CN114478724A - 一种ramB突变体及其构建赖氨酸生产菌株的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物技术和基因工程领域。具体地说，本发明涉及一种RamB的突变体，以及利用该突变体构建L‑赖氨酸生产菌株生产L‑赖氨酸的方法。本发明通过对RamB进行突变，获得了能够显著提高L‑赖氨酸的产量的RamB突变体，并利用该突变体构建L‑赖氨酸的高产菌株，对于降低L‑赖氨酸的生产成本具有较高的应用价值。

Description

一种ramB突变体及其构建赖氨酸生产菌株的方法

技术领域

本发明涉及生物技术和基因工程领域。具体地说，本发明涉及一种RamB的突变体，以及利用该突变体构建L-赖氨酸生产菌株生产L-赖氨酸的方法。

背景技术

L-赖氨酸，简称L-赖氨酸，是人类和动物营养中最重要的必需氨基酸，被广泛应用于医药、食品、动物饲料和化妆品等行业中。目前，L-赖氨酸的主要生产为微生物发酵法，谷氨酸棒杆菌是目前工业中最重要的生产菌株。

随着生物技术的不断发展，近年来，对谷氨酸棒杆菌进行遗传改造以提高其L-赖氨酸产量的方法也不断出现，包括L-赖氨酸合成途径的改造，加强四碳回补途径，加强L-赖氨酸外排等等，如CN1206342C报道通过增强dapA基因、lysC基因、dapB基因、pyc基因和lysE基因的表达，从而使菌株中的L-赖氨酸产量增加。当前L-赖氨酸工业生产菌株的产酸能力已达到较高的水平，但菌株的产量尚未达到理论最大转化率。

RamB是谷氨酸棒杆菌中参与乙酸代谢的转录调控因子，在以葡萄糖为碳源生长时，RamB负调控磷酸转乙酰酶基因pta、异柠檬酸裂解酶基因aceA、苹果酸合酶基因aceB、乙酸激酶基因ack（Robert G , Annette C , Petra D , et al. RamB, a noveltranscriptional regulator of genes involved in acetate metabolism ofCorynebacterium glutamicum. Journal of Bacteriology, 2004）。CN101374953B报道了敲除ramB基因可以增加磷酸转乙酰酶Pta的活性从而提高谷氨酸的产量。然而，RamB在细胞中存在复杂的调控关系，同时包括转录激活和转录抑制调控，简单的ramB敲除对L-赖氨酸产量提高有限，因此本领域需要进一步开发RamB的突变体，以便更好地提高菌株的L-赖氨酸产量。

发明内容

针对上述问题，发明人经过广泛而深入的研究，对来源于谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)的RamB进行突变，获得了系列RamB突变体，该突变体能够显著提高L-赖氨酸的产量，从而获得L-赖氨酸的高产菌株。在此基础上完成了本发明。

本发明首先提供一种RamB突变体，相对于SEQ ID NO：1所示的野生型RamB而言，存在下述突变：M80V，Q104R，S317T且W388R；S70P且V200D；D297G且F367L；Q376R；N86S，P134S，E263V，H417R且C358R；或者Q77L。

进而本发明提供编码所述RamB突变体的核酸分子，所述核酸分子是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；或者是RNA，如mRNA、hnRNA或tRNA；优选地，所述核酸分子为编码所述RamB突变体的基因。

本发明提供含有所述核酸分子的表达盒、重组载体或重组菌。其中，所述重组载体可为重组表达载体，也可为重组克隆载体，所述重组表达载体包含外源基因的3’端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段，优选地在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型、组成型、组织特异型或诱导型启动子，它们可单独使用或与其它的启动子结合使用，更进一步包括增强子，如翻译增强子或转录增强子。

本发明进一步提供一种L-赖氨酸生产菌株，其中导入所述的RamB突变体的编码基因；或者通过突变的方法使其内源性RamB蛋白编码基因表达所述的RamB突变体。

优选地，L-赖氨酸生产菌株是棒杆菌属的微生物，更优选地，是谷氨酸棒杆菌。在具体的实施方式中，所述的出发菌株可以是谷氨酸棒杆菌ATCC 13032、谷氨酸棒杆菌ATCC13869、谷氨酸棒杆菌ATCC 14067及其衍生菌株等任何菌株，只要该菌株具有生产L-赖氨酸的能力。示例地，L-赖氨酸生产菌株可以是在谷氨酸棒杆菌ATCC 13032基础上表达解除反馈抑制的天冬氨酸激酶LysC的衍生菌株。现有技术已报道解除反馈抑制的LysC 如LysC^T311I、LysC^S301F、LysC^L301K、LysC^L301M、LysC^FBR、LysC^I293Y、LysC^I293Q、LysC^D294F、LysC^T307G等等。

