JP2015530115A - ケトール酸レダクトイソメラーゼ活性を有するポリペプチド - Google Patents
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Abstract
Description
本願は、2012年9月26日に出願された米国仮特許出願第61/705977号明細書に関連し、且つその優先権の利益を主張するものであり、この仮特許出願の全体は、本明細書において参照によって本明細書に援用される。
本願と共に提出するASCIIテキストファイル(名称:20130926_CL5862WOPCT_SeqList.txt、サイズ:1,236,821バイト、及び作成日:2013年9月26日)において電子的に提出する配列表の内容は、全体として参照により本明細書に援用される。
本発明は、本願の一部をなす以下の詳細な説明、図、及び添付の配列説明からさらに完全に理解され得る。
特に定義されない限り、本明細書で使用される全ての科学技術用語は、本発明が属する技術分野の当業者が一般的に理解するのと同じ意味を有する。矛盾が生じる場合、それらの定義を含む本願が優先するものとする。また、文脈上特に必要でない限り、単数形の用語は複数を含むものとし、複数形の用語は単数を含むものとする。本明細書で言及される全ての刊行物、特許及び他の参考文献は、あらゆる目的から全体として参照により援用される。
本明細書には、アナエロスティペス・カッカエ(Anaerostipes caccae)由来のKARI酵素の変異体が開示される。かかる変異体は、イソブタノール生合成経路などのKARIを利用する生合成経路の効率を特定の生成条件に対して最適化するための代替法を提供する。実施例に、アナエロスティペス・カッカエ(Anaerostipes caccae)に由来するK9 KARI酵素の変異体を用いるイソブタノール生成を実証する。従って、当業者はこの開示を与えられることによって、様々な生成条件に適した開示されるKARI酵素又はその変異体若しくは活性断片を含む組換え宿主細胞を生成することが可能である。このように、本明細書に提供される変異体はまた、KARI活性によって触媒される基質から生成物への変換を含む他の生合成経路においても有用であり得る。
本明細書で用いられる標準的な組換えDNA及び分子クローニング技法は、当該技術分野において周知されており、Sambrook,J.,Fritsch,E.F.and Maniatis,T.,Molecular Cloning: A Laboratory Manual,Second Edition,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY(1989)(以下「Maniatis」);及びSilhavy,T.J.,Bennan,M.L.and Enquist,L.W.,Experiments with Gene Fusions,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY(1984);及びAusubel,F.M.et al.,Current Protocols in Molecular Biology,発行元Greene Publishing Assoc.and Wiley−Interscience(1987)により記載されている。
この開示を与えられることにより、当業者は、KARI活性を有するさらなる好適なポリペプチドを同定することが容易に可能となる。文献及び当業者に周知されているバイオインフォマティクスデータベースにおいて、本明細書に開示される配列及び当該技術分野で利用可能な配列を使用して、他のポリヌクレオチド、遺伝子及び/又はポリペプチドの配列を同定することができる。例えば、かかる配列は、本明細書に提供されるポリヌクレオチド又はポリペプチド配列による公的に利用可能なデータベースのBLAST検索により同定することができる。かかる方法では、同一性は、ギャップペナルティ=10、ギャップ長ペナルティ=0.1、及びGonnet 250シリーズのタンパク質重み行列のデフォルトパラメータを使用するClustal Wアラインメント法に基づき得る。
本明細書に記載される変異体は、当該技術分野において公知の任意の方法によって作成され得る。当該技術分野において公知の部位特異的突然変異誘発方法には、例えば、QuikChange(登録商標)(Agilent,Santa Clara,CA)及びChange−IT(登録商標)(Affymetrix/USB,Santa Clara,CA)が含まれる。当該技術分野において公知のランダム点突然変異誘発方法には、例えば、エラープローンPCR(例えば、Bloom et al.,BMC Biol.2007,5:29,doi:10.1186/1741−7007−5−29.)又はGeneMorph(登録商標)(Agilent,Santa Clara,CA)、化学的突然変異原(例えばエチルメタンスルホン酸)又は紫外線への曝露、PCRにおける修飾ヌクレオチドの使用(例えば、Wong et al.,Nucleic Acids Res.2004,32:3,e26.)、及び特異的ミューテーター株の使用が含まれる。当該技術分野において公知のDNA組換え又は「シャッフリング」方法には、例えば、ランダム断片化及び再構築(例えば、Stemmer 1994 Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91:22,10747−10751.)、ヘテロ二重鎖修復(例えば、Volkov et al.,Nucleic Acids Res.1999 27:18,e18.)、付着伸長(例えば、Zhao et al.,Nat.Biotechnol.1998,16:3,258−261.)、アンペアードプライマーシャッフリング(例えば、Milano et al.,米国特許第7,879,582号明細書)、部位特異的組換え(例えば、Hiraga et al.,J.Mol.Biol.2003,330:2,287−296.)、及び合成シャッフリング(例えば、Ness et al.,Nat.Biotechnol.2002,20,1251−1255.)が含まれる。他のタンパク質変異体ライブラリ構築方法には、例えば、循環置換(例えば、Guntas et al.,PLoS One.2012,7(4):e35998)、及び化学的DNA合成が含まれる。当業者はこの開示を与えられることによって、本明細書に提供される変異体並びにそれと(上記に記載したとおり)同一性が100%未満の変異体を容易に作製及び使用することができる。
補因子特異性を決定するため、飽和アセトラクテートにおける各補因子のVmax/KM比を計算し得る;NADHについて高い比を有する変異体ほど、等モル濃度の2つの補因子及び飽和アセトラクテートの条件下でNADPHと比べてNADHでの反応速度が高くなる。NADH及びNADPHに対するVmax値及びKM値は、当該技術分野において公知の及び/又は本明細書に提供される方法を用いて決定することができる。例えば、NADH及びNADPHに対するVmax値及びKM値を決定するため、部分的に精製したタンパク質を様々な濃度のNADH及びNADPHでアッセイしてもよい。
KARI活性を有するポリペプチドの同定及び修飾において有用な構造情報は、当該技術分野において、例えばここに記載する文献、並びに本明細書と共に表Zに提供されるプロファイルHMM、及び米国特許出願公開第20100197519号明細書及び同第20090163376号明細書に提供されている。
本明細書に記載されるポリペプチドは、KARI活性を有するポリペプチドを含む。KARI活性は、当該技術分野において(例えば、参照により本明細書に援用される米国特許第8,129,162号明細書に)記載される方法を用いて、アセトラクテートから2,3−ジヒドロキシイソバレレートへの酵素変換をアッセイすることにより確認することができる。例えば、この変換は、プレートリーダー(Molecular Device,Sunnyvale,Calif.のものなど)を使用して340nmで反応からの補因子NADPH又はNADHの消失を計測することにより追跡し得る。
培養培地中のイソブタノールの存在及び/又は濃度は、当該技術分野で公知の多くの方法によって決定することができる(例えば、参照によって援用される米国特許第7,851,188号明細書を参照のこと)。例えば、特定の高速液体クロマトグラフィー(HPLC)方法は、Shodex SH−1011カラムをShodex SHGガードカラムと共に(いずれもWaters Corporation(Milford,Mass.)から購入し得る)を利用し、屈折率(RI)検出を伴う。クロマトグラフ分離は、0.5mL/分の流量及び50℃のカラム温度で0.01M H2SO4を移動相として使用して達成される。用いられる条件下で、イソブタノールの保持時間は46.6分である。
イソブタノール生合成経路を含む宿主細胞におけるDHMBの生成は、経路基質の全てが所望の生成物に変換されていないことを示している。従って、収率は低くなる。加えて、DHMBは生成物の生成に対して阻害効果を有し得る。例えば、DHMBは生合成経路における酵素の活性を減少させ、又は発酵中の酵母の成長及び/又は生成能力に対して他の阻害効果を有し得る。従って、本明細書に記載される方法は、発酵中におけるDHMBの低減方法を提供する。このような方法には、DHMBの生成を減少させる方法及び発酵組成物からDHMBを除去する方法の双方が含まれる。
本明細書に記載される一部の実施形態において、組換え宿主細胞は、アセトラクテートからDHMBに変換する能力の低下又は消失を含むことができる。アセトラクテートからDHMBに変換する宿主細胞の能力は、例えば、アセト乳酸レダクターゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド若しくは遺伝子の修飾若しくは破壊、又はアセト乳酸レダクターゼ活性を有するポリペプチドの修飾若しくは破壊により、低下又は消失させることができる。他の実施形態において、組換え宿主細胞は、アセト乳酸レダクターゼ活性を有するポリペプチドをコードする内因性ポリヌクレオチド若しくは遺伝子に、又はアセト乳酸レダクターゼを有する内因性ポリペプチドに、欠失、突然変異、及び/又は置換を含むことができる。かかる修飾、破壊、欠失、突然変異、及び/又は置換により、低下した、実質的に消失した、又は消失したアセト乳酸レダクターゼ活性がもたらされ得る。本発明の一部の実施形態では、生合成経路の生成物は、アセトラクテートからDHMBに変換する能力の低下又は消失を含まない組換え宿主細胞における同じ生成物の生成と比較してより高収率で又はより多量に生成される。一部の実施形態では、組換え宿主細胞におけるアセトラクテートからDHMBへの変換が低下し、実質的に消失し、又は消失する。一部の実施形態では、アセト乳酸レダクターゼ活性を有するポリペプチドは、以下からなる群から選択される:YMR226C、YER081W、YIL074C、YBR006W、YPL275W、YOL059W、YIR036C、YPL061W、YPL088W、YCR105W、YOR375C、及びYDR541C。
他の実施形態において、発酵からDHMBを除去することにより、DHMBの低減を実現することができる。従って、DHMB濃度が低下した発酵もまた、本明細書に記載される。DHMBの除去により、例えば、より高純度の生成物、又は所望の純度を達成するのに必要な処理がより少ない生成物を得ることができる。従って、高い純度を有するエタノール又はブタノールなどの生合成経路の生成物を含む組成物もまた、提供される。
本明細書に提供されるKARI変異体はイソブタノールの生成に好適であるが(実施例を参照のこと)、本明細書に開示されるKARIが、アセトラクテートから2,3−ジヒドロキシイソバレレート又は2−アセト−2−ヒドロキシブタノエートから2,3−ジヒドロキシ−3−メチルペンタノエートなどの、KARI活性によって触媒される基質から生成物への変換を用いる任意の生合成経路で有用となり得ることが想定される。かかる経路としては、限定はされないが、パントテン酸、バリン、ロイシン、イソロイシン又は3,3−ジメチルマレートの生成経路が挙げられる。
−ピルベートからアセトラクテートへの変換、これは例えばアセト乳酸シンターゼによって触媒され得る;
−アセトラクテートから2,3−ジヒドロキシイソバレレートへの変換、これは例えばケトール酸レダクトイソメラーゼ(KARI)によって触媒され得る;
−2,3−ジヒドロキシイソバレレートからα−ケトイソバレレートへの変換、これは例えばジヒドロキシ酸デヒドラターゼ(DHAD)によって触媒され得る;
−α−ケトイソバレレートから2−デヒドロパントエートへの変換、これは例えば3−メチル−2−オキソブタン酸ヒドロキシメチルトランスフェラーゼ(panB;これはEC2.1.2.11に分類され得る)によって触媒され得る;
−2−デヒドロパントエートから(R)−パントエートへの変換、これは例えば2−デヒドロパントエート2−レダクターゼ(panE;これはEC1.1.1.169に分類され得る)によって触媒され得る
−(R)−パントエートから(R)−パントテネートへの変換。これは例えばパントエート−β−アラニンリガーゼ(panC;これはEC6.3.2.1に分類され得る)によって触媒され得る。
−ピルベートからアセトラクテートへの変換、これは例えばアセト乳酸シンターゼによって触媒され得る;
−アセトラクテートから2,3−ジヒドロキシイソバレレートへの変換、これは例えばケトール酸レダクトイソメラーゼ(KARI)によって触媒され得る;
−2,3−ジヒドロキシイソバレレートからα−ケトイソバレレートへの変換、これは例えばジヒドロキシ酸デヒドラターゼ(DHAD)によって触媒され得る;
−α−ケトイソバレレートからバリンへの変換、これは例えば分枝鎖アミノトランスフェラーゼ(ilvE(BAT);これはEC2.6.1.42に分類され得る)によって触媒され得る。
−ピルベート及びα−ケトブチレートから2−アセト−2−ヒドロキシブタノエートへの変換、これは例えばアセト乳酸シンターゼによって触媒され得る;
−2−アセト−2−ヒドロキシブタノエートから2,3−ジヒドロキシ−3−メチルペンタノエートへの変換、これは例えばKARIによって触媒され得る;
−2,3−ジヒドロキシ−3−メチルペンタノエートから3−メチル−2−オキソ−ペンタノエートへの変換、これは例えばDHADによって触媒され得る;
−3−メチル−2−オキソ−ペンタノエートからイソロイシンへの変換、これは例えば分枝鎖アミノトランスフェラーゼ(ilvE(BAT);これはEC2.6.1.42に分類され得る)によって触媒され得る。
−ピルベートからアセトラクテートへの変換、これは例えばアセト乳酸シンターゼによって触媒され得る;
−アセトラクテートから2,3−ジヒドロキシイソバレレートへの変換、これは例えばケトール酸レダクトイソメラーゼ(KARI)によって触媒され得る;
−2,3−ジヒドロキシイソバレレートからα−ケトイソバレレートへの変換、これは例えばジヒドロキシ酸デヒドラターゼ(DHAD)によって触媒され得る;
−α−ケトイソバレレートから2−イソプロピルマレートへの変換、これは例えば2−イソプロピルマレートシンターゼ(leuA、これはEC2.3.3.13に分類され得る)によって触媒され得る;
−2−イソプロピルマレートから2−イソプロピルマレエートへの変換、これは例えば3−イソプロピルマレートデヒドラターゼ(leu1;これはEC4.2.1.33に分類され得る)によって触媒され得る;
−2−イソプロピルマレエートから3−イソプロピルマレートへの変換、これは例えば3−イソプロピルマレートデヒドラターゼ(leu1;これはEC4.2.1.33に分類され得る)によって触媒され得る;
−3−イソプロピルマレートから2−イソプロピル−3−オキソスクシネートへの変換、これは例えば3−イソプロピルリンゴ酸デヒドロゲナーゼ(leuB;これはEC1.1.1.85に分類され得る)によって触媒され得る;
−2−イソプロピル−3−オキソスクシネートから4−メチル−2−オキソペンタノエートへの変換(自発的反応);及び
−4−メチル−2−オキソペンタノエートからロイシンへの変換、これは例えば分枝鎖アミノトランスフェラーゼ(ilvE(BAT);これはEC2.6.1.42に分類され得る)によって触媒され得る。
−ピルベートからアセトラクテートへの変換、これは例えばアセト乳酸シンターゼによって触媒され得る;
−アセトラクテートから2,3−ジヒドロキシイソバレレートへの変換、これは例えばケトール酸レダクトイソメラーゼ(KARI)によって触媒され得る;
−2,3−ジヒドロキシイソバレレートからα−ケトイソバレレートへの変換、これは例えばジヒドロキシ酸デヒドラターゼ(DHAD)によって触媒され得る;
−α−ケトイソバレレートから(R)−3,3ジメチルマレートへの変換、これは例えばジメチルマレートデヒドロゲナーゼ(DMMD;これは1.1.1.84に分類され得る)によって触媒され得る。
特定の好適なイソブタノール生合成経路が、米国特許出願公開第20070092957号明細書(参照により本明細書に援用される)に開示される。この開示されているイソブタノール生合成経路の図を、図1に提供する。米国特許出願公開第20070092957 A1号明細書(参照により本明細書に援用される)に記載されるとおり、例示的なイソブタノール生合成経路のステップには、以下の変換が含まれる:
−例えばアセト乳酸シンターゼにより触媒されるとおりの、ピルベートからアセトラクテートへの変換(図1を参照、その中の経路ステップa)、
−例えばKARIにより触媒されるとおりの、アセトラクテートから2,3−ジヒドロキシイソバレレートへの変換(図1を参照、その中の経路ステップb);
−例えばジヒドロキシ酸デヒドラターゼ(DHAD)とも称されるアセトヒドロキシ酸デヒドラターゼにより触媒されるとおりの、2,3−ジヒドロキシイソバレレートから2−ケトイソバレレートへの変換(図1を参照、その中の経路ステップc);
−例えばケトイソ吉草酸デカルボキシラーゼ(「kivD」)とも称される分枝鎖2−ケト酸デカルボキシラーゼにより触媒されるとおりの、2−ケトイソバレレートからイソブチルアルデヒドへの変換(図1を参照、その中の経路ステップd);及び
−例えば分枝鎖アルコールデヒドロゲナーゼにより触媒されるとおりの、イソブチルアルデヒドからイソブタノールへの変換(図1を参照、その中の経路ステップe)。
i)ピルベートからアセトラクテートへの変換、(経路ステップa)
ii)アセトラクテートから2,3−ジヒドロキシイソバレレートへの変換、(経路ステップb)
iii)2,3−ジヒドロキシイソバレレートからα−ケトイソバレレートへの変換、(経路ステップc)
