KR20160126969A

KR20160126969A - 아실-CoA의 생합성 제조를 위한 아실-CoA 신테타제의 사용 방법

Info

Publication number: KR20160126969A
Application number: KR1020167014616A
Authority: KR
Inventors: 첸 후이; 왕 홍수에; 유 샤오단
Original assignee: 코나겐 인크.
Priority date: 2013-11-01
Filing date: 2014-11-03
Publication date: 2016-11-02
Also published as: US20170247733A2; JP2016534758A; EP3063283A2; WO2015066615A2; CN105916991A; US20160273014A1; JP6587358B2; CA2962266A1; WO2015066615A3; BR112016009764A2; EP3063283A4; US10392643B2; MX2016005718A

Abstract

본 발명은 세포 시스템에서 ACS를 발현시키는 것, 장쇄 카르복실산을 세포 시스템에 공급하는 것, 배지 중에서 세포 시스템을 성장시키는 것, 및 카르복실 CoA를 생성시키는 것을 포함하는 것인 장쇄 카르복실산으로부터의 카르복실 CoA의 생합성 제조 방법에 관한 것이다.

Description

아실-CoA의 생합성 제조를 위한 아실-CoA 신테타제의 사용 방법{METHODS OF USING ACYL-COA SYNTHETASE FOR BIOSYNTHETIC PRODUCTION OF ACYL-COAS}

[관련 출원의 상호-참조]

본 개시내용은 발명의 명칭 [Methods of Using Acyl - CoA Synthetase for Biosynthetic Production of Acyl - CoAs]의 PCT 특허 출원이다. 본 출원은 2013년 11월 1일자 US 특허 가출원 제61/898,944호의 우선권을 주장하며, 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.

[기술 분야]

본 개시내용은 식품, 의약 및 약물학 산업에 이용가능성을 가진다. 본 개시내용은 일반적으로 아실-CoA 신테타제 (ACS)를 이용한 아실-CoA의 생합성 제조 방법에 관한 것이다.

배경 기술: 8-메틸-N-바닐릴-트랜스-6-노넨아미드인 캡사이신은 고추 (캅시 쿰(Capsicum) 종)에서 생성되는 이차 대사물로써, 그의 자극적인 풍미를 담당한다. 도 1에 나타낸 바와 같이, 캡사이신은 8-메틸노네노일-CoA로부터 바닐릴아민으로 8-메틸노네노일 잔기를 전달하여 아미드 접합체를 형성시키는 아실트랜스퍼라제인 캡사이신 신타제 (CS)에 의해 합성되는 것으로 여겨지지만, 관련 가출원 출원 시점까지 CS를 코딩하는 유전자는 명확하게 확인되지 않고 있다. 또한 도 1에 상술되어 있는 바와 같이, CS의 기질인 8-메틸노네노일-CoA는 아실-CoA 신테타제 (ACS)의 활성을 통하여 8-메틸-트랜스-6-노넨산으로부터 유도된다.

ACS는 ATP-의존성 2-단계 반응을 통하여 카르복실산의 그의 아실-CoA 티오에스테르로의 전환을 촉매촉진한다. 첫 번째 단계에서는, 유리 지방산이 피로포스페이트의 방출을 동반하여 아실-AMP 중간체로 전환된다. 두 번째 단계에서는, 활성화된 아실 기가 CoA의 티올 기에 결합됨으로써, AMP 및 아실-CoA 생성물을 방출한다 (문헌 [Groot et al., 1976]). ACS 및 다른 관련 단백질들은 AMP 결합 모티프의 코어를 형성하는 고도로 보존된 12-아미노산 서열 (프로사이트(PROSITE) PS00455)을 특징으로 한다. 약 44종의 추정상 ACS 유전자가 모델 식물인 아라비돕시스 탈리아나(Arabidopsis thaliana)에서 확인되어 있다 (문헌 [Shockey et al., 2003]). 현재, 장쇄 아실-CoA 신테타제, 아실-ACP 신테타제, 4-쿠마로일-CoA 리가제, 아세틸-CoA 신테타제, OPC-8:0 CoA 리가제, 숙시닐벤조일-CoA 리가제, 말로닐-CoA 신테타제 및 옥살릴-CoA 신테타제를 포함하여, 그들 중 약 절반이 알려져 있는 생화학적 기능을 가지고 있다 (문헌 [Shockey et al., 2003]; [Koo et al., 2005]; [Koo et al., 2006]; [Kim et al., 2008]; [Lin and Oliver, 2008]; [Chen et al., 2011]; [Foster et al., 2012]). 캅시쿰 안눔(Capsicum annuum)에서는, 3종의 전체-길이 추정상 ACS 유전자가 클로닝되어 있다 (문헌 [Lee et al., 2001]; [Mazourek et al., 2009]). 그러나, 이들 단백질 중 어느 것의 결과라고 간주되는 생화학적 활성은 없다.

본 출원인은 캡사이신 생합성에 연관되어 있는 유전자, 특히 ACS의 확인에 착수하였다. 연구가 개시되었던 시점에는 고추 게놈 서열이 가용하지 않았었기 때문에, 출원인은 RNA 서열분석 (RNA-Seq) 기술을 씨. 키넨세(C. chinense)와 씨. 프루테센스(C. frutescens)의 종간 혼성체인 고스트 칠리 페퍼(ghost chili pepper) 녹색 과실의 전사체 분석에 사용하였다. RNAseq 실험은 MO진(MOgene), LC 사 (미주리 세인트루이스 소재)에 의해 수행되었다. 출원인은 새로운 미가공 RNAseq 데이터 모음을 통하여 약 18,987종의 콘티그(contig)를 입수하였는데, 그 중 33종이 아실-CoA 신테타제-유사 단백질로 해석되었다. 이들 콘티그 중 Comp2147-1은 캅시 쿰 안눔의 추정상 아실-CoA 신테타제를 코딩하는 병원체-유도성 cDNA인 CaSIG4 (문헌 [Lee et al., 2001])에 대하여 우수한 일치성을 나타내었다 (도 2). 또한, Comp66462 및 Comp79520은 고추 ACS1 (진뱅크(GenBank): EU616571)로 매핑되었으며 (도 3), Comp167_c0, Comp167_c1 및 Comp 46218은 고추 ACS2 (진뱅크: EU616572)로 매핑되었다 (도 4). 이에 따라, ACS1 및 ACS2가 색소체로부터 지방산을 유출하는 아실-CoA 신테타제의 두 후보이다 (문헌 [Mazourek et al., 2009]).

출원인은 ACS1이 8-메틸-트랜스-6-노넨산을 캡사이신 생합성 경로의 핵심 중간체인 상응하는 8-메틸-6-노네노일-CoA로 전환시키는 중간쇄/장쇄 아실-CoA 신테타제임을 입증한다. 본 출원에서, 출원인은 아실-CoA의 생합성 제조를 위한 ACS, 특히 ACS1의 사용 방법을 개시한다.

