평가와 같은 방법으로 6-아미노카프로산의 농도를 증가시켜, 이의 전환반응에서 생성되는 글루타메이트의 생성량을 TLC 상에서 분석하였다 (도 5). 그 결과 (도 5, D) 반응에서 확인할 수 있는 바와 같이, 6-아미노카프로산의 농도가 두 배 (20mM), 또는 세 배 (30mM) 증가됨에 따라 글루타메이트의 생성량이 증가되는 것을 확인할 수 있었다. 이에 따라 N-아세틸오르니틴 트랜스아미나제에 의한 6-아미노카프로산의 전환 반응이 상기 기질이 증가될수록 반응물이 증가되는 전형적인 효소 반응임을 확인할 수 있었다.

결론적으로 상기 결과들을 통해, 슈도모나스 스투체리 CJ-MKB 유래 트랜스아미나제 활성을 갖는 폴리펩티드의 유전자를 재조합하여 대장균에서 과발현함으로써 본 발명의 폴리펩티드가 6-아미노카프로산에 대한 탈아민 반응 활성을 갖는 것을 확인할 수 있었다.

실시예 4: 다양한 슈도모나스 균주 유래의 N- 아세틸오르니틴 트랜스아미나제의 탈아민 활성 평가

상기 실시예 3을 통해 슈도모나스 스투체리 CJ-MKB 유래 트랜스아미나제 활성을 갖는 폴리펩티드의 6-아미노카프로산에 대한 탈아민 활성이 평가되었다. 이에 따라 동일한 생전환 반응이 가능할 것으로 판단되는 슈도모나스 멘도시나(Pseudomonas mendocina), 슈도모나스 푸티다(P. putida), 슈도모나스 레시노보란스(P. resinovorans), 슈도모나스 시린게(P. syringae), 슈도모나스 써모톨러란스(P. thermotolerans) 등의 다양한 슈도모나스 속 미생물 유래의 N-아세틸오르니틴 트랜스아미나제 유전자를 대장균에 발현시키고 그 반응성을 평가하였다.

1) 다양한 슈도모나스 균주 유래의 N- 아세틸오르니틴 트랜스아미나제 상동성 비교

슈도모나스 속 미생물 중에서 5 개의 균주를 선정하여 National Center for Biotechnology Information (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)에서 제공되는 nucleotide 와 genome 프로그램을 이용하여, 슈도모나스 멘도시나, 슈도모나스 푸티다, 슈도모나스 레시노보란스, 슈도모나스 시린게, 슈도모나스 써모톨러란스 유래의 N-아세틸오르니틴 트랜스아미나제의 유전자와 아미노산 서열을 확인하고, 슈도모나스 스투체리 CJ-MKB 유래 트랜스아미나제 활성을 갖는 폴리펩티드의 아미노산 서열과 상동성을 비교하였다 (표 2). 각 슈도모나스 속 미생물로부터 유래한 각각의 효소들은 서로 약 75 이상%의 아미노산 상동성을 보였다.

5종의 슈도모나스 속 미생물 유래 N-아세틸오르니틴 트랜스아미나제들 및 P.스투체리 CJ-MKB 유래 폴리펩티드의 아미노산 상동성 비교 결과 (단위: %)

	P.resinovorans (서열번호 13)	P.thermotolerans (서열번호 17)	P.stutzeri CJ-MKB	P.mendocina (서열번호 9)	P.syringae (서열번호 15)	P.putida (서열번호 11)
P.resinovorans		86.1728	80.0493	78.0788	80.4938	83.4975
P.thermotolerans	86.1728		78.0247	79.2593	78.2716	78.0247
P.stutzeri CJ-MKB	80.0493	78.0247		76.3547	75.3086	78.0788
P.mendocina	78.0788	79.2593	76.3547		80.9877	80.2956
P.syringae	80.4938	78.2716	75.3086	80.9877		79.0123
P.putida	83.4975	78.0247	78.0788	80.2956	79.0123

2) 5종의 슈도모나스 균주 유래의 N-아세틸오르니틴 트랜스아미나제 및 본 발명의 폴리펩티드의 분리 및 정제

상기 실시예 4-1)의 5종의 슈도모나스 균주로부터 얻어진 N-아세틸오르니틴 트랜스아미나제 유전자 및 본 발명의 슈도모나스 스투체리 CJ-MKB 유래 트랜스아미나제 활성을 갖는 폴리펩티드의 유전자를 실시예 3-1)과 같은 방법으로 대장균에서 발현시키고, His-tag 컬럼을 이용하여 정제된 단백질을 얻을 수 있었다. 얻어진 단백질을 SDS-PAGE 겔 상에서 비교해 본 결과 정상적인 정제가 되었음을 확인하였다 (도 6).

3) 5종의 슈도모나스 균주 유래의 N- 아세틸오르니틴 트랜스아미나제 및 본 발명의 폴리펩티드의 6- 아미노카프로산에 대한 탈아민 활성 평가

실시예 4-2)에서 정제된 단백질(도 6의 lane 3, 5, 7, 9, 11, 13)을 가지고 6-아미노카프로산에 대한 반응성을 검증하였다. 구체적으로 20 mM 6-아미노카프로산, 10 mM 알파-케토 글루타레이트, 및 0.1 mM의 피리독살포스페이트에, 정제된 각각의 N-아세틸오르니틴 트랜스아미나제를 전체 반응액의 0.5 mg/ml 농도로 첨가하였다. 상기 혼합액에 50 mM HEPES 완충액 (pH 8.0)을 부가하여 100 ㎕의 부피로 반응을 진행하였다. 37 ℃에서 한시간 반응 후, 반응 완료된 샘플 10 ㎕를 990 ㎕의 에탄올로 희석하여 효소 활성을 제거하였다. 이후 14,000 rpm, 4 ℃, 10분 조건으로 원심분리하고 상등액 중 10 ㎕을 990 ㎕의 멸균 증류수 (sterilized distilled water)로 희석하여 액체 크로마토그래피-질량분석기 (LC-MASS)로 6-아미노카프로산의 감소 정도를 분석하였다.

그 결과, P.시린게 유래의 N-아세틸오르니틴 트랜스아미나제가 56.69 %의 6-아미노카프로산 전환을 보였으며 P. 스투체리 CJ-MKB 유래의 폴리펩티드는 45.52 %로 다른 비교균주들과 유사한 정도를 보였다.

