JP2016534758A

JP2016534758A - アシル‐ＣｏＡの生合成製造のためにアシル‐ＣｏＡシンテターゼを使用する方法

Info

Publication number: JP2016534758A
Application number: JP2016552437A
Authority: JP
Inventors: フイ、チェン; ホンシュエ、ワン; シャオダン、ユ
Original assignee: コナゲンインコーポレイテッド
Priority date: 2013-11-01
Filing date: 2014-11-03
Publication date: 2016-11-10
Anticipated expiration: 2034-11-03
Also published as: CA2962266A1; US20170247733A2; US20160273014A1; EP3063283A4; CN105916991A; WO2015066615A2; BR112016009764A2; EP3063283A2; US10392643B2; WO2015066615A3; MX2016005718A; KR20160126969A; JP6587358B2

Abstract

長鎖カルボン酸からカルボキシルＣｏＡを生成する生合成方法は、細胞システムにおいてＡＣＳを発現させる段階と、長鎖カルボン酸を上記細胞システムに供給する段階と、上記細胞システムを培地で培養する段階と、カルボキシルＣｏＡを生成する段階と、を備える。

Description

［関連出願への相互参照］

本開示は、発明の名称「アシル‐ＣｏＡの生合成製造のためにアシル‐ＣｏＡシンテターゼを使用する方法」のＰＣＴ特許出願である。本願は、２０１３年１１月１日に出願された米国仮特許出願第６１／８９８，９４４号に対する優先権を主張し、それは参照により本明細書にその全体が組み込まれる。

本開示は、食品、医療、および薬物産業における適用可能性を有する。本開示は概して、アシル‐ＣｏＡシンテターゼ（ＡＣＳ）を利用するアシル‐ＣｏＡの生合成製造のための方法である。

背景技術：カプサイシン、すなわち８‐メチル‐Ｎ‐バニリル‐トランス‐６ノネンアミドは、ホットペッパー（Ｃａｐｓｉｃｕｍｓｐｐ．）において生成される二次代謝産物であり、これがホットペッパーの辛味の要因である。図１に示される通り、カプサイシンは、カプサイシンシンターゼ（ＣＳ）、すなわち８‐メチルノネノイル‐ＣｏＡの８‐メチルノネノイル部分をバニリルアミンに転移してアミド抱合を形成するアシルトランスフェラーゼによって合成されると考えられているが、ＣＳをコードする遺伝子は、関連する仮出願の出願時においては明確に識別されていなかった。繰り返すが、図１に詳しく示される通り、ＣＳの基質、８‐メチルノネノイル‐ＣｏＡは、アシル‐ＣｏＡシンテターゼ（ＡＣＳ）の活性を介する、８‐メチル‐トランス‐６‐ノネン酸に由来する。

ＡＣＳは、ＡＴＰに依存する２段階の反応を介して、カルボン酸のそのアシル‐ＣｏＡチオエステルへの変換を触媒する。第１段階において、ピロリン酸塩の放出とともに、遊離脂肪酸がアシル‐ＡＭＰ中間物に変換される。第２段階において、活性化されたアシル基が、ＣｏＡのチオール基に結合され、ＡＭＰおよびアシル‐ＣｏＡ生成物を放出する（１９７６年、グルートその他）。ＡＣＳおよび他のタンパク質は、ＡＭＰ結合モチーフ（ＰＲＯＳＩＴＥＰＳ００４５５）のコアを形成する高度に保存された１２アミノ酸配列によって特徴付けられる。約４４の推定上のＡＣＳ遺伝子が、モデル植物シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｔｈａｌｉａｎａ）において特定された（２００３年、ショッキーその他）。現在、それらの約半分が既知の生化学的機能を有し、それには、長鎖アシル‐ＣｏＡシンテターゼ、アシル‐ＡＣＰシンテターゼ、４‐クマロイル‐ＣｏＡリガーゼ、アセチル‐ＣｏＡシンテターゼ、ＯＰＣ‐８：０ＣｏＡリガーゼ、スクシニルベンゾイル‐ＣｏＡリガーゼ、マロニル‐ＣｏＡシンテターゼ、およびオキサリル‐ＣｏＡシンテターゼ（２００３年ショッキーその他、２００５年クーその他、２００６年クーその他、２００８年キムその他、２００８年リンおよびオリバー、２０１１年チェンその他、２０１２年フォスターその他）が含まれる。Ｃａｐｓｉｃｕｍａｎｎｕｕｍ（トウガラシ）において、３つの推定ＡＣＳ遺伝子の全長がクローニングされた（２００１年リーその他、２００９年マゾウレクその他）。しかしながら、生化学的活性は、これらのタンパク質のいずれにも帰するものとみなされていない。

