MX2010012191A - Cepa de levadura mejorada para producir cuatro alcoholes de carbono. - Google Patents

Abstract

Se descubrió que las células de levadura con una respuesta de control general reducida a la privación de aminoácidos tienen mayor tolerancia al butanol en el medio de crecimiento. La respuesta reducida se desarrolló por modificación genética de un gen involucrado en la respuesta, un gen GCN, para eliminar la actividad de la proteína codificada. Las cepas de levadura con una ruta biosintética de butanol modificada y una modificación genética en un gen involucrado en la respuesta de control general a la privación de aminoácidos, que tienen una mayor tolerancia al butanol, son útiles para la producción de butanol.

Description

CEPA DE LEVADURA MEJORADA PARA PRODUCIR CUATRO ALCOHOLES DE CARBONO CAMPO DE LA INVENCIÓN La invención se relaciona con el campo de la microbiología y la ingeniería genética. Más específicamente, se identificaron genes de levadura involucrados en la respuesta al butanol. Se descubrió que las cepas de levadura con expresión reducida de los genes identificados tienen un rendimiento de crecimiento mejorado en presencia de bútanol.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN El butanol es una sustancia química industrial importante, útil como aditivo de combustible, como materia prima de alimentación en la industria del plástico y como solvente extractor grado alimenticio en la industria de los alimentos y saborizantes . . Cada año se producen 4.5 a 5.4 teragramos (10 a 12 mil millones de libras) de butanol por medios petroquímicos , y es probable que la necesidad de esta sustancia química genérica aumente.

Los métodos para la síntesis química de los butanoles son conocidos; sin embargo, estos procesos usan materias primas derivadas de productos químicos del petróleo, y generalmente son costosos y contaminantes. Los métodos para producir butanol por fermentación también son conocidos; el REF.:214294 proceso más popular produce una mezcla de acetona, 1-butanol y etanol, y se lo denomina proceso ABE (Blaschek et al., patente de los Estados Unidos núm. 6,358,717). La fermentación acetona-butanol-etanol (ABE) por Clostridium acetobutylicum es una de las fermentaciones industriales más antiguas, y se han informado las rutas y los genes responsables de la producción de estos solventes (Girbal et al., Trends in Biotechnology 16:11-16 (1998)). El isobutanol se produce biológicamente como un subproducto de la fermentación de la levadura. Es un componente del "aceite de fusel" que se forma como resultado del metabolismo incompleto de aminoácidos por parte de este grupo de hongos. El isobutanol se produce específicamente a partir del catabolismo de la L-valina. Después de que el grupo amino de la L-valina se recolecta como una fuente de nitrógeno, las enzimas de la llamada ruta Ehrlich descarboxilan y reducen el ácido a-ceto resultante (Dickinson et al., J. Biol . Chem. 273 (40) : 25752-25756 (1998)). Los rendimientos del aceite de fusel y/o sus componentes alcanzados durante la fermentación de bebidas generalmente son bajos.

Además, se han descrito hospederos de producción microbiana recombinantes que expresan una ruta biosintética de 1-butanol (Donaldson et al., publicación de solicitud de patente de los Estados Unidos copendiente y de propiedad mancomunada núm. 20080182308), una ruta biosintética de 2- butanol (Donaldson et al., publicaciones de solicitud de patente de los Estados Unidos copendientes y de propiedad mancomunada núm. 20070259410A1 y 2007-0292927) , y una ruta biosintética de isobutanol (Maggio-Hall et al., publicación de solicitud de patente de los Estados Unidos copendiente y de propiedad mancomunada núm. 20070092957) .

Se cree que la producción biológica de los butanoles está limitada, por la toxicidad del butanol, al microorganismo hospedero usado para la producción de butanol. Las cepas de Clostridium que son tolerantes al 1-butanol se han aislado mediante mutagénesis química (Jain et al., patente de los Estados Unidos núm. 5,192,673; y Blaschek et al., patente de los Estados Unidos núm. 6,358,717), sobreexpresion de ciertas clases de genes tales como los que expresan proteínas de respuesta al estrés (Papoutsakis et al., patente de los Estados Unidos núm. 6,960,465; y Tomas et al., Appl. Environ. Microbiol . 69 (8) :4951-4965 (2003)), y enriquecimiento en serie (Quratulain et al., Folia Microbiologica (Praga) 40 (5) : 467-471 (1995); y Soucaille et al., Current Microbiology 14 (5) : 295-299 (1987)). Desmond et al. (Appl. Environ. Microbiol. 70 (10) : 5929-5936 (2004)) informan que la sobreexpresion de GroESL, dos proteínas de respuesta al estrés, en Lactococcus lactis y Lactobacillus paracasei producía cepas que eran capaces de crecer en presencia de 0.5 % volumen/volumen (v/v) [0.4 % peso/volumen (p/v) ] de 1-butanol. Además, se describió el aislamiento de cepas tolerantes al 1-butanol de sedimento de estuario (Sardessai et al., Current Science 82 (6) : 622-623 (2002)) y de barro activado (Bieszkiewicz et al., Acta Microbiologica Polonica 36 ( 3 ): 259-265 (1987)). Se han aislado cepas bacterianas resistentes al butanol de consorcios microbianos (publicaciones de patentes de los Estados Unidos copendientes y de propiedad mancomunada núm. 20070259411, . 20080124774 y 20080138870) o por cribado de mutantes (solicitudes de patentes de los Estados Unidos copendientes y de propiedad mancomunada núm. 12/330530, 12/330531, y 12/330534) .

Aún existe la necesidad de proporcionar cepas de levadura productoras de butanol que sean más tolerantes a los butanoles, así como métodos para la producción de butanoles mediante el uso de cepas hospederas de levadura que sean más tolerantes a estas sustancias químicas y que estén modificadas para la producción de butanol.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCION La invención proporciona un hospedero de levadura recombinante que produce butanol y comprende una modificación genética que resulta en una respuesta reducida en la respuesta de control general a la privación de aminoácidos. Estas células tienen una mayor tolerancia al butanol comparadas con las células que no poseen la modificación genética. La reducción en la respuesta en la respuesta de control general a la privación de aminoácidos podría alcanzarse mediante la mutación de los genes endógenos que influyen en la respuesta. Las células hospederas de la invención podrían producir butanol naturalmente o podrían modificarse para que lo hagan a través de una ruta modificada .

De conformidad, la invención proporciona una célula hospedera de levadura recombinante que produce butanol, en donde la célula de levadura comprende al menos una modificación genética que reduce la respuesta en la respuesta de control general a la privación de aminoácidos.

En una modalidad la célula de levadura de la invención comprende una modificación genética en un gen que codifica una proteína seleccionada de Gcnlp, Gcn2p, Gcn3p, Gcn4p, Gcn5p y Gcn20p.

En otra modalidad, la célula de levadura comprende una ruta biosintética recombinante seleccionada del grupo que consiste de: a) una ruta biosintética de 1-butanol; b) una ruta biosintética de 2-butanol; y c) una ruta biosintética de isobutanol.

En otra modalidad la invención proporciona un método para la producción de butanol; el método comprende las siguientes etapas: (a) proporcionar una célula hospedera de levadura recombinante que 1) produce butanol y 2) comprende al menos una modificación genética que reduce la respuesta en la respuesta de control general a la privación de aminoácidos; y (b) cultivar la cepa de (a) bajo condiciones en donde se produce butanol .

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS Las distiritas modalidades de la invención pueden entenderse mejor a partir de la siguiente descripción detallada, las figuras y las descripciones de las secuencias adjuntas, que forman parte de la presente solicitud .

Las figuras 1A-1B muestran rendimientos de crecimiento fraccional de las cepas silvestres de GCN2 mutante y GCN4 mutante en los puntos de tiempo de 8 horas (Figura 1A) y 24 horas (Figura IB) para el crecimiento en YVCM que contiene diferentes concentraciones de isobutanol .

Las figuras 2A-2B muestran rendimientos de crecimiento fraccional de las cepas silvestres de GCN2 mutante y GCN4 mutante en los puntos de tiempo de 7 horas (Figura 2A) y 23 horas (Figura 2B) para el crecimiento en YPD que contiene diferentes concentraciones de isobutanol .

BREVE DESCRIPCIÓN DEL LISTADO DE SECUENCIAS La presente invención puede comprenderse mejor a partir de la siguiente descripción detallada y las descripciones de secuencias adjuntas que forman parte de la presente solicitud.

Las siguientes secuencias cumplen con 37 C.F.R. 1.821-1.825 ("Requisitos para solicitudes de patentes que contienen descripciones de secuencias de nucleótidos y/o secuencias de aminoácidos - las Reglas de secuencias") y se ajustan al estándar ST.25 de la Organización Mundial de la Propiedad Intelectual (OMPI) (1998) y los requisitos para el listado de secuencias de la EPO y el PCT (reglas 5.2 y 49.5(a-bis), y la sección 208 y el anexo C de las Instrucciones administrativas) . Los símbolos y el formato que se usan para los datos de las secuencias de nucleótidos y de aminoácidos cumplen las reglas que se exponen en 37 C.F.R. §1.822.

Tabla 1 Resumen de números de ident . de sec . de proteínas y genes para la ruta biosintética de 1-butanol Descripción Sec. con núm. de Sec . con núm . de iden . : ident . : Ácido nucleico Péptido Acetil-CoA acetiltransferasa thlA de 1 2 Clostridiu acetobutylicu ATCC 824 Acetil-CoA acetiltransferasa thlB de 3 4 Tabla 2 Resumen de números de ident. de sec. de proteínas y genes para la ruta biosintética de 2-butanol Descripción Sec. con núm. de Sec. con núm. de iden . ident . Ácido nucleico Péptido budA, acetolactato decarboxilasa de 17 18 Klebsiella pneu oniae ATCC 25955 budB, acetolactato sintasa de 19 20 Klebsiella pneumoniae ATCC 25955 budC, butanodiol deshidrogenasa de 21 22 Tabla 3 Resumen de números de ident. de sec. de proteínas y genes para la ruta biosintética de isobutanol Descripción Sec. con núm. de Sec. con núm. ident . de ident . Ácido nucleico Péptido Klebsiella pneumoniae budB 19 20 (acetolactato sintasa) Bacillus subtilis alsS 41 42 (acetolactato sintasa) E. coli ilvC (ácido acetohidroxi 31 32 reductoisomerasa) Descripción Sec. con núm. de Sec. con núm. ident . de ident . Ácido nucleico Péptido S. cerevisiae ILV5 43 44 (ácido acetohidroxi reductoisomerasa) B. ' subtilis ilvC (ácido 45 46 acetohidroxi reductoisomerasa) E. coli ilvD (ácido acetohidroxi 33 34 deshidratasa) S. cerevisiae ILV3 47 48 (Dihidroxiácido deshidratasa) Lactococcus lactis kivD (ácido 35 36 ceto decarboxilasa de cadena ramificada) , codón optimizado E. coli yqhD (alcohol 37 38 deshidrogenasa de cadena ramificada) Tabla 4 Resumen de números de ident . de sec . de proteínas y genes para elementos de sistema de control general para biosíntesis de aminoácidos * la misma secuencia de aminoácidos está codificada por las sec. con núm. de ident. : 73 y 75 La sec. con núm. de ident. : 76 es la secuencia de nucleótidos del promotor GPD descrito en el Ejemplo 2.

La sec. con núm. de ident. : 77 es la secuencia de nucleótidos del terminador CYCl descrito en el Ejemplo 2.

La sec . con núm. de ident . : 78 es la secuencia de nucleótidos del promotor FBA descrito en el Ejemplo 2.

La sec. con núm. de ident. : 79 es la secuencia de nucleótidos del promotor ADHl descrito en el Ejemplo 2.

La sec. con núm. de ident. : 80 es la secuencia de nucleótidos del terminador ADHl descrito en el Ejemplo 2.

La sec. con núm. de ident. : 81 es la secuencia de nucleótidos del promotor GPM descrito en el Ejemplo 2.

Las sec. con núm. de ident.: 82-137 son las secuencias de nucleótidos de los cebadores de secuenciación, cribado o clonación de oligonucleótidos usados en los ejemplos descritos en la presente .

La sec. con núm. de ident. : 138 es la secuencia de nucleótidos del fragmento de las "repeticiones UKA3".

Las sec. con núm. de ident.: 139 y 140 son las secuencias de nucleótidos de los cebadores de PCR usados para amplificar un fragmento de ADN para la deleción de gcn2.

Las sec. con núm. de ident. : 141 y 142 son las secuencias de nucleótidos de los cebadores de PCR usados para amplificar un fragmento de ADN para la deleción de gcn4.

Las sec. con núm. de ident. : 143 y 144 son secuencias de unión de los cebadores que rodean repeticiones directas que flanquean URA3+ : en el fragmento de "repeticiones URA3" . Las sec. con núm. de ident.: 145 y 146 son secuencias de repeticiones directas que flanquean el promotor y la secuencia codificante en el fragmento de "repeticiones URA3" .

La sec . con núm. de ident . : 147 es la secuencia del promotor en el fragmento de "repeticiones URA3" .

La sec. con núm. de ident.: 148 es la secuencia codificante de URA3 en el fragmento de "repeticiones URA3" .

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La presente invención proporciona un hospedero de levadura recombinante que produce butanol y que comprende una modificación genética que resulta en una respuesta reducida en la respuesta de control general a la privación de aminoácidos. Estas células tienen una mayor tolerancia al butanol comparadas con las células que no poseen la modificación genética. Una cepa de levadura tolerante de la presente invención tiene al menos una modificación genética que causa la respuesta de control general reducida a la privación de aminoácidos. Esta respuesta reducida podría alcanzarse por la mutación de los genes endógenos que influyen en la respuesta. Las células hospederas de la invención podrían producir butanol naturalmente o podrían modificarse para que lo hagan a través de una ruta modificada .

El butanol producido mediante el uso de las presentes cepas podría usarse como una fuente de energía alternativa a los combustibles fósiles. La producción fermentativa de butanol produce menos contaminantes que la síntesis petroquímica típica.

Las siguientes definiciones y abreviaturas se usarán para la interpretación de la especificación y las reivindicaciones.

Como se usa en la presente, los términos "comprende", "que comprende", "incluye", "que incluye", "tiene", "que tiene", "contiene" o "que contiene", o cualquier otra variante de éstos, pretenden abarcar una inclusión no excluyente. Por ejemplo, una composición, una mezcla, un proceso, método, artículo o aparato que comprende una lista de elementos no se limita necesariamente sólo a esos elementos, sino que puede incluir otros que no estén expresamente listados o sean inherentes a tal composición, mezcla, proceso, método, artículo o aparato. Además, a menos que se especifique expresamente lo contrario, la disyunción se relaciona con un "o" incluyente y no con un "o" excluyente. Por ejemplo, una condición A o B se satisface mediante cualquiera de los siguientes criterios: A es verdadero (o actual) y B es falso (o no actual) , A es falso (o no actual) y B es verdadero (o actual) , y tanto A como B son verdaderos (o actuales) .

Asimismo, los artículos indefinidos "un (a)" y "unos (as)" que preceden un elemento o componente de la invención "están previstos para ser no restrictivos con respecto a la cantidad de instancias (es decir, incidencias) del elemento o componente. Por consiguiente, "un (a)" o "unos (as)" deben interpretarse para incluir uno o por lo menos uno, y la forma singular de la palabra del elemento o componente también incluye el plural, a menos que el número obviamente indique que es singular.

