CN101437936A

CN101437936A - 溶剂耐受微生物及分离方法

Info

Publication number: CN101437936A
Application number: CNA2007800163100A
Authority: CN
Inventors: M·G·布拉穆奇; V·纳加拉彦; N·塞德科瓦; M·辛格
Original assignee: EI Du Pont de Nemours and Co
Current assignee: EIDP Inc
Priority date: 2006-05-05
Filing date: 2007-05-04
Publication date: 2009-05-20
Also published as: DK2016169T3; US20100093020A1; BRPI0710404A2; WO2007130560A3; DE602007011051D1; US20070259411A1; ATE491020T1; US7659104B2; EP2016169B1; WO2007130560A2; EP2016169A2

Abstract

分离了具有对丁醇的增强的耐受性的肠球菌细菌。该细菌对于发酵生产丁醇是有用的。还提供了分离丁醇耐受肠球菌的新方法。

Description

溶剂耐受微生物及分离方法

本申请请求2006年5月5日提交的美国临时申请No.60/798417的益处。

发明领域

本发明涉及工业微生物的领域。特别是，已分离了对醇特别是丁醇显示出高耐受性的微生物。

发明背景

丁醇是重要的工业化学制剂，用作燃料添加剂，塑料工业中的给料化学制剂，以及食品和调料工业中的食品级提取物。每年通过石油化学途径生产10到12十亿磅的丁醇，并且对于这种助剂的需求很可能会增加。

丁醇的化学合成方法是已知的。例如，1-丁醇可利用Oxo工艺，Reppe工艺，或巴豆醛的氢化而生产(Ullmann’s Encyclopedia ofIndustrial Chemistry，6^th edition，2003，Wiley-VCHVerlag GmbH and Co.，Weinheim，Germany，Vol.5，pp.716-719)。2-丁醇可利用正丁烯水合而生产(Ullmann’s Encyclopedia of Industrial Chemistry，6^th edition，2003，Wiley-VCHVerlag GmbH and Co.，Weinheim，Germany，Vol.5，pp.716-719)。另外，异丁醇可利用Oxo合成，一氧化碳的催化氢化(Ullmann’s Encyclopedia of Industrial Chemistry，6^th edition，2003，Wiley-VCHVerlag GmbH and Co.，Weinheim，Germany，Vol.5，pp.716-719)或利用正丙醇的甲醇格尔伯特浓缩(Guerbet condensation)(Carlini等人，J.Molec.Catal.A：Chem.220：215-220(2004))而生产。这些方法利用源于石油化学品的起始材料，通常是昂贵的，并且对于环境是不友好的。

通过发酵生产丁醇的方法也是已知的，其中最通常的方法生产丙酮，1-丁醇和乙醇的混合物，并且表示为ABE工艺(Blaschek等人，U.S.专利6,358,717)。通过丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)的丙酮-丁醇-乙醇(ABE)发酵是已知的最古老的工业发酵方法之一，已经报道了用于生产这些溶剂的途径和基因(Girbal等人，Trends inBiotechnology 16：11-16(1998))。另外，已经描述了表达1-丁醇的生物合成途径(Donaldson等人，共同未决和共同拥有的美国专利申请No.11/527995)，2-丁醇生物合成途径(Donaldson等人，共同未决和共同拥有的美国专利申请No.60/796816)，和异丁醇生物合成途径(Maggio-Hall等人，共同未决和共同拥有的美国专利申请No.11/586315)的重组微生物生产宿主。但是，丁醇的生物生产据信受限于丁醇对用于发酵中宿主微生物的毒性。

对1-丁醇耐受的梭菌菌株已通过化学突变(Jain等人U.S.专利5,192,673；和Blaschek等人US.专利6,358,717)，某些类基因例如表达应激反应蛋白的基因的过表达(Papoutsakis等人U.S.专利6,960,465；和Tomas等人，Appl.Environ.Microbiol.69(8)：4951-4965(2003))，和通过连续富集(Quratulain等人，Folia Microbiologica(Prague)40(5)：467-471(1995)；和Soucaille等人，Current Microbiology 14(5)：295-299(1987))而分离。Desmond等人(Appl.Environ.Microbiol.70(10)：5929-5936 (2004))报道了GroESL，一种应激反应蛋白，在乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)和类干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)中的过表达生产了能够在0.5％体积/体积(v/v)[0.4％重量/体积(w/v)]的1-丁醇的存在下生长的菌株。另外，已经描述了1-丁醇耐受菌株从河口沉积物中(Sardessai等人，Current Science 82(6)：622-623(2002))和从活性污泥中(Bieszkiewicz等人，Acta Microbiologica Polonica36(3)：259-265(1987))的分离。但是，对于这些技术中描述的大多数微生物，当在37℃下生长于液体培养基中时，在低于2.0％w/v浓度的1-丁醇中生长被完全抑制。而且，对2-丁醇和异丁醇耐受的微生物株在这些技术中是未知的。因此，鉴定对于1-丁醇，2-丁醇和异丁醇具有高耐受性的微生物在现有技术中将代表一种进步。

另外，2-丁酮和乙醇是可通过利用微生物发酵生产的有价值的化合物。2-丁酮，也表示为甲基乙基酮(MEK)，是广泛利用的溶剂并且是丙酮之后最重要的商业生产的酮。它用作涂料，树脂和粘合剂的溶剂，以及氧化反应的选择性提取物和活化剂。2-丁酮可通过省略2-丁醇生物合成途径的最后步骤而制备(Donaldson等人，共同未决和共同拥有的美国专利申请No.60/796816)。乙醇作为替代的燃料是高度需求的。大肠埃希氏菌的遗传修饰菌株已被用作用于乙醇生产的生物催化剂(Underwood等人，(2002)Appl.Environ.Microbiol.68：6263-6272).在US 2003/0162271 A1中已经描述了具有提高的乙醇产量的运动发酵单胞菌(Zymomonas mobilis)的遗传修饰菌株。对于具有对2-丁酮和乙醇提高的耐受性的微生物的鉴定将提高这些化合物的生产。

因此，需要对丁醇更耐受并且可用于生物生产高滴度的丁醇的微生物宿主株。本发明通过发现丁醇耐受微生物并发展了分离它们的方法而满足了这一需求。另外，发现的微生物具有对2-丁酮和乙醇的提高的耐受性。

发明概述

本发明涉及丁醇耐受微生物，特别是肠球菌属(Enterococcus)的成员，和分离相同微生物的方法。富集微生物聚生体并选择对丁醇的耐受。分离了当在37℃生长于固体培养基上时对至少2.5％w/v的1-丁醇的丁醇浓度显示出耐受性的几种肠球菌。

相应的，在一个实施方案中本发明提供了用于分离丁醇耐受微生物的方法，所述方法包括：

a)提供包含微生物聚生体的微生物样品；

b)接触在包含可发酵碳源的生长培养基中的微生物聚生体直到微生物聚生体成员正在生长；

c)将步骤(b)中生长的微生物聚生体与丁醇接触；和

d)分离步骤(c)中存活的成员，其中丁醇耐受微生物被分离。在一个优选实施方案中，微生物聚生体的存活成员通过包含下述步骤的方法分离：

i)在不存在丁醇时在液体培养基中生长已经用丁醇攻击(challenge)的聚生体中的存活成员；由此存活成员繁殖；

ii)在存在丁醇时生长步骤(i)的细胞；和

iii)收集在存在丁醇时生长的步骤(ii)的细胞，其中丁醇耐受微生物被分离。

在另一实施方案中，本发明提供了通过本发明方法分离的丁醇耐受微生物，其中优选的丁醇耐受微生物属于肠球菌属。

在另一实施方案中，本发明提供了分离丁醇耐受肠球菌的方法，所述方法包括：

a)提供包含微生物聚生体的微生物样品；

b)在包含下述成分的生长培养基中为肠球菌的存在富集微生物聚生体：

i)可发酵碳源；和

ii)竞争物生长抑制剂；

以产生肠球菌富集培养物，其中肠球菌富集培养物成员正在生长；

c)使步骤(b)的生长的肠球菌富集培养物与丁醇接触；和

d)分离步骤(c)的存活成员，其中丁醇耐受肠球菌被分离。

在另一实施方案中，本发明提供了具有下述特征的丁醇耐受肠球菌：

i)为兼性厌氧性生物；和

ii)为革兰氏阳性；和

iii)为不能动的；和

iv)具有球形或卵形细胞形态学；和

v)具有启动在6.5％氯化钠肉汤中和在PH9.6的肉汤中生长的能力；和

vi)当生长于固体培养基上时，对至少2.5％w/v丁醇耐受。

在另一实施方案中，本发明提供的丁醇耐受肠球菌选自：ATCCPTA-7478(屎肠球菌(Enterococcus faecium)PN0110)，ATCC_PTA-7479(鹑鸡肠球菌(Enterococcus gallinarium)PN0048)，ATCC PTA-7477(粪肠球菌(Enterococcus faecalis)PN0197-10)和ATCC PTA-7480(屎肠球菌(Enterococcus faecium)PN0133)。

在另一实施方案中，本发明提供了生产2-丁酮的方法，所述方法包括：

a)提供包含编码2-丁酮生物合成途径的遗传构建体的肠球菌，其具有下述特征：

i)为兼性厌氧生物；和

ii)为革兰氏阳性；和

iii)为不能动的；

iv)具有球形或卵形细胞形态学；和

v)具有启动在6.5％氯化钠肉汤和PH9.6肉汤中生长的能力；和

vi)当生长于固体培养基上时对至少2.5％w/v丁醇耐受，和

b)在生产2-丁酮的条件下生长步骤(a)的肠球菌。

对生物保藏和序列描述的简要说明

本发明的多种实施方案可从下述详细的描述，生物保藏，和所附的序列描述中更充分地理解，其组成本申请的一部分。

申请人根据国际承认用于专利程序目的的微生物保藏布达佩斯条约进行了如下生物保藏：

下述序列遵守37 C.F.R.1.821-1.825(“包含核苷酸序列和/或氨基酸序列公开的专利申请的要求-序列规则”)并与世界知识产权组织(WIPO)标准ST.25(1998)和EPO和PCT(细则5.2和49.5(a-bis)，和行政规程第208部分和附件C)的序列表要求一致。用于核苷酸和氨基酸序列的符号和格式遵守37 C.F.R.§1.822中设定的规则。

