KR20170008255A - 초장 탄소쇄 화합물의 생물학적 생성 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 공급원료로서 메탄 또는 천연가스와 같은 C₁ 기질을 이용하는 재조합 C₁ 대사 미생물로부터로부터 초장 탄소쇄 화합물 (C₂₄ 초과), 예컨대 지방 아실-CoA, 지방 알데하이드, 지방 알콜, 지방 에스테르 왁스, 알칸 및 케톤을 생물학적으로 생성하기 위한 조성물 및 방법을 제공한다.

Description

초장 탄소쇄 화합물의 생물학적 생성 방법{Methods for biological production of very long carbon chain compounds}

본 발명은 초장쇄 탄소 화합물의 생물학적 생성을 위한 조성물 및 방법, 보다 구체적으로 C₁ 기질 (예컨대 메탄 또는 천연 가스)로부터 초장쇄 지방 알콜, 초장쇄 알데하이드, 초장쇄 알칸, 초장쇄 케톤, 또는 초장쇄 지방 에스테르 왁스를 생성하기 위한 재조합 C₁ 대사 미생물의 사용을 제공한다.

초장쇄 지방산은 24개 초과 지방족 말단을 갖는 지방산이다. 이들은 말단 탄소에 부착된 극성 (친수성) 카복실기 및 비극성 (친유성) 포화 또는 불포화 탄화수소쇄로 구성된다. 초장쇄 지방산은 왁스로 도입될 수 있거나, 알칸, 일차 및 이차 알콜, 케톤, 알데하이드, 아실-에스테르를 비롯해 왁스에서 발견되는 다른 지방족 탄화수소에 대한 전구체로서 기능할 수 있다. 초장쇄 지방산 및 그의 유도체는 건강 보조 식품, 식품, 의약품 제제, 윤활제, 세정제, 계면활성제, 화장품, 나일론, 코팅, 접착제 및 바이오연료의 생산에 사용될 수 있는 고가치 화학 물질이다.

천연 공급원 및 화학 합성에서 초장 지방산의 공급은 상업적 요구에 충분하지 않다. 천연 공급원 또는 화학적 합성을 통해 초장 지방산을 수득하는 것은 열악한 제조 환경, 비싼 출발물질, 제한된 환경 자원의 사용을 필요로 하거나, 해로운 부산물을 생성한다. 초장쇄 지방산을 생명공학적으로 생성하는데 많은 노력을 들이고 있다. 많은 작업은 형질전환 식물의 종자유 생산에 초점을 맞추고 있다. 대장균 및 다양한 효모와 같은 재조합 미생물이 또한 바이오매스 유래의 공급원료를 초장쇄 지방산으로 전환하는 데 사용되어 왔다. 그러나, 비교적 저렴한 셀룰로오스 바이오매스를 원료로 사용하는 경우에도, 탄수화물 공급원료 매스의 절반 이상이 산소로 구성되며, 이는 전환 효율에 상당한 제한을 나타낸다. 초장쇄 지방산 및 이들의 유도체 (예컨대 초장쇄 지방 알콜, 초장쇄 지방 알데하이드, 초장쇄 알칸, 초장쇄 왁스 에스테르 및 초장쇄 케톤)는, 탄수화물 공급 원료보다 현저하게 낮은 산소 함량을 가지고 있고, 이는 폐기물로 제거해야 하는 탄수화물 산소가 많이 있기 때문에 이론적 수율을 제한한다. 따라서, 탄수화물 공급 원료로부터 초장쇄 지방산 및 이들의 유도체의 경제적 대가는 엄청나게 비싸다.

초장쇄 지방산 및 관련 화합물의 제조를 위한 탄수화물 기반 발효법에 관련한 제한의 관점에서, 초장쇄 지방산의 비용 효율적이고 환경 친화적인 대안의 제조 방법에 대한 필요성이 존재한다. 본 발명은 이러한 필요성을 충족하고, 또한 다른 관련된 이점을 제공한다.

개요

특정 측면에서, 본 개시내용은 (A) 비-천연 C₁ 대사 비-광합성 미생물을 C₁ 기질 공급원료와 배양시키는 단계; 및 (B) 초장쇄 탄소 화합물을 회수하는 단계에 의해 초장 탄소쇄 화합물을 제조하는 방법에 관한 것으로서, 여기서 C₁　대사 비광합성 미생물은 β-케토아실-CoA 신타아제 (KCS); β-케토아실-CoA 리덕타아제 (KCR); β-하이드록시 아실-CoA 데하이드라타아제 (HCD); 에노일-CoA 리덕타아제 (ECR)의 효소들을 코딩하는 하나 이상의 재조합 핵산 분자를 포함하고; C₁　대사 비광합성 미생물은 초장 탄소쇄 화합물을 초장쇄 지방 아실-CoA, 초장쇄 지방 알데하이드, 초장쇄 지방 알콜, 초장쇄 지방 에스테르 왁스, 초장쇄 알칸, 초장쇄 케톤, 또는 그의 조합을 포함하는 C₁　기질로 전환시킨다.

관련 측면에서, 본 개시내용은 β-케토아실-CoA 신타아제 (KCS); β-케토아실-CoA 리덕타아제 (KCR); β-하이드록시 아실-CoA 데하이드라타아제 (HCD); 에노일-CoA 리덕타아제 (ECR)의 효소들을 코딩하는 하나 이상의 재조합 핵산 분자를 포함하며; C₁ 기질을 초장쇄 지방 아실-CoA, 초장쇄 지방 알데하이드, 초장쇄 지방 알콜, 초장쇄 지방 에스테르 왁스, 초장쇄 알칸, 초장쇄 케톤, 또는 그의 조합을 포함하는 초장 탄소쇄 화합물로 전환시킬 수 있는 비-천연 메탄영양체를 제공한다. 특정 구체예에서, 지방 아실-CoA 리덕타아제를 코딩하는 재조합 핵산 분자를 함유하는 비-천연 메탄영양체가 제공되며, 상기 메탄영양체는 C₁ 기질을 초장쇄 지방 알데하이드로 전환시킬 수 있다.

특정 구체예에서, 아실-CoA 리덕타아제를 형성하는 이종 지방 알콜을 코딩하는 재조합 핵산 분자, 또는 이종 지방 아실-CoA 리덕타아제를 코딩하는 재조합 핵산 분자, 및 이종 알데하이드 리덕타아제를 코딩하는 재조합 핵산 분자를 함유하는 비-천연 메탄영양체가 제공되며, 상기 메탄영양체는 C₁ 기질을 초장쇄 지방 알콜로 전환시킬 수 있다.

추가 구체예에서, 아실-CoA 리덕타아제를 형성하는 이종 지방 알콜을 코딩하는 재조합 핵산 분자 및 이종 에스테르 신타아제를 코딩하는 재조합 핵산 분자를 함유하는 비-천연 메탄영양체가 제공되며, 상기 메탄영양체는 C₁ 기질을 초장쇄 지방 에스테르 왁스로 전환시킬 수 있다.

특정 구체예에서, 이종 지방 아실-CoA 리덕타아제를 코딩하는 재조합 핵산 분자 및 이종 알데하이드 데카보닐라아제를 코딩하는 재조합 핵산 분자를 함유하는 비-천연 메탄영양체가 제공되며, 상기 메탄영양체는 C₁ 기질을 초장쇄 알칸으로 전환시킬 수 있다.

추가 구체예에서, 이종 지방 아실-CoA 리덕타아제를 코딩하는 재조합 핵산 분자, 이종 알데하이드 데카보닐라아제를 코딩하는 재조합 핵산 분자, 및 이종 알칸 하이드록실라아제를 코딩하는 재조합 핵산 분자를 함유하는 비-천연 메탄영양체가 제공되며, 상기 메탄영양체는 C₁ 기질을 초장쇄 케톤으로 전환시킬 수 있다.

다른 측면에서, 본 개시내용은 초장쇄 탄소 화합물 조성물을 포함하는 C₁ 대사 미생물 바이오매스를 제공하며, 초장 탄소쇄 화합물을 함유하는 바이오매스 또는 그것으로부터의 초장 탄소쇄 화합물 조성물은 약 -35‰ 내지 약 -50‰, -45‰ 내지 약 -35‰, 또는 약 -50‰ 내지 약 -40‰, 또는 약 -45‰ 내지 약 -65‰, 또는 약 -60‰ 내지 약 -70‰, 또는 약 -30‰ 내지 약 -70‰의 δ³C를 가진다. 특정 구체예에서, 초장 탄소쇄 화합물 조성물은 초장쇄 지방 아실-CoA, 초장쇄 지방 알데하이드, 초장쇄 지방 알콜, 초장쇄 지방 에스테르 왁스, 초장쇄 알칸, 초장쇄 케톤, 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다. 또한 추가 구체예에서, 초장 탄소쇄 화합물 조성물은 C₂₅-C₅₀ 초장쇄 지방 아실-CoA, C₂₅-C₅₀ 초장쇄 지방 알데하이드, C₂₅-C₅₀ 초장쇄 지방 알콜, C₂₅-C₅₀ 초장쇄 지방 에스테르 왁스, C₂₅-C₅₀ 초장쇄 알칸, 또는 C₂₅-C₅₀ 초장쇄 케톤을 포함한다. 또한 추가 구체예에서, 초장 탄소쇄 화합물 조성물은 탄소쇄 길이가 C₂₅-C₅₀의 범위에 있는 대다수의(50% w/w 초과)의 초장 탄소쇄 화합물, 또는 탄소쇄 길이가 C₂₄ 초과인 대다수의 초장 탄소쇄 화합물, 또는 전체 초장 탄소쇄 화합물의 적어도 70%가 C₂₅-C₅₀ 초장 탄소쇄 화합물을 포함하는 초장 탄소쇄 화합물을 포함한다.

도 1은 초장쇄 아실 CoA 생성에 대한 지방산 신장 경로의 개요를 나타낸다.
도 2는 초장쇄 지방 일차 알콜 생성의 개요를 나타낸다.
도 3은 초장쇄 지방 에스테르 왁스 생성의 개요를 나타낸다.
도 4는 초장쇄 알칸 생성 및 초장쇄 케톤 생성의 개요를 나타낸다.
도 5는 지방 알콜 생성에 대한 아실-CoA 의존성 FAR 경로의 개요를 나타낸다.
도 6은 지방 알콜 생성에 대한 아실-CoA 독립성 FAR 경로의 개요를 나타낸다.
도 7은 지방 알콜 생성에 대한 아실-CoA 독립성 CAR 경로의 개요를 나타낸다.
도 8은 ω-하이드록시 지방산 생성 경로의 개요를 나타낸다.
도 9는 디카복실산 생성 경로의 개요를 나타낸다.
도 10은 지방 에스테르 생성에 대한 아실-CoA 의존성 FAR 경로의 개요를 나타낸다.
도 11은 다양한 탄소 공급원의 δ¹³C 분포 개략도를 나타낸다.

본 개시내용은 초장쇄 탄소 화합물을 제조하기 위한 조성물 및 방법을 제공한다. 예를 들어, 재조합 C₁ 대사 미생물을 C₁ 기질 공급원료(예를 들어, 메탄)와 배양하여 C₂₄ 초과 지방 아실-CoA, 지방 알데하이드, 지방 알콜, 지방 에스테르 왁스, 알칸, 케톤, 또는 이들의 임의의 조합을 생성한다. 이 새로운 접근은, 예를 들어 건강 보조 식품, 식품, 의약품 제제, 윤활제, 세정제, 계면활성제, 화장품, 나일론, 코팅재, 접착제 또는 바이오연료의 제조에서 사용을 위한 초장쇄 지방산 유도체를 제조하기 위한 새로운 숙주 시스템으로서 메틸영양체 또는 메탄영양체 박테리아의 사용을 허용한다.

배경기술의 방법에 의해, 천연가스를 포함하는 다양한 공급원으로부터의 메탄은 풍부한 내수용 자원을 나타낸다. 상기 언급한 바와 같이, 탄수화물계 공급원료는 그의 질량의 절반 이상을 산소로 함유하는데, 이는 초장쇄 지방산이 이들 공급원료보다 상당히 더 낮은 산소 함량을 가지기 때문에, 전환 효율이 상당한 제한된다. 현재 시스템의 제한을 처리하기 위한 해결책은 전환을 위한 공급원료로서 메탄 또는 천연가스를 이용하는 것이다. 천연가스로부터의 메탄은 싸고 풍부하며, 중요하게는 산소를 함유하지 않는데, 이는 이론적 전환 효율을 상당히 개선시킨다. 더 나아가, C₁ 탄소 공급원은 탄수화물 공급원료에 비해 싸고 풍부한데, 이는 초장쇄 지방산 생성의 자본 환경을 개선시키는데 기여한다.

초장쇄 지방산 생성은 피부보호막 형성, 망막 기능, 염증 해소, 미엘린 유지, 정자 발생 및 성숙, 간 항상성, 소공내 높은 막 왜곡, GPI 지질 앵커 합성, 및 식물 종자에서 트리아실글리세롤의 저장과 같은 다양한 생리 기능에 필요하기 때문에 많은 상이한 유기체에서 중요한 경로이다. 초장쇄 지방산은 또한 식물 각피 왁스 및 막 스핑고지질의 성분이다. 지방산은 아실-CoA 형태로 연장되며, 여기서 지방산은 티오에스테르 결합을 통해 조효소 A에 연결된다. 본 개시에서, 대사 공학적 기법은, 예를 들어 지방 아실-CoA 기질 (예를 들어, C₁₆ 또는 C₁₈ 지방 아실-CoA)로부터 초장쇄 지방 아실-CoA의 생성을 허용하도록 지방산 신장 경로 (예를 들어, 하나 이상의 β-케토아실-CoA 신타아제, β-케토아실-CoA 리덕타아제, β-하이드록시아실-CoA 데하이드라타아제, 및 에노일-CoA 리덕타아제)을 제공하기 위해 적용된다. 추가적인 구체예에서, 초장쇄 지방 아실-CoA는 또한 알칸 형성 경로의 다양한 효소 도입에 의해 초장쇄 지방 알데하이드, 초장쇄 알칸, 초장쇄 지방 이차 알콜, 초장쇄 케톤, 또는 이들의 임의의 조합을 생성하도록 변경된다. 다른 구체예에서, 초장쇄 지방 아실-CoA는 알콜 형성 경로의 다양한 효소 도입에 의해 초장쇄 알데하이드, 초장쇄 지방 일차 알콜, 초장쇄 왁스 에스테르, 또는 이들의 임의의 조합을 생성하도록 변경된다.

일 측면에서, 본 개시내용은 C₁ 기질 공급원료의 존재하에 비-천연 C₁ 대사 비-광합성 미생물을 배양시키는 단계 및 초장쇄 탄소 화합물을 회수하는 단계를 포함하는 초장 탄소쇄 화합물의 제조 방법을 제공하며, 상기 C₁ 대사 비-광합성 미생물은 β-케토아실-CoA 신타아제, β-케토아실-CoA 리덕타아제, β-하이드록시아실-CoA 데하이드라타아제, 및 에노일-CoA 리덕타아제의 효소들을 코딩하는 하나 이상의 재조합 핵산 분자를 포함하고, C₁ 기질을 초장 탄소쇄 화합물로 전환시킨다. 다른 측면에서, 본 개시내용은 β-케토아실-CoA 신타아제, β-케토아실-CoA 리덕타아제, β-하이드록시아실-CoA 데하이드라타아제, 및 에노일-CoA 리덕타아제의 효소들을 코딩하는 하나 이상의 재조합 핵산 분자를 포함하는 비-천연 메탄영양체를 제공하며, 여기서 메탄영양체는 C₁ 기질을 초장 탄소쇄 화합물로 전환시킬 수 있다.

본 개시내용을 더 상세하게 제시하기 전에, 본 명세서에 사용된 특정 용어의 정의를 제공하는 것이 본 개시내용의 이해에 도움을 줄 수 있다. 추가적인 정의는 본 개시내용 전반에 제시된다.

본 설명에서, 임의의 농도 범위, 백분율 범위, 비율 범위 또는 정수 범위는, 달리 표시되지 않는 한, 인용된 범위 내의 임의의 정수 값, 및 적절하다면 이의 분수(예컨대, 정수의 1/10 및 1/100)를 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 또한, 중합체 서브유닛, 크기 또는 두께와 같은 임의의 물리적 특징에 관해 본 명세서에 인용된 임의의 수 범위는, 달리 표시되지 않는 한, 인용된 범위 내에서 임의의 정수를 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 본원에 사용된 바와 같은 용어 "약"은, 달리 표시되지 않는 한, 표시한 범위, 값 또는 구조의 ± 20%를 의미한다. 용어 "본질적으로 이루어지는"은 구체화된 물질 또는 단계로 또는 청구된 발명의 기본적 및 신규한 특징에 실질적으로 영향을 미치지 않는 것으로 청구범위의 범주를 제한한다. 본 명세서에 사용된 바와 같은 단수의 용어는 열거된 성분 중 "하나 이상"을 지칭하는 것으로 이해되어야 한다. 대안의(예를 들어, "또는")의 사용은 대안 중 하나, 둘 다 또는 이들의 임의의 조합을 의미하는 것으로 이해되어야 한다. 본원에 사용된 바와 같은 용어 "포함한다", "가지다" 및 "함유한다"는 동의어로 사용되며, 이들 용어 및 변형은 비제한적으로 해석되는 것으로 의도된다.

본원에 사용된 바와 같은 용어 "재조합" 또는 "비-천연"은 적어도 하나의 유전적 변경을 포함하거나 또는 외인성 핵산의 도입에 의해 변형된 유기체, 미생물, 세포, 핵산 분자, 또는 벡터를 지칭하거나, 또는 이러한 변경 또는 변형이 유전적 조작에 의해 도입되는 경우, 외인성 핵산 분자 또는 유전자가 제어될 수 있도록 변경된(altered) 세포를 지칭한다. 유전적 변경은, 예를 들어 단백질 또는 효소를 코딩하는 발현가능한 핵산 분자를 도입하는 변형, 다른 핵산 첨가, 핵산 결실, 핵산 치환 또는 세포의 유전자 물질의 다른 기능적 파괴를 포함한다. 이러한 변형은, 예를 들어, 참조로 하는 종에 대한 이종성 또는 상동성 폴리펩티드에 대해 코딩 영역 및 이의 기능적 단편을 포함한다. 추가적인 변형은, 예를 들어, 비-코딩 조절 영역을 포함하며, 이때 변형은 유전자 또는 오페론의 발현을 변경시킨다. 예시적인 단백질 또는 효소는 초장쇄 지방산 신장 경로 내에 단백질 또는 효소 (즉, 성분)를 포함한다 (예를 들어, β-케토아실-CoA 신타아제, β-케토아실-CoA 리덕타아제, β-하이드록시아실-CoA 데하이드라타아제, 에노일-CoA 리덕타아제, 또는 그의 조합). 효소를 코딩하는 핵산 분자, 또는 이의 기능적 단편에 대한 유전적 변형은 자연적으로 생기는 상태로부터 변형된 재조합 세포에 대해 생화학적 반응 능력 또는 대사적 경로 능력을 부여할 수 있다.

효소 명칭의 다음의 약어를 본 명세서에서 사용한다: "지방산 엘롱가제(elongase)"는 "FAE"로서 지칭되고; "β-케토아실-CoA 신타아제" 또는 "3-케토아실-CoA 신타아제"는 "KCS"로서 지칭되고; "β-케토아실-CoA 리덕타아제" 또는 "3-케토아실-CoA 리덕타아제"는 "KCR"로서 지칭되고; "β-하이드록시아실-CoA 데하이드라타아제" 또는 "3-하이드록시아실-CoA 데하이드라타아제"는 "HCD"로서 지칭되고; "에노일-CoA 리덕타아제"는 "ECR"로서 지칭되고; "디아실글리세롤 O-아실트랜스퍼라아제"는 "DGAT"로서 지칭되고; "지방 아실 리덕타아제" 또는 "지방 알콜 형성 아실-CoA 리덕타아제"는 "FAR"로서 지칭되고; "아실 운반체 단백질"은 "ACP"로서 지칭되고; "조효소 A"는 "CoA"로서 지칭되고; "티오에스테라아제"는 "TE"로서 지칭되고; "지방산 신타아제" 또는 "지방산 신쎄타아제"는 "FAS"로서 지칭되고; "지방 아실-CoA 리덕타아제"는 "FACR"로서 지칭되고; "지방 아실-CoA 신타아제" 또는 "지방 아실-CoA 신쎄타아제" 또는 "아실-CoA 신타아제" 또는 "아실-CoA 신쎄타아제"는 본 명세서에서 상호호환적으로 사용되고, "FACS"로서 지칭되며; "아세틸-CoA 카복실라아제"는 "ACC"로서 지칭된다.

본원에서 사용한 바와 같은 말로닐-CoA는 구조 COOH-(CO)-S-CoA의 말론산의 조효소 A 유도체를 지칭한다. 말로닐-CoA는 아세틸-CoA 카복실라아제 (ACC) 효소를 사용하여 아세틸-CoA를 카복실화하여 형성한다.

본원에서 사용한 바와 같은 지방산 엘롱가제 (FAE)는 말로닐-CoA로부터 제공된 C₂ 부분을 지방 아실-CoA 기질에 가해 순차적으로 초장쇄 지방산을 생성하는 4개의 상이한 효소로 이루어진 헤테로테트라머 효소 복합체를 지칭한다. 각각의 반복 FAE 촉매화 지방산 신장 사이클은 각각 두 개의 탄소쇄 단위에 의해 지방 아실-CoA 쇄를 신장하는 β-케토아실-CoA 신타아제, β-케토아실-CoA 리덕타아제, β-하이드록시아실-CoA 데하이드라타아제, 및 에노일-CoA 리덕타아제에 의해 촉매화되는 4개의 연속적인 효소 반응 (축합, 환원, 탈수, 및 환원)을 포함한다.

도 1에 도시되고 본원에서 사용한 바와 같은 β-케토아실-CoA 신타아제 (KCS) (3-케토아실-CoA 신타아제 또는 지방산 엘롱가제로도 알려짐)는 지방 아실-CoA를 말로닐-CoA와 축합시켜 β-케토아실-CoA (3-케토아실-CoA로도 알려짐)를 제공하는 지방산 신장 과정의 율속 효소를 지칭한다. 초장쇄 지방산 신장 사이클의 아실 쇄 길이 기질 특이성은 KCS에 의해 결정될 것으로 생각된다. 단일 KCS는 수 개의 연속 신장 사이클에서 축합을 촉매화할 수 있다. 다양한 KCS 효소는 아실-CoA 기질 쇄 길이의 중첩 범위를 가질 수 있다.

본원에서 사용한 바와 같은 β-케토아실-CoA 리덕타아제 (KCR) 또는 3-케토아실-CoA 리덕타아제는 β-케토아실-CoA를 β-하이드록시아실-CoA (3-하이드록시아실-CoA로도 알려짐)로 환원시키는 효소를 지칭한다 (도 1 참조). 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드 포스페이트 (NADPH)가 이 반응에서 환원제로서 사용된다. KCR은 기질 쇄 길이에 대해 넓은 양립성을 가질 수 있다.

본원에서 사용한 바와 같은 β-하이드록시아실-CoA 데하이드라타아제 (HCD) 또는 3-하이드록시아실-CoA 데하이드라타아제는 β-하이드록시아실-CoA를 트랜스-에노일-CoA (2,3-트랜스-에노일-CoA로도 알려짐)로 탈수시키는 효소를 지칭한다 (도 1 참조). HCD는 기질 쇄 길이에 대해 넓은 양립성을 가질 수 있다.

본원에서 사용한 바와 같은 에노일-CoA 리덕타아제 (ECR) 또는 2,3-트랜스-에노일-CoA 리덕타아제는 트랜스-에노일-CoA를 환원하여 원래의 지방 아실-CoA 보다 2개의 탄소 쇄 단위를 추가로 가지는 지방 아실-CoA를 생성하는 효소를 지칭한다 (도 1 참조). NADPH가 이 반응에서 환원제로서 사용된다. ECR은 기질 쇄 길이에 대해 넓은 양립성을 가질 수 있다.

본원에서 사용한 바와 같은 디아실글리세롤 O-아실트랜스퍼라아제 (DGAT) 또는 "O-아실트랜스퍼라아제"는 디아실글리세롤 기질 및 지방 아실-CoA로부터 트리아실글리세롤을 형성하는 효소를 지칭한다.

본원에서 사용한 바와 같은 알데하이드 데카보닐라아제는 초장쇄 지방 알데하이드를 탈카보닐화하여 초장쇄 지방 알데하이드 기질보다 탄소 쇄 단위가 하나 적은 초장쇄 알칸을 생성하는 효소를 지칭한다 (도 4 참조).

본원에서 사용한 바와 같은 알칸 하이드록실라아제는 초장쇄 지방 이차 알콜을 생성하기 위한 초장쇄 알칸의 중쇄의 중쇄 하이드록실화를 촉매화하는 효소를 지칭한다 (도 4 참조).

본원에서 사용한 바와 같고 도 1에 도시된 어구 "지방산 신장 경로"는 KCS, KCR, HCD, 및 ECR에 의해 촉매화되는 하나 이상의 신장 사이클을 포함하는 장쇄 지방산 기질 (예를 들어, C₈ 내지 C₂₄ 지방 아실-CoA)의 초장쇄 지방 아실-CoA (C₂₄ 초과)로의 신장을 지칭한다. 각각의 반복 신장 사이클은 알련의 네 반응 (축합, 환원, 탈수, 및 환원)을 통해 2개의 탄소에 의해 지방 아실-CoA 탄화수소 쇄를 연장한다.

도 1 및 2에서 나타내고 본원에서 사용한 바와 같은 "지방 아실 리덕타아제" 또는 "지방 알콜 형성 아실-CoA 리덕타아제" (FAR)는 지방 아실-CoA, 지방 아실-ACP, 또는 다른 지방 아실 티오에스테르 복합체(각각은 화학식 I인 R-(CO)-S-R₁의 구조를 가짐)의 지방 알콜(화학식 II인 구조 R-OH, 화학식 II)로의 환원을 촉매화하는 효소를 지칭한다. 예를 들어, NADPH의 2개 분자가 NADP⁺로 산화될 때, R-(CO)-S-R₁(화학식 I)은 R-OH(화학식 II) 및 R₁-SH(화학식 III)로 전환되되, 여기서, R은 C₈ 내지 C₂₄ 포화, 불포화, 선형, 분지형 또는 환식 탄화수소이며, R₁은 CoA, ACP 또는 다른 지방 아실 티오에스테르 기질을 표시한다. FAR은 또한 초장쇄 지방 아실-CoA의 초장쇄 지방 알콜로의 환원을 촉매화할 수 있다. CoA는 지방산의 합성 및 산화에 연루된 비-단백질 아실 운반체 기이다. "ACP"는 지방산의 합성에 사용된 FAS의 폴리펩티드 또는 단백질 서브단위이다. FAR은 지방 아실-CoA 리덕타아제 (FACR)와 별개이다. FACR은 지방 아실-CoA 중간체 또는 초장쇄 지방 아실-CoA 중간체만을 지방 알데하이드 또는 초장쇄 지방 알데하이드로 각각 환원시키며, 대응하는 지방 알콜을 만들기 위해 추가적인 옥시도리덕타아제를 필요로 한다. 본원에서 사용되는 바와 같은 지방 알데하이드(도 5 참조)는 포화 또는 불포화 지방족 알데하이드를 지칭하며, R은 상기 정의한 바와 같다. 초장쇄 지방 알데하이드는 R이 적어도 C₂₅ 포화, 불포화, 선형, 분지형 또는 환식 탄화수소인 지방 알데하이드이다.

본원에서 사용한 바와 같은 "지방산"은 구조 R-COOH(화학식 IV)의 화합물을 지칭하되, R은 C₈ 내지 C₂₄ 포화, 불포화, 선형, 분지형 또는 환식 탄화수소이고, 카복실기는 위치 1에 있다. 포화 또는 불포화 지방산은 "Cx:y"로서 기재될 수 있되, 여기서 "x"는 탄소 원자의 총 수를 나타내는 정수이고, "y"는 탄소 쇄 내 이중 결합의 수를 지칭하는 정수이다. 예를 들어, C12:0 또는 1-도데칸산으로서 지칭되는 지방산은 12개 탄소 및 0개의 이중 결합을 가지는 것을 의미한다. 본원에서 사용한 바와 같은 용어 "초장쇄 지방산"은 R이 적어도 C₂₅ 포화, 불포화, 선형, 분지형 또는 환식 탄화수소이고 카복실기가 1 위치에 있는 지방산을 지칭한다.

본원에서 사용한 바와 같은 용어 "초장쇄 지방 왁스 에스테르" 또는 "초장쇄 지방 에스테르 왁스"는 탄소 단위의 수가 적어도 25개인 지방 아실-CoA 및 지방 알콜의 에스테르를 지칭한다

본원에서 사용한 바와 같은 용어 "초장쇄 알칸"은 적어도 C₂₅ 선형 또는 분지형 포화 탄화수소를 지칭한다.

본원에서 사용한 바와 같은 용어 "초장쇄 케톤"은 구조 R-CO-R₁의 화합물 (여기서 R 및 R₁은 독립적으로 포화, 불포화, 선형, 분지형 또는 환식 탄화수소이고 탄소 단위의 수는 적어도 25이다)을 지칭한다.

본원에서 사용한 바와 같은 용어 "초장 탄소쇄 화합물"은 적어도 25개의 탄소 원자를 가지는 포화, 불포화, 실질적으로 선형 탄소 백본을 포함하는 화합물을 지칭한다. 초장 탄소쇄 화합물은 초장쇄 지방 아실 CoA, 초장쇄 지방 알데하이드, 초장쇄 지방 일차 알콜, 초장쇄 지방 이차 알콜, 초장쇄 지방 에스테르 왁스, 초장쇄 알칸, 초장쇄 케톤, 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다.

본원에서 사용한 바와 같은 용어 "왁스 신타아제" 또는 "에스테르 신타아제"는 에스테르 연결을 통해 지방 알콜을 지방 아실-CoA에 접합시키는 효소를 지칭한다.

본원에서 사용한 바와 같은 용어 "알데하이드 리덕타아제"는 초장쇄 지방 알데하이드를 환원시켜 초장쇄 지방 일차 알콜을 생성하는 효소를 지칭한다. NADPH가 이 반응에서 환원제로서 사용된다. 알데하이드 리덕타아제는 또한 초장쇄 지방 일차 알콜을 생성하기 위해 초장쇄 지방 알데하이드를 환원시키는 데 사용되는 효소를 지칭할 수 있다.

본원에서 사용한 바와 같은 용어 "하이드록실 지방산"은 구조 OH-R-COOH(화학식 V)의 화합물을 지칭하되, 여기서 R은 C₈ 내지 C₂₄ 포화, 불포화, 선형, 분지형 또는 환식 탄화수소이다. 오메가 하이드록시 지방산(또한 ω-하이드록시산으로서 알려짐)은 위치 1에서 카복실기를 지니고 위치 n에서 하이드록실을 지니는 특정 수의 탄소 원자 길이를 갖는 자연적으로 생기는 직쇄 지방족 유기산의 부류이다. 예를 들어, 예시적인 C₁₆ ω-하이드록시 지방산은 16-하이드록시 팔미트산(위치 1에서 카복실기 및 위치 16에서 하이드록실기를 지니며, 16개의 탄소 원자를 가짐) 및 10,16-디하이드록시 팔미트산(위치 1에서 카복실기, 위치 10에서 첫 번째 하이드록실기, 및 위치 16에서 두 번째 하이드록실기를 지니며, 16개 탄소 원자를 가짐)이다.