[발명의 개요]

본 개시내용은 효모 또는 박테리아와 같은 세포 시스템에서 아실-CoA를 제조하는 것에 관한 기술적 문제를 다룬다. 본 출원인은 ACS의 유전자를 단리하고, 아실-CoA의 제조를 촉진하는 세포 시스템에서 독자적으로 이를 발현시켰다. 이후 캡사이신이 생성되는 캡사이신 신타제 (CS)에 필요한 기질은 특정 아실 CoA인 8-메틸-6-노네노일-CoA이다. 따라서, 본 개시내용은 8-메틸-6-노네노일-CoA의 산업적 제조를 제공하여, 이후의 캡사이신 제조를 촉진하는 것을 돕는다.

본 개시내용은 세포 시스템에서 ACS를 발현시키는 것, 장쇄 카르복실산을 세포 시스템에 공급하는 것, 배지 중에서 세포 시스템을 성장시키는 것, 및 카르복실 CoA를 생성시키는 것을 포함하는, 중간쇄/장쇄 카르복실산으로부터의 카르복실 CoA의 생합성 제조 방법이다.

또 다른 실시양태는 세포 시스템에서 ACS를 발현시키는 것, 8-메틸-트랜스-6-노넨산을 세포 시스템에 공급하는 것, 배지 중에서 세포 시스템을 성장시키는 것, 및 8-메틸노네노일-CoA를 생성시키는 것을 포함하는, 8-메틸노네노일-CoA의 생합성 제조 방법이다.

본 개시내용의 더 우수한 이해를 위하여, 첨부 도면을 참조할 수 있는 바, 하기와 같다:
도 1은 8-메틸-6-노넨산으로부터 8-메틸-6-노네노일-CoA를 생성시키는 ACS에 의한 반응을 포함하는 캡사이신 생합성 경로를 나타낸다. 문헌 [Stewart et al. (2007)]로부터 준용하였음.
도 2는 Comp2147-1과 CaSIG4 (진뱅크: AF354454) 사이의 서열 비교를 나타낸다.
도 3은 Comp66462, Comp79520 및 ACS1 (진뱅크: EU616571) 사이의 서열 비교를 나타낸다.
도 4는 Comp167_c0, Comp167_c1, Comp46218 및 ACS2 (진뱅크: EU616572) 사이의 서열 비교를 나타낸다.
도 5는 고스트 페퍼 ACS1과 ACS1 (진뱅크: ACF17663) 사이의 서열 비교를 나타낸다.
도 6은 고스트 페퍼 ACS1, 아라비돕시스 LACS4 (진뱅크: AEE84812) 및 LACS5 (진뱅크: AAM28872)의 서열 정렬을 나타낸다.
도 7은 BL21(DE3) 세포에서의 His-SUMO-ACS1 발현의 SDS-PAGE 분석을 나타낸다. 0, 20: IPTG 유도 후 시간에서의 총 단백질; C, 가용성 조질 단백질 추출물; E1 내지 E4, Ni-NTA 컬럼으로부터의 분획. ACS1의 분자량은 약 73.5 Kd이며, His-SUMO 태그의 분자량은 약 12 Kd이다.
도 8은 다양한 카르복실산에 대한 ACS1의 활성을 나타낸다. C2, 아세트산; C4, 부티르산; C6, 헥산산; C8, 카프릴산; C10, 카프르산; C12, 라우르산; C14, 미리스트산; C16, 팔미트산; C18, 스테아르산. 검정은 100 mM 트리 완충제, pH 8.0 중에서 수행하였다.
도 9는 각각 기질로서 8-메틸-트랜스-6-노넨산 또는 8-메틸 노난산을 사용한 ACS1 효소 생성물의 HPLC 프로파일을 나타낸다.
도 10은 음성 모드에서의 정제된 8-메틸-트랜스-6-노네노일-CoA의 MS/MS 분석을 나타낸다.
도 11은 음성 모드에서의 정제된 8-메틸노나노일-CoA의 MS/MS 분석을 나타낸다.
도 12는 8-메틸노난산에 대한 ACS1의 활성에 효과적인 pH를 나타낸다. 상이한 pH 범위에 대하여 4종의 상이한 완충제 시스템이 사용되었다.
본 개시내용이 다양한 변형 및 대안적인 형태의 여지가 있는 한편, 그의 구체적인 실시양태들을 도면에 예로써 나타내며, 이는 본원에서 상세하게 기술될 것이다. 그러나, 본원에서 제시되는 도면 및 상세한 설명이 본 개시내용을 개시된 특정 실시양태로 제한하고자 하는 것은 아니며, 오히려 반대로, 첨부된 청구범위에 의해 한정되는 바와 같은 본 개시내용의 기술사상 및 영역 내에 속하는 모든 변형, 등가물 및 대안들을 포괄하고자 하는 것임이 이해되어야 한다.

[정의]

세포 시스템

세포 시스템은 전위 단백질의 발현을 제공하는 임의의 세포이다. 여기에는 박테리아, 효모, 식물 세포 및 동물 세포가 포함된다. 여기에는 원핵 및 진핵 세포 모두가 포함된다. 여기에는 또한 리보솜과 같은 세포 구성요소들을 기초로 하는 시험관 내 단백질 발현이 포함된다.

세포 시스템의 성장

성장시키는 것에는 세포가 증식 및 분할하는 것을 가능케 하게 되는 배지를 제공하는 것이 포함된다. 여기에는 또한 자원을 제공함으로써 세포 또는 세포 구성요소가 재조합 단백질을 번역하여 생성시킬 수 있도록 하는 것이 포함된다.

단백질 발현

단백질 생성은 유전자 발현 후에 이루어질 수 있다. 그것은 DNA가 전령 RNA (mRNA)로 전사된 후의 단계들로 이루어진다. mRNA는 이후 폴리펩티드 사슬로 번역되며, 그것은 궁극적으로 단백질로 접힌다. DNA는 형질감염 - 의도적으로 핵산을 세포에 도입하는 과정 -을 통하여 세포에 존재한다. 상기 용어는 종종 진핵 세포에서의 비-바이러스적 방법에 사용된다. 그것이 다른 방법 및 세포 유형을 지칭할 수도 있기는 하지만, 하기의 다른 용어가 바람직하다: 박테리아, 식물 세포를 포함한 비-동물 진핵 세포에서의 비-바이러스적 DNA 전달을 기술하는 데에는 "형질전환"이 좀 더 자주 사용됨. 동물 세포에서는, 형질감염이 바람직한 용어인데, 형질전환은 해당 세포에서의 암성 상태로의 진행 (발암)을 지칭하는 데에도 사용되기 때문이다. 바이러스-매개 DNA 전달을 기술하는 데에는 종종 형질도입이 사용된다. 본 출원에서는, 형질전환, 형질도입 및 바이러스 감염이 형질감염의 정의하에 포함된다.