序列表按照37 CFR 1.53(e)在此提供在光盘上，并且在此引入作为参考。

表1

用于1-丁醇生物合成途径的基因和蛋白SEQ ID号的概述

描述	SEQ IDNO：核酸	SEQ IDNO：肽
描述	SEQ IDNO：核酸	SEQ IDNO：肽	来自丙酮丁醇梭菌(Clostridiumacetobutylicum)ATCC 824的Acetyl-CoA乙酰转移酶thlA	1	2
来自丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)ATCC 824的Acety1-CoA乙酰转移酶thlB	3	4		1	2
	3	4	来自丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)ATCC 824的3-羟基丁酰-CoA脱氢酶	5	6
来自丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)ATCC 824的巴豆酸酶	7	8	来自丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)ATCC 824的3-羟基丁酰-CoA脱氢酶	5	6
来自丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)ATCC 824的巴豆酸酶	7	8	来自丙酮丁醇梭菌(Clostridium acatobutylicum)ATCC 824的推定的转-烯酰CoA还原酶	9	10
来自拜氏梭菌(Clostridium beijerinckii)NRRLB594的丁醛脱氢酶	11	12	来自丙酮丁醇梭菌(Clostridium acatobutylicum)ATCC 824的推定的转-烯酰CoA还原酶	9	10
来自拜氏梭菌(Clostridium beijerinckii)NRRLB594的丁醛脱氢酶	11	12	来自丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)ATCC 824的1-丁醇脱氢酶bdhB	13	14
来自丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)ATCC 824的1-丁醇脱氢酶bdhA	15	16	来自丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)ATCC 824的1-丁醇脱氢酶bdhB	13	14

表2

用于2-丁醇生物合成途径的基因和蛋白SEQ ID号的概述

描述	SEQ IDNO：核酸	SEQ IDNO：肽
描述	SEQ IDNO：核酸	SEQ IDNO：肽	来自肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)ATCC 25955的budA，乙酰乳酸脱羧酶	17	18
来自肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)ATCC 25955的budB，乙酰乳酸合酶	19	20	来自肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)ATCC 25955的budA，乙酰乳酸脱羧酶	17	18
来自肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)ATCC 25955的budB，乙酰乳酸合酶	19	20	来自肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)IAM1063的budC，丁二醇脱氢酶	21	22
来自产酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca)ATCC8724的pddA，丁二醇脱水酶α亚单元	23	24	来自肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)IAM1063的budC，丁二醇脱氢酶	21	22
来自产酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca)ATCC8724的pddA，丁二醇脱水酶α亚单元	23	24	来自产酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca)ATCC8724的pddB，丁二醇脱水酶β亚单元	25	26
来自产酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca)ATCC8724的pddC，丁二醇脱水酶γ亚单元	27	28	来自产酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca)ATCC8724的pddB，丁二醇脱水酶β亚单元	25	26
来自产酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca)ATCC8724的pddC，丁二醇脱水酶γ亚单元	27	28	来自赤红球菌(Rhodococcus ruber)219的sadH，2-丁二醇脱氢酶	29	30

表3

用于异丁醇生物合成途径的基因和蛋白SEQ ID号的概述

描述	SEQ IDNO：核酸	SEQ IDNO：肽
描述	SEQ IDNO：核酸	SEQ IDNO：肽	肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)budB(乙酰乳酸合酶)	19	20
大肠埃希氏菌(E.coli)ilvC(乙酰羟酸还原异构酶)	31	32	肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)budB(乙酰乳酸合酶)	19	20
大肠埃希氏菌(E.coli)ilvC(乙酰羟酸还原异构酶)	31	32	大肠埃希氏菌(E.coli)ilvD(乙酰羟酸脱水酶)	33	34
乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)kivD(支链α-酮酸脱羧酶)，密码子最优化的	35	36	大肠埃希氏菌(E.coli)ilvD(乙酰羟酸脱水酶)	33	34
乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)kivD(支链α-酮酸脱羧酶)，密码子最优化的	35	36	大肠埃希氏菌(E.coli)yqhD(支链醇脱氢酶)	37	38

如实施例1所述，SEQ ID NOs：39和40是用于扩增丁醇耐受菌株的16S rRNA基因的引物的核苷酸序列。

SEQ ID NOs：41-44是如实施例1-4所述分离的丁醇耐受肠球菌菌株的16S rRNA基因的核苷酸序列。

发明详述

本发明提供了对于醇特别是丁醇以及2-丁醇和乙醇显示出高耐受性的微生物。本发明的微生物能够在固体培养基上存在2.5％w/v或更高的1-丁醇，2-丁醇，异丁醇，2-丁酮，或乙醇时生长。另外，本发明提供了分离丁醇耐受微生物的方法。这些丁醇耐受微生物可被遗传工程化以包含丁醇生物合成途径或2-丁酮生物合成途径，并且可被用于生物生产高滴度的1-丁醇，2-丁醇，异丁醇或2-丁酮。

下述定义和缩写可用于解释权利要求和说明书。

如此处所用的术语“丁醇”指1-丁醇，2-丁醇，异丁醇，或其混合物。

当用于描述本发明的微生物时，术语“丁醇耐受微生物”和“耐受”指当在37℃下在固体培养基中生长时，在2.5％w/v或更高的1-丁醇，2-丁醇，或异丁醇存在下显示出生长，或者当在37℃下在液体培养基中生长时，在2.0％w/v或更高的1-丁醇，2-丁醇，或异丁醇存在下显示出生长的细菌或酵母。

术语“微生物聚生体”指不同基因型的微生物的异源组。通过举例的方式，微生物聚生体可以是环境样品例如废水污泥或土壤或堆肥或污染的水样品；纯细菌株的化学突变微生物群；包含多拷贝质粒库的微生物株；特定株的转座子标记的突变体群。

术语“环境样品”指获自环境的样品。特别的，环境样品可以是废水污泥或获自已经暴露于丁醇和/或其他溶剂的环境的其他样品。环境样品包含微生物聚生体。

当应用于微生物培养物并且特别是应用于微生物聚生体的培养时，术语“富集”指向聚生体细胞或微生物培养物提供过量的生长养分以增强或促进细胞的生长。

术语“可发酵的碳源”，“碳底物”或“可发酵的碳底物”可互换使用，并且指容易地为微生物聚生体利用的碳源。可发酵的碳源包括但不限于单糖，寡糖，多糖，和一碳底物或其混合物。优选的可发酵的碳源的非限制性名单包括单糖，例如葡萄糖，果糖，和蔗糖；以及羧酸例如脂肪酸，丁酸，和戊酸。

术语“需氧条件”表示在氧气存在下的生长条件。

术语“厌氧条件”表示在氧气不存在下的生长条件。

术语“微需氧条件”表示具有低水平氧气的生长条件(也就是，在正常大气氧气水平之下)。

术语“丁醇生物合成途径”指生产1-丁醇，2-丁醇，或异丁醇的酶途径。

术语“1-丁醇生物合成途径”指从乙酰-辅酶A(乙酰-CoA)生产1-丁醇的酶途径。

术语“2-丁醇生物合成途径”指从丙酮酸盐生产2-丁醇的酶途径。

术语“2-丁酮生物合成途径”指从丙酮酸盐生产2-丁酮的酶途径。

术语“异丁醇生物合成途径”指从丙酮酸盐生产异丁醇的酶途径。

术语“乙酰-CoA乙酰转移酶”指催化两分子乙酰-CoA转化为乙酰乙酰-CoA和辅酶A(CoA)的酶。优选的乙酰-CoA乙酰转移酶是对短链酰基-CoA和乙酰-CoA具有底物偏好(正向反应)的乙酰-CoA乙酰转移酶，并且分类为E.C.2.3.1.9[酶命名法1992，Academic Press，San Diego]；虽然具有更宽底物范围的酶(E.C.2.3.1.16)也将是功能性的。乙酰-CoA乙酰转移酶可获自多种来源，例如，大肠埃希氏菌(Escherichia coli)(GenBank Nos：NP_416728，NC_000913；NCBI(国家生物信息中心)氨基酸序列，NCBI核苷酸序列)，丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)(GenBank Nos：NP_349476.1(SEQID NO：2)，NC_003030；NP_149242(SEQ ID NO：4)，NC_001988)，枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)(GenBank Nos：NP 390297，NC_000964)，和酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)(GenBank Nos：NP_015297，NC_001148)。

术语“3-羟基丁酰-CoA脱氢酶”指催化乙酰乙酰-CoA转化为3-羟基丁酰-CoA的酶。3-羟基丁酰-CoA脱氢酶可以是还原烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)-依赖性的，具有对于(S)-3-羟基丁酰-CoA或(R)-3-羟基丁酰-CoA的底物偏好，并且分别分类为E.C.1.1.1.35和E.C.1.1.1.30。另外，3-羟基丁酰-CoA脱氢酶可以是还原烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸盐(NADPH)-依赖性的，具有对于(S)-3-羟基丁酰-CoA或(R)-3-羟基丁酰-CoA的底物偏好，并且分别分类为E.C.1.1.1.157和E.C.1.1.1.36。3-羟基丁酰-CoA脱氢酶可从许多来源获得，例如，丙酮丁醇梭菌(C.acetobutylicum)(GenBank NOs：NP_349314(SEQ ID NO：6)，NC_003030)，枯草芽孢杆菌(B.subtilis)(GenBank NOs：AAB09614，U29084)，富养罗尔斯通氏菌(Ralstonia eutropha)(GenBank NOs：ZP_0017144，NZ_AADY01000001，富养产碱菌(Alcaligenes eutrophus)(GenBankNOs：YP_294481，NC_007347)，和富养产碱菌(A.eutrophus)(GenBankNOs：P14697，J04987)。

术语“巴豆酸酶”指催化3-羟基丁酰-CoA转化为巴豆酰-CoA和水的酶。巴豆酸酶可具有对(S)-3-羟基丁酰-CoA或(R)-3-羟基丁酰-CoA的底物偏好，并且分别分类为E.C.4.2.1.17和E.C.4.2.1.55。巴豆酸酶可从多种来源获得，例如，大肠埃希氏菌(E.coli)(GenBank NOs：NP_415911(SEQ ID NO：8)，NC_000913)，丙酮丁醇梭菌(C.acetobutylicum)(GenBank NOs：NP 349318，NC_003030)，枯草芽孢杆菌(B.subtilis)(GenBank NOs：CAB13705，Z99113)，和豚鼠气单胞菌(Aeromonas caviae)(GenBank NOs：BAA21816，D88825)。

