KR20090004971A - Ｐｕｆａ 폴리케티드 신타제 시스템을 이용한 이종 생물체내 다불포화 지방산의 제조 - Google Patents

Ｐｕｆａ 폴리케티드 신타제 시스템을 이용한 이종 생물체내 다불포화 지방산의 제조 Download PDF

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Abstract

본 발명은 신규 아실-CoA 신테타제 및 신규 아실트랜스퍼라제, 이를 코딩하는 핵산 분자, 재조합 핵산 분자 및 상기 핵산 분자를 포함하는 재조합 숙주 세포, 상기 핵산 분자를 포함하는 유전적으로 개질된 생물체 (미생물 및 식물), 및 이들의 제조 및 사용 방법을 개시한다. 또한, 본 발명은 PUFA의 제조를 위한 PKS-유사 시스템 (PUFA PKS 시스템 또는 PUFA 신타제)를 발현시키도록 유전적으로 개질된 생물체이며, 이 생물체는 아실-CoA 신테타제를 발현시키거나, 아실 트랜스퍼라제를 발현시키거나, 생물체에 의해 발현된 지방산 신타제 (FAS)를 결실시키거나 또는 불활성화하거나, 말로닐 CoA에 대해 PUFA 신타제와 경쟁하는 것을 감소시키거나, 또는 생물체에서 말로닐 CoA의 수준을 증가시키도록 개질되었으며, 한 측면에서 KASII 또는 KASIII을 억제하도록 개질시킨 것인, 유전적으로 개질된 생물체 (예, 식물, 미생물)을 개시한다. 상기 생물체로부터 얻어진 PUFA 및 오일 이외에도 추가의 개질 및 상기 생물체의 생성 및 사용 방법이 그러한 PUFA 및 오일을 포함하는 다양한 생성물과 함께 개시된다.
Figure P1020087025100
아실-CoA 신테타제, 아실트랜스퍼라제, PUFA PKS 시스템, PUFA 신타제.

Description

ＰＵＦＡ 폴리케티드 신타제 시스템을 이용한 이종 생물체내 다불포화 지방산의 제조 {Polyunsaturated Fatty Acid Production in Heterologous Organisms Using PUFA Polyketide Synthase Systems}
본 발명은 일반적으로, 다불포화 지방산 (PUFA)의 제조를 위한 PKS-유사 시스템 (즉, PUFA PKS 시스템 또는 PUFA 신타제)으로 유전적으로 개질된 숙주 생물체에서 다불포화 지방산 (PUFA), 특히 장쇄 PUFA (LCPUFA)의 제조를 향상시키는 부속(accessory) 단백질 및 표적의 용도에 관한 것이다. 본 발명은 또한 이러한 부속 단백질을 발현시키도록 유전적으로 개질되었거나 또는 그러한 표적에 대하여 개질된 생물체 및 이 생물체의 제조 및 사용 방법에 관한 것이다.
다불포화 지방산 (PUFA)은 영양학적 용도, 제약학적 용도, 산업적 용도 및 다른 목적에 유용한 것으로 고려된다. 그러나, 현재 천연 공급원 및 화학적 합성으로부터의 PUFA 공급은 상업적 요구에 있어서 충분치 않다. 오일 종자 작물 유래의 식물성 오일은 상대적으로 저렴하며 어유(fish oil)와 관련된 오염 문제를 갖지 않는다. 그러나, 상업적으로 개발된 식물 오일 중에 존재하는 PUFA는 전형적으로 리놀레산 (탄소수는 18이며 델타 9 및 12 위치에 2개의 이중 결합을 가짐 (18:2 델타 9,12)) 및 리놀렌산 (18:3 델타 9,12,15)으로 한정된다. 리놀레인산 및 리놀렌 산으로부터 포화도가 더 높고 쇄 길이가 더 긴 PUFA를 제조하는 지방산 합성에서는 다수의 별도의 데새투라제(desaturase) 및 엘론가제(elongase) 효소가 필요하다. 따라서, PUFA, 예를 들면 EPA 및 도코사헥사엔산 (DHA)의 발현을 위한 식물 숙주 세포의 조작에서는 합성을 달성하기 위해 여러 별도의 효소를 발현시키는 것이 필요할 수 있다. 추가로, 상기 PUFA를 사용가능한 양으로 제조하기 위해서는 추가의 조작 수행이 필요할 수 있다. 따라서, PUFA의 제조를 위한 대안적인 시스템인 폴리케티드 신타제-유사 시스템의 발견은 "전형적" 또는 "표준" 지방산 합성 경로의 데새투라제 및 엘론가제를 사용해서 식물 또는 다른 생물체 (예, 미생물)를 유전적으로 조작하는 것에 대해 주목할만한 대안을 제공해 왔다.
오일-종자 작물 식물에서 내생적으로-제조된 지방산을 개질시켜 PUFA를 제조하기 위한 많은 노력이 있어 왔다. 지방산 엘론가제 및 데새투라제에 대한 다양한 개별적인 유전자들을 사용해서 상기 식물을 유전적으로 개질시킴으로써 유의한 수준의 PUFA, 예를 들면 EPA를 함유하며 또한 쇄 길이가 더 짧고 포화도가 더 낮은 유의한 수준의 혼합 PUFA를 함유하는 잎(leave) 또는 종자를 생산해 왔다 [Qi et al., Nature Biotech. 22:739 (2004); PCT 공개 제WO 04/071467호; Abbadi et al., Plant Cell 16:1 (2004)); Napier and Sayanova, Proceedings of the Nutrition Society (2005), 64:387?393; Robert et al., Functional Plant Biology (2005) 32:473-479; 또는 미국 특허 출원 공개 제2004/0172682호].
따라서, 오일-종자 식물에서 목적하는 PUFA 중 풍부화된 지질 (예, 트리아실글리세롤 (TAG) 및 인지질 (PL))의 양을 효율적이고 효과적으로 제조하는 방법에 대한 당업계의 요구가 존재한다.
폴리케티드 신타제 (PKS) 시스템은 일반적으로 지방산 신타제 (FAS) 시스템과 관련된 효소 복합체로서 당업계에 공지되어 있지만, 흔히 이를 고도로 개질함으로써 전형적으로는 지방산과 거의 유사하지 않은 특화된 생성물을 제조한다. 그러나, 본 발명에 이르러 폴리케티드 신타제 시스템은 아세틸-CoA 및 말로닐-CoA로부터 다불포화 지방산 (PUFA)을 합성할 수 있는 해양 세균 및 특정 미세조류에 존재하는 것으로 밝혀졌다. 이들 시스템은 본원에서 PUFA PKS 시스템, PUFA의 제조의 제조를 위한 PKS-유사 시스템, 또는 PUFA 신타제 시스템으로 지칭되며, 이들 모두는 본원에서 상호교환가능하게 사용된다.
쉬바넬라(Shewanella) 및 다른 해양 세균, 비브리오 마리누스(Vibrio marinus)에서의 PUFA 합성을 위한 PUFA PKS 경로는 미국 특허 제6,140,486호에 상세히 기재되어 있다. 진핵생물 트라우스토키트리드(Thraustochytrid), 쉬조키트리움(Schizochytrium)에서의 PUFA 합성을 위한 PUFA PKS 경로는 미국 특허 제6,566,583호에 상세히 기재되어 있다. 쉬조키트리움에서의 PUFA PKS 시스템에 대한 추가의 기재 및 트라우스토키트리움(Thraustochytrium)에서의 PUFA PKS 시스템의 동정 (이들 시스템의 사용에 대한 세부사항을 포함함)을 비롯해서 트라우스토키트리알레스(Thraustochytriales)의 구성원과 같은 진핵생물에서의 PUFA 합성을 위한 PUFA PKS 경로는 2002년 12월 19일 공개된 미국 특허 출원 공개 제20020194641호, 2006년 12월 21일 공개된 PCT 공개 제WO 2006/135866호에 상세히 기재되어 있다. 2004년 11월 25일 공개된 미국 특허 출원 공개 제20040235127호는 트라우스토 키트리움에서의 PUFA PKS 시스템에 대한 상세한 구조적 설명, 및 추가로 에이코사펜타엔산 (C20:5, ω-3) (EPA)의 제조 및 상기 시스템을 사용한 다른 PUFA의 제조에 대한 추가의 세부사항을 개시한다. 2005년 5월 12일 공개된 미국 특허 출원 공개 제20050100995호는 쉬바넬라 올레야나(Shewanella olleyana) 및 쉬바넬라 야포니카(Shewanella japonica)에서의 PUFA PKS 시스템의 구조적 및 기능적 설명과 이 시스템의 사용을 개시한다. 상기 간행물들은 또한 PUFA PKS 경로를 포함하는 유전자들을 사용해서 미생물 및 식물을 비롯한 생물체를 유전적으로 개질시키는 것과 이러한 생물체에 의해 PUFA를 제조하는 것에 대하여 개시한다. 또한, PCT 특허 공개 제WO 05/097982호는 울케니아(Ulkenia)에서의 PUFA PKS 시스템을 기재하며, 미국 특허 출원 공개 제20050014231호는 트라우스토키트리움 아우레움(Thraustochytrium aureum) 유래의 PUFA PKS 유전자들 및 단백질을 기재한다. 상기 각각의 간행물은 그 전체 내용이 본원에 참고로 도입된다.
따라서, PUFA 신타제 패밀리 효소의 기본적인 도메인 구조 및 서열 특징들이 기술되어 왔으며, PUFA 신타제 효소는 다양한 PUFA (예, 에이코사펜타엔산 (EPA; C20:5n-3), 도코사헥사엔산 (DHA; 22:6n-3) 및 도코사펜타엔산 (DPAn-6; C22:5n-6)을 드노보(de novo) 합성할 수 있는 것으로 입증되어 왔다. 또한, PUFA 생성물은 숙주 생물체의 인지질 (PL) 중에 축적될 수 있으며, 어떤 경우에는 중성 지질 (예, 트리아실글리세롤 (TAG)) 중에 축적될 수 있는 것으로 입증되어 왔다. 그러나, 본 발명자들이 잘 알고 있는 바와 같이, 상기 효소로부터 표적으로 PUFA를 전달하는 정확한 메카니즘은 본 발명 이전에는 규명된 바 없었다.
생물체에서 PUFA를 표적 목적지로 전달하는 메카니즘은 PUFA를 제조하도록 유전적으로 개질된 생물체에서 PUFA의 제조 효율을 증가시키고/시키거나 상기 제조를 개선하기 위한 것과 관련될 수 있기 때문에, 이러한 메카니즘에 대한 정보에 관하여 당업계의 요구가 존재한다. 따라서, 상기 메카니즘에 대한 지식을 이용해서 PUFA를 제조하도록 유전적으로 개질된 식물 및 미생물에서의 PUFA의 제조를 비롯해서 PUFA를 제조하는 개선된 방법에 대한 당업계의 요구가 또한 존재한다.
본 발명의 개요
본 발명의 한 실시양태는 장쇄 PUFA 무함유 지방산 (FFA)의 아실-CoA로의 전환을 촉매하는 아실-CoA 신테타제(ACoAS)를 코딩하는 핵산 서열을 포함하며, 상기 핵산 서열은 서열 83, 서열 85, 서열 87, 서열 89, 서열 91, 서열 93, 서열 95, 서열 97 및 서열 99로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 ACoAS와 60％ 이상 동일한 아실-CoA 신테타제(ACoAS)를 코딩하는 것인, 단리된 핵산 분자에 관한 것이다. 한 측면에서, 핵산 서열은 서열 83, 서열 85, 서열 87, 서열 89, 서열 91, 서열 93, 서열 95, 서열 97 및 서열 99로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 아실-CoA 신테타제(ACoAS)를 코딩한다. 한 측면에서, 핵산 서열은 서열 83, 서열 85 및 서열 97로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 코딩한다. 한 측면에서, 핵산 서열은 서열 82, 서열 84, 서열 86, 서열 88, 서열 90, 서열 92, 서열 94, 서열 96 및 서열 98로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 발명의 또 다른 실시양태는 인지질 (PL) 또는 트리아실글리세롤 (TAG)을 형성하는데 있어서 기질로서 PUFA-CoA를 이용하는 단백질을 코딩하는 핵산 서열을 포함하며, 상기 단백질은 서열 102, 서열 104, 서열 107, 서열 110 및 서열 113으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열과 60％ 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하는 것인, 단리된 핵산 분자에 관한 것이다. 한 측면에서, 핵산 서열은 서열 102, 서열 104, 서열 107, 서열 110 및 서열 113으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 단백질을 코딩한다. 한 측면에서, 핵산 서열은 서열 102 및 서열 104로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 단백질을 코딩한다. 한 측면에서, 핵산 서열은 서열 100, 서열 102, 서열 103, 서열 105, 서열 106, 서열 108, 서열 109, 서열 111 및 서열 112로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 발명의 다른 실시양태는 상기 기재된 임의의 핵산 분자에 의해 코딩된 단리된 단백질에 관한 것이다.
본 발명의 다른 실시양태는 발현 조절 서열에 작동적으로 연결된 상기 기재된 임의의 핵산 분자를 포함하는 재조합 핵산 분자에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 실시양태는 상기 기재된 임의의 재조합 핵산 분자를 포함하는 재조합 숙주 세포에 관한 것이다. 한 측면에서, 숙주 세포는 미생물이다. 다른 측면에서, 숙주 세포는 식물 세포이다.
본 발명의 다른 실시양태는 상기 기재된 임의의 핵산 분자 또는 이들의 임의의 조합물을 발현시키도록 유전적으로 개질된 것인 유전적으로 개질된 생물체에 관한 것이다. 한 측면에서, 생물체는 PUFA 신타제 및 포스포판테테이닐 트랜스퍼라제 (PPTase)를 발현시킨다. 한 측면에서, 생물체는 신타제 및 PPTase를 발현시키 도록 유전적으로 개질된 것이다. 한 측면에서, 생물체는 그에 의해 발현된 지방산 신타제 (FAS)를 결실시키거나 또는 불활성화하는 추가의 유전적 개질을 함유한다. 한 측면에서, 생물체는 말로닐 CoA에 대해 PUFA 신타제와 경쟁하는 것을 감소시키거나 또는 생물체에서의 말로닐 CoA의 수준을 증가시키는 추가의 유전적 개질을 함유한다.
다른 실시양태는 한가지 이상의 다불포화 지방산 (PUFA)을 제조하는 PUFA 신타제, 및 포스포판테테이닐 트랜스퍼라제 (PPTase)를 발현시키며, 장쇄 PUFA 무함유 지방산 (FFA)의 아실-CoA로의 전환을 촉매하는 하나 이상의 이종 아실-CoA 신테타제(ACoAS) 또는 그의 상동체를 발현시키는 유전적 개질을 함유하는 것인, 유전적으로 개질된 생물체에 관한 것이다. 한 측면에서, 생물체는 PUFA 신타제를 내생적으로 발현시키는 생물체로부터 아실-CoA 신테타제(ACoAS) 또는 그의 상동체를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 핵산 분자로 형질전환시킨다. 한 측면에서, 생물체는 크립테코디니움 코니(Crypthecodinium cohnii) 유래의 아실-CoA 신테타제(ACoAS) 또는 그의 상동체를 코딩하는 핵산 서열을 포함하며, ACoAS 또는 그의 상동체는 장쇄 PUFA 무함유 지방산 (FFA)의 아실-CoA로의 전환을 촉매하는 것인, 핵산 분자로 형질전환시킨다. 한 측면에서, 생물체는 트라우스토키트리알레스 미생물 유래의 아실-CoA 신테타제(ACoAS) 또는 그의 상동체를 코딩하는 핵산 서열을 포함하며, ACoAS 또는 그의 상동체는 장쇄 PUFA 무함유 지방산 (FFA)의 아실-CoA로의 전환을 촉매하는 것인, 핵산 분자로 형질전환시킨다. 한 측면에서, 생물체는 쉬조키트리움 유래의 아실-CoA 신테타제(ACoAS) 또는 그의 상동체를 코딩하는 핵산 서열을 포 함하며, ACoAS 또는 그의 상동체는 장쇄 PUFA 무함유 지방산 (FFA)의 아실-CoA로의 전환을 촉매하는 것인, 핵산 분자로 형질전환시킨다. 한 측면에서, 생물체는 그에 의해 발현된 지방산 신타제 (FAS)를 결실시키거나 또는 불활성화하는 추가의 유전적 개질을 함유한다. 한 측면에서, 생물체는 말로닐 CoA에 대해 PUFA 신타제와 경쟁하는 것을 감소시키거나 또는 생물체에서의 말로닐 CoA의 수준을 증가시키는 추가의 유전적 개질을 함유한다. 한 측면에서, 생물체는 PUFA를 내생적으로 제조하는 생물체 유래의 한가지 이상의 이종 단백질을 발현시키는 추가의 유전적 개질을 함유하며, 상기 단백질은 인지질 (PL) 또는 트리아실글리세롤 (TAG)을 형성하는데 있어서 기질로서 PUFA-CoA를 이용한다.
다른 실시양태는 한가지 이상의 다불포화 지방산 (PUFA)을 제조하는 PUFA 신타제, 및 포스포판테테이닐 트랜스퍼라제 (PPTase)를 발현시키는 생물체이며, 이 생물체는 그에 의해 발현된 지방산 신타제 (FAS)를 결실시키거나 또는 불활성화하는 유전적 개질을 함유하는 것인, 유전적으로 개질된 생물체에 관한 것이다. 한 측면에서, 생물체는 말로닐 CoA에 대해 PUFA 신타제와 경쟁하는 것을 감소시키거나 또는 생물체에서의 말로닐 CoA의 수준을 증가시키는 추가의 유전적 개질을 함유한다.
다른 실시양태는 한가지 이상의 다불포화 지방산 (PUFA)을 제조하는 PUFA 신타제, 및 포스포판테테이닐 트랜스퍼라제 (PPTase)를 발현시키는 생물체이며, 이 생물체는 말로닐 CoA에 대해 PUFA 신타제와 경쟁하는 것을 감소시키거나 또는 생물체에서의 말로닐 CoA의 수준을 증가시키는 유전적 개질을 함유하는 것인, 유전적으 로 개질된 생물체에 관한 것이다. 한 측면에서, 생물체는 그에 의해 발현된 지방산 신타제 (FAS)를 결실시키거나 또는 불활성화하는 추가의 유전적 개질을 함유한다.
또 다른 실시양태는 한가지 이상의 다불포화 지방산 (PUFA)을 제조하는 PUFA 신타제, 및 포스포판테테이닐 트랜스퍼라제 (PPTase)를 발현시키는 생물체이며, 이 생물체는 PUFA를 내생적으로 제조하는 생물체 유래의 한가지 이상의 이종 단백질을 발현시키는 유전적 개질을 함유하고, 상기 단백질은 인지질 (PL) 또는 트리아실글리세롤 (TAG)을 형성하는데 있어서 기질로서 PUFA-CoA를 이용하는 것인, 유전적으로 개질된 생물체에 관한 것이다. 한 측면에서, 단백질은 DAGAT 또는 LPAAT이다. 한 측면에서, 생물체는 인지질 (PL) 또는 트리아실글리세롤 (TAG)을 형성하는데 있어서 기질로서 PUFA-CoA를 이용하는 트라우스토키트리드 또는 라비린툴리드(Labyrinthulid) 유래의 단백질을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 핵산 분자로 형질전환시킨다. 한 측면에서, 생물체는 인지질 (PL) 또는 트리아실글리세롤 (TAG)을 형성하는데 있어서 기질로서 PUFA-CoA를 이용하는 쉬조키트리움 유래의 단백질을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 핵산 분자로 형질전환시킨다. 한 측면에서, 생물체는 장쇄 PUFA 무함유 지방산 (FFA)의 아실-CoA로의 전환을 촉매하는 하나 이상의 이종 아실-CoA 신테타제(ACoAS) 또는 그의 상동체를 발현시키는 추가의 개질물을 포함한다. 한 측면에서, 생물체는 그에 의해 발현된 지방산 신타제 (FAS)를 결실시키거나 또는 불활성화하는 추가의 유전적 개질을 함유한다. 한 측면에서, 생물체는 말로닐 CoA에 대해 PUFA 신타제와 경쟁하는 것을 감소시키거나 또는 생물체에서의 말로닐 CoA의 수준을 증가시키는 추가의 유전적 개질을 함유한다.
한 실시양태에서, 본 발명은 한가지 이상의 다불포화 지방산 (PUFA)을 제조하는 PUFA 신타제, 및 포스포판테테이닐 트랜스퍼라제 (PPTase)로 유전적으로 개질되었으며, KASII 및 KASIII으로 이루어진 군으로부터 선택된 단백질의 발현 또는 활성을 억제하는 유전적 개질을 함유하는, 유전적으로 개질된 생물체 (미생물, 식물, 식물의 부분 또는 식물 세포를 포함함)를 제공한다.
다른 실시양태에서, 본 발명은 한가지 이상의 다불포화 지방산 (PUFA)을 제조하는 PUFA 신타제, 및 포스포판테테이닐 트랜스퍼라제 (PPTase)로 유전적으로 개질된 생물체이며, PUFA 신타제 또는 PPTase를 코딩하는 하나 이상의 핵산 분자가 서열 81에 나타낸 색소체-표적화 서열을 코딩하는 핵산 서열에 작동적으로 연결된 것인, 유전적으로 개질된 생물체 (미생물, 식물, 식물의 부분 또는 식물 세포를 포함함)를 제공한다.
추가의 실시양태에서, 본 발명은 한가지 이상의 다불포화 지방산 (PUFA)을 제조하는 PUFA 신타제, 및 포스포판테테이닐 트랜스퍼라제 (PPTase)로 유전적으로 개질되었고, KASII 및 KASIII으로 이루어진 군으로부터 선택된 단백질의 발현 또는 활성을 억제하는 유전적 개질을 함유하며, 장쇄 PUFA 무함유 지방산 (FFA)의 아실-CoA로의 전환을 촉매하는 하나 이상의 이종 아실-CoA 신테타제(ACoAS) 또는 그의 상동체를 발현시키는 추가의 유전적 개질을 함유하는, 유전적으로 개질된 생물체 (미생물, 식물, 식물의 부분 또는 식물 세포를 포함함)를 제공한다.
다른 추가의 실시양태에서, 본 발명은 한가지 이상의 다불포화 지방산 (PUFA)을 제조하는 PUFA 신타제, 및 포스포판테테이닐 트랜스퍼라제 (PPTase)로 유전적으로 개질된 생물체이며, PUFA 신타제 또는 PPTase를 코딩하는 하나 이상의 핵산 분자가 서열 81에 나타낸 것을 포함하지만 이에 한정되지 않는 색소체-표적화 서열을 코딩하는 핵산 서열에 작동적으로 연결되어 있거나, 또는 생물체가 장쇄 PUFA 무함유 지방산 (FFA)의 아실-CoA로의 전환을 촉매하는 하나 이상의 이종 아실-CoA 신테타제(ACoAS) 또는 그의 상동체를 발현시키는 추가의 유전적 개질을 함유하는 것인, 유전적으로 개질된 생물체 (미생물, 식물, 식물의 부분 또는 식물 세포를 포함함)를 제공한다.
한 실시양태에서, 본 발명은 한가지 이상의 다불포화 지방산 (PUFA)을 제조하는 PUFA 신타제, 및 포스포판테테이닐 트랜스퍼라제 (PPTase)로 유전적으로 개질되었고, 단백질, 예를 들어 KASII 및 KASIII으로 이루어진 군으로부터 선택된 단백질의 발현 또는 활성을 억제하는 유전적 개질을 함유하며, PUFA를 내생적으로 제조하는 생물체 유래의 한가지 이상의 이종 단백질을 발현시키는 추가의 유전적 개질을 함유하는 생물체이며, 상기 단백질은 인지질 (PL) 또는 트리아실글리세롤 (TAG)을 형성하는데 있어서 기질로서 PUFA-CoA를 이용하는 것인, 유전적으로 개질된 생물체 (미생물, 식물, 식물의 부분 또는 식물 세포를 포함함)를 제공한다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명은 한가지 이상의 다불포화 지방산 (PUFA)을 제조하는 PUFA 신타제, 및 포스포판테테이닐 트랜스퍼라제 (PPTase)로 유전적으로 개질되었고, 단백질, 예를 들어 KASII 및 KASIII으로 이루어진 군으로부터 선택된 단백질의 발현 또는 활성을 억제하는 유전적 개질을 함유하며, PUFA를 내생적으로 제조하는 생물체 유래의 한가지 이상의 이종 단백질을 발현시키는 추가의 유전적 개질을 함유하는 생물체이며, 상기 단백질은 인지질 (PL) 또는 트리아실글리세롤 (TAG)을 형성하는데 있어서 기질로서 PUFA-CoA를 이용하며, 생물체는 장쇄 PUFA 무함유 지방산 (FFA)의 아실-CoA로의 전환을 촉매하는 하나 이상의 이종 아실-CoA 신테타제(ACoAS) 또는 그의 상동체를 발현시키는 추가의 유전적 개질을 함유하는 것인, 유전적으로 개질된 생물체 (미생물, 식물, 식물의 부분 또는 식물 세포를 포함함)를 제공한다.
다른 실시양태에서, 본 발명은 한가지 이상의 다불포화 지방산 (PUFA)을 제조하는 PUFA 신타제, 및 포스포판테테이닐 트랜스퍼라제 (PPTase)로 유전적으로 개질된 생물체이며, PUFA 신타제 또는 PPTase를 코딩하는 하나 이상의 핵산 분자가 서열 81에 나타낸 것을 포함하지만 이에 한정되지 않는 색소체-표적화 서열을 코딩하는 핵산 서열에 작동적으로 연결되어 있고, 생물체는 PUFA를 내생적으로 제조하는 생물체 유래의 한가지 이상의 이종 단백질을 발현시키는 추가의 유전적 개질을 함유하며, 상기 단백질은 인지질 (PL) 또는 트리아실글리세롤 (TAG)을 형성하는데 있어서 기질로서 PUFA-CoA를 이용하는 것인, 유전적으로 개질된 생물체 (미생물, 식물, 식물의 부분 또는 식물 세포를 포함함)를 제공한다.
다른 실시양태에서, 본 발명은 한가지 이상의 다불포화 지방산 (PUFA)을 제조하는 PUFA 신타제, 및 포스포판테테이닐 트랜스퍼라제 (PPTase)로 유전적으로 개질된 생물체이며, PUFA 신타제 또는 PPTase를 코딩하는 하나 이상의 핵산 분자가 서열 81에 나타낸 것을 포함하지만 이에 한정되지 않는 색소체-표적화 서열을 코딩하는 핵산 서열에 작동적으로 연결되어 있고, 생물체는 PUFA를 내생적으로 제조하는 생물체 유래의 한가지 이상의 이종 단백질을 발현시키는 추가의 유전적 개질을 함유하며, 상기 단백질은 인지질 (PL) 또는 트리아실글리세롤 (TAG)을 형성하는데 있어서 기질로서 PUFA-CoA를 이용하고, 생물체는 장쇄 PUFA 무함유 지방산 (FFA)의 아실-CoA로의 전환을 촉매하는 하나 이상의 이종 아실-CoA 신테타제(ACoAS) 또는 그의 상동체를 발현시키는 추가의 유전적 개질을 함유하는 것인, 유전적으로 개질된 생물체 (미생물, 식물, 식물의 부분 또는 식물 세포를 포함함)를 제공한다.
한 실시양태에서, 본 발명은 한가지 이상의 다불포화 지방산 (PUFA)을 제조하는 PUFA 신타제, 및 포스포판테테이닐 트랜스퍼라제 (PPTase)로 유전적으로 개질되었고, 단백질, 예를 들어 KASII 및 KASIII으로 이루어진 군으로부터 선택된 단백질의 발현 또는 활성을 억제하는 유전적 개질을 함유하는 생물체이며, 이 생물체는 내생성 지방산 신타제 (FAS) 또는 생물체에 의해 발현된 FAS와 관련된 단백질을 결실시키거나 또는 불활성화하는 추가의 유전적 개질을 포함하는 것인, 유전적으로 개질된 생물체 (미생물, 식물, 식물의 부분 또는 식물 세포를 포함함)를 제공한다.
한 실시양태에서, 본 발명은 한가지 이상의 다불포화 지방산 (PUFA)을 제조하는 PUFA 신타제, 및 포스포판테테이닐 트랜스퍼라제 (PPTase)로 유전적으로 개질되었고, 단백질, 예를 들어 KASII 및 KASIII으로 이루어진 군으로부터 선택된 단백질의 발현 또는 활성을 억제하는 유전적 개질을 함유하는 생물체이며, 이 생물체는 내생성 지방산 신타제 (FAS) 또는 생물체에 의해 발현된 FAS와 관련된 단백질을 결 실시키거나 또는 불활성화하는 추가의 유전적 개질을 포함하고, 장쇄 PUFA 무함유 지방산 (FFA)의 아실-CoA로의 전환을 촉매하는 하나 이상의 이종 아실-CoA 신테타제(ACoAS) 또는 그의 상동체를 발현시키는 추가의 유전적 개질을 함유하는 것인, 유전적으로 개질된 생물체 (미생물, 식물, 식물의 부분 또는 식물 세포를 포함함)를 제공한다.
한 실시양태에서, 본 발명은 한가지 이상의 다불포화 지방산 (PUFA)을 제조하는 PUFA 신타제, 및 포스포판테테이닐 트랜스퍼라제 (PPTase)로 유전적으로 개질되었고, 단백질, 예를 들어 KASII 및 KASIII으로 이루어진 군으로부터 선택된 단백질의 발현 또는 활성을 억제하는 유전적 개질을 함유하는 생물체이며, 이 생물체는 내생성 지방산 신타제 (FAS) 또는 생물체에 의해 발현된 FAS와 관련된 단백질을 결실시키거나 또는 불활성화하는 추가의 유전적 개질을 포함하고, PUFA를 내생적으로 제조하는 생물체 유래의 한가지 이상의 이종 단백질을 발현시키는 추가의 유전적 개질을 함유하며, 상기 단백질은 인지질 (PL) 또는 트리아실글리세롤 (TAG)을 형성하는데 있어서 기질로서 PUFA-CoA를 이용하는 것인, 유전적으로 개질된 생물체 (미생물, 식물, 식물의 부분 또는 식물 세포를 포함함)를 제공한다.
한 실시양태에서, 본 발명은 한가지 이상의 다불포화 지방산 (PUFA)을 제조하는 PUFA 신타제, 및 포스포판테테이닐 트랜스퍼라제 (PPTase)로 유전적으로 개질되었고, 단백질, 예를 들어 KASII 및 KASIII으로 이루어진 군으로부터 선택된 단백질의 발현 또는 활성을 억제하는 유전적 개질을 함유하는 생물체이며, 이 생물체는 내생성 지방산 신타제 (FAS) 또는 생물체에 의해 발현된 FAS와 관련된 단백질을 결 실시키거나 또는 불활성화하는 추가의 유전적 개질을 포함하고, 장쇄 PUFA 무함유 지방산 (FFA)의 아실-CoA로의 전환을 촉매하는 하나 이상의 이종 아실-CoA 신테타제(ACoAS) 또는 그의 상동체를 발현시키는 추가의 유전적 개질을 함유하고, PUFA를 내생적으로 제조하는 생물체 유래의 한가지 이상의 이종 단백질을 발현시키는 추가의 유전적 개질을 함유하며, 상기 단백질은 인지질 (PL) 또는 트리아실글리세롤 (TAG)을 형성하는데 있어서 기질로서 PUFA-CoA를 이용하는 것인, 유전적으로 개질된 생물체 (미생물, 식물, 식물의 부분 또는 식물 세포를 포함함)를 제공한다. 다른 실시양태에서, 본 발명은 한가지 이상의 다불포화 지방산 (PUFA)을 제조하는 PUFA 신타제, 및 포스포판테테이닐 트랜스퍼라제 (PPTase)로 유전적으로 개질된 생물체이며, PUFA 신타제 또는 PPTase를 코딩하는 하나 이상의 핵산 분자가 서열 81로 나타낸 것을 포함하지만 이에 한정되지 않는 색소체-표적화 서열을 코딩하는 핵산 서열에 작동적으로 연결되어 있고, 생물체는 내생성 지방산 신타제 (FAS) 또는 생물체에 의해 발현된 FAS와 관련된 단백질을 결실시키거나 또는 불활성화하는 추가의 유전적 개질을 포함하는 것인, 유전적으로 개질된 생물체 (미생물, 식물, 식물의 부분 또는 식물 세포를 포함함)를 제공한다.
다른 실시양태에서, 본 발명은 한가지 이상의 다불포화 지방산 (PUFA)을 제조하는 PUFA 신타제, 및 포스포판테테이닐 트랜스퍼라제 (PPTase)로 유전적으로 개질되었고, PUFA 신타제 또는 PPTase를 코딩하는 하나 이상의 핵산 분자가 서열 81로 나타낸 것을 포함하지만 이에 한정되지 않는 색소체-표적화 서열을 코딩하는 핵산 서열에 작동적으로 연결되어 있고, 생물체는 내생성 지방산 신타제 (FAS) 또는 생물체에 의해 발현된 FAS와 관련된 단백질을 결실시키거나 또는 불활성화하는 추가의 유전적 개질을 포함하며, 장쇄 PUFA 무함유 지방산 (FFA)의 아실-CoA로의 전환을 촉매하는 하나 이상의 이종 아실-CoA 신테타제(ACoAS) 또는 그의 상동체를 발현시키는 추가의 유전적 개질을 함유하는 것인, 유전적으로 개질된 생물체 (미생물, 식물, 식물의 부분 또는 식물 세포를 포함함)를 제공한다.
다른 실시양태에서, 본 발명은 한가지 이상의 다불포화 지방산 (PUFA)을 제조하는 PUFA 신타제, 및 포스포판테테이닐 트랜스퍼라제 (PPTase)로 유전적으로 개질된 생물체이며, PUFA 신타제 또는 PPTase를 코딩하는 하나 이상의 핵산 분자가 서열 81로 나타낸 것을 포함하지만 이에 한정되지 않는 색소체-표적화 서열을 코딩하는 핵산 서열에 작동적으로 연결되어 있고, 생물체는 내생성 지방산 신타제 (FAS) 또는 생물체에 의해 발현된 FAS와 관련된 단백질을 결실시키거나 또는 불활성화하는 추가의 유전적 개질을 포함하고, PUFA를 내생적으로 제조하는 생물체 유래의 한가지 이상의 이종 단백질을 발현시키는 추가의 유전적 개질을 함유하며, 상기 단백질은 인지질 (PL) 또는 트리아실글리세롤 (TAG)을 형성하는데 있어서 기질로서 PUFA-CoA를 이용하는 것인, 유전적으로 개질된 생물체 (미생물, 식물, 식물의 부분 또는 식물 세포를 포함함)를 제공한다.
다른 실시양태에서, 본 발명은 한가지 이상의 다불포화 지방산 (PUFA)을 제조하는 PUFA 신타제, 및 포스포판테테이닐 트랜스퍼라제 (PPTase)로 유전적으로 개질된 생물체이며, PUFA 신타제 또는 PPTase를 코딩하는 하나 이상의 핵산 분자가 서열 81로 나타낸 것을 포함하지만 이에 한정되지 않는 색소체-표적화 서열을 코딩 하는 핵산 서열에 작동적으로 연결되어 있고, 생물체는 내생성 지방산 신타제 (FAS) 또는 생물체에 의해 발현된 FAS와 관련된 단백질을 결실시키거나 또는 불활성화하는 추가의 유전적 개질을 포함하고, 장쇄 PUFA 무함유 지방산 (FFA)의 아실-CoA로의 전환을 촉매하는 하나 이상의 이종 아실-CoA 신테타제(ACoAS) 또는 그의 상동체를 발현시키는 추가의 유전적 개질을 함유하고, PUFA를 내생적으로 제조하는 생물체 유래의 한가지 이상의 이종 단백질을 발현시키는 추가의 유전적 개질을 함유하며, 상기 단백질은 인지질 (PL) 또는 트리아실글리세롤 (TAG)을 형성하는데 있어서 기질로서 PUFA-CoA를 이용하는 것인, 유전적으로 개질된 생물체 (미생물, 식물, 식물의 부분 또는 식물 세포를 포함함)를 제공한다.
한 실시양태에서, 본 발명은 한가지 이상의 다불포화 지방산 (PUFA)을 제조하는 PUFA 신타제, 및 포스포판테테이닐 트랜스퍼라제 (PPTase)로 유전적으로 개질되었고, 단백질, 예를 들어 KASII 및 KASIII으로 이루어진 군으로부터 선택된 단백질의 발현 또는 활성을 억제하는 유전적 개질을 함유하는 생물체이며, 이 생물체는 말로닐 CoA에 대해 PUFA 신타제와 경쟁하는 것을 감소시키거나 또는 생물체내의 말로닐 CoA의 수준을 증가시키는 추가의 유전적 개질을 포함하는 것인, 유전적으로 개질된 생물체 (미생물, 식물, 식물의 부분 또는 식물 세포를 포함함)를 제공한다.
한 실시양태에서, 본 발명은 한가지 이상의 다불포화 지방산 (PUFA)을 제조하는 PUFA 신타제, 및 포스포판테테이닐 트랜스퍼라제 (PPTase)로 유전적으로 개질되었고, 단백질, 예를 들어 KASII 및 KASIII으로 이루어진 군으로부터 선택된 단백질의 발현 또는 활성을 억제하는 유전적 개질을 함유하는 생물체이며, 이 생물체는 말로닐 CoA에 대해 PUFA 신타제와 경쟁하는 것을 감소시키거나 또는 생물체내의 말로닐 CoA의 수준을 증가시키는 추가의 유전적 개질을 포함하고, 장쇄 PUFA 무함유 지방산 (FFA)의 아실-CoA로의 전환을 촉매하는 하나 이상의 이종 아실-CoA 신테타제(ACoAS) 또는 그의 상동체를 발현시키는 추가의 유전적 개질을 함유하는 것인, 유전적으로 개질된 생물체 (미생물, 식물, 식물의 부분 또는 식물 세포를 포함함)를 제공한다.
한 실시양태에서, 본 발명은 한가지 이상의 다불포화 지방산 (PUFA)을 제조하는 PUFA 신타제, 및 포스포판테테이닐 트랜스퍼라제 (PPTase)로 유전적으로 개질되었고, 단백질, 예를 들어 KASII 및 KASIII으로 이루어진 군으로부터 선택된 단백질의 발현 또는 활성을 억제하는 유전적 개질을 함유하는 생물체이며, 이 생물체는 말로닐 CoA에 대해 PUFA 신타제와 경쟁하는 것을 감소시키거나 또는 생물체내의 말로닐 CoA의 수준을 증가시키는 추가의 유전적 개질을 포함하고, PUFA를 내생적으로 제조하는 생물체 유래의 한가지 이상의 이종 단백질을 발현시키는 추가의 유전적 개질을 함유하며, 상기 단백질은 인지질 (PL) 또는 트리아실글리세롤 (TAG)을 형성하는데 있어서 기질로서 PUFA-CoA를 이용하는 것인, 유전적으로 개질된 생물체 (미생물, 식물, 식물의 부분 또는 식물 세포를 포함함)를 제공한다.
한 실시양태에서, 본 발명은 한가지 이상의 다불포화 지방산 (PUFA)을 제조하는 PUFA 신타제, 및 포스포판테테이닐 트랜스퍼라제 (PPTase)로 유전적으로 개질되었고, 단백질, 예를 들어 KASII 및 KASIII으로 이루어진 군으로부터 선택된 단백질의 발현 또는 활성을 억제하는 유전적 개질을 함유하는 생물체이며, 이 생물체는 말로닐 CoA에 대해 PUFA 신타제와 경쟁하는 것을 감소시키거나 또는 생물체내의 말로닐 CoA의 수준을 증가시키는 추가의 유전적 개질을 포함하고, 내생성 지방산 신타제 (FAS) 또는 생물체에 의해 발현된 FAS와 관련된 단백질을 결실시키거나 또는 불활성화하는 추가의 유전적 개질을 포함하는 것인, 유전적으로 개질된 생물체 (미생물, 식물, 식물의 부분 또는 식물 세포를 포함함)를 제공한다.
한 실시양태에서, 본 발명은 한가지 이상의 다불포화 지방산 (PUFA)을 제조하는 PUFA 신타제, 및 포스포판테테이닐 트랜스퍼라제 (PPTase)로 유전적으로 개질되었고, 단백질, 예를 들어 KASII 및 KASIII으로 이루어진 군으로부터 선택된 단백질의 발현 또는 활성을 억제하는 유전적 개질을 함유하는 생물체이며, 이 생물체는 말로닐 CoA에 대해 PUFA 신타제와 경쟁하는 것을 감소시키거나 또는 생물체내의 말로닐 CoA의 수준을 증가시키는 추가의 유전적 개질을 포함하고, 장쇄 PUFA 무함유 지방산 (FFA)의 아실-CoA로의 전환을 촉매하는 하나 이상의 이종 아실-CoA 신테타제(ACoAS) 또는 그의 상동체를 발현시키는 추가의 유전적 개질을 함유하고, PUFA를 내생적으로 제조하는 생물체 유래의 한가지 이상의 이종 단백질을 발현시키는 추가의 유전적 개질을 함유하며, 상기 단백질은 인지질 (PL) 또는 트리아실글리세롤 (TAG)을 형성하는데 있어서 기질로서 PUFA-CoA를 이용하는 것인, 유전적으로 개질된 생물체 (미생물, 식물, 식물의 부분 또는 식물 세포를 포함함)를 제공한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 한가지 이상의 다불포화 지방산 (PUFA)을 제조하는 PUFA 신타제, 및 포스포판테테이닐 트랜스퍼라제 (PPTase)로 유전적으로 개질되었고, 단백질, 예를 들어 KASII 및 KASIII으로 이루어진 군으로부터 선택된 단백질의 발현 또는 활성을 억제하는 유전적 개질을 함유하는 생물체이며, 이 생물체는 말로닐 CoA에 대해 PUFA 신타제와 경쟁하는 것을 감소시키거나 또는 생물체내의 말로닐 CoA의 수준을 증가시키는 추가의 유전적 개질을 포함하고, 장쇄 PUFA 무함유 지방산 (FFA)의 아실-CoA로의 전환을 촉매하는 하나 이상의 이종 아실-CoA 신테타제(ACoAS) 또는 그의 상동체를 발현시키는 추가의 유전적 개질을 함유하며, 내생성 지방산 신타제 (FAS) 또는 생물체에 의해 발현된 FAS와 관련된 단백질을 결실시키거나 또는 불활성화하는 추가의 유전적 개질을 포함하는 것인, 유전적으로 개질된 생물체 (미생물, 식물, 식물의 부분 또는 식물 세포를 포함함)를 제공한다.
한 실시양태에서, 본 발명은 한가지 이상의 다불포화 지방산 (PUFA)을 제조하는 PUFA 신타제, 및 포스포판테테이닐 트랜스퍼라제 (PPTase)로 유전적으로 개질되었고, 단백질, 예를 들어 KASII 및 KASIII으로 이루어진 군으로부터 선택된 단백질의 발현 또는 활성을 억제하는 유전적 개질을 함유하는 생물체이며, 이 생물체는 말로닐 CoA에 대해 PUFA 신타제와 경쟁하는 것을 감소시키거나 또는 생물체내의 말로닐 CoA의 수준을 증가시키는 추가의 유전적 개질을 포함하고, PUFA를 내생적으로 제조하는 생물체 유래의 한가지 이상의 이종 단백질을 발현시키는 추가의 유전적 개질을 함유하며, 상기 단백질은 인지질 (PL) 또는 트리아실글리세롤 (TAG)을 형성하는데 있어서 기질로서 PUFA-CoA를 이용하고, 생물체는 내생성 지방산 신타제 (FAS) 또는 생물체에 의해 발현된 FAS와 관련된 단백질을 결실시키거나 또는 불활성화하는 추가의 유전적 개질을 포함하는 것인, 유전적으로 개질된 생물체 (미생물, 식물, 식물의 부분 또는 식물 세포를 포함함)를 제공한다.
한 실시양태에서, 본 발명은 한가지 이상의 다불포화 지방산 (PUFA)을 제조하는 PUFA 신타제, 및 포스포판테테이닐 트랜스퍼라제 (PPTase)로 유전적으로 개질되었고, 단백질, 예를 들어 KASII 및 KASIII으로 이루어진 군으로부터 선택된 단백질의 발현 또는 활성을 억제하는 유전적 개질을 함유하는 생물체이며, 이 생물체는 말로닐 CoA에 대해 PUFA 신타제와 경쟁하는 것을 감소시키거나 또는 생물체내의 말로닐 CoA의 수준을 증가시키는 추가의 유전적 개질을 포함하고, 장쇄 PUFA 무함유 지방산 (FFA)의 아실-CoA로의 전환을 촉매하는 하나 이상의 이종 아실-CoA 신테타제(ACoAS) 또는 그의 상동체를 발현시키는 추가의 유전적 개질을 함유하고, PUFA를 내생적으로 제조하는 생물체 유래의 한가지 이상의 이종 단백질을 발현시키는 추가의 유전적 개질을 함유하며, 상기 단백질은 인지질 (PL) 또는 트리아실글리세롤 (TAG)을 형성하는데 있어서 기질로서 PUFA-CoA를 이용하고, 생물체는 내생성 지방산 신타제 (FAS) 또는 생물체에 의해 발현된 FAS와 관련된 단백질을 결실시키거나 또는 불활성화하는 추가의 유전적 개질을 포함하는 것인, 유전적으로 개질된 생물체 (미생물, 식물, 식물의 부분 또는 식물 세포를 포함함)를 제공한다.
다른 실시양태에서, 본 발명은 한가지 이상의 다불포화 지방산 (PUFA)을 제조하는 PUFA 신타제, 및 포스포판테테이닐 트랜스퍼라제 (PPTase)로 유전적으로 개질된 생물체이며, PUFA 신타제 또는 PPTase를 코딩하는 하나 이상의 핵산 분자가 서열 81에 나타낸 것을 포함하지만 이에 한정되지 않는 색소체-표적화 서열을 코딩하는 핵산 서열에 작동적으로 연결되어 있고, 생물체는 말로닐 CoA에 대해 PUFA 신타제와 경쟁하는 것을 감소시키거나 또는 생물체내의 말로닐 CoA의 수준을 증가시 키는 추가의 유전적 개질을 포함하는 것인, 유전적으로 개질된 생물체 (미생물, 식물, 식물의 부분 또는 식물 세포를 포함함)를 제공한다.
다른 실시양태에서, 본 발명은 한가지 이상의 다불포화 지방산 (PUFA)을 제조하는 PUFA 신타제, 및 포스포판테테이닐 트랜스퍼라제 (PPTase)로 유전적으로 개질된 생물체이며, PUFA 신타제 또는 PPTase를 코딩하는 하나 이상의 핵산 분자가 서열 81에 나타낸 것을 포함하지만 이에 한정되지 않는 색소체-표적화 서열을 코딩하는 핵산 서열에 작동적으로 연결되어 있고, 생물체는 말로닐 CoA에 대해 PUFA 신타제와 경쟁하는 것을 감소시키거나 또는 생물체내의 말로닐 CoA의 수준을 증가시키는 추가의 유전적 개질을 포함하며, 장쇄 PUFA 무함유 지방산 (FFA)의 아실-CoA로의 전환을 촉매하는 하나 이상의 이종 아실-CoA 신테타제(ACoAS) 또는 그의 상동체를 발현시키는 추가의 유전적 개질을 함유하는 것인, 유전적으로 개질된 생물체 (미생물, 식물, 식물의 부분 또는 식물 세포를 포함함)를 제공한다.
다른 실시양태에서, 본 발명은 한가지 이상의 다불포화 지방산 (PUFA)을 제조하는 PUFA 신타제, 및 포스포판테테이닐 트랜스퍼라제 (PPTase)로 유전적으로 개질된 생물체이며, PUFA 신타제 또는 PPTase를 코딩하는 하나 이상의 핵산 분자가 서열 81에 나타낸 것을 포함하지만 이에 한정되지 않는 색소체-표적화 서열을 코딩하는 핵산 서열에 작동적으로 연결되어 있고, 생물체는 말로닐 CoA에 대해 PUFA 신타제와 경쟁하는 것을 감소시키거나 또는 생물체내의 말로닐 CoA의 수준을 증가시키는 추가의 유전적 개질을 포함하고, PUFA를 내생적으로 제조하는 생물체 유래의 한가지 이상의 이종 단백질을 발현시키는 추가의 유전적 개질을 함유하며, 상기 단 백질은 인지질 (PL) 또는 트리아실글리세롤 (TAG)을 형성하는데 있어서 기질로서 PUFA-CoA를 이용하는 것인, 유전적으로 개질된 생물체 (미생물, 식물, 식물의 부분 또는 식물 세포를 포함함)를 제공한다.
다른 실시양태에서, 본 발명은 한가지 이상의 다불포화 지방산 (PUFA)을 제조하는 PUFA 신타제, 및 포스포판테테이닐 트랜스퍼라제 (PPTase)로 유전적으로 개질된 생물체이며, PUFA 신타제 또는 PPTase를 코딩하는 하나 이상의 핵산 분자가 서열 81에 나타낸 것을 포함하지만 이에 한정되지 않는 색소체-표적화 서열을 코딩하는 핵산 서열에 작동적으로 연결되어 있고, 생물체는 말로닐 CoA에 대해 PUFA 신타제와 경쟁하는 것을 감소시키거나 또는 생물체내의 말로닐 CoA의 수준을 증가시키는 추가의 유전적 개질을 포함하며, 내생성 지방산 신타제 (FAS) 또는 생물체에 의해 발현된 FAS와 관련된 단백질을 결실시키거나 또는 불활성화하는 추가의 유전적 개질을 포함하는 것인, 유전적으로 개질된 생물체 (미생물, 식물, 식물의 부분 또는 식물 세포를 포함함)를 제공한다.
다른 실시양태에서, 본 발명은 한가지 이상의 다불포화 지방산 (PUFA)을 제조하는 PUFA 신타제, 및 포스포판테테이닐 트랜스퍼라제 (PPTase)로 유전적으로 개질된 생물체이며, PUFA 신타제 또는 PPTase를 코딩하는 하나 이상의 핵산 분자가 서열 81에 나타낸 것을 포함하지만 이에 한정되지 않는 색소체-표적화 서열을 코딩하는 핵산 서열에 작동적으로 연결되어 있고, 생물체는 말로닐 CoA에 대해 PUFA 신타제와 경쟁하는 것을 감소시키거나 또는 생물체내의 말로닐 CoA의 수준을 증가시키는 추가의 유전적 개질을 포함하고, 장쇄 PUFA 무함유 지방산 (FFA)의 아실-CoA 로의 전환을 촉매하는 하나 이상의 이종 아실-CoA 신테타제(ACoAS) 또는 그의 상동체를 발현시키는 추가의 유전적 개질을 함유하고, PUFA를 내생적으로 제조하는 생물체 유래의 한가지 이상의 이종 단백질을 발현시키는 추가의 유전적 개질을 함유하며, 상기 단백질은 인지질 (PL) 또는 트리아실글리세롤 (TAG)을 형성하는데 있어서 기질로서 PUFA-CoA를 이용하는 것인, 유전적으로 개질된 생물체 (미생물, 식물, 식물의 부분 또는 식물 세포를 포함함)를 제공한다.
다른 실시양태에서, 본 발명은 한가지 이상의 다불포화 지방산 (PUFA)을 제조하는 PUFA 신타제, 및 포스포판테테이닐 트랜스퍼라제 (PPTase)로 유전적으로 개질된 생물체이며, PUFA 신타제 또는 PPTase를 코딩하는 하나 이상의 핵산 분자가 서열 81에 나타낸 것을 포함하지만 이에 한정되지 않는 색소체-표적화 서열을 코딩하는 핵산 서열에 작동적으로 연결되어 있고, 생물체는 말로닐 CoA에 대해 PUFA 신타제와 경쟁하는 것을 감소시키거나 또는 생물체내의 말로닐 CoA의 수준을 증가시키는 추가의 유전적 개질을 포함하고, 장쇄 PUFA 무함유 지방산 (FFA)의 아실-CoA로의 전환을 촉매하는 하나 이상의 이종 아실-CoA 신테타제(ACoAS) 또는 그의 상동체를 발현시키는 추가의 유전적 개질을 함유하며, 내생성 지방산 신타제 (FAS) 또는 생물체에 의해 발현된 FAS와 관련된 단백질을 결실시키거나 또는 불활성화하는 추가의 유전적 개질을 포함하는 것인, 유전적으로 개질된 생물체 (미생물, 식물, 식물의 부분 또는 식물 세포를 포함함)를 제공한다.
다른 실시양태에서, 본 발명은 한가지 이상의 다불포화 지방산 (PUFA)을 제조하는 PUFA 신타제, 및 포스포판테테이닐 트랜스퍼라제 (PPTase)로 유전적으로 개 질된 생물체이며, PUFA 신타제 또는 PPTase를 코딩하는 하나 이상의 핵산 분자가 서열 81에 나타낸 것을 포함하지만 이에 한정되지 않는 색소체-표적화 서열을 코딩하는 핵산 서열에 작동적으로 연결되어 있고, 생물체는 말로닐 CoA에 대해 PUFA 신타제와 경쟁하는 것을 감소시키거나 또는 생물체내의 말로닐 CoA의 수준을 증가시키는 추가의 유전적 개질을 포함하고, PUFA를 내생적으로 제조하는 생물체 유래의 한가지 이상의 이종 단백질을 발현시키는 추가의 유전적 개질을 함유하며, 상기 단백질은 인지질 (PL) 또는 트리아실글리세롤 (TAG)을 형성하는데 있어서 기질로서 PUFA-CoA를 이용하고, 생물체는 내생성 지방산 신타제 (FAS) 또는 생물체에 의해 발현된 FAS와 관련된 단백질을 결실시키거나 또는 불활성화하는 추가의 유전적 개질을 포함하는 것인, 유전적으로 개질된 생물체 (미생물, 식물, 식물의 부분 또는 식물 세포를 포함함)를 제공한다.
다른 실시양태에서, 본 발명은 한가지 이상의 다불포화 지방산 (PUFA)을 제조하는 PUFA 신타제, 및 포스포판테테이닐 트랜스퍼라제 (PPTase)로 유전적으로 개질된 생물체이며, PUFA 신타제 또는 PPTase를 코딩하는 하나 이상의 핵산 분자가 서열 81에 나타낸 것을 포함하지만 이에 한정되지 않는 색소체-표적화 서열을 코딩하는 핵산 서열에 작동적으로 연결되어 있고, 생물체는 말로닐 CoA에 대해 PUFA 신타제와 경쟁하는 것을 감소시키거나 또는 생물체내의 말로닐 CoA의 수준을 증가시키는 추가의 유전적 개질을 포함하고, 장쇄 PUFA 무함유 지방산 (FFA)의 아실-CoA로의 전환을 촉매하는 하나 이상의 이종 아실-CoA 신테타제(ACoAS) 또는 그의 상동체를 발현시키는 추가의 유전적 개질을 함유하고, PUFA를 내생적으로 제조하는 생 물체 유래의 한가지 이상의 이종 단백질을 발현시키는 추가의 유전적 개질을 함유하며, 상기 단백질은 인지질 (PL) 또는 트리아실글리세롤 (TAG)을 형성하는데 있어서 기질로서 PUFA-CoA를 이용하고, 생물체는 내생성 지방산 신타제 (FAS) 또는 생물체에 의해 발현된 FAS와 관련된 단백질을 결실시키거나 또는 불활성화하는 추가의 유전적 개질을 포함하는 것인, 유전적으로 개질된 생물체 (미생물, 식물, 식물의 부분 또는 식물 세포를 포함함)를 제공한다. 일부 실시양태에서, 생물체는 단백질 KASII 또는 KASIII 중 어느 하나의 발현 또는 활성을 억제하는 유전적 개질을 함유한다.
다른 실시양태에서, 생물체는 상기 KASII 또는 KASIII 억제의 부재하에서와 비교해서 상기 한가지 이상의 PUFA를 증가된 수준으로 제조한다.
유전적 개질은 KASII의 발현 또는 활성을 억제하는 RNAi 구조물 또는 KASIII의 발현 또는 활성을 억제하는 RNAi 구조물을 사용해서 생물체를 형질전환시키는 것을 포함할 수 있다. RNAi 구조물은 서열 122 또는 서열 124로 나타낸 핵산 서열을 포함할 수 있다.
다른 실시양태에서, 유전적 개질은 KASII의 발현 또는 활성을 억제하는 안티센스 핵산 분자 또는 KASIII의 발현 또는 활성을 억제하는 안티센스 핵산 분자를 사용해서 생물체를 형질전환시키는 것을 포함한다. 안티센스 핵산 분자는 본원에서 서열 123 또는 서열 125에 나타낸 핵산 서열을 포함할 수 있다.
생물체가, 장쇄 PUFA 무함유 지방산 (FFA)의 아실-CoA로의 전환을 촉매하는 하나 이상의 이종 아실-CoA 신테타제(ACoAS) 또는 그의 상동체를 발현시키는 추가 의 유전적 개질을 함유하는 것인 실시양태에서, 생물체는 크립테코디니움 코니 유래의 아실-CoA 신테타제(ACoAS) 또는 그의 상동체를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 핵산 분자로 형질전환시킬 수 있으며, ACoAS 또는 그의 상동체는 장쇄 PUFA 무함유 지방산 (FFA)의 아실-CoA로의 전환을 촉매한다. 다른 실시양태에서, 생물체는 쉬조키트리움 유래의 아실-CoA 신테타제(ACoAS) 또는 쉬조키트리움 유래의 ACoAS를 코딩하는 아미노산 서열과 60％ 이상 동일한 상동체를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 핵산 분자로 형질전환시키며, ACoAS 또는 그의 상동체는 장쇄 PUFA 무함유 지방산 (FFA)의 아실-CoA로의 전환을 촉매한다. 또 다른 실시양태에서, 생물체는 서열 83, 서열 85, 서열 87, 서열 89, 서열 91, 서열 93, 서열 95, 서열 97 및 서열 99로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 ACoAS와 60％ 이상 동일한 아실-CoA 신테타제(ACoAS)를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 핵산 분자로 형질전환시킨다. 또 다른 실시양태에서, 생물체는 서열 83, 서열 85, 서열 87, 서열 89, 서열 91, 서열 93, 서열 95, 서열 97 및 서열 99로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 아실-CoA 신테타제(ACoAS)를 코딩하는 핵산 서열, 더 바람직하게는 서열 83, 서열 85 및 서열 97로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 아실-CoA 신테타제(ACoAS)를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 핵산 분자로 형질전환시킨다. 또 다른 실시양태에서, 생물체는 서열 83 또는 서열 85의 아미노산 서열을 갖는 아실-CoA 신테타제(ACoAS)를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 핵산 분자, 및 서열 97의 아미노산 서열을 갖는 아실-CoA 신테타제(ACoAS)를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 핵산 분자로 형질전환시킨다. 또 다른 실시양태에서, 생물체는 서열 82, 서열 84, 서열 86, 서열 88, 서열 90, 서열 92, 서열 94, 서열 96 및 서열 98로 이루어진 군으로부터 선택된 핵산 서열을 포함하는 핵산 분자로 형질전환시킨다.
생물체가 PUFA를 내생적으로 제조하는 생물체 유래의 한가지 이상의 이종 단백질을 발현시키는 추가의 유전적 개질을 함유하며 상기 단백질은 인지질 (PL) 또는 트리아실글리세롤 (TAG)을 형성하는데 있어서 기질로서 PUFA-CoA를 이용하는 것인 일부 실시양태에서, 생물체는 PUFA 신타제를 내생적으로 발현시킨다. 다른 실시양태에서, 단백질은 DAGAT 또는 LPAAT이다. 다른 실시양태에서, 생물체는 인지질 (PL) 또는 트리아실글리세롤 (TAG)을 형성하는데 있어서 기질로서 PUFA-CoA를 이용하는 트라우스토키트리드 또는 라비린툴리드 유래의 단백질을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 핵산 분자로 형질전환시킨다. 또 다른 실시양태에서, 생물체는 인지질 (PL) 또는 트리아실글리세롤 (TAG)을 형성하는데 있어서 기질로서 PUFA-CoA를 이용하는 쉬조키트리움 유래의 단백질을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 핵산 분자로 형질전환시킨다. 일부 실시양태에서, 핵산 서열은 서열 102, 서열 104, 서열 107, 서열 110 및 서열 113으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열과 60％ 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하는 단백질을 코딩한다. 다른 실시양태에서, 생물체는 서열 102, 서열 104, 서열 107, 서열 110 및 서열 113으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 단백질을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 핵산 분자, 더 바람직하게는 서열 서열 102 및 서열 104로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산을 포함하는 단백질을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 핵산 분 자로 형질전환시킨다. 또 다른 실시양태에서, 생물체는 서열 102의 아미노산 서열을 포함하는 단백질을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 핵산 분자, 및 서열 104의 아미노산 서열을 포함하는 단백질을 코딩하는 핵산 서열을 사용해서 형질전환시킨다. 다른 실시양태에서, 생물체는 서열 100, 서열 102, 서열 103, 서열 105, 서열 106, 서열 108, 서열 109, 서열 111 및 서열 112로 이루어진 군으로부터 선택된 핵산 서열을 포함하는 핵산 분자로 형질전환시킨다. 여기서, 생물체는 인지질 (PL) 또는 트리아실글리세롤 (TAG)을 형성하는데 있어서 기질로서 PUFA-CoA를 이용하는 크립테코디니움 코니 유래의 단백질을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 핵산 분자로 형질전환시킨다. 어떤 실시양태에서, 생물체는 서열 114, 서열 115, 서열 116, 서열 117, 서열 118, 서열 119, 서열 120 및 서열 121로 이루어진 군으로부터 선택된 핵산 서열과 90％ 이상 동일한 핵산 서열을 포함하는 핵산 분자로 형질전환시킨다.
상기 임의의 실시양태들의 일부 실시양태에서, PUFA 신타제는 트라우스토키트리드 또는 라비린툴리드 유래의 PUFA 신타제로부터의 하나 이상의 기능성 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, PUFA 신타제는 트라우스토키트리알레스 미생물 유래의 PUFA 신타제로부터의 하나 이상의 기능성 도메인을 포함한다. 다른 실시양태에서, PUFA 신타제는 쉬조키트리움, 트라우스토키트리움, 울케니아 및 라비린툴라(Labyrinthula)로 이루어진 군으로부터 선택된 생물체 유래의 PUFA 신타제로부터의 하나 이상의 기능성 도메인을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, PUFA 신타제는 쉬조키트리움 종(Schizochytrium sp.) 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 (ATCC) 번호 20888, 트라우스토키트리움 23B ATCC 번호 20892, 및 이들 미생물 중 어느 것의 돌 연변이체로 이루어진 군으로부터 선택된 생물체 유래의 PUFA 신타제의 하나 이상의 기능성 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, PUFA 신타제는 해양 세균 유래의 PUFA 신타제의 하나 이상의 기능성 도메인을 포함한다. 다른 실시양태에서, PUFA 신타제는 쉬바넬라, 모리텔라(Moritella) 및 포토박테리움(Photobacterium)으로 이루어진 군으로부터 선택된 생물체 유래의 PUFA 신타제의 하나 이상의 기능성 도메인을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, PUFA 신타제는
1개 이상의 에노일-ACP 리덕타제 (ER) 도메인;
4개 이상의 아실 운반 단백질 (ACP) 도메인;
2개 이상의 β-케토아실-ACP 신타제 (KS) 도메인;
1개 이상의 아실트랜스퍼라제 (AT) 도메인;
1개 이상의 β-케토아실-ACP 리덕타제 (KR) 도메인;
2개 이상의 FabA-유사 β-히드록시아실-ACP 데히드라제 (DH) 도메인; 및
1개 이상의 쇄 길이 인자 (CLF) 도메인;
1개 이상의 말로닐-CoA:ACP 아실트랜스퍼라제 (MAT) 도메인
을 포함하는 하나 이상의 단백질로 구성된다.
추가의 실시양태에서, PUFA 신타제는
2개의 에노일 ACP-리덕타제 (ER) 도메인;
8개 또는 9개의 아실 운반 단백질 (ACP) 도메인;
2개의 β-케토 아실-ACP 신타제 (KS) 도메인;
1개의 아실트랜스퍼라제 (AT) 도메인;
1개의 케토리덕타제 (KR) 도메인;
2개의 FabA-유사 β-히드록시 아실-ACP 데히드라제 (DH) 도메인;
1개의 쇄 길이 인자 (CLF) 도메인; 및
1개의 말로닐-CoA:ACP 아실트랜스퍼라제 (MAT) 도메인
을 포함하는 하나 이상의 단백질로 구성된다.
또 다른 실시양태에서, PUFA 신타제는 약 25℃의 온도에서 PUFA를 제조하는 세균성 PUFA 신타제이며, 상기 PUFA 신타제는
1개 이상의 에노일 ACP-리덕타제 (ER) 도메인;
6개 이상의 아실 운반 단백질 (ACP) 도메인;
2개 이상의 β-케토 아실-ACP 신타제 (KS) 도메인;
1개 이상의 아실트랜스퍼라제 (AT) 도메인;
1개 이상의 케토리덕타제 (KR) 도메인;
2개 이상의 FabA-유사 β-히드록시 아실-ACP 데히드라제 (DH) 도메인;
1개 이상의 쇄 길이 인자 (CLF) 도메인;
1개 이상의 말로닐-CoA:ACP 아실트랜스퍼라제 (MAT) 도메인; 및
1개 이상의 4'-포스포판테테이닐 트랜스퍼라제 (PPTase) 도메인
을 포함하는 하나 이상의 단백질로 구성된다.
일부 실시양태에서, PUFA 신타제는 서열 1-32 중 어느 하나 및 서열 35-80 중 어느 하나로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, PUFA 신타제를 코딩하는 하나 이상의 핵산 서열은 식물 또는 식물 세포에서 PUFA 신타제의 발현을 향상시키도록 최적화되었다. 다른 실시양태에서, PUFA 신타제 및 PPTase의 발현은 식물 또는 식물 세포의 색소체로 표적화된다.
일부 실시양태에서, 유전적으로 개질된 생물체는 식물이며, 식물은 오일 종자 식물이다. 다른 실시양태에서, 식물은 쌍자엽 식물이다. 또 다른 실시양태에서, 식물은 카놀라, 대두, 평지씨, 아마인, 옥수수, 잇꽃, 해바라기 및 담배로 이루어진 군으로부터 선택되지만 이에 한정되지 않는다.
또 다른 실시양태에서, 유전적으로 개질된 생물체는 EPA (C20:5, n-3), DHA (C22:6, n-3), DPA (C22:5, n-6 또는 n-3), ARA (C20:4, n-6), GLA (C18:3, n-6), 및/또는 SDA (C18:4, n-3), 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 한가지 이상의 다불포화 지방산 (PUFA)을 제조한다. 일부 실시양태에서, 유전적으로 개질된 생물체는 DHA, EPA 및 DPAn-6으로 이루어진 군으로부터 선택된 한가지 이상의 다불포화 지방산 (PUFA)을 제조한다. 다른 실시양태에서, 유전적으로 개질된 생물체는 DHA 및 DPAn-6을 제조한다. 또 다른 실시양태에서, 유전적으로 개질된 생물체는 ARA를 제조한다.
일부 실시양태에서, 유전적으로 개질된 생물체는 상기 한가지 이상의 PUFA를 0.5 중량％ 이상 포함한다. 다른 실시양태에서, 상기 한가지 이상의 PUFA 이외에 상기 PUFA 신타제에 의해 제조된 총 지방산은 상기 생물체에 의해 제조된 총 지방산의 약 10 중량％ 미만을 차지한다. 또 다른 실시양태에서, 상기 한가지 이상의 PUFA 이외에 상기 PUFA 신타제에 의해 제조된 총 지방산은 상기 생물체에 의해 제 조된 총 지방산의 약 5 중량％ 미만을 차지한다.
또 다른 실시양태에서, 식물, 식물의 부분 또는 식물 세포의 총 지방산 프로필은 20개 이상의 탄소 및 4개 이상의 탄소-탄소 이중 결합을 갖는 한가지 이상의 다불포화 지방산 (PUFA)을 약 0.5 중량％ 이상 포함하며, 식물 또는 식물의 일부의 총 지방산 프로필은 하기 PUFA의 모두를 총 5％ 미만으로 함유한다: 감마-리놀렌산 (GLA; 18:3, n-6), 18개의 탄소 및 4개의 탄소-탄소 이중 결합을 갖는 PUFA, 20개의 탄소 및 3개의 탄소-탄소 이중 결합을 갖는 PUFA, 및 22개의 탄소 및 2개 또는 3개의 탄소-탄소 이중 결합을 갖는 PUFA.
또 다른 실시양태에서, 식물, 식물의 부분 또는 식물 세포의 총 지방산 프로필은 20개 이상의 탄소 및 4개 이상의 탄소-탄소 이중 결합을 갖는 한가지 이상의 다불포화 지방산 (PUFA)을 약 0.5 중량％ 이상 포함하며, 식물 또는 식물의 일부의 총 지방산 프로필은 하기 PUFA의 각각을 1％ 미만 함유한다: 감마-리놀렌산 (GLA; 18:3, n-6), 18개의 탄소 및 4개의 탄소-탄소 이중 결합을 갖는 PUFA, 20개의 탄소 및 3개의 탄소-탄소 이중 결합을 갖는 PUFA, 및 22개의 탄소 및 2개 또는 3개의 탄소-탄소 이중 결합을 갖는 PUFA.
또 다른 실시양태에서, 식물, 식물의 부분 또는 식물 세포의 총 지방산 프로필은 20개 이상의 탄소 및 4개 이상의 탄소-탄소 이중 결합을 갖는 한가지 이상의 다불포화 지방산 (PUFA)을 약 0.5 중량％ 이상 포함하며, 식물 또는 식물의 일부의 총 지방산 프로필은 감마-리놀렌산 (GLA; 18:3, n-6) 및 디호모-감마-리놀렌산 (DGLA 또는 HGLA; 20:3, n-6)을 2％ 미만 함유한다.
다른 실시양태에서, 유전적으로 개질된 생물체의 총 지방산 프로필은 감마-리놀렌산 (GLA; 18:3, n-6) 및 디호모-감마-리놀렌산 (DGLA 또는 HGLA; 20:3, n-6)을 1 중량％ 미만 함유한다.
다른 실시양태에서, 유전적으로 개질된 생물체의 총 지방산 프로필은 20개 이상의 탄소 및 4개 이상의 탄소-탄소 이중 결합을 갖는 한가지 이상의 다불포화 지방산 (PUFA)을 약 0.5 중량％ 이상 포함하며, 식물 또는 식물의 일부의 총 지방산 프로필은 감마-리놀렌산 (GLA; 18:3, n-6)을 1％ 미만 함유한다.
다른 실시양태에서, 유전적으로 개질된 생물체의 총 지방산 프로필은 감마-리놀렌산 (GLA; 18:3, n-6)을 0.5 중량％ 미만 함유한다.
본 발명은 또한 본 발명의 유전적으로 개질된 임의의 생물체로부터 얻어진 오일을 제공한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 검출가능한 양의 DHA (도코사헥사엔산 (C22:6, n-3)) 및 DPA (도코사펜타엔산 (C22:5, n-6)를 포함하는 오일을 제공하며, DPAn-6 대 DHA의 비율은 1:1이거나 또는 1:1보다 더 크고, 식물 오일은 본 발명의 유전적으로 개질된 임의의 생물체로부터 얻어진다.
유전적으로 개질된 생물체가 식물인 경우, 본 발명은 식물로부터 얻어진 종자를 제공한다.
본 발명은 또한 본 발명의 임의의 오일 또는 종자를 포함하는 식품 생성물을 제공한다.
본 발명은 또한 본 발명의 오일을 함유하는 제약 생성물을 제공한다.
본 발명은 또한 본 발명의 종자로부터 오일을 회수하는 것을 포함하는, 한가 지 이상의 PUFA를 포함하는 오일을 제조하는 방법을 제공한다.
본 발명은 또한 본 발명의 유전적으로 개질된 임의의 생물체로부터 오일을 회수하는 것을 포함하는, 한가지 이상의 PUFA를 포함하는 오일을 제조하는 방법을 제공한다.
본 발명은 또한 본 발명의 유전적으로 개질된 임의의 식물 또는 미생물을 성장시키는 것을 포함하는, 한가지 이상의 다불포화 지방산 (PUFA)을 제조하는 방법을 제공한다.
추가로, 본 발명은 개체에게 본 발명의 유전적으로 개질된 생물체, 본 발명의 종자, 본 발명의 오일, 본 발명의 식품 생성물 또는 본 발명의 제약 생성물을 제공하는 것을 포함하는, 개체에게 한가지 이상의 PUFA를 함유하는 보충 또는 치료 생성물을 제공하는 방법을 제공한다.
본 발명은 또한 KASII 및 KASIII으로 이루어진 군으로부터 선택된 단백질의 발현 또는 활성을 억제하는 유전적 개질을 함유하는 생물체를, PUFA 신타제 및 PPTase를 코딩하는 하나 이상의 핵산 분자로 형질전환시키는 것을 포함하는, 상기 유전적으로 개질된 생물체를 생성하는 방법을 제공한다.
본 발명은 또한 PUFA 신타제 및 PPTase를 코딩하는 하나 이상의 핵산 분자를 사용해서 생물체를 형질전환시키고, 이 생물체가 KASII 및 KASIII으로 이루어진 군으로부터 선택된 단백질의 발현 또는 활성을 억제하도록 추가로 유전적으로 개질시키는 것을 포함하는, 상기 유전적으로 개질된 생물체를 생성하는 방법을 제공한다.
본 발명은 또한 PUFA 신타제를 코딩하는 핵산 분자, 포스포판테테이닐 트랜 스퍼라제 (PPTase)를 코딩하는 핵산 분자, 및 본원에 기재된 임의의 아실-CoA 신테타제 또는 아실트랜스퍼라제를 코딩하는 핵산 분자를 사용해서 생물체를 형질전환시키는 것을 포함하는, 생물체가 PUFA를 발현하도록 형질전환시키는 방법을 제공한다. 한 측면에서, 생물체는 생물체에 의해 발현된 지방산 신타제 (FAS)를 결실시키거나 또는 불활성화하는 유전적 개질을 함유한다. 한 측면에서, 생물체는 말로닐 CoA에 대해 PUFA 신타제와 경쟁하는 것을 감소시키거나 또는 생물체에서 말로닐 CoA의 수준을 증가시키는 유전적 개질을 함유한다. 생물체는 예를 들어 식물 또는 미생물을 포함한다.
도 1은 쉬조키트리움 균주 Ac66 및PUFA-S KO 및 이 균주로부터 유도된 FAS KO 돌연변이체의 세포 무함유 균질물의 시험관내 활성 검정에 대한 포스포르이미지(phosphorimage) 분석을 나타내는 디지털화 영상이다.
도 2는 쉬조키트리움 FAS-KO 균주의 시험관내 활성 검정의 정상(normal phase) TLC 분리의 포스포르이미지 분석을 나타내는 디지털화 영상이다. 반응을 표시된 시간 동안 수행하였다.
도 3은 쉬조키트리움 FAS-KO 균주의 시험관내 활성 검정의 정상 상 TLC 분리의 포스포르이미지 분석을 나타내는 디지털화 영상이다. 표준 검정 성분들을 사용하였지만, NADH, NADPH 및 아세틸-CoA 성분들은 달라졌다 (레인 1- NADH/NADPH/아세틸-CoA, 레인 2 - NADPH/아세틸-CoA, 레인 3 - NADH/아세틸-CoA, 레인 4 - NADH/NADPH, 레인 5 - 없음).
도 4는 쉬조키트리움 FAS-KO 균주의 시험관내 활성 검정의 정상 상 TLC 분리의 포스포르이미지 분석을 나타내는 디지털화 영상이다. 반응을 10분 동안 수행한 다음, ATP 및 Mg+2를 첨가하였다. 반응은 하단에 나타낸 시간에서 중단시켰다 (" = 초, ' = 분).
도 5는 쉬조키트리움 FAS-KO 균주의 시험관내 활성 검정의 정상 상 TLC 분리의 포스포르이미지 분석을 나타내는 디지털화 영상이다. 반응을 10분 동안 수행하고, ATP 및 Mg+2를 첨가하고 (샘플 1에서는 제외됨), 인큐베이션을 추가로 20분 동안 지속하였다 (레인 3 - 2 uL DMSO, 레인 4 - 4 uL DMSO, 레인 5 - 25 uM 트리아스신(Triascin) C, 레인 6 - 100 uM 트리아스신 C, 레인 7 - 200 uM 트리아스신 C).
도 6A는 쉬조키트리움 OrfA, OrfB*, OrfC 및 HetI을 발현시키는 이. 콜라이(E. coli)의 FAME 분석을 나타내는 디지털 영상이다. 균질물, 고속 펠릿 분획 (P2), 상등액 분획 (S1) 및 고속 상등액 분획 (S2) 중의 표적 PUFA를 나타낸다.
도 6B는, TLC에 의한 분리에 앞서 (FAMES로 전환되는 것보다는 오히려) HIP로 지질 생성물을 간단히 추출한 것을 제외하면, 도 6A에서 사용된 동일한 이. 콜라이 균주 샘플의 검정 결과를 나타내는 디지털 영상이다.
도 7은 쉬조키트리움 OrfsA, OrfsB, OrfC 및 HetI을 발현시키는 효모 및 대조군 효모의 FAME 프로필이다.
도 8은 표적 PUFA의 제조를 예시하도록 확대된, 도 1로부터의 효모에 대한 FAME 프로필이다.
도 9는 쉬조키트리움 PUFA 신타제 (sOrfA, sOrfB, OrfC) 및 HetI을 단독으로 또는 아실 CoA 신테타제와의 조합으로 발현시키는 효모의 DHA 프로필에 대한 FAS 활성의 억제 효과를 (총 FAME의 백분율로서) 나타내는 그래프이다.
도 10은 쉬조키트리움 PUFA 신타제 (sOrfA, sOrfB, OrfC) 및 HetI을 단독으로 또는 아실 CoA 신테타제와의 조합으로 발현시키는 효모의 DHA 및 DPAn6 프로필에 대한 FAS 활성의 억제 효과를 (총 FAME의 백분율로서) 나타내는 그래프이다.
도 11은 효모에서의 DHA 및 DPAn6 생성에 대하여, (세룰레닌에 의한) FAS 활성의 억제, 쉬조키트리움 PUFA 신타제 (sOrfA, sOrfB, OrfC) 및 HetI의 발현, 및 아실 CoA 신테타제의 발현의 조합된 효과를 나타내는 FAME 프로필이다.
도 12는 DAGAT 유전자가 녹아웃된(knocked out) 쉬조키트리움으로부터의 지질 프로필을 나타낸다.
도 13은 종자 발생 동안 쉬조키트리움 Orfs A, B*, C 및 HetI을 발현시키는, 야생형 아라비돕시스(Arabidopsis) 및 아라비돕시스 라인(Line) 263 (색소체 표적화됨)의 FAME 프로필이다.
도 14는 종자 발생 동안 FAS 억제 (KAS III 안티센스)와 조합된 색소체로 표적화된 쉬조키트리움 Orfs A, B*, C 및 HetI을 발현시키는, 라인 1087-7 (색소체 표적화됨)로부터의 아라비돕시스 종자의 FAME 프로필이다.
도 15는 종자 발생 동안 FAS 억제 (KAS II RNAi) 및 ACS-1과 조합된 색소체로 표적화된 쉬조키트리움 Orfs A, B*, C 및 HetI을 발현시키는 라인 1366으로부터의 푸울링된 아라비돕시스 종자의 FAME 프로필이다.
본 발명은 일반적으로, 다불포화 지방산 (PUFA)을 제조하도록 유전적으로 개질된 숙주 생물체에서 다불포화 지방산 (PUFA), 특히 장쇄 PUFA (LCPUFA)의 제조를 향상시키기 위해 (본원에서 일반적으로 "부속 단백질" 또는 "부속 표적"으로 지칭되는) 단백질 또는 표적 및 이러한 단백질을 코딩하는 핵산 분자를 제공하는 것에 관한 것이다. 본 발명은 또한 이러한 특정 단백질을 발현시키도록 유전적으로 개질된 생물체, 및 상기 단백질 및 생물체를 사용 및 제조하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 생물체내 특정 유전자들 또는 표적의 결실 또는 불활성화를 포함할 수 있는, PUFA를 제조하는 생물체에 대한 추가의 유전적 개질 (유전적 개질에 의해 PUFA를 제조하는 것을 포함함)에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 (내생적으로 또는 유전적 조작에 의해) PUFA PKS 시스템을 발현시키는 생물체를 유전적으로 개질시켜 이 생물체에 의한 PUFA 제조 및/또는 축적을 향상 또는 증진시키는 것에 관한 것이다. 예를 들어, 본 발명은 또한 기질에 대해 경쟁하는 효소의 하향 조절(down regulation)을 조작하는 것과, 예를 들어 세포질 뿐만 아니라 색소체 세포소기관에 대한 효소의 표적화 또는 돌연변이유발에 의해 더 높은 효소 활성을 조작하는 것에 관한 것이다.
본 발명에 따라, PUFA PKS 시스템 (또한 PUFA 신타제 시스템이라고도 알려져 있으며, 이는 PUFA의 제조에 있어서 PUFA PKS 시스템 또는 PKS-유사 시스템과 상호교환가능하게 사용됨) 또는 적어도 그러한 PUFA PKS 시스템 또는 그의 일부를 발현시키도록 유전적으로 개질된 생물체 (상기 시스템을 자연적으로 (내생적으로, 유전적 개질 없이) 발현시키지 않음)는, 본원에서 생물체를 PUFA PKS 시스템 또는 이 생물체에 의해 내생적으로 발현되지 않는 다른 단백질을 사용해서 개질시키는 것과 관련하여 "이종" 숙주 생물체로 지칭될 수 있다. 또한 본 발명의 유전적 개질은 PUFA PKS 시스템을 내생적으로 발현시키며 다른 PUFA PKS 시스템 또는 그의 일부로 추가로 개질되지 않은 숙주 생물체에서 PUFA 제조를 향상시키기 위해 이용될 수 있다.
보다 구체적으로, 본 발명자들은 쉬조키트리움 PUFA 신타제의 지방산 생성물 (주로 DHA 및 DPAn-6)이 상기 효소로부터 유리 지방산 (FFA)으로서 방출되며 이 방출 메카니즘은 효소에 필수적이라는 사실을 본 발명에 이르러 최초로 밝혀내고 이를 본원에 개시하였다. 이러한 생성물 방출 메카니즘은 모든 트라우스토키트리드 PUFA PKS (PUFA 신타제) 효소 시스템의 특징인 것으로 여겨지며, 라비린툴리드 시스템을 비롯해서 모든 진핵생물 PUFA PKS 시스템의 특징일 수 있다. 추가로, 본 발명자들은 쉬조키트리움을 모델로 이용해서 DHA 및 DPA FFA가 추후에 내생성 아실-CoA 신테타제(ACoAS 또는 ACS) 또는 신테타제의 작용에 의해 조효소 A (CoA)로 에스테르화됨을 보여준다. 이후, 상기 활성화된 형태의 지방산 (아실-CoA)은 PL 및 TAG 형성 효소를 위한 기질로서 작용할 수 있다.
쉬조키트리움의 내생성 효소는 그의 PUFA 신타제의 FFA 생성물을 아실-CoA로 전환시킨 다음, 이를 PL 및 TAG의 합성을 위해 사용하는데 있어서 매우 효과적이다. 이는 쉬조키트리움 오일 및 PL 분획 중에 DHA 및 DPA가 높은 수준으로 축적되는 것에 의해 입증된다. 그러나, 이론에 얽매이고자 하는 것은 아니지만, 본 발명자들은 PUFA 신타제 시스템으로 형질전환시킬 수 있는 이종 숙주내에 존재하는 ACoAS 효소가 상기 반응을 PUFA 신타제 공여자 생물체 유래의 ACoAS 만큼 효율적으로 수행할 수는 없는 것으로 이해하고 있다. 추가로, 상기 신규 숙수 생물체내에서 PL 및 TAG를 형성하는 내생성 아실-트랜스퍼라제 효소는, 특히 PUFA 신타제가 유도된 생물체에 비해, 기질로서 PUFA-CoA를 효율적으로 이용할 수 없다. 본 발명자들은 또한 특정 생물체 유래의 아실트랜스퍼라제가 다른 생물체 유래의 유사한 효소보다 숙주 생물체의 오일 및 오일 분획 중 PUFA, 특히 특정 PUFA의 축적에 대하여 일반적으로 더 우수한 효소일 수 있음을 제안한다 (예, 한 생물체 유래의 아실트랜스퍼라제는 다른 생물체 유래의 아실트랜스퍼라제보다 더 많은 DHA-CoA 단위를 TAG로 전달할 수 있음). 따라서, 본 발명자들은 본원에서 쉬조키트리움과 유사하지만 쉬조키트리움에 한정되지 않는 생물체 (예, 트라우스토키트리드 또는 다른 생물체, 특히 다른 진핵 생물체)가 PUFA 신타제 효소 (PUFA PKS 시스템)에 의해 또는 다른 아실 쇄 생합성 시스템을 통해 그의 PUFA를 제조하고 그의 PL 및 TAG 중에 고수준의 PUFA를 축적하여 상기 효소를 코딩하는 유전자들의 우수한 공급원 역할을 하게 될 것이라고 개시하고 있다.
PUFA 생성물이 PUFA 신타제로부터 FFA로서 방출된다는 본 발명자들의 발견은 상기 시스템을 이종 숙주로 전달하는 측면에서 도전이자 기회가 되며 이종 숙주 생물체에서 PUFA의 제조 효율을 조절 및 향상시키는 실질적인 기회를 제공한다.
설명하자면, 장쇄 PUFA (LCPUFA)는 "표준" 또는 "전형적" PUFA 생합성 경로 (하기 정의됨)의 부분으로서 FFA로 생성되지 않는다. 실제로, 생물체에서 일반적으로 FFA로서 PUFA를 직면하게 되는 것은 단지 그가 외생적으로 제공되는 경우에서 이다. 예를 들어, 대부분의 세균과 유사한 이. 콜라이는 PUFA를 합성하지 않는다. 이 생물체에 의해 제조된 16개 및 18개의 탄소 포화 또는 단일-불포화 지방산은 제II형 FAS 시스템에 의해 아실 운반 단백질 (ACP) 상에서 합성된다. 아실-ACP는 PL 형성 효소를 위한 기질로서 작용한다. 이. 콜라이는 외생성 탄소 공급원으로서 다양한 FFA를 이용할 수 있다. 이러한 FFA는 PL 또는 분해 사이클로 진입하기에 앞서 아실-CoA로 전환된다. FadD 유전자는 이. 콜라이에서 유일하게 공지된 ACoAS 효소를 코딩하며, 이 유전자에서의 돌연변이는 유일한 탄소 공급원으로서 FFAd에 대한 성장 불능을 나타낸다.
진핵 생물체는 전형적으로 제I형 지방산 신타제 (FAS) (또는 고등 식물의 경우에는 제II형 FAS)를 사용해서 포화 지방산 (16개 및 18개의 탄소)을 제조한다. FAS 시스템의 생성물은 FFA (예, 동물 FAS) 또는 아실-CoA (예, 진균 FAS)로서 방출될 수 있다. 식물의 경우, 제II형 FAS는 색소체 내에 국소화된다. 이 경우, 탄소수 16 또는 18의 지방산이 제II형 FAS에 의해 제조되고, 흔히 단일 이중 결합이 형성되며, 지방산은 ACP에 부착된다. 아실-ACP는 색소체 PL의 형성을 위한 기질 역할을 할 수 있다. (세포질 PL에서의 사용 또는 TAG 합성을 위해) 색소체로부터 배출될 예정인 지방산의 경우, 아실-ACP 티오에스테라제는 티오에스테르 결합을 가수분해하여 FFA를 방출시킨다. 이어서, FFA는 색소체로부터 배출되며, 세포질 ACoAS에 의해 아실-CoA로 전환된다. 이들 아실-CoA는 PL 및 TAG 합성 효소를 위한 기질로서 작용한다.
진핵 생물체에서의 장쇄 PUFA (LCPUFA)의 합성을 위한 "표준" 또는 "전형적" 경로는 중간 쇄-길이 포화 또는 단일-불포화 지방산 (예, 상기 기재된 FAS 시스템의 생성물)의 개질을 포함한다. 이러한 개질은 연장 단계 및 탈포화(desaturation) 단계로 이루어진다. 연장 반응을 위한 기질은 지방 아실-CoA (연장될 지방산 쇄) 및 말로닐-CoA (각 연장 반응 동안 첨가될 탄소 2개의 공급원)이다. 엘론가제 반응의 생성물은 선형 쇄 내에 2개의 추가의 탄소를 갖는 지방 아실-CoA이다. 유리 지방산 (FFA)은 통상적으로 상기 반응 사이클에서 생성되지 않는다. 데새투라제는 산소-의존적 반응에서 2개의 수소를 추출함으로써 기존의 지방산 쇄 내에 시스 이중 결합을 생성시킨다. 데새투라제를 위한 기질은 PL (예, 포스포티딜콜린)의 글리세롤 주쇄로 에스테르화되는 지방산 또는 아실-CoA (일부 동물의 경우)이다. 또한, FFA는 이러한 반응 메카니즘에서 생성되지 않는다. 따라서, FFA가 "표준" 또는 "전형적" LCPUFA 합성 경로에서 생성되는 유일한 시기는 일부 FAS 시스템으로부터 지방산이 방출되는 동안이다. 상기 논의된 바와 같이, 이는 전형적으로 탄소수 16 또는 18의 지방산, 일반적으로 포화 또는 단일불포화 지방산이며, 더 긴 쇄 길이의 PUFA, 예를 들어 EPA 또는 DHA는 아니다. 장쇄 PUFA 제조를 위한 이러한 방안의 한 결과는 중간체들이 흔히 경로내에 축적됨으로써 이 시스템에 의해 제조된 신규 지방산의 대부분에 해당한다는 것이다.
따라서, 본 발명에 따라, PUFA의 제조를 위한 "표준" 또는 "전형적" 경로라는 언급은 중간 쇄-길이의 포화 지방산 (예, 지방산 신타제 (FAS) 시스템의 생성물)이 일련의 연장 및 탈포화 반응에 의해 개질되는 것인 지방산 합성 경로를 지칭한다. 연장 반응을 위한 기질은 지방 아실-CoA (연장될 지방산 쇄) 및 말로닐-CoA (각 연장 반응 동안 첨가된 2개의 탄소의 공급원)이다. 엘론가제 반응의 생성물은 선형 쇄내에 2개의 추가의 탄소를 갖는 지방 아실-CoA이다. 데새투라제는 산소-의존적 반응에서 2개의 수소를 추출함으로써 기존의 지방산 쇄 내에 시스 이중 결합을 생성시킨다. 이러한 경로 및 이 경로와 관련된 유전자들은 문헌에 잘 알려져 있다 (예, 상기 배경기술 참조).
PUFA PKS (PUFA 신타제) 효소에 의한 장쇄 PUFA의 합성을 위한 경로 (이하에 상세히 기재됨)는 상기 기재된 "표준" 경로와는 매우 다르다. PUFA 신타제는 탄소 공급원으로서 말로닐-CoA를 이용하며, 임의의 유의한 양의 중간체를 방출하지 않으면서 최종 PUFA를 제조한다. 산소를 필요로 하지 않는 메카니즘을 이용해서 합성하는 동안 적절한 시스 이중 결합이 부가된다. NADPH는 합성 사이클 동안 환원제로서 사용된다. 적어도 트라우스토키트리드 PUFA PKS 시스템에서, 효소는 본 발명자들에 의해 본원에서 최초로 개시된 바와 같이 FFA로서 PUFA 생성물을 방출시킨다. 이러한 방출 메카니즘은 효소 자체의 일부이다. 따라서, PUFA 효소 시스템으로부터 FFA로서 LCPUFA의 방출은 쉬조키트리움의 PUFA PKS 시스템의 고유한 특징이며, 모든 진핵생물 PUFA 신타제 시스템, 예를 들면 트라우스토키트리드에서의 상기 시스템의 특징일 수 있다.
따라서, 본 발명자들은 이종 숙주 (예, 내생적으로 특정 PUFA PKS 시스템을 발현시키지 않는 숙주 생물체)에서 PUFA PKS 시스템 (PUFA 신타제 시스템)을 발현시키는 경우, 원하는 구획 또는 지질 분획 내에서 PUFA 제조 및 축적을 최적화하는 것에 대하여 고려할 인자는 도입된 시스템의 FFA 생성물을 상응하는 아실-CoA로의 전환을 위한 기질로서 인식하는 숙주의 내생성 아실-CoA 신테타제(ACoAS) 효소(들)의 능력이라는 것을 제안한다. 상기 논의된 바와 같이 일반적으로 PUFA PKS 시스템이 도입될 수 있는 대부분의 이종 숙주 생물체에서 FFA로서 PUFA를 직면하게 되는 것은 단지 그가 외생적으로 제공되는 경우이기 때문에, 숙주 생물체는 FFA 취급에 적절한 최적의 부속 단백질을 갖지 않을 수 있으며, 이는 숙주 생물체가 원하는 지질 분획 또는 구획에서 PUFA를 최적으로 제조 및 축적하는데 있어서 억제 요인이 될 수 있다. 예를 들어, ACoAS 활성을 갖는 여러 단백질 군이 존재하며 이러한 효소의 바람직한 FFA 기질은 상당히 특이적이라는 사실은 잘 알려져 있다. 따라서, 일부 잠재적인 숙주에 존재하는 ACoAS는 특히 그러한 숙주에 FFA 형태의 PUFA가 통상적으로 존재하지 않는 경우에는 장쇄 PUFA FFA를 아실-CoA로 효율적으로 전환시키지 않을 수 있다. 또한, 숙주 생물체는 PL 및 TAG를 형성하며 기질로서 PUFA-CoA를 이용할 수 있는 최적의 아실트랜스퍼라제를 갖지 않을 수 있다. 마지막으로, PUFA PKS 시스템을 내생적으로 발현시키는 숙주 생물체의 경우에도, 본 발명자들은 생물체에서 오일 및 오일 분획 중 PUFA의 축적을 향상시키기 위해 본원에 논의된 개질을 이용해서 생물체를 유전적으로 개질시키는 것이 가능하다고 믿는다.
상기 기재된 본 발명자들에 의한 발견 및 경로는 이종 (또는 천연) 숙주에서 PUFA 신타제의 발현에 의해 PUFA를 제조하기 위한 여러 가이드라인 또는 전략을 제공한다:
1. 유전자 최적화 유전자 서열을 이종 숙주의 것에 매치시키는 것은 단백질을 발현시키기 위해 필요할 수 있다. 이는 하기 기재된 실시예들에 예시되어 있으며, 쉬조키트리움 유래의 PUFA PKS 시스템으로부터의 단백질을 코딩하는 유전자들을 세균 숙주 및 효모에서의 코돈 용법을 위해 최적화한다. 세균에서의 사용을 위해 최적화된 유전자는 또한 식물에서 쉬조키트리움 PUFA PKS의 발현에 유용한 것으로 나타났다. 이들 최적화된 유전자들에 대한 세부사항은 하기에 기재되어 있다.
2. PPTase 발현 본 발명자들은 이. 콜라이, 효모 및 식물에 존재하는 내생성 PPTase가 PUFA 신타제 ACP 도메인을 활성화할 수 없다고 결정하였다. 본 발명자들은 Nostoc으로부터 적합한 다른 PPTase, HetI을 이미 확인하였으며 (미국 특허 출원 공개 제20020194641호에 기재됨), 이는 내생성 PPTase가 PUFA 신타제 ACP 도메인을 활성화하지 않는 숙주에서 사용될 수 있다. 다른 적합한 PPTase가 또한 기재되어 있으며, 쉽게 얻을 수 있다. 다양한 이종 숙주 세포에서의 PPTase의 사용은 하기에 기재 및 예시되어 있다.
3. 기질 흐름(flux) 변경/FAS 억제 PUFA 신타제는 연장 반응을 위한 탄소의 공급원으로서 말로닐-CoA를 이용한다. 말로닐-CoA는 또한 FAS, 세포질 지방산 연장 반응 및 다른 효소 (예, 칼콘 신타제)에 의해 사용된다. PUFA 신타제는 말로닐-CoA에 대해 상기 다른 효소 시스템과 경쟁한다. 이는 PUFA 신타제 경로를 통해 흐름을 증가시키는 한가지 방법이 말로닐-CoA 푸울(들)에 대해 경쟁하는 그의 능력을 증진시키게 됨을 암시한다. 이러한 기질에 대해 경쟁하는 증진된 능력을 달성하기 위한 가능한 방법이 많이 있다. 이들 방법으로는 1) FAS 경로에서 임의의 요소들을 억제하는 것을 비롯해서 경쟁 경로를 억제하는 방법, 예를 들어 상기 경로에 관련된 효소 또는 서브유닛의 발현 수준을 (예를 들어, 안티센스 RNA, RNAi, 공동억제(co-suppression), 또는 돌연변이를 이용함으로써) 감소시키는 방법, 2) 경쟁 경로가 감소되거나 차단된 이종 숙주 (예를 들어, 카놀라의 경우 세포질에서 지방산을 연장시키는 능력이 차단됨)에서 PUFA 신타제를 발현시키는 방법, 및/또는 3) (예를 들어, 아세틸-CoA 카르복실라제를 발현시킴으로써) 말로닐-CoA의 푸울을 증가시키는 방법을 들 수 있지만 이에 한정되지 않는다.
이러한 전략의 예는 이하에 보다 상세히 기재되어 있으며 실시예에 예시되어 있다.
4. 아실-CoA 신테타제의 발현 쉬조키트리움에 존재하는 효소는 PUFA 신타제의 유리 지방산 생성물을 아실-CoA로 효율적으로 전환시킨다. 이종 숙주에 존재하는 효소는 이러한 반응을 유사한 효율로 수행하지 않을 수 있는데, 이는 상기 생물체가 전형적으로는 그러한 유리 지방산과 마주치지 않을 수 있기 때문이다. 예를 들어, 상기 이종 숙주에서 다양한 PUFA 신타제의 유리 지방산 생성물 (예, DHA, DPAn-6, EPA, 또는 다른 생성물)을 아실-CoA로 효율적으로 전환시키는 아실-CoA 신테타제효소의 발현은 상기 생성물을 축적하는 증가된 능력을 나타낼 수 있다. 이와 관련해서, 쉬조키트리움, 또는 PUFA 신타제 경로에 의해 PUFA를 제조하는 다른 생물체는 이들 효소를 코딩하는 유전자들의 우수한 공급원으로서의 역할을 하게 될 것이다 (하기 기술내용 및 실시예 참조).
5. 아실트랜스퍼라제 및 관련 효소의 발현 쉬조키트리움에 존재하는 효소는 PUFA 신타제의 아실-CoA 형태의 생성물을 효율적으로 이용해서 PL 및 TAG 분자를 합성한다. 이종 숙주에 존재하는 효소는 이러한 반응을 유사한 효율로 수행하지 않을 수 있는데, 이는 상기 생물체가 전형적으로는 그러한 PUFA-CoA와 직면하지 않을 수 있기 때문이다. 예를 들어, 상기 이종 숙주에서 다양한 PUFA 신타제의 아실-CoA 생성물 (예, DHA-CoA, DPAn-6-CoA, EPA-CoA, 또는 다른)을 PL 또는 TAG 분자로 효율적으로 통합하는 PL 또는 TAG 합성 효소의 발현은 상기 생성물을 축적하는 증가된 능력을 나타낼 수 있다. 이와 관련해서, 쉬조키트리움, 또는 PUFA 신타제 경로에 의해 PUFA를 제조하는 다른 생물체는 이들 효소를 코딩하는 유전자들의 우수한 공급원으로서의 역할을 하게 될 것이다 (하기 기술내용 및 실시예 참조).
6. 세포소기관-특이적 발현 이종 숙주에서 축적되는 PUFA의 양을 증가시키거나 또는 프로필을 변화시키기 위해 이용할 수 있는 다른 방법들이 본원에서 고려된다. 한 예로서, 당업자라면 숙주내 별도의 구획에서 PUFA 신타제 시스템을 발현시킴으로써 (예를 들어, 식물 세포의 색소체 및 세포질에서) 축적량 증가를 나타낼 수 있는 별도의 말로닐-CoA 푸울에 도달할 수 있다. 이러한 전략은 또한 하기 실시예에 예시되어 있다.
따라서, 본 발명은 이종 숙주 생물체에서 PUFA 제조 및/또는 축적을 잠재적으로 억제하는 것에 대한 해결책을 제시하며, 또한 PUFA PKS 시스템을 이용해서 (유전적 개질에 의해 또는 내생적으로) PUFA를 제조하는 임의의 생물체에서 PUFA의 제조를 조절 및 증진시키는 독특한 기회를 제공한다. 특히, 본 발명은 PUFA PKS 시스템을 발현시키도록 유전적으로 개질된 생물체에서 발현시킬 수 있는 단백질 및 이를 코딩하는 핵산 분자 형태의 다양한 표적, 및 본원에 기재된 다른 유전적 개질 및 전략을 제공함으로써, 특히 생물체내의 바람직한 구획 또는 지질 분획에서 생물체에 의한 PUFA의 제조 및/또는 축적을 증진 또는 증가시킨다. 이러한 표적은 본원에서 일반적으로 PUFA PKS 시스템에 대한 "부속" 표적으로 지칭될 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, 표적은 본원에 기재된 바와 같은 숙주 생물체에서 발현 또는 과발현되는 것이 바람직한 핵산 분자 및/또는 그의 코딩된 단백질일 수 있으며, 결실 또는 불활성화에 관한 표적일 수 있거나, 또는 표적 세포소기관 (예, 식물의 색소체로의 표적화)이기도 하다. 달리 말하면, 표적은 PUFA의 제조를 위한 효소 시스템, 특히 PUFA PKS 시스템에 부가된 요소이거나 또는 이러한 시스템의 임의의 개질물일 수 있으며, 이 표적은 숙주 생물체내 지방산의 제조 및/또는 축적에 있어서 유용한 것으로 확인된다.
PUFA PKS 시스템 (PUFA 신타제)
따라서, 본 발명은 PUFA PKS 시스템과 관련하여 사용하기 위한 부속 단백질 및 다른 표적을 제공하는 것에 관한 것이다. 본원에 사용된 바와 같이, PUFA PKS 시스템 (PUFA 신타제 시스템 또는 PUFA 신타제이라고 지칭할 수도 있음)은 일반적으로 하기 식별 특징을 갖는다: (1) 상기 시스템은 그의 천연 생성물로서 PUFA, 특히 장쇄 PUFA를 제조함; 및 (2) 상기 시스템은 선택된 사이클에서의 트랜스-시스 이성질체화 및 에노일 환원 반응을 비롯해서 지방산 쇄의 반복적 프로세싱 및 비-반복적 프로세싱을 둘 다 수행하는 복합체로 어셈블리된 여러 다기능성 단백질을 포함한다. 또한, PUFA 신타제 효소에 존재하는 ACP 도메인은 보조인자(cofactor) (4-포스포판테테인)의 부착에 의한 활성화를 필요로 한다. 이러한 보조인자의 부착은 포스포판테테이닐 트랜스퍼라제 (PPTase)에 의해 수행된다. 숙주 생물체의 내생성 PPTase가 PUFA 신타제 ACP 도메인을 활성화할 수 없다면, 이후에는 이 기능을 수행할 수 있는 PPTase를 제공하는 것이 필요하다. 본 발명자들은 PUFA 신타제 ACP 도메인을 활성화하기 위한 예시적인 적합한 PPTase로서 Nostoc 종의 HetI 효소를 동정하였다. PUFA PKS 시스템 또는 PUFA 신타제에 대한 언급은 생물체에서 PUFA를 제조하는 복합체에서 작용하는 모든 유전자들 및 이들의 코딩된 생성물을 총칭해서 지칭한다. 따라서, PUFA PKS 시스템은 특히 천연 생성물이 PUFA인 PKS 시스템을 지칭한다.