본원에서 사용한 바와 같은 용어 "지방 알콜"은 화학식 II의 지방족 알콜을 지칭하되, 여기서 R은 C₈ 내지 C₂₄ 포화, 불포화, 선형, 분지형 또는 환식 탄화수소이다. 포화 또는 불포화 지방 알콜은 "Cx:y-OH"로서 기재될 수 있되, 여기서 "x"는 지방 알콜에서 탄소 원자의 총 수를 나타내는 정수이고, "y"는 탄소쇄에서 이중 결합의 수를 지칭하는 정수이다.

"초장쇄 지방 알콜"은 R이 적어도 C₂₅ 포화, 불포화, 선형, 분지형 또는 환식 탄화수소인 지방 알콜을 지칭한다. 초장쇄 지방 일차 알콜은 일차 탄소 원자에 연결된 하이드록실기를 가지는 초장쇄 알콜을 지칭한다. 초장쇄 지방 이차 알콜은 하이드록실기가 부착된 탄소가 2개의 알킬기에 직접 연결된 초장쇄 알콜을 지칭한다.

불포화 지방산 또는 지방 알콜은 "시스Δ^z" 또는 "트랜스Δ^z"로서 지칭될 수 있되, "시스" 및 "트랜스"는 이중 결합 주위의 탄소쇄 배열을 지칭하며, "z"는 이중 결합의 첫 번째 탄소의 수를 나타내고, 넘버링은 지방산의 카복실산을 갖는 탄소 또는 지방 알콜의 -OH 기에 결합된 탄소로 시작한다.

용어 "지방 아실-티오에스테르" 또는 "지방 아실-티오에스테르 복합체"는 지방 아실 부분이 티오에스테르 결합을 통해 운반체 부분에 공유적으로 연결되는 화학식 I의 화합물을 지칭한다. 지방 아실-티오에스테르는 본원에 기재된 FAR 효소에 대한 기질이다.

용어 "지방 아실-CoA"는 R₁이 조효소 A인 화학식 I의 화합물을 지칭하고, 용어 "지방 아실-ACP"는 R₁이 아실 운반체 단백질 ACP인 화학식 I의 화합물을 지칭한다. 용어 "초장쇄 지방 아실-CoA"는 R이 적어도 C₂₅ 포화, 불포화, 선형, 분지형 또는 환식 탄화수소인 지방 아실-CoA를 지칭한다.

어구 "아실-CoA 독립적 경로"는 지방 아실-ACP 기질의 지방 알콜로의 직접 효소적 전환에 의한 지방 알콜의 생성을 지칭하며, 유리 지방산 또는 지방 아실-CoA 중간체의 사용을 수반하지 않는다. 이 생합성 경로는 두 유형의 지방 아실-CoA 의존적 경로 - 아실-전달 반응을 통해 지방 아실-ACP를 지방 아실 CoA로 직접 전환하는 하나, 및 유리 지방산 중간체를 통해 지방 아실-ACP를 지방 아실-CoA로 전환하는 두 번째(도 5 참조)와 상이하다. 아실-CoA 독립적 경로는 유리 지방산으로부터 지방 아실-CoA 기질을 형성하는 단계(이 단계는 ATP의 사용을 필요로 함)를 우회하는 이점을 가진다. 따라서, 아실-CoA 독립적 경로는 유리 지방산 중간체를 이용하는 아실-CoA 의존적 경로보다 에너지를 더 적게 사용할 수 있다.

본원에서 사용한 바와 같은, "알콜 데하이드로게나아제"(ADH)는 알콜을 그의 대응하는 알데하이드, 케톤 또는 산으로 전환시킬 수 있고 또한 역반응을 촉매화할 수 있는 임의의 효소를 지칭한다. 알콜 데하이드로게나아제는 적어도 몇몇 알콜 기질을 전환시킬 수 있는 일반적 특이성을 가질 수 있거나, 또는 1, 2 또는 소수의 알콜 기질을 수용하는 좁은 특이성을 가질 수 있다. 알콜 데하이드로게나아제는 초장쇄 케톤을 생성하기 위한 초장쇄 지방 이차 알콜의 산화를 촉매화하기 위해 사용될 수 있다. 알콜 데하이드로게나아제는 초장쇄 지방 알데하이드의 초장쇄 지방 일차 알콜로의 전환을 촉매화하기 위해 사용될 수 있다.

본원에서 사용한 바와 같은, "미립자 메탄 모노옥시게나아제"(pMMO)는 메탄영양체 박테리아에서 메탄의 메탄올로의 산화를 촉매화하는 막-결합 미립자 효소를 지칭한다. 용어 pMMO는 다-성분 효소 또는 효소의 활성 부위를 포함하는 서브단위 중 하나를 의미한다.

본원에서 사용한 바와 같은, "가용성 메탄 모노옥시게나아제"(sMMO)는 메탄영양체 박테리아에서 메탄의 메탄올로의 산화를 촉매화하는 세포 용해물(세포질)의 가용성 분획에서 발견되는 효소를 지칭한다. 용어 sMMO는 다-구성요소 효소 또는 효소의 활성 부위를 포함하는 서브단위 중 하나를 의미한다.

본원에서 사용한 바와 같은, "사이토크롬 P450" 또는 "CYP"로서도 공지된 "P450"은 지질, 스테로이드 호르몬 및 생체이물(xenobiotic) 물질을 포함하는 유기 화합물의 산화를 촉매화하는 넓은 기질 특이성을 지니는 효소의 그룹을 지칭한다. P450 효소는 가장 흔하게는 산소 원자를 유기 물질의 R-H 결합 내로 삽입함으로써 모노옥시게나아제 반응을 촉매화한다.

"전환"은 기질의 하나 이상의 대응하는 생성물로의 효소적 전환을 지칭한다. "전환 백분율"은 구체화된 조건 하에서 일정 시간 내에 하나 이상의 생성물로 환원되는 기질의 백분율을 지칭한다. 따라서, 폴리펩티드 효소의 "효소 활성" 또는 "활성"은 기질의 생성물로의 "전환 백분율"로서 표현될 수 있다.

본원에서 사용한 바와 같은 용어 "숙주"는 C₁ 기질 공급원료를 적어도 C₂₅ 지방 아실-CoA, 지방 알데하이드, 지방 알콜, 지방 에스테르 왁스, 알칸, 케톤 또는 이들의 임의의 조합으로 전환시키기 위해 초장쇄 지방산 생합성 성분 (예를 들어, KCS, KCR, HCD, ECR, 또는 이들의 임의의 조합)을 이용하여 유전적으로 변형되고 있는 미생물(예를 들어, 메탄영양체)을 지칭한다. 숙주 세포는 본원에 개시된 초장쇄 지방산 생합성 경로와 관련없는 소정 특성을 부여하는 다른 유전적 변형을 이미 소유할 수 있다. 예를 들어, 숙주 세포는 고성장을 부여하는 유전적 변형, 오염물질의 내약성 또는 특정 배양 조건, 추가적인 탄소 기질을 대사하는 능력, 또는 바람직한 생성물 또는 중간체를 합성하는 능력을 소유할 수 있다.

본원에서 사용한 바와 같은 용어 "메탄영양체," "메탄영양체 박테리아" 또는 "메탄영양체 박테리아들"은 그의 1차 또는 유일한 탄소 및 에너지 공급원으로서 메탄 또는 비재래형 천연가스(unconventional natural gas)와 같은 C₁ 기질을 이용할 수 있는 메틸영양체 박테리아를 지칭한다. 본원에서 사용한 바와 같은, "메탄영양체 박테리아"는 탄소 및 에너지 공급원에 대해 C₁ 기질만을 이용할 수 있는 "절대 메탄영양체 박테리아" 및 그들의 유일한 탄소 및 에너지 공급원으로서 C₁ 기질에 추가적으로 다중-탄소 기질, 예컨대 아세트산염, 피루브산염, 숙신산염, 말산염 또는 에탄올을 자연적으로 사용할 수 있는 "조건적(facultative) 메탄영양체 박테리아"를 포함한다. 조건적 메탄영양체는 메틸로셀라(Methylocella), 메틸로시스티스(Methylocystis) 및 메틸로캡사(Methylocapsa)(예를 들어, 메틸로셀라 실베스트리스(Methylocella silvestris), 메틸로셀라 팔루스트리스(Methylocella palustris), 메틸로셀라 툰드라(Methylocella tundrae), 메틸로시스티스 달토나(Methylocystis daltona) SB2, 메틸로시스티스 브리오필라(Methylocystis bryophila) 및 메틸로캡사 아우레아(Methylocapsa aurea) KYG) 및 메틸로박테리움 오가노필룸(ATCC 27,886)의 일부 종을 포함한다.

본원에서 사용한 바와 같은 용어 "C₁ 기질" 또는 "C₁ 화합물"은 탄소 간의 결합이 없는 유기 화합물을 지칭한다. C₁ 기질은 합성 가스, 천연가스, 비재래형 천연가스, 메탄, 메탄올, 포름알데하이드, 포름산(포르메이트), 일산화탄소, 이산화탄소, 메틸화된 아민(예를 들어, 메틸아민, 디메틸아민, 트리메틸아민 등), 메틸화된 티올, 메틸 할로겐(예를 들어, 브로모메탄, 클로로메탄, 요오도메탄, 디클로로메탄 등) 및 시아나이드를 포함한다.

본원에서 사용한 바와 같은, "C₁ 대사 미생물" 또는 "C₁ 대사 비-광합성 미생물"은 에너지의 공급원으로서 또는 그의 1차 에너지 공급원으로서 또는 그의 유일한 에너지 및 바이오매스의 공급원으로서 C₁ 기질을 사용하는 능력을 갖는 임의의 미생물을 지칭하고, 에너지 및 바이오매스를 위해 다른 탄소 기질(예컨대 당 및 복합 탄수화물)을 사용할 수도 있고, 사용하지 않을 수도 있다. 예를 들어, C₁ 대사 미생물은 C₁ 기질, 예컨대 메탄, 천연가스 또는 메탄올을 산화할 수 있다. C₁ 대사 미생물은 박테리아(예컨대 메탄영양체 및 메틸영양체)를 포함한다. 특정 구체예에서, C₁ 대사 미생물은 광합성 미생물, 예컨대 조류(algae)를 포함하지 않는다. 특정 구체예에서, C₁ 대사 미생물은, 에너지의 1차 공급원이 C₁ 기질이라는 것을 의미하는 "절대 C₁ 대사 미생물"일 것이다. 추가 구체예에서, C₁ 대사 미생물(예를 들어, 메탄영양체)는 C₁ 기질 공급원료(즉, 에너지의 1차 또는 유일한 공급원으로서 C₁ 기질을 사용)의 존재하에 배양될 것이다.

본원에서 사용한 바와 같은 용어 "메틸영양체" 또는 "메틸영양체 박테리아"는 탄소-탄소 결합을 함유하지 않는 유기 화합물을 산화시킬 수 있는 임의의 박테리아를 지칭한다. 특정 구체예에서, 메틸영양체 박테리아는 메탄영양체일 수 있다. 예를 들어, "메탄영양체 박테리아"는 그것의 탄소 및 에너지의 1차 공급원으로서 메탄을 산화하는 능력을 갖는 임의의 메틸영양체 박테리아를 지칭한다. 예시적인 메탄영양체 박테리아는 메틸로모나스(Methylomonas), 메틸로박터(Methylobacter), 메틸로코커스(Methylococcus), 메틸로시너스(Methylosinus), 메틸로시스티스(Methylocystis), 메틸로마이크로븀(Methylomicrobium), 또는 메타노모나스(Methanomonas)를 포함한다. 특정의 다른 구체예에서, 메틸영양체 박테리아는, 에너지의 생성을 위해 C₁ 기질의 사용으로 제한되지 않는 박테리아를 지칭하는 "절대 메틸영양체 박테리아"이다.

본원에서 사용한 바와 같은 용어 "CO 이용 박테리아"는 탄소 및 에너지의 공급원으로서 일산화탄소(CO)를 산화하는 능력을 자연적으로 소유하는 박테리아를 지칭한다. 일산화탄소는 "합성 가스(synthesis gas 또는 syngas)", 임의의 유기 공급원료, 예컨대 석탄, 석유, 천연가스, 바이오매스, 및 폐기 유기 물질의 가스화에 의해 생성되는 일산화탄소와 수소의 혼합물로부터 이용될 수 있다. CO 이용 박테리아는 그의 탄소 공급원으로서 CO 상에서 성장을 위해 유전자적으로 변형되어야 하는 박테리아를 포함하지 않는다.

본원에서 사용한 바와 같은, "천연가스"는 다공성 저장소에서 형성된 자연적으로 생기는 가스 혼합물을 지칭하며, 전통적인 공정(예를 들어, 드릴링)에 의해 접근될 수 있으며, 주로 메탄으로 구성되지만, 또한 다른 성분, 예컨대 이산화탄소, 질소 또는 황화수소를 가질 수 있다.

본원에서 사용한 바와 같은, "비재래형 천연가스"는 비통상적인 방법, 예컨대 수압파쇄법, 수평 드릴링 또는 방향 드릴링에 의해 접근되어야 하는 낮은 투과성을 이용한 형성에서 생성된 자연적으로 생기는 가스 혼합물을 지칭한다. 예시적인 비재래형 천연가스 침적물은 사암 또는 탄산염으로부터 형성된 치밀가스, 석탄층에서 형성되고 석탄 입자에서 흡착된 탄층 메탄, 미립자의 혈암으로부터 형성되고 점토 입자에 흡착되거나 혹은 소기공 또는 미세천공 내에 보유된 셰일가스, 해양 및 영구동토 하에서와 같이 적소에서 저온 및 고압에서 형성된 천연가스와 물의 결정질 조합물인 메탄 수화물을 포함한다.

본원에서 사용한 바와 같은, "합성 가스"는 일산화탄소(CO)와 수소(H₂)의 혼합물을 지칭한다. 합성가스는 또한 CO₂, 메탄, 및 CO 및 H₂에 비해 더 적은 양으로 다른 가스를 포함할 수 있다.

본원에서 사용한 바와 같은, "메탄"은 화학식 CH₄를 지니는 가장 단순한 알칸 화합물을 지칭한다. 메탄은 실온 및 압력에서 무색 및 무취이다. 메탄의 공급원은 천연 공급원(예컨대 천연가스 분야), "비재래형 천연가스" 공급원(예컨대 셰일가스 또는 석탄층 메탄, 이때 함량은 공급원에 따라 다를 것임) 및 생물학적 공급원(예를 들어 메탄생성 미생물에 의해, 및 산업적 또는 실험적 합성에 의해 합성되는 경우)을 포함한다. 메탄은 순수한 메탄, 실질적으로 정제된 조성물, 예컨대 "파이프라인 품질 천연가스" 또는 "건식 천연가스"(95 내지 98% 메탄) 및 비정제 조성물, 예컨대 "습식 천연가스"(다른 탄화수소는 아직 제거되지 않았고, 메탄은 조성물의 60% 초과로 포함됨)를 포함한다.

본원에서 사용한 바와 같은, 폴리뉴클레오티드로서도 공지된 "핵산 분자"는 뉴클레오티드로 불리는 공유적으로 연결된 서브단위을 포함하는 중합체 화합물을 지칭한다. 핵산 분자는 폴리리보핵산(RNA), 폴리데옥시리보핵산(DNA)을 포함하며, 이들은 둘 다 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있다. DNA는 cDNA, 게놈 DNA, 합성 DNA, 반-합성 DNA 등을 포함한다.

본원에서 사용한 바와 같은, "형질전환"은 숙주 내로 핵산 분자(예를 들어, 외인성 또는 이종 핵산 분자)를 전달하는 것을 지칭한다. 형질전환된 숙주는 염색체밖으로 외인성 또는 이종 핵산 분자를 운반할 수 있거나 또는 핵산 분자는 염색체 내로 통합될 수 있다. 숙주 게놈 및 자가-복제성 벡터 내로의 통합은 일반적으로 형질전환된 핵산 분자의 유전적으로 안정한 유전을 초래한다. 형질전환된 핵산을 함유하는 숙주 세포는 "재조합" 또는 "비-자연적으로 생기는" 또는 "유전자 조작된" 또는 "형질전환된" 또는 "유전자이식" 세포(예를 들어¸ 박테리아)로서 지칭된다.

본원에서 사용한 바와 같은 용어 "내인성" 또는 "고유한"(native)은 정상적으로 숙주 세포 내에 존재하는 유전자, 단백질, 화합물 또는 활성을 지칭한다.

본원에서 사용한 바와 같은, "이종" 핵산 분자, 작제물 또는 서열은 숙주 세포에 고유하지 않은 핵산 분자 또는 핵산 분자 서열의 일부를 지칭하거나, 또는 유사한 조건에서 고유한 발현 수준에 비해 변경된 발현을 지니는 핵산 분자이다. 예를 들어, 이종 조절 서열(예를 들어, 프로모터, 인핸서)은, 고유한 유전자 또는 핵산 분자가 천연에서 또는 배양물에서 발현된 방법과 상이한 방법으로 고유한 유전자 또는 핵산 분자의 발현을 조절하기 위해 사용될 수 있다. 특정 구체예에서, 이종 핵산 분자는 숙주 세포 또는 숙주 게놈에 대해 내인성이 아닐 수도 있지만, 대신에 접합, 형질전환, 형질감염, 전기천공 등에 의해 숙주 세포에 첨가될 수 있되, 첨가된 분자는 숙주 게놈 내로 통합될 수 있거나 또는 염색체밖 유전자 물질로서(예를 들어, 플라스미드 또는 다른 자가 복제성 벡터) 존재할 수 있다. 추가로, "이종"은 숙주 세포에서 발견된 상이한 또는 변경된 효소, 단백질 또는 다른 활성, 또는 숙주세포에 고유하지 않지만, 대신에 숙주 세포 내로 도입된 핵산 분자에 의해 코딩된 효소, 단백질 또는 다른 활성을 지칭할 수 있다. 용어 "상동성" 또는 "상동체"는 숙주 세포, 종 또는 균주에서 발견되거나 또는 이들로부터 유래된 분자 또는 활성을 지칭한다. 예를 들어, 이종 핵산 분자는 고유한 숙주 세포 유전자에 상동성일 수 있지만, 변경된 발현 수준을 가질 수 있거나, 또는 상이한 서열을 가지거나, 또는 둘 다 일 수 있다.

특정 구체예에서, 복수 이종 핵산 분자는 별개의 핵산 분자로서, 다시트론성 핵산 분자로서, 융합 단백질을 코딩하는 단일 핵산 분자로서, 또는 이들의 임의의 조합으로서 숙주 세포 내로 도입될 수 있고, 또한 1종 이상의 이종 핵산으로서 고려될 수 있다. 예를 들어, 본 명세서에 개시된 바와 같이, C₁ 대사 미생물은 목적으로 하는 초장쇄 지방산 생합성 경로 성분을 코딩하는 2 이상의 이종 또는 외인성 핵산 분자(예를 들어, β-케토아실-CoA 신타아제, β-케토아실-CoA 리덕타아제, β-하이드록시아실-CoA 데하이드라타아제, 및 에노일-CoA 리덕타아제)를 발현시키도록 변형될 수 있다. 초장쇄 지방산 생합성 경로 성분을 코딩하는 2 이상의 외인성 핵산 분자가 숙주 C₁ 대사 미생물 내로 도입될 때, 2 이상의 외인성 핵산 분자가 단일 핵산 분자로서, 예를 들어 단일 벡터 상에서, 별개의 벡터 상에서 도입될 수 있고, 단일 부위 또는 다수 부위에서 숙주 염색체 내로 통합될 수 있으며, 또한 2 이상의 외인성 핵산 분자로 고려될 수 있다는 것이 이해된다. 따라서, 언급된 이종 핵산 분자 또는 단백질 활성의 수는 핵산 분자를 코딩하는 수 또는 단백질 활성의 수를 지칭하지만, 숙주 세포 내로 도입된 별개의 핵산 분자의 수를 지칭하지는 않는다.

용어 "키메라"는 함께 결합 또는 연결된(정상적으로는 천연에서 함께 결합 또는 연결되지 않음) 서열을 포함하며 내인성이 아닌 임의의 핵산 분자 또는 단백질이다. 예를 들어, 키메라 핵산 분자는 상이한 공급원으로부터 유래된 조절 서열 및 코딩 서열, 또는 천연에서 발견된 것과 동일한 공급원으로부터 유래되지만 상이한 방식으로 배열된 조절 서열 및 코딩 서열을 포함할 수 있다.

2 이상의 핵산 서열 간의 "동일성 백분율"은 서열에 의해 공유되는 동일한 위치의 수의 함수이며(즉, 동일성%=동일한 위치의 수/위치의 총 수 x 100), 2 이상의 서열의 배열을 최적화하도록 도입될 필요가 있는 각각의 갭의 길이 및 갭의 수를 고려한다. 2 이상의 서열 간의 서열의 비교 및 동일성 백분율의 결정은 그들의 디폴트 파라미터에서 BLAST 및 Gapped BLAST 프로그램과 같은 수학적 알고리즘을 사용하여 수행될 수 있다(예를 들어, 문헌[Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403, 1990]; 또한 www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST에서의 BLASTN 참조).

"보존적 치환"은 하나의 아미노산의 유사한 특성을 갖는 다른 아미노산으로의 치환으로서 당업계에서 인식된다. 예시적인 보존적 치환은 당업계에 잘 공지되어 있다(예를 들어, 1997년 3월 13일 공개된 WO 97/09433호, 10 페이지; 문헌[Lehninger, Biochemistry, Second Edition; Worth Publishers, Inc. NY:NY (1975), pp.71-77; Lewin, Genes IV, Oxford University Press, NY and Cell Press, Cambridge, MA (1990), p. 8] 참조).

본원에서 사용한 바와 같은 "저해하다" 또는 "저해된"은 대조군, 내인성 또는 기준 분자에 비해 표적 유전자의 발현에서의 또는 표적 분자(예를 들어, 티오에스테르라제, 아실-CoA 신쎄타아제, 알콜 데하이드로게나아제)의 활성에서의 직접적 또는 간접적 변경, 감소, 하향조절 또는 폐기를 지칭하되, 상기 변경, 감소, 하향조절 또는 폐기는 통계적으로, 생물학적으로, 산업적으로 또는 임상적으로 유의하다.

본원에서 사용한 바와 같은 용어 "유도체"는 효소에 의한 또는 효소 없이 화학적 또는 생물학적 수단에 의한 화합물의 변형을 지칭하되, 변형된 화합물은 모 화합물과 구조적으로 유사하고 (사실상 또는 이론적으로) 해당 모 화합물로부터 유도가능하다. 유도체는 모 화합물의 상이한 화학적, 생물학적 또는 물리적 특성을 가질 수 있으며, 예컨대 모 화합물에 비해 더 친수성이거나 또는 변경된 반응성을 가질 수 있다. 유도체화(즉, 변형)는 분자 내에서 하나 이상의 부분의 치환(예를 들어, 작용기에서의 변화)을 수반할 수 있다. 예를 들어, 수소는 할로겐, 예컨대 불소 또는 염소로 치환될 수 있거나, 또는 하이드록실기(-OH)는 카복실산 부분(-COOH)로 대체될 수 있다. 다른 예시적인 유도체화는 글리코실화, 알킬화, 아실화, 아세틸화, 유비퀴틴화, 에스테르화 및 아미드화를 포함한다. 본원에서 사용한 바와 같은, "지방산 유도체"는 세포에서 발견되는 지방산 생합성 경로의 중간체 및 산물, 예컨대 지방 아실 운반 단백질, 활성화된 지방산(예를 들어, 아실 또는 CoA 함유), 지방 알데하이드, 지방 알콜, 지방 에스테르 왁스, 하이드록시 지방산, 디카복실산, 분지형 지방산 등을 포함한다. 본원에서 사용한 바와 같은 "초장쇄 지방산 유도체"는 초장쇄 탄소 화합물 중간체 및 초장쇄 지방산 신장 경로, 알칸 형성 경로, 및 알콜 형성 경로의 산물, 예컨대 초장쇄 지방산 (예를 들어, 아실 또는 CoA 함유), 초장쇄 지방 알데하이드, 초장쇄 지방 알콜, 초장쇄 지방 에스테르 왁스, 초장쇄 알칸, 초장쇄 케톤 등을 포함한다.

용어 "유도체"는 또한 모든 용매화물, 예를 들어 수화물 또는 부가물(예를 들어 알콜과의 부가물), 활성 대사물, 및 모 화합물의 염을 지칭한다. 제조될 수 있는 염의 유형은 화합물 내에서의 부분의 특성에 의존한다. 예를 들어, 산성기, 예컨대 카복실산기는 알칼리 금속염 또는 알칼리 토금속염(예를 들어, 나트륨염, 칼륨염, 마그네슘염 및 칼슘염 및 또한 생리적으로 용인가능한 4차 암모늄 이온과의 염 및 암모니아 및 생리학적으로 용인가능한 유기아민과의 산부가염, 예를 들어, 트리에틸아민, 에탄올아민 또는 트리스-(2-하이드록시에틸)아민))을 형성할 수 있다. 염기성 기는, 예를 들어 염산, 황산 또는 인산과 같은 무기산과, 또는 유기 카복실산 및 설폰산, 예컨대 아세트산, 시트르산, 락트산, 벤조산, 말레산, 푸마르산, 타르타르산, 메탄설폰산 또는 p-톨루엔설폰산과 산부가염을 형성할 수 있다. 염기성기 및 산성기, 예를 들어 염기성 질소 원자에 추가로 카복실기를 동시에 함유하는 화합물은 쯔비터성 이온으로서 존재할 수 있다. 염은 당업자에게 공지된 관습적 방법에 의해, 예를 들어 용매 또는 희석액 중에서 무기 또는 유기산과 화합물을 조합함으로써 또는 양이온 교환 또는 음이온 교환에 의해 다른 염으로부터 얻어질 수 있다.

초장 탄소쇄 화합물의 제조를 위한 조성물 및 방법

본원에 기술된 바와 같이, 초장 탄소쇄 화합물의 생합성은 하나 이상의 사이클을 통해 지방산 엘롱가제 (하나 이상의 β-케토아실-CoA 신타아제, β-케토아실-CoA 리덕타아제, β-하이드록시 아실-CoA 데하이드라타아제, 및 에노일-CoA 리덕타아제)에 의한 지방산 기질 (예를 들어, C₈-C₂₄ 지방 아실-CoA)의 신장을 포함한다 (도 1 참조). 소정 길이로 신장되었으면, 이어서 초장쇄 지방산을 초장쇄 지방 알데하이드, 초장쇄 알칸, 초장쇄 지방 이차 알콜, 또는 초장쇄 케톤을 제공하는 알칸-형성 (탈카보닐화) 경로 (도 4 참조)에 의해, 또는 초장쇄 지방 알데하이드, 초장쇄 지방 일차 알콜, 또는 초장쇄 지방 왁스 에스테르를 제공하는 알콜 형성 (아실 환원) 경로 (도 2-3 참조)에 의해 변경시킬 수 있다. 초장쇄 지방산으로의 신장을 위한 지방산 기질은 숙주 C₁ 대사 비광합성 미생물에서 자연적으로 합성될 수 있다. 대안적으로, 숙주 C₁ 대사 비광합성 미생물을 생체공학적으로 처리하여 초장쇄 지방산으로의 신장을 위한 지방산 기질을 제공하거나 내인성 생성을 증가시킬 수 있다.

초장 탄소쇄 화합물을 제공하기 위해 사용된 C₁ 대사 미생물은 해당 폴리펩티드를 발현 또는 과발현하는 핵산 서열을 포함하도록 재조합적으로 조작될 수 있다. 예를 들어, C₁ 대사 미생물은 아실-CoA의 생성을 증가시키고 지방산 생합성 경로에서 지방산 유도체 및 중간체, 예컨대 아실-CoA의 이화작용을 감소시키거나, 또는 지방산 생합성 경로에서 특정 부위에서의 피드백 저해를 감소시키기 위해 조작될 수 있다. 본원에 기술된 유전자 조작 외에, 추가의 세포 자원이 지방산을 과생산하도록 전환될 수 있으며, 예를 들어, 락테이트, 숙시네이트 또는 아세테이트 경로가 감쇠될 수 있고, 아세틸-CoA 카복실라아제 (acc )가 과발현될 수 있다. 본원에 기술된 C₁ 대사 미생물로의 변경은 게놈 변경, 재조합 발현 시스템의 첨가 또는 그의 조합을 통할 수 있다.

초장 탄소쇄 화합물의 생합성 경로는 도 1 내지 4에 도시된다. 경로의 상이한 단계는 서로 다른 효소에 의해 촉매화되고, 각 단계는 복수의 효소를 생산하기 위해 유전자 과발현의 잠재적인 장소이며 따라서 더 많은 초장 탄소쇄 화합물의 생산을 유도한다. 경로에 필요한 효소를 코딩하는 핵산 분자가 또한 재조합적으로 이러한 효소가 부족한 C₁ 대사 미생물에 첨가될 수 있다. 마지막으로, 초장 탄소쇄 화합물의 제조에 이르는 경로와 경쟁하는 단계가 원하는 생성물의 생산을 증가시키기 위하여 감쇠 또는 차단될 수 있다.

일 측면에서, 본원에 (a) (i) β-케토아실-CoA 신타아제, (ii) β-케토아실-CoA 리덕타아제, (iii) β-하이드록시 아실-CoA 데하이드라타아제, 및 (iv) 에노일-CoA 리덕타아제의 효소들을 코딩하는 하나 이상의 재조합 핵산 분자를 포함하고, C₁ 기질을 초장 탄소쇄 화합물로 전환시키는 비-천연 C₁ 대사 비광합성 미생물을 C₁ 기질 공급원료와 배양하는 단계를 포함하는, 초장 탄소쇄의 화합물을 제조하는 방법이 제공된다. 특정 구체예에서, C₁ 대사 비광합성 미생물은 다음 효소들을 코딩하는 2 이상의 재조합 핵산 분자를 포함한다: (i) β-케토아실-CoA 신타아제, (ii) β-케토아실-CoA 리덕타아제, (iii) β-하이드록시 아실-CoA 데하이드라타아제, 및 (iv) 에노일-CoA 리덕타아제. 특정 구체예에서, C₁ 대사 비광합성 미생물은 다음 효소들을 코딩하는 3 이상의 재조합 핵산 분자를 포함한다: (i) β-케토아실-CoA 신타아제, (ii) β-케토아실-CoA 리덕타아제, (iii) β-하이드록시 아실-CoA 데하이드라타아제, 및 (iv) 에노일-CoA 리덕타아제. 특정 구체예에서, C₁ 대사 비광합성 미생물은 다음 효소들을 모두 코딩하는 재조합 핵산 분자를 포함한다: (i) β-케토아실-CoA 신타아제, (ii) β-케토아실-CoA 리덕타아제, (iii) β-하이드록시 아실-CoA 데하이드라타아제, 및 (iv) 에노일-CoA 리덕타아제. 특정 구체예에서, 초장 탄소쇄 화합물은 초장 지방 아실-CoA이다.