出願人らは、カプサイシン生合成、特にＡＣＳに関係する遺伝子を特定しようと試みた。ホットペッパーのゲノム配列は、本研究が開始された時点において利用不可能であったので、出願人らは、ゴーストチリペッパー、すなわちＣ．ｃｈｉｎｅｎｓｅ（シネンセ種）とＣ．ｆｒｕｉｔｅｓｃｅｎｓ（キダチ種）の種間雑種の青玉果のトランスクリプトーム解析のためのＲＮＡシーケンシング（ＲＮＡ‐Ｓｅｑ）技術を採用した。ＲＮＡｓｅｑ実験は、モジーンＬＣ社（ミズーリ州セントルイス）によって行われた。出願人らは、未編集のＲＮＡｓｅｑデータのｄｅｎｏｖｏアセンブリを介して、約１８，９８７のコンティグを取得した。そのうちの３３個は、アシル‐ＣｏＡシンテターゼ様タンパク質として注釈を付けられた。これらのコンティグの中で、Ｃｏｍｐ２１４７‐１が、Ｃａｐｓｉｃｕｍａｎｎｕｕｍ（トウガラシ）からの推定上のアシルＣｏＡシンテターゼをコードする病原体誘導性ｃＤＮＡであるＣａＳＩＧ４と良好な一致を示した（図２）（２００１年リーその他）。また、Ｃｏｍｐ６６４６２およびＣｏｍｐ７９５２０がペッパーＡＣＳ１（ＧｅｎＢａｎｋ：ＥＵ６１６５７１）（図３）に、Ｃｏｍｐ１６７＿ｃ０、Ｃｏｍｐｌ６７＿ｃｌおよびＣｏｍｐ４６２１８がペッパーＡＣＳ２（ＧｅｎＢａｎｋ：ＥＵ６１６５７２）にマッピングされた（図４）。従って、ＡＣＳ１およびＡＣＳ２が、プラスチドから脂肪酸を輸送するアシル‐ＣｏＡシンテターゼの２つの候補である（２００９年マゾウレクその他）。

出願人らは、ＡＣＳ１は、８‐メチル‐トランス‐６‐ノネン酸を対応する８‐メチル‐６‐ノネノイル‐ＣｏＡ、すなわちカプサイシン生合成経路における重要な中間物に変換する中／長鎖アシル‐ＣｏＡシンテターゼであることを実証する。出願人らは、本願において、ＡＣＳ、特にＡＣＳ１をアシル‐ＣｏＡの生合成製造に使用する方法を開示する。

本開示は、酵母またはバクテリアのような細胞システムにおいてアシル‐ＣｏＡを生成することに関する技術的課題に対処する。出願人らは、ＡＣＳの遺伝子を分離し、それをアシル‐ＣｏＡの生成を促進する細胞システムにおいて独自に発現させた。特定のアシル‐ＣｏＡ、８‐メチル‐６‐ノネノイル‐ＣｏＡは、カプサイシンシンターゼ（ＣＳ）の必須基質であり、それによりカプサイシンを生成する。故に、本開示は、８‐メチル‐６‐ノネノイル‐ＣｏＡの産業的製造をもたらし、その後のカプサイシンの生成を促進することに寄与する。

本開示は、中鎖／長鎖カルボン酸からカルボキシルＣｏＡを生成する生合成方法であり、細胞システムにおいてＡＣＳを発現させる段階と、中鎖／長鎖カルボン酸を上記細胞システムに供給する段階と、上記細胞システムを培地で培養する段階と、カルボキシルＣｏＡを生成する段階と、を備える。

別の実施形態は、細胞システムにおいてＡＣＳを発現させる段階と、８‐メチル‐トランス‐６‐ノネン酸を上記細胞システムに供給する段階と、上記細胞システムを培地で培養する段階と、８‐メチルノネノイル‐ＣｏＡを生成する段階と、を備える、８‐メチルノネノイル‐ＣｏＡを生成する生合成方法である。

本開示をより良く理解するために、以下の添付図面への参照がなされることがある。本開示には様々な修正形態および代替的形態を取り入れることが可能であるが、図面においては、その複数の特定の実施形態が例示として示されており、本明細書において詳細に説明されている。しかしながら、図面および本明細書において示される詳細な説明は、本開示を開示された特定の実施形態に限定する意図はなく、その逆に、添付の特許請求の範囲によって定義される本開示の精神および範囲に属する、すべての修正形態、均等技術、および代替形態に及ぶ意図であることを理解されたい。