术语“丁酰-CoA脱氢酶”，也称作转-烯酰CoA还原酶，指催化巴豆酰-CoA转化为丁酰-CoA的酶。丁酰-CoA脱氢酶可以是NADH-依赖性的或NADPH-依赖性的，并且分别分类为E.C.1.3.1.44和E.C.1.3.1.38。丁酰-CoA脱氢酶可从多种来源获得，例如，丙酮丁醇梭菌(C.acetobutylicum)(GenBank NOs：NP_347102(SEQ ID NO：10)，NC_003030)，小眼虫(Euglena gracilis)(GenBank NOs：Q5EU90，AY741582)，山丘链霉菌(Streptomyces collinus)(GenBank NOs：AAA92890，U37135)，和天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)(GenBank NOs：CAA22721，AL939127)。

术语“丁醛脱氢酶”指利用NADH或NADPH作为辅因子催化丁酰-CoA转化为丁醛的酶。对于NADH偏好的丁醛脱氢酶称作E.C.1.2.1.57并且可获自例如，拜氏梭菌(Clostridium beijerinckii)(GenBankNOs：AAD31841(SEQ ID NO：12)，AF157306)和丙酮丁醇梭菌(C.acetobutylicum)(GenBank NOs：NP_149325，NC_001988)。

术语“1-丁醇脱氢酶”指催化丁醛转化为1-丁醇的酶。1-丁醇脱氢酶是醇脱氢酶的广大家族中的亚群。1-丁醇脱氢酶可以是NADH-或NADPH-依赖性的。1-丁醇脱氢酶可获自例如，丙酮丁醇梭菌(C.acetobutylicum)(GenBank NOs：NP_149325，NC_001988；NP_349891(SEQ ID NO：14)，NC_003030；和NP_349892(SEQ ID NO：16)，NC_003030)和大肠埃希氏菌(E.coli)(GenBank NOs：NP_417484，NC_000913)。

术语“乙酰乳酸合酶”，也称作“乙酰羟酸合酶”，指具有催化两分子的丙酮酸转化为一分子的α-乙酰乳酸的酶活性的多肽。乙酰乳酸合酶，称作EC2.2.1.6[以前为4.1.3.18](Enzyme Nomenclature 1992，Academic Press，San Diego)，可以是依赖于辅因子硫胺焦磷酸盐的。适当的乙酰乳酸合酶可以获自多种来源，例如，枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)(GenBank Nos：AAA22222 NCBI(国家生物技术信息中心)氨基酸序列，L04470 NCBI核苷酸序列)，土生克雷伯氏菌(Klebsiellaterrigena)(GenBank Nos：AAA25055，L04507)，和肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)(GenBank Nos：AAA25079(SEQ ID NO：20)，M73842(SEQ ID NO：19)。

术语“乙酰乳酸脱羧酶”指具有催化α-乙酰乳酸盐转化为乙偶姻的酶活性的多肽。乙酰乳酸脱羧酶称作EC 4.1.1.5，并且可获自例如，枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)(GenBank Nos：AAA22223，L04470)，土生克雷伯氏菌(Klebsiella terrigena)(GenBank Nos：AAA25054，L04507)和肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)(SEQ ID NO：18(氨基酸)SEQ ID NO：17(核苷酸))。

术语“丁二醇脱氢酶”也称作“乙偶姻还原酶”，指具有催化乙偶姻转化为2，3-丁二醇的酶活性的多肽。丁二醇脱氢酶是醇脱氢酶的广大家族中的亚群。丁二醇脱氢酶可具有生产醇产品中R-或S-立体化学的特异性。S-特异性丁二醇脱氢酶称作EC 1.1.1.76并且可获自，例如，肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)(GenBank Nos：BBA13085(SEQ ID NO：22)，D86412。R-特异性丁二醇脱氢酶称作EC 1.1.1.4并且可获自，例如蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)(GenBank Nos.NP_830481，NC_004722；AAP07682，AE017000)，和乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)(GenBank Nos.AAK04995，AE006323)。

术语“丁二醇脱水酶”也称作“二醇脱水酶”或“丙二醇脱水酶”，指具有催化2，3-丁二醇转化为2-丁酮的酶活性的多肽，2-丁酮也称作甲基乙基酮(MEK)。丁二醇脱水酶可利用辅因子腺苷钴胺素。腺苷钴胺素-依赖性酶称作EC 4.2.1.28，并且可获自，例如，产酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca)(GenBank Nos：BAA08099(α亚基)(SEQID NO：24)，BAA08100(β亚基)(SEQ ID NO：26)，和BBA08101(γ亚基)(SEQ ID NO：28)，(注意这三种亚基对于活性都是需要的)，D45071)。

术语“2-丁醇脱氢酶”指具有催化使2-丁酮转化为2-丁醇的酶活性的多肽。2-丁醇脱氢酶是醇脱氢酶的广大家族中的亚群。2-丁醇脱氢酶可以是NADH或NADPH-依赖性的。NADH-依赖性酶称作EC 1.1.1.1，并且可获自例如，赤红球菌(Rhodococcus ruber)(GenBankNos：CAD36475(SEQ ID NO：30)，AJ491307(SEQ ID NO：29))。NADPH-依赖性酶称作EC1.1.1.2并且可获自例如，激烈热球菌(Pyrococcus furiosus)(GenBank Nos：AAC25556，AF013169)。

术语“乙酰羟酸异构还原酶”或“乙酰羟酸还原异构酶”指利用NADPH(还原烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸盐)作为电子供体催化乙酰乳酸盐转化为2，3-二羟基异戊酸盐的酶。优选的乙酰羟酸异构还原酶称作EC 1.1.1.86，并且序列可获自大量的微生物，包括但不限于，大肠埃希氏菌(Escherichia coli)(GenBank Nos：NP_418222(SEQ IDNO：32)，NC_000913(SEQ ID NO：31))，酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)(GenBank Nos：NP_013459，NC_001144)，海沼甲烷球菌(Methanococcus maripaludis)(GenBank Nos：CAF30210，BX957220)，和枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)(GenBank Nos：CAB14789，Z99118)。

术语“乙酰羟酸脱水酶”指催化2，3-二羟基异戊酸盐转化为-酮异戊酸盐的酶。优选的乙酰羟酸脱水酶称作EC4.2.1.9。这些酶可获自大量微生物，包括但不限于，大肠埃希氏菌(E.coli)(GenBank Nos：YP_026248(SEQ ID NO：34)，NC_000913(SEQ ID NO：33))，酿酒酵母(S.cerevisiae)(GenBank Nos：NP_012550，NC_001142)，海沼甲烷球菌(M.maripaludis)(GenBank Nos：CAF29874，BX957219)，和枯草芽孢杆菌(B.subtilis)(GenBank Nos：CAB14105，Z99115)。

术语“支链-酮酸脱羧酶”指催化-酮异戊酸盐转化为异丁醛和二氧化碳的酶。优选的支链-酮酸脱羧酶称作EC4.1.1.72，并且可获自许多来源，包括但不限于，乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)(GenBankNos：AAS49166，AY548760；CAG34226(SEQ ID NO：36)，AJ746364，鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)(GenBank Nos：NP_461346，NC_003197)，和丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)(GenBankNos：NP_149189，NC_001988)。

术语“支链醇脱氢酶”指催化异丁醛转化为异丁醇的酶。优选的支链醇脱氢酶称作EC1.1.1.265，但也可归类到其他醇脱氢酶之下(特别是，EC 1.1.1.1或1.1.1.2)。这些酶利用NADH(还原烟酰胺腺苷二核苷酸)和/或NADPH作为电子供体，并且可获自多种来源，包括但不限于，酿酒酵母(S.cerevisiae)(GenBank Nos：NP_010656，NC_001136；NP_014051，NC_001145)，大肠埃希氏菌(E.co li)(GenBank Nos：NP_417484(SEQ ID NO：38)，NC_000913(SEQ ID NO：37))，和丙酮丁醇梭菌(C.acetobutylicum)(GenBank Nos：NP_349892，NC_003030)。

术语“基因”指能够作为特定蛋白表达的核酸片段，任选地包括在编码序列之前(5’非编码序列)和之后(3’非编码序列)的调节序列。“天然基因”指在自然界发现具有其自身调节序列的基因。“嵌合基因”指不是天然基因的任何基因，包含没有在自然界一起发现的调节和编码序列。相应地，嵌合基因可包含源于不同来源的调节序列和编码序列，或源于相同来源但以与在自然中发现的不同方式排列的调节序列和编码序列。“内源基因”指位于生物的基因组中其天然位点的天然基因。“外来”基因指通常在宿主生物中没有发现但通过基因转移引入宿主生物的基因。外来基因可包含插入非天然生物的天然基因，或嵌合基因。“转基因”是通过转化方法引入基因组的基因。

如此处所用，术语“编码序列”指编码特定氨基酸序列的DNA序列。“适当的调节序列”指位于编码序列的上游(5’非编码序列)，之间或下游(3’非编码序列)的核苷酸序列，其影响相关编码序列的转录，RNA加工或稳定性，或翻译。调节序列可包括启动子，翻译引导序列，内含子，聚腺苷酸化识别序列，RNA加工位点，效应物结合位点和茎-环结构。

术语“启动子”指能够控制编码序列或功能性RNA的表达的DNA序列。一般而言，编码序列位于启动子序列的3’。启动子整体可获自天然基因，或由源于天然发现的不同启动子的不同元件组成，或甚至包含合成的DNA片段。本领域技术人员理解不同的启动子可指引不同组织或细胞类型中，或不同发育阶段中，或响应于不同环境或生理条件的基因表达。在大多数细胞类型中在大多数时候引起基因表达的启动子通常称作“组成型启动子”。进一步认识到既然在大多数情况下调节序列的确切边界没有完全确定，不同长度的DNA片段可具有等同的启动子活性。

术语“可操纵连接”指核酸序列与单个核酸片段的联合，使得一种的功能被另一种影响。例如，启动子与编码序列可操纵连接，此时它能够影响编码序列的表达(也就是，编码序列在启动子的转录控制之下)。编码序列可与调节序列以正向或反向可操纵连接。