본 개시내용의 실시양태는 세포 시스템에서 ACS를 발현시키는 것, 중간쇄 내지 장쇄 카르복실산을 세포 시스템에 공급하는 것, 배지 중에서 세포 시스템을 성장시키는 것, 및 카르복실 CoA를 생성시키는 것을 포함하는, 중간쇄 내지 장쇄 카르복실산으로부터의 카르복실 CoA의 생합성 제조 방법이다.

다른 실시양태는 고스트 칠리 페퍼로부터 클로닝된 ACS1으로부터 ACS가 발현되는 것이다. 대안적인 실시양태는 LCAS4 또는 LCAS5를 기초로 하여 아라비돕시스로부터 ACS가 발현되는 것이다. 또 다른 실시양태에서, ACS는 캅시쿰 종으로부터 클로닝된 ACS2로부터 발현된다. 또한, ACS는 고스트 칠리 페퍼로부터 클로닝된 ACS1과 66 % 이상의 서열 동일성을 공유하는 ACS이다. 또 다른 변형에서, ACS는 고스트 칠리 페퍼로부터 클로닝된 ACS1과 97 % 이상의 서열 유사성을 공유하는 ACS이다.

다른 실시양태는 중간쇄 또는 장쇄 카르복실산이 8-메틸-트랜스-6-노넨산인 것이다. 장쇄 카르복실산은 일반적으로 14 내지 18개의 탄소를 가지는 반면, 중간쇄 카르복실산은 일반적으로 8 내지 13개의 탄소를 가진다. 일 실시양태에서, 중간쇄 내지 장쇄 카르복실산을 세포 시스템에 공급하는 것은 중간쇄 내지 장쇄 카르복실산을 세포 시스템에 첨가하는 것을 포함한다. 대안적인 실시양태에서, 중간쇄 내지 장쇄 카르복실산을 세포 시스템에 공급하는 것은 세포 시스템의 생합성 경로로부터 중간쇄 내지 장쇄 카르복실산을 발현시키는 것을 포함한다.

실시양태의 세포 시스템과 관련하여, 그것은 박테리아, 효모 및 이들의 조합, 또는 생합성 생성이 제공되는 것을 가능케 하게 되는 임의의 세포 시스템으로 이루어진 군에서 선택된다.

본 개시내용의 실시양태는 세포 시스템에서 ACS를 발현시키는 것, 8-메틸-트랜스-6-노넨산을 세포 시스템에 공급하는 것, 배지 중에서 세포 시스템을 성장시키는 것, 및 8-메틸노네노일-CoA를 생성시키는 것을 포함하는, 8-메틸노네노일-CoA의 생합성 제조 방법이다. ACS는 고스트 칠리 페퍼로부터 클로닝된 ACS1으로부터 발현된다. ACS는 아라비돕시스로부터 클로닝된 LCAS4 또는 LCAS5로부터 발현될 수 있다. 또 다른 실시양태에서, ACS는 캅시쿰 종으로부터 클로닝된 ACS2로부터 발현된다. 또한, ACS는 고스트 칠리 페퍼로부터 클로닝된 ACS1과 66 % 이상의 서열 동일성을 공유하는 ACS이다. 또 다른 변이에서, ACS는 고스트 칠리 페퍼로부터 클로닝된 ACS1과 97 % 이상의 서열 유사성을 공유하는 ACS이다.

[ 실시예 ]

실시예 1

아실-CoA의 생성

클로닝

본 출원인은 하기의 프라이머들을 사용하여 고스트 칠리 페퍼 녹색 과실의 cDNA로부터 ACS1 유전자를 증폭하였다: ACS1-sumo-F: CGC GAA CAG ATT GGA GGT GCAACAGATAAATTTATTATTG 및 ACS1-sumo-R: GTG GCG GCC GCT CTA TTA TCACTTGGTACCCTTGTACAT. 생성되는 PCR 생성물을 1 % 아가로스 겔상에서 정제하여, 선형 pETite N-His SUMO Kan 발현 벡터 (루시젠(Lucigen) 사, 위스콘신 미들턴 소재)와 혼합하였다. 상기 DNA 혼합물을 사용하여 열 충격에 의해 HI-컨트롤(control) 10G 화학적 적격 세포를 형질전환시켰다 (루시젠 사). 유전자 삽입물을 완전히 서열분석하여, 코딩되어 있는 아미노산 서열을 ACS1의 것과 정렬시켰다 (도 5). 도 5에 나타낸 바와 같이, 이들 2종의 서열은 캅시쿰 안눔 ACS1의 Ile476이 고스트 페퍼 ACS1에서는 Val로 대체된다는 것 이외에는 거의 동일하다. 고스트 페퍼 ACS1의 서열을 사용하여 아라비돕시스 데이터베이스 (http://www.arabidopsis.org/)를 블라스트 분석함으로써, LCAS4 및 LACS5를 그의 동종체로 확인하였다 (도 6). 도 6에 나타낸 바와 같이, 이들 3종의 서열은 66.7 %의 서열 동일성 및 97.1 %의 서열 유사성을 공유한다. LACS4 및 LACS5 모두는 생화학적으로 지방산 및 글리세로지질 대사에 참여하는 장쇄 아실-CoA 신테타제로 특징화되어 있다 (문헌 [Shockey et al., 2002]). 최근에, LACS4는 아라비돕시스에서 화분 외피 지질의 형성에 필요한 것으로 주장되고 있다 (문헌 [Jessen et al., 2011]).

발현

출원인은 pETite N-His SUMO-고스트 페퍼 ACS1을 사용하여 HI-컨트롤 BL21(DE3) 세포 (루시젠 사)를 형질전환시키고, 16 ℃에서 20시간 동안 0.5 mM IPTG에 의해 His-SUMO-ACS1의 발현을 유도하였다. 융합 단백질을 Ni-NTA컬럼에 의해 정제하였다 (도 7). ACS1은 약 73.5 Kd의 분자량을 가지며, His-SUMO 태그의 크기는 약 12 Kd이다. SDS-PAGE상 His-SUMO-고스트 페퍼 ACS1 융합 단백질은 예상 크기 (약 85 Kd)에 가깝게 이동하였다 (도 7).

