JP2017515480A - 極長炭素鎖化合物を生物学的に産生するための方法 - Google Patents
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Abstract
本開示は、メタンまたは天然ガス等、C1基質を原料として利用する組換えC1代謝微生物から、脂肪アシル−CoA、脂肪アルデヒド、脂肪アルコール、脂肪エステルワックス、アルカンおよびケトン等、極長炭素鎖化合物(C24よりも長い)を生物学的に産生するための組成物および方法を提供する。ある特定の実施形態では、脂肪アシル−CoAレダクターゼをコードする組換え核酸分子を含有する非天然メタン資化性菌であって、C1基質を極長鎖脂肪アルデヒドに変換することができるメタン資化性菌が提供される。
Description
本開示は、極長鎖炭素化合物を生物学的に産生するための、より具体的には、組換えC1代謝微生物を使用して、C1基質(メタンまたは天然ガス等)から極長鎖脂肪アルコール、極長鎖アルデヒド、極長鎖アルカン、極長鎖ケトンまたは極長鎖脂肪エステルワックスを産生するための組成物および方法を提供する。
極長鎖脂肪酸は、24個を超える炭素を有する脂肪族尾部を有する脂肪酸である。これは、非極性(親油性)、飽和または不飽和炭化水素鎖と、末端炭素に結合している極性(親水性)カルボキシル基で構成される。極長鎖脂肪酸は、ワックスに取り込まれる、またはアルカン、一級および二級アルコール、ケトン、アルデヒドならびにアシル−エス尾部を含む、ワックス中に見出される他の脂肪族炭化水素の前駆体として機能することができる。極長鎖脂肪酸およびその誘導体は、栄養補助食品、食品、医薬製剤、潤滑剤、洗剤、界面活性物質、化粧品、ナイロン、コーティング、接着剤およびバイオ燃料の生産において使用することができる価値の高い化学物質である。
天然源および化学合成からの極長脂肪酸の供給は、商業的なニーズに十分ではない。天然源または化学合成により極長脂肪酸を得ることは、苛酷な生産環境、高価な出発材料、限定された環境資源の使用または有害な副生成物の産生のいずれかを要する。極長鎖脂肪酸の生物工学的生産の試みが増えつつある。多くの研究は、トランスジェニック植物の種子油における生産に集中した。E.coliおよび様々な酵母等、組換え微生物も、バイオマス由来の原料から極長鎖脂肪酸への変換に使用されてきた。しかし、原料として相対的に安価なセルロース性バイオマスを使用する場合であっても、炭水化物原料の質量の半分超が酸素で構成されており、これが変換効率における有意な限界を表す。極長鎖脂肪酸およびその誘導体(極長鎖脂肪アルコール、極長鎖脂肪アルデヒド、極長鎖アルカン、極長鎖ワックスエステルおよび極長鎖ケトン等)は、炭水化物原料よりも有意に低い酸素含有量を有し、これが理論上の収率を限定する。なぜなら炭水化物酸素の大半を廃棄物として排除しなければならないからである。よって、炭水化物原料からの極長鎖脂肪酸およびその誘導体の産生の経済は、法外に高価である。
極長鎖脂肪酸および関連化合物の産生のための炭水化物に基づく発酵方法に関連する限界を踏まえて、当該分野において、代替的な、対費用効果の高い、環境に優しい極長鎖脂肪酸産生方法の必要がある。本開示は、このような必要を満たし、他の関連する利点をさらに提供する。
ある特定の態様では、本開示は、(A)次の酵素:β−ケトアシル−CoAシンターゼ(KCS);β−ケトアシル−CoAレダクターゼ(KCR);β−ヒドロキシアシル−CoAデヒドラターゼ(HCD);エノイル−CoAレダクターゼ(ECR)をコードする1種または複数種の組換え核酸分子を含む非天然C1代謝非光合成微生物であって、C1基質を、極長鎖脂肪アシル−CoA、極長鎖脂肪アルデヒド、極長鎖脂肪アルコール、極長鎖脂肪エステルワックス、極長鎖アルカン、極長鎖ケトンまたはこれらの組合せを含む極長炭素鎖化合物に変換する非天然C1代謝非光合成微生物をC1基質原料と共に培養すること、および(B)該極長炭素鎖化合物を回収することにより、極長炭素鎖化合物を作製するための方法を対象にする。
関連する態様では、本開示は、次の酵素:β−ケトアシル−CoAシンターゼ(KCS);β−ケトアシル−CoAレダクターゼ(KCR);β−ヒドロキシアシル−CoAデヒドラターゼ(HCD);エノイル−CoAレダクターゼ(ECR)をコードする1種または複数種の組換え核酸分子を含む非天然メタン資化性菌であって、C1基質を、極長鎖脂肪アシル−CoA、極長鎖脂肪アルデヒド、極長鎖脂肪アルコール、極長鎖脂肪エステルワックス、極長鎖アルカン、極長鎖ケトンまたはこれらの組合せを含む極長炭素鎖化合物に変換することができるメタン資化性菌を提供する。ある特定の実施形態では、脂肪アシル−CoAレダクターゼをコードする組換え核酸分子を含有する非天然メタン資化性菌であって、C1基質を極長鎖脂肪アルデヒドに変換することができるメタン資化性菌が提供される。
ある特定の実施形態では、異種脂肪アルコール生成アシル−CoAレダクターゼ(heterologous fatty alcohol forming acyl−CoA reductase)をコードする組換え核酸分子または異種脂肪アシル−CoAレダクターゼをコードする組換え核酸分子および異種アルデヒドレダクターゼをコードする組換え核酸分子を含有する非天然メタン資化性菌であって、C1基質を極長鎖脂肪アルコールに変換することができるメタン資化性菌が提供される。
さらなる実施形態では、異種脂肪アルコール生成アシル−CoAレダクターゼをコードする組換え核酸分子および異種エステルシンターゼをコードする組換え核酸分子を含有する非天然メタン資化性菌であって、C1基質を極長鎖脂肪エステルワックスに変換することができるメタン資化性菌が提供される。
ある特定の実施形態では、異種脂肪アシル−CoAレダクターゼをコードする組換え核酸分子および異種アルデヒドデカルボニラーゼ(decarbonylase)をコードする組換え核酸分子を含有する非天然メタン資化性菌であって、C1基質を極長鎖アルカンに変換することができるメタン資化性菌が提供される。
さらなる実施形態では、異種脂肪アシル−CoAレダクターゼをコードする組換え核酸分子、異種アルデヒドデカルボニラーゼをコードする組換え核酸分子および異種アルカンヒドロキシラーゼをコードする組換え核酸分子を含有する非天然メタン資化性菌であって、C1基質を極長鎖ケトンに変換することができるメタン資化性菌が提供される。
別の態様では、本開示は、極長鎖炭素化合物の組成物を含むC1代謝微生物バイオマスを提供し、該極長炭素鎖化合物含有バイオマスまたはそれに由来する極長炭素鎖化合物の組成物は、約−35‰〜約−50‰、−45‰〜約−35‰または約−50‰〜約−40‰または約−45‰〜約−65‰または約−60‰〜約−70‰または約−30‰〜約−70‰のδ13Cを有する。ある特定の実施形態では、極長炭素鎖化合物の組成物は、極長鎖脂肪アシル−CoA、極長鎖脂肪アルデヒド、極長鎖脂肪アルコール、極長鎖脂肪エステルワックス、極長鎖アルカン、極長鎖ケトンまたはこれらのいずれかの組合せを含む。なおさらなる実施形態では、極長炭素鎖化合物の組成物は、C25〜C50極長鎖脂肪アシル−CoA、C25〜C50極長鎖脂肪アルデヒド、C25〜C50極長鎖脂肪アルコール、C25〜C50極長鎖脂肪エステルワックス、C25〜C50極長鎖アルカンまたはC25〜C50極長鎖ケトンを含む。またさらなる実施形態では、極長炭素鎖化合物の組成物は、C25〜C50の範囲の炭素鎖長を有する大部分(50%w/w超)の極長炭素鎖化合物またはC24を超える炭素鎖長を有する大部分の極長炭素鎖化合物、または総極長炭素鎖化合物の少なくとも70%がC25〜C50極長炭素鎖化合物を含む極長炭素鎖化合物を含有する組成物を含む。
本開示は、極長鎖炭素化合物を生成するための組成物および方法を提供する。例えば、組換えC1代謝微生物は、C1基質原料(例えば、メタン)と共に培養されて、C24を超える脂肪アシル−CoA、脂肪アルデヒド、脂肪アルコール、脂肪エステルワックス、アルカン、ケトンまたはこれらのいずれかの組合せを生成する。この新たなアプローチは、例えば、栄養補助食品、食品、医薬製剤、潤滑剤、洗剤、界面活性物質、化粧品、ナイロン、コーティング、接着剤またはバイオ燃料の産生における使用のための極長鎖脂肪酸誘導体を生成するための新たな宿主系としての、メチロトローフ菌またはメタン資化性菌の使用を可能にする。
背景として、天然ガスを含む種々の供給源由来のメタンは、豊富な国内資源を表す。上に記す通り、炭水化物に基づく原料は、その質量の半分超を酸素が含有し、極長鎖脂肪酸は、これらの原料よりも有意に低い酸素含有量を有するため、これが変換効率における有意な限界となる。現在のシステムの限界に取り組むための解法は、変換のための原料としてメタンまたは天然ガスを利用することである。天然ガス由来のメタンは、安価かつ豊富であり、重要なことに、酸素を含有しないことから、理論上の変換効率における有意な改善を可能にする。さらに、C1炭素源が、炭水化物原料と比較して安価かつ豊富であることも、極長鎖脂肪酸産生の経済の改善に寄与する。
極長鎖脂肪酸産生は、皮膚バリア形成、網膜機能、炎症の消散、ミエリンの維持、精子発生および成熟、肝臓恒常性、核膜孔における高い膜湾曲、GPI脂質アンカーの合成、ならびに植物種子におけるトリアシルグリセロールの貯蔵等、多様な生理的機能に必要とされるため、多くの異なる生物における重要な経路である。極長鎖脂肪酸は、植物クチクラワックスおよび膜スフィンゴ脂質の構成成分でもある。脂肪酸は、脂肪酸がチオエステル結合によりコエンザイムAに連結されたアシル−CoAの形態で伸長される。本開示において、代謝工学技法が適用されて、脂肪酸伸長経路(例えば、β−ケトアシル−CoAシンターゼ、β−ケトアシル−CoAレダクターゼ、β−ヒドロキシアシル−CoAデヒドラターゼおよびエノイル−CoAレダクターゼのうち1種または複数種)を提供して、脂肪アシル−CoA基質(例えば、C16またはC18脂肪アシル−CoA)からの極長鎖脂肪アシル−CoAの産生を可能にする。追加的な実施形態では、アルカン生成経路の様々な酵素の導入により、極長鎖脂肪アシル−CoAがさらに改変されて、極長鎖脂肪アルデヒド、極長鎖アルカン、極長鎖脂肪二級アルコール、極長鎖ケトンまたはこれらのいずれかの組合せを産生する。他の実施形態では、アルコール生成経路の様々な酵素の導入により、極長鎖脂肪アシル−CoAがさらに改変されて、極長鎖アルデヒド、極長鎖脂肪一級アルコール、極長鎖ワックスエステルまたはこれらのいずれかの組合せを産生する。
一態様では、本開示は、C1基質原料の存在下で非天然C1代謝非光合成微生物を培養するステップであって、該C1代謝非光合成微生物が、次の酵素:β−ケトアシル−CoAシンターゼ、β−ケトアシル−CoAレダクターゼ、β−ヒドロキシアシル−CoAデヒドラターゼおよびエノイル−CoAレダクターゼをコードする1種または複数種の組換え核酸分子を含み、該C1代謝非光合成微生物が該C1基質を極長炭素鎖化合物に変換する、ステップと、該極長炭素鎖化合物を回収するステップとを含む、極長炭素鎖化合物を産生するための方法を提供する。別の態様では、本開示は、次の酵素:β−ケトアシル−CoAシンターゼ、β−ケトアシル−CoAレダクターゼ、β−ヒドロキシアシル−CoAデヒドラターゼおよびエノイル−CoAレダクターゼをコードする1種または複数種の組換え核酸分子を含む非天然メタン資化性菌であって、C1基質を極長炭素鎖化合物に変換することができるメタン資化性菌を提供する。
より詳細に本開示を表記する前に、本明細書に使用されるある特定の用語の定義を提示することが、その理解に役立つ。追加的な定義は、本開示を通して表記されている。
本明細書中で使用する場合、他に断りがなければ、いずれかの濃度範囲、パーセンテージ範囲、比率範囲または整数範囲は、列挙された範囲内のいずれかの整数の値と、適切であれば、その分数(整数の10分の1および100分の1等)を含むものと理解されたい。また、ポリマーサブユニット、サイズまたは厚さ等、いずれかの物理的特色に関する本明細書に列挙されているいずれかの数値範囲は、他に断りがなければ、列挙されている範囲内のいずれかの整数を含むものと理解されたい。本明細書中で使用する場合、用語「約」は、他に断りがなければ、表示の範囲、値または構造の±20%を意味する。用語「から本質的になる」は、指定の材料もしくはステップ、または請求されている発明の基本および新規の特徴に実質的に影響を与えないものに特許請求の範囲を限定する。用語「1つの(a)」および「1つの(an)」が、本明細書中で使用する場合、列挙されている構成成分のうち「1種または複数種」を指すことを理解されたい。選択肢(例えば、「または(もしくは)」)の使用は、選択肢のいずれか一方、両方またはこれらのいずれかの組合せを意味するものと理解されたい。本明細書中で使用する場合、用語「含む(include)」、「有する(have)」および「含む(comprise)」は、同義に使用されており、この用語およびその変種は、非限定的なものとして解釈されることを目的とする。
本明細書中で使用する場合、用語「組換え」または「非天然」は、少なくとも1個の遺伝的変更を含む、または外因性核酸の導入によって改変された、生物、微生物、細胞、核酸分子またはベクターを指す、あるいは内因性核酸分子または遺伝子の発現が制御できるように変更された細胞を指し、かかる変更または改変は、遺伝子操作によって導入される。遺伝的変更は、例えば、タンパク質もしくは酵素をコードする発現できる核酸分子を導入する改変、他の核酸付加、核酸欠失、核酸置換または細胞の遺伝子材料の他の機能破壊を含む。かかる改変は、例えば、参照されている種に対し異種または相同ポリペプチドのコード領域およびその機能断片を含む。追加的な改変は、例えば、改変が、遺伝子またはオペロンの発現を変更する非コード調節領域を含む。例示的なタンパク質または酵素は、極長鎖脂肪酸伸長経路内のタンパク質または酵素(すなわち、構成成分)を含む(例えば、β−ケトアシル−CoAシンターゼ、β−ケトアシル−CoAレダクターゼ、β−ヒドロキシアシル−CoAデヒドラターゼ、エノイル−CoAレダクターゼまたはこれらの組合せ)。酵素またはその機能断片をコードする核酸分子に対する遺伝子改変は、その天然起源状態から変更された組換え細胞に生化学的反応能力または代謝経路能力を付与することができる。
本明細書において、酵素名の次の略語が使用される:「脂肪酸エロンガーゼ(elongase)」は、「FAE」と称され;「β−ケトアシル−CoAシンターゼ」または「3−ケトアシル−CoAシンターゼ」は、「KCS」と称され;「β−ケトアシル−CoAレダクターゼ」または「3−ケトアシル−CoAレダクターゼ」は、「KCR」と称され;「β−ヒドロキシアシル−CoAデヒドラターゼ」または「3−ヒドロキシアシル−CoAデヒドラターゼ」は、「HCD」と称され;「エノイル−CoAレダクターゼ」は、「ECR」と称され;「ジアシルグリセロールO−アシルトランスフェラーゼ」は、「DGAT」と称され;「脂肪アシルレダクターゼ」または「脂肪アルコール生成アシル−CoAレダクターゼ」は、「FAR」と称され;「アシルキャリアータンパク質」は、「ACP」と称され;「コエンザイムA」は、「CoA」と称され;「チオエステラーゼ」は、「TE」と称され;「脂肪酸シンターゼ」または「脂肪酸シンテターゼ」は、「FAS」と称され;「脂肪アシル−CoAレダクターゼ」は、「FACR」と称され;「脂肪アシル−CoAシンターゼ」または「脂肪アシル−CoAシンテターゼ」または「アシル−CoAシンターゼ」または「アシル−CoAシンテターゼ」は、本明細書において互換的に使用され、「FACS」と称され;「アセチル−CoAカルボキシラーゼ」は、「ACC」と称される。
マロニル−CoAは、本明細書中で使用する場合、構造COOH−(CO)−S−CoAのマロン酸のコエンザイムA誘導体を指す。マロニル−CoAは、アセチル−CoAカルボキシラーゼ(ACC)酵素を使用してアセチル−CoAをカルボキシル化することにより生成される。
脂肪酸エロンガーゼ(FAE)は、本明細書中で使用する場合、マロニル−CoAから供与されるC2部分を脂肪アシル−CoA基質に逐次に付加して極長鎖脂肪酸を産生する、4個の別個の酵素からなるヘテロ四量体酵素複合体を指す。反復FAE触媒性脂肪酸伸長サイクルのそれぞれは、それぞれβ−ケトアシル−CoAシンターゼ、β−ケトアシル−CoAレダクターゼ、β−ヒドロキシアシル−CoAデヒドラターゼおよびエノイル−CoAレダクターゼによって触媒される4連続した酵素反応(縮合、還元、脱水および還元)を含み、これは、脂肪アシル−CoA鎖を2炭素鎖単位づつ伸長する。
図1に示され、本明細書において使用される、3−ケトアシル−CoAシンターゼまたは脂肪酸エロンガーゼとしても公知のβ−ケトアシル−CoAシンターゼ(KCS)は、脂肪酸伸長過程の律速酵素を指し、これは、脂肪アシル−CoAをマロニル−CoAと縮合して、3−ケトアシル−CoAとしても公知のβ−ケトアシル−CoAを産生する。極長鎖脂肪酸伸長サイクルのアシル鎖長基質特異性は、KCSによって決定されると考えられる。単一のKCSは、数回の連続した伸長サイクルにおいて縮合を触媒することができる。様々なKCS酵素は、アシル−CoA基質鎖長の重複する範囲を有することができる。
β−ケトアシル−CoAレダクターゼ(KCR)または3−ケトアシル−CoAレダクターゼは、本明細書中で使用する場合、β−ケトアシル−CoAを3−ヒドロキシアシル−CoAとしても公知のβ−ヒドロキシアシル−CoAに還元する酵素を指す(図1を参照)。ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸(NADPH)は、この反応における還元剤として使用される。KCRは、基質鎖長に対し幅広い適合性を有することができる。
β−ヒドロキシアシル−CoAデヒドラターゼ(HCD)または3−ヒドロキシアシル−CoAデヒドラターゼは、本明細書中で使用する場合、β−ヒドロキシアシル−CoAを2,3−トランス−エノイル−CoAとしても公知のトランス−エノイル−CoAに脱水する酵素を指す(図1を参照)。HCDは、基質鎖長に対し幅広い適合性を有することができる。
エノイル−CoAレダクターゼ(ECR)または2,3−トランス−エノイル−CoAレダクターゼは、本明細書中で使用する場合、トランス−エノイル−CoAを還元して、本来の脂肪アシル−CoAよりも2個の追加的な炭素鎖単位を有する脂肪アシル−CoAを生成する酵素を指す(図1を参照)。NADPHは、この反応における還元剤として使用される。ECRは、基質鎖長に対し幅広い適合性を有することができる。
ジアシルグリセロールO−アシルトランスフェラーゼ(DGAT)または「O−アシルトランスフェラーゼ」は、本明細書中で使用する場合、ジアシルグリセロール基質および脂肪アシル−CoAからトリアシルグリセロールを生成する酵素を指す。
ジアシルグリセロールO−アシルトランスフェラーゼ(DGAT)または「O−アシルトランスフェラーゼ」は、本明細書中で使用する場合、ジアシルグリセロール基質および脂肪アシル−CoAからトリアシルグリセロールを生成する酵素を指す。
アルデヒドデカルボニラーゼは、本明細書中で使用する場合、極長鎖脂肪アルデヒドを脱カルボニルして(decarbonylate)、極長鎖脂肪アルデヒド基質よりも1個少ない炭素鎖単位を有する極長鎖アルカンを生成する酵素を指す(図4を参照)。
アルカンヒドロキシラーゼは、本明細書中で使用する場合、極長鎖アルカンの鎖中央(midchain)ヒドロキシル化を触媒して、極長鎖脂肪二級アルコールを生成する酵素を指す(図4を参照)。
本明細書に使用され、かつ図1に示す語句「脂肪酸伸長経路」は、KCS、KCR、HCDおよびECRによって触媒される1または複数の伸長サイクルに関与する、長鎖脂肪酸基質(例えば、C8〜C24脂肪アシル−CoA)から極長鎖脂肪アシル−CoA(C24超)への伸長を指す。反復伸長サイクルのそれぞれは、一連の4反応(縮合、還元、脱水および還元)により、脂肪アシル−CoA炭化水素鎖を2炭素づつ延長する。
図1および図2に示され、かつ本明細書に使用されている「脂肪アシルレダクターゼ」または「脂肪アルコール生成アシル−CoAレダクターゼ」(FAR)は、脂肪アシル−CoA、脂肪アシル−ACPまたは他の脂肪アシルチオエステル複合体(それぞれ、R−(CO)−S−R1、式Iの構造を有する)から脂肪アルコール(構造R−OH、式II)への還元を触媒する酵素を指す。例えば、2分子のNADPHが、NADP+に酸化されるときに、R−(CO)−S−R1(式I)は、R−OH(式II)およびR1−SH(式III)に変換される(式中、Rは、C8〜C24飽和、不飽和、直鎖状、分枝状または環状炭化水素であり、R1は、CoA、ACPまたは他の脂肪アシルチオエステル基質を表す)。FARは、極長鎖脂肪アシル−CoAから極長鎖脂肪アルコールへの還元を触媒することもできる。CoAは、脂肪酸の合成および酸化に関与する非タンパク質アシルキャリアー基である。「ACP」は、脂肪酸の合成において使用されるFASのポリペプチドまたはタンパク質サブユニットである。FARは、脂肪アシル−CoAレダクターゼ(FACR)とは別個のものである。FACRは、脂肪アシル−CoAまたは極長鎖脂肪アシル−CoA中間体のみを還元して、それぞれ脂肪アルデヒドまたは極長鎖脂肪アルデヒドとし、相当する脂肪アルコールの生成に追加的なオキシドレダクターゼ酵素を必要とする。脂肪アルデヒドは、本明細書中で使用する場合(図5を参照)、Rが上に定義されている通りである、飽和または不飽和脂肪族アルデヒドを指す。極長鎖脂肪アルデヒドは、Rが少なくともC25飽和、不飽和、直鎖状、分枝状または環状炭化水素である、脂肪アルデヒドである。
用語「脂肪酸」は、本明細書中で使用する場合、構造R−COOH(式IV)(式中、Rは、C8〜C24飽和、不飽和、直鎖状、分枝状または環状炭化水素であり、カルボキシル基は、1位に存在する)の化合物を指す。飽和または不飽和脂肪酸は、「Cx:y」(式中、「x」は、炭素原子の総数を表す整数であり、「y」は、炭素鎖における二重結合の数を指す整数である)として記載することができる。例えば、C12:0と称される脂肪酸または1−ドデカン酸は、この化合物が、12個の炭素およびゼロ個の二重結合を有することを意味する。用語「極長鎖脂肪酸」は、本明細書中で使用する場合、Rが、少なくともC25飽和、不飽和、直鎖状、分枝状または環状炭化水素であり、カルボキシル基が1位に存在する、脂肪酸を指す。
用語「極長鎖脂肪ワックスエステル」または「極長鎖脂肪エステルワックス」は、本明細書中で使用する場合、炭素単位の数が少なくとも25の脂肪アシル−CoAおよび脂肪アルコールのエステルを指す。
用語「極長鎖アルカン」は、本明細書中で使用する場合、少なくともC25直鎖状または分枝状飽和炭化水素を指す。
用語「極長鎖ケトン」は、本明細書中で使用する場合、構造R−CO−R1(式中、RおよびR1は独立に、飽和、不飽和、直鎖状、分枝状または環状炭化水素であり、炭素単位の数は、少なくとも25である)の化合物を指す。
用語「極長炭素鎖化合物」は、本明細書中で使用する場合、少なくとも25個の炭素原子を有する飽和、不飽和、実質的に直鎖状の炭素骨格を含む化合物を指す。極長炭素鎖化合物は、極長鎖脂肪アシル−CoA、極長鎖脂肪アルデヒド、極長鎖脂肪一級アルコール、極長鎖脂肪二級アルコール、極長鎖脂肪エステルワックス、極長鎖アルカン、極長鎖ケトンまたはこれらのいずれかの組合せを含む。
用語「ワックスシンターゼ」または「エステルシンターゼ」は、本明細書中で使用する場合、エステル結合により脂肪アシル−CoAに脂肪アルコールをコンジュゲートする酵素を指す。
用語「アルデヒドレダクターゼ」は、本明細書中で使用する場合、極長鎖脂肪アルデヒドを還元して、極長鎖脂肪一級アルコールを生成する酵素を指す。NADPHは、この反応のための還元剤として使用される。アルデヒドレダクターゼは、極長鎖脂肪アルデヒドを還元して極長鎖脂肪一級アルコールを生成するために使用することもできるアルコールデヒドロゲナーゼ酵素を指すこともできる。
用語「ヒドロキシル脂肪酸」は、本明細書中で使用する場合、構造OH−R−COOH(式V)(式中、Rは、C8〜C24飽和、不飽和、直鎖状、分枝状または環状炭化水素である)の化合物を指す。オメガヒドロキシ脂肪酸(ω−ヒドロキシ酸としても公知)は、カルボキシル基を1位に、ヒドロキシルをn位に有する、ある数の炭素原子長を有する天然起源の直鎖脂肪族有機酸のクラスである。例えば、例示的なC16ω−ヒドロキシ脂肪酸は、16−ヒドロキシパルミチン酸(16個の炭素原子を有し、カルボキシル基を1位に、ヒドロキシル基を16位に有する)および10,16−ジヒドロキシパルミチン酸(16個の炭素原子を有し、カルボキシル基を1位に、第1のヒドロキシル基を10位に、第2のヒドロキシル基を16位に有する)である。
用語「脂肪アルコール」は、本明細書中で使用する場合、式II(式中、Rは、C8〜C24飽和、不飽和、直鎖状、分枝状または環状炭化水素である)の脂肪族アルコールを指す。飽和または不飽和脂肪アルコールは、「Cx:y−OH」(式中、「x」は、脂肪アルコールにおける炭素原子の総数を表す整数であり、「y」は、炭素鎖における二重結合の数を指す整数である)として記載することができる。「極長鎖脂肪アルコール」は、Rが少なくともC25飽和、不飽和、直鎖状、分枝状または環状炭化水素である、脂肪アルコールを指す。極長鎖脂肪一級アルコールは、第1級炭素原子に結合した(connected)ヒドロキシル基を有する極長鎖アルコールを指す。極長鎖脂肪二級アルコールは、ヒドロキシル基が結合している(attached)炭素が、2個のアルキル基に直接的に結合した(joined)極長鎖アルコールを指す。
不飽和脂肪酸または脂肪アルコールは、「シスΔz」または「トランスΔz」と称することができ、「シス」および「トランス」は、二重結合周囲の炭素鎖立体配置を指し、「z」は、二重結合の第1の炭素の番号を示し、このナンバリングは、脂肪酸のカルボン酸を有する炭素または脂肪アルコールの−OH基に結合した炭素から始まる。
用語「脂肪アシル−チオエステル」または「脂肪アシル−チオエステル複合体」は、脂肪アシル部分がチオエステル結合を介してキャリアー部分に共有結合により連結される式Iの化合物を指す。脂肪アシル−チオエステルは、本明細書に記載されているFAR酵素の基質である。
用語「脂肪アシル−CoA」は、R1がコエンザイムAである式Iの化合物を指し、用語「脂肪アシル−ACP」は、R1がアシルキャリアータンパク質ACP)である式Iの化合物を指す。用語「極長鎖脂肪アシル−CoA」は、Rが少なくともC25飽和、不飽和、直鎖状、分枝状または環状炭化水素である脂肪アシル−CoAを指す。
語句「アシル−CoA非依存性経路」は、脂肪アシル−ACP基質から脂肪アルコールへの直接的な酵素変換による脂肪アルコールの産生を指し、遊離脂肪酸または脂肪アシル−CoA中間体の使用を必要としない。この生合成経路は、2種類の脂肪アシル−CoA依存性経路とは異なる−1種類は、アシル転移反応により脂肪アシル−ACPを脂肪アシルCoAに直接的に変換し、第2の種類は、遊離脂肪酸中間体を経て脂肪アシル−ACPを脂肪アシル−CoAに変換する(図5を参照)。アシル−CoA非依存性経路は、ATPの使用を必要とする、遊離脂肪酸から脂肪アシル−CoA基質を生成するステップを迂回する利点を有する。したがって、アシル−CoA非依存性経路は、遊離脂肪酸中間体を利用するアシル−CoA依存性経路よりも少ないエネルギーを使用することができる。