术语“表达”，如此处所用，指源于本发明的核酸片段的正义(mRNA)或反义RNA的转录和稳定的积累。表达也可指mRNA翻译为多肽。

如此处所用的术语“转化”指核酸片段转移入宿主生物，导致遗传上稳定地遗传。包含转化核酸片段的宿主生物称作“转基因的”或“重组的”或“转化的”生物。

术语“质粒”和“载体”指经常携带基因的染色体外元件，其不是细胞的中心新陈代谢(central metabolism)的部分，并且通常为环形双链DNA片段的形式。所述元件可以是源于任何来源的自主复制序列，基因组整合序列，噬菌体或核苷酸序列，线性或环形的单或双链DNA或RNA，其中许多核苷酸序列已被连接或重组入唯一的构建体，其能够将启动子片段和选择的基因产品的DNA序列与适当的3’未翻译序列引入细胞中。“转化载体”指包含外来基因并且具有外来基因之外促进特定宿主细胞的转化的元件的特定载体。

如此处所用，术语“密码子简并性”指允许核苷酸序列改变而不影响编码多肽的氨基酸序列的遗传密码中的性质。本领域技术人员清楚地知道特定宿主细胞在使用核苷酸密码子以指定(specify)给定的氨基酸中显示出的“密码子-偏好”。因此，当为宿主细胞中提高的表达合成基因时，期望设计基因使得密码子使用的频率接近宿主细胞的优选密码子使用频率。

术语“密码子最优化”当指用于转化多种宿主的核酸分子的基因或编码区域时，指核酸分子的基因或编码区域的密码子的改变以反映宿主生物的典型密码子使用而不改变DNA编码的多肽。

此处利用的标准重组DNA和分子克隆技术是本领域公知的，并且描述于Sambrook，J.，Fritsch，E.F.和Maniatis，T.，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Second Edition，Cold Spring Harbor LaboratoryPress，Cold Spring Harbor，NY (1989)(此后表示为“Maniatis”)；和Silhavy，T.J.，Bennan，M.L.和Enquist，L.W.，Experiments with GeneFusions，Cold Spring Harbor Laboratory Cold Press Spring Harbor，NY(1984)；和Ausubel，F M.等人，Current Protocols in Molecular Biology，Greene Publishing Assoc.and Wiley-Interscience(1987)出版。

此处使用的术语“发明”或“本发明”意味着一般地应用于目前或以后修改和补充的权利要求，或说明书所述的所有实施方案。

在一个实施方案中，本发明提供了分离丁醇耐受微生物的方法。如下面详细描述的，该方法包含在生长条件下富集微生物聚生体并使富集的微生物聚生体接触丁醇。还提供了通过本发明方法鉴定的显示出对醇特别是丁醇高度耐受的微生物。这些丁醇耐受微生物可被遗传工程化以包含丁醇生物合成途径并用于生物生产高滴度的1-丁醇，2-丁醇，或异丁醇。

丁醇耐受微生物的分离

丁醇耐受微生物可从环境样品例如废水污泥和来自暴露于丁醇和/或其他溶剂的其他环境的样品中分离。例如，环境样品可获自化工厂的废水处理设备。工业废水生物反应器是具有期望抗性显型的微生物的环境样品的特别好的来源，因为在多种有机溶剂的存在下的长期生长(Bramucci等人，Trends Biotechnol.18：501-505(2000))。丁醇耐受微生物也可以分离自其他微生物样品。例如，微生物样品可以是纯细菌株的化学突变的微生物群，包含多拷贝质粒库的微生物株，或特定株的转座子标记的突变体。包括混合群体的任何这些微生物样品可以说包括了微生物聚生体。

在本发明的一个实施方案中，微生物样品在生长培养基中培养以富集其包含的微生物聚生体直到聚生体成员生长。在一个实施方案中培养物在对数期中生长。生长培养基包含可发酵碳源并且可包括适当水平的氮，磷，硫和盐。适当水平的对于微生物聚生体生长必需的这些养分是本领域技术人员公知的，并且下面将提供非限制性的例子。可发酵碳源可以是被微生物聚生体成员容易地代谢的任何碳源，包括但不限于，蔗糖，果糖，葡萄糖，和其混合物。可发酵碳源还可以是羧酸例如脂肪酸，丁酸或戊酸。典型地，碳源以从大约0.1％重量/体积w/v到大约1.5％w/v的浓度存在。氮源可以是任何适当的氮源，包括但不限于铵盐或酵母提取物。氮源典型地以大约10mM的浓度存在于生长培养基中。磷可以磷酸盐的形式存在于培养基中，例如磷酸钠和磷酸钾，其典型地以大约50mM的浓度存在于生长培养基中。硫可以硫酸盐的形式存在于培养基中，例如硫酸钠或硫酸铵，其典型地以大约10mM的浓度存在于生长培养基中。其他的盐包括但不限于，氯化镁，氯化钙，氯化锰，氯化铁，氯化亚铁，氯化锌，氯化铜，氯化钴，和钼酸钠。这些盐典型地以大约1μM到大约2mM的浓度存在于生长培养基中。生长培养基还可包含维生素例如盐酸硫胺素。

富集培养物在大约25℃到大约60℃的温度下生长一段时间，所述时间足以使样品中微生物聚生体显示出生长，典型的为大约12小时到大约24小时。培养物可在厌氧，微需氧，或需氧条件下生长，搅拌或不搅拌。如本领域技术人员容易地理解的，厌氧条件是缺乏氧的条件，需氧条件是包含氧的条件，微需氧条件是其中氧气以低于空气中发现的水平也就是低于21％存在的条件。培养物生长可以通过测量光密度而监测，典型地以600nm波长。

生长富集培养物然后与丁醇接触。这种接触可通过用包含丁醇的新鲜生长培养基稀释富集培养物而完成。在此点中富集培养物生长于对数期是特别适合的。使用的丁醇浓度是大约0.8％w/v到大约3.0％w/v，优选大约0.8％w/v到大约2.0％w/v。在一个实施方案中，丁醇主要是1-丁醇。在另一实施方案中，丁醇主要是2-丁醇。在另一实施方案中，丁醇主要是异丁醇。如此处所用，主要表示至少总丁醇重量的大约90％。另外，可使用包含两种或多种1-丁醇，2-丁醇和异丁醇的多种组合的混合物。培养物生长一段时期直到观察到显著的生长。任选地，显示出显著生长的培养物可再次与丁醇接触一次或多次以选择对丁醇提高的耐受。每次接触可用逐渐增高的丁醇浓度来完成。

然后分开与丁醇接触的微生物聚生体以分离单个株。本领域技术人员已知涉及液体或固体培养基的多种细胞分离方法。例如，与丁醇接触的微生物聚生体可平板接种于固体培养基上，例如营养琼脂，LuriaBertani(LB)琼脂，改良的LB琼脂(也就是，补充了可发酵碳源和盐的LB琼脂)，或具有琼脂的最小富集培养基，其可包含或不包含丁醇。如果丁醇存在于固体培养基中，其浓度典型地为大约1.2％w/v到大约3％w/v。生长培养物直到形成集落。然后利用本领域已知的方法分离集落以提供丁醇耐受微生物。例如，如下所述，来自固体培养基的集落可利用本领域已知的方法收集和鉴定。可选地，来自固体培养基的集落可接种到生长培养基上(例如，最小富集培养基)，液体的或固体的，其不包含丁醇。生长之后，可收集和鉴定细胞。任选地，来自集落的细胞可在存在丁醇时在液体或固体生长培养基中(例如，最小富集培养基)生长。典型地，培养基中的丁醇浓度是大约1.2％w/v到大约3％w/v。收集在存在丁醇时生长的细胞。分离的微生物可利用本领域已知的方法鉴定，例如，16S核糖体RNA(rRNA)基因测序，脂肪酸分布图(profile)分析，或rRNA基因指纹技术(ribotyping)。

通过本发明方法分离的丁醇耐受微生物当在固体培养基上在37℃下生长时对至少2.5％丁醇(也就是，1-丁醇，2-丁醇，或异丁醇)耐受，或当在液体培养基上在37℃下生长时对至少2.0％w/v丁醇耐受。应该注意微生物的丁醇耐受当在固体培养基上生长时典型地比当在液体培养基上生长时要高。另外，微生物的丁醇耐受依赖于生长温度，典型地在更低生长温度下更高。通过用一种丁醇与富集的微生物聚生体接触分离的微生物通常对其他丁醇也是耐受的。例如，利用1-丁醇分离的微生物对2-丁醇和异丁醇也是耐受的。

富集培养物也可在恒化生物反应器中生长并与连续培养物中的丁醇接触。恒化生物反应器中的细胞可通过适当调整稀释率而以不同生长率生长。可精确控制恒化培养物的通风和PH，产生更高的细胞密度。另外，可通过调整给料组合物以渐增的浓度逐渐添加丁醇。在富集培养物与丁醇在生物反应器中接触之后，如上所述分离并鉴定丁醇耐受微生物。

未预料到的，此处实施例中利用本发明方法鉴定的大多数丁醇耐受微生物是属于肠球菌属的细菌。肠球菌是兼性(facultively)厌氧，革兰氏阳性，不能动的，球形或卵形的细胞，具有启动在6.5％氯化钠肉汤和PH9.6的肉汤中生长的能力(Bergey’s Manual of SystematicBacteriology，Vol 2，Sneath等人，Eds.；Williams & Wilkins，Baltimore，MD，1986，pp.1063-1065)。本发明的丁醇耐受肠球菌菌株的另外的特征是SEQ ID NOs：41，42，43，和44所示16S rRNA基因序列。

分离丁醇耐受微生物的本方法可被修饰以选择性分离丁醇耐受肠球菌。在此实施方案中，为肠球菌的存在在包含如上所述的可发酵碳源，适当水平氮，磷，硫，和盐，以及功能为抑制肠球菌之外的微生物生长的“竞争物生长抑制剂”的生长培养基中富集来自环境样品的微生物聚生体。适当的竞争物生长抑制剂包括但不限于胆汁，叠氮化物，和其混合物。使用的竞争物生长抑制剂的最佳量依赖于微生物聚生体和抑制剂的类型，并且可利用常规实验确定。如上所述肠球菌富集培养物生长到对数期并且与丁醇接触。如上所述然后分离并鉴定丁醇耐受肠球菌菌株。