생성물

출원인은 HPLC-기반 방법을 사용하여 고스트 페퍼 ACS1의 활성을 측정하였다 (문헌 [Chen et al., 2011]). 간단하게 말하자면, 반응 혼합물 (400 μL)은 0.1 M 트리스(Tris)-HCl, pH 7.5, 2 mM DTT, 5 mM ATP, 10 mM MgCl₂, 0.5 mM CoA, 0.1 % 트리톤(Triton) 및 200 μM 카르복실산을 함유하였다. 20 μl의 정제된 효소를 첨가하는 것에 의해 반응을 개시하고, 30분 후 아세트산 20 μl의 첨가에 의해 중지하였다. HPLC는 아클레임(Acclaim)® 120 C18 역상 컬럼 (서모 사이언티픽(Thermo Scientific) 사; 3 μ, 120 Å, 150×3 mm)을 사용하는 디오넥스-얼티메이트(Dionex-UltiMate)® 3000 LC 시스템 (서모 사이언티픽 사)로 수행하였다. 이동상은 용매 A (0.1 % 트리플루오로아세트산) 및 용매 B (아세토니트릴)로 이루어졌다. 구배 용리 절차는 하기와 같았다: 0 내지 5분, B 5 %; 5 내지 9분, B 5로부터 80 %로의 선형 구배; 9 내지 11분, B 80%; 11 내지 12분, B 5 %. 유량은 0.6 ml/분이었다. 다이오드 어레이 검출기가 200-내지 400-nm 범위에서 데이터를 수집하였다. 기질 및 생성물의 검출 및 정량을 위하여, 257 nm에서 피크 면적을 측정하였다.

도 8에 나타낸 바와 같이, ACS1은 다양한 배지에서 장쇄 카르복실산에 대하여 활성을 가졌는데, 카프르산 (C10)에 대하여 최고 활성을 가졌다. 반면, ACS1은 아세트산 (C2) 또는 부티르산 (C4) - 단쇄 카르복실산 -에 대해서는 어떠한 활성도 나타내지 않았다.

다음, 출원인은 캡사이신 생합성 경로의 내인성 중간체인 8-메틸-트랜스-6-노넨산 (6E), 또는 그의 환원 생성물인 8-메틸노난산 (8M)을 기질로 사용하여, ACS1 활성을 검정하였다. 도 9에 나타낸 바와 같이, ACS1은 둘 다의 기질과 활성을 나타내었는데, 6E에 대하여 더 높은 활성을 가졌다. 출원인은 생성물 피크에 대하여 상응하는 HPLC 분획들을 수집한 후, 추가적인 MS/MS 확인을 위하여 스피드박(SpeedVac) 농축기상에서 건조하였다.

생성물의 확인

각 건조 샘플을 1:1:2 메탄올:물:아세토니트릴 완충제 40 μL에 재현탁시켰다. 10 μL를 트리베르사 나노메이트(TriVersa Nanomate)® (아드비온(Advion) 사, 뉴욕 이타카 소재)를 사용하는 직접 주입에 사용하였다. 질량 분광측정기인 LTQ-오비트랩 벨로스(Orbitrap Velos) (서모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific) 사, 매사추세츠 왈탐 소재)는 음성 이온화 모드로 작동시켰다. MS 탐색 스캔은 FT 셀에서 300 내지 2,000 m/z의 질량 범위로 수행하였다. 해상도는 60,000 @ 400 m/z로 고정하였다. CID 단편화를 MS/MS에 사용하였으며, 검출은 이온 트랩에서 1.5 m/z의 단리 범위로 수행하였다. 단편화는 35 %의 표준화 충돌 에너지로 수행하였다. 도 10-11에 나타낸 바와 같이, MS 데이터는 각각 8-메틸-트랜스-6-노네노일-CoA 및 8-메틸 노나노일-CoA의 분자량에 부합한다.

8-메틸노난산에 대한 ACS1의 pH 최적치도 연구하였다. 아세테이트, 포스페이트, 트리스 및 글리신/NaOH 완충제를 사용하여 4.0 내지 10.5의 pH 범위를 제공하였다. 도 12에 나타낸 바와 같이, ACS1의 광학 pH는 약 9.5이다.

이에 따라, 본 출원인은 캡사이신 신타제에 기질을 제공하는 고스트 핫 페퍼(ghost hot pepper)에서의 신규 중간쇄/장쇄 아실-CoA 신테타제를 확인한 것이다. 또한, 신규 효소는 중간쇄 지방산 유도체를 제조하기 위한 생물연료 산업에 적용분야를 가질 수도 있다.

추가적인 실시양태에는 ACS1의, 유전자의 과발현을 위한 표준 공지 기술을 이용하여 ACS1을 과발현시키는 것에 의해 고추 식물에서 캡사이시노이드의 수준을 변형시키기 위한 용도가 포함된다. 또 다른 실시양태에는 ACS1의, 유전자의 발현을 녹아웃시키거나 녹다운시키기 위한 위한 표준 공지 기술을 이용하여 ACS1을 녹아웃시키거나 녹다운시키는 것에 의해 고추 식물에서 캡사이시노이드의 수준을 변형시키기 위한 용도가 포함된다. 다시 말하면, 상기 과발현 또는 녹아웃/녹다운은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 알려져 있는 표준 분자 세포 전략 및 기술에 의한다. 또 다른 실시양태에는 ACS1의, ACS1의 발현 또는 과발현과 연관되어 아실-CoA, 및 지방산을 포함한 그의 하류 대사물을 생성시키기 위한 용도가 포함된다. 또 다른 변이는 ACS1의, ACS1을 녹아웃시키거나 녹다운시키는 것을 포함하여 아실-CoA, 및 지방산을 포함한 그의 하류 대사물의 수준을 조절하기 위한 용도이다.

상기 방법에 의해 제조되는 아실 CoA는 캡사이신을 제조하는 데에 이용될 수 있는데, 그것은 일반적으로 중간쇄 변종의 것일 수 있다. 다시 말하자면, ACS1이 중간쇄- 및 장쇄-카르복실산 모두의 아실-CoA로의 전환을 매개할 수 있기는 하지만, 장쇄 활성에 비해 중간쇄 활성이 훨씬 더 중요한데, 중간쇄 활성이 오늘날 생물연료 산업에 있어서 필수적인 성분이기 때문이다. ACS1에 대하여 상기에서 언급된 바와 같은 다른 중요성은 트랜스제닉 기술을 통하여 식물에서 캡사이신 수준을 조절하는 데에 그것이 사용될 수 있다는 것이다. 그러나, ACS1이 장쇄 아실-CoA와 관련한 용도에서 배제되는 것은 아니다.

실시양태에서는, 박테리아 기반 시스템 또는 효모 기반 시스템과 같은 세포 시스템이 ACS를 발현하도록 변형될 수 있다. 상기 ACS는 고스트 페퍼로부터 클로닝된 ACS1일 수 있다. 적합한 다른 ACS는 아라비돕시스 유래의 LCAS4 및 LCAS5를 기초로 하는 것이다. 다른 알려져 있는 ACS1 및 ACS2 역시 세포 시스템에서 발현될 수 있다. 다음에는, 8-메틸-트랜스-6-노넨산 및 8-메틸노난산과 같은 적절한 기질이 세포 시스템에 공급될 수 있다. 기질은 세포 시스템 내에서 생합성 경로의 일부로서 발현될 수도 있다. 다음에, 세포 시스템은 인큐베이팅됨으로써, 8-메틸-트랜스-6-노네노일-CoA 또는 8-메틸 노나노일-CoA의 생합성 제조를 가능케 한다.

