JP2008514221A - シンテターゼ酵素 - Google Patents
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Abstract
藻類アシル−CoAシンテターゼを発現し、コエンザイムAで長鎖脂肪酸をエステル化するためのプロセスを含む、トランスジェニック細胞に関する。
Description
本発明は藻類のアシル−CoAシンテターゼを発現するトランスジェニック細胞に関する。
トリアシルグリセロール中に脂肪酸を細胞内に貯蔵するには、脂肪酸がアシル−CoAシンテターゼ酵素の作用を通じてアシル−CoAをまず活性化する必要がある。アシル−CoAは、アシル−CoAシンテターゼにより脂肪酸、ATP及びコエンザイムAから作られる。アシル−CoAシンテターゼは、脂肪酸の異なる鎖長又は異なる飽和度に対して基質特異性を示す。例えば、アラキドン酸塩(20:4n−6)を好むアシル−CoAシンテターゼがラットで同定された。この酵素はアラキドン酸塩、エイコサペンタエン酸(EPA)に高い親和性を有し、パルミチン酸塩には低い親和性を有する。また、アシル−CoAシンテターゼのいくつかのアイソフォームがアラビドプシスで同定された。アシル−CoAシンテターゼ(ACSs)は、ほとんど全ての脂肪酸由来の分子の生合成経路において重要な役割を果たしている。長鎖アシル−CoAシンテターゼ(LACS)酵素は、アシルCoAsを生成するために遊離脂肪酸をコエンザイムAにエステル化するが、このステップは、多くの脂質代謝酵素による脂肪酸の利用に対し必要となる重要な活性化ステップである(1)。
酵素反応のメカニズムは、アシルアデニレート(アシルAMP)中間体の形成を介して進行する2段階反応である(2)。アシル−CoAは、脂肪酸の伸長及びβ酸化、酵素の活性化、細胞情報伝達、及び転写制御など多くの代謝経路の重要な中間体として役立っている[3]。細胞代謝におけるアシル−CoAシンテターゼ(ACS)の様々な役割に対応して、多くの真核生物は、短い(C6−C8)、中程度(C10−C12)、長い(C14−C20)、非常に長い(>C22)鎖長の脂肪酸を特異的に活性化する幾つかの異なるACSsをコードしている[3]。さらに、ある種の生物は各セットのアシル鎖長に対して複数の酵素を持っている。植物において、LACS活性は幾つかの細胞内コンパートメントに局在し[4,5]、新規の脂肪酸合成によって合成されるアシル鎖をCoAのエステルに活性化させ、その後、発生過程の種子中での膜グリセロ脂質及び貯蔵脂質(トリアシルグリセロール、TAGs)の合成に関与する代謝経路に使用可能にする[6]。
さらに、LACS酵素は脂肪酸輸送に重要な役割を果たしている。この過程は、バクテリア[7]、酵母(Saccharomayces cerevisiae)[8]、及び哺乳類細胞[9]において詳細に研究されてきた。
酵素反応のメカニズムは、アシルアデニレート(アシルAMP)中間体の形成を介して進行する2段階反応である(2)。アシル−CoAは、脂肪酸の伸長及びβ酸化、酵素の活性化、細胞情報伝達、及び転写制御など多くの代謝経路の重要な中間体として役立っている[3]。細胞代謝におけるアシル−CoAシンテターゼ(ACS)の様々な役割に対応して、多くの真核生物は、短い(C6−C8)、中程度(C10−C12)、長い(C14−C20)、非常に長い(>C22)鎖長の脂肪酸を特異的に活性化する幾つかの異なるACSsをコードしている[3]。さらに、ある種の生物は各セットのアシル鎖長に対して複数の酵素を持っている。植物において、LACS活性は幾つかの細胞内コンパートメントに局在し[4,5]、新規の脂肪酸合成によって合成されるアシル鎖をCoAのエステルに活性化させ、その後、発生過程の種子中での膜グリセロ脂質及び貯蔵脂質(トリアシルグリセロール、TAGs)の合成に関与する代謝経路に使用可能にする[6]。
さらに、LACS酵素は脂肪酸輸送に重要な役割を果たしている。この過程は、バクテリア[7]、酵母(Saccharomayces cerevisiae)[8]、及び哺乳類細胞[9]において詳細に研究されてきた。
海洋微小藻類は多種多様な脂肪酸を生成し、幾つかの種は健康に有用な多価不飽和脂肪酸(PUFAs)を含んでいるため興味を集めている[11]。以下、多価不飽和脂肪酸をPUFAs、LCPUFA又はLCPUFAs(polyunsaturated fatty acids,PUFA,long chain polyunsaturated fatty acids,LCPUFA)と称する。高等植物において微小藻類の非常に長鎖の多価不飽和脂肪酸(VLCPUFA)生合成経路の究極的な再構築が望ましいゴールであるが、そのためには、TAGsへの取り込みに適する基質を形成するための脱飽和、伸長、及び活性化を導入する必要がある。
同時係属出願において、PUFA生合成経路に関連する活性をコードする核酸分子について記載している。WO03/078639が引用文献としてここに含まれているが(特にそこに開示されている核酸配列)、そこには長鎖脂肪酸の修飾に関与するエロンゲース、デサチュラーゼ、アシル−CoAシンテターゼ及びジアシルグリセロール アシルトランスフェラーゼなど、幾つかの酵素活性について記載されている。これらの核酸分子は藻類の1種であるPavlova lutheriから単離される。現在のところまだ公開されていない出願のPCT/GB04/003057が引用文献としてここに含まれているが(特にそこに開示されている核酸配列)、藻類種のThalassiosira pseudonanaから単離されたエロンゲースポリペプチドの特徴付けについて記載されている。さらに、引用文献としてここに含まれており(特にそこに開示されている核酸配列)、現在のところまだ公開されていない出願のGB0403452.6には、新規デサチュラーゼ活性を持つ酵素が記載されている。例えば、Δ11−デサチュラーゼ活性を示すチトクロームb5デサチュラーゼ、さらにΔ6−デサチュラーゼ活性を持つ酵素が、各々、Thalassiosira pseudonanaから単離される。我々は、Thalassiosira pseudonanaのアシル−CoAシンテターゼ(TplascA)の特徴について記載する。この酵素は、健康に有用なVLCPUFAs EPA及びドコサヘキサエン酸(DHA)に対して高い活性を示し、酵母TAGs中に貯蔵されるDHAの量を増加させる。
本発明のある態様によると、図3Aに示される配列からなる核酸分子、又は該配列とストリンジェントなハイブリダイズ条件下でハイブリダイズし、かつ、該核酸分子がアシル−CoAシンテターゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸分子の核酸配列を含む核酸分子を含んでなる、トランスジェニック細胞が提供される。
本発明の好ましい実施態様によれば、前記核酸分子は図3Aに示される核酸配列と約50%の相同性を持つ核酸配列を含む。
より好ましくは、前記相同性は、図3Aに示される核酸配列と少なくとも50%、60%、70%、80%、90% 又は少なくとも99%の同一性を有し、アシル−CoAシンテターゼ活性を持つポリペプチドをコードする。
本発明のより好ましい実施態様において、前記核酸分子は図3Aに示される核酸配列を含む。好ましくは、前記核酸分子は図3Aに示される核酸配列からなる。
本発明の好ましい実施態様によれば、前記核酸分子は図3Aに示される核酸配列と約50%の相同性を持つ核酸配列を含む。
より好ましくは、前記相同性は、図3Aに示される核酸配列と少なくとも50%、60%、70%、80%、90% 又は少なくとも99%の同一性を有し、アシル−CoAシンテターゼ活性を持つポリペプチドをコードする。
本発明のより好ましい実施態様において、前記核酸分子は図3Aに示される核酸配列を含む。好ましくは、前記核酸分子は図3Aに示される核酸配列からなる。
本発明の更なる態様によると、図3Bに表されるアミノ酸配列又は配列が少なくとも1アミノ酸残基の付加、欠失又は置換によって修飾される変異体アミノ酸配列で示されるポリペプチドであって、該ポリペプチド又は変異体ポリペプチドがアシル−CoAシンテターゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸分子を発現するように適合されるトランスジェニック細胞が提供される。
核酸分子のハイブリダイゼーションは、2つの相補的な核酸分子がお互いの間である程度の水素結合が起きるときに生じる。ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーは、核酸を取り巻く環境、ハイブリダイゼーションの方法の性質、及び用いる核酸分子の組成と長さによって変動する。特定の程度のストリンジェンシーを達成するために必要なハイブリダイゼーション条件に関する計算については、Sambrookら,Molecular Cloning:A Lagoratory Manual(Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY,1993);及びTijssen,Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology−Hybridization with Nucleic Acid Probes Part I,Chapter2(Elsevier,New York,1993)中で論じられている。Tmは、核酸分子のある鎖の50%がその相補鎖とハイブリダイズする温度のことである。以下にハイブリダイゼーション条件の例を示すが、これらに限定されるわけではない:
極めて高いストリンジェンシー(少なくとも90%の同一性を共有する配列のハイブリダイズを可能にする)
ハイブリダイゼーション:5xSSC 65℃ 16時間
2回の洗浄 :2xSSC 室温 15分間 各回
2回の洗浄 :0.5xSSC 65℃ 20分間 各回
高いストリンジェンシー(少なくとも80%の同一性を共有する配列のハイブリダイズを可能にする)
ハイブリダイゼーション:5x−6xSSC 65℃−70℃ 16−20時間
2回の洗浄 :2xSSC 室温 5−20分間 各回
2回の洗浄 :1xSSC 55℃−70℃ 30分間 各回
低いストリンジェンシー(少なくとも50%の同一性を共有する配列のハイブリダイズを可能にする)
ハイブリダイゼーション:6xSSC 室温〜55℃ 16−20時間
少なくとも2回の洗浄 :2x−3xSSC 室温〜55℃ 20−30分間 各回
核酸分子のハイブリダイゼーションは、2つの相補的な核酸分子がお互いの間である程度の水素結合が起きるときに生じる。ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーは、核酸を取り巻く環境、ハイブリダイゼーションの方法の性質、及び用いる核酸分子の組成と長さによって変動する。特定の程度のストリンジェンシーを達成するために必要なハイブリダイゼーション条件に関する計算については、Sambrookら,Molecular Cloning:A Lagoratory Manual(Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY,1993);及びTijssen,Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology−Hybridization with Nucleic Acid Probes Part I,Chapter2(Elsevier,New York,1993)中で論じられている。Tmは、核酸分子のある鎖の50%がその相補鎖とハイブリダイズする温度のことである。以下にハイブリダイゼーション条件の例を示すが、これらに限定されるわけではない:
極めて高いストリンジェンシー(少なくとも90%の同一性を共有する配列のハイブリダイズを可能にする)
ハイブリダイゼーション:5xSSC 65℃ 16時間
2回の洗浄 :2xSSC 室温 15分間 各回
2回の洗浄 :0.5xSSC 65℃ 20分間 各回
高いストリンジェンシー(少なくとも80%の同一性を共有する配列のハイブリダイズを可能にする)
ハイブリダイゼーション:5x−6xSSC 65℃−70℃ 16−20時間
2回の洗浄 :2xSSC 室温 5−20分間 各回
2回の洗浄 :1xSSC 55℃−70℃ 30分間 各回
低いストリンジェンシー(少なくとも50%の同一性を共有する配列のハイブリダイズを可能にする)
ハイブリダイゼーション:6xSSC 室温〜55℃ 16−20時間
少なくとも2回の洗浄 :2x−3xSSC 室温〜55℃ 20−30分間 各回
本発明の好ましい実施態様において、前記修飾は前記ポリペプチドの酵素活性を保持又は促進する。
変異体ポリペプチドは、アミノ酸配列において、組み合わされて存在し得る1又は複数の置換、付加、欠失トランケーションにより相違が生じる。中でも好ましい変異体は保存的なアミノ酸置換により、対比されるポリペプチドと異なるものである。このような置換は、類似の性質の他のアミノ酸と任意のアミノ酸を置換するものである。以下の非限定的に示すアミノ酸のリストは、保存的置換(類似の)と考えられる:a)アラニン、セリン及びスレオニン;b)グルタミン酸及びアスパラギン酸;c)アスパラギン及びグルタミンd)アルギニン及びリジン;e)イソロイシン、ロイシン、メチオニン及びバリン、及びf)フェニルアラニン、チロシン及びトリプトファン。最も好ましくは、変異の対象となるポリペプチドと同じ生物学的機能及び活性を保持又は促進する変異体である。
変異体ポリペプチドは、アミノ酸配列において、組み合わされて存在し得る1又は複数の置換、付加、欠失トランケーションにより相違が生じる。中でも好ましい変異体は保存的なアミノ酸置換により、対比されるポリペプチドと異なるものである。このような置換は、類似の性質の他のアミノ酸と任意のアミノ酸を置換するものである。以下の非限定的に示すアミノ酸のリストは、保存的置換(類似の)と考えられる:a)アラニン、セリン及びスレオニン;b)グルタミン酸及びアスパラギン酸;c)アスパラギン及びグルタミンd)アルギニン及びリジン;e)イソロイシン、ロイシン、メチオニン及びバリン、及びf)フェニルアラニン、チロシン及びトリプトファン。最も好ましくは、変異の対象となるポリペプチドと同じ生物学的機能及び活性を保持又は促進する変異体である。
さらに、本発明はここに開示されるポリペプチド配列と少なくとも75%の同一性を有するポリペプチド、又はその断片及び機能的に等価なポリペプチドを提示する。ある実施態様において、本ポリペプチドは、ここに開示されるアミノ酸配列と少なくとも85%の同一性、より好ましくは少なくとも90%の同一性、さらにより好ましくは少なくとも95%の同一性、よりさらに好ましくは少なくとも97%の同一性、及び最も好ましくは少なくとも99%の同一性を有する。
本発明の好ましい実施態様において、前記核酸分子は藻類種から単離される
好ましい前記藻類種は以下のグループから選択される:Amphidinium carterae,Amphiphora hyalina,Amphiphora sp.,Chaetoceros gracilis,Coscinodiscus sp.,Crypthecodinium cohnii,Cryptomonas sp.,Cylindrotheca fusiformis,Haslea ostrearia,Isochrysis galbana,Nannochloropsis oculata,Navicula sp.,Nitzschia closterium,Pavlova lutheri,Phaeodactylum tricornutum,Prorocentrum minimum,Rhizosolenia setigera,Skeletonema costatum,Skeletonema sp.,Tetraselmis tetrathele,Thalassiosira nitzschioides,Thalassiosira heterophorma,Thalassiosira pseudonana,Thalassiosira stellaris。
好ましい前記藻類種は以下のグループから選択される:Amphidinium carterae,Amphiphora hyalina,Amphiphora sp.,Chaetoceros gracilis,Coscinodiscus sp.,Crypthecodinium cohnii,Cryptomonas sp.,Cylindrotheca fusiformis,Haslea ostrearia,Isochrysis galbana,Nannochloropsis oculata,Navicula sp.,Nitzschia closterium,Pavlova lutheri,Phaeodactylum tricornutum,Prorocentrum minimum,Rhizosolenia setigera,Skeletonema costatum,Skeletonema sp.,Tetraselmis tetrathele,Thalassiosira nitzschioides,Thalassiosira heterophorma,Thalassiosira pseudonana,Thalassiosira stellaris。
本発明の好ましい実施態様において、前記アシル−CoAシンテターゼ活性は20及び/又は22炭素多価不飽和脂肪酸を修飾する。好ましくは、前記脂肪酸は20:4n6,20:5n3又は22:6n3炭素多価不飽和脂肪酸である。
本発明のさらなる態様において、本発明の核酸分子を含むベクターが提供される。
特に安定な形質転換体のためのゲノムへの組換えのために該核酸を細胞に導入するのに該ベクターが使用される場合には、本発明の核酸を含むベクターにはプロモーター又は他の制御配列が含まれる必要はない。
好ましくは、ベクター中の核酸は、原核(例えば、バクテリア)又は真核(例えば、カビ、植物、哺乳類又は昆虫細胞)などの宿主細胞中で、適当なプロモーター又は転写のための他の制御エレメントと作用可能に結合される。ベクターは複数の宿主中で機能する二作用性発現ベクターである。本発明のポリペプチドをコードする核酸の例において、その天然のプロモーター又は他の制御エレメントが含まれてもよく、また、cDNAの場合には、宿主細胞中での発現に対し適当なプロモーター又は他の制御エレメントの制御下にあってもよい。
本発明のさらなる態様において、本発明の核酸分子を含むベクターが提供される。
特に安定な形質転換体のためのゲノムへの組換えのために該核酸を細胞に導入するのに該ベクターが使用される場合には、本発明の核酸を含むベクターにはプロモーター又は他の制御配列が含まれる必要はない。
好ましくは、ベクター中の核酸は、原核(例えば、バクテリア)又は真核(例えば、カビ、植物、哺乳類又は昆虫細胞)などの宿主細胞中で、適当なプロモーター又は転写のための他の制御エレメントと作用可能に結合される。ベクターは複数の宿主中で機能する二作用性発現ベクターである。本発明のポリペプチドをコードする核酸の例において、その天然のプロモーター又は他の制御エレメントが含まれてもよく、また、cDNAの場合には、宿主細胞中での発現に対し適当なプロモーター又は他の制御エレメントの制御下にあってもよい。
「プロモーター」は、転写開始部位の上流のヌクレオチド配列を意味し、転写に必要な全ての制御領域を含む。適当なプロモーターには、設計に応じて、植物に含まれる植物細胞における発現のための構成的、組織特異的、誘導的、発生的又はその他のプロモーターが含まれる。
構成的なプロモーターには、例えば、CaMV 35S プロモーター(Odellら、(1985) Nature 313,9810−812);ライスアクチン(McElroyら、(1990) Plant Cell 2:163−171);ユビキチン(Christianら、(1989) Plant MoI. Biol. 18(675−689);pEMU(Lastら、(1991) Theor Appl. Genet. 81:581−588);MAS(Veltenら、(1984) EMBO J. 3.2723−2730);ALSプロモーター(米国特許出願番号第08/409,297)などである。他の構成的プロモーターは、米国特許第5,608,149;5,608,144;5,604,121;5,569,597;5,466,785;5,399,680,5,268,463;及び5,608,142に含まれる。
構成的なプロモーターには、例えば、CaMV 35S プロモーター(Odellら、(1985) Nature 313,9810−812);ライスアクチン(McElroyら、(1990) Plant Cell 2:163−171);ユビキチン(Christianら、(1989) Plant MoI. Biol. 18(675−689);pEMU(Lastら、(1991) Theor Appl. Genet. 81:581−588);MAS(Veltenら、(1984) EMBO J. 3.2723−2730);ALSプロモーター(米国特許出願番号第08/409,297)などである。他の構成的プロモーターは、米国特許第5,608,149;5,608,144;5,604,121;5,569,597;5,466,785;5,399,680,5,268,463;及び5,608,142に含まれる。
化学物質によって制御されるプロモーターは外部からの化学物質制御因子の適用を通じて植物における遺伝子発現を修飾するために使用することができる。目的に応じて、化学物質誘導性遺伝子発現の用途の場合、化学物質誘導性プロモーターを、又は化学物質抑制性発現の用途の場合、化学物質抑制性プロモーターを使用してもよい。化学物質誘導性プロモーターは、当該技術分野において知られており、限定はしないが、ベンゼンスルホンアミド ハーミサイド セーフナーによって活性化されるトウモロコシIn2−2プロモーター、発芽前散布除草剤として使用される疎水性求電子化合物によって活性化されるトウモロコシGSTプロモーター、及びサリチル酸によって活性化されるタバコPR−1aプロモーターが含まれる。その他の対象となる化学物質制御プロモーターは、ステロイド応答性プロモーター(例えば、Schemaら(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88:10421−10425及びMcNellieら(1998)Plant J.14(2):247−257に記載のグルココルチコイド誘導性プロモーターを参照のこと)、及びテトラサイクリン誘導性及びテトラサイクリン抑制性プロモーター(例えば、Gatzら(1991)MoI.Gen.Genet.227:229−237及びここに出典として含まれる、米国特許第5,814,618号及び第5,789,156号を参照のこと)が含まれる。
特定の組織における増強した発現が望まれる場合、組織特異的なプロモーターを利用することができる。組織特異的プロモーターには、Yamamotoら(1997)Plant J.12(2):255−265;Kawamataら(1997)Plant Cell Physiol.38(7):792−803;Hansenら(1997)MoI.Gen.Genet.254(3):337−343;Russellら(1997)Transgenic Res.6(2):157−168;Rinehartら(1996)Plant Physiol.112(3):1331−1341;Van Campら(1996)Plant Physiol.112(2):525−535;Canevascniら(1996)Plant Physiol.112(2):513−524;Yamamotoら(1994)Plant Cell Physiol.35(5):773−778;Lam(1994)Results Probl. Cell Differ.20:181−196;Orozcoら(1993)Plant MoI.Biol.23(6):1129−1138;Mutsuokaら(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90(20):9586−9590;及びGuevara−Garciaら(1993)Plant J.4(3):495−50、に記載されるものが含まれる。
本発明の好ましい実施態様において、前記組織特異的プロモーターは、発生中の脂肪種子のオイルの蓄積の間に活性化されるプロモーターである;Brounら(1988)Plant J.13(2):201−210を参照のこと
本発明の好ましい実施態様において、前記組織特異的プロモーターは、発生中の脂肪種子のオイルの蓄積の間に活性化されるプロモーターである;Brounら(1988)Plant J.13(2):201−210を参照のこと
「作用可能に結合」とは、プロモーターから開始される転写にとって適切な位置及び方向で、同じ核酸分子の一部として結合されることを意味する。プロモーターに作用可能に結合したDNAは、そのプロモーターの「転写開始制御下」にある。
