KR20100016602A - 고도 활성 케톨-산 리덕토아이소머라아제 효소를 이용한 아이소부탄올의 발효 생산 - Google Patents

고도 활성 케톨-산 리덕토아이소머라아제 효소를 이용한 아이소부탄올의 발효 생산 Download PDF

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Abstract

고도 활성 케톨-산 리덕토아이소머라아제 효소와, 이외에도 글루코스의 아이소부탄올로의 전환에 필요한 기타 효소를 발현하는 재조합 미생물의 발효 배양에 의한 아이소부탄올의 발효 생산 방법이 제공된다.
유전자, 글루코스, 아이소부탄올, 비활성, 폴리펩티드, 숙주 세포

Description

고도 활성 케톨-산 리덕토아이소머라아제 효소를 이용한 아이소부탄올의 발효 생산{FERMENTIVE PRODUCTION OF ISOBUTANOL USING HIGHLY ACTIVE KETOL-ACID REDUCTOISOMERASE ENZYMES}
본 발명은 산업 미생물학 분야 및 알코올의 생성에 관한 것이다. 보다 구체적으로는, 큰 전환수(turnover number)를 갖는 특별한 케톨-산 리덕토아이소머라아제(ketol-acid reductoisomerase, KARI) 효소를 이용하여 재조합 미생물의 산업적 발효를 통하여 아이소부탄올을 생성한다. 또한, 본 발명은 천연 미생물 유래의 고도 활성 KARI 효소의 발견 방법에 관한 것이다.
부탄올은 연료 첨가제로서, 플라스틱 산업에서 공급 원료 화학물질로서, 그리고 식품 및 향료(flavor) 산업에서의 식품등급 추출제로서 유용한, 중요한 산업용 화학물질이다. 매해 100억 내지 120억 파운드의 부탄올이 석유화학적 수단에 의해 생산되며, 이러한 범용 화학물질에 대한 필요성은 증가할 가능성이 있을 것이다.
아이소부탄올의 화학적 합성 방법, 예를 들어 옥소 합성법, 일산화탄소의 촉매적 수소화 (문헌[Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry, 6th edition, 2003, Wiley-VCHVerlag GmbH and Co., Weinheim, Germany, Vol. 5, pp. 716-719]), 및 메탄올과 n-프로판올의 게르베(Guerbet) 축합법 (문헌[Carlini et al., J. Molec. Catal. A:Chem. 220, 215-220, 2004])이 공지되어 있다. 이들 방법은 석유화학물질로부터 유도되는 출발 물질을 이용하며, 일반적으로 비용이 많이 들고, 환경 친화적이지 못하다. 식물-유래된 원료로부터의 아이소부탄올의 생성은 온실 가스 방출을 최소화하며, 본 기술 분야에서의 진보를 나타낼 것이다.
아이소부탄올은 효모 발효의 부산물로서 생물학적으로 생성된다. 이것은 "퓨젤유(fusel oil)"의 성분인데, 이는 상기 군의 진균류에 의한 아미노산의 불완전한 대사 작용의 결과로서 형성된다. 아이소부탄올은 L-발린의 이화 작용에 의해 특이적으로 생성된다. L-발린의 아미노기가 질소 공급원으로서 얻어진 후, 생성된 α-케토산은 소위 에를리히(Ehrlich) 경로의 효소에 의해 아이소부탄올로 탈카르복실화되어 환원된다 (문헌[Dickinson et al., J. Biol. Chem. 273, 25752-25756, 1998]). 음료 발효 동안 성취되는 퓨젤유 및/또는 그 성분의 수율은 전형적으로 낮다. 예를 들어, 맥주 발효에서 생성되는 아이소부탄올의 농도는 16 백만분율(parts per million, ppm) 미만인 것으로 보고되어 있다 (문헌[Garcia et al., Process Biochemistry 29, 303-309, 1994]). 외인성 L-발린의 상기 발효에의 첨가는 아이소부탄올의 수율을 증가시키며, 이는 디킨슨(Dickinson) 등의 상기 문헌에 개시된 바와 같은데, 여기서, 발효에 있어서 20 g/L의 농도의 L-발린을 제공함으로써 3 g/L의 아이소부탄올의 수율이 얻어짐이 보고되어 있다. 게다가 n-프로판올, 아이소부탄올 및 아이소아밀알코올의 생성이 자이모모나스 모빌리스(Zymomonas mobilis)의 알긴산칼슘 고정된 세포에 의해 나타났다. L-Leu, L-Ile, L-Val, 알파-케토아이소카프로익산(알파--KCA), 알파-케토부티르산(알파-KBA) 또는 알파-케토아이소발레르산(알파-KVA) 중 어느 하나가 보충된 10% 글루코스-함유 배지가 사용되었다 (문헌[Oaxaca, et al., Acta Biotechnol.; 11, 523-532, 1991]). 알파-KCA는 아이소부탄올 수준을 증가시켰다. 아미노산이 또한 상응하는 알코올을 생성하였지만, 케토산보다는 보다 적은 정도로 이를 생성하였다. 탄수화물로부터의 C3-C5 알코올의 수율의 증가는 아미노산인 류신, 아이소류신 및/또는 발린이 질소 공급원으로서 성장 배지에 첨가되었을 때 나타났다 (국제특허 공개 WO 2005040392호).
상기에 설명된 방법은 생물학적 수단을 통한 아이소부탄올 생성의 잠재성을 나타내기는 하나, 이들 방법은 산업적 규모의 아이소부탄올 생산에 있어서 비용이 엄청나다. 당으로부터 직접적으로 아이소부탄올을 생합성하는 것은 경제적으로 실행가능하며 본 기술 분야에서 진보를 나타낼 것이다. 그러나, 이러한 생성은 아세토락테이트를 다이하이드록시-아이소발레레이트로 전환시키는 아이소-부탄올 경로에서의 제2 단계를 촉매하는 느린 케톨-산 리덕토아이소머라아제(KARI) 효소에 의해 심하게 방해를 받는다. 이 효소는 이미 높은 수준으로 발현되고 있기 때문에 (문헌[S. Epelbaum et al. J. Bacteriol.,180, 4056-4067, 1998]), 단백질의 양의 증가 없이 KARI의 활성을 증가시킬 필요가 있으며, 즉, 당해 효소의 비활성을 증가시킬 필요가 있다.
본 출원인은 아이소부탄올의 생물학적 생성을 향상시키기 위하여 사용될 수 있는, 비활성이 높은 KARI 효소의 발견을 통하여 기술한 문제를 해결하였다.
발명의 개요
본 발명은 고도 활성 KARI 효소를 발현하는 재조합 유기체에 관한 것이다. 엔지니어링된(engineered) 미생물은 유의하게 더 높은 비활성 (이. 콜라이(E. coli)의 KARI 효소의 6 내지 8배)을 보유하는 높은 수준의 짧은 형태의 KARI 효소를 가질 것이며, 이는 아이소부탄올의 상업적 생산에 사용될 수 있다. 따라서, 일 실시 형태에서, 본 발명은 아세토락테이트를 다이하이드록시-아이소발레레이트로 전환시키는 방법을 제공하며, 본 방법은
a) 케톨-산 리덕토아이소머라아제의 비활성이 이. 콜라이 케톨-산 리덕토아이소머라아제의 비활성보다 큰 폴리펩티드를 코딩하는 유전자 제작물을 포함하는 미생물 숙주 세포를 제공하는 단계; 및
b) (a)의 숙주 세포를 아세토락테이트와 접촉시키는 단계 - 여기서, 2,3-다이하이드록시-아이소발레레이트가 생성됨 - 를 포함한다.
바람직한 실시 형태에서, 본 유전자 제작물은 하기 조건:
a) 약 7.5의 pH;
b) 약 22.5℃의 온도; 및
c) 약 10 mM 초과의 칼륨
하에서 실행되는 NADPH 소비 분석(consumption assay)에 의해 측정할 때 정제된 단백질을 기준으로 케톨-산 리덕토아이소머라아제의 비활성이 1.1 mole/분/㎎보다 큰 폴리펩티드를 코딩한다. 다른 실시 형태에서, 본 발명은
a) 하기 유전자 제작물:
1) 피루베이트를 아세토락테이트로 전환시키는(경로 단계 a) 아세토락테이트 신타아제 효소를 코딩하는 적어도 하나의 유전자 제작물;
2) (S)-아세토락테이트의 2,3-다이하이드록시아이소발레레이트로의 전환(경로 단계 b)을 위한, 하기 조건:
i) 약 7.5의 pH;
ii) 약 22.5℃의 온도; 및
iii) 약 10 mM 초과의 칼륨 하에서 실행되는 NADPH 소비 분석에 의해 측정할 때 정제된 단백질을 기준으로 1.1 mole/분/㎎보다 큰 비활성의 케톨-산 리덕토아이소머라아제 효소를 코딩하는 적어도 하나의 유전자 제작물;
3) 2,3-다이하이드록시아이소발레레이트의 α-케토아이소발레레이트로의 전환(경로 단계 c)을 위한 아세토하이드록시산 데하이드라타아제를 코딩하는 적어도 하나의 유전자 제작물;
4) α-케토아이소발레레이트를 아이소부티르알데히드로 전환시키는(경로 단계 d) 분지쇄 케토산 데카르복실라아제를 코딩하는 적어도 하나의 유전자 제작물;
5) 아이소부티르알데히드의 아이소부탄올로의 전환(경로 단계 e)을 위한 분지쇄 알코올 데하이드로게나아제를 코딩하는 적어도 하나의 유전자 제작물을 포함하는 재조합 미생물 숙주 세포를 제공하는 단계; 및
b) 아이소부탄올을 생성시키는 조건 하에서 (a)의 숙주 세포를 배양하는 단계를 포함하는, 아이소부탄올을 생성하는 방법을 제공한다.
다른 실시 형태에서, 본 발명은 비활성이 이. 콜라이 케톨-산 리덕토아이소 머라아제의 비활성보다 큰 케톨-산 리덕토아이소머라아제 효소를 포함하는 재조합 숙주 세포를 제공한다.
다른 실시 형태에서, 본 발명은 하기 조건:
i) 약 7.5의 pH;
ii) 약 22.5℃의 온도; 및
iii) 약 10 mM 초과의 칼륨
하에서 실행되는 NADPH 소비 분석에 의해 측정할 때 정제된 단백질을 기준으로 비활성이1.1 mole/분/㎎보다 큰 케톨-산 리덕토아이소머라아제 효소를 코딩하는 유전자 제작물을 동정 및 단리하는,
a) M9 최소 배지에서 배양할 때 배증 시간이 이. 콜라이의 배증 시간보다 짧은 박테리아 종을 동정하는 단계;
b) (a)의 박테리아 종을 케톨-산 리덕토아이소머라아제 활성에 대하여 스크리닝하여 활성 박테리아 종을 동정하는 단계;
c) 케톨-산 리덕토아이소머라아제를 코딩하는 것으로 공지된 유전자 제작물에 대하여 상동성을 갖는 핵산 서열을 이용하여 (b)의 활성 박테리아 종의 게놈 DNA를 프로빙하여 상기 활성 박테리아 종 유래의 케톨-산 리덕토아이소머라아제를 코딩하는 유전자 제작물을 동정 및 단리하는 단계; 및
d) 상기 활성 박테리아 종 유래의 케톨-산 리덕토아이소머라아제를 코딩하는 유전자 제작물을 증폭 및 발현시키는 단계와;
e) 단계 (d)의 발현된 유전자 제작물을, 하기 조건:
i) 약 7.5의 pH;
ii) 약 22.5℃의 온도; 및
iii) 약 10 mM 초과의 칼륨 하에서 실행되는 NADPH 소비 분석에 의해 측정할 때 정제된 단백질을 기준으로 비활성이 1.1 mole/분/㎎보다 큰 것에 대하여 스크리닝하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.
본 발명의 도면 및 서열의 간단한 설명
본 발명은 하기의 상세한 설명, 도면, 및 첨부된 서열 설명 - 이는 본 출원의 일부를 형성함 - 으로부터 더욱 완전하게 이해될 수 있다.
도 1은 4가지의 상이한 아이소부탄올 생합성 경로를 도시한다. "a", "b", "c", "d", "e", "f", "g", "h", "i", "j" 및 "k"로 표식된 단계는 하기에 설명된 기질의 생성물로의 전환을 나타낸다.
하기 서열은 37 C.F.R. 1.821-1.825 ("뉴클레오티드 서열 및/또는 아미노산 서열에 대한 개시 내용을 포함하는 특허 출원의 요건 - 서열에 대한 규칙")에 따르며, 세계 지적 재산권 기구(World Intellectual Property Organization, WIPO) 표준 ST.25 (1998)와, EPO 및 PCT의 서열 목록 요건 (규칙 5.2 및 49.5(a-bis)와, 시행 세칙의 섹션 208 및 별첨(Annex) C)에 부합된다. 뉴클레오티드 및 아미노산 서열 데이터에 사용되는 기호 및 형식은 37 C.F.R. §1.822에 개시된 규칙에 따른다.
Figure 112009070373452-PCT00001
서열 번호 11 내지 서열 번호 22는 실시예 1에서의 제작물의 생성을 위하여 사용되는 올리고뉴클레오티드 프라이머의 뉴클레오티드 서열이다.
서열 번호 23 내지 서열 번호 30은 실시예 2에서의 제작물의 생성을 위하여 사용되는 올리고뉴클레오티드 프라이머의 뉴클레오티드 서열이다.
서열 번호 11 및 서열 번호 12는 ilvC 유전자의 PCR 증폭을 위하여 실시예 1에서 사용된 프라이머의 DNA 서열이다.
서열 번호 13은 이. 콜라이에서 pBAD 벡터에 KARI 유전자를 클로닝하기 위하여 사용된 프라이머의 전방향 DNA 서열이다.
서열 번호 14는 이. 콜라이에서 pBAD 벡터에 KARI 유전자를 클로닝하기 위하여 사용된 프라이머의 역방향 DNA 서열이다.
서열 번호 15는 KARI 유전자의 증폭을 위하여 사용되는 ilvC-trc-SacI-F의 전방향 DNA 서열이다.
서열 번호 16은 KARI 유전자의 증폭을 위하여 사용되는 ilvC-trc-SacI-F의 역방향 DNA 서열이다.
서열 번호 17 내지 서열 번호 22는 SacI 절단 및 DNA 서열결정에 의해 이. 콜라이 ilvC 인서트의 존재를 확인하기 위하여 사용되는 올리고뉴클레오티드 프라이머의 뉴클레오티드 서열이다.
서열 번호 17 - ilvC-trc-F3
서열 번호 18 - ilvC-trc-F5
서열 번호 19 - ilvC-trc-R2
서열 번호 20 - ilvC-trc-R4
서열 번호 21 - pBAD-eF1
서열 번호 22 - PALPK-R1
서열 번호 23 내지 서열 번호 26은 슈도모나스 아에루기노사(Pseudomonas aeruginosa) (PAO1) 및 슈도모나스 플루오레센스(Pseudomonas fluorescens) (PF5)의 게놈 DNA 유래의 ilvC 유전자를 PCR에 의해 증폭시키기 위하여 전방향 및 역방향에서 사용되는 올리고뉴클레오티드 프라이머의 뉴클레오티드 서열이다.
서열 번호 23 - PAO1-C-F1
서열 번호 24 - PAO1-C-R1
서열 번호 25 - PF5-C-F1
서열 번호 26 - PF5-C-R1
서열 번호 21, 서열 번호 22, 서열 번호 27 및 서열 번호 28은 슈도모나스의 ilvC 유전자를 포함하는 양성 클론의 DNA 서열을 확인하기 위하여 사용되는 올리고뉴클레오티드 프라이머의 뉴클레오티드 서열이다.
서열 번호 27 - PF5-S-F2
서열 번호 28 - PF5-S-R2
하기 서열 번호는 본 발명에서 사용되는 KARI 유전자의 DNA 서열에 상응한다:
서열 번호 29 - 이. 콜라이 K12 - ilvC
서열 번호 30 - 이. 콜라이 발현을 위한 비브리오(Vibrio) 유래의 코돈 최적화된 KARI
서열 번호 31 - 슈도모나스 아에루기노사 - PAO1 - ilvC
서열 번호 32 - 슈도모나스 플루오레센스 - PF5 - ilvC
하기 서열 번호는 각각 서열 번호 29 내지 서열 번호 32에 상응하는 아미노산 서열이다:
서열 번호 33 - 이. 콜라이 K12 - ilvC - [이. 콜라이 K12 유래의 KARI]
서열 번호 34 - 비브리오 콜레레(Vibrio cholerae) 유래의 KARI
서열 번호 35 - PAO1-ilvC (1aa - 338 aa)
서열 번호 36 - PF5-ilvC (1aa - 338aa)
서열 번호 37은 전방향 프라이머 PAL-F1이다.
서열 번호 38은 역방향 프라이머(PAL-R1)이다.
서열 번호 39는 전방향 프라이머 (PAL-EcoR1-F1)이다.
서열 번호 40은 역방향 프라이머(PAL-EcoR1-R1)이다.
본 발명은 매우 활성인 KARI 효소를 포함하는 미생물 숙주 세포를 사용하여 아세토락테이트를 2,3-다이하이드록시-아이소발레레이트로 전환시키는 방법에 관한 것이다. 그와 같이 형성된 2,3-다이하이드록시-아이소발레레이트는 도 1에 예시된 단계를 통하여 아이소부탄올로 추가로 전환된다. 또한, 본 발명은 천연 숙주 미생물에서 보다 빠른 KARI 효소를 찾는 방법 및 그의 촉매 활성을 추가로 향상시킬 목적을 위한 그러한 효소의 분자적 진화 방법을 개시한다.
본 발명은 많은 상업적 및 산업적 필요성을 충족시킨다. 부탄올은 다양한 응용에서 중요한 산업적 상품용의 화학물질이며, 여기서, 연료 또는 연료 첨가제로서의 그의 잠재성은 특히 상당하다. 유일하게 C4 알코올이기는 하지만, 부탄올이 가솔린의 에너지 함량과 유사한 에너지 함량을 가지며 임의의 화석 연료와 블렌딩될 수 있다. 부탄올은 표준 내연 기관(internal combustion engine)에서 연소될 때 이것이 단지 CO2를 생성하며 SOX 또는 NOX는 거의 생성하지 않거나 전혀 생성하지 않기 때문에 연료 또는 연료 첨가제로서 유리하다. 부가적으로, 부탄올은 현재까지 가장 바람직한 연료 첨가제인 에탄올보다 부식성이 덜하다.
부탄올은 바이오연료 또는 연료 첨가제로서의 그의 유용성 외에, 신생의 연료 전지 산업에서 수소 분포의 문제에 영향을 주는 잠재성을 갖는다. 오늘날 연료 전지는 수소 수송 및 분포와 관련된 안전성에 대한 우려로 괴롭힘을 당하고 있다. 부탄올은 그의 수소 함량 때문에 용이하게 재형성될 수 있으며, 연료 전지 또는 차량 중 어느 하나에 필요한 순도 면에서 기존의 주유소를 통하여 분배될 수 있다.
하기 정의 및 약어가 청구의 범위 및 명세서의 해석에 사용된다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "발명" 또는 "본 발명"은 제시된, 또는 이후에 보정되고 보충되는 청구의 범위에, 또는 명세서에 개시된 본 발명의 모든 실시 형태에 일반적으로 적용하고자 한다.
용어 "아이소부탄올 생합성 경로"는 아이소부탄올을 생성하는 효소적 경로를 말한다.
바람직한 아이소부탄올 생합성 경로는 도 1에 예시되어 있으며, 본 명세서에 개시된다.
용어 "NADPH 소비 분석"은 문헌[Aulabaugh et al.; Biochemistry, 29, 2824-2830, 1990]에 설명된 바와 같이 효소 반응에 의해 KARI 보조인자인 NADPH가 사라지는 것을 측정하는 것을 포함하는, KARI 효소의 비활성을 측정하는 효소 분석을 말한다.
"KARI"는 효소 케톨-산 리덕토아이소머라아제의 약어이다.
용어 "아세토하이드록시산 아이소머로리덕타아제" 및 "케톨-산 리덕토아이소머라아제"는 상호교환가능하게 사용되며 EC 번호, EC 1.1.1.86을 갖는 효소를 지칭할 것이다 (문헌[Enzyme Nomenclature 1992, Academic Press, San Diego]). 케톨-산 리덕토아이소머라아제는 하기에 더욱 충분히 설명되는 바와 같이 (S)-아세토락테이트의2,3다이하이드록시아이소발레레이트로의 반응을 촉매한다. 이들 효소는 많은 공급처로부터 입수가능하며, 이는 이. 콜라이 젠뱅크(GenBank) 등록 번호 NC_000913 영역: 3955993..3957468, 비브리오 콜레레 젠뱅크 등록 번호 NC_002505 영역: 157441..158925, 슈도모나스 아에루기노사 젠뱅크 등록 번호 NC_002516 영역: 5272455..5273471, 및 슈도모나스 플루오레센스 젠뱅크 등록 번호 NC_004129 영역: 6017379..6018395를 포함하지만, 이에 한정되지 않는다.
용어 "아세토락테이트 신타아제"는 피루베이트를 아세토락테이트 및 CO2로 전환시키는 것을 촉매하는 효소를 말한다. 아세토락테이트는 2가지, 즉, (R)- 및 (S)-입체이성체를 가지며, 효소는 생물학적 시스템에 의해 만들어지는 (S)-이성체를 선호한다. 바람직한 아세토락테이트 신타아제는 EC 번호2.2.1.6 9로 공지되어 있다 (문헌[Enzyme Nomenclature 1992, Academic Press, San Diego]). 이들 효소는 많은 공급처로부터 입수가능하며, 이는 바실러스 서틸리스(Bacillus subtilis) (젠뱅크 번호: CAB15618, Z99122, 각각 NCBI (국립 생명 공학 정보 센터(National Center for Biotechnology Information)) 아미노산 서열, NCBI 뉴클레오티드 서열), 클렙시엘라 뉴모니에(Klebsiella pneumoniae) (젠뱅크 번호: AAA25079 (서열 번호 2), M73842 (서열 번호 1)), 및 락토코커스 락티스 (젠뱅크 번호: AAA25161, L16975)를 포함하지만, 이에 한정되지 않는다.
용어 "아세토하이드록시산 데하이드라타아제"는 2,3-다이하이드록시아이소발레레이트의 α-케토아이소발레레이트로의 전환을 촉매하는 효소를 말한다. 바람직한 아세토하이드록시산 데하이드라타아제는 EC 번호 4.2.1.9로 공지되어 있다. 이들 효소는 일련의 광대한 미생물로부터 입수가능하며, 이는 이. 콜라이 (젠뱅크 번호: YP_026248 (서열 번호 6), NC_000913 (서열 번호5)), 에스. 세레비지에 (젠뱅크 번호: NP_012550, NC_001142), 엠. 마리팔루디스(M. maripaludis) (젠뱅크 번호: CAF29874, BX957219), 및 비. 서틸리스 (젠뱅크 번호: CAB14105, Z99115)를 포함하지만, 이에 한정되지 않는다.
용어 "분지쇄 α-케토산 데카르복실라아제"는 α-케토아이소발레레이트의 아이소부티르알데히드 및 CO2로의 전환을 촉매하는 효소를 말한다. 바람직한 분지쇄 α-케토산 데카르복실라아제는 EC 번호4.1.1.72로 공지되어 있으며, 락토코커스 락티스 (젠뱅크 번호: AAS49166, AY548760; CAG34226 (서열 번호:8), AJ746364, 살모넬라 타이피무륨(Salmonella typhimurium) (젠뱅크 번호: NP_461346, NC_003197), 및 클로스트리듐 아세토부틸리쿰(Clostridium acetobutylicum) (젠뱅크 번호: NP_149189, NC_001988)을 포함하지만 이에 한정되지 않는 많은 공급처로부터 입수가능하다.
