CN103827304A - 用于异丁醇生产的宿主细胞和方法 - Google Patents

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Abstract

本文提供了产生异丁醇的重组酵母宿主细胞及其使用方法。所提供的酵母宿主细胞包含：异丁醇生物合成途径和降低或消除的醛脱氢酶活性、降低或消除的乙酰乳酸还原酶活性中的至少一个；或编码具有酮醇酸还原异构酶活性的多肽的异源多核苷酸。

Description

用于异丁醇生产的宿主细胞和方法
政府许可权利
本发明根据能源部授予的合同号DE-AR0000006受到美国政府的支持。美国政府拥有本发明的某些权利。
技术领域
本发明涉及用于异丁醇发酵生产的重组宿主细胞和方法。
相关申请的交叉引用
本专利申请根据35U.S.C.§119（e）要求美国专利申请61/472,484（提交于2011年4月6日）、61/467,261（提交于2011年3月24日）、61/472,487（提交于2011年4月6日）、61/467,271（提交于2011年3月24日）、61/570,513（提交于2011年12月14日）、61/467,249（提交于2011年3月24日）、61/472,497（提交于2011年4月6日）以及61/472,474（提交于2011年4月6日）的优先权，其各自全文以引用的方式并入本文。
对于通过EFS-WEB电子递交的序列表的引用
电子递交的序列表（名称：20120323_CL5367USNA_SEQLIST.txt；大小2,003,893字节；创建日期2012年3月23日）的内容在此全文以引用的方式并入本文。
背景技术
丁醇是重要的工业化学品，可用作为染料添加剂、作为塑料工业中的原料化学品以及作为食品和调味品工业中的食品级提取剂。每年度通过石油化学手段生产100至120亿磅的丁醇并且对这一商业化学品的需求在未来很可能增加。
用于异丁醇的化学合成的方法是已知的，例如羰基合成、一氧化碳的催化氢化（Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry，第6版，2003，Wiley-VCH Verlag GmbH andCo.，Weinheim，Germany，第5卷，716-719页）和甲醇与正丙醇的格尔伯特缩合（Carlini等人，J.Molec.Catal.A.Chem.220:215-220，2004）。这些方法使用了来自于石化产品的起始物质，一般价格昂贵，且不环保。通过植物来源的原材料进行的异丁醇生产将使温室气体排放最小化并且将是本领域中的一个进步。
异丁醇作为酵母发酵的副产品而进行生物生产。其为由于真菌对氨基酸的不完全代谢而形成的“杂醇油”的组分。异丁醇通过L-缬氨酸的分解代谢而特异性产生。在L-缬氨酸的氨基基团被收集作为氮源后，所得的α-酮酸通过所谓的艾利希途径（Ehrlich pathway）的酶进行脱羧化并且还原成为异丁醇（Dickinson等人，J.Biol.Chem.273:25752-25756，1998）。
对于通过糖直接生物合成丁醇的改进方案和替代方案将改善经济可行性并且将是本领域中的一个进步。
发明内容
本文提供了用于异丁醇生产的重组酵母宿主细胞和方法。
在一些实施例中，重组宿主细胞包含工程化的异丁醇生产途径，以及（a）下列中的至少一个：（i）具有酮醇酸还原异构酶（KARI）活性的异源多肽，其选自（1）与来源于角双歧杆菌（Bifidobacteriumangulatum）、齿双歧杆菌（Bifidobacterium dentium）、运动发酵单胞菌（Zymomonas mobilis）、拜氏梭菌（Clostridium beijerinckii）或粪厌氧棒状菌（Anaerostipes caccae）的KARI酶或其活性片段具有至少约90%同一性的多肽，（2）与SEQ ID NO:27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63或65具有至少约90%同一性或具有至少约95%同一性的多肽；或（ii）编码（a）的具有KARI活性的异源多肽的异源多核苷酸；和（b）至少一个宿主细胞修饰，其增强了所述工程化异丁醇生产途径的性能。在一些实施例中，（a）和（b）的组合引起异丁醇生产途径性能中的协同提高。
在一些实施例中，重组宿主细胞包含异丁醇生物合成途径，以及（a）具有酮醇酸还原异构酶（KARI）活性的异源多肽，其选自（i）与来源于角双歧杆菌、齿双歧杆菌、运动发酵单胞菌、拜氏梭菌或粪厌氧棒状菌的KARI酶或其活性片段具有至少约90%同一性的多肽，（ii）与SEQIDNO:27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63或65具有至少约90%同一性或具有至少约95%同一性的多肽；（iii）与来自形双歧杆菌、齿双歧杆菌、鹑鸡肠球菌（Enterococcus gallinarum）、链球菌嗜热菌（Streptococcusthermophiles）、运动发酵单胞菌、拜氏梭菌、粪厌氧棒状菌或乳酸乳球菌乳脂亚种MG1363（Lactococcus lactis subsp.cremorisMG1363）的KARI酶或其活性片段具有至少约90%同一性或至少约95%同一性的多肽，其中所述多肽针对NADH具有小于约50的KM，（iv）与来自头葡萄球菌（Staphylococcus capitis）SK14，表皮葡萄球菌（Staphylococcusepidermidis）M23864-W1，人葡萄球菌（Staphylococcus hominis）SK119，金黄色葡萄球菌金黄亚种（Staphylococcus aureus subsp.aureus）TCH130，沃氏葡萄球菌（Staphylococcuswarneri）L37603，表皮葡萄球菌W23144，腐生葡萄球菌腐生亚种（Staphylococcus saprophyticus subsp.saprophyticus）ATCC15305，肉葡萄球菌肉亚种（Staphylococcus carnosussubsp.Carnosus）TM300，单核细胞增多性李斯特菌（Listeriamonocytogenes）EGD-e、格氏李斯特菌（Listeria grayi）DSM20601、酪黄肠球菌（Enterococcus casseliflavus）EC30，鹑鸡肠球菌EG2，溶酪大球菌（Macrococcus caseolyticus）JCSC5402，前庭链球菌（Streptococcusvestibularis）、变异链球菌（Streptococcus mutans）UA159，格氏链球菌（Streptococcus gordonii）str，cgakkus sybstr.CH1，猪链球菌（Streptococcus suis）89/1591、婴儿链球菌婴儿亚种（Streptococcusinfantarius subsp.infantarius）ATCCBAA-102、乳酸乳球菌乳脂亚种MG1363，乳酸乳球菌、肠膜明串珠菌肠膜亚种（Leuconostocmesenteroides subsp mesenteroides）ATCC8293，布氏乳杆菌（Lactobacillusbuchneri）ATCC11577、溶血葡萄球菌（Staphylococcus haemolyticus）JCSC1435，表皮葡萄球菌ATCC12228，肺炎链球菌（Streptococcuspneumoniae）CGSP14，肺炎链球菌TIGR4，血链球菌（Streptococcussanguinis）SK36，唾液链球菌（Streptococcus salivarius）SK126，嗜热链球菌（Streptococcus thermophilus）LMD-9、肺炎链球菌CCRI1974M2，乳酸乳球菌乳酸亚种l1403，肠膜明串珠菌乳脂亚种（Leuconostocmesenteroides subsp cremoris）ATCC19254，肠膜明串珠菌乳脂亚种、短乳杆菌格雷夫斯亚种（Lactobacillus brevis subsp.gravesensis）ATCC27305或乳酸乳球菌乳酸亚种NCDO2118的KARI酶或其活性片段具有至少约90%同一性或至少约95%同一性的多肽，其中所述异源多肽针对NADH具有小于约50的KM，（v）与SEQIDNO:67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、119、121、123、125、127、129、131、133或135或它们的活性片段具有至少约90%同一性或具有至少约95%同一性的具有KARI活性的多肽，其中所述异源多肽针对NADH具有小于约50的KM；（b）编码具有KARI活性的异源多肽的异源多核苷酸；（c）降低或消除的醛脱氢酶活性；（d）降低或消除的醛氧化酶活性；（e）降低或消除的乙酰乳酸还原酶活性；或（f）它们的组合。
在一个实施例中，所述重组宿主细胞包含降低或消除的醛脱氢酶表达活性和降低或消除的乙酰乳酸还原酶表达或活性。
在另一个实施例中，所述重组宿主细胞包含（i）降低或消除的醛脱氢酶表达或活性或降低或消除的乙酰乳酸还原酶表达或活性，以及（ii）编码具有KARI活性并且针对NADH具有小于300μM的KM的多肽的异源多核苷酸。
在另一个实施例中，所述重组宿主细胞包含具有KARI活性的异源多肽，其与SEQ ID NO:27、29、141、143、275或277具有至少约90%或至少约95%同一性。
在一些实施例中，所述重组宿主细胞包含具有KARI活性的异源多肽，其在对应于SEQ ID NO:27的S56和S58的氨基酸处包含替换。在一些实施例中，具有KARI活性的多肽还包含对应于SEQ ID NO:27的I86、N87、T131、或T191的一个或多个氨基酸的替换。在一些实施例中，具有KARI活性的多肽对于SEQ ID NO:31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63或65具有至少约90%同一性或至少约95%同一性。
在一些实施例中，所述重组宿主细胞在约48小时后具有至少约3、至少约4、或至少约5克/克细胞的有效异丁醇产率，其中所述48小时中的至少最后约24小时处于厌氧条件下。
在一些实施例中，所述重组宿主细胞包含具有KARI活性的异源多肽，其在pH6.8下针对NADH具有小于约350、小于约100、小于约50、或小于约10μM的KM。
在一些实施例中，所述重组宿主细胞包含具有KARI活性的异源多肽，其与SEQ ID NO:376、382、378或275具有至少约90%同一性或至少约95%同一性。
在一些实施例中，所述重组宿主细胞包含具有KARI活性的异源多肽，其包含在对应于来自粪厌氧棒状菌的KARI酶（SEQ ID NO:27）的氨基酸A41、S56、S58、I87、T131、T191、R227、或Q246的一个或多个位点上具有氨基酸替换。
在一些实施例中，所述重组宿主细胞包含具有KARI活性的异源多肽，其包含SEQ ID NO:33或SEQ ID NO:35或它们的活性片段。
在另一个实施例中，所述重组宿主细胞在编码具有醛脱氢酶活性的多肽的内源多核苷酸中包含缺失、突变和/或替换。在一些实施例中，所述具有醛脱氢酶活性的多肽催化异丁醛向异丁酸的转化。在一些实施例中，所述具有醛脱氢酶活性的多肽对应于酶学委员会编号（EnzymeCommissionNumber）EC1.21.3、EC1.2.1.4和/或EC1.2.1.5。在一些实施例中，所述宿主细胞是啤酒糖酵母（S.cerevisiae）并且所述具有醛脱氢酶活性的多肽是ALD2、ALD3、ALD4、ALD5、ALD6或它们的同源物。在一些实施例中，所述宿主细胞是乳酸克鲁维酵母（K.lactis）并且所述具有醛脱氢酶活性的多肽是KLLA0F00440、KLLA0E23057、KLLA0D10021或KLLA0D09999G。在一些实施例中，所述宿主细胞是树干毕赤酵母（P.stipitis）并且所述具有醛脱氢酶活性的多肽是ALD2、ALD3、ALD4、ALD5、或ALD7。在一些实施例中，所述宿主细胞是植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）并且所述具有醛脱氢酶活性的多肽是AldH。在一些实施例中，所述宿主细胞是大肠杆菌（E.coli）并且所述具有醛脱氢酶活性的多肽是aldA、aldB或aldH。
在另一个实施例中，所述宿主细胞包含编码具有醛氧化酶活性的多肽的内源多核苷酸中的缺失、突变和/或替换。在一些实施例中，所述具有醛氧化酶活性的多肽催化异丁醛至异丁酸的转化。在一些实施例中，所述具有醛氧化酶活性的多肽对应于酶学委员会编号EC1.2.3.1。在一些实施例中，所述具有醛氧化酶活性的多肽是AOX1和/或AOX2。
在另一个实施例中，所述宿主细胞包含编码具有乙酰乳酸还原酶的多肽的内源多核苷酸中的缺失、突变和/或替换。在一些实施例中，所述具有乙酰乳酸还原酶的多肽包含由选自SEQ ID NO:676、SEQ ID NO:678、SEQ ID NO:680、SEQ ID NO:682、SEQ ID NO:684、SEQ ID NO:686、SEQ ID NO:688、SEQ ID NO:690、SEQ ID NO:692、SEQ ID NO:694、SEQ ID NO:696、SEQ ID NO:702、SEQ ID NO:704、SEQ ID NO:706、SEQ ID NO:708、SEQ ID NO:710、SEQ ID NO:712、SEQ ID NO:714、SEQ ID NO:716、SEQ ID NO:718、SEQ ID NO:720、SEQ ID NO:722、SEQ ID NO:724、SEQ ID NO:726、SEQ ID NO:728和SEQ ID NO:730的多核苷酸所编码的多肽。在一些实施例中，所述具有乙酰乳酸还原酶的多肽是YMR226C。
在另一个实施例中，所述重组宿主细胞是酵母宿主细胞。在一些实施例中，所述酵母选自糖酵母（Saccharomyce）、裂殖酵母（Schizosaccharomyces）、汉逊酵母（Hansenula）、假丝酵母（Candida）、克鲁维酵母菌（Kluyveromyces）、耶氏酵母（Yarrowia）、伊萨酵母（Issatchenkia）或毕赤酵母（Pichia）。在一些实施例中，所述宿主细胞是啤酒糖酵母。
在另一个实施例中，所述宿主细胞是细菌细胞。在一些实施例中，所述细菌细胞是梭菌（Clostridium）、发酵单胞菌（Zymomonas）、埃希氏菌（Escherichia）、沙门氏菌（Salmonella）、红球菌（Rhodococcus）、假单胞菌（Pseudomonas）、芽孢杆菌（Bacillus）、乳杆菌（Lactobacillus）、肠球菌（Enterococcus）、片球菌（Pediococcus）、产碱杆菌（Alcaligenes）、克雷伯氏菌（Klebsiella）、类芽孢杆菌（Paenibacillus）、节杆菌（Arthrobacter）、棒状杆菌（Corynebacterium）、短杆菌（Brevibacterium）、乳球菌（Lactococcus）、明串珠菌（Leuconostoc）、酒球菌（Oenococcus）、片球菌（Pediococcus）或链球菌（Streptococcus）的细胞。在一些实施例中，所述细菌细胞并非大肠杆菌。
在一些实施例中，所述重组宿主细胞的工程化异丁醇生产途径包括下列底物至产物转化：（a）丙酮酸至乙酰乳酸，（b）乙酰乳酸至2,3-二羟基异戊酸，（c）2,3-二羟基异戊酸至2-酮异戊酸，（d）2-酮异戊酸至异丁醛，以及（e）异丁醛至异丁醇，并且超过一种所述底物至产物的转化通过对于所述宿主细胞异源的酶催化。在一些实施例中，编码对于所述宿主细胞异源的酶中的至少一个异源多核苷酸通过染色体整合到该宿主细胞中。在一些实施例中，所述底物至产物的转化通过基本上定位于细胞溶胶的酶催化。在一些实施例中，异丁醛至异丁醇的底物至产物的转化通过利用NADH作为辅因子的醇脱氢酶催化。在一些实施例中，乙酰乳酸至2,3-二羟基异戊酸的转化通过使用NADH作为辅因子的KARI催化。
在一些实施例中，所述宿主细胞包含质粒pLH702或pLH701或具有相同编码区的质粒。在一些实施例中，所述宿主细胞包含质粒pBP915或具有相同编码区的质粒。在一些实施例中，所述宿主细胞包含质粒pYZ067ΔkivDΔhADH或具有相同编码区的质粒。
在一些实施例中，所述宿主细胞包含降低、破坏或消除的将乙酰乳酸转化成2,3-二羟基-2-甲基丁酸的能力。
在一些实施例中，所述宿主细胞是酵母并且具有降低或消除的丙酮酸脱羧酶表达或活性。在一些实施例中，所述宿主细胞具有降低或消除的PDC1、PDC5、或PDC6活性或它们的组合。
在一些实施例中，所述宿主细胞具有降低或消除的NAD-依赖型甘油-3-磷酸酯脱氢酶表达或活性。在一些实施例中，所述宿主细胞具有降低的GPD2活性。
在一些实施例中，所述宿主细胞具有降低或消除的FRA2表达或活性。
在一些实施例中，所述宿主细胞在厌氧条件下产生异丁醇，并且异丁醇与甘油的摩尔比大于1。
在一些实施例中，具有酮醇酸还原异构酶活性的多肽以<10-3的序型HMME值匹配表Z中提供的序型HMM。
在一些实施例中，所述宿主细胞以大于理论收率约25%、约50%、约75%、或约90%的收率生产异丁醇。
在一些实施例中，产生异丁醇和乙醇。
用于生产异丁醇的方法包括：提供如上所述的重组宿主细胞，以及在由此产生异丁醇的条件下，使所述宿主细胞与碳底物接触。在一些实施例中，所述接触的至少一部分在厌氧条件下进行。在一些实施例中，所述接触在提取剂存在下进行。在一些实施例中，所述接触在足量的有机提取剂存在下进行以形成包含水相和有机相两相体系。在一些实施例中，与使用不包含具有KARI活性的异源多肽、不包含编码具有KARI活性的多肽的异源多核苷酸、不包含降低或消除的醛脱氢酶活性、不包含降低或消除的醛氧化酶活性、不包含降低或消除的乙酰乳酸还原酶活性或其组合的重组宿主细胞的方法相比，异丁醇的有效速率、有效滴度、或有效收率中的一个或多个是提高的。在一些实施例中，与使用不包含（i）具有KARI活性的异源多肽或编码具有KARI活性的多肽的异源多核苷酸以及（ii）增强工程化异丁醇生产途径的性能的至少一个修饰的重组宿主细胞的方法相比，异丁醇的有效速率、有效滴度或有效收率中的一个或多个是提高的。在一些实施例中，与使用不包含具有KARI活性的异源多肽、不包含编码具有KARI活性的多肽的异源多核苷酸、不包含降低或消除的醛脱氢酶活性、不包含降低或消除的醛氧化酶活性、不包含降低或消除的乙酰乳酸还原酶活性或它们的组合的重组宿主细胞的方法相比，DHMB生产、异丁酸生产或两者均是降低的。在一些实施例中，与使用不包含（i）具有KARI活性的异源多肽或编码具有KARI活性的多肽的异源多核苷酸以及（ii）增强工程化异丁醇生产途径的性能的至少一种修饰的重组宿主细胞的方法相比，DHMB生产、异丁酸生产或两者有所减低。在一些实施例中，异丁醇与甘油的摩尔比大于1。
用于生产异丁醇的方法还包括提供产生异丁醇的重组宿主细胞，以及在由此产生异丁醇的条件下，使所述宿主细胞与碳底物接触，其中接触的至少一部分在厌氧条件下进行，并且其中所产生的异丁醇与甘油的比率大于1。
用于生产异丁醇的方法还包括使重组酵母在由此产生丁醇的条件下生长，其包含能够将丙酮酸转化成乙酰乳酸的生物合成途径，以及从所述培养物中移除DHMB。
本文还提供了通过该方法产生的组合物。在一些实施例中，所述组合物包含异丁醇和上文提供的重组宿主细胞。在一些实施例中，所述组合物包含丁醇以及不超过约0.5mM的DHMB。
本文还提供了发酵组合物。在一些实施例中，发酵组合物包含所述宿主细胞以及根据上文所述的方法产生的异丁醇。
还提供了包含i）能够产生丁醇的重组酵母，ii）丁醇，和iii）不超过约0.5mMDHMB的组合物。
还提供了用于制备重组宿主细胞的方法。这类方法可包括（a）提供重组宿主细胞，其包含编码具有醛脱氢酶活性或醛氧化酶活性的多肽的多核苷酸中的修饰；以及（b）使用编码异丁醇生物合成途径的多肽的多核苷酸转化所述宿主细胞。
还提供了降低或消除异丁醇至异丁酸的转化的方法。这类方法可包括（a）提供权利要求1-52中任一项的重组宿主细胞；以及（b）对所述宿主细胞施以条件，其中与使用并不包含降低或消除的醛脱氢酶和/或醛氧化酶活性的重组宿主细胞的方法相比，异丁醛至异丁酸的转化是降低或消除的。
还提供了某些多肽。在一些实施例中，所述多肽与SEQ ID NO:29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、417、419、421、423、425、427、429、431、433、434、435、436、437、438、439、440、441、442、443、444、445、446、447、448、449、450、451、452、453、454、455、456、457、458、459、460、461、462、463、464、465、466、467、468、469、470、471、472、473、474、475、476、477、478、479、480、481、482、483、484、485、486、487、488、489、490、491、492、493、494、495、496、497、498、499、500、501、502、503、504、505、506、507、508、509、510、511、512、513、514、515、516、517、518、519、520、521、522、523、524、525、526、527、528、529、530、531、532、533、534、535、536、537、624、626、628、630、632或它们的活性片段包含至少约90%同一性，或至少约95%同一性，或至少约99%同一性，并且具有酮醇酸还原异构酶活性。在一些实施例中，所述多肽与SEQID NO:417、419、421、423、425或427包含至少约90%同一性或至少约95%同一性或至少约99%同一性，并且具有酮醇酸还原异构酶活性。在一些实施例中，多肽包含与SEQ ID NO:927、928、196、266、267、389、405、637、781、782、783、835、853、854、855、856、857或859具有至少约90%同一性、至少约95%同一性或至少约99%同一性的序列。
还提供了编码这类多肽的多核苷酸和包含这类多核苷酸和多肽的宿主细胞。
还提供了将乙酰乳酸转化成2,3-二羟基异戊酸的方法。例如，这类方法可包含（a）提供上文描述的多肽，以及（b）在由此产生2,3-二羟基异戊酸的条件下，使所述多肽与乙酰乳酸接触。
还提供了重组酵母细胞。在一些实施例中，重组酵母细胞包含能够将丙酮酸转化成乙酰乳酸的生物合成途径，并且所述酵母产生小于0.01摩尔2,3-二羟基-2-甲基丁酸（DHMB）/摩尔消耗的糖。在一些实施例中，重组酵母包含能够将丙酮酸转化成乙酰乳酸的生物合成途径，并且所述酵母以小于约1.0mM/小时的速率产生DHMB。在一些实施例中，重组酵母包含能够将丙酮酸转化成乙酰乳酸的生物合成途径，并且所述酵母产生2,3-二羟基-3-异戊酸（DHIV）的量是所述产生DHMB的量的至少约1.5倍。
还提供了鉴定参与DHMB产生的基因的方法。在一些实施例中，所述方法包括（i）提供包含至少两个或更多个基因缺失的酵母菌株的集合；（ii）测量单个酵母菌株产生的DHMB的量；（iii）选择产生不超过约1.0mMDHMB/小时的酵母菌株；以及（iv）在所选择的酵母菌株中鉴定缺失的基因。在一些实施例中，所述方法包括（i）提供过表达至少两个或更多个基因的酵母菌株的集合；（ii）测量单个酵母菌株产生的DHMB的量；（iii）选择产生至少约1.0mMDHMB/小时的酵母菌株；以及（iv）在所选择的酵母菌株中鉴定过表达的基因。
还提供了用于异丁醇生产的方法。在一些实施例中，所述方法包括（a）使重组酵母在由此产生丁醇的条件下生长，其包含能够将丙酮酸转化成乙酰乳酸的生物合成途径；以及b）测量DHIV和/或DHMB浓度。在一些实施例中，所述生长和测量可同步进行或以任何顺序先后进行。在一些实施例中，所述测量包括液相色谱-质谱法。
还提供了提高酮醇酸还原异构酶（KARI）活性的方法。在一些实施例中，所述方法包括（a）提供包含乙酰乳酸、KARI酶和乙酰乳酸还原酶的组合物，以及（b）降低DHMB水平。在一些实施例中，降低DHMB水平是通过降低乙酰乳酸还原酶的活性而实现的。在一些实施例中，降低DHMB水平是通过从所述组合物中移除DHMB而实现的。
在一些实施例中，提高宿主细胞中KARI酶产率可包括培养宿主细胞，其中所述宿主细胞包含异源KARI酶和降低、破坏或消除乙酰乳酸还原酶表达或活性的至少一个遗传修饰，并且其中在DHMB存在下，所述KARI酶活性是降低的。在一些实施例中，所述KARI与大肠杆菌或乳酸乳球菌的KARI具有至少约90%、至少约95%或至少约99%同一性。在一些实施例中，所述降低、破坏或消除的乙酰乳酸还原酶表达或活性实质上降低DHMB的存在。
还提供了提高二羟酸脱水酶（DHAD）活性的方法。在一些实施例中，所述方法包括（a）提供包含二羟基异戊酸（DHIV）和DHAD酶的组合物，以及（b）降低DHMB水平。
附图说明和以引用的方式并入的随本文进行电子提交的表格
通过下面的具体实施方式、附图和随附的序列描述可以更全面地理解本发明，这些具体实施方式、附图和序列描述形成本专利申请的一部分。
图1示出了四种不同的异丁醇生物合成途径。标记有“a”、“b”、“c”、“d”、“e”、“f”、“g”、“h”、“i”、“j”和“k”的步骤代表下述的底物至产物的转化。
图2描述了来自荧光假单胞菌（“PF5”；SEQ ID NO:5）的KARI与来自粪厌氧棒状菌（“K9”；SEQ ID NO:27）的KARI的氨基酸序列比对。粗体的位点被靶定用于如本文所述的诱变。
图3A、3B和3C描述了来自角双歧杆菌DSM20098（“K1”；SEQID NO:141）、齿双歧杆菌ATCC27678（“K2”；SEQ ID NO:143）、拜氏梭菌NCIMB8052（“K7”；SEQ ID NO:275）、粪厌氧棒状菌DSM14662（“K9”；SEQ ID NO:27）、鹑鸡肠球菌EG2（“K25”SEQ IDNO:376）、嗜热链球菌LMD-9（“K26”SEQ ID NO:121）、乳酸乳球菌乳脂亚种MG1363（“K29”；SEQ ID NO:382）、运动发酵单胞菌（“S2”；SEQ ID NO:277）和乳酸乳球菌（“LTS”；SEQ ID NO:380）。粗体的位点被靶定用于如本文所述的诱变。
图4是pLH556（pHR81-PIlv5-Pf5.KARI）载体（SEQ ID NO:138）的质粒图谱。
图5示出了两种菌株PNY1910和PNY2242的异丁醇生产的特异速率Qp。
图6示出了发酵时程期间PNY1910（三角形）和PNY2242（菱形）的培养物上清中的DHIV+DHMB积累。（所使用的HPLC方法未区分DHMB和DHIV。）
图7示出了甘油、丙酮酸、2,3-丁二醇（BDO）、DHIV/DHMB、α-酮异戊酸（aKIV）和异丁酸（iBuAc）的收率。DHIV和DHMB一同示出，因为所使用的HPLC方法未对其进行区分。
图8示出了K9G9变体的Vmax/KM值的概述，如实例16中所述。
图9A、B和C示出了K9变体的异丁醇与甘油的摩尔收率比，异丁醇的摩尔收率和异丁醇滴度，如实例19中所述。
图10示出了异丁醇生物合成途径。步骤“a”为丙酮酸至乙酰乳酸的转化。步骤“b”为乙酰乳酸至DHIV的转化。步骤“c”为DHIV至KIV的转化。步骤“d”为KIV至异丁醛的转化。步骤“e”为异丁醛至异丁醇的转化。步骤“f”为乙酰乳酸至DHMB的转化。
图11示出了来自子囊菌酵母菌种的YMR226c同源物的系统发生树。将一个丝状真菌（粗糙脉孢菌（Neurospora crassa））序列包括在内以作为外类群（outgroup）。
图12示出了与YMR226C具有同源性的ORF的核苷酸序列的多序列比对（MSF格式）。示出的基因名对应于表7中给出的登录号和序列号。所述比对通过AlignX（VectorNTI）产生。
图13示出了DHMB随时间的摩尔收率图。
图14描述了酵母菌株NYLA84中的异丁醇和异丁酸产量。
表Z-是经实验验证的KARI酶的序型HMM表（随本文进行电子提交并且以引用的方式并入），所述KARI酶在表1中列出并且如美国申请公开2010/0197519和2009/0163376中所描述，其全文以引用的方式并入本文。
表1：经实验验证的KARI酶。
Figure BDA0000419940220000131
Figure BDA0000419940220000141
代表了该比对中的纵栏的序型HMM中的十一个位点（对应于荧光假单胞菌Pf-5的KARI中的十一个辅因子转化位点）被标识为位点24、33、47、50、52、53、61、80、115、156和170。表Z随本文进行电子递交并且以引用的方式并入本文。
随本文提交的序列表中提供的序列（名称20120323_CL5367USNA_SEQLIST.txt；大小2,003,893字节；创建日期2012年3月23日）以引用的方式并入本文。
遵循世界知识产权组织（WIPO）标准ST.25（2009），序列表中和本文给出的某些引物使用N来代表核苷酸a或g或c或t。K用来代表g或t。M用来代表a或c。
具体实施方式
除非另行定义，否则本文所用的所有科技术语的含义与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的一样。如发生矛盾，以本申请（包括其定义）为准。此外，除非上下文另有所需，单数术语将包括复数并且复数术语将包括单数。本文提及的所有公布、专利和其它参考文献出于各种目的全文以引用方式并入本文，如同每一单独的公布或专利申请均特定且个别地以引用方式并入一样，除非仅专利或专利申请的特定部分被提及以引用方式并入本文。
下文公开了合适的方法和材料，虽然在本发明的实施或试验过程中也可以使用与本文所公开的那些类似或等同的方法和材料。材料、方法和实例仅是例示性的并且不旨在进行限制。根据具体实施方式和权利要求，本发明的其它特点和优点将显而易见。
通过丙酮酸利用型生物合成途径的异丁醇生物合成的最后步骤是异丁醛向异丁醇的转化（图1）。这一途径中的一个副反应是异丁醛向异丁酸的转化，其导致了可用于转化成为异丁醇的异丁醛的降低量和降低的异丁醇收率。为进行有效的生物合成加工，对于防止异丁醛向异丁酸的转化从而使提高量的异丁醛可用于向异丁醇的转化并提高异丁醇收率而言存在着需求。
醛脱氢酶是催化醛的氧化（脱氢）的反应的酶家族（Wang等人，J.Bacteriol.180:822-30，1998；Navarro-Avino等人，Yeast15:829-42，1999；以及Saint-Prix等人，Microbiology 150:2209-20，2004）。存在着对于鉴定合适的醛脱氢酶的需求，所述醛脱氢酶可经修饰以降低或消除醛脱氢酶活性，并且可降低或消除异丁醛向异丁酸的转化，从而使提高量的异丁醛可用于向异丁醇的转化并提高异丁醇收率。
醛氧化酶是催化羧酸通过醛的产生的酶家族（Nomura等人，Biosci.Biotechnol.Biochem.62:1134-7，1998；以及Johnson等人，Genetics151:1379-1391，1999）。存在着对于鉴定合适的醛氧化酶的需求，所述醛脱氢酶可经修饰以降低或消除醛氧化酶活性，并且可降低或消除异丁醛向异丁酸的转化，从而使提高量的异丁醛可用于向异丁醇的转化并提高异丁醇收率。
基因工程化酵母的丁醇产生生物途径包括乙酰乳酸至2,3-二羟基-3-异戊酸（DHIV）的转化，其随后转化成为丁醇。参见图10。然而，这一途径中的一个减少丁醇总体产量的副反应是乙酰乳酸至2,3-二羟基-2-甲基丁酸（DHMB）的转化。事实上，本申请人已经发现，DHMB对于异丁醇生产途径中的酶（二羟酸脱水酶和酮醇酸还原异构酶）具有抑制效果。对于有效的生物合成加工，存在着防止乙酰乳酸向DHMB转化的需求。
本申请人已经通过提供重组酵母宿主细胞而解决了所声明的问题，所述重组酵母宿主细胞包含异丁醇生物合成途径；以及下列中的至少一个：i）降低或消除的醛脱氢酶活性；ii）降低或消除的醛氧化酶活性；iii）降低或消除的乙酰乳酸还原酶活性；iv）编码具有酮醇酸还原异构酶的多肽的异源多核苷酸；以及v）具有酮醇酸还原异构酶的异源多肽。此外，本申请人提供了产生利用丁醇的这类宿主细胞的方法。这类重组宿主细胞可用于提高生物合成途径的产物（例如，异丁醇、1-丁醇或2-丁醇）的生产和/或降低或消除途径中间物向不良副产物的转化。本申请人还已经提供了估测多种候选酶的合适筛选策略。所鉴定的酶可经改造来增强生物合成途径的产物（例如，异丁醇、1-丁醇或2-丁醇）的生产和/或降低或消除途径中间物向不良副产物的转化。
为了进一步明确本发明，提供了下列术语、缩写和定义。
应当理解针对本文公开的多肽的“来源于”涵盖了基于所标明的生物体中存在的KARI的氨基酸序列而合成的序列以及通过该生物体的遗传物质直接克隆的序列。
如本文所用，术语“包含”、“包括”、“具有”、“含有”或它们的任何其它变型应理解为是指包括指定的整数或整数组但不排除任何其它整数或整数组，并且旨在是非排它性的或是无限度的。例如，包含一系列元素的组合物、混合物、工艺、方法、制品或设备不必仅限于那些元素，而可包括其它未明确列出的元素，或此类组合物、混合物、工艺、方法、制品或设备固有的元素。此外，除非另外特别说明，否则“或”是指包含性的或，而不是指排它性的或。例如，条件A或B由以下任何一种情况所满足：A为真（或存在）且B为假（或不存在），A为假（或不存在）且B为真（或存在），以及A和B均为真（或存在）。
如本文所用，如整个说明书和权利要求中所使用的，术语“由…组成”或诸如“由…组成”的不同时态的变型表明包括任何列举的整数或整数组，但是无附加整数或整数组可加入到指定的方法、结构或组合物中。
如本文所用，如整个说明书和权利要求中所使用的，术语“基本上包括”或如“基本上包括”或“基本上由…组成”的变型表明包括任何列举的整数或整数组，并且任选地包括未显著改变指定的方法、结构或组合物的基本或新颖特性的任何列举的整数或整数组。参见M.P.E.P.§2111.03。
此外，涉及元素或组分实例（即出现）的数目在本发明元素或组分前的不定冠词“一个”或“一种”旨在为非限制性的。因此，应将“一个”或“一种”理解为包括一个或至少一个，并且元素或组分的词语单数形式也包括复数指代，除非有数字明显表示单数。
如本文所用，术语“发明”或“本发明”是非限制性术语，并且不旨在指本发明的任何单独实施例，而是涵盖如权利要求（所提供的或随后附加的和补充的）中所述的以及本说明书中所述的所有可能的实施例。
如本文所用，用术语“约”修饰本发明的成分或反应物的数量时是指数值量的变化，它们可能发生在，例如，典型的测量和用于制备浓缩液或实际使用溶液的液体处理程序中；这些程序中的偶然误差中；制造、来源、或用于制备组合物或实施方法的成分的纯度的差异中等。术语“约”还包括由于产生自特定起始混合物的组合物的不同平衡条件而不同的量。无论是否通过术语“约”来修饰，权利要求包括量的等同量。在一个实施例中，术语“约”指在报告数值10%范围内，或是在报告数值5%范围内。
如本文所用，“协同”是指通过组合而产生的超加和效应（即，超过个体效应总和的效应），或是在预期个体效应非加和时的加和效应。该术语还指一种化合物的添加，其导致了需要更少的另一种化合物。
本文所用术语“丁醇生物合成途径”是指产生1-丁醇、2-丁醇或异丁醇的酶途径。例如，异丁醇生物合成途径在美国专利申请公布2007/0092957中公开，该专利以引用方式并入本文。
术语“异丁醇生物合成途径”是指产生异丁醇的酶途径。某些异丁醇生物合成途径在图1中示出并在本文中描述。“异丁醇生物合成途径”有时与“异丁醇生产途径”同义使用。
本文所用术语“丁醇”是指2-丁醇、1-丁醇、异丁醇或它们的混合物。异丁醇也被称为2-甲基-1-丙醇。
包含“工程化的醇生产途径”（诸如工程化的丁醇或异丁醇生产途径）的重组宿主细胞是指包含经修饰的途径的宿主细胞，该途径以与宿主细胞中通常存在的途径不同的方式生产醇。此类差异包括生产通常宿主细胞不产生的醇，或者提高产量或更有效地生产。
如本文所用，术语“异源生物合成途径”是指产生产物的酶途径，其中至少一种酶对于包含该生物合成途径的宿主细胞而言是外源的。
如本文所用，术语“提取剂”是指可用于从发酵液体培养基中提取丁醇的一种或多种有机溶剂。
如本文所用，术语“有效的异丁醇产率”是指每克细胞产生的异丁醇量（克）。
如本文所用，术语“有效滴度”是指每升发酵培养基通过发酵产生的特定醇（例如丁醇）的总量。丁醇的总量包括：（i）发酵培养基中的丁醇量；（ii）从有机提取剂中回收的丁醇量；和（iii）当采用汽提时从气相中回收的丁醇量。
本文所用术语“有效速率”是指每升发酵培养基通过发酵每小时产生的丁醇总量。
如本文所用，术语“有效收率”是指发酵期间生物催化剂消耗每单位可发酵碳底物产生的丁醇的量。
如本文所用，术语“分离”与“回收”同义，并且是指从初始混合物中移除化合物以获得纯度或浓度比初始混合物中的所述化合物纯度或浓度更高的化合物。
如本文所用，术语“水相”是指通过使发酵液体培养基接触与水不混溶的有机提取剂而获得的两相混合物中的水相。在本文所述的包括发酵提取的过程的实施例中，术语“发酵液体培养基”具体地指两相发酵提取中的水相。
如本文所用，术语“有机相”是指通过使发酵液体培养基接触与水不混溶的有机提取剂而获得的两相混合物中的非水相。
如本文所用，术语“PDC-”、“PDC敲除”、或“PDC-KO”是指具有灭活或降低编码丙酮酸脱羧酶（PDC）的基因的表达的遗传修饰从而使该细胞基本上或完全没有丙酮酸脱羧酶酶活性的细胞。如果所述细胞具有多于一种被表达的（活性的）PDC基因，则每个活性PDC基因可以被灭活或具有最小的表达从而生成PDC-细胞。
术语“多核苷酸”旨在包括单数的核酸以及复数的核酸，并且是指核酸分子或构建体，例如，信使RNA（mRNA）或质粒DNA（pDNA）。多核苷酸可包含全长cDNA序列的核苷酸序列，或其片段，包括非翻译的5'和3'端序列和编码序列。多核苷酸可由任何多核糖核苷酸或多脱氧核糖核苷酸组成，其可以是未被修饰的RNA或DNA或者修饰的RNA或DNA。例如，多核苷酸可由单链和双链DNA、属于单链和双链区域混合物的DNA、单链和双链RNA、和属于单链和双链区域的混合物的RNA、包含可以为单链或更典型地为双链的或者是单链和双链区域的混合物的DNA和RNA的杂交分子组成。“多核苷酸”包含了化学地、酶学地、或代谢地改性的形式。
多核苷酸序列可以指“分离的”，其中它从天然的环境中移除出来。例如，包含在载体中的编码具有二羟酸脱水酶活性多肽或多肽片段的异源多核苷酸，出于本发明的目的可被认为是分离的。分离的多核苷酸的另一个例子包括异源宿主细胞拥有的重组多核苷酸或溶液中的纯化的（部分地或基本上）多核苷酸。根据本发明分离的多核苷酸或核酸还包括此类人工合成生产的分子。DNA聚合物形式的分离的多核苷酸片段可以由cDNA、基因组DNA或合成DNA的一个或多个片段构成。
术语“NAD（P）H消耗测定法”是指用于测定KARI酶的比活性的酶测定法，其涉及测量KARI的辅因子NAD（P）H从酶反应物中的消失。这类测定法描述于Aulabaugh与Schloss，Biochemistry29:2824-2830，1990中，其全文以引用的方式并入本文。
术语“NAD（P）H”是指NADH或NADPH。
“KARI”是酮醇酸还原异构酶的简称。
术语“紧邻”在针对NADPH的腺苷2'-磷酸而提及KARI酶的多个氨基酸残基位点时意指酶的三维模型中的氨基酸，所述氨基酸位于结合于该酶的NADPH的腺苷2'-磷酸的磷原子
Figure BDA0000419940220000191
之内。
术语“酮醇酸还原异构酶”（简称“KARI”）和“乙酰羟酸异构还原酶”应可互换地使用并且是指能够催化（S）-乙酰乳酸成为2,3-二羟基异戊酸的反应的酶，其归类为EC编号EC1.1.1.86（Enzyme Nomenclature1992，Academic Press，San Diego）。如本文所用，术语“I型酮醇酸还原异构酶”意指通常具有330至340个氨基酸残基的短小形式，并且其与通常具有约490个残基的称为II型的长型相区别。这些酶可获自大量的来源，其包括但不限于大肠杆菌（氨基酸SEQ ID NO:942；GenBank登录号NC_000913，区域：3955993.3957468）、霍乱弧菌（Vibrio cholerae）（GenBank登录号NC_002505，区域：157441.158925）、铜绿假单胞菌（GenBank登录号NC_002516，区域：5272455.5273471以及荧光假单胞菌（氨基酸SEQ ID NO:943；GenBank登录号NC_004129，区域：6017379.6018395）。KARI酶描述于，例如，美国专利7,910，342和8,129,162以及美国申请公布2010/0197519，全部文献全文以引用的方式并入本文。
KARI见于多种生物体内并且跨物种的氨基酸序列比较已经显示存在2类该酶：短型（I型）见于真菌和多数细菌中，而长型（II型）对于植物是典型的。I型KARI通常具有330-340个氨基酸残基。长型KARI酶具有约490个氨基酸残基。然而，一些细菌如大肠杆菌具有长型酶，其中的氨基酸序列略微不同于存在于植物中的氨基酸序列。KARI由ilvC基因编码，是基本培养基中大肠杆菌和其它细菌生长的必需酶。II型KARI通常由225个残基的N末端结构域和287个残基的C末端结构域组成。包含NADPH结合位点的N末端结构域具有αβ结构并且与其它吡啶核苷酸依赖型氧化还原酶中存在的结构域相似。C末端结构域几乎完全由α-螺旋组成。
酮醇酸还原异构酶（KARI）有用于使用工程化微生物进行的异丁醇生产的途径（美国专利7,851,188和7,993,889，以引用方式并入）。
利用NADH的KARI可利用通过在最为常用的微生物细胞中存在的糖酵解和其它代谢途径所产生的NADH，并且可导致改善的异丁醇生产。Rane等人（Arch.Biochem.Biophys.，338:83-89，1997）探讨了分离自大肠杆菌的酮醇酸还原异构酶的辅因子转换。美国申请公布2009/0163376和2010/0197519（各自全文以引用的方式并入本文）描述了可使用NADH的KARI酶的生成。美国申请公布2010/0143997（其全文以引用的方式并入本文）描述了对于NADH具有改善的KM值的大肠杆菌。
术语“酮醇酸还原异构酶活性”和“KARI活性”是指催化底物向产物的转化（（S）-乙酰乳酸向2,3-二羟基异戊酸）的能力。
术语“乙酰乳酸合酶”是指催化丙酮酸转化为乙酰乳酸和CO2的酶。乙酰乳酸具有（R）和（S）两种立体异构体，所述酶以通过生物体系制备的（S）异构体为优选。某些乙酰乳酸合酶已知EC编号为2.2.1.6（EnzymeNomenclature1992，Academic Press，SanDiego）。这些酶可获自大量的来源，其包括但不限于枯草芽孢杆菌（GenBank No:CAB15618、Z99122，分别为NCBI（国家生物技术信息中心）氨基酸序列、NCBI核苷酸序列）、肺炎克雷伯氏菌（Klebsiella pneumoniae）（GenBankNo:AAA25079，M73842）和乳酸乳球菌（GenBankNo:AAA25161，L16975）。
术语“乙酰羟酸脱水酶”是指催化2,3-二羟基异戊酸转化为α-酮异戊酸的酶。某些乙酰羟酸脱水酶已知EC编号为EC4.2.1.9。这些酶可获自广泛的微生物，其包括但不限于大肠杆菌（GenBankNo:YP_026248，NC_000913）、啤酒糖酵母（GenBank No:NP_012550，NC_001142）、M.maripaludis（GenBank No:CAF29874，BX957219）、枯草芽孢杆菌（GenBank No:CAB14105，Z99115）、乳酸乳球菌（SEQ ID NO:926）以及变异链球菌（Streptococcus mutans）（SEQ ID NO:939）。
术语“支链α-酮酸脱羧酶”指催化α-酮异戊酸转化为异丁醛和CO2的酶。某些支链α-酮酸脱羧酶已知EC编号为4.1.1.72并且可获自大量的来源，其包括但不限于乳酸乳球菌（GenBank No:AAS49166，AY548760；CAG34226，AJ746364）、鼠伤寒沙门氏菌（Salmonella typhimurium）（GenBank No:NP-461346，NC-003197）、丙酮丁醇梭菌（Clostridiumacetobutylicum）（GenBank No:NP-149189，NC-001988）、溶酪大球菌（Macrococcus caseolyticus）（SEQ ID NO:940）以及格氏李斯特菌（SEQID NO:941）。
术语“支链醇脱氢酶”是指催化异丁醛转化为异丁醇的酶。某些支链醇脱氢酶已知其EC编号为1.1.1.265，但是所述酶也可归类为其它醇脱氢酶（具体地讲，EC1.1.1.1或1.1.1.2）。这些酶利用NADH（还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸）和/或NADPH作为电子供体并且可获自大量的来源，其包括但不限于啤酒糖酵母（GenBank No:NP_010656，NC_001136；NP_014051，NC_001145）、大肠杆菌（GenBank No:NP_417484）、丙酮丁醇梭菌（C.acetobutylicum）（GenBank No:NP_349892，NC_003030）、B.indica（氨基酸SEQ ID NO:945）、木糖氧化产碱菌（A.xylosoxidans）（氨基酸SEQ ID NO:944）。
术语“支链酮酸脱氢酶”是指催化α-酮异戊酸转化为异丁酰-CoA（异丁酰-辅因子A）的酶，使用NAD+（烟酰胺腺嘌呤二核苷酸）作为电子受体。特定支链酮酸脱氢酶已知编号为EC1.2.4.4。这些支链酮酸脱氢酶包含四个亚基，并且来自全部亚基的序列可获自广泛的微生物，其包括但不限于枯草芽孢杆菌（GenBankNo:CAB14336、Z99116；CAB14335、Z99116；CAB14334、Z99116；以及CAB14337、Z99116）和恶臭假单胞菌（GenBankNo:AAA65614、M57613；AAA65615、M57613；AAA65617、M57613；以及AAA65618、M57613）。
如本文所用，“醛脱氢酶活性”是指具有醛脱氢酶的生物学功能的任何多肽，包括本文所提供的例子。这类多肽包括催化醛氧化（脱氢）的多肽。这类多肽包括催化异丁醛向异丁酸转化的多肽。此类多肽还包括对应于酶学委员会编号EC1.2.1.3、EC1.2.1.4或EC1.2.1.5的多肽。此类多肽可通过本领域熟知的和本文所公开的方法被确定。
如本文所用，“醛氧化酶活性”是指具有醛氧化酶的生物学功能的任何多肽，包括本文所提供的例子。这类多肽包括催化通过醛成为羧酸的多肽。这类多肽包括催化异丁醛向异丁酸转化的多肽。此类多肽还包括对应于酶学委员会编号EC1.2.3.1的多肽。此类多肽可通过本领域熟知的和本文所公开的方法被确定。
如本文所用，“丙酮酸脱羧酶活性”是指具有丙酮酸脱羧酶的生物学功能的任何多肽的活性，包括本文所提供的例子。此类多肽包括催化丙酮酸向乙醛的转化的多肽。此类多肽还包括对应于酶学委员会编号4.1.1.1的多肽。此类多肽可通过本领域熟知的和本文所公开的方法被确定。具有丙酮酸脱羧化活性的多肽可以是，例如，PDC1、PDC5、PDC6或它们的任何组合。
如本文所用，“乙酰乳酸还原酶活性”是指具有催化乙酰乳酸向DHMB转化的能力的任何多肽的活性。此类多肽可通过本领域熟知的和本文所公开的方法被确定。
如本文所用，“DHMB”是指2,3-二羟基-2-甲基丁酸。DHMB包括具有2S，3S构型的“快DHMB”和具有2S，3R构型的“慢DHMB”。参见Kaneko等人，Phytochemistry39:115-120（1995），其全文以引用的方式并入本文，并且将快DHMB称为angliceric酸而慢DHMB称为tigliceric酸。
如本文所用，“降低的活性”是指与导致该降低的活性的变化之前多肽的已知的生物学活性相比，该多肽的相同的生物学活性的任何可测量的下降。此类变化可包括多肽或编码多肽的多核苷酸的修饰，如本文所述。本文所公开的多肽的降低的活性可通过本领域熟知的和本文所公开的方法测定。