동일성 및 유사성

동일성은 서열 정렬 (서열 정보만, 또는 구조 정보 또는 소정의 다른 정보를 사용하여 수행될 수 있지만, 보통은 서열 정보만을 기초로 함) 후 서열 쌍 사이에서 동일한 아미노산의 비율이며, 유사성은 소정의 유사성 행렬을 사용한 정렬을 기초로 하여 할당되는 점수이다. 유사성 지수는 BLOSUM62, PAM250 또는 GONNET, 또는 단백질 서열 정렬에 통상의 기술자가 사용하는 임의의 행렬에 따르는 임의의 것일 수 있다.

동일성은 2종 하위-서열들 사이의 대응 정도이다 (서열들 사이에 갭 없음). 25 % 이상의 동일성은 기능의 유사성을 시사하는 한편, 18-25 %는 구조 또는 기능의 유사성을 시사한다. 2종의 완전히 무관하거나 무작위인 서열들 (100개 잔기 초과)이 20 %를 초과하는 동일성을 가질 수 있다는 것에 유념해야 한다. 유사성은 그들이 비교되었을 경우의 2종 서열 사이의 유사 정도이다. 이것은 그의 동일성에 의존한다.

전기의 상세한 설명에서 드러나는 바와 같이, 본 개시내용의 소정 측면들이 본원에서 예시되는 예들의 구체적인 세부사항에 의해 제한되는 것은 아니며, 그에 따라 그의 다른 변형 및 적용 또는 등가물들이 통상의 기술자에게 고려될 것으로 생각된다. 따라서, 청구범위는 본 개시내용의 기술사상 및 영역에서 벗어나지 않는 모든 그와 같은 변형 및 적용들을 포괄하고자 한다.

또한, 달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용되는 모든 기술 및 과학 용어들은 본 개시내용이 속하는 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가진다. 바람직한 방법 및 물질들이 상기에서 기술되기는 하였지만, 본 개시내용의 실시 또는 시험에는, 본원에서 기술되는 것들과 유사하거나 그에 등가인 어떠한 방법 및 물질들도 사용될 수 있다.

본 개시내용의 다른 측면, 목적 및 장점들은 도면, 개시내용 및 첨부된 청구범위의 연구로부터 얻을 수 있다.