本明細書中で使用する場合、「アルコールデヒドロゲナーゼ(ADH)」は、アルコールをその相当するアルデヒド、ケトンまたは酸に変換することができるいずれかの酵素を指し、逆反応を触媒することもできる。アルコールデヒドロゲナーゼは、少なくとも数種類のアルコール基質を変換することができる広い特異性(general specificity)を有することができる、あるいは1、2または数種のアルコール基質を受け入れる狭い特異性を有することができる。アルコールデヒドロゲナーゼを使用して、極長鎖二級脂肪アルコールの酸化を触媒して、極長鎖ケトンを生成することができる。アルコールデヒドロゲナーゼを使用して、極長鎖脂肪アルデヒドから極長鎖脂肪一級アルコールへの変換を触媒することができる。
本明細書中で使用する場合、「粒子状メタンモノオキシゲナーゼ(pMMO)」は、メタン資化性細菌におけるメタンからメタノールへの酸化を触媒する膜結合型粒子状酵素を指す。用語pMMOは、多成分酵素または酵素の活性部位を含むサブユニットのいずれかを意味する。
本明細書中で使用する場合、「可溶性メタンモノオキシゲナーゼ(sMMO)」は、メタン資化性細菌におけるメタンからメタノールへの酸化を触媒する細胞ライセートの可溶性画分(細胞質)に見出される酵素を指す。用語sMMOは、多成分酵素または酵素の活性部位を含むサブユニットのいずれかを意味する。
本明細書中で使用する場合、「チトクロムP450」または「CYP」としても公知の「P450」は、脂質、ステロイド系ホルモンおよび生体異物の物質を含む有機化合物の酸化を触媒する、幅広い基質特異性を有する酵素の群を指す。P450酵素は、最も一般的には、酸素原子を有機基質のR−H結合に挿入することにより、モノオキシゲナーゼ(monooxgenase)反応を触媒する。
「変換」は、基質から1個または複数の相当する生成物への酵素変換を指す。「パーセント変換」は、指定の条件下で期間内に1個または複数の生成物に還元される(reduced)基質のパーセントを指す。よって、ポリペプチド酵素の「酵素活性」または「活性」は、基質から生成物への「パーセント変換」として表現することができる。
本明細書中で使用する場合、用語「宿主」は、C1基質原料を少なくともC25脂肪アシル−CoA、脂肪アルデヒド、脂肪アルコール、脂肪エステルワックス、アルカン、ケトンまたはこれらのいずれかの組合せに変換するように、極長鎖脂肪酸生合成構成成分(例えば、KCS、KCR、HCD、ECRまたはこれらのいずれかの組合せ)により遺伝子改変されている微生物(例えば、メタン資化性菌)を指す。宿主細胞は、本明細書に開示されている極長鎖脂肪酸生合成経路とは無関係の所望の特性を付与する他の遺伝子改変を既に保有していてよい。例えば、宿主細胞は、高度な成長、汚染物質もしくは特定の培養条件に対する耐性、追加的な炭素基質を代謝する能力、または望ましい生成物もしくは中間体を合成する能力を付与する遺伝子改変を保有することができる。
本明細書中で使用する場合、用語「メタン資化性菌」、「メタン資化性細菌(methanotrophic bacterium)」または「メタン資化性細菌(methanotrophic bacteria)」は、その主要なまたは唯一の炭素およびエネルギー源として、メタンまたは非従来型天然ガス等、C1基質を利用することができるメチロトローフ細菌を指す。本明細書中で使用する場合、「メタン資化性細菌」は、炭素およびエネルギー源のためにC1基質のみを利用できる「偏性メタン資化性細菌」と、その唯一の炭素およびエネルギー源としてのC1基質に加えてアセテート、ピルベート、サクシネート、マレートまたはエタノール等の多炭素基質を天然に使用することができる「通性メタン資化性細菌」とを含む。通性メタン資化性菌は、Methylocella、MethylocystisおよびMethylocapsaのいくつかの種(例えば、Methylocella silvestris、Methylocella palustris、Methylocella tundrae、Methylocystis daltona SB2、Methylocystis bryophilaおよびMethylocapsa aurea KYG)ならびにMethylobacterium organophilum(ATCC 27,886)を含む。
本明細書中で使用する場合、用語「C1基質」または「C1化合物」は、炭素−炭素結合を欠く有機化合物を指す。C1基質は、シンガス、天然ガス、非従来型天然ガス、メタン、メタノール、ホルムアルデヒド、ギ酸(ギ酸塩)、一酸化炭素、二酸化炭素、メチル化アミン(例えば、メチルアミン、ジメチルアミン、トリメチルアミン等)、メチル化チオール、メチルハロゲン(例えば、ブロモメタン、クロロメタン、ヨードメタン、ジクロロメタン等)およびシアン化物を含む。
本明細書中で使用する場合、「C1代謝微生物」または「C1代謝非光合成微生物」は、エネルギーの供給源またはその主要なエネルギーの供給源またはその唯一のエネルギーおよびバイオマスの供給源としてC1基質を使用する能力を有するいずれかの微生物を指し、エネルギーおよびバイオマスのために他の炭素基質(糖および複合糖質等)を使用してもしなくてもよい。例えば、C1代謝微生物は、メタン、天然ガスまたはメタノール等、C1基質を酸化することができる。C1代謝微生物は、細菌(メタン資化性菌およびメチロトローフ等)を含む。ある特定の実施形態では、C1代謝微生物は、藻類等、光合成微生物を含まない。ある特定の実施形態では、C1代謝微生物は、その主要なエネルギー供給源がC1基質であることを意味する「偏性C1代謝微生物」である。さらなる実施形態では、C1代謝微生物(例えば、メタン資化性菌)は、C1基質原料の存在下で(すなわち、主要なまたは唯一のエネルギー供給源としてC1基質を使用して)培養される。
本明細書中で使用する場合、用語「メチロトローフ」または「メチロトローフ細菌」は、炭素−炭素結合を含有しない有機化合物を酸化することができるいずれかの細菌を指す。ある特定の実施形態では、メチロトローフ細菌は、メタン資化性菌であり得る。例えば、「メタン資化性細菌」は、その主要な炭素およびエネルギーの供給源としてメタンを酸化する能力を有するいずれかのメチロトローフ細菌を指す。例示的なメタン資化性細菌は、Methylomonas、Methylobacter、Methylococcus、Methylosinus、Methylocystis、MethylomicrobiumまたはMethanomonasを含む。ある特定の他の実施形態では、メチロトローフ細菌は、エネルギーの生成のためにC1基質の使用に限定される細菌を指す「偏性メチロトローフ細菌」である。
本明細書中で使用する場合、用語「CO利用細菌」は、炭素およびエネルギーの供給源として一酸化炭素(CO)を酸化する能力を天然に保有する細菌を指す。一酸化炭素は、石炭、石炭油(coal oil)、天然ガス、バイオマスおよび廃棄有機物等、いずれかの有機原料のガス化法によって産生される一酸化炭素および水素の混合物である「合成ガス」または「シンガス」から利用することができる。CO利用細菌は、その炭素源としてCOを用いた成長のために遺伝子改変しなければならない細菌を含まない。
本明細書中で使用する場合、「天然ガス」は、多孔質貯留層において生成された、従来プロセス(例えば、掘削)によって入手することができる、主にメタンで構成されているが、二酸化炭素、窒素または硫化水素等、他の構成成分を有していてもよい天然起源のガス混合物を指す。
本明細書中で使用する場合、「非従来型天然ガス」は、水圧破砕、水平掘削または傾斜掘削等、非従来方法によって入手する必要がある、低い透過性を有する地層において生成された天然起源のガス混合物を指す。例示的な非従来型天然ガス鉱床として、砂岩または炭酸塩に形成されるタイトガスサンド(tight gas sand)、石炭鉱床に形成され石炭粒子に吸着される炭層メタン、細粒頁岩に形成され粘土粒子に吸着されるまたは小孔もしくは微細穴(microfracture)内に保持されるシェールガス、海洋および永久凍土下などの場所において低温高圧で形成される天然ガスおよび水の結晶性組合せであるメタンハイドレートが挙げられる。
本明細書中で使用する場合、「シンガス」は、一酸化炭素(CO)および水素(H2)の混合物を指す。シンガスは、COおよびH2と比べてより少量のCO2、メタンおよび他のガスを含むこともできる。
本明細書中で使用する場合、「メタン」は、化学式CH4を有する最も単純なアルカン化合物を指す。メタンは、室温および室内の圧力で無色および無臭のガスである。メタンの供給源は、天然ガス田等の天然源、「非従来型天然ガス」供給源(含有量が、供給源に応じて変動する、シェールガスまたは炭層メタン等)ならびに例えば、メタン生成微生物および産業的または研究室合成によって合成される生物学的供給源を含む。メタンは、95〜98%パーセントメタンである「パイプライン品質の天然ガス」または「乾性天然ガス」等、実質的に精製された組成物である純粋メタンと、他の炭化水素が未だ除去されていない、メタンが組成の60%超を構成する「湿性天然ガス」等、非精製組成物とを含む。
本明細書中で使用する場合、ポリヌクレオチドとしても公知の「核酸分子」は、共有結合により連結されたヌクレオチドと呼ばれるサブユニットで構成されたポリマー化合物を指す。核酸分子は、両者共に一本鎖であっても二本鎖であってもよい、ポリリボ核酸(RNA)、ポリデオキシリボ核酸(DNA)を含む。DNAは、cDNA、ゲノムDNA、合成DNA、半合成DNAなどを含む。
本明細書中で使用する場合、「形質転換」は、宿主への核酸分子(例えば、外因性または異種核酸分子)の移入を指す。形質転換された宿主は、外因性または異種核酸分子を染色体外に保有し得るか、あるいは核酸分子は、染色体中に組み込まれていてよい。宿主ゲノムおよび自己複製ベクターへの組み込みは、一般に、形質転換された核酸分子の遺伝的に安定的な継承をもたらす。形質転換された核酸を含有する宿主細胞は、「組換え」または「非天然起源の」または「遺伝子操作された」または「形質転換された」または「トランスジェニック」細胞(例えば、細菌)と称される。
本明細書中で使用する場合、用語「内因性」または「未変性(native)」は、宿主細胞において正常に存在する遺伝子、タンパク質、化合物または活性を指す。
本明細書中で使用する場合、「異種」核酸分子、構築物または配列は、宿主細胞に対し未変性ではない、または同様の条件での未変性発現レベルと比較して変更された発現を有する核酸分子である、核酸分子または核酸分子配列の部分を指す。例えば、異種制御配列(例えば、プロモーター、エンハンサー)を使用して、未変性遺伝子または核酸分子が、天然にまたは培養で正常に発現される方法とは異なる方法で、未変性遺伝子または核酸分子の発現を調節することができる。ある特定の実施形態では、異種核酸分子は、宿主細胞または宿主ゲノムに対して内因性でなくてもよいが、代わりに、接合、形質転換、トランスフェクション、エレクトロポレーションなどによって宿主細胞に付加されていてよく、付加された分子は、宿主ゲノムに組み込まれていても、染色体外遺伝子材料として(例えば、プラスミドまたは他の自己複製ベクターとして)存在してもよい。加えて、「異種」は、宿主細胞に見出されるものとは異なるもしくは変更された、または宿主細胞に対して未変性ではないが、代わりに宿主細胞に導入された核酸分子によってコードされた、酵素、タンパク質または他の活性を指すことができる。用語「相同」または「ホモログ」は、宿主細胞、種または株に見出されるまたは由来する分子または活性を指す。例えば、異種核酸分子は、未変性宿主細胞遺伝子に対し相同であり得るが、変更された発現レベルを有するかもしくは異なる配列を有するかまたはその両方を有することができる。
ある特定の実施形態では、2種以上の異種核酸分子は、別々の核酸分子として、ポリシストロニック核酸分子として、融合タンパク質をコードする単一の核酸分子として、またはこれらのいずれかの組合せとして宿主細胞に導入することができ、これらは依然として、2種以上の異種核酸として考慮され得る。例えば、本明細書に開示されている通り、C1代謝微生物は、所望の極長鎖脂肪酸伸長経路構成成分(例えば、β−ケトアシル−CoAシンターゼ、β−ケトアシル−CoAレダクターゼ、β−ヒドロキシアシル−CoAデヒドラターゼおよびエノイル−CoAレダクターゼ)をコードする2種またはそれを超える異種または外因性核酸分子を発現するように改変することができる。極長鎖脂肪酸伸長経路構成成分をコードする2種またはそれを超える外因性核酸分子が、宿主C1代謝微生物に導入されるときに、この2種またはそれを超える(the two more)外因性核酸分子が、例えば、単一の核酸分子として単一のベクターに、別々のベクターに導入されてよく、宿主染色体の単一の部位または複数の部位に組み込まれてよく、これらは依然として、2種またはそれを超える外因性核酸分子とみなされ得ることが理解される。よって、参照される異種核酸分子またはタンパク質活性の数は、宿主細胞に導入された別々の核酸分子の数ではなく、コード核酸分子の数またはタンパク質活性の数を指す。
用語「キメラ」は、内因性ではなく、天然では普通一緒に接続または連結しているとは見出されていない、一緒に接続または連結された配列を含む、いずれかの核酸分子またはタンパク質を指す。例えば、キメラ核酸分子は、異なる供給源に由来する調節配列およびコード配列、または同じ供給源に由来するが、天然に見出されるものとは異なる様式で配置された調節配列およびコード配列を含むことができる。
2種またはそれを超える核酸配列の間の「パーセント同一性」は、2種またはそれを超える配列のアライメントを最適化するために導入される必要のあるギャップの数および各ギャップの長さを考慮に入れた、配列によって共有される同一位置の数の関数である(すなわち、%同一性=同一位置の数/位置の総数×100)。2種またはそれを超える配列の間の配列の比較およびパーセント同一性の決定は、デフォルトパラメーターのBLASTおよびGapped BLASTプログラム等、数学的アルゴリズムを使用して達成することができる(例えば、Altschulら、J. Mol. Biol.215巻:403頁、1990年;www.ncbi.nlm.nih.gov/BLASTのBLASTNも参照されたい)。
「保存的置換」は、あるアミノ酸の、同様の特性を有する別のアミノ酸に代えての置換として当該分野において認識される。例示的な保存的置換は、当該分野で周知である(例えば、WO97/09433、10頁、1997年3月13日に公開;Lehninger、Biochemistry、第2版;Worth Publishers, Inc. NY:NY(1975年)、71〜77頁;Lewin、Genes IV、Oxford University Press、NYおよびCell Press、Cambridge、MA(1990年)、8頁を参照)。
「阻害する」または「阻害される」は、本明細書中で使用する場合、コントロール、内因性または基準の分子と比較した、標的遺伝子の発現または標的分子(例えば、チオエステラーゼ、アシル−CoAシンテターゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ)の活性の直接的または間接的な変更、減少、下方制御または抑止を指し、ここで変更、減少、下方制御または抑止は、統計的、生物学的、産業的にまたは臨床的に有意である。
本明細書中で使用する場合、用語「誘導体」は、酵素によるまたはよらない、化学的または生物学的手段による化合物の改変を指し、この改変された化合物は、親化合物と構造的に同様であり、(実際にまたは理論上)この親化合物から誘導できる。誘導体は、親化合物と比較してより親水性であるまたは変更された反応性を有する等、親化合物と異なる化学的、生物学的または物理的特性を有することができる。誘導体化(すなわち、改変)は、分子内の1個または複数の部分の置換(例えば、官能基の変化)をもたらすことができる。例えば、水素は、フッ素または塩素等、ハロゲンで置換することができる、あるいはヒドロキシル基(−OH)は、カルボン酸部分(−COOH)で置き換えることができる。他の例示的な誘導体化は、グリコシル化、アルキル化、アシル化、アセチル化、ユビキチン化(ubiqutination)、エステル化およびアミド化を含む。本明細書中で使用する場合、「脂肪酸誘導体」は、例えば、脂肪アシルキャリアータンパク質、活性化脂肪酸(例えば、アシルまたはCoA含有)、脂肪アルデヒド、脂肪アルコール、脂肪エステルワックス、ヒドロキシ脂肪酸、ジカルボン酸、分枝状脂肪酸など、細胞に見出される脂肪酸生合成経路の中間体および生成物を含む。本明細書中で使用する場合、「極長鎖脂肪酸誘導体」は、例えば、極長鎖脂肪酸(例えば、アシルまたはCoA含有)、極長鎖脂肪アルデヒド、極長鎖脂肪アルコール、極長鎖脂肪エステルワックス、極長鎖アルカン、極長鎖ケトンなど、極長鎖脂肪酸伸長経路、アルカン生成経路およびアルコール生成経路の極長鎖炭素化合物中間体および生成物を含む。
用語「誘導体」は、親化合物のあらゆる溶媒和物、例えば、水和物または付加物(例えば、アルコールによる付加物)、活性代謝物および塩も指す。調製することができる塩の種類は、化合物内の部分の性質に依存する。例えば、カルボン酸基等、酸性基は、アルカリ金属塩またはアルカリ土類金属塩(例えば、ナトリウム塩、カリウム塩、マグネシウム塩およびカルシウム塩および、さらに、生理的に容認できる四級アンモニウムイオンによる塩ならびにアンモニアおよび例えば、トリエチルアミン、エタノールアミンまたはtris−(2−ヒドロキシエチル)アミン等の生理的に容認できる有機アミンによる酸付加塩)を生成することができる。塩基性基は、例えば、塩酸、硫酸もしくはリン酸等、無機酸によりまたは酢酸、クエン酸、乳酸、安息香酸、マレイン酸、フマル酸、酒石酸、メタンスルホン酸もしくはp−トルエンスルホン酸等、有機カルボン酸およびスルホン酸により酸付加塩を生成することができる。塩基性基および酸性基、例えば、塩基性窒素原子に加えてカルボキシル基を同時に含有する化合物は、双性イオンとして提示することができる。塩は、当業者に公知の慣習的な方法によって、例えば、溶媒または希釈液において無機もしくは有機酸または無機もしくは有機塩基と化合物を組み合わせることにより、またはカチオン交換もしくはアニオン交換により他の塩から得ることができる。
極長炭素鎖化合物を作製するための組成物および方法
本明細書に記載されている通り、極長炭素鎖化合物生合成は、1または複数サイクルによる、脂肪酸エロンガーゼ(β−ケトアシル−CoAシンターゼ、β−ケトアシル−CoAレダクターゼ、β−ヒドロキシアシル−CoAデヒドラターゼおよびエノイル−CoAレダクターゼのうち1種または複数種)による脂肪酸基質(例えば、C8〜C24脂肪アシル−CoA)の伸長をもたらす(図1を参照)。所望の長さまで伸長されたら、極長鎖脂肪酸はその後、極長鎖脂肪アルデヒド、極長鎖アルカン、極長鎖脂肪二級アルコールもしくは極長鎖ケトンを生じるアルカン生成(脱カルボニル)経路(図4を参照)、または極長鎖脂肪アルデヒド、極長鎖脂肪一級アルコールもしくは極長鎖脂肪ワックスエステルを生じるアルコール生成(アシル還元)経路(図2〜図3を参照)のいずれかにより改変することができる。極長鎖脂肪酸への伸長のための脂肪酸基質は、宿主C1代謝非光合成微生物において天然に合成することができる。あるいは、宿主C1代謝非光合成微生物は、極長鎖脂肪酸への伸長のための脂肪酸基質を産生するように、または内因性産生を増強するように生物工学的に作製する(bioengineered)ことができる。
本明細書に記載されている通り、極長炭素鎖化合物生合成は、1または複数サイクルによる、脂肪酸エロンガーゼ(β−ケトアシル−CoAシンターゼ、β−ケトアシル−CoAレダクターゼ、β−ヒドロキシアシル−CoAデヒドラターゼおよびエノイル−CoAレダクターゼのうち1種または複数種)による脂肪酸基質(例えば、C8〜C24脂肪アシル−CoA)の伸長をもたらす(図1を参照)。所望の長さまで伸長されたら、極長鎖脂肪酸はその後、極長鎖脂肪アルデヒド、極長鎖アルカン、極長鎖脂肪二級アルコールもしくは極長鎖ケトンを生じるアルカン生成(脱カルボニル)経路(図4を参照)、または極長鎖脂肪アルデヒド、極長鎖脂肪一級アルコールもしくは極長鎖脂肪ワックスエステルを生じるアルコール生成(アシル還元)経路(図2〜図3を参照)のいずれかにより改変することができる。極長鎖脂肪酸への伸長のための脂肪酸基質は、宿主C1代謝非光合成微生物において天然に合成することができる。あるいは、宿主C1代謝非光合成微生物は、極長鎖脂肪酸への伸長のための脂肪酸基質を産生するように、または内因性産生を増強するように生物工学的に作製する(bioengineered)ことができる。
極長炭素鎖化合物の産生に使用されるC1代謝微生物は、目的のポリペプチドを発現または過剰発現する核酸配列を含むように組換えにより改変することができる。例えば、C1代謝微生物は、アシル−CoAの産生を増加させる、アシル−CoA等、脂肪酸生合成経路における脂肪酸誘導体および中間体の異化反応を低下させる、または脂肪酸生合成経路における特異的な個所でのフィードバック阻害を低下させるように改変することができる。本明細書に記載されている遺伝子の改変に加えて、追加的な細胞資源を転用して脂肪酸を過剰産生させることができ、例えば、乳酸経路、コハク酸経路または酢酸経路を減弱させ、アセチル−CoAカルボキシラーゼ(acc)を過剰発現させることができる。本明細書に記載されているC1代謝微生物に対する改変は、ゲノム変更、組換え発現系の付加またはこれらの組合せによって為すことができる。
極長炭素鎖化合物生合成経路は、図1〜図4に図解されている。経路における異なるステップは、異なる酵素によって触媒され、各ステップは、より多くの酵素を産生するための遺伝子の過剰発現のための潜在的な場であり、よって、より多くの極長炭素鎖化合物の産生を駆動する。経路に必要とされる酵素をコードする核酸分子は、かかる酵素を欠くC1代謝微生物に組換えにより付加することもできる。最後に、所望の生成物の産生を増加させるために、極長炭素鎖化合物の産生をもたらす経路と競合するステップを減弱または遮断することができる。
一態様では、(a)C1基質原料と共に非天然C1代謝非光合成微生物を培養することを含む、極長炭素鎖化合物を作製するための方法であって、該C1代謝非光合成微生物が、次の酵素:(i)β−ケトアシル−CoAシンターゼ、(ii)β−ケトアシル−CoAレダクターゼ、(iii)β−ヒドロキシアシル−CoAデヒドラターゼおよび(iv)エノイル−CoAレダクターゼをコードする1種または複数種の組換え核酸分子を含み、該C1代謝非光合成微生物が、該C1基質を極長炭素鎖化合物に変換する、方法が本明細書に提供される。ある特定の実施形態では、C1代謝非光合成微生物は、次の酵素:(i)β−ケトアシル−CoAシンターゼ、(ii)β−ケトアシル−CoAレダクターゼ、(iii)β−ヒドロキシアシル−CoAデヒドラターゼおよび(iv)エノイル−CoAレダクターゼをコードする2種またはそれを超える組換え核酸分子を含む。ある特定の実施形態では、C1代謝非光合成微生物は、次の酵素:(i)β−ケトアシル−CoAシンターゼ、(ii)β−ケトアシル−CoAレダクターゼ、(iii)β−ヒドロキシアシル−CoAデヒドラターゼおよび(iv)エノイル−CoAレダクターゼをコードする3種またはそれを超える組換え核酸分子を含む。ある特定の実施形態では、C1代謝非光合成微生物は、次の酵素:(i)β−ケトアシル−CoAシンターゼ、(ii)β−ケトアシル−CoAレダクターゼ、(iii)β−ヒドロキシアシル−CoAデヒドラターゼおよび(iv)エノイル−CoAレダクターゼの全てをコードする組換え核酸分子を含む。ある特定の実施形態では、極長炭素鎖化合物は、極長脂肪アシル−CoAである。
脂肪酸エロンガーゼは、マロニル−CoAから供与されたC2部分をアシル−CoA基質に付加して、極長鎖脂肪酸を産生する、4個の別個の酵素で構成されたヘテロ四量体複合体である。各FAE触媒性脂肪酸伸長サイクルは、一緒にアシル−CoA基質鎖を2炭素鎖単位づつ伸長する、それぞれβ−ケトアシル−CoAシンターゼ、β−ケトアシル−CoAレダクターゼ、β−ヒドロキシアシル−CoAデヒドラターゼおよびエノイル−CoAレダクターゼによって触媒される4種の連続した酵素反応(縮合、還元、脱水および還元)からなる。この伸長サイクルは、Samuelsら(Annu. Rev. Plant Biol.59巻:683〜707頁、2008年)およびKiharaら(J. Biochem.152巻:387〜395頁、2012年)によって記載されている。
β−ケトアシル−CoAシンターゼ(KCS)は、脂肪酸伸長過程の律速酵素である。KCSは、アシル−CoAとマロニル−CoAの縮合を触媒して、3−ケトアシル−CoAとしても公知のβ−ケトアシル−CoAを産生する。極長鎖脂肪酸伸長サイクルのアシル鎖長基質特異性は、KCSによって決定されると考えられる。単一のKCSは、数回の連続した伸長サイクルにおいて縮合を触媒することができる。様々なKCSは、重複する範囲のアシル−CoA基質鎖長を有することができる。例えば、Arabidopsis KCS2/DAISY(Genbank受託識別子NM_100303.3)およびKCS20(Genbank受託識別子NM_123743.3)は、C20〜C22極長鎖脂肪酸の伸長に関与する(Leeら、2009年、Plant J.60巻:462〜75頁)。Arabidopsis KCS9(Genbank受託識別子NM_127184.2)は、C22〜C24極長鎖脂肪酸の伸長に関与する(Kimら、2013年、Plant Phsyiol.162巻:567〜80頁)。Arabidopsis KCS1(At1g01120)(Genbank受託識別子AF053345.1)は、飽和およびモノ不飽和C16〜C24アシル−CoAに対し幅広い基質特異性を有する(BlacklockおよびJawaorski、2006年、Biochem. Biophys. Res. Commun.346巻:583〜90頁)。哺乳動物は、7種のKCS遺伝子(ELOVL1〜7)を有し、それぞれ、特徴的な基質特異性を有する(Guillouら、2010年、Prog. Lipid Res.49巻:186〜199頁;Ohnoら、2010年、Proc. Nat’l. Acad. Sci. USA 107巻:18439〜18444頁)。ELOVL6は、C16:0−CoAまたはより短い、飽和アシル−CoAを伸長する。ELOVL3およびELOVL7は、飽和および不飽和C16〜C22アシル−CoAの両方を伸長する。ELOVL2およびELOVL5は、ポリ不飽和脂肪酸に対し厳密な特異性を有し、それぞれC22−アシル−CoAおよびC18−CoAを伸長することができ、両者共に、C20−アシル−CoAに対し重複する特異性を有する。ELOVL1は、飽和C18:0〜C26:0ならびにモノ不飽和C20:1n−9およびC22:1n−9アシル−CoAを伸長する。Arabidopsis CER6(Genbank受託識別子NM_179530.1)は、脂肪アシル−CoA>C22に対し特異性を有する。Saccharomyces cerevisiae ELO1(Genbank受託識別子NM_001181629)は、14:0〜16:0脂肪酸を伸長することができる(Toke、1996年、J. Biol. Chem.271巻:18413〜18422頁)。Saccharomyces cerevisiae ELO2(Genbank受託識別子NM_001178748.1)は、最大24個の炭素の脂肪酸を伸長することができ、ELO3(Genbank受託識別子NM_001182261.3)は、より幅広い基質特異性を有し、C24〜C26種の伸長に必須である(Ohら、1997年、J. Biol. Chem.272巻:17376〜84頁)。他のKCS遺伝子のGenbank受託識別子は、例えば、EU001741.1(Gossypium hirsutum)、EU001741.1(Gossypium hirsutum)、EU616538.1(Solanum tuberosum)、NM_001124636.1(Oncorhynchus mykiss)、JX436487.1(Physcomitrella patens)を含む。ある特定の実施形態では、KCS遺伝子は、CER6、Elo1、Fen1/Elo2、Sur4/Elo3、KCS1、KCS2、KCS11、KCS20、KCS9、ELOVL1、ELOVL2、ELOVL3、ELOVL4、ELOVL5、ELOVL6、ELOVL7またはFDHである。