iv)α−ケトイソバレレートからイソブチリル−CoAへの変換、(経路ステップf)
v)イソブチリル−CoAからイソブチルアルデヒドへの変換、(経路ステップg)、及び
vi)イソブチルアルデヒドからイソブタノールへの変換;(経路ステップe)
i)ピルベートからアセトラクテートへの変換、(経路ステップa)
ii)アセトラクテートから2,3−ジヒドロキシイソバレレートへの変換、(経路ステップb)
iii)2,3−ジヒドロキシイソバレレートからα−ケトイソバレレートへの変換、(経路ステップc)
iv)α−ケトイソバレレートからバリンへの変換、(経路ステップh)
v)バリンからイソブチルアミンへの変換、(経路ステップi)
vi)イソブチルアミンからイソブチルアルデヒドへの変換、(経路ステップj)、及び
vii)イソブチルアルデヒドからイソブタノールへの変換:(経路ステップe)
ピルビン酸デカルボキシラーゼ遺伝子の機能欠失を用いることで、生合成生成物経路に利用されるピルベートの利用可能性が高められている。例えば、米国特許出願公開第2007/0031950 A1号明細書は、1つ以上のピルビン酸デカルボキシラーゼ遺伝子の破壊及びD−乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の発現を含む酵母株を開示し、この酵母株はD−乳酸の生成に用いられる。米国特許出願公開第2005/0059136 A1号明細書は、ピルビン酸デカルボキシラーゼ活性を有しないグルコース耐性二炭素源非依存性(GCSI)酵母株を開示し、この酵母株は外因性乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子を有し得る。Nevoigt and Stahl(Yeast 12:1331−1337(1996))は、サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)におけるピルビン酸デカルボキシラーゼの減少及びNAD依存性グリセロール−3−リン酸デヒドロゲナーゼの増加がグリセロール収率に及ぼす影響について記載している。米国特許出願公開第20090305363号明細書は、サイトゾルに局在するアセト乳酸シンターゼが発現し、且つピルビン酸デカルボキシラーゼ活性が実質的に消失するように酵母を操作することによるピルベートからアセトラクテートへの変換の増加を開示している。
イソブタノール生成用の微生物宿主は、細菌、シアノバクテリア、糸状菌及び酵母から選択され得る。イソブタノール生成に用いられる微生物宿主は、収率がブタノール毒性によって制限されることのないように、イソブタノールに耐性を有しなければならない。高力価のイソブタノールレベルで代謝的に活性な微生物は、当該技術分野において周知されている。ブタノール生成に用いられる微生物宿主は、収率がブタノール毒性によって制限されることのないように、イソブタノールに耐性を有しなければならない。ブタノール耐性突然変異体がソルベント生成クロストリジウムから単離されているが、他の潜在的に有用な細菌株のブタノール耐性に関しては、利用可能な情報はほとんどない。細菌におけるアルコール耐性の比較に関する研究の多くが、ブタノールの毒性がエタノールより高いことを示唆しており(de Cavalho,et al.,Microsc.Res.Tech.,64:215−22,2004)及び(Kabelitz,et al.,FEMS Microbiol.Lett.,220:223−227,2003、Tomas,et al.,J.Bacteriol.,186:2006−2018,2004)は、クロストリジウム・アセトブチリカム(Clostridium acetobutylicum)における発酵中の1−ブタノールの収率が1−ブタノールの毒性によって制限され得ることを報告している。クロストリジウム・アセトブチリカム(Clostridium acetobutylicum)に対する1−ブタノールの一次的な効果は、膜機能の破壊である(Hermann et al.,Appl.Environ.Microbiol.,50:1238−1243,1985)。
発酵性炭素基質をイソブタノールに変換する酵素経路をコードし得る必要な遺伝子を含む組換え微生物を、当該技術分野において公知の技法を用いて構築することができる。本発明では、本発明のイソブタノール生合成経路の一つの酵素、例えば、アセト乳酸シンターゼ、アセトヒドロキシ酸イソメロレダクターゼ、アセトヒドロキシ酸デヒドラターゼ、分枝鎖α−ケト酸デカルボキシラーゼ、及び分枝鎖アルコールデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子を、上記に記載したとおり、様々な供給源から単離することができる。
大腸菌(E.coli)の形質転換に有用なベクター又はカセットは一般的であり、上記に列挙した会社から市販されている。例えば、イソブタノール生合成経路の遺伝子は、様々な供給源から単離し、修飾pUC19ベクターにクローニングして、大腸菌(E.coli)NM522に形質転換することができる。
一連の大腸菌(E.coli)−ロドコッカス属(Rhodococcus)シャトルベクターが、R.エリスロポリス(R.erythropolis)における発現に利用可能であり、限定はされないが、pRhBR17及びpDA71(Kostichka et al.,Appl.Microbiol.Biotechnol.,62:61−68,2003)が挙げられる。加えて、一連のプロモーターが、R.エリスロポリス(R.erythropolis)における異種遺伝子発現に利用可能である(Nakashima et al.,Appl.Environ.Microbiol.,70:5557−5568,2004及びTao et al.,Appl.Microbiol.Biotechnol.,68:346−354,2005)。R.エリスロポリス(R.erythropolis)における染色体遺伝子の標的遺伝子破壊を、Tao et al.,、前掲、及びBrans et al.(Appl.Environ.Microbiol.,66:2029−2036,2000)により記載される方法を用いて作成することができる。
枯草菌(B.subtilis)における遺伝子発現及び突然変異の作成の方法もまた、当該技術分野において公知である。例えば、イソブタノール生合成経路の遺伝子を様々な供給源から単離し、修飾pUC19ベクターにクローニングして、枯草菌(Bacillus subtilis)BE1010に形質転換することができる。加えて、イソブタノール生合成経路の5つの遺伝子を、発現用に2つのオペロンに分割することができる。経路の3つの遺伝子(bubB、ilvD、及びkivD)は、枯草菌(Bacillus subtilis)BE1010の染色体に組み込むことができる(Payne,et al.,J.Bacteriol.,173,2278−2282,1991)。残りの2つの遺伝子(ilvC及びbdhB)は発現ベクターにクローニングして、組み込まれたイソブタノール遺伝子を有するバチルス属(Bacillus)株に形質転換することができる。
枯草菌(B.subtilis)で複製するプラスミド及びシャトルベクターの多くは、プロトプラスト形質転換又は電気穿孔のいずれかによるB.リケニフォルミス(B.licheniformis)の形質転換に用いることができる。イソブタノールの生成に必要な遺伝子を、プラスミドpBE20又はpBE60誘導体にクローニングすることができる(Nagarajan et al.,Gene,114:121−126,1992)。B.リケニフォルミス(B.licheniformis)を形質転換する方法は、当該技術分野において公知である(Fleming et al.Appl.Environ.Microbiol.,61:3775−3780,1995)。枯草菌(B.subtilis)での発現用に構築されたプラスミドをB.リケニフォルミス(B.licheniformis)に形質転換することにより、イソブタノールを生成する組換え微生物宿主を作製することができる。
枯草菌(B.subtilis)における発現について上記に記載したとおりプラスミドを構築し、それを使用してプロトプラスト形質転換によりパエニバチルス・マセランス(Paenibacillus macerans)を形質転換することにより、イソブタノールを生成する組換え微生物宿主を作製することができる。
アルカリゲネス・ユートロフス(Alcaligenes eutrophus)における遺伝子発現及び突然変異の作成の方法は、当該技術分野において公知である(Taghavi et al.,Appl.Environ.Microbiol.,60:3585−3591,1994)。イソブタノール生合成経路の遺伝子を上記に記載される広宿主域ベクターのいずれかにクローニングし、電気穿孔により、イソブタノールを生成する組換え体を生じさせることができる。アルカリゲネス属(Alcaligenes)におけるポリ(ヒドロキシブチレート)経路については詳細な記載がなされており、アルカリゲネス・ユートロフス(Alcaligenes eutrophus)ゲノムを修飾する様々な遺伝学的技法が公知であり、それらのツールをイソブタノール生合成経路の操作に適用することができる。
シュードモナス・プチダ(Pseudomonas putida)における遺伝子発現方法は、当該技術分野において公知である(例えば、Ben−Bassat et al.,米国特許第6,586,229号明細書(これは参照により本明細書に援用される)を参照)。ブタノール経路遺伝子をpPCU18に挿入することができ、このライゲートされたDNAをエレクトロコンピテントなシュードモナス・プチダ(Pseudomonas putida)DOT−T1 C5aAR1細胞に電気穿孔することにより、イソブタノールを生成する組換え体を生じさせることができる。
サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)における遺伝子発現方法は、当該技術分野において公知である(例えば、Methods in Enzymology,Volume 194,Guide to Yeast Genetics and Molecular and Cell Biology,Part A,2004,Christine Guthrie and Gerald R.Fink,eds.,Elsevier Academic Press,San Diego,CA)。酵母における遺伝子の発現には、典型的にはプロモーターが必要であり、続いて目的の遺伝子、及び転写ターミネーターが必要である。本明細書の実施例で使用されるものを含めて、数多くの酵母プロモーターを、イソブタノール生合成経路をコードする遺伝子用の発現カセットの構築に使用することができ、限定はされないが、構成的プロモーターFBA、GPD、ADH1、及びGPM、並びに誘導性プロモーターGAL1、GAL10、及びCUP1が挙げられる。好適な転写ターミネーターとしては、限定はされないが、FBAt、GPDt、GPMt、ERG10t、GAL1t、CYC1、及びADH1が挙げられる。例えば、イソブタノール生合成経路の好適なプロモーター、転写ターミネーター、及び遺伝子を、米国特許出願公開第20100129886号明細書に記載されるとおり、大腸菌(E.coli)−酵母シャトルベクターにクローニングし、酵母細胞に形質転換することができる。これらのベクターは、大腸菌(E.coli)株及び酵母株のいずれにおける株増殖も可能にする。典型的には、ベクターは、選択可能なマーカーと、所望の宿主における自己複製又は染色体への組込みを可能にする配列とを含む。酵母で典型的に用いられるプラスミドは、シャトルベクターpRS423、pRS424、pRS425、及びpRS426(American Type Culture Collection,Rockville,MD)であり、これらは、大腸菌(E.coli)複製起点(例えば、pMB1)、酵母2μ複製起点、及び栄養選択用マーカーを含む。これらの4つのベクターの選択マーカーは、His3(ベクターpRS423)、Trp1(ベクターpRS424)、Leu2(ベクターpRS425)及びUra3(ベクターpRS426)である。対象のポリペプチドをコードする遺伝子を含む発現ベクターの構築は、大腸菌(E.coli)における標準的な分子クローニング技術によるか、或いは酵母におけるギャップ修復組換え法により行うことができる。
ラクトバチルス属(Lactobacillus)はラクトバチルス目(Lactobacillales)のファミリーに属し、枯草菌(Bacillus subtilis)及びストレプトコッカス属(Streptococcus)の形質転換に用いられる多くのプラスミド及びベクターをラクトバチルス属(Lactobacillus)に使用することができる。好適なベクターの非限定的な例としては、pAMβ1及びその誘導体(Renault et al.,Gene 183:175−182,1996);及び(O’Sullivan et al.,Gene,137:227−231,1993);pMBB1、及びpMBB1の誘導体であるpHW800(Wyckoff et al.,Appl.Environ.Microbiol.,62:1481−1486,1996);接合性プラスミドであるpMG1(Tanimoto et al.,J.Bacteriol.,184:5800−5804,2002);pNZ9520(Kleerebezem et al.,Appl.Environ.Microbiol.,63:4581−4584,1997);pAM401(Fujimoto et al.,Appl.Environ.Microbiol.,67:1262−1267,2001);及びpAT392(Arthur et al.,Antimicrob.Agents Chemother.,38:1899−1903,1994)が挙げられる。ラクトバチルス・プランタルム(Lactobacillus plantarum)由来のいくつかのプラスミドもまた報告されている(van Kranenburg R,et al. Appl.Environ.Microbiol.,71:1223−1230,2005)。
エンテロコッカス属(Enterococcus)はラクトバチルス目(Lactobacillales)のファミリーに属し、乳酸菌種、桿菌種及びレンサ球菌種の形質転換に用いられる多くのプラスミド及びベクターを、エンテロコッカス属(Enterococcus)の種に使用することができる。好適なベクターの非限定的な例としては、pAMβ1及びその誘導体(Renault et al.,Gene,183:175−182,1996);及び(O’Sullivan et al.,Gene,137:227−231,1993);pMBB1、及びpMBB1の誘導体であるpHW800(Wyckoff et al.Appl.Environ.Microbiol.,62:1481−1486,1996);接合性プラスミドであるpMG1(Tanimoto et al.,J.Bacteriol.,184:5800−5804,2002);pNZ9520(Kleerebezem et al.,Appl.Environ.Microbiol.,63:4581−4584,1997);pAM401(Fujimoto et al.,Appl.Environ.Microbiol.,67:1262−1267,2001);及びpAT392(Arthur et al.,Antimicrob.Agents Chemother.,38:,1899−1903,1994)が挙げられる。ラクトコッカス属(Lactococcus)由来のnisA遺伝子を使用するE.フェカリス(E.faecalis)の発現ベクターもまた、使用することができる(Eichenbaum et al.,Appl.Environ.Microbiol.,64:2763−2769,1998)。加えて、E.フェシウム(E.faecium)染色体における遺伝子置換用のベクターを使用することができる(Nallaapareddy et al.,Appl.Environ.Microbiol.,72:334−345,2006)。
本発明における発酵培地は、好適な炭素基質を含有しなければならない。好適な基質としては、限定はされないが、グルコース及びフルクトースなどの単糖類、ラクトース、又はスクロースなどのオリゴ糖類、デンプン又はセルロースなどの多糖類又はこれらの混合物、並びにチーズホエー透過液、コーンスティープリカー、シュガービート廃糖蜜、及び大麦モルトなどの再生可能原料からの未精製混合物を挙げることができる。さらに、炭素基質はまた、二酸化炭素、又は主要な生化学的中間体への代謝変換が実証されているメタノールなどの、一炭素基質であってもよい。一炭素及び二炭素基質に加え、メチロトローフ微生物はまた、メチルアミン、グルコサミン及び様々なアミノ酸などの数多くの他の炭素含有化合物を代謝活性に利用することが知られている。例えば、メチロトローフ酵母は、メチルアミンからの炭素を利用してトレハロース又はグリセロールを形成することが知られている(Bellion et al.,Microb.Growth C1 Compd.,[Int.Symp.],7th(1993),415−32.(eds): Murrell,J.Collin;Kelly,Don P.Publisher: Intercept,Andover,英国)。同様に、カンジダ属(Candida)の様々な種が、アラニン又はオレイン酸を代謝し得る(Sulter et al.,Arch.Microbiol.,153:485−489,1990)。従って、本発明において利用される炭素供給源は多種多様な炭素含有基質を包含し、微生物の選択によってのみ制限されることが企図される。
典型的には細胞は、適切な培地において約25℃〜約40℃の範囲の温度で成長させる。本発明における好適な成長培地は、ルリア−ベルターニ(LB)ブロス、サブローデキストロース(SD)ブロス又は酵母培地(YM)ブロスなどの一般的な市販の調製培地である。他の限定又は合成成長培地もまた使用することができ、特定の微生物の成長に適切な培地は微生物学又は発酵科学分野の当業者に周知されている。カタボライト抑制を直接的又は間接的に調節することが知られる薬剤、例えば、環状アデノシン2’,3’−一リン酸(cAMP)の使用もまた、発酵培地に取り入れることができる。