보다 구체적으로, 본원에 언급된 PUFA PKS 시스템은 생성물로서 다불포화 지방산 (PUFA), 특히 장쇄 PUFA (LCPUFA)를 제조한다. 예를 들어, 내생적으로 (천연적으로) PUFA PKS 시스템을 함유하는 생물체는 상기 시스템을 이용해서 PUFA를 제조한다. 본 발명에 따라, PUFA는 16개 이상의 탄소, 바람직하게는 18개 이상의 탄소, 더 바람직하게는 20개 이상의 탄소, 훨씬 더 바람직하게는 22개 이상의 탄소로 된 탄소 쇄 길이를 갖고 적어도 3개 이상의 이중 결합, 바람직하게는 4개 이상, 더 바람직하게는 5개 이상, 훨씬 더 바람직하게는 6개 이상의 이중 결합을 함유하는 지방산이며, 모든 이중 결합는 시스 배치로 존재한다. 본원에서 장쇄 다불포화 지방산 (LCPUFA)에 대한 언급은 보다 구체적으로 18개 이상의 탄소 쇄 길이, 바람직하게는 20개 이상의 탄소 쇄 길이를 갖고 3개 이상의 이중 결합을 함유하는 지방산을 지칭한다. 오메가-6 시리즈의 LCPUFA로는 감마-리놀렌산 (C18:3), 디-호모-감마-리놀렌산 (C20:3n-6), 아라키돈산 (C20:4n-6), 아드렌산 (또한, 도코사테트라엔산 또는 DTA라고 부름) (C22:4n-6), 및 도코사펜타엔산 (C22:5n-6)을 들 수 있다. 오메가-3의 LCPUFA로는 알파-리놀렌산 (C18:3), 에이코사트리엔산 (C20:3n-3), 에이코사테트라엔산 (C20:4n-3), 에이코사펜타엔산 (C20:5n-3), 도코사펜타엔산 (C22:5n-3), 및 도코사헥사엔산 (C22:6n-3)을 들 수 있다. LCPUFA로는 또한 22개 초과의 탄소 및 4개 이상의 이중 결합을 갖는 지방산을 들 수 있으며, 이에는 C28:8(n-3)가 포함되지만 이에 한정되지 않는다.
또한 본 발명에 따른 PUFA PKS 시스템은 선택된 사이클에서의 트랜스-시스 이성질체화 및 에노일 환원 반응을 비롯해서 지방산 쇄의 반복적 프로세싱 및 비-반복적 프로세싱을 둘 다 수행하는 복합체로 어셈블리되는 여러 다기능성 단백질을 포함한다 (단일 기능 단백질, 특히 해양 세균 유래의 PUFA PKS 시스템을 포함할 수 있음). 이러한 단백질은 또한 본원에서 코어 PUFA PKS 효소 복합체 또는 코어 PUFA PKS 시스템으로 지칭될 수 있다. 이 단백질내에 함유된 도메인 및 모티프의 일반적인 기능은 각각 당업계에 공지되어 있으며, 해양 세균 및 진핵 생물체 유래의 다양한 PUFA PKS 시스템에 대하여 상세히 기재되어 왔다 (예, 미국 특허 제6,140,486호; 미국 특허 제6,566,583호; 문헌 [Metz et al., Science 293:290-293 (2001)]; 미국 특허 출원 공개 제20020194641호; 미국 특허 출원 공개 제20040235127호; 미국 특허 출원 공개 제20050100995호, 및 PCT 공개 제WO 2006/135866호 참조). 도메인은 상기 언급한 바와 같이 단일 단백질 (즉, 도메인 및 단백질은 동의어임)로서 또는 단일 단백질내 2개 이상의 (다중) 도메인의 하나로 존재할 수 있다.
해양 세균 및 트라우스토키트리움 구성원 유래의 다양한 PUFA PKS 시스템의 도메인 구축, 및 이러한 PUFA PKS 시스템을 구성하는 유전자들 및 단백질의 구조적 및 기능적 특징이 상세히 기술되어 왔다(예, 미국 특허 제6,140,486호; 미국 특허 제6,566,583호; 문헌 [Metz et al., Science 293:290-293 (2001)]; 미국 특허 출원 공개 제20020194641호; 미국 특허 출원 공개 제20040235127호; 미국 특허 출원 공개 제20050100995호 및 PCT 공개 제WO 2006/135866호 참조).
본 발명에 유용한 PUFA PKS 시스템 및 그의 단백질 또는 도메인은 세균성 및 비-세균성 PUFA PKS 시스템을 둘 다 포함한다. 비-세균성 PUFA PKS 시스템은 세균이 아닌, 예를 들면 진핵생물 또는 고세균인 생물체로부터 얻어지거나 또는 그로부터 유도된 PUFA PKS 시스템이다. 진핵생물은 세포의 분화 정도를 기준으로 원핵생물로부터 분리되는데, 진핵생물이 원핵생물보다 더 분화된 것이다. 일반적으로, 원핵생물은 핵막을 보유하지 않고, 세포 분열 동안 유사분열을 나타내지 않고, 염색체를 1개만 갖고, 세포질내에 70S 리보솜을 함유하고, 미토콘드리아, 소포체, 엽록체, 리소좀 또는 골지체를 보유하지 않으며, 존재하는 경우 단일 원섬유(fibril)를 함유하는 편모를 가질 수 있다. 대조적으로, 진핵생물은 핵막을 갖고, 세포 분열 동안 유사분열을 나타내고, 다수의 염색체를 갖고, 세포질 내에 80S 리보솜을 함유하고, 미토콘드리아, 소포체, (조류에서) 엽록체, 리소좀 및 골지체를 보유하며, 존재하는 경우 다수의 원섬유를 함유하는 편모를 가질 수 있다. 일반적으로, 세균은 원핵생물이지만, 조류, 진균, 원생생물(protist), 원생동물 및 고등 식물은 진핵생물이다. 본 발명에 따라, 다른 PKS 시스템 (제I형 반복적 또는 모듈성, 제II형, 또는 제III형) 또는 FAS 시스템으로부터의 PKS 기능성 도메인 또는 단백질 뿐만 아니라 세균성 PUFA PKS 기능성 도메인과 함께 비-세균성 PUFA PKS 기능성 도메인을 혼입하는 유전적으로 개질된 식물을 제조할 수 있다.
바람직하게는, 본 발명의 PUFA PKS 시스템은 전형적으로 3종 이상의 단백질 상에 함유되는 하기의 생물학적 활성 도메인을 적어도 포함한다: (a) 1개 이상의 에노일-ACP 리덕타제 (ER) 도메인; (b) 다중 아실 운반 단백질 (ACP) 도메인(들) (예, 적어도 1개 내지 4개, 바람직하게는 5개 이상의 ACP 도메인, 및 일부 실시양태에서는 6개, 7개, 8개, 9개, 10개 이하, 또는 10개 초과의 ACP 도메인); (c) 2개 이상의 β-케토아실-ACP 신타제 (KS) 도메인; (d) 1개 이상의 아실트랜스퍼라제 (AT) 도메인; (e) 1개 이상의 β-케토아실-ACP 리덕타제 (KR) 도메인; (f) 2개 이상의 FabA-유사 β-히드록시아실-ACP 데히드라제 (DH) 도메인; (g) 1개 이상의 쇄 길이 인자 (CLF) 도메인; (h) 1개 이상의 말로닐-CoA:ACP 아실트랜스퍼라제 (MAT) 도메인. 한 실시양태에서, 본 발명에 따른 PUFA PKS 시스템은 또한 데히드라타제 (DH) 보존된 활성 부위 모티프를 함유하는 1개 이상의 영역을 포함한다.
바람직한 실시양태에서, PUFA PKS 시스템은 적어도 하기 생물학적 활성 도메인을 포함한다: (a) 1개 이상의 에노일-ACP 리덕타제 (ER) 도메인; (b) 5개 이상의 아실 운반 단백질 (ACP) 도메인; (c) 2개 이상의 β-케토아실-ACP 신타제 (KS) 도메인; (d) 1개 이상의 아실트랜스퍼라제 (AT) 도메인; (e) 1개 이상의 β-케토아실-ACP 리덕타제 (KR) 도메인; (f) 2개 이상의 FabA-유사 β-히드록시아실-ACP 데히드라제 (DH) 도메인; (g) 1개 이상의 쇄 길이 인자 (CLF) 도메인; 및 (h) 1개 이상의 말로닐-CoA:ACP 아실트랜스퍼라제 (MAT) 도메인. 한 실시양태에서, 본 발명에 따른 PUFA PKS 시스템은 또한 FabA-유사 DH 도메인의 부분이 아닌 데히드라타제 (DH) 보존된 활성 부위 모티프를 함유하는 1개 이상의 영역 또는 도메인을 포함한다. 이들 도메인 각각의 구조적 및 기능적 특징은 미국 특허 출원 공개 제20020194641호; 미국 특허 출원 공개 제20040235127호; 미국 특허 출원 공개 제20050100995호; 및 PCT 공개 제WO 2006/135866호에 상세히 기재되어 있다.
본 발명에 따라, 3-케토 아실-ACP 신타제 (KS) 생물학적 활성 (기능)을 갖는 도메인 또는 단백질은 FAS (및 PKS) 연장 반응 사이클의 초기 단계를 수행하는 효소를 특징으로 한다. "β-케토아실-ACP 신타제"라는 용어는 "3-케토 아실-ACP 신타제", "β-케토 아실-ACP 신타제" 및 "케토-아실 ACP 신타제"라는 용어들 및 유사한 용어들과 함께 상호교환가능하게 사용될 수 있다. 연장용으로 예정된 아실기는 효소의 활성 부위에서 티오에스테르 결합에 의해 시스테인 잔기에 연결된다. 다단계 반응에서, 아실-효소는 말로닐-ACP와 축합반응을 수행하여 -케토 아실-ACP, CO2 및 유리 효소를 형성시킨다. KS는 연장 사이클에서 중요한 역할을 수행하며, 다수의 시스템에서 반응 사이클의 다른 효소보다 더 큰 기질 특이성을 보유하는 것으로 알려져 왔다. 예를 들어, 이. 콜라이는 3가지 상이한 KS 효소를 가지며, 이들 각각은 생물체의 생리학에서 그 자신의 특별한 역할을 수행한다 [Magnuson et al., Microbiol. Rev. 57, 522 (1993)]. 본원에 기재된 해양 세균 및 트라우스토키트리드에서 기술된 PUFA-PKS 시스템의 2개의 KS 도메인은 PUFA 생합성 반응 서열에서 상이한 역할을 수행할 수 있다. 효소의 분류에서, KS는 잘 특성화되었다. 다수의 확인된 KS 유전자들의 서열은 공지되어 있고, 활성 부위 모티프들이 확인되었으며, 여러 결정 구조가 결정되었다. 단백질 (또는 단백질의 도메인)은 공지된 KS 서열에 대한 상동성에 의해 KS 효소 패밀리에 속하는 것으로 쉽게 확인될 수 있다.
본 발명에 따라, 말로닐-CoA:ACP 아실트랜스퍼라제 (MAT) 생물학적 활성 (기능)을 갖는 도메인 또는 단백질은 말로닐-CoA로부터의 말로닐 잔기를 ACP에 전달하는 것으로 특성화된다. "말로닐-CoA:ACP 아실트랜스퍼라제"라는 용어는 "말로닐 아실트랜스퍼라제" 및 유사한 용어들과 함께 상호교환가능하게 사용될 수 있다. 활성 부위 모티프 (GxSxG) 이외에, 이들 효소는 주요 위치에서 R 및 Q 아미노산의 연장된 모티프를 보유하며, 이 모티프에 의해 상기 효소가 (예를 들어, 하기 기재된 AT 도메인과 달리) MAT 효소로서 확인된다. 일부 PKS 시스템에서 (단, PUFA PKS 도메인은 아님), MAT 도메인은 (상응하는 CoA 에스테르로부터) ACP 기 상으로 메틸- 또는 에틸-말로네이트를 선택적으로 로딩함으로써 선형 탄소 쇄에 분지를 도입하게 될 것이다. MAT 도메인은 공지된 MAT 서열에 대한 그의 상동성에 의해, 그리고 그의 연장된 모티프 구조에 의해 인식될 수 있다.
본 발명에 따라, 아실 운반 단백질 (ACP) 생물학적 활성 (기능)을 갖는 도메인 또는 단백질은 이 단백질의 공유 결합된 보조인자에 대한 티오에스테르 결합에 의해 지방 아실 쇄를 성장시키기 위한 운반자로서 기능하는 작은 폴리펩티드 (전형적으로, 아미노산 80 내지 100개 길이)인 것을 특징으로 한다. 상기 폴리펩티드는 별도의 단위로 또는 더 큰 단백질 내의 도메인으로 존재한다. ACP는 CoA의 포스포판테테이닐 잔기가 ACP의 고도로 보존된 세린 잔기로 전달됨으로써 불활성 아포(apo)-형태로부터 기능적 홀로(holo)-형태로 전환된다. 아실기는 포스포판테테이닐 잔기의 유리 말단에서 티오에스테르 결합에 의해 ACP에 부착된다. ACP는 방사활성 판테테인으로 표지함으로써, 그리고 공지된 ACP에 대한 서열 상동성에 의해 확인될 수 있다. 상기 언급된 모티프 (LGIDS*)의 개질물의 존재는 또한 ACP의 표시(signature)이다.
본 발명에 따라, 3-케토아실-ACP 리덕타제 (KR) 생물학적 활성 (기능)이라고도 불리우는 케토리덕타제 활성을 갖는 도메인 또는 단백질은 3-케토 아실 형태의 ACP의 피리딘-뉴클레오티드-의존성 환원을 촉매하는 것으로 특성화된다. 이는 드노보 지방산 생합성 연장 사이클에서 첫번째 환원 단계이며, 폴리케티드 생합성에서 흔히 수행되는 반응이다. "β-케토아실-ACP 리덕타제"라는 용어는 "케토리덕타제", "3-케토아실-ACP 리덕타제", "케토-아실 ACP 리덕타제"라는 용어들, 및 상기 용어와 유사한 용어들과 상호교환가능하게 사용될 수 있다. FAS의 다른 리덕타제인 에노일 ACP 리덕타제 (ER)의 한 패밀리 (단, PUFA PKS 시스템에 존재하는 ER 패밀리는 아님)와 단쇄 알콜 데히드로게나제 패밀리 사이에 유의한 서열 유사성이 관찰된다. 상기 나타낸 PUFA PKS 영역의 Pfam 분석은 코어 영역에서 단쇄 알콜 데히드로게나제 패밀리에 대한 상동성을 나타낸다. 동일한 영역에 대한 Blast 분석은 코어 영역에서 공지된 KR 효소에 대한 대응 및 다른 특성화된 PUFA PKS 시스템으로부터의 도메인에 대한 연장된 영역의 상동성을 나타낸다.
본 발명에 따라, 도메인 또는 단백질은 하기 이론적 설명을 기초로 쇄 길이 인자 (CLF)라고 지칭된다. CLF는 본래 제II형 (해리된 효소) PKS 시스템의 특징으로 기술되었으며, 연장 사이클의 횟수, 따라서 최종 생성물의 쇄 길이를 결정하는데 있어서 역할을 수행한다는 가설이 세워졌다. CLF 아미노산 서열은 KS 도메인에 대한 상동성을 나타내지만 (KS 단백질과 헤테로이량체를 형성하는 것으로 생각됨), 상기 서열은 활성 부위 시스테인이 결여되어 있다. PKS 시스템에서의 CLF의 역할은 논쟁의 여지가 있어 왔다. 새로운 증거 [C. Bisang et al., Nature 401, 502 (1999)]는 PKS 시스템을 개시 (연장될 초기 아실기를 제공)하는 데 있어서의 역할을 제안한다. 이 역할에서, CLF 도메인은 말로네이트를 (말로닐-ACP로서) 탈카르복실화함으로써, KS 활성 부위로 전달될 수 있는 아세테이트기를 형성하는 것으로 생각된다. 따라서, 이 아세테이트는 초기 연장(축합) 반응을 수행할 수 있는 "개시" 분자로서 작용한다. 제II형 CLF의 상동체가 일부 모듈성 PKS 시스템에서 '로딩' 도메인으로서 확인되었다. CLF의 서열 특징을 갖는 도메인은 현재 확인된 모든 PUFA PKS 시스템에 존재하며, 각 경우에서 다중단백질의 부분으로서 존재한다.
"아실트랜스퍼라제" 또는 "AT"는 다수의 상이한 아실 전달 반응을 수행할 수 있는 일반적인 효소 군으로서 지칭된다. "아실트랜스퍼라제"라는 용어는 "아실 트랜스퍼라제"라는 용어와 상호교환가능하게 사용될 수 있다. 본원에 기재된 바와 같은 PUFA PKS 시스템에서 확인된 AT 도메인은 현재 조사된 다른 PUFA PKS 시스템의 모두에 존재하는 도메인에 대해 서로 양호한 상동성을 나타내며, 특정 기능이 확인된 일부 아실트랜스퍼라제 (예, 말로닐-CoA:ACP 아실트랜스퍼라제, MAT)에 대해 매우 약한 상동성을 나타낸다. MAT에 대한 약한 상동성에도 불구하고, 상기 AT 도메인은 그러한 효소의 연장된 모티프 구조 특징을 보유하지 않기 때문에 MAT로서 기능하는 것으로 여겨지지 않는다 (MAT 도메인에 대한 상기 설명 참조). 이에 대한 개시 목적으로, PUFA PKS 시스템에서의 AT 도메인의 가능한 기능들로는 하기 것들을 들 수 있지만 이에 한정되지 않는다: ORFA ACP 도메인(들)로부터 물로 지방 아실기를 전달함 (즉, 티오에스테라제 - 지방 아실기를 유리 지방산으로서 방출함), 지방 아실기를 CoA와 같은 어셉터(acceptor)로 전달함, 아실기를 다양한 ACP 도메인 중에 전달함, 또는 지방 아실기를 친지질성 어셉터 분자 (예, 리소포스파드산(lysophosphadic acid))에 전달함.
본 발명에 따라, 상기 도메인은 에노일 리덕타제 (ER) 생물학적 활성을 갖는다. ER 효소는 지방 아실-ACP에서 (DH 활성에 의해 도입된) 트랜스-이중 결합을 감소시켜 완전히 포화된 상기 탄소를 생성시킨다. PUFA-PKS에서의 ER 도메인은 새로 특성화된 ER 효소 패밀리에 대한 상동성을 나타낸다 [Heath et al., Nature 406, 145 (2000)]. 히쓰(Heath)와 록(Rock)은 스트렙토코커스 뉴모니애(Streptococcus pneumoniae)로부터 대상 유전자를 클로닝하고, 이 유전자로부터 발현된 단백질을 정제하고, 그가 시험관내 검정에서 ER 활성을 나타냈음을 보여줌으로써 이러한 새로운 종류의 ER 효소를 확인하였다. 현재 조사된 모든 PUFA PKS 시스템은 쉬조키트리움 ER 도메인에 대해 매우 높은 서열 상동성을 갖는 하나 이상의 도메인을 함유하는데, 이는 에스. 뉴모니애(S. pneumoniae) ER 단백질에 대해 상동성을 나타낸다.
본 발명에 따라, 데히드라제 또는 데히드라타제 (DH) 활성을 갖는 단백질 또는 도메인은 탈수 반응을 촉매한다. 본원에서 일반적으로 사용된 바와 같이, DH 활성에 대한 언급은 전형적으로 FabA-유사 β-히드록시아실-ACP 데히드라제 (DH) 생물학적 활성을 지칭한다. FabA-유사 β-히드록시아실-ACP 데히드라제 (DH) 생물학적 활성은 β-케토아실-ACP로부터 HOH를 제거하며, 탄소 쇄에서 초기에 트랜스 이중 결합을 생성시킨다. "FabA-유사 β-히드록시아실-ACP 데히드라제"라는 용어는 "FabA-유사 β-히드록시 아실-ACP 데히드라제", "β-히드록시아실-ACP 데히드라제", "데히드라제"라는 용어들 및 이와 유사한 용어들과 상호교환가능하게 사용될 수 있다. PUFA PKS 시스템의 DH 도메인은 (다른 PKS 시스템의 DH 도메인에 대해서 보다는) 그의 FAS 시스템과 관련된 세균성 DH 효소에 대해 상동성을 나타낸다. 세균성 DH의 하위세트인 FabA-유사 DH는 시스-트랜스 이소머라제 활성을 보유한다 [Heath et al., J. Biol. Chem., 271, 27795 (1996)]. FabA-유사 DH 단백질에 대한 상동성은 본원에 기재된 하나 또는 모든 DH 도메인이 PUFA PKS 생성물에서 시스 이중 결합의 삽입을 담당한다는 것을 암시한다.
본 발명의 유용한 PUFA PKS 단백질은 또한, 일반적으로 본원에서 비-FabA-유사 DH 활성, 또는 비-FabA-유사 β-히드록시아실-ACP 데히드라제 (DH) 생물학적 활성으로 지칭되는 FabA-유사로 특성화되지 않은 데히드라타제 활성을 가질 수 있다 (예를 들어, 상기 기술된 시스-트랜스 활성은 FabA-유사 활성과 관련이 있다). 보다 구체적으로, 보존된 활성 부위 모티프 (아미노산 약 13개 길이: L*xxHxxxGxxxxP; 예를 들어, 서열 70의 아미노산 2504-2516에 의해 예시됨; *모티프에서, L은 또한 I일 수 있음)는 PKS 시스템에서 데히드라타제 도메인내에 존재한다 [Donadio S, Katz L. Gene. 1992 Feb 1;111(1):51-60]. 본원에서 데히드라타제 (DH) 보존된 활성 부위 모티프 또는 DH 모티프라고도 지칭되는 이러한 보존된 모티프는 최근까지 기술된 모든 공지된 PUFA-PKS 서열의 유사한 영역내 및 본원에 기재된 바와 같은 PUFA PKS 서열내에 존재하지만, his 모티프는 단지 최근에 검출된 것으로 여겨진다. 이러한 보존된 모티프는 PUFA-PKS 서열에서 높은 상동성을 갖는 특성화되지 않은 영역내에 존재한다. PUFA-PKS에 의한 PUFA의 제안된 생합성은 비-FabA 유사 탈수를 필요로 하며, 이러한 모티프는 반응을 담당할 수 있다.
예시 목적으로, 여러 PUFA PKS 시스템의 구조는 하기에 상세히 기재되어 있다. 그러나, 본 발명은 이러한 PUFA PKS 시스템의 사용으로 제한되지 않는 것으로 이해된다.
쉬조키트리움 PUFA PKS 시스템
한 실시양태에서, 쉬조키트리움 유래의 PUFA PKS 시스템은 적어도 하기 생물학적 활성 도메인을 포함한다: (a) 2개의 에노일-ACP 리덕타제 (ER) 도메인; (b) 5개 내지 10개 이상의 아실 운반 단백질 (ACP) 도메인, 및 한 측면에서 9개의 ACP 도메인; (c) 2개의 β-케토아실-ACP 신타제 (KS) 도메인; (d) 1개의 아실트랜스퍼라제 (AT) 도메인; (e) 1개의 β-케토아실-ACP 리덕타제 (KR) 도메인; (f) 2개의 FabA-유사 β-히드록시아실-ACP 데히드라제 (DH) 도메인; (g) 1개의 쇄 길이 인자 (CLF) 도메인; 및 (h) 1개의 말로닐-CoA:ACP 아실트랜스퍼라제 (MAT) 도메인. 한 실시양태에서, 본 발명에 따른 쉬조키트리움 PUFA PKS 시스템은 또한 FabA-유사 DH 도메인의 부분이 아닌 데히드라타제 (DH) 보존된 활성 부위 모티프를 함유하는 하나 이상의 영역 또는 도메인을 포함한다. 이들 도메인의 구조적 및 기능적 특징은 일반적으로 각각 당업계에 공지되어 있다 (예를 들어, 미국 특허 제6,566,583호; 문헌 [Metz et al., Science 293:290-293 (2001)]; 미국 특허 출원 공개 제20020194641호; 및 PCT 공개 제WO 2006/135866호 참조).
상기 기재된 코어 쉬조키트리움 PUFA PKS 시스템을 형성하는 3개의 오픈 리딩 프레임이 존재한다. 각 오픈 리딩 프레임의 도메인 구조는 다음과 같다.
쉬조키트리움 오픈 리딩 프레임 A (OrfA):
OrfA의 완전한 뉴클레오티드 서열은 본원에서 서열 1로 나타낸다. OrfA는 본원에서 서열 2로 나타낸, 2910개의 아미노산 서열을 코딩하는 8730개의 뉴클레오티드 서열 (종결 코돈은 포함하지 않음)이다. OrfA 내에는 다음과 같은 12개의 도메인이 존재한다: (a) 1개의 β-케토 아실-ACP 신타제 (KS) 도메인; (b) 1개의 말로닐-CoA:ACP 아실트랜스퍼라제 (MAT) 도메인; (c) 9개의 아실 운반 단백질 (ACP) 도메인; 및 (d) 1개의 케토리덕타제 (KR) 도메인. 쉬조키트리움 종(Schizochytrium sp.) ATCC 20888, 및 쉬조키트리움 종, 균주 N230D로 명명된 ATCC 20888의 자손 균주 둘 다로부터의 OrfA를 코딩하는 게놈 DNA 클론 (플라스미드)을 단리 및 서열화하였다.
쉬조키트리움 종 ATCC 20888로부터 단리된, 본원에서 JK1126으로 기재된 게놈 클론은 본 발명자들이 가장 잘 알고있는 바와 같이 서열 1의 위치 1 내지 8730에 걸쳐있는 뉴클레오티드 서열을 포함하며, 서열 2의 상응하는 아미노산 서열을 코딩한다. 게놈 클론 pJK1126 (쉬조키트리움 ATCC 20888로부터의 "OrfA" 유전자를 함유하는 이. 콜라이 플라스미드 벡터 형태의 pJK1126 OrfA 게놈 클론으로 표시됨)은 2006년 6월 8일자로 미국 20110-2209 버지니아주 마나사스 유니버시티 불러바드 10801에 소재하는 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 (ATCC)에 기탁되었으며, ATCC 기탁 번호 PTA-7648을 배정받았다. pJK1126 OrfA 게놈 클론의 뉴클레오티드 서열 및 이 플라스미드에 의해 코딩된 아미노산 서열은 본 발명에 포함된다.
쉬조키트리움 종 N230D으로부터 함께 단리되며 본원에 pJK306 OrfA 게놈 클론 및 pJK320 OrfA 게놈 클론으로 기재된 2개의 게놈 클론 (중복 클론)은 본 발명자들이 가장 잘 알고있는 바와 같이 서열 1의 뉴클레오티드 서열을 포함하며 서열 2의 아미노산 서열을 코딩한다. 게놈 클론 pJK306 (쉬조키트리움 종 N230D (pJK320과 2.2kB 중복됨)으로부터의 OrfA 유전자의 5' 부분을 함유하는 이. 콜라이 플라스미드 형태의 pJK306 OrfA 게놈 클론으로 표시됨)은 2006년 6월 8일자로 미국 20110-2209 버지니아주 마나사스 유니버시티 불러바드 10801에 소재하는 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 (ATCC)에 기탁되었으며, ATCC 기탁 번호 PTA-7641을 배정받았다. pJK306 OrfA 게놈 클론의 뉴클레오티드 서열 및 이 플라스미드에 의해 코딩되는 아미노산 서열은 본 발명에 포함된다. 게놈 클론 pJK320 (쉬조키트리움 종 N230D (pJK306과 2.2kB 중복됨)으로부터의 OrfA 유전자의 3' 부분을 함유하는 이. 콜라이 플라스미드 형태의 pJK320 OrfA 게놈 클론으로 표시됨)은 2006년 6월 8일자로 미국 20110-2209 버지니아주 마나사스 유니버시티 불러바드 10801에 소재하는 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 (ATCC)에 기탁되었으며, ATCC 기탁 번호 PTA-7644를 배정받았다. pJK320 OrfA 게놈 클론의 뉴클레오티드 서열 및 이 플라스미드에 의해 코딩되는 아미노산 서열은 본 발명에 포함된다.
OrfA의 제1 도메인은 본원에서 ORFA-KS라고도 지칭되는 KS 도메인이며, ORFA-KS 도메인을 코딩하는 서열을 함유하는 뉴클레오티드 서열은 본원에서 서열 7 (서열 1의 위치 1-1500)로 나타낸다. ORFA-KS 도메인을 함유하는 아미노산 서열은 본원에서 서열 8 (서열 2의 위치 1-500)로 나타낸다. ORFA-KS 도메인이 활성 부위 모티프: DXAC* (*아실 결합 부위 C215)를 함유한다는 것을 유의한다. 또한, 쉬조키트리움 KS 영역의 말단에 있는 특징적인 모티프인 GFGG는 서열 2내의 상기 도메인, 즉 서열 8 내에 존재한다.
OrfA의 제2 도메인은 본원에서 ORFA-MAT라고도 지칭되는 MAT 도메인이며, ORFA-MAT 도메인을 코딩하는 서열을 함유하는 뉴클레오티드 서열은 본원에서 서열 9 (서열 1의 위치 1723-3000)로 나타낸다. ORFA-MAT 도메인을 함유하는 아미노산 서열은 본원에서 서열 10 (서열 2의 위치 575-1000)으로 나타낸다. MAT 도메인은 위치 93에서 아스파르테이트 및 서열 94에서 히스티딘을 포함한다 (각각 서열 2의 위치 667 및 668에 상응함). ORFA-MAT 도메인은 본원에서 서열 11로 나타낸 활성 부위 모티프: GHS*XG (*아실 결합 부위 S706)를 함유한다는 것을 유의한다.
OrfA의 도메인 3-11은 본원에서 ORFA-ACP라고도 지칭되는 9개의 탄뎀(tandem) ACP 도메인이다 (예컨대, 이 서열의 제1 도메인은 ORFA-ACP1이고, 제2 도메인은 ORFA-ACP2이고, 제3 도메인은 ORFA-ACP3임). 제1 ACP 도메인인 ORFA-ACP1은 서열 1 (OrfA)의 위치 약 3343 내지 위치 약 3600에 걸쳐있는 뉴클레오티드내에 함유되어 있다. ORFA-ACP1 도메인을 코딩하는 서열을 함유하는 뉴클레오티드 서열은 본원에서 서열 12 (서열 1의 위치 3343-3600)로 나타낸다. 제1 ACP 도메인을 함유하는 아미노산 서열은 서열 2의 위치 약 1115 내지 위치 약 1200에 걸쳐있다. ORFA-ACP1 도메인을 함유하는 아미노산 서열은 본원에서 서열 13 (서열 2의 위치 1115-1200)으로 나타낸다. ORFA-ACP1 도메인은 본원에서 서열 14로 나타낸 활성 부위 모티프: LGIDS* (*판테테인 결합 모티프 S1157)를 함유한다는 것을 유의한다.
9개의 ACP 도메인 모두의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열은 고도로 보존되어 있으며, 따라서 각 도메인의 서열은 본원에서 개별 서열 식별자(identifier)로 나타내지 않는다. 그러나, 본원에 개시된 정보를 기초로, 당업자라면 다른 8개의 ACP 도메인의 각각을 함유하는 서열을 용이하게 결정할 수 있을 것이다. 9개의 ACP 도메인 모두는 함께 서열 1의 위치 약 3283 내지 위치 약 6288의 OrfA의 영역에 걸쳐있으며, 이는 서열 2의 약 1095 내지 약 2096의 아미노산 위치에 상응한다. 9개의 도메인 모두를 함유하는 전체 ACP 영역에 대한 뉴클레오티드 서열은 본원에서 서열 16으로 나타낸다. 서열 16으로 나타낸 영역은 개별 ACP 도메인 사이의 링커 세그먼트를 포함한다. 9개의 도메인에 대한 반복 간격은 서열 16의 뉴클레오티드 대략 330개 마다이다 (인접한 활성 부위 세린 사이에서 측정된 아미노산의 실제 수는 아미노산 104개 내지 116개의 범위임). 9개의 ACP 도메인의 각각은 (본원에서 서열 14로 나타낸) 판테테인 결합 모티프 LGIDS*를 함유하며, 여기서 S*는 판테테인 결합 부위 세린 (S)이다. 판테테인 결합 부위 세린 (S)은 각각의 ACP 도메인 서열의 중심 근처에 위치한다. ACP 도메인 영역의 각 말단에서 및 각 ACP 도메인 사이에는 프롤린 (P) 및 알라닌 (A)이 고도로 풍부한 영역이 존재하며, 이는 링커 영역인 것으로 여겨진다. 예를 들어, ACP 도메인 1과 2 사이에는 본원에서 서열 15로 나타낸 서열 APAPVKAAAPAAPVASAPAPA이 있다. 서열 2의 아미노산 서열에 대하여 9개의 ACP 도메인 각각에 있어서의 활성 부위 세린 잔기 (즉, 판테테인 결합 부위)의 위치는 다음과 같다: ACP1 = S1157; ACP2 = S1266; ACP3 = S1377; ACP4 = S1488; ACP5 = S1604; ACP6 = S1715; ACP7 = S1819; ACP8 = S1930; 및 ACP9 = S2034. ACP 도메인의 평균 크기가 링커를 제외하고 아미노산 약 85개이고, 링커를 포함하면 아미노산 약 110개이며, 활성 부위 세린이 대략 도메인 중심에 있음을 고려하면, 당업자는 OrfA에서 9개의 ACP 도메인 각각의 위치를 용이하게 결정할 수 있을 것이다.
OrfA의 도메인 12는 본원에서 ORFA-KR이라고도 지칭되는 KR 도메인이며, ORFA-KR 도메인을 코딩하는 서열을 함유하는 뉴클레오티드 서열은 본원에서 서열 17 (서열 1의 위치 6598-8730)로 나타낸다. ORFA-KR 도메인을 함유하는 아미노산 서열은 본원에서 서열 18 (서열 2의 위치 2200-2910)로 나타낸다. KR 도메인 내에는 단쇄 알데히드-데히드로게나제에 대해 상동성을 갖는 코어 영역이 존재한다 (KR은 이 패밀리의 구성원임). 이 코어 영역은 서열 1의 위치 약 7198 내지 위치 약 7500에 걸쳐있으며, 이는 서열 2의 아미노산 위치 2400-2500에 상응한다.
쉬조키트리움 오픈 리딩 프레임 B (OrfB):
OrfB에 대한 완전한 뉴클레오티드 서열은 본원에서 서열 3으로 나타낸다. OrfB는 본원에서 서열 4로 나타낸 2059개의 아미노산 서열을 코딩하는 6177개의 뉴클레오티드 서열 (종결 코돈은 포함하지 않음)이다. OrfB 내에는 다음과 같은 4개의 도메인이 존재한다: (a) 1개의-케토 아실-ACP 신타제 (KS) 도메인; (b) 1개의 쇄 길이 인자 (CLF) 도메인; (c) 1개의 아실 트랜스퍼라제 (AT) 도메인; 및 (d) 1개의 에노일 ACP-리덕타제 (ER) 도메인.
쉬조키트리움 종 ATCC 20888, 및 쉬조키트리움 종, 균주 N230D로 명명된 ATCC 20888의 자손 균주 둘 다로부터의 OrfB를 코딩하는 게놈 DNA 클론 (플라스미드)이 단리 및 서열화되었다.
쉬조키트리움 종 ATCC 20888로부터 단리된, 본원에서 pJK1129로 기재된 게놈 클론은 본 발명자들이 가장 잘 알고있는 바와 같이 서열 3의 뉴클레오티드 서열을 포함하며 서열 4의 아미노산 서열을 코딩한다. 게놈 클론 pJK1129 (쉬조키트리움 ATCC 20888로부터의 "OrfB" 유전자를 함유하는 이. 콜라이 플라스미드 벡터 형태의 pJK1129 OrfB 게놈 클론이라 표시됨)은 2006년 6월 8일자로 미국 20110-2209 버지니아주 마나사스 유니버시티 불러바드 10801에 소재하는 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 (ATCC)에 기탁되었으며, ATCC 기탁 번호 PTA-7649를 배정받았다. pJK1126 OrfB 게놈 클론의 뉴클레오티드 서열 및 이 플라스미드에 의해 코딩되는 아미노산 서열은 본 발명에 포함된다.
쉬조키트리움 종 N230D로부터 단리된, 본원에서 pJK324 OrfB 게놈 클론으로 기재된 게놈 클론은 본 발명자들이 가장 잘 알고있는 바와 같이 서열 3의 뉴클레오티드 서열을 포함하며 서열 4의 아미노산 서열을 코딩한다. 게놈 클론 pJK324 (쉬조키트리움 종 N230D로부터의 OrfB 유전자 서열을 함유하는 이. 콜라이 플라스미드 형태의 pJK324 OrfB 게놈 클론으로 표시됨)는 2006년 6월 8일자로 미국 20110-2209 버지니아주 마나사스 유니버시티 불러바드 10801에 소재하는 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 (ATCC)에 기탁되었으며, ATCC 기탁 번호 PTA-7643을 배정받았다. pJK324 OrfB 게놈 클론의 뉴클레오티드 서열 및 이 플라스미드에 의해 코딩되는 아미노산 서열은 본 발명에 포함된다.
OrfB의 제1 도메인은 본원에서 ORFB-KS라고도 지칭되는 KS 도메인이며, ORFB-KS 도메인을 코딩하는 서열을 함유하는 뉴클레오티드 서열은 본원에서 서열 19 (서열 3의 위치 1-1350)로 나타낸다. ORFB-KS 도메인을 함유하는 아미노산 서열은 본원에서 서열 20 (서열 4의 위치 1-450)으로 나타낸다. 이 KS 도메인은 서열 20의 위치 371의 발린 (또한 서열 20의 위치 371)을 포함한다. ORFB-KS 도메인이 활성 부위 모티프: DXAC* (*아실 결합 부위 C196)을 함유한다는 것을 유의한다. 또한, 상기 KS 영역의 말단에 있는 특징적인 모티프인 GFGG는 서열 4의 상기 도메인내, 따라서 서열 20내에 존재한다.
OrfB의 제2 도메인은 본원에서 ORFB-CLF라고도 지칭되는 CLF 도메인이며, ORFB-CLF 도메인을 코딩하는 서열을 함유하는 뉴클레오티드 서열은 본원에서 서열 21 (서열 3의 위치 1378-2700)로 나타낸다. ORFB-CLF 도메인을 함유하는 아미노산 서열은 본원에서 서열 22 (서열 4의 위치 460-900)로 나타낸다. ORFB-CLF 도메인이 아실-결합 시스테인이 없는 KS 활성 부위 모티프를 함유한다는 것을 유의한다.
OrfB의 제3 도메인은 본원에서 ORFB-AT라고도 지칭되는 AT 도메인이며, ORFB-AT 도메인을 코딩하는 서열을 함유하는 뉴클레오티드 서열은 본원에서 서열 23 (서열 3의 위치 2701-4200)으로 나타낸다. ORFB-AT 도메인을 함유하는 아미노산 서열은 본원에서 서열 24 (서열 4의 위치 901-1400)로 나타낸다. ORFB-AT 도메인은 아실트랜스퍼라제 (AT) 단백질의 특징인 GxS*xG (*아실 결합 부위 S1140)의 활성 부위 모티프를 함유한다는 것을 유의한다.
OrfB의 제4 도메인은 본원에서 ORFB-ER이라고도 지칭되는 ER 도메인이며, ORFB-ER 도메인을 코딩하는 서열을 함유하는 뉴클레오티드 서열은 본원에서 서열 25 (서열 3의 위치 4648-6177)로 나타낸다. ORFB-ER 도메인을 함유하는 아미노산 서열은 본원에서 서열 26 (서열 4의 위치 1550-2059)으로 나타낸다.
쉬조키트리움 오픈 리딩 프레임 C (OrfC):
OrfC에 대한 완전한 뉴클레오티드 서열은 본원에서 서열 5로 나타낸다. OrfC는 본원에서 서열 6으로 나타내는 1502개의 아미노산 서열을 코딩하는 4506개의 뉴클레오티드 서열 (종결 코돈은 포함하지 않음)이다. OrfC 내에는 다음과 같은 3개의 도메인이 존재한다: (a) 2개의 FabA-유사-히드록시 아실-ACP 데히드라제 (DH) 도메인; 및 (b) 1개의 에노일 ACP-리덕타제 (ER) 도메인.
쉬조키트리움 종 ATCC 20888, 및 쉬조키트리움 종, 균주 N230D로 명명된 ATCC 20888의 자손 균주 둘 다로부터의 OrfC를 코딩하는 게놈 DNA 클론 (플라스미드)을 단리 및 서열화하였다.
쉬조키트리움 종 ATCC 20888로부터 단리된, 본원에서 pJK1131로 기재된 게놈 클론은 본 발명자들이 가장 잘 알고있는 바와 같이 서열 5의 뉴클레오티드 서열을 포함하며 서열 6의 아미노산 서열을 코딩한다. 게놈 클론 pJK1131 (쉬조키트리움 ATCC 20888로부터의 "OrfC" 유전자를 함유하는 이. 콜라이 플라스미드 벡터 형태의 pJK1131 OrfC 게놈 클론으로 표시됨)은 2006년 6월 8일자로 미국 20110-2209 버지니아주 마나사스 유니버시티 불러바드 10801에 소재하는 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 (ATCC)에 기탁되었으며, ATCC 기탁 번호 PTA-7650을 배정받았다. pJK1131 OrfC 게놈 클론의 뉴클레오티드 서열 및 이 플라스미드에 의해 코딩되는 아미노산 서열은 본 발명에 포함된다.
쉬조키트리움 종 N230D으로부터 단리된, 본원에서 pBR002 OrfC 게놈 클론으로 기재된 게놈 클론은 본 발명자들이 가장 잘 알고있는 바와 같이 서열 5의 뉴클레오티드 서열을 포함하며 서열 6의 아미노산 서열을 코딩한다. 게놈 클론 pBR002 (쉬조키트리움 종 N230D로부터의 OrfC 유전자 서열을 함유하는 이. 콜라이 플라스미드 벡터 형태의 pBR002 OrfC 게놈 클론으로 표시됨)은 2006년 6월 8일자로 미국 20110-2209 버지니아주 마나사스 유니버시티 불러바드 10801에 소재하는 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 (ATCC)에 기탁되었으며, ATCC 기탁 번호 PTA-7642를 배정받았다. pBR002 OrfC 게놈 클론의 뉴클레오티드 서열 및 이 플라스미드에 의해 코딩되는 아미노산 서열은 본 발명에 포함된다.
OrfC의 제1 도메인은 본원에서 ORFC-DH1이라고도 지칭되는 DH 도메인이다. 이는 OrfC의 2개의 DH 도메인의 하나이며, 따라서 DH1로 표시된다. ORFC-DH1 도메인을 코딩하는 서열을 함유하는 뉴클레오티드 서열은 본원에서 서열 27 (서열 5의 위치 1-1350)로 나타낸다. ORFC-DH1 도메인을 함유하는 아미노산 서열은 본원에서 서열 28 (서열 6의 위치 1-450)로 나타낸다.
OrfC의 제2 도메인은 본원에서 ORFC-DH2라고도 지칭되는 DH 도메인이다. 이는 OrfC의 2개의 DH 도메인 중 두번째 것이며, 따라서 DH2로 나타낸다. ORFC-DH2 도메인을 코딩하는 서열을 함유하는 뉴클레오티드 서열은 본원에서 서열 29 (서열 5의 위치 1351-2847)로 나타낸다. ORFC-DH2 도메인을 함유하는 아미노산 서열은 본원에서 서열 30 (서열 6의 위치 451-949)으로 나타낸다. 이 DH 도메인은 서열 30의 위치 426-440에서 아미노산 H-G-I-A-N-P-T-F-V-H-A-P-G-K-I (서열 6의 위치 876-890)를 포함한다.
OrfC의 제3 도메인은 본원에서 ORFC-ER이라고도 지칭되는 ER 도메인이며, ORFC-ER 도메인을 코딩하는 서열을 함유하는 뉴클레오티드 서열은 본원에서 서열 31 (서열 5의 위치 2995-4506)로 나타낸다. ORFC-ER 도메인을 함유하는 아미노산 서열은 본원에서 서열 32 (서열 6의 위치 999-1502)로 나타낸다.
트라우스토키트리움 PUFA PKS 시스템
한 실시양태에서, 트라우스토키트리움 PUFA PKS 시스템은 적어도 하기 생물학적 활성 도메인을 포함한다: (a) 2개의 에노일-ACP 리덕타제 (ER) 도메인; (b) 5개 내지 10개 또는 그보다 많은 아실 운반 단백질 (ACP) 도메인, 및 한 측면에서 8개의 ACP 도메인; (c) 2개의 β-케토아실-ACP 신타제 (KS) 도메인; (d) 1개의 아실트랜스퍼라제 (AT) 도메인; (e) 1개의 β-케토아실-ACP 리덕타제 (KR) 도메인; (f) 2개의 FabA-유사 β-히드록시아실-ACP 데히드라제 (DH) 도메인; (g) 1개의 쇄 길이 인자 (CLF) 도메인; 및 (h) 1개의 말로닐-CoA:ACP 아실트랜스퍼라제 (MAT) 도메인. 한 실시양태에서, 본 발명에 따른 트라우스토키트리움 PUFA PKS 시스템은 또한 FabA-유사 DH 도메인의 부분이 아닌 데히드라타제 (DH) 보존된 활성 부위 모티프를 함유하는 하나 이상의 영역 또는 도메인을 포함한다. 이들 도메인의 구조적 및 기능적 특징은 일반적으로 각각 당업계에 공지되어 있다 (예를 들어, 미국 특허 공개 제2004035127호, 상기 참조).
상기 기재된 코어 트라우스토키트리움 23B PUFA PKS 시스템을 형성하는 3개의 오픈 리딩 프레임이 존재한다. 각 오픈 리딩 프레임의 도메인 구조는 다음과 같다.
트라우스토키트리움 23B 오픈 리딩 프레임 A (OrfA):
Th. 23B OrfA에 대한 완전한 뉴클레오티드 서열은 본원에서 서열 38로 나타낸다. Th. 23B OrfA는 본원에서 서열 39로 나태낸, 2811개의 아미노산 서열을 코딩하는 8433개의 뉴클레오티드 서열 (종결 코돈은 포함하지 않음)이다. 서열 38은 Th. 23B OrfA에서 하기 도메인을 코딩한다: (a) 1개의 β-케토아실-ACP 신타제 (KS) 도메인; (b) 1개의 말로닐-CoA:ACP 아실트랜스퍼라제 (MAT) 도메인; (c) 8개의 아실 운반 단백질 (ACP) 도메인; 및 (d) 1개의 β-케토아실-ACP 리덕타제 (KR) 도메인.
트라우스토키트리움 23B로부터 함께 단리된, 본원에서 Th23BOrfA_pBR812.1 및 Th23BOrfA_pBR811 (OrfA 게놈 클론)로 기재된 2개의 게놈 클론 (중복 클론)은, 본 발명자들이 가장 잘 알고있는 바와 같이, 서열 38의 뉴클레오티드 서열을 포함하며, 서열 39의 아미노산 서열을 코딩한다. 게놈 클론 Th23BOrfA_pBR812.1 (트라우스토키트리움 23B로부터의 OrfA 유전자 서열을 함유하는 이. 콜라이 플라스미드 벡터 형태의 Th23BOrfA_pBR812.1 게놈 클론으로 표시됨)은 2007년 3월 1일자로 미국 20110-2209 버지니아주 마나사스 유니버시티 불러바드 10801에 소재하는 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 (ATCC)에 기탁되었으며, ATCC 기탁 번호 PTA-8232를 배정받았다. Th23BOrfA_pBR812.1, OrfA 게놈 클론의 뉴클레오티드 서열 및 이 플라스미드에 의해 코딩되는 아미노산 서열은 본 발명에 포함된다. 게놈 클론 Th23BOrfA_pBR811 (트라우스토키트리움 23B로부터의 OrfA 유전자 서열을 함유하는 이. 콜라이 플라스미드 벡터 형태의 Th23BOrfA_pBR811 게놈 클론으로 표시됨)은 2007년 3월 1일자로 미국 20110-2209 버지니아주 마나사스 유니버시티 불러바드 10801에 소재하는 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 (ATCC)에 기탁되었으며, ATCC 기탁 번호 PTA-8231을 배정받았다. Th23BOrfA_pBR811, OrfA 게놈 클론의 뉴클레오티드 서열 및 이 플라스미드에 의해 코딩되는 아미노산 서열은 본 발명에 포함된다.
Th. 23B OrfA의 제1 도메인은 본원에서 Th. 23B OrfA-KS라고도 지칭되는 KS 도메인이며, 본원에서 서열 40로 나타낸, 서열 38의 위치 약 1 내지 위치 약 1500에 걸쳐있는 뉴클레오티드 서열내에 함유되어 있다. Th. 23B KS 도메인을 함유하는 아미노산 서열은 본원에서 서열 41로 나타낸, 서열 39의 위치 약 1 내지 위치 약 500에 걸쳐있는 서열 39의 영역이다. 서열 39의 이 영역은 서열 39의 위치 1 내지 위치 약 450 (또한 서열 41의 위치 1 내지 약 450)에 걸쳐있는 FabB (β-케토아실-ACP 신타제)에 대한 Pfam 대응(match)을 갖는다. Th. 23B OrfA-KS 도메인이 활성 부위 모티프: DXAC* (*아실 결합 부위 C207)를 함유한다는 것을 유의한다. 또한, Th. 23B KS 영역의 말단에 있는 특징적인 모티프인 GFGG는 서열 39의 위치 453-456 (또한 서열 41의 위치 453-456)에 존재한다.
Th. 23B OrfA의 제2 도메인은 본원에서 Th. 23B OrfA-MAT라고도 지칭되는 MAT 도메인이며, 본원에서 서열 42로 나타낸, 서열 38의 위치 약 1503 내지 위치 약 3000에 걸쳐있는 뉴클레오티드 서열내에 함유되어 있다. Th. 23B MAT 도메인을 함유하는 아미노산 서열은 본원에서 서열 43으로 나타낸, 위치 약 501 내지 위치 약 1000에 걸쳐있는 서열 39의 영역이다. 서열 39의 이 영역은 서열 39의 위치 약 580 내지 위치 약 900 (서열 43의 위치 80-400)에 걸쳐있는 FabD (말로닐-CoA:ACP 아실트랜스퍼라제)에 대한 Pfam 대응을 갖는다. Th. 23B OrfA-MAT 도메인은 서열 39의 위치 695-699로 나타낸, 활성 부위 모티프: GHS*XG (*아실 결합 부위 S697)를 함유한다는 것을 유의한다.
Th. 23B OrfA의 도메인 3-10은 본원에서 Th. 23B OrfA-ACP라고도 지칭되는 8개의 탄뎀 ACP 도메인이다 (예를 들어, 상기 서열의 제1 도메인은 OrfA-ACP1이고, 제2 도메인은 OrfA-ACP2이며, 제3 도메인은 OrfA-ACP3임). 제1 Th. 23B ACP 도메인인 Th. 23B OrfA-ACP1은 본원에서 서열 44로 나타낸, 서열 38 (OrfA)의 위치 약 3205 내지 위치 약 3555에 걸쳐있는 뉴클레오티드 서열내에 함유되어 있다. 제1 Th. 23B ACP 도메인을 함유하는 아미노산 서열은 본원에서 서열 45로 나타낸, 서열 39의 위치 약 1069 내지 위치 약 1185에 걸쳐있는 서열 39의 영역이다.
Th. 23B OrfA의 8개의 ACP 도메인은 서로 인접해 있으며, 포스포판테테인 결합 부위 모티프, LGXDS* (서열 46으로 나타냄)(여기서, S*는 포스포판테테인 부착 부위임)의 존재에 의해 확인될 수 있다. 서열 39와 관련하여 8개의 S* 부위의 각각의 아미노산 위치는 1128 (ACP1), 1244 (ACP2), 1360 (ACP3), 1476 (ACP4), 1592 (ACP5), 1708 (ACP6), 1824 (ACP7) 및 1940 (ACP8)이다. 8개의 Th. 23B ACP 도메인 모두의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열은 고도로 보존되어 있으며, 따라서 각 도메인의 서열은 본원에서 개별 서열 확인자에 의해 나타내지 않는다. 그러나, 본원에 개시된 정보를 기초로, 당업자라면 서열 38 및 서열 39에서 다른 7개의 ACP 도메인의 각각을 함유하는 서열을 용이하게 결정할 수 있을 것이다.
8개의 Th. 23B ACP 도메인 모두는 함께 서열 38의 위치 약 3205 내지 위치 약 5994의 Th. 23B OrfA의 영역에 걸쳐있으며, 이는 서열 39의 약 1069 내지 약 1998의 아미노산 위치에 상응한다. 8개의 도메인 모두를 함유하는 전체 ACP 영역에 대한 뉴클레오티드 서열은 본원에서 서열 47로 나타낸다. 서열 47은 본원에서 서열 48로 나타낸 아미노산 서열을 코딩한다. 서열 48은 개별 ACP 도메인 사이의 링커 세그먼트를 포함한다. 8개의 도메인에 대한 반복 간격은 서열 48에서 대략 116개의 아미노산 마다이며, 각 도메인은 (상기 기재된) 활성 부위 모티프 상에 중심이 있는 약 116개의 아미노산으로 구성되는 것으로 고려될 수 있다.
Th. 23B OrfA의 마지막 도메인은 본원에서 Th. 23B OrfA-KR이라고도 지칭되는 KR 도메인이며, 이는 본원에서 서열 49로 나타낸, 서열 38의 위치 약 6001 내지 위치 약 8433에 걸쳐있는 뉴클레오티드 서열내에 함유되어 있다. Th. 23B KR 도메인을 함유하는 아미노산 서열은 본원에서 서열 50으로 나타낸, 서열 39의 위치 약 2001 내지 위치 약 2811에 걸쳐있는 서열 39의 영역이다. 서열 39의 상기 영역은 서열 39의 위치 약 2300 내지 약 2550 (서열 50의 위치 300-550)에 걸쳐있는 FabG (β-케토아실-ACP 리덕타제)에 대한 Pfam 대응을 갖는다.
트라우스토키트리움. 23B 오픈 리딩 프레임 B (OrfB):
Th. 23B OrfB에 대한 완전한 뉴클레오티드 서열은 본원에서 서열 51로 나타내며, 이는 본원에서 서열 52로 나타낸, 1935개의 아미노산 서열을 코딩하는 5805개의 뉴클레오티드 서열 (종결 코돈은 포함하지 않음)이다. 서열 51은 Th. 23B OrfB의 하기 도메인을 코딩한다: (a) 1개의 β-케토아실-ACP 신타제 (KS) 도메인; (b) 1개의 쇄 길이 인자 (CLF) 도메인; (c) 1개의 아실트랜스퍼라제 (AT) 도메인; 및 (d) 1개의 에노일-ACP 리덕타제 (ER) 도메인.
트라우스토키트리움 23B로부터 단리된, 본원에서 Th23BOrfB_pBR800 (OrfB 게놈 클론)으로 기재된 게놈 클론은 본 발명자들이 가장 잘 알고있는 바와 같이 서열 51의 뉴클레오티드 서열을 포함하며 서열 52의 아미노산 서열을 코딩한다. 게놈 클론 Th23BOrfB_pBR800 (트라우스토키트리움 23B로부터의 OrfB 유전자 서열을 함유하는 이. 콜라이 플라스미드 벡터 형태의 Th23BOrfB_pBR800 게놈 클론으로 표시됨)은 2007년 3월 1일자로 미국 20110-2209 버지니아주 마나사스 유니버시티 불러바드 10801에 소재하는 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 (ATCC)에 기탁되었으며, ATCC 기탁 번호 PTA-8227을 배정받았다. Th23BOrfB_pBR800, OrfB 게놈 클론의 뉴클레오티드 서열 및 이 플라스미드에 의해 코딩되는 아미노산 서열은 본 발명에 포함된다.
Th. 23B OrfB의 제1 도메인은 본원에서 Th. 23B OrfB-KS라고도 지칭되는 KS 도메인이며, 이는 본원에서 서열 53으로 나타낸, 서열 51 (Th. 23B OrfB)의 위치 약 1 내지 위치 약 1500에 걸쳐있는 뉴클레오티드 서열내에 함유되어 있다. Th. 23B KS 도메인을 함유하는 아미노산 서열은 본원에서 서열 54로 나타낸, 서열 52의 위치 약 1 내지 위치 약 500에 걸쳐있는 서열 52의 영역이다. 서열 52의 상기 영역은 위치 약 1 내지 위치 약 450 (서열 54의 위치 1-450)에 걸쳐있는 FabB (β-케토아실-ACP 신타제)에 대한 Pfam 대응을 갖는다. Th. 23B OrfB-KS 도메인이 활성 부위 모티프: DXAC* (C*는 아실기 부착 부위이며, C*는 서열 52의 위치 201에 있음)를 함유한다는 것을 유의한다. 또한, KS 영역의 말단에 있는 특징적인 모티프인 GFGG는 서열 52의 아미노산 위치 434-437에 존재한다.
Th. 23B OrfB의 제2 도메인은 본원에서 Th. 23B OrfB-CLF라고도 지칭되는 CLF 도메인이며, 이는 본원에서 서열 55로 나타낸, 서열 51 (OrfB)의 위치 약 1501 내지 위치 약 3000에 걸쳐있는 뉴클레오티드 서열내에 함유되어 있다. CLF 도메인을 함유하는 아미노산 서열은 본원에서 서열 56으로 나타낸, 서열 52의 위치 약 501 내지 위치 약 1000에 걸쳐있는 서열 52의 영역이다. 서열 52의 상기 영역은 위치 약 550 내지 위치 약 910 (서열 56의 위치 50-410)에 걸쳐있는 FabB (β-케토아실-ACP 신타제)에 대한 Pfam 대응을 갖는다. CLF가 KS 단백질에 대해 상동성을 갖지만, CLF는 KS 단백질에서 아실기가 부착되는 활성 부위 시스테인이 결여되어 있다.
Th. 23B OrfB의 제3 도메인은 본원에서 Th. 23B OrfB-AT라고도 지칭되는 AT 도메인이며, 이는 본원에서 서열 58로 나타낸, 서열 51 (Th. 23B OrfB)의 위치 약 3001 내지 위치 약 4500에 걸쳐있는 뉴클레오티드 서열내에 함유되어 있다. Th. 23B AT 도메인을 함유하는 아미노산 서열은 본원에서 서열 58로 나타낸, 서열 52의 위치 약 1001 내지 위치 약 1500에 걸쳐있는 서열 52의 영역이다. 서열 52의 상기 영역은 위치 약 1100 내지 위치 약 1375 (서열 58의 위치 100-375)에 걸쳐있는 FabD (말로닐-CoA:ACP 아실트랜스퍼라제)에 대한 Pfam 대응을 갖는다. PUFA 신타제의 이러한 AT 도메인은 MAT 단백질에 대해 상동성을 갖지만, 상기 도메인은 MAT의 연장된 모티프 (주요 아르기닌 및 글루타민 잔기)가 결여되어 있으며, 말로닐-CoA 전달에 관여하는 것으로 생각되지 않는다. 아실트랜스퍼라제의 GXS*XG 모티프가 존재하는데, 여기서 S*는 아실 부착 부위이며 서열 52에 대하여 위치 1123에 위치한다.
Th. 23B OrfB의 제4 도메인은 본원에서 Th. 23B OrfB-ER라고도 지칭되는 ER 도메인이며, 이는 본원에서 서열 59로 나타낸, 서열 51 (OrfB)의 위치 약 4501 내지 위치 약 5805에 걸쳐있는 뉴클레오티드 서열내에 함유되어 있다. Th. 23B ER 도메인을 함유하는 아미노산 서열은 본원에서 서열 60으로 나타낸, 서열 52의 위치 약 1501 내지 위치 약 1935에 걸쳐있는 서열 52의 영역이다. 서열 52의 상기 영역은 위치 약 1501 내지 위치 약 1810 (서열 60의 위치 1-310)에 걸쳐있는 2-니트로프로판 디옥시게나제(dioxygenase)와 관련된 디옥시게나제 패밀리에 대한 Pfam 대응을 갖는다. 이 도메인이 ER로서 기능하는 것은 추가로, 스트렙토코커스 뉴모니애로부터의 새로 특성화된 ER 효소와의 상동성으로 인해 예상될 수 있다.
트라우스토키트리움. 23B 오픈 리딩 프레임 C (OrfC):
Th. 23B OrfC에 대한 완전한 뉴클레오티드 서열은 본원에서 서열 61로 나타내며, 이는 본원에서 서열 62로 나타낸, 1470개의 아미노산 서열을 코딩하는 4410개의 뉴클레오티드 서열 (종결 코돈은 포함하지 않음)이다. 서열 61은 Th. 23B OrfC의 하기 도메인을 코딩한다: (a) 2개의 FabA-유사 β-히드록시아실-ACP 데히드라제 (DH) 도메인, 이들은 둘 다 FabA 단백질 (트랜스-2-데스에노일-ACP의 합성 및 이 생성물의 시스-3-데스에노일-ACP로의 가역적 이성질체화를 촉매하는 효소)에 대해 상동성을 가짐; 및 (b) 쉬조키트리움 OrfB의 ER 도메인에 대해 높은 상동성을 갖는 1개의 에노일-ACP 리덕타제 (ER) 도메인.
트라우스토키트리움 23B로부터 단리된, 본원에서 Th23BOrfC_pBR709A (OrfC 게놈 클론)로 기재된 게놈 클론은 본 발명자들이 가장 잘 알고있는 바와 같이 서열 61의 뉴클레오티드 서열을 포함하며 서열 62의 아미노산 서열을 코딩한다. 게놈 클론 Th23BOrfC_pBR709A (트라우스토키트리움 23B로부터의 OrfC 유전자 서열을 함유하는 이. 콜라이 플라스미드 벡터 형태의 Th23BOrfC_pBR709A 게놈 클론으로 표시됨)는 2007년 3월 1일자로 미국 20110-2209 버지니아주 마나사스 유니버시티 불러바드 10801에 소재하는 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 (ATCC)에 기탁되었으며, ATCC 기탁 번호 PTA-8228을 배정받았다. Th23BOrfC_pBR709A, OrfC 게놈 클론의 뉴클레오티드 서열 및 이 플라스미드에 의해 코딩되는 아미노산 서열은 본 발명에 포함된다.
Th. 23B OrfC의 제1 도메인은 본원에서 Th. 23B OrfC-DH1이라고도 지칭되는 DH 도메인이며, 이는 본원에서 서열 63으로 나타낸, 서열 61 (OrfC)의 위치 약 1 내지 위치 약 1500에 걸쳐있는 뉴클레오티드 서열내에 함유되어 있다. Th. 23B DH1 도메인을 함유하는 아미노산 서열은 본원에서 서열 64로 나타낸, 서열 62의 위치 약 1 to 위치 약 500에 걸쳐있는 서열 62의 영역이다. 서열 62의 상기 영역은 상기 언급한 바와 같이 위치 약 275 내지 위치 약 400 (서열 64의 위치 275-400)에 걸쳐있는 FabA에 대한 Pfam 대응을 갖는다.
Th. 23B OrfC의 제2 도메인은 또한 본원에서 Th. 23B OrfC-DH2라고도 지칭되는 DH 도메인이며, 이는 본원에서 서열 65로 나타낸, 서열 61 (OrfC)의 위치 약 1501 내지 약 3000에 걸쳐있는 뉴클레오티드 서열내에 함유되어 있다. Th. 23B DH2 도메인을 함유하는 아미노산 서열은 본원에서 서열 66으로 나타낸, 서열 62의 위치 약 501 내지 위치 약 1000에 걸쳐있는 서열 62의 영역이다. 서열 62의 상기 영역은 상기 언급한 바와 같이 위치 약 800 내지 위치 약 925 (서열 66의 위치 300-425)에 걸쳐있는 FabA에 대한 Pfam 대응을 갖는다.
Th. 23B OrfC의 제3 도메인은 본원에서 Th. 23B OrfC-ER이라고도 지칭되는 ER 도메인이며, 이는 본원에서 서열 67로 나타낸, 서열 61 (OrfC)의 위치 약 3001 내지 위치 약 4410에 걸쳐있는 뉴클레오티드 서열내에 함유되어 있다. Th. 23B ER 도메인을 함유하는 아미노산 서열은 본원에서 서열 68로 나타낸, 서열 62의 위치 약 1001 내지 위치 약 1470에 걸쳐있는 서열 62의 영역이다. 서열 62의 상기 영역은 상기 언급한 바와 같이 위치 약 1025 내지 위치 약 1320 (서열 68의 위치 25-320)에 걸쳐있는 2-니트로프로판 디옥시게나제와 관련된 디옥시게나제에 대한 Pfam 대응을 갖는다. ER로서의 상기 도메인 기능은 또한 스트렙토코커스 뉴모니애 유래의 새로 특성화된 ER 효소와의 상동성으로 인해 예상될 수 있다.
쉬바넬라 야포니카( Shewanella japonica ) PUFA PKS
쉬바넬라 야포니카 코어 PUFA PKS 시스템 및 상기 기재된 그의 PPTase를 형성하는 5개의 오픈 리딩 프레임이 존재한다. 각 오픈 리딩 프레임의 도메인 구조는 다음과 같다.
서열 69는 쉬바넬라 야포니카 코스미드 3F3에 대한 뉴클레오티드 서열이며, 15개의 ORF를 함유하는 것으로 나타나 있다. 이 미생물에서 PUFA PKS 시스템과 관련된 ORF는 다음과 같은 특징이 있다.
pfaA (서열 69의 뉴클레오티드 10491-18854)는 하기 도메인을 보유하는 PUFA PKS 단백질인 PFAS A (서열 70)를 코딩한다: β-케토아실-신타제 (KS) (서열 69의 뉴클레오티드 10575-12029, 서열 70의 아미노산 29-513); 말로닐-CoA:ACP 아실트랜스퍼라제 (MAT) (서열 69의 뉴클레오티드 12366-13319, 서열 70의 아미노산 625-943); 6개의 탄뎀 아실-운반자 단백질 (ACP) 도메인 (서열 69의 뉴클레오티드 14280-16157, 서열 70의 아미노산 1264-1889); β-케토아실-ACP 리덕타제 (KR) (서열 69의 뉴클레오티드 17280-17684, 서열 70의 아미노산 2264-2398); 및 본원에서 DH-모티프 영역으로 지칭된, 데히드라타제 (DH) 보존된 활성 부위 모티프 LxxHxxxGxxxxP (서열 70의 아미노산 2504-2516)를 함유하는 서열 70의 아미노산 2399 내지 2787의 PFAS A 단백질의 영역.
PFAS A에서, KS 활성 부위 DXAC*는 서열 70의 아미노산 226-229에 위치하며, 여기서 C*는 아실 부착 부위이다. MAT 활성 부위, GHS*XG는 서열 70의 아미노산 721-725에 위치하며, 여기서 S*는 아실 결합 부위이다. LGXDS*의 ACP 활성 부위는 다음과 같은 위치에 위치한다: 서열 70에서 아미노산 1296-1300, 아미노산 1402-1406, 아미노산 1513-1517, 아미노산 1614-1618, 아미노산 1728-1732, 및 아미노산 1843-1847, 여기서 S*는 포스포판테테인 부착 부위이다. 서열 70의 아미노산 2399 내지 2787에서, PFAS A는 또한 상기 언급한 데히드라타제 (DH) 보존된 활성 부위 모티프 LxxHxxxGxxxxP (서열 70의 아미노산 2504-2516)를 함유한다.
pfaB (서열 69의 뉴클레오티드 18851-21130)는 하기 도메인을 보유하는 PUFA PKS 단백질인 PFAS B (서열 71)를 코딩한다: 아실트랜스퍼라제 (AT) (서열 69의 뉴클레오티드 19982-20902, 서열 71의 아미노산 378-684).
PFAS B에서, 활성 부위 GXS*XG 모티프는 서열 71의 아미노산 463-467에 위치하며, 여기서 S*는 아실 부착 부위이다.
pfaC (서열 69의 뉴클레오티드 21127-27186)는 하기 도메인을 보유하는 PUFA PKS 단백질인 PFAS C (서열 72)를 코딩한다: KS (서열 69의 뉴클레오티드 21139-22575, 서열 72의 아미노산 5-483); 쇄 길이 인자 (CLF) (서열 69의 뉴클레오티드 22591-23439, 서열 72의 아미노산 489-771); 및 2개의 FabA 3-히드록시아실-ACP 데히드라타제, DH1 (서열 69의 뉴클레오티드 25408-25836, 서열 72의 아미노산 1428-1570) 및 DH2 (서열 69의 뉴클레오티드 26767-27183, 서열 72의 아미노산 1881-2019)로 지칭됨.
PFAS C에서, KS 활성 부위 DXAC*는 서열 72의 아미노산 211-214에 위치하며, 여기서 C*는 아실 부착 부위이다.
pfaD (서열 69의 뉴클레오티드 27197-28825)는 하기 도메인을 보유하는 PUFA PKS 단백질인 PFAS D (서열 73)를 코딩한다: 에노일 리덕타제 (ER) (서열 69의 뉴클레오티드 27446-28687, 서열 73의 아미노산 84-497).
pfaE (역 상보성 가닥 상의 서열 69의 뉴클레오티드 6150-7061)는 확인된 도메인 (서열 69의 뉴클레오티드 6504-6944, 서열 74의 아미노산 40-186)을 갖는 4'-포스포판테테이닐 트랜스퍼라제 (PPTase)인 PFAS E (서열 74)를 코딩한다.
쉬바넬라 올레야나( Shewanella olleyana ) PUFA PKS
쉬바넬라 올레야나 코어 PUFA PKS 시스템 및 상기 기재된 그의 PPTase를 형성하는 5개의 오픈 리딩 프레임이 존재한다. 각 오픈 리딩 프레임의 도메인 구조는 다음과 같다.
서열 75는 쉬바넬라 올레야나 코스미드 9A10에 대한 뉴클레오티드 서열이며, 17개의 ORF를 함유하는 것으로 나타났다. 이 미생물에서 PUFA PKS 시스템과 관련된 ORF는 다음과 같이 특성화된다.
pfaA (서열 75의 뉴클레오티드 17437-25743)는 하기 도메인을 보유하는 PUFA PKS 단백질인 PFAS A (서열 76)를 코딩한다: β-케토아실-신타제 (KS) (서열 75의 뉴클레오티드 17521-18975, 서열 76의 아미노산 29-513); 말로닐-CoA:ACP 아실트랜스퍼라제 (MAT) (서열 75의 뉴클레오티드 19309-20265, 서열 76의 아미노산 625-943); 6개의 탄뎀 아실-운반자 단백질 (ACP) 도메인 (서열 75의 뉴클레오티드 21259-23052, 서열 76의 아미노산 1275-1872); β-케토아실-ACP 리덕타제 (KR) (서열 75의 뉴클레오티드 24154-24558, 서열 76의 아미노산 2240-2374); 및 본원에서 DH-모티프 영역으로 지칭되는, 데히드라타제 (DH) 보존된 활성 부위 모티프 LxxHxxxGxxxxP (서열 76의 아미노산 2480-2492)를 함유하는 서열 76의 아미노산 2241 내지 2768의 PFAS A 단백질의 영역.
PFAS A에서, KS 활성 부위 DXAC*는 서열 76의 AA 226-229에 위치하며, 여기서 C*는 아실 부착 부위이다. MAT 활성 부위, GHS*XG는 서열 76의 아미노산 721-725에 위치하며, 여기서 S*는 아실 결합 부위이다. LGXDS*의 ACP 활성 부위는 서열 76에서 아미노산 1307-1311, 아미노산 1408-1412, 아미노산 1509-1513, 아미노산 1617-1621, 아미노산 1721-1725, 및 아미노산 1826-1830에 위치하며, 여기서 S*는 포스포판테테인 부착 부위이다. 서열 76의 아미노산 2241 내지 2768에서, PFAS A는 또한 상기 언급한 데히드라타제 (DH) 보존된 활성 부위 모티프 LxxHxxxGxxxxP (서열 76의 아미노산 2480-2492)를 함유한다.
pfaB (뉴클레오티드s 25740-27971 of 서열 75)는 하기 도메인을 보유하는 PUFA PKS 단백질인 PFAS B (서열 77)를 코딩한다: 아실트랜스퍼라제 (AT) (서열 75의 뉴클레오티드 26837-27848, 서열 77의 아미노산 366-703).
PFAS B에서, 활성 부위 GXS*XG 모티프는 서열 77의 아미노산 451-455에 위치하며, 여기서 S*는 아실 부착 부위이다.
pfaC (서열 75의 뉴클레오티드 27968-34030)는 하기 도메인을 보유하는 PUFA PKS 단백질인 PFAS C (서열 78)를 코딩한다: KS (서열 75의 뉴클레오티드 27995-29431, 서열 78이 아미노산 10-488); 쇄 길이 인자 (CLF) (서열 75의 뉴클레오티드 29471-30217, 서열 78의 아미노산 502-750); 및 2개의 FabA 3-히드록시아실-ACP 데히드라타제, DH1 (서열 75의 뉴클레오티드 32258-32686, 서열 78의 아미노산 1431-1573), 및 DH2 (서열 75의 뉴클레오티드 33611-34027, 서열 78의 아미노산 1882-2020)로 지칭됨.
PFAS C에서, KS 활성 부위 DXAC*는 서열 78의 아미노산 216-219에 위치하며, 여기서 C*는 아실 부착 부위이다.
pfaD (서열 75의 뉴클레오티드 34041-35669)는 하기 도메인을 보유하는 PUFA PKS 단백질인 PFAS D (서열 79)를 코딩한다: 에노일 리덕타제 (ER) (서열 75의 뉴클레오티드 34290-35531, 서열 79의 아미노산 84-497).
pfaE (역 상보성 가닥 상의 서열 75의 뉴클레오티드 13027-13899)는 확인된 도메인 (서열 75의 뉴클레오티드 13369-13815, 서열 80의 아미노산 29-177)을 갖는 4'-포스포판테테이닐 트랜스퍼라제 (PPTase)인 PFAS E (서열 80)를 코딩한다.
최적화된 PUFA PKS 서열을 비롯한 다른 PUFA PKS 서열
본 발명은 이종 숙주에서 PUFA PKS 시스템의 발현에 사용하기 위한 다양한 최적화된 서열을 포함하며, 그의 예가 이하에서 제공된다. 당업자라면 최적화된 서열, 특히 이종 숙주에서 바람직한 코돈 용법 또는 우수한 발현 및 기능에 대해 최적화된 서열을 제조할 수 있을 것이다.
sOrfA
sOrfA로 표시된 서열 35는 효모에서의 최적화된 코돈 용법을 위해 재합성된 쉬조키트리움으로부터의 OrfA를 코딩하는 핵산 서열 (서열 1)을 나타낸다. 서열 1 및 서열 35는 각각 서열 2를 코딩한다.
sOrfB
sOrfB로 표시된 서열 36은 효모에서의 최적화된 코돈 용법을 위해 재합성된 쉬조키트리움으로부터의 OrfB를 코딩하는 핵산 서열 (서열 3)을 나타낸다. 서열 3 및 서열 36은 각각 서열 4를 코딩한다.
OrfB*
OrfB*로 표시된 서열 37은, 식물 세포에서의 사용을 위해 서열 3의 일부 내에서 재합성되었으며 OrfB*라고도 지칭되는 이. 콜라이에서의 최적화된 코돈 용법을 위해 먼저 개발된 매우 유사한 서열로부터 유도된 쉬조키트리움으로부터의 OrfB를 코딩하는 핵산 서열 (서열 3)을 나타낸다. (이. 콜라이 및 식물에 대한) 두 가지 형태의 OrfB*는 SacII 단편 (서열 3내의 특이적 부위)에 대한 재합성된 BspHI (서열 3의 뉴클레오티드 4415)를 제외하면 서열 3과 동일하다. 두 가지 형태 (이. 콜라이 및 식물)는 orfB (서열 3)의 본래의 게놈 서열에 비해 유전자 출발점 근처에서 2개의 상이한 코돈 변경을 갖는다. 먼저, 제4 코돈인 아르기닌 (R)은 게놈 서열에서의 CGG로부터 orfB*에서의 CGC로 변경되었다. 다음으로, 제5 코돈인 아스파라긴 (N)은 게놈 서열에서의 AAT로부터 orf B*에서의 AAC로 변경되었다. 상기 유전자를 식물 벡터내에 클로닝시켜 서열 37을 생성하는 것을 촉진시키기 위해, PstI 부위 (CTGCAG)를 또한 조작해서 상기 유전자의 출발점으로부터 염기 20개 만큼 떨어진 이. 콜라이 orfB*내에 넣었다. 이러한 변화는 코딩된 단백질의 아미노산 서열을 변화시키지 않았다. 서열 37 및 서열 3 (및 이. 콜라이에 대한 OrfB* 형태)은 둘 다 서열 4를 코딩한다.
개선된 PUFA 제조 및 축적을 위한 부속 단백질 및 추가의 표적 및 전략
본 발명에 따라, 이종 숙주에서의 PUFA의 제조 및/또는 축적 또는 내생성 숙주에서의 PUFA의 개선된 제조 및/또는 축적을 위한 PUFA PKS 시스템은 바람직하게는 PUFA의 제조를 위해 상기 기재된 다양한 표적 또는 전략 중 한가지 이상을 이용한다 (상기 기재된 6 가지 가이드라인 및 전략 참조). 이러한 전략으로는 특히, 본원에서 상기 기재된 바와 같은 코어 PUFA PKS 시스템의 부분인 것으로 고려되지 않는 (즉, UFA 신타제 효소 복합체 자체의 부분이 아닌) 단백질로서 정의되지만 본 발명의 코어 PUFA 신타제 효소 복합체를 사용해서 PUFA를 제조하거나 적어도 효과적으로 PUFA를 제조하기 위해 필요하거나 필요할 수 있는 다양한 부속 단백질의 사용을 들 수 있다. 이러한 전략은 또한 말로닐-CoA 푸울(들)에 대해 경쟁하는 능력을 증진시킴으로써 PUFA 신타제 경로를 통한 기질, 말로닐 CoA의 흐름을 증가시키는 다양한 유전적 개질을 포함한다. 본 발명의 이러한 실시양태의 변형은 이하에 기재되어 있다.
포스포판테테이닐 트랜스퍼라제 (PPTase)
상기 이종 숙주에서 PUFA의 제조를 위한 일반적인 가이드라인 및 전략 하에 논의된 바와 같이, PUFA를 제조하기 위해, PUFA PKS 시스템은 4'-포스포판테테이닐 잔기를 조효소 A로부터 아실 운반 단백질 (ACP) 도메인(들)로 전달하는 부속 단백질과 함께 작동해야만 한다. 따라서, PUFA PKS 시스템은 1개 이상의 4'-포스포판테테이닐 트랜스퍼라제 (PPTase) 도메인을 포함하는 것으로 고려될 수 있으며, 이러한 도메인은 PUFA PKS 시스템에 대한 부속 도메인 또는 단백질인 것으로 고려될 수 있다. PPTase의 구조적 및 기능적 특징은 예를 들어 미국 특허 출원 공개 제20020194641호; 미국 특허 출원 공개 제20040235127호; 및 미국 특허 출원 공개 제20050100995호에 상세히 기재되어 있다.
본 발명에 따라, 4'-포스포판테테이닐 트랜스퍼라제 (PPTase) 생물학적 활성 (기능)을 갖는 도메인 또는 단백질은 4'-포스포판테테이닐 잔기를 조효소 A로부터 아실 운반 단백질 (ACP)로 전달하는 효소를 특징으로 한다. ACP의 불변체(invariant) 세린로의 이러한 전달은 불활성 아포-형태를 홀로-형태로 활성화한다. 폴리케티드 및 지방산 합성 둘 다에서, 포스포판테테인 기는 성장하는 아실 쇄와 티오에스테르를 형성한다. PPTase는 지방산 합성, 폴리케티드 합성, 및 비-리보좀성 펩티드 합성에서 잘 특성화된 효소 패밀리이다. 다수의 PPTase의 서열이 공지되어 있으며, 활성에 중요한 아미노산 잔기에 대한 돌연변이 분석 [Mofid MR, Finking R, Essen LO, Marahiel MA. Structure-based mutational analysis of the 4'-phosphopantetheinyl transferases Sfp from Bacillus subtilis: carrier protein recognition and reaction mechanism Biochemistry. 2004 Apr 13;43(14):4128-36]이 수행되고, 결정 구조 (예, 문헌 [Reuter K, Mofid MR, Marahiel MA, Ficner R. "Crystal structure of the surfactin synthetase-activating enzyme sfp: a prototype of the 4'-phosphopantetheinyl transferase superfamily" EMBO J. 1999 Dec 1;18(23):6823-31])가 정해졌다. PPTase에서 고도로 보존된 아미노산 및 상기 불변체는 상기 기재된 두 쉬바넬라 균주로부터의 pfaE ORF 내에 함유되어 있다.
본원에 기재된 OrfA ACP 도메인을 기질로 인식하는 것으로서 이전에 입증된 한가지 이종 PPTase는 Nostoc 종 PCC 7120 (이전에는 아나배나(Anabaena) 종 PCC 7120이라고 불림)의 HetI 단백질이다. HetI은 이 생물체의 이형세포(heterocyst)에 존재하는 당-지질 층의 성분인 장쇄 히드록시-지방산의 합성을 담당하는 것으로 알려진 Nostoc의 유전자 클러스터내에 존재한다 [Black and Wolk, 1994, J. Bacteriol. 176, 2282-2292; Campbell et al., 1997, Arch. Microbiol. 167, 251-258]. HetI은 상기 클러스터에 존재하는 단백질, Hgl E의 ACP 도메인을 활성화할 가능성이 있다. Hgl E의 2개의 ACP 도메인은 쉬조키트리움 Orf A에 존재하는 ACP 도메인에 대해 고도의 서열 상동성을 갖는다. 서열 34는 Nostoc HetI 단백질의 아미노산 서열을 나타내며, 쉬조키트리움 및 트라우스토키트리움 유래의 PUFA PKS 시스템을 비롯해서 본원에 기재된 바와 같은 PUFA PKS 시스템과 함께 사용될 수 있는 기능적 PPTase이다. 서열 34는 서열 33에 의해 코딩된다. HetI의 내생성 개시 코돈은 확인된 바 없다 (추정의 단백질내에 존재하는 메티오닌은 없음). 오픈 리딩 프레임의 5' 말단 근처에는 여러 잠재적인 다른 개시 코돈들 (예, TTG 및 ATT)이 존재한다. 메티오닌 코돈 (ATG)은 서열내에 존재하지 않는다. 그러나, PCR을 이용해서 가장 먼 5'의 잠재적인 다른 개시 코돈 (TTG)을 메티오닌 코돈 (NdeI 제한 효소 인식 부위의 일부로서의 ATG)으로 대체하고 코딩 서열의 3' 말단에 XhoI 부위를 도입함으로써 HetI 발현 구조물의 구성을 완료하였으며, 코딩된 PPTase (서열 34)는 기능성인 것으로 나타났다.
본원에 기재된 OrfA ACP 도메인을 기질로서 인식하는 것으로 이전에 입증된 다른 이종 PPTase는 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)로부터 유래된 sfp이다. Sfp는 잘 특성화되었으며, 광범위한 기질을 인식하는 그의 능력으로 인해 널리 사용된다. 공개된 서열 정보 [Nakana, et al., 1992, Molecular and General Genetics 232: 313-321]를 기초로, 발현 벡터는 sfp에 대하여 코딩 영역을 정해진 상류 및 하류 플랭킹(flanking) DNA 서열과 함께 pACYC-184 클로닝 벡터내에 클로닝함으로써 이전에 제조되었다. 이러한 구조물은 이. 콜라이에서 쉬조키트리움 Orfs A, B*, 및 C와 함께 공동발현되는 능력에 의해 입증된 바와 같이 기능적 PPTase를 코딩하며, 이는 적절한 조건하에 상기 세포내에 DHA를 축적시켰다 (미국 특허 출원 공개 제20040235127호 참조).
본 발명에 따른 PUFA PKS 시스템을 발현하도록 유전적으로 개질된 생물체 (예, 미생물 또는 식물)의 경우, 일부 숙주 생물체는 PUFA를 제조하는 PUFA PKS (예, PPTase)와 함께 작용할 필요가 있는 부속 단백질을 내생적으로 발현시킬 수 있다. 그러나 일부 생물체는 이 생물체가 상동성 부속 단백질을 내생적으로 제조하는 경우라도 본원에서 이 생물체에 의해 PUFA를 제조하고/하거나 상기 생물체에 의한 PUFA의 제조를 증진시키는 것으로 기재된 하나 이상의 부속 단백질을 코딩하는 핵산 분자로 형질전환시킬 수 있다 (즉, 일부 이종 부속 단백질은 숙주 세포의 내생성 부속 단백질보다는 형질전환된 PUFA 신타제 단백질과 함께 더 효과적이거나 또는 더 효율적으로 작용할 수 있음). 본 발명은 부속 PPTase를 포함하는 본 발명의 PUFA PKS 시스템으로 유전적으로 개질된 세균, 효모 및 식물의 예를 제공한다.
따라서, 본 발명의 한 실시양태는 본원에 기재된 바와 같은 코어 PUFA PKS 시스템 및 또한 본원에 기재된 바와 같은 PPTase를 발현시키도록 유전적으로 개질된 숙주 세포 또는 생물체인 유전적으로 개질된 숙주 세포 또는 생물체 (예, 미생물 또는 식물, 또는 이들의 세포)에 관한 것이다. 적합한 PPTase는 상기 기재되어 있으며, 또한 당업계에 기술되어 있다. PPTase는 동일 또는 상이한 구조물 상에서 코어 PUFA PKS 단백질 또는 단백질들을 코딩하는 하나 이상의 핵산 분자로서 발현될 수 있다. 두 가지 실시양태가 실시예에 예시되어 있다 (실시예 12 및 13 참조). 한 측면에서, PPTase는 Nostoc HetI (본원에서 서열 33 및 34로 나타냄)이다.
본 발명의 한 실시양태에서, PUFA 제조 및 축적은 숙주 세포 또는 숙주 생물체에 의해 발현된 내생성 PPTase의 발현 또는 활성을 감소 (억제, 하향조절, 감쇠)시킴으로써 (예를 들어, 이 실시양태에 따른 PUFA PKS 효소와 함께 도입된 PPTase와의 경쟁을 회피함으로써) 증진된다. 내생성 PPTase 활성의 억제는 안티센스 RNA, RNAi, 공동억제의 이용 또는 돌연변이의 도입을 포함하지만 이에 한정되지 않는 유전자의 결실 또는 불활성화의 임의의 적합한 방법에 의해 달성될 수 있다.
본 발명은 본원에 기재된 바와 같은 PUFA 신타제의 발현과 함께 외생성 PPTase의 발현을 (단독으로 또는 내생성 PPTase 억제와의 조합으로) 포함하며, 이를 단독으로 또는 본원에 기재된 임의의 하나 이상의 전략 (예를 들어, 코돈 최적화, 세포소기관-표적화, (예를 들어, FAS의 억제에 의한) 말로닐 CoA에 대한 PUFA 신타제 경쟁의 증진, 아실 CoA 신테타제의 발현, 및/또는 하나 이상의 아실트랜스퍼라제 또는 관련 효소의 발현 중 임의의 한가지, 두가지, 세가지, 네가지 또는 다섯가지)과 조합하여 이용함으로써 이종 숙주에서 PUFA 제조 및/또는 축적을 증가시킨다.
말로닐 CoA 흐름 변경/FAS 억제
상기 논의된 바와 같이, PUFA PKS 시스템 (PUFA 신타제), 말로닐-CoA에 대한 기질은 또한 지방산 신타제 시스템 (FAS), 세포질 지방산 연장 반응 및 다른 효소 (예, 칼콘 신타제)에 의해 사용된다. 따라서, PUFA 신타제는 말로닐-CoA에 대하여 상기 다른 효소 시스템과 경쟁한다. 따라서, 본 발명의 한 실시양태는 말로닐-CoA 푸울(들)에 대해 경쟁하는 PUFA 신타제 효소의 능력을 증진시킴으로써 PUFA 신타제 경로를 통한 말로닐 CoA의 흐름을 증가시키는 방법 및 유전적 개질에 관한 것이다. 본원에 제안된 방법으로는 1) FAS 경로에서 임의의 요소를 억제하는 것을 비롯해서 경쟁 경로를 억제하는 방법, 예를 들어 상기 경로에 관여하는 효소 또는 서브유닛의 발현 수준을 감소시킴으로써 경쟁 경로를 억제하는 방법 (예컨대, 안티센스 RNA, RNAi, 공동억제 또는 돌연변이의 사용에 의함), 2) 경쟁 경로가 감소 또는 차단된 이종 숙주에서 PUFA 신타제를 발현시키는 방법 (예를 들어, 카놀라에서는 세포질에서 지방산을 연장시키는 능력이 차단됨), 및/또는 3) (예를 들어, 아세틸-CoA 카르복실라제의 발현에 의해) 말로닐-CoA 푸울을 증가시키는 방법을 들 수 있으나 이에 한정되지 않는다.
보다 구체적으로, 본 발명의 한 측면은 또한 PUFA를 제조하는 숙주 생물체, 특히 이종 PUFA PKS 시스템을 발현시키는 숙주 생물체를 유전적으로 개질시킴으로써 PUFA PKS 시스템에 의한 PUFA 제조 및/또는 축적과 경쟁할 수 있거나 또는 이를 방해할 수 있는 유전자(들)을 결실시키거나 불활성화하거나, 또는 이 유전자들에 의해 코딩되는 효소의 활성 수준을 감소시키는 것을 포함한다. 예를 들어, 본 발명자들은 PUFA PKS 시스템으로 형질전환된 숙주 생물체에서 FAS 활성을 감소시킴으로써 PUFA 제조 및 축적이 정상 수준의 FAS 활성을 보유하는 숙주 생물체에 비해 향상된다는 사실을 밝혀냈다 (실시예에서 효모 및 식물에 대해 상세화된 실험뿐만 아니라 쉬조키트리움에서의 예시적인 실험 참조).
한 실시양태에서, FAS 경로를 통해 지방산의 제조를 억제하는 다양한 효소가 예견되었다. 다수의 효소는 본 발명의 이러한 실시양태에 대해 적합한 표적일 수 있으며, 두 가지 특히 유용한 표적이 하기에 상세히 예시 및 기재되어 있다. 본 발명자들은 쉬조키트리움에서 FAS 효소를 녹아웃시키는 능력을 입증하였으며 (실시예 참조), 이러한 전략은 이종 숙주에 적용될 수 있다. 다른 실시양태에서, 본 발명자들은 효모 숙주에서 생화학적 방법에 의해 FAS 시스템을 억제함으로써 PUFA 신타제 및 PPTase를 발현시키는 효모에서 FAS 시스템의 생화학적 표적의 부재하에서와 비교해서 PUFA 제조를 개선시키는 능력을 입증하였다. 여러 다른 숙주들이 유사한 전략을 따를 수 있다.
마지막으로, 식물에서 본 발명자들은 안티센스 또는 RNAi 기술을 이용해서 KASII 또는 KASIII을 억제함으로써 FAS 경로를 억제하는 것이 PUFA 신타제 및PPTase를 발현시키는 이종 숙주에서 PUFA 제조를 향상시킨다는 것을 입증하였다. 본 발명을 이러한 특정 표적으로 제한하고자 하는 것은 아니지만, 본 발명의 한 측면은 억제에 있어서 상기 효소의 하나 또는 둘 다를 본원에 기재된 바와 같은 PUFA 신타제 및 PPTase의 발현과 함께, 단독으로 또는 본원에 기재된 다른 전략 (예를 들어, 코돈 최적화, 세포소기관-표적화, 아실 CoA 신테타제의 발현, 및/또는 하나 이상의 아실트랜스퍼라제 또는 관련 효소의 발현)과 조합하여 표적화함으로써 이종 숙주에서 PUFA 제조 및/또는 축적을 증가시키는 것에 관한 것이다.
종자에서, 주로 트리아실글리세롤 (TAG)의 형태인 지질은 정교한 효소 경로를 통해 동화물(assimilates)로부터 유도된다. 일반적으로, 환원된 탄소는 식물의 다른 부분으로부터의 체관부(phloem)를 통해 종자로 전달된다. 식물 종자에서, TAG의 생합성은 여러 세포소기관 내에서 세포내적으로 수행된다 [Ohrolgge and Browse, 1995, Plant Cell 7: 957-970]. 색소체 내에서, 짧은 탄소 전구체는 지방 아실 쇄에 C2-단위를 반복적으로 부가하고 다음 연장 라운드를 위해 상기 쇄를 준비시키는 제II형 가용성 지방산 신타제 (FAS) 복합체 [Slabas and Fawcett, 1992, Plant Molecular Biology 19: 169-191]에 의해 장쇄 지방산으로 전환된다. 8 또는 9 라운드의 C2-단위 축합반응에 의해 막 지질을 특징으로 하는 C16 및 C18 지방산이 생성된다. 초기 FAS 활성은 핵에 의해 코딩된, 색소체 표적화 효소 말로닐-CoA:ACP 트랜스아실라제 (MCAT)에 의해 수행되며, 이는 말로닐기를 말로닐-CoA로부터 아실 운반 단백질 (ACP)로 전달한다 [Yasuno et al., 2004, Journal of Biological Chemistry 292: 8242-8251]. 이는 후속 연장을 위해 C2-단위를 제공하는 기질, 말로닐-ACP를 형성시킨다. 합성의 다음 단계는 핵에 의해 코딩된, 색소체 표적화 β-케토아실-아실 운반자 단백질 신테타제III (KAS III)의 촉매 활성을 통해 달성되며, 여기서 말로닐-CoA와 공여자, 말로닐-ACP의 축합반응으로 부티릴 (C4)-ACP가 생성된다. ACP-활성화된 아실 쇄의 모든 후속 연장은 핵에 의해 코딩된, 색소체 표적화 3-케토아실-아실 운반자 단백질 신테타제I (KAS I) 및 β-케토아실-아실 운반자 단백질 신테타제II (KAS II) 이소자임에 의해 수행된다. KAS I은 부티릴 (C4)- 내지 미리스토일 (C14)-ACP를 기질로 사용함으로써 C4-ACP를 C16-ACP로 전환시키는 축합반응을 촉매하며, KAS II는 팔미토일 (C16)-ACP를 이용함으로써 스테아로일 (C18)-ACP를 생성시키는 마지막 단계를 수행한다 [Carlsson et al., 2002, Plant Journal 29: 761-770]. 따라서, KasIII 또는 KasII의 발현을 억제하거나 또는 약화시킴으로써 종자 발생 동안 지방산 생합성의 억제를 달성할 수 있다.
한 실시양태에서, 본 발명은 숙주 세포에서 KASII 또는 KASIII 중 어느 하나를 표적화하는 RNAi를 포함하는 핵산 분자를 사용해서 이종 숙주 생물체 또는 세포를 형질전환시키는 것을 포함한다. 한 실시양태에서, 숙주 세포는 식물 세포이다. 한 실시양태에서, 본 발명은 숙주 세포에서 KASII 또는 KASIII 중 어느 하나를 표적화하는 안티센스를 포함하는 핵산 분자를 사용해서 이종 숙주 생물체 또는 세포를 형질전환시키는 것을 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 숙주 세포는 식물 세포이다.
한 실시양태에서, 본 발명은 실시예 13에 기재된 CHSA 인트론을 갖는 KAS II RNAi인 서열 122로 나타낸 핵산 서열을 포함하는 핵산 분자를 사용해서 이종 숙주 생물체 또는 세포를 형질전환시키는 것을 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 실시예 13에 기재된 CHSA 인트론을 갖는 KAS III RNAi인 서열 124로 나타낸 핵산 서열을 포함하는 핵산 분자를 사용해서 이종 숙주 생물체 또는 세포를 형질전환시키는 것을 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 실시예 13에 기재된 바와 같은 KAS II 안티센스 핵산 서열인 서열 123으로 나타낸 핵산 서열을 포함하는 핵산 분자를 사용해서 이종 숙주 생물체 또는 세포를 형질전환시키는 것을 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 실시예 13에 기재된 바와 같은 KAS III 안티센스 핵산 서열인 서열 125로 나타낸 핵산 서열을 포함하는 핵산 분자를 사용해서 이종 숙주 생물체 또는 세포를 형질전환시키는 것을 포함한다.
말로닐-CoA 푸울(들)에 대해 경쟁하는 PUFA 신타제 효소의 능력을 증진시키기 위한 추가의 방법은 경쟁 경로가 감소되거나 차단된 이종 숙주에서 PUFA 신타제의 발현을 포함한다 (예를 들어, 카놀라에서는 세포질에서 지방산을 연장시키는 능력이 차단됨). 다른 적합한 이종 숙주 (선별, 무작위 돌연변이 및 스크리닝, 및/또는 지정된 돌연변이에 의해 확인된 천연 발생 생물체 및/또는 돌연변이체)는 감소 또는 차단된 경쟁 경로, 예를 들면 FAS 경로 등에 있어서 틸링(tilling), 브리딩(breeding), 마커 보조 선별 등과 같은 기술에 의해 선별할 수 있다.
다른 효소, 예를 들면 아세틸-CoA 카르복실라제의 발현은 또한 모든 효소 시스템에 대하여 이용가능한 말로닐 CoA 푸울을 증가시키며, 따라서 PUFA PKS 시스템을 통한 흐름을 향상시킨다.
본 발명은 본원에 기재된 바와 같은 PUFA 신타제의 발현과 함께 외생성 PPTase의 발현 (단독으로 또는 내생성 PPTase의 억제와 조합됨)과 말로닐 CoA를 이용하는 PUFA PKS 시스템의 능력을 개선시키는 것을 포함하며, 이를 단독으로 또는 본원에 기재된 임의의 하나 이상의 전략 (예를 들어, 코돈 최적화, 세포소기관-표적화, 아실 CoA 신테타제의 발현, 및/또는 하나 이상의 아실트랜스퍼라제 또는 관련 효소의 발현 중 임의의 한가지, 두가지, 세가지 또는 네가지)과 조합하여 이용함으로써 이종 숙주에서 PUFA 제조 및/또는 축적을 증가시키는 임의의 실시양태의 수행을 포함한다.
아실-CoA 신테타제
본 발명의 다른 실시양태는 장쇄 PUFA 무함유 지방산 (FFA)의 아실-CoA로의 전환을 촉매하는 아실-CoA 신테타제(ACoAS) 단백질을 제공한다.
본 발명자들은 PUFA PKS 시스템에 의한 PUFA의 내생성 생산자인 쉬조키트리움이 그의 PUFA PKS 시스템의 FFA 생성물을 아실-CoA로 전환시킬 수 있는 하나 이상의 ACoAS를 보유한다고 결정하였다. 이러한 결정은 고수준의 PUFA가 상기 생물체내의 그러한 분획내에 축적된다는 사실로부터 명백하다. 따라서, 쉬조키트리움, 및 PUFA PKS 시스템을 내생적으로 함유하는 다른 생물체 (예, 다른 트라우스토키트리드) 또는 PUFA를 제조하는 다른 진핵생물 (예를 들면, 탈라시오시라 슈도나나(Thalassiosira pseudonana) 또는 크립테코디니움 코니)은 이종 숙주에서 발현된 PUFA PKS 시스템의 생성물의 축적을 허용하거나 증가시키는데 있어서 유용한 효소를 코딩하는 유전자들에 대한 우수한 공급원을 나타낸다.
본 발명자들은 공지된 또는 추정된 아실-CoA 신테타제(ACoAS) 활성을 갖는 단백질에 대해 상동성을 갖는 단백질을 코딩하는 쉬조키트리움의 9개의 핵산 서열을 확인하였다. 본 발명자들은 이들 서열의 하나 또는 여러개가 쉬조키트리움 PUFA 신타제의 FFA 생성물을 아실-CoA로 전환시킬 수 있는 ACoAS를 코딩하는 유전자와 관련이 있는 것으로 믿고 있으며, 이들 여러 서열을 사용해서 숙주 생물체에서 PUFA 제조 및/또는 축적을 증가시키는 능력을 입증하였다. 이와 같이, 이들은 쉬조키트리움 PUFA 신타제 또는 다른 PUFA 신타제가 내부에서 발현되는 이종 숙주에서 PUFA의 축적을 증가시키는데 있어서 큰 유용성을 가질 것이다. 이론에 얽매이고자 하는 것은 아니지만, 본 발명자들은 본 발명자들에 의해 발견된 ACoAS가 쉬조키트리움의 것과 유사한 생성물 프로필을 갖는 PUFA 신타제를 발현시키는 숙주 및 쉬조키트리움 PUFA 신타제의 것과 상이한 생성물 프로필을 갖는 PUFA 신타제를 발현시키는 숙주에서 PUFA 축적을 증가시키는데 유용하다고 믿는다. 실제로, 본원에 제시된 실시예는 쉬조키트리움 유래의 여러 ACoAS가 쉬조키트리움 PUFA PKS 시스템으로 유전적으로 개질된 효모 균주에서, 또한 유사하게 유전적으로 개질된 식물에서 PUFA의 축적을 증가시킨다는 것을 입증한다. 또한, 쉬조키트리움 ACoAS는 EPA가 FFA로서 존재하는 경우 다른 생물체 유래의 PUFA 신타제에 의해 제조된 EPA를 인식하는데 있어서 효과적인 것으로 예상된다. 게다가, 본 발명에 의해 제공된 개시내용을 고려해서, 다른 생물체 유래의 ACoAS를 코딩하는 유전자들을 그러한 PUFA 신타제를 발현시키는 이종 숙주 생물체에서 사용하기 위해 동정 및 수득할 수 있다. 상기 ACoAS 단백질과 이를 코딩하는 핵산의 각각, 및 이들의 상동체 및 생물학적 활성 단편은 본 발명에 포함된다. 이들 단백질 및 핵산 분자는 하기 기술내용과 실시예에서 상세히 논의될 것이다.
본 발명의 한 실시양태는 장쇄 PUFA 무함유 지방산 (FFA)의 아실-CoA로의 전환을 촉매하는 단리된 아실-CoA 신테타제(ACoAS)에 관한 것이다. 본 발명의 한 측면에서, 단리된 ACoAS는 PUFA PKS 시스템 (PUFA 신타제)을 내생적으로 발현시키는 생물체로부터 유도된다. 이러한 생물체로는 트라우스토키트리드를 들 수 있지만 이에 한정되지 않는다. 한 측면에서, 단리된 ACoAS는 쉬조키트리움, 트라우스토키트리움, 또는 울케니아로부터 유도된다. 다른 측면에서, 단리된 ACoAS는 쉬조키트리움 ATCC 20888 또는 쉬조키트리움 종 균주 N230D로부터 유도되는데, 이는 개선된 오일 제조를 위한 돌연변이유발 및 선별에 의해 쉬조키트리움 ATCC 20888로부터 유도된 균주이다. 다른 측면에서, 임의의 PUFA PKS 시스템과 함께 기능해서 숙주 세포 또는 생물체에서 PUFA의 제조 및/또는 축적을 증가시키는 임의의 ACoAS가 본 발명에서 사용될 수 있다. 본 발명은 본원에 기재된 그러한 특정 실시예들로 제한되지 않는다.
