CN101374953A

CN101374953A - 用于产生l-氨基酸的方法

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Publication number: CN101374953A
Application number: CNA2007800037625A
Authority: CN
Inventors: 知念秋人; 安枝寿; 中村纯
Original assignee: Ajinomoto Co Inc
Current assignee: Ajinomoto Co Inc
Priority date: 2006-01-27
Filing date: 2007-01-29
Publication date: 2009-02-25
Anticipated expiration: 2027-01-29
Also published as: PE20071235A1; BRPI0707229B8; BRPI0707229A2; EP1976995A1; WO2007086608A1; CN101374953B; BRPI0707229B1; US8012722B2; EP1976995B1; US20100099152A1

Abstract

通过在培养基中培养具有产生L－氨基酸能力的细菌产生L－氨基酸，如L－谷氨酸、L－谷氨酰胺、L－脯氨酸、L－精氨酸、L－亮氨酸和L－半胱氨酸，其中所述细菌经过修饰，使其磷酸转乙酰酶活性增强。

Description

用于产生L-氨基酸的方法

技术领域

本发明涉及通过发酵有效产生L-氨基酸，如L-谷氨酸、L-谷氨酰胺、L-脯氨酸、L-精氨酸、L-亮氨酸和L-半胱氨酸的方法。

背景技术

L-氨基酸主要通过各种发酵方法使用产生L-氨基酸的棒状杆菌型细菌(coryneform bacteria)产生，所述细菌包括属于短杆菌属(Brevibacterium)、棒杆菌属(Corynebacterium)、微杆菌属(Microbacterium)的细菌，或其突变菌株(Amino ..Acid Fermentation，Japan Scientific Societies Press，p.195-215，1986)。使用其它细菌，通过发酵产生L-氨基酸的已知方法的实例包括:使用属于芽孢杆菌属(Bacillus)、链霉菌属(Streptomyces)或青霉属(Penicillium)的微生物的方法(美国专利3,220,929)，使用属于假单胞菌属(Pseudomonas)、节杆菌属(Arthrobacter)、沙雷氏菌属(Serratia)或假丝酵母属(Candida)的细菌的方法(美国专利3,563,857)，使用属于芽孢杆菌属、假单胞菌属、沙雷氏菌属或产气气杆菌(Aerobacter aerogenes)(现在名为产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes))的细菌的方法(JP 32-9393B)，和使用大肠杆菌的突变菌株的方法(美国专利5378616)。此外，还已经公开了使用属于克雷伯氏菌属(Klebsiella)、欧文氏菌属(Erwinia)、泛菌属(Pantotea)或肠杆菌属(Enterobacter)的细菌产生L-氨基酸的方法(EP 955368 A、EP 952221 B和EP 999282 A)。

也已经公开了通过重组DNA技术增强L-氨基酸生物合成酶的活性，从而增加产生L-氨基酸的能力的各种方法。例如，已经报道，将源自大肠杆菌或谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)的编码柠檬酸合成酶的基因引入属于棒杆菌属或短杆菌属的细菌中，有效地增强了所述细菌产生L-氨基酸的能力(JP 07-121228B)。另外，已经报道，将源自棒状杆菌型细菌的柠檬酸合成酶基因引入属于肠杆菌属、克雷伯氏菌属、沙雷氏菌属、欧文氏菌属或埃希氏菌属的肠细菌(enterobacterium)中，有效地增强了L-谷氨酸的产生能力(EP 999282 A)。

磷酸转乙酰酶是参与乙酸代谢的酶。在大肠杆菌中，这个酶在由乙酰CoA和磷酸产生乙酰磷酸的反应中起作用，所述反应是产生乙酸的主要途径的一部分。此外，已知在谷氨酸棒杆菌中，通过同化乙酸产生乙酰CoA时，磷酸转乙酰酶活性增加，并且所述活性受到转录因子RamB的负调控(Microbiology1999 503-513，Journal of Bacteriology 2004 vol.186，No.9 p2798-2809)。

使用将磷酸转乙酰酶活性增强的细菌发酵产生有用材料的已知方法的实例包括:产生聚β-羟基链烷酸酯共聚物(poly-β-hydroxyalkanoate copolymer)(美国专利5,891,686和美国专利5,569,595)，和产生乙醇(WO 2003/078643)。此外，已经公开了使用磷酸转乙酰酶产生含硫L-氨基酸的酶法(JP 09-009982A)。然而，尚未报道在产生L-氨基酸的细菌的培育中增强磷酸转乙酰酶活性，而且磷酸转乙酰酶活性与L-氨基酸生产能力之间的关系尚未阐明。

发明内容

本发明的目的是提供新的发酵方法，用于产生L-氨基酸，如L-谷氨酸、L-谷氨酰胺、L-脯氨酸、L-精氨酸、L-亮氨酸和L-半胱氨酸。

本发明的发明人进行了深入的研究以实现上述目标。结果是，他们发现，L-氨基酸，如L-谷氨酸、L-谷氨酰胺、L-脯氨酸、L-精氨酸、L-亮氨酸和L-半胱氨酸，能够通过下述方法有效地产生:培养产生L-氨基酸的细菌，其经过修饰，增强了磷酸转乙酰酶活性，从而完成本发明。

本发明的目的是提供用于产生L-氨基酸的方法，所述方法包含在培养基中培养产生L-氨基酸的细菌，其经过修饰而具有增强的磷酸转乙酰酶活性；和从所述培养基或细菌中收集L-氨基酸。

本发明的另一个目的是提供如上所述的方法，其中通过增加编码磷酸转乙酰酶的基因的拷贝数，或通过修饰编码磷酸转乙酰酶的基因的表达调控序列，来增强磷酸转乙酰酶活性。

本发明的另一个目的是提供如上所述的方法，其中编码磷酸转乙酰酶的基因是选自下组的DNA:

(a)包含SEQ ID NO:34中核苷酸1214至2641或SEQ ID NO:40中核苷酸序列的DNA；和

(b)与下述核苷酸序列杂交的DNA，所述核苷酸序列与SEQ ID NO:34的核苷酸1214至2641的核苷酸序列或SEQ ID NO:40的核苷酸序列互补，其中所述DNA在严紧条件下杂交，并编码具有磷酸转乙酰酶活性的蛋白。

本发明的另一个目的是提供如上所述的方法，其中通过破坏ramB基因而增强磷酸转乙酰酶活性。

本发明的另一个目的是提供如上所述的方法，其中进一步修饰细菌，从而使选自下组的蛋白的活性增强:D-木糖5-磷酸-磷酸酮醇酶、果糖-6-磷酸磷酸酮醇酶，及其组合。

本发明的另一个目的是提供如上所述的方法，其中进一步修饰细菌，使其具有增强的丙酮酸羧化酶活性。

本发明的另一个目的是提供如上所述的方法，其中进一步修饰细菌，使其具有增强的磷酸烯醇丙酮酸羧化酶活性。

本发明的另一个目的是提供如上所述的方法，其中细菌选自下组:棒状杆菌型细菌、泛菌属细菌、肠杆菌属细菌和埃希氏菌属细菌。

本发明的另一个目的是提供如上所述的方法，其中L-氨基酸选自下组:L-谷氨酸、L-谷氨酰胺、L-脯氨酸、L-精氨酸、L-亮氨酸和L-半胱氨酸。

附图简述

图1表示突变型yggB基因中插入了IS的位点。

优选实施方案描述

<1-1>本发明的细菌

本发明的产生方法中使用的细菌(也称作本发明的细菌)具有产生L-氨基酸的能力，并经过了修饰，使其具有增强的磷酸转乙酰酶活性。本发明的细菌可以通过下述方法获得:修饰具有产生L-氨基酸能力的细菌(即，亲本菌株)，从而使磷酸转乙酰酶活性增强。本发明的细菌可以具有天然的产生L-氨基酸的能力，或者可以通过培育使其具有产生L-氨基酸的能力。

在本文中，“产生L-氨基酸的能力”表示以允许从细菌细胞或培养基中收集L-氨基酸的量产生L-氨基酸的能力。优选地，它表示与在同样条件下培养的野生型或未修饰的菌株相比，产生较大量L-氨基酸的能力。

产生的L-氨基酸的实例包括L-赖氨酸、L-谷氨酸、L-苏氨酸、L-缬氨酸、L-亮氨酸、L-异亮氨酸、L-丝氨酸、L-天冬氨酸、L-天冬酰胺、L-谷氨酰胺、L-精氨酸、L-半胱氨酸(胱氨酸)、L-甲硫氨酸、L-苯丙氨酸、L-色氨酸、L-酪氨酸、L-甘氨酸、L-丙氨酸、L-脯氨酸、L-鸟氨酸、L-瓜氨酸和L-高丝氨酸。优选源自乙酰CoA的L-氨基酸，并优选L-谷氨酸、L-谷氨酰胺、L-脯氨酸、L-精氨酸、L-亮氨酸和L-半胱氨酸。

本发明的细菌实例包括，但不限于，属于肠杆菌科(Enterobacteriaceaefamily)的细菌，包括属于埃希氏菌属、泛菌属、肠杆菌属的细菌等；棒状杆菌型细菌，如谷氨酸棒杆菌和乳发酵短杆菌(Brevibacterium lactofermentum)，和属于芽孢杆菌属的细菌，如枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。

在本发明中，“棒状杆菌型细菌”包括原来归类于短杆菌属、但现在归类于棒杆菌属的细菌(Int.J.Syst.Bacteriol.，41，255(1991))，以及属于短杆菌属的细菌，其与棒杆菌属高度相关。这些细菌的实例包括下述:

嗜乙酰乙酸棒杆菌(Corynebacterium acetoacidophilum)

醋谷棒杆菌(Corynebacterium acetoglutamicum)

烷醇棒杆菌(Corynebacterium alkanolyticum)

美棒杆菌(Corynebacterium callunae)

谷氨酸棒杆菌

百合花棒杆菌(Corynebacterium lilium)

栖糖蜜棒杆菌(Corynebacterium melassecola)

嗜热产氨棒杆菌(Corynebacterium thermoaminogenes)(Corynebacteriumefficiens)

力士棒杆菌(Corynebacterium herculis)

二歧短杆菌(Brevibacterium divaricatum)

黄色短杆菌(Brevibacterium flavum)

Brevibacterium immariophilum

乳发酵短杆菌(Brevibacterium lactofermentum)(谷氨酸棒杆菌)

玫瑰色短杆菌(Brevibacterium roseum)

解糖短杆菌(Brevibacterium saccharolyticum)

生硫短杆菌(Brevibacterium thiogenitalis)

产氨棒杆菌(Brevibacterium ammoniagenes)

白色短杆菌(Brevibacterium album)

Brevibacterium selinum

嗜氨微杆菌(Microbacterium ammoniaphilum)

具体地，以下述菌株为例:

嗜乙酰乙酸棒杆菌ATCC13870

醋谷棒杆菌ATCC15806

烷醇棒杆菌ATCC21511

酶棒杆菌ATCC15991

谷氨酸棒杆菌ATCC13020、ATCC13032、ATCC13060

百合花棒杆菌ATCC15990

栖糖蜜棒杆菌ATCC17965

嗜热产氨棒杆菌AJ12340(FERM BP-1539)

力士棒杆菌ATCC13868

二歧短杆菌ATCC14020

黄色短杆菌ATCC13826、ATCC14067

Brevibacterium immariophilum ATCC14068

乳发酵短杆菌ATCC13869(谷氨酸棒杆菌ATCC13869)

玫瑰色短杆菌ATCC13825

解糖短杆菌ATCC14066

生硫短杆菌ATCC19240

产氨棒杆菌ATCC6871、ATCC6872

白色短杆菌ATCC15111

Brevibacterium selinum ATCC15112

嗜氨微杆菌ATCC15354

这些菌株可从美国典型培养物保藏中心(American Type CultureCollection，ATCC:地址:P.O.Box 1549，Manassas，VA 20108，1，United Statesof America)获得。即，对每株菌都给出了登录号，可以使用这些号码定购菌株(http://www.atcc.org/)。美国典型培养物保藏中心的目录中列出了菌株的登录号。根据布达佩斯条约(Budapest Treaty)的规定，将AJ12340菌株于1987年10月27日保藏在通商产业省工业技术院生命工学工业技术研究所(National Institute of Bioscience and Human-Technology，Agency of IndustrialScience and Technology)，(目前为，独立行政法人产业技术综合研究所特许微生物保藏中心(International Patent Organism Depositary，National Institute ofAdvanced Industrial Science and Technology))(Central 6，1-1-1Higashi，Tsukuba，Ibaraki 305-5466，Japan)，并给予登录号FERM BP-1539。

不对属于肠杆菌科的细菌做特别限定，只要它们具有产生L-氨基酸的能力，并且包括属于埃希氏菌属、肠杆菌属、泛菌属、克雷伯氏菌属、沙雷氏菌属、欧文氏菌属、沙门氏菌属、摩根氏菌属(Morganella)的那些细菌等。可以使用按照NCBI(国家生物技术信息中心，National Center for BiotechnologyInformation)数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/htbin-post/Taxonomy/wgetorg？mode＝Tree&id＝1236&lvl＝3&keep＝1&srchmode＝1&unlock)中所述分类属于肠杆菌科的细菌。在这些细菌中，优选属于埃希氏菌属、肠杆菌属或泛菌属的细菌。

不对能够用来获得本发明细菌的埃希氏菌属细菌的亲本菌株做特别限定，具体而言，可以使用Neidhardt等(Escherichia coli and SalmonellaTyphimurium，American Society for Microbiology，Washington D.C.，1029表1)列出的细菌。在这些细菌中，优选大肠杆菌。大肠杆菌的具体实例包括大肠杆菌W3110菌株(ATCC 27325)和大肠杆菌MG1655菌株(ATCC 47076)，它们源自原型野生型K12菌株。