分离的丁醇耐受肠球菌菌株可以被遗传工程化以包含编码丁醇生物合成途径的遗传构建体并且在适当条件下生长以生产丁醇。丁醇生物合成途径可以是1-丁醇、2-丁醇或异丁醇生物合成途径。

1-丁醇生物合成途径

Donaldson等人在共同未决和共同拥有的美国专利申请No.11/527995中描述了生产1-丁醇的生物合成途径，其在此全文引入作为参考。该生物合成途径包含下述底物到产物的转化：

a)乙酰-CoA到乙酰乙酰-CoA，例如如被SEQ ID NO：1或3给出的基因编码的乙酰-CoA乙酰转移酶催化的那样；

b)乙酰乙酰-CoA到3-羟基丁酰-CoA，例如如被SEQ IDNO：5给出的基因编码的3-羟基丁酰-CoA脱氢酶催化的那样；

c)3-羟基丁酰-CoA到巴豆酰-CoA，例如如被SEQ ID NO：7给出的基因编码的巴豆酸酶催化的那样；

d)巴豆酰-CoA到丁酰-CoA，例如如被SEQ ID NO：9给出的基因编码的丁酰-CoA脱氢酶催化的那样；

e)丁酰-CoA到丁醛，例如如被SEQ ID NO：11给出的基因编码的丁醛脱氢酶催化的那样；和

f)丁醛到1-丁醇，例如如被SEQ ID NO：13或15给出的基因编码的1-丁醇脱氢酶催化的那样。

该途径不需要ATP并且产生NAD⁺和/或NADP⁺，因此，它与产生乙酰-CoA的中心新陈代谢(central metabolic route)途径达成平衡。

2-丁醇和2-丁酮生物合成途径

Donaldson等人在共同未决和共同拥有的美国专利申请No.60/796816中描述了生产2-丁醇和2-丁酮的生物合成途径，其在此全文引入作为参考。一种2-丁醇生物合成途径包含下述底物到产物的转化：

a)丙酮酸盐到α-乙酰乳酸盐，例如如被SEQ ID NO：19给出的基因编码的乙酰乳酸合酶催化的那样；

b)α-乙酰乳酸盐到乙偶姻，例如如被SEQ ID NO：17给出的基因编码的乙酰乳酸脱羧酶催化的那样；

c)乙偶姻到2，3-丁二醇，例如如被SEQ ID NO：21给出的基因编码的丁二醇脱氢酶催化的那样；

d)2，3-丁二醇到2-丁酮，例如如被SEQ ID NOs：23，25和27给出的基因编码的丁二醇脱水酶催化的那样；

e)2-丁酮到2-丁醇，例如如被SEQ ID NO：29给出的基因编码的2-丁醇脱氢酶催化的那样。

省略上述途径的最后步骤(e)提供了生产2-丁酮，也称为甲基乙基酮(MEK)的生物合成途径。

异丁醇生物合成途径

Maggio-Hall等人在共同未决和共同拥有的美国专利申请No.11/586315中描述了生产异丁醇的生物合成途径，其在此全文引入作为参考。一种异丁醇生物合成途径包含下述底物到产物的转化：

a)丙酮酸盐到乙酰乳酸盐，例如如被SEQ ID NO：19给出的基因编码的乙酰乳酸合酶催化的那样；

b)乙酰乳酸盐到2，3-二羟基异戊酸盐，例如如被SEQ IDNO：31给出的基因编码的乙酰羟酸异构还原酶催化的那样；

c)2，3-二羟基异戊酸盐到α-酮异戊酸盐，例如如被SEQ IDNO：33给出的基因编码的乙酰羟酸脱水酶催化的那样；

d)α-酮异戊酸盐到异丁醛，例如如被SEQ ID NO：35给出的基因编码的支链酮酸脱羧酶催化的那样；和

e)异丁醛到异丁醇，例如如被SEQ ID NO：37给出的基因编码的支链醇脱氢酶催化的那样。

用于丁醇生产的肠球菌宿主的构建

可利用本领域公知的技术构建包含编码一种用于将可发酵碳底物转化为丁醇的酶途径的必需基因的重组，丁醇耐受肠球菌菌株。粪肠球菌(Enterococcus faecalis)和屎肠球菌(Enterococcus faecium)的基因组序列是已知的(国家生物技术信息中心(NCBI)数据库)。这些细菌具有37％的G+C含量。鹑鸡肠球菌(Enterococcus gallinarum)与粪肠球菌(Enterococcus faecalis)和屎肠球菌(Enterococcus faecium)密切相关。

本发明中，编码一种上述的丁醇生物合成途径的酶的基因可分离自多种来源(见上述)。获得来自细菌基因组的期望的基因的方法是分子生物学领域普通的并且公知的。例如，如果基因序列是已知的，可设计引物，并且利用标准引物定向扩增方法例如聚合酶链式反应(美国专利No.4,683,202)扩增期望的序列以获得一定量的适合于克隆入转化载体的DNA。如果要分离异源于已知序列的基因，适合的基因组文库可通过限制性内切酶消化产生，并且用具有期望的基因序列的互补序列的探针筛选。一旦序列被分离，DNA可利用标准引物-定向扩增方法例如聚合酶链式反应(美国专利NO.4,683,202)进行扩增，以获得一定量的适合于利用适当载体的转化的DNA。用于为在异源宿主中表达的密码子最优化的工具是可容易地获得的。

一旦相关途径基因被鉴定并且被分离，它们可通过本领域公知的方法插入载体并被转化入丁醇耐受肠球菌宿主。对于肠球菌的转化有用的载体是已知的(见下述)。典型地，载体包含指引插入的DNA片段的转录和翻译的序列，可选择的标记物，和允许自主复制或染色体整合的序列。适当的载体包含插入的DNA片段的5’区域，其包含转录起始控制物，和DNA片段的3’区，其控制转录终止。两种控制区域可获自与转化的宿主细胞同源的基因，虽然可以理解所述控制区域还可获自与特定生产宿主非天然的基因。

起始控制区域或启动子，其对于驱动在期望的肠球菌宿主细胞中的相关途径编码区域区域的表达是有用的，可获自其他乳酸细菌或其他革兰氏阳性生物。一种非限制性例子是来自乳球菌的nisA启动子。终止控制区域还可获自优选宿主或相关细菌的多种天然基因。任选地，终止位点可以是非必需的，然而，如果包括是最优选的。

肠球菌属属于乳杆菌属(Lactobacillales)家族并且用于乳杆菌(Lactobacillus)，枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，和链球菌(Streptococcus)的许多质粒和载体可用于肠球菌。适合的载体的非限制性例子包括pAMβ1及其衍生物(Renault等人，Gene 183：175-182(1996)；和O’Sullivan等人，Gene 137：227-231(1993))；pMBB1和pHW800，pMBB1的一种衍生物(Wyckoff等人Appl.Environ.Microbiol.62：1481-1486(1996))；pMG1，一种接合质粒(Tanimoto等人，J.Bacteriol184：5800-5804(2002))；pNZ9520(Kleerebezem等人，Appl.Environ.Microbiol.63：4581-4584(1997))；pAM401(Fujimoto等人，Appl.Environ.Microbiol.67：1262-1267(2001))；和pAT392(Arthur等人，Antimicrob.Agents Chemother.38：1899-1903(1994))。利用来自乳球菌的nisA启动子的粪肠球菌(E.faecalis)的表达质粒也可利用(Eichenbaum等人，Appl.Environ.Microbiol.64：2763-2769(1998)。另外，用于在屎肠球菌(E.faecium)染色体中基因置换的载体可被使用(Nallaapareddy等人，Appl.Environ.Microbiol.72：334-345(2006))。

用于丁醇生物合成途径的多种基因可被组装入任何适当的载体，例如上述的那些。密码子可为表达基于从粪肠球菌(Enterococcusfaecalis)或屎肠球菌(Enterococcus faecium)的基因组序列推导出的密码子索引(codon index)进行最优化。质粒可利用本领域已知的方法引入丁醇耐受宿主细胞，所述方法例如Cruz-Rodz等人(MolecularGenetics and Genomics 224：1252-154(1990))所述电穿孔，或Tanimoto等人(J.Bacteriol.184：5800-5804(2002))和Grohamann等人(Microbiol.Mol.Biol.Rev.67：277-301(2003))所述接合。

发酵培养基

用于丁醇生产的发酵培养基必须包含适当的碳底物。适当的底物可包括但不限于单糖例如葡萄糖和果糖，寡糖例如乳糖或蔗糖，多糖例如淀粉或纤维素，或其混合物和来自可再生饲料例如干酪乳清渗透物，玉米浆，糖用甜菜蜂蜜，和大麦芽的未纯化混合物。

尽管预期上述碳底物和其混合物都适用于本发明，优选的碳底物是葡萄糖，果糖和蔗糖。

除了适当的碳底物之外，发酵培养基必须包含对于本领域技术人员来说是已知的，适合于培养物的生长和促进丁醇生产必需的酶途径的适当的矿物质，盐，辅因子，缓冲液和其他成分。

培养条件

典型地，细胞在适当的培养基中生长于大约25℃到大约40℃的温度范围内。本发明中适当的生长培养基是普通的商业制备的培养基例如Luria Bertani(LB)肉汤，Sabouraud右旋糖(SD)肉汤或酵母培养基(YM)肉汤。还可使用其他已知成分的或合成的生长培养基，并且用于特定微生物的生长的适当培养基对于微生物或发酵科学领域的技术人员是已知的。已知的直接或间接调节分解代谢物抑制的试剂例如环腺苷2’：3’-一磷酸盐也可并入发酵培养基中。

发酵的适当的PH范围是pH5.0到pH9.0，其中pH6.0到pH8.0作为起始条件是优选的。

发酵可在需氧或厌氧条件下进行，其中厌氧或微需氧条件是优选的。

工业化分批和连续发酵

丁醇可利用分批发酵方法生产。经典的分批发酵是封闭的系统，其中培养基的组分在发酵开始设定，并且在发酵过程中不进行人工改变。标准分批系统的变体是补料-分批系统。补料-分批发酵方法也适合于本发明，并且包含典型的分批系统除了当发酵进行时增量添加底物之外。当分解代谢物抑制倾向于抑制细胞的新陈代谢时和期望在培养基中具有限制量的底物时，补料-分批系统是有用的。分批和补料-分批发酵是本领域中普通的并且是公知的，其例子可在Thomas D.Brock in Biotechnology：A Textbook of Industrial Microbiology，SecondEdition(1989)Sinauer Associates，Inc.，Sunderland，MA.，or Deshpande，Mukund V.，App l.Biochem.Biotechnol.，36：227，(1992)中找到，其全文在此引入作为参考。