지방산 엘롱가제는 말로닐-CoA로부터 제공된 C₂ 부분을 아실-CoA 기질에 가해 초장쇄 지방산을 생성하는 4개의 상이한 효소로 이루어진 헤테로테트라머 복합체이다. 각각의 FAE 촉매화 지방산 신장 사이클은 각각 두 개의 탄소쇄 단위에 의해 지방 아실-CoA 쇄를 함께 신장하는 β-케토아실-CoA 신타아제, β-케토아실-CoA 리덕타아제, β-하이드록시아실-CoA 데하이드라타아제, 및 에노일-CoA 리덕타아제에 의해 촉매화되는 4개의 연속적인 효소 반응 (축합, 환원, 탈수, 및 환원)으로 구성된다. 이러한 신장 사이클은 문헌[Samuels et al. (Annu . Rev. Plant Biol . 59:683-707, 2008)] 및 [Kihara et al. (J. Biochem . 152:387-395, 2012)]에 기술되었다.

β-케토아실-CoA 신타아제 (KCS)는 지방산 신장 과정의 율속 효소이다. KCS는 β-케토아실-CoA (3-케토아실-CoA로도 알려짐)를 생성하기 위한 아실-CoA와 말로닐-CoA의 축합을 촉매화한다. 초장쇄 지방산 신장 사이클의 아실 쇄 길이 기질 특이성은 KCS에 의해 결정될 것으로 생각된다. 단일 KCS는 수 개의 연속 신장 사이클에서 축합을 촉매화할 수 있다. 다양한 KCS 효소는 아실-CoA 기질 쇄 길이의 중첩 범위를 가질 수 있다. 예를 들어, 아라비돕시스 KCS2/DAISY (진뱅크 등록 식별번호 NM_100303.3) 및 KCS20 (진뱅크 등록 식별번호 NM_123743.3)은 C₂₀에서부터 C₂₂의 초장쇄 지방산으로의 신장에 관여한다 (Lee et al., 2009, Plant J. 60:462-75). 아라비돕시스 KCS9 (진뱅크 등록 식별번호 NM_127184.2)는 C₂₂에서부터 C₂₄의 초장쇄 지방산으로의 신장에 관여한다 (Kim et al., 2013, Plant Phsyiol. 162:567-80). 아라비돕시스 KCS1 (At1g01120) (진뱅크 등록 식별번호 AF053345.1)은 포화 및 단일-불포화 C₁₆에서부터 C₂₄의 아실-CoA에 대해 광범위 기질 특이성을 가진다 (Blacklock and Jawaorski, 2006, Biochem. Biophys. Res. Commun. 346:583-90). 포유동물은 7개의 KCS 유전자 (ELOVL1-7)를 가지며, 각각 특징적인 기질 특이성을 갖는다 (Guillou et al., 2010, Prog. Lipid Res. 49:186-199; Ohno et al., 2010, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 107:18439-18444). ELOVL6은 C16:0-CoA, 또는 더 짧은 포화아실-CoA를 신장시킨다. ELOVL3 및 ELOVL7는 포화 및 불포화 C₁₆-C₂₂ 아실-CoA를 모두 신장시킨다. ELOVL2 및 ELOVL5는 다중불포화 지방산에 대해 엄격한 특이성을 가지며, C₂₂-아실-CoA 및 C₁₈-CoA를 각각 신장시킬 수 있고, 양자는 C₂₀-아실-CoA에 대한 중첩 특이성을 가진다. ELOVL1은 포화 C18:0-C26:0 및 단일불포화 C20:1n-9 및 C22:1n-9 아실-CoA를 신장시킨다. 아라비돕시스 CER6 (진뱅크 등록 식별번호 NM_179530.1)은 지방 아실-CoA > C₂₂에 대한 특이성을 가진다. Saccharomyces cerevisiae ELO1 (진뱅크 등록 식별번호 NM_001181629)은 14:0에서 16:0으로 지방산을 신장시킬 수 있다 (Toke, 1996, J. Biol. Chem. 271:18413-18422). Saccharomyces cerevisiae ELO2 (진뱅크 등록 식별번호 NM_001178748.1)는 24 탄소까지로 지방산을 신장시킬 수 있으며, ELO3 (진뱅크 등록 식별번호 NM_001182261.3)은 광범위 기질 특이성을 갖고 C₂₄에서 C₂₆ 종으로의 신장에 필수이다 (Oh et al., 1997, J. Biol. Chem. 272:17376-84). 기타 KCS 유전자에 대한 진뱅크 등록 식별번호는, 예를 들어, EU001741.1 (Gossypium hirsutum), EU001741.1 (Gossypium hirsutum), EU616538.1 (Solanum tuberosum), NM_001124636.1 (Oncorhynchus mykiss), JX436487.1 (Physcomitrella patens)을 포함한다. 특정 구체예에서, KCS 유전자는 CER6, Elo1, Fen1/Elo2, Sur4/Elo3, KCS1, KCS2, KCS11, KCS20, KCS9, ELOVL1, ELOVL2, ELOVL3, ELOVL4, ELOVL5, ELOVL6, ELOVL7, 또는 FDH이다.

3-케토아실-CoA 리덕타아제로도 알려진 β-케토아실-CoA 리덕타아제 (KCR)는 β-케토아실-CoA를 β-하이드록시아실-CoA (3-하이드록시아실-CoA로도 알려짐)로 환원시킨다. 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드 포스페이트 (NADPH)가 이 반응에서 환원제로서 사용된다. KCR은 기질 쇄 길이에 대해 광범위 양립성을 가질 것으로 생각된다. KCR 유전자는 예를 들어, Saccharomyces cerevisiae YBR159w (Beaudoin et al., J. Biol. Chem., 2002, 277:11481-8), 아라비돕시스 AtKCR1 (At1g67730) (Beaudoin et al., 2009, Plant Physiol. 150:1174-1191), Zea mays L. GL8A 및 GL8B (Dietrich et al., 2005, Plant J. 42:844-61), 아라비돕시스 CER10 (Zhang et al., 2005, Plant Cell 17:1467-1481), 및 AYR1을 포함한다. 특정 구체예에서, KCR 유전자는 CER10, KAR, GL8A, GL8B, Ybr159w, AYR1, 또는 At1g67730이다.

3-하이드록시아실-CoA 데하이드라타아제로도 알려진 β-하이드록시아실-CoA 데하이드라타아제 (HCD)는 β-하이드록시아실-CoA를 트랜스-에노일-CoA (2,3-트랜스-에노일-CoA로도 알려짐)로 탈수시킨다. HCD는 기질 쇄 길이에 대해 광범위 양립성을 가질 것으로 생각된다. HCD 유전자는 예를 들어, 아라비돕시스 PAS2 (진뱅크 등록 식별번호 NM_001203348.1) (Bach et al. 2008, Proc. Natl. Acad. Sci. 105:14727-14731), Saccharomyces cerevisiae PHS1 (진뱅크 등록 식별번호 NM_001181530.1), 및 포유동물 동질효소 HACD1 (진뱅크 등록 식별번호 NM_014241.3, Homo sapiens), HACD2 (진뱅크 등록 식별번호 NM_198402.3, Homo sapiens), HACD3 (진뱅크 등록 식별번호 NM_016395.2, Homo sapiens), 및 HACD4 (진뱅크 등록 식별번호 NM_001010915.3, Homo sapiens)를 포함한다. 특정 구체예에서, HCD 유전자는 PHS1, PAS2, HACD1, HACD2, HACD3, HACD4, 또는 PAS2-1이다.

2,3-트랜스-에노일-CoA 리덕타아제로도 알려진 에노일-CoA 리덕타아제 (ECR)는 트랜스-에노일-CoA를 환원하여 원래의 지방 아실-CoA 보다 2개의 탄소 쇄 단위를 추가로 가지는 지방 아실-CoA를 생성한다. NADPH가 이 반응에서 환원제로서 사용된다. ECR은 기질 쇄 길이에 대해 넓은 양립성을 가질 것으로 생각된다. ECR 유전자는 예를 들어, 아라비돕시스 CER10 (진뱅크 등록 식별번호 NM_115394.3), Homo sapiens TER (진뱅크 등록 식별번호 NM_138501.5), Saccharomyces cerevisiae TSC13 (진뱅크 등록 식별번호 NM_01180074.1), Gossypium hirsutum GhECR1 (진뱅크 등록 식별번호 EU001742.1), Gossypium hirsutum GhECR2 (진뱅크 등록 식별번호 EU001743.1)를 포함한다. 특정 구체예에서, ECR은 CER10, TER, TSC13, 또는 GhECR1, GhECR2이다.

본 개시에 유용한 Nannochloropsis oculata 유래의 예시적인 KCS, KCR, HCD, 및 ECR 유전자는 또한 PCT 공개 WO2012/052468에서 제공되었다.

신장 사이클은 적절한 길이의 포화 지방산이 만들어질 때까지 반복된다. 초장쇄 지방 아실-CoA의 홀수 쇄 길이가 α-하이드록실라아제 효소에 의한 알파 탄소의 하이드록실화 및 짝수 쇄 길이 초장쇄 지방 아실-CoA 기질의 탈카복실화를 포함하는 α-산화에 의해 생성될 수 있다.

특정 탄소 쇄 길이(들)의 초장 탄소쇄 화합물의 동종 또는 혼합 집단의 생성을 위한 C₁ 대사 미생물을 공학적으로 처리하기 위해, 선택된 아실 쇄 길이 특이성을 가지는 하나 이상의 KCS 효소가 C₁ 대사 미생물에서 발현될 수 있다. 또한, 원치않는 길이의 초장쇄 지방산을 생성하는 하나 이상의 내인성 유전자가 감쇠, 저해 또는 기능적으로 결실될 수 있다.

신장 사이클에 대한 초기 지방 아실-CoA 기질은 C₁ 대사 미생물에서 내인성 지방산 생성으로부터 기원할 수 있다. 연루된 지방 아실-CoA 경로 및 효소는 도 5에 나타내었다. 특정 구체예에서, 신장 사이클에 대한 초기 지방 아실-CoA 기질은 약 8 내지 24 탄소 원자, 약 14 내지 24 탄소 원자, 약 10 내지 20 탄소 원자, 약 12 내지 18 탄소 원자 또는 약 16 내지 18 탄소 원자의 탄소쇄를 가지는 지방 아실 Co-A이다.

특정 구체예에서, C₁ 대사 비광합성 미생물은 추가로 초장쇄 지방 알콜을 형성할 수 있는 지방 알콜 형성 아실-CoA 리덕타아제 (FAR)를 코딩하며 여기서 초장 탄소쇄 화합물은 초장쇄 지방 일차 알콜인 핵산 분자를 포함한다. 초장쇄 지방 아실-CoA의 변경을 위한 한가지 경로는 알콜 형성 경로 (아실 환원)이다. 초장쇄 지방산의 그의 대응 초장쇄 지방 일차 알콜로의 환원은 초장쇄 지방 알데하이드 중간체를 경유하고, 각 반응 단계에 대한 환원제로서 NADPH를 사용한다. FAR 효소는 유리 알데하이드의 방출 없이 양 반응을 촉매화할 수 있다. FAR 유전자는 예를 들어, 아라비돕시스 CER4 (진뱅크 등록 식별번호 NM_119538.6) 및 Maqu_2220 (진뱅크 등록 식별번호 YP_959486.1)를 포함한다. 초장쇄 지방 아실-CoA의 변경을 위한 알콜 형성 경로는 문헌[Samuels et al., 2008, Annu Rev. Plant Biol. 59:683-707]에 기술되어 있다.

대안적으로, 초장쇄 아실-CoA의 그의 대응 초장쇄 지방 일차 알콜로의 환원은 두 개의 독립적인 효소에 의해 촉매화될 수 있다. 특정 구체예에서, C₁ 대사 비광합성 미생물은 추가로 초장쇄 지방 알데하이드를 형성할 수 있는 지방 아실-CoA 리덕타아제 및 초장쇄 지방 알콜을 형성할 수 있는 알데하이드 리덕타아제를 코딩하며, 여기서 초장 탄소쇄 화합물은 초장쇄 지방 일차 알콜인 핵산 분자를 포함한다. 지방 아실-CoA 리덕타아제 유전자는 예를 들어, Acinetobacter baylyi ACR1 (U77680.1), Synechococcus elongatus ACR (Lin et al., 2013, FEBS J. 280:4773-81) 및 아라비돕시스 CER3 (진뱅크 등록 식별번호 NM_125164.2)을 포함한다. 초장쇄 지방 알데하이드는 알데하이드 리덕타아제 또는 NADPH-의존성 알콜 데하이드로게나아제 (예를 들어, YqhD)에 의해 지방 알콜로 환원될 수 있다. 알데하이드 리덕타아제 유전자는 예를 들어, YqhD를 포함한다.

특정 구체예에서, C₁ 대사 비광합성 미생물은 추가로 초장쇄 지방 알데하이드를 형성할 수 있는 지방 아실-CoA 리덕타아제를 코딩하며, 여기서 초장 탄소쇄 화합물은 초장쇄 지방 알데하이드인 핵산 분자(들)를 포함한다. 지방 아실-CoA 리덕타아제 유전자는 예를 들어, ACR1, ACR, 및 아라비돕시스 CER3 (진뱅크 등록 식별번호 NM_125164.2)을 포함한다.

특정 구체예에서, C₁ 대사 비광합성 미생물은 초장쇄 지방 알콜을 형성할 수 있는 지방 알콜 형성 아실-CoA 리덕타아제 및 초장쇄 지방 에스테르 왁스를 형성할 수 있는 에스테르 신타아제를 코딩하며, 여기서 초장 탄소쇄 화합물은 초장쇄 지방 에스테르 왁스인 핵산 분자를 포함한다. 본원에 상세히 기술된 지방 일차 알콜 (적어도 C₂₅)은 또한 에스테르 연결을 통해 본원에 상세히 기술된 지방 아실-CoA (≤ C₂₄)와 에스테르 신타아제에 의해 접합하여 초장쇄 지방 에스테르 왁스 (> C₂₄)를 생성할 수 있다. 다른 구체예에서, 초장쇄 지방 에스테르 왁스는 에스테르 신타아제 효소를 통해 초장쇄 지방 일차 알콜과 지방 아실-CoA의 접합, 지방 일차 알콜과 초장쇄 지방 아실-CoA의 접합, 또는 초장쇄 지방 일차 알콜과 초장쇄 지방 아실-CoA의 접합에 의해 생성될 수 있다. 예시적인 에스테르 신타아제 유전자는 예를 들어, 아라비돕시스 WSD1 (Li et al., 2008, Plant Phsyiol. 148:97-107; 진뱅크 등록 식별번호 NM_123089.2)을 포함한다.

초장쇄 지방 에스테르 왁스는 왁스의 주성분이다. 각종 천연 및 합성 왁스는 산업상 중요하다. 일부 구체예에서, C₁ 대사 미생물은 천연 또는 합성 왁스의 초장쇄 지방산 에스테르 왁스 성분을 생성하도록 변경된다. 천연 왁스의 예로는 밀랍, 고래 경랍, 호호바, 카나우바, 중국랍 (충백랍), 칸데릴라 왁스 및 쌀겨유 등이 있다. 밀랍의 주요 성분은 팔미테이트, 팔미톨레에이트 및 초장쇄 (C₃₀-C₃₂) 지방족 알콜의 올레이트 에스테르이다. 향유 고래 오일은 주로 팔미테이트 (C₃₂) 및 세틸 미리스테이트 (C₃₀)의 지방 왁스 에스테르 (65-95%)를 포함한다. 호호바 종자유는 주로 20:1, 22:1 및 24:1 지방 알콜에 연결된 18:1, 20:1 및 22:1 지방산으로 구성되고, C₃₈-C₄₄ 초장쇄 지방 에스테르를 생성한다. 카나우바 왁스는 C₃₀ 내지 C₃₄ 알콜에 연결된 C₁₆ 내지 C₂₀ 지방산으로 구성되어 C₄₆ 내지 C₅₄ 왁스 에스테르를 생성하는 초장쇄 지방 왁스 에스테르로 주로 구성된다. Coccu ceriferus에 의해 분비되는 중국 충백랍의 주성분은 46 내지 60개 이하의 탄소 원자를 가지는 쇄로 형성된 왁스 에스테르이고 대부분의 알콜 및 산은 26 또는 28개의 탄소 원자를 가진다. 칸데릴라 왁스는 주로 짝수 탄소 쇄 (C₂₈ 내지 C₃₄)를 가지는 알콜 및 산의 에스테르와 함께 홀수의 포화 탄화수소 (C₂₉ 내지 C₃₃)로 구성된다. 쌀겨유는 초장쇄 지방산 (C₂₆ 내지 C₃₀) 및 초장쇄 알콜 (C₂₆ 내지 C₃₀)의 에스테르를 함유한다.

초장쇄 지방 아실-CoA의 변경을 위한 제2 경로는 알칸 형성 (탈카보닐화) 경로이다. 특정 구체예에서, C₁ 대사 비광합성 미생물은 초장쇄 지방 알데하이드를 형성할 수 있는 지방 아실-CoA 리덕타아제 및 초장쇄 알칸을 형성할 수 있는 알데하이드 데카보닐라아제를 코딩하며, 여기서 초장 탄소쇄 화합물은 초장쇄 알칸인 핵산 분자(들)를 포함한다. 제1 단계는 아실-CoA 리덕타아제에 의한 초장쇄 지방 아실-CoA의 그의 대응 초장쇄 지방 알데하이드로의 환원이다. 알데하이드 데카보닐라아제에 의한 카보닐기의 제거에 의해 그의 초장쇄 지방 아실-CoA 전구체 보다 한 개 적은 탄소 원자를 가지는 초장쇄 알칸이 생성된다. 알칸 형성 (탈카보닐화) 경로는 문헌[Samuels et al., 2008, Annu Rev. Plant Biol. 59:683-707]에 기술되어 있다. 지방 아실-CoA 리덕타아제 유전자는 예를 들어, ACR1 및 아라비돕시스 thalianCER3 (진뱅크 등록 식별번호 NM_125164.2)을 포함한다. 알데하이드 데카보닐라아제 유전자는 예를 들어, 아라비돕시스 thalianCER1 (진뱅크 등록 식별번호 D64155.1) 및 아라비돕시스 CER22를 포함한다.

알칸 하이드록실라아제에 의한 초장쇄 알칸의 추가 변경에 의해 하이드록실기 중쇄가 삽입되어 초장쇄 지방 이차 알콜을 생성한다. 하이드록실기의 치환 위치는 하이드록실라아제의 특이성에 의존한다. 하이드록실라아제 유전자는 예를 들어, 아라비돕시스 thaliana MAH1 (CYP96A15) (Greer et al., 2007, Plant Physiol. 145:653-667; 진뱅크 등록 식별번호 NM_001124037.1)을 포함한다.

알콜 데하이드로게나아제에 의해 촉매화되는 초장쇄 지방 이차 알콜의 제2 산화 반응에 의해 초장쇄 케톤이 생성된다. 특정 구체예에서, C₁ 대사 비광합성 미생물은 초장쇄 지방 알데하이드를 형성할 수 있는 지방 아실-CoA 리덕타아제, 초장쇄 알칸을 형성할 수 있는 알데하이드 데카보닐라아제, 및 초장쇄 지방 이차 알콜을 형성할 수 있는 알칸 하이드록실라아제, 및 초장쇄 케톤을 형성할 수 있는 알콜 데하이드로게나아제를 코딩하며, 여기서 초장 탄소쇄 화합물은 초장쇄 케톤인 핵산 분자(들)를 포함한다. MAH1 (진뱅크 등록 식별번호 NM_001124037.1) 또한 이러한 제2 산화 반응을 수행할 수 있다.

24개 이하의 탄소 단위를 가지는 지방 아실-CoA 기질 및 지방산 유도체를 생성하기 위한 본원에 기술된 효소 (예를 들어, 아실-CoA 리덕타아제, 지방 알콜 형성 아실-CoA 리덕타아제, 알콜 데하이드로게나아제)는 또한 초장쇄 지방 아실-CoA를 그의 유도체로 추가 변경하기 위해 사용될 수도 있다.

특정 구체예에서, 초장 탄소쇄 화합물은 약 C₂₅-C₃₀, C₃₁-C₄₀, C₄₁-C₆₀, C₆₁-C₈₀, C₈₁-C₁₀₀, C₁₀₁-C₁₂₀, C₁₂₁-C₁₄₀, C₁₄₁-C₁₆₀, C₁₆₁-C₁₈₀, 또는 C₁₈₁-C₂₀₀의 탄소 쇄 길이를 가진다. 대안적인 구체예에서, 초장 탄소쇄 화합물은 C₂₅-C₄₀, C₂₅-C₅₀, C₂₅-C₇₅, C₂₅-C₁₀₀, C₂₅-C₁₂₅, C₂₅-C₁₅₀, C₂₅-C₁₇₅, 또는 C₂₅-C₂₀₀ 초장 탄소쇄 화합물이다.

초장쇄 지방 아실-CoA를 생성하기 위한 신장 반응의 지방 아실-CoA 기질은 C₁ 대사 미생물에 의해 내인적으로 생성될 수 있다. 대안적으로, C₁ 대사 미생물은 신장용 지방 아실-CoA 기질의 합성을 위해 생체공학적으로 처리될 수 있다. 연루된 지방산 생합성 경로는 도 5 내지 10에 도시된다. 경로의 상이한 단계는 서로 다른 효소에 의해 촉매화되고, 각 단계는 복수의 효소를 생산하기 위해 유전자 과발현의 잠재적인 장소이며 따라서 더 많은 초장 탄소쇄 화합물의 생산을 유도한다. 경로에 필요한 효소를 코딩하는 핵산 분자가 또한 재조합적으로 이러한 효소가 부족한 C₁ 대사 미생물에 첨가될 수 있다. 마지막으로, 지방산 및 지방산 유도체의 제조에 이르는 경로와 경쟁하는 단계가 원하는 생성물의 생산을 증가시키기 위하여 감쇠 또는 차단될 수 있다.

지방산 신타아제(FAS)는 아실쇄의 개시 및 신장을 촉매화하는 효소의 그룹이다(Marrakchi et al., Biochemical Society 30:1050, 2002). FAS 경로에서의 효소와 함께 아실 운반체 단백질(ACP)은 생성된 지방산의 길이, 포화도 및 분지도를 제어한다. 이 경로에서의 단계들은 지방산 생합성(fab) 및 아세틸-CoA 카복실라아제(acc) 유전자 패밀리의 효소에 의해 촉매화된다. 목적으로 하는 생성물에 따라서, 이들 유전자 중 하나 이상은 감쇠, 발현 또는 과발현될 수 있다(각각의 효소의 효소적 활성 및 그의 효소 분류 번호의 도시에 대해 도 5 내지 10을 참조).

생성 숙주에서 지방산 생합성 경로는 전구체 아세틸-CoA 및 말로닐-CoA를 사용한다(예를 들어, 도 5 참조). 이 경로에서의 단계들은 지방산 생합성(fab) 및 아세틸-CoA 카복실라아제(acc) 유전자 패밀리의 효소에 의해 촉매화된다. 이 경로는 문헌[Heath et al., Prog . Lipid Res. 40:467, 2001]에 기재되어 있다.

아세틸-CoA는 아세틸-CoA 카복실라아제(Acc, 4가지의 별개 유전자에 의해 코딩되는 멀티서브단위 효소, accABCD)에 의해 카복실화되어 말로닐-CoA를 형성한다. 말로네이트기는 말로닐-CoA:ACP 트랜스아실라아제(FabD)에 의해 ACP에 전달되어 말로닐-ACP를 형성한다. 이어서, 말로닐-ACP가 아세틸-CoA와 합쳐지는 경우 축합 반응이 일어나서, β-케토아실-ACP를 초래한다. β-케토아실-ACP 신타아제 III(FabH)은 FAS 주기를 개시하는데 반해, β-케토아실-ACP 신타아제 I(FabB) 및 β-케토아실-ACP 신타아제 II(FabF)는 후속 주기에 관여한다.

다음에, 적절한 길이의 포화 지방산이 만들어질 때까지 단계들의 주기는 반복된다. 첫째로, β-케토아실-ACP는 NADPH에 의해 환원되어 β-하이드록시아실-ACP를 형성한다. 이 단계는 β-케토아실-ACP 리덕타아제(FabG)에 의해 촉매화된다. 이어서, β-하이드록시아실-ACP는 탈수되어 트랜스-2-에노일-ACP를 형성한다. β-하이드록시아실-ACP 데하이드라타아제/이소머라아제(FabA) 또는 β-하이드록시아실-ACP 데하이드라타아제(FabZ)는 이 단계를 촉매화한다. NADPH-의존성 트랜스-2-에노일-ACP 리덕타아제 I, II 또는 III(각각 FabI, FabK 및 FabL)은 트랜스-2-에노일-ACP를 환원시켜 아실-ACP를 형성한다. 후속 주기는 β-케토아실-ACP 신타아제 I 또는 β-케토아실-ACP 신타아제 II 리덕타아제에 의해 아실-ACP와 함께 말로닐-ACP의 축합에 의해 시작된다(각각 FabB 및 FabF).

본원에 기재된 바와 같은 C₁ 대사 미생물은 아세틸-CoA 및 말로닐-CoA를 과생성하도록 공학적으로 처리될 수 있다. 아세틸-CoA/말로닐-CoA/지방산, 지방산 유도체 생성 및 초장 탄소쇄 화합물 생성을 얻기 위해 몇몇 상이한 변형이 조합으로 또는 개별적으로 C₁ 대사 미생물에 대해 만들어질 수 있다.

예를 들어, 아세틸-CoA 생성을 증가시키기 위해, 다음의 유전자 중 하나 이상이 C₁ 대사 미생물에서 발현될 수 있다: pdh, panK, aceEF(E1p 데하이드로게나아제 성분 및 피루베이트 및 2-옥소글루타레이트 데하이드로게나아제 복합체의 E2p 디하이드로리포아미드 아실트랜스퍼라아제 성분을 코딩), fabH, fabD, fabG, acpP 또는 fabF. 다른 예에서, 지방-아실-CoA 리덕타아제 및 알데하이드 데카보닐라제를 코딩하는 추가적인 DNA 서열이 C₁ 대사 미생물에서 발현될 수 있다. 모두 항시적, 또는 달리 제어가능한 프로모터의 조절하에 앞서 언급한 유전자 중 하나 이상을 함유하는 플라스미드가 구성될 수 있다는 것은 당업계에 잘 공지되어 있다. 예시적인 이들 유전자의 진뱅크 등록번호는 pdh(BAB34380, AAC73227, AAC73226), panK(또한 coaA, AAC76952로서 알려짐), aceEF(AAC73227, AAC73226), fabH(AAC74175), fabD(AAC74176), fabG(AAC74177), acpP(AAC74178), fabF(AAC74179)이다.

추가적으로, fadE, gpsA, ldhA, pflb, adhE, pta, poxB, ackA 또는 ackB의 발현 수준은 대응하는 유전자의 삭제(null) 또는 결실 돌연변이를 함유하는 조건적으로 복제성 또는 비복제성 플라스미드에 의한 형질전환에 의해, 또는 프로모터 또는 인핸서 서열을 치환함으로써 공학적으로 처리된 미생물에서 감소, 저해 또는 넉아웃(knocked-out)될 수 있다. 이들 유전자에 대한 예시적인 진뱅크 등록번호는 fadE(AAC73325), gspA(AAC76632), ldhA(AAC74462), pflb(AAC73989), adhE(AAC74323), pta(AAC75357), poxB(AAC73958), ackA(AAC75356) 및 ackB(BAB81430)이다. 얻어진 공학적으로 처리된 C₁ 대사 미생물은, 적절한 환경에서, 예컨대 C₁ 기질 공급원료와 함께 성장될 때 아세틸-CoA 생성 수준이 증가될 것이다.

게다가, 말로닐-CoA 과생성은 드노보(de novo)로 합성된 플라스미드에 포함된 accABCD(예를 들어, 등록번호 AAC73296, EC 6.4.1.2)를 이용하여 본원에 기재된 바와 같은 C₁ 대사 미생물을 공학적으로 처리함으로써 수행될 수 있다. 지방산 과생성은 드노보로 합성된 플라스미드에서 핵산 분자 코딩 리파아제(예를 들어, 진뱅크 등록번호 CAA89087, CAA98876)를 코딩하는 핵산 분자를 추가로 포함함으로써 달성될 수 있다.

결과로서, 일부 예에서, 아세틸-CoA 카복실라아제는 고유한 발현 수준에 비해 적어도 약 2배, 바람직하게는 적어도 약 5배, 또는 더 바람직하게는 적어도 약 10배만큼 이들의 세포내 농도 수준을 증가시키도록 과발현된다.

일부 구체예에서, plsB(예를 들어, 진뱅크 등록번호 AAC77011) D311E 돌연변이가 이용가능한 아실-CoA의 양을 증가시키기 위해 사용될 수 있다. 추가 구체예에서, sfa 유전자(FabA의 억제유전자, 예를 들어, 진뱅크 등록번호 AAN79592)의 과발현이 단일불포화된 지방산의 생성을 증가시키기 위해 C₁ 대사 미생물에 포함될 수 있다(Rock et al., J. Bacteriology 178:5382, 1996).

본원에 기재한 바와 같이, 아세틸-CoA 및 말로닐-CoA는 몇몇 단계들로 처리되어 아실-ACP 쇄를 형성한다. 효소 sn-글리세롤-3-포스페이트 아실트랜스퍼라아제(PlsB)는 아실-ACP 또는 아실-CoA로부터의 아실기의 글리세롤-3-포스페이트의 sn-1 위치로의 전달을 촉매화한다. 따라서, PlsB는 지방산 경로의 부분인 인지질 합성에서의 중요한 조절 효소이다. PlsB를 저해하는 것은 장쇄 아실-ACP의 수준에서의 증가를 야기하는데, 피드백은 경로에서 초기 단계들을 저해할 것이다(예를 들어, accABCD, fabH, 및 fabI). 예를 들어, 티오에스테르라제 과발현에 의한 이 조절의 비커플링은 증가된 지방산 생성을 야기한다. tes 및 fat 유전자 패밀리는 티오에스테르라제를 발현한다. FabI는 또한 장쇄 아실-CoA에 의해 시험관내에서 저해된다.