3−ケトアシル−CoAレダクターゼとしても公知のβ−ケトアシル−CoAレダクターゼ(KCR)は、β−ケトアシル−CoAを還元して、3−ヒドロキシアシル−CoAとしても公知のβ−ヒドロキシアシル−CoAとする。ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸(NADPH)は、この反応における還元剤として使用される。KCRは、基質鎖長に対し幅広い適合性を有すると考えられる。KCR遺伝子は、例えば、Saccharomyces cerevisiae YBR159w(Beaudoinら、J. Biol. Chem.、2002年、277巻:11481〜8頁)、Arabidopsis AtKCR1(At1g67730)(Beaudoinら、2009年、Plant Physiol.150巻:1174〜1191頁)、Zea mays L.GL8AおよびGL8B(Dietrichら、2005年、Plant J.42巻:844〜61頁)、Arabidopsis CER10(Zhangら、2005年、Plant Cell 17巻:1467〜1481頁)およびAYR1を含む。ある特定の実施形態では、KCR遺伝子は、CER10、KAR、GL8A、GL8B、Ybr159w、AYR1またはAt1g67730である。
3−ヒドロキシアシル−CoAデヒドラターゼとしても公知のβ−ヒドロキシアシル−CoAデヒドラターゼ(HCD)は、β−ヒドロキシアシル−CoAを脱水して、2,3−トランス−エノイル−CoAとしても公知のトランス−エノイル−CoAとする。HCDは、基質鎖長に対し幅広い適合性を有すると考えられる。HCD遺伝子は、例えば、Arabidopsis PAS2(Genbank受託識別子NM_001203348.1)(Bachら、2008年、Proc. Natl. Acad. Sci.105巻:14727〜14731頁)、Saccharomyces cerevisiae PHS1(Genbank受託識別子NM_001181530.1)ならびに哺乳動物アイソザイムHACD1(Genbank受託識別子NM_014241.3、Homo sapiens)、HACD2(Genbank受託識別子NM_198402.3、Homo sapiens)、HACD3(Genbank受託識別子NM_016395.2、Homo sapiens)およびHACD4(Genbank受託識別子NM_001010915.3、Homo sapiens)を含む。ある特定の実施形態では、HCD遺伝子は、PHS1、PAS2、HACD1、HACD2、HACD3、HACD4またはPAS2−1である。
2,3−トランス−エノイル−CoAレダクターゼとしても公知のエノイル−CoAレダクターゼ(ECR)は、トランス−エノイル−CoAを還元して、本来の脂肪アシル−CoA基質よりも2個の追加的な炭素鎖単位を有する脂肪アシル−CoAを生成する。NADPHは、この反応において還元剤として使用される。ECRは、基質鎖長に対し幅広い適合性を有すると考えられる。ECR遺伝子は、例えば、Arabidopsis CER10(Genbank受託識別子NM_115394.3)、Homo sapiens TER(Genbank受託識別子NM_138501.5)、Saccharomyces cerevisiae TSC13(Genbank受託識別子NM_01180074.1)、Gossypium hirsutum GhECR1(Genbank受託識別子EU001742.1)、Gossypium hirsutum GhECR2(Genbank受託識別子EU001743.1)を含む。ある特定の実施形態では、ECRは、CER10、TER、TSC13またはGhECR1、GhECR2である。
本開示において有用な、Nannochloropsis oculata由来の例示的なKCS、KCR、HCDおよびECR遺伝子は、PCT公開WO2012/052468にも提示されている。
適切な長さの飽和脂肪酸が作製されるまで、伸長サイクルは反復される。極長鎖脂肪アシル−CoAの奇数鎖長は、α−ヒドロキシラーゼ酵素によるアルファ炭素のヒドロキシル化および偶数鎖長極長鎖脂肪アシル−CoA基質の脱炭酸(decarboyxlation)をもたらすα−酸化によって生成され得る。
特定の炭素鎖長(複数可)の極長炭素鎖化合物の均質なまたは混合型集団の産生のためにC1代謝微生物を操作するために、選択されたアシル鎖長特異性を有する1種または複数種のKCS酵素をC1代謝微生物において発現させることができる。その上、望ましくない長さの極長鎖脂肪酸を産生する1種または複数種の内因性遺伝子は、減弱、阻害または機能的に欠失させることができる。
伸長サイクルのための最初の脂肪アシル−CoA基質は、C1代謝微生物における内因性脂肪酸産生に由来し得る。関与する脂肪アシル−CoA経路および酵素を図5に示す。ある特定の実施形態では、伸長サイクルのための最初の脂肪アシル−CoA基質は、約8〜24個の炭素原子、約14〜24個の炭素原子、約10〜20個の炭素原子、約12〜18個の炭素原子または約16〜18個の炭素原子の炭素鎖を有する脂肪アシルco−Aである。
ある特定の実施形態では、C1代謝非光合成微生物は、極長鎖脂肪アルコールを生成することができる脂肪アルコール生成アシル−CoAレダクターゼ(FAR)をコードする核酸分子をさらに含み、この場合の極長炭素鎖化合物は、極長鎖脂肪一級アルコールである。極長鎖脂肪アシル−CoAの改変のための一経路は、アルコール生成経路(アシル還元)である。極長鎖脂肪酸からその相当する極長鎖脂肪一級アルコールへの還元は、極長鎖脂肪アルデヒド中間体を経由し、反応ステップ毎の還元剤としてNADPHを使用する。FAR酵素は、遊離アルデヒドを放出することなく、両方の反応を触媒することができる。FAR遺伝子は、例えば、Arabidopsis CER4(Genbank受託識別子NM_119538.6)およびMaqu_2220(Genbank受託識別子YP_959486.1)を含む。極長鎖脂肪アシル−CoAを改変するためのアルコール生成経路は、Samuelsら、2008年、Annu Rev. Plant Biol.59巻:683〜707頁に記載されている。
あるいは、極長鎖アシル−CoAからその相当する極長鎖脂肪一級アルコールへの還元は、2種の独立した酵素によって触媒することができる。ある特定の実施形態では、C1代謝非光合成微生物は、極長鎖脂肪アルデヒドを生成することができる脂肪アシル−CoAレダクターゼと、極長鎖脂肪アルコールを生成することができるアルデヒドレダクターゼとをコードする核酸分子をさらに含み、この場合の極長炭素鎖化合物は、極長鎖脂肪一級アルコールである。脂肪アシル−CoAレダクターゼ遺伝子は、例えば、Acinetobacter baylyi ACR1(U77680.1)、Synechococcus elongatus ACR(Linら、2013年、FEBS J.280巻:4773〜81頁)およびArabidopsis CER3(Genbank受託識別子NM_125164.2)を含む。アルデヒドレダクターゼまたはNADPH依存性アルコールデヒドロゲナーゼ(例えば、YqhD)により、極長鎖脂肪アルデヒドを還元して、脂肪アルコールとすることができる。アルデヒドレダクターゼ遺伝子は、例えば、YqhDを含む。
ある特定の実施形態では、C1代謝非光合成微生物は、極長鎖脂肪アルデヒドを生成することができる脂肪アシル−CoAレダクターゼをコードする核酸分子(複数可)をさらに含み、この場合の極長炭素鎖化合物は、極長鎖脂肪アルデヒドである。脂肪アシル−CoAレダクターゼ遺伝子は、例えば、ACR1、ACRおよびArabidopsis CER3(Genbank受託識別子NM_125164.2)を含む。
ある特定の実施形態では、C1代謝非光合成微生物は、極長鎖脂肪アルコールを生成することができる脂肪アルコール生成アシル−CoAレダクターゼと、極長鎖脂肪エステルワックスを生成することができるエステルシンターゼとをコードする核酸分子を含み、この場合の極長炭素鎖化合物は、極長鎖脂肪エステルワックスである。本明細書に詳細に記載されている通り、脂肪一級アルコール(少なくともC25)は、本明細書に詳細に記載されている通り、エステルシンターゼによって脂肪アシル−CoA(≦C24)とエステル結合によりコンジュゲートして、極長鎖脂肪エステルワックス(>C24)を生成することもできる。他の実施形態では、極長鎖脂肪エステルワックスは、エステルシンターゼ酵素により、極長鎖脂肪一級アルコールを脂肪アシル−CoAと、脂肪一級アルコールを極長鎖脂肪アシル−CoAと、または極長鎖脂肪一級アルコールを極長鎖脂肪アシル−CoAとコンジュゲートすることにより生成することができる。例示的なエステルシンターゼ遺伝子は、例えば、Arabidopsis WSD1(Liら、2008年、Plant Phsyiol.148巻:97〜107頁;Genbank受託識別子NM_123089.2)を含む。
極長鎖脂肪エステルワックスは、ワックスの主要な構成成分である。種々の天然および合成ワックスは、産業的に重要である。一部の実施形態では、C1代謝微生物は、天然または合成ワックスの極長鎖脂肪エステルワックス構成成分を産生するように改変される。天然ワックスの例として、蜜ろう、鯨ろう、ホホバ、カルナウバ、虫白蝋(Chinese wax)(昆虫ワックス)、カンデリラろうおよび米糠油が挙げられる。蜜ろうの主な構成成分は、極長鎖(C30〜C32)脂肪族アルコールのパルミチン酸エステル、パルミトレイン酸エステルおよびオレイン酸エステルである。マッコウクジラ油は、パルミチン酸セチル(C32)およびミリスチン酸セチル(C30)の脂肪ワックスエステル(65〜95%)を主に含有する。ホホバ種子油は、C38〜C44極長鎖脂肪エステルワックスを生成する、20:1、22:1および24:1脂肪アルコールに連結された18:1、20:1および22:1脂肪酸から主になる。カルナウバワックスは、C46〜C54ワックスエステルを生成する、C30〜C34アルコールに連結されたC16〜C20脂肪酸を構成する極長鎖脂肪ワックスエステルで主に構成される。Coccu ceriferusによって分泌される中国の昆虫ワックスの主要構成成分は、46〜最大60個の炭素原子を有する鎖から生成されるワックスエステルであり、大部分のアルコールおよび酸は、26または28個の炭素原子を有する。カンデリラろうは、偶数の炭素鎖(C28〜C34)を有する酸およびアルコールのエステルと共に、奇数の飽和炭化水素(C29〜C33)から主になる。米糠油は、極長鎖脂肪酸(C26〜C30)および極長鎖アルコール(C26〜C30)のエステルを含有する。
極長鎖脂肪アシル−CoAの改変のための第2の経路は、アルカン生成(脱カルボニル)経路である。ある特定の実施形態では、C1代謝非光合成微生物は、極長鎖脂肪アルデヒドを生成することができる脂肪アシル−CoAレダクターゼと、極長鎖アルカンを生成することができるアルデヒドデカルボニラーゼとをコードする核酸分子(複数可)を含み、この場合の極長炭素鎖化合物は、極長鎖アルカンである。第1のステップは、アシル−CoAレダクターゼによる極長鎖脂肪アシル−CoAからその相当する極長鎖脂肪アルデヒドへの還元である。アルデヒドデカルボニラーゼによるカルボニル基の除去は、その極長鎖脂肪アシル−CoA前駆体よりも1個少ない炭素原子を有する極長鎖アルカンを生成する。アルカン生成(脱カルボニル)経路は、Samuelsら、2008年、Annu Rev. Plant Biol.59巻:683〜707頁に記載されている。脂肪アシル−CoAレダクターゼ遺伝子は、例えば、ACR1およびArabidopsis thaliana CER3(Genbank受託識別子NM_125164.2)を含む。アルデヒドデカルボニラーゼ遺伝子は、例えば、Arabidopsis thaliana CER1(Genbank受託識別子D64155.1)およびArabidopsis CER22を含む。
アルカンヒドロキシラーゼによる極長鎖アルカンのさらなる改変は、ヒドロキシル基を鎖中央に挿入して、極長鎖脂肪二級アルコールを生成する。ヒドロキシル基置換の位置は、ヒドロキシラーゼの特異性に依存する。ヒドロキシラーゼ遺伝子は、例えば、Arabidopsis thaliana MAH1(CYP96A15)(Greerら、2007年、Plant Physiol.145巻:653〜667頁;Genbank受託識別子NM_001124037.1)を含む。
アルコールデヒドロゲナーゼによって触媒される極長鎖脂肪二級アルコールの第2の酸化反応は、極長鎖ケトンを生成する。ある特定の実施形態では、C1代謝非光合成微生物は、極長鎖脂肪アルデヒドを生成することができる脂肪アシル−CoAレダクターゼと、極長鎖アルカンを生成することができるアルデヒドデカルボニラーゼと、極長鎖脂肪二級アルコールを生成することができるアルカンヒドロキシラーゼと、極長鎖ケトンを生成することができるアルコールデヒドロゲナーゼとをコードする核酸分子(複数可)を含み、この場合の極長炭素鎖化合物は、極長鎖ケトンである。MAH1(Genbank受託識別子NM_001124037.1)も、この第2の酸化反応を行うことができる。
24炭素単位またはそれに満たない脂肪アシル−CoA基質および脂肪酸誘導体を生成するための本明細書に記載されている酵素(例えば、アシル−CoAレダクターゼ、脂肪アルコール生成アシル−CoAレダクターゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ)を使用して、極長鎖脂肪アシル−CoAをその誘導体にさらに改変することもできる。
ある特定の実施形態では、極長炭素鎖化合物は、約C25〜C30、C31〜C40、C41〜C60、C61〜C80、C81〜C100、C101〜C120、C121〜C140、C141〜C160、C161〜C180またはC181〜C200の炭素鎖長を有する。代替的な実施形態では、極長炭素鎖化合物は、C25〜C40、C25〜C50、C25〜C75、C25〜C100、C25〜C125、C25〜C150、C25〜C175またはC25〜C200極長炭素鎖化合物である。
極長鎖脂肪アシル−CoAを産生する伸長反応のための脂肪アシル−CoA基質は、C1代謝微生物によって内因性に産生することができる。あるいは、C1代謝微生物は、伸長のための脂肪アシル−CoA基質を合成するように生物工学的に作製することができる。関与する脂肪酸生合成経路は、図5〜図10に図解されている。経路における異なるステップは、異なる酵素によって触媒され、各ステップは、より多くの酵素を産生する遺伝子の過剰発現のための潜在的な場であり、よって、より多くの脂肪酸および脂肪酸誘導体の産生を駆動する。経路に必要とされる酵素をコードする核酸分子は、かかる酵素を欠くC1代謝微生物に組換えにより付加することもできる。最後に、所望の生成物の産生を増加させるために、脂肪酸および脂肪酸誘導体の産生をもたらす経路と競合するステップは、減弱または遮断することができる。
脂肪酸シンターゼ(FAS)は、アシル鎖の開始および伸長を触媒する酵素の群である(Marrakchiら、Biochemical Society 30巻:1050頁、2002年)。アシルキャリアータンパク質(ACP)は、FAS経路において、この酵素と共に、産生される脂肪酸の長さ、飽和の程度および分枝を制御する。この経路におけるステップは、脂肪酸生合成(fab)およびアセチル−CoAカルボキシラーゼ(acc)遺伝子ファミリーの酵素によって触媒される。所望の生成物に依存して、これらの遺伝子のうち1種または複数種は、減弱、発現または過剰発現させることができる(各酵素の酵素活性およびその酵素分類番号の描写に関して図5〜図10を参照)。
産生宿主における脂肪酸生合成経路は、前駆体アセチル−CoAおよびマロニル−CoAを使用する(例えば、図5を参照)。この経路におけるステップは、脂肪酸生合成(fab)およびアセチル−CoAカルボキシラーゼ(acc)遺伝子ファミリーの酵素によって触媒される。この経路は、Heathら、Prog. Lipid Res.40巻:467頁、2001年に記載されている。
アセチル−CoAは、アセチル−CoAカルボキシラーゼ(Acc、4種の別々の遺伝子、accABCDによってコードされるマルチサブユニット酵素)によってカルボキシル化されて、マロニル−CoAを生成する。マロン酸基は、マロニル−CoA:ACPトランスアシラーゼ(FabD)によってACPに転移されて、マロニル−ACPを生成する。次に、縮合反応が起こり、マロニル−ACPは、アセチル−CoAと結合し(merge)、β−ケトアシル−ACPをもたらす。β−ケトアシル−ACPシンターゼIII(FabH)は、FASサイクルを開始する一方、β−ケトアシル−ACPシンターゼI(FabB)およびβ−ケトアシル−ACPシンターゼII(FabF)は、その後のサイクルに関与する。
次に、ステップのサイクルは、適切な長さの飽和脂肪酸が作製されるまで反復される。先ず、β−ケトアシル−ACPは、NADPHによって還元されて、β−ヒドロキシアシル−ACPを生成する。このステップは、β−ケトアシル−ACPレダクターゼ(FabG)によって触媒される。次に、β−ヒドロキシアシル−ACPが脱水されて、トランス−2−エノイル−ACPを生成する。β−ヒドロキシアシル−ACPデヒドラターゼ/イソメラーゼ(FabA)またはβ−ヒドロキシアシル−ACPデヒドラターゼ(FabZ)は、このステップを触媒する。NADPH依存性トランス−2−エノイル−ACPレダクターゼI、IIまたはIII(それぞれFabI、FabKおよびFabL)は、トランス−2−エノイル−ACPを還元して、アシル−ACPを生成する。その後のサイクルは、β−ケトアシル−ACPシンターゼIまたはβ−ケトアシル−ACPシンターゼII(それぞれFabBおよびFabF)による、アシル−ACPとマロニル−ACPとの縮合によって開始される。
本明細書に記載されているC1代謝微生物は、アセチル−CoAおよびマロニル−CoAを過剰産生するように操作することができる。C1代謝微生物に対し、数種類の異なる改変を組み合わせてまたは個々に為して、アセチル−CoA/マロニル−CoA/脂肪酸、脂肪酸誘導体産生および極長炭素鎖化合物産生の増加を得ることができる。
例えば、アセチル−CoA産生を増加させるために、C1代謝微生物において次の遺伝子のうち1種または複数種を発現させることができる:pdh、panK、aceEF(ピルビン酸および2−オキソグルタル酸デヒドロゲナーゼ複合体のE1pデヒドロゲナーゼ構成成分およびE2pジヒドロリポアミドアシルトランスフェラーゼ構成成分をコードする)、fabH、fabD、fabG、acpPまたはfabF。他の例において、脂肪アシル−CoAレダクターゼおよびアルデヒドデカルボニラーゼをコードする追加的なDNA配列を、C1代謝微生物において発現させることができる。全て構成的または他の方法で制御可能なプロモーターの制御下の、上述の遺伝子のうち1種または複数種を含有するプラスミドを構築することができることは、当該分野で周知である。これらの遺伝子の例示的なGenBank受託番号は、pdh(BAB34380、AAC73227、AAC73226)、panK(coaAとしても公知、AAC76952)、aceEF(AAC73227、AAC73226)、fabH(AAC74175)、fabD(AAC74176)、fabG(AAC74177)、acpP(AAC74178)、fabF(AAC74179)である。
その上、fadE、gpsA、ldhA、pflb、adhE、pta、poxB、ackAまたはackBの発現レベルは、相当する遺伝子のヌルもしくは欠失変異を含有する条件的複製または非複製プラスミドによる形質転換により、またはプロモーターもしくはエンハンサー配列の置換により、操作された微生物において低下、阻害またはノックアウトさせることができる。これらの遺伝子の例示的なGenBank受託番号は、fadE(AAC73325)、gspA(AAC76632)、ldhA(AAC74462)、pflb(AAC73989)、adhE(AAC74323)、pta(AAC75357)、poxB(AAC73958)、ackA(AAC75356)およびackB(BAB81430)である。その結果得られる操作されたC1代謝微生物は、C1基質原料による等、適切な環境において成長させた場合、増加したアセチル−CoA産生レベルを有する。
さらに、マロニル−CoA過剰産生は、de novo合成されたプラスミドに含まれるaccABCD(例えば、受託番号AAC73296、EC6.4.1.2)により、本明細書に記載されているC1代謝微生物を操作することにより影響され得る。脂肪酸過剰産生は、de novo合成されたプラスミドにおいてリパーゼ(例えば、Genbank受託番号CAA89087、CAA98876)をコードする核酸分子をさらに含めることにより達成することができる。
その結果、いくつかの例では、アセチル−CoAカルボキシラーゼが過剰発現されて、その細胞内濃度を、未変性発現レベルと比べて少なくとも約2倍、好ましくは少なくとも約5倍またはより好ましくは少なくとも約10倍増加させる。
一部の実施形態では、plsB(例えば、Genbank受託番号AAC77011)D311E変異を使用して、利用できるアシル−CoAの量を増加させることができる。さらなる実施形態では、C1代謝微生物においてsfa遺伝子(FabAのサプレッサー、例えば、Genbank受託番号AAN79592)の過剰発現が含まれて、モノ不飽和脂肪酸の産生を増加させることができる(Rockら、J. Bacteriology 178巻:5382頁、1996年)。
本明細書に記載されている通り、アセチル−CoAおよびマロニル−CoAは、いくつかのステップにおいてプロセシングされて、アシル−ACP鎖を生成する。酵素sn−グリセロール−3−リン酸アシルトランスフェラーゼ(PlsB)は、アシル−ACPまたはアシル−CoAからグリセロール−3−リン酸のsn−1位へのアシル基の転移を触媒する。よって、PlsBは、脂肪酸経路の一部であるリン脂質合成における鍵となる調節酵素である。PlsBの阻害は、長鎖アシル−ACPのレベルの増加をもたらし、このフィードバックは、経路における初期ステップを阻害する(例えば、accABCD、fabHおよびfabI)。例えば、チオエステラーゼ過剰発現によるこの調節のアンカップリングは、脂肪酸産生の増加をもたらす。tesおよびfat遺伝子ファミリーは、チオエステラーゼを発現する。長鎖アシル−CoAによってin vitroでFabIも阻害される。
脂肪酸誘導体の均一なまたは混合型集団の産生のためにC1代謝微生物を操作するために、1種または複数種の内因性遺伝子を減弱、阻害または機能的に欠失させることができ、その結果、1種または複数種のチオエステラーゼを発現させることができる。例えば、C10脂肪酸誘導体は、C18:1−ACPを使用するチオエステラーゼC18(例えば、Genbank受託番号AAC73596およびP0ADA1)を減弱し、同時に、C10−ACPを使用するチオエステラーゼC10(例えば、Genbank受託番号Q39513)を発現させることにより産生することができる。これは、炭素鎖長10を有する脂肪酸誘導体の相対的に均一な集団をもたらす。別の例において、C14脂肪酸誘導体は、非C14脂肪酸を産生する内因性チオエステラーゼを減弱し、チオエステラーゼ受託番号Q39473(C14−ACPを使用する)を発現させることにより産生することができる。さらに別の例において、C12脂肪酸誘導体は、C12−ACPを使用するチオエステラーゼ(例えば、Genbank受託番号Q41635)を発現させ、非C12脂肪酸を産生するチオエステラーゼを減弱することにより産生することができる。よって、C1代謝微生物は、KCSによって開始されるその後伸長反応のための基質として、好まれる鎖長(複数可)の脂肪アシル−CoAを産生するように操作することができる。アセチル−CoA、マロニル−CoAおよび脂肪酸過剰産生は、当該分野で公知の方法を使用して、例えば、細胞溶解後の放射性前駆体、HPLCおよびGC−MSを使用することにより検証することができる。請求されている方法および本開示のC1代謝微生物において有用なチオエステラーゼの非限定例は、米国特許第8,283,143号の表1に収載されており、この表は、これによりその全体が本明細書中に参考として援用される。
アシル−CoAシンターゼ(ACS)は、二段階機構により、遊離脂肪酸をエステル化してアシル−CoAとする。遊離脂肪酸は先ず、ATPの加ピロリン酸分解(pyrophosphorolysis)によりアシル−AMP中間体(アデニラート)に変換される。次に、アデニラートの活性化カルボニル炭素は、CoAのチオール基にカップリングさせ、AMPおよびアシル−CoA最終生成物を放出する。Shockeyら、Plant. Physiol.129巻:1710頁、2002年を参照されたい。
E.coli ACS酵素FadDおよび脂肪酸輸送タンパク質FadLは、脂肪酸取り込み系の必須構成成分である。FadLは、細菌細胞への脂肪酸の輸送を媒介し、FadDは、アシル−CoAエステルの生成を媒介する。他の炭素源が利用できない場合、外因性脂肪酸が、細菌によって取り入れられ、アシル−CoAエステルに変換され、これは転写因子FadRに結合し、脂肪酸輸送(FadL)、活性化(FadD)およびβ−酸化(FadA、FadB、FadEおよびFadH)の原因となるタンパク質をコードするfad遺伝子の発現を抑制解除する。代替的な炭素源が利用できる場合、細菌は、リン脂質合成に使用されるがβ−酸化のための基質ではないアシル−ACPとして脂肪酸を合成する。よって、アシル−CoAおよびアシル−ACPは両者共に、異なる最終生成物をもたらす脂肪酸の独立的な供給源である。Cavigliaら、J. Biol. Chem.279巻:1163頁、2004年を参照されたい。
公知ポリペプチドをコードする核酸分子を使用してC1代謝微生物を操作して、様々な長さの脂肪酸を産生し、次にこれをアシル−CoAおよび最終的に極長炭素鎖化合物に変換することができる。極長炭素鎖化合物を作製する一方法は、1種または複数種のアシル−CoAシンターゼペプチド(EC6.2.1.−)の発現の増加またはそのより多くの活性型の発現をもたらす。アシル−CoAおよび脂肪酸誘導体を産生するために発現させることができるアシル−CoAシンターゼのリストは、米国特許第8,283,143号の表2に示されており、この表は、これによりその全体が本明細書中に参考として援用される。これらのアシル−CoAシンターゼを使用して、基質として脂肪アシル−CoAを使用するいずれかの経路を改善することができる。