丁醇还可利用连续发酵方法生产。连续发酵是开放的系统，其中已知成分的发酵培养基连续添加到生物反应器中并且同时移除等量的条件培养基以处理。连续发酵通常包含恒定高密度的培养物，其中细胞主要在对数生长期。连续发酵允许调节影响细胞生长或最终产物浓度的一种因素或任何数目的因素。调节连续发酵方法的养分和生长因素和最大化产物形成率的技术是工业微生物学领域公知的，并且上述Brock描述了多种方法。

预期可利用分批，补料-分批或连续方法进行丁醇的生产，并且任何发酵模式是适合的。另外，预期细胞可固定在底物上作为完整细胞催化剂并在发酵条件的作用下进行丁醇生产。

用于从发酵培养基中分离丁醇的方法

生物生产的丁醇可从发酵培养基中利用本领域已知用于ABE发酵的方法分离(见例如Durre，Appl.Microbiol.Biotechnol.49：639-648(1998)，Groot等人，Process.Biochem.27：61-75(1992)，和其参考文献)。例如，固体可通过离心，过滤，倾析等从发酵培养基中去除。然后，丁醇可利用例如蒸馏，共沸蒸馏，液-液萃取，吸附，气提，膜蒸发，或全蒸发从发酵培养基中分离。

实施例

本发明进一步在下述实施例中被限定。应理解这些实施例，显示了本发明的优选实施方案的同时，仅仅作为例示的方式给出。从上述讨论和这些实施例中，本领域技术人员可确定本发明的本质特征，并且在不偏离本发明的精神和范围之下对本发明作出多种改变和修饰以适应多种用途和条件。

使用的缩略语的含义如下所述：“min”表示分钟，“h”表示小时，“sec”表示秒，“μL”表示微升，“mL”表示毫升，“L”表示升，“nm”表示纳米，“mm”表示毫米，“cm”表示厘米，“μm”表示微米，“mM”表示毫摩尔，“M”表示摩尔，“mmol”表示毫摩尔，“μmole”表示微摩尔，“g”表示克，“μg”表示微克，“mg”表示毫克，“rpm”表示转每分钟，“w/v”表示重量/体积，“OD”表示光学密度，“OD₆₀₀”表示在600nm波长下测量的光学密度，“OD₅₉₅”表示在595nm波长下测量的光学密度，“IC₅₀”表示导致50％生长抑制的丁醇浓度，“GCMS”表示气相色谱-质谱，“HPLC”表示高效液相色谱。

一般方法

用于实施例的标准重组DNA和分子克隆技术是本领域公知的，并且描述于Sambrook，J.，Fritsch，E.F.和Maniatis，T.，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold SpringHarbor，N.Y.，1989，by T.J.Silhavy，M.L.Bennan，和L.W.Enquist，Experiments with Gene Fusions，Cold Spring Harbor Laboratory，ColdSpring Harbor，N.Y.，1984，和Ausubel，F.M.等人，Current Protocolsin Molecular Biology，Greene Publishing Assoc.and Wiley-Interscience，N.Y.，1987。

适合于细菌培养物的维持和生长的材料和方法是本领域公知的。适合于用于下述实施例的技术可在Manual of Methods for GeneralBacteriology，Phillipp Gerhardt，R.G.E.Murray，Ralph N.Costilow，Eugene W.Nester，Willis A.Wood，Noel R.Krieg and G.B riggs Phillips，eds.，American Society for Microbiology，Washington，DC.，1994中或Thomas D.Brock：Biotechnology：A Textbook of Industrial Microbiology，Second Edition，Sinauer Associates，Inc.，Sunderland，MA，1989中找到。用于细菌细胞的生长和维持的所有的试剂，限制性酶和材料除了另外说明均获自Aldrich Chemicals(Milwaukee，WI)，BD DiagnosticSystems(Sparks，MD)，Life Technologies(Rockville，MD)，or SigmaChemical Company(St.Louis，MO)。

实施例1丁醇耐受微生物的分离

本实施例的目的是分离丁醇耐受微生物。环境样品获自几种废水处理地点并且在摇瓶中包含1-丁醇的富集培养物中生长。丁醇耐受细菌菌株被分离并鉴定为屎肠球菌(Enterococcus faecium)。

环境污泥样品获自位于几种E.I.du Pont de Nemours and Company地点的废水处理设备。对每种样品通过用在10mL最小富集培养基(也就是，10mM硫酸铵，50mM磷酸钾缓冲液，pH7.0，2mM MgCl₂，0.7mM CaCl₂，50μM MnCl₂，1μM FeCl₃，1μM ZnCl₂，1.72μM CuCl₂，2.53μM CoCl₂，2.42μM Na₂MoO₄，2μM盐酸硫胺素，0.5％葡萄糖，0.5％果糖，0.5％蔗糖和0.1％酵母提取物)中的1mL污泥样品接种125-mL的screw cap锥形烧瓶而建立富集培养物。富集培养物在37℃震荡培养。24h的培养之后，富集培养物以1：10稀释为包含0.8％，1.2％或1.6％w/v的1-丁醇的新鲜培养基(Sigma Chemical Co.；分子生物等级(大于或等于99％纯度))。培养在相同条件下继续。具有允许显著生长(例如，具有大约0.1的起始OD₆₀₀，在24到48h内增长到大约1.0的OD₆₀₀的培养物)的最高水平的1-丁醇的培养物然后以1：10稀释为包含更高水平的1-丁醇的新鲜培养基以选择对1-丁醇提高的耐受。大多数富集培养物在1.2％的1-丁醇存在下生长，并且来自一些地点的富集培养物在1.6％的1-丁醇存在下生长。但是，没有富集培养物在液体培养基中2.0％的1-丁醇存在下生长。

1-丁醇抗性细菌的纯化株如下分离自富集培养物。生长于包含1.2％或1.6％的富集培养物的细胞被连续稀释，连续稀释液平板接种于Luria Bertani(LB)琼脂培养基，改良的LB琼脂(也就是，补充了0.5％蔗糖，0.5％葡萄糖，0.5％果糖，0.5％丙酮酸钠，2mM MgCl₂，0.7mM

CaCl₂，50μM MnCl₂，1μM FeCl₃，1μM ZnCl₂，1.72μM CuCl₂，2.53μM CoCl₂，2.42μM Na₂MoO₄和2μM盐酸硫胺素的LB琼脂)或具有2.0％Difco^TM Agar Noble的最小富集培养基(BD Diagnostic Systems，Sparks，MD)，所有培养基都没有1-丁醇。然后从琼脂培养基将集落接种到微量滴定板的孔中没有1-丁醇的最小富集培养基中。每孔中的细胞在具有或不具有1-丁醇的分离的微量滴定板中再培养以鉴定1-丁醇-耐受分离物。用于攻击分离物的1-丁醇的量在1.2％到3.0％w/v之间。几种来自富集的分离物在37℃下在液体培养基中存在2.0％或更高的1-丁醇时显示出生长。如下所述测定能够在包含至少2.0％的1-丁醇的液体培养基中生长的分离的株的IC₅₀值。在37℃下在不存在(对照)和存在1.2％到3.0％w/v的1-丁醇时监测(通过OD₆₀₀)培养于S30L培养基(也就是，10mM硫酸铵，5mM磷酸钾缓冲液，pH7.0，50mM MOPS，pH7.0，2mM MgCl₂，0.7mM CaCl₂，50μM MnCl₂，1μM FeCl₃，1μM ZnCl₂，1.72μM CuCl₂，2.53μM CoCl₂，2.42μMNa₂MoO₄，2μM盐酸硫胺素，0.01M葡萄糖，和0.2％酵母提取物)中的分离物的生长，并且从生长曲线的对数部分计算每种培养物的倍增时间(倍增时间＝0.693/生长率)。通过从100％减去生长百分比([对照瓶的倍增时间/样品瓶的倍增时间]X100)确定样品中由1-丁醇引起的生长抑制百分比。IC₅₀是引起50％的生长抑制的丁醇的浓度，并且通过将丁醇浓度对抑制百分比绘图而测定。能够在包含2.5％w/v的1-丁醇的固体培养基中在37℃下生长的代表性株的结果总结于表4。当该株在30℃培养时获得更高的IC₅₀值(数据未显示)。通过对在从每种分离物提取的DNA中聚合酶链式反应(PCR)扩增16S rRNA基因而获得的产物进行测序而鉴定分离物。从每种1-丁醇耐受株抽提DNA。利用商业试剂盒处理每种分离物(Ultraclean Microbial GenomicDNA Isolation Kit，获自Mo Bio Laboratories，Inc，Carlsbad，CA，PartNo.12224-50)。分离物的16S rRNA基因利用具有如SEQ ID NO：39给出的引物JCR14(ACGGGCGGTGTGTAC)，和如SEQ ID NO：40给出的JCR15(GCCAGCAGCCGCGGTA)的HotStar Taq(Qiagen，Valencia，CA；Catalog No.203446)通过PCR进行扩增。PCR条件是在95℃15分钟，然后在94℃45秒进行30循环，55℃1分钟，72℃1分钟，然后72℃10分钟。PCR产物进行纯化并测序。每种序列用作GenBank的BLAST检索的查询序列以检索最相类似的先前鉴定的16SrRNA基因序列。命名为PN0110(SEQ ID NO：41)的分离株的rRNA基因序列匹配于屎肠球菌(Enterococcus faecium)已知的rRNA序列(见表4)。

表4

分离自环境样品的丁醇耐受细菌株

分离物	种系型	ATTC No.	16S rRNA序列	IC₅₀(％)1-丁醇在37℃下
分离物	种系型	ATTC No.	16S rRNA序列	IC₅₀(％)1-丁醇在37℃下	PN0110	屎肠球菌(Enterococcusfaecium)	PTA-7478	SEQ ID NO：41	1.7

