CN113583884A - 一种产γ-氨基丁酸的发酵培养基及生产方法 - Google Patents
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本发明公开了一种产γ‑氨基丁酸的发酵培养基；它包括：0.1~1%L‑Glu、10~20%豆渣、0.05~0.2%K.marxianus发酵剂，余量为水；一种γ‑氨基丁酸的生产方法，它包括：1）K.marxianus发酵剂的培养：菌株K.marxianus在MRS培养基中生长，并在28~32°C、100~150rpm下摇床培养10~15h；在5000~6000 rpm、0~4°C下离心3~7分钟；洗涤3次并重悬，冻干，得K.marxianus发酵剂；2）生产γ‑氨基丁酸：豆渣、水、L‑Glu混合，121°C灭菌20分钟，冷却至室温；接种K.marxianus发酵剂,在32~37℃、转速为100~150rpm下发酵48~72h；在10000~15000 rpm转速下离心8~12分钟，得上清液，纯化，得γ‑氨基丁酸；结果发现K.marxianus可以将豆渣中的L‑Glu和MSG转化为GABA，且对L‑Glu的转化效果优于MSG。在优化的发酵条件下，K.marxianus显示出GABA的最高产量（4.31 mg/mL）。此外，证明蛋白胨对GABA产量有显著影响。
Description
技术领域
本发明属于微生物发酵技术领域，具体涉及一种产γ-氨基丁酸的发酵培养基及生产方法。
背景技术
γ-氨基丁酸（GABA）是一种四碳非蛋白质氨基酸，作为一种重要的抑制性神经递质，具有多种生理活性，包括抗高血压、抗失眠、抗氧化、抗肥胖和增强免疫力等。它被认为是食品和制药行业的功能性成分，因此GABA在各个行业的应用导致了对高效生产的需求。
GABA的合成是通过谷氨酸脱羧酶（GAD）催化谷氨酸脱羧的不可逆酶促反应，使用5'-磷酸吡哆醛（PLP）作为辅助因子。尽管GABA存在于多种植物和动物中，但更多的微生物是GABA生产的重要来源。在发酵食品和饮料中已经发现了多种微生物，例如奶酪、酸奶清酒和发酵大豆。目前，生产GABA最常见的菌株是乳酸菌（LAB）、霉菌和酵母，例如短乳杆菌RK03，短乳杆菌TISTR860，嗜热链球菌Hp，植物乳杆菌Taj-Apis362，副干酪乳杆菌Lactobacillus paracasei，米曲霉，毕赤酵母。最近有报道称GABA可以由马克斯克鲁维酵母（K.marxianus）产生，它通常从范围广泛的自然栖息地分离，例如发酵的传统乳制品。据研究报道，从不同乳制品中分离出的50株K. marxianus释放出少量的GABA，产量仅为2.54μg/mL至7.33 μg/mL。因此，增加细胞外GABA的产量仍有待探索。此外，使用低成本底物获得GABA以降低生产成本是可行的策略。豆渣可以作为底物，因为它的成本低，营养丰富。
豆渣是一种副产品，主要来自豆腐、豆浆和其他豆制品的生产。中国是大豆的主要生产国和最大消费国，每年生产约280万吨豆渣。因此，回收大量豆渣是大豆产业中极为重要的方法。与普通微生物培养基相比，豆渣的营养可能不够丰富，但仍含有约20-30%的蛋白质和40-60%的碳水化合物，可以为特定的微生物生长提供营养。
发明内容
本发明目的是为增加GABA的产量、降低生产成本，而提供一种产γ-氨基丁酸的发酵培养基及生产方法。
一种产γ-氨基丁酸的发酵培养基，按质量分数计，包括： 0.1~1%L-Glu、10~20%豆渣、0.05~0.2%K. marxianus发酵剂，余量为水；
所述的培养基还包括0.5~2%蛋白胨；
所述的L-Glu 含量为0.5%、K. marxianus发酵剂含量为0.1%，蛋白胨含量为1% 。
一种γ-氨基丁酸的生产方法，它包括：
1）K. marxianus发酵剂的培养：菌株K. marxianus在MRS培养基中生长，并在28~32°C、100 ~150rpm下摇床培养10~15h；在5000~6000 rpm、 0~4°C下离心3~7分钟；洗涤3次并重悬，冻干，得K. marxianus发酵剂；