지방산 유도체의 동종 또는 혼합 집단의 생성을 위한 C₁ 대사 미생물을 공학적으로 처리하기 위해, 하나 이상의 내인성 유전자가 감쇠, 저해 또는 기능적으로 결실될 수 있고, 결과로서, 하나 이상의 티오에스테르라제가 발현될 수 있다. 예를 들어, C₁₀ 지방산 유도체는 C_18:1-ACP를 사용하는 티오에스테르라제 C₁₈(예를 들어, 진뱅크 등록번호 AAC73596 및 P0ADA1)을, 그리고 동시에 C₁₀-ACP를 사용하는 티오에스테르라제 C₁₀(예를 들어, 진뱅크 등록번호 Q39513)을 발현시킴으로써 생성될 수 있다. 이는 탄소쇄 길이가 10인 지방산 유도체의 상대적으로 동종인 집단을 초래한다. 다른 예에서, C₁₄ 지방산 유도체는 비-C₁₄ 지방산을 생성하는 내인성 티오에스테르라제를 감쇠시키고 티오에스테르라제 등록번호 Q39473(C₁₄-ACP를 사용)을 발현시킴으로써 생성될 수 있다. 또 다른 예에서, C₁₂ 지방산 유도체는 C₁₂-ACP(예를 들어, 진뱅크 등록번호 Q41635)를 사용하는 티오에스테르라제를 발현시키고, 비-C₁₂ 지방산을 생성하는 티오에스테르라제를 감소시킴으로써 생성될 수 있다. 따라서, C₁ 대사 미생물은 KCS에 의해 개시되는 후속 신장 반응에 대한 기질로서 바람직한 사슬 길이(들)의 지방 아실-CoA를 생성하도록 공학적으로 처리될 수 있다. 아세틸-CoA, 말로닐-CoA, 및 지방산 과생성은, 예를 들어 세포 용해에 후속적으로 방사성 전구체, 전구체, HPLC, 및 GC-MS를 사용함으로써 당업계에 공지된 방법을 사용하여 입증될 수 있다. 청구된 방법에 유용한 티오에스테르라제의 비-제한적 예 및 본 개시내용의 C₁ 대사 미생물은 본원에 전문이 참조로 포함되는 미국 특허 제8,283,143호의 표 1에 열거된다.

아실-CoA 신타아제(ACS)는 2-단계 메커니즘에 의해 유리 지방산을 아실-CoA로 에스테르화한다. 유리 지방산은 처음에 ATP의 피로인산분해(pyrophosphorolysis)를 통해 아실-AMP 중간체(알데하이드)로 전환된다. 이어서, 알데닐레이트의 활성화된 카보닐 탄소는 CoA의 티올기에 결합되고, AMP 및 아실-CoA 최종 생성물을 방출한다. 문헌[Shockey et al., Plant. Physiol . 129:1710, 2002] 참조.

대장균 ACS 효소 FadD 및 지방산 수송 단백질 FadL은 지방산 흡수 시스템의 필수 성분이다. FadL은 박테리아 세포 내로 지방산의 수송을 매개하고, FadD는 아실-CoA 에스테르의 형성을 매개한다. 어떤 다른 탄소 공급원도 이용가능하지 않을 때, 외인성 지방산은 박테리아에 의해 흡수되고, 아실-CoA 에스테르(전사 인자 FadR에 결합하며 지방산 수송(FadL), 활성화(FadD) 및 β-산화(FadA, FadB, FadE, 및 FadH)를 초래할 수 있는 단백질을 코딩하는 fad 유전자의 발현을 억제함)로 전환된다. 탄소의 대안의 공급원이 이용가능할 때, 박테리아는, 인지질 합성을 위해 사용되지만 β-산화를 위한 기질은 아닌 아실-ACP로서 지방산을 합성한다. 따라서, 아실-CoA 및 아실-ACP는 둘 다 상이한 최종 생성물을 초래하는 지방산의 독립적 공급원이다. 문헌[Caviglia et al., J. Biol. Chem. 279:1163, 2004] 참조.

C₁ 대사 미생물은 다양한 길이의 지방산을 생성하기 위해 공지된 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자를 사용하여 공학적으로 처리될 수 있고, 이어서 아실-CoA로, 궁극적으로는 지방 알콜과 같은 초장 탄소쇄 화합물로 전환될 수 있다. 초장 탄소쇄 화합물을 제조하는 하나의 방법은 발현을 증가시키는 단계 또는 하나 이상의 아실-CoA 신타아제 펩티드(EC 6.2.1.-)의 더 활성인 형태를 발현시키는 단계를 수반한다. 아실-CoA 및 지방산 유도체를 생성하기 위해 발현될 수 있는 아실-CoA 신타아제의 열거는 미국 특허 제8,283,143호의 표 2에서 제시되며, 이것의 표는 본원에 그의 전문이 참조로서 포함된다. 이들 아실-CoA 신타아제는 기질로서 지방-아실-CoA를 사용하는 임의의 경로를 개선시키기 위해 사용될 수 있다.

아실-CoA는 NADH-의존성 아실-CoA 리덕타아제(예를 들어, Acr1)에 의해 지방 알데하이드로 환원된다. 이어서, 지방 알데하이드는 NADPH-의존성 알콜 데하이드로게나아제(예를 들어, YqhD)에 의해 지방 알콜로 환원된다. 대안적으로, 지방 알콜 형성 아실-CoA 리덕타아제(FAR)는 아실-CoA의 지방 알콜 및 CoASH로의 환원을 촉매화한다. FAR은 이런 4-전자 환원에서 보조인자로서 NADH 또는 NADPH를 사용한다. 알콜-생성 FAR 반응은 알데하이드 중간체를 통해 진행되지만, 유리 알데하이드는 방출되지 않는다. 따라서, 알콜-형성 FAR은 아실-CoA의 2-전자 환원을 수행하는 해당 효소와 별개이며, 생성물로서 유리 지방 알데하이드를 수득한다. (문헌[Cheng and Russell, J. Biol . Chem., 279:37789, 2004; Metz et al., Plant Physiol . 122:635, 2000] 참조).

C₁ 대사 미생물은 아실-CoA로부터 지방 알콜을 생성하기 위해 공지된 폴리펩티드를 사용하여 공학적으로 처리될 수 있다. 지방 알콜을 제조하는 한 가지 방법은 지방 알콜 형성 아실-CoA 리덕타아제(FAR, EC 1.2.1.50/1.1.1로부터의 acr1과 같은 유전자에 의해 코딩됨) 또는 아실-CoA 리덕타아제(EC 1.2.1.50) 및 알콜 데하이드로게나아제(EC 1.1.1.1)의 발현을 증가시키는 단계 또는 이들의 더 활성인 형태를 발현시키는 단계를 수반한다. 예시적인 진뱅크 등록번호는 미국 특허 제8,283,143호의 도 1에 열거되었으며, 이 도면은 본원에 그의 전문이 참조로 포함된다.

지방 알콜은 탄화수소계 계면활성제로서 설명될 수 있다. 계면활성제 생성을 위해, C₁ 대사 미생물은, 그것이 C₁ 기질 공급원료로부터 계면활성제를 생성하도록 변형된다. 이러한 C₁ 대사 미생물은 지방산을 지방 알데하이드로 전환시킬 수 있는 단백질을 코딩하는 제1 외인성 핵산 분자 및 지방 알데하이드를 알콜로 전환시킬 수 있는 단백질을 코딩하는 제2 외인성 핵산 분자를 포함한다. 일부 예에서, 제1 외인성 핵산 분자는 지방산 리덕타아제(FAR)를 코딩한다. 일 구체예에서, 제2 외인성 핵산 분자는 포유류 마이크로솜 알데하이드 리덕타아제 또는 장쇄 알데하이드 데하이드로게나아제를 코딩한다. 추가 예에서, 제1 외인성 핵산 분자 및 제2 외인성 핵산 분자는 아트로박터 AK 19, 로도토룰라 글루티닌스(Rhodotorula glutinins), 아시네토박터 종(Acinetobacter sp.) M-1 또는 칸디다 리폴리티카(Candida lipolytica)로부터 유래된다. 일 구체예에서, 제1 이종성 핵산 분자 및 제2 이종성 핵산 분자는 아시네토박터 종 M-1 또는 칸디다 리폴리티카로부터의 다효소 복합체로부터 유래된다.

계면활성제 생성에서 사용될 수 있는 장쇄 알콜 전환 단백질로 지방산을 코딩하는 이종 핵산 분자의 추가적인 공급원은 모르티에렐라 알피나(Mortierella alpina)(ATCC 32222), 크립토코커스 쿠르바투스(Cryptococcus curvatus), (또한 아피오트리쿰 쿠르바툼(Apiotricum curvatum)으로서 지칭됨), 아카니보락스 자덴시스(Akanivorax jadensis)(T9T=DSM 12718=ATCC 700854), 아시네토박터 종 HO1-N(ATCC 14987) 및 로도코커스 오파쿠스(Rhodococcus opacus)(PD630 DSMZ 44193)를 포함한다.

일례에서, 지방산 유도체는 탄소쇄 길이가 약 8 내지 약 24개 탄소 원자, 약 8 내지 약 18개 탄소 원자, 약 8 내지 약 14개 탄소 원자, 약 10 내지 약 18개 탄소 원자, 또는 약 12 내지 약 16개 탄소 원자인 포화 또는 불포화 계면활성제 생성물이다. 다른 예에서, 계면활성제 생성물은 약 10 내지 약 14개 탄소 원자, 또는 약 12 내지 약 14개 탄소 원자의 탄소쇄 길이를 가진다.

계면활성제를 생성하기 위한 적절한 C₁ 대사 미생물은 진핵생물 또는 원핵생물 미생물 중 하나일 수 있다. 지방산 유도체의 형태로 C₁ 공급원료로부터 고수준의 계면활성제 전구체를 합성하는 선천적 능력을 입증한 C₁ 대사 미생물, 예컨대 아세틸 CoA 카복실라아제를 발현시키도록 공학적으로 처리된 메탄 생성균이 사용된다.

생성 숙주는 다양한 길이의 지방 에스테르를 생성하기 위해 공지된 폴리펩티드를 사용하여 공학적으로 처리될 수 있다. 지방 에스테르를 제조하는 한 가지 방법은 하나 이상의 알콜 O-아실트랜스퍼라아제 펩티드(EC 2.3.1.84)의 발현을 증가시키거나, 이의 더 활성인 형태를 발현시키는 것을 포함한다. 이들 펩티드는 아세틸-CoA 및 알콜을 CoA 및 에스테르로 전환시킴으로써 알콜의 아세틸화를 촉매화한다. 일부 예에서, 알콜 O-아실트랜스퍼라아제 펩티드는 선택된 티오에스테르라제 펩티드, FAS 펩티드, 및 지방 알콜 형성 펩티드와 함께 발현될 수 있고, 탄소쇄 길이, 포화, 및 분지도가 제어되게 할 수 있다. 일부 경우에, bkd 오페론은 분지된 지방산 전구체가 생성될 수 있도록 공동발현될 수 있다.

본원에 사용되는 바와 같은, 알콜 O-아실트랜스퍼라아제 펩티드는 효소 분류 번호 EC 2.3.1.84에서의 펩티드뿐만 아니라 CoA 및 에스테르를 형성하도록 아세틸-CoA 및 알콜의 전환을 촉매화할 수 있는 다른 펩티드를 포함한다. 추가적으로, 당업자는 알콜 O-아실트랜스퍼라아제 펩티드가 다른 반응을 촉매화할 것을 인식할 것이다.

예를 들어, 일부 알콜 O-아실트랜스퍼라아제 펩티드는 지방 알콜 또는 아세틸-CoA 티오에스테르, 예컨대 다른 알콜 및 다른 아실-CoA 티오에스테르에 추가로 다른 기질을 수용할 것이다. 따라서 이러한 비-특이적 또는 분기-특이성 알콜 O-아실트랜스퍼라아제 펩티드가 또한 포함된다. 알콜 O-아실트랜스퍼라아제 펩티드 서열은 공개적으로 입수가능하며, 예시적인 진뱅크 등록번호는 미국 특허 제8,283,143호의 도 1에서 열거되었으며, 이 도면은 본원에 그의 전문이 참조로 포함된다. 특정 알콜 O-아실트랜스퍼라아제 펩티드의 활성을 특성규명하기 위한 분석은 당업계에 잘 공지되어 있다. O-아실트랜스퍼라아제는 공여체 아실기 또는 수용체 알콜 부분에 대해 새로운 활성 및 특이성을 갖도록 공학적으로 처리될 수 있다. 공학적으로 처리된 효소는 잘-기록된 합리적이고 발전적인 접근을 통해 생성될 수 있다.

지방 에스테르는 에스테르 결합을 통해 장쇄 지방 알콜을 지방 아실-CoA에 접합하는 아실-CoA:지방 알콜 아실트랜스퍼라아제(예를 들어, 에스테르 신타아제)에 의해 합성된다. 에스테르 신타아제 및 코딩 유전자는 호호바 식물 및 박테리움 아시네토박터 종 ADP1(앞서 아시네토박터 칼코아세티쿠스(Acinetobacter calcoaceticus) ADP1)로부터 공지되어 있다. 박테리아 에스테르 신타아제는 에스테르 신타아제 활성, 및 디아실글리세롤 기질 및 지방 아실-CoA로부터 트리아실글리세롤을 형성하는 능력(아실-CoA:디글리세롤 아실트랜스퍼라아제(DGAT) 활성)을 나타내는 이작용성 효소이다. 유전자 wax/dgat는 에스테르 신타아제와 DGAT를 둘 다 코딩한다. 문헌[Cheng et al., J. Biol . Chem . 279:37798, 2004; Kalscheuer and Steinbuchel, J. Biol . Chem. 278:8075, 2003] 참조. 에스테르 신타아제는 또한 특정 지방 에스테르를 생성하기 위해 사용될 수 있다.

아실-CoA 및 알콜로부터 왁스를 포함하는 지방 에스테르의 생성은 공지된 폴리펩티드를 사용하여 공학적으로 처리될 수 있다. 지방 에스테르를 제조하는 한 가지 방법은 하나 이상의 에스테르 신타아제(EC 2.3.1.20, 2.3.1.75)의 발현을 증가시키는 단계 또는 더 활성인 형태를 발현시키는 단계를 포함한다. 에스테르 신타아제 펩티드 서열은 공개적으로 입수가능하고, 예시적인 진뱅크 등록번호는 미국 특허 제8,283,143호의 도 1에 열거되었으며, 이 도면은 본원에 그의 전문이 참조로 포함된다. 에스테르 신타아제 활성을 동정하기 위한 방법은 미국 특허 제7,118,896호에 제공되어 있다.

특정 예에서, 목적으로 하는 생성물이 지방산 에스테르 왁스라면, C₁ 대사 미생물은, 에스테르를 생성하도록 변형된다. 이러한 C₁ 대사 미생물은 C₁ 대사 미생물에 대해 C₁ 기질 공급원료로부터 포화, 불포화 또는 분지 지방 에스테르를 합성하기 위한 능력을 부여하도록 발현된 에스테르 신타아제를 코딩하는 외인성 핵산 분자를 포함한다. 일부 구체예에서, C₁ 대사 미생물은 또한 다음의 예시적인 단백질을 코딩하는 핵산 분자를 발현시킬 수 있다: 지방산 엘롱가제, 아실-CoA 리덕타아제, 아실트랜스퍼라아제, 에스테르 신타아제, 지방 아실 트랜스퍼라아제, 디아실글리세롤 아실트랜스퍼라아제, 아실-coA 왁스 알콜 아실트랜스퍼라아제, 또는 이들의 임의의 조합. 대안의 구체예에서, C₁ 대사 미생물은 이작용성 에스테르 신타아제/아실-CoA:디아실글리세롤 아실트랜스퍼라아제를 코딩하는 핵산 분자를 포함한다. 예를 들어, 이작용성 에스테르 신타아제/아실-CoA:디아실글리세롤 아실트랜스퍼라아제는 심몬드시아 치넨시스(Simmondsia chinensis), 아시네토박터 종 ADP1(앞에서 아시네토박터 칼코아세티쿠스 ADP1), 알카니보락스 보르쿠멘시스(Alcanivorax borkumensis), 슈도모나스 아에루기노사(Pseudomonas aeruginosa), 펀디박터 자덴시스(Fundibacter jadensis), 아라비돕시스 탈리아나(Arabidopsis thaliana) 또는 알칼리게네스 유트로푸스(Alcaligenes eutrophus)(이후에 랄스토니아 유트로파(Ralstonia eutropha)로 재명명함)로부터의 다중효소 복합체로부터 선택될 수 있다. 일 구체예에서, 지방산 엘롱가제, 아실-CoA 리덕타아제 또는 왁스 신타아제는 왁스 또는 지방 에스테르와 같은 에스테르를 생성하기 위해 랄스토니아 유트로파 또는 문헌에 공지된 다른 유기체로부터의 다중효소 복합체로부터 유래된다.

지방 에스테르 생성에서 유용한 에스테르 합성 단백질을 코딩하는 이종 핵산 분자의 추가적인 공급원은 모르티에렐라 알피나(예를 들어, ATCC 32222), 크립토코커스 쿠르바투스(또한 아피오트리쿰 쿠르바툼으로서 지칭됨), 알카니보락스 자덴시스(Alcanivorax jadensis)(예를 들어, T9T=DSM 12718=ATCC 700854), 아시네토박터 종 HO1-N(예를 들어, ATCC 14987) 및 로도코커스 오파쿠스(예를 들어, PD630, DSMZ 44193)를 포함한다. 일례에서, 좌위 AA017391에서 아시네토박터 종 ADP1로부터의 에스테르 신타아제(문헌[Kalscheuer and Steinbuchel, J. Biol . Chem . 278:8075, 2003]에 기재됨)가 사용된다. 다른 예에서, 좌위 AAD38041에서 심몬드시아 치넨시스로부터의 에스테르 신타아제가 사용된다.

선택적으로, 에스테르 유출자, 예컨대 FATP 패밀리의 구성원이 세포밖 환경내로 에스테르의 방출을 용이하게 하기 위해 사용될 수 있다. 사용될 수 있는 에스테르 유출자의 비제한적 예는 좌위 NP_524723에서 드로소필라 멜라노게스터(Drosophila melanogaster)로부터의 지방산(장쇄) 수송 단백질 CG7400-PA, 이소폼 A이다.

수송 단백질은 C₁ 대사 미생물 밖으로 초장 탄소쇄 화합물를 유출한다. 다수의 수송 및 유출 단백질은 매우 다양한 화합물을 배출하는 작용을 하며, 특정 유형의 초장 탄소쇄 화합물에 대해 선택적이 되도록 자연적으로 변형될 수 있다. 적합한 수송 단백질의 비-제한적 예는 ATP-결합 카세트(ABC) 수송 단백질, 유출 단백질, 및 지방산 수송 단백질(FATP)이다. 적합한 수송 단백질의 추가적인 비-제한적 예는 캐노랩디티스 엘레강스(Caenorhabditis elegans), 아라비돕시스 탈라니아(Arabidopsis thalania), 알칼리게네스 유트로푸스(Alkaligenes eutrophus), 로도코쿠스 에리트로폴리스(Rhodococcus erythropolis)와 같은 유기체로부터의 ABC 수송 단백질을 포함한다. 사용될 수 있는 예시적인 ABC 수송 단백질은 CER5, AtMRP5, AmiS2, 또는 AtPGP1이다. 바람직한 구체예에서, ABC 수송 단백질은 CER5(예를 들어, AY734542)이다. 적합한 수송 단백질을 발현시키는 유전자를 함유하는 벡터는 초장 탄소쇄 화합물의 방출을 증가시키기 위해 단백질 생성 숙주 내로 삽입될 수 있다.

C₁ 대사 미생물은 또한 지방산 유도체를 방출시키는 그들의 내인성 능력에 대해 선택될 수 있다. 생성물 생성 및 발효 브로스 내로 방출의 효율은 세포내 생성물 대 세포밖 생성물의 비로서 표현될 수 있다. 일부 예에서, 비는 약 5:1, 4:1, 3:1, 2:1, 1:1, 1:2, 1:3, 1:4 또는 1:5일 수 있다.

특정 분지점, 포화 수준, 탄소쇄 길이 및 에스테르 특징을 지니는 지방산 유도체가 바람직하게 생성될 수 있다. 특정 유도체를 자연적으로 생성하는 C₁ 대사 미생물은 개시 숙주 세포로서 선택될 수 있다. 대안적으로, 특정 지방산 유도체를 생성할 효소를 발현시키는 유전자는 본원에 기재된 바와 같이 C₁ 대사 미생물 내로 삽입될 수 있다.

일부 예에서, 상이한 종 또는 공학적으로 처리된 변이체로부터 유래된 외인성 FAS 유전자의 발현은 C₁ 대사 미생물 내로 도입되어 고유한 숙주 세포의 지방산과 구조적으로 상이한(길이, 분지, 불포화도 등) 지방산을 생합성하게 할 수 있다. 이들 이종 유전자 산물은 또한 숙주 세포 내 자연 조절 메커니즘에 의해 영향받지 않도록 선택되거나 또는 공학적 처리될 수 있고, 따라서 목적으로 하는 상업적 제품의 생성을 제어한다. 예를 들어, 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 사카로마이세스 세레비시애(Saccharomyces cerevisiae), 스트렙토마이세스 종(Streptomyces spp .), 랄스토니아(Ralstonia), 로도코커스(Rhodococcus), 코리네박테리아(Corynebacteria), 브레비박테리아(Brevibacteria), 마이코박테리아(Mycobacteria), 유질의 효모 등으로부터의 FAS 효소가 본 개시의 C₁ 대사 미생물에서 발현될 수 있다. 이러한 외인성 효소의 발현은 생성된 지방산 및 궁극적으로는 지방산 유도체의 구조를 변경시킬 것이다.

C₁ 대사 미생물이 특정 수준의 불포화, 분지 또는 탄소쇄 길이를 지니는 지방산을 생성하도록 공학적 처리될 때, 얻어진 공학적으로 처리된 지방산은 지방산 유도체의 생성에서 사용될 수 있다. 이러한 C₁ 대사 미생물로부터 생성된 지방산 유도체는 공학적으로 처리된 지방산의 특징을 나타낼 수 있다.

예를 들어, 생성 숙주는 분지의 단쇄 지방산을 만들도록 공학적 처리될 수 있고, 이어서, 이는 분지의 단쇄 지방 알콜을 생성하기 위해 생성 숙주에 의해 사용될 수 있다. 유사하게, 탄화수소는 정해진 수준의 분지, 불포화 또는 탄소쇄 길이를 갖는 지방산을 생성하기 위해 생성 숙주를 유전자 조작함으로써 생성될 수 있고; 따라서, 동종 탄화수소 집단을 생성한다. 추가적인 단계는 얻어진 생성물의 동질성을 개선시키기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 불포화 알콜, 지방 에스테르 또는 탄화수소가 요망될 때, C₁ 대사 미생물은 저수준의 포화 지방산을 생성하도록 공학적 처리될 수 있고, 추가로 추가 불포화효소를 발현하도록 변형되어 포화 생성물의 생성을 줄이거나 또는 감소시킬 수 있다.

지방산은 지방산 유도체의 생성에서 중요한 중간체이다. 지방산 유도체는 지방산 유도체를 만들기 위해 분지 또는 환식 지방산을 사용함으로써 분지점, 환식 부분 및 이들의 조합을 함유하도록 생성될 수 있다.

예를 들어, C₁ 대사 미생물은 직쇄 지방산을 자연적으로 생성할 수 있다. 분지쇄 지방산을 생성하도록 C₁ 대사 미생물을 유전자 조작하기 위해, 분지된 전구체(예를 들어, bkd 오페론)를 제공하는 몇몇 유전자가 C₁ 대사 미생물(예를 들어, 메탄 생성균) 내로 도입될 수 있고 분지된 전구체(예를 들어, fabH)로부터 지방산 생합성을 개시하도록 발현될 수 있다. bkd, ilv, icm 및 fab 유전자 패밀리는 분지쇄 초장 탄소쇄 화합물을 생성하도록 발현 또는 과발현될 수 있다. 유사하게, 환식 지방산을 생성하기 위해, 환식 전구체를 제공하는 유전자는 생성 숙주 내로 도입될 수 있고, 환식 전구체로부터 지방산 생합성을 개시하도록 발현될 수 있다. ans, chc 및 plm 유전자 패밀리는 환식 지방산을 생성하기 위해 발현 또는 과발현될 수 있다. 본 방법에서 사용될 수 있는 이들 유전자 패밀리 내 유전자의 비-제한적 예 및 본 개시내용의 C₁ 대사 미생물은 미국 특허 제8,283,143호(도 1, 도면은 본원에 참조로 포함됨)에서 열거된다.

추가적으로, 생성 숙주는 분지된 지방산의 신장을 위해 단백질을 코딩하는 유전자(예를 들어, ACP, FabF 등)를 발현시키기 위해 또는 정상적으로는 직쇄 지방산을 야기하는 대응하는 유전자를 결실 또는 감쇠시키기 위해 공학적으로 처리될 수 있다. 이와 관련하여, 도입된 유전자(예를 들어, fabH, fabF)와 경쟁하는 내인성 유전자는 결실, 저해 또는 감쇠된다.

분지된 아실-CoA(예를 들어, 2-메틸-부티릴-CoA, 이소발레릴-CoA, 이소부티릴-CoA 등)은 분지된 지방산의 전구체이다. 분지된 지방산을 함유하는 대부분의 미생물에서, 분지된 지방산은 분지된 아미노산(예를 들어, 이소류신, 류신 및 발린)으로부터 2 단계로 합성된다(Kadena, Microbiol . Rev. 55:288, 1991). C₁ 대사 미생물은 분지된 지방산 유도체를 생성하거나, 혹은 분지된 지방산 유도체를 과발현시키기 위해 이들 2 단계에 수반된 효소 중 하나 이상을 발현 또는 과발현시키도록 공학적으로 처리될 수 있다. 예를 들어, C₁ 대사 미생물은 분지된 지방산 유도체를 야기하는 1 단계를 수행할 수 있는 내인성 효소를 가질 수 있고; 따라서, 제2 단계에 수반되는 효소를 코딩하는 유전자 만이 재조합적으로 도입될 필요가 있다.

분지된 지방산 유도체를 형성함에 있어 제1 단계는 분지쇄 아미노산 아미노트랜스퍼라아제에 의한 대응하는 α-케토산의 생성이다. 메탄영양체와 같은 C₁ 대사 미생물은 이러한 효소를 코딩하는 유전자를 내인성으로 포함할 수 있거나, 또는 이러한 유전자는 재조합적으로 도입될 수 있다. 일부 C₁ 대사 미생물에서, 이종 분지쇄 아미노산 아미노트랜스퍼라아제는 발현되지 않을 수도 있다. 따라서, 특정 구체예에서, 대장균로부터의 IlvE 또는 임의의 다른 분지쇄 아미노산 아미노트랜스퍼라아제(예를 들어, 락토코커스 락티스(Lactococcus lactis)(진뱅크 등록번호 AAF34406)로부터의 IlvE, 슈도모나스 푸티다(Pseudomonas putida )(진뱅크 등록번호 NP_745648)로부터의 IlvE, 또는 스트렙토마이세스 코엘리컬러(Streptomyces coelicolor)(진뱅크 등록번호 NP_629657)로부터의 IlvE)는 본 개시내용의 C₁ 대사 미생물 내로 도입될 수 있다. 아미노트랜스퍼라아제 반응이 선택된 C₁ 대사 미생물 내 분지된 지방산 생합성에서 율속적이라면, 아미노트랜스퍼라아제는 과발현될 수 있다.

제2 단계는 α-케토산의 대응하는 분지쇄 아실-CoA로의 산화적 탈카복실화이다. 이 반응은 E1α/β(탈카복실라아제), E2(디하이드로리포일 트랜스아실라아제) 및 E3(디하이드로리포일 데하이드로게나아제) 서브단위를 포함하는 분지쇄 α-케토산 데하이드로게나아제 복합체(bkd; EC 1.2.4.4.)에 의해 촉매될 수 있다(Denoya et al., J. Bacteriol . 177:3504, 1995). 이들 분지쇄 α-케토산 데하이드로게나아제 복합체는 피루베이트 및 α-케토글루타레이트 데하이드로게나아제 복합체와 유사하다. 분지된 지방산을 소유하고 분지쇄 아미노산 상에서 성장하는 모든 미생물은 메탄영양체와 같은 C₁ 대사 미생물에서 발현을 위한 bkd 유전자를 단리시키기 위한 공급원으로서 사용될 수 있다. 더 나아가, C₁ 대사 미생물이 그의 피루베이트 데하이드로게나아제 복합체(lpd, EC 1.8.1.4)의 부분으로서 E3 성분을 가진다면, 이는 단지 E1α/β 및 E2 bkd 유전자를 발현시키는데 충분할 수 있다.

다른 예에서, 이소부티릴-CoA는 크로토닐-CoA 리덕타아제(Ccr, EC 1.6.5.5, 1.1.1.1)와 이소부티릴-CoA 뮤타아제(거대 서브단위 IcmA, EC 5.4.99.2; 작은 서브단위 IcmB, EC 5.4.99.2)의 공동발현을 통해 C₁ 대사 미생물에서, 예를 들어, 메탄영양체에서 만들어질 수 있다(Han and Reynolds, J. Bacteriol . 179:5157, 1997). 크로토닐-CoA는 대장균 및 다른 미생물 내 지방산 생합성에서 중간체이다.

bkd 유전자의 발현에 추가로, brFA 생합성의 개시는 분지쇄 아실-CoA에 대해 특이성을 지니는 β-케토아실-아실-운반체-단백질 신타아제 III(FabH, EC 2.3.1.41)을 이용한다(Li et al., J. Bacteriol . 187:3795, 2005). 임의의 분지된 지방산-함유 미생물의 지방산 생합성에 수반된 fabH 유전자는 본 개시내용의 C₁ 대사 미생물에서 발현될 수 있다. 분지된 지방산 또는 이들의 유도체를 자연적으로 생성하지 않는 생성 숙주로부터의 Bkd 및 FabH 효소는 분지된 지방산 생성을 지원하지 않을 수도 있고; 따라서, Bkd 및 FabH는 재조합적으로 발현될 수 있다. bkd 및 fabH 유전자를 함유하는 벡터는 이러한 C₁ 대사 미생물 내로 삽입될 수 있다. 유사하게, Bkd 및 FabH 생성의 내인성 수준은 분지된 초장 탄소쇄 화합물를 생성하는데 충분하지 않을 수도 있고, 따라서 특정 구체예에서 그들은 과발현된다. 추가적으로, 지방산 생합성 경로의 다른 성분, 예컨대 아실 운반체 단백질(ACP) 및 β-케토아실-아실-운반체-단백질 신타아제 II(fabF, EC 2.3.1.41)는 발현 또는 과발현될 수 있다. 이들 유전자를 발현시키는데 추가로, 내인성 지방산 생합성 경로 내 일부 유전자는 본 개시내용의 C₁ 대사 미생물에서 감쇠될 수 있다. 기질에 대해 brFA 생성을 초래하는 경로의 효소와 경쟁하는 유전자 코딩 효소는 분지된 지방산 유도체 생성을 증가시키기 위해 감쇠 또는 저해될 수 있다.

상기 언급한 바와 같이, 분지쇄 알콜은 분지된 지방산 합성 및 알콜 합성을 지원하는 발현 유전자의 조합을 통해 생성될 수 있다. 예를 들어, 알콜 리덕타아제, 예컨대 아시네토박터 베일리(Acinetobacter baylyi) ADP1로부터의 Acr1이 bkd 오페론에 의해 공동발현될 때, 본 개시내용의 C₁ 대사 미생물은 이소펜탄올, 이소부탄올 또는 2-메틸 부탄올을 합성할 수 있다. 유사하게, Acr1이 ccr/icm 유전자와 공동발현될 때, 본 개시내용의 C₁ 대사 미생물은 이소부탄올을 합성할 수 있다.