肠杆菌属细菌的实例包括成团肠杆菌(Enterobacter agglomerans)和产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)，泛菌属细菌的实例包括Pantoea ananatis。近来，在某些情况下，根据对16S rRNA的核苷酸序列的分析，将成团肠杆菌重新归类为成团泛菌(Pantoea agglomerans)、Pantoea ananatis或斯氏泛菌(Pantoea stewartii)。因此，本发明的细菌可以属于肠杆菌属或泛菌属，只要归类在肠杆菌科中即可。当使用基因工程技术培育Pantoea ananatis时，可以使用Pantoea ananatis AJ13355(FERM BP-6614)、AJ13356菌株(FERMBP-6615)、AJ13601(FERM BP-7207)及其衍生菌株。在分离时将这些菌株确认为成团肠杆菌，并按照成团肠杆菌保藏，但是后来根据对16S rRNA的核苷酸序列的分析重新分类为Pantoea ananatis。

在下文中，将叙述赋予如上所述细菌产生L-氨基酸的能力的方法。

为了赋予产生L-氨基酸的能力，可以使用在产生氨基酸的细菌，如棒状杆菌型细菌或埃希氏菌属细菌的常规培育中通常所使用的方法。这些方法包括获得营养缺陷型的突变菌株、类似物抗性菌株和代谢调控突变菌株，和培育将编码L-氨基酸生物合成酶的基因表达增强的重组菌株(Amino AcidFermentation，Japan Scientific Societies Press，first edition publication:May 30，1986，p.77至100)。在培育产生L-氨基酸的细菌的过程中，可以单独地或以组合形式赋予营养缺陷型突变、类似物抗性突变和代谢调控突变。此外，可以增强L-氨基酸生物合成酶中的一种或多种的活性。甚至还可以将赋予营养缺陷型突变、类似物抗性突变和代谢调控突变，与增强L-氨基酸生物合成酶的活性组合。

可以如下所述获得具有产生L-氨基酸的能力的营养缺陷型突变菌株、类似物抗性菌株和代谢调控突变菌株。即，对亲本菌株或野生型菌株进行常规的突变处理，即用X射线或紫外线照射，或用试剂进行处理，如N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍。从突变菌株中选择表现出营养缺陷型、类似物抗性或代谢调控突变，并且具有产生L-氨基酸的能力的菌株。

另外，可以通过遗传重组增强L-氨基酸生物合成酶的活性来获得产生L-氨基酸的细菌。然而，产生L-氨基酸的能力可以是野生型细菌的天然性质。此外，如下所述，可以通过增强磷酸转乙酰酶基因的表达而赋予产生L-氨基酸的能力。

在下文中，作为实例叙述了赋予L-谷氨酸产生能力的方法和赋予了L-谷氨酸产生能力的细菌。

为了赋予和/或增强L-谷氨酸产生能力，可以增强L-谷氨酸生物合成中相关的酶的编码基因的表达。L-谷氨酸生物合成中的相关的酶包括谷氨酸脱氢酶、谷氨酰胺合成酶、谷氨酸合成酶、异柠檬酸脱氢酶、乌头酸水合酶、柠檬酸合成酶、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶、丙酮酸羧化酶、丙酮酸脱氢酶、丙酮酸激酶、磷酸烯醇丙酮酸合成酶、烯醇化酶、磷酸甘油酸变位酶、磷酸甘油激酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、丙糖磷酸异构酶、果糖二磷酸醛缩酶、磷酸果糖激酶和葡糖磷酸异构酶。

基因表达可以通过下述方法增强:用包含期望基因和质粒复制所需序列的质粒转化细菌，通过同源重组、接合、基因转移等将基因整合入细菌的染色体，或将突变引入基因的启动子区域(WO 95/34672)。

在使用质粒将期望基因转入细菌中时，或者在将基因整合入染色体时，表达基因的启动子可以是任何启动子，只要其可以在选择的宿主细菌中发挥作用即可，启动子可以是基因的天然启动子或异源启动子。

可以通过选择已知在选择的宿主细菌中是强启动子的启动子，或通过修饰启动子的-35区或-10区使其接近共有序列，来增加基因的表达水平。

经过修饰使柠檬酸合成酶基因、异柠檬酸脱氢酶、丙酮酸脱氢酶基因和/或谷氨酸脱氢酶基因的表达增强的细菌包括WO 00/18935和EP 1010755A中描述的那些。

对于从L-谷氨酸合成途径分流(branch off)并得到L-谷氨酸以外的化合物的反应，可以通过将催化该反应的酶的活性降低或消除，从而赋予L-谷氨酸产生能力。这些酶包括异柠檬酸裂合酶、α-酮戊二酸脱氢酶、乙酰羟酸合酶、乙酰乳酸合酶、甲酸乙酰转移酶、乳酸脱氢酶、谷氨酸脱羧酶和1-吡咯啉脱氢酶。

例如，可以使用编码α-酮戊二酸脱氢酶的Elo亚基的sucA(odhA)基因来降低α-酮戊二酸脱氢酶的活性。α-酮戊二酸脱氢酶活性降低的菌株如下所述:

乳发酵短杆菌ΔS菌株(WO 95/34672)

乳发酵短杆菌AJ12821(FERM BP-4172；FR 9401748A)

黄色短杆菌AJ12822(FERM BP-4173；FR 9401748A)

谷氨酸棒杆菌AJ12823(FERM BP-4174；FR 9401748A)

Pantoea ananatis AJ13601(FERM BP-7207)

植生克雷伯氏菌(Klebsiella planticola)AJ13410菌株(FERM BP-6617)

Pantoea ananatis AJ13355(FERM BP-6614)

为了降低或消除这种酶的活性，可以使用常规突变处理，向染色体上编码该酶的基因中引入突变。例如，可以通过下述方法破坏基因:基因重组，或者修饰表达调控序列，如启动子和Shine-Dalgarno(SD)序列，从而减少基因的表达或翻译。另外，可以在染色体上编码酶的区域引入氨基酸取代(错义突变)、终止子(无义突变)、添加/缺失一个或两个核苷酸的移码突变，或者可以缺失该基因或其中一部分(Journal of Biological Chemistry 272:8611-8617(1997))。同样地，酶的活性也可以通过下述方法降低或消除:用突变基因替换染色体上的野生型基因，在所述突变基因中，通过同源重组缺失编码区，或者在基因中引入转座子或IS因子。

例如，可以使用下述方法，通过同源重组引入降低或消除上述酶的活性的突变。通过修饰目的基因的部分序列使其不产生所编码的酶来制备突变基因，并且用包含所述突变基因的DNA转化宿主细菌。这引起突变基因和染色体上的基因之间的重组，从而用突变基因替换染色体上的基因。这种使用同源重组，通过基因取代的定点诱变是已知的，而且可以通过使用包含温度敏感型复制起点的线性DNA或质粒实现(美国专利6303383或JP 05-007491A)。同样地，也可以通过用不能在选择的宿主细菌中复制的质粒，来实现使用同源重组通过基因取代的定点诱变。

棒状杆菌型细菌中温度敏感型质粒的实例包括p48K、pSFKT2(美国专利6303383)和pHSC4(FR 1992-2667875A和JP 05-7491A)。这些质粒可以在25℃自主复制，但是在37℃不能自主复制。用pHSC4转化的大肠杆菌AJ12571于1990年10月11日保藏在通商产业省工业技术院生命工学工业技术研究所(目前为，独立行政法人产业技术综合研究所特许微生物保藏中心，Central 6，1-1-1Higashi，Tsukuba，Ibaraki 305-5466，Japan)，给出的登录号为FERMP-11763，然后按照布达佩斯条约的规定，在1991年8月26日转为国际保藏，并给出登录号FERM BP-3524。

此外，可以通过下述方法赋予宿主细菌产生L-谷氨酸的能力:扩增yggB基因(NCgl 1221；NP_600492.[gi:19552490]；SEQ ID NO:32)，或者通过引入在其编码区包含突变的突变yggB基因(WO2006/070944)。可以使用下述基因作为突变的yggB基因。

(1)C末端区中的突变

将这种突变引入编码SEQ ID NO:33中氨基酸419-533的氨基酸序列的区域中。这种突变可以是任何突变，只要是引入编码上述区域的核苷酸序列中即可，而且优选插入突变，其包括插入序列(在下文中称作IS)或转座子的插入。插入突变可能导致氨基酸取代(错义突变)、移码或终止子(无义突变)。SEQ ID NO:7和8分别表示突变yggB基因的核苷酸序列和由该突变基因编码的氨基酸序列，所述突变yggB基因在C末端区中包含转座因子(IS)。

同时，C末端区中突变的实例还包括用另一种氨基酸取代SEQ ID NO:33中氨基酸419-533的序列中的脯氨酸。

(2)跨膜区中的突变

据预测，由yggB基因编码的Ygg蛋白具有五个跨膜区，而这些跨膜区对应于野生型YggB蛋白(SEQ ID NO:33)中的氨基酸1-23(第一个跨膜区)、25-47(第二个跨膜区)、62-84(第三个跨膜区)、86-108(第四个跨膜区)和110-132(第五个跨膜区)。跨膜区中的突变优选导致一个或几个氨基酸的取代、缺失、增加、插入或倒置，而不导致移码或翻译终止。

跨膜区中突变的实例包括在SEQ ID NO:33的氨基酸序列中14位的亮氨酸和15位的色氨酸之间插入一个或几个氨基酸，用另一个氨基酸取代100位的丙氨酸，和用另一个氨基酸取代111位的丙氨酸。

可以使用另一种方法赋予和/或增强L-谷氨酸产生能力，赋予对有机酸类似物、呼吸链抑制剂等的抗性，和赋予对细胞壁合成抑制剂的敏感性。这种方法的实例包括赋予单氟乙酸抗性(JP 50-113209 A)、赋予腺嘌呤或胸腺嘧啶抗性(JP 57-065198 A)、削弱脲酶(JP 52-038088 A)、赋予丙二酸抗性(JP52-038088 A)、赋予苯并吡喃酮或萘醌抗性(JP 56-1889 A)、赋予HOQNO抗性(JP 56-140895 A)、赋予α-酮丙二酸抗性(JP 57-2689 A)、赋予胍抗性(JP56-35981 A)和赋予青霉素敏感性(JP 4-88994 A)。

这些抗性细菌的具体实例包括:

黄色短杆菌AJ3949(FERM BP-2632；JP 50-113209 A)

谷氨酸棒杆菌AJ11628(FERM P-5736；JP 57-065198 A)

黄色短杆菌AJ11355(FERM P-5007；JP 56-1889 A)

谷氨酸棒杆菌AJ11368(FERM P-5020；JP 56-1889 A)

黄色短杆菌AJ11217(FERM P-4318；JP 57-2689 A)

谷氨酸棒杆菌AJ11218(FERM P-4319；JP 57-2689 A)

黄色短杆菌AJ11564(FERM P-5472；JP 56-140895 A)

黄色短杆菌AJ11439(FERM P-5136；JP 56-35981 A)

谷氨酸棒杆菌H7684(FERM BP-3004；JP 04-88994 A)

乳发酵短杆菌AJ11426(FERM P-5123；JP 56-048890 A)

谷氨酸棒杆菌AJ11440(FERM P-5137；JP 56-048890 A)

乳发酵短杆菌AJ11796(FERM P-6402；JP 58-158192 A)

赋予了L-谷氨酰胺产生能力的细菌包括:谷氨酸脱氢酶活性增强的细菌，谷氨酰胺合成酶(glnA)活性增强的细菌，和属于肠杆菌科并具有破坏的谷氨酰胺酶基因的细菌(EP 1229121 A和EP 1424398 A)。谷氨酰胺合成酶活性可以通过破坏谷氨酰胺腺苷酰转移酶基因(glnE)或破坏编码PII调控蛋白的基因(glnB)来增强。另外，优选的L-谷氨酰胺产生细菌包括具有突变的谷氨酰胺合成酶的埃希氏菌属细菌，其中397位的酪氨酸由另一个氨基酸取代(美国专利公开号2003-0148474)。

赋予和/或增强L-谷氨酰胺产生能力的其它方法包括:赋予6-重氮-5-氧-正亮氨酸抗性(JP 03-232497 A)，赋予嘌呤类似物和甲硫氨酸亚砜抗性(JP61-202694 A)，和赋予α-酮顺丁烯二酸抗性(JP 56-151495 A)。具有L-谷氨酰胺产生能力的棒状杆菌型细菌的具体实例包括:

黄色短杆菌AJ11573(FERM P-5492；JP 56-161495 A)

黄色短杆菌AJ11576(FERM BP-10381；JP 56-161495 A)

黄色短杆菌AJ12212(FERM P-8123；JP 61-202694 A)

具有产生L-脯氨酸的能力的细菌包括:携带γ-谷氨酰激酶的细菌，所述酶不受L-脯氨酸的反馈抑制；和削弱了L-脯氨酸降解系统的细菌。使用不受L-脯氨酸反馈抑制的编码γ-谷氨酰激酶的DNA修饰细菌的方法公开在Dandekar，A.M.，Uratsu，S.L，J.Bacteriol.，170，12，5943-5(1988)中。同样地，可以通过向脯氨酸脱氢酶基因中引入导致酶活性降低的突变来获得L-脯氨酸降解系统削弱的细菌。具有产生L-脯氨酸的能力的细菌的具体实例包括大肠杆菌NRRL B-12403、NRRL B-12404(GB 2075056)和VKPM B-8012(美国专利2002-0058315)。用于引入这种突变的突变质粒的实例包括DE 3127361B中公开的突变质粒，和由Bloom等(The 15th Miami Winter Symposium，1983，p.34)公开的突变质粒。

优选的产生L-脯氨酸的细菌包括大肠杆菌702(VKPM B-8011)，其对3，4-脱羟脯氨酸(3，4-dehydroxyproline)和azatidine-2-羟酸具有抗性；702ilvA(VKPM B-8012)，其为702菌株的ilvA-缺陷型的衍生菌株；和由b2682基因、b2683基因、b1242基因或b3434基因编码的蛋白活性增强的大肠杆菌菌株(JP2002-300874 A)。

产生L-亮氨酸的细菌的实例包括大肠杆菌H-9068(ATCC 21530)、H-9070(FERM BP-4704)和H-9072(FERM BP-4706)，其表现出对4-氮杂亮氨酸或5，5，5-三氟亮氨酸的抗性(美国专利5,744,331)；包含不会受到L-亮氨酸反馈抑制的异丙基苹果酸合酶的大肠杆菌(EP 1067191 B)；对β-2-噻吩丙氨酸和β-羟亮氨酸具有抗性的大肠杆菌AJ11478(美国专利5,763,231)，和大肠杆菌57(VKPM B-7386，RU 2140450)。