８‐メチル‐６‐ノネン酸から８‐メチル‐６‐ノネノイル‐ＣｏＡを作成するＡＣＳによる反応を含むカプサイシン生合成経路を示す。スチュワートその他（２００７年）から適合。Ｃｏｍｐ２１４７‐１およびＣａＳＩＧ４（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＦ３５４４５４）間の配列比較を示す。Ｃｏｍｐ６６４６２、Ｃｏｍｐ７９５２０とＡＣＳ１（ＧｅｎＢａｎｋ：ＥＵ６１６５７１）との間の配列比較を示す。Ｃｏｍｐｌ６７＿ｃ０、Ｃｏｍｐｌ６７＿ｃｌ、Ｃｏｍｐ４６２１８と、ＡＣＳ２（ＧｅｎＢａｎｋ：ＥＵ６１６５７２）との間の配列比較を示す。ゴーストペッパーＡＣＳ１とＡＣＳ１（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＣＦ１７６６３）との間の配列比較を示す。ゴーストペッパーＡＣＳ１と、シロイヌナズナＬＡＣＳ４（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＥＥ８４８１２）およびＬＡＣＳ５（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＡＭ２８８７２）との間の配列アライメントを示す。ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞におけるＨｉｓ‐ＳＵＭＯ‐ＡＣＳ１発現のＳＤＳ‐ＰＡＧＥ解析を示す。０，２０：ＩＰＴＧ誘導後の時点における総タンパク量；Ｃは可溶性粗製タンパク質抽出；Ｅ１からＥ４は、Ｎｉ‐ＮＴＡカラムからの画分。ＡＣＳ１の分子量は約７３．５Ｋｄであり、Ｈｉｓ‐ＳＵＭＯタグの分子量は約１２Ｋｄである。様々なカルボン酸に対するＡＣＳ１の活性を示す。Ｃ２は酢酸、Ｃ４は酪酸、Ｃ６はヘキサン酸、Ｃ８はカプリル酸、Ｃ１０はカプリン酸、Ｃ１２はラウリン酸、Ｃ１４はミリスチン酸、Ｃ１６はパルミチン酸、Ｃ１８はステアリン酸である。試験は１００ｍＭトリバッファー（Ｔｒｉｂｕｆｆｅｒ）、ｐＨ８．０で行われた。８‐メチル‐トランス‐６‐ノネン酸または８‐メチルノナン酸をそれぞれ基質とするＡＣＳ１の酵素生成物のＨＰＬＣプロファイルを示す。ネガティブモードにおける、精製された８‐メチル‐トランス‐６‐ノネノイル‐ＣｏＡのＭＳ／ＭＳ解析を示す。ネガティブモードにおける、精製された８‐メチルノナノイル‐ＣｏＡのＭＳ／ＭＳ解析を示す。８‐メチルノナン酸に対するＡＣＳ１の活性におけるｐＨ依存性を示す。異なるｐＨ範囲に対し、４つの異なるバッファー系が使用された。

［定義］
［細胞システム］

細胞システムとは、異所性タンパク質の発現をもたらす任意の細胞である。それには、バクテリア、酵母、植物細胞および動物細胞が含まれる。それには、原核および真核細胞の両方が含まれる。また、それにはリボソームのような細胞コンポーネントに依るタンパク質のインビトロ発現も含まれる。
［細胞システムの培養］

培養には、細胞が増殖および分裂することを可能にする培地を提供することが含まれる。培養には、細胞または細胞コンポーネントが、組み換えタンパク質を翻訳し、生成できるように複数のリソースを提供することも含まれる。
［タンパク質の発現］

タンパク質の生成は、遺伝子の発現後に発生し得る。それは、ＤＮＡがメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）に転写された後の複数の段階から成る。ｍＲＮＡは次にポリペプチド鎖に変換され、それは最終的にタンパク質にフォールディングされる。ＤＮＡは遺伝子導入を介して細胞に存在し、遺伝子導入とは核酸を細胞に意図的に導入するプロセスである。当該用語は通常、真核細胞における非ウイルス方法に使用される。当該用語が他の方法および細胞タイプにも言及することがあるが、他の用語が好ましい。バクテリア、植物細胞を含む動物以外の真核細胞における非ウイルスＤＮＡ転移を記載するのに、「形質転換」がより一般的に使用される。動物細胞においては、遺伝子導入が好ましい用語である。というのは、形質転換は、これらの細胞における癌状態（発癌）の進行を言及する際にも使用されるからである。ウイルス仲介のＤＮＡ転移を記載するのに、形質導入が通常使用される。形質転換、形質導入、およびウイルス感染が、本願の遺伝子導入の定義下に含まれる。