El término "invención" o "presente invención", tal como se usa en la presente, es un término no limitante y no se refiere a ninguna modalidad de la invención particular, si no que abarca todas las modalidades posibles tal como se describen en la especificación y en las reivindicaciones.

Tal como se usa en la presente, el término "aproximadamente" usado para modificar la cantidad de un ingrediente o reactivo de la invención empleada se refiere a la variación en la cantidad numérica que puede ocurrir, por ejemplo, por los procedimientos típicos de medición y manejo de líquidos usados para fabricar concentrados o para usar soluciones en el mundo real; por errores involuntarios en estos procedimientos; por diferencias en la fabricación, la fuente o la pureza de los ingredientes empleados para realizar las composiciones o llevar a cabo los métodos; y similares. El término "aproximadamente" también abarca cantidades que difieren debido a diferentes condiciones de equilibrio para una composición resultante de una mezcla inicial. Estén modificadas por el término "aproximadamente" o no, las reivindicaciones incluyen equivalentes de las cantidades. En una modalidad el término "aproximadamente" significa dentro del 10 % del valor numérico declarado, de preferencia, dentro del 5 % del valor numérico informado.

El término "butanol", tal como se usa en la presente, se refiere a 1-butanol, 2 -butanol, isobutanol, o mezclas de éstos.

Los términos "tolerante" y "cepa de levadura tolerante al butanol", cuando se usan para describir una cepa de levadura modificada de la invención, se refieren a una levadura modificada que presenta mejor crecimiento en presencia de butanol que la cepa original de la que se derivó.

El término "ruta biosintética de butanol" se refiere a una ruta enzimática para producir 1-butanol, 2 -butanol o isobutanol .

El término "ruta biosintética de 1-butanol" se refiere a una' ruta enzimática para producir 1-butanol a partir de acetil-coenzima A (acetil-CoA) .

El término "ruta biosintética de 2 -butanol" se refiere a una ruta enzimática para producir 2 -butanol a partir de piruvato.

El término "ruta biosintética de isobutanol" se refiere a una ruta enzimática para producir isobutanol a partir de piruvato .

El término "acetil-CoA acetiltransferasa" se refiere a una enzima que cataliza la conversión de dos moléculas de acetil- CoA a acetoacetil-CoA y coenzima A (CoA) . Las acetil-CoA acetiltransferasas preferidas son las acetil-CoA acetiltransferasas con preferencias de sustrato (reacción hacia adelante) por una acetil-CoA y acil-CoA de cadena corta, y se clasifican como E.C. 2.3.1.9 [Enzyme Nomenclature 1992, Academic Press, San Diego] ; aunque las enzimas con un intervalo de sustrato más amplio (E.C. 2.3.1.16) también serán funcionales. Las acetil-CoA acetiltransferasas se encuentran disponibles de una variedad de fuentes, por ejemplo, Escherichia coli (núm. de GenBank: NP_416728, NC_000913; secuencia de aminoácidos del NCBI (National Center for Biotechnology Information) , secuencia de nucleótidos del NCBI) , Clostridium acetobutylicum (núm. de GenBank: NP_349476.1 (sec. con núm. de ident . : 2), NC_003030; NP_149242 (sec. con núm. de ident. : 4), NC_001988) , Bacillus subtilis (núm. de GenBank: NP_390297, NC_000964) y Saccharomyces cerevisiae (núm. de GenBank: NP_015297, NC_001148 (sec. con núm. de ident.: 39)).

El término "3-hidroxibutiril-CoA deshidrogenasa" se refiere a una enzima que cataliza la conversión de acetoacetil-CoA a 3-hidroxibutiril-CoA. Las 3 -hidroxibutiril-CoA deshidrogenasas podrían ser dependientes de nicotinamida adenina dinucleótido reducido (NADH) , con una preferencia de sustrato por (S) -3-hidroxibutiril-CoA o (R) -3-hidroxibutiril-CoA, y se clasifican como E.C. 1.1.1.35 y E.C. 1.1.1.30, respectivamente. Además, las 3-hidroxibutiril-CoA deshidrogenasas podrían ser dependientes de nicotinamida adenina dinucleótido fosfato (NADPH) , con una preferencia de sustrato por (S) -3 -hidroxibutiril-CoA o (R) -3-hidroxibutiril-CoA, y se clasifican como E.C. 1.1.1.157 y E.C. 1.1.1.36, respectivamente. Las 3-hidroxibutiril-CoA deshidrogenasas se encuentran disponibles de una variedad de fuentes, por ejemplo, C. acetojbutylicum (núm. de GenBank: NP_349314 (sec. con núm. de ident . : 6), NC_003030) , B . subtilis (núm. de GenBank: AAB09614, U29084), Ralstonia eutropha (núm. de GenBank: ZP_0017144, NZ_AADY01000001, Alcaligenes eutrophus (núm. de GenBank: YP_294481, NC_007347) y A. eutrophus (núm. de GenBank: P14697, J04987) .

El término "crotonasa" se refiere a una enzima que cataliza la conversión de 3 -hidroxibutiril -CoA a crotonil-CoA y H20. Las crotonasas podrían tener una preferencia de sustratos por (S) -3 -hidroxibutiril-CoA o (R)-3-hidroxibutiril-CoA y se clasifican como E.C. 4.2.1.17 y E.C. 4.2.1.55, respectivamente. Las crotonasas se encuentran disponibles de una variedad de fuentes, por ejemplo, E. coli (núm. de GenBank: NP_415911 (sec. con núm. de ident.: 8), NC_000913) , C. acetojbutylicum (núm. de GenBank: NP_349318, NC_003030) ,· B . subtilis (núm. de GenBank: CAB13705, Z99113) y Aeromonas caviae (núm. de GenBank: BAA21816, D88825).

El término "butiril-CoA deshidrogenasa", también denominado trans-enoil CoA reductasa, se refiere a una enzima que cataliza la conversión de crotonil-CoA a butiril-CoA. Las 1 butiril-CoA deshidrogenasas podrían ser dependientes de NADH o dependientes de NADPH y se clasifican como E.C. 1.3.1.44 y E.C. 1.3.1.38, respectivamente. Las butiril-CoA deshidrogenasas se encuentran disponibles de una variedad de fuentes, por ejemplo, C. acetojbutylicum (núm. de GenBank: NP_347102 (sec. con núm. de ident . : 10), NC_003030) , Euglena gracilis (núm. de GenBank: Q5EU90, AY741582) , Streptomyces collinus (núm. de GenBank: AAA92890, U37135) y Streptomyces coelicolor (núm. de GenBank: CAA22721, AL939127) .

El término "butiraldehído deshidrogenasa" se refiere a una enzima que cataliza la conversión de butiril-CoA a butiraldehído, usando NADH o NADPH como cofactor. Las butiraldehído deshidrogenasas con una preferencia por NADH se conocen como E.C. 1.2.1.57 y se encuentran disponibles de, por ejemplo, Clostridium beijerinckii (núm. de GenBank: AAD31841 (sec. con núm. de ident.: 12), AF157306) y C. acetobutylicum (núm. de GenBank: NP_149325, NC_001988) .

El término "1-butanol deshidrogenasa" se refiere a una enzima que cataliza la conversión de butiraldehído a 1-butanol . Las 1-butanol deshidrogenasas son un subgrupo de la gran familia de las alcohol deshidrogenasas. La 1-butanol deshidrogenasa podría ser dependiente de NADH o de NADPH. Las 1-butanol deshidrogenasas se encuentran disponibles de, por ejemplo, C. acetoJutylicum (núm. de GenBank: NP_149325, NC 001988; NP 349891 (sec. con núm. de ident.: 14), NC_003030; y NP_349892 (sec. con núm. de ident.: 16), NC_003030) y E. coli (núm. de GenBank : NP_417484, NC_000913) .

El término "acetolactato sintasa", también llamada "ácido acetohidroxi sintasa", se refiere a un polipéptido (o polipéptidos) que tiene una actividad enzimática que cataliza la conversión de dos moléculas de ácido pirúvico a una molécula de alfa-acetolactato . La acetolactato sintasa, conocida como EC 2.2.1.6 [antes 4.1.3.18] (Enzyme Nomenclature 1992, Academic Press, San Diego) podría ser dependiente del cofactor tiamina pirofosfato para su actividad. Las enzimas de acetolactato sintasa adecuadas se encuentran disponibles de una variedad de fuentes, por ejemplo, Bacillus subtilis (núm. de GenBank: AAA22222 secuencia de aminoácidos de NCBI (National Center for Biotechnology Information) (sec. con núm. de ident.: 42), L04470 secuencia de nucleótidos de NCBI (sec. con núm. de ident.: 41)), Klebsiella terrigena (núm. de GenBank: AAA25055, L04507) y Klebsiella pneumoniae (núm. de GenBank: AAA25079 (sec. con núm. de ident.: 20), M73842 (sec. con núm. de ident. : 19) .

El término "acetolactato decarboxilasa" se refiere a un polipéptido (o polipéptidos) que tiene una actividad enzimática que cataliza la conversión de alfa-acetolactato a acetoína. Las acetolactato decarboxilasas se conocen como EC 4.1.1.5 y se encuentran disponibles, por ejemplo, de Bacillus subtilis (núm. de GenBank: AAA22223, L04470) , Klebsiella terrigena (núm. de GenBank: AAA25054, L04507) y Klebsiella pneu oniae (sec. con núm. de ident . : 18 (aminoácido) sec. con núm. de ident.: 17 (nucleótido) ) .

El término "butanodiol deshidrogenasa", también conocida como "acetoína reductasa", se refiere a un polipéptido (o polipéptidos) que tiene una actividad enzimática que cataliza la conversión de acetoína a 2 , 3 -butanodiol . Las butanodiol deshidrogenasas son un subgrupo de la gran familia de alcohol deshidrogenasas. Las enzimas de butanodiol deshidrogenasa podrían tener especificidad para la producción de R- o S-estereoquímica en el producto de alcohol. Las butanodiol deshidrogenasas S-específicas se conocen como EC 1.1.1.76 y se encuentran disponibles, por ejemplo, de Klebsiella pneumoniae (núm. GenBank: BBA13085 (sec. con núm. de ident.: 22), D86412. Las butanodiol deshidrogenasas específicas de R se conocen como EC 1.1.1.4 y se encuentran disponibles, por ejemplo, de Bacillus cereus (núm. de GenBank NP_830481, NC_004722; AAP07682, AE017000) , y Lactococcus lactis (núm. de GenBank ???04995, AE006323) .

El término "butanodiol deshidratasa", también conocida como "diol deshidratasa" o "propanodiol deshidratasa", se refiere a un polipéptido (o polipéptidos) que tiene una actividad enzimática que cataliza la conversión de 2,3-butanodiol a 2-butanona, también conocida como metil etil cetona (MEC) . La butanodiol deshidratasa podría usar el cofactor adenosil cobalamina. Las enzimas dependientes de adenosil-cobalamina se conocen como EC 4.2.1.28 y se encuentran disponibles, por ejemplo, de Klebsiella oxytoca (núm. de GenBank: BAA08099 (subunidad alfa) (sec. con núm. de ident.: 24), BAA08100 (subunidad beta) (sec. con núm. de ident.: 26) y BBA08101 (subunidad gamma) (sec. con núm. de ident.: 28), (note que las tres subunidades son necesarias para la actividad) , D45071) .

El término "2-butanol deshidrogenasa" se refiere a un polipéptido (o polipéptidos) que tiene una actividad enzimática que cataliza la conversión de 2-butanona a 2-butanol. Las 2-butanol deshidrogenasas son un subgrupo de la gran familia de las alcohol deshidrogenasas. La 2-butanol deshidrogenasa podría ser dependiente de NADH o de NADPH. Las enzimas dependientes de NADH se conocen como EC 1.1.1.1 y se encuentran disponibles, por ejemplo, de Rhodococcus ruber (núm. de GenBank: CAD36475 (sec. con núm. de ident.: 30), AJ491307 (sec. con núm. de ident.: 29)) . Las enzimas dependientes de NADPH se conocen como EC 1.1.1.2 y se encuentran disponibles, por ejemplo, de Pyrococcus furiosus (núm. de GenBank: AAC25556, AF013169) .

El término "ácido acetohidroxi isomeroreductasa" o "ácido acetohidroxi reductoisomerasa" se refiere a una enzima que cataliza la conversión de acetolactato a 2,3-dihidroxiisovalerato usando NADPH (nicotinamida adenina dinucleótido fosfato reducido) como dador de electrones. Las ácido acetohidroxi isomeroreductasas preferidas se conocen con el número EC 1.1.1.86 y las secuencias se encuentran disponibles de una gran variedad de microorganismos que incluyen, pero no se limitan a, Escherichia coli (núm. de GenBank: NP_418222 (sec. con núm. de ident.: 32), NC_000913 (sec. con núm. de ident.: 31)), Saccharomyces cerevisiae (núm. de GenBank: NP_013459 (sec. con núm. de ident.: 44), NC_001144 (sec. con núm. de ident.: 43)), Methanococcus maripaludis (núm. de GenBank: CAF30210, BX957220) y Bacillus subtilis (núm. de GenBank: CAB14789 (sec. con núm. de ident.: 46), Z99118 (sec. con núm. de ident.: 45)).

El término "ácido acetohidroxi deshidratasa" o "ácido dihidroxi deshidratasa" se refiere a una enzima que cataliza la conversión de 2 , 3 -dihidroxiisovalerato a -cetoisovalerato . Las ácido acetohidroxi deshidratasas preferidas se conocen por el número EC 4.2.1.9. Estas enzimas se encuentran disponibles de una gran variedad de microorganismos que incluyen, pero no se limitan a, E. coli (núm. de GenBank: YP_026248 (sec. con núm. de ident. : 34) , NC_000913 (sec. con núm. de ident. : 33) ) , S. cerevisiae (núm. de GenBank: NP_012550 (sec. con núm. de ident.: 48), NC_001142 (sec. con núm. de ident.: 47)), M. maripaludis (núm. de GenBank: CAF29874, BX957219) y B. subtilis (núm. de GenBank: CABÍ4105, Z99115) .

El término "ácido a-ceto decarboxilasa de cadena ramificada" se refiere a una enzima que cataliza la conversión de a-cetoisovalerato a isobutiraldehído y C02. Las ácido a-ceto decarboxilasas de cadena ramificada preferidas se conocen por el número EC 4.1.1.72 y se encuentran disponibles de una variedad de fuentes que incluyen, pero no se limitan a, Lactococcus lactis (núm. de GenBank: AAS49166, AY548760; CAG34226 (sec. con núm. de ident . : 36), AJ746364, Salmonella typhimurium (núm. de GenBank: NP_461346, NC_003197) y Clostridium acetobutylicum (núm. de GenBank: NP_149189, NC_001988) .

El término "alcohol deshidrogenasa de cadena ramificada" se refiere a una enzima que cataliza la conversión de isobutiraldehído a isobutanol . Las alcohol deshidrogenasas de cadena ramificada preferidas se conocen por el número EC 1.1.1.265, pero también podrían clasificarse bajo otras alcohol deshidrogenasas (específicamente, EC 1.1.1.1 ó 1.1.1.2). Estas enzimas usan NADH (nicotinamida adenina dinucleótido reducido) y/o NADPH como dador de electrones, y se encuentran disponibles de una variedad de fuentes que incluyen, pero no se limitan a, S. cerevisiae (núm. de GenBank: NP_010656, NC_001136; NP_014051, NC_001145) , E. coli (núm. de GenBank: NP_417484 (sec. con núm. de ident.: 38), NC_000913 (sec. con núm. de ident.: 37)), y C. acetobutylicum (núm. de GenBank: NP_349892, NC_003030).