产生L-半胱氨酸的细菌的实例包括:用cysE基因的等位基因转化的大肠杆菌JM15，所述等位基因编码不受反馈抑制的丝氨酸乙酰转移酶(美国专利6,218,168)；大肠杆菌W3110，其中负责细胞毒素物质分泌的蛋白质的编码基因过量表达(美国专利5,972,663)；半胱氨酸脱巯基酶活性降低的大肠杆菌(JP11-155571A)；和大肠杆菌W3110，其具有由cysB基因编码的半胱氨酸调节子的扩增的转录激活因子(WO 01/27307)。

产生L-异亮氨酸的细菌的实例包括:抗6-二甲基氨基嘌呤的埃希氏菌属突变菌株(JP 05-304969 A)，对L-异亮氨酸异羟肟酸(L-isoleucinehydroxamate)、硫代异亮氨酸(thiaisoleucine)、DL-乙硫氨酸或精氨酸异羟肟酸有抗性的突变菌株(JP 05-130882 A)，和具有扩增的苏氨酸脱氨酶基因和乙酰羟基化物合酶(acetohydroxylate synthase)基因的重组菌株(JP 02-458 A，JP02-42988 A和JP 08-47397 A)。

可以通过下述方法赋予产生L-缬氨酸的能力:增加由ilvGMEDA操纵子编码的L-缬氨酸合成酶的活性，具体地，由ilvG基因编码的乙酰羟基化物合酶(JP 02-748418 B)。这种L-缬氨酸合成酶不受L-缬氨酸的反馈抑制。可以通过降低乙酰乳酸合酶III基因(ilvIH基因)的表达来赋予产生L-缬氨酸的能力。

此外，可以通过赋予细菌对氨基酸类似物的抗性来赋予产生L-缬氨酸的能力。这种细菌的实例包括突变菌株，其对L-异亮氨酸或L-甲硫氨酸是营养缺陷的，而且对D-核糖、嘌呤核苷或嘧啶核糖核苷具有抗性(FERM P-1841和P-5556；JP 53-025034 A)；和对聚酮化合物(polyketide)具有抗性的突变菌株(FERM P-9325；JP 1934507 B)。

产生L-丙氨酸的细菌的实例包括H+-ATP酶活性缺陷的棒状杆菌型细菌(Appl Microbiol Biotechno1.2001 Nov；57(4):534-40)；和将天冬氨酸脱羧酶的基因扩增的棒状杆菌型细菌(JP 07-163383 A)。

产生L-精氨酸的细菌的实例包括对α-甲基甲硫氨酸、对氟苯丙氨酸、D-精氨酸、精氨酸异羟肟酸、S-(2-氨乙基)-半胱氨酸、α-甲基丝氨酸、β-2-噻吩丙氨酸或磺胺胍具有抗性的大肠杆菌突变菌株(JP 56-106598 A)。优选的产生L-精氨酸的细菌是突变菌株大肠杆菌237，其对L-精氨酸的反馈抑制具有抗性，而且具有增强的N-乙酰谷氨酸合酶活性(RU 2000117677)。该菌株在2000年4月10日保藏在俄罗斯国立工业微生物保藏中心(Russian NationalCollection of Industrial Microorganisms)(VKPM)，GNII Genetika保藏，并给出了登录号VKPM B-7925，然后按照布达佩斯条约的规定，于2001年5月18日转为国际保藏。大肠杆菌382，其为237菌株的衍生菌株，改善了同化乙酸的能力(JP 2002-017342 A)，可以将该菌株用作产生L-精氨酸的细菌。大肠杆菌382菌株在2000年4月10日保藏在俄罗斯国立工业微生物保藏中心(VKPM)，并给出了登录号VKPM B-7926。

产生L-精氨酸的细菌的实例包括经过修饰而具有改进的基因表达的细菌，所述基因编码L-精氨酸生物合成中的相关酶。L-精氨酸生物合成酶包括N-乙酰谷氨酸合酶(argA)、N-乙酰谷氨酰-磷酸还原酶(argC)、鸟氨酸乙酰转移酶(argJ)、N-乙酰谷氨酸激酶(argB)、乙酰鸟氨酸转氨酶(argD)、乙酰鸟氨酸脱乙酰酶(argE)、鸟氨酸氨基甲酰转移酶(argF)、精氨基琥珀酸合酶(argG)、精氨基琥珀酸裂合酶(argH)和氨甲酰磷酸合酶(carAB)。酶名字后面圆括号中的术语是指编码这些酶的基因的名字。对于N-乙酰谷氨酸合酶(argA)，更优选地是使用突变酶，其中将15至19位的野生型氨基酸序列取代，结果使L-精氨酸的反馈抑制减轻(EP 1170361 A)。

L-瓜氨酸和L-鸟氨酸的生物合成途径与L-精氨酸的生物合成途径是一样的，并且可以通过增加下述酶活性来赋予产生L-瓜氨酸和L-鸟氨酸的能力:N-乙酰谷氨酸合酶(argA)、N-乙酰谷氨酰磷酸还原酶(argC)、鸟氨酸乙酰转移酶(argJ)、N-乙酰谷氨酸激酶(argB)、乙酰鸟氨酸转氨酶(argD)和乙酰鸟氨酸脱乙酰酶(argE)。

产生L-赖氨酸的细菌的实例包括抗L-赖氨酸类似物的菌株和代谢调控突变菌株。其具体实例包括大肠杆菌AJ11442(FERM BP-1543，NRRL B-12185；JP 56-18596 A和美国专利4,346,170)和大肠杆菌VL611(JP 2000-189180 A)。此外，WC196(WO 96/17930)可以用作大肠杆菌的L-赖氨酸产生菌株。WC196菌株通过赋予W3110菌株对AEC(S-(2-氨乙基)-半胱氨酸)的抗性而获得，W3110菌株源自大肠杆菌K-12菌株。将WC196菌株命名为大肠杆菌AJ13069菌株，并于1994年12月6日保藏在工业技术研究院国立生命科学与人体技术研究所(National Institute of Bioscience and Human-Technology，Agency ofIndustrial Science and Technology)(现在称作独立行政法人产业技术综合研究所特许微生物保藏中心(International Patent Organism Depositary，NationalInstitute of Advanced Industrial Science and Technology)Central 6，1-1-1Higashi，Tsukuba，Ibaraki 305-5466，Japan)，其后根据布达佩斯条约的规定于1995年9月29日转为国际保藏，给出登录号FERM BP-5252。

还可以通过增加L-赖氨酸生物合成系统中相关酶的活性而获得具有L-赖氨酸产生能力的细菌。酶活性可以通过下述方法增加:增加细胞中编码所述酶的基因的拷贝数，或者修饰所属基因的表达调控序列。

编码L-赖氨酸生物合成酶的基因包括编码二氨基庚二酸途径中涉及的酶的基因，如二氢吡啶二羧酸合酶基因(dapA)、天冬氨酸激酶基因(lysC)、二氢吡啶二羧酸还原酶基因(dapB)、二氨基庚二酸脱羧酶基因(lysA)、二氨基庚二酸脱氢酶基因(ddh)(WO 96/40934)、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因(ppc)(JP60-87788 A)、天冬氨酸转氨酶基因(aspC)(JP 6-102028 B)、二氨基庚二酸差向异构酶基因(dapF)(JP 2003-135066 A)和天冬氨酸半醛脱氢酶基因(asd)(WO00/61723)；和编码氨基己二酸途径中涉及的酶的基因，如高乌头酸水合酶(JP2000-157276 A)。

同时，优选修饰天冬氨酸激酶III基因(lysC)，从而减轻L-赖氨酸的反馈抑制。这种lysC基因可以通过美国专利5,932,453中描述的方法获得。

此外，可以通过下述方法获得具有L-赖氨酸产生能力的细菌:对于产生除L-赖氨酸之外的产物的反应，降低或消除催化所述反应的酶的活性；或者降低或消除对L-赖氨酸产生有负作用的酶的活性。这些酶的实例包括高丝氨酸脱氢酶、赖氨酸脱羧酶(cadA、ldcC)和苹果酸酶，WO 95/23864、WO 96/17930和WO 2005/010175中描述了这些酶的活性降低或缺乏的菌株。

L-色氨酸产生细菌优选下述酶中的一种或更多的活性增强的那些菌株:邻氨基苯甲酸合成酶、磷酸甘油酸脱氢酶和色氨酸合成酶。邻氨基苯甲酸合成酶和磷酸甘油酸脱氢酶分别受L-色氨酸和L-丝氨酸反馈抑制的调控。因此，可以修饰这些酶，以减轻反馈抑制。具体地，突变邻氨基苯甲酸合成酶基因(trpE)和/或磷酸甘油酸脱氢酶基因(serA)，以减轻反馈抑制，并且将突变基因引入细菌，例如，属于肠杆菌科的细菌。特别的实例包括重组菌株，其通过用pGH5(WO 94/08031)转化大肠杆菌SV164而获得，大肠杆菌SV164携带有抗反馈的邻氨基苯甲酸合成酶，而且质粒pGH5包含突变的serA基因，其编码抗反馈的磷酸甘油酸脱氢酶。

可以通过引入包含色氨酸操纵子的重组DNA而赋予L-色氨酸产生能力。其特定的实例包括用色氨酸操纵子转化的大肠杆菌，所述操纵子包含编码抗反馈的邻氨基苯甲酸合酶的基因(JP 57-71397 A，JP 62-244382 A和美国专利4,371,614)。L-色氨酸产生能力也可以通过增强编码色氨酸操纵子的基因，具体地，编码色氨酸合成酶(trpBA)的基因的表达而赋予和/或增强。色氨酸合成酶有α和β亚基，其分别由trpA和trpB编码。

L-色氨酸产生能力也可以通过破坏trpR基因而赋予，所述基因抑制色氨酸操纵子，或者通过向trpR基因中引入突变而赋予(美国专利4,371,614和WO 2005/056776)。

L-色氨酸产生细菌的优选实例包括下述细菌，所述细菌中苹果酸合成酶、异柠檬酸裂合酶、异柠檬酸脱氢酶激酶/磷酸酶操纵子(ace操纵子)为组成型表达，或者将所述细菌中操纵子的表达增强。优选修饰ace操纵子的启动子，以避免受到阻抑物(repressor)iclR的抑制，或者可以破坏iclR基因。

可以通过下述方法获得ace操纵子的表达增强的细菌:将包含ace操纵子的DNA与强启动子连接，并且使用质粒、同源重组或转座子向细菌中引入获得的构建体，以增加DNA的拷贝数。

此外，具有L-色氨酸产生能力的细菌的实例包括大肠杆菌AGX17(pGX44)[NRRL B-122363]，其表现为L-苯丙氨酸和L-酪氨酸-营养缺陷型；和大肠杆菌AGX6(pGX50)aroP[NRRL B-12264]，其包含pGX50，pGX50中包含色氨酸操纵子(美国专利4,371,614)。

L-色氨酸、L-苯丙氨酸和L-酪氨酸是芳香族氨基酸，可以由普通的生物合成途径产生。编码芳香族氨基酸生物合成途径中酶的基因的实例包括脱氧阿拉伯-庚酮糖酸磷酸合成酶(deoxyarabino-heptulosonate phosphate synthase)(aroG)、3-脱氢奎宁酸合成酶(aroB)、莽草酸脱水酶、莽草酸激酶(aroL)、5-烯醇丙酮酰莽草酸3-磷酸合成酶(5-enolpyruvylshikimate 3-phosphate synthase)(aroA)和分支酸合成酶(aroC)(EP 763127 A)。因此，可以通过增加这些基因在质粒上或染色体上的拷贝数增强芳香族氨基酸产生能力。此外，已知这些基因受酪氨酸阻抑物(tyrR)的调控，而且芳香族氨基酸生物合成酶活性可以通过破坏tyrR基因来增加(EP 763127 B)。

具有L-苯丙氨酸产生能力的细菌的实例包括AJ12739，其中将tyrA基因和tyrR基因破坏(tyrA:Tn10，tyrR)(VKPM B-8197)，和其中将苯丙氨酸输出基因如yddG和yedA扩增的菌株(WO 03/044192)。

具有L-苏氨酸产生能力的细菌的实例包括L-苏氨酸生物合成酶活性增强的肠杆菌。编码L-苏氨酸生物合成酶的基因的实例包括天冬氨酸激酶III基因(lysC)、天冬氨酸半醛脱氢酶基因(asd)、天冬氨酸激酶I基因(thrA)、高丝氨酸激酶基因(thrB)和苏氨酸合成酶基因(thrC)。酶名称后面的圆括号中的术语指编码这些酶的基因的名称。可以将这些酶中的两种或更多种引入宿主细菌。可以将这种L-苏氨酸生物合成基因引入L-苏氨酸降解受到抑制的埃希氏菌属细菌。L-苏氨酸降解受到抑制的埃希氏菌属细菌的实例包括TDH6菌株，其中苏氨酸脱氢酶的活性有缺陷(JP 2001-346578 A)。

L-苏氨酸生物合成酶的活性受L-苏氨酸的抑制。因此，为了构建L-苏氨酸产生细菌，优选修饰L-苏氨酸生物合成基因，使酶不受L-苏氨酸反馈抑制的调控。同时，上述thrA、thrB和thrC基因组成苏氨酸操纵子，其形成弱化子结构，而所述苏氨酸操纵子的表达受培养基中异亮氨酸或苏氨酸的抑制，即受到弱化的抑制。可以通过去除弱化区域中的前导序列和/或弱化子来完成修饰(Lynn，S.P.，Burton，W.S.，Donohue，T.J.，Gould，R.M.，Gumport，R.I.，andGardner，J.F.J.Mol.Biol.194:59-69(1987)；WO 02/26993和WO2005/049808)。

特定的启动子位于苏氨酸操纵子的上游，可以用异源启动子替换所述启动子(WO 98/04715)，或者可以用λ噬菌体的阻抑物或启动子调控苏氨酸操纵子(EP 0593792 B)。要修饰埃希氏菌属细菌，使苏氨酸操纵子不受L-苏氨酸反馈抑制的调控，可以选择抗α-氨基-β-羟基戊酸(AHV)的细菌菌株。