용어 "분지쇄 알코올 데하이드로게나아제"는 아이소부티르알데히드의 아이소부탄올로의 전환을 촉매하는 효소를 말한다. 바람직한 분지쇄 알코올 데하이드로게나아제는 EC 번호 1.1.1.265로 공지되어 있지만, 다른 알코올 데하이드로게나아제 (구체적으로, EC 1.1.1.1 또는 1.1.1.2)로 또한 분류될 수도 있다. 이들 효소는 전자 공여체로서 NADH (환원된 니코틴아미드 아데닌 다이뉴클레오티드) 및/또는 NADPH를 이용하며, 에스. 세레비지에 (젠뱅크 번호: NP_010656, NC_001136; NP_014051, NC_001145), 이. 콜라이 (젠뱅크 번호: NP_417484 (서열 번호10), NC_000913 (서열 번호:9)), 및 씨. 아세토부틸리쿰 (젠뱅크 번호: NP_349892, NC_003030)을 포함하지만 이에 한정되지 않는 많은 공급처로부터 입수가능하다.
용어 "분지쇄 케토산 데하이드로게나아제"는 전자 수용체로서 NAD+ (니코틴아미드 아데닌 다이뉴클레오티드)를 사용하여 α-케토아이소발레레이트의 아이소부틸-CoA (아이소부틸-조효소 A)로의 전환을 촉매하는 효소를 말한다. 바람직한 분지쇄 케토산 데하이드로게나아제는 EC 번호 1.2.4.4로 공지되어 있다. 이들 분지쇄 케토산 데하이드로게나아제는 4개의 서브유닛으로 이루어지며, 모든 서브유닛으로부터의 서열은 비. 서틸리스 (젠뱅크 번호: CAB14336, Z99116; CAB14335, Z99116; CAB14334, Z99116; and CAB14337, Z99116) 및 슈도모나스 퓨티다(Pseudomonas putida) (젠뱅크 번호: AAA65614, M57613; AAA65615, M57613; AAA65617, M57613; 및 AAA65618, M57613)를 포함하지만 이에 한정되지 않는 일련의 광대한 미생물로부터 입수가능하다.
용어 "탄소 기질" 또는 "발효가능한 탄소 기질"은 본 발명의 숙주 유기체에 의해 대사될 수 있는 탄소 공급원, 그리고 특히 단당류, 올리고당류, 다당류, 및 C1 기질 또는 그 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 탄소 공급원을 말한다.
용어 "kcat" 및 "Km" 은 당업자에게 공지되어 있으며, 문헌[Enzyme Structure and Mechanism, 2nd ed. (Ferst; W.H. Freeman: NY, 1985; pp 98-120)]에 설명되어 있다. 흔히 "전환수(turnover number)"로 불리는 용어 "kcat"은 단위 시간 당 활성 부위 당 생성물로 변환되는 기질 분자의 최대 수, 또는 단위 시간 당 효소가 전환되는 횟수로 정의된다. kcat = Vmax / [E](여기서, [E]는 효소의 농도이다 (페르스트(Ferst)의 상기 문헌). 용어 "총 전환" 및 "총 전환수"는 본 명세서에서 KARI 효소와 기질의 반응에 의해 형성되는 생성물의 양을 말하려는 것이다.
용어 "촉매 효율"은 효소의 kcat/KM으로 정의된다. "촉매 효율"은 기질에 대한 효소의 특이성을 정량화하기 위하여 사용된다.
용어 "비활성"은 온도, pH, [S] 등의 명시된 조건 하에서 분 당 형성된 생성물의 몰로서 정의된다.
효소 활성과 관련하여 사용될 때 용어 "느린" 또는 "빠른"은 표준물과 비교할 때의 효소의 전환수에 관련된다.
용어 "단리된 핵산 분자", "단리된 핵산 단편" 및 "유전자 제작물" 은 상호교환가능하게 사용될 것이며, 단일-가닥 또는 이중-가닥의, 선택적으로 합성, 비-천연 또는 변경된 뉴클레오티드 염기를 포함하는 RNA 또는 DNA의 중합체를 의미할 것이다. DNA 중합체 형태의 단리된 핵산 단편은 cDNA, 게놈 DNA 또는 합성 DNA의 하나 이상의 절편으로 이루어질 수 있다.
용어 "유전자"는 코딩 서열 앞의 (5' 비-코딩 서열) 그리고 코딩 서열 다음의 (3' 비-코딩 서열) 조절 서열을 선택적으로 포함하는, 특정 단백질로서 발현될 수 있는 핵산 단편을 말한다. "천연 유전자"는 자연에서 발견되는 대로의, 그 자신의 조절 서열을 포함하는 유전자를 말한다. "키메라 유전자"는 천연 유전자가 아니며, 자연에서 함께 발견되지 않는 조절 및 코딩 서열을 포함하는 임의의 유전자를 말한다. 따라서, 키메라 유전자는 상이한 공급원으로부터 유래되는 조절 서열 및 코딩 서열, 또는 동일한 공급원으로부터 유래되지만 자연에서 발견되는 것과는 상이한 방식으로 배열된 조절 서열 및 코딩 서열을 포함할 수 있다. "내인성 유전자"는 유기체의 게놈에서 그의 자연적인 위치로 있는 천연 유전자를 말한다. "외래" 유전자는 숙주 유기체에서 보통 발견되지 않으며, 유전자 전달(gene transfer)에 의해 숙주 유기체 내로 도입되는 유전자를 말한다. 외래 유전자는 비-천연 유기체 내로 삽입되는 천연 유전자, 또는 키메라 유전자를 포함할 수 있다. "트랜스진"(transgene)은 형질전환 절차에 의해 게놈 내로 도입된 유전자이다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "코딩 서열"은 특정 아미노산 서열을 코딩하는 DNA 서열을 말한다. "적합한 조절 서열"은 코딩 서열의 상류 (5' 비-코딩 서열), 코딩 서열의 내부, 또는 코딩 서열의 하류 (3' 비-코딩 서열)에 위치하며, 관련된 코딩 서열의 전사-RNA 프로세싱 또는 안정성, 또는 번역에 영향을 주는 뉴클레오티드 서열을 말한다. 조절 서열은 프로모터, 번역 리더 서열, 인트론, 폴리아데닐화 인식 서열(polyadenylation recognition sequences), RNA 프로세싱 부위, 이펙터(effector) 결합 부위 및 스템-루프(stem-loop) 구조를 포함할 수 있다.
용어 "프로모터"는 코딩 서열 또는 기능성 RNA의 발현을 제어할 수 있는 DNA 서열을 말한다. 일반적으로, 코딩 서열은 프로모터 서열에 대하여 3'에 위치한다. 프로모터는 그 전체가 천연 유전자로부터 유래되거나, 또는 자연에서 발견되는 상이한 프로모터들로부터 유래되는 상이한 요소들로 구성되거나, 또는 심지어 합성 DNA 절편을 포함할 수 있다. 당업자라면 상이한 프로모터들이 상이한 조직 또는 세포 유형에서, 또는 상이한 발달 단계에서, 또는 상이한 환경적 또는 생리학적 조건에 응답하여 유전자의 발현을 유도할 수 있음을 이해한다. 대부분의 시점에서 대부분의 세포 유형에서 유전자가 발현되게 하는 프로모터는 보통 "구성적 프로모터(constitutive promoter)"로 지칭된다. 대부분의 경우, 조절 서열의 정확한 경계가 완벽하게 정의되지 않았기 때문에, 상이한 길이의 DNA 단편은 동일한 프로모터 활성을 가질 수도 있음이 또한 인정된다.
용어 "작동가능하게 결합된"은 하나의 기능이 다른 하나에 의해 영향을 받도록 단일 핵산 단편 상에서 핵산 서열들이 결부되는 것을 말한다. 예를 들어, 프로모터는 이것이 코딩 서열의 발현을 초래할 수 있을 때 상기 코딩 서열과 작동가능하게 결합된 것이다 (즉, 코딩 서열은 프로모터의 전사 제어 하에 있음). 코딩 서열은 센스(sense) 또는 안티센스(antisense) 배향으로 조절 서열에 작동가능하게 결합될 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "발현"은 본 발명의 핵산 단편으로부터 유래되는 센스(mRNA) 또는 안티센스 RNA의 전사 및 안정한 축적을 말한다. 발현은 mRNA의 폴리펩티드로의 번역을 또한 말할 수도 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "형질전환"은 핵산 단편이 숙주 유기체의 게놈 내로 이동하여 유전적으로 안정한 유전으로 이어지는 것을 말한다. 형질전환된 핵산 단편을 포함하는 숙주 유기체는 "트랜스제닉"(transgenic) 또는 "재조합" 또는 "형질전환" 유기체로 지칭된다.
용어 "플라스미드", "벡터" 및 "카세트"는 세포의 중추적인 대사 작용의 일부분이 아닌 유전자들을 흔히 지니며, 보통 원형 이중-가닥 DNA 단편의 형태인 과잉 염색체 요소를 말한다. 그러한 요소는 임의의 공급원으로부터 유래되는 단일- 또는 이중-가닥 DNA 또는 RNA의 자율적으로 복제되는 서열, 게놈 통합 서열, 파지 또는 뉴클레오티드 서열 - 선형 또는 원형 - 일 수 있으며, 여기서, 많은 뉴클레오티드 서열은 선택된 유전자 산물을 위한 프로모터 단편 및 DNA 서열을 적절한 3' 미번역 서열과 함께 세포 내로 도입할 수 있는 독특한 구성으로 연결되었거나 재조합되었다. "형질전환 카세트"는 외래 유전자를 포함하며 외래 유전자 외에 특정 숙주 세포의 형질전환을 돕는 요소들을 갖는 특정 벡터를 말한다. "발현 카세트"는 외래 유전자를 포함하며 외래 유전자 외에 외래 숙주에서 상기 유전자의 증강된 발현을 허용하는 요소들을 갖는 특정 벡터를 말한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "코돈 축퇴(degeneracy)"는 코딩되는 폴리펩티드의 아미노산 서열에 영향을 주지 않고서 뉴클레오티드 서열의 변이를 가능케 하는 유전자 코드의 성질을 말한다. 당업자라면 주어진 아미노산을 특정하는 뉴클레오티드 코돈의 사용에서 특정 숙주 세포가 나타내는 "코돈-편향(codon-bias) "을 잘 알고 있다. 따라서, 숙주 세포에서의 개선된 발현을 위한 유전자를 합성할 때, 코돈 사용 빈도가 숙주 세포의 바람직한 코돈 사용 빈도에 가깝도록 그 유전자를 설계하는 것이 바람직하다. 다양한 숙주의 형질전환을 위한 핵산 분자의 코딩 영역 또는 유전자를 말할 때 용어 "코돈-최적화된"은 DNA에 의해 코딩되는 폴리펩티드를 변경하지 않고서 숙주 유기체의 전형적인 코돈 사용을 반영하기 위하여 핵산 분자의 코딩 영역 또는 유전자에서 코돈을 변경하는 것을 말한다.
본 발명에서 사용되는 표준 재조합 DNA 및 분자 클로닝 기술은 당업계에 잘 알려져 있으며, 샘브룩(Sambrook) 등의 문헌[Sambrook, Fritsch, and Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989] (이하, "마니아티스(Maniatis)"); 및 실하비(Silhavy) 등의 문헌[Silhavy, et al., Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory Press Cold Spring Harbor, NY, 1984]; 및 오스벨, 에프. 엠. (Ausubel, F. M.) 등의 문헌[Ausubel, et al, Current Protocols in Molecular Biology, published by Greene Publishing Assoc. and Wiley-Interscience, 1987]에 기재되어 있다.
본 발명은 식물 유래된 탄소 공급원으로부터 아이소부탄올을 생성하여, 부탄올 생성을 위한 표준 석유화학 공정과 관련된 부정적인 환경 영향을 피하게 된다. 일 실시 형태에서, 본 발명은 촉매 효율이 높은 KARI 효소의 동정 방법을 제공하는데, 상기의 높은 촉매 효율에 의해 탄수화물의 아이소부탄올로의 전환에서 속도 제한 단계로서의 이것이 제거되게 된다. 본 방법은 적합한 KARI 효소를 동정하는 것 및 하기에 상세하게 설명되는 바와 같이 효소의 비활성을 증가시키기 위하여 당업계에 잘 알려진 방법을 사용하여 이것을 돌연변이 유발하는 것을 포함한다.
케토산 리덕토아이소머라아제(KARI) 효소
아세토하이드록시산 아이소머로리덕타아제 또는 케톨-산 리덕토아이소머라아제(KARI; EC 1.1.1.86)는 분지쇄 아미노산의 생합성에서 2개의 단계를 촉매하며, 그의 생합성에서 주요 효소이다. KARI는 다양한 유기체에서 발견되며, 종간 아미노산 서열 비교에 의하면, 이 효소의 2가지 유형, 즉, 진균류 및 대부분의 박테리아에서 발견되는 짧은 형태 (클래스(class) I)와, 식물에 전형적인 긴 형태(클래스 II)가 있음이 나타났다.
짧은 형태의 KARI는 전형적으로 330 내지 340개의 아미노산 잔기를 갖는다. 긴 형태의 KARI는 약 490개의 아미노산 잔기를 갖는다. 그러나, 에스케리키아 콜라이와 같은 일부 박테리아는 긴 형태를 보유하며, 여기서, 아미노산 서열은 식물에서 발견되는 것과는 상당히 상이하다. KARI는 ilvC 유전자에 의해 코딩되며, 최소 배지에서 이. 콜라이 및 기타 박테리아의 성장에 필수적인 효소이다. KARI는 NADPH를 보조 인자로서 사용하며, 그의 활성을 위하여 Mg++와 같은 2가 양이온을 필요로 한다. 발린 경로에서 아세토락테이트를 이용하는 것 외에, KARI는 또한 아이소류신 생성 경로에서 아세토하이드록시부타노에이트를 다이하이드록시메틸펜타노에이트로 전환시킨다.
2.6 Å 해상도에서 이. 콜라이 KARI 효소의 결정 구조가 해명되었다 (문헌[Tyagi, et al., Protein Science, 14, 3089-3100, 2005]). 이 효소는 2개의 도메인으로 이루어지며, 하나는 다른 피리딘 뉴클레오티드-의존성 데하이드로게나아제에서 발견되는 것과 유사한 혼합 α/β 구조를 갖는다. 두 번째 도메인은 주로 α-나선형이며, 내부 중복(internal duplication )의 강력한 증거를 나타낸다. 이. 콜라이, 슈도모나스 아에루기노사, 및 시금치의 KARI의 활성 부위의 비교에 의하면 상기 효소의 활성 부위 내의 대부분의 잔기는 보존된 위치를 점유함이 나타났다. 이. 콜라이 KARI는 아마도 생물학적 활성을 가질 가능성이 있는 단위인 사량체로서 결정화된 반면, 피. 아에루기노사 KARI (문헌[Ahn, et al., J. Mol. Biol., 328, 505-515, 2003])는 십이량체를 형성하였으며, 시금치 유래의 효소는 이량체를 형성하였다. 공지된 KARI는 보고된 전환수가 아세토락테이트에 대하여 2 s-1 (문헌[Aulabaugh et al.; Biochemistry, 29, 2824-2830, 1990]) 또는 0.12 s-1(문헌[Rane et al., Arch. Biochem. Biophys. 338, 83-89, 1997])인 느린 효소이다. 연구에 의하면 이. 콜라이에서의 아이소류신-발린 생합성의 유전적 제어가 피. 아에루기노사에서의 것과 상이함이 밝혀졌다 (문헌[Marinus, et al., Genetics, 63, 547-56, 1969]).
고 활성 KARI 효소의 동정 및 단리.
이. 콜라이보다 빠른 증배 속도를 갖는 유기체에 대한 개관이 수행되었다. M9 최소 배지에서 성장될 때 이. 콜라이보다 배증 시간이 빠른 3가지 미생물, 슈도모나스 아에루기노사 (PAO1), 슈도모나스 플루오레센스 (PF5), 및 비브리오 콜레레 (N16961)를 동정하였다. KARI 효소를 코딩하는 유전자를 이들 변종들 각각으로부터 단리하고, 코딩된 단백질을 발현시키고, 부분적으로 정제하였다. 높은 배증 속도의 유기체로부터 단리된 효소의 비활성은, 340 ㎚에서 아세토락테이트의 α,β-다이하이드록시-아이소발레레이트로의 효소적 전환 동안 보조 인자, NADPH의 사라짐을 측정하는 NADPH 소비 분석 방법을 사용하여 이. 콜라이 KARI의 것과 비교하였다. 비활성은 NADPH에 있어서 6220 M-1㎝-1의 몰랄 흡광 계수를 사용하여 계산되며, 세포 추출물에서의 총 단백질 ㎎ 당 분 당 소비되는 NADPH의 μmole로서 보고된다 (문헌[Aulabaugh and Schloss, Biochemistry, 29, 2824-2830, 1990] 참조)
본 발명의 목적은 본 명세서에 설명된 NADPH 소비 분석법에 따라 정제된 단백질을 이용하여 측정할 때 비활성이 1.1 mole/분/㎎ KARI 초과인 KARI 효소를 제공하는 것이다. 이. 콜라이 KARI는 느린 효소이며, 분지쇄 아미노산 합성 경로에서 필수적이다. KARI를 코딩하는 유전자(ilvC)는 세포가 영양 배지(rich medium)에서 배양될 때에는 중지되지만, 이것은 최소 배지에서 배양될 때에는 고수준으로 (약 10%의 용해성 단백질) 발현된다 (에스. 에펠바움(S. Epelbaum) 등의 상기 문헌).
적합한 KARI 효소의 선택 과정은 2가지 접근법을 포함하였다. 첫 번째는 천연 다양체(diversity) 중에서 신규한 KARI를 탐색하는 것이었다. 그러한 탐색은 당업계에 잘 알려진 기술을 사용하여 다른 유기체로부터 널리 입수가능한 효소에 대한 상동체를 단리하는 것을 포함하였다. 이 탐색은 유기체의 배증 시간을 기반으로 하여 유기체가 적합한 KARI를 가질 가능성이 가장 높다는 가설에 의해 정보가 제공되었다. 두 번째 접근법은 강력한 발현 벡터의 제작, KARI 코딩 서열의 돌연변이 유발 및 진화, 그리고 마지막으로 개선된 KARI 활성을 갖는 변이체의 선별에 의해 인공적 다양체를 생성 및 탐색하는 것을 포함하였다. 상기 방법을 사용하여, 비활성이 이. 콜라이로부터 단리된 KARI 효소(서열 번호 33 [이. 콜라이 K12 - ilvC])의 비활성보다 큰 KARI 효소를 슈도모나스 플루오레센스 (서열 번호 35 [ PAO1-ilvC]
서열 번호 36 [PF5-ilvC]) 및 비브리오 콜레레 (서열 번호 34)로부터 단리하였다. 본 발명에서 바람직한 것은 약 1.1 mole/분/㎎ 초과의 비활성을 갖는 KARI 효소이며, 여기서, 약 5 내지 40 mole/분/㎎의 비활성이 특히 적합하다. KARI의 비활성이 정제된 단백질을 사용하여, 그리고 20℃ 내지 25 ℃ - 여기서, 약 22.5℃ 가 바람직함 - 에서, 7.0 내지 8.0의 pH - 여기서, 약 7.5의 pH가 바람직함 - 에서, 그리고 적어도 약 10 Mm - 여기서, 적어도 약 10 mM 내지 약 50 mM이 적합함 - 의 칼륨을 갖는 완충액에서 실행되는 NADPH 소비 분석 (올라바우흐(Aulabaugh)의 상기 문헌)을 포함시켜 측정되는 경우가 바람직하다. 본 발명에 유용한 특정 효소들 중 일부가 하기 표 2에 열거되어 있다.
Figure 112009070373452-PCT00002
본 발명은 본 명세서에 개시된 특정 슈도모나스 및 비브리오 효소에 한정되지 않는다. 예를 들어, 이들 폴리펩티드는 유사한 활성을 갖는 상동체를 찾기 위한 기반으로서, 또는 돌연변이 유발 및 단백질 진화를 위한 주형으로서 사용될 수 있다
KARI 상동체의 단리
본 발명의 핵산 단편은 동일한 또는 기타 미생물 종으로부터 상동성 단백질을 코딩하는 유전자를 단리하기 위하여 사용될 수 있다. 서열-의존성 프로토콜을 사용하여 상동성 KARI 유전자를 단리하는 것은 당업계에 잘 알려져 있다. 서열-의존성 프로토콜의 예에는 핵산 혼성화 방법, 및 DNA 및 RNA 증폭 방법이 포함되지만 이에 한정되지 않으며, 이는 다양한 핵산 증폭 기술, 예를 들어 폴리머라아제 연쇄 반응(polymerase chain reaction, PCR) (문헌[Mullis et al., U.S. Patent 4,683,202]), 리가아제 연쇄 반응(ligase chain reaction, LCR) (문헌[Tabor, et al., Proc. Acad. Sci. USA 82, 1074, 1985]) 또는 가닥 대체식 증폭(strand displacement amplification, SDA) (문헌[Walker, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 89, 392, 1992])의 이용에 의해 예시되는 바와 같다.
예를 들어, 본 발명의 것과 유사한 단백질 또는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자는, 당업자에게 잘 알려진 방법을 이용하여 임의의 원하는 박테리아 유래의 라이브러리를 스크리닝하기 위하여 DNA 혼성화 프로브로서 본 발명의 핵산 단편 전부 또는 그 일부분을 사용함으로써 직접적으로 단리될 수 있다. 본 발명의 핵산 서열을 기반으로 하는 특정 올리고뉴클레오티드 프로브는 당업계에 잘 알려진 방법에 의해 설계 및 합성될 수 있다 (마니아티스의 상기 문헌). 게다가, 랜덤 프라이머 DNA 표식, 닉(nick) 번역, 또는 말단-표식 기술과 같이 당업자에게 공지된 방법에 의해 DNA 프로브를 합성하기 위하여, 또는 시험관내 전사 시스템에서 이용가능한 것을 사용하여 RNA 프로브를 합성하기 위하여 전체 서열이 직접적으로 사용될 수 있다. 게다가, 특정 프라이머는 일부분의 또는 전장의 본 발명의 서열의 증폭을 위하여 설계 및 사용될 수 있다. 생성된 증폭 산물은 증폭 반응 동안 직접적으로 표식되거나, 또는 증폭 반응 후 표식되고, 적절한 엄격도의 조건 하에서 전장 DNA 단편을 단리하기 위하여 프로브로서 사용될 수 있다.
전형적으로, PCR식 증폭 기술에서, 프라이머는 상이한 서열을 가지며, 서로에 대하여 상보성을 갖지 않는다. 원하는 시험 조건에 따라, 프라이머의 서열은 표적 핵산의 효율적이면서도 신뢰할 만한 복제를 제공하도록 설계되어야 한다. PCR 프라이머 설계 방법은 통상적이며, 당업계, 예를 들어 테인(Thein) 등의 문헌[Thein et al.,, "The use of oligonucleotide as specific hybridization probes in the Diagnosis of Genetic Disorders", in Human Genetic Diseases: A Practical Approach, K. e. Davis Ed., 1986, pp. 33-50 IRL Press, Herndon, Virginia]; 및 라이클릭(Rychlik)의 문헌[Rychlik, 1993, In White, B. A. (ed.), Methods in Molecular Biology, Vol. 15, pages 31-39, PCR Protocols: Current Methods and Applications. Humana Press, Inc., Totowa, NJ.]에 잘 알려져 있다.
일반적으로 본 발명의 서열의 2개의 짧은 절편을 폴리머라아제 연쇄 반응 프로토콜에 사용하여 DNA 또는 RNA로부터 상동성 유전자를 코딩하는 보다 긴 핵산 단편을 증폭시킬 수 있다. 또한, 폴리머라아제 연쇄 반응은 클로닝된 핵산 단편의 라이브러리에서 실시될 수 있으며, 여기서, 하나의 프라이머의 서열은 본 발명의 핵산 단편으로부터 유래되고, 다른 하나의 프라이머의 서열은 미생물 유전자를 코딩하는 mRNA 전구체의 3' 말단에 폴리아데닐산 트랙(tract)이 존재하는 것을 이용한다.