다른 측면에서, 단리된 ACoAS는 서열 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96 또는 98 중 어느 하나로부터 선택된 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩된다. 다른 측면에서, 단리된 ACoAS는 서열 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96 또는 98 중 어느 하나로부터 선택된 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 단백질을 코딩하는 축퇴성(degenerate) 핵산 서열에 의해 코딩된다. 또 다른 측면에서, 단리된 ACoAS는 서열 83, 85, 87, 89, 91, 93, 95, 97 또는 99 중 어느 하나로부터 선택된 아미노산 서열 또는 이러한 아미노산 서열 중 어느 하나의 상동체 (하기 기재됨)를 포함한다 (상기 서열의 임의의 생물학적 활성 단편 또는 도메인을 포함함). 바람직한 실시양태에서, 단리된 ACoAS는 본원에서 서열 83, 85, 87, 89, 91, 93, 95, 97 또는 99로 나타낸 아미노산 서열 또는 이러한 아미노산 서열의 상동체를 포함한다. 더 바람직한 실시양태에서, 단리된 ACoAS는 본원에서 서열 83, 85, 87, 91 또는 97로 나타낸 아미노산 서열 또는 이러한 서열의 상동체를 포함하며, 서열 83, 85 또는 97이 특히 바람직하다. 또한 임의의 하나 이상의 아실-CoA 신테타제의 조합이 본 발명에 포함된다.
본 발명은 본원에 기재된 바와 같은 PUFA 신타제 및 외생성 PPTase와 함께 본원에 기재 및 예시된 하나 이상의 아실-CoA 신테타제의 발현을 (단독으로 또는 내생성 PPTase 억제와의 조합으로) 포함하며, 이를 단독으로 또는 본원에 기재된 임의의 하나 이상의 전략 (예를 들어, 코돈 최적화, 세포소기관-표적화, (예를 들어, FAS의 억제에 의한) 말로닐 CoA에 대한 PUFA 신타제 경쟁의 증진, 및/또는 하나 이상의 아실트랜스퍼라제 또는 관련 효소의 발현 중 임의의 한가지, 두가지, 세가지 또는 네가지)과 조합하여 이용함으로써 이종 숙주에서 PUFA 제조 및/또는 축적을 증가시킨다.
아실트랜스퍼라제
상기 기재된 이종 숙주에서 PUFA의 제조 및/또는 축적을 증가시키기 위한 다른 전략과 관련해서, 본 발명의 다른 실시양태는 PL 또는 TAG를 형성하는데 있어서 기질로서 PUFA-CoA를 이용하는 추가의 아실트랜스퍼라제 단백질 (예, 3-글리세롤-포스페이트 아실트랜스퍼라제 (GPAT), 리소포스파티드산 아실트랜스퍼라제 (LPAAT) 및 디아실글리세롤 아실트랜스퍼라제 (DAGAT)), 또는 PL 또는 TAG 중 PUFA를 풍부화할 수 있는 다른 아실트랜스퍼라제 (예, 인지질:디아실글리세롤 아실트랜스퍼라제 (PDAT))를 제공한다. 본 발명은 이러한 단리된 단백질 및 그의 상동체, 이러한 단백질을 코딩하는 핵산 분자, 이러한 단백질을 발현시키는 유전적으로 개질된 생물체, 및 상기 단백질을 사용해서 특히 생물체에서 PUFA 제조 및 축적을 증진시키는 다양한 방법을 포함한다.
또한, 본원에서 본 발명자들은 PL 또는 TAG를 형성하는데 있어서 기질로서 PUFA-CoA를 이용할 수 있는 효소를 개시하며, 따라서 PUFA 신타제에 의해 제조된 PUFA의 축적을 증진시키는 PUFA 신타제를 발현시키는 이종 숙주 생물체에서 사용될 수 있는 추가의 부속 단백질을 나타낸다. 후보 효소로는 3-글리세롤-포스페이트 아실트랜스퍼라제 (GPAT), 리소포스파티드산 아실트랜스퍼라제 (LPAAT) 및 디아실글리세롤 아실트랜스퍼라제 (DAGAT)를 들 수 있지만 이에 한정되지 않는다. 이들 아실-CoA-이용 단백질의 각각 및 이를 코딩하는 핵산은 본 발명에 포함된다. 예를 들어, DAGAT 활성 (예를 들어, ScDAGAT 참조)을 보유하는 효소를 코딩하는 것으로 여겨지는 쉬조키트리움 핵산 서열이 확인되었다. 또한, 하기에도 기재되어 있는, LPAAT 또는 DAGAT 활성을 보유하는 효소를 코딩하는 것으로 여겨지는 크립테코디니움 코니 서열이 확인되었다. 이들 단백질, 그의 생물학적 활성 상동체, 및 핵산 분자, 및 다른 아실트랜스퍼라제 단백질, 그의 상동체, 및 핵산 분자는 본 발명에 포함되며, 구체적인 실시예는 이하에서 상세히 논의될 것이다.
본 발명의 다른 실시양태는 PL 또는 TAG를 형성하는데 있어서 기질로서 PUFA-CoA를 사용하는 단리된 단백질 (예, 3-글리세롤-포스페이트 아실트랜스퍼라제 (GPAT), 리소포스파티드산 아실트랜스퍼라제 (LPAAT) 및 디아실글리세롤 아실트랜스퍼라제 (DAGAT))에 관한 것이다. 바람직한 단백질로는 GPAT, LPAAT 및 DAGAT로부터 선택된 임의의 아실트랜스퍼라제를 들 수 있다. 한 측면에서, 단리된 단백질은 PUFA PKS 시스템 (PKS 신타제) 또는 적어도 PUFA의 제조를 위한 생합성 경로를 내생적으로 발현시키는 생물체로부터 유도된다. 이러한 생물체로는 트라우스토키트리드 또는 크립테코디니움 코니를 들 수 있지만 이에 한정되지 않는다. 한 측면에서, 단리된 아실트랜스퍼라제는 쉬조키트리움, 트라우스토키트리움 또는 울케니아로부터 유도된다. 다른 측면에서, 단리된 아실트랜스퍼라제는 쉬조키트리움 ATCC 20888 또는 쉬조키트리움 종 균주 N230D로부터 유도된다. 다른 측면에서, 아실트랜스퍼라제는 크립테코디니움 코니로부터 유도된다. 다른 측면에서, 숙주 세포 또는 생물체에서 PUFA의 제조 및/또는 축적을 증가시키는 임의의 PUFA PKS 시스템과 함께 기능하는 임의의 아실트랜스퍼라제가 본 발명에서 사용될 수 있다. 본 발명은 본원에 기재된 이러한 특정 실시예들로 제한되지 않는다.
다른 측면에서, 단리된 아실 트랜스퍼라제는 서열 100, 102, 103, 105, 106, 108, 109, 111, 112, 또는 114-121 중 어느 하나로부터 선택된 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩된다. 다른 측면에서, 단리된 아실트랜스퍼라제는 서열 100, 102, 103, 105, 106, 108, 109, 111, 112, 또는 114-121 중 어느 하나로부터 선택된 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 단백질을 코딩하는 축퇴성 핵산 서열에 의해 코딩된다. 또 다른 측면에서, 단리된 아실트랜스퍼라제는 서열 101, 104, 107, 110 또는 113 중 어느 하나로부터 선택된 아미노산 서열 또는 이러한 아미노산 서열 중 어느 것의 상동체 (하기 기재됨)를 포함한다 (상기 서열의 임의의 생물학적 활성 단편 또는 도메인을 포함함). 바람직한 실시양태에서, 단리된 아실트랜스퍼라제는 본원에서 서열 101, 104, 107, 110 또는 113으로 나타낸 아미노산 서열 또는 이 아미노산 서열의 상동체를 포함한다. 더 바람직한 실시양태에서, 단리된 아실트랜스퍼라제는 본원에서 본원에서 서열 101 또는 104로 나타낸 아미노산 서열 또는 이 서열의 상동체를 포함하며, 서열 101이 특히 바람직하다. 본원에 기재된 아실트랜스퍼라제의 조합물은 또한 본 발명에 사용하는 것으로 포함된다.
또 다른 측면에서, 단리된 아실트랜스퍼라제는 임의의 한 서열로부터 선택된 아미노산 서열 또는 상기 임의의 아미노산 서열의 상동체 (하기 기재됨)를 포함한다 (상기 서열의 임의의 생물학적 활성 단편 또는 도메인을 포함함).
본 발명은 본원에 기재된 바와 같은 PUFA 신타제 및 외생성 PPTase (단독으로 또는 내생성 PPTase의 억제와의 조합으로)와 함께 본원에 기재 및 예시된 바와 같은 하나 이상의 아실-CoA 신테타제의 발현을 포함하며, 이를 단독으로 또는 본원에 기재된 임의의 하나 이상의 전략 (예를 들어, 코돈 최적화, 세포소기관-표적화, (예를 들어 FAS의 억제에 의한) 말로닐 CoA에 대한 PUFA 신타제 경쟁의 증진, 및/또는 아실 CoA 신테타제의 발현 중 어느 한가지, 두가지, 세가지 또는 네가지)과 조합하여 이용함으로써 이종 숙주에서 PUFA 제조 및/또는 축적을 증가시키는 것을 포함한다.
세포소기관-특이적 발현
상기 기재된 다른 전략과 관련해서, 본 발명의 한 실시양태는 PUFA 신타제 효소, PPTase, 및/또는 임의의 하나 이상의 부속 단백질의 발현의 표적화 및/또는 숙주의 하나 이상의 세포소기관에 대한 표적화된 유전적 개질에 관한 것이다. 예를 들어, 한 실시양태에서 PUFA 신타제 시스템 및 PPTase의 발현은 식물의 색소체로 표적화된다. 다른 실시양태에서, PUFA 신타제 시스템 및 PPTase의 발현은 세포질로 표적화된다. 다른 실시양태에서, PUFA 신타제 시스템 및 PPTase의 발현은 식물의 색소체와 세포질 둘 다로 표적화된다. 이들 실시양태들 중 어느 하나에서, 다른 표적이 색소체 또는 세포질로 지시될 수 있다. 한 측면에서 아실-CoA 신테타제의 발현은 세포질로 표적화되며, 다른 실시양태에서 이러한 발현은 색소체로 표적화된다. 한 실시양태에서, 하나의 아실-CoA 신테타제는 세포질로 표적화되며, 다른 아실-CoA 신테타제는 색소체로 표적화된다. 바람직하게는, 아실-CoA 신테타제는 세포질에서 발현되어 DHA 및/또는 DPA 유리 지방산을 아실-CoA로 전환시키며, 이는 다시 아실트랜스퍼라제에 의해 이용될 수 있다. 아실트랜스퍼라제는 일반적으로 동시번역적으로 소포체로 표적화된다. 예를 들어 유전적 개질에 의해 FAS 시스템을 억제하는 것에 의한 하나 이상의 숙주 효소의 억제는 PUFA 신타제가 발현되는 동일한 세포소기관(들)로 지시될 수 있다.
하나의 예시적인 색소체 표적화 서열은 브라시카 나푸스(Brassica napus) 아실-ACP 티오에스테라제로부터 유도되며, 코딩된 표적화 펩티드의 아미노산 서열을 본원에서 서열 81로 나타낸다. 다양한 다른 색소체 표적화 서열은 당업계에 공지되어 있으며, 이종 숙주가 식물 또는 식물 세포이며 색소체로의 표적화가 바람직한 것인 실시양태에서 사용될 수 있다.
본 발명은 본원에 기재된 바와 같은 PUFA 신타제의 발현 및 외생성 PPTase (단독으로 또는 내생성 PPTase의 억제와의 조합으로)와 함께 세포소기관 표적화 (예를 들어, 식물에서 색소체 또는 엽록체로의 표적화)의 사용을 포함하며, 이를 단독으로 또는 본원에 기재된 임의의 하나 이상의 전략 (예를 들어, 코돈 최적화, (예를 들어 FAS의 억제에 의한) 말로닐 CoA에 대한 PUFA 신타제 경쟁의 증진, 하나 이상의 아실-CoA 신테타제의 발현, 및/또는 하나 이상의 아실트랜스퍼라제 또는 관련 효소의 발현 중 어느 한가지, 두가지, 세가지 또는 네가지)과 조합하여 이용함으로써 이종 숙주에서 PUFA 제조 및/또는 축적을 증가시키는 것을 포함한다.
유전자 생성물의 색소체 또는 엽록체로의 표적화는 다양한 단백질의 아미노 말단에 존재하며 임포트(import) 동안 절단되어 성숙 단백질을 형성하는 신호 서열에 의해 조절된다 (예를 들어, 엽록체 표적화에 대해서는 예컨대 문헌 [Comai et al., J. Biol. Chem. 263: 15104-15109 (1988)]을 참조한다). 이들 신호 서열을 이종 유전자 생성물에 융합시켜 이종 생성물을 엽록체로 임포트할 수 있다 [van den Broeck et al. Nature 313: 358-363 (1985)]. 적절한 신호 서열을 코딩하는 DNA는 RUBISCO 단백질, CAB 단백질, EPSP 신타제 효소, GS2 단백질, 및 국소화된 엽록체인 것으로 공지된 다수의 다른 단백질을 코딩하는 cDNA로부터 단리될 수 있다.
본 발명의 다양한 실시양태에서, 본 발명에 이용된 단백질이 세포내 구획, 예를 들어 색소체 또는 엽록체로 국소화되도록 지시하는 것이 특히 유리할 수 있다. 단백질은 그의 아미노-말단에 엽록체 수송(transit) 펩티드 (CTP)를 포함시킴으로써 엽록체로 지시될 수 있다. 유사하게, 단백질은 그의 N-말단에 색소체 수송 또는 신호화 펩티드를 포함시킴으로써 색소체로 지시될 수 있다.
아미노-말단의 엽록체 표적화 펩티드를 함유하는 큰 전구체 단백질로서 합성된 천연 발생 엽록체 표적화 단백질은 당업계에 잘 알려져 있으며, 상기 펩티드는 전구체를 엽록체 임포트 기구로 지시한다. 엽록체 표적화 펩티드는 일반적으로 엽록체 세포소기관내에 위치하는 특정 엔도프로테아제에 의해 절단되며, 따라서 표적화 성숙된, 바람직하게는 활성 효소를 전구체로부터 엽록체 환경으로 방출시킨다. 유전자 또는 유전자 생성물을 식물 세포의 엽록체 또는 색소체로 표적화하는 것을 지시하는데 적합한 펩티드를 코딩하는 서열의 예는 피튜니아(petunia) EPSPS CTP, 아라비돕시스 EPSPS CTP2 및 인트론, 및 당업계에 숙련자에게 공지된 다른 것들을 포함한다. 이러한 표적화 서열은 목적하는 발현된 단백질이 그가 가장 효과적으로 기능하는 세포 구조로 전달되도록 준비하거나 또는 목적하는 발현된 단백질을 목적하는 표현형 기능에 필요한 세포 프로세스가 집중되어 있는 세포 영역에 전달한다. 엽록체 표적화 펩티드의 특정 예는 당업계에 잘 알려져 있으며, 아라비돕시스 탈리아나 리불로스 비스포스페이트 카르복실라제의 작은 서브유닛 ats1A 수송 펩티드, 아라비돕시스 탈리아나 EPSPS 수송 펩티드, 및 옥수수(Zea maize) 리불로스 비스포스페이트 카르복실라제의 작은 서브유닛 수송 펩티드를 들 수 있다.
최적화된 수송 펩티드는 예를 들어 문헌 [Van den Broeck et al., "Targeting of a foreign protein to chloroplasts by fusion to the transit peptide from the small subunit of ribulose 1,5-biphosphate carboxylase", Nature, 313:358-363 (1985)]에 기재되어 있다. 원핵생물 및 진핵생물 신호 서열은 예를 들어 문헌 [Michaelis et al. (1982) Ann. Rev. Microbiol. 36, 425]에 개시되어 있다. 본 발명에 사용될 수 있는 수송 펩티드의 추가의 예로는 문헌 [Von Heijne et al., Plant Mol. Biol. Rep. 9:104-126(1991); Mazur et al., Plant Physiol. 85: 1110 (1987); Vorst et al., Gene 65: 59 (1988)]에 기재된 것들과 같은 엽록체 수송 펩티드를 들 수 있다. 첸(Chen) 및 야겐도르프(Jagendorf)는 문헌 [J. Biol. Chem. 268: 2363-2367 (1993)]에서 이종 트랜스유전자의 임포트를 위한 엽록체 수송 펩티드의 사용을 기재하였다. 상기 사용된 펩티드는 니코티아나 플럼바기니폴리아(Nicotiana plumbaginifolia) 유래의 rbcS 유전자로부터의 수송 펩티드이다 [Poulsen et al. Mol. Gen. Genet. 205: 193-200 (1986)]. 본원에서 이종 단백질을 엽록체로 국소화하는 기능을 하는 하나의 CTP는 브라시카 나푸스 아실-ACP 티오에스테라제로부터 유도되었다.
유전자들을 엽록체 또는 색소체로 국소화하기 위한 다른 수단으로는 엽록체 또는 색소체 형질전환을 들 수 있다. 엽록체 DNA만이 이 출원에서 고려되는 분자를 혼입하도록 개질된 재조합 식물을 제조할 수 있다. 엽록체에서 기능하는 프로모터는 당업계에 공지되어 있다 [Hanley-Bowden et al., Trends in Biochemical Sciences 12:67-70, 1987]. 이종 DNA가 삽입된 엽록체를 함유하는 세포를 얻기 위한 방법 및 조성물은 예를 들어 문헌 [Daniell et al. (미국 특허 제5,693,507호; 1997) 및 Maliga et al. (미국 특허 제5,451,513호; 1995)]에 기재되어 있다.
전략들의 조합
본 발명에 따라, 하나 이상의 표적 PUFA의 제조 및 축적을 위한 이종 숙주의 생성에서, 숙주에서 PUFA의 제조 및/또는 축적을 향상시키기 위해 본원에 기재된 임의의 하나 이상의 전략 (전략들의 임의의 조합)을 이용할 수 있다. 실제로, 전략들의 다양한 조합들은 상가적 또는 상승적이며 한가지 이상의 이러한 전략의 부재하에서와 비교해서 PUFA의 향상된 제조 및/또는 축적을 제공할 것으로 예상된다. 실제로, 실시예는 숙주 생물체 (PUFA PKS 시스템을 자연적으로 발현시키는 생물체 및 이종 숙주인 것들)에서 PUFA의 제조를 위한 전략들의 다양한 조합들을 비롯해서 다수의 예시적인 전략을 제공한다.
본 발명에 따른 PUFA의 제조를 위한 적합한 유전적으로 개질된 숙주 세포 또는 생물체는 하기의 기본 특질을 갖는다. 숙주 세포 또는 생물체는 PUFA PKS 시스템을 발현시키는데, 이는 본원에 기재된 코어 PUFA PKS 효소, 및 코어 PUFA PKS 효소와 함께 사용하는 경우 PUFA를 제조하는데 효과적인 PPTase를 포함한다. PUFA PKS 시스템 및/또는 PPTase는 숙주 세포 또는 생물체에 의해 내생적으로 제조되거나 또는 숙주에서 (예를 들어, 재조합 기술에 의해) 이종 단백질로서 발현될 수 있다. 코어 PUFA PKS 효소 및/또는 PPTase를 코딩하는 핵산 분자는 숙주 세포 또는 생물체에서 코돈 용법 또는 우수한 발현을 위해 최적화될 수 있다. 숙주 세포 또는 생물체는 또한 본원에 기재되거나 그렇지 않다면 당업계에 공지된 것들 중 임의의 것을 비롯해서 하나, 둘, 셋, 또는 그보다 많은 종류의 아실-Co 신테타제를 발현하도록 개질될 수 있다. 숙주 세포 또는 생물체는 본원에 기재되거나 그렇지 않다면 당업계에 공지된 것들 중 임의의 것을 비롯해서 하나, 둘, 셋, 또는 그보다 많은 종류의 아실트랜스퍼라제를 발현하도록 추가로 개질될 수 있다. 숙주 세포 또는 생물체는 기질인 말로닐 CoA에 대해 경쟁하는 PUFA PKS 시스템의 능력을 증진시키도록 추가로 유전적으로 개질 (또는 그렇지 않다면 선별 또는 제조)될 수 있다. 한 측면에서, 이는 자연적으로 또는 천연, 선택된 또는 지정된 돌연변이로 인해 또는 브리딩 또는 다른 기술에 의해 상기한 특징을 갖는 생물체의 선별에 의해 달성된다. 다른 측면에서, 이는 말로닐 CoA에 대해 PUFA PKS, 예를 들면 FAS 시스템과 경쟁하는 경로(들)에서 하나 이상의 효소를 선택적으로 억제함으로써 달성된다. 어떤 실시양태에서, PUFA PKS 또는 부속 단백질의 표적화 또는 개질은 예를 들면 식물의 색소체에 대해 세포소기관-특이적일 수 있다.
코어 PUFA PKS 시스템 및 PPTase와 관련해서 사용하기 위한 일부 바람직한 조합들로는 다음과 같은 것들을 들 수 있지만 이에 한정되지 않는다: (1) 한가지, 두가지, 또는 그보다 많은 아실-CoA 신테타제의 발현; (2) (예를 들어, KASII 또는 KASIII의 억제에 의한) FAS 억제; (3) (예를 들어, KASII 또는 KASIII의 억제에 의한) FAS 억제와 한가지, 두가지, 또는 그보다 많은 아실-CoA 신테타제의 발현과의 조합; (4) 한가지, 두가지, 또는 그보다 많은 아실 트랜스퍼라제의 발현; (5) 한가지, 두가지, 또는 그보다 많은 아실-CoA 신테타제의 발현; (예를 들어, KASII 또는 KASIII의 억제에 의한) FAS 억제; 및 한가지, 두가지, 또는 그보다 많은 아실 트랜스퍼라제의 발현의 조합.
식물에서 본원에 예시된 개질들의 일부 예시적인 조합들 (실시예 13 참조)은
(a) 아실-CoA 신테타제 (ACS-1 및 ACS-2가 예시됨)의 발현;
(b) FAS 억제 (KASII RNAi, KAS II 안티센스, KASIII RNAi, 및 KASIII 안티센스에 의한 억제가 예시됨);
(c) 아실-CoA 신테타제의 발현과 FAS 억제의 조합 (KASII RNAi, KAS II 안티센스, KASIII RNAi, 및 KASIII 안티센스의 각각에 의한 FAS 억제와 ACS-1의 발현이 예시됨);
(d) 아실트랜스퍼라제의 발현 (LPAAT-1이 예시됨);
(e) 아실트랜스퍼라제의 발현과, 아실-CoA 신테타제의 발현 및 FAS 억제와의 조합 (KASII RNAi 또는 KASIII 안티센스에 의한 FAS의 억제와 각각 조합된, ACS-1의 발현과 함께 DAGAT-1의 발현이 예시됨);
(f) 아실트랜스퍼라제의 발현과, 두가지 아실-CoA 신테타제의 발현 및 FAS 억제와의 조합 (KASII RNAi 또는 KASIII 안티센스에 의한 FAS의 억제와 각각 조합된, ACS-8의 발현, ACS-1의 발현과 함께 DAGAT-1의 발현이 예시됨);
(g) 두가지 아실트랜스퍼라제의 발현과, 아실-CoA 신테타제의 발현 및 FAS 억제와의 조합 (KASII RNAi 또는 KASIII 안티센스에 의한 FAS의 억제와 각각 조합된, ACS-1의 발현과 함께 DAGAT-1 및 LPAAT-1의 발현이 예시됨); 및
(h) 두가지 아실트랜스퍼라제의 발현과, 두가지 아실-CoA 신테타제의 발현 및 FAS 억제와의 조합 (KASII RNAi 또는 KASIII 안티센스에 의한 FAS의 억제와 각각 조합된, ACS-1 및 ACS-8의 발현과 함께 DAGAT-1 및 LPAAT-1의 발현이 예시됨)
과 함께 PUFA PKS (예, 쉬조키트리움 유래의 것) 및 이종 PPTase (예, Nostoc 유래의 HetI)의 발현을 포함한다.
이러한 개질의 조합들 또는 본원에 기재된 개질의 임의의 다른 개질 또는 조합을 이용하는 임의의 식물 또는 식물 세포가 본 발명에 포함된다. 또한, 본원에 기재된 임의의 개질 또는 개질의 조합을 이용하는 임의의 숙주 세포 또는 생물체가 본 발명에 포함되며, 표적 PUFA를 포함하는 오일을 비롯해서 이러한 세포 또는 생물체로부터 유도된 임의의 생성물도 본 발명에 포함된다. 본 발명의 이들 실시양태의 모두는 유전적으로 개질된 임의의 생물체 및 본원에 기재된 상기 생물체를 생성 및 이용하는 방법에 대한 논의로 적용된다.
유전적으로 개질된 세포, 생물체, 및 이의 생성 및 이용 방법
한가지 이상의 목적하는 다불포화 지방산 또는 다른 생활성 분자를 유의하게 높은 수율로 제조하기 위해, 생물체, 바람직하게는 미생물 또는 식물을 유전적으로 개질시킴으로써 미생물 또는 식물에서 PUFA PKS 시스템의 활성, 특히 최종 생성물을 변화시키거나 또는 PUFA PKS 시스템을 미생물 또는 식물에 도입한다. 본 발명은 이러한 유전적 개질의 효과를 향상시키거나 증진시키는, 특히 PUFA PKS 시스템의 최종 생성물, 바람직하게는 PUFA(들)의 제조 및/또는 축적을 향상시키거나 증진시키는 방법에 관한 것이다.
따라서, 본 발명의 한 실시양태는 PUFA PKS 시스템을 발현시키며, 숙주에 의한 PUFA (또는 PUFA PKS 시스템의 다른 생활성 생성물)의 제조 및/또는 축적을 향상시키기 위한 본원에 기재된 바와 같은 부속 단백질을 발현시키도록 유전적으로 개질되었고/되었거나 자연 선택 및 돌연변이를 비롯한 임의의 방법에 의해 숙주내의 기질에 대해 (예를 들어, FAS 경로 및 본원에 기재된 다른 경쟁 경로의 억제에 의해) 경쟁하는 PUFA PKS의 능력을 증진시키도록 유전적으로 개질된 것인, 유전적으로 개질된 생물체에 관한 것이다. PUFA PKS 시스템이 숙주에 대해 이종인 경우, 생물체는 또한 바람직하게는 PUFA PKS 부속 단백질로서 PPTase를 발현시키도록 유전적으로 개질되며, 이는 상기에 상세히 기재되어 있다. 한 실시양태에서, 생물체는 본원에 기재된 ACoAS, 바람직하게는 PUFA PKS 시스템이 유도된 생물체와 동일한 속, 종 또는 특정 생물체로부터 유도되거나 또는 PUFA PKS 시스템에 의해 제조된 장쇄 PUFA 무함유 지방산 (FFA)의 아실-CoA로의 전환을 촉매할 수 있는 ACoAS를 발현시키도록 유전적으로 개질되었다. 다른 실시양태에서, 생물체는 PL 또는 TAG를 형성하는데 있어서 기질로서 PUFA-CoA를 이용하는 단백질을 발현시키도록 유전적으로 개질되었다. 또 다른 실시양태에서, 생물체는 PL 또는 TAG를 형성하는데 있어서 기질로서 PUFA-CoA를 이용하는 단백질 및 상기 기재된 ACoAS를 둘 다 발현시키도록 유전적으로 개질되었다. 한 실시양태에서, PUFA PKS 시스템이 숙주에 대해 내생성인 경우, 생물체는 숙주 생물체에서 PUFA (또는 PUFA PKS 시스템의 다른 생활성 생성물)의 제조 및/또는 축적을 향상시키거나 증진시키는 상기 기재된 바와 같은 이종 부속 단백질을 발현시키도록 유전적으로 개질될 수 있고/있거나 생물체는 (예를 들어, 숙주에서 내생성 PUFA PKS 시스템과 함께 작용하는 내생성 ACoAS의 발현 또는 활성을 향상시키기 위해) 생물체에 의해 내생적으로 발현되는 상기 부속 단백질의 발현 및/또는 생물학적 활성을 증가, 최적화 또는 증진시키도록 유전적으로 개질될 수 있다. 한 실시양태에서, 생물체는 자연 선택 및 돌연변이, 지시된 돌연변이, 또는 무작위 돌연변이 및 스크리닝 등을 비롯한 임의의 방법에 의해 유전적으로 개질되어 (예를 들어, 본원에 기재된 FAS 경로 및 다른 경쟁 경로를 억제하여) 숙주 내에서 기질에 대해 경쟁하는 PUFA PKS의 능력을 증진시킨다. 한 실시양태에서, 생물체내의 FAS 경로가 억제된다. 한 실시양태에서, 생물체내의 KASII 및/또는 KASIII이 억제된다. 본 발명의 이러한 실시양태들은 상기에 상세히 기재되어 있다. 바람직한 유전적으로 개질된 생물체로는 유전적으로 개질된 미생물 및 유전적으로 개질된 식물을 들 수 있다.
생물체가 PUFA PKS 시스템을 내생적으로 발현시킬 수 있지만, 본 발명은 PUFA PKS 시스템 (이종 숙주)을 발현시키도록 유전적으로 개질된 생물체에서 PUFA의 제조 및/또는 축적을 증진시키는데 특히 유용하다. 생물체에 의해 발현된 PUFA PKS 시스템은 임의의 PUFA PKS 시스템, 예를 들어 특정 생물체로부터 전적으로 유래하는 PUFA PKS 시스템 (예, 쉬조키트리움 PUFA PKS 시스템), 및 상이한 PUFA PKS 시스템 및/또는 상이한 비-PUFA PKS 시스템 (예, 제I형 모듈성, 제I형 반복적, 제II형 또는 제III형 PKS 시스템)으로부터의 단백질 및/또는 도메인을 코딩하는 핵산 서열을 "혼합 및 대응"시킴으로써 (예를 들어, 예, 트라우스토키트리움, 울케니아, 쉬바넬라, 모리텔라, 및/또는 포토박테리움 등 유래의 PUFA PKS 단백질 및/또는 도메인과 쉬조키트리움 PUFA PKS 단백질 및/또는 도메인을 혼합함으로써) 제조되는 PUFA PKS 시스템을 포함할 수 있으며, 여기서 상이한 생물체로부터의 단백질 및/또는 도메인을 조합하여 완전한 기능적 PUFA PKS 시스템을 형성시킨다. 상이한 생물체 유래의 PUFA PKS 유전자들 또는 단백질을 조합하는 것을 포함하는 PUFA PKS 시스템은 미국 특허 제6,140,486호; 미국 특허 제6,566,583호; 문헌 [Metz et al., Science 293:290-293 (2001)]; 미국 특허 출원 공개 제20020194641호; 미국 특허 출원 공개 제20040235127호; 미국 특허 출원 공개 제20050100995호; 및 PCT 공개 제WO 2006/135866호; 상기 참조)에 상세히 기재되어 있다. PUFA PKS 유전자들 및 단백질은 또한 PCT 특허 공개 제WO 05/097982호; 및 미국 특허 출원 공개 제20050014231호에 개시되어 있다. 상기 확인된 각각의 개시물 및 여기에 기재된 유전자들 및 단백질은 본원에 참고로 포함된다.
따라서, 본원에 구체적으로 기재된 임의의 PUFA PKS 시스템을 포함하지만 이에 한정되지 않는 PUFA PKS 시스템의 하나 이상의 기능성 도메인 또는 단백질 (또는 그의 생물학적 활성 단편 또는 상동체)을 코딩하는 생물체내의 하나 이상의 핵산 서열을 유전적으로 개질하고/하거나 이러한 도메인 또는 단백질을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 하나 이상의 재조합 핵산 분자를 발현시킴으로써 생물체를 유전적으로 개질시키는 방법이 본 발명에 포함된다. 또한, 이러한 방법은 PL 또는 TAG를 형성하는데 있어서 기질로서 PUFA-CoA를 이용하는 ACoAS 및/또는 단백질 또는 하나 이상의 기능성 도메인 또는 단백질을 코딩하는 생물체내의 하나 이상의 핵산 서열을 유전적으로 개질시키고/시키거나 이러한 단백질(들)을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 하나 이상의 재조합 핵산 분자를 발현시킴으로써 생물체를 유전적으로 개질시키는 것을 포함한다. 이 방법은 생물체를 유전적으로 개질시킴으로써, 생물체내의 KASII 또는 KASIII의 억제를 포함하지만 이에 한정되지 않는, FAS 시스템과 같이 기질에 대해 PUFA PKS와 경쟁하는 경로를 억제하는 것을 추가로 포함할 수 있다. 한 실시양태에서, 외생적으로 도입된 임의의 핵산 서열을 숙주에서의 코돈 용법 또는 향상된 발현을 위해 최적화할 수 있다. 한 실시양태에서, 도입된 임의의 핵산 서열을 생물체내의 하나 이상의 세포소기관으로 표적화할 수 있다. 이러한 서열, 생물체를 유전적으로 개질시키는 방법, 특정 개질물, 및 이들의 조합에 대한 다양한 실시양태가 상기에 상세히 기재되어 있으며, 본 발명에 포함된다. 전형적으로, 상기 방법을 이용해서 특정 생활성 분자 또는 분자들을 제조하는 유전적으로 개질된 특정 생물체를 제공한다. 바람직하게는 유전적으로 개질된 생물체는 유전적으로 개질된 미생물 또는 유전적으로 개질된 식물이다.
바람직하게는, 본 발명의 유전적으로 개질된 생물체는 EPA (C20:5, n-3), DHA (C22:6, n-3), DPA (C22:5, n-6 또는 n-3), ARA (C20:4, n-6), GLA (C18:3, n-6), ALA (C18:3, n-3), 및/또는 SDA (C18:4, n-3)를 포함하지만 이에 한정되지 않는 한가지 이상의 다불포화 지방산, 더 바람직하게는 EPA (C20:5, n-3), DHA (C22:6, n-3), DPA (C22:5, n-6 또는 n-3), 또는 DTA (C22:4, n-6), 또는 이들의 임의의 조합을 포함하지만 이에 한정되지 않는 한가지 이상의 장쇄 PUFA를 제조한다. 특히 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 유전적으로 개질된 식물은 EPA (C20:5, n-3), DHA (C22:6, n-3), 및/또는 DPA (C22:5, n-6 또는 n-3), 또는 이들의 임의의 조합을 포함하지만 이에 한정되지 않는 한가지 이상의 다불포화 지방산을 제조한다.
본 발명에 따라, 유전적으로 개질된 생물체는 재조합 기술을 이용하거나 또는 전형적 돌연변이유발 및 스크리닝 기술에 의해 개질된 생물체를 포함한다. 본원에 사용된 바와 같이, 유전자 발현, 유전자 기능 또는 유전자 생성물 (즉, 유전자에 의해 코딩된 단백질) 기능에서의 저하를 일으키는 유전적 개질은 유전자의 불활성화 (완전한 또는 부분적인 불활성화), 결실, 중단(interruption), 차단 또는 하향조절로서 지칭될 수 있다. 예를 들어, 상기 유전자에 의해 코딩되는 단백질의 기능의 저하를 일으키는 유전자내 유전적 개질은 유전자의 완전한 결실 (즉, 유전자가 존재하지 않으며, 따라서 단백질도 존재하지 않음), 단백질을 불완전하게 번역하거나 전혀 번역하지 않는 (예를 들어, 단백질이 발현되지 않는) 유전자내 돌연변이, 또는 단백질의 천연 기능을 감소시키거나 폐지하는 유전자내 돌연변이 (예를 들어, 감소된 효소 활성 또는 작용을 갖거나 그러한 활성 또는 작용을 전혀 갖지 않는 단백질이 발현됨)의 결과일 수 있다. 유전자 발현 또는 기능의 증가를 일으키는 유전적 개질은 유전자의 증폭, 과제조, 과발현, 활성화, 증진, 부가, 또는 상향조절로서 지칭될 수 있다.
본 발명에 따른 생물체의 유전적 개질은, PUFA PKS 시스템이 내생성이며 유전적으로 개질된 것인지, 생물체로 도입된 재조합 핵산 분자에 의해 내생성이 된 것인지 (이 옵션에서는 내생성 시스템을 개질시키거나 개질시키지 않음), 또는 재조합 기술에 의해 완전하게 제공된 것인지의 여부에 상관없이, 바람직하게는 생물체에 의해 발현된 PUFA PKS 시스템의 활성에 영향을 준다. PUFA PKS 시스템 또는 이러한 시스템을 발현시키는 생물체의 PUFA 제조 프로필을 변화시키는 것은, 유전적 개질의 부재시와 비교해서 (즉, 비개질, 야생형 생물체, 또는 적어도 PUFA 합성에 대하여 개질되지 않은 생물체 - 즉, PUFA 합성과 관련되지 않은 다른 개질을 가질 수 있는 생물체와 비교해서) 숙주 생물체에 의한 한가지 이상의 임의의 PUFA (또는 PUFA PKS 시스템에 의해 제조된 다른 생활성 분자)의 제조에서 임의의 검출가능한 또는 측정가능한 변화를 일으키는 것을 포함한다. PUFA PKS 시스템의 활성에 영향을 주는 것은 유전적 개질의 부재시와 비교해서 생물체에 의해 발현된 PUFA PKS 시스템에서의 임의의 검출가능한 또는 측정가능한 변화 또는 개질을 유발하는 임의의 유전적 개질을 포함한다. PUFA PKS 시스템에서의 검출가능한 변화 또는 개질은 유전적 개질의 부재하의 내생성 PUFA PKS 시스템과 비교해서 개질된 PUFA PKS 시스템에서의 하나 이상의 임의의 도메인의 발현 및/또는 생물학적 활성을 변화 또는 개질시키는 것 (상기 발현 또는 활성을 도입하거나, 이를 증가시키거나 또는 감소시키는 것), PUFA PKS 시스템 활성 (즉, 생물체는 유전적 개질에 앞서 PKS 시스템 또는 PUFA PKS 시스템을 함유하지 않았음)을 생물체로 도입하여 생물체가 측정가능한/검출가능한 PUFA PKS 시스템 활성을 갖도록 하는 것을 포함하지만 이에 한정되지 않을 수 있다.
PUFA PKS 시스템에 대한 부속 단백질에서의 것들을 비롯해서 PUFA PKS 시스템에서의 기능성 도메인 또는 단백질의 활성을 증가시키는 것에 대한 언급은, 상기 도메인 또는 단백질을 함유하는 (또는 도메인 또는 단백질이 도입될) 생물체에서 도메인 또는 단백질 또는 시스템의 기능성 증가를 나타내며, 더 높은 활성의 도메인 또는 단백질 또는 시스템 (예, 비(specific) 활성 또는 생체내 효소 활성), 억제 또는 분해가 감소된 도메인 또는 단백질 또는 시스템, 및 과발현된 도메인 또는 단백질 또는 시스템을 포함할 수 있는 임의의 유전적 개질을 지칭한다는 것을 유의해야 한다. 예를 들어, 유전자 카피수를 증가시킬 수 있거나, 천연 프로모터의 것보다 더 높은 발현 수준을 제공하는 프로모터를 사용해서 발현 수준을 증가시킬 수 있거나, 또는 유전자에 의해 코딩되는 도메인 또는 단백질의 활성을 증가시키는 유전적 조작 또는 전형적 돌연변이유발에 의해 유전자를 변화시킬 수 있다.
유사하게, PUFA PKS 시스템에 대한 부속 단백질에서의 것들을 비롯해서 PUFA PKS 시스템에서의 기능성 도메인 또는 단백질의 활성을 감소시키는 것에 대한 언급은, 이러한 도메인 또는 단백질을 함유하는 (또는 도메인 또는 단백질이 도입될) 생물체에서 상기 도메인 또는 단백질의 기능성 감소를 나타내며, 감소된 활성의 도메인 또는 단백질, 억제 또는 분해가 증가된 도메인 또는 단백질, 및 발현이 감소 또는 제거된 도메인 또는 단백질을 포함하는 임의의 유전적 개질을 지칭한다. 예를 들어, 본 발명의 도메인 또는 단백질의 작용은 상기 도메인 또는 단백질의 제조를 차단 또는 감소시키거나, 도메인 또는 단백질을 코딩하는 유전자 또는 그의 일부를 "녹아웃시키거나," 도메인 또는 단백질 활성을 감소시키거나, 또는 도메인 또는 단백질 활성을 억제함으로써 감소시킬 수 있다. 도메인 또는 단백질의 제조를 차단하거나 감소시키는 것은 상기 도메인 또는 단백질을 코딩하는 유전자를, 배양 배지 중 유도성 화합물의 존재를 필요로 하는 프로모터의 조절하에 놓는 것을 포함할 수 있다. 인듀서가 배지로부터 고갈되도록 하는 조건을 확립함으로써, 상기 도메인 또는 단백질을 코딩하는 유전자의 발현 (따라서, 단백질 합성의 발현)을 종료시킬 수 있다. 본 발명자들은 실시예 부분에서 트라우스토키트리드 미생물내의 표적화된 유전자들을 결실 (녹아웃)시키는 능력을 입증한다. 상기 도메인 또는 단백질의 활성을 차단하거나 감소시키는 것은 또한 본원에 참고로 도입되는 미국 특허 제4,743,546호에 기재된 것과 유사한 제거(excision) 기술 방법을 이용하는 것을 포함할 수 있다. 이러한 방법을 이용하기 위해, 대상 단백질을 코딩하는 유전자를 게놈으로부터 유전자가 특이적으로 조절 제거될 수 있도록 하는 특이적 유전자 서열들 사이에 클로닝한다. 예를 들어 미국 특허 제4,743,546호에서와 같은 배양물의 배양 온도의 변화에 의해 또는 일부 다른 물리적 또는 영양적인 신호에 의해 절단을 촉진시킬 수 있다.
유전적으로 개질된 미생물
본원에 사용된 바와 같이, 유전적으로 개질된 미생물로는 유전적으로 개질된 세균, 원생생물, 미세조류, 조류, 진균, 또는 다른 미생물을 들 수 있다. 상기 유전적으로 개질된 미생물은 원하는 결과가 달성되게끔 정상 (즉, 야생형 또는 천연 발생) 형태로부터 개질된 (즉, 돌연변이되거나 또는 변화된) 게놈을 갖는다 (즉, 증가 또는 변화된 PUFA PKS 활성 및/또는 PUFA PKS 시스템을 이용한 원하는 생성물의 제조 및 축적). 미생물의 유전적 개질은 전형적인 균주 개발 및/또는 분자 유전적 기술을 이용해서 달성할 수 있다. 이러한 기술은 당업계에 공지되어 있으며, 일반적으로는 예를 들어 문헌 [Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Labs Press]의 미생물에 대하여 개시되어 있다. 문헌 [Sambrook et al., 동일 문헌]은 그의 전체 개시내용이 본원에 참고로 도입된다. 유전적으로 개질된 미생물은 미생물 내에 원하는 효과를 제공하는 방식으로 핵산 분자가 삽입, 결실 또는 개질 (즉, 예를 들어 뉴클레오티드의 삽입, 결실, 치환 및/또는 역위(inversion))된 미생물을 포함할 수 있다.
유전적 개질을 위한 적합한 숙주 미생물의 예로는 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae), 사카로마이세스 카를스베르겐시스(Saccharomyces carlsbergensis)를 비롯한 효모, 또는 칸디다(Candida), 클루이베로마이세스(Kluyveromyces)와 같은 다른 효모, 또는 다른 진균, 예를 들어 섬유상 진균, 예컨대 아스페르길루스(Aspergillus), 뉴로스포라(Neurospora), 페니실리움(Penicillium) 등을 들 수 있다. 세균성 세포가 또한 숙주로 사용될 수 있다. 이들의 예로는 발효 프로세스에서 유용할 수 있는 에세리키아 콜라이(Escherichia coli)를 들 수 있지만 이에 한정되지 않는다. 또는, 단지 예를 들자면, 락토바실러스(Lactobacillus) 종 또는 바실러스(Bacillus) 종과 같은 숙주를 숙주로 사용할 수 있다.
본 발명에 사용하기 위한 다른 숙주는 트라우스토키트리아세애(Thraustochytriaceae) 내의 트라우스토키트리움, 야포노키트리움(Japonochytrium), 아플라노키트리움(Aplanochytrium), 엘리나(Elina) 및 쉬조키트리움, 및 라비린툴라세애(Labyrinthulaceae) 내의 라비린툴라(Labyrinthula), 라비린툴로이데스(Labyrinthuloides), 및 라비린토믹사(Labyrinthomyxa)를 포함하지만 이에 한정되지 않는 속으로부터의 미생물을 포함한다. 이러한 속 내의 바람직한 종으로는 하기 기재된 임의의 종을 들 수 있지만 이에 한정되지 않는다. 특히 바람직한 트라우스토키트리알레스 균주로는 쉬조키트리움 종 (S31)(ATCC 20888); 쉬조키트리움 종 (S8)(ATCC 20889); 쉬조키트리움 종 (LC-RM)(ATCC 18915); 쉬조키트리움 종 (SR21); 쉬조키트리움 종 N230D, 쉬조키트리움 아그레가툼(Schizochytrium aggregatum)(Goldstein et Belsky)(ATCC 28209); 쉬조키트리움 리마시눔(Schizochytrium limacinum)(Honda et Yokochi)(IFO 32693); 트라우스토키트리움 종 (23B)(ATCC 20891); 트라우스토키트리움 스트리아툼(Schizochytrium striatum)(Schneider)(ATCC 24473); 트라우스토키트리움 아우레움(Thraustochytrium aureum)(Goldstein)(ATCC 34304); 트라우스토키트리움 로세움(Thraustochytrium roseum)(Goldstein)(ATCC 28210); 및 야포노키트리움(Japonochytrium) 종 (L1)(ATCC 28207)을 들 수 있지만 이에 한정되지 않는다.
본 발명에 따라, "트라우스토키트리드"라는 용어는 트라우스토키트리아세애 과(family)를 포함하는 트라우스토키트리알레스 목(order)의 임의의 구성원을 지칭하며, "라비린툴리드"라는 용어는 라비린툴라세애(Labyrinthulaceae) 과를 포함하는 라비린툴라레스(Labyrinthulales) 목의 임의의 구성원을 포함한다. 라비린툴라세애 과의 구성원은 한때 트라우스토키트리알레스 목의 구성원인 것으로 고려되었지만, 이 생물체의 분류에 대한 보다 최근의 개정에서는 상기 과가 라비린툴라레스 목의 구성원인 것으로 고려되며, 라비린툴라레스와 트라우스토키트리알레스는 둘 다 라비린툴로미코타(Labyrinthulomycota) 문(phylum)의 구성원인 것으로 고려된다. 이 분야의 발전에 따라 트라우스토키트리드 및 라비린툴리드의 분류는 빈번하게 개정되어 왔다. 그러나, 분류 이론가들은 이러한 두가지 미생물 군을 조류 또는 조류-유사 원생생물과 함께 스트라메노필(Stramenopile) 계보내에 위치시킨다. 트라우스토키트리드 및 라비린툴리드의 현재의 분류학적 위치는 다음과 같이 요약될 수 있다:
계(Realm): 스트라메노필라(Stramenopila) (크로미스타(Chromista))
문(Phylum): 라비린툴로미코타
강(Class): 라비린툴로미세테스(Labyrinthulomycetes)
목: 라비린툴라레스
과: 라비린툴라세애
목: 트라우스토키트리알레스
과: 트라우스토키트리아세애
그러나, 잔존하는 분류학적 불확실성으로 인해, 본 발명에 있어서는 본 발명에서 트라우스토키트리드로서 기재된 균주들이 하기 생물체들을 포함하도록 하는 것이 최선책일 것이다: 목: 트라우스토키트리알레스; 과: 트라우스토키트리아세애; 속: 트라우스토키트리움 (종(Species): 종(sp.), 아루디멘탈(arudimentale), 아우레움(aureum), 벤티콜라(benthicola), 글로보섬(globosum), 키네이(kinnei), 모티붐(motivum), 멀티루디멘탈(multirudimentale), 파키데르뭄(pachydermum), 프롤리페룸(proliferum), 로세움(roseum), 스트리아툼(striatum)), 울케니아 (종(Species): 종(sp.), 아모에보이데아(amoeboidea), 케르구엘렌시스(kerguelensis), 미누타(minuta), 프로펀다(profunda), 라디아타(radiata), 사일렌스(sailens), 사르카리아나(sarkariana), 쉬조키트롭스(schizochytrops), 비수르겐시스(visurgensis), 요르켄시스(yorkensis)), 쉬조키트리움 (종(Species): 종(sp.), 아그레가툼(aggregatum), 림나세움(limnaceum), 만그로베이(mangrovei), 미누툼(minutum), 옥토스포룸(octosporum)), 야포노키트리움(Japonochytrium) (종(Species): 종(sp.), 마리눔(marinum)), 아플라노키트리움(Aplanochytrium) (종(Species): 종(sp.), 할리오티디스(haliotidis), 케르구엘렌시스(kerguelensis), 프로펀다(profunda), 스토키노이(stocchinoi)), 알토르니아(Althornia) (종(Species): 종(sp.), 크로우키(crouchii)), 또는 엘리나(Elina) (종(Species): 종(sp.), 마리살바(marisalba), 시노리피카(sinorifica)). 울케니아 속에 대한 최초의 기술은 논문 심사를 거친 저널에는 공개되지 않았으며 그래서 이 속 및 그 내부에 위치하는 종의 유효성에 대해 여전히 의문의 여지가 남아 있다는 것을 유의한다. 본 발명에 있어서, 울케니아 내에 속하는 것으로 기재된 종은 트라우스토키트리움 속의 구성원인 것으로 고려될 것이다.
본 발명에서 라비린툴리드로서 기재된 균주는 하기 생물체들을 포함한다: 목: 라비린툴라레스, 과: 라비린툴라세애, 속: 라비린툴라 (종(Species): 종(sp.), 알게리엔시스(algeriensis), 코에노시스티스(coenocystis), 카토니(chattonii), 마크로시스티스(macrocystis), 마크로시스티스 아틀란티카(macrocystis atlantica), 마크로시스티스 마크로시스티스(macrocystis macrocystis), 마리나(marina), 미누타(minuta), 로스코펜시스(roscoffensis), 발카노비(valkanovii), 비텔리나(vitellina), 비텔리나 파시피카(vitellina pacifica), 비텔리나 비텔리나(vitellina vitellina), 조프피(zopfii)), 라비린툴로이데스(Labyrinthuloides) (종(Species): 종(sp.), 할리오티디스(haliotidis), 요르켄시스(yorkensis)), 라비린토믹사(Labyrinthomyxa) (종(Species): 종(sp.), 마리나(marina)), 디플로프리스(Diplophrys) (종(Species): 종(sp.), 아르케리(archeri)), 피르호소루스(Pyrrhosorus) (종(Species): 종(sp.), 마리누스(marinus)), 소로디플로프리스(Sorodiplophrys) (종(Species): 종(sp.), 스테르코레아(stercorea)) 또는 클라미도믹사(Chlamydomyxa) (종(Species): 종(sp.), 라비린툴로이데스(labyrinthuloides), 몬타나(montana)) (그렇지만, 현재 피르호소루스, 소로디플로프리스 또는 클라미도믹사의 정확한 분류학적 위치는 일치하지 않고 있다).
본 발명의 한 실시양태에서, 미생물의 내생성 PUFA PKS 시스템 및/또는 내생성 PUFA PKS 부속 단백질 (예, ACoAS)은 예를 들어 전형적인 돌연변이유발 및 선별 기술 및/또는 분자 유전적 기술 (유전 공학 기술 포함)에 의해 유전적으로 개질된다. 유전 공학 기술은 예를 들어 표적화 재조합 벡터를 사용해서 내생성 유전자의 일부를 결실시키거나 또는 내생성 유전자의 일부를 이종 서열로 대체하는 것을 포함할 수 있다. 숙주 게놈으로 도입될 수 있는 이종 서열의 예로는 다른 PKS 시스템으로부터의 하나 이상의 기능적 PUFA PKS 도메인 또는 단백질 또는 심지어 전체 PUFA PKS 시스템 (예, PUFA PKS 시스템과 관련된 모든 유전자들)을 코딩하는 서열을 들 수 있다. 이종 서열은 또한 PUFA PKS 시스템으로부터의 천연 도메인의 개질된 기능성 도메인 (상동체)를 코딩하는 서열을 포함할 수 있다. 숙주 게놈으로 도입될 수 있는 다른 이종 서열로는 내생성 PUFA PKS 시스템의 활성에 영향을주는 단백질, 예를 들면 본원에 개시된 부속 단백질을 코딩하는 핵산 분자를 들 수 있다. 예를 들어, 당업자라면 ACoAS, 특히 PUFA PKS 시스템과 함께 작용하는 내생성 ACoAS과 비교해서 숙주에서 PUFA의 제조 및/또는 축적을 증진시키는 ACoAS를 코딩하는 핵산 분자를 숙주 게놈으로 도입할 수 있을 것이다.
유전적으로 개질된 식물
본 발명의 다른 실시양태는 본원에 기재된 바와 같은 PPTase를 비롯한 PUFA PKS 시스템을 재조합적으로 발현시키도록 유전적으로 개질되었으며, 숙주에 의한 PUFA (또는 PUFA PKS 시스템의 다른 생활성 생성물)의 제조 및/또는 축적을 향상시키기 위한 본원에 기재된 바와 같은 부속 단백질을 발현시키고/시키거나 PUFA PKS 시스템과 경쟁하는 경로를 억제 (예, FAS 시스템을 억제)하도록 추가로 유전적으로 개질된 것인 유전적으로 개질된 식물에 관한 것이다. 바람직하게는, 이러한 부속 단백질은 PL 또는 TAG (예, GPAT, LFAAT, 또는 DAGAT)를 형성하는데 있어서 기질로서 PUFA-CoA를 이용하는 단백질 및/또는 ACoAS이다.
본원에 사용된 바와 같이, 유전적으로 개질된 식물은 고등 식물, 특히 본 발명의 생활성 분자 (예, PUFA)를 제조하는데 유용한 임의의 소비가능한 식물 또는 식물들을 비롯한 임의의 유전적으로 개질된 식물을 포함할 수 있다. "식물 부분"은, 본원에 사용된 바와 같이, 종자 (성숙 종자 및 미성숙 종자 포함), 화분, 배아, 꽃, 과실, 새싹, 잎, 뿌리, 줄기, 이식체 등을 포함하지만 이에 한정되지 않는 식물의 임의의 일부를 포함한다. 유전적으로 개질된 식물은 목적하는 결과 (즉, 증가 또는 변경된 PUFA PKS 활성 및/또는 PUFA PKS 시스템을 이용한 목적 생성물의 제조 및/또는 축적)가 달성되도록 정상 (즉, 야생형 또는 천연 발생) 형태로부터 개질된 (즉, 돌연변이되거나 변화된) 게놈을 갖는다. 식물의 유전적 개질은 전형적인 균주 개발 및/또는 분자 유전적 기술을 이용해서 달성할 수 있다. 목적하는 아미노산 서열을 코딩하는 재조합 핵산 분자가 게놈내로 도입된 트랜스제닉 식물을 생성시키는 방법은 당업계에 공지되어 있다. 본 발명에 따라 유전적으로 개질시키는데 바람직한 식물은 바람직하게는 인간을 비롯한 동물이 소비하기에 적합한 식물이다.
본 발명에 따라 유전적으로 개질시키는데 바람직한 식물 (즉, 식물 숙주 세포)로는 쌍자엽 및 단자엽 식물을 비롯한 임의의 고등 식물, 특히 작물 식물을 비롯한 소비가능한 식물, 보다 특히는 오일용으로 사용되는 식물을 들 수 있지만 이에 한정되지 않는다. 이러한 식물로는 예를 들어 다음과 같은 것들이 포함될 수 있지만 이에 한정되지 않는다: 카놀라, 대두, 평지씨, 아마인, 옥수수, 잇꽃, 해바라기 및 담배. 따라서, 임의의 식물 종 또는 식물 세포를 선택할 수 있다. 본원에 사용된 특정 세포 및 그로부터 성장 또는 유래된 식물로는 카놀라 (Brassica rapa L.); 대두 (Glycine max); 평지씨 (Brassica spp.); 아마인/아마 (Linum usitatissimum); 옥수수 (corn) (Zea mays); 잇꽃 (Carthamus tinctorius); 해바라기 (Helianthus annuus); 담배 (Nicotiana tabacum); 아라비돕시스 탈리아나 (Arabidopsis thaliana), 브라질 견과 (Betholettia excelsa); 아주까리 종자 (Riccinus communis); 코코넛 (Cocus nucifera); 고수풀 (Coriandrum sativum); 면화 (Gossypium spp.); 땅콩 (Arachis hypogaea); 호호바 (Simmondsia chinensis); 머스타드 (Brassica spp. 및 Sinapis alba); 야자유 (Elaeis guineeis); 올리브 (Olea eurpaea); 벼 (Oryza sativa); 스쿼시 (Cucurbita maxima); 보리 (Hordeum vulgare); 밀 (Traeticum aestivum); 및 좀개구리밥 (Lemnaceae sp.)으로부터 얻을 수 있는 세포를 들 수 있지만 이에 한정되지 않는다. 이와 함께 식물 종 내부의 유전적 배경이 달라질 수 있음을 유의해야 한다.
특히 바람직한 특징, 예를 들어 질병 내성, 식물 형질전환 용이성, 오일 함량 또는 프로필 등에 대해 최적화된, 상기 식물로부터의 식물 세포주를 본원에 따라 제조, 선별 또는 확인할 수 있다. 바람직한 식물 세포주는 식물 브리딩에 의해 또는 마커 보조 브리딩 및 틸링과 같은 방법에 의해 선별할 수 있다. 본원에 언급된 부속 단백질, 표적화된 경로 억제, 및/또는 PUFA PKS 시스템 (PUFA 신타제)에 대해 조절된 활성을 나타내는 식물 세포주가 특히 유용하다는 것을 유의해야 한다.
추가의 실시양태에서 식물 세포 배양물은 본원에 따라 사용할 수 있다. 이러한 실시양태에서, 식물 세포는 통상의 농업 실무를 이용해서는 분화된 식물로 성장 및 재배되지 않으며, 대신 액상 배지 중에서 성장 및 유지시킨다.
다른 바람직한 식물로는 제약 제제, 향미제, 건강식 제제, 기능성 식품 성분 또는 화장용 활성제로서 사용되는 화합물을 제조하는 것으로 알려진 식물 또는 이들 화합물/물질들을 제조하도록 유전적으로 조작된 식물을 들 수 있다.
상기 논의된 바와 같이, 본 발명의 PUFA PKS 신타제는 FAS 시스템의 지방산 생성물을 이용하지 않는다. 대신, 상기 신타제는 FAS 및 엘론가제 (말로닐-CoA)에 의해 이용되는 동일한 작은 전구체 분자로부터 최종 PUFA 생성물 (주요 PUFA 생성물)을 제조한다. 따라서, 합성 사이클에서의 중간체는 임의의 유의한 양으로 방출되지 않으며, PUFA 생성물 (본원에서 주요 PUFA 생성물이라고도 지칭함)은 인지질 (PL) 및 이 지질의 트리아실글리세롤 (TAG) 분획으로 효율적으로 전달된다. 실제로, PUFA PKS 시스템은 두가지 표적 또는 주요 PUFA 생성물을 제조할 수 있지만 (예를 들어, 쉬조키트리움 유래의 PUFA PKS 시스템은 주요 생성물로서 DHA 및 DPAn-6을 둘 다 제조함), DPA는 DHA를 제조하는 경로에서 중간체가 아니다. 오히려, 각각은 동일한 PUFA PKS 시스템의 별도의 생성물이다. 따라서, PUFA PKS 유전자들은 식물과 같은 이종 숙주에서 PUFA, 특히 장쇄 PUFA (LCPUFA)를 함유하는 오일을 제조하는 훌륭한 수단이며, 상기 오일은 "표준" PUFA 경로 (하기에서도 정의됨)에 의해 제조된 오일을 오염시키는 부(side) 생성물 및 중간체를 실질적으로 함유하지 않는다 (하기에서 정의됨).
따라서, 본 발명의 목적은 본원에 기재된 바와 같은 식물의 유전적 조작을 통해 원하는 수의 이중 결합을 갖는 목적하는 쇄 길이의 다불포화 지방산을 제조하고, 연장에 의해 이러한 식물로부터 얻어진 (즉, 이러한 식물의 오일 종자로부터 얻어진) PUFA를 포함하는 오일 및 오일 종자를 제조하는 것이다. 본 발명에 의해 제조될 수 있는 PUFA의 예로는 DHA (도코사헥사엔산 (C22:6, n-3)), ARA (에이코사테트라엔산 또는 아라키돈산 (C20:4, n-6)), DPA (도코사펜타엔산 (C22:5, n-6 또는 n-3)) 및 EPA (에이코사펜타엔산 (C20:5, n-3)), 및 이들의 임의의 조합을 들 수 있지만 이에 한정되지 않는다. 본 발명에 따르면, PUFA를 제조하는 폴리케티드 신타제-유사 시스템(본 발명자들에 의해 개발됨)을 사용함으로써 한가지 이상의 목적하는 (표적 또는 주요) PUFA 중 풍부화된 상업적으로 가치있는 지질을 제조할 수 있다.
본 발명에 따라, "주요 PUFA", "표적 PUFA", "의도된 PUFA", 또는 "목적하는 PUFA"에 대한 언급는 PUFA(들)을 제조하는데 사용되는 효소 경로의 의도된 또는 표적화된 생성물인 특정 PUFA 또는 PUFA들을 지칭한다. 예를 들어, 엘론가제 및 데새투라제를 사용해서 FAS 시스템의 생성물을 개질시키는 경우, 당업자라면 함께 사용하는 경우에 표적 또는 목적하는 PUFA (예, DHA 또는 EPA)를 제조하는 엘론가제 및 데새투라제의 특정 조합을 선별할 수 있다. 상기 논의된 바와 같이, 표준 경로에 의해 제조된 이러한 표적 또는 목적하는 PUFA는, 이 시스템에 의해 제조된 생성물의 대부분을 실제로 나타낼 수 있는 부 생성물 및 중간체의 형성으로 인해, 상기 시스템에 의해 제조된 총 지방산의 비율로는 PUFA의 양 측면에서 사실상 "주요" PUFA가 아닐 수 있다. 그러나, 당업자라면 상기 시스템에서 사용된 엘론가제 또는 데새투라제에 의해 제조되는 표적 또는 의도된 PUFA 생성물을 지칭하는 경우에도 "주요 PUFA"라는 용어를 사용할 수 있다.
본 발명에서 바람직한 것으로 PUFA PKS 시스템을 사용하는 경우, 특정 생물체로부터 유래된 주어진 PUFA PKS 시스템에 의해 특정 PUFA(들)이 제조될 것이며, 그 결과 특정 생물체로부터 PUFA PKS 시스템의 선별로 특정의 표적 또는 주요 PUFA가 제조될 것이다. 예를 들어, 쉬조키트리움 유래의 PUFA PKS 시스템의 사용에 의해 표적 또는 주요 PUFA로서 DHA 및 DPAn-6이 제조될 것이다. 한편, 다양한 쉬바넬라 종 유래의 PUFA PKS 시스템의 사용에 의해 표적 또는 주요 PUFA로서 EPA가 제조될 것이다. 주요 또는 표적 PUFA의 비율은 특정 PUFA PKS 시스템의 선택 및 이 시스템이 그가 발현되는 특정 조건에 대해 반응하는 방식에 따라 차이가 있을 수 있음을 유의한다. 예를 들어, 트라우스토키트리움 23B (ATCC 번호 20892) 유래의 PUFA PKS 시스템의 사용에 의해 표적 또는 주요 PUFA로서 DHA 및 DPAn-6이 제조될 것이다. 그러나, 트라우스토키트리움 23B의 경우에는 DHA 대 DPAn-6의 비율이 약 10:1이지만 (약 8:1 내지 약 40:1의 범위일 수 있음), 쉬조키트리움에서는 상기 비율이 전형적으로 약 2.5:1이다. 따라서, 표적 PUFA가 동일한 경우에도, 트라우스토키트리움 PUFA PKS 시스템 또는 단백질 또는 도메인을 사용하면 쉬조키트리움에 비해 생물체에 의해 제조되는 PUFA의 비율을 변화시킬 수 있다. 또한, 하기 논의된 바와 같이, 당업자라면 여러 PUFA PKS 시스템 또는 PUFA PKS 및 PKS 시스템으로부터의 단백질 및 도메인을 상호혼합함으로써 주어진 PUFA PKS 시스템을 개질시킬 수 있거나 또는 주어진 PUFA PKS 시스템의 도메인 또는 단백질을 개질시켜 표적 PUFA 생성물 및/또는 비율을 변화시킬 수 있다.
본 발명에 따라, PUFA를 제조하는 효소 시스템의 "중간체 생성물" 또는 "부 생성물"에 대한 언급은 이 시스템의 표적 또는 주요 PUFA(들)의 제조 결과로서 효소 시스템에 의해 제조되지만 주요 또는 표적 PUFA(들)은 아닌 임의의 생성물, 특히 지방산 생성물을 지칭한다. 한 실시양태에서, 중간체 및 부 생성물은, 야생형 식물에 의해 또는 지시된 유전적 개질에 대한 수령자(recipient)로서 사용된 모체 식물에 의해 천연적으로 제조되지만 유전적 개질의 결과로 야생형 식물에 의해 또는 지시된 유전적 개질에 대한 수령자로서 사용된 모체 식물에 의해 제조되는 수준에 비해 더 높은 수준으로 제조되기 때문에 중간체 또는 부 생성물로서 분류되는 비-표적 지방산을 포함할 수 있다. 상기 논의된 바와 같이, 중간체 및 부 생성물은 PUFA 합성을 위한 표준 경로에서 특히 중요하지만 PUFA PKS 경로에서는 사실상 덜 중요하다. 하나의 효소 시스템의 주요 또는 표적 PUFA는 주요 또는 표적 생성물이 상이한 PUFA인 경우에 상이한 효소 시스템의 중간체일 수 있으며, 이는 PUFA PKS 시스템에서 중간체가 실질적으로 생성되지 않기 때문에 PUFA 제조를 위한 표준 경로의 생성물의 경우에 특히 그러하다는 것을 유의한다. 예를 들어, 표준 경로를 이용해서 EPA를 제조하는 경우, 지방산, 예를 들면 GLA, DGLA 및 SDA는 중간체 생성물로서 유의한 양으로 제조된다 (예를 들어, 미국 특허 출원 공개 제2004/0172682호는 이러한 점을 예시한다). 유사하게는 미국 특허 출원 공개 제2004/0172682호에도 예시된 바와 같이, 표준 경로를 이용해서 DHA를 제조하는 경우, 상기 언급한 지방산 이외에, ETA 및 EPA (특히, 상기 첫번째 예의 표적 PUFA임)가 유의한 양으로 제조되며, 실제로는 표적 PUFA 자체보다 총 지방산 생성물에 대해 상당히 더 많은 양으로 존재할 수 있다. 후자의 사실은 미국 특허 출원 공개 제2004/0172682호에서도 밝히고 있으며, 여기서 표준 경로에 의해 DHA를 제조하도록 조작된 식물은 표적화된 DHA보다 총 지방산의 비율로서 더 많은 EPA를 제조하는 것으로 되어 있다.
한가지 이상의 목적하는 다불포화 지방산을 상당히 높은 수율로 제조하기 위해, 식물을 유전적으로 개질시켜 식물에 PUFA PKS 시스템을 도입할 수 있다. 식물은 PUFA PKS 시스템을 내생적으로 함유하지 않는 것으로 알려져 있으며, 따라서 본 발명의 PUFA PKS 시스템은 특이적인 지방산 제조 능력을 갖는 식물을 제조하는 기회를 제공한다. 본 발명의 특히 바람직한 실시양태는 동일 식물에서 EPA, DHA, DPA (n3 또는 n6), ARA, GLA, SDA 등 (이들의 임의의 조합 포함)을 비롯한 한가지 이상의 PUFA를 제조하도록 유전적으로 조작된 식물에 관한 것이다. 본 발명은 다수의 "디자이너(designer) 오일" 중 어느 하나를 다양한 비율 및 형태로 생성시키는 능력을 부여한다. 게다가, 본원에 기재된 특정 해양 생물체 유래의 PUFA PKS 유전자들의 개시내용은 PUFA 제조 범위를 보다 용이하게 확장시켜 대부분의 작물 식물을 성장시키는데 사용되는 온도 범위내에서 상기 PUFA를 성공적으로 제조하도록 하는 기회를 부여한다.
따라서, 본 발명의 한 실시양태는 본원에 기재된 바와 같은 코어 PUFA PKS 효소 복합체 및 PPTase를 포함하며, 숙주에 의한 PUFA (또는 PUFA PKS 시스템의 다른 생활성 생성물)의 제조 및/또는 축적을 향상시키기 위한 본원에 기재된 바와 같은 부속 단백질을 발현시키도록 추가로 유전적으로 개질되고/되거나 본원에 기재된 바와 같은 PUFA PKS 시스템과 경쟁하는 경로를 억제 (예를 들어, FAS 시스템을 억제)하도록 유전적으로 개질된 것인 유전적으로 개질된 식물 또는 식물의 일부 (예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 PUFA PKS 시스템을 발현시키도록 유전적으로 개질된 식물)에 관한 것이다. 바람직하게는, 이러한 부속 단백질은 식물이 PUFA를 제조하도록 PL 또는 TAG (예, GPAT, LFAAT, 또는 DAGAT)를 형성하는데 있어서 기질로서 PUFA-CoA를 이용하는 단백질 및/또는 ACoAS이다.
바람직하게는, 이러한 추가의 유전적 개질은 말로닐-CoA 푸울(들)에 대한 경쟁을 감소시킴으로써 PUFA 신타제 경로를 통한 흐름을 증가시키는 (천연 발생, 선별된, 또는 합성된) 임의의 조합이다. 상기 기질과 경쟁하는 능력을 증진시키기 위한 가능한 방법이 다수 존재한다. 이러한 방법으로는 1) FAS 경로에서의 임의의 요소의 억제를 비롯한 경쟁 경로를, 예를 들어 상기 경로에 관여하는 효소 또는 서브유닛의 발현 수준을 감소시킴으로써 억제하는 방법 (예를 들어, 안티센스 RNA, RNAi, 공동억제 또는 돌연변이를 이용함), 2) 경쟁 경로가 감소 또는 차단된 이종 숙주 (예를 들어, 세포질에서 지방산을 연장시키는 능력이 차단된 카놀라)에서 PUFA 신타제를 발현시키는 방법, 및/또는 3) (예를 들어, 아세틸-CoA 카르복실라제의 발현에 의해) 말로닐-CoA의 푸울을 증가시키는 방법을 들 수 있지만 이에 한정되지 않는다. 한 실시양태에서, KASII 및/또는 KASIII은 (예를 들어, RNAi 또는 안티센스에 의해) 식물에서 억제된다.
상기 언급된 바와 같이, 본 발명에 유용한 유전적으로 개질된 식물은 PUFA PKS 시스템을 발현시키도록 유전적으로 개질된 것이다. PUFA PKS 시스템은 예를 들어 미국 특허 제6,566,583호; 미국 특허 출원 공개 제20020194641호; 미국 특허 출원 공개 제20040235127호; 미국 특허 출원 공개 제20050100995호; 및 PCT 공개 제WO 2006/135866호에 기재된 임의의 PUFA PKS 시스템과 같은 임의의 PUFA PKS 시스템을 포함할 수 있다. PUFA PKS 시스템은 상기 특허 및 특허 간행물들에서 확인 및 특성화된 특정 PUFA PKS 시스템들 중 어떤 것, 예를 들면 쉬조키트리움 종 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 (ATCC) 번호 20888 및 그로부터 유래된 돌연변이체 균주 (예, 균주 N230D); 트라우스토키트리움 23B ATCC 번호 20892 및 그로부터 유래된 돌연변이체 균주; 쉬바넬라 올레야나(Shewanella olleyana) 오스트랠리언 콜렉션 오브 앤타크틱 마이크로오르가니즘스 (Australian Collection of Antarctic Microorganism; ACAM) 균주 번호 644 및 그로부터 유래된 돌연변이체 균주; 또는 쉬바넬라 야포니카 ATCC 균주 번호 BAA-316 및 그로부터 유래된 돌연변이체 균주 유래의 PUFA PKS 시스템으로부터 선택될 수 있지만 이에 한정되지 않는다.
한 실시양태에서, PUFA PKS 시스템은 조합 (혼합 및 대응)에 의해 상기 논의된 바와 같은 최소 요건을 충족시키는 완전한 PUFA PKS 시스템을 형성시키는, 상기 PUFA PKS 시스템 중 어떤 것으로부터 얻어진 도메인들을 포함한다. 또한, 식물은 제I형 PKS 시스템 (반복적 또는 모듈성), 제II형 PKS 시스템, 및/또는 제III형 PKS 시스템을 포함하지만 이에 한정되지 않는 다른 PKS 시스템의 하나 이상의 도메인 또는 그의 생물학적 활성 단편으로 추가로 개질시킬 수 있으며, 이는 PUFA PKS 시스템내의 어떤 도메인을 대체할 수 있다. 마지막으로, PUFA PKS 시스템의 도메인 중 어떤 도메인은 그의 천연 구조를 개질시켜 PUFA PKS 시스템내의 상기 도메인의 기능을 변경 또는 개질시킬 수 있다 (예를 들어, 상기 시스템에 의해 제조된 PUFA 유형 또는 그의 비율을 변화시킬 수 있음). 이와 같이 도메인을 혼합해서 키메라 PUFA PKS 단백질을 제조하는 것은 상기 언급된 특허 및 특허 간행물들에 기재되어 있다.
바람직하게는, 상기 확인된 특징들 중 어느 것을 갖는 식물은 본원에 상세히 기재된 바와 같은 PUFA PKS 시스템 (PUFA 신타제)를 발현시키도록 유전적으로 개질된 식물이다 (즉, PUFA PKS 시스템은 식물에서 표적 PUFA(들)을 제조하는 효소 시스템임). 한 실시양태에서, 식물은 쉬조키트리움, 트라우스토키트리움, 울케니아, 야포노키트리움, 아플라노키트리움, 알토르니아 또는 엘리나를 포함하지만 이에 한정되지 않는 트라우스토키트리드 유래의 PUFA PKS 단백질/도메인으로 구성된 PUFA PKS 시스템을 발현시키도록 유전적으로 개질되었다. 한 실시양태에서, 식물은 라브린툴리드(labrynthulid) 유래의 PUFA PKS 단백질/도메인로 구성된 PUFA PKS 시스템을 발현시키도록 유전적으로 개질되었다. 다른 실시양태에서, 식물은 쉬바넬라 야포니카 또는 쉬바넬라 올레야나를 포함하지만 이에 한정되지 않는 해양 세균 유래의 PUFA PKS 단백질/도메인으로 이루어진 PUFA PKS 시스템을 발현시키도록 유전적으로 개질되었다. 한 실시양태에서, 식물은 상기 기재된 바와 같은 쉬조키트리움 OrfA, B 및 C (이들의 상동체 또는 합성 형태를 포함함), 및 PPTase (예, HetI)로 이루어진 PUFA PKS 시스템을 발현시키도록 유전적으로 개질되었다 (예를 들어, 서열 1-32 및 서열 33, 및 상기 쉬조키트리움 PUFA PKS 시스템에 대한 논의를 참조한다). 다른 실시양태에서, 식물은 상기 기재된 바와 같은 트라우스토키트리움 OrfA, B 및 C (이들의 상동체 또는 합성 형태를 포함함), 및 PPTase (예, HetI)로 이루어진 PUFA PKS 시스템을 발현시키도록 유전적으로 개질되었다 (예를 들어, 서열 38-68 및 서열 33, 및 상기 트라우스토키트리움 PUFA PKS 시스템에 대한 논의를 참조한다; 또한 미국 특허 출원 공개 제20050014231호를 참조한다). 다른 실시양태에서, 식물은 다른 트라우스토키트리드 OrfA, B 및 C (이들의 상동체 또는 합성 형태를 포함함), 및 PPTase (예, HetI)로 이루어진 PUFA PKS 시스템을 발현시키도록 유전적으로 개질되었다 (예를 들어, PCT 특허 공개 제WO 05/097982호를 참조한다). 다른 실시양태에서, 식물은 쉬바넬라와 같은 해양 세균 유래의 PUFA PKS Orf (이들의 상동체 또는 합성 형태를 포함함), 및 상기 기재된 바와 같은 PPTase (예, 내생성 쉬바넬라 PPTase)로 이루어진 PUFA PKS 시스템을 발현시키도록 유전적으로 개질되었다 (예를 들어, 쉬바넬라 야포니카에 대한 서열 1-6, 및 쉬바넬라 올레야나에 대한 서열 7-12를 참조한다). 다른 실시양태에서, 식물은 상기 PUFA PKS 시스템 (예, 키메라 PUFA PKS 시스템) 유래의 도메인 및 단백질의 임의의 조합을 발현시키도록 유전적으로 개질되었다.
마지막으로, 상기 논의된 바와 같이, 식물의 유전적 개질은 코어 PUFA PKS 효소 복합체와 함께 작용해서 식물에 의한 PUFA 제조를 가능케하거나, 촉진시키거나 또는 증진시키는 한가지 이상의 부속 단백질의 도입, 및/또는 예를 들어 본원에 기재된 FAS 시스템의 임의의 억제에 의한 것과 같이 PUFA PKS 시스템을 통한 말로닐 CoA 기질의 흐름을 증대시키는 유전적 개질, 또는 상기 기재된 바와 같은 것과 동일한 결과를 달성하기 위한 다른 전략의 이용을 포함할 수 있다. 또한 식물의 유전적 개질은 바람직한 숙주 코돈 용법을 위한 유전자들의 최적화, 및 PUFA 신타제 효소의 특정 세포소기관 (예, 색소체)으로의 표적화를 포함할 수 있다.
바람직하게는, 식물은 오일 종자 식물이며, 오일 종자 및/또는 오일 종자 중의 오일은 PUFA PKS 시스템에 의해 제조된 PUFA를 함유한다. 이러한 오일은 PUFA PKS 시스템의 생성물인 검출가능한 양의 하나 이상의 표적 또는 주요 PUFA를 함유한다. 추가로, 이러한 오일은 표적 또는 주요 PUFA 생성물이 아니며 야생형 식물내의 내생성 FAS 시스템에 의해 천연적으로 제조되지 않는 중간체 또는 부 생성물을 실질적으로 함유하지 않는다 (즉, 야생형 식물은 FAS 시스템에 의해 짧은 길이 또는 중간 길이의 쇄를 갖는 일부 PUFA, 예를 들면 탄소수 18의 PUFA를 제조하지만, PUFA PKS 시스템을 이용한 유전적 개질의 결과로서 식물에서 신규 또는 추가의 지방산이 제조될 것임). 달리 말하면, 지시된 유전적 개질의 수령자로서 사용된 모체 식물 또는 야생형 식물 (유전적으로 개질되지 않음)로부터의 총 지방산의 프로필과 비교해서, PUFA PKS 시스템을 이용해서 유전적으로 개질시킨 식물에 의해 제조된 총 지방산의 프로필 중 대부분의 추가의 지방산 (유전적 개질으로부터 얻어진 증가된 지방산 또는 신규 지방산)은 PUFA PKS 시스템의 표적 또는 의도된 PUFA 생성물을 포함한다 (즉, 유전적으로 개질된 식물에 의해 제조되는 총 지방산 중 대부분의 추가의 또는 신규 지방산은 표적 PUFA(들)임).
또한, PUFA를 합성하기 위한 시스템의 중간체 또는 부 생성물을 "실질적으로 함유하지 않는" 것 또는 중간체 또는 부 생성물이 실질적인 양으로 존재하지 않는 것은, PUFA를 제조하기 위한 효소 시스템의 도입 또는 존재의 결과로서 유전적으로 개질된 식물 (및/또는 식물의 부분 및/또는 종자 오일 분획)에서 제조되는 (즉, 지시된 유전적 개질에 대한 수령자로서 사용되는 모체 식물 또는 야생형 식물에 의해 제조되지 않는) 임의의 중간체 또는 부 생성물 지방산 (비-표적 PUFA)이 식물에 의해 제조된 총 지방산의 약 10 중량％ 미만, 더 바람직하게는 식물에 의해 제조된 총 지방산의 약 9 중량％ 미만, 더 바람직하게는 약 8 중량％ 미만, 더 바람직하게는 약 7 중량％ 미만, 더 바람직하게는 약 6 중량％ 미만, 더 바람직하게는 약 5 중량％ 미만, 더 바람직하게는 약 4 중량％ 미만, 더 바람직하게는 약 3 중량％ 미만, 더 바람직하게는 약 2 중량％ 미만, 더 바람직하게는 약 1 중량％ 미만인 양으로 존재한다는 것을 의미한다.
바람직한 실시양태에서, PUFA를 합성하기 위한 시스템의 중간체 또는 부 생성물을 "실질적으로 함유하지 않는" 것 또는 중간체 또는 부 생성물이 실질적인 양으로 존재하지 않는 것은, PUFA를 제조하기 위한 효소 시스템의 결과로서 유전적으로 개질된 식물 (및/또는 식물의 부분 및/또는 종자 오일 분획)에 존재하는 임의의 중간체 또는 부 생성물 지방산이 식물에 의해 제조된 추가의 지방산 (추가의 지방산은 표적 PUFA의 제조를 위한 지시된 유전적 개질에 대한 수령자로서 사용되는 모체 식물 또는 야생형 식물에 의해 천연적으로 제조되지 않는 지방산 또는 지방산 수준으로 정의됨) 전체의 약 10 중량％ 미만, 더 바람직하게는 식물에 의해 제조된 추가의 지방산 전체의 약 9％ 미만, 더 바람직하게는 약 8％ 미만, 더 바람직하게는 약 7％ 미만, 더 바람직하게는 약 6％ 미만, 더 바람직하게는 약 5％ 미만, 더 바람직하게는 약 4％ 미만, 더 바람직하게는 약 3％ 미만, 더 바람직하게는 약 2％ 미만, 더 바람직하게는 약 1％ 미만인 양으로 존재한다는 것을 의미한다. 따라서, 표준 경로에 의해 PUFA를 제조하도록 유전적으로 개질된 식물의 지방산 프로필과는 달리, PUFA PKS 시스템을 이용한 유전적 개질으로부터 생성된 대부분의 지방산 생성물은 표적 또는 의도된 지방산 생성물일 것이다.
PUFA PKS 시스템의 표적 생성물이 장쇄 PUFA, 예를 들면 DHA, DPA (n-6 또는 n-3), 또는 EPA인 경우, 그러한 PUFA PKS를 사용해서 유전적으로 개질된 식물의 총 지질 중에 실질적인 양으로 존재하지 않는 중간체 생성물 및 부 생성물은 감마-리놀렌산 (GLA; 18:3, n-6); 스테아리돈산 (STA 또는 SDA; 18:4, n-3); 디호모-감마-리놀렌산 (DGLA 또는 HGLA; 20:3, n-6), 아라키돈산 (ARA, C20:4, n-6); 에이코사트리엔산 (ETA; 20:3, n-9) 및 다양한 다른 중간체 또는 부 생성물, 예를 들면 20:0; 20:1 (Δ5); 20:1 (Δ11); 20:2 (Δ8,11); 20:2 (Δ11,14); 20:3 (Δ5,11,14); 20:3 (Δ11,14,17); 미드산(mead acid) (20:3; Δ5,8,11); 또는 20:4 (Δ5,1,14,17)를 포함할 수 있지만 이에 한정되지 않는다. 또한, 표적 생성물이 특정 PUFA, 예를 들면 DHA인 경우, 유전적으로 개질된 식물의 총 지질 중에 실질적인 양으로 존재하지 않는 중간체 생성물 및 부 생성물은 상기 예에서 EPA와 같은, PUFA PKS 시스템의 천연 생성물인 다른 PUFA를 비롯한 다른 PUFA를 포함한다. 본 발명의 PUFA PKS 시스템은 또한 원한다면 표적 PUFA로서 GLA, SDA 또는 DGLA를 포함할 수 있는 PUFA를 제조하는데 사용될 수 있음을 유의한다.
본원에 기재된 바와 같은 PUFA PKS 시스템의 도메인 구조 및 유전적 기초에 대한 지식을 이용해서, 본 발명자들은 상기 PUFA PKS 시스템을 코딩하는 구조물을 설계 및 제조하고, 이러한 PUFA PKS 시스템을 발현시키는 트랜스제닉 식물을 성공적으로 생성시켰다. 트랜스제닉 식물은 PUFA를 함유하는 오일을 제조하며, 오일은 표준 PUFA 경로에서 축적되는 중간체 생성물을 실질적으로 함유하지 않는다. 본 발명자들은 또한 트랜스제닉 식물의 생성에 앞서서 개념증명(proof-of-concept) 실험으로서 다른 진핵생물인 효모에서 상기 구조물을 사용해서 PUFA를 제조하는 것을 입증하였다. 상기 예는 표적 PUFA로서 DHA 및 DPAn-6을 제조하는 PUFA PKS 시스템을 사용해서 효모 및 식물을 형질전환시킴으로써 상기 PUFA의 둘 다가 식물에서는 총 지방산 중 주요 추가의 지방산으로서 (즉, 야생형 식물에서 제조되는 지방산은 제외함) 제조되고 효모에서도 제조되며, 추가로 야생형 식물 또는 모체 식물의 지방산 중에 존재하지 않는 임의의 다른 지방산은 사실상 검출가능하지 않다는 것을 입증한다. 본 발명의 유전적으로 개질된 식물 및 그의 부분 및 오일의 구체적인 특징은 하기에 상세히 기재되어 있다.
본 발명에 따라, 유전적으로 개질된 식물로는 전형적인 돌연변이유발 및 스크리닝 기술과 조합될 수 있는 재조합 기술을 이용해서 개질시킨 식물을 들 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, 유전자 발현, 유전자 기능 또는 유전자 생성물 (즉, 유전자에 의해 코딩된 단백질)의 기능에서의 감소를 일으키는 유전적 개질은 유전자의 불활성화 (완전한 또는 부분적인 불활성화), 결실, 중단, 차단 또는 하향조절로서 지칭될 수 있다. 예를 들어, 유전자에 의해 코딩된 단백질의 기능 감소를 일으키는 유전자의 유전적 개질은 유전자의 완전한 결실 (즉, 유전자는 존재하지 않으며, 따라서 단백질도 존재하지 않음), 단백질이 불완전하게 번역되거나 또는 전혀 번역되지 않는 (예를 들어, 단백질이 발현되지 않음) 유전자 돌연변이, 또는 단백질의 천연 기능을 감소시키거나 또는 폐지하는 유전자 돌연변이 (예를 들어, 효소 활성 또는 작용이 감소되거나 또는 전혀 존재하지 않는 단백질이 발현됨)의 결과일 수 있다. 유전자 발현 또는 기능의 증가를 나타내는 유전적 개질은 유전자의 증폭, 과제조, 과발현, 활성화, 증진, 부가 또는 상향조절로서 지칭될 수 있다.
본 발명에 따른 식물의 유전적 개질에 따라 이 식물에 의해 한가지 이상의 PUFA가 제조된다. 식물에 의해 제조된 PUFA의 비율 및 PUFA 프로필은 PUFA PKS 시스템이 유래된 생물체에 의해 제조된 PUFA의 비율 또는 PUFA 프로필과 반드시 동일하지는 않다.
유전적으로 개질된 식물의 제조에 있어서, 식물의 유전적 조작을 위한 방법은 또한 당업계에 잘 알려져 있다. 예를 들어, 쌍자엽 식물 및 단자엽 식물을 위한 생물학적 및 물리적 형질전환 프로토콜을 비롯한 다수의 식물 형질전환 방법이 개발되어 왔다 (예, 문헌 [Goto-Fumiyuki et al., 1999, Nature Biotech 17: 282-286]). 예를 들어, 문헌 [Miki et al., "Procedures for Introducing Foreign DNA into Plants" in Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology, Glick, B.R. and Thompson, J.E. Eds. (CRC Press, Inc., Boca Raton, 1993) pp. 67-88]을 참조한다. 또한, 식물 세포 또는 조직 형질전환 및 식물 재생을 위한 벡터 및 시험관내 배양 방법이 이용가능하다. 예를 들어, 문헌 [Gruber et al., "Vectors for Plant Transformation" in Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology, Glick, B.R. and Thompson, J.E. Eds. (CRC Press, Inc., Boca Raton, 1993) pp. 89-119]을 참조한다.
발현 벡터를 식물로 도입하기 위해 가장 널리 이용되는 방법은 아그로박테리움의 천연 형질전환 시스템을 기초로 한다. 예를 들어, 문헌 [Horsch et al., Science 227:1229 (1985)]을 참조한다. 에이. 투메파시엔스(A. tumefaciens) 및 에이. 리조게네스(A. rhizogenes)는 식물 세포를 유전적으로 형질전환시키는 식물 병원성 토양 세균이다. 에이. 투메파시엔스 및 에이. 리조게네스의 Ti 및 Ri 플라스미드는 각각 식물의 유전적 형질전환을 담당하는 유전자들을 보유한다. 예를 들어, 문헌 [Kado, C.I., Crit. Rev. Plant. Sci. 10:1 (1991)]을 참조한다. 아그로박테리움 벡터 시스템 및 아그로박테리움-매개된 유전자 전달 방법에 대한 설명은 문헌 [Gruber et al., 상기 문헌, Miki et al., 상기 문헌, Moloney et al., Plant Cell Reports 8:238 (1989)], 및 미국 특허 제4,940,838호 및 동 제5,464,763호를 비롯한 다수의 문헌들에 제시되어 있다.
일반적으로 적용가능한 다른 식물 형질전환 방법으로는 미세발사체(microprojectile)-매개된 형질전환이 있으며, 여기서 DNA는 미세발사체의 표면상에 보유된다. 식물 세포벽 및 세포막을 통과하기에 충분한 속도로 미세발사체를 가속시키는 바이오리스틱(biolistic) 장치를 사용해서 발현 벡터를 식물 조직내에 도입한다 [Sanford et al., Part. Sci. Technol. 5:27 (1987), Sanford, J.C., Trends Biotech. 6:299 (1988), Sanford, J.C., Physiol. Plant 79:206 (1990), Klein et al., Biotechnology 10:268 (1992)].
DNA를 식물로 물리적으로 전달하기 위한 다른 방법으로는 표적 세포의 초음파처리가 있다 [Zhang et al., Bio/Technology 9:996 (1991)]. 별법으로, 리포좀 또는 스페로플라스트(spheroplast) 융합을 이용해서 발현 벡터를 식물에 도입한다 [Deshayes et al., EMBO J., 4:2731 (1985), Christou et al., Proc Natl. Acad. Sci. USA 84:3962 (1987)]. CaCl2 침전, 폴리비닐 알콜 또는 폴리-L-오르니틴을 사용해서 DNA를 원형질체(protoplast)에 직접 수용시키는 것이 또한 보고되었다 [Hain et al., Mol. Gen. Genet. 199:161 (1985) and Draper et al., Plant Cell Physiol. 23:451 (1982)]. 원형질체 및 전체 세포 및 조직의 전기천공이 또한 기재되었다 [Donn et al., In Abstracts of VIIth International Congress on Plant Cell and Tissue Culture IAPTC, A2-38, p. 53 (1990); D'Halluin et al., Plant Cell 4:1495-1505 (1992) and Spencer et al., Plant Mol. Biol. 24:51-61 (1994)]. 추가로, 실리콘 카바이드 휘스커(whisker) [Kaepler et al., 1990, Plant Cell Reports] 및 예를 들어 플라워(flower) 침지 방법을 이용한 식물 형질전환 [Clough and Bent, 1998, Plant J. 16: 735 - 743]이 이용될 수 있다.
정확한 식물 형질전환 방법은 선택된 식물 종 및 형질전환을 위해 선택된 식물 세포 유형 (예, 실생식물(seedling) 유래의 세포 유형, 예를 들면 배축(hypocotyl) 및 자엽(cotelydon) 또는 배아 조직)에 따라 다소 달라질 수 있다.
상기 한 실시양태에서 언급된 바와 같이, 선택된 식물은 잇꽃이다. 잇꽃 형질전환체를 얻는 방법은 문헌 [Baker and Dyer (Plant Cell Reports, 1996, 16: 106 -110)]에 기재되었다.
유전적 구조물을 식물 세포로 도입한 다음, 식물 세포를 성장시키고, 새싹 및 뿌리와 같은 분화된 조직이 나오게 되면 성숙한 식물이 생성된다. 전형적으로, 다수의 식물을 발생시킨다. 식물을 재생시키는 방법은 일반적으로 당업자에게 공지되어 있으며, 예를 들어 문헌 [Plant Cell and Tissue Culture, 1994, Vasil and Thorpe Eds. Kluwer Academic Publishers and in: Plant Cell Culture 프로토콜s (Methods in Molecular Biology 111, 1999 Hall Eds Humana Press)]에서 찾을 수 있다.
따라서, 본 발명은 특정 해양 세균성 및 임의의 트라우스토키트리드 유래의 유전자들 또는 다른 진핵생물 PUFA PKS 시스템을 이용해서 식물 세포를 유전적으로 개질시키는 방법을 포함하며, 추가로 유전자 혼합을 이용해서 PUFA 생성물의 범위가 EPA, DHA, DPA (n-3 또는 n-6), ARA, GLA, SDA 및 다른 것들을 포함하도록 연장시키고/시키거나 변화시킬 수 있다. 상기 변화된 PUFA 제조 프로필을 얻는 방법은 다양한 생물체 유래의 유전자들을 트라우스토키트리드 PUFA PKS 유전자로 혼합하는 것 뿐만 아니라 본원에 개시된 내생성 트라우스토키트리드 PUFA PKS 유전자들을 유전적으로 개질시키는 다양한 방법을 또한 포함한다. 트라우스토키트리드 PUFA PKS 시스템 및 해양 세균성 PUFA PKS 시스템의 유전적 기초 및 도메인 구조에 대한 지식은 다양한 PUFA 프로필을 제조하는 신규한 유전적으로 개질된 생물체를 설계하기 위한 기초를 제공한다. 트라우스토키트리드와 같은 미생물에서 또는 이. 콜라이에서 제조되는 신규 PUFA PKS 구조물을 단리할 수 있으며, 이 구조물을 사용해서 식물을 형질전환시킴으로써 식물에 대해 유사한 PUFA 제조 특성을 부여할 수 있다. 본 발명에 포함되는 PUFA PKS 시스템의 특정 개질물에 대한 상세한 논의는 예를 들어 미국 특허 출원 공개 제20020194641호; 미국 특허 출원 공개 제20040235127호; 및 미국 특허 출원 공개 제20050100995호에 기재되어 있다.
유전적으로 개질된 식물은 바람직하게는 발효 배지 중에서 배양하거나 또는 토양과 같은 적합한 배지에서 성장시킨다. 적절한 또는 효과적인 발효 배지는 상기에서 상세히 논의되어 왔다. 고등 식물을 위한 적합한 배양 배지는 토양, 모래, 뿌리 성장을 뒷받침하는 임의의 다른 미립자 배지 (예, 질석, 진주암 등) 또는 수경법 배양, 및 고등 식물의 성장을 최적화하는 적합한 광, 물 및 영양 보충물을 포함하지만 이에 한정되지 않는, 식물용 임의의 성장 배지를 포함한다. 본 발명의 유전적으로 개질된 식물은 PUFA PKS 시스템의 활성에 의해 PUFA를 제조하도록 조작된다. PUFA는 식물로부터 화합물을 추출하는 정제 과정을 통해 회수될 수 있다. 바람직한 실시양태에서, PUFA는 식물을 수확함으로써 회수된다. 특히 바람직한 실시양태에서, PUFA는 식물로부터 (예, 오일 종자로부터) 오일을 수확함으로써 회수된다. 식물은 또한 그의 천연 상태로 소비될 수 있거나 또는 소비가능한 생성물로 추가로 가공될 수 있다.
바람직하게는, 본 발명의 유전적으로 개질된 식물은 EPA (C20:5, n-3), DHA (C22:6, n-3), DPA (C22:5, n-6 또는 n-3), ARA (C20:4, n-6), GLA (C18:3, n-6), ALA (C18:3, n-3), 및/또는 SDA (C18:4, n-3)를 포함하지만 이에 한정되지 않는 한가지 이상의 다불포화 지방산, 더 바람직하게는 EPA (C20:5, n-3), DHA (C22:6, n-3), DPA (C22:5, n-6 또는 n-3), 또는 DTA (C22:4, n-6)를 포함하지만 이에 한정되지 않는 한가지 이상의 장쇄 지방산 (LCPUFA)을 제조한다. 특히 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 유전적으로 개질된 식물은 EPA (C20:5, n-3), DHA (C22:6, n-3), 및/또는 DPA (C22:5, n-6 또는 n-3)를 포함하지만 이에 한정되지 않는 한가지 이상의 다불포화 지방산을 제조한다.
따라서, 본 발명의 한 실시양태는 (예를 들어, 그의 성숙한 종자에서 (오일 종자 식물의 경우) 또는 오일 종자 식물의 종자의 오일에서) 한가지 이상의 PUFA (표적 PUFA)를 제조하는 식물이며, 식물 또는 PUFA를 축적하는 식물의 일부 (예, 성숙한 종자(식물이 오일 종자 식물인 경우), 또는 오일 종자 식물의 종자의 오일)에서의 총 지방산 프로필이 검출가능한 양의 상기 PUFA 또는 PUFA들을 포함하는 것인, 식물, 바람직하게는 오일 종자 식물에 관한 것이다. 바람직하게는, 표적 PUFA는 20개 이상의 탄소의 PUFA이며, 3개 이상의 이중 결합, 더 바람직하게는 4개 이상의 이중 결합, 훨씬 더 바람직하게는, 5개 이상의 이중 결합을 포함한다. 또한, 표적 PUFA는 바람직하게는 식물 (즉, 유전적 개질의 부재하의 야생형 식물 또는 지시된 유전적 개질에 대한 수령자로서 사용되는 모체 식물)에 의해 천연적으로 제조되지 않는 PUFA이다. 바람직하게는, PUFA (식물의 종자 오일을 포함함)를 축적하는 식물의 일부 또는 식물에서의 총 지방산 프로필은 식물에 의해 제조된 총 지방산의 중량을 기준으로 표적 PUFA(들)을 0.1％ 이상, 더 바람직하게는 약 0.2％ 이상, 더 바람직하게는 약 0.3％ 이상, 더 바람직하게는 약 0.4％ 이상, 더 바람직하게는 약 0.5％ 이상, 더 바람직하게는 약 1％ 이상, 더 바람직하게는 약 1.5％ 이상, 더 바람직하게는 약 2％ 이상, 더 바람직하게는 약 2.5％ 이상, 더 바람직하게는 약 3％ 이상, 더 바람직하게는 약 3.5％ 이상, 더 바람직하게는 약 4％ 이상, 더 바람직하게는 약 4.5％ 이상, 더 바람직하게는 약 5％ 이상, 더 바람직하게는 약 5.5％ 이상, 더 바람직하게는 약 10％ 이상, 더 바람직하게는 약 15％ 이상, 더 바람직하게는 약 20％ 이상, 더 바람직하게는 약 25％ 이상, 더 바람직하게는 약 30％ 이상, 더 바람직하게는 약 35％ 이상, 더 바람직하게는 약 40％ 이상, 더 바람직하게는 약 45％ 이상, 더 바람직하게는 약 50％ 이상, 더 바람직하게는 약 55％ 이상, 더 바람직하게는 약 60％ 이상, 더 바람직하게는 약 65％ 이상, 더 바람직하게는 약 70％ 이상, 더 바람직하게는 약 75％ 이상 포함하거나, 더 바람직하게는 식물에 의해 제조된 총 지방산의 중량을 기준으로 한가지 이상의 다불포화 지방산 (표적 PUFA 또는 PUFA)을 75％ 넘게 포함하거나, 또는 표적 PUFA(들)을 0.1％ 내지 75％, 또는 75％ 초과 (100％ 이하 또는 약 100％)(0.1％씩 증분됨)의 임의의 비율로 포함한다. 본원에서 일반적으로 사용된 바와 같이, PUFA 제조의 백분율 양에 대한 언급은 달리 언급하지 않는다면 생물체 (식물)에 의해 제조된 총 지방산의 중량을 기준으로 한다 (예를 들어 어떤 경우에는, 중량 백분율은 효소 복합체, 예를 들면 PUFA PKS 시스템에 의해 제조된 총 지방산에 대해 상대적임). 한 실시양태에서, 식물에 의해 제조된 총 지방산은 지방산 메틸 에스테르 (FAME) 제제의 가스 크로마토그래피 (GC) 분석에 의해 결정되는 바와 같이 중량 퍼센트로 제시되지만, 총 지방산의 결정은 이러한 방법으로 제한되지 않는다.
상기 기재된 바와 같이, 상기 기재된 식물 (및/또는 식물의 부분 또는 종자 오일 분획)에 의해 제조된 총 지방산의 추가의 특징은, 식물에 의해 제조된 상기 총 지방산이 표적 PUFA(들)을 제조하는 효소 복합체에 의해 제조되는 표적 PUFA(들) 이외의 임의의 지방산을 약 10 중량％ 미만으로 포함 (또는 이보다 더 많은 임의의 양을 함유하지 않음)한다는 것이다. 바람직하게는, 표적 PUFA(들) 이외에, (예를 들어, 표적 PUFA(들)을 제조하는 효소 또는 효소 복합체를 이용해서 식물을 유전적으로 개질시킨 결과로서) 표적 PUFA(들)을 제조하는 효소 복합체에 의해 제조되는 임의의 지방산은 식물에 의해 제조된 총 지방산의 약 9％ 미만, 더 바람직하게는 약 8％ 미만, 더 바람직하게는 약 7％ 미만, 더 바람직하게는 약 6％ 미만, 더 바람직하게는 약 5％ 미만, 더 바람직하게는 약 4％ 미만, 더 바람직하게는 약 3％ 미만, 더 바람직하게는 약 2％ 미만, 더 바람직하게는 약 1 중량％ 미만으로 존재한다.
다른 실시양태에서, 표적 PUFA(들) 이외의 표적 PUFA(들)을 제조하는 효소 복합체에 의해 제조되는 임의의 지방산은 식물에서 표적 PUFA(들)을 제조하는 효소 복합체에 의해 제조되는 총 지방산의 약 10 중량％ 미만으로 (이보다 더 많은 임의의 양을 함유하지 않음) (즉, 이 측정치는 표적 PUFA를 제조하는 효소 복합체에 의해 제조되는 총 지방산들로 한정됨), 더 바람직하게는 식물에서 표적 PUFA(들)을 제조하는 효소 복합체에 의해 제조되는 총 지방산의 약 9％ 미만, 더 바람직하게는 약 8％ 미만, 더 바람직하게는 약 7％ 미만, 더 바람직하게는 약 6％ 미만, 더 바람직하게는 약 5％ 미만, 더 바람직하게는 약 4％ 미만, 더 바람직하게는 약 3％ 미만, 더 바람직하게는 약 2％ 미만, 더 바람직하게는 약 1 중량％ 미만, 더 바람직하게는 약 0.5 중량％ 미만으로 존재한다.