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actttctctg agtgggatga tccttctgtt gggcgtgttg 720 gtccacctct tcctt 735 <210> 10 <211> 438 <212> DNA <213> Ghost Chili Pepper <400> 10 ctcggggaga agtaggtgtt ggtccacctc ttccttgttc ctacataaag cttgttactt 60 gggaagaagg aggttacaga atagttgata agcctatgcc tcggggagaa gtagttgttg 120 gtggatgcag catcactgct ggttacttca acaatgagga caaaactaat gaggtttata 180 aggttgatga gagaggcatg cgctggttct atactggtga cattggaagg tttcatcccg 240 atggatgcat tgaaattatt gatagaaaga aagatatcgt taagcttcag cacggggagt 300 atatctcact tggaaaggtt gaggcagcac ttttatcaag tgattatgtg gaaagcatca 360 tggtctacgc ggaccccttc cacaattatt gtgtagcttt aattgtccct tcacgccagg 420 tgcttgagaa atggtccc 438 <210> 11 <211> 808 <212> DNA <213> Ghost Chili Pepper <400> 11 aatccatata cgagtacagt ggagagactg accagctatg attatatctc caaaaattat 60 gggtcatctg gggttactgg tgcagttttt attgccatta ttatgccaat aatcctctcc 120 atgttactta tggggaagaa gaaggcaaaa cagagaggtg ttccggttca agttggtggt 180 gaggcaggtc ttgcaatgcg caatgttaaa tcagcaagat tagttgaagt tccttgggaa 240 ggggctacaa ctgtaccagc tctatttgag cagtcttgca aaaaacattc ttctgatcgc 300 tgtcttggaa ctagaaaact agttagcagg gactttgtta ctgcaagtga tggaaggaag 360 tttgagaaac ttcacttggg ggagtatcag tgggaatctt atggacaagt atttgatcgc 420 acttgcaact ttgcctctgg tcttattaaa tttggtcatg atgtggacac tcacgctgct 480 atctttgcag aaactcgtcc agagtggatc attgcctttc agggatgctt ccggcagaat 540 gttactgttg ttaccattta tgcttccttg ggtgatgatg cactcattca ttcactcaat 600 gagacccaag tatctacatt gatatgtgat gccaagcaac tgaaaaaagt ggcttctgtt 660 agttcgagcc tgaaaaccat caagaatgtc atctattttg aggatgacga gacggcaata 720 gattccacaa atattgacag ctggaggatg tcgtctttct cagcagttga aaagctgggt 780 aaaaatagtc ctattcagcc aagactgc 808 <210> 12 <211> 658 <212> PRT <213> Capsicum annuum <400> 12 Met Ala Thr Asp Lys Phe Ile Ile Glu Val Glu Ser Ala Lys Pro Ala 1 5 10 15 Lys Asp Gly Arg Pro Ser Met Gly Pro Val Tyr Arg Ser Ile Phe Ala 20 25 30 Lys His Gly Phe Pro Pro Pro Ile Pro Gly Leu Asp Ser Cys Trp Asp 35 40 45 Ile Phe Arg Met Ser Val Glu Lys Tyr Pro Asn Asn Arg Met Leu Gly 50 55 60 Arg Arg Glu Ile Val Asp Gly Lys Pro Gly Lys Tyr Val Trp Met Ser 65 70 75 80 Tyr Lys Glu Val Tyr Asp Ile Val Ile Lys Val Gly Asn Ser Ile Arg 85 90 95 Ser Ile Gly Val Asp Val Gly Asp Lys Cys Gly Ile Tyr Gly Ala Asn 100 105 110 Cys Pro Glu Trp Ile Ile Ser Met Glu Ala Cys Asn Ala His Gly Leu 115 120 125 Tyr Cys Val Pro Leu Tyr Asp Thr Leu Gly Ala Gly Ala Val Glu Phe 130 135 140 Ile Ile Ser His Ala Glu Val Thr Ile Ala Phe Val Glu Glu Lys Lys 145 150 155 160 Leu Pro Glu Leu Leu Lys Thr Phe Pro Asn Ala Ser Lys Tyr Leu Lys 165 170 175 Thr Ile Val Ser Phe Gly Lys Val Thr Pro Glu Gln Lys Lys Glu Leu 180 185 190 Glu Glu Phe Gly Val Val Leu Tyr Ser Trp Asp Glu Phe Leu Gln Leu 195 200 205 Gly Ser Gly Lys Gln Phe Asp Leu Pro Val Lys Lys Lys Glu Asp Ile 210 215 220 Cys Thr Ile Met Tyr Thr Ser Gly Thr Thr Gly Asp Pro Lys Gly Val 225 230 235 240 Leu Ile Ser Asn Thr Ser Ile Val Thr Leu Ile Ala Gly Val Arg Arg 245 250 255 Phe Leu Gly Ser Val Asp Glu Ser Leu Asn Val Asp Asp Val Tyr Leu 260 265 270 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Arg Pro Ser Met Gly Pro Val Tyr Arg Ser Ile Phe Ala 20 25 30 Lys His Gly Phe Pro Pro Pro Ile Pro Gly Leu Asp Ser Cys Trp Asp 35 40 45 Ile Phe Arg Met Ser Val Glu Lys Tyr Pro Asn Asn Arg Met Leu Gly 50 55 60 Arg Arg Glu Ile Val Asp Gly Lys Pro Gly Lys Tyr Val Trp Met Ser 65 70 75 80 Tyr Lys Glu Val Tyr Asp Ile Val Ile Lys Val Gly Asn Ser Ile Arg 85 90 95 Ser Ile Gly Val Asp Val Gly Asp Lys Cys Gly Ile Tyr Gly Ala Asn 100 105 110 Cys Pro Glu Trp Ile Ile Ser Met Glu Ala Cys Asn Ala His Gly Leu 115 120 125 Tyr Cys Val Pro Leu Tyr Asp Thr Leu Gly Ala Gly Ala Val Glu Phe 130 135 140 Ile Ile Ser His Ala Glu Val Thr Ile Ala Phe Val Glu Glu Lys Lys 145 150 155 160 Leu Pro Glu Leu Leu Lys Thr Phe Pro Asn Ala Ser Lys Tyr Leu Lys 165 170 175 Thr Ile Val Ser Phe Gly Lys Val Thr Pro Glu Gln Lys Lys Glu Leu 180 185 190 Glu Glu Phe Gly Val Val Leu Tyr Ser Trp Asp Glu Phe Leu Gln Leu 195 200 205 Gly Ser Gly Lys Gln Phe Asp Leu Pro Val Lys Lys Lys Glu Asp Ile 210 215 220 Cys Thr Ile Met Tyr Thr Ser Gly Thr Thr Gly Asp Pro Lys Gly Val 225 230 235 240 Leu Ile Ser Asn Thr Ser Ile Val Thr Leu Ile Ala Gly Val Arg Arg 245 250 255 Phe Leu Gly Ser Val Asp Glu Ser Leu Asn Val Asp Asp Val Tyr Leu 260 265 270 Ser Tyr Leu Pro Leu Ala His Ile Phe Asp Arg Val Ile Glu Glu Cys 275 280 285 Phe Ile His His Gly Ala Ser Ile Gly Phe Trp Arg Gly Asp Val Lys 290 295 300 Leu Leu Thr Glu Asp Ile Gly Glu Leu Lys Pro Thr Val Phe Cys Ala 305 310 315 320 Val Pro Arg Val Leu Asp Arg Ile Tyr Ser Gly Leu Gln Gln Lys Ile 325 330 335 Ala Ala Gly Gly Phe Leu Lys Ser Thr Leu Phe Asn Leu Ala Tyr Ala 340 345 350 Tyr Lys His His Asn Leu Lys Lys Gly Arg Lys His Phe Glu Ala Ser 355 360 365 Pro Leu Ser Asp Lys Val Val Phe Ser Lys Val Lys Glu Gly Leu Gly 370 375 380 Gly Arg Val Arg Leu Ile Leu Ser Gly Ala Ala Pro Leu Ala Ala His 385 390 395 400 Val Glu Ala Phe Leu Arg Val Val Ala Cys Cys His Val Leu Gln Gly 405 410 415 Tyr Gly Leu Thr Glu Thr Cys Ala Gly Thr Phe Val Ser Leu Pro Asn 420 425 430 Arg Tyr Asp Met Leu Gly Thr Val Gly Pro Pro Val Pro Asn Val Asp 435 440 445 Val Cys Leu Glu Ser Val Pro Glu Met Ser Tyr Asp Ala Leu Ser Ser 450 455 460 Thr Pro Arg Gly Glu Val Cys Val Arg Gly Asp Val Leu Phe Ser Gly 465 470 475 480 Tyr Tyr Lys Arg Glu Asp Leu Thr Lys Glu Val Met Ile Asp Gly Trp 485 490 