El término "gen" se refiere a un fragmento de ácido nucleico que es capaz de expresarse como una proteína específica que, opcionalmente, incluye las secuencias regulatorias precedentes (secuencias no codificantes 5') y posteriores (secuencias no codificantes 3') a la secuencia codificante. "Gen nativo" se refiere a un gen tal como se encuentra en la naturaleza con sus propias secuencias regulatorias.' "Gen quimérico" se refiere a cualquier gen que no sea nativo, que comprende secuencias regulatorias y codificantes que no se encuentran juntas en la naturaleza. De conformidad, un gen quimérico podría comprender secuencias regulatorias y secuencias codificantes que derivan de distintas fuentes, o secuencias regulatorias y secuencias codificantes que derivan de la misma fuente, pero organizadas de una manera distinta a la que se encuentra en la naturaleza. "Gen endógeno" se refiere a un gen nativo en su ubicación natural en el genoma de un organismo. Un gen "extraño" se refiere a un gen que normalmente no se encuentra en el organismo hospedero, pero que se introduce en el organismo hospedero por medio de transferencia de genes. Los genes extraños pueden comprender genes nativos insertados en un organismo no nativo o genes quiméricos. Un "transgen" es un gen que ha sido introducido en el genoma por medio de un procedimiento de transformación.

Tal como se usa en la presente, el término "secuencia codificante" se refiere a una secuencia de ADN que codifica una secuencia de aminoácidos específica. "Secuencias regulatorias adecuadas" se refiere a secuencias de nucleótidos ubicadas corriente arriba (secuencias no codificantes 5'), dentro o corriente abajo (secuencias no codificantes 3') de una secuencia codificante y que influyen en la transcripción, el procesamiento o la estabilidad del ARN o la traducción de la secuencia codificante asociada. Las secuencias regulatorias podrían incluir promotores, secuencias líderes de traducción, intrones, secuencias de reconocimiento de poliadenilación, sitio de procesamiento de ARN, sitio de unión de efectores y estructura tallo-lazo.

El término "promotor" se refiere a una secuencia de ADN capaz de controlar la expresión de una secuencia codificante o ARN funcional. En general, una secuencia codificante se ubica 3' a una secuencia de promotor. Los promotores pueden derivarse en su totalidad de un gen nativo o pueden estar compuestos por elementos diferentes derivados de promotores distintos que se encuentran en la naturaleza, o aun, pueden comprender segmentos de ADN sintético. Las personas con experiencia en la técnica entienden que distintos promotores podrían dirigir la expresión de un gen en tejidos o tipos de células diferentes, o en distintas etapas del desarrollo, o en respuesta a condiciones ambientales o fisiológicas diferentes. Los promotores que hacen que un gen se exprese en la mayoría de los tipos de células la mayoría de las veces comúnmente se denominan "promotores constitutivos". También se reconoce que dado que en la mayoría de los casos no se han definido completamente los límites exactos de las secuencias regulatorias , fragmentos de ADN de longitudes diferentes podrían tener la misma actividad de promotores.

El término "operativamente unido"" se refiere a la asociación de secuencias de ácido nucleico en un solo fragmento de ácido nucleico de manera que la función de una afecta a la otra. Por ejemplo, un promotor está operativamente unido a una secuencia codificante cuando es capaz de afectar la expresión de esa secuencia codificante (es decir, la secuencia codificante está bajo el control transcripcional del promotor) . Las secuencias codificantes pueden estar operativamente unidas a secuencias regulatorias en una orientación con sentido o antisentido.

El término "expresión", tal como se usa en la presente, se refiere a la transcripción y la acumulación estable de ARN antisentido o (ARNm) con sentido derivados del fragmento de ácido nucleico de la invención. Expresión también podría referirse a la traducción de ARNm en un polipéptido.

Tal como se usa en la presente, el término "transformación" se refiere a la transferencia de un fragmento de ácido nucleico a un organismo hospedero que produce una herencia genéticamente estable. Los organismos hospederos que contienen los fragmentos de ácido nucleico transformados se denominan organismos "transgénicos" o "recombinantes" o "transformados".

Los términos "plásmido" y "vector" se refieren a un elemento extracromosómico que muchas veces porta genes que no son parte del metabolismo central de la célula y que habitualmente está en la forma de fragmentos de ADN bicatenario circular. Dichos elementos pueden ser secuencias de replicación autónoma, secuencias que integran genomas, secuencias de fagos o nucleótidos, lineales o circulares, de un ADN o ARN mono o bicatenario, derivado de cualquier fuente, en la cual un número de secuencias de nucleótidos se ha unido o recombinado en una construcción única capaz de introducir un fragmento de un promotor y una secuencia de ADN para un producto seleccionado de un gen junto con la secuencia 3' no traducida apropiada en una célula. "Vector de transformación" se refiere a un vector específico que contiene un gen extraño y que tiene elementos, además del gen extraño, que facilitan la transformación de una célula hospedera específica.

Tal como se usa en la presente, el término "degeneración de codón" se refiere a la naturaleza del código genético que permite la variación de la secuencia de nucleótidos sin afectar la secuencia de aminoácidos de un polipéptido codificado. El técnico con experiencia es consciente de la "preferencia codónica" que exhibe una célula hospedera específica en el uso de codones de nucleótidos para especificar un aminoácido dado. Por ello, cuando se sintetiza un gen para mejorar su expresión en una célula hospedera, es deseable diseñar el gen de manera 2 que la frecuencia de uso de codones se aproxime a la frecuencia del uso preferido de codones de la célula hospedera.

El término "codón modificado", cuando se refiere a genes o a regiones codificantes de moléculas de ácido nucleico para la transformación de distintos hospederos, se refiere a la alteración de codones en el gen o en las regiones codificantes de las moléculas de ácido nucleico para reflejar el uso típico de codones del organismo hospedero sin alterar el polipéptido codificado por el ADN.

Un "sustrato de carbono" significa un compuesto que contiene carbono útil como fuente de energía de una levadura y podría incluir, pero no se limita a, monosacáridos tales como glucosa y fructosa, oligosacáridos tales como lactosa o sacarosa, polisacáridos tales como almidón o celulosa, o mezclas de éstos y mezclas no purificadas de materias primas renovables, tales como permeado de suero de queso, licor de maceración del maíz, melaza de remolacha azucarera y malta de cebada.

Una "célula que tiene una respuesta reducida en la respuesta de control general a la privación de aminoácidos" se refiere en la presente descripción a una célula que no siente el ARNt descargado como una señal para la inducción de la transcripción de genes biosintéticos de aminoácidos y/o que no responde a la privación de aminoácidos induciendo la transcripción de genes biosintéticos de aminoácidos (Hinnebusch (2005) ???. Rev. Microbiol . 59:407-450).

Tal como se usa en la presente descripción, los términos "fragmento de ácido nucleico aislado" y "molécula de ácido nucleico aislada" se usarán indistintamente y significarán un polímero de ARN o ADN que es mono o bicatenario que contiene, opcionalmente , bases de nucleótidos alterados, no naturales o sintéticos. Un fragmento de ácido nucleico aislado en la forma de un polímero de ADN podría comprender uno o más segmentos de ADNc, ADN genómico o ADN sintético.

Un fragmento de ácido nucleico es "hibridizable" a otro fragmento de ácido nucleico, tal como un ADNc, ADN genómico o una molécula de ARN, cuando una forma monocatenaria del fragmento de ácido nucleico puede aparearse con el otro fragmento de ácido nucleico bajo las condiciones adecuadas de temperatura y resistencia iónica de la solución. Las condiciones de hibridación y lavado son conocidas y se ilustran en Sambrook, J. , Fritsch, E. F. y Maniatis, T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2.° ed. , Cold Spring Harbor Laboratory: Cold Spring Harbor, NY (1989), particularmente el Capítulo 11 y la Tabla 11.1 (incorporado en su totalidad a modo de referencia) . Las condiciones de temperatura y resistencia iónica determinan el "rigor" de la hibridación. Las condiciones rigurosas se pueden ajustar para identificar fragmentos moderadamente similares (tales como secuencias homologas a partir de organismos poco relacionados) , con fragmentos altamente similares (tales como los genes que duplican enzimas funcionales de organismos estrechamente relacionados) . Los lavados posteriores a la hibridación determinan condiciones rigurosas. Un grupo de condiciones preferidas usa una serie de lavados que comienza con 6X SSC, 0.5 % SDS a temperatura ambiente durante 15 minutos, después se repite con 2X SSC, 0.5 % SDS a 45 °C durante 30 minutos, y después se repite dos veces con 0.2X SSC, 0.5 % SDS a 50 °C durante 30 minutos. Un grupo más preferido de condiciones rigurosas usa temperaturas más elevadas en las que los lavados son idénticos a los anteriores excepto que la temperatura de los dos lavados finales de 30 minutos en 0.2X SSC, 0.5 % SDS se aumentó a 60 °C. Otro grupo preferido de condiciones muy rigurosas usa dos lavados finales en 0. IX SSC, 0.1 % SDS a 65 °C. Un grupo adicional de condiciones rigurosas incluye hibridación a 0. IX SSC, 0.1 % SDS, 65 °C y lavados con 2X SSC, 0.1 % SDS seguidos por 0. IX SSC, 0.1 % SDS, por ejemplo.

La hibridación requiere que los dos ácidos nucleicos contengan secuencias complementarias, aunque dependiendo de la rigurosidad de la hibridación, es posible que ocurran malapareamientos entre las bases. La rigurosidad adecuada para la hibridación de ácidos nucleicos depende de la longitud de los ácidos nucleicos y del grado de complementación, variables muy conocidas en la técnica.

Cuanto mayor es el grado de similitud o homología entre dos secuencias de nucleótidos, mayor es el valor de Tm para los híbridos de ácidos nucleicos que tienen esas secuencias. La estabilidad relativa (que corresponde a Tm más elevadas) de las hibridaciones de ácidos nucleicos disminuye en el siguiente orden: ARN-.ARN, AD :ARN, ADNrAR . Para los híbridos de más de 100 nucleótidos de longitud, se derivaron ecuaciones para calcular la Tm (véase Sambrook et al . , arriba, 9.50-9.51). Para hibridaciones con ácidos nucleicos más cortos, es decir, oligonucleótidos , la posición de los malapareamientos se vuelve más importante y la longitud del oligonucleótido determina su especificidad (véase Sambrook et al., arriba, 11.7-11.8) . En una modalidad la longitud para un ácido nucleico hibridizable es al menos 10 nucleótidos. De preferencia, una longitud mínima para un ácido nucleico hibridizable es al menos 15 nucleótidos; con más preferencia, al menos aproximadamente 20 nucleótidos; y con la máxima preferencia, la longitud es al menos aproximadamente 30 nucleótidos. Además, el técnico con experiencia reconocerá que la temperatura y la concentración de sal de la solución de lavado podría ajustarse según sea necesario de conformidad con factores tales como longitud de la sonda.

El término "complementario" se usa para describir la relación entre bases de nucleótidos capaces de hibridarse entre sí. Por ejemplo, con respecto al ADN, la adenosina es complementaria a la timina y la citosina es complementaria a la guanina.

El término "porcentaje de identidad", como se conoce en la técnica, es una relación entre dos o más secuencias de polipéptidos o dos o más secuencias de polinucleótidos , que se determina comparando las secuencias. En la técnica, "identidad" también significa el grado de relación de secuencias entre secuencias de polipéptidos o polinucleótidos, según corresponda, determinado por el apareamiento entre las cadenas de esas secuencias. La "identidad" y la "similitud" se pueden calcular fácilmente mediante métodos conocidos que incluyen, pero no se limitan a, aquellos descritos en: 1.) Computational Molecular Biology (Lesk, A. M. , Ed. ) Oxford University: NY (1988); 2.) Biocomputing : Informatics and Genome Projects (Smith, D. W., Ed.) Academic : NY (1993); 3.) Computer Analysis of Sequence Data, Parte I (Griffin, A. M. , and Griffin, H. G. , Eds . ) Humania: NJ (1994); 4.) Sequence Analysis in Molecular Biology (von Heinje, G. , Ed.) Academic (1987); y 5.) Sequence Analysis Primer (Gribskov, M. y Devereux, J. , Eds.) Stockton: NY (1991).

Los métodos preferidos para determinar la identidad se diseñan para que brinden el mejor apareamiento entre las secuencias probadas. Los métodos para determinar la identidad y la similitud se codifican en programas de computadora disponibles al público. Los alineamientos de secuencias y los cálculos de porcentaje de identidad podrían realizarse mediante el uso del programa MegAlign™ del paquete integrado para bioinformática LASERGENE (DNSTAR Inc., Madison, WI) . El alineamiento múltiple de las secuencias se realiza mediante el uso del "Método de alineamiento Clustal", que comprende distintas variedades del algoritmo que incluye el "Método de alineamiento Clustal V" que corresponde al método de alineamiento denominado Clustal V (descrito por Higgins y Sharp, CABIOS. 5:151-153 (1989); Higgins, D.G. et al . , ' Comput . Appl. Biosci . , 8:189-191 (1992)) e incluido en el programa MegAlign™ del paquete de computación integrado para bioinformática LASERGENE (DNASTAR Inc.). Para alineamientos múltiples, los valores predeterminados corresponden a PENALIZACIÓN POR INTERRUPCIÓN10 y PENALIZACIÓN POR LONGITUD DE INTERRUPCIÓN=10. Los parámetros predeterminados para los alineamientos en pares y para el cálculo del porcentaje de identidad de secuencias de proteínas con el método Clustal son KTUPLE=1, PENALIZACIÓN POR INTERRUPCIÓN3 , VENTANA=5 y DIAGONALES GUARDADAS=5. Para ácidos nucleicos, estos parámetros son KTUPLE=2, PENALIZACIÓN POR INTERRUPCIÓN=5 , VENTANA=4 y DIAGONALES GUARDADAS=4. Después del alineamiento de las secuencias con el programa Clustal V es posible obtener un "porcentaje de identidad" al observar la tabla de "distancias de secuencias" en el mismo programa. Además, el "Método de alineamiento Clustal " se encuentra disponible y corresponde al método de alineamiento denominado Clustal (descrito por Higgins y Sharp, CABIOS. 5:151-153 (1989); Higgins, D.G. et al., Comput . Appl . Biosci . 8:189-191(1992)) e incluido en el programa MegAlign™ v6.1 del paquete de computación integrado para bioinformática LASERGENE (DNASTAR Inc.). Parámetros predeterminados para alineamientos múltiples (PENALIZACIÓN POR INTERRUPCIÓN10 , PENALIZACIÓN POR LONGITUD DE INTERRUPCIÓN0.2, Retraso de las sec . diverg . (%) =30 , Peso de transición de ADN=0.5, Matriz de peso de proteínas=Serie Gonnet, Matriz de peso de ADN=IUB) . Después del alineamiento de las secuencias mediante el uso del programa Clustal , es posible obtener un "porcentaje de identidad" al observar la tabla de "distancias de secuencias" en el mismo programa.