본 발명의 상기 실시양태의 다른 측면에서, 식물 (및/또는 식물의 부분 또는 종자 오일 분획)에 의해 제조된 총 지방산은 야생형 식물 (유전적으로 개질되지 않음)에 존재하거나 또는 지시된 유전적 개질에 대한 수령자로서 사용된 모체 식물에 존재하는 PUFA들 또는 표적 PUFA(들) 이외에, 식물에 의해 제조된 총 지방산의 중량을 기준으로 탄소수 18 이상의 PUFA를 10％ 미만으로 함유한다 (또는 이보다 더 많은 양을 함유하지 않음). 추가의 측면에서, 식물 (및/또는 식물의 부분 또는 종자 오일 분획)에 의해 제조된 총 지방산은 야생형 식물 (유전적으로 개질되지 않음)에 존재하거나 또는 지시된 유전적 개질에 대한 수령자로서 사용된 모체 식물에 존재하는 PUFA들 또는 표적 PUFA(들) 이외에, 식물에 의해 제조된 총 지방산의 중량을 기준으로 18개 이상의 탄소를 갖는 PUFA를 9％ 미만, 또는 18개 이상의 탄소를 갖는 PUFA를 8％ 미만, 또는 18개 이상의 탄소를 갖는 PUFA를 7％ 미만, 또는 18개 이상의 탄소를 갖는 PUFA를 6％ 미만, 또는 18개 이상의 탄소를 갖는 PUFA를 5％ 미만, 또는 18개 이상의 탄소를 갖는 PUFA를 4％ 미만, 또는 18개 이상의 탄소를 갖는 PUFA를 3％ 미만, 또는 18개 이상의 탄소를 갖는 PUFA를 2％ 미만, 또는 18개 이상의 탄소를 갖는 PUFA를 1％ 미만으로 함유한다.
본 발명의 상기 실시양태의 다른 측면에서, 식물 (및/또는 식물의 부분 또는 종자 오일 분획)에 의해 제조된 총 지방산은 야생형 식물 (유전적으로 개질되지 않음)에 존재하거나 또는 지시된 유전적 개질에 대한 수령자로서 사용된 모체 식물에 존재하는 PUFA들 또는 표적 PUFA(들) 이외에, 식물에 의해 제조된 총 지방산의 중량을 기준으로 20개 이상의 탄소를 갖는 PUFA를 10％ 미만으로 함유한다 (또는 이보다 많은 임의의 양을 함유하지 않음). 추가의 측면에서, 식물 (및/또는 식물의 부분 또는 종자 오일 분획)에 의해 제조된 총 지방산은 야생형 식물 (유전적으로 개질되지 않음)에 존재하거나 또는 지시된 유전적 개질에 대한 수령자로서 사용된 모체 식물에 존재하는 PUFA들 또는 표적 PUFA(들) 이외에, 식물에 의해 제조된 총 지방산의 중량을 기준으로 20개 이상의 탄소를 갖는 PUFA를 9％ 미만, 또는 20개 이상의 탄소를 갖는 PUFA를 8％ 미만, 또는 20개 이상의 탄소를 갖는 PUFA를 7％ 미만, 또는 20개 이상의 탄소를 갖는 PUFA를 6％ 미만, 또는 20개 이상의 탄소를 갖는 PUFA를 5％ 미만, 또는 20개 이상의 탄소를 갖는 PUFA를 4％ 미만, 또는 20개 이상의 탄소를 갖는 PUFA를 3％ 미만, 또는 20개 이상의 탄소를 갖는 PUFA를 2％ 미만, 또는 20개 이상의 탄소를 갖는 PUFA를 1％ 미만으로 함유한다.
한 실시양태에서, 식물 (및/또는 식물의 부분 또는 종자 오일 분획)의 총 지방산은 식물에 의해 제조된 총 지방산을 약 10 중량％ 미만 함유하며, 더 바람직하게는 감마-리놀렌산 (GLA; 18:3, n-6); 스테아리돈산 (STA 또는 SDA; 18:4, n-3); 디호모-감마-리놀렌산 (DGLA 또는 HGLA; 20:3, n-6), 아라키돈산 (ARA, C20:4, n-6); 에이코사트리엔산 (ETA; 20:3, n-9) 및 다양한 다른 지방산, 예를 들면 20:0; 20:1 (Δ5); 20:1 (Δ11); 20:2 (Δ8,11); 20:2 (Δ11,14); 20:3 (Δ5,11,14); 20:3 (Δ11,14,17); 미드산 (20:3; Δ5,8,11); 또는 20:4 (Δ5,1,14,17) 중 임의의 한가지 이상으로부터 선택된 지방산을 약 9％ 미만, 더 바람직하게는 약 8％ 미만, 더 바람직하게는 약 7％ 미만, 더 바람직하게는 약 6％ 미만, 더 바람직하게는 약 5％ 미만, 더 바람직하게는 약 4％ 미만, 더 바람직하게는 약 3％ 미만, 더 바람직하게는 약 2％ 미만, 더 바람직하게는 약 1％ 미만으로 함유한다.
다른 실시양태에서, 식물에서 장쇄 PUFA를 제조하는 효소 시스템에 의해 제조되는 지방산은 감마-리놀렌산 (GLA; 18:3, n-6); 스테아리돈산 (STA 또는 SDA; 18:4, n-3); 디호모-감마-리놀렌산 (DGLA 또는 HGLA; 20:3, n-6), 아라키돈산 (ARA, C20:4, n-6); 에이코사트리엔산 (ETA; 20:3, n-9) 및 다양한 다른 지방산, 예를 들면 20:0; 20:1 (Δ5); 20:1 (Δ11); 20:2 (Δ8,11); 20:2 (Δ11,14); 20:3 (Δ5,11,14); 20:3 (Δ11,14,17); 미드산 (20:3; Δ5,8,11); 또는 20:4 (Δ5,1,14,17)로부터 선택되는 지방산을 식물에 의해 제조된 총 지방산의 비율로서 약 10 중량％ 미만으로 함유하며, 더 바람직하게는 감마-리놀렌산 (GLA; 18:3, n-6); 스테아리돈산 (STA 또는 SDA; 18:4, n-3); 디호모-감마-리놀렌산 (DGLA 또는 HGLA; 20:3, n-6), 아라키돈산 (ARA, C20:4, n-6); 에이코사트리엔산 (ETA; 20:3, n-9) 및 다양한 다른 지방산, 예를 들면 20:0; 20:1 (Δ5); 20:1 (Δ11); 20:2 (Δ8,11); 20:2 (Δ11,14); 20:3 (Δ5,11,14); 20:3 (Δ11,14,17); 미드산 (20:3; Δ5,8,11); 또는 20:4 (Δ5,1,14,17)로부터 선택된 지방산을 약 9％ 미만, 더 바람직하게는 약 8％ 미만, 더 바람직하게는 약 7％ 미만, 더 바람직하게는 약 6％ 미만, 더 바람직하게는 약 5％ 미만, 더 바람직하게는 약 4％ 미만, 더 바람직하게는 약 3％ 미만, 더 바람직하게는 약 2％ 미만, 더 바람직하게는 약 1％ 미만으로 함유한다.
다른 실시양태에서, 식물에서 장쇄 PUFA를 제조하는 효소 시스템에 의해 제조되는 지방산은 PUFA로서 감마-리놀렌산 (GLA; 18:3, n-6), 18개의 탄소 및 4개의 탄소-탄소 이중 결합을 갖는 PUFA, 20개의 탄소 및 3개의 탄소-탄소 이중 결합을 갖는 PUFA, 및 22개의 탄소 및 2개 또는 3개의 탄소-탄소 이중 결합을 갖는 PUFA 의 모두를 식물에 의해 제조된 총 지방산의 비율로서 약 10 중량％ 미만으로 함유하며, 더 바람직하게는 PUFA로서 감마-리놀렌산 (GLA; 18:3, n-6), 18개의 탄소 및 4개의 탄소-탄소 이중 결합을 갖는 PUFA, 20개의 탄소 및 3개의 탄소-탄소 이중 결합을 갖는 PUFA, 및 22개의 탄소 및 2개 또는 3개의 탄소-탄소 이중 결합을 갖는 PUFA의 모두를 약 9％ 미만, 더 바람직하게는 약 8％ 미만, 더 바람직하게는 약 7％ 미만, 더 바람직하게는 약 6％ 미만, 더 바람직하게는 약 5％ 미만, 더 바람직하게는 약 4％ 미만, 더 바람직하게는 약 3％ 미만, 더 바람직하게는 약 2％ 미만, 더 바람직하게는 약 1％ 미만으로 함유한다.
다른 실시양태에서, 식물에서 장쇄 PUFA를 제조하는 효소 시스템에 의해 제조되는 지방산은 PUFA로서 감마-리놀렌산 (GLA; 18:3, n-6), 18개의 탄소 및 4개의 탄소-탄소 이중 결합을 갖는 PUFA, 20개의 탄소 및 3개의 탄소-탄소 이중 결합을 갖는 PUFA, 및 22개의 탄소 및 2개 또는 3개의 탄소-탄소 이중 결합을 갖는 PUFA의 각각을 식물에 의해 제조된 총 지방산의 비율로서 약 10 중량％ 미만으로 함유하며, 더 바람직하게는 PUFA로서 감마-리놀렌산 (GLA; 18:3, n-6), 18개의 탄소 및 4개의 탄소-탄소 이중 결합을 갖는 PUFA, 20개의 탄소 및 3개의 탄소-탄소 이중 결합을 갖는 PUFA, 및 22개의 탄소 및 2개 또는 3개의 탄소-탄소 이중 결합을 갖는 PUFA의 각각을 약 9％ 미만, 더 바람직하게는 약 8％ 미만, 더 바람직하게는 약 7％ 미만, 더 바람직하게는 약 6％ 미만, 더 바람직하게는 약 5％ 미만, 더 바람직하게는 약 4％ 미만, 더 바람직하게는 약 3％ 미만, 더 바람직하게는 약 2％ 미만, 더 바람직하게는 약 1％ 미만으로 함유한다.
다른 실시양태에서, 식물에서 장쇄 PUFA를 제조하는 효소 시스템에 의해 제조되는 지방산은 PUFA로서 감마-리놀렌산 (GLA; 18:3, n-6), 18개의 탄소 및 4개의 탄소-탄소 이중 결합을 갖는 PUFA, 20개의 탄소 및 3개의 탄소-탄소 이중 결합을 갖는 PUFA, 및 22개의 탄소 및 2개 또는 3개의 탄소-탄소 이중 결합을 갖는 PUFA 중 임의의 한가지 이상을 식물에 의해 제조된 총 지방산의 비율로서 약 10 중량％ 미만으로 함유하며, 더 바람직하게는 PUFA로서 감마-리놀렌산 (GLA; 18:3, n-6), 18개의 탄소 및 4개의 탄소-탄소 이중 결합을 갖는 PUFA, 20개의 탄소 및 3개의 탄소-탄소 이중 결합을 갖는 PUFA, 및 22개의 탄소 및 2개 또는 3개의 탄소-탄소 이중 결합을 갖는 PUFA 중 임의의 한가지 이상을 약 9％ 미만, 더 바람직하게는 약 8％ 미만, 더 바람직하게는 약 7％ 미만, 더 바람직하게는 약 6％ 미만, 더 바람직하게는 약 5％ 미만, 더 바람직하게는 약 4％ 미만, 더 바람직하게는 약 3％ 미만, 더 바람직하게는 약 2％ 미만, 더 바람직하게는 약 1％ 미만으로 함유한다.
본 발명의 상기 실시양태의 한 측면에서, 식물은 두가지 이상의 표적 PUFA를 제조하며, (오일 종자 유래의 오일을 비롯한) PUFA를 축적하는 식물의 일부 또는 식물의 총 지방산 프로필은 검출가능한 양의 상기 PUFA를 포함한다. 이 실시양태에서, PUFA는 바람직하게는 각각 20개 이상의 탄소의 PUFA이며, 3개 이상의 이중 결합, 더 바람직하게는 4개 이상의 이중 결합, 훨씬 더 바람직하게는 5개 이상의 이중 결합을 포함한다. 이러한 PUFA는 가장 바람직하게는 DHA, DPAn-6 및 EPA로부터 선택된다. 한 측면에서, 식물은 DHA 및 DPAn-6을 제조하며, DHA 대 DPAn-6의 비율은 약 1:10 내지 약 10:1 (이들 사이의 임의의 비율을 포함함)이다. 한 실시양태에서, DHA 대 DPA의 비율은 약 1:1 내지 약 3:1이며, 다른 실시양태에서 약 2.5:1이다. 한 실시양태에서, 식물은 DHA 및 EPA를 제조한다.
본 발명의 상기 실시양태의 다른 측면에서, 식물은 도 13 또는 도 14에 나타낸 총 지방산 프로필을 생성한다.
추가로, 본 발명은 본원에 기재된 식물에 의해 생산된 임의의 종자, 및 본원에 기재된 식물 또는 종자에 의해 생성된 임의의 오일을 포함한다. 본 발명은 또한 본원에 기재된 식물, 종자 또는 오일을 이용해서 제조한 임의의 생성물을 포함한다.
본 발명의 유전적으로 개질된 생물체의 용도
본 발명의 한 실시양태는 본 발명의 유전적으로 개질된 생물체 (예, 미생물 또는 식물)을 성장시키거나 배양함으로써 목적하는 생활성 분자 (생성물 또는 화합물로 지칭되기도 함)을 제조하는 방법에 관한 것이다 (상기에 상세히 기재됨). 바람직하게는, 생활성 분자는 PUFA, 가장 바람직하게는 LCPUFA이다. 바람직하게는, 유전적으로 개질된 생물체는 유전적으로 개질된 미생물 또는 유전적으로 개질된 식물이다. 이러한 방법은 예를 들어 본원의 상기에 기재되어 있는 본 발명에 따른 유전적 개질을 갖는 미생물 또는 식물을 발효 배지에서 배양하거나 또는 적합한 환경, 예를 들면 토양에서 성장시키는 단계를 포함한다. 본 발명의 PUFA PKS 시스템과 관련된 유전적 개질을 위한 바람직한 숙주 세포 및 생물체는 상기에 기재되어 있다.
본 발명의 한 실시양태는 본 발명의 유전적으로 개질된 미생물을 배양함으로써 목적하는 PUFA를 제조하는 방법에 관한 것이다 (상기에 상세히 기재됨). 이러한 방법은 PUFA(들)을 제조하기에 효과적인 조건하에 발효 배지에서 본원의 상기에 기재되어 있는 본 발명에 따른 유전적 개질을 갖는 미생물을 배양하는 단계를 포함한다. 적절한 또는 효과적인 배지는, 본 발명의 유전적으로 개질된 미생물이 배양되는 경우 목적하는 PUFA 생성물(들)을 제조할 수 있는 임의의 배지를 지칭한다. 이러한 배지는 전형적으로는 동화가능한 탄소, 질소 및 포스페이트 공급원을 포함하는 수성 배지이다. 상기 배지는 또한 적절한 염, 미네랄, 금속 및 다른 영양소를 포함할 수 있다. 본 발명의 임의의 미생물은 통상의 발효 생물반응기(bioreactor)에서 배양할 수 있다. 미생물은 배치, 공급-배치(fed-batch), 셀 리사이클(cell recycle), 및 연속 발효를 포함하지만 이에 한정되지 않는 임의의 발효 공정에 의해 배양할 수 있다. 본 발명에 따른 트라우스토키트리드 미생물에 대한 바람직한 성장 조건은 당업계에 잘 알려져 있으며, 예를 들어 각각 전체 개시내용이 본원에 참고로 포함되는 미국 특허 제5,130,242호, 미국 특허 제5,340,742호, 및 미국 특허 제5,698,244호에 상세히 기재되어 있다.
유전적으로 개질된 미생물에 의해 제조된 목적하는 PUFA(들) 및/또는 다른 생활성 분자는 통상의 분리 및 정제 기술을 이용해서 발효 배지로부터 회수할 수 있다. 예를 들어, 발효 배지를 여과 또는 원심분리해서 미생물, 세포 잔해(debris) 및 다른 미립자 물질을 제거할 수 있으며, 생성물은 예를 들어 이온 교환, 크로마토그래피, 추출, 용매 추출, 상 분리, 막 분리, 전기투석(electrodialysis), 역 삼투, 증류, 화학적 유도체화 및 결정화와 같은 통상의 방법에 의해 세포-무함유 상등액으로부터 회수할 수 있다. 또는, PUFA(들) 또는 그의 추출물 및 다양한 분획을 제조하는 미생물은 생성물로부터 미생물 성분들을 제거하지 않고 사용할 수 있다.
바람직하게는, PUFA는 미생물의 건조 중량을 기준으로 약 5％ 초과의 양, 한 측면에서 6％ 초과의 양, 다른 측면에서 7％ 초과의 양, 다른 측면에서 8％ 초과의 양, 다른 측면에서 9％ 초과의 양, 다른 측면에서 10％ 초과의 양 등으로, 전체 정수 퍼센트에서 미생물 건조 중량의 최대 90％ 초과 (예, 15％, 20％, 30％, 40％, 50％, 및 상기 비율 사이의 임의의 비율)까지의 양으로 제조된다.
바람직하게는, 대상 생활성 화합물은 유전적으로 개질된 미생물에 의해 미생물의 건조 중량을 기준으로 약 0.05％ 초과, 바람직하게는 약 0.1％ 초과, 더 바람직하게는 약 0.25％ 초과, 더 바람직하게는 약 0.5％ 초과, 더 바람직하게는 약 0.75％ 초과, 더 바람직하게는 약 1％ 초과, 더 바람직하게는 약 2.5％ 초과, 더 바람직하게는 약 5％ 초과, 더 바람직하게는 약 10％ 초과, 더 바람직하게는 약 15％ 초과, 더 바람직하게는 약 20％ 초과의 양으로 제조된다. 지질 화합물의 경우, 바람직하게는 상기 화합물은 미생물의 건조 중량의 약 5％ 초과의 양으로 제조된다. 다른 생활성 화합물, 예를 들면 소량으로 합성되는 항생제 또는 화합물의 경우, 이러한 화합물을 미생물의 건조 중량으로 보유하는 균주는 예상가능하게는 상기 재된 유형의 신규 PKS 시스템을 함유하는 것으로 확인된다. 일부 실시양태에서, 특정 생활성 분자 (화합물)은 축적되기보다는 미생물에 의해 분비된다. 따라서, 이러한 생활성 분자는 일반적으로 배양 배지로부터 회수되며, 제조된 분자의 농도는 미생물 및 배양 크기에 따라 달라질 것이다.
본 발명의 목적하는 생활성 화합물의 제조 방법에서, 유전적으로 개질된 식물을 발효 배지 중에서 배양하거나 또는 토양과 같은 적합한 배지에서 성장시킨다. 적절한 또는 효과적인 발효 배지는 상기에 상세히 논의되어 있다. 고등 식물에 대한 적합한 배양 배지는 토양, 모래, 뿌리 성장을 뒷받침하는 임의의 다른 미립자 배지 (예, 질석, 진주암 등) 또는 수경법 배양, 및 고등 식물의 성장을 최적화하는 적합한 광, 물 및 영양 보충물을 포함하지만 이에 한정되지 않는, 식물용 임의의 성장 배지를 포함한다. 본 발명의 유전적으로 개질된 식물은 본 발명에 따른 PUFA PKS 시스템 및 다른 이종 단백질 (PUFA PKS 시스템에 대한 부속 단백질)의 활성을 통해 목적하는 생성물을 상당한 양으로 제조하도록 조작된다. 이러한 화합물은 식물로부터 화합물을 추출하는 정제 공정에 의해 회수할 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 화합물은 식물을 수확함으로써 회수된다. 상기 실시양태에서, 식물은 천연 상태로 소비될 수 있거나 또는 소비가능한 생성물로 추가로 가공될 수 있다.
본 발명은 본원에 기재된 임의의 생물체 또는 그의 부분 (예, 미생물 및 그의 제제 또는 분획 또는 식물, 식물의 부분 (예, 오일 종자), 또는 이들의 제제 또는 분획), 및 본원에 기재된 생물체에 의해 제조되는 임의의 오일을 추가로 포함한다. 본 발명은 또한 상기 생물체를 사용해서 제조된 임의의 생성물, 그의 부분, 또는 본원에 기재된 오일을 포함한다.
본 발명의 한 실시양태는 생물체, 그의 부분, 또는 본 발명에 따라 본원에 기재된 바와 같이 유전적으로 개질된 생물체 (예, PUFA PKS 시스템을 사용해서 유전적으로 개질키고, 본원에 기재된 바와 같은 PUFA의 제조 및/또는 축적을 향상시키기 위한 임의의 전략을 이용하며, 본원에 기재된 지방산 프로필을 갖는 식물 또는 미생물)에 의해 제조되는 오일을 상기 생성물에 부가하는 것을 포함하는, 한가지 이상의 지방산을 함유하는 생성물을 개질시키는 방법에 관한 것이다. 상기 방법에 의해 제조되거나 또는 일반적으로 임의의 생물체, 그의 부분, 본원에 기재된 생물체로부터의 오일을 함유하는 임의의 생성물이 또한 본 발명에 포함된다.
바람직하게는, 생성물은 식품, 식이 보충물, 제약 제제, 인간화된 동물의 밀크, 및 유아용 조제식(infant formula)으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 적합한 제약 제제로는 항염증성 제제, 화학치료제, 활성 부형제, 골다공증 약물, 항우울제, 항경련제, 항-헬레코박터 파이로리(Heliobactor pylori) 약물, 신경퇴행성 질환 치료용 약물, 퇴행성 간 질환 치료용 약물, 항생제, 및 콜레스테롤 저하용 제제를 들 수 있지만 이에 한정되지 않는다. 한 실시양태에서, 생성물은 만성 염증, 급성 염증, 위장관 장애, 암, 악액질, 심장 재협착증, 신경퇴행성 장애, 간의 퇴행성 장애, 혈액 지질 장애, 골다공증, 골관절염, 자가면역 질환, 자간전증, 조산(preterm birth), 연령 관련 황반병증, 폐 장애, 및 페록시좀성(peroxisomal) 장애로 이루어진 군으로부터 선택된 증상을 치료하는데 사용된다.
적합한 식품으로는 고급 베이커리 제품, 식빵 및 롤빵(bread and rolls), 아침용 시리얼, 가공 및 비가공 치즈, 조미료 (케첩, 마요네즈 등), 낙농 제품 (우유, 요거트), 푸딩 및 젤라틴 디저트, 탄산 음료, 차, 분말화된 음료용 믹스, 가공된 어류 제품, 과일-기재 음료, 츄잉검, 경질 과자, 동결 낙농 제품, 가공된 육류 제품, 견과 및 견과-기재 스프레드, 파스타, 가공된 가금류 제품, 육즙 및 소스, 감자 칩 및 다른 칩 또는 튀김(crisp), 초콜렛 및 다른 과자, 수프 및 수프 믹스, 콩(soya) 기재 생성물 (밀크, 드링크, 크림, 표백제), 식물성오일-기재 스프레드, 및 식물성-기재 드링크를 들 수 있지만 이에 한정되지 않는다.
일반적인 정의 및 안내
본 발명에 따라, 단리된 단백질은 천연 환경으로부터 제거된 (즉, 인간에 의해 조작처리된) 단백질 또는 그의 단편 (폴리펩티드 또는 펩티드 포함)이며, 예를 들어 정제된 단백질, 부분 정제된 단백질, 재조합에 의해 제조된 단백질, 및 합성에 의해 제조된 단백질을 포함할 수 있다. 이와 같이, "단리된"은 단백질이 정제된 정도를 반영하지 않는다. 바람직하게는, 본 발명의 단리된 단백질은 재조합적으로 제조된다. 단리된 펩티드는 합성에 의해 (예를 들어, 펩티드 합성과 같이 화학적으로) 또는 재조합적으로 제조될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, "지질"이라는 용어는 인지질; 유리 지방산; 지방산의 에스테르; 트리아실글리세롤; 디아실글리세라이드; 모노아실글리세라이드; 라이소(lyso)인지질; 비누; 포스파티드; 왁스 (알콜과 지방산의 에스테르); 스테롤 및 스테롤 에스테르; 카로테노이드; 크산토필 (예, 옥시카로테노이드); 탄화수소; 및 당업자에게 공지된 다른 지질을 포함한다. "다불포화 지방산" 및 "PUFA"라는 용어들은 유리 지방산 형태 뿐만 아니라 다른 형태, 예를 들면 TAG 형태 및 PL 형태를 포함한다.
특정 생물체 유래의 특정 단백질 또는 특정 생물체로부터 유도된 특정 단백질에 대한 언급, 예를 들어 "쉬조키트리움 ACoAS" 또는 "쉬조키트리움으로부터 유도된 ACoAS"는 쉬조키트리움 유래의 ACoAS (천연 발생 ACoAS의 상동체를 포함함) 또는 다르게는 쉬조키트리움 유래의 천연 발생 ACoAS의 구조 (예, 서열)에 대한 지식으로부터 제조된 ACoAS를 지칭한다. 달리 말하면, 쉬조키트리움 ACoAS는 쉬조키트리움 유래의 천연 발생 ACoAS의 구조 및 기능을 갖거나 또는 ACoAS가 쉬조키트리움 유래의 천연 발생 ACoAS의 생물학적 활성 (즉, 생물학적 활성을 갖는) 상동체가 되도록 쉬조키트리움 ACoAS와 충분히 유사한 구조 및 기능을 갖는 임의의 ACoAS를 포함한다. 이와 같이, 쉬조키트리움 ACoAS는 정제, 부분 정제, 재조합, 돌연변이/개질 및 합성 단백질을 포함할 수 있다.
본 발명에 따라, "개질" 및 "돌연변이"라는 용어들은 특히 본원에 기재된 단백질 또는 펩티드의 주요 아미노산 서열 (또는 핵산 서열)에 대한 개질/돌연변이와 관련하여 상호교환가능하게 사용될 수 있다. "개질"이라는 용어는 또한 메틸화, 파르네실화(farnesylation), 카르복시메틸화, 게라닐(geranyl) 게라닐화, 글리코실화, 인산화, 아세틸화, 미리스토일화, 프레닐화, 팔미테이트화, 및/또는 아미드화를 포함하지만 이에 한정되지 않는, 단백질 또는 펩티드에 대한 번역후 개질을 기술하는 것으로 사용될 수 있다. 또한 개질은 예를 들어 단백질 또는 펩티드와 다른 화합물의 복합체화를 포함할 수 있다. 이러한 개질은, 예를 들어 개질이 천연, 야생형 단백질 또는 펩티드에서 발생하는 번역후 개질과 상이한 경우, 돌연변이인 것으로 고려될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, "상동체"라는 용어는 천연 발생 단백질 또는 펩티드 (즉, "원형(prototype)" 또는 "야생형" 단백질)에 대해 하나 이상의 사소한 개질 또는 돌연변이만큼 천연 발생 단백질 또는 펩티드와 상이하지만 천연 발생 형태의 전체 기본 단백질 및 측쇄 구조를 유지하는 (즉, 상동체가 야생형 단백질과 관련되는 것으로 확인될 수 있는) 단백질 또는 펩티드를 지칭하는데 사용된다. 이러한 변화는 하나 또는 몇몇 (예, 1％ 이하) 아미노산 측쇄에서의 변화; 결실 (예, 단백질 또는 펩티드의 말단절단된 형태), 삽입 및/또는 치환을 비롯해서 하나 또는 몇몇 (예, 1％ 이하) 아미노산에서의 변화; 하나 또는 몇몇 (예, 1％ 이하) 원자의 입체화학에서의 변화; 및/또는 메틸화, 파르네실화, 게라닐 게라닐화, 글리코실화, 카르복시메틸화, 인산화, 아세틸화, 미리스토일화, 프레닐화, 팔미테이트화, 및/또는 아미드화를 포함하지만 이에 한정되지 않는 사소한 유도체화를 포함하지만 이에 한정되지 않는다. 상동체는 천연 발생 단백질 또는 펩티드와 비교해서 증진된, 감소된, 또는 실질적으로 유사한 특성을 가질 수 있다. 단백질의 바람직한 상동체는 하기에 상세히 기재되어 있다. 상동체는 합성에 의해 제조된 상동체, 주어진 단백질 또는 그의 도메인의 천연 발생 대립유전자 변이체, 또는 관련 서열이 유도된 생물체 이외의 생물체로부터의 상동성 서열을 포함할 수 있음을 유의한다.
보존적 치환은 전형적으로는 하기 군 내에서의 치환을 포함한다: 글리신 및 알라닌; 발린, 이소루이신 및 루이신; 아스파르트산, 글루탐산, 아스파라긴 및 글루타민; 세린 및 트레오닌; 리신 및 아르기닌; 및 페닐알라닌 및 티로신. 치환은 또한 보존된 소수성 또는 친수성을 기초로 [Kyte and Doolittle, J. Mol. Biol. 157:105 (1982)], 또는 유사한 폴리펩티드 2차 구조를 추정하는 능력을 기초로 [Chou and Fasman, Adv. Enzymol. 47: 45 (1978)] 수행될 수 있다.
상동체는 천연 대립유전자 변화 또는 천연 돌연변이의 결과일 수 있다. 단백질을 코딩하는 핵산의 천연 발생 대립유전자 변이체는, 이러한 단백질을 코딩하지만 예를 들어 돌연변이 또는 재조합에 의해 생성된 천연 변화로 인해 유사하되 동일하지는 않은 서열을 갖는 유전자와 본질적으로 동일한 게놈내 유전자좌 (또는 유전자좌들)에서 발생하는 유전자이다. 대립유전자 변이체는 전형적으로는 비교되는 유전자에 의해 코딩되는 단백질의 활성과 유사한 활성을 갖는 단백질을 코딩한다. 한가지 종류의 대립유전자 변이체는 동일한 단백질을 코딩할 수 있지만, 유전자 코드의 축퇴성으로 인해 상이한 핵산 서열을 가질 수 있다. 대립유전자 변이체는 또한 유전자의 5' 또는 3' 비번역 영역 (예를 들어, 조절성 제어 영역)에서의 변화를 포함할 수 있다. 대립유전자 변이체는 당업자에게 잘 알려져 있다.
상동체는 단리된 천연 발생 단백질에 대한 직접적인 개질, 직접적인 단백질 합성, 또는 예를 들어 무작위 또는 표적 돌연변이유발을 수행하는 전통적인 또는 재조합 DNA 기술에 의해 단백질을 코딩하는 핵산 서열을 개질시키는 방법을 포함하지만 이에 한정되지 않는, 당업계에 공지된 단백질 제조 기술을 이용해서 제조할 수 있다.
야생형 단백질에 비해 단백질 상동체를 개질 또는 돌연변이시키면 상동체의 기본적인 생물학적 활성이 천연 발생 (야생형) 단백질에 비해 증가하거나, 감소되거나, 또는 실질적으로 변하지 않는다. 일반적으로, 단백질의 생물학적 활성 또는 생물학적 작용은 생체내 (즉, 단백질의 천연 생리학적 환경) 또는 시험관내 (즉, 실험실 조건하)에서 측정 또는 관찰되는 바와 같은 단백질의 천연 발생 형태로 인해 단백질에 의해 발현 또는 수행되는 임의의 기능(들)을 지칭한다. PUFA PKS 시스템의 생물학적 활성 및 PUFA PKS 시스템을 구성하는 개별 단백질/도메인은 본원 및 참조된 특허 및 간행물들에 상세히 기재되어 있다. ACoAS의 생물학적 활성은 본 발명의 경우 바람직하게는 PUFA의 유리 지방산 (FFA)을 기질에 결합시키고 FFA의 아실-CoA PUFA로의 전환을 촉매하는 것을 포함한다.
상동체에서와 같은 단백질의 개질은 천연 발생 단백질과 동일한 생물학적 활성을 갖는 단백질 또는 천연 발생 단백질에 비해 감소 또는 증가된 생물학적 활성을 갖는 단백질을 생성시킬 수 있다. 단백질 발현의 증가 또는 단백질 활성의 감소를 일으키는 개질은 단백질의 불활성화 (완전한 또는 부분적인 불활성화), 하향조절, 또는 감소된 작용 (또는 활성)으로 지칭될 수 있다. 유사하게, 단백질 발현 증가 또는 단백질 활성 감소를 일으키는 개질은 단백질의 증폭, 과제조, 활성화, 증진, 상향조절, 또는 증가된 작용 (또는 활성)으로 지칭될 수 있다. 야생형 단백질의 생물학적 활성을 갖는 상동체에 대한 일반적인 언급은 상동체가 특히 생물학적 활성의 수준과 관련하여 반드시 야생형 단백질과 동일한 생물학적 활성을 갖는다는 것을 의미하지는 않음을 유의한다. 오히려, 상동체는 야생형 단백질과 동일한 생물학적 활성을 수행하지만 이 활성은 야생형 단백질에 비해 증가 또는 감소된 것일 수 있다. 단백질의 기능성 도메인은 생물학적 활성을 수행할 수 있는 (즉, 생물학적 활성을 갖는) 도메인이다 (즉, 도메인은 단백질의 일부일 수 있음).
단백질을 검출하거나 또는 단백질의 활성을 측정하는 방법으로는 단백질의 전사를 측정하는 방법, 단백질의 번역을 측정하는 방법, 단백질의 번역후 개질을 측정하는 방법, 단백질의 효소 활성을 측정하는 방법, 및/또는 단백질의 활성으로부터 얻어진 한가지 이상의 생성물을 제조 (예, PUFA를 제조)하는 방법을 들 수 있지만 이에 한정되지 않는다. 본 발명의 단리된 단백질 (상동체를 포함함)이 반드시 야생형 단백질의 생물학적 활성을 가져야 할 필요는 없음을 유의한다. 예를 들어, 단백질은 말단절단된, 돌연변이된 또는 불활성 단백질일 수 있다. 이러한 단백질은 예를 들어 스크리닝 검정, 또는 항체 제조와 같은 다른 목적에 유용하다. 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 단리된 단백질은 야생형 단백질의 활성과 유사한 (상기 논의된 바와 같이 반드시 등가는 아님) 생물학적 활성을 갖는다.
단백질 발현 수준을 측정하는 방법으로는 일반적으로 웨스턴 블롯, 이뮤노블롯, 효소-연결 면역흡착 검정 (ELISA), 방사성면역검정 (RIA), 면역침전, 표면 플라즈몬 공명, 화학발광, 형광 편광(fluorescent polarization), 인광(phosphorescence), 면역조직화학 분석, 매트릭스-보조 레이져 탈착/이온화 비행시간 (MALDI-TOF) 질량 분광법, 미세세포측정(microcytometry), 마이크로어레이, 현미경검사, 형광 활성화된 세포 분류 (FACS), 및 유동세포분석, 및 효소 활성을 포함하지만 이에 한정되지 않는, 단백질의 특성 또는 다른 단백질 대응물(partner)과의 상호작용을 기초로 한 검정법을 들 수 있지만 이에 한정되지 않는다. 결합 검정은 또한 당업계에 잘 알려져 있다. 예를 들어, BIA코어 기계를 사용해서 두 단백질 사이의 복합체의 결합 상수를 결정할 수 있다. 복합체에 대한 해리 상수는 완충액이 칩상에 지나가는 시간에 대하여 굴절률의 변화를 모니터링함으로써 결정될 수 있다 [O'Shannessy et al. Anal. Biochem. 212:457 (1993); Schuster et al., Nature 365:343 (1993)]. 한 단백질과 다른 단백질의 결합을 측정하기 위한 다른 적합한 검정법으로는 예를 들어 면역검정법, 예를 들면 효소 연결 면역흡착 검정법 (ELISA) 및 방사성 면역검정법 (RIA); 또는 형광, UV 흡수, 원형 광이색성(circular dichroism), 또는 핵 자기 공명(NMR)을 통해 단백질의 분광(spectroscopic) 또는 광학 특성의 변화를 모니터링함으로써 결합을 측정하는 방법을 들 수 있다.
본 발명의 한 측면에서, 본원에 기재된 특정 단백질의 상동체를 비롯해서 본 발명에 포함되는 단백질은 기준(reference) 단백질로부터의 아미노산 서열의 약 100개 이상의 연속적인 아미노산을 포함하는 아미노산 서열을 포함하며, 여기서 상동체의 아미노산 서열은 본원에 기재된 바와 같은 단백질의 생물학적 활성을 갖는다. 추가의 측면에서, 단백질의 아미노산 서열은 기준 단백질의 약 200개 이상의 연속적인 아미노산, 더 바람직하게는 약 300개 이상의 연속적인 아미노산, 더 바람직하게는 약 400개 이상의 연속적인 아미노산을 포함하며, 전체 정수에서의 임의의 증분을 비롯해서 (예, 200, 201, 202, 203 등) 기준 단백질의 500개의 연속적인 아미노산 또는 그보다 많은 아미노산 서열, 최대로는 이 단백질의 전체 길이를 포함할 수 있다.
본 발명에 따라, 본원에 기재된 핵산 또는 아미노산 서열에 대해 "인접하는(contiguous)" 또는 "연속적인(consecutive)"이라는 용어는 파괴되지 않은 서열에 연결되는 것을 의미한다. 예를 들어, 제1 서열이 제2 서열의 30개의 인접하는 (또는 연속적인) 아미노산을 포함한다는 것은, 제1 서열이 제2 서열에서 30개의 아미노산 잔기로 된 파괴되지 않은 서열과 100％ 동일한 것인 30개의 아미노산 잔기로 된 파괴되지 않은 서열을 포함한다는 것을 의미한다. 유사하게, 제1 서열이 제2 서열과 "100％ 동일성"을 갖는다는 것은, 제1 서열이 뉴클레오티드 또는 아미노산 사이에 갭(gap)이 없는 제2 서열과 정확하게 대응한다는 것을 의미한다.
전형적으로, 기준 단백질의 상동체, 예를 들면 본원에 기재된 ACoAS 단백질의 상동체는 기준 단백질 (예를 들어, ACoAS 단백질)의 아미노산 서열과 약 50％ 이상, 더 바람직하게는 약 55％ 이상, 더 바람직하게는 약 60％ 이상, 더 바람직하게는 약 65％ 이상, 더 바람직하게는 약 70％ 이상, 더 바람직하게는 약 75％ 이상, 더 바람직하게는 약 80％ 이상, 더 바람직하게는 약 85％ 이상, 더 바람직하게는 약 90％ 이상, 더 바람직하게는 약 95％ 이상, 더 바람직하게는 약 96％ 이상, 더 바람직하게는 약 97％ 이상, 더 바람직하게는 약 98％ 이상, 더 바람직하게는 약 99％ 이상 (또는 60％ 내지 99％의 전체에서 1％씩 증분시킨 임의의 비율만큼) 동일한 아미노산 서열을 갖는다. 상동체는 바람직하게는 그가 유도되거나 관련되는 단백질 또는 도메인 (즉, 기준 아미노산 서열을 갖는 단백질 또는 도메인)의 생물학적 활성을 갖는다. ACoAS 상동체와 관련해서, 상동체는 바람직하게는 ACoAS 효소 활성, 보다 구체적으로는 장쇄 PUFA 무함유 지방산 (FFA)의 아실-CoA로의 전환을 촉매하는 능력을 갖는다. 본원에 기재된 다른 부속 단백질과 관련해서, 이러한 단백질은 예를 들어 PL 또는 TAG를 형성하는데 있어서 기질로서 PUFA-CoA를 이용하는 생물학적 활성을 가질 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 달리 명시하지 않는다면, 서열 (％) 동일성에 대한 언급은 (1) 아미노산 검색을 위한 blastp, 핵산 검색을 위한 blastn, 및 핵산 검색 및 번역된 아미노산의 검색을 위한 blastX (6개의 오픈 리딩 프레임 모두에서임)를 이용한 BLAST 2.0 Basic BLAST 상동성 검색 (이들 모두 표준 디폴트(default) 매개변수를 가지며, 문의(query) 서열은 덜 복잡한 영역에 대하여 디폴트로 필터링됨) (전체 개시내용이 본원에 참고로 도입되는 문헌 [Altschul, S.F., Madden, T.L., Schaeaeffer, A.A., Zhang, J., Zhang, Z., Miller, W. & Lipman, D.J. (1997) "Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs." Nucleic Acids Res. 25:3389]에 기재됨); (2) BLAST 2 정렬 (하기 기재된 매개변수를 이용함); (3) 및/또는 표준 디폴트 매개변수를 갖는 PSI-BLAST (위치-특이적 반복 BLAST)를 이용해서 수행한 상동성 평가결과를 지칭한다. BLAST 2.0 Basic BLAST와 BLAST 2 사이에서 표준 매개변수에서의 일부 차이로 인해, 두 특이적 서열은 BLAST 2를 이용하는 경우 유의한 상동성을 갖는 것으로 인식될 수 있지만 서열들 중 하나를 문의 서열로 이용하는 BLAST 2.0 Basic BLAST에서 수행된 검색에서는 탑 매치(top match)에서 제 2 서열이 확인되지 않을 수 있음을 유의한다. 또한, PSI-BLAST는 사용이 편리한 자동화된 형태의 "프로필" 검색을 제공하며, 이는 서열 상동성을 조사하는 민감한 방법이다. 프로그램은 먼저 갭이 존재하는 BLAST 데이터베이스 검색을 수행한다. PSI-BLAST 프로그램은 위치 특이적 스코어 매트릭스를 구성하도록 리턴된 임의의 유의한 정렬들로부터의 정보를 이용하며, 이는 다음 회차의 데이터베이스 검색에서 문의 서열을 대체한다. 따라서, 퍼센트 동일성은 이들 프로그램 중 어느 한가지를 이용해서 결정할 수 있는 것으로 이해된다.
전체 개시내용이 본원에 참고로 도입되는 문헌 [Tatusova and Madden, "Blast 2 sequences - a new tool for comparing protein and nucleotide sequences", FEMS Microbiol Lett. 174:247 (1999)]에 기재된 BLAST 2 서열을 이용해서 2개의 특이적 서열을 서로 정렬시킬 수 있다. 생성된 정렬에서 갭 (결실 또는 삽입)이 도입될 수 있도록 두 서열 사이에서 갭 형성(Gapped) BLAST 검색 (BLAST 2.0)을 수행하는 BLAST 2.0 알고리즘을 이용해서 blastp 또는 blastn에서 BLAST 2 서열 정렬을 수행한다. 본원에서 명확히 하고자, 하기 표준 디폴트 매개변수를 이용해서 BLAST 2 서열 정렬을 수행한다.
blastn의 경우, 0 BLOSUM62 매트릭스를 이용한다:
Reward for match = 1
Penalty for mismatch = -2
Open gap (5) and extension gap (2) penalties
gap x_dropoff (50) expect (10) word size (11) filter (on)
blastp의 경우, 0 BLOSUM62 매트릭스를 이용한다:
Open gap (11) and extension gap (1) penalties
gap x_dropoff (50) expect (10) word size (3) filter (on).
본 발명의 한 실시양태에서, 본 발명의 단리된 단백질 또는 도메인은 미국 특허 제6,566,583호; 문헌 [Metz et al., Science 293:290-293 (2001)]; 미국 특허 출원 공개 제20020194641호; 미국 특허 출원 공개 제20040235127호; 미국 특허 출원 공개 제20050100995호; 및 미국 가출원 제60/689,167호 (출원일: 2005년 6월 10일) 중 어느 문헌에 기재된 임의의 아미노산 서열 또는 그의 임의의 생물학적 활성 단편 또는 도메인을 포함하거나, 이러한 단편 또는 도메인으로 본질적으로 이루어지거나, 또는 상기 단편 또는 도메인으로 이루어진다. 상기 단백질은 PUFA PKS 시스템의 단백질이며, 본원에 기재된 임의의 부속 단백질과 관련하여 사용될 수 있다.
본 발명의 다른 실시양태에서, 본원에 기재된 단백질(예, ACoAS 단백질)의 생물학적 활성을 갖는 아미노산 서열은 본원에 구체적으로 기재된 천연 발생 단백질 또는 폴리펩티드와 충분히 유사한 아미노산 서열을 포함하며, 이 아미노산 서열을 코딩하는 핵산 서열은 중간, 높은, 또는 매우 높은 엄격 조건 (하기에 기재됨)하에 천연 발생 단백질 또는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자 (천연 발생 단백질 또는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 스트랜드의 상보체)에(와) 혼성화할 수 있다. 바람직하게는, 본원에 기재된 단백질의 생물학적 활성을 갖는 아미노산 서열은 중간, 높은 또는 매우 높은 엄격 조건하에 본원에 기재된 임의의 아미노산 서열을 코딩하는 핵산 서열의 상보체와 혼성화하는 핵산 서열에 의해 코딩된다. 상보성 서열을 추론하는 방법은 당업자에게 공지되어 있다. 아미노산 서열화 및 핵산 서열화 기술에 오류가 완전히 없는 것은 아니기 때문에 본원에 제시된 서열은 본 발명에 포함되는 단백질의 자명한 서열을 나타내는 것에 불과하다는 것을 유의해야 한다.
본원에 사용된 바와 같이, 혼성화 조건은 핵산 분자를 사용해서 유사한 핵산 분자를 확인하는 표준 혼성화 조건을 지칭한다. 이러한 표준 조건은 예를 들어 전체 개시내용이 본원에 참곡로 도입되는 문헌 [Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Labs Press (1989). Sambrook et al., ibid.](특히, 9.31-9.62 페이지 참조)에 개시되어 있다. 또한, 다양한 정도의 뉴클레오티드 미스매치를 허용하는 혼성화를 달성하기 위해 적절한 혼성화 및 세척 조건을 계산하는 공식은 예를 들어 전체 개시내용이 본원에 참고로 도입되는 문헌 [Meinkoth et al., Anal. Biochem. 138, 267 (1984); Meinkoth et al., ibid.]에 개시되어 있다.
보다 구체적으로, 본원에 언급된 바와 같은 중간 엄격 혼성화 및 세척 조건은 혼성화 반응에서 프로브로 사용되는 핵산 분자와 약 70％ 이상의 핵산 서열 동일성을 갖는 핵산 분자의 단리를 허용하는 조건 (즉, 약 30％ 이하의 뉴클레오티드 미스매치를 허용하는 조건)을 지칭한다. 본원에 언급된 바와 같은 높은 엄격 혼성화 및 세척 조건은 혼성화 반응에서 프로브로 사용되는 핵산 분자와 약 80％ 이상의 핵산 서열 동일성을 갖는 핵산 분자의 단리를 허용하는 조건 (즉, 약 20％ 이하의 뉴클레오티드 미스매치를 허용하는 조건)을 지칭한다. 본원에 언급된 바와 같은 매우 높은 엄격 혼성화 및 세척 조건은 혼성화 반응에서 프로브로 사용되는 핵산 분자와 약 90％ 이상의 핵산 서열 동일성을 갖는 핵산 분자의 단리를 허용하는 조건 (즉, 약 10％ 이하의 뉴클레오티드 미스매치를 허용하는 조건)을 지칭한다. 상기 논의된 바와 같이, 당업자라면 문헌 [Meinkoth et al., ibid.]의 공식을 이용해서 상기 특정 수준의 뉴클레오티드 미스매치를 달성하기 위한 적절한 혼성화 및 세척 조건을 계산할 수 있을 것이다. 이러한 조건은 DNA:RNA 또는 DNA:DNA 하이브리드 형성 여부에 따라 달라질 것이다. DNA:DNA 하이브리드에 대해 계산된 융점은 DNA:RNA 하이브리드에 대한 융점보다 10℃ 더 낮다. 특정 실시양태에서, DNA:DNA 하이브리드에 대한 엄격 혼성화 조건은 적절한 세척 조건과 함께 6X SSC (0.9 M Na+)의 이온 농도하에 약 20℃ 내지 약 35℃의 온도 (낮은 엄격도), 더 바람직하게는 약 28℃ 내지 약 40℃ (보다 높은 엄격도), 훨씬 더 바람직하게는 약 35℃ 내지 약 45℃ (훨씬 더 높은 엄격도)의 온도에서의 혼성화를 포함한다. 특정 실시양태에서, DNA:RNA 하이브리드에 대한 엄격 혼성화 조건은 유사한 엄격 세척 조건과 함께 6X SSC (0.9 M Na+)의 이온 농도하에 약 30℃ 내지 약 45℃, 더 바람직하게는 약 38℃ 내지 약 50℃, 훨씬 더 바람직하게는 약 45℃ 내지 약 55℃의 온도에서의 혼성화를 포함한다. 이러한 수치는 뉴클레오티드 약 100개보다 더 많은 분자에 대한 융점, 0％ 포름아미드 및 약 40％의 G + C 함량의 계산을 기초로 한다. 별법으로, Tm은 문헌 [Sambrook et al., 상기 문헌, 9.31 내지 9.62 페이지]에 기재된 바와 같이 경험적으로 계산될 수 있다. 일반적으로, 세척 조건은 가능한 엄격해야하며, 선택된 혼성화 조건에 대해 적절해야 한다. 예를 들어, 혼성화 조건은 염의 형성 및 특정 하이브리드의 계산된 Tm보다 대략 20-25℃ 낮은 온도 조건을 포함할 수 있으며, 세척 조건은 전형적으로는 특정 하이브리드의 계산된 Tm보다 대략 12-20℃ 낮은 온도 조건과 염의 조합을 포함한다. DNA:DNA 하이브리드와 함께 사용하기에 적합한 혼성화 조건의 한 예는 약 42℃에서 6X SSC (50％ 포름아미드) 중 2 내지 24시간의 혼성화에 이어서 실온에서 약 2X SSC로 1회 이상 세척하는 것을 포함하는 세척 단계, 및 이후 더 높은 온도 및 더 낮은 이온 농도에서의 추가의 세척 (예를 들어, 약 37℃에서 약 0.1X-0.5X SSC로 1회 이상 세척한 다음, 약 68℃에서 약 0.1X-0.5X SSC로 1회 이상 세척함)을 포함한다.
본 발명은 또한 하나 이상의 융합 세그먼트에 부착된 본 발명의 임의의 단백질 또는 임의의 상동체 또는 그의 단편을 포함하는 융합 단백질을 포함한다. 본 발명과 함께 사용하기에 적합한 융합 세그먼트로는 단백질의 안정성을 증가시킬 수 있고/있거나; 다른 바람직한 생물학적 활성을 제공할 수 있고/있거나 (예. 친화성 크로마토그래피에 의해) 단백질의 정제를 보조할 수 있는 세그먼트를 포함하지만 이에 한정되지 않는다. 적합한 융합 세그먼트는 목적하는 기능을 갖는 (예를 들어, 증가된 안정성, 용해도, 생물학적 활성을 부여하고/하거나 단백질 정제를 단순화하는) 임의의 크기의 도메인일 수 있다. 융합 세그먼트는 단백질의 아미노 및/또는 카르복실 말단에 연결될 수 있으며, 목적 단백질을 직접 회수하기 위해 절단될 수 있다. 융합 단백질은 바람직하게는 상기 논의된 바와 같은 본 발명의 단백질의 카르복실 및/또는 아미노 말단에 부착된 융합 세그먼트를 포함하는 단백질을 코딩하는 융합 핵산 분자로 트랜스펙션된 재조합 세포를 배양함으로써 제조될 수 있다.
본 발명의 한 실시양태에서, 본원에 기재된 임의의 아미노산 서열 및 이러한 서열의 상동체는, 주어진 아미노산 서열의 C- 및/또는 N-말단 각각을 플랭킹하는 1개 이상 약 20 이하의 추가의 이종 아미노산을 갖도록 제조할 수 있다. 생성된 단백질 또는 폴리펩티드는 주어진 아미노산 서열로 "본질적으로 이루어지는" 것으로 언급될 수 있다. 본 발명에 따라, 이종 아미노산은 천연에서 주어진 아미노산 서열을 플랭킹하는 것으로 발견되지 않거나 (즉, 자연, 생체내에 존재하지 않음) 또는 유전자내에 존재할 때 주어진 아미노산 서열을 코딩하는 천연 발생 핵산 서열을 플랭킹하는 뉴클레오티드에 의해 코딩되지 않는 아미노산의 서열이며, 이는 천연 발생 서열내의 이러한 뉴클레오티드가 주어진 아미노산 서열이 유도되는 생물체에서 표준 코돈 용법을 이용해서 번역된 경우에 그러하다. 유사하게, 본원에서 핵산 서열과 관련하여 사용되는 경우 "~로 본질적으로 이루어지는"이라는 구절은 주어진 아미노산 서열을 코딩하는 핵산서열의 5' 및/또는 3' 말단의 각각에서 1개 이상 최대 약 60개 만큼 많은 추가의 이종 뉴클레오티드에 의해 플랭킹될 수 있는 주어진 아미노산 서열을 코딩하는 핵산 서열을 지칭한다. 이종 뉴클레오티드는 천연 유전자내에 존재할 때 주어진 아미노산 서열을 코딩하는 핵산 서열을 플랭킹하는 것으로 천연에서는 발견되지 않는다 (즉, 자연, 생채내에 존재하지 않음).
한 측면에서, 본 발명의 단백질 또는 도메인 및/또는 그의 상동체 또는 단편의 최소 크기는 필요한 생물학적 활성을 나타내는데 충분하거나 또는 시험관내 검정에서 표적으로 또는 항체 발생을 위한 항원으로 작용하기에 충분한 크기이다. 한 실시양태에서, 본 발명의 단백질은 본 발명의 단백질 또는 도메인의 아미노산 8개 길이 내지 전체 길이 사이의 임의의 길이로서 약 8개 이상의 아미노산 길이 (예를 들어, 항체 에피토프의 경우 또는 검정에서 검출가능한 펩티드로서 적합함), 또는 약 25개 이상의 아미노산 길이, 또는 약 50개 이상의 아미노산 길이, 또는 약 100개 이상의 아미노산 길이, 또는 약 150개 이상의 아미노산 길이, 또는 약 200개 이상의 아미노산 길이, 또는 약 250개 이상의 아미노산 길이, 또는 약 300개 이상의 아미노산 길이, 또는 약 350개 이상의 아미노산 길이, 또는 약 400개 이상의 아미노산 길이, 또는 약 450개 이상의 아미노산 길이, 또는 약 500개 이상의 아미노산 길이 등이거나 또는 전체 정수에서 그보다 더 긴 길이 (예, 8, 9, 10,...25, 26,...500, 501,...)이다. 단백질은 단백질의 일부, 도메인, 또는 그의 생물학적으로 활성인 또는 유용한 단편, 또는 전장 단백질 또는 도메인에 더하여 필요하다면 추가의 서열 (예, 융합 단백질 서열)을 포함할 수 있다는 점에서, 실제적인 제한 이외에 상기 단백질의 최대 크기에 대한 제한은 없다.
본 발명의 다른 실시양태는 본원에 기재된 임의의 단백질 (이러한 임의의 단백질의 상동체 또는 단편을 포함함)을 코딩하는 핵산 서열 및 이 서열과 완전히 상보적인 핵산 서열을 포함하거나, 이들 서열로 본질적으로 이루어지거나, 또는 상기 서열들로 이루어지는 단리된 핵산 분자에 관한 것이다. 본 발명에 따라, 단리된 핵산 분자는 천연에 존재하는 핵산 분자가 있는 게놈 또는 염색체인 천연 환경으로부터 제거된 (즉, 인간에 의해 조작처리된) 핵산 분자이다. 이와 같이, "단리된"은 핵산 분자가 정제되는 정도를 반드시 반영하는 것은 아니지만, 상기 핵산 분자가 천연에서 발견되는 핵산 분자가 있는 전체 게놈 또는 전체 염색체를 포함하지 않는다는 것을 나타낸다. 단리된 핵산 분자는 유전자를 포함할 수 있다. 유전자를 포함하는 단리된 핵산 분자는 이러한 유전자를 포함하는 염색체의 단편이 아니라, 오히려 유전자와 관련된 조절 영역 및 코딩 영역을 포함하되 천연에서 동일 염색체 상에 존재하는 추가의 유전자들을 포함하지 않으며, 단 핵산 분자가 코어 PUFA PKS 단백질을 코딩하는 경우, 본원에 기재된 바와 같은 PUFA PKS 시스템의 다른 단백질을 코딩하는 다른 유전자들은 제외한다. 단리된 핵산 분자는 또한 천연에서 특정 핵산 서열을 정상적으로 플랭킹하지 않는 추가의 핵산에 의해 (즉, 이 서열의 5' 및/또는 3'에서) 플랭킹된 특정 핵산 서열 (즉, 이종 서열)을 포함한다. 단리된 핵산 분자는 DNA, RNA (예, mRNA), 또는 DNA 또는 RNA의 유도체 (예, cDNA)를 포함할 수 있다. "핵산 분자"라는 구절이 주로 물리적인 핵산 분자를 지칭하며 "핵산 서열"이라는 구절은 주로 핵산 분자상의 뉴클레오티드의 서열을 지칭하지만, 이들 두 구절은 특히 단백질 또는 단백질의 도메인을 코딩할 수 있는 핵산 분자 또는 핵산 서열에 관하여 상호교환가능하게 사용될 수 있다.
바람직하게는, 재조합 DNA 기술 (예, 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR) 증폭, 클로닝) 또는 화학적 합성을 이용해서 본 발명의 단리된 핵산 분자를 제조한다. 단리된 핵산 분자는, 목적하는 효과 (예를 들어, 단백질의 활성을 보유, 향상 또는 감소시킴)를 제공하는 방식으로 뉴클레오티드가 삽입, 결실, 치환 및/또는 역위된 천연 대립유전자 변이체 및 개질된 핵산 분자를 포함하지만 이에 한정되지 않는 천연 핵산 분자 및 그의 상동체를 포함한다. 단백질 상동체 (예, 핵산 상동체에 의해 코딩된 단백질)은 상기에 상세히 논의되어 있다.
핵산 분자 상동체는 당업자에게 공지된 다수의 방법을 이용해서 제조할 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Labs Press (1989)] 참조). 예를 들어, 핵산 분자는 전형적인 돌연변이유발 기술 및 재조합 DNA 기술, 예를 들면 부위-지시된 돌연변이유발, 핵산 분자를 화학적으로 처리해서 돌연변이를 유도하는 기술, 핵산 단편의 제한 효소 절단, 핵산 단편의 라이게이션, 핵산 서열의 선택된 영역의 PCR 증폭 및/또는 돌연변이유발, 올리고뉴클레오티드 혼합물의 합성 및 혼합물 군을 라이게이션하여 핵산 분자의 혼합물 및 그의 조합물을 "형성하는(build)" 기술을 포함하지만 이에 한정되지 않는 다양한 기술을 이용해서 개질시킬 수 있다. 핵산 분자 상동체는 핵산에 의해 코딩된 단백질의 기능에 대한 스크리닝에 의해 및/또는 야생형 유전자와의 혼성화에 의해 개질된 핵산의 혼합물로부터 선별될 수 있다.
본 발명의 핵산 분자의 최소 크기는 (예를 들어, 중간, 높은 또는 매우 높은 엄격도 조건하에) 본 발명의 핵산 분자의 상보적 서열과 안정한 하이브리드를 형성할 수 있는 프로브 또는 올리고뉴클레오티드 프라이머를 형성하기에 충분한 크기이거나 또는 본 발명에 따른 단백질의 생물학적 활성을 갖는 아미노산 서열을 코딩하기에 충분한 크기이다. 이와 같이, 상기 단백질을 코딩하는 핵산 분자의 크기는 핵산 조성 및 핵산 분자와 상보적 서열 사이의 퍼센트 상동성 또는 동일성, 및 혼성화 조건 그 자체 (예, 온도, 염 농도, 및 포름아미드 농도)에 따라 달라질 수 있다. 올리고뉴클레오티드 프라이머 또는 프로브로서 사용되는 핵산 분자의 최소 크기는 전형적으로는, 핵산 분자가 GC-풍부한 경우 적어도 약 12개 내지 약 15개의 뉴클레오티드 길이이며 핵산 분자가 AT-풍부한 경우 적어도 약 15개 내지 약 18개의 염기 길이이다. 본 발명의 핵산 분자가 단백질 또는 전장 단백질의 생물학적 활성 단편을 코딩하기에 충분한 서열을 포함할 수 있다는 점에서, 실제적인 제한 이외에 본 발명의 핵산 분자의 최대 크기에 대한 제한은 없다.
본 발명의 다른 실시양태는 재조합 벡터를 포함하는 재조합 핵산 분자 및 본원에 기재된 임의의 단백질의 생물학적 활성을 갖는 단백질 또는 펩티드를 코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 이러한 핵산 서열은 상기에 상세히 기재되어 있다. 본 발명에 따라, 재조합 벡터는 선택된 핵산 서열을 조작하고 이러한 핵산 서열을 숙주 세포에 도입하기 위한 수단으로서 사용되는 조작된 (즉, 인공적으로 제조된) 핵산 분자이다. 따라서 재조합 벡터는, 예를 들어 선택된 핵산 서열을 숙주 세포로 발현 및/또는 전달하여 재조합 세포를 형성함으로써 선택된 핵산 서열을 클로닝, 서열화, 및/또는 다르게는 조작에 사용하기에 적합하다. 이러한 벡터는 전형적으로 천연에서 클로닝 또는 전달될 핵산 서열에 인접하여 존재하지 않는 핵산 서열인 이종 핵산 서열을 함유하지만, 상기 벡터는 또한 천연에서 본 발명의 핵산 분자에 인접하여 존재하거나 또는 본 발명의 핵산 분자의 발현에 유용한 조절성 핵산 서열 (예, 프로모터, 비번역 영역)을 함유할 수 있다 (하기에서 상세히 논의됨). 벡터는 RNA 또는 DNA, 원핵 또는 진핵일 수 있으며, 전형적으로는 플라스미드이다. 벡터는 염색체외 요소 (예, 플라스미드)로서 유지될 수 있거나 또는 재조합 생물체 (예, 미생물 또는 식물)의 염색체에 통합될 수 있다. 전체 벡터는 숙주 세포내에 잔류할 수 있거나, 또는 특정 조건하에서 플라스미드 DNA가 결실되어 본 발명의 핵산 분자를 남겨둘 수 있다. 통합된 핵산 분자는 염색체 프로모터 조절하에, 천연 또는 플라스미드 프로모터 조절하에, 또는 조합된 여러 프로모터 조절하에 있을 수 있다. 단일 카피 또는 여러 카피수의 핵산 분자가 염색체로 통합될 수 있다. 본 발명의 재조합 벡터는 하나 이상의 선택가능한 마커를 함유할 수 있다.
한 실시양태에서, 본 발명의 재조합 핵산 분자에서 사용된 재조합 벡터는 발현 벡터이다. 본원에 사용된 바와 같이, "발현 벡터"라는 구절은 코딩된 생성물 (예, 대상 단백질)의 제조에 적합한 벡터를 지칭하는데 사용된다. 상기 실시양태에서, 제조될 생성물 (예, PUFA PKS 도메인 또는 단백질)을 코딩하는 핵산 서열을 재조합 벡터에 삽입해서 재조합 핵산 분자를 제조한다. 제조될 단백질을 코딩하는 핵산 서열은, 재조합 숙주 세포내에서의 상기 핵산 서열의 전사 및 번역을 가능케하는 벡터에서 상기 핵산 서열을 조절 서열에 작동적으로 연결시키는 방식으로 벡터에 삽입한다.
다른 실시양태에서, 본 발명의 재조합 핵산 분자에 사용된 재조합 벡터는 표적화 벡터이다. 본원에 사용된 바와 같이, "표적화 벡터"라는 구절은, 특정 핵산 분자가 숙주 세포 또는 미생물내의 내생성 유전자 또는 유전자의 일부를 결실, 불활성화 또는 대체하는데 사용 (즉, 표적화된 유전자 파괴 또는 녹아웃 기술에 사용)되는 것인 상기 핵산 분자를 재조합 숙주 세포로 전달하는데 사용되는 벡터를 지칭하는데 사용된다. 이러한 벡터는 또한 당업계에서 "녹아웃" 벡터로 공지되어 있을 수 있다. 상기 실시양태의 한 측면에서, 벡터의 일부, 보다 전형적으로 말하자면 벡터에 삽입된 핵산 분자 (즉, 삽입물)은 숙주 세포내의 표적 유전자 (즉, 결실 또는 불활성화되도록 표적화된 유전자)의 핵산 서열과 상동성인 핵산 서열을 갖는다. 벡터 삽입물의 핵산 서열은, 표적 유전자 및 삽입물이 상동성 재조합을 수행하여 내생성 표적 유전자가 결실, 불활성화, 약화 (즉, 돌연변이 또는 결실되는 내생성 표적 유전자의 적어도 일부에 의해), 또는 대체될 수 있도록, 상기 표적 유전자와 관련되도록 설계된다. 이러한 유형의 재조합 벡터를 사용해서 예를 들어 내생성 쉬조키트리움 유전자를 재조합 유전자로 대체하는 것은 본 발명자들에 의해 앞서 기술되었으며, 트라우스토키트리드의 유전적 형질전환에 대한 일반적인 기술은 미국 특허 출원 공개 제20030166207호 (공개일: 2003년 9월 4일)로서 공개된 미국 특허 출원 제10/124,807호에 상세히 기재되어 있다. 식물에 대한 유전적 형질전환 기술은 당업계에 잘 알려져 있다.
전형적으로, 재조합 핵산 분자는 하나 이상의 발현 조절 서열에 작동적으로 연결된 본 발명의 하나 이상의 핵산 분자를 포함한다. 본원에 사용된 바와 같이, "재조합 분자" 또는 "재조합 핵산 분자"라는 구절은 주로 발현 조절 서열에 작동적으로 연결된 핵산 분자 또는 핵산 서열을 지칭하지만, 본원에 논의된 바와 같은 재조합 핵산 분자인 "핵산 분자"와 상호교환가능하게 사용될 수 있다. 본 발명에 따라, "작동적으로 연결된"이라는 구절은 핵산 분자가 숙주 세포에 트랜스펙션된 (즉, 형질전환된, 형질도입된(transduced), 트랜스펙션된, 컨쥬게이션된 또는 컨 Z선된(conduced)) 경우 발현될 수 있도록 하는 방식으로 상기 핵산 분자를 발현 조절 서열 (예, 전사 조절 서열 및/또는 번역 조절 서열)에 연결하는 것을 지칭한다. 전사 조절 서열은 전사의 개시, 연장 또는 종결을 조절하는 서열이다. 특히 중요한 전사 조절 서열은 전사 개시를 조절하는 서열, 예를 들면 프로모터, 인핸서, 오퍼레이터 및 리프레서 서열이다. 적합한 전사 조절 서열은 재조합 핵산 분자가 도입되는 숙주 세포 또는 생물체에서 기능할 수 있는 임의의 전사 조절 서열을 포함한다.
본 발명의 재조합 핵산 분자는 또한 추가의 조절 서열, 예를 들면 번역 조절 서열, 복제 기점, 및 재조합 세포에 적합한 다른 조절 서열을 함유할 수 있다. 한 실시양태에서, 숙주 세포 염색체에 통합되는 것들을 비롯한 본 발명의 재조합 분자는 또한 발현된 단백질이 단백질을 제조하는 세포로부터 분비될 수 있도록 하는 분비 신호 (즉, 신호 세그먼트 핵산 서열)을 함유한다. 적합한 신호 세그먼트는 본 발명에 따른 단백질의 분비를 지시할 수 있는 임의의 이종 신호 세그먼트 또는 발현될 단백질과 본래 관련이 있는 신호 세그먼트를 포함한다. 다른 실시양태에서, 본 발명의 재조합 분자는 발현된 단백질이 숙주 세포막으로 전달 및 삽입되도록 하는 리더 서열을 포함한다. 적합한 리더 서열은 단백질과 본래 관련이 있는 리더 서열 또는 단백질이 세포막으로 전달 및 삽입되도록 지시할 수 있는 임의의 이종 리더 서열을 포함한다.
본 발명의 한가지 이상의 재조합 분자를 사용해서 본 발명의 코딩된 생성물 (예, ACoAS)을 제조할 수 있다. 한 실시양태에서, 코딩된 생성물은 본원에 기재된 바와 같은 핵산 분자를 단백질 제조에 효과적인 조건하에서 발현시킴으로써 제조된다. 코딩된 단백질을 제조하는 바람직한 방법은 숙주 세포를 하나 이상의 재조합 분자로 트랜스펙션시켜 재조합 세포를 형성시키는 것이다. 트랜스펙션에 적합한 숙주 세포로는 트랜스펙션시킬 임의의 세균성, 진균 (예, 효모), 원생생물, 미세조류, 조류, 곤충, 식물 또는 동물 세포를 들 수 있지만 이에 한정되지 않는다. 본 발명의 한 실시양태에서, 바람직한 숙주 세포는 식물 숙주 세포이다. 숙주 세포는 트랜스펙션되지 않은 세포이거나 또는 하나 이상의 다른 재조합 핵산 분자로 이미 트랜스펙션된 세포일 수 있다.
본 발명에 따라, "트랜스펙션"이라는 용어는 외생성 핵산 분자 (즉, 재조합 핵산 분자)가 세포로 삽입될 수 있는 임의의 방법을 지칭하는데 사용된다. "형질전환"이라는 용어는 이 용어가 핵산 분자의 미생물 세포, 예를 들면 조류, 세균 및 효모로의 또는 식물 세포로의 도입을 지칭하는데 사용되는 경우 "트랜스펙션"이라는 용어와 상호교환가능하게 사용될 수 있다. 미생물 및 식물 시스템에서, "형질전환"이라는 용어는 미생물 또는 생물이 외생성 핵산을 획득됨으로 인해 발생되는 고유한 변화를 기술하는데 사용되며, 본질적으로는 "트랜스펙션"이라는 용어와 동의어이다. 그러나, 동물 세포에서, 형질전환은 예를 들어 배양물 중의 세포가 암성으로 된 후에 상기 세포의 성장 특성 변화를 지칭할 수 있는 다른 의미를 갖는다. 따라서, 혼동을 피하기 위해, "트랜스펙션"이라는 용어는 바람직하게는 외생성 핵산의 동물 세포로의 도입과 관련하여 사용되며, 본원에서는 "트랜스펙션"이라는 용어가 일반적으로 동물 세포의 트랜스펙션, 및 미생물 세포 또는 식물 세포의 형질전환을 (이들 용어가 외생성 핵산의 세포로의 도입과 관련되는 정도로) 포함하도록 사용될 것이다. 따라서, 트랜스펙션 기술로는 형질전환, 입자 충격(particle bombardment), 확산, 능동 수송, 조 초음파처리, 전기천공, 미세주입, 리포펙션, 흡착(adsorption), 감염 및 원형질체 융합을 들 수 있지만 이에 한정되지 않는다.
당업자라면 재조합 DNA 기술을 이용해서 예를 들어 숙주 세포내의 핵산 분자의 카피수, 핵산 분자가 전사되는 효율, 생성된 전사체가 번역되는 효율 및 번역후 개질 효율을 조작함으로써 트랜스펙션된 핵산 분자의 발현 조절을 향상시킬 수 있음을 이해할 것이다. 추가로, 프로모터 서열을 유전적으로 조작하여 천연 프로모터에 비해 발현 수준을 향상시킬 수 있다. 핵산 분자의 발현을 조절하는데 유용한 재조합 기술로는 핵산 분자의 하나 이상의 숙주 세포 염색체로의 통합, 벡터 안정성 서열의 플라스미드로의 부가, 전사 조절 신호 (예, 프로모터, 오퍼레이터, 인핸서)의 치환 또는 개질, 번역 조절 신호 (예, 리보좀 결합 부위, 샤인-달가노(Shine-Dalgarno) 서열)의 치환 또는 개질, 숙주 세포의 코돈 용법에 상응하는 핵산 분자의 개질, 및 전사체를 불안정화하는 서열의 결실을 들 수 있지만 이에 한정되지 않는다.
본원의 개시내용을 고려하면 생활성 분자의 제조에 유용한 다수의 유전적 개질은 당업자에게 자명할 것이며, 본원에서는 다양한 다른 변형들이 앞서 논의되었다. 본 발명은 목적하는 생활성 분자를 제조하는 본원에 기재된 바와 같은 PUFA PKS 시스템 및/또는 부속 단백질에 관련된 임의의 유전적 개질을 고려한다.
본 발명에 따른 생활성 분자는 생물학적 활성을 가지며 PUFA PKS 시스템에 의해 제조될 수 있는 임의의 분자 (화합물, 생성물 등)를 포함한다. 이러한 생활성 분자는 다불포화 지방산 (PUFA), 항염증성 제제, 화학치료제, 활성 부형제, 골다공증 약물, 항우울제, 항경련제, 항-헬레코박터 파이로리 약물, 신경퇴행성 질환 치료용 약물, 퇴행성 간 질환 치료용 약물, 항생제, 및 콜레스테롤 저하용 제제를 포함할 수 있지만 이에 한정되지 않는다. 본 발명의 PUFA PKS 시스템의 한가지 이점은 이러한 시스템이 시스 배치의 탄소-탄소 이중 결합 및 3개의 탄소마다 이중 결합을 포함하는 분자를 도입하는 능력이다. 이러한 능력은 다양한 화합물을 제조하는데 이용될 수 있다.
본원에 언급된 각 간행물, 특허 또는 특허 출원은 그 전체 개시내용이 본원에 참고로 도입된다.
하기 실시예는 예시를 목적으로 제공된 것이며 본 발명의 범위를 제한하고자 하는 것은 아니다.
실시예에 대한 일반적인 도입. PUFA 신타제를 코딩하는 유전자들은 해양 세균 및 트라우스토키트리드 종에서 확인되었다. 이들 유전자의 여러 세트가 이. 콜라이에서 발현되었으며, 적절한 PPTase와 함께 공급되는 경우에는 이들 효소의 특정 PUFA 생성물이 상기 세포내에 축적될 수 있다. 그러나, 본 발명자들이 알고있는 바로는, 상기 효소로부터 PUFA를 방출시키는 방법은 기존에는 기술된 바 없었다. 방출 메카니즘은 이종 숙주 생물체에서 PUFA 신타제 시스템의 발현과 관련된 용도를 갖는다. 상기 메카니즘은 또한 상기 시스템을 통한 탄소의 흐름 및 이종 또는 천연 숙주 생물체 중에 축적되는 PUFA의 최종적인 양을 조절하는데 목적이 있는 연구들에 대하여 방향성을 제공할 수 있다. 여기서 본 발명자들은 쉬조키트리움 PUFA 신타제 (및 이론에 얽매이고자 하는 것은 아니지만 모든 트라우스토키트리드 PUFA PKS 시스템을 비롯한 모든 진핵생물 PUFA 신타제 시스템일 수 있음)의 생성물이 유리 지방산이며, 유리 지방산의 방출은 효소 복합체 자체에 대해 필수적이라는 것을 보여준다. 추가로, 쉬조키트리움에서 PUFA FFA는 인지질 (PL) 및 트리아실글리세롤 (TAG)로 진입하기에 앞서 CoA로 에스테르화된다. 하기 실시예에 기재된 데이터는 이종 숙주 생물체에서의 발현을 위한 전략 및 천연 숙주 생물체에서의 PUFA 축적의 변경을 위한 전략을 나타낸다.
실시예 1
본 실시예는 생화학적 연구를 위한 쉬조키트리움 FAS 녹아웃 균주의 생성을 기술한다.
쉬조키트리움은 단쇄 포화 지방산의 제조를 담당하는 FAS 효소를 코딩하는 단일 거대 유전자를 함유한다 (미국 특허 출원 공개 제20050191679 A1호에 기재됨). 쉬조키트리움 FAS 녹아웃 (FAS-KO) 구조물은 미국 특허 제7,001,772호에 기재된 절차를 이용해서 제조하였다. FAS Orf의 대부분을 함유하는 게놈 DNA의 약 10.0 kB EcoRV 단편 (추정된 ATG 개시 코돈의 하류 약 728 bp로부터 종결 코돈의 하류 약 680 bp까지임)을 스트라타진 블루스크립트(Stratagene bluescript) 벡터 (pBSK)내의 다중 클로닝 영역의 EcoRV 부위에 클로닝하였다. 약 3.5 kB의 내부 BglII 단편을 클로닝된 쉬조키트리움 DNA로부터 제거하고, Zeocin 내성 카세트를 함유하는 pTubZeo11-2로부터의 약 1.1 kB BamHI 단편으로 대체하였다 (미국 특허 제7,001,772호, 상기 문헌 참조). 이 플라스미드 (pJK878)를 입자 폭격에 의해 쉬조키트리움의 세포 벽 결핍 균주 (Ac66으로 표시됨)에 도입하였다. Zeocin을 함유하며 팔미트산이 보충된 배지상에 플레이팅함으로써 형질전환체를 1차 선별하였다. 팔미트산이 보충되지 않은 플레이트에서의 성장 실패에 의해 선별하는 제2 선별을 이용해서, FAS 게놈 영역의 일부가 Zeocin 내성 카세트에 의해 대체된 것인 잠재적인 이중 교차 반응을 확인하였다. PCR 및 서던 블롯 분석을 이용해서 형질전환체 (표지된 FAS-KO) 중 하나가 예상된 게놈 구조를 가짐을 확인하였다. 이 균주는 500 uM 팔미트산이 보충된 배지 중에서 성장시킴으로써 유지하였다. 유사한 전략, 즉 쉬조키트리움 PUFA 신타제의 서브유닛을 코딩하는 유전자들의 하나에 Zeocin 내성 카세트를 삽입하는 전략을 이용해서 쉬조키트리움 Ac66 균주내의 효소를 불활성화할 수 있었다. 이 경우, 배지에 500 uM DHA를 보충하였다. 이들 균주의 전체 세포 및 세포 무함유 추출물을 이후의 생화학적 연구에 사용하였다 (하기 실시예 참조).
실시예 2
하기 실시예는 쉬조키트리움 Ac66의 세포 무함유 추출물 및 쉬조키트리움 Ac66으로부터 유도된 PUFA 신타제 KO 및 FAS-KO 균주의 제조에 대한 일반적인 프로토콜을 기술한다.
쉬조키트리움의 세포벽 결핍 균주로부터의 세포 무함유 균질물 (CFH)의 제조를 위한 프로토콜의 예는 다음과 같다. 세포를 A50-3 배지에서 성장시킨 다음, M2B 배지 중으로 희석시켰다. KO 균주를 성장시키는데 사용된 배지에 적절한 지방산을 보충하였다. 세포를 M2B 배지 중에서 OD600nm 약 2.5 초과 약 5 미만으로 성장시켰다. 배양 배지 50 mL 중의 세포를 50 mL 플라스틱 튜브에서 원심분리 (테이블 탑 원심분리 - 약 1200 rpm x 4 분)에 의해 수집하였다. 상등액을 따라내고, 세포를 5 mL 완충액 A (100 mM 포스페이트 pH 7.2, 10％ (w/v) 글리세롤, 1 mM EDTA 및 2 mM DTT) 중에 재현탁시키고, 상기와 같이 원심분리하였다. 상등액을 따라내고, 세포를 빙냉 5 mL 완충액 A 중에 재현탁시켰다. 현탁액을 초음파처리 (마이크로팁을 갖는 울트라소닉 프로세서 모델(Ultrasonic Processor Model) GE130, 펄스 간격 2초, 전력 설정 약 1 와트(Watt))하고, 얼음상 튜브에 1.5분 동안 두었 다. 샘플을 현미경으로 조사해서 모든 세포가 파괴되었음을 확인하였다. CFH를 200 uL 분액씩 분취하여 마개가 있는 0.5 mL PCR 튜브에 넣고, 액체 N2에 넣어 동결시켰다. 샘플을 필요시까지 -74℃에서 보관하였다.
실시예 3
본 실시예는 시험관내 FAS 및 PUFA 신타제 활성 검정에 대한 일반적인 조건을 기술한다.
FAS 및 PUFA 신타제 활성 둘 다의 시험관내 활성 검정에 대한 프로토콜의 예는 다음과 같다. 100 uL의 최종 부피로, 효소 제제 및 완충액 A (이들 두 성분의 부피 = 90 uL)에 더하여 (10 uL의) 혼합물로서 첨가된 하기 성분들을 혼합하여 괄호안에 표시된 최종 농도를 얻는다: 말로닐-CoA (50 uM - 냉각 및 말로닐-2-14C-CoA의 혼합물, 방사성표지의 최종 농도는 0.65 μCi/mL임), NADH (1 mM), NADPH (1 mM) 및 아세틸-CoA (10 uM). 이들 성분들 및 추가의 성분들은 특정 실험 요건에 따라 조정될 수 있다. 검정 반응은 실온 (약 21℃) 수조내의 유리 튜브 중에서 수행된다. 인큐베이션 시간은 실험 요건에 따라 달라진다. 처리(work-up) 프로토콜에 따라 상기 두 방법들 중 하나를 이용해서 반응을 중지시킨다. 산성 방법을 이용해서 지방산을 지방산 메틸-에스테르 (FAME)로 전환시키는 경우, 반응은 FAME 시약을 첨가하여 중단시킨다 (하기 참조). 유도체화 없이 지질을 추출하는 경우, 이소프로판올/아세트산 (4:1 v/v) 125 uL를 가하여 반응을 중단시킨다 (하기 참조).
산성 FAME 프로토콜: 메탄올 중 4％ HCl 2.0 mL에 더하여 톨루엔 50 uL를 가하여 반응을 종결시키고, 테플론(Teflon) 라이닝된 마개가 있는 유리 튜브를 밀봉하고, 100℃에서 1 시간 동안 가열한다. 실온으로 냉각시키고, 헥산 1.0 mL 및 물 0.5 mL를 가하고, 볼텍싱한 다음, 분리되도록 한다. 필요하다면, 액체 섬광 계수 (LSC)를 위해 일부를 제거한다. 유기상 약 600 uL를 새로운 튜브에 전달하고, N2하에 용매를 제거한다. 잔류물을 헥산 50 uL 중에 용해시키고, 실리카게 겔 60 A TLC 플레이트 (헥산:디에틸-에테르:아세트산 - 70:30:2로 전개시킴) 또는 10％ AgNO3/90％ 아세토니트릴 중에 함침된 실리카 겔 G 플레이트 (사용에 앞서 100℃에서 30분 동안 활성화됨) (w/ 헥산:디에틸-에테르/아세트산 - 70:20:2로 전개시킴) 상에 스폿팅한다. 플레이트가 공기 건조되도록 하고, 포스포르이미지화 기술을 이용해서 방사활성 면적을 검출한다.
HIP 프로토콜 - 유도체화되지 않은 지질의 추출: 상기 나타낸 바와 같이, 이소프로판올:아세트산 (4:1 v/v) 125 uL를 가한 다음 헥산:이소프로판올 (3:2, v/v) 2 mL를 가하여 반응을 중단시키고, 볼텍싱한 다음, 6.7 ％ (w/v) 황산나트륨 1 mL를 가하고, 다시 볼텍싱한다. 상이 분리되도록 한다. 필요하다면, LSC를 위해 (상부) 유기 상의 일부를 제거한 다음, 나머지 (약 1.0 mL)를 새로운 튜브에 전달한다. 용매를 N2로 제거하고, 잔류물을 헥산 50 uL 중에 용해시킨다. 샘플을 실리카 겔 60 A TLC 플레이트 상에 스폿팅하고, 헥산:디에틸-에테르:아세트산 (70:30:2)으로 전개시킨다. 플레이트가 공기 건조되도록 하고, 포스포르이미지화 기술을 이용해서 방사활성 면적을 검출한다.
실시예 4
하기 실시예는 FAS 및 PUFA 신타제 활성의 시험관내 검정 결과를 기술한다.
쉬조키트리움 Ac66 및 쉬조키트리움 Ac66으로부터 유도된 PUFA 신타제 KO 및 FAS-KO 균주의 CFH를 제조하고, 상기 기재된 바와 같이 산성 FAME 및 은 TLC 프로토콜을 이용해서 FAS 및 PUFA 신타제 활성에 대해 검정하였다. 도 1은 이러한 검정의 결과를 나타낸다. TLC 플레이트의 영상에서 표지된 밴드는 FAME에 혼입된 방사활성을 나타낸다 (표준물을 이용한 공동이동(co-migration) 및 HPLC 분리에 의해 확인됨). 레인 1 및 2는 Ac66 모체(parental) 균주로부터의 추출물을 이용해서 얻어진 프로필을 나타낸다. FAS (14:0 및 16:0 FAME) 및 PUFA 신타제 (DHA 및 DPAn-6)의 생성물은 상기 레인에서 관찰될 수 있다. PUFA 신타제 효소가 불활성화된 경우에 얻어진 프로필은 레인 3 및 4에 나타나 있다. 이 경우, DHA 및 DPAn-6 FAME는 존재하지 않는다. FAS가 불활성화된 경우에 얻어진 프로필은 레인 5 및 6에 나타나 있다. 이 경우, FAS로부터 유도된 지방산, 즉 14:0 및 16:0 및 이들 지방산의 유도체는 소실되어 있다. 이러한 데이터는 상기 FAS-KO 균주에서 FAS 활성이 극심하게 또는 완전히 손상되었음을 나타낸다. FAS-KO 균주는 쉬조키트리움 PUFA 합성 및 축적 경로의 추가의 특성화를 위해 사용되었다.
실시예 5
하기 실시예는 쉬조키트리움에서 PUFA 합성의 추가의 특성화를 기술하며, 쉬조키트리움 PUFA 신타제의 초기 생성물이 유리 지방산 (FFA)이라는 증거를 제시한다.
산성 방법을 이용해서 시험관내 검정 반응 생성물을 FAME로 전환시키는 것은 말로닐-CoA로부터 지방산 잔기로 혼입된 방사활성을 결정하는데 있어서 유용하지만 그러한 유도체화에 앞서 상기 지방산의 분자 형태를 나타내지 않는다. 도 2는 FAS-KO 균주의 시험관내 검정의 시간 과정의 결과를 나타내며, 여기서 상기 기재된 HIP 프로토콜을 이용해서 (즉, 지방 아실 잔기의 메틸 에스테르로의 전환 없이) 지질을 추출한 다음, 정상 상 TLC를 사용해서 분리하였다. TAG 및 유리 지방산 (FFA) 표준물이 이동하는 플레이트상의 위치는 좌측에 나타나 있다. 이 TLC 시스템에서, 상이한 쇄 길이 및 불포화도의 FFA는 충분히 분리되지 않는다. 그러나, 이용된 균주는 FAS 활성 FFA가 거의 없거나 전혀 없기 때문에, 이 대역에서의 FFA는 PUFA 신타제 시스템으로부터 유도될 수 있다. 이러한 사실을 뒷받침하는 추가의 증거는 도 3에 나타나 있다. 여기서 시험관내 검정 동안 FFA 밴드에서의 방사활성의 출현은 NADPH의 첨가에 의존하는 것으로 나타난다. 대조적으로, NADH는 이러한 반응을 뒷받침하지 않는다. 환원제로서 NADPH에 대한 이러한 엄격한 의존성은 쉬바넬라 SCRC2738로부터 유도된 PUFA 신타제의 특징이기도 하다 (문헌 [Metz et al., Science 293:290-293 (2001)]의 도 2C). 도 2 및 3의 둘 다에서, FFA 밴드보다 약간 더 빠르게 이동하는 방사성표지된 밴드가 뚜렷하다 ('미지의 것'으로서 표지됨). 밴드의 출현은 환원제 (NADH 또는 NADPH - 레인 5, 도 3 참조)의 첨가와는 독립적이기 때문에, 이는 PUFA 신타제 활성과 관련되지 않을 수 있다. 추가로 이 밴드는 PUFA 신타제가 불활성화된 유사한 균주 분석 동안 검출될 수 있다 (데이터는 나타내지 않음). 도 2 및 3에서의 데이터는 쉬조키트리움 PUFA 신타제 의 초기 생성물이 FFA임을 제안한다. 생성물로서 FFA를 방출하는 FAS 시스템 (예, 포유동물 FAS)에서, 그러한 FFA는 PL 또는 TAG로의 진입에 앞서 CoA로 에스테르화된다. FFA의 활성화는 ATP 및 Mg+2를 필요로 하는 반응에서 아실-CoA 신테타제에 의해 수행된다. 시험관내 반응의 시간 과정에서 늦은 TAG 분획 중 일부 방사활성의 출현은 (샘플 중의 잔류 ATP로 인해) 쉬조키트리움에서의 상기 경로와 일치한다. 이러한 개념을 추가로 시험하였다 (하기 참조).
실시예 6
하기 실시예는 쉬조키트리움의 PUFA 축적 경로에서 아실-CoA 신테타제 반응이 관여함을 뒷받침하는 증거를 제시한다.
쉬조키트리움 FAS-KO 유래의 샘플 중 시험관내 검정 생성물에 대한 ATP (2.5 mM) 및 Mg+2 (10 mM)의 첨가 효과는 도 4에 나타나 있다. 샘플을 표준 반응 혼합물 중에서 10분 동안 인큐베이션한 다음, ATP 및 Mg+2를 첨가하였다. ATP 및 Mg+2를 첨가한 후 다양한 시점 (즉, 0 = 첨가 없음, 10 및 30 초, 및 1, 3, 10 및 30 분)에서 반응을 중단시켰다. 이 시간 과정 동안 FFA 밴드와 관련된 방사성표지는 감소하며 TAG 밴드와 관련된 방사성표지 증가한다는 것을 알 수 있다. '미지의 것'으로 표지된 밴드와 관련된 방사성표지는 ATP의 첨가에 의해 영향을 받지 않는다. 상기 데이터는 표지된 FFA가 TAG 분획으로 이동하는데 있어서의 ATP 필요 반응의 관련성과 일치한다.
트리아스신 C는 장쇄 PUFA를 활성화하는 아실-CoA 신테타제의 특이적 억제제 로서 특성화되었다 [Knoll et al., 1995]. FAS-KO 샘플의 시험관내 검정 동안 생성물 프로필에 대한 트리아스신 C의 효과를 시험하였다. 다양한 농도의 트리아스신 C를 함유하는 표준 혼합물 중에서 10분 동안 샘플을 인큐베이션한 다음, ATP 및 Mg+2를 첨가하였다. 반응을 추가의 20분 동안 진행시킨 다음 중단시키고, 지질을 추출하여 HIP 프로토콜을 이용한 TLC에 의해 분리하였다. 결과는 도 5에 나타나 있다. 더 높은 농도의 트리아스신 C의 첨가는 FFA 밴드로부터 방사성표지의 손실을 차단하였다. 이러한 결과는 상기 경로에서의 아실-CoA 신테타제의 관련성과 일치한다.
실시예 7
하기 실시예는 쉬조키트리움 Orf A, OrfBss (OrfB*), OrfC 및 Nostoc HetI을 발현시키는 이. 콜라이로부터의 추출물의 시험관내 검정을 기술한다.
상기 실시예에 나타낸 데이터는 쉬조키트리움에서의 PUFA가 TAG 및 PL로의 진입에 앞서 유리 지방산 형태로 전환된다는 것을 나타낸다. 유리 지방산으로서 PUFA의 방출이 PUFA 신타제 효소의 필수적인 부분이라는 것을 나타내는 데이터가 이 실시예에 제시되어 있다. 쉬조키트리움 천연 OrfA (서열 1로 나타낸 핵산 서열), OrfBss (또한 OrfB*로 표시됨; 서열 37로 나타낸 핵산 서열) 및 천연 OrfC (서열 5로 나타낸 핵산 서열)를 미국 특허 출원 공개 제20050100995호 (상기 문헌)에 기재된 바와 같이 pET 벡터내에 인공 오페론으로서 클로닝하고 이. 콜라이에서 발현시켰다. HetI을 pACYC 기재의 벡터내에 클로닝하고 상기 동일한 세포에서 발 현시켰다. 세포를 O.D. 약 1로 성장시키고, IPTG를 (최종 농도 1 mM로) 첨가하여 T7 폴리머라제의 제조를 유도하였다. 대략 4 시간 인큐베이션한 다음, 세포를 수획하고, 완충액 A로 세척하고, 프렌치(French) 압력 셀에 2회 통과시켜 파열시켰다. 균질물의 분취액을 따로 두고, 나머지를 원심분리 (5k x g x 5분)시켜 상등액 1 (S1)을 얻었다. 또한, 분취액을 따로 두고, 나머지 물질을 100,000 x g에서 1 시간 동안 원심분리하여 고속 펠릿 (P2) 및 고속 상등액 (S2) 분획을 얻었다. 펠릿 분획을 완충액 A 중에서 최초 원심분리 튜브에 놓인 부피로 재현탁시켰다. 산성 FAME는 상 TLC 처리 또는 지질의 HIP 추출에 이어서 정상 상 TLC에서의 분리를 이용하는 상기 기재된 일반적인 방법을 이용해서 상기 분획 모두를 검정하였다. 도 6은 이들 검정의 결과를 나타낸다.
산성 FAME 분석 (도 6A)은 시험관내 검정의 주요 생성물이 DHA 및 DPAn-6임을 나타낸다. 가장 높은 활성을 갖는 분획은 S1 및 P2 분획에서 훨씬 적은 활성을 갖는 균질물이다. S2 분획에서 매우 적은 활성이 검출되었다. CFH 및 S1 분획의 경우에서도 FAS 시스템의 생성물의 매우 적은 증거가 검출될 수 있다는 것 (도 6A에서 16:0으로 표지된 화살표로 나타냄)은 관심의 대상이 된다. 이는 T7 시스템을 사용하는 경우에 높은 수준으로 발현되는 PUFA 신타제 효소 성분들로 인한 것일 수 있다. 대조적으로, 쉬바넬라 유래의 EPA 신타제를 코딩하는 코스미드를 함유하는 이. 콜라이로부터의 추출물 (CFH 및 S1)에 대해 유사한 검정을 수행한 경우, TLC 플레이트상의 방사활성의 대부분은 FAS 생성물과 관련이 있었다 [Metz et al., Science 293:290-293 (2001), 도 2B]. 또한, 내생성 이. 콜라이 FAS 시스템은 여 러 개별적인 가용성 단백질로 이루어지며, FAS 활성은 고속 원심분리 후에 상등액 분획 중에 잔존한다 [Metz et al., Science 293:290-293 (2001), 도 2B]. 대조적으로, 도 6A에 나타낸 PUFA 신타제 활성은 고속 원심분리 후에 펠릿 분획으로 분배된다.
도 6B의 데이터는, 지질 생성물이 TLC에 의한 분리에 앞서 (FAMES로 전환되기보다는) HIP로 추출되었다는 점을 제외하면, 도 6A에서 사용된 동일한 이. 콜라이 균주 샘플의 검정 결과를 나타낸다. CFH (도면의 좌측) 및 P2 (우측)의 두가지 분획을 사용하였다. 검정에 사용된 추출물의 양은, 상기 두 경우에서 대략 동일한 양의 방사활성이 지질로 혼입되도록 조정되었다. 또한 검정 혼합물의 환원제 성분 (NADH 및/또는 NADPH)이 다음과 같이 달라진 경우에 대한 결과가 나타나 있다: 레인 1 - NADPH 단독, 레인 2 - NADPH 단독, 레인 3 - NADH 및 NADPH 둘 다, 및 레인 4 - 각 성분을 함유하는 스톡 용액 대신 물을 첨가함. 도 6B의 데이터는 TLC 플레이트 상에서 이동하는 방사성표지의 대부분이 유리 지방산 표준물과 함께 이동한다는 것을 보여준다. 또한, 주요 (FFA) 밴드의 출현은 검정 혼합물로 첨가되는 NADPH에 의존한다. NADPH에 대한 요구 및 상기 분획 (특히 P2 분획)에서 유의한 FAS 활성의 결여는 FFA가 PUFA 신타제 효소의 생성물임을 나타낸다. 쉬조키트리움 (Orf A, B 및 C를 코딩함) 유래의 세가지 유전자들만이 (HetI과 함께) 상기 이. 콜라이 균주에서 발현되었기 때문에, 데이터는 신타제로부터의 PUFA 방출이 상기 효소의 고유한 특징이며 별도의 티오에스테라제 효소로 인한 것이 아님을 나타낸다.
상기 실시예에 중요한 측면이 제시되어 있는 다양한 데이터는 쉬조키트리움 에서 다음과 같은 PUFA 합성 및 축적의 특징을 나타낸다. DPAn-6 및 DHA 둘 다를 담당하는 PUFA 신타제는 미국 특허 6,566,583호, 문헌 [Metz et al., Science 293:290-293 (2001)], 미국 특허 출원 공개 제20020194641호, 및 PCT 공개 제WO 2006/135866호에 기재된 바와 같은 Orf A, B 및 C에 의해 코딩된다. 서브유닛 A의 ACP 도메인은 내생성 PPTase에 의해 활성화된다. 합성 반응은 탄소 공급원으로서 말로닐-CoA를 이용하고 (아세틸-CoA는 필요하거나 필요하지 않을 수 있음), 환원제로서 NADPH를 이용한다. PUFA 생성물은 효소로부터 FFA로서 방출되며, 이러한 방출은 상기 효소 자체의 고유한 특징이다. FFA는 하나 이상의 내생성 아실-CoA 신테타제에 의해 촉매되는 ATP 의존적 반응에서 CoA로 에스테르화된다. 이후, PUFA-CoA는 PL 및 TAG 합성 효소를 위한 기질로서 작용한다.
실시예 8
하기 실시예는 제빵용 효모에서 HetI과 함께 쉬조키트리움 PUFA 신타제 (sOrf A, sOrfB 및 천연 OrfC, 하기 참조)를 코딩하는 유전자들의 발현을 나타낸다.
인비트로젠(Invitrogen)사로부터 얻은 물질을 사용해서 효모에서 쉬조키트리움 PUFA 신타제 유전자들 및 HetI을 발현시켰다. 사카로마이세스 세레비지애의 INVsc1 균주를 하기 형질전환 벡터와 함께 사용하였다: pYESLeu (sOrfA, 서열 35, 이는 서열 2를 코딩함), pYES3/CT (sOrfB, 서열 36, 이는 서열 4를 코딩함), pYES2/CT (OrfC, 서열 5, 이는 서열 6을 코딩함) 및 pYESHis (HetI, 서열 33, 이는 서열 34를 코딩함). 일부 벡터가 특정 클로닝 요건을 수용하도록 개질시켰다. 특 정 실험에 따라 적절한 선별 배지를 사용하였다. 각 경우에서 GAL1 프로모터 뒤쪽에 유전자들을 클로닝하였으며, 세척된 세포를 인비트로젠사에 의해 제공된 가이드라인에 따라 갈락토스를 함유하는 배지 중에 재현탁시켜 발현을 유도하였다. 세포를 30℃에서 성장시키고, 유도 배지로 전달한 다음 표시된 시간에서 (원심분리에 의해) 수획하였다. 세포 펠릿을 동결 건조시키고, 산성 메탄올을 사용해서 FAME를 제조하고, 헥산 중으로 추출하고, GC에 의해 분석하였다.
예비 실험에서는 천연 형태의 OrfA (서열 1) 및 약간 변경된 천연 형태의 OrfB (OrfB*, 서열 37) (효모에서)가 예상된 크기의 단백질을 제조하지 않은 것으로 나타났다 (또한 정확한 mRNA가 검출되지 않았음). 대조적으로, 예상된 크기의 단백질은 천연 형태의 OrfC (서열 5)가 발현된 세포에서 검출되었다. OrfA 및 B를 코딩하는 유전자들은 이들의 코돈 용법이 효모에 의해 관용되는 것들과 보다 일치하도록 재합성되었다 (재합성은 블루 헤론, 인크.(Blue Heron, Inc.)사에 의해 수행되었음). 이 합성 유전자들을 본원에서 sOrfA (서열 35) 및 sOrfB (서열 36)로 나타낸다. 효모에서 상기 유전자들의 발현은 각각 Orf A 및 B의 예상 크기에 상응하는 단백질을 축적시켰다.
도 7은 쉬조키트리움 PUFA 신타제 시스템 (sOrfA, sOrfB, OrfC 및 HetI)을 발현시키는 효모 세포로부터의 지방산 프로필과 대조군 세포 (sOrfA 유전자가 결여됨)로부터 얻어진 지방산 프로필의 비교를 나타낸다. 유도 후 약 20시간의 시점에서 세포를 수획하였다. 나타난 2개의 신규 FAME 피크는 완전한 PUFA 신타제 시스템을 발현시키는 균주의 프로필임을 알 수 있다. 이들 2개의 피크는 진 정(authentic) 표준물과의 용출 시간의 비교 및 이후의 MS 분석에 의해 DPAn-6 및 DHA로서 확인되었다. 본 발명자들에 의한 쉬조키트리움 PUFA 신타제의 특성화로부터 예상된 바와 같이, 프로필에서 DHA 및 DPAn-6 이외에 다른 신규 피크는 분명하지 않았다.
도 8은 PUFA FAME를 함유하는 도 7의 GC 크로마토그램의 영역을 나타낸다. 대조군 세포 및 PUFA 신타제를 함유하는 세포는 둘 다 DHA FAME 근처에서 용출하는 피크를 함유한다. 이 피크는 C26:0 FAME로서 확인되었으며, (참고문헌을 토대로) 스핑고지질로부터 유래한다. 이는 DHA 피크 가까이에서 용출되지만, DHA의 정량화를 방해하지 않게끔 해상도가 충분하다. DPAn-6 피크는 FAME 프로필에서 다른 내생성 효모 지질로부터 충분히 분리된다. 이러한 특정 예에서, 쉬조키트리움 PUFA 신타제 시스템을 발현시키는 세포는 (총 FAME의 비율로서) 2.4％ DHA 및 2.0％ DPAn-6를 축적시켰다. DHA 및 DPAn-6의 합계 = 세포내에서 측정된 지방산의 4.4％. 세포에서 관찰된 DHA 대 DPAn-6의 비율은 약 1.2:1이었다.
효모에서 쉬조키트리움 PUFA 신타제의 발현을 나타내는 상기 제시된 결과는 상기 경우들에서 제안된 경로, 및 효모 및 또한 식물에서 예상될 수 있는 지방산 프로필에 대한 변화 측면에서의 예상을 제공한다.
실시예 9
하기 실시예는 쉬조키트리움 PUFA 신타제를 발현시키는 효모에서 특이적 아실-CoA 신테타제를 공동발현시킴으로써 PUFA의 축적을 증가시키는 것에 대하여 기술한다.
본 발명자들은 쉬조키트리움에서 PUFA 신타제의 FFA 생성물이 내생성 아실-CoA 신테타제(ACoAS)에 의해 아실-CoA로 효율적으로 전환됨을 보여주었다 (상기 실시예 참조). EST 데이터베이스를 조사함으로써, 본 발명자들은 PUFA의 상응하는 아실-CoA로의 전환에 관여할 수 있는 9가지 추정의 ACoAS를 확인하였다.
요컨대, 본 발명자들은 공지된 (또는 예상된) ACoAS 활성을 갖는 단백질에 대해 상동성을 나타내는 EST에 대한 다양한 cDNA 라이브러리로부터 채집된 콜로니로부터 단리된 약 20,000개의 플라스미드로부터 얻어진 서열로 이루어진 쉬조키트리움 EST 데이터베이스를 조사하였다. 본 발명자들은 벡터NTI 프로그램, 콘티그 익스프레스(Express)를 사용해서 이들을 콘티그로 조립하고 (둘 이상의 중복되는 서열이 이용가능한 경우) 개별적인 서열정보의 양을 기초로 편집하였다. 이러한 연구의 결과는 다음과 같이 요약된다. 8개의 상이한 콘티그 및 1개의 콘티그 (데이터베이스내 중복되는 서열이 없음)가, PUFA 신타제를 상응하는 아실-CoA로 효율적으로 전환시킬 수 있는 ACoAS 효소와 관련되는 후보인 것으로 확인되었다. EST 데이터 세트를 가이드로 사용해서, 각 후보에 대한 완전한 코딩 영역의 서열을 얻고, 다양한 표준 방법 (예, 게놈 DNA의 서브클론 및 게놈 DNA로부터 유도된 PCR 생성물의 서열화)을 이용해서 확인하였다.
쉬조키트리움 아실-CoA 신테타제(ACS) 코딩 서열 및 추론된 번역물:
1. 길이 = 뉴클레오티드 2004개 (종결 코돈을 포함하지 않음) (서열 82). 이는 668개의 아미노산 (서열 83), 73.5 kDa, 단백질을 코딩하는 것으로 예상된다. 단백질 서열은 공지된 ACS와 양호한 상동성을 갖는다. 최적의 블라스트 대응은 특 성화되었으며 DHA와 높은 활성을 갖는 것으로 나타난 탈라시오시라 슈도난나(Thalassiosira pseudonanna) ACS (TplacA, 기탁 번호: AAW58006)에 대한 것이다 [Tonon et al., Plant Physiol. 2005 May;138(1):402-8). 서열 83의 C-말단의 3개의 아미노산은 SKL (단백질을 페록시좀으로 표적화하는 것과 관련된 모티프)이다. 이러한 C-말단의 모티프는 또한 상기 언급된 탈라시오시라 슈도난나 ACS에 존재한다.