대안적으로, 제2 프라이머 서열은 클로닝 벡터로부터 유래되는 서열을 기반으로 할 수 있다. 예를 들어, 당업자는 전사체 중 단일한 지점과 3' 또는 5' 말단 사이의 영역의 카피(copy)를 증폭시키기 위하여 PCR을 이용함으로써 cDNA를 생성하기 위하여 RACE 프로토콜 (문헌[Frohman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85, 8998, 1988])을 따를 수 있다. 3' 및 5' 방향으로 배향된 프라이머가 본 발명의 서열로부터 설계될 수 있다. 구매가능한 3' RACE 또는 5' RACE 시스템 (라이프 테크놀로지스(Life Technologies), 미국 메릴랜드주 록빌 소재)을 사용하여 특정 3' 또는 5' cDNA 단편을 단리할 수 있다 (문헌[Ohara et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86, 5673, 1989]; 및 문헌[Loh et al., Science, 243, 217-220 1989]).
대안적으로, 본 발명의 서열은 상동체의 동정을 위한 혼성화 시약으로서 이용될 수 있다. 핵산 혼성화 시험의 기본적인 구성요소들은 프로브, 관심있는 유전자 또는 유전자 단편을 포함하는 것으로 추측되는 샘플, 및 특정 혼성화 방법을 포함한다. 전형적으로 본 발명의 프로브는 탐지될 핵선 서열에 상보적인 단일 가닥 핵산 서열이다. 프로브는 탐지될 핵산 서열에 "혼성화가능"하다. 프로브 길이는 5개의 염기로부터 수만개의 염기까지 다양할 수 있으며, 행해질 특정 시험에 의존적일 것이다. 전형적으로 약 15 개의 염기 내지 약 30개의 염기의 프로브 길이가 적합하다. 프로브 분자의 단지 일부분만이 탐색될 핵산 서열에 상보적일 필요가 있다. 게다가, 프로브와 표적 서열 사이의 상보성은 완벽할 필요는 없다. 혼성화는 불완전하게 상보적인 분자들 사이에 일어나며, 이때 그 결과는 혼성화된 영역 내의 소정 분율의 염기가 적당한 상보성 염기와 쌍을 형성하지 않는다는 것이다.
혼성화 방법은 잘 정의되어 있다. 전형적으로, 프로브와 샘플은 핵산 혼성화를 가능케 할 조건 하에서 혼합되어야 한다. 이는 적당한 농도 및 온도 조건 하에서 무기 또는 유기 염의 존재 하에서 프로브와 샘플을 접촉시키는 것을 포함한다. 프로브 및 샘플 핵산은 프로브와 샘플 핵산 사이의 임의의 가능한 혼성화가 일어날 수 있기에 충분히 오랜 시간 동안 접촉 상태로 있어야 한다. 혼합물 중 프로브 또는 표적의 농도는 혼성화가 일어나는 데 필요한 시간을 결정할 것이다. 프로브 또는 표적의 농도가 높을수록 필요한 혼성화 인큐베이션 시간이 더 짧아진다. 선택적으로, 카오트로픽제(chaotropic agent)가 첨가될 수도 있다. 카오트로픽제는 뉴클레아제 활성의 저해에 의해 핵산을 안정화시킨다. 더욱이, 카오트로픽제는 실온에서의 짧은 올리고뉴클레오티드 프로브의 민감하고 엄격한 혼성화를 허용한다 (문헌[Van Ness et al., Nucl. Acids Res. 19, 5143-5151, 1991]). 적합한 카오트로픽제는 특히 구아니디늄 클로라이드, 구아니디늄 티오시아네이트, 티오시안산나트륨, 리튬 테트라클로로아세테이트, 과염소산나트륨, 루비듐 테트라클로로아세테이트, 요오드화칼륨, 및 세슘 트라이플루오로아세테이트를 포함한다. 전형적으로, 카오트로픽제는 약 3M의 최종 농도로 존재할 것이다. 원할 경우, 포름아미드를 전형적으로 30 내지 50% (v/v)로 혼성화 혼합물에 첨가할 수 있다.
다양한 혼성화 용액이 이용될 수 있다. 전형적으로, 이들은 약 20 내지 60 부피%, 바람직하게는 30 부피%의 극성 유기 용매를 포함한다. 일반적인 혼성화 용액은 약 30 내지 50% (v/v)의 포름아미드, 약 0.15 내지 1.0 M의 염화나트륨, 약 0.05 내지 0.1M의 완충액, 예를 들어 시트르산나트륨, 트리스(Tris)-HCl, PIPES 또는 HEPES (약 6 내지 9의 pH 범위), 약 0.05 내지 0.2%의 세제(detergent), 예를 들어 소듐 도데실설페이트, 또는 0.5 내지 20 Mm의 EDTA, 피콜(FICOLL) (파마시아 인크.(Pharmacia Inc.)) (약 498 내지 830 zg (300 내지 500 킬로달톤)), 폴리비닐피롤리돈 (약 415 내지 830 zg (250 내지 500 킬로달톤)), 및 혈청 알부민을 이용한다. 전형적인 혼성화 용액에 또한 포함되는 것은 약 0.1 내지 5 ㎎/mL의 비표식된 캐리어 핵산, 단편화된 핵 DNA, 예를 들어 송아지 흉선 또는 연어 정자 DNA, 또는 효모 RNA, 및 선택적으로 약 0.5 내지 2% (w/v)의 글리신일 것이다. 다른 첨가제, 예를 들어 다양한 극성 수-용해성 또는 팽윤성 에이전트(agent), 예컨대 폴리에틸렌 글리콜, 음이온성 중합체, 예컨대 폴리아크릴레이트 또는 폴리메틸아크릴레이트, 및 음이온성 당류 중합체, 예컨대 덱스트란 설페이트를 포함하는 부피 배제제(volume exclusion agent)가 또한 포함될 수 있다.
핵산 혼성화는 다양한 분석 형식에 적용가능하다. 가장 적합한 것 중 하나는 샌드위치(sandwich) 분석 형식이다. 샌드위치 분석은 비-변성 조건 하에서의 혼성화에 특히 적용가능하다. 샌드위치식 분석의 일차적인 구성요소는 고형 지지체이다. 고형 지지체는 비표식된 그리고 당해 서열의 한 부분에 상보적인 고정된 핵산 프로브가 그에 흡착되거나 공유 결합에 의해 그에 커플링되어 있다.
아이소부탄올 생합성 경로
본 발명의 고 활성 KARI 효소의 주요 용도 중 하나는 아이소부탄올의 생성에 유용한 대사 경로에서의 요소로서의 것일 것이다. 많은 이들 경로가 해명되고 특성화되었다.
탄수화물 이용 미생물은 성장 및 유지를 위한 에너지 및 세포 전구체를 제공하기 위하여 중추적 대사 경로로서 엠덴-마이어호프-파르나스(Embden-Meyerhof-Parnas, EMP) 경로, 엔트너(Entner) 및 도도로프(Doudoroff) 경로, 및 펜토스 포스페이트 사이클을 이용한다. 이들 경로는 공통적으로 중간체 글리세르알데히드-3-포스페이트를 가지며, 궁극적으로, 피루베이트가 직접적으로 또는 EMP 경로와 조합되어 형성된다. 후속적으로, 피루베이트는 다양한 수단을 통하여 아세틸-조효소 A(아세틸-CoA)로 변환된다. 아세틸-CoA는 예를 들어 지방산, 아미노산 및 2차 대사 산물의 생성에서 주요 중간체로서의 역할을 한다. 당의 피루베이트로의 전환의 조합된 반응들에 의해 에너지 (예를 들어, 아데노신 -5'-트라이포스페이트, ATP) 및 환원 등가물 (예를 들어, 환원된 니코틴아미드 아데닌 다이뉴클레오티드, NADH, 및 환원된 니코틴아미드 아데닌 다이뉴클레오티드 포스페이트, NADPH)이 생성된다. NADH 및 NADPH는 그의 산화된 형태(각각 NAD+ 및 NADP+)로 재순환되어야 한다. 무기 전자 수용체 (예를 들어, O2, NO3 - 및 SO4 2-)의 존재 하에서, 환원 등가물은 에너지 풀(pool)의 증대를 위하여 사용될 수 있으며, 대안적으로, 환원된 탄소 부산물이 형성될 수 있다.
도 1에 도시된 바와 같이 재조합 미생물을 이용하여 탄수화물 공급원으로부터 아이소부탄올을 생성하는 4가지 잠재적인 경로가 있다. 탄수화물의 아이소부탄올로의 전환을 위한 모든 잠재적인 경로는 공유된 미국 특허 출원 제 11/586315호에 개시되었으며, 상기 미국 특허 출원은 본 명세서에 참고로 포함된다.
피루베이트의 아이소부탄올로의 전환에 바람직한 경로는 효소적 단계 "a", "b", "c", "d", 및 "e" (도 1)로 이루어지며, 하기 기질의 생성물로의 전환을 포함한다:
a) 예를 들어 아세토락테이트 신타아제에 의해 촉매되는 피루베이트의 아세토락테이트로의 전환,
b) 예를 들어 아세토하이드록시산 아이소머로리덕타아제에 의해 촉매되는 (S)-아세토락테이트의 2,3-다이하이드록시아이소발레레이트로의 전환,
c) 예를 들어 아세토하이드록시산 데하이드라타아제에 의해 촉매되는 2,3-다이하이드록시아이소발레레이트의 α-케토아이소발레레이트로의 전환,
d) 예를 들어 분지쇄 케토산 데카르복실라아제에 의해 촉매되는 α-케토아이소발레레이트의 아이소부티르알데히드로의 전환, 및
e) 예를 들어 분지쇄 알코올 데하이드로게나아제에 의해 촉매되는 아이소부티르알데히드의 아이소부탄올로의 전환.
이 경로에서는 발린 생합성(피루베이트에서 α-케토아이소발레레이트로)과, 발린 이화 작용(α-케토아이소발레레이트에서 아이소부탄올로)을 위한 충분히 특성화된 경로에 연루된 효소들이 합해진다. 많은 발린 생합성 효소가 아이소류신 생합성 경로에서 유사한 반응들을 또한 촉매하기 때문에, 기질 특이성이 유전자 공급원의 선택에서 주요 고려 사항이다. 이러한 이유로, 아세토락테이트 신타아제 효소에 있어서의 관심있는 일차 유전자는 바실러스(alsS) 및 클렙시엘라(budB) 유래의 것이다. 이러한 특정 아세토락테이트 신타아제는 이들 유기체에서 부탄다이올 발효에 참여하며, 케토부티르에 비하여 피루베이트에 대하여 증가된 친화도를 나타내는 것으로 공지되어 있다 (문헌[Gollop et al., J. Bacteriol. 172, 3444-3449, 1990]; 및 문헌[Holtzclaw et al., J. Bacteriol. 121, 917-922, 1975]). 두 번째 및 세 번째 경로 단계는 각각 아세토하이드록시산 리덕토아이소머라아제 및 데하이드라타아제에 의해 촉매된다. 이들 효소는 많은 공급원, 예를 들어 이. 콜라이로부터 특성화되었다 (문헌[Chunduru et al., Biochemistry 28, 486-493,1989]; 및 문헌[Flint et al., J. Biol. Chem. 268, 14732-14742,1993]). 바람직한 아이소부탄올 경로의 마지막 두 단계는 효모에서 일어나는 것으로 공지되어 있으며, 이는 질소 공급원으로서 발린을 이용할 수 있고, 당해 과정 중에 아이소부탄올을 분비한다. α-케토-발레레이트는 많은 케토산 데카르복실라아제 효소, 예를 들어 피루베이트 데카르복실라아제에 의해 아이소부티르알데히드로 전환될 수 있다. 아이소부탄올 생성과는 먼 피루베이트의 오도를 방지하기 위하여, 피루베이트에 대한 친화도가 감소된 데카르복실라아제가 요망된다. 지금까지, 당업계에 공지된 두 가지의 그러한 효소가 있다 (문헌[Smit et al., Appl. Environ. Microbiol. 71, 303-311, 2005]; 및 문헌[de la Plaza et al., FEMS Microbiol. Lett. 238, 367-374, 2004]). 둘 모두의 효소는 락토코커스 락티스 균주 유래의 것이며, 피루베이트에 비하여 케토아이소발레레이트에 대하여 50 내지 200배의 선호도를 갖는다. 마지막으로, 많은 알데히드 리덕타아제가 효모에서 동정되었으며, 그 다수는 중첩된 기질 특이성을 갖는다. 아세트알데히드에 비하여 분지쇄 기질을 선호하는 것으로 공지된 것에는 알코올 데하이드로게나아제 VI (ADH6) 및 Ypr1p (문헌[Larroy et al., Biochem. J. 361, 163-172, 2002]; 및 문헌[Ford et al., Yeast 19, 1087-1096, 2002])가 포함되지만, 이에 한정되지 않으며, 이들 둘 모두는 NADPH를 전자 공여체로서 이용한다. 분지쇄 기질에서 활성을 갖는, NADPH-의존성 리덕타아제, YqhD가 이. 콜라이에서 최근에 또한 동정되었다 (문헌[Sulzenbacher et al., J. Mol. Biol. 342, 489-502, 2004]).-아이소부탄올 생성을 위한 기타 잠재적인 경로들 중 두 가지는 또한 "a", "b" 및 "c"의 초기의 세 단계를 또한 포함한다. 하나의 경로는 효소적 단계 "a","b", "c", "f", "g", "e"로 이루어진다. 단계 "f"는 EC 번호가 1.2.4.4인 "분지쇄 케토산 데하이드로게나아제"를 포함한다. 단계 "g"는 EC 번호가 1.2.1.10 및 1.2.1.57인 "아실화 알데히드 데하이드로게나아제"를 포함하며, 이외에도 단계 "e"는 "분지쇄 알코올 데하이드로게나아제"를 포함한다. 다른 하나의 잠재적인 경로는 단계 "a", "b", "c", "h", "i","j", "e"로 이루어진다. 용어 "트랜스아미나아제" (단계 "h")는 EC 번호가 2.6.1.42 및 2.6.1.66이다. 단계 "h"는 EC 번호가 1.4.1.8 및 1.4.1.9인 어느 하나의 "발린 데하이드로게나아제"로 이루어지거나, 또는 단계 "i"는 EC 번호가 4.1.1.14인 "발린 데카르복실라아제"로 이루어진다. 마지막으로, 단계 "j"는 EC 번호가 2.6.1.18인 "오메가 트랜스아미나아제"를 이용하여 아이소부티르알데히드를 생성할 것이고, 상기 아이소부티르알데히드는 단계 "e"에 의해 환원되어 아이소부탄올을 생성할 것이다. 피루베이트의 아이소부탄올로의 전환을 위한 모든 잠재적인 경로가 도 1에 도시되어 있다.
부가적으로, 많은 유기체가 부틸-CoA 중간체를 통하여 부티레이트 및/또는 부탄올을 생성하는 것으로 공지되어 있다 (문헌
Figure 112009070373452-PCT00003
FEMS Microbiol. Rev. 17, 251-262, 1995]; 및 문헌[Abbad-Andaloussi et al., Microbiology 142, 1149-1158, 1996]). 따라서, 이들 유기체에서의 아이소부탄올 생성은 도 1에 도시된 단계 "k", "g" 및 "e" 를 이용하여 일어날 것이다. 단계 "k"는 EC 번호가 5.4.99.13인 "아이소부티릴-CoA 뮤타아제"를 이용할 것이다. 다음 단계는 EC 번호가 1.2.1.10 및 1.2.1.57인 "아실화 알데히드 데하이드로게나아제"를 사용하여 아이소부티르알데히드를 생성하고, 이어서 효소적 단계 "e"에 의해 아이소부탄올을 생성하는 것을 포함할 것이다. 모든 이들 경로는 공유된 미국 특허 출원 제11/586315호에 충분히 설명되어 있으며, 상기 미국 특허 출원은 전체적으로 본 명세서에 참고로 포함된다.
아이소부탄올 생성을 위한 미생물 숙주
아이소부탄올 생성을 위한 미생물 숙주는 박테리아, 시아노박테리아, 사상균 및 효모로부터 선택될 수 있다. 아이소부탄올 생성에 사용되는 미생물 숙주는 수율이 부탄올 독성에 의해 한정되지 않도록 아이소부탄올에 대하여 내성이어야 한다. 높은 역가 수준의 아이소부탄올에서 대사 작용 면에서 활성인 미생물은 당업계에 잘 알려져 있지 않다. 부탄올-내성 돌연변이체가 솔벤토제닉(solventogenic) 클로스트리디아(Clostridia)로부터 단리되었지만, 다른 잠재적으로 유용한 박테리아 균주의 부탄올 내성에 관해서는 정보가 거의 입수가능하지 않다. 박테리아에서의 알코올 내성의 비교에 대한 대부분의 연구는 부탄올이 에탄올보다 더 큰 독성을 가짐을 시사하며 (문헌[de Cavalho et al., Microsc. Res. Tech. 64, 215-22, 2004] 및 문헌[Kabelitz et al., FEMS Microbiol. Lett. 220, 223-227, 2003, Tomas et al. J. Bacteriol. 186, 2006-2018, 2004]), 클로스트리듐 아세토부틸리쿰에서의 발효 동안 1-부탄올의 수율은 1-부탄올 독성에 의해 한정될 수도 있음을 보고하고 있다. 클로스트리듐 아세토부틸리쿰에 대한 1-부탄올의 일차적인 영향은 막 기능의 파괴이다 (문헌[Hermann et al., Appl. Environ. Microbiol. 50, 1238-1243, 1985]).
아이소부탄올의 생성을 위하여 선택되는 미생물 숙주는 아이소부탄올에 대하여 내성이어야 하며, 탄수화물을 아이소부탄올로 전환시킬 수 있어야 한다. 적합한 미생물 숙주의 선택 기준은 하기를 포함한다: 아이소부탄올에 대한 고유 내성, 높은 글루코스 이용률, 유전자 조작을 위한 유전학적 도구의 이용가능성, 및 안정한 염색체 변경을 생성하는 능력.
아이소부탄올에 대한 내성을 갖는 적합한 숙주 균주는 이 균주의 고유 내성에 기초하여 스크리닝에 의해 동정될 수 있다. 아이소부탄올에 대한 미생물의 고유 내성은 최소 배지에서 성장될 때 성장 속도를 50% 저해하는 데 책임이 있는 아이소부탄올의 농도(IC50)를 결정함으로써 측정될 수 있다. IC50 값은 당업계에 공지된 방법을 사용하여 결정될 수 있다. 예를 들어, 관심있는 미생물을 다양한 양의 아이소부탄올의 존재 하에 성장시킬 수 있으며, 성장 속도는 600 ㎚에서의 광학 밀도(OD600)를 측정함으로써 모니터링하였다. 배증 시간은 성장 곡선의 로그 부분으로부터 계산되어 성장 속도의 척도로서 사용될 수 있다. 50% 성장 저해를 생성하는 아이소부탄올의 농도는 성장 저해 퍼센트 대 아이소부탄올 농도의 그래프로부터 결정될 수 있다. 바람직하게는, 숙주 균주는 아이소부탄올에 대한 IC50이 약 0.5% 초과여야 한다.
아이소부탄올 생성을 위한 미생물 숙주는 또한 글루코스를 높은 속도로 이용하여야 한다. 대부분의 미생물은 탄수화물을 이용할 수 있다. 그러나, 소정의 환경 미생물은 탄수화물을 고효율로 이용할 수 없으며, 따라서 적합한 숙주가 아니다.
숙주를 유전자 변형시키는 능력은 임의의 재조합 미생물의 생성에 필수적이다. 유전자 전달 기술의 양식은 전기천공, 접합(conjugation), 형질도입 또는 자연적 형질전환에 의한 것일 수 있다. 광범위한 숙주 접합 플라스미드 및 약물 내성 마커가 이용가능하다. 클로닝 벡터는 숙주 유기체에서 기능할 수 있는 항생제 내성 마커의 성질에 기초하여 상기 숙주에 맞추어진다.
또한, 미생물 숙주는 다양한 유전자의 결실에 의해 탄소 흐름에 대한 경쟁 경로의 불활성화를 위하여 조작되어야 한다. 이는 직접적인 불활성화 또는 염색체 통합 벡터에의 트랜스포존의 이용가능성을 필요로 한다. 부가적으로, 생산 숙주는 고유 아이소부탄올 내성을 향상시키는 돌연변이가 얻어질 수 있도록 화학적 돌연변이 유발에 따라야 한다.
상기에 설명된 기준을 근거로 하면, 아이소부탄올 생성에 적합한 미생물 숙주는 클로스트리듐, 자이모모나스, 에스케리키아, 살모넬라, 로도코커스, 슈도모나스, 바실러스, 비브리오, 락토바실러스, 엔테로코커스, 알칼리제네스, 클렙시엘라, 파에니바실러스, 아트로박터, 코리네박테리움, 브레비박테리움, 피키아, 칸디다, 한세눌라 및 사카로마이세스 속의 구성원을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 바람직한 숙주는 에스케리키아 콜라이, 알칼리제네스 에우트로푸스(Alcaligenes eutrophus), 바실러스 리케니포르미스(Bacillus licheniformis), 파에니바실러스 마세란스(Paenibacillus macerans), 로도코커스 에리트로폴리스(Rhodococcus erythropolis), 슈도모나스 퓨티다, 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum), 엔테로코커스 파에시움(Enterococcus faecium), 엔테로코커스 갈리나륨(Enterococcus gallinarium), 엔테로코커스 파에칼리스(Enterococcus faecalis), 바실러스 서틸리스 및 사카로마이세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae)를 포함한다.
생산 숙주의 제작
발효가능한 탄소 기질의 아이소부탄올로의 전환을 위한 효소 경로를 코딩할 필요한 유전자를 포함하는 재조합 유기체를 당업계에 잘 알려진 기술을 사용하여 제작할 수 있다. 본 발명에서, 본 발명의 아이소부탄올 생합성 경로들 중 하나의 효소, 예를 들어 아세토락테이트 신타아제, 아세토하이드록시산 아이소머로리덕타아제, 아세토하이드록시산 데하이드라타아제, 분지쇄 α-케토산 데카르복실라아제, 및 분지쇄 알코올 데하이드로게나아제를 코딩하는 유전자는 다양한 공급원으로부터 단리될 수 있으며, 이는 상기에 기재된 바와 같다.
박테리아 게놈으로부터 원하는 유전자를 얻는 방법은 분자 생물학 분야에서 일반적이며 잘 알려져 있다. 예를 들어, 당해 유전자의 서열이 공지되어 있는 경우, 적합한 게놈 라이브러리가 제한 엔도뉴클레아제 절단에 의해 생성될 수 있으며, 원하는 유전자 서열에 상보적인 프로브를 이용하여 스크리닝될 수 있다. 일단 당해 서열이 단리되면, 그 DNA는 표준 프라이머-유도 증폭 방법, 예를 들어 폴리머라아제 연쇄 반응 (미국 특허 제4,683,202호)을 이용하여 증폭되어 적절한 벡터를 이용한 형질전환에 적합한 양의 DNA가 얻어질 수 있다. 이종 숙주에서의 발현을 위한 코돈 최적화 도구는 쉽게 이용가능하다. 코돈 최적화를 위한 일부 도구는 숙주 유기체의 GC 함량을 기반으로 하여 이용가능하다.
일단 관련 경로 유전자가 동정되어 단리되면, 이 유전자는 당업계에 잘 알려진 수단에 의해 적합한 발현 숙주를 형질전환시킬 수 있다. 다양한 숙주 세포의 형질전환에 유용한 벡터 또는 카세트는 일반적이며, 에피센터(EPICENTRE)(등록상표) (미국 위스콘신주 매디슨 소재), 인비트로젠 코포레이션(Invitrogen Corp.) (미국 캘리포니아주 칼스배드 소재), 스트라타진(Stratagene) (미국 캘리포니아주 라졸라 소재), 및 뉴 잉글랜드 바이오랩스, 인크.(New England Biolabs, Inc.) (미국 매사추세츠주 비벌리 소재)와 같이 회사로부터 구매가능하다. 전형적으로, 상기 벡터 또는 카세트는 관련 유전자, 선별가능한 마커, 및 자가 복제 또는 염색체 통합을 허용하는 서열의 전사 및 번역을 유도하는 서열을 포함한다. 적합한 벡터는 전사 개시 제어부를 품고 있는 유전자의 5' 의 영역 및 전사 종결을 제어하는 DNA 단편의 3' 의 영역을 포함한다. 둘 모두의 제어 영역은 형질전환된 숙주 세포에 대하여 상동성인 유전자로부터 유래될 수 있지만, 그러한 제어 영역은 생산 숙주로서 선택된 특정 종에 자생적이지 않은 유전자로부터 또한 유래될 수도 있음이 이해되어야 한다.