本開示の一実施形態は、中鎖から長鎖カルボン酸からカルボキシルＣｏＡを生成する生合成方法であり、細胞システムにおいてＡＣＳを発現させる段階と、中鎖から長鎖カルボン酸を上記細胞システムに供給する段階と、上記細胞システムを培地で培養する段階と、カルボキシルＣｏＡを生成する段階と、を備える。

さらなる実施形態は、上記ＡＣＳは、ゴーストチリペッパーからクローニングされたＡＣＳ１から発現される。代替的な実施形態は、上記ＡＣＳは、シロイヌナズナから発現され、ＬＣＡＳ４またはＬＣＡＳ５に基づく。別の実施形態において、上記ＡＣＳは、Ｃａｐｓｉｃｕｍｓｐｐ．（トウガラシ）からクローニングされたＡＣＳ２から発現される。さらに、上記ＡＣＳは、ゴーストチリペッパーからクローニングされたＡＣＳ１との少なくとも６６％の配列同一性を共有するＡＣＳである。別の変形例において、上記ＡＣＳは、ゴーストチリペッパーからクローニングされたＡＣＳ１との少なくとも９７％の配列類似性を共有するＡＣＳである。

さらなる実施形態は、中鎖または長鎖カルボン酸は、８‐メチル‐トランス‐６‐ノネン酸である。長鎖カルボン酸は概して１４から１８炭素数を有する一方、中鎖カルボン酸は概して８から１３炭素数を有する。一実施形態において、中鎖から長鎖カルボン酸を上記細胞システムに上記供給する段階は、上記中鎖から長鎖カルボン酸を上記細胞システムに追加する段階を含む。代替的な実施形態において、中鎖から長鎖カルボン酸を上記細胞システムに上記供給する段階は、上記細胞システムにおいて生合成経路から上記中鎖から長鎖カルボン酸を発現させる段階を含む。

当該実施形態における細胞システムについて、それはバクテリア、酵母、およびそれらの組み合わせ、または生合成製造の提供を可能にする任意の細胞システムから成る群から選択される。

本開示の一実施形態は、細胞システムにおいてＡＣＳを発現させる段階と、８‐メチル‐トランス‐６‐ノネン酸を上記細胞システムに供給する段階と、上記細胞システムを培地で培養する段階と、８‐メチルノネノイル‐ＣｏＡを生成する段階と、を備える、８‐メチルノネノイル‐ＣｏＡを生成する生合成方法である。上記ＡＣＳは、ゴーストチリペッパーからクローニングされたＡＣＳ１から発現される。上記ＡＣＳは、シロイヌナズナからクローニングされたＬＣＡＳ４またはＬＣＡＳ５から発現され得る。別の実施形態において、上記ＡＣＳは、Ｃａｐｓｉｃｕｍｓｐｐ．（トウガラシ）からクローニングされたＡＣＳ２から発現される。さらに、上記ＡＣＳは、ゴーストチリペッパーからクローニングされたＡＣＳ１との少なくとも６６％の配列同一性を共有するＡＣＳである。別の変形例において、上記ＡＣＳは、ゴーストチリペッパーからクローニングされた上記ＡＣＳ１との少なくとも９７％の配列類似性を共有するＡＣＳである。