好ましい実施態様において、プロモーターは誘導性プロモーター又は発生において制御されるプロモーターである。
好ましい実施態様において、プロモーターは誘導性プロモーター又は発生において制御されるプロモーターである。
特定のベクターは植物ベクターとして作用する核酸コンストラクトである。植物においてこれまでに広く、有効に使用されている特定の方法及びベクターは、Guerineau及びMullineaux(1993)(Plant Molecular Biology Labfax(Croy RRD ed) Oxford, BIOS Scientific Publishers, pp 121−148中、「Plant transformation and expression vectors」)に記載されている。適切なベクターには植物ウィルス由来のベクターが含まれてもよい(例えば、EP−A−194809を参照のこと)。
また、ベクターには除草剤(herbicides)に耐性な選択的表現型を付与するような選択的遺伝子マーカー(例えば、カナマイシン、ハイグロマイシン、ホスフィノトリシン、クロルスルフロン、メトトレキセート、ゲンタマイシン、スペクチノマイシン、イミダゾリノン及びグリフォセート)が含まれていてもよい。
また、ベクターには除草剤(herbicides)に耐性な選択的表現型を付与するような選択的遺伝子マーカー(例えば、カナマイシン、ハイグロマイシン、ホスフィノトリシン、クロルスルフロン、メトトレキセート、ゲンタマイシン、スペクチノマイシン、イミダゾリノン及びグリフォセート)が含まれていてもよい。
上記の代わりに、又は加えて、前記ベクターは哺乳類細胞のトランスフェクション又は酵母細胞のトランスフェクションに適切なベクターである。後者の例として、2μエピソーム型ベクターなどのマルチコピーベクターが好ましい。あるいは、酵母のCENベクター及びYIPベクターなどのインテグレート型ベクターは、Saccharomyces cerevisiae及びPichia spp.に適する。
本発明のさらに好ましい実施態様において、前記細胞が前記核酸分子によってコードされるものを過剰発現する。
本発明の好ましい実施態様において、同じ種で形質転換していない対照となる細胞と比較した場合、前記過剰発現は少なくとも2倍高い。
好ましくは、前記過剰発現は、同じ種で形質転換していない対照となる細胞と比較して、少なくとも3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍又は少なくとも10倍である。
本発明の好ましい実施態様において、同じ種で形質転換していない対照となる細胞と比較した場合、前記過剰発現は少なくとも2倍高い。
好ましくは、前記過剰発現は、同じ種で形質転換していない対照となる細胞と比較して、少なくとも3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍又は少なくとも10倍である。
本発明の好ましい実施態様において、前記核酸分子はcDNAである。
さらにより好ましい実施態様において、前記核酸分子はゲノムDNAである。
さらにより好ましい実施態様において、前記核酸分子はゲノムDNAである。
本発明の好ましい実施態様において、前記トランスジェニック細胞は真核細胞である。
他の好ましい実施態様において、前記細胞は原核細胞である。
さらに好ましい実施態様において、前記真核細胞は植物細胞である。本発明の植物細胞を含む植物は、前記植物によって作られる種子としても提供される。
本発明の好ましい実施態様において、前記植物は以下に示される中から選択される:トウモロコシ(Zea mays),キャノーラ(Brassica napus,Brassica rapa ssp.), 麻(Linum usitatissimum),アルファルファ(Medicago sativa),ライス(Oryza sativa),ライ麦(Secale cerate),モロコシ(Sorghum bicolor,Sorghum vulgare),ヒマワリ(Helianthus annus),小麦(Tritium aestivum),大豆(Glycine max),タバコ(Nicotiana tabacum),ジャガイモ(Solanum tuberosum), ピーナッ(Arachis hypogaea),綿(Gossypium hirsutum),サツマイモ(Iopmoea batatus), キャッサバ(Manihot esculenta),コーヒー(Cofea spp.),ココナッツ(Cocos nucifera),パイナップル(Anana comosus), 柑橘類(Citrus spp.),ココア(Theobroma cacao),茶(Camellia senensis),バナナ(Musa spp.),アボカド(Persea americana),イチジク(Ficus casica),グアヴァ(Psidium guajava),マンゴー(Mangifer indica),オリーブ(Olea europaea),パパイア(Carica papaya),カシューナッツ(Anacardium occidentale),マカデミア(Macadamia intergrifolia),アーモンド(Prunus amygdalus),砂糖大根(Beta vulgaris),エン麦,大麦,野菜及びオーナメンタル(ornamentals)。
他の好ましい実施態様において、前記細胞は原核細胞である。
さらに好ましい実施態様において、前記真核細胞は植物細胞である。本発明の植物細胞を含む植物は、前記植物によって作られる種子としても提供される。
本発明の好ましい実施態様において、前記植物は以下に示される中から選択される:トウモロコシ(Zea mays),キャノーラ(Brassica napus,Brassica rapa ssp.), 麻(Linum usitatissimum),アルファルファ(Medicago sativa),ライス(Oryza sativa),ライ麦(Secale cerate),モロコシ(Sorghum bicolor,Sorghum vulgare),ヒマワリ(Helianthus annus),小麦(Tritium aestivum),大豆(Glycine max),タバコ(Nicotiana tabacum),ジャガイモ(Solanum tuberosum), ピーナッ(Arachis hypogaea),綿(Gossypium hirsutum),サツマイモ(Iopmoea batatus), キャッサバ(Manihot esculenta),コーヒー(Cofea spp.),ココナッツ(Cocos nucifera),パイナップル(Anana comosus), 柑橘類(Citrus spp.),ココア(Theobroma cacao),茶(Camellia senensis),バナナ(Musa spp.),アボカド(Persea americana),イチジク(Ficus casica),グアヴァ(Psidium guajava),マンゴー(Mangifer indica),オリーブ(Olea europaea),パパイア(Carica papaya),カシューナッツ(Anacardium occidentale),マカデミア(Macadamia intergrifolia),アーモンド(Prunus amygdalus),砂糖大根(Beta vulgaris),エン麦,大麦,野菜及びオーナメンタル(ornamentals)。
好ましくは、本発明の植物は、作物(例えば、穀類とパルス(puluse)、トウモロコシ、小麦、ジャガイモ、タピオカ、ライス、モロコシ、あわ、キャッサバ、大麦、えんどう)、及びその他の根、塊茎又は種子作物である。重要な種子作物は、アブラナ、砂糖大根、トウモロコシ、ヒマワリ、大豆、モロコシ、及び麻(アマニ)である。本発明が適用される園芸植物には、レタス、エンダイブ、及びキャベツ、ブロッコリー、カリフラワーを含むアブラナ属の野菜である。本発明は、タバコ、ウリ、ニンジン、ストロベリー、ヒマワリ、トマト、コショウに適用される。
対象の種子を提供する穀物植物には脂肪種子植物及び豆科植物が含まれる。対象の種子には、トウモロコシ、小麦、大麦、ライス、モロコシ、ライ麦などの穀物の種子が含まれる。
オイル種子植物には、綿、大豆、紅花、ヒマワリ、アブラナ属、トウモロコシ、アルファルファ、パーム、ココナッツなどが含まれる。 豆科植物にはビーンズとえんどうが含まれる。 ビーンズには、グアール(guar)、イナゴマメ、コロハ(fenugreek)、大豆、ガーデンビーンズ、カウピー、マングビーン、ライマビーン、ソラマメ、レンズ豆、ヒヨコマメなどが含まれる。
対象の種子を提供する穀物植物には脂肪種子植物及び豆科植物が含まれる。対象の種子には、トウモロコシ、小麦、大麦、ライス、モロコシ、ライ麦などの穀物の種子が含まれる。
オイル種子植物には、綿、大豆、紅花、ヒマワリ、アブラナ属、トウモロコシ、アルファルファ、パーム、ココナッツなどが含まれる。 豆科植物にはビーンズとえんどうが含まれる。 ビーンズには、グアール(guar)、イナゴマメ、コロハ(fenugreek)、大豆、ガーデンビーンズ、カウピー、マングビーン、ライマビーン、ソラマメ、レンズ豆、ヒヨコマメなどが含まれる。
本発明の更なる態様によると、本発明の植物細胞を含む種子が提供される。好ましくは、前記種子は脂肪種子植物である。
本発明のある態様によると、アシル−CoAを形成するために長鎖脂肪酸をコエンザイムAにエステル化する際の、本発明のポリペプチド又は細胞の使用が提供される。
さらに本発明の他の態様によると、本発明のポリペプチド、長鎖脂肪酸、ATP及びコエンザイムAを含む反応容器が提供される。好ましくは、容器は発酵槽である。
本発明の好ましい実施態様において、前記ポリペプチドは本発明の細胞によって発現される。
好ましくは、前記細胞は、例えば酵母などの真核細胞である。
あるいは本発明のその他の実施態様において、前記細胞は原核細胞である。
本発明のある態様によると、アシル−CoAを形成するために長鎖脂肪酸をコエンザイムAにエステル化する際の、本発明のポリペプチド又は細胞の使用が提供される。
さらに本発明の他の態様によると、本発明のポリペプチド、長鎖脂肪酸、ATP及びコエンザイムAを含む反応容器が提供される。好ましくは、容器は発酵槽である。
本発明の好ましい実施態様において、前記ポリペプチドは本発明の細胞によって発現される。
好ましくは、前記細胞は、例えば酵母などの真核細胞である。
あるいは本発明のその他の実施態様において、前記細胞は原核細胞である。
本発明のさらなる態様によると、以下の工程を含むアシル−CoAを生成するためのコエンザイムAへの長鎖脂肪酸基質のエステル化を行う方法が提供される:
i)本発明の反応容器を提供し、
ii)長鎖脂肪酸のアシル−CoAへのエステル化が可能な条件下で前記反応容器に含まれる細胞を生育させる工程。
有利には、本発明の方法で生産される多価不飽和脂肪酸には、少なくとも2、有利には、3、4又は5の二重結合が含まれる。特に有利には、本脂肪酸には4又は5の二重結合が含まれる。本方法において有利に生産される脂肪酸は、18、20、22又は24の炭素原子を脂肪酸鎖中に有する;好ましくは、脂肪酸は20、22又は24の炭素原子を脂肪酸鎖中に含む。有利には、飽和脂肪酸は、本方法に使用される核酸とマイナーな限度で反応するか、又は全く反応しない。マイナーな限度とは、飽和脂肪酸が、多価不飽和脂肪酸と比較して、有利には、活性の5%未満、3%未満、特に有利には、2%未満でしか反応しない。生産されるこれらの脂肪酸は、単一の製造物又は脂肪酸の混合物として生産され得る。
i)本発明の反応容器を提供し、
ii)長鎖脂肪酸のアシル−CoAへのエステル化が可能な条件下で前記反応容器に含まれる細胞を生育させる工程。
有利には、本発明の方法で生産される多価不飽和脂肪酸には、少なくとも2、有利には、3、4又は5の二重結合が含まれる。特に有利には、本脂肪酸には4又は5の二重結合が含まれる。本方法において有利に生産される脂肪酸は、18、20、22又は24の炭素原子を脂肪酸鎖中に有する;好ましくは、脂肪酸は20、22又は24の炭素原子を脂肪酸鎖中に含む。有利には、飽和脂肪酸は、本方法に使用される核酸とマイナーな限度で反応するか、又は全く反応しない。マイナーな限度とは、飽和脂肪酸が、多価不飽和脂肪酸と比較して、有利には、活性の5%未満、3%未満、特に有利には、2%未満でしか反応しない。生産されるこれらの脂肪酸は、単一の製造物又は脂肪酸の混合物として生産され得る。
本発明の好ましい方法において、前記長鎖脂肪酸は以下のグループから選択される:18:3n6、20:4n6、18:4n3、20:5n3及び22:6n3である。
本方法で生産される多価不飽和脂肪酸は、膜脂質及び/又はトリアシルグリセリドと有利に結合するが、遊離脂肪酸としても生物体内に生じ、又は他の脂肪酸エステルの形体で結合する。このような関係において、それらは「純粋な製造物」、又は有利には種々の脂肪酸の混合物又は異なるグリセリドの混合物の形体であると言われるような状態で存在する。トリアシルグリセリドと結合している種々の脂肪酸は、4〜6炭素原子の短鎖脂肪酸、8〜12炭素原子の中鎖脂肪酸、又は14〜24炭素原子の長鎖脂肪酸に由来し、好ましくは長鎖脂肪酸であり、特に好ましくはC18−、C20−、C22−及び/又はC24−脂肪酸の長鎖脂肪酸、LCPUFAsである。
本発明の方法は、多価不飽和脂肪酸のC18−、C20−、C22−及び/又はC24−脂肪酸分子との脂肪酸エステルを生産し、少なくとも2つの二重結合が脂肪酸エステル中に存在する。これらの脂肪酸分子は、好ましくは3、4又は5の二重結合を含み、有利に、ヘキサデカジエン酸(C16:2Δ9,12),γ−リノレン酸(=GLA,C18:3Δ6,9,12),ステアリドン酸(=SDA,C18:4Δ6,9,12,15),ジホモ−γ−リノレン酸(=DGLA,20:3Δ8,11,14),エイコサテトラエン酸(=ETA,C20:4Δ5,8,11,14),アラキドン酸(ARA),エイコサペンタエン酸(EPA)又はこれらの混合物、好ましくは、EPA及び/又はARAを生み出す。
本方法で生産される多価不飽和脂肪酸は、膜脂質及び/又はトリアシルグリセリドと有利に結合するが、遊離脂肪酸としても生物体内に生じ、又は他の脂肪酸エステルの形体で結合する。このような関係において、それらは「純粋な製造物」、又は有利には種々の脂肪酸の混合物又は異なるグリセリドの混合物の形体であると言われるような状態で存在する。トリアシルグリセリドと結合している種々の脂肪酸は、4〜6炭素原子の短鎖脂肪酸、8〜12炭素原子の中鎖脂肪酸、又は14〜24炭素原子の長鎖脂肪酸に由来し、好ましくは長鎖脂肪酸であり、特に好ましくはC18−、C20−、C22−及び/又はC24−脂肪酸の長鎖脂肪酸、LCPUFAsである。
本発明の方法は、多価不飽和脂肪酸のC18−、C20−、C22−及び/又はC24−脂肪酸分子との脂肪酸エステルを生産し、少なくとも2つの二重結合が脂肪酸エステル中に存在する。これらの脂肪酸分子は、好ましくは3、4又は5の二重結合を含み、有利に、ヘキサデカジエン酸(C16:2Δ9,12),γ−リノレン酸(=GLA,C18:3Δ6,9,12),ステアリドン酸(=SDA,C18:4Δ6,9,12,15),ジホモ−γ−リノレン酸(=DGLA,20:3Δ8,11,14),エイコサテトラエン酸(=ETA,C20:4Δ5,8,11,14),アラキドン酸(ARA),エイコサペンタエン酸(EPA)又はこれらの混合物、好ましくは、EPA及び/又はARAを生み出す。
多価不飽和脂肪酸のC18−、C20−、C22−及び/又はC24−脂肪酸分子との脂肪酸エステルは、脂肪酸エステルの調製に用いられる生物から、オイル又は脂質の形体で、例えば、少なくとも2つ、好ましくは3つの二重結合を持つ多価不飽和脂肪酸を含むスフィンゴ脂質、ホスホグリセリド、脂質、糖スフィンゴ脂質などの糖脂質、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルイノシトール又はジホスファチジルグリセロールなどのリン脂質、モノアシルグリセリド、ジアシルグリセリド、トリアシルグリセリドなどの化合物の形体で単離することができる;それらは、そのジアシルグリセリド、トリアシルグリセリド及び/又はホスファチジルコリン、特に好ましくはトリアシルグリセリドの形体で有利に単離される。これらのエステルの他、多価不飽和脂肪酸は生物体、有利には、植物中に遊離脂肪酸又は他の化合物と結合しても存在する。通常、上記種々の化合物(脂肪酸エステル及び遊離脂肪酸)は、だいたい、トリグリセリドの80〜90重量%、ジグリセリドの2〜8重量%、モノグリセリドの5〜10重量%、遊離脂肪酸の1〜5重量%、リン脂質の2〜5重量%、種々の化合物の総量の100重量%の分布で生物中に存在している。
本発明の方法は、トランスジェニック生物、有利にはトランスジェニック植物中の総脂肪酸に基づいて、少なくとも3重量%、有利には少なくとも5重量%、好ましくは少なく後も8重量%、特に好ましくは少なくとも10重量%、最も好ましくは少なくとも15重量%の含量で生産されるLCPUFAsを製造する。有利には、脂肪酸は結合型で生産される。本発明の方法で使用される核酸を用いて、これらの不飽和脂肪酸は、有利に調製されるトリグリセリドのsn1、sn2及び/又はsn3の位置に作り出される。本発明の方法において、ヘキサデカジエン酸(C16:2)、リノール酸(C18:2)及びリノレン酸(C18:3)の出発化合物により複数の反応ステップが進行するため、本方法の最終産物、例えば、アラキドン酸(ARA)又はエイコサペンタエン酸(EPA)又はドコサヘキサエン酸(DHA)などは、完全に純粋な産物としては得られない;極微量の前駆体が常に最終産物中に存在する。例えば、リノレン酸とリノール酸は出発生物及び出発植物中に存在すれば、ARAやEPAなどの最終産物は混合物として存在する。前駆体は、問題となる最終産物の量に基づいて、有利には、20重量%、好ましくは15重量%、特に好ましくは10重量%、最も好ましくは5重量%を超えない。有利には、本発明の方法において、ARAのみ又はEPAのみが、結合型又は遊離脂肪酸の形体で、トランスジェニック植物中に最終産物として生産される。両方の化合物(ARA及びEPA)が同時に生産される場合、それらは有利には少なくとも1:2(EPA:ARA)、有利には少なくとも1:3、好ましくは1:4特に好ましくは1:5で生産される。
本発明の核酸配列により、多価不飽和脂肪酸の少なくとも50%、有利には少なくとも80%、特に有利には100%、さらに特に有利には少なくとも150%の収量の増大が、非トランスジェニック出発生物に対し、GC分析における比較によって得られる。さらなる有利な実施態様において、多価不飽和脂肪酸の収量は、少なくとも200%、好ましくは250%、さらに特に好ましくは少なくとも300%増大し得る。
また、化学的に純粋な多価不飽和脂肪酸又は脂肪酸組成物が上述の方法によって合成される。このために、脂肪酸又は脂肪酸組成物が微生物、植物又は生物が成育した培地、又は生物体及び培地から、既知の方法で、例えば、抽出、蒸留、結晶化、クロマトグラフィー又はこれらの方法の組合せによって単離される。これらの化学的に純粋な脂肪酸又は脂肪酸組成物は、食品産業領域、化粧品産業領域及び特に製薬産業領域において有利に使用することが出来る。
本発明の方法において生産に適する生物は、基本的には、微生物、非ヒト動物又は植物などの任意の生物である。有利には、本発明の方法は、Mortierella又はTraustochytriumなどのカビ、Saccharomyces又はSchizosaccharomycesなどの酵母、Physcomitrella又はCeratodonなどのコケ類、Caenorhabditisなどの非ヒト動物、Crypthecodinium又はPhaeodactylumなどの藻類、又は、双子葉又は単子葉植物などの植物を使用する。本発明の方法に特に有利に用いられる生物は、オイル生産生物に属する生物、つまり、オイル生産に使用される、例えば、Mortierella又はTraustochytriumなどのカビ、Crypthecodinium、Phaeodactylumなどの藻類、又は、植物、特定の植物であって、好ましくは、ピーナッツ、アブラナ、キャノーラ、ヒマワリ、紅花、けし、マスタード、大麻、トウゴマ、オリーブ、胡麻、キンセンカ、ザクロ、月見草、モウズイカ、あざみ、野ばら、ヘーゼルナッツ、アーモンド、マカデミア、アボカド、月桂樹、かぼちゃ/スカッシュ、アマニ、大豆、ピスタチオ、ボリジ、木(パーム油、ココナッツ又はクルミ)などの多量の脂質化合物を含む油料穀物植物、又はトウモロコシ、小麦、ライ麦、燕麦、ライ小麦、ライス、大麦、綿、キャッサバ、コショウなどの耕地の作物、マンジュギク、ジャガイモ、タバコ、ナス及びトマトなどのナス科植物、エンドウ豆、アルファルファ、又はブッシュの植物(コーヒー、カカオ、紅茶)などのソラマメ属、シダレヤナギ属、及び多年生牧草と家畜用農作物である。本発明において好ましい植物は、ピーナッツ、アブラナ、キャノーラ、ヒマワリ、紅花、けし、マスタード、大麻、トウゴマ、オリーブ、キンセンカ、ザクロ、月見草、かぼちゃ/スカッシュ、アマニ、大豆、ボリジ、木(パーム油、ココナッツ) などの油料穀物プラントである。 特に好ましくは、C18:2−及び/又はC18:3−脂肪酸の多い植物で、ヒマワリ、紅花、タバコ、モウズイカ属、胡麻、綿、かぼちゃ/スカッシュ、けし、月見草、クルミ、アマニ、大麻、あざみまたは紅花などである。さらに特に好ましい植物は、紅花、ヒマワリ、けし、月見草、クルミ、アマニ又は大麻などの植物である。
本発明の方法において生産に適する生物は、基本的には、微生物、非ヒト動物又は植物などの任意の生物である。有利には、本発明の方法は、Mortierella又はTraustochytriumなどのカビ、Saccharomyces又はSchizosaccharomycesなどの酵母、Physcomitrella又はCeratodonなどのコケ類、Caenorhabditisなどの非ヒト動物、Crypthecodinium又はPhaeodactylumなどの藻類、又は、双子葉又は単子葉植物などの植物を使用する。本発明の方法に特に有利に用いられる生物は、オイル生産生物に属する生物、つまり、オイル生産に使用される、例えば、Mortierella又はTraustochytriumなどのカビ、Crypthecodinium、Phaeodactylumなどの藻類、又は、植物、特定の植物であって、好ましくは、ピーナッツ、アブラナ、キャノーラ、ヒマワリ、紅花、けし、マスタード、大麻、トウゴマ、オリーブ、胡麻、キンセンカ、ザクロ、月見草、モウズイカ、あざみ、野ばら、ヘーゼルナッツ、アーモンド、マカデミア、アボカド、月桂樹、かぼちゃ/スカッシュ、アマニ、大豆、ピスタチオ、ボリジ、木(パーム油、ココナッツ又はクルミ)などの多量の脂質化合物を含む油料穀物植物、又はトウモロコシ、小麦、ライ麦、燕麦、ライ小麦、ライス、大麦、綿、キャッサバ、コショウなどの耕地の作物、マンジュギク、ジャガイモ、タバコ、ナス及びトマトなどのナス科植物、エンドウ豆、アルファルファ、又はブッシュの植物(コーヒー、カカオ、紅茶)などのソラマメ属、シダレヤナギ属、及び多年生牧草と家畜用農作物である。本発明において好ましい植物は、ピーナッツ、アブラナ、キャノーラ、ヒマワリ、紅花、けし、マスタード、大麻、トウゴマ、オリーブ、キンセンカ、ザクロ、月見草、かぼちゃ/スカッシュ、アマニ、大豆、ボリジ、木(パーム油、ココナッツ) などの油料穀物プラントである。 特に好ましくは、C18:2−及び/又はC18:3−脂肪酸の多い植物で、ヒマワリ、紅花、タバコ、モウズイカ属、胡麻、綿、かぼちゃ/スカッシュ、けし、月見草、クルミ、アマニ、大麻、あざみまたは紅花などである。さらに特に好ましい植物は、紅花、ヒマワリ、けし、月見草、クルミ、アマニ又は大麻などの植物である。
本発明の核酸に加えて、脂肪酸又は脂質代謝のための酵素をコードするさらなる核酸を生物内に導入することは、ここに開示される進歩性において有利である。
基本的に、全ての脂肪酸又は脂質代謝の遺伝子は多価不飽和脂肪酸の生産過程で使用することが可能で、本発明性のあるアシルCoAシンテターゼと組み合わせると有利である。以下のグループから選択される脂肪酸又は脂質代謝の遺伝子は、アシル−CoAシンテターゼとの組合せて有利に使用される:アシル−CoA:リゾリン脂質アセチルトランスフェラーゼ、アシル−CoAデヒドロゲナーゼ、アシルACP[=acyl carrier protein]デサチュラーゼ、アシル−ACPチオエステラーゼ、脂肪酸アシルトランスフェラーゼ、アシル−CoA:リゾリン脂質アセチルトランスフェラーゼ、脂肪酸シンターゼ、脂肪酸ヒドロキシラーゼ、アセチルコエンザイムAカルボキシラーゼ、アシルコエンザイムAオキシダーゼ、脂肪酸デサチュラーゼ、脂肪酸アセチレナーゼ、リポキシゲナーゼ、トリアシルグリセロールリパーゼ、アレンオキシドシンターゼ、ヒドロパーオキサイドリアーゼ又は脂肪酸エロンゲース。アシル−CoA:リゾリン脂質アシルトランスフェラーゼ、Δ−4−デサチュラーゼ、Δ−5−デサチュラーゼ、Δ−6−デサチュラーゼ、Δ−8−デサチュラーゼ、Δ−9−デサチュラーゼ、Δ−12−デサチュラーゼ、Δ−5−エロンゲース、Δ−6−エロンゲース又はΔ−9−エロンゲースからなるグループより選択される遺伝子は、個々の遺伝子又は複数の遺伝子を組み合わせて使用することができる、アシル−CoAシンテターゼ、グリセロ−3−ホスフェートアシルトランスフェラーゼ、ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ又はレシチンコレステロールアシルトランスフェラーゼに対する上述の遺伝子と組み合わせて使用すると特に好ましい。