本方法は、バッチ発酵方法を用いる。古典的なバッチ発酵は、培地の組成が発酵開始時に設定され、発酵中に人為的な改変を受けない閉鎖系である。従って、発酵開始時、培地に所望の1つ又は複数の微生物を接種し、その系に何も加えることなく発酵を生じさせる。しかしながら、典型的には「バッチ」発酵は、炭素源の添加に関するバッチであり、多くの場合にpH及び酸素濃度などの要素の制御が試みられる。バッチ系では、その系の代謝産物及びバイオマス組成物が、発酵の停止時まで絶えず変化する。バッチ培養物内では、細胞は静止遅滞期を通じて調節され、高成長の対数期に至り、最終的に定常期に至って、そこで成長速度が低下し又は停止する。処理されない場合、定常期の細胞は最終的には死滅し得る。対数期の細胞は、概して最終生成物又は中間体の生成のバルクに関与する。
生物学的に生成されたイソブタノールは、ABE発酵の技術分野において公知の方法を用いて発酵培地から単離することができる(例えば、Durre,Appl.Microbiol.Biotechnol.49:639−648(1998)、Groot et al.,Process.Biochem.27:61−75(1992)、及びこれらの中の参考文献を参照)。例えば、発酵培地から遠心、ろ過、デカンテーションなどによって固形物を取り除くことができる。次に、蒸留、共沸蒸留、液液抽出、吸着、ガスストリッピング、膜蒸発、又はパーベーパレイションなどの方法を用いて、イソブタノールを発酵培地から単離することができる。
本明細書に記載し及び実証するとおり、本出願者らは、イソブタノール生成経路での使用に適したKARI酵素変異体を発見した。
細菌培養物の維持及び成長に好適な材料及び方法もまた、当該技術分野において周知されている。以下の実施例での使用に好適な技法は、Manual of Methods for General Bacteriology,Phillipp Gerhardt,R.G.E.Murray,Ralph N.Costilow,Eugene W.Nester,Willis A.Wood,Noel R.Krieg and G.Briggs Phillips,eds.,American Society for Microbiology,Washington,DC.,1994、又はThomas D.BrockによるBiotechnology:A Textbook of Industrial Microbiology,Second Edition,Sinauer Associates,Inc.,Sunderland,MA,1989を参照することができる。細菌細胞の成長及び維持に用いる全ての試薬、制限酵素及び材料は、特記されない限り、Aldrich Chemicals(Milwaukee,WI)、BD Diagnostic Systems(Sparks,MD)、Life Technologies(Rockville,MD)、又はSigma Chemical Company(St.Louis,MO)から入手した。
PNY2068及びPNY2115に関するさらなる遺伝子操作の宿主細胞として、サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)PNY0827株を使用する。PNY0827は、ブダペスト条約に基づきAmerican Type Culture Collection,Patent Depository 10801 University Boulevard,Manassas,VA 20110−2209にて2011年9月22日にATCCに寄託された特許寄託番号PTA−12105を有するサッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)に由来する株を参照する。
内因性URA3コード領域を欠失させるため、インビボでの相同組換え及び続くKANMX4マーカーの除去を可能にするためloxP部位が隣接するPTEF1−kanMX4−TEF1tカセットを含むpLA54(配列番号1)から、欠失カセットをPCR増幅した。PCRは、PhusionハイフィデリティPCRマスターミックス(New 英国 BioLabs;Ipswich,MA)並びにプライマーBK505(配列番号2)及びBK506(配列番号3)を使用することにより行った。各プライマーのURA3部分をURA3 ATGの180bp上流の5’領域及びコード領域の78bp下流の3’領域から得て、kanMX4カセットの組込みによりURA3コード領域の置換が生じるようにした。PCR産物を、標準的な遺伝学的技法(Methods in Yeast Genetics,2005,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY,pp.201−202)を用いてPNY0827に形質転換し、30℃の2%グルコース及び100μg/mlジェネティシン添加YEP培地で形質転換体を選択した。プライマーLA468(配列番号4)及びLA492(配列番号5)によるコロニーPCRによって形質転換体をスクリーニングし、組込みカセットの存在を確認した。遺伝子型MATa/α URA3/ura3::loxP−kanMX4−loxPを有するヘテロ接合二倍体:NYLA98が得られた。半数体を得るため、標準方法(Codon AC,Gasent−Ramirez JM,Benitez T.「パン酵母サッカロミセス・セレビシエにおける胞子形成及び四分子形成の頻度に影響を及ぼす因子(Factors which affect the frequency of sporulation and tetrad formation in Saccharomyces cerevisiae baker’s yeast)」、Appl Environ Microbiol.1995 PMID:7574601)を用いてNYLA98を胞子形成させた。マイクロマニピュレータを使用して四分子を切断し、2%グルコース添加富栄養YPE培地で成長させた。4つの生存胞子を含む四分子をウラシル不含2%グルコース添加合成完全培地にパッチし、プライマーAK109−1(配列番号6)、AK109−2(配列番号7)、及びAK109−3(配列番号8)を使用した多重コロニーPCRによって交配型を確認した。得られた同定半数体株は、NYLA103(これは遺伝子型:MATα ura3Δ::loxP−kanMX4−loxPを有する)、及びNYLA106(これは遺伝子型:MATa ura3Δ::loxP−kanMX4−loxPを有する)と命名した。
内因性HIS3コード領域を欠失させるため、スカーレス欠失カセットを使用した。スカーレスなHIS3欠失用のPCRカセットの4つの断片を、PhusionハイフィデリティPCRマスターミックス(New 英国 BioLabs;Ipswich,MA)、及び鋳型として、Gentra Puregene Yeast/Bactキット(Qiagen;Valencia,CA)で調製したCEN.PK 113−7DゲノムDNAを使用して増幅した。HIS3断片Aは、プライマーoBP452(配列番号9)、及びHIS3断片Bの5’末端と相同性を有する5’テールを含むプライマーoBP453(配列番号10)で増幅した。HIS3断片Bは、HIS3断片Aの3’末端と相同性を有する5’テールを含むプライマーoBP454(配列番号11)、及びHIS3断片Uの5’末端と相同性を有する5’テールを含むプライマーoBP455(配列番号12)で増幅した。HIS3断片Uは、HIS3断片Bの3’末端と相同性を有する5’テールを含むプライマーoBP456(配列番号13)、及びHIS3断片Cの5’末端と相同性を有する5’テールを含むプライマーoBP457(配列番号14)で増幅した。HIS3断片Cは、HIS3断片Uの3’末端と相同性を有する5’テールを含むプライマーoBP458(配列番号15)、及びプライマーoBP459(配列番号16)で増幅した。PCR産物はPCR精製キット(Qiagen)で精製した。オーバーラップPCRにより、HIS3断片AとHIS3断片Bとを混合し、プライマーoBP452(配列番号9)及びoBP455(配列番号12)で増幅して、HIS3断片ABを作成した。オーバーラップPCRにより、HIS3断片UとHIS3断片Cとを混合し、プライマーoBP456(配列番号13)及びoBP459(配列番号16)で増幅して、HIS3断片UCを作成した。得られたPCR産物をアガロースゲルと、続いてゲル抽出キット(Qiagen)で精製した。オーバーラップPCRにより、HIS3断片ABとHIS3断片UCとを混合し、プライマーoBP452(配列番号9)及びoBP459(配列番号16)で増幅して、HIS3 ABUCカセットを作成した。PCR産物をPCR精製キット(Qiagen)で精製した。NYLA106のコンピテント細胞をHIS3 ABUC PCRカセットで形質転換し、30℃のウラシル不含2%グルコース添加合成完全培地に播いた。30℃のヒスチジン不含2%グルコース添加合成完全培地におけるレプリカ平板法により形質転換体をスクリーニングして、組込みが正しいことを確認した。ゲノムDNA調製を行い、5’末端用のプライマーoBP460(配列番号17)及びLA135(配列番号18)及び3’末端用のプライマーoBP461(配列番号19)及びLA92(配列番号20)を使用するPCRによって組込みを確認した。URA3マーカーは、標準プロトコルに従い30℃の2%グルコース及び5−FOA添加合成完全培地に播くことにより再利用した。5−FOAプレートからのコロニーをSD −URA培地にパッチして成長がないことを確認し、マーカーの除去を確かめた。PNY2003と命名される得られた同定株は、遺伝子型:MATa ura3Δ::loxP−kanMX4−loxP his3Δを有する。
内因性PDC1コード領域を欠失させるため、インビボでの相同組換え及び続くURA3マーカーの除去を可能にするため変性loxP部位が隣接するURA3マーカーを含むpLA59(配列番号21)から、欠失カセットをPCR増幅した。PCRは、PhusionハイフィデリティPCRマスターミックス(New 英国 BioLabs;Ipswich,MA)並びにプライマーLA678(配列番号22)及びLA679(配列番号23)を使用することにより行った。各プライマーのPDC1部分は、PDC1開始コドンの50bp下流の5’領域及び終止コドンの50bp上流の3’領域から得て、URA3カセットの組込みによりPDC1コード領域の置換が生じ、しかしコード領域の最初の50bp及び最後の50bpは残るようにした。PCR産物を標準的な遺伝学的技法を用いてPNY2003に形質転換し、30℃のウラシル不含2%グルコース添加合成完全培地で形質転換体を選択した。5’コード領域の外部のプライマーLA337(配列番号24)及びURA3の内部プライマーであるLA135(配列番号18)を使用するコロニーPCRによって形質転換体をスクリーニングし、組込みが正しいことを確認した。次に、PDC1コード領域の内部のプライマーLA692(配列番号25)及びLA693(配列番号26)を使用するコロニーPCRによって陽性形質転換体をスクリーニングした。URA3マーカーは、GAL1プロモーター下にあるCREリコンビナーゼを含むpLA34(配列番号27)で形質転換することにより再利用し、30℃のヒスチジン不含2%グルコース添加合成完全培地に播いた。形質転換体を0.5%ガラクトース添加富栄養培地に播き、リコンビナーゼを誘導した。コロニーをウラシル不含2%グルコース添加合成完全培地にパッチして成長がないことを確認し、マーカーの除去を確かめた。PNY2008と命名される得られた同定株は、遺伝子型:MATa ura3Δ::loxP−kanMX4−loxP his3Δ pdc1Δ::loxP71/66を有する。
内因性PDC5コード領域を欠失させるため、インビボでの相同組換え及び続くURA3マーカーの除去を可能にするため変性loxP部位が隣接するURA3マーカーを含むpLA59(配列番号21)から、欠失カセットをPCR増幅した。PCRは、PhusionハイフィデリティPCRマスターミックス(New 英国 BioLabs;Ipswich,MA)並びにプライマーLA722(配列番号28)及びLA733(配列番号29)を使用することにより行った。各プライマーのPDC5部分は、PDC5開始コドンの50bp上流の5’領域及び終止コドンの50bp下流の3’領域から得て、URA3カセットの組込みによりPDC5コード領域全体の置換が生じるようにした。PCR産物を標準的な遺伝学的技法を用いてPNY2008に形質転換し、30℃のウラシル不含1%エタノール添加合成完全培地で形質転換体を選択した。5’コード領域の外部のプライマーLA453(配列番号30)及びURA3の内部プライマーLA135(配列番号18)を使用するコロニーPCRによって形質転換体をスクリーニングし、組込みが正しいことを確認した。次に、PDC5コード領域の内部のプライマーLA694(配列番号31)及びLA695(配列番号32)を使用するコロニーPCRによって陽性形質転換体をスクリーニングした。URA3マーカーは、GAL1プロモーター下にあるCREリコンビナーゼを含むpLA34(配列番号27)で形質転換することにより再利用し、30℃のヒスチジン不含1%エタノール添加合成完全培地に播いた。形質転換体を1%エタノール及び0.5%ガラクトース添加富栄養YEP培地に播き、リコンビナーゼを誘導した。ウラシル不含1%エタノール添加合成完全培地にコロニーをパッチして成長がないことを確認し、マーカーの除去を確かめた。PNY2009と命名される得られた同定株は、遺伝子型:MATa ura3Δ::loxP−kanMX4−loxP his3Δ pdc1Δ::loxP71/66 pdc5Δ::loxP71/66を有する。
FRA2欠失は、コード配列の3’末端から250ヌクレオチドを欠失させ、FRA2コード配列の最初の113ヌクレオチドをインタクトなまま残すように設計した。欠失の7ヌクレオチド下流にインフレームの終止コドンが存在した。スカーレスなFRA2欠失用のPCRカセットの4つの断片を、PhusionハイフィデリティPCRマスターミックス(New 英国 BioLabs;Ipswich,MA)、及び鋳型として、Gentra Puregene Yeast/Bactキット(Qiagen;Valencia,CA)で調製したCEN.PK 113−7DゲノムDNAを使用して増幅した。FRA2断片Aは、プライマーoBP594(配列番号33)及びFRA2断片Bの5’末端と相同性を有する5’テールを含むプライマーoBP595(配列番号34)で増幅した。FRA2断片Bは、FRA2断片Aの3’末端と相同性を有する5’’テールを含むプライマーoBP596(配列番号35)及びFRA2断片Uの5’末端と相同性を有する5’テールを含むプライマーoBP597(配列番号36)で増幅した。FRA2断片Uは、FRA2断片Bの3’末端と相同性を有する5’テールを含むプライマーoBP598(配列番号37)及びFRA2断片Cの5’末端と相同性を有する5’テールを含むプライマーoBP599(配列番号38)で増幅した。FRA2断片Cは、FRA2断片Uの3’末端と相同性を有する5’テールを含むプライマーoBP600(配列番号39)、及びプライマーoBP601(配列番号40)で増幅した。PCR産物はPCR精製キット(Qiagen)で精製した。オーバーラップPCRにより、FRA2断片AとFRA2断片Bとを混合し、プライマーoBP594(配列番号33)及びoBP597(配列番号36)で増幅して、FRA2断片ABを作成した。オーバーラップPCRにより、FRA2断片UとFRA2断片Cとを混合し、プライマーoBP598(配列番号37)及びoBP601(配列番号40)で増幅して、FRA2断片UCを作成した。得られたPCR産物はアガロースゲルと、続いてゲル抽出キット(Qiagen)で精製した。オーバーラップPCRにより、FRA2断片ABとFRA2断片UCとを混合し、プライマーoBP594(配列番号33)及びoBP601(配列番号40)で増幅して、FRA2 ABUCカセットを作成した。PCR産物はPCR精製キット(Qiagen)で精製した。
loxP71−URA3−loxP66マーカーを、pLA59(配列番号29)からPhusion DNAポリメラーゼ(New 英国 BioLabs;Ipswich,MA)を使用してPCR増幅し、30℃のSE −URAプレートにおいてLA811×817(配列番号43、44)及びLA812×818(配列番号45、46)2ミクロンプラスミド断片(CEN.PK 113−7D;Centraalbureau voor Schimmelcultures(CBS)Fungal Biodiversity Centre由来の天然2ミクロンプラスミドから増幅した)と共に株PNY2037に形質転換した。得られた株PNY2037 2μ::loxP71−URA3−loxP66をpLA34(pRS423::cre)(pLA34とも称される)(配列番号27)で形質転換し、30℃のSE −HIS −URAプレートで選択した。形質転換体をYP−1%ガラクトースプレートにパッチし、30℃で48時間成長させることにより、Creリコンビナーゼ発現を誘導した。次に個々のコロニーをSE −URA、SE −HIS、及びYPEプレートにパッチし、URA3マーカーの除去を確認した。得られた同定株PNY2050は、遺伝子型:MATa ura3Δ::loxP−kanMX4−loxP,his3Δ pdc1Δ::loxP71/66 pdc5Δ::loxP71/66 fra2Δ 2ミクロンを有する。
PNY2068[MATa ura3Δ::loxP−kanMX4−loxP his3Δ pdc1Δ::loxP71/66 pdc5Δ::loxP71/66 fra2Δ 2ミクロン gpd2Δ ymr226cΔ::PFBA1−alsS_Bs−CYC1t−loxP71/66 ald6Δ::(UAS)PGK1−PFBA1−kivD_Lg−TDH3t−loxP71/66 adh1Δ::PILV5−ADH_Bi(y)−ADH1t−loxP71/66 pdc1Δ::PPDC1−ADH_Bi(y)−ADH1t−loxP71/66]を、PNY2050から以下のとおり構築した。