원하는 숙주 세포에서 관련 경로의 코딩 영역의 발현을 유도하는 데 유용한 개시 제어 영역 또는 프로모터는 많이 있으며, 당업자에게 친숙하다. 실질적으로 이들 유전자 요소를 유도할 수 있는 임의의 프로모터가 본 발명에 적합하며, 이는 CYC1, HIS3, GAL1, GAL10, ADH1, PGK, PHO5, GAPDH, ADC1, TRP1, URA3, LEU2, ENO, TPI (사카로마이세스에서의 발현에 유용함); AOX1 (피키아에서의 발현에 유용함); 및 lac, ara, tet, trp, lPL, lPR, T7, tac, 및 trc (에스케리키아 콜라이, 알칼리제네스, 및 슈도모나스에서의 발현에 유용함)뿐만 아니라 바실러스 서틸리스, 바실러스 리케니포르미스, 및 파에니바실러스 마세란스에서의 발현에 유용한 다양한 파지 프로모터 및 amy, apr, npr 프로모터를 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. - 종결 제어 영역은 바람직한 숙주에 자생적인 다양한 유전자로부터 또한 유래될 수도 있다. 선택적으로, 종결 부위는 불필요할 수도 있지만, 포함될 경우가 가장 바람직하다.
소정 벡터는 광범위한 숙주 박테리아에서 복제될 수 있으며, 접합에 의해 이동될 수 있다. pRK404의 완전한 그리고 주석을 단 서열과 3가지의 관련 벡터 - pRK437, pRK442, 및 pRK442(H)가 입수가능하다. 이들 유도체는 그람(Gram) 음성균에서의 유전자 조작에 유익한 도구인 것으로 입증되었다 (문헌[Scott et al., Plasmid 50, 74-79, 2003]). 일련의 그람 음성균에서 기능할 수 있는 프로모터를 갖는 광범한 숙주 범위의 몇몇 플라스미드 유도체인 Inc P4 플라스미드 RSF1010이 또한 이용가능하다. 플라스미드 pAYC36 및 pAYC37은 그람 음성균에서 이종성 유전자 발현을 허용하기 위한 다수의 클로닝 부위와 함께 활성 프로모터를 갖는다.
염색체 유전자 대체 도구가 또한 널리 이용가능하다. 예를 들어, 광범한 숙주 범위의 레플리콘(replicon)의 감열성 변이체 pWV101을 변형시켜 일련의 그람 양성균에서 유전자 대체를 초래하기 위하여 사용될 수 있는 플라스미드 pVE6002를 제작하였다 (문헌[Maguin et al., J. Bacteriol. 174, 5633-5638, 1992]). 부가적으로, 에피센터(등록상표)와 같이 상업적 공급원 유래의 다양한 게놈에서 랜덤 돌연변이를 생성하는 데 시험관내 트랜스포좀(transposome)이 이용가능하다.
다양한 바람직한 미생물 숙주에서의 아이소부탄올 생합성 경로의 발현이 하기에 더욱 상세하게 설명된다.
이. 콜라이에서의 아이소부탄올 생합성 경로의 발현
이. 콜라이의 형질전환에 유용한 벡터 또는 카세트는 통상적이며 상기에 열거된 회사로부터 구매가능하다. 예를 들어, 아이소부탄올 생합성 경로의 유전자들은 다양한 공급원으로부터 단리되고, 변형된 pUC19 벡터 내로 클로닝되고, 이. 콜라이 NM522를 형질전환시킬 수 있다.
로도코커스 에리트로폴리스에서의 아이소부탄올 생합성 경로의 발현
일련의 이. 콜라이-로도코커스 셔틀 벡터(shuttle vector)가 알. 에리트로폴리스에서의 발현에 이용가능하며, 이는 pRhBR17 및 pDA71을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다 (문헌[Kostichka et al., Appl. Microbiol. Biotechnol. 62, 61-68, 2003]). 부가적으로, 일련의 프로모터가 알. 에리트로폴리스에서의 이종성 유전자 발현에 이용가능하다 (문헌[Nakashima et al., Appl. Environ. Microbiol. 70, 5557-5568, 2004] 및 문헌[Tao et al., Appl. Microbiol. Biotechnol. 68, 346-354, 2005]). 알. 에리트로폴리스에서의 염색체 유전자의 표적화된 유전자 파괴가 타오(Tao) 등의 상기 문헌 및 문헌[Brans et al., Appl. Environ. Microbiol. 66, 2029-2036, 2000]에 개시된 방법을 이용하여 생성될 수 있다.
상기에 설명된 바와 같이, 아이소부탄올의 생성에 필요한 이종성 유전자는 처음에 pDA71 또는 pRhBR71 내에 클로닝되어 이. 콜라이를 형질전환시킬 수 있다. 이어서, 이 벡터는 코스티치카(Kostichka) 등의 상기 문헌에 설명된 바와 같이 전기천공에 의해 알. 에리트로폴리스를 형질전환시킬 수 있다. 재조합체는 글루코스를 포함하는 합성 배지에서 성장될 수 있으며, 아이소부탄올의 생성이 당업계에 공지된 방법을 사용하여 뒤따를 수 있다.
비. 서틸리스에서의 아이소부탄올 생합성 경로의 발현
비. 서틸리스에서의 돌연변이의 생성 및 유전자 발현 방법이 당업계에 또한 잘 알려져 있다. 예를 들어, 아이소부탄올 생합성 경로의 유전자가 다양한 공급원으로부터 단리되고, 변형된 pUC19 벡터 내로 클로닝되고, 바실러스 서틸리스 BE1010을 형질전환시킬 수 있다. 부가적으로, 아이소부탄올 생합성 경로의 5개의 유전자는 발현을 위하여 2개의 오페론으로 분할될 수 있다. 상기 경로의 3개의 유전자(bubB, ilvD, 및 kivD)는 바실러스 서틸리스 BE1010의 염색체 내로 통합될 수 있다 (문헌[Payne, et al., J. Bacteriol. 173, 2278-2282, 1991]). 나머지 2개의 유전자(ilvC 및 bdhB)는 발현 벡터 내로 클로닝되고, 통합된 아이소부탄올 유전자를 지니는 바실러스 균주를 형질전환시킬 수 있다.
비. 리케니포르미스에서의 아이소부탄올 생합성 경로의 발현
비. 서틸리스에서 복제되는 대부분의 플라스미드 및 셔틀 벡터를 이용하여 원형질체 형질전환 또는 전기천공 중 어느 하나에 의해 비. 리케니포르미스를 형질전환시킬 수 있다. 아이소부탄올의 생성에 필요한 유전자는 플라스미드 pBE20 또는 pBE60 유도체 내에 클로닝될 수 있다 (문헌[Nagarajan et al., Gene 114, 121-126, 1992]). 비. 리케니포르미스를 형질전환시키는 방법은 당업계에 공지되어 있다 (문헌[Fleming et al. Appl. Environ. Microbiol., 61, 3775-3780, 1995]). 비. 서틸리스에서의 발현용으로 제작된 플라스미드로 비. 리케니포르미스를 형질전환시켜 아이소부탄올을 생성하는 재조합 미생물 숙주를 생성할 수 있다.
파에니바실러스 마세란스에서의 아이소부탄올 생합성 경로의 발현
비. 서틸리스에서의 발현을 위하여 상기에 기재된 바와 같이 플라스미드를 제작하고, 이를 사용하여 원형질체 형질전환에 의해 파에니바실러스 마세란스를 형질전환시켜 아이소부탄올을 생성하는 재조합 미생물 숙주를 생성할 수 있다.
알칼리제네스 (랄스토니아(Ralstonia)) 에우트로푸스에서의 아이소부탄올 생합성 경로의 발현
알칼리제네스 에우트로푸스에서의 돌연변이의 생성 및 유전자 발현 방법이 당업계에 공지되어 있다 (문헌[Taghavi et al.,-Appl. Environ. Microbiol., 60, 3585-3591, 1994]). 아이소부탄올 생합성 경로에 있어서의 유전자는 상기에 설명된 광범한 숙주 범위의 임의의 벡터 내에 클로닝되고, 전기천공되어 아이소부탄올을 생성하는 재조합체를 생성할 수 있다. 알칼리제네스에서의 폴리(하이드록시부티레이트) 경로는 상세하게 설명되었으며, 알칼리제네스 에우트로푸스 게놈을 변형하는 다양한 유전자 기술이 공지되어 있고, 그러한 도구는 아이소부탄올 생합성 경로의 엔지니어링에 적용될 수 있다.
슈도모나스 퓨티다에서의 아이소부탄올 생합성 경로의 발현 - 슈도모나스 퓨티다에서의 유전자 발현 방법이 당업계에 공지되어 있다 (예를 들어, 본 명세서에 참고로 포함된 벤-바사트(Ben-Bassat) 등의 미국 특허 제 6,586,229호 참조). 부탄올 경로의 유전자는 pPCU18 내에 삽입될 수 있으며, 이 라이게이션된 DNA로 일렉트로컴피턴트 슈도모나스 퓨티다 DOT-T1 C5aAR1 세포를 전기천공시켜 아이소부탄올을 생성하는 재조합체를 생성할 수 있다.
사카로마이세스 세레비지에에서의 아이소부탄올 생합성 경로의 발현
사카로마이세스 세레비지에에서의 유전자 발현 방법이 당업계에 공지되어 있다 (예를 들어, 문헌[Methods in Enzymology, Volume 194, Guide to Yeast Genetics and Molecular and Cell Biology, Part A, 2004, Christine Guthrie and Gerald R. Fink ,eds., Elsevier Academic Press, San Diego, CA]). 효모에서의 유전자의 발현은 전형적으로 프로모터, 이어서 관심있는 유전자, 및 전사 종결자를 필요로 한다. 많은 효모 프로모터가 아이소부탄올 생합성 경로를 코딩하는 유전자를 위한 발현 카세트의 제작에서 사용될 수 있으며, 이는 구성적 프로모터 FBA, GPD, ADH1, 및 GPM과, 유도성 프로모터 GAL1, GAL10, 및 CUP1을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 적합한 전사 종결자는 FBAt, GPDt, GPMt, ERG10t, GAL1t, CYC1, 및 ADH1을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 예를 들어, 적합한 프로모터, 전사 종결자, 및 아이소부탄올 생합성 경로의 유전자를 이. 콜라이-효모 셔틀 벡터 내에 클로닝시킬 수 있다.
락토바실러스 플란타룸에서의 아이소부탄올 생합성 경로의 발현
락토바실러스 속은 락토바실랄레스(Lactobacillales) 과에 속하며, 바실러스 서틸리스 및 스트렙토코커스(Streptococcus)의 형질전환에 사용되는 많은 플라스미드 및 벡터가 락토바실러스에 사용될 수 있다. 적합한 벡터의 비제한적인 예에는 pAMβ1 및 그 유도체 (문헌[Renault et al., Gene 183, 175-182, 1996]; 및 문헌[O'Sullivan et al., Gene 137, 227-231, 1993]); pMBB1 및 pMBB1의 유도체인 pHW800 (문헌[Wyckoff et al. Appl. Environ. Microbiol. 62, 1481-1486, 1996]); 접합 플라스미드인 pMG1 (문헌[Tanimoto et al., J. Bacteriol. 184, 5800-5804, 2002]); pNZ9520 (문헌[Kleerebezem et al., Appl. Environ. Microbiol. 63, 4581-4584, 1997]); pAM401 (문헌[Fujimoto et al., Appl. Environ. Microbiol. 67, 1262-1267, 2001]); 및 pAT392 (문헌[Arthur et al., Antimicrob. Agents Chemother. 38, 1899-1903, 1994])가 포함된다. 락토바실러스 플란타룸 유래의 몇몇 플라스미드가 또한 보고되었다 (문헌[van Kranenburg R, et al. Appl. Environ. Microbiol. 71, 1223-1230, 2005]).
다양한 엔테로코커스 종(이. 파에시움 (E. faecium ), 이. 갈리나륨(E. gallinarium), 및 이. 파에칼리스 (E. faecalis ))에서의 아이소부탄올 생합성 경로의 발현
엔테로코커스 속은 락토바실랄레스 과에 속하며, 락토바실러스, 바실러스 및 스트렙토코커스 종의 형질전환에 사용되는 많은 플라스미드 및 벡터가 엔테로코커스 종에 사용될 수 있다. 적합한 벡터의 비제한적인 예에는 pAMβ1 및 그 유도체 (문헌[Renault et al., Gene 183, 175-182, 1996]; 및 문헌[O'Sullivan et al., Gene 137, 227-231, 1993]); pMBB1 및 pMBB1의 유도체인 pHW800 (문헌[Wyckoff et al. Appl. Environ. Microbiol. 62, 1481-1486, 1996]); 접합 플라스미드인 pMG1 (문헌[Tanimoto et al., J. Bacteriol. 184, 5800-5804, 2002]); pNZ9520 (문헌[Kleerebezem et al., Appl. Environ. Microbiol. 63, 4581-4584, 1997]); pAM401 (문헌[Fujimoto et al., Appl. Environ. Microbiol. 67, 1262-1267, 2001]); 및 pAT392 (문헌[Arthur et al., Antimicrob. Agents Chemother. 38, 1899-1903, 1994])가 포함된다. 락토코커스 유래의 nisA 유전자를 사용한 이. 파에칼리스를 위한 발현 벡터가 또한 사용될 수도 있다 (문헌[Eichenbaum et al., Appl. Environ. Microbiol. 64, 2763-2769, 1998]). 부가적으로, 이. 파에시움 염색체에서 유전자 치환을 위한 벡터가 사용될 수도 있다 (문헌[Nallaapareddy et al., Appl. Environ. Microbiol. 72, 334-345, 2006]).
발효 배지
본 발명에서 발효 배지는 적합한 탄소 기질을 포함하여야 한다. 적합한 기질은 단당류, 예를 들어 글루코스 및 프룩토스, 올리고당류, 예를 들어 락토스 또는 수크로스, 다당류, 예를 들어 전분 또는 셀룰로오스 또는 그 혼합물과, 재생가능한 공급재료로부터의 비정제된 혼합물, 예를 들어 치즈 유장 투과물, 옥수수 침지액, 사탕무 당밀 및 보리 누룩을 포함할 수 있지만, 이에 한정되지 않는다. 부가적으로, 탄소 기질은 또한 C1 기질, 예를 들어 이산화탄소, 또는 메탄올일 수 있으며, 이것에 있어서 주요한 생화학적 중간체로의 대사적 전환이 입증되었다. C1 및 C2 기질 외에, 메틸요구(methylotrophic) 유기체는 대사 활성을 위한 다양한 아미노산, 글루코사민 및 메틸아민과 같은 많은 기타 탄소 함유 화합물을 이용하는 것으로 또한 공지되어 있다. 예를 들어, 메틸요구 효모는 메틸아민 유래의 탄소를 이용하여 트레할로스 또는 글리세롤을 형성하는 것으로 공지되어 있다 (문헌[Bellion et al., Microb. Growth C1 Compd., [Int. Symp.], 7th (1993), 415-32. (eds): Murrell, J. Collin; Kelly, Don P. Publisher: Intercept, Andover, UK]). 이와 유사하게, 칸디다의 다양한 종은 알라닌 또는 올레산을 대사시킬 것이다 (문헌[Sulter et al., Arch. Microbiol. 153, 485-489, 1990]). 따라서, 본 발명에서 이용되는 탄소 공급원은 매우 다양한 탄소 함유 기질을 포함할 수 있으며, 단지 유기체의 선택에 의해 한정될 것으로 생각된다.
상기에 언급된 모든 탄소 기질 및 그 혼합물이 본 발명에서 적합한 것으로 생각되지만, 바람직한 탄소 기질은 글루코스, 프룩토스 및 수크로스이다.
적절한 탄소 공급원 외에, 발효 배지는 적합한 미네랄, 염, 보조 인자, 완충액 및 아이소부탄올 생성에 필요한 효소 경로의 촉진 및 배양물의 성장에 적합한, 당업자에게 공지된 기타 성분을 포함하여야 한다.
배양 조건
전형적으로, 세포는 적절한 배지에서 약 25℃ 내지 약 40℃ 범위의 온도에서 성장시킨다. 본 발명에서 적합한 성장 배지는 루리아 베르타니(Luria Bertani, LB) 액체 배지, 사부로 덱스트로스(Sabouraud Dextrose, SD) 액체 배지 또는 효모 배지(Yeast Medium, YM) 액체 배지와 같이 일반적으로 상업적으로 제조된 배지이다. 다른 규정 또는 합성 성장 배지가 또한 사용될 수도 있으며, 특정 미생물의 성장에 적절한 배지는 미생물학 또는 발효 과학 분야의 당업자가 알고 있을 것이다. 직접적으로 또는 간접적으로 이화생성물 억제를 조정하는 것으로 공지된 제제의 사용이, 예를 들어 환형 아데노신 2',3'-모노포스페이트(cAMP)가 발효 배지 내에 또한 포함될 수도 있다.
발효에 적합한 pH 범위는 pH 5.0 내지 pH 9.0이며, 여기서 pH 6.0 내지 pH 8.0이 초기 조건에 바람직하다.
발효는 호기 조건 또는 혐기 조건 하에 실시될 수 있으며, 여기서 혐기 또는 미세호기 조건이 바람직하다. 산업적 배치 및 연속 발효
본 발명은 배치식 발효 방법을 이용한다. 고전적인 배치 발효는 배지의 조성이 발효 시작시에 정해지며, 발효 동안 인공적으로 변경되지 않는 폐쇄 시스템이다. 따라서, 발효의 시작시에 배지에 원하는 유기체 또는 유기체들이 접종되며, 상기 시스템에 어떠한 것도 첨가하지 않고서 발효가 일어나는 것을 가능케 한다. 그러나, 전형적으로 "배치" 발효는 탄소 공급원의 첨가와 관련하여 배치식이며, pH 및 산소 농도와 같은 인자를 제어하려는 시도가 흔히 이루어진다. 배치 시스템에서, 이 시스템의 대사 산물 및 생물질 조성물은 발효가 중단되는 시점까지 끊임없이 변화한다. 배치 배양 내에서 세포는 정적 유도기(static lag phase)를 통하여 고 성장 로그기로, 그리고 마지막으로 성장 속도가 감소되거나 정지되는 정상기로 완화된다. 미처리될 경우, 정상기의 세포는 결국 죽을 것이다. 로그기의 세포는 일반적으로 최종 생성물 또는 중간체의 벌크 생성에 책임이 있다.
표준 배치 시스템이 변화된 것은 유가식(Fed-Batch) 시스템이다. 또한, 유가식 발효 공정이 본 발명에서 적합하며, 이는 발효가 진행됨에 따라 기질이 증분식으로 첨가된다는 것을 제외하고는 전형적인 배치 시스템을 포함한다. 유가식 시스템은 이화 대사 산물 억제가 세포의 대사 작용을 저해하는 경향이 있을 때 그리고 배지 중에 한정된 양의 기질이 있는 것이 바람직한 경우 유용하다. 유가식 시스템 중 실제 기질 농도의 측정은 어려우며, 따라서 pH, 용존 산소 및 CO2와 같은 폐기 가스의 분압과 같은 측정가능한 인자의 변화를 기반으로 하여 개산된다. 배치식 및 유가식 발효는 통상적이며, 당업계에 잘 알려져 있고, 그 예를 본 명세서에 참고로 포함된 문헌[Thomas D. Brock in Biotechnology: A Textbook of Industrial Microbiology, Second Edition (1989) Sinauer Associates, Inc., Sunderland, MA.], 또는 문헌[Deshpande, Mukund (Appl. Biochem. Biotechnol., 36, 227, 1992)]에서 찾아볼 수 있다.
본 발명은 배치식으로 실시될 수 있지만, 본 방법은 연속식 발효 방법에 적용가능한 것으로 생각된다. 연속식 발효는 규정된 발효 배지가 계속하여 생물 반응기에 첨가되고, 동일한 양의 조절 배지가 프로세싱을 위하여 동시에 제거되는 개방 시스템이다. 연속식 발효에서는 일반적으로 배양물이 일정한 고밀도로 유지되는데, 여기서 세포는 주로 대수기 성장 상태에 있다.
연속식 발효는 세포 성장 또는 최종 생성물 농도에 영향을 주는 하나의 인자 또는 임의의 개수의 인자의 조정을 허용한다. 예를 들어, 한 가지 방법은 제한 영양소, 예를 들어 탄소 공급원 또는 질소의 수준을 고정된 비율로 유지하고 모든 다른 파라미터는 조정되게 할 것이다. 다른 시스템에서, 배지 탁도로 측정되는 세포 농도는 일정하게 유지하면서 성장에 영향을 주는 많은 인자는 계속하여 변경시킬 수 있다. 연속식 시스템은 정상 상태 성장 조건을 유지하도록 노력하며, 따라서 배출되는 배지로 인한 세포 손실은 발효에서 세포 성장 속도에 대하여 균형이 맞추어져야 한다. 연속식 발효 공정에 있어서 영양소 및 성장 인자를 조정하는 방법뿐만 아니라, 생성물 형성 속도를 최대화하는 기술도 산업 미생물학 분야에서 잘 알려져 있으며, 다양한 방법이 브록(Brock)의 상기 문헌에 상술되어 있다.
본 발명은 배치식, 유가식 또는 연속식 공정 중 어느 하나를 이용하여 실시될 수 있으며, 임의의 공지된 발효 방식이 적합할 것으로 생각된다. 부가적으로, 세포는 전세포 촉매로서 기재 상에 고정되어 아이소부탄올 생성을 위한 발효 조건에 처해질 수 있다고 생각된다.
발효 배지로부터의 아이소부탄올의 단리 방법
생물학적으로 생성된 아이소부탄올은 아세톤-부탄올-에탄올(ABE) 발효에 대하여 당업계에 공지된 방법을 사용하여 발효 배지로부터 단리될 수 있다 (예를 들어, 문헌[Durre, Appl. Microbiol. Biotechnol. 49, 639-648, 1998] 및 문헌[Groot et al., Process. Biochem. 27, 61-75, 1992]과 상기 문헌 내의 참고 문헌 참조). 예를 들어, 고체는 원심분리, 여과, 및 경사법에 의해 발효 배지로부터 제거될 수 있으며, 아이소부탄올은 증류, 공비 증류, 액체-액체 추출, 흡착, 가스 스트리핑(gas stripping), 막 증발, 또는 투과증발(pervaporation)과 같은 방법을 사용하여 발효 배지로부터 단리될 수 있다.
본 발명을 하기 실시예에서 추가로 설명한다. 이러한 실시예는, 본 발명의 바람직한 실시 형태를 나타내면서, 오직 예로서 주어지는 것으로 이해되어야만 한다. 당업자라면, 상기 논의 및 이러한 실시예로부터 본 발명의 본질적인 특징을 확인할 수 있으며, 본 발명의 사상 및 범주를 벗어나지 않고서도 본 발명을 다양하게 변경하고 수정하여 본 발명을 다양한 용도 및 조건에 적합하게 할 수 있다.
일반적인 방법
실시예에서 사용한 표준 재조합 DNA 및 분자 클로닝 기술은 당업계에 잘 알려져 있으며, 샘브룩 등의 문헌[Sambrook, J., Fritsch, E. F. and Maniatis, T., Molecular Cloning: A Laboratory Manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, 1989] (이하, 본 명세서에서 마니아티스로 지칭됨) 및 마니아티스의 상기 문헌과 실라비(Silhavy) 등의 문헌[Silhavy, et al., Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y. 1984] 및 오스벨(Ausubel) 등의 문헌[Ausubel et al , Current Protocols in Molecular Biology, pub. by Greene Publishing Assoc. and Wiley-Interscience, 1987]에 설명되어 있다.