在一些实施方式中，所述生产L-赖氨酸的宿主细胞中还可以包括但不限于选自以下的一个或多个基因被弱化或表达降低：

a . 编码乙醇脱氢酶的adhE基因；

b. 编码乙酸激酶的ackA基因；

c. 编码磷酸乙酰转移酶的pta基因；

d . 编码乳酸脱氢酶的ldhA基因；

e . 编码甲酸转运蛋白的focA基因；

f . 编码丙酮酸甲酸裂解酶的pflB基因；

g . 编码丙酮酸氧化酶的poxB基因；

h. 编码天冬氨酸激酶I/高丝氨酸脱氢酶I双功能酶的thrA基因；

i. 编码高丝氨酸激酶的thrB基因；

j. 编码L-赖氨酸脱羧酶的ldcC基因；

h. 编码L-赖氨酸脱羧酶的cadA基因。

在一些实施方式中，所述生产L-赖氨酸宿主细胞中还可以包括但不限于选自以下的一个或多个基因被增强或过表达：

a . 编码解除L-赖氨酸反馈抑制的二氢二吡啶合成酶的dapA基因；

b. 编码二氢二吡啶二羧酸还原酶的dapB基因；

c. 编码二氨基庚二酸脱氢酶的ddh基因；

d .编码四氢吡啶二羧酸琥珀酰酶的dapD和编码琥珀酰二氨基庚二酸脱酰酶的dapE；

e .编码天冬氨酸-半醛脱氢酶的asd基因；

f .编码磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的ppc基因；

g .编码烟酸胺腺嘌呤二核苷酸转氢酶的pntAB基因；

i.编码L-赖氨酸的运输蛋白lysE基因。

本发明还提供利用如所述的L-赖氨酸生产菌株生产L-赖氨酸的方法，包括培养所述菌株的步骤，以及分离产生的L-赖氨酸的步骤。

本发明进一步提供一种构建L-赖氨酸生产菌株的方法：在所述菌株中导入并能表达所述的RamB突变体；或者通过突变的方法使其内源性RamB蛋白发生所述的突变。

本发明通过对RamB进行突变，获得了能够显著提高L-赖氨酸的产量的RamB突变体，并利用该突变体可以构建L-赖氨酸的高产菌株，对于降低L-赖氨酸的生产成本具有较高的应用价值。

附图说明

图1突变体在摇瓶培养中产L-赖氨酸比较。其中，数值为3个生物学重复的平均值±SD。

具体实施方式

定义

本发明的术语“包含”、“具有”、“包括”或“含有”是指包括在内的或开放式的，并不排除额外的、未引述的元件或方法步骤。

本发明的术语“或”的定义仅为替代物以及“和/或”，但除非明确表示仅为替代物或替代物之间相互排斥外，权利要求中的术语“或”是指“和/或”。

本发明的术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”在本文中互换地使用并且为任意长度的氨基酸聚合物。该聚合物可以是线形或分支的，它可以包含修饰的氨基酸，并且它可以由非氨基酸隔断。该术语也包括已经被修饰（例如，二硫键形成、糖基化、脂质化、乙酰化、磷酸化或任何其他操作，如以标记组分缀合）的氨基酸聚合物。

本发明的术语“多核苷酸”、“核酸分子”指由核苷酸组成的聚合物。多核苷酸可以是单独片段的形式，也可以是更大的核苷酸序列结构的一个组成部分，其是从至少在数量或浓度上分离一次的核苷酸序列衍生而来的，能够通过标准分子生物学方法（例如，使用克隆载体）识别、操纵以及恢复序列及其组分核苷酸序列。当一个核苷酸序列通过一个DNA序列（即A、T、G、C）表示时，这也包括一个RNA序列（即A、U、G、C），其中“U”取代“T”。换句话说，“多核苷酸”指从其他核苷酸（单独的片段或整个片段）中去除的核苷酸聚合物，或者可以是一个较大核苷酸结构的组成部分或成分，如表达载体或多顺反子序列。多核苷酸包括DNA、RNA和cDNA序列。