优选地，将修饰后不受L-苏氨酸反馈抑制调控的苏氨酸操纵子与强启动子连接，并引入宿主细菌中。增加拷贝数可以通过下述方法实现:使用质粒扩增苏氨酸操纵子，或者使用转座子、Mu-噬菌体等将苏氨酸操纵子转移至染色体。

优选增强下述基因的表达:糖酵解途径、TCA循环和呼吸链中相关基因，调控这些基因表达的基因，和糖摄取基因，以及编码L-苏氨酸生物合成酶的基因。对L-苏氨酸产生有效的这些基因的实例包括转氢酶基因(pntAB)(EP733712 B)、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶(pepC)(WO 95/06114)、磷酸烯醇丙酮酸合酶基因(pps)(EP 877090)，和源自棒状杆菌型细菌或芽孢杆菌属细菌的丙酮酸羧化酶基因(WO 99/18228和EP 1092776)。

对于赋予宿主L-苏氨酸和L-高丝氨酸抗性，或赋予L-苏氨酸和/或L-高丝氨酸抗性的基因，优选增强其表达。这些基因的实例包括rhtA基因(Res.Microbiol.154:123-135(2003))、rhtB基因(EP 0994190 A)、rhtC基因(EP1013765 A)、yfiK基因和yeaS基因(EP 1016710 A)。L-苏氨酸抗性还可以参照EP 0994190 A和WO 90/04636中所述的方法赋予宿主。

具有L-苏氨酸产生能力的细菌的实例包括大肠杆菌VKPM B-3996菌株(美国专利5,175,107)。VKPM B-3996菌株在1987年4月7日保藏在俄罗斯国立工业微生物保藏中心(VKPM)，GNII Genetika，给出的登录号为VKPMB-3996。VKPM B-3996菌株包含质粒pVIC40(WO 90/04636)，其通过向pAYC32中插入苏氨酸生物合成基因(苏氨酸操纵子:thrABC)而获得，pAYC32是具有广泛宿主范围的质粒载体，包含链霉素抗性标记(Chistorerdov，A.Y.，andTsygankov，Y.D.Plasmid，16，161-167(1986))。pVIC40包含突变的thrA基因，其编码不受L-苏氨酸反馈抑制的天冬氨酸激酶L-高丝氨酸脱氢酶I。

具有L-苏氨酸产生能力的细菌的另一个实例是大肠杆菌B-5318菌株(EP0593792B)。B-5318菌株在1990年5月3日保藏在俄罗斯国立工业微生物保藏中心(VKPM)，GNII Genetika，给出的登录号为VKPM B-5318。B-5318菌株是异亮氨酸相关的原养型，并且携带具有苏氨酸操纵子的质粒，苏氨酸操纵子具有弱化子区，弱化子区位于λ噬菌体的温度敏感型C1阻抑物、PR启动子和Cro蛋白N末端位点的下游，从而使苏氨酸生物合成基因表达受λ噬菌体的阻抑物和启动子的调控。

<1-2>增强磷酸转乙酰酶活性

本发明的细菌可以通过对上述具有产生L-氨基酸的能力的细菌进行修饰，以增强其磷酸转乙酰酶活性而获得。然而，可以在对细菌进行修饰以增强其磷酸转乙酰酶活性之后再赋予产生L-氨基酸的能力。

短语“修饰以增强磷酸转乙酰酶活性”包括与野生型菌株或未经修饰的菌株相比，每细胞的磷酸转乙酰酶分子数目增加的情况和每分子的磷酸转乙酰酶活性增加的情况。对于棒状杆菌型细菌，可以用作对照的野生型菌株的实例包括谷氨酸棒杆菌(乳发酵短杆菌)ATCC13869和ATCC13032。野生型大肠杆菌的实例包括大肠杆菌W3110(ATCC 27325)和大肠杆菌MG1655(ATCC47076)，其源自原养型的野生型K-12菌株。野生型Pantoea ananatis的实例包括Pantoea ananatis AJ13355(FERM BP-6614)和AJ13356(FERM BP-6615)。

在本发明中，磷酸转乙酰酶(磷酸乙酰转移酶)催化反应，由乙酰磷酸和CoA生成乙酰CoA和磷酸，或催化其逆反应，所述酶也称作磷酸乙酰转移酶或磷酸乙酰基转移酶(EC 2.3.1.8)。

在本发明中，可以通过Reinscheid D.J.等描述的方法确定增强的磷酸转乙酰酶活性(Microbiology.145:503-513(1999))。

也可以通过比较编码磷酸转乙酰酶的基因的mRNA水平和野生型或未修饰的菌株中的水平来证实磷酸转乙酰酶活性的增强。检测基因表达水平的方法包括Northern杂交和RT-PCR(Molecular cloning(Cold spring HarborLaboratory Press，Cold spring Harbor(USA)，2001)。本发明的细菌中磷酸转乙酰酶活性或基因表达水平可以为任何水平，只要与野生型或未经修饰的菌株相比增加即可，例如，与野生型或未经修饰的菌株相比，活性或基因表达优选地增加为不少于1.5倍，更优选不少于2倍，此外优选不少于3倍。

棒状杆菌型细菌中编码磷酸转乙酰酶的基因(pta基因)包括在Genbank注册的NCg12657(ATCC13032)的核苷酸序列(登录号NC_003450.3中2936506至2937891的互补链)。SEQ ID NO:40和41分别表示所述基因和由该基因编码的氨基酸序列。此外，SEQ ID NO:34中的核苷酸数目1214-2641和SEQ IDNO:35分别表示谷氨酸棒杆菌ATCC13869中pta基因的核苷酸序列和由该基因编码的氨基酸序列。

此外，本发明的基因可以是pta基因的同源物，其源自另一种细菌，只要其编码具有磷酸转乙酰酶活性的蛋白即可。参照SEQ ID NO:34的核苷酸1214-2641的核苷酸序列或SEQ ID NO:40的核苷酸序列，可以用BLAST(http://blast.genome.jp/)等查找这种同源物。

对本发明的pta基因的核苷酸序列进行了修饰。因此，使用根据已知核苷酸序列制备的引物，例如使用SEQ ID NO:9和10的引物，并且使用棒状杆菌型细菌的染色体DNA作为模板，可以用PCR(PCR:聚合酶链式反应；White，T.J.et al.，Trends Genet.5，185(1989))获得包含pta基因的区域，或pta基因及其表达调控序列。可以用同样的方法获得源自另一种细菌的pta基因同源物。

pta基因核苷酸序列之间可能有差异，这依赖于用来分离pta基因的细菌的属或菌株。因此，本发明所用的pta基因不限于SEQ ID NO:34的核苷酸1214-2641或SEQ ID NO:40的核苷酸序列，而可以是突变体或人为修饰的基因，其编码具有SEQ ID NO:35或41的氨基酸序列的蛋白，而且可在一个或几个位点包括一个或几个氨基酸的取代、缺失、插入或添加，只要其编码具有磷酸转乙酰酶活性的蛋白即可。尽管取决于在蛋白三级结构(ternarystructure)的位点或氨基酸的类型，但是本文所用的术语“一个或几个”特指1至20个，优选1至10个，更优选1至5个。同时，这些取代、缺失、插入、添加或倒置包括因为携带pta基因的细菌的个体差异或种间差异引起的天然存在的突变(突变体或变体)。

上述取代优选为不导致功能变化的保守取代。保守取代包括芳香族氨基酸之间的取代，如Phe、Trp和Tyr之间的取代；疏水氨基酸之间的取代，如Leu、Ile和Val之间的取代；极性氨基酸之间的取代，如Gln和Asn之间的取代；碱性氨基酸之间的取代，如Lys、Arg和His之间的取代；酸性氨基酸之间的取代，如asp和Glu之间的取代；具有羟基的氨基酸之间的取代，如Ser和Thr之间的取代。保守取代的具体实例包括:用Ser或Thr取代Ala；用Gln、His或Lys取代Arg；用Glu、Gln、Lys、His或Asp取代Asn；用Asn、Glu或Gln取代Asp；用Ser或Ala取代Cys；用Asn、Glu、Lys、His、Asp或Arg取代Gln；用Gly、Asn、Gln、Lys或Asp取代Glu；用Pro取代Gly；用Asn、Lys、Gln、Arg或Tyr取代His；用Leu、Met、Val或Phe取代Ile；用Ile、Met、Val或Phe取代Leu；用Asn、Glu、Gln、His或Arg取代Lys；用Ile、Leu、Val或Phe取代Met；用Trp、Tyr、Met、Ile或Leu取代Phe；用Thr或Ala取代Ser；用Ser或Ala取代Thr；用Phe或Tyr取代Trp；用His、Phe或Trp取代Tyr；和用Met、Ile或Leu取代Val。

此外，pta基因可以是具有下述核苷酸序列的基因，所述序列与SEQ IDNO:35或41的完整氨基酸序列具有至少80％同源性，优选至少90％，更优选至少95％，特别优选至少97％，而且编码具有磷酸转乙酰酶活性的蛋白。另外，可以修饰pta基因，使其具有选择的宿主细菌容易使用的密码子，因为基因的简并水平随着宿主细胞的不同而不同。

pta基因可以在N末端侧和/或C末端侧具有延长或缩短的序列，只要其编码具有磷酸转乙酰酶活性的蛋白即可。延长或缩短的氨基酸序列的长度为50或者更少，优选20或者更少，更优选10或者更少，特别优选5或者更少。更具体地，pta基因可以具有SEQ ID NO:35或41的氨基酸序列，其中在N末端侧和/或在C末端侧存在额外的50至5个氨基酸。

可以通过下述方法获得pta基因的同源基因:修饰SEQ ID NO:34中核苷酸1214至2641的核苷酸序列或SEQ ID NO:40的核苷酸序列，从而由所述基因编码的蛋白中具体的氨基酸残基被取代、缺失、插入或添加，例如，通过定点突变。此外，同源基因还可以用如下所述的已知突变处理方法获得。同源基因可以通过下述方法获得:在体外用羟胺等处理上述核苷酸序列，处理携带所述基因的细菌，例如，用紫外线或者用诱变剂如N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍(NTG)或甲烷磺酸乙酯(ethyl methanesulfonate)(EMS)处理棒状杆菌型细菌，或者通过基因重组，如易错PCR、DNA改组(DNA shuffling)和StEP-PCR，向pta基因中人工引入突变(Firth AE，Patrick WM；Bioinformatics.2005 Jun 2；Statistics of protein library construction)。通过上述方法测定酶活性能证实pta基因同源基因是否编码具有磷酸转乙酰酶活性的蛋白。

pta基因的实例包括在严紧条件下与下述序列杂交，并且编码具有磷酸转乙酰酶活性的蛋白的DNA:SEQ ID NO:34的核苷酸1214至2641互补的序列或SEQ ID NO:40的核苷酸序列，或者能从这两个序列制备的探针。本文所用的术语“严紧条件”包括形成所谓特异性杂合子而不形成非特异性杂合子的条件。其实例包括下述条件:在该条件下，具有至少80％的高同源性的DNA互相杂交，优选至少90％，更优选至少95％，还更优选至少97％，而具有少于80％的同源性的DNA不互相杂交；并特定地包括常规Southern杂交中的洗涤条件，即包括于60℃，优选68℃，在盐浓度为1×SSC、0.1％SDS，优选0.1×SSC、0.1％SDS，洗涤一次，优选两次或三次的条件。

SEQ ID NO:34中核苷酸1214至2641的部分序列或SEQ ID NO:40的核苷酸序列的部分序列可以用作探针。可以使用根据所述核苷酸序列制备的寡核苷酸作为引物，具有SEQ ID NO:34的核苷酸1214至2641的核苷酸序列或SEQ ID NO:40的核苷酸序列的DNA片段作为模板，通过PCR制备这种探针。例如，当使用长约300bp的DNA片段时，示例性的洗涤条件包括于50℃，在2×SSC、0.1％SDS中杂交。

可以通过增加pta基因的拷贝数来增强pta基因的表达。例如，可以用下述方法增强表达:将包含pta基因的片段连接到能在宿主细菌中起作用的载体中来制备重组DNA，所述载体优选多拷贝载体；然后用所述重组DNA转化上述具有产生L-氨基酸的能力的细菌。或者，通过下述方法增强表达:将上述重组DNA引入野生型细菌来制备转化体，然后赋予该转化体产生L-氨基酸的能力。同时，可以通过将一个或多个拷贝的pta基因转移至染色体上来增加拷贝数。可以用部分pta基因作为探针，通过Southern杂交确认pta基因整合入染色体。

还可以通过修饰pta基因的表达调控区来增强pta基因的表达。例如，可以通过下述方法实现:用更强效的启动子取代pta基因的启动子序列，或者修饰启动子序列，使其接近共有序列(WO 00/18935)。

在下文中，给出了构建经过修饰而使磷酸转乙酰酶活性增加的棒状杆菌型细菌的方法。这些方法可以按照分子克隆(Cold spring Harbor LaboratoryPress，Cold spring Harbor(USA)，2001)等进行。还可以用同样的方法修饰除棒状杆菌型细菌之外的细菌，使其磷酸转乙酰酶活性增加。

可以通过增加pta基因的拷贝数来增强pta基因的表达水平，可以使用如下所述的质粒扩增pta基因而增加拷贝数。首先，从棒状杆菌型细菌的染色体克隆pta基因。可以通过，例如Saito和Miura的方法(Biochem.Biophys.Acta，72，619(1963)，Experiment Manual for Biotechnology，edited by The Society forBiotechnology，Japan，p97-98，Baifukan Co.，Ltd.，1992)，从作为DNA供体的细菌制备染色体DNA。根据上述已知的序列信息合成用于PCR的寡核苷酸，例如，可以使用SEQ ID NO:9和10的合成寡核苷酸扩增pta基因。

将包含扩增的pta基因的基因片段连接至在大肠杆菌和/或棒状杆菌型细菌中能自主复制的载体上，并且将重组DNA引入大肠杆菌。在大肠杆菌中能自主复制的载体的实例包括pUC19、pUC18、pHSG299、pHSG399、pHSG398、RSF1010、pBR322、pACYC184和pMW219。