2. ScACS-2 (또한 ScACoAS-2 또는 ACS-2로 표시됨): 길이 = 2340개 (종결 코돈을 포함하지 않음)의 뉴클레오티드 (서열 84). 이는 780개의 아미노산 (서열 85), 84.7 kDa 단백질을 코딩하는 것으로 예상된다. 추정의 단백질의 대부분에 대하여 인간의 예, 리피도신(Lipidosin) 및 버블 검(Bubble Gum)을 비롯한 공지된 ACS와 양호한 상동성이 존재한다.
3. ScACS-3 (또한 ScACoAS-3 또는 ACS-3으로 표시됨): 길이 = 2526개 (종결 코돈을 포함하지 않음)의 뉴클레오티드 (서열 86). 이는 842개의 아미노산 (서열 87), 90.6 kDa 단백질을 코딩하는 것으로 예상된다. 추정의 단백질 (특히 중심의 약 700개의 아미노산)의 대부분에 대하여 버블 검 유형 ACS 단백질과 양호한 상동성이 존재한다.
4. ScACS-4 (또한 ScACoAS-4 또는 ACS-4로 표시됨): 길이 = 2037개 (종결 코돈을 포함하지 않음)의 뉴클레오티드 (서열 88). 이는 679개의 아미노산 (서열 89), 74.7 kDa 단백질을 코딩하는 것으로 예상된다. 이 단백질의 대부분에 대하여 인간 및 다른 포유동물 유래의 예를 비롯한 공지된 ACS 단백질과 양호한 상동성이 존재한다.
5. ScACS-5 (또한 ScACoAS-5 또는 ACS-5로 표시됨): 길이 = 1734개의 뉴클레오티드 (종결 코돈을 포함하지 않음) (서열 90). 이는 578개의 아미노산 (서열 91), 63.1 kDa 단백질을 코딩하는 것으로 예상된다. 이 단백질의 대부분에 대하여 공지된 ACS 단백질과 양호한 상동성이 존재한다. 최적의 블라스트 대응은 세균성 ACS에 대한 것이다. 서열 91의 C-말단의 3개의 아미노산은 SKL (단백질을 페록시좀으로 표적화하는 것과 관련된 모티프)이다.
6. ScACS-6 (또한 ScACoAS-6 또는 ACS-6으로 표시됨): 길이 = 1806개 (종결 코돈을 포함하지 않음)의 뉴클레오티드 (서열 92). 이는 602개의 아미노산 (서열 93), 66.0 kDa 단백질을 코딩하는 것으로 예상된다. 이 단백질의 대부분에 대하여 공지된 ACS 단백질과 양호한 상동성이 존재한다. 최적의 블라스트 대응은 세균성 ACS에 관한 것이다. 서열 93의 C-말단의 3개의 아미노산은 SKL (단백질을 페록시좀으로 표적화하는 것과 관련된 모티프)이다.
7. ScACS-7 (또한 ScACoAS-7 또는 ACS-7로 표시됨): 길이 = 1920개 (종결 코돈을 포함하지 않음)의 뉴클레오티드 (서열 94). 이는 640개의 아미노산 단백질 (서열 95), 70.4 kDa을 코딩하는 것으로 예상된다. 이 단백질의 대부분에 대하여 공지된 ACS 단백질과 양호한 상동성이 존재한다. 최적의 블라스트 대응은 세균성 ACS에 관한 것이다.
8. ScACS-8 (또한 ScACoAS-8 또는 ACS-8로 표시됨): 길이 = 1893 (종결 코돈을 포함하지 않음)개의 뉴클레오티드 (서열 96). 이는 631개의 아미노산 (서열 97), 70.7 kDa 단백질을 코딩하는 것으로 예상된다. 최적의 블라스트 대응은 ACoAS 활성을 또한 가질 수 있는 지방산 운반 단백질 패밀리의 구성원에 관한 것이다.
9. ScACS-9 (또한 ScACoAS-9 또는 ACS-9로 표시됨): 길이 = 2950개 (종결 코돈을 포함하지 않음)의 뉴클레오티드 (서열 98). 이는 766개의 아미노산 (서열 99), 84.1 kDa 단백질을 코딩하는 것으로 예상된다. 이 단백질의 대부분에 대하여 공지된 ACS 단백질과 양호한 상동성이 존재한다. 최적의 블라스트 대응은 동물 ACS에 관한 것이다.
본 발명자들은 PUFA 신타제의 이종 숙주에 존재하는 효소가 신규 (이 생물체의 경우) PUFA 무함유 지방산 (FFA)을 효율적으로 프로세싱할 수 없으며 적절한 ACoAS(들)의 공동발현이 상기 숙주에서 PUFA의 축적을 증가시킨다고 믿었다. 상기 기재된 두가지 쉬조키트리움 후보 ACoAS (ScACS-1, 서열 82/83 및 ScACS-2, 서열 84/85)는 쉬조키트리움 PUFA 신타제 시스템 (예, sOrfA, sOrfB 및 nOrfC, 및 HetI)을 코딩하는 유전자들을 함유한 효모에서 개별적으로 발현되었다.
보다 구제척으로, 상기 실시예에 기재된 효모 발현 시스템은 4개의 벡터를 사용해서 제5 ACoAS 유전자의 도입을 수용하도록 개질되었다 (즉, 효모는 또한 쉬조키트리움 PUFA 신타제 시스템의 Orf A, B 및 C, 및 PPTase (Nostoc 유래의 HetI)를 함유하였다). 두 유전자들이 클로닝될 수 있는 효모 발현 벡터 (pESC 벡터)는 스트라타진(Stratagene)사로부터 입수하였다. 이들 벡터는 상기 기재된 pYES 벡터와 유사하며 이 벡터와 상용성이다. 두 유전자, 즉 천연 OrfC (nOrfC, 서열 5) 및 HetI (서열 33)을 하나의 pESC 벡터에 클로닝하였으며, sOrfA (서열 35, sOrfB (서 열 36) 및 제5 유전자 (ScACS-1 (서열 82) 또는 ScACS-2 (서열 84))를 pYES 벡터에 클로닝하였다. 4개의 벡터를 효모에 도입하고, 상기 기재된 갈락토스-함유 배지 중에 세포를 현탁시킴으로써 유전자들을 유도하였다. 세포를 30℃에서 성장시키고, 유도 후 18시간의 시점에서 수획하였다. 이들 세포의 FAME 분석의 요약은 표 1에 나타나 있다. 대조군 세포는 4개의 벡터 모두를 함유하였지만, Orf A를 코딩하는 유전자는 결여되었다. ScACOAS들 중 어느 하나의 공동발현은 DHA 및 DPAn-6의 축적을 (대조군 세포에서의 양의 대략 2배로) 증가시켰다. 이로써 이종 숙주에서 PUFA 신타제의 생성물의 축적이 이 생성물의 이용에 있어서 보다 효율적일 수 있는 효소의 공동발현에 의해 증가될 수 있음이 확인되었다.
Figure 112008071536835-PCT00001
후속 실험에서, 상기 기재된 바와 같은 유사한 방법을 이용해서 쉬조키트리움 PUFA 신타제 시스템 (예, sOrfA, sOrfB 및 nOrfC, 및 HetI)을 코딩하는 유전자들을 함유한 효모에서 ScACS-3, ScACS-5, ScACS-6 및 ScACS-8을 또한 시험하였다. ScACS-3, ScACS-5 또는 ScACS-8의 각각의 발현은 첨가된 아실-CoA 신테타제 유전자의 부재하에서와 비교해서 효모에서 DHA의 제조를 증가시켰다 (데이터는 나타내지 않음).
상기 나타낸 바와 같이, ScACS-8은 ACS 활성을 또한 가질 수 있는 지방산 운반 단백질 패밀리의 구성원과 상동성을 나타낸다. 이들 단백질은 원형질막과 관련이 있으며 유리 지방산의 세포로의 임포트를 촉진시키고 또한 이들을 아실-CoA 유도체로 전환시키는 것으로 여겨진다. 상기 효소 패밀리는 식물 세포의 색소체에서 생성물을 유리 지방산으로 방출시키는 PUFA 신타제 시스템을 발현시키는 경우 특히 유용할 수 있다. 색소체의 외부 엔벨로프(envelope)는 원형질막으로부터 유도되는 것으로 생각되며, 원형질막으로 표적화된 단백질 (예, ScACS-8)은 또한 색소체 외부 엔벨로프로 표적화될 수 있다. 이러한 경우, 상기 지방산 운반 단백질 (예, ScAC-8)은 색소체로부터 PUFA 신타제의 유리 지방산 생성물의 배출을 촉진시킬 수 있으며, 또한 상기 생성물을 아실-CoA 유도체로 전환시킬 수 있다. 쉬조키트리움 PUFA PKS 시스템을 발현시키는 식물에서 이러한 아실-CoA 신테타제를 제공하는 실험은 하기 기재되어 있다.
실시예 10
하기 실시예는 ScACoAS-1이 있거나 또는 없이 쉬조키트리움 PUFA 신타제를 발현시키는 효모에서, FAS 경로를 억제하는 세룰레닌의 존재하에서의 성장에 의해 PUFA의 수준이 증가함을 입증한다.
PUFA 신타제와 FAS는 둘 다 이들의 지방산 생성물의 합성을 위한 탄소 공급원으로서 말로닐-CoA를 이용한다. 또한, 상기 두 시스템으로부터의 지방산의 아실-CoA 형태는 PL 및 TAG를 합성하는 효소에 대한 기질로서 작용할 수 있다. 상기 논의된 바와 같이, PUFA 신타제 및 FAS가 둘 다 한 생물체내에 존재하는 경우, FAS 시스템의 하향조절 또는 억제는 PUFA의 축적에 유리할 것으로 예상된다. 세룰레닌은 지방산 합성의 축합반응에 대한 잘 연구된 억제제이다. 선행 연구는 PUFA 신타제가 FAS 시스템보다 세룰레닌에 의한 억제에 대해 상대적으로 덜 민감하다는 것을 나타냈다.
본 발명자들은 FAS 활성 감소 개념의 모델로서 실시예 8에 기재된 효모 균주의 지방산 프로필에 대한 세룰레닌의 효과를 시험하였다. 아실 CoA-신테타제를 또한 함유한 실시예 9에 기재된 효모를 상기 시스템에서 추가로 시험해서 두가지 전략의 효과가 PUFA 제조를 상가적으로 또는 상승적으로 증가시키는지를 결정하였다.
초기 실험은 4 uM 세룰레닌의 농도에서 (총 지방산 프로필의 퍼센트인 PUFA 증가로서) 최대 효과가 얻어졌음을 나타냈다. 갈락토스 유도 배지로 전달한 다음 4시간 후에 세룰레닌을 첨가하였다. 유도 배지로 전달한 다음 19시간의 시점에서 세포를 수획하고, 동결 건조하고, FAMES 제조하고, GC에 의해 분석하였다.
시험된 효모 균주는 다음과 같았다:
ㆍ 균주 5.5는 상기 실시예 8에 기재된 바와 같은 PUFA 신타제 유전자들 (sOrfA, sOrfB, OrfC 및 HetI)을 함유하였고;
ㆍ 균주 5.6은 상기 실시예 9에 기재된 바와 같이 균주 5.5의 PUFA 신타제 유전자 세트에 더하여 ScACoAS-1 (서열 82)을 함유하였다.
표 2를 언급하면, "0 Cer"은 세룰레닌이 첨가되지 않았음을 나타내며, "4 uM Cer"은 유도 배지로 전달한 다음 4시간 후에 배지에 4 uM 세룰레닌을 넣었음을 나타낸다. 세룰레닌의 존재 및 부재하에 각 균주를 지방산 제조에 대하여 평가해서 PUFA 제조에 대한 FAS 경로 억제의 효과를 평가하였다. 표 2는 GC 프로필에서 검출된 주요 지방산을 나타낸다 (또한 도 11 참조). 수치는 검출된 총 지방산의 퍼센트로서 제시되어 있다. 쉬조키트리움 PUFA PKS 시스템의 생성물인 DHA 및 DPAn-6은 프로필 중에 존재하는 유일한 PUFA이었다. DHA와 DPAn-6의 합은 또한 표 2에 나타나 있다. 도 9 및 10은 효모에 의해 제조된 DHA (도 9) 또는 DHA 및 DPAn-6 (도 10; 백색 막대는 DHA이고; 흑색 막대는 DHA + DPAn-6임)의 양을 총 FAME의 백분율로서 예시한다.
PUFA 신타제 유전자들이 없는 효모 세포는 임의의 검출가능한 PUFA를 만들지 않는다. 이 실험에서 효모에서의 PUFA 신타제 시스템의 발현은 1.2％ DHA를 축적하였다. ScACoA-1 유전자 (서열 82)를 포함시키자 DHA 수준이 4.1％로 증가하였다. 4 uM 세룰레닌의 존재하에서 (FAS 시스템의 억제) PUFA 신타제 시스템만을 갖는 세포의 성장은 DHA 수준을 3.7％로 증가시켰다. PUFA 신타제 및 ScACoAS-1 유전자를 둘 다 발현시키는 세포를 4 uM 세룰레닌 중에서 성장시킨 경우 (즉, FAS 시스템의 억제 및 아실-CoA 신테타제의 조합 발현), DHA 수준은 총 지방산의 8.2％로 증가하였다. 모든 샘플에서, DPAn-6 축적에서의 상응하는 증가가 존재하였다. 샘플 중 DHA와 DPAn-6의 합은 또한 표 2에 나타나 있으며, 가장 많은 양 (총 지방산의 14.5％)은 4 uM 세룰레닌에서 성장시킨 균주 5.6에 존재한다. 세룰레닌 존재하에서의 성장 및 ACoA 신테타제 유전자 발현의 효과는 상가적임을 알 수 있다. 이들 데이터는 이종 숙주에서 PUFA의 축적을 증가시키기 위해 본원에 제안된 본 발명을 뒷받침한다.
Figure 112008071536835-PCT00002
실시예 11
하기 실시예는 이종 숙주에서 PUFA 제조 및/또는 축적을 증가시키는데 있어서 사용하기 위한 추가의 부속 단백질 또는 표적의 동정을 기술한다.
쉬조키트리움에 존재하는 효소는 PUFA 신타제의 생성물의 아실-CoA 형태를 효율적으로 이용해서 인지질 (PL) 및 트리아실글리세롤 (TAG) 분자를 합성한다. 그러나, 이종 숙주에 존재하는 효소는 상기 반응을 유사한 효율로 수행하지 않을 수 있는데, 이는 상기 생물체가 전형적으로 상기 PUFA-CoA와 직면하지 않을 수 있기 때문이다. 예를 들어, 상기 이종 숙주에서 다양한 PUFA 신타제의 아실-CoA 생성물 (예, DHA-CoA, DPAn-6-CoA 또는 EPA-CoA 등)을 PL 또는 TAG 분자로 효율적으로 통합하는 PL 또는 TAG 합성 효소의 발현은 상기 생성물을 축적시키는 증가된 능력을 나타낼 수 있다. 이와 관련해서, 쉬조키트리움 또는 PUFA 신타제 경로를 통해 PUFA를 제조하는 다른 생물체는 상기 효소를 코딩하는 유전자들의 우수한 공급원으로서 작용할 수 있다. 따라서, 본 발명자들은 PL 또는 TAG를 형성하는데 있어서 기질로서 PUFA-CoA를 이용하는 여러 아실트랜스퍼라제 단백질 (예, 3-글리세롤-포스페이트 아실트랜스퍼라제 (GPAT), 리소포스파티드산 아실트랜스퍼라제 (LPAAT) 및 디아실글리세롤 아실트랜스퍼라제 (DAGAT)) 또는 PL 또는 TAG 중 PUFA를 풍부화할 수 있는 다른 아실트랜스퍼라제 (예, 인지질:디아실글리세롤 아실트랜스퍼라제 (PDAT))의 사용을 제안한다. 이러한 여러 아실트랜스퍼라제의 동정은 하기 기재되어 있다. 몇몇 후보를 효모에서 시험하고 식물에서 시험하였다.
DAGAT 효소
본 발명자들은 공지된 (또는 추정된) DAGAT 활성을 갖는 단백질에 대해 상동성을 나타내는 EST에 대한 쉬조키트리움 EST 데이터베이스를 조사하였다. 본 발명자들은 PUFA PKS 시스템과 함께 사용하기 위한 가능한 DAGAT 효소로서 세가지 후보를 확인하였으며, 이중 하나가 하기 기재되어 있고 이는 쉬조키트리움에서 유리 지방산의 TAG 분자로의 축적에 관여하는 것으로 나타났다.
쉬조키트리움 DAGAT (또한 DAGAT-1 또는 ScDAGAT-1로서 지칭됨) - 코딩 영역의 길이 = 1518개의 뉴클레오티드 (종결 코돈을 포함하지 않음) (서열 100). 이는 506개의 아미노산 (서열 101), 57.4 kDa 단백질을 코딩하는 것으로 예상된다. 이 단백질의 2/3 (아미노산 약 170번에서 시작해서 C-말단으로 계속됨)에 대하여 DAGAT 유형 2B 효소로서 확인된 단백질과 양호한 상동성이 존재한다. 단백질 서열의 처음 1/3 (아미노산 1 내지 170)의 Blast 분석에서는 임의의 단백질과 유의한 상동성이 나타나지 않았으며, 임의의 Pfam 대응이 검출되지 않았다.
쉬조키트리움에서 FAS에 대하여 상기 실시예 1에 기재된 녹아웃 기술을 이용해서, 본 발명자들은 B73-8로 표시된 쉬조키트리움 균주에서 DAGAT 유전자 (서열 100을 포함함)를 유사하게 놋아웃시켰다. 도 13에 나타낸 바와 같이, 쉬조키트리움에서 DAGAT 유전자의 불활성화는 TAG에서 지방산의 축적을 유의하게 억제하였다. 구체적으로, DAGAT의 불활성화는 mg FAME/gm 생물량(biomass)에서 대략 80％ 감소 및 TAG에서 대략 90％ 감소를 나타냈다. 따라서, 본 발명자들은 상기 DAGAT가 쉬조키트리움에서 TAG 합성을 담당하는 주요 효소라고 결론지었다.
따라서, 본원에 기재된 바와 같은 PUFA PKS 시스템을 발현시키는 숙주 (예, 효모, 식물)에서의 상기 핵산 분자의 발현은 유리 지방산의 PL 또는 TAG로의 축적을 증가시킬 것으로 예상된다. 트랜스제닉 식물에서 상기 유전자를 발현시키는 대표적인 실험은 하기 기재되어 있다.
LPAAT 효소
본 발명자들은 또한 공지된 (또는 추정된) LPAAT 활성을 갖는 단백질에 대해 상동성을 나타내는 EST에 대한 쉬조키트리움 EST 데이터베이스를 조사하였다. 본 발명자들은 이를 콘티그로 어셈블리하고 (둘 이상의 중복되는 서열이 이용가능한 경우), 상기 콘티그를 상기 기재된 바와 같은 개별적인 서열정보의 품질을 기준으로 편집하였다. 이러한 연구의 결과는 하기 요약되어 있다. 세가지 상이한 콘티그 및 하나의 싱글렛(singlet) (데이터베이스내 중복되는 서열 없음)이 확인되었으며, 이들은 LPAAT 효소와 관련해서 특히 우수한 후보이었다. 이들 서열에 의해 코딩되는 효소는 추정의 LPAAT 활성과 관련이 있지만 이 활성과 상이한 활성을 가질 수 있는 것으로 인식된다. 네가지 경우 모두에서, 추정의 Orf (개시 및 종결 코돈을 포함함)가 확인되었다. 더 많은 데이터가 얻어짐에 따라 내생성 개시 코돈의 확인을 비롯한 정확한 서열 표시는 달라질 수 있는 것으로 인식된다.
EST 데이터베이스의 분석에 의해 확인된 쉬조키트리움 LPAAT 후보:
1. ScLPAAT-1 콘티그: 길이 = 1478개의 뉴클레오티드 (서열 102). 이는 927 nt의 전장 Orf (종결 코돈을 포함함, ScLPAAT-1 CDS, 서열 103)를 포함하는 것으로 보인다. CDS (서열 104)의 번역을 이용한 Blast 검색은 코딩된 단백질의 대부분에 대하여 공지된 및 추정의 아실트랜스퍼라제 단백질과 양호한 상동성이 존재한다는 것을 보여준다. 최적의 대응은 아라비돕시스 유래의 단백질에 대한 것이다. Pfam 분석은 PlsC (1-아실-sn-글리세롤-3-포스페이트 아실트랜스퍼라제, 즉, LPAAT) 패밀리와 관련된 거대한 보존된 중심 도메인을 나타낸다.
2. ScLPAAT-2 콘티그: 길이 = 2112개의 뉴클레오티드 (서열 105). 이는 1140 nt의 전장 Orf (종결 코돈을 포함함, ScLPAAT-2 CDS, 서열 106)를 포함하는 것으로 보인다. CDS (서열 107)의 번역을 이용한 Blast 검색은 코딩된 단백질의 대부분에 대하여 공지된 및 추정의 아실트랜스퍼라제 단백질과 양호한 상동성이 존재한다는 것을 보여준다. 최적의 대응은 아라비돕시스 유래의 단백질에 대한 것이다. Pfam 분석은 PlsC (1-아실-sn-글리세롤-3-포스페이트 아실트랜스퍼라제, 즉, LPAAT) 패밀리와 관련된 거대한 보존된 중심 도메인을 나타낸다.
3. ScLPAAT-3 콘티그: 길이 = 1862개의 뉴클레오티드 (서열 108). 이는 1323 nt의 전장 Orf (종결 코돈을 포함함, ScLPAAT-3 CDS, 서열 109)를 포함하는 것으로 보인다. CDS (서열 110)의 번역을 이용한 Blast 검색은 코딩된 단백질의 중심 부분에 대하여 공지된 및 추정의 아실트랜스퍼라제 단백질과 양호한 상동성이 존재한다는 것을 보여준다. 최적의 대응은 포유동물 유래의 단백질에 대한 것이다. Pfam 분석은 PlsC (1-아실-sn-글리세롤-3-포스페이트 아실트랜스퍼라제, 즉, LPAAT) 패밀리와 관련된 거대한 보존된 중심 도메인을 나타낸다.
4. ScLPAAT-4 싱글렛: 길이 = 794개의 뉴클레오티드 (서열 111). 이는 756 nt의 전장 Orf (종결 코돈을 포함함, ScLPAAT-4 CDS, 서열 112)를 포함하는 것으로 보인다. CDS (서열 113)의 번역을 이용한 Blast 검색은 코딩된 단백질의 많은 부분에 대하여 공지된 및 추정의 아실트랜스퍼라제와 양호한 상동성이 존재한다는 것을 보여준다. 최적의 대응은 조류 및 포유동물 유래의 단백질에 대한 것이다. Pfam 분석은 PlsC (1-아실-sn-글리세롤-3-포스페이트 아실트랜스퍼라제, 즉, LPAAT) 패밀리와 관련된 거대한 보존된 중심 도메인을 나타낸다.
ScLPAAT-1은 효모 및 식물에서 클로닝 및 발현되었다.
추가의 DAGAT 또는 LPAAT 효소
본 발명자들은 또한 공지된 또는 추정의 DAGAT 또는 LPAAT 활성을 갖는 단백질에 대해 상동성을 나타내는 EST에 대하여 크립테코디니움 코니 EST 데이터베이스를 조사하였다. 이러한 연구의 결과는 하기에 요약되어 있다.
A) EST 데이터베이스의 분석에 의해 확인된 크립테코디니움 코니 DAGAT 후보:
1. CA5_PTA.838.C: 길이 = 817개의 뉴클레오티드 (서열 114). 이 서열의 마지막 274개의 뉴클레오티드에 대하여 PCT 공개 제WO 2004/087902호에 기재된 크립테코디니움 아실트랜스퍼라제 서열과 양호한 상동성이 존재한다.
2. CA5_PTA.131.C1: 길이 = 850개의 뉴클레오티드 (서열 115)
3. CA12_cot10_003a_h10: 길이 = 663개의 뉴클레오티드 (서열 116)
4. CA12_cot10_001a_h02: 길이 = 807개의 뉴클레오티드 (서열 117)
5. CA12_cot10_005b_g12: 길이 = 765개의 뉴클레오티드 (서열 118)
6. CA12_cot50_005c_d07: 길이 = 782개의 뉴클레오티드 (서열 119)
B) EST 데이터베이스의 분석에 의해 확인된 크립테코디니움 코니 LPAAT 후보:
1. CA12_cot10_003a_e11: 길이 = 793개의 뉴클레오티드 (서열 120)
2. CA12_PTA.739.C1: 길이 = 744개의 뉴클레오티드 (서열 121)
이 실시예에 기재된 임의의 하나 이상의 핵산 분자를 사용해서 본원에 기재된 유전적으로 개질된 임의의 생물체 (예, 식물 또는 미생물)를 제조하는 것을 비롯해서 임의의 숙주 세포를 형질전환시킴으로써 생물체, 특히 PUFA PKS 시스템을 발현시키는 생물체에서 PUFA 축적을 추가로 증진시킬 수 있다. 이러한 효소는 또한, 전형적 또는 표준 지방산 신타제 경로에 의해 PUFA를 제조하는 숙주 생물체에서 발현되는 경우 유용성을 가질 수 있다. 이러한 구조물은 PUFA PKS 시스템과 함께 단독으로 또는 본원에 기재된 바와 같은 숙주 생물체에서 PUFA 제조 및 축적을 증진시키기 위한 다른 전략과 조합하여 (예를 들어, 아실-CoA 신테타제의 발현과 함께 또는 FAS 경로의 억제와 함께) 이용될 수 있다. PCT 공개 제WO 2004/087902호에 기재된 추가의 아실트랜스퍼라제 서열은 또한 본 발명에 잠재적으로 유용한 것으로 고려되며 본원에 참고로 포함된다.
실시예 12
하기 실시예는 아라비돕시스에서 HetI과 함께 쉬조키트리움 PUFA 신타제 (OrfA, OrfB* 및 OrfC)를 코딩하는 유전자들의 발현 및 임의의 검출가능한 중간체 또는 부 생성물의 실질적인 부재하에 표적 PUFA, DHA 및 DPAn-6의 제조를 기술한다.
HetI (서열 33으로 나타낸 뉴클레오티드 서열)과 함께 쉬조키트리움 OrfA (서열 1로 나타낸 뉴클레오티드 서열), OrfB* (서열 37로 나타낸 뉴클레오티드 서열) 및 OrfC (서열 5로 나타낸 뉴클레오티드 서열)를, (별도로 또는 하나의 슈퍼구조물(superconstruct)상에 네가지 유전자들을 모두 포함하는 다양한 조합으로) 유전자들을 식물로 도입하기 위한 적절한 바이너리 벡터에 클로닝하였다. 이러한 구조물 및 벡터의 예는 하기 (세가지 발현 구조물) 및 실시예 13 (4127에 대한 한가지 "슈퍼구조물")에 기재되어 있다.
5720의 작제: Orf B* (색소체 발현)
Orf B* (서열 4를 코딩함)는 flax 리닌 프로모터/터미네이터 (미국 특허 제6,777,591호)의 조절하에 발현 카세트에 제한 클로닝하였다. 리닌 프로모터는 종자 발생 동안 트랜스유전자(들)의 특정-시간적 및 조직-특이적 발현을 조절한다. 쉬조키트리움 Orf B*의 직접 상류 및 인-프레임은 브라시카 나푸스(Brassica napus) 아실-ACP 티오에스테라제 (PT-신호 펩티드)로부터 유도된, Orf B*를 색소체로 표적화하는 색소체 표적화 서열이었다. 식물 바이너리 벡터는 또한 양성(positive) 선별 [Haldrup et al., 1998, Plant Mol. Biol. 37:287-296]을 위해 좌측 및 우측 경계 서열 사이에 피트로셀리눔 크리스품(Petroselinum crispum) 유래의 유비퀴틴 프로모터/터미네이터 [Kawalleck et al., 1993, Plant Mol. Bio., 21:673-684]에 의해 구동되는 기존의 이. 콜라이 포스포만노스 이소머라제 유전자 [Miles and Guest, 1984, Gene 32: 41-48]를 함유하였다.
4107의 작제: HetI 및 Orf C (색소체 발현)
쉬조키트리움 Orf C (서열 5로 표시된 뉴클레오티드 서열)는 HetI (서열 33으로 표시된 뉴클레오티드 서열)과 함께 flax 리닌 프로모터/터미네이터 (미국 특허 제6,777,591호)의 조절하에 발현 카세트에 클로닝하였다. 리닌 프로모터는 종자 발생 동안 트랜스유전자(들)의 특정-시간적 및 조직-특이적 발현을 조절한다. 쉬조키트리움 Orf C 및 HetI의 직접 상류 및 인-프레임은 브라시카 나푸스 아실-ACP 티오에스테라제 (PT-신호 펩티드)로부터 유도된, PUFA 신타제 및 PPTase를 색소체로 표적화하는 색소체 표적화 서열이었다. 이어서, 상기 두 발현 카세트를, 좌측 및 우측 경계 서열 사이에 피트로셀리눔 크리스품 유래의 유비퀴틴 프로모터/터미네이터 [Kawalleck et al., 1993, Plant Mol. Bio., 21:673-684]에 의해 구동되는 숙주 식물 포스피노트리신 내성 부여 pat 유전자 [Wohlleben et al., 1988, Gene 70:25-37]를 함유하는 하나의 식물 바이너리 벡터내에 어셈블리하였다.
4757의 작제: Orf A (색소체 발현)
쉬조키트리움 Orf A (서열 1로 나타낸 뉴클레오티드 서열)를 flax 리닌 프로모터/터미네이터 (미국 특허 제6,777,591호)의 조절하에 발현 카세트에 클로닝하였다. 리닌 프로모터는 종자 발생 동안 트랜스유전자(들)의 특정-시간적 및 조직-특이적 발현을 조절한다. 쉬조키트리움 Orf A의 직접 상류 및 인-프레임은 브라시카 나푸스 아실-ACP 티오에스테라제 (PT-신호 펩티드)로부터 유도된, PUFA 신타제 및 PPTase를 색소체로 표적화하는 색소체 표적화 서열이었다. 발현 카세트는, 좌측 및 우측 경계 서열 사이에 MAS 프로모터/터미네이터에 의해 구동되는 숙주 식물 카나마이신 내성 부여 nptII 유전자를 함유하는 식물 바이너리 벡터내에 함유되었다.
한 예에서, 트랜스유전자를 다음과 같은 세가지 별도의 발현 카세트에 클로닝하였다: 상기 기재된 바와 같은 5720으로 표시된 구조물 (OrfB*를 함유, 서열 4를 코딩), 4107로 표시된 구조물 (OrfC를 함유, 서열 6 및 HetI을 코딩, 서열 34를 코딩) 및 4757로 표시된 구조물 (OrfA를 함유, 서열 2를 함유). 각 구조물에서, 유전자를 클로닝하였다. 단백질을 색소체로 지시하기 위해, 브라시카 나푸스 아실-ACP 티오에스테라제로부터 유도된 색소체 표적화 서열을 코딩하는 추가의 5' 서열을 Orfs A, B*,C 및 HetI의 직접 상류에 위치시켰다. 코딩된 표적화 펩티드의 아미노산 서열은 MLKLSCNVTNHLHTFSFFSDSSLFIPVNRRTLAVS (서열 81)이다. 이 펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을, 각각의 PUFA 신타제 Orf의 출발 메티오닌 코돈 및 HetI의 조작된 개시 코돈 (ATG)과 인-프레임으로 두었다. 다른 구조물에서, PUFA 신타제의 배치를 식물 세포의 세포질로 표적화한 경우, Orf의 5' 말단에 어떤 추가의 단백질 코딩 서열도 부가되지 않았다.
표준 방법을 이용해서 유전자들을 아라비돕시스에 도입하였다 (문헌 [Clough et al., 1998, Plant J. 16: 735-743]에 기재된 바와 같이, 적절한 벡터를 함유하는 아그로박테리움 균주의 현탁액으로의 플라워 침지법). 이 방법의 세부사항은 하기 실시예 13에 기재되어 있다. 상기 식물로부터 얻은 종자를 선별 배지상에 플레이팅하고, 발아시켰다. 성장한 식물의 일부를 성숙시키고, PUFA 함량에 대하여 종자를 분석하였다. PUFA 함량을 기초로 상기 종자의 일부를 다음 세대로 진행시켰다. 이들 식물로부터 얻은 푸울링된 종자를 지방산 함량에 대하여 분석하였다. 상기 트랜스제닉 식물로부터 예상된 표적 PUFA는 도코사헥사엔산 (DHA) 및 도코사펜타엔산 (DPAn-6)이었으며, 이들은 식물을 형질전환시키는데 사용되는 유전자들이 유래하는 쉬조키트리움 PUFA PKS 시스템에 의해 제조된 주요 PUFA이다.
예시적인 트랜스제닉 식물 세포주들 중 하나에서의 한가지 예시적인 지방산 분석으로부터 얻어진 결과가 도 13에 나타나 있다. 도 13의 상부 패널은 푸울링된 종자 샘플로부터 제조된 FAME의 GC 분리 및 FID 검출에 의해 나타낸 바와 같은 야생형 아라비돕시스 종자의 전형적인 지방산 프로필을 나타낸다. 우세한 지방산은16:0, 18:0, 16:1, 18:1, 20:1, 20:2 및 22:1이다. 야생형 종자 유래의 샘플에는 DHA 또는 DPAn-6이 존재하지 않는다.
도 13의 하부 패널은 상기 기재된 바와 같이 색소체로 표적화된 세가지 별도의 발현 카세트 (5720, 4107 및 4757)로부터 도입된 쉬조키트리움 PUFA 신타제 유전자들 및 HetI 유전자를 발현시키는 예시적인 트랜스제닉 아라비돕시스 세포주들 중 하나 (세포주 263)로부터의 푸울링된 종자 샘플의 지방산 프로필을 나타낸다. 세포주 263의 지방산 프로필을 언급하면, 2개의 FAME 피크가 야생형 종자로부터의 프로필에 존재하지 않는 트랜스제닉 식물 종자로부터의 프로필에 존재한다는 것이 쉽게 관찰된다. 이들 두 피크의 용출 패턴은 진정 DHA 및 DPAn-6의 용출에 정확하게 상응한다 (표준물로서 쉬조키트리움 오일로부터 제조된 FAME, 및 뉴체크 프렙(NuCheck Prep)사로부터 시판되는 DHA 표준물을 구입해서 이용함). 이러한 특정 예에서, DHA 피크는 계산된 총 FAME의 0.8％를 나타내지만 DPAn-6 피크는 1.7％를 나타낸다. 신규 PUFA의 합은 총 FAME의 2.5％이다.
다른 트랜스제닉 식물 세포주를 사용한 실험은 유사한 결과를 나타냈다. 예를 들어, 263 세포주와 동일한 구조물을 사용해서 동일한 방식으로 형질전환시킨 269로 표시된 다른 트랜스제닉 세포주는 계산된 총 FAME의 대략 0.75％ DHA 및 계산된 총 FAME의 1.41％ DPAn-6을 제조하였다 (데이터는 나타내지 않음).
게다가, 상기 기재된 동일한 핵산 분자를 사용해서 제조된 여러 다른 트랜스제닉 아라비돕시스 식물은 또한 이들이 별도의 구조물, 조합 구조물 또는 단일 슈퍼구조물 상에서 PUFA PKS 유전자들 및 HetI PPTase를 제공하는 구조물을 사용해서 제조되었는지의 여부와는 무관하게 표적 PUFA를 제조하였다 (데이터는 하기 실시예 13에 나타냄).
또한, PUFA PKS 유전자들을 세포질로 표적화하는 트랜스제닉 식물은 모두 표적 PUFA를 발현시켰다 (데이터는 상세히 나타내지 않음). 예를 들어, 상기 기재된 바와 같은 (색소체 표적화 서열이 없는) 세가지 별도의 발현 카세트상에 도입된 세포질내의 쉬조키트리움 PUFA PKS에 더하여 HetI을 발현시키는 식물 세포주는 총 FAME의 백분율로서 대략 0.45％ DHA 및 대략 0.8％ DPA를 제조하였다. 다른 예에서, 단일 슈퍼구조물 (하기 실시예 13에 기재된 것과 유사함)상에 도입된 세포질내의 쉬조키트리움 PUFA PKS에 더하여 HetI을 발현시키는 식물 세포주는 총 FAME의 백분율로서 대략 0.2-0.3％ DHA 및 대략 0.5％ DPA를 제조하였다.
도 13에 나타낸 종자 지방산 프로필 중 DHA 및 DPAn-6이 출현 (다른 트랜스제닉 세포주에서 관찰되는 바와 같으며, 이의 일부가 상기 기재되어 있음)은 도입된 쉬조키트리움 PUFA 신타제 시스템이 식물 세포에서 발현되는 경우에 기능한다는 것과 단백질이 섹소체로 표적화될 수 있다는 것을 입증한다. 또한, 본 발명자들은 단백질이 또한 세포질로 표적화될 수 있거나 또는 색소체와 세포질이 PUFA를 제조한다는 것을 확인하였다. 다른 숙주 (예, 이. 콜라이 및 효모)에서의 생화학적 및 이종 발현 데이터로부터 예상된 바와 같이, 트랜스제닉 식물 유래의 종자의 프로필 중에서 검출된 유일한 신규 지방산은 DHA 및 DPAn-6이며 (즉, 지방산 프로필은 PUFA 제조 효소 시스템으로부터 얻어지는 오염성 중간체 또는 부 생성물을 실질적으로 함유하지 않음), 이는 식물에서 PUFA를 제조하는데 있어서 PUFA PKS 시스템이 표준 경로 효소에 비해 유리하다는 것을 추가로 예시한다.
실시예 13(a) - 13(j)
하기 실시예는 식물에서 PUFA의 제조 및/또는 축적을 증가시키기 위한 본원에 기재된 다양한 전략 (전략들의 조합을 포함함)의 이용을 기술한다.
구체적으로, 하기 실시예는 아라비돕시스 종자에서 HetI과 함께 쉬조키트리움 PUFA 신타제 (nOrfA, Orf B* 및 nOrfC)를 코딩하는 유전자들을 단독으로 또는 다른 부속 단백질 및/또는 유전적 개질 전략과 조합하여 발현시킴으로써 PUFA 제조 및 축적을 증진시키는 것에 대하여 기술한다. 특히, 쉬조키트리움 PUFA 신타제 및 HetI은 식물에서 단독으로 또는 (1) 아실-CoA 신테타제(ACS)를 코딩하는 유전자, 또는 (2) 내생성 FAS 활성을 억제하도록 의도된 유전적 요소와 조합하여 발현된다. 또한, 쉬조키트리움 PUFA 신타제와 HetI의 조합을, 내생성 FAS 활성을 억제하도록 의도된 유전적 요소 및 ACS 유전자의 발현과의 조합으로 사용하는 예가 나타나 있다. 마지막으로, DAGAT 및/또는 LPAAT를 비롯한 아실트랜스퍼라제를 단독으로 또는 내생성 FAS 활성을 억제하도록 의도된 하나 이상의 아실-CoA 신테타제 및 유전적 요소의 발현과의 조합으로 발현시키는 것에 대하여 하기에 기술되어 있다. 여기에 요약된 전략은 식물에서 앞선 실시예에 기재된 임의의 개념을 규정하는 능력을 예시한다.
실시예 13(a)-(j)에 대한 재료 및 방법
(1) 구조물
구조물 4127의 작제: PT-신호 펩티드:nORFA, PT-신호 펩티드:nORFB*, PT-신호 펩티드:HetI, PT-신호 펩티드:nORFC (HetI과 쉬조키트리움 PUFA 신타제의 색소체 표적화 발현)
쉬조키트리움 천연 OrfA (nOrfA, 서열 1로 나타냄, 이는 서열 2를 코딩함), 합성 (재합성된) OrfB* (OrfB*, 서열 37로 나타냄, 이는 서열 4를 코딩함) 및 천연 OrfC (nOrfC, 서열 5로 나타냄, 이는 서열 6을 코딩함)를 Nostoc 유래의 HetI (서열 33으로 나타냄, 이는 서열 34를 코딩함)과 함께 flax 리닌 프로모터/터미네이터의 조절하의 발현 카세트에 클로닝하였다 (프로모터/터미네이터에 대해서는 미국 특허 제6,777,591호를 참조). 리닌 프로모터는 종자 발생 동안 트랜스유전자(들)의 특정-시간적 및 조직-특이적 발현을 조절한다. 쉬조키트리움 Orfs A, B*, C 및 HetI의 직접 상류 및 인-프레임은 또한 실시예 12에 기재된 바와 같이 브라시카 나푸스 아실-ACP 티오에스테라제 (본원에서 PT-신호 펩티드로 지칭되며, 그의 아미노산 서열은 서열 81로 나타냄)로부터 유도된, PUFA 신타제 및 PPTase를 색소체로 표적화하는 색소체 표적화 서열이었다. 이어서, 상기 네가지 발현 카세트를, 좌측 및 우측 경계 서열 사이에 피트로셀리눔 크리스품 유래의 유비퀴틴 프로모터/터미네이터 [Kawalleck et al., 1993, Plant Mol. Bio., 21:673-684]에 의해 구동되는 숙주 식물 포스피노트리신 내성 부여 pat 유전자 [Wohlleben et al., 1988, Gene 70:25-37]를 함유하는 하나의 식물 바이너리 벡터내에 어셈블리하였다.
5723의 작제: ACS-1 (세포질 발현)
아실-CoA 신테타제의 발현을 위해, 별도의 식물 바이너리 벡터를 작제하여 쉬조키트리움 ACS-1에 대한 핵산 서열 (서열 82, 이는 서열 83을 코딩함)을 발현시켰다. 5' 및 3' 말단에서 조작된 적절한 제한 부위를 갖는 ACS-1을 서브클로닝 및 서열화하였다. 이어서, ACS-1을 flax 리닌 프로모터/터미네이터의조절하에 있는 발현 카세트 (미국 특허 제6,777,591호)에 제한 클로닝하고, 양성 선별 [Haldrup et al., 1998, Plant Mol. Biol. 37:287-296]을 위해 좌측 및 우측 경계 서열 사이에 피트로셀리눔 크리스품 유래의 유비퀴틴 프로모터/터미네이터 [Kawalleck et al., 1993, Plant Mol. Bio., 21:673-684]에 의해 구동되는 이. 콜라이 포스포만노스 이소머라제 유전자 [Miles and Guest, 1984, Gene 32: 41-48]를 함유하는 식물 바이너리 벡터에 넣었다.
본원에서 각각 ACS-2 (서열 84/85) 및 ACS-8 (서열 96/97), 5724 및 5730으로 지칭되는 아실-CoA 신테타제의 발현을 위해 유사한 구조물을 제조하였다. 한 측면에서, 아실-CoA 신테타제서열을 하기 기재된 바와 같이 DAGAT (서열 100/101) 및/또는 LPAAT (서열 102/103/104)를 코딩하는 핵산 분자와 조합하였다.
5727의 작제: CHSA 인트론을 갖는 KAS II RNAi (인트론을 갖는 RNAi의 세포질 발현)
FAS 억제를 위해, 별도의 식물 바이너리 벡터를 작제하여 KAS II의 발현을 약화시켰다. 이 경우, 피튜니아 칼콘 신타제 A (CHSA) 유전자 [McGinnis et al., 2005, Methods in Enzymology 392:1-24; Koes et al., 1989, Gene 81: 245-257]로부터 유도된 개입성(intervening) 인트론을 갖는 RNA 간섭 (RNAi)에 의해, At1g74960 로커스 [Carlsson et al., 2002, Plant J. 29: 761-770]에 의해 코딩된 핵 코딩 KAS II 전사체의 499 bp 영역을 표적화하였다. CHSA 인트론을 갖는 KAS II RNAi (서열 122로 나타냄)를 식물 바이너리 벡터내의 리닌 프로모터/터미네이터 (미국 특허 제6,777,591호) 사이, 양성 선별 [Haldrup et al., 1998, Plant Mol. Biol. 37:287-296]을 위해 좌측 및 우측 경계 서열 사이에 피트로셀리눔 크리스품 유래의 유비퀴틴 프로모터/터미네이터 [Kawalleck et al., 1993, Plant Mol. Bio., 21:673-684]에 의해 구동되는 이. 콜라이 포스포만노스 이소머라제 유전자 [Miles and Guest, 1984, Gene 32: 41-48]를 함유하는 식물 바이너리 벡터에 클로닝하였다.
5729의 작제: KAS III 안티센스 RNA (KAS III 안티센스 RNA의 세포질 발현)
FAS 억제를 위해, 별도의 식물 바이너리 벡터를 작제하여 KAS III의 발현을 약화시켰다. 이 경우, At1g62640 로커스 [Yamada et al., 2002, GenBank Accession AY091275]에 의해 코딩된 핵 코딩 전사체로부터 유도된 1210 bp 크기의 안티센스 KAS III 서열을 표적화하였다. KAS III 안티센스 서열 (본원에서 서열 125로 나타냄)을 식물 바이너리 벡터내의 리닌 프로모터/터미네이터 (미국 특허 제6,777,591호) 사이, 양성 선별 [Haldrup et al., 1998, Plant Mol. Biol. 37:287-296]을 위해 좌측 및 우측 경계 서열 사이에 피트로셀리눔 크리스품 유래의 유비퀴틴 프로모터/터미네이터 [Kawalleck et al., 1993, Plant Mol. Bio., 21:673-684]에 의해 구동되는 포스포만노스 이소머라제 유전자 [Miles and Guest, 1984, Gene 32: 41-48]를 함유하는 식물 바이너리 벡터에 클로닝하였다.
5731의 작제: ACS-1, 및 인트론을 갖는 KAS II RNAi (세포질 발현)
FAS 억제와 조합된 아실-CoA 신테타제의 발현을 위해, 별도의 식물 바이너리 벡터를 작제하여 KAS II의 발현을 약화시키고 쉬조키트리움 ACS-1에 대한 핵산 서열 (서열 82, 이는 서열 83을 코딩함)을 발현시켰다. 이 구조물의 경우, ACS-1, 및 인트론을 갖는 KAS II RNAi의 이중 발현 카세트를, 양성 선별 [Haldrup et al., 1998, Plant Mol. Biol. 37:287-296]을 위해 좌측 및 우측 경계 서열 사이에 피트로셀리눔 크리스품 유래의 유비퀴틴 프로모터/터미네이터 [Kawalleck et al., 1993, Plant Mol. Bio., 21:673-684]에 의해 구동되는 이. 콜라이 포스포만노스 이소머라제 유전자 [Miles and Guest, 1984, Gene 32: 41-48]를 함유하는 식물 바이너리 벡터내에서 flax 리닌 프로모터/터미네이터 (미국 특허 제6,777,591호)의 조절하에 발현시켰다.
5732의 작제: ACS-1 및 안티센스 KAS II (세포질 발현)
FAS 억제와 조합된 아실-CoA 신테타제의 발현을 위해, 별도의 식물 바이너리 벡터를 작제하여 KAS II의 발현을 약화시키고 쉬조키트리움 ACS-1에 대한 핵산 서열 (서열 82, 이는 서열 83을 코딩함)을 발현시켰다. 이 구조물의 경우, ACS-1, 및 인트론을 갖는 KAS II 안티센스 (본원에서 서열 123으로 나타낸 KASII 안티센스 서열)의 이중 발현 카세트를, 양성 선별 [Haldrup et al., 1998, Plant Mol. Biol. 37:287-296]을 위해 좌측 및 우측 경계 서열 사이에 피트로셀리눔 크리스품 유래의 유비퀴틴 프로모터/터미네이터 [Kawalleck et al., 1993, Plant Mol. Bio., 21:673-684]에 의해 구동되는 이. 콜라이 포스포만노스 이소머라제 유전자 [Miles and Guest, 1984, Gene 32: 41-48]를 함유하는 식물 바이너리 벡터내에서 flax 리닌 프로모터/터미네이터 (미국 특허 제6,777,591호)의 조절하에 발현시켰다.
5733의 작제: ACS-1 및 KAS III RNAi (세포질 발현)
FAS 억제와 조합된 아실-CoA 신테타제의 발현을 위해, 별도의 식물 바이너리 벡터를 작제하여 KAS III의 발현을 약화시키고 쉬조키트리움 ACS-1에 대한 핵산 서열 (서열 82, 이는 서열 83을 코딩함)을 발현시켰다. 이 구조물의 경우, ACS-1 및 KAS III RNAi (본원에서 서열 124로 나타낸 KASIII RNAi 서열)의 이중 발현 카세트를, 양성 선별 [Haldrup et al., 1998, Plant Mol. Biol. 37:287-296]을 위해 좌측 및 우측 경계 서열 사이에 피트로셀리눔 크리스품 유래의 유비퀴틴 프로모터/터미네이터 [Kawalleck et al., 1993, Plant Mol. Bio., 21:673-684]에 의해 구동되는 이. 콜라이 포스포만노스 이소머라제 유전자 [Miles and Guest, 1984, Gene 32: 41-48]를 함유하는 식물 바이너리 벡터내에서 flax 리닌 프로모터/터미네이터 (미국 특허 제6,777,591호)의 조절하에 발현시켰다.
5734의 작제: ACS-1 및 KAS III 안티센스 RNA (세포질 발현)
FAS 억제와 조합된 아실-CoA 신테타제의 발현을 위해, 별도의 식물 바이너리 벡터를 작제하여 KAS III의 발현을 약화시키고 쉬조키트리움 ACS-1에 대한 핵산 서열 (서열 82, 이는 서열 83을 코딩함)을 발현시켰다. 이 구조물의 경우, ACS-1 및 KAS III 안티센스의 이중 발현 카세트를, 양성 선별 [Haldrup et al., 1998, Plant Mol. Biol. 37:287-296]을 위해 좌측 및 우측 경계 서열 사이에 피트로셀리눔 크리스품 유래의 유비퀴틴 프로모터/터미네이터 [Kawalleck et al., 1993, Plant Mol. Bio., 21:673-684]에 의해 구동되는 이. 콜라이 포스포만노스 이소머라제 유전자 [Miles and Guest, 1984, Gene 32: 41-48]를 함유하는 식물 바이너리 벡터내에서 flax 리닌 프로모터/터미네이터 (미국 특허 제6,777,591호)의 조절하에 발현시켰다.
4793의 작제: DAGAT
DAGAT의 발현을 위해, 별도의 식물 바이너리 벡터를 작제하여 쉬조키트리움 DAGAT-1에 대한 핵산 서열 (서열 100, 이는 서열 101을 코딩함)을 발현시켰다. 쉬조키트리움 DAGAT (서열 100으로 나타낸 뉴클레오티드 서열)를 flax 리닌 프로모터/터미네이터 (미국 특허 제6,777,591호) 조절하의 발현 카세트에 클로닝시켰다. 리닌 프로모터는 종자 발생 동안 트랜스유전자(들)의 특정-시간적 및 조직-특이적 발현을 조절한다. 발현 카세트는, 좌측 및 우측 경계 서열 사이에 MAS 프로모터/터미네이터에 의해 구동되는 숙주 식물 카나마이신 내성 부여 nptII 유전자를 함유하는 식물 바이너리 벡터내에 함유되었다.
4794의 작제: DAGAT 및 ACS-8
DAGAT 및 아실-CoA 신테타제의 발현을 위해, 별도의 식물 바이너리 벡터를 작제하여 (1) 쉬조키트리움 DAGAT에 대한 핵산 서열 (서열 100, 이는 서열 101을 코딩함) 및 (2) 쉬조키트리움 ACS-8에 대한 핵산 서열 (서열 96, 이는 서열 97을 코딩함)을 발현시켰다. 이 구조물의 경우, ACS-8 및 DAGAT의 이중 발현 카세트를, 좌측 및 우측 경계 서열 사이에 MAS 프로모터/터미네이터에 의해 구동되는 숙주 식물 카나마이신 내성 부여 nptII 유전자를 함유하는 식물 바이너리 벡터내에서 flax 리닌 프로모터/터미네이터(미국 특허 제6,777,591호)의 조절하에 발현시켰다.
4795의 작제: LPAAT 및 DAGAT
LPAAT 및 DAGAT의 발현을 위해, 별도의 식물 바이너리 벡터를 작제하여 (1) 쉬조키트리움 LPAAT에 대한 핵산 서열 (서열 103, 이는 서열 104를 코딩함) 및 (2) 쉬조키트리움 DAGAT-1에 대한 핵산 서열 (서열 100, 이는 서열 101을 코딩함)을 발현시켰다. 이 구조물의 경우, LPAAT 및 DAGAT의 이중 발현 카세트를, 좌측 및 우측 경계 서열 사이에 MAS 프로모터/터미네이터에 의해 구동되는 숙주 식물 카나마이신 내성 부여 nptII 유전자를 함유하는 식물 바이너리 벡터내에서 flax 리닌 프로모터/터미네이터(미국 특허 제6,777,591호)의 조절하에 발현시켰다.
4796의 작제: ACS-8, LPAAT 및 DAGAT
아실-CoA 신테타제, LPAAT 및 DAGAT의 발현을 위해, 별도의 식물 바이너리 벡터를 작제하여 (1) 쉬조키트리움 LPAAT에 대한 핵산 서열 (서열 103, 이는 서열 104를 코딩함), (2) 쉬조키트리움 DAGAT-1에 대한 핵산 서열 (서열 100, 이는 서열 101을 코딩함), 및 (3) 쉬조키트리움 ACS-8에 대한 핵산 서열 (서열 96, 이는 서열 97을 코딩함)을 발현시켰다. 이 구조물의 경우, ACS-8, LPAAT 및 DAGAT의 삼중 발현 카세트를, 좌측 및 우측 경계 서열 사이에 MAS 프로모터/터미네이터에 의해 구동되는 숙주 식물 카나마이신 내성 부여 nptII 유전자를 함유하는 식물 바이너리 벡터내에서 flax 리닌 프로모터/터미네이터(미국 특허 제6,777,591호)의 조절하에 발현시켰다.
(2) 아라비돕시스의 형질전환
모든 식물 바이너리 벡터의 온전함(integrity)을 진단적 제한 절단 및 서열 분석에 의해 확인하였다. 이어서, 단리된 플라스미드를 사용해서 전기천공 (25 μF, 2.5 kV, 200 Ω)에 의해 수용성(competent) 아그로박테리움 균주 EH101 [Hood et al., 1986, J. Bacteriol. 144: 732-743]을 형질전환시켰다. 재조합 아그로박테리움을 AB-스펙티노마이신/카나마이신 (20x AB 염, 2 M 글루코스, 0.25 mg/ml FeSO4ㆍ7H2O, 1 M MgSO4, 1 M CaCl2) 상에 플레이팅하고, 단일 콜로니를 이용해서 5 ml의 AB-스펙티노마이신/카나마이신 브로쓰를 접종시켰다. 이들 배양물을 28 ℃에서 밤새 성장시켰다. 이후, 4127 플라스미드를 함유하는 재조합 아그로박테리움을 사용해서 플라워 침지 방법 [Clough et al., 1998, Plant J. 16: 735-743]에 의해 야생형 C24 아라비돕시스 탈리아나 식물을 형질전환시켰다. 상기 식물로부터 얻은 종자를 포스피노트리신의 존재하에 선별 배지상에 플레이팅하고 발아되도록 하였다. 양성으로 확인된 실생식물을 토양으로 옮기고, 성숙시킨 다음, PUFA 함량에 대하여 종자를 분석하였다.
다른 플라스미드 (5723, 5724, 5730, 5727, 5729, 5731, 5732, 5733, 5734, 4793, 4794, 4795, 및/또는 4796)를 함유하는 재조합 아그로박테리움의 경우, 트랜스제닉 4127-라인 150 아라비돕시스 탈리아나 식물을 플라워 침지 방법 [Clough et al., 1998, Plant J. 16: 735-743]에 의해 다시 형질전환시켰다. 이들 식물로부터 얻은 종자를, 포스피노트리신 및 만노스 (이중 선별의 경우) 또는 포스피노트리신, 만노스 및 카나마이신 또는 포스피노트리신 및 카나마이신 (삼중 선별의 경우)의 존재하에 선별 배지상에 플레이팅하고, 경우에 따라, 발아되도록 하였다. 양성으로 확인된 실생식물을 토양으로 옮기고, 성숙시킨 다음, PUFA 함량에 대하여 종자를 분석하였다.
실시예 13a
이 실시예는 슈퍼구조물 (4127) 상에서 HetI과 함께 쉬조키트리움 PUFA 신타제 (OrfA, OrfB* 및 OrfC)를 발현시키는 트랜스제닉 아라비돕시스 탈리아나 종자에서의 DHA 및 DPAn-6의 제조를 기술한다.
HetI과 함께 쉬조키트리움 PUFA 신타제를 발현시키는 (구조물 4127) 아라비돕시스 식물 유래의 푸울링된 종자에 대한 GC-FAME 분석 결과, 지방산 함량에서 유의한 수준의 표적 PUFA, DHAn-3 및 DPAn-6이 확인되었다. 표 3에 나타낸 바와 같이, 특히 하나의 라인 (4127-라인 150)은 조합된 1.3％ 쉬조키트리움-유형 PUFA 함량에서 0.6％ DHAn-3 및 0.7％ DPAn-6을 나타냈다. 예상된 바와 같이, 야생형 (C24) 백그라운드(background)로부터의 대조군 종자는 임의의 검출가능한 수준의 DHAn-3 또는 DPAn-6을 함유하지 않는다. SDS-PAGE 및 웨스턴 블롯팅에 의해 수행된 4127-라인 150에 대한 추후의 발현 분석 결과, 재조합 종자가 색소체로 정확하게 표적화된 OrfA, OrfB*, OrfC 및 HetI을 발현시킨 것으로 나타났다 (데이터는 나타내지 않음). 또한, 이러한 표현형은 T2 세대의 분석으로부터 T4 세대의 분석에 이르기까지 안정하였으며, 이는 본원에 기재된 다양한 전략 (전략들의 조합을 포함함)이 식물에서 PUFA의 제조 및/또는 축적을 증가시키는 것으로 평가된 경우에 DHA 및 쉬조키트리움 PUFA 수준을 결정하는데 있어서 양성 대조군으로서 작용하였다.
포스피노트리신 양성 식물로부터 선택된 T2 및 T4 푸울링된 종자 집단에서 쉬조키트리움 PUFA 신타제를 HetI (색소체 표적화됨)과 함께 발현시키는 트랜스제닉 종자와 비교된, 성숙한 야생형 아라비돕시스 종자에서의 DHA 및 DPA 수준. ％ DHAn-3 및 ％ DPAn-6은 총 계산된 FAME에 대한 후속 GC 분리 및 FID 검출에 의해 결정하였다.
전략 유전자형 라인 세대 표현형
％DHA (C22:6 n-3) ％DPA (C22:5 n-6) ％DHA + DPA
음성 대조군 야생형 (푸울링된 종자) C24 생태형 (ecotype) N/A 0 0 0
PUFA 신타제 + HetI OrfA, OrfB*, OrfC, HetI (푸울링된 종자) 4127-라인 150 T2 0.6 0.7 1.3
T4 0.6 0.6 1.2
실시예 13b
이 실시예는 쉬조키트리움 PUFA 신타제 (Orf A, Orf B* 및 Orf C)와 HetI (4127)을 쉬조키트리움 ScACS-1 유전자 (5723) 또는 ScACS-2 유전자 (5724)와의 조합으로 발현시키는 트랜스제닉 아라비돕시스 탈리아나 종자에서의 DHAn-3 및 DPAn-6의 제조를 기술한다.
4127-라인 150 (실시예 13a 참조)으로부터 유래된 식물은 상기 기재된 바와 같은 아그로박테리움-매개 형질전환에 의해 ScACS-1 구조물 (5723) 또는 ScACS-2 구조물 (5724)을 도입하기 위해 사용되었다. 포스피노트리신 및 만노스 둘다의 존재하에 재조합 식물을 선별한 다음, 종자를 수확하고, 푸울링된 종자로부터 제조된 FAME의 GC 분리 및 FID 검출에 의해 지방산 프로필에 대하여 분석하였다.
예로서, 특히 쉬조키트리움 PKS를 HetI과 함께 ACS-1과 조합하여 발현시키는 하나의 라인 (4127/5723-라인 514)은 총 지방산 프로필 중 조합된 2.4％ 쉬조키트리움 PUFA 함량에 있어서 1.5％ DHA 및 0.9％ DPAn-6을 나타냈다 (표 4). 이러한 결과는 4127-라인 150 양성 대조군에 비해 DHAn-3 함량이 2.5배 증가한 것이었다. 양성 대조군에 비해 DHAn-3 함량에서 1.8배 증가를 나타낸 ACS-2 (4127/5724-라인 552)과의 조합으로 쉬조키트리움 PKS를 HetI과 함께 발현시킨 라인에서 유사한 결과가 관찰되었다. 또한, DHA 대 DPA의 비율은 4127-라인 150의 T2 세대에서의 대략 0.85:1.0 또는 T4 세대에서의 대략 1.0:1.0으로부터 ACS-1 라인에서의 대략 1.7:1.0 및 ACS-2 라인에서의 대략 1.2:1.0에 이르기까지 변화된 것으로 관찰되었다. 분석된 모든 트랜스제닉 종자에서, 프로필 중 검출된 유일한 신규 지방산은 DHA n-3 또는 DPAn-6이었다.
푸울링된 종자에서, 쉬조키트리움 PUFA 신타제를 HetI (색소체 표적화됨) 발현과 함께 쉬조키트리움 ACS-1 또는 ACS-2의 발현과 조합하는 트랜스제닉 종자와 비교된, 쉬조키트리움 PUFA 신타제를 HetI (색소체 표적화됨)과 함께 발현시키는 성숙한 야생형 및 트랜스제닉 아라비돕시스 종자에서의 DHAn-3 및 DPAn-6 수준. ％ DHA n-3 및 ％ DPAn-6은 총 계산된 FAME에 대한 후속 GC 분리 및 FID 검출에 의해 결정하였다.
전략 유전자형 라인 세대 표현형
％DHA (C22:6 n-3) ％DPA (C22:5 n-6) ％DHA + DPA
음성 대조군 야생형 (푸울링된 종자) C24 생태형 N/A 0 0 0
양성 대조군 OrfA, OrfB*, OrfC, HetI (푸울링된 종자) 4127-라인 150 T2 0.6 0.7 1.3
T4 0.6 0.6 1.2
아실CoAS 발현 OrfA, OrfB*, OrfC, HetI, ACS-1 (푸울링된 종자) 4127/5723-라인 514 T4/T2 1.5 0.9 2.4
OrfA, OrfB*, OrfC, HetI, ACS-2 (푸울링된 종자) 4127/5724-라인 552 1.1 0.9 2.0
실시예 13c
이 실시예는 RNA 간섭 (RNAi)을 이용해서 KAS II를 약화시킴으로써 FAS를 억제하는 것과 조합하여, 쉬조키트리움 PUFA 신타제 (OrfA, OrfB* 및 OrfC)를 HetI과 함께 발현시키는 트랜스제닉 아라비돕시스 탈리아나 종자에서 DHA 및 DPAn-6을 제조하는 것을 기술한다.
4127-라인 150으로부터 유래된 식물은 상기 기재된 바와 같은 아그로박테리움-매개 형질전환에 의해 인트론을 갖는 KAS II RNAi (구조물 5727)를 도입하기 위해 사용되었다. 포스피노트리신 및 만노스 둘다의 존재하에 재조합 식물을 선별한 다음, 종자를 수확하고, 푸울링된 종자로부터 제조된 FAME의 GC 분리 및 FID 검출에 의해 지방산 프로필에 대하여 분석하였다.
예로서, 특히 하나의 라인 (4127/5727-라인 1097)은 총 지방산 프로필 중 조합된 2.5％ 쉬조키트리움 PUFA 함량에 있어서 1.3％ DHA n-3 및 1.2％ DPAn-6을 나타냈다 (표 5). 이러한 결과는 4127-라인 150 양성 대조군에 비해 DHA 함량이 2.1배 넘게 증가한 것이었다. 이후, 4127/5727-라인 1097로부터의 단일-종자를 GC 분리 및 FID 검출에 의해 총 계산된 FAME에 대하여 개별적으로 분석하였다.
상기 분석 후, 이 집단내의 종자가 총 지방산 프로필 중 조합된 3.6％ 쉬조키트리움 PUFA 함량에 있어서 2.0％ DHAn-3 및 1.6％ DPAn-6을 나타냈다 (표 5). 이러한 결과는 4127-라인 150 양성 대조군에 비해 DHA 함량에서 3.3배 증가 및 쉬조키트리움 PUFA 함량에서 3배 증가를 나타낸다. 또한, DHA 대 DPA 비율은 4127-라인 150의 T2 세대에서의 0.85:1.0 또는 T4 세대에서의 1.0:1.0으로부터 FAS 억제 라인에서의 1.25:1.0 또는 그보다 큰 비율에 이르기까지 변화된 것으로 관찰되었다. 단일 종자 평균은 ％DHA n-3, ％DPAn-6 및 총 ％ (DHA + DPA)에 대하여 푸울링된 샘플과 일치하였으며, 이 집단내의 차이는 공동형질전환된 종자에서의 재조합 4127 및 5727 유전자좌의 분리로 인한 것일 수 있다. 분석된 모든 트랜스제닉 종자에서, 프로필 중 검출된 유일한 신규 지방산은 DHA n-3 또는 DPAn-6이었다.
푸울링 및 단일 종자에서 쉬조키트리움 PUFA 신타제를 HetI (색소체 표적화된) 발현과 함께 KAS II 약화와 조합하는 트랜스제닉 종자와 비교된, 쉬조키트리움 PUFA 신타제를 HetI (색소체 표적화됨)과 함께 발현시키는 성숙한 야생형 및 트랜스제닉 아라비돕시스 종자에서의 DHA 및 DPA 수준. ％ DHA n-3 및 ％ DPAn-6은 총 계산된 FAME에 대한 후속 GC 분리 및 FID 검출에 의해 결정하였다.
전략 유전자형 라인 세대 표현형
％DHA (C22:6 n-3) ％DPA (C22:5 n-6) ％DHA + DPA
음성 대조군 야생형 (푸울링된 종자) C24 생태형 N/A 0 0 0
양성 대조군 OrfA, OrfB*, OrfC, HetI (푸울링된 종자) 4127-라인 150 T2 0.6 0.7 1.3
T4 0.6 0.6 1.2
FAS 억제 OrfA, OrfB*, OrfC, HetI, 인트론을 갖는 KAS II RNAi (푸울링된 종자) 4127/5727-라인 1097 T4/T2 1.3 1.2 2.5
OrfA, OrfB*, OrfC, HetI, 인트론을 갖는 KAS II RNAi (단일 종자) 1097-7 0.7 0.7 1.4
1097-9 0.7 0.8 1.5
1097-2 0.9 0.9 1.8
1097-5 1.0 0.9 1.9
1097-6 1.0 1.1 2.1
1097-1 1.2 1.3 2.5
1097-8 1.3 1.3 2.6
1097-4 1.4 0.8 2.2
1097-10 1.4 1.2 2.6
1097-3 2.0 1.6 3.6
단일 종자 평균 T4/T2 1.2 1.0 2.2
실시예 13d
이 실시예는 안티센스 RNA를 이용해서 KAS III을 약화시킴으로써 FAS를 억제하는 것과 조합하여, 쉬조키트리움 PUFA 신타제 (OrfA, OrfB* 및 OrfC)를 HetI과 함께 발현시키는 트랜스제닉 아라비돕시스 탈리아나 종자에서 DHA 및 DPAn-6을 제조하는 것을 기술한다.
4127-라인 150으로부터 유래된 식물은 상기 기재된 바와 같은 아그로박테리움-매개 형질전환에 의해 KAS III 안티센스 구조물 (5129)을 도입하기 위해 사용되었다. 포스피노트리신 및 만노스 둘 다의 존재하에 재조합 식물을 선별한 다음, 종자를 수확하고, 푸울링된 종자로부터 제조된 FAME의 GC 분리 및 FID 검출에 의해 지방산 프로필에 대하여 분석하였다.
예로서, 특히 하나의 라인 (4127/5729-라인 1087)은 총 지방산 프로필 중 조합된 2.5％ 쉬조키트리움 PUFA 함량에 있어서 1.7％ DHA n-3 및 1.2％ DPAn-6을 나타냈다 (표 6). 이러한 결과는 4127-라인 150 양성 대조군에 비해 DHA 함량이 2.1배 넘게 증가한 것이었다. 이후, 4127/5727-라인 1097로부터의 단일-종자를 GC 분리 및 FID 검출에 의해 총 계산된 FAME에 대하여 개별적으로 분석하였다. 이러한 결과는 4127-라인 150 양성 대조군에 비해 DHA 함량에서의 2.8배 증가를 나타냈다.
이후, 4127/5729-라인 1087 유래의 단일-종자를 GC 분리 및 FID 검출에 의해 총 계산된 FAME에 대하여 개별적으로 분석하였다. 이 분석 후, 상기 집단내의 종자는 지방산 프로필에서 조합된 4.2％ 쉬조키트리움 PUFA 함량에 있어서 최대 2.4％의 DHA n-3 및 1.8％의 DPAn-6을 나타낸 것으로 관찰되었다 (표 6). 이러한 결과는 4127-라인 150 양성 대조군에 비해 DHA 함량에서의 4배 증가 및 쉬조키트리움 PUFA 함량에서의 3.2배 증가를 나타낸다. 또한, DHA 대 DPA의 비율은 4127-라인 150의 T2 세대에서의 0.85:1.0 또는 T4 세대에서의 1.0:1.0으로부터 FAS 억제 라인에서의 1.33:1.0 또는 그보다 높은 비율로 변화된 것으로 관찰되었다. 단일 종자 평균은 ％DHA n-3, ％DPAn-6 및 총 ％ (DHA + DPA)에 대하여 푸울링된 샘플과 일치하였으며, 이 집단내의 차이는 공동형질전환된 종자에서 재조합 4127 및 5729 유전자좌의 분리로 인한 것일 수 있다. 분석된 모든 트랜스제닉 종자에서, 프로필 중 검출된 유일한 신규 지방산은 이. 콜라이 및 효모에서 관찰된 기존의 생화학적 및 이종 발현 데이터로부터 예상된 바와 같이 DHA n-3 또는 DPAn-6이었다. 종자 샘플 1087-7의 분석에서 얻어진 GC-FAME 크로마토그램은 도 14에 나타나있다.
푸울링 및 단일 종자에서 쉬조키트리움 PUFA 신타제를 HetI (색소체 표적화된) 발현과 함께 KAS III 약화와 조합하는 트랜스제닉 종자와 비교된, 쉬조키트리움 PUFA 신타제를 HetI (색소체 표적화됨)과 함께 발현시키는 성숙한 야생형 및 트랜스제닉 아라비돕시스 종자에서의 DHA 및 DPA 수준. ％ DHA n-3 및 ％ DPAn-6은 총 계산된 FAME에 대한 후속 GC 분리 및 FID 검출에 의해 결정하였다.
전략 유전자형 라인 세대 표현형
％DHA (C22:6 n-3) ％DPA (C22:5 n-6) ％DHA + DPA
음성 대조군 야생형 (푸울링된 종자) C24 생태형 N/A 0 0 0
양성 대조군 OrfA, OrfB*, OrfC, HetI (푸울링된 종자) 4127-라인 150 T2 0.6 0.7 1.3
T4 0.6 0.6 1.2
FAS 억제 OrfA, OrfB*, OrfC, HetI, 인트론을 갖는 KAS III 안티센스 RNA (푸울링된 종자) 4127/5729-라인 1087 T4/T2 1.7 1.2 2.9
OrfA, OrfB*, OrfC, HetI, KAS III 안티센스 RNA (단일 종자) 1087-9 0.9 1.0 1.9
1087-4 1.0 1.1 2.1
1087-2 1.1 0.9 2.0
1087-6 1.2 0.6 1.8
1087-1 1.3 1.1 2.4
1087-8 1.4 1.5 2.9
1087-3 1.7 1.1 2.8
1087-10 1.8 1.6 3.4
1087-5 2.0 1.6 3.6
1087-7 2.4 1.8 4.2
단일 종자 평균 T4/T2 1.5 1.2 2.7
실시예 13e
이 실시예는 안티센스 RNA를 이용해서 KAS III을 약화시킴으로써 ScACS-1 유전자를 발현시키면서 동시에 FAS를 억제하는 것과 조합하여, 쉬조키트리움 PUFA 신타제 (OrfA, OrfB* 및 OrfC)를 HetI과 함께 발현시키는 트랜스제닉 아라비돕시스 탈리아나 종자에서 DHA 및 DPAn-6을 제조하는 것을 기술한다.
4127-라인 150으로부터 유래된 식물은 상기 기재된 바와 같은 아그로박테리움-매개 형질전환에 의해 구조물 5731을 사용해서 ScACS-1에 더하여 KAS II RNAi를 도입하기 위해 사용되었다. 포스피노트리신 및 만노스 둘 다의 존재하에 재조합 식물을 선별한 다음, 종자를 수확하고, 푸울링된 종자로부터 제조된 FAME의 GC 분리 및 FID 검출에 의해 지방산 프로필에 대하여 분석하였다.
예로서, 하나의 라인 (4127/5731-라인 1366)은 총 지방산 프로필 중 조합된 3.8％ 쉬조키트리움 PUFA 함량에 있어서 1.9％ DHA 및 1.9％ DPAn-6을 나타냈다 (표 7). 이러한 결과는, 각각 실시예 13b 및 13c (표 4 및 5)에 기재된 바와 같은 푸울링된 종자 집단으로부터의 DHA 함량을 비교했을 때, 4127-라인 150 양성 대조군에 비해 3.2배 증가, 4127/5723-라인 514에서 관찰된 바와 같은 ACS-1 전략 단독에 비해 1.3배 증가 및 4127/5727-라인 1097에서 관찰된 바와 같은 KAS II RNAi 약화 전략 단독에 비해 1.5배 증가를 나타냈다.
당업자라면 푸울링된 종자 중의 4127 및 5731 유전자좌의 분리를 반영하는 것으로서 상기 집단내의 단일 종자에서 관찰되는 DHA 함량이 더 높은 수준이라는 것을 예상할 것이다. 분석된 모든 트랜스제닉 종자에서, 프로필 중 검출된 유일한 신규 지방산은 이. 콜라이 및 효모에서 간찰된 기존의 생화학적 및 이종 발현 데이터로부터 예상된 바와 같은 DHA n-3 또는 DPAn-6이었다. 푸울링된 종자 샘플 4127/5731-라인 1366의 분석에서 얻어진 GC-FAME 크로마토그램은 도 15에 나타나 있다.
푸울링된 종자에서, 쉬조키트리움 ACS-1 발현 및 FAS 억제와 함께 조합된 HetI (색소체 표적화됨)과 함께 쉬조키트리움 PUFA 신타제를 조합하는 트랜스제닉 종자와 비교된, 쉬조키트리움 PUFA 신타제를 HetI (색소체 표적화됨)과 함께 발현시키는 성숙한 야생형 및 트랜스제닉 아라비돕시스 종자에서의 DHAn-3 및 DPAn-6 수준. ％ DHA n-3 및 ％ DPAn-6은 총 계산된 FAME에 대한 후속 GC 분리 및 FID 검출에 의해 결정하였다.
전략 유전자형 라인 세대 표현형
％DHA (C22:6 n-3) ％DPA (C22:5 n-6) ％DHA + DPA
음성 대조군 야생형 (푸울링된 종자) C24 생태형 N/A 0 0 0
양성 대조군 OrfA, OrfB*, OrfC, HetI (푸울링된 종자) 4127-라인 150 T2 0.6 0.7 1.3
T4 0.6 0.6 1.2
아실CoAS 발현 및 FAS 억제 OrfA, OrfB*, OrfC, HetI, ACS-1, KAS II RNAi (푸울링된 종자) 4127/5731-라인 1366 T4/T2 1.9 1.9 3.8
실시예 13f
이 실시예는 쉬조키트리움 LPAAT의 발현과 조합된, 쉬조키트리움 PUFA 신타제 (OrfA, OrfB* 및 OrfC)를 HetI과 함께 발현시키는 트랜스제닉 아라비돕시스 탈리아나 종자에서의 DHA 및 DPAn-6의 제조를 기술한다.
4127-라인 150으로부터 유래된 식물은 상기 기재된 바와 같은 아그로박테리움-매개 형질전환에 의해 LPAAT 구조물 (5725)을 도입하기 위해 사용되었다. 포스피노트리신 및 만노스 둘 다의 존재하에 재조합 식물을 선별한 다음, 종자를 수확하고, 푸울링된 종자로부터 제조된 FAME의 GC 분리 및 FID 검출에 의해 지방산 프로필에 대하여 분석하였다.
상기 식물 유래의 종자는 표적 PUFA (DHA 및 DPAn-6)를 제조하는 것으로 예상된다. 또한 DHA 및/또는 DPAn-6의 제조 수준은 첨가된 LPAAT 구조물의 부재하에서의 PUFA PKS-발현 식물과 비교해서 증가되는 것으로 예상된다.
실시예 13g
이 실시예는 RNAi를 이용해서 KAS II를 약화시키거나 또는 안티센스를 이용해서 KAS III을 약화시킴으로써 FAS를 억제하는 것 및 쉬조키트리움 DAGAT 및 ACS-1을 발현시키는 것과 조합하여, 쉬조키트리움 PUFA 신타제 (OrfA, OrfB* 및 OrfC)를 HetI과 함께 발현시키는 트랜스제닉 아라비돕시스 탈리아나 종자에서 DHA 및 DPAn-6을 제조하는 것을 기술한다.
5731 (KASII RNAi에 의한 FAS 억제 및 ACS-1 발현의 조합)로부터 유래된 식물은 상기 기재된 바와 같은 아그로박테리움-매개 형질전환에 의해 DAGAT 구조물 (4793)을 도입하기 위해 사용되었다. 유사한 식물이 또한 5734 백그라운드 (KASIII 안티센스에 의한 FAS 억제 및 ACS-1 발현의 조합) 상에서 생성되었다. 포스피노트리신 및 만노스 둘 다의 존재하에 재조합 식물을 선별한 다음, 종자를 수확하고, 푸울링된 종자로부터 제조된 FAME의 GC 분리 및 FID 검출에 의해 지방산 프로필에 대하여 분석하였다.
상기 식물 유래의 종자는 표적 PUFA (DHA 및 DPAn-6)를 제조하는 것으로 예상된다. 또한 DHA 및/또는 DPAn-6의 제조 수준은 첨가된 DAGAT 구조물 및 FAS 억제의 부재하에 PUFA PKS-발현 식물에 비해 증가하는 것으로 예상된다.
실시예 13h
이 실시예는 쉬조키트리움 DAGAT 및 ACS-8의 발현과 함께 조합되고, 추가로 RNAi를 사용해서 KAS II를 약화시키거나 또는 안티센스를 사용해서 KAS III을 약화시킴으로써 FAS를 억제하고 동시에 쉬조키트리움 ACS-1을 발현시키는 것과 조합하여, 쉬조키트리움 PUFA 신타제 (OrfA, OrfB* 및 OrfC)를 HetI과 함께 발현시키는 트랜스제닉 아라비돕시스 탈리아나 종자에서의 DHA 및 DPAn-6의 제조를 기술한다.
5731 (KASII RNAi에 의한 FAS 억제 및 ACS-1 발현의 조합) 유래의 식물은 상기 기재된 바와 같은 아그로박테리움-매개 형질전환에 의해 DAGAT/ACS-8 구조물 (4794)을 도입하기 위해 사용되었다. 유사한 식물이 또한 5734 백그라운드 (KASIII 안티센스에 의한 FAS 억제 및 ACS-1 발현의 조합) 상에서 생성되었다. 포스피노트리신 및 만노스 둘 다의 존재하에 재조합 식물을 선별한 다음, 종자를 수확하고, 푸울링된 종자로부터 제조된 FAME의 GC 분리 및 FID 검출에 의해 지방산 프로필에 대하여 분석하였다.
상기 식물 유래의 종자는 표적 PUFA (DHA 및 DPAn-6)를 제조하는 것으로 예상된다. 또한 DHA 및/또는 DPAn-6의 제조 수준은 첨가된 DAGAT/ACS-8 구조물, ACS-1 구조물, 및 FAS 억제의 부재하에 PUFA PKS-발현 식물에 비해 증가하는 것으로 예상된다.
실시예 13i
이 실시예는 쉬조키트리움 LPAAT 및 쉬조키트리움 DAGAT의 발현과 함께 조합되고, 추가로 RNAi를 사용해서 KAS II를 약화시키거나 또는 안티센스를 사용해서 KAS III을 약화시킴으로써 FAS를 억제하고 동시에 쉬조키트리움 ACS-1을 발현시키는 것과 조합하여, 쉬조키트리움 PUFA 신타제 (OrfA, OrfB* 및 OrfC)를 HetI과 함께 발현시키는 트랜스제닉 아라비돕시스 탈리아나 종자에서의 DHA 및 DPAn-6의 제조를 기술한다.
5731 (KASII RNAi에 의한 FAS 억제 및 ACS-1 발현의 조합) 유래의 식물은 상기 기재된 바와 같은 아그로박테리움-매개 형질전환에 의해 DAGAT/LPAAT 구조물 (4795)을 도입하기 위해 사용되었다. 유사한 식물이 또한 5734 백그라운드 (KASIII 안티센스에 의한 FAS 억제 및 ACS-1 발현의 조합) 상에서 생성되었다. 포스피노트리신 및 만노스 둘 다의 존재하에 재조합 식물을 선별한 다음, 종자를 수확하고, 푸울링된 종자로부터 제조된 FAME의 GC 분리 및 FID 검출에 의해 지방산 프로필에 대하여 분석하였다.
상기 식물 유래의 종자는 표적 PUFA (DHA 및 DPAn-6)를 제조하는 것으로 예상된다. 또한 DHA 및/또는 DPAn-6의 제조 수준은 첨가된 DAGAT/LPAAT 구조물, ACS-1 구조물, 및 FAS 억제의 부재하에 PUFA PKS-발현 식물에 비해 증가하는 것으로 예상된다.
실시예 13j
이 실시예는 쉬조키트리움 LPAAT, 쉬조키트리움 DAGAT, 및 쉬조키트리움 ACS-8의 발현과 함께 조합되고, 추가로 RNAi를 사용해서 KAS II를 약화시키거나 또는 안티센스를 사용해서 KAS III을 약화시킴으로써 FAS를 억제하고 동시에 쉬조키트리움 ACS-1을 발현시키는 것과 조합하여, 쉬조키트리움 PUFA 신타제 (OrfA, OrfB* 및 OrfC)를 HetI과 함께 발현시키는 트랜스제닉 아라비돕시스 탈리아나 종자에서의 DHA 및 DPAn-6의 제조를 기술한다.
5731 (KASII RNAi에 의한 FAS 억제 및 ACS-1 발현의 조합) 유래의 식물은 상기 기재된 바와 같은 아그로박테리움-매개 형질전환에 의해 DAGAT/LPAAT/ACS-8 구조물 (4796)을 도입하기 위해 사용되었다. 유사한 식물이 또한 5734 백그라운드 (KASIII 안티센스에 의한 FAS 억제 및 ACS-1 발현의 조합) 상에서 생성되었다. 포스피노트리신 및 만노스 둘 다의 존재하에 재조합 식물을 선별한 다음, 종자를 수확하고, 푸울링된 종자로부터 제조된 FAME의 GC 분리 및 FID 검출에 의해 지방산 프로필에 대하여 분석하였다.
상기 식물 유래의 종자는 표적 PUFA (DHA 및 DPAn-6)를 제조하는 것으로 예상된다. 또한 DHA 및/또는 DPAn-6의 제조 수준은 첨가된 DAGAT/LPAAT/ACS-8 구조물, ACS-1 구조물, 및 FAS 억제의 부재하에 PUFA PKS-발현 식물에 비해 증가하는 것으로 예상된다.
2006년 3월 15일에 출원된 미국 가출원 일련번호 제60/783,205호 및 미국 가출원 일련번호 제60/784,616호 각각의 전체 개시내용은 본원에 참고로 도입된다.
본 발명의 다양한 실시양태를 상세히 기술하였지만, 이러한 실시양태의 변형 및 개질은 당업자에게는 자명한 것이다. 그러나, 상기 변형 및 개질은 본 발명의 범위내에 포함되는 것으로 명확하게 이해된다.