2）生产γ-氨基丁酸：按权利要求1所述的一种产γ-氨基丁酸的发酵培养基的成分称取各物质，豆渣、水、L-Glu混合，121°C灭菌20分钟，冷却至室温；接种K. marxianus发酵剂, 在32~37℃、转速为100~150rpm下发酵48~72h；在10000~15 000 rpm转速下离心8~12分钟，得上清液，纯化，得γ-氨基丁酸；
步骤2）所述的发酵温度为35℃；
步骤2）所述的发酵转速为120rpm；
步骤2）所述的发酵时间为60h；
所述的发酵的初始pH为5。
本发明提供了一种产γ-氨基丁酸的发酵培养基，按质量分数计，包括： 0.1~1%L-Glu、10~20%豆渣、0.05~0.2%K. marxianus发酵剂，余量为水；一种γ-氨基丁酸的生产方法，它包括：1）K. marxianus发酵剂的培养：菌株K. marxianus在MRS培养基中生长，并在28~32°C、100 ~150rpm下摇床培养10~15h；在5000~6000 rpm、 0~4°C下离心3~7分钟；洗涤3次并重悬，冻干，得K. marxianus发酵剂；2）生产γ-氨基丁酸：按权利要求1所述的一种产γ-氨基丁酸的发酵培养基的成分称取各物质，豆渣、水、L-Glu混合，121°C灭菌20分钟，冷却至室温；接种K. marxianus发酵剂, 在32~37℃、转速为100~150rpm下发酵48~72h；在10000~15 000 rpm转速下离心8~12分钟，得上清液，纯化，得γ-氨基丁酸；结果发现K. marxianus可以将豆渣中的L-Glu和MSG转化为GABA，且对L-Glu的转化效果优于MSG。在优化的发酵条件下，K.marxianus显示出GABA的最高产量（4.31 mg/mL）。此外，证明蛋白胨对GABA产量有显著影响。该研究为GABA的规模化生产提供了良好的基础。如何利用和调控豆渣培养基中的氮源和其他诱导剂，以经济有效的方式进一步提高GABA的产量，值得探索和发展。本发明将为农业残渣规模化生产的附加值利用提供有力证据。
附图说明
图1 不同菌株和培养基中K. marxianus发酵生产GABA的TLC分析；（a）含有L-Glu的豆渣；（b）含有MSG的豆渣；（c）含有L-Glu的Okara、YPD和MRS培养基；（d）含MSG的豆渣、YPD和MRS培养基；K. marxianus（K）；乳酸菌（L）；K. marxianus和LAB（K+L）；
图2 GABA和L-Glu在不同溶液中的标准曲线；（a）蒸馏水；（b）豆渣发酵液；
图3 含有L-Glu的不同培养基对K. marxianus生物量和GABA产量的影响；（a）豆渣；（b）MRS培养基；（c）YPD培养基；数值和误差棒代表一式三份实验数据的平均值和标准偏差；
图4 不同发酵参数对GABA产量的影响；（a）初始 pH；（b）培养温度；（c）孵育时间；（d）接种量；（e）转速；（f）L-Glu量；数值和误差棒代表一式三份实验数据的平均值和标准偏差；
图5 GABA生产的三维曲面图；（a）培养温度和初始pH值的影响；（b）孵育时间和初始pH值的影响；（c）孵育时间和培养温度的影响；
图6 豆渣和其他成分对GABA的影响；豆渣与L-Glu，然后添加葡萄糖（G）、蛋白胨（P）或VB6（V）。
具体实施方式
本发明材料和菌株：大豆（黑河43，黑龙江，中国）购自山东盛丰种业有限公司（中国山东济宁）； MRS培养基和蛋白胨购自AoBoXing biotechnology（中国北京）；酵母提取物和葡萄糖购自北京化工厂（中国北京）；丁二酸钠和L-谷氨酸（L-Glu）购自上海化学工业园区（中国上海）；谷氨酸钠（MSG）购自中国惠氏生化试剂有限公司（中国上海）；乳酸菌（LAB）购自青岛科美盛食品科技有限公司；从开菲尔粒中分离出的K. marxianus由中国微生物保藏管理委员会（CGMCC，No. 13907，中国北京）保存。
实施例1 一种γ-氨基丁酸的生产方法
一、豆渣的制备
将生大豆以1:5（m/v）的比例在水中浸泡8-12h，滤去水；使用豆浆机，加入泡好的大豆和水，料液比例为1:9（m/v），打浆；将浆液通过60目筛过滤，获得新鲜的豆渣；将新鲜豆渣在立式压力蒸汽灭菌锅中在121°C下灭菌20分钟。