本发明的术语“高严格条件”是指，对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准DNA印迹程序，在42℃处在5X SSPE（saline sodium phosphate EDTA）、0.3％SDS、200微克/ml剪切并变性的鲑精DNA和50％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。最后在65℃处使用2X SSC、0.2％SDS将载体材料洗涤三次，每次15分钟。

本发明的术语“非常高严格条件”是指，对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准DNA印迹程序，在42℃处在5X SSPE（saline sodium phosphate EDTA）、0.3％SDS、200微克/ml剪切并变性的鲑精DNA和50％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。最后在70℃处使用2X SSC、0.2％SDS将载体材料洗涤三次，每次15分钟。

本发明的术语“野生型的”指在自然界中可以找到的对象。例如，一种存在于生物体中，可以从自然界的一个来源中分离出来并且在实验室中没有被人类有意修改的多肽或多核苷酸序列是天然存在的。如本发明所用的，“天然存在的”和“野生型的”是同义词。

本发明的术语“突变体”是指相对于“野生型”，或者“相比较的”多核苷酸或多肽，在一个或多个（例如，若干个）位置处包含改变（即，取代、插入和/或缺失）的多核苷酸或多肽，其中，取代是指用不同的核苷酸或氨基酸置换占用一个位置的核苷酸或氨基酸。缺失是指去除占据某一位置的核苷酸或氨基酸。插入是指在邻接并且紧随占据位置的核苷酸或氨基酸之后添加核苷酸或氨基酸。示例性的，本发明中的“突变体”为具有提高的天冬氨酸激酶活性的多肽。

本发明的术语“氨基酸突变”或“核苷酸突变”，包括“取代、重复、缺失或添加一个或多个氨基酸或核苷酸”。在本发明中，术语“突变”是指核苷酸序列或者氨基酸序列的改变。在一个具体的实施方式中，术语“突变”是指“取代”。

在一些实施方式中，本发明的“突变”包含在SEQ ID NO：1所示序列的基础上存在M80V，Q104R，S317T且W388R；S70P且V200D；D297G且F367L；Q376R；N86S，P134S，E263V，H417R且C358R；或者Q77L突变。上述突变体可以提高菌株的L-赖氨酸的产量。

本发明的术语“突变”还可以包含在对应SEQ ID NO：1所示序列的一个或几个位置处不影响其活性的添加、缺失或取代的氨基酸。众所周知，在多肽的某些区域，例如非重要区域改变少数氨基酸残基基本上不会改变生物活性，例如，适当替换、添加或缺失某些氨基酸得到的序列并不会影响其活性。示例性的，本发明的“突变”包含在对应SEQ ID NO：1所示序列的多肽的C端和N端至少一端的至少一个氨基酸残基的缺失或添加，且多肽具有RamB的活性。在一些实施方式中，本发明的“突变”对应如SEQ ID NO：1所示序列的多肽的N端起或C端起，缺失或添加1-20个氨基酸，优选1-15个，更优选1-10个，更优选1-3个，最优选1个，并且具有RamB活性。

在一些实施方式中，本发明的“突变”可以选自“保守突变”。在本发明中，术语“保守突变”是指可正常维持蛋白质的功能的突变。保守突变的代表性例子为保守置换。

本发明的术语“保守置换”涉及用具有类似侧链的氨基酸残基替换氨基酸残基。本领域已经定义了具有类似侧链的氨基酸残基家族，并且包括具有碱性侧链（例如L-赖氨酸、精氨酸和组氨酸）、酸性侧链（例如天冬氨酸和谷氨酸）、不带电极性侧链（例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、和半胱氨酸）、非极性侧链（例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸和色氨酸）、β-支链（例如苏氨酸、缬氨酸和异亮氨酸）和芳香侧链（例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和组氨酸）。