如本文所用，“被除去的活性”是指与导致该被除去的活性的变化之前多肽的已知的生物学活性相比，该多肽的相同的生物学活性的完全消失。此类变化可包括多肽或编码多肽的多核苷酸的修饰，如本文所述。被除去的活性包括与导致该被除去的活性的变化之前多肽的生物学活性相比，该多肽的不能被测量到的相同的生物学活性。本文所公开的多肽的被除去的活性可通过本领域熟知的和本文所公开的方法测定。
术语“碳底物”或“可发酵的碳底物”是指本发明的宿主生物体能够代谢的碳源，和尤其是选自：单糖、寡糖、多糖、和单碳底物或它们的混合物的碳源。本文提供了非限制性的碳底物的例子，包括但不限于单糖、寡糖、多糖、乙醇、乳酸盐、琥珀酸盐、甘油、二氧化碳、甲醇、葡萄糖、果糖、蔗糖、木糖、阿拉伯糖、右旋糖、或它们的混合物。其它碳底物可包括乙醇、乳酸盐、琥珀酸盐或甘油。
如本文所用，“发酵液体培养基”是指水、糖（可发酵碳源）、溶解固体（在其存在的情况下）、微生物产生的醇、产物醇及发酵容器内具有的所有其它物质组分的混合物，其中产物醇通过在微生物的存在下使糖反应生成醇、水和二氧化碳（CO2）而制得。有时，如本文所用，术语“发酵培养基”和“发酵混合物”可与“发酵液体培养基”同义使用。
如本文所用，“生物质”是指包含提供可发酵糖的可水解淀粉的天然产品，包括任何纤维素或木质纤维素物质以及包含纤维素的物质，并且任选地还包含半纤维素、木质素、淀粉、低聚糖、二糖和/或单糖。生物质也可包含附加组分如蛋白质和/或脂质。生物质可来源于单一来源，或者生物质可包括来源于一种以上来源的混合物。例如，生物质可包括玉米芯和玉米秸秆的混合物，或草和叶片的混合物。生物质包括但不限于生物能作物、农业残余物、市政固体垃圾、工业固体垃圾、来自造纸业的淤渣、庭院垃圾、木材和林业垃圾。生物质的例子包括但不限于：玉米粒、玉米芯、作物残余物如玉米壳、玉米秸秆、草、小麦、裸麦、小麦秸秆、大麦、大麦秸秆、干草、稻秆、柳枝稷、废纸、甘蔗渣、高粱、大豆、从谷物的研磨中获得的组分、树、枝、根、叶、木屑、锯末、灌木和灌丛、蔬菜、水果、花、动物粪肥、以及它们的混合物。
如本文所用，“原料”意指包含可发酵碳源的产品。适用的原料包括但不限于裸麦、小麦、玉米、糖甘蔗以及它们的混合物。
本文所用术语“有氧条件”是指有氧气存在下的生长条件。
如本文所用术语“微氧条件”是指有低水平的氧气（即低于正常的大气氧气水平）存在的生长条件。
本文所用术语“厌氧条件”是指不存在氧气的生长条件。
如本文所用术语“比活性”定义为一定量蛋白的活性单位。因此，比活性并非直接测得，而是通过将1）酶样品的活性（单位/ml）除以2）该样品中的蛋白质浓度来计算，所以比活性以单位/mg来表达，其中酶的单位定义为所形成产物的摩尔/分钟。纯的、完全活性的酶样品的比活性是这种酶的特性。蛋白混合物的比活性是量度由感兴趣的活性酶组成的样品中的蛋白相对分数。
术语“kcat”和“KM”为本领域中的技术人员所知并且描述于EnzymeStructure and Mechanism，第2版（Ferst；W.H.Freeman Press，NY，1985；第98-120页）。米氏常数KM是产生半最大速度的底物浓度。术语“kcat”（通常称为“转换数”）定义为转化成为产物的底物分子最大数/活性位点/单位时间，或酶转换次数/单位时间。kcat=Vmax/[E]，其中[E]是酶的浓度（Ferst，参见上文）。术语“总转换”和“总转换数”在本文用于指KARI酶与底物反应形成的产物的量。
术语“催化效率”定义为酶的kcat/KM。催化效率用于测定酶对底物的特异性。
术语“分离的核酸分子”、“分离的核酸片段”和“基因构建体”可以互换使用，并应指单链或双链的RNA或DNA聚合体，任选含有合成的、非天然的或改变的核苷酸碱基。DNA聚合物形式的分离的核酸片段可由cDNA、基因组DNA或合成DNA的一个或多个片段构成。
术语“氨基酸”是指蛋白质或多肽的基本化学结构单元。在本文中使用下列缩写来表示具体的氨基酸：
术语“基因”指可被表达为特定蛋白质的核酸片段，其任选包括编码序列前的调节序列（5'非编码序列）和编码序列后的调节序列（3'非编码序列）。“天然基因”是指天然存在的具有其自己的调控序列的基因。“嵌合基因”指不是天然基因的任何基因，包含在天然情况下不是一起存在的调控序列和编码序列。因此，嵌合基因可包括源于不同来源的调节序列和编码序列，或者包括源于同一来源但以不同于天然存在的方式排列的调节序列和编码序列。“内源基因”指在微生物体基因组中处于其天然位置的天然基因。“外来”基因指宿主微生物中通常不存在的但是通过基因转导被导入宿主微生物的基因。外来基因可以包含插入到非天然微生物体内的天然基因，或嵌合基因。“转基因”是已通过转化方法导入基因组内的基因。
如本文所用，“天然的”是指多核苷酸、基因或多肽的形式与天然存在的一样，带有其自身的调控序列（在其存在的情况下）。
如本文所用，术语“编码序列”或“编码区”是指编码特定氨基酸序列的DNA序列。“合适的调控序列”指位于编码序列的上游（5'非编码序列）、中间或下游（3'非编码序列）的核苷酸序列，其可影响相关编码序列的转录、RNA加工或稳定性或者翻译。调节序列可以包括启动子、翻译前导序列、内含子、多腺苷酸化识别序列、RNA加工位点、效应器结合位点和茎环结构。
如本文所用，“内源”是指多核苷酸、基因或多肽在其在生物体中或生物体的基因组中的天然位置的天然形式。“内源多核苷酸”包括在其在生物体的基因组中的天然位置的天然多核苷酸。“内源基因”包括在其在生物体的基因组中的天然位置的天然基因。“内源多肽”包括处于其在生物体的天然位置的天然多肽，其转录并翻译自处于生物体基因组的天然位置的天然多核苷酸或基因。
术语“异源”在用于提及多核苷酸、基因、或多肽时是指在宿主生物体中没有正常地发现的多核苷酸、基因、或多肽。“异源”也包括原生的编码区、或它们的一部分，即以不同于对应的原生基因的形式重新导入源生物体，例如，不在所述生物体基因组中的原生位置上。所述异源多核苷酸或基因可通过例如基因转移的方式导入宿主生物体。异源基因可包括天然的编码区，其带有重新导入所述天然宿主的非天然调节区。例如，异源基因可包括是被再引入至天然宿主的嵌合基因的一个部分的天然编码区，其中所述嵌合基因包括非天然的调控区。“异源多肽”包括重新引入源生物体的处于不同于对应的天然多肽形式的天然多肽。
“转基因”是已通过转化方法导入基因组内的基因。
如本文所用，术语“修饰”是指本文公开的多核苷酸的改变（所述改变导致由所述多核苷酸编码的多肽的降低或消除的活性）以及本文所公开的多肽的改变，（所述改变导致该多肽的降低或消除的活性）。此类改变能够通过本领域熟知的方法实现，包括但不限于删除、突变（例如，自发诱变、随机诱变、由增变基因导致的诱变、或转座诱变）、替换、插入、下调、改变细胞定位、改变多核苷酸或多肽的状态（例如，甲基化、磷酸化或泛素化）、移除辅因子、反义RNA/DNA的引入、干扰RNA/DNA的引入、化学修饰、共价修饰、用UV或X-射线照射、同源重组、有丝分裂重组、启动子置换法、和/或它们的组合。通过将特定多核苷酸或多肽的序列与同源的多核苷酸或多肽（例如酵母或细菌的）的序列进行比较，并使高度同源区（保守区）或共有序列中进行的修饰的数量最大化，可发现用以确定哪些核苷酸或氨基酸残基可被修饰的指导。
术语“重组基因表达元件”是指表达一个或多个特异性蛋白的核苷酸片段，其包括前面的调控序列（5'非编码序列）和之后的（3'终止序列）蛋白编码序列。嵌合基因是重组基因表达元件。操纵子的编码区可形成重组基因表达元件，一起的还有可操作地连接的启动子和终止区。
“调控序列”是指位于编码序列上游（5'非编码序列）、内部、或下游（3'非编码序列）的核苷酸序列，并且能影响相关的编码序列的转录、RNA加工或RNA稳定性、或翻译。调控序列可包括启动子、增强子、操纵子、阻遏子、转录终止信号、翻译引导序列、内含子、多聚腺苷酸识别序列、RNA加工位点、效应器结合位点和茎-环结构。
术语“启动子”是指能够控制编码序列或功能RNA表达的核苷酸序列。一般来讲，编码序列位于启动子序列的3'端。启动子可完全来源于天然基因，或由来自天然存在的不同启动子的不同元件组成，或甚至包含合成的核酸片段。本领域内的技术人员应当理解，不同的启动子可以在不同的组织或细胞类型中，或者在不同的发育阶段，或者响应不同的环境条件或生理条件而引导基因的表达。通常将在大多数细胞类型中、在大多数情况下引起基因表达的启动子称为“组成型启动子”。另一方面，“诱导型启动子”在所述启动子被启动子特异的信号或分子诱导或打开时导致基因表达。进一步认识到，因为在多数情况下还不能完全确定调控序列的确切范围，所以不同长度的DNA片段可具有相同的启动子活性。例如，应当理解“FBA1启动子”可用于指来自于FBA1基因的启动子区的片段。
如本文所用的术语“终止子”是指位于编码序列下游的DNA序列。这包括多腺苷酸化识别序列和编码能影响mRNA加工或基因表达的调节信号的其它序列。多腺苷酸化信号通常表征为影响多腺苷酸片添加到mRNA前体的3'端。3'区可影响相关编码序列的转录、RNA加工或稳定性或翻译。应认识到，因为在大多数情况下还不能完全确定调控序列的确切范围，所以不同长度的DNA片段可具有相同的终止子活性。例如，应当理解“CYC1终止子”可用于指来源于CYC1基因启动子区的片段。
术语“可操作地连接”是指单个核酸片段上的核酸序列的关联，使得其中一个核酸序列的功能受到另一个核酸序列的影响。例如，当启动子能够影响编码序列的表达（即该编码序列受到该启动子的转录控制）时，则该启动子与该编码序列可操作地连接。编码序列可以按有义或反义的取向可操作地连接至调控序列。
如本文所用，术语“表达”指源于本发明核酸片段的正义RNA（mRNA）或反义RNA的转录和稳定积聚。表达也可指将mRNA翻译成多肽。
如本文所用，术语“过表达”是指比相同的或相关的基因的内源性表达更高的表达。如果异源基因的表达比可比较的内源基因的表达更高，则所述异源基因是过表达的。术语过表达是指宿主细胞中的核酸或蛋白质水平的提高。因此，过表达可由于宿主细胞中的内源序列的转录或翻译水平的提高所致，或可由于宿主细胞中的异源序列的引入所致。过表达还可由于核酸或蛋白质序列稳定性的提高所致。
如本文所用，术语“转化”指将核酸片段转移至宿主微生物体的基因组内，导致在基因上稳定遗传。含有转化核酸片段的宿主微生物被称为“转基因”或“重组”或“转化”微生物。
术语“质粒”、“载体”和“盒”指通常携带有不属于细胞中心代谢的部分的基因的染色体外元件，并且常常是环状双链DNA片段的形式。这类元件可以是源自任何来源的自主复制序列、基因组整合序列、噬菌体或单链或双链DNA或RNA的核苷酸序列（线性或环状），其中多个核苷酸序列已连接或重组进入独特构建体中，该独特构建体能够将所选基因产物的启动子片段和DNA序列与相应的3'端非翻译序列一起导入细胞中。“转化盒”指包含外来基因并且除该外来基因外还含有有利于转化特定宿主细胞转化的元件的特定载体。“表达盒”指包含外来基因并且除该外来基因外还具有使得该基因在外来宿主中的表达增强的元件的特定载体。
术语“位点饱和文库”是指在特定氨基酸位点处包含具有最高达并同时包括全部20种可能的氨基酸的随机替换的文库。
术语“易错PCR”是指通过实施缺陷型或‘出错型’PCR反应条件来加入随机复制错误，所述PCR反应条件在特定的核苷酸序列中产生突变的随机化文库。
如本文所用，术语“密码子简并性”指允许核苷酸序列在不影响所编码的多肽的氨基酸序列的情况下发生变化的遗传密码的性质。技术人员非常了解具体宿主细胞在使用核苷酸密码子以确定给定氨基酸时所表现出的“密码子偏倚性”。因此，当合成基因用以改善在宿主细胞中的表达时，期望对基因进行设计，使得其密码子使用频率接近该宿主细胞优选的密码子使用频率。
如它是指用于转化各种宿主的基因或编码区的核酸分子，术语“密码子优化的”是指在基因或编码区的核酸分子中的密码子改变，反映了在没有改变DNA编码的多肽情况下宿主生物典型的密码子使用情况。此类优化包括将至少一个、或多于一个、或显著的数目的密码子替换为在那种生物体中使用频率更高的一个或多个密码子。
包含编码任何多肽链的氨基酸的密码子的核苷酸序列中的偏差，允许编码该基因的序列中的变型。由于每一密码子由三个核苷酸组成，而组成DNA的核苷酸限于四种特异性碱基，存在64种可能的核苷酸组合，其中的61种编码氨基酸（其余三种密码子编码结束翻译的信号）。本文将显示哪些密码子编码哪些氨基酸的“遗传密码”重制为表2A。因此，许多氨基酸被分配了多于一种的密码子。例如，氨基酸丙氨酸和脯氨酸由四种三联体编码，丝氨酸和精氨酸由六种，而色氨酸和甲硫氨酸仅由一种三联体编码。这种简并性允许DNA碱基组成在宽范围内变化而不会改变由该DNA编码的蛋白质的氨基酸序列。
表2A：标准遗传密码
Figure BDA0000419940220000301
对于使用特定密码子来编码特定氨基酸向延伸中的肽链中的插入，许多生物表现出偏好。密码子偏好、或密码子偏倚性、生物体间密码子使用的差异是遗传密码子的简并性造成的，在很多生物体中有很详细的记录。密码子偏倚性常与信使RNA（mRNA）的翻译效率有关，这继而据信取决于特别是被翻译的密码子的特性和特定转运RNA（tRNA）分子的可用性。选定的tRNA在细胞中的优势一般而言反映了在肽的合成中最经常使用的密码子。相应地，可基于密码子优化对基因进行加工，以使基因在给定生物中的表达最优化。
考虑到对于多种多样的动物、植物和微生物物种存在大量的基因序列，计算密码子使用的相对频率是可能的。密码子使用表是易得的，例如在www.kazusa.or.jp/codon/（2008年3月20日访问）提供的“密码子利用率数据库”，并且这些表格可以在许多方面进行调整。参见Nakamura，Y.等人.Nucl.AcidsRes.28:292（2000）。通过GenBankRelease128.0[2002年2月15日]计算的酵母的密码子利用率表被重制为下文的表2B。该表使用mRNA命名，因此，该表使用存在于RNA中的尿嘧啶（U），而不是存在于DNA中的胸腺嘧啶（T）。表2B经过了调整，从而此计算了每个氨基酸的频率，而非全部64个密码子。
表2B：啤酒糖酵母的密码子利用率表
Figure BDA0000419940220000311
Figure BDA0000419940220000321
Figure BDA0000419940220000331
通过利用该表或类似的表，本领域的普通技术人员可将这些频率应用于任何给定的多肽序列，并产生密码子优化的编码所述多肽的编码区的核酸片段，但其使用针对给定的物种优化的密码子。
以优化的频率随机分配密码子来编码给定的多肽序列，可通过计算每种氨基酸的密码子频率，然后随机地为给多肽序列分配密码子而人工地实现。此外，多种算法和计算机软件程序是本领域的普通技术人员容易获得的。例如，可从DNAstar，Inc.，Madison，WI获得的Lasergene软件包中的“EditSeq”功能，可从InforMax，Inc.，Bethesda，MD获得的VectorNTI套件中的“backtranslation”功能，和可从Accelrys，Inc.，SanDiego，CA获得的GCG-Wisconsin软件包中的“backtranslate”功能。此外，多种用于对编码区序列进行密码子优化的资源是可公开获得的，例如www.entelechon.com/bioinformatics/backtranslation.php？lang=eng（2008年4月15日访问）的“backtranslation”功能，和可在http://bioinfo.pbi.nrc.ca:8090/EMBOSS/index.html（2002年7月9日访问）使用的“backtranseq”功能。构建基本的算法来基于给定的频率分配密码子也可由本领域的普通技术人员用基本的数学函数实现。
密码子优化的编码区也可通过本领域的技术人员已知的多个方法进行设计，包括软件包如“syntheticgenedesigner”（userpages.umbc.edu/～wug1/codon/sgd/，2012年3月19日访问）。
当在合适的温度和溶液离子强度条件下单链形式的核酸片段可以退火至另一核酸片段时，多核苷酸或核酸片段“可杂交”至另一核酸片段，例如cDNA、基因组DNA或RNA分子。杂交和洗涤条件是为人所熟知的并且例示于Sambrook，J.，Fritsch，E.F.和Maniatis，T.Molecular Cloning:ALaboratory Manual，第2版.，Cold Spring Harbor Laboratory:Cold SpringHarbor，NY（1989）中，尤其是第11章和其中的表11.1（全文以引用的方式并入本文）。温度和离子强度条件确定了杂交的“严格性”。可调节严格性条件以筛选中度相似的片段（例如来自远缘生物的同源序列），到筛选高度相似的片段（例如从近缘生物复制功能性酶的基因）。杂交后的洗涤决定了严格性条件。一组条件使用一系列洗涤，开始是6×SSC、0.5%SDS在室温下洗涤15分钟，然后用2×SSC、0.5%SDS在45℃下重复30分钟，再用0.2×SSC、0.5%SDS在50℃下重复洗涤两次，每次30分钟。另一组严格性条件采用更高的温度，其中洗涤与上述洗涤相同，不同的是最后两次在0.2XSSC、0.5%SDS中洗涤30分钟时的温度被增加到60℃。另一组高严格性条件是最后两次洗涤是在65℃下用0.1×SSC、0.1%SDS进行。例如，另一组严格性条件包括在0.1XSSC、0.1%SDS中于65℃下杂交并用2XSSC、0.1%SDS洗涤，随后用0.1XSSC、0.1%SDS洗涤。
杂交需要两种核酸含有互补序列，但取决于杂交的严格性，碱基之间可能会发生错配。用于使核酸杂交的合适的严格性取决于核酸的长度和互补的程度，它们为本领域熟知的变量。两条核苷酸序列之间的相似性或同源性程度越高，具有那些序列的核酸的杂交体的Tm值就越大。核酸杂交的相对稳定性（对应较高的Tm）按以下顺序依次降低：RNA:RNA、DNA:RNA、DNA:DNA。就长度大于100个核苷酸的杂交体而言，已有计算Tm的方程式（参见Sambrook等人，参见上文，9.509.51）。对于较短核酸（即寡核苷酸）的杂交，错配的位置变得更重要，而且寡核苷酸的长度决定了其特异性（参见Sambrook等人，参见上文，11.711.8）。在一个实施例中，可杂交核酸的长度为至少约10个核苷酸。在一个实施例中，可杂交核酸的最小长度为至少约15个核苷酸；至少约20个核苷酸；或长度为至少约30个核苷酸。此外，技术人员将认识到，必要时可根据诸如探针长度之类的因素来调节温度和洗涤溶液的盐浓度。
如本文所用，术语“多肽”旨在涵盖单数的“多肽”以及复数的“多肽”，并指由单体（氨基酸）通过酰胺键（也被称为肽键）线性连接组成的分子。术语“多肽”是指任何两个或更多个氨基酸的链，并且不涉及产物的特定长度。因此，肽、二肽、三肽、寡肽、“蛋白”、“氨基酸链”、或其它任何用于指由两个或更多个氨基酸组成的一条链或多条链的术语，都包括在“多肽”的定义内，并且术语“多肽”可用于替换或与这些术语中任一项互换使用。多肽可来源于天然生物来源或由重组技术产生，但不一定是由一条指定的核酸序列翻译的。它可由任何方式生成，包括通过化学合成。
以“分离的”多肽或片段形式的变体和其衍生物拟为不在其自然环境下的多肽。不需要特别的纯化水平。例如，分离的多肽可从它原生的或天然的环境中去除。在宿主细胞中重组产生的多种多肽和蛋白考虑以所述发明目的进行分离，即为原生的或重组的多肽，其已通过任何适宜的技术分离、分馏、或部分或大幅纯化。
如本文所用，术语“变体”和“突变体”是同义的，并且是指由于一个或多个氨基酸插入、缺失、突变和替换（使用，例如，重组DNA技术来产生，诸如诱变）而与具体提及的多肽有所区别的多肽。可通过比较特定多肽序列与同源多肽的序列，例如酵母或细菌多肽的序列，并且最小化在高同源性区（保守区）氨基酸序列变化的数量或用共有序列替换氨基酸的数量，从而得出判断哪个氨基酸残基可被替换、添加、或删除而不影响受关注活性的指导意见。
如本文所用，“工程化多肽”是指合成的多肽，即，在某些方面不同于天然存在多肽。
作为另外一种选择，编码这些相同或相似多肽的重组多核苷酸变体可以合成或通过利用遗传密码子的冗余而选出。各种密码子替换，如产生各种限制性位点的沉默变化，可引入以优化克隆到质粒表达载体或病毒表达载体。多核苷酸序列的多种突变可体现在所述多肽或添加到所述多肽的其它肽的结构域中以改变多肽中任意部分的性质。例如，突变能用于降低或消除靶蛋白的表达，并且包括但不限于整个或部分基因的缺失、基因中DNA片段的插入（在启动子区或编码区），因此所述蛋白不表达或低水平表达；在编码区引入突变即增加终止密码子或移框使得有功能的蛋白不表达；以及在编码区引入一个或多个突变以改变氨基酸，因此表达无功能的或较少酶活性的蛋白。
氨基酸“替换”可以是用具有相似的结构和/或化学特性的另一种氨基酸替换一种氨基酸的结果，即保守的氨基酸替换，或它们可以是用具有不同的结构和/或化学特性的另一种氨基酸替换一种氨基酸的结果，即非保守的氨基酸替换。“保守的”氨基酸替换可在参与残基在极性、电荷、溶解度、疏水性、亲水性、或两亲性本质相似性的基础上进行。例如，非极性（疏水）氨基酸包括丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和甲硫氨酸；极性中性氨基酸包括甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺；带正电的（碱性）氨基酸包括精氨酸、赖氨酸和组氨酸；并且带负电的（酸性）氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸。作为另外一种选择，“非保守”氨基酸替换可通过选择这些氨基酸中任一项在极性、电荷、溶解度、疏水性、亲水性或两亲性特性的差异而进行。当在结构上或功能上被重组蛋白质所容受时，“插入”或“缺失”可处于改动范围内。通过系统地利用重组DNA技术产生多肽分子中的氨基酸的插入、缺失、或替换，并检测所得到的重组变体的活性，可以以实验方法确定所允许的改动。
氨基酸或核苷酸序列的“基本部分”是指这样的部分，该部分包括的多肽的氨基酸序列或基因的核苷酸序列足以通过推定而鉴定所述多肽或基因，所述鉴定或者可以由本领域技术人员通过人工评价序列来完成，或者可以利用诸如BLAST（Altschul，S.F.等人，J.Mol.Biol.，215:403-410（1993））的算法通过计算机自动化的序列比对和鉴定来进行。一般来讲，为了推测鉴定多肽或核酸序列是否与已知的蛋白质或基因同源，需要有十个或更多邻接氨基酸或者三十个或更多核苷酸的序列。此外，对于核苷酸序列，包含20-30个邻接核苷酸的基因特异性寡核苷酸探针可用于序列依赖性的基因鉴定（如DNA杂交）和基因分离（如细菌菌落或噬菌斑的原位杂交）的方法中。此外，12-15个碱基的短寡核苷酸可在PCR中用作扩增引物，以便获得包含该引物的特定核酸片段。因此，核苷酸序列的“基本部分”包含的序列足以特异性地鉴定和/或分离包含该序列的核酸片段。本说明书讲授了编码特定蛋白质的完整的氨基酸和核苷酸序列。利用本文所公开的序列，技术人员现在可以将本发明所公开序列的全部或基本部分用于本领域技术人员已知的目的。因此，本发明包括如随附的序列表中所示的完整序列，以及如上文定义的这些序列的基本部分。
术语“互补的”用于描述核苷酸碱基之间能够彼此杂交的关系。例如，针对DNA，腺嘌呤与胸腺嘧啶互补并且胞嘧啶与鸟嘌呤互补，和针对RNA，腺嘌呤与尿嘧啶互补并且胞嘧啶与鸟嘌呤互补。
术语“百分比同一性”如本领域已知是指通过比较多个序列测定的、两个或更多个多肽序列或两个或更多个多核苷酸序列之间的关系。本领域中“同一性”也意为多肽或多核苷酸序列之间的序列关联度，视情况而定，如由此类序列字符串的匹配来测定。“同一性”和“相似性”可容易地通过已知方法计算出来，所述的方法包括但不限于以下文献中所描述的那些：1.）ComputationalMolecularBiology（Lesk，A.M.编辑）OxfordUniversity：NY（1988）；2.）Biocomputing:InformaticsandGenome Projects（Smith，D.W.编辑）Academic：NY（1993）；3.）Computer AnalysisofSequenceData，PartI（Griffin，A.M.和Griffin，H.G.编辑）Humania：NJ（1994）；4.）SequenceAnalysisinMolecularBiology（vonHeinje，G.编辑），Academic（1987）；和5.）SequenceAnalysisPrimer（Gribskov，M.和Devereux，J.编辑）Stockton：NY（1991）。
确定同一性的方法经设计用于给出待测试序列之间的最佳匹配。确定同一性和相似性的方法在可公开获得的计算机程序中编成代码。序列比对和同一性百分比计算可以用LASERGENE生物信息学计算软件包（LASERGENE bioinformatics computing suite（DNASTARInc.，Madison，WI））中的MegAlignTM程序进行。序列多重比对采用“Clustal比对方法”进行，其涵盖几种算法包括“ClustalV比对方法”，其对应于标记为ClustalV的比对方法（描述见Higgins和Sharp，CABIOS.5:151-153（1989）；Higgins，D.G.等人，Comput.申请Biosci.，8：189-191（1992））中，并且可以在LASERGENE生物信息学计算软件包（DNASTARInc.）中的MegAlignTM程序中找到的比对方法。对于多重比对，默认值对应于GAPPENALTY=10、以及GAPLENGTHPENALTY=10。用Clustal方法进行成对比对和蛋白质序列的百分比同一性计算的默认参数为KTUPLE=1、GAPPENALTY=3、WINDOW=5、以及DIAGONALSSAVED=5。对于核酸，这些参数为KTUPLE=2、GAPPENALTY=5、WINDOW=4、以及DIAGONALSSAVED=4。在使用ClustalV程序进行序列比对后，通过查看同一程序中的“序列距离”表格有可能获得“百分比同一性”。另外所述“ClustalW比对方法”是可用的并对应于标记为Clustal W的比对方法（描述见Higgins和Sharp，CABIOS.5:151-153（1989）；Higgins，D.G.等人，Comput.Appl.Biosci.8:189-191（1992）中有所描述）和可以在LASERGENE生物信息学计算软件包（DNASTAR Inc.）中的MegAlignTM v6.1程序中找到的比对方法。用于多重比对的默认参数（GAPPENALTY=10、GAPLENGTHPENALTY=0.2、Delay DivergenSeqs（%）=30、DNA Transition Weight=0.5、Protein WeightMatrix=Gonnet系列、以及DNA Weight Matrix=IUB）。在使用Clustal W程序进行序列比对后，通过查看在同一程序中的“序列距离”表有可能获得“百分比同一性”。
本领域的技术人员充分理解许多水平的序列一致性对鉴定多肽有用，诸如来自其它物种的多肽，其中此类多肽具有相同或相似的功能或活性，或对描述相应的多核苷酸有用。百分比同一性的有用例子包括但不限于：55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%或95%，或者55%至100%的任何整数百分比可用于描述本发明，诸如55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%。适宜的多核苷酸片段不仅具有上述同源性，而且典型地包含多核苷酸有至少50个核苷酸、至少100个核苷酸、至少150个核苷酸、至少200个核苷酸、或至少250个核苷酸。此外，适宜的具有上述同源性的多核苷酸片段编码的多肽有至少50个氨基酸、至少100个氨基酸、至少150个氨基酸、至少200个氨基酸、或至少250个氨基酸。
术语“序列分析软件”指可用于分析核苷酸或氨基酸序列的任何计算机算法或软件程序。“序列分析软件”可商购获得或独立开发。典型的序列分析软件将包括但不限于：1）GCG程序软件包（Wisconsin PackageVersion9.0，Genetics Computer Group（GCG），Madison，WI）；2）BLASTP、BLASTN、BLASTX（Altschul等人，J.Mol.Biol.，215:403-410（1990））；3.）DNASTAR（DNASTAR，Inc.Madison，WI）；4.）Sequencher（Gene Codes Corporation，AnnArbor，MI）；以及5.）整合了Smith-Waterman算法的FASTA程序（W.R.Pearson，Comput.MethodsGenomeRes.，[Proc.Int.Symp.]（1994），MeetingDate1992，111-20.编辑：Suhai，Sandor.Plenum：NewYork，NY）。在本专利申请案的上下文中应当理解，使用序列分析软件进行分析时，除非另外指明，否则分析结果将基于所参考程序的“默认值”。在此所用的“默认值”是指在首次初始化软件时软件最初加载的任何值或参数集。
本文使用的标准重组DNA和分子克隆技术在本领域中是为人所熟知的，并且更为全面地描述于Sambrook，J.，Fritsch，E.F.和Maniatis，T.，Molecular Cloning:A Laboratory Manual，第二版，Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold Spring Harbor，NY（1989）（此后称为“Maniatis”）；以及Silhavy，T.J.，Bennan，M.L.和Enquist，L.W.，Experiments with Gene Fusions，Cold Spring Harbor Laboratory Press，ColdSpring Harbor，NY（1984）；以及Ausubel，F.M.等人，Current Protocolsin Molecular Biology，Greene Publishing Assoc.and Wiley-Interscience出版（1987）。此处所用的附加的方法参见Methods in Enzymology，第194卷，Guide to Yeast Genetics and Molecular and Cell Biology（部分A，2004，Christine Guthrie和GeraldR.Fink（编辑），Elsevier AcademicPress，San Diego，CA）。其它的分子工具是本领域已知的，包括通过重叠延伸聚合酶链反应（PCR）的拼接（Yu等人（2004）Fungal Genet.Biol.41:973–981），对于啤酒糖酵母（Saccharomyces cerevisiae）URA3基因座突变的阳性选择（Boeke，J.D.等人（1984）Mol.Gen.Genet.197，345-346；M A Romanos等人，Nucleic Acids Res.1991年1月11日；19（1）:187）,cre-lox位点特异性重组系统以及突变lox位点和FLP底物突变（Sauer，B.（1987）MolCellBiol7:2087-2096；Senecoff等人（1988）Journal of Molecular Biology，第201卷，第2期，第405-421页；Albert等人（1995）The Plant Journal.第7卷，第4期，第649-659页），无缝基因删除（Akada等人（2006）Yeast；23（5）:399-405），以及空位修复方法（Ma等人，Genetics58:201-216；1981）。
对本文所公开的重组宿主细胞的遗传操纵可利用标准遗传技术和筛选进行，并且可在任何适合遗传操纵的宿主细胞中完成（Methods in YeastGenetics，2005，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，第201-202页）。
在多个实施例中，本文公开的重组宿主细胞可以是可用于遗传修饰和重组基因表达的任何酵母或真菌宿主，包括本文它处提及的酵母，例如在表7中。在其它实施例中，重组宿主细胞可以是伊萨酵母属（Issatchenkia）、接合酵母属（Zygosaccharomyces）、裂殖酵母属（Schizosaccharomyces）、德克酵母属（Dekkera）、球拟酵母属（Torulopsis）、酒香酵母属（Brettanomyces）、有孢圆酵母属（Torulaspora）、汉逊酵母属（Hanseniaspora）、克鲁维酵母属（Kluveromyces）、耶氏酵母属（Yarrowia）的成员以及假丝酵母属（Candida）的一些物种。
具有KARI活性的多肽
在一些实施例中，本文提供的重组宿主细胞和方法致力于在异丁醇的微生物生产中产生的需求，其中KARI酶发挥关键作用。在图1中示出的异丁醇生物合成途径中，KARI酶催化乙酰乳酸至二羟基异戊酸（DHIV）的底物至产物的转化。具有酮醇酸还原异构酶活性的多肽公开于美国申请公布US2011/0244536中并以引用的方式并入，其为KARI的SLSL进化支成员。本文公开的具有KARI活性的多肽据发现对于异丁醇生产有效。KARI的SLSL进化支包括表3中列出的KARI酶。
表3：有效的KARI
Figure BDA0000419940220000411
如本文描述和展示，本申请人已发现了另外的KARI酶以及所述另外KARI的变体，其产生了与相对于来自乳酸乳球菌的KARI所观测结果是可比较的和/或超过其的异丁醇生产。当在相同的条件下与对于来自乳酸乳球菌的KARI所观测结果相比较时，这类KARI酶和变体产生了可比较的或更高的异丁醇滴度和/或更为高效的异丁醇产率。因此，在多个实施例中，在异丁醇生产途径中发挥功能的具有KARI活性的多肽具有与乳酸乳球菌KARI（SEQ ID NO:380）相比较是可比较的或更优的异丁醇滴度和/或有效异丁醇产率。
这类具有KARI活性的多肽可因此而适合于异丁醇生产。应当理解通过使用可获自本领域的结构和序列信息的组合可构建包含KARI活性和与例示的序列小于100%同一性的多肽以用于异丁醇生物合成途径。例如，大肠杆菌KARI酶的
Figure BDA0000419940220000421
分辨率晶体结构已被解析（Tyagi等人，ProteinSci.，14:3089-3100，2005），铜绿假单胞菌KARI（Ahn等人，J.Mol.Biol.，328:505-515，2003）并且来自菠菜的KARI酶的结构也被解析（BiouV.等人，TheEMBOJournal，16:3405-3415，1997）。此外，本文描述了序型HMM（本文中提供；表Z），其使用具有经实验验证的25种KARI蛋白（如表1描述）的氨基酸序列制成。所述KARI来自于荧光假单胞菌Pf-5、硫磺矿硫化叶菌P2、耐超高温热棒菌菌株IM2、盐碱古菌（Natronomonas pharaonis）DSM2160、枯草芽孢杆菌枯草亚种菌株168（Bacillus subtilis subsp.subtilis168）、谷氨酸棒状杆菌（Corynebacteriumglutamicum）ATCC13032、莫氏褐螺菌、青枯罗尔斯通氏菌（Ralstoniasolanacearum）GMI1000、运动发酵单胞菌运动亚种ZM4、Alkalilimnicolaehrlichei MLHE-、红嘴鸥弯曲杆菌（Campylobacter lari）RM2100、水油海杆菌（Marinobacter aquaeolei）VT8、Psychrobacter arcticus273-4、Hahella chejuensisKCTC2396、脱氮硫杆菌（Thiobacillus denitrificans）ATCC25259、维涅兰德固氮菌（Azotobacter vinelandii）AvOP、丁香假单胞菌丁香致病变型B728a、丁香假单胞菌番茄致病变型菌株DC3000、恶臭假单胞菌KT2440、嗜虫假单胞菌（Pseudomonas entomophila）L48、门多萨假单胞菌（Pseudomonas mendocina）ymp、铜绿假单胞菌PAO1、蜡状芽孢杆菌ATCC10987、蜡状芽孢杆菌ATCC10987以及菠菜。使用HMMER包中的hmmsearch程序以<10-3的E值匹配该序型HMM的任何蛋白质被预期为功能性的KARI。
异丁醇生产据信利用了宿主微生物体中存在的糖酵解途径。在糖酵解中从葡萄糖产生两个分子的丙酮酸的过程中，通过3-磷酸甘油醛脱氢酶反应而存在着两个分子的NADH从NAD+的净生成。在从两个分子的丙酮酸进一步产生一个分子的异丁醇的过程中，通过KARI反应而存在着一个分子的NAD（P）H的净消耗，以及通过异丁醇脱氢酶反应而存在着一个分子的NAD（P）H的净消耗。NADH与NADPH的互变在酵母中一般是缓慢而低效的；因此，用来消耗的NADPH是通过消耗该加工中的底物的代谢过程（例如，通过戊糖磷酸途径）而产生的。与此同时，细胞致力于维持NAD+/NADH比率的体内平衡引起了异丁醇生产中产生的过量NADH被消耗于其它代谢中间体的浪费性的还原中，例如，通过甘油的生成而产生的代谢中间体（Bakker，等人，2001.Stoichiometry and compartmentationof NADH metabolism in Saccharomyces cerevisiae.FEMS Microbiol.Rev.25:15-37.）。因此，异丁醇途径所产生的NADH和所消耗的NADPH之间的不平衡可在两个方面导致从葡萄糖产生的异丁醇的摩尔收率降低：1）产生NADPH的不必要代谢运转，以及2）用于维持NAD+/NADH体内平衡而对代谢中间体的浪费性反应。在异丁醇途径中功能良好并且针对NADH具有低KM的具有KARI活性的多肽可用于改进异丁醇生产。
本文还公开了对KARI酶序列的替换（在表3和表10中提供），其用于产生具有利用NADH作为辅因子的不同能力的变体。这类变体提供了替代物，其可用于针对具体的生产条件来优化利用KARI的生物合成途径的效能，诸如异丁醇生物合成途径。例子中展示了来自粪厌氧棒状菌的具有利用NADH的不同能力的K9KARI酶变体从有氧向厌氧转换的条件下的异丁醇生产。因此，使用本发明，本领域的技术人员应能够产生重组宿主细胞，其包含SLSL进化支的KARI酶，或鹑鸡肠球菌、嗜热链球菌、乳酸乳球菌乳脂亚种MG1363、角双歧杆菌、齿双歧杆菌或粪厌氧棒状菌、乳酸乳球菌的KARI酶或其变体或活性片段，其适用于一定范围的生产条件。
本文在一些实施例中提供了多肽。其具有KARI活性并且与表3或表10或实例16、17、21的KARI酶具有至少约80%、至少约85%、至少约90%、至少约95%、至少约98%或至少约99%同一性，并且针对NADH具有小于约300μM、100μM、50μM、20μM、10μM或5μM的KM。本文在一些实施例中提供了工程化多肽，其具有KARI活性并且与表3、表10或实例16、17、21的KARI酶具有至少约80%、至少约85%、至少约90%、至少约95%、至少约98%或至少约99%同一性。在一些实施例中，这类多肽针对NADH具有小于所对应的天然酶的KM。在一些实施例中，针对NADH的KM与针对NADPH的KM的比率小于0.1，在一些实施例中小于1，在一些实施例中小于2，在一些实施例中小于4。
尤其有用于异丁醇生产的KARI酶及其变体包括但不限于来自粪厌氧棒状菌DSM14662（SEQ ID NO:643）的酮醇酸还原异构酶：“K9G9”（SEQ ID NO:644）和“K9D3”（SEQ ID NO:645），其针对NADH具有低于天然酶（SEQ ID NO:643）的KM。
本文提供的宿主细胞可包含具有酮醇酸还原异构酶的多肽。在多个实施例中，这类多肽与SEQ ID NO:643或其活性变体或者来自粪厌氧棒状菌DSM14662的KARI或其活性变体具有至少约80%、至少约85%、至少约90%、至少约95%、至少约98%或至少约99%同一性。在多个实施例中，所述多肽与SEQ ID NO:645或644至少约80%、至少约85%、至少约90%、至少约95%、至少约98%或至少约99%同一性。在多个实施例中，所述多肽包含SEQ ID NO:645或644。
在一些实施例中，具有KARI活性的多肽包含与SEQ ID NO:419[JB4P]、427[SB2]和表25和26中列出的全部变体的至少约80%、至少约85%、至少约90%、至少约95%、至少约98%或至少约99%同一性。这类变体为针对具体生产条件来优化异丁醇生物合成途径的效能提供了替代物。例子中展示了在一定条件下的异丁醇生产。
对具有KARI活性的其它多肽的鉴定
实例1中描述了对于来自多种细菌和真菌物种的KARI编码基因的生物多样性筛选，其显示了用于异丁醇生产的合适KARI。使用本发明，本领域的技术人员应容易地能够鉴定具有KARI活性的其它合适多肽。
可利用本文所公开的和本领域中可获得的序列从文献和技术人员熟知的生物信息学数据库中鉴定其它多核苷酸、基因和/或多肽的序列。例如，通过用本文提供的多核苷酸或多肽序列对可公开获得的数据库的BLAST检索能够鉴定此类序列。在此类方法中，同一性可基于Clustal W比对方法，所述方法采用GAP PENALTY=10、GAP LENGTHPENALTY=0.1和Gonnet 250系列的蛋白质权重矩阵的默认参数。
此外，本文公开的多核苷酸或多肽序列可用于鉴定天然中的其它KARI同源物。例如，本文公开的每个KARI编码核酸片段均可用于分离编码同源蛋白的基因。使用序列依赖性规程分离同源基因是本领域熟知的。序列依赖性规程的例子包括但不限于（1）核酸杂交方法；（2）DNA和RNA扩增方法，例如多种核酸扩增技术[例如，聚合酶链反应（PCR），Mullis等人的美国专利4,683,202；连接酶链反应（LCR），Tabor等人，Proc.Acad.Sci.USA82:1074（1985）；或链置换扩增反应（SDA），Walker等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，89:392（1992）]；以及（3）文库构建和互补筛选方法。
应当理解，本领域的平台技术人员使用本发明可产生本文提供的多肽的活性片段，例如，通过根据N末端的序列比对和对KARI活性的证实来截短本文提供的多肽。在多个实施例中，本文提供的粪厌氧棒状菌的KARI及其变体在N末端受到截短。在一个实施例中，从本文提供的多肽上截下了最高达并包括最初五个氨基酸。在多个实施例中，所述多肽是SEQ ID NO:27或其变体。在一个实施例中，具有KARI活性的多肽包含SEQ ID NO:635、637（分别由SEQ ID NO:636和638编码）、K9_Annabel_SH（SEQ ID NO:862，蛋白质SEQ ID NO:863）和K9_Zeke_SH（SEQ ID NO:860，蛋白质SEQ ID NO:861）以及表40中列出的任何变体。
降低针对NADH的K M
如图2和例子中示出，与野生型相比，在来自粪厌氧棒状菌的KARI酶中对应于荧光假单胞菌KARI的第50、52和53以及任选的47位上的突变产生了针对NADH具有降低的KM的KARI，证明在这些位点上的突变产生了高效率KARI的NADH接受型变体。粪厌氧棒状菌KARI的进一步突变显示了进一步降低针对NADH的KM的位置。
如本文显示（参见实例），在磷酸结合区中的氨基酸（尤其是对应于PF5KARI（SEQ ID NO:5）的第47、50、52和53位的两个或更多个位置）的替换产生了针对NADH的降低KM。因此，本文提供了来自本文列出的生物体的多肽，例如，在表3和10中列出的多肽，其具有KARI活性并且与天然氨基酸序列相比其在对应于PF5 KARI的第47、50、52和53位的四个位置中的至少两个位置上包含替换。本文提供了具有KARI活性并且在磷酸结合区中包含替换的多肽。本文提供了具有KARI活性并且在对应于K9 KARI（SEQ ID NO:27）的S56和S58的位置上包含替换的多肽。在一些实施例中，对应于S56位置的替换是A。在一些实施例中，对应于S58位置的替换是D或E。在一些实施例中，对应于S53位置的替换是Q、E、P或A。在一些实施例中，对应于S56位置的替换是V或D。在一些实施例中，对应于S58位置的替换是D或Q。在多个实施例中，所述多肽还在对应于K9 KARI（SEQ ID NO:27）的I86、N87、N107、T131或T191的一个或多个位置上包含替换。在一些实施例中，所述多肽在所标明的位置中的至少2个、至少3个、至少4个或全部位置上包含替换。在一些实施例中，对应于I86位置的替换是T或V。在一些实施例中，对应于N87位置的替换是P。在一些实施例中，对应于N107位置的替换是S。在一些实施例中，对应于T131位置的替换是C、L、A、M或V。在一些实施例中，对应于T191位置的替换是A、S、D、C或G。
在多个实施例中，所述多肽相对野生型序列包含少于10个、15个或20个替换。在多个实施例中，所述多肽以小于<10-3的E值匹配基于实验验证的KARI并且在表Z中给出的序型HMM。可使用hmmsearch（可获自Janelia Farm Research Campus，Ashburn，VA的HMMER软件包）来将序列与表Z中给出的序型HMM进行比较。
另外的具有KARI活性和降低的针对NADH的KM的多肽可使用本文描述和展示的方法获得。例如，具有KARI活性的多肽可用于构建位点饱和基因文库，如本文所述。用于构建这类基因文库的试剂盒可商购获得（例如，获自USBCorporation，Cleveland，OH，#78480.）。还可使用可商购获得的试剂盒（例如，QuickChangeIIXL定点诱变试剂盒，目录号200524，Stratagene，La Jolla，CA）进行定点诱变。用于诱变靶向位点的引物设计是本领域熟知的，并且用于鉴定诱变靶向位点的多序列对比同样是熟知的。
一旦已经生成变体，使用NADH或NADPH的KARI活性可容易地使用本领域中已知的方法或本文公开的方法来估测。例如，可通过在340nm下测量NADPH或NADH从反应中的消失或通过使用HPLC/MS测量2,3-二羟基异戊酸的形成来测定米氏常数，从而测定KARI活性。同样，可证实通过包含变体的菌株进行的异丁醇生产。
辅因子特异性
为测定辅因子特异性，可针对各辅因子在饱和乙酰乳酸下来计算Vmax/KM比率；针对NADH具有较高比率的变体应在等摩尔浓度的两种辅因子以及饱和乙酰乳酸下以NADH在高于NADPH的速度下反应。可使用本领域中已知的方法和/或本文提供的方法（参见实例16）测定NADH和NADPH的Vmax和KM值。例如，为测定NADH和NADPH的Vmax和KM值，可在多种浓度下对部分纯化的蛋白进行分析。
如本文所展示（参见实例16和18以及图8），对K9G9中另外的氨基酸的替换产生了具有提高的NADH特异性的变体。因此，本文提供了在对应于K9KARI（SEQ ID NO:27）的K57、Y53和E74的一个或多个或全部位置上包含替换的多肽。本文还提供了在对应于Y53、K57、E74、N87和K90的一个或多个或全部位置上包含替换的多肽。在多个实施例中，在对应于Y53的位置上的替换为F。在多个实施例中，在对应于K57位置上的替换为E。在多个实施例中，在对应于E74位置上的替换为G。在多个实施例中，在对应于N87位置上的替换为P。在多个实施例中，在对应于K90位置上的替换为M或L。在多个实施例中，所述变体包含对应于SEQID NO:27的S56或S58的至少一个位置上的替换，并且还包含对应于本文鉴定的SEQ ID NO:27的位置的至少一个、至少两个、至少三个或超过三个进一步的替换。
在多个实施例中，所述多肽相对野生型序列包含少于2个、3个、4个、5个、10个、15个或20个替换。在多个实施例中，所述多肽以小于<10-3的E值匹配基于实验验证的KARI并且在表Z中给出的序型HMM。
如例子中所展示，生成了K9SB2（SEQ ID NO:427）的变体并针对具有降低的NADPH亲和性的变体进行筛选，显示了另外的替换位置。因此，在多个实施例中，多肽还在对应于SEQ ID NO:427的F53、G55、A56、W59、F67、I84、L85、Q91、M94和P135的一个或多个位置上包含替换。在多个实施例中，在G55位置上的替换是D或C，在Q91位置上的替换是L，在A56位置上的替换是T或V，在P135位置上的替换是S，在F53位置上的替换是L，在M94位置上的替换是I，在F67位置上的替换是L或I，在W59位置上的替换是C，在I84位置上的替换是L，并且在L85位置上的替换是M。
KARI的结构