같은 샘플을 시프 시약을 통하여 알데하이드 생성 정도를 상대적인 활성값으로 비교하였다 (도 8). 20 mM 6-아미노카프로산 반응에서 10 ㎕의 반응물을 50 mM HEPES 완충액 (pH 8.0) 180 ㎕에 희석하고 10 ㎕의 시프 시약을 넣고 상온에서 30 분간 반응시켰다. 기질을 넣어 주지 않은 효소 샘플과 기질들만 넣어준 샘플을 컨트롤 샘플로 사용하였다. 96 웰 플레이트 리더를 이용하여 490 nm의 파장에서 흡수되는 값을 기반으로 상대적인 효소 활성을 비교하였다 (도 8).

P. 써모톨러란스 유래의 N-아세틸오르니틴 트랜스아미나제 반응 샘플의 알데하이드 생성이 LC-Mass 결과와 비교하여 높게 측정되었으나, 전체적인 반응 정도는 동일한 순으로 확인되었다. 또한 LC-Mass의 결과와 시프 시약 결과가 상관 관계를 가지는 것으로 확인되었다.

4) N- 아세틸오르니틴 , 감마아미노부티르산 , 5- 아미노발레르산 기질에 대한 종의 슈도모나스 균주 유래의 N- 아세틸오르니틴 트랜스아미나제 및 본 발명의 폴리펩티드의 탈아민 활성 평가

실시예 4-3)에서 반응성 확인된 5종의 슈도모나스종 유래의 N-아세틸오르니틴 트랜스아미나제 및 본 발명의 폴리펩티드의 다양한 기질들에 대한 반응성을 평가하였다. 10 mM 알파-케토 글루타레이트, 0.1 mM의 피리독살포스페이트와 함께 각각 전체 반응액의 10 mM 농도로 N-아세틸오르니틴, 감마아미노부티르산, 또는 5-아미노발레르산 및 전체 반응액의 0.5 mg/ml 농도로 N-아세틸오르니틴 트랜스아미나제를 첨가하여 37 ℃에서 한시간 반응시켰다. 총 100 ㎕의 반응물 중에 10 ㎕을 180 ㎕의 50 mM HEPES 완충액 (pH 8.0)으로 희석하고 10 ㎕의 시프 시약을 사용하여 30분간 반응시킨 후 96 웰 플레이트 리더를 이용하여 상대적인 효소 활성을 비교하였다.

N-아세틸오르니틴 트랜스아미나제의 본래 기질로 알려진 N-아세틸오르니틴에 대한 탈아민 반응은 P. 멘도시나 유래가 가장 높은 활성을 보였다 (도 9).

감마아미노부티르산에 대해서는 P. 레시노보란스 유래의 N-아세틸오르니틴 트랜스아미나제가 가장 높은 반응성을 보였다 (도 10).

5-아미노발레르산에 대한 반응성은 본 발명의 P. 스투체리 CJ-MKB 유래의 폴리펩티드가 가장 높은 것을 확인하였다 (도 11).

실시예 5: P. 스투체리 CJ- MKB 유래의 트랜스아미나제 활성을 갖는 폴리펩티드의 역반응 활성 평가

상기 실시예 4를 통해 다양한 슈도모나스 유래의 N-아세틸오르니틴 트랜스아미나제 및 본 발명의 폴리펩티드가 6-아미노카프로산 등의 아민화합물을 탈아민시키면서 아디페이트 세미알데하이드 등으로 전환됨을 확인하였다. 본 실시예에서는 이의 역반응으로서, 아디페이트 세미알데하이드로부터 6-아미노카프로산으로의 전환 반응성을 확인하기 위해, N-아세틸오르니틴 트랜스아미나제에 의해서 생성되는 아디페이트 세미알데하이드가 존재하는 상황에서 과량의 글루타메이트를 처리함으로써 아디페이트 세미알데하이드가 다시 6-아미노카프로산으로 생성되는지 여부를 확인하였다.

먼저, 5 mM 6-아미노카프로산, 5 mM 알파-케토 글루타레이트, 0.1 mM의 피리독살포스페이트를 50 mM HEPES 완충액 (pH 8.0)으로 100 ㎕의 부피를 고정하고, 전체 반응액의 0.5 mg/ml 농도로 5종의 슈도모나스 균주 유래의 N-아세틸오르니틴 트랜스아미나제 및 본 발명의 폴리펩티드를 첨가하여 37 ℃에서 한시간 반응을 진행하였다. 반응이 끝난 후에는 반응 샘플을 100 ℃에서 5분 이상 처리해서 효소의 활성을 제거하였다. 열처리가 끝난 샘플은 14,000 rpm, 4 ℃, 10분 조건으로 원심분리하고 상등액중 10 ㎕을 취하여, 180 ㎕의 50 mM HEPES 완충액 (pH 8.0)으로 희석하였다. (정반응, α-KG reaction (알파-케토글루타레이트 반응))

또한 이의 역반응을 유도하기 위하여 200 ㎕의 부피를 가지는 동일한 샘플을 제작하여 위와 동일한 조건으로 처리하여 원심분리 후, 97 ㎕의 상등액에 20 mM 글루타메이트와 0.5 mg/ml의 효소를 넣어주어 100 ㎕ 부피의 반응 샘플을 37 ℃에서 한시간 반응하고 100 ℃에서 5분간 처리하였다. 이후 14,000 rpm, 4 ℃, 10분 조건으로 원심분리하고 상등액중 10 ㎕를 180 ㎕의 50 mM HEPES 완충액 (pH 8.0)으로 희석하였다 (역반응, Glutamate reaction(글루타메이트 반응)).

얻어진 샘플에 10 ㎕의 시프 시약을 사용하여 30분간 반응시킨 후 96 well plate reader를 이용하여 상대적인 효소 활성을 비교하였다. 그 결과 시프 시약의 반응 후 96 웰 플레이트 리더를 통해서 얻어진 값들을 비교할 때, 5종의 슈도모나스 균주 유래의 N-아세틸오르니틴 트랜스아미나제 및 및 본 발명의 폴리펩티드가 아디페이트 세미알데하이드를 전환시켜 6-아미노카프로산을 생성하는 것을 확인할 수 있었다 (도 12).