495 Phe His Thr Gly Asp Val Gly Glu Trp Gln Pro Asn Gly Ser Leu Lys 500 505 510 Ile Ile Asp Arg Lys Lys Asn Ile Phe Lys Leu Ser Gln Gly Glu Tyr 515 520 525 Val Ala Val Glu Asn Leu Glu Asn Ile Tyr Gly Asn Asn Pro Ile Ile 530 535 540 Asp Ser Ile Trp Ile Tyr Gly Asn Ser Phe Glu Ser Phe Leu Val Ala 545 550 555 560 Val Ile Asn Pro Asn Gln Arg Ala Val Glu Gln Trp Ala Glu Val Asn 565 570 575 Gly Leu Ser Gly Asp Phe Ala Ser Leu Cys Glu Lys Pro Glu Val Lys 580 585 590 Glu Tyr Ile Leu Arg Glu Leu Thr Lys Thr Gly Lys Glu Lys Lys Leu 595 600 605 Lys Gly Phe Glu Phe Leu Lys Ala Val His Leu Asp Pro Val Pro Phe 610 615 620 Asp Met Glu Arg Asp Leu Leu Thr Pro Thr Phe Lys Lys Lys Arg Pro 625 630 635 640 Gln Leu Leu Lys Tyr Tyr Lys Asp Val Ile Asp Ser Met Tyr Lys Gly 645 650 655 Thr Lys <210> 14 <211> 666 <212> PRT <213> Arabidopsis thaliana <400> 14 Met Ser Gln Gln Lys Lys Tyr Ile Phe Gln Val Glu Glu Gly Lys Glu 1 5 10 15 Gly Ser Asp Gly Arg Pro Ser Val Gly Pro Val Tyr Arg Ser Ile Phe 20 25 30 Ala Lys Asp Gly Phe Pro Asp Pro Ile Glu Gly Met Asp Ser Cys Trp 35 40 45 Asp Val Phe Arg Met Ser Val Glu Lys Tyr Pro Asn Asn Pro Met Leu 50 55 60 Gly Arg Arg Glu Ile Val Asp Gly Lys Pro Gly Lys Tyr Val Trp Gln 65 70 75 80 Thr Tyr Gln Glu Val Tyr Asp Ile Val Met Lys Leu Gly Asn Ser Leu 85 90 95 Arg Ser Val Gly Val Lys Asp Glu Ala Lys Cys Gly Ile Tyr Gly Ala 100 105 110 Asn Ser Pro Glu Trp Ile Ile Ser Met Glu Ala Cys Asn Ala His Gly 115 120 125 Leu Tyr Cys Val Pro Leu Tyr Asp Thr Leu Gly Ala Asp Ala Val Glu 130 135 140 Phe Ile Ile Ser His Ser Glu Val Ser Ile Val Phe Val Glu Glu Lys 145 150 155 160 Lys Ile Ser Glu Leu Phe Lys Thr Cys Pro Asn Ser Thr Glu Tyr Met 165 170 175 Lys Thr Val Val Ser Phe Gly Gly Val Ser Arg Glu Gln Lys 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Ser 385 390 395 400 His Val Glu Ser Phe Leu Arg Val Val Ala Cys Cys His Val Leu Gln 405 410 415 Gly Tyr Gly Leu Thr Glu Ser Cys Ala Gly Thr Phe Val Ser Leu Pro 420 425 430 Asp Glu Leu Gly Met Leu Gly Thr Val Gly Pro Pro Val Pro Asn Val 435 440 445 Asp Ile Arg Leu Glu Ser Val Pro Glu Met Glu Tyr Asp Ala Leu Ala 450 455 460 Ser Thr Ala Arg Gly Glu Ile Cys Ile Arg Gly Lys Thr Leu Phe Ser 465 470 475 480 Gly Tyr Tyr Lys Arg Glu Asp Leu Thr Lys Glu Val Leu Ile Asp Gly 485 490 495 Trp Leu His Thr Gly Asp Val Gly Glu Trp Gln Pro Asp Gly Ser Met 500 505 510 Lys Ile Ile Asp Arg Lys Lys Asn Ile Phe Lys Leu Ser Gln Gly Glu 515 520 525 Tyr Val Ala Val Glu Asn Ile Glu Asn Ile Tyr Gly Glu Val Gln Ala 530 535 540 Val Asp Ser Val Trp Val Tyr Gly Asn Ser Phe Glu Ser Phe Leu Ile 545 550 555 560 Ala Ile Ala Asn Pro Asn Gln His Ile Leu Glu Arg Trp Ala Ala Glu 565 570 575 Asn Gly Val Ser Gly Asp Tyr Asp Ala Leu Cys Gln Asn Glu Lys Ala 580 585 590 Lys Glu Phe Ile Leu Gly Glu Leu Val Lys Met Ala Lys Glu Lys Lys 595 600 605 Met Lys Gly Phe Glu Ile Ile Lys Ala Ile His Leu Asp Pro Val Pro 610 615 620 Phe Asp Met Glu Arg Asp Leu Leu Thr Pro Thr Phe Lys Lys Lys Arg 625 630 635 640 Pro Gln Leu Leu Lys Tyr Tyr Gln Ser Val Ile Asp Glu Met Tyr Lys 645 650 655 Thr Ile Asn Ala Lys Phe Ala Ser Arg Gly 660 665 <210> 15 <211> 666 <212> PRT <213> Arabidopsis thaliana <400> 15 Met Thr Ser Gln Lys Arg Phe Ile Phe Glu Val Glu Ala Ala Lys Glu 1 5 10 15 Ala Thr Asp Gly Asn Pro Ser Val Gly Pro Val Tyr Arg Ser Thr Phe 20 25 30 Ala Gln Asn Gly Phe Pro Asn Pro Ile Asp Gly Ile Gln Ser Cys Trp 35 40 45 Asp Ile Phe Arg Thr Ala Val Glu Lys Tyr Pro Asn Asn Arg Met Leu 50 55 60 Gly Arg Arg Glu Ile Ser Asn Gly Lys Ala Gly Lys Tyr Val Trp Lys 65 70 75 80 Thr Tyr Lys Glu Val Tyr Asp Ile Val Ile Lys Leu Gly Asn Ser Leu 85 90 95 Arg Ser Cys Gly Ile Lys Glu Gly Glu Lys Cys Gly Ile Tyr Gly Ile 100 105 110 Asn Cys Cys Glu Trp Ile Ile Ser Met Glu Ala Cys Asn Ala His Gly 115 120 125 Leu Tyr Cys Val Pro Leu Tyr Asp Thr Leu Gly 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Phe Asp Val Ala Phe 340 345 350 Ser Tyr Lys Phe Gly Asn Met Lys Lys Gly Gln Ser His Val Ala Ala 355 360 365 Ser Pro Phe Cys Asp Lys Leu Val Phe Asn Lys Val Lys Gln Gly Leu 370 375 380 Gly Gly Asn Val Arg Ile Ile Leu Ser Gly Ala Ala Pro Leu Ala Ser 385 390 395 400 His Ile Glu Ser Phe Leu Arg Val Val Ala Cys Cys Asn Val Leu Gln 405 410 415 Gly Tyr Gly Leu Thr Glu Ser Cys Ala Gly Thr Phe Ala Thr Phe Pro 420 425 430 Asp Glu Leu Asp Met Leu Gly Thr Val Gly Pro Pro Val Pro Asn Val 435 440 445 Asp Ile Arg Leu Glu Ser Val Pro Glu Met Asn Tyr Asp Ala Leu Gly 450 455 460 Ser Thr Pro Arg Gly Glu Ile Cys Ile Arg Gly Lys Thr Leu Phe Ser 465 470 475 480 Gly Tyr Tyr Lys Arg Glu Asp Leu Thr Lys Glu Val Phe Ile Asp Gly 485 490 495 Trp Leu His Thr Gly Asp Val Gly Glu Trp Gln Pro Asn Gly Ser Met 500 505 510 Lys Ile Ile Asp Arg Lys Lys Asn Ile Phe Lys Leu Ala Gln Gly Glu 515 520 525 Tyr Val Ala Val Glu Asn Leu Glu Asn Val Tyr Ser Gln Val Glu Val 530 535 540 Ile Glu Ser Ile Trp Val Tyr Gly Asn Ser Phe Glu Ser Phe Leu Val 545 550 555 560 Ala Ile Ala Asn Pro Ala Gln Gln Thr Leu Glu Arg Trp Ala Val Glu 565 570 575 Asn Gly Val Asn Gly Asp Phe Asn Ser Ile Cys Gln Asn Ala Lys Ala 580 585 590 Lys Ala Phe Ile Leu Gly Glu Leu Val Lys Thr Ala Lys Glu Asn Lys 595 600 605 Leu Lys Gly Phe Glu Ile Ile Lys Asp Val His Leu Glu Pro Val Ala 610 615 620 Phe Asp Met Glu Arg Asp Leu Leu Thr Pro Thr Tyr Lys Lys Lys Arg 625 630 635 640 Pro Gln Leu Leu Lys Tyr Tyr Gln Asn Val Ile His Glu Met Tyr Lys 645 650 655 Thr Thr Lys Glu Thr Leu Ala Ser Gly Gln 660 665