本发明的术语“序列同一性”或“同一性百分比”，是指当使用核苷酸或氨基酸残基序列比较算法或通过目视检查测量，以最大的对应性进行比较和比对时，它们是相同的或具有相同序列特定百分比数。也就是说，核苷酸或者氨基酸序列的同一性可以利用下述比例来定义，该比例是将两个或多个核苷酸或氨基酸序列按照一致的核苷酸或氨基酸数达到最大的方式，并根据需要加入空位来进行比对时一致的核苷酸数或氨基酸数，在比对部分的全部核苷酸或氨基酸数中的比例。本领域技术人员均知，测定“序列同一性”或“同一性百分比”的方法包括但不限于：计算机分子生物学(Computational Molecular Biology)，Lesk，A.M.编，牛津大学出版社，纽约，1988；生物计算：信息学和基因组项目(Biocomputing:Informatics and Genome Projects)，Smith，D.W.编，学术出版社，纽约，1993；序列数据的计算机分析(Computer Analysis of Sequence Data)，第一部分，Griffin，A.M.和Griffin，H.G.编，Humana Press，新泽西，1994；分子生物学中的序列分析(Sequence Analysis in Molecular Biology)，von Heinje，G.，学术出版社，1987和序列分析引物(Sequence Analysis Primer)，Gribskov，M.与Devereux，J.编M StocktonPress，纽约，1991和Carillo，H.与Lipman，D.，SIAM J. Applied Math.，48:1073(1988)。测定相同性的优选方法要在测试的序列之间得到最大的匹配。测定相同性的方法编译在公众可获得的计算机程序中。优选的测定两条序列之间相同性的计算机程序方法包括但不限于：GCG程序包 (Devereux，J.等，1984)、BLASTP、BLASTN和FASTA(Altschul，S，F.等，1990)。公众可从NCBI和其它来源得到BLASTX程序（BLAST手册，Altschul，S.等，NCBI NLM NIHBethesda，Md.20894；Altschul，S.等，1990）。熟知的Smith Waterman算法也可用于测定相同性。

在一些实施方式中，本发明的具有RamB活性的多肽包含与SEQ ID NO：1所示序列的多肽的突变体具有至少70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%氨基酸残基的“序列同一性”或“同一性百分比”。在另外一些实施方式中，本发明的编码具有RamB活性的多肽的多核苷酸包含与编码SEQ ID NO：1所示序列的多肽的突变体的多核苷酸具有至少70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%核苷酸的“序列同一性”或“同一性百分比”。“序列同一性”或“同一性百分比”的判断/计算可以基于序列任何合适的区域上。例如，长度至少约50个残基的区域、至少约100个残基的区域，至少约200个残基的区域，至少约400个残基的区域，或至少约500个残基的区域。在某些实施方案中，所述序列在任一或两个相比较的生物聚合物（就是核酸或多肽）的整个长度上基本相同。

本发明的术语“表达”包括涉及多肽产生的任何步骤，包括但不限于：转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰、和分泌。

本发明的术语“表达载体”是指线状或环状DNA分子，该分子包含编码多肽的多核苷酸并且该多核苷酸有效地连接于供用于其表达的控制序列。“重组表达载体”指用于表达例如编码所需多肽的多核苷酸的DNA结构。重组表达载体可包括，例如包含i）对基因表达具有调控作用的遗传元素的集合，例如启动子和增强子；ii）转录成mRNA并翻译成蛋白质的结构或编码序列；以及iii）适当的转录和翻译起始和终止序列的转录亚单位。重组表达载体以任何合适的方式构建。载体的性质并不重要，并可以使用任何载体，包括质粒、病毒、噬菌体和转座子。用于本发明的可能载体包括但不限于染色体、非染色体和合成DNA序列，例如细菌质粒、噬菌体DNA、酵母质粒以及从质粒和噬菌体DNA的组合中衍生的载体，来自如牛痘、腺病毒、鸡痘、杆状病毒、SV40和伪狂犬病等病毒的DNA。

本发明的术语“表达盒”包含与适合的调控序列有效地连接的编码多肽或结构域或模块的多核苷酸，该调控序列对于在所选细胞或者菌株进行多核苷酸的表达是必需的。在本发明中，转录调控元件包含启动子，在此基础上，还可以包含增强子、沉默子、绝缘子等元件。

本发明中的“出发菌株”、“野生型菌株”可以是未经人工改造，在自然界中可以找到的微生物。此外，也包括经过一定修饰、改造的衍生微生物。需要说明的是，在本发明中，只要菌株中未引入本发明的RamB突变体即可认为是出发菌株。

本发明的术语“重组菌株”意指易于用包含本发明的突变体多肽、编码突变体多肽的多核苷酸或重组表达载体转化、转染、转导等的任何菌株类型。重组菌株具体通过转化来实现。本发明的重组菌株可以是原核细胞，只要是能够导入本发明的具有编码RamB突变体的多肽、重组多肽的多核苷酸的细胞即可。在一个实施方案中，重组菌株来源于适合发酵生产L-赖氨酸的微生物，例如棒状杆菌属、短杆菌属、节杆菌属、微杆菌属或埃希氏菌属。作为优选地，宿主细胞是来源于棒状杆菌属的谷氨酸棒杆菌。