한국미생물보존센터(국외) KCCM11587P 20141022 한국미생물보존센터(국외) KCCM11588P 20141022

<110> CJ Cheiljedang Corporation <120> Novel transaminases and method for deamination of amino compound using thereof <130> PN107903 <160> 25 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 1384 <212> DNA <213> a partial DNA sequence of P. stutzeri CJ-MKB 16S rRNA <400> 1 tgcagtcgag cggatgaatg gagcttgctc catgattcag cggcggacgg gtgagtaatg 60 cctaggaatc tgcctggtag tgggggacaa cgtttcgaaa ggaacgctaa taccgcatac 120 gtcctacggg agaaagtggg ggatcttcgg acctcacgct atcagatgag cctaggtcgg 180 attagctagt tggtgaggta aaggctcacc aaggcgacga tccgtaactg gtctgagagg 240 atgatcagtc acactggaac tgagacacgg tccagactcc tacgggaggc agcagtgggg 300 aatattggac aatgggcgaa agcctgatcc agccatgccg cgtgtgtgaa gaaggtcttc 360 ggattgtaaa gcactttaag ttgggaggaa gggcagtaag ttaatacctt gctgttttga 420 cgttaccaac agaataagca ccggctaact tcgtgccagc agccgcggta atacgaaggg 480 tgcaagcgtt aatcggaatt actgggcgta aagcgcgcgt aggtggttcg ttaagttgga 540 tgtgaaagcc ccgggctcaa cctgggaact gcatccaaaa ctggcgagct agagtatggc 600 agagggtggt ggaatttcct gtgtagcggt gaaatgcgta gatataggaa ggaacaccag 660 tggcgaaggc gaccacctgg gctaatactg acactgaggt gcgaaagcgt ggggagcaaa 720 caggattaga taccctggta gtccacgccg taaacgatgt cgactagccg ttgggatcct 780 tgagatctta gtggcgcagc taacgcatta agtcgaccgc ctggggagta cggccgcaag 840 gttaaaactc aaatgaattg acgggggccc gcacaagcgg tggagcatgt ggtttaattc 900 gaagcaacgc gaagaacctt accaggcctt gacatgcaga gaactttcca gagatggatt 960 ggtgccttcg ggaactctga cacaggtgct gcatggctgt cgtcagctcg tgtcgtgaga 1020 tgttgggtta agtcccgtaa cgagcgcaac ccttgtcctt agttaccagc acgttaaggt 1080 gggcactcta aggagactgc cggtgacaaa ccggaggaag gtggggatga cgtcaagtca 1140 tcatggccct tacggcctgg gctacacacg tgctacaatg gtcggtacaa agggttgcca 1200 agccgcgagg tggagctaat cccataaaac cgatcgtagt ccggatcgca gtctgcaact 1260 cgactgcgtg aagtcggaat cgctagtaat cgtgaatcag aatgtcacgg tgaatacgtt 1320 cccgggcctt gtacacaccg cccgtcacac catgggagtg ggttgctcca gaagtagcta 1380 gtct 1384 <210> 2 <211> 714 <212> DNA <213> a partial DNA sequence of P. stutzeri CJ-MKB oxidoreductase molybdopterin-binding <400> 2 agcccttcct cgaacagggt gttgagcagg ccgaacaaca gcgcggcgtc ctgtccgggg 60 cgcacgaaca gatgttgatc ggcgatggcg gcggtctcgc tgcgccgcgg gtcgaccacc 120 accagtttgc cgccgcgggc gcggatcgcc ttcagccgct tctccacatc gggcacggtc 180 atgatgctac cgttggaggc caaagggttg ccgccgagaa tcagcatgaa atcggtgtga 240 tcgatgtccg gcaccggcag cagcagacca tggccgtaca tcaggtggct ggtcaggtgg 300 tgcggcagct ggtcgaccga cgtggccgag aagcggttgc gcgtcttcag cagaccgagg 360 aagtaattgc tgtgggtcgt cagcccgtag ttatgcacac tcgggttgcc ttggtagatc 420 gccacggcat tactaccgtg gcgctcgcgg atctcagcca ggcgctcggc gaccagttcg 480 taggcctcct cccagctgat ggcctgccac tcatcgccgc agcggcgcat cgggtggcgc 540 aggcgatcgg ggtcgttctg gatgtcctgc agcgccactg ccttcggaca gatatggccg 600 cggctgaagc tgtcgagggg atcgcccttg atcgaaagga tgcgctcgcc ttcggtctgg 660 atggtcaggc cgcagatggc ttcgcacagg tgacaggcac ggtgatggac gctg 714 <210> 3 <211> 1221 <212> DNA <213> N-acetylornithine transaminase gene of P. stutzeri A1501 <400> 3 atgtccgccc cgcacacccc ggtagaacgc 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ggtgctggat 900 atcgtcaaca ccccggaggt gctggagggc gtcaaggccc gccacgagcg cttcaaggcc 960 cggctgttgc agatcggtga gcgctacggc gtgttcagcc aggtccgcgg ccgtggcctg 1020 ttgatcggct gcgtgctctc ggatgcctgg aaaggcaagg ccggtgcatt ctgggccgcg 1080 gcggagaagg aggcgctgat ggtgctgcag gcagggccgg acgtggttcg cctggcgccg 1140 agtctgatca tcgacgaagc tgacatagac gaggggctgg atcgtttcga gcgcgccatc 1200 gcgacgctga cccaggcctg a 1221 <210> 4 <211> 1221 <212> DNA <213> new transaminase gene of P. stutzeri CJ-MKB <400> 4 gtgtccgccc cgcacacccc ggtagaacgc gccgatttcg accaggtcat tgttcccact 60 ttcgcccccg ccgccttcgt gccggtgcgt ggtctgggct cgcgagtatg ggatcagagc 120 ggtcgagaac tggtggactt cgctggcggc atcgcggtca acgccctggg ccatgcccat 180 ccggccatga tcgcggcact gacggagcag gctggcaagc tctggcacat ctccaacatc 240 tataccaacg agccggcgct gcgcctggcc aagaagctgg tggcggcgac cttcgccgac 300 cgcgccttct tctgcaattc cggtgcagag gccaacgagg cggcgttcaa actggcccgt 360 cgctacgccc atgatgtgta cggcccgcag aagttcgaga tcatctcggc gctcaacagc 420 ttccacggcc gcaccctgtt caccgtcacg gtgggcgggc agtcgaagta ctccgatggc 480 ttcgggccga agatcgaagg cattactcac gtgccttaca acgacctcga agcgctgaag 540 gcggcgatct ccgacaagac ctgtgccgtg gtgctcgaac