박테리아 배양물의 유지 및 성장에 적합한 재료 및 방법은 당업계에 잘 알려져 있다. 하기 실시예에 사용하기에 적합한 기술은 문헌[Manual of Methods for General Bacteriology, Phillipp etal, eds., American Society for Microbiology, Washington, DC.,1994] 또는 문헌[Thomas D. Brock, Brock, Biotechnology: A Textbook of Industrial Microbiology, Second Edition, Sinauer Associates, Inc., Sunderland, MA (1989)]에 설명된 바와 같이 찾아볼 수 있다. 박테리아 세포의 성장 및 유지에 사용한 모든 시약, 제한 효소 및 재료는 달리 명시되지 않으면 알드리치 케미칼스(Aldrich Chemicals) (미국 위스콘신주 밀워키 소재), 비디 다이아그노스틱 시스템즈(BD Diagnostic Systems) (미국 메릴랜드주 스파크스 소재), 라이프 테크놀로지스 (미국 메릴랜드주 록빌 소재), 또는 시그마 케미칼 컴퍼니(Sigma Chemical Company) (미국 미주리주 세인트 루이스 소재)로부터 입수하였다.
하기 실시예에서 사용하기 위한 올리고뉴클레오티드 프라이머가 표 3에 주어져 있다.
Figure 112009070373452-PCT00004
약어의 의미는 하기와 같다: "sec"는 초를 의미하며, "min"은 분을 의미하며, "h"는 시간을 의미하며, "㎚"는 나노미터를 의미하며, "uL"은 마이크로리터를 의미하며, "mL"은 밀리리터를 의미하며, "㎎/mL"은 밀리리터 당 밀리그램을 의미하며, "L"은 리터를 의미하며, "㎚"은 나노미터를 의미하며, "mM"은 밀리몰랄을 의미하며, "M"은 몰랄을 의미하며, "mmol"은 밀리몰을 의미하며, "μmole"는 마이크로몰을 의미하며, "㎏"는 킬로그램을 의미하며, "g"는 그램을 의미하며, "μg"는 마이크로그램을 의미하며, "ng"는 나노그램을 의미하며, "PCR"은 폴리머라아제 연쇄 반응을 의미하며, "OD"는 광학 밀도를 의미하며, "OD600"은 600 ㎚의 파장에서 측정한 광학 밀도를 의미하며, "kDa"는 킬로달톤을 의미하며, "g"는 인력 상수를 의미하며, "bp"는 염기쌍(들)을 의미하며, "kbp"는 킬로베이스 쌍(들)을 의미하며, "kb"는 킬로베이스를 의미하며, "%"는 퍼센트를 의미하며, "% (w/v)"는 중량/부피 퍼센트를 의미하며, "% (v/v)"는 부피/부피 퍼센트를 의미하며, "HPLC"는 고성능 액체 크로마토그래피를 의미하며, "g/L"은 리터 당 그램을 의미하며, "ug/L"은 리터 당 마이크로그램을 의미하며, 'ng/uL"는 마이크로리터 당 나노그램을 의미하며, "pmol/uL"은 마이크로리터 당 피코몰을 의미하며, "RPM"은 분 당 회전수를 의미하며, "umol/min/㎎"는 밀리그램 당 분 당 마이크로몰을 의미하며, "w/v"는 부피 당 중량을 의미하며, "v/v"는 부피 당 부피를 의미한다.
실시예 1 (비교용)
KARI 효소 활성의 분석
이 실시예는 ilvC 유전자 과다 발현 제작물의 제조 및 이. 콜라이의 ilvC 유전자에 의해 코딩되는 KARI 효소에 의한 NADPH의 아세토락테이트 의존적 산화를 이용한 효소 활성의 측정을 설명한다.
pBAD - ilvC 발현 플라스미드의 제작 - 이. 콜라이 유래의 ilvC 유전자의 단리
ilvC 유전자 코딩 영역을 PCR을 이용하여 이. 콜라이 균주 FM5 (ATCC 53911) 게놈 DNA로부터 증폭시켰다. 4 mL의 루리아 베르타니(Luria Bertani, LB) 배지 (메디아테크 인크.(Mediatech Inc.), 미국 버지니아주 헌던 소재)를 포함하는 50 mL 배양 튜브에서 상기 세포를 하룻밤 성장시켰다 (37℃, 300 RPM에서 교반). 이어서, 1000 xg에서 3분 동안 원심분리함으로써 상기 세포를 수확하고, 세포의 게놈 DNA를 젠트라 퓨어진(Gentra Puregene) 키트 (젠트라 시스템즈, 인크.(Gentra Systems, Inc.), 미국 미네소타주 미니애폴리스 소재; 카탈로그 번호 D-5000A)를 사용하여 제조업자의 지시에 따라 준비하였다. ilvC 코딩 영역 DNA 단편을 이. 콜라이 DNA를 주형으로 사용하고 프라이머인 서열 번호 11 및 서열 번호 12의 서열을 사용하여 PCR에 의해 제조하였다.
제조업자의 프로토콜에 따라 핀자임스 퓨전(Finnzymes Phusion)™ 하이-피델리티(High-Fidelity) PCR 마스터 믹스 (뉴 잉글랜드 바이오랩스 인크.(New England Biolabs Inc.), 미국 매사추세츠주 비벌리 소재; 카탈로그 번호 F-531)를 사용하여 PCR을 수행하였다. DNA 서모사이클러 진앰프(Thermocycler GeneAmp) 9700 (피이 어플라이드 바이오시스템스(PE Applied Biosystems), 미국 캘리포니아주 포스터 시티 소재)에서 증폭을 수행하였다. PCR 생성물 (0.5 uL)을 추가의 정제 없이 pCR4Blunt TOPO (인비트로젠(Invitrogen), 미국 캘리포니아주 칼즈배드 소재, 카탈로그 번호 45-0031) 내에 라이게이션하고, 화학적 컴피턴트(chemically competent) TOP10 세포 (인비트로젠 44-0301)를 형질전환시켰다. LB 배지에 100 ug/Ml의 암피실린이 더해진 것을 포함하는 플레이트 (테크노바 인크(Teknova Inc), 미국 캘리포니아주 홀리스터 소재, 카탈로그 번호 L1004) 상에 라이게이션 생성물을 도말하였다. ilvC 인서트를 포함하는 클론을 SacI/BamHI을 이용한 제한효소 절단에 의해 확인하였다. 절단된 4개의 플라스미드 중 3개는 기대되는 1.5 kbp 밴드를 가졌다. 생성된 클론을 pCR4Blunt TOPO-ilvC로 명명하였다.
-pCR4Blunt TOPO-ilvC 클로닝 벡터 유래의 ilvC 단편을 SacI/BamHI 절단에 의해 유리시키고, T4 DNA 리가아제 (뉴 잉글랜드 바이오랩스, 미국 매사추세츠주 비벌리 소재)를 사용하여 SacI/BamHI 절단된 pTrc99A 내에 라이게이션시켰다 (문헌[Amann, et al., Gene, 69, 301-315, 1988]) 이 제작물을 일렉트로컴피턴트(electrocompetent) 이. 콜라이 TOP10 세포 (인비트로젠 44-0035) 내에 전기천공으로 넣고, 상기에 설명한 바와 같이 LB/암피실린 플레이트 상에 도말하였다. 1.5 kb 인서트를 포함하는 벡터를 pTrc99A-ilvC로 명명하였다.
클로닝을 위한 pBAD 벡터의 준비
당해 유전자의 5'-말단에 SacI 부위를 포함하는 pBAD.HisA (인비트로젠)의 유도체를 SacI/HindIII 제한효소 부위를 이용한 pBAD 내로의 ilvC 유전자의 클로닝용으로 제작하였다. 이 제작물을 3개의 단계로 생성하였다. 첫째, 로도토룰라 글루티니스(Rhodotorula glutinis) 유래의 페닐알라닌 암모니아 라이아제 (PAL; EC 4.3.1.5) 코딩 영역을 pBAD-HisA 벡터 내로 클로닝하여 pBAD-PAL을 만들었다. 둘째, pBAD-PAL 제작물의 시작 코돈 바로 앞에 유전자의 5'-말단에 EcoRI 부위를 부가하여 pBAD-PAL-EcoRI을 만들었다. 셋째, EcoRI 부위를 SacI 부위로 대체하고, 생성된 벡터를 SacI/HindIII로 절단하여 ilvC 유전자의 클로닝을 위한 pBAD-SacI 벡터를 만들었다. 전방향 프라이머 (PAL-F1) (서열 번호 37) 및 역방향 프라이머 (PAL-R1) (서열 번호 38)를 사용하여 PAL 유전자를 pKK223-PAL 벡터 (미국 특허 제6521748호)로부터 먼저 PCR 증폭시켰다.
제조업자의 프로토콜에 따라 타카라(TaKaRa) Taq DNA 폴리머라아제 프리믹스(Polymerase Premix) (타카라 바이오 유에스에이(TAKARA Bio USA), 미국 위스콘신주 매디슨 소재, 카탈로그 번호 TAK_R004A)를 사용하여 퍼킨 엘머(Perkin Elmer) PCR9700 서모사이클러 (피이 어플라이드 바이오시스템스, 미국 캘리포니아주 포스터 시티 소재)에서 PCR을 수행하였다. PCR 생성물을 퀴아퀵(QIAQuik) PCR 정제 키트 (퀴아젠(Qiagen) 카탈로그 번호 28106)를 사용하여 부분적으로 정제하고, BbsI 및 HindIII로 절단하였다. 이것에 의해 5 말단에 NcoI 오버행(overhang)을 포함하는 단편이 생성되었다. 이어서 절단 생성물을 NcoI/HindIII로 절단된 pBAD.HisA (인비트로젠) 벡터 내로 라이게이션시켰다. 제조업자에 의해 제공되는 표준 프로토콜에 따라 T4 DNA 리가아제 (프로메가(Promega))를 사용하여 라이게이션 반응을 수행하였다. 제조업자의 지시에 따라 바이오-라드 진 펄서(Bio-RAD Gene Pulser) II (바이오-라드 래버러토리즈 인크(Bio-Rad Laboratories Inc), 미국 캘리포니아주 헤르쿨레스 소재)를 사용하여 2 uL의 라이게이션 생성물을 사용하여 TOP10 일렉트로컴피턴트 세포를 형질전환시켰다. 형질전환된 세포를, LB 배지에 100 ug/Ml의 암피실린이 더해진 것을 포함하는 한천 플레이트(테크노바 인크, 미국 캘리포니아주 홀리스터 소재, 카탈로그 번호 L1004) 상에 도말하고, 37℃에서 하룻밤 배양하였다. PAL 인서트를 포함하는 클론을 NcoI/HindIII를 이용한 제한효소 절단에 의해 확인하였다. 이 제작물을 pBAD-PAL로 명명하였다. 이어서, 퀵체인지(QuikChange) II XL 특정 부위 돌연변이 유발(site directed mutagenesis) 키트 (스트라타진(Stratagene), 미국 캘리포니아주 라졸라 소재, 카탈로그 번호 200524)를 사용하여 상기 제작물 내의 PAL 유전자의 5'-말단에 EcoRI 부위를 부가하였다 전방향 프라이머 (PAL-EcoRI-F1) (서열 번호 39) 및 역방향 프라이머 (PAL-EcoR1-R1) (서열 번호 40)를 설계하고, 제조업자의 지시에 따라 반응 혼합물을 제조하였다. 상기에서 제조된 pBAD-PAL 제작물을 하기 반응에서 주형으로서 사용하였다.
50 uL 반응 혼합물은 50 ng/uL의 주형 플라스미드 1.0 uL, 10 pmol/uL의 각각의 프라이머 1.0 uL, 10x 반응 완충액 5uL, 1.0 uL의 dNTP 믹스 및 3 uL의 퀵(Quik) 용액, 30 uL의 물 및 1.0 uL의 pfu-초 고 충실도 DNA 폴리머라아제를 얇은 벽의 200 uL 튜브 내에 포함하였다. 이 반응에서 사용한 모든 시약 및 폴리머라아제는 상기 퀵체인지 II XL 키트 내에 제공되어 있었다. 하기 조건을 이용하여 DNA 서모사이클러 진앰프 2400 (피이 어플라이드 바이오시스템스, 미국 캘리포니아주 포스터 시티 소재)에서 반응을 수행하였다. 출발 온도는 96℃, 2분이었으며, 그 후 18회의 가열/냉각 사이클을 실시하였다. 각각의 사이클은 96℃, 30초, 이어서 60℃, 30초, 및 72℃, 160초로 이루어졌다. 온도 사이클링의 완료시에, 샘플을 72℃에서 600초 더 유지하고, 이어서 4℃에서 샘플 복구를 기다리면서 유지하였다.
반응의 완료 후, (상기 키트로부터의) 1.0 uL의 제한 효소 DpnI을 반응물에 첨가하고, 이어서 37℃에서 3시간 동안 인큐베이션하여 반응물 중의 주형 플라스미드를 절단하였다.
이어서, 제조업자의 지시에 따라 바이오라드 진 펄서 II (바이오-라드 래버러토리즈 인크, 미국 캘리포니아주 헤르쿨레스 소재)를 사용하여 DpnI 절단된 반응 생성물 2.0 uL로 50 ul의 이. 콜라이 TOP10 일렉트로컴피턴트 세포 (인비트로젠)를 형질전환시켰다 LB 배지 및 100 ug/mL의 암피실린을 포함하는 10 ㎝ 한천 플레이트 상에 상이한 부피 (2.0 uL, 5.0 uL 및 20 uL)의 형질전환된 세포를 도말하고, 플레이트를 37℃에서 하룻밤 인큐베이션하였다. 잘 분리된 콜로니를 포함하는 플레이트로부터 3개의 클론을 골라냈다. 3개의 클론 유래의 플라스미드를 제조업자의 지시에 따라 퀴아프렙(Qiaprep) 스핀 미니프렙(spin miniprep) 키트 (퀴아젠, 미국 캘리포니아주 발렌시아 소재, 카탈로그 번호 27106)를 사용하여 정제하였다. 6.0 uL의 탈이온수 중에 1.0 uL의 10x 반응 완충액 (프로메가 완충액), 1.0 uL의 정제된 플라스미드 및 1.0 uL의 각각의 제한 효소를 넣음으로써 제한 효소 EcoRI 및 Hind III (프로메가, 미국 위스콘신주 매디슨 소재)을 사용하여 제한 효소 절단 분석에 의해 양성 클론을 확인하였다. 반응 혼합물을 37℃에서 60분 동안 인큐베이션하였다. 각각의 클론의 절단된 생성물을 0.8% 아가로스 E 젤 (인비트로젠, 카탈로그 번호 G5018-08)에서 분리하였다. 제작물 내에 EcoRI 및 HindIII 제한 효소 부위 둘 모두를 갖는 샘플에서 하나의 2.1 kbp 및 하나의 4.0 kbp DNA 단편이 젤 상에서 검출되었다. 이어서 이 제작물 내의 EcoRI 부위를 플라스미드 주형 pBAD-PAL-EcoRI과 서열 번호 13 및 서열 번호 14의 프라이머를 이용하여 상기에 설명된 것과 동일한 프로토콜을 사용하여 SacI 부위로 대체하였다.
양성 클론을 제한 효소 SacI 및 Hind III (프로메가, 미국 위스콘신주 매디슨 소재)를 사용하여 제한 효소 절단 분석에 의해 확인하였다. 일단 양성 클론이 동정되었으면, 상기 제한 효소 절단 반응을 보다 큰 규모 (50 uL)로 셋업하였다. 제조업자의 프로토콜에 따라 1% 아가로스 젤 및 퀴아퀵 젤 추출 키트 (퀴아젠, 미국 캘리포니아주 발렌시아 소재, 카탈로그 번호 28704)를 사용하여 믹스로부터 절단된 벡터를 포함하는 4 kbp 단편을 젤 정제하였다. 이 제작물을 pBAD-SacI으로 명명하였다.
KARI의 과다 발현에 사용한 숙주 균주
KARI 효소를 과다 발현하는 제작물의 제조에 숙주 균주 이. 콜라이 Bw25113 (ΔilvC) - ilvC 유전자-넉아웃(knockout)을 사용하였다. 이 균주에서, 람다 레드(Lambda red) 상동 재조합 기술을 사용하여 이. 콜라이 염색체 상의 전체 ilvC 유전자를 카나마이신 카세트로 대체하였다 (문헌[ Datsenko and Wanner, Proc. Natl. Acad Sci. USA. 97, 6640-6645, 2000]). 이 기술을 사용하여 넉아웃 균주를 생성하는 데 필요한 모든 균주 및 벡터를 배리 워너(Barry Wanner) 교수 (퍼듀 유니버시티, 미국 인디애나주 웨스트 라파예트 소재)로부터 입수하였다.
클로닝을 위한 ilvC 코딩 영역의 준비
고 충실도 pfu-울트라 폴리머라아제 (스트라타진, 미국 캘리포니아주 라졸라 소재)를 사용하여 ilvC의 코딩 영역을 증폭시켰으며, 이때 SacI 부위를 ATG 직전의 전방향 프라이머의 5' 말단에 부가시켰고, HindIII 부위를 종결 코돈 직후의 역방향 프라이머의 5' 말단에 부가시켰다. 서열 번호 15의 프라이머 (전방향: ilvc-trc-SacI-F) 및 서열 번호 16의 프라이머 (역방향: ilvc-trc-HindIII-R)를 이 반응에 사용하였다. PCR 반응에서 사용한 주형은 상기에 설명한 ptrc99A-ilvC 제작물이었다.
50 uL 반응 혼합물은 5.0 uL의 10x 반응 완충액 - pfu-울트라 폴리머라아제와 함께 공급됨 - (스트라타진), 1.0 uL의 50 ng/uL의 주형, 1.0 uL의 각각의 10 pmol/uL의 전방향 및 역방향 프라이머, 1.0 uL의 40 mM dNTP 믹스 (클론테크(Clonetech), 미국 캘리포니아주 마운틴 뷰 소재), 1.0 uL의 pfu-울트라 DNA 폴리머라아제 (스트라타진) 및 39 uL의 물을 포함하였다. 이 반응 혼합물을 DNA 서모사이클러 진앰프 2400 (피이 어플라이드 바이오시스템스, 미국 캘리포니아주 포스터 시티 소재) 내의 PCR 반응용의 얇은 벽의 200 Ul 튜브 내에 넣었다. 하기 조건을 PCR 반응의 수행에 사용하였다. 출발 온도는 94℃, 2분이었다. 이어서 30회의 가열/냉각 사이클을 수행하였다. 각각의 사이클은 94℃, 30초, 58℃, 30초 및 68℃, 1분 40초로 이루어졌다. 온도 사이클링의 완료시에, 샘플을 60℃에서 10분 더 유지하고, 이어서 샘플 복구를 기다리면서 4℃에서 유지하였다.
PCR 생성물을 퀴아퀵 PCR 정제 키트 (퀴아젠, 카탈로그 번호 28106)를 사용하여 부분적으로 정제하고, HindIII 및 SacI으로 절단하고, 이어서 상기에 설명된 프로토콜을 사용하여 젤 정제하였다. 절단된 PCR 단편을 동일한 효소 세트로 절단한 pBAD-SacI 벡터 내에 라이게이션시켰다. 20 uL의 라이게이션 반응물은 1.0 uL의 T4 DNA 리가아제 (프로메가), T4 DNA 리가아제와 함께 오는 2.0 uL의 10x 반응 완충액, 45 ng의 벡터 및 45 ng의 인서트와 탈이온수를 포함하였다. 반응물을 에펜도르프(Eppendorf) 서멀 사이클러 (에펜도르프 노스 아메리카(Eppendorf North America), 미국 뉴욕주 웨스트베리 소재)에서 16℃에서 하룻밤 인큐베이션하였다.
바이오라드 진 펄서 II (바이오-라드 래버러토리즈 인크., 미국 캘리포니아주 헤르쿨레스 소재)를 사용하여 2 uL 의 라이게이션 생성물로 이. 콜라이 TOP10 일렉트로컴피턴트 세포 (인비트로젠)를 형질전환시켰다. 형질전환된 클론을 LB 배지 및 100 ug/mL의 암피실린을 포함하는 한천 플레이트 상에서 선별하였다. 클론 중 이. 콜라이 ilvC 유전자 인서트의 존재는 SacI 절단과, 서열 번호 17 내지 서열 번호 22의 프라이머를 사용한 DNA 서열결정에 의해 확인하였다. ilvC 유전자 인서트를 갖는 제작물을 pBAD-K12-ilvC로 명명하였다.
KARI 발현 분석을 위한 균주의 준비
상기 pBAD-K12-ilvC 제작물 및 pTrc99A-ilvC의 플라스미드 - 이들 둘 모두 TOP10 숙주 균주 내에 있음 - 를 제조업자의 지시에 따라 퀴아프렙 스핀 미니프렙 키트 (퀴아젠, 미국 캘리포니아주 발렌시아 소재, 카탈로그 번호 27106)를 사용하여 100 ug/Ml의 암피실린을 포함하는 LB 배지 중의 하룻밤 배양물 3 ml로부터 준비하였다. 제조업자의 지시에 따라 바이오라드 진 펄서 II (바이오-라드 래버러토리즈 인크., 미국 캘리포니아주 헤르쿨레스 소재)를 사용하여 1 uL의 pBAD-K12-ilvC 및 1 uL의 pTrc99A-ilvC로 이. 콜라이 Bw25113 (ΔilvC) 일렉트로컴피턴트 세포를 개별적으로 형질전환시켰다. LB 배지에 100 ug/Ml의 암피실린을 더한 것을 포함하는 한천 플레이트 상에 형질전환된 세포를 도말하고, 이를 37℃에서 하룻밤 배양하였다. 이들 플레이트로부터의 콜로니를 무세포 추출물의 제조에 사용하였다.
무세포 추출물의 제조
250 rpm에서 진탕하면서 37℃에서 100 ug/mL의 암피실린 및 유도제인 0.02%(w/v)의 아라비노스 및 1 mM의 아이소프로필 β-D-1-티오갈락토피라노사이드(IPTG)를 각각 포함하는 3.0 mL의 LB 배지에서 pBAD-K12-ilvC 및 pTrc99A-ilvC를 포함하는 세포를 배양하였다. 22.5℃에서 6000 xg에서 5본 동안 원심분리함으로써 세포를 수확하고, 세포 펠렛을 1.5 mL 미세-원심분리 튜브 내의 300 uL의 100 mM HEPES 완충액 (pH7.5)에 재현탁시키고, 40%의 물과 60%의 얼음 (부피 기준)이 채워진 수조 내에 두고, 미소닉스(Misonix) 300 초음파기 (미소닉스, 미국 뉴욕주 파밍데일 소재)를 사용하여 2 내지 3분 동안 초음파 처리하였다 (1.0의 힘에서 3.0초의 버스트(burst), 이어서 3.0초의 휴지). 세포 잔해를 원심분리에 의해 제거하였다 (에펜도르프 미세-원심분리기 모델 5415D, 22.5℃ 에서 9300 xg에서 5분).
대안적으로, 세제 기반 단백질 추출 시약 버그버스터(BugBuster) 마스터 믹스 (노바겐(Novagen), 카탈로그 번호 71456)를 사용하여 세포 추출물을 준비하였다. 배양물 3.0 mL로부터의 세포 펠렛을 버그버스터 마스터 믹스 300 uL에 재현탁시키고, 실온에서 20 분 동안 인큐베이션하였다. 22.5℃에서 9300 xg에서 5분 동안 원심분리함으로써 (에펜도르프 미세-원심분리기 모델 5415D) 세포 잔해를 제거하였다.