［アシル‐ＣｏＡの生成］
［クローニング］

出願人らは、ＡＣＳ１‐ｓｕｍｏ‐Ｆ：ＣＧＣＧＡＡＣＡＧＡＴＴＧＧＡＧＧＴＧＣＡＡＣＡＧＡＴＡＡＡＴＴＴＡＴＴＡＴＴＧおよびＡＣＳ１‐ｓｕｍｏ‐Ｒ：ＧＴＧＧＣＧＧＣＣＧＣＴＣＴＡＴＴＡＴＣＡＣＴＴＧＧＴＡＣＣＣＴＴＧＴＡＣＡＴのプライマーを使用して、ゴーストチリペッパーの青玉果のｃＤＮＡからＡＣＳ１遺伝子を増幅させた。結果として得られたＰＣＲ生成物が、１％のアガロースゲルで精製され、リニアｐＥＴｉｔｅＮ‐ＨｉｓＳＵＭＯＫａｎ発現ベクター（ウィスコンシン州ミドルトンのルシジェン社製）を用いて混合された。当該ＤＮＡ混合物が、熱ショックによりＨＩ‐コントロール１０Ｇケミカルコンピテントセル（ルシジェン社製）を変換するのに使用された。その遺伝子挿入は完全に配列決定され、そのコードされるアミノ酸配列は、ＡＣＳ１のアミノ酸配列とアライメントされた（図５）。図５に示される通り、Ｃａｐｓｉｃｕｍａｎｎｕｕｍ（トウガラシ）ＡＣＳ１内のＩｌｅ４７６が、ゴーストペッパーＡＣＳ１内でＶａｌによって置換されていることを除き、これらの２つの配列はほぼ同一である。ゴーストペッパーＡＣＳ１の配列が、シロイヌナズナデータベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ．ｏｒｇ／）をブラストするのに使用され、ＬＣＡＳ４およびＬＡＣＳ５がそのホモログとして識別された（図６）。図６に示される通り、これらの３つの配列は、６６．７％の配列同一性および９７．１％の配列類似性を共有する。ＬＡＣＳ４およびＬＡＣＳ５の両方は、脂肪酸およびグリセロ脂質代謝に関与する長鎖アシル‐ＣｏＡシンテターゼとして生化学的に特徴付けられてきた（２００２年Ｓｈｏｃｋｅｙその他）。最近、シロイヌナズナの花粉コート脂質の形成にＬＡＣＳ４が必要であることが実証された（２０１１年Ｊｅｓｓｅｎその他）。
［発現］

出願人らは、ＨＩ−ＣｏｎｔｒｏｌＢＬ２１（ＤＥ３）セル（ルシジェン社製）の変換に、ｐＥＴｉｔｅＮ−ＨｉｓＳＵＭＯ‐ゴーストペッパーＡＣＳ１を使用し、Ｈｉｓ−ＳＵＭＯ−ＡＣＳ１の発現は、１６℃で２０時間、０．５ｍＭのＩＰＴＧにより誘導された。融合タンパク質は、Ｎｉ‐ＮＴＡカラムによって精製された（図７）。ＡＣＳ１は、分子量約７３．５Ｋｄを有し、Ｈｉｓ‐ＳＵＭＯタグのサイズは、約１２Ｋｄである。ＳＤＳ‐ＰＡＧＥ上のＨｉｓ−ＳＵＭＯゴーストペッパーＡＣＳ１融合タンパク質は、推測されるサイズ（約８５Ｋｄ）（図７）近くに移動した。
［生成物］

出願人らは、ゴーストペッパーＡＣＳ１（２０１１年チェンその他）の活性を測定するためにＨＰＬＣベースの方法を使用した。簡単に言うと、反応混合物（４００μＬ）は、０．１Ｍのトリス‐ＨＣＬ、ｐＨ７．５、２ｍＭのＤＴＴ、５ｍＭのＡＴＰ、１０ｍＭのＭｇＣｌ_２、０．５ｍＭのＣｏＡ、０．１％のトリトンおよび２００μＭのカルボン酸を含有していた。反応は、２０μｌの精製酵素を追加することで開始され、３０分後に２０μｌの酢酸を追加することで終了された。ＨＰＬＣがＤｉｏｎｅｘ−ＵｌｔｉＭａｔｅ（コピーライト）３０００ＬＣＳｙｓｔｅｍｓ（サーモサイエンティフィック）とともに、Ａｃｃｌａｉｍ（登録商標）１２０Ｃ１８逆相カラム（サーモサイエンティフィック；３μ、１２０Å、１５０×３ｍｍ）を使用して行われた。移動相は、溶媒Ａ（０．１％のトリフルオロ酢酸）および溶媒Ｂ（アセトニトリル）から成る。勾配溶離手順は、次の通りである。０〜５分、５％のＢ、５〜９分、５％から８０％の直線勾配となるＢ、９〜１１分、８０％のＢ、１１〜１２分、５％のＢである。フローレートは０．６ｍｌ／分であった。ダイオードアレイ検出器は、２００から４００ｎｍ範囲でデータを収集した。基質および生成物の検出および定量化については、ピーク領域が２５７ｎｍで測定された。

図８に示される通り、ＡＣＳ１は、長鎖カルボン酸よりも様々の中鎖カルボン酸において活性を有し、最も高い活性はカプリン酸（Ｃ１０）に対するものであった。対照的に、ＡＣＳ１は、短鎖カルボン酸である、酢酸（Ｃ２）または酪酸（Ｃ４）に対しては活性を全く示さなかった。