SEQUENCE LISTING <110> Martek Biosciences Corporation Metz, James G Kuner, Jerry M Lippmeier, James Casey <120> Polyunsaturated Fatty Acid Production in Heterologous Organisms Using PUFA Polyketide Synthase Systems <130> 2997-114 <150> 60/783,205 <151> 2006-03-15 <150> 60/784,616 <151> 2006-03-21 <160> 125 <170> PatentIn version 3.4 <210> 1 <211> 8733 <212> DNA <213> Schizochytrium sp. <220> <221> CDS <222> (1)..(8733) <400> 1 atg gcg gcc cgt ctg cag gag caa aag gga ggc gag atg gat acc cgc 48 Met Ala Ala Arg Leu Gln Glu Gln Lys Gly Gly Glu Met Asp Thr Arg 1 5 10 15 att gcc atc atc ggc atg tcg gcc atc ctc ccc tgc ggc acg acc gtg 96 Ile Ala Ile Ile Gly Met Ser Ala Ile Leu Pro Cys Gly Thr Thr Val 20 25 30 cgc gag tcg tgg gag acc atc cgc gcc ggc atc gac tgc ctg tcg gat 144 Arg Glu Ser Trp Glu Thr Ile Arg Ala Gly Ile Asp Cys Leu Ser Asp 35 40 45 ctc ccc gag gac cgc gtc gac gtg acg gcg tac ttt gac ccc gtc aag 192 Leu Pro Glu Asp Arg Val Asp Val Thr Ala Tyr Phe Asp Pro Val Lys 50 55 60 acc acc aag gac aag atc tac tgc aag cgc ggt ggc ttc att ccc gag 240 Thr Thr Lys Asp Lys Ile Tyr Cys Lys Arg Gly Gly Phe Ile Pro Glu 65 70 75 80 tac gac ttt gac gcc cgc gag ttc gga ctc aac atg ttc cag atg gag 288 Tyr Asp Phe Asp Ala Arg Glu Phe Gly Leu Asn Met Phe Gln Met Glu 85 90 95 gac tcg gac gca aac cag acc atc tcg ctt ctc aag gtc aag gag gcc 336 Asp Ser Asp Ala Asn Gln Thr Ile Ser Leu Leu Lys Val Lys Glu Ala 100 105 110 ctc cag gac gcc ggc atc gac gcc ctc ggc aag gaa aag aag aac atc 384 Leu Gln Asp Ala Gly Ile Asp Ala Leu Gly Lys Glu Lys Lys Asn Ile 115 120 125 ggc tgc gtg ctc ggc att ggc ggc ggc caa aag tcc agc cac gag ttc 432 Gly Cys Val Leu Gly Ile Gly Gly Gly Gln Lys Ser Ser His Glu Phe 130 135 140 tac tcg cgc ctt aat tat gtt gtc gtg gag aag gtc ctc cgc aag atg 480 Tyr Ser Arg Leu Asn Tyr Val Val Val Glu Lys Val Leu Arg Lys Met 145 150 155 160 ggc atg ccc gag gag gac gtc aag gtc gcc gtc gaa aag tac aag gcc 528 Gly Met Pro Glu Glu Asp Val Lys Val Ala Val Glu Lys Tyr Lys Ala 165 170 175 aac ttc ccc gag tgg cgc ctc gac tcc ttc cct ggc ttc ctc ggc aac 576 Asn Phe Pro Glu Trp Arg Leu Asp Ser Phe Pro Gly Phe Leu Gly Asn 180 185 190 gtc acc gcc ggt cgc tgc acc aac acc ttc aac ctc gac ggc atg aac 624 Val Thr Ala Gly Arg Cys Thr Asn Thr Phe Asn Leu Asp Gly Met Asn 195 200 205 tgc gtt gtc gac gcc gca tgc gcc tcg tcc ctc atc gcc gtc aag gtc 672 Cys Val Val Asp Ala Ala Cys Ala Ser Ser Leu Ile Ala Val Lys Val 210 215 220 gcc atc gac gag ctg ctc tac ggt gac tgc gac atg atg gtc acc ggt 720 Ala Ile Asp Glu Leu Leu Tyr Gly Asp Cys Asp Met Met Val Thr Gly 225 230 235 240 gcc acc tgc acg gat aac tcc atc ggc atg tac atg gcc ttc tcc aag 768 Ala Thr Cys Thr Asp Asn Ser Ile Gly Met Tyr Met Ala Phe Ser Lys 245 250 255 acc ccc gtg ttc tcc acg gac ccc agc gtg cgc gcc tac gac gaa aag 816 Thr Pro Val Phe Ser Thr Asp Pro Ser Val Arg Ala Tyr Asp Glu Lys 260 265 270 aca aag ggc atg ctc atc ggc gag ggc tcc gcc atg ctc gtc ctc aag 864 Thr Lys Gly Met Leu Ile Gly Glu Gly Ser Ala Met Leu Val Leu 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atc ctc tcc gag gtc cag gcc atg ctc aat gtc 3519 Lys Arg Val Glu Ile Leu Ser Glu Val Gln Ala Met Leu Asn Val 1160 1165 1170 gag gcc aag gat gtc gat gcc ctc agc cgc act cgc act gtt ggt 3564 Glu Ala Lys Asp Val Asp Ala Leu Ser Arg Thr Arg Thr Val Gly 1175 1180 1185 gag gtt gtc aac gcc atg aag gcc gag atc gct ggc agc tct gcc 3609 Glu Val Val Asn Ala Met Lys Ala Glu Ile Ala Gly Ser Ser Ala 1190 1195 1200 ccg gcg cct gct gcc gct gct ccg gct ccg gcc aag gct gcc cct 3654 Pro Ala Pro Ala Ala Ala Ala Pro Ala Pro Ala Lys Ala Ala Pro 1205 1210 1215 gcc gcc gct gcg cct gct gtc tcg aac gag ctt ctc gag aag gcc 3699 Ala Ala Ala Ala Pro Ala Val Ser Asn Glu Leu Leu Glu Lys Ala 1220 1225 1230 gag acc gtc gtc atg gag gtc ctc gcc gcc aag act ggc tac gag 3744 Glu Thr Val Val Met Glu Val Leu Ala Ala Lys Thr Gly Tyr Glu 1235 1240 1245 act gac atg atc gag tcc gac atg gag ctc gag act gag ctc ggc 3789 Thr Asp Met Ile Glu Ser Asp Met Glu Leu Glu Thr Glu Leu Gly 1250 1255 1260 att gac tcc atc aag cgt gtc gag atc 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atg ggc gcc ccg gac cgc gtc atg gac tac 4284 Ser Arg Trp Ala Asn Met Gly Ala Pro Asp Arg Val Met Asp Tyr 1415 1420 1425 cag gtc tgg tgt ggc ccg gcc att ggc gcc ttc aac gac ttc atc 4329 Gln Val Trp Cys Gly Pro Ala Ile Gly Ala Phe Asn Asp Phe Ile 1430 1435 1440 aag ggc acc tac ctc gac ccc gct gtc tcc aac gag tac ccc tgt 4374 Lys Gly Thr Tyr Leu Asp Pro Ala Val Ser Asn Glu Tyr Pro Cys 1445 1450 1455 gtc gtc cag atc aac ctg caa atc ctc cgt ggt gcc tgc tac ctg 4419 Val Val Gln Ile Asn Leu Gln Ile Leu Arg Gly Ala Cys Tyr Leu 1460 1465 1470 cgc cgt ctc aac gcc ctg cgc aac gac ccg cgc att gac ctc gag 4464 Arg Arg Leu Asn Ala Leu Arg Asn Asp Pro Arg Ile Asp Leu Glu 1475 1480 1485 acc gag gat gct gcc ttt gtc tac gag ccc acc aac gcg ctc taa 4509 Thr Glu Asp Ala Ala Phe Val Tyr Glu Pro Thr Asn Ala Leu 1490 1495 1500 <210> 6 <211> 1502 <212> PRT <213> Schizochytrium sp. <400> 6 Met Ala Leu Arg Val Lys Thr Asn Lys Lys Pro Cys Trp Glu Met Thr 1 5 10 15 Lys Glu Glu Leu Thr Ser Gly Lys Thr Glu Val Phe 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1248 Arg Asp Ala Ala Met Asn Asp Gly Arg Cys Val Thr Tyr Leu Lys Gly 405 410 415 gcc gca ccg ctc atc aag gcc ccg gag ccc 1278 Ala Ala Pro Leu Ile Lys Ala Pro Glu Pro 420 425 <210> 10 <211> 426 <212> PRT <213> Schizochytrium sp. <400> 10 Asp Val Thr Lys Glu Ala Trp Arg Leu Pro Arg Glu Gly Val Ser Phe 1 5 10 15 Arg Ala Lys Gly Ile Ala Thr Asn Gly Ala Val Ala Ala Leu Phe Ser 20 25 30 Gly Gln Gly Ala Gln Tyr Thr His Met Phe Ser Glu Val Ala Met Asn 35 40 45 Trp Pro Gln Phe Arg Gln Ser Ile Ala Ala Met Asp Ala Ala Gln Ser 50 55 60 Lys Val Ala Gly Ser Asp Lys Asp Phe Glu Arg Val Ser Gln Val Leu 65 70 75 80 Tyr Pro Arg Lys Pro Tyr Glu Arg Glu Pro Glu Gln Asp His Lys Lys 85 90 95 Ile Ser Leu Thr Ala Tyr Ser Gln Pro Ser Thr Leu Ala Cys Ala Leu 100 105 110 Gly Ala Phe Glu Ile Phe Lys Glu Ala Gly Phe Thr Pro Asp Phe Ala 115 120 125 Ala Gly His Ser Leu Gly Glu Phe Ala Ala Leu Tyr Ala Ala Gly Cys 130 135 140 Val Asp Arg Asp Glu Leu Phe Glu Leu Val Cys Arg Arg Ala Arg Ile 145 150 155 160 Met Gly Gly Lys Asp Ala Pro Ala Thr Pro Lys Gly Cys Met Ala Ala 165 170 175 Val Ile Gly Pro Asn Ala Glu Asn Ile Lys Val Gln Ala Ala Asn Val 180 185 190 Trp Leu Gly Asn Ser Asn Ser Pro Ser Gln Thr Val Ile Thr Gly Ser 195 200 205 Val Glu Gly Ile Gln Ala Glu Ser Ala Arg Leu Gln Lys Glu Gly Phe 210 215 220 Arg Val Val Pro Leu Ala Cys Glu Ser Ala Phe His Ser Pro Gln Met 225 230 235 240 Glu Asn Ala Ser Ser Ala Phe Lys Asp Val Ile Ser Lys Val Ser Phe 245 250 255 Arg Thr Pro Lys Ala Glu Thr Lys Leu Phe Ser Asn Val Ser Gly Glu 260 265 270 Thr Tyr Pro Thr Asp Ala Arg Glu Met Leu Thr Gln His Met Thr Ser 275 280 285 Ser Val Lys Phe Leu Thr Gln Val Arg Asn Met His Gln Ala Gly Ala 290 295 300 Arg Ile Phe Val Glu Phe Gly Pro Lys Gln Val Leu Ser Lys Leu Val 305 310 315 320 Ser Glu Thr Leu Lys Asp Asp Pro Ser Val Val Thr Val Ser Val Asn 325 330 335 Pro Ala Ser Gly Thr Asp Ser Asp Ile Gln Leu Arg Asp Ala Ala Val 340 345 350 Gln Leu Val Val Ala Gly Val Asn Leu Gln Gly Phe Asp Lys Trp Asp 355 360 365 Ala Pro Asp Ala Thr Arg Met Gln Ala Ile Lys Lys Lys Arg Thr Thr 370 375 380 Leu Arg Leu Ser Ala Ala Thr Tyr Val Ser Asp Lys Thr Lys Lys Val 385 390 395 400 Arg Asp Ala Ala Met Asn Asp Gly Arg Cys Val Thr Tyr Leu Lys Gly 405 410 415 Ala Ala Pro Leu Ile Lys Ala Pro Glu Pro 420 425 <210> 11 <211> 5 <212> PRT <213> Schizochytrium sp. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4) <223> X = any amino acid <400> 11 Gly His Ser Xaa Gly 1 5 <210> 12 <211> 258 <212> DNA <213> Schizochytrium sp. <220> <221> CDS <222> (1)..(258) <400> 12 gct gtc tcg aac gag ctt ctt gag aag gcc gag act gtc gtc atg gag 48 Ala Val Ser Asn Glu Leu Leu Glu Lys Ala Glu Thr Val Val Met Glu 1 5 10 15 gtc ctc gcc gcc aag acc ggc tac gag acc gac atg atc gag gct gac 96 Val Leu Ala Ala Lys Thr Gly Tyr Glu Thr Asp Met Ile Glu Ala Asp 20 25 30 atg gag ctc gag acc gag ctc ggc att gac tcc atc aag cgt gtc gag 144 Met Glu Leu Glu Thr Glu Leu Gly Ile Asp Ser Ile Lys Arg Val Glu 35 40 45 atc ctc tcc gag gtc cag gcc atg ctc aat gtc gag gcc aag gat gtc 192 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agctcgagac cgagctcggc 840 attgactcca tcaagcgtgt cgagattctc tccgaggtcc aggccatgct caacgtcgag 900 gccaaggacg tcgacgctct cagccgcacc cgcactgttg gcgaggtcgt cgatgccatg 960 aaggccgaga tcgctggtgg ctctgccccg gcgcctgccg ccgctgctcc tgctccggct 1020 gctgccgccc ctgcgcctgc cgcccctgcg cctgctgtct cgagcgagct tctcgagaag 1080 gccgagactg tcgtcatgga ggtcctcgcc gccaagactg gctacgagac tgacatgatc 1140 gagtccgaca tggagctcga gaccgagctc ggcattgact ccatcaagcg tgtcgagatt 1200 ctctccgagg tccaggccat gctcaacgtc gaggccaagg acgtcgacgc tctcagccgc 1260 acccgcactg ttggcgaggt cgtcgatgcc atgaaggccg agatcgctgg tggctctgcc 1320 ccggcgcctg ccgccgctgc tcctgctccg gctgctgccg cccctgcgcc tgccgcccct 1380 gcgcctgccg cccctgcgcc tgctgtctcg agcgagcttc tcgagaaggc cgagactgtc 1440 gtcatggagg tcctcgccgc caagactggc tacgagactg acatgattga gtccgacatg 1500 gagctcgaga ccgagctcgg cattgactcc atcaagcgtg tcgagattct ctccgaggtt 1560 caggccatgc tcaacgtcga ggccaaggac gtcgacgctc tcagccgcac tcgcactgtt 1620 ggtgaggtcg tcgatgccat gaaggctgag atcgctggca gctccgcctc ggcgcctgcc 1680 gccgctgctc ctgctccggc tgctgccgct cctgcgcccg ctgccgccgc ccctgctgtc 1740 tcgaacgagc ttctcgagaa agccgagact gtcgtcatgg aggtcctcgc cgccaagact 1800 ggctacgaga ctgacatgat cgagtccgac atggagctcg agactgagct cggcattgac 1860 tccatcaagc gtgtcgagat cctctccgag gttcaggcca tgctcaacgt cgaggccaag 1920 gacgtcgatg ccctcagccg cacccgcact gttggcgagg ttgtcgatgc catgaaggcc 1980 gagatcgctg gtggctctgc cccggcgcct gccgccgctg cccctgctcc ggctgccgcc 2040 gcccctgctg tctcgaacga gcttctcgag aaggccgaga ctgtcgtcat ggaggtcctc 2100 gccgccaaga ctggctacga gaccgacatg atcgagtccg acatggagct cgagaccgag 2160 ctcggcattg actccatcaa gcgtgtcgag attctctccg aggttcaggc catgctcaac 2220 gtcgaggcca aggacgtcga tgctctcagc cgcactcgca ctgttggcga ggtcgtcgat 2280 gccatgaagg ctgagatcgc cggcagctcc gccccggcgc ctgccgccgc tgctcctgct 2340 ccggctgctg ccgctcctgc gcccgctgcc gctgcccctg ctgtctcgag cgagcttctc 2400 gagaaggccg agaccgtcgt catggaggtc ctcgccgcca agactggcta cgagactgac 2460 atgattgagt ccgacatgga gctcgagact gagctcggca ttgactccat caagcgtgtc 2520 gagatcctct ccgaggttca ggccatgctc aacgtcgagg ccaaggacgt cgatgccctc 2580 agccgcaccc gcactgttgg cgaggttgtc gatgccatga aggccgagat cgctggtggc 2640 tctgccccgg cgcctgccgc cgctgcccct gctccggctg ccgccgcccc tgctgtctcg 2700 aacgagcttc ttgagaaggc cgagaccgtc gtcatggagg tcctcgccgc caagactggc 2760 tacgagaccg acatgatcga gtccgacatg gagctcgaga ccgagctcgg cattgactcc 2820 atcaagcgtg tcgagattct ctccgaggtt caggccatgc tcaacgtcga ggccaaggac 2880 gtcgacgctc tcagccgcac tcgcactgtt ggcgaggtcg tcgatgccat gaaggctgag 2940 atcgctggtg gctctgcccc ggcgcctgcc gccgctgctc ctgcctcggc tggcgccgcg 3000 cctgcg 3006 <210> 17 <211> 2133 <212> DNA <213> Schizochytrium sp. <220> <221> CDS <222> (1)..(2133) <400> 17 ttt ggc gct ctc ggc ggc ttc atc tcg cag cag gcg gag cgc ttc gag 48 Phe Gly Ala Leu Gly Gly Phe Ile Ser Gln Gln Ala Glu Arg Phe Glu 1 5 10 15 ccc gcc gaa atc ctc ggc ttc acg ctc atg tgc gcc aag ttc gcc aag 96 Pro Ala Glu Ile Leu Gly Phe Thr Leu Met Cys Ala Lys Phe Ala Lys 20 25 30 gct tcc ctc tgc acg gct gtg gct ggc ggc cgc ccg gcc ttt atc ggt 144 Ala Ser Leu Cys Thr Ala Val Ala Gly Gly Arg Pro Ala Phe Ile Gly 35 40 45 gtg gcg cgc ctt gac ggc cgc ctc gga ttc act tcg cag ggc act tct 192 Val Ala Arg Leu Asp Gly Arg Leu Gly Phe Thr Ser Gln Gly Thr Ser 50 55 60 gac gcg ctc aag cgt gcc cag cgt ggt gcc atc ttt ggc ctc tgc aag 240 Asp Ala Leu Lys Arg Ala Gln Arg Gly Ala Ile Phe Gly Leu Cys Lys 65 70 75 80 acc atc ggc ctc gag tgg tcc gag tct gac gtc ttt tcc cgc ggc gtg 288 Thr Ile Gly Leu Glu Trp Ser Glu Ser Asp Val Phe Ser Arg Gly Val 85 90 95 gac att gct cag ggc atg cac ccc gag gat gcc gcc gtg gcg att gtg 336 Asp Ile Ala Gln Gly Met His Pro Glu Asp Ala Ala Val Ala Ile Val 100 105 110 cgc gag atg gcg tgc gct gac att cgc att cgc gag gtc ggc att ggc 384 Arg Glu Met Ala Cys Ala Asp Ile Arg Ile Arg Glu Val Gly Ile Gly 115 120 125 gca aac cag cag cgc tgc acg atc cgt gcc gcc aag ctc gag acc ggc 432 Ala Asn Gln Gln Arg Cys Thr Ile Arg Ala Ala Lys Leu Glu Thr Gly 130 135 140 aac ccg cag cgc cag atc gcc aag gac gac gtg ctg ctc gtt tct ggc 480 Asn Pro Gln Arg Gln Ile Ala Lys Asp Asp Val Leu Leu Val Ser Gly 145 150 155 160 ggc gct cgc ggc atc acg cct ctt tgc atc cgg gag atc acg cgc cag 528 Gly Ala Arg Gly Ile Thr Pro Leu Cys Ile Arg Glu Ile Thr Arg Gln 165 170 175 atc gcg ggc ggc aag tac att ctg ctt ggc cgc agc aag gtc tct gcg 576 Ile Ala Gly Gly Lys Tyr Ile Leu Leu Gly Arg Ser Lys Val Ser Ala 180 185 190 agc gaa ccg gca tgg tgc gct ggc atc act gac gag aag gct gtg caa 624 Ser Glu Pro Ala Trp Cys Ala Gly Ile Thr Asp Glu Lys Ala Val Gln 195 200 205 aag gct gct acc cag gag ctc aag cgc gcc ttt agc gct ggc gag ggc 672 Lys Ala Ala Thr Gln Glu Leu Lys Arg Ala Phe Ser Ala Gly Glu Gly 210 215 220 ccc aag ccc acg ccc cgc gct gtc act aag ctt gtg ggc tct gtt ctt 720 Pro Lys Pro Thr Pro Arg Ala Val Thr Lys Leu Val Gly Ser Val Leu 225 230 235 240 ggc gct cgc gag gtg cgc agc tct att gct gcg att gaa gcg ctc ggc 768 Gly Ala Arg Glu Val Arg Ser Ser Ile Ala Ala Ile Glu Ala Leu Gly 245 250 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atc 2112 His Asn Glu Gln Gly Asp Leu Phe Ile Asp Val Gln Ala Ser Val Ile 690 695 700 gcc acg gac agc ctt gcc ttc 2133 Ala Thr Asp Ser Leu Ala Phe 705 710 <210> 18 <211> 711 <212> PRT <213> Schizochytrium sp. <400> 18 Phe Gly Ala Leu Gly Gly Phe Ile Ser Gln Gln Ala Glu Arg Phe Glu 1 5 10 15 Pro Ala Glu Ile Leu Gly Phe Thr Leu Met Cys Ala Lys Phe Ala Lys 20 25 30 Ala Ser Leu Cys Thr Ala Val Ala Gly Gly Arg Pro Ala Phe Ile Gly 35 40 45 Val Ala Arg Leu Asp Gly Arg Leu Gly Phe Thr Ser Gln Gly Thr Ser 50 55 60 Asp Ala Leu Lys Arg Ala Gln Arg Gly Ala Ile Phe Gly Leu Cys Lys 65 70 75 80 Thr Ile Gly Leu Glu Trp Ser Glu Ser Asp Val Phe Ser Arg Gly Val 85 90 95 Asp Ile Ala Gln Gly Met His Pro Glu Asp Ala Ala Val Ala Ile Val 100 105 110 Arg Glu Met Ala Cys Ala Asp Ile Arg Ile Arg Glu Val Gly Ile Gly 115 120 125 Ala Asn Gln Gln Arg Cys Thr Ile Arg Ala Ala Lys Leu Glu Thr Gly 130 135 140 Asn Pro Gln Arg Gln Ile Ala Lys Asp Asp Val Leu Leu Val Ser Gly 145 150 155 160 Gly Ala Arg Gly Ile Thr Pro Leu 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Arg Gly Ile Asp Asp Val Leu 580 585 590 Ser Cys Thr Lys Ser Gln Leu Val Ala Lys Cys Ser Ala Val Pro Gly 595 600 605 Ser Asp Ala Ala Arg Gly Glu Phe Ala Thr Asp Thr Asp Ala His Asp 610 615 620 Pro Phe Val Asn Asp Leu Ala Phe Gln Ala Met Leu Val Trp Val Arg 625 630 635 640 Arg Thr Leu Gly Gln Ala Ala Leu Pro Asn Ser Ile Gln Arg Ile Val 645 650 655 Gln His Arg Pro Val Pro Gln Asp Lys Pro Phe Tyr Ile Thr Leu Arg 660 665 670 Ser Asn Gln Ser Gly Gly His Ser Gln His Lys His Ala Leu Gln Phe 675 680 685 His Asn Glu Gln Gly Asp Leu Phe Ile Asp Val Gln Ala Ser Val Ile 690 695 700 Ala Thr Asp Ser Leu Ala Phe 705 710 <210> 19 <211> 1350 <212> DNA <213> Schizochytrium sp. <220> <221> CDS <222> (1)..(1350) <400> 19 atg gcc gct cgg aat gtg agc gcc gcg cat gag atg cac gat gaa aag 48 Met Ala Ala Arg Asn Val Ser Ala Ala His Glu Met His Asp Glu Lys 1 5 10 15 cgc atc gcc gtc gtc ggc atg gcc gtc cag tac gcc gga tgc aaa acc 96 Arg Ile Ala Val Val Gly Met Ala Val Gln Tyr Ala Gly Cys Lys Thr 20 25 30 aag gac gag ttc tgg gag gtg ctc atg aac ggc aag gtc gag tcc aag 144 Lys Asp Glu Phe Trp Glu Val Leu Met Asn Gly Lys Val Glu Ser Lys 35 40 45 gtg atc agc gac aaa cga ctc ggc tcc aac tac cgc gcc gag cac tac 192 Val Ile Ser Asp Lys Arg Leu Gly Ser Asn Tyr Arg Ala Glu His Tyr 50 55 60 aaa gca gag cgc agc aag tat gcc gac acc ttt tgc aac gaa acg tac 240 Lys Ala Glu Arg Ser Lys Tyr Ala Asp Thr Phe Cys Asn Glu Thr Tyr 65 70 75 80 ggc acc ctt gac gag aac gag atc gac aac gag cac gaa ctc ctc ctc 288 Gly Thr Leu Asp Glu Asn Glu Ile Asp Asn Glu His Glu Leu Leu Leu 85 90 95 aac ctc gcc aag cag gca ctc gca gag aca tcc gtc aaa gac tcg aca 336 Asn Leu Ala Lys Gln Ala Leu Ala Glu Thr Ser Val Lys Asp Ser Thr 100 105 110 cgc tgc ggc atc gtc agc ggc tgc ctc tcg ttc ccc atg gac aac ctc 384 Arg Cys Gly Ile Val Ser Gly Cys Leu Ser Phe Pro Met Asp Asn Leu 115 120 125 cag ggt gaa ctc ctc aac gtg tac caa aac cat gtc gag aaa aag ctc 432 Gln Gly Glu Leu Leu Asn Val Tyr Gln Asn His Val Glu Lys Lys Leu 130 135 140 ggg gcc 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Asp Glu Phe Trp Gln Gly Tyr Ile Val Arg 290 295 300 ggc acc aag cag gat atc gag gcg gcc atc gcc ccg gac agc aag tac 960 Gly Thr Lys Gln Asp Ile Glu Ala Ala Ile Ala Pro Asp Ser Lys Tyr 305 310 315 320 gtg cgc ctc acc atc atc aat gat gcc aac acc gcc ctc att agc ggc 1008 Val Arg Leu Thr Ile Ile Asn Asp Ala Asn Thr Ala Leu Ile Ser Gly 325 330 335 aag ccc gac gcc tgc aag gct gcg atc gcg cgt ctc ggt ggc aac att 1056 Lys Pro Asp Ala Cys Lys Ala Ala Ile Ala Arg Leu Gly Gly Asn Ile 340 345 350 cct gcg ctt ccc gtg acc cag ggc atg tgc ggc cac tgc ccc gag gtg 1104 Pro Ala Leu Pro Val Thr Gln Gly Met Cys Gly His Cys Pro Glu Val 355 360 365 gga cct tat acc aag gat atc gcc aag atc cat gcc aac ctt gag ttc 1152 Gly Pro Tyr Thr Lys Asp Ile Ala Lys Ile His Ala Asn Leu Glu Phe 370 375 380 ccc gtt gtc gac ggc ctt gac ctc tgg acc aca atc aac cag aag cgc 1200 Pro Val Val Asp Gly Leu Asp Leu Trp Thr Thr Ile Asn Gln Lys Arg 385 390 395 400 ctc gtg cca cgc gcc acg ggc gcc aag gac gaa tgg gcc cct tct tcc 1248 Leu Val Pro Arg Ala Thr Gly Ala Lys Asp Glu Trp Ala Pro Ser Ser 405 410 415 ttt ggc gag tac gcc ggc cag ctc tac gag aag cag gct aac ttc ccc 1296 Phe Gly Glu Tyr Ala Gly Gln Leu Tyr Glu Lys Gln Ala Asn Phe Pro 420 425 430 caa atc gtc gag acc att tac aag caa aac tac gac gtc ttt gtc gag 1344 Gln Ile Val Glu Thr Ile Tyr Lys Gln Asn Tyr Asp Val Phe Val Glu 435 440 445 gtt ggg ccc aac aac cac cgt agc acc gca gtg cgc acc acg ctt ggt 1392 Val Gly Pro Asn Asn His Arg Ser Thr Ala Val Arg Thr Thr Leu Gly 450 455 460 ccc cag cgc aac cac ctt gct ggc gcc atc gac aag cag aac gag gat 1440 Pro Gln Arg Asn His Leu Ala Gly Ala Ile Asp Lys Gln Asn Glu Asp 465 470 475 480 gct tgg acg acc atc gtc aag ctt gtg gct tcg ctc aag gcc cac ctt 1488 Ala Trp Thr Thr Ile Val Lys Leu Val Ala Ser Leu Lys Ala His Leu 485 490 495 gtt cct ggc gtc 1500 Val Pro Gly Val 500 <210> 24 <211> 500 <212> PRT <213> Schizochytrium sp. <400> 24 Cys Tyr Ser Val Leu Leu Ser Glu Ala Glu Gly His Tyr Glu Arg Glu 1 5 10 15 Asn Arg Ile Ser Leu Asp Glu Glu Ala Pro Lys Leu Ile Val Leu Arg 20 25 30 Ala Asp Ser His Glu Glu Ile Leu Gly Arg Leu Asp Lys Ile Arg Glu 35 40 45 Arg Phe Leu Gln Pro Thr Gly Ala Ala Pro Arg Glu Ser Glu Leu Lys 50 55 60 Ala Gln Ala Arg Arg Ile Phe Leu Glu Leu Leu Gly Glu Thr Leu Ala 65 70 75 80 Gln Asp Ala Ala Ser Ser Gly Ser Gln Lys Pro Leu Ala Leu Ser Leu 85 90 95 Val Ser Thr Pro Ser Lys Leu Gln Arg Glu Val Glu Leu Ala Ala Lys 100 105 110 Gly Ile Pro Arg Cys Leu Lys Met Arg Arg Asp Trp Ser Ser Pro Ala 115 120 125 Gly Ser Arg Tyr Ala Pro Glu Pro Leu Ala Ser Asp Arg Val Ala Phe 130 135 140 Met Tyr Gly Glu Gly Arg Ser Pro Tyr Tyr Gly Ile Thr Gln Asp Ile 145 150 155 160 His Arg Ile Trp Pro Glu Leu His Glu Val Ile Asn Glu Lys Thr Asn 165 170 175 Arg Leu Trp Ala Glu Gly Asp Arg Trp Val Met Pro Arg Ala Ser Phe 180 185 190 Lys Ser Glu Leu Glu Ser Gln Gln Gln Glu Phe Asp Arg Asn Met Ile 195 200 205 Glu Met Phe Arg Leu Gly Ile Leu Thr Ser Ile Ala Phe Thr Asn Leu 210 215 220 Ala Arg Asp Val Leu Asn Ile Thr Pro Lys Ala Ala Phe Gly Leu Ser 225 230 235 240 Leu Gly Glu Ile Ser Met Ile Phe Ala Phe Ser Lys Lys Asn Gly Leu 245 250 255 Ile Ser Asp Gln Leu Thr Lys Asp Leu Arg Glu Ser Asp Val Trp Asn 260 265 270 Lys Ala Leu Ala Val Glu Phe Asn Ala Leu Arg Glu Ala Trp Gly Ile 275 280 285 Pro Gln Ser Val Pro Lys Asp Glu Phe Trp Gln Gly Tyr Ile Val Arg 290 295 300 Gly Thr Lys Gln Asp Ile Glu Ala Ala Ile Ala Pro Asp Ser Lys Tyr 305 310 315 320 Val Arg Leu Thr Ile Ile Asn Asp Ala Asn Thr Ala Leu Ile Ser Gly 325 330 335 Lys Pro Asp Ala Cys Lys Ala Ala Ile Ala Arg Leu Gly Gly Asn Ile 340 345 350 Pro Ala Leu Pro Val Thr Gln Gly Met Cys Gly His Cys Pro Glu Val 355 360 365 Gly Pro Tyr Thr Lys Asp Ile Ala Lys Ile His Ala Asn Leu Glu Phe 370 375 380 Pro Val Val Asp Gly Leu Asp Leu Trp Thr Thr Ile Asn Gln Lys Arg 385 390 395 400 Leu Val Pro Arg Ala Thr Gly Ala Lys Asp Glu Trp Ala Pro Ser Ser 405 410 415 Phe Gly Glu Tyr Ala Gly Gln Leu Tyr Glu Lys Gln Ala Asn Phe Pro 420 425 430 Gln Ile Val Glu Thr Ile Tyr Lys Gln 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atc ctt gcg tcc 240 Ser Ala Asp Leu Val Ile Ala Ala Gly Arg Gln Gly Ile Leu Ala Ser 65 70 75 80 ttt ggc gcc ggc gga ctt ccc atg cag gtt gtg cgt gag tcc atc gaa 288 Phe Gly Ala Gly Gly Leu Pro Met Gln Val Val Arg Glu Ser Ile Glu 85 90 95 aag att cag gcc gcc ctg ccc aat ggc ccg tac gct gtc aac ctt atc 336 Lys Ile Gln Ala Ala Leu Pro Asn Gly Pro Tyr Ala Val Asn Leu Ile 100 105 110 cat tct ccc ttt gac agc aac ctc gaa aag ggc aat gtc gat ctc ttc 384 His Ser Pro Phe Asp Ser Asn Leu Glu Lys Gly Asn Val Asp Leu Phe 115 120 125 ctc gag aag ggt gtc acc ttt gtc gag gcc tcg gcc ttt atg acg ctc 432 Leu Glu Lys Gly Val Thr Phe Val Glu Ala Ser Ala Phe Met Thr Leu 130 135 140 acc ccg cag gtc gtg cgg tac cgc gcg gct ggc ctc acg cgc aac gcc 480 Thr Pro Gln Val Val Arg Tyr Arg Ala Ala Gly Leu Thr Arg Asn Ala 145 150 155 160 gac ggc tcg gtc aac atc cgc aac cgt atc att ggc aag gtc tcg cgc 528 Asp Gly Ser Val Asn Ile Arg Asn Arg Ile Ile Gly Lys Val Ser Arg 165 170 175 acc gag ctc gcc gag atg ttc atg cgt cct gcg ccc gag cac ctt ctt 576 Thr Glu Leu Ala Glu Met Phe Met Arg Pro Ala Pro Glu His Leu Leu 180 185 190 cag aag ctc att gct tcc ggc gag atc aac cag gag cag gcc gag ctc 624 Gln Lys Leu Ile Ala Ser Gly Glu Ile Asn Gln Glu Gln Ala Glu Leu 195 200 205 gcc cgc cgt gtt ccc gtc gct gac gac atc gcg gtc gaa gct gac tcg 672 Ala Arg Arg Val Pro Val Ala Asp Asp Ile Ala Val Glu Ala Asp Ser 210 215 220 ggt ggc cac acc gac aac cgc ccc atc cac gtc att ctg ccc ctc atc 720 Gly Gly His Thr Asp Asn Arg Pro Ile His Val Ile Leu Pro Leu Ile 225 230 235 240 atc aac ctt cgc gac cgc ctt cac cgc gag tgc ggc tac ccg gcc aac 768 Ile Asn Leu Arg Asp Arg Leu His Arg Glu Cys Gly Tyr Pro Ala Asn 245 250 255 ctt cgc gtc cgt gtg ggc gcc ggc ggt ggc att ggg tgc ccc cag gcg 816 Leu Arg Val Arg Val Gly Ala Gly Gly Gly Ile Gly Cys Pro Gln Ala 260 265 270 gcg ctg gcc acc ttc aac atg ggt gcc tcc ttt att gtc acc ggc acc 864 Ala Leu Ala Thr Phe Asn Met Gly Ala Ser Phe Ile Val Thr Gly Thr 275 280 285 gtg aac cag gtc gcc aag cag tcg ggc acg tgc gac aat gtg cgc aag 912 Val Asn Gln Val Ala Lys Gln Ser Gly Thr Cys Asp Asn Val Arg Lys 290 295 300 cag ctc gcg aag gcc act tac tcg gac gta tgc atg gcc ccg gct gcc 960 Gln Leu Ala Lys Ala Thr Tyr Ser Asp Val Cys Met Ala Pro Ala Ala 305 310 315 320 gac atg ttc gag gaa ggc gtc aag ctt cag gtc ctc aag aag gga acc 1008 Asp Met Phe Glu Glu Gly Val Lys Leu Gln Val Leu Lys Lys Gly Thr 325 330 335 atg ttt ccc tcg cgc gcc aac aag ctc tac gag ctc ttt tgc aag tac 1056 Met Phe Pro Ser Arg Ala Asn Lys Leu Tyr Glu Leu Phe Cys Lys Tyr 340 345 350 gac tcg ttc gag tcc atg ccc ccc gca gag ctt gcg cgc gtc gag aag 1104 Asp Ser Phe Glu Ser Met Pro Pro Ala Glu Leu Ala Arg Val Glu Lys 355 360 365 cgc atc ttc agc cgc gcg ctc gaa gag gtc tgg gac gag acc aaa aac 1152 Arg Ile Phe Ser Arg Ala Leu Glu Glu Val Trp Asp Glu Thr Lys Asn 370 375 380 ttt tac att aac cgt ctt cac aac ccg gag aag atc cag cgc gcc gag 1200 Phe Tyr Ile Asn Arg Leu His Asn Pro Glu Lys Ile Gln Arg Ala Glu 385 390 395 400 cgc gac 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26 <211> 510 <212> PRT <213> Schizochytrium sp. <400> 26 Leu Leu Asp Leu Asp Ser Met Leu Ala Leu Ser Ser Ala Ser Ala Ser 1 5 10 15 Gly Asn Leu Val Glu Thr Ala Pro Ser Asp Ala Ser Val Ile Val Pro 20 25 30 Pro Cys Asn Ile Ala Asp Leu Gly Ser Arg Ala Phe Met Lys Thr Tyr 35 40 45 Gly Val Ser Ala Pro Leu Tyr Thr Gly Ala Met Ala Lys Gly Ile Ala 50 55 60 Ser Ala Asp Leu Val Ile Ala Ala Gly Arg Gln Gly Ile Leu Ala Ser 65 70 75 80 Phe Gly Ala Gly Gly Leu Pro Met Gln Val Val Arg Glu Ser Ile Glu 85 90 95 Lys Ile Gln Ala Ala Leu Pro Asn Gly Pro Tyr Ala Val Asn Leu Ile 100 105 110 His Ser Pro Phe Asp Ser Asn Leu Glu Lys Gly Asn Val Asp Leu Phe 115 120 125 Leu Glu Lys Gly Val Thr Phe Val Glu Ala Ser Ala Phe Met Thr Leu 130 135 140 Thr Pro Gln Val Val Arg Tyr Arg Ala Ala Gly Leu Thr Arg Asn Ala 145 150 155 160 Asp Gly Ser Val Asn Ile Arg Asn Arg Ile Ile Gly Lys Val Ser Arg 165 170 175 Thr Glu Leu Ala Glu Met Phe Met Arg Pro Ala Pro Glu His Leu Leu 180 185 190 Gln Lys Leu Ile Ala Ser Gly Glu Ile Asn 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Phe Arg Trp Tyr Leu Ser 405 410 415 Leu Ala Ser Arg Trp Ala Asn Thr Gly Ala Ser Asp Arg Val Met Asp 420 425 430 Tyr Gln Val Trp Cys Gly Pro Ala Ile Gly Ser Phe Asn Asp Phe Ile 435 440 445 Lys Gly Thr Tyr Leu Asp Pro Ala Val Ala Asn Glu Tyr Pro Cys Val 450 455 460 Val Gln Ile Asn Lys Gln Ile Leu Arg Gly Ala Cys Phe Leu Arg Arg 465 470 475 480 Leu Glu Ile Leu Arg Asn Ala Arg Leu Ser Asp Gly Ala Ala Ala Leu 485 490 495 Val Ala Ser Ile Asp Asp Thr Tyr Val Pro Ala Glu Lys Leu 500 505 510 <210> 27 <211> 1350 <212> DNA <213> Schizochytrium sp. <220> <221> CDS <222> (1)..(1350) <400> 27 atg gcg ctc cgt gtc aag acg aac aag aag cca tgc tgg gag atg acc 48 Met Ala Leu Arg Val Lys Thr Asn Lys Lys Pro Cys Trp Glu Met Thr 1 5 10 15 aag gag gag ctg acc agc ggc aag acc gag gtg ttc aac tat gag gaa 96 Lys Glu Glu Leu Thr Ser Gly Lys Thr Glu Val Phe Asn Tyr Glu Glu 20 25 30 ctc ctc gag ttc gca gag ggc gac atc gcc aag gtc ttc gga ccc gag 144 Leu Leu Glu Phe Ala Glu Gly Asp Ile Ala Lys Val Phe Gly Pro Glu 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gac agc aac ctc gag aag ggc aac gtc gat ctc ttc ctc gag aag 384 Phe Asp Ser Asn Leu Glu Lys Gly Asn Val Asp Leu Phe Leu Glu Lys 115 120 125 ggc gtc act gtg gtg gag gcc tcg gca ttc atg acc ctc acc ccg cag 432 Gly Val Thr Val Val Glu Ala Ser Ala Phe Met Thr Leu Thr Pro Gln 130 135 140 gtc gtg cgc tac cgc gcc gcc ggc ctc tcg cgc aac gcc gac ggt tcg 480 Val Val Arg Tyr Arg Ala Ala Gly Leu Ser Arg Asn Ala Asp Gly Ser 145 150 155 160 gtc aac atc cgc aac cgc atc atc ggc aag gtc tcg cgc acc gag ctc 528 Val Asn Ile Arg Asn Arg Ile Ile Gly Lys Val Ser Arg Thr Glu Leu 165 170 175 gcc gag atg ttc atc cgc ccg gcc ccg gag cac ctc ctc gag aag ctc 576 Ala Glu Met Phe Ile Arg Pro Ala Pro Glu His Leu Leu Glu Lys Leu 180 185 190 atc gcc tcg ggc gag atc acc cag gag cag gcc gag ctc gcg cgc cgc 624 Ile Ala Ser Gly Glu Ile Thr Gln Glu Gln Ala Glu Leu Ala Arg Arg 195 200 205 gtt ccc gtc gcc gac gat atc gct gtc gag gct gac tcg ggc ggc cac 672 Val Pro Val Ala Asp Asp Ile Ala Val Glu Ala Asp Ser Gly Gly His 210 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atg gcg aac gct agt gac gga gct atg gca gca 2208 Lys Arg Ala Lys Ala Met Ala Asn Ala Ser Asp Gly Ala Met Ala Ala 725 730 735 gtg att ggc cca gat gca cgt cta gtt acg cca caa aat agt gac gtt 2256 Val Ile Gly Pro Asp Ala Arg Leu Val Thr Pro Gln Asn Ser Asp Val 740 745 750 tat gtc gca aac ttc aac tcc gca act caa gta gtc atc agt ggc act 2304 Tyr Val Ala Asn Phe Asn Ser Ala Thr Gln Val Val Ile Ser Gly Thr 755 760 765 gtt caa ggt gtg aaa gaa gag tcg aaa ttg ctc att tca aag ggg ttc 2352 Val Gln Gly Val Lys Glu Glu Ser Lys Leu Leu Ile Ser Lys Gly Phe 770 775 780 cgc gta ctg cca ctt aaa tgc cag ggc gcc ttc cat tct cct ttg atg 2400 Arg Val Leu Pro Leu Lys Cys Gln Gly Ala Phe His Ser Pro Leu Met 785 790 795 800 ggg cct tct gag gat agt ttc aaa tca ctt gtg gag act tgt acc atc 2448 Gly Pro Ser Glu Asp Ser Phe Lys Ser Leu Val Glu Thr Cys Thr Ile 805 810 815 tcg ccg cca aaa aat gtg aaa ttc ttt tgc aat gtt agt ggc aag gaa 2496 Ser Pro Pro Lys Asn Val Lys Phe Phe Cys Asn Val Ser Gly Lys Glu 820 825 830 agc cca aac cca aaa cag acc ctc aag tca cac atg acg tct agc gtt 2544 Ser Pro Asn Pro Lys Gln Thr Leu Lys Ser His Met Thr Ser Ser Val 835 840 845 cag ttc gag gag cag att cgt aac atg tac gat gcc gga gca cgt gtt 2592 Gln Phe Glu Glu Gln Ile Arg Asn Met Tyr Asp Ala Gly Ala Arg Val 850 855 860 ttt ctg gag ttt gga ccc cgc caa gtc ctt gca aag ctt atc gcg gaa 2640 Phe Leu Glu Phe Gly Pro Arg Gln Val Leu Ala Lys Leu Ile Ala Glu 865 870 875 880 atg ttt ccc tcg tgt aca gct atc agc gtt aac ccc gcg agc agt ggt 2688 Met Phe Pro Ser Cys Thr Ala Ile Ser Val Asn Pro Ala Ser Ser Gly 885 890 895 gac agt gac gtg caa ctc cgc ctc gcc gcc gta aaa ttc gcg gtc tcg 2736 Asp Ser Asp Val Gln Leu Arg Leu Ala Ala Val Lys Phe Ala Val Ser 900 905 910 ggt gca gcc ctt agc acc ttt gat cca tgg gag tat cgc aag cca caa 2784 Gly Ala Ala Leu Ser Thr Phe Asp Pro Trp Glu Tyr Arg Lys Pro Gln 915 920 925 gat ctt ctt att cga aaa cca cga aaa act gcc ctt gtt cta tca gca 2832 Asp Leu Leu Ile Arg Lys Pro Arg Lys Thr Ala Leu Val Leu 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Phe Ala Val 1040 1045 1050 cgt tct gtt gca gtg gac aac acc gcg ccg tat gct gac caa gtt 3204 Arg Ser Val Ala Val Asp Asn Thr Ala Pro Tyr Ala Asp Gln Val 1055 1060 1065 tcg acc cca gcg tca gag cgg tcg gct tca ccg ctt ttc gag aaa 3249 Ser Thr Pro Ala Ser Glu Arg Ser Ala Ser Pro Leu Phe Glu Lys 1070 1075 1080 cgc agt tcg gtt tcg tca gca cgc ctc gct gaa gct gaa gcc gcg 3294 Arg Ser Ser Val Ser Ser Ala Arg Leu Ala Glu Ala Glu Ala Ala 1085 1090 1095 gta ctg agc gtt ctc gca gac aag aca ggc tac gac agc tca atg 3339 Val Leu Ser Val Leu Ala Asp Lys Thr Gly Tyr Asp Ser Ser Met 1100 1105 1110 atc gag atg gac atg gac ctg gag agt gag ctt ggc gtt gat agc 3384 Ile Glu Met Asp Met Asp Leu Glu Ser Glu Leu Gly Val Asp Ser 1115 1120 1125 atc aaa cgc gtg gag atc atg agc gag gtt caa acg ctg ctc agc 3429 Ile Lys Arg Val Glu Ile Met Ser Glu Val Gln Thr Leu Leu Ser 1130 1135 1140 gtg gaa gtc tcc gac gtt gac gct ctg tca aga acc aag act gtt 3474 Val Glu Val Ser Asp Val Asp Ala Leu Ser Arg Thr Lys Thr Val 1145 1150 1155 ggc gac gtc atc gag gcg atg aag ctg gaa ctc ggt gga ccc caa 3519 Gly Asp Val Ile Glu Ala Met Lys Leu Glu Leu Gly Gly Pro Gln 1160 1165 1170 ggc cag act ttg acc gcg gaa tcg atc cgt cag cca ccg gtg tcc 3564 Gly Gln Thr Leu Thr Ala Glu Ser Ile Arg Gln Pro Pro Val Ser 1175 1180 1185 gag cct gct gta ccg acc tca tcg tca agc agt att gct aat gtt 3609 Glu Pro Ala Val Pro Thr Ser Ser Ser Ser Ser Ile Ala Asn Val 1190 1195 1200 tcg tca gca cgc ctc gct gaa gct gaa gct gcg gta ctg agc gtt 3654 Ser Ser Ala Arg Leu Ala Glu Ala Glu Ala Ala Val Leu Ser Val 1205 1210 1215 ctc gca gac aag aca ggc tac gac agc tca atg atc gag atg gac 3699 Leu Ala Asp Lys Thr Gly Tyr Asp Ser Ser Met Ile Glu Met Asp 1220 1225 1230 atg gac ctg gag agc gag ctt ggc gtt gat agc atc aaa cgc gtg 3744 Met Asp Leu Glu Ser Glu Leu Gly Val Asp Ser Ile Lys Arg Val 1235 1240 1245 gag atc atg agc gag gtt caa acg ctg ctc agc gtg gaa gtc tcc 3789 Glu Ile Met Ser Glu Val Gln Thr Leu Leu Ser Val Glu Val Ser 1250 1255 1260 gac gtt gac gct ctg tca aga act aag act gtt ggc gac gtc atc 3834 Asp Val Asp Ala Leu Ser Arg Thr Lys Thr Val Gly Asp Val Ile 1265 1270 1275 gag gcg atg aag ctg gaa ctc ggt gga ccc caa ggc cag act ttg 3879 Glu Ala Met Lys Leu Glu Leu Gly Gly Pro Gln Gly Gln Thr Leu 1280 1285 1290 acc gcg gaa tcg atc cgt cag cca ccg gtg tct gag cct gct gta 3924 Thr Ala Glu Ser Ile Arg Gln Pro Pro Val Ser Glu Pro Ala Val 1295 1300 1305 ccg acc tca tcg tca agc agt att gct aat gtt tcg tca gca cgc 3969 Pro Thr Ser Ser Ser Ser Ser Ile Ala Asn Val Ser Ser Ala Arg 1310 1315 1320 ctc gct gaa gct gaa gcg gcg gta ctg agc gtt ctc gca gac aag 4014 Leu Ala Glu Ala Glu Ala Ala Val Leu Ser Val Leu Ala Asp Lys 1325 1330 1335 aca ggc tac gac agc tca atg atc gag atg gac atg gac ctg gag 4059 Thr Gly Tyr Asp Ser Ser Met Ile Glu Met Asp Met Asp Leu Glu 1340 1345 1350 agc gag ctt ggc gtc gac agc atc aaa cgc gtg gag atc atg agc 4104 Ser Glu Leu Gly Val Asp Ser Ile Lys Arg Val Glu Ile Met Ser 1355 1360 1365 gag gtt caa acg ctg ctc agc gtg gaa gtc tcc gac gtt gac gct 4149 Glu Val Gln Thr Leu Leu Ser Val Glu Val Ser Asp Val Asp Ala 1370 1375 1380 ctg tca aga acc aag act gtt ggc gac gtc atc gag gcg atg aag 4194 Leu Ser Arg Thr Lys Thr Val Gly Asp Val Ile Glu Ala Met Lys 1385 1390 1395 ctg gaa ctc ggt gga ccc caa ggc cag act ttg acc gcg gaa tcg 4239 Leu Glu Leu Gly Gly Pro Gln Gly Gln Thr Leu Thr Ala Glu Ser 1400 1405 1410 atc cgt cag cca ccg gtg tcc gag cct gct gta ccg acc tca tcg 4284 Ile Arg Gln Pro Pro Val Ser Glu Pro Ala Val Pro Thr Ser Ser 1415 1420 1425 tca agc agt att gct aat gtt ttg tca gca cgc ctc gct gaa gct 4329 Ser Ser Ser Ile Ala Asn Val Leu Ser Ala Arg Leu Ala Glu Ala 1430 1435 1440 gaa gcc gcg gta ctg agc gtt ctc gca gac aag aca ggc tac gac 4374 Glu Ala Ala Val Leu Ser Val Leu Ala Asp Lys Thr Gly Tyr Asp 1445 1450 1455 agc tca atg atc gag atg gac atg gac ctg gag agc gag ctt ggc 4419 Ser Ser Met Ile Glu Met Asp Met Asp Leu Glu Ser Glu Leu Gly 1460 1465 1470 gtt gat agc atc aaa cgc gtg gag atc atg agc gag gtt caa acg 4464 Val Asp Ser Ile Lys Arg Val Glu Ile Met Ser Glu Val Gln Thr 1475 1480 1485 ttg ctc agc gtg gaa gtc tcc gac gtt gac gct ctg tca aga acc 4509 Leu Leu Ser Val Glu Val Ser Asp Val Asp Ala Leu Ser Arg Thr 1490 1495 1500 aag act gtt ggc gac gtc atc gag gcg atg aag ctg gaa ctc ggt 4554 Lys Thr Val Gly Asp Val Ile Glu Ala Met Lys Leu Glu Leu Gly 1505 1510 1515 gga ccc caa ggc cag act ttg acc gcg gaa tcg atc cgt cag cca 4599 Gly Pro Gln Gly Gln Thr Leu Thr Ala Glu Ser Ile Arg Gln Pro 1520 1525 1530 ccg gtg tct gag cct gct gta ccg acc tca tcg tca agc agt att 4644 Pro Val Ser Glu Pro Ala Val Pro Thr Ser Ser Ser Ser Ser Ile 1535 1540 1545 gct aat gtt tcg tca gca cgc ctc gct gaa gct gaa gcc gcg gta 4689 Ala Asn Val Ser Ser Ala Arg Leu Ala Glu Ala Glu Ala Ala Val 1550 1555 1560 ctg agc gtt ctc gca gac aag aca ggc tac gac agc tca atg atc 4734 Leu Ser Val Leu Ala Asp Lys Thr Gly Tyr Asp Ser Ser Met Ile 1565 1570 1575 gag atg gac atg gac ctg gag agt gag ctt ggc gtc gac agc atc 4779 Glu Met Asp Met Asp Leu Glu Ser Glu Leu Gly Val Asp Ser Ile 1580 1585 1590 aaa cgc gtg gag atc atg agc gag gtt caa acg ctg ctc agc gtg 4824 Lys Arg Val Glu Ile Met Ser Glu Val Gln Thr Leu Leu Ser Val 1595 1600 1605 gaa gtc tcc gac gtt gac gct ctg tca aga acc aag act gtt ggc 4869 Glu Val Ser Asp Val Asp Ala Leu Ser Arg Thr Lys Thr Val Gly 1610 1615 1620 gac gtc atc gag gcg atg aag ctg gaa ctc ggt gga ccc caa ggc 4914 Asp Val Ile Glu Ala Met Lys Leu Glu Leu Gly Gly Pro Gln Gly 1625 1630 1635 cag act ttg acc tct gaa ccg atc cat cag cca cca gtg tcc gag 4959 Gln Thr Leu Thr Ser Glu Pro Ile His Gln Pro Pro Val Ser Glu 1640 1645 1650 cct gct gta ccg acc tca tcg tca agc agt att gct aat gtt tct 5004 Pro Ala Val Pro Thr Ser Ser Ser Ser Ser Ile Ala Asn Val Ser 1655 1660 1665 tca gca cgc ctc gct gaa gct gaa gcc gcg gta ctg agc gtt ctc 5049 Ser Ala Arg Leu Ala Glu Ala Glu Ala Ala Val Leu Ser Val Leu 1670 1675 1680 gca gac aag aca ggc tac gac agc tca atg atc gag atg gac atg 5094 Ala Asp Lys Thr Gly Tyr Asp Ser Ser Met Ile Glu Met Asp Met 1685 1690 1695 gac ctg gag agc gag ctt ggc gtt gat agc atc aaa cgc gtg gaa 5139 Asp Leu Glu Ser Glu Leu Gly Val Asp Ser Ile Lys Arg Val Glu 1700 1705 1710 atc atg agc gag gtt caa acg ctg ctc agc gtg gaa gtc tcc gac 5184 Ile Met Ser Glu Val Gln Thr Leu Leu Ser Val Glu Val Ser Asp 1715 1720 1725 gtt gac gct ctg tca aga acc aag act gtt ggc gac gtc atc gag 5229 Val Asp Ala Leu Ser Arg Thr Lys Thr Val Gly Asp Val Ile Glu 1730 1735 1740 gcg atg aag atg gaa ctc ggt gga ccc caa ggc cag act ttg acc 5274 Ala Met Lys Met Glu Leu Gly Gly Pro Gln Gly Gln Thr Leu Thr 1745 1750 1755 gcg gaa tcg atc cgt cag cca ccg gtg tct gag cct gct gta ccg 5319 Ala Glu Ser Ile Arg Gln Pro Pro Val Ser Glu Pro Ala Val Pro 1760 1765 1770 acc tca tcg tca agc agt att gct aat gtt tcg tca gca cgc ctc 5364 Thr Ser Ser Ser Ser Ser Ile Ala Asn Val Ser Ser Ala Arg Leu 1775 1780 1785 gct gaa gct gaa gcg gcg gta ctg agc gtt ctc gca gac aag aca 5409 Ala Glu Ala Glu Ala Ala Val Leu Ser Val Leu Ala Asp Lys Thr 1790 1795 1800 ggc tac gac agc tca atg atc gag atg gac atg gac ctg gag agc 5454 Gly Tyr Asp Ser Ser Met Ile Glu Met Asp Met Asp Leu Glu Ser 1805 1810 1815 gag ctt ggc gtt gat agc atc aaa cgc gtg gag atc atg agc gag 5499 Glu Leu Gly Val Asp Ser Ile Lys Arg Val Glu Ile Met Ser Glu 1820 1825 1830 gtt caa gcg ctg ctc agc gtg gaa gtc tcc gac gtt gac gct ctg 5544 Val Gln Ala Leu Leu Ser Val Glu Val Ser Asp Val Asp Ala Leu 1835 1840 1845 tca aga acc aag act gtt ggc gac gtc atc gag gcg atg aag atg 5589 Ser Arg Thr Lys Thr Val Gly Asp Val Ile Glu Ala Met Lys Met 1850 1855 1860 gaa ctc ggt gga ccc caa ggc cag act ttg acc gca gaa tcg atc 5634 Glu Leu Gly Gly Pro Gln Gly Gln Thr Leu Thr Ala Glu Ser Ile 1865 1870 1875 cgt gag cca ccg gtg tct gag cct gct gta ccg acc tca tcg tca 5679 Arg Glu Pro Pro Val Ser Glu Pro Ala Val Pro Thr Ser Ser Ser 1880 1885 1890 agt agt atc gct aat gtt tct tca gct cgc ctc gct gaa gct gaa 5724 Ser Ser Ile Ala Asn Val Ser Ser Ala Arg Leu Ala Glu Ala Glu 1895 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gct aag gtt gta caa atc tcg ctt cct agc aag ctg aaa 6084 Arg Phe Ala Lys Val Val Gln Ile Ser Leu Pro Ser Lys Leu Lys 2015 2020 2025 tcc act gtg tcg cac gat cga cct gta att gtt gta gat gat gga 6129 Ser Thr Val Ser His Asp Arg Pro Val Ile Val Val Asp Asp Gly 2030 2035 2040 acg ccc tta acc acg gag ctt tgt aaa att ctt ggg ggt aat att 6174 Thr Pro Leu Thr Thr Glu Leu Cys Lys Ile Leu Gly Gly Asn Ile 2045 2050 2055 gtg gtt ctc tct tat caa ggg aag ccc gct ggt cca cgg gga gtc 6219 Val Val Leu Ser Tyr Gln Gly Lys Pro Ala Gly Pro Arg Gly Val 2060 2065 2070 gag gtg cca gat ctt tcc gag gaa gcc cta att caa gct ctt gca 6264 Glu Val Pro Asp Leu Ser Glu Glu Ala Leu Ile Gln Ala Leu Ala 2075 2080 2085 ttg att cgg tct aca tat gga gtt cca att ggt ttt att tgt cag 6309 Leu Ile Arg Ser Thr Tyr Gly Val Pro Ile Gly Phe Ile Cys Gln 2090 2095 2100 caa gtg tct aat gtg agc acc aag gca cag ctt tgt tgg gca ctc 6354 Gln Val Ser Asn Val Ser Thr Lys Ala Gln Leu Cys Trp Ala Leu 2105 2110 2115 ctc gca gcg aag cat ctc aag aag gat ttg aat gct gtc tta ccc 6399 Leu Ala Ala Lys His Leu Lys Lys Asp Leu Asn Ala Val Leu Pro 2120 2125 2130 gat tca aga tcc ttc ttc gtc gga gtt gta cgc ttg aac ggg aaa 6444 Asp Ser Arg Ser Phe Phe Val Gly Val Val Arg Leu Asn Gly Lys 2135 2140 2145 ctt gga act ttc gaa aac atc agc gac ttc tct aaa ttt gat ttg 6489 Leu Gly Thr Phe Glu Asn Ile Ser Asp Phe Ser Lys Phe Asp Leu 2150 2155 2160 acg aaa gcc cta gat tac gga cag cgt ggt tct ctc tta ggc ctg 6534 Thr Lys Ala Leu Asp Tyr Gly Gln Arg Gly Ser Leu Leu Gly Leu 2165 2170 2175 tgc aag tca cta gac tta gaa tgg gaa cag gtg ttt tgc cgt gga 6579 Cys Lys Ser Leu Asp Leu Glu Trp Glu Gln Val Phe Cys Arg Gly 2180 2185 2190 ata gat ctt gcg tgt gat ctt atg cca ctc cag gcc gca agg ata 6624 Ile Asp Leu Ala Cys Asp Leu Met Pro Leu Gln Ala Ala Arg Ile 2195 2200 2205 ctc aga aat gag ctt cag tgt ccc aat atg cgc ctt cgc gag gtt 6669 Leu Arg Asn Glu Leu Gln Cys Pro Asn Met Arg Leu Arg Glu Val 2210 2215 2220 ggg tac gat att tct ggc gcc agg tac acc att tca 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Phe His Gly Asn Lys Gly Gln Thr Asp 2435 2440 2445 tat gca att gct aat gaa gcc ttg aac aaa atc gcg cat act ctc 7389 Tyr Ala Ile Ala Asn Glu Ala Leu Asn Lys Ile Ala His Thr Leu 2450 2455 2460 tca gcg ttt ttg ccc aaa ctg aat gca aag gtg cta gac ttc ggt 7434 Ser Ala Phe Leu Pro Lys Leu Asn Ala Lys Val Leu Asp Phe Gly 2465 2470 2475 ccg tgg gta ggt tca gga atg gta acc gaa aca ctt gag aag cat 7479 Pro Trp Val Gly Ser Gly Met Val Thr Glu Thr Leu Glu Lys His 2480 2485 2490 ttt aaa gct atg ggg gtt cag act att cct ctc gag cca gga gca 7524 Phe Lys Ala Met Gly Val Gln Thr Ile Pro Leu Glu Pro Gly Ala 2495 2500 2505 cgg act gtt gcg caa atc att ttg gca agt tcg cca ccg caa tcg 7569 Arg Thr Val Ala Gln Ile Ile Leu Ala Ser Ser Pro Pro Gln Ser 2510 2515 2520 ctt ttg ggg aac tgg ggc ttt cca gcc acc aaa ccg cta caa cgc 7614 Leu Leu Gly Asn Trp Gly Phe Pro Ala Thr Lys Pro Leu Gln Arg 2525 2530 2535 tct aat gta gtc acg ggc aca ctc tct ccg gaa gag ata gaa ttc 7659 Ser Asn Val Val Thr Gly Thr Leu Ser Pro Glu 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2650 2655 att ctt aac ttg gaa gtt gac cct gca tgc gag gtt aac ccc tat 8019 Ile Leu Asn Leu Glu Val Asp Pro Ala Cys Glu Val Asn Pro Tyr 2660 2665 2670 gat gga aag tcg ttg ttc cac ggt ccg ctt ttg caa ttc gtt caa 8064 Asp Gly Lys Ser Leu Phe His Gly Pro Leu Leu Gln Phe Val Gln 2675 2680 2685 caa gtg ttg cac tca agt acc aaa ggc ctc gtt gcc aag tgc cgc 8109 Gln Val Leu His Ser Ser Thr Lys Gly Leu Val Ala Lys Cys Arg 2690 2695 2700 gcg ctt cca atc aaa gaa gcc atc cga ggg cca ttt atc aag caa 8154 Ala Leu Pro Ile Lys Glu Ala Ile Arg Gly Pro Phe Ile Lys Gln 2705 2710 2715 aca ctc cat gat cca att cta gac gac gtc att ttt cag cta atg 8199 Thr Leu His Asp Pro Ile Leu Asp Asp Val Ile Phe Gln Leu Met 2720 2725 2730 ctc gtg tgg tgt cgt aat gct cta gga agt gca tcg cta ccc aac 8244 Leu Val Trp Cys Arg Asn Ala Leu Gly Ser Ala Ser Leu Pro Asn 2735 2740 2745 aga att gaa aag atg tca tac ttt ggg aat gtc tca gaa ggt agc 8289 Arg Ile Glu Lys Met Ser Tyr Phe Gly Asn Val Ser Glu Gly Ser 2750 2755 2760 act ttc ttt gcc tca gtt aca cct gtg gga cca aga gta cca aag 8334 Thr Phe Phe Ala Ser Val Thr Pro Val Gly Pro Arg Val Pro Lys 2765 2770 2775 gat ccc gtg atc aaa atg cag ttt ctt ctc caa gat gaa tcc ggc 8379 Asp Pro Val Ile Lys Met Gln Phe Leu Leu Gln Asp Glu Ser Gly 2780 2785 2790 aac aca ttt tca tcg ggg gag ggc tcg gtt gtg ctt agt gac gaa 8424 Asn Thr Phe Ser Ser Gly Glu Gly Ser Val Val Leu Ser Asp Glu 2795 2800 2805 ctc gtc ttt tga 8436 Leu Val Phe 2810 <210> 39 <211> 2811 <212> PRT <213> Thraustochytrium sp. <400> 39 Met Lys Asp Met Glu Asp Arg Arg Val Ala Ile Val Gly Met Ser Ala 1 5 10 15 His Leu Pro Cys Gly Thr Asp Val Lys Glu Ser Trp Gln Ala Ile Arg 20 25 30 Asp Gly Ile Asp Cys Leu Ser Asp Leu Pro Ala Asp Arg Leu Asp Val 35 40 45 Thr Ala Tyr Tyr Asn Pro Asn Lys Ala Thr Lys Asp Lys Ile Tyr Cys 50 55 60 Lys Arg Gly Gly Phe Ile Pro Asn Tyr Asp Phe Asp Pro Arg Glu Phe 65 70 75 80 Gly Leu Asn Met Phe Gln Met Glu Asp Ser Asp Ala Asn Gln Thr Leu 85 90 95 Thr Leu Leu Lys Val Lys Gln Ala Leu Glu 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Ala Leu Gly Ser Ala Ser Leu Pro Asn 2735 2740 2745 Arg Ile Glu Lys Met Ser Tyr Phe Gly Asn Val Ser Glu Gly Ser 2750 2755 2760 Thr Phe Phe Ala Ser Val Thr Pro Val Gly Pro Arg Val Pro Lys 2765 2770 2775 Asp Pro Val Ile Lys Met Gln Phe Leu Leu Gln Asp Glu Ser Gly 2780 2785 2790 Asn Thr Phe Ser Ser Gly Glu Gly Ser Val Val Leu Ser Asp Glu 2795 2800 2805 Leu Val Phe 2810 <210> 40 <211> 1500 <212> DNA <213> Thraustochytrium sp. <220> <221> CDS <222> (1)..(1500) <400> 40 atg aag gac atg gaa gat aga cgg gtc gct att gtg ggc atg tca gct 48 Met Lys Asp Met Glu Asp Arg Arg Val Ala Ile Val Gly Met Ser Ala 1 5 10 15 cac ttg cct tgt ggg aca gat gtg aag gaa tca tgg cag gct att cgc 96 His Leu Pro Cys Gly Thr Asp Val Lys Glu Ser Trp Gln Ala Ile Arg 20 25 30 gat gga atc gac tgt cta agt gac cta ccc gcg gat cgt ctc gac gtt 144 Asp Gly Ile Asp Cys Leu Ser Asp Leu Pro Ala Asp Arg Leu Asp Val 35 40 45 aca gct tac tac aat ccc aac aaa gcc acg aaa gac aag atc tac tgc 192 Thr Ala Tyr Tyr Asn Pro Asn Lys Ala Thr Lys Asp Lys Ile Tyr Cys 50 55 60 aaa cgg ggt ggc ttc atc ccg aac tat gac ttc gac ccc cgc gaa ttt 240 Lys Arg Gly Gly Phe Ile Pro Asn Tyr Asp Phe Asp Pro Arg Glu Phe 65 70 75 80 ggg ctc aac atg ttt caa atg gaa gac tct gat gcg aat cag aca ctt 288 Gly Leu Asn Met Phe Gln Met Glu Asp Ser Asp Ala Asn Gln Thr Leu 85 90 95 acc ttg ctc aaa gtc aaa caa gct ctc gaa gat gca agc ata gag cct 336 Thr Leu Leu Lys Val Lys Gln Ala Leu Glu Asp Ala Ser Ile Glu Pro 100 105 110 ttc acc aag gag aag aag aac att gga tgt gtt tta ggt att ggt ggg 384 Phe Thr Lys Glu Lys Lys Asn Ile Gly Cys Val Leu Gly Ile Gly Gly 115 120 125 ggc caa aag gcg agt cat gag ttc tac tct cgt ctc aac tac gtt gtc 432 Gly Gln Lys Ala Ser His Glu Phe Tyr Ser Arg Leu Asn Tyr Val Val 130 135 140 gtt gaa aag gta ctt cgg aaa atg ggt tta cca gat gct gat gtt gaa 480 Val Glu Lys Val Leu Arg Lys Met Gly Leu Pro Asp Ala Asp Val Glu 145 150 155 160 gaa gct gtg gag aaa tac aag gca aat ttt ccc gag tgg cgc cta gac 528 Glu Ala Val Glu Lys Tyr Lys Ala Asn Phe Pro Glu Trp Arg Leu Asp 165 170 175 tct ttc cct ggg ttt ctt ggg aat gta acg gct ggt cgg tgc agt aac 576 Ser Phe Pro Gly Phe Leu Gly Asn Val Thr Ala Gly Arg Cys Ser Asn 180 185 190 acc ttc aac atg gaa ggt atg aac tgc gtt gtg gat gct gca tgt gcc 624 Thr Phe Asn Met Glu Gly Met Asn Cys Val Val Asp Ala Ala Cys Ala 195 200 205 agt tct cta att gca atc aag gtt gca gtt gaa gag cta ctc ttt ggt 672 Ser Ser Leu Ile Ala Ile Lys Val Ala Val Glu Glu Leu Leu Phe Gly 210 215 220 gac tgt gac acc atg att gca ggt gcc acc tgc acg gac aat tca ctt 720 Asp Cys Asp Thr Met Ile Ala Gly Ala Thr Cys Thr Asp Asn Ser Leu 225 230 235 240 ggc atg tac atg gcc ttc tct aaa acg cca gtt ttt tct act gac cca 768 Gly Met Tyr Met Ala Phe Ser Lys Thr Pro Val Phe Ser Thr Asp Pro 245 250 255 agt gtc cgc gcg tat gat gag aaa aca aaa ggg atg cta att gga gaa 816 Ser Val Arg Ala Tyr Asp Glu Lys Thr Lys Gly Met Leu Ile Gly Glu 260 265 270 ggt tca gca atg ttc gtt ctt aaa cgc tat gcg gat gcc gta cgt gat 864 Gly Ser Ala Met Phe Val Leu Lys Arg Tyr Ala Asp Ala Val Arg Asp 275 280 285 ggc gac aca att cac gcg gtt ctg cgt tct tgc tct tcg tct agt gat 912 Gly Asp Thr Ile His Ala Val Leu Arg Ser Cys Ser Ser Ser Ser Asp 290 295 300 gga aaa gcg gca gga att tat act cct act ata tct gga caa gaa gaa 960 Gly Lys Ala Ala Gly Ile Tyr Thr Pro Thr Ile Ser Gly Gln Glu Glu 305 310 315 320 gct ttg cgt cga gcg tat gcc cgt gcg ggg gta tgt cca tct acg atc 1008 Ala Leu Arg Arg Ala Tyr Ala Arg Ala Gly Val Cys Pro Ser Thr Ile 325 330 335 ggg ctt gtt gag ggt cac ggg aca ggg acc cct gtt gga gat cgc att 1056 Gly Leu Val Glu Gly His Gly Thr Gly Thr Pro Val Gly Asp Arg Ile 340 345 350 gag tta aca gct ctg cgg aac ttg ttt gac aaa gct ttt ggt agc aag 1104 Glu Leu Thr Ala Leu Arg Asn Leu Phe Asp Lys Ala Phe Gly Ser Lys 355 360 365 aag gaa caa ata gca gtt ggc agc ata aag tct cag ata ggt cac ctg 1152 Lys Glu Gln Ile Ala Val Gly Ser Ile Lys Ser Gln Ile Gly His Leu 370 375 380 aaa tct gtt gcc ggc ttt gcc ggc ttg gtc aaa gct gtg ctt gcg ctt 1200 Lys Ser Val Ala Gly Phe Ala Gly Leu Val Lys Ala Val Leu Ala Leu 385 390 395 400 aaa cac aaa acg ctc cca ggt tcg att aat gtc gac cag cca cct ttg 1248 Lys His Lys Thr Leu Pro Gly Ser Ile Asn Val Asp Gln Pro Pro Leu 405 410 415 ttg tat gac ggt act caa att caa gac tct tct tta tat atc aac aag 1296 Leu Tyr Asp Gly Thr Gln Ile Gln Asp Ser Ser Leu Tyr Ile Asn Lys 420 425 430 aca aat aga cca tgg ttt acg caa aac aag ctt ccg cgt cgg gct ggt 1344 Thr Asn Arg Pro Trp Phe Thr Gln Asn Lys Leu Pro Arg Arg Ala Gly 435 440 445 gtc tca agt ttt gga ttt gga ggt gca aac tac cac gcg gtt ctg gaa 1392 Val Ser Ser Phe Gly Phe Gly Gly Ala Asn Tyr His Ala Val Leu Glu 450 455 460 gaa ttc gag ccc gag cat gaa aaa cca tac cgc ctc aat act gtt gga 1440 Glu Phe Glu Pro Glu His Glu Lys Pro Tyr Arg Leu Asn Thr Val Gly 465 470 475 480 cat cct gtc ctc ttg tac gct ccg tct gtg gaa gcc ctc aaa gta ctt 1488 His Pro Val Leu Leu Tyr Ala Pro Ser Val Glu Ala Leu Lys Val Leu 485 490 495 tgc aac gac cag 1500 Cys Asn Asp Gln 500 <210> 41 <211> 500 <212> PRT <213> Thraustochytrium sp. <400> 41 Met Lys Asp Met Glu Asp Arg Arg Val Ala Ile Val Gly Met Ser Ala 1 5 10 15 His Leu Pro Cys Gly Thr Asp Val Lys Glu Ser Trp Gln Ala Ile Arg 20 25 30 Asp Gly Ile Asp Cys Leu Ser Asp Leu Pro Ala Asp Arg Leu Asp Val 35 40 45 Thr Ala Tyr Tyr Asn Pro Asn Lys Ala Thr Lys Asp Lys Ile Tyr Cys 50 55 60 Lys Arg Gly Gly Phe Ile Pro Asn Tyr Asp Phe Asp Pro Arg Glu Phe 65 70 75 80 Gly Leu Asn Met Phe Gln Met Glu Asp Ser Asp Ala Asn Gln Thr Leu 85 90 95 Thr Leu Leu Lys Val Lys Gln Ala Leu Glu Asp Ala Ser Ile Glu Pro 100 105 110 Phe Thr Lys Glu Lys Lys Asn Ile Gly Cys Val Leu Gly Ile Gly Gly 115 120 125 Gly Gln Lys Ala Ser His Glu Phe Tyr Ser Arg Leu Asn Tyr Val Val 130 135 140 Val Glu Lys Val Leu Arg Lys Met Gly Leu Pro Asp Ala Asp Val Glu 145 150 155 160 Glu Ala Val Glu Lys Tyr Lys Ala Asn Phe Pro Glu Trp Arg Leu Asp 165 170 175 Ser Phe Pro Gly Phe Leu Gly Asn Val Thr Ala Gly Arg Cys Ser Asn 180 185 190 Thr Phe Asn Met Glu Gly Met Asn Cys Val Val Asp Ala Ala Cys Ala 195 200 205 Ser Ser Leu Ile Ala Ile Lys Val Ala Val Glu Glu Leu Leu Phe Gly 210 215 220 Asp Cys Asp Thr Met Ile Ala Gly Ala Thr Cys Thr Asp Asn Ser Leu 225 230 235 240 Gly Met Tyr Met Ala Phe Ser Lys Thr Pro Val Phe Ser Thr Asp Pro 245 250 255 Ser Val Arg Ala Tyr Asp Glu Lys Thr Lys Gly Met Leu Ile Gly Glu 260 265 270 Gly Ser Ala Met Phe Val Leu Lys Arg Tyr Ala Asp Ala Val Arg Asp 275 280 285 Gly Asp Thr Ile His Ala Val Leu Arg Ser Cys Ser Ser Ser Ser Asp 290 295 300 Gly Lys Ala Ala Gly Ile Tyr Thr Pro Thr Ile Ser Gly Gln Glu Glu 305 310 315 320 Ala Leu Arg Arg Ala Tyr Ala Arg Ala Gly Val Cys Pro Ser Thr Ile 325 330 335 Gly Leu Val Glu Gly His Gly Thr Gly Thr Pro Val Gly Asp Arg Ile 340 345 350 Glu Leu Thr Ala Leu Arg Asn Leu Phe Asp Lys Ala Phe Gly Ser Lys 355 360 365 Lys Glu Gln Ile Ala Val Gly Ser Ile Lys Ser Gln Ile Gly His Leu 370 375 380 Lys Ser Val Ala Gly Phe Ala Gly Leu Val Lys Ala Val Leu Ala Leu 385 390 395 400 Lys His Lys Thr Leu Pro Gly Ser Ile Asn Val Asp Gln Pro Pro Leu 405 410 415 Leu Tyr Asp Gly Thr Gln Ile Gln Asp Ser Ser Leu Tyr Ile Asn Lys 420 425 430 Thr Asn Arg Pro Trp Phe Thr Gln Asn Lys Leu Pro Arg Arg Ala Gly 435 440 445 Val Ser Ser Phe Gly Phe Gly Gly Ala Asn Tyr His Ala Val Leu Glu 450 455 460 Glu Phe Glu Pro Glu His Glu Lys Pro Tyr Arg Leu Asn Thr Val Gly 465 470 475 480 His Pro Val Leu Leu Tyr Ala Pro Ser Val Glu Ala Leu Lys Val Leu 485 490 495 Cys Asn Asp Gln 500 <210> 42 <211> 1500 <212> DNA <213> Thraustochytrium sp. <220> <221> CDS <222> (1)..(1500) <400> 42 ctt gcg gag ctc aca att gca ttg gaa gag gca aaa aca cat aaa aat 48 Leu Ala Glu Leu Thr Ile Ala Leu Glu Glu Ala Lys Thr His Lys Asn 1 5 10 15 gtt gac aaa gtt tgt ggc tac aag ttt att gac gaa ttt cag ctc caa 96 Val Asp Lys Val Cys Gly Tyr Lys Phe Ile Asp Glu Phe Gln Leu Gln 20 25 30 gga agc tgt cct cca gaa aat ccg aga gta gga ttt tta gca aca ctg 144 Gly Ser Cys Pro Pro Glu Asn Pro Arg Val Gly Phe Leu Ala Thr Leu 35 40 45 cct act tca aat atc att gtc gcg ctt aag gca att ctc gcg cag ctt 192 Pro Thr Ser Asn Ile Ile Val Ala Leu Lys Ala Ile Leu Ala Gln Leu 50 55 60 gat gca aaa cca gat gcg aag aaa tgg gat ttg cct cat aaa aag gct 240 Asp Ala Lys Pro Asp Ala Lys Lys Trp Asp Leu Pro His Lys Lys Ala 65 70 75 80 ttt ggg gct acc ttc gca tcg tct tca gtg aaa ggc tct gtt gct gcg 288 Phe Gly Ala Thr Phe Ala Ser Ser Ser Val Lys Gly Ser Val Ala Ala 85 90 95 ctc ttc gca gga cag ggt acc cag tac tta aac atg ttc tct gat gtg 336 Leu Phe Ala Gly Gln Gly Thr Gln Tyr Leu Asn Met Phe Ser Asp Val 100 105 110 gca atg aac tgg cca ccg ttc cgt gac agc att gtc gca atg gaa gaa 384 Ala Met Asn Trp Pro Pro Phe Arg Asp Ser Ile Val Ala Met Glu Glu 115 120 125 gct caa act gag gta ttt gag ggc caa gtt gaa cca att agc aaa gtt 432 Ala Gln Thr Glu Val Phe Glu Gly Gln Val Glu Pro Ile Ser Lys Val 130 135 140 ctg ttt cca cga gag cgc tat gca tcc gaa agt gaa cag ggg aat gaa 480 Leu Phe Pro Arg Glu Arg Tyr Ala Ser Glu Ser Glu Gln Gly Asn Glu 145 150 155 160 ctt ctt tgc tta aca gag tac tct cag cca act acg ata gca gcc gca 528 Leu Leu Cys Leu Thr Glu Tyr Ser Gln Pro Thr Thr Ile Ala Ala Ala 165 170 175 gta ggg gcc ttc gat att ttc aaa gcg gct ggc ttt aag cca gac atg 576 Val Gly Ala Phe Asp Ile Phe Lys Ala Ala Gly Phe Lys Pro Asp Met 180 185 190 gtt gga ggg cat tca ctt ggc gaa ttt gct gct ttg tac gcg gct ggg 624 Val Gly Gly His Ser Leu Gly Glu Phe Ala Ala Leu Tyr Ala Ala Gly 195 200 205 tcc att tcg cgt gac gac ctg tac aag ctt gtg tgc aaa cgg gca aag 672 Ser Ile Ser Arg Asp Asp Leu Tyr Lys Leu Val Cys Lys Arg Ala Lys 210 215 220 gca atg gcg aac gct agt gac gga gct atg gca gca gtg att ggc cca 720 Ala Met Ala Asn Ala Ser Asp Gly Ala Met Ala Ala Val Ile Gly Pro 225 230 235 240 gat gca cgt cta gtt acg cca caa aat agt gac gtt tat gtc gca aac 768 Asp Ala Arg Leu Val Thr Pro Gln Asn Ser Asp Val Tyr Val Ala Asn 245 250 255 ttc aac tcc gca act caa gta gtc atc agt ggc act gtt caa ggt gtg 816 Phe Asn Ser Ala Thr Gln Val Val Ile Ser Gly Thr Val Gln Gly Val 260 265 270 aaa gaa gag tcg aaa ttg ctc att tca aag ggg ttc cgc gta ctg cca 864 Lys Glu Glu Ser Lys Leu Leu Ile Ser Lys Gly Phe Arg Val Leu Pro 275 280 285 ctt aaa tgc cag ggc gcc ttc cat tct cct ttg atg ggg cct tct gag 912 Leu Lys Cys Gln Gly Ala Phe His Ser Pro Leu Met Gly Pro Ser Glu 290 295 300 gat agt ttc aaa tca ctt gtg gag act tgt acc atc tcg ccg cca aaa 960 Asp Ser Phe Lys Ser Leu Val Glu Thr Cys Thr Ile Ser Pro Pro Lys 305 310 315 320 aat gtg aaa ttc ttt tgc aat gtt agt ggc aag gaa agc cca aac cca 1008 Asn Val Lys Phe Phe Cys Asn Val Ser Gly Lys Glu Ser Pro Asn Pro 325 330 335 aaa cag acc ctc aag tca cac atg acg tct agc gtt cag ttc gag gag 1056 Lys Gln Thr Leu Lys Ser His Met Thr Ser Ser Val Gln Phe Glu Glu 340 345 350 cag att cgt aac atg tac gat gcc gga gca cgt gtt ttt ctg gag ttt 1104 Gln Ile Arg Asn Met Tyr Asp Ala Gly Ala Arg Val Phe Leu Glu Phe 355 360 365 gga ccc cgc caa gtc ctt gca aag ctt atc gcg gaa atg ttt ccc tcg 1152 Gly Pro Arg Gln Val Leu Ala Lys Leu Ile Ala Glu Met Phe Pro Ser 370 375 380 tgt aca gct atc agc gtt aac ccc gcg agc agt ggt gac agt gac gtg 1200 Cys Thr Ala Ile Ser Val Asn Pro Ala Ser Ser Gly Asp Ser Asp Val 385 390 395 400 caa ctc cgc ctc gcc gcc gta aaa ttc gcg gtc tcg ggt gca gcc ctt 1248 Gln Leu Arg Leu Ala Ala Val Lys Phe Ala Val Ser Gly Ala Ala Leu 405 410 415 agc acc ttt gat cca tgg gag tat cgc aag cca caa gat ctt ctt att 1296 Ser Thr Phe Asp Pro Trp Glu Tyr Arg Lys Pro Gln Asp Leu Leu Ile 420 425 430 cga aaa cca cga aaa act gcc ctt gtt cta tca gca gca aca tat gtt 1344 Arg Lys Pro Arg Lys Thr Ala Leu Val Leu Ser Ala Ala Thr Tyr Val 435 440 445 tcc cca aag act ctt gca gaa cgt aaa aag gct atg gaa gat atc aag 1392 Ser Pro Lys Thr Leu Ala Glu Arg Lys Lys Ala Met Glu Asp Ile Lys 450 455 460 cta gta tcc att aca cca aga gat agt atg gta tca att gga aaa atc 1440 Leu Val Ser Ile Thr Pro Arg Asp Ser Met Val Ser Ile Gly Lys Ile 465 470 475 480 gcg caa gaa gta cgg aca gct aaa cag cct tta gaa acc gaa att cga 1488 Ala Gln Glu Val Arg Thr Ala Lys Gln Pro Leu Glu Thr Glu Ile Arg 485 490 495 aga ctc aac aaa 1500 Arg Leu Asn Lys 500 <210> 43 <211> 500 <212> PRT <213> Thraustochytrium sp. <400> 43 Leu Ala Glu Leu Thr Ile Ala Leu Glu Glu Ala Lys Thr His Lys Asn 1 5 10 15 Val Asp Lys Val Cys Gly Tyr Lys Phe Ile Asp Glu Phe Gln Leu Gln 20 25 30 Gly Ser Cys Pro Pro Glu Asn Pro Arg Val Gly Phe Leu Ala Thr Leu 35 40 45 Pro Thr Ser Asn Ile Ile Val Ala Leu Lys Ala Ile Leu Ala Gln Leu 50 55 60 Asp Ala Lys Pro Asp Ala Lys Lys Trp Asp Leu Pro His Lys Lys Ala 65 70 75 80 Phe Gly Ala Thr Phe Ala Ser Ser Ser Val Lys Gly Ser Val Ala Ala 85 90 95 Leu Phe Ala Gly Gln Gly Thr Gln Tyr Leu Asn Met Phe Ser Asp Val 100 105 110 Ala Met Asn Trp Pro Pro Phe Arg Asp Ser Ile Val Ala Met Glu Glu 115 120 125 Ala Gln Thr Glu Val Phe Glu Gly Gln Val Glu Pro Ile Ser Lys Val 130 135 140 Leu Phe Pro Arg Glu Arg Tyr Ala Ser Glu Ser Glu Gln Gly Asn Glu 145 150 155 160 Leu Leu Cys Leu Thr Glu Tyr Ser Gln Pro Thr Thr Ile Ala Ala Ala 165 170 175 Val Gly Ala Phe Asp Ile Phe Lys Ala Ala Gly Phe Lys Pro Asp Met 180 185 190 Val Gly Gly His Ser Leu Gly Glu Phe Ala Ala Leu Tyr Ala Ala Gly 195 200 205 Ser Ile Ser Arg Asp Asp Leu Tyr Lys Leu Val Cys Lys Arg Ala Lys 210 215 220 Ala Met Ala Asn Ala Ser Asp Gly Ala Met Ala Ala Val Ile Gly Pro 225 230 235 240 Asp Ala Arg Leu Val Thr Pro Gln Asn Ser Asp Val Tyr Val Ala Asn 245 250 255 Phe Asn Ser Ala Thr Gln Val Val Ile Ser Gly Thr Val Gln Gly Val 260 265 270 Lys Glu Glu Ser Lys Leu Leu Ile Ser Lys Gly Phe Arg Val Leu Pro 275 280 285 Leu Lys Cys Gln Gly Ala Phe His Ser Pro Leu Met Gly Pro Ser Glu 290 295 300 Asp Ser Phe Lys Ser Leu Val Glu Thr Cys Thr Ile Ser Pro Pro Lys 305 310 315 320 Asn Val Lys Phe Phe Cys Asn Val Ser Gly Lys Glu Ser Pro Asn Pro 325 330 335 Lys Gln Thr Leu Lys Ser His Met Thr Ser Ser Val Gln Phe Glu Glu 340 345 350 Gln Ile Arg Asn Met Tyr Asp Ala Gly Ala Arg Val Phe Leu Glu Phe 355 360 365 Gly Pro Arg Gln Val Leu Ala Lys Leu Ile Ala Glu Met Phe Pro Ser 370 375 380 Cys Thr Ala Ile Ser Val Asn Pro Ala Ser Ser Gly Asp Ser Asp Val 385 390 395 400 Gln Leu Arg Leu Ala Ala Val Lys Phe Ala Val Ser Gly Ala Ala Leu 405 410 415 Ser Thr Phe Asp Pro Trp Glu Tyr Arg Lys Pro Gln Asp Leu Leu Ile 420 425 430 Arg Lys Pro Arg Lys Thr Ala Leu Val Leu Ser Ala Ala Thr Tyr Val 435 440 445 Ser Pro Lys Thr Leu Ala Glu Arg Lys Lys Ala Met Glu Asp Ile Lys 450 455 460 Leu Val Ser Ile Thr Pro Arg Asp Ser Met Val Ser Ile Gly Lys Ile 465 470 475 480 Ala Gln Glu Val Arg Thr Ala Lys Gln Pro Leu Glu Thr Glu Ile Arg 485 490 495 Arg Leu Asn Lys 500 <210> 44 <211> 351 <212> DNA <213> Thraustochytrium sp. <220> <221> CDS <222> (1)..(351) <400> 44 tcg acc cca gcg tca gag cgg tcg gct tca ccg ctt ttc gag aaa cgc 48 Ser Thr Pro Ala Ser Glu Arg Ser Ala Ser Pro Leu Phe Glu Lys Arg 1 5 10 15 agt tcg gtt tcg tca gca cgc ctc gct gaa gct gaa gcc gcg gta ctg 96 Ser Ser Val Ser Ser Ala Arg Leu Ala Glu Ala Glu Ala Ala Val Leu 20 25 30 agc gtt ctc gca gac aag aca ggc tac gac agc tca atg atc gag atg 144 Ser Val Leu Ala Asp Lys Thr Gly Tyr Asp Ser Ser Met Ile Glu Met 35 40 45 gac atg gac ctg gag agt gag ctt ggc gtt gat agc atc aaa cgc gtg 192 Asp Met Asp Leu Glu Ser Glu Leu Gly Val Asp Ser Ile Lys Arg Val 50 55 60 gag atc atg agc gag gtt caa acg ctg ctc agc gtg gaa gtc tcc gac 240 Glu Ile Met Ser Glu Val Gln Thr Leu Leu Ser Val Glu Val Ser Asp 65 70 75 80 gtt gac gct ctg tca aga acc aag act gtt ggc gac gtc atc gag gcg 288 Val Asp Ala Leu Ser Arg Thr Lys Thr Val Gly Asp Val Ile Glu Ala 85 90 95 atg aag ctg gaa ctc ggt gga ccc caa ggc cag act ttg acc gcg gaa 336 Met Lys Leu Glu Leu Gly Gly Pro Gln Gly Gln Thr Leu Thr Ala Glu 100 105 110 tcg atc cgt cag cca 351 Ser Ile Arg Gln Pro 115 <210> 45 <211> 117 <212> PRT <213> Thraustochytrium sp. <400> 45 Ser Thr Pro Ala Ser Glu Arg Ser Ala Ser Pro Leu Phe Glu Lys Arg 1 5 10 15 Ser Ser Val Ser Ser Ala Arg Leu Ala Glu Ala Glu Ala Ala Val Leu 20 25 30 Ser Val Leu Ala Asp Lys Thr Gly Tyr Asp Ser Ser Met Ile Glu Met 35 40 45 Asp Met Asp Leu Glu Ser Glu Leu Gly Val Asp Ser Ile Lys Arg Val 50 55 60 Glu Ile Met Ser Glu Val Gln Thr Leu Leu Ser Val Glu Val Ser Asp 65 70 75 80 Val Asp Ala Leu Ser Arg Thr Lys Thr Val Gly Asp Val Ile Glu Ala 85 90 95 Met Lys Leu Glu Leu Gly Gly Pro Gln Gly Gln Thr Leu Thr Ala Glu 100 105 110 Ser Ile Arg Gln Pro 115 <210> 46 <211> 5 <212> PRT <213> Thraustochytrium sp. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(5) <223> Xaa = any amino acid <400> 46 Leu Gly Xaa Asp Ser 1 5 <210> 47 <211> 2790 <212> DNA <213> Thraustochytrium sp. <220> <221> CDS <222> (1)..(2790) <400> 47 tcg acc cca gcg tca gag cgg tcg gct tca ccg ctt ttc gag aaa cgc 48 Ser Thr Pro Ala Ser Glu Arg Ser Ala Ser Pro Leu Phe Glu Lys Arg 1 5 10 15 agt tcg gtt tcg tca gca cgc ctc gct gaa gct gaa gcc gcg gta ctg 96 Ser Ser Val Ser Ser Ala Arg Leu Ala Glu Ala Glu Ala Ala Val Leu 20 25 30 agc gtt ctc gca gac aag aca ggc tac gac agc tca atg atc gag atg 144 Ser Val Leu Ala Asp Lys Thr Gly Tyr Asp Ser Ser Met Ile Glu Met 35 40 45 gac atg gac ctg gag agt gag ctt ggc gtt gat agc atc aaa cgc gtg 192 Asp Met Asp Leu Glu Ser Glu Leu Gly Val Asp Ser Ile Lys Arg Val 50 55 60 gag atc atg agc gag gtt caa acg ctg ctc agc gtg gaa gtc tcc gac 240 Glu Ile Met Ser Glu Val Gln Thr Leu Leu Ser Val Glu Val Ser Asp 65 70 75 80 gtt gac gct ctg tca aga acc aag act gtt ggc gac gtc atc gag gcg 288 Val Asp Ala Leu Ser Arg Thr Lys Thr Val Gly Asp Val Ile Glu Ala 85 90 95 atg aag ctg gaa ctc ggt gga ccc caa ggc cag act ttg acc gcg gaa 336 Met Lys Leu Glu Leu Gly Gly Pro Gln Gly Gln Thr Leu Thr Ala Glu 100 105 110 tcg atc cgt cag cca ccg gtg tcc gag cct gct gta ccg acc tca tcg 384 Ser Ile Arg Gln Pro Pro Val Ser Glu Pro Ala Val Pro Thr Ser Ser 115 120 125 tca agc agt att gct aat gtt tcg tca gca cgc ctc gct gaa gct gaa 432 Ser Ser Ser Ile Ala Asn Val Ser Ser Ala Arg Leu Ala Glu Ala Glu 130 135 140 gct gcg gta ctg agc gtt ctc gca gac aag aca ggc tac gac agc tca 480 Ala Ala Val Leu Ser Val Leu Ala Asp Lys Thr Gly Tyr Asp Ser Ser 145 150 155 160 atg atc gag atg gac atg gac ctg gag agc gag ctt ggc gtt gat agc 528 Met Ile Glu Met Asp Met Asp Leu Glu Ser Glu Leu Gly Val Asp Ser 165 170 175 atc aaa cgc gtg gag atc atg agc gag gtt caa acg ctg ctc agc gtg 576 Ile Lys Arg Val Glu Ile Met Ser Glu Val Gln Thr Leu Leu Ser Val 180 185 190 gaa gtc tcc gac gtt gac gct ctg tca aga act aag act gtt ggc gac 624 Glu Val Ser Asp Val Asp Ala Leu Ser Arg Thr Lys Thr Val Gly Asp 195 200 205 gtc atc gag gcg atg aag ctg gaa ctc ggt gga ccc caa ggc cag act 672 Val Ile Glu Ala Met Lys Leu Glu Leu Gly Gly Pro Gln Gly Gln Thr 210 215 220 ttg acc gcg gaa tcg atc cgt cag cca ccg gtg tct gag cct gct gta 720 Leu Thr Ala Glu Ser Ile Arg Gln Pro Pro Val Ser Glu Pro Ala Val 225 230 235 240 ccg acc tca tcg tca agc agt att gct aat gtt tcg tca gca cgc ctc 768 Pro Thr Ser Ser Ser Ser Ser Ile Ala Asn Val Ser Ser Ala Arg Leu 245 250 255 gct gaa gct gaa gcg gcg gta ctg agc gtt ctc gca gac aag aca ggc 816 Ala Glu Ala Glu Ala Ala Val Leu Ser Val Leu Ala Asp Lys Thr Gly 260 265 270 tac gac agc tca atg atc gag atg gac atg gac ctg gag agc gag ctt 864 Tyr Asp Ser Ser Met Ile Glu Met Asp Met Asp Leu Glu Ser Glu Leu 275 280 285 ggc gtc gac agc atc aaa cgc gtg gag atc atg agc gag gtt caa acg 912 Gly Val Asp Ser Ile Lys Arg Val Glu Ile Met Ser Glu Val Gln Thr 290 295 300 ctg ctc agc gtg gaa gtc tcc gac gtt gac gct ctg tca aga acc aag 960 Leu Leu Ser Val Glu Val Ser Asp Val Asp Ala Leu Ser Arg Thr Lys 305 310 315 320 act gtt ggc gac gtc atc gag gcg atg aag ctg gaa ctc ggt gga ccc 1008 Thr Val Gly Asp Val Ile Glu Ala Met Lys Leu Glu Leu Gly Gly Pro 325 330 335 caa ggc cag act ttg acc gcg gaa tcg atc cgt cag cca ccg gtg tcc 1056 Gln Gly Gln Thr Leu Thr Ala Glu Ser Ile Arg Gln Pro Pro Val Ser 340 345 350 gag cct gct gta ccg acc tca tcg tca agc agt att gct aat gtt ttg 1104 Glu Pro Ala Val Pro Thr Ser Ser Ser Ser Ser Ile Ala Asn Val Leu 355 360 365 tca gca cgc ctc gct gaa gct gaa gcc gcg gta ctg agc gtt ctc gca 1152 Ser Ala Arg Leu Ala Glu Ala Glu Ala Ala Val Leu Ser Val Leu Ala 370 375 380 gac aag aca ggc tac gac agc tca atg atc gag atg gac atg gac ctg 1200 Asp Lys Thr Gly Tyr Asp Ser Ser Met Ile Glu Met Asp Met Asp Leu 385 390 395 400 gag agc gag ctt ggc gtt gat agc atc aaa cgc gtg gag atc atg agc 1248 Glu Ser Glu Leu Gly Val Asp Ser Ile Lys Arg Val Glu Ile Met Ser 405 410 415 gag gtt caa acg ttg ctc agc gtg gaa gtc tcc gac gtt gac gct ctg 1296 Glu Val Gln Thr Leu Leu Ser Val Glu Val Ser Asp Val Asp Ala Leu 420 425 430 tca aga acc aag act gtt ggc gac gtc atc gag gcg atg aag ctg gaa 1344 Ser Arg Thr Lys Thr Val Gly Asp Val Ile Glu Ala Met Lys Leu Glu 435 440 445 ctc ggt gga ccc caa ggc cag act ttg acc gcg gaa tcg atc cgt cag 1392 Leu Gly Gly Pro Gln Gly Gln Thr Leu Thr Ala Glu Ser Ile Arg Gln 450 455 460 cca ccg gtg tct gag cct gct gta ccg acc tca tcg tca agc agt att 1440 Pro Pro Val Ser Glu Pro Ala Val Pro Thr Ser Ser Ser Ser Ser Ile 465 470 475 480 gct aat gtt tcg tca gca cgc ctc gct gaa gct gaa gcc gcg gta ctg 1488 Ala Asn Val Ser Ser Ala Arg Leu Ala Glu Ala Glu Ala Ala Val Leu 485 490 495 agc gtt ctc gca gac aag aca ggc tac gac agc tca atg atc gag atg 1536 Ser Val Leu Ala Asp Lys Thr Gly Tyr Asp Ser Ser Met Ile Glu Met 500 505 510 gac atg gac ctg gag agt gag ctt ggc gtc gac agc atc aaa cgc gtg 1584 Asp Met Asp Leu Glu Ser Glu Leu Gly Val Asp Ser Ile Lys Arg Val 515 520 525 gag atc atg agc gag gtt caa acg ctg ctc agc gtg gaa gtc tcc gac 1632 Glu Ile Met Ser Glu Val Gln Thr Leu Leu Ser Val Glu Val Ser Asp 530 535 540 gtt gac gct ctg tca aga acc aag act gtt ggc gac gtc atc gag gcg 1680 Val Asp Ala Leu Ser Arg Thr Lys Thr Val Gly Asp Val Ile Glu Ala 545 550 555 560 atg aag ctg gaa ctc ggt gga ccc caa ggc cag act ttg acc tct gaa 1728 Met Lys Leu Glu Leu Gly Gly Pro Gln Gly Gln Thr Leu Thr Ser Glu 565 570 575 ccg atc cat cag cca cca gtg tcc gag cct gct gta ccg acc tca tcg 1776 Pro Ile His Gln Pro Pro Val Ser Glu Pro Ala Val Pro Thr Ser Ser 580 585 590 tca agc agt att gct aat gtt tct tca gca cgc ctc gct gaa gct gaa 1824 Ser Ser Ser Ile Ala Asn Val Ser Ser Ala Arg Leu Ala Glu Ala Glu 595 600 605 gcc gcg gta ctg agc gtt ctc gca gac aag aca ggc tac gac agc tca 1872 Ala Ala Val Leu Ser Val Leu Ala Asp Lys Thr Gly Tyr Asp Ser Ser 610 615 620 atg atc gag atg gac atg gac ctg gag agc gag ctt ggc gtt gat agc 1920 Met Ile Glu Met Asp Met Asp Leu Glu Ser Glu Leu Gly Val Asp Ser 625 630 635 640 atc aaa cgc gtg gaa atc atg agc gag gtt caa acg ctg ctc agc gtg 1968 Ile Lys Arg Val Glu Ile Met Ser Glu Val Gln Thr Leu Leu Ser Val 645 650 655 gaa gtc tcc gac gtt gac gct ctg tca aga acc aag act gtt ggc gac 2016 Glu Val Ser Asp Val Asp Ala Leu Ser Arg Thr Lys Thr Val Gly Asp 660 665 670 gtc atc gag gcg atg aag atg gaa ctc ggt gga ccc caa ggc cag act 2064 Val Ile Glu Ala Met Lys Met Glu Leu Gly Gly Pro Gln Gly Gln Thr 675 680 685 ttg acc gcg gaa tcg atc cgt cag cca ccg gtg tct gag cct gct gta 2112 Leu Thr Ala Glu Ser Ile Arg Gln Pro Pro Val Ser Glu Pro Ala Val 690 695 700 ccg acc tca tcg tca agc agt att gct aat gtt tcg tca gca cgc ctc 2160 Pro Thr Ser Ser Ser Ser Ser Ile Ala Asn Val Ser Ser Ala Arg Leu 705 710 715 720 gct gaa gct gaa gcg gcg gta ctg agc gtt ctc gca gac aag aca ggc 2208 Ala Glu Ala Glu Ala Ala Val Leu Ser Val Leu Ala Asp Lys Thr Gly 725 730 735 tac gac agc tca atg atc gag atg gac atg gac ctg gag agc gag ctt 2256 Tyr Asp Ser Ser Met Ile Glu Met Asp Met Asp Leu Glu Ser Glu Leu 740 745 750 ggc gtt gat agc atc aaa cgc gtg gag atc atg agc gag gtt caa gcg 2304 Gly Val Asp Ser Ile Lys Arg Val Glu Ile Met Ser Glu Val Gln Ala 755 760 765 ctg ctc agc gtg gaa gtc tcc gac gtt gac gct ctg tca aga acc aag 2352 Leu Leu Ser Val Glu Val Ser Asp Val Asp Ala Leu Ser Arg Thr Lys 770 775 780 act gtt ggc gac gtc atc gag gcg atg aag atg gaa ctc ggt gga ccc 2400 Thr Val Gly Asp Val Ile Glu Ala Met Lys Met Glu Leu Gly Gly Pro 785 790 795 800 caa ggc cag act ttg acc gca gaa tcg atc cgt gag cca ccg gtg tct 2448 Gln Gly Gln Thr Leu Thr Ala Glu Ser Ile Arg Glu Pro Pro Val Ser 805 810 815 gag cct gct gta ccg acc tca tcg tca agt agt atc gct aat gtt tct 2496 Glu Pro Ala Val Pro Thr Ser Ser Ser Ser Ser Ile Ala Asn Val Ser 820 825 830 tca gct cgc ctc gct gaa gct gaa gcc gcg gta ctg agc gtt ctc gca 2544 Ser Ala Arg Leu Ala Glu Ala Glu Ala Ala Val Leu Ser Val Leu Ala 835 840 845 gac aag aca ggc tac gac agc tca atg atc gag atg gac atg gac ctg 2592 Asp Lys Thr Gly Tyr Asp Ser Ser Met Ile Glu Met Asp Met Asp Leu 850 855 860 gag agt gag ctt ggc gtc gac agc atc aaa cgc gtg gag atc atg agc 2640 Glu Ser Glu Leu Gly Val Asp Ser Ile Lys Arg Val Glu Ile Met Ser 865 870 875 880 gag gtt caa acg ttg ctc agc gtg gaa gtc tcc gac gtt gac gct ctg 2688 Glu Val Gln Thr Leu Leu Ser Val Glu Val Ser Asp Val Asp Ala Leu 885 890 895 tca aga acc aag act gtt ggc gac gtc atc gag gcg atg aag ctg gaa 2736 Ser Arg Thr Lys Thr Val Gly Asp Val Ile Glu Ala Met Lys Leu Glu 900 905 910 ctt ggg gaa tca tca agt att gag act ctc aat tgt acc gag gtt gag 2784 Leu Gly Glu Ser Ser Ser Ile Glu Thr Leu Asn Cys Thr Glu Val Glu 915 920 925 cac acg 2790 His Thr 930 <210> 48 <211> 930 <212> PRT <213> Thraustochytrium sp. <400> 48 Ser Thr Pro Ala Ser Glu Arg Ser Ala Ser Pro Leu Phe Glu Lys Arg 1 5 10 15 Ser Ser Val Ser Ser Ala Arg Leu Ala Glu Ala Glu Ala Ala Val Leu 20 25 30 Ser Val Leu Ala Asp Lys Thr Gly Tyr Asp Ser Ser Met Ile Glu Met 35 40 45 Asp Met Asp Leu Glu Ser Glu Leu Gly Val Asp Ser Ile Lys Arg Val 50 55 60 Glu Ile Met Ser Glu Val Gln Thr Leu Leu Ser Val Glu Val Ser Asp 65 70 75 80 Val Asp Ala Leu Ser Arg Thr Lys Thr Val Gly Asp Val Ile Glu Ala 85 90 95 Met Lys Leu Glu Leu Gly Gly Pro Gln Gly Gln Thr Leu Thr Ala Glu 100 105 110 Ser Ile Arg Gln Pro Pro Val Ser Glu Pro Ala Val Pro Thr Ser Ser 115 120 125 Ser Ser Ser Ile Ala Asn Val Ser Ser Ala Arg Leu Ala Glu Ala Glu 130 135 140 Ala Ala Val Leu Ser Val Leu Ala Asp Lys Thr Gly Tyr Asp Ser Ser 145 150 155 160 Met Ile Glu Met Asp Met Asp Leu Glu Ser Glu Leu Gly Val Asp Ser 165 170 175 Ile Lys Arg Val Glu Ile Met Ser Glu Val Gln Thr Leu Leu Ser Val 180 185 190 Glu Val Ser Asp Val Asp Ala Leu Ser Arg Thr Lys Thr Val Gly Asp 195 200 205 Val Ile Glu Ala Met Lys Leu Glu Leu Gly Gly Pro Gln Gly Gln Thr 210 215 220 Leu Thr Ala Glu Ser Ile Arg Gln Pro Pro Val Ser Glu Pro Ala Val 225 230 235 240 Pro Thr Ser Ser Ser Ser Ser Ile Ala Asn Val Ser Ser Ala Arg Leu 245 250 255 Ala Glu Ala Glu Ala Ala Val Leu Ser Val Leu Ala Asp Lys Thr Gly 260 265 270 Tyr Asp Ser Ser Met Ile Glu Met Asp Met Asp Leu Glu Ser Glu Leu 275 280 285 Gly Val Asp Ser Ile Lys Arg Val Glu Ile Met Ser Glu Val Gln Thr 290 295 300 Leu Leu Ser Val Glu Val Ser Asp Val Asp Ala Leu Ser Arg Thr Lys 305 310 315 320 Thr Val Gly Asp Val Ile Glu Ala Met Lys Leu Glu Leu Gly Gly Pro 325 330 335 Gln Gly Gln Thr Leu Thr Ala Glu Ser Ile Arg Gln Pro Pro Val Ser 340 345 350 Glu Pro Ala Val Pro Thr Ser Ser Ser Ser Ser Ile Ala Asn Val Leu 355 360 365 Ser Ala Arg Leu Ala Glu Ala Glu Ala Ala Val Leu Ser Val Leu Ala 370 375 380 Asp Lys Thr Gly Tyr Asp Ser Ser Met Ile Glu Met Asp Met Asp Leu 385 390 395 400 Glu Ser Glu Leu Gly Val Asp Ser Ile Lys Arg Val Glu Ile Met Ser 405 410 415 Glu Val Gln Thr Leu Leu Ser Val Glu Val Ser Asp Val Asp Ala Leu 420 425 430 Ser Arg Thr Lys Thr Val Gly Asp Val Ile Glu Ala Met Lys Leu Glu 435 440 445 Leu Gly Gly Pro Gln Gly Gln Thr Leu Thr Ala Glu Ser Ile Arg Gln 450 455 460 Pro Pro Val Ser Glu Pro Ala Val Pro Thr Ser Ser Ser Ser Ser Ile 465 470 475 480 Ala Asn Val Ser Ser Ala Arg Leu Ala Glu Ala Glu Ala Ala Val Leu 485 490 495 Ser Val Leu Ala Asp Lys Thr Gly Tyr Asp Ser Ser Met Ile Glu Met 500 505 510 Asp Met Asp Leu Glu Ser Glu Leu Gly Val Asp Ser Ile Lys Arg Val 515 520 525 Glu Ile Met Ser Glu Val Gln Thr Leu Leu Ser Val Glu Val Ser Asp 530 535 540 Val Asp Ala Leu Ser Arg Thr Lys Thr Val Gly Asp Val Ile Glu Ala 545 550 555 560 Met Lys Leu Glu Leu Gly Gly Pro Gln Gly Gln Thr Leu Thr Ser Glu 565 570 575 Pro Ile His Gln Pro Pro Val Ser Glu Pro Ala Val Pro Thr Ser Ser 580 585 590 Ser Ser Ser Ile Ala Asn Val Ser Ser Ala Arg Leu Ala Glu Ala Glu 595 600 605 Ala Ala Val Leu Ser Val Leu Ala Asp Lys Thr Gly Tyr Asp Ser Ser 610 615 620 Met Ile Glu Met Asp Met Asp Leu Glu Ser Glu Leu Gly Val Asp Ser 625 630 635 640 Ile Lys Arg Val Glu Ile Met Ser Glu Val Gln Thr Leu Leu Ser Val 645 650 655 Glu Val Ser Asp Val Asp Ala Leu Ser Arg Thr Lys Thr Val Gly Asp 660 665 670 Val Ile Glu Ala Met Lys Met Glu Leu Gly Gly Pro Gln Gly Gln Thr 675 680 685 Leu Thr Ala Glu Ser Ile Arg Gln Pro Pro Val Ser Glu Pro Ala Val 690 695 700 Pro Thr Ser Ser Ser Ser Ser Ile Ala Asn Val Ser Ser Ala Arg Leu 705 710 715 720 Ala Glu Ala Glu Ala Ala Val Leu Ser Val Leu Ala Asp Lys Thr Gly 725 730 735 Tyr Asp Ser Ser Met Ile Glu Met Asp Met Asp Leu Glu Ser Glu Leu 740 745 750 Gly Val Asp Ser Ile Lys Arg Val Glu Ile Met Ser Glu Val Gln Ala 755 760 765 Leu Leu Ser Val Glu Val Ser Asp Val Asp Ala Leu Ser Arg Thr Lys 770 775 780 Thr Val Gly Asp Val Ile Glu Ala Met Lys Met Glu Leu Gly Gly Pro 785 790 795 800 Gln Gly Gln Thr Leu Thr Ala Glu Ser Ile Arg Glu Pro Pro Val Ser 805 810 815 Glu Pro Ala Val Pro Thr Ser Ser Ser Ser Ser Ile Ala Asn Val Ser 820 825 830 Ser Ala Arg Leu Ala Glu Ala Glu Ala Ala Val Leu Ser Val Leu Ala 835 840 845 Asp Lys Thr Gly Tyr Asp Ser Ser Met Ile Glu Met Asp Met Asp Leu 850 855 860 Glu Ser Glu Leu Gly Val Asp Ser Ile Lys Arg Val Glu Ile Met Ser 865 870 875 880 Glu Val Gln Thr Leu Leu Ser Val Glu Val Ser Asp Val Asp Ala Leu 885 890 895 Ser Arg Thr Lys Thr Val Gly Asp Val Ile Glu Ala Met Lys Leu Glu 900 905 910 Leu Gly Glu Ser Ser Ser Ile Glu Thr Leu Asn Cys Thr Glu Val Glu 915 920 925 His Thr 930 <210> 49 <211> 2433 <212> DNA <213> Thraustochytrium sp. <220> <221> CDS <222> (1)..