Una persona con experiencia en la técnica comprende que para identificar polipéptidos a partir de otras especies, en donde dichos polipéptidos tienen la misma función o actividad o similar, son útiles varios niveles de identidad de secuencia. Los ejemplos útiles de porcentajes de identidades incluyen, pero no se limitan a, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, ó 95 %, o podría ser útil para describir la presente invención cualquier porcentaje entero de 70 % a 100 %, tal como 70 %, 71 %, 72 %, 73 %, 74 % , 75 %, 76 "o , 77 %, 78 %, 79 %, 80 %, 81 %, 82 o / 83 %, 84 % , 85 % , 86 %, 87 % , 88 % , 89 % , 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 % , 95 %, 96 0, "o , 97 %, 98 % ó 99 %. Los fragmentos de ácido nucleico adecuados codifican polipéptidos con las identidades mencionadas anteriormente y, típicamente, codifican un polipéptido que tiene al menos aproximadamente 250 aminoácidos, de preferencia, al menos 300 aminoácidos y, con la máxima preferencia, al menos aproximadamente 348 aminoácidos.

El término "programa de análisis de secuencias" se refiere a cualquier programa o algoritmo de computadora que resulta útil para el análisis de secuencias de aminoácidos o nucleótidos. Los "programas de análisis de secuencias" podrían estar disponibles comercialmente o desarrollarse independientemente. Un programa de análisis de secuencias típico incluirá, pero no se limita a: 1.) el paquete integrado de programas GCG ( isconsin Package Versión 9.0, Genetics Computer Group (GCG), Madison, WI) ; 2.) BLASTP, BLASTN, BLASTX (Altschul et al., J. Mol. Biol . , 215:403-410 (1990)); 3.) DNASTAR (DNASTAR, Inc. Madison, WI); 4.) Sequencher (Gene Codes Corporation, Ann Arbor, MI); y 5.) el programa FASTA que incorpora el algoritmo Smith-Waterman (W. R. Pearson, Comput. Methods Genome Res., [Proc. Int. Symp . ] (1994), fecha de reunión 1992, 111-20. Editor(es): Suhai, Sandor. Recinto: Nueva York, NY) . Dentro del contexto de esta aplicación se entenderá que cuando el análisis se realiza con el programa de análisis de secuencias, los resultados del análisis estarán basados en los "valores predeterminados" del programa de la referencia, a menos que se especifique de cualquier otra forma. Como se usa en la presente descripción, "valores predeterminados" se refiere a cualquier conjunto de valores o parámetros que se carga originalmente con el programa la primera vez que se inicia.

Una "porción sustancial" de una secuencia de nucleótidos o aminoácidos es aquella porción que comprende suficiente de la secuencia de aminoácidos de un polipéptido o de la secuencia de nucleótidos de un gen para identificar potencialmente ese polipéptido o gen, tanto por la evaluación manual de la secuencia por parte de una persona con experiencia en la técnica o por comparación de secuencias automatizada por computadora e identificación mediante el uso de algoritmos tales como BLAST (Altschul, S. F. , et al., J. Mol. Biol . , 215:403-410 (1993)). Generalmente, es necesaria una secuencia de diez aminoácidos contiguos o más o treinta nucleótidos o más a fin de identificar potencialmente una secuencia de ácido nucleico o polipéptidos como homologa a una proteína o un gen conocido. Además, con respecto a secuencias de nucleótidos, sondas de oligonucleótidos específicas de genes que comprenden 20-30 nucleótidos contiguos podrían usarse en métodos de identificación de genes dependientes de las secuencias (por ejemplo, . hibridación Southern) y de aislamiento (por ejemplo, hibridación in situ de colonias bacterianas o placas bacteriófagas) . Además, podrían usarse oligonucleótidos cortos de 12-15 bases como cebadores de amplificación en PCR a fin de obtener un fragmento de ácido nucleico particular que comprende los cebadores. De conformidad, una "porción sustancial" de una secuencia de nucleótidos comprende suficiente de la secuencia, para aislar y/o identificar específicamente un fragmento de ácido nucleico que comprende la secuencia. La especificación de la presente invención enseña la secuencia completa de nucleótidos y aminoácidos que codifica proteínas alcohol deshidrogenasa particulares. El técnico con experiencia, con el beneficio de las secuencias como se reportan en la presente, ahora puede usar todas o una porción sustancial de las secuencias descritas para propósitos conocidos para aquellos expertos en la técnica. Por lo tanto, la presente invención comprende las secuencias completas como se reportan en el listado de secuencias anexo, así como las porciones sustanciales de aquellas secuencias tal como se definieron anteriormente.

La invención abarca más que las secuencias ilustrativas específicas porque se conoce en la técnica que las alteraciones en una secuencia de aminoácidos o en una región codificante, en donde un aminoácido químicamente equivalente se sustituye en un sitio dado, que no afecta las propiedades funcionales de la proteína codificada, son comunes. Para los propósitos de la presente invención, las sustituciones se definen como intercambios dentro de uno de los siguientes cinco grupos: 1. Pequeños residuos alifáticos no polares o ligeramente polares: Ala, Ser, Thr (Pro, Gly) ; 2. Residuos polares cargados negativamente y sus amidas: Asp, Asn, Glu, Gln; 3 Residuos polares cargados positivamente: His, Arg, Lys ; 4 Residuos alifáticos grandes no polares: Met, Leu, lie, Val (Cys) ; y 5. Residuos aromáticos grandes: Phe, Tyr, Trp .

Por tanto, un codón para el aminoácido alanina, un aminoácido hidrófobo, podría sustituirse por un codón que codifica otro residuo menos hidrófobo (tal como glicina) o un residuo más hidrófobo (tal como valina, leucina o isoleucina) . De modo similar, también se puede esperar que los cambios que resultan en la sustitución de un residuo cargado negativamente por otro (tal como ácido aspártico por ácido glutámico) o de un residuo cargado positivamente por otro (tal como lisina por arginina) produzcan un producto funcionalmente equivalente. En muchos casos, no se espera que los cambios de nucleótidos que resultan en la alteración de las porciones N-terminal y C-terminal de la molécula de la proteína alteren la actividad de la proteína. Por tanto, la presente invención abarca las regiones codificantes con las variaciones de codones descritas y las proteínas con las variaciones de aminoácidos descritas.

Las técnicas estándar de clonación molecular y de ADN recombinante usadas aquí son muy conocidas en la técnica y se describen en Sambrook, J. , Fritsch, E. F. y Maniatis, T.

Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2.° ed. ; Cold Spring Harbor Laboratory: Cold Spring Harbor, Nueva York, 1989 (en adelante, "Maniatis") ; y en Silhavy, T. J. , Bennan, M. L. y Enquist, L. . Experimente with Gene Fusions; Cold Spring Harbor Laboratory: Cold Spring Harbor, Nueva York, 1984; y en Ausubel, F. M. et al., Current Protocole in Molecular Biology, publicado por Greene Publishing y Wiley-Interscience, 1987. Los métodos adicionales usados aquí se encuentran en Methods in Enzymology, Volumen 194, Guide to Yeast Genetics and Molecular and Cell Biology (Parte A, 2004, Christine Guthrie y Gerald R. Fink (Eds.), Elsevier Academic Press, San Diego, CA) .

Genes destino de respuesta de control general para desarrollar tolerancia al butanol en levaduras La invención se relaciona con el descubrimiento que indica que la reducción de la expresión de un gen involucrado en la respuesta de control general a la privación de aminoácidos en Saccharomyces cerevisiae resulta en una mayor tolerancia de las células al butanol . La respuesta de control general a la privación de aminoácidos en levadura es un sistema complejo que siente la presencia de ARNt descargados y responde por medio de inducir la transcripción de los genes biosintéticos de aminoácidos. Este sistema de control (revisado en Hinebusch (2005) Ann. Rev. Microbiol . 59: 407-450) incluye genes que cuando se silencian confieren sensibilidad a una amplia variedad de análogos y antagonistas de aminoácidos; estos genes se denominaron de control general no depresibles o GCN, para el fenotipo mutante de no responder a la privación. de aminoácidos.

Por ejemplo, GCN2 codifica una proteína (Gcn2p) que • siente el ARNt descargado y se une a ribosomas mediante un dominio Gcn2p, el dominio corboxi -terminal . Al ARNt descargado lo siente un segundo dominio terminal de Gcn2p denominado HisRS (por similitud a histidil -ARNt sintetasa) . Esta unión de ARNt descargado al dominio HRS resulta en otro deminio Gcn2p (PK) fosforilando el factor de iniciación eucariota 2 que está asociado con GDP (eIF2~GDP) produciendo eIF2-P~GDP. A su vez, el eIF2-P~GDP estimula la traducción del ARNm codificado por GCN4 y la Gcn4p (la proteína codificada por GCN4) activa la expresión de muchos genes involucrados en la biosíntesis de aminoácidos.

La iniciación de la traducción requiere una forma activada de un factor de iniciación, eIF2 : eIF2~GTP. Esta forma activada presenta el ARNt iniciador, fmet-ARNt, al ribosoma. El eIF2- fmet-ARNt~GTP normalmente inicia la traducción mediante la unión a ribosomas en donde, finalmente, se libera el eIF2~GDP. Esta forma del factor de iniciación es inactiva y debe activarse mediante el intercambio de GTP por GDP produciendo eIF2-GTP. Cuando se activa la quinasa de Gcn2p, el eIF2~GDP se secuestra produciendo eIF2~P. Esta forma, eIF2~P, no permite que el factor de intercambio de guanina eIF2B catalice la reacción: eIF2~GDP +GTP ->eIF2~GTP +GDP. Por tanto, la mayoría de las iniciaciones traduccionales se retrasan mientras que la traducción de Gcn4p, el activador transcripcional de genes biosintéticos de aminoácidos, aumenta.

Las proteínas adicionales codificadas por el gen GCN involucradas en la respuesta de control general al sistema de privación de aminoácidos en Saccharomyces cerevisiae incluyen: Gcnlp : un activador de la actividad de la quinasa Gcn2p Gcn3p: subunidad alfa del factor de iniciación de traducción eIF2B, un activador de la expresión de GCN4 Gcn5p: histona acetiltransferasa, acetila lisinas N- terminales en histonas H2B y H3 ; subunidad catalítica de los complejos histona acetiltransferasa ADA y SAGA Gcn6p: activador de la transcripción de GCN4 Gcn7p: activador de la transcripción de GCN4 Gcn8p: rol indefinido Gcn9 : rol indefinido Gcn20p: activador de la actividad de la quinasa Gcn2p, forma un complejo con Gcnlp En la Tabla 4 se indican los núm. de ident . de sec. para las proteínas Gcnl-5p y Gcn20p de Saccharomyces cerevisiae y sus regiones codificantes. En la Tabla 4 también se indican las regiones codificantes representativas para los genes GCN de Yarrowia lipolytica y Candida albicans.

Una mutación que reduce o elimina la expresión de una proteína involucrada en la respuesta de control general a la 3 privación de aminoácidos en levadura reducirá la respuesta y producirá, sorpresivamente, un aumento en la tolerancia al butanol . Por tanto, el hospedero de la presente levadura tiene una modificación genética que reduce la actividad de al menos un proteína involucrada en la respuesta de control general a la privación de aminoácidos. Los genes adecuados para la modificación genética para reducir la respuesta de control general a la privación de aminoácidos incluyen genes que codifican Gcnlp, Gcn2p, Gcn3p, Gcn4p, Gcn5p, Gcn6p, Gcn7p, Gcn8p, Gcn9p y Gcn20p. Los ejemplos de estas proteínas se indican en la Tabla 4 como secs. con núms . de ident. : 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72 y 74. Los genes que codifican proteínas con identidades de secuencias de al menos aproximadamente 80 %, 85 %, 90 %, 95 % o más para estas proteínas y que tienen actividad GCN podrían ser destino de modificación genética para reducir la respuesta de control general a la privación de aminoácidos . Los genes que codifican Gcnlp, Gcn2p, Gcn3p, Gcn4p, Gcn5p y Gcn20p son destinos más adecuados. Los genes que codifican Gcn2p and Gcn4p son los destinos más adecuados.

Cualquier gen de levadura identificado como codificador de una proteína Gcnlp, Gcn2p, Gcn3p, Gcn4p, Gcn5p, Gcn6p, Gcn7p, Gcn8p, Gcn9p o Gcn20p, u otro gen que codifique una proteína involucrada en la respuesta de control general a la privación de aminoácidos es un gen destino para la modificación en la cepa de levadura correspondiente, a fin de crear una cepa de la presente invención con mayor tolerancia al butanol. Cualquier tipo de levadura que contenga un sistema GCN podría desarrollarse para la tolerancia al butanol mediante el uso del método de la presente invención. Los géneros de levadura que incluyen Saccharomyces, Yarrowia, Candida y Hansenula tienen sistemas GCN (Bode et al. (199) J. Basic. Microbiol . 30(1) :31-5) y los ejemplos de genes GCN de Saccharomyces cerevisiae, Yarrowia lipolytica, y Candida albicans que son destino de modificación para proporcionar tolerancia se indican en la Tabla 4. Los ejemplos de proteínas codificadas por GCN de Saccharomyces cerevisiae incluyen las sec . con núm. de ident . : 50, 52, 54, 56, 58 y 60. Los ejemplos de las proteínas codificadas por GCN de Yarrowia lipolytica incluyen las sec. con núm. de ident.: 62, 64, 66 y 68. Los. ejemplos de proteínas codificadas por GCN de Candida albicans incluyen las sec. con núm. de ident.: 70, 72 y 74. Además, se han encontrado homólogos de GCN2 y GCN4 en el moho Neurospora crassa (Paluh et al. (1988) Proc. Nati. Acad. Sci . US A 85(11) :3728-3732) .

Otros genes destino del sistema GCN podrían identificarse en la literatura y en las bases de datos bioinformáticas conocidas por las personas con experiencia en la técnica. Además, las secuencias descritas en la presente o aquellas mencionadas en la técnica podrían usarse para identificar otras de naturaleza homologa. Por ejemplo, cada uno de los fragmentos de ácido nucleico de GCN descritos en la presente podrían usarse para aislar genes que codifican proteínas homologas de la misma levadura o de otras . En la técnica se conoce el aislamiento de genes homólogos por medio de protocolos que dependen de la secuencia. Los ejemplos de protocolos que dependen de la secuencia incluyen, pero no se limitan a, 1.) métodos de hibridación de ácido nucleico; 2.) métodos de amplificación de ADN y ARN, como ilustran los diferentes usos de tecnologías de amplificación de ácido nucleico [por ejemplo, reacción en cadena de la polimerasa (PCR) , Mullís et al., patente de los Estados Unidos núm. 4,683,202; reacción en cadena de la ligasa (LCR) , Tabor, S. et al., Proc. Acad. Sci . Estados Unidos 82:1074 (1985); o amplificación de desplazamiento de cadena (SDA) , alker, et al., Proc. Nati. Acad. Sci. Estados Unidos., 89:392 (1992)]; y 3.) métodos de construcción y cribado de genotecas por complementación.