出願人らは次に、カプサイシン生合成経路の内因性中間体である８‐メチル‐／トランス‐６ノネン酸（６Ｅ）、または、その還元生成物である８‐メチルノナン酸（８Ｍ）を、ＡＣＳ１活性を試験する基質として使用した。図９に示される通り、ＡＣＳ１は、両方の基質との活性を示した。６Ｅの活性の方が高かった。出願人らは、生成物のピークに対する対応するＨＰＬＣ画分を収集し、さらなるＭＳ／ＭＳ識別のために、それらをＳｐｅｅｄＶａｃコンセントレータの上で乾燥させた。
［生成物の確認］

各乾燥させた試料は、メタノール：水：アセトニトリルが１：１：２の割合であるバッファー４０μｌで再懸濁された。１０μＬが、ＴｒｉＶｅｒｓａＮａｎｏｍａｔｅ（登録商標）（ニューヨーク州イサカのアドビオン社製）を使用する直接注入に使用された。質量分析計、ＬＴＱ−ＯｒｂｉｔｒａｐＶｅｌｏｓ（マサチューセッツ州ウォルサムのサーモフィッシャーサイエンティフィック社製）がネガティブイオンモードで操作された。ＭＳサーベイスキャンがＦＴ細胞に３００から２０００ｍ／ｚの質量範囲で行われた。解像度は、４００ｍ／ｚにおける６０，０００に設定された。ＣＩＤフラグメンテーションがＭＳ／ＭＳに使用され、検出が１．５ｍ／ｚの分離ウィンドウを用いてイオントラップで行われた。フラグメンテーションは、３５％の正規化衝突エネルギーで行われた。図１０から図１１に示される通り、ＭＳデータは、８‐メチル‐トランス‐６‐ノネノイル‐ＣｏＡおよび８‐メチルノナノイル‐ＣｏＡの分子量とそれぞれ一致した。

８‐メチルノナン酸に対するＡＣＳ１の最適なｐＨも調査された。アセタート、リン酸、トリス、およびグリシン／ＮａＯＨバッファーが使用され、４．０から１０．５のｐＨ範囲が提供された。図１２に示される通り、ＡＣＳ１の最適なｐＨは、約９．５である。

従って、出願人らは、ゴーストホットペッパーにおいて、カプサイシンシンターゼの基質を提供する新規な中鎖／長鎖アシル‐ＣｏＡシンテターゼを特定した。また、当該新規な酵素は、バイオ燃料業界における中鎖脂肪酸誘導体を作成する応用も有してよい。

追加の複数の実施形態は、遺伝子の過剰発現のための標準的な既知の技術を利用してＡＣＳ１を過剰発現させることによる、コショウ植物におけるカプサイシノイドのレベルを変更するためのＡＣＳ１の使用を含む。別の実施形態は、遺伝子の発現をノックアウトまたはノックダウンするための標準的な既知の技術を利用してＡＣＳ１をノックアウトまたはノックダウンすることによる、コショウ植物におけるカプサイシノイドのレベルを調節するためのＡＣＳ１の使用を含む。繰り返すが、標準的な分子細胞法および技術による過剰発現またはノックアウト若しくはノックダウンは、当業者によって既知である。別の実施形態は、ＡＣＳ１の発現または過剰発現に関与する複数のアシル‐ＣｏＡおよびそれらの脂肪酸を含む下流代謝産物を生成するためのＡＣＳ１の使用を含む。別の変形例は、複数のアシル‐ＣｏＡおよびそれらの脂肪酸を含む下流代謝産物のレベルを調節するためのＡＣＳ１の使用であり、ＡＣＳ１をノックアウトまたはノックダウンすることを含む。

上記複数の方法により作成される複数のアシルＣｏＡは、カプサイシンを作成するのに利用され得、アシルＣｏＡは概して中鎖型であろう。繰り返すが、ＡＣＳ１は中鎖および長鎖両方のカルボン酸のアシル‐ＣｏＡへの変換を媒介可能であり、中鎖活性は今日のバイオ燃料産業における必須成分であるので、中鎖活性の方が長鎖活性よりはるかに重要である。ＡＣＳ１の上記の他の重要な点は、それがトランスジェニック技術を介して植物におけるカプサイシンレベルを変更するのに使用可能なことである。しかしながら、ＡＣＳ１は長鎖アシル‐ＣｏＡに関する使用から除外されない。