cgatccaggg cgagagcggc 600 atcctgccgg gcgaacaggc gtacctggaa ggcgcacgcc agctgtgcaa cgagcacaac 660 gcgctgctga tcttcgatga ggtgcagacc ggtctgggcc gtaccggtga gctgttcgcc 720 tacatgcact atggcgtcac gccggacatt ctgaccaacg ccaagagcct tggtggcggc 780 ttcccgatcg gtgcgatgct gaccaccaac gagatcgccg cccatttcag cgtcggtacc 840 cacggcacca cgtacggcgg caatccgctg gcctgcgcgg tggccgagac ggtgctggat 900 atcgtcaaca ccccggaggt gctggagggc gtcaaggccc gccacgagcg cttcaaggcc 960 aggctgttgc agatcggtga gcgctacggc gtgttcagcc aggtccgcgg ccgcggcctg 1020 ttgatcggct gcgtgctctc ggatgcctgg aaaggcaagg ccggtgcatt ctgggccgcg 1080 gcggagaagg aggcgctgat ggtgctgcag gcagggccgg acgtggttcg cctggcgccg 1140 agtctgatca tcgacgaagc tgacatagac gaggggctgg atcgtttcga gcgcgccatc 1200 gcgacgctga cccaggcctg a 1221 <210> 5 <211> 1257 <212> DNA <213> 4-aminobutyrate aminotransferase gene (gabT) of P. stutzeri A1501 <400> 5 atgcaacgcc gtgtcgccgc cgttccccgt ggcgtcggcc agatccaccc gatctttgcc 60 gaccacgcga agaacagcag cgtggtggat gtggagggcc gcgagttcat cgatttcgcc 120 ggcggcatcg ccgtgctgaa taccggccac ctgcacccga agatcgtcaa ggcggtggaa 180 gaccagctgc acaagctcac ccacacctgc ttccaggtgc tggcctacga gccgtacgtc 240 gagctgtgcg agaagatcaa cgcgcgggtg ccgggtgatt tcgccaagaa gactctgctg 300 gtcaccaccg gctccgaggc cgtggagaac gcggtgaaga tcgcccgcgc cgccaccggc 360 cgtgccggcg tgattgcctt caccggcgcc tatcacggcc gcaccatgat gaccctcggc 420 ctgaccggca aggtcgcccc gtactccgcc ggcatgggcc tgatgccggg cgggatcttc 480 cgtgcgcagt atccctgcgc gatccatggt gtcagcgtcg atgactcgat cgcgagcatc 540 gagcgcatct tcaagaacga tgccgagccg cgcgacatcg ccgcgatcat cgtcgaaccg 600 gtgcagggcg agggcggctt caatgtcgcg ccgaaggatt tcatggcccg cctgcgcgcg 660 ctctgcgacg agcacggcat cctgctgatc gccgacgagg tgcagaccgg cgccgggcgc 720 accggcacct tcttcgccat ggagcagatg ggcgtggtcg ccgacctgac caccttcgcc 780 aagtcggtcg gcggcggctt cccgatcgcc ggcgtgtgcg gcaaggccga gatcatggat 840 gccatcgcac ccggcgggct gggcggcacc tatgccggca acccgttgtc ctgcgcggcg 900 gcgctggcgg tcatggaaat cttcgaggag gagcatctgc tcgaccgctg caaggccgtg 960 gcggagaagc tcaccaccgg cctcaaggcg atccaggcca agcacaagga gatcggcgag 1020 gtgcgcggcc tcggcgcgat gatcgccatc gagctgttcg aggatggcga cctggcgcga 1080 ccggccgcgg cgctcacgtc gcagatcgtc gcccgggcgc gggagaaggg attgatcctg 1140 ctgtcctgcg gtacctacta caacgtgctg cgcgtgctgg tgccgctgac cgtcgaggac 1200 gagctgctcg agcgcggcct ggccatcctc ggcgagtgtt tcgacgagct gacctga 1257 <210> 6 <211> 1257 <212> DNA <213> 4-aminobutyrate aminotransferase gene of P. stutzeri CJ-MKB <400> 6 atgcaacgcc gtgtctccgc cgttccccgt ggcgtcggcc agatccaccc gatctttgcc 60 gaccacgcga agaacagcag cgtggtggat gtggaggggc gccagttcat cgatttcgcc 120 ggcggcaacg ccgtgctgaa taccggccac ctgcacccga agatcgtcaa ggcggtggaa 180 gaccagctgc acaagctcac ccacacctgc ttccaggtgc tggcctacga gccgtacgtc 240 gagctgtgcg agaagatcaa cgcgcgggtg ccgggtgatt tcgccaagaa gactctgctg 300 gtcaccaccg gctccgaggc cgtggagaac gcggtgaaga tcgcccgcgc cgccaccggc 360 cgtgccggcg tcattgcctt caccggcgcc tatcacggcc gcaccatgat gaccctcggc 420 ctgaccggca aggtcgcccc gtactccgcc ggcatgggcc tgatgccggg cgggatcttc 480 cgtgcgcagt acccctgcgc gatccatggt gtcagcgtcg atgactcgat cgcgagcatc 540 gagcgcatct tcaagaacga cgccgagccg cgcgacatcg ccgcgatcat cgtcgaaccg 600 gtgcagggcg agggcggctt caatgtcgcg ccgaaggatt tcatggcccg cctgcgcgcg 660 ctctgcgacg agcacggcat cctgctgatc gccgacgagg tgcagaccgg cgccggacgc 720 accggcacct tcttcgccat ggagcagatg ggcgtggtcg ccgatctgac caccttcgcc 780 aagtcggtcg gcggcggctt cccgatcgcc ggcgtgtgcg gcaaggccga gatcatggat 840 gccatcgcgc ccggcgggct gggcggcacc tatgccggca acccgctgtc ttgcgcggcg 900 gcgctggcgg tcatggaaat cttcgaggag gagcatctgc tcgaccgctg caaggcggtg 960 gcggagaagc tcaccaccgg cctcaaggcg atccaggcca agcataagga gatcggcgag 1020 gtgcgcggcc tcggcgcgat gatcgccatc gagctgttcg aggatggcga cctggcgcga 1080 ccggccgcgg cgctgacgtc gcagatcgtc gcccgggcgc gggacaaggg gctgatcctg 1140 ttgtcctgcg gtacctacta caacgtgctg cgcgtgctgg tgccgctgac cgtcgaggac 1200 gagctgtacg agcgcggcct ggccatcctc ggcgagtgtt tcgacgagct gacctga 1257 <210> 7 <211> 406 <212> PRT <213> new aminotransferase from Pseudomonas stutzeri CJ-MKB <400> 7 Met Ser Ala Pro His Thr Pro Val Glu Arg Ala Asp Phe Asp Gln Val 1 5 10 15 Ile Val Pro Thr Phe Ala Pro Ala Ala Phe Val Pro Val Arg Gly Leu 20 25 30 Gly Ser Arg Val Trp Asp Gln Ser Gly Arg Glu Leu Val Asp Phe Ala 35 40 45 Gly Gly Ile Ala Val Asn Ala Leu Gly