二、K. marxianus的培养
对于种子培养，菌株K. marxianus在MRS培养基中生长，并在30°C下在培养摇床中以120 rpm的速度培养12h；孵育后，将悬浮液以5,500 rpm和4°C离心5分钟。离心后的酵母用无菌水洗涤3次并重悬，然后冻干成粉末作为发酵剂。
三、K. marxianus发酵豆渣生产GABA
将豆渣和L-Glu浸泡在蒸馏水中，豆渣和水以1:5（m/v）比例、L-Glu占体积比0.5%（m/v）；121°C灭菌20分钟，冷却至室温，得到以L-Glu为底物的豆渣培养基；K. marxianus发酵剂以0.1%（m/v）的比例加入豆渣培养基中，发酵60h；12, 000 rpm离心10分钟后得上清液，纯化得γ-氨基丁酸GABA。
实施例2K. marxianus在豆渣中生产GABA的可行性实验
分别以L-Glu和MSG为底物，比较了K. marxianus和LAB在发酵豆渣中的GABA转化能力；具体方法为：0.1%K. marxianus或0.1%LAB接种至豆渣中，加入0.5%L-Glu或0.5% MSG底物，在30°C下发酵60h；结果是，在豆渣基质中，K. marxianus有效地转化了L-Glu和MSG，而LAB几乎没有表现出转化能力（图1a和b）。尽管许多LAB表现出广泛的GABA转化能力，但它们在豆渣培养基中的生长是出乎意料的，因此可能会影响生产GABA的能力。L-Glu作为底物的产量高于MSG，表明L-Glu更适合K. marxianus在豆渣基质中产生GABA（图1a和b）。
此外，在不同种类的培养基下探索了K. marxianus生产GABA的能力。具体方法为：分别以0.5% L-Glu和0.5% MSG为底物，比较了K. marxianus和LAB在发酵豆渣、MRS、YPD中的GABA转化能力，接种量为0.1%，在30°C下发酵60 h；结果表明，K.marxianus在豆渣、MRS和YPD培养基中有效产生GABA（图1c和d），表明该菌株具有很强的产生细胞外GABA的能力，仍有待探索。与豆渣相比，在MRS和YPD培养基中检测到更多的GABA类似物。这必然会导致GABA日后分离纯化的复杂性。综上，可以证明K. marxianus在豆渣中发酵生产GABA是可行的。
实施例3豆渣中GABA定量方法的建立
GABA含量的测定方法：
1）TLC分析：薄层色谱分析采用硅胶板（10 × 10 cm）（中国青岛），用于GABA的定性；将悬浮液以12，000 rpm离心10分钟，然后将等分试样（4 μL）上清液加载到硅胶板上。使用正丁醇：乙酸：蒸馏水（3:1:2，v/v/v）的展开溶剂和0.2%（m/v）茚三酮溶液在层析缸中使板展开1.5h。然后在烘箱中显色。
2）比色法：悬浮液在12,000rpm下离心10分钟。200 μL上清液与400 μL硼酸盐缓冲液（pH 9）、200 μL苯酚（6%，m/v）和1 mL次氯酸钠（10%，v/v）反应，静置约3分钟，然后在沸水（98 °C）中放置10分钟，然后立即放入冰浴中10分钟。最后，向每个样品中加入4 mL酒精（60%，v/v），并在645 nm处测量吸光度。GABA标准曲线的绘制方法与上述相同。将待测样品测得的吸光度代入标准曲线以换算GABA产率。
GABA的定量方法有很多，例如放射性受体（RRA）、高效液相色谱（HPLC）、比色法。使用HPLC检测GABA相对准确，通常用于许多GABA研究，但它需要样品衍生，不能满足大量GABA检测。GABA的比色测定基于Berthelot反应，使用苯酚和次氯酸钠与ω-氨基酸反应生成有色物质，以测定不同系统中的痕量氨及其盐，具有极高的灵敏度。它适用于发酵液基质中GABA的检测，因为它快速、有价值且具有成本效益，并且Berthelot比色法和HPLC之间没有显着差异。
为确定L-Glu和K. marxianus发酵豆渣溶液中（不添加L-Glu）产生的一些杂质对GABA测定的影响，分别建立了GABA和L-Glu在水和豆渣发酵液（不添加L-Glu）中的标准曲线（图 2）；结果表明，在水和发酵豆渣溶液中L-Glu对GABA的测定不产生干扰。水中的R2为0.9997（图 2a），而豆渣发酵液中的R2为 0.995（图 2b），表明比色法可用于豆渣发酵液中GABA的精确定量。