アシル−CoAは、NADH依存性アシル−CoAレダクターゼ(例えば、Acr1)によって脂肪アルデヒドに還元される。次に、脂肪アルデヒドは、NADPH依存性アルコールデヒドロゲナーゼ(例えば、YqhD)によって脂肪アルコールに還元される。あるいは、脂肪アルコール生成アシル−CoAレダクターゼ(FAR)は、アシル−CoAから脂肪アルコールおよびCoASHへの還元を触媒する。FARは、この4電子還元における補因子としてNADHまたはNADPHを使用する。アルコール生成FAR反応は、アルデヒド中間体を経て進むが、遊離アルデヒドは放出されない。よって、アルコール生成FARは、アシル−CoAの2電子還元を行い、生成物として遊離脂肪アルデヒドを生じる酵素とは別個である(ChengおよびRussell、J. Biol. Chem.、279巻:37789頁、2004年;Metzら、Plant Physiol.122巻:635頁、2000年を参照)。
C1代謝微生物は、公知ポリペプチドを使用して、アシル−CoAから脂肪アルコールを産生するように操作することができる。脂肪アルコールを作製する一方法は、脂肪アルコール生成アシル−CoAレダクターゼ(FAR由来のacr1等の遺伝子によってコードされる、EC1.2.1.50/1.1.1)またはアシル−CoAレダクターゼ(EC1.2.1.50)およびアルコールデヒドロゲナーゼ(EC1.1.1.1)の発現の増加またはそのより多くの活性型の発現をもたらす。例示的なGenBank受託番号は、米国特許第8,283,143号の図1に収載されており、この図は、これによりその全体が本明細書中に参考として援用される。
脂肪アルコールは、炭化水素に基づく界面活性物質として記載することができる。界面活性物質産生のため、C1代謝微生物は、C1基質原料から界面活性物質を産生するように改変される。かかるC1代謝微生物は、脂肪酸を脂肪アルデヒドに変換することができるタンパク質をコードする第1の外因性核酸分子と、脂肪アルデヒドをアルコールに変換することができるタンパク質をコードする第2の外因性核酸分子とを含む。いくつかの例では、第1の外因性核酸分子は、脂肪酸レダクターゼ(FAR)をコードする。一実施形態では、第2の外因性核酸分子は、哺乳動物ミクロソームアルデヒドレダクターゼまたは長鎖アルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする。さらなる例において、第1および第2の外因性核酸分子は、Arthrobacter AK 19、Rhodotorula glutinins、Acinetobacter sp.M−1またはCandida lipolyticaに由来する。一実施形態では、第1および第2の異種核酸分子は、Acinetobacter sp.M−1またはCandida lipolytica由来の多酵素複合体に由来する。
界面活性物質産生において使用することができる、脂肪酸から長鎖アルコールに変換するタンパク質をコードする異種核酸分子の追加的な供給源は、Mortierella alpina(ATCC 32222)、Cryptococcus curvatus(Apiotricum curvatumとも称される)、Akanivorax jadensis(T9T=DSM 12718=ATCC 700854)、Acinetobacter sp.HO1−N(ATCC 14987)およびRhodococcus opacus(PD630 DSMZ 44193)を含む。
一例において、脂肪酸誘導体は、約8〜約24炭素原子、約8〜約18炭素原子、約8〜約14炭素原子、約10〜約18炭素原子または約12〜約16炭素原子の炭素鎖長を有する飽和または不飽和界面活性物質生成物である。別の例において、界面活性物質生成物は、約10〜約14炭素原子または約12〜約14炭素原子の炭素鎖長を有する。
界面活性物質の産生に適切なC1代謝微生物は、真核生物または原核生物微生物のいずれかであってよい。アセチルCoAカルボキシラーゼを発現するように操作されたメタン生成菌等、脂肪酸誘導体の形態のC1原料から高レベルの界面活性物質前駆体を合成する生得的な能力を実証するC1代謝微生物が使用される。
産生宿主は、公知ポリペプチドを使用して、様々な長さの脂肪エステルを産生するように操作することができる。脂肪エステルを作製する一方法は、1種または複数種のアルコールO−アセチルトランスフェラーゼペプチド(EC2.3.1.84)の発現を増加させること、またはそのより多くの活性型を発現させることを含む。このようなペプチドは、アセチル−CoAおよびアルコールをCoAおよびエステルに変換することにより、アルコールのアセチル化を触媒する。いくつかの例では、アルコールO−アセチルトランスフェラーゼペプチドは、選択されたチオエステラーゼペプチド、FASペプチドおよび脂肪アルコール生成ペプチドと併せて発現させ、これにより、炭素鎖長、飽和および分枝の程度を制御することができる。いくつかの事例において、bkdオペロンを共発現させて、分枝状脂肪酸前駆体を産生させることができる。
本明細書中で使用する場合、アルコールO−アセチルトランスフェラーゼペプチドは、酵素分類番号EC2.3.1.84のペプチドと共に、アセチル−CoAおよびアルコールの変換を触媒してCoAおよびエステルを生成することができる他のいずれかのペプチドを含む。その上、当業者であれば、アルコールO−アセチルトランスフェラーゼペプチドが、他の反応を触媒することを認められよう。
例えば、いくつかのアルコールO−アセチルトランスフェラーゼペプチドは、他のアルコールおよび他のアシル−CoAチオエステル等、脂肪アルコールまたはアセチル−CoAチオエステルに加えて他の基質を受け入れる。したがって、かかる非特異的または多岐にわたる特異性アルコールO−アセチルトランスフェラーゼペプチドも含まれる。アルコールO−アセチルトランスフェラーゼペプチド配列は、公的に入手可能であり、例示的なGenBank受託番号は、米国特許第8,283,143号の図1に収載されており、この図は、これによりその全体が本明細書中に参考として援用される。特定のアルコールO−アセチルトランスフェラーゼペプチドの活性を特徴付けるためのアッセイは、当該分野で周知である。O−アシルトランスフェラーゼは、ドナーアシル基またはアクセプターアルコール部分に対する新たな活性および特異性を有するように操作することができる。操作された酵素は、十分に裏付けられた合理的および進化的アプローチにより生成することができる。
脂肪エステルは、エステル結合により脂肪アシル−CoAに長鎖脂肪アルコールをコンジュゲートする、アシル−CoA:脂肪アルコールアシルトランスフェラーゼ(例えば、エステルシンターゼ)によって合成される。エステルシンターゼおよびコード遺伝子は、ホホバ植物および細菌Acinetobacter sp.ADP1(以前はAcinetobacter calcoaceticus ADP1)由来が公知である。細菌エステルシンターゼは、エステルシンターゼ活性ならびにジアシルグリセロール基質および脂肪アシル−CoAからトリアシルグリセロールを生成する能力(アシル−CoA:ジグリセロールアシルトランスフェラーゼ(DGAT)活性)を示す二官能性酵素である。遺伝子wax/dgatは、エステルシンターゼおよびDGATの両方をコードする。Chengら、J. Biol. Chem.279巻:37798頁、2004年;KalscheuerおよびSteinbuchel、J. Biol. Chem.278巻:8075頁、2003年を参照されたい。エステルシンターゼを使用して、ある特定の脂肪エステルを産生することもできる。
アシル−CoAおよびアルコールからのワックスを含む脂肪エステルの産生は、公知ポリペプチドを使用して操作することができる。脂肪エステルを作製する一方法は、1種または複数種のエステルシンターゼ(EC2.3.1.20、2.3.1.75)の発現を増加させること、またはそのより多くの活性型を発現させることを含む。エステルシンターゼペプチド配列は、公的に入手可能であり、例示的なGenBank受託番号は、米国特許第8,283,143号の図1に収載されており、この図は、これによりその全体が本明細書中に参考として援用される。エステルシンターゼ活性を同定するための方法は、米国特許第7,118,896号に提示されている。
特定の例において、所望の生成物が、脂肪酸エステルワックスである場合、C1代謝微生物は、エステルを産生するように改変される。かかるC1代謝微生物は、C1代謝微生物に、C1基質原料から飽和、不飽和または分枝状脂肪エステルを合成する能力を付与するように発現される、エステルシンターゼをコードする外因性核酸分子を含む。一部の実施形態では、C1代謝微生物は、次の例示的なタンパク質:脂肪酸エロンガーゼ、アシル−CoAレダクターゼ、アシルトランスフェラーゼ、エステルシンターゼ、脂肪アシルトランスフェラーゼ、ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ、アシル−coAワックスアルコールアシルトランスフェラーゼまたはこれらのいずれかの組合せをコードする核酸分子を発現することもできる。代替実施形態において、C1代謝微生物は、二官能性エステルシンターゼ/アシル−CoA:ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼをコードする核酸分子を含む。例えば、二官能性エステルシンターゼ/アシル−CoA:ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼは、Simmondsia chinensis、Acinetobacter sp.ADP1(以前はAcinetobacter calcoaceticus ADP1)、Alcanivorax borkumensis、Pseudomonas aeruginosa、Fundibacter jadensis、Arabidopsis thalianaまたはAlcaligenes eutrophus(後に、Ralstonia eutrophaと新たに命名)由来の多酵素複合体から選択することができる。一実施形態では、脂肪酸エロンガーゼ、アシル−CoAレダクターゼまたはワックスシンターゼは、Ralstonia eutrophaまたはワックスもしくは脂肪エステル等、エステルを産生することが文献において公知の他の生物由来の多酵素複合体に由来する。
脂肪エステル産生において有用なエステル合成タンパク質をコードする異種核酸分子の追加的な供給源は、Mortierella alpina(例えば、ATCC 32222)、Cryptococcus curvatus(Apiotricum curvatumとも称される)、Alcanivorax jadensis(例えば、T9T=DSM 12718=ATCC 700854)、Acinetobacter sp.HO1−N(例えば、ATCC 14987)およびRhodococcus opacus(例えば、PD630、DSMZ 44193)を含む。一例において、遺伝子座AA017391におけるAcinetobacter sp.ADP1由来のエステルシンターゼ(KalscheuerおよびSteinbuchel、J. Biol. Chem.278巻:8075頁、2003年に記載)が使用される。別の例において、遺伝子座AAD38041におけるSimmondsia chinensis由来のエステルシンターゼが使用される。
任意選択で、FATPファミリーのメンバー等、エステル排出輸送体(exporter)を使用して、細胞外環境へのエステルの放出を容易にすることができる。使用することができるエステル排出輸送体の非限定例は、遺伝子座NP_524723におけるDrosophila melanogaster由来の脂肪酸(長鎖)輸送タンパク質CG7400−PA、アイソフォームAである。
輸送タンパク質は、C1代謝微生物外に脂肪酸誘導体を輸出する。多くの輸送および流出タンパク質は、多種多様な化合物の排出に役立ち、特定の種類の脂肪酸誘導体に対し選択的となるように天然に改変することができる。適した輸送タンパク質の非限定例は、ATP結合カセット(ABC)輸送タンパク質、流出タンパク質および脂肪酸輸送体タンパク質(FATP)である。適した輸送タンパク質の追加的な非限定例として、Caenorhabditis elegans、Arabidopsis thalania、Alkaligenes eutrophus、Rhodococcus erythropolis等の生物由来のABC輸送タンパク質が挙げられる。使用することができる例示的なABC輸送タンパク質は、CER5、AtMRP5、AmiS2またはAtPGP1である。好まれる実施形態では、ABC輸送タンパク質は、CER5(例えば、AY734542)である。適した輸送タンパク質を発現する遺伝子を含有するベクターをタンパク質産生宿主に挿入して、脂肪酸誘導体の放出を増加させることができる。
C1代謝微生物は、脂肪酸誘導体を放出するその内因性能力のために選択することもできる。生成物産生および発酵ブロスへの放出の効率は、細胞内生成物対細胞外生成物の比として表現することができる。いくつかの例では、比は、約5:1、4:1、3:1、2:1、1:1、1:2、1:3、1:4または1:5であってよい。
特定の枝分かれ個所、飽和のレベル、炭素鎖長およびエステル特徴を有する脂肪酸誘導体を所望の通りに産生することができる。特定の誘導体を天然に産生するC1代謝微生物を初期宿主細胞として選択することができる。あるいは、特定の脂肪酸誘導体を産生する酵素を発現する遺伝子を、本明細書に記載されている通り、C1代謝微生物に挿入することができる。
いくつかの例では、異なる種または操作されたバリアントに起源をもつ外因性FAS遺伝子の発現をC1代謝微生物に導入して、未変性宿主細胞のものとは構造的に異なる(長さ、分枝、不飽和の程度等において)脂肪酸の生合成を可能にすることができる。このような異種遺伝子生成物は、宿主細胞における天然の調節機構による影響を受けないように選択または操作することもでき、したがって、所望の商業製品の産生の制御を可能にする。例えば、Bacillus subtilis、Saccharomyces cerevisiae、Streptomyces spp.、Ralstonia、Rhodococcus、Corynebacteria、Brevibacteria、Mycobacteria、油性酵母など由来のFAS酵素を、本開示のC1代謝微生物において発現させることができる。かかる外因性酵素の発現は、産生される脂肪酸および最終的には脂肪酸誘導体の構造を変更する。
C1代謝微生物が、特異的なレベルの不飽和、分枝または炭素鎖長を有する脂肪酸を産生するように操作されると、その結果得られる操作された脂肪酸は、脂肪酸誘導体の産生において使用することができる。かかるC1代謝微生物から生成された脂肪酸誘導体は、操作された脂肪酸の特徴を呈することができる。
例えば、産生宿主は、分枝状、短鎖脂肪酸を作製するように操作することができ、これを次に産生宿主が使用して、分枝状、短鎖脂肪アルコールを産生することができる。同様に、定義されたレベルの分枝、不飽和または炭素鎖長を有する脂肪酸を産生するように産生宿主を操作することにより、炭化水素を産生することができ;よって、均一な炭化水素集団を産生することができる。追加的なステップを用いて、得られる生成物の均一性を改善することができる。例えば、不飽和アルコール、脂肪エステルまたは炭化水素が所望の場合、C1代謝微生物は、低レベルの飽和脂肪酸を産生するように操作することができ、加えて、飽和生成物の産生を低減または低下させるために、追加的なデサチュラーゼを発現するように改変することができる。
脂肪酸は、脂肪酸誘導体の産生における鍵となる中間体である。分枝状または環状脂肪酸を使用して脂肪酸誘導体を作製することにより、脂肪酸誘導体は、枝分かれ個所、環状部分およびこれらの組合せを含有するように産生することができる。
例えば、C1代謝微生物は、直鎖脂肪酸を天然に産生することができる。分枝鎖脂肪酸を産生するようにC1代謝微生物を操作するために、分枝状前駆体をもたらす数種類の遺伝子(例えば、bkdオペロン)をC1代謝微生物(例えば、メタン生成菌)に導入し、発現させて、分枝状前駆体(例えば、fabH)から脂肪酸生合成を開始させることができる。bkd、ilv、icmおよびfab遺伝子ファミリーを発現または過剰発現させて、分枝鎖脂肪酸誘導体を産生することができる。同様に、環状脂肪酸を産生するために、環状前駆体をもたらす遺伝子を産生宿主に導入し、発現させて、環状前駆体から脂肪酸生合成を開始させることができる。ans、chcおよびplm遺伝子ファミリーを発現または過剰発現させて、環状脂肪酸を産生することができる。本方法および本開示のC1代謝微生物において使用することができるこれらの遺伝子ファミリーにおける遺伝子の非限定例は、米国特許第8,283,143号(図1、この図は、本明細書中に参考として援用される)に収載されている。
その上、産生宿主は、分枝状脂肪酸の伸長のためのタンパク質をコードする遺伝子(例えば、ACP、FabF等)を発現するように、または直鎖脂肪酸を正常にもたらす相当する遺伝子を欠失もしくは減弱させるように操作することができる。この点に関して、導入された遺伝子(例えば、fabH、fabF)と競合する内因性遺伝子は、欠失、阻害または減弱される。
分枝状アシル−CoA(例えば、2−メチル−ブチリル−CoA、イソバレリル−CoA、イソブチリル−CoA等)は、分枝状脂肪酸の前駆体である。分枝状脂肪酸を含有する大部分の微生物において、分枝状脂肪酸は、分枝状アミノ酸(例えば、イソロイシン、ロイシンおよびバリン)から2ステップで合成される(Kadena、Microbiol. Rev.55巻:288頁、1991年)。C1代謝微生物は、これら2ステップに関与する酵素のうち1種または複数種を発現または過剰発現するように操作して、分枝状脂肪酸誘導体を産生する、または分枝状脂肪酸誘導体を過剰産生することができる。例えば、C1代謝微生物は、分枝状脂肪酸誘導体をもたらす1ステップを達成することができる内因性酵素を有することができ;したがって、第2のステップに関与する酵素をコードする遺伝子のみを、組換えにより導入する必要がある。
分枝状脂肪酸誘導体の生成における第1のステップは、分枝鎖アミノ酸アミノトランスフェラーゼによる、相当するα−ケト酸の産生である。メタン資化性菌等、C1代謝微生物は、かかる酵素をコードする遺伝子を内因性に含むことができる、またはかかる遺伝子は、組換えにより導入することができる。いくつかのC1代謝微生物において、異種分枝鎖アミノ酸アミノトランスフェラーゼは、発現されなくてもよい。したがって、ある特定の実施形態では、E.coli由来のIlvEまたは他のいずれかの分枝鎖アミノ酸アミノトランスフェラーゼ(例えば、Lactococcus lactis由来のIlvE(GenBank受託AAF34406)、Pseudomonas putida由来のIlvE(GenBank受託NP_745648)またはStreptomyces coelicolor由来のIlvE(GenBank受託NP_629657))を、本開示のC1代謝微生物に導入することができる。アミノトランスフェラーゼ反応が、選択されたC1代謝微生物の分枝状脂肪酸生合成において律速である場合、アミノトランスフェラーゼを過剰発現させることができる。
第2のステップは、α−ケト酸から相当する分枝鎖アシル−CoAへの酸化的脱カルボキシル化である。この反応は、E1α/β(デカルボキシラーゼ)、E2(ジヒドロリポイルトランスアシラーゼ)およびE3(ジヒドロリポイルデヒドロゲナーゼ)サブユニットを含む、分枝鎖α−ケト酸デヒドロゲナーゼ複合体(bkd;EC1.2.4.4.)によって触媒することができる(Denoyaら、J. Bacteriol.177巻:3504頁、1995年)。このような分枝鎖α−ケト酸デヒドロゲナーゼ複合体は、ピルビン酸およびα−ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ複合体と同様である。分枝状脂肪酸を保有するまたは分枝鎖アミノ酸で成長するあらゆる微生物を供給源として使用して、メタン資化性菌等、C1代謝微生物における発現のためのbkd遺伝子を単離することができる。さらに、C1代謝微生物が、そのピルビン酸デヒドロゲナーゼ複合体(lpd、EC1.8.1.4)の一部としてE3構成成分を有する場合、次にE1α/βおよびE2 bkd遺伝子を発現させることのみで十分であり得る。
別の例において、イソブチリル−CoAは、クロトニル−CoAレダクターゼ(Ccr、EC1.6.5.5、1.1.1.1)およびイソブチリル−CoAムターゼ(大サブユニットIcmA、EC5.4.99.2;小サブユニットIcmB、EC5.4.99.2)の共発現により、C1代謝微生物、例えば、メタン資化性菌において作製することができる(HanおよびReynolds、J. Bacteriol.179巻:5157頁、1997年)。クロトニル−CoAは、E.coliおよび他の微生物の脂肪酸生合成における中間体である。
bkd遺伝子の発現に加えて、brFA生合成の開始は、分枝鎖アシル−CoAに対し特異性を有するβ−ケトアシル−アシルキャリアータンパク質シンターゼIII(FabH、EC2.3.1.41)を利用する(Liら、J. Bacteriol.187巻:3795頁、2005年)。いずれかの分枝状脂肪酸含有微生物の脂肪酸生合成に関与するfabH遺伝子は、本開示のC1代謝微生物において発現させることができる。分枝状脂肪酸またはその誘導体を天然に作製しない産生宿主由来のBkdおよびFabH酵素は、分枝状脂肪酸産生を支持し得ない;したがって、BkdおよびFabHは、組換えにより発現することができる。bkdおよびfabH遺伝子を含有するベクターをかかるC1代謝微生物に挿入することができる。同様に、BkdおよびFabH産生の内因性レベルは、分枝状脂肪酸誘導体の産生に十分ではない場合があるため、ある特定の実施形態では、これらは過剰発現される。その上、アシルキャリアータンパク質(ACP)およびβ−ケトアシル−アシルキャリアータンパク質シンターゼII(fabF、EC2.3.1.41)等、脂肪酸生合成経路の他の構成成分を発現または過剰発現させることができる。これらの遺伝子の発現に加えて、内因性脂肪酸生合成経路におけるいくつかの遺伝子を、本開示のC1代謝微生物において減弱させることができる。基質に関してbrFA産生をもたらす経路の酵素と競合する酵素をコードする遺伝子を減弱または阻害して、分枝状脂肪酸誘導体産生を増加させることができる。
上述の通り、分枝鎖アルコールは、分枝状脂肪酸合成およびアルコール合成を支持する発現遺伝子の組合せにより産生することができる。例えば、Acinetobacter baylyi ADP1由来のAcr1等、アルコールレダクターゼが、bkdオペロンと共発現される場合、本開示のC1代謝微生物は、イソペンタノール、イソブタノールまたは2−メチルブタノールを合成することができる。同様に、Acr1が、ccr/icm遺伝子と共発現される場合、本開示のC1代謝微生物は、イソブタノールを合成することができる。
メタン資化性菌等、本開示のC1代謝微生物を、ω−環状脂肪酸(cyFA)を合成することができる生物に変換するために、環状前駆体シクロヘキシルカルボニル−CoA(CHC−CoA)(Croppら、Nature Biotech.18巻:980頁、2000年)をもたらす遺伝子を本開示のC1代謝微生物において導入し、発現させる。
CHC−CoAをもたらす遺伝子の非限定例として、S.collinus、S.avermitilisまたはS.coelicolor由来のchcB遺伝子(Pattonら、Biochem.39巻:7595頁、2000年)と共に、Streptomyces collinusのアンサトリエニン(ansatrienin)遺伝子クラスター由来のansJ、ansK、ansL、chcAおよびansM(Chenら、Eur. J. Biochem.261巻:98頁、1999年)、またはStreptomyces sp.HK803のホスラクトマイシン(phoslactomycin)B遺伝子クラスター由来のplmJ、plmK、plmL、chcAおよびplmM(Palaniappanら、J. Biol. Chem.278巻:35552頁、2003年)が挙げられる。FabH、ACPおよびfabF遺伝子を発現させて、共環状(co−cyclic)脂肪酸を開始および伸長させることができる。あるいは、相同遺伝子は、cyFAを作製する微生物から単離し、本開示のC1代謝微生物において発現させることができる。
遺伝子fabH、acpおよびfabFは、幅広い基質特異性を有することができるため、ω−環状脂肪酸を開始および伸長させるのに十分である。これらの遺伝子のいずれかと、ansJKLM/chcABまたはpmlJKLM/chcAB遺伝子との共発現が、cyFAを生じない場合、cyFAを作製する微生物由来のfabH、acpまたはfabFホモログを単離(例えば、縮重PCRプライマーまたは異種DNA配列プローブを使用することにより)および共発現することができる。
脂肪酸は、脂肪酸誘導体の産生における鍵となる中間体である。脂肪酸誘導体における飽和の程度は、脂肪酸中間体の飽和の程度を調節することにより制御することができる。遺伝子のsfa、gnsおよびfabファミリーを発現または過剰発現させて、脂肪酸の飽和を制御することができる。本方法においておよび本開示のC1代謝微生物と共に使用することができるこれらの遺伝子ファミリーにおける遺伝子の非限定例は、米国特許第8,283,143号の図1に収載されており、この図は、その全体が本明細書中に参考として援用される。
本開示のC1代謝微生物は、fabBを過剰発現するようにC1代謝微生物(例えば、メタン資化性菌)を操作することにより、またはC1代謝微生物を低温(例えば、37℃未満)で成長させることにより、不飽和脂肪酸誘導体を産生するように操作することができる。E.coliにおいて、FabBは、シスΔ3デセノイル−ACPに対する嗜好性を有し、不飽和脂肪酸産生をもたらす。FabBの過剰発現は、有意なパーセンテージの不飽和脂肪酸の産生をもたらす(de Mendozaら、J. Biol. Chem.258巻:2098頁、1983年)。fabBをコードする核酸分子を、この遺伝子を天然に持たないC1代謝微生物(例えば、メタン資化性菌)に挿入し、この中で発現させることができる。次に、このような不飽和脂肪酸は、脂肪アルコール、脂肪エステル、ワックス、ヒドロキシ脂肪酸、ジカルボン酸など、脂肪酸誘導体を産生するように操作されたC1代謝微生物において中間体として使用することができる。