实施例2

利用连续培养的丁醇耐受细菌株的分离

本实施例的目的是分离丁醇耐受细菌株。环境样品获自几种废水处理地点并且在恒化生物反应器连续培养中存在1-丁醇的情况下生长。几种1-丁醇耐受细菌株被分离并鉴定为不同种的肠球菌。

Appilikon发酵罐(Appilikon Inc.，Clinton，NJ)用作厌氧恒化器。这种生物反应器系统由1-L碟形底(dished bottom)反应器，控制器ADI 1032 P100，以及具有海船和涡轮机叶轮(marine and turbineimpeller)的搅拌器单元组成。具有适当传感器的生物控制器ADI 1030Z510300020用于监控PH，溶解氧，和温度。Cole Parmer泵和泵头(ColeParmer Instrument Co.，Vernon Hills，IL)用于添加酸和碱以维持培养基在PH7.0。利用循环水浴将温度保持在37℃。培养基(S20培养基)由5mM磷酸钾缓冲液，pH7.0，10mM的硫酸铵，0.1％酵母提取物，0.1％caseamino acids，100mM MOPS，2mM MgCl₂，0.7mM CaCl₂，0.05mM MnCl₂，0.001mM ZnCl₂，0.002mM盐酸硫胺素，1.72μMCuCl₂，2.53μM CoCl₂，2.42μM Na₂MoO₄，25mM葡萄糖，12.5mM蔗糖，和12.5mM果糖组成，并且500mL体积的培养基用于本生物反应器中。生物反应器利用0.1到1.0mL/分钟和50rpm的搅拌器速度进行操作。

用获自几种E.I.du Pont de Nemours and Company地点的不同废水处理设备的几种废水污泥样品的混合物接种生物反应器。分批模式操作短期之后，生物反应器以连续补料模式操作。1-丁醇作为流入的培养基的部分而被添加到生物反应器中。当生物反应器从分批模式转换到连续补料模式时，1-丁醇在生物反应器中的水平是0％，并且然后1-丁醇在生物反应器中逐渐增加到2.5％。培养基的流率在0.1到1.0mL/分钟的范围内。

通过测量在600nm的光学密度监测生物反应器中的细胞密度。利用具有5973质量检测器的HP6890气相色谱仪(Agilent Technologies，Inc，Wilmington，DE)的GCMS测定补料和流出物中的1-丁醇。GC柱是DB-WAX，30m x 0.32mm ID x 0.25μm柱(J & W Scientific，Inc.，Folsom，CA)。可选的，样品被过滤(Acrodisc CR PTFE0.2μm滤器)并且通过利用具有Shodex

SH-G保护柱的Shodex

SH1011柱(8mm IDx 300mm length；Shoko America Inc.，Colorado Springs，CO)的HPLC而分析。柱温度是50℃并且利用0.5mL/分钟的流率。为了检测，利用在210nm的光度检测器和折射率检测器。样品注射体积是10μL。

起始调整期之后，通过补料进入生物反应器的1-丁醇的量逐渐增加使得培养基中最终的1-丁醇浓度达到2.5％w/v。在相同的时期，生物反应器流出物中的葡萄糖量被监测。提高补料中的1-丁醇量导致细胞密度的降低和伴随的葡萄糖利用的降低。连续的培养导致细胞密度和葡萄糖利用在适应更高水平的1-丁醇之后再次提高。例如，提高1-丁醇到1.6％导致细胞密度降低到小于1.5OD₆₀₀并具有葡萄糖利用的相应降低。但是，连续培养导致细胞密度提高到2.3OD₆₀₀并具有葡萄糖消耗的相应提高。

厌氧生物反应器中微生物聚生体的系统发育的特征鉴定和来自生物反应器的1-丁醇抗性细菌的纯株的分离如下实施。在不同时间取自生物反应器的细胞样品和取自生物反应器废水罐(waste jug)的细胞样品被连续稀释，并且连续稀释液平板接种于没有1-丁醇的S20琼脂培养基上(具有1.6％Difco^TM琼脂，Noble-凝固剂的S20培养基)。然后从S20琼脂培养基将集落接种到方孔微量滴定板(Beckman CoulterInc，Fullerton，CA；目录号No.069681)的孔中没有1-丁醇的1.2mL的S20培养基中。方孔微量滴定板用粘合盖密封(Beckman Coulter Inc.；目录号No.538619)并且在37℃振荡培养直到72h。通过将来自每个方孔的200L培养物分配到“U-底”微量滴定板(VWR Scientific Products，West Chester，PA；目录号No.62409-052)的相应孔中，利用方孔微量滴定板制备主平板。每孔中的细胞然后再培养入具有或不具有1-丁醇的U-底微量滴定板(BD Diagnostic Systems；目录号No.353077)的孔中的200 L的S20培养基以鉴定1-丁醇耐受分离物。分离物分别用2.0％和3.0％w/v的1-丁醇攻击。通过在1-丁醇存在下的生长而测定丁醇耐受，所述生长通过在微量滴定板读数器上(HTS 7000 Plus BioAssay Reader，PerkinElmer Life and Analytical Sciences Inc.，Wellesley，MA)测量在595nm(OD₅₉₅)下光学密度的提高而测定。在37℃振荡生长48h之后具有OD₅₉₅读数在0.1到0.8范围的分离物被选择进行进一步的耐受测试。可选的，来自主培养板的分离物利用Nunc-TSP可转移固相筛选系统(Nalgene Nunc International，Napersville，IL；目录号No.445497)复制铺板于包含高达3.4％1-丁醇的S20琼脂。耐受分离物通过在37℃生长24到72h之后被鉴定。几种分离物，包括表5列出的那些，显示出在2.5％或更高的1-丁醇下在固体培养基上的生长。分离株的IC₅₀值在37℃对1-丁醇，2-丁醇，异丁醇，2-丁酮(也称作甲基乙基酮(MEK))和乙醇按照实施例1所述方法测定。结果总结于表5.基于对每种化合物测定的IC₅₀值和在对1-丁醇和对每种其他测试化合物的耐受性所见的相关性，鉴定的耐受株期望生长于包含3.9％w/v2-丁醇，2.7％w/v异丁醇，5.0％w/v2-丁酮，或9.0％w/v乙醇的固体培养基上。

通过对16S rRNA基因测序鉴定分离物，如实施例1所述。每种分离物的16S rRNA的SEQ ID，种系型，和分离物命名也在表5中给出。

表5

利用连续培养从环境样品中分离的丁醇耐受细菌株

分离物	种系型	16S rRNA序列	IC₅₀(％)1-丁醇	IC₅₀(％)2-丁醇	IC₅₀(％)异丁醇	IC₅₀(％)2-丁酮	IC₅₀(％)乙醇
分离物	种系型	16S rRNA序列	IC₅₀(％)1-丁醇	IC₅₀(％)2-丁醇	IC₅₀(％)异丁醇	IC₅₀(％)2-丁酮	IC₅₀(％)乙醇	PN0048	鹑鸡肠球菌(Enterococcusgallinarium)	SEQ IDNO：42	1.7	2.6	1.8	3.6	4.4
PN0197-10	粪肠球菌(Enterococcusfaecalis)	SEQ IDNO：43	1.8	2.9	1.8	3.2	4.1	PN0048	鹑鸡肠球菌(Enterococcusgallinarium)	SEQ IDNO：42	1.7	2.6	1.8	3.6	4.4
PN0197-10	粪肠球菌(Enterococcusfaecalis)	SEQ IDNO：43	1.8	2.9	1.8	3.2	4.1	PN0133	屎肠球菌(Enterococcusfaecium)	SEQ IDNO：44	1.9	2.8	2.1	3.0	4.4

<110>E.I.du Pont de Nemours and Co.