本领域中提供了在对具有KARI活性的多肽的鉴定和修饰中有用的结构信息，诸如此处描述的引用中的结构信息，以及在表Z和美国申请公布20100197519和20090163376（其以引用的方式并入本文）中提供的序型HMM中的结构信息。
据报道NADPH的磷酸p2'氧原子与菠菜KARI的Arg162、Ser165和Ser167的侧链形成氢键（BiouV.，等人，TheEMBOJournal，16:3405-3415，1997）。Ahn等人（J.Mol.Biol.，328:505-515，2003）进行的研究已经在将其结构与菠菜KARI的结构比较后鉴定了铜绿假单胞菌（PAO-KARI）的三个NADPH磷酸结合位点（Arg47、Ser50和Thr52）。具有结合NADH、乙酰乳酸和镁离子的PF5-KARI的结构已经根据铜绿假单胞菌PAO1-KARI的晶体结构（PDB ID 1NP3，AhnH.J.等人，J.Mol.Biol.，328:505-515，2003）进行了构建，其与PF5KARI具有92%的氨基酸序列同源性。PAO1-KARI的结构是同十二聚体，并且各十二聚体由六组具有宽广的二聚体界面的同二聚体组成。KARI的活性位点位于这个二聚体界面中。该生物装配体是由位于四面体边的六组同二聚体形成，产生了23点群对称的高度对称十二聚体。
PF5-KARI二聚体的模型是根据PAO1-KARI的单体A和单体B的坐标以及PF5-KARI的序列使用DeepView/SwissPDB viewer来构建的（Guex，N.和Peitsch，M.C.，Electrophoresis，18:2714-2723，1997）。随后在Silicon Graphics系统中将这一模型引入程序O（Jones，T.A.等人，ActaCrystallogr.A47:110-119，1991）以进行进一步改进。
PAO1-KARI的结构在活性位点中并无NADPH、底物或抑制剂或镁。因此，在乙酰乳酸结合位点中具有镁离子、NADPH和抑制剂（N-羟基-N-异丙基草氨酸酯）的菠菜KARI结构（PDB ID 1yve，BiouV.等人，TheEMBO Journal，16:3405-3415，1997.）被用于构建这些分子在活性位点中的模型。该植物KARI与PF5-或PAO1 KARI均具有极低的序列同源性（<20%氨基酸同一性），但是这两种KARI酶在活性位点区中的结构极为类似。为将这两种KARI结构的活性位点叠合，在程序O中使用了命令LSQ_ext、LSQ_improve、LSQ_mol来将菠菜KARI的单体A的活性位点与PF5KARI模型的单体A进行重合。NADPH的坐标、结合于菠菜KARI的活性位点的两个镁离子和抑制剂被提取并且并入PF5 KARI的分子A。通过由该程序计算而施用从单体A向单体B的变换算符，由单体A向单体B的针对PF5 KARI的单体B产生了这些分子的坐标组A。
因为在PAO1 KARI晶体结构的活性位点中无NADPH，所以NADPH结合位点中的磷酸结合弯环区（PAO1 KARI中的残基44-45，菠菜KARI中的残基157-170）的结构在所述两者之间非常不同。为对NADPH结合形式进行建模，PF5-KARI的磷酸结合弯环（44-55）被1yve的弯环（157-170）所替换。使用程序O中的mutate_replace命令将这两者的之间侧链的任何差异转换成为PF5-KARI中的侧链，并且手工调节替换的侧链的构型。完整的NADPH/Mg/抑制剂结合型二聚体PF5-KARI模型使用程序CNX（ACCELRYS SanDiegoCA，Burnger，A.T.和Warren，G.L.，ActaCrystallogr.，D54:905-921，1998）通过了一轮能量最小化，此后在该模型中以底物乙酰乳酸（AL）替换了抑制剂。
异丁醇生产
本文提供的宿主细胞可包含具有酮醇酸还原异构酶的多肽。如本文描述和展示，本申请人业已发现了另外的KARI酶以及所述另外KARI的变体，其产生了与对于来自乳酸乳球菌的KARI所观测结果是可比较的和/或超过其的异丁醇生产（参见实例）。因此，在多个实施例中，在异丁醇生产途径中发挥功能的具有KARI活性的多肽具有与乳酸乳球菌KARI（SEQID NO:380）相比较是可比较的或更优的有效异丁醇产率，并且或者以与之可比较的或更优的滴度生产异丁醇。这类多肽由此被认为有用于异丁醇生产，尤其是在本文所述的包含异丁醇生产途径的细胞中。在多个实施例中，本文提供的多肽具有与比在相同条件下对乳酸乳球菌KARI（SEQ IDNO:380）所观测到更高的或大致相等的有效异丁醇产率，并且或者以比其更高或大致相等的滴度生产异丁醇。在多个实施例中，本文提供的多肽在约48小时候具有大于约3克/克细胞，大于约4，大于约5、或大于约6克/克细胞的有效异丁醇产率，其中所述48小时的至少最后约24小时处于厌氧条件下。
此外，本申请人业已发现，上述具有KARI活性的多肽的变体，包括具有低于未受到替换多肽的针对NADH的KM的多肽变体，提供了在厌氧条件下异丁醇生产的有利之处。不受理论的束缚，据信这类变体由于对NADH作为还原对等物的更高效利用而提供了改进的异丁醇生产。在多个实施例中，利用了这一变体的异丁醇生产降低了甘油积累。在多个实施例中，针对上文所述的具有KARI活性的具有低于未受到替换的多肽的针对NADH的KM的多肽变体，异丁醇与甘油的摩尔比有所提高。在多个实施例中，异丁醇与甘油的摩尔比大于1。在多个实施例中，异丁醇与甘油的摩尔比大于2。在多个实施例中，该摩尔比大于3。在多个实施例中，该摩尔比大于4，大于5，大于6，大于7，大于8，大于9，大于10，大于12，或大于14。在多个实施例中，该摩尔比处于约1至5，约1至10，约2至8，约5至10，约5至15，约10至15或12至15的范围内。
如本文的例子所展示，随着针对NADH辅因子的生化特异性（根据（NADHVmax/KM）/（NADPHVmax/KM）所定义）提高，在异丁醇/甘油比率中存在着可观测的提高，提示了改动的辅因子特异性导致了减弱的NADPH利用和副产物形成。
醛脱氢酶的修饰
在本发明的实施例中，重组宿主细胞可包含降低或消除的醛脱氢酶活性并包含异丁醇生物合成途径，其中所述宿主细胞产生丁醇。在其它实施例中，所述重组宿主细胞可包含异丁醇或1-丁醇生物合成途径，如本文进一步描述。在其它实施例中，所述异丁醇生物合成途径可包含编码催化底物至产物转化的多肽的多核苷酸，所述底物至产物转化选自：（a）丙酮酸至乙酰乳酸；（b）乙酰乳酸至2,3-二羟基异戊酸；（c）2,3-二羟基异戊酸至2-酮异戊酸；（d）2-酮异戊酸至异丁醛；以及（e）异丁醛至异丁醇。在其它实施例中，所述异丁醇生物合成途径可包含编码多肽的多核苷酸，所述多肽具有乙酰乳酸合酶、酮酸还原异构酶、二羟酸脱水酶、酮异戊酸脱羧酶和醇脱氢酶活性。在其它实施例中，所述重组细胞包含1-丁醇生物合成途径。在其它实施例中，所述1-丁醇生物合成途径包含编码催化底物至产物转化的多肽的多核苷酸，所述底物至产物转化选自：（a）乙酰-CoA至乙酰乙酰-CoA；（b）乙酰乙酰-CoA至3-羟丁酰-CoA；（c）3-羟丁酰-CoA至巴豆酰-CoA；（d）巴豆酰-CoA至丁酰-CoA；（e）丁酰-CoA至丁醛；（f）丁醛至1-丁醇。在其它实施例中，1-丁醇生物合成途径可包含编码具有活性的多肽的多核苷酸。
在本发明的实施例中，重组宿主细胞可包含对编码具有醛脱氢酶活性的多肽的多核苷酸或基因的修饰或破坏，或对具有醛脱氢酶活性的多肽的修饰或破坏。对靶基因进行遗传修饰和破坏，以降低或除去其表达的许多方法是本领域的普通技术人员已知的，并且可被用于产生本文所公开的重组宿主细胞。在其它实施例中，所述重组宿主细胞可在编码具有醛脱氢酶活性的多肽的内源多核苷酸或基因中或在具有醛脱氢酶活性的多肽中包含缺失、突变和/或替换。此类修饰、破坏、缺失、突变、和/或替换可导致降低或消除的醛脱氢酶活性。可被使用的修饰包括但不限于：编码醛脱氢酶蛋白质的整个基因或所述基因的部分的删除；向编码基因中（在启动子或编码区）插入DNA片段，从而使蛋白质不表达或以较低水平表达；向编码区中引入突变，突变的引入导致终止密码子的加入或移框，从而使功能性蛋白质不表达；以及向编码区中引入一个或多个突变以改变氨基酸，从而表达无功能的或活性较低的蛋白质。在其它实施例中，靶基因的表达可被反义RNA或干扰RNA的表达阻止，并且构建体可被引入，导致共抑制。在其它实施例中，转录物的合成或稳定性可通过突变降低。在多个实施例中，从mRNA翻译为蛋白质的效率可通过突变受到调控。全部这些方法均可由本领域的技术人员使用已知的或鉴定的编码靶蛋白的序列容易地实施。
在其它实施例中，靶醛脱氢酶编码序列周边的DNA序列在一些修饰方法中也是有用的，并且对于例如酵母如酿酒酵母，在由NCBI（美国国家生物技术信息中心）协调的基因组计划中以基因组计划ID9518协调的、具有标识GOPID#13838的完整基因组序列中是可用的。酵母基因组序列的附加的非限制性例子是白假丝酵母（Candida albicans）的基因组序列，其被包括于GPID#10771、#10701和#16373中。本领域的技术人员可容易地在可公开获得的数据库中找到其它的酵母基因组序列。
在其它实施例中，醛脱氢酶编码序列周边的DNA序列对于利用同源重组的修饰方法可以是有用的。在这种方法的非限制性例子中，醛脱氢酶基因的侧接序列可置于选择性标记基因的边界处以介导同源重组，所述标记基因从而替换该醛脱氢酶基因。在另一个非限制性例子中，位于选择性标记基因边界的部分醛脱氢酶基因序列和醛脱氢酶基因侧接序列能够被用于介导同源重组，所述标记基因从而置换该靶醛脱氢酶基因的一部分。在多个实施例中，所述选择性标记能够被位点特异性重组位点限定边界，如此在相应的位点特异性重组酶表达之后，抗性基因被从所述醛脱氢酶基因处切除，而不会使后者再活化。在多个实施例中，位点特异性重组留下了重组位点，所述重组位点破坏所述醛脱氢酶蛋白质的表达。在其它实施例中，所述同源重组载体能够被构建为在选择性标记的切除之后同样留下所述醛脱氢酶基因中的缺失，如本领域的技术人员所熟知的。
在其它实施例中，可利用如Wach等人（Yeast，10:1793-1808；1994）所描述的有丝分裂重组来向醛脱氢酶靶基因中制备缺失。此类方法能够涉及制备包含介于基因组区域之间的选择性标记的DNA片段，其中所述基因组区域能够短至20bp并且限定了靶DNA序列的边界。在其它实施例中，这种DNA片段能够通过对所述选择性标记基因的PCR扩增制备，扩增用与所述标记基因末端杂交的寡核苷酸作为引物并且包括能与酵母基因组重组的所述基因组区域。在多个实施例中，所述线性DNA片段可被有效地转化到酵母中并重组至基因组中，导致包括了靶DNA序列的缺失的基因置换（如在，例如，Methods in Enzymology，第194卷，Guideto Yeast Genetics and Molecular and Cell Biology（部分A，2004，ChristineGuthrie和Gerald R.Fink（编辑），Elsevier Academic Press，San Diego，CA）中所公开）。
此外，启动子置换方法能够被用于交换内源转录调控元件，所述方法允许了调控表达的其它途径，例如Mnaimneh等人（（2004）Cell118（1）:31-44）所描述。
在其它实施例中，可采用随机诱变来破坏醛脱氢酶靶基因编码的活性，然后可通过筛选来鉴定具有降低的或基本上被消除的活性的菌株。在这种类型的方法中，靶基因编码区或者影响生长相关的碳底物依赖性的任何其它基因组区域的DNA序列不必是已知的。在多个实施例中，对具有降低的醛脱氢酶活性的细胞或具有降低的醛脱氢酶活性的其它突变体的筛选可用于本发明的重组宿主细胞。
用于产生基因突变的方法是本领域中通用的和已知的，并能够被用于制备突变体的应用中。常用的随机遗传修饰方法（综述于Methods in YeastGenetics，2005，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY）包括自发突变、增变基因导致的突变、化学诱变、UV或X-射线照射或转座子诱变。
对宿主细胞的化学诱变可涉及但不限于使用以下DNA突变原中的一种进行处理：乙基甲磺酸（EMS）、亚硝酸、硫酸二乙酯或N-甲基-N'-硝基-N-亚硝基胍（MNNG）。这类诱变方法已在Spencer等人的文献中进行了综述（Mutagenesis in Yeast，1996，Yeast Protocols:Methods in Cell andMolecular Biology.Humana Press，Totowa，NJ）。在多个实施例中，使用EMS的化学诱变能够如Methods in Yeast Genetics，2005，Cold SpringHarbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY中所述进行。用紫外（UV）光或X-射线辐照也可被用于在酵母细胞中产生随机突变生成。通过UV辐照的诱变的主要效应是会破坏DNA复制保真性的嘧啶二聚体的形成。对酵母进行UV诱变的方案已在Spencer等人的文献中进行了综述（Mutagenesis in Yeast，1996，Yeast Protocols:Methods in Cell andMolecular Biology.Humana Press，Totowa，NJ）。在多个实施例中，增变表型的引入也能够被用于在宿主细胞中产生随机的染色体突变。在实施例中，常用的增变表型可通过对下列基因中的一个或多个的破坏而获得：PMS1、MAG1、RAD18或RAD51。在其它实施例中，非增变表型的恢复能够通过插入野生型等位基因实现。在其它实施例中，由任何的这些或其它已知的随机诱变方法制备的修饰的细胞的集合，可以针对降低或消除的醛脱氢酶活性进行筛选。
对于以下酵母菌株，基因组已经进行了完整测序和标注并且可公开获得：棉阿舒囊霉（Ashbya gossypii）ATCC10895、光滑假丝酵母（Candidaglabrata）CBS138、乳酸克鲁维酵母NRRLY-1140、树干毕赤酵母CBS6054、啤酒糖酵母S288c、粟酒裂殖酵母972h-和解脂耶氏酵母（Yarrowialipolytica）CLIB122。用已知的醛脱氢酶多核苷酸或多肽序列（例如本文所提供的那些）对可公开获得的数据库进行的典型的BLAST（如上文所述）检索，被用于鉴定其它宿主细胞如酵母细胞的醛脱氢酶编码序列。
在其它实施例中，具有醛脱氢酶活性的多肽可催化异丁醛至异丁酸的转化。在其它实施例中，所述异丁醛至异丁酸的转化在重组宿主细胞中受到降低或消除。在另外的实施例中，具有醛脱氢酶活性的多核苷酸、基因或多肽KARI对应于酶学委员会编号EC1.2.1.3、EC1.2.1.4和/或EC1.2.1.5。
在多个实施例中，本发明的重组宿主细胞可以是啤酒糖酵母，并且具有醛脱氢酶活性的多肽可以是ALD2、ALD3、ALD4、ALD5、ALD6或它们的组合。在其它实施例中，重组宿主细胞可以是乳酸克鲁维酵母，并且具有醛脱氢酶的多肽可以是KLLA0F00440、KLLA0E23057、KLLA0D10021、KLLA0D09999G或它们的组合。在其它实施例中，重组宿主细胞可以是树干毕赤酵母，并且具有醛脱氢酶活性的多肽可以是ALD2、ALD3、ALD4、ALD5、ALD7或它们的组合。在其它实施例中，重组宿主细胞可以是植物乳杆菌，并且具有醛脱氢酶活性的多肽可以是AldH。在其它实施例中，重组宿主细胞可以是大肠杆菌，并且具有醛脱氢酶活性的多肽可以是aldA、aldB、aldH或它们的组合。
在本发明的实施例中，本发明的重组宿主细胞可以是啤酒糖酵母，并且编码具有醛脱氢酶的多肽的内源多核苷酸或基因可以是ALD2、ALD3、ALD4、ALD5、ALD6或它们的组合。在本发明的实施例中，本发明的重组宿主细胞可以是啤酒糖酵母，并且编码具有醛脱氢酶的多肽的内源多核苷酸或基因可以是ALD6。在其它实施例中，重组宿主细胞可以是乳酸克鲁维酵母，并且编码具有醛脱氢酶的多肽的内源多核苷酸或基因可以是KLLA0F00440、KLLA0E23057、KLLA0D10021、KLLA0D09999G或它们的组合。在其它实施例中，本发明的重组宿主细胞可以是树干毕赤酵母，并且编码具有醛脱氢酶的多肽的内源多核苷酸或基因可以是ALD2、ALD3、ALD4、ALD5、ALD7或它们的组合。在多个实施例中，具有醛脱氢酶活性的多肽是来自啤酒糖酵母的ALD6的同源物。包含以kanMX基因框进行醛脱氢酶基因缺失的啤酒糖酵母缺失菌株可从美国典型培养物保藏中心商购获得[目录号4000753]。
在其它实施例中，重组宿主细胞可以是植物乳杆菌，并且编码具有醛脱氢酶活性的多肽的内源多核苷酸可以是AldH。在其它实施例中，重组宿主细胞可以是大肠杆菌并且编码具有醛脱氢酶的多肽的内源多核苷酸或基因可以是aldA、aldB、aldH或它们的组合。
能够在本文所公开的重组宿主细胞中作为修饰或灭活的靶标的醛脱氢酶多核苷酸、基因和多肽的例子包括但不限于下文的表4的那些。
表4：醛脱氢酶靶基因编码区和蛋白质。
Figure BDA0000419940220000561
可在本文所公开的重组宿主细胞中作为修饰或灭活的靶标的醛脱氢酶多核苷酸、基因和多肽的其它例子包括但不限于：与表4的任何一个序列具有至少约70%至约75%、约75%至约80%、约80%至约85%、约85%至约90%、约90%至约95%、约96%、约97%、约98%、或约99%序列同一性的醛脱氢酶多核苷酸、基因和/或多肽，其中此类多核苷酸或基因编码醛脱氢酶活性，或者此类多肽具有醛脱氢酶活性。能够在本文所公开的重组宿主细胞中作为修饰或灭活的靶标的醛脱氢酶多核苷酸、基因和多肽的另外的其它例子包括但不限于：表4的任何一个序列的活性变体、片段或衍生物，其中此类多核苷酸或基因编码醛脱氢酶活性，或者此类多肽具有醛脱氢酶活性。
在多个实施例中，其它醛脱氢酶活性多核苷酸、基因、和/或多肽的序列可在文献中被鉴定，利用本文所公开的和本领域中可获得的序列可在技术人员熟知的生物信息学数据库中鉴定候选。例如，通过用已知的醛脱氢酶活性编码多核苷酸或多肽序列对可公开获得的数据库的BLAST检索可以鉴定此类序列。在此类方法中，同一性能够基于ClustalW比对方法，所述方法采用GAP PENALTY=10、GAP LENGTHPENALTY=0.1和Gonnet250系列的蛋白质权重矩阵的默认参数。
另外，本文公开的或本领域中已知的醛脱氢酶多核苷酸或多肽序列可用于鉴定天然中的其它醛脱氢酶同源物。例如，本文公开的每个醛脱氢酶编码核酸片段均可用于分离编码同源蛋白的基因。使用序列依赖性规程分离同源基因是本领域熟知的。序列依赖性规程的例子包括但不限于（1）核酸杂交方法；（2）DNA和RNA扩增方法，例如多种核酸扩增技术[例如，聚合酶链反应（PCR），Mullis等人的美国专利4,683,202；连接酶链反应（LCR），Tabor等人，Proc.Acad.Sci.USA82:1074（1985）的使用；或链置换扩增反应（SDA），Walker等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，89：392（1992）]；以及（3）文库构建和互补筛选方法。
因此，提供醛脱氢酶多核苷酸、基因和多肽处于在本发明的范围之内，所述醛脱氢酶多核苷酸、基因和多肽与本文公开的任何醛脱氢酶多核苷酸或多肽（例如，表4的SEQ ID NO:732-765）具有至少约70%至约75%、约75%至约80%、约80%至约85%、约85%至约90%、约90%至约95%、约96%、约97%、约98%或约99%的序列同一性。同一性是基于ClustalW比对方法，使用GAP PENALTY=10，GAP LENGTHPENALTY=0.1和Gonnet250系列多肽蛋白质权重矩阵的默认参数。
在本文所公开的重组宿主细胞中用以降低或除去醛脱氢酶活性的醛脱氢酶修饰可以使用本领域已知的方法来确认。例如，对特定醛脱氢酶的破坏可使用该醛脱氢酶基因内部或外部的引物以PCR筛选确认，或通过使用针对醛脱氢酶基因序列而设计的探针而进行的Southern印迹法来确认。作为另外一种选择，可利用气相色谱-质谱法或液相色谱法针对异丁酸的减少形成来筛选暴露于异丁醛的菌株。因此，本文提供了筛选具有降低的异丁酸形成的菌株的方法，其包括：a）提供在编码具有醛脱氢酶活性的多肽的多核苷酸中包含修饰或在编码具有醛氧化酶活性的多肽的多核苷酸中具有修饰的菌株；b）将该细胞接触异丁醛；以及c）测量异丁酸的形成；其中异丁酸的形成与不具有修饰的对照相比有所降低。在一些实施例中，该修饰为缺失、突变和/或替换。在一些实施例中，该测量使用气相色谱-质谱法进行。在一些实施例中，异丁酸降低了至少约10%、至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%或至少90%。在一些实施例中，异丁酸的形成基本上被消除。
对醛氧化酶的修饰
在本发明的实施例中，本文公开的重组宿主细胞可具有对编码醛氧化酶的多核苷酸、基因或多肽的修饰或破坏。在其它实施例中，所述重组宿主细胞在编码具有醛氧化酶活性的多肽的内源多核苷酸或基因中或在具有醛氧化酶活性的多肽中包含缺失、突变和/或替换。此类修饰、破坏、缺失、突变、和/或替换可导致降低或消除的醛氧化酶活性。
在本发明的实施例中，具有醛氧化酶活性的多肽可催化异丁醛向异丁酸的转化。在其它实施例中，所述异丁醛至异丁酸的转化在重组宿主细胞中受到降低或消除。在其它实施例中，具有醛氧化酶活性的多核苷酸、基因或多肽能够对应于酶学委员会编号EC1.2.3.1。
在多个实施例中，本发明的重组宿主细胞可以是树干毕赤酵母并且具有醛氧化酶活性的多核苷酸、基因或多肽可以是AOX1和/或AOX2。
能够在本文所公开的重组宿主细胞中作为修饰或灭活的靶标的醛氧化酶多核苷酸、基因和多肽的例子包括但不限于下文的表5的那些。
表5：醛氧化酶靶基因编码区和蛋白质。
Figure BDA0000419940220000581
能够在本文所公开的重组宿主细胞中作为修饰或灭活的靶标的醛氧化酶多核苷酸、基因和多肽的其它例子包括但不限于：与表5的任何一个序列具有至少约70%至约75%、约75%至约80%、约80%至约85%、约85%至约90%、约90%至约95%、约96%、约97%、约98%、或约99%序列同一性的醛氧化多核苷酸、基因和/或多肽，其中此类多核苷酸或基因编码醛氧化酶活性，或者此类多肽具有醛氧化酶活性。能够在本文所公开的重组宿主细胞中作为修饰或灭活的靶标的醛氧化酶活性多核苷酸、基因和多肽的另外的其它例子包括但不限于：表5的任何一个序列的活性变体、片段或衍生物，其中此类多核苷酸或基因编码醛氧化酶活性，或者此类多肽具有醛氧化酶活性。
在多个实施例中，编码本文公开的或本领域中已知的醛氧化酶序列的多核苷酸、基因和/或多肽可如上文针对乙酰乳酸还原酶或醛脱氢酶公开而进行修饰。在其它实施例中，编码醛氧化酶的多核苷酸、基因和/或多肽可用于鉴定另一种醛氧化酶多核苷酸、基因和/或多肽序列，并且/或者可用于在其它细胞中鉴定醛氧化酶同源物，如上文针对醛脱氢酶所公开。此类醛氧化酶编码序列能够在，例如，文献中和/或技术人员熟知的生物信息学数据库中被鉴定。例如，利用生物信息学在另外的细胞类型中对醛氧化酶编码序列的鉴定，能够通过用已知的己糖激酶编码DNA和多肽序列（例如任何本文所提供的那些）对可公开获得的数据库进行BLAST（如上文所公开的）检索而实现。同一性基于Clustal W比对方法，所述方法采用GAPPENALTY=10、GAPLENGTHPENALTY=0.1和Gonnet250系列的蛋白质权重矩阵的默认参数。
在本文所公开的重组宿主细胞中用以降低或除去醛氧化酶活性的醛氧化酶修饰可以使用本领域已知的方法来确认。例如，对特定醛氧化酶的破坏可使用该醛氧化酶基因内部或外部的引物以PCR筛选确认，或通过使用针对醛氧化酶基因序列而设计的探针而进行的Southern印迹法来确认。作为另外一种选择，可利用气相色谱或其它分析方法来针对异丁酸的减少形成来筛选暴露于异丁醛的菌株（如例子中所描述和展示）。在一些实施例中，异丁酸降低了至少约10%、至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%或至少90%。在一些实施例中，异丁酸的形成基本上被消除。
本申请人已经提供了包含降低或消除的醛脱氢酶和/或醛氧化酶活性的重组宿主细胞。在多个实施例中，本文所公开的重组宿主细胞还可在编码具有丙酮酸脱羧酶活性的多肽的多核苷酸中包含修饰，并且或者在具有己糖激酶2活性的多肽中包含修饰。在多个实施例中，本发明的重组宿主细胞可产生生物合成途径的生产（例如，异丁醇）并且可包含编码催化底物至产物转化的多肽的多核苷酸，所述底物至产物转化选自：（a）丙酮酸至乙酰乳酸；（b）乙酰乳酸至2,3-二羟基异戊酸；（c）2,3-二羟基异戊酸至2-酮异戊酸；（d）2-酮异戊酸至异丁醛；以及（e）异丁醛至异丁醇。在其它实施例中，这类重组宿主细胞可产生生物合成途径的产物（例如，异丁醇），其收率或量超过由不包含降低或消除的醛脱氢酶活性和/或醛氧化酶活性的重组宿主细胞所产生的相同产物的收率或量。在其它实施例中，本发明的重组宿主细胞可降低或消除异丁醛向异丁酸的转化，并且可用于筛选具有醛脱氢酶和/或醛氧化酶活性的候选多肽。就此，本申请人还已经提供了提高生物合成途径的产物（例如，异丁醇）的收率或滴度的方法、降低或消除异丁醛向异丁酸转化的方法以及筛选具有醛脱氢酶和/或醛氧化酶活性的候选多肽的方法。
在本发明的实施例中，提供了产生重组宿主细胞的方法，其包括（a）提供本文公开的重组宿主细胞；以及（b）使用编码生物合成途径（例如异丁醇生物合成途径）的多肽的多核苷酸来转化所述的宿主细胞。在其它实施例中，提供了产生重组宿主细胞的方法，其包括（a）提供重组宿主细胞，其在编码具有醛脱氢酶活性多肽的多核苷酸中或在具有醛脱氢酶活性的多肽中包含修饰；以及（b）使用编码生物合成途径（例如，异丁醇生物合成途径）的多肽的多核苷酸转化所述的宿主细胞。在其它实施例中，提供了产生重组宿主细胞的方法，其包括（a）提供重组宿主细胞，其在编码具有醛氧化酶活性多肽的多核苷酸中或在具有醛氧化酶活性的多肽中包含修饰；以及（b）使用编码异丁醇生物合成途径的多肽的多核苷酸转化所述的宿主细胞。
还提供了用于降低或消除异丁醇向异丁酸的转化的方法。这类方法可包括（a）提供权本文公开的重组宿主细胞；以及（b）在一定条件下生长所述宿主细胞，其中与使用并不包含降低或消除的醛脱氢酶和/或醛氧化酶活性的重组宿主细胞相比，异丁醛向异丁酸的所述转化降低或消除。本文公开的重组宿主细胞进行的异丁醛向异丁酸的转化可通过本领域中已知的方法（参见，例如，Methods in Yeast Genetics，2005，Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，第201-202页）和/或本文所述的方法来测量。
DHMB的还原
DHMB在包含异丁醇生物合成途径的宿主细胞中的产生表明并非全部的途径底物均被转化成为所期望的产物。因此而降低了收率。此外，DHMB对于产物生产可具有抑制效果。例如，DHMB可降低生物合成途径中的酶的活性，或者对于酵母生长和/或发酵期间的产率具有其它抑制效果。因此，本文所述的方法提供了在发酵期间减少DHMB的方法。该方法包括降低DHMB生产的方法以及从发酵组合物中去除DHMB的方法。
减少DHMB生产
在本文所述的一些实施例中，重组宿主细胞可包含降低或消除的将乙酰乳酸向DHMB转化的能力。宿主细胞将乙酰乳酸向DHMB转化的能力可受到降低或消除，例如，通过对编码具有乙酰乳酸还原酶活性的多肽的多核苷酸或基因进行修饰或破坏，或者对具有乙酰乳酸还原酶活性的多肽进行修饰或破坏。在其它实施例中，所述重组宿主细胞可在编码具有乙酰乳酸还原酶活性的多肽的内源多核苷酸或基因中或在具有乙酰乳酸还原酶活性的多肽中包含缺失、突变和/或替换。此类修饰、破坏、缺失、突变、和/或替换可导致降低、基本消除或消除的乙酰乳酸还原酶活性。在本发明的一些实施例中，与在不包含降低或消除的将乙酰乳酸向DHMB转化的能力的重组宿主细胞中的相同产物生产相比，所述生物合成途径的产物以更高的收率或量进行生产。
因此，该产物可以是包含丁醇的组合物，其基本不含或不含DHMB。在一些实施例中，所述包含丁醇的组合物包含不超过约5mM、约4mM、约3mM、约2mM、约1mM、约0.5mM、约0.4mM、约0.3mMDHMB或约0.2mM的DHMB。
该产物也可以是包含2,3-丁二醇（BDO）的组合物，其基本不含或不含DHMB。在一些实施例中，所述包含BDO的组合物包含不超过约5mM、约4mM、约3mM、约2mM、约1mM、约0.5mM、约0.4mM、约0.3mMDHMB或约0.2mM的DHMB。
在本文公开的具有所描述的乙酰乳酸还原酶活性修饰的重组宿主细胞中，参与乙酰乳酸向并非DHMB的底物的转化的生物合成途径的任何产物均可以以更高的效能进行生产。这类产物包括但不限于丁醇，例如异丁醇、2-丁醇和BDO，以及支链氨基酸。
在一些实施例中，所述宿主细胞在编码具有乙酰乳酸还原酶活性的多肽的至少一种内源多核苷酸中包含缺失、突变和/或替换。在一些实施例中，所述宿主细胞在编码具有乙酰乳酸还原酶活性的多肽的至少两种内源多核苷酸中各自包含缺失、突变和/或替换。
在一些实施例中，具有乙酰乳酸还原酶活性的多肽可催化乙酰乳酸向DHMB的转化。在一些实施例中，具有乙酰乳酸还原酶活性的多肽能够催化乙酰乳酸成为2S,3S-DHMB（快DHMB）和/或2S,3R-DHMB（慢DHMB）。
表6：
在啤酒糖酵母中具有乙酰乳酸还原酶活性的多肽和多核苷酸
Figure BDA0000419940220000621
在一些实施例中，乙酰乳酸向DHMB的转化在重组宿主细胞中受到降低、基本上消除或消除。在一些实施例中，所述具有乙酰乳酸还原酶活性的多肽选自：YMR226C、YER081W、YIL074C、YBR006W、YPL275W、YOL059W、YIR036C、YPL061W、YPL088W、YCR105W、YOR375C和YDR541C。在一些实施例中，所述具有乙酰乳酸还原酶活性的多肽是包含表6中列出的序列的多肽或包含与表6中列出的多肽序列是至少约70%、至少约75%、至少约80%、至少约85%、至少约90%、至少约95%或至少约99%相同的序列的多肽。在一些实施例中，所述具有乙酰乳酸还原酶活性的多肽是由表6中列出的多核苷酸序列编码的多肽或由与表6中列出的多核苷酸序列是至少约70%、至少约75%、至少约80%、至少约85%、至少约90%、至少约95%或至少约99%相同的序列编码的多肽。
表7：实例YMR226C酵母同源物
Figure BDA0000419940220000631
在一些实施例中，具有乙酰乳酸还原酶活性的多肽是YMR226C或YMR226C的同源物。因此，在一些实施例中，所述具有乙酰乳酸还原酶活性的多肽是包含表7中列出的序列的多肽或包含与表7中列出的多肽序列是至少约70%、至少约75%、至少约80%、至少约85%、至少约90%、至少约95%或至少约99%相同的序列的多肽。在一些实施例中，所述具有乙酰乳酸还原酶活性的多肽是由表7中列出的多核苷酸序列编码的多肽或由与表7中列出的多核苷酸序列是至少约70%、至少约75%、至少约80%、至少约85%、至少约90%、至少约95%或至少约99%相同的序列编码的多肽。
能够将乙酰乳酸向DHMB转化的乙酰乳酸还原酶可通过，例如，通过针对乙酰乳酸消耗的变化、DHMB生产的变化、DHIV生产的变化或其它下游产物（例如丁醇）生产的变化来筛选基因改造的酵母来鉴定。
鉴定参与DHMB生产的基因的一种方法包括测量酵母敲除文库中的单个酵母所产生的DHMB的量。敲除文库可获自，例如，Open
Figure BDA0000419940220000642
（Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA的分支）。在这一方法中，DHMB生产中的减少显示已被敲除的基因发挥提高DHMB生产的功能，并且DHMB生产中的提高显示已被敲除的基因发挥减少DHMB生产的功能。
可将敲除（“KO”）文库用于鉴定参与DHMB合成的候选基因的两种方法包括：（1）可在来自培养物的样品中分析在生长期间来自内源底物（乙酰乳酸和NADPH或NADH）的积累于该培养物中的DHMB和DHIV。可将这些异丁醇生产置于热的（80-100℃）水浴中10-20分钟，或者稀释于诸如2%甲酸这样的溶液中，其将细胞杀灭并透化。在进行两种处理之一后，小分子应在离心（5分钟，1100×g）后存在于上清液中。可将对照菌株（例如，BY4743）的DHMB/DHIV比率与不同的KO衍生株相比较，并且在具有非常低的DHMB/DHIV比率的任何菌株中缺少的基因均可能编码乙酰乳酸还原酶（ALR）。（2）可在从增透化细胞的悬浮液中定时采集并且以上述两种方式之一进行灭火的样品内测量来自外源底物（乙酰乳酸和NADPH或NADH）的DHMB和/或DHIV的体外形成速度。由于用于DHMB和DHIV合成的底物是相同的，这使得可在该样品中测量ALR和KARI活性的相对水平。
鉴定参与DHMB生产的基因的另一种方法包括测量酵母过表达文库中的单个酵母所产生的DHMB的量。过表达文库可获自，例如，Open
Figure BDA0000419940220000651
（Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA的分支）。在这一方法中，DHMB生产中的减少显示过表达的基因发挥减少DHMB生产的功能，并且DHMB生产中的提高显示过表达的基因发挥提高DHMB生产的功能。
鉴定参与DHMB生产的基因的另一种方法是对DHMB生产型酵母菌株进行生化分析。例如，可破坏DHMB生产型细胞。这种破坏可在低pH和冷温度下实施。可将细胞裂解物分离成为级分，例如，通过加入硫酸铵或其它技术分离，并且可针对酶活性分析所得的级分。例如，所述级分可针对将乙酰乳酸向DHMB转化的能力进行分析。可通过本领域中已知的方法处理具有酶活性的级分来纯化和浓缩该酶（例如，透析和色谱分离）。当获得了充分的纯度和浓度时，可对该酶进行测序并且可鉴定出编码能够将乙酰乳酸向DHMB转化的乙酰乳酸还原酶的对应基因。
此外，由于乙酰乳酸向DHMB的还原在酵母进行，而在大肠杆菌中并未以相同的程度进行，在酵母中表达但未在大肠杆菌中表达的乙酰乳酸还原酶可被选用于筛选。所选择的酶可在酵母或其它蛋白质表达系统中表达，并且针对将乙酰乳酸向DHMB转化的能力进行筛选。
能够催化乙酰乳酸向DHMB的转化的酶可通过分析乙酸乳酸水平、通过分析DHMB水平、通过分析DHIV水平或通过分析DHIV向丁醇（包括异丁醇）转化的任何下游产物来筛选。
DHMB可使用本领域的技术人员所知的任何技术来测量。例如，可通过本领域的技术人员所知的方法和本文提供的实例中描述的技术来分离和定量DHMB。例如，DHMB可使用液相色谱-质谱法、液相色谱-核磁共振（NMR）、薄层色谱法和/或具有UV/Vis检测的HPLC来分离和定量。
在多个实施例中，可修饰或破坏本文公开的所选择的乙酰乳酸还原酶多核苷酸、基因和/或多肽。大量合适的方法对于本领域的技术人员是已知的并且包括针对醛脱氢酶所描述的方法（上文）。
在本文所公开的重组宿主细胞中用以降低或除去乙酰乳酸还原酶活性的乙酰乳酸还原酶修饰可以使用本领域已知的方法来确认。例如，编码乙酰乳酸还原酶的多核苷酸序列的存在与否可使用PCR筛选进行确定。乙酰乳酸还原酶活性的降低还可根据乙酰乳酸向DHMB的转化的降低来确定。乙酰乳酸还原酶活性的降低还可根据DHMB生产的降低来确定。乙酰乳酸还原酶活性的降低还可根据丁醇生产的提高来确定。
因此，在一些实施例中，能够生产丁醇的酵母产生了不超过5mM、约4mM、约3mM、约2mM、约1mM、约0.9mM、约0.8mM、约0.7mM、约0.6mM、约0.5mM、约0.4mM或约0.3mM的DHMB。在一些实施例中，生产丁醇的酵母产生了不超过约5mM、约4mM、约3mM、约2mM、约1mM、约0.9mM、约0.8mM、约0.7mM、约0.6mM、约0.5mM、约0.4mM或约0.3mM的DHMB。在一些实施例中，生产丁醇的酵母产生了不超过约0.2mM或0.2mM的DHMB。
在一些实施例中，能够生产丁醇的酵母当在发酵条件下培养了至少约50小时的时候产生了不超过约10mM的DHMB。在一些实施例中，能够生产丁醇的酵母当在发酵条件下培养了至少约20小时、至少约25小时、至少约30小时、至少约35小时、至少约40小时、至少约45小时或至少约50小时的时候产生了不超过约5mM的DHMB。在一些实施例中，能够生产丁醇的酵母当在发酵条件下培养了至少约5小时、至少约10小时、至少约15小时、至少约20小时、至少约25小时、至少约30小时、至少约35小时、至少约40小时、至少约45小时或至少约50小时的时候产生了不超过约3mM的DHMB。在一些实施例中，能够生产丁醇的酵母当在发酵条件下培养了至少约1小时、至少约5小时、至少约10小时、至少约15小时、至少约20小时、至少约25小时、至少约30小时、至少约35小时、至少约40小时、至少约45小时或至少约50小时的时候产生了不超过约1mM的DHMB。在一些实施例中，能够生产丁醇的酵母当在发酵条件下培养了至少约1小时、至少约5小时、至少约10小时、至少约15小时、至少约20小时、至少约25小时、至少约30小时、至少约35小时、至少约40小时、至少约45小时或至少约50小时的时候产生了不超过约0.5mM的DHMB。
在一些实施例中，在编码乙酰乳酸还原酶的内源多核苷酸中包含至少一个缺失、突变和/或替换的酵母产生了不超过约0.5倍、约0.4倍、约0.3倍、约0.2倍、约0.1倍、约0.05倍的由包含编码乙酰乳酸还原酶的内源多核苷酸的酵母在相同发酵条件下培养相同时间量的情况下产生的DHMB量。
在一些实施例中，能够生产丁醇的酵母产生了至少约至少约5mM、至少约6mM、至少约7mM、至少约8mM、至少约9mM或至少约10mM的DHIV的量。
在一些实施例中，能够生产丁醇的酵母产生了至少为所产生的DHMB的量的DHIV的量。在一些实施例中，能够生产丁醇的酵母产生了为所产生的DHMB的量的至少约二倍、约三倍、约五倍、约十倍、约15倍、约20倍、约25倍、约30倍、约35倍、约40倍、约45倍或约50倍的DHIV的量。
在一些实施例中，能够生产丁醇的酵母与至少等于DHMB生产速率的速率产生DHIV。在一些实施例中，能够生产丁醇的酵母以DHMB生产速率的至少约二倍、约三倍、约五倍、约十倍、约15倍、约20倍、约25倍、约30倍、约35倍、约40倍、约45倍或约50倍的速率产生DHIV。
在一些实施例中，能够生产丁醇的酵母产生了小于0.010摩尔DHMB/摩尔消耗葡萄糖。在一些实施例中，酵母产生了小于约0.009、小于约0.008、小于约0.007、小于约0.006、或小于约0.005摩尔DHMB/摩尔消耗葡萄糖。在一些实施例中，酵母产生了小于约0.004、小于约0.003、小于约0.002、或小于约0.001摩尔DHMB/摩尔消耗葡萄糖。
在一些实施例中，乙酰乳酸还原酶活性通过化学手段进行抑制。例如，乙酰乳酸还原酶可使用其它已知底物进行抑制，诸如Fujisawa等人文献中列出的底物，包括L-丝氨酸、D-丝氨酸、2-甲基-DL-丝氨酸、D-苏氨酸、L-别苏氨酸、L-3-羟基异丁酸、D-3-羟基异丁酸，3-羟基丙酸、L-3-羟基丁酸和D-3-羟基丁酸。BiochimicaetBiophysicaActa1645:89-94（2003），其全文以引用的方式并入本文。
DHMB的移除
在本文所述的其它实施例中，DHMB的降低可通过从发酵中移除DHMB来实现。因此，本文还描述了使用降低的DHMB浓度进行的发酵。DHMB的移除可产生，例如，产生更高纯度的产物或需要更少加工以获得所期望纯度的产物。因此，还提供了包含具有提高纯度的生物合成途径产物（诸如乙醇或丁醇）的组合物。
DHMB可在发酵加工期间或之后移除并且可通过本领域中已知的任何手段移除。DHMB可通过，例如，通过提取进入有机相或反应提取来移除。
在一些实施例中，所述发酵液体培养基包含小于约0.5mM的DHMB。在一些实施例中，在约5小时、约10小时、约15小时、约20小时、约25小时、约30小时、约35小时、约40小时、约45小时或约50小时发酵后所述发酵液体培养基包含小于约1.0mM的DHMB。在一些实施例中，在约20小时、约25小时、约30小时、约35小时、约40小时、约45小时或约50小时的发酵后所述发酵液体培养基包含小于约5.0mM的DHMB。
丁醇生物合成途径
某些合适的异丁醇生物合成途径公开于美国专利7,851,188和7,993,889中，其以引用的方式并入本文。在图1中提供了所公开的异丁醇生物合成途径的图表。如美国专利公布7,851,188中所述，在一个例子中异丁醇生物合成途径的步骤包括下列转化：
-丙酮酸至乙酰乳酸的转化（参见图1，其中途径的步骤a），例如受乙酰乳酸合酶（ALS）催化，
-乙酰乳酸至2,3-二羟基异戊酸的转化（参见图1，其中途径的步骤b），例如受乙酰羟酸异构还原酶（KARI）催化；
-2,3-二羟基异戊酸至2-酮异戊酸的转化（参见图1，其中途径的步骤c），例如受乙酰羟酸脱水酶（亦称二羟酸脱水酶（DHAD））催化；
-2-酮异戊酸至异丁醛的转化（参见图1，其中途径的步骤d），例如受支链2-酮酸脱羧酶催化；以及
-异丁醛至异丁醇的转化（参见图1，其中途径的步骤e），例如受支链醇脱氢酶催化。
在另一个实施例中，异丁醇生物合成途径包括下列底物至产物的转化：
-丙酮酸至乙酰乳酸的转化，其可被，例如，乙酰乳酸合酶催化；
-乙酰乳酸至2,3-二羟基异戊酸的转化，其可被，例如，酮醇酸还原异构酶催化；
-2,3-二羟基异戊酸至a-酮异戊酸的转化，其可被，例如，二羟基酸脱水酶催化；
-α-酮异戊酸至缬氨酸的转化，其可被，例如，转氨酶或缬氨酸脱氢酶催化；
-缬氨酸至异丁胺的转化，其可被，例如，缬氨酸脱羧酶催化；
-异丁胺至异丁醛的转化，其可被，例如，ω转氨酶催化；以及
-异丁醛至异丁醇的转化，其可被，例如，支链醇脱氢酶催化。
在另一个实施例中，异丁醇生物合成途径包括下列底物至产物的转化：
-丙酮酸至乙酰乳酸的转化，其可被，例如，乙酰乳酸合酶催化；
-乙酰乳酸至2,3-二羟基异戊酸的转化，其可被，例如，乙酰羟酸催化；
-2,3-二羟基异戊酸至α-酮异戊酸的转化，其可被，例如，乙酰羟酸脱水酶催化；
-α-酮异戊酸至异丁酰-CoA的转化，其可被，例如，支链酮酸脱氢酶催化；
-异丁酰CoA至异丁醛的转化，其可被，例如，乙酰化醛脱氢酶催化；以及
-异丁醛至异丁醇的转化，其可被，例如，支链醇脱氢酶催化。
在另一个实施例中，异丁醇生物合成途径包括如图1中步骤k、g、和e所示的底物至产物的转化。
可用于上文描述的底物至产物转化以及另外的异丁醇途径的基因和多肽描述于美国申请公布2007/0092957和PCT公布WO2011/019894中，两者均已以引用的方式并入本文。以引用的方式并入本文的美国申请公布2011/019894、2007/0092957、2010/0081154描述了二羟酸脱水酶，包括来自乳酸乳球菌和变异链球菌的二羟酸脱水酶。酮异戊酸脱羧酶包括来自于乳酸乳球菌、溶酪大球菌（Macrococcus caseolyticus）（SEQ ID NO:542）和格氏李斯特菌（SEQ ID NO:543）的酮异戊酸脱羧酶。以引用的方式并入的美国专利申请公布2009/0269823和美国申请公布2011/0269199描述了醇脱氢酶，包括利用NADH作为辅因子的醇脱氢酶。醇脱氢酶包括来自木糖氧化无色杆菌（Achromobacter xylosoxidans）的SadB。另外的醇脱氢酶包括马肝ADH和Beijerinkia indica的ADH。醇脱氢酶包括利用NADH作为辅因子的醇脱氢酶。在一个实施例中，丁醇生物合成途径包含a）酮醇酸还原异构酶，其针对NADH具有小于约300μM、小于约100μM、小于约50μM、小于约20μM或小于约10μM的KM；b）利用NADH作为辅因子的醇脱氢酶；或者c）兼而包含a）和b）。
全文以引用的方式并入本文的WO2011/019894和美国申请2011/019894、2007/0092957、2010/0081154描述了合适的二羟酸脱水酶。提高DHAD活性的方法描述于，例如美国专利申请公布2010/0081173和美国专利申请13/029,558（2011年2月17日提交），其全文以引用的方式并入本文。
合适的酮醇酸还原异构酶（KARI）描述于美国专利申请公布2008/0261230A1、2009/0163376、2010/0197519、2010/0143997和2011/0244536之中，其全文以引用的方式并入本文。在其中公开的KARIs的例子为来自霍乱弧菌、铜绿假单胞菌PAO1和荧光假单胞菌PF5的KARI。在一些实施例中，所述KARI酶具有至少约0.1微摩尔/分钟/mg、至少约0.2微摩尔/分钟/mg、至少约0.3微摩尔/分钟/mg、至少约0.4微摩尔/分钟/mg、至少约0.5微摩尔/分钟/mg、至少约0.6微摩尔/分钟/mg、至少约0.7微摩尔/分钟/mg、至少约0.8微摩尔/分钟/mg、至少约0.9微摩尔/分钟/mg、至少约1.0微摩尔/分钟/mg或至少约1.1微摩尔/分钟/mg的比活性。催化乙酰乳酸向2,3-二羟基异戊酸的底物向产物转化的合适多肽包括针对NADH具有小于约300μM、小于约100μM、小于约50μM、小于约25μM或小于约10μM的KM的多肽。
在一些实施例中，所述KARI利用NADPH。测量NADPH消耗的方法在本领域中是已知的。例如，以引用的方式全文并入本文的美国公开申请2008/0261230提供了测量NADPH消耗的方法。在一些实施例中，NADPH消耗测定法是在340nm下测量乙酰乳酸向α-β-二羟基异戊酸的酶法转化期间辅因子NADPH的消失的方法。使用NADPH的6220M-1cm-1的摩尔消光系数来计算活性，并且将其以微摩尔消耗的NADPH/分钟/mg细胞提取物的总蛋白加以报道（参见Aulabaugh和Schloss，Biochemistry29:2824-2830，1990）。
在一些实施例中，所述KARI能够利用NADH。在一些实施例中，所述KARI能够在厌氧条件下利用NADH。使用NADH的KARI酶描述于，例如，美国专利申请公布2009/0163376之中，其全文以引用的方式并入本文。
本领域的技术人员可通过生物信息学或使用本领域中为人熟知的方法来鉴定其它可使用的基因。
在以引用方式并入本文的美国专利申请公布US2007/0092957A1中另行描述了用于以所公开的生物合成途径进行异丁醇生产的嵌合基因和对细菌和酵母基因工程改造。
用于生产可使用的1-丁醇的生物合成途径包括描述于美国申请公布2008/0182308中的生物合成途径，其以引用方式并入本文。在一个实施例中，1-丁醇生物合成途径包括下列底物至产物的转化：
-a)乙酰-CoA至乙酰乙酰-CoA的转化，其可被，例如，乙酰-CoA乙酰转移酶催化；
-b)乙酰乙酰-CoA至3-羟丁酸-CoA的转化，其可被，例如，3-羟丁酸-CoA脱氢酶催化；
-c)3-羟丁酸-CoA至丁烯酰-CoA的转化，其可被，例如，巴豆酸酶催化；
-d)丁烯酰-CoA至丁酰-CoA的转化，其可被，例如，丁酰-CoA脱氢酶催化；
-e)丁酰-CoA至丁醛的转化，其可被，例如，丁醛脱氢酶催化；以及
-f)丁醛至1-丁醇的转化，其可被，例如，丁醇脱氢酶催化。
用于生产可使用的2-丁醇的生物合成途径包括描述于美国申请公布2007/0259410和美国申请2009/0155870中的生物合成途径，其以引用的方式并入本文。在一个实施例中，2-丁醇生物合成途径包括下列底物至产物的转化：
-a)丙酮酸至α-乙酰乳酸的转化，其可被，例如，乙酰乳酸合酶催化；
-b)α-乙酰乳酸至乙偶姻的转化，其可被，例如，乙酰乳酸脱羧酶催化；
-c)乙偶姻至3-氨基-2-丁醇的转化，其可被，例如，乙偶姻胺化酶催化；
-d)3-氨基-2-丁醇至3-氨基-2-丁醇磷酸的转化，其可被，例如，氨基丁醇激酶催化；
-e)3-氨基-2-丁醇磷酸至2-丁酮的转化，其可被，例如，氨基丁醇磷酸磷酸化酶催化；以及
-f)2-丁酮至2-丁醇的转化，其可被，例如，丁醇脱氢酶催化。
在另一个实施例中，2-丁醇生物合成途径包括下列底物至产物的转化：
-a)丙酮酸至α-乙酰乳酸的转化，其可被，例如，乙酰乳酸合酶催化；
-b)α-乙酰乳酸至乙偶姻的转化，其可被，例如，乙酰乳酸脱羧酶催化；
-c)乙偶姻至2,3-丁二醇的转化，其可被，例如，丁二醇脱氢酶催化；
-d)2,3-丁二醇至2-丁酮的转化，其可被，例如，丁二醇脱水酶催化；以及
-e)2-丁酮至2-丁醇的转化，其可被，例如，丁醇脱氢酶催化。