本发明的术语“转化、转染、转导”具有本领域技术人员普遍理解的意思，即将外源性的DNA导入菌株细胞的过程。所述转化、转染、转导的方法包括任何将核酸导入细胞的方法，这些方法包括但不限于电穿孔法、磷酸钙(CaPO₄)沉淀法、氯化钙(CaCl₂)沉淀法、微注射法、聚乙二醇(PEG)法、DEAE-葡聚糖法、阳离子脂质体法以及乙酸锂-DMSO法。

本发明的重组菌株的培养可以根据本领域的常规方法进行，包括但不限于孔板培养、摇瓶培养、批次培养、连续培养和分批补料培养等，并可以根据实际情况适当地调整各种培养条件如温度、时间和培养基的pH值等。

除非另外定义或由背景清楚指示，否则在本发明中的全部技术与科学术语具有如本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂、仪器等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例

1、培养基

TSB培养基：葡萄糖，5 g/L；酵母粉，5 g/L；大豆蛋白胨，9 g/L；尿素，3 g/L；丁二酸，0.5 g/L；K₂HPO₄·3H₂O，1 g/L；MgSO₄·7H₂O，0.1 g/L；生物素，0.01 mg/L；维生素 B1，0.1 mg/L；MOPS，20 g/L。

CGXII培养基（g/L）：(NH₄)₂SO₄，20；尿素，5；KH₂PO₄，1；K₂HPO₄•3H₂O，1.3；MOPS，42；CaCl₂，0.01；FeSO₄•7H₂O，0.01；MnSO₄•H₂O，0.01；ZnSO₄•7H₂O，0.001；CuSO₄，0.0002；NiCl•6H₂O，0.00002；MgSO₄•7H₂O，0.25；原儿茶酸，0.03；维生素B1，0.0001；生物素，0.0002；葡萄糖，80。

2、L-赖氨酸检测方法

取100 μl培养物与900 μl的ddH₂O混合均匀（稀释10倍），4℃，7500 rpm离心5min，取上清。通过SBA检测L-赖氨酸量。

3、OD₆₀₀检测方法

将培养物用ddH₂O适当稀释后，用分光光度计检测600下的吸光度。

实施例1. 谷氨酸棒杆菌ramB基因敲除菌株的构建

本发明选择在质粒上表达ramB基因（其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示），并通过PCR方法引入随机突变，进而定向进化RamB转录因子。为了排除基因组上野生型ramB基因对定向进化的干扰，首先构建一株ramB敲除的底盘菌株。

ramB敲除重组载体构建如下：根据已报道的谷氨酸棒杆菌ATCC13032基因组序列，分别以ATCC13032基因组（Gene ID: 2830649）为模板，以引物0369shsh：ATTCGAGCTCGGTACCCTTGATGCACTGCGTCGAATTGAG和0369shx：CCTTAGCAGCAACCCTTGGCGAAGTAGACAAAATGTTCGCCATC扩增上游同源臂；以引物0369xsh：GCCAAGGGTTGCTGCTAAGGATG和0369xx：GACTCTAGAGGATCCCCTAATGAACGCAAGGAGAACGATTC扩增下游同源臂。上述PCR片段回收后，通过诺唯赞的一步重组试剂盒，与SmaI酶切处理的pK18mobsacB载体进行重组连接，获得ramB敲除载体pK18-ramB。

由于野生型谷氨酸棒杆菌ATCC13032不能生产L-赖氨酸，因此，本发明首先构建一个产L-赖氨酸的菌株，即在谷氨酸棒杆菌ATCC13032菌株天冬氨酸激酶基因lysC引入了T311I点突变，在丙酮酸羧化激酶基因pyc引入P458S点突变，获得L-赖氨酸生产菌株AHP。制备AHP菌株的感受态细胞，将上述构建的pK18-ramB质粒转化该菌株，涂布在含有25 mg/L卡那霉素的TSB平板上，放30℃培养获得第一次重组的转化子。将正确转化子在TSB培养基中培养3 h后，涂布含有10%蔗糖的TSB平板，放30℃培养，待长出转化子后，分别转移至TSB无抗平板和带有卡那霉素抗性的TSB平板培养，并分别以0369shsh：ATTCGAGCTCGGTACCCTTGATGCACTGCGTCGAATTGAG和0369xx：GACTCTAGAGGATCCCCTAATGAACGCAAGGAGAACGATTC为引物进行菌落PCR，对能在无抗TSB平板生长且不能在卡那霉素平板生长的突变体的PCR产物进行测序验证，获得ramB敲除的菌株AHPΔramB。