实施例4 不同培养基对K. marxianus细胞生物量和GABA产量的影响
为了进一步确定以L-Glu为底物时豆渣培养基在生产GABA方面的优势，使用YPD和MRS培养基来比较K. marxianus的生物量和GABA产量。接种量为0.1%，在30°C下发酵60 h。细胞生物量采用标准平板计数琼脂法在MRS琼脂上测定不同培养基对细胞生长的影响。发酵微生物悬浮液用0.85%（m/v）盐水、连续稀释（稀释倍数为 10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7）取稀释比为10-5、10-6和10-7μL的微生物悬浮液涂板，将平板在37°C下孵育48h，然后计数菌落。
结果表明，在所有培养基中发酵时间为60h时GABA产量达到最高点。此时，分别获得了豆渣中2.14 mg/mL的GABA（图 3a）、MRS中的2.54 mg/mL（图 3b）和YPD中的1.28 mg/mL（图3c）。有趣的是，YPD培养基中的生物量（8.17 Log cfu/mL）高于豆渣（8.05 Log cfu/mL）和MRS（8.02 Log cfu/mL）这些数据表明生物量和GABA生产之间没有直接关系，LAB发酵报告了类似的观察结果。尽管豆渣中GABA的产量略低于MRS培养基中的产量，但从经济成本方面来看，豆渣无疑是生产GABA的良好底物。关于大豆中GABA产生的研究很多，但据我们所知，还没有关于以豆渣为底物产生GABA的报道，因此具有不可估量的应用前景。
实施例5 发酵条件对K. marxianus在豆渣培养基中生产GABA的影响
考察初始发酵pH、发酵温度、时间、接菌量、转速和L-Glu添加量对K.marxianus发酵豆渣培养基生产GABA的影响，结果如图4所示。以GABA总量为指标，确定各单因素合适的发酵条件，为产GABA的条件优化提供参考范围，每个试验设置3个平行，分别计算在不同条件下的GABA产量。
（1）当发酵初始pH为5，温度为30℃，转速为120 rpm，发酵时间为60 h，谷氨酸添加量为0.5%时，考察接菌量为0.02%、0.06%、0.1%、0.14%、0.18%对GABA产量的影响。
（2）当发酵初始pH为5，接菌量为0.1%，转速为120 rpm，发酵时间为60 h，谷氨酸添加量为0.5%时，考察温度为20℃、25℃、30℃、35℃、40℃对GABA产量的影响。
（3）当温度为30℃，接菌量为0.1%，转速为120 rpm时，发酵时间为60 h，谷氨酸添加量为0.5%时，考察发酵初始pH为3、3.5、4、4.5、5对GABA产量的影响。
（4）当发酵初始pH为5，温度为30℃，接菌量为0.1%，发酵时间为60 h，谷氨酸添加量为0.5%时，考察转速为60 rpm、90 rpm、120 rpm、150 rpm、180 rpm对GABA产量的影响。
（5）当发酵初始pH为5，温度为30℃，转速为120 rpm，谷氨酸添加量为0.5%，接菌量为0.1%时，考察发酵时间为24 h、48 h、60 h、72 h、96 h对GABA产量的影响。
（6）当发酵初始pH为5，温度为30℃，转速为120 rpm，发酵时间为60 h，接菌量为0.1%时，考察谷氨酸添加量为0.1%、0.3%、0.5%、0.7%、0.9%对GABA产量的影响。
与豆渣中初始pH值（3-5）的不同范围相比，在pH4时产量为3.94 mg/mL（图 4a）。一些研究表明，发酵微生物的GADs最佳pH值范围为pH 3.5-5.0，根据的不同GADs特性而有所不同。在35°C下观察到的GABA产量高于其他温度（20、25、30和40°C），达到3.23 mg/mL（图4b）。这可能与K. marxianus的耐高温特性有关。初始pH值和培养温度是菌株产生 GABA的关键因素，因为它不仅会影响微生物的生长，还会影响GAD活性。