在本发明的一些实施例中，重组宿主细胞包含生物合成途径。所述生物合成途径可包含降低或消除的醛脱氢酶活性和异丁醇或1-丁醇生物合成途径，其中所述途径包含丙酮酸至乙酰乳酸的底物至产物转化。在一些实施例中，包含能够将丙酮酸至乙酰乳酸转化的生物合成途径的重组宿主细胞包含编码具有乙酰乳酸合酶活性的多肽的多核苷酸。例如，所述生物合成途径可以是丁醇生产途径或丁二醇生产途径。所述生物合成途径还可以是支链氨基酸（例如，亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸）生产途径。
在其它实施例中，所述重组宿主细胞可包含异丁醇、1-丁醇或2-丁醇生物合成途径，如本文描述。在一些实施例中，所述丁醇生物合成途径为异丁醇生物合成途径。在所述公开的重组宿主细胞中的异丁醇或2-丁醇生产可受益于乙酰乳酸还原酶活性的降低、基本消除或消除。
修饰
丙酮酸脱羧酶基因的功能性缺失已被用于提高用于生物合成产物途径的丙酮酸的可用性。例如，全文以引用的方式并入本文的美国申请公布US2007/0031950A1公开了具有对一种或多种丙酮酸脱羧酶基因的破坏和对用于D-乳酸生产的D-乳酸脱氢酶基因的表达的酵母菌株。全文以引用的方式并入本文的美国申请公布US2005/0059136A1公开了不具有丙酮酸脱羧酶活性的葡萄糖耐受的二碳源不依赖型（GCSI）酵母菌株，其可具有外源的乳酸脱氢酶基因。Nevoigt和Stahl（Yeast12:1331-1337（1996））描述了降低的丙酮酸脱羧酶和提高的NAD-依赖的甘油-3-磷酸脱氢酶在啤酒糖酵母中对甘油收率的影响。全文以引用的方式并入本文的美国申请公布2009/0305363公开了丙酮酸向乙酰乳酸的提高转化，其通过工程化酵母以表达细胞溶胶定位的乙酰乳酸合酶和基本消除丙酮酸脱羧酶活性而进行。
在本发明的实施例中，本文所公开的重组宿主细胞可包含在编码具有丙酮酸脱羧酶（PDC）活性的多肽的内源多核苷酸中的修饰，或在具有PDC活性的内源多肽中的修饰。在多个实施例中，本文公开的重组宿主细胞可具有编码PDC的多核苷酸、基因和/或多肽的修饰或破坏。在多个实施例中，重组宿主细胞在编码具有PDC活性的多肽的内源多核苷酸或基因中，或在具有PDC活性的内源多肽中，包含缺失、突变和/或替换。这类修饰、破坏、缺失、突变和/或替换能够导致降低的或消除的PDC活性，导致例如，PDC敲除（PDC-KO）表型。
在本发明的实施例中，本文所公开的重组宿主细胞的内源丙酮酸脱羧酶活性将丙酮酸向乙醛转化，乙醛能够随后被转化为乙醇或通过乙酸转化为乙酰-CoA。在其它实施例中，重组宿主细胞是包含一个编码丙酮酸脱羧酶的基因的乳酸克鲁维酵母、包含一个编码丙酮酸脱羧酶的基因的光滑假丝酵母、或包含一个编码丙酮酸脱羧酶的基因的粟酒裂殖酵母。
在其它实施例中，重组宿主细胞是包含由PDC1、PDC5和PDC6基因编码的丙酮酸脱羧酶的三种同功酶以及丙酮酸脱羧酶调节基因PDC2的啤酒糖酵母。在啤酒糖酵母中的非限制性例子中，所述PDC1和PDC5基因，或所述PDC1、PDC5和PDC6基因受到破坏。在啤酒糖酵母中的另一个非限制性例子中，丙酮酸脱羧酶活性能够通过破坏PDC2调控基因而降低。在啤酒糖酵母中的另一个非限制性例子中，编码丙酮酸脱羧酶蛋白的多核苷酸或基因能够受到破坏，所述蛋白质诸如与PDC1、PDC2、PDC5和/或PDC6具有约70%至约75%、约75%至约80%、约80%至约85%、约85%至约90%、约90%至约95%、约96%、约97%、约98%、或约99%的序列同一性的蛋白质。
在多个实施例中，具有PDC活性的多肽或编码具有PDC活性的多肽的多核苷酸或基因对应于酶学委员会编号EC4.1.1.1。在其它实施例中，本文所公开的重组宿主细胞的PDC基因在所使用的发酵条件下不是活性的，因此这类基因将不需要被修饰或灭活。
具有由于丙酮酸脱羧酶编码基因的破坏导致丙酮酸脱羧酶活性降低的重组宿主细胞的例子已有报道，例如Flikweert等人文献中对于糖酵母的报道（Yeast（1996）12:247-257），Bianchi等人文献中对于克鲁维酵母菌的报道（Mol.Microbiol.（1996）19（1）:27-36）以及Hohmann文献中对调控基因的破坏（Mol.Gen.Genet（1993）241:657-666）。无丙酮酸脱羧酶活性的糖酵母属菌株可以使用登录号200027和200028获自ATCC。
可在本文所公开的重组宿主细胞中作为修饰或灭活的靶标的PDC多核苷酸、基因和/或多肽的例子包括但不限于下列的表8的那些。
表8：丙酮酸脱羧酶靶基因编码区和蛋白质。
Figure BDA0000419940220000751
能够在本文所公开的重组宿主细胞中作为修饰或灭活的靶标的PDC多核苷酸、基因和多肽的其它例子包括但不限于与表8的任何一个序列具有至少约70%至约75%、约75%至约80%、约80%至约85%、约85%至约90%、约90%至约95%、约96%、约97%、约98%、或约99%序列同一性的PDC多核苷酸、基因和/或多肽，其中这类多核苷酸或基因编码或这类多肽具有PDC活性。能够在本文所公开的重组宿主细胞中作为修饰或灭活的靶标的PDC多核苷酸、基因和多肽的另外的其它例子包括但不限于表8的任意一个序列的活性变体、片段或衍生物，其中这类多核苷酸或基因编码或这类多肽具有PDC活性。
在多个实施例中，编码本文所公开的或本领域已知的PDC序列的多核苷酸、基因和/或多肽能够被修饰，如上文针对醛脱氢酶所公开。在其它实施例中，编码PDC的多核苷酸、基因和/或多肽能够被用于鉴定另外的PDC多核苷酸、基因和/或多肽序列，或用于鉴定其它细胞中的PDC同源物，如上文针对乙酰乳酸脱氢酶所公开。这类PDC编码序列能够在，例如，文献中和/或技术人员熟知的生物信息学数据库中被鉴定。例如，利用生物信息学在其它的细胞类型中对PDC编码序列的鉴定，能够通过用已知的PDC编码DNA和多肽序列（例如本文所提供的那些）对可公开获得的数据库进行BLAST（如上文所述）检索而实现。同一性基于Clustal W比对方法，所述方法采用GAP PENALTY=10、GAP LENGTH PENALTY=0.1和Gonnet 250系列的蛋白质权重矩阵的默认参数。
在本文所公开的重组宿主细胞中用以降低或消除PDC活性的对PDC的修饰能够使用本领域已知的方法来确认。例如，对特定丙酮酸脱羧酶的破坏可使用该基因序列外部的引物以PCR筛选确认，或通过使用针对丙酮酸脱羧酶基因序列而设计的探针而进行的Southern印迹法来确认。作为另外一种选择，可利用诸如气相色谱或HPLC这样的分析方法针对乙醛和/或乙醇的减少生产或消除生产来筛选菌株。
己糖激酶2基因的功能性缺失已被用于减少葡萄糖阻遏作用和提高用于生物合成途径的丙酮酸的可用性。例如，全文以引用的方式并入本文的国际公布WO2000/061722A1公开了通过有氧生长具有一种或多种功能缺失的己糖激酶2基因或类似物的酵母而进行的酵母生物质生产。此外，Rossell等人（Yeast Research8：155-164（2008））发现带有己糖激酶2基因的缺失的啤酒糖酵母表现出发酵能力（以在糖过量且厌氧的条件下二氧化钛生产的特定比率定义）75%的降低。在经受饥饿后，其发酵能力与不含己糖激酶2基因缺失的菌株的能力相似。Diderich等人（Applied andEnvironmental Microbiology 67：1587-1593（2001））发现带有己糖激酶2的缺失的啤酒糖酵母具有较低的丙酮酸脱羧酶活性。
在多个实施例中，本文所公开的重组宿主细胞可在编码具有己糖激酶2活性的多肽的内源多核苷酸中包含修饰，并且或者在具有己糖激酶2活性的多肽中包含修饰。在多个实施例中，本文所公开的重组宿主细胞可具有对编码己糖激酶2的多核苷酸、基因或多肽的修饰或破坏。在多个实施例中，重组宿主细胞在编码具有己糖激酶2活性的多肽的内源多核苷酸或基因中，或在具有己糖激酶2活性的内源多肽中，包含缺失、突变和/或替换。这类修饰、破坏、缺失、突变和/或替换能够导致降低的或基本上消除的己糖激酶2活性，导致例如，己糖激酶2（HXK2-KO）敲除表型。在多个实施例中，所述宿主细胞包含美国申请系列号2011/0124060A1或2012/0015416A1中描述的修饰，其全文以引用的方式并入本文。
在多个实施例中，具有己糖激酶2活性的多肽能够催化下列转化：己糖至己糖-6-磷酸的转化和/或能够催化D-葡萄糖至D-葡萄糖6-磷酸的转化、D-果糖至D-果糖6-磷酸的转化和/或D-甘露糖至D-甘露糖6-磷酸的转化。在其它实施例中，具有己糖激酶2活性的多核苷酸、基因或多肽能够对应于酶学委员会编号EC2.7.1.1。
在本发明的实施例中，重组宿主细胞可以是啤酒糖酵母，并且具有己糖激酶2活性的多核苷酸、基因或多肽可以是HXK2。在其它实施例中，重组宿主细胞可以是乳酸克鲁维酵母，并且具有己糖激酶2活性的多核苷酸、基因或多肽可以是RAG5。在其它实施例中，重组宿主细胞可以是多形汉逊酵母，并且具有己糖激酶2活性的多核苷酸、基因或多肽可以是HPGLK1。在其它实施例中，重组宿主细胞可以是粟酒裂殖酵母，并且具有己糖激酶2活性的多核苷酸、基因或多肽可以是HXK2。
能够在本文所公开的重组宿主细胞中作为修饰或灭活的靶标的己糖激酶2的多核苷酸、基因和多肽的例子包括但不限于下文的表9的那些。
表9：己糖激酶2靶基因编码区和蛋白质。
Figure BDA0000419940220000771
Figure BDA0000419940220000781
能够在本文所公开的重组宿主细胞中作为修饰或灭活的靶标的己糖激酶2的多核苷酸、基因和多肽的其它例子包括但不限于：与表9的任何一个序列具有至少约70%至约75%、约75%至约80%、约80%至约85%、约85%至约90%、约90%至约95%、约96%、约97%、约98%、或约99%序列同一性的己糖激酶2多核苷酸、基因和/或多肽，其中这类多核苷酸或基因编码己糖激酶2活性，或者这类多肽具有己糖激酶2活性。能够在本文所公开的重组宿主细胞中作为修饰或灭活的靶标的己糖激酶2的多核苷酸、基因和多肽的另外的其它例子包括但不限于：表9的任何一个序列的活性变体、片段或衍生物，其中这类多核苷酸或基因编码己糖激酶2活性，或者这类多肽具有己糖激酶2活性。
在多个实施例中，编码本文所公开的或本领域已知的己糖激酶2序列的多核苷酸、基因和/或多肽可受到修饰或破坏，如上文针对醛脱氢酶所公开。在其它实施例中，编码己糖激酶2的多核苷酸、基因和/或多肽能够被用于鉴定另外的己糖激酶2多核苷酸、基因和/或多肽序列，或用于鉴定其它细胞中的己糖激酶2同源物，如上文针对醛脱氢酶所公开。这类己糖激酶2编码序列能够在，例如，文献中和/或技术人员熟知的生物信息学数据库中被鉴定。例如，利用生物信息学在其它的细胞类型中对己糖激酶2编码序列的鉴定，可通过用已知的己糖激酶2编码DNA和多肽序列（例如本文所提供的那些）对可公开获得的数据库进行BLAST（如上文所述）检索而实现。同一性基于Clustal W比对方法，所述方法采用GAPPENALTY=10、GAPLENGTH PENALTY=0.1和Gonnet250系列的蛋白质权重矩阵的默认参数。
可以使用本领域已知的方法来确认用于在本文所公开的重组宿主细胞中降低或消除己糖激酶2活性的己糖激酶2修饰。例如，对特定己糖激酶2的破坏可使用该己糖激酶2基因外部的引物以PCR筛选来确认，或通过使用针对己糖激酶2基因序列而设计的探针而进行的Southern印迹法来确认。作为另外一种选择，可针对含葡萄糖培养基上提高的生物质收率来检测推定的己糖激酶2敲除菌株。
在本文提供的细胞中可用的另外修改的例子包括降低甘油-3-磷酸脱氢酶的活性的修饰和/或对编码具有丙酮酸脱羧酶活性的多肽的至少一个基因的破坏，或对编码控制丙酮酸脱羧酶基因表达的调控元件的至少一个基因的破坏，如美国专利申请公布No.2009/0305363所述（以引用方式并入本文），对宿主细胞的修改通过Entner-Doudoroff途径提供增加的碳流量或降低等价平衡，如美国专利申请公布2010/0120105所述（以引用方式并入本文）。其它的修改包括整合编码催化丙酮酸利用的生物合成途径中一个步骤的多肽的至少一个多核苷酸，其描述于PCT申请公布WO2012/033832中，其全文以引用的方式并入本文。具有降低葡萄糖抑制的遗传修饰（其中酵母生产的宿主细胞是pdc-）描述于美国申请公布US2011/0124060中，其全文以引用的方式并入本文。
以引用的方式并入本文的美国申请公布20120064561A1公开了重组宿主细胞，其包含（a）至少一种多核苷酸，其编码二羟酸脱水酶活性的多肽；以及（b）（i）在编码影响Fe-S簇生物合成的多肽的内源基因中的至少一个缺失、突变和/或替换；和/或（ii）编码影响Fe-S簇生物合成的多肽的至少一种多核苷酸。在多个实施例中，所述影响铁-硫簇生物合成的多肽由AFT1、AFT2、FRA2、GRX3或CCC1所编码。在多个实施例中，所述影响Fe-S簇生物合成的多肽为组成型突变体AFT1 L99A、AFT1 L102A、AFT1 C291F或AFT1 C293F。
此外，宿主细胞可包含编码具有磷酸酮醇酶活性多肽的异源多核苷酸和/或编码具有磷酸转乙酰酶活性的多肽的异源多核苷酸，诸如，由SEQID NO:962和963编码的多肽，以及如PCT申请公布WO2011/159853中的描述，其全文以引用的方式并入本文。
异丁醇和其它产物
在本发明的实施例中，提供了用于生产生物合成途径的产物的方法，其包括（a）提供本文公开的重组宿主细胞，以及（b）使所述宿主细胞在由此产生所述生物合成途径的产物的条件下生长。在其它实施例中，所述产物作为副产物与乙醇一起生产。在另外的实施例中，所述生物合成途径的产物是异丁醇。
在其它实施例中，与在不包含降低或消除的醛脱氢酶和/或醛氧化酶活性和/或乙酰乳酸还原酶活性的重组宿主细胞中的相同产物生产相比，所述生物合成途径的产物以更高的收率或量进行生产。在多个实施例中，收率提高了至少约2%，至少约5%或至少约10%。在多个实施例中，这一更高的收率包括大于理论值的约10%的收率的生产，大于理论值的约20%的收率的生产，大于理论值的约25%的收率的生产，大于理论值的约30%的收率的生产，大于理论值的约40%的收率的生产，大于理论值的约50%的收率的生产，大于理论值的约60%的收率的生产，大于理论值的约70%的收率的生产，大于理论值的约75%的收率的生产，大于理论值的约80%的收率的生产，大于理论值的约85%的收率的生产，大于理论值的约90%的收率的生产，大于理论值的约95%的收率的生产，大于理论值的约96%的收率的生产，大于理论值的约97%的收率的生产，大于理论值的约98%的收率的生产，大于理论值的约99%的收率的生产，或理论值约100%的收率的生产。在其它实施例中，所述产物作为副产物与乙醇一起生产。在另外的实施例中，所述生物合成途径的产物是异丁醇。
具有异丁醛向异丁酸（作为途径副产物）的转化的生物合成途径的任何产物可在本文公开的重组宿主细胞中以更高的效能生产，所述重组宿主细胞具有所描述的对醛脱氢酶和/或醛氧化酶活性的修饰。这类产物的列单包括但不限于异丁醇。
用于异丁醇生产的微生物宿主
用于生产异丁醇的微生物宿主可以选自细菌、蓝细菌、丝状真菌和酵母。用于生产丁醇的微生物宿主应是异丁醇耐受型的，以便收率不受丁醇毒性的限制。尽管已从产溶剂梭菌（solventogenic Clostridia）中分离了丁醇耐受性突变体，但有关其它潜在可用的细菌菌株的丁醇耐受性方面的信息几乎没有。关于细菌中醇耐受性的比较的大部分研究表明，丁醇的毒性大于乙醇（deCavalho等人，Microsc.Res.Tech.，64:215-22，2004），并且（Kabelitz等人，FEMS Microbiol.Lett.，220:223-227，2003，Tomas等人，J.Bacteriol.，186:2006-2018，2004）报道在丙酮丁醇梭菌中的发酵期间1-丁醇的收率可收到1-丁醇毒性的限制。1-丁醇对丙酮丁醇梭菌的主要影响是破坏膜功能（Hermann等人，Appl.Environ.Microbiol.，50：1238-1243，1985）。
选择用于生产异丁醇的微生物宿主应该是异丁醇耐受型的，并应能将碳水化合物转化为异丁醇。选择合适微生物宿主的标准包括如下：对异丁醇的固有耐受，高效率的葡萄糖利用，用于基因操作的遗传工具的可用性，以及产生稳定的染色体变化的能力。
具有异丁醇耐受性的合适宿主菌株可以通过基于菌株的固有耐受性进行筛选而鉴定。微生物对异丁醇的固有耐受性可以通过测定在基本培养基中培养时造成生长率50%抑制的异丁醇浓度（IC50）来测量。所述IC50可以利用本领域已知的方法来确定。例如，可让所关注的微生物在含有不同量的异丁醇的情况下生长，通过测量600纳米下的光密度来监测生长率。倍增时间可以从生长曲线的对数部分计算并用作生长率的量度。产生50%生长抑制的异丁醇的浓度可以从生长抑制百分对异丁醇浓度的曲线图来测定。在一个实施例中，所述宿主细胞对于异丁醇具有大于约0.5%的IC50。
用于生产异丁醇的微生物宿主还应以高速率利用葡萄糖。大多数微生物都能够代谢碳水化合物。然而，某些环境微生物不能高效代谢碳水化合物，因此它们应非合适的宿主。
对宿主进行遗传修饰的能力对任何重组微生物的产生来说十分关键。基因转移技术的模式可以是电穿孔、接合、转导或自然转化。可利用多种宿主接合性质粒和药物抗性标记。基于可在宿主中产生作用的抗生素抗性标记的性质，针对该宿主微生物体来定制克隆载体。
还必须对微生物宿主进行操作处理以便通过删除多种基因而使竞争性途径失活。这就需要存在转座子或染色体整合载体用以引导失活。此外，生产宿主应受到化学诱变以便得到改善的异丁醇固有耐受性的突变体。
基于上述标准，用于生产异丁醇的合适微生物宿主包括但不限于：梭菌属（Clostridium）、发酵单胞菌属（Zymomonas）、埃希氏菌属（Escherichia）、沙门氏菌属（Salmonella）、红球菌属（Rhodococcus）、假单胞菌属（Pseudomonas）、芽孢杆菌属（Bacillus）、弧菌属（Vibrio）、乳酸菌属（Lactobacillus）、肠球菌属（Enterococcus）、产碱杆菌属（Alcaligenes）、克雷伯氏菌属（Klebsiella）、类芽孢杆菌属（Paenibacillus）、节杆菌属（Arthrobacter）、棒状杆菌属（Corynebacterium）、短杆菌属（Brevibacterium）、毕赤酵母属（Pichia）、假丝酵母属（Candida）、伊萨酵母属（Issatchenkia）、汉逊酵母属（Hansenula）、克鲁维酵母属（Kluyveromyces）和糖酵母属（Saccharomyces）。合适的宿主包括：大肠杆菌（Escherichia coli）、真养产碱杆菌（Alcaligenes eutrophus）、地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）、浸麻类芽孢杆菌（Paenibacillusmacerans）、红平红球菌（Rhodococcus erythropolis）、恶臭假单胞菌（Pseudomonas putida）、植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）、屎肠球菌（Enterococcus faecium）、鹑鸡肠球菌（Enterococcus gallinarium）、粪肠球菌（Enterococcus faecalis）、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）和啤酒糖酵母。在一些实施例中，所述宿主细胞是啤酒糖酵母。啤酒糖酵母菌酵母在本领域中是已知的并且可获自不同的来源，包括但不限于美国典型培养物保藏中心（Rockville，MD）、Centraalbureau voor Schimmelcultures（CBS）的真菌多样性中心（FungalBiodiversityCentre）、LeSaffre、GertStrand AB、Ferm Solutions、North American Bioproducts、Martrex和Lallemand。啤酒糖酵母包括但不限于BY4741、CEN.PK113-7D、Ethanol
Figure BDA0000419940220000821
酵母、Ferm ProTM酵母、
Figure BDA0000419940220000822
XR酵母、Gert Strand Prestige BatchTurbo alcohol酵母、Gert Strand Pot Distillers酵母、Gert Strand DistillersTurbo酵母、FerMaxTMGreen酵母、FerMaxTMGold酵母、
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酵母、BG-1、PE-2、CAT-1、CBS7959、CBS7960和CBS7961。
生产宿主的构建
可以采用本领域熟知的技术来构建含有必需基因的重组微生物，所述必需基因应编码用于将可发酵碳底物转化为丁醇的酶途径。如上所述，在本发明中，可从多个来源分离获得编码本发明其中一种异丁醇生物合成途径的酶的基因，例如乙酰乳酸合酶、乙酰羟酸还原异构酶、乙酰羟酸脱水酶、支链α-酮酸脱羧酶和支链的醇脱氢酶。
从基因组中获得所需基因的方法是分子生物学领域中常用并且为人所熟知的。例如，如果基因的序列已知，则可以通过限制性内切酶消化来产生合适的基因组文库并且可以用与所需基因序列互补的探针来筛选。分离了序列之后，即可以用标准的引物引导的扩增方法如聚合酶链反应（U.S.4,683,202）来扩增DNA，以获得适于使用合适载体转化的量的DNA。用于优化密码子以在异源宿主细胞内表达的工具很容易得到。一些密码子优化工具可基于宿主微生物的GC含量获得。
鉴定并分离了相关途径的基因之后，即可将它们通过本领域中已知的方法转化到合适的表达宿主内。用于转化多种宿主细胞的载体或盒是常见的，并且可从以下公司商购获得：如
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（Madison，WI）、Invitrogen Corp.（Carlsbad，CA）、Stratagene（La Jolla，CA）和NewEngland Biolabs，Inc.（Beverly，MA）。通常，载体或盒包含指导相关基因转录和翻译的序列、选择性标记和允许自主复制或染色体整合的序列。合适的载体包含含有转录起始控制的基因5'区和控制转录终止的DNA片段3'区。这两种控制区均能够来源于与转化的宿主细胞同源的基因，但是应当理解，这种控制区也能够来源于对被选择作生产宿主的特定物种来说是非天然的基因。
可用于驱动相关途径编码区在所需宿主细胞中表达的起始控制区或启动子有很多，并且为本领域技术人员所熟悉。实际上能够驱动这些基因元件的任何启动子（包括例子中使用的启动子）均适用于本发明，其包括但不限于CYC1、HIS3、GAL1、GAL10、ADH1、PGK、PHO5、GAPDH、ADC1、TRP1、URA3、LEU2、ENO、TPI（用于糖酵母属中的表达）；AOX1（用于毕赤酵母属中的表达）；以及lac、ara、tet、trp、lPL、lPR、T7、tac和trc（用于大肠杆菌、产碱杆菌属和假单胞菌属中的表达），以及amy、apr、npr启动子和用于枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌和浸麻类芽孢杆菌中的表达的多种噬菌体启动子。对于酵母重组宿主细胞，大量的启动子可用于构建基因的表达盒，包括但不限于适用于酵母的以下组成型启动子：FBA1、TDH3（GPD）、ADH1、ILV5和GPM1；以及适用于酵母的以下诱导型启动子：GAL1、GAL10、OLE1和CUP1。其它酵母启动子包括杂合启动子UAS（PGK1）-FBA1p（SEQ ID NO:406）、UAS（PGK1）-ENO2p（SEQ ID NO:538）、UAS（FBA1）-PDC1p（SEQ IDNO:539）、UAS（PGK1）-PDC1p（SEQ ID NO:540）和UAS（PGK）-OLE1p（SEQ ID NO:541）。
启动子、转录终止子和编码区可克隆进酵母2μ质粒并转化到酵母细胞中（Ludwig等人，Gene，132:33-40，1993；美国申请公布20080261861A1）。
在给定宿主中对基因表达量的调节可通过改变转录水平而实现，诸如通过选择天然或人工的启动子。此外，诸如使用启动子文库以获得所期望的基因转录水平这样的技术在本领域中是为人所熟知的。这类文库可使用本领域中已知的技术来创建，例如，通过克隆基因盒前的随机cDNA片段（Goh等人（2002）AEM99，17025），通过调节启动子内存在的调控序列（Ligr等人（2006）Genetics172，2113），或通过对已知启动子序列的诱变（Alper等人（2005）PNAS，12678；Nevoigt等人（2006）AEM72，5266）。
终止控制区也可源于宿主的天然的多种基因。任选地，终止位点可以是非必要的或可被包含入。
某些载体能够在广泛的宿主细菌中复制并可通过接合进行转移。可利用完全并注解的序列pRK404和三个相关载体-pRK437、pRK442和pRK442（H）。这些衍生物已被证明是在革兰氏阴性菌中进行遗传操作处理的有用工具（Scott等人，Plasmid，50:74-79，2003）。广宿主范围的IncP4质粒RSF1010的几种衍生质粒也可获得，其具有在一系列革兰氏阴性菌中发挥功能的启动子。质粒pAYC36和pAYC37具有连同多个克隆位点一起的活性启动子，使得在革兰氏阴性菌中的异源基因能够表达。
染色体基因置换工具也可广泛获得。例如，将广宿主范围的复制子pWV101的热敏性变体进行改良以构建可用于在一系列革兰氏阳性菌内实现基因置换的质粒pVE6002（Maguin等人，J.Bacteriol.，174:5633-5638，1992）。此外，体外转座体可得自商业来源（例如
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），用以在各种基因组中产生随机突变。
异醇生物合成途径在多种微生物宿主中的表达在下面进行了更详细的描述。
丁醇生物合成途径在大肠杆菌中的表达
可用于转化大肠杆菌的载体或试剂盒是很常见的并且可以从上述公司商购获得。例如，异丁醇生物合成途径的基因可从多个来源分离、克隆到经修饰的pUC19载体中并转化进大肠杆菌NM522中。
丁醇生物合成途径在红平红球菌（Rhodococcus erythropolis）中的表 达
大肠杆菌-红球菌属穿梭载体可用于红平红球菌（R.erythropolis），包括但不限于pRhBR17和pDA71（Kostichka等人，Appl.Microbiol.Biotechnol.，62:61-68，2003）。此外，一系列启动子可用于异源基因在红平红球菌中的表达（Nakashima等人，Appl.Environ.Microbiol.，70:5557-5568，2004和Tao等人，Appl.Microbiol.Biotechnol.，68:346-354，2005）。红平红球菌染色体基因中的靶向基因破坏可以利用Tao等人（参见上文）和Brans等人（Appl.Environ.Microbiol.，66:2029-2036，2000）所描述的方法来产生。
最初可以将如上所述的产生异丁醇所需的异源基因克隆至pDA71或pRhBR71内，并转化到大肠杆菌中。然后，可以通过电穿孔将载体转化进红平红球菌中，如Kostichka等人（参见上文）所述。重组子可在含有葡萄糖的合成培养基中生长，并随后可利用本领域已知的方法来产生异丁醇。
丁醇生物合成途径在枯草芽孢杆菌中的表达
枯草芽孢杆菌中基因表达及突变产生的方法也是本领域所熟知的。例如，异丁醇生物合成途径的基因可从多个来源分离，克隆到经修饰的pUC19载体中并转化到枯草芽孢杆菌BE1010中。此外，可将异丁醇生物合成途径的五个基因分成两个操纵子用于表达。可将该途径的三个基因（bubB、ilvD和kivD）整合到枯草芽孢杆菌BE1010的染色体中（Payne等人，J.Bacteriol.，173，2278-2282，1991）。可将其余的两个基因（ilvC和bdhB）克隆到表达载体中并转化进携带整合的异丁醇基因的芽孢杆菌菌株中。
丁醇生物合成途径在地衣芽孢杆菌中的表达
在枯草芽孢杆菌中复制的大多数质粒和穿梭载体可用于通过原生质体转化或电穿孔来转化地衣芽孢杆菌。可将异丁醇生产所需的基因克隆于质粒pBE20或pBE60的衍生物中（Nagarajan等人，Gene，114:121-126，1992）。转化地衣芽孢杆菌的方法在本领域中是已知的（Fleming等人Appl.Environ.Microbiol.，61:3775-3780，1995）。所构建的用于在枯草芽孢杆菌中表达的质粒可以被转化到地衣芽孢杆菌内以产生可生产异丁醇的重组微生物宿主。
丁醇生物合成途径在浸麻类芽孢杆菌中的表达
可按照上文关于在枯草芽孢杆菌中表达的描述来构建质粒，并通过原生质体转化法将该质粒用于转化浸麻类芽孢杆菌，以产生可生产异丁醇的重组微生物宿主。
丁醇生物合成途径在真氧产碱杆菌（Alcaligenes（Ralstonia） eutrophus）中的应用
用于在真养产碱杆菌中进行基因表达和产生突变的方法是本领域内已知的（Taghavi等人，Appl.Environ.Microbiol.，60:3585-3591，1994）。可以将异丁醇生物合成途径的基因克隆进上述任何广宿主范围的载体中，并通过电穿孔以形成生产异丁醇的重组子。产碱杆菌属中的聚羟基丁酸酯途径已经有详细描述，多种改良真养产碱杆菌基因组的遗传技术是已知的，并且这些工具可以应用于工程化异丁醇生物合成途径。
丁醇生物合成途径在恶臭假单胞菌中的表达
在恶臭假单胞菌中表达基因的方法是本领域内已知的（参见例如Ben-Bassat等人，美国专利6,586,229，其以引用的方式并入本文）。可将所述丁醇途径基因插入pPCU18，并且该连接DNA可通过电穿孔进入电感受态恶臭假单胞菌DOT-T1C5aAR1细胞中以形成能生产异丁醇的重组子。
丁醇生物合成途径在啤酒糖酵母中的表达
用于啤酒糖酵母中基因表达的方法是本领域已知的（例如，Methods in Enzymology，第194卷，GuidetoYeast Genetics and Molecular and Cell Biology，A部分，2004，Christine Guthrie和GeraldR.Fink编辑，ElsevierAcademic Press，San Diego，CA）。酵母中的基因表达通常需要在受关注的基因前的启动子和转录终止子。大量的酵母启动子，包括本文例子中使用的启动子，可用于构建编码异丁醇生物合成途径的基因的表达盒，所述启动子包括但不限于组成型启动子FBA、GPD、ADH1和GPM，以及诱导型启动子GAL1、GAL10和CUP1。适宜的转录终止子包括但不限于FBAt、GPDt、GPMt、ERG10t、GAL1t、CYC1和ADH1。例如，可将合适的启动子、转录终止子和异丁醇生物合成途径的基因克隆进入大肠杆菌-酵母穿梭载体并且转化进入酵母细胞，如美国申请公布20100129886中所描述。这些载体允许菌株在大肠杆菌和酵母株中繁殖。载体通常包含选择性标记和在目标宿主中允许自主复制或染色体整合的序列。在酵母中通常使用的质粒是穿梭载体pRS423、pRS424、pRS425和pRS426（美国典型培养物保藏中心，Rockville，MD），它们包含大肠杆菌复制起点（例如，pMB1）、酵母2μ复制起点，以及用于营养选择的标记。这四种载体的选择标记物是His3（载体pRS423）、Trp1（载体pRS424）、Leu2（载体pRS425）和Ura3（载体pRS426）。构建具有编码所关注多肽的基因的表达载体可在大肠杆菌中以标准分子克隆技术完成或者在酵母中以缺口修复重组方法完成。
缺口修复克隆方法利用了酵母中高效的同源重组。典型地，酵母载体DNA被消化（例如，在其多克隆位点），以在其序列中产生“空位”。生成了许多受关注的插入DNA，所述插入DNA在5'和3'端包含×21bp的序列，这些序列彼此依次重叠，并且与载体DNA的5'和3'端重叠。例如，为构建“GeneX”的酵母表达载体，表达盒选择了酵母启动子和酵母终止子。所述启动子和终止子扩增自酵母基因组DNA，而基因X通过PCR扩增自其源生物，或者从包含基因X序列的克隆载体获得。至少21bp的重叠序列存在于在线性载体和启动子序列的5'之间、在启动子和基因X之间、基因X与终止子序列之间和在终止子与线性载体3'端之间。然后，所述“有间隙的”载体和所述插入DNAs共转化到酵母菌株中并且接种到包含适宜化合物混合物的培养基上，将允许质粒上的营养选择标记互补。通过利用从选择的细胞制备的质粒DNA进行PCR作图，能够验证正确的插入组合的存在。然后可将从酵母分离的质粒DNA（通常浓度较低）转入大肠杆菌菌株，例如TOP10，然后通过小量抽提和限制性作图进一步验证所述质粒构建体。最后，所述构建体可通过序列分析得到验证。
与缺口修复技术类似，向酵母基因组的整合也利用了酵母中的同源重组系统。典型地，利用高保真度DNA聚合酶和引物，包含编码区加上控制元件（启动子和终止子）和营养缺陷型标记的盒被PCR扩增，其中所述引物与所述盒杂交，并且包含与期望插入发生的基因组区域的5'和3'区同源的40-70碱基对的序列。然后将PCR产物转入酵母，并涂布于包含适当的化合物混合物的培养基上，所述混合物允许对所整合的营养缺陷型标记的选择。例如，为整合“基因X”到染色体位置“Y”中，所述启动子-编码区X-终止子构建体是由质粒DNA构建体PCR扩增的，并通过SOE聚合酶链反应或一般的限制性消化和克隆接合到营养缺陷型标记（如URA3）。所述全长盒，包含启动子-编码区X-终止子-URA3区，是PCR扩增得到的，所用引物序列为包含40-70个碱基对、与酵母染色体Y位置的5'和3'区同源性。上述PCR产物被转入酵母，并在缺乏尿嘧啶的生长培养基上进行选择。转化子可通过克隆PCR或通过对染色体DNA的直接测序得到验证。
丁醇生物合成途径在植物乳杆菌中的表达
乳杆菌属属于乳杆菌科（Lactobacillales），并且用于转化枯草芽孢杆菌和链球菌的许多质粒及载体可用于转化乳杆菌属。合适载体的非限制性例子包括：pAMβ1及其衍生物（Renault等人，Gene183:175-182，1996）；以及（O'Sullivan等人，Gene，137:227-231，1993）；pMBB1和pMBB1的衍生物pHW800（Wyckoff等人，Appl.Environ.Microbiol.，62:1481-1486，1996）；接合性质粒pMG1（Tanimoto等人，J.Bacteriol.，184:5800-5804，2002）；pNZ9520（Kleerebezem等人，Appl.Environ.Microbiol.，63:4581-4584，1997）；pAM401（Fujimoto等人，Appl.Environ.Microbiol.，67:1262-1267，2001）；以及pAT392（Arthur等人，Antimicrob.AgentsChemother.，38:1899-1903，1994）。几种来源于植物乳杆菌的质粒也已被报道（vanKranenburg等人，Appl.Environ.Microbiol.，71：1223-1230，2005）。
丁醇生物合成途径在多种肠球菌属菌种（屎肠球菌（E.faecium）、鹑 鸡肠球菌（E.gallinarium）和粪肠球菌（E.faecalis））中的表达
肠球菌属属于乳杆菌科，上述用于转化乳酸杆菌、芽孢杆菌和链球菌菌种的多种质粒和载体也可用于肠球菌属的菌种。合适载体的非限制性例子包括：pAMβ1及其衍生物（Renault等人，Gene183:175-182，1996）；以及（O'Sullivan等人，Gene，137:227-231，1993）；pMBB1和pMBB1的衍生物pHW800（Wyckoff等人，Appl.Environ.Microbiol.，62:1481-1486，1996）；接合性质粒pMG1（Tanimoto等人，J.Bacteriol.，184:5800-5804，2002）；pNZ9520（Kleerebezem等人，Appl.Environ.Microbiol.，63:4581-4584，1997）；pAM401（Fujimoto等人，Appl.Environ.Microbiol.，67:1262-1267，2001）；以及pAT392（Arthur等人，Antimicrob.AgentsChemother.，38:，1899-1903，1994）。采用来自乳球菌属的nisA基因的粪肠球菌表达载体也可使用（Eichenbaum等人，Appl.Environ.Microbiol.，64：2763-2769，1998）。另外，用于在屎肠球菌染色体中进行基因置换的载体（Nallaapareddy等人，Appl.Environ.Microbiol.，72:334-345，2006）也可使用。
发酵培养基
本发明中的发酵培养基必须包含合适的碳底物。合适的底物可包括但不限于：单糖诸如葡萄糖和果糖；低聚糖诸如乳糖、麦芽糖、半乳糖、蔗糖；多糖诸如淀粉、纤维素或它们的混合物；以及来自可再生原料的未纯化混合物，例如干酪乳清渗透物、玉米浆、甜菜糖蜜及大麦麦芽。另外，碳底物也可以是已被证明可以经代谢转化为关键生化中间产物（诸如二氧化碳）的一碳底物或甲醇。除了一碳和二碳底物之外，甲基营养微生物体也已知可以利用多种其它含碳化合物，例如甲胺、葡糖胺及用于代谢活动的多种氨基酸。例如，甲基营养酵母已知可利用来自甲胺的碳来形成海藻糖或甘油（Bellion等人，Microb.GrowthC1Compd.，[Int.Symp.]，第7届（1993），415-32.（编辑）：Murrell，J.Collin；Kelly，DonP.Publisher:Intercept，Andover，UK）。类似地，假丝酵母属的多种菌种可代谢丙氨酸或油酸（Sulter等人，Arch.Microbiol.，153:485-489，1990）。因此，预期本发明中所利用的碳源可涵盖各种含碳底物并且将仅受限于微生物体的选择。
尽管预期以上提及的所有碳底物以及它们的混合物均适用于本发明，但是在一些实施例中，对于经过修饰以利用C5糖的酵母细胞，优选的碳底物是葡萄糖、果糖和蔗糖，或者是它们与C5糖如木糖和/或阿拉伯糖的混合物。蔗糖能够来源于可再生的糖源例如甘蔗、甜菜、木薯、甜高粱、以及它们的混合物。葡萄糖和右旋糖可通过糖化淀粉基原料来源于可再生的谷物来源，包括谷物如玉米、小麦、黑麦、大麦、燕麦、以及它们的混合物。此外，可发酵的糖类可通过预处理和糖化过程来源于可再生的纤维素的或木质纤维素的生物质，例如，如美国专利申请公布2007/0031918A1中的描述，其全文以引用的方式并入本文。生物质指任何纤维质或木质纤维质材料，并包括包含纤维素的材料，以及任选地还包含半纤维素、木质素、淀粉、低聚糖和/或单糖的材料。生物质也能够包含附加组分如蛋白质和/或脂质。生物质可来源于单一来源，或者生物质可包括来源于一种以上来源的混合物；例如，生物质可包括玉米芯和玉米秸秆的混合物，或草和叶片的混合物。生物质包括但不限于生物能作物、农业残余物、市政固体垃圾、工业固体垃圾、来自造纸业的淤渣、庭院垃圾、木材和林业垃圾。生物质的例子包括但不限于：玉米粒、玉米芯、作物残余物如玉米壳、玉米秸秆、草、小麦、小麦秸秆、大麦、大麦秸秆、干草、稻秆、柳枝稷、废纸、甘蔗渣、高粱、大豆、从谷物研磨中获得的组分、树、枝、根、叶、木屑、锯末、灌木和灌丛、蔬菜、水果、花、动物粪肥、以及它们的混合物。
除了合适的碳源外，发酵培养基还必须含有本领域技术人员已知的适于培养物生长并促进本文所述的丁醇生产所必需的酶途径的矿物、盐、辅因子、缓冲液和其它组分。
培养条件
通常，使细胞在约20℃至约40℃的温度范围下在合适的培养基中生长。本发明中的合适生长培养基是常规的商业制备培养基，诸如LuriaBertani（LB）液体培养基、沙氏葡糖（SD）液体培养基或酵母液体培养基（YM），或者包含酵母氮基、硫酸铵和右旋糖（作为碳源/能源）的液体培养基或YPD培养基（其为蛋白胨、酵母提取物和右旋糖的最优比例共混物，用于生长大多数啤酒糖酵母菌株）。也可使用其它的限定或合成生长培养基，并且用于特定微生物生长的适当的培养基对于微生物学或发酵科学领域中的技术人员来说是已知的。还可向发酵培养基中并入已知直接或间接调节分解代谢物阻遏的试剂，如环腺苷酸2',3'-单磷酸（cAMP）。
适于发酵的pH范围在pH5.0到pH9.0之间，其中pH6.0至pH8.0优选作为初始条件。适宜酵母发酵的pH值范围通常为约pH3.0至约pH9.0。在一个实施例中，初始条件采用了约pH5.0至约pH8.0。适宜其它微生物体发酵的pH值范围为约pH3.0至约pH7.5。在一个实施例中，初始条件采用了约pH4.5至约pH6.5。
发酵可在有氧或厌氧条件下进行。在一个实施例中，使用了有氧或厌氧的发酵条件。
工业分批发酵和连续发酵
本方法可使用分批发酵方法。经典的分批发酵是封闭系统，其中培养基的组成在发酵开始时设定并且在发酵过程中不进行人工改变。因此在发酵开始时，用所期望的微生物对培养基进行接种，在不向系统添加任何物质的情况下进行发酵。然而，通常来说，“分批”发酵是指碳源的添加是成批的，但经常试图控制诸如pH和氧浓度之类的因素。在分批发酵系统中，代谢产物和生物质组成持续改变直至发酵结束时。在分批培养物内，细胞缓慢通过静态延滞期到达高速生长对数期，并最后达到稳定期，此时生长速率减缓或终止。如果不加以处理，稳定期中的细胞将最终死亡。通常，对数期中的细胞负责产生大部分终产物或中间产物。
标准分批式系统的一种变型是补料分批系统。补料分批发酵工艺也适用于本发明，并且包括典型的分批式系统，不同的是随着发酵进程递增地添加底物。在代谢产物往往抑制细胞的代谢作用以及其中期望培养基中具有有限量的底物时，补料分批式系统是有用的。补料分批式系统中的实际底物浓度难以测量并因而可根据可测量因素例如pH、溶解氧以及废气如CO2的分压进行评估。分批和补料-分批发酵是常见的和本领域熟知的，例子可见于ThomasD.Brock，Biotechnology:A Textbook of Industrial Microbiology，第二版，Sinauer Associates，Inc.，Sunderland，MA（1989）或Deshpande，Mukund（Appl.Biochem.Biotechnol.，36:227，1992），该文献以引用方式并入本文。
尽管本发明是以分批模式进行，但预期该方法将可适用于连续发酵方法。连续发酵是一种开放式系统，其中将设定好的发酵培养基连续加入生物反应器中，并同时移出等量条件培养基用于加工。连续发酵一般使培养物维持在其中细胞主要处于对数生长期的恒定高密度。
连续发酵允许调节一种因素或任意数目的因素，这些因素影响细胞生长或终产物浓度。例如，一种方法将维持限制性营养物质例如碳源或氮水平处于固定速率并允许所有其它参数适度。在其它系统中，影响生长的许多因素能够连续改变，而通过培养基浊度测量的细胞浓度保持不变。连续系统力求维持稳态的生长条件，并因而在发酵过程中由于培养基被取出而导致的细胞损失必须与细胞的生长率保持平衡。用于调节连续发酵工艺中的营养物质和生长因子的方法以及使产物形成速率保持最高水平的方法是工业微生物学领域众所周知的，并且多种方法已由Brock（同上）详细描述。
预期可采用分批发酵、补料分批发酵或采用连续发酵工艺来实施本发明，并且任何已知的发酵模式均将适用。另外，预期可以将细胞固定在底物上而作为全细胞催化剂并让其经受发酵条件以生产异丁醇。
用于从发酵培养基中分离丁醇的方法
使用ABE发酵的领域中已知的方法可从发酵培养基中分离生物生产的丁醇（参见例如，Durre，Appl.Microbiol.Biotechnol.，49：639-648（1998），Groot等人，Process.Biochem.27:61-75（1992），以及本文参考文献）。例如，能够通过离心、过滤、滗析等方法从发酵培养基中去除固体。然后，能够使用诸如蒸馏、共沸蒸馏、液-液提取、吸附、汽提、膜蒸发、或全蒸发的方法从发酵培养基中分离所述丁醇。
因为丁醇与水形成低沸点的共沸混合物，蒸馏可被用于分离混合物直至其共沸组成。蒸馏能够与其它分离方法组合使用以分离共沸物。能够与蒸馏组合使用以分离并纯化丁醇的方法包括但不限于滗析、液-液提取、吸附和基于膜的技术。另外，使用夹带剂的共沸蒸馏可以分离丁醇（参见，例如，Doherty和Malone，Conceptual Design of Distillation Systems，McGraw Hill，New York，2001）。
丁醇-水混合物形成非均相共沸物，从而能够组合使用蒸馏和滗析以分离并纯化丁醇。在这种方法中，包含丁醇的发酵液体培养基被蒸馏至接近共沸组成。然后，冷凝共沸混合物，通过滗析从发酵培养基分离丁醇。滗析后的含水相能够作为回流返回第一蒸馏塔。富含丁醇的滗析有机相可通过在第二蒸馏塔中蒸馏进一步被纯化。
也可从发酵培养基中组合使用液-液提取和蒸馏分离丁醇。在这种方法中，使用液-液提取用合适溶剂从发酵液体培养基中提取丁醇。然后蒸馏包含丁醇的有机相以从溶剂中分离丁醇。
蒸馏与吸附的组合也可用于从发酵培养基中分离丁醇。在这种方法中，蒸馏包含丁醇的发酵液体培养基使其接近共沸组成，然后使用吸附剂移除剩余的水，例如分子筛（Aden等人，Lignocellulosic Biomass toEthanol Process Design and Economics Utilizing Co-Current Dilute AcidPrehydrolysis and Enzymatic Hydrolysis for Corn Stover，ReportNREL/TP-510-32438，National Renewable Energy Laboratory，2002年6月）。
此外，可组合使用蒸馏和全蒸发以从发酵培养基中分离和纯化丁醇。在这种方法中，蒸馏包含丁醇的发酵液体培养基使其接近共沸组合物，然后用全蒸发通过亲水性膜移除剩余的水（Guo等人，J.Membr.Sci.245，199-210（2004））。
当生产丁醇时可使用原位产物移除（ISPR）（也称为提取发酵）从发酵容器中移除丁醇（或其它发酵性醇），从而使得微生物以高收率生产丁醇。本领域已描述的移除发酵性醇的一种ISPR方法为液-液提取。一般来讲，关于丁醇发酵例如所述包括微生物的发酵培养基，在丁醇浓度达到毒性水平之前与有机提取剂接触。所述有机提取剂和所述发酵培养基形成两相混合物。所述丁醇分配至有机提取剂相，降低了在包含微生物的水相中的浓度，从而限制了微生物在抑制性的丁醇中的暴露。
可进行液-液提取，例如，根据美国专利申请公布2009/0305370中描述的方法，其公开内容以全文形式并入本文。美国专利申请公布2009/0305370描述了采用液-液提取生产和从发酵液体培养基中移除丁醇的方法，所述方法包括了将发酵液体培养基同与水不混溶的提取剂接触、已形成包含水相和有机相的两相混合物的步骤。通常，所述提取剂可为选自饱和的、单不饱和的、多不饱和的（以及它们的混合物）C12-C22脂肪醇、C12-C22脂肪酸、C12-C22脂肪酸的酯、C12-C22脂肪醛、以及它们的混合物。用于ISPR的所述提取剂可为非醇提取剂。所述ISPR提取剂可为外源性有机提取剂，如油醇、二十二醇、鲸蜡醇、月桂醇、十四醇、硬脂醇、1-十一醇、油酸、月桂酸、肉豆蔻酸、硬脂酸、肉豆蔻酸甲酯、油酸甲酯、十一醛、月桂醛、20-甲基十一醛、以及它们的混合物。
在一些实施例中，可通过将发酵培养基中的醇接触羧酸（例如脂肪酸）和能够以该羧酸酯化该醇的催化剂来形成酯，如PCT申请公布WO/2011/159998所描述，其全文以引用的方式并入本文。在这类实施例中，所述羧酸可作为ISPR提取剂，其中分配入了醇酯。羧酸可被提供至发酵容器和/或来源于生物质，所述生物质向发酵容器提供可发酵的碳原料。可将所述原料中存在的脂质催化水解成为羧酸，并且相同的催化剂（例如，酶）可使所述羧酸与醇酯化。所述催化剂可在发酵前供应至原料中，或在供给原料前或与其同时供应至发酵容器中。当催化剂被供给到发酵容器中时，能通过脂质水解成羧酸，并且羧酸与发酵容器中存在的丁醇基本上同时进行酯化而获得醇酯。羧酸和/或并非来源于所述原料的天然的油也可被进料至发酵容器，所述天然的油被水解为羧酸。任何不与醇酯化的羧酸均可作为ISPR提取剂的一部分。所述包含醇酯的提取剂可从发酵培养基中分离，并且所述醇可从提取剂中回收。所述提取剂可在发酵容器中循环利用。因此，就生产丁醇而言，例如丁醇至酯的转化可降低发酵培养基中的游离丁醇浓度，防护微生物免受趋升的丁醇浓度的毒性作用。此外，未分级的谷物可被用作原料而不从其中分离脂质，因为脂质可被催化水解为羧酸，从而降低了脂质在ISPR提取剂中积累的速率。