(2433) <400> 49 aaa agt gtc aag gct tca ggg tgt gag aat gta gat acc cgt ttc gct 48 Lys Ser Val Lys Ala Ser Gly Cys Glu Asn Val Asp Thr Arg Phe Ala 1 5 10 15 aag gtt gta caa atc tcg ctt cct agc aag ctg aaa tcc act gtg tcg 96 Lys Val Val Gln Ile Ser Leu Pro Ser Lys Leu Lys Ser Thr Val Ser 20 25 30 cac gat cga cct gta att gtt gta gat gat gga acg ccc tta acc acg 144 His Asp Arg Pro Val Ile Val Val Asp Asp Gly Thr Pro Leu Thr Thr 35 40 45 gag ctt tgt aaa att ctt ggg ggt aat att gtg gtt ctc tct tat caa 192 Glu Leu Cys Lys Ile Leu Gly Gly Asn Ile Val Val Leu Ser Tyr Gln 50 55 60 ggg aag ccc gct ggt cca cgg gga gtc gag gtg cca gat ctt tcc gag 240 Gly Lys Pro Ala Gly Pro Arg Gly Val Glu Val Pro Asp Leu Ser Glu 65 70 75 80 gaa gcc cta att caa gct ctt gca ttg att cgg tct aca tat gga gtt 288 Glu Ala Leu Ile Gln Ala Leu Ala Leu Ile Arg Ser Thr Tyr Gly Val 85 90 95 cca att ggt ttt att tgt cag caa gtg tct aat gtg agc acc aag gca 336 Pro Ile Gly Phe Ile Cys Gln Gln Val Ser Asn Val Ser Thr Lys Ala 100 105 110 cag ctt tgt tgg gca ctc ctc gca gcg aag cat ctc aag aag gat ttg 384 Gln Leu Cys Trp Ala Leu Leu Ala Ala Lys His Leu Lys Lys Asp Leu 115 120 125 aat gct gtc tta ccc gat tca aga tcc ttc ttc gtc gga gtt gta cgc 432 Asn Ala Val Leu Pro Asp Ser Arg Ser Phe Phe Val Gly Val Val Arg 130 135 140 ttg aac ggg aaa ctt gga act ttc gaa aac atc agc gac ttc tct aaa 480 Leu Asn Gly Lys Leu Gly Thr Phe Glu Asn Ile Ser Asp Phe Ser Lys 145 150 155 160 ttt gat ttg acg aaa gcc cta gat tac gga cag cgt ggt tct ctc tta 528 Phe Asp Leu Thr Lys Ala Leu Asp Tyr Gly Gln Arg Gly Ser Leu Leu 165 170 175 ggc ctg tgc aag tca cta gac tta gaa tgg gaa cag gtg ttt tgc cgt 576 Gly Leu Cys Lys Ser Leu Asp Leu Glu Trp Glu Gln Val Phe Cys Arg 180 185 190 gga ata gat ctt gcg tgt gat ctt atg cca ctc cag gcc gca agg ata 624 Gly Ile Asp Leu Ala Cys Asp Leu Met Pro Leu Gln Ala Ala Arg Ile 195 200 205 ctc aga aat gag ctt cag tgt ccc aat atg cgc ctt cgc gag gtt ggg 672 Leu Arg Asn Glu Leu Gln Cys Pro Asn Met Arg Leu Arg Glu Val Gly 210 215 220 tac gat att tct ggc gcc agg tac acc att tca acc gat gac ctg cta 720 Tyr Asp Ile Ser Gly Ala Arg Tyr Thr Ile Ser Thr Asp Asp Leu Leu 225 230 235 240 tgt gga ccc tcg aag gct aaa gta gag gcc gca gac ttg ttt ctt gtg 768 Cys Gly Pro Ser Lys Ala Lys Val Glu Ala Ala Asp Leu Phe Leu Val 245 250 255 aca ggt ggc gca cga ggt att aca cct cat tgt gtt cgt gag att gca 816 Thr Gly Gly Ala Arg Gly Ile Thr Pro His Cys Val Arg Glu Ile Ala 260 265 270 agt cga tcc ccc gga acc aca ttt gtg ctg gtt gga aga agc gaa atg 864 Ser Arg Ser Pro Gly Thr Thr Phe Val Leu Val Gly Arg Ser Glu Met 275 280 285 tcc gac gag cct gac tgg gct gtt ggc cac tac aat aaa gac ctg gac 912 Ser Asp Glu Pro Asp Trp Ala Val Gly His Tyr Asn Lys Asp Leu Asp 290 295 300 caa agc aca atg aaa cac ttg aaa gca acg cat gct gct gga ggg gta 960 Gln Ser Thr Met Lys His Leu Lys Ala Thr His Ala Ala Gly Gly Val 305 310 315 320 aaa cct acg cct aaa gca cat cgt gca ctt gtg aac agg gtc act ggc 1008 Lys Pro Thr Pro Lys Ala His Arg Ala Leu Val Asn Arg Val Thr Gly 325 330 335 tca cgg gag gta cga gaa tct ctt aga gca atc cag gag gca ggg gca 1056 Ser Arg Glu Val Arg Glu Ser Leu Arg Ala Ile Gln Glu Ala Gly Ala 340 345 350 aat gtc gaa tat atc gcc tgt gat gtt tcg gat gaa aac aag gtc cgc 1104 Asn Val Glu Tyr Ile Ala Cys Asp Val Ser Asp Glu Asn Lys Val Arg 355 360 365 caa ctt gtg caa aga gtg gag caa aag tat ggc tgt gaa ata act ggg 1152 Gln Leu Val Gln Arg Val Glu Gln Lys Tyr Gly Cys Glu Ile Thr Gly 370 375 380 att tgg cat gca agc ggg gtt ctt cgt gac aaa ctt gtc gag caa aag 1200 Ile Trp His Ala Ser Gly Val Leu Arg Asp Lys Leu Val Glu Gln Lys 385 390 395 400 act aca gac gac ttt gag gca gtt ttt ggg acc aag gtg act ggc ctt 1248 Thr Thr Asp Asp Phe Glu Ala Val Phe Gly Thr Lys Val Thr Gly Leu 405 410 415 gta aac atc gtg tca caa gtc aat atg tct aag cta cga cac ttc atc 1296 Val Asn Ile Val Ser Gln Val Asn Met Ser Lys Leu Arg His Phe Ile 420 425 430 ctc ttc agt tct ttg gct gga ttt cat ggg aac aag ggc caa acg gat 1344 Leu Phe Ser Ser Leu Ala Gly Phe His Gly Asn Lys Gly Gln Thr Asp 435 440 445 tat gca att gct aat gaa gcc ttg aac aaa atc gcg cat act ctc tca 1392 Tyr Ala Ile Ala Asn Glu Ala Leu Asn Lys Ile Ala His Thr Leu Ser 450 455 460 gcg ttt ttg ccc aaa ctg aat gca aag gtg cta gac ttc ggt ccg tgg 1440 Ala Phe Leu Pro Lys Leu Asn Ala Lys Val Leu Asp Phe Gly Pro Trp 465 470 475 480 gta ggt tca gga atg gta acc gaa aca ctt gag aag cat ttt aaa gct 1488 Val Gly Ser Gly Met Val Thr Glu Thr Leu Glu Lys His Phe Lys Ala 485 490 495 atg ggg gtt cag act att cct ctc gag cca gga gca cgg act gtt gcg 1536 Met Gly Val Gln Thr Ile Pro Leu Glu Pro Gly Ala Arg Thr Val Ala 500 505 510 caa atc att ttg gca agt tcg cca ccg caa tcg ctt ttg ggg aac tgg 1584 Gln Ile Ile Leu Ala Ser Ser Pro Pro Gln Ser Leu Leu Gly Asn Trp 515 520 525 ggc ttt cca gcc acc aaa ccg cta caa cgc tct aat gta gtc acg ggc 1632 Gly Phe Pro Ala Thr Lys Pro Leu Gln Arg Ser Asn Val Val Thr Gly 530 535 540 aca ctc tct ccg gaa gag ata gaa ttc atc gca gac cac aaa att caa 1680 Thr Leu Ser Pro Glu Glu Ile Glu Phe Ile Ala Asp His Lys Ile Gln 545 550 555 560 ggc cgc aag gtg ctt ccc atg atg gct gca atc ggg ttc atg gcc tct 1728 Gly Arg Lys Val Leu Pro Met Met Ala Ala Ile Gly Phe Met Ala Ser 565 570 575 att gcg gaa gga ctc tac ccg ggg tac aat ctg caa ggc gtg gaa aat 1776 Ile Ala Glu Gly Leu Tyr Pro Gly Tyr Asn Leu Gln Gly Val Glu Asn 580 585 590 gct cag ctc ttt caa ggc ttg act atc aac caa gag aca aaa ttt caa 1824 Ala Gln Leu Phe Gln Gly Leu Thr Ile Asn Gln Glu Thr Lys Phe Gln 595 600 605 atc act ctc att gag gag cac aac tct gag gaa aac ctg gat gtc ctg 1872 Ile Thr Leu Ile Glu Glu His Asn Ser Glu Glu Asn Leu Asp Val Leu 610 615 620 aca tcc ctt ggt gta atg ttg gaa agc ggg aag gtg ctt ccc gct tac 1920 Thr Ser Leu Gly Val Met Leu Glu Ser Gly Lys Val Leu Pro Ala Tyr 625 630 635 640 cga tgt gtt gta tgc ttg aat aca acc cag cag cag ccc aag cta tct 1968 Arg Cys Val Val Cys Leu Asn Thr Thr Gln Gln Gln Pro Lys Leu Ser 645 650 655 cca aaa att ctt aac ttg gaa gtt gac cct gca tgc gag gtt aac ccc 2016 Pro Lys Ile Leu Asn Leu Glu Val Asp Pro Ala Cys Glu Val Asn Pro 660 665 670 tat gat gga aag tcg ttg ttc cac ggt ccg ctt ttg caa ttc gtt caa 2064 Tyr Asp Gly Lys Ser Leu Phe His Gly Pro Leu Leu Gln Phe Val Gln 675 680 685 caa gtg ttg cac tca agt acc aaa ggc ctc gtt gcc aag tgc cgc gcg 2112 Gln Val Leu His Ser Ser Thr Lys Gly Leu Val Ala Lys Cys Arg Ala 690 695 700 ctt cca atc aaa gaa gcc atc cga ggg cca ttt atc aag caa aca ctc 2160 Leu Pro Ile Lys Glu Ala Ile Arg Gly Pro Phe Ile Lys Gln Thr Leu 705 710 715 720 cat gat cca att cta gac gac gtc att ttt cag cta atg ctc gtg tgg 2208 His Asp Pro Ile Leu Asp Asp Val Ile Phe Gln Leu Met Leu Val Trp 725 730 735 tgt cgt aat gct cta gga agt gca tcg cta ccc aac aga att gaa aag 2256 Cys Arg Asn Ala Leu Gly Ser Ala Ser Leu Pro Asn Arg Ile Glu Lys 740 745 750 atg tca tac ttt ggg aat gtc tca gaa ggt agc act ttc ttt gcc tca 2304 Met Ser Tyr Phe Gly Asn Val Ser Glu Gly Ser Thr Phe Phe Ala Ser 755 760 765 gtt aca cct gtg gga cca aga gta cca aag gat ccc gtg atc aaa atg 2352 Val Thr Pro Val Gly Pro Arg Val Pro Lys Asp Pro Val Ile Lys Met 770 775 780 cag ttt ctt ctc caa gat gaa tcc ggc aac aca ttt tca tcg ggg gag 2400 Gln Phe Leu Leu Gln Asp Glu Ser Gly Asn Thr Phe Ser Ser Gly Glu 785 790 795 800 ggc tcg gtt gtg ctt agt gac gaa ctc gtc ttt 2433 Gly Ser Val Val Leu Ser Asp Glu Leu Val Phe 805 810 <210> 50 <211> 811 <212> PRT <213> Thraustochytrium sp. <400> 50 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Gln Val Asn Met Ser Lys Leu Arg His Phe Ile 420 425 430 Leu Phe Ser Ser Leu Ala Gly Phe His Gly Asn Lys Gly Gln Thr Asp 435 440 445 Tyr Ala Ile Ala Asn Glu Ala Leu Asn Lys Ile Ala His Thr Leu Ser 450 455 460 Ala Phe Leu Pro Lys Leu Asn Ala Lys Val Leu Asp Phe Gly Pro Trp 465 470 475 480 Val Gly Ser Gly Met Val Thr Glu Thr Leu Glu Lys His Phe Lys Ala 485 490 495 Met Gly Val Gln Thr Ile Pro Leu Glu Pro Gly Ala Arg Thr Val Ala 500 505 510 Gln Ile Ile Leu Ala Ser Ser Pro Pro Gln Ser Leu Leu Gly Asn Trp 515 520 525 Gly Phe Pro Ala Thr Lys Pro Leu Gln Arg Ser Asn Val Val Thr Gly 530 535 540 Thr Leu Ser Pro Glu Glu Ile Glu Phe Ile Ala Asp His Lys Ile Gln 545 550 555 560 Gly Arg Lys Val Leu Pro Met Met Ala Ala Ile Gly Phe Met Ala Ser 565 570 575 Ile Ala Glu Gly Leu Tyr Pro Gly Tyr Asn Leu Gln Gly Val Glu Asn 580 585 590 Ala Gln Leu Phe Gln Gly Leu Thr Ile Asn Gln Glu Thr Lys Phe Gln 595 600 605 Ile Thr Leu Ile Glu Glu His Asn Ser Glu Glu Asn Leu Asp Val Leu 610 615 620 Thr Ser Leu Gly Val Met Leu Glu Ser Gly Lys Val Leu Pro Ala Tyr 625 630 635 640 Arg Cys Val Val Cys Leu Asn Thr Thr Gln Gln Gln Pro Lys Leu Ser 645 650 655 Pro Lys Ile Leu Asn Leu Glu Val Asp Pro Ala Cys Glu Val Asn Pro 660 665 670 Tyr Asp Gly Lys Ser Leu Phe His Gly Pro Leu Leu Gln Phe Val Gln 675 680 685 Gln Val Leu His Ser Ser Thr Lys Gly Leu Val Ala Lys Cys Arg Ala 690 695 700 Leu Pro Ile Lys Glu Ala Ile Arg Gly Pro Phe Ile Lys Gln Thr Leu 705 710 715 720 His Asp Pro Ile Leu Asp Asp Val Ile Phe Gln Leu Met Leu Val Trp 725 730 735 Cys Arg Asn Ala Leu Gly Ser Ala Ser Leu Pro Asn Arg Ile Glu Lys 740 745 750 Met Ser Tyr Phe Gly Asn Val Ser Glu Gly Ser Thr Phe Phe Ala Ser 755 760 765 Val Thr Pro Val Gly Pro Arg Val Pro Lys Asp Pro Val Ile Lys Met 770 775 780 Gln Phe Leu Leu Gln Asp Glu Ser Gly Asn Thr Phe Ser Ser Gly Glu 785 790 795 800 Gly Ser Val Val Leu Ser Asp Glu Leu Val Phe 805 810 <210> 51 <211> 5808 <212> DNA <213> Thraustochytrium sp. <220> <221> CDS <222> (1)..(5805) <220> <221> misc_feature <222> (1)..(5808) <223> n = a c t or g <400> 51 atg caa ctt cct cca gcg cat tct gcc gat gag aat cgc atc gcg gtc 48 Met Gln Leu Pro Pro Ala His Ser Ala Asp Glu Asn Arg Ile Ala Val 1 5 10 15 gtg ggc atg gcc gtc aaa tat gcg ggc tgt gac aat aaa gaa gag ttt 96 Val Gly Met Ala Val Lys Tyr Ala Gly Cys Asp Asn Lys Glu Glu Phe 20 25 30 tgg aag act ttg atg aat ggt agt atc aat acc aag tcg att tcg gca 144 Trp Lys Thr Leu Met Asn Gly Ser Ile Asn Thr Lys Ser Ile Ser Ala 35 40 45 gca agg ttg ggc agc aat aag cgt gac gaa cac tat gtt cct gaa cga 192 Ala Arg Leu Gly Ser Asn Lys Arg Asp Glu His Tyr Val Pro Glu Arg 50 55 60 tcg aaa tat gca gat acg ttc tgt aac gaa agg tac ggt tgt atc cag 240 Ser Lys Tyr Ala Asp Thr Phe Cys Asn Glu Arg Tyr Gly Cys Ile Gln 65 70 75 80 caa ggt acg gat aat gag cat gac ctc ctc cta ggt ctt gct caa gaa 288 Gln Gly Thr Asp Asn Glu His Asp Leu Leu Leu Gly Leu Ala Gln Glu 85 90 95 gct ctc gct gac gct gcc ggg cgg atg gag aaa caa cct tcg gag gcg 336 Ala Leu Ala Asp Ala Ala Gly Arg Met Glu Lys Gln Pro Ser Glu Ala 100 105 110 ttc gat ctg gaa aat act ggc atc gtg agt ggg tgc tta tct ttt cca 384 Phe Asp Leu Glu Asn Thr Gly Ile Val Ser Gly Cys Leu Ser Phe Pro 115 120 125 atg gat aac ctg caa gga gag ttg ttg aac ttg tat caa agc cat gtg 432 Met Asp Asn Leu Gln Gly Glu Leu Leu Asn Leu Tyr Gln Ser His Val 130 135 140 gag aaa caa ctt cca cct agt gcc ttg gta gaa gcc gtg aag ctt tgg 480 Glu Lys Gln Leu Pro Pro Ser Ala Leu Val Glu Ala Val Lys Leu Trp 145 150 155 160 tct gag cga cag aaa tct acg aaa gca cat gca ggg gac aag cgc cgg 528 Ser Glu Arg Gln Lys Ser Thr Lys Ala His Ala Gly Asp Lys Arg Arg 165 170 175 ttc att gac cca gct tct ttt gta gct gat aaa ctg aac cta ggc cca 576 Phe Ile Asp Pro Ala Ser Phe Val Ala Asp Lys Leu Asn Leu Gly Pro 180 185 190 cta cat tat gcg atc gat gca gca tgc gct tct gca ttg tac gtg tta 624 Leu His Tyr Ala Ile Asp Ala Ala Cys Ala Ser Ala Leu Tyr Val Leu 195 200 205 aaa tta gct caa gac cac ctt gtt tca ggt gcc gtt gat atg atg tta 672 Lys Leu Ala Gln Asp His Leu Val Ser Gly Ala Val Asp Met Met Leu 210 215 220 tgt gga gcg acg tgc ttc cca gaa cca ttc ttc atc ttg tct ggg ttc 720 Cys Gly Ala Thr Cys Phe Pro Glu Pro Phe Phe Ile Leu Ser Gly Phe 225 230 235 240 tcg act ttt caa gcg atg cct gnt ggg gca gat gga gtc tca cta cct 768 Ser Thr Phe Gln Ala Met Pro Xaa Gly Ala Asp Gly Val Ser Leu Pro 245 250 255 ctc cat aaa acg agt gct ggg ctc act cca ggt gaa ggg ggg tcc att 816 Leu His Lys Thr Ser Ala Gly Leu Thr Pro Gly Glu Gly Gly Ser Ile 260 265 270 atg gtg ctc aag cga ctg aaa gac gct atc aga gat gga aat cac att 864 Met Val Leu Lys Arg Leu Lys Asp Ala Ile Arg Asp Gly Asn His Ile 275 280 285 tat ggt gtg ctc ctt gaa gca aat tta agt aac gca ggt tgt ggg ctt 912 Tyr Gly Val Leu Leu Glu Ala Asn Leu Ser Asn Ala Gly Cys Gly Leu 290 295 300 cca ctc agc ccg cac tta ccg agc gaa gaa tca tgt att cgt gat acc 960 Pro Leu Ser Pro His Leu Pro Ser Glu Glu Ser Cys Ile Arg Asp Thr 305 310 315 320 tac cgc cgt gct gga gtt gct gca gat caa agt att cag tat att gag 1008 Tyr Arg Arg Ala Gly Val Ala Ala Asp Gln Ser Ile Gln Tyr Ile Glu 325 330 335 tgc cac gct acg gga acc cct cga ggg gat gtc gtg gaa att gag gcg 1056 Cys His Ala Thr Gly Thr Pro Arg Gly Asp Val Val Glu Ile Glu Ala 340 345 350 gtt gaa aga gtt ttc aag aaa aac gtt cca cgc tta ggc tcg acg aaa 1104 Val Glu Arg Val Phe Lys Lys Asn Val Pro Arg Leu Gly Ser Thr Lys 355 360 365 gga aat ttt ggt cac tcg tta gtt gcg gct ggt ttc gca ggt atg gca 1152 Gly Asn Phe Gly His Ser Leu Val Ala Ala Gly Phe Ala Gly Met Ala 370 375 380 aag ctt ctt ctt gca atg gaa cat gga gtg att cct ccc aca cca ggt 1200 Lys Leu Leu Leu Ala Met Glu His Gly Val Ile Pro Pro Thr Pro Gly 385 390 395 400 ctt gat gct tcg aac cag gca agt gag cac gtt gtg aca aag gct atc 1248 Leu Asp Ala Ser Asn Gln Ala Ser Glu His Val Val Thr Lys Ala Ile 405 410 415 act tgg cct gag aca cat ggg gct cca aaa cga gct ggc ctt tca gca 1296 Thr Trp Pro Glu Thr His Gly Ala Pro Lys Arg Ala Gly Leu Ser Ala 420 425 430 ttt gga ttt ggt ggg act aat gcg cat gca ctc ttc gaa gag ttt aat 1344 Phe Gly Phe Gly Gly Thr Asn Ala His Ala Leu Phe Glu Glu Phe Asn 435 440 445 gcc gag ggc ata agt tat cgc cct gga aag cct cca gtc gaa tcg aat 1392 Ala Glu Gly Ile Ser Tyr Arg Pro Gly Lys Pro Pro Val Glu Ser Asn 450 455 460 acc cgt cct tcc gtc gta ata act ggg atg gac tgt acc ttt ggg agc 1440 Thr Arg Pro Ser Val Val Ile Thr Gly Met Asp Cys Thr Phe Gly Ser 465 470 475 480 ctt gaa ggg att gat gcg ttc gag act gcc ctg tac gag ggg cgt gac 1488 Leu Glu Gly Ile Asp Ala Phe Glu Thr Ala Leu Tyr Glu Gly Arg Asp 485 490 495 gca gct cgt gac tta ccc gcc aaa cgt tgg agg ttc cta ggt gag gac 1536 Ala Ala Arg Asp Leu Pro Ala Lys Arg Trp Arg Phe Leu Gly Glu Asp 500 505 510 ttg gag ttt ctc cga gcc atc agg ctc aag gaa aag cct agg ggt tgt 1584 Leu Glu Phe Leu Arg Ala Ile Arg Leu Lys Glu Lys Pro Arg Gly Cys 515 520 525 ttt gtg gag agt gtt gac gtt aac ttt aga cgg ctg aaa acg ccc ttg 1632 Phe Val Glu Ser Val Asp Val Asn Phe Arg Arg Leu Lys Thr Pro Leu 530 535 540 aca cca gaa gat atg ttg cgg ccc caa caa ctc ttg gcg gtt tct acg 1680 Thr Pro Glu Asp Met Leu Arg Pro Gln Gln Leu Leu Ala Val Ser Thr 545 550 555 560 atg gac cga gca att atc gat gca ggt cta aag aag ggc caa cat gta 1728 Met Asp Arg Ala Ile Ile Asp Ala Gly Leu Lys Lys Gly Gln His Val 565 570 575 gca gtt ctt gtt ggc cta gga act gac ctg gaa ctt tac cgt cat cga 1776 Ala Val Leu Val Gly Leu Gly Thr Asp Leu Glu Leu Tyr Arg His Arg 580 585 590 gca aga gtc gcg ctt aaa gag gtt ttg cac ccg agc tta aag tca gac 1824 Ala Arg Val Ala Leu Lys Glu Val Leu His Pro Ser Leu Lys Ser Asp 595 600 605 act gca att ctc cag aaa ata atg caa tat gtg aat gat gca gga act 1872 Thr Ala Ile Leu Gln Lys Ile Met Gln Tyr Val Asn Asp Ala Gly Thr 610 615 620 tcg act tca tac aca tct tac att gga aac ctc gtt gcc acg cgt att 1920 Ser Thr Ser Tyr Thr Ser Tyr Ile Gly Asn Leu Val Ala Thr Arg Ile 625 630 635 640 tcg tct cag tgg gga ttc aca ggg ccg tcc ttt act gtc aca gaa gga 1968 Ser Ser Gln Trp Gly Phe Thr Gly Pro Ser Phe Thr Val Thr Glu Gly 645 650 655 aat aat tcc gtg tac aga tgt gca caa cta gcc aaa gat atg ctt cag 2016 Asn Asn Ser Val Tyr Arg Cys Ala Gln Leu Ala Lys Asp Met Leu Gln 660 665 670 gtt aac cga gtt gat gct gtc gtc atc gca ggc gtt gat ctc aac gga 2064 Val Asn Arg Val Asp Ala Val Val Ile Ala Gly Val Asp Leu Asn Gly 675 680 685 agc gcc gaa agt ttt ttt gtc cga gca aat cgt caa aag ata tcc aag 2112 Ser Ala Glu Ser Phe Phe Val Arg Ala Asn Arg Gln Lys Ile Ser Lys 690 695 700 cta agt cat cca tgt gca agc ttc gac aga gat gca gat gga ttt ttc 2160 Leu Ser His Pro Cys Ala Ser Phe Asp Arg Asp Ala Asp Gly Phe Phe 705 710 715 720 gca ggt gag ggc tgt ggt gcc cta gtt ttc aag agg tta gaa gac tgt 2208 Ala Gly Glu Gly Cys Gly Ala Leu Val Phe Lys Arg Leu Glu Asp Cys 725 730 735 gct cct cag gaa aaa att tat gct agt ata gac tct atc gca ata gat 2256 Ala Pro Gln Glu Lys Ile Tyr Ala Ser Ile Asp Ser Ile Ala Ile Asp 740 745 750 aaa gag cct act agc tca gct gtg aaa gct gtc tac caa agt gat tcg 2304 Lys Glu Pro Thr Ser Ser Ala Val Lys Ala Val Tyr Gln Ser Asp Ser 755 760 765 agt ctc tcc gat att gag ctg tta gaa atc agt gga gac tcc aaa cgg 2352 Ser Leu Ser Asp Ile Glu Leu Leu Glu Ile Ser Gly Asp Ser Lys Arg 770 775 780 ttt gca gca ttc gaa ggc gct gtg gaa att caa tca agt gtg gaa gcc 2400 Phe Ala Ala Phe Glu Gly Ala Val Glu Ile Gln Ser Ser Val Glu Ala 785 790 795 800 cag cta aaa gga ctt tcc aaa gtc ctt gaa cct gca aaa ggc caa ggc 2448 Gln Leu Lys Gly Leu Ser Lys Val Leu Glu Pro Ala Lys Gly Gln Gly 805 810 815 gta gcg gtg gga agt act cga gca acc gtt ggg gat ata ggg tat gct 2496 Val Ala Val Gly Ser Thr Arg Ala Thr Val Gly Asp Ile Gly Tyr Ala 820 825 830 aca gga gcg gca agc ctg att aaa act gca ctc tgc tta tat aat cgc 2544 Thr Gly Ala Ala Ser Leu Ile Lys Thr Ala Leu Cys Leu Tyr Asn Arg 835 840 845 tac ctt ccg gca tta gca aac tgg agt ggc cca tgt gaa cag tcc gcc 2592 Tyr Leu Pro Ala Leu Ala Asn Trp Ser Gly Pro Cys Glu Gln Ser Ala 850 855 860 tgg ggc tca aac atg ttc gtt tgc cat gaa aca cgg ccg tgg atg aaa 2640 Trp Gly Ser Asn Met Phe Val Cys His Glu Thr Arg Pro Trp Met Lys 865 870 875 880 aac cag aat gaa aag aga tgt gcc ctc att tct gga aca gat cca tct 2688 Asn Gln Asn Glu Lys Arg Cys Ala Leu Ile Ser Gly Thr Asp Pro Ser 885 890 895 cat aca tgc ttt tcc ctc gta cta tcg gat act ggg tgt tat gaa gag 2736 His Thr Cys Phe Ser Leu Val Leu Ser Asp Thr Gly Cys Tyr Glu Glu 900 905 910 cac aat cga acg tgc ttt gat gtg caa gcg cca cag cta gtt ctg ata 2784 His Asn Arg Thr Cys Phe Asp Val Gln Ala Pro Gln Leu Val Leu Ile 915 920 925 cac gga ttc gat gga aaa act att gtg cgg cga ctt gaa gga tat ctc 2832 His Gly Phe Asp Gly Lys Thr Ile Val Arg Arg Leu Glu Gly Tyr Leu 930 935 940 ctt gaa ctt gtt gaa ggg cat gca agc cct tca gag tat ttc cac aaa 2880 Leu Glu Leu Val Glu Gly His Ala Ser Pro Ser Glu Tyr Phe His Lys 945 950 955 960 ctg att gga caa agt cta ctt gag aac tcg aaa gaa agt aaa ctc aca 2928 Leu Ile Gly Gln Ser Leu Leu Glu Asn Ser Lys Glu Ser Lys Leu Thr 965 970 975 ctt tcg ctt gtg tgc aat ccg aac cag ctc caa aag gag ctc atg ctt 2976 Leu Ser Leu Val Cys Asn Pro Asn Gln Leu Gln Lys Glu Leu Met Leu 980 985 990 gct atc aaa gga gta caa cga agc atg tta aca ggg aag gat tgg gtc 3024 Ala Ile Lys Gly Val Gln Arg Ser Met Leu Thr Gly Lys Asp Trp Val 995 1000 1005 agt cca tca gga agt tgt ttt gcc cca aat ccg tta tca agc gca 3069 Ser Pro Ser Gly Ser Cys Phe Ala Pro Asn Pro Leu Ser Ser Ala 1010 1015 1020 aaa gtg gca ttc atg tac gga gaa ggc cga agc ccg tac tgt ggt 3114 Lys Val Ala Phe Met Tyr Gly Glu Gly Arg Ser Pro Tyr Cys Gly 1025 1030 1035 gta ggc ttg ggt cta cat cgt ttg tgg ccc ggt ctc cat gaa aat 3159 Val Gly Leu Gly Leu His Arg Leu Trp Pro Gly Leu His Glu Asn 1040 1045 1050 gtg aac aat aag aca gtc gat tta tgg acg gaa gga gat ggt tgg 3204 Val Asn Asn Lys Thr Val Asp Leu Trp Thr Glu Gly Asp Gly Trp 1055 1060 1065 tta tat cct cga acg ttg aca cga gaa gag cat aca aaa gcc atc 3249 Leu Tyr Pro Arg Thr Leu Thr Arg Glu Glu His Thr Lys Ala Ile 1070 1075 1080 gaa tct ttc aac gca aat caa att gaa atg ttt cgc gct ggg att 3294 Glu Ser Phe Asn Ala Asn Gln Ile Glu Met Phe Arg Ala Gly Ile 1085 1090 1095 ttc atc tca atg tgt cag aca gac tat gtc atg aat gtt ctc ggt 3339 Phe Ile Ser Met Cys Gln Thr Asp Tyr Val Met Asn Val Leu Gly 1100 1105 1110 gtc cag cct aag gcc gga ttt ggg ctg agc ttg gga gaa att tca 3384 Val Gln Pro Lys Ala Gly Phe Gly Leu Ser Leu Gly Glu Ile Ser 1115 1120 1125 atg ctc ttt gcg atg tca aag gag aac tgc agg cag tca cag gaa 3429 Met Leu Phe Ala Met Ser Lys Glu Asn Cys Arg Gln Ser Gln Glu 1130 1135 1140 atg acc aat cgt ttg cgc ggt tct cca gtg tgg tct aac gag ctt 3474 Met Thr Asn Arg Leu Arg Gly Ser Pro Val Trp Ser Asn Glu Leu 1145 1150 1155 gct atc aac ttc aat gca att cgc aag tta tgg aaa atc ccc cga 3519 Ala Ile Asn Phe Asn Ala Ile Arg Lys Leu Trp Lys Ile Pro Arg 1160 1165 1170 gga gct ccc tta gaa tcc ttt tgg caa gga tac ttg gtt cac ggc 3564 Gly Ala Pro Leu Glu Ser Phe Trp Gln Gly Tyr Leu Val His Gly 1175 1180 1185 aca aga gaa gaa gta gag cat gct att ggt ctt tct gag cct tat 3609 Thr Arg Glu Glu Val Glu His Ala Ile Gly Leu Ser Glu Pro Tyr 1190 1195 1200 gta cgt ctg ctt att gtg aac gat tca agg agt gcc ttg att gct 3654 Val Arg Leu Leu Ile Val Asn Asp Ser Arg Ser Ala Leu Ile Ala 1205 1210 1215 gga aaa cca gac gcc tgt cag gca gta atc agt aga cta aac tcc 3699 Gly Lys Pro Asp Ala Cys Gln Ala Val Ile Ser Arg Leu Asn Ser 1220 1225 1230 aag ttc cct tct ctg ccg gta aag caa gga atg att ggt cat tgc 3744 Lys Phe Pro Ser Leu Pro Val Lys Gln Gly Met Ile Gly His Cys 1235 1240 1245 cca gaa gtt cgt gcg ttc atc aaa gat att ggg tac atc cat gaa 3789 Pro Glu Val Arg Ala Phe Ile Lys Asp Ile Gly Tyr Ile His Glu 1250 1255 1260 aca ctc cga att tcc aat gac tat tcg gat tgt cag ctt ttc tca 3834 Thr Leu Arg Ile Ser Asn Asp Tyr Ser Asp Cys Gln Leu Phe Ser 1265 1270 1275 gcg gta acc aag ggc gca ctt gac agc tcc aca atg gaa atc aaa 3879 Ala Val Thr Lys Gly Ala Leu Asp Ser Ser Thr Met Glu Ile Lys 1280 1285 1290 cac ttt gtg gga gag gtc tac tcc cgg atc gca gac ttt cct caa 3924 His Phe Val Gly Glu Val Tyr Ser Arg Ile Ala Asp Phe Pro Gln 1295 1300 1305 atc gtc aac acg gtg cat tcg gct ggt tat gac gta ttt ctt gag 3969 Ile Val Asn Thr Val His Ser Ala Gly Tyr Asp Val Phe Leu Glu 1310 1315 1320 ctt ggc tgt gat gct tct aga tct gca gca gtt caa aac att ctt 4014 Leu Gly Cys Asp Ala Ser Arg Ser Ala Ala Val Gln Asn Ile Leu 1325 1330 1335 ggt ggt caa gga aag ttc ttg tct aca gct att gac aaa aaa gga 4059 Gly Gly Gln Gly Lys Phe Leu Ser Thr Ala Ile Asp Lys Lys Gly 1340 1345 1350 cac tcc gcc tgg tca caa gta ctt cgg gct acc gca tca tta gct 4104 His Ser Ala Trp Ser Gln Val Leu Arg Ala Thr Ala Ser Leu Ala 1355 1360 1365 gca cat cga gta ccg gga atc tca att ttg gat ttg ttt cac cca 4149 Ala His Arg Val Pro Gly Ile Ser Ile Leu Asp Leu Phe His Pro 1370 1375 1380 aat ttc cga gaa atg tgc tgt aca atg gca acc aca cct aaa gtg 4194 Asn Phe Arg Glu Met Cys Cys Thr Met Ala Thr Thr Pro Lys Val 1385 1390 1395 gaa gat aag ttc ctg cgc acg att caa atc aat ggt cgg ttt gaa 4239 Glu Asp Lys Phe Leu Arg Thr Ile Gln Ile Asn Gly Arg Phe Glu 1400 1405 1410 aaa gaa atg att cac cta gaa gat aca aca tta agt tgc tta ccc 4284 Lys Glu Met Ile His Leu Glu Asp Thr Thr Leu Ser Cys Leu Pro 1415 1420 1425 gct cca agt gaa gca aat atc gca gct att caa tct cgg tca att 4329 Ala Pro Ser Glu Ala Asn Ile Ala Ala Ile Gln Ser Arg Ser Ile 1430 1435 1440 cga tct gct gcg gcg cgt tct gga caa tcc cat gat tgt gca tcc 4374 Arg Ser Ala Ala Ala Arg Ser Gly Gln Ser His Asp Cys Ala Ser 1445 1450 1455 cat agc cat gaa gaa aat aag gat tca tgc cct gaa aag ctg aag 4419 His Ser His Glu Glu Asn Lys Asp Ser Cys Pro Glu Lys Leu Lys 1460 1465 1470 ctt gat tct gtg tcc gtc gcc ata aat ttc gac aat gat gac cgc 4464 Leu Asp Ser Val Ser Val Ala Ile Asn Phe Asp Asn Asp Asp Arg 1475 1480 1485 att cag ctt ggg cac gcg ggt ttt cgg gag atg tac aat aca aga 4509 Ile Gln Leu Gly His Ala Gly Phe Arg Glu Met Tyr Asn Thr Arg 1490 1495 1500 tat agc ttg tac aca ggg gcg atg gca aag gga att gca tct gca 4554 Tyr Ser Leu Tyr Thr Gly Ala Met Ala Lys Gly Ile Ala Ser Ala 1505 1510 1515 gat ctt gtc att gcc gct ggg aaa gag ggc atc cta gct tcc tat 4599 Asp Leu Val Ile Ala Ala Gly Lys Glu Gly Ile Leu Ala Ser Tyr 1520 1525 1530 gga gct gga gga cta cct ctt gct act gtt cga aag gga ata gac 4644 Gly Ala Gly Gly Leu Pro Leu Ala Thr Val Arg Lys Gly Ile Asp 1535 1540 1545 aaa att caa caa gcc ttg cca agt ggc cca tat gct gta aat ctt 4689 Lys Ile Gln Gln Ala Leu Pro Ser Gly Pro Tyr Ala Val Asn Leu 1550 1555 1560 att cac tct ccc ttt gac ggc aac ttg gag cag gga aac gtc gat 4734 Ile His Ser Pro Phe Asp Gly Asn Leu Glu Gln Gly Asn Val Asp 1565 1570 1575 ttg ttc ttg gaa aag aac gtc cgc gtg gcg gaa tgt tcc gcg ttt 4779 Leu Phe Leu Glu Lys Asn Val Arg Val Ala Glu Cys Ser Ala Phe 1580 1585 1590 aca acg cta aca gtg cca gta gta cac tat cgt gct gca ggg ctt 4824 Thr Thr Leu Thr Val Pro Val Val His Tyr Arg Ala Ala Gly Leu 1595 1600 1605 gtt cgg cgc caa gat gga agc att ttg atc aag aac cga atc att 4869 Val Arg Arg Gln Asp Gly Ser Ile Leu Ile Lys Asn Arg Ile Ile 1610 1615 1620 gct aaa gta tct agg aca gaa ctc gct gag atg ttc ctt cgt ccg 4914 Ala Lys Val Ser Arg Thr Glu Leu Ala Glu Met Phe Leu Arg Pro 1625 1630 1635 gca cct caa atc atc ctc gaa aaa ctg gta gca gca gaa atc att 4959 Ala Pro Gln Ile Ile Leu Glu Lys Leu Val Ala Ala Glu Ile Ile 1640 1645 1650 tca tct gac caa gcg cgt atg gca gcc aaa gtt ccc atg gcg gac 5004 Ser Ser Asp Gln Ala Arg Met Ala Ala Lys Val Pro Met Ala Asp 1655 1660 1665 gac atc gca gtc gaa gcc gac tct ggt ggg cac acg gat aat cgg 5049 Asp Ile Ala Val Glu Ala Asp Ser Gly Gly His Thr Asp Asn Arg 1670 1675 1680 cct atg cac gtc att ttg ccc ctg ata att caa ctc cgc aat act 5094 Pro Met His Val Ile Leu Pro Leu Ile Ile Gln Leu Arg Asn Thr 1685 1690 1695 ata ctt gca gag tat ggc tgt gcc acg gct ttt cgt acc cgt ata 5139 Ile Leu Ala Glu Tyr Gly Cys Ala Thr Ala Phe Arg Thr Arg Ile 1700 1705 1710 ggc gct gga gga ggc att ggt tgt cct tca gcg gcc ctc gca gcc 5184 Gly Ala Gly Gly Gly Ile Gly Cys Pro Ser Ala Ala Leu Ala Ala 1715 1720 1725 ttt gat atg ggt gcg agt ttt gtc gtg act gga agc ata aat caa 5229 Phe Asp Met Gly Ala Ser Phe Val Val Thr Gly Ser Ile Asn Gln 1730 1735 1740 att tgc cgc gag gca ggg act tgc gat act gtt cgg gag cta ctt 5274 Ile Cys Arg Glu Ala Gly Thr Cys Asp Thr Val Arg Glu Leu Leu 1745 1750 1755 gcc aac tca agc tac tcg gac gtg acg atg gcg cca gca gca gac 5319 Ala Asn Ser Ser Tyr Ser Asp Val Thr Met Ala Pro Ala Ala Asp 1760 1765 1770 atg ttt gac caa ggt gtg aaa ctc caa gtc tta aaa cga gga acg 5364 Met Phe Asp Gln Gly Val Lys Leu Gln Val Leu Lys Arg Gly Thr 1775 1780 1785 atg ttt cca agc aga gca aat aaa ctc cgg aag ctc ttt gtg aac 5409 Met Phe Pro Ser Arg Ala Asn Lys Leu Arg Lys Leu Phe Val Asn 1790 1795 1800 tac gaa tct cta gaa aca ctc ccg tcg aaa gag ttg aaa tac ctg 5454 Tyr Glu Ser Leu Glu Thr Leu Pro Ser Lys Glu Leu Lys Tyr Leu 1805 1810 1815 gaa aac atc ata ttc aag caa gca gta gac cag gtg tgg gag gaa 5499 Glu Asn Ile Ile Phe Lys Gln Ala Val Asp Gln Val Trp Glu Glu 1820 1825 1830 aca aag cgc ttt tac tgt gaa aaa ctg aac aat cca gat aaa att 5544 Thr Lys Arg Phe Tyr Cys Glu Lys Leu Asn Asn Pro Asp Lys Ile 1835 1840 1845 gca agg gcc atg aaa gat cct aaa ttg aag atg tcg ctt tgc ttt 5589 Ala Arg Ala Met Lys Asp Pro Lys Leu Lys Met Ser Leu Cys Phe 1850 1855 1860 cgg tgg tat ctc tcc aag agc tct ggg tgg gcc aac gca gga att 5634 Arg Trp Tyr Leu Ser Lys Ser Ser Gly Trp Ala Asn Ala Gly Ile 1865 1870 1875 aaa tct cgt gca ctc gac tac cag atc tgg tgt ggc ccg gca atg 5679 Lys Ser Arg Ala Leu Asp Tyr Gln Ile Trp Cys Gly Pro Ala Met 1880 1885 1890 ggc tcg ttc aac aat ttc gcc agc ggc aca tcc ctc gat tgg aaa 5724 Gly Ser Phe Asn Asn Phe Ala Ser Gly Thr Ser Leu Asp Trp Lys 1895 1900 1905 gtg act ggg gtt ttc cct ggc gtt gcg gaa gta aac atg gcc att 5769 Val Thr Gly Val Phe Pro Gly Val Ala Glu Val Asn Met Ala Ile 1910 1915 1920 tta gat ggc gcg cga gaa cta gct gct aaa cga aat taa 5808 Leu Asp Gly Ala Arg Glu Leu Ala Ala Lys Arg Asn 1925 1930 1935 <210> 52 <211> 1935 <212> PRT <213> Thraustochytrium sp. <220> <221> misc_feature <222> (248)..(248) <223> The 'Xaa' at location 248 stands for Asp, Gly, Ala, or Val. <400> 52 Met Gln Leu Pro Pro Ala His Ser Ala Asp Glu Asn Arg Ile Ala Val 1 5 10 15 Val Gly Met Ala Val Lys Tyr Ala Gly Cys Asp Asn Lys Glu Glu Phe 20 25 30 Trp Lys Thr Leu Met Asn Gly Ser Ile Asn Thr Lys Ser Ile Ser Ala 35 40 45 Ala Arg Leu Gly Ser Asn Lys Arg Asp Glu His Tyr Val Pro Glu Arg 50 55 60 Ser Lys Tyr Ala Asp Thr Phe Cys Asn Glu Arg Tyr Gly Cys Ile Gln 65 70 75 80 Gln Gly Thr Asp Asn Glu His Asp Leu Leu Leu Gly Leu Ala Gln Glu 85 90 95 Ala Leu Ala Asp Ala Ala Gly Arg Met Glu Lys Gln Pro Ser Glu Ala 100 105 110 Phe Asp Leu Glu Asn Thr Gly Ile Val Ser Gly Cys Leu Ser Phe Pro 115 120 125 Met Asp Asn Leu Gln Gly Glu Leu Leu Asn Leu Tyr Gln Ser His Val 130 135 140 Glu Lys Gln Leu Pro Pro Ser Ala Leu Val Glu Ala Val Lys Leu Trp 145 150 155 160 Ser Glu Arg Gln Lys Ser Thr Lys Ala His Ala Gly Asp Lys Arg Arg 165 170 175 Phe Ile Asp Pro Ala Ser Phe Val Ala Asp Lys Leu Asn Leu Gly Pro 180 185 190 Leu His Tyr Ala Ile Asp Ala Ala Cys Ala Ser Ala Leu Tyr Val Leu 195 200 205 Lys Leu Ala Gln Asp His Leu Val Ser Gly Ala Val Asp Met Met Leu 210 215 220 Cys Gly Ala Thr Cys Phe Pro Glu Pro Phe Phe Ile Leu Ser Gly Phe 225 230 235 240 Ser Thr Phe Gln Ala Met Pro Xaa Gly Ala Asp Gly Val Ser Leu Pro 245 250 255 Leu His Lys Thr Ser Ala Gly Leu Thr Pro Gly Glu Gly Gly Ser Ile 260 265 270 Met Val Leu Lys Arg Leu Lys Asp Ala Ile Arg Asp Gly Asn His Ile 275 280 285 Tyr Gly Val Leu Leu Glu Ala Asn Leu Ser Asn Ala Gly Cys Gly Leu 290 295 300 Pro Leu Ser Pro His Leu Pro Ser Glu Glu Ser Cys Ile Arg Asp Thr 305 310 315 320 Tyr Arg Arg Ala Gly Val Ala Ala Asp Gln Ser Ile Gln Tyr Ile Glu 325 330 335 Cys His Ala Thr Gly Thr Pro Arg Gly Asp Val Val Glu Ile Glu Ala 340 345 350 Val Glu Arg Val Phe Lys Lys Asn Val Pro Arg Leu Gly Ser Thr Lys 355 360 365 Gly Asn Phe Gly His Ser Leu Val Ala Ala Gly Phe Ala Gly Met Ala 370 375 380 Lys Leu Leu Leu Ala Met Glu His Gly Val Ile Pro Pro Thr Pro Gly 385 390 395 400 Leu Asp Ala Ser Asn Gln Ala Ser Glu His Val Val Thr Lys Ala Ile 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1035 Val Gly Leu Gly Leu His Arg Leu Trp Pro Gly Leu His Glu Asn 1040 1045 1050 Val Asn Asn Lys Thr Val Asp Leu Trp Thr Glu Gly Asp Gly Trp 1055 1060 1065 Leu Tyr Pro Arg Thr Leu Thr Arg Glu Glu His Thr Lys Ala Ile 1070 1075 1080 Glu Ser Phe Asn Ala Asn Gln Ile Glu Met Phe Arg Ala Gly Ile 1085 1090 1095 Phe Ile Ser Met Cys Gln Thr Asp Tyr Val Met Asn Val Leu Gly 1100 1105 1110 Val Gln Pro Lys Ala Gly Phe Gly Leu Ser Leu Gly Glu Ile Ser 1115 1120 1125 Met Leu Phe Ala Met Ser Lys Glu Asn Cys Arg Gln Ser Gln Glu 1130 1135 1140 Met Thr Asn Arg Leu Arg Gly Ser Pro Val Trp Ser Asn Glu Leu 1145 1150 1155 Ala Ile Asn Phe Asn Ala Ile Arg Lys Leu Trp Lys Ile Pro Arg 1160 1165 1170 Gly Ala Pro Leu Glu Ser Phe Trp Gln Gly Tyr Leu Val His Gly 1175 1180 1185 Thr Arg Glu Glu Val Glu His Ala Ile Gly Leu Ser Glu Pro Tyr 1190 1195 1200 Val Arg Leu Leu Ile Val Asn Asp Ser Arg Ser Ala Leu Ile Ala 1205 1210 1215 Gly Lys Pro Asp Ala Cys Gln Ala Val Ile Ser Arg Leu Asn Ser 1220 1225 1230 Lys Phe Pro Ser Leu Pro Val Lys Gln Gly Met Ile Gly His Cys 1235 1240 1245 Pro Glu Val Arg Ala Phe Ile Lys Asp Ile Gly Tyr Ile His Glu 1250 1255 1260 Thr Leu Arg Ile Ser Asn Asp Tyr Ser Asp Cys Gln Leu Phe Ser 1265 1270 1275 Ala Val Thr Lys Gly Ala Leu Asp Ser Ser Thr Met Glu Ile Lys 1280 1285 1290 His Phe Val Gly Glu Val Tyr Ser Arg Ile Ala Asp Phe Pro Gln 1295 1300 1305 Ile Val Asn Thr Val His Ser Ala Gly Tyr Asp Val Phe Leu Glu 1310 1315 1320 Leu Gly Cys Asp Ala Ser Arg Ser Ala Ala Val Gln Asn Ile Leu 1325 1330 1335 Gly Gly Gln Gly Lys Phe Leu Ser Thr Ala Ile Asp Lys Lys Gly 1340 1345 1350 His Ser Ala Trp Ser Gln Val Leu Arg Ala Thr Ala Ser Leu Ala 1355 1360 1365 Ala His Arg Val Pro Gly Ile Ser Ile Leu Asp Leu Phe His Pro 1370 1375 1380 Asn Phe Arg Glu Met Cys Cys Thr Met Ala Thr Thr Pro Lys Val 1385 1390 1395 Glu Asp Lys Phe Leu Arg Thr Ile Gln Ile Asn Gly Arg Phe Glu 1400 1405 1410 Lys Glu Met Ile His Leu Glu Asp Thr Thr Leu Ser Cys Leu Pro 1415 1420 1425 Ala Pro Ser Glu Ala Asn Ile Ala Ala Ile Gln Ser Arg Ser Ile 1430 1435 1440 Arg Ser Ala Ala Ala Arg Ser Gly Gln Ser His Asp Cys Ala Ser 1445 1450 1455 His Ser His Glu Glu Asn Lys Asp Ser Cys Pro Glu Lys Leu Lys 1460 1465 1470 Leu Asp Ser Val Ser Val Ala Ile Asn Phe Asp Asn Asp Asp Arg 1475 1480 1485 Ile Gln Leu Gly His Ala Gly Phe Arg Glu Met Tyr Asn Thr Arg 1490 1495 1500 Tyr Ser Leu Tyr Thr Gly Ala Met Ala Lys Gly Ile Ala Ser Ala 1505 1510 1515 Asp Leu Val Ile Ala Ala Gly Lys Glu Gly Ile Leu Ala Ser Tyr 1520 1525 1530 Gly Ala Gly Gly Leu Pro Leu Ala Thr Val Arg Lys Gly Ile Asp 1535 1540 1545 Lys Ile Gln Gln Ala Leu Pro Ser Gly Pro Tyr Ala Val Asn Leu 1550 1555 1560 Ile His Ser Pro Phe Asp Gly Asn Leu Glu Gln Gly Asn Val Asp 1565 1570 1575 Leu Phe Leu Glu Lys Asn Val Arg Val Ala Glu Cys Ser Ala Phe 1580 1585 1590 Thr Thr Leu Thr Val Pro Val Val His Tyr Arg Ala Ala Gly Leu 1595 1600 1605 Val Arg Arg Gln Asp Gly Ser Ile Leu Ile Lys Asn Arg Ile Ile 1610 1615 1620 Ala Lys Val Ser Arg Thr Glu Leu Ala Glu Met Phe Leu Arg Pro 1625 1630 1635 Ala Pro Gln Ile Ile Leu Glu Lys Leu Val Ala Ala Glu Ile Ile 1640 1645 1650 Ser Ser Asp Gln Ala Arg Met Ala Ala Lys Val Pro Met Ala Asp 1655 1660 1665 Asp Ile Ala Val Glu Ala Asp Ser Gly Gly His Thr Asp Asn Arg 1670 1675 1680 Pro Met His Val Ile Leu Pro Leu Ile Ile Gln Leu Arg Asn Thr 1685 1690 1695 Ile Leu Ala Glu Tyr Gly Cys Ala Thr Ala Phe Arg Thr Arg Ile 1700 1705 1710 Gly Ala Gly Gly Gly Ile Gly Cys Pro Ser Ala Ala Leu Ala Ala 1715 1720 1725 Phe Asp Met Gly Ala Ser Phe Val Val Thr Gly Ser Ile Asn Gln 1730 1735 1740 Ile Cys Arg Glu Ala Gly Thr Cys Asp Thr Val Arg Glu Leu Leu 1745 1750 1755 Ala Asn Ser Ser Tyr Ser Asp Val Thr Met Ala Pro Ala Ala Asp 1760 1765 1770 Met Phe Asp Gln Gly Val Lys Leu Gln Val Leu Lys Arg Gly Thr 1775 1780 1785 Met Phe Pro Ser Arg Ala Asn Lys Leu Arg Lys Leu Phe Val Asn 1790 1795 1800 Tyr Glu Ser Leu Glu Thr Leu Pro Ser Lys Glu Leu Lys Tyr Leu 1805 1810 1815 Glu Asn Ile Ile Phe Lys Gln Ala Val Asp Gln Val Trp Glu Glu 1820 1825 1830 Thr Lys Arg Phe Tyr 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gca 144 Trp Lys Thr Leu Met Asn Gly Ser Ile Asn Thr Lys Ser Ile Ser Ala 35 40 45 gca agg ttg ggc agc aat aag cgt gac gaa cac tat gtt cct gaa cga 192 Ala Arg Leu Gly Ser Asn Lys Arg Asp Glu His Tyr Val Pro Glu Arg 50 55 60 tcg aaa tat gca gat acg ttc tgt aac gaa agg tac ggt tgt atc cag 240 Ser Lys Tyr Ala Asp Thr Phe Cys Asn Glu Arg Tyr Gly Cys Ile Gln 65 70 75 80 caa ggt acg gat aat gag cat gac ctc ctc cta ggt ctt gct caa gaa 288 Gln Gly Thr Asp Asn Glu His Asp Leu Leu Leu Gly Leu Ala Gln Glu 85 90 95 gct ctc gct gac gct gcc ggg cgg atg gag aaa caa cct tcg gag gcg 336 Ala Leu Ala Asp Ala Ala Gly Arg Met Glu Lys Gln Pro Ser Glu Ala 100 105 110 ttc gat ctg gaa aat act ggc atc gtg agt ggg tgc tta tct ttt cca 384 Phe Asp Leu Glu Asn Thr Gly Ile Val Ser Gly Cys Leu Ser Phe Pro 115 120 125 atg gat aac ctg caa gga gag ttg ttg aac ttg tat caa agc cat gtg 432 Met Asp Asn Leu Gln Gly Glu Leu Leu Asn Leu Tyr Gln Ser His Val 130 135 140 gag aaa caa ctt cca cct agt gcc ttg gta gaa gcc gtg aag ctt tgg 480 Glu Lys Gln Leu Pro Pro Ser Ala Leu Val Glu Ala Val Lys Leu Trp 145 150 155 160 tct gag cga cag aaa tct acg aaa gca cat gca ggg gac aag cgc cgg 528 Ser Glu Arg Gln Lys Ser Thr Lys Ala His Ala Gly Asp Lys Arg Arg 165 170 175 ttc att gac cca gct tct ttt gta gct gat aaa ctg aac cta ggc cca 576 Phe Ile Asp Pro Ala Ser Phe Val Ala Asp Lys Leu Asn Leu Gly Pro 180 185 190 cta cat tat gcg atc gat gca gca tgc gct tct gca ttg tac gtg tta 624 Leu His Tyr Ala Ile Asp Ala Ala Cys Ala Ser Ala Leu Tyr Val Leu 195 200 205 aaa tta gct caa gac cac ctt gtt tca ggt gcc gtt gat atg atg tta 672 Lys Leu Ala Gln Asp His Leu Val Ser Gly Ala Val Asp Met Met Leu 210 215 220 tgt gga gcg acg tgc ttc cca gaa cca ttc ttc atc ttg tct ggg ttc 720 Cys Gly Ala Thr Cys Phe Pro Glu Pro Phe Phe Ile Leu Ser Gly Phe 225 230 235 240 tcg act ttt caa gcg atg cct gnt ggg gca gat gga gtc tca cta cct 768 Ser Thr Phe Gln Ala Met Pro Xaa Gly Ala Asp Gly Val Ser Leu Pro 245 250 255 ctc cat aaa acg agt gct ggg ctc act cca ggt gaa ggg ggg tcc att 816 Leu His Lys Thr Ser Ala Gly Leu Thr Pro Gly Glu Gly Gly Ser Ile 260 265 270 atg gtg ctc aag cga ctg aaa gac gct atc aga gat gga aat cac att 864 Met Val Leu Lys Arg Leu Lys Asp Ala Ile Arg Asp Gly Asn His Ile 275 280 285 tat ggt gtg ctc ctt gaa gca aat tta agt aac gca ggt tgt ggg ctt 912 Tyr Gly Val Leu Leu Glu Ala Asn Leu Ser Asn Ala Gly Cys Gly Leu 290 295 300 cca ctc agc ccg cac tta ccg agc gaa gaa tca tgt att cgt gat acc 960 Pro Leu Ser Pro His Leu Pro Ser Glu Glu Ser Cys Ile Arg Asp Thr 305 310 315 320 tac cgc cgt gct gga gtt gct gca gat caa agt att cag tat att gag 1008 Tyr Arg Arg Ala Gly Val Ala Ala Asp Gln Ser Ile Gln Tyr Ile Glu 325 330 335 tgc cac gct acg gga acc cct cga ggg gat gtc gtg gaa att gag gcg 1056 Cys His Ala Thr Gly Thr Pro Arg Gly Asp Val Val Glu Ile Glu Ala 340 345 350 gtt gaa aga gtt ttc aag aaa aac gtt cca cgc tta ggc tcg acg aaa 1104 Val Glu Arg Val Phe Lys Lys Asn Val Pro Arg Leu Gly Ser Thr Lys 355 360 365 gga aat ttt ggt cac tcg tta gtt gcg gct ggt ttc gca ggt atg gca 1152 Gly Asn Phe Gly His Ser Leu Val Ala Ala Gly Phe Ala Gly Met Ala 370 375 380 aag ctt ctt ctt gca atg gaa cat gga gtg att cct ccc aca cca ggt 1200 Lys Leu Leu Leu Ala Met Glu His Gly Val Ile Pro Pro Thr Pro Gly 385 390 395 400 ctt gat gct tcg aac cag gca agt gag cac gtt gtg aca aag gct atc 1248 Leu Asp Ala Ser Asn Gln Ala Ser Glu His Val Val Thr Lys Ala Ile 405 410 415 act tgg cct gag aca cat ggg gct cca aaa cga gct ggc ctt tca gca 1296 Thr Trp Pro Glu Thr His Gly Ala Pro Lys Arg Ala Gly Leu Ser Ala 420 425 430 ttt gga ttt ggt ggg act aat gcg cat gca ctc ttc gaa gag ttt aat 1344 Phe Gly Phe Gly Gly Thr Asn Ala His Ala Leu Phe Glu Glu Phe Asn 435 440 445 gcc gag ggc ata agt tat cgc cct gga aag cct cca gtc gaa tcg aat 1392 Ala Glu Gly Ile Ser Tyr Arg Pro Gly Lys Pro Pro Val Glu Ser Asn 450 455 460 acc cgt cct tcc gtc gta ata act ggg atg gac tgt acc ttt ggg agc 1440 Thr Arg Pro Ser Val Val Ile Thr Gly Met Asp Cys Thr Phe Gly Ser 465 470 475 480 ctt gaa ggg att gat gcg ttc gag act gcc ctg tac gag ggg cgt gac 1488 Leu Glu Gly Ile Asp Ala Phe Glu Thr Ala Leu Tyr Glu Gly Arg Asp 485 490 495 gca gct cgt gac 1500 Ala Ala Arg Asp 500 <210> 54 <211> 500 <212> PRT <213> Thraustochytrium sp. <220> <221> misc_feature <222> (248)..(248) <223> The 'Xaa' at location 248 stands for Asp, Gly, Ala, or Val. <400> 54 Met Gln Leu Pro Pro Ala His Ser Ala Asp Glu Asn Arg Ile Ala Val 1 5 10 15 Val Gly Met Ala Val Lys Tyr Ala Gly Cys Asp Asn Lys Glu Glu Phe 20 25 30 Trp Lys Thr Leu Met Asn Gly Ser Ile Asn Thr Lys Ser Ile Ser Ala 35 40 45 Ala Arg Leu Gly Ser Asn Lys Arg Asp Glu His Tyr Val Pro Glu Arg 50 55 60 Ser Lys Tyr Ala Asp Thr Phe Cys Asn Glu Arg Tyr Gly Cys Ile Gln 65 70 75 80 Gln Gly Thr Asp Asn Glu His Asp Leu Leu Leu Gly Leu Ala Gln Glu 85 90 95 Ala Leu Ala Asp Ala Ala Gly Arg Met Glu Lys Gln Pro Ser Glu Ala 100 105 110 Phe Asp Leu Glu Asn Thr Gly Ile Val Ser Gly Cys Leu Ser Phe Pro 115 120 125 Met Asp Asn Leu Gln Gly Glu Leu Leu Asn Leu Tyr Gln Ser His Val 130 135 140 Glu Lys Gln Leu Pro Pro Ser Ala Leu Val Glu Ala Val Lys Leu Trp 145 150 155 160 Ser Glu Arg Gln Lys Ser Thr Lys Ala His Ala Gly Asp Lys Arg Arg 165 170 175 Phe Ile Asp Pro Ala Ser Phe Val Ala Asp Lys Leu Asn Leu Gly Pro 180 185 190 Leu His Tyr Ala Ile Asp Ala Ala Cys Ala Ser Ala Leu Tyr Val Leu 195 200 205 Lys Leu Ala Gln Asp His Leu Val Ser Gly Ala Val Asp Met Met Leu 210 215 220 Cys Gly Ala Thr Cys Phe Pro Glu Pro Phe Phe Ile Leu Ser Gly Phe 225 230 235 240 Ser Thr Phe Gln Ala Met Pro Xaa Gly Ala Asp Gly Val Ser Leu Pro 245 250 255 Leu His Lys Thr Ser Ala Gly Leu Thr Pro Gly Glu Gly Gly Ser Ile 260 265 270 Met Val Leu Lys Arg Leu Lys Asp Ala Ile Arg Asp Gly Asn His Ile 275 280 285 Tyr Gly Val Leu Leu Glu Ala Asn Leu Ser Asn Ala Gly Cys Gly Leu 290 295 300 Pro Leu Ser Pro His Leu Pro Ser Glu Glu Ser Cys Ile Arg Asp Thr 305 310 315 320 Tyr Arg Arg Ala Gly Val Ala Ala Asp Gln Ser Ile Gln Tyr Ile Glu 325 330 335 Cys His Ala Thr Gly Thr Pro Arg Gly Asp Val Val Glu Ile Glu Ala 340 345 350 Val Glu Arg Val Phe Lys Lys Asn Val Pro Arg Leu Gly Ser Thr Lys 355 360 365 Gly Asn Phe Gly His Ser Leu Val Ala Ala Gly Phe Ala Gly Met Ala 370 375 380 Lys Leu Leu Leu Ala Met Glu His Gly Val Ile Pro Pro Thr Pro Gly 385 390 395 400 Leu Asp Ala Ser Asn Gln Ala Ser Glu His Val Val Thr Lys Ala Ile 405 410 415 Thr Trp Pro Glu Thr His Gly Ala Pro Lys Arg Ala Gly Leu Ser Ala 420 425 430 Phe Gly Phe Gly Gly Thr Asn Ala His Ala Leu Phe Glu Glu Phe Asn 435 440 445 Ala Glu Gly Ile Ser Tyr Arg Pro Gly Lys Pro Pro Val Glu Ser Asn 450 455 460 Thr Arg Pro Ser Val Val Ile Thr Gly Met Asp Cys Thr Phe Gly Ser 465 470 475 480 Leu Glu Gly Ile Asp Ala Phe Glu Thr Ala Leu Tyr Glu Gly Arg Asp 485 490 495 Ala Ala Arg Asp 500 <210> 55 <211> 1500 <212> DNA <213> Thraustochytrium sp. <220> <221> CDS <222> (1)..(1500) <400> 55 tta ccc gcc aaa cgt tgg agg ttc cta ggt gag gac ttg gag ttt ctc 48 Leu Pro Ala Lys Arg Trp Arg Phe Leu Gly Glu Asp Leu Glu Phe Leu 1 5 10 15 cga gcc atc agg ctc aag gaa aag cct agg ggt tgt ttt gtg gag agt 96 Arg Ala Ile Arg Leu Lys Glu Lys Pro Arg Gly Cys Phe Val Glu Ser 20 25 30 gtt gac gtt aac ttt aga cgg ctg aaa acg ccc ttg aca cca gaa gat 144 Val Asp Val Asn Phe Arg Arg Leu Lys Thr Pro Leu Thr Pro Glu Asp 35 40 45 atg ttg cgg ccc caa caa ctc ttg gcg gtt tct acg atg gac cga gca 192 Met Leu Arg Pro Gln Gln Leu Leu Ala Val Ser Thr Met Asp Arg Ala 50 55 60 att atc gat gca ggt cta aag aag ggc caa cat gta gca gtt ctt gtt 240 Ile Ile Asp Ala Gly Leu Lys Lys Gly Gln His Val Ala Val Leu Val 65 70 75 80 ggc cta gga act gac ctg gaa ctt tac cgt cat cga gca aga gtc gcg 288 Gly Leu Gly Thr Asp Leu Glu Leu Tyr Arg His Arg Ala Arg Val Ala 85 90 95 ctt aaa gag gtt ttg cac ccg agc tta aag tca gac act gca att ctc 336 Leu Lys Glu Val Leu His Pro Ser Leu Lys Ser Asp Thr Ala Ile Leu 100 105 110 cag aaa ata atg caa tat gtg aat gat gca gga act tcg act tca tac 384 Gln Lys Ile Met Gln Tyr Val Asn Asp Ala Gly Thr Ser Thr Ser Tyr 115 120 125 aca tct tac att gga aac ctc gtt gcc acg cgt att tcg tct cag tgg 432 Thr Ser Tyr Ile Gly Asn Leu Val Ala Thr Arg Ile Ser Ser Gln Trp 130 135 140 gga ttc aca ggg ccg tcc ttt act gtc aca gaa gga aat aat tcc gtg 480 Gly Phe Thr Gly Pro Ser Phe Thr Val Thr Glu Gly Asn Asn Ser Val 145 150 155 160 tac aga tgt gca caa cta gcc aaa gat atg ctt cag gtt aac cga gtt 528 Tyr Arg Cys Ala Gln Leu Ala Lys Asp Met Leu Gln Val Asn Arg Val 165 170 175 gat gct gtc gtc atc gca ggc gtt gat ctc aac gga agc gcc gaa agt 576 Asp Ala Val Val Ile Ala Gly Val Asp Leu Asn Gly Ser Ala Glu Ser 180 185 190 ttt ttt gtc cga gca aat cgt caa aag ata tcc aag cta agt cat cca 624 Phe Phe Val Arg Ala Asn Arg Gln Lys Ile Ser Lys Leu Ser His Pro 195 200 205 tgt gca agc ttc gac aga gat gca gat gga ttt ttc gca ggt gag ggc 672 Cys Ala Ser Phe Asp Arg Asp Ala Asp Gly Phe Phe Ala Gly Glu Gly 210 215 220 tgt ggt gcc cta gtt ttc aag agg tta gaa gac tgt gct cct cag gaa 720 Cys Gly Ala Leu Val Phe Lys Arg Leu Glu Asp Cys Ala Pro Gln Glu 225 230 235 240 aaa att tat gct agt ata gac tct atc gca ata gat aaa gag cct act 768 Lys Ile Tyr Ala Ser Ile Asp Ser Ile Ala Ile Asp Lys Glu Pro Thr 245 250 255 agc tca gct gtg aaa gct gtc tac caa agt gat tcg agt ctc tcc gat 816 Ser Ser Ala Val Lys Ala Val Tyr Gln Ser Asp Ser Ser Leu Ser Asp 260 265 270 att gag ctg tta gaa atc agt gga gac tcc aaa cgg ttt gca gca ttc 864 Ile Glu Leu Leu Glu Ile Ser Gly Asp Ser Lys Arg Phe Ala Ala Phe 275 280 285 gaa ggc gct gtg gaa att caa tca agt gtg gaa gcc cag cta aaa gga 912 Glu Gly Ala Val Glu Ile Gln Ser Ser Val Glu Ala Gln Leu Lys Gly 290 295 300 ctt tcc aaa gtc ctt gaa cct gca aaa ggc caa ggc gta gcg gtg gga 960 Leu Ser Lys Val Leu Glu Pro Ala Lys Gly Gln Gly Val Ala Val Gly 305 310 315 320 agt act cga gca acc gtt ggg gat ata ggg tat gct aca gga gcg gca 1008 Ser Thr Arg Ala Thr Val Gly Asp Ile Gly Tyr Ala Thr Gly Ala Ala 325 330 335 agc ctg att aaa act gca ctc tgc tta tat aat cgc tac ctt ccg gca 1056 Ser Leu Ile Lys Thr Ala Leu Cys Leu Tyr Asn Arg Tyr Leu Pro Ala 340 345 350 tta gca aac tgg agt ggc cca tgt gaa cag tcc gcc tgg ggc tca aac 1104 Leu Ala Asn Trp Ser Gly Pro Cys Glu Gln Ser Ala Trp Gly Ser Asn 355 360 365 atg ttc gtt tgc cat gaa aca cgg ccg tgg atg aaa aac cag aat gaa 1152 Met Phe Val Cys His Glu Thr Arg Pro Trp Met Lys Asn Gln Asn Glu 370 375 380 aag aga tgt gcc ctc att tct gga aca gat cca tct cat aca tgc ttt 1200 Lys Arg Cys Ala Leu Ile Ser Gly Thr Asp Pro Ser His Thr Cys Phe 385 390 395 400 tcc ctc gta cta tcg gat act ggg tgt tat gaa gag cac aat cga acg 1248 Ser Leu Val Leu Ser Asp Thr Gly Cys Tyr Glu Glu His Asn Arg Thr 405 410 415 tgc ttt gat gtg caa gcg cca cag cta gtt ctg ata cac gga ttc gat 1296 Cys Phe Asp Val Gln Ala Pro Gln Leu Val Leu Ile His Gly Phe Asp 420 425 430 gga aaa act att gtg cgg cga ctt gaa gga tat ctc ctt gaa ctt gtt 1344 Gly Lys Thr Ile Val Arg Arg Leu Glu Gly Tyr Leu Leu Glu Leu Val 435 440 445 gaa ggg cat gca agc cct tca gag tat ttc cac aaa ctg att gga caa 1392 Glu Gly His Ala Ser Pro Ser Glu Tyr Phe His Lys Leu Ile Gly Gln 450 455 460 agt cta ctt gag aac tcg aaa gaa agt aaa ctc aca ctt tcg ctt gtg 1440 Ser Leu Leu Glu Asn Ser Lys Glu Ser Lys Leu Thr Leu Ser Leu Val 465 470 475 480 tgc aat ccg aac cag ctc caa aag gag ctc atg ctt gct atc aaa gga 1488 Cys Asn Pro Asn Gln Leu Gln Lys Glu Leu Met Leu Ala Ile Lys Gly 485 490 495 gta caa cga agc 1500 Val Gln Arg Ser 500 <210> 56 <211> 500 <212> PRT <213> Thraustochytrium sp. <400> 56 Leu Pro Ala Lys Arg Trp Arg Phe Leu Gly Glu Asp Leu Glu Phe Leu 1 5 10 15 Arg Ala Ile Arg Leu Lys Glu Lys Pro Arg Gly Cys Phe Val Glu Ser 20 25 30 Val Asp Val Asn Phe Arg Arg Leu Lys Thr Pro Leu Thr Pro Glu Asp 35 40 45 Met Leu Arg Pro Gln Gln Leu Leu Ala Val Ser Thr Met Asp Arg Ala 50 55 60 Ile Ile Asp Ala Gly Leu Lys Lys Gly Gln His Val Ala Val Leu Val 65 70 75 80 Gly Leu Gly Thr Asp Leu Glu Leu Tyr Arg His Arg Ala Arg Val Ala 85 90 95 Leu Lys Glu Val Leu His Pro Ser Leu Lys Ser Asp Thr Ala Ile Leu 100 105 110 Gln Lys Ile Met Gln Tyr Val Asn Asp Ala Gly Thr Ser Thr Ser Tyr 115 120 125 Thr Ser Tyr Ile Gly Asn Leu Val Ala Thr Arg Ile Ser Ser Gln Trp 130 135 140 Gly Phe Thr Gly Pro Ser Phe Thr Val Thr Glu Gly Asn Asn Ser Val 145 150 155 160 Tyr Arg Cys Ala Gln Leu Ala Lys Asp Met Leu Gln Val Asn Arg Val 165 170 175 Asp Ala Val Val Ile Ala Gly Val Asp Leu Asn Gly Ser Ala Glu Ser 180 185 190 Phe Phe Val Arg Ala Asn Arg Gln Lys Ile Ser Lys Leu Ser His Pro 195 200 205 Cys Ala Ser Phe Asp Arg Asp Ala Asp Gly Phe Phe Ala Gly Glu Gly 210 215 220 Cys Gly Ala Leu Val Phe Lys Arg Leu Glu Asp Cys Ala Pro Gln Glu 225 230 235 240 Lys Ile Tyr Ala Ser Ile Asp Ser Ile Ala Ile Asp Lys Glu Pro Thr 245 250 255 Ser Ser Ala Val Lys Ala Val Tyr Gln Ser Asp Ser Ser Leu Ser Asp 260 265 270 Ile Glu Leu Leu Glu Ile Ser Gly Asp Ser Lys Arg Phe Ala Ala Phe 275 280 285 Glu Gly Ala Val Glu Ile Gln Ser Ser Val Glu Ala Gln Leu Lys Gly 290 295 300 Leu Ser Lys Val Leu Glu Pro Ala Lys Gly Gln Gly Val Ala Val Gly 305 310 315 320 Ser Thr Arg Ala Thr Val Gly Asp Ile Gly Tyr Ala Thr Gly Ala Ala 325 330 335 Ser Leu Ile Lys Thr Ala Leu Cys Leu Tyr Asn Arg Tyr Leu Pro Ala 340 345 350 Leu Ala Asn Trp Ser Gly Pro Cys Glu Gln Ser Ala Trp Gly Ser Asn 355 360 365 Met Phe Val Cys His Glu Thr Arg Pro Trp Met Lys Asn Gln Asn Glu 370 375 380 Lys Arg Cys Ala Leu Ile Ser Gly Thr Asp Pro Ser His Thr Cys Phe 385 390 395 400 Ser Leu Val Leu Ser Asp Thr Gly Cys Tyr Glu Glu His Asn Arg Thr 405 410 415 Cys Phe Asp Val Gln Ala Pro Gln Leu Val Leu Ile His Gly Phe Asp 420 425 430 Gly Lys Thr Ile Val Arg Arg Leu Glu Gly Tyr Leu Leu Glu Leu Val 435 440 445 Glu Gly His Ala Ser Pro Ser Glu Tyr Phe His Lys Leu Ile Gly Gln 450 455 460 Ser Leu Leu Glu Asn Ser Lys Glu Ser Lys Leu Thr Leu Ser Leu Val 465 470 475 480 Cys Asn Pro Asn Gln Leu Gln Lys Glu Leu Met Leu Ala Ile Lys Gly 485 490 495 Val Gln Arg Ser 500 <210> 57 <211> 1500 <212> DNA <213> Thraustochytrium sp. <220> <221> CDS <222> (1)..(1500) <400> 57 atg tta aca ggg aag gat tgg gtc agt cca tca gga agt tgt ttt gcc 48 Met Leu Thr Gly Lys Asp Trp Val Ser Pro Ser Gly Ser Cys Phe Ala 1 5 10 15 cca aat ccg tta tca agc gca aaa gtg gca ttc atg tac gga gaa ggc 96 Pro Asn Pro Leu Ser Ser Ala Lys Val Ala Phe Met Tyr Gly Glu Gly 20 25 30 cga agc ccg tac tgt ggt gta ggc ttg ggt cta cat cgt ttg tgg ccc 144 Arg Ser Pro Tyr Cys Gly Val Gly Leu Gly Leu His Arg Leu Trp Pro 35 40 45 ggt ctc cat gaa aat gtg aac aat aag aca gtc gat tta tgg acg gaa 192 Gly Leu His Glu Asn Val Asn Asn Lys Thr Val Asp Leu Trp Thr Glu 50 55 60 gga gat ggt tgg tta tat cct cga acg ttg aca cga gaa gag cat aca 240 Gly Asp Gly Trp Leu Tyr Pro Arg Thr Leu Thr Arg Glu Glu His Thr 65 70 75 80 aaa gcc atc gaa tct ttc aac gca aat caa att gaa atg ttt cgc gct 288 Lys Ala Ile Glu Ser Phe Asn Ala Asn Gln Ile Glu Met Phe Arg Ala 85 90 95 ggg att ttc atc tca atg tgt cag aca gac tat gtc atg aat gtt ctc 336 Gly Ile Phe Ile Ser Met Cys Gln Thr Asp Tyr Val Met Asn Val Leu 100 105 110 ggt gtc cag cct aag gcc gga ttt ggg ctg agc ttg gga gaa att tca 384 Gly Val Gln Pro Lys Ala Gly Phe Gly Leu Ser Leu Gly Glu Ile Ser 115 120 125 atg ctc ttt gcg atg tca aag gag aac tgc agg cag tca cag gaa atg 432 Met Leu Phe Ala Met Ser Lys Glu Asn Cys Arg Gln Ser Gln Glu Met 130 135 140 acc aat cgt ttg cgc ggt tct cca gtg tgg tct aac gag ctt gct atc 480 Thr Asn Arg Leu Arg Gly Ser Pro Val Trp Ser Asn Glu Leu Ala Ile 145 150 155 160 aac ttc aat gca att cgc aag tta tgg aaa atc ccc cga gga gct ccc 528 Asn Phe Asn Ala Ile Arg Lys Leu Trp Lys Ile Pro Arg Gly Ala Pro 165 170 175 tta gaa tcc ttt tgg caa gga tac ttg gtt cac ggc aca aga gaa gaa 576 Leu Glu Ser Phe Trp Gln Gly Tyr Leu Val His Gly Thr Arg Glu Glu 180 185 190 gta gag cat gct att ggt ctt tct gag cct tat gta cgt ctg ctt att 624 Val Glu His Ala Ile Gly Leu Ser Glu Pro Tyr Val Arg Leu Leu Ile 195 200 205 gtg aac gat tca agg agt gcc ttg att gct gga aaa cca gac gcc tgt 672 Val Asn Asp Ser Arg Ser Ala Leu Ile Ala Gly Lys Pro Asp Ala Cys 210 215 220 cag gca gta atc agt aga cta aac tcc aag ttc cct tct ctg ccg gta 720 Gln Ala Val Ile Ser Arg Leu Asn Ser Lys Phe Pro Ser Leu Pro Val 225 230 235 240 aag caa gga atg att ggt cat tgc cca gaa gtt cgt gcg ttc atc aaa 768 Lys Gln Gly Met Ile Gly His Cys Pro Glu Val Arg Ala Phe Ile Lys 245 250 255 gat att ggg tac atc cat gaa aca ctc cga att tcc aat gac tat tcg 816 Asp Ile Gly Tyr Ile His Glu Thr Leu Arg Ile Ser Asn Asp Tyr Ser 260 265 270 gat tgt cag ctt ttc tca gcg gta acc aag ggc gca ctt gac agc tcc 864 Asp Cys Gln Leu Phe Ser Ala Val Thr Lys Gly Ala Leu Asp Ser Ser 275 280 285 aca atg gaa atc aaa cac ttt gtg gga gag gtc tac tcc cgg atc gca 912 Thr Met Glu Ile Lys His Phe Val Gly Glu Val Tyr Ser Arg Ile Ala 290 295 300 gac ttt cct caa atc gtc aac acg gtg cat tcg gct ggt tat gac gta 960 Asp Phe Pro Gln Ile Val Asn Thr Val His Ser Ala Gly Tyr Asp Val 305 310 315 320 ttt ctt gag ctt ggc tgt gat gct tct aga tct gca gca gtt caa aac 1008 Phe Leu Glu Leu Gly Cys Asp Ala Ser Arg Ser Ala Ala Val Gln Asn 325 330 335 att ctt ggt ggt caa gga aag ttc ttg tct aca gct att gac aaa aaa 1056 Ile Leu Gly Gly Gln Gly Lys Phe Leu Ser Thr Ala Ile Asp Lys Lys 340 345 350 gga cac tcc gcc tgg tca caa gta ctt cgg gct acc gca tca tta gct 1104 Gly His Ser Ala Trp Ser Gln Val Leu Arg Ala Thr Ala Ser Leu Ala 355 360 365 gca cat cga gta ccg gga atc tca att ttg gat ttg ttt cac cca aat 1152 Ala His Arg Val Pro Gly Ile Ser Ile Leu Asp Leu Phe His Pro Asn 370 375 380 ttc cga gaa atg tgc tgt aca atg gca acc aca cct aaa gtg gaa gat 1200 Phe Arg Glu Met Cys Cys Thr Met Ala Thr Thr Pro Lys Val Glu Asp 385 390 395 400 aag ttc ctg cgc acg att caa atc aat ggt cgg ttt gaa aaa gaa atg 1248 Lys Phe Leu Arg Thr Ile Gln Ile Asn Gly Arg Phe Glu Lys Glu Met 405 410 415 att cac cta gaa gat aca aca tta agt tgc tta ccc gct cca agt gaa 1296 Ile His Leu Glu Asp Thr Thr Leu Ser Cys Leu Pro Ala Pro Ser Glu 420 425 430 gca aat atc gca gct att caa tct cgg tca att cga tct gct gcg gcg 1344 Ala Asn Ile Ala Ala Ile Gln Ser Arg Ser Ile Arg Ser Ala Ala Ala 435 440 445 cgt tct gga caa tcc cat gat tgt gca tcc cat agc cat gaa gaa aat 1392 Arg Ser Gly Gln Ser His Asp Cys Ala Ser His Ser His Glu Glu Asn 450 455 460 aag gat tca tgc cct gaa aag ctg aag ctt gat tct gtg tcc gtc gcc 1440 Lys Asp Ser Cys Pro Glu Lys Leu Lys Leu Asp Ser Val Ser Val Ala 465 470 475 480 ata aat ttc gac aat gat gac cgc att cag ctt ggg cac gcg ggt ttt 1488 Ile Asn Phe Asp Asn Asp Asp Arg Ile Gln Leu Gly His Ala Gly Phe 485 490 495 cgg gag atg tac 1500 Arg Glu Met Tyr 500 <210> 58 <211> 500 <212> PRT <213> Thraustochytrium sp. <400> 58 Met Leu Thr Gly Lys Asp Trp Val Ser Pro Ser Gly Ser Cys Phe Ala 1 5 10 15 Pro Asn Pro Leu Ser Ser Ala Lys Val Ala Phe Met Tyr Gly Glu Gly 20 25 30 Arg Ser Pro Tyr Cys Gly Val Gly Leu Gly Leu His Arg Leu Trp Pro 35 40 45 Gly Leu His Glu Asn Val Asn Asn Lys Thr Val Asp Leu Trp Thr Glu 50 55 60 Gly Asp Gly Trp Leu Tyr Pro Arg Thr Leu Thr Arg Glu Glu His Thr 65 70 75 80 Lys Ala Ile Glu Ser Phe Asn Ala Asn Gln Ile Glu Met Phe Arg Ala 85 90 95 Gly Ile Phe Ile Ser Met Cys Gln Thr Asp Tyr Val Met Asn Val Leu 100 105 110 Gly Val Gln Pro Lys Ala Gly Phe Gly Leu Ser Leu Gly Glu Ile Ser 115 120 125 Met Leu Phe Ala Met Ser Lys Glu Asn Cys Arg Gln Ser Gln Glu Met 130 135 140 Thr Asn Arg Leu Arg Gly Ser Pro Val Trp Ser Asn Glu Leu Ala Ile 145 150 155 160 Asn Phe Asn Ala Ile Arg Lys Leu Trp Lys Ile Pro Arg Gly Ala Pro 165 170 175 Leu Glu Ser Phe Trp Gln Gly Tyr Leu Val His Gly Thr Arg Glu Glu 180 185 190 Val Glu His Ala Ile Gly Leu Ser Glu Pro Tyr Val Arg Leu Leu Ile 195 200 205 Val Asn Asp Ser Arg Ser Ala Leu Ile Ala Gly Lys Pro Asp Ala Cys 210 215 220 Gln Ala Val Ile Ser Arg Leu Asn Ser Lys Phe Pro Ser Leu Pro Val 225 230 235 240 Lys Gln Gly Met Ile Gly His Cys Pro Glu Val Arg Ala Phe Ile Lys 245 250 255 Asp Ile Gly Tyr Ile His Glu Thr Leu Arg Ile Ser Asn Asp Tyr Ser 260 265 270 Asp Cys Gln Leu Phe Ser Ala Val Thr Lys Gly Ala Leu Asp Ser Ser 275 280 285 Thr Met Glu Ile Lys His Phe Val Gly Glu Val Tyr Ser Arg Ile Ala 290 295 300 Asp Phe Pro Gln Ile Val Asn Thr Val His Ser Ala Gly Tyr Asp Val 305 310 315 320 Phe Leu Glu Leu Gly Cys Asp Ala Ser Arg Ser Ala Ala Val Gln Asn 325 330 335 Ile Leu Gly Gly Gln Gly Lys Phe Leu Ser Thr Ala Ile Asp Lys Lys 340 345 350 Gly His Ser Ala Trp Ser Gln Val Leu Arg Ala Thr Ala Ser Leu Ala 355 360 365 Ala His Arg Val Pro Gly Ile Ser Ile Leu Asp Leu Phe His Pro Asn 370 375 380 Phe Arg Glu Met Cys Cys Thr Met Ala Thr Thr Pro Lys Val Glu Asp 385 390 395 400 Lys Phe Leu Arg Thr Ile Gln Ile Asn Gly Arg Phe Glu Lys Glu Met 405 410 415 Ile His Leu Glu Asp Thr Thr Leu Ser Cys Leu Pro Ala Pro Ser Glu 420 425 430 Ala Asn Ile Ala Ala Ile Gln Ser Arg Ser Ile Arg Ser Ala Ala Ala 435 440 445 Arg Ser Gly Gln Ser His Asp Cys Ala Ser His Ser His Glu Glu Asn 450 455 460 Lys Asp Ser Cys Pro Glu Lys Leu Lys Leu Asp Ser Val Ser Val Ala 465 470 475 480 Ile Asn Phe Asp Asn Asp Asp Arg Ile Gln Leu Gly His Ala Gly Phe 485 490 495 Arg Glu Met Tyr 500 <210> 59 <211> 1305 <212> DNA <213> Thraustochytrium sp. <220> <221> CDS <222> (1)..(1305) <400> 59 aat aca aga tat agc ttg tac aca ggg gcg atg gca aag gga att gca 48 Asn Thr Arg Tyr Ser Leu Tyr Thr Gly Ala Met Ala Lys Gly Ile Ala 1 5 10 15 tct gca gat ctt gtc att gcc gct ggg aaa gag ggc atc cta gct tcc 96 Ser Ala Asp Leu Val Ile Ala Ala Gly Lys Glu Gly Ile Leu Ala Ser 20 25 30 tat gga gct gga gga cta cct ctt gct act gtt cga aag gga ata gac 144 Tyr Gly Ala Gly Gly Leu Pro Leu Ala Thr Val Arg Lys Gly Ile Asp 35 40 45 aaa att caa caa gcc ttg cca agt ggc cca tat gct gta aat ctt att 192 Lys Ile Gln Gln Ala Leu Pro Ser Gly Pro Tyr Ala Val Asn Leu Ile 50 55 60 cac tct ccc ttt gac ggc aac ttg gag cag gga aac gtc gat ttg ttc 240 His Ser Pro Phe Asp Gly Asn Leu Glu Gln Gly Asn Val Asp Leu Phe 65 70 75 80 ttg gaa aag aac gtc cgc gtg gcg gaa tgt tcc gcg ttt aca acg cta 288 Leu Glu Lys Asn Val Arg Val Ala Glu Cys Ser Ala Phe Thr Thr Leu 85 90 95 aca gtg cca gta gta cac tat cgt gct gca ggg ctt gtt cgg cgc caa 336 Thr Val Pro Val Val His Tyr Arg Ala Ala Gly Leu Val Arg Arg Gln 100 105 110 gat gga agc att ttg atc aag aac cga atc att gct aaa gta tct agg 384 Asp Gly Ser Ile Leu Ile Lys Asn Arg Ile Ile Ala Lys Val Ser Arg 115 120 125 aca gaa ctc gct gag atg ttc ctt cgt ccg gca cct caa atc atc ctc 432 Thr Glu Leu Ala Glu Met Phe Leu Arg Pro Ala Pro Gln Ile Ile Leu 130 135 140 gaa aaa ctg gta gca gca gaa atc att tca tct gac caa gcg cgt atg 480 Glu Lys Leu Val Ala Ala Glu Ile Ile Ser Ser Asp Gln Ala Arg Met 145 150 155 160 gca gcc aaa gtt ccc atg gcg gac gac atc gca gtc gaa gcc gac tct 528 Ala Ala Lys Val Pro Met Ala Asp Asp Ile Ala Val Glu Ala Asp Ser 165 170 175 ggt ggg cac acg gat aat cgg cct atg cac gtc att ttg ccc ctg ata 576 Gly Gly His Thr Asp Asn Arg Pro Met His Val Ile Leu Pro Leu Ile 180 185 190 att caa ctc cgc aat act ata ctt gca gag tat ggc tgt gcc acg gct 624 Ile Gln Leu Arg Asn Thr Ile Leu Ala Glu Tyr Gly Cys Ala Thr Ala 195 200 205 ttt cgt acc cgt ata ggc gct gga gga ggc att ggt tgt cct tca gcg 672 Phe Arg Thr Arg Ile Gly Ala Gly Gly Gly Ile Gly Cys Pro Ser Ala 210 215 220 gcc ctc gca gcc ttt gat atg ggt gcg agt ttt gtc gtg act gga agc 720 Ala Leu Ala Ala Phe Asp Met Gly Ala Ser Phe Val Val Thr Gly Ser 225 230 235 240 ata aat caa att tgc cgc gag gca ggg act tgc gat act gtt cgg gag 768 Ile Asn Gln Ile Cys Arg Glu Ala Gly Thr Cys Asp Thr Val Arg Glu 245 250 255 cta ctt gcc aac tca agc tac tcg gac gtg acg atg gcg cca gca gca 816 Leu Leu Ala Asn Ser Ser Tyr Ser Asp Val Thr Met Ala Pro Ala Ala 260 265 270 gac atg ttt gac caa ggt gtg aaa ctc caa gtc tta aaa cga gga acg 864 Asp Met Phe Asp Gln Gly Val Lys Leu Gln Val Leu Lys Arg Gly Thr 275 280 285 atg ttt cca agc aga gca aat aaa ctc cgg aag ctc ttt gtg aac tac 912 Met Phe Pro Ser Arg Ala Asn Lys Leu Arg Lys Leu Phe Val Asn Tyr 290 295 300 gaa tct cta gaa aca ctc ccg tcg aaa gag ttg aaa tac ctg gaa aac 960 Glu Ser Leu Glu Thr Leu Pro Ser Lys Glu Leu Lys Tyr Leu Glu Asn 305 310 315 320 atc ata ttc aag caa gca gta gac cag gtg tgg gag gaa aca aag cgc 1008 Ile Ile Phe Lys Gln Ala Val Asp Gln Val Trp Glu Glu Thr Lys Arg 325 330 335 ttt tac tgt gaa aaa ctg aac aat cca gat aaa att gca agg gcc atg 1056 Phe Tyr Cys Glu Lys Leu Asn Asn Pro Asp Lys Ile Ala Arg Ala Met 340 345 350 aaa gat cct aaa ttg aag atg tcg ctt tgc ttt cgg tgg tat ctc tcc 1104 Lys Asp Pro Lys Leu Lys Met Ser Leu Cys Phe Arg Trp Tyr Leu Ser 355 360 365 aag agc tct ggg tgg gcc aac gca gga att aaa tct cgt gca ctc gac 1152 Lys Ser Ser Gly Trp Ala Asn Ala Gly Ile Lys Ser Arg Ala Leu Asp 370 375 380 tac cag atc tgg tgt ggc ccg gca atg ggc tcg ttc aac aat ttc gcc 1200 Tyr Gln Ile Trp Cys Gly Pro Ala Met Gly Ser Phe Asn Asn Phe Ala 385 390 395 400 agc ggc aca tcc ctc gat tgg aaa gtg act ggg gtt ttc cct ggc gtt 1248 Ser Gly Thr Ser Leu Asp Trp Lys Val Thr Gly Val Phe Pro Gly Val 405 410 415 gcg gaa gta aac atg gcc att tta gat ggc gcg cga gaa cta gct gct 1296 Ala Glu Val Asn Met Ala Ile Leu Asp Gly Ala Arg Glu Leu Ala Ala 420 425 430 aaa cga aat 1305 Lys Arg Asn 435 <210> 60 <211> 435 <212> PRT <213> Thraustochytrium sp. <400> 60 Asn Thr Arg Tyr Ser Leu 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gga gag ctc tcg gaa ggg gga gat gtg ccg tgg gct gtg ttg gtg 336 Asn Gly Glu Leu Ser Glu Gly Gly Asp Val Pro Trp Ala Val Leu Val 100 105 110 gaa gcc ggg cag tgc gac ttg ctg cta att tct tac atg ggc atc gat 384 Glu Ala Gly Gln Cys Asp Leu Leu Leu Ile Ser Tyr Met Gly Ile Asp 115 120 125 ttc cag tgc aaa gga gag cgg gtc tac cgg ctg ctg aac acc acc ttg 432 Phe Gln Cys Lys Gly Glu Arg Val Tyr Arg Leu Leu Asn Thr Thr Leu 130 135 140 acg ttt ttt ggc gtc gcg aaa gaa ggg gaa acg ctt gtg tac gat att 480 Thr Phe Phe Gly Val Ala Lys Glu Gly Glu Thr Leu Val Tyr Asp Ile 145 150 155 160 cgc gtc acg ggt ttc gcc aag agg ccg gac gga gat atc tcc atg ttc 528 Arg Val Thr Gly Phe Ala Lys Arg Pro Asp Gly Asp Ile Ser Met Phe 165 170 175 ttt ttc gaa tat gat tgc tac tgc aat ggc aag ctt ctc atc gaa atg 576 Phe Phe Glu Tyr Asp Cys Tyr Cys Asn Gly Lys Leu Leu Ile Glu Met 180 185 190 cga gat ggc tct gca ggc ttc ttc acg gac gaa gag ctc gct gcc ggc 624 Arg Asp Gly Ser Ala Gly Phe Phe Thr Asp Glu Glu Leu Ala Ala Gly 195 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Asp Leu Ser Lys Lys Ile Val Val 420 425 430 gac ttc aaa gga att gct ttg cag ctc aaa ggc cgc gct ttt tca cgc 1344 Asp Phe Lys Gly Ile Ala Leu Gln Leu Lys Gly Arg Ala Phe Ser Arg 435 440 445 atg agt tcc agc tcg tcc ttg aac gaa gga tgg caa tgt gtt cca aaa 1392 Met Ser Ser Ser Ser Ser Leu Asn Glu Gly Trp Gln Cys Val Pro Lys 450 455 460 cca agc cag aga atg gaa cac gaa cag ccc cct gct cac tgc ctt gca 1440 Pro Ser Gln Arg Met Glu His Glu Gln Pro Pro Ala His Cys Leu Ala 465 470 475 480 agc gac ccc gaa gcc cct tca act gtg acc tgg cac cca atg tca aag 1488 Ser Asp Pro Glu Ala Pro Ser Thr Val Thr Trp His Pro Met Ser Lys 485 490 495 ctt cct ggc aac cct acg ccg ttc ttc tcc cct tca tct tac cct ccg 1536 Leu Pro Gly Asn Pro Thr Pro Phe Phe Ser Pro Ser Ser Tyr Pro Pro 500 505 510 agg gca att tgc ttc atc cct ttc ccg ggc aat ccc ctt gac aac aac 1584 Arg Ala Ile Cys Phe Ile Pro Phe Pro Gly Asn Pro Leu Asp Asn Asn 515 520 525 tgc aag gct gga gaa atg ccc ctg aac tgg tac aac atg tca gag ttc 1632 Cys Lys Ala 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act gag aag ctt ccc gac gca 2304 Ala Ser Ala Lys Gly Lys Glu Gln Leu Thr Glu Lys Leu Pro Asp Ala 755 760 765 act aat gct caa gtt ctt cgg cgt tca gag cag tgt gaa tac ctc gat 2352 Thr Asn Ala Gln Val Leu Arg Arg Ser Glu Gln Cys Glu Tyr Leu Asp 770 775 780 tac ctc aat att gcc cct gac tct ggg ctg cat ggg aag ggc tac gcc 2400 Tyr Leu Asn Ile Ala Pro Asp Ser Gly Leu His Gly Lys Gly Tyr Ala 785 790 795 800 cac gga cac aaa gac gtt aac ccg caa gac tgg ttc ttc tct tgc cac 2448 His Gly His Lys Asp Val Asn Pro Gln Asp Trp Phe Phe Ser Cys His 805 810 815 ttt tgg ttc gat cct gta atg cca gga tct tta gga att gaa tca atg 2496 Phe Trp Phe Asp Pro Val Met Pro Gly Ser Leu Gly Ile Glu Ser Met 820 825 830 ttc cag ctt atc gag gcc ttt gcg gtg gac caa aac att cct gga gag 2544 Phe Gln Leu Ile Glu Ala Phe Ala Val Asp Gln Asn Ile Pro Gly Glu 835 840 845 tac aac gta tcc aat ccg acc ttt gcc cat gca cca ggc aaa acg gcg 2592 Tyr Asn Val Ser Asn Pro Thr Phe Ala His Ala Pro Gly Lys Thr Ala 850 855 860 tgg aaa tac cga ggc cag ctc aca cca aag aac cgt gcg atg gac tgc 2640 Trp Lys Tyr Arg Gly Gln Leu Thr Pro Lys Asn Arg Ala Met Asp Cys 865 870 875 880 gag gtg cat atc gtt tca att acc gcc tcc ccc gag aac ggg ggc tac 2688 Glu Val His Ile Val Ser Ile Thr Ala Ser Pro Glu Asn Gly Gly Tyr 885 890 895 gtt gac atc gtg gcc gat gga gcg ctt tgg gta gat gga ctt cgc gtg 2736 Val Asp Ile Val Ala Asp Gly Ala Leu Trp Val Asp Gly Leu Arg Val 900 905 910 tac gaa gcc aaa gag ctt cga gtt cgt gtc gtt tcg gca aaa cct caa 2784 Tyr Glu Ala Lys Glu Leu Arg Val Arg Val Val Ser Ala Lys Pro Gln 915 920 925 gca att ccg gat gta caa caa cag cca cct agc gca aag gcg gac ccg 2832 Ala Ile Pro Asp Val Gln Gln Gln Pro Pro Ser Ala Lys Ala Asp Pro 930 935 940 ggg aaa aca gga gtt gca ctt tcg ccc act cag cta cgc gac gtc ctg 2880 Gly Lys Thr Gly Val Ala Leu Ser Pro Thr Gln Leu Arg Asp Val Leu 945 950 955 960 ctt gaa gtg gac aat cca ttg tat ctt ggt gta gag aac tcc aat ttg 2928 Leu Glu Val Asp Asn Pro Leu Tyr Leu Gly Val Glu Asn Ser Asn Leu 965 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ggc aac gtt gac ctc ttt ctc gag atg ggc gtg aca gtg gta gaa 3294 Gly Asn Val Asp Leu Phe Leu Glu Met Gly Val Thr Val Val Glu 1085 1090 1095 tgc agc gcg ttc atg gaa ctc acg gcc cag gtt gtc cgg tac cgc 3339 Cys Ser Ala Phe Met Glu Leu Thr Ala Gln Val Val Arg Tyr Arg 1100 1105 1110 gcg tct ggt cta agc aaa agt gcg gac ggt tcg att cgc att gct 3384 Ala Ser Gly Leu Ser Lys Ser Ala Asp Gly Ser Ile Arg Ile Ala 1115 1120 1125 cac cgt att att ggc aag gtt tcc aga acc gag ctg gca gaa atg 3429 His Arg Ile Ile Gly Lys Val Ser Arg Thr Glu Leu Ala Glu Met 1130 1135 1140 ttt att cgt cca gca cca cag cac ctc ctc caa aaa ctc gta gcc 3474 Phe Ile Arg Pro Ala Pro Gln His Leu Leu Gln Lys Leu Val Ala 1145 1150 1155 tcc ggc gag ctg aca gct gag caa gcc gag ctt gca aca cag gtt 3519 Ser Gly Glu Leu Thr Ala Glu Gln Ala Glu Leu Ala Thr Gln Val 1160 1165 1170 ccg gtg gcg gat gac att gcg gtc gaa gcc gac tcg ggg ggg cat 3564 Pro Val Ala Asp Asp Ile Ala Val Glu Ala Asp Ser Gly Gly His 1175 1180 1185 acc gac aac agg cct att cac gtc att ctt cct cta atc atc aac 3609 Thr Asp Asn Arg Pro Ile His Val Ile Leu Pro Leu Ile Ile Asn 1190 1195 1200 cta cgc aac cgt ttg cat aaa gag ctt gac tac cct tcg cat ctc 3654 Leu Arg Asn Arg Leu His Lys Glu Leu Asp Tyr Pro Ser His Leu 1205 1210 1215 cgg gta cgt gtg ggt gct ggt ggt ggt att gga tgt cct caa gcc 3699 Arg Val Arg Val Gly Ala Gly Gly Gly Ile Gly Cys Pro Gln Ala 1220 1225 1230 gct ctt gca gca ttt caa atg ggg gca gcg ttt tta atc act gga 3744 Ala Leu Ala Ala Phe Gln Met Gly Ala Ala Phe Leu Ile Thr Gly 1235 1240 1245 acg gtg aac cag ctt gct cgt gaa agt ggc act tgt gac aac gtc 3789 Thr Val Asn Gln Leu Ala Arg Glu Ser Gly Thr Cys Asp Asn Val 1250 1255 1260 cgg tta cag ctc tca aag gcc acg tat agc gac gtg tgt atg gct 3834 Arg Leu Gln Leu Ser Lys Ala Thr Tyr Ser Asp Val Cys Met Ala 1265 1270 1275 cct gct gcc gat atg ttt gac caa ggc gtg gag ctg caa gta ttg 3879 Pro Ala Ala Asp Met Phe Asp Gln Gly Val Glu Leu Gln Val Leu 1280 1285 1290 aag aaa ggc acg ctg ttc cca agt cgt gct aag aag ctg tac gag 3924 Lys Lys Gly Thr Leu Phe Pro Ser Arg Ala Lys Lys Leu Tyr Glu 1295 1300 1305 ctg ttc tgc aag tat gac tcg ttt gag gca atg ccg gct gaa gaa 3969 Leu Phe Cys Lys Tyr Asp Ser Phe Glu Ala Met Pro Ala Glu Glu 1310 1315 1320 ttg caa cgg gtt gaa aag cgg att ttt caa aag tcg ctt gct gaa 4014 Leu Gln Arg Val Glu Lys Arg Ile Phe Gln Lys Ser Leu Ala Glu 1325 1330 1335 gtt tgg cag gag acc agt gac ttt tac att cat cgt atc aag aac 4059 Val Trp Gln Glu Thr Ser Asp Phe Tyr Ile His Arg Ile Lys Asn 1340 1345 1350 cct gag aaa atc aat cgt gct gca agc gat ggc aaa ctg aaa atg 4104 Pro Glu Lys Ile Asn Arg Ala Ala Ser Asp Gly Lys Leu Lys Met 1355 1360 1365 tcg ctt tgc ttt cgc tgg tac ctt ggg ctt tcc tca ttt tgg gcc 4149 Ser Leu Cys Phe Arg Trp Tyr Leu Gly Leu Ser Ser Phe Trp Ala 1370 1375 1380 aac tct ggg gca caa gat cgc gtc atg gac tat caa att tgg tgt 4194 Asn Ser Gly Ala Gln Asp Arg Val Met Asp Tyr Gln Ile Trp Cys 1385 1390 1395 ggc cct gct att ggc gct ttc aat gat ttt acc aag ggc acg tac 4239 Gly Pro Ala Ile Gly Ala Phe Asn Asp Phe Thr Lys Gly Thr Tyr 1400 1405 1410 ctt gac gtg act gtt gca aag agt tac cct tgt gtg gca cag atc 4284 Leu Asp Val Thr Val Ala Lys Ser Tyr Pro Cys Val Ala Gln Ile 1415 1420 1425 aat ttg caa att ttg caa gga gct gcg tat ctg aaa cgc ctt ggt 4329 Asn Leu Gln Ile Leu Gln Gly Ala Ala Tyr Leu Lys Arg Leu Gly 1430 1435 1440 gtc att cgt ttt gac cgc atg ctg ctg cag gcc gtc gat atc gac 4374 Val Ile Arg Phe Asp Arg Met Leu Leu Gln Ala Val Asp Ile Asp 1445 1450 1455 gat cct gta ttt act tac gtg ccg acc cag cca ctt 4410 Asp Pro Val Phe Thr Tyr Val Pro Thr Gln Pro Leu 1460 1465 1470 <210> 62 <211> 1470 <212> PRT <213> Thraustochytrium sp. <400> 62 Met Gly Pro Arg Val Ala Ser Gly Lys Val Pro Ala Trp Glu Met Ser 1 5 10 15 Lys Ser Glu Leu Cys Asp Asp Arg Thr Val Val Phe Asp Tyr Glu Glu 20 25 30 Leu Leu Glu Phe Ala Glu Gly Asp Ile Ser Lys Val Phe Gly Pro Glu 35 40 45 Phe Lys Val Val Asp Gly Phe Arg Arg Arg Val Arg Leu Pro Ala Arg 50 55 60 Glu Tyr Leu Leu Val Thr Arg Val Thr Leu Met Asp Ala Glu Val Gly 65 70 75 80 Asn Phe Arg Val Gly Ala Arg Met Val Thr Glu Tyr Asp Val Pro Val 85 90 95 Asn Gly Glu Leu Ser Glu Gly Gly Asp Val Pro Trp Ala Val Leu Val 100 105 110 Glu Ala Gly Gln Cys Asp Leu Leu Leu Ile Ser Tyr Met Gly Ile Asp 115 120 125 Phe Gln Cys Lys Gly Glu Arg Val Tyr Arg Leu Leu Asn Thr Thr Leu 130 135 140 Thr Phe Phe Gly Val Ala Lys Glu Gly Glu Thr Leu Val Tyr Asp Ile 145 150 155 160 Arg Val Thr Gly Phe Ala Lys Arg Pro Asp Gly Asp Ile Ser Met Phe 165 170 175 Phe Phe Glu Tyr Asp Cys Tyr Cys Asn Gly Lys Leu Leu Ile Glu Met 180 185 190 Arg Asp Gly Ser Ala Gly Phe Phe Thr Asp Glu Glu Leu Ala Ala Gly 195 200 205 Lys Gly Val Val Val Thr Arg Ala Gln Gln Asn Met Arg Asp Lys Ile 210 215 220 Val Arg Gln Ser Ile Glu Pro Phe Ala Leu Ala Ala Cys Thr His Lys 225 230 235 240 Thr Thr Leu Asn Glu Ser Asp Met Gln Ser Leu Val Glu Arg Asn Trp 245 250 255 Ala Asn Val Phe Gly Thr Ser Asn Lys Met Ala Glu Leu Asn Tyr Lys 260 265 270 Ile Cys Ala Arg Lys Met Leu Met Ile Asp Arg Val Thr His Ile Asp 275 280 285 His His Gly Gly Ala Tyr Gly Leu Gly Leu Leu Val Gly Glu Lys Ile 290 295 300 Leu Asp Arg Asn His Trp Tyr Phe Pro Cys His Phe Val Asn Asp Gln 305 310 315 320 Val Met Ala Gly Ser Leu Val Ser Asp Gly Cys Ser Gln Leu Leu Lys 325 330 335 Leu Tyr Met Ile Trp Leu Gly Leu His Leu Lys Met Glu Glu Phe Asp 340 345 350 Phe Leu Pro Val Ser Gly His Lys Asn Lys Val Arg Cys Arg Gly Gln 355 360 365 Ile Ser Pro His Lys Gly Lys Leu Val Tyr Val Met Glu Ile Lys Lys 370 375 380 Met Gly Tyr Asp Gln Ala Ser Gly Ser Pro Tyr Ala Ile Ala Asp Val 385 390 395 400 Asp Ile Ile Asp Val Asn Glu Glu Leu Gly Gln Ser Phe Asp Ile Asn 405 410 415 Asp Leu Ala Ser Tyr Gly Lys Gly Asp Leu Ser Lys Lys Ile Val Val 420 425 430 Asp Phe Lys Gly Ile Ala Leu Gln Leu Lys Gly Arg Ala Phe Ser Arg 435 440 445 Met Ser Ser Ser Ser Ser Leu Asn Glu Gly Trp Gln Cys Val Pro Lys 450 455 460 Pro Ser Gln Arg Met Glu His Glu Gln Pro Pro Ala His Cys Leu Ala 465 470 475 480 Ser Asp Pro Glu Ala Pro Ser Thr 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Phe Thr Phe Glu Leu Ser Val 690 695 700 Asp Gly Val Val Phe Tyr Lys Gly Ser Thr Ser Phe Gly Trp Phe Thr 705 710 715 720 Pro Glu Val Phe Ala Gln Gln Ala Gly Leu Asp Asn Gly Lys Lys Thr 725 730 735 Glu Pro Trp Cys Lys Thr Asn Asn Thr Ser Val Arg Arg Val Glu Ile 740 745 750 Ala Ser Ala Lys Gly Lys Glu Gln Leu Thr Glu Lys Leu Pro Asp Ala 755 760 765 Thr Asn Ala Gln Val Leu Arg Arg Ser Glu Gln Cys Glu Tyr Leu Asp 770 775 780 Tyr Leu Asn Ile Ala Pro Asp Ser Gly Leu His Gly Lys Gly Tyr Ala 785 790 795 800 His Gly His Lys Asp Val Asn Pro Gln Asp Trp Phe Phe Ser Cys His 805 810 815 Phe Trp Phe Asp Pro Val Met Pro Gly Ser Leu Gly Ile Glu Ser Met 820 825 830 Phe Gln Leu Ile Glu Ala Phe Ala Val Asp Gln Asn Ile Pro Gly Glu 835 840 845 Tyr Asn Val Ser Asn Pro Thr Phe Ala His Ala Pro Gly Lys Thr Ala 850 855 860 Trp Lys Tyr Arg Gly Gln Leu Thr Pro Lys Asn Arg Ala Met Asp Cys 865 870 875 880 Glu Val His Ile Val Ser Ile Thr Ala Ser Pro Glu Asn Gly Gly Tyr 885 890 895 Val Asp Ile Val Ala Asp Gly Ala Leu 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1305 Leu Phe Cys Lys Tyr Asp Ser Phe Glu Ala Met Pro Ala Glu Glu 1310 1315 1320 Leu Gln Arg Val Glu Lys Arg Ile Phe Gln Lys Ser Leu Ala Glu 1325 1330 1335 Val Trp Gln Glu Thr Ser Asp Phe Tyr Ile His Arg Ile Lys Asn 1340 1345 1350 Pro Glu Lys Ile Asn Arg Ala Ala Ser Asp Gly Lys Leu Lys Met 1355 1360 1365 Ser Leu Cys Phe Arg Trp Tyr Leu Gly Leu Ser Ser Phe Trp Ala 1370 1375 1380 Asn Ser Gly Ala Gln Asp Arg Val Met Asp Tyr Gln Ile Trp Cys 1385 1390 1395 Gly Pro Ala Ile Gly Ala Phe Asn Asp Phe Thr Lys Gly Thr Tyr 1400 1405 1410 Leu Asp Val Thr Val Ala Lys Ser Tyr Pro Cys Val Ala Gln Ile 1415 1420 1425 Asn Leu Gln Ile Leu Gln Gly Ala Ala Tyr Leu Lys Arg Leu Gly 1430 1435 1440 Val Ile Arg Phe Asp Arg Met Leu Leu Gln Ala Val Asp Ile Asp 1445 1450 1455 Asp Pro Val Phe Thr Tyr Val Pro Thr Gln Pro Leu 1460 1465 1470 <210> 63 <211> 1500 <212> DNA <213> Thraustochytrium sp. <220> <221> CDS <222> (1)..