实施例2. ramB表达质粒的构建

分别以0369-EcoRV-F：CGTATCCCACTACCGAGATGCTCATTTAATTGAGTGTGCTCTAC和0369-EcoRI-R：CAAAACAGCCAAGCTGAATTCCGATAGGGCAGAAGAACAAGCACC为引物，以谷氨酸棒杆菌 ATCC13032的基因组为模板，扩增ramB基因及其启动子的片段。上述PCR片段回收后，通过诺唯赞的一步重组试剂盒，与EcoRV和EcoRI酶切的pXMJ19载体进行重组连接，获得得表达质粒pXMJ19-ramB。

实施例3. ramB突变体库的构建

本发明通过在PCR反应中添加锰离子，降低DNA聚合酶的保真性，进而在ramB基因中引入随机突变。以质粒pXMJ19-ramB为模板，以0369tbF：GGATTCGTGCGCGTCGATGTTGATG和0369tbR：TGAGCCAGGCATCCTTAGCAGCAAC为引物，扩增ramB基因起始密码子和终止密码子中间的编码序列片段，此过程使用保真性较低的Taq酶，并添加了0.05-0.5 mMMnCl₂，扩增带有随机突变的ramB基因片段。以pXMJ19质粒为模板，以P19-03tbF：GCTAAGGATGCCTGGCTCAGGTCTC和P19-03tbR：CATCGACGCGCACGAATCCACTATC为引物，采用高保真的DNA聚合酶扩增pXMJ19质粒骨架，以避免质粒骨架的突变。将扩增出的ramB片段，通过诺唯赞的一步重组试剂盒，连接至上述扩增的pXMJ19骨架。将连接产物按照感受态细胞说明书转入大肠杆菌 Trans T1（北京全式金生物技术），孵育培养适当时间，涂布至含有20 μg/mL氯霉素的LB平板，在37℃培养箱中进行培养；待长出菌落后，用涂布棒将菌落刮下并提质粒，得到ramB基因突变的质粒突变体库pXMJ19-ramB library。

实施例4. 基于荧光激活流式细胞分选筛选提高L-赖氨酸产量的突变体

为了实现基于荧光进行高通量筛选，首先构建L-赖氨酸生物传感器质粒pLysGE^E58V，构建过程如下：根据已报道的eyfp基因序列信息（GeneBank No. CCD28585.1）做全基因合成，利用引物eyfp-F：GTAATAGATGAACTTTAAGAAGGAGATATACATATGGTGAGCAAGGGCGAG和eyfp-R：CAGCGGCCGCTACTAGTTTATTACTTGTACAGCTCGTCCATG，以eyfp基因序列为模板PCR扩增得到eyfp基因片段；以谷氨酸棒状杆菌ATCC13032基因组（Gene ID: 2830649）为模板，利用lysGE-F：GCCCTTAGTGACTCGAATTCCTAAGGCCGCAATCCCTC和lysGE-R：TCTTAAAGTTCATCTATTACGGTCCGATGGACAGTAAAAGA为引物PCR扩增得到lysGE基因的片段；以质粒pTRCmob（Qian Liu, et al., J Biotechnol, 2007, 132, 273–279）为模板，利用pTRCmob-Rev-F：TAAACTAGTAGCGGCCGCTG和pTRCmob-Rev-R：GAATTCGAGTCACTAAGGGCTA为引物PCR反向扩增全长质粒，得到线性化载体片段。上述三个片段纯化回收后，利用重组酶将质粒骨架、lysGE基因片段和eyfp基因片段连接，经转化及测序验证，获得正确的质粒，命名为pLysGE。设计点突变引物LysGE-mut-F：CCCTTAGTGACTCGAATTCCTA和引物LysGE-mut-R：TAAAGCTCTCGAGCATCACGTG，以pLysGE为模板，通过PCR反向扩增、片段纯化及转化，得到对赖氨酸响应浓度范围变宽和响应强度显著增强的赖氨酸生物传感器pLysGE^E58V。