将上述DNA引入在棒状杆菌型细菌中能够发挥功能的载体。这种载体的实例包括在棒状杆菌型细菌中能自主复制的质粒。其具体实例包括JP3-210184 A中所述的pCRY30；JP 2-72876 A和美国专利5,185,262中所述的pCRY21、pCRY2KE、pCRY2KX、pCRY31、pCRY3KE和pCRY3KX；JP1-191686 A中所述的pCRY2和pCRY3；JP 58-67679 A中所述的pAM330；JP58-77895 A中所述的pHM1519；和JP 58-192900 A中所述的pAJ655、pAJ611和pAJ1844；JP 57-134500 A中所述的pCG1；JP 58-35197 A中所述的pCG2；JP 57-183799 A中所述的pCG4和pCG11；和JP 10-215883 A中所述的pVK7。

此外，如果将在棒状杆菌型细菌中能自主复制的DNA片段从这些质粒中的一个上切下，并插入上述用于大肠杆菌的载体中，则可将这种载体作为所谓的穿梭载体使用，而且该载体在大肠杆菌和棒状杆菌型细菌中都能自主复制。

这些载体可以如下从上述专利文件中给出的已保藏细菌获得。用溶菌酶和SDS溶解在对数生长期采集的细胞，并且在30,000×g离心，然后向上清液中加入聚乙二醇，之后用氯化铯-溴化乙锭平衡梯度离心来分离和纯化。

为了通过将pta基因与在棒状杆菌型细菌中有功能的载体相连接来制备重组DNA，用适合于剪切包含pta基因的片段的限制性酶消化载体。可以预先在用于扩增pta基因的合成寡核苷酸中引入限制性位点。通常使用连接酶，如T4DNA连接酶进行连接。

可以通过已经报道的任何转化方法，将如上所述制备的重组质粒引入棒状杆菌型细菌。其实例包括通过用氯化钙处理受体细胞来增加DNA的渗透性，这种方法据报道已经用于大肠杆菌K-12(Mandel，M.and Higa，A.，J.Mol.Biol.，53，159(1970))，和将DNA引入从增殖阶段的细胞制备的感受态细胞中，这种方法据报道已经用于枯草芽孢杆菌(Duncan，C.H.，Wilson，G.A and Young，F.E，Gene，1，153(1977))。可选地，也可以使用下述方法:制备能够容易地并入重组DNA的DNA受体细菌的原生质体样细胞或原生质球样细胞，并且将重组DNA引入这些细胞(Chang，S.and Choen，S.N.，Mol.Gen.Genet.，168,111(1979)；Bibb，M.J.，Ward，J.M.and Hopwood，O.A.，Nature，274,398(1978)；Hinnen，A.，Hicks，J.B.and Fink，G.R.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，751929(1978))。还可以用电脉冲方法(JP 02-207791 A)或接合转移方法(Biotechnology(NY).1991 Jan；9(1):84-7)转化棒状杆菌型细菌。

可以通过将多拷贝pta基因引入棒状杆菌型细菌的染色体DNA来增加pta基因的拷贝数。为了将多拷贝的pta基因引入棒状杆菌型细菌的染色体DNA，使用以多拷贝存在于染色体DNA上的序列进行同源重组。可以将转座因子末端存在的重复DNA或反向重复序列作为以多拷贝存在于染色体DNA上的序列使用。可选地，如JP 02-109985 A中所公开的，可以通过向转座子中插入pta基因，从而将多拷贝的该基因转移入染色体DNA来引入多拷贝pta基因(JP 02-109985 A，JP 07-107976 A，and Mol.Gen.Genet.，245,397-405(1994)，Plasmid.2000 Nov；44(3):285-91)。

此外，可以用下述方法扩增染色体上的pta基因:将pta基因插入具有复制起点的质粒，所述复制起点不能在宿主中复制，或者不能在宿主中复制，但能进行接合转移。这种质粒的实例包括pSUP301(Simo et al.，Bio/Technology 1，784-791(1983))、pK18mob，或pK19mob(Schaefer et al.，Gene 145，69-73(1994))、pGEM-T(Promega corporation，Madison，WI，USA)、pCR2.1-TOPO(Shuman(1994).Journal of Biological Chemistry 269:32678-84；美国专利5487993)、pCR(R)Blunt(Invitrogen，Groningen，Netherlands；Bernardet al.，Journal of Molecular Biology，234:534-541(1993))、pEM1(Schrumpf et al.，1991，Journal of Bacteriology 173:4510-4516)，和pBGS8(spratt et al.，1986，Gene，41:337-342)。通过接合或转化，将包含pta基因的质粒载体转移至棒状杆菌型细菌中。接合的方法，由例如Schaefer等(Applied and EnvironmentalMicrobiology 60，756-759(1994))描述。转化的方法，由例如Theirbach等(Applied Microbiology and Biotechnology 29，356-362(1988))，Dunican andShivinan(Bio/Technology 7，1067-1070(1989))和Tauch等(FEMSMicrobiological Letters 123，343-347(1994))描述。

可以用下述方法增加pta基因的表达:用更强效的启动子取代表达调控序列，如染色体DNA或质粒上的pta基因的启动子；修饰pta基因表达的调控中的相关因子，例如，操纵子或阻抑物；或者连接更强效的终止子(Hamilton etal.；Journal of Bacterology 171:4617-4622)。已知的强效启动子的实例包括lac启动子、trp启动子、trc启动子和PS2启动子。Goldstein等描述了评价启动子强度的方法和强效启动子的实例(Prokaryotic promoters in biotechnology.Biotechnol.Annu.Rev.，1995，1.105-128)。如WO 00/18935中所公开的，可以在目的基因的启动子区域引入几个核苷酸的取代，使启动子变得接近共有序列，从而使启动子更强。例如，可以将-35区域变成TTGACA或TTGCCA，而可以将-10区域变成TATAAT或TATAAC。另外，已经知道在核糖体结合位点(RBS)和翻译起始密码子，特别是和翻译起始密码子紧邻的上游序列之间的间隔序列中取代几个核苷酸，将显著影响mRNA的翻译效率，则可以按照这种方式修饰间隔序列。

pta基因上游区域的实例包括SEQ ID NO:34的核苷酸1至1213。表达调控序列，如pta基因的启动子可以使用启动子搜索载体或基因探测软件如GENETYX来确定。上述启动子取代或修饰使pta基因的表达增强。表达调控序列还可以使用温度敏感型的质粒取代。对表达调控序列的修饰可以与增加pta基因的拷贝数结合。

此外，还可以通过延长mRNA的保留时间，或者通过防止细胞中PTA蛋白的降解，来增加表达。

同样，有RamB蛋白的结合位点，其负调控pta基因的表达。这个结合位点位于棒状杆菌细菌中pta基因的上游，因此，可以修饰RamB蛋白结合位点以增加pta活性。在J Bacteriol.2004 May；186(9):2798-2809中已经报道了pta基因上游的RamB蛋白结合位点，并预测其包括起始于-87位的AAAACTTTGCAAA和起始于-203位的AAAACTTTGCAAA，如从pta基因的翻译起始密码子开始计算(这些RamB蛋白结合位点的序列分别对应于SEQID NO:34中的核苷酸1000至1012和1115至1127)。据报道，RamB蛋白结合序列具有A(A/G)AACTTTGCAAA的保守序列，而且位于下述基因的上游:编码异柠檬酸裂解酶的aceA基因、编码苹果酸合成酶的aceB基因，和pta-ack操纵子，并且这些基因的表达在高浓度乙酸存在下被诱导。因此，修饰保守序列能够防止因为结合RamB而导致pta基因表达量的减少，对序列的修饰的实例包括用GC碱基对取代AT碱基对和用AT碱基对取代GC碱基对，特定地包括用aaaacGAGgcGaG或aaaacGAGgcaaa取代AAAACTTTGCAAA。

是否修饰了pta基因而使其受到RamB的负调控可以通过在缺少乙酸时(例如，只有葡萄糖作为碳源存在)检测pta基因是否为组成型表达来确认(JBacteriol.2004 May；186(9):2798-809)。

还可以通过修饰调控pta基因表达的调控子蛋白来增加磷酸转乙酰酶活性。pta基因调控子的实例包括上述RamB蛋白，因为其负调控pta基因的表达。棒状杆菌型细菌的ramB基因已经在Genbank中登记。例如，谷氨酸棒杆菌ATCC13032菌株的ramB基因以登录号NC_006958.1:390784..392208登记。SEQ ID NO:42和43分别表示ramB基因的序列和由该ramB基因编码的氨基酸序列。同时，SEQ ID NO:36和37分别表示谷氨酸棒杆菌ATCC13869菌株的ramB基因和由该ramB基因编码的氨基酸序列。RamB基因可以是在严紧条件下与下述序列杂交的DNA:SEQ ID NO:36或42的核苷酸序列的互补链，或由其制备的探针；并且所述DNA编码与RamB结合位点结合来抑制pta基因的表达的蛋白。在此，严紧条件如上所述。

可以降低ramB基因的表达，以增强pta基因的表达。例如，可以通过下述基因重组技术引入突变，所述突变降低或消除ramB基因的表达。将ramB基因的部分序列突变，使其不产生RamB蛋白，并用包含该突变ramB基因的DNA转化细菌，以在突变ramB基因和染色体上的野生型ramB基因之间引起重组，导致由突变ramB基因取代染色体上的野生型ramB基因。

可以通过，例如下述方法，用突变ramB基因取代宿主细菌中染色体上的野生型ramB基因。首先，向质粒载体中插入温度敏感型复制起点、突变的ramB基因、编码果聚糖蔗糖酶的sacB基因和对抗生素如氯霉素表现出抗性的标记基因，由此制备用于重组的质粒。

在本文中，sac B基因编码果聚糖蔗糖酶，并且将sacB基因用于有效地筛选载体部分已经从染色体上消除的(cured)菌株(Schafer，A.et al.Gene 145(1994)69-73)。当在细菌中表达果聚糖蔗糖酶时，细菌不能生长，因为通过同化蔗糖产生的果聚糖对细菌有致死效果。如果在菌株中携带sacB基因的载体保留在染色体上，则在含蔗糖的平板上培养所述菌株时，该菌株不能生长。因此，只有已将载体从染色体去除的菌株能够在含蔗糖的平板上筛选出来。

sacB基因及其同源基因的实例包括下述:

枯草芽孢杆菌:sacB GenBank登录号X02730(WO 2005/113745)

解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens):sacB GenBank登录号X52988

运动发酵单孢菌(Zymomonas mobilis):sacB GenBank登录号L33402

嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus):surB GenBank登录号U34874

旧金山乳杆菌(Lactobacillus sanfranciscensis):frfA GenBank登录号AJ50839l

木醋杆菌(Acetobacter xylinus):lsxA GenBank登录号AB034152

重氮营养葡糖酸醋杆菌(Gluconacetobacter diazotrophicus):lsdA GenBank登录号L41732

在温度敏感型复制起点能够起作用的适当温度(25℃)培养转化体，所述转化体通过引入包含sacB基因和突变ramB基因的质粒而获得。在高温(例如，34℃)培养这种菌株，使温度敏感型复制起点不能起作用，导致温度敏感型质粒的消除，然后在包含抗生素的平板上培养这种株菌。因为温度敏感型质粒在高温不能复制，而消除了质粒的菌株不能在包含抗生素的平板上生长，但是在质粒上的突变ramB基因和染色体上的野生型ramB基因之间发生重组的菌株能够生长，并出现菌落。

在包含整合入染色体DNA的突变ramB基因的菌株中，在突变ramB基因和染色体上天然的野生型ramB基因之间发生重组，并且将野生型ramB基因和突变ramB基因的融合基因插入染色体，使重组DNA的其它部分(载体片段、温度敏感型复制起点和抗生素抗性标记)存在于融合基因之间。

然后，为了在染色体上只保留突变的ramB基因，将一个拷贝的ramB基因与载体片段(包括温度敏感型复制起点和抗生素抗性标记)一起从染色体DNA上去除。在这种情况下，将野生型ramB基因留在染色体DNA上，而将突变ramB基因从染色体DNA上切除，或者相反，将突变ramB基因留在染色体DNA上，而将野生型ramB基因从染色体DNA上切除。在这两种情况中，当在允许温度敏感型复制起点起作用的温度培养宿主细菌时，切除的DNA保留在宿主细菌中。然后，通过在用不允许温度敏感型复制起点起作用的温度培养细菌，将质粒上的基因与质粒一起从细胞中去除。对于sacB基因的情况，通过在含蔗糖的培养基中培养细菌，能够有效地获得将质粒去除的菌株。通过从消除了质粒的菌株中选择携带突变ramB基因的菌株，能够获得用突变ramB基因取代野生型ramB基因的菌株。

可以修饰本发明的细菌，使其除了磷酸转乙酰酶活性增强之外，还增加D-木糖5-磷酸-磷酸酮醇酶和/或果糖6-磷酸-磷酸酮醇酶的活性。

可以增加D-木糖5-磷酸-磷酸酮醇酶活性和果糖6-磷酸-磷酸酮醇酶活性中的至少一种。在本说明书中，D-木糖5-磷酸-磷酸酮醇酶和果糖6-磷酸-磷酸酮醇酶有时共同称作磷酸酮醇酶。

D-木糖5-磷酸-磷酸酮醇酶的活性指通过消耗磷酸，同时释放一分子的水，将木糖-5-磷酸转化成甘油醛-3-磷酸和乙酰磷酸的活性。可以用Goldberg等描述的方法(Methods Enzymol.，9，515-520(1996))或L Meile描述的方法(J.Bacteriol.(2001)183；2929-2936)测定这种活性。

同时，果糖6-磷酸-磷酸酮醇酶活性指通过消耗磷酸，同时释放一分子的水，将果糖-6-磷酸转化成赤藓糖-4-磷酸和乙酰磷酸的活性。可以用Racker，E描述的方法(Methods Enzymol.，5，276-280(1962))或L Meile描述的方法(J.Bacteriol.(2001)183；2929-2936)测定这种活性。