在豆渣中培养K. marxianus发酵60h后，观察到GABA的产量最高（1.09 mg/mL）。随着孵育时间增加到96h，观察到GABA产量降低（图 4c）。可能是由于发酵后期微生物的代谢能力下降，使养分不能继续为微生物细胞的生长提供营养和分泌谷氨酸脱羧酶，也可能是由于微生物产生的相关酶降解了GABA。
接菌量是直接影响发酵液中微生物初始活菌量的因素之一，发酵液中微生物的数量直接影响微生物的生长和代谢，因此有必要测定接种量。它显示GABA浓度随着接种量从0.02%增加到0.14% （m/v）而增加，其中获得了最大的GABA产量（2.73 mg/mL）（图4d）。
转速决定了培养基的氧气流量，而酵母是好氧微生物，因此有必要对转速进行研究。图4e显示GABA浓度随着转速从60 rpm增加到120 rpm增加，获得了最大GABA产量（1.01mg/mL），然后当转速达到180 rpm时GABA产量缓慢降低。
L-Glu旨在通过刺激GAD产生GABA。在含有0.3% L-Glu的豆渣中，K. marxianus观察到GABA浓度增加3.84 mg/mL（图 4f）。L-Glu含量进一步增加至0.9%会抑制GABA的产生，因为高浓度的L-Glu可能会抑制酵母产生GABA的能力。其转化率达到128%，这是由于内源性L-Glu和在酵母发酵过程中由蛋白酶酶促豆渣产生的L-Glu参与了GABA转化。
实施例6K. marxianus在豆渣培养基中生产GABA的发酵条件优化实验
1、单因素试验
通过一系列单因素实验，研究了初始pH、培养温度、孵育时间、接种量、转速和L-Glu添加量6个因素对GABA产量的影响。开始时，将0.5%（m/v）L-Glu添加到豆渣中进行发酵，有效地产生GABA。单因素实验的后续优化条件固定为：初始pH为5，培养温度30°C，孵育时间60h，接种量0.1%（m/v），转速120rpm，L-Glu作为底物其添加量为0.5%（m/v)。为了优化每个单一因素，在以下给定范围内变化一个单一变量，而其他5个变量固定在上述给定值。培养温度在20、25、30、35和40°C下测定；初始pH为3.0、3.5、4.0、4.5和5.0；孵育时间分别为24、48、60、72和96h；L-Glu 的添加量为0.1、0.3、0.5、0.7和1%（m/v）；接种量为0.02、0.06、0.1、0.14和0.18% （m/v）；转速为60、90、120、150 和180rpm。然后，分析了GABA的产量。每个实验重复三次。
2、响应面法（RSM）
通过对单因素试验结果的分析处理，基于Box-Behnken中心组合设计（DTD）进行RSM试验，并根据单因素趋势选择对GABA产量显著影响的参数。在L-Glu添加量为0.3%，接菌量为0.14%，转速为120rpm时，以培养温度、初始pH、培养时间作为DTD实验因素。以GABA的产率作为响应值，设计了3因素3水平的测试方案。因素和水平见表1。
RSM 结果：为了模拟基于单变量优化的发酵过程，初始pH值、培养温度和孵育时间被选为响应面设计中的有效变量，其中初始pH值为4，培养温度为35 °C，和60h孵育时间固定为响应面分析的中心点，如表2所示。
使用Design-Expert 8.0.6软件（Stat-Ease Inc.，Minneapolis，MN，USA）对Box-Behnken实验设计的结果进行二次多元回归拟合，建立了三个多元二次响应面回归模型。GABA产量的重要影响因素，即GABA产量、培养温度和孵育时间。得到的二次回归方程。公式（1）如下：
其中Y代表GABA产量，A代表初始pH值，B代表培养温度，C代表孵育时间。
方差分析结果如表3所示。回归模型的F检验呈现高显着性（P< 0.01），R2为96.52%，表明该模型拟合程度良好。失拟比为0.2308小于0.05，不显著。该设计的Adeq精度为15.846。这表明该模型可用于预测GABA的产量。
R2 = 0.9652
3、最佳工艺参数的RSM分析