内因性GPD2コード領域を欠失させるため、インビボでの相同組換え及び続くURA3マーカーの除去を可能にするため変性loxP部位が隣接するURA3マーカーを含むpLA59(配列番号21)から、欠失カセットをPCR増幅した。PCRは、PhusionハイフィデリティPCRマスターミックス(New 英国 BioLabs;Ipswich,MA)並びにプライマーLA512(配列番号47)及びLA513(配列番号48)を使用することにより行った。各プライマーのGPD2部分は、GPD2開始コドンの50bp上流の5’領域及び終止コドンの50bp下流の3’領域から得て、URA3カセットの組込みによりGPD2コード領域全体の置換が生じるようにした。PCR産物を標準的な遺伝学的技法を用いてPNY2050に形質転換し、30℃のウラシル不含1%エタノール添加合成完全培地で形質転換体を選択した。5’コード領域の外部のプライマーLA516(配列番号49)及びURA3の内部のLA135(配列番号18)を使用するコロニーPCRによって形質転換体をスクリーニングし、組込みが正しいことを確認した。次に、GPD2コード領域の内部のプライマーLA514(配列番号50)及びLA515(配列番号51)を使用するコロニーPCRによって陽性形質転換体をスクリーニングした。URA3マーカーは、GAL1プロモーター下にあるCREリコンビナーゼを含むpLA34(配列番号27)で形質転換することにより再利用し、30℃のヒスチジン不含1%エタノール添加合成完全培地に播いた。1%エタノール及び0.5%ガラクトース添加富栄養培地に形質転換体を播き、リコンビナーゼを誘導した。ウラシル不含1%エタノール添加合成完全培地にコロニーをパッチして成長がないことを確認し、マーカーの除去を確かめた。得られた同定株PNY2056は、遺伝子型:MATa ura3Δ::loxP−kanMX4−loxP his3Δ pdc1Δ::loxP71/66 pdc5Δ::loxP71/66 fra2Δ 2ミクロン gpd2Δを有する。
内因性YMR226Cコード領域を欠失させるため、枯草菌(Bacillus subtilis)種由来の遺伝子アセト乳酸シンターゼを、FBA1プロモーター及びCYC1ターミネーター、並びにインビボでの相同組換え及び続くURA3マーカーの除去を可能にするため変性loxP部位が隣接するURA3マーカーと共に含むpLA71(配列番号52)から、組込みカセットをPCR増幅した。PCRは、Kapa Biosystems,Woburn,MAからのKAPA HiFi並びにプライマーLA829(配列番号53)及びLA834(配列番号54)を使用することにより行った。各プライマーのYMR226C部分は、コード配列の最初の60bp及び終止コドンの409bp上流の65bpから得た。PCR産物を標準的な遺伝学的技法を用いてPNY2056に形質転換し、30℃のウラシル不含1%エタノール添加合成完全培地で形質転換体を選択した。5’コード領域の外部のプライマーN1257(配列番号55)及びFBA1プロモーターの内部のLA740(配列番号61)を使用するコロニーPCRによって形質転換体をスクリーニングし、組込みが正しいことを確認した。次に、YMR226Cコード領域の内部のプライマーN1257(配列番号55)及びLA830(配列番号56)、及び3’コード領域の外部のプライマーLA830(配列番号56)、及びURA3マーカーの内部のLA92(配列番号20)を使用するコロニーPCRによって陽性形質転換体をスクリーニングした。URA3マーカーは、GAL1プロモーター下にあるCREリコンビナーゼを含むpLA34(配列番号27)で形質転換することにより再利用し、30℃のヒスチジン不含1%エタノール添加合成完全培地に播いた。1%エタノール及び0.5%ガラクトース添加富栄養培地に形質転換体を播き、リコンビナーゼを誘導した。ウラシル不含1%エタノール添加合成完全培地にコロニーをパッチして成長がないことを確認し、マーカーの除去を確かめた。得られた同定株PNY2061は、遺伝子型:MATa ura3Δ::loxP−kanMX4−loxP his3Δ pdc1Δ::loxP71/66 pdc5Δ::loxP71/66 fra2Δ 2ミクロン gpd2Δ ymr226cΔ::PFBA1−alsS_Bs−CYC1t−loxP71/66を有する。
内因性ALD6コード領域を欠失させるため、リステリア・グレイ(Listeria grayi)種由来のkivD遺伝子を、ハイブリッドFBA1プロモーター及びTDH3ターミネーター、並びにインビボでの相同組換え及び続くURA3マーカーの除去を可能にするため変性loxP部位が隣接するURA3マーカーと共に含むpLA78(配列番号57)から、組込みカセットをPCR増幅した。PCRは、Kapa Biosystems,Woburn,MAからのKAPA HiFi並びにプライマーLA850(配列番号58)及びLA851(配列番号59)を使用することにより行った。各プライマーのALD6部分は、コード配列の最初の65bp及びコード領域の最後の63bpから得た。PCR産物を標準的な遺伝学的技法を用いてPNY2061に形質転換し、30℃のウラシル不含1%エタノール添加合成完全培地で形質転換体を選択した。5’コード領域の外部のプライマーN1262(配列番号60)及びFBA1プロモーターの内部のLA740(配列番号61)を使用するコロニーPCRによって形質転換体をスクリーニングし、組込みが正しいことを確認した。次に、3’コード領域の外部のプライマーN1263(配列番号62)及びURA3マーカーの内部のLA92(配列番号20)を使用するコロニーPCRによって陽性形質転換体をスクリーニングした。URA3マーカーは、GAL1プロモーター下にあるCREリコンビナーゼを含むpLA34(配列番号27)で形質転換することにより再利用し、30℃のヒスチジン不含1%エタノール添加合成完全培地に播いた。1%エタノール及び0.5%ガラクトース添加富栄養培地に形質転換体を播き、リコンビナーゼを誘導した。ウラシル不含1%エタノール添加合成完全培地にコロニーをパッチして成長がないことを確認し、マーカーの除去を確かめた。得られた同定株PNY2065は、遺伝子型:MATa ura3Δ::loxP−kanMX4−loxP his3Δ pdc1Δ::loxP71/66 pdc5Δ::loxP71/66 fra2Δ 2ミクロン gpd2Δ ymr226cΔ::PFBA1−alsS_Bs−CYC1t−loxP71/66 ald6Δ::(UAS)PGK1−PFBA1−kivD_Lg−TDH3t−loxP71を有する。
ADH1は、サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)に存在する内因性アルコールデヒドロゲナーゼである。以下に記載するとおり、内因性ADH1をベイジェリンキア・インディカ(Beijerinckii indica)由来のアルコールデヒドロゲナーゼ(alchol dehydrogenase)(ADH)に置換した。内因性ADH1コード領域を欠失させるため、ベイジェリンキア・インディカ(Beijerinckii indica)種由来のアルコールデヒドロゲナーゼを、ILV5プロモーター及びADH1ターミネーター、並びにインビボでの相同組換え及び続くURA3マーカーの除去を可能にするため変性loxP部位が隣接するURA3マーカーと共に含むpLA65(配列番号63)から、組込みカセットをPCR増幅した。PCRは、Kapa Biosystems,Woburn,MAからのKAPA HiFi並びにプライマーLA855(配列番号64)及びLA856(配列番号65)を使用することにより行った。各プライマーのADH1部分は、ADH1開始コドンの50bp上流の5’領域及びコード領域の最後の50bpから得た。PCR産物を標準的な遺伝学的技法を用いてPNY2065に形質転換し、30℃のウラシル不含1%エタノール添加合成完全培地で形質転換体を選択した。5’コード領域の外部のプライマーLA414(配列番号66)及びILV5プロモーターの内部のLA749(配列番号67)を使用するコロニーPCRによって形質転換体をスクリーニングし、組込みが正しいことを確認した。次に、3’コード領域の外部のプライマーLA413(配列番号68)及びURA3マーカーの内部のLA92(配列番号20)を使用するコロニーPCRによって陽性形質転換体をスクリーニングした。URA3マーカーは、GAL1プロモーター下にあるCREリコンビナーゼを含むpLA34(配列番号27)で形質転換することにより再利用し、30℃のヒスチジン不含1%エタノール添加合成完全培地に播いた。1%エタノール及び0.5%ガラクトース添加富栄養培地に形質転換体を播き、リコンビナーゼを誘導した。ウラシル不含1%エタノール添加合成完全培地にコロニーをパッチして成長がないことを確認し、マーカーの除去を確かめた。PNY2066と命名される得られた同定株は、遺伝子型:MATa ura3Δ::loxP−kanMX4−loxP his3Δ pdc1Δ::loxP71/66 pdc5Δ::loxP71/66 fra2Δ 2ミクロン gpd2Δ ymr226cΔ::PFBA1−alsS_Bs−CYC1t−loxP71/66 ald6Δ::(UAS)PGK1−PFBA1−kivD_Lg−TDH3t−loxP71/66 adh1Δ::PILV5−ADH_Bi(y)−ADH1t−loxP71/66を有する。
ADHのさらなるコピーをpdc1Δ領域に組み込むため、ベイジェリンキア・インディカ(Beijerinckii indica)種由来のアルコールデヒドロゲナーゼを、ADH1ターミネーター、並びにインビボでの相同組換え及び続くURA3マーカーの除去を可能にするため変性loxP部位が隣接するURA3マーカーと共に含むpLA65(配列番号63)から、組込みカセットをPCR増幅した。PCRは、Kapa Biosystems,Woburn,MAからのKAPA HiFi並びにプライマーLA860(配列番号69)及びLA679(配列番号23)を使用することにより行った。各プライマーのPDC1部分は、PDC1開始コドンの60bp上流の5’領域及び終止コドンの103bp上流の50bpから得た。内因性PDC1プロモーターを使用した。PCR産物を標準的な遺伝学的技法を用いてPNY2066に形質転換し、30℃のウラシル不含1%エタノール添加合成完全培地で形質転換体を選択した。5’コード領域の外部のプライマーLA337(配列番号24)及びBiADH遺伝子の内部のN1093(配列番号70)を使用するコロニーPCRによって形質転換体をスクリーニングし、組込みが正しいことを確認した。次に、3’コード領域の外部のプライマーLA681(配列番号71)及びURA3マーカーの内部のLA92(配列番号20)を使用するコロニーPCRによって陽性形質転換体をスクリーニングした。URA3マーカーは、GAL1プロモーター下にあるCREリコンビナーゼを含むpLA34(配列番号27)で形質転換することにより再利用し、30℃のヒスチジン不含1%エタノール添加合成完全培地に播いた。1%エタノール及び0.5%ガラクトース添加富栄養培地に形質転換体を播き、リコンビナーゼを誘導した。ウラシル不含1%エタノール添加合成完全培地にコロニーをパッチして成長がないことを確認し、マーカーの除去を確かめた。得られた同定株をPNY2068と命名し、これは遺伝子型:MATa ura3Δ::loxP−kanMX4−loxP his3Δ pdc1Δ::loxP71/66 pdc5Δ::loxP71/66 fra2Δ 2ミクロン gpd2Δ ymr226cΔ::PFBA1−alsS_Bs−CYC1t−loxP71/66 ald6Δ::(UAS)PGK1−PFBA1−kivD_Lg−TDH3t−loxP71/66 adh1Δ::PILV5−ADH_Bi(y)−ADH1t−loxP71/66 pdc1Δ::PPDC1−ADH_Bi(y)−ADH1t−loxP71/66を有する。
PNY2050からのPNY2115[MATa ura3Δ::loxP his3Δ pdc5Δ::loxP66/71 fra2Δ 2ミクロンプラスミド(CEN.PK2)pdc1Δ::P[PDC1]−ALS|alsS_Bs−CYC1t−loxP71/66 pdc6Δ::(UAS)PGK1−P[FBA1]−KIVD|Lg(y)−TDH3t−loxP71/66 adh1Δ::P[ADH1]−ADH|Bi(y)−ADHt−loxP71/66 fra2Δ::P[ILV5]−ADH|Bi(y)−ADHt−loxP71/66 gpd2Δ::loxP71/66]の構築は、以下のとおりであった。
内因性PDC1プロモーターを使用してPNY2050のpdc1Δ::loxP66/71遺伝子座にalsSを組み込むため、枯草菌(Bacillus subtilis)種由来の遺伝子アセト乳酸シンターゼを、FBA1プロモーター及びCYC1ターミネーター、並びにインビボでの相同組換え及び続くURA3マーカーの除去を可能にするため変性loxP部位が隣接するURA3マーカーと共に含むpLA71(配列番号52)から、組込みカセットをPCR増幅した。PCRは、KAPA HiFi並びにプライマー895(配列番号72)及び679(配列番号73)を使用することにより行った。各プライマーのPDC1部分は、コード配列の上流の60bp及び終止コドンの53bp上流の50bpから得た。PCR産物を標準的な遺伝学的技法を用いてPNY2050に形質転換し、30℃のウラシル不含1%エタノール添加合成完全培地で形質転換体を選択した。3’コード領域の外部のプライマー681(配列番号74)及びURA3遺伝子の内部の92(配列番号75)を使用するコロニーPCRによって形質転換体をスクリーニングし、組込みが正しいことを確認した。次に陽性形質転換体をゲノムDNA用に調製し、プライマーN245(配列番号76)及びN246(配列番号77)を使用するPCRによりスクリーニングした。URA3マーカーは、GAL1プロモーター下にあるCREリコンビナーゼを含むpLA34(配列番号27)で形質転換することにより再利用し、30℃のヒスチジン不含1%エタノール添加合成完全培地に播いた。1%エタノール及び0.5%ガラクトース添加富栄養培地に形質転換体を播き、リコンビナーゼを誘導した。ウラシル不含1%エタノール添加合成完全培地にコロニーをパッチして成長がないことを確認し、マーカーの除去を確かめた。PNY2090と命名される得られた同定株は、遺伝子型MATa ura3Δ::loxP,his3Δ、pdc1Δ::loxP71/66,pdc5Δ::loxP71/66 fra2Δ 2ミクロン pdc1Δ::P[PDC1]−ALS|alsS_Bs−CYC1t−loxP71/66を有する。
内因性PDC6コード領域を欠失させるため、リステリア・グレイ(Listeria grayi)種由来のkivD遺伝子を、ハイブリッドFBA1プロモーター及びTDH3ターミネーター、並びにインビボでの相同組換え及び続くURA3マーカーの除去を可能にするため変性loxP部位が隣接するURA3マーカーと共に含むpLA78(配列番号57)から、組込みカセットをPCR増幅した。PCRは、KAPA HiFi並びにプライマー896(配列番号78)及び897(配列番号79)を使用することにより行った。各プライマーのPDC6部分は、コード配列の60bp上流及びコード領域の59bp下流から得た。PCR産物を標準的な遺伝学的技法を用いてPNY2090に形質転換し、30℃のウラシル不含1%エタノール添加合成完全培地で形質転換体を選択した。PDC6遺伝子の内部プライマーであるプライマー365(配列番号80)及び366(配列番号81)を使用するコロニーPCRによって形質転換体をスクリーニングし、組込みが正しいことを確認した。次に産物が存在しない形質転換体を、コロニーPCR、遺伝子の5’末端の外部のN638(配列番号82)及びFBA1プロモーターの内部の740(配列番号83)によってスクリーニングした。次に陽性形質転換体をゲノムDNA用に調製し、PDC6コード配列に対する2つの外部プライマーによるPCRによってスクリーニングした。陽性の組込み体は4720bpの産物を産生し得る一方、PDC6野生型形質転換体は2130bpの産物を産生し得る。URA3マーカーは、GAL1プロモーター下にあるCREリコンビナーゼを含むpLA34で形質転換することにより再利用し、30℃のヒスチジン不含1%エタノール添加合成完全培地に播いた。1%エタノール及び0.5%ガラクトース添加富栄養培地に形質転換体を播き、リコンビナーゼを誘導した。ウラシル不含1%エタノール添加合成完全培地にコロニーをパッチして成長がないことを確認し、マーカーの除去を確かめた。得られた同定株はPNY2093と命名され、遺伝子型MATa ura3Δ::loxP his3Δ pdc5Δ::loxP71/66 fra2Δ 2ミクロン pdc1Δ::P[PDC1]−ALS|alsS_Bs−CYC1t−loxP71/66 pdc6Δ::(UAS)PGK1−P[FBA1]−KIVD|Lg(y)−TDH3t−loxP71/66を有する。
内因性ADH1コード領域を欠失させ、内因性ADH1プロモーターを使用してBiADHを組み込むため、ベイジェリンキア(Beijerinckii)属の種由来のアルコールデヒドロゲナーゼを、ILV5プロモーター及びADH1ターミネーター、並びにインビボでの相同組換え及び続くURA3マーカーの除去を可能にするため変性loxP部位が隣接するURA3マーカーと共に含むpLA65(配列番号63)から、組込みカセットをPCR増幅した。PCRは、KAPA HiFi並びにプライマー856(配列番号84)及び857(配列番号85)を使用することにより行った。各プライマーのADH1部分は、ADH1開始コドンの50bp上流の5’領域及びコード領域の最後の50bpから得た。PCR産物を標準的な遺伝学的技法を用いてPNY2093に形質転換し、30℃のウラシル不含1%エタノール添加合成完全培地で形質転換体を選択した。5’コード領域の外部のプライマーBK415(配列番号86)及びBiADH遺伝子の内部のN1092(配列番号87)を使用するコロニーPCRによって形質転換体をスクリーニングし、組込みが正しいことを確認した。次に、3’コード領域の外部のプライマー413(配列番号88)及びURA3マーカーの内部の92(配列番号75)を使用するコロニーPCRによって陽性形質転換体をスクリーニングした。URA3マーカーは、GAL1プロモーター下にあるCREリコンビナーゼを含むpLA34(配列番号27)で形質転換することにより再利用し、30℃のヒスチジン不含1%エタノール添加合成完全培地に播いた。1%エタノール及び0.5%ガラクトース添加富栄養培地に形質転換体を播き、リコンビナーゼを誘導した。ウラシル不含1%エタノール添加合成完全培地にコロニーをパッチして成長がないことを確認し、マーカーの除去を確かめた。PNY2101と命名される得られた同定株は、遺伝子型MATa ura3Δ::loxP his3Δ pdc5Δ::loxP71/66 fra2Δ 2ミクロン pdc1Δ::P[PDC1]−ALS|alsS_Bs−CYC1t−loxP71/66 pdc6Δ::(UAS)PGK1−P[FBA1]−KIVD|Lg(y)−TDH3t−loxP71/66 adh1Δ::P[ADH1]−ADH|Bi(y)−ADHt−loxP71/66を有する。