与未经修饰的菌株或野生型菌株相比，优选将磷酸酮醇酶的活性增强为不少于1.5倍，更优选不少于2倍，特别优选不少于3倍。

同如上所述增强磷酸转乙酰酶活性时一样，能够通过增加编码磷酸酮醇酶的基因的拷贝数，或修饰编码磷酸酮醇酶的基因的启动子，从而增强磷酸酮醇酶活性。

可以扩增宿主细菌的磷酸酮醇酶基因，如果宿主细菌没有磷酸酮醇酶活性，可以通过引入异源基因来赋予磷酸酮醇酶活性。

可以使用具有5-磷酸D-木糖-磷酸酮醇酶酶活性的细菌的染色体DNA作为模板，用PCR获得编码D-木糖5-磷酸-磷酸酮醇酶的基因。这种细菌的实例包括细菌，如乳酸细菌，甲醇-同化细菌，甲烷-同化细菌，属于链球菌属(Streptococcus)、醋杆菌属(Acetobacter)、双歧杆菌属(Bifidobacterium)、乳杆菌属(Lactobacillus)、硫杆菌属(Thiobacillus)、甲基球菌属(Methylococcus)、丁酸弧菌属(Butyrivibrio)或丝状杆菌属(Fibrobactor)的细菌；和属于假丝酵母属(Candida)、红酵母属(Rhodotorula)、红冬孢酵母属(Rhodosporidium)、毕赤酵母属(Pichia)、西洋蓍霉属(Yarrowia)、汉逊氏酵母属(Hansenula)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、酵母属(Saccharomyces)、丝孢酵母属(Trichosporon)、温酵母属(Wingea)属等的酵母。

可以使用具有果糖6-磷酸磷酸酮醇酶的酶活性的细菌的染色体DNA作为模板，通过PCR获得编码果糖6-磷酸磷酸酮醇酶的基因。这种细菌的实例包括属于醋杆菌属、双歧杆菌属、绿菌属(Chlorobium)、布鲁氏菌属(Brucella)、甲基球菌属或加德纳菌属(Gardnerella)的细菌，和属于假丝酵母属、红冬孢酵母属、酵母属等的酵母。

编码D-木糖5-磷酸磷酸酮醇酶的基因的具体实例是源自戊糖乳杆菌(Lactobacillus pentosus)MD363的xpkA基因。其核苷酸序列以登录号AJ309011(Posthuma，C.C.et al，Appl.Environ.Microbiol.，68(2)，831-7(2002))(SEQ ID NO:52)在EMBL/GenBank数据库中登记。在严紧条件下，xpkA基因可以与SEQ ID NO:52的核苷酸序列的互补链或由其制备的探针杂交，而且其编码具有D-木糖5-磷酸磷酸酮醇酶活性的蛋白。

还可以使用源自植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)的xpk1基因。其核苷酸序列以登录号NC_004567 Region(2362936..2365302的补体)(Kleerebezem，M.，et al，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.100(4)，1990-1995(2003))(SEQ ID NO:54)在EMBL/GenBank数据库登记。在严紧条件下，xpk1基因可以与SEQ ID NO:54的核苷酸序列的互补链或由其制备的探针杂交，而且xpk1基因编码具有D-木糖5-磷酸磷酸酮醇酶活性的蛋白。

另外，这些基因的同源基因的实例包括植物乳杆菌的基因，其以GenBank登录号NC_004567(3169067-3171478的补体)登记；无乳链球菌(Streptococcusagalactiae)的基因，其编码GenBank登录号为NP_736274的氨基酸序列；乳酸乳球菌乳酸亚种(Lactococcus lactis subsp.Lactis)的基因，其编码GenBank登录号为NP_267658的氨基酸序列；约氏乳杆菌(Lactobacillus johnsonii)的基因，其以GenBank登录号NC_005362(696462..698867)登记，和嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)的基因，其编码GenBank登录号为YP_193510的氨基酸序列。

WO2006/016705中公开了果糖6-磷酸磷酸酮醇酶基因和/或D-木糖5-磷酸磷酸酮醇酶基因的其它实例。

还可以使用同时具有D-木糖5-磷酸磷酸酮醇酶和果糖6-磷酸磷酸酮醇酶活性的蛋白的编码基因。这种基因的实例包括动物双歧杆菌(Bifidobacteriumanimalis)的xfp基因。其核苷酸以登录号AJ293946(Meile，L.et al，J.Bacteriol.，183(9)，2929-36(2001))(SEQ ID NO:56)在EMBL/GenBank数据库登记。在严紧条件下，xfp基因可以与SEQ ID NO:56的核苷酸序列的互补链或由其制备的探针杂交，而且xfp基因编码具有D-木糖5-磷酸磷酸酮醇酶活性和果糖6-磷酸磷酸酮醇酶活性的蛋白。

另外，xfp基因的同源基因的实例包括分离自长双歧杆菌(Bifidobacteriumlongum)的基因，其编码GenBank登录号为NP_696135的氨基酸序列；分离自Chlorobium tepidum的基因，其编码GenBank登录号为NP_662409的氨基酸序列；分离自猪布鲁氏菌(Brucella suis)的基因，其编码GenBank登录号为NP_699578的氨基酸序列；和分离自流产布鲁氏菌(Brucella abortus)的基因，其编码GenBank登录号为YP_223570的氨基酸序列。

可以修饰本发明的细菌，从而在增强磷酸转乙酰酶活性之外，或者在增强磷酸转乙酰酶与D-木糖5-磷酸-磷酸酮醇酶和/或果糖6-磷酸磷酸酮醇酶的活性之外，还增加丙酮酸羧化酶活性。

丙酮酸羧化酶基因的实例包括源自棒状杆菌型细菌的pyc基因和源自芽孢杆菌属细菌的pyc基因，其具体实例包括源自谷氨酸棒杆菌ATCC13032菌株(GenBank登录号NCgl0659:SEQ ID NO:64)的pyc基因和源自枯草芽孢杆菌的pyc基因(EP 1092776)。在严紧条件下，丙酮酸羧化酶基因可以与SEQ IDNO:64的核苷酸序列的互补链或由其制备的探针杂交，而且其编码具有丙酮酸羧化酶活性的蛋白。

还可以修饰本发明的细菌，在增强磷酸转乙酰酶活性之外，或者在增强磷酸转乙酰酶、D-木糖5-磷酸-磷酸酮醇酶和/或果糖6-磷酸磷酸酮醇酶的活性之外，还增加磷酸烯醇丙酮酸羧化酶活性。磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因的实例包括源自棒状杆菌型细菌的ppc基因和源自埃希氏菌属细菌的ppc基因，而其具体实例包括源自谷氨酸棒杆菌ATCC13032菌株的ppc基因(GenBank登录号NCgl1523:SEQ ID NO:62)和源自大肠杆菌MG1655菌株的ppc基因(GenBank登录号NP_418391)。在严紧条件下，磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因可以与SEQ ID NO:62的核苷酸序列的互补链或由其制备的探针杂交，而且其编码具有磷酸烯醇丙酮酸羧化酶活性的蛋白。此外，因为某些种类的磷酸烯醇丙酮酸羧化酶对天冬氨酸的反馈抑制敏感，所以优选进行修饰，使其对天冬氨酸的反馈抑制具有抗性(EP0723011)。

<2>产生L-氨基酸的方法

可以通过下述方法产生L-氨基酸:在培养基中培养如上所述获得的细菌，以在培养基或细菌细胞中产生并积累L-氨基酸；和从所述培养基或从所述细菌细胞收集L-氨基酸。

培养基可以是常规培养基，其包含碳源、氮源、无机盐，如果需要的话，还包含有机痕量营养物，如氨基酸或维生素。可以使用合成或天然的培养基。碳源和氮源可以是任何物质，只要能被选择的菌株利用即可。

可以使用糖作为碳源，所述糖如葡萄糖、甘油、果糖、蔗糖、麦芽糖、甘露糖、半乳糖、淀粉水解物和糖蜜，也可以单独使用或者与另一种碳源组合使用有机酸，如乙酸和柠檬酸，以及醇，如乙醇。作为氮源，可以使用铵盐，如氨、硫酸铵、碳酸铵、氯化铵、磷酸铵或乙酸铵，或者使用硝酸盐。作为有机痕量营养物，可以使用氨基酸、维生素、脂肪酸和核酸，以及包含这些营养物的蛋白胨、酪蛋白氨基酸、酵母提取物、大豆水解物，并且在使用需要氨基酸等用于生长的营养物营养缺陷型突变菌株时，其需要氨基酸等用于生长，可以补充需要的营养物。可以使用磷酸盐、镁盐、钙盐、铁盐、锰盐等作为无机盐。

优选搅拌进行培养，同时将发酵温度调至20至45℃，并且将pH调至3-9。如果培养过程中pH降低，通过添加碳酸钙或碱，如氨气等，将培养基中和。在这种条件下，培养优选进行约10至120小时，从而，培养基中能积累大量的L-氨基酸。

当产生L-谷氨酸时，可以使用液体培养基进行培养，将所述培养基调至适于产生L-谷氨酸的条件，同时使L-谷氨酸在培养基中沉淀。这些条件的实例包括5.0至4.0的pH范围，优选pH4.5至4.0，更优选pH4.3至4.0，特别优选pH4.0(EP 1078989 A)。

可以用已知的收集方法从培养基中收集L-氨基酸。例如，可以通过下述方法收集L-氨基酸:从培养基中去除细菌细胞，继之以浓缩和结晶、离子交换层析等。当在使L-谷氨酸沉淀的条件下培养时，可以通过离心、过滤等收集L-谷氨酸。在这种情况下，也可以将溶解在培养基中的L-谷氨酸结晶，然后收集。

实施例

在下文中，将通过下述非限定性实例详细描述本发明。

实施例1:构建ATCC13869的扩增了pta基因的菌株

使用破坏了sucA基因并引入突变yggB的菌株，作为扩增pta基因的亲本菌株。可以用下述方法构建菌株。

(1-1)构建破坏了sucA菌株

如下所述构建sucA基因破坏菌株(ATCC13869ΔsucA)。

根据WO 2005/113745和2005/113744所述的方法，使用pBS3进行对编码α-酮戊二酸脱氢酶的Elo亚基的sucA基因的破坏，所述pBS3携带编码果聚糖蔗糖酶的sacB基因。

根据谷氨酸棒杆菌ATCC13032(GenBank数据库登录号NC_003450)中sucA基因的已知核苷酸序列(SEQ ID NO:30)设计合成DNA，使用所述合成DNA作为引物，用重叠PCR方法，获得源自谷氨酸棒杆菌ATCC13869菌株的基因片段，其中将sucA基因的ORF缺失。具体地，使用谷氨酸棒杆菌ATCC13869菌株的染色体DNA作为模板，并且使用SEQ ID NO:1和2的合成DNA作为引物，用常规方法进行PCR，从而获得对应于sucA基因的N末端区域的扩增产物。为了获得对应于sucA基因的C末端区域的扩增产物，使用谷氨酸棒杆菌ATCC13869菌株的染色体DNA作为模板，并使用SEQ IDNO:3和4的合成DNA作为引物进行PCR。SEQ ID NO:2和3彼此互补，设计用来扩增将全部ORF缺失的sucA基因。

然后，为了获得其中内部序列缺失的sucA基因片段，将上述对应于sucA基因的N末端区域和C末端区域的每种扩增产物以近似相等的摩尔量混合，再使用所述混合物作为模板，并且使用SEQ ID NO:5和6的合成DNA作为引物，进行PCR，从而获得引入缺失突变的扩增了sucA基因的产物。用常规方法纯化PCR产物，然后用BamHI消化，之后插入上述pBS3的BamHI位点中。使用该DNA转化大肠杆菌JM109的感受态细胞(Takara Bio Inc.)，在LB平板上过夜培养经转化细胞，所述LB平板包含100μM的IPTG、40μg/ml的X-Gal和25μg/ml的卡那霉素(Km)。通过选择出现的白色菌落来分离转化体的单菌落。从这些转化体中提取质粒，将包含期望PCR产物的那些质粒命名为pBS3ΔsucA。

在上述(A)中获得的pBS3ΔsucA不包含允许在棒状杆菌型细菌中自主复制的区域。因此，当用该质粒转化棒状杆菌型细菌时，只有包含通过同源重组整合进染色体的质粒的转化体将以低频率出现。通过电脉冲方法，用高浓度的质粒pBS3ΔsucA转化谷氨酸棒杆菌ATCC13869，将细胞涂布于包含25μg/ml的卡那霉素的CM-Dex平板(5g/L葡萄糖、10g/L聚蛋白胨、10g/L酵母提取物、1g/L KH₂PO₄、0.4g/L MgSO₄·7H₂O、0.01g/L FeSO₄·7H₂O、0.01g/LMnSO₄·7H₂O、3g/L脲、1.2g/L大豆水解物、10μg/L生物素、15g/L琼脂，用NaOH将pH调至7.5)，在31.5℃培养约30小时。在这种培养基上生长的细胞中，通过质粒的sucA基因和ATCC13869菌株染色体上的sucA基因之间的同源重组，将来自质粒的卡那霉素抗性基因和sacB基因整合入染色体。

然后，在不包含卡那霉素的CM-Dex液体培养基中，在31.5℃过夜培养获得的单交换重组体，在适当的稀释后，将细胞涂布于不包含卡那霉素、含10％蔗糖的Dex-S10平板(100g/L蔗糖、10g/L聚蛋白胨、10g/L酵母提取物、1g/L KH₂PO₄、0.4g/L MgSO₄·7H₂O、0.01g/L FeSO₄·7H₂O、0.01g/LMnSO₄·4H₂O、3g/L脲、1.2g/L大豆水解物、10μg/L生物素，15g/L琼脂，用KOH将pH调至7.5)，在31.5℃培养约30小时。结果获得了因通过二次同源重组将sacB基因消除而对蔗糖不敏感的菌株。

如此获得的菌株包括:一种菌株，其中的sucA基因由源自pBS3ΔsucA的突变基因取代；和一种菌株，其中的sucA基因已经回复为野生型基因。可以将通过在Dex-S10平板上的培养获得的细菌细胞直接进行PCR，并检测sucA基因，从而容易地确认sucA基因是突变基因或野生型基因。分析如下进行:使用用于通过PCR扩增sucA基因的引物(SEQ ID NO:5和6)，和确定为包含与使用ATCC13869菌株染色体DNA的PCR产物相比较小的PCR产物的菌株作为模板。用这种方法，筛选出破坏了sucA的菌株，并在下述实验中使用。