基本的に、全ての脂肪酸又は脂質代謝の遺伝子は多価不飽和脂肪酸の生産過程で使用することが可能で、本発明性のあるアシルCoAシンテターゼと組み合わせると有利である。以下のグループから選択される脂肪酸又は脂質代謝の遺伝子は、アシル−CoAシンテターゼとの組合せて有利に使用される:アシル−CoA:リゾリン脂質アセチルトランスフェラーゼ、アシル−CoAデヒドロゲナーゼ、アシルACP[=acyl carrier protein]デサチュラーゼ、アシル−ACPチオエステラーゼ、脂肪酸アシルトランスフェラーゼ、アシル−CoA:リゾリン脂質アセチルトランスフェラーゼ、脂肪酸シンターゼ、脂肪酸ヒドロキシラーゼ、アセチルコエンザイムAカルボキシラーゼ、アシルコエンザイムAオキシダーゼ、脂肪酸デサチュラーゼ、脂肪酸アセチレナーゼ、リポキシゲナーゼ、トリアシルグリセロールリパーゼ、アレンオキシドシンターゼ、ヒドロパーオキサイドリアーゼ又は脂肪酸エロンゲース。アシル−CoA:リゾリン脂質アシルトランスフェラーゼ、Δ−4−デサチュラーゼ、Δ−5−デサチュラーゼ、Δ−6−デサチュラーゼ、Δ−8−デサチュラーゼ、Δ−9−デサチュラーゼ、Δ−12−デサチュラーゼ、Δ−5−エロンゲース、Δ−6−エロンゲース又はΔ−9−エロンゲースからなるグループより選択される遺伝子は、個々の遺伝子又は複数の遺伝子を組み合わせて使用することができる、アシル−CoAシンテターゼ、グリセロ−3−ホスフェートアシルトランスフェラーゼ、ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ又はレシチンコレステロールアシルトランスフェラーゼに対する上述の遺伝子と組み合わせて使用すると特に好ましい。
リゾホスファチジン酸アシルトランスフェラーゼ、グリセロ−3−ホスフェートアシルトランスフェラーゼ、ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ又はレシチンコレステロールアシルトランスフェラーゼ活性を持つポリペプチドをコードする、本発明の方法で使用される核酸の酵素活性によれば、また、有利には、アシル−CoAシンテターゼ、Δ−4−、Δ−5−、Δ−6−、Δ−8−デサチュラーゼ又は、Δ−5−、Δ−6−若しくはΔ−9−エロンゲース活性などの脂肪酸又は脂質代謝のポリペプチドをコードする核酸配列と組み合わせると、多種多様な多価不飽和脂肪酸を本発明の方法において生産することができる。本発明の方法に使用される、有利な植物などの選択される生物に依存して、EPA又はARA又はDHAなどの種々の多価不飽和脂肪酸又は個々の多価不飽和脂肪酸を遊離又は結合型で生産することができる。出発植物中の一般的な脂肪酸組成(C18:2−又はC18:3−脂肪酸)に依存して、GLD、DGLA又はARAなどのC18:2−脂肪酸由来の脂肪酸、SDA、ETA、EPA又はDHAなどのC18:3−脂肪酸由来の脂肪酸が得られる。リノール酸(=LA,C18:2Δ9,12)のみが本方法で使用される植物中に不飽和多価脂肪酸として存在する場合、GLA,DGLA及びARAのみを産物として産出することができ、それら全て遊離脂肪酸又は結合型として存在する。本方法に使用される植物中に不飽和脂肪酸として、例えば、アマニなどのように、α−リノレン酸(=ALA,C18:3Δ9,12,15)のみが存在している場合、産物としてSDA、ETA及びEPAのみを得ることができ、上述のようにそれら全ては遊離脂肪酸又は結合型として存在する。リゾホスファチジン酸アシルトランスフェラーゼ、グリセロ−3−ホスフェートアシルトランスフェラーゼ、ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ又はレシチンコレステロールアシルトランスフェラーゼを、アシルCoAシンテターゼ、Δ−5−、Δ−6−デサチュラーゼ及び/又はΔ−6−デサチュラーゼ及び/又はΔ−6−エロンゲース又はアシル−CoAシンテターゼ、Δ−5−、Δ−8−デサチュラーゼ及び/又はΔ−9−エロンゲースと有利に組み合わせて、又は合成カスケードの最初の3つの遺伝子、アシル−CoAシンテターゼ、Δ−6−デサチュラーゼ及び/又はΔ−6−エロンゲース、アシル−CoAシンテターゼ、Δ−8−デサチュラーゼ及びΔ−9−エロンゲース、のみとを組み合わせて、合成に関与する酵素の活性を修飾することにより、上述の生物、有利には上述の植物中で個々の産物のみを、目標を絞った形で生産することができる。Δ−6−デサチュラーゼ及びΔ−6−エロンゲースの活性によると、出発植物と多価不飽和脂肪酸に依存して、例えば、GLAとDGLA、又はSDAとETAが形成される。好ましくは、DGLA又はETA又はこれらの混合物が形成される。Δ−5−デサチュラーゼが付加的に生物内、有利には植物内に導入されると、ARA又はEPAがさらに形成される。また、これはΔ−8−デサチュラーゼ及びΔ−9−エロンゲースが予め導入されている生物にも適用される。有利には、合成のための出発基質として作用する、生物内又は植物内に存在する脂肪酸に依存して、ARA又はEPAのみ又はこれらの混合物が合成される。生合成カスケードが関与するため、目的の最終産物生物内で純粋な形では存在しない。少量の前駆体化合物が常に最終産物中に存在する。この少量の産物は、最終産物であるDGLA、ETA又はこれらの混合物、又はARA、EPA、DHA又はこれらの混合物に対し、20重量%未満、有利には、15重量%未満、特に有利には、10重量%未満、最も有利には、5,4,3,2又は1重量%未満である。
有利に増大した量の多価不飽和脂肪酸を持つオイル及び/又はトリグリセリドの生産に関するここに開示される方法において、収量を増やすために、脂肪酸合成のための出発産物の量を増やすと有利である;これは、例えば、生物内にΔ−12−デサチュラーゼのポリペプチドをコードする核酸を導入することにより達成することができる。これは、オレイン酸に富むアブラナなどのオイル生産生物において特に有利である。これらの生物はリノレン酸が少ないので(Mikoklajczakら,Journal of the American Oil Chemical Society,38,1961,678−681)、出発物質であるリノレン酸を生産するために上述のΔ−12−デサチュラーゼの使用が有利である。
本発明の方法において使用され核酸は、有利には、Isochrysis又はCrypthecodinium等の藻類、Phaeodactylum等の藻類/珪藻類、Physcomitrella又はCeratodon等のコケ類などの植物、Aleuritia、Calendula stellata、Osteospermum spinescens又はOsteospermum hyoseroides等のPrimulaceaeなどの高等植物、Aspergillus、Thraustochytrium、Phytophthora、Entomophthora、Mucor又はMortierella等カビなどの微生物、Shewanellaなどのバクテリア、酵母、又はCaenorhabditis等線虫などの動物、昆虫又はヒトに由来する。該核酸 は、有利には、カビ、動物に由来し、又は藻類若しくはコケなどの植物に由来し、好ましくは、Caenorhabditisなどの線虫に由来する。
本発明の方法は、有利には、上述の核酸配列又はそれらの誘導体又は該核酸配列によってコードされるタンパク質の酵素活性を保持するポリペプチドをコードするホモログを使用する。アシル−CoAシンテターゼをコードする核酸配列と組み合わせて、これらの配列を発現コンストラクトにクローニングし、生物内に導入及び発現させるために使用する。このようなコンストラクションにより、これらの発現コンストラクトによって、本発明の方法において生産される多価不飽和脂肪酸の有利で適切な合成が可能となる。
好ましい実施態様において、本方法において使用される核酸配列を含む細胞又は無傷の生物を獲るステップがさらに含まれ、その細胞及び/又は生物は、本発明の核酸配列である遺伝子コンストラクト又は後述のベクター、単独又は脂肪酸又は脂質代謝のタンパク質をコードする核酸配列とさらに組み合わせて形質転換される。さらに好ましい実施態様において、本方法はさらに培地から精製化学物質を得るステップが含まれる。培養は、例えば、Mortierella、Saccharomyce又はTraustochytriumなどの微生物の培養の場合には、例えば、発酵槽培養の形式を、又は植物のグリーンハウス又は畑での栽培を行うことができる。従って、作り出される細胞又は生物は、有利には、例えば、ピーナッツ、アブラナ、キャノーラ、アマニ、麻、大豆、紅花、ヒマワリ又はルリヂサ等、油料植物などのオイル生産生物である。
植物細胞、植物組織又は植物器官の場合、「生育する」とは、例えば、培養液中又は培養液上における培養、又は、例えば、水耕栽培、培養土、耕地の素地上又は素地中での無傷の植物の栽培を意味するものとして理解できる。
本発明の目的に関し、「トランスジェニック」又は「組換体」とは、核酸配列の例として、発現カセット(=遺伝子コンストラクト)又は本発明の核酸配列を含むベクターを意味し、又は発現カセット又は本発明のベクターなどの核酸配列で形質転換された生物を意味し、これら全てのコンストラクションは組換手法によって作製されるものであり;
a)本発明の核酸配列、又は
b)例えば、プロモーターなど、本発明の核酸と作用可能に結合した遺伝子制御配列、又は、
c)(a)及び(b)
は、その天然の遺伝的環境中には存在せず、あるいは、例えば、1又は複数のヌクレオチド残基の置換、付加、欠失、インバージョン又は挿入形体を得るための修飾を可能にする組換手法により修飾されている。天然の遺伝的環境とは、オリジナルの生物中の天然のゲノム又は染色体座、又はゲノムライブラリー中に存在することを意味するものとして理解される。ゲノムライブラリーの場合、好ましくは核酸配列の天然の遺伝子環境が、少なくとも一部保持される。周囲には少なくとも片側に核酸が隣接し、少なくとも50塩基対、好ましくは少なくとも500塩基対、特に好ましくは少なくとも1000塩基対、最も好ましくは少なくとも5000塩基対の長さの配列が存在する。自然に生じる発現カセット(例えば、自然に生じる本発明の核酸配列の天然のプロモーターの組合せ)は、本発現カセットが、例えば、変異原処理などの非天然の合成(「人工的な」)方法によって修飾される場合、トランスジェニック発現カセットとなる。適切な方法は、例えば、米国特許第5,565,350号又は国際公開第00/15815号中に記載されている。
本発明の目的に関し、「トランスジェニック」又は「組換体」とは、核酸配列の例として、発現カセット(=遺伝子コンストラクト)又は本発明の核酸配列を含むベクターを意味し、又は発現カセット又は本発明のベクターなどの核酸配列で形質転換された生物を意味し、これら全てのコンストラクションは組換手法によって作製されるものであり;
a)本発明の核酸配列、又は
b)例えば、プロモーターなど、本発明の核酸と作用可能に結合した遺伝子制御配列、又は、
c)(a)及び(b)
は、その天然の遺伝的環境中には存在せず、あるいは、例えば、1又は複数のヌクレオチド残基の置換、付加、欠失、インバージョン又は挿入形体を得るための修飾を可能にする組換手法により修飾されている。天然の遺伝的環境とは、オリジナルの生物中の天然のゲノム又は染色体座、又はゲノムライブラリー中に存在することを意味するものとして理解される。ゲノムライブラリーの場合、好ましくは核酸配列の天然の遺伝子環境が、少なくとも一部保持される。周囲には少なくとも片側に核酸が隣接し、少なくとも50塩基対、好ましくは少なくとも500塩基対、特に好ましくは少なくとも1000塩基対、最も好ましくは少なくとも5000塩基対の長さの配列が存在する。自然に生じる発現カセット(例えば、自然に生じる本発明の核酸配列の天然のプロモーターの組合せ)は、本発現カセットが、例えば、変異原処理などの非天然の合成(「人工的な」)方法によって修飾される場合、トランスジェニック発現カセットとなる。適切な方法は、例えば、米国特許第5,565,350号又は国際公開第00/15815号中に記載されている。
本発明の目的のトランスジェニック生物又は植物は、上述の通り、本発明で使用される核酸が生物ゲノムの本来の座位に存在せず、該核酸がホモローガスに又はヘテロローガスに発現され得ることを意味するものとして理解される。しかし、先に述べた通り、トランスジェニックとは、本発明の核酸が生物ゲノム中の本来の座位に存在しけれども、該配列が、天然の配列について修飾されること、及び/又は天然の配列の制御配列が修飾されることをも意味する。トランスジェニックとは、好ましくは、ゲノム中の天然の座位における本発明の核酸の発現のこと、すなわち、本発明の核酸のホモローガス、又は、好ましくは、ヘテロローガスな発現が生じることを意味するものとして理解される。好ましいトランスジェニック生物は、Mortierellaなどのカビ、Physcomitrellなどのコケ、Crypocodiniumなどの藻類、又は油料作物などの植物である。
本発明の方法において使用される発現カセット又はベクターなどの核酸にとって適切な生物又は宿主生物は、基本的に有利には、脂肪酸、特に不飽和脂肪酸を合成することができる全ての生物、及び/又は組換遺伝子の発現に適する全ての生物である。例えば、アラビドプシス、キンセンカ属などのキク科植物、大豆、ピーナッツ、トウゴマ、ヒマワリ、トウモロコシ、綿、麻、アブラナ、ココナッツ、油やし、紅花(Carthamus tinctorius)又はココア豆などの作物植物、例えば、Mortierell属、Thraustochytrium属、Saprolegnia属又はPythium属等のカビ、Escherichia属又はShewnella属等のバクテリア、Saccharomyce属等の酵母、シアノバクテリア、繊毛虫、渦鞭毛虫などの藻類又は原生動物、Crypthecodiniumなどの微生物である。好ましい生物は、天然に相当量のオイルを合成することができる生物で、例えば、Mortierella alpina、Pythium insidiosumなどのカビ、大豆、アブラナ、ココナッツ、油やし、紅花、麻、大麻、トウゴマ、キンセンカ、ピーナッツ、ココア豆又はヒマワリなどの植物、又はSaccharaomyce cerevisiaeなどの酵母であり、大豆、麻、アブラナ、紅花、ヒマワリ、キンセンカ、Mortierell又はSaccharomyce cerevisiaeが特に好ましい。基本的に、適切な宿主生物は、上述のトランス下ニック生物に加えて、トランスジェニック動物、有利には、非ヒト動物、例えば、C.elegansなどである。
さらに利用可能な宿主細胞については、Goeddel,Gene Expression Technology:Methods in Enzymology 185, Academic Press,SanDiego,CA(1990)中に詳述されている。
使用可能な発現株、例えば、低いプロテアーゼ活性を持つものなどについては、Gottesman,S.,Gene Expression Technology:Methods in Enzymology 185, Academic Press,SanDiego,California(1990)119−128中に記載されている。
これらには、植物の細胞及び葯、繊維、根毛、茎、胚、カルス、子葉、葉柄、収穫物、植物組織、再生組織、及び実際のトランスジェニック植物に由来し、及び/又はトランスジェニック植物を生み出すために使用し得る細胞培養物が含まれる。
使用可能な発現株、例えば、低いプロテアーゼ活性を持つものなどについては、Gottesman,S.,Gene Expression Technology:Methods in Enzymology 185, Academic Press,SanDiego,California(1990)119−128中に記載されている。
これらには、植物の細胞及び葯、繊維、根毛、茎、胚、カルス、子葉、葉柄、収穫物、植物組織、再生組織、及び実際のトランスジェニック植物に由来し、及び/又はトランスジェニック植物を生み出すために使用し得る細胞培養物が含まれる。
本発明の方法において合成される多価不飽和脂肪酸を含むトランスジェニック植物は、オイル、脂質又は単離されるべく合成された脂肪酸を特に必要とすることなく、市場へ直接売り込むことができる。本発明の方法のための植物は、無傷の植物、及び植物の器官又は葉、幹、種子、根、塊茎、葯、繊維、根毛、茎、胚、カルス、子葉、葉柄収穫物、植物組織、再生組織、及び実際のトランスジェニック植物に由来し、及び/又はトランスジェニック植物を生み出すために使用し得る細胞培養物など、植物の全ての部分を意味するものとして、挙げられている。この場合、種子には種皮、表皮細胞、種子細胞、内胚乳又は胚組織などの種子の全ての部分が含まれる。しかし、本発明の方法において生産される化合物は、生物、有利には、オイル、脂肪、脂質、及び/又は遊離脂肪酸の形で植物から単離することができる。この過程で生産される多価不飽和脂肪酸は、生物体を、それらが生育する作物、又は畑から収穫することで得ることができる。植物の部分、好ましくは植物の種子を絞るか、エクストラクトすることで行うことができる。この点において、オイル、脂肪、脂質及び/又は遊離脂肪酸は、圧縮による熱を発生させないコールドビーティング(cold−beating)又はコールドプレッシング(cold−pressing)として知られる方法によって得ることができる。植物の部分、特に種子をより容易に破壊するために、種子を予め粉砕し、蒸し又はローストする。このような方法で前処理された種子は、次に、プレス又は暖かいヘキサンでエクストラクトすることができる。溶媒は、その後再度除かれる。
微生物の場合、回収後、例えば、更なる処理工程を行わずにエクストラクトするか、又は、破壊後、当業者に周知の種々の方法によりエクストラクトする。この方法で、本方法で生産される化合物の96%以上を単離することができる。その後、得られた産物はさらに処理、つまり精製される。本方法において、植物の粘液及び浮遊物などの物質は最初に除去される。いわゆるデスライミングは、酵素的、又はリン酸などの酸を添加することで、例えば、物理化学的に効果を及ぼす。その後、遊離脂肪酸は例えば水酸化ナトリウム溶液などの塩基で処理し、除去される。得られた産物は、残留するアルカリを除くために水で十分に洗浄し、乾燥させる。産物に残っている色素を除くために、例えば、フラー土又は活性炭を用いて産物を漂白する。最後に、蒸気などを用いて産物を脱臭する。
本方法により生産されるPUFs又はLCPUFAsは、好ましくは、脂肪酸分子中に少なくとも2つの二重結合を、好ましくは3つ、4つ、5つ又は 6つの二重結合を持つC18−、C20−、C22−又はC24−脂肪酸分子である。これらのC18−、C20−、C22−又はC24−脂肪酸分子生物からオイル、脂質又は遊離脂肪酸の形で単離することができる。適切な生物は、例えば、上述されている。好ましい生物はトランスジェニック植物である。
従って、本発明のある実施態様は、上述の方法で生産されるオイル、脂質又は脂肪酸又はそれらのフラクションであり、特に好ましくは、PUFAs及びトランスジェニック植物から得られるものを含むオイル、脂質又は脂肪酸組成物である。
本発明のさらなる実施態様は、飼料、食品、化粧品及び医薬品中の脂肪酸及び/又は脂肪酸組成物である。
「オイル」、「脂質」又は「脂肪」とは、不飽和又は飽和、好ましくはエステル化された脂肪酸を含む脂肪酸混合物を意味するものと理解される。オイル、脂質又は脂肪は、好ましくは、多価不飽和遊離又は有利にはエステル化された脂肪酸、特に、リノレン酸、γ−リノレン酸、ジホモ−γ−リノレン酸、アラキドン酸、α−リノレン酸、ステアリドン酸、エイコサテトラエン酸、エイコサペンタエン酸、ドコサペンタエン酸又はドコサヘキサエン酸が多く含まれる。不飽和のエステル化された脂肪酸含量は、好ましくはおよそ30%に達し、50%の含量がより好ましく、60%、70%、80%又はそれ以上の含量はさらにより好ましい。分析に関し、脂肪酸含量は、例えば、エステル交換により脂肪酸をメチルエステルに変換した後、ガスクロマトグラフィーによって決定することができる。オイル、脂質又は脂肪は、種々の他の飽和又は不飽和脂肪酸、例えば、カレンジュリン酸(calendulic acid)、パルミチン酸、パルミトレイン酸、ステアリン酸、オレイン酸などを含むことができる。
本発明のさらなる実施態様は、飼料、食品、化粧品及び医薬品中の脂肪酸及び/又は脂肪酸組成物である。
「オイル」、「脂質」又は「脂肪」とは、不飽和又は飽和、好ましくはエステル化された脂肪酸を含む脂肪酸混合物を意味するものと理解される。オイル、脂質又は脂肪は、好ましくは、多価不飽和遊離又は有利にはエステル化された脂肪酸、特に、リノレン酸、γ−リノレン酸、ジホモ−γ−リノレン酸、アラキドン酸、α−リノレン酸、ステアリドン酸、エイコサテトラエン酸、エイコサペンタエン酸、ドコサペンタエン酸又はドコサヘキサエン酸が多く含まれる。不飽和のエステル化された脂肪酸含量は、好ましくはおよそ30%に達し、50%の含量がより好ましく、60%、70%、80%又はそれ以上の含量はさらにより好ましい。分析に関し、脂肪酸含量は、例えば、エステル交換により脂肪酸をメチルエステルに変換した後、ガスクロマトグラフィーによって決定することができる。オイル、脂質又は脂肪は、種々の他の飽和又は不飽和脂肪酸、例えば、カレンジュリン酸(calendulic acid)、パルミチン酸、パルミトレイン酸、ステアリン酸、オレイン酸などを含むことができる。
上述のように、本方法で生産された少なくとも2つの二重結合を有利に保持する多価不飽和脂肪酸は、例えば、スフィンゴ脂質、ホスホグリセリド、脂質、糖脂質、リン脂質、モノアシルグリセロール、ジアシルグリセロール、トリアシルグリセロール又は他の脂肪酸エステルである。
少なくとも2つの二重結合を有利に有し、酸は本発明の方法で調製された多価不飽和脂肪酸から出発すると、そこに含まれる多価不飽和脂肪酸を、例えば、有利には、メタノール又はエタノールなどのアルコール存在下においてKOH又はNaOH水溶液などのアルカリ処理又は酸加水分解など介し、あるいは、酵素的切断を介して遊離することができ、また、例えば、相分離及びH2SO4などによる酸性化によって単離することができる。また、脂肪酸は上述処理ステップを介さずに直接遊離させることもできる。
少なくとも2つの二重結合を有利に有し、酸は本発明の方法で調製された多価不飽和脂肪酸から出発すると、そこに含まれる多価不飽和脂肪酸を、例えば、有利には、メタノール又はエタノールなどのアルコール存在下においてKOH又はNaOH水溶液などのアルカリ処理又は酸加水分解など介し、あるいは、酵素的切断を介して遊離することができ、また、例えば、相分離及びH2SO4などによる酸性化によって単離することができる。また、脂肪酸は上述処理ステップを介さずに直接遊離させることもできる。
有利には植物細胞又は植物などの生物内にそれらを導入した後、本方法において使用される核酸は、別のプラスミド上に存在するか、又は、宿主細胞のゲノム中にインテグレートされる。ゲノム中へのインテグレーションの場合、インテグレーションはランダムであるか、又は、それにより細胞による目的の化合物の生産が影響を受けるような、天然の遺伝子が導入されたコピーによって置換されるような組換えによって、又はトランスに遺伝子を使用することにより影響され、そのため、遺伝子の発現を保証する少なくとも1つの配列、及び機能的に転写される遺伝子のポリアデニル化を保証する少なくとも1つの配列を含む機能的発現ユニットと機能的に連結する。
コケ類と藻類は、アラキドン酸(ARA)及び/又はエイコサペンタエン酸(EPA)及び/又はドコサヘキサエン酸(DHA)などの不飽和脂肪酸の相当量を生産する唯一の植物システムとして知られている。コケ類は、PUFAsを膜脂質中に含んでおり、一方、藻類、藻類及びカビ類と関連する生物は、相当量のPUFAsをトリアシルグリセロール画分にも蓄積している。そのため、トリアシルグリセロール画分中にもPUFAsを蓄積するような株から単離される核酸分子が、特に、本発明の方法にとって有利に適しており、従って、宿主、特に、アブラナ、キャノーラ、アマニ、大麻、大豆、ヒマワリ及びルリヂサなどの油料作物植物中の脂質及びPUFA生産システムにとって有利に適している。