His Ala His Pro Ala Met Ile 50 55 60 Ala Ala Leu Thr Glu Gln Ala Gly Lys Leu Trp His Ile Ser Asn Ile 65 70 75 80 Tyr Thr Asn Glu Pro Ala Leu Arg Leu Ala Lys Lys Leu Val Ala Ala 85 90 95 Thr Phe Ala Asp Arg Ala Phe Phe Cys Asn Ser Gly Ala Glu Ala Asn 100 105 110 Glu Ala Ala Phe Lys Leu Ala Arg Arg Tyr Ala His Asp Val Tyr Gly 115 120 125 Pro Gln Lys Phe Glu Ile Ile Ser Ala Leu Asn Ser Phe His Gly Arg 130 135 140 Thr Leu Phe Thr Val Thr Val Gly Gly Gln Ser Lys Tyr Ser Asp Gly 145 150 155 160 Phe Gly Pro Lys Ile Glu Gly Ile Thr His Val Pro Tyr Asn Asp Leu 165 170 175 Glu Ala Leu Lys Ala Ala Ile Ser Asp Lys Thr Cys Ala Val Val Leu 180 185 190 Glu Pro Ile Gln Gly Glu Ser Gly Ile Leu Pro Gly Glu Gln Ala Tyr 195 200 205 Leu Glu Gly Ala Arg Gln Leu Cys Asn Glu His Asn Ala Leu Leu Ile 210 215 220 Phe Asp Glu Val Gln Thr Gly Leu Gly Arg Thr Gly Glu Leu Phe Ala 225 230 235 240 Tyr Met His Tyr Gly Val Thr Pro Asp Ile Leu Thr Asn Ala Lys Ser 245 250 255 Leu Gly Gly Gly Phe Pro Ile Gly Ala Met Leu Thr Thr Asn Glu Ile 260 265 270 Ala Ala His Phe Ser Val Gly Thr His Gly Thr Thr Tyr Gly Gly Asn 275 280 285 Pro Leu Ala Cys Ala Val Ala Glu Thr Val Leu Asp Ile Val Asn Thr 290 295 300 Pro Glu Val Leu Glu Gly Val Lys Ala Arg His Glu Arg Phe Lys Ala 305 310 315 320 Arg Leu Leu Gln Ile Gly Glu Arg Tyr Gly Val Phe Ser Gln Val Arg 325 330 335 Gly Arg Gly Leu Leu Ile Gly Cys Val Leu Ser Asp Ala Trp Lys Gly 340 345 350 Lys Ala Gly Ala Phe Trp Ala Ala Ala Glu Lys Glu Ala Leu Met Val 355 360 365 Leu Gln Ala Gly Pro Asp Val Val Arg Leu Ala Pro Ser Leu Ile Ile 370 375 380 Asp Glu Ala Asp Ile Asp Glu Gly Leu Asp Arg Phe Glu Arg Ala Ile 385 390 395 400 Ala Thr Leu Thr Gln Ala 405 <210> 8 <211> 1221 <212> DNA <213> acetylornithine aminotransferase gene from Pseudomonas mendocina <400> 8 atgtctgttc agcacgatgc ggtgcaacgc gccgatttcg accagtacat ggtccccaac 60 tacgcccctg ccgccttcgt acccgtgcgt ggcctcggtt cgcgagtctg ggatcagagt 120 ggtcgagagc tgatcgactt cgccggcggc atcgccgtca acgtgcttgg ccactgccat 180 ccggcgctgg tcgcggcgct gaccgagcag gccaacaccc tctggcacat ctccaacgtg 240 ttcaccaacg agccgaccct gcgcctgggc aagaagctgg tcgatgcgac cttcgccgag 300 cgcgtgttct tctgcaactc tggcgccgag gccaacgagg ccgcgttcaa gctggcccgt 360 cgtgttgcgc atgaccgttt cggcccggaa aagcacgaga tcattgccgc gctcaacagc 420 ttccacggcc gtaccctgtt caccgtcagc gtcggcggcc agccgaagta ctccgacggc 480 ttcggtccga agatccaggg catcacccac gtgccctaca acgatctgga ggcgctgaag 540 gcggccattt ccgacaagac ctgcgcagtg gtactcgagc cgatccaggg cgagggcggc 600 gtgctgccgg ccgagaaagc ctacctggaa ggcgcccgtg agctgtgcaa cgcgcacaac 660 gcgctgctgg tattcgacga ggtgcagagc ggcatgggcc gcagcggcga actgttcgcc 720 tacatgcact atggtgtggt gccggacatt ctctccagcg ccaagagcct ggggggtggc 780 ttccccatcg ccgccatgct caccaccacc gacctggcca agcactttac ccccggtacc 840 cacggcacca cctatggtgg caacccgctg gcctgcgcag tgggcgaggc ggtgctggac 900 atcgtcaata cccgcgagac cctggatggc gtgaaggtca agcaccagca gttcaagcaa 960 cgcctggagg cgctcggcaa gcagttcggt ctgttcgagc aggtgcgcgg catgggcctg 1020 ctgctcggtt gcgtgctcaa cgaggcgtgg aagggcaagg ccaagcaggt gctggacgcc 1080 gcttccgcgg aagggctgat gattctgcag gccggtccgg acgtggtgcg tttcgccccg 1140 agcctggtgg tggaagagcg cgatatcgaa gaaggcctgg cccgtttcga gcgtgcgctg 1200 agcaagctgg ccaacgcctg a 1221 <210> 9 <211> 406 <212> PRT <213> acetylornithine aminotransferase Pseudomonas mendocina <400> 9 Met Ser Val Gln His Asp Ala Val Gln Arg Ala Asp Phe Asp Gln Tyr 1 5 10 15 Met Val Pro Asn Tyr Ala Pro Ala Ala Phe Val Pro Val Arg Gly Leu 20 25 30 Gly Ser Arg Val Trp Asp Gln Ser Gly Arg Glu Leu Ile Asp Phe Ala 35 40 45 Gly Gly Ile Ala Val Asn Val Leu Gly His Cys His Pro Ala Leu Val 50 55 60 Ala Ala Leu Thr Glu Gln Ala Asn Thr Leu Trp His Ile Ser Asn Val 65 70 75 80 Phe Thr Asn Glu Pro Thr Leu Arg Leu Gly Lys Lys Leu Val Asp Ala 85 90 95 Thr Phe Ala Glu Arg Val Phe Phe Cys Asn Ser Gly Ala Glu Ala Asn 100 105 110 Glu Ala Ala Phe Lys Leu Ala Arg Arg Val Ala His Asp Arg Phe Gly 115 120 125 Pro Glu Lys His Glu Ile Ile Ala Ala Leu Asn Ser Phe His Gly Arg 130 135 140 Thr Leu Phe Thr Val Ser Val Gly Gly Gln Pro Lys Tyr Ser Asp Gly 145 150 155 160 Phe Gly Pro Lys Ile Gln Gly Ile Thr His Val Pro Tyr Asn Asp Leu 165 170 175 Glu Ala Leu Lys Ala Ala Ile Ser Asp Lys Thr Cys Ala Val Val Leu 180 185 190 Glu Pro Ile Gln Gly Glu Gly Gly Val Leu Pro Ala Glu Lys