将L-赖氨酸生物传感器质粒pLysGE^E58V转化至菌株AHPΔramB中，获得突变体库筛选出发菌株AHPΔramB(pLysGE^E58V)。将AHPΔramB(pLysGE^E58V)菌株制备感受态细胞，分别转化等量的野生型质粒pXMJ19-ramB和突变型质粒库pXMJ19-ramB library，30℃复苏2 h，将复苏液转接含有25 μg/mL卡那霉素和5 μg/mL氯霉素的TSB液体培养基，30℃培养16 h，得到用于筛选的野生型对照菌株和突变体文库菌株。将突变体库和野生型对照菌株初始OD₆₀₀调节为0.5，转接至装有1 mL的CGXII（葡萄糖浓度为6%）的24孔板中，在30℃和800 rpm条件下培养6 h后，检测菌体OD₆₀₀，利用无机盐缓冲液将上述培养液的菌体浓度稀释到OD_600nm为0.1，使用流式细胞仪对上述菌株的荧光强度进行分析，所用仪器为Beckman CoulterMoFlo XDP cell sorter。根据野生型对照菌株的荧光值，设置高于其荧光值为分选参数，共计分选了2.4×10⁶个突变体，将这些分选的高荧光值突变体分选至含有氯霉素和卡那霉素双抗的TSB平板，培养18h后共获得约100个克隆。以引物P19cxEcIF：CTCATCCGCCAAAACAGCCAAGCTG 和P19cxEcVR：CTTCGGTATCGTCGTATCCCACTAC对长出的菌落进行菌落PCR验证，发现较多菌株是含有没有克隆ramB基因的空质粒，对其余突变体进行测序，共获得6个引入氨基酸突变的突变体E8、G4、A9、G1、F7和7A2，具体的氨基酸残基突变如表1所示。

表1RamB突变体的具体氨基酸残基突变

实施例5. 突变体产L-赖氨酸水平评价

为了排除因基因组或质粒其它位置发生了突变导致的L-赖氨酸生产水平变化，同时也避免L-赖氨酸生物传感器质粒的干扰，本发明根据上述测序结果，将突变体E8、G4、A9、G1、F7、7A2分别进行了重构，在野生型质粒pXMJ19-ramB基础上分别引入相同的突变，再分别将野生型和突变型质粒重新转入AHPΔramB中，分别获得对应的E8、G4、A9、G1、F7、7A2突变体和野生型对照菌株AHPΔramB(pXMJ19-ram)。为了对比ramB基因敲除和本发明突变体对L-赖氨酸生产的影响，同时将质粒pXMJ19导入菌株AHPΔramB，获得敲除ramB的对照菌株AHPΔramB(pXMJ19)。

将上述对照菌株和突变体分别转接至含有氯霉素和卡那霉素双抗的200 μLTSB液体培养基中，在30℃和800 rpm条件下培养7 h后，用ddH₂O稀释10倍后通过酶标仪检测OD₆₀₀，转接至装有200 μL的CGXII（葡萄糖浓度为80 g/L）的96孔板中，调节初始OD₆₀₀至0.2，培养26 h后，发酵液用ddH₂O稀释20倍，酶标仪检测OD₆₀₀；稀释10倍，用SBA检测L-赖氨酸产量。结果如表2所示，所有突变体的L-赖氨酸产量都高于野生型对照菌株AHPΔramB(pXMJ19-ram)，说明所有突变体都有L-赖氨酸产量的提高有积极的影响，而7A2突变体的L-赖氨酸产量比敲除型对照菌株AHPΔramB(pXMJ19)还要高20%，其效果十分显著。

表2突变体对L-赖氨酸生产的影响

实施例6. 突变体产L-赖氨酸的摇瓶发酵验证

为了进一步验证上述突变体对于菌株L-赖氨酸产量的影响，选取实施例5中产量最高的突变体7A2及对照菌株进行摇瓶发酵验证。将菌株接种至装有25 mL液体TSB的250mL摇瓶中，在30℃和220 rpm条件下培养7 h后，用分光光度计检测OD₆₀₀。然后转接至装有25mL的CGXII（初始葡萄糖浓度为100 g/L）的500 mL的摇瓶中，调节初始OD₆₀₀至0.5，在30℃和220 rpm条件下培养16 h后开始检测L-赖氨酸，每隔4 h取样检测一次。在培养过程中检测pH值，并补充适量尿素，以防止pH降低对生长和产酸造成影响。结果表3和图1所示，发酵结束后，7A2的L-赖氨酸产量最高，比野生型对照菌株AHPΔramB(pXMJ19-ram)高53%，比敲除型对照菌株AHPΔramB(pXMJ19)高21%，说明本发明的突变体可以显著提高菌株的L-赖氨酸产量。