本発明の長鎖PUFAsを生産するために、多価不飽和C16−又はC18−脂肪酸は、まず、デサチュラーゼの酵素活性によって脱飽和化され、次に、エロンゲースによって少なくとも2つの炭素原子で伸長される。1つの伸長サイクルの後、この酵素活性は、C18−又はC20−脂肪酸を生じさせ、2又は3の伸長サイクルの後、C22−又はC24−脂肪酸が生じる。本発明の方法によって使用されるデサチュラーゼ及びエロンゲース活性は、好ましくは、C18−、C20−、C22−及び/又はC24−脂肪酸を生じさせ、有利には、脂肪酸分子中に少なくとも2つ、好ましくは3、4又は5つの二重結合を有し、特に好ましくは、脂肪酸分子中に2つの二重結合、好ましくは、3、4又は5つの二重結合を分子中に有するC20−及び/又はC22−脂肪酸を生じさせる。最初の脱飽和及び伸長が起こった後、更なる不飽和化ステップが、例えば、Δ5位に1つ生じる。特に好ましい本発明の方法による産物は、ジホモ−γ−リノレン酸、アラキドン酸、エイコサペンタエン酸、ドコサペンタエン酸及び/又はドコサヘキサエン酸である。脂肪酸中に少なくとも2つの二重結合を持つC18−脂肪酸は、遊離脂肪酸又はリン脂質、糖脂質、スフィンゴ脂質、ホスホグリセリド、モノアシルグリセロール、ジアシルグリセロール又はトリアシルグリセロールなどのエステルの形体で本発明の酵素活性によって伸長される。
植物中の脂肪酸、オイル、脂質又は脂肪の有利に使用される好ましい生合成部位は、例えば、通常、種子又は種子の細胞層(cell strata)であるため、本方法で使用される核酸の種子特異的な発現が意味をなす。しかし、脂肪酸、オイル又は脂質の生合成は、種子組織に限定される必要はなく、植物のその他全ての部位、例えば、表皮細胞又は塊茎においても生じ得ることは明らかである。
Saccharomyces又はSchizosaccharomycesなどの酵母、Mortierella、Aspergillus、Phytophtora、Entomophthora、Mucor又はThraustochytriumなどのカビは、本発明の方法における生物として使用される場合、これらの生物は発酵培養中で有利に生育できる。
基本的には、本方法で使用される生物中における、本発明の方法により生産される不飽和脂肪酸は、2つの異なる方法で増大される。有利には、本方法により生産される遊離不飽和脂肪酸のプール、及び/又は本方法により生産されるエステル化され多価不飽和脂肪酸の含量を拡大することができる。有利には、トランスジェニック生物に存在するエステル化された多価不飽和脂肪酸のプールは、本発明の方法によって詳説される。
基本的には、本方法で使用される生物中における、本発明の方法により生産される不飽和脂肪酸は、2つの異なる方法で増大される。有利には、本方法により生産される遊離不飽和脂肪酸のプール、及び/又は本方法により生産されるエステル化され多価不飽和脂肪酸の含量を拡大することができる。有利には、トランスジェニック生物に存在するエステル化された多価不飽和脂肪酸のプールは、本発明の方法によって詳説される。
微生物は本発明の方法の生物として使用される場合、それらは、宿主生物に依存して、当業者にとっても通常の方法で生育される。原則として、微生物は、一般に糖などの炭素源、一般にイーストエクストラクトなどの有機的窒素源又は硫安などの塩の形で窒素源を、鉄、マンガン及びマグネシウムの塩などの微量成分、適当な場合には、ビタミンなどを含む液体培地中で、0℃及び100℃の間、好ましくは、10℃及び60℃の間の温度で、酸素ガスを供給しながら生育させる。液体培地のpHは一定に保たれても、又は保たれなくてもよく、つまり、培養期間中制御される。培養はバッチ状態、セミバッチ状態又は連続的に生育させる。栄養素は発酵の最初に供給されるか、又は半連続的又は連続的に与えられる。生産される多価不飽和脂肪酸は、上述のように、当業者に知られた方法、例えば、抽出、蒸留、結晶化。適当な場合には、塩による沈殿、及び/又はクロマトグラフィーによって生物から単離することができる。そのためには、有利には、生物を予め破砕してもよい。
宿主生物が微小生物である場合、本発明の方法は、0℃〜95℃、好ましくは10℃〜85℃、特に好ましくは15℃〜75℃、非常に特に好ましくは、15℃〜45℃の温度で有利に実施することができる。
この過程において、pH値はpH4〜12、好ましくは、pH6〜9、特に好ましくはpH7〜8に有利に保つことができる。
本発明の方法は、バッチ状態、セミバッチ状態又は連続的に操作することができる。既知の培養方法を概要は、Chmiel(Bioprozeβtechnik 1.Emfuhrung in die Bioverfahrenstechnik [Bioprocess technology 1. Introduction to Bioprocess technology] (Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1991)又はStorhasの教科書(Bioreaktoren und periphere Einrichtungen [Bioreactors and peripheral equipment](Verlag, Brunswick/Wiesbaden,1994)を参照のこと)に見出すことができる。
この過程において、pH値はpH4〜12、好ましくは、pH6〜9、特に好ましくはpH7〜8に有利に保つことができる。
本発明の方法は、バッチ状態、セミバッチ状態又は連続的に操作することができる。既知の培養方法を概要は、Chmiel(Bioprozeβtechnik 1.Emfuhrung in die Bioverfahrenstechnik [Bioprocess technology 1. Introduction to Bioprocess technology] (Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1991)又はStorhasの教科書(Bioreaktoren und periphere Einrichtungen [Bioreactors and peripheral equipment](Verlag, Brunswick/Wiesbaden,1994)を参照のこと)に見出すことができる。
使用される培地は、対象となっている株の必要条件を適切に満たす必要がある。種々の微生物に対する培地の詳細については、米国細菌学会(Washington D.C.,USA,1981)の教科書“Manual of Methods for General Bacteriology”に記載されている。
上述のように、本発明に従って使用できるこれらの培地は、通常、1又は複数の炭素源、窒素源、無機塩、ビタミン及び/又は微量成分を含んでいる。
好ましい炭素源は、モノ−、ジ−又は多糖類などの糖である。非常に適した炭素源の例として、グルコース、フルクトース、マンノース、ガラクトース、リボース、ソルボース、リブロース、ラクトース、マルトース、スクロース、ラフィノース、スターチ又はセルロースを挙げることができる。また、糖は、糖液又はその他精糖による副産物などの複合化合物を介して培地に添加することもできる。また、種々の炭素源混合物の添加も有益である。その他使用可能な炭素源は、例えば、ソーヤ油、ヒマワリ油、ピーナッツオイル及び/又はココナッツ脂肪などのオイル及び脂肪、例えば、パルミチン酸、ステアリン酸、及び/又はリノレン酸、などの脂肪酸、アルコール及び/又は、例えば、グリセロール、メタノール及び/又はエタノール、などのポリアルコール、及び/又は例えば、酢酸及び/又は乳酸などの有機酸である。
上述のように、本発明に従って使用できるこれらの培地は、通常、1又は複数の炭素源、窒素源、無機塩、ビタミン及び/又は微量成分を含んでいる。
好ましい炭素源は、モノ−、ジ−又は多糖類などの糖である。非常に適した炭素源の例として、グルコース、フルクトース、マンノース、ガラクトース、リボース、ソルボース、リブロース、ラクトース、マルトース、スクロース、ラフィノース、スターチ又はセルロースを挙げることができる。また、糖は、糖液又はその他精糖による副産物などの複合化合物を介して培地に添加することもできる。また、種々の炭素源混合物の添加も有益である。その他使用可能な炭素源は、例えば、ソーヤ油、ヒマワリ油、ピーナッツオイル及び/又はココナッツ脂肪などのオイル及び脂肪、例えば、パルミチン酸、ステアリン酸、及び/又はリノレン酸、などの脂肪酸、アルコール及び/又は、例えば、グリセロール、メタノール及び/又はエタノール、などのポリアルコール、及び/又は例えば、酢酸及び/又は乳酸などの有機酸である。
窒素源は、通常、有機又は無機窒素化合物又はこれらの化合物を含む物質である。窒素源の例として、硫安、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、炭酸アンモニウム、硝酸アンモニウムなどの硫酸塩、硝酸塩、尿素、アミノ酸などに由来する液体又は気体のアンモニアを含む窒素源、又はコーンスティープリカー、ソーヤミール、ソーヤタンパク質、イーストエクストラクト、肉汁などの複合窒素源を挙げることができる。窒素源は個別に又は混合物として使用できる。
培地中に存在する無機塩化合物には、塩素、カルシウム、マグネシウム、ナトリウム、コバルト、モリブデン、カリウム、マンガン、亜鉛、銅及び鉄のリン酸及び硫酸塩が含まれる。
例えば、硫酸塩、亜硫酸塩、亜ジチオン酸塩、テトラチオン酸塩、チオ硫酸塩、硫化物などの無機硫黄含有化合物、又は、例えば、メルカプタン及びチオールなどの他の有機硫酸化合物を、硫黄含有精製化学品の生産のための硫黄源として使用でき、特に、メチオニンが好ましい。
リン酸、二水素リン酸カリウム又は水素リン酸ジカリウム又はこれらに対応するナトリウム含有塩をリン源として使用してもよい。
溶液中に金属イオンを保つために培地へキレート剤を添加してもよい。特に適当なキレート剤には、カテコール又はプロトカテク酸塩などのジヒドロキシフェノール及びクエン酸などの有機酸が含まれる。
培地中に存在する無機塩化合物には、塩素、カルシウム、マグネシウム、ナトリウム、コバルト、モリブデン、カリウム、マンガン、亜鉛、銅及び鉄のリン酸及び硫酸塩が含まれる。
例えば、硫酸塩、亜硫酸塩、亜ジチオン酸塩、テトラチオン酸塩、チオ硫酸塩、硫化物などの無機硫黄含有化合物、又は、例えば、メルカプタン及びチオールなどの他の有機硫酸化合物を、硫黄含有精製化学品の生産のための硫黄源として使用でき、特に、メチオニンが好ましい。
リン酸、二水素リン酸カリウム又は水素リン酸ジカリウム又はこれらに対応するナトリウム含有塩をリン源として使用してもよい。
溶液中に金属イオンを保つために培地へキレート剤を添加してもよい。特に適当なキレート剤には、カテコール又はプロトカテク酸塩などのジヒドロキシフェノール及びクエン酸などの有機酸が含まれる。
また、微生物の培養に対し本発明で使用される発酵培地には、通常、ビオチン、リボフラビン、チアミン、葉酸、ニコチン酸、パントテン酸及びピリドキシンなどのビタミン又は成長プロモーターなどの成長因子も含まれる。成長因子及びその塩は、しばしば、イーストエクストラクト、糖液、コーンスティープリカーなどの複合培地成分に由来する。培地に適切な前駆体を添加することもできる。正確な培地化合物の組成は、特定の実験に大きく依存し、各特定のケースに対し個別に決定される。培地の最適化に関する情報は、教科書“Applied Microbiol.Physiology,A Practical Approach”(P.M. Rhodes,P.F.Stanbury,編集 IRL Press(1997)pp.53−73,ISBN 0 19 963577 3)に記載されている。また、成長培地は、例えば、Standard1(Merck)又はBHI(brain herat infusion,DIFCO)など、業者から購入することができる。
全ての培地成分は、高熱(1.5bar、121℃で20分間)又はフィルター滅菌により滅菌される。構成成分は、一緒に滅菌しても、又必要ならば、個別に滅菌してもよい。全ての培地成分は培養開始時に存在するか、又は連続的バッチ的に、望ましい様に添加される。
全ての培地成分は、高熱(1.5bar、121℃で20分間)又はフィルター滅菌により滅菌される。構成成分は、一緒に滅菌しても、又必要ならば、個別に滅菌してもよい。全ての培地成分は培養開始時に存在するか、又は連続的バッチ的に、望ましい様に添加される。
培養温度は、通常、15℃〜45℃、好ましくは25℃〜40℃、そして一定に維持されるか、又は実験の間に変動されてもよい。培地のpHは、5〜8.5の範囲、好ましくは、約7.0である。培養のためのpHは水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、アンモニア及びアンモニア水などの塩基化合物、又はリン酸又は硫酸などの酸化合物を添加して、培養中、コントロールすることができる。発砲は例えば、脂肪酸ポリグリコールエステルなどの消泡剤を用いて制御することができる。プラスミドの安定性を維持するための、例えば、抗生物質などの選択的効果を有する培地に適する物質を添加することができる。好気的状態は、酸素又は外気などの酸素を含む気体混合物を導入することによって維持される。培養温度は、通常、20℃〜45℃、好ましくは25℃〜40℃である。培養は、所望の産物の形成が最大になるまで続ける。この目的は、通常、10〜160時間で達成される。
このような方法で得られた発酵ブロース、特に、多価不飽和脂肪酸を含むものは、通常、7.5〜25重量%の乾燥総量が含まれる。
次に、発酵ブロースはさらに処理される。バイオマスは、例えば、遠心、濾過、デカンテーション又はこれらの方法の組合せた分離方法により、発酵ブロースから必要に応じて完全に又は部分的に除去されるか、又は該ブロース中に全て残存させる。分離後にバイオマスを処理した方が有効である。
しかし、また、発酵ブロースは細胞を分離することなく、既知の方法、例えば、ロータリーエバポレーター、薄膜エバポレーター、フォーリングフィルムエバポレーターなどを用いて、逆浸透などにより、濃く、濃縮することができる。最後に、この濃縮された発酵ブロースはその中に存在する脂肪酸を得るために処理される。
このような方法で得られた発酵ブロース、特に、多価不飽和脂肪酸を含むものは、通常、7.5〜25重量%の乾燥総量が含まれる。
次に、発酵ブロースはさらに処理される。バイオマスは、例えば、遠心、濾過、デカンテーション又はこれらの方法の組合せた分離方法により、発酵ブロースから必要に応じて完全に又は部分的に除去されるか、又は該ブロース中に全て残存させる。分離後にバイオマスを処理した方が有効である。
しかし、また、発酵ブロースは細胞を分離することなく、既知の方法、例えば、ロータリーエバポレーター、薄膜エバポレーター、フォーリングフィルムエバポレーターなどを用いて、逆浸透などにより、濃く、濃縮することができる。最後に、この濃縮された発酵ブロースはその中に存在する脂肪酸を得るために処理される。
また、本方法で得られる脂肪酸は、目的の更なる産物の化学合成に対する出発物質としても適当である。例えば、それらは互いに組み合わせて、又は単独で、医薬品、食品、動物飼料又は化粧品の調製に使用することができる。本方法で使用される核酸を導入するために、既知の方法で有利に増幅及びライゲーションすることができる。好ましくは、PfuDNAポリメラーゼ又はPfu/TaqDNAポリメラーゼ混合物に関するプロトコールに従う方法による。プライマーは、増幅する配列を考慮に入れて選択される。プライマーは便宜上、増幅産物が開始コドンから停止コドンまでの全コード配列を含むように選択される必要がある。増幅後、増幅物は便宜上分析される。例えば、ゲル電気泳動分離は質及び量について実施することができる。その後、増幅物は標準的なプロトコール(例えば、Qiagenn)により精製することができる。その後、精製した増幅物のアリコットを次のクローニングのステップで使用することができる。適切なクローニングベクターは、一般に、当業者に周知である。特に、これらには微生物のシステムで複製可能なベクターであり、つまり、主として酵母又はカビでの有効なクローニングを保証し、安定な植物への形質導入を可能にするベクターが含まれる。特に挙げるとすれば、T−DNAを介する形質転換に適した種々のバイナリー又は共導入(co−integrated)用のベクターシステムである。一般に、これらのベクターシステムは、少なくとも、アグロバクテリウムを介する形質転換に必要なvir遺伝子とT−DNA境界(T−DNA delimiting)配列(T−DNA border)を含む。また、好ましくは、これらのベクターシステムは、さらに、プロモーター及びターミネーター及び/又は、適切に形質転換された生物を同定するための選択マーカーなどのシス制御領域を更に含む。共導入ベクターシステムにおいて、vir遺伝子とT−DNA配列を同じベクター上に配置するが、バイナリーシステムは、vir遺伝子を持つがT−DNAを持たないベクターと、これに対し、T−DNAを持つがvir遺伝子を持たない第2のベクターの少なくとも2つのベクターに基づいている。この事実によると、後者のベクターは比較的小さく、操作が容易で、大腸菌とアグロバクテリウムの両方において複製することができる。これらのバイナリーベクターは、一連のpBIB−HYG,pPZP,pBecks,pGreenに由来するベクターが含まれる。本発明によると、Binl9,pBHOl,pBinAR,pGPTV及びpCAMBIAが好適に使用される。バイナリーベクターの概説及びその使用については、Hillensら,Trends in Plant Science(2000)5,446−451中に記載されている。ベクターを調製するために、ベクターはまず制限エンドヌクレアーゼで直鎖化し、適当な形に酵素的に修飾する。その後、ベクターを精製し、アリコットをクローニングステップに使用する。クローニングステップにおいて、酵素的切断し、適当な場合には、増幅物を精製し、同様の方法で調製したベクター断片を使用し、ラーゲースによりクローン化する。この場合、特定の核酸コンストラクト、又はベクター又はプラスミドコンストラクトは、1又は複数のコード化遺伝子断片を有する。これらのコンストラクト中のコード化遺伝子断片は、好ましくは、制御配列と作用可能に結合する。制御配列には、特に、上述のプロモーター及び御ターミネーターなどの植物配列が含まれる。コンストラクトは微生物、特に大腸菌、アグロバクテリウム・ツメファシエンス中にて、選択的条件下で増殖することができ、ヘテロローガスなDNAを植物又は微生物中に導入することを可能にする。
本方法において使用される核酸は、つまり、本発明の核酸及び核酸コンストラクトは、微生物または有利には植物などの生物に、有利には、クローニングベクターを用いて導入することが可能であり、従って、以下に発行され引用されているように、植物の形質転換に使用される:Plant Molecular Biology and Biotechnology(CRC Press,Boca Raton,Florida), Chapter 6/7, pp.71−119(1993);F.F.White,Vectors for Gene Transfer in Higher Plants; in:Transgenic Plants,Vol.1,Engineering and Utilization, Ed.:Kung and R. Wu, Academic Press, 1993,15−38;B. Jenesら,Techniques for Gene Transfer,in:Transgenic Plants, Vol.1,Engineering and Utilization, Ed.:Kung及びR.Wu,Academic Press(1993),128−143;Potrykus,Annu.Rev.Plant Physiol.Plant Molec.Biol.42(1991),205−225。従って、本発明に使用される核酸、つまり、本発明の核酸及び核酸コンストラクト、及び/又はベクターは、広い範囲の生物、有利には植物の組換え修飾に使用可能であり、後者はPUFA生産物としてより適切、及び/又はより効果的である。
本方法で有利に使用される核酸は、バクテリア、例えばShewanella,Physcomitrella,Thraustochytrium,Fusarium,Phytophtora,Ceratodon,Isochrysis,Aleurita,Muscarioides,Mortierella,Borago,Phaeodactylum,Crypthecodiniumなど藻類若しくはコケ類などの植物、又はCaenorhabditisなどの線虫に由来し、特に、Shewanella hanedai,Physcomitrella patens,Phytophtora infestans,Fusarium graminaeum,Cryptocodinium cohnii,Ceratodon purpureus,Isochrysis galbana,Aleurita farinosa,Muscarioides viallii,Mortierella alpina,Borago officinalis,Phaeodactylum tricornutumの属又は種に由来し、特に有利には、Caenorhabditis elegans(シーエレガンス)に由来する。
本方法で使用される核酸は、微生物又は植物などの生物中における核酸の発現を可能にする発現カセット中に有利に導入される。
これを行う場合、本発明の核酸の核酸をコードする核酸配列、及び組み合わせて使用されるアシル−CoAシンテターゼ、デサチュラーゼ及び/又はエロンゲースをコードする核酸配列は、1又は複数の制御シグナル、有利には、遺伝子発現を促進するものと機能的に連結される。これらの制御配列は、遺伝子及びタンパク質の特異的な発現を可能ならしめることを目的とされる。宿主生物に依存するが、このことは、例えば、遺伝子が、誘導が行われた後のみ、発現及び/又は過剰発現され、あるいは、即時に発現及び/又は発現されることを意味する。例えば、これらの制御配列は誘導因子又は抑制因子が結合する配列の形態をとり、核酸の発現をコントロールする。これらの新規制御配列に加えて、又はこれらの配列の代わりに、現実の構造遺伝子の前にこれらの配列の天然の制御が依然として存在することがあり、適当であるならば、天然の制御を除去して、該遺伝子の発現を促進するように遺伝学的に修飾してもよい。しかし、発現カセット(=発現コンストラクト=遺伝子コンストラクト)は、コンストラクトにおいてよりシンプルであってもよい。つまり、核酸配列又はその誘導体の前に何ら制御シグナルを挿入せずに、その制御と共に天然のプロモーターを除去する。その代わり、天然の制御配列には、もはや制御が起こらず、及び/又は遺伝子発現が促進されるように変異を導入される。これらの修飾されたプロモーターは、活性を促進するために部分配列の形態で(=本発明の核酸配列の一部を持つプロモーター)天然の遺伝子の前に各々配置してもよい。さらに、遺伝子コンストラクトは、プロモーターと機能的にリンクしたエンハンサー配列として知られる1又は複数の配列、つまり、核酸配列の増強した発現を可能にする配列を有利に含んでもよい。さらなる有利な配列、更なる制御エレメント又はターミネーターをDNA配列の3’末端に挿入してもよい。脂肪酸生合成に関与するアシルCoAシンテターゼ、Δ−4−デサチュラーゼ、Δ−5−デサチュラーゼ、Δ−6−デサチュラーゼ及び/又はΔ−8−デサチュラーゼ遺伝子及び/又はΔ−5−エロンゲース、Δ−6−エロンゲース及び/又はΔ−9−エロンゲース遺伝子、又は他の遺伝子は、発現カセット(=遺伝子コンストラクト)中に1又は複数のコピーとして存在してもよい。好ましくは、遺伝子の1コピーのみが各発現カセット中に存在する。この遺伝子コンストラクト又は遺伝子コンストラクト(群)は、宿主生物中で共に発現される。この場合、遺伝子コンストラクト(群)は、1又は複数のベクター中に挿入され、遊離型で細胞内に存在し、あるいは、ゲノム中に挿入される。宿主ゲノム中への更なる遺伝子の挿入にとって、発現される遺伝子が1つの遺伝子コンストラクト中に共に存在することは有利である。
この場合制御配列又は因子は、上述のように、好ましくは、導入された遺伝子の遺伝子発現に対しポジティブな効果を示し、その結果、発現を促進する。従って、制御エレメントの促進は、有利には転写レベルであり、プロモーター及び/又はエンハンサーなど強力な転写シグナルを用いることで行われる。しかしながら、さらに、増強された翻訳も、例えば、mRNAの安定性を改善することで可能である。