用下述方法评价破坏了sucA的菌株产生L-谷氨酸的能力。在CM-Dex平板培养基上培养所述菌株，将每株破坏了sucA基因的菌株接种于Sakaguchi摇瓶中，摇瓶中包含20ml培养基，该培养基在1L纯水中包含30g葡萄糖、1g KH₂PO₄、0.4g MgSO₄、15g(NH₄)₂SO₄、0.01g FeSO₄·7H₂O、0.01gMnSO₄·7H₂O、13.7ml大豆水解物、200μg氯化硫胺、300μg生物素和50gCaCO₃(用KOH将pH调至8.0)，然后在31.5℃进行摇瓶培养。在培养后，确定培养基中积累的L-谷氨酸的量，选出显示最大L-谷氨酸产生产率的菌株，命名为ATCC13869ΔsucA。

(1-2)引入突变yggB基因

通过将IS(插入序列)插入yggB基因的C末端，制备突变yggB基因，将该突变yggB基因引入ATCC13869ΔsucA菌株(图1)。突变yggB基因的核苷酸序列和其编码的氨基酸序列分别在SEQ ID NO:7和8中给出。将引入了突变yggB基因的菌株命名为ATCC13869ΔsucAyggB::IS。

可选地，还可以通过如下所述的用PCR扩增三个片段来构建将IS插入yggB基因的C末端区域的菌株。

首先，使用SEQ ID NO:44和45的寡核苷酸作为引物，使用来自ATCC13869菌株的染色体DNA作为模板进行PCR，从而获得yggB基因的上游片段。使用SEQ ID NO:46和47的寡核苷酸作为引物，使用来自ATCC13869菌株的染色体DNA作为模板进行另一PCR，从而获得IS片段。SEQ ID NO:45和46的寡核苷酸彼此部分互补。接着，使用摩尔量近似相等的这些PCR产物作为模板，使用SEQ ID NO:44和47的寡核苷酸作为引物进行PCR，从而制备片段，其中将yggB片段插入IS的上游。

使用SEQ ID NO:48和49的寡核苷酸作为引物，使用来自ATCC13869菌株的染色体DNA作为模板进行PCR，从而获得yggB基因的下游片段。SEQID NO:47和48的寡核苷酸彼此互补。将yggB下游片段和包含在IS上游插入了yggB片段的上述片段以近似相等的摩尔量混合，并且使用SEQ ID NO:50和51的寡核苷酸作为引物进行PCR，从而获得其中插入了IS的yggB基因(yggB::IS)。将片段用SacI处理，并插入pBS4S(WO 2005/113745和2005/113744)的SacI位点中，从而构建质粒，该质粒可以用于用yggB::IS取代染色体上的yggB基因。ATCC13869菌株有很多相似的IS序列。因此，要获得完全对应于SEQ ID NO:7的插入了IS的yggB基因，需要确认质粒的核苷酸序列，以确定质粒是否有相同的序列。然而，IS衍生区域中一些核苷酸的差异对插入了IS的yggB基因的功能没有大的影响。用得到的质粒通过常规方法取代染色体上的yggB基因，得到染色体的yggB基因中插入了IS的菌株。

(1-3)构建扩增了pta的菌株

为了构建将磷酸转乙酰酶(pta)基因表达增强的菌株，用PCR扩增源自谷氨酸棒杆菌ATCC13869的磷酸转乙酰酶(pta)基因，并将其克隆进穿梭载体pVC7。用HindIII消化pAM330(来自ATCC13869菌株(GenBank数据库登录号D00038)的隐蔽性质粒)并且平端化，将由此获得的片段插入pHSG399(Takara Bio)的BsaAI位点中来构建pVC7(US 20030134397)。使用根据谷氨酸棒杆菌ATCC13032中磷酸转乙酰酶基因的已知核苷酸序列(GenBank数据库登录号NC_003450，SEQ ID NO:40)设计的合成DNA(SEQ ID NO:9和10)进行PCR，从而获得包含磷酸转乙酰酶基因的完整ORF及其启动子区域的基因片段。通过常规方法纯化这种PCR产物，用BamHI和KpnI消化，并插入pVC7中的BamHI位点和KpnI位点之间。使用这个质粒转化大肠杆菌DH5α的感受态细胞(Takara Bio Inc.)，在LB平板上过夜培养经转化的细胞，所述LB平板包含100μM的IPTG、40μg/ml的X-Gal和25μg/ml的氯霉素(Cm)。然后，通过选择出现的白色菌落分离转化体的单菌落。从这些转化体中提取质粒，选择包含目的PCR产物的质粒，并命名为pVC7-pta。

(1-4)确认ATCC13869ΔsucAyggB::IS菌株中增强的PTA活性

用pVK9转化ATCC13869ΔsucAyggB::IS菌株。通过电脉冲方法进行转化，在含25μg/ml卡那霉素的CM-Dex平板上于31.5℃培养细胞约30小时。将包含pVK9的这种菌株命名为ATCC13869ΔsucAyggB::IS(pVK9)。

pVK9(美国专利20050196846)是穿梭载体。通过用BamHI和KpnI消化pHK4(JP-A-05-007491)并且平端化获得片段，将获得的片段(能在棒状杆菌型细菌中自主复制的片段)插入pHSG299(TAKARA BIO INC.)的平端化的AvaII位点中，由此构建pVK9。

然后，分别用pVC7(对照质粒)和pVC7-pta(用于扩增PTA的质粒)转化ATCC13869ΔsucAyggB::IS(pVK9)菌株。用电脉冲方法进行转化，将细胞在包含25μg/ml卡那霉素和5μg/ml氯霉素的CM-Dex平板上于31.5℃培养约30小时。分别将引入了上述质粒的菌株命名为ATCC13869ΔsucAyggB::IS(pVK9，pVC7)和ATCC13869ΔsucAyggB::IS(pVK9，pVC7-pta)。

为了确定这些菌株的PTA活性，通过下述方法制备粗酶溶液。首先，将各菌株于31.5℃在CM-Dex液体培养基中培养。使用Taitec Mini photo 518R数字色度计确定OD 660，继续培养直至OD达到0.6至0.9，然后收集细胞。在4℃进行下述操作。用50mM Tris/HCl(pH7.0)溶液洗涤细胞两次，然后将细胞悬于缓冲液(50mM Tris/HCl(pH7.0)、10mM MgCl₂、1mM EDTA、1mMDTT和30％(w/v)甘油)中至4g(湿重)/ml。用超声波均质机(Bioruptor)使细胞均质化，并离心(15,000g，60分钟)。使用上清作为粗酶溶液。将粗酶溶液中蛋白质水平定量的步骤如下所述。使每种粗酶溶液和浓度已知(用于产生校正曲线)的BSA(牛血清白蛋白)，与CBB溶液(Nacalai tesque蛋白化验CBB溶液)反应，产生颜色，然后使用确定酶活性的仪器(Molecular Devices，最大光谱190(spectra max 190))，通过确定OD 595 nm将蛋白浓度定量。

然后，参照已知方法(D.J.Reinscheid，S.Schnicke，D.Rittmann，U.Zahnow，H.Sahm and B.J.Eikmanns(1999)Micobiology.145:503-513)确定PTA活性。具体的步骤如下。通过向反应溶液添加粗酶溶液启动酶反应，所述反应溶液为100mM Tris/HCl(pH7.6)、5mM MgCl₂、0.5mM盐酸L-半胱氨酸、20mMNH4Cl₂、1mM CoA和20mM乙酰磷酸。使用确定酶活性的仪器(MolecularDevices，最大光谱190)，通过确定OD 232nm检测乙酰CoA的产生，从而确定PTA活性。表1显示与对照菌株相比，ATCC13869ΔsucAyggB::IS(pVK9，pVC7-pta)具有较高的PTA活性。

[表1]

	ΔABS/秒/mg	与限定为1的对照的相对活性
	ΔABS/秒/mg	与限定为1的对照的相对活性	ATCC13869ΔsucAyggB::IS(pVK9，pVC7)	0.365	1(对照)
ATCC13869ΔsucAyggB::IS(pVK9，pVC7-pta)	1.550	4.27	ATCC13869ΔsucAyggB::IS(pVK9，pVC7)	0.365	1(对照)

实施例2:用增强了PTA的ATCC13869ΔsucAyggB::IS菌株产生L-谷氨酸

用与如上所示(1-1)同样的方法，通过培养谷氨酸棒杆菌ATCC13869ΔsucAyggB::IS(pVK9，pVC7)菌株和ATCC13869ΔsucAyggB::IS(pVK9，pVC7-pta)菌株，评价在发酵过程中增强PTA活性对L-谷氨酸产率的影响。结果示于表2中。发现增强了PTA的菌株的L-谷氨酸产率高于对照菌株的产率。

[表2]

	L-谷氨酸的发酵产率(平均值±标准偏差％(n＝样品数目))
	L-谷氨酸的发酵产率(平均值±标准偏差％(n＝样品数目))	ATCC13869ΔsucAyggB::IS(pVK9，pVC7)	47.0±0.2(n＝4)
ATCC13869ΔsucAyggB::IS(pVK9，pVC7-pta)	50.5±0.9(n＝4)	ATCC13869ΔsucAyggB::IS(pVK9，pVC7)	47.0±0.2(n＝4)

实施例3:用增强了PTA和磷酸酮醇酶活性的菌株产生L-谷氨酸

接着，研究增强的磷酸转乙酰酶活性和增强的磷酸酮醇酶活性对L-谷氨酸的组合作用。

如下所述构建磷酸酮醇酶表达质粒。

[0121]

(A)构建pVK9-xfp

为了用PCR扩增磷酸酮醇酶基因(已经公开序列信息:AY518213:gi:41056820)并将该基因插入实施例1所用的穿梭载体pVK9，使用Wizard Genomic Purification Kit(Promega Corporation)从动物双歧杆菌提取染色体DNA。使用动物双歧杆菌的染色体DNA作为模板，SEQ ID NO:11和12的合成DNA作为引物进行PCR，从而获得包含磷酸酮醇酶基因的全部ORF及其启动子区域的PCR产物。用常规方法纯化这个PCR产物，然后用XbaI消化，接着插入pVK9的XbaI位点中。用这种DNA转化大肠杆菌DH5α的感受态细胞(Takara Bio Inc.)，在LB平板上过夜培养转化细胞，所述LB平板包含100μM IPTG、40μg/ml X-Gal和25μg/ml Km。然后，通过选择出现的白色菌落分离转化体的单菌落。从转化体提取质粒，选择包含期望PCR产物的那些质粒并命名为pVK9-xfp。

(B)构建pVK9-PS2_xfp

进行重叠PCR方法(R.M.Horton，H.D.Hunt，S.N.Ho，J.K.Pullen，and L.R.Pease(1989)Gene 77:61-68)获得DNA片段，在该DNA片段中用PS2启动子取代动物双歧杆菌磷酸酮醇酶基因的启动子区域。具体地，使用pPSTG1(Y.Kikuchi，M.Date，K.Yokoyama，Y.Umezawa，and H.Matsui(2003)Appl.Environ.Microbiol.69:358-366)作为模板，SEQ ID NO:13和14的合成DNA作为引物进行PCR，从而获得PS2启动子的扩增产物。使用pVK9-xfp作为模板，SEQ ID NO:15和16的合成DNA作为引物进行另一PCR，从而获得动物双歧杆菌磷酸酮醇酶基因的扩增产物。SEQ ID NO:14和16的引物彼此互补。接着，为了获得其中将PS2启动子插入动物双歧杆菌磷酸酮醇酶基因上游的片段，将PS2启动子和动物双歧杆菌磷酸酮醇酶基因产物以近似相等的量混合，使用该混合物作为模板，SEQ ID NO:12和17的合成DNA作为引物进行PCR。用常规方法纯化这个PCR产物，然后用XbaI消化，接着插入pVK9的XbaI位点中。用DNA转化大肠杆菌DH5α的感受态细胞(TakaraBio Inc.)，在LB平板上过夜培养经转化的细胞，所述LB平板包含100μMIPTG、40μg/ml X-Gal和25μg/ml Km。然后，通过选择出现的白色菌落分离转化体的单菌落。从这些转化体提取质粒，选择包含具有期望PCR产物的质粒的那些并命名为pVK9-PS2_xfp。

(C)使用具有增强的PTA和磷酸酮醇酶活性的菌株产生L-谷氨酸

按照上述方法用pVK9_PS2_xfp转化谷氨酸棒杆菌ATCC13869ΔsucAyggB::IS菌株，从而获得转化体菌株，将其命名为ATCC13869ΔsucAyggB::IS(pVK9_PS2_xfp)。接着，分别用pVC7(用作对照的质粒)和pVC7-pta(用于扩增PTA的质粒)转化ATCC13869ΔsucAyggB::IS(pVK9_PS2_xfp)菌株，并将经转化菌株分别命名为ATCC13869ΔsucAyggB::IS(pVK9_PS2_xfp，pVC7)和ATCC13869ΔsucAyggB::IS(pVK9_PS2_xfp，pVC7-pta)。

用实施例1中(1-1)的方法培养谷氨酸棒杆菌ATCC13869ΔsucAyggB::IS(pVK9，pVC7)、ATCC13869ΔsucAyggB::IS(pVK9，pVC7-pta)、ATCC13869ΔsucAyggB::IS(pVK9_PS2_xfp，pVC7)和ATCC13869ΔsucAyggB::IS(pVK9_PS2_xfp，pVC7-pta)菌株。结果示于表3中。发现与PTA或磷酸酮醇酶之一增强的菌株相比，同时具有增强的PTA和磷酸酮醇酶活性的菌株的L-谷氨酸产率较高。

[表3]