단백질 정량화
샘플 중 총 단백질 농도를 쿠마시 플러스(Coomassie Plus) (피어스 번호 23238, 미국 일리노이주 록포드 소재)를 사용하여 브래드포드 쿠마시 분석(Bradford Coomassie Assay, BCA)에 의해 측정하였다. 제조업자의 프로토콜에 따라 샘플 및 단백질 표준물 (소 혈청 알부민, BSA)을 96-웰 미세플레이트에 셋업하였다. 스펙트라맥스(SpectraMax) 플레이트 판독기 (몰레큘러 디바이시즈 코포레이션(Molecular Devices Corporation), 미국 캘리포니아주 서니베일 소재)를 사용하여 595 ㎚에서의 흡광도에 따라 단백질의 농도를 측정하였다.
KARI 효소 분석 프로토콜
분석용 기질인 (R,S)-아세토락테이트를 올라보프(Aulabaugh) 및 스클로스(Schloss)의 문헌[Aulabaugh and Schloss, Biochemistry, 29, 2824-2830, 1990]에 기재된 바와 같이 합성하였다: 1.0g의 2-아세톡시-2-메틸-3-옥소부티르산 에틸 에스테르 (알드리치, 미국 위스콘신주 밀워키 소재)를 10 mL의 1.0 M NaOH와 혼합하고, 실온에서 교반시켰다. 용액 pH가 중성으로 되었을 때, 추가의 NaOH를 서서히 첨가하여 pH를 약 8.0으로 유지하였다. 본 분석에서 사용한 모든 다른 화학물질을 시그마로부터 구매하였다.
KARI에 의한 아세토락테이트의 2,3-다이하이드록시아이소발레레이트로의 효소적 전환 후에, 분광광도계 (애질런트 테크놀로지스(Agilent Technologies), 미국 캘리포니아주 산타 클라라 소재)를 사용하여 340 ㎚에서 판독하여 보조 인자 NADPH의 사라짐을 측정하였다. NADPH에 있어서 6220 M-1㎝-1의 몰랄 흡광 계수를 사용하여 활성을 계산하였다. 사용한 원액은 HCl/KOH로 pH를 7.5로 조정한 100 mM HEPES-칼륨 염; 1.0 M MgCl2; 20 mM NADPH 및 90 mM 아세토락테이트였다. 40 mL 반응 완충액 믹스 원액은 100 mM HEPES 원액 및 400 Ul의 MgCl2 원액을 포함하였다.
일회용 플라스틱 큐벳 (에펜도르프 유베트(Eppendorf UVette), 에펜도르프 아게(Eppendorf AG), 독일 함부르크 소재)에서 반응 완충액 (194 uL)을 NADPH (2.0uL) 원액 및 세포 추출물 (2.0uL)과 혼합하고, 22.5℃에서 340 ㎚에서의 흡광도를 20초 동안 기록하였다. 초기 A340은 일반적으로 약 0.9 내지 1.0이었다. 이어서, 아세토락테이트 (2.0 uL)를 큐벳에 첨가하여 반응을 시작하였다. 이 분석에서 성분들의 최종 농도는 pH 7.5의 100 mM 포타슘 HEPES, 10 mM MgCl2, 200 uM NADPH 및 900 uM 아세토락테이트였다. 이 용액을 완전히 혼합하고, 추가의 80초 동안의 340 ㎚에서의 그의 흡광도를 기록하였다. 본 명세서에 보고한 KARI 활성은 세포 추출물 중 총 단백질의 ㎎ 당 분 당 소비되는 NADPH의 μmole로서 정의된다. pBAD-K12-ilvC 플라스미드 및 ptrc99A-ilvC 플라스미드로 형질전환시킨 이. 콜라이 Bw25113 (ΔilvC) 세포로부터 준비한 세포 추출물 중의 단백질의 농도 및 KARI의 활성에 대한 결과가 표 4에 예시되어 있다. 두 가지 세포 추출물 샘플을 pBAD-K12-ilvC 제작물에 대하여 준비하였는데, 하나는 초음파 처리에 의한 것이고, 다른 하나는 버그버스터를 사용한 것이었다. pTrc99A-ilvC 제작물에 대한 세포 추출물 샘플을 버그버스터를 사용하여 준비하였다. 이들 분석에 의하면, KARI 단백질은 pTrc99A-ilvC를 포함하는 것보다 pBAD-K12-ilvC 플라스미드를 포함하는 세포에서 보다 높은 수준으로 발현되었지만, 두 가지 상이한 방법에 의해 준비한 세포 추출물 샘플에서의 효소 비활성은 유의하게 상이하지 않았다. pBAD-HisB (인비트로젠)로 형질전환시킨 이. 콜라이 균주 Bw25113을 음성 대조군으로서 사용하였다. 음성 대조군에서의 NADPH 소비율은 극심하게 낮았다 (pBAD-K12-ilvC 유전자를 포함하는 것에 대하여 측정한 소비율의 약 1% 내지 2%).
Figure 112009070373452-PCT00005
실시예 2
다양한 미생물 유래의, 비활성이 높은 KARI 효소의 동정
이 실시예의 목적은 비활성이 높은 KARI 효소를 포함하는 미생물을 동정하는 방법을 설명하는 것이다.
최소 배지에서의 성장 동안 이. 콜라이보다 빠른 배증 시간을 갖는 KARI-함유 유기체가 고활성 KARI 효소를 포함할 것이라고 가정하였다. M9 최소 배지에서 성장시킬 때 배증 시간이 이. 콜라이보다 빠른 3가지 미생물, 슈도모나스 아에루기노사 (PAO1), 슈도모나스 플루오레센스 (PF5), 및 비브리오 콜레레 (N16961)를 동정하였다. 이들 유기체의 게놈 DNA 제제는 구매가능하다. 표 5는 M9 최소 배지에서의 성장 후 이. 콜라이와 비교한 이들 유기체의 배증 시간을 예시한다.
Figure 112009070373452-PCT00006
상기에 기술한 바와 같이, KARI 효소는 상이한 부류로 분류되었다. 슈도모나스 PF5 및 PAO1 효소는 클래스 I KARI 군 - 이는 당해 패밀리에서 가장 큰 군임 - 에 속하는 반면, 이. 콜라이 및 브이. 콜레레의 효소는 클래스 II 박테리아 KARI 군에 속한다.
피. 아에루기노사 (PAO1, ATCC 47085), 및 피. 플루오레센스 (PF5, ATCC BAA-477)의 정제된 게놈 DNA를 ATCC (아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(American Type Culture Collection), 미국 10801 버지니아주 머내서스 유니버시티 불러바드 소재)로부터 구매하였다. 각각의 유기체 유래의 게놈 DNA (각각 10 ug)를 PCR 반응에서 사용하기 위하여 100 uL의 10 mM 트리스-HCl - pH 8.5 - 에 재수화시켰다. 하기의 프라이머쌍 - 전방향 프라이머 (서열 번호 23 및 서열 번호 25)에 부착된 SacI 부위 및 역방향 프라이머 (서열 번호 24 및 서열 번호 26)에 부착된 HindIII 부위를 포함함 - 을 사용하여, 고 충실도 pfu-울트라 DNA 폴리머라아제 (스트라타진)를 사용하여 PCR에 의해 PAO1 및 PF5의 게놈 DNA로부터 ilvC 유전자 코딩 영역을 증폭시켰다. 이들 유기체에 있어서 PF5 및 PAO1 ilvC 유전자의 공식적으로 입수가능한 (젠뱅크) 서열에 기반하여 프라이머를 설계하였다.
각각의 50 uL PCR 반응물은 1.0 Ul의 게놈 DNA와, 각각의 유전자를 위한 1.0 uL의 각각의 10 pmol/uL의 전방향 및 역방향 프라이머를 포함하였다.
PCR 반응을 하기 반응 조건을 이용하여 에펜도르프 마스터 사이클러 그래디언트(master cyclers gradient) (에펜도르프 노스 아메리카, 미국 뉴욕주 웨스트베리 소재)에서 수행하였다. 출발 온도는 95℃, 2분이었다. 이어서 5회의 가열/냉각 사이클을 실시하였다. 각각의 사이클은 95℃, 30초, 55℃, 30초, 및 72℃, 1분 30초로 이루어졌다. 이어서 25회의 추가의 가열/냉각 사이클을 실시하였다. 이들 사이클 각각은 95℃, 30초, 65℃, 30초, 및 72℃, 1.0분 30초로 이루어졌다. 이들 온도 사이클의 완료시에, 샘플을 72℃에서 10분 더 유지하고, 이어서 4℃에서 샘플 복구를 기다리면서 유지하였다.
생성된 PCR 단편을 HindIII 및 SacI으로 절단하고, pBAD-SacI 발현 벡터 내에 클로닝하고, 실시예 1에 설명한 절차를 이용하여 ilvC-넉아웃 균주 BW25113(ΔilvC)을 형질전환시켰다. 양성 클론을 제한 효소 절단에 의해 동정하고, 서열 번호 21 (pBAD-eF1), 서열 번호 22 (PALPK-R1), 서열 번호 27 (PF5-S-F2), 및 서열 번호 28 (PF5-S-R2)의 프라이머를 사용하여 전장 DNA 서열결정에 의해 확인하였다. 생성된 균주를 BW25113( ΔilvC) -PAO1-ilvC 및 BW25113( ΔilvC) -PF5-ilvC로 명명하였다.
브이. 콜레레 VC0162 유전자 코딩 영역은 공지된 단백질 서열 (등록 NP_229819.1)을 기반으로 하여 이. 콜라이 발현용으로 코돈 최적화하고, 주문 합성에 의한 유전자 합성(synthetic custom gene synthesis) (디엔에이 2.0, 인크.( DNA 2.0, Inc., 미국 캘리포니아주 멘로 파크 소재)에 의해 제조하였다. 이것은 SacI 및 HindIII 부위가 유전자의 말단에 부착되도록 하여 제조하였다. 이 DNA 단편을 SacI 및 HindIII 제한 효소 부위를 사용하여 pBAD-SacI 발현 벡터 내에 또한 클로닝하고, ilvC-넉아웃 균주 BW25113(ΔilvC)을 형질전환시켰다. 생성된 균주를 BW25113( ΔilvC) -VCopt-VC0162로 명명하였다. 코돈 최적화된 VC0162의 서열이 서열 번호 30으로서 주어져 있다.
K12, PAO1, PF5 및 VC 균주로부터의 단백질 및 KARI 활성 분석
모두 KARI 효소를 발현하는 BW25113( ΔilvC )-K12-ilvC, BW25113( ΔilvC) -PAO1-ilvC. BW25113( ΔilvC) -PF5-ilvC 및 BW25113( ΔilvC) -VCopt-VC0162 균주의 무세포 추출물을 실시예 1에 설명된 바와 같이 버그버스터를 사용하여 준비하였다. 188 uL의 반응 완충액, 2.0 uL의 20 mM NADPH 원액, 분석 완충액에 희석시킨 5.0 uL의 20% 세포 추출물 및 5.0 uL의 90 mM 아세토락테이트를 사용하여 KARI 분석을 실시하였다. 따라서, 이 실시예에서 사용한 최종 분석 용액은 효소, 100 mM 포타슘-HEPES, 10 mM MgCl2, 200 uM NADPH 및 2.25 mM 아세토락테이트로 이루어졌다.
표 6은 유도제로서 0.02% (w/v)의 아라비노스의 존재 하에 하룻밤 성장시킨 4가지의 상이한 유기체의 KARI 비활성을 예시한다. 세포 추출물 중 총 단백질 양 및 KARI 활성을 상기에 설명한 바와 같이 측정하였다. 표 6에 약술된 바와 같이, 최소 배지에서 성장시킬 때 배증 시간이 더 빠른 것으로 확인된 유기체 유래의 KARI 효소 (표 5) 전부는 비활성이 이. 콜라이 유래의 KARI보다 더 컸다. 각각의 추출물은 SDS-PAGE에 의해 개산할 때 대략 동일한 KARI 단백질 발현 수준을 가졌다 (데이터는 예시되지 않음). 이들 결과는 최소 배지에서의 성장 동안의 배증 시간을 비활성이 보다 큰 KARI 효소의 동정을 위한 수단으로 사용할 수 있다는 가정을 지지한다.
Figure 112009070373452-PCT00007
실시예 3
정제된 K12-KARI 및 PF5-KARI의 비활성의 분석
실시예 2에서 조 세포 추출물에서 관찰되는 KARI의 비활성의 증가를 보다 잘 해명하기 위하여, K12-KARI 및 PF5-KARI를 균질해질 때까지 정제하여 개개의 단백질의 농도의 정확한 정량화를 허용하고 정제된 KARI 효소의 비활성을 결정하였다.
K12-KARI 및 PF5-KARI의 정제
K12-KARI 및 PF5-KARI 둘 모두를 약한 음이온-교환 스핀 컬럼, 비바퓨어(Vivapure) IEX D, 미니H(miniH) (비바사이언스 아게(Vivascience AG), 독일 하노베르 소재)를 사용하여 정제하고, 이어서 100 KDa 분자량 컷오프(cutoff)를 갖는 마이크로콘(Microcon) 장치 (YM100, 밀리포어(Millpore), 미국 매사추세츠주 베드포드 소재)에서 농축시켰다. 정제 절차를 실온(22.5℃)에서 수행하였다.
음이온-교환 스핀 컬럼에서 사용한 원액은 100 mM 포타슘-HEPES - pH 7.0, 1.0 M MgCl2, 250 mM EDTA, 10% Brij35 및 2 M KCl이었다. 5.0 uL MgCl2원액, 20 uL EDTA 원액 및 10 uL의 10% Brij35를 첨가한 15 mL의 물에 5.0 mL의 100 mM HEPES 원액을 첨가함으로써 세척 완충액 (완충액 A)을 제조하였다. 50 ul MgCl2원액, 20 uL EDTA 원액 및 10 uL의 10% Brij35를 첨가한 13 mL의 물에 5.0 ml의 100 mM HEPES, 2.0 mL의 KCl 원액을 첨가함으로써 용출 완충액 #1 (완충액 B)을 제조하였다. 50 uL MgCl2 원액, 20 uL EDTA 원액 및 10 uL의 10% Brij35를 첨가한 10 mL의 물에 5 mL의 100 mM HEPES 원액, 5.0 mL의 KCl 원액을 첨가함으로써 용출 완충액 #2 (완충액 C)를 제조하였다. 완충액 B 중 최종 KCl 농도는 약 200 mM이고 완충액 C에서는 약 500 mM이다.
균주 BW25113( ΔilvC )-K12-ilvC 및 BW25113( ΔilvC) -PF5-ilvC의 무세포 추출물을 실시예 1에 설명된 바와 같이 버그버스터를 사용하여 준비하였다. 비바퓨어 IEX D 컬럼 내로의 로딩을 위한 희석 세포 추출물을 제조하기 위하여, 600 uL의 이중으로 탈이온화된 물을 200 uL의 추출물에 첨가하였다.
비바퓨어 IEX D 컬럼을 먼저 완충액 A 400 uL를 이용하여 2000 xg에서 5분 동안 원심분리 (에펜도르프 미세-원심분리기 모델 5415D)함으로써 세척하였다. 동일한 장비 및 과정을 전체 비바퓨어 IEX D 정제 절차에서 사용하였다. 희석 세포 추출물 (상기에 설명됨)을 컬럼 상에 로딩하고, 각각 400 uL의 두 배치로 원심분리하였다. 이어서 컬럼을 400 uL의 완충액 A로 2회 세척하였다. PF5-KARI 샘플에 있어서, 400 uL의 완충액 B를 로딩하여 효소를 컬럼으로부터 수집 튜브 내로 용출시켰다. -K12-KARI 샘플에 있어서, 400 uL의 완충액 C를 대신 사용하였다.
마이크로콘 YM100 장치를 먼저 400 uL의 탈이온수를 이용하여 13800 xg에서 5분 동안 원심분리 (에펜도르프 미세-원심분리기 모델 5415D)함으로써 세척하였다. 이어서, 비바퓨어 IEX D 정제에 의해 수집된 샘플을 로딩하고, 13800 xg에서 4분 동안 원심분리하였다. 관통 유동물(flow- though)을 버리고, 400 uL의 완충액 B를 샘플 챔버에 첨가하고, 13800 xg에서 4분 동안 원심분리하였다. 200 uL 의 완충액 B를 샘플 챔버에 첨가하기 전에 세척 절차를 2회 반복하였다. 샘플 챔버를 청결한 수집 튜브에 뒤집어 놓고, 5000 xg에서 2분 동안 원심분리하여 정제된 샘플을 수집하였다.
각각의 정제된 KARI 샘플의 순도를 모세관-전기영동 (애질런트 2100 바이오애널라이저(Agilent 2100 Bioanalyzer), 애질런트 테크놀로지, 미국 캘리포니아주 산타 클라라 소재)에 의해 확인하였다. 샘플을 제조업자의 지시에 따라 프로틴 230(Protein 230) 시약 키트를 사용하여 준비하여 프로틴 랩칩(Protein Labchip) (상기 시약 키트와 함께 공급됨)에 적용하고, 바이오애널라이저로 분석하였다. 배경이 적은 단일 피크가 각각의 정제된 샘플의 전기 기록도에서 관찰되었다.
정제된 KARI 샘플의 단백질 정량화
280 ㎚에서의 정제된 KARI 샘플의 UV 흡광도 측정을 분광 광도계 (애질런트 테크놀로지, 미국 캘리포니아주 산타 클라라 소재) 및 1 ㎝ 경로 길이의 일회용 플라스틱 큐벳 (유베트, 에펜도르프, 독일 함부르크 소재)을 사용하여 실시하여 정제된 샘플 중 KARI의 양을 정량화하였다. PF5-KARI (1 ㎎/mL에 대하여 0.73), 및 K12-KARI (1 ㎎/mL에 대하여 0.98)의 280 ㎚에서의 흡광 계수를 ExPASy 웹 사이트에서 입수가능한 프로그램인 프롯파람(Protparam)에 의해 예측하였다 (문헌[Pace, C.N., et al., Protein Sci. 11, 2411-2423, 1995]). 정제된 샘플을 UV 흡광도 측정을 위하여 완충액 B 중에 20% (v/v)로 희석시켰다. 희석된 PF5-KARI 샘플의 A280은 0.41이었으며, 희석된 K12-KARI의 경우에는0.36이었다.
정제된 KARI의 활성 분석
이 실시예에서 사용한 분석 조건은, 세포 추출물 대신 5 uL의 20% (v/v)의 정제된 샘플을 사용한 것을 제외하고는 실시예 2에서와 동일하였다. 정제된 샘플의 단백질 농도 및 그의 비활성이 표 7에 예시되어 있다. 가장 빠르게 성장하는 것을 시험했을 때 정제된 PF5-KARI의 비활성은 K12-KARI의 비활성의 2배였다. 이들 결과는 실시예 2에서 이들 두 효소의 조 제제를 사용하여 얻은 데이터와 일치하였으며, 따라서 이는 이. 콜라이 효소와 비교하여 비활성이 보다 큰 KARI 효소를 동정하기 위한 수단으로서 최소 배지에서의 성장 동안의 배증 시간을 사용할 수 있다는 가설을 추가로 지지하는 것이다.