これを行う場合、本発明の核酸の核酸をコードする核酸配列、及び組み合わせて使用されるアシル−CoAシンテターゼ、デサチュラーゼ及び/又はエロンゲースをコードする核酸配列は、1又は複数の制御シグナル、有利には、遺伝子発現を促進するものと機能的に連結される。これらの制御配列は、遺伝子及びタンパク質の特異的な発現を可能ならしめることを目的とされる。宿主生物に依存するが、このことは、例えば、遺伝子が、誘導が行われた後のみ、発現及び/又は過剰発現され、あるいは、即時に発現及び/又は発現されることを意味する。例えば、これらの制御配列は誘導因子又は抑制因子が結合する配列の形態をとり、核酸の発現をコントロールする。これらの新規制御配列に加えて、又はこれらの配列の代わりに、現実の構造遺伝子の前にこれらの配列の天然の制御が依然として存在することがあり、適当であるならば、天然の制御を除去して、該遺伝子の発現を促進するように遺伝学的に修飾してもよい。しかし、発現カセット(=発現コンストラクト=遺伝子コンストラクト)は、コンストラクトにおいてよりシンプルであってもよい。つまり、核酸配列又はその誘導体の前に何ら制御シグナルを挿入せずに、その制御と共に天然のプロモーターを除去する。その代わり、天然の制御配列には、もはや制御が起こらず、及び/又は遺伝子発現が促進されるように変異を導入される。これらの修飾されたプロモーターは、活性を促進するために部分配列の形態で(=本発明の核酸配列の一部を持つプロモーター)天然の遺伝子の前に各々配置してもよい。さらに、遺伝子コンストラクトは、プロモーターと機能的にリンクしたエンハンサー配列として知られる1又は複数の配列、つまり、核酸配列の増強した発現を可能にする配列を有利に含んでもよい。さらなる有利な配列、更なる制御エレメント又はターミネーターをDNA配列の3’末端に挿入してもよい。脂肪酸生合成に関与するアシルCoAシンテターゼ、Δ−4−デサチュラーゼ、Δ−5−デサチュラーゼ、Δ−6−デサチュラーゼ及び/又はΔ−8−デサチュラーゼ遺伝子及び/又はΔ−5−エロンゲース、Δ−6−エロンゲース及び/又はΔ−9−エロンゲース遺伝子、又は他の遺伝子は、発現カセット(=遺伝子コンストラクト)中に1又は複数のコピーとして存在してもよい。好ましくは、遺伝子の1コピーのみが各発現カセット中に存在する。この遺伝子コンストラクト又は遺伝子コンストラクト(群)は、宿主生物中で共に発現される。この場合、遺伝子コンストラクト(群)は、1又は複数のベクター中に挿入され、遊離型で細胞内に存在し、あるいは、ゲノム中に挿入される。宿主ゲノム中への更なる遺伝子の挿入にとって、発現される遺伝子が1つの遺伝子コンストラクト中に共に存在することは有利である。
この場合制御配列又は因子は、上述のように、好ましくは、導入された遺伝子の遺伝子発現に対しポジティブな効果を示し、その結果、発現を促進する。従って、制御エレメントの促進は、有利には転写レベルであり、プロモーター及び/又はエンハンサーなど強力な転写シグナルを用いることで行われる。しかしながら、さらに、増強された翻訳も、例えば、mRNAの安定性を改善することで可能である。
新規方法のための有利な制御配列は、例えば、cos,tac,trp,tet,trp−tet,lpp,lac,lpp−lac,laclq,T7,T5,T3,gal,trc,ara,SP6,λ−PR又はλ−PLなどのプロモーター中に存在し、グラム陰性細菌中で有利に使用される。さらに有利な制御配列は、例えば、酵母のグラム陽性プロモーター、amy、SPO2、又はカビのプロモーターのADCl,MFa,AC,P−60,CYCl,GAPDH,TEF,rp28,ADH、又は植物プロモーターのCaMV/35S[Franckら,Cell 21(1980)285−294],PRPl[Wardら,Plant.MoI.Biol.22(1993)],SSU,OCS,Iib4,usp,STLSl,B33,nos、又はユビキチン又はファゼオリンプロモーター中に存在する。この点において、EP−A−0388186(ベンジルスルホンアミド−誘導性)、Plant J. 2,1992:397−404(Gatzら,テトラサイクリン−誘導性)、EP−A−0335528(アブサイシン酸−誘導性)、又はWO93/21334(エタノール−又はシクロヘキセノール−誘導性)中に記載されているプロモーターなどの誘導性プロモーターも有効である。さらに適切な植物プロモーターは、ジャガイモのサイトゾルFBPaseプロモーター又はST−LSIプロモーター(Stochhausら,EMBO J.8,1989,2445)、グリシン マックス ホスホリボシルピロホスフェート アミドトランスフェラーゼプロモーター(Genbankアクセッション番号U87999)又はEP−A−0249676に記載のノード特異的プロモーターである。さらに特に有利なものは、前述のUSPプロモーターなどの種子特異的プロモーター、また、LeB4、DC3、ファセオリン、ナピン(napin)プロモーターなどの他のプロモーターである。特に有利なプロモーターは、脂肪酸の生合成に関与する組織に発現を可能にするプロモーターである。非常に、特に有利なプロモーターは、単子葉又は双子葉植物で使用することができる種子特異的プロモーター、及びUS5,608,152(アブラナnapinプロモーター)、WO98/45461(Arabidopsisi oleosinプロモーター)、US5,504,200(Phaseolus vulgaris phaseolinプロモーター)、WO91/13980(アブラナ属Bce4プロモーター)、Baeumleinら,Plant J.,2,2,1992:233−239(マメ科植物のLeB4プロモーター)により記載されもので、これらのプロモーターは、双子葉植物に適している。単子葉植物に適するプロモーターの例として、大麦のlpt−2又はlpt−1プロモーター(WO95/15389及びWO95/23230)、大麦麦粒腫プロモーター及びWO99/16890に記載の他の適切なプロモーターが挙げられる。
原則として、新規方法に対し、全て天然プロモーターを、上述したようなその制御配列と共に使用することができる。また、合成プロモーターを付加的に又は単独で使用することも可能かつ有効であり、特に、種子特異的発現を媒介する場合は、WO99/16890に記載されるようなものである。
特に高いPUFA含量を、特にトランスジェニック植物で達成するためには、PUFA生合成遺伝子は、種子特異的な方法で油料作物中で有利に発現することができる。このために、種子特異的プロモーターを使用し、又は胚及び/又は内乳中で作用するプロモーターを使用することができる。原則として、種子特異的プロモーターは、双子葉植物及び単子葉植物の両方から単離することができる。有利に好ましいプロモーターを以下に挙げる:USP(=unknown seed protein)及びvicilin(ソラマメ科)[Baumleinら,Mol.Gen Genet.,1991,225(3)]、napin(アブラナ)[US5,608,152]、acyl carrier protein(アブラナ)[US5,315,001及びWO92/18634]、oleosin(シロイヌナズナ)[WO98/45461及びWO93/20216]、phaseolin(インゲンマメ)[US5,504,200]、Bce4[WO91/13980]、legumes B4(LegB4プロモーター)[Baumleinら, Plant J.,2,2,1992]、Lpt2及びlptl(大麦)[WO95/15389及びWO95/23230]、ライス、トウモロコシ及び小麦由来種子特異的プロモーター[WO99/16890]、Amy32b、Amy 6−6及びaleurain[US5,677,474]、Bce4(アブラナ)[US5,530,149]、 glycinin(大豆)[EP571741]、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ(大豆)[JP06/62870]、ADR12−2(大豆)[WO98/08962]、イソクエン酸リアーゼ(アブラナ)[US5,689,040]又はα−アミラーゼ(大麦)[EP781849]。
また、植物遺伝子の発現は化学的に誘導可能なプロモーターによって促進される(Gatz 1997,Annu.Rev.Plant Physiol.Plant Mol.Biol.,48:89−108を参照のこと)。化学的誘導プロモーターは、遺伝子発現が時間特異的に行われるべき場合に特に適している。そのようなプロモーターの例として、サリチル酸誘導プロモーター(WO95/19443)、テトラサイクリン誘導プロモーター(Gatzら,(1992)Plant J.2,397−404)及びエタノール誘導性プロモーターなどがある。
繰り返し配列モチーフは、T−DNA又は組換えの不安定性を生じさせるため、複数の世代を通してトランスジェニック植物中に生合成遺伝子の安定なインテグレーションを保証するために、アシル−CoAシンテターゼ、Δ−4−デサチュラーゼ、Δ−5−デサチュラーゼ、Δ−6−デサチュラーゼ、Δ−8−デサチュラーゼ及び/又はΔ−5−エロンゲース、Δ−6−エロンゲース及び/又はΔ−9−エロンゲースをコードする各核酸、及び本方法で使用される各核酸は、個別のプロモーター、好ましくは、他のプロモーターと異なるプロモーターの支配下で発現される。この点において、発現カセットは、発現されるべき核酸の挿入に対して、適当な切断部位の後にプロモーターが配置されるように、有利には、ポリリンカー中に構築され、適当な場合には、ターミネーターがポリリンカーの後に配置される。この配列は数回、好ましくは3回、4又は5回繰り返され、その結果、5遺伝子までが1つのコンストラクト中で組み合わされ、発現されるようにトランスジェニック植物中に導入される。有利には、配列は3回繰り返される。核酸配列を発現するために、該核酸は適当な切断部位によりプロモーターの後に挿入される。有利には、各核酸はそれ自身のプロモーターを、適切ならば、それ自身のターミネーターを有している。しかし、複数の核酸配列をプロモーターの後に、適切ならば、ターミネーターの前に挿入することもできる。ここで、発現カセット中の挿入核酸の挿入部位又は配列は、決定的に重要というわけではなく、つまり、核酸配列は、その発現が実質的に影響を受けないカセット中の最初又は最後の位置に挿入することができる。有利には、例えば、USP、LegB4又はDC3プロモーターなどの異なるプロモーター、及び異なるターミネーターを発現カセット中で使用することができる。しかし、カセット中で唯一のタイプのプロモーターを使用することもできる。しかし、これは望ましくない組換えを引き起こす可能性がある。
上述の通り、導入された遺伝子の転写は、導入された(停止コドンの後に)生合成遺伝子の3’末端にある適当なターミネーターによって都合よく停止される。この点において、使用可能な配列の例には、OSC1ターミネーターがある。プロモーターの場合、異なるターミネーター配列が各遺伝子に対して使用される。
上述の通り、遺伝子コンストラクトは、生物に導入される更なる遺伝子を含むこともできる。生合成過程の1又は複数の遺伝子の制御に関与するインダクター、リプレッサー、又はその酵素活性により制御に関与する酵素の遺伝子などの制御遺伝子を、宿主生物に導入し、それにより発現させることは可能であり、都合がよい。これらの遺伝子はヘテロローガス又はホモローガスな由来であってもよい。さらに、脂肪酸又は脂質代謝の更なる生合成遺伝子を、核酸コンストラクト又は遺伝子コンストラクト中に都合良く配置することもできる;しかし、これらの遺伝子は1又はさらなる遺伝子コンストラクト上に配置することもできる。都合よく使用される脂肪酸又は脂質代謝の生合成遺伝子は、アシル−CoAデヒドロゲナーゼ、アシルACP[=acyl carrier protein]デサチュラーゼ、アシルACPチオエステラーゼ、脂肪酸アシルトランスフェラーゼ、アシル−CoA:リゾリン脂質アセチルトランスフェラーゼ、脂肪酸シンターゼ、脂肪酸ヒドロキシラーゼ、アセチルコエンザイムAカルボキシラーゼ、アシルコエンザイムAオキシダーゼ、脂肪酸デサチュラーゼ、脂肪酸アセチレナーゼ、リポキシゲナーゼ、トリアシルグリセロールリパーゼ、アレンオキシドシンターゼ、ヒドロパーオキサイドリアーゼ又は脂肪酸エロンゲース又はこれらの組合せからなるグループより選択される遺伝子である。特に、本発明の核酸の組み合わせる上で都合のよい核酸配列は、Δ−4−デサチュラーゼ、Δ−5−デサチュラーゼ、Δ−6−デサチュラーゼ、Δ−8−デサチュラーゼ、Δ−9−デサチュラーゼ、Δ−12−デサチュラーゼ、Δ−5−エロンゲース、Δ−6−エロンゲース又はΔ−9−エロンゲースからなるグループより選択される脂肪酸又は脂質代謝の生合成遺伝子である。
上述の通り、遺伝子コンストラクトは、生物に導入される更なる遺伝子を含むこともできる。生合成過程の1又は複数の遺伝子の制御に関与するインダクター、リプレッサー、又はその酵素活性により制御に関与する酵素の遺伝子などの制御遺伝子を、宿主生物に導入し、それにより発現させることは可能であり、都合がよい。これらの遺伝子はヘテロローガス又はホモローガスな由来であってもよい。さらに、脂肪酸又は脂質代謝の更なる生合成遺伝子を、核酸コンストラクト又は遺伝子コンストラクト中に都合良く配置することもできる;しかし、これらの遺伝子は1又はさらなる遺伝子コンストラクト上に配置することもできる。都合よく使用される脂肪酸又は脂質代謝の生合成遺伝子は、アシル−CoAデヒドロゲナーゼ、アシルACP[=acyl carrier protein]デサチュラーゼ、アシルACPチオエステラーゼ、脂肪酸アシルトランスフェラーゼ、アシル−CoA:リゾリン脂質アセチルトランスフェラーゼ、脂肪酸シンターゼ、脂肪酸ヒドロキシラーゼ、アセチルコエンザイムAカルボキシラーゼ、アシルコエンザイムAオキシダーゼ、脂肪酸デサチュラーゼ、脂肪酸アセチレナーゼ、リポキシゲナーゼ、トリアシルグリセロールリパーゼ、アレンオキシドシンターゼ、ヒドロパーオキサイドリアーゼ又は脂肪酸エロンゲース又はこれらの組合せからなるグループより選択される遺伝子である。特に、本発明の核酸の組み合わせる上で都合のよい核酸配列は、Δ−4−デサチュラーゼ、Δ−5−デサチュラーゼ、Δ−6−デサチュラーゼ、Δ−8−デサチュラーゼ、Δ−9−デサチュラーゼ、Δ−12−デサチュラーゼ、Δ−5−エロンゲース、Δ−6−エロンゲース又はΔ−9−エロンゲースからなるグループより選択される脂肪酸又は脂質代謝の生合成遺伝子である。
この点において、上述の核酸および遺伝子は、本発明の発現カセット中に、他のエロンゲース及びデサチュラーゼと組み合わせてクローン化することができ、アグロバクテリアを利用して植物をトランスフォームするために使用することができる。
ここで、上述の制御配列又は因子は、好ましくは、導入された遺伝子の発現に対してポジティブな効果を有し、発現を促進する。従って、制御エレメントの促進は、プロモーター及び/又はエンハンサーなどの強力な転写シグナルを使用することにより、転写レベルで都合良く引き起こされる。しかし、増強された翻訳も、例えばmRNAの安定性を改善することにより可能である。原則として、発現カセットは直接植物中に導入するために使用することができ、あるいは、ベクターに導入することができる。
ここで、上述の制御配列又は因子は、好ましくは、導入された遺伝子の発現に対してポジティブな効果を有し、発現を促進する。従って、制御エレメントの促進は、プロモーター及び/又はエンハンサーなどの強力な転写シグナルを使用することにより、転写レベルで都合良く引き起こされる。しかし、増強された翻訳も、例えばmRNAの安定性を改善することにより可能である。原則として、発現カセットは直接植物中に導入するために使用することができ、あるいは、ベクターに導入することができる。
これらの有利なベクター、好ましくは、発現ベクターは、リゾホスファチジン酸アシルトランスフェラーゼ、グリセロ−3−ホスフェートアシルトランスフェラーゼ、ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ又はレシチンコレステロールアシルトランスフェラーゼをコードし、本方法で使用される核酸、又は、単独であるいは、アシル−CoA:リゾリン脂質アセチルトランスフェラーゼ、Δ−4−デサチュラーゼ、Δ−5−デサチュラーゼ、Δ−6−デサチュラーゼ、Δ−8−デサチュラーゼ、Δ−9−デサチュラーゼ、Δ−12−デサチュラーゼ、Δ−5−エロンゲース、Δ−6−エロンゲース及び/又はΔ−9−エロンゲースなどの更なる脂肪酸又は脂質代謝の生合成遺伝子と組み合わせて、使用される核酸を含む核酸コンストラクトを含んでいる。この文脈で使用される場合、「ベクター」という用語は、それに結合する他の核酸を運ぶことができる核酸分子のことである。ベクターの1つのタイプは、付加的なDNA断片をライゲートすることができる環状二重鎖DNAループである「プラスミド」である。さらなるベクターのタイプは、ウィルスベクターであり、付加的なDNA断片をウィルスゲノム中にライゲートすることができる。ある種のベクターは、導入された宿主細胞中で自律的複製を行うことができる(例えば、バクテリア性複製起点を持つバクテリアベクター)。他のベクターは宿主細胞中に導入されたとき、宿主ゲノム中に都合良くインテグレートされ、宿主ゲノムと共に複製される。さらに、あるベクターは、機能的な関連を持つ遺伝子の発現をコントロールすることができる。これらのベクターは、ここでは、「発現ベクター」と称される。通常、DNAの組換え技術に適した発現ベクターは、プラスミドの形態をとる。プラスミドは、最もしばしば使用されるベクターの形態であるため、本明細書中では、「プラスミド」及び「ベクター」は交換可能に用いられる。しかし、本発明は、類似の機能を示すウィルスベクターなど、他の形態の発現ベクターを含むことも意図される。さらに、「ベクター」という用語は、当業者に周知のベクター、例えば、ファージ、SV40などのウィルス、CMV、TMV、トランスポゾン、ISエレメント、ファスミド、ファージミド、コスミド、直鎖又は環状DNAなどを含むことが意図される。
本方法で使用される組換え発現ベクターは、以下の核酸又は宿主細胞で使用される核酸を発現するのに適した形態の上述の遺伝子コンストラクトを含むが、このことは、組換え発現ベクターが、発現に使用される宿主細胞に基づいて選択され、発現されるべき核酸配列と機能的に関連する1又は複数の制御配列を含むことを意味する。組換え発現ベクターにおいて、「機能的に関連する」とは、対象のヌクレオチド配列が発現可能に制御配列と結合し、両配列が配列に割り当てられた予測される機能(例えば、インビトロ転写/翻訳システムにおいて、又はベクターが宿主細胞に導入された場合宿主細胞中において)を実行するように互いに結合することを意味する。「制御配列」という用語は、プロモーター、エンハンサー及び他の発現コントロールエレメント(例えば、ポリアデニル化シグナル)を含むことが意図される。これらの制御配列は、例えば、Goeddel:Gene Expression Technology:Methods in Enzymology 185,Academic Press,San Diego,CA(1990),又は:Gruber及びCrosby,in:Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology,CRC Press,Boca Raton,Florida,Ed.:Glick及びThompson,Chapter 7,89−108、これらに引用される文献中に記載されている。制御配列には、多くのタイプの宿主細胞中のヌクレオチド配列の構成的発現を支配するもの、及び特定の条件下、特定の宿主細胞でのみヌクレオチド配列の直接的な発現を支配するものが含まれる。当業者であれば、発現ベクターの設計は、形質転換される宿主細胞の選択、所望のタンパク質の発現レベルなどの要因に依存することを知っている。
使用される組換え発現ベクターは、本発明の核酸単独又は、リゾホスファチジン酸アシルトランスフェラーゼ、グリセロール−3−ホスフェートアシルトランスフェラーゼ、ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ又はレシチンコレステロールアシルトランスフェラーゼ、アシル−CoA:リゾリン脂質アシルチルトランスフェラーゼ、デサチュラーゼ及びエロンゲースなどの原核又は真核細胞に存在する脂肪酸合成酵素をコードするその他の核酸と組み合わせて、設計することができる。この点は、ベクター構築の中間ステップを、しばしば、微生物中で簡単に行うことができるため、都合がよい。例えば、リゾホスファチジン酸アシルトランスフェラーゼ、グリセロール−3−ホスフェートアシルトランスフェラーゼ、ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ、レシチンコレステロールアシルトランスフェラーゼ、アシル−CoA:リゾリン脂質アシルチルトランスフェラーゼ、デサチュラーゼ及び/又はエロンゲース遺伝子は、バクテリア細胞、昆虫細胞(バキュロウィルス発現システムを使用して)、酵母、その他のカビ細胞(Romanos,M. A.ら,(1992)“Foreign gene expression in yeast:a review”,Yeast 8:423−488;van den Hondel,C.A.M.J.J.ら,(1991)“Heterologous gene expression in filamentous fungi”,in:More Gene Manipulations in Fungi,J.W.Bennet&L.L.Lasure,Ed.,pp. 396−428:Academic Press:San Diego;及びvan den Hondel,C.A.M.JJ.,&Punt,PJ.(1991)“Gene transfer systems and vector development for filamentous fungi,in:Applied Molecular Genetics of Fungi,Peberdy,J.F.ら,Ed.,pp.1−28,Cambridge University Press:Cambridgeを参照のこと)、藻類(Falciatoreら,1999,Marine Biotechnology.1,3:239−251)、以下の繊毛虫:Holotrichia,Peritrichia,Spirotrichia,Suctoria,Tetrahymena,Paramecium,Colpidium,Glaucoma,Platyophrya,Potomacus,Desaturaseudocohnilembus,Euplotes,Engelmaniella及びStylonychia,特に、Stylonychia lemnae属中で、WO98/01572に開示される形質転換法でベクターを使用し、好ましくは、多細胞植物の細胞中で(Schmidt,R.及びWillmitzer,L.(1988)“High efficiency Agrobacterium tumefaciens−mediated transformation of Arabidopsis thaliana leaf and cotyledon explants” Plant Cell Rep.:583−586;Plant Molecular Biology and Biotechnology,C Press,Boca Raton,Florida, Chapter 6/7,pp.71−119(1993);F.F.White,B. Jenesら,Techniques for Gene Transfer,in:Transgenic Plants,Vol.1,Engineering and Utilization,Ed.:Kung及びR.Wu,Academic Press(1993),128−43;Potrykus,Annu.Rev.Plant Physiol.Plant Molec.Biol.42(1991),205−225(及びこれらに引用された文献)を参照のこと)で発現することができる。適切な宿主細胞については、さらにGoeddel,Gene Expression Technology:Methods in Enzymology 185,Academic Press,San Diego,CA(1990)中に記載されている。あるいは、組換え発現ベクターは、例えば、T7−プロモーター制御配列及びT7−ポリメラーゼを用いて、インビトロにて転写及び翻訳を行わせることができる。
多くの場合、原核生物でのタンパク質の発現は、融合又は非融合タンパク質の発現を支配する構成的又は誘導性プロモーターを含むベクターの使用を伴う。典型的な融合発現ベクターは、特に、pGEX(Pharmacia Biotech Inc;Smith, D.B.及びJohnson,K.S.(1988) Gene 67:31−40)、 pMAL(New England Biolabs,Beverly,MA)及びpRIT5(Pharmacia,Piscataway,NJ)であり、各々、グルタチオンS−トランスフェラーゼ(GST)、マルトース−E結合タンパク質及びプロテインAが組換え標的タンパク質と融合している。