Por ejemplo, los genes que codifican polipéptidos o proteínas similares a los genes GCN descritos en la presente podrían aislarse directamente mediante el uso de todos o una porción de los fragmentos de ácido nucleico de la presente "como sondas de hibridación de ADN para cribar genotecas de cualquier levadura deseada, usando metodologías muy conocidas para las personas con experiencia en la técnica. Las sondas de oligonucleótidos específicas basadas en las secuencias de ácido nucleico expuestas pueden diseñarse y sintetizarse mediante métodos conocidos en la técnica (Maniatis, arriba). Además, las secuencias completas se pueden usar directamente para sintetizar sondas de ADN mediante métodos conocidos para las personas con experiencia en la técnica (por ejemplo, técnicas de marcado de ADN cebadores al azar, traducción de mellas o marcado de extremos) , o sondas de ARN con sistemas de traducción in vitro disponibles. Además, se pueden diseñar y usar cebadores específicos para amplificar una parte (o la longitud completa de) las secuencias de la presente invención. Los productos resultantes de la amplificación se pueden marcar directamente durante las reacciones de amplificación o después de las reacciones de amplificación, y se pueden usar como sondas para aislar fragmentos de ADNc de longitud completa en las condiciones de rigor apropiadas. También se pueden identificar genes heterólogos mediante el uso de selecciones funcionales como las ilustradas por la selección de complementación para función GCN descrita en Paluh et al. (ibid.) .

Típicamente, en las técnicas de amplificación tipo PCR, los cebadores tienen distintas secuencias y no son complementarios entre sí. Dependiendo de las condiciones de prueba deseadas, la secuencias de los cebadores deberán diseñarse para proporcionar una replicación fiel y eficaz del ácido nucleico destino. Los métodos de diseño de cebadores de PCR son comunes y muy conocidos en la técnica (Thein y Wallace, "The use of oligonucleotides as specific hybridization probes in the Diagnosis of Genetic Disorders", en Human Genetic Diseases: A Practical Approach, K. E. Davis Ed., (1986) págs. 33-50, IRL: Herndon, VA; y Rychlik, W., en Methods in Molecular Biology, White, B. A. Ed. , (1993) Vol . 15, págs. 31-39, PCR Protocols: Current Methods and Applications. Humania: Totowa, NJ) .

Generalmente, dos segmentos cortos de las secuencias descritas podrían usarse en protocolos de la reacción en cadena de la polimerasa para amplificar fragmentos de ácido nucleico más largos que codifican genes homólogos de ADN o AR . La reacción en cadena de la polimerasa también se puede realizar en una genoteca de fragmentos de ácido nucleico clonados, en donde la secuencia de un cebador se deriva de los fragmentos de ácido nucleico descritos y la secuencia del otro cebador aprovecha la presencia de las cadenas de ácido poliadenílico al extremo 3' del precursor de ARNm que codifica genes microbianos.

Alternativamente, la secuencia del segundo cebador se puede basar en secuencias derivadas del vector de clonación. Por ejemplo, la persona con experiencia en la técnica puede seguir el protocolo.—RACE (Frohman et al., PNAS USA 85:8998 (1988)) para generar ADNc mediante el uso de PCR para amplificar copias de la región entre un único punto del transcrito y los extremos 3 ' ó 51. Los cebadores orientados en las direcciones de los extremos 3' y 5' se pueden diseñar a partir de las secuencias de la presente invención. Mediante el uso de sistemas 3' RACE o 5' RACE (por ejemplo, BRL, Gaithersburg , MD) , pueden aislarse fragmentos de ADNc 3' o 5' específicos (Ohara et al., PNAS USA 86:5673 (1989); Loh et al., Science 243:217 (1989)).

Alternativamente, las secuencias de GCN descritas podrían emplearse como reactivos de hibridación para la identificación de homólogos. Los componentes básicos de una prueba de hibridación de ácido nucleico incluyen una sonda, una muestra sospechada de contener el gen o el fragmento de gen de interés y un método de hibridación específico. Las sondas son, "típicamente, secuencias de ácido nucleico monocatenarias que son complementarias a las secuencias de ácido nucleico a detectarse. Las sondas son "hibridizables" a la secuencia de ácido nucleico a detectarse. La longitud de la sonda puede variar desde 5 bases a decenas de miles de bases, y dependerá de la prueba específica a realizarse. Típicamente, una longitud de sonda de aproximadamente 15 bases a aproximadamente 30 bases es adecuada . Solamente parte de la molécula de la sonda necesita ser complementaria a la secuencia de ácido nucleico a detectarse. Además, la complementariedad entre la sonda y la secuencia destino no necesita ser perfecta. La hibridación ocurre entre moléculas imperfectamente complementarias con el resultado de que una cierta fracción de las bases en la región hibridizada no se aparea con la base complementaria apropiada.

Los métodos de hibridación se encuentran bien definidos. Típicamente, la sonda, y la muestra deben mezclarse bajo condiciones que permitirán la hibridación de ácido nucleico. Esto incluye poner el contacto la sonda y la muestra en presencia de una sal orgánica o inorgánica, bajo las condiciones de concentración y temperatura apropiadas. La sonda y los ácidos nucleicos de muestra deben estar en contacto por un tiempo suficientemente largo como para que pueda ocurrir cualquier hibridación posible entre la sonda y el ácido nucleico de muestra. La concentración de sonda o destino en la mezcla determinará el tiempo necesario para que ocurra la hibridación. Cuanto más alta es la concentración de sonda o destino, menor es el tiempo necesario para la incubación de la hibridación. Opcionalmente , podría adicionarse un agente caotrópico. El agente caotrópico estabiliza los ácidos nucleicos mediante la inhibición de la actividad nucleasa. Además, el agente caotrópico permite la hibridación rigurosa y sensible de sondas de oligonucleótidos cortas a temperatura ambiente (Van Ness y Chen, Nucí. Acids Res. 19:5143-5151 (1991)). Los agentes caotrópicos adecuados incluyen cloruro de guanidina, tocianato de guanidina, tiocianato sódico, tetracloroacetato de litio, perclorato sódico, tetracloroacetato de rubidio, yoduro potásico y trifluoroacetato de cesio, entre otros. Típicamente, el agente caotrópico estará presente en una concentración final de aproximadamente 3 M. Si se desea, se puede adicionar formamida a la mezcla de hibridación, típicamente, 30-50 % (v/v) .

Pueden emplearse distintas soluciones de hibridación. Típicamente, éstas comprenden de aproximadamente 20 a 60 % volumen, de preferencia, 30 % de un solvente orgánico polar. Una solución de hibridación común emplea aproximadamente 30-50 % v/v de formamida, aproximadamente 0.15 a 1 M de cloruro sódico, aproximadamente 0.05 a 0.1 M de tampones (por ejemplo, citrato sódico, tri-HCl, PIPES o HEPES (intervalo de pH aproximadamente 6-9)), aproximadamente 0.05 a 0.2 % de detergente (por ejemplo, dodecilsulfato sódico) o entre 0.5-20 mM de EDTA, FICOLL (Pharmacia Inc.) (aproximadamente 300-500 kdal) , polivinilpirrolidona (aproximadamente 250-500 kdal) y albúmina sérica. También se incluirán en la solución de hibridación típica ácidos nucleicos portadores no marcados de aproximadamente 0.1 a 5 mg/ml, ADN nucleico fragmentado (por ejemplo, ADN de timo de becerro o de esperma de salmón, o ARN de levadura) y, opcionalmente , de aproximadamente 0.5 a 2 % pt/vol de glicina. También podrían incluirse otros aditivos, tales como agentes de exclusión de volumen que incluyen una variedad de agentes hinchables o solubles en agua (por ejemplo, polietilenglicol ) , polímeros aniónicos (por ejemplo, poliacrilato o polimetilacrilato) y polímeros glucídicos aniónicos (por ejemplo, sulfato de dextrano) .

La hibridación de ácido nucleico es adaptable a una variedad de formatos de ensayo. Uno de los más adecuados es el formato de ensayo sándwich. El ensayo sándwich es particularmente adaptable a la hibridación bajo condiciones no desnaturalizantes. Un componente primario de un ensayo tipo sándwich es un soporte sólido. El soporte sólido adsorbió o apareó covalentemente la sonda de ácido nucleico inmovilizado no marcada y complementaria a una porción de la secuencia.

Alternativamente, dado que las secuencias de GCN son muy conocidas y que la secuenciación de los genomas de hongos prevalece (10 se completaron, 71 fueron sujetos a un enfoque de perdigonado de todo el genoma y se están ensamblando mientras otros 42 se encuentran en progreso) , los genes destino adecuados del sistema GCN podrían identificarse sobre la base de similitud de secuencia mediante el uso de enfoques bioinformáticos únicamente, que son muy conocidos para una persona con experiencia en la técnica.

Modificación genética de genes de respuesta de control general en levadura para tolerancia al butanol La persona con experiencia en la técnica conoce muchos métodos para modificar genéticamente genes destino y estos métodos podrían usarse para crear las presentes cepas de levadura. Las modificaciones que podrían usarse para reducir o eliminar la expresión de una proteína destino son interrupciones que incluyen, pero no se limitan a, eliminar el gen completo o una porción del gen que codifica Gcnp, insertar un fragmento de ADN en un gen GCN (tanto en el promotor como en la región codificante) para que la proteína no se exprese o se exprese a niveles inferiores, introducir una mutación en una región codificante de GCn que adiciona un codón de terminación o un marco de lectura de manera que no se exprese una proteína funcional e introducir una o más mutaciones en una región codificante de GCN para alterar aminoácidos de manera que se exprese una proteína no funcional o menos activa enzimáticamente . Además, la expresión de un gen GCN podría bloquearse por la expresión de un ARN antisentido o un ARN interférente , y podrían introducirse constructos que resulten en cosupresión. Además, podría sintetizarse un gen GCN cuya expresión sea baja porque los codones raros se sustituyen por codones óptimos, y sustituirse este gen por el gen GCN endógeno correspondiente. Un gen así producirá el mismo polipéptido pero a una velocidad más baja. Además, la síntesis o estabilidad del transcrito podría disminuirse por mutación. De forma similar, la eficacia con la que una proteína se traduce a partir de ARNm podría modularse por mutación. Todos estos métodos podrían llevarse a la práctica fácilmente por una persona con experiencia en la técnica haciendo uso de las secuencias conocidas que codifican proteínas de Gen. Las secuencias GCN de levadura se encuentran disponibles al público y las secuencias representativas se encuentran enumeradas en la Tabla 4. Una persona con experiencia en la técnica podría elegir estrategias de modificación específicas para eliminar o reducir la expresión de un gen GCN como se desee para aumentar la tolerancia al butanol.

Las secuencias de ADN que rodean una secuencia codificante GCN también resultan útiles en algunos procedimientos de modificación y se encuentran disponibles para levaduras, tales como para Saccharomycse cerevisiae en la secuencia de genoma completa coordinada por el Proyecto genoma con identificación 9518 de Proyectos genoma coordinados por NCBI (Centro Nacional de Información Biotecnológica) con identificación de proyecto genográfico (GOPID) núm. 13838. Los ejemplos adicionales de las secuencias genómicas de levadura incluyen las secuencias genómicas de Yarrowia lipolytica, GOPIC núm. 13837, y de Candida albicans, que se incluye en GPID núm. 10771, 10701 y 16373. Una persona con experiencia en la técnica puede encontrar fácilmente otras secuencias genómicas de levadura en las bases de datos disponibles al público.

En particular, las secuencias de ADN que rodean una secuencia codificante GCN son útiles para los métodos de modificación que usan recombinación homologa. Por ejemplo, en este método, las secuencias flanqueadoras del gen GCN se ubican alrededor de un gen marcador seleccionable para mediar la recombinación homologa por la cual el gen marcador reemplaza al gen GCN. También podrían usarse secuencias de gen GCN y secuencias flanqueadoras GCN que rodean a un gen marcador seleccionable para mediar la recombinación homologa por la cual el gen marcador reemplaza una porción del gen GCN destino. Además, el marcador seleccionable podría estar rodeado por sitios de recombinación sitio-específicos, de manera que después de la expresión de la recombinasa sitio-específica correspondiente, el gen de resistencia se elimine del gen GCN sin reactivarlo. La recombinación sitio-específica deja atrás un sitio de recombinación que interrumpe la expresión de la proteína Gen. Como sabe una persona con experiencia en la técnica, el vector de recombinación homologa podría construirse para que también deje una deleción en el gen GCN después de la eliminación del marcador seleccionable.

Las deleciones podrían realizarse mediante el uso de' recombinación mitótica como se describe en Wach et al. ((1994) Yeast 10:1793-1808). Este método incluye preparar un fragmento de ADN que contenga un marcador seleccionable entre las regiones genómicas que podrían ser tan cortas como 20 bp, y que rodean una secuencia de ADN destino. Este fragmento de ADN puede prepararse por amplificación por PCR del gen marcador seleccionable mediante el uso de oligonucleótidos como cebadores que hibridizan con los extremos del gen marcador y que incluyen las regiones genómicas que pueden recombinarse con el genoma de levadura. El fragmento de ADN lineal puede transformarse eficazmente en levadura y recombinarse en el genoma, lo que resulta en el reemplazo de genes con deleción de la secuencia de ADN destino (como se describe en Methods in Enzymology, vl94, pág. 281-301 (1991)).

Además, podrían usarse métodos de reemplazo de promotores para intercambiar los elementos endógenos de control transcripcional permitiendo que otro medio module la expresión, como se describe en Mnaimneh et al. ((2004) Cell 118 (1) : 31-44) . Tolerancia al butanol de la presente cepa de levadura modificada Una cepa de levadura de la presente invención, que está modificada genéticamente para obtener una respuesta reducida en la respuesta de control general para la privación de aminoácidos, ha mejorado la tolerancia al butanol. La tolerancia de las cepas de respuesta reducida podría analizarse probando su crecimiento en concentraciones de butanol que perjudican el crecimiento de las cepas parentales (anteriores a la modificación genética) . La tolerancia mejorada es a compuestos de butanol que incluyen 1-butanol, isobutanol y 2-butanol. La cantidad de tolerancia observada variará dependiendo de la sustancia química inhibidora y su concentración, las condiciones de crecimiento, el período de crecimiento y la cepa genéticamente modificada específica. Por ejemplo, como se muestra en el Ejemplo 1 de la presente invención, la tolerancia mejorada se observó con crecimiento en 1 % - 2 % de isobutanol durante 8 horas en un medio que no tiene otros aminoácidos más que histidina y leucina. En este medio, las células tienen más demanda biosintética que en un medio rico, que contiene histidina y leucina. Otras condiciones para demostrar la tolerancia al butanol mejorada de las cepas de levadura de la presente invención incluyen condiciones en donde la demanda biosintética es más elevada que en condiciones de medio rico, que incluyen la falta de cualquier producto metabólico, tal como otros aminoácidos, nucleótidos o ácidos grasos. Además, la presencia de inhibidores, el desequilibrio osmótico u otras condiciones de crecimiento no ideales podrían proporcionar condiciones para demostrar la tolerancia mejorada al butanol.

Ruta biosintética del butanol En la presente invención se desarrolla una modificación genética que confiere mayor tolerancia al butanol, como se describió anteriormente, en una célula de levadura que se modifica para expresar una ruta biosintética de butanol. Cualquier modificación genética podría ocurrir antes que la otra .