原位产物移除可以成批模式或连续模式进行。在连续模式的原位产物移除中，产物从反应器中持续地移除。在分批模式的原位产物移除中，一定体积的有机提取剂加入至发酵容器中，并且在这个过程中不移除所述提取剂。对于原位产物移除，有机提取剂可在形成两相发酵培养基的发酵开始时接触发酵培养基。作为另外一种选择，所述有机提取剂可以在当所述微生物达到一个期望的生长量之后与所述发酵培养基接触，其中所述生长量的达到可以通过测定培养物的光密度而确定。而且，所述有机提取剂可在发酵培养基中的产物醇水平到达预设水平时接触发酵培养基。就根据本发明的一些实施例的丁醇生产而言，羧酸提取剂可在丁醇浓度到达毒性水平之前接触发酵培养基，以便使丁醇和羧酸进行酯化以生产丁醇酯，并因而降低发酵容器中的丁醇浓度。然后在丁醇酯达到期望的有效滴度后，所述含酯的有机相可从发酵容器中移除（并于与组成水相的发酵液体培养基分离）。在一些实施例中，在发酵容器中的可利用发酵糖的发酵基本上完成后，所述含酯的有机相可与水相分离。
实例
在下面的实例中将进一步限定本发明。应该理解，这些实例尽管示出了本发明的优选实施例，但仅是以说明性方式给出的。通过上述讨论和这些实例，本领域技术人员可以确定本发明的实质性特征，并且在不脱离本发明的实质和范围的前提下，可以对本发明进行各种改变和修饰以适应各种应用和条件。
一般方法：
实例中使用的标准重组DNA和分子克隆技术在本领域中是为人们所熟知的并且描述于：Sambrook，J.，Fritsch，E.F.和Maniatis，T.，Molecular Cloning:A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor LaboratoryPress，Cold Spring Harbor，N.Y.，1989，T.J.Silhavy，M.L；Bennan和L.W.Enquist，Experiments with Gene Fusions，Cold Spring HarborLaboratory，Cold Spring Harbor，N.Y.，1984以及Ausubel，F.M.等人，Current Protocols in Molecular Biology，Greene Publishing Assoc.and Wiley-Interscience，N.Y.，1987。
适合细菌培养物维持及生长的材料和方法在领域内也是众所周知的。适用于如下实例的技术可见于：Manual of Methods for General Bacteriology，Phillipp Gerhardt，R.G.E.Murray，Ralph N.Costilow，Eugene W.Nester，Willis A.Wood，NoelR.Krieg和G.BriggsPhillips编辑，American Society for Microbiology，Washington，DC.，1994或ThomasD.Brock在Biotechnology:A Textbook of Industrial Microbiology，第二版，Sinauer Associates，Inc.，Sunderland，MA，1989之中。使用的用于细菌细胞生长和维持的所有试剂、限制性内切酶和材料均得自Aldrich Chemicals（Milwaukee，WI）、BD Diagnostic Systems（Sparks，MD）、LifeTechnologies（Rockville，MD）或Sigma Chemical Company（St.Louis，MO）获得，除非另外指明。
所使用的简称的含义如下：“
Figure BDA0000419940220000971
”意为埃，“min”意为分钟，“h”意为小时，“μl”意为微升，“ng/μl”意为纳克/微升，“pmol/μl”意为皮摩尔/微升，“ml”意为毫升，“L”意为升，“g/L”意为克/升，“ng”意为纳克，“sec”意为秒，“ml/min”意为毫升/分钟，“w/v”意为重量/体积，“v/v”意为体积/体积，“nm”意为纳米，“mm”意为毫米，“cm”意为厘米，“mM”意为毫摩，“M”意为摩，“g”意为克，“μg”意为微克，“mg”意为毫克，“g”意为重力常数，“rpm”意为转数/分钟，“HPLC”意为高效液相色谱法，“MS”意为质谱法，“HPLC/MS”意为高效液相色谱法/质谱法，“EDTA”意为四乙酸乙二胺，“dNTP”意为脱氧核苷酸三磷酸，“℃”意为摄氏度，并且“V”意为电压。
基因文库的高通量筛选测定法
突变KARI酶基因文库的高通量筛选如本文描述而进行（实例16和21有所例外）：使用分子纯级别的水制备了10×冷冻培养基并过滤消毒，其包含554.4g/L甘油、68mM的(NH4)2SO4、4mMMgSO4、17mM柠檬酸钠、132mMKH2PO4、36mMK2HPO4。通过使用LB培养基稀释所述10×冷冻培养基来制备冷冻培养基。将冷冻培养基的等分试样（200μl）用于96孔存档平板（目录号3370，Corning Inc.Corning，NY）的各孔。
来自LB琼脂平板的克隆受到选择并且接种到包含冷冻培养基的96孔存档平板中，并不经振荡而在37℃下生长过夜。随后将该存档平板储存于-80℃。一直使用由pBAD-HisB（Invitrogen）转化过的大肠杆菌Bw25113菌株作阴性对照。实例3、4和5的文库的阳性对照分别是野生型的K9-KARI、AB1D3、AB1D3。
将来自存档平板的克隆接种到96深孔平板。各孔包含3.0μl来自融化的存档平板的细胞、200μlLB培养基，其包含100μg/ml氨苄青霉素和0.02%（w/v）阿拉伯糖作为诱导物。将细胞以80%的湿度同时振荡（900rpm）而在37℃下生长过夜，通过离心进行收集（4000rpm，5分钟，25℃下）（Eppendorf离心机，Brinkmann Instruments，Inc.Westbury，NY）并且将细胞团块储存于-20℃以用于随后的分析。
测定底物（R,S）-乙酰乳酸如Aulabaugh和Schloss所描述进行合成（Aulabaugh和Schloss，Biochemistry，29:2824-2830，1990）。测定法中使用的所有其它化学药品均购自Sigma。
KARI对乙酰乳酸向α,β-二羟基异戊酸的酶促转换通过使用酶标仪（MolecularDevice，Sunnyvale，CA）在340nm下测量辅因子NADPH或NADH从反应中的消失来加以追踪。针对NADPH或NADH均使用6220M-1cm-1的摩尔消光系数来计算活性。所使用的储存溶液为：K2HPO4（0.2M）；KH2PO4（0.2M）；EDTA（0.5M）；MgCl2（1.0M）；NADPH（2.0mM）；NADH（2.0mM）和乙酰乳酸（45mM）。制备了100ml的反应缓冲液（pH6.8），其包含：2.0mlK2HPO4，3.0mlKH2PO4，4.0mlMgCl2，0.1mlEDTA和90.9ml水。
同时，在室温下将深孔平板中的冷冻细胞团块和BugBuster暖化30分钟。将96孔分析平板的各孔充入120μl反应缓冲液和20μl的NADH（2.0mM）。在30分钟的暖化后向各孔中加入75μl的50%BugBuster（v/v，水中）并使用平板振荡器悬浮细胞。在室温下孵育所述平板20分钟。将细胞裂解物的等分试样（15至25μl，取决于预期活性）转移进入96孔分析平板的各孔中。记录340nm下的吸光度以作为背景，向各孔内加入16μl的乙酰乳酸（4.5mM，使用反应缓冲液进行稀释）并且通过酶标仪进行振荡混合。在加入底物后的第0分钟并且根据预期的活性在第10至30分钟记录340nm下的吸光度。吸光度的差异（加入底物之前和之后）用于测定所述突变体的活性。与阳性对照相比具有更高KARI活性的突变体被选用于再筛选。
用于实例1、2和3中的文库的筛选的克隆数量分别为约12,000、12,000和92。来自各文库的最优表现者如下文描述进行再度筛选以作为二次测定法。
对活性突变体的二次测定法
在37℃下将包含通过高通量筛选（上文）而鉴定出的获选突变体的细胞在3.0ml的LB培养基中过夜生长，其包含100μg/ml氨苄青霉素和0.025%（w/v）阿拉伯糖作为诱导物，同时在250rpm下振荡。随后将所述细胞等分取样进入96深孔平板（200μl/孔）并且通过在室温下以4,000×g离心5分钟来收集。向各孔中加入75μl的50%BugBuster（v/v，水中）并使用平板振荡器悬浮细胞。在室温下孵育所述平板20分钟。将细胞裂解物的等分试样（15至25μl，取决于预期活性）转移进入96孔分析平板中，其包含120μl反应缓冲液和20μl的NADH（2.0mM）/孔。记录340nm下的吸光度以作为背景，向各孔内加入16μl的乙酰乳酸（4.5mM，使用反应缓冲液进行稀释）并且通过酶标仪进行振荡混合。在加入底物后的第0分钟并且根据预期的活性在第5至10分钟记录340nm下的吸光度。使用吸光度的差异（加入底物之前和之后）来测定所述突变体的活性。与阳性对照相比具有更高KARI活性的突变体被选用于进一步表征。
对NADH和NADPH的米氏常数的测量。
KARI酶活性可如上所述通过NADH或NADPH氧化来进行常规测量，然而，为针对这些吡啶核苷酸来测量米氏常数（KM），使用了HPLC/MS以直接测量2,3-二羟基异戊酸产物的形成。
来自Bugbuster裂解细胞（如上文描述）的粗制细胞提取物的蛋白质浓度使用BioRad蛋白质测定试剂（BioRad Laboratories，Inc.，Hercules，CA94547）进行测量。将0.2至1.0微克的粗制提取物蛋白加入反应缓冲液达到90μL的体积，所述反应缓冲液由100mM MOPS KOH，pH6.8、10mM MgCl2、1mM EDTA、1mM葡糖-6-磷酸（Sigma-Aldrich）、0.2单位的肠膜明串珠菌（Leuconostoc mesenteroides）葡糖-6-磷酸脱氢酶（Sigma-Aldrich）和不同浓度的NADH或NADPH组成。该反应通过加入10μL[S]-乙酰乳酸以达到2.5mM的最终浓度和100μL的最终体积来起始。在30℃下孵育10分钟后，通过移取50μL的反应混合物并将其加入150μL的0.1%甲酸来淬灭该反应。为测量NADH和NADPH的KM，所使用的浓度为0.0003、0.001、0.003、0.01、0.03、0.1、0.3和1mM。
为分析2,3-二羟基异戊酸，将2μL的甲酸淬灭反应混合物注入WatersAcquity HPLC，其配备WatersSQD质谱仪（Waters Corporation，Milford，MA）。色谱条件为：流速（0.5ml/分钟），在Waters AcquityHSST3色谱柱上（直径2.1mm，长度100mm）进行。缓冲液A由0.1%（v/v）处于水中组成，缓冲液B是乙腈中的0.1%甲酸。使用1%缓冲液B（处于缓冲液A中）进行1分钟，随后为从第1分钟时的1%缓冲液B至第1.5分钟时的75%缓冲液B的梯度，从而分析所述样品。通过使用电喷雾离子化-30V的进样锥电压而在m/z=133下的离子化来检测反应产物2,3-二羟基异戊酸。产物2,3-二羟基异戊酸的量通过与正标物进行的比较来计算。
为计算NADH和NADPH的KM，将在固定浓度的S-乙酰乳酸（2.5mM）下的测定法中测得的DHIV形成速度数据对单底物米氏方程进行拟合，其使用了MicrosoftExcel中的最小二乘回归法，假设了饱和的乙酰乳酸浓度。
质粒pYZ058、pLH550、pLH556和pLH702的构建
pYZ058（pHR81-PCUP1-AlsS-PILV5-酵母KARI；SEQ ID NO:176）来自于pYZ090（pHR81-PCUP1-AlsS-PILV5-lactisKARI；SEQ ID NO:195）。pYZ090使用PmeI和SfiI酶进行了切割并且与酵母KARI的PCR产物进行连接。该PCR产物从啤酒糖酵母BY4741（ResearchGeneticsInc.）菌株中使用上引物5'-catcatcacagtttaaacagtatgttgaagcaaatcaacttcggtgg-3'（SEQ ID NO:272）和下引物5'-ggacgggccctgcaggccttattggttttctggtctcaactttctgac-3'（SEQ IDNO:273）而扩增，并且使用PmeI和SfiI酶进行消化。pYZ058通过测序加以证实。
pLH550（pHR81-PCUP1-AlsS-PILV5-Pf5.KARI，SEQ ID NO:175）来自于pYZ058（SEQ ID NO:176）。野生型Pf5.KARI基因使用OT1349（5'-catcatcacagtttaaacagtatgaaagttttctacgataaagactgcgacc-3'；SEQ ID NO:177）和OT1318（5'-gcacttgataggcctgcagggccttagttcttggctttgtcgacgattttg-3'；SEQ ID NO:178）进行PCR扩增，使用PmeI和SfiI酶消化并且与使用PmeI和SfiI进行切割的pYZ058载体进行连接。所产生的载体pLH550通过测序进行证实。
pLH556（SEQ ID NO:138；图4）是通过SpeI和NotI酶消化载体而从pLH550产生的，并且与使用从OT1383（5'-ctagtcaccggtggc-3'，SEQ IDNO:179）和OT1384（5'-ggccgccaccggtga-3'，SEQ ID NO:180）退火而得的接头进行连接，其包含用于SpeI和NotI位点的重叠序列。这一克隆步骤消除了AlsS基因和PCUP1启动子的大片段，具有160bp的无功能剩余上游序列。pLH556通过测序进行了证实。
pHR81::ILV5p-K9D3（pLH702，SEQ ID NO:181）来自于pLH556。使用PmeI和SfiI酶从载体pBAD-K9D3中切出K9D3突变KARI基因并且将其与pLH556在PmeI和SfiI位点进行连接，从而以K9D3基因替换了Pf5.KARI基因。所构建的载体通过测序进行了证实。
实例1
包含多种KARI基因的酵母异丁醇途径菌株的构建
为鉴定在酵母异丁醇生产中具有KARI活性和性能的多肽，对来自多种细菌和真菌物种的KARI编码基因实施了生物多样性筛选。KARI基因根据啤酒糖酵母基因的密码子偏倚性（如表10示出）进行了密码子优化。对于各KARI基因，使用序列5'-GTTTAAACAGT-3'（SEQ ID NO:136）在ATG起始密码子之前向5'端加入了PmeI限制性位点和额外的3个bp（AGT），并且使用序列5'-GGCCCTGCAGGCC-3'（SEQ ID NO:137）向3'端加入了SfiI限制性位点。全部KARI基因均由GenScriptUSAInc.（Piscataway，NJ）合成。各KARI基因均通过PmeI和SfiI位点亚克隆进入pHR81-PCUP1-AlsS-PIlv5-Pf5.Ilv5载体（SEQ ID NO:175）（Ilv5编码酵母酮醇酸还原异构酶）。这一载体包含两个表达盒：处于酵母CUP1启动子之下的枯草芽孢杆菌乙酰乳酸合酶（AlsS）基因以及受到Ilv5启动子控制的酵母Ilv5基因。进行了序列分析来证实KARI基因的序列。
携带KARI基因的pHR81-PCUP1-AlsS-PIlv5-KARI载体与pLH468（pRS423-PFBA1-DHAD-PTDH3-kivD-PGPM1-hADH1；SEQ ID NO:139）共转化进入宿主菌株BP1135（PNY1505；实例8）（CEN.pk113-7DΔura3::loxPΔhis3Δpdc6Δpdc1::ilvD.SmΔpdc5::sadBΔgpd2::loxPΔfra2）。在30℃下5-7天后在最低drop-out培养基平板（SE-Ura-His，2%乙醇）上选择酵母转化子，并将其重新划线于SE-Ura-His上以在另外3天孵育后获得细胞菌斑。该细胞菌斑用于摇瓶接种。
实例2
针对异丁醇生产筛选KARI多样性收集物
所述多种KARI基因根据其在酵母中的“有效产率”进行评估。该有效产率在进行性限氧条件下生长一定时期后（例如48h）进行测定。酵母生物质以1OD600的酵母细胞相当于0.3g/L的假设来计算。
将携带不同KARI基因的酵母异丁醇途径菌株接种到10mlSEG-Ura,His培养基，其具有0.2%葡萄糖和0.2%乙醇，并使其在30℃下有氧生长过夜至约2OD。对所述培养物进行离心并在125ml摇瓶中将部分细胞重悬浮于SEG-Ura,His（2%葡萄糖，1%乙醇），达到25ml总体积中的0.4的初始OD600。以旋紧式固体塑料盖封闭该摇瓶，并在进行性限氧条件下在该烧瓶中以同外界环境的最低空气和氧气交换来生长培养物。在30℃，250rpm下进行48h的孵育后，移取培养物用于OD600测量和HPLC分析，以测量异丁醇生产。
通过进行筛选的KARI基因，如下文所示出，多种具有与乳酸乳球菌KARI可比较或比之更优的异丁醇滴度。具体地，根据在进行性限氧条件下生长48h后进行的测量，K9（粪厌氧棒状菌DSM14662）KARI克隆表现出高异丁醇滴度和有效的异丁醇产率（表10）。
表10：来自携带多种KARI基因的酵母异丁醇生产菌株的异丁醇滴度 和有效产率，在进行性限氧条件下在30℃下摇瓶中生长48h后测量而得。
Figure BDA0000419940220001021
Figure BDA0000419940220001031
实例3
对酵母异丁醇途径菌株的KARI酶分析
IpOHA（N-异丙基乙二酰氧肟酸）是KARI酶所催化的反应的反应中间物的模拟物。其为紧密的结合性抑制剂，结合于KARI酶的活性位点。IpOHA的合成及其与来自大肠杆菌的KARI的紧密结合描述于文献中（A.Aulabaugh和J.V.Schloss，Biochemistry，1990，29，2824-2830）。其对于活性位点滴定的应用此前尚无报道。IpOHA通过[14C]-草酸盐根据文献来合成。
收集来自实例2的酵母培养物并针对KARI酶活性进行分析。对25ml的培养物离心并且重悬浮于10ml的50mM Tris-HCl，pH7.5中。对细胞进行再度离心以除去缓冲液，并将细胞团块储存于-70℃下。将细胞团块重悬浮于1ml的50mM Tris-HCl pH7.5中并进行超声破碎。可溶性粗制细胞提取物用于实施酶测定法。将部分的酶与摩尔过量的[14C]-IpOHA以及饱和浓度的NAD（P）H和Mg2+进行孵育。因为最初形成了可逆的、对稀释度敏感的复合物，所以将提取物的浓度保持了高水平以利于复合化并且因此而降低了紧密复合物形成所用的时间。因为各个KARI形成紧密复合物所用的时间长度是先验未知的，所以对各样品取了两个时间点来确认结果相符。在孵育时间的最后，通过使用
Figure BDA0000419940220001042
（Millipore Inc.，Billerica，MA）进行超滤来将小分子与蛋白质分子相分离，并对高分子量的级分进行计数。通过14Cdpm、体积和KARI亚基分子量来反算样品中的KARI浓度（以μM或mg/ml）。同时运行固定时间的酶测定法，并将数据用于计算U/ml。通过对给定样品将U/ml除以mg/ml来计算比活性。所做出的假设是全活性与结合IpOHA的能力是严格相关的。由此而测得的KARI酶比活性在表11中列出。KARI活性（以“单位/mg”）为活性/毫克KARI酶，如使用所述IpOHA测定法所定量。总蛋白浓度通过Bradford法来测定，并且KARI的表达水平通过将KARI酶量除以总可溶细胞蛋白的量来计算。
表11：通过IPOHA测定法测得的KARI酶活性
Figure BDA0000419940220001041
实例4
用于鉴定以低于野生型的K M 来利用NADH的变体的位点饱和文库的 构建
为构建基于pBAD的细菌表达载体以用于K9 KARI，将K9 KARI基因（由Genscript，Piscataway，NJ合成）通过PmeI和SfiI位点亚克隆进入pBAD-ps-JEA1载体（SEQ ID NO:905）。将来自粪厌氧棒状菌酮醇酸还原异构酶（KARI）（称为K9-KARI）用于文库构建。使用可商购获得的试剂盒，T4多核苷酸激酶（PNK）（USB Corporation，Cleveland，Ohio，70031Z）和Chang_IT多重位点介导诱变试剂盒（Multiple MutationSiteDirected MutagenesisKit）（USB Corporation，Cleveland，Ohio，78480），来构建一个基因文库。
寡核苷酸（K9_56_58_060210f：GAAGGANNKAAANNKTGGAAGAGAGC，SEQ ID NO:144；以及K9_56_58_060210r：GCTCTCTTCCAMNNTTTMNNTCCTTC，SEQ ID NO:145）由IntegratedDNATechnologies，Inc（CoralvilleIA）合成。它们首先通过T4PNK进行磷酸化。简而言之，30μl的反应混合物包含：3.0μl试剂盒提供的10×T4PNK缓冲液、4.0μl引物（约35μ）、0.8μl100mMATP混合物、0.6μlT4PNk和22μl水。将反应混合物在37℃下孵育1.0小时并随后在65℃下灭活T4PNK20分钟。
磷酰化的引物随后直接用于此后的PCR反应，从而使用试剂盒在两处位点将突变引入K9KARI野生型。简而言之，30μl反应混合物包含：3.0μl试剂盒提供的10×反应缓冲液、3.0μl磷酰化的正向引物和反向引物、2.0μlK9KARI野生型（50ng/μl）、1.2μlChang_IT酶和17.8μl的水。将这一反应混合物置于薄孔200μl容量的PCR管中，并将以下PCR反应程序用于PCR：起始温度为95℃下2分钟，随后是30个加热/冷却循环。每个循环由95℃下30秒，55℃下30秒，68℃分钟下20秒组成。在温度循环完成后，将样品保持在68℃下25分钟或更长，然后保持于4℃以用于此后的处理。使用ZymoDNA清理试剂盒（Zymo Research Corporation，OrangeCA，D4004）来清理该PCR反应。使用84μl的水将DNA从膜上洗脱。使用DpnI（Promega，MadisonWI，R6231）在37℃下进行3小时（反应混合物：10μl的10×反应缓冲液、1.0μlBSA、6.0μl的DpnI和83μl经过清理的PCRDNA）来除去DNA模板。经DpnI消化的DNA使用ZymoDNA清理试剂盒进行再度清理，并且使用DpnI再度消化来完全除去DNA模板（反应混合物：1.5μl的10×反应缓冲液、0.15μlBSA、0.85μlDpnI和83μl经过清理的PCR DNA）。使用BioRad Gene Pulser II（Bio-RadLaboratoriesInc.，Hercules，CA）将反应混合物直接用于转化大肠杆菌的电感受态菌株Bw25113（ΔilvC）（描述于美国专利8,129,162，其全文以引用的方式并入本文）。将转化的克隆划线于琼脂平板，其包含LB培养基和100μg/ml氨苄青霉素（目录号L1004，Teknova Inc.Hollister，CA）并且在37℃孵育过夜。针对利用NADH的活性筛选克隆。测量了所述变体的KM（表12）。
表12：
K9KARI变体在大肠杆菌提取物中的动力学数值，通过DHIV形成测 定法来测定
实例5
用于降低针对NADH的K M 的位点饱和基因文库的构建
基于对荧光假单胞菌KARI（PF5-KARI）的工作，第24、33、61、80、156和170位被靶定作为K9KARI的诱变靶点。通过PF5-KARI与K9KARI之间的多序列比对（图2），所对应的位置为30、39、67、86、162和176。
为鉴定出更多的诱变靶点，对确定在丁醇原菌株（参见其它的例子）中产生异丁醇的现有KARI酶（K1、K2、K7、K9、K25、K26，乳酸乳杆菌和S2）进行MSA以用于鉴定更多的诱变靶点。将第41、87、131、191、227和246位选作为诱变靶点。
靶向第30、39、41、67、86、87、131、162、176、191、227和246位的寡核苷酸由Integrated DNA Technologies，Inc（Coralville IA）进行商业合成（表13）。使用靶向第30、67、131、162、176、191、227和246位的八对寡核苷酸以来自Invitrogen（目录号10572-014，Invitrogen，Carlsbad，CA）的Supermix产生巨引物（Megaprimer）。对于各PCR反应，使用了编码来自这八对寡核苷酸的不同位置的一个正向引物和一个反向引物的任意组合（例如K9_30_101110f和K9_67_101110r）的一对引物。总计P8 2有56种组合。25μl反应混合物包含：22.5μl的Supermix溶液、1.0μl正向引物和1.0μl反向引物、0.5μlAB1D3 DNA模板（50ng/μl）。将该混合物置于薄壁200μl管中，用于在Mastercycler梯度设备（Brinkmann Instruments，Inc.Westbury，NY）中进行PCR反应。将以下的条件用于PCR反应：起始温度为95℃下1.0分钟，随后为35个加热/冷却循环。每个循环由95℃下20秒，55℃下20秒以及72℃下1.0分钟组成。在温度循环完成后，将样品保持在72℃下2.0分钟或更长，然后在4℃下等待回收。使用DNA清理试剂盒（目录号D4003，Zymo Research，Orange，CA）根据制造商的建议来清理PCR产物。
随后使用巨引物以QuickChange II XL位点介导诱变试剂盒（目录号200524，Stratagene，La JollaCA）来产生基因文库。25μl反应混合物包含：2.5μl的10×反应缓冲液、1.0μl50ng/μl的模板、20.5μl巨引物、0.5μl的40mMdNTP混合物、0.5μl pfu-ultraDNA聚合酶。除巨引物和模板之外，所使用的全部试剂与上文指出的试剂盒一起供应。将这一反应混合物置于薄孔200μl容量的PCR管中，并将以下反应用于PCR：起始温度为95℃下30秒，随后是25轮加热/冷却循环。每个循环由95℃下30秒，55℃下1分钟，68℃分钟下6分钟组成。在温度循环完成后，将样品保持在68℃下8分钟或更长，然后保持于4℃以用于此后的处理。以DpnI限制性酶对PCR反应混合物进行与实例4中相同的处理。
随后以QuickChange II XL位点介导诱变试剂盒将寡核苷酸K9_37&39_101110f、K9_37&39_101110r和K9_86&87_101110f、K9_86&87_101110r直接用于产生基因文库。两组25μl反应混合物用于两套寡核苷酸组。各25μl反应混合物包含：2.5μl的10×反应缓冲液、1.0μl50ng/μl模板、1.0μl正向引物、1.0μl反向引物、0.5μl的40mM dNTP混合物、0.5μlpfu-ultraDNA聚合酶和18.5μl的水。PCR程序与随后的DpnI处理是相同的。
经DpnI处理的DNA混合物使用Zymo DNA清理试剂盒遵循制造商的方案而进行清理。使用BioRad Gene Pulser II（Bio-Rad LaboratoriesInc.，Hercules，CA）将经清理的DNA用于转化大肠杆菌的电感受态菌株Bw25113（ΔilvC）。将转化的克隆划线于琼脂平板，其包含LB培养基和100μg/ml氨苄青霉素（目录号L1004，Teknova Inc.Hollister，CA）并且在37℃孵育过夜。针对利用NADH的改进活性筛选克隆。测量了改进突变体的KM（表14）。
表13：引物
Figure BDA0000419940220001081
Figure BDA0000419940220001091
表14：
一些突变体与其测得的K M 值的列表
Figure BDA0000419940220001092
实例6
用于降低针对NADH的K M 的组合文库的构建
根据诱变的结果（实例4），T131L、T131A、T131V、T131M、T131C、T191D、T191C、T191S和T191G被认为是改进针对NADH的KM的有利突变。制备了用于将这些有利突变引入AO7B5的组合文库。
全部寡核苷酸由Integrated DNA Technologies，Inc（Coralville IA）合成。它们首先通过T4PNK进行磷酸化。简而言之，20μl的反应混合物包含：2.0μl试剂盒提供的10×T4PNK缓冲液、2.85μl引物（约35μ）、0.6μl100mMATP混合物、0.4μlT4PNK和14.15μl水。将反应混合物在37℃下孵育1.0小时并随后在65℃下灭活T4PNK20分钟。
磷酰化的引物随后直接用于此后的PCR反应，从而使用试剂盒在两处位点将突变引入AO7B5。简而言之，50μl反应混合物包含：5.0μl试剂盒提供的10×反应缓冲液、2.5μl磷酰化的正向引物（0.5μl表15中示出的各正向引物）、2.5μl反向引物（0.625μl表15中示出的各正向引物）、2.5μlAO7B5（50ng/μl）、2.5μlChang_IT酶和35μ水。将这一反应混合物置于薄孔200μl容量的PCR管中，并将以下PCR反应程序用于PCR：起始温度为95℃下2分钟，随后是30个加热/冷却循环。每个循环由95℃下30秒，55℃下30秒，68℃分钟下20秒组成。在温度循环完成后，将样品保持在68℃下25分钟或更长，然后保持于4℃以用于此后的处理。使用Zymo DNA清理试剂盒（Zymo Research Corporation，OrangeCA，D4004）来清理该PCR反应。使用84μl的水将DNA从膜上洗脱。使用DpnI（Promega，Madison WI，R6231）在37℃下进行3小时（反应混合物：10μl的10×反应缓冲液、1.0μlBSA、6.0μl的DpnI和83μl经过清理的PCRDNA）来除去DNA模板。使用ZymoDNA清理试剂盒再度清理经DpnI消化的DNA，并且使用DpnI再度消化来完全除去DNA模板（反应混合物：1.5μl的10×反应缓冲液、0.15μlBSA、0.85μlDpnI和83μl经过清理的PCRDNA）。
经DpnI处理的DNA混合物使用Zymo DNA清理试剂盒遵循制造商的方案而进行清理。使用BioRad Gene Pulser II（Bio-Rad LaboratoriesInc.，Hercules，CA）将经清理的DNA用于转化大肠杆菌的电感受态菌株Bw25113（ΔilvC）。将转化的克隆划线于琼脂平板，其包含LB培养基和100μg/ml氨苄青霉素（目录号L1004，TeknovaInc.Hollister，CA）并且在37℃孵育过夜。针对利用NADH的改进活性筛选克隆。测量了改进突变体的KM（表16）。
表15：用于实例6的引物
Figure BDA0000419940220001101
表16：
一些突变体与其测得的K M 值的列表
Figure BDA0000419940220001112
实例7
通过K9KARI变体进行的异丁醇生产
如上文描述产生了K9KARI的以下变体。
表17：
KARI变体和对应的酵母表达载体
通过从大肠杆菌载体（pBAD.KARI）将变体KARI基因在PmeI和SfiI位点亚克隆进入pHR81-PIlv5-Pf5.KARI载体pLH556（图4，SEQ IDNO:138）而制备酵母表达载体。在PNY2204宿主（MATa ura3Δ::loxPhis3Δpdc6Δpdc1Δ::P[PDC1]-DHAD|ilvD_Sm-PDC1t-pUC19-loxP-kanMX-loxP-P[FBA1]-ALS|alsS_Bs-CYC1t pdc5Δ::P[PDC5]-ADH|sadB_Ax-PDC5tgpd2Δ::loxP fra2Δ adh1Δ::UAS（PGK1）P[FBA1]-kivD_Ll（y）-ADH1t；实例13）通过共转化KARI载体作为途径质粒1与pBP915（pRS423-PFBA1-DHAD-PGPM1-hADH1；SEQ ID NO:182）作为途径质粒2来制备酵母途径菌株。将转化子点覆于包含2%葡萄糖和0.1%乙醇作为碳源的相同培养基上。在微氧条件下在血清瓶中针对异丁醇生产测试了三组菌斑。使用pBP915和表达K9D3的pLH702质粒转化的克隆命名为PNY1910。
来自SE-Ura-His平板上的转化的酵母菌落在5-7天后出现。将菌落点覆于新鲜的SE-Ura-His平板上，在30℃下孵育3天。将点覆的细胞接种到25mlSEG-Ura,His培养基，其具有0.2%葡萄糖和0.2%乙醇，并将其在30℃下有氧生长1-2天达到约2-3OD。对细胞进行离心并重悬浮于1ml的SEG-Ura,His培养基中（2%葡萄糖、0.1%乙醇、10mg/L麦角固醇、50mMMES，pH5.5、硫胺素30mg/L、烟酸30mg/L）。将计算量的细胞转移至45ml总体积的相同培养基中以得60ml血清瓶中的起始OD=0.2，其顶部以亚折器紧密闭合。这一步骤在常规生物通风橱中在空气下完成。该血清瓶在30℃下以200rpm孵育2天。在第48h，移取样品用于OD分析和对葡萄糖、异丁醇和途径中间物的HPLC分析。在无氧室中采集24h的样品以维持血清瓶中的厌氧条件。在所述48h孵育的初始阶段，顶部空间（～15mL）和液体培养基中存在的空气通过生长中的酵母细胞加以消耗。在顶部空间中的氧气被消耗后，该培养物变成厌氧。因此，这一实验包括从有氧向限氧和厌氧条件的转换。
在四种K9变体中，AB1G9和AB1D3产生了相对高的异丁醇滴度，而495B5和AB1D1具有更低的滴度。野生型K9 KARI菌株产生了最低的滴度。不受理论的束缚，据信较低的滴度是由于当细胞从有氧向厌氧条件转换时NADH和NADPH的偏向平衡所导致。根据这一原理依据，在厌氧条件下NADH浓度和有效性显著提高，有利于使用NADH的变体KARI酶。根据动力学分析，除了其针对NADH相对低的KM（47& 38μM）之外，AB1G9（“K9G9”）和AB1D3（“K9D3”）突变体还针对NADPH具有相对高的KM（23&9.2μM）。根据比较，495B5和AB1D1针对NADPH的KM分别为2.5和1.1μM，并且野生型K9的KM为0.10μM。AB1G9和AB1D3的低NADHKM与AB1G9和AB1D3的高NADPHKM结合在一起可导致厌氧条件下降低的NADPH利用和相对高的NADH利用。作为证据，与相比495B5和AB1D1（2-3），AB1G9和AB1D3具有较低的甘油积累（异丁醇:甘油=3.3）。在相同的有氧向厌氧转换条件下，对于野生型K9而言异丁醇:甘油比为1:1。
表18：
通过在血清瓶中的有氧向厌氧转换实验而测得的野生型和变体K9 KARI酶的动力学性能、以及异丁醇滴度和产率。
Figure BDA0000419940220001141
实例8
啤酒糖酵母菌株BP1135（PNY1505）和PNY1507以及异丁醇生产型 衍生物的构建
本实例描述了啤酒糖酵母菌株BP1135和PNY1507。这些菌株来源于PNY1503（BP1064）。PNY1503来源于CEN.PK 113-7D（CBS 8340；Centraalbureau voor Schimmelcultures（CBS）Fungal Biodiversiry Centre，Netherlands）。bp1135包含附加的FRA2基因缺失。PNY1507来源于BP1135，其具有附加的ADH1基因缺失，以及将来自乳酸乳球菌（Lactococcus lactis）的kivD基因（其经密码子优化以在啤酒糖酵母中表达）整合到ADH1基因座中。
缺失/整合通过与PCR片段的同源性重组生成，所述PCR片段包含靶基因上游和下游同源性区以及用于转化子选择的URA3基因。所述URA3基因通过同源性重组去除以生成无痕的缺失/整合。
所述无痕缺失/整合步骤是改编自Akada等人，Yeast，23:399，2006。一般来讲，用于各缺失/整合的PCR盒是通过组合四个片段A-B-U-C和待整合基因而制备，这是在通过PCR扩增整个盒以用于缺失/整合工序之前将单个片段克隆进入质粒而完成的。待整合的基因在片段A和B之间包括于该盒。所述PCR包含选择/反选标记URA3（片段U），其由天然的CEN.PK113-7D URA3基因与启动子（URA3基因的上游250bp）和终止子（URA3基因的下游150bp）区组成。片段A和C（各长约100至500bp）对应于紧接靶区域（片段A）上游的序列以及靶区域的3'序列（片段C）。片段A和C用于通过同源重组将盒整合到染色体中。片段B（长500bp）对应于紧接靶区域下游的500bp并用于通过同源性重组从染色体上切除URA3标记和片段C，同时在该盒整合到染色体时生成对应片段B的序列的直接重复。
FRA2缺失
FRA2缺失被设计为从编码序列3'端删除250个核苷酸，保留FRA2编码序列的最初113个核苷酸不动。一个阅读框终止密码子出现在去除下游7个核苷酸的位置。用于无痕FRA2缺失的PCR盒的四个片段使用Phusion High FidelityPCR Master Mix（New England BioLabs；Ipswich，MA）并以CEN.PK 113-7D基因组DNA为模板来扩增，所述基因组DNA使用Gentra Puregene Yeast/Bact试剂盒（Qiagen；Valencia，CA）制备。使用引物为oBP594（SEQ ID NO:183）和包含与FRA2片段B的5'端具有同源性的5'尾的引物oBP595（SEQ ID NO:184）扩增FRA2片段A。使用包含与FRA2片段A的3'端具有同源性的5'尾的引物oBP596（SEQ ID NO:185）和包含与FRA2片段U的5'端具有同源性的5'尾的引物oBP597（SEQ ID NO:186）扩增FRA2片段B。使用包含与FRA2片段B的3'端具有同源性的5'尾的引物oBP598（SEQ ID NO:187）和包含与FRA2片段C的5'端具有同源性的5'尾的引物oBP599（SEQ ID NO:188）扩增FRA2片段U。使用包含与FRA2片段U的3'端具有同源性的5'尾的引物oBP600（SEQ ID NO:189）和引物oBP601（SEQ ID NO:190）扩增FRA2片段C。用PCR纯化试剂盒（Qiagen）纯化PCR产物。FRA2片段AB通过重叠PCR生成，通过混合FRA2片段A和FRA2片段B并用引物oBP594（SEQ ID NO:183）和oBP597（SEQ ID NO:186）进行扩增。FRA2片段UC通过重叠PCR生成，通过混合FRA2片段U和FRA2片段C并用引物oBP598（SEQ ID NO:187）和oBP601（SEQ ID NO:190）进行扩增。所得PCR产物在琼脂糖凝胶上电泳，然后通过Gel Extraction试剂盒（Qiagen）纯化。FRA2 ABUC盒通过重叠PCR生成，通过混合FRA2片段AB和FRA2片段UC并用引物oBP594（SEQ ID NO:183和oBP601（SEQ ID NO:190）进行扩增。用PCR纯化试剂盒（Qiagen）纯化PCR产物。
制备了PNY1503的感受态细胞，并使用Frozen-EZYeastTransformation II试剂盒（Zymo Research；Orange，CA）以FRA2 ABUCPCR盒转化了感受态细胞。转化混合物在30℃接种到缺乏尿嘧啶补充以1%的乙醇的合成完全培养基上。以引物oBP602（SEQ ID NO:191）和oBP603（SEQ ID NO:192）使用以Gentra Puregene Yeast/Bact试剂盒（Qiagen）制备的基因组DNA通过PCR来筛选具有fra2敲除的转化子。正确的转化子生长于YPE（酵母提取物、蛋白胨、1%乙醇）中，并在30℃下涂板到包含5-氟-乳清酸（0.1%）的合成完全培养基上以选择失去了URA3标记的分离株。以引物oBP602（SEQ ID NO:191）和oBP603（SEQID NO:192）使用以Gentra Puregene Yeast/Bact试剂盒（Qiagen）制备的基因组DNA通过PCR来确认所述缺失和标记移除。来自分离株的FRA2基因的缺乏通过PCR阴性结果来证明，所用FRA2的缺失编码区的特异性引物为oBP605（SEQ ID NO:193）和oBP606（SEQ ID NO:194）。所述正确的分离株被选择为菌株CEN.PK113-7D MATa ura3Δ::loxP his3Δpdc6Δpdc1Δ::P[PDC1]-DHAD|ilvD_Sm-PDC1t pdc5Δ::P[PDC5]-ADH|sadB_Ax-PDC5t gpd2Δ::loxP fra2Δ并命名为PNY1505（BP1135）。
使用异丁醇途径质粒（pYZ090，SEQ ID NO:195）和pLH468（SEQID NO:139）转化这一菌株，并将一个克隆命名为BP1168（PNY1506）。
pYZ090（SEQ ID NO:195）经构建而包含具有来自枯草芽孢杆菌alsS基因编码区（核苷酸位置457-2172）的嵌合基因（所述alsS基因通过酵母CUP1启动子（核苷酸2-449）表达并继之以CYC1终止子（核苷酸2181-2430））以用于表达ALS，以及具有来自乳酸乳球菌ilvC基因（核苷酸3634-4656）的嵌合基因（所述ilvC通过酵母ILV5启动子（2433-3626）表达并后接ILV5终止子（核苷酸4682-5304））以用于表达KARI。
ADH1的缺失和kivDLl（y）的整合
ADH1基因被删除，并被来自乳酸乳球菌的kivD编码区替代，所述kivD编码区针对在啤酒糖酵母中的表达经过密码子优化。将ADH1缺失-kivD_Ll（y）整合无痕盒首先克隆进质粒pUC19-URA3MCS中，如美国申请61/356379所述，该申请提交于2010年6月18日，以引用方式并入本文。该载体是基于pUC19的并包含处于多克隆位点（MCS）内的来自啤酒糖酵母CEN.PK113-7D的URA3基因序列。pUC19包含pMB1复制子和编码β-内酰胺酶的基因以用于大肠杆菌中的复制与选择。除了URA3的编码序列，还存在这一基因上游（250bp）和下游（150bp）的序列以表达URA3基因。所述载体能用于克隆的目的，并且能用做酵母整合载体。
使用pLH468（SEQ ID NO:139）作为模板，以包含PmeI限制性位点的引物oBP562（SEQ ID NO:197）以及包含与ADH1片段B的5'端具有同源性的5'尾的引物oBP563（SEQ ID NO:198）来扩增针对啤酒糖酵母中的表达进行了密码子优化的来自乳酸乳球菌的kivD编码区。通过如上制备的基因组DNA使用包含与kivD_Ll（y）的3'端具有同源性的5'尾的引物oBP564（SEQ ID NO:199）和包含FseI限制性位点的引物oBP565（SEQID NO:200）来扩增ADH1片段B。用PCR纯化试剂盒（Qiagen）纯化了PCR产物。kivD_Ll（y）-ADH1片段B通过重叠PCR生成，通过混合kivD_Ll（y）和ADH1片段BPCR产物并用引物oBP562（SEQ ID NO:197）和oBP565（SEQ ID NO:200）扩增。所得到的PCR产物用PmeI和FseI消化，用T4DNA连接酶连到用适合的酶消化过的pUC19-URA3MCS的对应的位点上。通过基因组DNA中使用包含SacI限制性位点的引物oBP505（SEQ ID NO:201）和包含AscI限制性位点的引物oBP506（SEQID NO:202）扩增ADH1片段A。ADH1片段A的PCR产物用SacI和AscI消化并用T4DNA连接酶连接到包含kivD_Ll（y）-ADH1片段B的质粒的相应位点中。通过基因组DNA使用包含PacI限制性位点的引物oBP507（SEQ ID NO:203）和包含SalI限制性位点的引物oBP508（SEQ ID NO:204）扩增ADH1片段C。ADH1片段C的PCR产物用PacI和SalI消化并用T4DNA连接酶连接到包含ADH1片段A-kivD_Ll（y）-ADH1片段B的质粒的相应位点中。通过载体pRS316-UAS（PGK1）-PFBA1-GUS（SEQ IDNO:209）使用包含AscI限制性位点的引物oBP674（SEQ ID NO:205）和包含PmeI限制性位点的引物oBP675（SEQ ID NO:206）来扩增杂合启动子UAS（PGK1）-PFBA1。用PacI和SalI消化了UAS（PGK1）-PFBA1PCR产物，并用T4DNA连接酶连接至包含kivD_Ll（y）-ADH1片段ABC的质粒的相应位点。从所得质粒中使用引物oBP505（SEQ ID NO:201）和oBP508（SEQ ID NO:204）扩增整个整合盒，并且用PCR纯化试剂盒（Qiagen）纯化。
制备了PNY1505的感受态细胞，并使用Frozen-EZYeastTransformation II试剂盒（Zymo Research），用以上构建的ADH1-kivD_Ll（y）PCR盒转化了感受态细胞。转化混合物在30℃接种到缺乏尿嘧啶补充以1%的乙醇的合成完全培养基上。转化子在YPE（1%乙醇）中生长并且接种到合成完全培养基上，所述培养基包含5-氟代-乳清酸（0.1%），在30℃选择丢失了URA3标记的分离株。以外部引物oBP495（SEQ IDNO:207）和oBP496（SEQ ID NO:208）并以kivD_Ll（y）特异性引物oBP562（SEQ ID NO:197）和外部引物oBP496（SEQ ID NO:208）使用以Gentra Puregene Yeast/Bact试剂盒（Qiagen）制备的基因组DNA通过PCR来确认ADH1的缺失和kivD_Ll（y）的整合。正确的分离株被选择为菌株CEN.PK113-7D MATa ura3Δ::loxP his3Δ pdc6Δ pdc1Δ::P[PDC1]-DHAD|ilvD_Sm-PDC1tpdc5Δ::P[PDC5]-ADH|sadB_Ax-PDC5t gpd2Δ::loxPfra2Δ adh1Δ::UAS（PGK1）P[FBA1]-kivD_Ll（y）-ADH1t，并命名为PNY1507（BP1201）。使用异丁醇途径质粒pYZ090（SEQ ID NO:195）和pBP915（SEQ ID NO:182）转化PNY1507，并将所得菌株命名为PNY1513。
pRS316-UAS（PGK1）-FBA1p-GUS载体的构建
为了对盒UAS（PGK1）-FBA1p（SEQ ID NO:766）进行克隆，首选通过CEN.PK的基因组DNA使用引物T-FBA1（SalI）（SEQ ID NO:767）和B-FBA1（SpeI）（SEQ ID NO:768）来PCR扩增602bp的FBA1启动子（FBA1p），并将其在用SalI/SpeI消化质粒pWS358-PGK1p-GUS（SEQ ID NO:769）以除去PGK1p启动子后克隆进入该质粒上的SalI和SpeI位点中，生成pWS358-FBA1p-GUS。通过将PGK1p和β-葡糖醛酸糖苷酶基因（GUS）DNA片段插入来源于pRS423载体（Christianson等人，Gene，110:119-122，1992）的pWS358的多克隆位点，产生了pWS358-PGK1p-GUS质粒。第二，用SalI和SacI消化了所得到的pWS358-FBA1p-GUS质粒，凝胶纯化了包含FBA1p启动子、GUS基因和FBAt终止子的DNA片段，并克隆至pRS316的SalI/SacI位点以构建pRS316-FBA1p-GUS。第三，通过CEN.PK的基因组DNA使用了引物T-U/PGK1（KpnI）（SEQ ID NO:770）和B-U/PGK1（SalI）（SEQ ID NO:771）以PCR扩增了包含位于3-磷酸甘油酸激酶（PGK1）开放阅读框上游-519和-402位点之间的上游活化序列（UAS）的118bpDNA片段，即UAS（PGK1）。用KpnI和SalI消化了PCR产物，并克隆至pRS316-FBA1p-GUS上的KpnI/SalI位点以构建pRS316-UAS（PGK1）-FBA1p-GUS。
实例9
包含ALD6消除的改进重组宿主细胞
本实例的目的在于描述用于针对异丁醇的改进生产来修饰酵母宿主菌株的方法。这些修饰包括编码异丁醛还原酶活性基因的整合以及对分别编码NADP+-依赖型乙醛脱氢酶和NADPH-依赖型脱氢酶的天然基因ALD6和YMR226c的消除。
啤酒糖酵母菌株PNY2211的构建