(1500) <400> 63 atg ggc ccg cga gtg gcg tca ggc aag gtg ccg gct tgg gag atg agc 48 Met Gly Pro Arg Val Ala Ser Gly Lys Val Pro Ala Trp Glu Met Ser 1 5 10 15 aag tcc gag ctg tgt gat gac cgc acg gta gtc ttt gac tat gag gag 96 Lys Ser Glu Leu Cys Asp Asp Arg Thr Val Val Phe Asp Tyr Glu Glu 20 25 30 ctg ctg gag ttc gct gag ggc gat atc agt aag gtt ttt ggg ccg gag 144 Leu Leu Glu Phe Ala Glu Gly Asp Ile Ser Lys Val Phe Gly Pro Glu 35 40 45 ttc aaa gtg gtg gac ggg ttt agg cgc agg gtg agg ttg ccc gct cga 192 Phe Lys Val Val Asp Gly Phe Arg Arg Arg Val Arg Leu Pro Ala Arg 50 55 60 gag tac ctg ctg gtg acc cgg gtt acg ctg atg gat gcc gag gtg ggc 240 Glu Tyr Leu Leu Val Thr Arg Val Thr Leu Met Asp Ala Glu Val Gly 65 70 75 80 aac ttt cga gtg gga gca cgt atg gtg aca gag tat gac gta cct gtg 288 Asn Phe Arg Val Gly Ala Arg Met Val Thr Glu Tyr Asp Val Pro Val 85 90 95 aac gga gag ctc tcg gaa ggg gga gat gtg ccg tgg gct gtg ttg gtg 336 Asn Gly Glu Leu Ser Glu Gly Gly Asp Val Pro Trp Ala Val Leu Val 100 105 110 gaa gcc ggg cag tgc gac ttg ctg cta att tct tac atg ggc atc gat 384 Glu Ala Gly Gln Cys Asp Leu Leu Leu Ile Ser Tyr Met Gly Ile Asp 115 120 125 ttc cag tgc aaa gga gag cgg gtc tac cgg ctg ctg aac acc acc ttg 432 Phe Gln Cys Lys Gly Glu Arg Val Tyr Arg Leu Leu Asn Thr Thr Leu 130 135 140 acg ttt ttt ggc gtc gcg aaa gaa ggg gaa acg ctt gtg tac gat att 480 Thr Phe Phe Gly Val Ala Lys Glu Gly Glu Thr Leu Val Tyr Asp Ile 145 150 155 160 cgc gtc acg ggt ttc gcc aag agg ccg gac gga gat atc tcc atg ttc 528 Arg Val Thr Gly Phe Ala Lys Arg Pro Asp Gly Asp Ile Ser Met Phe 165 170 175 ttt ttc gaa tat gat tgc tac tgc aat ggc aag ctt ctc atc gaa atg 576 Phe Phe Glu Tyr Asp Cys Tyr Cys Asn Gly Lys Leu Leu Ile Glu Met 180 185 190 cga gat ggc tct gca ggc ttc ttc acg gac gaa gag ctc gct gcc ggc 624 Arg Asp Gly Ser Ala Gly Phe Phe Thr Asp Glu Glu Leu Ala Ala Gly 195 200 205 aaa gga gtg gtc gtc act cgt gca cag caa aac atg cgg gac aaa att 672 Lys Gly Val Val Val Thr Arg Ala Gln Gln Asn Met Arg Asp Lys Ile 210 215 220 gta cgg cag tcc att gag cct ttt gca ctg gcg gct tgc acg cac aaa 720 Val Arg Gln Ser Ile Glu Pro Phe Ala Leu Ala Ala Cys Thr His Lys 225 230 235 240 acg act ctg aac gag agt gac atg cag tcc ctt gtg gag cga aac tgg 768 Thr Thr Leu Asn Glu Ser Asp Met Gln Ser Leu Val Glu Arg Asn Trp 245 250 255 gca aac gtt ttt ggc acc agt aac aag atg gcg gag ctc aac tat aaa 816 Ala Asn Val Phe Gly Thr Ser Asn Lys Met Ala Glu Leu Asn Tyr Lys 260 265 270 att tgc gcc agg aaa atg ctc atg atc gac agg gtt acc cac att gac 864 Ile Cys Ala Arg Lys Met Leu Met Ile Asp Arg Val Thr His Ile Asp 275 280 285 cac cac ggt ggg gcg tat ggc ctc gga cta ctt gtt gga gag aag atc 912 His His Gly Gly Ala Tyr Gly Leu Gly Leu Leu Val Gly Glu Lys Ile 290 295 300 ttg gat cga aac cat tgg tac ttt cct tgt cac ttt gtc aat gat caa 960 Leu Asp Arg Asn His Trp Tyr Phe Pro Cys His Phe Val Asn Asp Gln 305 310 315 320 gtc atg gca ggg tca ctg gtc agc gat ggt tgc agc cag ctc tta aaa 1008 Val Met Ala Gly Ser Leu Val Ser Asp Gly Cys Ser Gln Leu Leu Lys 325 330 335 ctc tat atg atc tgg ctt ggc ctc cac ctg aaa atg gag gaa ttt gat 1056 Leu Tyr Met Ile Trp Leu Gly Leu His Leu Lys Met Glu Glu Phe Asp 340 345 350 ttt ctc cca gtt agc ggc cac aaa aac aag gtg cga tgc agg gga caa 1104 Phe Leu Pro Val Ser Gly His Lys Asn Lys Val Arg Cys Arg Gly Gln 355 360 365 att tca ccg cat aaa ggc aag ctt gtc tac gtc atg gaa atc aaa aag 1152 Ile Ser Pro His Lys Gly Lys Leu Val Tyr Val Met Glu Ile Lys Lys 370 375 380 atg ggt tac gat caa gca tct gga agc cca tac gcc atc gcg gac gtt 1200 Met Gly Tyr Asp Gln Ala Ser Gly Ser Pro Tyr Ala Ile Ala Asp Val 385 390 395 400 gat atc att gac gtc aac gaa gag ctg ggt caa agt ttt gac atc aac 1248 Asp Ile Ile Asp Val Asn Glu Glu Leu Gly Gln Ser Phe Asp Ile Asn 405 410 415 gac ctt gcg agc tac gga aaa ggt gac ctg agc aaa aaa atc gtg gtt 1296 Asp Leu Ala Ser Tyr Gly Lys Gly Asp Leu Ser Lys Lys Ile Val Val 420 425 430 gac ttc aaa gga att gct ttg cag ctc aaa ggc cgc gct ttt tca cgc 1344 Asp Phe Lys Gly Ile Ala Leu Gln Leu Lys Gly Arg Ala Phe Ser Arg 435 440 445 atg agt tcc agc tcg tcc ttg aac gaa gga tgg caa tgt gtt cca aaa 1392 Met Ser Ser Ser Ser Ser Leu Asn Glu Gly Trp Gln Cys Val Pro Lys 450 455 460 cca agc cag aga atg gaa cac gaa cag ccc cct gct cac tgc ctt gca 1440 Pro Ser Gln Arg Met Glu His Glu Gln Pro Pro Ala His Cys Leu Ala 465 470 475 480 agc gac ccc gaa gcc cct tca act gtg acc tgg cac cca atg tca aag 1488 Ser Asp Pro Glu Ala Pro Ser Thr Val Thr Trp His Pro Met Ser Lys 485 490 495 ctt cct ggc aac 1500 Leu Pro Gly Asn 500 <210> 64 <211> 500 <212> PRT <213> Thraustochytrium sp. <400> 64 Met Gly Pro Arg Val Ala Ser Gly Lys Val Pro Ala Trp Glu Met Ser 1 5 10 15 Lys Ser Glu Leu Cys Asp Asp Arg Thr Val Val Phe Asp Tyr Glu Glu 20 25 30 Leu Leu Glu Phe Ala Glu Gly Asp Ile Ser Lys Val Phe Gly Pro Glu 35 40 45 Phe Lys Val Val Asp Gly Phe Arg Arg Arg Val Arg Leu Pro Ala Arg 50 55 60 Glu Tyr Leu Leu Val Thr Arg Val Thr Leu Met Asp Ala Glu Val Gly 65 70 75 80 Asn Phe Arg Val Gly Ala Arg Met Val Thr Glu Tyr Asp Val Pro Val 85 90 95 Asn Gly Glu Leu Ser Glu Gly Gly Asp Val Pro Trp Ala Val Leu Val 100 105 110 Glu Ala Gly Gln Cys Asp Leu Leu Leu Ile Ser Tyr Met Gly Ile Asp 115 120 125 Phe Gln Cys Lys Gly Glu Arg Val Tyr Arg Leu Leu Asn Thr Thr Leu 130 135 140 Thr Phe Phe Gly Val Ala Lys Glu Gly Glu Thr Leu Val Tyr Asp Ile 145 150 155 160 Arg Val Thr Gly Phe Ala Lys Arg Pro Asp Gly Asp Ile Ser Met Phe 165 170 175 Phe Phe Glu Tyr Asp Cys Tyr Cys Asn Gly Lys Leu Leu Ile Glu Met 180 185 190 Arg Asp Gly Ser Ala Gly Phe Phe Thr Asp Glu Glu Leu Ala Ala Gly 195 200 205 Lys Gly Val Val Val Thr Arg Ala Gln Gln Asn Met Arg Asp Lys Ile 210 215 220 Val Arg Gln Ser Ile Glu Pro Phe Ala Leu Ala Ala Cys Thr His Lys 225 230 235 240 Thr Thr Leu Asn Glu Ser Asp Met Gln Ser Leu Val Glu Arg Asn Trp 245 250 255 Ala Asn Val Phe Gly Thr Ser Asn Lys Met Ala Glu Leu Asn Tyr Lys 260 265 270 Ile Cys Ala Arg Lys Met Leu Met Ile Asp Arg Val Thr His Ile Asp 275 280 285 His His Gly Gly Ala Tyr Gly Leu Gly Leu Leu Val Gly Glu Lys Ile 290 295 300 Leu Asp Arg Asn His Trp Tyr Phe Pro Cys His Phe Val Asn Asp 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ttc tcc cct tca tct tac cct ccg agg gca att tgc 48 Pro Thr Pro Phe Phe Ser Pro Ser Ser Tyr Pro Pro Arg Ala Ile Cys 1 5 10 15 ttc atc cct ttc ccg ggc aat ccc ctt gac aac aac tgc aag gct gga 96 Phe Ile Pro Phe Pro Gly Asn Pro Leu Asp Asn Asn Cys Lys Ala Gly 20 25 30 gaa atg ccc ctg aac tgg tac aac atg tca gag ttc atg tgt ggc aag 144 Glu Met Pro Leu Asn Trp Tyr Asn Met Ser Glu Phe Met Cys Gly Lys 35 40 45 gtt tct aac tgc ttg ggc cca gaa ttc gca cgc ttt gac aag tcg aac 192 Val Ser Asn Cys Leu Gly Pro Glu Phe Ala Arg Phe Asp Lys Ser Asn 50 55 60 acc agc cgg agc cct gct ttt gac ttg gct ctg gtg acc cga gtt gtt 240 Thr Ser Arg Ser Pro Ala Phe Asp Leu Ala Leu Val Thr Arg Val Val 65 70 75 80 gaa gtc aca aac atg gaa cac ggc aag ttt cta aac gtt gat tgc aat 288 Glu Val Thr Asn Met Glu His Gly Lys Phe Leu Asn Val Asp Cys Asn 85 90 95 cca agc aaa ggc aca atg gtg ggg gag ttt gac tgt ccc caa gac gcg 336 Pro Ser Lys Gly Thr Met Val Gly Glu Phe Asp Cys Pro Gln Asp Ala 100 105 110 tgg ttc ttt gat ggt tcg tgc aac gac ggc cat atg ccg tat tcc att 384 Trp Phe Phe Asp Gly Ser Cys Asn Asp Gly His Met Pro Tyr Ser Ile 115 120 125 atc atg gaa atc gga ctg caa acc tca ggt gtt ctc acc tcg gtg ttg 432 Ile Met Glu Ile Gly Leu Gln Thr Ser Gly Val Leu Thr Ser Val Leu 130 135 140 aag gca ccg ctg act atg gac aag gat gac att ctc ttt cga aac ctc 480 Lys Ala Pro Leu Thr Met Asp Lys Asp Asp Ile Leu Phe Arg Asn Leu 145 150 155 160 gat gca agt gct gaa atg gtg cgt cca gac gtg gat gtt cgc ggc aaa 528 Asp Ala Ser Ala Glu Met Val Arg Pro Asp Val Asp Val Arg Gly Lys 165 170 175 acg att cga aac gtg acc aag tgt acc ggc tat gca atg ttg gga aag 576 Thr Ile Arg Asn Val Thr Lys Cys Thr Gly Tyr Ala Met Leu Gly Lys 180 185 190 atg ggg att cac cgg ttc acg ttt gag ttg agc gtt gac ggc gtg gta 624 Met Gly Ile His Arg Phe Thr Phe Glu Leu Ser Val Asp Gly Val Val 195 200 205 ttt tat aaa gga tcc act tcc ttt gga tgg ttc act ccc gag gtg ttt 672 Phe Tyr Lys Gly Ser Thr Ser Phe Gly Trp Phe Thr Pro Glu Val Phe 210 215 220 gct cag caa gct gga ctc gac aac ggg aaa aag acg gag ccc tgg tgc 720 Ala Gln Gln Ala Gly Leu Asp Asn Gly Lys Lys Thr Glu Pro Trp Cys 225 230 235 240 aag act aac aac acc tcg gtt cga aga gtt gaa atc gca tcc gcc aaa 768 Lys Thr Asn Asn Thr Ser Val Arg Arg Val Glu Ile Ala Ser Ala Lys 245 250 255 gga aaa gag cag ctg act gag aag ctt ccc gac gca act aat gct caa 816 Gly Lys Glu Gln Leu Thr Glu Lys Leu Pro Asp Ala Thr Asn Ala Gln 260 265 270 gtt ctt cgg cgt tca gag cag tgt gaa tac ctc gat tac ctc aat att 864 Val Leu Arg Arg Ser Glu Gln Cys Glu Tyr Leu Asp Tyr Leu Asn Ile 275 280 285 gcc cct gac tct ggg ctg cat ggg aag ggc tac gcc cac gga cac aaa 912 Ala Pro Asp Ser Gly Leu His Gly Lys Gly Tyr Ala His Gly His Lys 290 295 300 gac gtt aac ccg caa gac tgg ttc ttc tct tgc cac ttt tgg ttc gat 960 Asp Val Asn Pro Gln Asp Trp Phe Phe Ser Cys His Phe Trp Phe Asp 305 310 315 320 cct gta atg cca gga tct tta gga att gaa tca atg ttc cag ctt atc 1008 Pro Val Met Pro Gly Ser Leu Gly Ile Glu Ser Met Phe Gln Leu Ile 325 330 335 gag gcc ttt gcg gtg gac caa aac att cct gga gag tac aac gta tcc 1056 Glu Ala Phe Ala Val Asp Gln Asn Ile Pro Gly Glu Tyr Asn Val Ser 340 345 350 aat ccg acc ttt gcc cat gca cca ggc aaa acg gcg tgg aaa tac cga 1104 Asn Pro Thr Phe Ala His Ala Pro Gly Lys Thr Ala Trp Lys Tyr Arg 355 360 365 ggc cag ctc aca cca aag aac cgt gcg atg gac tgc gag gtg cat atc 1152 Gly Gln Leu Thr Pro Lys Asn Arg Ala Met Asp Cys Glu Val His Ile 370 375 380 gtt tca att acc gcc tcc ccc gag aac ggg ggc tac gtt gac atc gtg 1200 Val Ser Ile Thr Ala Ser Pro Glu Asn Gly Gly Tyr Val Asp Ile Val 385 390 395 400 gcc gat gga gcg ctt tgg gta gat gga ctt cgc gtg tac gaa gcc aaa 1248 Ala Asp Gly Ala Leu Trp Val Asp Gly Leu Arg Val Tyr Glu Ala Lys 405 410 415 gag ctt cga gtt cgt gtc gtt tcg gca aaa cct caa gca att ccg gat 1296 Glu Leu Arg Val Arg Val Val Ser Ala Lys Pro Gln Ala Ile Pro Asp 420 425 430 gta caa caa cag cca cct agc gca aag gcg gac ccg ggg aaa aca gga 1344 Val Gln Gln Gln Pro Pro Ser Ala Lys Ala Asp Pro Gly 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Thraustochytrium sp. <220> <221> CDS <222> (1)..(1410) <400> 67 ggc gat aag tct ttt atg gaa acg tac aac gtg tca gca cct ctg tat 48 Gly Asp Lys Ser Phe Met Glu Thr Tyr Asn Val Ser Ala Pro Leu Tyr 1 5 10 15 act gga gca atg gcc aag ggc att gca tcc gcc gac ttg gtc att gct 96 Thr Gly Ala Met Ala Lys Gly Ile Ala Ser Ala Asp Leu Val Ile Ala 20 25 30 gct ggg aaa cgc aag ata ctt gga tcg ttt ggt gcg gga ggg ctg cct 144 Ala Gly Lys Arg Lys Ile Leu Gly Ser Phe Gly Ala Gly Gly Leu Pro 35 40 45 att tcc ata gtc cgt gaa gca ctg gag aaa att caa caa cac ctg ccc 192 Ile Ser Ile Val Arg Glu Ala Leu Glu Lys Ile Gln Gln His Leu Pro 50 55 60 cac ggc ccc tac gct gtt aac ctc att cac tcg cct ttc gac agc aac 240 His Gly Pro Tyr Ala Val Asn Leu Ile His Ser Pro Phe Asp Ser Asn 65 70 75 80 ttg gaa aag ggc aac gtt gac ctc ttt ctc gag atg ggc gtg aca gtg 288 Leu Glu Lys Gly Asn Val Asp Leu Phe Leu Glu Met Gly Val Thr Val 85 90 95 gta gaa tgc agc gcg ttc atg gaa ctc acg gcc cag gtt gtc cgg tac 336 Val Glu Cys Ser Ala Phe Met Glu Leu Thr Ala Gln Val Val Arg Tyr 100 105 110 cgc gcg tct ggt cta agc aaa agt gcg gac ggt tcg att cgc att gct 384 Arg Ala Ser Gly Leu Ser Lys Ser Ala Asp Gly Ser Ile Arg Ile Ala 115 120 125 cac cgt att att ggc aag gtt tcc aga acc gag ctg gca gaa atg ttt 432 His Arg Ile Ile Gly Lys Val Ser Arg Thr Glu Leu Ala Glu Met Phe 130 135 140 att cgt cca gca cca cag cac ctc ctc caa aaa ctc gta gcc tcc ggc 480 Ile Arg Pro Ala Pro Gln His Leu Leu Gln Lys Leu Val Ala Ser Gly 145 150 155 160 gag ctg aca gct gag caa gcc gag ctt gca aca cag gtt ccg gtg gcg 528 Glu Leu Thr Ala Glu Gln Ala Glu Leu Ala Thr Gln Val Pro Val Ala 165 170 175 gat gac att gcg gtc gaa gcc gac tcg ggg ggg cat acc gac aac agg 576 Asp Asp Ile Ala Val Glu Ala Asp Ser Gly Gly His Thr Asp Asn Arg 180 185 190 cct att cac gtc att ctt cct cta atc atc aac cta cgc aac cgt ttg 624 Pro Ile His Val Ile Leu Pro Leu Ile Ile Asn Leu Arg Asn Arg Leu 195 200 205 cat aaa gag ctt gac tac cct tcg cat ctc cgg gta cgt gtg ggt gct 672 His Lys Glu Leu Asp Tyr Pro Ser His Leu Arg Val Arg Val Gly Ala 210 215 220 ggt ggt ggt att gga tgt cct caa gcc gct ctt gca gca ttt caa atg 720 Gly Gly Gly Ile Gly Cys Pro Gln Ala Ala Leu Ala Ala Phe Gln Met 225 230 235 240 ggg gca gcg ttt tta atc act gga acg gtg aac cag ctt gct cgt gaa 768 Gly Ala Ala Phe Leu Ile Thr Gly Thr Val Asn Gln Leu Ala Arg Glu 245 250 255 agt ggc act tgt gac aac gtc cgg tta cag ctc tca aag gcc acg tat 816 Ser Gly Thr Cys Asp Asn Val Arg Leu Gln Leu Ser Lys Ala Thr Tyr 260 265 270 agc gac gtg tgt atg gct cct gct gcc gat atg ttt gac caa ggc gtg 864 Ser Asp Val Cys Met Ala Pro Ala Ala Asp Met Phe Asp Gln Gly Val 275 280 285 gag ctg caa gta ttg aag aaa ggc acg ctg ttc cca agt cgt gct aag 912 Glu Leu Gln Val Leu Lys Lys Gly Thr Leu Phe Pro Ser Arg Ala Lys 290 295 300 aag ctg tac gag ctg ttc tgc aag tat gac tcg ttt gag gca atg ccg 960 Lys Leu Tyr Glu Leu Phe Cys Lys Tyr Asp Ser Phe Glu Ala Met Pro 305 310 315 320 gct gaa gaa ttg caa cgg gtt gaa aag cgg att ttt caa aag tcg ctt 1008 Ala Glu Glu Leu Gln Arg Val Glu Lys Arg Ile Phe Gln Lys Ser Leu 325 330 335 gct gaa gtt tgg cag gag acc agt gac ttt tac att cat cgt atc aag 1056 Ala Glu Val Trp Gln Glu Thr Ser Asp Phe Tyr Ile His Arg Ile Lys 340 345 350 aac cct gag aaa atc aat cgt gct gca agc gat ggc aaa ctg aaa atg 1104 Asn Pro Glu Lys Ile Asn Arg Ala Ala Ser Asp Gly Lys Leu Lys Met 355 360 365 tcg ctt tgc ttt cgc tgg tac ctt ggg ctt tcc tca ttt tgg gcc aac 1152 Ser Leu Cys Phe Arg Trp Tyr Leu Gly Leu Ser Ser Phe Trp Ala Asn 370 375 380 tct ggg gca caa gat cgc gtc atg gac tat caa att tgg tgt ggc cct 1200 Ser Gly Ala Gln Asp Arg Val Met Asp Tyr Gln Ile Trp Cys Gly Pro 385 390 395 400 gct att ggc gct ttc aat gat ttt acc aag ggc acg tac ctt gac gtg 1248 Ala Ile Gly Ala Phe Asn Asp Phe Thr Lys Gly Thr Tyr Leu Asp Val 405 410 415 act gtt gca aag agt tac cct tgt gtg gca cag atc aat ttg caa att 1296 Thr Val Ala Lys Ser Tyr Pro Cys Val Ala Gln Ile Asn Leu Gln Ile 420 425 430 ttg caa gga gct gcg tat ctg aaa cgc ctt ggt gtc att cgt ttt gac 1344 Leu Gln Gly Ala Ala Tyr Leu Lys Arg Leu Gly Val Ile Arg Phe Asp 435 440 445 cgc atg ctg ctg cag gcc gtc gat atc gac gat cct gta ttt act tac 1392 Arg Met Leu Leu Gln Ala Val Asp Ile Asp Asp Pro Val Phe Thr Tyr 450 455 460 gtg ccg acc cag cca ctt 1410 Val Pro Thr Gln Pro Leu 465 470 <210> 68 <211> 470 <212> PRT <213> Thraustochytrium sp. <400> 68 Gly Asp Lys Ser Phe Met Glu Thr Tyr Asn Val Ser Ala Pro Leu Tyr 1 5 10 15 Thr Gly Ala Met Ala Lys Gly Ile Ala Ser Ala Asp Leu Val Ile Ala 20 25 30 Ala Gly Lys Arg Lys Ile Leu Gly Ser Phe Gly Ala Gly Gly Leu Pro 35 40 45 Ile Ser Ile Val Arg Glu Ala Leu Glu Lys Ile Gln Gln His Leu Pro 50 55 60 His Gly Pro Tyr Ala Val Asn Leu Ile His Ser Pro Phe Asp Ser Asn 65 70 75 80 Leu Glu Lys Gly Asn Val Asp Leu Phe Leu Glu Met Gly Val Thr Val 85 90 95 Val Glu Cys Ser Ala Phe Met Glu Leu Thr Ala Gln Val Val Arg Tyr 100 105 110 Arg Ala Ser Gly Leu Ser Lys Ser Ala Asp Gly Ser Ile Arg Ile Ala 115 120 125 His Arg Ile Ile Gly Lys Val 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Ser Asp Phe Tyr Ile His Arg Ile Lys 340 345 350 Asn Pro Glu Lys Ile Asn Arg Ala Ala Ser Asp Gly Lys Leu Lys Met 355 360 365 Ser Leu Cys Phe Arg Trp Tyr Leu Gly Leu Ser Ser Phe Trp Ala Asn 370 375 380 Ser Gly Ala Gln Asp Arg Val Met Asp Tyr Gln Ile Trp Cys Gly Pro 385 390 395 400 Ala Ile Gly Ala Phe Asn Asp Phe Thr Lys Gly Thr Tyr Leu Asp Val 405 410 415 Thr Val Ala Lys Ser Tyr Pro Cys Val Ala Gln Ile Asn Leu Gln Ile 420 425 430 Leu Gln Gly Ala Ala Tyr Leu Lys Arg Leu Gly Val Ile Arg Phe Asp 435 440 445 Arg Met Leu Leu Gln Ala Val Asp Ile Asp Asp Pro Val Phe Thr Tyr 450 455 460 Val Pro Thr Gln Pro Leu 465 470 <210> 69 <211> 39669 <212> DNA <213> Sh. japonica <400> 69 gatctggcga taacttactc cccattccac tgtatcagct gcctgcaacc tttaacggcg 60 atcataaacg cgtcattcgc tggcagacag agtggcaagc ctgtgatgaa ttacaaatgg 120 cagcggccac aaaggctgaa tttgcagcat tagaagaaat taccagtcat caaagtgatt 180 tatttagacg gggctgggat atcaggggcg gagttgagta tttaactaaa atcccaactt 240 attattattt ataccgtgtc ggtggcgaaa accttgccag tgaaaaaaac cgagcttgtc 300 cacgttgcgg ctcaaaagcg tggcgtttag atgagccatt attagacatg ttccacttta 360 ggtgcgagcc atgtcgaatt gtatcgaata tctcatggga tcatcagtaa aattatcttc 420 tcgtcaatag atactaatac aacgagttag ctgataacgc attatcggtt cattcaataa 480 aaaagccaga ccgcatctat agcctgatct atagcctggc ttttttattt tatgtccgaa 540 taagcaatta tttcttgcct ttaatcaaat cattccacat cattttcatt cgctgccaaa 600 tacctggatg agcaacatat tcctctacaa tcggctctac cggcggcgtt actcgtggtg 660 ttagcgcatc aataaattcc gcaagactat cggctaattt atctttgggc ctatcacctg 720 gaatttcaat ccacacactg ccatcttcat tatcgacagt aatcatctgt tcgccatcac 780 ctaaaacgcc aacaaaccaa gttggtgctt gtttaagctt tttcttcatc attaagtggc 840 caattacatt ttgttgcaaa gattcaaaat cttgctggtt ccaaacctgc agtaactccc 900 cttcgcccca tttagaatcg aaaaaaagtg gcgcagaaaa aaactcacca taaaaggcat 960 taatgtcttg atgaagcttg atgtctaatg catgttctac attactgaaa tctgaattac 1020 tttttcgttt taccgctttc caaaaaaccg caccgtcaga ttcaagatca tacttgcctt 1080 caatacaagc ggatccttgc ccaagtggga aataacgggg taactcgtct 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atatattatt gtttttgaga 3480 aagatgctaa acagaactgt agacaacata tggttcacaa aatgacagtt ttatttactt 3540 ggataaatga gaatttcacc atcgacactg ccaattgtta attcagacaa atgattaaag 3600 ccttcacgag caaataattc tgcatgctta gggttattca cgaaaacacc gataccatca 3660 agttctggct gctcatcaca ccaacttaac actgcctgga tcagcttagc gccattacct 3720 ttactttgct caattggcga taaagcaata aattgcaaaa taccatactg cttactcggc 3780 aagctttcta agatactgtg ctcttttttc atgagcgctt gggtcgagtt ccaaccggta 3840 cctaacacca ttttcaaacg ccaatgccaa taacggctct cacctaatgg cacttgatga 3900 gttatgacac aggcgactcc aatgagcctt tcaccatcga accagccaat taaaggttgt 3960 tcttgttgcc aaagttccgt taactcctcg cgaatagagg cacgtagttt ctgctcgtaa 4020 ctagcttggt tagtagtagc aagagcttca ataaagaaag gatcatcatg gtaagcgtta 4080 taaataattg atgcagccac gcgtaaatct tctgcagtta aataaacagc tctgtgttct 4140 tctaacgtgt tttgttccat gtttacactc tttactaaac caagttaata gttacaactt 4200 aacaagttta aaacatattg caattttaat gctgtcacct aggcttaaag atatctcgat 4260 agccaagtac acgataaatt ggggatgaaa atggatacaa 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ggcattgcga tccttgacgt ctacggcgcc agcgagagca cgggaggcgt caccggcaac 1440 tccatcaagg cccaccaatt cggtacggtc ggccacactc tgcccggcat ggacgttcgg 1500 gtcttccaaa aggccgaggg cggcgacagt agtgccgaga cgggtctcgg cgagctccgt 1560 gagccggcgc gggccaagga catcttccat ccctccgagg aggagcaggg cgaagtctgc 1620 ttccgcggac gctccgtcat gctcggctac atggccaatc ccaagcttgg cgaggaacac 1680 gtcgccgagg tcgagcgcaa aaacgcatcg gccatcgatc gccacggatg gtaccattcc 1740 ggtgacaagg gcgcctgttc caagaagaac atgtttgtca tcaccggtcg ctacaaggag 1800 atcattattg gcgccggtgg cgaaaacatt gcgcccctgc ccatggaaga tgccgtcaag 1860 tcccttgccc ccggcgttgc gaacgcaatc atgatcggcg acaagcgcaa gttcaatatt 1920 atgctcatca cgcttcgcgc cgagggcgcc actggcgagt tcccgggctc ggacaacctc 1980 gaccccgatg tgcggagcat tggctccgat tccacgcgca cgattcaaaa ggcaatggcc 2040 gactccaagt ggatcgagca tgtccgtgac gccatctcca agaccaacgc caatggcgac 2100 gcctgccaga gcaacgcctg gaagattggc agattcacca ttctccctta cgacatctcc 2160 atcgttggtg gcgagctcac gccgacgctc aagctcaagc gcaactttgt cgacgaaaag 2220 tacaaggctg tcattgacca tgtctatgcg cacgagggcg acagcaagga tctcacatac 2280 gtcccttgcc ccatcgaccg ggtgccgcgc aagatctctg gcgacgagag cgctgctgga 2340 gctgcgagcc cggaggccaa tgtcgccgag cctgtcacgg ccgagagcgg ttcaccttcg 2400 gaggtaacga ctgaggccaa gcctgccaac gaaaccgacg acgccgagag caaggacgcc 2460 gctgcgcccc ttgcggccaa ggtcgacacg acagttcctg acgtggcgca gcctcaggcc 2520 gccagctag 2529 <210> 87 <211> 842 <212> PRT <213> Schizochytrium sp. <400> 87 Met Gly Cys Ser Gly Ser Lys Pro Ala Ala Pro Gly Glu Val Pro Ala 1 5 10 15 Val Gln Gly Tyr Glu Val Thr Glu Glu Val Ala Pro Gly Pro Tyr Asp 20 25 30 Pro Glu Lys Gly Pro Tyr Tyr Val Ser Asn Lys Ala Glu Arg Arg Glu 35 40 45 Ile Ile Phe Ala Ala Lys Gly Val Ala Ser Glu Ala Thr Thr Pro Ala 50 55 60 Met Thr Leu Ser Lys Met Phe Arg Lys Ala Ala Glu Ala Ser Lys Asp 65 70 75 80 Glu Val Ala Leu Ala Val Glu Trp Pro Val Pro Glu Ile Gly Ala Asp 85 90 95 Gly Lys Ile Pro Asp Ser Leu Pro Leu Asp Lys Trp Arg Thr Trp Thr 100 105 110 Phe Gly Gln Tyr Tyr Ala Asp Ser His Ala Met Ala 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ccttgagcgc 420 ggcatcgtcg tggccaccag ctacgccaat cttggtcccg aggccgtcgc ctacggcctc 480 aagcagacca agtgctcggt tgtctttacc gacgctgacc ttatcccgac gctcaacaag 540 gttctcggcg actgccccga cgtcaagcac gtcgtcttct cgcgcgacaa gcgcccggcg 600 aaccatccgg cccacaactc cgacgagaag gtgcgcgaca tgatcacgca cagcggcatc 660 caggcgcaca gctttgaaga ggttgagcag ctcggcgagg gcgccaccaa ggaggacctt 720 ccttcggtta agcccgatga caccggtgtc atcatgtaca cctcgggctc caccggcaac 780 cccaagggcg tcatcatctc ccaccgcaac cttgttgccg gcattgccgg ttgcgccgat 840 gccatttgcg gcatgagcac cgacgatgtc taccttgcct acctcccgct cgcgcacatt 900 ctcgagctca tcgccgagag ctccctctac tttcgcggtg tcgccgtcgg ctacggctcc 960 accaagacca tcaccgacgc atccgtgtgt atcgaggccg gcaagtgcgt cggtgacgcc 1020 aacgagctcc gccccacgct catggctgcc gtgcccatga ttatggacaa gatccgggcc 1080 ggtgtcatga acaagatcaa ctccactggc ggtatcacca agcagctctt cgagcttggc 1140 tttagccgca aaaaggctgc ccttgccgaa ggcaaagaat ctcccttctg gaacaagatc 1200 ctctttgaca acattcgcgc gcgcctcctt ggcggccgcg tccgctacat gctcagtggt 1260 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acaatcacga tgatatcaat gaagtggcgg ctatcccagt cccccatccc 1500 acgcttggcg aggaggtcgg cattgccgtc tttagccagt ctggcgcgcg accctcgctc 1560 cagagcattc gcgatgtctg cgggaacctc gcgcgctatg aaatgcctac gcatatttat 1620 tattggcccg agcagctccc gcgtggagac acgggcaaga ttcataagcg caccattttg 1680 gccgacatca aggccggcaa ggtcaaggac gaggctgtgc ctgcctccaa gctctga 1737 <210> 91 <211> 578 <212> PRT <213> Schizochytrium sp. <400> 91 Met Leu Glu Met Arg Glu Glu Val Val Lys His Glu Gly Glu Ala Ala 1 5 10 15 His Phe Lys Gly Val Lys Met Lys Val Phe Pro Asn Gly Phe Gln Thr 20 25 30 Met Val Asp Ile Phe Lys Val Pro Phe Glu Lys Gln Val Met Lys Asn 35 40 45 Asp Leu Leu Val Asp Glu Thr Gly Arg Met Thr Phe Gln Glu Val Phe 50 55 60 Asp Thr Ala Ala Ala Leu Gly Asp Ala Leu Val Asn Glu Tyr Gly Val 65 70 75 80 Glu Lys Gly Asp Arg Val Val Ala Leu Ser Lys Asn Arg Asn Glu Tyr 85 90 95 Ile Val Thr Met Ile Ala Ala Thr Ser Val Gly Ala Ile Phe Ala Pro 100 105 110 Leu Asn Ser Tyr Trp Lys Thr Glu Gln Leu Ser Tyr Gly Leu Asp Asp 115 120 125 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gcgtgctcat catgaaccct cacgtttcgc gctcaaacta cattgaaatg 600 cttcacactc tcgttccctc cttgcgcgaa aggacgcaaa gcacgtgccg ggaccccgta 660 caaagtgaca aagtgcctca ccttcgccac gttgtcctgg cagaggcaga cggctccgac 720 ggcgaggaca cctttatccg cttcgaggac cttctcgaaa aggacggagc tgcggccgtt 780 cctacgggcc agggcctttt gcaacccgac gacccaatta acattcagtt cacaagtgga 840 accacaggag ctcctaaggg agctctgctg tcgagccgca atattgtcaa caatggtaac 900 tttgtgggcg cctgcatccg tcttacgcca gacgacatta tcaatgtccc cgtgcccttg 960 taccactgct ttggagtcgt catgggcaac ttggcgtcca tttcgcatgg cgcttctgtg 1020 gtgtatccgg cgcgtgtatt ctccgcgagc aaaacgctca gtgtggtcga gtcggagcgc 1080 tgtactgcgc tttacggagt gcctaccatg ttttctgcca tgcttgcgta ccagcaagag 1140 gccaaacacg acgtttcgac gctgcggacg ggcattatgg caggaagcaa ctgtccgcgt 1200 gaaatgatgc gtcgggttgt tgccgagttg aacatgaccg acacctgcat tggctacggt 1260 cagaccgagt cttctcccgt gagtttcatg tcgcgcatcg tcgatgacga ggatcaccgc 1320 tgcgagaccg tgggtcgcat cactccgcac atagaagcca aggttgtgga tgaggatgga 1380 gagactcttc cggttggtgt tccgggtgag ctttacgtga gaggctatca catctttaag 1440 ggctacataa atgctccgga gcagaccaag gctaccttga cggacgatgg ctggctgcgt 1500 acgggcgacc tcgttgactt ggaccgcgat ggttacctac gcgtagatgg ccgcctcaag 1560 gacgtgatta ttcgaggcgg cgagaatatc gccccgcgcg aatgcgaaga gctcattctc 1620 gagctccccg gcgttcttac cgtggccgtc gtgggtgtgc ccgacgaggt ctttggcgag 1680 caagtctgcg cagtggtggt gccgaacatg gacacatccg aaggcaaggc gctcgatggc 1740 gatgctgtgc gcgattttgt ccgggctgag ctctctcatc aaaaggtgcc aaagttcgtc 1800 ctttttcgcc actcctttga cgaattcatg actgtcactg gcaagctgcg aaagtttcaa 1860 gtgcgagact gggcgaccaa ggagacatct gcgcagaagg aagctgctgc caaagctgct 1920 taa 1923 <210> 95 <211> 640 <212> PRT <213> Schizochytrium sp. <400> 95 Met Arg Arg Thr Ser Phe Ala Leu Ala Ser Arg Arg Leu Arg Leu Gln 1 5 10 15 Glu Arg Leu Arg Leu Gly Ala Arg Ser Ala Thr Gln Arg Met Gln Ser 20 25 30 Thr Asp Ala Arg Phe Tyr Arg Ala Ser Ala Ala Phe Ser Ser Gln Ala 35 40 45 Ser Phe Pro Asp Asp Leu Gly Thr Thr Tyr Leu Val Gly Asp Gln Arg 50 55 60 Leu Ala His Ala 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tctttaatgt gaccaacatg 180 tggtacgagg cgtacgccaa gaacccgaaa aagccggcgc tcctctacct cgacgaggtc 240 gtcacgtacc aggacatgga ggaccgctca aaccaggtgg ccaactggct cctgagcaag 300 gggctcaagc gcggcgacac cgtggccctt ctcatggaga accgtcccga gttcgtcatc 360 tcgtggctcg gcatgaccaa gatcggcgtc aaggtcgcgc tcatcaacac gagcatcaaa 420 cagaagcctc tcttgcattg cctgaaaatc tcggggtgca aaatcgttct ctttggaagc 480 gagctcgcgg agcccatcct cgacatcaag gacgagctcg ccgacctcgg catcgagctt 540 gccgccgagg gcgcgcgtga agcctctccc gactggatcg aggtcgtcaa cccggaaatc 600 gaggcctcgc ccaagaccgc gacctcgccc aagcttcgcg aaggcatcgg tatgcaggac 660 gtctttggct tcatttacac ctcgggcacc acgggtctgc ccaaggcggc tgtcattctt 720 caccaaaaaa tgtttagctt tggcgccctc atgaccaacg ccttccagtg cactcaggac 780 gatattgtct acacctgcct tccgctcttc cacagcgcgg gcggcggtct cggcatcggc 840 atcatgctct acaccggagc caccgtggtc atcaagcgca agttcagcgt cacggacttt 900 tggagcgatt gcgtcaagta caagtgcact gtcgtacagt acattggtga actctgccgg 960 tacctcgtca tggccgagtc gcggcccgag gagacccagc acaaggtccg ccttgccatc 1020 ggcaacggcc tgcggcccga gatctgggcc gagtttcagg agcgcttcca gattccgcaa 1080 attggcgagt tctatggcgc caccgagggc aatggcgccc tcgtacagca ctgcaccaag 1140 cccgaagacc gcggtgccgt cgggcgcatg ggttcgctgc tcatgcgcgt tacgggcgtc 1200 aagtttgctc gcttcgatgt cctcgaggag gcaccggtgc gcggcgctga cggcttttgc 1260 atcgaatgtg acgtcgacga gcctggcgag ctcctttttc ctattcgcga caacgacccc 1320 agctctgcct ttgccggcta caacgacccc aaggccacag caaagaagat catcacggac 1380 gcctttacca agggcgacaa gtactttcgc accggcgact tgctcagtcg tgatgcccgc 1440 ggccgcatct actttcgcga ccgcatcggc gacacctttc gctgtaaggg cgaaaacgtt 1500 tccaccagcg aggtcgccga agtcctttct acctatccgg gtatcgagga gctcaacatc 1560 tatggcgttc agatccccaa caatgaagat ggccgctttc cctgtgctgc tcttacgccc 1620 aaggatagcg acctttccaa cgttgatctc aaaggatttt acgagcacgc caagaagaat 1680 cttccgagtt actcgatccc gatgttcatt cgcgtacagc cggtcatgcc tgtgactgcc 1740 acgatgaagc atcaaaaggt gcagcttcgc aaggaaggca tggacattca cgtcatcaag 1800 gaccctatgt actggctcca tgacgtaaag aaggagtatg atcccttgac 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tcgagggcga tgcacaaggc ttgcaagaac gaccgcgtgt gattgttgca 600 aatcacattt cgtatcttga gattttgtac tttatgtcga cagcgcattg cccttcgttc 660 gtcatgaaaa agacctgttt aaaagtcccc ctcgttggct acgtcgccat ggagcttgga 720 ggtctcttgg tagaccgcga gggtggcggt ccgagcgctt cggaggcaat cttctcgagg 780 gtgaagagtc ctcgcaaaga cgagaaacag ccactgcttg tgtttcctga aggaacgact 840 tcaaatggga cgtgtctttt gcagttcaaa acaggagctt ttcgcccggg cgtcccggtt 900 ctccctgtgg ttctcgagtt ccccattgat gcttctcgcg gagatttttc gccagcatat 960 gaatcggtgc acacgccgac acacctttta cgcatgcttg cgcagtggcg acaccgcttg 1020 cgcgtgcgct atcttccact cttcgagccc aatgagatgg agaaagctga tgcggcgctt 1080 tttgcgcgca atgttcgaaa ggagatggca agcgcgcttc atgtgcctac ggtcgagcaa 1140 acctacagcg ataagctcgc atatcatgca gagctcatgc ctcactacaa gcgagctggt 1200 cctggtgcgc tttatctcta tgtgcgtccg gacatcctac cacatgcacg caacacagtg 1260 tcatcatgaa cgtattttgg ttaacggaag tatgcacatg catgggagag aggaaagtat 1320 gctcaaagat gcacttgcac accatttgta ggtaacccga ttcgaagagg ggaaaagggt 1380 tatataaaat gaaagaggat tcatctaaca atctagcatc atttgttctc cttgacatgc 1440 accctccgag aggaagaaaa cctttcactt gggcacta 1478 <210> 103 <211> 927 <212> DNA <213> Schizochytrium sp. <400> 103 atggacgcgt ggacgcgact gaaaactgcc attgcgctcg tgacgctggt ccctgtgagg 60 atcgctctct tgacaacgct gctcggaacg tacggcttgg cgctcgcagc gagtgcacgt 120 tttggcattc cgcagcgcta caagctcgct gtgacccgcc acgtgacgcg ctggacccta 180 tggatccttg gtttttatca tattgaagtc gagggcgatg cacaaggctt gcaagaacga 240 ccgcgtgtga ttgttgcaaa tcacatttcg tatcttgaga ttttgtactt tatgtcgaca 300 gcgcattgcc cttcgttcgt catgaaaaag acctgtttaa aagtccccct cgttggctac 360 gtcgccatgg agcttggagg tctcttggta gaccgcgagg gtggcggtcc gagcgcttcg 420 gaggcaatct tctcgagggt gaagagtcct cgcaaagacg agaaacagcc actgcttgtg 480 tttcctgaag gaacgacttc aaatgggacg tgtcttttgc agttcaaaac aggagctttt 540 cgcccgggcg tcccggttct ccctgtggtt ctcgagttcc ccattgatgc ttctcgcgga 600 gatttttcgc cagcatatga atcggtgcac acgccgacac accttttacg catgcttgcg 660 cagtggcgac accgcttgcg cgtgcgctat cttccactct tcgagcccaa tgagatggag 720 aaagctgatg cggcgctttt tgcgcgcaat gttcgaaagg agatggcaag cgcgcttcat 780 gtgcctacgg tcgagcaaac ctacagcgat aagctcgcat atcatgcaga gctcatgcct 840 cactacaagc gagctggtcc tggtgcgctt tatctctatg tgcgtccgga catcctacca 900 catgcacgca acacagtgtc atcatga 927 <210> 104 <211> 308 <212> PRT <213> Schizochytrium sp. <400> 104 Met Asp Ala Trp Thr Arg Leu Lys Thr Ala Ile Ala Leu Val Thr Leu 1 5 10 15 Val Pro Val Arg Ile Ala Leu Leu Thr Thr Leu Leu Gly Thr Tyr Gly 20 25 30 Leu Ala Leu Ala Ala Ser Ala Arg Phe Gly Ile Pro Gln Arg Tyr Lys 35 40 45 Leu Ala Val Thr Arg His Val Thr Arg Trp Thr Leu Trp Ile Leu Gly 50 55 60 Phe Tyr His Ile Glu Val Glu Gly Asp Ala Gln Gly Leu Gln Glu Arg 65 70 75 80 Pro Arg Val Ile Val Ala Asn His Ile Ser Tyr Leu Glu Ile Leu Tyr 85 90 95 Phe Met Ser Thr Ala His Cys Pro Ser Phe Val Met Lys Lys Thr Cys 100 105 110 Leu Lys Val Pro Leu Val Gly Tyr Val Ala Met Glu Leu Gly Gly Leu 115 120 125 Leu Val Asp Arg Glu Gly Gly Gly Pro Ser Ala Ser Glu Ala Ile Phe 130 135 140 Ser Arg Val Lys Ser 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accgttccga caagttcaac cgctccagcg 1020 tggcagcgca gatccgcgcg cgtgtgggcg ccgcctcgcc ctggcgtagg caactcatga 1080 tcttccccga aggcacctgc accaaccgga ccagcctcat ctcttttcgc cgcggtgctt 1140 tcgagccttg tgcacctgtg cagccagtcg tgctccattg gtcgtacacc aactttgacc 1200 cgacctggtg cgccggcgcg ccctcgcgca ccctcatcgc cctccgtacg ctctcgcagt 1260 tcttccacga ggtcactgtt gagtttctgc ccgtgtacaa gccctcggaa gaggaacgcg 1320 cggattccgc cctgtacagc gagaatgtgc gcaagcttat ggctgtctcg ctcggcatcc 1380 cgacctcgga ccactcgtac gaggacatgt ttctcgccca aatcgccgcc aaaaacaagc 1440 tcaagcctag cgctgtgctc ccctttacat acgcctccct ccggagcaag cttccgcccg 1500 cagctgcctc gagcccgcgc ctctttgagc gtgtgcgggg cctgctcttg tgctttgcca 1560 aggctcctct catgacaaag gagcgccctc gtctcgatcg tgcccagttt gatgtcgtgt 1620 ctcctgtggc ggccacatcg ctcgacatta agatttcgct tacctggacc caggtcgctt 1680 tggagagctc cgtcgccggt gcgccttcgt cggccgatac cttttccttt tacgagtttg 1740 cactcgccca gctcaaggct gcatcatggg actagcgact ctgctttggc caagttcctt 1800 gcatgttaga ctctacaggc aacaaagacg 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gtcgcacctc gaactcaaag 300 aggtcaatcc atttcagacg gatgaggcca tggacgcaca agaatgggtc ctcttcgtga 360 ccggcctcgt cgtgcttgcg ccgttccgca ttctcatctt tctcgtcacc attcccgtcg 420 ccactggact cgtcctgctc tccgtcattg gatgcgacgt caacgagcca ctcccagcat 480 ctcgcgctcg cattcaggca catattgttt acgccacggc tcgcatcctc ctctcctgct 540 ttggtgtcta caccgtcgag acggttggca agcttgcgcc tgcaagcaag gcccgcgtcg 600 ccgtcgttgg gcctcactcc actccctttg acgctctcct cgcagccgca ttcatggacg 660 cccccagctt tgttgcaaaa gctgatctca cagagacctt tgtcggaccc gttctcaagg 720 ccatgcagac cattctcgtc gaccgcgaaa atatttccag caggcacctc gctgcggagg 780 ccatcctaca gcgcgccgat cgcacaggaa cttggcgccg acgtcttgcc gtttaccccg 840 aaggcacgtg cacgaatcga accagtctca ttcagttcag acgtggcgcc tttgagcccc 900 tcgcacccgt acagcctgca gttctccagt ggaacgtcgg ggcctttgac cccgcatgga 960 ccgtcggatc cccccgacgt ggactcattg ttctccgctg ccttgctcga ctccagcttc 1020 acgtgaccgt acaatttctg cccgtcatgg agcccctaaa aaatgaggac gccgctgcat 1080 tttgcgaccg cgtgcgcagc gccatggccg acgcgctcgg cgtccccacc accgagtaca 1140 cctatcctga tctctttctt gcaaagattg ccgcaaagcg caaagtcaag cccgcaatcg 1200 tactcccatg gcccttcgtc gatgtccagc gcgcctttcc tgacgttcct ggcatttttg 1260 aaatcacaag agccctcttg cttcgctacc tcgcagctcc tggcgtacaa gccaacaatg 1320 gacgcatgga ccactcggca ttcaaggctg tcgctgtaaa ggcggctcgt gatgccggaa 1380 tcgagggtga gcctcctacc tgggatcagg tcgcgcgtga aacccacacc gacaagaccg 1440 tctcctttac agacttcctt caagctcatc tcgagtgcct cgtttccaat ccaacttcct 1500 catcttcata acgagccatt ttctttccat ctgggatctc acatcgcgca ccaagaaaac 1560 cttgacggac aacactgtgt ccttttttaa acgaacttgc tccaagacca tcccaaaagt 1620 ctcgttttca tgctcatcgt gacgtgcttt attgtttctc aattttgggt ctcatctcag 1680 cccgcacacg aaacccatac ggacaacacc gtctctcttt cttcgtatat actccaagct 1740 catctcgacg tcctcacaag gggacgtgaa tcttcctcct catgaggaaa gaagatggcc 1800 ttgtagcaca acattgaata acatacgaac gtattttcac gcttccccta gaaaaaaaaa 1860 a 1861 <210> 109 <211> 1323 <212> DNA <213> Schizochytrium sp. <400> 109 atggcgaccg agcagccgtc tttgcggcga ctctccgcta aagagacgcg 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cgcgtgcgca gcgccatggc cgacgcgctc ggcgtcccca ccaccgagta cacctatcct 960 gatctctttc ttgcaaagat tgccgcaaag cgcaaagtca agcccgcaat cgtactccca 1020 tggcccttcg tcgatgtcca gcgcgccttt cctgacgttc ctggcatttt tgaaatcaca 1080 agagccctct tgcttcgcta cctcgcagct cctggcgtac aagccaacaa tggacgcatg 1140 gaccactcgg cattcaaggc tgtcgctgta aaggcggctc gtgatgccgg aatcgagggt 1200 gagcctccta cctgggatca ggtcgcgcgt gaaacccaca ccgacaagac cgtctccttt 1260 acagacttcc ttcaagctca tctcgagtgc ctcgtttcca atccaacttc ctcatcttca 1320 taa 1323 <210> 110 <211> 440 <212> PRT <213> Schizochytrium sp. <400> 110 Met Ala Thr Glu Gln Pro Ser Leu Arg Arg Leu Ser Ala Lys Glu Thr 1 5 10 15 Arg Arg Ile Glu Arg Arg Leu Ser Thr Thr Arg Arg Arg Arg Arg Ser 20 25 30 His Leu Glu Leu Lys Glu Val Asn Pro Phe Gln Thr Asp Glu Ala Met 35 40 45 Asp Ala Gln Glu Trp Val Leu Phe Val Thr Gly Leu Val Val Leu Ala 50 55 60 Pro Phe Arg Ile Leu Ile Phe Leu Val Thr Ile Pro Val Ala Thr Gly 65 70 75 80 Leu Val Leu Leu Ser Val Ile Gly Cys Asp Val Asn Glu Pro Leu 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tgcaaatgat 240 tgcggtggac cgcgagaatc cggagggtcg caaggccgcg ctcgacgagt ttgtgcggcg 300 cgcacaagat aacaaagggt ggcctcagct tgttgtcttt ccagaaggta cttgcaccaa 360 tcggcgtgcc ctcatccaat tcaagcgcgg gcccttcgtc cccggcgttc ccattcagcc 420 tgtcgtgatg cgctggccat attatttctt tgacccggca tggacctcga gcgggccgaa 480 ccggatcgca ctcgtgttcc gtctcatgac acaaatcttt acgcgtgtcg aggtggagtt 540 tctccccgtg tacacgccga gcgacgaaga aaaggaagat ccagagcttt tcgcgcacaa 600 cgtacgcaat accatggccc aggcgcttgg cgtgccaacc acggagcact cttacgagga 660 tacgtttttg agcatggcgg caaagaaggc caagtttaat ccggatgaaa ttgtcgattt 720 cgagttcacc aaggtgaaaa gagctcttgg atattgacct caaggaagcg cgccggcttc 780 tgaagcgatt cggg 794 <210> 112 <211> 756 <212> DNA <213> Schizochytrium sp. <400> 112 atgtggcctg tgcggatttt gtgcagactc ttcatctttt gctttggtgt gtactggatt 60 tctgtcaagg gtaaaaaggc gagtcatgct gaagcagcgg tggccgtggt ggccccgcat 120 tccacatttc tggacaccat gacgtactat gccgtttatg gccggtggtc gggtttgggt 180 aaaaaggaag tgaccaagac tccgtttttt ggcacgattt tccgcggtct gcaaatgatt 240 gcggtggacc gcgagaatcc ggagggtcgc aaggccgcgc tcgacgagtt tgtgcggcgc 300 gcacaagata acaaagggtg gcctcagctt gttgtctttc cagaaggtac ttgcaccaat 360 cggcgtgccc tcatccaatt caagcgcggg cccttcgtcc ccggcgttcc cattcagcct 420 gtcgtgatgc gctggccata ttatttcttt gacccggcat ggacctcgag cgggccgaac 480 cggatcgcac tcgtgttccg tctcatgaca caaatcttta cgcgtgtcga ggtggagttt 540 ctccccgtgt acacgccgag cgacgaagaa aaggaagatc cagagctttt cgcgcacaac 600 gtacgcaata ccatggccca ggcgcttggc gtgccaacca cggagcactc ttacgaggat 660 acgtttttga gcatggcggc aaagaaggcc aagtttaatc cggatgaaat tgtcgatttc 720 gagttcacca aggtgaaaag agctcttgga tattga 756 <210> 113 <211> 251 <212> PRT <213> Schizochytrium sp. <400> 113 Met Trp Pro Val Arg Ile Leu Cys Arg Leu Phe Ile Phe Cys Phe Gly 1 5 10 15 Val Tyr Trp Ile Ser Val Lys Gly Lys Lys Ala Ser His Ala Glu Ala 20 25 30 Ala Val Ala Val Val Ala Pro His Ser Thr Phe Leu Asp Thr Met Thr 35 40 45 Tyr Tyr Ala Val Tyr Gly Arg Trp Ser Gly Leu Gly Lys Lys Glu Val 50 55 60 Thr Lys Thr Pro Phe Phe Gly Thr Ile Phe Arg Gly Leu Gln Met Ile 65 70 75 80 Ala Val Asp Arg Glu Asn Pro Glu Gly Arg Lys Ala Ala Leu Asp Glu 85 90 95 Phe Val Arg Arg Ala Gln Asp Asn Lys Gly Trp Pro Gln Leu Val Val 100 105 110 Phe Pro Glu Gly Thr Cys Thr Asn Arg Arg Ala Leu Ile Gln Phe Lys 115 120 125 Arg Gly Pro Phe Val Pro Gly Val Pro Ile Gln Pro Val Val Met Arg 130 135 140 Trp Pro Tyr Tyr Phe Phe Asp Pro Ala Trp Thr Ser Ser Gly Pro Asn 145 150 155 160 Arg Ile Ala Leu Val Phe Arg Leu Met Thr Gln Ile Phe Thr Arg Val 165 170 175 Glu Val Glu Phe Leu Pro Val Tyr Thr Pro Ser Asp Glu Glu Lys Glu 180 185 190 Asp Pro Glu Leu Phe Ala His Asn Val Arg Asn Thr Met Ala Gln Ala 195 200 205 Leu Gly Val Pro Thr Thr Glu His Ser Tyr Glu Asp Thr Phe Leu Ser 210 215 220 Met Ala Ala Lys Lys Ala Lys Phe Asn Pro Asp Glu Ile Val Asp Phe 225 230 235 240 Glu Phe Thr Lys Val Lys Arg Ala Leu Gly Tyr 245 250 <210> 114 <211> 817 <212> DNA <213> Crypthecodinium cohnii <400> 114 cactccaacg tacgacagct tcctcatatt ctttccaaca tgtcgaacga tgctggaaag 60 actgcagggc ccctgacgaa gcccacacgc agctacttgg agtcgacagc ggtcgagcga 120 ctggcaggat ggctgtcggc ttccatcttt tccatcgtct actttgcggc accgatctac 180 ttgacaggca cagctcttct tctggcacgg gctccccgct cgaagttcac ctggggtttg 240 gctgcgcccg tctgcctcgc agcgcttttg ccctgcgacc tcagcgcgcg cgtcggccca 300 tcgatcttca ggacttggtt catgaagcaa attgtcaagt acttcaagta tgaggaatat 360 cttgagttca cggacaagga tattgcggat tcgcacaaag aggggaagcg cttcatcttc 420 gctagccacc ctcacggtgt cgtgagcttc tgcggcatgt gcgctgctat cagcagtcat 480 agtgctgttg atggcttctc aaccttcggc atcatggatc tgccgacggc agtggcctcg 540 gtgatcaaga tggttccatt cttgaaaaac gttctcggcg ttttcggcct catcgatgcc 600 agcaagcagg tgctcgtgaa gcgattgaag cgcgctggcg gatccgtggt gatctacatc 660 ggaggcatgg tggaactctt catgtccagc ccgaagcagg aggttgtctt cttgaagaag 720 aggaagggct tcatcaggct cgctctgagc acaggtgccg atgttgtgcc aatctacttg 780 ttcggcaaca ccaccgtgct ctcggttttg acttctg 817 <210> 115 <211> 850 <212> DNA <213> Crypthecodinium cohnii <400> 115 ctgccagcga gatagcagat atcgtcgtat tgtcgtgcaa tcgagtgatt gagtcaaatc 60 tagcgatatc tgccttgttt tttttggggg ggcgccttgc caatcacccg cagcaaccat 120 ggctacacct gctgcttctc catcggtgaa gaagtcggct ccgaccacat ttggcccaga 180 ttgttgcgag ggtccgacag tgctcatgca gattttggca gttctgctga tatccgcagt 240 ccccttgatc ttcactctgg cactcacaaa cgggtctctg tttgctggcc tccttgtggt 300 cggtgtggtg gcgctgccac ggatcctttg gcagcctgga gggaatgaag gtttcgcttt 360 tcagttcgct ttgggcctct actggaactt ggtcaatgct gcgtgctttg ggtcagtgtt 420 ccttctcgga gctgcttgct attttgctcc cagaacagtt ctgcctttga tggcagtcta 480 cgtgctgtgg atgcaggtca cacacttcga gttgaaggat gggcgagcgt gggcttcttt 540 tgccatgcga gagtggggtt tccaggcatt ccgtcatttc atccaccttc aagttgttct 600 accagaggcg attttgcaga aaccggcaga cgaacctctt tttttcgctg tccatcccca 660 tggtgtggcc agtgattttc gacttctgat ggatggcatg cttcacaagg caatgccctc 720 acgtgaaatt ctcgttctgg ccgcatcggt tctcttcaag ctccccttgg tgcgggagct 780 ctgcctgtgg tctcgatgca tcgatgctag caggccagtg gcagagcgtg ccttgcgccg 840 aggtcatagt 850 <210> 116 <211> 663 <212> DNA <213> Crypthecodinium cohnii <400> 116 caggtcagcg gcgtgcaggc gccgatccta ttcaggatac ccatcctaag acaagttttg 60 ctctctttcg gttgcacaat gccagccacc aaggacggaa tgttcaaact cttccgaaaa 120 aagatgccct tcggtataat tgtcgggggg agcgaggatg ttgccatcca aatcaccggt 180 cgcgagcgta tctacctcag acaccgcgct ggttttttga agtacgctct ccagttcggt 240 tacaaagtcg tggtagccta caacttcggt gagagcgatt tgtacaggtc cttcagcatc 300 ttagcgcctc tgaacttgtg gctcgtgaag cgatttggct tcgttttgcc gctgttctac 360 gggcagtggt ggtgtccact cctcccacgt agcgacgtta ccttgaacac cgtctatggg 420 gcggtcttgg agcttcccag aatagatttc cccagcgacg aagaggtcgc ccattggcac 480 ggcaagtaca tcgaggctgt gaccgacgtg ttcgaaacac acaaggagcg attcggcttc 540 gcttcgagaa cgctggagat tttgtaaggt ctcgaagaac aaaaaatcct cgaccgttga 600 agagacacta tcgtcgacga aaggttcgaa gatcaaatct cctcgattgt tgaagacact 660 atg 663 <210> 117 <211> 807 <212> DNA <213> Crypthecodinium cohnii <400> 117 tcacactgaa agtcctcact gtttttgctg ctcggtttcc tgaacttgcg aactcctcac 60 tagttcgact tttcctcggg gacaagtgta gcagcacgga tcacgcgcgc gaagctccgc 120 tgtgtgtttt tgcgtatata atcatcgatt caacagagtc tctcctccgc tccactcgac 180 tccactcaac ttcacctgtc tggtttggac tttttcgttc gccccacttg actgggaatg 240 actgtggaga agaacatgga cagcatcaaa ccagtcgatg atgccaagcc acttgacgcc 300 aagcttggcc acaacttgca tgcggcgagt cctgcagctg ctaccgaaag gcctggctcc 360 agagggctcg accgatgtgc cttgatgctt tacttgactt tcccgctggc gaacatcgcc 420 gcggctggct gcctcacctt ctgggctttg cttcgtggcg gactcaaagt gcggtcgggc 480 atgttggcct acctgtgctg gatctgtttc ttcgatcgaa ctccggagcg gggaggctac 540 aacttttgct ggcgaaccgg aatcacccag aaattgcgag catccttctt ctggaaatgg 600 gcagcaagat actttcctgt ccggctacat gcagtggctc ctcttccccc agatcaaggc 660 ccctacattt ttgtgtgcca cccacacggc atcttcggca tctcgccgat gactcacttt 720 gggaccgatg ccacagactt ctccaagata tttccgggaa tccaagtgca ccttctcggc 780 catagtgcga tcttcagaat ccgttct 807 <210> 118 <211> 765 <212> DNA <213> Crypthecodinium cohnii <400> 118 gtccttcttc tgtgctcgac tataaattac ttgtttggca gctttcaccc acccacccac 60 ccagccatct ataatagctt ttgatctttt ccttcccatc catacacttc tctacctgtg 120 cttgtactgt gtacgtaatc acgcacgcac gcagtgcgtg cgaccaatgg cttccaaatg 180 gatgctcttc agtggtggtg ctgcagctgc agcattggcg ctcttggagg ctgcccaaca 240 tcgtttgccg acatcggtgc gcgctcggat aatgctagct tcgttggccg catatctgcc 300 catgtatctc gatggaagcg agtaccgggc tgcaccccgg agaagtgagc gagcctcgag 360 ggttcttcgg cagctgttca agatgatggt ggaccgtctc ttcattgtca aaaagccgat 420 tatcgaggcg gccgaagagc taacatcctg cagccagtgc atcttgtcgg ttcatcctca 480 tggggttctg tccctggatc atctcctgac agtcatcgcc tatgaccccg agctggaaag 540 ggtgctgccc cagggccgac gaagtgccct gagtgcaggt gtcctcttca aaatccccat 600 cttgcgagag gtgctgttgt ggaccggttg cgttgatgcc ggggggcgga cagtggattc 660 gtgtctgaag gctggcttaa gcctctctgt ggtgcctggg ggtgagcgcg aacagctcct 720 agcccaacgt ggcaacacag aaacgcttgt gctcaaaaac aggaa 765 <210> 119 <211> 782 <212> DNA <213> Crypthecodinium cohnii <400> 119 ttcctgagct ttcatcctct gccggacctc tcggagaccc tctgcgagtc ctggttcacc 60 atcgccctct acaagtactt ctcctaccgc ttcatctgga gcgacgacga caacgagaag 120 gtgcgaacag ctccggcctg gttcggcgca tctcctcccc acggtgtcct gccgctggcc 180 aacttgctgt gtattcccgc gataaacaac tttgggttca gggagttcgt tggggctcct 240 gcctcggtcg tctttcgaac tccctttctc agatacatga cgatgctggg ctgcgtcgat 300 gtcagcggca agtcgatgac caaggcggtc aatgctggtc agtgtgttgg cctcgtgccc 360 gacggcatcg caggcatctt taagacgaag gaaaaggacg aagttgtctt cctcaagaac 420 agaaaaggcc tcgcaaagct ggctctgaag acaggcaccc cactgcttcc tgcctacagc 480 ctgggcaaca cagcagtttt cggcgcctgg ttcgacccct tcggaatcat ggaggctctg 540 tccagaaaag ctcagacatc cgtcttcgtg ttttggggtc gcttctacct cccgcttccc 600 aggcgcgtca acatcacgat ggtctatggc aagcccatca ttgttgagaa ggtggaggat 660 cccagcaccg agcaaatcga ccagctgcat gcggagtacc tccaagagct ggaggccttg 720 ttcaacaggc acaaggcaag tgtttgggtg gggtcacaag aacattcgct tcgtctgagc 780 at 782 <210> 120 <211> 793 <212> DNA <213> Crypthecodinium cohnii <400> 120 cgtgcttgaa gctcttgtct gtgtgtgtaa tcaatgtatc tttatcttcc cggtgcagct 60 ccagctagct gcactgcccc ctccaattga tctggcggtg gccctgagct gccgtcttgc 120 atgccgacga ctcgattttc ctctgccaaa gcctgggttt caaagcaagc gatggccgtc 180 acgtcagcgc tctgcagtgg cgtcggcgca gggctcttga tccacacagc tgtcgtggcc 240 tatctgtacc cactcttctt tgcgccagtg ctgctgttgg ttccctcccg cagaacgagg 300 gcgatgttca gatcgtattg tcagttctgg caggacatgt ggatggcttc ttcttgcgtg 360 gtgctggagt acgtgattgg tgtccgcttg ttcatacatt ccccaacagc cttgaagggg 420 ttgcgtggca tcaaaaccat gtgcaacggc cacgatgtga ttctcatcaa gaaccaccgc 480 actcgaattg attggatgtt cacctggggg ctctgtctag ctctcgaccg cctgggtagc 540 ctgaagatag taatgaaaga ctccttgaag aaagttccct ttttcggttg ggcgatgcag 600 cacttcggct ttaccttcct ttccaggaaa aaccgagatc atgacctggc caccctgaag 660 tggtcgagct cctaccagag tcacgagcct ggcagccgca tgacgatgct gatcttccca 720 gagggaacgg acctaagctc atcgaacctg gaaaaaagca aggctttcgc caccaaagca 780 ggactgccgg tct 793 <210> 121 <211> 744 <212> DNA <213> Crypthecodinium cohnii <400> 121 cgagccggtc gtagacagat agacagatag atagacacgt agataggttt tgtcgcatct 60 ttcgccaact ctgcccgggg ggccaaacct tcttgctggg gtttctgctc tcttctcttc 120 ttgctggggc ggcatgggga agcaccctcc tgccaattat ggcatcacgg ctgtgatcgc 180 cctcctcctc tccgtgggcc ttatattggc gggcgtcatt cagataatca ctgcgctgct 240 gacactcccc gtactcgcct gcaagggccg caacgccttc cacagcatcc agagcgcggt 300 gtggcgcagc atcgtcacct tcctctccgt ggggctcaac ccgttctggt gcgcacgaat 360 ggtgtgggtg ggtgacaacc ctggccctcc gaagggaaag atggggtcag tcttcttcat 420 caaccatcgc tcaaatgctg acgcctggtt cagcgcctgg ggaatcaccc gaatgtgtca 480 tgaagcgcgg tacgtctaca agagtagcct aaagaagatt cccttcttcg gctggaactt 540 gcagcttgct ggcgacctcg ctgtggagtt cggagacaag tccaagatcg tagcgatgat 600 ggagaacgcg aaagaggcat tgaggcaggg ctacaatgtg gcggtctttc cggaaggtac 660 gagaagtcct agtggtatgt tgcaggaatt caagcctgga ttcttcaaga tcttgtgcag 720 agcttggctg cccagcggtc ccca 744 <210> 122 <211> 2361 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic <400> 122 gccgggctct ttcacaaagg aataatgatc ccacaaaagc ttcacgtcct tgggatacca 60 atcgagatgg tttcgtgatg ggagagggag ctggagttct acttttggaa gaactcgagc 120 atgctaagaa aagaggtgca actatctacg cagagttcct cggtgggagt ttcacatgtg 180 atgcctatca catgaccgag cctcaccctg atggggctgg tgttattctc tgtattgaga 240 gagcgttagc tagtgctggg atttccaagg aacaaataaa ttacataaat gcacatgcaa 300 cctcaacgca tgctggagat attaaggaat accaagccct tgctcactgt tttggccaaa 360 atcctgagct taaggtaaat tccacaaaat ctatgattgg acacttgctg ggagctgctg 420 gggccgtgga ggctgttgca actgtgcagg cgatacggac cggatgggtt catccaaata 480 tcaacctcga gaatccagac atttaaatgt aagaatttct tatgttacat tattacattc 540 aacgttttat cttaattggc tcttcatttg attgaaattt gacaattatt tcttgttttt 600 tttttgtcac actctttttg ggtttggggt ggccgacgaa ttgtgggaag gtagaaagag 660 gggaggactt tgttatactc cattagattt tactgtttcc gtttcaattt atgtgacata 720 tttccttttt agtcggttcc aaaagaaaat gtcagcatta taaacaattt aattttgaaa 780 ttacaatttt gccattaata aaatgattta caaccacaaa agtatctatg agcctgtttg 840 ggtgggctta taagcagctt attttaagtg gcttataagt caaaaagtga caatttttga 900 gaagttagaa aatcctaact tctcaaaaag tagcttttaa gccacttatg acttataagt 960 ccaaaaattt ttaagttacc aaacatatat taatgggttt ataagcttat aagccacttt 1020 taagctcacc caaacgggtt ctatgtctca ctttagacta caaattttaa aagtcttcat 1080 ttatttctta atctccgtgg cgagtaaaac tataacacat aaagtgaaac gtagggagta 1140 agatggagtc ataaactaat ccaaatctat actctctccg ttaatttgtt ttttagtttg 1200 atttggtaca ttaataaaac agatttttcg aaggttataa acacagacag atgtttccca 1260 gcgagctagc aaaattccaa gatttctgtc gaaaattcgt gtgtttctag ctagtacttg 1320 atgttatctt taacctttta gtaatttttt gtccttttct ttctattttt catcttacaa 1380 tgaattatga gcaagttcct taagtagcat cacacgtgag atgtttttta tgatattgac 1440 taaatccaat ctttaccatt ccttaactag taaaatacaa cacatgttaa ttgatacatt 1500 gcttaacact gaggttagaa aattttagaa attagttgtc caaatgcttt gaaattagaa 1560 atctttaatc ccttattttt ttttaaaatg ttttttctcg ctccaaagaa agagaaactg 1620 acatgaaagc tcaaaagatc atgaatctta ctaactttgt ggaactaaat gtacatcaga 1680 atgtttctga catgtgaaaa tgaaagctct taattttctt cttttattta ttgagggttt 1740 ttgcatgcta tgcattcaat ttgagtactt taaagcacct ataaacactt acttacactt 1800 gccttggagt ttatgtttta gtgttttctt cacatctttt ttggtcaatt tgcagggatc 1860 cgtctggatt ctcgaggttg atatttggat gaacccatcc ggtccgtatc gcctgcacag 1920 ttgcaacagc ctccacggcc ccagcagctc ccagcaagtg tccaatcata gattttgtgg 1980 aatttacctt aagctcagga ttttggccaa aacagtgagc aagggcttgg tattccttaa 2040 tatctccagc atgcgttgag gttgcatgtg catttatgta atttatttgt tccttggaaa 2100 tcccagcact agctaacgct ctctcaatac agagaataac accagcccca tcagggtgag 2160 gctcggtcat gtgataggca tcacatgtga aactcccacc gaggaactct gcgtagatag 2220 ttgcacctct tttcttagca tgctcgagtt cttccaaaag tagaactcca gctccctctc 2280 ccatcacgaa accatctcga ttggtatccc aaggacgtga agcttttgtg ggatcattat 2340 tcctttgtga aagagcccgg c 2361 <210> 123 <211> 1380 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic <400> 123 cgatagaggc aaagagcaaa gatgcatttg ttcctccaaa gccaaacgaa ttcgacattg 60 ctgtcctaac taacatcttt ttcgaagtgg ttaaaggcat gaacctcttg tcgaagatgg 120 gatctggatt cttgacattc agcgtcatag gagcaacccc gtgatgtata gcaaggatac 180 tgaaaatagc ttccactgct ccagctgctc caagaagatg accagtagcc cccttggtgg 240 aggagaatgc caaggtgcct gaagtagcat gttcagagaa 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cgctgtgcac 540 atcaaaactg aacaaaccat catcttcaat atcacaagcc tgaacaacca cagcaccagc 600 agcatctcca aatagaatgc aagtccctct atccgtccaa tcaacaaacc gagacaaaga 660 atcagctccg atcactaaaa cgttcttaaa accgcctccc cttatatgac aagcagctga 720 aactagaccc aaaacaaatc cactacaagc agctgtgata tcataagcca atgggttctt 780 tgtgcaacca agtgcctttt gaatctgtgg agcagcacca aatagatcat caggagtgga 840 agtacacatc aagactaagt caatatcttc aggaacaacc tcagccattt caagagcttt 900 ggttgctgct tctactgcta agccaaccaa gctatctttg cctgagacaa ctcgacggtt 960 gcgaatacca gtacgagtag caatccattc atcattagta tcaactattt tagcgagatc 1020 atcattagaa atctctagag agttaattaa ga 1052 <210> 125 <211> 1208 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic <400> 125 cctccatcgc ataattgctg atccccacgt taaaccggct ccaaaaccgg atgtcgctat 60 ggtatgtcct ggtttaactt ttccgcttct cactgcctca tcaagagcca gcggaatcga 120 agcagcgctc gtgttaccat aattagccaa attcgatatg actctctctg gtgggaaatg 180 cagccttgta gccacagagt ctattattct ctggttcgcc tggtggagga ggagccagtc 240 gatggcagaa gcaggaagac 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ggaaacgcaa aacccagatc cagaaactct 1140 aaccggaaca tggattctgc ttcgcaagtt aggaattgaa ggatgagtga agaacccaga 1200 tgcattag 1208

Claims (96)

  1. 장쇄 PUFA 무함유 지방산 (FFA)의 아실-CoA로의 전환을 촉매하는 아실-CoA 신테타제(ACoAS)를 코딩하는 핵산 서열을 포함하며, 핵산 서열은 서열 83, 서열 85, 서열 87, 서열 89, 서열 91, 서열 93, 서열 95, 서열 97 및 서열 99로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 ACoAS와 동일성이 60％ 이상인 아실-CoA 신테타제(ACoAS)를 코딩하는 것인, 단리된 핵산 분자.
  2. 제1항에 있어서, 핵산 서열이 서열 83, 서열 85, 서열 87, 서열 89, 서열 91, 서열 93, 서열 95, 서열 97 및 서열 99로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 아실-CoA 신테타제(ACoAS)를 코딩하는 것인 단리된 핵산 분자.
  3. 제1항에 있어서, 핵산 서열이 서열 83, 서열 85 및 서열 97로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 코딩하는 것인 단리된 핵산 분자.
  4. 제1항에 있어서, 핵산 서열이 서열 82, 서열 84, 서열 86, 서열 88, 서열 90, 서열 92, 서열 94, 서열 96 및 서열 98로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 단리된 핵산 분자.
  5. 인지질 (PL) 또는 트리아실글리세롤 (TAG)을 형성하는데 있어서 기질로서 PUFA-CoA를 이용하는 단백질을 코딩하는 핵산 서열을 포함하며, 단백질은 서열 102, 서열 104, 서열 107, 서열 110 및 서열 113으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열과 동일성이 60％ 이상인 아미노산 서열을 포함하는 것인, 단리된 핵산 분자.
  6. 제5항에 있어서, 핵산 서열이 서열 102, 서열 104, 서열 107, 서열 110 및 서열 113으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 단백질을 코딩하는 것인 단리된 핵산 분자.
  7. 제5항에 있어서, 핵산 서열이 서열 102 및 서열 104로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 단백질을 코딩하는 것인 단리된 핵산 분자.
  8. 제5항에 있어서, 핵산 서열이 서열 100, 서열 102, 서열 103, 서열 105, 서열 106, 서열 108, 서열 109, 서열 111 및 서열 112로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 단리된 핵산 분자.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항의 핵산 분자에 의해 코딩된 단리된 단백질.
  10. 발현 조절 서열에 작동적으로 연결된 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따른 핵산 분자를 포함하는 재조합 핵산 분자.
  11. 제10항의 재조합 핵산 분자를 포함하는 재조합 숙주 세포.
  12. 제11항에 있어서, 미생물인 재조합 숙주 세포.
  13. 제11항에 있어서, 식물 세포인 재조합 숙주 세포.
  14. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항의 단리된 핵산 분자를 발현시키도록 유전적으로 개질된 것인 유전적으로 개질된 생물체.
  15. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 따른 하나 이상의 단리된 핵산 분자를 발현시키도록 유전적으로 개질된 것인 유전적으로 개질된 생물체.
  16. 제5항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따른 하나 이상의 단리된 핵산 분자를 발현시키도록 유전적으로 개질된 것인 유전적으로 개질된 생물체.
  17. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 따른 하나 이상의 단리된 핵산 분자 및 제5항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따른 하나 이상의 단리된 핵산 분자를 발현시키도록 유전적으로 개질된 것인 유전적으로 개질된 생물체.
  18. 제3항에 따른 하나 이상의 단리된 핵산 분자 및 제7항에 따른 하나 이상의 단리된 핵산 분자를 발현시키도록 유전적으로 개질된 것인 유전적으로 개질된 생물체.
  19. 제14항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, PUFA 신타제 및 포스포판테테이닐 트랜스퍼라제 (PPTase)를 발현시키는 것인 유전적으로 개질된 생물체.
  20. 제19항에 있어서, 신타제 및 PPTase를 발현시키도록 유전적으로 개질된 것인 유전적으로 개질된 생물체.
  21. 한가지 이상의 다불포화 지방산 (PUFA)을 제조하는 PUFA 신타제, 및 포스포판테테이닐 트랜스퍼라제 (PPTase)를 발현시키며, 장쇄 PUFA 무함유 지방산 (FFA)의 아실-CoA로의 전환을 촉매하는 하나 이상의 이종 아실-CoA 신테타제(ACoAS) 또는 그의 상동체를 발현시키는 유전적 개질을 함유하는, 유전적으로 개질된 생물체.
  22. 제21항에 있어서, PUFA 신타제를 내생적으로 발현시키는 생물체 유래의 아실-CoA 신테타제(ACoAS) 또는 그의 상동체를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 핵산 분자로 형질전환되는 것인 유전적으로 개질된 생물체.
  23. 제21항에 있어서, 크립테코디니움 코니(Crypthecodinium cohnii) 유래의 아 실-CoA 신테타제(ACoAS) 또는 그의 상동체를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 핵산 분자로 형질전환되며, ACoAS 또는 그의 상동체는 장쇄 PUFA 무함유 지방산 (FFA)의 아실-CoA로의 전환을 촉매하는 것인, 유전적으로 개질된 생물체.
  24. 제21항에 있어서, 트라우스토키트리알레스(Thraustochytriales) 미생물 유래의 아실-CoA 신테타제(ACoAS) 또는 그의 상동체를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 핵산 분자로 형질전환되며, ACoAS 또는 그의 상동체는 장쇄 PUFA 무함유 지방산 (FFA)의 아실-CoA로의 전환을 촉매하는 것인, 유전적으로 개질된 생물체.
  25. 제21항에 있어서, 쉬조키트리움(Schizochytrium) 유래의 아실-CoA 신테타제(ACoAS) 또는 그의 상동체를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 핵산 분자로 형질전환되며, ACoAS 또는 그의 상동체는 장쇄 PUFA 무함유 지방산 (FFA)의 아실-CoA로의 전환을 촉매하는 것인, 유전적으로 개질된 생물체.
  26. 제21항에 있어서, 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 핵산 분자로 형질전환되는 것인 유전적으로 개질된 생물체.
  27. 제21항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 생물체에 의해 발현된 지방산 신타제 (FAS)를 결실시키거나 또는 불활성화하는 추가의 유전적 개질을 함유하는 것인 유전적으로 개질된 생물체.
  28. 제21항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 말로닐 CoA에 대해 PUFA 신타제와 경쟁하는 것을 감소시키거나 또는 생물체에서의 말로닐 CoA의 수준을 증가시키는 추가의 유전적 개질을 함유하는 것인 유전적으로 개질된 생물체.
  29. 제21항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, PUFA를 내생적으로 제조하는 생물체 유래의 한가지 이상의 이종 단백질을 발현시키는 추가의 유전적 개질을 함유하며, 단백질은 인지질 (PL) 또는 트리아실글리세롤 (TAG)을 형성하는데 있어서 기질로서 PUFA-CoA를 이용하는 것인, 유전적으로 개질된 생물체.
  30. 한가지 이상의 다불포화 지방산 (PUFA)을 제조하는 PUFA 신타제, 및 포스포판테테이닐 트랜스퍼라제 (PPTase)를 발현시키는 생물체이며, 생물체는 그에 의해 발현된 지방산 신타제 (FAS)를 결실시키거나 또는 불활성화하는 유전적 개질을 함유하는 것인, 유전적으로 개질된 생물체.
  31. 제30항에 있어서, 말로닐 CoA에 대해 PUFA 신타제와 경쟁하는 것을 감소시키거나 또는 생물체에서의 말로닐 CoA의 수준을 증가시키는 추가의 유전적 개질을 함유하는 것인 유전적으로 개질된 생물체.
  32. 한가지 이상의 다불포화 지방산 (PUFA)을 제조하는 PUFA 신타제, 및 포스포 판테테이닐 트랜스퍼라제 (PPTase)를 발현시키는 생물체이며, 말로닐 CoA에 대해 PUFA 신타제와 경쟁하는 것을 감소시키거나 또는 생물체에서의 말로닐 CoA의 수준을 증가시키는 유전적 개질을 함유하는 것인, 유전적으로 개질된 생물체.
  33. 제32항에 있어서, 생물체에 의해 발현된 지방산 신타제 (FAS)를 결실시키거나 또는 불활성화하는 추가의 유전적 개질을 함유하는 것인 유전적으로 개질된 생물체.
  34. 한가지 이상의 다불포화 지방산 (PUFA)을 제조하는 PUFA 신타제, 및 포스포판테테이닐 트랜스퍼라제 (PPTase)를 발현시키는 생물체이며, 이 생물체는 PUFA를 내생적으로 제조하는 생물체 유래의 한가지 이상의 이종 단백질을 발현시키는 유전적 개질을 함유하고, 단백질은 인지질 (PL) 또는 트리아실글리세롤 (TAG)을 형성하는데 있어서 기질로서 PUFA-CoA를 이용하는 것인, 유전적으로 개질된 생물체.
  35. 제34항에 있어서, 단백질이 DAGAT 또는 LPAAT인 유전적으로 개질된 생물체.
  36. 제34항에 있어서, 인지질 (PL) 또는 트리아실글리세롤 (TAG)을 형성하는데 있어서 기질로서 PUFA-CoA를 이용하는 트라우스토키트리드(Thraustochytrid) 또는 라비린툴리드(Labyrinthulid) 유래의 단백질을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 핵산 분자로 형질전환되는 것인 유전적으로 개질된 생물체.
  37. 제34항에 있어서, 인지질 (PL) 또는 트리아실글리세롤 (TAG)을 형성하는데 있어서 기질로서 PUFA-CoA를 이용하는 쉬조키트리움 유래의 단백질을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 핵산 분자로 형질전환되는 것인 유전적으로 개질된 생물체.
  38. 제34항에 있어서, 제5항 내지 제8항 중 어느 한 항의 핵산 분자로 형질전환되는 것인 유전적으로 개질된 생물체.
  39. 제34항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 장쇄 PUFA 무함유 지방산 (FFA)의 아실-CoA로의 전환을 촉매하는 하나 이상의 이종 아실-CoA 신테타제(ACoAS) 또는 그의 상동체를 발현시키는 추가의 개질을 포함하는 것인 유전적으로 개질된 생물체.
  40. 제34항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 생물체에 의해 발현된 지방산 신타제 (FAS)를 결실시키거나 또는 불활성화하는 추가의 유전적 개질을 함유하는 것인 유전적으로 개질된 생물체.
  41. 제34항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 말로닐 CoA에 대해 PUFA 신타제와 경쟁하는 것을 감소시키거나 또는 생물체에서의 말로닐 CoA의 수준을 증가시키는 추가의 유전적 개질을 함유하는 것인 유전적으로 개질된 생물체.
  42. 제21항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, PUFA 신타제가 트라우스토키트리드 또는 라비린툴리드 유래의 PUFA 신타제로부터의 하나 이상의 기능성 도메인을 포함하는 것인 유전적으로 개질된 생물체.
  43. 제21항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, PUFA 신타제가 트라우스토키트리알레스 미생물 유래의 PUFA 신타제로부터의 하나 이상의 기능성 도메인을 포함하는 것인 유전적으로 개질된 생물체.
  44. 제21항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, PUFA 신타제가 쉬조키트리움, 트라우스토키트리움(Thraustochytrium), 울케니아(Ulkenia) 및 라비린툴라(Labyrinthula)로 이루어진 군으로부터 선택된 생물체 유래의 PUFA 신타제로부터의 하나 이상의 기능성 도메인을 포함하는 것인 유전적으로 개질된 생물체.
  45. 제21항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, PUFA 신타제가 쉬조키트리움 유래의 PUFA 신타제로부터의 하나 이상의 기능성 도메인을 포함하는 것인 유전적으로 개질된 생물체.
  46. 제21항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, PUFA 신타제가 쉬조키트리움 종(Schizochytrium sp.) 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 (ATCC) 번호 20888, 트라우스 토키트리움 23B ATCC 번호 20892, 및 상기 미생물들의 돌연변이체로 이루어진 군으로부터 선택된 생물체 유래의 PUFA 신타제로부터의 하나 이상의 기능성 도메인을 포함하는 것인 유전적으로 개질된 생물체.
  47. 제21항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, PUFA 신타제가 해양(marine) 세균 유래의 PUFA 신타제로부터의 하나 이상의 기능성 도메인을 포함하는 것인 유전적으로 개질된 생물체.
  48. 제21항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, PUFA 신타제가 쉬바넬라(Shewanella), 모리텔라(Moritella) 및 포토박테리움(Photobacterium)으로 이루어진 군으로부터 선택된 생물체 유래의 PUFA 신타제로부터의 하나 이상의 기능성 도메인을 포함하는 것인 유전적으로 개질된 생물체.
  49. 제21항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, PUFA 신타제가
    a) 1개 이상의 에노일-ACP 리덕타제 (ER) 도메인;
    b) 4개 이상의 아실 운반 단백질 (ACP) 도메인;
    c) 2개 이상의 β-케토아실-ACP 신타제 (KS) 도메인;
    d) 1개 이상의 아실트랜스퍼라제 (AT) 도메인;
    e) 1개 이상의 β-케토아실-ACP 리덕타제 (KR) 도메인;
    f) 2개 이상의 FabA-유사 β-히드록시아실-ACP 데히드라제 (DH) 도메인;
    g) 1개 이상의 쇄 길이 인자 (CLF) 도메인; 및
    h) 1개 이상의 말로닐-CoA:ACP 아실트랜스퍼라제 (MAT) 도메인
    을 포함하는 하나 이상의 단백질로 이루어지는 것인 유전적으로 개질된 생물체.
  50. 제21항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, PUFA 신타제가
    a) 2개의 에노일 ACP-리덕타제 (ER) 도메인;
    b) 8개 또는 9개의 아실 운반 단백질 (ACP) 도메인;
    c) 2개의 β-케토 아실-ACP 신타제 (KS) 도메인;
    d) 1개의 아실트랜스퍼라제 (AT) 도메인;
    e) 1개의 케토리덕타제 (KR) 도메인;
    f) 2개의 FabA-유사 β-히드록시 아실-ACP 데히드라제 (DH) 도메인;
    g) 1개의 쇄 길이 인자 (CLF) 도메인; 및
    h) 1개의 말로닐-CoA:ACP 아실트랜스퍼라제 (MAT) 도메인
    을 포함하는 하나 이상의 단백질로 이루어지는 것인 유전적으로 개질된 생물체.
  51. 제21항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, PUFA 신타제가 약 25℃ 이상의 온도에서 PUFA를 제조하는 세균성 PUFA 신타제이며, PUFA 신타제가
    a) 1개 이상의 에노일 ACP-리덕타제 (ER) 도메인;
    b) 6개 이상의 아실 운반 단백질 (ACP) 도메인;
    c) 2개 이상의 β-케토 아실-ACP 신타제 (KS) 도메인;
    d) 1개 이상의 아실트랜스퍼라제 (AT) 도메인;
    e) 1개 이상의 케토리덕타제 (KR) 도메인;
    f) 2개 이상의 FabA-유사 β-히드록시 아실-ACP 데히드라제 (DH) 도메인;
    g) 1개 이상의 쇄 길이 인자 (CLF) 도메인;
    h) 1개 이상의 말로닐-CoA:ACP 아실트랜스퍼라제 (MAT) 도메인; 및
    i) 1개 이상의 4'-포스포판테테이닐 트랜스퍼라제 (PPTase) 도메인
    을 포함하는 하나 이상의 단백질로 이루어지는 것인, 유전적으로 개질된 생물체.
  52. 제21항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, PUFA 신타제가 서열 1 내지 32 중 어느 한 서열 및 서열 35 내지 80 중 어느 한 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 서열을 포함하거나 이 서열에 의해 코딩되는 것인 유전적으로 개질된 생물체.
  53. 제21항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서, PUFA 신타제를 코딩하는 하나 이상의 핵산 서열이 생물체에서의 PUFA 신타제의 발현을 향상시키도록 최적화된 것인 유전적으로 개질된 생물체.
  54. 제21항 내지 제53항 중 어느 한 항에 있어서, EPA (C20:5, n-3), DHA (C22:6, n-3), DPA (C22:5, n-6 또는 n-3), ARA (C20:4, n-6), GLA (C18:3, n-6), 및/또는 SDA (C18:4, n-3)로 이루어진 군으로부터 선택된 한가지 이상의 다불포화 지방산 (PUFA)을 제조하는 것인 유전적으로 개질된 생물체.
  55. 제21항 내지 제53항 중 어느 한 항에 있어서, DHA, EPA 및 DPAn-6으로 이루어진 군으로부터 선택된 한가지 이상의 다불포화 지방산 (PUFA)을 제조하는 것인 유전적으로 개질된 생물체.
  56. 제21항 내지 제53항 중 어느 한 항에 있어서, DHA 및 DPAn-6을 제조하는 것인 유전적으로 개질된 생물체.
  57. 제21항 내지 제53항 중 어느 한 항에 있어서, ARA를 제조하는 것인 유전적으로 개질된 생물체.
  58. 제21항 내지 제53항 중 어느 한 항에 있어서, 생물체내의 총 지방산 프로필이 PUFA 신타제에 의해 제조된 상기 한가지 이상의 PUFA를 0.5 중량％ 이상 포함하는 것인 유전적으로 개질된 생물체.
  59. 제21항 내지 제58항 중 어느 한 항에 있어서, 미생물인 유전적으로 개질된 생물체.
  60. 제59항에 있어서, 미생물이 PUFA PKS 시스템을 내생적으로 발현시키는 것인 유전적으로 개질된 생물체.
  61. 제59항에 있어서, 미생물이 트라우스토키트리알레스 미생물 및 해양 세균으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 유전적으로 개질된 생물체.
  62. 제59항에 있어서, 미생물이 PUFA PKS 시스템을 발현시키도록 유전적으로 개질된 것인 유전적으로 개질된 생물체.
  63. 제59항에 있어서, 미생물이 효모 또는 세균인 유전적으로 개질된 생물체.
  64. 제21항 내지 제53항 중 어느 한 항에 있어서, 식물 또는 식물 세포인 유전적으로 개질된 생물체.
  65. 제64항에 있어서, PUFA 신타제 및 PPTase의 발현이 식물 또는 식물 세포의 색소체로 표적화되는 것인 유전적으로 개질된 생물체.
  66. 제64항에 있어서, 식물이 오일 종자 식물인 유전적으로 개질된 생물체.
  67. 제64항에 있어서, 식물이 쌍자엽 식물인 유전적으로 개질된 생물체.
  68. 제64항에 있어서, 식물이 카놀라, 대두, 평지씨, 아마인, 옥수수, 잇꽃, 해바라기 및 담배로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 유전적으로 개질된 생물체.
  69. 제64항에 있어서, 상기 한가지 이상의 PUFA 이외에 상기 PUFA 신타제에 의해 제조된 총 지방산이 상기 식물 또는 식물 세포에 의해 제조된 총 지방산의 약 10 중량％ 미만을 차지하는 것인 유전적으로 개질된 생물체.
  70. 제64항에 있어서, 상기 한가지 이상의 PUFA 이외에 상기 PUFA 신타제에 의해 제조된 총 지방산이 상기 식물 또는 식물 세포에 의해 제조된 총 지방산의 약 5 중량％ 미만을 차지하는 것인 유전적으로 개질된 생물체.
  71. 제64항에 있어서, 식물, 식물의 부분 또는 식물 세포 중의 총 지방산 프로필이 20개 이상의 탄소 및 4개 이상의 탄소-탄소 이중 결합을 갖는 한가지 이상의 다불포화 지방산 (PUFA)을 약 0.5 중량％ 이상 포함하며, 식물 또는 식물의 일부 중의 총 지방산 프로필이 PUFA로서 감마-리놀렌산 (GLA; 18:3, n-6), 18개의 탄소 및 4개의 탄소-탄소 이중 결합을 갖는 PUFA, 20개의 탄소 및 3개의 탄소-탄소 이중 결합을 갖는 PUFA, 및 22개의 탄소 및 2개 또는 3개의 탄소-탄소 이중 결합을 갖는 PUFA의 모두를 총 5％ 미만 함유하는 것인 유전적으로 개질된 생물체.
  72. 제64항에 있어서, 식물, 식물의 부분 또는 식물 세포 중의 총 지방산 프로필 이 20개 이상의 탄소 및 4개 이상의 탄소-탄소 이중 결합을 갖는 한가지 이상의 다불포화 지방산 (PUFA)을 약 0.5 중량％ 이상 포함하며, 식물 또는 식물의 일부 중의 총 지방산 프로필이 PUFA로서 감마-리놀렌산 (GLA; 18:3, n-6), 18개의 탄소 및 4개의 탄소-탄소 이중 결합을 갖는 PUFA, 20개의 탄소 및 3개의 탄소-탄소 이중 결합을 갖는 PUFA, 및 22개의 탄소 및 2개 또는 3개의 탄소-탄소 이중 결합을 갖는 PUFA의 각각을 1％ 미만 함유하는 것인 유전적으로 개질된 생물체.
  73. 제64항에 있어서, 식물, 식물의 부분 또는 식물 세포 중의 총 지방산 프로필이 20개 이상의 탄소 및 4개 이상의 탄소-탄소 이중 결합을 갖는 한가지 이상의 다불포화 지방산 (PUFA)을 약 0.5 중량％ 이상 포함하며, 식물 또는 식물의 일부 중의 총 지방산 프로필이 감마-리놀렌산 (GLA; 18:3, n-6) 및 디호모-감마-리놀렌산 (DGLA 또는 HGLA; 20:3, n-6)을 2％ 미만 함유하는 것인 유전적으로 개질된 생물체.
  74. 제73항에 있어서, 식물, 식물의 부분 또는 식물 세포 중의 총 지방산 프로필이 감마-리놀렌산 (GLA; 18:3, n-6) 및 디호모-감마-리놀렌산 (DGLA 또는 HGLA; 20:3, n-6)을 1 중량％ 미만 함유하는 것인 유전적으로 개질된 생물체.
  75. 제64항에 있어서, 식물, 식물의 부분 또는 식물 세포 중의 총 지방산 프로필이 20개 이상의 탄소 및 4개 이상의 탄소-탄소 이중 결합을 갖는 한가지 이상의 다 불포화 지방산 (PUFA)을 약 0.5 중량％ 이상 포함하며, 식물 또는 식물의 일부 중의 총 지방산 프로필이 감마-리놀렌산 (GLA; 18:3, n-6)을 1％ 미만 함유하는 것인 유전적으로 개질된 생물체.
  76. 제64항에 있어서, 식물, 식물의 부분 또는 식물 세포 중의 총 지방산 프로필이 감마-리놀렌산 (GLA; 18:3, n-6)을 0.5 중량％ 미만 함유하는 것인 유전적으로 개질된 생물체.
  77. 제21항 내지 제76항 중 어느 한 항의 유전적으로 개질된 생물체로부터 얻어진 오일.
  78. 제21항 내지 제76항 중 어느 한 항의 생물체를 성장시키는 것을 포함하는, 한가지 이상의 다불포화 지방산 (PUFA)을 포함하는 오일의 제조 방법.
  79. 제78항의 방법에 의해 제조된 오일.
  80. 검출가능한 양의 DHA (도코사헥사엔산 (C22:6, n-3)) 및 DPA (도코사펜타엔산 (C22:5, n-6)을 포함하는 식물 오일이며, DPAn-6 대 DHA의 비율이 1:1이거나 또는 1:1을 초과하고, 제64항 내지 제76항 중 어느 한 항의 식물 또는 식물 세포로부터 얻어지는 것인 식물 오일.
  81. 제64항 내지 제76항 중 어느 한 항의 식물로부터 얻어진 종자.
  82. 제77항, 제79항 또는 제80항 중 어느 한 항에 있어서, EPA (C20:5, n-3), DHA (C22:6, n-3), DPA (C22:5, n-6 또는 n-3), ARA (C20:4, n-6), GLA (C18:3, n-6), 및/또는 SDA (C18:4, n-3)로 이루어진 군으로부터 선택된 한가지 이상의 다불포화 지방산 (PUFA)을 함유하는 오일.
  83. 제77항, 제79항 또는 제80항 중 어느 한 항에 있어서, EPA (C20:5, n-3), DHA (C22:6, n-3), DPA (C22:5, n-6 또는 n-3), 또는 DTA (C22:4, n-6)로 이루어진 군으로부터 선택된 한가지 이상의 다불포화 지방산 (PUFA)을 함유하는 오일.
  84. 제77항, 제79항 또는 제80항 중 어느 한 항에 있어서, EPA (C20:5, n-3), DHA (C22:6, n-3), 및/또는 DPA (C22:5, n-6 또는 n-3)로 이루어진 군으로부터 선택된 한가지 이상의 다불포화 지방산 (PUFA)을 함유하는 오일.
  85. 제77항, 제79항 또는 제80항 중 어느 한 항의 오일 또는 제81항으로부터의 종자를 함유하는 식품 생성물.
  86. 제77항, 제79항 또는 제80항 중 어느 한 항의 오일을 함유하는 제약 생성물.
  87. 제81항의 종자로부터 오일을 회수하는 것을 포함하는, 한가지 이상의 PUFA를 포함하는 오일의 제조 방법.
  88. 제21항 내지 제76항 중 어느 한 항의 유전적으로 개질된 생물체로부터 오일을 회수하는 것을 포함하는, 한가지 이상의 PUFA를 포함하는 오일의 제조 방법.
  89. 제21항 내지 제76항 중 어느 한 항의 유전적으로 개질된 생물체를 성장시키는 것을 포함하는, 한가지 이상의 다불포화 지방산 (PUFA)의 제조 방법.
  90. 제21항 내지 제76항 중 어느 한 항의 유전적으로 개질된 생물체로부터 PUFA를 얻거나 또는 회수하는 것을 포함하는, 한가지 이상의 다불포화 지방산 (PUFA)의 제조 방법.
  91. 제21항 내지 제76항 중 어느 한 항의 유전적으로 개질된 개별 생물체 또는 그의 부분, 제81항의 종자, 제77항, 제79항 또는 제80항의 오일, 제85항의 식품 생성물 또는 제86항의 제약 생성물을 제공하는 것을 포함하는, 한가지 이상의 PUFA를 함유하는 보충 또는 치료 생성물을 개체에게 제공하는 방법.
  92. PUFA 신타제를 코딩하는 핵산 분자, 포스포판테테이닐 트랜스퍼라제 (PPTase)를 코딩하는 핵산 분자 및 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따른 하나 이상의 핵산 분자로 생물체를 형질전환시키는 것을 포함하는, PUFA를 발현시키도록 생물체를 형질전환시키는 방법.
  93. 제92항에 있어서, 생물체가 그에 의해 발현된 지방산 신타제 (FAS)를 결실시키거나 또는 불활성화하는 유전적 개질을 함유하는 것인 방법.
  94. 제92항에 있어서, 생물체가 말로닐 CoA에 대해 PUFA 신타제와 경쟁하는 것을 감소시키거나 또는 생물체에서의 말로닐 CoA의 수준을 증가시키는 유전적 개질을 함유하는 것인 방법.
  95. 제92항에 있어서, 생물체가 식물인 방법.
  96. 제92항에 있어서, 생물체가 미생물인 방법.
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