あるいは、脂肪酸生合成のリプレッサー、例えば、fabRをC1代謝微生物(例えば、メタン資化性菌)において阻害または欠失することができ、これは、E.coliにおいて認められる通り(Zhangら、J. Biol. Chem.277巻:15558頁、2002年)、不飽和脂肪酸産生の増加をもたらすこともできる。不飽和脂肪酸のさらなる増加は、例えば、fabI(トランス−2−エノイル−ACPレダクターゼ)を欠失しつつ、fabM(トランス−2,シス−3−デセノイル−ACPイソメラーゼ)を過剰発現およびStreptococcus pneumoniae由来のfabK(トランス−2−エノイル−ACPレダクターゼII)(Marrakchiら、J. Biol. Chem.277巻:44809頁、2002年)を発現制御することにより達成することができる。その上、不飽和脂肪エステルのパーセンテージを増加させるために、C1代謝微生物(例えば、メタン資化性菌)は、fabB(β−ケトアシル−ACPシンターゼIをコードする、受託番号EC:2.3.1.41)、sfa(fabAのサプレッサーをコードする)ならびにgnsAおよびgnsB(両者共にsecGヌル変異体サプレッサーをコードする、すなわち、寒冷ショックタンパク質)を過剰発現することもできる。いくつかの例では、内因性fabF遺伝子を減弱することができ、これは、産生されるパルミトレエート(C16:1)のパーセンテージを増加させることができる。
別の例において、所望の脂肪酸誘導体は、ヒドロキシル化脂肪酸である。ヒドロキシル改変は、特異的な酵素を使用して、鎖の至る所で生じ得る。特に、ω−ヒドロキシル化は、分子両端に官能基を含有する特に有用な分子を産生する(例えば、ポリエステルプラスチックを産生する直鎖状重合を可能にする)。ある特定の実施形態では、C1代謝微生物(例えば、メタン資化性菌)は、CYP52A13、CYP52A14、CYP52A17、CYP52A18、CYP52A12およびCYP52A12Bから選択される1種または複数種の改変されたCYP52A型チトクロムP450を含むことができ、このチトクロムは、脂肪酸を例えば、ω−ヒドロキシ脂肪酸に改変する。異なる脂肪酸は、異なるチトクロムP450によって異なる比率でヒドロキシル化される。所望の脂肪酸原料の効率的なヒドロキシル化を達成するために、C1代謝微生物が、広範囲の高度に豊富な脂肪酸基質をω−ヒドロキシル化することができる1種または複数種のP450酵素を発現するように作製される。ラウリン酸(C12:0)、ミリスチン酸(C14:0)、パルミチン酸(C16:0)、ステアリン酸(C18:0)、オレイン酸(C18:1)、リノール酸(C18:2)およびα−リノレン酸(ω3、C18:3)のω−ヒドロキシル化を触媒するP450酵素が特に興味深い。C1代謝非光合成微生物にクローニングすることができる異なる脂肪酸に対して公知ω−ヒドロキシル化活性を有するP450酵素の例として、Vicia sativa由来のCYP94A1(Tijetら、Biochem. J.332巻:583頁、1988年);Nicotiana tabacum由来のCYP 94A5(Le Bouquinら、Eur. J. Biochem.268巻:3083頁、2001年);Zea mays由来のCYP78A1(Larkin、Plant Mol. Biol.25巻:343頁、1994年);Arabidopsis thaliana由来のCYP 86A1(Benvenisteら、Biochem. Biophys. Res. Commun.243巻:688頁、1998年)およびCYP86A8(Wellesenら、Proc. Nat’l. Acad. Sci. USA 98巻:9694頁、2001年);Petunia hybrida由来のCYP 92B1(Petkova−Andonovaら、Biosci. Biotechnol. Biochem.66巻:1819頁、2002年);Bacillus megaterium由来のCYP102A1(BM−3)変異体F87(Oliverら、Biochem.36巻:1567頁、1997年);ならびに哺乳動物および昆虫由来のCYP 4ファミリー(Hardwick、Biochem. Pharmacol.75巻:2263頁、2008年)が挙げられる。
ある特定の実施形態では、C1代謝非光合成微生物は、脂肪酸またはω−ヒドロキシ脂肪酸の特異的な部位に追加的な内部ヒドロキシル化を導入することができるP450酵素をコードする核酸分子を含み、ここで、この組換えC1代謝微生物は、内部に酸化された脂肪酸またはω−ヒドロキシ脂肪酸またはアルデヒドまたはジカルボン酸を産生することができる。本開示のC1代謝微生物において使用することができる、異なる脂肪酸における公知の鎖内(in−chain)ヒドロキシル化活性を有するP450酵素の例として、ω−1からω−5ヒドロキシル化を有するHelianthus tuberosus由来のCYP81B1(Cabello−Hurtadoら、J. Biol. Chem.273巻:7260頁、1998年);ω−1およびω−2ヒドロキシル化を有するHelianthus tuberosus由来のCYP790C1(Kandelら、J. Biol. Chem.280巻:35881頁、2005年);脂肪酸不飽和におけるエポキシ化を有するEuphorbia lagscae由来のCYP726A1(Cahoonら、Plant Physiol.128巻:615頁、2002年);α−ヒドロキシル化を有するSphingomonas paucimobilis由来のCYP152B1(Matsunagaら、Biomed. Life Sci.35巻:365頁、2000年);ω−1ヒドロキシル化を有するヒト肝臓由来のCYP2E1および4A1(Adasら、J. Lip. Res.40巻:1990頁、1999年);α−およびβ−ヒドロキシル化を有するBacillus substilis由来のP450BSβ(Leeら、J. Biol. Chem.278巻:9761頁、2003年);ならびにω−1、ω−2およびω−3ヒドロキシル化を有するBacillus megaterium由来のCYP102A1(BM−3)(Shiraneら、Biochem.32巻:13732頁、1993年)が挙げられる。
ある特定の実施形態では、ω−ヒドロキシル化を含むように脂肪酸を改変することができるP450酵素をコードする核酸分子を含むC1代謝非光合成微生物は、ω−ヒドロキシ脂肪酸誘導体をさらに酸化して、ジカルボン酸を生じるようにさらに改変することができる。多くの事例において、第1の事例におけるヒドロキシル化を行うことができるP450酵素は、さらなる酸化を行って、ジカルボン酸を生じることもできる。他の実施形態では、宿主生物における非特異的未変性アルコールデヒドロゲナーゼは、ω−ヒドロキシ脂肪酸を酸化して、ジカルボン酸とすることができる。さらなる実施形態では、C1代謝非光合成生物は、1種または複数種の脂肪アルコールオキシダーゼ(FAO1、FAO1B、FAO2、FAO2B等)またはアルコールデヒドロゲナーゼ(ADH−A4、ADH−A4B、ADH−B4、ADH−B4B、ADH−A10およびADH−B11等)(例えば、米国特許出願公開第2010/0291653号に収載されているCandida tropicalis由来、このリストは、その全体が本明細書中に援用される)をコードする核酸分子をさらに含み、ジカルボン酸の産生を容易にする。
本明細書に記載されている方法は、変動する炭素鎖長を有する脂肪エステルおよび脂肪酸誘導体の産生を可能にする。鎖長は、tesおよびfat遺伝子ファミリーの発現によって産生されるチオエステラーゼならびに脂肪酸エロンガーゼ(すなわち、KCS、KCR、HCDおよびECR)によって制御される。特異的なチオエステラーゼを発現することにより、脂肪酸エロンガーゼの基質としての使用のための所望の炭素鎖長を有する脂肪酸誘導体を産生することができる。適したチオエステラーゼの非限定例は、本明細書に記載されており、米国特許第8,283,143号に収載されている(図1、この図は、本明細書中に参考として援用される)。特定の炭素鎖長の脂肪酸誘導体が産生されるように、特定のチオエステラーゼをコードする核酸分子をC1代謝微生物(例えば、メタン資化性菌)に導入することができる。ある特定の実施形態では、内因性チオエステラーゼの発現が、阻害、抑制または下方制御される。
ある特定の実施形態では、脂肪酸誘導体は、約8〜24炭素原子、約8〜18炭素原子、約10〜18炭素原子、約10〜16炭素原子、約12〜16炭素原子、約12〜14炭素原子、約14〜24炭素原子、約14〜18炭素原子、約8〜16炭素原子または約8〜14炭素原子の炭素鎖を有する。代替的な実施形態では、脂肪酸誘導体は、約20未満の炭素原子、約18未満の炭素原子、約16未満の炭素原子、約14未満の炭素原子または約12未満の炭素原子の炭素鎖を有する。他の実施形態では、脂肪エステル生成物は、8〜24個の間の炭素原子の炭素原子含有量を有する飽和または不飽和脂肪エステル生成物である。さらなる実施形態では、脂肪エステル生成物は、8〜14個の間の炭素原子の炭素原子含有量を有する。なおさらなる実施形態では、脂肪エステル生成物は、14および20個の炭素の炭素含有量を有する。さらに他の実施形態では、脂肪エステルは、C18:1のメチルエステルである。さらなる実施形態では、脂肪エステルは、C16:1のエチルエステルである。他の実施形態では、脂肪エステルは、C16:1のメチルエステルである。さらに他の実施形態では、脂肪エステルは、オクタノールのオクタデシルエステルである。
いくつかの微生物は、偶数または奇数の炭素鎖脂肪酸および脂肪酸誘導体を優先的に産生する。例えば、E.coliは、偶数の炭素鎖脂肪酸および脂肪酸エチルエステル(FAEE)を正常に産生する。ある特定の実施形態では、奇数の炭素鎖脂肪酸誘導体を産生するC1代謝微生物(例えば、メタン資化性菌)を作製することができるように、本明細書に開示されている方法を使用して、C1代謝微生物(例えば、メタン資化性菌)におけるこの産生を変更することができる。
エステルは、「A」面(side)および「B」面と命名され得るものを含む。B面は、本開示のC1代謝微生物(例えば、メタン資化性菌)におけるde novo合成から産生される脂肪酸によって寄与され得る。一部の実施形態では、C1代謝微生物(例えば、メタン資化性菌)が、脂肪アルコールを含むアルコールを作製するように追加的に操作される場合、C1代謝微生物(例えば、メタン資化性菌)によってA面も産生される。さらに他の実施形態では、A面は、中間(medium)に配置することができる。所望のチオエステラーゼコード核酸分子を選択することにより、B面(および脂肪アルコールが作製されている場合はA面)は、ある特定の炭素鎖特徴を有するように設計することができる。このような特徴は、分枝の個所、不飽和および所望の炭素鎖長を含む。
特定のチオエステラーゼおよびFAE遺伝子が選択される場合、AおよびB面は、両者共に、脂肪酸生合成経路中間体を使用するC1代謝微生物(例えば、メタン資化性菌)によって寄与されるのであれば、同様の炭素鎖特徴を有する。例えば、産生される脂肪エステルの少なくとも約50%、60%、70%または80%は、長さが約2、4、6、8、10、12または14炭素まで様々であるA面およびB面を有する。A面およびB面は、同様の分枝および飽和レベルを呈することもできる。
A面に対する寄与のための脂肪アルコールの産生に加えて、C1代謝微生物(例えば、メタン資化性菌)は、A面における取り込みのために、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、イソブタノールおよびブタノール等、他の短鎖アルコールを産生することができる。例えば、C1代謝微生物(例えば、メタン資化性菌)によってブタノールを作製することができる。ブタノール産生細胞を作出するために、例えば、C1代謝微生物(例えば、メタン資化性菌)は、例えば、prpBCDEプロモーター系に置かれたpBAD24発現ベクターにおいて、Escherichia coli K12由来のatoB(アセチル−CoAアセチルトランスフェラーゼ)、Butyrivibrio fibrisolvens由来のβ−ヒドロキシブチリル−CoAデヒドロゲナーゼ、Clostridium beijerinckii由来のクロトナーゼ、Clostridium beijerinckii由来のブチリルCoAデヒドロゲナーゼ、Cladosporium fulvum由来のCoA−アシル化アルデヒドデヒドロゲナーゼ(ALDH)およびClostridium acetobutylicumのadhEコードアルデヒド−アルコールデヒドロゲナーゼを発現するようにさらに操作することができる。C1代謝微生物(例えば、メタン資化性菌)は、他の短鎖アルコールを産生するように同様に改変することができる。例えば、エタノールは、Kalscheuerら(Microbiol.152巻:2529頁、2006年)によって教示される方法を使用して、産生宿主において産生することができる。
C1代謝微生物−宿主細胞
本開示のC1代謝微生物は、天然の株、適応された株(例えば、発酵を行って、親株と比較して改善された成長速度および増加した総バイオマス収率を有する株を選択する)であってよい、あるいは目的の極長炭素鎖化合物を産生するように、または増加された成長速度を有するようにまたはその両方となるように組換えにより改変することができる(例えば、KCS、KCR、HCD、ECRまたはこれらの組合せを発現するように遺伝的に変更される)。ある特定の実施形態では、C1代謝微生物は、藻類または植物等、光合成微生物ではない。
本開示のC1代謝微生物は、天然の株、適応された株(例えば、発酵を行って、親株と比較して改善された成長速度および増加した総バイオマス収率を有する株を選択する)であってよい、あるいは目的の極長炭素鎖化合物を産生するように、または増加された成長速度を有するようにまたはその両方となるように組換えにより改変することができる(例えば、KCS、KCR、HCD、ECRまたはこれらの組合せを発現するように遺伝的に変更される)。ある特定の実施形態では、C1代謝微生物は、藻類または植物等、光合成微生物ではない。
ある特定の実施形態では、本開示は、Methylomonas、Methylobacter、Methylococcus、Methylosinus、Methylocystis、Methylomicrobium、Methanomonas、Methylophilus、Methylobacillus、Methylobacterium、Hyphomicrobium、Xanthobacter、Bacillus、Paracoccus、Nocardia、Arthrobacter、RhodopseudomonasまたはPseudomonas等、原核生物または細菌であるC1代謝微生物を提供する。
さらなる実施形態では、C1代謝細菌は、メタン資化性菌またはメチロトローフである。例示的なメタン資化性菌は、Methylomonas、Methylobacter、Methylococcus、Methylosinus、Methylocystis、Methylomicrobium、Methanomonas、Methylocellaまたはこれらのいずれかの組合せを含む。例示的なメチロトローフは、Methylobacterium extorquens、Methylobacterium radiotolerans、Methylobacterium populi、Methylobacterium chloromethanicum、Methylobacterium nodulansまたはこれらのいずれかの組合せを含む。
ある特定の実施形態では、メタン資化性細菌は、C1基質原料を極長炭素鎖化合物に変換する能力に関して遺伝子操作されている。メタン資化性細菌は、炭素およびエネルギー源としてメタンを酸化する能力を有する。メタン資化性細菌は、その炭素同化経路および内膜構造に基づき3群に分類される:I型(ガンマプロテオバクテリア)、II型(アルファプロテオバクテリア)およびX型(ガンマプロテオバクテリア)。I型メタン資化性菌は、炭素同化のためにリブロース一リン酸(RuMP)経路を使用する一方、II型メタン資化性菌は、セリン経路を使用する。X型メタン資化性菌は、RuMP経路を使用するが、セリン経路の低レベルの酵素も発現する。メタン資化性細菌は、炭素およびエネルギー源のためにC1基質のみを利用することができる偏性メタン資化性菌と、唯一の炭素およびエネルギー源としていくつかの多炭素基質を利用する能力を天然に有する通性メタン資化性菌とを含む。
例示的な通性メタン資化性菌は、Methylocella、MethylocystisおよびMethylocapsaのいくつかの種(例えば、Methylocella silvestris、Methylocella palustris、Methylocella tundrae、Methylocystis daltona株SB2、Methylocystis bryophilaおよびMethylocapsa aurea KYG)、Methylobacterium organophilum(ATCC 27,886)、Methylibium petroleiphilumまたはこれらの高成長バリアントを含む。例示的な偏性メタン資化性細菌は、Methylococcus capsulatus Bath、Methylomonas 16a(ATCC PTA 2402)、Methylosinus trichosporium OB3b(NRRL B−11,196)、Methylosinus sporium(NRRL B−11,197)、Methylocystis parvus(NRRL B−11,198)、Methylomonas methanica(NRRL B−11,199)、Methylomonas albus(NRRL B−11,200)、Methylobacter capsulatus(NRRL B−11,201)、Methylomonas flagellata sp AJ−3670(FERM P−2400)、Methylacidiphilum infernorumおよびMethylomicrobium alcaliphilumまたはこれらの高成長バリアントを含む。
なおさらなる実施形態では、本開示は、Clostridium、Moorella、Pyrococcus、Eubacterium、Desulfobacterium、Carboxydothermus、Acetogenium、Acetobacterium、Acetoanaerobium、Butyribaceterium、Peptostreptococcusまたはこれらのいずれかの組合せ等、シンガス代謝細菌であるC1代謝微生物を提供する。例示的なメチロトローフは、Clostridium autoethanogenum、Clostridium ljungdahli、Clostridium ragsdalei、Clostridium carboxydivorans、Butyribacterium methylotrophicum,Clostridium woodii、Clostridium neopropanologenまたはこれらのいずれかの組合せを含む。
本明細書に記載されている実施形態のいずれかでは、C1代謝非光合成微生物は、Yarrowia等、酵母ではない。
一定の他の実施形態では、C1代謝非光合成微生物は、偏性メタン資化性菌またはメチロトローフ等、偏性C1代謝非光合成微生物である。さらなる実施形態では、C1代謝非光合成微生物は、KCS、KCR、HCD、ECR、これらの組合せまたは全4種をコードする異種ポリヌクレオチドを含む組換え微生物である。
C1代謝微生物−非天然または組換え
一部の実施形態では、本明細書に記載されている通り、極長鎖脂肪アシル−CoA等、>C24極長炭素鎖化合物の生成にC1基質原料(例えば、メタン)を利用する、β−ケトアシル−CoAシンターゼ、β−ヒドロキシアシル−CoAデヒドラターゼ、β−ケトアシル−CoAレダクターゼおよびエノイル−CoAレダクターゼを有する組換えC1代謝微生物(例えば、非天然メタン資化性菌)が提供される。様々な実施形態では、組換えC1代謝微生物は、KCS酵素をコードする核酸分子を発現または過剰発現する。ある特定の実施形態では、KCS酵素は、このC1代謝微生物に対し内因性であってよい、またはKCS酵素は、このC1代謝微生物に対し異種であってよい。
一部の実施形態では、本明細書に記載されている通り、極長鎖脂肪アシル−CoA等、>C24極長炭素鎖化合物の生成にC1基質原料(例えば、メタン)を利用する、β−ケトアシル−CoAシンターゼ、β−ヒドロキシアシル−CoAデヒドラターゼ、β−ケトアシル−CoAレダクターゼおよびエノイル−CoAレダクターゼを有する組換えC1代謝微生物(例えば、非天然メタン資化性菌)が提供される。様々な実施形態では、組換えC1代謝微生物は、KCS酵素をコードする核酸分子を発現または過剰発現する。ある特定の実施形態では、KCS酵素は、このC1代謝微生物に対し内因性であってよい、またはKCS酵素は、このC1代謝微生物に対し異種であってよい。
一態様では、本開示は、次の酵素:(i)β−ケトアシル−CoAシンターゼ、(ii)β−ヒドロキシアシル−CoAデヒドラターゼ、(iii)β−ケトアシル−CoAレダクターゼおよび(iv)エノイル−CoAレダクターゼをコードする組換え核酸分子を有する非天然メタン資化性菌であって、C1基質を、極長鎖脂肪アシル−CoA、極長鎖脂肪アルデヒド、極長鎖脂肪アルコール(一級または二級)、極長鎖脂肪エステルワックス、極長鎖アルカン、極長鎖ケトンまたはこれらの組合せから選択される極長炭素鎖化合物に変換することができるメタン資化性菌を提供する。ある特定の実施形態では、KCSは、CER6、Elo1、Fen1/Elo2、Sur4/Elo3、KCS1、KCS2、KCS11、KCS20、KCS9、ELOVL1、ELOVL2、ELOVL3、ELOVL4、ELOVL5、ELOVL6、ELOVL7またはFDHである。ある特定の実施形態では、非天然メタン資化性菌は、少なくとも2種の異なるKCS酵素をコードする組換え核酸分子を含む。ある特定の実施形態では、KCRは、CER10、KAR、GL8A、GL8B、Ybr159w、AYR1またはAt1g67730である。ある特定の実施形態では、HCDは、PHS1、PAS2、HACD1、HACD2、HACD3、HACD4またはPAS2−1である。ある特定の実施形態では、ECRは、CER10、TER、TSC13またはGhECR1、GhECR2である。
ある特定の実施形態では、非天然メタン資化性菌は、極長鎖脂肪アルコールを生成することができる脂肪アルコール生成アシル−CoAレダクターゼをコードする組換え核酸をさらに含む。ある特定の実施形態では、脂肪アルコール生成アシル−CoAレダクターゼは、FAR、CER4(Genbank受託番号JN315781.1)またはMaqu_2220である。ある特定の実施形態では、非天然メタン資化性菌は、極長鎖脂肪アルデヒドを生成することができる脂肪アシル−CoAレダクターゼと、極長鎖脂肪アルコールを生成することができるアルデヒドレダクターゼとをコードする組換え核酸分子をさらに含む。ある特定の実施形態では、脂肪アシル−CoAレダクターゼは、ACR1またはCER3である。ある特定の実施形態では、アルデヒドレダクターゼは、YqhDである。一部の実施形態では、この過程は、C24を超える長さの炭素を含む脂肪アルコールの産生をもたらす。
ある特定の実施形態では、非天然メタン資化性菌は、極長鎖脂肪アルコールを生成することができる脂肪アルコール生成アシル−CoAレダクターゼと、極長鎖脂肪エステルワックスを生成することができるエステルシンターゼとをコードする組換え核酸分子をさらに含む。ある特定の実施形態では、脂肪アルコール生成アシル−CoAレダクターゼは、FAR、CER4(Genbank受託番号JN315781.1)またはMaqu_2220である。ある特定の実施形態では、エステルシンターゼは、WSD1である。一部の実施形態では、この過程は、C24を超える長さの炭素を含む脂肪エステルワックスの産生をもたらす。
ある特定の実施形態では、非天然メタン資化性菌は、極長鎖脂肪アルデヒドを生成することができる脂肪アシル−CoAレダクターゼと、極長鎖アルカンを生成することができるアルデヒドデカルボニラーゼとをコードする組換え核酸分子をさらに含む。ある特定の実施形態では、脂肪アシル−CoAレダクターゼは、ACR1またはCER3である。ある特定の実施形態では、アルデヒドデカルボニラーゼは、CER1またはCER22である。一部の実施形態では、この過程は、C24を超える長さの炭素を含む極長鎖アルカンの産生をもたらす。
ある特定の実施形態では、非天然メタン資化性菌は、極長鎖脂肪アルデヒドを生成することができる脂肪アシル−CoAレダクターゼと、極長鎖アルカンを生成することができるアルデヒドデカルボニラーゼと、極長鎖脂肪二級アルコールを生成することができるアルカンヒドロキシラーゼと、極長鎖ケトンを生成することができるアルコールデヒドロゲナーゼとをコードする組換え核酸分子をさらに含む。ある特定の実施形態では、脂肪アシル−CoAレダクターゼは、ACR1またはCER3である。ある特定の実施形態では、アルデヒドデカルボニラーゼは、CER1またはCER22である。ある特定の実施形態では、アルカンヒドロキシラーゼおよびアルコールデヒドロゲナーゼは、MAH1である。
本開示によって包含される極長炭素鎖化合物を産生することができる上述の組換えC1代謝微生物のいずれかにおいて、非天然メタン資化性菌は、リーダー配列を欠くtesA、UcFatBまたはBTE等、チオエステラーゼをコードする組換え核酸分子をさらに含む。ある特定の実施形態では、内因性チオエステラーゼ活性は、無変更の内因性チオエステラーゼ活性と比較して低下される、最小であるまたは消失される。
本開示によって包含される極長炭素鎖化合物を産生することができる上述の組換えC1代謝微生物のいずれかにおいて、非天然メタン資化性菌は、FadD、yng1またはFAA2等、アシル−CoAシンテターゼをコードする組換え核酸分子をさらに含む。ある特定の実施形態では、内因性アシル−CoAシンテターゼ活性は、無変更の内因性アシル−CoAシンテターゼ活性と比較して低下される、最小であるまたは消失される。
さらなる実施形態では、本開示は、異種KCS、KCR、HCDおよびECRをコードする組換え核酸分子と、異種チオエステラーゼをコードする組換え核酸分子と、異種アシル−CoAシンテターゼをコードする組換え核酸分子とを有する非天然メタン資化性菌であって、C1基質を極長鎖アシル−CoAに変換することができるメタン資化性菌を提供する。ある特定の実施形態では、非天然メタン資化性菌が、脂肪アシル−CoAレダクターゼまたは脂肪アルコール生成アシル−CoAレダクターゼをコードする核酸分子をさらに含む場合、脂肪アシル−CoAレダクターゼまたは脂肪アルコール生成アシル−CoAレダクターゼは、それぞれ未変性脂肪アシル−CoAレダクターゼまたは脂肪アルコール生成アシル−CoAレダクターゼの発現レベルと比較して、該非天然メタン資化性菌において過剰発現される。ある特定の実施形態では、脂肪アルデヒドを生成することができる脂肪アシル−CoAレダクターゼは、ACR1またはCER3である、あるいは脂肪アルコールを生成することができる脂肪アルコール生成アシル−CoAレダクターゼは、FAR、CER4またはMaqu_2220である。ある特定の実施形態では、アシル−CoAシンテターゼは、FadD、yng1またはFAA2である。