以多个步骤从啤酒糖酵母菌株PNY1507（实例8）中构建PNY2211，如下列段落所述。首先PNY1507经修饰以包含磷酸酮醇酶基因。随后，使用靶向于邻接该磷酸酮醇酶基因的序列的整合载体向该菌株中加入乙酰乳酸合酶基因（alsS）。最后，使用同源重组除去磷酸酮醇酶基因和整合载体序列，导致alsS在染色体XII的pdc1Δ::ilvD（描述于实例12中）与天然TRX1基因之间的基因间区中无痕插入。所得PNY2211的基因型是MATa ura3Δ::loxP his3Δ pdc6Δ pdc1Δ::P[PDC1]-DHAD|ilvD_Sm-PDC1t-P[FBA1]-ALS|alsS_Bs-CYC1t pdc5Δ::P[PDC5]-ADH| sadB_Ax-PDC5tgpd2Δ::loxP fra2Δadh1Δ::UAS（PGK1）P[FBA1]-kivD_Ll（y）-ADH1t。
通过同源重组将磷酸酮醇酶基因盒导入PNY1507中。如下生成整合构建体。质粒pRS423::CUP1-alsS+FBA-budA（此前描述于US2009/0305363中，其全文以引用的方式并入本文）使用NotI和XmaI进行消化以去除1.8kb的FBA-budA序列，并在以克列诺片段（Klenowfragment）处理后将该载体重新连接。接下来，通过DNA2.0（MenloPark，CA）的DNA合成和载体构建服务用TEF1启动子变体替换CUP1启动子（M4变体，此前由Nevoigt等人Appl.Environ.Microbiol.72：5266-5273（2006）描述，其全文以引用的方式并入本文）。所得的质粒pRS423::TEF（M4）-alsS使用StuI和MluI进行切割（除去包含部分alsS基因和CYC1终止子的1.6kb部分），结合4kb的PCR产物（其通过pRS426::GPD-xpk1+ADH-eutD（SEQ ID NO:383）使用引物N1176（SEQID NO:282）和N1177（SEQ ID NO:283）产生）以及0.8kb的PCR产物DNA（SEQ ID NO:284）（通过酵母基因组DNA（ENO1启动子区）使用引物N822（SEQ ID NO:285）和N1178（SEQ ID NO:286）产生）并且转化进入啤酒糖酵母菌株BY4741（ATCC 201388）；缺口修复克隆方法；参见Ma等人Gene58:201-216（1987）。通过将细胞接种到无组氨酸的合成完全培养基上获得转化子。所预期质粒（pRS423::TEF（M4）-xpk1+ENO1-eutD，SEQ ID NO:293）的正确装配通过PCR（引物N821（SEQ ID NO:287）和N1115（SEQ ID NO:288））和限制性消化（BglI）进行确认。随后对两个克隆测序。通过用SacI和NotI消化分离3.1kb的TEF（M4）-xpk1基因并将其克隆到pUC19-URA3::ilvD-TRX1载体中（克隆A，以AflII切割）。克隆片段用Klenow片段处理以生成平末端用于连接。将连接反应产物转化到大肠杆菌Stbl3细胞中，选择氨苄青霉素抗性。TEF（M4）-xpk1的插入通过PCR（引物N1110（SEQ ID NO:367）和N1114（SEQ ID NO:290））确认。所述载体用线性化AflII并用Klenow片段处理。1.8kb的KpnI-HincII遗传霉素抗性盒（SEQ ID NO:384）在克列诺片段处理后通过连接进行克隆。将连接反应产物转化到大肠杆菌Stbl3细胞中，选择氨苄青霉素抗性。遗传霉素盒的插入通过PCR（引物N160SeqF5（SEQ ID NO:210）和BK468（SEQ ID NO:368））确认。提供的质粒序列为SEQ ID NO:291（pUC19-URA3::pdc1::TEF（M4）-xpk1::kan）。
对所得整合盒（pdc1::TEF（M4）-xpk1::KanMX::TRX1）进行分离（AscI和NaeI消化产生5.3kb条带，其进行凝胶纯化）并将其转化到PNY1507中，所述转化使用Zymo Research Frozen-EZ Yeast Transformation试剂盒（目录号T2001）。通过接种到YPE（加50μg/mlG418）上选择转化子。在所预期基因座的插入通过PCR（引物N886（SEQ ID NO:211）和N1214（SEQ ID NO:281））确认。接下来，使用编码Cre重组酶的质粒pRS423::GAL1p-Cre（SEQ ID NO:271）除去loxP-flanked KanMX盒。所述盒的正确去除通过PCR（引物oBP512（SEQ ID NO:337）和N160SeqF5（SEQ ID NO:210））确认。最后，使用包括的遗传霉素选择标记将实例13中描述的alsS整合质粒（pUC19-kan::pdc1::FBA-alsS::TRX1，克隆A）转化到这一菌株中。通过使用质粒pYZ090ΔalsS（SEQ ID NO:371）和pBP915（SEQ ID NO:182）进行的转化而针对乙酰乳酸合酶核酸测试里两种整合子（使用Amberg，Burke和Strathern“Methods in Yeast Genetics”（2005）中的方案2（Protocol#2）进行转化），并且对含葡萄糖培养基中的生长和异丁醇生产（用于生长和异丁醇测量的方法）的评估如下：全部菌株在合成完全培养基（缺失组氨酸和尿嘧啶，包含0.3%的葡萄糖和0.3%乙醇作为碳源）（10mL培养基，处于125ml通风Erlenmeyer烧瓶中（VWR目录号89095-260））。在过夜培养后（30℃，在250rpm的
Figure BDA0000419940220001211
40 New Brunswick Scientific Shaker中），在包含2%葡萄糖和0.05%乙醇的合成完全培养基中（20mL培养基，处于在125mL紧密封口的Erlenmeyer烧瓶中（VWR目录号89095-260））将培养物稀释到0.2OD（Eppendorf BioPhotometer测量）。在培养48小时后（30℃，在250rpm的
Figure BDA0000419940220001212
40 New Brunswick Scientific Shaker中），培养物上清液（使用Spin-X离心管过滤单位，Costar目录号8169收集）用HPLC，按照美国申请公布2007/0092957，其全文以引用的方式并入本文）所述分析进行分析。所述两个克隆之一为阳性并命名为PNY2218。
PNY2218用Cre重组酶处理，并且针对丢失xpk1基因和pUC19整合载体序列来筛选克隆，所述筛选通过PCR（引物N886（SEQ ID NO:211）和N160SeqR5（SEQ ID NO:388））进行。在整合载体插入期间重组xpk1上游的DNA和导入的同源DNA后，这仅留下整合到pdc1-TRX1基因间区域的alsS基因（“无痕”插入，因为载体、标记基因和loxP序列丢失）。虽然这种重组可在任何点上发生，载体整合似乎在无遗传霉素选择的情况下是稳定的，并且仅在导入Cre重组酶后观察到所述重组事件。一个克隆称为PNY2211。
包含质粒pYZ090ΔalsS和pBP915的PNY2218分离株称为PNY2209。
PNY1528（PNY2211中的hADH整合）
缺失/整合通过与PCR产物的同源性重组生成，所述PCR产物包含靶区域上游和下游同源性区以及用于转化子选择的URA3基因。所述URA3基因通过同源性重组去除以生成无痕的缺失/整合。
YPRCΔ15缺失和马肝adh的整合
YPRCΔ15基因座被删除并代之以针对啤酒糖酵母进行了密码子优化的马肝adh基因，以及来自啤酒糖酵母的PDC5启动子区（538bp）以及来自啤酒糖酵母的ADH1终止子区（316bp）。首先将用于YPRCΔ15缺失-P[PDC5]-adh_HL（y）-ADH1t整合的无痕盒克隆进入质粒pUC19-URA3MCS（描述于实例8中）。
片段A-B-U-C使用Phusion High Fidelity PCR Master Mix（NewEngland BioLabs，Ipswich，MA）并以CEN.PK113-7D基因组DNA为模板来扩增，所述基因组DNA使用Gentra Puregene Yeast/Bact试剂盒（Qiagen，Valencia，CA）制备。通过基因组DNA以包含KpnI限制性位点的引物oBP622（SEQ ID NO:212）和包含与YPRCΔ15片段B的5'端具有同源性的5'尾的引物oBP623（SEQ ID NO:213）来扩增YPRCΔ15片段A。通过基因组DNA以包含与YPRCΔ15片段A的3‘端具有同源性的5'尾的引物oBP624（SEQ ID NO:214）和包含FseI限制性位点的引物oBP625（SEQ ID NO:215）来扩增YPRCΔ15片段B。用PCR纯化试剂盒（Qiagen）纯化PCR产物。YPRCΔ15片段A-YPRCΔ15片段B通过重叠PCR生成，其通过混合YPRCΔ15片段A和YPRCΔ15片段B的PCR产物并用引物oBP622（SEQ ID NO:212）和oBP625（SEQ ID NO:215）加以扩增。所述所得PCR产物用KpnI和FseI消化，用T4DNA连接酶连到用适宜的酶消化过的pUC19-URA3MCS的对应的位点上。通过基因组DNA使用包含NotI限制性位点的引物oBP626（SEQ ID NO:216）和包含PacI限制性位点的引物oBP627（SEQ ID NO:217）来扩增YPRCΔ15片段C。所述YPRCΔ15片段CPCR产物用NotI和PacI消化，并且用T4DNA连接酶连到包含YPRCΔ15片段AB的质粒的对应的位点上。通过CEN.PK113-7D基因组DNA以包含AscI限制性位点的引物HY21（SEQ ID NO:218）和包含与adh_Hl（y）的5'端具有同源性的5'尾的引物HY24（SEQ ID NO:219）来扩增PDC5启动子区。通过pBP915（SEQ ID NO:182）以包含与P[PDC5]的3'端具有同源性的5'尾的引物HY25（SEQ ID NO:220）和包含PmeI限制性位点的引物HY4（SEQ ID NO:221）来扩增adh_Hl（y）-ADH1t。用PCR纯化试剂盒（Qiagen）纯化PCR产物。P[PDC5]-adh_HL（y）-ADH1t通过重叠PCR生成，其通过混合P[PDC5]和adh_HL（y）-ADH1t PCR产物并使用引物HY21（SEQ ID NO:218）和HY4（SEQ IDNO:221）进行扩增而进行。所得PCR产物使用AscI和PmeI进行消化并且使用T4DNA连接酶连接进入包含YPRCΔ15片段ABC的质粒的对应位点。整个整合盒通过所得质粒使用引物oBP622（SEQ ID NO:212）和oBP627（SEQ ID NO:217）进行扩增。
制备了PNY2211感受态细胞并使用Frozen-EZ Yeast Transformation II试剂盒（Zymo Research；Orange，CA）以YPRCΔ15缺失-P[PDC5]-adh_HL（y）-ADH1t整合盒PCR产物对其转化。转化混合物在30℃接种到缺乏尿嘧啶补充以1%的乙醇的合成完全培养基上。通过PCR以引物URA3-endF（SEQ ID NO:222）和oBP637（SEQ ID NO:224）来筛选转化子。正确的转化子生长在YEP（1%乙醇）并在30℃下接种到补充有1%乙醇并包含5-氟-乳清酸（0.1%）的合成完全培养基上，以选择失去了URA3标记的分离株。使用以YeaStar GenomicDNA试剂盒（Zymo Research）制备的DNA以外部引物oBP636（SEQ ID NO:223）和oBP637（SEQ ID NO:224）通过PCR来证实YPRCΔ15的缺失和P[PDC5]-adh_HL（y）-ADH1t的整合。针对进一步修饰而选择了如下基因型的正确分离株：CEN.PK113-7D MATa ura3Δ::loxP his3Δ pdc6Δ pdc1Δ::P[PDC1]-DHAD|ilvD_Sm-PDC1t-P[FBA1]-ALS|alsS_Bs-CYC1t pdc5Δ::P[PDC5]-ADH|sadB_Ax-PDC5tgpd2Δ::loxP fra2Δ adh1Δ::UAS（PGK1）P[FBA1]-kivD_Ll（y）-ADH1typrcΔ15Δ::P[PDC5]-ADH|adh_Hl-ADH1t。
马肝adh在fra2Δ处的整合
针对啤酒糖酵母中的表达进行了密码子优化的马肝adh基因，以及来自啤酒糖酵母的PDC1启动子区（870bp）和来自啤酒糖酵母的ADH1终止子区（316bp）被整合进入fra2缺失的位点。首先将用于fra2Δ-P[PDC1]-adh_HL（y）-ADH1t整合的无痕盒克隆进入质粒pUC19-URA3MCS。
使用Phusion High Fidelity PCR Master Mix（New England BioLabs；Ipswich，MA）和CEN.PK113-7D基因组DNA作为模板来扩增片段A-B-U-C，所述基因组DNA使用Gentra Puregene Yeast/Bact试剂盒（Qiagen；Valencia，CA）来制备。通过基因组DNA使用包含NotI限制性位点的引物oBP695（SEQ ID NO:229）和包含PacI限制性位点的引物oBP696（SEQ ID NO:230）扩增了fra2Δ片段C。fra2Δ片段C的PCR产物使用NotI和PacI进行消化，并且使用T4DNA连接酶连接进入pUC19-URA3MCS的对应位点。通过DNA使用包含PmeI限制性位点的引物oBP693（SEQ ID NO:227）和包含FseI限制性位点的引物oBP694（SEQID NO:228）扩增了fra2Δ片段B。所得的PCR产物使用PmeI和FseI进行消化并且使用T4DNA连接酶连接进入包含fra2Δ片段C的质粒在以适当的酶消化后的对应位点。通过基因组DNA使用包含BamHI和AsiSI限制性位点的引物oBP691（SEQ ID NO:225）以及包含包含AscI和SwaI限制性位点的引物oBP692（SEQ ID NO:226）来扩增fra2Δ片段A。fra2Δ片段A的PCR产物使用BamHI和AscI进行消化并且使用T4DNA连接酶连接进入包含fra2Δ片段BC的质粒在以适当的酶消化后的对应位点。通过CEN.PK113-7D基因组DNA使用包含AscI限制性位点的引物HY16（SEQID NO:231）和包含与adh_Hl（y）的5'端具有同源性的5'尾的引物HY19（SEQ ID NO:232）来扩增PDC1启动子区。通过pBP915使用包含与P[PDC1]的3'端具有同源性的5'尾的引物HY20（SEQ ID NO:233）和包含PmeI限制性位点的HY4（SEQ ID NO:221）来扩增adh_Hl（y）-ADH1t。用PCR纯化试剂盒（Qiagen）纯化PCR产物。P[PDC1]-adh_HL（y）-ADH1t通过重叠PCR生成，其通过混合P[PDC1]和adh_HL（y）-ADH1tPCR产物并使用引物HY16（SEQ ID NO:231）和HY4（SEQ ID NO:221）进行扩增而进行。所得PCR产物使用AscI和PmeI进行消化并且使用T4DNA连接酶连接进入包含fra2Δ片段ABC的质粒的对应位点。整个整合盒通过所得质粒使用引物oBP691（SEQ ID NO:225）和oBP696（SEQ ID NO:230）进行扩增。
制备了在YPRCΔ15处整合了adh_Hl（y）的PNY2211变体的感受态细胞，并使用Frozen-EZ Yeast Transformation II试剂盒（Zymo Research）以fra2Δ-P[PDC1]-adh_HL（y）-ADH1t整合盒PCR产物对其转化。转化混合物在30℃接种到缺乏尿嘧啶补充以1%的乙醇的合成完全培养基上。通过PCR以引物URA3-endF（SEQ ID NO:222）和oBP731（SEQ ID NO:235）来筛选转化子。正确的转化子生长在YEP上（1%乙醇）并在30℃下接种到补充有1%乙醇并包含5-氟-乳清酸（0.1%）的合成完全培养基上，以选择失去了URA3标记的分离株。P[PDC1]-adh_HL（y）-ADH1t的整合通过以内部引物HY31（SEQ ID NO:236）和外部引物oBP731（SEQ IDNO:235）进行的菌落PCR以及以外部引物oBP730（SEQ ID NO:234）和oBP731（SEQ ID NO:235）使用以YeaStar GenomicDNA试剂盒（ZymoResearch）制备的基因组DNA进行的PCR来证实。如下基因型的正确分离株被命名为PNY1528：CEN.PK113-7D MATa ura3Δ::loxP his3Δpdc6Δpdc1Δ::P[PDC1]-DHAD|ilvD_Sm-PDC1t-P[FBA1]-ALS|alsS_Bs-CYC1tpdc5Δ::P[PDC5]-ADH|sadB_Ax-PDC5t gpd2Δ::loxP fra2Δ::P[PDC1]-ADH|adh_Hl-ADH1t adh1Δ::UAS（PGK1）P[FBA1]-kivD_Ll（y）-ADH1typrcΔ15Δ::P[PDC5]-ADH|adh_Hl-ADH1t。
PNY2237（无痕YMR226c缺失）
通过同源重组使用PCR扩增的2.0kb线型无痕缺失盒来从啤酒糖酵母菌株PNY1528中删除基因YMR226c。该盒通过剪接PCR扩增的片段来构建，所述片段包含URA3基因以及其天然启动子和终止子（作为选择标记）、侧接于YMR226c基因染色体基因座的上游和下游同源序列（用于促进所述缺失盒的整合以及天然居间序列的去除）以及重复序列（用于促进整合和URA3标记的去除）。正向和反向PCR引物（N1251和N1252，分别为SEQ ID NO:247和248）扩增了1,208bp的URA3表达盒，其源自于pLA33（pUC19::loxP-URA3-loxP（SEQ ID NO:268））。正向和反向引物（N1253和N1254，分别为SEQ ID NO:249和250）扩增了250bp的下游同源序列，其具有3'URA3重叠序列标记，来自啤酒糖酵母菌株PNY2211的基因组DNA制备物（上文）。正向和反向引物（N1255和N1256，分别为SEQ ID NO:251和252）扩增了250bp的重复序列，其具有5'URA3重叠序列，来自啤酒糖酵母菌株PNY2211的基因组DNA制备物。正向和反向引物（N1257和N1258，分别为SEQ ID NO:253和254）扩增了250bp的上游同源序列，其具有5'重复重叠序列标记，来自啤酒糖酵母菌株PNY2211的基因组DNA制备物。
将大约1.5μg经PCR扩增的盒转化进入菌株PNY1528（上文），其使用ZYMO Research Frozen Yeast Transformation试剂盒制成感受态，并将所述转化混合物涂平板于SE1.0%-尿嘧啶上并在30℃下孵育以选择具有整合的ymr226cΔ::URA3盒的细胞。随后将在72至96小时后出现的转化子短划线于相同的培养基上并且在30℃下孵育24至48小时。所述短划线物通过PCR针对ymr226cΔ::URA3来筛选，其使用5'外向URA3缺失盒特异性内部引物（N1249，SEQ ID NO:245）与侧接的内向染色体特异性引物（N1239，SEQ ID NO:243）配对，以及3'外向URA3缺失盒特异性引物（N1250，SEQ ID NO:246）与侧接的内向染色体特异性引物（N1242，SEQ ID NO:244）配对。阳性的PNY1528 ymr226cΔ::URA3 PCR筛选产生了5'和3'PCR产物，分别为598和726bp。
选取了三个阳性PNY1528 ymr226cΔ::URA3克隆并在YPE1%培养基中过夜培养，将其100μL涂平板于YPE1%+5-FOA上来进行标记去除。使用5'和3'染色体特异性引物（N1239和N1242）对在24至48小时后出现的菌落针对标记去除而进行PCR筛选。阳性的PNY1528ymr226cΔ无标记PCR筛选产生了801bp的PCR产物。获得了多个克隆并且将一个命名为PNY2237。
PNY2238和PNY2243（ALD6缺失菌株）
设计了载体以使用Cre-lox可回收URA3标记来替换ALD6。通过PCR扩增了ALD6的5'和3'序列（分别为引物对N1179和N1180以及N1181和N1182，分别为SEQ ID NO:237、238、239和240）。在将这些片段克隆进入TOPO载体（Invitrogen目录号K2875-J10）并进行测序（M13正向（SEQ ID NO:269）和反向（SEQ ID NO:270）引物），分别在EcoRI和SphI位点将5'和3'侧接序列克隆进入pLA33（pUC19::loxP::URA3::loxP）（SEQ ID NO:268）。将各连接反应物转化进入大肠杆菌Stbl3细胞，将其在LBAmp平板上孵育以选择转化子。合适的序列插入通过PCR进行证实（引物分别为M13正向（SEQ ID NO:269）和N1180（SEQ ID NO:238）以及M13反向（SEQ ID NO:270）和N1181（SEQ ID NO:239））。
对上述载体（pUC19::ald6Δ::loxP-URA3-loxP）使用AhdI进行线型化并使用标准的乙酸锂方法转化进入PNY1528和PNY2237（不同的是细胞与DNA的孵育延长至2.5h）。通过在提供1%的乙醇作为碳源的尿嘧啶缺失合成完全培养基上涂平板来获得转化子。通过PCR筛选点覆的转化子以证实缺失/整合，其使用引物N1212（SEQ ID NO:241）和N1180（5'端）（SEQ ID NO:238）和N1181（SEQ ID NO:239）和N1213（SEQ ID NO:242）（3'端）。使用组氨酸标记选择将携带Cre重组酶（pRS423::GAL1p-Cre=SEQ ID NO:271）的质粒转化进入所述菌株。在补充有0.5%半乳糖的YPE上对转化子进行传代。针对5-FOA抗性（URA3标记的丧失）和组氨酸营养缺陷型（Cre质粒的丧失）来筛选菌落。通过PCR来证实URA3基因通过侧接loxP位点的适当去除（引物N1262和N1263，分别为SEQID NO:255和256。此外，ALD6基因的内部引物（N1230和N1231；分别为SEQ ID NO:261和262）用于证实不存在部分二倍体。最后，通过PCR筛选ald6Δ::loxP克隆以证实ura3Δ::loxP（N1228和N1229，SEQ ID NO:259和260）与gpd2Δ::loxP（N1223和N1225，SEQ ID NO:257和258）之间的易位并未发生。通过对PNY1528转化子的筛选鉴定了两个阳性克隆。已将克隆B命名为PNY2243。通过对PNY2237转化子的筛选鉴定了三个阳性克隆。克隆E和K均针对小规模异丁醇生产受到了估测（下文）。尽管在大多参数中统计上相等，但是选择克隆E（PNY2238）进行进一步开发。
实例10
异丁醇途径质粒
本实例的目的在于描述用于在宿主菌株中生产异丁醇的异丁醇途径质粒的构建或修饰。
构建了pYZ067（SEQ ID NO:374）以包含以下嵌合基因：1）来自变异链球菌UA159的ilvD基因编码区，其具有C-末端Lumio标记，该标记通过酵母FBA1启动子进行表达，后接FBA1终止子，用于表达二羟酸脱水酶，2）马肝ADH的编码区，通过酵母GPM1启动子进行表达，后接ADH1终止子，用于表达醇脱氢酶，以及3）来自乳酸乳球菌的KivD基因，通过酵母TDH3启动子进行表达，后接TDH3终止子，用于表达酮异戊酸脱羧酶。
通过删除kivD和adh的启动子-基因-终止子盒而从pYZ067（SEQ IDNO:374）构建了pYZ067ΔkivDΔhADH（SEQ ID NO:385）。pYZ067使用BamHI和SacI（New England BioLabs；Ipswich，MA）进行了消化并且以琼脂糖凝胶并随后以Gel Extraction试剂盒（Qiagen；Valencia，CA）来纯化7934bp片段。所分离的DNA片段使用DNA聚合酶I的大片段（克列诺片段）（New England BioLabs；Ipswich，MA）进行处理并随后使用T4DNA连接酶进行自连并用于转化感受态TOP10大肠杆菌（Invitrogen；Carlsbad，CA）。分离了来自转化子的质粒并通过序列分析检查适当的删除。正确的质粒分离株命名为pYZ067ΔkivDΔhADH。
构建了pYZ067ΔkivDΔilvD（SEQ ID NO:772）以包含嵌合基因，其具有来自马肝的针对啤酒糖酵母进行了密码子优化的adh基因的编码区（核苷酸位置3148-2021），通过酵母GPM启动子（核苷酸3916-3160）进行表达，后继ADH1终止子（核苷酸2012-1697）用于表达AHD。通过删除kivD和ilvD的启动子-基因-终止子盒从pYZ067构建了pYZ067DkivDDilvD。pYZ067使用AatII和SacI（New England BioLabs；Ipswich，MA）进行消化并且以以琼脂糖凝胶并随后以Gel Extraction试剂盒（Qiagen；Valencia，CA）纯化了10196bp的片段。所分离的DNA片段使用DNA聚合酶I的大片段（克列诺片段）（New England BioLabs；Ipswich，MA）进行处理并随后使用T4DNA连接酶进行自连。所得的质粒随后使用NgoMIV和BamHI（New England BioLabs；Ipswich，MA）进行消化并以琼脂糖凝胶并随后以Gel Extraction试剂盒（Qiagen；Valencia，CA）纯化了7533bp的片段。所分离的DNA片段使用DNA聚合酶I的大片段（克列诺片段）（New England BioLabs；Ipswich，MA）进行处理并随后使用T4DNA连接酶进行自连。分离了质粒并通过序列分析检查适当的删除。正确的质粒分离株命名为pYZ067DkivDDilvD。
构建了来自于pYZ090（SEQ ID NO:195）的pK9G9.OLE1p.ilvD（SEQ ID NO:773）以包含具有来自变异链球菌的ilvD基因的编码区（核苷酸位置5377-3641）的嵌合基因（通过酵母OLE1启动子（核苷酸5986-5387）进行表达并后接FBA1终止子（核苷酸3632-3320），用于表达DHAD）和包含具有来自粪厌氧棒状菌的ilvC基因的变体K9G9的编码区（核酸和氨基酸SEQ ID NO:774和647）（核苷酸1628-2659）的嵌合基因（其通过酵母ILV5启动子（核苷酸427-1620）进行表达并后接ILV5终止子（核苷酸2685-3307），用于表达KARI）。所述质粒如下构建。具有来自变异链球菌的ilvD的编码区的（通过酵母FBA1启动子表达并后接FBA1终止子）来自质粒pYZ067的嵌合基因使用限制性酶NgoMIV和BamHI连接进入pYZ090。通过使用限制性酶SpeI和PacI消化并对所得的大DNA片段进行自连接来从所得质粒中删除alsS编码区和来自CUP1启动子的3'端的280bp。通过使用限制性酶NgoMIV和PmlI消化而从所得质粒中去除ilvD上游的酵母FBA1启动子并代之以OLE1启动子，其使用引物pOLE1-NgoMI（SEQ ID NO:775）和pOLE1-PmlI（SEQ ID NO:776）进行扩增。通过使用限制性酶PmeI和SfiI消化继之以对大DNA片段的凝胶纯化来从所得质粒中删除来自乳酸乳球菌的ilvC基因编码区。使用PmeI和SfiI将来自粪厌氧棒状菌的变体K9G9ilvC基因（SEQ ID NO:777）编码区消化出pLH701（SEQ ID NO:778）并进行凝胶纯化。将所述两个DNA片段连接以产生pK9G9.OLE1p.ilvD。
实例11
PNY2240和PNY2242的构建
在使用质粒pLH702（SEQ ID NO:181）和pBP915（SEQ ID NO:182）进行转化之后，通过PNY2211产生菌株PNY2240。将转化子在不含组氨酸和尿嘧啶的合成完全培养基（1%乙醇作为碳源）上涂平板。将转化子点覆于相同的但是包含2%葡萄糖和0.05%乙醇作为碳源的培养基上。将三组菌斑用于接种液体培养基（合成完全培养基，缺失尿嘧啶，具有0.3%葡萄糖和0.3%乙醇作为碳源）。为测试异丁醇生产，将液体培养物分转培养至合成完全培养基（缺失尿嘧啶，包含2%葡萄糖和0.05%乙醇作为碳源），其还包含BME维生素混合物（Sigma目录号B6891）。在30℃下将培养物在密封的血清瓶中（10ml培养基，在15ml瓶内）振荡孵育（250rpm，在Infors Multitron摇床中）。在48小时后，过滤培养物培养基（Spin-X柱）并通过HPLC进行分析（如美国申请公布2007/0092957所述，其全文以引用的方式并入本文）。将一个克隆命名为PNY2240。
在使用质粒pLH702（SEQ ID NO:181）和pYZ067ΔkivDΔhADH（本文上述）进行转化之后，通过PNY2238产生了菌株PNY2242。将转化子在不含组氨酸和尿嘧啶的合成完全培养基（1%乙醇作为碳源）上涂平板。将转化子点覆于相同的但是包含2%葡萄糖和0.05%乙醇作为碳源的培养基上。测试了三个菌斑的异丁醇生产，如上文描述。在葡萄糖消耗和异丁醇生产上全部三个表现类似。将一个克隆命名为PNY2242，并在发酵条件下对其进一步表征，如本文下文所描述。
实例12
啤酒糖酵母菌株bp1064（PNY1503）的构建
菌株BP1064来源于CEN.PK113-7D（CBS8340；Centraalbureau voorSchimmelcultures（CBS）Fungal Biodiversity Centre，Netherlands）并包含以下基因缺失：URA3、HIS3、PDC1、PDC5、PDC6和GPD2。使用质粒pYZ090（SEQ ID NO:195）和pLH468（SEQ ID NO:139）转化BP1064来产生菌株NGCI-070（BP1083；PNY1504）。
缺失，即完全去除整个编码序列，通过与PCR片段同源性重组而创建，所述PCR片段包含靶基因的上游和下游同源性区以及用于选择转化子的G418抗性标记或URA3基因。使用Cre重组酶去除侧接有loxP位点的G418抗性标记（pRS423::PGAL1-cre；SEQ ID NO:271）。通过同源性重组去除所述URA3基因以生成无痕缺失，或如果侧接有loxP位点则用Cre重组酶去除。
URA3缺失
为删除内源URA3编码区，ura3::loxP-kanMX-loxP以盒聚合酶链反应扩增自pLA54模板DNA（SEQ ID NO:386）。pLA54包含乳酸克鲁维酵母TEF1启动子和kanMX标记，并且侧翼序列为loxP位点，允许Cre重组酶参与重组并去除标记。PCR使用Phusion DNA聚合酶和引物BK505与BK506（SEQ ID NO:294和295）来实施。所述每个引物的URA3部分来源于URA3启动子上游5'区，和编码区下游3'区，使得loxP-kanMX-loxP标记的整合导致URA3编码区的替换。使用标准基因技术将所述PCR产物转化到CEN.PK113-7D中（Methods in YeastGenetics，2005，Cold SpringHarbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，第201-202页）并且转化子在30℃包含G418（100μg/ml）的YPD上选择。使用引物LA468和LA492（SEQIDNO:296和297）通过PCR来验证筛选的转化子的正确整合，并将其命名为CEN.PK113-7DΔura3::kanMX。
HIS3缺失
使用Phusion High Fidelity PCR Master Mix（New England BioLabs，Ipswich，MA）并以CEN.PK113-7D基因组DNA为模板来扩增用于无痕HIS3缺失的PCR盒的四个片段，所述基因组DNA使用Gentra PuregeneYeast/Bact试剂盒（Qiagen，Valencia，CA）制备。使用引物oBP452（SEQ ID NO:298）和包含与HIS3片段B的5'端具有同源性的5'尾的引物oBP453（SEQ ID NO:299）扩增HIS3片段A。使用包含与HIS3片段A的3'端具有同源性的5'尾的引物oBP454（SEQ ID NO:300）和包含与HIS3片段U的5'端具有同源性的5'尾的引物oBP455（SEQ ID NO:301）扩增HIS3片段B。使用包含与HIS3片段B的3'端具有同源性的5'尾的引物oBP456（SEQ ID NO:302）和包含与HIS3片段C的5'端具有同源性的5'尾的引物oBP457（SEQ ID NO:303）扩增HIS3片段U。使用包含与HIS3片段U的3'端具有同源性的5'尾的引物oBP458（SEQ ID NO:304）和引物oBP459（SEQ ID NO:305）扩增HIS3片段C。用PCR纯化试剂盒（Qiagen）纯化PCR产物。HIS3片段AB通过重叠聚合酶链反应生成，通过混合HIS3片段A和HIS3片段B并用引物oBP452（SEQ ID NO:298）和oBP455（SEQ ID NO:301）进行扩增。HIS3片段UC通过重叠PCR生成，通过混合HIS3片段U和HIS3片段C并用引物oBP456（SEQ ID NO:302）和oBP459（SEQ ID NO:305）进行扩增。所得PCR产物在琼脂糖凝胶上电泳，然后通过GelExtraction试剂盒（Qiagen）纯化。HIS3ABUC盒通过重叠PCR生成，通过混合HIS3片段AB和HIS3片段UC并用引物oBP452（SEQ ID NO:298）和oBP459（SEQ ID NO:305）进行扩增。用PCR纯化试剂盒（Qiagen）纯化PCR产物。
制备CEN.PK113-7DΔura3::kanMX的感受态细胞，并以Frozen-EZYeast Transformation II试剂盒（Zymo Research；Orange，CA）对其使用HIS3ABUC聚合酶链反应盒进行转化。转化混合物在30℃接种到缺乏尿嘧啶补充以2%的乙醇的合成完全培养基上。具有his3敲除的转化子用PCR进行筛选，所用引物为oBP460（SEQ ID NO:306）和oBP461（SEQID NO:307），所用的基因组DNA用Gentra Puregene Yeast/Bact试剂盒（Qiagen）制备。正确的转化子选择为菌株CEN.PK113-7D Δura3::kanMXΔhis3::URA3。
从Δura3位点移除KanMX标记以及从Δhis3位点移除URA3标记
通过使用pRS423::PGAL1-cre（SEQ ID NO:271）来转化CEN.PK113-7DΔura3::kanMX Δhis3::URA3而去除KanMX标记，所述转化使用Frozen-EZ Yeast Transformation II试剂盒（Zymo Research）并在30℃下接种到合成完全培养基（缺乏组氨酸和尿嘧啶，补充以2%的葡萄糖）上而进行。转化子在30℃的补充以1%的半乳糖的YP上生长6个小时以诱导Cre重组酶和KanMX标记切除，并在30℃接种到YPD（2%葡萄糖）平板上以复苏。分离株过夜生长在YPD中并在30℃接种到包含5-氟-乳清酸（0.1%）的合成完全培养基上，以选择失去了URA3标记的转化子的分离株。抗5-氟-乳清酸的分离株生长和接种到YPD中以去除pRS423::PGAL1-cre质粒。检测分离株中KanMX标记和URA3标记的丢失，并通过在YPD+G418平板、缺乏尿嘧啶的合成完全培养基平板和缺乏组氨酸的合成完全培养基平板的生长检测，检测pRS423::PGAL1-cre质粒的丢失。对G418敏感并为尿嘧啶和组氨酸营养缺陷性的正确的分离株被选为菌株CEN.PK113-7D Δura3::loxP Δhis3并命名为BP857。所述缺失和标记移除通过PCR和测序确认，对于Δura3所用引物为oBP450（SEQ ID NO:308）和oBP451（SEQ ID NO:309），对于Δhis3所用引物为oBP460（SEQ ID NO:306）和oBP461（SEQ ID NO:307），使用的基因组DNA用Gentra Puregene Yeast/Bact试剂盒（Qiagen）制备。
PDC6缺失
用于无痕PDC6缺失的PCR盒的四个片段的扩增使用Phusion HighFidelity PCR Master Mix（New England BioLabs）并以CEN.PK113-7D基因组DNA为模板，用Gentra PuregeneYeast/Bact试剂盒（Qiagen）制备。使用引物oBP440（SEQ ID NO:310）和包含与PDC6片段B的5'端具有同源性的5'尾的引物oBP441（SEQ ID NO:311）扩增PDC6片段A。使用包含与PDC6片段A的3'端具有同源性的5'尾的引物oBP442（SEQ ID NO:312）和包含与PDC6片段U的5'端具有同源性的5'尾的引物oBP443（SEQ ID NO:313）扩增PDC6片段B。使用包含与PDC6片段B的3'端具有同源性的5'尾的引物oBP444（SEQ ID NO:314）和包含与PDC6片段C的5'端具有同源性的5'尾的引物oBP445（SEQ ID NO:315）扩增PDC6片段U。使用包含与PDC6片段U的3'端具有同源性的5'尾的引物oBP446（SEQ ID NO:316）和引物oBP447（SEQ ID NO:317）扩增PDC6片段C。用PCR纯化试剂盒（Qiagen）纯化PCR产物。PDC6片段AB通过重叠聚合酶链反应生成，通过混合PDC6片段A和PDC6片段B并用引物oBP440（SEQ ID NO:310）和oBP443（SEQ ID NO:313）进行扩增。PDC6片段UC通过重叠PCR生成，通过混合PDC6片段U和PDC6片段C并用引物oBP444（SEQ ID NO:314）和oBP447（SEQ ID NO:317）进行扩增。所得PCR产物在琼脂糖凝胶上电泳，然后通过Gel Extraction试剂盒（Qiagen）纯化。PDC6 ABUC盒通过重叠聚合酶链反应生成，通过混合PDC6片段AB和PDC6片段UC并用引物oBP440（SEQ ID NO:310）和oBP447（SEQ ID NO:317）进行扩增。用PCR纯化试剂盒（Qiagen）纯化PCR产物。
制备CEN.PK 113-7D Δura3::loxP Δhis3的感受态细胞，并用PDC6ABUCPCR盒转化，使用Frozen-EZ Yeast Transformation II试剂盒（ZymoResearch）。转化混合物在30℃接种到缺乏尿嘧啶补充以2%的乙醇的合成完全培养基上。具有pdc6敲除的转化子用PCR进行筛选，所用引物为oBP448（SEQ ID NO:318）和oBP449（SEQ ID NO:319），所用的基因组DNA用Gentra Puregene Yeast/Bact试剂盒（Qiagen）制备。正确的转化子被选为菌株CEN.PK 113-7D Δura3::loxP Δhis3 Δpdc6::URA3。
CEN.PK 113-7D Δura3::loxP Δhis3 Δpdc6::URA3分离株过夜生长在YPD中并在30℃接种到包含5-氟-乳清酸（0.1%）的合成完全培养基上，以选择失去了URA3标记的转化子的分离株。所述缺失和标记移除通过PCR和测序确认，所用引物为oBP448（SEQ ID NO:318）和oBP449（SEQ ID NO:319），所用的基因组DNA用Gentra Puregene Yeast/Bact试剂盒（Qiagen）制备。来自分离物的PDC6基因的缺乏通过聚合酶链反应阴性结果来证明，所用PDC6的编码区的特异性引物为oBP554（SEQ IDNO:320）和oBP555（SEQ ID NO:321）。正确的分离株被选为菌株CEN.PK 113-7D Δura3::loxP Δhis3 Δpdc6并被命名为BP891。
PDC1缺失ilvDSm整合
所述PDC1基因被删除并代之以变异链球菌ATCC 700610的ilvD编码区。后接来自变异链球菌的ilvD编码区的A片段（用于PDC1缺失-ilvDSm整合的PCR盒）使用Phusion High Fidelity PCR Master Mix（NewEngland BioLabs）和NYLA83基因组DNA作为模板来扩增，所述基因组DNA使用Gentra Puregene Yeast/Bact试剂盒（Qiagen）制备。NYLA83是携带PDC1缺失-ilvDSm整合的菌株，其描述于美国专利申请公布2009/0305363，其全文以引用的方式并入本文。使用引物oBP513（SEQ IDNO:326）和包含与PDC1片段B的5'端具有同源性的5'尾的引物oBP515（SEQ ID NO:327）扩增PDC1片段A-ilvDSm（SEQ ID NO:322）。用于PDC1缺失-ilvDSm整合的PCR盒的B、U和C片段用Phusion HighFidelity PCR Master Mix（New England BioLabs）和CEN.PK113-7D基因组DNA作为模板进行扩增，所述基因组DNA使用Gentra Puregene Yeast/Bact试剂盒（Qiagen）制备。使用包含与PDC1片段A-ilvDSm的3'端具有同源性的5'尾的引物oBP516（SEQ ID NO:328）和包含与PDC1片段U的5'端具有同源性的5'尾的引物oBP517（SEQ ID NO:329）扩增PDC1片段B。使用包含与PDC1片段B的3'端具有同源性的5'尾的引物oBP518（SEQ IDNO:330）和包含与PDC1片段C的5'端具有同源性的5'尾的引物oBP519（SEQ ID NO:331）扩增PDC1片段U。使用包含与PDC1片段U的3'端具有同源性的5'尾的引物oBP520（SEQ ID NO:332）和引物oBP521（SEQ ID NO:333）扩增PDC1片段C。用PCR纯化试剂盒（Qiagen）纯化PCR产物。PDC1片段A-ilvDSm-B通过重叠PCR生成，通过混合PDC1片段A-ilvDSm和PDC1片段B并用引物oBP513（SEQ ID NO:326）和oBP517（SEQ ID NO:329）进行扩增。PDC1片段UC通过重叠PCR生成，通过混合PDC1片段U和PDC1片段C并用引物oBP518（SEQID NO:330）和oBP521（SEQ ID NO:333）进行扩增。所得PCR产物在琼脂糖凝胶上电泳，然后通过Gel Extraction试剂盒（Qiagen）纯化。所述PDC1 A-ilvDSm-BUC盒（SEQ ID NO:323）通过重叠PCR生成，通过混合PDC1片段A-ilvDSm-B和PDC1片段UC并使用引物oBP513（SEQ IDNO:326）和oBP521（SEQ ID NO:333）进行扩增。用PCR纯化试剂盒（Qiagen）纯化PCR产物。
制备CEN.PK 113-7D Δura3::loxP Δhis3 Δpdc6的感受态细胞，并用PDC1 A-ilvDSm-BUCPCR盒转化，使用Frozen-EZ Yeast Transformation II试剂盒（Zymo Research）。转化混合物在30℃接种到缺乏尿嘧啶补充以2%的乙醇的合成完全培养基上。具有PDC1敲除-ilvDSm整合的转化子用PCR进行筛选，所用引物为oBP511（SEQ ID NO:336）和oBP512（SEQID NO:337），所用的基因组DNA用Gentra Puregene Yeast/Bact试剂盒（Qiagen）制备。PDC1基因在所述分离株中的缺乏通过聚合酶链反应阴性结果来证明，所用PDC1的编码区的特异性引物为oBP550（SEQ ID NO:338）和oBP551（SEQ ID NO:339）。正确的转化子被选为菌株CEN.PK113-7D Δura3::loxP Δhis3 Δpdc6 Δpdc1::ilvDSm-URA3。
CEN.PK 113-7D Δura3::loxP Δhis3 Δpdc6 Δpdc1::ilvDSm-URA3过夜生长在YPD中并在30℃接种到包含5-氟-乳清酸（0.1%）的合成完全培养基上，以选择失去了URA3标记的转化子的分离株。所述PDC1的缺失、ilvDSm的整合以及标记的移除通过PCR和测序来确认，所用引物为oBP511（SEQ ID NO:336）和oBP512（SEQ ID NO:337），所用的基因组DNA用Gentra Puregene Yeast/Bact试剂盒（Qiagen）制备。正确的分离株被选为菌株CEN.PK 113-7D Δura3::loxP Δhis3 Δpdc6 Δpdc1::ilvDSm并命名为BP907。
PDC5缺失sadB整合
将PDC5基因删除并代之以来自木糖氧化无色杆菌（Achromobacterxylosoxidans）的sadB编码区（所述sadB基因描述于美国专利申请2009/0269823，其全文以引用的方式并入本文）。对于PDC5缺失-sadB整合的PCR盒的一个片段首先克隆到质粒pUC19-URA3MCS中。
pUC19-URA3MCS是基于pUC19的并包含处于多克隆位点（MCS）内的URA3基因，其来自啤酒糖酵母。pUC19包含pMB1复制子和编码β-内酰胺酶的基因，该基因负责在大肠杆菌中的复制与选择。除URA3的编码序列外，该基因的上游至下游序列都被包括用于在酵母中表达URA3。所述载体能用于克隆的目的，并且能用做酵母整合载体。
使用Phusion High-Fidelity PCR Master Mix（New England BioLabs）以包含BamHI、AscI、PmeI和FseI限制性位点的引物oBP438（SEQ ID NO:334）和包含XbaI、PacI和NotI限制性位点的oBP439（SEQ ID NO:335）扩增了DNA，其涵盖了来自啤酒糖酵母CEN.PK113-7D基因组DNA的URA3编码区以及URA3编码区上游250bp和下游150bp。基因组DNA使用Gentra Puregene Yeast/Bact试剂盒（Qiagen）来制备。在使用BamHI和XbaI消化后，所述PCR产物和pUC19（SEQ ID NO:325）用T4 DNA连接酶连接来生成载体pUC19-URA3MCS。所述载体通过PCR和测序来确认，所用引物为oBP264（SEQ ID NO:342）和oBP265（SEQ ID NO:343）。
所述sadB编码序列和PDC5片段B克隆到pUC19-URA3MCS生成PDC5 A-sadB-BUCPCR盒的sadB-BU部分。以pLH468-sadB（SEQ ID NO:359）作为模板使用包含AscI限制性位点的引物oBP530（SEQ ID NO:344）和包含与PDC5片段B的5'端具有同源性的5'尾的引物oBP531（SEQ ID NO:345）扩增sadB编码序列。使用包含与sadB的3'端具有同源性的5'尾的引物oBP532（SEQ ID NO:346）和包含PmeI限制性位点的引物oBP533（SEQ ID NO:347）扩增PDC5片段B。用PCR纯化试剂盒（Qiagen）纯化PCR产物。sadB-PDC5片段B通过重叠PCR生成，通过混合sadB片段U和PDC5片段B并用引物oBP530（SEQ ID NO:344）和oBP533（SEQ ID NO:347）进行扩增。在用合适的酶消化后，所得PCR产物经AscI和PmeI消化用T4 DNA连接酶连接到pUC19-URA3MCS对应的位点上。所得质粒用作模板以扩增sadB-片段B-片段U，所用引物为oBP536（SEQ ID NO:348）和包含与PDC5片段C的5'端具有同源性的5'尾的oBP546（SEQ ID NO:349）。使用引物包含与PDC5 sadB-片段B-片段U的3'端具有同源性的5'尾的oBP547（SEQ ID NO:350）和引物oBP539（SEQ ID NO:351）扩增PDC5片段C。用PCR纯化试剂盒（Qiagen）纯化PCR产物。PDC5sadB-片段B-片段U-片段C通过重叠PCR生成，通过混合PDC5 sadB-片段B-片段U和PDC5片段C并用引物oBP536（SEQ ID NO:348）和oBP539（SEQ ID NO:351）进行扩增。所得PCR产物在琼脂糖凝胶上纯化接着使用Gel Extraction试剂盒（Qiagen）。所述PDC5 A-sadB-BUC盒（SEQ ID NO:324）通过扩增PDC5 sadB-片段B-片段U-片段C而生成，所用引物为包含与原生PDC5编码序列上游50个核苷酸具有同源性的5'尾的oBP542（SEQ ID NO:352）和oBP539（SEQ ID NO:351）。用PCR纯化试剂盒（Qiagen）纯化PCR产物。