Figure 112009070373452-PCT00008
SEQUENCE LISTING <110> E.I. du Pont de Nemours and Co. <120> Fermentative production of isobutanol using highly active ketol-acid reductoisomerase enzymes <130> CL3761 <160> 40 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 1680 <212> DNA <213> K. pneumoniae <400> 1 atggacaaac agtatccggt acgccagtgg gcgcacggcg ccgatctcgt cgtcagtcag 60 ctggaagctc agggagtacg ccaggtgttc ggcatccccg gcgccaaaat cgacaaggtc 120 tttgattcac tgctggattc ctccattcgc attattccgg tacgccacga agccaacgcc 180 gcatttatgg ccgccgccgt cggacgcatt accggcaaag cgggcgtggc gctggtcacc 240 tccggtccgg gctgttccaa cctgatcacc ggcatggcca ccgcgaacag cgaaggcgac 300 ccggtggtgg ccctgggcgg cgcggtaaaa cgcgccgata aagcgaagca ggtccaccag 360 agtatggata cggtggcgat gttcagcccg gtcaccaaat acgccatcga ggtgacggcg 420 ccggatgcgc tggcggaagt ggtctccaac gccttccgcg ccgccgagca gggccggccg 480 ggcagcgcgt tcgttagcct gccgcaggat gtggtcgatg gcccggtcag cggcaaagtg 540 ctgccggcca gcggggcccc gcagatgggc gccgcgccgg atgatgccat cgaccaggtg 600 gcgaagctta tcgcccaggc gaagaacccg atcttcctgc tcggcctgat ggccagccag 660 ccggaaaaca gcaaggcgct gcgccgtttg ctggagacca gccatattcc agtcaccagc 720 acctatcagg ccgccggagc ggtgaatcag gataacttct ctcgcttcgc cggccgggtt 780 gggctgttta acaaccaggc cggggaccgt ctgctgcagc tcgccgacct ggtgatctgc 840 atcggctaca gcccggtgga atacgaaccg gcgatgtgga acagcggcaa cgcgacgctg 900 gtgcacatcg acgtgctgcc cgcctatgaa gagcgcaact acaccccgga tgtcgagctg 960 gtgggcgata tcgccggcac tctcaacaag ctggcgcaaa atatcgatca tcggctggtg 1020 ctctccccgc aggcggcgga gatcctccgc gaccgccagc accagcgcga gctgctggac 1080 cgccgcggcg cgcagctcaa ccagtttgcc ctgcatcccc tgcgcatcgt tcgcgccatg 1140 caggatatcg tcaacagcga cgtcacgttg accgtggaca tgggcagctt ccatatctgg 1200 attgcccgct acctgtacac gttccgcgcc cgtcaggtga tgatctccaa cggccagcag 1260 accatgggcg tcgccctgcc ctgggctatc ggcgcctggc tggtcaatcc tgagcgcaaa 1320 gtggtctccg tctccggcga cggcggcttc ctgcagtcga gcatggagct ggagaccgcc 1380 gtccgcctga aagccaacgt gctgcatctt atctgggtcg ataacggcta caacatggtc 1440 gctatccagg aagagaaaaa atatcagcgc ctgtccggcg tcgagtttgg gccgatggat 1500 tttaaagcct atgccgaatc cttcggcgcg aaagggtttg ccgtggaaag cgccgaggcg 1560 ctggagccga ccctgcgcgc ggcgatggac gtcgacggcc cggcggtagt ggccatcccg 1620 gtggattatc gcgataaccc gctgctgatg ggccagctgc atctgagtca gattctgtaa 1680 <210> 2 <211> 559 <212> PRT <213> K. pneumoniae <400> 2 Met Asp Lys Gln Tyr Pro Val Arg Gln Trp Ala His Gly Ala Asp Leu 1 5 10 15 Val Val Ser Gln Leu Glu Ala Gln Gly Val Arg Gln Val Phe Gly Ile 20 25 30 Pro Gly Ala Lys Ile Asp Lys Val Phe Asp Ser Leu Leu Asp Ser Ser 35 40 45 Ile Arg Ile Ile Pro Val Arg His Glu Ala Asn Ala Ala Phe Met Ala 50 55 60 Ala Ala Val Gly Arg Ile Thr Gly Lys Ala Gly Val Ala Leu Val Thr 65 70 75 80 Ser Gly Pro Gly Cys Ser Asn Leu Ile Thr Gly Met Ala Thr Ala Asn 85 90 95 Ser Glu Gly Asp Pro Val Val Ala Leu Gly Gly Ala Val Lys Arg Ala 100 105 110 Asp Lys Ala Lys Gln Val His Gln Ser Met Asp Thr Val Ala Met Phe 115 120 125 Ser Pro Val Thr Lys Tyr Ala Ile Glu Val Thr Ala Pro Asp Ala Leu 130 135 140 Ala Glu Val Val Ser Asn Ala Phe Arg Ala Ala Glu Gln Gly Arg Pro 145 150 155 160 Gly Ser Ala Phe Val Ser Leu Pro Gln Asp Val Val Asp Gly Pro Val 165 170 175 Ser Gly Lys Val Leu Pro Ala Ser Gly Ala Pro Gln Met Gly Ala Ala 180 185 190 Pro Asp Asp Ala Ile Asp Gln Val Ala Lys Leu Ile Ala Gln Ala Lys 195 200 205 Asn Pro Ile Phe Leu Leu Gly Leu Met Ala Ser Gln Pro Glu Asn Ser 210 215 220 Lys Ala Leu Arg Arg Leu Leu Glu Thr Ser His Ile Pro Val Thr Ser 225 230 235 240 Thr Tyr Gln Ala Ala Gly Ala Val Asn Gln Asp Asn Phe Ser Arg Phe 245 250 255 Ala Gly Arg Val Gly Leu Phe Asn Asn Gln Ala Gly Asp Arg Leu Leu 260 265 270 Gln Leu Ala Asp Leu Val Ile Cys Ile Gly Tyr Ser Pro Val Glu Tyr 275 280 285 Glu Pro Ala Met Trp Asn Ser Gly Asn Ala Thr Leu Val His Ile Asp 290 295 300 Val Leu Pro Ala Tyr Glu Glu Arg Asn Tyr Thr Pro Asp Val Glu Leu 305 310 315 320 Val Gly Asp Ile Ala Gly Thr Leu Asn Lys Leu Ala Gln Asn Ile Asp 325 330 335 His Arg Leu Val Leu Ser Pro Gln Ala Ala Glu Ile Leu Arg Asp Arg 340 345 350 Gln His Gln Arg Glu Leu Leu Asp Arg Arg Gly Ala Gln Leu Asn Gln 355 360 365 Phe Ala Leu His Pro Leu Arg Ile Val Arg Ala Met Gln Asp Ile Val 370 375 380 Asn Ser Asp Val Thr Leu Thr Val Asp Met Gly Ser Phe His Ile Trp 385 390 395 400 Ile Ala Arg Tyr Leu Tyr Thr Phe Arg Ala Arg Gln Val Met Ile Ser 405 410 415 Asn Gly Gln Gln Thr Met Gly Val Ala Leu Pro Trp Ala Ile Gly Ala 420 425 430 Trp Leu Val Asn Pro Glu Arg Lys Val Val Ser Val Ser Gly Asp Gly 435 440 445 Gly Phe Leu Gln Ser Ser Met Glu Leu Glu Thr Ala Val Arg Leu Lys 450 455 460 Ala Asn Val Leu His Leu Ile Trp Val Asp Asn Gly Tyr Asn Met Val 465 470 475 480 Ala Ile Gln Glu Glu Lys Lys Tyr Gln Arg Leu Ser Gly Val Glu Phe 485 490 495 Gly Pro Met Asp Phe Lys Ala Tyr Ala Glu Ser Phe Gly Ala Lys Gly 500 505 510 Phe Ala Val Glu Ser Ala Glu Ala Leu Glu Pro Thr Leu Arg Ala Ala 515 520 525 Met Asp Val Asp Gly Pro Ala Val Val Ala Ile Pro Val Asp Tyr Arg 530 535 540 Asp Asn Pro Leu Leu Met Gly Gln Leu His Leu Ser Gln Ile Leu 545 550 555 <210> 3 <211> 1476 <212> DNA <213> E. coli <400> 3 atggctaact acttcaatac actgaatctg cgccagcagc tggcacagct gggcaaatgt 60 cgctttatgg gccgcgatga attcgccgat ggcgcgagct accttcaggg taaaaaagta 120 gtcatcgtcg gctgtggcgc acagggtctg aaccagggcc tgaacatgcg tgattctggt 180 ctcgatatct cctacgctct gcgtaaagaa gcgattgccg agaagcgcgc gtcctggcgt 240 aaagcgaccg aaaatggttt taaagtgggt acttacgaag aactgatccc acaggcggat 300 ctggtgatta acctgacgcc ggacaagcag cactctgatg tagtgcgcac cgtacagcca 360 ctgatgaaag acggcgcggc gctgggctac tcgcacggtt tcaacatcgt cgaagtgggc 420 gagcagatcc gtaaagatat caccgtagtg atggttgcgc cgaaatgccc aggcaccgaa 480 gtgcgtgaag agtacaaacg tgggttcggc gtaccgacgc tgattgccgt tcacccggaa 540 aacgatccga aaggcgaagg catggcgatt gccaaagcct gggcggctgc aaccggtggt 600 caccgtgcgg gtgtgctgga atcgtccttc gttgcggaag tgaaatctga cctgatgggc 660 gagcaaacca tcctgtgcgg tatgttgcag gctggctctc tgctgtgctt cgacaagctg 720 gtggaagaag gtaccgatcc agcatacgca gaaaaactga ttcagttcgg ttgggaaacc 780 atcaccgaag cactgaaaca gggcggcatc accctgatga tggaccgtct ctctaacccg 840 gcgaaactgc gtgcttatgc gctttctgaa cagctgaaag agatcatggc acccctgttc 900 cagaaacata tggacgacat catctccggc gaattctctt ccggtatgat ggcggactgg 960 gccaacgatg ataagaaact gctgacctgg cgtgaagaga ccggcaaaac cgcgtttgaa 1020 accgcgccgc agtatgaagg caaaatcggc gagcaggagt acttcgataa aggcgtactg 1080 atgattgcga tggtgaaagc gggcgttgaa ctggcgttcg aaaccatggt cgattccggc 1140 atcattgaag agtctgcata ttatgaatca ctgcacgagc tgccgctgat tgccaacacc 1200 atcgcccgta agcgtctgta cgaaatgaac gtggttatct ctgataccgc tgagtacggt 1260 aactatctgt tctcttacgc ttgtgtgccg ttgctgaaac cgtttatggc agagctgcaa 1320 ccgggcgacc tgggtaaagc tattccggaa ggcgcggtag ataacgggca actgcgtgat 1380 gtgaacgaag cgattcgcag ccatgcgatt gagcaggtag gtaagaaact gcgcggctat 1440 atgacagata tgaaacgtat tgctgttgcg ggttaa 1476 <210> 4 <211> 491 <212> PRT <213> E. coli <400> 4 Met Ala Asn Tyr Phe Asn Thr Leu Asn Leu Arg Gln Gln Leu Ala Gln 1 5 10 15 Leu Gly Lys Cys Arg Phe Met Gly Arg Asp Glu Phe Ala Asp Gly Ala 20 25 30 Ser Tyr Leu Gln Gly Lys Lys Val Val Ile Val Gly Cys Gly Ala Gln 35 40 45 Gly Leu Asn Gln Gly Leu Asn Met Arg Asp Ser Gly Leu Asp Ile Ser 50 55 60 Tyr Ala Leu Arg Lys Glu Ala Ile Ala Glu Lys Arg Ala Ser Trp Arg 65 70 75 80 Lys Ala Thr Glu Asn Gly Phe Lys Val Gly Thr Tyr Glu Glu Leu Ile 85 90 95 Pro Gln Ala Asp Leu Val Ile Asn Leu Thr Pro Asp Lys Gln His Ser 100 105 110 Asp Val Val Arg Thr Val Gln Pro Leu Met Lys Asp Gly Ala Ala Leu 115 120 125 Gly Tyr Ser His Gly Phe Asn Ile Val Glu Val Gly Glu Gln Ile Arg 130 135 140 Lys Asp Ile Thr Val Val Met Val Ala Pro Lys Cys Pro Gly Thr Glu 145 150 155 160 Val Arg Glu Glu Tyr Lys Arg Gly Phe Gly Val Pro Thr Leu Ile Ala 165 170 175 Val His Pro Glu Asn Asp Pro Lys Gly Glu Gly Met Ala Ile Ala Lys 180 185 190 Ala Trp Ala Ala Ala Thr Gly Gly His Arg Ala Gly Val Leu Glu Ser 195 200 205 Ser Phe Val Ala Glu Val Lys Ser Asp Leu Met Gly Glu Gln Thr Ile 210 215 220 Leu Cys Gly Met Leu Gln Ala Gly Ser Leu Leu Cys Phe Asp Lys Leu 225 230 235 240 Val Glu Glu Gly Thr Asp Pro Ala Tyr Ala Glu Lys Leu Ile Gln Phe 245 250 255 Gly Trp Glu Thr Ile Thr Glu Ala Leu Lys Gln Gly Gly Ile Thr Leu 260 265 270 Met Met Asp Arg Leu Ser Asn Pro Ala Lys Leu Arg Ala Tyr Ala Leu 275 280 285 Ser Glu Gln Leu Lys Glu Ile Met Ala Pro Leu Phe Gln Lys His Met 290 295 300 Asp Asp Ile Ile Ser Gly Glu Phe Ser Ser Gly Met Met Ala Asp Trp 305 310 315 320 Ala Asn Asp Asp Lys Lys Leu Leu Thr Trp Arg Glu Glu Thr Gly Lys 325 330 335 Thr Ala Phe Glu Thr Ala Pro Gln Tyr Glu Gly Lys Ile Gly Glu Gln 340 345 350 Glu Tyr Phe Asp Lys Gly Val Leu Met Ile Ala Met Val Lys Ala Gly 355 360 365 Val Glu Leu Ala Phe Glu Thr Met Val Asp Ser Gly Ile Ile Glu Glu 370 375 380 Ser Ala Tyr Tyr Glu Ser Leu His Glu Leu Pro Leu Ile Ala Asn Thr 385 390 395 400 Ile Ala Arg Lys Arg Leu Tyr Glu Met Asn Val Val Ile Ser Asp Thr 405 410 415 Ala Glu Tyr Gly Asn Tyr Leu Phe Ser Tyr Ala Cys Val Pro Leu Leu 420 425 430 Lys Pro Phe Met Ala Glu Leu Gln Pro Gly Asp Leu Gly Lys Ala Ile 435 440 445 Pro Glu Gly Ala Val Asp Asn Gly Gln Leu Arg Asp Val Asn Glu Ala 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ctgttcctta atgctggtaa acgcattgtt 720 gaattgacca aacgttatta cgagcaaaac gacgaaagtg cactgccgcg taatatcgcc 780 agtaaggcgg cgtttgaaaa cgccatgacg ctggatatcg cgatgggtgg atcgactaac 840 accgtacttc acctgctggc ggcggcgcag gaagcggaaa tcgacttcac catgagtgat 900 atcgataagc tttcccgcaa ggttccacag ctgtgtaaag ttgcgccgag cacccagaaa 960 taccatatgg aagatgttca ccgtgctggt ggtgttatcg gtattctcgg cgaactggat 1020 cgcgcggggt tactgaaccg tgatgtgaaa aacgtacttg gcctgacgtt gccgcaaacg 1080 ctggaacaat acgacgttat gctgacccag gatgacgcgg taaaaaatat gttccgcgca 1140 ggtcctgcag gcattcgtac cacacaggca ttctcgcaag attgccgttg ggatacgctg 1200 gacgacgatc gcgccaatgg ctgtatccgc tcgctggaac acgcctacag caaagacggc 1260 ggcctggcgg tgctctacgg taactttgcg gaaaacggct gcatcgtgaa aacggcaggc 1320 gtcgatgaca gcatcctcaa attcaccggc ccggcgaaag tgtacgaaag ccaggacgat 1380 gcggtagaag cgattctcgg cggtaaagtt gtcgccggag atgtggtagt aattcgctat 1440 gaaggcccga aaggcggtcc ggggatgcag gaaatgctct acccaaccag cttcctgaaa 1500 tcaatgggtc tcggcaaagc ctgtgcgctg atcaccgacg 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tgaaaaaatc aatccgattt gctttatcat caataacgac 1380 ggctacaccg tcgaacgcga aattcatgga ccgaatcaaa gttacaatga catcccgatg 1440 tggaactata gcaaactgcc ggaatccttt ggcgcgacag aggatcgcgt ggtgagtaaa 1500 attgtgcgta cggaaaacga atttgtgtcg gttatgaaag aagcgcaggc tgacccgaat 1560 cgcatgtatt ggattgaact gatcctggca aaagaaggcg caccgaaagt tctgaaaaag 1620 atggggaaac tgtttgcgga gcaaaataaa agctaaggat cc 1662 <210> 8 <211> 548 <212> PRT <213> Lactococcus lactis <400> 8 Met Tyr Thr Val Gly Asp Tyr Leu Leu Asp Arg Leu His Glu Leu Gly 1 5 10 15 Ile Glu Glu Ile Phe Gly Val Pro Gly Asp Tyr Asn Leu Gln Phe Leu 20 25 30 Asp Gln Ile Ile Ser His Lys Asp Met Lys Trp Val Gly Asn Ala Asn 35 40 45 Glu Leu Asn Ala Ser Tyr Met Ala Asp Gly Tyr Ala Arg Thr Lys Lys 50 55 60 Ala Ala Ala Phe Leu Thr Thr Phe Gly Val Gly Glu Leu Ser Ala Val 65 70 75 80 Asn Gly Leu Ala Gly Ser Tyr Ala Glu Asn Leu Pro Val Val Glu Ile 85 90 95 Val Gly Ser Pro Thr Ser Lys Val Gln Asn Glu Gly Lys Phe Val His 100 105 110 His Thr Leu Ala Asp Gly Asp Phe Lys 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cgctggcgta 780 ccgcaggact gggcaacgca tatgctgggc cacgaactga ctgcgatgca cggtctggat 840 cacgcgcaaa cactggctat cgtcctgcct gcactgtgga atgaaaaacg cgataccaag 900 cgcgctaagc tgctgcaata tgctgaacgc gtctggaaca tcactgaagg ttccgatgat 960 gagcgtattg acgccgcgat tgccgcaacc cgcaatttct ttgagcaatt aggcgtgccg 1020 acccacctct ccgactacgg tctggacggc agctccatcc cggctttgct gaaaaaactg 1080 gaagagcacg gcatgaccca actgggcgaa aatcatgaca ttacgttgga tgtcagccgc 1140 cgtatatacg aagccgcccg ctaa 1164 <210> 10 <211> 387 <212> PRT <213> E. coli <400> 10 Met Asn Asn Phe Asn Leu His Thr Pro Thr Arg Ile Leu Phe Gly Lys 1 5 10 15 Gly Ala Ile Ala Gly Leu Arg Glu Gln Ile Pro His Asp Ala Arg Val 20 25 30 Leu Ile Thr Tyr Gly Gly Gly Ser Val Lys Lys Thr Gly Val Leu Asp 35 40 45 Gln Val Leu Asp Ala Leu Lys Gly Met Asp Val Leu Glu Phe Gly Gly 50 55 60 Ile Glu Pro Asn Pro Ala Tyr Glu Thr Leu Met Asn Ala Val Lys Leu 65 70 75 80 Val Arg Glu Gln Lys Val Thr Phe Leu Leu Ala Val Gly Gly Gly Ser 85 90 95 Val Leu Asp Gly Thr Lys Phe Ile Ala 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acactgaatc tgcg 44 <210> 16 <211> 46 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> primer <400> 16 ggccgcaagc ttttaacccg caacagcaat acgtttcata tctgtc 46 <210> 17 <211> 20 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> primer <400> 17 ccgtaaagat atcaccgtag 20 <210> 18 <211> 20 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> primer <400> 18 cagtatgaag gcaaaatcgg 20 <210> 19 <211> 20 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> primer <400> 19 cgtactcagc ggtatcagag 20 <210> 20 <211> 20 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> primer <400> 20 cagatttcac ttccgcaacg 20 <210> 21 <211> 29 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> primer <400> 21 cgcaactctc tactgtttct ccatacccg 29 <210> 22 <211> 25 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> primer <400> 22 accgcttctg cgttctgatt taatc 25 <210> 23 <211> 44 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> primer <400> 23 caaaacagcc aagcttttag ttcttgctct tgtcgacgat cttg 44 <210> 24 <211> 43 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> primer <400> 24 caggaggaag agctcatgcg cgttttctac gataaagact gtg 43 <210> 25 <211> 44 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> primer <400> 25 caaaacagcc aagcttttag ttcttggctt tgtcgacgat tttg 44 <210> 26 <211> 45 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> primer <400> 26 caggaggaag agctcatgaa agttttctac gataaagact gcgac 45 <210> 27 <211> 20 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> primer <400> 27 gatcatgatc gcgccgaagg 20 <210> 28 <211> 20 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> primer <400> 28 ctgctcaccg aacaggtcgg 20 <210> 29 <211> 1476 <212> DNA <213> genomic sequence <400> 29 atggctaact acttcaatac actgaatctg cgccagcagc tggcacagct gggcaaatgt 60 cgctttatgg gccgcgatga attcgccgat ggcgcgagct accttcaggg taaaaaagta 120 gtcatcgtcg gctgtggcgc acagggtctg aaccagggcc tgaacatgcg tgattctggt 180 ctcgatatct cctacgctct gcgtaaagaa gcgattgccg agaagcgcgc gtcctggcgt 240 aaagcgaccg aaaatggttt taaagtgggt acttacgaag aactgatccc acaggcggat 300 ctggtgatta acctgacgcc ggacaagcag cactctgatg tagtgcgcac cgtacagcca 360 ctgatgaaag acggcgcggc gctgggctac tcgcacggtt tcaacatcgt cgaagtgggc 420 gagcagatcc gtaaagatat caccgtagtg atggttgcgc cgaaatgccc aggcaccgaa 480 gtgcgtgaag agtacaaacg tgggttcggc gtaccgacgc tgattgccgt tcacccggaa 540 aacgatccga aaggcgaagg catggcgatt gccaaagcct gggcggctgc aaccggtggt 600 caccgtgcgg gtgtgctgga atcgtccttc gttgcggaag tgaaatctga cctgatgggc 660 gagcaaacca tcctgtgcgg tatgttgcag gctggctctc tgctgtgctt cgacaagctg 720 gtggaagaag gtaccgatcc agcatacgca gaaaaactga ttcagttcgg ttgggaaacc 780 atcaccgaag cactgaaaca gggcggcatc accctgatga tggaccgtct ctctaacccg 840 gcgaaactgc gtgcttatgc gctttctgaa cagctgaaag agatcatggc acccctgttc 900 cagaaacata tggacgacat catctccggc gaattctctt ccggtatgat ggcggactgg 960 gccaacgatg ataagaaact gctgacctgg cgtgaagaga ccggcaaaac cgcgtttgaa 1020 accgcgccgc agtatgaagg caaaatcggc gagcaggagt acttcgataa aggcgtactg 1080 atgattgcga tggtgaaagc gggcgttgaa ctggcgttcg aaaccatggt cgattccggc 1140 atcattgaag agtctgcata ttatgaatca ctgcacgagc tgccgctgat tgccaacacc 1200 atcgcccgta agcgtctgta cgaaatgaac gtggttatct ctgataccgc tgagtacggt 1260 aactatctgt tctcttacgc ttgtgtgccg ttgctgaaac cgtttatggc agagctgcaa 1320 ccgggcgacc tgggtaaagc tattccggaa ggcgcggtag ataacgggca actgcgtgat 1380 gtgaacgaag cgattcgcag ccatgcgatt gagcaggtag gtaagaaact gcgcggctat 1440 atgacagata tgaaacgtat tgctgttgcg ggttaa 1476 <210> 30 <211> 1485 <212> DNA <213> vibrio <400> 30 atggctaact attttaacac tctgaatctg cgcgaacagc tggatcagct gggtcgttgt 60 cgcttcatgg cgcgcgagga attcgcaact gaagcggact acctgaaggg taagaaagtg 120 gtcatcgtag gctgtggcgc gcagggcctg aaccagggtc tgaatatgcg tgatagcggc 180 ctggacgtgt cttacgcact gcgtcaagcg gccatcgatg aacagcgtca gtctttcaaa 240 aatgctaaga acaacggttt caatgtaggt tcttacgaac agctgattcc gacggcggac 300 ctggttatca atctgacccc ggataaacag cacaccagcg tggttaacgc ggttatgccg 360 ctgatgaaac agggcgctgc tctgggctat agccatggtt ttaacatcgt ggaagagggc 420 atgcagattc gtaaagacat cacggtagta atggtggcgc cgaaatgccc aggtactgag 480 gttcgtgagg aatacaagcg tggttttggc gttcctaccc tgattgcagt gcacccggaa 540 