FAR酵素またはその機能断片を有することができる上述の組換えC1代謝微生物(例えば、非天然メタン資化性菌)のいずれかは、M.algicola、M.alkaliphilus、M.aquaeolei、M.arcticus、M.bryozoorum、M.daepoensis、M.excellens、M.flavimaris、M.guadonensis、M.hydrocarbonoclasticus、M.koreenis、M.lipolyticus、M.litoralis、M.lutaoensis、M.maritimus、M.sediminum、M.squalenivirans、M.vinifirmusまたはこれらの均等および同義の種等、Marinobacterの種に由来するまたはこれから得ることができる。ある特定の実施形態では、本明細書に開示されている組成物および方法における使用のためのFAR酵素は、海洋性細菌Marinobacter algicola DG893(Genbank受託番号EDM49836.1、FAR「Maa_893」)またはMarinobacter aquaeolei VT8(Genbank受託番号YP_959486.1、FAR「Maqu_2220」)またはOceanobacter sp.RED65(Genbank受託番号EAT13695.1、FAR「Ocs_65」)に由来する。
上述の組換えC1代謝微生物(例えば、非天然メタン資化性菌)のいずれかのなおさらなる実施形態では、FAR酵素またはその機能断片は、FAR_Hch(Hahella chejuensis KCTC 2396、GenBank受託番号YP_436183.1);FAR_Act(海洋性Actinobacterium株PHSC20C1由来、GenBank受託番号EAR25464.1由来)、FAR_Mme(海洋性メタゲノム、GenBank受託番号EDD40059.1)、FAR_Aec(Acromyrmex echinatior、GenBank受託番号EGI61731.1)、FAR_Cfl(Camponotus floridanus、GenBank受託番号EFN62239.1)およびFAR_Sca(Streptomyces cattleya NRRL 8057、GenBank受託番号YP_006052652.1)である。他の実施形態では、FAR酵素またはその機能断片は、Vitis vinifera(FAR_Vvi、GenBank受託番号CAO22305.1またはCAO67776.1)、Desulfatibacillum alkenivorans AK−01(FAR_Dal、GenBank受託番号YP_002430327.1)、Simmondsia chinensis(FAR_Sch、GenBank受託番号AAD38039.1)、Bombyx mori(FAR_Bmo、GenBank受託番号BAC79425.1)、Arabidopsis thaliana(FAR_Ath;GenBank受託番号DQ446732.1またはNM_115529.1)またはOstrinia scapulalis(FAR_Osc;GenBank受託番号EU817405.1)から単離されるまたはこれに由来する。
ある特定の実施形態では、FAR酵素またはその機能断片は、M.algicola DG893またはMarinobacter aquaeolei YT8に由来するまたはこれから得られ、それぞれGenbank受託番号EDM49836.1もしくはYP_959486.1に表記されている配列またはその機能断片と、少なくとも少なくとも75%、少なくとも80%同一、少なくとも85%同一、少なくとも90%同一、少なくとも91%同一、少なくとも92%同一、少なくとも93%同一、少なくとも94%同一、少なくとも95%同一、少なくとも96%同一、少なくとも97%同一、少なくとも98%同一または少なくとも99%同一であるアミノ酸配列を有する。別の実施形態では、組換えコードFAR酵素(recombinant encoded FAR enzyme)は、Genbank受託番号EDM49836.1またはYP_959486.1に表記されている配列と同一のアミノ酸配列を有する。
別の態様では、本開示は、ω−ヒドロキシ脂肪酸を産生するためにP450酵素またはモノオキシゲナーゼ(monoxygenase)酵素をコードする組換え核酸分子をさらに含む、上述のC1代謝微生物または非天然メタン資化性菌のいずれかを提供する。ある特定の実施形態では、内因性アルコールデヒドロゲナーゼ活性は、無変更の内因性アルコールデヒドロゲナーゼ活性と比較して阻害される。他の実施形態では、内因性アルコールデヒドロゲナーゼ活性は、無変更の内因性アルコールデヒドロゲナーゼ活性と比較して増加または上昇して、ジカルボン酸が産生される。
上述の非天然メタン資化性菌のいずれかにおいて、約C25〜C30、C31〜C40、C41〜C60、C61〜C80、C81〜C100、C101〜C120、C121〜C140、C141〜C160、C161〜C180、C181〜C200、C25〜C40、C25〜C50、C25〜C75、C25〜C100、C25〜C125、C25〜C150、C25〜C175またはC25〜C200極長炭素鎖化合物のうち1種または複数種を含む極長炭素鎖化合物が産生される。ある特定の実施形態では、メタン資化性菌は、C25〜C50極長脂肪鎖アルコールを含む極長脂肪アルコールを産生し、このC25〜C50極長脂肪鎖アルコールは、総脂肪アルコールの少なくとも70%を構成する。さらなる実施形態では、メタン資化性菌は、極長分枝鎖脂肪アルコールを含む極長脂肪アルコールを産生する。ある特定の実施形態では、メタン資化性菌は、C25〜C50極長脂肪ワックスエステルを含む極長鎖ワックスエステルを産生し、このC25〜C50極長鎖ワックスエステルは、総ワックスエステルの少なくとも70%を構成する。ある特定の実施形態では、メタン資化性菌は、C25〜C50極長鎖アルカンを含む極長鎖アルカンを産生し、このC25〜C50極長鎖アルカンは、総アルカンの少なくとも70%を構成する。ある特定の実施形態では、メタン資化性菌は、C25〜C50極長鎖ケトンを含む極長鎖ケトンを産生し、このC25〜C50極長鎖ケトンは、総ケトンの少なくとも70%を構成する。
上述の非天然メタン資化性菌のいずれかにおいて、非天然メタン資化性菌によって産生される極長鎖脂肪アシル−CoA、極長鎖脂肪アルデヒド、極長鎖脂肪アルコール、極長鎖脂肪エステルワックス、極長鎖アルカンまたは極長鎖ケトンの量は、約1mg/L〜約500g/Lの範囲である。一定の他の実施形態では、記載されているC1代謝微生物または非天然メタン資化性菌のためのC1基質原料は、メタン、メタノール、ホルムアルデヒド、ギ酸もしくはその塩、一酸化炭素、二酸化炭素、メチルアミン、メチルチオール、メチルハロゲン、天然ガスまたは非従来型天然ガスである。ある特定の実施形態では、C1代謝微生物または非天然メタン資化性菌は、天然ガス、非従来型天然ガスまたはシンガス(またはメタンを含むシンガス)を、C24を超える極長脂肪アシル−CoA、極長脂肪アルデヒド、極長脂肪アルコール、極長鎖脂肪エステルワックス、極長鎖アルカンまたは極長鎖ケトンに変換することができる。
上述のC1代謝微生物または非天然メタン資化性菌のいずれかにおいて、宿主メタン資化性菌は、Methylococcus capsulatus Bath株、Methylomonas 16a(ATCC PTA 2402)、Methylosinus trichosporium OB3b(NRRL B−11,196)、Methylosinus sporium(NRRL B−11,197)、Methylocystis parvus(NRRL B−11,198)、Methylomonas methanica(NRRL B−11,199)、Methylomonas albus(NRRL B−11,200)、Methylobacter capsulatus(NRRL B−11,201)、Methylobacterium organophilum(ATCC 27,886)、Methylomonas sp AJ−3670(FERM P−2400)、Methylocella silvestris、Methylocella palustris(ATCC 700799)、Methylocella tundrae、Methylocystis daltona株SB2、Methylocystis bryophila、Methylocapsa aurea KYG、Methylacidiphilum infernorum、Methylibium petroleiphilum、Methylomicrobium alcaliphilumまたはこれらの組合せであってよい。
上述のC1代謝微生物または非天然メタン資化性菌のいずれかは、組換え核酸分子の導入前または後に、脂肪酸誘導体産生のための改善された特性を有するバリアントを産生するように、選択的条件下で株適応を起こしていてもよい。改善された特性は、増加された成長速度、所望の生成物(例えば、極長鎖炭素化合物)の収率、またはプロセスもしくは培養汚染物質に対する耐性を含むことができる。特定の実施形態では、高成長バリアントC1代謝微生物またはメタン資化性菌は、メタン原料を主要炭素およびエネルギー源として成長することができ、その親細菌、参照細菌または野生型細菌よりも速い指数期成長速度(すなわち、より短い倍加時間)を保有する宿主細菌を含む(例えば、米国特許第6,689,601号を参照)。
本開示の各微生物を、成長を助けることができる異種生物を有する単離培養物として成長させることができるか、またはこれらの細菌のうちの1つもしくはそれより多くを混合培養物が生成されるように組み合わせることができる。なおさらなる実施形態では、本開示のC1代謝非光合成微生物は、偏性C1代謝非光合成微生物である。
C1代謝微生物−極長炭素鎖化合物の産生
別の態様では、本明細書に記載されている通り、非天然C1代謝非光合成微生物をC1基質原料と共に培養すること、および極長炭素鎖化合物を回収することにより、極長炭素鎖化合物を作製するための方法が提供され、このC1代謝非光合成微生物は、β−ケトアシル−CoAシンターゼ、β−ケトアシル−CoAレダクターゼ、β−ヒドロキシアシル−CoAデヒドラターゼおよびエノイル−CoAレダクターゼをコードする1種または複数種の組換え核酸分子を含み、このC1代謝非光合成微生物は、C1基質を、極長鎖アシル−CoA、極長鎖脂肪アルデヒド、極長鎖脂肪アルコール(一級または二級)、極長鎖アルカン、極長鎖ケトンまたはこれらの組合せを含むC24を超える極長炭素鎖化合物に変換する。
別の態様では、本明細書に記載されている通り、非天然C1代謝非光合成微生物をC1基質原料と共に培養すること、および極長炭素鎖化合物を回収することにより、極長炭素鎖化合物を作製するための方法が提供され、このC1代謝非光合成微生物は、β−ケトアシル−CoAシンターゼ、β−ケトアシル−CoAレダクターゼ、β−ヒドロキシアシル−CoAデヒドラターゼおよびエノイル−CoAレダクターゼをコードする1種または複数種の組換え核酸分子を含み、このC1代謝非光合成微生物は、C1基質を、極長鎖アシル−CoA、極長鎖脂肪アルデヒド、極長鎖脂肪アルコール(一級または二級)、極長鎖アルカン、極長鎖ケトンまたはこれらの組合せを含むC24を超える極長炭素鎖化合物に変換する。
ある特定の実施形態では、培養されているC1代謝非光合成微生物は、Methylomonas、Methylobacter、Methylococcus、Methylosinus、Methylocystis、Methylomicrobium、Methanomonas、Methylophilus、Methylobacillus、Methylobacterium、Hyphomicrobium、Xanthobacter、Bacillus、Paracoccus、Nocardia、Arthrobacter、RhodopseudomonasまたはPseudomonasである。さらなる実施形態では、培養されているC1代謝非光合成微生物は、メタン資化性菌またはメチロトローフ等、細菌である。
メタン資化性菌は、Methylomonas sp.16a(ATCC PTA 2402)、Methylosinus trichosporium(NRRL B−11,196)、Methylosinus sporium(NRRL B−11,197)、Methylocystis parvus(NRRL B−11,198)、Methylomonas methanica(NRRL B−11,199)、Methylomonas albus(NRRL B−11,200)、Methylobacter capsulatus(NRRL B−11,201)、Methylobacterium organophilum(ATCC 27,886)、Methylomonas sp.AJ−3670(FERM P−2400)、Methylocella silvestris、Methylacidiphilum infernorum、Methylibium petroleiphilumまたはこれらの組合せであってよい。ある特定の実施形態では、メタン資化性菌培養物は、1種または複数種の異種細菌をさらに含む。
メチロトローフは、Methylobacterium extorquens、Methylobacterium radiotolerans、Methylobacterium populi、Methylobacterium chloromethanicum、Methylobacterium nodulansまたはこれらの組合せであってよい。
さらなる実施形態では、C1代謝微生物または細菌は、天然ガス、非従来型天然ガスまたはシンガスを代謝することができる。ある特定の実施形態では、シンガス代謝細菌は、Clostridium autoethanogenum、Clostridium ljungdahli、Clostridium ragsdalei、Clostridium carboxydivorans、Butyribacterium methylotrophicum、Clostridium woodii、Clostridium neopropanologenまたはこれらの組合せを含む。一定の他の実施形態では、代謝非光合成微生物は、偏性C1代謝非光合成微生物である。一定の他の実施形態では、代謝非光合成微生物は、通性C1代謝非光合成微生物である。
上述の方法のいずれかにおいて、培養されるC1代謝微生物は、極長鎖脂肪アルコールを生成することができるFAR、CER4(Genbank受託番号JN315781.1)またはMaqu_2220等、脂肪アルコール生成脂肪アシル−CoAレダクターゼを含有する。ある特定の実施形態では、培養されているC1代謝微生物は、acr1またはCER3等、脂肪アルデヒドを生成することができる脂肪アシル−CoAレダクターゼを含有する。一部の実施形態では、この過程は、C24を超える長さの炭素を含む脂肪アルコールの産生をもたらす。
本方法によって包含される極長炭素鎖化合物を産生することができる上述の組換えC1代謝微生物のいずれかにおいて、C1代謝微生物は、リーダー配列を欠くtesA、UcFatBまたはBTE等、チオエステラーゼをコードする組換え核酸分子をさらに含む。ある特定の実施形態では、内因性チオエステラーゼ活性は、無変更の内因性チオエステラーゼ活性と比較して低下される、最小であるまたは消失される。
本方法によって包含される極長炭素鎖化合物を産生することができる上述の組換えC1代謝微生物のいずれかにおいて、C1代謝微生物は、FadD、yng1またはFAA2等、アシル−CoAシンテターゼをコードする組換え核酸分子をさらに含む。ある特定の実施形態では、内因性アシル−CoAシンテターゼ活性は、無変更の内因性アシル−CoAシンテターゼ活性と比較して低下される、最小であるまたは消失される。
さらなる実施形態では、本方法は、異種KCSをコードする組換え核酸、異種KCRをコードする組換え核酸、異種HCDをコードする組換え核酸、異種ECRをコードする組換え核酸、異種脂肪アルコール生成アシル−CoAレダクターゼをコードする組換え核酸分子、異種チオエステラーゼをコードする組換え核酸分子および異種アシル−CoAシンテターゼをコードする組換え核酸分子を有するC1代謝微生物であって、C1基質を、C24を超える脂肪アルコールに変換することができるC1代謝微生物を提供する。ある特定の実施形態では、脂肪アルコール生成アシル−CoAレダクターゼは、未変性脂肪アルコール生成アシル−CoAレダクターゼの発現レベルと比較して、培養されるC1代謝微生物において過剰発現される。ある特定の実施形態では、脂肪アルコールを生成することができる脂肪アルコール生成アシル−CoAレダクターゼは、FAR、CER4またはMaqu_2220である。ある特定の実施形態では、アシル−CoAシンテターゼは、FadD、yng1またはFAA2である。
上述の培養されるC1代謝微生物のいずれかにおいて、本方法は、C25〜C30、C31〜C40、C41〜C60、C61〜C80、C81〜C100、C101〜C120、C121〜C140、C141〜C160、C161〜C180、C181〜C200、C25〜C40、C25〜C50、C25〜C75、C25〜C100、C25〜C125、C25〜C150、C25〜C175またはC25〜C200極長炭素鎖化合物のうち1種または複数種を含む極長炭素鎖化合物を産生する。ある特定の実施形態では、C1代謝微生物は、C25〜C50極長脂肪鎖アルコールを含む極長脂肪アルコールを産生し、このC25〜C50極長脂肪鎖アルコールは、総脂肪アルコールの少なくとも70%を構成する。さらなる実施形態では、メタン資化性菌は、極長分枝鎖脂肪アルコールを含む極長脂肪アルコールを産生する。ある特定の実施形態では、C1代謝微生物は、C25〜C50極長脂肪ワックスエステルを含む極長鎖ワックスエステルを産生し、このC25〜C50極長鎖ワックスエステルは、総ワックスエステルの少なくとも70%を構成する。ある特定の実施形態では、C1代謝微生物は、C25〜C50極長鎖アルカンを含む極長鎖アルカンを産生し、このC25〜C50極長鎖アルカンは、総アルカンの少なくとも70%を構成する。ある特定の実施形態では、C1代謝微生物は、C25〜C50極長鎖ケトンを含む極長鎖ケトンを産生し、このC25〜C50極長鎖ケトンは、総ケトンの少なくとも70%を構成する。
上述の培養されるC1代謝微生物のいずれかにおいて、C1代謝微生物によって産生される極長鎖脂肪アシル−CoA、極長鎖脂肪アルデヒド、極長鎖脂肪アルコール、極長鎖ワックスエステル、極長鎖アルカンまたは極長鎖ケトンの量は、約1mg/L〜約500g/Lの範囲である。一定の他の実施形態では、極長炭素鎖化合物を作製する方法において使用されるC1代謝微生物のためのC1基質原料は、メタン、メタノール、ホルムアルデヒド、ギ酸もしくはその塩、一酸化炭素、二酸化炭素、メチルアミン、メチルチオール、メチルハロゲン、天然ガスまたは非従来型天然ガスである。ある特定の実施形態では、C1代謝微生物は、メタンを含む天然ガス、非従来型天然ガスまたはシンガスを、C24を超えるアシル−CoA、脂肪アルデヒド、脂肪アルコール、ワックスエステル、アルカンまたはケトンに変換する。
上述の方法のいずれかにおいて、C1代謝微生物は、発酵槽またはバイオリアクター等、制御された培養ユニットにおいて培養することができる。
コドン最適化
組換えタンパク質の発現は、多くの場合、その本来の宿主の外側では困難である。例えば、コドン使用バイアスにおける変種が、細菌の異なる種にわたって観察されてきた(Sharpら、Nucl. Acids. Res.33巻:1141頁、2005年)。組換えタンパク質の過剰発現は、その未変性宿主内であっても、困難となる場合もある。本発明のある特定の実施形態では、本明細書に記載されている宿主メタン資化性細菌に導入するべき核酸(例えば、脂肪酸伸長酵素をコードする核酸)は、タンパク質発現を増強するためにコドン最適化を受けることができる。コドン最適化は、DNAがコードするポリペプチドを変更しない、宿主細菌種の典型的なコドン使用を反映するための、メタン資化性細菌の形質転換のための核酸の遺伝子またはコード領域におけるコドンの変更を指す。異種宿主における最適な遺伝子発現のためのコドン最適化方法は、以前に記載されている(例えば、Welchら、PLoS One 4巻:e7002頁、2009年;Gustafssonら、Trends Biotechnol.22巻:346頁、2004年;Wuら、Nucl. Acids Res.35巻:D76頁、2007年;Villalobosら、BMC Bioinformatics 7巻:285頁、2006年;米国特許出願公開番号US2011/0111413;US2008/0292918を参照;これらの開示は、その全体が本明細書中に参考として援用される)。
組換えタンパク質の発現は、多くの場合、その本来の宿主の外側では困難である。例えば、コドン使用バイアスにおける変種が、細菌の異なる種にわたって観察されてきた(Sharpら、Nucl. Acids. Res.33巻:1141頁、2005年)。組換えタンパク質の過剰発現は、その未変性宿主内であっても、困難となる場合もある。本発明のある特定の実施形態では、本明細書に記載されている宿主メタン資化性細菌に導入するべき核酸(例えば、脂肪酸伸長酵素をコードする核酸)は、タンパク質発現を増強するためにコドン最適化を受けることができる。コドン最適化は、DNAがコードするポリペプチドを変更しない、宿主細菌種の典型的なコドン使用を反映するための、メタン資化性細菌の形質転換のための核酸の遺伝子またはコード領域におけるコドンの変更を指す。異種宿主における最適な遺伝子発現のためのコドン最適化方法は、以前に記載されている(例えば、Welchら、PLoS One 4巻:e7002頁、2009年;Gustafssonら、Trends Biotechnol.22巻:346頁、2004年;Wuら、Nucl. Acids Res.35巻:D76頁、2007年;Villalobosら、BMC Bioinformatics 7巻:285頁、2006年;米国特許出願公開番号US2011/0111413;US2008/0292918を参照;これらの開示は、その全体が本明細書中に参考として援用される)。
形質転換方法
本明細書に記載されている組換えC1代謝微生物またはメタン資化性細菌のいずれかは、新たなまたは増強された活性(例えば、酵素活性)を有する宿主細菌を提供するために、少なくとも1種の外因性核酸を含むように形質転換することができる、あるいは当該分野で公知の種々の方法を使用して、内因性遺伝子機能を除去または実質的に低下させるように遺伝子改変することができる。
本明細書に記載されている組換えC1代謝微生物またはメタン資化性細菌のいずれかは、新たなまたは増強された活性(例えば、酵素活性)を有する宿主細菌を提供するために、少なくとも1種の外因性核酸を含むように形質転換することができる、あるいは当該分野で公知の種々の方法を使用して、内因性遺伝子機能を除去または実質的に低下させるように遺伝子改変することができる。
形質転換は、遺伝的に安定的な継承をもたらす、宿主細胞のゲノムへの核酸(例えば、外因性核酸)の移行を指す。形質転換された核酸分子を含有する宿主細胞は、「非天然起源の」または「組換え」または「形質転換された」または「トランスジェニック」細胞と称される。
C1代謝微生物、または、メタン資化性細菌内での異種核酸の発現に有用な発現系および発現ベクターは公知である。
C1代謝細菌のエレクトロポレーションは、Toyamaら,FEMS Microbiol.Lett.166:1,1998;Kim and Wood,Appl.Microbiol.Biotechnol.48:105,1997;Yoshidaら,Biotechnol.Lett.23:787,2001,および米国特許出願公開第2008/0026005号に以前に記載されている。
ドナー細胞とレシピエント細胞との直接的接触を含む特定のタイプの形質転換をいう細胞接合は、C1代謝細菌への核酸の移入のためにより頻繁に使用されている。細菌接合は、相互に密接して接触させた「ドナー」細胞および「レシピエント」細胞の混合を含む。接合は、新規に合成されたドナー核酸分子がレシピエント細胞に一方向性に移入される、ドナー細菌とレシピエント細菌との間の細胞質連結の形成によって生じる。接合反応におけるレシピエントは、ドナー細菌からの水平伝播によって核酸を受容することができる任意の細胞である。接合反応におけるドナーは、接合性プラスミド、接合性トランスポゾン、または可動化プラスミドを含む細菌である。ドナープラスミドの物理的移入は、自己伝達性プラスミドによるか、または「ヘルパー」プラスミドの補助によって行うことができる。C1代謝細菌に関する接合は、Stolyarら,Mikrobiologiya 64:686,1995;Motoyamaら,Appl.Micro.Biotech.42:67,1994;Lloydら,Arch.Microbiol.171:364,1999;およびOdomら、PCT公開第02/18617号;Aliら,Microbiol.152:2931,2006に以前に記載されている。
C1代謝細菌における異種核酸の発現は、当該分野で公知である(例えば、米国特許第6,818,424号;米国特許出願公開番号US2003/0003528を参照)。メチロトローフ細菌のMuトランスポゾンに基づく形質転換について記載されている(Akhverdyanら、Appl. Microbiol. Biotechnol.91巻:857頁、2011年)。Methylobacteriumにおける宿主遺伝子の挿入不活性化を伴わない、異種遺伝子のシングルおよびマルチコピー発現のためのmini−Tn7トランスポゾン系について記載されている(米国特許出願公開番号US2008/0026005)。
C1代謝細菌における内因性遺伝子機能を不活性化、ノックアウトまたは欠失するための様々な方法を使用することができる。成長が遅いC1代謝細菌における欠失/挿入変異体を構築するための、自殺ベクターを使用した対立遺伝子交換も、ToyamaおよびLidstrom、Microbiol.144巻:183頁、1998年;Stolyarら、Microbiol.145巻:1235頁、1999年;Aliら、Microbiol.152巻:2931頁、2006年;Van Dienら、Microbiol.149巻:601頁、2003年に記載されている。