<120>溶剂耐受微生物及分离方法

<130>CL3423PCT

<160>44

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>1179

<212>DNA

<213>丙酮丁醇梭菌

<400>1

<210>2

<211>392

<212>PRT

<213>丙酮丁醇梭菌

<400>2

<210>3

<211>1179

<212>DNA

<213>丙酮丁醇梭菌

<400>3

<210>4

<211>392

<212>PRT

<213>丙酮丁醇梭菌

<400>4

<210>5

<211>849

<212>DNA

<213>丙酮丁醇梭菌

<400>5

<210>6

<211>282

<212>PRT

<213>丙酮丁醇梭菌

<400>6

<210>7

<211>786

<212>DNA

<213>丙酮丁醇梭菌

<400>7

<210>8

<211>261

<212>PRT

<213>丙酮丁醇梭菌

<400>8

<210>9

<211>1197

<212>DNA

<213>丙酮丁醇梭菌

<400>9

<210>10

<211>398

<212>PRT

<213>丙酮丁醇梭菌

<400>10

<210>11

<211>1407

<212>DNA

<213>拜氏梭菌

<400>11

<210>12

<211>468

<212>PRT

<213>拜氏梭菌

<400>12

<210>13

<211>1215

<212>DNA

<213>丙酮丁醇梭菌

<400>13

<210>14

<211>390

<212>PRT

<213>丙酮丁醇梭菌

<400>14

<210>15

<211>1170

<212>DNA

<213>丙酮丁醇梭菌

<400>15

<210>16

<211>389

<212>PRT

<213>丙酮丁醇梭菌

<400>16

<210>17

<211>780

<212>DNA

<213>肺炎克雷伯氏菌

<400>17

<210>18

<211>259

<212>PRT

<213>肺炎克雷伯氏菌

<400>18

<210>19

<211>1680

<212>DNA

<213>肺炎克雷伯氏菌

<400>19

<210>20

<211>559

<212>PRT

<213>肺炎克雷伯氏菌

<400>20

<210>21

<211>771

<212>DNA

<213>肺炎克雷伯氏菌

<400>21

<210>22

<211>256

<212>PRT

<213>肺炎克雷伯氏菌

<400>22

<210>23

<211>1665

<212>DNA

<213>产酸克雷伯氏菌

<400>23

<210>24

<211>554

<212>PRT

<213>产酸克雷伯氏菌

<400>24

<210>25

<211>675

<212>DNA

<213>产酸克雷伯氏菌

<400>25

<210>26

<211>224

<212>PRT

<213>产酸克雷伯氏菌

<400>26

<210>27

<211>522

<212>DNA

<213>产酸克雷伯氏菌

<400>27

<210>28

<211>173

<212>PRT

<213>产酸克雷伯氏菌

<400>28

<210>29

<211>1041

<212>DNA

<213>赤红球菌

<400>29

<210>30

<211>346

<212>PRT

<213>赤红球菌

<400>30

<210>31

<211>1476

<212>DNA

<213>大肠埃希氏菌

<400>31

<210>32

<211>491

<212>PRT

<213>大肠埃希氏菌

<400>32

<210>33

<211>1851

<212>DNA

<213>大肠埃希氏菌

<400>33

<210>34

<211>616

<212>PRT

<213>大肠埃希氏菌

<400>34

<210>35

<211>1662

<212>DNA

<213>乳酸乳球菌

<400>35

<210>36

<211>548

<212>PRT

<213>乳酸乳球菌

<400>36

<210>37

<211>1164

<212>DNA

<213>大肠埃希氏菌

<400>37

<210>38

<211>387

<212>PRT

<213>大肠埃希氏菌

<400>38

<210>39

<211>15

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>39

<210>40

<211>16

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>40

<210>41

<211>819

<212>DNA

<213>屎肠球菌

<400>41

<210>42

<211>1458

<212>DNA

<213>鹑鸡肠球菌

<400>42

<210>43

<211>818

<212>DNA

<213>粪肠球菌

<400>43

<210>44

<211>794

<212>DNA

<213>屎肠球菌

<400>44

Claims

1.分离丁醇耐受微生物的方法，所述方法包括：

a)提供包含微生物聚生体的微生物样品；

b)将微生物聚生体与包含可发酵碳源的生长培养基接触，直到微生物聚生体成员正在生长；

c)将步骤(b)的生长的微生物聚生体与丁醇接触；和

d)分离步骤(c)的存活的成员，其中丁醇耐受微生物被分离。

2.根据权利要求1的方法，其中步骤(b)生长的聚生体是生长于对数期。

3.根据权利要求1的方法，其中步骤(c)之后聚生体平板接种于固体培养基上。

4.根据权利要求3的方法，其中固体培养基包含丁醇。

5.根据权利要求1的方法，其中步骤(c)的接触重复一次或多次。

6.根据权利要求1的方法，其中接触步骤(c)的丁醇浓度是从大约0.8％w/v到大约3.0％w/v。

7.根据权利要求1的方法，其中步骤(d)的分离包括以下步骤：

i)在不存在丁醇时在液体培养基中生长步骤(d)的存活成员；由此存活成员繁殖；

ii)在存在丁醇时生长步骤(i)的细胞；和

8.根据权利要求1的方法，其中可发酵碳源选自：蔗糖、果糖、葡萄糖、丁酸、戊酸及其混合物。

9.根据权利要求1的方法，其中丁醇主要是1-丁醇。

10.根据权利要求1的方法，其中丁醇主要是2-丁醇。

11.根据权利要求1的方法，其中丁醇主要是异丁醇。

12.根据权利要求1的方法，其中聚生体在厌氧条件下生长。

13.根据权利要求1的方法，其中聚生体在微需氧条件下生长。

14.根据权利要求1的方法，其中聚生体在需氧条件下生长。

15.根据权利要求1的方法，其中步骤(d)的存活成员当在37℃生长于固体培养基上时对于至少2.5％w/v的1-丁醇耐受。

16.根据权利要求1的方法，其中步骤(d)的存活成员当在37℃生长于固体培养基上时对于至少3.9％w/v的2-丁醇耐受。

17.根据权利要求1的方法，其中步骤(d)的存活成员当在37℃生长于固体培养基上时对于至少2.7％w/v的异丁醇耐受。

18.根据权利要求1的方法，其中步骤(d)的存活成员当在37℃生长于固体培养基上时对于至少5.0％w/v的2-丁酮耐受。

19.根据权利要求1的方法，其中步骤(d)的存活成员当在37℃生长于固体培养基上时对于至少9.0％w/v的乙醇耐受。

20.根据权利要求1的方法，其中微生物样品是环境样品。

21.根据权利要求1的方法，其中丁醇耐受微生物是肠球菌种。

22.通过权利要求1的方法分离的丁醇耐受微生物。

23.根据权利要求22的丁醇耐受微生物，其中微生物是肠球菌属的细菌。

24.分离丁醇耐受肠球菌的方法，所述方法包括：

a)提供包含微生物聚生体的微生物样品；

b)为肠球菌的存在在包含下述成分的生长培养基中富集微生物聚生体：

i)可发酵碳源；和

ii)竞争物生长抑制剂；

以产生肠球菌富集的培养物，其中肠球菌富集的培养物的成员正在生长；

c)使步骤(b)的生长的肠球菌富集的培养物与丁醇接触；和

d)分离步骤(c)的存活的成员，其中丁醇耐受肠球菌被分离。

25.根据权利要求24的方法，其中步骤(c)的生长的肠球菌生长于对数期。

26.根据权利要求24的方法，其中微生物样品是环境样品。

27.根据权利要求24的方法，其中步骤(c)之后聚生体成员平板接种于固体培养基上。

28.根据权利要求27的方法，其中固体培养基包含丁醇。

29.根据权利要求24的方法，其中竞争物生长抑制剂选自胆汁、叠氮化物及其混合物。

30.根据权利要求24的方法，其中步骤(c)的接触重复一次或多次。

31.根据权利要求24的方法，其中步骤(c)的接触是与大约0.8％w/v到大约3.0％w/v的浓度的丁醇接触。

32.根据权利要求24的方法，其中步骤(d)的分离包括以下步骤：

i)在不存在丁醇时在液体培养基中生长步骤(d)的存活成员，由此存活成员繁殖；

ii)在存在丁醇时生长步骤(i)的细胞；和

33.根据权利要求24的方法，其中可发酵碳源选自蔗糖、果糖、葡萄糖、丁酸、戊酸及其混合物。

34.根据权利要求24的方法，其中丁醇主要是1-丁醇。

35.根据权利要求24的方法，其中丁醇主要是2-丁醇。

36.根据权利要求24的方法，其中丁醇主要是异丁醇。

37.根据权利要求24的方法，其中步骤(d)的存活成员当在37℃生长于固体培养基上时对于至少2.5％w/v的1-丁醇耐受。

38.根据权利要求24的方法，其中步骤(d)的存活成员当在37℃生长于固体培养基上时对于至少3.9％w/v的2-丁醇耐受。

39.根据权利要求24的方法，其中步骤(d)的存活成员当在37℃生长于固体培养基上时对于至少2.7％w/v的异丁醇耐受。

40.根据权利要求24的方法，其中步骤(d)的存活成员当在37℃生长于固体培养基上时对于至少5.0％w/v的2-丁酮耐受。

41.根据权利要求24的方法，其中步骤(d)的存活成员当在37℃生长于固体培养基上时对于至少9.0％w/v的2-乙醇耐受。

42.通过权利要求24的方法分离的丁醇耐受肠球菌。

43.权利要求42的丁醇耐受肠球菌，其当生长于固体培养基上时对于至少2.5％w/v的丁醇耐受。

44.根据权利要求42的丁醇耐受肠球菌，其中肠球菌具有下述特征：

i)为兼性厌氧生物；和

ii)为革兰氏阳性；和

iii)为不能动的；

iv)具有球形或卵形细胞形态学；和

v)具有启动在6.5％氯化钠肉汤和PH9.6肉汤中生长的能力；和

vi)包含选自SEQ ID NO：41，SEQ ID NO：42，SEQ ID NO：43，和SEQ ID NO：44的16S rRNA基因序列。

45.具有下述特征的丁醇耐受肠球菌：

i)为兼性厌氧性生物；和

ii)为革兰氏阳性；和

iii)为不能动的；和

iv)具有球形或卵形细胞形态学；和

vi)当生长于固体培养基上时，对至少2.5％w/v丁醇耐受。

46.根据权利要求45的丁醇耐受肠球菌，其包含选自SEQ ID NO：41，SEQ ID NO：42，SEQ ID NO：43，和SEQ ID NO：44的16S rRNA基因序列。

47.选自下组的丁醇耐受肠球菌：ATCC_PTA-7478(屎肠球菌PN0110)，ATCC PTA-7479(鹑鸡肠球菌PN0048)，ATCC PTA-7477(粪肠球菌PN0197-10)和ATCC PTA-7480(屎肠球菌PN0133)。

48.生产丁醇的方法，所述方法包括：

a)提供包含编码丁醇生物合成途径的遗传构建体的肠球菌，其具有下述特征：

i)为兼性厌氧生物；和

ii)为革兰氏阳性；和

iii)为不能动的；

iv)具有球形或卵形细胞形态学；和

v)具有启动在6.5％氯化钠肉汤和PH9.6肉汤中生长的能力；和

vi)当生长于固体培养基上时对至少2.5％w/v丁醇耐受，和

b)在生产丁醇的条件下生长步骤(a)的肠球菌。

49.生产丁醇的方法，所述方法包括：

a)提供权利要求24的方法分离的包含编码丁醇生物合成途径的遗传构建体的肠球菌，和

b)在生产丁醇的条件下生长步骤(a)的肠球菌。

50.根据权利要求48或49的方法，其中丁醇主要是1-丁醇。

51.根据权利要求48或49的方法，其中丁醇主要是2-丁醇。

52.根据权利要求48或49的方法，其中丁醇主要是异丁醇。

53.根据权利要求48或49的方法，其中肠球菌选自：ATCC_PTA-7478(屎肠球菌PN0110)，ATCC PTA-7479(鹑鸡肠球菌PN0048)，ATCC PTA-7477(粪肠球菌PN0197-10)和ATCC PTA-7480(屎肠球菌PN0133)。

54.用于生产丁醇的丁醇耐受肠球菌。

55.用于生产2-丁酮的2-丁酮耐受肠球菌。

56.生产2-丁酮的方法，所述方法包括：

i)为兼性厌氧生物；和

ii)为革兰氏阳性；和

iii)为不能动的；

iv)具有球形或卵形细胞形态学；和

v)具有启动在6.5％氯化钠肉汤和PH9.6肉汤中生长的能力；和

vi)当生长于固体培养基上时对至少2.5％w/v丁醇耐受，和

b)在生产2-丁酮的条件下生长步骤(a)的肠球菌。

57.生产2-丁酮的方法，所述方法包括：

a)提供通过权利要求24的方法分离的包含编码丁醇生物合成途径的遗传构建体的肠球菌；和

b)在生产2-丁酮的条件下生长步骤(a)的肠球菌。