一実施形態において、バクテリアベースのシステムまたは酵母ベースのシステムのような細胞システムが、ＡＣＳの発現のために改変可能である。ＡＣＳは、ゴーストペッパーからクローニングされたＡＣＳ１であり得る。他の好適なＡＣＳは、シロイヌナズナからのＬＣＡＳ４およびＬＣＡＳ５に基づくものである。他の既知のＡＣＳ１およびＡＣＳ２も、細胞システムにおいて発現可能である。次に、８メチル‐トランス‐６‐ノネン酸および８‐メチルノナン酸のような適切な基質が細胞システムに供給され得る。当該基質はまた、細胞システム内の生合成経路の一部として発現可能である。次に、細胞システムは培養され、８‐メチル‐トランス‐６‐ノネノイル‐ＣｏＡまたは８‐メチルノナノイル‐ＣｏＡの生合成製造を可能にする。
［同一性および類似性］

同一性とは、配列のアライメント後における一組の配列間で同一であるアミノ酸の割合をいう（これは、配列情報または構造情報または何らかの他の情報のみを使用して行うことができるが、通常は配列情報のみに基づく）。類似性とは、いくつかの類似性マトリックスを使用するアライメントに基づき、割り当てられたスコアをいう。類似性インデックスは、次のＢＬＯＳＵＭ６２、ＰＡＭ２５０、若しくはＧＯＮＮＥＴ、または当業者によってタンパク質の配列アライメントのために使用される任意のマトリックスのうちのいずれかであってよい。

同一性は、２つのサブ配列間の一致の度合いをいう（当該配列間にギャップがない）。２５％または２５％より高い同一性は、機能の類似性を示唆し、一方１８〜２５％の同一性は、構造または機能の類似性を示唆する。２つの全く無関係またはランダムな配列（１００より大きい残基）が、２０％より高い同一性を有し得ることに留意されたい。類似性は、２つの配列を比較する際の２つの配列間の類似の度合いである。これは、それらの同一性に依存する。

前述の説明から明らかなように、本開示の特定の態様は、本明細書に示される実施例の具体的な詳細によっては限定されず、従って、複数の他の修正および応用、またはそれらの均等技術が当業者に想起されことが考えられる。従って、特許請求の範囲は、本開示の精神および範囲から逸脱しない、そのようなすべての修正および応用に及ぶことが意図されている。

さらに、別途規定されない限り、本明細書で使用されるすべての技術的および科学的な用語は、本開示が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるものと同一の意味を有する。本明細書に記載のものと同様または均等な任意の方法および材料が、本開示の実施または試験において使用可能であり、好ましい方法および材料が上記されている。

本開示の他の態様、目的および利点は、図面、本開示および添付の特許請求を検討することで得ることが可能である。
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Claims