본 개시내용의 C₁ 대사 미생물, 예컨대 메탄영양체를 ω-환식 지방산(cyFA)을 합성할 수 있는 유기체로 전환하기 위해, 환식 전구체 사이클로헥실카보닐-CoA(CHC-CoA)를 제공하는 유전자(Cropp et al., Nature Biotech. 18:980, 2000)가 본 개시내용의 C₁ 대사 미생물에 도입되고 발현된다.

CHC-CoA를 제공하는 유전자의 비-제한적 예는 스트렙토마이세스 콜리누스(Streptomyces collinus)의 안사트리에닌 유전자 클러스터로부터의 ansJ, ansK, ansL, chcA 및 ansM(Chen et al., Eur . J. Biochem . 261:98, 1999) 또는 스트렙토마이세스 종 HK803의 포스락토마이신 B 유전자 클러스터로부터의 plmJ, plmK, plmL, chcA 및 plmM(Palaniappan et al., J. Biol . Chem . 278:35552, 2003)을 스트렙토마이세스 콜리누스, 스트렙토마이세스 아베르미틸리스(S. avermitilis) 또는 스트렙토마이세스 코엘리컬러로부터의 chcB 유전자(Patton et al., Biochem . 39:7595, 2000)와 함께 포함한다. FabH, ACP 및 fabF 유전자는 공동-환식 지방산을 개시 및 신장시키도록 발현될 수 있다. 대안적으로, 상동성 유전자가 cyFA를 만드는 미생물로부터 단리되고, 본 개시내용의 C₁ 대사 미생물에서 발현될 수 있다.

유전자 fabH, acp 및 fabF는 그들이 넓은 기질 특이성을 갖기 때문에, ω-환식 지방산을 개시 및 신장시키는데 충분하다. 임의의 이들 유전자와 ansJKLM/chcAB 또는 pmlJKLM/chcAB 유전자의 공동발현이 cyFA를 수득하지 않는다면, cyFA를 생성하는 미생물로부터의 fabH, acp 또는 fabF 상동체는 단리되고(예를 들어, 축퇴 PCR 프라이머 또는 이종 DNA 서열 프로브를 사용함으로써) 공동-발현될 수 있다.

지방산은 지방산 유도체의 생성에서 중요한 중간체이다. 지방산 유도체 내 포화도는 지방산 중간체의 포화도를 조절함으로써 제어될 수 있다. 유전자의 sfa, gns 및 fab 패밀리는 지방산의 포화도를 제어하기 위해 발현 또는 과발현될 수 있다. 본 방법에서 그리고 본 개시내용의 C₁ 대사 미생물와 함께 사용될 수 있는 이들 유전자 패밀리 내 유전자의 비-제한적 예는, 미국 특허 제8,283,143호의 도 1에 열거되어 있으며, 이 도면은 그의 전문이 본원에 참조로서 포함된다.

본 개시내용의 C₁ 대사 미생물은 fabB를 과발현시키도록 C₁ 대사 미생물(예를 들어, 메탄영양체)를 유전자 조작함으로써, 또는 저온(예를 들어, 37℃ 미만)에서 C₁ 대사 미생물을 성장시킴으로써 불포화 지방산 유도체를 생성하도록 공학적으로 처리될 수 있다. 대장균에서, FabB는 시스Δ³데세노일-ACP에 대한 선호도를 가지며, 불포화 지방산 생성을 초래한다. FabB의 과발현은 상당한 백분율의 불포화 지방산의 생성을 초래한다(de Mendoza et al., J. Biol . Chem . 258:2098, 1983). fabB를 코딩하는 핵산 분자는 자연적으로 유전자를 갖지 않는 C₁ 대사 미생물(예를 들어, 메탄영양체) 내로 삽입되거나 그 안에서 발현될 수 있다. 이어서, 이들 불포화 지방산은 지방 알콜, 지방 에스테르, 왁스, 하이드록시 지방산, 디카복실산 등과 같은 초장 탄소쇄 화합물를 생성하도록 공학적으로 처리된 C₁ 대사 미생물에서 중간체로서 사용될 수 있다.

대안적으로, 지방산 생합성의 억제유전자, 예를 들어, fabR은 C₁ 대사 미생물(예를 들어, 메탄영양체)에서 저해 또는 결실될 수 있는데, 이는 또한 대장균에서 알 수 있는 것과 같이 증가된 불포화 지방산 생성을 초래할 수 있다(Zhang et al., J. Biol . Chem . 277:15558, 2002). 불포화 지방산에서의 추가적인 증가는, 예를 들어, fabI(트랜스-2-에노일-ACP 리덕타아제)를 결실시키는 동안 스트렙토코커스 뉴모니애(Streptococcus pneumoniae)로부터의 fabM(트랜스-2, 시스-3-데세노일-ACP 이소머라제)의 과발현 및 fabK(트랜스-2-에노일-ACP 리덕타아제 II)의 제어된 발현에 의해 달성될 수 있다(Marrakchi et al., J. Biol . Chem . 277:44809, 2002). 추가적으로, 불포화 지방 에스테르의 백분율을 증가시키기 위해, C₁ 대사 미생물(예를 들어, 메탄영양체)는 또한 fabB(β-케토아실-ACP 신타아제 I을 코딩, 등록 번호 EC:2.3.1.41), sfa(fabA의 억제 유전자를 코딩), 및 gnsA 및 gnsB(둘 다 secG 삭제 돌연변이체 억제 유전자, 즉, 저온 충격 단백질을 코딩함)를 코딩할 수 있다. 일부 예에서, 내인성 fabF 유전자는 감쇠될 수 있는데, 이는 생성된 팔미톨리에이트(C_16:1)의 백분율을 증가시킬 수 있다.

다른 예에서, 목적으로 하는 지방산 유도체는 하이드록실화된 지방산이다. 하이드록실 변형은 특이적 효소를 사용하여 쇄 전체적으로 생길 수 있다. 특히, ω-하이드록실화는 분자의 양 말단에서 작용기를 함유하는 특히 유용한 분자를 생성한다(예를 들어, 폴리에스테르 플라스틱을 생성하도록 선형 중합을 허용). 특정 구체예에서, C₁ 대사 미생물(예를 들어, 메탄영양체)는 CYP52A13, CYP52A14, CYP52A17, CYP52A18, CYP52A12 및 CYP52A12B로부터 선택된 하나 이상의 변형된 CYP52A형 사이토크롬 P450을 포함할 수 있되, 사이토크롬은 지방산을, 예를 들어, ω-하이드록시 지방산으로 변형시킨다. 상이한 지방산은 상이한 사이토크롬 P450에 의해 상이한 비율로 하이드록실화된다. 목적으로 하는 지방산 공급원료의 효율적인 하이드록실화를 달성하기 위해, C₁ 대사 미생물은 넓은 범위의 고도로 풍부한 지방산 기질을 ω-하이드록실화할 수 있는 하나 이상의 P450 효소를 발현시키도록 생성된다. 라우르산(C_12:0), 미리스트산(C₁₄:0), 팔미트산(C_16:0), 스테아르산(C_18:0), 올레산(C_18:1), 리놀레산(C_18:2) 및 α-리놀렌산(ω3, C_18:3)의 ω-하이드록실화를 촉매화하는 P450 효소가 특히 관심 대상이다. C₁ 대사 비-광합성 미생물 내로 클로닝될 수 있는 상이한 지방산에 대해 알려진 ω-하이드록실화 활성을 지니는 P450 효소의 예는 비시아 사티바(Vicia sativa)로부터의 CYP94A1(Tijet et al., Biochem . J. 332:583, 1988); 니코티아나 타바쿰(Nicotiana tabacum)으로부터의 CYP 94A5(Le Bouquin et al., Eur . J. Biochem . 268:3083, 2001); 제아 메이즈(Zea mays)로부터의 CYP78A1(Larkin, Plant Mol . Biol . 25:343, 1994); CYP 86A1(Benveniste et al., Biochem . Biophys . Res. Commun . 243:688, 1998) 및 아라비돕시스 탈리아나로부터의 CYP86A8(Wellesen et al., Proc . Nat'l. Acad . Sci . USA 98:9694, 2001); 페투니아 하이브리다(Petunia hybrida)로부터의 CYP 92B1(Petkova-Andonova et al., Biosci . Biotechnol . Biochem . 66:1819, 2002); CYP102A1(BM-3) 바실러스 메가테리움(Bacillus megaterium)으로부터의 돌연변이체 F87(Oliver et al., Biochem . 36:1567, 1997); 및 포유류 및 곤충으로부터의 CYP 4 패밀리(Hardwick, Biochem . Pharmacol . 75:2263, 2008)를 포함한다.

특정 구체예에서, C₁ 대사 비-광합성 미생물은 지방산 또는 ω-하이드록시 지방산의 특이적 부위에서 추가적인 내부 하이드록실화를 도입할 수 있는 P450 효소를 코딩하는 핵산 분자를 포함하되, 재조합 C₁ 대사 미생물은 내부로 산화된 지방산 또는 ω-하이드록시 지방산 또는 알데하이드 또는 디카복실산을 생성할 수 있다. 본 개시내용의 C₁ 대사 미생물에서 사용될 수 있는 상이한 지방산에 대해 알려진 쇄 내 하이드록실화 활성을 지니는 P450 효소의 예는 ω-1 내지 ω-5 하이드록실화를 지니는 헬리안투스 투베로서스(Helianthus tuberosus)로부터의 CYP81B1(Cabello-Hurtado et al., J. Biol . Chem . 273:7260, 1998); ω-1 및 ω-2 하이드록실화를 지니는 헬리안투스 투베로서스로부터의 CYP790C1(Kandel et al., J. Biol . Chem . 280:35881, 2005); 지방산 불포화에 대한 에폭시화를 지니는 유포르비아 라그스캐(Euphorbia lagscae)로부터의 CYP726A1(Cahoon et al., Plant Physiol . 128:615, 2002); α-하이드록실화를 지니는 스핑고모나스 파우시모빌리스(Sphingomonas paucimobilis)로부터의 CYP152B1(Matsunaga et al., Biomed . Life Sci . 35:365, 2000); ω-1 하이드록실화를 지니는 인간 간으로부터의 CYP2E1 및 4A1(Adas et al., J. Lip. Res. 40:1990, 1999); α- 및 β-하이드록실화를 지니는 바실러스 서브틸리스로부터의 P450_BSβ(Lee et al., J. Biol . Chem . 278:9761, 2003); 및 ω-1, ω-2 및 ω-3 하이드록실화를 지니는 바실러스 메가테리움으로부터의 CYP102A1(BM-3)(Shirane et al., Biochem . 32:13732, 1993)을 포함한다.

특정 구체예에서, C₁ 대사 비-광합성 미생물은 ω-하이드록실화(ω-하이드록시 지방산 유도체를 추가로 산화시키도록 추가로 변형되어 디카복실산을 수득할 수 있음)를 포함하도록 지방산을 변형시킬 수 있는 P450 효소를 코딩하는 핵산 분자를 포함한다. 다수의 경우에, 첫 번째 예에서 하이드록실화를 수행할 수 있는 P450 효소는 또한 디카복실산을 수득하도록 추가 산화를 수행할 수 있다. 다른 구체예에서, 숙주 유기체에서 비-특이적 고유 알콜 데하이드로게나아제는 ω-하이드록시 지방산을 디카복실산으로 산화시킬 수 있다. 추가 구체예에서, C₁ 대사 비-광합성 유기체는 디카복실산의 생성을 용이하게 하기 위해 하나 이상의 지방 알콜 옥시다제(예컨대 FAO1, FAO1B, FAO2, FAO2B) 또는 알콜 데하이드로게나아제(예컨대 ADH-A4, ADH-A4B, ADH-B4, ADH-B4B, ADH-A10 및 ADH-B11)(예를 들어, 본원에 전문이 참조로서 포함된 미국 특허 출원 공개 제2010/0291653호에 열거된 바와 같이 칸디다 트로피칼리스(Candida tropicalis)로부터)를 코딩하는 핵산 분자를 추가로 포함한다.

본원에 기재된 방법은 탄소쇄 길이를 변화시킨 지방 에스테르 및 지방산 유도체를 생성시킨다. 쇄 길이는 tes 및 fat 유전자 패밀리의 발현에 의해 생성되는 티오에스테르라제 및 지방산 엘롱가제 (즉, KCS, KCR, HCD, 및 ECR)에 의해 제어된다. 특이적 티오에스테르라제를 발현시킴으로써, 목적으로 하는 탄소쇄 길이를 갖는 지방산 유도체가 생성될 수 있다. 적합한 티오에스테르라제의 비-제한적 예는 본원에 기재되어 있고, 미국 특허 제8,283,143호(도 1, 이 도면은 본원에 참조로서 포함됨)에 열거되어 있다. 특정 티오에스테르라제를 코딩하는 핵산 분자는 C₁ 대사 미생물(예를 들어, 메탄영양체) 내로 도입될 수 있으며, 따라서 특정 탄소쇄 길이의 지방산 유도체가 생성된다. 특정 구체예에서, 내인성 티오에스테르라제의 발현이 저해, 억제 또는 하향 조절된다.

특정 구체예에서, 지방산 유도체는 약 8 내지 24개 탄소 원자, 약 8 내지 18개 탄소 원자, 약 10 내지 18개 탄소 원자, 약 10 내지 16개 탄소 원자, 약 12 내지 16개 탄소 원자, 약 12 내지 14개 탄소 원자, 약 14 내지 24개 탄소 원자, 약 14 내지 18개 탄소 원자, 약 8 내지 16개 탄소 워자, 또는 약 8 내지 14개 탄소 원자의 탄소쇄를 가진다. 대안의 구체예에서, 지방산 유도체는 약 20개 미만의 탄소 원자, 약 18개 미만의 탄소 원자, 약 16개 미만의 탄소 원자, 약 14개 미만의 탄소 원자, 또는 약 12개 미만의 탄소 원자의 탄소쇄를 가진다. 다른 구체예에서, 지방 에스테르 생성물은 8 내지 24개 탄소 원자의 탄소 원자 함량을 갖는 포화 또는 불포화 지방 에스테르 생성물이다. 추가 구체예에서, 지방 에스테르 생성물은 8 내지 14개 탄소 원자의 탄소 원자 함량을 갖는다. 또한 추가 구체예에서, 지방 에스테르 생성물은 14 내지 20개 탄소의 탄소 원자 함량을 갖는다. 또 다른 구체예에서, 지방 에스테르는 C_18:1의 메틸 에스테르이다. 추가 구체예에서, 지방 에스테르는 C_16:1의 에틸 에스테르이다. 다른 구체예에서, 지방 에스테르는 C_16:1의 메틸 에스테르이다. 또 다른 구체예에서, 지방 에스테르는 옥탄올의 옥타데실 에스테르이다.

일부 미생물은 짝수 또는 홀수의 탄소쇄 지방산 및 지방산 유도체를 우선적으로 생성한다. 예를 들어, 대장균은 정상적으로 짝수 탄소쇄 지방산 및 지방산 에틸 에스테르(FAEE)를 생성한다. 특정 구체예에서, 본원에 개시된 방법은, C₁ 대사 미생물(예를 들어, 메탄영양체)가 홀수 탄소쇄 초장 탄소쇄 지방산 유도체를 생성하기 위해 만들어질 수 있도록, C₁ 대사 미생물(예를 들어, 메탄영양체)에서의 생성을 변경시키는데 사용될 수 있다.

에스테르는 "A"측 및 "B"측으로 표기될 수 있는 것을 포함한다. B측은 본 개시내용의 C₁ 대사 미생물(예를 들어, 메탄영양체)에서 드 노보 합성으로부터 생성된 지방산에 의해 기여될 수 있다. 일부 구체예에서, C₁ 대사 미생물(예를 들어, 메탄영양체)가 지방 알콜을 포함하는 알콜을 만들도록 추가적으로 공학적으로 처리된 경우, A측은 또한 C₁ 대사 미생물(예를 들어, 메탄영양체)에 의해 생성된다. 또 다른 구체예에서, A측은 배지에서 제공될 수 있다. 핵산 분자를 코딩하는 목적으로 하는 티오에스테르라제를 선택함으로써, B측(지방 알콜이 생성될 때는 A측)은 특정 탄소쇄 특징을 갖도록 설계될 수 있다. 이들 특징은 분지 지점, 불포화 및 목적으로 하는 탄소쇄 길이를 포함한다.

특정 티오에스테르라제 및 FAE 유전자가 선택될 때에, A 및 B측은, 그들이 둘 다 지방산 생합성 경로 중간체를 사용하여 C₁ 대사 미생물(예를 들어, 메탄영양체)에 의해 기여될 때와 유사한 탄소쇄 특징을 가질 것이다. 예를 들어, 생성된 지방 에스테르의 적어도 약 50%, 60%, 70% 또는 80%는 길이가 약 2, 4, 6, 8, 10, 12 또는 14개 탄소로 변하는 A측 및 B측을 가질 것이다. A측 및 B측은 또한 유사한 분지 및 포화 수준을 나타낼 수 있다.

A측에 대한 기여를 위한 지방 알콜을 생성하는 것에 추가로, C₁ 대사 미생물(예를 들어, 메탄영양체)는 A측에 대한 포함을 위해 다른 단쇄 알콜, 예컨대 에탄올, 프로판올, 이소프로판올, 이소부탄올 및 부탄올을 생성할 수 있다. 예를 들어, 부탄올은 C₁ 대사 미생물(예를 들어, 메탄영양체)에 의해 만들어질 수 있다. 부탄올 생성 세포를 생성하기 위해, 예를 들어, C₁ 대사 미생물(예를 들어, 메탄영양체)는 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli) K12로부터의 atoB(아세틸-CoA 아실트랜스퍼라아제), 뷰티리비브리오 피브리솔벤스(Butyrivibrio fibrisolvens)로부터의 β-하이드록시부티릴-CoA 데하이드로게나아제, 클로스트리듐 베이제린키(Clostridium beijerinckii)로부터의 크로토나제, 클로스트리듐 베이제린키로부터의 부티릴 CoA 데하이드로게나아제, 클라도스포리움 풀붐(Cladosporium fulvum)으로부터의 CoA-아실화 알데하이드 데하이드로게나아제(ALDH) 및 클라도스포리움 아세토부틸리쿰(Clostridium acetobutylicum)의 알데하이드-알콜 데하이드로게나아제를 코딩하는 adhEn, 예를 들어, prpBCDE 프로모터 시스템 하의 pBAD24 발현 벡터를 발현하도록 추가로 공학적으로 처리될 수 있다. C₁ 대사 미생물(예를 들어, 메탄영양체)는 다른 단쇄 알콜을 생성하기 위해 유사하게 변형될 수 있다. 예를 들어, 에탄올은 칼소이어(Kalscheuer) 등에 의해 교시되는 방법을 사용하여 생성 숙주에서 생성될 수 있다(Microbiol. 152:2529, 2006).

C ₁ 대사 미생물 - 숙주 세포

본 개시내용의 C₁ 대사 미생물은 천연 균주, 또는 관심 대상의 초장 탄소쇄 화합물을 생성하기 위해 또는 증가된 성장 속도를 갖기 위해 또는 둘 다를 위해 적합화(예를 들어, 모 균주에 비해 개선된 성장 속도 및 증가된 총 바이오매스 수율을 지니는 균주를 선택하기 위해 발효를 수행) 또는 재조합적으로 변형된(예를 들어, KCS, KCR, HCD ECR, 또는 이들의 조합을 발현시키도록 유전자 변형됨) 균주일 수 있다. 특정 구체예에서, C₁ 대사 미생물은 광합성 미생물, 예컨대 조류 또는 식물이 아니다.

특정 구체예에서, 본 개시내용은 원핵생물 또는 박테리아, 예컨대 메틸로모나스, 메틸로박터, 메틸로코커스, 메틸로시너스, 메틸로시스티스, 메틸로마이크로븀, 메타노모나스, 메틸로필러스(Methylophilus), 메틸로바실러스(Methylobacillus), 메틸로박테리움(Methylobacterium), 하이포마이크로븀(Hyphomicrobium), 잔토박터(Xanthobacter), 바실러스(Bacillus), 파라코커스(Paracoccus), 노카르디아(Nocardia), 아트로박터(Arthrobacter), 로도슈도모나스(Rhodopseudomonas) 또는 슈도모나스(Pseudomonas)인 C₁ 대사 미생물을 제공한다.

추가 구체예에서, C₁ 대사 박테리아는 메탄영양체 또는 메틸영양체이다. 예시적인 메탄영양체는 메틸로모나스, 메틸로박터, 메틸로코커스, 메틸로시너스, 메틸로시스티스, 메틸로마이크로븀, 메타노모나스, 메틸로셀라, 또는 임의의 이들의 조합을 포함한다. 예시적인 메틸영양체는 메틸로박테리움 엑스토르퀀스(Methylobacterium extorquens), 메틸로박테리움 라디오톨러런스(Methylobacterium radiotolerans), 메틸로박테리움 포풀리(Methylobacterium populi), 메틸로박테리움 클로로메타니쿰(Methylobacterium chloromethanicum), 메틸로박테리움 노둘란스(Methylobacterium nodulans), 또는 임의의 이들의 조합을 포함한다.

특정 구체예에서, 메탄영양체 박테리아는 C₁ 기질 공급원료를 초장 탄소쇄 화합물로 전환하는 능력을 지니도록 유전자적으로 처리된다. 메탄영양체 박테리아는 탄소 및 에너지 공급원으로서 메탄을 산화하는 능력을 가진다. 메탄영양체 박테리아는 그들의 탄소 동화 경로 및 내부 막 구조에 기반하여 3가지 그룹으로 분류된다: I형(감마 프로테오박테리아), II형(알파 프로테오박테리아 및 X형(감마 프로테오박테리아). I형 메탄영양체는 탄소 동화를 위해 리불로스 모노포스페이트(RuMP) 경로를 사용하는 반면, II형 메탄영양체는 세린 경로를 사용한다. X형 메탄영양체는 RuMP 경로를 사용하지만, 또한 세린 경로의 저수준의 효소를 발현시킨다. 메탄영양체 박테리아는 탄소 및 에너지 공급원에 대해 C1 기질만을 이용할 수 있는 절대 메탄영양체, 및 유일한 탄소 및 에너지 공급원으로서 일부 다중-탄소 기질을 이용하는 능력을 자연적으로 갖는 조건적 메탄영양체를 포함한다.

예시적인 조건적 메탄영양체는 메틸로셀라, 메틸로시스티스, 및 메틸로캡사(예를 들어, 메틸로셀라 실베스트리스, 메틸로셀라 팔루스트리스, 메틸로셀라 툰드라, 메틸로시스티스 달토나 균주 SB2, 메틸로시스티스 브리오필라, 및 메틸로캡사 아우레아 KYG), 메틸로박테리움 오가노필룸(ATCC 27,886), 메틸리비움 페트롤레이필룸, 또는 이들의 고성장 변이체의 일부 종을 포함한다. 예시적인 절대 메탄영양체 박테리아는: 메틸로코커스 캡슐라투스 배스(Methylococcus capsulatus Bath), 메틸로모나스 16a(ATCC PTA 2402), 메틸로시너스 트리코스포륨(Methylosinus trichosporium) OB3b(NRRL B-11,196), 메틸로시너스 스포륨(NRRL B-11,197), 메틸로시스티스 파르부스(NRRL B-11,198), 메틸로모나스 메타니카(NRRL B-11,199), 메틸로모나스 알부스(NRRL B-11,200), 메틸로박터 캡슐라투스(NRRL B-11,201), 메틸로모나스 플라겔라타 종(Methylomonas flagellata sp) AJ-3670 (FERM P-2400), 메틸애시디필룸 인페르노룸 및 메틸로마이크로븀 알칼리필룸, 또는 이들의 고성장 변이체를 포함한다.

또한 추가 구체예에서, 본 개시내용은 합성 가스 대사 박테리아, 예컨대 클로스트리듐(Clostridium), 무렐라(Moorella), 파이로코커스(Pyrococcus), 유박테리움(Eubacterium), 데설포박테리움(Desulfobacterium), 카복시도테르무스(Carboxydothermus), 아세토게늄(Acetogenium), 아세토박테리움(Acetobacterium), 아세토아나에로븀(Acetoanaerobium), 뷰티리바세테리움(Butyribaceterium), 펩토스트렙토코커스(Peptostreptococcus), 또는 이들의 조합인 C₁ 대사 미생물을 제공한다. 예시적인 메틸영양체는 클로스트리듐 오토에타노게눔(Clostridium autoethanogenum), 클로스트리듐 리중다리(Clostridium ljungdahli), 클로스트리듐 라그스달레이(Clostridium ragsdalei), 클로스트리듐 카복시다이보란스(Clostridium carboxydivorans), 뷰티리박테리움 메틸로트로피쿰(Butyribacterium methylotrophicum), 클로스트리듐 우디(Clostridium woodii), 클로스트리듐 네오프로판올로겐(Clostridium neopropanologen) 또는 임의의 이들의 조합을 포함한다.

본원에 기술된 임의의 구체예에서, C₁ 대사 비-광합성 미생물은 야로위아(Yarrowia)와 같은 효모가 아니다.

특정의 다른 구체예에서, C₁ 대사 비-광합성 미생물은 절대 C₁ 대사 비-광합성 미생물, 예컨대 절대 메탄영양체 또는 메틸영양체이다. 추가 구체예에서, C₁ 대사 비-광합성 미생물은 KCS, KCR, HCD, ECR, 그의 조합, 또는 이들 모두를 코딩하는 이종 폴리뉴클레오티드를포함하는 재조합 미생물이다.

C ₁ 대사 미생물 - 비-천연 또는 재조합체

일부 구체예에서, 본원에 기재한 바와 같이, > C₂₄ 초장 탄소쇄 화합물, 예컨대 초장쇄 지방 아실-CoA를 생성하기 위해 C₁ 기질 공급원료(예를 들어, 메탄)를 이용하는 β-케토아실-CoA 신타아제, β-하이드록시 아실-CoA 데하이드라타아제, β-케토아실-CoA 리덕타아제, 및 에노일-CoA 리덕타아제를 가지는 재조합 C₁ 대사 미생물(예를 들어, 비-천연 메탄영양체 박테리아)가 제공된다. 다양한 구체예에서, 재조합 C₁ 대사 미생물은 KCS 효소를 코딩하는 핵산 분자를 발현 또는 과발현시킨다. 특정 구체예에서, KCS 효소는 C₁ 대사 미생물에 대해 내인성일 수 있거나 또는 KCS 효소는 C₁ 대사 미생물에 대해 이종일 수 있다.

일 측면에서, 본 개시내용은 (i) β-케토아실-CoA 신타아제, (ii) β-하이드록시 아실-CoA 데하이드라타아제, (iii) β-케토아실-CoA 리덕타아제, 및 (iv) 에노일-CoA 리덕타아제의 효소들을 코딩하는 재조합 핵산 분자를 갖는 비-천연 메탄영양체를 제공하되, 메탄영양체는 C₁ 기질을 초장쇄 지방 아실 CoA, 초장쇄 지방 알데하이드, 초장쇄 지방 알콜(일차 또는 이차), 초장쇄 지방 에스테르 왁스, 초장쇄 알칸, 초장쇄 케톤 또는 이들의 조합에서 선택되는 초장 탄소쇄 화합물로 전환시킬 수 있다. 특정 구체예에서, KCS는 CER6, Elo1, Fen1/Elo2, Sur4/Elo3, KCS1, KCS2, KCS11, KCS20, KCS9, ELOVL1, ELOVL2, ELOVL3, ELOVL4, ELOVL5, ELOVL6, ELOVL7, 또는 FDH이다. 특정 구체예에서, 비천연 메탄영양체는 적어도 2개의 상이한 KCS 효소를 코딩하는 재조합 핵산 분자를 포함한다. 특정 구체예에서, KCR은 CER10, KAR, GL8A, GL8B, Ybr159w, AYR1, 또는 At1g67730이다. 특정 구체예에서, HCD는 PHS1, PAS2, HACD1, HACD2, HACD3, HACD4, 또는 PAS2-1이다. 특정 구체예에서, ECR은 CER10, TER, TSC13, 또는 GhECR1, GhECR2이다.

특정 구체예에서, 비-천연 메탄영양체는 추가로 초장쇄 지방 알콜을 형성할 수 있는 지방 알콜 형성 아실-CoA 리덕타아제를 코딩하는 재조합 핵산을 포함한다. 특정 구체예에서, 지방 알콜 형성 아실-CoA 리덕타아제는 FAR, CER4 (진뱅크 등록번호 JN315781.1), 또는 Maqu_2220이다. 특정 구체예에서, 비-천연 메탄영양체는 추가로 초장쇄 지방 알데하이드를 형성할 수 있는 지방 아실-CoA 리덕타아제 및 초장쇄 지방 알콜을 형성할 수 있는 알데하이드 리덕타아제를 코딩하는 재조합 핵산 분자를 포함한다. 특정 구체예에서, 지방 아실-CoA 리덕타아제는 ACR1 또는 CER3이다. 특정 구체예에서, 알데하이드 리덕타아제는 YqhD이다. 일부 구체예에서, 이 과정에 의해 탄소 길이가 C₂₄를 초과한 지방 알콜이 생성될 것이다.

특정 구체예에서, 비-천연 메탄영양체는 추가로 초장쇄 지방 알콜을 형성할 수 있는 지방 알콜 형성 아실-CoA 리덕타아제 및 초장쇄 지방 에스테르 왁스를 형성할 수 있는 에스테르 신타아제를 코딩하는 재조합 핵산 분자를 포함한다. 특정 구체예에서, 지방 알콜 형성 아실-CoA 리덕타아제는 FAR, CER4 (진뱅크 등록번호 JN315781.1), 또는 Maqu_2220이다. 특정 구체예에서, 에스테르 신타아제는 WSD1이다. 일부 구체예에서, 이 과정에 의해 탄소 길이가 C₂₄를 초과한 지방 에스테르 왁스가 생성될 것이다.

특정 구체예에서, 비-천연 메탄영양체는 추가로 초장쇄 지방 알데하이드를 형성할 수 있는 지방 아실-CoA 리덕타아제 및 초장쇄 알칸을 형성할 수 있는 알데하이드 데카보닐라아제를 코딩하는 재조합 핵산 분자를 포함한다. 특정 구체예에서, 지방 아실-CoA 리덕타아제는 ACR1 또는 CER3이다. 특정 구체예에서, 알데하이드 데카보닐라아제는 CER1 또는 CER22이다. 일부 구체예에서, 이 과정에 의해 탄소 길이가 C₂₄를 초과한 초장쇄 알칸이 생성될 것이다.