表3突变体在摇瓶培养中产L-赖氨酸比较

此外，通过对野生型对照菌株AHPΔramB(pXMJ19-ram)、敲除型对照菌株AHPΔ ramB(pXMJ19)和突变体菌株7A2进行发酵过程转录组分析，发现与野生型菌株相比，敲除型对照菌株有234个差异表达基因，而突变体菌株7A2只有19个差异表达基因，突变体呈现更特异性的调控变化；同时敲除型对照菌株主要是通过上调葡萄糖的摄入及EMP途径提高L-赖氨酸产量，而突变体菌株7A2主要是通过下调TCA循环提高L-赖氨酸产量。以上结果表明Q77L引起的RamB活性改变与ramB基因敲除对L-赖氨酸生产的影响机制明显不同，更有利于L-赖氨酸的生产。

<110> 中国科学院天津工业生物技术研究所

<120> 一种ramB突变体及其构建赖氨酸生产菌株的方法

<160> 1

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 474

<212> PRT

<213> 谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)

<400> 1

MGKTYVGSRLRQLRRERDLSQASLAATLGLSASYVNQIEHDVRPLTVPVLLRITEAFGVDATFFSRDDDSRLLAEVQDVMLDREINPANVELQELSEMVYNHPQLARAMVEMHQRYRNVRDKFSIAVDNRTNTPEERRPIAEAVSMPHEEVRDFIYARQNYFDALDRRAEAIAAQLGWQPYDSRAMEDSIARRLQMDHDVTITSSKEESGTLHHFDPETRLLTIHARLNPGQRAFRMATELGYLEANDLIEGIVDDGIWSTPEARTLAIRGVASYFAAAVMLPYKIFHSEAEKSGYDIEYLGQLFGVGYETTAHRLSTLQRPNLRGIPFTFVRVDRAGNMSKRQSATGFHFTHYGGTCPLWNVFETFTNPGQVLRQFAQMPDGRNYLWISRTVRHHEARFGEVDKMFAIGLGCEARHADRTVYSRGFNLQDLSTATPIGSGCRVCTRENCAQRAFPSVHGRINIDAHESTIAPY 474

Claims (10)

1.一种RamB突变体，其特征在于，相对于SEQ ID NO：1所示的野生型RamB而言，存在下述任一项的突变：

（a）M80V，Q104R，S317T且W388R；S70P且V200D；D297G且F367L；Q376R；N86S，P134S，E263V，H417R且C358R；或者Q77L；

（b）与SEQ ID NO：1所示序列的多肽具有至少95%、至少98%或者至少99%序列同一性，且具有（a）中所述的突变；

（c）在SEQ ID NO：1所示序列的两端添加或缺失1个、2个、3个、4个、5个氨基酸残基的序列，且具有（a）中所述的突变；

（d）由多核苷酸编码的多肽，所述多核苷酸能在高严格条件下与（a）或（b）所示的多核苷酸杂交。

2.编码权利要求1所述RamB突变体的核酸分子。

3.含有权利要求2所述RamB突变体编码核酸分子的表达盒、重组载体。

4.含有权利要求2所述RamB突变体编码核苷酸的重组菌株。

5.如权利要求4所述的重组菌株，其特征在于，所述菌株是谷氨酸棒杆菌。

6.如权利要求1所述的RamB突变体或权利要求2所述的核酸分子或权利要求3所述的表达盒、重组载体或权利要求4-5所述的重组菌株在生产L-赖氨酸中的应用。

7.一种L-赖氨酸生产菌株，其特征在于，所述菌株中含有如权利要求1所述的RamB突变体。

8.如权利要求7所述的L-赖氨酸生产菌株，其特征在于，所述菌株是谷氨酸棒杆菌。

9.利用如权利要求7至8任一项所述的L-赖氨酸生产菌株生产L-赖氨酸的方法，包括培养所述菌株的步骤，以及分离产生的L-赖氨酸的步骤。

10.一种构建L-赖氨酸生产菌株的方法，其特征在于，在所述菌株中导入如权利要求1所述的RamB突变体的编码基因；或者通过突变的方法使其内源性RamB蛋白编码基因表达如权利要求1所述的RamB突变体。

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