適切な誘導性非融合大腸菌発現ベクターの例として、特に、pTrc(Amannら,(1988) Gene 69:301−315)及びpET11d(Studierら, Gene Expression Technology:Methods in Enzymology 185,Academic Press,San Diego,California (1990)60−89)などがある。pTrcベクターからの標的遺伝子発現は、ハイブリッドtrp−lac融合プロモーターから宿主のRNAポリメラーゼによる転写に基づいている。ベクターpET11dからの標的遺伝子の発現は、共発現されるウィルスRNAポリメラーゼ(T7 gn1)によってメディエートされるT7−gn10−lac融合プロモーターの転写に基づいている。このウィルスポリメラーゼは宿主株BL21(DE3)又はHMS174(DE3)により、lacUV5プロモーターの転写コントロール下にT7gn1遺伝子を持つ在住λプロファージから提供される。
適切な誘導性非融合大腸菌発現ベクターの例として、特に、pTrc(Amannら,(1988) Gene 69:301−315)及びpET11d(Studierら, Gene Expression Technology:Methods in Enzymology 185,Academic Press,San Diego,California (1990)60−89)などがある。pTrcベクターからの標的遺伝子発現は、ハイブリッドtrp−lac融合プロモーターから宿主のRNAポリメラーゼによる転写に基づいている。ベクターpET11dからの標的遺伝子の発現は、共発現されるウィルスRNAポリメラーゼ(T7 gn1)によってメディエートされるT7−gn10−lac融合プロモーターの転写に基づいている。このウィルスポリメラーゼは宿主株BL21(DE3)又はHMS174(DE3)により、lacUV5プロモーターの転写コントロール下にT7gn1遺伝子を持つ在住λプロファージから提供される。
原核生物に適する他のベクターは、当業者に既知であり、これらのベクターとして、例えば、大腸菌のpLG338、pACYC184、pBR322などのpBRシリーズ、pUC18又はpUC19などのpUCシリーズ、M113mpシリーズ、pKC30、pRep4、pHSl、pHS2、pPLc236、pMBL24、pLG200、pUR290、pIN−III113−B1、λgt11又はpBdCI、ストレプトミセスのpIJ10l、pIJ364、pIJ702又はpIJ361、バチラスのpUB110、pC194又はpBD214、コリネバクテリウムのpSA77又はpAJ667などである。
さらなる実施態様において、発現ベクターは酵母発現ベクターである。酵母S.cerevisiaeの発現ベクターの例として、pYeDesaturasec1(Baldariら,(1987)Embo J.6:229−234)、pMFa(Kurjan及びHerskowitz(1982) Cell 30:933−943)、pJRY88(Schultzら,(1987) Gene 54:113−123)及びpYES2(Invitrogen Corporation,San Diego,CA)などがある。糸状菌などの他のカビ中での使用に適するベクター構築のためのベクター及び方法には、van den Hondel,C.A.M.J.J.,& Punt,PJ.(1
991)“Gene transfer systems and vector development for filamentous fungi,in:Applied Molecular Genetics of fungi,J.F.Peberdyら,Ed.,pp.1−28,Cambridge University Press:Cambridge,又はin:More Gene Manipulations in Fungi[J.W.Bennet & L.L. Lasure,Ed., pp.396−428:Academic Press:San Diego]に詳細に記載されるものが含まれる。さらに、適切な酵母のベクターは、例えば、pAG−1、YEp6、YEp13又はpEMBLYe23である。
991)“Gene transfer systems and vector development for filamentous fungi,in:Applied Molecular Genetics of fungi,J.F.Peberdyら,Ed.,pp.1−28,Cambridge University Press:Cambridge,又はin:More Gene Manipulations in Fungi[J.W.Bennet & L.L. Lasure,Ed., pp.396−428:Academic Press:San Diego]に詳細に記載されるものが含まれる。さらに、適切な酵母のベクターは、例えば、pAG−1、YEp6、YEp13又はpEMBLYe23である。
あるいは、アシル−CoAシンテターゼ、リゾホスファチジン酸アシルトランスフェラーゼ、グリセロール−3−ホスフェートアシルトランスフェラーゼ、ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ、レシチンコレステロールアシルトランスフェラーゼ、アシル−CoA:リゾリン脂質アシルチルトランスフェラーゼ、デサチュラーゼ及び/又はエロンゲースは、バキュロウィルス発現ベクターを用いて昆虫細胞内で発現できる。培養昆虫細胞(例えば、Sf9細胞)でタンパク質の発現に利用できるバキュロウィルスベクターには、pAcシリーズ(Smithら,(1983)Mol.Cell Biol.3:2156−2165)及びpVLシリーズ(Lucklow及びSummers(1989)Virology170:31−39)が含まれる。前記ベクターは、利用可能な適当なベクターのほんの一部の概要である。さらなるプラスミドが当業者によって知られており、例えば、Cloning Vectors(Pouwels, P.H.ら,編集、Elsevier,Amsterdam−New York−Oxford,1985,ISBN 0 444 904018)中に開示されている。原核生物及び真核生物に関するさらなる適切な発現ベクターについては、the Chapters 16 and 17 in Sambrook,J.,Fritsch,E.F.及びManiatis, T.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual, 2nd edition,Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY,1989の第16章及び17章を参照のこと。
本発明のさらなる実施態様において、アシル−CoAシンテターゼ、リゾホスファチジン酸アシルトランスフェラーゼ、グリセロール−3−ホスフェートアシルトランスフェラーゼ、ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ、レシチンコレステロールアシルトランスフェラーゼ、アシル−CoA:リゾリン脂質アシルチルトランスフェラーゼ、デサチュラーゼ及び/又はエロンゲースは、単細胞植物細胞(藻類など)−Falciatoreら,1999,Marine Biotechnology 1(3):239−251及びそこに挙げられた参考文献を参照のこと−、及び高等植物由来の植物細胞中で発現することができる(例えば、耕地作物などの種子植物)。植物発現ベクターの例として、Becker,D.,Kemper,E.,Schell,J.及びMasterson, R. (1992)“New plant binary vectors with selectable markers located proximal to the left border”,Plant MoI.Biol.20:1195−1197;及びBevan,M.W.(1984)“Binary Agrobacterium vectors for plant transformation”, Nucl.Acids Res.12:8711−8721; Vectors for Gene Transfer in Higher Plants;in:Transgenic Plants,Vol.1,Engineering and Utilization,:Kung及びR.Wu編集,Academic Press, 1993,pp.15−38に詳細に記載されるものが含まれる。
植物発現カセットは、好ましくは、植物細胞中で遺伝子発現を支配可能で、各配列がその機能を果たすように作用可能に結合された制御配列、例えば、転写ターミネーション、ポリアデニル化シグナルなどを含む。好ましいポリアデニル化シグナルは、オクトピンシンターゼとして知られるTiプラスミドpTiACH5のgene3など、アグロバクテリウム・ツメファシエンスT−DNAに由来するものであるが、植物で機能的に活性な他のターミネーターも適している。植物遺伝子発現は、転写レベルにそれほど限定されないので、植物発現カセットには、好ましくは、作用可能に結合する、例えば、タバコモザイクウィルス5’−非翻訳リーダー配列を含む、タンパク質/RNA比を増大させるオーバードライブ配列などの翻訳エンハンサーなどの他の配列を含む(Gallieら,1987,Nucl.Acids Research 15:8693−8711)。
上述のように、植物遺伝子発現は、正確なタイミングで、細胞又は組織に特異的な方法で遺伝子発現を誘起する適切なプロモーターと作用可能に結合する必要がある。利用可能なプロモーターは、35S CAMV(Franckら,Cell 21(1980)285−294)、19S CaMV(US5352605及びWO84/02913も参照のこと)などの植物ウィルスに由来するものなどの構成的プロモーター(Benfeyら,EMBO J.8(1989)2198−2202)、又はUS4,962,028に開示されるsmall rubisco subunitのプロモーターなどの植物プロモーターである。
植物遺伝子発現カセット中に作用可能に結合させる上で使用可能なその他の好ましい配列としては、遺伝子産物を対応する細胞内コンパートメント(Kermode,Crit.Rev.Plant Sci.15,4(1996)285−423中の総説及びこれに引用される参考文献を参照のこと)、例えば、液胞、核、アミロプラスト、葉緑体、有色体、細胞外空間、ミトコンドリア、小胞体、エライオプラスト、ペルオキシソーム及び他の植物細胞コンパートメントなどの、全ての植物細胞小器官に移動させるのに必要な標的配列である。
上述の通り、植物遺伝子発現は、化学的誘導性プロモーターによっても促進することができる(Gatz 1997,Annu.Rev.Plant Physiol.Plant Mol.Biol.,48:89−108中の総説を参照のこと)。化学的誘導性プロモーターは、遺伝子発現が時間特異的な方法で生じることが望ましい場合に特に適している。そのようなプロモーターの例として、サリチル酸誘導プロモーター(WO95/19433)、テトラサイクリン誘導プロモーター(Gatzら(1992)Plant J.2,397−404)及びエタノール誘導プロモーターなどがある。
生物的又は非生物的なストレス条件に応答するプロモーター、例えば、病原体誘導PRP1遺伝子プロモーター(Wardら,Plant.Mol.Biol.22(1993)361−366)、熱誘導性トマトhsp80プロモーター(US5,187,267)、低温誘導性ポテトαアミラーゼプロモーター(WO96/12814)又は創傷誘導性pinIIプロモーター(EP−A−0375091)なども適している。
特に好ましくは、脂肪酸、脂質及びオイルの生合成が行われる組織及び器官、内乳及び発生中の胚の細胞など、種子細胞中で遺伝子発現を引き起こすようなプロモーターである。適切なプロモーターは、アブラナnapinプロモーター(US5,608,152)、ソラマメ科USPプロモーター(Baumleinら,Mol.Gen Genet.,1991,225(3):459−67)、Arabidopsisi oleosinプロモーター(WO98/45461)、Phaseolus vulgaris phaseolinプロモーター(US5,504,200)、アブラナ属Bce4プロモーター(WO91/13980)又はレグミンB4プロモーター(LeB4;Baeumleinら,1992 Plant Journal,2(2):233−9)、及びトウモロコシ、大麦、小麦、ライ麦、ライスなどの単子葉植物中で種子特異的に発現を誘導するプロモーターである。適切な注目すべきプロモーターは、大麦のlpt2又はlpt1遺伝子プロモーター(WO95/15389及びWO95−23230)又は大麦麦粒腫遺伝子、ライスグルテリン遺伝子、ライスオリジン(oryzin)遺伝子、ライスプロラミン遺伝子、小麦グリアディン遺伝子、小麦グルテリン遺伝子、トウモロコシゼイン(zeine)遺伝子、カラスムギグルテリン遺伝子、モロコシカシリン(kasirin)遺伝子又はライ麦セカリン(secalin)遺伝子由来のプロモーター(以上、WO99/16890に開示されている)などである。
特に好ましくは、脂肪酸、脂質及びオイルの生合成が行われる組織及び器官、内乳及び発生中の胚の細胞など、種子細胞中で遺伝子発現を引き起こすようなプロモーターである。適切なプロモーターは、アブラナnapinプロモーター(US5,608,152)、ソラマメ科USPプロモーター(Baumleinら,Mol.Gen Genet.,1991,225(3):459−67)、Arabidopsisi oleosinプロモーター(WO98/45461)、Phaseolus vulgaris phaseolinプロモーター(US5,504,200)、アブラナ属Bce4プロモーター(WO91/13980)又はレグミンB4プロモーター(LeB4;Baeumleinら,1992 Plant Journal,2(2):233−9)、及びトウモロコシ、大麦、小麦、ライ麦、ライスなどの単子葉植物中で種子特異的に発現を誘導するプロモーターである。適切な注目すべきプロモーターは、大麦のlpt2又はlpt1遺伝子プロモーター(WO95/15389及びWO95−23230)又は大麦麦粒腫遺伝子、ライスグルテリン遺伝子、ライスオリジン(oryzin)遺伝子、ライスプロラミン遺伝子、小麦グリアディン遺伝子、小麦グルテリン遺伝子、トウモロコシゼイン(zeine)遺伝子、カラスムギグルテリン遺伝子、モロコシカシリン(kasirin)遺伝子又はライ麦セカリン(secalin)遺伝子由来のプロモーター(以上、WO99/16890に開示されている)などである。
特に、本方法で使用されるアシル−CoAシンテターゼ、リゾホスファチジン酸アシルトランスフェラーゼ、グリセロール−3−ホスフェートアシルトランスフェラーゼ、ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ又はレシチンコレステロールアシルトランスフェラーゼ単独、又は、アシル−CoA:リゾリン脂質アセチルトランスフェラーゼ、デサチュラーゼ及び/又はエロンゲースとの組合せで複数並行した発現を引き起こすことが望ましい。そのような発現カセットは、複数の個々の発現コンストラクトの同時形質転換を通して導入することができ、好ましくは、1つのコンストラクト上に複数の発現カセットを組み合わせることにより導入できる。また、複数のベクターは各ケース毎に複数の発現カセットで形質転換することができ、その後、宿主細胞に導入することができる。
さらに特に適切なプロモーターは、色素体が脂質生合成の前駆体及びいくつかの最終産物が合成されるコンパートメントを構成するため、色素体特異的な発現を引き起こすものである。ウィルスRNAポリメラーゼプロモーターなどの適切なプロモーターについて、WO95/16783及びWO97/06250に開示されており、アラビドプシス由来のclpPプロモーターがWO99/46394に開示されている。
ベクターDNAは従来の形質転換及び形質導入技術によって、原核又は真核細胞中に導入することができる。「形質転換」及び「形質移入」、コンジュゲーション及びトランスダクションという用語には、ここで使用される場合、外来核酸(例えば、DNA)を宿主細胞中に導入するために、リン酸カルシウム又は塩化カルシウム共沈、DEAE−デキストランによるトランスフェクション、リポフェクチン、ナチュラルコンピテンス、化学的導入、エレクトロポレーション又は微粒子銃などを含む、先行技術において知られる複数の方法が含まれる。植物細胞を含む宿主細胞の形質転換又は形質移入に関する適当な方法は、Sambrookら,(Molecular Cloning:A Laboratory Manual,2nd ed.,Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY,1989)他の研究室用教科書、例えば、Methods in Molecular Biology,1995,Vol.44,Agrobacterium protocols,Ed.:Gartland and Davey,Humana Press,Totowa,New Jersey.中に記載されている。
本発明の核酸、本発明の遺伝子産物、又は本発明のベクターを取り込むために、基本的に適する宿主細胞は、全ての原核又は真核細胞である。好適に使用される宿主生物は、カビ、酵母、植物細胞で、好ましくは、植物又はその一部である。カビ、酵母又は植物は好ましく使用され、特に好ましくは植物であり、極めて好ましくは、オイル生産植物などの植物であって、脂質化合物の豊富であり、例えば、アブラナ、月見草、大麻、あざみ、ピーナッツ、キャノーラ、アマニ、大豆、紅花、ヒマワリ、ルリヂサなど、例えば、トウモロコシ、小麦、ライ麦、エン麦、ライコヌギ、ライス、大麦、綿、キャッサバ、コショウ、マンジュギクなどの植物、じゃがいも、タバコ、ナスやトマトなどのナス科植物、エンドウマメ、アルファルファ、ブッシュの植物(コーヒー、カカオ、茶)などのソラマメ属、木(パーム油、ココナツ)などのヤナギ属、及び多年生牧草や家畜用農作物などのである。本発明の特に好ましい植物は、大豆、ピーナッツ、アブラナ、キャノーラ、アマニ、大麻、月見草、ヒマワリ、紅花、木(パーム油、ココナッツ)などの油料作物である。本発明の上述の核酸は、動物、繊毛虫、カビ、藻類又は渦鞭毛虫などの植物に由来し、PUFAsを合成することができる。
有意な実施態様において、ここで使用される「核酸(分子)」という用語は、付加的に、遺伝子コード配列の3’及び5’末端に非翻訳配列を含んでいる:コード領域の5’末端の上流配列の、少なくとも、500、好ましくは200、特に好ましくは100ヌクレオチド、遺伝子コード領域の3’末端の下流配列の、少なくとも100、好ましくは50、特に好ましくは20ヌクレオチドである。「単離された」核酸分子は該核酸の天然源に存在する他の核酸分子から分離される。「単離された」核酸は、好ましくは、該核酸が由来する生物のゲノムDNA中において、元々隣接している配列(例えば、該核酸の5’及び3’に位置する配列)を保持していない。種々の実施態様において、単離されたアシル−CoAシンテターゼ、リゾホスファチジン酸アシルトランスフェラーゼ、グリセロール−3−ホスフェートアシルトランスフェラーゼ、ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ及び/又はレシチンコレステロールアシルトランスフェラーゼ分子は、該核酸が由来する細胞のゲノムDNA中で元来隣接している核酸の、約5kb、4kb、3kb、2kb、1kb、0.5kb又は0.1kb以下を含んでいる。
上述の核酸、及び脂質、脂肪酸、PUFAコファクター及び酵素の生合成、又は膜を横切る親油性物質の輸送に関与するアシル−CoAシンテターゼ、リゾホスファチジン酸アシルトランスフェラーゼ、グリセロール−3−ホスフェートアシルトランスフェラーゼ、ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ又はレシチンコレステロールアシルトランスフェラーゼ活性を持つタンパク質分子は、トランスジェニック生物、有利には、トウモロコシ、小麦、ライ麦、カラスムギ、ライ小麦、ライス、大麦、大豆、綿などの植物、アマニ又はアマなどのアマ属、アブラナ、キャノーラ及びターニップ、コショウ、ヒマワリ、ルリヂサ、月見草及びマンジュギクなどのアブラナ属、じゃがいも、タバコ、ナスやトマトなどのナス科植物、エンドウマメ、アルファルファ、ブッシュの植物(コーヒー、カカオ、茶)などのソラマメ属、木(パーム油、ココナツ)などのヤナギ属、及び多年生牧草や家畜用農作物中で、直接(例えば、脂肪酸合成タンパク質の過剰発現又は至適化が、修飾した生物に由来する脂肪酸の収率、生産及び又は生産効率に直接影響する場合)、及び/又は、PUFAsの増大した収率、生産及び/又は生産効率、又は望ましくない物質の低減を引き起こすものではあるが、間接的な効果(例えば、脂質及び脂肪酸、コファクター及び酵素の代謝における修飾が、細胞内の望ましい物質の収率、生産及び/又は生産効率の修飾を引き起こし、1又は複数の脂肪酸の生産に影響を与える場合)をもたらすことができる。
多価不飽和脂肪酸(=PUFAs)はトリアシルグリセロールだけではなく、膜脂質中にも取り込まれるため、種々の前駆体分子及び合成酵素の組合せは、種々の脂肪酸分子の生産を引き起こし、種々の脂肪酸分子脂質の組成に重要な影響を及ぼす。
脂質合成は、2つのセクションに分けることができる:脂肪酸の合成及びそれらのsn−グリセロール−3−ホスフェートへの結合、及び水溶性頭部グループの付加又は修飾。膜で使用される通常の脂質には、リン脂質、糖脂質、スフィンゴ脂質及びホスホグリセリドが含まれる。脂肪酸合成は、アセチルCoAカルボキシラーゼによるアセチルCoAのマロニルCoAへの変換、又はアセチルトランスアセチラーゼによるアセチルACPへの変換により開始される。重合反応の後、これらの2つの産物からアセトアセチルACPが生産されるが、これは、一連の重合、還元及び脱水反応によって変換され、その結果、所望の鎖長を持つ飽和脂肪酸分子が得られる。これらの分子からの不飽和多価脂肪酸の生産は、特定のデサチュラーゼにより、酸素分子を用いた好気的な方法、又は嫌気的に触媒される(微生物での脂肪酸合成については、F.C.Neidhardtら(1996)E.coli and Salmonella.ASM Press:Washington,D.C,pp.612−636及びそこに引用される参考文献;Lengelerら,(Ed.)(1999)Biology of Procaryotes.Thieme:Stuttgart,New York,及びそこに引用される参考文献,及びMagnuson, K.ら,(1993)Microbiological Reviews 57:522−542及びそこに引用される参考文献を参照のこと)。さらに伸長過程を行うためには、生産されたリン脂質結合脂肪酸が、リン脂質から脂肪酸CoAエステルのプールへ戻される必要がある。この過程はアシル−CoA:リゾリン脂質アシルトランスフェラーゼにより可能である。さらに、これらの酵素はCoAエステルからリン脂質へ伸長した脂肪酸を戻すことも可能である。適当な場合には、この一連の反応を繰り返し行うこともできる。
脂質合成は、2つのセクションに分けることができる:脂肪酸の合成及びそれらのsn−グリセロール−3−ホスフェートへの結合、及び水溶性頭部グループの付加又は修飾。膜で使用される通常の脂質には、リン脂質、糖脂質、スフィンゴ脂質及びホスホグリセリドが含まれる。脂肪酸合成は、アセチルCoAカルボキシラーゼによるアセチルCoAのマロニルCoAへの変換、又はアセチルトランスアセチラーゼによるアセチルACPへの変換により開始される。重合反応の後、これらの2つの産物からアセトアセチルACPが生産されるが、これは、一連の重合、還元及び脱水反応によって変換され、その結果、所望の鎖長を持つ飽和脂肪酸分子が得られる。これらの分子からの不飽和多価脂肪酸の生産は、特定のデサチュラーゼにより、酸素分子を用いた好気的な方法、又は嫌気的に触媒される(微生物での脂肪酸合成については、F.C.Neidhardtら(1996)E.coli and Salmonella.ASM Press:Washington,D.C,pp.612−636及びそこに引用される参考文献;Lengelerら,(Ed.)(1999)Biology of Procaryotes.Thieme:Stuttgart,New York,及びそこに引用される参考文献,及びMagnuson, K.ら,(1993)Microbiological Reviews 57:522−542及びそこに引用される参考文献を参照のこと)。さらに伸長過程を行うためには、生産されたリン脂質結合脂肪酸が、リン脂質から脂肪酸CoAエステルのプールへ戻される必要がある。この過程はアシル−CoA:リゾリン脂質アシルトランスフェラーゼにより可能である。さらに、これらの酵素はCoAエステルからリン脂質へ伸長した脂肪酸を戻すことも可能である。適当な場合には、この一連の反応を繰り返し行うこともできる。