細胞システムにおいてＡＣＳを発現させる段階と、
中鎖カルボン酸若しくは長鎖カルボン酸またはその両方を前記細胞システムに供給する段階と、
前記細胞システムを培地で培養する段階と、
カルボキシルＣｏＡを生成する段階と、を備える、中鎖カルボン酸または長鎖カルボン酸からカルボキシルＣｏＡを生成する生合成方法。
前記ＡＣＳはゴーストチリペッパーからクローニングされたＡＣＳ１、Ｃａｐｓｉｃｕｍａｎｎｕｕｍ（トウガラシ）からクローニングされたＣａＳＩＧ４、若しくはＣａｐｓｉｃｕｍａｎｎｕｕｍ（トウガラシ）からクローニングされたＡＣＳ１、またはそれらの組み合わせから発現される、請求項１に記載の中鎖カルボン酸または長鎖カルボン酸からカルボキシルＣｏＡを生成する生合成方法。
前記ＡＣＳは、シロイヌナズナからクローニングされたＬＣＡＳ４またはＬＣＡＳ５に基づく遺伝子から発現される、請求項１に記載の中鎖カルボン酸または長鎖カルボン酸からカルボキシルＣｏＡを生成する生合成方法。
前記ＡＣＳは、コショウ植物からクローニングされたＡＣＳ２から発現される、請求項１に記載の中鎖カルボン酸または長鎖カルボン酸からカルボキシルＣｏＡを生成する生合成方法。
前記ＡＣＳは、ゴーストチリペッパーからクローニングされたＡＣＳ１との少なくとも６６％の配列同一性を共有するＡＣＳである、請求項１に記載の中鎖カルボン酸または長鎖カルボン酸からカルボキシルＣｏＡを生成する生合成方法。
前記ＡＣＳは、ゴーストチリペッパーからクローニングされたＡＣＳ１との少なくとも９７％の配列類似性を共有するＡＣＳである、請求項１に記載の中鎖カルボン酸または長鎖カルボン酸からカルボキシルＣｏＡを生成する生合成方法。
前記長鎖カルボン酸は、８‐メチル‐トランス‐６‐ノネン酸である、請求項１に記載の中鎖カルボン酸または長鎖カルボン酸からカルボキシルＣｏＡを生成する生合成方法。
中鎖カルボン酸若しくは長鎖カルボン酸またはその両方を前記細胞システムに前記供給する段階は、中鎖カルボン若しくは長鎖カルボン酸またはその両方を前記細胞システムに追加する段階を含む、請求項１に記載の中鎖カルボン酸または長鎖カルボン酸からカルボキシルＣｏＡを生成する生合成方法。
中鎖カルボン酸若しくは長鎖カルボン酸またはその両方を前記細胞システムに前記供給する段階は、前記細胞システムにおける生合成経路に基づき、前記中鎖カルボン酸若しくは長鎖カルボン酸またはその両方を前記細胞システムにおいて発現させる段階を含む、請求項１に記載の中鎖カルボン酸または長鎖カルボン酸からカルボキシルＣｏＡを生成する生合成方法。
前記細胞システムは、バクテリア、酵母、植物細胞、動物細胞、インビトロ翻訳システム、およびそれらの組み合わせから成る群から選択される、請求項１に記載の中鎖カルボン酸または長鎖カルボン酸からカルボキシルＣｏＡを生成する生合成方法。
細胞システムにおいてＡＣＳを発現させる段階と、
８‐メチル‐トランス‐６‐ノネン酸を前記細胞システムに供給する段階と、
前記細胞システムを培地で培養する段階と、
８‐メチルノネノイル‐ＣｏＡを生成する段階と、を備える、８‐メチルノネノイル‐ＣｏＡを生成する生合成方法。
前記ＡＣＳはゴーストチリペッパーからクローニングされたＡＣＳ１、トウガラシからクローニングされたＣａＳＩＧ４、若しくはトウガラシからクローニングされたＡＣＳ１、またはそれらの組み合わせから発現される、請求項１１に記載の８‐メチルノネノイル‐ＣｏＡを生成する生合成方法。
前記ＡＣＳは、シロイヌナズナからクローニングされたＬＣＡＳ４またはＬＣＡＳ５に基づく遺伝子から発現される、請求項１１に記載の８‐メチルノネノイル‐ＣｏＡを生成する生合成方法。
前記ＡＣＳは、コショウ植物からクローニングされたＡＣＳ２から発現される、請求項１１に記載の８‐メチルノネノイル‐ＣｏＡを生成する生合成方法。
前記ＡＣＳは、ゴーストチリペッパーからクローニングされたＡＣＳ１との少なくとも６６％の配列同一性を共有するＡＣＳである、請求項１１に記載の８‐メチルノネノイル‐ＣｏＡを生成する生合成方法。
前記ＡＣＳは、ゴーストチリペッパーからクローニングされたＡＣＳ１との少なくとも９７％の配列類似性を共有するＡＣＳである、請求項１１に記載の８‐メチルノネノイル‐ＣｏＡを生成する生合成方法。
８‐メチル‐トランス‐６‐ノネン酸を前記細胞システムに前記供給する段階は、前記８‐メチル‐トランス‐６‐ノネン酸を前記細胞システムに追加する段階を含む、請求項１１に記載の８‐メチルノネノイル‐ＣｏＡを生成する生合成方法。
８‐メチル‐トランス‐６‐ノネン酸を前記細胞システムに前記供給する段階は、前記細胞システムにおける生合成経路に基づき、前記８‐メチル‐トランス‐６‐ノネン酸を前記細胞システムにおいて発現させる段階を含む、請求項１１に記載の８‐メチルノネノイル‐ＣｏＡを生成する生合成方法。
前記細胞システムは、バクテリア、酵母、植物細胞、動物細胞、インビトロ翻訳システム、およびそれらの組み合わせから成る群から選択される、請求項１１に記載の８‐メチルノネノイル‐ＣｏＡを生成する生合成方法。
ＡＣＳ１を過剰発現させる段階、またはＡＣＳ１をノックアウト若しくはノックダウンする段階を備える、コショウ植物におけるカプサイシノイドのレベルを調節するためのＡＣＳ１の使用。
細胞システムにおいてＡＣＳ１を過剰発現させる段階または細胞システムにおいてＡＣＳ１をノックアウト若しくはノックダウンする段階を備える、アシル‐ＣｏＡおよびそれらの脂肪酸を含む下流代謝産物のレベルを調節するためのＡＣＳ１の使用。