PNY2101のfra2Δ遺伝子座にBiADHを組み込むため、ベイジェリンキア・インディカ(Beijerinckii indica)種由来のアルコールデヒドロゲナーゼを、ILV5プロモーター及びADH1ターミネーター、並びにインビボでの相同組換え及び続くURA3マーカーの除去を可能にするため変性loxP部位が隣接するURA3マーカーと共に含むpLA65(配列番号63)から、組込みカセットをPCR増幅した。PCRは、KAPA HiFi並びにプライマー906(配列番号89)及び907(配列番号90)を使用することにより行った。各プライマーのFRA2部分は、ATGを始端とするコード配列の最初の60bp及び終止コドンの56bp下流から得た。PCR産物を標準的な遺伝学的技法を用いてPNY2101に形質転換し、30℃のウラシル不含1%エタノール添加合成完全培地で形質転換体を選択した。5’コード領域の外部のプライマー667(配列番号91)及びILV5プロモーターの内部の749(配列番号92)を使用するコロニーPCRによって形質転換体をスクリーニングし、組込みが正しいことを確認した。URA3マーカーは、GAL1プロモーター下にあるCREリコンビナーゼを含むpLA34(配列番号27)で形質転換することにより再利用し、30℃のヒスチジン不含1%エタノール添加合成完全培地に播いた。1%エタノール及び0.5%ガラクトース添加富栄養培地に形質転換体を播き、リコンビナーゼを誘導した。ウラシル不含1%エタノール添加合成完全培地にコロニーをパッチして成長がないことを確認し、マーカーの除去を確かめた。PNY2110と命名される得られた同定株は、遺伝子型MATa ura3Δ::loxP his3Δ pdc5Δ::loxP66/71 2ミクロン pdc1Δ::P[PDC1]−ALS|alsS_Bs−CYC1t−loxP71/66 pdc6Δ::(UAS)PGK1−P[FBA1]−KIVD|Lg(y)−TDH3t−loxP71/66 adh1Δ::P[ADH1]−ADH|Bi(y)−ADHt−loxP71/66 fra2Δ::P[ILV5]−ADH|Bi(y)−ADHt−loxP71/66を有する。
内因性GPD2コード領域を欠失させるため、インビボでの相同組換え及び続くURA3マーカーの除去を可能にするため変性loxP部位が隣接するURA3マーカーを含むpLA59(配列番号21)から、欠失カセットをPCR増幅した。PCRは、KAPA HiFi並びにプライマーLA512(配列番号47)及びLA513(配列番号48)を使用することにより行った。各プライマーのGPD2部分は、GPD2開始コドンの50bp上流の5’領域及び終止コドンの50bp下流の3’領域から得て、URA3カセットの組込みによりGPD2コード領域全体の置換が生じるようにした。PCR産物を標準的な遺伝学的技法を用いてPNY2110に形質転換し、30℃のウラシル不含1%エタノール添加合成完全培地で形質転換体を選択した。5’コード領域の外部のプライマーLA516(配列番号49)及びURA3の内部のLA135(配列番号18)を使用するコロニーPCRによって形質転換体をスクリーニングし、組込みが正しいことを確認した。次に、GPD2コード領域の内部のプライマーLA514(配列番号50)及びLA515(配列番号51)を使用するコロニーPCRによって陽性形質転換体をスクリーニングした。URA3マーカーは、GAL1プロモーター下にあるCREリコンビナーゼを含むpLA34(配列番号27)で形質転換することにより再利用し、30℃のヒスチジン不含1%エタノール添加合成完全培地に播いた。1%エタノール及び0.5%ガラクトース添加富栄養培地に形質転換体を播き、リコンビナーゼを誘導した。ウラシル不含1%エタノール添加合成完全培地にコロニーをパッチして成長がないことを確認し、マーカーの除去を確かめた。PNY2115と命名される得られた同定株は、遺伝子型MATa ura3Δ::loxP his3Δ pdc5Δ::loxP66/71 fra2Δ 2ミクロン pdc1Δ::P[PDC1]−ALS|alsS_Bs−CYC1t−loxP71/66 pdc6Δ::(UAS)PGK1−P[FBA1]−KIVD|Lg(y)−TDH3t−loxP71/66 adh1Δ::P[ADH1]−ADH|Bi(y)−ADHt−loxP71/66 fra2Δ::P[ILV5]−ADH|Bi(y)−ADHt−loxP71/66 gpd2Δ::loxP71/66を有する。
アナエロスティペス・カッカエ(Anaerostipes caccae)KARI変異体K9SB2_SH(配列番号94)のコンビナトリアル突然変異誘発に、90位及び93位(付番はアナエロスティペス・カッカエ(Anaerostipes caccae)由来の完全長KARI酵素;配列番号93に基づく)を選択した。これらの位置における置換は、以前、K9SB2 ePCRライブラリのスクリーニングで観察された。90位のLys、Ala、Met、Leu、又はTyrと93位のThr、Leu、Ile、Val、又はAlaとの可能な組み合わせの各々を含む一組の変異体を作成した。K9SB2_SH_DHAD(配列番号95)を初期鋳型とする90位及び93位での逐次的な突然変異誘発によって25個の変異体を調製した。いずれの突然変異誘発手順も、突然変異誘発プライマーの混合物によるPCRステップによって開始し、続いてそのPCR産物をメガプライマーとして用いる第2の反応を行った。
90位及び93位におけるコンビナトリアル突然変異誘発から得られた25個のプラスミドを用いて、48ウェルプレートにおいて嫌気条件下で成長する酵母のイソブタノール生成を評価した。イソブタノール生成株は、宿主PNY2259(MATa ura3Δ::loxP his3Δ pdc6Δ pdc1Δ::P[PDC1]−DHAD|ilvD_Sm−PDC1t−P[FBA1]−ALS|alsS_Bs−CYC1t pdc5Δ::P[PDC5]−ADH|sadB_Ax−PDC5t gpd2Δ::loxP fra2Δ::P[PDC1]−ADH|adh_Hl−ADH1t adh1Δ::UAS(PGK1)P[FBA1]−kivD_Lg(y)−ADH1t yprcΔ15Δ::P[PDC5]−ADH|adh_Hl−ADH1t ymr226cΔ ald6Δ::loxP)において、KARI変異体のコード配列を含むプラスミドを形質転換してウラシル不含合成培地(炭素源として1%エタノール)に播くことにより作成した。30℃で3〜5日間インキュベートした後、SE−Uraプレート上に形質転換からの酵母コロニーが現れた。各変異体から少なくとも3つのコロニーを新鮮なSE−Uraプレートにパッチし、30℃でインキュベートした。
好気培養培地:2g/lエタノール含有SE −Ura培地。
嫌気培養培地:10mg/lエルゴステロール、50mM MES緩衝液(pH5.5)、30mg/lチアミン、及び30mg/lニコチン酸を添加した30g/lグルコース及び1g/lエタノール含有SEG −Ura。
48ウェルプレート:Axygen カタログ番号P−5ML−48−C−S、5ml/ウェル総容積、1.5ml/ウェルの培養容積。
SE −Ura寒天プレート上の単一の酵母コロニーを新鮮なSE −Ura寒天プレートにストリークし、高密度の細胞パッチが成長するまで30℃でインキュベートした。最初の好気培養のため、48ウェルプレートにある液体前培養物にこれらの細胞のループを接種した。一晩振盪した後、各ウェルの0.15mlを平底96ウェルプレートに移し、Molecular Devices(Sunnyvale,CA)プレートリーダーで各ウェルの600nmの吸光度を計測することにより、各培養ウェルのOD600を計測した。実験的に決定された検量線に基づく線形変換をこれらのプレートリーダーの計測による光学濃度に当てはめることにより、それらの光学濃度をキュベットベースの分光光度計に相当する吸光度の値に変換した。
90位、93位、及び93位におけるコンビナトリアル突然変異誘発に基づきK9SB2_SHのさらなる誘導体を調製した(付番は完全長アナエロスティペス・カッカエ(Anaerostipes caccae)KARIに基づく)。作成した変異体は、90位にLys、Met、又はTyrを含み、93位にAla、Ile、Thr、又はValを含み、及び94位にIle、Leu、Met、又はPheを含んだ。突然変異誘発は、最初に突然変異誘発プライマーの混合物によるPCRステップ、続いてそのPCR産物をメガプライマーとして用いる一連の反応を行うことにより実施した。表4に掲載する突然変異誘発プライマーは、Integrated DNA Technologies,Inc(Coralville IA)により商業的に合成された。
プライマーを6つのグループに組み合わせた。グループ1:プライマー1〜10;グループ2:プライマー11〜20;グループ3:プライマー21〜30;グループ4:プライマー31〜40;グループ5:プライマー41〜50;グループ6:プライマー51〜58。各プライマーの10μLのアリコートを滅菌1.5mLエッペンドルフチューブに入れた。次にプライマー混合物を分子生物学級の水で、最終的な総濃度が10μMとなるように10倍希釈した。リバースプライマーは、最終濃度が10μMとなるように10倍希釈した。
AgilentのQuikchange Lightning部位特異的突然変異誘発キット(カタログ番号210518;Agilent Technologies,Stratagene Products Division,La Jolla,CA)を用いることにより、プラスミドを増幅して突然変異を導入するPCRステップを実施した。反応は、250ngの精製メガプライマーPCR産物、100ng K9SB2_SH_DHAD鋳型DNA(配列番号95)、5μL 10×反応緩衝液、1.5μL Quik Solution、1μL dNTP混合物及び総反応容積を50μLにするための所定量の分子生物学級の水からなった。プライマー、鋳型、及びddH2Oを除き、ここで使用した全ての試薬が、上記に指示するキットに含まれたものであった。両方の反応に、以下の条件を用いた:開始温度は95℃で30秒、続いて16回の加熱/冷却サイクルであった。各サイクルは、95℃で30秒、55℃で30秒、及び68℃で6.0分からなった。温度サイクルの完了時点で、試料を試料回収まで4℃に保持した。1μlのDpn I(10U/μl)を各反応に添加し、混合物を37℃で1時間インキュベートした。
表4のプライマーの一部を3つのグループに組み合わせた。グループS−1:プライマー31、44、45、48、55、56及び58;グループS−2:プライマー22、25、28及び41;グループS−3:プライマー24、37、40、43及び52。各プライマーの10μLのアリコートを滅菌1.5mLエッペンドルフチューブに入れた。次にプライマー混合物を分子生物学級の水で、最終的な総濃度が10μMとなるように10倍希釈した。リバースプライマーは、最終濃度が10μMとなるように10倍希釈した。
AgilentのQuikchange Lightning部位特異的突然変異誘発キット(カタログ番号210518;Agilent Technologies,Stratagene Products Division,La Jolla,CA)を用いることにより、プラスミドを増幅して突然変異を導入するPCRステップを実施した。反応は、250ngの精製メガプライマーPCR産物、100ng K9SB2_SH_DHAD鋳型DNA(配列番号95)、5μL 10×反応緩衝液、1.5μL Quik Solution、1μL dNTP混合物及び総反応容積を50μLにするための所定量の分子生物学級の水からなった。プライマー、鋳型、及びddH2Oを除き、ここで使用した全ての試薬が、上記に指示するキットに含まれたものであった。両方の反応に、以下の条件を用いた:開始温度は95℃で30秒、続いて16回の加熱/冷却サイクルであった。各サイクルは、95℃で30秒、55℃で30秒、及び68℃で6.0分からなった。温度サイクルの完了時点で、試料を試料回収まで4℃に保持した。1μlのDpn I(10U/μl)を各反応に添加し、混合物を37℃で1時間インキュベートした。
成長培地
酵母株を成長させる手順の中では、3種類の培地を使用した:SE−ura回収プレート、好気前培養培地及び嫌気培養培地。特に注記しない限り、化学物質は全てSigma(St.Louis,MO)から入手した。
好気前培養培地の1.5mLアリコートをAxygen 48ディープウェルプレート(#P−5mL−48−C−S,Axygen,Union City,CA)の各ウェルに分注し、SE−Ura−His寒天プレートで成長した細胞を接種した。滅菌通気性カバー(#60941−086、VWR,Radnor,PA)を使用して培養プレートを密閉した。プレートを30℃のインキュベーターに置き、振盪しながら24時間成長させて、このとき1.5〜2.0の目標OD600値に達した(Spectra Max384 Plusプレートリーダー(Molecular Devices、Sunnyvale,CA)によって決定するとき)。OD600値を記録した。プレートにおいて、Heraeus Multifuge X1R遠心機(Thermo Scientific,Waltham,MA)及びM−20プレートロータ(#41102742、Thermo Scientific,Waltham,MA)を使用した遠心によって細胞をペレット化し、生じた上清は廃棄した。細胞ペレットをCoy嫌気バッグ(Grass Lake,MI)に移し、そこでペレットを、嫌気条件に少なくとも24時間平衡させた0.1mLの嫌気成長培地(上記に記載される)に再懸濁した。ペレット/培地懸濁液を使用して、Axygen 48ディープウェルプレート(#P−5mL−48−C−S,Axygen,Union City,CA)中の1.5mLアリコートの嫌気培養培地を、0.2の初期目標OD600値となるように接種した。次にプレートを滅菌フォイルシール(60941−076、VWR,Radnor,PA)で密閉し、脱酸素パックと共にMGC 2.5L嫌気ジャー(#50−25、#10−01、三菱ガス化学株式会社アネロパックシステム(MGC AnaeroPac System)、日本)に入れ、次にこれを密閉した。嫌気ジャーをCoy嫌気バッグから取り出し、30℃のインキュベーターに置き、振盪しながら69時間成長させた。最初の嫌気継代培養が終了した時点で細胞を遠心し、HPLC分析用に上清の試料を保存した。実験により決められるとおりペレットを使用して次の嫌気継代培養物を接種した;次の継代培養物は24〜72時間成長させた。各変異体につき3つの形質転換体を評価した(結果は表7に提供する)。選択の変異体を血清バイアル試験で分析した(結果は表8に提供する)。
フィルタ付き蓋を有する125mLフラスコ中の好気前培養培地の10mLアリコートに、SE−Ura−His寒天プレートで成長した細胞を接種した。好気前培養物を、約1.5〜2の目標OD600値に達するまで、振盪しながら30℃で約24時間好気的に成長させた。OD600値はCary 300分光光度計(spectrophotemeter)(Agilent Technologies,Wilmington,DE)を使用して決定し、値を記録した。培養物を50mLチューブ(#89039−666、VWR,Radnor,PA)に移し、遠心によって細胞をペレット化し、上清を廃棄した。細胞ペレットをCoy嫌気バッグ(Grass Lake,MI)に移し、そこでペレットを1.0mL嫌気成長培地(SEG−Ura−His)に再懸濁した。再懸濁した細胞ペレットを使用して、0.2の目標初期OD600値になるように50mL血清ボトル(Wheaton,223748,Millville,NJ)中の30mL SEG−Ura−His培地を接種した。全ての嫌気培地、血清バイアル、栓及びクリンプを、接種前に嫌気バッグにおいて少なくとも24時間脱気させた。血清ボトルに栓をしてクリンプし、嫌気バッグから出して、240rpmで振盪しながら30℃で成長させた。嫌気培養物を、少なくとも1.2の目標OD600値になるように24〜72時間成長させた。さらなる嫌気成長ステップでは、前の嫌気培養ステップからの細胞を接種材料として使用し、HPLC分析用に上清のアリコートを保存した。各変異体につき3つの形質転換体を評価した(結果は表8に提供する)。
HPLC分析用に、嫌気成長期間が終了した時点のOD600値を得るため試料を取った。Waters 2695分離ユニット、2996フォトダイオードアレイ検出器、及び2414屈折率検出器(Waters,Milford,MA)を、Shodex Sugar SH−Gプレカラム及びShodex Sugar SH1011分離カラム(Shodex,JM Science,Grand Island,NY)と共に使用して、HPLC分析を実施した。0.5mL/分の流量で0.01N硫酸の均一濃度溶離によって化合物を分離した。Waters Empower Proソフトウェアを使用してクロマトグラムを解析した。
実施例3及び実施例11で調製した変異体を、酵母株PNY2115(MATa ura3Δ::loxP his3Δ pdc5Δ::loxP66/71 fra2Δ 2ミクロンプラスミド(CEN.PK2)pdc1Δ::P[PDC1]−ALS|alsS_Bs−CYC1t−loxP71/66 pdc6Δ::(UAS)PGK1−P[FBA1]−KIVD|Lg(y)−TDH3t−loxP71/66 adh1Δ::P[ADH1]−ADH|Bi(y)−ADHt−loxP71/66 fra2Δ::P[ILV5]−ADH|Bi(y)−ADHt−loxP71/66 gpd2Δ::loxP71/66)におけるイソブタノール生成について分析した。
酵母株を成長させる手順の中では、4種類の培地を使用した:SE−ura寒天プレート、SAG−2−ura寒天プレート、好気前培養培地及び嫌気培養培地。特に注記しない限り、化学物質は全てSigma(St.Louis,MO)から入手した。
PNY2115のコンピテント細胞を作成し、Frozen−EZ酵母形質転換IIキット(Zymo Research;Orange,CA)を使用して1μLの精製プラスミド(約0.4〜0.8μg総DNA)で形質転換した。形質転換混合物をSE−uraプレートに播き、30℃で4日間インキュベートした。各形質転換体につき3つのコロニーを選択し、SE−uraプレートにパッチし、30℃で2日間インキュベートした。K9SB2_SH、K9ALL3(配列番号237)、及びK9JM11に6つの形質転換体を用いた。次に、SAG−2−Uraプレートにパッチし、30℃で2日間成長させることにより、変異体がグルコース適応を起こした。