制备CEN.PK 113-7D Δura3::loxP Δhis3 Δpdc6 Δpdc1::ilvDSm的感受态细胞，并用PDC5 A-sadB-BUC PCR盒转化，所述转化使用Frozen-EZYeast Transformation II试剂盒（Zymo Research）。转化混合物在30℃接种到缺乏尿嘧啶补充以1%的乙醇（无葡萄糖）的合成完全培养基上。通过PCR使用引物oBP540（SEQ ID NO:353）和oBP541（SEQ ID NO:354）筛选具有pdc5敲除-sadB整合的转化子，所用的基因组DNA用GentraPuregeneYeast/Bact试剂盒（Qiagen）制备。PDC5基因在分离物中的缺乏通过聚合酶链反应阴性结果来证明，所用的PDC5编码区的特异性引物为oBP552（SEQ ID NO:355）和oBP553（SEQ ID NO:356）。正确的转化子被选为菌株CEN.PK 113-7D Δura3::loxP Δhis3 Δpdc6 Δpdc1::ilvDSmΔpdc5::sadB-URA3。
CEN.PK113-7D Δura3::loxP Δhis3 Δpdc6 Δpdc1::ilvDSm Δpdc5::sadB-URA3过夜生长在YPD（0.1%乙醇）中并在30℃接种到合成完全培养基上，补充以乙醇（无葡萄糖）并包含包含5-氟-乳清酸（0.1%），以选择失去了URA3标记的分离株。使用以Gentra Puregene Yeast/Bact试剂盒（Qiagen）制备的基因组DNA通过PCR以引物oBP540（SEQ ID NO:353）和oBP541（SEQ ID NO:354）证实了所述PDC5缺失、sadB整合以及标记去除。所述正确的分离株被选为菌株CEN.PK 113-7D Δura3::loxPΔhis3Δpdc6Δpdc1::ilvDSmΔpdc5::sadB并命名为BP913。
GPD2缺失
为删除内源的GPD2编码区，使用loxP-URA3-loxP PCR（SEQ ID NO:360）作为模板DNA对gpd2::loxP-URA3-loxP盒（SEQ ID NO:361）进行PCR扩增。loxP-URA3-loxP包含来自（ATCC#77107）的URA3标记，其侧接loxP重组酶位点。PCR使用Phusion DNA聚合酶和引物LA512与LA513（SEQ ID NO:340和341）来完成。每个引物的GPD2部分来源于GPD2编码区上游5'区和编码区下游3'区，使得loxP-URA3-loxP标记的整合导致GPD2编码区的替换。所述PCR产物转化到BP913并且转化子在缺乏尿嘧啶的补充以1%乙醇（无葡萄糖）的合成完全培养基上筛选。筛选的转化子的正确整合通过PCR来验证，所用引物为oBP582和AA270（SEQ ID NO:357和358）。
所述URA3标记的循环是通过转化pRS423::PGAL1-cre（SEQ ID NO:271）并在30℃接种到合成完全培养基（缺乏组氨酸，补充以1%的乙醇）上。将转化子划线接种到补充以1%乙醇的，并包含5-氟-乳清酸（0.1%）的合成完全培养基上，并且在30℃孵育以选择失去了URA3标记的转化子的分离物。抗5-氟-乳清酸的分离株生长在YPE（1%乙醇）上以移除pRS423::PGAL1-cre质粒。使用引物oBP582（SEQ ID NO:357）和oBP591（SEQ ID NO:362）通过PCR确认缺失和标记移除。正确的分离株被选为菌株CEN.PK 113-7D Δura3::loxP Δhis3 Δpdc6 Δpdc1::ilvDSm Δpdc5::sadBΔgpd2::loxP并命名为PNY1503（BP1064）。
实例13
PNY2204和异丁醇途径质粒的构建
这个实例的目的是为了描述载体的构建以将编码乙酰乳酸合酶的基因整合到天然存在的在染色体XII中的PDC1和TRX1编码序列之间的基因间区域。还描述了使用这一质粒产生的菌株。
整合载体pUC19-kan::pdc1::FBA-alsS::TRX1的构建
通过将1.7kb的BbvCI/PacI片段从pRS426::GPD::alsS::CYC（描述于美国专利7,851,188，其全文以引用的方式并入本文）移至此前已经使用BbvCI/PacI进行消化以释出ILV5基因的pRS426::FBA::ILV5::CYC（描述于美国专利7,851,188，其全文以引用的方式并入本文）来构建FBA-alsS-CYCt盒。连接反应被转化成大肠杆菌TOP10细胞，并使用引物N98SeqF1（SEQ ID NO:363）和N99SeqR2（SEQ ID NO:365）通过PCR筛选了转化子。用BglII和NotI从所述载体分离了FBA-alsS-CYCt盒，用于克隆进pUC19-URA3::ilvD-TRX1（克隆“B”）的AflII位点（使用Klenow片段制备适合连接的末端）。获得在载体中两个方向上包含alsS盒的转化子并通过PCR确认，所述PCR对于构型“A”使用引物N98SeqF4（SEQ IDNO:364）和N1111（SEQ ID NO:366），并且对于构型“B”使用N98SeqF4（SEQ ID NO:364）和N1110（SEQ ID NO:367）。随后通过移除URA3基因（1.2kbNotI/NaeI片段）并添加遗传霉素盒来制备“A”构型的载体的遗传霉素选择型。使用Klenow片段来制备适合用于连接的全部末端，并通过PCR筛选了转化子以选择以与之前的URA3标记相同的取向具有遗传霉素抗性基因的克隆，所使用的引物为BK468（SEQ ID NO:368）和N160SeqF5（SEQ ID NO:210）。所得到的克隆被称为pUC19-kan::pdc1::FBA-alsS::TRX1（克隆A）（SEQ ID NO:387）。
构建alsS整合子菌株和生产异丁醇的衍生物
用PmeI使上文所述的pUC19-kan::pdc1::FBA-alsS整合载体线性化，并将其转化进入PNY1507（实例8）。PmeI在克隆的pdc1-TRX1基因间区域内内切载体并因此导致在该位点的靶向整合（Rodney Rothstein，Methods in Enzymology，1991，第194卷，第281-301页）。在添加了50μg/mLG418的YPE上选择了转化子。使用引物N160SeqF5（SEQ IDNO:210）和oBP512（SEQ ID NO:337）通过PCR筛选整合事件的转化子菌斑R。通过评估菌株制造异丁醇的能力，针对乙酰乳酸合酶功能对两个转化子进行了间接测试。为了进行该测试，在大肠杆菌-酵母穿梭载体（pYZ090ΔalsS和pBP915，描述于下文中）上提供了附加的异丁醇途径基因。将一个克隆命名为PNY2205。不含质粒的亲本菌株命名为PNY2204（MATa ura3Δ::loxP his3Δpdc6Δ pdc1Δ::P[PDC1]-DHAD|ilvD_Sm-PDC1t-pUC19-loxP-kanMX-loxP-P[FBA1]-ALS|alsS_Bs-CYC1t pdc5Δ::P[PDC5]-ADH|sadB_Ax-PDC5t gpd2Δ::loxP fra2Δ adh1Δ::UAS（PGK1）P[FBA1]-kivD_Ll（y）-ADH1t）。
异丁醇途径质粒（pYZ090ΔalsS和pBP915）
用SpeI和NotI消化pYZ090（SEQ ID NO:195）以移除大部分CUP1启动子以及全部的alsS编码序列和CYC终止子。在用Klenow片段处理之后使载体自连，并转入大肠杆菌（E.coli）Stbl3细胞，针对氨苄青霉素抗性进行选择。两个独立克隆的DNA区域的去除通过包括连接部分的DNA测序进行确认，所述测序通过使用引物N191（SEQ ID NO:370）的PCR进行。所得质粒命名为pYZ090ΔalsS（SEQ ID NO:371）。构建了pLH468质粒用于在酵母中表达DHAD、KivD和HADH。通过删除kivD基因和kivD上游的957个碱基对的TDH3启动子而从pLH468（SEQ ID NO:139）构建了pBP915（SEQ ID NO:182）。使用SwaI消化pLH468并以琼脂糖凝胶并随后以GelExtraction试剂盒（Qiagen；Valencia，CA）纯化了大片段（12896bp）。用T4DNA连接酶使所分离的DNA自连，并用于转化电感受态的TOP10大肠杆菌（Invitrogen；Carlsbad，CA）。分离了来自转化子的质粒，并通过用SwaI限制性酶进行限制性分析，针对正确的删除进行了检查。还使用引物oBP556（SEQ ID NO:372）和oBP561（SEQ IDNO:373）对分离株进行覆盖缺失位点的测序。带有正确的缺失的一个克隆被命名为pBP915（pLH468ΔkivD）（SEQ ID NO:182）。
pYZ090是基于pHR81（ATCC#87541，Manassas，VA）主链。pYZ090被构建以包含一个嵌合基因，其具有来自枯草芽孢杆菌的alsS基因（核苷酸位置457-2172）编码区，所述alsS基因表达通过酵母CUP1启动子（核苷酸2-449）进行并后接CYC1终止子（核苷酸2181-2430）；以及一个嵌合基因，其具有来自乳酸乳球菌的ilvC基因（核苷酸3634-4656），所述KARI的表达通过酵母ILV5启动子（核苷酸2433-3626）进行并后接ILV5终止子（核苷酸4682-5304）。
实例14
异丁醇生产-PNY1910和PNY2242
方法：
接种物培养基的制备
1L的接种物培养基包含：6.7g，酵母氮基，不含氨基酸（Difco 0919-15-3）；2.8g，酵母合成Drop-out培养基补充物，不含组氨酸、亮氨酸、色氨酸和尿嘧啶（Sigma Y2001）；20ml1%（w/v）L-亮氨酸；4ml1%（w/v）L-色氨酸；3g乙醇；10g葡萄糖。
限定发酵培养基的制备
接种后的液体培养基体积为800mL，每升具有以下的最终组分：5g硫酸铵、2.8g磷酸二氢钾、1.9g七水硫酸镁、0.2ml消泡剂（SigmaDF204）、酵母合成Drop-out培养基补充物（不含组氨酸、亮氨酸、色氨酸和尿嘧啶）（Sigma Y2001）、16mgL-亮氨酸、4mgL-色氨酸、6ml维生素混合物（1L水中含50mg生物素、1gCa-泛酸、1g烟酸、25g肌醇、1g盐酸硫胺素）、1g盐酸吡哆醛、0.2g对氨基苯甲酸）、6ml微量元素溶液（1L水中含15gEDTA、4.5g七水硫酸锌、0.8g无水氯化镁、0.3g六水氯化钴、0.3g五水硫酸铜、0.4g无水钼酸二钠、4.5g二水氯化钙、3g七水硫酸铁、1g硼酸、0.1g碘化钾）、30mg盐酸硫胺素、30mg烟酸。使用2NNaOH将pH调至5.2并加入葡萄糖至10g/L。
接种物的制备
通过用移液管移取全部小瓶培养物（大约1ml）到10mL种菌培养基中，从冷冻小瓶直接接种125mL的烧瓶。烧瓶在260rpm和30℃条件下培养。菌株过夜生长至OD为约1.0。λ=600nm下的OD在Beckman分光光度计（Beckman，USA）中测定。
生物反应器实验设计
在1L Biostat BDCU3发酵罐（Sartorius，USA）中以0.8L的工作体积进行发酵。废气组成通过Prima DB质谱（Thermo Electron Corp.，USA）监测。在整个发酵中，温度维持在30C下并使用2NKOH将pH控制在5.2。紧接着使用80ml所述接种物接种之后，通过在30%下搅拌来控制dO，pH控制于5.25，空气控制在0.2L/分钟。一旦达到约3的OD，将气体转换成N2进行厌氧培养。在所述发酵全过程中，通过手工添加50%（w/w）溶液来维持葡萄糖过量（5-20g/L）。
用于分析培养实验的方法
通过将混合均匀的液体培养基样品移入比色杯（CS500 VWRInternational，Germany）而在分光光度计中测定了λ=600nm下的OD。如果样品的生物质浓度超过分光光度计（通常OD值为0.000至0.300）的线性吸光度范围时，用0.9%的氯化钠溶液稀释样品以生成在线性范围内的值。
对培养物上清液中的葡萄糖、异丁醇和其它发酵副产物通过HPLC进行来测量，其使用Bio-Rad Aminex HPX-87H色谱柱（Bio-Rad，USA），以折射率（RI）和二极管阵列（210nm）检测器进行。用0.01N的H2SO4作为流动相，以0.6mL/分钟流量和40℃的柱温实现色谱分离。在这些条件下，异丁醇持留时间为32.2分钟。废气样品中的异丁醇浓度通过质谱仪而测定。
结果
以光密测（OD）来测量的最大生物质浓度、异丁醇生产的体积速率、最终异丁醇滴度和葡萄糖对异丁醇的收率在下文表中给出。菌株PNY2242具有比菌株PNY1910更高的滴度和更快的速率，并以更高的特异速率和滴度生产异丁醇。特异速率在图5中示出。DHIV+DHMB在培养物上清液中的积累比对于PNY1910而言其相比PNY2242菌株高三倍（图6）。葡萄糖对于甘油、丙酮酸、BDO、DHIV+DHMB*、αKIV和异丁酸的收率在图7中示出。
*通过HPLC方法分析的DHIV包括DHIV和DHMB。
表19
菌株 最大OD600 速率（g/L/h） 滴度（g/L） 收率（g/g）
PNY1910 5.0 0.16 10.9 0.25
PNY2242 5.0 0.23 16.1 0.27
实例15
K9G9易错PCR文库的构建
对K9G9进行了易错PCR以产生文库，其筛选相对NADH具有针对NADPH的Km值的提高的变体。使用
Figure BDA0000419940220001431
II EZClone DomainMutagenesis试剂盒（目录号200552；Agilent Technologies，StratageneProducts Division，La Jolla，CA）对K9G9进行了诱变PCR。引物K9G9_EZ_F1（AAA CAT GGA AGA ATG TAA GAT GGC；SEQ ID NO:390）和K9G9_EZ_R1（TCA GTT GTT AAT CAA CTT GTC TTC G；SEQID NO:391）由Integrated DNA Technologies，Inc（Coralville IA）进行商业合成。除引物、模板和ddH2O外，此处使用的试剂由上文指出的试剂盒提供。所述诱变PCR混合物由4μl pHR81-PIlv5-KARI-K9.G9（SEQ ID NO:392）（770ng/μg）、1.25μl的各个引物（100ng/μl储液）、5μl的10×Mutazyme II反应缓冲液、1μl40mM dNTP混合物、1.5μlMutazyme IIDNA聚合酶以及36μlddH2O组成。使用以下条件进行PCR反应：起始温度为95℃下2.0分钟，随后是30个加热/冷却循环。每个循环由95℃下30秒，48℃下30秒以及72℃下2.0分钟组成。在温度循环完成后，将样品保持在72℃下10.0分钟或更长，然后在4℃下等待回收。通过琼脂糖凝胶电泳（1%琼脂糖，1×TBE缓冲液）并且使用
Figure BDA0000419940220001432
DNA Gel Extraction试剂盒（目录号400766，Agilent Technologies，Stratagene ProductsDivision，La Jolla，CA）根据制造商建议从模板中分离反应产物。
所分离的反应产物作为巨引物用于在上文指出的试剂盒的“EZClone反应”中生成基因文库。除巨引物、模板和ddH2O外，其它试剂由上文指出的试剂盒提供。该反应由25μl的2×EZClone酶混合物、4μlmegaprimer（125ng/μl）、2μlK9G9（处于pBAD.KARI载体中（25ng/μl））、3μlEZClone溶液和16μlddH2O组成。使用以下条件进行该反应：起始温度为95℃下1.0分钟，随后进行30个加热/冷却循环。每个循环由95℃下50秒，60℃下50秒以及68℃下10.0分钟组成。在温度循环完成后，将样品保持在72℃下10.0分钟或更长，然后在4℃下等待回收。加入1μl的DpnI（10U/μl）并将该混合物在37℃下孵育4小时。
随后根据制造商的建议将4μl经Dpn I消化的“EZClone反应”产物转化进入50μl
Figure BDA0000419940220001441
Ultracompetent大肠杆菌细胞中（提供于II EZClone Domain Mutagenesis试剂盒中）。将转化子涂布于琼脂平板上，其包含LB培养基和100μg/ml氨苄青霉素（目录号L1004，Teknova Inc.Hollister，CA），在37℃下孵育过夜并储存于4℃下。对全部10个转化子使用4μl经DpnI消化的“EZClone反应”产物和50μl细胞/组转化来重复这些步骤。使用包含M9盐的溶液从所述琼脂平板上刮下所得的处于XL-Gold中的文库，将其结合并稀释进入包含LB培养基和100μg/ml氨苄青霉素的培养基中并在37℃下孵育过夜。使用QIAprep SpinMiniprep试剂盒（目录号2706；Qiagen，Valencia，CA）根据制造商提供的方案从所述细胞中分离文库DNA。随后使用BioRad Gene Pulser II（Bio-Rad Laboratories Inc.，Hercules，CA）将所扩增的文库用于转化大肠杆菌的电感受态菌株Bw25113（ΔilvC）。将转化的克隆涂布于包含LB培养基和100μg/ml氨苄青霉素（#101320-154，Teknova Inc.Hollister，CA）的琼脂平板，并在37℃下过夜孵育。使用克隆进行高通量筛选，如实例16所描述。
实例16
通过筛选对于NADH活性具有减弱的NADP+的抑制来鉴定具有针对 NADPH的提高K M 的K9G9变体
针对具有降低的NADP+抑制NADH依赖型KARI活性的变体来筛选实例15中描述的K9G9文库。对于NADH活性具有降低的NADP+抑制的K9G9变体可有可能表现出NADPH的KM与NADH的KM之间比率的提高。根据提高NADPH的KM相对于NADH的Km的具体目标，来自筛选的命中物经部分纯化并且实施了动力学分析以测定对于NADH以及对于NADPH的Vmax和KM参数。
K9G9基因文库的高通量筛选测定法
突变KARI酶基因文库的高通量筛选如本文描述而进行：使用分子纯级别的水制备了10×冷冻培养基并对过滤消毒，其包含554.4g/L甘油、68mM的(NH4)2SO4、4mM MgSO4、17mM柠檬酸钠、132mMKH2PO4、36mMK2HPO4。通过使用LB培养基稀释所述10×冷冻培养基来制备冷冻培养基。将1×冷冻培养基的等分试样（200μL）用于96孔存档平板（目录号3370，Corning Inc.Corning，NY）的各孔。
来自LB琼脂平板的克隆受到选择并且接种到包含冷冻培养基的96孔存档平板中，并且不经振荡而在37℃下生长过夜。随后将该存档平板储存于-80℃。使用pBAD-HisB（Invitrogen）进行转化的大肠杆菌菌株Bw25113（ΔilvC）（如美国专利8,129,162中所描述）一直被用作为阴性对照。该文库的阳性对照是处于大肠杆菌菌株Bw25113（ΔilvC）中的K9G9-KARI，如美国专利8,129,162中所描述。
将来自存档平板的克隆接种到96深孔平板。各孔包含3.0μl来自融化的存档平板的细胞、200μlLB培养基，其包含100μg/ml氨苄青霉素和0.02%（w/v）阿拉伯糖作为诱导物。将细胞在37℃下以80%的湿度振荡（900rpm）生长过夜，通过离心进行收集（3750rpm，5分钟，25℃下）（Eppendorf离心机，Brinkmann Instruments，Inc.Westbury，NY）并且将细胞团块储存于-20℃以用于随后的分析。
按照以下文献中所述的方法来合成测定底物（R,S）-乙酰乳酸：Aulabaugh和Schloss（Aulabaugh and Schloss，Biochemistry，29:2824-2830，1990）。测定法中使用的所有其它化学药品均购自Sigma。KARI对乙酰乳酸向α,β-二羟基异戊酸的酶促转换通过使用酶标仪（Saphire2，Tecan，Mannedorf，Switzerland）在340nm下测量来自反应的辅因子NADH氧化来加以追踪。使用6220M-1cm-1的NADH摩尔消光系数来计算活性。
同时，在室温下将深孔平板中的冷冻细胞团块和BugBuster（Novagen71456，Darmstadt，Germany）暖化30分钟。在30分钟的暖化后向各孔中加入75μl的50%BugBuster（v/v，水中）并使用平板振荡器悬浮细胞。具有细胞团块/50%BugBuster悬液的平板在室温下孵育30分钟。使用75μl双蒸水稀释细胞裂解物，产生了0.5×的裂解物。对稀释的无细胞提取物的分析在30℃下在包含2.4mM（R/S）-乙酰乳酸、100mM HEPES pH6.8、100mMKCl、10mMMgCl2、150μMNADH、12.5μl0.5×细胞裂解物的缓冲液中以2.5mM NADP+或不含NADP+的条件下进行。
对NADHKARI活性具有降低的NADP+抑制的K9G9变体的鉴定
针对各个变体和阳性对照孔（2个/平板）计算了在NADP+存在的情况下NADH氧化的测得速率与不存在NADP+的情况下NADH氧化的测得速率之间的比率。计算了全部阳性对照孔（总计104个）的比率平均值和标准偏差。
在不存在NADP+的情况下的速率大于0.1OD/小时并且速率比大于0.45（比阳性对照的平均值高三倍标准偏差）且小于1的情况下，变体孔被认为包含初始的命中物。从4607个潜在变体的库内总计鉴定出521个命中物。将这些初始命中物汇总，形成较小的文库用于进一步分析。
对初始文库命中物的二次筛选
以三重复生物组生长汇总的命中物文库，并且制备无细胞提取物并如上述加以分析。随后针对变体和阳性对照如上文计算速率比。选用于细化动力学分析的最终命中物符合以下标准：在不存在NADP+的情况下的速率大于0.6OD/小时，速率比大于0.51并小于1，并且三重复生物组中的至少两个通过该标准。十七个命中物经鉴定用于动力学分析，并在含100μg/mL氨苄青霉素的LB平板上划线。
K9G9变体的序列分析
通过使用TempliPhiTM（GE Healthcare）以引物pBAD-For（ATGCCATAGCATTTTTATCC；SEQ ID NO:393）和pBAD-Rev（CTGATTTAATCTGTATCAGGCT；SEQ ID NO:394）来实施对从二次HTS筛选中鉴定出的十七个变体进行的DNA测序。
表20：K9G9变体的氨基酸替换
变体 SEQ 氨基酸替换
878C1 873 未鉴定出
879A7 874 K90M
879C2 875 H37Q
880A11 876 A182T,P320Q
880B4 877 K57E
880D11 878 K90M,A174V
881A2 879 K90M,I133V,K282T
881G3 880 Y53F,E74G
881G9 881 K90E
882B12 882 H118R
882C10 883 G31S,R61S,C121Y,D129N,G183D
882C7 933 E54G
882F9 934 K90E,Q160H
882G6 935 G55A
882G12 936 V142L，S285Y
883C4 937 A170V
883G9 938 L197M,K310M
对部分纯化的变体蛋白的动力学分析
如美国专利8,129,162中所描述，大肠杆菌菌株Bw25113（ΔilvC）用于表达所述十七个变体和阳性对照K9G9。在37℃下将菌株在125ml具缘底通气过滤顶盖烧瓶中在10ml包含100μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基（46-060-CM，Mediatech，Manassas，VA）内振荡生长8小时。使用200μl的这一培养物接种100mlLB液体培养基，其加入了100μg/mL氨苄青霉素和0.2%（w/v）阿拉伯糖。在500ml具缘底通气过滤顶盖烧瓶中将这些培养物在37℃下振荡生长16至18小时。将细胞收集成20ml和两组40ml等分试样，倒出上清液并将细胞团块在-80℃下冷冻。
为部分地纯化该蛋白，将对应于20mL细胞培养物收集样的细胞团块融化并重悬浮于1ml的Bug Buster Master Mix（Novagen 71456，Darmstadt，Germany）中。将所述细胞悬液在室温下孵育15分钟，随后在60℃下进行15分钟孵育以变性热易感蛋白。通过在4℃下离心30分钟来沉淀细胞碎片和变性蛋白。回收包含热稳定的胞质蛋白（包括K9G9和变体）的上清液并在4℃下储存。
热稳定胞质蛋白级分的总蛋白通过Bradford Assay使用Coomaisse Plus（Thermo Scientific#23238，Rockford，Ill.）来测量。使用BSA作为标准物。蛋白质的浓度通过使用Cary 300分光光度计（Agilent Technologies，Wilmington，DE）测定595nm下的吸光度而测量。
为测定NADP和NADPH的Vmax和KM，在多个浓度的NADH（0、16.4、32.8、65.7、98.5、164.3和246.5μM）和NADPH（0、12.8、25.6、51.2、76.8和128μM）下测定部分纯化的蛋白质。在30℃下100mMHEPES（pH6.8），10mMMgCl2，100mMKCl和4.8mMR/S-乙酰乳酸中实施测定法。向该测定中加入0.1至0.35mg/mL的总蛋白。通过使用Cary300分光光度计（Agilent Technologies，Wilmington，DE）在340nm下监测NAD（P）H的氧化来测量S-乙酰乳酸向DHIV转化的速率。使用6220M-1cm-1的摩尔消光系数来计算活性。通过将比活性（U/mg）对辅因子浓度进行作图并使用Kaleidagraph软件（Synergy，Reading，PA）将该数据对米氏方程进行拟合来计算Vmax和Km值。
表21：通过NAD（P）H消耗测定法测定的部分纯化的K9G9的动力 学数值
Figure BDA0000419940220001481
实例17
通过定点诱变而对K9KARI变体的手工重组
对K9G9衍生物K9JB4和K9JG3（在实例16中分别标识为880B4和881G3）实施了定点诱变来并入实例中描述的其它氨基酸变化。初始步骤为加入N87P替换，其描述于实例5中。使用II Site-DirectedMutagenesis试剂盒（目录号200523；Agilent Technologies，StratageneProducts Division,La Jolla，CA）以引物N87PC1（CTGACATCATTATGATCTTGATCCCAGATGAAAAGCAGGCTACCATGTAC；SEQ ID NO:395）和N87PC1r（GTACATGGTAGCCTGCTTTTCATCTGGGATCAAGATCATAATGATGTCAG；SEQ ID NO:396）来将突变引入KARI基因。除引物、模板和ddH2O外，所使用的全部试剂与上文指出的试剂盒一起供应。引物由IntegratedDNATechnologies，Inc（Coralville IA）商业合成。模板为K9KARI变体，其处于大肠杆菌载体中（pBAD.KARI）。对于K9JB4的诱变，所述反应混合物包含1μlK9JB4（50ng/μl）、1μl各个引物（150ng/ul）、5μl的10×反应缓冲液、1μldNTP混合物、1μlPfuUltra HFDNA聚合酶以及40μlddH2O。对于K9JG3反应混合物，使用1μlK9JG3（50ng/μl）替换1μlK9JB4（50ng/ul）。对于两个反应均使用以下的条件：起始温度为95℃下30秒，随后为16轮加热/冷却循环。每个循环由95℃下30秒，55℃下30秒以及68℃下5.0分钟组成。在温度循环完成后，将样品保持在4℃下等待回收。向各反应中加入1μl的DpnI（10U/μl）并在37℃下孵育所述混合物1小时。
根据制造商的说明，将2μl的各个诱变反应物转化进入One
Figure BDA0000419940220001491
TOP10化学感受态大肠杆菌（Invitrogen，目录号C404003）。将转化子涂布于包含LB培养基和100μg/ml氨苄青霉素（目录号L1004，Teknova Inc.Hollister，CA）的琼脂平板上，并在37℃下过夜孵育。随后选择多个转化子进行基于TempliPhiTM（GE Healthcare）的DNA测序，其使用引物pBAD-For（ATGCCATAGCATTTTTATCC；SEQ ID NO:393）和pBAD-Rev（CTGATTTAATCTGTATCAGGCT；SEQ ID NO:394）。将具有经证实的KARI序列的转化子接种于包含100μg/mL氨苄青霉素的LB培养基中并在33℃下以225rpm振荡孵育。使用QIAprep Spin Miniprep试剂盒（目录号2706；Qiagen，Valencia，CA）根据制造商提供的方案从所述细胞中分离质粒DNA。所得的克隆K9JB4P和K9JG3P分别来自于K9JB4和K9JG3。
如上针对修饰的描述进行了另外的定点诱变。
变体K9JA1使用引物oK57E1（GGTTTATTCGAAGGTGCGGAGGAGTGGAAAAGAGCTG；SEQ ID NO:397）和oK57E1r（CAGCTCTTTTCCACTCCTCCGCACCTTCGAATAAACC；SEQ ID NO:398）来自于K9JG3P。诱变反应包含1μlK9JG3P（50ng/μl）、1μl各个引物（150ng/ul）、5μl的10×反应缓冲液、1μldNTP混合物、1μlPfuUltraHFDNA聚合酶以及40μlddH2O。大肠杆菌转化子的液体培养物在37℃下而非33℃下孵育。
变体K9SB2使用引物oY53F1（GTAACGTTATCATTGGTTTATACGAAGGTGCGGAGGAG；SEQ IDNO:399）和oY53F1r（CTCCTCCGCACCTTCGAATAAACCAATGATAACGTTAC；SEQ ID NO:400）来自于K9JB4P。诱变反应物包含1μlK9JB4P（50ng/μl）、1μl各个引物（150ng/ul）、5μl的10×反应缓冲液、1μldNTP混合物、1μlPfuUltraHFDNA聚合酶以及40μlddH2O。大肠杆菌转化子的液体培养物在37℃下而非33℃下孵育。
变体K9SB2-K90L使用引物oK90L1（GATCTTGATCCCAGATGAATTGCAGGCTACCATGTACAAAAAC；SEQ ID NO:401）和oK90L1r（GTT TTT GTA CAT GGT AGC CTG CAATTC ATC TGG GAT CAA GAT C；SEQ ID NO:402）来自于K9SB2。诱变反应包含2.5μlK9SB2（50ng/μl）、1μl各个引物（150ng/ul）、5μl的10×反应缓冲液、1μldNTP混合物、1μlPfuUltra HFDNA聚合酶，以及38.5μlddH2O。对于加热/冷却循环，55℃下30秒的步骤增加至1分钟。大肠杆菌转化子的液体培养物在37℃下而非33℃下孵育。
变体K9SB2-K90M使用引物oK90M1（CTTGATCCCAGATGAAATGCAGGCTACCATGTACAAAAAC；SEQ IDNO:403）和oK90M1r（GTT TTT GTA CAT GGT AGC CTG CAT TTCATC TGG GAT CAA G；SEQ ID NO:404）来自于K9SB2。诱变反应包含2.5μlK9SB2（50ng/μl）、1μl各个引物（150ng/ul）、5μl的10×反应缓冲液、1μldNTP混合物、1μlPfuUltraHFDNA聚合酶，以及38.5μlddH2O。对于加热/冷却循环，55℃下30秒的步骤增加至1分钟。大肠杆菌转化子的液体培养物在37℃下而非33℃下孵育。
表22：K9G9变体和组合的氨基酸替换。
Figure BDA0000419940220001511
实例18
对具有提高的NADPHK M 与NADHK M 比率的纯化的K9G9衍生物的 动力学表征
如美国专利8,129,162中所描述，K9G9和变体在大肠杆菌菌株Bw25113（ΔilvC）中过表达，并进行纯化以获得对辅因子亲和性和最大速度的更为精确的测定。
为进行表达和表征，使用大肠杆菌质粒（pBAD.KARI）来转化电感受态大肠杆菌的菌株Bw25113（ΔilvC），如美国专利8,129,162中所描述，使用BioRad Gene Pulser II（Bio-Rad Laboratories Inc.，Hercules，CA）进行。将转化的克隆涂布于包含LB培养基和100μg/ml氨苄青霉素（101320-154，Teknova Inc.Hollister，CA）的琼脂平板，并在37℃下过夜孵育。将各个菌株的单一转化子划线于具有100μg/mL氨苄青霉素的LB平板。将来自各个平板的单菌落用于接种10ml具有100μg/mL氨苄青霉素LB液体培养基。在125ml具缘底通气过滤顶盖烧瓶中将这些培养物在37℃下振荡生长8小时。使用200μl的这一培养物来接种两组500ml具缘底通气过滤顶盖烧瓶，其包含具有100μg/mL氨苄青霉素和0.2%（w/v）阿拉伯糖的LB液体培养基。将所述表达培养物在37℃下振荡生长16–18小时。通过离心将细胞收集成为40ml的等分试样，弃去上清液并将细胞团块在-80℃下冷冻直至进行纯化。
K9G9和全部变体使用相同的方法纯化。两组细胞团块（各代表了40mL的细胞培养物等分试样）重悬浮于4mL Bug Buste rMaster Mix（Novagen 71456，Darmstadt，Germany）中并且在室温下孵育15分钟，随后在60℃下15分钟。变性的蛋白质和细胞碎片通过在4℃下以7,000rpm离心30分钟来沉淀。倒出上清液，保存并通过Acrodisc0.2μm的注射器滤器（PN4192，Pall，Ann Arbor，MI）进行过滤。使用GEHealthcare HiLoad 26/60 Superdex200凝胶过滤色谱柱（17-1071-01，Buckinghamshire，England）从过滤的热处理无细胞提取物中纯化K9G9。在蛋白质加载前，对该色谱柱使用50mMHEPES（pH7.5）5mMMgCl2的缓冲液在2.0mL/分钟的流速下以0.2CV的平衡体积进行预平衡。K9G9和变体在1.5CV的无梯度步骤中洗脱，该步骤由50mMHEPES（pH7.5）、5mMMgCl2的缓冲液在2.0mL/分钟的流速下组成。使用Frac-950级分收集器（Buckinghamshire，England）以回形模式收集体积为2.5mL的级分。K9G9和变体全部在级分D5–E5或D6–E4之间被洗脱。使用15mLAmicon UltraYM-30离心滤器（UFC903008，Millipore，Billercia，MA）来汇合级分并使用10mL 100mM HEPES（pH6.8）和10mMMgCl2的缓冲液进行洗涤。弃去滤过物并使用包含100mMHEPES（pH6.8）和10mMMgCl2的1mL缓冲液将纯化的蛋白从膜上洗脱。
为测定NADH和NADPH的Vmax和KM值，以不同浓度的NAD（P）H（0至1000μM）结合NAD（P）H再生体系来测定纯化的蛋白质。在30℃下在包含100mMMOPS，pH6.8、10mMMgCl2、1mMEDTA、5mM（R/S）-乙酰乳酸、1mM葡糖-6-磷酸、3mU/μL葡糖-6-磷酸脱氢酶的缓冲液中进行测定。使用三倍体积的0.1%甲酸在十分钟后淬灭反应。使用LC-MS测量DHIV浓度。S-乙酰乳酸向DHIV的转化速率通过测量固定时间点处所产生的DHIV量来测定。通过将比活性（U/mg）对辅因子浓度进行作图并将该数据对米氏方程进行拟合来计算Vmax和Km值。乙酰乳酸的Km值（在固定NADH浓度下）的测量显示用于辅因子Km测定的固定乙酰乳酸浓度是饱和性的。
表23：通过DHIV形成测定的纯化K9G9的动力学数值
Figure BDA0000419940220001531
实例19
具有提高的NADPHK m 与NADHK m 比率的K9G9衍生物的异丁醇生 产
K9JB4、K9JB4P、K9JG3、K9JG3P、K9JA1和K9SB2的酵母表达质粒通过从大肠杆菌载体（pBAD.KARI）中将变体KARI基因在PmeI和SfiI位点亚克隆进入pHR81-PIlv5-KARI-K9.G9而制备。所得的质粒以及pHR81-PIlv5-KARI-K9.G9和pHR81-PIlv5-KARI-K9.D3（SEQ ID NO:181）一起在酵母中受到针对异丁醇生产和副产物形成的分析。酵母途径菌株在PNY2259（MATa ura3Δ::loxP his3Δpdc6Δpdc1Δ::P[PDC1]-DHAD|ilvD_Sm-PDC1t-P[FBA1]-ALS|alsS_Bs-CYC1t pdc5Δ::P[PDC5]-ADH|sadB_Ax-PDC5t gpd2Δ::loxP fra2Δ::P[PDC1]-ADH|adh_Hl-ADH1tadh1Δ::UAS（PGK1）P[FBA1]-kivD_Lg（y）-ADH1t yprcΔ15Δ::P[PDC5]-ADH|adh_Hl-ADH1t ymr226cΔald6Δ::loxP；实例22）中制备，其共转化有作为途径质粒#1的KARI载体与作为途径质粒2的pBP915（pRS423-PFBA1-DHAD-PGPM1-hADH1；SEQ ID NO:182）。将转化的细胞在不含组氨酸和尿嘧啶的合成培养基（1%乙醇作为碳源）上涂平板。将三个转化子转移至相同培养基的新鲜平板。在厌氧条件下在血清瓶中针对异丁醇生产测试了所述转化子。
来自SE-Ura-His平板上的转化的酵母菌落在3-5天后出现。将来自各个变体的三个菌落点覆于新鲜的SE-Ura-Hi平板上，在30℃下孵育3天。
生长培养基和工序
在酵母菌株的生长工序期间使用了两种类型的培养基：有氧预培养培养基和厌氧培养培养基。除非另行申明，否则全部化学物均获自Sigma（St.Louis，MO）。
有氧预培养培养基（SE-Ura-His）：6.7g/L无氨基酸酵母氮基（Difco，291940，Sparks，MD），1.4g/L酵母合成drop-out培养基补充物，无组氨酸、亮氨酸、色氨酸和尿嘧啶，0.2%乙醇，0.2%葡萄糖，0.01%w/v亮氨酸和0.002%w/v色氨酸。
厌氧培养培养基（SEG-Ura-His）：50mMMES（pH5.5），6.7g/L无氨基酸酵母氮基（Difco，291940，Sparks，MD），1.4g/L酵母合成drop-out培养基补充物，无组氨酸、亮氨酸、色氨酸和尿嘧啶，具有0.1%乙醇，3%葡萄糖，0.01%亮氨酸，0.002%色氨酸，30mg/L烟酸，30mg/L硫胺素和10mg/L麦角固醇，在50/50v/v的Tween/乙醇溶液中制成。
将点覆的细胞接种于25mLSEG-Ura，His培养基中（具有0.2%葡萄糖和0.2%乙醇），并且在进行性限氧条件下在30℃下闭盖振荡生长约48小时，直至达到了约1.5至2的目标OD600值。记录OD600值。通过离心沉淀细胞并弃去上清液。将细胞团块转移至Coy无氧袋（Grass Lake，MI），在其中将团块重悬浮于1.0mL的厌氧生长培养基中（SEG-Ura-His）。使用重悬浮的细胞团块在50mL血清瓶（Wheaton，223748，Millville，NJ）中接种30mL的SEG-Ura-His培养基，达到0.2的目标起始OD600值。在接种前，将全部厌氧培养基、血清瓶、隔塞和卷夹在无氧袋中脱气至少24小时。将血清瓶封隔、夹紧并转移出无氧袋，并在30℃下以240rpm振荡生长。将厌氧培养物生长24至72小时，目标OD600值为至少1.2。另外的厌氧生长步骤使用来自先前厌氧培养物步骤的细胞作为接种物。对各变体评估了三个转化子。
对具有K9G9KARI变体的酵母菌株的HPLC分析
在厌氧生长时期结束时取样用于HPLC分析并用于获取OD600值。使用Waters 2695分离装置、2996光电二极管阵列检测器和2414折射率检测器（Waters，Milford，MA）与Shodex Sugar SH-G前柱和Shodex SugarSH1011分离柱（Shodex，JMScience，Grand Island，NY）进行HPLC分析。通过在0.01N硫酸下以0.5mL/分钟的流速进行无梯度洗脱来分离化合物。使用WatersEmpowerPro软件分析色谱图。
测定了甘油、异丁醇的摩尔收率以及甘油/异丁醇比率。通过三组重复分析对各变体计算平均值和标准偏差。随后使用学生t检验来通过K9D3对照值测定所述值中的差异是否在统计上是显著的。对于新的变体，NADPH的KM值相对于NADH的KM的提高是降低的NADPH利用的预期结果。在下文表中和图9中报道的结果显示，相对于K9D3和K9G9而言，具有提高的NADPHKM与NADHKM比率的新变体表现出更高的异丁醇与甘油比率。与K9D3相比，K9SB2在异丁醇滴度中表现出35%的提高。
表24：K9G9变体动力学和异丁醇数据
Figure BDA0000419940220001551
实例20
K9SB2易错PCR文库的构建
K9SB2易错PCR文库以与K9G9文库类似的方式构建，具有以下的改动。诱变PCR混合物由9.5μlpBAD.KARI载体中的K9SB2（190ng/μl）、1.25μl引物K9G9_EZ_F1（100ng/μl）、1.25μl引物K9G9_EZ_R1（100ng/μl）、5μl的10×MutazymeII反应缓冲液、1μl的40mMdNTP混合物、1.5μlMutazyme II DNA聚合酶和30.5μlddH2O组成。“EZclone反应”包含25μl的2×EZClone酶混合物、3μl巨引物（K9SB2诱变PCR产物，190ng/μl）、2.6μlK9SB2模板DNA（19ng/μl）、3μlEZClone溶液1和16μlddH2O。对于DpnI步骤，将该混合物在37℃下孵育3小时。使用克隆进行高通量筛选，如实例21所描述。
实例21
基于提高的NADH与NADPH活性比率而筛选具有进一步提高的 NADPHKm与NADPHKm比率的K9SB2变体
针对具有降低的NADPH亲和性的变体筛选实例20中描述的K9SB2文库。根据提高NADPH的Km的相对于NADH的Km的具体目标，来自筛选的命中物经部分纯化并且实施了动力学分析以测定对于NADH以及对于NADPH的Vmax和Km参数。
K9SB2基因文库的高通量筛选测定法
如实例16中所描述使用HTS筛选变体，其具有以下不同之处。分析缓冲液由2.4mM（R/S）-乙酰乳酸、100mMHEPESpH6.8、10mMMgCl2、150μMNADH或100μMNADPH，以及12.5μL0.5×细胞裂解物组成。
针对各个变体和阳性对照孔（2个/平板）计算了100μMNADPH氧化的测得速率与150μMNADH氧化的测得速率之间的比率。在NADH速率大于0.6OD/小时并且速率比（NADPH/NADH）小于0.37（比阳性对照的平均值低三倍标准偏差）的情况下，变体孔被认为包含初始的命中物。从4947个潜在变体的库内总计鉴定出218个命中物。将这些初始命中物汇总，形成较小的文库用于进一步分析。
以三重复生物组生长汇总的初始命中物文库，并且制备无细胞提取物并如上述加以分析。随后针对变体和阳性对照如上文计算速率比。选用于精密动力学分析的最终命中物符合以下标准：NADPH/NADH速率比小于0.45，NADH速率大于0.6OD/小时，并且三重复生物组中的至少两个通过该标准。鉴定了107个变体。
还分析了数据以鉴定使用NADH辅因子针对S-乙酰乳酸向DHIV的转化具有更高速率的变体。针对全部阳性对照计算NADH氧化的平均速率和标准偏差。在NADH氧化速率比阳性对照的速率（2.524OD/hr）高至少3倍标准偏差的情况下，变体被认为是潜在的命中物。鉴定出了68个变体，并且序列分析测定17个具有至少一个氨基酸替换。替换T93A和T93I各自出现了两次，并且将变体2017B12和D6选用于进一步分析。
通过使用TempliPhiTM（GEHealthcare）以引物pBAD-For（ATGCCATAGCATTTTTATCC；SEQ ID NO:393）和pBAD-Rev（CTGATTTAATCTGTATCAGGCT；SEQ ID NO:394）来实施对从二次HTS筛选中鉴定出的107个变体进行的DNA测序。有105个序列不同于亲本并且氨基酸替换在下文两表的第一个中列出。
通过使用TempliPhiTM（GEHealthcare）以引物pBAD-For（ATGCCATAGCATTTTTATCC；SEQ ID NO:393）和pBAD-Rev（CTGATTTAATCTGTATCAGGCT；SEQ ID NO:394）来实施对从NADH速率筛选中鉴定出的68个变体进行的DNA测序。17个序列不同于野生型并且重复出现的2种替换的氨基酸替换在下文第二个表中列出。
表25：K9SB2变体的氨基酸替换
Figure BDA0000419940220001571
Figure BDA0000419940220001591
表26：K9SB2变体的氨基酸替换
Figure BDA0000419940220001601
部分纯化的K9SB2变体蛋白的动力学分析
如美国专利8,129,162中所描述，将大肠杆菌菌株Bw25113（ΔilvC）用于表达来自二次HTS筛选的107个变体和阳性对照K9SB2。将来自存档平板的克隆接种到96深孔平板。各孔包含3.0μl来自融化的存档平板的细胞、200μlLB培养基，其包含100μg/ml氨苄青霉素和0.02%（w/v）阿拉伯糖作为诱导物。将细胞在37℃下以80%的湿度进行过夜振荡（900rpm）生长，通过离心进行收集（4000rpm，4℃下7分钟）（75004251，ThermoScientific，Rockford，IL）并将细胞团块储存于-80℃以用于后期分析。
与此同时，在室温下融解深孔板内的冷冻细胞团块30分钟。向各孔内加入75μl50%的BugBuster（Novagen71456，Darmstadt，Germany）（v/v，处于水中），并且使用平板振荡器悬浮细胞。在室温下孵育50%Bug Buster中的细胞悬液30分钟，其后在60℃下进行15分钟孵育。通过离心（4000rpm，4℃下15分钟）（75004251，Thermo Scientific，Rockford，IL）沉淀细胞碎片和变性的热易感性蛋白，并将75μL的上清液转移至平底96-孔平板（Corning，3370，Corning，NY）并以75μL100mMHEPES（pH6.8），100mMKCl，10mMMgCl2稀释二倍。
通过使用Bradford测定法以Coomaisse Plus（Thermo Scientific，23238，Rockford，IL）测定总蛋白。使用BSA作为标准物。蛋白质的浓度通过使用Cary 300分光光度计（Agilent Technologies，Wilmington，DE）测定595nm下的吸光度而测量。
为测定NADP和NADPH的Vmax和KM值，在多个浓度的NADH（20、30、40、60、80、120、200和300μM）和NADPH（60、80、120、200、300和400μM）下测定部分纯化的蛋白质。在30℃下100mMHEPES（pH6.8），10mMMgCl2，100mMKCl和4.8mMR/S-乙酰乳酸中实施测定法。向该测定中加入0.005至0.015mg/mL的总蛋白。通过使用Spectramax384Plus酶标仪（MolecularDevices，Sunnyvale，CA）在340nm下监测NAD（P）H的氧化来测量S-乙酰乳酸向DHIV转化的速率。使用6220M-1cm-1的摩尔消光系数来计算活性。通过将比活性（U/mg）对辅因子浓度进行作图并使用Kaleidagraph软件（Synergy，Reading，PA）将该数据对米氏方程进行拟合来计算Vmax和Km值。
表27：通过NAD（P）H消耗测定法测定的部分纯化的K9SB2的动 力学数值
Figure BDA0000419940220001611
Figure BDA0000419940220001621
Figure BDA0000419940220001631
实例22
菌株PNY2259的构建
本实例的目的在于描述用于在PNY2238中的adh1Δ基因座以kivD_Lg（y）替换kivD_Ll（y）的染色体拷贝的构建体的组装。