	L-谷氨酸的发酵产率(％)(平均值±标准偏差(n＝样品数))
	L-谷氨酸的发酵产率(％)(平均值±标准偏差(n＝样品数))	ATCC13869ΔsucAyggB::IS(pVK9，pVC7)	47.0±0.2(n＝4)
ATCC13869ΔsucAyggB::IS(pVK9，pVC7-pta)	50.5±0.9(n＝4)	ATCC13869ΔsucAyggB::IS(pVK9，pVC7)	47.0±0.2(n＝4)
ATCC13869ΔsucAyggB::IS(pVK9，pVC7-pta)	50.5±0.9(n＝4)	ATCC13869ΔsucAyggB::IS(pVK9_PS2_xfp，pVC7)	54.5±0.2(n＝3)
ATCC13869ΔsucAyggB::IS(pVK9_PS2_xfp，pVC7-pta)	56.6±0.7(n＝6)	ATCC13869ΔsucAyggB::IS(pVK9_PS2_xfp，pVC7)	54.5±0.2(n＝3)

实施例4:通过破坏编码转录因子的ramB基因构建将PTA活性增强的菌株，并评价其效果

已知PTA基因的表达受转录因子RamB的负调控，而且在ramB基因缺陷菌株中的PTA活性增加(Journal of Bacteriology May 2004 2798-2809)。因此，构建ramB缺陷菌株，并且研究在发酵过程中其对L-谷氨酸产率的作用。

(4-1)克隆用于破坏ramB基因的片段

使用pBS5T破坏ramB基因，pBS5T是携带sacB基因的温度敏感型质粒(WO 2005/113745和WO 2005/113744)。使用根据谷氨酸棒杆菌ATCC13032的基因的已知核苷酸序列(GenBank数据库登录号NC_003450，SEQ ID NO:36和37分别显示了ramB基因的核苷酸序列和由其编码的氨基酸序列)设计的合成DNA为引物，通过重叠PCR方法获得基因片段，所述基因片段源自ATCC13869菌株的ramB基因，并且在ramB基因的ORF中有缺失。具体地，使用谷氨酸棒杆菌ATCC13869菌株的染色体DNA作为模板，SEQ ID NO:19和20的合成DNA为引物进行PCR，从而获得对应于ramB基因的N末端区域的扩增产物。进行另一PCR扩增对应于ramB基因的C末端区域的片段，使用ATCC13869菌株的染色体DNA作为模板，SEQ ID NO:18和21的合成DNA作为引物。SEQ ID NO:18和19的DNA彼此互补，并且将它们设计为扩增缺失全部ORF的突变ramB基因。然后，为了获得缺失内部序列的突变ramB基因片段，将对应于ramB基因的N末端区域和C末端区域的上述扩增产物以近似相等的摩尔量混合，并且使用该混合物作为模板，使用SEQ ID NO:22和23的合成DNA作为引物进行PCR。用常规方法纯化这个PCR产物，然后用XbaI消化，接着插入上述pBS5T的XbaI位点中。用这个DNA转化大肠杆菌DH5α的感受态细胞(Takara Bio Inc.)，在LB培养基上过夜培养细胞，所述LB培养基包含100μM IPTG、40μg/ml X-Gal和25μg/ml Km。然后，通过选择出现的白色菌落分离转化体的单菌落。从这些转化体中提取质粒，选择包含期望PCR的那些质粒并命名为pBS5T-ramB。

(4-2)构建破坏了ramB基因的菌株

首先，通过电脉冲方法，用高浓度的pBS5T-ramB转化ATCC13869ΔsucAyggB::IS菌株，在包含25μg/ml卡那霉素的CM-Dex平板上于25℃培养经转化的细胞约60小时。将这种转化体于34℃在CM-Dex液体培养基中振荡过夜培养，经过适当稀释后，在包含25μg/ml卡那霉素的CM-Dex培养基中于34℃培养约30小时。

在这种培养基上生长的菌株中，通过在质粒的突变ramB基因和ATCC13869ΔsucAyggB::IS菌株染色体上ramB基因之间的同源重组，将源自该质粒的卡那霉素抗性基因和sacB基因整合进染色体。

接着，在不包含卡那霉素的CM-Dex液体培养基中，在31.5℃过夜培养这些单交换重组体，在适当的稀释后，在不包含卡那霉素、含10％蔗糖的Dex-S10培养基中(100g/L蔗糖、10g/L聚蛋白胨、10g/L酵母提取物、1g/LKH₂PO₄、0.4g/L MgSO₄·7H₂O、0.01g/L FeSO₄·7H₂O、0.01g/L MnSO₄·4H₂O、3g/L脲、1.2g/L大豆水解物、10μg/L生物素、2g/l乙酸钠，pH7.5(KOH))，在34℃培养约30小时。结果获得因为通过二次同源重组将sacB基因消除而对蔗糖不敏感的菌株。

如此获得的菌株包括:一种菌株，其中的ramB基因由源自pBS5T-ramB的突变基因取代；和一种菌株，其中的ramB基因回复为野生型基因。可以通过直接将在Dex-S10平板上培养获得的细菌细胞进行PCR，来确认ramB基因是突变基因还是野生型基因。选出只具有突变ramB基因的菌株，并命名为ATCC13869ΔsucAyggB::ISΔramB。

(4-3)使用破坏了ramB基因的菌株产生L-谷氨酸

分别用pVK9(作为对照的质粒)和pVK9_PS2_xfp(用于扩增磷酸酮醇酶基因(PKT)的质粒)转化ATCC13869ΔsucAyggB::ISΔramB。通过电脉冲方法进行转化，在包含25μg/ml卡那霉素的CM-Dex平板上于31.5℃培养细胞约30小时。将引入了质粒的菌株分别命名为ATCC13869ΔsucAyggB::ISΔramB(pVK9)和ATCC13869ΔsucAyggB::ISΔramB(pVK9_PS2_xfp)。通过根据实施例1中(1-1)的方法进行培养来评价这些菌株连同实施例1中构建的ATCC13869ΔsucAyggB::IS(pVK9)菌株和ATCC13869ΔsucAyggB::IS(pVK9_PS2_xfp)菌株。这个过程确认通过ramB基因破坏和通过ramB基因破坏与PKT增强的组合，使L-谷氨酸产率改进。

实施例5:通过修饰pta基因的启动子构建增强了PTA活性的菌株，并评价其效果

可以通过修饰pta基因的启动子来增强PTA活性。已知的是，pta基因启动子有两个被认为与RamB介导的影响PTA活性的负调控有关的区(JBacteriol.2004 May；186(9):2798-2809)。因此，构建仅在pta启动子中一个RamB结合位点进行修饰或在pta启动子中两个RamB结合位点都进行修饰的菌株，以检验其对L-谷氨酸发酵产率的影响。

(5-1)构建质粒用于突变pta启动子、pBS5T-m1PTA、pBS5T-m2PTA、PBS5T-m1m2PTA

使用根据来自谷氨酸棒杆菌ATCC13032的基因的已知核苷酸序列(GenBank数据登录号NC_003450)设计的合成DNA，通过PCR获得基因片段，该基因片段包含源自ATCC13869的pta基因的ORF区和启动子区。具体地，为了扩增pta基因的启动子区，使用谷氨酸棒杆菌ATCC13869菌株的染色体DNA作为模板，SEQ ID NO:24和25的合成DNA作为引物进行PCR。用常规方法纯化这种PCR产物，用XbaI消化，然后将其插入pUC19(Takara Bio Inc.)的XbaI区中。用该DNA转化大肠杆菌DH5α的感受态细胞(Takara Bio Inc.)，在LB培养基上过夜培养细胞，所述LB培养基包含100μM IPTG、40μg/mlX-Gal和50μg/ml Km。然后，通过选择出现的白色菌落分离转化体的单菌落。从这些转化体中提取质粒，选择包含期望PCR产物的那些质粒并命名为pUC19-PTA。

接着，使用定点诱变试剂盒(STARATAGENE)向pta启动子区中引入突变。使用pUC19-PTA作为模板，SEQ ID NO:26和27的合成DNA作为引物，按照试剂盒提供的操作说明进行PCR，结果得到在最初的RamB-结合位点之一中具有突变的质粒。将这个质粒命名为pUC19-m1PTA。

接着，使用pUC19-m1PTA作为模板，SEQ ID NO:24和25的合成DNA作为引物进行PCR，从而获得包含具有突变的pta基因启动子区的扩增产物。用常规方法纯化这个PCR产物，并将其插入pBS5T的上述SmaI区中。用这种DNA转化大肠杆菌DH5α的感受态细胞(Takara Bio Inc.)，在LB培养基上过夜培养该细胞，所述LB培养基包含100μM IPTG、40μg/ml X-Gal和25μg/ml Km。然后，通过选择出现的白色菌落分离转化体的单菌落。从这些转化体中提取质粒，序列分析确认质粒具有期望的突变，而且其它核苷酸中没有序列错误。因此，将质粒命名为pBS5T-m1PTA。

以同样的方式，使用SEQ ID NO:28和29的合成DNA进行PCR，然后将期望序列插入pBS5T，来构建在第二RamB结合位点中具有突变的质粒。将这个质粒命名为pBS5T-m2PTA。另外，用如上所述同样的方法构建在两个RamB结合位点都有突变的质粒，并命名为pBS5T-m1m2PTA。

(5-2)构建携带启动子经修饰的pta基因的菌株

根据实施例4的方法，从ATCC13869ΔsucAyggB::IS菌株获得具有经修饰的PTA启动子的菌株。通过分析启动子区的序列来确认突变。将pta启动子中的RamB结合位点经修饰的菌株命名为ATCC13869ΔsucAyggB::ISm1、ATCC13869ΔsucAyggB::ISm2和ATCC13869ΔsucAyggB::ISm1m2。

(5-3)使用携带启动子经修饰的pta基因的菌株产生L-谷氨酸

用pVK9(对照质粒)和pVK9_PS2_xfp(用于扩增PKT的质粒)转化ATCC13869ΔsucAyggB::ISm1菌株、ATCC13869ΔsucAyggB::ISm2菌株和ATCC13869ΔsucAyggB::ISm1m2菌株中的每一种。用电脉冲方法进行转化，在包含25μg/ml卡那霉素的CM-Dex平板上在31.5℃培养经转化的细胞约30小时。将这些菌株命名为ATCC13869ΔsucAyggB::ISm1(pVK9)、ATCC13869ΔsucAyggB::ISm1(pVK9_PS2_xfp)、ATCC13869ΔsucAyggB::ISm2(pVK9)、ATCC13869ΔsucAyggB::ISm2(pVK9_PS2_xfp)、ATCC13869ΔsucAyggB::ISm1m2(pVK9)和ATCC13869ΔsucAm1m2(pVK9_PS2_xfp)，并且通过根据实施例1的方法进行培养来评价这些菌株连同实施例1中构建的ATCC13869ΔsucAyggB::IS(pVK9)和ATCC13869ΔsucA(pVK9_PS2_xfp)。确认了通过pta启动子修饰，和通过PTA启动子修饰与PKT增强的组合，使L-谷氨酸的产率改进。

实施例6

构建将PTA增强与回补途径(anaplerotic pathway)中酶的增强组合的菌株

为了评价PTA和磷酸烯醇丙酮酸羧化酶(PPC)或丙酮酸羧化酶(PC)组合增强的效果，构建具有增强的PTA和PPC活性或具有增强的PTA和PC活性的菌株。

(6-1)构建表达ppc的质粒pVC-PPC

如下所述构建表达ppc的质粒。使用SEQ ID NO:58和59的合成寡核苷酸作为引物，谷氨酸棒杆菌ATCC 14067菌株的染色体DNA作为模板，通过进行PCR扩增ppc基因。将扩增的DNA平端化，并插入pHSG399(TAKARABIO INC.)的SmaI位点中，从而获得质粒pPCF。然后，为了去除ppc基因编码区上游的区域，用DraI和SalI消化pPCF，并且将得到的片段插入pHSG398(TAKARA BIO INC.)的SmaI位点中，获得具有相对于lacZ基因以反向插入的ppc基因的质粒，并将其命名为pPCFds。然后，通过用PstI和ApaI消化p399AKYB(JP6-62866)然后平端化来制备DNA片段，所述DNA片段包含天冬氨酸激酶启动子和能在棒状杆菌型细菌中自主复制的区域，将获得的片段插入已经用SalI消化并平端化的pPCFds中，从而将天冬氨酸激酶启动子连接至ppc基因的上游。选出天冬氨酸激酶启动子和ppc基因以相同方向连接的质粒，并命名为pAKPFds。pAKPFds中与在棒状杆菌型细菌中自主复制有关的区域源自pHM1519，其来自pVK9_PS2_xfp的自主复制区，所以，pAKPFds不能与pVK9_PS2_xfp在棒杆菌中共存。所以，使用SEQ ID NO:60和61的合成寡核苷酸作为引物，pAKPFds作为模板进行PCR，用KpnI消化扩增的片段，并将其插入pVC7(JP2000-201692)的KpnI位点中，其包含来自pAM330的自主复制区。将获得的质粒命名为pVC-PPC。

(6-2)构建扩增了pta基因和ppc基因的菌株，以及扩增了pta基因和pc基因的菌株

使用pVC7(对照)、pVC-PPC或pBPYC6(表达pc基因的质粒:JP2000-201692)转化ATCC13869ΔsucAyggB::IS(pVK9)(见实施例2)、ATCC13869ΔsucA(pVK9_PS2_xfp)(见实施例3)，和ATCC13869ΔsucAyggB::ISm1(pVK9)、ATCC13869ΔsucAyggB::IS m1(pVK9_PS2_xfp)、ATCC13869ΔsucAyggB::IS m2(pVK9)、ATCC13869ΔsucAyggB::IS m2(pVK9_PS2_xfp)、ATCC13869ΔsucAyggB::IS m1m2(pVK9)，和ATCC13869ΔsucAyggB::ISm1m2(pVK9_PS2_xfp)(见实施例5)。根据实施例1中(1-1)的方法培养这些转化体，并评价L-谷氨酸的生产。由此确认通过将修饰pta启动子与增强PC或PPC组合，或者通过将修饰pta启动子与增强PKT和增强PC或PPC组合，使L-谷氨酸生产改进。

工业适用性

本发明的生产方法能够有效生产L-氨基酸，如L-谷氨酸、L-谷氨酰胺、L-脯氨酸、L-精氨酸、L-亮氨酸和L-半胱氨酸。

序列表