La ruta biosintética del butanol podría ser una ruta biosintética de 1-butanol, 2 -butanol, o isobutanol. Los hospederos de levadura particularmente adecuados para la producción de butanol y para la modificación de la respuesta de control general a la privación de aminoácidos para una mayor tolerancia al butanol incluyen, pero no se limitan a, miembros de los géneros Saecharomyces, Candida, Hansenula y Yarowia. Los hospederos preferidos incluyen Saccharomyces cerevesiae, Candida albicans y Yarowia lipolytica .

Ruta biosintética del 1-butanol Una ruta biosintética para la producción de 1-butanol se describe en la publicación de solicitud de patente de los Estados Unidos, copendiente y de propiedad mancomunada, núm. 0080182308 de Donaldson et al., incorporada en la presente como referencia. La ruta biosintética comprende el siguiente sustrato para conversiones de productos: a) acetil-CoA a acetoacetil-CoA, catalizada, por ejemplo, por acetil-CoA acetiltransferasa con secuencia de proteínas tal como sec . con núm. de ident.: 2, 4 ó 40 codificadas por los genes dados como sec. con núm. de ident. : 1, 3 ó 39; b) acetoacetil-CoA a 3-hidroxibutiril-CoA, catalizada, por ejemplo, por 3 -hidroxibutiril - CoA deshidrogenasa con secuencia de proteínas tal como sec. con núm. de ident. : 6 codificada por el gen dado como sec. con núm. de ident. : 5; c) 3 -hidroxibutiril-CoA a crotonil-CoA, catalizada, por ejemplo, por crotonasa con secuencia de proteínas tal como sec. con núm. de ident.: 8 codificada por el gen dado como sec . con núm. de ident. : 7; d) crotonil-CoA a butiril-CoA, catalizada, por ejemplo, por butiril-CoA deshidrogenasa con secuencia de proteínas tal como sec. con núm. de ident.: 10 codificada por el gen dado como sec. con núm. de ident. : 9; e) butiril--CoA a butiraldehído , catalizada, por ejemplo, por butiraldehído deshidrogenasa con secuencia de proteínas tal como sec. con núm. de ident. : 12 codificada por el gen dado como sec. con núm. de ident. : 11; y f) butiraldehído a 1-butanol, catalizada, por ejemplo, por 1-butanol deshidrogenasa con secuencia de proteínas tal como. sec. con núm. de ident.: 14 ó 16 codificada por los genes dados como sec. con núm. de ident. : 13 ó 15. La ruta no requiere ATP y genera NAD+ y/o NADP+, por tanto, se equilibra con las rutas metabólicas centrales que generan acetil-CoA.

Ruta biosintética del 2-butanol Una ruta biosintética para la producción de 2-butanol se describen en la publicaciones de solicitud de patente de los Estados unidos copendiente y de propiedad mancomunada núm. 20070259410 y 20070292927 de Donaldson et al., ambas incorporadas en la presente como referencia. Una ruta biosintética del 2-butanol comprende el siguiente sustrato para conversiones de productos: a) piruvato a alfa-acetolactato , catalizada, por ejemplo, por acetolactato sintasa con secuencia de proteínas tal como sec . con núm. de ident . : 20 codificada por el gen dado como sec. con núm. de ident. : 19; b) alfa-acetolactato a acetoína, catalizada, por ejemplo, por acetolactato decarboxilasa con secuencia de proteínas tal como sec. con núm. de ident. : 18 codificada por el gen dado como sec. con núm. de ident. : 17;. . c) acetoína a 2 , 3 -butanodiol , catalizada, por ejemplo, por butanodiol deshidrogenasa con secuencia de proteínas tal como sec. con núm. de ident. : 22 codificada por el gen dado como sec. con núm. de ident. : 21; d) 2 , 3 -butanodiol a 2-butanona, catalizada, por ejemplo, por butanodiol deshidratasa con secuencia de proteínas tal como sec. con núm. de ident.: 24, 26 ó 28 codificada por genes dados como sec. con núm. de ident.: 23, 25 ó 27; y e) 2-butanona a 2-butanol, catalizada, por ejemplo, por 2-butanol deshidrogenasa con secuencia de proteínas tal como sec. con núm. de ident . : 30 codificada por el gen dado como sec. con núm. de ident. : 29.

Ruta biosintética del isobutanol Las rutas biosintéticas para la producción de isobutanol se describen en la publicación de solicitud de patente de los Estados Unidos copendiente y de propiedad mancomunada núm. 20070092957 de Maggio-Hall et al., incorporada en la presente descripción como referencia. Una ruta biosintética del isobutanol comprende el siguiente sustrato para conversiones de productos: a) piruvato a acetolactato, catalizado, por ejemplo, por acetolactato sintasa con secuencia de proteínas tal como sec. con núm. de ident. : 20 ó 42 codificada por genes dados como sec. con núm. de ident.: 19 ó 41; b) acetolactato a 2 , 3 -dihidroxiisovalerato , catalizada, por ejemplo, por ácido acetohidroxi isomeroreductasa con secuencia de proteínas tal como sec. con núm. de ident. : 32, 44 ó 46 codificada por genes dados como sec. con núm. de ident.: 31, 43 ó 45; c) 2 , 3 -dihidroxiisovalerato a a-cetoisovalerato, catalizada, por ejemplo, por ácido acetohidroxi deshidratasa con secuencia de proteínas tal como sec . con núra. de ident . : 34 codificada por el gen dado como sec. con núm. de ident.: 33; o ácido dihidroxi deshidratasa con secuencia de proteínas tal como sec. con núm. de ident.: 48 codificada por el gen dado como sec. con núm. de ident.: 47; d) a-cetoisovalerato a isobutiraldehído, catalizada, por ejemplo, por ácido ceto decarboxilasa de cadena ramificada con secuencia de proteínas tal como sec. con núm. de ident.: 36 codificada por el gen dado como sec. con núm. de ident.: 35; y e) isobutiraldehído a isobutanol, catalizada, por ejemplo, por alcohol deshidrogenasa de cadena ramificada con secuencia de proteínas tal como sec. con núm. de ident. : 38 codificada por el gen dado como sec. con núm. de ident. : 37.

Construcción de cepas de levadura para la producción de butanol Cualquier cepa de levadura modificada genéticamente para la tolerancia al butanol como se describe en la presente, además, se modifica genéticamente (antes o después de la modificación para la tolerancia) para que incorpore una ruta biosintética de butanol mediante métodos conocidos por una persona con experiencia en la técnica. Los genes que codifican las actividades enzimáticas descritas anteriormente, o los homólogos que podrían identificarse y obtenerse por métodos usados comúnmente, como los descritos anteriormente, que son muy conocidos para una persona con experiencia en la técnica, se introducen en un hospedero de levadura. Las secuencias codificantes y de aminoácidos representativas para enzimas de rutas que podrían usarse se presentan en las Tablas 1, 2 y 3 con las sec . con núm. de ident.: 1-48.

Los métodos para la expresión génica en levaduras son muy conocidos en la técnica; específicamente, los protocolos básicos de biología molecular de levadura que incluyen la transformación, el crecimiento celular, la expresión génica, la recombinación de reparación de interrupciones, etc. se describen en Methods in Enzymology, volumen 194, Guide to Yeast Genetics and Molecular and Cell Biology (Parte A, 2004, Christine Guthrie y Gerald R. Fink (Eds.), Elsevier Academic Press, San Diego, CA. La expresión de un gen en levadura, típicamente, requiere un promotor, seguido por la región codificante de interés, y un terminador transcripcional , todos unidos operativamente para proporcionar casetes de expresión. Puede usarse una variedad de promotores de levadura en la construcción de casetes de expresión para genes que codifican una ruta biosintética de butanol que incluyen, pero no se limitan a, los promotores constitutivos FBA, GPD y GPM, y los promotores inducibles GAL1 , GALIO y CUP1. Los terminadores transcripcionales adecuados incluyen, pero no se limitan a, FBAt , GPDt, GPMt, ERGIOt y GALlt . Por ejemplo, los promotores adecuados, los terminadores transcripcionales y los genes de una ruta biosintética de 1-butanol o isobutanol podrían clonarse en vectores versátiles de levadura de E. coli, como se describe en el Ejemplo 2.

Los plásmidos usados típicamente en levadura son los vectores versátiles pRS423, pRS424, pRS425 y pRS426 (American Type Culture Collection, Rockville, MD) , que contienen un origen de replicación de E. coli (por ejemplo, pMBl) , un origen de replicación de levadura 2 µ y un marcador de selección nutricional. Los marcadores de selección para estos cuatro vectores son His3 (vector pRS423) , Trpl (vector pRS424) , Leu2 (vector pRS425) y Ura3 (vector pRS426) . Estos vectores permiten la propagación de la cepa en E. coli y cepas de levadura. Los hospederos típicos para la expresión y clonación de genes incluyen una cepa haploide de levadura BY4741 (MATa his3Zil leu2Z\0 metl5_ü0 ura3Z\0) (Research Genetics, Huntsville, AL, también disponible de ATCC 201388) y una cepa diploide BY4743 ( ATa/alfa his3Al/his3Al leu2ú0/leu2A0 lys2A0/LYS2 MET15/metl5 O ura3A0/ura3A0) (Research Genetics, Huntsville, AL, también disponible de ATCC 201390) . La construcción de vectores de expresión para genes que codifican enzimas de rutas biosintéticas de butanol podría llevarse a cabo mediante cualquier técnica de clonación molecular estándar en E. coli o por el método de recombinación de reparación de interrupciones en levadura.

El enfoque de clonación de reparación de interrupciones aprovecha la muy eficaz recombinación homologa en levadura. Típicamente, el ADN vector de levadura se digiere (por ejemplo, en su sitio de clonación múltiple) para crear una "interrupción" en su secuencia. Se genera una cantidad de ADN insertos de interés que contienen una secuencia de = 21 bp en los extremos 5' y 3' que se superponen secuencialmente entre sí, y con los extremos 5' y 3' del ADN vector. Por ejemplo, para construir un vector de expresión de levadura para el "Gen X", se seleccionan un promotor de levadura y un terminador de levadura para el cásete de expresión. El promotor y el terminador se amplifican del ADN genómico de levadura y el Gen X se amplifica por PCR de su organismo fuente o se obtiene de un vector de clonación que comprende la secuencia del Gen X. Hay al menos una secuencia de superposición de 21 bp entre el extremo 5' del vector linealizado y la secuencia del promotor, entre el promotor y el Gen X, entre el Gen X y la secuencia del terminador, y entre el terminador y el extremo 3' del vector linealizado. El vector "interrumpido" y los ADN insertos se cotransforman, después, en una cepa de levadura y se siembran en placas en el medio que contiene las mezclas de compuestos adecuadas que permiten la complementacion de los marcadores de selección nutricional en los plásmidos . La presencia de combinaciones de insertos correctas puede confirmarse mediante mapeo por PCR usando un ADN plásmido preparado a partir de las células seleccionadas. Después, el ADN plásmido aislado de levadura (usualmente, de concentración baja) puede transformarse en una cepa de E. coli, por ejemplo, TOP10, seguido por mini preps y mapeo de restricción para verificar aun más el constructo plásmido. Finalmente, el constructo puede verificarse por análisis de secuencias. Los transformantes de levadura de plásmidos positivos se cultivan para realizar ensayos enzimáticos a fin de caracterizar las actividades de las enzimas expresadas por los genes de interés.

Medios de fermentación Los medios de fermentación de la presente invención deben contener sustratos de carbono adecuados . Los sustratos adecuados podrían incluir, pero no se limitan a, monosacáridos tales como glucosa y fructosa, oligosacáridos tales como lactosa o sacarosa, polisacáridos tales como almidón o celulosa, o mezclas de éstos y mezclas no purificadas de materias primas renovables tales como permeado de suero de queso, licor de maceración del maíz, melaza de remolacha azucarera y malta de cebada. Además, el sustrato de carbono también podría ser un sustrato de un carbono tal como dióxido de carbono o metanol , para los cuales se ha demostrado la conversión metabólica en intermedios bioquímicos clave. Además de sustratos de uno y dos carbonos, se conoce que los organismos metilotróficos también usan un número de otros compuestos que contienen carbono tales como metilamina, glucosamina y una variedad de aminoácidos para la actividad metabólica. Por ejemplo, se conoce que las levaduras metilotróficas usan el carbono de la metilamina para formar trehalosa o glicerina (Bellion et al., Microb. Growth Cl Compd., [Int. Symp.], 7mo (1993), 415-32. Editor (es): Murrell, J. Collin; Kelly, Don P. Editorial: Intercept, Andover, Reino Unido) . De forma similar, varias especies de Candida metabolizarán alanina o ácido oleico (Sulter et al., Arch. Microbiol. 153:485-489 (1990)). Por tanto, se contempla que la fuente de carbono que se usa en la presente invención podría abarcar una gran variedad de sustratos que contienen carbono y sólo será limitada por la elección de organismo.

Aunque se contempla que todos los sustratos de carbono y mezclas de éstos mencionados anteriormente son adecuados para la presente invención, los sustratos de carbono preferidos son glucosa, fructosa y sacarosa.

Además de una fuente de carbono adecuada, los medios de fermentación deben contener minerales, sales, cofactores, tampones y otros componentes, conocidos para aquellas personas con experiencia en la técnica, adecuados para el crecimiento de los cultivos y la promoción de la ruta enzimática necesaria para la producción de butanol.

Condiciones de cultivo Típicamente, las células se cultivan a una temperatura que se encuentra en el intervalo de aproximadamente 20 °C a aproximadamente 37 °C en un medio adecuado. Los medios de crecimiento adecuados de la presente invención son medios comunes preparados comercialmente tal como caldo de cultivo (que incluye base de nitrógeno de levadura, sulfato amónico y dextrosa como la fuente de carbono/energía) o medio YPD, una mezcla de peptona, extractos de levadura y dextrosa en proporciones óptimas para cultivar la mayoría de las cepas de Saccharomyces cerevisiae . También podrían usarse otros medios de crecimiento definidos o sintéticos y el técnico con experiencia en microbiología o ciencia de fermentación conocerá el medio adecuado para el crecimiento del microorganismo particular.

Los intervalos de pH adecuados para la fermentación se encuentran entre pH 3.0 a pH 7.5, donde pH 4.5.0 a pH 6.5 se prefiere como la condición inicial.

Las fermentaciones podrían realizarse bajo condiciones aeróbicas o anaerobias, donde se prefieren las condiciones anaerobias o microaeróbicas .

La cantidad de butanol producido en el medio de fermentación puede determinarse mediante el uso de diferentes métodos conocidos en la técnica, por ejemplo, cromatografía líquida de alta eficacia (HPLC) o cromatografía de gas (GC) . Métodos para el aislamiento de butanol del medio de fermentación El butanol bioproducido podría aislarse del medio de fermentación mediante el uso de métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, podrían quitarse los sólidos del medio de fermentación mediante centrifugación, filtración, decantación, o similares. Después, podría aislarse el butanol del medio de fermentación, que se trató para eliminar los sólidos como se describió anteriormente, mediante el uso de métodos tales como destilación, extracción líquido a líquido, separación basada en membranas. Dado que el butanol forma una mezcla azeotrópica de bajo punto de ebullición con agua, la destilación sólo puede usarse para separar la mezcla a su composición azeotrópica. La destilación podría usarse en combinación con otro método de separación para obtener la separación alrededor del azeótropo. Los métodos que podrían usarse en combinación con la destilación para aislar y purificar butanol incluyen, pero no se limitan a, decantación, extracción líquido a líquido, adsorción y técnicas basadas en membranas. Además, el butanol podría aislarse mediante el uso de destilación azeotrópica con un arrastrante (véase, por ejemplo, Doherty y Malone, Conceptual Design of Distillation Systems, McGraw Hill, Nueva York, 2001) .