Ala Tyr 195 200 205 Leu Glu Gly Ala Arg Glu Leu Cys Asn Ala His Asn Ala Leu Leu Val 210 215 220 Phe Asp Glu Val Gln Ser Gly Met Gly Arg Ser Gly Glu Leu Phe Ala 225 230 235 240 Tyr Met His Tyr Gly Val Val Pro Asp Ile Leu Ser Ser Ala Lys Ser 245 250 255 Leu Gly Gly Gly Phe Pro Ile Ala Ala Met Leu Thr Thr Thr Asp Leu 260 265 270 Ala Lys His Phe Thr Pro Gly Thr His Gly Thr Thr Tyr Gly Gly Asn 275 280 285 Pro Leu Ala Cys Ala Val Gly Glu Ala Val Leu Asp Ile Val Asn Thr 290 295 300 Arg Glu Thr Leu Asp Gly Val Lys Val Lys His Gln Gln Phe Lys Gln 305 310 315 320 Arg Leu Glu Ala Leu Gly Lys Gln Phe Gly Leu Phe Glu Gln Val Arg 325 330 335 Gly Met Gly Leu Leu Leu Gly Cys Val Leu Asn Glu Ala Trp Lys Gly 340 345 350 Lys Ala Lys Gln Val Leu Asp Ala Ala Ser Ala Glu Gly Leu Met Ile 355 360 365 Leu Gln Ala Gly Pro Asp Val Val Arg Phe Ala Pro Ser Leu Val Val 370 375 380 Glu Glu Arg Asp Ile Glu Glu Gly Leu Ala Arg Phe Glu Arg Ala Leu 385 390 395 400 Ser Lys Leu Ala Asn Ala 405 <210> 10 <211> 1221 <212> DNA <213> acetylornithine aminotransferase gene from Pseudomonas putida <400> 10 atgtccgttg agcaagcccc ggtgcaacgt gccgatttcg accaggtgat ggtccccaac 60 tattctccgg cggccttcat tcctgtgcga ggcgagggtt cccgcgtctg ggaccagtcg 120 ggtcgcgagt tgatcgactt tgccggcggc atcgcggtca atgccctggg ccactgccac 180 ccggcactgg tcaaggccct gactgaacag gccaacaccc tctggcacgt ctccaacgtg 240 ttcaccaacg agccggccct gcgcctggcc cacaagctgg tggacgccac ctttgccgac 300 cgcgcgttct tctgcaactc cggcgccgag tccaacgagg ccgctttcaa gctggcccgt 360 cgtgtggcgc atgaccgctt cggtccgcaa aagcacgaaa tcatcgccac cgtgaacagc 420 ttccacggtc gcaccctgtt taccgtcagc gtgggtggcc agccgaagta ctccgatggc 480 tttggcccga agatcaccgg tatcagccat gtgccgtaca acgacctgga agcgttgaag 540 gcacagattt ccgacaagac ctgcgccgtg gtgatcgagc cgatccaggg cgagagcggc 600 gtggttccgg ccgacaaggc ctacctggaa ggcgcgcgca agctgtgtga tgagcacaat 660 gcgctgctga tcttcgacga agtgcagact ggcgtgggcc gtaccggctc gctgtatgcc 720 taccagcact acggcgtgac cccggacatt ctgaccagtg ccaagagcct gggcggcggc 780 ttcccgattg gcgccatgct gaccaccacc gagctggcca agcacctggc cgttggcacc 840 cacggcacca cctatggcgg caacccgctg ggttgcgccg tggcctgcgc ggtgctggat 900 gtggtcaaca ccccggaaac cctggccggt atcaaggcaa agcacgagcg cttcaaaacc 960 cgcctggagc agatcggcca gcagtacaac ctgttcagcc aggtgcgtgg cgtcggcttg 1020 ctgctgggct gtgtcttgac cgaggcctgg caaggcaagg ccaaggacgt gctcaatgct 1080 gccgagaaag aaggcgtgat ggtgctgcag gccggcccgg acgtggtccg cttcgcgcca 1140 agcctggtgg ttgaagatgc tgacatcgac gaaggcctgg accgcttcga acgcgctgtg 1200 gccacactga ccaaaggctg a 1221 <210> 11 <211> 406 <212> PRT <213> acetylornithine aminotransferase from Pseudomonas putida <400> 11 Met Ser Val Glu Gln Ala Pro Val Gln Arg Ala Asp Phe Asp Gln Val 1 5 10 15 Met Val Pro Asn Tyr Ser Pro Ala Ala Phe Ile Pro Val Arg Gly Glu 20 25 30 Gly Ser Arg Val Trp Asp Gln Ser Gly Arg Glu Leu Ile Asp Phe Ala 35 40 45 Gly Gly Ile Ala Val Asn Ala Leu Gly His Cys His Pro Ala Leu Val 50 55 60 Lys Ala Leu Thr Glu Gln Ala Asn Thr Leu Trp His Val Ser Asn Val 65 70 75 80 Phe Thr Asn Glu Pro Ala Leu Arg Leu Ala His Lys Leu Val Asp Ala 85 90 95 Thr Phe Ala Asp Arg Ala Phe Phe Cys Asn Ser Gly Ala Glu Ser Asn 100 105 110 Glu Ala Ala Phe Lys Leu Ala Arg Arg Val Ala His Asp Arg Phe Gly 115 120 125 Pro Gln Lys His Glu Ile Ile Ala Thr Val Asn Ser Phe His Gly Arg 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cgccctcaag 540 gcggccattt ccgacaagac ctgcgccgtg gtccttgagc ccgtgcaggg cgagggcggc 600 gtgctgccgg ccgacaaggc ctacctggaa ggcgcccgca agctgtgcga cgagcacaac 660 gcgctgctga tcttcgacga agtgcagagc ggcatgggcc gtaccggcca cttgttcgcc 720 tacgagcact acggcgtgac cccggacatc ctctccagtg ccaagagcct gggcggcggc 780 ttccccatcg gcgccatgct gaccaccacc gagatcgcca agcacctggc ggtgggcacc 840 cacggcacta cctacggcgg caacccgctg gcgagtgcgg tggccgaagc ggtactggac 900 gtgatcaaca ccccggaagt gctcagcggc atcaatgcca agcacgaccg cttcaaggcc 960 cgcctcgacg ccatcggcgc caagtacggc atcttcagtg aagtccgtgg cctgggcctg 1020 ctgatcggcg ccgtgctgac cgacgcctgg aagggcaagg ccaaggacgt gctgaacgcc 1080 gccgagaagg aggccgtgat ggtcctccag gccggtccgg acgtggtgcg cttcgcgccc 1140 agcctggtga ttccggatgc ggacatcgac gccggcctgg accgcttcga gcgcgccgtc 1200 gccaagctga cccaggcgta a 1221 <210> 13 <211> 406 <212> PRT <213> acetylornithine aminotransferase gene from Pseudomonas resinovorans <400> 13 Met Ser Val Glu