PUFAsの生合成のための前駆体の例として、オレイン酸、リノール酸及びリノレン酸が挙げられる。これらのC18− 炭素脂肪酸はエイコサ及びドコサ鎖型の脂肪酸を得るためにC20及びC22へと伸長される必要がある。当該過程で使用されるリゾホスファチジン酸アシルトランスフェラーゼ、グリセロール−3−ホスフェートアシルトランスフェラーゼ、ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ、レシチンコレステロールアシルトランスフェラーゼによって、有利には、アシル−CoA:リゾリン脂質アシルトランスフェラーゼ、Δ−4−、Δ−5−、Δ−6−及びΔ−8−デサチュラーゼなどのデサチュラーゼ及び/又は、Δ−5−、Δ−6−、Δ−9−エロンゲースと組み合わせて、アラキドン酸、エイコサペンタエン酸、ドコサペンタエン酸又はドコサヘキサエン酸及び種々の他の長鎖PUFAsを得、抽出することができ、食品、飼料、化粧品又は医薬品などの種々の用途に用いることができる。好ましくは、脂肪酸分子中に少なくも2つ、有利には、少なくとも3、4、5、又は6つの二重鎖結合を持つ、好ましくは、C18−、C20−、C22−、及び/又はC24−脂肪酸が上述の酵素を用いて調製され、脂肪酸中に、有利には、少なくとも3、4、5、又は6つの二重鎖結合を持つ、好ましくは、C18−、C20−、C22−、及び/又はC24−脂肪酸が得られる。脱飽和は、目的の脂肪酸の伸長前又は後に生じる。このようなわけで、デサチュラーゼ活性の産物、及びC20−〜C22−脂肪酸からγ−リノレン酸、ジホモ−γ−リノレン酸、アラキドン酸、ステアリドン酸、エイコサテトラエン酸又はエイコサペンタエン酸などの脂肪酸へのさらなる伸長を含む、さらに可能な脱飽和及び伸長過程によって、好ましい高いレベルの不飽和度を有するPUFAsが生じる。本発明の方法におけるリゾホスファチジン酸アシルトランスフェラーゼ、グリセロール−3−ホスフェートアシルトランスフェラーゼ、ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ又はレシチンコレステロールアシルトランスフェラーゼの基質は、例えば、リノール酸、γ−リノレン酸、α−リノレン酸、ジホモ−γ−リノレン酸、エイコサテトラエン酸又はステアリドン酸などのC18−、C20−又はC22−脂肪酸である。好ましい基質は、リノール酸、γ−リノレン酸及び/又はα−リノレン酸、ジホモ−γ−リノレン酸、アラキドン酸、エイコサテトラエン酸又はエイコサペンタエン酸である。脂肪酸分子中に少なくとも2つの二重鎖結合を持つC18−、C20−又はC22−脂肪酸は、遊離脂肪酸型又はグリセリドなどのそれらのエステル型で、本発明の方法により取得される。
「グリセリド」という用語は、1、2又は3のカルボキシルラジカル(モノ−、ジ−又はトリグリセリド)でエステル化されたグリセロールのことを意味する。また、「グリセリド」は種々のグリセリドの混合物を意味するものとしても理解される。グリセリド又はグリセリド混合物には、さらなる付加物、例えば、遊離脂肪酸、抗酸化物、タンパク質、炭水化物、ビタミン及び/又は他の基質を含んでもよい。
本発明の方法に目的に対し、「グリセリド」は、さらに、グリセロール誘導体を意味するものとしても理解される。上述の脂肪酸グリセリドに加えて、グリセロリン脂質 及びグリセロ糖脂質も含まれる。ここで言及される好ましい例には、レシチン(ホスファチジルコリン)、カルジオリピン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルセリン及びアルキルアシルグリセロリン脂質などのグリセロリン脂質がある。
さらに、脂肪酸は、引き続き、種々の修飾サイトへ移行し、トリアシルグリセロール貯蔵脂質に取り込まれる。脂質合成におけるさらに重要なステップは、例えば、グリセロール脂肪酸アシルトランスフェラーゼによって、水溶性頭部グループへ脂肪酸を転移させるステップである(Frentzen,1998,Lipid,100(4−5):161−166)。
さらに、脂肪酸は、引き続き、種々の修飾サイトへ移行し、トリアシルグリセロール貯蔵脂質に取り込まれる。脂質合成におけるさらに重要なステップは、例えば、グリセロール脂肪酸アシルトランスフェラーゼによって、水溶性頭部グループへ脂肪酸を転移させるステップである(Frentzen,1998,Lipid,100(4−5):161−166)。
植物脂肪酸生合成及び脱飽和、脂質代謝及び脂質性化合物の膜輸送、β−酸化、脂肪酸修飾及びコファクター、トリアシルグリセロール貯蔵及びトリアシルグリセロール会合に関する出版物に関しては、以下の論文及びこれらに含まれる参考文献を参照のこと:Kinney,1997,Genetic Engineering,Ed.:JK Setlow,19:149−166;Ohlrogge及びBrowse,1995,Plant Cell 7:957−970;Shanklin及びCahoon,1998,Annu.Rev.Plant Physiol.Plant MoI.Biol.49:611−641;Voelker,1996,Genetic Engineering,Ed.:JK Setlow,18:111−13;Gerhardt,1992,Prog.Lipid R.31:397−417;G?hnemann−Scafer及びKindl,1995,Biochim.Biophys Acta 1256:181−186;Kunauら,1995,Prog.Lipid Res.34:267−342;Stymneら,1993,in:Biochemistry and Molecular Biology of Membrane and Storage Lipids of Plants,Ed.:Murata及びSomerville,Rockville,American Society of Plant Physiologists,150−158,Murphy及びRoss 1998,Plant Journal.13(1):1−16。
本方法で生産されるPUFAsには、高等動物が全く合成することができないため、摂取しなくてはならない、あるいは、高等動物が十分な量で合成できず付加量を摂取しなくてはならないが、それらはバクテリアなどの他の生物によって容易に合成される分子集団が含まれる;例えば、ネコはアラキドン酸を全く合成することができない。
「アシル−CoAシンテターゼ、リゾホスファチジル酸アシルトランスフェラーゼ又はレシチンコレステロールアシルトランスフェラーゼ」という用語には、本発明の目的に関し、脂肪酸及びそれらのホモログ、誘導体及び類似体の生合成に関与するタンパク質が含まれる。本発明の目的に対するリン脂質は、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルグリセロール及び/又はホスファチジルイノシトール、有利には、ホスファチジルコリンを意味するものとして理解される。リゾホスファチジル酸アシルトランスフェラーゼ、グリセロール−3−ホスフェートアシルトランスフェラーゼ、ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ又はレシチンコレステロールアシルトランスフェラーゼ核酸配列という用語には、リゾホスファチジル酸アシルトランスフェラーゼ、グリセロール−3−ホスフェートアシルトランスフェラーゼ、ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ又はレシチンコレステロールアシルトランスフェラーゼのコード配列、及びコード化領域部分及び5’及び3’非翻訳配列領域が含まれる。「生産」又は「生産性」という用語は、当該技術分野では周知であり、特定の期間、特定の発酵量で(例えば、生産物kg/時間/リットル)生成される発酵産物(式Iの産物)の濃度も包含される。生産効率という用語には、特定の生産量を得るために必要な時間(例えば、精製化学物質のあるスループットを確立するために細胞により必要とされる時間)が含まれる。収率又は産物/炭素収率という用語は、当該技術分野で周知であり、炭素源を産物(すなわち、精製化学物質)へ変換する効率が含まれる。通常、例えば、生産物kg/炭素kgのように表現される。化合物の収率又は生産を増加させることにより、該化合物の得られる量、又は特定の期間、特定の培養量で得られる化合物の適当な分子の量は増加する。生合成又は生合成過程という用語は、当該技術分野では周知であり、化合物、好ましくは細胞による中間体からの有機化合物の合成、例えば、複数の工程及び強力に制御されたプロセスにおける合成を含む。異化又は異化経路という用語は、当該技術分野では周知であり、例えば、複数のステップ及び強力に制御されたプロセスにおいて、細胞により異化生成物(より一般的な用語では、より小さく、より複雑ではない分子)を生成するための、化合物、好ましくは有機化合物の切断を含む。代謝という用語は、当該技術分野では周知であり、生物で行われる生化学反応の全てを含む。従って、ある化合物の代謝(例えば、脂肪酸の代謝)には、該化合物に関係する細胞中の生合成経路、修飾経路及び異化経路の全てを含む。
「アシル−CoAシンテターゼ、リゾホスファチジル酸アシルトランスフェラーゼ又はレシチンコレステロールアシルトランスフェラーゼ」という用語には、本発明の目的に関し、脂肪酸及びそれらのホモログ、誘導体及び類似体の生合成に関与するタンパク質が含まれる。本発明の目的に対するリン脂質は、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルグリセロール及び/又はホスファチジルイノシトール、有利には、ホスファチジルコリンを意味するものとして理解される。リゾホスファチジル酸アシルトランスフェラーゼ、グリセロール−3−ホスフェートアシルトランスフェラーゼ、ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ又はレシチンコレステロールアシルトランスフェラーゼ核酸配列という用語には、リゾホスファチジル酸アシルトランスフェラーゼ、グリセロール−3−ホスフェートアシルトランスフェラーゼ、ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ又はレシチンコレステロールアシルトランスフェラーゼのコード配列、及びコード化領域部分及び5’及び3’非翻訳配列領域が含まれる。「生産」又は「生産性」という用語は、当該技術分野では周知であり、特定の期間、特定の発酵量で(例えば、生産物kg/時間/リットル)生成される発酵産物(式Iの産物)の濃度も包含される。生産効率という用語には、特定の生産量を得るために必要な時間(例えば、精製化学物質のあるスループットを確立するために細胞により必要とされる時間)が含まれる。収率又は産物/炭素収率という用語は、当該技術分野で周知であり、炭素源を産物(すなわち、精製化学物質)へ変換する効率が含まれる。通常、例えば、生産物kg/炭素kgのように表現される。化合物の収率又は生産を増加させることにより、該化合物の得られる量、又は特定の期間、特定の培養量で得られる化合物の適当な分子の量は増加する。生合成又は生合成過程という用語は、当該技術分野では周知であり、化合物、好ましくは細胞による中間体からの有機化合物の合成、例えば、複数の工程及び強力に制御されたプロセスにおける合成を含む。異化又は異化経路という用語は、当該技術分野では周知であり、例えば、複数のステップ及び強力に制御されたプロセスにおいて、細胞により異化生成物(より一般的な用語では、より小さく、より複雑ではない分子)を生成するための、化合物、好ましくは有機化合物の切断を含む。代謝という用語は、当該技術分野では周知であり、生物で行われる生化学反応の全てを含む。従って、ある化合物の代謝(例えば、脂肪酸の代謝)には、該化合物に関係する細胞中の生合成経路、修飾経路及び異化経路の全てを含む。
当該特許出願に引用される全ての引用文献、特許出願、特許及び公開特許出願は、出典としてここに含まれる。
当該明細書の詳細な説明及び請求の範囲を通じて、「含む」及び「包含する」及び「含んでいる」及び「含む」などの言葉のバリエーションは、「特に限定はしない」ことを意味し、他の部分、付加物、構成要素、整数(integers)又はステップを排除することを意図するものではない。
当該明細書の詳細な説明及び請求の範囲を通じて、単数は文脈が他を要求しない限り、複数も包含する。特に、不定冠詞が用いられる場合、文脈が他を要求しない限り、単数と同様に複数を考慮しているものと理解される。本発明の特定の態様、実施態様又は実施例に関連して記述される特長、整数(integers)、特性、化合物、化学成分又は化学基は、不整合がない限り、ここに記述される任意の他の態様、実施態様又は実施例に適用されるものと理解される。
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当該明細書の詳細な説明及び請求の範囲を通じて、単数は文脈が他を要求しない限り、複数も包含する。特に、不定冠詞が用いられる場合、文脈が他を要求しない限り、単数と同様に複数を考慮しているものと理解される。本発明の特定の態様、実施態様又は実施例に関連して記述される特長、整数(integers)、特性、化合物、化学成分又は化学基は、不整合がない限り、ここに記述される任意の他の態様、実施態様又は実施例に適用されるものと理解される。
材料及び方法
一連の長鎖アシル−CoAシンテターゼをコードする推定的なゲノムDNA配列の同定
珪藻類のT.pseudonanaのドラフトゲノムは、全ゲノムショットガン法により約9回のカバー度となるまで配列決定された。生の配列データを米国エネルギー省ジョイントゲノム研究所(US Department of Energy Joint Genome Institute)(http://.jgi.doe.gov/)からローカルサーバー上にダウンロードした。Batch tblastnサーチは、3つ哺乳類タンパク質を含む以下の既知の12長鎖アシル−CoAシンテターゼタンパク質配列をクエリーとして使用して行った:マウスMmLACS4(BC016416)、ラットRnLACS4(D85189)、ヒトHsLACS4(BC034959)、及び9種のアラビドプシス配列AtLACSl(AF503751)、AtLACS2(AF503752)、AtLACS3(AF503753)、AtLACS4(AF503754)、AtLACS5(AF503755)、AtLACS6(AF503756)、AtLACS7(AF503757)、AtLACS8(AF503758)及びAtLACS9(AF503759)。E値が0.001未満の全ての非縮重配列を抽出し、CAP3配列アセンブリープログラム[12]を用いてコンティグ中にアセンブルした。コンティグはtblastnの結果によって示される方向で、3つの読枠でアミノ酸配列に翻訳された。8つの推定上の長鎖アシル−CoAシンテターゼ遺伝子モデルが、配列相同性に基づいて手動により構築され、インフレームのGT−AGイントロン境界が同定された。
一連の長鎖アシル−CoAシンテターゼをコードする推定的なゲノムDNA配列の同定
珪藻類のT.pseudonanaのドラフトゲノムは、全ゲノムショットガン法により約9回のカバー度となるまで配列決定された。生の配列データを米国エネルギー省ジョイントゲノム研究所(US Department of Energy Joint Genome Institute)(http://.jgi.doe.gov/)からローカルサーバー上にダウンロードした。Batch tblastnサーチは、3つ哺乳類タンパク質を含む以下の既知の12長鎖アシル−CoAシンテターゼタンパク質配列をクエリーとして使用して行った:マウスMmLACS4(BC016416)、ラットRnLACS4(D85189)、ヒトHsLACS4(BC034959)、及び9種のアラビドプシス配列AtLACSl(AF503751)、AtLACS2(AF503752)、AtLACS3(AF503753)、AtLACS4(AF503754)、AtLACS5(AF503755)、AtLACS6(AF503756)、AtLACS7(AF503757)、AtLACS8(AF503758)及びAtLACS9(AF503759)。E値が0.001未満の全ての非縮重配列を抽出し、CAP3配列アセンブリープログラム[12]を用いてコンティグ中にアセンブルした。コンティグはtblastnの結果によって示される方向で、3つの読枠でアミノ酸配列に翻訳された。8つの推定上の長鎖アシル−CoAシンテターゼ遺伝子モデルが、配列相同性に基づいて手動により構築され、インフレームのGT−AGイントロン境界が同定された。
T.pseudonanaの培養、RNA抽出及びRT−PCR解析
T.pseudonanaは既述の通り培養を行った[13]。細胞の密度は、ヘモサイトメーターで細胞をカウントすることによりモニターした。硝酸塩の濃度は、220nmにおける培地の吸光度の変化を測定することにより、培養期間中定期的に決定した[14]。
トータルRNAはRNase plant mini kit(Qiagen)を用いて増殖の異なるステージで回収した細胞から抽出した。第1のcDNA鎖は3μgのDNase処理したRNAから、Prostar First−strand RT−PCR kit(Stratagene)を用いて合成した。予想されるThalassiosira長鎖アシル−CoAシンテターゼ遺伝子TplacsAに特異的なプライマー対により、無希釈及び5倍希釈のcDNAsを用いて、以下のようにPCRを行った:反応は、95℃、5分間熱処理をした後、、95℃30秒、使用されるプライマーにより55℃30秒(TplacsA,18SrRNA)、72℃2分を35サイクル、次いで、72℃10分を1工程。18SrRNA遺伝子は、異なるRNAサンプルについて同量のcDNAが使用されることを保証するために用いられた。PCR反応のアリコットを1%アガロースゲルで電気泳動した。
T.pseudonanaは既述の通り培養を行った[13]。細胞の密度は、ヘモサイトメーターで細胞をカウントすることによりモニターした。硝酸塩の濃度は、220nmにおける培地の吸光度の変化を測定することにより、培養期間中定期的に決定した[14]。
トータルRNAはRNase plant mini kit(Qiagen)を用いて増殖の異なるステージで回収した細胞から抽出した。第1のcDNA鎖は3μgのDNase処理したRNAから、Prostar First−strand RT−PCR kit(Stratagene)を用いて合成した。予想されるThalassiosira長鎖アシル−CoAシンテターゼ遺伝子TplacsAに特異的なプライマー対により、無希釈及び5倍希釈のcDNAsを用いて、以下のようにPCRを行った:反応は、95℃、5分間熱処理をした後、、95℃30秒、使用されるプライマーにより55℃30秒(TplacsA,18SrRNA)、72℃2分を35サイクル、次いで、72℃10分を1工程。18SrRNA遺伝子は、異なるRNAサンプルについて同量のcDNAが使用されることを保証するために用いられた。PCR反応のアリコットを1%アガロースゲルで電気泳動した。
酵母のTplacsAのヘテローガスな発現
T.pseudonana cDNAは、SuperScriptTMIIIRnaseH−Reverse Transcriptase(Invitrogen)を用いて合成し、プライマー、TpLACSANH 5’−CCCAAGCTTACCATGGCrACGAACAAATGGT−3’(オープンリーディングフレームの開始コドンを太字で示す;下線の配列はHindIIIサイトである;斜字体の配列は付加されたアラニンのコドンであり、元々のTplacsAには存在しない)、及び、TpLACSACE 5’−GCGAATTCTTACAACTTGCTCTGTGGAGA−3’(ORFの終止コドンを太字で示す;下線の配列はEcoRIサイトである)を用いてTplacsAコード領域の全体を増幅するために用いた。Expand Long Template PCR System(Roche)は潜在的なPCRエラーを最小限にするために用いた。増幅産物は、まず、TOPO TA cloning kit(Invitrogen)を用いてクローン化され、クローン化されたPCR産物の正確性は配列決定によりチェックした。その後、プラスミドpYLACSAを作製するために、組換えベクターはHindIII及びEcoRIで処理し、pYES2のガラクトース誘導性GAL1プロモーターの後の対応部位にクローニングした。その後、ベクターコントロールのpYES2とpYLACSAは、Saccharomyces cerevisiaeに酢酸リチウム法によって形質転換し、形質転換体をウラシルを欠く最少培地上で選択した。宿主酵母株はEuroscarf yeast deletion strain collection(Frankfurut)から取得した:野生型BY4741(MATa;his3Δl;leu2Δ0,metl5Δ0;ura3Δ0)及び欠失株Y06477(YOR317w::kanMX4,FAAl変異体),Y01401(YIL009w::kanMX4,FAA3変異体),及びY00833(YMR246w::kanMX4,FAA4変異体)。これら3つの変異株はBY4741とコンジェニックである。
T.pseudonana cDNAは、SuperScriptTMIIIRnaseH−Reverse Transcriptase(Invitrogen)を用いて合成し、プライマー、TpLACSANH 5’−CCCAAGCTTACCATGGCrACGAACAAATGGT−3’(オープンリーディングフレームの開始コドンを太字で示す;下線の配列はHindIIIサイトである;斜字体の配列は付加されたアラニンのコドンであり、元々のTplacsAには存在しない)、及び、TpLACSACE 5’−GCGAATTCTTACAACTTGCTCTGTGGAGA−3’(ORFの終止コドンを太字で示す;下線の配列はEcoRIサイトである)を用いてTplacsAコード領域の全体を増幅するために用いた。Expand Long Template PCR System(Roche)は潜在的なPCRエラーを最小限にするために用いた。増幅産物は、まず、TOPO TA cloning kit(Invitrogen)を用いてクローン化され、クローン化されたPCR産物の正確性は配列決定によりチェックした。その後、プラスミドpYLACSAを作製するために、組換えベクターはHindIII及びEcoRIで処理し、pYES2のガラクトース誘導性GAL1プロモーターの後の対応部位にクローニングした。その後、ベクターコントロールのpYES2とpYLACSAは、Saccharomyces cerevisiaeに酢酸リチウム法によって形質転換し、形質転換体をウラシルを欠く最少培地上で選択した。宿主酵母株はEuroscarf yeast deletion strain collection(Frankfurut)から取得した:野生型BY4741(MATa;his3Δl;leu2Δ0,metl5Δ0;ura3Δ0)及び欠失株Y06477(YOR317w::kanMX4,FAAl変異体),Y01401(YIL009w::kanMX4,FAA3変異体),及びY00833(YMR246w::kanMX4,FAA4変異体)。これら3つの変異株はBY4741とコンジェニックである。
摂取(feeding)及び共摂取(co−feeding)実験に関し、培養は25又は30℃で、2%(w/v)ラフィノース及び1%(w/v)タージトールNP−40(Sigma)の存在下にて行った。導入遺伝子の発現は、ガラクトースを2%(w/v)となるように添加し、OD6000.2−0.3で誘導した。この時点で、適当な脂肪酸を最終濃度50μMとなるように添加した。アシルCoA分析については、3mlの細胞サンプルを5分後に回収し、25℃で1時間及び24時間インキュベートした。総量とトリアシルグリセロール脂肪酸の分析については、細胞(サンプルで1.5ml)を30℃で4日間インキュベートした後、回収した。
酵母での酵素の過剰生産、及びアシル−CoAシンテターゼアッセイ
細胞は2%ラフィノースと2%ガラクトースを含むウラシルを欠く最少培地中で一晩培養した。増殖後、細胞は遠心により回収し、100mM MOPS,pH7.5,0.4mM EDTA,5mM 2−メルカプトエタノール,10 % グリセロール,0.01% トリトン X−100及びプロテアーゼインヒビターミックス(Sigma)中に再懸濁した。次に、この懸濁溶液を、500μlの酸洗浄したカラスビーズ(425−600ミクロン、Sigma)入りの2mlのエッペンドルフチューブに移し、1分間、5回のビードミル処理で細胞を溶解した。サンプルは、遠心により透明化し、上清をアシル−CoAの評価のために使用した。これらの酵素抽出液のタンパク質濃度は、スタンダートにウシ血清アルブミンを使用し、ブラッドフォードアッセイにより測定した[15]。