Claims

세포 시스템에서 ACS를 발현시키는 것,
중간쇄 카르복실산 또는 장쇄 카르복실산, 또는 둘 다를 세포 시스템에 공급하는 것,
배지 중에서 세포 시스템을 성장시키는 것, 및
카르복실 CoA를 생성시키는 것
을 포함하는, 중간쇄 카르복실산 또는 장쇄 카르복실산으로부터의 카르복실 CoA의 생합성 제조 방법.
제1항에 있어서, ACS가 고스트 칠리 페퍼로부터 클로닝된 ACS1, 또는 캅시쿰 안눔(Capsicum annuum )으로부터 클로닝된 CaSIG4, 또는 ACS1 클로닝된 캅시쿰 안눔, 또는 이들의 조합으로부터 발현되는 것인 중간쇄 카르복실산 또는 장쇄 카르복실산으로부터의 카르복실 CoA의 생합성 제조 방법.
제1항에 있어서, ACS가 LCAS4 또는 LCAS5를 기초로 하는 아라비돕시스로부터 클로닝된 유전자로부터 발현되는 것인 중간쇄 카르복실산 내지 장쇄 카르복실산으로부터의 카르복실 CoA의 생합성 제조 방법.
제1항에 있어서, ACS가 고추 식물로부터 클로닝된 ACS2로부터 발현되는 것인 중간쇄 카르복실산 또는 장쇄 카르복실산으로부터의 카르복실 CoA의 생합성 제조 방법.
제1항에 있어서, ACS가 고스트 칠리 페퍼로부터 클로닝된 ACS1과 66 % 이상의 서열 동일성을 공유하는 ACS인 중간쇄 카르복실산 내지 장쇄 카르복실산으로부터의 카르복실 CoA의 생합성 제조 방법.
제1항에 있어서, ACS가 고스트 칠리 페퍼로부터 클로닝된 ACS1과 97 % 이상의 서열 유사성을 공유하는 ACS인 중간쇄 카르복실산 또는 장쇄 카르복실산으로부터의 카르복실 CoA의 생합성 제조 방법.
제1항에 있어서, 장쇄 카르복실산이 8-메틸-트랜스-6-노넨산인 중간쇄 카르복실산 또는 장쇄 카르복실산으로부터의 카르복실 CoA의 생합성 제조 방법.
제1항에 있어서, 중간쇄 카르복실산 또는 장쇄 카르복실산, 또는 둘 다를 세포 시스템에 공급하는 것이 중간쇄 카르복실산 또는 장쇄 카르복실산, 또는 둘 다를 세포 시스템에 첨가하는 것을 포함하는 것인 중간쇄 카르복실산 또는 장쇄 카르복실산으로부터의 카르복실 CoA의 생합성 제조 방법.
제1항에 있어서, 중간쇄 카르복실산 또는 장쇄 카르복실산, 또는 둘 다를 세포 시스템에 공급하는 것이 세포 시스템의 생합성 경로를 기반으로 하여 세포 시스템 내에서 중간쇄 카르복실산 또는 장쇄 카르복실산, 또는 둘 다를 발현시키는 것을 포함하는 것인 중간쇄 카르복실산 또는 장쇄 카르복실산으로부터의 카르복실 CoA의 생합성 제조 방법.
제1항에 있어서, 세포 시스템이 박테리아, 효모, 식물 세포, 동물 세포, 시험관내 번역 시스템, 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택되는 것인 중간쇄 카르복실산 내지 장쇄 카르복실산으로부터의 카르복실 CoA의 생합성 제조 방법.
세포 시스템에서 ACS를 발현시키는 것,
8-메틸-트랜스-6-노넨산을 세포 시스템에 공급하는 것,
배지 중에서 세포 시스템을 성장시키는 것, 및
8-메틸노네노일-CoA를 생성시키는 것
을 포함하는, 8-메틸노네노일-CoA의 생합성 제조 방법.
제11항에 있어서, ACS가 고스트 칠리 페퍼로부터 클로닝된 ACS1, 또는 캅시쿰 안눔으로부터 클로닝된 CaSIG4, 또는 ACS1 클로닝된 캅시쿰 안눔, 또는 이들의 조합으로부터 발현되는 것인 8-메틸노네노일-CoA의 생합성 제조 방법.
제11항에 있어서, ACS가 아라비돕시스로부터 클로닝된 LCAS4 또는 LCAS5를 기초로 하는 유전자로부터 발현되는 것인 8-메틸노네노일-CoA의 생합성 제조 방법.
제11항에 있어서, ACS가 고추 식물로부터 클로닝된 ACS2로부터 발현되는 것인 8-메틸노네노일-CoA의 생합성 제조 방법.
제11항에 있어서, ACS가 고스트 칠리 페퍼로부터 클로닝된 ACS1과 66 % 이상의 서열 동일성을 공유하는 ACS인 8-메틸노네노일-CoA의 생합성 제조 방법.
제11항에 있어서, ACS가 고스트 칠리 페퍼로부터 클로닝된 ACS1과 97 % 이상의 서열 유사성을 공유하는 ACS인 8-메틸노네노일-CoA의 생합성 제조 방법.
제11항에 있어서, 8-메틸-트랜스-6-노넨산을 세포 시스템에 공급하는 것이 8-메틸-트랜스-6-노넨산을 세포 시스템에 첨가하는 것을 포함하는 것인 8-메틸노네노일-CoA의 생합성 제조 방법.
제11항에 있어서, 8-메틸-트랜스-6-노넨산을 세포 시스템에 공급하는 것이 세포 시스템의 생합성 경로를 기반으로 하여 세포 시스템 내에서 8-메틸-트랜스-6-노넨산을 발현시키는 것을 포함하는 것인 8-메틸노네노일-CoA의 생합성 제조 방법.
제11항에 있어서, 세포 시스템이 박테리아, 효모, 식물 세포, 동물 세포, 시험관내 번역 시스템, 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택되는 것인 8-메틸노네노일-CoA의 생합성 제조 방법.
ACS1의, ACS1을 과발현시키는 것; 또는 ACS1을 녹아웃시키거나 녹다운시키는 것을 포함하여 고추 식물에서 캡사이시노이드의 수준을 변형시키기 위한 용도.
ACS1의, 세포 시스템에서 ACS1을 과발현시키는 것; 또는 세포 시스템에서 ACS1을 녹아웃시키거나 녹다운시키는 것을 포함하여 아실-CoA, 및 지방산을 포함한 그의 하류 대사물의 수준을 조정하기 위한 용도.