His Ala Gln Val Glu Arg Ala Asp Phe Asp Lys Val 1 5 10 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ggtgcaacgc gccgatttcg accaggtaat ggtccccaat 60 tacgccccgg ccgggttcat ccctgtgcgc ggtgcgggct cccgggtctg ggatcaggcg 120 gggcgcgaac tggtggattt ctcgggcggg atcgccgtca acgtattggg ccactgccac 180 ccggcgctgg tcggtgcctt gaccgagcag gccaataacc tctggcatgt gtccaacgtc 240 ttcaccaacg agccgaccct gcgcctggcg aaaaaactgg tggatgcgac gttcgccgag 300 cgcgtgttct tctgtaactc cggtgcggaa gccaacgaag ccgccttcaa gctggcacgt 360 cgtgtggcgc atgaccagta cggcccggaa aagtacgaaa tcatcgcggc gctgaacagt 420 tttcatggcc gtaccctgtt caccgtcagc gtcggtgggc agccgaagta ctccgatggt 480 ttcgggccga agatcaccgg catcagccat gtgccgtaca acgacctcga cgcactgaag 540 gccgctgtga ccgacaagac ctgtgccgtg gtgctggagc cgatccaggg cgagggcggt 600 gttctgccgg gtcagctgga atacctgcaa ggtgcgcgca aactgtgtga cgagcacaac 660 gccctgctgg tgttcgatga agtgcagagc ggcatgggcc gtagcggtca tctgttcgcc 720 tacatgcatt acggcgtgac cccggacatc ctttccagcg ccaagagcat cggcggaggt 780 ttcccgctgg cggcgatgtt gaccactgaa aagctcgcca ggcactttgc ggtcggcgtt 840 cacggcacca cctatggcgg caacccgctg gcgtgtgcgg 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Ala Glu Ala Asn 100 105 110 Glu Ala Ala Phe Lys Leu Ala Arg Arg Val Ala His Asp Gln Tyr Gly 115 120 125 Pro Glu Lys Tyr Glu Ile Ile Ala Ala Leu Asn Ser Phe His Gly Arg 130 135 140 Thr Leu Phe Thr Val Ser Val Gly Gly Gln Pro Lys Tyr Ser Asp Gly 145 150 155 160 Phe Gly Pro Lys Ile Thr Gly Ile Ser His Val Pro Tyr Asn Asp Leu 165 170 175 Asp Ala Leu Lys Ala Ala Val Thr Asp Lys Thr Cys Ala Val Val Leu 180 185 190 Glu Pro Ile Gln Gly Glu Gly Gly Val Leu Pro Gly Gln Leu Glu Tyr 195 200 205 Leu Gln Gly Ala Arg Lys Leu Cys Asp Glu His Asn Ala Leu Leu Val 210 215 220 Phe Asp Glu Val Gln Ser Gly Met Gly Arg Ser Gly His Leu Phe Ala 225 230 235 240 Tyr Met His Tyr Gly Val Thr Pro Asp Ile Leu Ser Ser Ala Lys Ser 245 250 255 Ile Gly Gly Gly Phe Pro Leu Ala Ala Met Leu Thr Thr Glu Lys Leu 260 265 270 Ala Arg His Phe Ala Val Gly Val His Gly Thr Thr Tyr Gly Gly Asn 275 280 285 Pro Leu Ala Cys Ala Val Gly Glu Ala Val Ile Asp Val Ile Asn Thr 290 295 300 Pro Glu Val Leu Ala Gly Val Gln Arg Lys His Gln Gln 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cggtcccgag aagtacgaga tcatcgccgc cagcaacagt 420 tttcacggcc gtaccctgtt caccgtcaac gtcggcggcc agcccaagta ttccgacggc 480 ttcgggccga agatcgaggg catcacccac gtcccctaca acgacctgga ggccctcaag 540 gcggtcattt ccgccaagac ctgcgcggtg gtcctcgagc cggtacaggg cgagggcggc 600 gtgttgccgg ccgatcaggc ctacctggag ggcgtgcgcg agctgtgcaa ccagcacaac 660 gcgctgctgg tgttcgacga ggtgcagagt ggcatgggcc gtaccggcga gctgttcgcc 720 tacatgcact acggggtgac tccggacatc ctgtccagcg ccaagagcct gggcggtggc 780 ttcccgatcg gcgccatgat gaccaccagc gagatcgcca agcacctgtc ggtgggcacc 840 cacggcacca cctacggcgg caacccgctg gcctgcgcgg tggccggggc ggtgttcgac 900 gtgatcaaca gccgcgaggt gctcgacggg gtcaagtcca agcaccagcg cttcaaggcc 960 cgcctccagg agatgggcgc caagtacggc atcttcagcg aggtgcgcgg cctcggcctg 1020 ctgatcggcg cgcagttgag cgagacctgg aagggcaagg cccgcgacgt gctcaacgcc 1080 gccgagcagg aggcgctgat ggtccttcag gccggtccgg acgtggtgcg cttcgcgccc 1140 agcctggtga tcccggacgc cgatatcgac gagggtctcg agcgtctcga gcgggctatc 1200 gtcaagctga cccggtag 1218 <210> 17 <211> 405 <212> PRT <213> acetylornithine aminotransferase from Pseudomonas thermotolerans <400> 17 Met Ser Val Gln His Glu Pro Val Gln Arg Ala Asp Phe Asp Gln Tyr 1 5 10 15 Met Val Pro Asn Tyr Ala Pro Ala Ala Phe Ile Pro Val Arg Gly Glu 20 25 30 Gly Ser Arg Val Trp Asp Gln Ser Gly Arg Glu Leu Ile Asp Phe Ala 35 40 45 Gly Gly Ile Ala Val Asn Ser Leu Gly His Ala His Pro Ala Leu Val 50 55 60 Lys Ala Leu Thr Glu Gln Ala Gly Lys Ile Trp His Val Ser Asn Val 65 70 75 80 Phe Thr Asn Glu Pro Ala Leu Arg Leu Ala Lys Lys Leu Val Gly Ala 85 90 95 Thr Phe Ala Glu Arg Val Phe Leu Ala Asn Ser Gly Ala Glu Ala Asn 100 105 110 Glu Ala Ala Phe Lys Leu Ala Arg Arg Tyr Ala Asn Asp Val Tyr Gly 115 120 125 Pro Glu Lys Tyr Glu Ile Ile Ala Ala Ser Asn Ser Phe His Gly Arg 130 135 140 Thr Leu Phe Thr Val Asn Val Gly Gly Gln Pro Lys Tyr Ser Asp Gly 145 150 155 160 Phe Gly Pro Lys Ile Glu Gly Ile Thr His Val Pro Tyr Asn Asp Leu 165 170 175 Glu Ala Leu Lys Ala Val Ile Ser Ala Lys Thr Cys Ala Val Val Leu 180 185 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acact 35