外因性核酸の高発現に適した相同または異種プロモーターを利用することができる。例えば、米国特許第7,098,005号は、C1代謝細菌における異種遺伝子発現のための、メタンまたはメタノールの存在下で高度に発現されるプロモーターの使用について記載する。使用することができる追加的なプロモーターは、デオキシ−キシルロースリン酸シンターゼメタノールデヒドロゲナーゼオペロンプロモーター(Springerら、FEMS Microbiol. Lett.160巻:119頁、1998年);PHA合成のためのプロモーター(Foellnerら、Appl. Microbiol. Biotechnol.40巻:284頁、1993年);またはメチロトローフにおける未変性プラスミドから同定されたプロモーター(欧州特許第EP296484)を含む。非未変性プロモーターは、lacオペロンPlacプロモーター(Toyamaら、Microbiol.143巻:595頁、1997年)またはPtrc等のハイブリッドプロモーター(Brosiusら、Gene 27巻:161頁、1984年)を含む。ある特定の実施形態では、宿主メタン資化性細菌におけるグリセロール利用経路酵素をコードする外因性核酸の高い構成的発現のために、プロモーターまたはコドン最適化が使用される。宿主メタン資化性細菌における外因性核酸の調節された発現を利用することもできる。特に、グリセロール利用酵素をコードする外因性核酸の調節された発現が、非天然起源のメタン資化性細菌の成長速度の最適化に望ましい場合がある。グリセロールの非存在下で(例えば、メタンを炭素源とした成長において)、グリセロール利用経路が逆行し、細菌からのグリセロールの分泌をもたらし、これにより成長速度を低下させることが可能である。グリセロールの存在に応答した、グリセロール利用経路酵素をコードする核酸の制御された発現は、種々の炭素源条件における細菌成長を最適化することができる。例えば、米国特許出願公開番号US2010/0221813に記載されている、メチロトローフおよびメタン資化性細菌における組換えタンパク質発現の誘導性/調節可能系を使用することができる。細菌におけるグリセロール利用遺伝子の調節は、十分に確立されている(SchweizerおよびPo、J. Bacteriol.178巻:5215頁、1996年;Abramら、Appl. Environ. Microbiol.74巻:594頁、2008年;Darbonら、Mol. Microbiol.43巻:1039頁、2002年;Weissenbornら、J. Biol. Chem.267巻:6122頁、1992年)。グリセロール利用経路酵素をコードする外因性核酸分子の所望の発現レベルのために、グリセロール利用調節エレメントを宿主メタン資化性細菌において導入または不活性化することもできる。
スクリーニング方法は、Brock、上記参照に開示されている。対立遺伝子交換変異体を同定するための選択方法は、当該分野で公知である(例えば、米国特許出願公開第US2006/0057726、Stolyarら、Microbiol.145巻:1235頁、1999年;およびAliら、Microbiol.152巻:2931頁、2006年を参照)。
培養方法
本明細書に記載されている組換えメタン資化性細菌に対し種々の培養方法論を使用することができる。例えば、メタン資化性細菌は、バッチ培養または連続培養方法によって成長させることができる。ある特定の実施形態では、培養物は、例えば、発酵槽、バイオリアクター、または中空繊維膜バイオリアクターなど、制御された培養ユニットにおいて成長させる。
本明細書に記載されている組換えメタン資化性細菌に対し種々の培養方法論を使用することができる。例えば、メタン資化性細菌は、バッチ培養または連続培養方法によって成長させることができる。ある特定の実施形態では、培養物は、例えば、発酵槽、バイオリアクター、または中空繊維膜バイオリアクターなど、制御された培養ユニットにおいて成長させる。
古典的なバッチ培養方法は、培養の初めに培地の組成が設定され、培養過程において外部からの変更に付されない閉鎖系である。よって、培養過程の初めに、培地に、所望のC1代謝微生物(例えば、メタン資化性菌)を接種し、系に何も加えることなく、成長または代謝活性を行わせる。しかし典型的には、「バッチ」培養は、炭素源の添加に関してバッチであり、pHおよび酸素濃度等の因子の制御に関する試みは頻繁に為される。バッチ系において、系の代謝物およびバイオマス組成は、培養終了のときまでたえず変化する。バッチ培養物内では、細胞は、静的遅滞期から高成長対数期へ、最後に定常期に落ち着き(moderate)、そこで成長速度が減少または停止する。何も処置しなければ、定常期の細胞は、最終的に死ぬ。対数成長期の細胞は多くの場合、いくつかの系における最終生成物または中間体の大量産生に関与する。他の系において、定常期または指数期後の産生を得ることができる。
フェドバッチ(Fed−Batch)系は、標準バッチ系の変種である。フェドバッチ培養過程は、培養が進行するにつれて基質が徐々に添加されるという点を改変した、典型的なバッチ系を含む。異化代謝産物抑制が、細胞の代謝を阻害する傾向があり、培地中に限定された量の基質が存在することが望ましい場合、フェドバッチ系が有用である。フェドバッチ系における実際の基質濃度の測定は、困難であり、したがって、pH、溶存酸素およびCO2等の廃ガスの分圧等、測定可能な因子の変化に基づいて推定される。バッチおよびフェドバッチ培養方法は、当該分野で一般的かつ公知である(例えば、Thomas D. Brock、Biotechnology: A Textbook of Industrial Microbiology、第2版(1989年)Sinauer Associates, Inc.、Sunderland、MA;Deshpande、Appl. Biochem. Biotechnol.36巻:227頁、1992年を参照)。
連続培養は、規定培養培地をバイオリアクターに連続的に添加し、処理のために同量の馴化培地を同時に除去する「開放」系である。連続培養は、一般的に、細胞が主に対数増殖期にあるように細胞の液相密度を高度に一定に維持する。あるいは、連続培養を、固定化細胞を使用して実施することができ、この培養は、炭素および栄養素を連続的に添加し、価値のある生成物、副生成物、および廃棄物を細胞集団から連続的に取り出す。細胞固定化を、天然材料および/または合成材料から構成される広範な固体支持体を使用して行うことができる。
連続培養または半連続培養は、細胞成長または最終生成物濃度に影響を与える一因子またはいずれかの数の因子のモジュレーションを可能にする。例えば、一方法は、炭素源または窒素レベル等、限定された栄養素を固定された比率で維持し、他の全パラメーターをモジュレートさせる。他の系において、培地濁度によって測定される細胞濃度を一定に維持しつつ、成長に影響を与える多数の因子を連続的に変更させることができる。連続系は、定常状態成長条件を維持するように努めるため、培地輸出による細胞損失は、培養における細胞成長速度に対してバランスを保つ必要がある。連続培養過程のために栄養素および成長因子をモジュレートする方法ならびに生成物生成速度を最大化するための技法は、当該分野で周知であり、種々の方法が、Brock、上記参照によって詳述されている。
極長炭素鎖化合物の組成物
背景として、安定同位体測定および物質収支アプローチは、メタンのグローバルなソースおよびシンクを評価するために広く使用されている(Whiticar and Faber,Org.Geochem.10:759,1986;Whiticar,Org.Geochem.16:531,1990を参照のこと)。酸化量を決定するために残留メタンのδ13C値を使用するために、メタンの微生物酸化に原因する同位体分留度を知ることが必要である。例えば、好気性メタン資化性菌は、特異的酵素であるメタンモノオキシゲナーゼ(methane monoxygenase(MMO))によってメタンを代謝することができる。メタン資化性菌は、メタンをメタノールに変換し、その後にホルムアルデヒドに変換する。ホルムアルデヒドを、CO2にさらに酸化して還元等価物(NADH)の形態で細胞にエネルギーを供給することができるか、または光合成生物における炭素同化経路と直接的に類似するRuMPサイクルまたはセリンサイクル(Hanson and Hanson,Microbiol.Rev.60:439,1996)のいずれかによってバイオマスに組み込むことができる。
背景として、安定同位体測定および物質収支アプローチは、メタンのグローバルなソースおよびシンクを評価するために広く使用されている(Whiticar and Faber,Org.Geochem.10:759,1986;Whiticar,Org.Geochem.16:531,1990を参照のこと)。酸化量を決定するために残留メタンのδ13C値を使用するために、メタンの微生物酸化に原因する同位体分留度を知ることが必要である。例えば、好気性メタン資化性菌は、特異的酵素であるメタンモノオキシゲナーゼ(methane monoxygenase(MMO))によってメタンを代謝することができる。メタン資化性菌は、メタンをメタノールに変換し、その後にホルムアルデヒドに変換する。ホルムアルデヒドを、CO2にさらに酸化して還元等価物(NADH)の形態で細胞にエネルギーを供給することができるか、または光合成生物における炭素同化経路と直接的に類似するRuMPサイクルまたはセリンサイクル(Hanson and Hanson,Microbiol.Rev.60:439,1996)のいずれかによってバイオマスに組み込むことができる。
より詳細には、タイプIメタン資化性菌は、バイオマス合成のためにRuMP経路を使用して完全にCH4に由来するバイオマスを生成するのに対して、タイプIIメタン資化性菌は、50〜70%のCH4由来の細胞炭素および30〜50%のCO2由来の細胞炭素を同化するセリン経路を使用する(Hanson and Hanson,1996)。炭素同位体組成の測定方法は、例えば、Templetonら(Geochim.Cosmochim.Acta 70:1739,2006)(その方法全体が本明細書中で参考として援用される)に示されている。
バイオマス由来の油組成物の13C/12C安定炭素比(「デルタ」値‰、δ13Cとして提示)は、使用したC1基質の供給源および純度に応じて変動し得る(例えば、図7を参照)。
バイオマス由来の油組成物の13C/12C安定炭素比(「デルタ」値‰、δ13Cとして提示)は、使用したC1基質の供給源および純度に応じて変動し得る(例えば、図7を参照)。
本明細書に記載されているC1代謝非光合成微生物および方法を使用して産生された極長炭素鎖化合物の組成物は、カーボン・フィンガープリンティングによって、石油化学物質または光合成微生物もしくは植物から産生された極長炭素鎖化合物から区別することができる。ある特定の実施形態では、C24を超える脂肪アシル−CoA、脂肪アルデヒド、脂肪アルコール、脂肪エステルワックス、アルカン、ケトンまたはこれらのいずれかの組合せの組成物は、−30‰未満の、−31‰未満の、−32‰未満の、−33‰未満の、−34‰未満の、−35‰未満の、−36‰未満の、−37‰未満の、−38‰未満の、−39‰未満の、−40‰未満の、−41‰未満の、−42‰未満の、−43‰未満の、−44‰未満の、−45‰未満の、−46‰未満の、−47‰未満の、−48‰未満の、−49‰未満の、−50‰未満の、−51‰未満の、−52‰未満の、−53‰未満の、−54‰未満の、−55‰未満の、−56‰未満の、−57‰未満の、−58‰未満の、−59‰未満の、−60‰未満の、−61‰未満の、−62‰未満の、−63‰未満の、−64‰未満の、−65‰未満の、−66‰未満の、−67‰未満の、−68‰未満の、−69‰未満のまたは−70‰未満のδ13Cを有する。
一部の実施形態では、C1代謝微生物バイオマスは、本明細書に記載されている極長炭素鎖化合物の組成物を含み、この極長炭素鎖化合物含有バイオマスまたは極長炭素鎖化合物の組成物は、約−35‰〜約−50‰、−45‰〜約−35‰または約−50‰〜約−40‰または約−45‰〜約−65‰または約−60‰〜約−70‰または約−30‰〜約−70‰のδ13Cを有する。ある特定の実施形態では、極長炭素鎖化合物の組成物は、少なくとも50%極長炭素鎖化合物を含む。さらなる実施形態では、極長炭素鎖化合物の組成物は、極長鎖脂肪アシル−CoA、極長鎖脂肪アルデヒド、極長鎖脂肪アルコール、極長鎖脂肪エステルワックス、極長鎖アルカン、極長鎖ケトンまたはこれらのいずれかの組合せを含む。なおさらなる実施形態では、極長鎖炭素化合物の組成物は、C25〜C30、C31〜C40、C41〜C60、C61〜C80、C81〜C100、C101〜C120、C121〜C140、C141〜C160、C161〜C180、C181〜C200、C25〜C40、C25〜C50、C25〜C75、C25〜C100、C25〜C125、C25〜C150、C25〜C175またはC25〜C200極長鎖脂肪アシル−CoA、極長鎖脂肪アルデヒド、極長鎖脂肪アルコール、極長鎖脂肪エステルワックス、極長鎖アルカンまたは極長鎖ケトンを含む。またさらなる実施形態では、極長鎖炭素化合物の組成物は、C25〜C40、C25〜C50、C25〜C75、C25〜C100、C25〜C125、C25〜C150、C25〜C175またはC25〜C200の範囲の炭素鎖長を有する大部分(50%w/w超)の極長鎖炭素化合物、またはC25を超える炭素鎖長を有する大部分の極長炭素鎖化合物、または総極長鎖炭素化合物の少なくとも70%が、C25〜C50極長炭素鎖化合物を含む組成物を含有する極長炭素鎖化合物を含む。
さらなる実施形態では、C1代謝非光合成微生物極長鎖化合物含有バイオマスまたは極長鎖化合物含有組成物は、約−30‰未満のδ13Cを有するか、または約−40‰〜約−60‰の範囲である。一定の実施形態では、極長鎖化合物含有バイオマスは使用済み培地と共に組換えC1代謝非光合成微生物を含むか、または極長鎖化合物含有バイオマスは組換えC1代謝非光合成微生物の培養物由来の使用済み培地上清組成物を含み、ここで、極長鎖化合物含有バイオマスまたはそこから得られた極長鎖化合物組成物のδ13Cは約−30‰未満である。一定の他の実施形態では、極長鎖化合物組成物を極長鎖化合物含有バイオマス(このバイオマスは、培養物由来の使用済み培地と共に組換えC1代謝非光合成微生物を含み得る)または組換えC1代謝非光合成微生物の培養物由来の使用済み培地上清組成物から単離、抽出または濃縮する。
ある特定の実施形態では、極長炭素鎖化合物含有バイオマスまたは極長炭素鎖化合物の組成物は、C1代謝非光合成微生物における効率的発現のためにコドン最適化された、本明細書に開示されている1種または複数種のエロンガーゼ複合体酵素を含む組換えC1代謝非光合成微生物のものである。
極長炭素鎖化合物含有バイオマスまたは極長炭素鎖化合物の組成物の生成における使用のための例示的な生物は、細菌等、本開示の組換えC1代謝非光合成微生物のものである。ある特定の実施形態では、極長炭素鎖化合物含有バイオマスまたは極長炭素鎖化合物の組成物は、Methylomonas sp.16a(ATCC PTA 2402)、Methylosinus trichosporium OB3b(NRRL B−11,196)、Methylosinus sporium(NRRL B−11,197)、Methylocystis parvus(NRRL B−11,198)、Methylomonas methanica(NRRL B−11,199)、Methylomonas albus(NRRL B−11,200)、Methylobacter capsulatus Y(NRRL B−11,201)、Methylococcus capsulatus Bath(NCIMB 11132)、Methylobacterium organophilum(ATCC 27,886)、Methylomonas sp.AJ−3670(FERM P−2400)、Methylomicrobium alcaliphilum、Methylocella silvestris、Methylacidiphilum infernorum、Methylibium petroleiphilum、Methylobacterium extorquens、Methylobacterium radiotolerans、Methylobacterium populi、Methylobacterium chloromethanicum、Methylobacterium nodulansまたはこれらのいずれかの組合せ等、メタン資化性菌またはメチロトローフ由来のC1代謝細菌のものである。
さらなる実施形態では、極長炭素鎖化合物含有バイオマスまたは極長炭素鎖化合物の組成物は、Clostridium autoethanogenum、Clostridium ljungdahli、Clostridium ragsdalei、Clostridium carboxydivorans、Butyribacterium methylotrophicum、Clostridium woodii、Clostridium neopropanologenまたはこれらの組合せ等、シンガス代謝細菌である本開示の組換えC1代謝細菌由来のC1代謝細菌のものである。
(実施例1)
C1代謝微生物からの脂質抽出
20℃(すなわち、室温)で、2容量のクロロホルム中1容量のメタノールで構成された抽出溶液(CM溶液)において行われる、Folchの抽出プロトコール(Folchら、J. Biol. Chem.226巻:497頁、1957年)の修正バージョンを使用して、収集された細菌バイオマス内に含有される脂肪酸油組成物を抽出した。新鮮な細菌バイオマス(または−80℃で貯蔵され、その後に解凍された細菌バイオマス)のいずれかの約5g湿細胞重量(WCW)を抽出に使用した。100mL CM溶液を細胞材料に添加し、この混合物を分液漏斗において激しく抽出した。少なくとも10分後に、3相が分離された。抽出された脂質を含有する有機相は、分液漏斗の底に沈降し、これをきれいなガラスビンに輸出した。中間層は、主に溶解した細胞材料を含有し、塩および他の可溶性細胞構成成分を含有する軽い水相から分離することができた。
C1代謝微生物からの脂質抽出
20℃(すなわち、室温)で、2容量のクロロホルム中1容量のメタノールで構成された抽出溶液(CM溶液)において行われる、Folchの抽出プロトコール(Folchら、J. Biol. Chem.226巻:497頁、1957年)の修正バージョンを使用して、収集された細菌バイオマス内に含有される脂肪酸油組成物を抽出した。新鮮な細菌バイオマス(または−80℃で貯蔵され、その後に解凍された細菌バイオマス)のいずれかの約5g湿細胞重量(WCW)を抽出に使用した。100mL CM溶液を細胞材料に添加し、この混合物を分液漏斗において激しく抽出した。少なくとも10分後に、3相が分離された。抽出された脂質を含有する有機相は、分液漏斗の底に沈降し、これをきれいなガラスビンに輸出した。中間層は、主に溶解した細胞材料を含有し、塩および他の可溶性細胞構成成分を含有する軽い水相から分離することができた。
任意選択で、遠心分離機または他の機械的濃縮器材を使用して、水相における固体を濃縮することができる。固体から除去された水をリサイクルすることができる一方、残留水を少々含む固体は、固体処理ユニットに与えることができる。
脂質抽出効率を増強するために、さらに100mLの新鮮CM溶液を、残留する溶解した細胞集団および残留水を含有する分液漏斗に直接添加することにより、第2の抽出ステップを行った。この混合物を徹底的に再度混合し、相を分離させ、2回の抽出から得た底の有機相をプールした。次に、プールされた有機相を分液漏斗において100mL脱イオン水で洗浄して、いかなる残留水溶性材料も除去した。分離された有機画分を、分液漏斗の底から再度単離し、好ましくは酸素の非存在下で加熱して回転蒸発を行うことにより、または窒素気流下55℃での蒸発により溶媒を除去した。
M.trichosporium OB3b、Methylococcus capsulatus BathおよびMethylomonas sp.16aの収集培養物から抽出された凝固した脂肪酸組成物をそれぞれ秤量し、本来の乾燥細胞重量(DCW)の重量分率として表1に示す。これらのデータは、これらのC1代謝微生物由来のDCWの有意な分率が、脂質で構成されていることを示す。
HaraおよびRadin(Anal. Biochem.90巻:420頁、1978年)のヘキサン:イソプロパノール(HIP)抽出方法も使用して、Methylomonas sp.16aバイオマス由来の脂肪酸組成物を抽出した。HIP方法を使用して抽出された脂肪酸組成物の解析は、脂肪酸組成物が、修正Folch方法を使用して抽出された脂肪酸組成物と基本的に同一であったことを示した(データ図示せず)。
(実施例2)
C1代謝微生物由来の脂質の脂肪酸メチルエステル変換
M.capsulatus Bath、M.trichosporium OB3bおよびMethylomonas sp.16a培養バイオマスから抽出された、乾燥固体の形態の脂質画分を、水酸化カリウム(KOH)で個々に加水分解し、単一のステップにおけるメタノールとの反応により、脂肪酸メチルエステル(FAME)に変換した。10mLガラスビン内の約5gの抽出固体脂質を、5mLのトルエン:メタノール(1:1v/v)の0.2M KOH溶液で溶解した。ビンを激しく撹拌し、続いて250rpm、42℃で60分間混合し、その後、溶液を周囲温度まで冷却し、分液漏斗に移した。およそ5mL蒸留水および5mL CM溶液を分液漏斗に添加し、混合し、続いて相を重力によるかまたは遠心分離(3,000rpm、25℃)により5分間分離させた。溶解したグリセロールリン酸エステルを含有する上の水性層を除去する一方、重い油相(底)を採取し、回転蒸発または一定の窒素流により濃縮乾固させた。
C1代謝微生物由来の脂質の脂肪酸メチルエステル変換
M.capsulatus Bath、M.trichosporium OB3bおよびMethylomonas sp.16a培養バイオマスから抽出された、乾燥固体の形態の脂質画分を、水酸化カリウム(KOH)で個々に加水分解し、単一のステップにおけるメタノールとの反応により、脂肪酸メチルエステル(FAME)に変換した。10mLガラスビン内の約5gの抽出固体脂質を、5mLのトルエン:メタノール(1:1v/v)の0.2M KOH溶液で溶解した。ビンを激しく撹拌し、続いて250rpm、42℃で60分間混合し、その後、溶液を周囲温度まで冷却し、分液漏斗に移した。およそ5mL蒸留水および5mL CM溶液を分液漏斗に添加し、混合し、続いて相を重力によるかまたは遠心分離(3,000rpm、25℃)により5分間分離させた。溶解したグリセロールリン酸エステルを含有する上の水性層を除去する一方、重い油相(底)を採取し、回転蒸発または一定の窒素流により濃縮乾固させた。
ガスクロマトグラフ/質量分析計(GC/MS)を使用して、各メタン資化性菌培養物由来の脂質中に存在するFFAおよびFAMEの解析を行った。加水分解/エステル交換反応ステップ前および後に採取された固体を、GC/MS解析の内部標準としてウンデカン酸を含有する300μL酢酸ブチルに溶解した。得られた溶液を5分間14,000rpmで遠心分離して、不溶性残渣を除去した。N,O−Bis(トリメチルシリル)トリフルオロアセトアミドの等容量均等物を、遠心分離ステップから得た上清に添加し、短時間ボルテックスした。質量分析計検出器(HP 5792)を備えるGCに試料をロードし、Agilent HP−5MS GC/MSカラム(30.0m×250μm×0.25μmフィルム厚)を使用して、FFAおよびFAMEを分離した。その標準の保持時間および質量スペクトルの電子イオン化により、FFAおよびFAMEの同一性を確認した。GC/MS方法は、流速1.2mL/minのキャリアーガスとしてヘリウムを利用した。注入ポートを分割比20:1で250℃に保持した。オーブン温度を60℃に1分間保持し、続いて300℃となるまで8℃増加/minを含む温度勾配を行った。質量検出器応答からの全イオンに基づき、各FFAおよびFAMEの%面積を計算した。
加水分解/エステル交換反応の前後に採取された固体残渣をGC/MSによりFFAおよびFAMEに関して解析した(表2を参照)。
表2から明らかな通り、加水分解/エステル交換反応前の抽出された脂質組成物は、豊富な遊離脂肪酸を有し、追加的な脂肪酸が存在するが、FFAは、加水分解/エステル交換反応後に様々な長さの脂肪酸メチルエステルに変換される。これらのデータは、本開示のC1代謝微生物由来の油組成物を精製および使用して、価値の高い分子を作製することができることを示す。
(実施例3)
C1代謝微生物由来の脂質中の安定炭素同位体分布
M.trichosporiumのバイオマスおよび脂質画分の乾燥サンプルを、IsoPrime100 IRMS(Isoprime,Cheadle,UK)を取り付けたCHNOS元素分析器(vario ISOTOPE cube,Elementar,Hanau,Germany)を使用した元素分析器/連続フロー型同位体比質量分析によって、炭素および窒素含有量(%乾燥重量)、ならびに炭素(13C)および窒素(15N)安定同位体比について分析した。発酵槽または血清ボトルで培養したメタン資化性バイオマスのサンプルを遠心分離し、脱イオン水に再懸濁し、0.2〜2mgの炭素(約0.5〜5mg乾燥細胞重量)に対応する体積を5×9mmスズカプセル(Costech Analytical Technologies,Inc.,Valencia,CA)に移し、80℃で24時間乾燥させた。同様に、事前に抽出した脂質画分をクロロホルムに懸濁し、0.1〜1.5mgの炭素を含む体積をスズカプセルに移し、80℃で24時間蒸発乾固させた。0.1mgの炭素を含む標準によって信頼性の有るδ13C値を得た。
C1代謝微生物由来の脂質中の安定炭素同位体分布
M.trichosporiumのバイオマスおよび脂質画分の乾燥サンプルを、IsoPrime100 IRMS(Isoprime,Cheadle,UK)を取り付けたCHNOS元素分析器(vario ISOTOPE cube,Elementar,Hanau,Germany)を使用した元素分析器/連続フロー型同位体比質量分析によって、炭素および窒素含有量(%乾燥重量)、ならびに炭素(13C)および窒素(15N)安定同位体比について分析した。発酵槽または血清ボトルで培養したメタン資化性バイオマスのサンプルを遠心分離し、脱イオン水に再懸濁し、0.2〜2mgの炭素(約0.5〜5mg乾燥細胞重量)に対応する体積を5×9mmスズカプセル(Costech Analytical Technologies,Inc.,Valencia,CA)に移し、80℃で24時間乾燥させた。同様に、事前に抽出した脂質画分をクロロホルムに懸濁し、0.1〜1.5mgの炭素を含む体積をスズカプセルに移し、80℃で24時間蒸発乾固させた。0.1mgの炭素を含む標準によって信頼性の有るδ13C値を得た。
同位体比を「δ」記号(‰)で示し、ここで、百万分の一(per million)偏差方式での、標準の同位体組成と比較した材料の同位体組成はδ13C(またはδ15N)=(Rサンプル/R標準−1)×1,000(式中、Rは重い同位体型対軽い同位体型の分子比である)で与えられる。炭素標準はウィーンピーディーベレムナイト(V−PDB)であり、窒素については大気である。NIST(国立標準技術研究所)は、SRM(標準参照物質)番号1547(モモの葉)を較正標準として使用することを推奨していた。全同位体分析を、カリフォルニア大学バークレー校の安定同位体生物地質化学センターで行った。C同位体およびN同位体分析の長期外部精度は、それぞれ0.10‰および0.15‰である。
M.trichosporium OB3b株を3つの異なる発酵バッチ内のメタンで成長させ、M.capsulatus Bathを2つの異なる発酵バッチ内のメタンで成長させ、Methylomonas sp.16aを単一の発酵バッチ内のメタンで成長させた。これらの各培養物由来のバイオマスを、安定炭素同位体分布(δ13C値;表3を参照のこと)について分析した。
さらに、安定炭素同位体分析を、バイオリアクター中でメタンで成長させたMethylosinus trichosporium OB3b株(Mt OB3b)、Methylococcus capsulatus Bath株(Mc Bath)、およびMethylomonas sp.16a株(Mms 16a)由来のバイオマスおよび対応する脂質画分(表4を参照のこと)について行った。