특정 구체예에서, 비-천연 메탄영양체는 추가로 초장쇄 지방 알데하이드를 형성할 수 있는 지방 아실-CoA 리덕타아제, 초장쇄 알칸을 형성할 수 있는 알데하이드 데카보닐라아제, 및 초장쇄 지방 이차 알콜을 형성할 수 있는 알칸 하이드록실라아제, 및 초장쇄 케톤을 형성할 수 있는 알콜 데하이드로게나아제를 코딩하는 재조합 핵산 분자를 포함한다. 특정 구체예에서, 지방 아실-CoA 리덕타아제는 ACR1 또는 CER3이다. 특정 구체예에서, 알데하이드 데카보닐라아제는 CER1 또는 CER22이다. 특정 구체예에서, 알칸 하이드록실라아제 및 알콜 데하이드로게나아제는 MAH1이다.

본 개시내용에 의해 포함되는 바와 같은 초장 탄소쇄 화합물을 생성할 수 있는 임의의 앞서 언급한 재조합 C₁ 대사 미생물에서, 비-천연 메탄영양체는 티오에스테르라제, 예컨대 tesA(리더 서열 없음), UcFatB, 또는 BTE를 코딩하는 재조합 핵산 분자를 추가로 포함한다. 특정 구체예에서, 내인성 티오에스테르라제 활성은 비변경 내인성 티오에스테르라제 활성(unaltered endogenous thioesterase activity)에 비해 감소되거나, 최소이거나 또는 없는다.

본 개시내용에 의해 포함되는 바와 같은 초장 탄소쇄 화합물을 생성할 수 있는 임의의 앞서 언급한 재조합 C₁ 대사 미생물에서, 비-천연 메탄영양체는 아실-CoA 신쎄타아제, 예컨대 FadD, yng1 또는 FAA2를 코딩하는 재조합 핵산 분자를 추가로 포함한다. 특정 구체예에서, 내인성 아실-CoA 신쎄타아제 활성는 비변경 내인성 아실-CoA 신쎄타아제 활성에 비해 감소되거나, 최소이거나 또는 없는다.

추가 구체예에서, 본 개시내용은 이종 KCS, KCR, HCD, 및 ECR을 코딩하는 재조합 핵산 분자, 이종 티오에스테라아제를 코딩하는 재조합 핵산 분자, 및 이종 아실-CoA 신쎄타아제를 코딩하는 재조합 핵산 분자를 가지는 비-천연 메탄영양체를 제공하고, 여기서 메탄영양체는 C₁ 기질을 초장쇄 아실-CoA로 전환시킬 수 있다. 특정 구체예에서, 비-천연 메탄영양체는 추가로 지방 아실-CoA 리덕타아제 또는 지방 알콜 형성 아실-CoA 리덕타아제를 코딩하는 핵산 분자를 포함하고, 상기 지방 아실-CoA 리덕타아제 또는 지방 알콜 형성 아실-CoA 리덕타아제는 고유한 지방 아실-CoA 리덕타아제 또는 지방 알콜 형성 아실-CoA 리덕타아제 각각의 발현 수준에 비해 비-천연 메탄영양체에서 과발현된다. 특정 구체예에서, 지방 알데하이드를 형성할 수 있는 지방 아실-CoA 리덕타아제는 ACR1 또는 CER3이거나, 또는 지방 알콜을 형성할 수 있는 지방 알콜 형성 아실-CoA 리덕타아제는 FAR, CER4, 또는 Maqu_2220이다. 특정 구체예에서, 아실-CoA 신쎄타아제는 FadD, yng1, 또는 FAA2이다.

임의의 앞서 언급한 재조합 C₁ 대사 미생물(예를 들어, 비-천연 메탄영양체 박테리아)는 FAR 효소 또는 이들의 기능적 단편을 가질 수 있고 마리노박터(Marinobacter)의 종, 예컨대 마리노박터 알기콜라(M. algicola), 마리노박터 알칼리필루스(M. alkaliphilus), 마리노박터 아쿠아에올레이(M. aquaeolei), 마리노박터 아크티쿠스(M. arcticus), 마리노박터 브리오조룸(M. bryozoorum), 마리노박터 다에포엔시스(M. daepoensis), 마리노박터 엑셀렌스(M. excellens), 마리노박터 플라비마리스(M. flavimaris), 마리노박터 구아도넨시스(M. guadonensis), 마리노박터 하이드로카보노클라스티쿠스(M. hydrocarbonoclasticus), 마리노박터 코리니스(M. koreenis), 마리노박터 리폴리티쿠스(M. lipolyticus), 마리노박터 리토랄리스(M. litoralis), 마리노박터 루타오엔시스(M. lutaoensis), 마리노박터 마리티무스(M. maritimus), 마리노박터 세디미뭄(M. sediminum), 마리노박터 스쿠알레니비란스(M. squalenivirans), 마리노박터 비니피르무스(M. vinifirmus) 또는 이들의 동등한 종 및 유사한 종으로부터 유래되거나 또는 얻어질 수 있다. 특정 구체예에서, 본원에 개시된 조성물 및 방법에서 사용을 위한 FAR 효소는 해양 박테리아 마리노박터 알기콜라(Marinobacter algicola) DG893(진뱅크 등록번호 EDM49836.1, FAR "Maa_893") 또는 마리노박터 아쿠아에올레이(Marinobacter aquaeolei) VT8(진뱅크 등록번호 YP_959486.1, FAR "Maqu_2220") 또는 오셔노박터(Oceanobacter) 종 RED65(진뱅크 등록번호 EAT13695.1, FAR "Ocs_65")로부터 유래된다.

또한 임의의 앞서 언급한 재조합 C₁ 대사 미생물(예를 들어, 비-천연 메탄영양체 박테리아)의 추가 구체예에서, FAR 효소 또는 이의 기능적 단편은 FAR_Hch(하헬라 제주엔시스(Hahella chejuensis) KCTC 2396, 진뱅크 등록번호 YP_436183.1); FAR_Act(마린 악티노박테리움 균주 PHSC20C1로부터 유래, 진뱅크 등록번호 EAR25464.1), FAR_Mme(마린 메타게놈, 진뱅크 등록번호 EDD40059.1), FAR_Aec(아크로미르멕스 에치나티오르(Acromyrmex echinatior), 진뱅크 등록번호 EGI61731.1), FAR_Cfl(캄포노투스 플로리다누스(Camponotus floridanus), 진뱅크 등록번호 EFN62239.1) 및 FAR_Sca(스트렙토마이세스 캐틀야(Streptomyces cattleya) NRRL 8057, 진뱅크 등록번호 YP_006052652.1)이다. 다른 구체예에서, FAR 효소 또는 이들의 기능적 단편은 비티스 비니페라(Vitis vinifera)(FAR_Vvi, 진뱅크 등록번호 CAO22305.1 또는 CAO67776.1), 데설파티바실룸 알케니보란스(Desulfatibacillum alkenivorans) AK-01(FAR_Dal, 진뱅크 등록번호 YP_002430327.1), 심몬드시아 치넨시스(FAR_Sch, 진뱅크 등록번호 AAD38039.1), 봄빅스 모리(Bombyx mori)(FAR_Bmo, 진뱅크 등록번호 BAC79425.1), 아라비돕시스 탈리아나(FAR_Ath; 진뱅크 등록번호 DQ446732.1 or NM_115529.1), 또는 오스트리니아 스캐퓰라리스(Ostrinia scapulalis)(FAR_Osc; 진뱅크 등록번호 EU817405.1)로부터 단리 또는 유래된다.

특정 구체예에서, FAR 효소 또는 이들의 기능적 단편은 마리노박터 알기콜라 DG893 또는 마리노박터 아쿠아에올레이 YT8로부터 유래되거나 또는 얻어지고, 진뱅크 등록번호 EDM49836.1 또는 YP_959486.1에 제시된 서열에 대해 각각 적어도 적어도 75%, 적어도 80% 동일, 적어도 85% 동일, 적어도 90% 동일, 적어도 91% 동일, 적어도 92% 동일, 적어도 93% 동일, 적어도 94% 동일, 적어도 95% 동일, 적어도 96% 동일, 적어도 97% 동일, 적어도 98% 동일 또는 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 가진다. 다른 구체예에서, 재조합 코딩된 FAR 효소는 진뱅크 등록번호 EDM49836.1 또는 YP_959486.1에서 제시된 서열과 동일한 아미노산을 가진다.

다른 측면에서, 본 개시내용은 임의의 앞서 언급한 C₁ 대사 미생물을 제공하거나 또는 비-천연 메탄영양체는 ω-하이드록시 지방산을 생성하기 위한 P450 효소 또는 모노옥시게나아제 효소를 코딩하는 재조합 핵산 분자를 추가로 포함한다. 특정 구체예에서, 내인성 알콜 데하이드로게나아제 활성은 비변경 내인성 알콜 데하이드로게나아제 활성에 비해 저해된다. 다른 구체예에서, 내인성 알콜 데하이드로게나아제 활성은 디카복실산을 생성하기 위한 비변경 내인성 알콜 데하이드로게나아제 활성에 비해 증가 또는 상승된다.

임의의 앞서 언급한 비-천연 메탄영양체에서, 약 C₂₅-C₃₀, C₃₁-C₄₀, C₄₁-C₆₀, C₆₁-C₈₀, C₈₁-C₁₀₀, C₁₀₁-C₁₂₀, C₁₂₁-C₁₄₀, C₁₄₁-C₁₆₀, C₁₆₁-C₁₈₀, C₁₈₁-C₂₀₀, C₂₅-C₄₀, C₂₅-C₅₀, C₂₅-C₇₅, C₂₅-C₁₀₀, C₂₅-C₁₂₅, C₂₅-C₁₅₀, C₂₅-C₁₇₅, 또는 C₂₅-C₂₀₀ 초장 탄소쇄 화합물의 하나 이상을 포함하는 초장 탄소쇄 화합물이 생성된다. 특정 구체예에서, 메탄영양체는 C₂₅ 내지 C₅₀ 초장 지방 쇄 알콜을 포함하는 초장 지방 알콜을 생성하며, C₂₅ 내지 C₅₀ 초장 지방 쇄 알콜은 총 지방 알콜의 적어도 70%를 구성한다. 추가 구체예에서, 메탄영양체는 초장 분지쇄 지방 알콜을 포함하는 초장 지방 알콜을 생성한다. 특정 구체예에서, 메탄영양체는 C₂₅ 내지 C₅₀ 초장 지방 왁스 에스테르를 포함하는 초장쇄 왁스 에스테르를 생성하며, C₂₅ 내지 C₅₀ 초장쇄 왁스 에스테르는 총 왁스 에스테르의 적어도 70%를 구성한다. 특정 구체예에서, 메탄영양체는 C₂₅ 내지 C₅₀ 초장쇄 알칸을 포함하는 초장쇄 알칸을 생성하며, C₂₅ 내지 C₅₀ 초장쇄 알칸은 총 알칸의 적어도 70%를 구성한다. 특정 구체예에서, 메탄영양체는 C₂₅ 내지 C₅₀ 초장쇄 케톤을 포함하는 초장쇄 케톤을 생성하며, C₂₅ 내지 C₅₀ 초장쇄 케톤은 총 케톤의 적어도 70%를 구성한다.

상기 언급된 임의의 비-천연 메탄영양체에서, 비-천연 메탄영양체에 의해 생성된 초장쇄 지방 아실-CoA, 초장쇄 지방 알데하이드, 초장쇄 지방 알콜, 초장쇄 지방 에스테르 왁스, 초장쇄 알칸 또는 초장쇄 케톤의 양은 약 1　mg/L 내지 약 500 g/L의 범위이다. 특정의 다른 구체예에서, 본원에 기재된 바와 같은 C₁ 대사 미생물 또는 비-천연 메탄영양체에 대한 C₁ 기질 공급원료는 메탄, 메탄올, 포름알데하이드, 포름산 또는 그의 염, 일산화탄소, 이산화탄소, 메틸아민, 메틸티올, 메틸할로겐, 천연가스, 또는 비재래형 천연가스이다. 특정 구체예에서, C₁ 대사 미생물 또는 비-천연 메탄영양체는 천연가스, 비재래형 천연가스 또는 합성 가스(또는 메탄을 포함하는 합성 가스)를 C₂₄ 초과 초장 지방 아실-CoA, 초장 지방 알데하이드, 초장 지방 알콜, 초장쇄 지방 에스테르 왁스, 초장쇄 알칸, 또는 초장쇄 케톤으로 전환시킬 수 있다.

임의의 앞서 언급한 C₁ 대사 미생물 또는 비-천연 메탄영양체에서, 숙주 메탄영양체는 메틸로코커스 캡슐라투스 배스 균주, 메틸로모나스 16a(ATCC PTA 2402), 메틸로시너스 트리코스포륨 OB3b(NRRL B-11,196), 메틸로시너스 스포륨(NRRL B-11,197), 메틸로시스티스 파르부스(NRRL B-11,198), 메틸로모나스 메타니카(NRRL B-11,199), 메틸로모나스 알부스(NRRL B-11,200), 메틸로박터 캡슐라투스(NRRL B-11,201), 메틸로박테리움 오가노필룸(ATCC 27,886), 메틸로모나스 종 AJ-3670(FERM P-2400), 메틸로셀라 실베스트리스, 메틸로셀라 팔루스트리스(ATCC 700799), 메틸로셀라 툰드라, 메틸로시스티스 달토나 균주 SB2, 메틸로시스티스 브리오필라, 메틸로캡사 아우레아 KYG, 메틸애시디필룸 인페르노룸, 메틸리비움 페트롤레이필룸, 메틸로마이크로븀 알칼리필룸, 또는 이들의 조합일 수 있다.

임의의 앞서 언급한 C₁ 대사 미생물 또는 비-천연 메탄영양체 박테리아는 또한 재조합 핵산 분자의 도입 전에 혹은 후에 지방산 유도체 생성을 위해 개선된 특성을 지니는 변이체를 생성하기 위해 선택적 조건 하에서 균주 적합화를 거칠 수 있다. 개선된 특성은 증가된 성장 속도, 목적으로 하는 생성물(예를 들어, 초장쇄 탄소 화합물)의 수율, 또는 오염물질을 처리 또는 배양하기 위한 내용성을 포함할 수 있다. 특정 구체예에서, 고성장 변이체 C₁ 대사 미생물 또는 메탄영양체는 1차 탄소 및 에너지 공급원으로서 메탄 공급원료 상에서 성장할 수 있고 그의 모, 기준 또는 야생형 박테리아보다 더 빠른 대수기 성장 속도(즉, 더 짧은 배가시간)를 소유하는 숙주 박테리아를 포함한다(예를 들어, 미국 특허 제6,689,601호 참조).

본 개시내용의 각각의 미생물은 성장에 도움을 줄 수 있는 이종 유기체와 함께 단리된 배양물로서 성장될 수 있거나, 또는 이들 박테리아 중 하나 이상은 혼합된 배양물을 생성하도록 조합될 수 있다. 또한 추가 구체예에서, 본 개시내용의 C₁ 대사 비-광합성 미생물은 절대 C₁ 대사 비-광합성 미생물이다.

C ₁ 대사 미생물 - 초장 탄소쇄 화합물의 생성

다른 측면에서, 본원에 기재한 바와 같이, C₁　기질 공급원료와 함께 비-천연 C₁　대사 비-광합성 미생물을 배양시키는 단계 및 초장 탄소쇄 화합물를 회수하는 단계에 의해 초장 탄소쇄 화합물를 제조하는 방법이 제공되며, 여기서 C₁　대사 비광합성 미생물은 β-케토아실-CoA 신타아제, β-케토아실-CoA 리덕타아제, β-하이드록시 아실-CoA 데하이드라타아제, 및 에노일-CoA 리덕타아제를 코딩하는 하나 이상의 재조합 핵산 분자를 포함하고, C₁　대사 비-광합성 미생물은 C₁　기질을 초장쇄 아실-CoA, 초장쇄 지방 알데하이드, 초장쇄 지방 알콜 (일차 또는 이차), 초장쇄 알칸, 초장쇄 케톤, 또는 그의 조합을 포함하는 C₂₄ 초과 초장 탄소쇄 화합물로 전환시킨다.

특정 구체예에서, 배양 중인 C₁ 대사 비-광합성 미생물은 메틸로모나스, 메틸로박터, 메틸로코커스, 메틸로시너스, 메틸로시스티스, 메틸로마이크로븀, 메타노모나스, 메틸로필러스, 메틸로바실러스, 메틸로박테리움, 하이포마이크로븀, 잔토박터, 바실러스, 파라코커스, 노카르디아, 아트로박터, 로도슈도모나스 또는 슈도모나스이다. 추가 구체예에서, 배양 중인 C₁ 대사 비-광합성 미생물은 박테리아, 예컨대 메탄영양체 또는 메틸영양체이다.

메탄영양체는 메틸로모나스 종 16a(ATCC PTA 2402), 메틸로시너스 트리코스포륨(NRRL B-11,196), 메틸로시너스 스포륨(NRRL B-11,197), 메틸로시스티스 파르부스(NRRL B-11,198), 메틸로모나스 메타니카(NRRL B-11,199), 메틸로모나스 알부스(NRRL B-11,200), 메틸로박터 캡슐라투스(NRRL B-11,201), 메틸로박테리움 오가노필룸(ATCC 27,886), 메틸로모나스 종 AJ-3670(FERM P-2400), 메틸로셀라 실베스트리스, 메틸애시디필룸 인페르노룸, 메틸리비움 페트롤레이필룸, 또는 이들의 조합일 수 있다. 특정 구체예에서, 메탄영양체 배양물은 1종 이상의 이종 박테리움을 추가로 포함한다.

메틸영양체는 메틸로박테리움 엑스토르퀀스, 메틸로박테리움 라디오톨러런스, 메틸로박테리움 포풀리, 메틸로박테리움 클로로메타니쿰, 메틸로박테리움 노둘란스, 또는 이들의 조합일 수 있다.

추가 구체예에서, C₁ 대사 미생물 또는 박테리아는 천연가스, 비재래형 천연가스 또는 합성 가스를 대사할 수 있다. 특정 구체예에서, 합성 가스 대사 박테리아는 클로스트리듐 오토에타노게눔, 클로스트리듐 리중다리, 클로스트리듐 라그스달레이, 클로스트리듐 카복시다이보란스, 뷰티리박테리움 메틸로트로피쿰, 클로스트리듐 우디, 클로스트리듐 네오프로판올로겐, 또는 임의의 이들의 조합을 포함한다. 특정의 다른 구체예에서, 대사 비-광합성 미생물은 절대 C₁ 대사 비-광합성 미생물이다. 특정의 다른 구체예에서, 대사 비-광합성 미생물은 조건적 C₁ 대사 비-광합성 미생물이다.

임의의 앞서 언급한 방법에서, 배양된 C₁ 대사 미생물은 초장쇄 지방 알콜을 형성할 수 있는 지방 알콜 형성 지방 아실-CoA 리덕타아제, 예컨대 FAR, CER4 (진뱅크 등록번호 JN315781.1) 또는 Maqu_2220을 함유한다. 특정 구체예에서, 배양 중인 C₁ 대사 미생물은 지방 알데하이드를 형성할 수 있는 지방 아실-CoA 리덕타아제, 예컨대 acr1 또는 CER3을 함유한다. 특정 구체예에서, 이 과정에 의해 C₂₄ 초과 탄소 길이의 지방 알콜이 형성될 것이다.

본 개시내용에 의해 포함되는 바와 같은 초장 탄소쇄 화합물을 생성할 수 있는 임의의 앞서 언급한 재조합 C₁ 대사 미생물에서, C₁ 대사 미생물은 티오에스테르라제, 예컨대 tesA(리더 서열 없음), UcFatB, 또는 BTE를 코딩하는 재조합 핵산 분자를 추가로 포함한다. 특정 구체예에서, 내인성 티오에스테르라제 활성은 비변경 내인성 티오에스테르라제 활성에 비해 감소되거나, 최소이거나 또는 없다.

본 개시내용에 의해 포함되는 바와 같은 초장 탄소쇄 화합물을 생성할 수 있는 임의의 앞서 언급한 재조합 C₁ 대사 미생물에서, C₁ 대사 미생물은 아실-CoA 신쎄타아제, 예컨대 FadD, yng1 또는 FAA2를 코딩하는 재조합 핵산 분자를 추가로 포함한다. 특정 구체예에서, 내인성 아실-CoA 신쎄타아제 활성는 비변경 내인성 아실-CoA 신쎄타아제 활성에 비해 감소되거나, 최소이거나 또는 없다.

추가 구체예에서, 본 개시내용은 이종 KCS을 코딩하는 재조합 핵산, 이종 KCR을 코딩하는 재조합 핵산, 이종 HCD을 코딩하는 재조합 핵산, 이종 ECR을 코딩하는 재조합 핵산, 아실-CoA 리덕타아제를 형성하는 이종 지방 알콜을 코딩하는 재조합 핵산 분자, 이종 티오에스테라아제를 코딩하는 재조합 핵산 분자, 및 이종 아실-CoA 신쎄타아제를 코딩하는 재조합 핵산 분자를 가지는 C₁ 대사 미생물을 제공하고, 여기서 C₁ 대사 미생물은 C₁ 기질을 C₂₄ 초과 지방 알콜로 전환시킬 수 있다. 특정 구체예에서, 지방 알콜 형성 아실-CoA 리덕타아제는 고유한 지방 알콜 형성 아실-CoA 리덕타아제의 발현 수준에 비해 배양된 C₁ 대사 미생물에서 과발현된다. 특정 구체예에서, 지방 알콜을 형성할 수 있는 지방 알콜 형성 아실-CoA 리덕타아제는 FAR, CER4, 또는 Maqu_2220이다. 특정 구체예에서, 아실-CoA 신쎄타아제는 FadD, yng1, 또는 FAA2이다.

임의의 앞서 언급한 배양된 C₁ 대사 미생물에서, C₂₅-C₃₀, C₃₁-C₄₀, C₄₁-C₆₀, C₆₁-C₈₀, C₈₁-C₁₀₀, C₁₀₁-C₁₂₀, C₁₂₁-C₁₄₀, C₁₄₁-C₁₆₀, C₁₆₁-C₁₈₀, C₁₈₁-C₂₀₀, C₂₅-C₄₀, C₂₅-C₅₀, C₂₅-C₇₅, C₂₅-C₁₀₀, C₂₅-C₁₂₅, C₂₅-C₁₅₀, C₂₅-C₁₇₅, 또는 C₂₅-C₂₀₀ 초장 탄소쇄 화합물의 하나 이상을 포함하는 초장 탄소쇄 화합물이 생성된다. 특정 구체예에서, C₁ 대사 미생물은 C₂₅ 내지 C₅₀ 초장 지방 쇄 알콜을 포함하는 초장 지방 알콜을 생성하며, C₂₅ 내지 C₅₀ 초장 지방 쇄 알콜은 총 지방 알콜의 적어도 70%를 구성한다. 추가 구체예에서, 메탄영양체는 초장 분지쇄 지방 알콜을 포함하는 초장 지방 알콜을 생성한다. 특정 구체예에서, C₁ 대사 미생물은 C₂₅ 내지 C₅₀ 초장 지방 왁스 에스테르를 포함하는 초장쇄 왁스 에스테르를 생성하며, C₂₅ 내지 C₅₀ 초장쇄 왁스 에스테르는 총 왁스 에스테르의 적어도 70%를 구성한다. 특정 구체예에서, C₁ 대사 미생물은 C₂₅ 내지 C₅₀ 초장쇄 알칸을 포함하는 초장쇄 알칸을 생성하며, C₂₅ 내지 C₅₀ 초장쇄 알칸은 총 알칸의 적어도 70%를 구성한다. 특정 구체예에서, C₁ 대사 미생물은 C₂₅ 내지 C₅₀ 초장쇄 케톤을 포함하는 초장쇄 케톤을 생성하며, C₂₅ 내지 C₅₀ 초장쇄 케톤은 총 케톤의 적어도 70%를 구성한다.

상기 언급된 임의의 C₁ 대사 미생물에서, C₁ 대사 미생물에 의해 생성된 초장쇄 지방 아실-CoA, 초장쇄 지방 알데하이드, 초장쇄 지방 알콜, 초장쇄 왁스 에스테르, 초장쇄 알칸, 또는 초장쇄 케톤의 양은 약 1　mg/L 내지 약 500 g/L의 범위이다. 특정의 다른 구체예에서, 초장 탄소쇄 화합물의 제조방법에 사용된 C₁ 대사 미생물의 C₁ 기질 공급원료는 메탄, 메탄올, 포름알데하이드, 포름산 또는 그의 염, 일산화탄소, 이산화탄소, 메틸아민, 메틸티올, 메틸할로겐, 천연가스, 또는 비재래형 천연가스이다. 특정 구체예에서, C₁ 대사 미생물은 메탄을 포함하는 천연가스, 비재래형 천연가스 또는 합성 가스를 C₂₄ 초과 초장 지방 아실-CoA, 지방 알데하이드, 지방 알콜, 왁스 에스테르, 알칸, 또는 케톤으로 전환시킬 수 있다.

임의의 앞서 언급한 방법에서, C₁ 대사 미생물은 발효기 또는 생물반응기(bioreactor)와 같은 제어된 배양 장치(controlled culturing unit)에서 배양될 수 있다.

코돈 최적화

재조합 단백질의 발현은 종종 그들의 본래 숙주 밖에서는 어렵다. 예를 들어, 코돈 사용 바이어스에서의 변화가 상이한 종의 박테리아에 걸쳐 관찰되었다(Sharp et al., Nucl . Acids. Res. 33:1141, 2005). 재조합 단백질의 과발현은 그들의 고유한 숙주 내에서조차도 또한 어려울 수 있다. 본 발명의 특정 구체예에서, 본원에 기재된 바와 같은 숙주 메탄영양체 박테리아 내로 도입될 핵산(예를 들어, 지방산 신장 효소를 코딩하는 핵산)은 단백질 발현을 향상시키기 위해 코돈 최적화를 거칠 수 있다. 코돈 최적화는 DNA가 코딩하는 폴리펩티드의 변경 없이 숙주 박테리아 종의 전형적인 코돈 사용을 반영하도록 메탄영양체 박테리아의 형질전환을 위한 유전자 내 코돈 또는 핵산의 코딩 영역의 변경을 지칭한다. 이종 숙주에서 최적 유전자 발현을 위한 코돈 최적화 방법은 이미 설명되었다(예를 들어, 문헌[Welch et al., PLoS One 4:e7002, 2009; Gustafsson et al., Trends Biotechnol . 22:346, 2004; Wu et al., Nucl . Acids Res. 35:D76, 2007; Villalobos et al., BMC Bioinformatics 7:285, 2006]; 미국 특허 출원 공개 제2011/0111413호; 미국 특허 제2008/0292918호 참조; 이들의 개시내용은 그들의 전문이 본원에 참조로서 포함됨).

형질전환 방법

본원에 기재된 임의의 재조합 C₁ 대사 미생물 또는 메탄영양체 박테리아는 새로운 또는 향상된 활성(예를 들어, 효소적 활성)을 지니는 숙주 박테리아를 제공하기 위해 적어도 하나의 외인성 핵산을 포함하도록 형질전환될 수 있거나, 또는 당업계에 공지된 다양한 방법을 사용하여 내인성 유전자를 제거하거나 또는 실질적으로 감소시키도록 유전적으로 변형될 수 있다.

형질전환은 유전적으로 안정한 유전을 초래하는, 숙주 세포의 게놈 내로 핵산(예를 들어, 외인성 핵산)의 전달을 지칭한다. 형질전환된 핵산 분자를 함유하는 숙주 세포는 "비-자연적으로 생기는" 또는 "재조합" 또는 "형질전환된" 또는 "유전자이식" 세포로서 지칭된다.

C₁ 대사 미생물 또는 메탄영양체 박테리아 내 이종 핵산의 발현에 유용한 벡터의 발현 시스템 및 발현 벡터는 공지되어 있다.

C₁ 대사 박테리아의 전기천공법은 문헌[Toyama et al., FEMS Microbiol . Lett. 166:1, 1998; Kim and Wood, Appl . Microbiol . Biotechnol . 48:105, 1997; Yoshida et al., Biotechnol . Lett . 23:787, 2001], 및 미국 특허 출원 공개 제2008/0026005호에 이전에 기재되어 있었다.

공여체 및 수용체 세포의 직접 접촉을 수반하는 특정 유형의 형질전환을 지칭하는 박테리아 접합이 핵산의 C₁ 대사 박테리아 내로의 전달을 위해 보다 빈번하게 사용된다. 박테리아 접합은 서로 밀접하게 접촉되는 "공여체"와 "수용체" 세포를 함께 혼합하는 것을 수반한다. 접합은 새로 합성된 공여체 핵산 분자의 수용체 세포 내로의 단방향적 전달을 이용하여 공여체 박테리아와 수용체 박테리아 간의 세포질 연결의 형성에 의해 일어난다. 접합 반응에서 수용자는 공여체 박테리움으로부터 수평적 전달을 통해 핵산을 수용할 수 있는 임의의 세포이다. 접합 반응에서 공여체는 접합성 플라스미드, 접합성 트랜스포손, 또는 이동 플라스미드를 함유하는 박테리아이다. 공여체 플라스미드의 물리적 전달은 자가-전염성 플라스미드를 통해 또는 "헬퍼" 플라스미드의 도움에 의해 생길 수 있다. C₁ 대사 박테리아와 연루된 접합은 문헌[Stolyar et al., Mikrobiologiya 64:686, 1995; Motoyama et al., Appl . Micro. Biotech. 42:67, 1994; Lloyd et al., Arch. Microbiol . 171:364, 1999]; 및 Odom 등, PCT 공개 WO　02/18617호; 문헌[Ali et al., Microbiol . 152:2931, 2006]에 이미 기재되어 있었다.

C1 대사 박테리아 내 이종 핵산의 발현은 당업계에 공지되어 있다(예를 들어, 미국 특허 제6,818,424호; 미국 특허 출원 공개 제2003/0003528호 참조). 메틸영양체 박테리아의 Mu 트랜스포손 기반 형질전환이 기재되어 있다(Akhverdyan et al., Appl . Microbiol. Biotechnol . 91:857, 2011). 메틸로박테리움에서 숙주 유전자의 삽입 불활성화 없이 이종 유저자의 단일 및 다중복제(multicopy) 발현을 위한 미니-Tn7 트랜스포손 시스템이 기재되어 있다(미국 특허 출원 공개 제2008/0026005호).

C₁ 대사 박테리아에서 내인성 유전자 기능을 불활성화, 넉아웃 또는 결실시키기 위한 다양한 방법이 사용될 수 있다. 느리게 성장하는 C₁ 대사 박테리아 내 작제물 결실/삽입 돌연변이체에 대해 자살 벡터를 사용하는 대립유전자 교환은 또한 문헌[Toyama and Lidstrom, Microbiol . 144:183, 1998; Stolyar et al., Microbiol . 145:1235, 1999; Ali et al., Microbiol . 152:2931, 2006; Van Dien et al., Microbiol. 149:601, 2003]에 기재되어 있다.