フィルタ付き蓋を有する125mLフラスコ中の好気前培養培地の10mLアリコートに、20μL 3M滅菌酢酸ナトリウム(pH7.0)を塗ったCM+グルコース寒天プレート(#C3080,Teknova,Hollister,CA)で成長させた細胞を接種した。好気前培養物は、約1.5〜2の目標OD600値に達するまで、振盪しながら30℃で約24時間好気的に成長させた。OD600値はCary 300分光光度計(spectrophotemeter)(Agilent Technologies,Wilmington,DE)を使用して決定し、値を記録した。培養物を50mLチューブ(#89039−666、VWR,Radnor,PA)に移し、遠心によって細胞をペレット化し、上清を廃棄した。細胞ペレットをCoy嫌気バッグ(Grass Lake,MI)に移し、そこでペレットを1.0mL嫌気成長培地(SAG−Ura)に再懸濁した。再懸濁した細胞ペレットを使用して、0.2の目標初期OD600値になるように50mL血清ボトル(Wheaton,223748,Millville,NJ)中の30mL SAG−Ura培地を接種した。全ての嫌気培地、血清バイアル、栓及びクリンプを、接種前に嫌気バッグにおいて少なくとも24時間脱気させた。血清ボトルに栓をしてクリンプし、嫌気バッグから出して、240rpmで振盪しながら30℃で成長させた。嫌気培養物を、少なくとも1.2の目標OD600値になるように24〜72時間成長させた。さらなる嫌気成長ステップでは、HPLC分析用に上清のアリコートを保存した前の嫌気培養ステップからの細胞を接種材料として使用した。各変異体につき3つの形質転換体を評価した。
HPLC分析用に試料を取り、嫌気成長期間が終了した時点でOD600値を得た。Waters 2695分離ユニット、2996フォトダイオードアレイ検出器、及び2414屈折率検出器(Waters,Milford,MA)を、Shodex Sugar SH−Gプレカラム及びShodex Sugar SH1011分離カラム(Shodex,JM Science,Grand Island,NY)と共に使用して、HPLC分析を実施した。0.5mL/分の流量で0.01N硫酸の均一濃度溶離によって化合物を分離した。Waters Empower Proソフトウェアを使用してクロマトグラムを解析した。
特性決定のため、KARI変異体の遺伝子を、PmeI及びSfiIでの消化並びにJEA1.PS.pBADプラスミド(配列番号238)の対応する部位へのライゲーションによって大腸菌(E.coli)発現プラスミドにサブクローニングした。得られた大腸菌(E.coli)プラスミドを、BioRad Gene Pulser II(Bio−Rad Laboratories Inc.,Hercules,CA)を使用して、エレクトロコンピテント大腸菌(E.coli)株Bw25113(ΔilvC)(全体として参照により本明細書に援用される米国特許第8,129,162号明細書に記載される)に形質転換した。形質転換クローンを、LB培地及び100μg/mlアンピシリンを含有する寒天プレート(#101320−154、Teknova Inc.Hollister,CA)に広げ、37℃で一晩インキュベートした。各株につき1つの形質転換体を、100μg/mLアンピシリン含有LBプレートにストリークした。これらのプレートの各々からの単一コロニーを使用して、100μg/mLアンピシリン及び0.025%(w/v)アラビノース含有3mL LBブロスを接種し、225rpmで振盪しながら一晩成長させた。4000×gで5分間遠心することにより培養物を回収した。細胞を300ulのBugBuster(登録商標)マスターミックス(EMD Sciences、カタログ番号71456−4)に再懸濁した。混合物を16,000×gで10分間遠心し、上清を収集した。
K9_Ursula(K9SB2+A56V)(配列番号239)のエラープローンPCRを実施して、NADHに対するKM値が低下した変異体をスクリーニングすることのできるライブラリを作成した。GeneMorph(登録商標)II EZCloneドメイン突然変異誘発キット(カタログ番号200552;Agilent Technologies,Stratagene Products Division,La Jolla,CA)で突然変異誘発PCRを実施した。プライマーK9G9_EZ_F1(AAA CAT GGA AGA ATG TAA GAT GGC;配列番号256)及びK9G9_EZ_R1(TCA GTT GTT AAT CAA CTT GTC TTC G;配列番号257)は、Integrated DNA Technologies,Inc(Coralville IA)により商業的に合成された。プライマー、鋳型、及びddH2O以外は、ここで使用した試薬は、上記に指示するキットに含まれたものであった。突然変異誘発PCR混合物は、6μlのpBAD.KARIベクター(配列番号258)(243ng/μl)中K9_Ursula、1.25μlの各プライマー(100ng/μlストック)、5μlの10×Mutazyme II反応緩衝液、1μlの40mM dNTP混合物、1.5μlのMutazyme II DNAポリメラーゼ、及び34μlのddH2Oからなった。PCR反応には、以下の条件を用いた:開始温度は95℃で2.0分間、続いて30回の加熱/冷却サイクルであった。各サイクルは、95℃で30秒、48℃で30秒、及び72℃で2.0分からなった。温度サイクルの完了時点で試料をさらに10.0分間72℃に保ち、次に試料回収まで4℃に保持した。アガロースゲル電気泳動(electrophloresis)(1%アガロース、1×TBE緩衝液)によって反応生成物を鋳型から分離し、QIAquickゲル抽出キット(カタログ番号28704、Qiagen Incorporated,Valencia,CA)を製造者の推奨どおり使用して回収した。
K9−Ursula ePCRライブラリのハイスループットスクリーニングアッセイ
突然変異体KARI酵素の遺伝子ライブラリのハイスループットスクリーニングを、本明細書に記載されるとおり実施した:554.4g/L グリセロール、68mMの(NH4)2SO4、4mM MgSO4、17mM クエン酸ナトリウム、132mM KH2PO4、36mM K2HPO4を含有する10×凍結用培地を、分子的に純粋な水で調製し、ろ過滅菌した。10×凍結用培地をLB培地で希釈することにより、凍結用培地を調製した。96ウェルアーカイブプレート(カタログ番号3370、Corning
Inc.Corning,NY)の各ウェルに、1×凍結用培地のアリコート(200μL)を使用した。
細胞溶解物の所定容積毎に、75μM NADHで計測されたNADH酸化速度と200μM NADHで計測されたNADH酸化速度との比を、各変異体及び陽性対照ウェル(1プレートにつき2個)について計算した。陽性対照ウェル(細胞溶解物あたり104個)に関する比の平均値及び標準偏差を計算した。
複数の手法を用いて統合ライブラリからの変異体を評価した。一つの手法では、一次スクリーニングと同様の方法に変更を加えて二次スクリーニングを実施した。統合ヒットライブラリ(CL1)を生物学的トリプリケートで成長させ、無細胞抽出物を調製し、上記に記載したとおりアッセイした。速度データを収集し、以下に記載するとおり分析した。CL1ライブラリの細胞溶解物の容積毎に、75μM NADHで計測されたNADH酸化速度と、200μM NADHで計測されたNADH酸化速度との比を、各変異体及び陽性対照ウェル(1プレートにつき2個)について計算した。これらの比を使用することにより、以下の式を用いてKm NADHを計算した(これは、2つの基質濃度に関するミカエリス−メンテン(Michealis−Menton)式の比から求めることができる):
「HTS」Km=75(1−R)/(R−75/200)、式中、R=速度比
二次HTSスクリーニングで同定された変異体のDNA配列決定を、TempliPhi(商標)(GE Healthcare)を用いることにより、プライマーpBAD−For(ATGCCATAGCATTTTTATCC;配列番号260)及びpBAD−Rev(CTGATTTAATCTGTATCAGGCT;配列番号261)で達成した。配列を表11に示す。
実施例8からのいくつかのK9_Ursula誘導体を動態特性用に選択した。変異体を大腸菌(E.coli)で発現させて、実施例6に記載するとおり分析した。NADH及びNADPHを補因子としたKARI反応の動態パラメータを表12に提供する。同じT191Sのアミノ酸置換を含む2つの独立したクローン(#1及び#2)を分析した。58位及び191位におけるアミノ酸置換がNADHのKMを低下させることが観察された。
K9_Ursulaにおける53位変異体の作成
53位のアミノ酸置換を部位特異的突然変異誘発によって個々にK9_Ursulaに導入し、得られた変異体を大腸菌(E.coli)で発現させて特徴付けた。K9_Ursulaの部位特異的突然変異誘発は、QuikChange Lightning部位特異的突然変異誘発キット(カタログ番号210518;Agilent Technologies,Stratagene Products Division,La Jolla,CA)で実施した。表13に掲載するプライマーは、Integrated DNA Technologies,Inc(Coralville IA)により商業的に合成された。プライマーは、表13に示すとおり(「混合物」と表示される列)、4つの混合物に組み合わせた。
K9_Ursula及び53位に置換を含む誘導体のサブセットを大腸菌(E.coli)株Bw25113(ΔilvC)で発現させ、実施例6に記載するとおり特徴付けた。NADH及びNADPHによる反応の動態パラメータを表14に提供する。置換F53L及びF53Iを含むK9_Ursula誘導体を、それぞれK9_Lucy(配列番号300)及びK9_Ilya(配列番号301)と命名した(表14)。
発現及び特性決定のため、大腸菌(E.coli)プラスミド(pBAD.KARI)を使用することにより、BioRad Gene Pulser II(Bio−Rad Laboratories Inc.,Hercules,CA)を使用してエレクトロコンピテント大腸菌(E.coli)株Bw25113(ΔilvC)を形質転換した。形質転換クローンを、LB培地及び100μg/mlアンピシリンを含有する寒天プレート(#101320−154、Teknova Inc.Hollister,CA)に広げ、37℃で一晩インキュベートした。各株につき1つの形質転換体を、100μg/mLアンピシリンを含むLBプレートにストリークした。これらのプレートの各々からの単一コロニーを使用して、100μg/mLアンピシリン含有10mL LBブロスを接種した。これらの培養物を、ベント付きフィルタ付きの蓋を有する125mLバッフル付きフラスコにおいて振盪しながら37℃で8時間成長させた。この培養物200μLを使用して、100μg/mLアンピシリン及び0.2%(w/v)アラビノース含有LBブロスが入った、フィルタ付きベント付きの蓋を有する500mLバッフル付きフラスコ2つを接種した。発現培養物を振盪しながら37℃で16〜18時間成長させた。細胞を遠心によって40mLアリコートに回収した;上清を廃棄し、精製まで細胞ペレットを−80℃で凍結した。
K9SB2_SH誘導体の部位特異的突然変異誘発を実施して、さらなるアミノ酸置換を組み込んだ。実施例10の記載に変更を加えて突然変異誘発を実施した。酵母シャトルプラスミド中の変異体で突然変異誘発反応を実施するため、温度サイクルの間の68℃ステップを4.0分から10分に増加させた。
実施例11で調製した変異体のサブセットを大腸菌(E.coli)で発現させ、実施例6に記載するとおり分析した。実施例3に記載される3つのさらなる変異体(K9JM36、K9JM43、K9JM44)をJEA1.PS.pBADプラスミド(配列番号238)のPmeI及びSfiI部位にサブクローニングし、大腸菌(E.coli)で発現させて、同様に分析した。NADH及びNADPHを補因子とするKARI反応の動態パラメータを表18に提供する。
158位を標的化する部位飽和遺伝子ライブラリの構築及びPNY2068における得られた変異体のイソブタノール生成のスクリーニング
野生型アナエロスティペス・カッカエ(Anaerostipes caccae)KARI配列(配列番号93)の158位に対応するアミノ酸における19個全ての個々のアミノ酸変化をコードするプライマーを含むフォワードプライマー混合物(この例ではK9_158fと称される)(表19)及びリバースプライマーK9_309T_111711r:CTTTCTCATAGCCTTAGTGTGGAC(配列番号415;この例ではK9_309Trと称される)を用いて、K9 KARIの位置158を標的化する単一部位飽和ライブラリを作成した。変異体K9SB2_SHを含むプラスミド(プラスミドK8SB2_SH_81;配列番号532)を鋳型として使用した。
酵母株を成長させる手順の中では、2種類の培地を使用した:好気前培養培地及び嫌気培養培地。特に注記しない限り、化学物質は全てSigma(St.Louis,MO)から入手した。
嫌気成長期間が終了した時点で、LC/MS分析用に試料を取った。LC/MS分析は、Waters AcQuity UPLC分離ユニット及びAcQuity TQDトリプル四重極質量分析器(Waters,Milford,MA)をWaters AcQuity UPLC HSS T3分離カラム(Waters,Milford,MA)と共に使用して実施した。化合物は、99%水相から始まり99%有機相で終わる水(+0.1%ギ酸)及びアセトニトリル(+0.1%ギ酸)の逆相勾配を使用して、0.5mL/分の流量で分離した。Waters Masslynx 4.1ソフトウェア(Waters,Milford,MA)を使用してクロマトグラムを分析した。Waters Quanlynxソフトウェア(Waters,Milford,MA)を使用し、標準物質のトリプリケート分析の検量線を使用してイソブタノールのマイクロモル収率を計算した。
67位を標的化する部位飽和遺伝子ライブラリの構築及びPNY2115における得られた変異体のイソブタノール生成のスクリーニング
野生型アナエロスティペス・カッカエ(Anaerostipes caccae)KARI配列(配列番号93)の67位に対応するアミノ酸における19個全ての個々のアミノ酸変化をコードするプライマーを含むフォワードプライマー混合物(この例ではK9_67fと称される)(表21)及びリバースプライマーK9_309T_111711r:CTTTCTCATAGCCTTAGTGTGGAC(配列番号415;この例ではK9_309Trと称される)を用いて、K9 KARIの位置67を標的化する単一部位飽和ライブラリを作成した。変異体K9SB2_SHを含むプラスミド(K8SB2_SH_81;配列番号532)を鋳型として使用した。
酵母株を成長させる手順の中では、2種類の培地を使用した:好気前培養培地及び嫌気培養培地。特に注記しない限り、化学物質は全てSigma(St.Louis,MO)から入手した。
嫌気成長期間が終了した時点で、LC/MS分析用に試料を取った。LC/MS分析は、Waters AcQuity UPLC分離ユニット及びAcQuity TQDトリプル四重極質量分析器(Waters,Milford,MA)をWaters AcQuity UPLC HSS T3分離カラム(Waters,Milford,MA)と共に使用して実施した。化合物は、99%水相から始まり99%有機相で終わる水(+0.1%ギ酸)及びアセトニトリル(+0.1%ギ酸)の逆相勾配を使用して、0.5mL/分の流量で分離した。Waters Masslynx 4.1ソフトウェア(Waters,Milford,MA)を使用してクロマトグラムを分析した。Waters Quanlynxソフトウェア(Waters,Milford,MA)を使用し、標準物質のトリプリケート分析の検量線を使用してイソブタノールのマイクロモル収率を計算した。
162位を標的化する部位飽和遺伝子ライブラリの構築及びPNY2115における得られた変異体のイソブタノール生成のスクリーニング
野生型アナエロスティペス・カッカエ(Anaerostipes caccae)KARI配列(配列番号93)の162位に対応するアミノ酸における19個全ての個々のアミノ酸変化をコードするプライマーを含むフォワードプライマー混合物(この例ではK9_162fと称される)(表24及びリバースプライマーK9_309T_111711r:CTTTCTCATAGCCTTAGTGTGGAC(配列番号415;この例ではK9_309Trと称される)を用いて、K9 KARIの位置162を標的化する単一部位飽和ライブラリを作成した。変異体K9SB2_SHを含むプラスミド(又はK8SB2_SH_81)を鋳型として使用した。
酵母株を成長させる手順の中では、2種類の培地を使用した:好気前培養培地及び嫌気培養培地。特に注記しない限り、化学物質は全てSigma(St.Louis,MO)から入手した。
嫌気成長期間が終了した時点で、LC/MS分析用に試料を取った。LC/MS分析は、Waters AcQuity UPLC分離ユニット及びAcQuity TQDトリプル四重極質量分析器(Waters,Milford,MA)をWaters AcQuity UPLC HSS T3分離カラム(Waters,Milford,MA)と共に使用して実施した。化合物は、99%水相から始まり99%有機相で終わる水(+0.1%ギ酸)及びアセトニトリル(+0.1%ギ酸)の逆相勾配を使用して、0.5mL/分の流量で分離した。Waters Masslynx 4.1ソフトウェア(Waters,Milford,MA)を使用してクロマトグラムを分析した。Waters Quanlynxソフトウェア(Waters,Milford,MA)を使用し、標準物質のトリプリケート分析の検量線を使用してイソブタノールのマイクロモル収率を計算した。
312位を標的化する部位飽和遺伝子ライブラリの構築及びPNY2115における得られた変異体のイソブタノール生成のスクリーニング
野生型アナエロスティペス・カッカエ(Anaerostipes caccae)KARI配列(配列番号93)の312位に対応するアミノ酸における19個全ての個々のアミノ酸変化をコードするプライマーを含むフォワードプライマー混合物(この例ではK9_312rと称される)(表27)及びリバースプライマーK9_219_032212f:GAAGCTGCTAAGAAGGCTGACATC(配列番号473;この例ではK9_219fと称される)を用いて、K9 KARIの312の位置を標的化する単一部位飽和ライブラリを作成した。変異体K9SB2_SHを含むプラスミド(又はK8SB2_SH_81)を鋳型として使用した。
酵母株を成長させる手順の中では、2種類の培地を使用した:好気前培養培地及び嫌気培養培地。特に注記しない限り、化学物質は全てSigma(St.Louis,MO)から入手した。