アシル−CoAシンテターゼ活性は、Pseudomonas sp.アシル−CoAシンテターゼ(PACS,Sigma)を用いた遊離脂肪酸、ATP及び遊離CoAからのアシル−CoAの合成に基づく方法に適合したプロトコールに従い、酵母の無細胞溶解物中で測定した。総遊離脂肪酸の20nmolを1.5mlエッペンドルフチューブ中で乾燥させた。100mM MOPS pH7.5,10mM MgCl2,10mM ATP,1mM ジチオスレイトール,0.1% トリトン X−100,及び5mM CoAが含まれるアッセイ混合物をチューブに添加し、5分間ソニケートした。反応はチューブに2μlのPseudomonas sp.酵素(Sigma)又は同体積の酵母タンパク質抽出液を添加することで開始し、インキュベーションは25℃で25分間行った。チューブはアッセイ開始後5分及び10分でソニケートした。反応は100μlの9:2メタノール:クロロホルム(v/v)、2μlの飽和(NH4)2SO4、10μlの内部標準(17:0−CoA、0.12mMのストック溶液)を添加して停止し、ボルテックスを行った。タンパク質を沈殿させるため、5分間、18,000gでのスピンダウンを行った後、5μlの上清をテイパードバイアルに移し、乾燥し、1mlのクロロアセトアルデヒド識別(derivitizing)バッファーを添加した。その後、サンプルを85℃で20分間熱処理し、20μlを後述の通りアシル−CoAの測定に用いた。
細胞は2%ラフィノースと2%ガラクトースを含むウラシルを欠く最少培地中で一晩培養した。増殖後、細胞は遠心により回収し、100mM MOPS,pH7.5,0.4mM EDTA,5mM 2−メルカプトエタノール,10 % グリセロール,0.01% トリトン X−100及びプロテアーゼインヒビターミックス(Sigma)中に再懸濁した。次に、この懸濁溶液を、500μlの酸洗浄したカラスビーズ(425−600ミクロン、Sigma)入りの2mlのエッペンドルフチューブに移し、1分間、5回のビードミル処理で細胞を溶解した。サンプルは、遠心により透明化し、上清をアシル−CoAの評価のために使用した。これらの酵素抽出液のタンパク質濃度は、スタンダートにウシ血清アルブミンを使用し、ブラッドフォードアッセイにより測定した[15]。
アシル−CoAシンテターゼ活性は、Pseudomonas sp.アシル−CoAシンテターゼ(PACS,Sigma)を用いた遊離脂肪酸、ATP及び遊離CoAからのアシル−CoAの合成に基づく方法に適合したプロトコールに従い、酵母の無細胞溶解物中で測定した。総遊離脂肪酸の20nmolを1.5mlエッペンドルフチューブ中で乾燥させた。100mM MOPS pH7.5,10mM MgCl2,10mM ATP,1mM ジチオスレイトール,0.1% トリトン X−100,及び5mM CoAが含まれるアッセイ混合物をチューブに添加し、5分間ソニケートした。反応はチューブに2μlのPseudomonas sp.酵素(Sigma)又は同体積の酵母タンパク質抽出液を添加することで開始し、インキュベーションは25℃で25分間行った。チューブはアッセイ開始後5分及び10分でソニケートした。反応は100μlの9:2メタノール:クロロホルム(v/v)、2μlの飽和(NH4)2SO4、10μlの内部標準(17:0−CoA、0.12mMのストック溶液)を添加して停止し、ボルテックスを行った。タンパク質を沈殿させるため、5分間、18,000gでのスピンダウンを行った後、5μlの上清をテイパードバイアルに移し、乾燥し、1mlのクロロアセトアルデヒド識別(derivitizing)バッファーを添加した。その後、サンプルを85℃で20分間熱処理し、20μlを後述の通りアシル−CoAの測定に用いた。
脂肪酸及びアシル−CoA分析
酵母及び藻類細胞は遠心により回収した。脂肪酸とアシル−CoAの抽出及び測定は、すでに報告されるように[17,18]、サンプルペレットについて行った。
トリアシルグリセロール分析については、酵母細胞を、予め重量を測定したチューブ中での遠心により回収し、蒸留水で洗浄し、乾燥重量を測定するためにスピードバック(speey−vacuum)ブロッターで一晩遠心した。翌日、沈殿は10μlの水で再度水和化し、10μlのトリペンタデカノイン(5mg/ml)及び700μlの2:1クロロホルム:メタノール(v/v)を添加した。細胞を300μlの酸洗浄ガラスビーズ(425−600ミクロン、Sigma)入りの1.5mlのエッペンドルフチューブに移し、3分間、2回のビードミル処理により溶解した。総脂肪酸及びトリアシルグリセロール脂肪酸の抽出及び測定はすでに報告されているように行った[11]。
酵母及び藻類細胞は遠心により回収した。脂肪酸とアシル−CoAの抽出及び測定は、すでに報告されるように[17,18]、サンプルペレットについて行った。
トリアシルグリセロール分析については、酵母細胞を、予め重量を測定したチューブ中での遠心により回収し、蒸留水で洗浄し、乾燥重量を測定するためにスピードバック(speey−vacuum)ブロッターで一晩遠心した。翌日、沈殿は10μlの水で再度水和化し、10μlのトリペンタデカノイン(5mg/ml)及び700μlの2:1クロロホルム:メタノール(v/v)を添加した。細胞を300μlの酸洗浄ガラスビーズ(425−600ミクロン、Sigma)入りの1.5mlのエッペンドルフチューブに移し、3分間、2回のビードミル処理により溶解した。総脂肪酸及びトリアシルグリセロール脂肪酸の抽出及び測定はすでに報告されているように行った[11]。
実施例1
T.pseudonanaの脂肪酸及びアシル−CoA組成物
Thalassiosira細胞の脂肪酸のプロファイルは、藻類細胞においてパルミチン酸(16:0)、パルミトレイン酸(16:1n7)及びEPAが最も豊富なFAであることを示した(表1)。有意な量のω3ステアリドン酸(STA,18:4n3)及びDHAに対し、極少量の割合のω6C20PUFAsが検出されが、このことから、珪藻植物細胞においてω3経路が最も活性化されていることが示される。アシル−CoAのプロファイルからは、パルミチン酸、パルミトレイン酸及びEPA CoAが最も多く、後者はアシル−CoAプールのほぼ30%に相当する。このハイレベルのEPA CoAは、潜在的に22:5n3への伸長及び22:6n3への不飽和化を介してDHAを合成する際の中間体として作用し得る。
T.pseudonanaの脂肪酸及びアシル−CoA組成物
Thalassiosira細胞の脂肪酸のプロファイルは、藻類細胞においてパルミチン酸(16:0)、パルミトレイン酸(16:1n7)及びEPAが最も豊富なFAであることを示した(表1)。有意な量のω3ステアリドン酸(STA,18:4n3)及びDHAに対し、極少量の割合のω6C20PUFAsが検出されが、このことから、珪藻植物細胞においてω3経路が最も活性化されていることが示される。アシル−CoAのプロファイルからは、パルミチン酸、パルミトレイン酸及びEPA CoAが最も多く、後者はアシル−CoAプールのほぼ30%に相当する。このハイレベルのEPA CoAは、潜在的に22:5n3への伸長及び22:6n3への不飽和化を介してDHAを合成する際の中間体として作用し得る。
実施例2
T.pseudonanaの推定されるLACS遺伝子の同定
TplacsAは現在の配列データ中では全長として見出され、2つのイントロンを含むことが予想される。Thalassiosira細胞のTplacsAの転写をモニターするために、RT−PCRにより一過的な発現分析を行った。図1は、TplacsAが細胞の培養の間中発現していたことを示す。藻類cDNA由来のTplacsAORFの増幅及び配列決定により、2025bp長で、674アミノ酸をコードすることが示される。このORFと対応するゲノムDNAとのアライメントから、各96bpと88bpの2つのイントロンが配列の後半に存在することが確認された。TpLACSAアミノ酸配列と機能解析されているLACSとの比較により、藻類の酵素は植物と動物の両方のLACSと35−40%の同一性を示し、予想されるAMP結合ドメインを含む領域において高い相同性を有することが明らかになった。我々の更なる研究は、TplacsAの機能解析に照準が絞られた。
T.pseudonanaの推定されるLACS遺伝子の同定
TplacsAは現在の配列データ中では全長として見出され、2つのイントロンを含むことが予想される。Thalassiosira細胞のTplacsAの転写をモニターするために、RT−PCRにより一過的な発現分析を行った。図1は、TplacsAが細胞の培養の間中発現していたことを示す。藻類cDNA由来のTplacsAORFの増幅及び配列決定により、2025bp長で、674アミノ酸をコードすることが示される。このORFと対応するゲノムDNAとのアライメントから、各96bpと88bpの2つのイントロンが配列の後半に存在することが確認された。TpLACSAアミノ酸配列と機能解析されているLACSとの比較により、藻類の酵素は植物と動物の両方のLACSと35−40%の同一性を示し、予想されるAMP結合ドメインを含む領域において高い相同性を有することが明らかになった。我々の更なる研究は、TplacsAの機能解析に照準が絞られた。
実施例3
Saccharomyces cereviseaeの脂肪酸活性欠損変異体の評価
TplacsAの機能解析にとって至適なS.cereviseae株を同定するために、Euroscarf collection由来の幾つかの遊離脂肪酸活性化欠損変異体(FAA)をテストした。FAA1及びFAA4遺伝子でコードされるタンパク質は、取り込まれるC12〜C18FAsの活性化に関与する最初の酵素であることが示されていたが、一方、FAA3はC18より長い脂肪酸に対し最も活性を示すことが見出されたいた[8]。野生型株BY4741及び欠損株Y06477,Y01401及びY00833は空のベクターコントロールであるpYE2で形質転換し、3つのω6(18:2n6,18:3n6,20:3n6)又は3つのω3(18:4n3,20:5n3,22:6n3)PUFAsの存在下で同時にインキュベートした。表2はこれらの異なる株における、25℃1時間のインキュベーション後のアシル−CoA組成を示す。驚くべきことに、C20PUF−CoAもC22PUF−CoAも野生型又はFAA変異体では検出されず、このことから、これらの細胞は対応するアシル−CoAをこの短いインキュベーションの間に生産することができなかったことが示唆される。しかしながら、FAのプロファイルは基質として使用された脂肪酸が洗浄された酵母細胞中に存在すること示したため、それら基質として使用された脂肪酸は4つの株によって取り込まれていた(データは示さず)。番号14:0,16:0及び18:0CoAはY06477細胞中に検出されず、このことからFAA1遺伝子産物が対応する飽和脂肪酸の活性化に関与することが示唆される。同様の割合の18:3n6及び18:4n3CoAが野生型細胞中で測定されたが、それらの量は18:2n6の測定値よりも低かった。異なる全ての系列において、より高い18:2n6CoAの割合は、このFAが酵母細胞へ効率よく取り込まれ及び/又は活性化されることを示唆した。野生型細胞との比較から、Y00833は外から摂取した不飽和18炭素CoAsから合成されるアシルCoAsの最も低い含量を示した。このことは、FAA4遺伝子産物が酵母細胞の不飽和脂肪酸の活性化において重要な役割を演じていることが示唆される。Y00833は、PUFAsについて非常に低いバックグラウンドのアシル−CoAシンテターゼ活性を有し、20:5n3及び22:6n3についてはゼロの活性であることに基づき、PUFAシンテターゼ活性をコードする遺伝子の同定を目的とするヘテロローガスな発現研究に対し、有用な系統として選択した。
Saccharomyces cereviseaeの脂肪酸活性欠損変異体の評価
TplacsAの機能解析にとって至適なS.cereviseae株を同定するために、Euroscarf collection由来の幾つかの遊離脂肪酸活性化欠損変異体(FAA)をテストした。FAA1及びFAA4遺伝子でコードされるタンパク質は、取り込まれるC12〜C18FAsの活性化に関与する最初の酵素であることが示されていたが、一方、FAA3はC18より長い脂肪酸に対し最も活性を示すことが見出されたいた[8]。野生型株BY4741及び欠損株Y06477,Y01401及びY00833は空のベクターコントロールであるpYE2で形質転換し、3つのω6(18:2n6,18:3n6,20:3n6)又は3つのω3(18:4n3,20:5n3,22:6n3)PUFAsの存在下で同時にインキュベートした。表2はこれらの異なる株における、25℃1時間のインキュベーション後のアシル−CoA組成を示す。驚くべきことに、C20PUF−CoAもC22PUF−CoAも野生型又はFAA変異体では検出されず、このことから、これらの細胞は対応するアシル−CoAをこの短いインキュベーションの間に生産することができなかったことが示唆される。しかしながら、FAのプロファイルは基質として使用された脂肪酸が洗浄された酵母細胞中に存在すること示したため、それら基質として使用された脂肪酸は4つの株によって取り込まれていた(データは示さず)。番号14:0,16:0及び18:0CoAはY06477細胞中に検出されず、このことからFAA1遺伝子産物が対応する飽和脂肪酸の活性化に関与することが示唆される。同様の割合の18:3n6及び18:4n3CoAが野生型細胞中で測定されたが、それらの量は18:2n6の測定値よりも低かった。異なる全ての系列において、より高い18:2n6CoAの割合は、このFAが酵母細胞へ効率よく取り込まれ及び/又は活性化されることを示唆した。野生型細胞との比較から、Y00833は外から摂取した不飽和18炭素CoAsから合成されるアシルCoAsの最も低い含量を示した。このことは、FAA4遺伝子産物が酵母細胞の不飽和脂肪酸の活性化において重要な役割を演じていることが示唆される。Y00833は、PUFAsについて非常に低いバックグラウンドのアシル−CoAシンテターゼ活性を有し、20:5n3及び22:6n3についてはゼロの活性であることに基づき、PUFAシンテターゼ活性をコードする遺伝子の同定を目的とするヘテロローガスな発現研究に対し、有用な系統として選択した。
S.cereviseaeのFAA欠損株であるY00833中でのTplacsAのヘテロローガスな発現
TpLACSAの機能を確証する目的で、プラスミドpYLACSAを調製するために全長TplacsAcDNAをpYES2のガラクトース誘導性GAL1プロモーターの後にクローン化した。ω6 18:3n6と20:4n6、及びω3 18:4n3と20:5n3 FAsの存在下で別々に行われたインキュベーション実験の結果を、各々表3及び4に示す。インキュベーションの5分後、C18PUFA−CoAは空のベクターコントロールpYES2及びpYLACSA Y00833形質転換体の両方において見出され、後者において高い割合であった。TplacsA遺伝子を含むY00833とは異なり、番号C20PUFA−CoAsは、空のベクターコントロールであるY00833中で検出された。ARA−CoAは、pYLACSA形質転換体で測定される最も豊富なPUFA−CoAsであり、インキュベーション5分後の濃度がピークであり、その後、続く24時間の間にこの初期濃度のおよそ半分にまで低下する。4つの外から摂取された脂肪酸は、細胞内に蓄積され、対応するアシル−CoAsによって示される一過的な変動へは進まなかった(データは示さず)。C20PUFA−CoAsは、空のベクターコントロールでは摂取60分後に検出されなかったが、24時間後には検出された。C18ω3及びω6FAsは、pYLACSA形質転換体中のARA−CoAと同様に、インキュベーションの最初の1時間で増加し、その後24時間後まで現象する蓄積パターンを示した。これに対して、EPA−CoAは、実験の間中ずっと増加した。また、TpLACSAは、内在性の飽和14:0、16:0及び18:0−CoAsの2倍の増加を誘導したのに対し、16:1及び18:1−CoAsは減少し、22.1−CoAは僅かに変動するのみであった。
TpLACSAの機能を確証する目的で、プラスミドpYLACSAを調製するために全長TplacsAcDNAをpYES2のガラクトース誘導性GAL1プロモーターの後にクローン化した。ω6 18:3n6と20:4n6、及びω3 18:4n3と20:5n3 FAsの存在下で別々に行われたインキュベーション実験の結果を、各々表3及び4に示す。インキュベーションの5分後、C18PUFA−CoAは空のベクターコントロールpYES2及びpYLACSA Y00833形質転換体の両方において見出され、後者において高い割合であった。TplacsA遺伝子を含むY00833とは異なり、番号C20PUFA−CoAsは、空のベクターコントロールであるY00833中で検出された。ARA−CoAは、pYLACSA形質転換体で測定される最も豊富なPUFA−CoAsであり、インキュベーション5分後の濃度がピークであり、その後、続く24時間の間にこの初期濃度のおよそ半分にまで低下する。4つの外から摂取された脂肪酸は、細胞内に蓄積され、対応するアシル−CoAsによって示される一過的な変動へは進まなかった(データは示さず)。C20PUFA−CoAsは、空のベクターコントロールでは摂取60分後に検出されなかったが、24時間後には検出された。C18ω3及びω6FAsは、pYLACSA形質転換体中のARA−CoAと同様に、インキュベーションの最初の1時間で増加し、その後24時間後まで現象する蓄積パターンを示した。これに対して、EPA−CoAは、実験の間中ずっと増加した。また、TpLACSAは、内在性の飽和14:0、16:0及び18:0−CoAsの2倍の増加を誘導したのに対し、16:1及び18:1−CoAsは減少し、22.1−CoAは僅かに変動するのみであった。
実施例5
インビトロアッセイによるアシル−CoAシンテターゼ活性の測定
TpLACSAの基質特異性を直接測定する目的で、幾つかの脂肪酸を、遊離脂肪酸、ATP及び遊離CoAの存在下で、アシル−CoAの酵素産物を測定するのに適したアッセイによりテストした。広範囲の脂肪酸基質を利用するPseudomonas sp.由来の市販のアシル−CoAシンテターゼがポジティブコントロールとして含まれた。図2に示される結果は、この酵素の広い特異性を確認する。pYES2とpYLACSA Y00833形質転換体から得られる抽出液中で測定される比活性を比較すると、TpLACSAはC20及びC22PUFAsに対して非常に活性が高いことが分かる。活性は、空のベクターコントロールと比べて、TpLACSA抽出液中において20:4n6、20:5n3及び22:6n3FAsに対し、62〜222倍と高く効果的であり、その一方、パルミチン酸又はC18PUFAsの存在下で行われたアッセイの値は、2−3倍程度(2−3の因数)の増加しか示さなかった。ARA、EPA及びDHA遊離脂肪酸の存在下において、アシル−CoAの生産はPYES2酵母抽出液中においてかろうじて検出される程度であった。
インビトロアッセイによるアシル−CoAシンテターゼ活性の測定
TpLACSAの基質特異性を直接測定する目的で、幾つかの脂肪酸を、遊離脂肪酸、ATP及び遊離CoAの存在下で、アシル−CoAの酵素産物を測定するのに適したアッセイによりテストした。広範囲の脂肪酸基質を利用するPseudomonas sp.由来の市販のアシル−CoAシンテターゼがポジティブコントロールとして含まれた。図2に示される結果は、この酵素の広い特異性を確認する。pYES2とpYLACSA Y00833形質転換体から得られる抽出液中で測定される比活性を比較すると、TpLACSAはC20及びC22PUFAsに対して非常に活性が高いことが分かる。活性は、空のベクターコントロールと比べて、TpLACSA抽出液中において20:4n6、20:5n3及び22:6n3FAsに対し、62〜222倍と高く効果的であり、その一方、パルミチン酸又はC18PUFAsの存在下で行われたアッセイの値は、2−3倍程度(2−3の因数)の増加しか示さなかった。ARA、EPA及びDHA遊離脂肪酸の存在下において、アシル−CoAの生産はPYES2酵母抽出液中においてかろうじて検出される程度であった。
実施例6
TplacsAを発現する酵母内でのDHAの貯蔵
TplacsA遺伝子の発現により酵母の貯蔵脂質中に貯蔵される22:6n3(DHA)の量が増加するかどうか確証するために、DHAの存在下、30℃でのインキュベーション4日後に、全ての及びTAG脂肪酸をpYES2及びpYLACSA Y00833形質転換体から抽出した。TplacsA遺伝子を含むY00833は、空のベクターコントロールと比較すると、乾燥重量を基礎にして、TAGsにおいておよそ6倍のDHAの量とこれに関連した総FAsの倍加を示したことが表5に提示されている。内在性の飽和及びモノ不飽和脂肪酸については、僅かな増加のみが示された(データは示さず)。
TplacsAを発現する酵母内でのDHAの貯蔵
TplacsA遺伝子の発現により酵母の貯蔵脂質中に貯蔵される22:6n3(DHA)の量が増加するかどうか確証するために、DHAの存在下、30℃でのインキュベーション4日後に、全ての及びTAG脂肪酸をpYES2及びpYLACSA Y00833形質転換体から抽出した。TplacsA遺伝子を含むY00833は、空のベクターコントロールと比較すると、乾燥重量を基礎にして、TAGsにおいておよそ6倍のDHAの量とこれに関連した総FAsの倍加を示したことが表5に提示されている。内在性の飽和及びモノ不飽和脂肪酸については、僅かな増加のみが示された(データは示さず)。
参考文献
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Claims (27)
- 図3Aに示される配列からなる核酸分子、又は該配列とストリンジェントなハイブリダイズ条件下でハイブリダイズし、かつ、該核酸分子がアシル−CoAシンテターゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸分子の核酸配列を含む核酸分子を含んでなる、トランスジェニック細胞。
- 前記核酸分子が図3Aで示される核酸配列を含む請求項1に記載の細胞。
- 前記核酸分子が図3Aで示される核酸配列からなる請求項1又は2に記載の細胞。
- 図3Bに表されるアミノ酸配列又は配列が少なくとも1アミノ酸残基の付加、欠失又は置換によって修飾される変異体アミノ酸配列で示されるポリペプチドであって、該ポリペプチド又は変異体ポリペプチドがアシル−CoAシンテターゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸分子を発現するように適合されるトランスジェニック細胞。
- 前記修飾が前記ポリペプチドの酵素活性を保持又は促進する請求項1乃至4のいずれかに記載の細胞。
- 前記核酸分子が藻類種から単離される請求項1乃至5のいずれかに記載の細胞。
- 前記アシル−CoAシンテターゼ活性が20及び/又は22炭素数の多価不飽和脂肪酸を修飾する請求項1乃至6のいずれかに記載の細胞。
- 請求項1乃至7のいずれかに記載の核酸分子を含むベクター。
- 前記ベクターが組織特異的なプロモーターであるように適合される請求項8に記載のベクター。
- 前記プロモーターが種子特異的プロモーターである請求項9に記載のベクター。
- 前記プロモーターが誘導性プロモーター又は発生制御プロモーターである請求項9又は10に記載のベクター。
- 前記細胞が真核細胞である請求項1乃至7のいずれかに記載の細胞。
- 前記細胞が原核細胞である請求項1乃至7のいずれかに記載の細胞。
- 前記真核細胞が植物細胞である請求項12に記載の細胞。
- 請求項14の植物細胞を含む種子。
- アシル−CoA生成するためのコエンザイムAへの長鎖脂肪酸のエステル化における請求項1乃至7又は12乃至15のいずれかに記載のポリペプチド、細胞、植物又は種子の使用。
- 請求項1乃至7のいずれかに記載のポリペプチド、長鎖脂肪酸、ATP及びコエンザイムAを含む反応容器。
- 前記容器が発酵槽である請求項17に記載の容器。
- 前記ポリペプチドが請求項12乃至14のいずれかに記載の細胞により発現されるものである請求項17又は18に記載の容器。
- 前記細胞が真核細胞である請求項17乃至19のいずれかに記載の容器。
- 前記細胞が酵母細胞である請求項20に記載の容器。
- 前記細胞が原核細胞である請求項17乃至19のいずれかに記載の容器。
- 以下の工程を含むアシル−CoAを生成するためのコエンザイムAへの長鎖脂肪酸基質のエステル化を行う方法。
i)請求項17乃至22のいずれかに記載の反応容器を提供し、
ii)長鎖脂肪酸のアシル−CoAへのエステル化が可能な条件下で前記反応容器に含まれる細胞を生育させる工程 - 前記長鎖脂肪酸が18:3n6、20:4n6、18:4n3、20:5n3及び22:6n3からなるグループより選択される請求項23に記載の方法。
- 請求項23又は24に記載の方法により調製される多価不飽和脂肪酸を含むオイル、脂質、又は脂肪酸の組成物。
- 前記組成物がトランスジェニック植物に由来する請求項25に記載の組成物。
- 請求項23又は24に記載の方法により生産されるオイル、脂質又は脂肪酸、又は食物
、食品、化粧品又は医薬品に含まれる請求項25又は26に記載のオイル、脂質又は脂肪酸の使用。
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