외인성 핵산의 고발현을 위한 적합한 상동성 또는 이종 프로모터가 이용될 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 제7,098,005호는 C₁ 대사 박테리아에서 이종 유전자 발현을 위해 메탄 또는 메탄올의 존재에서 고도로 발현되는 프로모터의 사용을 기재한다. 사용될 수 있는 추가적인 프로모터는 데옥시-자일룰로스 포스페이트 신타아제 메탄올 데하이드로게나아제 오페론 프로모터(Springer et al., FEMS Microbiol . Lett . 160:119, 1998); PHA 합성을 위한 프로모터(Foellner et al., Appl . Microbiol . Biotechnol. 40:284, 1993); 또는 메틸영양체에서 고유한 플라스미드로부터 동정한 프로모터(European Patent No. EP 296484)를 포함한다. 비-고유 프로모터는 lac 오페론 Plac 프로모터(Toyama et al., Microbiol . 143:595, 1997) 또는 혼성 프로모터, 예컨대 Ptrc(Brosius et al., Gene 27:161, 1984)를 포함한다. 특정 구체예에서, 프로모터 또는 코돈 최적화는 숙주 메탄영양체 박테리아에서 글리세롤 이용 경로 효소를 코딩하는 외인성 핵산의 높은 구성적 발현을 위해 사용된다. 숙주 메탄영양체 박테리아에서 외인성 핵산의 조절된 발현이 또한 이용될 수 있다. 특히, 글리세롤 이용 효소를 코딩하는 외인성 핵산의 발현 조절은 자연적으로 생기지 않는 메탄영양체 박테리아의 성장 속도를 최적화하는데 바람직할 수 있다. 글리세롤의 부재 시(예를 들어, 탄소 공급원으로서 메탄 상에서 성장 동안) 역 실행 글리세롤 이용 경로에 의해, 박테리아로부터 글리세롤의 분비가 초래되며, 이에 의해 성장 속도가 늦춰질 수 있다. 글리세롤의 존재에 대한 반응으로 글리세롤 이용 경로 효소를 코딩하는 핵산의 제어된 발현은 다양한 탄소 공급원 조건에서 박테리아 성장을 최적화할 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 출원 공개 제2010/0221813호에 기재된 바와 같은 메틸영양체 및 메탄영양체 박테리아에서 재조합 단백질 발현의 유도성/조절성 시스템이 사용될 수 있다. 박테리아에서 글리세롤 이용 유전자의 조절은 잘 확립되어 있다(Schweizer and Po, J. Bacteriol . 178:5215, 1996; Abram et al., Appl . Environ. Microbiol. 74:594, 2008; Darbon et al., Mol . Microbiol . 43:1039, 2002; Weissenborn et al., J. Biol . Chem . 267:6122, 1992). 글리세롤 이용 조절 요소는 또한 글리세롤 이용 경로 효소를 코딩하는 외인성 핵산 분자의 요망되는 발현 수준을 위해 숙주 메탄영양체 박테리아에 도입되거나 또는 숙주 메탄영양체 박테리아에서 불활성화될 수 있다.

선별 방법은 문헌[Brock, 상기 참조]에 개시되어 있다. 대립유전자 교환 돌연변이체를 동정하기 위한 선택 방법은 당업계에 공지되어 있다(예를 들어, 미국 특허 출원 공개 제2006/0057726호, 문헌[Stolyar et al., Microbiol . 145:1235, 1999; 및 Ali et al., Microbiol . 152:2931, 2006] 참조).

배양 방법

다양한 배양 방법이 본원에 기재된 재조합 메탄영양체 박테리아에 대해 사용될 수 있다. 예를 들어, 메탄영양체 박테리아는 배취(batch) 배양 또는 연속 배양 방법에 의해 성장될 수 있다. 특정 구체예에서, 배양은 제어된 배양 장치, 예컨대, 발효기, 생물반응기, 중공섬유막 생물반응기 등에서 성장된다.

고전적 배취 배양 방법은 배지의 조성물이 배양의 시작 시 설정되고 배양 공정 동안 외부 변경을 받지 않는 폐쇄된 시스템이다. 따라서, 배양 공정의 시작 시, 배지는 요망되는 C₁ 대사 미생물(예를 들어, 메탄영양체)로 접종되며, 성장 또는 대사 활성은 시스템에 무언가를 첨가하는 일 없이 허용된다. 그러나, 전형적으로, "배취" 배양은 탄소 공급원의 첨가에 대하여 배취이고, 종종 pH 및 산소 농도와 같은 인자로 제어가 시도된다. 배취 시스템에서, 시스템의 대사물 및 바이오매스 조성은 배양이 종결되는 시간까지 지속적으로 변한다. 배취 배양물 내에서, 정적 유도기 내지 고성장 대수기 및 최종적으로 성장 속도가 감소되거나 또는 멈추게 되는 정지기를 통해 세포는 조정된다. 처리되지 않는다면, 정지기에서 세포는 종국적으로 사멸될 것이다. 대수 성장기에서의 세포는 종종 일부 시스템에서 최종 생성물 또는 중간체의 벌크 생성을 초래한다. 정지기 또는 지수기 후 단계생성은 다른 시스템에서 얻어질 수 있다.

유가식 시스템은 표준 배취 시스템에 대한 변형이다. 유가식 배양 공정은 배양이 진행됨에 따라 기질이 증가되게 첨가되는 변형을 지니는 전형적인 배취 시스템을 포함한다. 유가식 시스템은, 이화 생성물 억제가 세포의 대사를 저해하는 경향이 있을 때 그리고 배지 내 기질의 양을 제한하는 것이 바람직한 경우에 유용하다. 유가식 시스템 내 실제 기질 농도의 측정은 어려우며, 따라서 측정가능한 인자, 예컨대 pH, 용존산소, 및 CO₂와 같은 폐가스의 부분압의 변화를 기준으로 추정된다. 배취 및 유가식 배양 방법은 통상적이며, 당업계에 공지되어 있다(예를 들어, 문헌[Thomas D. Brock, Biotechnology: A Textbook of Industrial Microbiology, 2^nd Ed. (1989) Sinauer Associates, Inc., Sunderland, MA; Deshpande, Appl . Biochem . Biotechnol . 36:227, 1992] 참조).

연속 배양은, 정해진 배양 배지가 생물반응기에 연속적으로 첨가되고 동일한 양의 조건화된 배지가 공정을 위해 동시에 제거되는 경우, "개방" 시스템이다. 연속 배양은 일반적으로, 세포가 주로 대수기 성장에 있는 경우 일정한 고액체상 밀도로 세포를 유지한다. 대안적으로, 연속 배양은, 탄소 및 영양소가 연속적으로 첨가되고, 가치있는 생성물, 부산물 및 폐생성물이 세포 덩어리로부터 연속적으로 제거되는 경우, 고정화 세포를 이용하여 실행될 수 있다. 세포 고정화는 천연 및/또는 합성 물질로 구성된 넓은 범위의 고체 지지체를 사용하여 수행될 수 있다.

연속 또는 반연속 배양은 세포 성장 또는 최종 생성물 농도에 영향을 미치는 하나의 인자 또는 다수의 인자의 조절을 고려한다. 예를 들어, 한 가지 방법은 고정된 비율로 제한된 영양소, 예컨대 탄소 공급원 또는 질소 수준을 유지할 것이고, 조절을 위한 모든 다른 파라미터를 허용한다. 다른 시스템에서, 성장에 영향을 미치는 다수의 인자는 지속적으로 변경될 수 있는 한편, 배지 혼탁도에 의해 측정되는 세포 농도는 일정하게 유지된다. 연속 시스템은 정상상태 조건을 유지하도록 하며, 따라서 배지를 빼내는 것에 기인하는 세포 상실은 배양물 내 세포 성장 속도에 대해 균형이 유지되어야 한다. 연속 배양 공정을 위한 영양소 및 성장 인자를 조절하는 방법뿐만 아니라 생성물 형성 속도를 최대화하는 기법은 당업계에 잘 공지되어 있으며, 다양한 방법이 문헌[Brock, 상기 참조]에 의해 상세히 설명되어 있다.

초장 탄소쇄 화합물 조성물

배경기술의 방법에 의해, 안정한 동위 원소 측정 및 물질균형(mass balance) 접근이 메탄의 전세계적 공급원 및 흡수원을 평가하는데 널리 사용된다(문헌[Whiticar and Faber, Org . Geochem . 10:759, 1986; Whiticar, Org . Geochem . 16: 531, 1990] 참조). 산화되는 양을 결정하기 위해 잔여 메탄의 δ¹³C 값을 사용하기 위해, 메탄의 미생물 산화에 의해 야기되는 동위 원소 분획화 정도를 아는 것은 필수이다. 예를 들어, 호기성 메탄영양체는 특이적 효소인 메탄 모노옥시게나아제(methane monoxygenase: MMO)를 통해 메탄을 대사시킬 수 있다. 메탄영양체는 메탄을 메탄올로 전환하고, 후속적으로 포름알데하이드로 전환한다. 포름알데하이드는 CO₂로 추가로 산화되어 환원 등가물 형태(NADH)로 세포에 에너지를 제공하거나, 또는 직접적으로 광합성 유기체 내 탄소 동화 경로와 유사한 RuMP 또는 세린 사이클 중 하나를 통해 바이오매스 내로 포함될 수 있다(Hanson and Hanson, Microbiol . Rev. 60:439, 1996).

더 구체적으로는, I형 메탄영양체는 바이오매스 합성을 위한 RuMP 경로를 사용하며, 전적으로 CH₄로부터 바이오매스를 생성하는 반면, II형 메탄영양체는 CH₄로부터 50 내지 70%의 세포 탄소 및 CO₂로부터 30 내지 50%를 동화시키는 세린 경로를 사용한다(Hanson and Hanson, 1996). 탄소 동위원소 조성물을 측정하기 위한 방법은, 예를 들어 문헌[Templeton et al. (Geochim . Cosmochim . Acta 70:1739, 2006)]에서 제공되며, 이 방법은 본원에 그의 전문이 참조로서 포함된다. 바이오매스로부터 오일 조성물의 ¹³C/¹²C 안정한 탄소 비("델타" 값 ‰, δ¹³C로서 제공됨)는 사용되는 C₁ 기질의 공급원 및 순도에 따라서 다를 수 있다(예를 들어, 도 7 참조).

본원에 기재된 C₁ 대사 비-광합성 미생물 및 방법을 사용하여 생성된 초장 탄소쇄 화합물 조성물은 석유화학물질로부터 또는 광합성 미생물 또는 식물로부터 탄소 핑거프린팅에 의해 생성된 초장 탄소쇄 화합물과 차이가 있을 수 있다. 특정 구체예에서, C₂₄ 초과 지방 아실-CoA, 지방 알데하이드, 지방 알콜, 지방 에스테르 왁스, 알칸, 케톤, 또는 이들의 임의의 조합의 조성물은 -30‰ 미만, -31‰ 미만, -32‰ 미만, -33‰ 미만, -34‰ 미만, -35‰ 미만, -36‰ 미만, -37‰ 미만, -38‰ 미만, -39‰ 미만, -40‰ 미만, -41‰ 미만, -42‰ 미만, -43‰ 미만, -44‰ 미만, -45‰ 미만, -46‰ 미만, -47‰ 미만, -48‰ 미만, -49‰ 미만, -50‰ 미만, -51‰ 미만, -52‰ 미만, -53‰ 미만, -54‰ 미만, -55‰ 미만, -56‰ 미만, -57‰ 미만, -58‰ 미만, -59‰ 미만, -60‰ 미만, -61‰ 미만, -62‰ 미만, -63‰ 미만, -64‰ 미만, -65‰ 미만, -66‰ 미만, -67‰ 미만, -68‰ 미만, -69‰ 미만, 또는 -70‰ 미만의 δ¹³C를 가진다.

일부 구체예에서, C₁ 대사 미생물 바이오매스는 본원에 기재한 바와 같은 초장 탄소쇄 화합물 조성물을 포함하되, 초장 탄소쇄 화합물 함유 바이오매스 또는 초장 탄소쇄 화합물 조성물은 약 -35‰ 내지 약 -50‰, -45‰ 내지 약 -35‰, 또는 약 -50‰ 내지 약 -40‰, 또는 약 -45‰ 내지 약 -65‰, 또는 약 -60‰ 내지 약 -70‰, 또는 약 -30‰ 내지 약 -70‰의 δ¹³C를 가진다. 특정 구체예에서, 초장 탄소쇄 화합물 조성물은 적어도 50% 초장 탄소쇄 화합물을 포함한다. 추가 구체예에서, 초장 탄소쇄 화합물 조성물은 초장쇄 지방 아실-CoA, 초장쇄 지방 알데하이드, 초장쇄 지방 알콜, 초장쇄 지방 에스테르 왁스, 초장쇄 알칸, 초장쇄 케톤, 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다. 또한 추가 구체예에서, 초장 탄소쇄 화합물 조성물은 C₂₅-C₃₀, C₃₁-C₄₀, C₄₁-C₆₀, C₆₁-C₈₀, C₈₁-C₁₀₀, C₁₀₁-C₁₂₀, C₁₂₁-C₁₄₀, C₁₄₁-C₁₆₀, C₁₆₁-C₁₈₀, C₁₈₁-C₂₀₀, C₂₅-C₄₀, C₂₅-C₅₀, C₂₅-C₇₅, C₂₅-C₁₀₀, C₂₅-C₁₂₅, C₂₅-C₁₅₀, C₂₅-C₁₇₅, 또는 C₂₅-C₂₀₀ 초장쇄 지방 아실-CoA, 초장쇄 지방 알데하이드, 초장쇄 지방 알콜, 초장쇄 지방 에스테르 왁스, 초장쇄 알칸, 또는 초장쇄 케톤을 포함한다. 또한 추가 구체예에서, 초장 탄소쇄 화합물 조성물은 탄소쇄 길이가 C₂₅ 내지 C₄₀, C₂₅ 내지 C₅₀, C₂₅ 내지 C₇₅, C₂₅ 내지 C₁₀₀, C₂₅ 내지 C₁₂₅, C₂₅ 내지 C₁₅₀, C₂₅ 내지 C₁₇₅, 또는 C₂₅ 내지 C₂₀₀의 범위에 있는 대다수의(50% w/w 초과) 초장 탄소쇄 화합물 또는 탄소쇄 길이가 C₂₅ 초과인 대다수의 초장 탄소쇄 화합물, 또는 총 초장쇄 탄소 화합물의 적어도 70%가 C₂₅ 내지 C₅₀ 초장 탄소쇄 화합물을 포함하는 초장 탄소쇄 화합물 함유 조성물을 포함한다.

추가 구체예에서, C₁　대사 비-광합성 미생물 초장 탄소쇄 화합물 함유 바이오매스 또는 초장 탄소쇄 화합물 조성물은 δ 13C이 약 -30‰ 미만이거나, 또는 약 -40‰ 내지 약 -60‰의 범위에 있다. 특정 구체예에서, 초장 탄소쇄 화합물 함유 바이오매스는 소모 배지와 함께 재조합 C₁　대사 비-광합성 미생물을 포함하거나, 또는 초장 탄소쇄 화합물 함유 바이오매스는 재조합 C₁　대사 비-광합성 미생물의 배양물로부터의 소모 배지 상청액 조성물을 포함하되, 초장 탄소쇄 화합물 함유 바이오매스 또는 그로부터 얻은 초장 탄소쇄 화합물 조성물의 δ¹³C은 약 -30‰ 미만이다. 특정의 다른 구체예에서, 초장 탄소쇄 화합물 조성물은, 배양물로부터의 소모 배지, 또는 재조합 C₁　대사 비-광합성 미생물 배양물로부터의 소모 배지 상청액 조성물과 함께 재조합 C₁　대사 비-광합성 미생물을 포함할 수 있는 초장 탄소쇄 화합물 함유 바이오매스로부터 단리, 추출 또는 농축된다.

특정 구체예에서, 초장 탄소쇄 화합물 함유 바이오매스 또는 초장 탄소쇄 화합물 조성물은 C₁　대사 비-광합성 미생물에서 효율적인 발현을 위해 코돈 최적화된 본원에 기재된 바와 같은 하나 이상의 엘롱가제 복합 효소를 포함하는 재조합 C₁　대사 비-광합성 미생물의 것이다.

초장 탄소쇄 화합물 함유 바이오매스 또는 초장 탄소쇄 화합물 조성물의 생성에 사용하기 위한 예시적인 유기체는 본 개시내용의 재조합 C₁　대사 비-광합성 미생물, 예컨대 박테리아를 포함한다. 특정 구체예에서, 초장 탄소쇄 화합물 함유 바이오매스 또는 초장 탄소쇄 화합물 조성물은 메탄영양체 또는 메틸영양체로부터의 C₁ 대사 박테리아, 예컨대 메틸로모나스 종 16a(ATCC PTA 2402), 메틸로시너스 트리코스포륨 OB3b(NRRL B-11,196), 메틸로시너스 스포륨(NRRL B-11,197), 메틸로시스티스 파르부스(NRRL B-11,198), 메틸로모나스 메타니카(NRRL B-11,199), 메틸로모나스 알부스(NRRL B-11,200), 메틸로박터 캡슐라투스 Y(NRRL B-11,201), 메틸로코커스 캡슐라투스 배스(NCIMB 11132), 메틸로박테리움 오가노필룸(ATCC 27,886), 메틸로모나스 종 AJ-3670(FERM P-2400), 메틸로마이크로븀 알칼리필룸, 메틸로셀라 실베스트리스, 메틸애시디필룸 인페르노룸, 메틸리비움 페트롤레이필룸, 메틸로박테리움 엑스토르퀀스, 메틸로박테리움 라디오톨러런스, 메틸로박테리움 포풀리, 메틸로박테리움 클로로메타니쿰, 메틸로박테리움 노둘란스, 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다.

추가 구체예에서, 초장 탄소쇄 화합물 함유 바이오매스 또는 초장 탄소쇄 화합물 조성물은 본 개시내용의 재조합 C₁ 대사 박테리아로부터의 C₁ 대사 박테리아인 합성 가스 대사 박테리아, 예컨대 클로스트리듐 오토에타노게눔, 클로스트리듐 리중다리, 클로스트리듐 라그스달레이, 클로스트리듐 카복시다이보란스, 뷰티리박테리움 메틸로트로피쿰, 클로스트리듐 우디, 클로스트리듐 네오프로판올로겐, 또는 이들의 조합을 포함한다.

실시예

실시예 1

C₁ 대사 미생물로부터의 지질 추출

채취한 박테리아 바이오매스 내에 함유된 지방산 오일 조성물을 폴츠(Folch) 추출 프로토콜의 변형된 방식을 사용하여 추출하는데(Folch et al., J. Biol . Chem . 226:497, 1957), 20℃(즉, 실온)에서 2 용적의 클로로포름(CM 용액)에서 1 용적의 메탄올로 구성된 추출 용액 중에서 수행하였다. 새로운 박테리아 바이오매스(또는 -80℃에서 저장하고 후속적으로 해동시킨 박테리아 바이오매스)의 약 5g의 습식 세포 중량(wet cell weight: WCW)을 추출을 위해 사용하였다. 100㎖ CM 용액을 세포 물질에 첨가하고 나서, 혼합물을 분별 깔때기에서 격렬하게 추출하였다. 적어도 10분 후에, 3가지 상으로 분리되었다. 추출 지질을 함유하는 유기상은 분별 깔때기의 바닥에 가라앉았고, 이를 깨끗한 유리병 내로 빼내었다. 중간층은 주로 용해된 세포 물질을 함유하였고, 염 및 다른 가용성 세포 성분을 함유하는 가벼운 수상으로부터 분리할 수 있었다.

선택적으로, 원심분리 또는 다른 기계적 농축 기기를 사용하여 수상 내 고체를 농축시킬 수 있다. 고체로부터 제거한 물은 재순환시킬 수 있고, 반면에 일부 잔여 물을 지니는 고체는 고체 처리 장치에 공급될 수 있다.

지질 추출 효율을 향상시키기 위해, 남아있는 용해된 세포 덩어리 및 잔여 물을 함유하는 분별 깔때기 내로 직접 추가적인 100㎖의 새로운 CM 용액을 첨가함으로써 제2 추출 단계를 수행하였다. 혼합물을 다시 철저하게 혼합하고, 상을 분리시킨 뒤, 2회 추출로부터의 하부 유기상을 모았다. 이어서, 모은 유기상을 분별 깔때기에서 100㎖ 탈이온수로 세척하여 임의의 잔여 수용성 물질을 제거하였다. 분리한 유기 분획을 다시 분별 깔때기의 하부로부터 단리시키고 나서, 용매를 가열에 의한 회전 증발에 의해, 바람직하게는 산소 없이, 또는 질소 증기 하에서 55℃에서 증발에 의해 제거하였다.

3종의 상이한 메탄영양체로부터 추출한 지질 함량
배취 번호	기준 균주	지질 분획 (g　/　g　 DCW )*
68C	메틸로시너스 트리코스포륨 OB3b	40.1
62A	메틸로코커스 캡슐라투스 배스	10.3
66A	메틸로모나스 종 16a	9.3
*추출한 물질(g)/건식 세포 중량(dry cell weight: DCW)(g)

메틸로시너스 트리코스포륨 OB3b, 메틸로코커스 캡슐라투스 배스 및 메틸로모나스 종 16a의 채취 배양물로부터 추출한 고형화 지방산 조성물을 각각 칭량하고, 표 1에서 본래의 건조 세포 중량(DCW)의 중량 분획으로서 나타낸다. 이들 데이터는 이들 C₁　대사 미생물로부터의 DCW의 상당한 분획이 지질로 구성된다는 것을 나타낸다.

하라(Hara) 및 라딘(Radin)의 헥산:이소프로판올(HIP) 추출 방법을 사용하여 메틸로모나스 종 16a 바이오매스로부터의 지방산 조성물을 또한 추출하였다(Anal. Biochem. 90:420, 1978). HIP 방법을 사용하여 추출한 지방산 조성물의 분석은 지방산 조성이 변형된 폴츠 방법을 사용하여 추출한 지방산 조성과 본질적으로 동일하다는 것을 나타내었다(데이터 미기재).

실시예 2

C₁ 대사 미생물로부터 지질의 지방산 메틸 에스테르 전환

건조 고체의 형태로 메틸로코커스 캡슐라투스 배스, 메틸로시너스 트리코스포륨 OB3b 및 메틸로모나스 종 16a 배양물 바이오매스로부터 추출한 지질 분획을 수산화칼륨(KOH)을 이용하여 개별적으로 가수분해시키고, 단일 단계로 메탄올과의 반응을 통해 지방산 메틸 에스테르(FAME)로 전환시켰다. 10㎖ 유리보틀 내 약 5g의 추출 고체 지질을 톨루엔:메탄올(1:1　v/v)의 0.2M　KOH 용액 5㎖를 이용하여 용해시켰다. 보틀을 격렬하게 교반시키고, 이어서 42℃에서 60분 동안 250rpm에서 혼합한 후에, 용액을 주위 온도로 냉각시키고 나서, 분별 깔때기로 옮겼다. 대략 5㎖ 증류수 및 5㎖ CM 용액을 분별 깔때기에 첨가하고, 혼합한 다음, 상을 중력에 의해 또는 5분 동안 원심분리(3,000　rpm, 25℃)에 의해 분리시켰다. 용해된 글리세롤 포스페이트 에스테르를 함유하는 상부 수성층을 제거하는 한편, 중질의 오일상(하부)을 수집하고 농축시켜 회전 증발에 의해 또는 일정한 질소 스트림에 의해 건조시켰다.

각각의 메탄영양체 배양물 유래 지질에서 발견된 FFA 및 FAME의 분석을 기체 크로마토그래피/질량 분석기(GC/MS)를 사용하여 수행하였다. 가수분해/에스테르교환 단계 전 및 후에 수집한 고체를 GC/MS 분석을 위한 내부 표준으로서 운데칸산을 함유하는 300㎕ 부틸 아세테이트 중에 용해시켰다. 얻어진 용액을 5분 동안 14,000rpm에서 원심분리시켜 불용성 잔사를 제거하였다. N,O-비스(트리메틸실릴)트리플루오로아세트아미드의 동일 용적 등가물을 원심분리 단계로부터 상청액에 첨가하고 나서 잠시 와동시켰다. 샘플을 질량 분석기 검출기(HP 5792)를 구비한 GC 상에 장입하고, 애질런트(Agilent) HP-5MS GC/MS 칼럼(30.0m x 250㎛ x 0.25㎛ 막 두께)을 사용하여 FFA와 FAME를 분리시켰다. FFA와 FAME의 동일성을 체류 시간 및 그들 표준의 질량 스펙트럼의 전자 이온화를 이용하여 확인하였다. GC/MS 방법은 1.2㎖/분의 유속에서 운반 기체로서 헬륨을 이용하였다. 주입 포트를 20:1의 분할비로 250℃에서 유지하였다. 오븐 온도는 60℃에서 1분을 유지한 다음, 온도 구배는 300℃까지 8℃ 증가/분을 포함하였다. 질량 검출기 반응으로부터의 총 이온을 기준으로 각각의 FFA 및 FAME의 면적%를 계산하였다.

가수분해/에스테르교환 전 및 후에 수집한 고체 잔사를 GC/MS에 의해 FFA 및 FAME에 대해 분석하였다(표 2 참조).

KOH 가수분해/에스테르화 전 및 후에 추출한 지질 내 FFA 및 FAME의 상대적 조성
지방산 유형	메틸로코커스 캡슐라투스 배스		메틸로시너스 트리코스포륨 OB3b		메틸로모나스 종 16a
	가수분해에 의해	가수분해 없이	가수분해에 의해	가수분해 없이	가수분해에 의해	가수분해 없이
	면적%		면적%		면적%
C14:0 FFA	-	-	-	-	-	12.9
C16:0 FFA	0.5	84.1	-	43.7	-	8.1
C16:1 FFA	-	13.4	-	-	-	76.1
C18:0 FFA	0.4	2.5	-	31.2	-	1.3
C18:1 FFA	-	-	-	25.1	-	1.5
C14:0 FAME	3.4	-	-	-	7.2	-
C16:0 FAME	54.4	-	1.4	-	14.7	-
C16:1 FAME	41.3	-	6.8	-	61.3	-
C18:0 FAME	-	-	1.0	-	N.D.	-
C18:1 FAME	-	-	90.8	-	16.8	-
* - = 검출가능하지 않음; 면적%: MS 검출기 반응-총 이온

표 2로부터 명백한 바와 같이, 가수분해/에스테르교환 전에 추출한 지질 조성물은 풍부한 유리 지방산을 가지고 추가적인 지방산이 존재하지만, FFA는 가수분해/에스테르교환 후에 다양한 길이의 지방산 메틸 에스테르로 전환된다. 이들 데이터는 본 개시내용의 C₁ 대사 미생물로부터의 오일 조성물이 고가치 분자를 제조하기 위해 정련되고 사용될 수 있다는 것을 나타낸다.

실시예 3

C₁ 대사 미생물로부터의 지질에서 안정한 탄소 동위원소 분포

메틸로시너스 트리코스포륨 바이오매스 및 지질 분획의 건조 샘플을 탄소 및 질소 함량(건조 중량%)에 대해 분석하고, 이소프라임100(IsoPrime100) IRMS(영국 치들에 소재한 이소프라임(Isoprime))과 결합한 CHNOS 원소 분석기(독일 하나우에 소재한 바리오 이소토프 큐브(vario ISOTOPE cube))를 사용하여 원소 분석기/연속 유동 동위원소 비 질량 분석법을 통해 탄소(¹³C) 및 질소(¹⁵N) 안정성 동위원소 비를 분석하였다. 발효기 또는 혈청 보틀에서 배양한 메탄영양체 바이오매스의 샘플을 원심분리시키고 나서, 탈이온수에 재현탁시키고, 0.2 내지 2㎎ 탄소(약 0.5 내지 5㎎ 건조 세포 중량)에 대응하는 용적을 5 x 9㎜ 주석 캡슐(캘리포니아주 발렌시아에 소재한 코스테크 아날리티칼 테크놀로지 인코포레이티드)에 옮기고 나서, 80℃에서 24시간 동안 건조시켰다. 유사하게, 이미 추출한 지질 분획을 클로로포름에 현탁시키고, 0.1 내지 1.5㎎ 탄소를 함유하는 용적을 주석 캡슐에 옮기고, 80℃에서 24시간 동안 증발건조시켰다. 0.1㎎ 탄소를 함유하는 표준은 믿을 수 있는 δ¹³C 값을 제공하였다.

동위원소 비를 "델타" 표기법(‰)으로 표현하되, 표준 조성물에 대한 물질의 동위원소 조성/백만 편차 기준을 δ¹³C(또는 δ¹⁵N) = (R_샘플/ R_{표준 -1}) x 1,000으로 제공하며, 여기서 R은 중질 대 경질 동위원소 형태의 분자비이다. 탄소에 대한 표준은 비엔나 피 디 벨렘나이트(Vienna Pee Dee Belemnite: V-PDB)이며, 질소에 대한 표준은 공기이다. NIST(미국표준기술연구소(National Institute of Standards and Technology))는 SRM(표준 기준 물질(Standard Reference Material)) 번호 1547인 복숭아 잎을 제안하였고, 교정 표준으로서 사용하였다. 모든 동위원소 분석을 버클리에 소재한 캘리포니아 유니버시티의 안정한 동위원소 생물지화학에 대한 센터(Stable Isotope Biogeochemistry)에서 수행하였다. C 및 N 동위원소 분석에 대한 장기 외부 정밀도는 각각 0.10‰ 및 0.15‰이다.

메틸로시너스 트리코스포륨 균주 OB3b를 3가지 상이한 발효 배취 내 메탄 상에서 성장시켰고, 메틸로코커스 캡슐라투스 배스를 2가지 상이한 발효 배취 내 메탄 상에서 성장시켰으며, 메틸로모나스 종 16a를 단일 발효 배취 내 메탄 상에서 성장시켰다. 각각의 이들 배양물로부터의 바이오매스를 안정한 탄소 동위원소 분포에 대해 분석하였다(δ¹³C 값; 표 3 참조).

추가로, 생물반응기 내 메탄 상에서 성장시킨 균주 메틸로시너스 트리코스포륨 OB3b(Mt OB3b), 메틸로코커스 캡슐라투스 배스(Mc 배스) 및 메틸로모나스 종 16a(Mms 16a)로부터의 바이오매스 및 대응하는 지질 분획에 대해 안정한 탄소 동위원소 분석을 수행하였다(표 4 참조).

세포 및 지질 내 안정한 탄소 동위원소 분포
배취 번호	균주	δ 13 C 세포	δ 13 C 지질
68C	Mt OB3b	-57.7	-48.6
62A	Mc 배스	-57.6	-52.8
66A	Mms 16a	-64.4	-42.2

균주 Mt OB3b, Mc 배스 및 Mms 16a로부터의 바이오매스를 94h(3.14g DCW/ℓ), 26h(2.2g DCW/ℓ) 및 39h(1.14g DCW/ℓ)에 각각 채취하였다. 표 4에서의 지질에 대한 δ¹³C값은 2회 결정의 평균을 나타낸다.