Mt OB3b株、Mc Bath株、およびMms 16a株由来のバイオマスを、それぞれ94時間(3.14gのDCW/L)、26時間(2.2gのDCW/L)、および39時間(1.14gのDCW/L)で収集した。表4中の脂質についてのδ13C値は、2連の決定値の平均を示す。
実施例4
脂質における安定炭素同位体分布に及ぼすメタン供給源および純度の影響
脂質における安定炭素同位体分布に及ぼすメタン供給源および純度の影響
メタン含有天然ガス成分で成長させたメタン資化性菌を試験するために、100mL特定培地MMS1.0を含む一連の0.5リットル血清ボトルに、メタンおよび空気の1:1(v/v)混合物を供給した同一培地中で成長させた血清ボトルバッチ培養(5%v/v)由来のMethylosinus trichosporium OB3bまたはMethylococcus capsulatus Bathを接種した。MMS1.0培地の組成は以下であった:0.8mMのMgSO4・7H2O、30mMのNaNO3、0.14mMのCaCl2、1.2mMのNaHCO3、2.35mMのKH2PO4、3.4mMのK2HPO4、20.7μMのNa2MoO4・2H2O、6μMのCuSO4・5H2O、10μMのFeIII−Na−EDTA、および1mL/リットルの微量金属溶液(Lあたり以下を含む:500mgのFeSO4・7H2O、400mgのZnSO4・7H2O、20mgのMnCl2・7H2O、50mgのCoCl2・6H2O、10mgのNiCl2・6H2O、15mgのH3BO3、250mgのEDTA)。培地をオートクレーブし、冷却した後に、リン酸塩、重炭酸塩、およびFeIII−Na−EDTAを添加した。培地の最終pHは7.0±0.1であった。
接種したボトルをゴムスリーブストッパーで密封し、滅菌0.45μmフィルターおよび滅菌27G針を通してシリンジを介して添加した60mLメタンガスを注入した。二連の培養物に60mLの体積の(A)純度99%のメタン(グレード2.0,Praxair through Alliance Gas,San Carlos,CA)、(B)天然ガス標準を示す純度70%のメタン(Sigma−Aldrich;9%エタン、6%プロパン、3%メチルプロパン、3%ブタン、および他の微量炭化水素成分も含む)、(C)メタン供給源AおよびBの1:1混合物として送達させた純度85%のメタン;ならびに(D)93%超のメタン(グレード1.3,Specialty Chemical Products,South Houston,TX;インハウス分析ではメタン99%超の組成を示した)をそれぞれ注入した。培養物を、250rpmでの回転振盪を使用して30℃(M.trichosporium OB3b株)または42℃(M.capsulatus Bath)でインキュベートし、1mLのサンプルを取り出してOD600を決定することによっておよそ12時間間隔で成長を測定した。この時ボトルを通気し、上部空間を60mLの各メタン供給源(A、B、C、またはD)および60mLの濃縮酸素(少なくとも純度85%)と置換した。約24時間間隔で、5mLのサンプルを取り出し、遠心分離(8,000rpm、10分間)によって細胞を回収し、次いで、分析するまで−80℃で保存した。
M.trichosporium OB3b株およびM.capsulatus Bath由来のメタン資化性バイオマスについての炭素含有量および窒素含有量(%乾燥重量)ならびに炭素(13C)および窒素(15N)安定同位体比の分析を実施例3に記載の通りに行った。表5は、異なるレベルの純度を有するメタンでボトル培養の種々のバッチで成長させたM.capsulatus Bath由来のバイオマスサンプルについての安定炭素同位体分析の結果を示す。
1つのメタン供給源(A、99%)で成長させたM.capsulatus Bathの平均δ13Cは−41.2±1.2であった一方で、異なるメタン供給源(B、70%)で成長させたM.capsulatus Bathの平均δ13Cは−44.2±1.2であった。メタン供給源AおよびBを混合した場合、−43.8±2.4という中間の平均δ13Cが認められた。これらのデータは、メタン供給源AおよびBで成長させた細胞材料のδ13Cが投入メタンのδ13Cの相違に起因して相互に有意に異なることを示す。しかし、2つのガスの混合物で成長させた細胞は12Cを優先的に利用し、したがって、より負のδ13C値となる傾向を示す。
異なるメタン供給源およびボトル培養の種々のバッチにおいて成長させた2つの異なるメタン資化性菌(Methylococcus capsulatus BathおよびMethylosinus trichosporium OB3b)がδ13C分布の相違を示すかどうかを試験するために、類似の実験を行った(表6を参照のこと)。
第1のメタン供給源(A)で成長させたM.capsulatusの平均δ13Cは−44.5±8.8であった一方で、同一メタン供給源で成長させたM.trichosporiumの平均δ13Cは−47.8±2.0であった。第2のメタン供給源(B)で成長させたM.capsulatusの平均δ13Cが−37.9±0.4であった一方で、M.trichosporiumの平均δ13Cは−39.8±4.5であった。これらのデータは、メタン供給源で成長させた細胞材料のδ13Cが同一のメタン供給源で成長させた異なる株由来の細胞材料のδ13Cと高度に類似することを示す。したがって、細胞材料のδ13Cの実測値は、研究された特定の細菌株の性質よりもむしろ投入ガスの組成に主に依存するようである。
上記の種々の実施形態を組み合わせてさらなる実施形態を得ることができる。本明細書中で言及されており、そして/または出願データシートに列挙されている米国特許、米国特許出願公開、米国特許出願、外国特許、外国特許出願、および非特許刊行物(2014年5月15日に出願された米国仮特許出願第61/994,042号が含まれる)の全ては、その全体が本明細書中で参考として援用される。様々な特許、出願および刊行物の概念を用いて、なおさらに別の実施形態を提供する必要がある場合、実施形態の態様を修正することができる。
上の詳細な記載を踏まえて、上述および他の変更を実施形態に為すことができる。一般に、以下の特許請求の範囲では、使用した用語は、明細書および特許請求の範囲中に開示した特定の実施形態に特許請求の範囲を制限すると解釈すべきでないが、特許請求の範囲は、かかる特許請求の範囲が権利を付与される均等物の全範囲と共に全ての可能な実施形態を含むと解釈すべきである。したがって、特許請求の範囲は、開示により制限されない。
Claims (85)
- 極長炭素鎖化合物を作製するための方法であって、
(a)非天然C1代謝非光合成微生物をC1基質原料と共に培養するステップであって、該C1代謝非光合成微生物が、次の酵素:
(i)β−ケトアシル−CoAシンターゼ(KCS)、
(ii)β−ケトアシル−CoAレダクターゼ(KCR)、
(iii)β−ヒドロキシアシル−CoAデヒドラターゼ(HCD)および
(iv)エノイル−CoAレダクターゼ(ECR)
をコードする1種または複数種の組換え核酸分子を含み、
該C1代謝非光合成微生物が該C1基質を極長炭素鎖化合物に変換する、ステップと、
(b)該極長炭素鎖化合物を回収するステップと
を含む方法。 - 前記極長炭素鎖化合物が、極長鎖脂肪アシル−CoAである、請求項1に記載の方法。
- 前記C1代謝非光合成微生物が、極長鎖脂肪アルコールを生成することができる脂肪アルコール生成アシル−CoAレダクターゼ(FAR)をコードする核酸分子をさらに含み、前記極長炭素鎖化合物が、極長鎖脂肪一級アルコールである、請求項1に記載の方法。
- 前記C1代謝非光合成微生物が、極長鎖脂肪アルデヒドを生成することができる脂肪アシル−CoAレダクターゼと、極長鎖脂肪アルコールを生成することができるアルデヒドレダクターゼとをコードする核酸分子をさらに含み、前記極長炭素鎖化合物が、極長鎖脂肪一級アルコールである、請求項1に記載の方法。
- 前記C1代謝非光合成微生物が、極長鎖脂肪アルデヒドを生成することができる脂肪アシル−CoAレダクターゼをコードする核酸分子(複数可)をさらに含み、前記極長炭素鎖化合物が、極長鎖脂肪アルデヒドである、請求項1に記載の方法。
- 前記C1代謝非光合成微生物が、極長鎖脂肪アルデヒドを生成することができる脂肪アシル−CoAレダクターゼと、極長鎖アルカンを生成することができるアルデヒドデカルボニラーゼとをコードする核酸分子(複数可)を含み、前記極長炭素鎖化合物が、極長鎖アルカンである、請求項1に記載の方法。
- 前記C1代謝非光合成微生物(microoganism)が、極長鎖脂肪アルデヒドを生成することができる脂肪アシル−CoAレダクターゼと、極長鎖アルカンを生成することができるアルデヒドデカルボニラーゼと、極長鎖脂肪二級アルコールを生成することができるアルカンヒドロキシラーゼと、極長鎖ケトンを生成することができるアルコールデヒドロゲナーゼとをコードする核酸分子(複数可)を含み、前記極長炭素鎖化合物が、極長鎖ケトンである、請求項1に記載の方法。
- 前記C1代謝非光合成微生物が、極長鎖脂肪アルコールを生成することができる脂肪アルコール生成アシル−CoAレダクターゼと、極長鎖脂肪エステルワックスを生成することができるエステルシンターゼとをコードする核酸分子(複数可)を含み、前記極長炭素鎖化合物が、極長鎖脂肪エステルワックスである、請求項1に記載の方法。
- 前記KCSが、CER6、Elo1、Fen1/Elo2、Sur4/Elo3、KCS1またはFDHである、請求項1〜8のいずれか一項に記載の方法。
- 前記KCRが、Ybr159w、AYR1、GL8A、GL8BまたはAt1g67730である、請求項1〜8のいずれか一項に記載の方法。
- 前記HCDが、PHS1、PAS2またはPAS2−1である、請求項1〜8のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ECRが、CER10またはTSC13である、請求項1〜8のいずれか一項に記載の方法。
- 前記脂肪アルコール生成アシル−CoAレダクターゼが、FAR、CER4またはMaqu_2220である、請求項3に記載の方法。
- 前記脂肪アシル−CoAレダクターゼが、ACR1またはCER3である、請求項5または6に記載の方法。
- 前記アルデヒドレダクターゼが、アルコールデヒドロゲナーゼであり、該アルコールデヒドロゲナーゼが、YqhDである、請求項4に記載の方法。
- 前記エステルシンターゼが、WSD1である、請求項8に記載の方法。
- 前記アルデヒドデカルボニラーゼが、CER1またはCER22である、請求項6に記載の方法。
- 前記アルカンヒドロキシラーゼが、MAH1である、請求項7に記載の方法。
- 前記アルコールデヒドロゲナーゼが、MAH1である、請求項7に記載の方法。
- 前記C1代謝非光合成微生物が、Methylomonas、Methylobacter、Methylococcus、Methylosinus、Methylocystis、Methylomicrobium、Methanomonas、Methylophilus、Methylobacillus、Methylobacterium、Hyphomicrobium、Xanthobacter、Bacillus、Paracoccus、Nocardia、Arthrobacter、RhodopseudomonasおよびPseudomonasからなる群から選択される、請求項1〜19のいずれかに記載の方法。
- 前記C1代謝非光合成微生物が、細菌である、請求項1〜19のいずれかに記載の方法。
- 前記C1代謝細菌が、メタン資化性菌またはメチロトローフである、請求項1〜19のいずれか一項に記載の方法。
- 前記C1代謝細菌が、メタン資化性菌である、請求項22に記載の方法。
- 前記メタン資化性菌が、Methylomonas、Methylobacter、Methylococcus、Methylosinus、Methylocystis、Methylomicrobium、Methanomonasまたはこれらのいずれかの組合せである、請求項23に記載の方法。
- 前記メタン資化性菌が、Methylomonas sp.16a(ATCC PTA 2402)、Methylosinus trichosporium(NRRL B−11,196)、Methylosinus sporium(NRRL B−11,197)、Methylocystis parvus(NRRL B−11,198)、Methylomonas methanica(NRRL B−11,199)、Methylomonas albus(NRRL B−11,200)、Methylobacter capsulatus(NRRL B−11,201)、Methylobacterium organophilum(ATCC 27,886)、Methylomonas sp.AJ−3670(FERM P−2400)、Methylocella silvestris、Methylacidiphilum infernorum、Methylibium petroleiphilumまたはこれらのいずれかの組合せである、請求項24に記載の方法。
- 前記メタン資化性菌が、Methylosinus trichosporium OB3b、Methylococcus capsulatus Bath、Methylomonas sp.16a、Methylomicrobium alcaliphilumまたはこれらの高成長バリアントである、請求項23に記載の方法。
- 前記培養物が、異種細菌をさらに含む、請求項22〜26のいずれか一項に記載の方法。
- 前記C1代謝細菌が、メチロトローフである、請求項22に記載の方法。
- 前記メチロトローフが、Methylobacterium extorquens、Methylobacterium radiotolerans、Methylobacterium populi、Methylobacterium chloromethanicum、Methylobacterium nodulansまたはこれらのいずれかの組合せである、請求項28に記載の方法。
- 前記C1代謝細菌が、天然ガス、非従来型天然ガスまたはシンガス代謝細菌である、請求項21〜29のいずれか一項に記載の方法。
- 前記シンガス代謝細菌が、Clostridium、Moorella、Pyrococcus、Eubacterium、Desulfobacterium、Carboxydothermus、Acetogenium、Acetobacterium、Acetoanaerobium、Butyribaceterium、Peptostreptococcusまたはこれらのいずれかの組合せである、請求項30に記載の方法。
- 前記シンガス代謝細菌が、Clostridium autoethanogenum、Clostridium ljungdahli、Clostridium ragsdalei、Clostridium carboxydivorans、Butyribacterium methylotrophicum、Clostridium woodii、Clostridium neopropanologenまたはこれらの組合せである、請求項30に記載の方法。
- 前記C1代謝非光合成微生物が、偏性C1代謝非光合成微生物である、先行する請求項のいずれか一項に記載の方法。
- チオエステラーゼをコードする組換え核酸分子をさらに含む、先行する請求項のいずれか一項に記載の方法。
- 前記チオエステラーゼが、シグナルペプチドを欠くtesA、UcFatBまたはBTEである、請求項34に記載の方法。
- 内因性チオエステラーゼ活性が、無変更の内因性チオエステラーゼ活性と比較して低下される、最小であるまたは消失される、請求項34または請求項35に記載の方法。
- アシル−CoAシンテターゼをコードする組換え核酸分子をさらに含む、先行する請求項のいずれかに記載の方法。
- 前記アシル−CoAシンテターゼが、FadD、yng1またはFAA2である、請求項37に記載の方法。
- 内因性アシル−CoAシンテターゼ活性が、無変更の内因性アシル−CoAシンテターゼ活性と比較して低下される、最小であるまたは消失される、請求項37または38に記載の方法。
- 前記C1代謝非光合成微生物が、1種または複数種のC25〜C30、C31〜C40、C41〜C60、C61〜C80、C81〜C100、C101〜C120、C121〜C140、C141〜C160、C161〜C180またはC181〜C200鎖化合物を含む極長炭素鎖化合物を産生する、請求項1〜39のいずれかに記載の方法。
- 前記C1代謝非光合成微生物が、C25〜C50鎖化合物を含む極長炭素鎖化合物を産生する、請求項1〜39のいずれかに記載の方法。
- 前記C1代謝非光合成微生物が、C25〜C50脂肪アルコールを含む脂肪アルコールを産生し、該C25〜C50脂肪アルコールが、総脂肪アルコールの少なくとも70%を構成する、請求項1〜41のいずれか一項に記載の方法。
- 前記C1代謝非光合成微生物が、メタンを含む天然ガス、非従来型天然ガスまたはシンガスを、極長鎖アシル−CoA、極長鎖脂肪アルデヒド、極長鎖脂肪アルコール、極長鎖脂肪エステルワックス、極長鎖アルカン、極長鎖ケトンまたはこれらのいずれかの組合せに変換することができる、先行する請求項のいずれか一項に記載の方法。
- 極長鎖アシル−CoA、極長鎖脂肪アルデヒド、極長鎖脂肪アルコール、極長鎖脂肪エステルワックス、極長鎖アルカン、極長鎖ケトンまたはこれらのいずれかの組合せの産生される量が、約1mg/L〜約500g/Lの範囲である、先行する請求項のいずれか一項に記載の方法。
- 前記C1基質が、メタン、メタノール、ホルムアルデヒド、ギ酸もしくはその塩、一酸化炭素、二酸化炭素、メチルアミン、メチルチオールまたはメチルハロゲンである、先行する請求項のいずれか一項に記載の方法。
- 前記C1基質が、メタン、天然ガス、非従来型天然ガスまたはシンガスである、先行する請求項のいずれか一項に記載の方法。
- 前記C1代謝非光合成微生物が、メタン資化性菌細菌であり、前記C1基質が、メタンであり、前記細菌が、好気性条件下で培養される、請求項1〜19のいずれか一項に記載の方法。
- 制御された培養ユニットにおいてC1代謝非光合成微生物を培養するステップをさらに含む、先行する請求項のいずれか一項に記載の方法。
- 前記C1基質が、メタン、メタノール、ホルムアルデヒド、ギ酸もしくはその塩、一酸化炭素、二酸化炭素、天然ガス、非従来型天然ガス、シンガス、メチルアミン、メチルチオールまたはメチルハロゲンである、請求項48に記載の方法。
- 前記制御された培養ユニットが、発酵槽またはバイオリアクターである、請求項48に記載の方法。
- 次の酵素:
(i)β−ケトアシル−CoAシンターゼ(KCS)、
(ii)β−ケトアシル−CoAレダクターゼ(KCR)、
(iii)β−ヒドロキシアシル−CoAデヒドラターゼ(HCD)および
(iv)エノイル−CoAレダクターゼ(ECR)
をコードする1種または複数種の組換え核酸分子を含む非天然メタン資化性菌であって、C1基質を、極長鎖脂肪アシル−CoA、極長鎖脂肪アルデヒド、極長鎖脂肪一級アルコール、極長鎖脂肪エステルワックス、極長鎖アルカン、極長鎖脂肪二級アルコール、極長鎖ケトンまたはこれらのいずれかの組合せから選択される極長炭素鎖化合物に変換することができる非天然メタン資化性菌。 - 前記KCSが、CER6、Elo1、Fen1/Elo2、Sur4/Elo3、KCS1またはFDHである、請求項51に記載の非天然メタン資化性菌。
- 前記非天然メタン資化性菌が、少なくとも2種の異なるKCS酵素をコードする組換え核酸分子を含む、請求項51または52に記載の非天然メタン資化性菌。
- 前記KCRが、Ybr159w、AYR1、GL8A、GL8BまたはAt1g67730である、請求項51〜53のいずれか一項に記載の非天然メタン資化性菌。
- 前記HCDが、PHS1、PAS2またはPAS2−1である、請求項51〜54のいずれか一項に記載の非天然メタン資化性菌。
- 前記ECRが、CER10またはTSC13である、請求項51〜55のいずれか一項に記載の非天然メタン資化性菌。
- 極長鎖脂肪アルコールを生成することができる脂肪アルコール生成アシル−CoAレダクターゼをコードする組換え核酸分子をさらに含む、請求項51〜56のいずれか一項に記載の非天然メタン資化性菌。
- 前記脂肪アルコール生成アシル−CoAレダクターゼが、FAR、CER4またはMaqu_2220である、請求項57に記載の非天然メタン資化性菌。
- 極長鎖脂肪アルデヒドを生成することができる脂肪アシル−CoAレダクターゼと、極長鎖脂肪アルコールを生成することができるアルデヒドレダクターゼとをコードする組換え核酸分子をさらに含む、請求項51〜56のいずれか一項に記載の非天然メタン資化性菌。
- 前記脂肪アシル−CoAレダクターゼが、ACR1またはCER3である、請求項59に記載の非天然メタン資化性菌。
- 前記アルデヒドレダクターゼが、YqhDである、請求項59または60に記載の非天然メタン資化性菌。
- 極長鎖脂肪アルコールを生成することができる脂肪アルコール生成アシル−CoAレダクターゼと、極長鎖脂肪エステルワックスを生成することができるエステルシンターゼとをコードする組換え核酸分子をさらに含む、請求項51〜56のいずれか一項に記載の非天然メタン資化性菌。
- 前記脂肪アルコール生成アシル−CoAレダクターゼが、FAR、CER4またはMaqu_2220である、請求項62に記載の非天然メタン資化性菌。
- 前記エステルシンターゼが、WSD1である、請求項62または63に記載の非天然メタン資化性菌。
- 極長鎖脂肪アルデヒドを生成することができる脂肪アシル−CoAレダクターゼと、極長鎖アルカンを生成することができるアルデヒドデカルボニラーゼとをコードする組換え核酸分子をさらに含む、請求項51〜56のいずれか一項に記載の非天然メタン資化性菌。
- 前記脂肪アシル−CoAレダクターゼが、ACR1またはCER3である、請求項65に記載の非天然メタン資化性菌。
- 前記アルデヒドデカルボニラーゼが、CER1またはCER22である、請求項65または66に記載の非天然メタン資化性菌。
- 極長鎖脂肪アルデヒドを生成することができる脂肪アシル−CoAレダクターゼと、極長鎖アルカンを生成することができるアルデヒドデカルボニラーゼと、極長鎖脂肪二級アルコールを生成することができるアルカンヒドロキシラーゼと、極長鎖ケトンを生成することができるアルコールデヒドロゲナーゼとをコードする核酸分子をさらに含む、請求項52〜57のいずれか一項に記載の非天然メタン資化性菌。
- 前記脂肪アシル−CoAレダクターゼが、ACR1またはCER3である、請求項68に記載の非天然メタン資化性菌。
- 前記アルデヒドデカルボニラーゼが、CER1またはCER22である、請求項68または69に記載の非天然メタン資化性菌。
- 前記アルカンヒドロキシラーゼおよびアルコールデヒドロゲナーゼが、MAH1である、請求項68〜70のいずれか一項に記載の非天然メタン資化性菌。
- チオエステラーゼをコードする組換え核酸分子をさらに含む、請求項51〜71のいずれか一項に記載の非天然メタン資化性菌。
- 前記チオエステラーゼが、リーダー配列を欠くtesA、UcFatBまたはBTEである、請求項72に記載の非天然メタン資化性菌。
- 内因性チオエステラーゼ活性が、無変更の内因性チオエステラーゼ活性と比較して低下される、最小であるまたは消失される、請求項72または73に記載の非天然メタン資化性菌。
- アシル−CoAシンテターゼをコードする組換え核酸分子をさらに含む、請求項51〜74のいずれか一項に記載の非天然メタン資化性菌。
- 前記アシル−CoAシンテターゼが、FadD、yng1またはFAA2である、請求項75に記載の非天然メタン資化性菌。
- 内因性アシル−CoAシンテターゼ活性が、無変更の内因性アシル−CoAシンテターゼ活性と比較して低下される、最小であるまたは消失される、請求項75または76に記載の非天然メタン資化性菌。
- 前記メタン資化性菌が、1種または複数種のC25〜C30、C31〜C40、C41〜C60、C61〜C80、C81〜C100、C101〜C120、C121〜C140、C141〜C160、C161〜C180またはC181〜C200鎖化合物を含む極長炭素鎖化合物を産生する、請求項51〜77のいずれか一項に記載の非天然メタン資化性菌。
- 前記メタン資化性菌が、C25〜C50鎖化合物を含む極長炭素鎖化合物を産生する、請求項51〜77のいずれか一項に記載の非天然メタン資化性菌。
- 前記メタン資化性菌が、C25〜C50脂肪ワックスエステルを含む脂肪ワックスエステルを産生し、該C25〜C50脂肪ワックスエステルが、総脂肪ワックスエステルの少なくとも70%を構成する、請求項51〜77のいずれか一項に記載の非天然メタン資化性菌。
- 産生される極長鎖脂肪アシル−CoA、極長鎖脂肪アルデヒド、極長鎖脂肪一級アルコール、極長鎖脂肪エステルワックス、極長鎖アルカン、極長鎖脂肪二級アルコール、極長鎖ケトンまたはこれらのいずれかの組合せの量が、約1mg/L〜約500g/Lの範囲である、請求項51〜80のいずれか一項に記載の非天然メタン資化性菌。
- 前記C1基質が、メタン、メタノール、ホルムアルデヒド、ギ酸もしくはその塩、一酸化炭素、二酸化炭素、メチルアミン、メチルチオールまたはメチルハロゲンである、請求項51〜81のいずれか一項に記載の非天然メタン資化性菌。
- 前記C1基質が、メタン、天然ガスまたは非従来型天然ガスである、請求項51〜81のいずれか一項に記載の非天然メタン資化性菌。
- 前記メタン資化性菌が、メタンを含む天然ガス、非従来型天然ガスまたはシンガスを、C25〜C50極長鎖脂肪アルデヒド、極長鎖脂肪一級アルコール、極長鎖脂肪ワックスエステル、極長鎖アルカン、極長鎖脂肪二級アルコールまたは極長鎖ケトンに変換することができる、請求項82に記載の非天然メタン資化性菌。
- 前記宿主メタン資化性菌が、Methylococcus capsulatus Bath株、Methylomonas 16a(ATCC PTA 2402)、Methylosinus trichosporium OB3b(NRRL B−11,196)、Methylosinus sporium(NRRL B−11,197)、Methylocystis parvus(NRRL B−11,198)、Methylomonas methanica(NRRL B−11,199)、Methylomonas albus(NRRL B−11,200)、Methylobacter capsulatus(NRRL B−11,201)、Methylobacterium organophilum(ATCC 27,886)、Methylomonas sp AJ−3670(FERM P−2400)、Methylocella silvestris、Methylocella palustris(ATCC 700799)、Methylocella tundrae、Methylocystis daltona株SB2、Methylocystis bryophila、Methylocapsa aurea KYG、Methylacidiphilum infernorum、Methylibium petroleiphilum、Methylomicrobium alcaliphilumまたはこれらのいずれかの組合せである、請求項51〜84のいずれか一項に記載の非天然メタン資化性菌。
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