使用RSM拟合的线性回归方程绘制分析图，并检查拟合响应面的形状以确定各因素的最佳值。RSM分析图如图5所示。从3D响应面图中可以看出，培养温度、初始pH值和培养时间之间存在良好的交互作用，这三个因素的影响都很显着。通过分析得到的线性回归方程，发现存在一个稳定点，这也是本实验中的最大值点。在偏导数的三个显着影响因素的线性回归方程中，最终结果为培养温度为35 °C，初始pH为4.0，孵育时间为60 h。在这些优化条件下，GABA产量达到最大值4.50 mg/mL。为了验证回归方程的可靠性，进行了实验。考虑到实验的可行性，将培养温度调整为35 °C，发酵时间60 h，初始pH4.0。在此条件下，测得GABA产率为4.31 mg/mL，达到预测值的95.6%，相对误差仅为4.4%，表明所建立的方程模型具有较高的准确性。
对于其他具有GABA生产能力的菌株，GABA的生产能力因底物和菌株而异，例如短乳杆菌TISTR 860发酵红芸豆和大麦仁，GABA产量为4.53 mg/mL。短乳杆菌BJ-20发酵海带提取物产生的GABA量为0.08mg/ml。植物乳杆菌Taj-Apis362在MRS培养基中，GABA产量为0.74 mg/mL。可以看出，K. marxianus发酵豆渣生产GABA在原料选择和产量上更经济、更有前景。
实施例7 葡萄糖、蛋白胨和VB6对GABA产生的影响
许多研究证实培养基中的碳源和氮源对GABA产率以及谷氨酸脱羧酶辅酶如VB6有显着影响。因此，优化后，在添加L-Glu的豆渣培养基中加入2%葡萄糖、1%蛋白胨和0.02%VB6，探讨对GABA产率的影响。发现葡萄糖和VB6都没有进一步促进GABA的产生，而是降低了GABA的产生。令人欣慰的是蛋白胨比对照（以L-Glu为底物的豆渣）高18.6%（图 6），表明充足培养基的氮源对GABA的产生影响最大。
综上，本发明对K. marxianus发酵豆渣生产GABA的可能性进行了探索了。本研究通过单因素实验和响应面方法（RSM）优化K. marxianus生产GABA的发酵工艺条件，以提高豆渣中GABA的产量。结果发现K. marxianus可以将豆渣中的L-Glu和MSG转化为GABA。在优化的发酵条件下，K.marxianus显示出GABA的最高产量（4.31 mg/mL）。此外，证明蛋白胨对GABA产量有显着影响。该研究为GABA的规模化生产提供了良好的基础。如何利用和调控豆渣培养基中的氮源和其他诱导剂，以经济有效的方式进一步提高GABA的产量，值得探索和发展。
Claims (8)
1.一种产γ-氨基丁酸的发酵培养基，按质量分数计，其特征在于；它包括： 0.1~1%L-Glu、10~20%豆渣、0.05~0.2%K. marxianus发酵剂，余量为水。
2.根据权利要求1所述的一种产γ-氨基丁酸的发酵培养基，其特征在于：所述的培养基还包括0.5~2%蛋白胨。
3.根据权利要求2所述的一种产γ-氨基丁酸的发酵培养基，其特征在于：所述的L-Glu含量为0.5%、K. marxianus发酵剂含量为0.1%，蛋白胨含量为1% 。
4.一种γ-氨基丁酸的生产方法，它包括：
1）K. marxianus发酵剂的培养：菌株K. marxianus在MRS培养基中生长，并在28~32°C、100 ~150rpm下摇床培养10~15h；在5000~6000 rpm、 0~4°C下离心3~7分钟；洗涤3次并重悬，冻干，得K. marxianus发酵剂；
2）生产γ-氨基丁酸：按权利要求1所述的一种产γ-氨基丁酸的发酵培养基的成分称取各物质，豆渣、水、L-Glu混合，121°C灭菌20分钟，冷却至室温；接种K. marxianus发酵剂,在32~37℃、转速为100~150rpm下发酵48~72h；在10000~15 000 rpm转速下离心8~12分钟，得上清液，纯化，得γ-氨基丁酸。
5.根据权利要求4所述的一种γ-氨基丁酸的生产方法，其特征在于：步骤2）所述的发酵温度为35℃。
6.根据权利要求5所述的一种γ-氨基丁酸的生产方法，其特征在于：步骤2）所述的发酵转速为120rpm。
7.根据权利要求6所述的一种γ-氨基丁酸的生产方法，其特征在于：步骤2）所述的发酵时间为60h。
8.根据权利要求7所述的一种γ-氨基丁酸的生产方法，其特征在于：所述的发酵的初始pH为5。
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