실시예 4

메탄 공급원의 효과 및 지질 내 안정한 탄소 동위원소 분포에 대한 순도

메탄 함유 천연가스 성분에 대한 메탄영양체 성장을 시험하기 위해, 100㎖ 한정 배지 MMS1.0을 함유하는 일련의 0.5-리터 혈청 보틀에, 메탄과 공기의 1:1(v/v) 혼합물을 공급한 동일 배지 상에서 성장시킨 혈청 보틀 배취 배양물(5% v/v)로부터의 메틸로시너스 트리코스포륨 OB3b 또는 메틸로코커스 캡슐라투스 배스로 접종하였다. 배지 MMS1.0의 조성은 다음과 같았다: 0.8mM MgSO₄ * 7H₂O, 30mM NaNO₃, 0.14mM CaCl₂, 1.2mM NaHCO₃, 2.35mM KH₂PO₄, 3.4mM K₂HPO₄, 20.7μM Na₂MoO₄ * 2H₂O, 6μM CuSO₄ * 5H₂O, 10μM Fe^III-Na-EDTA, 및 1㎖/미량 금속 용액(ℓ)(ℓ당: 500㎎ FeSO4 * 7H₂O, 400㎎ ZnSO₄ * 7H₂O, 20㎎ MnCl₂ * 7H2O, 50㎎ CoCl₂ * 6H₂O, 10㎎ NiCl₂ * 6H₂O, 15㎎ H₃BO₃, 250㎎ EDTA 함유). 배지를 오토클레이빙하고 냉각시킨 후에 인산염, 중탄산염, 및 Fe^III-Na-EDTA를 첨가하였다. 배지의 최종 pH는 7.0±0.1였다.

접종한 보틀을 고무 슬리브 마개로 밀봉하고, 멸균 0.45μm 필터 및 멸균 27G 바늘을 통한 주사기를 통해 60㎖ 메탄 가스로 주사하였다. 2회 배양물에 (A) 99% 순도의 메탄(2.0 등급, 캘리포니아주 샌 카를로스에 소재한 프렉스 스루 알리언스 가스((Praxair through Alliance Gas), (B) 천연가스 표준을 나타내는 70% 순도의 메탄(시그마-알드리치(Sigma-Aldrich); 또한 9% 에탄, 6% 프로판, 3% 메틸프로판, 3% 부탄, 및 다른 부수적 탄화수소 성분을 함유), (C) 메탄 공급원 A와 B의 1:1 혼합물로서 전달된 85% 순도의 메탄; 및 (D) >93% 메탄(등급 1.3, 텍사스주 사우스 휴스턴에 소재한 스페셜티 케미칼 프로덕츠(Specialty Chemical Products); 내부 분석은 조성물의 메탄이 99%를 초과한다는 것을 나타냄)의 60㎖ 용적으로 각각 주사하였다. 배양물을 250rpm에서 회전 진탕시키면서 30℃(메틸로시너스 트리코스포륨 균주 OB3b) 또는 42℃(메틸로코커스 캡슐라투스 배스)에서 접종하고 나서, 1㎖ 샘플을 회수함으로서 대략 12시간 간격으로 성장을 측정하여 OD₆₀₀을 결정하였다. 이들 시간에, 보틀을 탈기시키고, 헤드스페이스를 60㎖의 각각의 메탄 공급원(A, B, C 또는 D) 및 60㎖의 농축 산소(적어도 85% 순도)로 대체하였다. 약 24시간 간격으로, 5㎖ 샘플을 제거하고 나서, 세포를 원심분리(8,000rpm, 10분)에 의해 회수한 다음, -80℃에서 저장한 후에 분석하였다.

메틸로시너스 트리코스포륨 균주 OB3b 및 메틸로코커스 캡슐라투스 배스로부터 유래된 메탄영양체 바이오매스에 대한 탄소 및 질소 함량(건조 중량%)의 분석, 및 탄소(¹³C) 및 질소(¹⁵N) 안정성 동위원소를 실시예 3에 기재한 바와 같이 수행하였다. 표 5는 상이한 수준의 순도를 갖는 메탄 상에서 그리고 보틀 배양물의 다양한 배취에서 성장시킨 메틸로코커스 캡슐라투스 배스로부터의 바이오매스 샘플에 대한 안정성 탄소 동위원소 분석의 결과를 나타낸다.

메탄(A, 99%)의 하나의 공급원 상에서 성장시킨 메틸로코커스 캡슐라투스 배스에 대한 평균 δ¹³C는 -41.2　±　1.2인 반면, 메탄(B, 70%)의 상이한 공급원 상에서 성장시킨 메틸로코커스 캡슐라투스 배스에 대한 평균 δ¹³C는 -44.2　±　1.2였다. 메탄 공급원 A와 B를 혼합하였을 때, -43.8　±　2.4의 중간체 평균 δ¹³C가 관찰되었다. 이들 데이터는 메탄 공급원 A 및 B 상에서 성장시킨 세포 물질의 δ¹³C가 유입 메탄의 δ¹³C에서의 차이에 기인하여 서로 유의하게 상이하다는 것을 나타낸다. 그러나, 두 가스의 혼합물 상에서 성장시킨 세포는 ¹²C를 우선적으로 이용하고, 따라서 더 음의 δ¹³C 값 경향을 나타낸다.

상이한 메탄 공급원 상에서 그리고 보틀 배양물의 다양한 배취에서 성장시킨 2가지 상이한 메탄영양체, 메틸로코커스 캡슐라투스 배스 및 메틸로시너스 트리코스포륨 OB3b가 δ¹³C 분포에서 차이를 나타내는 지의 여부를 시험하기 위해 유사한 실험을 수행하였다(표 6 참조).

제1 메탄 공급원(A) 상에서 성장시킨 메틸로코커스 캡슐라투스에 대한 평균 δ¹³C는 -44.5　±　8.8인 반면, 메틸로시너스 트리코스포륨에 대한 평균 δ¹³C는 동일 메탄 공급원 상에서 -47.8　±　2.0였다. 제2 메탄 공급원(B) 상에서 성장시킨 메틸로코커스 캡슐라투스에 대한 평균 δ¹³C는 -37.9　±　0.4인 반면, 메틸로시너스 트리코스포륨에 대한 평균 δ¹³C는 -39.8　±　4.5였다. 이들 데이터는 메탄 공급원 상에서 성장시킨 세포 물질의 δ¹³C이 동일한 메탄 공급원 상에서 성장시킨 상이한 균주로부터의 세포 물질의 δ¹³C과 대단히 유사하다는 것을 나타낸다. 따라서, 세포 물질의 관찰된 δ¹³C은 연구 중인 특정 박테리아 균주의 특성보다는 유입 가스의 조성물에 주로 의존적인 것으로 나타난다.

상기 기재한 다양한 구체예는 추가 구체예를 제공하기 위해 조합될 수 있다. 본원에 언급되고/되거나 본원에 참조로 포함되는 2014년 5월 15일자로 출원된 미국 가출원 특허 제61/994,042호를 포함하는 출원 데이터 시트에 열거된 모든 미국 특허, 미국 특허 출원 공개, 미국 특허 출원, 외국 특허, 외국 특허 출원 및 비-특허 간행물은 그들의 전문이 참조로서 본원에 포함된다. 또한 추가 구체예를 제공하기 위해 필요하다면, 다양한 특허, 출원 및 공개의 개념을 사용하는데 구체예들의 측면이 변형될 수 있다.

상기 상세한 설명에 비추어 이들 및 다른 변화가 구체예에 대해 이뤄질 수 있다. 일반적으로, 다음의 청구범위에서 사용한 용어는 본 명세서 및 청구범위에 개시한 특정 구체예로 청구범위를 제한하는 것으로 해석되어서는 안 되지만, 이러한 특허청구범위가 자격을 부여하는 완전한 범주의 동등물과 마찬가지로 모든 가능한 구체예를 포함하도록 해석되어야 한다. 따라서, 청구범위는 본 개시내용에 의해 제한되지 않는다.

Claims (85)

1. (a) (i) β-케토아실-CoA 신타아제 (KCS);
   (ii) β-케토아실-CoA 리덕타아제 (KCR);
   (iii) β-하이드록시 아실-CoA 데하이드라타아제 (HCD); 및
   (iv) 에노일-CoA 리덕타아제 (ECR);
   의 효소들을 코딩하는 하나 이상의 재조합 핵산 분자를 포함하고, C₁　기질을 초장 탄소쇄 화합물로 전환시키는 비-천연 C₁　대사 비광합성 미생물을 C₁　기질 공급원료와 배양하는 단계; 및
   (b) 초장 탄소쇄 화합물을 회수하는 단계;
   를 포함하는, 초장 탄소쇄 화합물의 제조방법.
2. 제1항에 있어서, 초장 탄소쇄 화합물이 초장쇄 지방 아실-CoA인 방법.
3. 제1항에 있어서, C₁ 대사 비광합성 미생물이 추가로 초장쇄 지방 알콜을 형성할 수 있는 지방 알콜 형성 아실-CoA 리덕타아제 (FAR)를 코딩하는 핵산 분자를 포함하고, 여기서 초장 탄소쇄 화합물은 초장쇄 지방 일차 알콜인 방법.
4. 제1항에 있어서, C₁ 대사 비광합성 미생물이 추가로 초장쇄 지방 알데하이드를 형성할 수 있는 지방 아실-CoA 리덕타아제 및 초장쇄 지방 알콜을 형성할 수 있는 알데하이드 리덕타아제를 코딩하는 핵산 분자를 포함하고, 여기서 초장 탄소쇄 화합물은 초장쇄 지방 일차 알콜인 방법.
5. 제1항에 있어서, C₁ 대사 비광합성 미생물이 추가로 초장쇄 지방 알데하이드를 형성할 수 있는 지방 아실-CoA 리덕타아제를 코딩하는 핵산 분자(들)를 포함하고, 여기서 초장 탄소쇄 화합물은 초장쇄 지방 알데하이드인 방법.
6. 제1항에 있어서, C₁ 대사 비광합성 미생물이 초장쇄 지방 알데하이드를 형성할 수 있는 지방 아실-CoA 리덕타아제 및 초장쇄 알칸을 형성할 수 있는 알데하이드 데카보닐라아제를 코딩하는 핵산 분자(들)를 포함하고, 여기서 초장 탄소쇄 화합물은 초장쇄 알칸인 방법.
7. 제1항에 있어서, C₁ 대사 비광합성 미생물이 초장쇄 지방 알데하이드를 형성할 수 있는 지방 아실-CoA 리덕타아제, 초장쇄 알칸을 형성할 수 있는 알데하이드 데카보닐라아제, 및 초장쇄 지방 이차 알콜을 형성할 수 있는 알칸 하이드록실라아제, 및 초장쇄 케톤을 형성할 수 있는 알콜 데하이드로게나아제를 코딩하는 핵산 분자(들)를 포함하고, 여기서 초장 탄소쇄 화합물은 초장쇄 케톤인 방법.
8. 제1항에 있어서, C₁ 대사 비광합성 미생물이 초장쇄 지방 알콜을 형성할 수 있는 지방 알콜 형성 아실-CoA 리덕타아제 및 초장쇄 지방 에스테르 왁스를 형성할 수 있는 에스테르 신타아제를 코딩하는 핵산 분자(들)를 포함하고, 여기서 초장 탄소쇄 화합물은 초장쇄 지방 에스테르 왁스인 방법.
9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, KCS가 CER6, Elo1, Fen1/Elo2, Sur4/Elo3, KCS1, 또는 FDH인 방법.
10. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, KCR이 Ybr159w, AYR1, GL8A, GL8B, 또는 At1g67730인 방법.
11. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, HCD가 PHS1, PAS2, 또는 PAS2-1인 방법.
12. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, ECR이 CER10 또는 TSC13인 방법.
13. 제3항에 있어서, 지방 알콜 형성 아실-CoA 리덕타아제가 FAR, CER4, 또는 Maqu_2220인 방법.
14. 제5항 또는 제6항에 있어서, 지방 아실-CoA 리덕타아제가 ACR1 또는 CER3인 방법.
15. 제4항에 있어서, 알데하이드 리덕타아제가 알콜 데하이드로게나아제이고, 여기서 알콜 데하이드로게나아제는 YqhD인 방법.
16. 제8항에 있어서, 에스테르 신타아제가 WSD1인 방법.
17. 제6항에 있어서, 알데하이드 데카보닐라아제가 CER1 또는 CER22인 방법.
18. 제7항에 있어서, 알칸 하이드록실라아제가 MAH1인 방법.
19. 제7항에 있어서, 알콜 데하이드로게나아제가 MAH1인 방법.
20. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, C₁ 대사 비광합성 미생물이 메틸로모나스(Methylomonas), 메틸로박터(Methylobacter), 메틸로코커스(Methylococcus), 메틸로시너스(Methylosinus), 메틸로시스티스(Methylocystis), 메틸로마이크로븀(Methylomicrobium), 메타노모나스(Methanomonas), 메틸로필러스(Methylophilus), 메틸로바실러스(Methylobacillus), 메틸로박테리움(Methylobacterium), 하이포마이크로븀(Hyphomicrobium), 잔토박터(Xanthobacter), 바실러스(Bacillus), 파라코커스(Paracoccus), 노카르디아(Nocardia), 아트로박터(Arthrobacter), 로도슈도모나스(Rhodopseudomonas) 및 슈도모나스(Pseudomonas)로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
21. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, C₁ 대사 비광합성 미생물이 박테리움인 방법.
22. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, C₁ 대사 박테리아가 메탄영양체 또는 메틸영양체인 방법.
23. 제22항에 있어서, C₁ 대사 박테리아가 메탄영양체인 방법.
24. 제23항에 있어서, 메탄영양체가 메틸로모나스(Methylomonas), 메틸로박터(Methylobacter), 메틸로코커스(Methylococcus), 메틸로시너스(Methylosinus), 메틸로시스티스(Methylocystis), 메틸로마이크로븀(Methylomicrobium), 메타노모나스(Methanomonas), 또는 이들의 임의의 조합인 방법.
25. 제24항에 있어서, 메탄영양체가 메틸로모나스 종(Methylomonas sp.) 16a(ATCC PTA 2402), 메틸로시너스 트리코스포륨(Methylosinus trichosporium)(NRRL B-11,196), 메틸로시너스 스포륨(Methylosinus sporium)(NRRL B-11,197), 메틸로시스티스 파르부스(Methylocystis parvus)(NRRL B-11,198), 메틸로모나스 메타니카(Methylomonas methanica)(NRRL B-11,199), 메틸로모나스 알부스(Methylomonas albus)(NRRL B-11,200), 메틸로박터 캡슐라투스(Methylobacter capsulatus)(NRRL B-11,201), 메틸로박테리움 오가노필룸(Methylobacterium organophilum)(ATCC 27,886), 메틸로모나스 종 AJ-3670(FERM P-2400), 메틸로셀라 실베스트리스(Methylocella silvestris), 메틸애시디필룸 인페르노룸(Methylacidiphilum infernorum), 메틸리비움 페트롤레이필룸(Methylibium petroleiphilum), 또는 이들의 임의의 조합인 방법.
26. 제23항에 있어서, 메탄영양체가 메틸로시너스 트리코스포륨 OB3b, 메틸로코커스 캡슐라투스 배스(Methylococcus capsulatus Bath), 메틸로모나스 종 16a, 메틸로마이크로븀 알칼리필룸(Methylomicrobium alcaliphilum), 또는 이들의 고성장 변이체인 방법.
27. 제22항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 배양물이 이종 박테리움을 더 포함하는 방법.
28. 제22항에 있어서, C₁ 대사 박테리움이 메틸영양체인 방법.
29. 제28항에 있어서, 메틸영양체가 메틸로박테리움 엑스토르퀀스, 메틸로박테리움 라디오톨러런스, 메틸로박테리움 포풀리, 메틸로박테리움 클로로메타니쿰, 메틸로박테리움 노둘란스, 또는 임의의 이들의 조합인 방법.
30. 제21항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, C₁ 대사 박테리아가 천연가스, 비재래형 천연가스(unconventional natural gas) 또는 합성 가스 대사 박테리아인 방법.
31. 제30항에 있어서, 합성 가스 대사 박테리아가 클로스트리듐(Clostridium), 무렐라(Moorella), 파이로코커스(Pyrococcus), 유박테리움(Eubacterium), 데설포박테리움(Desulfobacterium), 카복시도테르무스(Carboxydothermus), 아세토게늄(Acetogenium), 아세토박테리움(Acetobacterium), 아세토아나에로븀(Acetoanaerobium), 뷰티리바세테리움(Butyribaceterium), 펩토스트렙토코커스(Peptostreptococcus) 또는 임의의 이들의 조합인 방법.
32. 제30항에 있어서, 합성 가스 대사 박테리아가 클로스트리듐 오토에타노게눔(Clostridium autoethanogenum), 클로스트리듐 리중다리(Clostridium ljungdahli), 클로스트리듐 라그스달레이(Clostridium ragsdalei), 클로스트리듐 카복시다이보란스(Clostridium carboxydivorans), 뷰티리박테리움 메틸로트로피쿰(Butyribacterium methylotrophicum), 클로스트리듐 우디(Clostridium woodii), 클로스트리듐 네오프로판올로겐(Clostridium neopropanologen) 또는 임의의 이들의 조합인 방법.
33. 제1항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, C₁ 대사 비-광합성 미생물이 절대(obligate) C₁ 대사 비-광합성 미생물인 방법.
34. 제1항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 티오에스테라아제를 코딩하는 재조합 핵산 분자를 더 포함하는 방법.
35. 제34항에 있어서, 티오에스테라아제가 신호 펩티드가 없는 tesA, UcFatB 또는 BTE인 방법.
36. 제34항 또는 제35항에 있어서, 내인성 티오에스테르라제 활성이 비변경 내인성 티오에스테르라제 활성에 비해 감소되거나, 최소이거나 또는 없는 방법.
37. 제1항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 아실-CoA 신쎄타아제를 코딩하는 재조합 핵산 분자를 더 포함하는 방법.
38. 제37항에 있어서, 아실-CoA 신쎄타아제가 FadD, yng1 또는 FAA2인 방법.
39. 제37항 또는 제38항에 있어서, 내인성 아실-CoA 신쎄타아제 활성이 비변경 내인성 아실-CoA 신쎄타아제 활성에 비해 감소되거나, 최소이거나 또는 없는 방법.
40. 제1항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, C₁ 대사 비광합성 미생물이 하나 이상의 C₂₅-C₃₀, C₃₁-C₄₀, C₄₁-C₆₀, C₆₁-C₈₀, C₈₁-C₁₀₀, C₁₀₁-C₁₂₀, C₁₂₁-C₁₄₀, C₁₄₁-C₁₆₀, C₁₆₁-C₁₈₀, 또는 C₁₈₁-C₂₀₀ 쇄 화합물을 포함하는 초장 탄소쇄 화합물을 생성하는 방법.
41. 제1항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, C₁ 대사 비광합성 미생물이 C₂₅-C₅₀ 쇄 화합물을 포함하는 초장 탄소쇄 화합물을 생성하는 방법.
42. 제1항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, C₁ 대사 비광합성 미생물이 C₂₅ 내지 C₅₀ 지방 알콜을 포함하는 지방 알콜을 생성하고, C₂₅ 내지 C₅₀ 지방 알콜은 총 지방 알콜의 적어도 70%를 구성하는 방법.
43. 제1항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, C₁ 대사 비-광합성 미생물이 메탄을 포함하는 천연가스, 비재래형 천연가스 또는 합성 가스를 초장쇄 아실-CoA, 초장쇄 지방 알데하이드, 초장쇄 지방 알콜, 초장쇄 지방 에스테르 왁스, 초장쇄 알칸, 초장쇄 케톤, 또는 이들의 임의의 조합으로 전환시킬 수 있는 방법.
44. 제1항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 초장쇄 아실-CoA, 초장쇄 지방 알데하이드, 초장쇄 지방 알콜, 초장쇄 지방 에스테르 왁스, 초장쇄 알칸, 초장쇄 케톤, 또는 이들의 임의의 조합의 생성된 양이 약 1　mg/L 내지 약 500　g/L의 범위인 방법.
45. 제1항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, C₁ 기질이 메탄, 메탄올, 포름알데하이드, 포름산 또는 그의 염, 일산화탄소, 이산화탄소, 메틸아민, 메틸티올 또는 메틸할로겐인 방법.
46. 제1항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, C₁ 기질이 메탄, 천연가스, 비재래형 천연가스 또는 합성 가스인 방법.
47. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, C₁ 대사 비-광합성 미생물이 메탄영양체 박테리아이고, C₁ 기질이 메탄이며, 박테리아는 호기성 조건 하에서 배양되는 방법.
48. 제1항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, 제어된 배양 장치에서 C₁ 대사 비-광합성 미생물을 배양하는 단계를 더 포함하는 방법.
49. 제48항에 있어서, C₁ 기질이 메탄, 메탄올, 포름알데하이드, 포름산 또는 그의 염, 일산화탄소, 이산화탄소, 천연가스, 비재래형 천연가스, 합성 가스, 메틸아민, 메틸티올 또는 메틸할로겐인 방법.
50. 제48항에 있어서, 제어된 배양 장치가 발효기 또는 생물반응기인 방법.
51. (i) β-케토아실-CoA 신타아제 (KCS);
    (ii) β-케토아실-CoA 리덕타아제 (KCR);
    (iii) β-하이드록시 아실-CoA 데하이드라타아제 (HCD); 및
    (iv) 에노일-CoA 리덕타아제 (ECR)
    의 효소들을 코딩하는 하나 이상의 재조합 핵산 분자를 포함하고;
    C₁ 기질을 초장쇄 지방 아실-CoA, 초장쇄 지방 알데하이드, 초장쇄 지방 일차 알콜, 초장쇄 지방 에스테르 왁스, 초장쇄 알칸, 초장쇄 지방 이차 알콜, 초장쇄 케톤, 또는 이들의 임의의 조합으로부터 선택되는 초장 탄소쇄 화합물로 전환시킬 수 있는, 비-천연 메탄영양체.
52. 제51항에 있어서, KCS가 CER6, Elo1, Fen1/Elo2, Sur4/Elo3, KCS1, 또는 FDH인 비-천연 메탄영양체.
53. 제51항 또는 제52항에 있어서, 적어도 두 개의 상이한 KCS 효소를 코딩하는 재조합 핵산 분자를 포함하는 비-천연 메탄영양체.
54. 제51항 내지 제53항 중 어느 한 항에 있어서, KCR이 Ybr159w, AYR1, GL8A, GL8B, 또는 At1g67730인 비-천연 메탄영양체.
55. 제51항 내지 제54항 중 어느 한 항에 있어서, HCD가 PHS1, PAS2, 또는 PAS2-1인 비-천연 메탄영양체.
56. 제51항 내지 제55항 중 어느 한 항에 있어서, ECR이 CER10 또는 TSC13인 비-천연 메탄영양체.
57. 제51항 내지 제56항 중 어느 한 항에 있어서, 초장쇄 지방 알콜을 형성할 수 있는 지방 알콜 형성 아실-CoA 리덕타아제를 코딩하는 재조합 핵산 분자를 더 포함하는 비-천연 메탄영양체.
58. 제57항에 있어서, 지방 알콜 형성 아실-CoA 리덕타아제가 FAR, CER4, 또는 Maqu_2220인 비-천연 메탄영양체.
59. 제51항 내지 제56항 중 어느 한 항에 있어서, 초장쇄 지방 알데하이드를 형성할 수 있는 지방 아실-CoA 리덕타아제 및 초장쇄 지방 알콜을 형성할 수 있는 알데하이드 리덕타아제를 코딩하는 재조합 핵산 분자를 더 포함하는 비-천연 메탄영양체.
60. 제59항에 있어서, 지방 아실-CoA 리덕타아제가 ACR1 또는 CER3인 비-천연 메탄영양체.
61. 제59항 또는 제60항에 있어서, 알데하이드 리덕타아제가 YqhD인 비-천연 메탄영양체.
62. 제51항 내지 제56항 중 어느 한 항에 있어서, 초장쇄 지방 알콜을 형성할 수 있는 지방 알콜 형성 아실-CoA 리덕타아제 및 초장쇄 지방 에스테르 왁스를 형성할 수 있는 에스테르 신타아제를 코딩하는 재조합 핵산 분자를 더 포함하는 비-천연 메탄영양체.
63. 제62항에 있어서, 지방 알콜 형성 아실-CoA 리덕타아제가 FAR, CER4 또는 Maqu_2220인 비-천연 메탄영양체.
64. 제62항 또는 제63항에 있어서, 에스테르 신타아제가 WSD1인 비-천연 메탄영양체.
65. 제51항 내지 제56항 중 어느 한 항에 있어서, 초장쇄 지방 알데하이드를 형성할 수 있는 지방 아실-CoA 리덕타아제 및 초장쇄 알칸을 형성할 수 있는 알데하이드 데카보닐라아제를 코딩하는 재조합 핵산 분자를 더 포함하는 비-천연 메탄영양체.
66. 제65항에 있어서, 지방 아실-CoA 리덕타아제가 ACR1 또는 CER3인 비-천연 메탄영양체.
67. 제65항 또는 제66항에 있어서, 알데하이드 데카보닐라아제가 CER1 또는 CER22인 비-천연 메탄영양체.
68. 제52항 내지 제57항 중 어느 한 항에 있어서, 초장쇄 지방 알데하이드를 형성할 수 있는 지방 아실-CoA 리덕타아제, 초장쇄 알칸을 형성할 수 있는 알데하이드 데카보닐라아제, 및 초장쇄 지방 이차 알콜을 형성할 수 있는 알칸 하이드록실라아제, 및 초장쇄 케톤을 형성할 수 있는 알콜 데하이드로게나아제를 코딩하는 핵산 분자를 더 포함하는 비-천연 메탄영양체.
69. 제68항에 있어서, 지방 아실-CoA 리덕타아제가 ACR1 또는 CER3인 비-천연 메탄영양체.
70. 제68항 또는 제69항에 있어서, 알데하이드 데카보닐라아제가 CER1 또는 CER22인 비-천연 메탄영양체.
71. 제68항 내지 제70항 중 어느 한 항에 있어서, 알칸 하이드록실라아제 및 알콜 데하이드로게나아제가 MAH1인 비-천연 메탄영양체.
72. 제51항 내지 제71항 중 어느 한 항에 있어서, 티오에스테라아제를 코딩하는 재조합 핵산 분자를 더 포함하는 비-천연 메탄영양체.
73. 제72항에 있어서, 티오에스테라아제가 리더 서열이 없는 tesA, UcFatB, 또는 BTE인 비-천연 메탄영양체.
74. 제72항 또는 제73항에 있어서, 내인성 티오에스테라아제 활성이 비변경 내인성 티오에스테라아제 활성에 비해 감소되거나, 최소이거나 또는 없는 비-천연 메탄영양체.
75. 제51항 내지 제74항 중 어느 한 항에 있어서, 아실-CoA 신쎄타아제를 코딩하는 재조합 핵산 분자를 더 포함하는 비-천연 메탄영양체.
76. 제75항에 있어서, 아실-CoA 신쎄타아제가 FadD, yng1, 또는 FAA2인 비-천연 메탄영양체.
77. 제75항 또는 제76항에 있어서, 내인성 아실-CoA 신쎄타아제 활성이 비변경 내인성 아실-CoA 신쎄타아제 활성에 비해 감소되거나, 최소이거나 또는 없는 비-천연 메탄영양체.
78. 제51항 내지 제77항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 C₂₅-C₃₀, C₃₁-C₄₀, C₄₁-C₆₀, C₆₁-C₈₀, C₈₁-C₁₀₀, C₁₀₁-C₁₂₀, C₁₂₁-C₁₄₀, C₁₄₁-C₁₆₀, C₁₆₁-C₁₈₀, 또는 C₁₈₁-C₂₀₀ 쇄 화합물을 포함하는 초장 탄소쇄 화합물을 생성하는 비-천연 메탄영양체.
79. 제51항 내지 제77항 중 어느 한 항에 있어서, C₂₅-C₅₀ 쇄 화합물을 포함하는 초장 탄소쇄 화합물을 생성하는 비-천연 메탄영양체.
80. 제51항 내지 제77항 중 어느 한 항에 있어서, C₂₅ 내지 C₅₀ 지방 왁스 에스테르를 포함하는 지방 왁스 에스테르를 생성하고, C₂₅ 내지 C₅₀ 지방 왁스 에스테르가 총 지방 왁스 에스테르의 적어도 70%를 구성하는 비-천연 메탄영양체.
81. 제51항 내지 제80항 중 어느 한 항에 있어서, 생성된 초장쇄 지방 아실-CoA, 초장쇄 지방 알데하이드, 초장쇄 지방 일차 알콜, 초장쇄 지방 에스테르 왁스, 초장쇄 알칸, 초장쇄 지방 이차 알콜, 초장쇄 케톤, 또는 이들의 임의의 조합의 양이 약 1　mg/L 내지 약 500 g/L의 범위인 비-천연 메탄영양체.
82. 제51항 내지 제81항 중 어느 한 항에 있어서, C₁ 기질이 메탄, 메탄올, 포름알데하이드, 포름산 또는 그의 염, 일산화탄소, 이산화탄소, 메틸아민, 메틸티올 또는 메틸할로겐인 비-천연 메탄영양체.
83. 제51항 내지 제81항 중 어느 한 항에 있어서, C₁ 기질이 메탄, 천연가스 또는 비재래형 천연가스인 비-천연 메탄영양체.
84. 제82항에 있어서, 메탄을 포함하는 천연가스, 비재래형 천연가스 또는 합성 가스를 C₂₅-C₅₀ 초장쇄 지방 알데하이드, 초장쇄 지방 일차 알콜, 초장쇄 지방 왁스 에스테르, 초장쇄 알칸, 초장쇄 지방 이차 알콜, 또는 초장쇄 케톤으로 전환시킬 수 있는, 비-천연 메탄영양체.
85. 제51항 내지 제84항 중 어느 한 항에 있어서, 숙주 메탄영양체가 메틸로코커스 캡슐라투스 배스 균주(Methylococcus capsulatus Bath strain), 메틸로모나스 16a(Methylomonas 16a)(ATCC PTA 2402), 메틸로시너스 트리코스포륨(Methylosinus trichosporium) OB3b(NRRL B-11,196), 메틸로시너스 스포륨(Methylosinus sporium)(NRRL B-11,197), 메틸로시스티스 파르부스(Methylocystis parvus)(NRRL B-11,198), 메틸로모나스 메타니카(Methylomonas methanica)(NRRL B-11,199), 메틸로모나스 알부스(Methylomonas albus)(NRRL B-11,200), 메틸로박터 캡슐라투스(Methylobacter capsulatus)(NRRL B-11,201), 메틸로박테리움 오가노필룸(Methylobacterium organophilum)(ATCC 27,886), 메틸로모나스 종(Methylomonas sp) AJ-3670(FERM P-2400), 메틸로셀라 실베스트리스(Methylocella silvestris), 메틸로셀라 팔루스트리스(Methylocella palustris)(ATCC 700799), 메틸로셀라 툰드라(Methylocella tundrae), 메틸로시스티스 달토나 균주 SB2(Methylocystis daltona strain SB2), 메틸로시스티스 브리오필라(Methylocystis bryophila), 메틸로캡사 아우레아 KYG(Methylocapsa aurea KYG), 메틸애시디필룸 인페르노룸(Methylacidiphilum infernorum), 메틸리비움 페트롤레이필룸(Methylibium petroleiphilum), 메틸로마이크로븀 알칼리필룸(Methylomicrobium alcaliphilum), 또는 이들의 임의의 조합인 것인, 비-천연 메탄영양체.

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