嫌気成長期間が終了した時点で、LC/MS分析用に試料を取った。LC/MS分析は、Waters AcQuity UPLC分離ユニット及びAcQuity TQDトリプル四重極質量分析器(Waters,Milford,MA)をWaters AcQuity UPLC HSS T3分離カラム(Waters,Milford,MA)と共に使用して実施した。化合物は、99%水相から始まり99%有機相で終わる水(+0.1%ギ酸)及びアセトニトリル(+0.1%ギ酸)の逆相勾配を使用して、0.5mL/分の流量で分離した。Waters Masslynx 4.1ソフトウェア(Waters,Milford,MA)を使用してクロマトグラムを分析した。Waters Quanlynxソフトウェア(Waters,Milford,MA)を使用し、標準物質のトリプリケート分析の検量線を使用してイソブタノールのマイクロモル収率を計算した。
169位を標的化する部位飽和遺伝子ライブラリの構築及びPNY2115における得られた変異体のイソブタノール生成のスクリーニング
野生型アナエロスティペス・カッカエ(Anaerostipes caccae)KARI配列(配列番号93)の169位に対応するアミノ酸における19個全ての個々のアミノ酸変化をコードするプライマーを含むフォワードプライマー混合物(この例ではK9_169fと称される)(表31)及びリバースプライマーK9_309T_111711r:CTTTCTCATAGCCTTAGTGTGGAC(配列番号415;この例ではK9_309Trと称される)を用いて、K9 KARIの位置169を標的化する単一部位飽和ライブラリを作成した。変異体K9SB2_SHを含むプラスミド(又はK8SB2_SH_81)を鋳型として使用した。
酵母株を成長させる手順の中では、2種類の培地を使用した:好気前培養培地及び嫌気培養培地。特に注記しない限り、化学物質は全てSigma(St.Louis,MO)から入手した。
嫌気成長期間が終了した時点で、LC/MS分析用に試料を取った。LC/MS分析は、Waters AcQuity UPLC分離ユニット及びAcQuity TQDトリプル四重極質量分析器(Waters,Milford,MA)をWaters AcQuity UPLC HSS T3分離カラム(Waters,Milford,MA)と共に使用して実施した。化合物は、99%水相から始まり99%有機相で終わる水(+0.1%ギ酸)及びアセトニトリル(+0.1%ギ酸)の逆相勾配を使用して、0.5mL/分の流量で分離した。Waters Masslynx 4.1ソフトウェア(Waters,Milford,MA)を使用してクロマトグラムを分析した。Waters Quanlynxソフトウェア(Waters,Milford,MA)を使用し、標準物質のトリプリケート分析の検量線を使用してイソブタノールのマイクロモル収率を計算した。
5個のN末端アミノ酸が欠失したトランケート形態のK9_LucyであるK9_Lucy_SH(核酸配列番号806)をベースとするさらなる変異体を調製し、酵母発現プラスミドpLH689(配列番号306)のPmeI及びSfiI部位にサブクローニングした。プラスミドを株PNY2115に形質転換し、実施例5に記載するとおりイソブタノール生成について分析した。
KARI変異体を有する株による発酵
イソブタノール生合成経路を含むS.セレビシエ(S.cerevisiae)の7つの株を表33に掲載する。示される株は全て、親株PNY2145(国際公開第2013/102147号パンフレット及び米国特許出願公開第20130252296号明細書(両方とも参照によって援用される)に開示される)をベースとしたものであり、表中に指示されるKARI変異体を別にして、表33の株は全て、イソブタノール生合成経路の基質から生成物への変換を触媒する以下の酵素を含む(「(y)」によって指示される場合、酵母発現用にコドンが最適化された遺伝子によりコードされる):アセト乳酸シンターゼ(「AlsS」;アミノ酸配列番号827及びコード配列番号826;ジヒドロキシ酸デヒドラターゼ(「L2V4」;配列番号821及び822;ケトイソ吉草酸デカルボキシラーゼ(「kivD_Lg」;配列番号825及び543)、及びアルコールデヒドロゲナーゼ(「Bi」;配列番号823及び824)。参考として、指示する株で異種発現させたKARIに関連するインビトロ動態計測値を提供する。
Claims (43)
- 組換え宿主細胞のイソブタノール生成を増加させる方法であって、
(a)イソブタノール生合成経路と、ケトール酸レダクトイソメラーゼ(KARI)活性を有する異種ポリペプチド又はその断片とを含む組換え宿主細胞を提供するステップであって、
前記異種ポリペプチド又はその断片が、(i)リジンでない配列番号93の90位に対応するアミノ酸残基、(ii)スレオニンでない配列番号93の93位に対応するアミノ酸残基;及び(iii)メチオニンでない配列番号93の94位に対応するアミノ酸残基の1つ以上を含む、ステップと、
(b)イソブタノールが生成される条件下で前記組換え宿主細胞を炭素基質と接触させるステップと
を含み、前記組換え宿主細胞によって生成されるイソブタノールが、前記異種ポリペプチド又はその断片を含まないイソブタノール生合成経路を含む組換え宿主細胞によって生成されるイソブタノールより多い、方法。 - 組換え宿主細胞のNADH利用を増加させる方法であって、
(a)イソブタノール生合成経路と、ケトール酸レダクトイソメラーゼ(KARI)活性を有する異種ポリペプチド又はその断片とを含む組換え宿主細胞を提供するステップであって、
前記異種ポリペプチド又はその断片が、(i)リジンでない配列番号93の90位に対応するアミノ酸残基;(ii)スレオニンでない配列番号93の93位に対応するアミノ酸残基;及び(iii)メチオニンでない配列番号93の94位に対応するアミノ酸残基の1つ以上を含む、ステップと、
(b)イソブタノールが生成される条件下で前記組換え宿主細胞を炭素基質と接触させるステップと
を含み、前記組換え宿主細胞のNADH利用が、前記異種ポリペプチド又はその断片を含まないイソブタノール生合成経路を含む組換え宿主細胞のNADH利用より高い、方法。 - 組換え宿主細胞の成長速度を増加させる方法であって、
(a)イソブタノール生合成経路と、ケトール酸レダクトイソメラーゼ(KARI)活性を有する異種ポリペプチド又はその断片とを含む組換え宿主細胞を提供するステップであって、
前記組換えポリペプチド又はその断片が、(i)リジンでない配列番号93の90位に対応するアミノ酸残基;(ii)スレオニンでない配列番号93の93位に対応するアミノ酸残基;及び(iii)メチオニンでない配列番号93の94位に対応するアミノ酸残基の1つ以上を含む、ステップと、
(b)イソブタノールが生成される条件下で前記宿主細胞を炭素基質と接触させるステップと
を含み、前記組換え宿主細胞の成長速度が、前記異種ポリペプチド又はその断片を含まないイソブタノール生合成経路を含む組換え宿主細胞の成長速度より高い、方法。 - 前記組換えポリペプチド又はその断片が、(i)チロシン又はアラニンである配列番号93の90位に対応するアミノ酸残基;(ii)バリン、アラニン、又はロイシンである配列番号93の93位に対応するアミノ酸残基;及び(iii)ロイシンである配列番号93の94位に対応するアミノ酸残基の1つ以上を含む、請求項1〜3のいずれか一項に記載の方法。
- 前記NADH利用の増加がNADH/NADPH比の増加である、請求項1〜4のいずれか一項に記載の方法。
- 前記組換え宿主細胞が酵母宿主細胞である、請求項1〜5のいずれか一項に記載の方法。
- 前記酵母が、サッカロミセス属(Saccharomyces)、シゾサッカロミセス属(Schizosaccharomyces)、ハンゼヌラ属(Hansenula)、カンジダ属(Candida)、クルイベロミセス属(Kluyveromyces)、ヤロウイア属(Yarrowia)、イサチェンキア属(Issatchenkia)、又はピキア属(Pichia)の酵母である、請求項1〜6のいずれか一項に記載の方法。
- 前記酵母がサッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)である、請求項1〜7のいずれか一項に記載の方法。
- 前記異種ポリペプチド又は断片が、配列番号761、752、759又は760と少なくとも約85%、少なくとも約90%の同一性、少なくとも約95%、又は少なくとも約98%の同一性を有する配列によりコードされる、請求項1〜8のいずれか一項に記載の方法。
- 前記異種ポリペプチド又は断片が、配列番号237、227、233又は234と少なくとも約85%、少なくとも約90%の同一性、少なくとも約95%、又は少なくとも約98%の同一性を有する配列を含む、請求項1〜9のいずれか一項に記載の方法。
- イソブタノール生合成経路と、
a.以下のうちの一つと少なくとも約85%、少なくとも約90%の同一性、少なくとも約95%、又は少なくとも約98%の同一性を有するケトール酸レダクトイソメラーゼ活性を有する異種ポリペプチド:K9JM2(配列番号193)、K9JM3(配列番号194)、K9JM4(配列番号195)、K9JM5(配列番号196)、K9JM6(配列番号197)、K9JM7(配列番号198)、K9JM8(配列番号199)、K9JM9(配列番号200)、K9JM10(配列番号201)、K9JM11(配列番号202)、K9JM12(配列番号203)、K9JM13(配列番号204)、K9JM14(配列番号205)、K9JM15(配列番号206)、K9JM16(配列番号207)、K9JM17(配列番号208)、K9JM18(配列番号209)、K9JM19(配列番号210)、K9JM20(配列番号211)、K9JM21(配列番号212)、K9JM22(配列番号213)、K9JM23(配列番号214)、K9JM24(配列番号215)、K9JM25(配列番号216)、K9JM26(配列番号217)、K9JM27(配列番号218)、K9JM28(配列番号219)、K9JM29(配列番号220)、K9JM30(配列番号221)、K9JM31(配列番号222)、JM32(配列番号223)、JM33(配列番号224)、JM34(配列番号225)、JM35(配列番号226)、JM36(配列番号227)、JM37(配列番号228)、JM38(配列番号229)、JM39(配列番号230)、JM40(配列番号231)、JM42(配列番号232)、JM43(配列番号233)、JM44(配列番号234)、K9SB2(配列番号235)、K9_DAVID_SH(配列番号236)、K9ALL3(配列番号237)、K9_URSALA(K9SB2+A56V)(配列番号239)、JM41(配列番号240)、K9ALL148(配列番号241)、K9JM148(配列番号242)、K9ALL156(配列番号243)、K9JM156(配列番号244)、K9ALL191(配列番号245)、K9JM191(配列番号246)、K9ALL254(配列番号247)、K9ALL278(配列番号248)、K9ALL37(配列番号249)、K9JM37S(配列番号250)、K9ALL66(配列番号66)、K9JM66(配列番号252)、K9ALL8Q(配列番号253)、K9JM8Q(配列番号254)、K9ALL45(配列番号255)、K9_LUCY(配列番号300)、K9_ILYA(配列番号301)、K9ALL258(配列番号302)、K9YW25−T191S(配列番号303)、F53L(配列番号307)、F53I(配列番号308)、F53M(配列番号309)、F53V(配列番号310)、F53P(配列番号311)、F53S(配列番号312)、F53A(配列番号313)、F53E(配列番号314)、F53Q(配列番号315)、T11−1(配列番号316)、T11−2(配列番号317)、T11−3(配列番号318)、T11−4(配列番号319)、T11−5(配列番号320)、T11−6(配列番号321)、T11−7(配列番号322)、T11−10(配列番号323)、T11−12(配列番号324)、T11−13(配列番号325)、T11−14(配列番号326)、T11−15(配列番号327)、T11−16(配列番号328)、T11−18(配列番号329)、T11−19(配列番号330)、T11−21(配列番号331)、T11−22(配列番号332)、T11−25(配列番号333)、T11−27(配列番号334)、T11−28(配列番号335)、T11−29(配列番号336)、T11−30(配列番号337)、T11−32(配列番号338)、T11−33(配列番号339)、T11−35(配列番号340)、T11−36(配列番号341)、T11−37(配列番号342)、T11−38(配列番号343)、T11−39(配列番号344)、T11−42(配列番号345)、T11−43(配列番号346)、T11−44(配列番号347)、T11−45(配列番号348)、T11−46(配列番号349)、T11−47(配列番号350)、T11−49(配列番号351)、T11−50(配列番号352)、T11−52(配列番号353)、T11−54(配列番号354)、T11−55(配列番号355)、T11−56(配列番号356)、T11−57(配列番号357)、T11−58(配列番号358)、T11−59(配列番号359)、T11−60(配列番号360)、T11−61(配列番号361)、T11−62(配列番号362)、T11−64(配列番号363)、T11−66(配列番号364)、T11−67(配列番号365)、T11−69(配列番号366)、T11−70(配列番号367)、T11−72(配列番号368)、T11−74(配列番号369)、T11−75(配列番号370)、T11−76(配列番号371)、T11−79(配列番号372)、T11−80(配列番号373)、T11−81(配列番号374)、T11−83(配列番号375)、T11−84(配列番号376)、T11−85(配列番号377)、T11−86(配列番号378)、T11−87(配列番号379)、T11−88(配列番号380)、T11−91(配列番号381)、T11−94(配列番号382)、T11−95(配列番号383)、T11−96(配列番号384)、T11−97(配列番号385)、T11−99(配列番号386)、T11−103(配列番号387)、T11−104(配列番号388)、T11−109(配列番号389)、T11−110(配列番号390)、T11−111(配列番号391)、T11−114(配列番号392)、T11−116(配列番号393)、T11−117(配列番号394)、T11−119(配列番号395)、T11−121(配列番号396)、T11−122(配列番号397)、T11−124(配列番号398)、T11−125(配列番号399)、T11−128(配列番号400)、T11−130(配列番号401)、T11−131(配列番号402)、T11−134(配列番号403)、E147V(配列番号552)、G164D(配列番号404)、G304V(配列番号405)、N258S(配列番号406)、T71S(配列番号407)、V184I(配列番号408)、A279D(配列番号409)、D98V(配列番号410)、M169F(配列番号411)、M169K(配列番号412)、M169L(配列番号413)、E100Q_M312K(配列番号414)、ECB11(配列番号534)、EC2A2(配列番号535)、EC2B12(配列番号536)、EGC10(配列番号537)、EGD9(配列番号538)、EGG8(配列番号539)、EHG1(配列番号540)、EHG2(配列番号541)、EHH6(配列番号520)、EHH9(配列番号521)、EHH10(配列番号522)、EHH12(配列番号523)、EKC5(配列番号546)、EKG4(配列番号547)、EJF5(配列番号548)、EJB8(配列番号549)、EJA1(配列番号550)、EJB10(配列番号551)、K9_Lucy_SH(配列番号553)、又はK9JM1(配列番号192)
又はその活性断片、又は
b.a)の前記異種ポリペプチドをコードする異種ポリヌクレオチドと
を含む組換え宿主細胞。 - イソブタノール生合成経路と、