La mezcla butanol -agua forma un azeótropo heterogéneo de manera que la destilación podría usarse en combinación con la decantación para aislar y purificar el butanol. En este método, el caldo de cultivo de fermentación que contiene butanol se destila para aproximarse a la composición azeotrópica. Después, la mezcla azeotrópica se condensa y el butanol se separa del medio de fermentación por decantación. La fase acuosa decantada podría regresarse a la primera columna de destilación como reflujo. La fase orgánica decantada rica en butanol podría purificarse aún más por destilación en una segunda columna de destilación.

El butanol también podría aislarse del medio de fermentación mediante el uso de extracción líquido a líquido en combinación con destilación. En este método el butanol se extrae del caldo de cultivo de fermentación mediante el uso de extracción líquido a líquido con un solvente adecuado. La fase orgánica que contiene butanol después se destila para separar el butanol del solvente.

También podría usarse destilación en combinación con adsorción para aislar el butanol del medio de fermentación. En este método el caldo de cultivo de fermentación que contiene el butanol se destila para acercarse a la composición azeotrópica y, después, el agua restante se elimina mediante el uso de un adsorbente, tal como tamices moleculares (Aden et al. Lignocellulosic Biomass to Ethanol Process Design and Economics Utilizing Co-Current Dilute Acid Prehydrolysis and Enzymatic Hydrolysis fox Corn Stover, informe NREL/TP-510-32438, Laboratorio Nacional de Energía Renovable, junio de 2002) .

Además, la destilación en combinación con la pervaporación podría usarse para aislar y purificar el butanol del medio de fermentación. En este método el caldo de cultivo de fermentación que contiene el butanol se destila para aproximarse a la composición azeotrópica y, después, el agua restante se elimina por pervaporacion a través de una membrana hidrófila (Guo et al., J. Membr. Sci . 245, 199-210 (2004)).

EJEMPLOS La presente invención se define más detalladamente a través de los siguientes ejemplos. Debe entenderse que si bien estos ejemplos señalan las modalidades preferidas de la invención, se aportan a manera de ejemplo únicamente. De la descripción precedente y de estos ejemplos, aquellos con experiencia en la técnica pueden determinar las características esenciales de esta invención y, sin apartarse del espíritu ni del alcance de ella, podrán introducir diversos cambios y modificaciones de la invención para adaptarla a los diversos usos y condiciones.

Métodos Generales Las técnicas de clonación molecular y de ADN recombinante estándar usadas en los ejemplos son muy conocidas en la técnica y se describen en Sambrook, J. , Fritsch, E. F. y Maniatis, T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press: Cold Spring Harbor, NY (1989) (Maniatis) y en T. J. Silhavy, M. L. Bennan, y L. W. Enquist, Experimente with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1984) y en Ausubel, F. M. efc al., Current Protocols in Molecular Biology, pub . por Greene Publishing Assoc. y iley-Interscience (1987) .

Los materiales y métodos adecuados para el mantenimiento y crecimiento de los cultivos bacterianos son muy conocidos en la técnica. Las técnicas adecuadas para usarse en los siguientes ejemplos se pueden encontrar en Manual of Methods for General Bacteriology (Phillipp Gerhardt, R. G. E. Murray, Ralph N. Costilow, Eugene W. Nester, illis A. Wood, Noel R. Krieg and G. Briggs Phillips, eds) , American Society for Microbiology, Washington, DC. (1994)) o Thomas D. Brock in Biotechnology: A Textbook of Industrial Microbiology, segunda edición, Sinauer Associates, Inc., Sunderland, MA (1989). Todos los reactivos, las enzimas de restricción y los materiales usados para el crecimiento y el mantenimiento de células bacterianas se obtuvieron de Aldrich Chemicals (Milwaukee, WI) , BD Diagnostic Systems (Sparks, MD) , Life Technologies (Rockville,. MD) , o Sigma Chemical Company (St. Louis, MO) , a menos que se indique de cualquier otra forma.

Las cepas microbianas se obtuvieron de The American Type Culture Collection (ATCC) , Manassas, VA, a menos que se indique de cualquier otra forma.

Métodos para determinar la concentración de isobutanol en medios de cultivo La concentración de isobutanol en los medios de cultivo puede determinarse mediante distintos métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, un método específico de cromatografía líquida de alta eficacia (HPCL) usa' una columna Shodex SH-1011 con una columna de protección Shodex SH-G, ambas obtenidas de aters Corporation (Milford, MA) , con detección de índice de refracción (RI) . La separación cromatográfica se alcanza usando 0.01 M H2S04 como la fase movible con una velocidad de flujo de 0.5 ml/min y una temperatura de columna de 50 °C. El isobutanol tiene un tiempo de retención de 46.6 minutos bajo las condiciones descritas. Alternativamente, se encuentran disponibles métodos de cromatografía de gas (GC) . Por ejemplo, un método específico de GC usa una columna HP-I NOWax (30 m x 0.53 mm id, 1 µp\ de espesor de película, Agilent Technologies, Wilmington, DE) con un detector de ionización de llamas (FID) . El gas portador es helio a una velocidad de flujo de 4.5 ml/min, medida a 150 °C con presión superior constante; la relación de partición del inyector es 1:25 a 200 °C; la temperatura del horno es 45 °C durante 1 minuto, 45 a 220 °C a 10 °C/min y 220 °C durante 5 minutos; y la detección de FID se emplea a 240 °C con 26 ml/min de gas auxiliar helio. El tiempo de retención del isobutanol es 4.5 min.

El significado de las abreviaturas es el siguiente: "s" significa segundo (s), "min" significa minuto (s), "h" significa hora(s), "psi" significa libras por pulgada cuadrada, "nm" significa nanómetros, "d" significa día(s), "µ?" significa microlitro (s) , "mi" significa mililitro (s) , "1" significa litro (s), mm" significa milímetro (s) , "nm" significa nanómetros , "mM" significa milimolar, "µ?" significa micromolar, "M" significa molar, "mmol" significa milimolar (es) , "µt???" significa micromolar (es) , "g" significa gramo (s), "ug" significa microgramo (s) y "ng" significa nonogramo (s) , "PCR" significa reacción en cadena de la polimerasa, "OD" significa densidad óptica, "OD60o" significa densidad óptica calculada a una longitud de onda de 600 nm, "kDa" significa kilodalton (es) , "g" significa la constante de gravitación, "bp" significa par (es) de bases, "kbp" significa par (es) de kilobases, "% p/v" significa porcentaje peso/volumen, "% v/v" significa porcentaje volumen/volumen, "HPLC" significa cromatografía líquida de alta eficacia y "GC" significa cromatografía de gas. El término "selectividad molar" es el número de moles de producto producido por mole de sustrato de azúcar consumido y se registra como un porcentaje.

Ejemplo 1 Tolerancia al butanol en mutantes gcn2 y geni Los mutantes de deleción del gen GCN2 y del gen GCN4 de la cepa diploide a/a de Saccharomyces cerevisiae BY4743 (Brachmann et al. (Yeast 14:115-132 (1998)) se encuentran disponibles en una colección de cepas de deleción ordenada casi completa (Giaever et al. Nature 418, 387-391 (2002); Saccharomyces Genome Deletion Project) . Las células de los imitantes de deleción del gen GCN2 y del gen GCN4 se cultivaron durante la noche a partir de una única colonia en una placa YPD, en medio YPD o YVCM (recetas abajo) en un tubo Falcon de 14 mi a 30 °C con agitación a 250 rpm. Los cultivos que se cultivaron durante la noche se diluyeron 1:100 (2 mi a 200 mi) en el mismo medio y se monitoreó el crecimiento cada 60 minutos hasta que se duplicaron. En ese punto, los cultivos se dividieron en muestras de 25 mi que se colocaron en matraces de plástico de 125 mi separadas. Se adicionaron concentraciones desafiantes de isobutanol en el intervalo entre 0.5 % y 2 % p/v a todas las matraces de cada cultivo menos a una, que sirvió como control positivo. Los cultivos de control y de desafío se incubaron con agitación en un baño de agua de 30 °C y se monitoreó la absorbancia cada aproximadamente una hora.

Los dos medios que se usaron eran un medio rico, YPD, que contiene por litro: 10 g de extracto de levadura, 20 g de peptona, 20 g de dextrosa; y un medio sintético definido, YVCM, que contiene por litro: 6.67 g de base de nitrógeno de levadura sin aminoácidos pero con sulfato amónico, 20 g de dextrosa, 20 mg de L-histidina, 30 mg de L-leucina, 20 mg de uracilo.

Mediante el uso de puntos de tiempo de 8 y 24 horas para el crecimiento en YVCM que contiene butanol, se determinaron los rendimientos de crecimiento funcional y los resultados se muestran en las figuras 1A-1B. Las líneas de deleción GCN2 y GCN4 que se cultivaron en el medio sintético resultaron sustáncialmente más tolerantes a un desafío de isobutanol de 8 horas que las cepas parentales. La ventaja acumulada desapareció después de la incubación durante la noche. La tolerancia aumentada se vio sobre un intervalo de concentración de 1-2 % de isobutanol.

Mediante el uso de puntos de tiempo de 7 y 23 horas para el crecimiento en YPD que contiene isobutanol, se determinaron los rendimientos de crecimiento fraccional y los resultados se muestran en las figuras 2A-2B. En estas condiciones no se observó tolerancia mejorada en el punto de tiempo corto, y se observó una mejora mínima con las mutaciones GCN2 y GCN4 en diferentes concentraciones de isobutanol .

Ejemplo 2 Expresión de genes de ruta de isobutanol en Saccharomyces Cerevisiae Para expresar genes de ruta de isobutanol en Saccharomyces cerevisiae, se construyeron diferentes vectores versátiles de levadura de E. coli. Se usó un enfoque de PCR (Yu, et al. Fungal Genet . Biol . 41:973-981(2004)) para fusionar genes con terminadores y promotores de levadura. Específicamente, el promotor GPD (sec. con núm. de ident . : 76) y el terminador CYC1 (sec. con núm. de ident.: 77) se fusionaron al gen alsS de Bacillus subtilis (sec. con núm. de ident . : 41), el promotor FBA (sec. con núm. de ident . : 78) y el terminador CYC1 se fusionaron al gen ILV5 de S. cerevisiae (sec. con núm. de ident.: 43), el promotor ADH1 (sec. con núm. de ident.: 79) y el terminador ADHl (sec. con núm. de ident.: 80) se fusionaron al gen ILV3 de S. cerevisiae (sec. con núm. de ident. : 47) , y el promotor GPM (sec. con núm. de ident.: 81) y el terminador ADHl se fusionaron al gen kivD de Lactococcus lactis (sec. con núm. de ident. : 35) . Los cebadores, que figuran en la Tabla 5, se diseñaron para que incluyan sitios de restricción para clonar productos de promotor/gen/terminador en vectores versátiles de levadura de E. coli de la serie pRS400 (Christianson et al. Gene 110:119-122 (1992)) y para intercambiar promotores entre constructos. Los cebadores para los extremos 5' de ILV5 y ILV3 (N138 y N155, respectivamente, dados como sec. con núm. de ident.: 92 y 104, respectivamente) generaron nuevos codones de comienzo para eliminar la localización mitocondrial de estas enzimas.

Todos los productos de PCR fusionados, primero, se clonaron en pCR4-Blunt por reacción de clonación TOPO (Invitrogen) y las secuencias se confirmaron (mediante el uso de cebadores directos e inversos M13 (Invitrogen) y los cebadores de secuenciación proporcionados en la Tabla 5) . Se clonaron dos promotores adicionales (CUP1 y GAL1) por reacción TOPO en pCR4-Blunt y se confirmaron por secuenciación; las secuencias de los cebadores se indican en la Tabla 5. Los plásmidos que se construyeron se describen en la Tabla 6. Los plásmidos se transformaron en Saccharomyces cerevisiae BY4743 (ATCC 201390) o YJR148w (ATCC 4036939) para evaluar las actividades específicas de las enzimas. Para la determinación de actividades enzimáticas, se realizaron los cultivos a una OD6oo de 1.0 en medio sintético completo {Methods in Yeast Genetics, 2005, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, pág. 201-202) sin ningún metabolito necesario para la selección de la expresión de plásmido(s), se cosecharon por centrifugación (2600 x g durante 8 minutos a 4 °C) , se lavaron con tampón, se centrifugaron nuevamente y se congelaron a -80 °C. Las células se descongelaron, se volvieron a suspender en 20 mM de Tris-HCl, pH 8.0 a un volumen final de 2 mi y, después, se rompieron con una centrífuga para disrupción celular con 1.2 g de microesferas de vidrio (0.5 mm de tamaño) . Se procesó cada muestra a alta velocidad durante un total de 3 minutos (con incubación en hielo después de cada minuto de batido) . Se- quitaron los residuos celulares de los extractos por centrifugación (20,000 x g durante 10 minutos a 4 °C) .

La actividad acetolactato sintasa en los extractos libres de células se mide mediante el uso del método descrito por Bauerle et al. (Biochim. Biophys . Acta 92 (1) : 142-149 (1964)). La actividad ácido acetohidroxi reductoisomerasa en los extractos libres de células se mide mediante el uso del método descrito por Arfin y Umbarger (J. Biol . Chem. 244 (5) : 1118-1127 (1969) ) . La actividad ácido acetohidroxi deshidratasa en los extractos libres de células se mide mediante el uso del método descrito por Flint et al. (J. Biol. Chem. 268 (20) : 14732-14742 (1993)) . La actividad ácido ceto decarboxilasa de cadena ramificada en los extractos libres de células se mide mediante el uso del método descrito por Smit et al.¦ (Appl . Microbiol . Biotechnol . 64:396-402 (2003)), excepto que se usa el reactivo Purpald® (Aldrich, núm. de catálogo: 162892) para detectar y cuantificar los productos de reacción de aldehidos.

Tabla 5 Secuencias de cebador para la clonación y la secuenciación de los vectores de expresión de S. CEREVISIAE Nombre Secuencia Descripción Sec. con núm. de ident .

N98SeqFl CGTGTTAGTCACATCAGGAC Cebador de 82 secuenciación B. subtilis alsS N98SeqF2 GGCCATAGCAAAAATCCAAACAGC Cebador de 83 secuenciación B. subtilis alsS N98SeqF3 CCACGATCAATCATATCGAACACG Cebador de 84 secuenciación B. subtilis alsS N98SeqF4 GGTTTCTGTCTCTGGTGACG Cebador de 85 secuenciación B.