aacgatccgc agggcgaagg ttgggaaatc gctaaggcat gggctgcagc cactggtggc 600 caccgcgctg gttgcctggc ctctagcttc gtcgcagaag taaaaagcga cctgatgggc 660 gaacagacca tcctgtgtgg tatgctgcag gccggtagca tcgtttgcta cgaaaagatg 720 gttgctgatg gtatcgaccc gggctacgcg ggcaaactgc tgcagtttgg ttgggaaact 780 attaccgagg ctctgaaatt cggtggcatc acccacatga tggaccgtct gagcaacccg 840 gcaaagatca aagcattcga actgtctgaa gagctgaaag acctgatgcg tccgctgtac 900 aacaagcaca tggacgacat tatttccggc cacttttctt ctaccatgat ggcggactgg 960 gccaacgacg acaaggatct gttcggctgg cgtgcggaga ccgctgaaac cgcatttgaa 1020 aactatccga ccactgacgt taagatcgcg gagcaggaat actttgacaa cggtatcctg 1080 atgattgcaa tggttcgcgc gggcgttgaa ctggcgtttg aagcgatgac cgcttctggt 1140 atcatcgatg aatctgcata ctatgagtcc ctgcacgagc tgccgctgat cgctaacacg 1200 gtggcccgca aacgtctgta tgaaatgaat gtcgtaatct ctgacacggc tgaatatggt 1260 aattatctgt tcgccaatgt ggcagttcct ctgctgcgtg agaaattcat gccgaaagtg 1320 ggtaccgatg ttattggtaa aggtctgggt gtcgtttcta accaggtaga taacgcgact 1380 ctgatcgaag tgaactccat catccgtaac cacccggtgg aatacattgg tgaagaactg 1440 cgtggttata tgaaggacat gaagcgtatc gccgttggtg attaa 1485 <210> 31 <211> 1014 <212> DNA <213> Pseudomonas <400> 31 atgcgcgttt tctacgataa agactgtgac ctctcgatca tccagggcaa gaaagttgcc 60 atcatcggct acggctccca gggccacgcc catgcctgca acctgaagga ctccggcgtc 120 gacgtcaccg tgggcctgcg tagcggctcc gccaccgtgg ccaaggccga agcgcacggt 180 ctgaaggttg ccgacgtgaa gaccgccgtc gccgcagccg acgtggtcat gatcctcacc 240 ccggacgagt tccagggccg cctgtacaag gaagagatcg agccgaacct gaagaagggc 300 gccaccctgg ccttcgctca cggcttctcc atccactaca accaggtcgt cccgcgcgcc 360 gacctcgacg tgatcatgat cgcgccgaag gcaccgggtc acaccgtgcg ttccgagttc 420 gtcaagggcg gtggcatccc tgacctgatc gccatctacc aggacgcttc cggcaacgcc 480 aagaacgtcg ccctgtccta cgcctgcggc gtcggcggcg gtcgtaccgg tatcatcgaa 540 accaccttca aggacgagac cgaaaccgac ctgttcggtg agcaggccgt tctctgcggt 600 ggttgcgtcg agctggtcaa ggccggtttc gaaaccctgg tcgaagccgg ttacgcgccg 660 gaaatggcct acttcgagtg cctgcacgag ctgaagctga tcgtcgacct gatgtacgaa 720 ggcggcatcg ccaacatgaa ctactccatc tccaacaatg ccgaatacgg tgagtacgta 780 accggtccgg aggtgatcaa cgccgagtcc cgtgctgcca tgcgcaacgc cctgaagcgc 840 atccaggacg gcgagtacgc gaaaatgttc attaccgaag gtgcggccaa ctacccgtcg 900 atgactgcct accgccgcaa caacgccgct cacccgatcg agcagatcgg cgagaagctg 960 cgcgcgatga tgccgtggat cgcagccaac aagatcgtcg acaagagcaa gaac 1014 <210> 32 <211> 1014 <212> DNA <213> Pseudomonas fluorescens <400> 32 atgaaagttt tctacgataa agactgcgac ctgtcgatca tccaaggtaa gaaagttgcc 60 atcatcggct acggttccca gggccacgct caagcatgca acctgaagga ttccggcgta 120 gacgtgactg ttggcctgcg taaaggctcg gctaccgttg ccaaggctga agcccacggc 180 ttgaaagtga ccgacgttgc tgcagccgtt gccggtgccg acttggtcat gatcctgacc 240 ccggacgagt tccagtccca gctgtacaag aacgaaatcg agccgaacat caagaagggc 300 gccactctgg ccttctccca cggcttcgcg atccactaca accaggttgt gcctcgtgcc 360 gacctcgacg tgatcatgat cgcgccgaag gctccaggcc acaccgtacg ttccgagttc 420 gtcaagggcg gtggtattcc tgacctgatc gcgatctacc aggacgcttc cggcaacgcc 480 aagaacgttg ccctgtccta cgccgcaggc gtgggcggcg gccgtaccgg catcatcgaa 540 accaccttca aggacgagac tgaaaccgac ctgttcggtg agcaggctgt tctgtgtggc 600 ggtaccgtcg agctggtcaa agccggtttc gaaaccctgg ttgaagctgg ctacgctcca 660 gaaatggcct acttcgagtg cctgcacgaa ctgaagctga tcgttgacct catgtacgaa 720 ggcggtatcg ccaacatgaa ctactcgatc tccaacaacg ctgaatacgg cgagtacgtg 780 actggtccag aagtcatcaa cgccgaatcc cgtcaggcca tgcgcaatgc tctgaagcgc 840 atccaggacg gcgaatacgc gaagatgttc atcagcgaag gcgctaccgg ctacccatcg 900 atgaccgcca agcgtcgtaa caacgctgct cacggtatcg aaatcatcgg cgagcaactg 960 cgctcgatga tgccttggat cggtgccaac aaaatcgtcg acaaagccaa gaac 1014 <210> 33 <211> 491 <212> PRT <213> E. coli <400> 33 Met Ala Asn Tyr Phe Asn Thr Leu Asn Leu Arg Gln Gln Leu Ala Gln 1 5 10 15 Leu Gly Lys Cys Arg Phe Met Gly Arg Asp Glu Phe Ala Asp Gly Ala 20 25 30 Ser Tyr Leu Gln Gly Lys Lys Val Val Ile Val Gly Cys Gly Ala Gln 35 40 45 Gly Leu Asn Gln Gly Leu Asn Met Arg Asp Ser Gly Leu Asp Ile Ser 50 55 60 Tyr Ala Leu Arg Lys Glu Ala Ile Ala Glu Lys Arg Ala Ser Trp Arg 65 70 75 80 Lys Ala Thr Glu Asn Gly Phe Lys Val Gly Thr Tyr Glu Glu Leu Ile 85 90 95 Pro Gln Ala Asp Leu Val Ile Asn Leu Thr Pro Asp Lys Gln His Ser 100 105 110 Asp Val Val Arg Thr Val Gln Pro Leu Met Lys Asp Gly Ala Ala Leu 115 120 125 Gly Tyr Ser His Gly Phe Asn Ile Val Glu Val Gly Glu Gln Ile Arg 130 135 140 Lys Asp Ile Thr Val Val Met Val Ala Pro Lys Cys Pro Gly Thr Glu 145 150 155 160 Val Arg Glu Glu Tyr Lys Arg Gly Phe Gly Val Pro Thr Leu Ile Ala 165 170 175 Val His Pro Glu Asn Asp Pro Lys Gly Glu Gly Met Ala Ile Ala Lys 180 185 190 Ala Trp Ala Ala Ala Thr Gly Gly His Arg Ala Gly Val Leu Glu Ser 195 200 205 Ser Phe Val Ala Glu Val Lys Ser Asp Leu Met Gly Glu Gln Thr Ile 210 215 220 Leu Cys Gly Met Leu Gln Ala Gly Ser Leu Leu Cys Phe Asp Lys Leu 225 230 235 240 Val Glu Glu Gly Thr Asp Pro Ala Tyr Ala Glu Lys Leu Ile Gln Phe 245 250 255 Gly Trp Glu Thr Ile Thr Glu Ala Leu Lys Gln Gly Gly Ile Thr Leu 260 265 270 Met Met Asp Arg Leu Ser Asn Pro Ala Lys Leu Arg Ala Tyr Ala Leu 275 280 285 Ser Glu Gln Leu Lys Glu Ile Met Ala Pro Leu Phe Gln Lys His Met 290 295 300 Asp Asp Ile Ile Ser Gly Glu Phe Ser Ser Gly Met Met Ala Asp Trp 305 310 315 320 Ala Asn Asp Asp Lys Lys Leu Leu Thr Trp Arg Glu Glu Thr Gly Lys 325 330 335 Thr Ala Phe Glu Thr Ala Pro Gln Tyr Glu Gly Lys Ile Gly Glu Gln 340 345 350 Glu Tyr Phe Asp Lys Gly Val Leu Met Ile Ala Met Val Lys Ala Gly 355 360 365 Val Glu Leu Ala Phe Glu Thr Met Val Asp Ser Gly Ile Ile Glu Glu 370 375 380 Ser Ala Tyr Tyr Glu Ser Leu His Glu Leu Pro Leu Ile Ala Asn Thr 385 390 395 400 Ile Ala Arg Lys Arg Leu Tyr Glu Met Asn Val Val Ile Ser Asp Thr 405 410 415 Ala Glu Tyr Gly Asn Tyr Leu Phe Ser Tyr Ala Cys Val Pro Leu Leu 420 425 430 Lys Pro Phe Met Ala Glu Leu Gln Pro Gly Asp Leu Gly Lys Ala Ile 435 440 445 Pro Glu Gly Ala Val Asp Asn Gly Gln Leu Arg Asp Val Asn Glu Ala 450 455 460 Ile Arg Ser His Ala Ile Glu Gln Val Gly Lys Lys Leu Arg Gly Tyr 465 470 475 480 Met Thr Asp Met Lys Arg Ile Ala Val Ala Gly 485 490 <210> 34 <211> 494 <212> PRT <213> Vibrion <400> 34 Met Ala Asn Tyr Phe Asn Thr Leu Asn Leu Arg Glu Gln Leu Asp Gln 1 5 10 15 Leu Gly Arg Cys Arg Phe Met Ala Arg Glu Glu Phe Ala Thr Glu Ala 20 25 30 Asp Tyr Leu Lys Gly Lys Lys Val Val Ile Val Gly Cys Gly Ala Gln 35 40 45 Gly Leu Asn Gln Gly Leu Asn Met Arg Asp Ser Gly Leu Asp Val Ser 50 55 60 Tyr Ala Leu Arg Gln Ala Ala Ile Asp Glu Gln Arg Gln Ser Phe Lys 65 70 75 80 Asn Ala Lys Asn Asn Gly Phe Asn Val Gly Ser Tyr Glu Gln Leu Ile 85 90 95 Pro Thr Ala Asp Leu Val Ile Asn Leu Thr Pro Asp Lys Gln His Thr 100 105 110 Ser Val Val Asn Ala Val Met Pro Leu Met Lys Gln Gly Ala Ala Leu 115 120 125 Gly Tyr Ser His Gly Phe Asn Ile Val Glu Glu Gly Met Gln Ile Arg 130 135 140 Lys Asp Ile Thr Val Val Met Val Ala Pro Lys Cys Pro Gly Thr Glu 145 150 155 160 Val Arg Glu Glu Tyr Lys Arg Gly Phe Gly Val Pro Thr Leu Ile Ala 165 170 175 Val His Pro Glu Asn Asp Pro Gln Gly Glu Gly Trp Glu Ile Ala Lys 180 185 190 Ala Trp Ala Ala Ala Thr Gly Gly His Arg Ala Gly Cys Leu Ala Ser 195 200 205 Ser Phe Val Ala Glu Val Lys Ser Asp Leu Met Gly Glu Gln Thr Ile 210 215 220 Leu Cys Gly Met Leu Gln Ala Gly Ser Ile Val Cys Tyr Glu Lys Met 225 230 235 240 Val Ala Asp Gly Ile Asp Pro Gly Tyr Ala Gly Lys Leu Leu Gln Phe 245 250 255 Gly Trp Glu Thr Ile Thr Glu Ala Leu Lys Phe Gly Gly Ile Thr His 260 265 270 Met Met Asp Arg Leu Ser Asn Pro Ala Lys Ile Lys Ala Phe Glu Leu 275 280 285 Ser Glu Glu Leu Lys Asp Leu Met Arg Pro Leu Tyr Asn Lys His Met 290 295 300 Asp Asp Ile Ile Ser Gly His Phe Ser Ser Thr Met Met Ala Asp Trp 305 310 315 320 Ala Asn Asp Asp Lys Asp Leu Phe Gly Trp Arg Ala Glu Thr Ala Glu 325 330 335 Thr Ala Phe Glu Asn Tyr Pro Thr Thr Asp Val Lys Ile Ala Glu Gln 340 345 350 Glu Tyr Phe Asp Asn Gly Ile Leu Met Ile Ala Met Val Arg Ala Gly 355 360 365 Val Glu Leu Ala Phe Glu Ala Met Thr Ala Ser Gly Ile Ile Asp Glu 370 375 380 Ser Ala Tyr Tyr Glu Ser Leu His Glu Leu Pro Leu Ile Ala Asn Thr 385 390 395 400 Val Ala Arg Lys Arg Leu Tyr Glu Met Asn Val Val Ile Ser Asp Thr 405 410 415 Ala Glu Tyr Gly Asn Tyr Leu Phe Ala Asn Val Ala Val Pro Leu Leu 420 425 430 Arg Glu Lys Phe Met Pro Lys Val Gly Thr Asp Val Ile Gly Lys Gly 435 440 445 Leu Gly Val Val Ser Asn Gln Val Asp Asn Ala Thr Leu Ile Glu Val 450 455 460 Asn Ser Ile Ile Arg Asn His Pro Val Glu Tyr Ile Gly Glu Glu Leu 465 470 475 480 Arg Gly Tyr Met Lys Asp Met Lys Arg Ile Ala Val Gly Asp 485 490 <210> 35 <211> 338 <212> PRT <213> Pseudomonas <400> 35 Met Arg Val Phe Tyr Asp Lys Asp Cys Asp Leu Ser Ile Ile Gln Gly 1 5 10 15 Lys Lys Val Ala Ile Ile Gly Tyr Gly Ser Gln Gly His Ala His Ala 20 25 30 Cys Asn Leu Lys Asp Ser Gly Val Asp Val Thr Val Gly Leu Arg Ser 35 40 45 Gly Ser Ala Thr Val Ala Lys Ala Glu Ala His Gly Leu Lys Val Ala 50 55 60 Asp Val Lys Thr Ala Val Ala Ala Ala Asp Val Val Met Ile Leu Thr 65 70 75 80 Pro Asp Glu Phe Gln Gly Arg Leu Tyr Lys Glu Glu Ile Glu Pro Asn 85 90 95 Leu Lys Lys Gly Ala Thr Leu Ala Phe Ala His Gly Phe Ser Ile His 100 105 110 Tyr Asn Gln Val Val Pro Arg Ala Asp Leu Asp Val Ile Met Ile Ala 115 120 125 Pro Lys Ala Pro Gly His Thr Val Arg Ser Glu Phe Val Lys Gly Gly 130 135 140 Gly Ile Pro Asp Leu Ile Ala Ile Tyr Gln Asp Ala Ser Gly Asn Ala 145 150 155 160 Lys Asn Val Ala Leu Ser Tyr Ala Cys Gly Val Gly Gly Gly Arg Thr 165 170 175 Gly Ile Ile Glu Thr Thr Phe Lys Asp Glu Thr Glu Thr Asp Leu Phe 180 185 190 Gly Glu Gln Ala Val Leu Cys Gly Gly Cys Val Glu Leu Val Lys Ala 195 200 205 Gly Phe Glu Thr Leu Val Glu Ala Gly Tyr Ala Pro Glu Met Ala Tyr 210 215 220 Phe Glu Cys Leu His Glu Leu Lys Leu Ile Val Asp Leu Met Tyr Glu 225 230 235 240 Gly Gly Ile Ala Asn Met Asn Tyr Ser Ile Ser Asn Asn Ala Glu Tyr 245 250 255 Gly Glu Tyr Val Thr Gly Pro Glu Val Ile Asn Ala Glu Ser Arg Ala 260 265 270 Ala Met Arg Asn Ala Leu Lys Arg Ile Gln Asp Gly Glu Tyr Ala Lys 275 280 285 Met Phe Ile Thr Glu Gly Ala Ala Asn Tyr Pro Ser Met Thr Ala Tyr 290 295 300 Arg Arg Asn Asn Ala Ala His Pro Ile Glu Gln Ile Gly Glu Lys Leu 305 310 315 320 Arg Ala Met Met Pro Trp Ile Ala Ala Asn Lys Ile Val Asp Lys Ser 325 330 335 Lys Asn <210> 36 <211> 338 <212> PRT <213> Pseudomonas <400> 36 Met Lys Val Phe Tyr Asp Lys Asp Cys Asp Leu Ser Ile Ile Gln Gly 1 5 10 15 Lys Lys Val Ala Ile Ile Gly Tyr Gly Ser Gln Gly His Ala Gln Ala 20 25 30 Cys Asn Leu Lys Asp Ser Gly Val Asp Val Thr Val Gly Leu Arg Lys 35 40 45 Gly Ser Ala Thr Val Ala Lys Ala Glu Ala His Gly Leu Lys Val Thr 50 55 60 Asp Val Ala Ala Ala Val Ala Gly Ala Asp Leu Val Met Ile Leu Thr 65 70 75 80 Pro Asp Glu Phe Gln Ser Gln Leu Tyr Lys Asn Glu Ile Glu Pro Asn 85 90 95 Ile Lys Lys Gly Ala Thr Leu Ala Phe Ser His Gly Phe Ala Ile His 100 105 110 Tyr Asn Gln Val Val Pro Arg Ala Asp Leu Asp Val Ile Met Ile Ala 115 120 125 Pro Lys Ala Pro Gly His Thr Val Arg Ser Glu Phe Val Lys Gly Gly 130 135 140 Gly Ile Pro Asp Leu Ile Ala Ile Tyr Gln Asp Ala Ser Gly Asn Ala 145 150 155 160 Lys Asn Val Ala Leu Ser Tyr Ala Ala Gly Val Gly Gly Gly Arg Thr 165 170 175 Gly Ile Ile Glu Thr Thr Phe Lys Asp Glu Thr Glu Thr Asp Leu Phe 180 185 190 Gly Glu Gln Ala Val Leu Cys Gly Gly Thr Val Glu Leu Val Lys Ala 195 200 205 Gly Phe Glu Thr Leu Val Glu Ala Gly Tyr Ala Pro Glu Met Ala Tyr 210 215 220 Phe Glu Cys Leu His Glu Leu Lys Leu Ile Val Asp Leu Met Tyr Glu 225 230 235 240 Gly Gly Ile Ala Asn Met Asn Tyr Ser Ile Ser Asn Asn Ala Glu Tyr 245 250 255 Gly Glu Tyr Val Thr Gly Pro Glu Val Ile Asn Ala Glu Ser Arg Gln 260 265 270 Ala Met Arg Asn Ala Leu Lys Arg Ile Gln Asp Gly Glu Tyr Ala Lys 275 280 285 Met Phe Ile Ser Glu Gly Ala Thr Gly Tyr Pro Ser Met Thr Ala Lys 290 295 300 Arg Arg Asn Asn Ala Ala His Gly Ile Glu Ile Ile Gly Glu Gln Leu 305 310 315 320 Arg Ser Met Met Pro Trp Ile Gly Ala Asn Lys Ile Val Asp Lys Ala 325 330 335 Lys Asn <210> 37 <211> 63 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> forward primer PAL-F1 <400> 37 ctgcagcaca tgaagactcc atggcaccct cgctcgactc gatctcgcac tcgttcgcaa 60 acg 63 <210> 38 <211> 40 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> reverse primer PAL-R1 <400> 38 tctctcatcc gccaaaacag aagcttctaa gcgagcatct 40 <210> 39 <211> 43 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> primer PAL-EcoRI-F1 <400> 39 gggctaacag gaggaagaat tcatggcacc ctcgctcgac tcg 43 <210> 40 <211> 42 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> reverse primer PAL-EcoRI-R1 <400> 40 cgagtcgagc gagggtgcca tgaattcttc ctcctgtagc cc 42

Claims (19)

  1. a) 케톨-산 리덕토아이소머라아제의 비활성이 이. 콜라이(E. coli) 케톨-산 리덕토아이소머라아제의 비활성보다 큰 폴리펩티드를 코딩하는 유전자 제작물을 포함하는 미생물 숙주 세포를 제공하는 단계; 및
    b) (a)의 숙주 세포를 아세토락테이트와 접촉시키는 단계 - 여기서, 2,3-다이하이드록시-아이소발레레이트가 생성됨 - 를 포함하는, 아세토락테이트를 다이하이드록시-아이소발레레이트로 전환시키는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 유전자 제작물은 하기 조건:
    a) 약 7.5의 pH;
    b) 약 22.5℃의 온도; 및
    c) 약 10 mM 초과의 칼륨 하에서 실행되는 NADPH 소비 분석(consumption assay)에 의해 측정할 때 정제된 단백질을 기준으로 케톨-산 리덕토아이소머라아제의 비활성이 1.1 μmole/분/㎎보다 큰 폴리펩티드를 코딩하는 방법.
  3. a) 하기 유전자 제작물:
    1) 피루베이트를 아세토락테이트로 전환시키는(경로 단계 a) 아세토락테이트 신타아제 효소를 코딩하는 적어도 하나의 유전자 제작물;
    2) (S)-아세토락테이트의 2,3-다이하이드록시아이소발레레이트로의 전환(경 로 단계 b)을 위한, 하기 조건:
    i) 약 7.5의 pH;
    ii) 약 22.5℃의 온도; 및
    iii) 약 10 mM 초과의 칼륨 하에 실행되는 NADPH 소비 분석에 의해 측정할 때 정제된 단백질을 기준으로 1.1 μmole/분/㎎보다 큰 비활성의 케톨-산 리덕토아이소머라아제 효소를 코딩하는 적어도 하나의 유전자 제작물;
    3) 2,3-다이하이드록시아이소발레레이트의 α-케토아이소발레레이트로의 전환(경로 단계 c)을 위한 아세토하이드록시산 데하이드라타아제를 코딩하는 적어도 하나의 유전자 제작물;
    4) α-케토아이소발레레이트를 아이소부티르알데히드로 전환시키는(경로 단계 d) 분지쇄 케토산 데카르복실라아제를 코딩하는 적어도 하나의 유전자 제작물;
    5) 아이소부티르알데히드의 아이소부탄올로의 전환(경로 단계 e)을 위한 분지쇄 알코올 데하이드로게나아제를 코딩하는 적어도 하나의 유전자 제작물을 포함하는 재조합 미생물 숙주 세포를 제공하는 단계; 및
    b) 아이소부탄올을 생성시키는 조건 하에서 (a)의 숙주 세포를 배양하는 단계를 포함하는, 아이소부탄올을 생성하는 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 케톨-산 리덕토아이소머라아제 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 적어도 하나의 유전자 제작물을 슈도모나스(Pseudomonas)로부터 단리하는 방법.
  5. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 숙주 세포가 박테리아(bacterium), 시아노박테리아(cyanobacterium), 사상균(filamentous fungus) 및 효모로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
  6. 제4항에 있어서, 숙주 세포가 클로스트리듐(Clostridium), 자이모모나스(Zymomonas), 에스케리키아(Escherichia), 살모넬라(Salmonella), 로도코커스(Rhodococcus), 슈도모나스, 바실러스(Bacillus), 락토바실러스, 엔테로코커스(Enterococcus), 알칼리제네스(Alcaligenes), 클렙시엘라(Klebsiella), 파에니바실러스(Paenibacillus), 아트로박터(Arthrobacter), 코리네박테리움(Corynebacterium), 브레비박테리움(Brevibacterium), 피키아(Pichia), 칸디다(Candida), 한세눌라(Hansenula), 비브리오(Vibrio) 및 사카로마이세스(Saccharomyces)로 이루어진 군으로부터 선택되는 속의 구성원인 방법.
  7. 제6항에 있어서, 숙주 세포가 에스케리키아 콜라이인 방법.
  8. 제6항에 있어서, 상기 세포가 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum)인 방법.
  9. 제6항에 있어서, 상기 세포가 사카로마이세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae)인 방법.
  10. 제3항에 있어서, 아세토락테이트 신타아제는 서열 번호 2에 개시된 아미노산 서열을 갖는 방법.
  11. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 케톨-산 리덕토아이소머라아제 활성을 갖는 폴리펩티드는 서열 번호 34, 서열 번호 35, 및 서열 번호 36의 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 방법.
  12. 제3항에 있어서, 아세토하이드록시산 데하이드라타아제 활성은 서열 번호 6에 개시된 아미노산 서열을 갖는 방법.
  13. 제3항에 있어서, 분지쇄 알코올 데하이드로게나아제는 서열 번호 10에 개시된 아미노산 서열을 갖는 방법.
  14. 제3항에 있어서, 분지쇄 α-케토산 데카르복실라아제는 서열 번호 8에 개시된 아미노산 서열을 갖는 방법.
  15. 비활성이 이. 콜라이 케톨-산 리덕토아이소머라아제의 비활성보다 큰 케톨-산 리덕토아이소머라아제 효소를 포함하는 재조합 숙주 세포.
  16. 제15항에 있어서, 하기 조건:
    a) 약 7.5의 pH;
    b) 약 22.5℃의 온도; 및
    c) 약 10 mM 초과의 칼륨 하에서 실행되는 NADPH 소비 분석에 의해 측정할 때 정제된 단백질을 기준으로 케톨-산 리덕토아이소머라아제 효소의 비활성이 1.1 μmole/분/㎎보다 큰 재조합 숙주 세포.
  17. 하기 조건:
    i) 약 7.5의 pH;
    ii) 약 22.5℃의 온도; 및
    iii) 약 10 mM 초과의 칼륨 하에서 실행되는 NADPH 소비 분석에 의해 측정할 때 정제된 단백질을 기준으로 비활성이 1.1 μmole/분/㎎보다 큰 케톨-산 리덕토아이소머라아제 효소를 코딩하는 유전자 제작물을 동정 및 단리하는 방법으로서,
    a) M9 최소 배지에서 배양할 때 배증 시간이 이. 콜라이의 배증 시간보다 짧은 박테리아 종을 동정하는 단계;
    b) (a)의 박테리아 종을 케톨-산 리덕토아이소머라아제 활성에 대하여 스크리닝하여 활성 박테리아 종을 동정하는 단계;
    c) 케톨-산 리덕토아이소머라아제를 코딩하는 것으로 공지된 유전자 제작물에 대하여 상동성을 갖는 핵산 서열을 이용하여 (b)의 활성 박테리아 종의 게놈 DNA를 프로빙하여 상기 활성 박테리아 종 유래의 케톨-산 리덕토아이소머라아제를 코딩하는 유전자 제작물을 동정 및 단리하는 단계; 및
    d) 상기 활성 박테리아 종 유래의 케톨-산 리덕토아이소머라아제를 코딩하는 유전자 제작물을 증폭 및 발현시키는 단계와;
    e) 단계 (d)의 발현된 유전자 제작물을 하기 조건:
    i) 약 7.5의 pH;
    ii) 약 22.5℃의 온도; 및
    iii) 약 10 mM 초과의 칼륨 하에서 실행되는 NADPH 소비 분석에 의해 측정할 때 정제된 단백질을 기준으로 비활성이 1.1 μmole/분/㎎보다 큰 것에 대하여 스크리닝하는 단계를 포함하는 방법.
  18. 제17항에 있어서, 상기 활성 박테리아 종이 클로스트리듐, 자이모모나스, 에스케리키아, 살모넬라, 로도코커스, 슈도모나스, 바실러스, 비브리오, 락토바실러스, 엔테로코커스, 알칼리제네스, 클렙시엘라, 파에니바실러스, 아트로박터, 코리네박테리움 및 브레비박테리움으로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
  19. 제17항에 있어서, 단계 (a)의 배증 시간이 M9 최소 배지에서 배양할 때 이. 콜라이의 배증 시간의 80% 이하인 방법.
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