a.K9JM2(配列番号193)、K9JM3(配列番号194)、K9JM4(配列番号195)、K9JM5(配列番号196)、K9JM6(配列番号197)、K9JM7(配列番号198)、K9JM8(配列番号199)、K9JM9(配列番号200)、K9JM10(配列番号201)、K9JM11(配列番号202)、K9JM12(配列番号203)、K9JM13(配列番号204)、K9JM14(配列番号205)、K9JM15(配列番号206)、K9JM16(配列番号207)、K9JM17(配列番号208)、K9JM18(配列番号209)、K9JM19(配列番号210)、K9JM20(配列番号211)、K9JM21(配列番号212)、K9JM22(配列番号213)、K9JM23(配列番号214)、K9JM24(配列番号215)、K9JM25(配列番号216)、K9JM26(配列番号217)、K9JM27(配列番号218)、K9JM28(配列番号219)、K9JM29(配列番号220)、K9JM30(配列番号221)、K9JM31(配列番号222)、JM32(配列番号223)、JM33(配列番号224)、JM34(配列番号225)、JM35(配列番号226)、JM36(配列番号227)、JM37(配列番号228)、JM38(配列番号229)、JM39(配列番号230)、JM40(配列番号231)、JM42(配列番号232)、JM43(配列番号233)、JM44(配列番号234)、K9SB2(配列番号235)、K9_DAVID_SH(配列番号236)、K9ALL3(配列番号237)、K9_URSALA(K9SB2+A56V)(配列番号239)、JM41(配列番号240)、K9ALL148(配列番号241)、K9JM148(配列番号242)、K9ALL156(配列番号243)、K9JM156(配列番号244)、K9ALL191(配列番号245)、K9JM191(配列番号246)、K9ALL254(配列番号247)、K9ALL278(配列番号248)、K9ALL37(配列番号249)、K9JM37S(配列番号250)、K9ALL66(配列番号66)、K9JM66(配列番号252)、K9ALL8Q(配列番号253)、K9JM8Q(配列番号254)、K9ALL45(配列番号255)、K9_LUCY(配列番号300)、K9_ILYA(配列番号301)、K9ALL258(配列番号302)、K9YW25−T191S(配列番号303)、F53L(配列番号307)、F53I(配列番号308)、F53M(配列番号309)、F53V(配列番号310)、F53P(配列番号311)、F53S(配列番号312)、F53A(配列番号313)、F53E(配列番号314)、F53Q(配列番号315)、T11−1(配列番号316)、T11−2(配列番号317)、T11−3(配列番号318)、T11−4(配列番号319)、T11−5(配列番号320)、T11−6(配列番号321)、T11−7(配列番号322)、T11−10(配列番号323)、T11−12(配列番号324)、T11−13(配列番号325)、T11−14(配列番号326)、T11−15(配列番号327)、T11−16(配列番号328)、T11−18(配列番号329)、T11−19(配列番号330)、T11−21(配列番号331)、T11−22(配列番号332)、T11−25(配列番号333)、T11−27(配列番号334)、T11−28(配列番号335)、T11−29(配列番号336)、T11−30(配列番号337)、T11−32(配列番号338)、T11−33(配列番号339)、T11−35(配列番号340)、T11−36(配列番号341)、T11−37(配列番号342)、T11−38(配列番号343)、T11−39(配列番号344)、T11−42(配列番号345)、T11−43(配列番号346)、T11−44(配列番号347)、T11−45(配列番号348)、T11−46(配列番号349)、T11−47(配列番号350)、T11−49(配列番号351)、T11−50(配列番号352)、T11−52(配列番号353)、T11−54(配列番号354)、T11−55(配列番号355)、T11−56(配列番号356)、T11−57(配列番号357)、T11−58(配列番号358)、T11−59(配列番号359)、T11−60(配列番号360)、T11−61(配列番号361)、T11−62(配列番号362)、T11−64(配列番号363)、T11−66(配列番号364)、T11−67(配列番号365)、T11−69(配列番号366)、T11−70(配列番号367)、T11−72(配列番号368)、T11−74(配列番号369)、T11−75(配列番号370)、T11−76(配列番号371)、T11−79(配列番号372)、T11−80(配列番号373)、T11−81(配列番号374)、T11−83(配列番号375)、T11−84(配列番号376)、T11−85(配列番号377)、T11−86(配列番号378)、T11−87(配列番号379)、T11−88(配列番号380)、T11−91(配列番号381)、T11−94(配列番号382)、T11−95(配列番号383)、T11−96(配列番号384)、T11−97(配列番号385)、T11−99(配列番号386)、T11−103(配列番号387)、T11−104(配列番号388)、T11−109(配列番号389)、T11−110(配列番号390)、T11−111(配列番号391)、T11−114(配列番号392)、T11−116(配列番号393)、T11−117(配列番号394)、T11−119(配列番号395)、T11−121(配列番号396)、T11−122(配列番号397)、T11−124(配列番号398)、T11−125(配列番号399)、T11−128(配列番号400)、T11−130(配列番号401)、T11−131(配列番号402)、T11−134(配列番号403)、E147V(配列番号552)、G164D(配列番号404)、G304V(配列番号405)、N258S(配列番号406)、T71S(配列番号407)、V184I(配列番号408)、A279D(配列番号409)、D98V(配列番号410)、M169F(配列番号411)、M169K(配列番号412)、M169L(配列番号413)、E100Q_M312K(配列番号414)、ECB11(配列番号534)、EC2A2(配列番号535)、EC2B12(配列番号536)、EGC10(配列番号537)、EGD9(配列番号538)、EGG8(配列番号539)、EHG1(配列番号540)、EHG2(配列番号541)、EHH6(配列番号520)、EHH9(配列番号521)、EHH10(配列番号522)、EHH12(配列番号523)、EKC5(配列番号546)、EKG4(配列番号547)、EJF5(配列番号548)、EJB8(配列番号549)、EJA1(配列番号550)、EJB10(配列番号551)、K9_Lucy_SH(配列番号553)、又はK9JM1(配列番号192)と少なくとも約90%の同一性、少なくとも約95%又は少なくとも約98%の同一性を有するケトール酸レダクトイソメラーゼ活性を有する異種ポリペプチド、
b.又はその活性断片、又は
c.a)の前記ポリペプチドをコードする異種ポリヌクレオチドと
を含む組換え宿主細胞であって、前記ケトール酸レダクトイソメラーゼ活性を有する異種ポリペプチドが、約50未満のNADHに対するKMを有する、組換え宿主細胞。 - 前記宿主細胞が酵母宿主細胞である、請求項11または12に記載の組換え宿主細胞。
- 前記酵母が、サッカロミセス属(Saccharomyces)、シゾサッカロミセス属(Schizosaccharomyces)、ハンゼヌラ属(Hansenula)、カンジダ属(Candida)、クルイベロミセス属(Kluyveromyces)、ヤロウイア属(Yarrowia)、イサチェンキア属(Issatchenkia)、又はピキア属(Pichia)からなる群から選択され、酵母細胞がそのメンバーである、請求項11〜13のいずれか一項に記載の組換え宿主細胞。
- 前記宿主細胞がサッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)である、請求項11〜14のいずれか一項に記載の組換え宿主細胞。
- 前記イソブタノール生成経路が、以下の基質から生成物への変換を含み:
a.ピルベートからアセトラクテート
b.アセトラクテートから2,3−ジヒドロキシイソバレレート
c.2,3−ジヒドロキシイソバレレートから2−ケトイソバレレート
d.2−ケトイソバレレートからイソブチルアルデヒド、及び
e.イソブチルアルデヒドからイソブタノール
前記基質から生成物への変換の2つ以上が、前記宿主細胞にとって異種の酵素によって触媒される、請求項11〜15のいずれか一項に記載の組換え宿主細胞。 - 前記基質から生成物への変換の全てが、前記宿主細胞にとって異種の酵素によって触媒される、請求項11〜16のいずれか一項に記載の組換え宿主細胞。
- 前記イソブチルアルデヒドからイソブタノールへの基質から生成物への変換が、NADHを補因子として利用するアルコールデヒドロゲナーゼ酵素によって触媒される、請求項11〜17のいずれか一項に記載の組換え宿主細胞。
- 前記宿主細胞が、低下又は消失したアセト乳酸レダクターゼ活性を有する、請求項11〜18のいずれか一項に記載の組換え宿主細胞。
- 前記宿主細胞が、低下又は消失したアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を有する、請求項11〜19のいずれか一項に記載の組換え宿主細胞。
- 前記宿主細胞が酵母であり、且つ低下又は消失したピルビン酸デカルボキシラーゼ活性を有する、請求項11〜20のいずれか一項に記載の組換え宿主細胞。
- 以下の基質から生成物への変換:
a.ピルベートからアセトラクテート
b.アセトラクテートから2,3−ジヒドロキシイソバレレート
c.2,3−ジヒドロキシイソバレレートから2−ケトイソバレレート
d.2−ケトイソバレレートからイソブチルアルデヒド;及び
e.イソブチルアルデヒドからイソブタノール
を含むイソブタノール生成経路を含む、請求項11〜21のいずれか一項に記載の組換え宿主細胞であって、
前記基質から生成物への変換が、実質的にサイトゾルに局在する酵素によって触媒される、組換え宿主細胞。 - 前記ケトール酸レダクトイソメラーゼ活性を有するポリペプチドが、表Zに提供されるKARIプロファイルHMMと比較したとき<10−3のE値を有する、請求項11〜22のいずれか一項に記載の宿主細胞。
- イソブタノールの生成方法であって、
a.請求項11〜23のいずれか一項に記載の組換え宿主細胞を提供するステップと、
b.イソブタノールが生成される条件下で前記a)の宿主細胞を炭素基質と接触させるステップと
を含む方法。 - 前記接触させるステップの少なくとも一部が嫌気条件下で行われる、請求項24に記載の方法。
- グリセロールに対するイソブタノールのモル比が1より大きい、請求項24または25に記載の方法。
- イソブタノールの生成方法であって
a.イソブタノールを生成する組換え宿主細胞を提供するステップと、
b.イソブタノールが生成される条件下で前記a)の宿主細胞を炭素基質と接触させるステップと
を含み、
前記接触させるステップの少なくとも一部が嫌気条件下で行われ、及び
生成されるグリセロールに対するイソブタノールの比が1より大きい、方法。 - イソブタノールと、請求項11〜23のいずれか一項に記載の組換え宿主細胞とを含む組成物。
- K9JM2(配列番号193)、K9JM3(配列番号194)、K9JM4(配列番号195)、K9JM5(配列番号196)、K9JM6(配列番号197)、K9JM7(配列番号198)、K9JM8(配列番号199)、K9JM9(配列番号200)、K9JM10(配列番号201)、K9JM11(配列番号202)、K9JM12(配列番号203)、K9JM13(配列番号204)、K9JM14(配列番号205)、K9JM15(配列番号206)、K9JM16(配列番号207)、K9JM17(配列番号208)、K9JM18(配列番号209)、K9JM19(配列番号210)、K9JM20(配列番号211)、K9JM21(配列番号212)、K9JM22(配列番号213)、K9JM23(配列番号214)、K9JM24(配列番号215)、K9JM25(配列番号216)、K9JM26(配列番号217)、K9JM27(配列番号218)、K9JM28(配列番号219)、K9JM29(配列番号220)、K9JM30(配列番号221)、K9JM31(配列番号222)、JM32(配列番号223)、JM33(配列番号224)、JM34(配列番号225)、JM35(配列番号226)、JM36(配列番号227)、JM37(配列番号228)、JM38(配列番号229)、JM39(配列番号230)、JM40(配列番号231)、JM42(配列番号232)、JM43(配列番号233)、JM44(配列番号234)、K9SB2(配列番号235)、K9_DAVID_SH(配列番号236)、K9ALL3(配列番号237)、K9_URSALA(K9SB2+A56V)(配列番号239)、JM41(配列番号240)、K9ALL148(配列番号241)、K9JM148(配列番号242)、K9ALL156(配列番号243)、K9JM156(配列番号244)、K9ALL191(配列番号245)、K9JM191(配列番号246)、K9ALL254(配列番号247)、K9ALL278(配列番号248)、K9ALL37(配列番号249)、K9JM37S(配列番号250)、K9ALL66(配列番号66)、K9JM66(配列番号252)、K9ALL8Q(配列番号253)、K9JM8Q(配列番号254)、K9ALL45(配列番号255)、K9_LUCY(配列番号300)、K9_ILYA(配列番号301)、K9ALL258(配列番号302)、K9YW25−T191S(配列番号303)、F53L(配列番号307)、F53I(配列番号308)、F53M(配列番号309)、F53V(配列番号310)、F53P(配列番号311)、F53S(配列番号312)、F53A(配列番号313)、F53E(配列番号314)、F53Q(配列番号315)、T11−1(配列番号316)、T11−2(配列番号317)、T11−3(配列番号318)、T11−4(配列番号319)、T11−5(配列番号320)、T11−6(配列番号321)、T11−7(配列番号322)、T11−10(配列番号323)、T11−12(配列番号324)、T11−13(配列番号325)、T11−14(配列番号326)、T11−15(配列番号327)、T11−16(配列番号328)、T11−18(配列番号329)、T11−19(配列番号330)、T11−21(配列番号331)、T11−22(配列番号332)、T11−25(配列番号333)、T11−27(配列番号334)、T11−28(配列番号335)、T11−29(配列番号336)、T11−30(配列番号337)、T11−32(配列番号338)、T11−33(配列番号339)、T11−35(配列番号340)、T11−36(配列番号341)、T11−37(配列番号342)、T11−38(配列番号343)、T11−39(配列番号344)、T11−42(配列番号345)、T11−43(配列番号346)、T11−44(配列番号347)、T11−45(配列番号348)、T11−46(配列番号349)、T11−47(配列番号350)、T11−49(配列番号351)、T11−50(配列番号352)、T11−52(配列番号353)、T11−54(配列番号354)、T11−55(配列番号355)、T11−56(配列番号356)、T11−57(配列番号357)、T11−58(配列番号358)、T11−59(配列番号359)、T11−60(配列番号360)、T11−61(配列番号361)、T11−62(配列番号362)、T11−64(配列番号363)、T11−66(配列番号364)、T11−67(配列番号365)、T11−69(配列番号366)、T11−70(配列番号367)、T11−72(配列番号368)、T11−74(配列番号369)、T11−75(配列番号370)、T11−76(配列番号371)、T11−79(配列番号372)、T11−80(配列番号373)、T11−81(配列番号374)、T11−83(配列番号375)、T11−84(配列番号376)、T11−85(配列番号377)、T11−86(配列番号378)、T11−87(配列番号379)、T11−88(配列番号380)、T11−91(配列番号381)、T11−94(配列番号382)、T11−95(配列番号383)、T11−96(配列番号384)、T11−97(配列番号385)、T11−99(配列番号386)、T11−103(配列番号387)、T11−104(配列番号388)、T11−109(配列番号389)、T11−110(配列番号390)、T11−111(配列番号391)、T11−114(配列番号392)、T11−116(配列番号393)、T11−117(配列番号394)、T11−119(配列番号395)、T11−121(配列番号396)、T11−122(配列番号397)、T11−124(配列番号398)、T11−125(配列番号399)、T11−128(配列番号400)、T11−130(配列番号401)、T11−131(配列番号402)、T11−134(配列番号403)、E147V(配列番号552)、G164D(配列番号404)、G304V(配列番号405)、N258S(配列番号406)、T71S(配列番号407)、V184I(配列番号408)、A279D(配列番号409)、D98V(配列番号410)、M169F(配列番号411)、M169K(配列番号412)、M169L(配列番号413)、E100Q_M312K(配列番号414)、ECB11(配列番号534)、EC2A2(配列番号535)、EC2B12(配列番号536)、EGC10(配列番号537)、EGD9(配列番号538)、EGG8(配列番号539)、EHG1(配列番号540)、EHG2(配列番号541)、EHH6(配列番号520)、EHH9(配列番号521)、EHH10(配列番号522)、EHH12(配列番号523)、EKC5(配列番号546)、EKG4(配列番号547)、EJF5(配列番号548)、EJB8(配列番号549)、EJA1(配列番号550)、EJB10(配列番号551)、K9_Lucy_SH(配列番号553)、又はK9JM1(配列番号192)と少なくとも約90%の同一性又は少なくとも約95%の同一性又は少なくとも約99%の同一性を含むポリペプチド、
又はその活性断片であって、ケトール酸レダクトイソメラーゼ活性を有するポリペプチド。 - 請求項29に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
- アセトラクテートから2,3−ジヒドロキシイソバレレートへの変換方法であって、
a.請求項29に記載のポリペプチドを提供するステップと、
b.2,3−ジヒドロキシイソバレレートが生成される条件下で前記a)のポリペプチドをアセトラクテートに接触させるステップと
を含む方法。 - 請求項29に記載の異種ポリペプチドを含む組換え宿主細胞。
- 前記宿主細胞がイソブタノール生合成経路をさらに含む、請求項32に記載の組換え宿主細胞。
- イソブタノールの生成方法であって
請求項32または33に記載の組換え宿主細胞を提供するステップと、
イソブタノールが生成される条件下で前記宿主細胞を炭素基質と接触させるステップとを含む方法。 - 配列番号692〜806のいずれか一つと少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、又は少なくとも約98%の同一性を有する核酸配列を含むポリヌクレオチド。
- 1つ以上のプロモーターに作動可能に連結された、請求項35に記載のポリヌクレオチド。
- 1つ以上の終結領域に作動可能に連結された、請求項35または36に記載のポリヌクレオチド。
- 請求項35〜37のいずれか一項に記載の1つ以上のポリヌクレオチドを含む組換えベクター。
- 請求項35〜37のいずれか一項に記載の1つ以上のポリヌクレオチドを含む組換え宿主細胞。
- 請求項38に記載の1つ以上のベクターを含む組換え宿主細胞。
- 前記宿主細胞が酵母宿主細胞である、前記請求項のいずれか一項に記載の組換え宿主細胞。
- 前記酵母が、サッカロミセス属(Saccharomyces)、シゾサッカロミセス属(Schizosaccharomyces)、ハンゼヌラ属(Hansenula)、カンジダ属(Candida)、クルイベロミセス属(Kluyveromyces)、ヤロウイア属(Yarrowia)、イサチェンキア属(Issatchenkia)、又はピキア属(Pichia)の酵母である、前記請求項のいずれか一項に記載の組換え宿主細胞。
- 前記酵母がサッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)である、前記請求項のいずれか一項に記載の組換え宿主細胞。
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