Nombre Secuencia Descripción Sec . con núm. de ident . subtilis alsS N99SeqRl GTCTGGTGATTCTACGCGCAAG Cebador de 86 secuenciación B. subtilis alsS N99SeqR2 CATCGACTGCATTACGCAACTC Cebador de 87 secuenciación B. subtilis alsS N99SeqR3 CGATCGTCAGAACAACATCTGC Cebador de 88 secuenciación B. subtilis alsS N99SeqR4 CCTTCAGTGTTCGCTGTCAG Cebador de 89 secuenciación B. subtilis alsS N136 CCGCGGATAGATCTGAAATGAATA Cebador directo de 90 ACAATACTGACA promotor FBA con sitios SacII/BglII N137 TACCACCGAAGTTGATTTGCTTCA Cebador inverso de 91 ACATCCTCAGCTCTAGATTTGAAT promotor FBA con ATGTATTACTTGGTTAT sitio BbvCI y región de hibridación de ILV5 N138 ATGTTGAAGCAAATCAACTTCGGT Cebador directo 92 GGTA ILV5 (crea codón de comienzo alterno) N139 TTATTGGTTTTCTGGTCTCAAC Cebador inverso 93 ILV5 N140 AAGTTGAGACCAGAAAACCAATAAT Cebador directo de 94 TAATTAATCATGTAATTAGTTATGT terminador CYC con CACGCTT sitio Pací y región de hibridación de ILV5 N141 GCGGCCGCCCGCAAATTAAAGCCT Cebador inverso de 95 TCGAGC terminador CYC con Tabla 6 Vectores versátiles de levadura de E. coli que tienen genes dé ruta de isobutanol Ejemplo 3 (esperado) Producción de isobutanol mediante el uso de la cepa de Saccharomyces cerevisiae tolerante La cepa de inicio para este trabajo es BY4741 (Brachmann, et al. Yeast . 14: 115-132 (1998)) y su derivado Abat2, YJR148 BY4741, tipo de apareamiento a (6939) disponible de la ATCC (núm. 406939) con el genotipo MATa his3deltal Ieu2delta0 metl5delta0 ura3delta0 deltaTWT2. bat2 codifica el aminoácido aminotransferasa citosólica de cadena ramificada. La deleción de bat2 en combinación con la deleción de URA3 permite que el crecimiento en ausencia de uracilo se use como una selección para la presencia de una inserción URA3.

Los primeros derivados AGCN2 y AGCN4 se realizan mediante el uso de la cepa de ATCC núm. 406939. Esto se logra mediante una estrategia de reemplazo de genes usada comúnmente en levadura en la que se usa un alelo URA3+ como un marcador seleccionable para . un alelo de inserción-deleción de GCN en el que se integra URA3+ en el genoma junto con secuencias flanqueadores de repetición directa reemplazando la secuencia objetivo de deleción. Subsiguientemente, se selecciona un suceso de recombinación entre las repeticiones directas mediante la demanda de resistencia de ácido fluoro-orótico (FOA) que selecciona en contra de la función URA3+ .

El fragmento de ADN que incluye un gen para la expresión de URA3 y que flanquea repeticiones directas (fragmento de "repeticiones URA3" ; sec. con núm. de ident . : 138) incluye lo siguiente (los números de posición se refieren a la posición en el fragmento de "repeticiones URA3" de sec. con núm. de ident. : 138) : 1) secuencias de unión de cebador que vinculan las repeticiones directas que flanquean URA3+: : gcattgcggattacgtattctaatg (posición 1-25; sec . con núm. de ident . : 143) y gatgatacaacgagttagccaaggtg (posición 1449-1474 de sec. con núm. de ident. : 144) ; las secuencias de repeticiones directas que flanquean el promotor y la secuencia codificante : ttcagcccgcggaacgccagcaaatcaccacccatgcgcatgatact gagtcttgtacacgctgggcttccagtg (posición 26-100 de sec. con núm. de ident. : 145) y ttcagcccgcggaacgccagcaaatcaccacccatgcgcatgatact gagtcttgtacacgctgggcttccagtg (posición 1375-1449 de sec. con núm. de ident. : 146) la secuencia del promotor: ttttttattcttttttttgatttcggtttctttgaaattttttt gattcggtaatctccgaacagaaggaagaacgaaggaaggagca cagacttagattggtatatatacgcatatgtagtgttgaagaaa catgaaattgcccagtattcttaacccaactgcacagaacaaaa acctgcaggaaacgaagataaatc (posición 149-348 de sec. con núm. de ident. : 147) y la región codificante: atgtcgaaagctacatataaggaacgtgctgctactcatcctagtc ctgttgctgccaagctatttaatatcatgcacgaaaagcaaacaaa cttgtgtgcttcattggatgttcgtaccaccaaggaattactggag ttagttgaagcattaggtcccaaaatttgtttactaaaaacacatg tggatatcttgactgatttttccatggagggcacagttaagccgct aaaggcattatccgccaagtacaattttttactcttcgaagacaga aaatttgctgacattggtaatacagtcaaattgcagtactctgcgg gtgtatacagaatagcagaatgggcagacattacgaatgcacacgg tgtggtgggcccaggtattgttagcggtttgaagcaggcggcagaa gaagtaacaaaggaacctagaggccttttgatgttagcagaattgt catgcaagggctccctatctactggagaatatactaagggtactgt tgacattgcgaagagcgacaaagattttgttatcggctttattgct caaagagacatgggtggaagagatgaaggttacgattggttgatta tgacacccggtgtgggtttagatgacaagggagacgcattgggtca acagtatagaaccgtggatgatgtggtctctacaggatctgacatt attattgttggaagaggactatttgcaaagggaagggatgctaagg tagagggtgaacgttacagaaaagcaggctgggaagcatatttgag aagatgcggccagcaaaactaa (posición 349-1152 de sec. con núm. de ident . : 148) .

Un fragmento de ADN que contiene una secuencia de 50 bp que está 100 bp corriente arriba de la región codificante GC 2 , el fragmento de repeticiones URA3 descrito anteriormente, y una secuencia de 50 bp que está 100 bp corriente abajo de la región codificante GCN2 se prepara mediante el uso de PCR. El cebador 5' es una secuencia quimérica que contiene 50 bp de secuencia corriente arriba de GCN2 y la secuencia de unión de cebador de posición 1-25 mencionada anteriormente en (1) : 50 (GCN2 5' flanqueador) + cebador 5'ura3 (I) (sec. con núm. de ident . : : 139) . El cebador 3' es una secuencia quimérica que contiene el complemento de 50 bp de secuencia corriente abajo de GCN2 y el complemento de secuencia de unión de cebador de posición 1449-1474: 50 (compl. inverso de GCN2 3' flanqueador) + cebador 3'ura3 (compl. inverso) (II) (sec. con núm. de ident .:: 140) .

La reacción de PCR es una mezcla de reacción de 50 µ? de 1 µ? de ADN plantilla (50 ng total) , 1 µ? de cada cebador a 20 µ?, 25 µ? de premezcla 2X TaKaRa Ex Taq, 22 µ? de agua. La plantilla es la repetición pUC19- URA3, un derivado de pUC19 (Yanisch-Perron et al. (1985) Gene, 33:103-119) en el que se insertó la "repetición URA3" en el sitio de clonación múltiple. La condición de PCR que se usó es: 94 °C 1 minuto, después 30 ciclos de 94 °C 20 segundos, 55 °C 20 segundos y 72 °C 2 minutos, seguido por 7 minutos a 72 °C. El tiempo de extensión es 1 minuto por kb .

El producto de PCR resultante, un fragmento AGCN2 : : URA3+, se purifica mediante el uso de un estuche de purificación por PCR de Qiagen.

Un fragmento de ADN similar se prepara como se describió anteriormente, pero mediante el uso de cebadores que contienen secuencias corriente arriba y corriente abajo de la región codificante GCN4 : 50 (GCN4 5' flanqueador) + cebador 5 ' ura3 (III) (sec. con núm. de ident.: 141) y 50 (compl. inverso de GCN4 3' flanqueador) + cebador 3'ura3 (compl. inverso) (GCN4) (IV) (sec. con núm. de ident . : 142).

El producto de PCR resultante, un fragmento AGCN4 : : URA3+, se purifica mediante el uso de un estuche de purificación por PCR de Qiagen.

Los productos de PCR se usan para transformar la cepa ATCC núm. 406939. Se seleccionan integrantes para el crecimiento en la ausencia de uracilo. Las cepas integrantes con inserción de "repeticiones URA3" y deleción de GCN2 o GCN4 se denominan, respectivamente: DYW1: MATa his3deltal Ieu2delta0 metl5delta0 ura3delta0 deltaT T2 Agcn2 : :URA3+ y DYW2 : MATa his3deltal Ieu2delta0 metl5delta0 ura3delta0 deltaTWT2 ágcn : : URA3+ .

Mediante el uso de la selección 5-FOA para seleccionar la eliminación del alelo URA3*' se obtienen las cepas con recombinación entre repeticiones directas; estas cepas se denominan : DYW3 : MATa his3deltal Ieu2delta0 metl5delta0 ura3delta0 deltaTWT2 Agcn2 y DYW4: MATa his3deltal Ieu2delta0 metl5delta0 ura3delta0 deltaTWT2 Agcn4 Los plásmidos pRS423 : : CUPl-alsS+FBA-ILV3 y pHR81::FBA- ILV5+GPM-kivD (descritos en el Ejemplo 2) se transforman en Saccharomyces cerevisiae DYW3 y DYW4 para producir las cepas DYW3 (Agcn2) /pRS423 : : CUPl-alsS+FBA-ILV3/ pHR81 : : FBA-ILV5+ GPM- kivD y DYW4 (ñgcn4) /pRS423 : :CUPl-alsS+FBA-ILV3/ pHR81::FBA-ILV5+ GP -kivD. Se prepara una cepa de control mediante la transformación de los vectores pRS423 y pHR81 (descritos en el Ejemplo 2) en Saccharomyces cerevisiae (cepa ATCC núm. 406939) [cepa 406939 (GCN2+ GCN4+) /pRS423/pHR81] . Las cepas se mantienen en medio completo sintético de S. cerevisiae estándar {Methods in Yeast Genetics, 2005, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, pág. 201-202) que contiene 2 % de glucosa o de sacarosa, pero que no tiene uracilo e histidina para asegurar el mantenimiento de plásmidos.

Para la producción de isobutanol, las células se transfieren a medio sintético completo que no tiene uracilo, histidina y leucina. La eliminación de leucina del medio pretende activar un aumento en el número de copias del plásmido basado en . HR81 debido a la escasa transcripción del alelo leu2-d (Erhart y Hollenberg, J. Bacteriol . 156:625-635 (1983)). Los cultivos aeróbicos se realizan en matraces de 175 mi de capacidad que contiene 50 mi de medio en una incubadora Innova4000 (New Brunswick Scientific, Edison, NJ) a 30 °C y 200 rpm. Se preparan cultivos con bajo contenido de oxígeno mediante la adición de 45 mi de medio a frascos de suero de 60 mi que se sellan con tapas onduladas y se mantienen a 30 °C. Se usan jeringas estériles para tomar muestras y adicionar el inductor, según sea necesario. Aproximadamente 24 horas después de la inoculación, se adiciona el inductor CuS04 a una concentración final de 0.03 mM. También se preparan los cultivos de control para cada cepa sin adición de CuS04. Se analizan los sobrenadantes del cultivo 18 ó 19 horas y 35 horas después de la adición de CuS04 por HPLC (columna Shodex Sugar SH1011 (Showa Denko America, Inc. Y) con detección de índice de refracción (RI) ) y GC (Varían CP-WAX 58 (FFAP) CB, 0.25 mm X 0.2 µt? X 25 m (Varían, Inc., Palo Alto, CA) con detección de ionización de llama (FID) ) para contenido de isobutanol, como se describe en la sección Métodos generales. La producción de isobutanol se aumenta por la presencia de los alelos del gen mutante . En general, los mutantes GCN producen niveles más altos de isobutanol por unidad de densidad óptica.

Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (13)

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones:

1. Una célula hospedera de levadura recombinante caracterizada porque: a) el hospedero de levadura produce butanol cuando se cultiva en un medio que contiene un sustrato de carbono; y b) la célula hospedera de levadura comprende al menos una modificación genética que reduce la respuesta en la respuesta de control general a la privación de aminoácidos.

2. La célula de levadura de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque comprende una ruta biosintética recombinante seleccionada del grupo que consiste de: a) una ruta biosintética de 1-butanol; b) una ruta biosintética de 2 -butanol; y c) una ruta biosintética de isobutanol.

3. La célula de levadura de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque al menos una modificación genética reduce la producción de una proteína seleccionada del grupo que consiste de Gcnlp, Gcn2p, Gcn3p, Gcn4p, Gcn5p, Gcn6p, Gcn7p, Gcn8p, Gcn9p y Gcn20p.

4. La célula de levadura de conformidad con la reivindicación 3, caracterizada porque una modificación genética es una interrupción en un gen endógeno que codifica una proteína seleccionada del grupo que consiste de Gcnlp, Gcn2p, Gcn3p, Gcn4p, Gcn5p, Gcn6p, Gcn7p, Gcn8p, Gcn9p y Gcn20 .

5. La célula de levadura de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque es un elemento de un género seleccionado de Saccharomyces, Candida, Yarowia y Hansenula .

6. La célula de levadura de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque es Saccharomyces cerevisiae que comprende una interrupción en un gen endógeno que codifica una proteína seleccionada del grupo que consiste de Gcnlp, Gcn2p, Gcn3p, Gcn4p, Gcn5p y Gcn20p.

7. La célula de levadura de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque es Yarrowia lipolytica que comprende una interrupción en un gen endógeno que codifica una proteína seleccionada del grupo que consiste de Gcnlp, Gcn2p, Gcn3p y Gcn5p .

8. La célula de levadura de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque es Candida albicans que comprende una interrupción en un gen endógeno que codifica una proteína seleccionada del grupo que consiste de Gcn2p, Gcn3p y Gcn5 .

9. La célula de levadura recombinante de conformidad con la reivindicación 2, caracterizada porque la ruta biosintética del isobutanol comprende: a) al menos un gen que codifica una acetolactato sintasa ; b) al menos un constructo genético que codifica ácido acetohidroxi isomeroreductasa ; c) al menos un gen que codifica ácido acetohidroxi deshidratasa ; d) al menos un gen que codifica ácido ceto decarboxilasa de cadena ramificada; y e) al menos un gen que codifica alcohol deshidrogenasa de cadena ramificada;

10. Un proceso para la producción de butanol a partir de una célula de levadura recombinante, caracterizado porque comprende : (a) proporcionar una célula hospedera de levadura recombinante que 1) produce butanol; y 2) comprende al menos una modificación genética que reduce la respuesta en la respuesta de control general a la privación de aminoácidos; y (b) cultivar la cepa de (a) bajo condiciones en donde se produce butanol .

11. El proceso de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado porque la célula hospedera de levadura recombinante comprende una ruta biosintética recombinante seleccionada del grupo que consiste de: a) una ruta biosintética de 1-butanol; b) una ruta biosintética de 2 -butanol; y c) una ruta biosintética de isobutanol.

12. El proceso de la reivindicación 11, caracterizado además porque la ruta biosintética de isobutanol comprende: a) al menos un gen que codifica una acetolactato sintasa ; b) al menos un gen que codifica ácido acetohidroxi isomeroreductasa ; c) al menos un gen que codifica ácido acetohidroxi deshidratasa; d) al menos un gen que codifica ácido ceto decarboxilasa de cadena ramificada; y e) al menos un gen que codifica alcohol deshidrogenasa de cadena ramificada;

13. El proceso de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado porque la al menos una modificación genética reduce la producción de una proteína seleccionada del grupo que consiste de Gcnlp, Gcn2p, Gcn3p, Gcn4p, Gcn5p, Gcn6p, Gcn7p, Gcn8p, Gcn9p y Gcn20p.