Claims (14)

1. 서열번호 7의 아미노산 서열 또는 이와 75% 이상의 상동성을 가지는 아미노산 서열을 포함하며, 아미노 화합물에 대한 트랜스아미나제 활성을 가지는 분리된 폴리펩티드.
2. 제1항에 있어서, 상기 아미노 화합물은 감마아미노부티르산, 5-아미노발레르산 및 6-아미노카프로산으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상인 폴리펩티드.
3. 제1항의 트랜스아미나제 활성을 가지는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드.
4. 제3항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드는 서열번호 4의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인 폴리뉴클레오티드.
5. 제1항의 폴리펩티드를 발현하도록 형질전환된 미생물.
6. 제5항에 있어서, 상기 미생물은 에스케리키아 속(genus Escherichia)인 미생물.
7. 제6항에 있어서, 상기 미생물은 대장균(Escherichia coli)인 미생물.
8. 제1항의 폴리펩티드, 또는 제5항의 미생물을 아미노 화합물이 함유된 용액에 가하는 단계를 포함하는, 아미노 화합물을 탈아민화시키는 방법.
9. 제8항에 있어서, 상기 아미노 화합물은 감마아미노부티르산, 5-아미노발레르산 및 6-아미노카프로산으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상인, 아미노 화합물을 탈아민화시키는 방법.
10. 제9항에 있어서, 상기 용액은 파이루베이트, 옥살로아세테이트 및 알파-케토글루타레이트로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상, 및 피리독살포스페이트를 추가로 포함하는, 아미노 화합물을 탈아민화시키는 방법.
11. 제1항의 폴리펩티드, 또는 제5항의 미생물을 세미 알데하이드 화합물이 함유된 용액에 가하는 단계를 포함하는, 아미노 화합물을 생산하는 방법.
12. 제11항에 있어서, 상기 세미 알데하이드 화합물은 N-아세틸글루타메이트5-세미알데하이드, 숙시네이트 세미알데하이드, 글루타레이트 세미알데하이드 및 아디페이트 세미알데하이드로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상인, 아미노 화합물을 생산하는 방법.
13. 제1항의 폴리펩티드 또는 제5항의 미생물을 포함하는, 아미노 화합물의 탈아민화를 위한 조성물.
14. 제13항에 있어서, 상기 아미노 화합물은 감마아미노부티르산, 5-아미노발레르산 및 6-아미노카프로산으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상인 조성물.
    

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