所述缺失/整合通过与PCR产物的同源性重组生成，所述PCR产物包含靶区域上游和下游同源性区以及用于转化子选择的URA3基因。所述URA3基因通过同源性重组去除以生成无痕的缺失/整合。用于整合kivD_Lg（y）的质粒来自经构建用于将UAS（PGK1）P[FBA1]-kivD_Ll（y）整合进入啤酒糖酵母的ADH1基因座的质粒。用于将UAS（PGK1）P[FBA1]-kivD_Ll（y）整合进入ADH1基因座的质粒的构建在下文描述。该质粒在pUC19-URA3MCS中构建。
ADH1缺失/UAS（PGK1）P[FBA1]-kivD_Ll（y）整合质粒的构建
使用pLH468（SEQ ID NO:139）作为模板，以包含PmeI限制性位点的引物oBP562（SEQ ID NO:197）以及包含与ADH1片段B的5'端具有同源性的5'尾的引物oBP563（SEQ ID NO:198）来扩增针对啤酒糖酵母中的表达进行了密码子优化的来自乳酸乳球菌的kivD编码区。通过啤酒糖酵母CEN.PK113-7D基因组DNA使用包含与kivD_Ll（y）的3'端具有同源性的5'尾的引物oBP564（SEQ ID NO:199）和包含FseI限制性位点的引物oBP565（SEQ ID NO:200）来扩增ADH1片段B。用PCR纯化试剂盒（Qiagen；Valencia，CA）纯化PCR产物。kivD_Ll（y）-ADH1片段B通过重叠PCR生成，通过混合kivD_Ll（y）和ADH1片段BPCR产物并用引物oBP562（SEQ ID NO:197）和oBP565（SEQ ID NO:200）扩增。所得到的聚合酶链反应产物用PmeI和FseI消化，用T4DNA连接酶连到用适合的酶消化过的pUC19-URA3MCS的对应的位点上。通过基因组DNA中使用包含SacI限制性位点的引物oBP505（SEQ ID NO:201）和包含AscI限制性位点的引物oBP506（SEQ ID NO:202）扩增ADH1片段A。ADH1片段A的PCR产物用SacI和AscI消化并用T4DNA连接酶连接到包含kivD_Ll（y）-ADH1片段B的质粒的相应位点中。ADH1片段C从基因组DNA中进行扩增，使用的引物为oBP507（SEQ ID NO:203），其包含PacI限制性位点，和引物oBP508（SEQ ID NO:204），其包含SalI限制性位点。ADH1片段CPCR产物用PacI和SalI消化并用T4DNA连接酶连接到包含ADH1片段A-kivD_Ll（y）-ADH1片段B的质粒的相应位点中。通过载体pRS316-UAS（PGK1）-PFBA1-GUS（SEQIDNO:406）使用包含AscI限制性位点的引物oBP674（SEQ ID NO:205）和包含PmeI限制性位点的引物oBP675（SEQ ID NO:206）来扩增杂合启动子UAS（PGK1）-PFBA1。用PacI和SalI消化了UAS（PGK1）-PFBA1PCR产物，并用T4DNA连接酶连接至包含kivD_Ll（y）-ADH1片段ABC的质粒的相应位点以产生pBP1181。
pBP1716和pBP1719的构建
从ADH1缺失/UAS（PGK1）P[FBA1]-kivD_Ll（y）整合质粒pBP1181中去除kivD_Ll（y）。使用PmeI和FseI消化该质粒，并且在琼脂糖凝胶上并继之以凝胶提取试剂盒（Qiagen）来纯化大DNA片段。从pBP1181中使用包含PmeI限制性位点的引物oBP821（SEQ ID NO:407）和包含FseI限制性位点的引物oBP484（SEQ ID NO:408）扩增ADH1片段B。ADH1片段B的PCR产物用PmeI和FseI消化，用T4DNA连接酶连到经凝胶纯化的大DNA片段的对应的位点上。将对应于3'500bp的kivD_Ll（y）的PCR片段克隆进入所得的载体以用于kivD_Ll（y）在PNY1528中的靶向删除。从pBP1181中使用包含NotI限制性位点的引物oBP822（SEQ ID NO:409）和包含PacI限制性位点的oBP823（SEQ IDNO:410）扩增该片段。使用NotI和pacI消化该片段并使用T4DNA连接酶连接进入上文具有kivD_Ll（y）缺失的质粒在经适当的限制性酶消化后的URA3下游对应位点中。所得质粒命名为pBP1716。
来自格氏李斯特菌针对啤酒糖酵母中的表达进行了密码子优化的kivD编码区（SEQ ID NO:411）kivD_Lg（y）由DNA2.0（Menlo Park，CA）合成。使用包含PmeI限制性位点的引物oBP828（SEQ ID NO:412）和包含PmeI限制性位点的oBP829（SEQ ID NO:413）扩增kivD_Lg（y）。所得到的PCR产物用PmeI消化，并用T4DNA连接酶连到用适合的酶消化过的pBP1716中的对应的位点上。使用引物FBAp-F（SEQ ID NO:414）和oBP829（SEQ ID NO:413）通过PCR来检查所克隆基因的朝向。具有正确朝向的kivD_Lg（y）分离株命名为pBP1719。
菌株PNY2259的构建
kivD_Ll（y）缺失/kivD_Lg（y）整合盒通过pBP1719使用引物oBP505（SEQ ID NO:201）和oBP823（SEQ ID NO:410）进行扩增。制备了PNY2238的感受态细胞，并使用Frozen-EZ Yeast Transformation II试剂盒（Zymo Research；Orange，CA）以PCR产物转化了感受态细胞。在30C将转化混合物置于缺乏尿嘧啶的合成完全培养基上，所述培养基补充有1%的乙醇。使用引物Ura3-endF（SEQ ID NO:222）和HY-50（SEQ IDNO:415）通过PCR（JumpStart（TM）REDTaq（c）ReadyMix（TM））来筛选转化子菌株。转化子生长在YEP（1%乙醇）并在30℃接种到辅以1%的乙醇的，并包含5-氟-乳清酸（0.1%）的合成完全培养基上，以选择失去了URA3标记的分离物。使用引物HY-50和oBP834（SEQ ID NO:416）通过PCR证实kivD_Ll（y）的缺失和kivD_Lg（y）的整合。在与PNY2238相同的基因座上包含kivD_Lg（y）并且通过相同的启动子表达的一个正确的分离株被命名为PNY2259。
实例23
用于鉴定具有对NADH的辅因子偏好的变体的两个位点饱和基因文库 的构建
在实例4中使用了具有简并性密码子NNK（N为全部四种核苷酸A、C、G和T，而K代表了G和T）的引物。在本实例中，使用了包含编码K9KARI的第53、56和58位的各种氨基酸变化（A、C、D、E、F、G、H、I、L、M、N、P、Q、V、W或Y）的引物的引物混合物，并且将向S、T、K和R的替换排除在外，因为其对这些位点是非优选的。靶向于K9KARI的三个NADPH磷酸根结合位点（第53、56和58位）的饱和文库的大小为4,096个（与实例4中使用NNK简并性密码引物的32×32×32或32,768个变体呈对比）。
一种文库构建方法是从第58位开始。首先通过混合靶向于相同位点的全部引物来制备引物混合物（例如，引物混合物K9_53f是通过混合等摩尔的靶向于第53位的全部16种正向引物（列于下表中）而制备的）。类似地制备了K9_56f和K9_58f。共用的引物为K9_191G_112210r（SEQID NO:174）：GGTTTCAGTTTCGCCTCTGAAGGTAGTTTC（本实例中称为SR）。首先通过PCR将第58位的突变引入AS6F1。诱变工序与实例4中描述的类似。简而言之，K9_58f和SR受到磷酸化。随后直接使用磷酸化的引物将突变引入AS6F1的第58位，使用USBChange_It试剂盒（USB Corporation，Cleveland，OH，78480）进行。使用DpnI去除模板。将经清理的PCR产物（Zymo DNA Clean & Concentrator-5；ZymoResearch Corporation，Irvine，CA，目录号D4003）转化进入KOBW-3a细胞。在37℃培养箱内在LB琼脂平板上过夜生长后，收集全部细胞并使用Qiaprep Spin miniprep试剂盒（Qiagen Inc.Valencia，CA，目录号27106）提取DNA。
随后使用所提取的DNA作为模板以与第58位的诱变相同的K9_56f和SR向第56位引入突变。最终类似地引入在第53位的突变。在将全部三个位置（53、56和58）的突变引入AS6F1后，新的文库以实例4中所描述相同的方式进行筛选，某些选定的突变体列于下表。
另一种方法从第53位开始。使用下表中列出的引物类似地制备引物混合物K9_56r和K9_58r。共用的正向引物是pBAD_266f：CTCTCTACTGTTTCTCCATACCCG（SEQ ID NO:634；在本实例中称为SF）。首先通过PCR将第53位的突变引入AS6F1。诱变工序与上文描述的类似，其使用AS6F1作为模板以及K9_53f和SR作为两个PCR引物。所得的突变DNA（第53位）用作为模板，并且K9_56r和SF用作为诱变引物来向第56位引入突变。最后，使用K9_58r和SF类似地引入第58位的突变。在将全部三个位置（53、56和58）的突变引入AS6F1后，新的文库以与上文描述相同的方式进行筛选，某些选定的突变体列于下表。
表28：正向突变引物
Figure BDA0000419940220001681
表29：正向突变引物
Figure BDA0000419940220001691
表30：某些突变体与其测得的K M 值的列表
Figure BDA0000419940220001701
实例24
ald6Δ菌株和异丁醇生产型衍生物的构建
来自pRS426::GPD-xpk1+ADH-eutD（SEQ ID NO:383）的5.3kb（BglII/EcoRV）的DNA片段（包含用于植物乳杆菌的xpk1和eutD基因的表达盒）被加入至ALD6侧接序列之间，上文实例9中描述的pUC19::ald6D::loxP-URA3-loxP载体的SnaBI位点处。将连接反应物转化进入大肠杆菌Stbl3细胞，将其在LBAmp平板上孵育以选择转化子。通过PCR（引物）证实了xpk1-eutD盒的插入。获得了阳性克隆（pUC19::Δald6::URA3::xpkS）。
使用AhdI对上文描述的载体线性化，并将其转化进入PNY1507（本文描述）细胞，该转化使用了Zymo Research Frozen-EZ YeastTransformation试剂盒（目录号T2001），对制造商的规程进行了如下改动：包括了在2.0mLYPE（酵母提取物，蛋白胨，具有1%乙醇）培养基中进行额外2.5小时的外生孵育（outgrowth incubation）。通过在提供1%的乙醇作为碳源的尿嘧啶缺失合成完全培养基上涂平板来获得转化子。通过使用引物N1090和N1213（SEQ ID NO:779和242）以PCR筛选点覆的转化子来证实该缺失/整合。使用组氨酸标记选择将携带Cre重组酶（pRS423::GAL1p-Cre；SEQ ID NO:271）的质粒转化进入所述菌株。在补充有0.5%半乳糖的YPE上对转化子进行传代。针对5-FOA抗性（URA3标记的丧失）和组氨酸营养缺陷型（Cre质粒的丧失）来筛选菌落。使用引物N1212和N1214（SEQ ID NO:241和281）通过PCR来证实通过侧接loxP位点对URA3基因的适当去除。最后，使用包括的遗传霉素选择标记将alsS整合质粒（SEQ ID NO:780）转化到这个菌株中。使用引物N160SeqF5和oBP512（SEQ ID NO:388和337）证实整合子。
通过乙酸锂转化（“Methods in Yeast Genetics”2005.Amberg，Burke与Strathern中的规程2）将质粒pYZ090ΔalsS和pBP915（SEQ ID NO:371和182）转化进入该菌株。通过在提供的组氨酸与尿嘧啶缺失合成完全培养基（以乙醇作为碳源）上涂平板来选择转化子。点覆转化子并再点覆于组氨酸与尿嘧啶缺失合成完全培养基（具有2%葡萄糖和0.05%乙醇）。针对生长和异丁醇生产评估了六个克隆。这些克隆之一命名为PNY2216。
实例25
从啤酒糖酵母菌株PNY2211中对YMR226c的删除（PNY2248的构 建）
通过使用经PCR扩增的线型KanMX4基缺失盒（可获自于啤酒糖酵母菌株BY4743ymr226cΔ::KanMX4（ATCC4020812）中）进行的同源重组来从啤酒糖酵母菌株PNY2211（实例9中描述）中删除基因YMR226c。正向和反向PCR引物N1237（SEQ ID NO:784）和N1238（SEQ ID NO:785）从XIII染色体中扩增了2,051bp的ymr226cΔ::KanMX4deletion盒。PCR产物包含上游和下游序列（分别为253和217bp），侧接有ymr226cΔ::KanMX4缺失盒，其与侧接于菌株PNY2211中的YMR226c基因座的序列具有100%的同源性。在侧接的同源序列处发生了重组和基因交换，其有效地删除了YMR226c基因并整合了ymr226cΔ::KanMX4缺失盒。
将大约2.0μg的PCR扩增产物转化进入菌株PNY2211，其使用乙酸锂方法制成感受态，该方法此前描述于Methods in Yeast Genetics（ColdSpring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，pp.201-202（2005）），并且将所述转化混合物在添加遗传霉素（50μg/mL）的YPE上涂平板并在30℃下孵育以选择具有整合的ymr226cΔ::KanMX4盒的细胞。通过PCR针对ymr226cΔ::KanMX4来筛选所述转化子，其使用5'外向KanMX4缺失盒特异性内部引物N1240（SEQ ID NO:786）与侧接的内向染色体特异性引物N1239（SEQ ID NO:243）配对，以及3'外向KanMX4缺失盒特异性引物N1241（SEQ ID NO:787）与侧接的内向染色体特异性引物N1242（SEQ ID NO:244）配对。获得了阳性的PNY2211ymr226cΔ::KanMX4克隆，其中之一命名为PNY2248。
实例26
在YMR226c敲除株中具有降低的DHMB收率的异丁醇生产
PNY2211ymr226cΔ::KanMX4转化子和非缺失对照（具有天然YMR226c的PNY2211）针对在葡萄糖培养基中的丁醇生产进行了测试，其通过首先通过快捷粗糙式（Quick and Dirty）乙酸锂转化方法同步引入包含异丁醇途径的质粒pYZ090ΔalsS（SEQ ID NO:371）和pBP915（SEQID NO:182）中，所述方法描述于Methods in Yeast Genetics（Cold SpringHarbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY（2005））之中。质粒选择是基于包含乙醇的选择平板（合成完全培养基，具有1.0%乙醇，-his-ura）上的组氨酸和尿嘧啶营养缺陷型的。在三至五天后，通过点覆于SD2.0%葡萄糖+0.05%乙醇上来使表现出最强劲的生长的数种转化子适应葡萄糖培养基，并在300℃下孵育48至72小时。在125mL通风烧瓶中将表现出最强劲的生长的三组划线用于接种10mL的种培养物（处于SD0.2%葡萄糖+0.2%乙醇-his-ura中）并在30℃，250rpm下培养约24小时。随后在125mL密封盖的烧瓶中将细胞继代培养于合成完全培养基（2%葡萄糖+0.05%乙醇–his–ura）中并在30℃下孵育48小时。通过HPLC分析在接种后收集的和接种48小时后收集的培养物上清液来测定异丁醇生产，并且通过LC/MS来定量DHMB。对照菌株据观测以0.03至0.07摩尔/摩尔葡萄糖的摩尔收率产生DHMB。在ymr226cΔ的培养物上清液中未观测到对应于DHMB的峰，所述菌株之一命名为PNY2249。
实例27
使用酵母敲除文库对编码乙酰乳酸还原酶（ALR）活性的基因的鉴 定。
通过来自于菌株BY4743（可获自Open（Thermo FisherScientific的分支，Waltham，MA））的>6000种酵母菌株的敲除（“KO”）收集物，选择了95个候选脱氢酶基因敲除菌株。在96孔深孔平板（Costar 3960，Corning Inc.，CorningNY，或类似品）中将敲除菌株的起始培养物生长于丰富培养基YPD，并且以～0.3的OD600nm将起始继代培养于包含0.67%酵母氮基、0.1%酪蛋白氨基酸、2%葡萄糖和0.1MK+-MES，pH5.5的培养基中。在5天期间取样用于DHMB和DHIV测量。在Waters（Milford，MA）AcquityTQD系统上使用AtlantisT3（货号186003539）色谱柱通过液相色谱-质谱法（“LC/MS”）对DHIV和DHMB的两种异构体进行分离和定量。柱温维持在30℃并且流速为0.5mL/分钟。所述A流动相为0.1%甲酸水0.溶液，以及B流动相为0.1%甲酸乙腈溶液。每次运行由99%的A下1分钟、1分钟中达到25%的B的线性梯度并继之以99%的A下1分钟组成。通过WatersACQ_TQD（s/nQBA688）质谱检测器以进样锥电压32.5V针对m/z=133（阴性ESI）的峰来监测该柱流出物。所谓的“快DHMB”通常在1.10分钟处出现，随后是1.2分钟处的DHIV，并且1.75分钟处出现“慢”DHMB。获得了基线分离并且以由1M水储液制备的标准溶液的分析作为参考将DHIV的峰面积转换为μMDHIV浓度。这些测量显示，DHMB水平中的大部分变化在最初的48-60小时中发生，因此在随后的实验中在大致这一时间处采集单一样品。在本实验中，快DHMB据发现水平远高于并非总是可检测的慢DHMB。多数培养物中的DHIV与快DHMB比率为～3，但是缺乏YMR226C基因的菌株稳定地表现出极低水平的快DHMB以及正常的DHIV，从而使DHIV/快DHMB比率为约100。这提示YMR226Cp是这一背景中的主要ALR。
为证实YMR226Cp是这一背景中的主要ALR，在ymr226c缺失菌株（美国典型培养物保藏中心（ATCC），ManassasVA，ATCC4020812）及其亲本BY4743（ATCC 201390；美国典型培养物保藏中心，ManassasVA）中测试了ALR和KARI的体外水平。通过YPD琼脂平板接种包含6mL YPD的50mL管并使其生长过夜（30℃，250rpm）。沉淀细胞，在水中洗涤一次并且重悬浮于1mL的酵母细胞质缓冲液中（Van Eunen等人，FEBS Journal 277:749-760（2010）），其包含酵母蛋白酶抑制剂混合物（Roche，Basel，Switzerland，目录号11836170001，来自销售商不加处理直接使用，1片/10mL缓冲液）。加入甲苯（0.02mL，Fisher Scientific，Fair LawnNJ），并在Vortex Genie2振荡器（Scientific Industries，Bohemia NY，Model G-560）上以最大速度振荡该管10分钟以进行增透化。将该管置于30℃下的水浴中，以如下终浓度加入底物：（S）-乙酰乳酸（如下文实例29中所描述进行酶促制备）为9.4mM，NADPH（Sigma-Aldrich，St.LouisMO）0.2mM加上NAD（P）H-再生系统，其由～10mM葡糖-6-磷酸和2.5U/ml肠膜明串珠菌葡糖-6-磷酸脱氢酶（Sigma，St.Louis，MO，目录号G8404）组成。在时间间隔中，将等分试样（0.15mL）加至2%甲酸的0.15mL等分试中以终止反应。随后如上所述通过LC/MS针对DHIV和的DHMB两种异构体来分析该样品；仅仅观测到快DHMB和DHIV。两种菌株中的两种酶的比活性在表31中示出。
表31：KARI和ALR的酶活性
菌株 KARI ALR
BY4743 1.7mU/mg蛋白质 20mU/mg
YMR226C缺失菌株 2.2mU/mg蛋白质 0.1mU/mg
该数据提示，YMR226C基因产物占ALR活性的>99%。
实例28
使用酵母过表达文库对编码乙酰乳酸还原酶（ALR）活性的基因的鉴 定。
通过>5000种Y258转化子（各具有携带已知酵母基因加C末端标签，其处于诱导型启动子控制之下）的“酵母ORF”收集物（（Open
Figure BDA0000419940220001741
，Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA的分支），将九十六种菌株（具有包含与脱氢酶活性相关的基因的质粒）生长于96孔模式，通过将销售商（Open
Figure BDA0000419940220001751
）推荐的生长和诱导规程加以适应性调整而进行。如上描述沉淀所述细胞并使用甲苯进行增透化，并将浓缩的底物混合物加入以给出实例27中的最终浓度。收取计时样品并针对DHIV和DHMB的两种异构体进行分析。计算ALR/KARI比率并进行比较。具有提高比率的菌株是过量生产ALR活性的候选物。当快DHMB和DHIV形成的相对速率的数据在
Figure BDA0000419940220001752
（Microsoft Inc.，Redmond，WA）箱线图中展示时，一半比率处于～9-13，并且其余中的大多数处于3与19之间。鉴定为异常值的例外包括YER081W、YIL074C、YMR226C、YBR006W和YOR375C，对于这些而言ALR/KARI的比率处于22与40之间。在对慢DHMB和DHIV形成的相对速率进行的类似分析中，一般的比率处于9与11之间，但是YMR226C、YPL275W、YER081W和YOL059W表现为异常值，比率介于13约25之间。因此，YMR226C和YER081W的过表达提高了全部两种DHMB的合成。此外，YIL074C、YBR006W和YOR375C提高了快DHMB的合成，并且YPL275W和YOL059W提高了慢DHMB的合成。在过表达中鉴定的基因组DNA序列（其可能包括内含子）和基因的ORF翻译序列在表6中提供。
实例29
DHMB对KARI的抑制
（S）-乙酰乳酸的酶促生产
（S）-乙酰乳酸被用作为DHMB合成的起始物质。（S）-乙酰乳酸如下进行酶促制备。经改动以在IPTG控制下表达克雷伯氏菌属BudB（此前描述于美国专利7,851,188，该文献全文以引用方式并入本文；参见该专利的实例9）的大肠杆菌TOP10菌株（Invitrogen，Carlsbad，CA）作为酶的来源使用。其以200-1000mL培养体积生长。例如，在0.5L锥形烧瓶中将200mL生长于包含0.1mg/ml氨苄青霉素（Sigma，St.Louis，MO）的Luria液体培养基（Mediatech，Manassas，VA）中，其在37℃下以250rpm振荡。在OD600～0.4下，加入0.4mM的异丙基硫代半乳糖苷（Sigma，St.Louis，MO）并在通过离心收集细胞前继续生长2小时，产生了～1g的湿重细胞。同样，在～0.5至5g湿细胞的规模下进行了部分纯化。例如，将～0.5g细胞悬浮于包含25mMNa-MESpH6的2.5mL缓冲液中，在0℃下超声破碎并且通过离心加以澄清。粗提物补充以0.1mM的硫胺素焦磷酸盐、10mM MgCl2和1mMEDTA（全部来自于Sigma，St.Louis，MO）。下一步，加入0.07mL的10%w/v硫酸链霉素水溶液（Sigma，St.Louis，MO）并将该样品在56℃水浴中加热20分钟。通过离心对其澄清，并且加入硫酸铵至50%的饱和度。离心所述混合物，并将团块加入0.5mL25mMNa-MES，pH6.2，并且不加进一步表征而进行使用。还在不同规模下进行了乙酰乳酸合成。如下进行大型制备：将5.5g丙酮酸钠溶解于25mMNa-MES，pH6.2中直至～45mL，并且补充以10mM MgCl2、1mM硫胺素焦磷酸盐、1mM EDTA（全部来自Sigma，St.Louis，MO）、25mM乙酸钠（Fisher Scientific，Fair LawnNJ）以及0.25mL的BudB制备物。在pH计下在室温下搅拌该混合物。随着反应进行，生成了CO2并且pH升高。通过蠕动泵缓慢加入丙酮酸（Alfa，Ward Hill，MA）以保持pH介于6和7之间。随着pH升高，该酶反应放缓，但是如果使其下降低于6，则乙酰乳酸的脱羧化成为了问题。当所述反应完成时，将该混合物储存于-80℃下。
DHMB的合成
DHMB通过（S）-乙酰乳酸进行化学合成。pH～8下～0.8M的3mL粗制乙酰乳酸制备物使用1.2当量的NaBH4（Aldrich Chemical Co，Milwaukee，WI）加以处理。将该反应置于室温下过夜，随后一分为二并在60cm×1cm直径的BiogelP-2柱上（Bio-Rad，Hercules，CA）使用水为流动相以两样份进行脱盐。包含混合的DHMB的级分通过旋转蒸发进行浓缩并使用硫酸调节至pH2.2。
DHMB的非对映体使用具有Waters Atlantis T3（5um，4.6×150mm）的HPLC系统（由LKB2249泵和梯度控制器（LKB，现为General Electric的分支，Chalfont St Giles，UK）和Hewlett-Packard（现为Agilent，SantaClara，CA）1040AUV/可见光检测器）组成）进行分离，其在室温下在0.2%的甲酸水溶液（pH2.5）中以0.3mL/分钟的流速运行，在215nm下进行UV检测。“快”DHMB在8.1分钟洗脱，并且“慢”DHMB在13.7分钟洗脱。DHIV并不存在。收取汇合的级分接近干燥，并与甲苯进行共蒸发以除去残余甲酸。随后将剩余物溶解于水中并使用三乙基胺（Fisher，Fair Lawn，NJ）使其呈碱性。
DHMB的浓度测定和绝对结构
纯化的DHMB溶液的浓度如下进行测定。根据NaBH4还原中使用的mmol乙酰乳酸估测浓度。向DHMB的样份中加入已知量的苯甲酸钠（通过将固体苯甲酸（ACSgrade，Fisher Scientific，Fair Lawn，NJ）溶于NaOH水溶液而制备）以给出（大致）等摩尔量的双组分混合物。还通过经定制合成（Albany Molecular Research，AlbanyNY）而获得的固体钠盐来制备DHIV的类似样品。所述样品与D2O（Aldrich，Milwaukee，WI）进行数次共蒸发，并且重溶解于D2O中。获得了积分质子NMR谱图并将其用于测定DHIV或DHMB与苯甲酸盐的摩尔比。DHMB的NMR谱图与CDCl3的三种游离酸的文献谱图（Kaneko等人，Phytochemistry39:115-120（1995））的比较显示快DHMB是赤型异构体。由于酶促合成的乙酰乳酸在C-2处具有（S）构型，因此快DHMB具有2S,3S构型。慢DHMB具有苏式2S,3R构型。
还使用独立制备的苯甲酸溶液作为标准物通过LC/MS分析了NMR样品的稀释物。在Waters（Milford，MA）AcquityTQD系统上使用AtlantisT3（货号186003539）色谱柱通过LC/MS对苯甲酸、DHIV和DHMB的两种异构体进行分离和定量，如上文描述。在m/z=121（阴性ESI）下检测到苯甲酸，并且其在2.05分钟出现。混合物中的苯甲酸盐浓度处于预期值的实验性不确定性内。本实验还显示，DHMB的两种异构体之一在该设备的整个反应范围中具有～80%的DHIV的LC/MS内敏感度（即，观测的MS峰/nmol注射量）。因此，如果使用DHIV标准物来定量在细胞提取物或酶促反应中存在的DHMB，那么表观DHMB浓度需要乘以1.25。
对DHMB抑制KARI的测量
由来自乳酸乳球菌（SEQ ID NO:864）的基因、称为JEA1荧光假单胞菌KARI的衍生物的基因（SEQ ID NO:799；美国申请公布2010/0197519，该文献全文以引用方式并入本文）或称为K9D3的粪厌氧棒状菌KARI的变体的基因（SEQ ID NO:788）所编码的经纯化的KARI针对其对于DHMB抑制的敏感性受到了测试，其在具有TCC240A温控装置（设定于30℃）的Shimadzu（Kyoto，Japan）UV160U设备中以分光光度曲线测定法进行。缓冲液为0.1MK+Hepes，pH6.8，其包含10mMMgCl2和1mMEDTA。NADPH为0.2mM，并且外消旋的乙酰乳酸为3mM或者0.725mM的（S）异构体。测量了在快或慢DHMB存在或不存在的情况下进行的NADPH氧化。各样品的Vmax通过观测的速率和已知的乙酰乳酸KM使用米氏方程来计算。对在DHMB存在的情况下使用米氏方程对各测量值估测了容积Ki，该方程针对竞争性抑制对乙酰乳酸加以改进（米氏方程中的KM项乘以（1+[I]/Ki），并且对Ki解该方程）。完成NMR实验后将结果转换成为mM并在表32中示出。
表32：DHMB异构体抑制KARI的K I 值
菌株 快DHMB 慢DHMB
JEA1 0.23mM 0.23mM
K9D3 0.3mM 0.2mM
乳酸乳球菌 2.8mM 2.3mM
实例30
DHMB对DHAD的抑制
针对DHMB对二羟基异戊酸（DHIV）向2-酮异戊酸（2-KIV）的转化的抑制测试了来自变异链球菌的纯化二羟酸脱水酶（DHAD），其通过使用对比色测定（如Szamosi等人，Plant Phys.101:999-1004（1993）所描述）的改进而进行。该测定法在2mLEppendorf管中进行，该管置于维持于30℃下的加热块中。该测定混合物均匀0.8mL的最终体积，其包含100mM Hepes-KOH缓冲液（pH6.8）、10mMMgCl2、0.5-10mMDHIV、0-40mMDHMB和18μgDHAD。通过加入10×底物浓储液来起始所述测定。在0.1和30分钟的时间移取样品（0.35mL），并通过在第二个Eppendorf管中混合进入具有0.05%的2,4-二硝基苯肼（Aldrich）的0.35mL0.1NHCl来终止该反应。在室温下孵育30分钟后，将0.35mL的4NNaOH加入该混合物，进行混合并在离心机（Beckman-CoulterMicrofuge18）中以15,000×G离心2分钟。随后在1cm路长的比色皿中使用Cary300BioUV-可见光分光光度计（Varian）来测量该溶液在540nm下的吸光度。根据使用可靠2-KIV（Fluka）所得的标准曲线，0.28mM2-KIV产生了540nm下的1OD吸光度。测量了在快或慢DHMB存在或不存在的情况下进行的2-KIV形成。两种形式的DHMB均表现为对DHIV的类似竞争性抑制剂。它们的抑制常数（Ki）通过用于简单竞争性抑制的米氏方程加以计算：v=S*Vmax/（S+KM*（1+I/Ki）），其中v是2-KIV形成的测得速率，S是DHIV的初始浓度，Vmax是通过10mMDHIV和无DHMB下的观测速率而计算的最大速率，KM是此前测量的0.5mM的常数，而I是DHMB的浓度。DHMB的快异构体和慢异构体分别具有7mM和5mM的计算抑制常数。
实例31
YMR226C同源物的鉴定
通过对GenBank非冗余核苷酸数据库的BLAST搜索（blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）、Saccharomyces Genome Database中的Fungal Genomes BLAST Search Tool（www.yeastgenome.org/cgi-bin/blast-fungal.pl）以及Genolevures Project的BLASTTool（genolevures.org/blast.html#）来搜寻啤酒糖酵母的YMR226C基因。鉴定出了与YMR226C具有高度序列同一性的来自18个酵母菌种的独特序列，并通过相关数据库的获取记录收取了这些基因的完整ORF。通过VectorNTI（Invitrogen，CarlsbadCA）的翻译功能来测定这些ORF编码的多肽序列。下文在表33中示出了所述多核苷酸和多肽的序列。该表中给出了酵母菌种、核苷酸数据库获取编号以及DNA和蛋白质序列。克鲁维糖酵母（S.kluyveri）序列以给出的获取编号处于Genolevures数据库内，其它的处于GenBank中。所述序列之间的百分比同一性在表34中示出。
使用AlignX（VectorNTI；编码来自粗糙脉孢菌的推定NADP+-依赖型脱氢酶（XM_957621，使用YMR226C的核苷酸序列在GenBankBLAST搜索中鉴定出）作为外类群（outgroup）使用）比对了18个ORF。所得的系统发育树在图11中示出，而序列比对在图12中示出。
这些同源物与YMR226C的序列同一性介于最小值55%（解脂耶氏酵母和粟酒裂殖酵母）与最大值90%（奇异酵母（S.paradoxus））之间。BLAST搜索还显示了在484个碱基对上具有92%的序列同一性的来自巴氏酵母（S.pastorianus）的cDNA（登录号CJ997537），但是由于这一菌种是贝酵母（S.bayanus）（其YMR226C同源物与啤酒糖酵母序列表现出82%同一性）之间的杂交种，并且由于仅仅可获得部分ORF序列，因此这一序列并未包括于该比较中。当来自标准实验室菌株S288C的YMR226C序列与来自啤酒糖酵母的12种其它菌株的序列进行比较时，仅仅发现了4个单核苷酸多态性（序列同一性为99.5%），这显示其在该菌种中是高度保守的基因。
表33：YMR226C酵母同源物
Figure BDA0000419940220001801
Figure BDA0000419940220001811
表34：YMR226C同源物的百分比同一性
物种 Sm Sb Sca Ag Dh Ss Mg Cd Cg Vp Sk Kl Lt Zr Sce Sp Yl Nc
Spa 88 82 70 64 62 62 58 57 67 68 68 69 68 68 90 55 55 56
Sm 82 70 64 60 62 58 56 67 69 68 70 68 69 86 57 56 57
Sb 71 63 59 62 58 53 67 66 68 70 69 67 82 56 56 58
Sca 60 62 61 60 59 65 69 69 71 64 70 69 57 53 54
Ag 56 60 57 54 59 61 62 62 62 62 63 54 55 55
Dh 64 62 61 61 63 62 61 59 63 62 57 57 53
Ss 68 64 61 62 62 64 62 63 62 56 58 58
Mg 60 57 58 60 60 59 62 59 57 57 56
Cd 57 62 59 60 54 60 58 57 53 49
Cg 69 70 68 67 67 66 55 56 55
Vp 71 72 67 70 71 58 52 51
Sk 77 71 72 69 53 54 54
Kl 71 72 71 56 52 54
Lt 69 69 53 60 58
Zr 69 58 55 55
Sce 55 55 56
Spo 58 60
Yl 61
Nc
表34关键词：奇异酵母（“Spa”）；Saccharomyces mikatae（“Sm”）；贝酵母（“Sb”）；芽殖酵母（“Sca”）；棉阿舒囊霉（“Ag”）；汉逊德巴利酵母（“Dh”）；木糖发酵酵母（“Ss”）；Meyerozyma guilliermondii（“Mg”）；都柏林假丝酵母（“Cd”）；光滑假丝酵母（“Cg”）；Vanderwaltozyma polyspora（“Vp”）；Saccharomyces kluyveri（“Sk”）；Kluyveromyces lactis（“Kl”）；Lachancea thermotolerans（“Lt”）；Zygosaccharomyces rouxii（“Zr”）；啤酒糖酵母（“Sce”）；粟酒裂殖酵母（“Spo”）；解脂耶氏酵母（“Yl”）；粗糙脉孢菌（“Nc”）
实例32（假想例）
针对将异丁醛向异丁酸的转化使用酶测定法对来自啤酒糖酵母的醛脱 氢酶的筛选
本实例展示了用于测定来自啤酒糖酵母的哪种醛脱氢酶可将异丁醛向异丁酸进行酶促转化。
在已知的全脱氢酶中包括个体破坏的啤酒糖酵母菌株获自ATCC：BY4741Δald2::kanMX4（ATCC 4000753）；BY4741 Δald3::kanMX4（ATCC4000752）；BY4741 Δald4::kanMX4（ATCC4001671）；BY4741Δald5::kanMX4（ATCC4000213）；以及BY4741 Δald6::kanMX4（ATCC4002767）。
上文的缺失菌株首先在包含5mLYPD培养基的管内在30℃下过夜生长。将所述5mL过夜培养物转移至500ml烧瓶中的100ml培养基内并在30℃下以220rpm振荡孵育。当培养物在600nm达到1至2O.D.时对它们进行收集。样品用10ml的20mMTris（pH7.5）洗涤，然后重悬于1ml的相同Tris缓冲液中。样品被转入包含0.1mm二氧化硅（Lysing MatrixB，MPbiomedicals）的2.0ml管中。然后在珠磨式研磨器（BIO101）中破碎细胞。在微量离心机中于4℃以13,000rpm离心30分钟，收集上清液。典型地，0.06至0.1mg的粗提蛋白质被用于单次分析中。粗提物中的蛋白质通过考马斯亮蓝染色用布拉德福德法测定。
醛脱氢酶活性根据Sigma-Aldrich和Bostian与Betts（Bostian，K.A.与Betts，G.F.（1978）Biochemical Journal173，773-786）所给出的规程进行测量。使用这一方法测试了来自上文缺失菌株的粗提物和可商购获得的醛脱氢酶。
替代性的测定法是在密封玻璃GC瓶中将浓度1至30mM的异丁醛加入约0.1mg的粗提物蛋白质中，将其在30℃下孵育30分钟。随后通过0.22μm的离心滤器（Corning，目录号8169）以3000rpm对提取物离心3分钟，随后将滤过物转移至GC瓶中用于GC-MS分析。检测了异丁醛和异丁酸。
该GC方法使用了Agilent7890GC，其配备有5975质谱仪以用于检测，以及DB-1701色谱柱（30m×0.25mM ID，0.25μm薄膜），其来自Agilent（Santa Clara，CA）。载气为1.0mL/分钟的恒定流速下的氦气；进样分流为1:10，250℃下；烘箱温度为40℃下1分钟，以10℃/分钟从40℃到120℃，并且以30℃/分钟从120℃到240℃。以全扫描模式使用MS检测，用于对异丁醛和异丁酸进行鉴定和定量。对以下化合物产生了经校准的标准曲线：异丁醛、异丁酸和异丁醇。
实例33
用于在酿酒酵母中表达异丁醇途径基因的表达载体的构建
pLH475-JEA1的构建
构建pLH475-JEA1质粒（SEQ ID NO:419），以在酵母中表达ALS和KARI。pLH475-JEA1是包含下列嵌合基因的pHR81载体（ATCC87541）：1）CUP1启动子（SEQ ID NO:789），来自枯草芽孢杆菌的乙酰乳酸合酶编码区（AlsS；SEQ ID NO:790；蛋白质SEQ ID NO:791）和CYC1终止子2（SEQ ID NO:792）；2）ILV5启动子（SEQ ID NO:793）、Pf5.IlvC-JEA1编码区和ILV5终止子（SEQ ID NO:794）；以及3）FBA1启动子（SEQ ID NO:795）、啤酒糖酵母KARI编码区（ILV5；SEQ ID NO:796；蛋白质SEQ ID NO:797）；和CYC1终止子（SEQ IDNO:798）。
Pf5.IlvC-JEA1编码区是编码来自荧光假单胞菌但包含突变的KARI的序列，其描述于美国专利申请公布2009/0163376和2010/0197519，其全文以引用的方式并入本文。Pf5.IlvC-JEA1所编码的KARI（核酸和氨基酸SEQ ID NO:799和800）与天然的荧光假单胞菌KARI相比具有氨基酸变动。
表达载体pLH468
构建了用于在酵母中表达DHAD、KivD和HADH的质粒pLH468（SEQ ID NO:139）。
基于针对在啤酒糖酵母中的表达优化的密码子，利用DNA2.0合成了乳酸乳杆菌酮异戊酸脱羧酶（KivD）和马肝脏醇脱氢酶（HADH）的编码区（分别为SEQ ID NO:801和802），并提供于质粒pKivDy-DNA2.0和pHadhy-DNA2.0中。所编码的蛋白质分别为SEQ ID NO:803和804。构建了KivD和HADH单独的表达载体。为装配pLH467（pRS426::PTDH3-kivDy-TDH3t），载体pNY8（又称为pRS426.GPD-ald-GPDt，描述于美国专利申请公布US2008/0182308，实例17，其以引用的方式并入本文）使用AscI和SfiI酶进行了消化，从而将GPD启动子和ald编码区切出。用5'引物oT1068和3'引物oT1067（SEQ ID NO:806和807）对来自pNY8的TDH3启动子片段（SEQ ID NO:805）进行了PCR扩增，以在5'端加上AscI位点，并在3'端加上一个SpeI位点。将所述经AscI/SfiI消化的pNY8载体片段，与经AscI和SpeI消化的TDH3启动子PCR产物，以及分离自载体pKivD-DNA2.0的包含经密码子优化的kivD编码区的SpeI-SfiI片段相连接。这种三元连接产生了载体pLH467（pRS426::PTDH3-kivDy-TDH3t）。通过限制性图谱和测序对pLH467（SEQ ID NO:808）进行验证。
pLH435（pRS425::PGPM1-Hadhy-ADH1t）来自于载体pRS425::GPM-sadB（SEQ ID NO:809），其描述于美国申请公布2009/0305363，实例3，其以引用的方式并入本文。pRS425::GPM-sadB是具有嵌合基因的pRS425载体（ATCC#77106），所述嵌合基因包含GPM1启动子（SEQID NO:810）、来自木糖氧化无色杆菌的丁醇脱氢酶（sadB；DNA SEQ IDNO:811；蛋白质SEQ ID NO:812），以及ADH1终止子（SEQ ID NO:444）。pRS425::GPMp-sadB分别在sadB编码区的5'和3'端包含BbvI和PacI位点。通过使用引物oT1074和OT1075（SEQ ID NO:813和814）进行定点诱变而将NheI位点添加于sadB编码区的5'端，从而产生了载体pRS425-GPMp-sadB-NheI，其通过测序进行了验证。pRS425::PGPM1-sadB-NheI使用NheI和PacI进行消化以取出sadB编码区，并与来自载体pHadhy-DNA2.0的包含经密码子优化的HADH编码区的NheI-PacI片段进行连接以产生pLH435（SEQ ID NO:815）。
用SacI和NotI消化了酵母载体pRS411（ATCC87474），并在一个三元连接反应中，将上述经消化的载体与来自pLH467的包含P-kivDy-t表达盒的SacI-SalI片段和来自TDH3pLH435的包含PGPM1TDH3-Hadhy-ADH1t表达盒的SalI-NotI片段相连接，以将KivD和HADH表达盒合并于同一载体中。这产生了载体pRS411::PTDH3-kivDy-PGPM1-Hadhy（pLH441，SEQ IDNO:816），该载体经过了限制性标测验证。
为产生共表达载体以用于下游异丁醇途径中的全部三种基因：ilvD、kivDy和Hadhy，我们使用pRS423 FBA ilvD（Strep）（SEQ ID NO:817）作为IlvD基因的来源。这种穿梭载体包含一个在大肠杆菌中共生所需的F1复制起点（核苷酸1423至1879）和一个在酵母中复制所需的2μ起点（核苷酸8082至9426）。该载体含有一个FBA1启动子（核苷酸2111至3108；SEQ ID NO:795）和FBA1终止子（核苷酸4861至5860；SEQ IDNO:818）。此外，它还携带用于在酵母中进行选择的His标记（核苷酸504至1163）和用于在大肠杆菌中进行选择的氨苄青霉素抗性标记（核苷酸7092至7949）。来自变异链球菌UA159（ATCC700610）的ilvD编码区（核苷酸3116至4828；SEQ ID NO:819；蛋白质SEQ ID NO:820）位于FBA1启动子和FBA1终止子之间，从而形成了用于表达的嵌合基因。此外，上述ilvD编码区还融合了一个lumio标签（核苷酸4829-4849）。
第一步是用SacI和SacII将pRS423FBAilvD（Strep）（也叫做pRS423-FBA（SpeI）-IlvD（变异链球菌）-Lumio）线性化（并利用T4DNA聚合酶将SacII位点平末端化），从而得到全长为9,482bp的载体。第二步是用SacI和KpnI从pLH441分离出kivDy-hADHy盒（并利用T4DNA聚合酶将KpnI位点平末端化），得到6,063bp的片段。将该片段与来自pRS423-FBA（SpeI）-IlvD（Streptococcus mutans）-Lumio的9,482bp载体片段相连接。如此产生了载体pLH468（pRS423::PFBA1-ilvD（Strep）Lumio-FBA1t-PTDH3-kivDy-TDH3t-PGPM1-hadhy-ADH1t），该载体经过了限制性标测和测序确认。
实例34
在丙酮酸脱羧酶和己糖激酶2中包含修饰的啤酒糖酵母宿主菌株的构 建
本实例描述了酿酒酵母内源PDC1、PDC5和PDC6基因的插入灭活。PDC1、PDC5和PDC6基因编码丙酮酸脱羧酶的三种主要的同功酶还灭活了己糖激酶2，其负责对葡萄糖的磷酸化以及转录遏制。所得PDC/HXK2灭活菌株被用作表达载体pLH475-JEA1和pLH468的宿主。
pdc6::P GPM1 -sadB整合盒和PDC6缺失的构建：
pdc6::PGPM1-sadB-ADH1t-URA3r整合盒通过将来自pRS425::GPM-sadB（描述于美国专利申请公布2009/0305363，以引用的方式并入）的GPM-sadB-ADHt片段（SEQ ID NO:821）连接至来自pUC19-URA3r的URA3r基因而制备。pUC19-URA3r（SEQ ID NO:822）包含来自pRS426（ATCC77107）的URA3标记，其侧接75bp的同源重复序列以实现体内同源重组以及对URA3标记的去除。所述两个DNA片段通过SOE PCR而连接（如Horton等人（1989）Gene77:61-68），其使用模板pRS425::GPM-sadB和pUC19-URA3r质粒DNA以PhusionDNA聚合酶（New England BiolabsInc.，Beverly，MA；目录号F-540S）和引物114117-11A至114117-11D（SEQ ID NO:823、824、825、826）以及114117-13A和114117-13B（SEQ ID NO:827和828）而进行。
SOE PCR的外侧引物（114117-13A和114117-13B）包含分别与PDC6启动子和终止子的上游和下游区同源的5'和3'～50bp区。利用标准遗传技术（Methods in Yeast Genetics，2005，Cold Spring Harbor LaboratoryPress，Cold Spring Harbor，NY，第201-202页），将完整的盒PCR片段转化到BY4700（ATCC 200866），并且将转化子在30℃培养于缺乏尿嘧啶且补充2%葡萄糖的合成完全培养基上。利用引物112590-34G和112590-34H（（SEQ ID NO:829和830），以及112590-34F和112590-49E（SEQ ID NO:831和832），通过PCR对转化子进行了筛选，以验证PDC6编码区的缺失在PDC6基因座处的整合。通过按照标准规程在30℃涂布于补充了2%葡萄糖和5-FOA的合成的完全培养基上，对上述URA3r标记进行了回收利用。通过将来自上述5-FOA平板的菌落接种至SD-URA培养基上，生长的被抑制确认了标记的移除。得到的经过鉴定的菌株具有下列基因型：BY4700pdc6::PGPM1-sadB-ADH1t。
pdc1::P PDC1 -ilvD整合盒和PDC1缺失的构建：
pdc1::PPDC1-ilvD-FBA1t-URA3r整合盒（SEQ ID NO:833）通过将来自pLH468的ilvD-FBA1t片段连接于来自pUC19-URA3r的URA3r基因（如Horton等人（1989）Gene77:61-68所描述）而制备，其使用模板pLH468和pUC19-URA3r质粒DNA以PhusionDNA聚合酶（New England BiolabsInc.，Beverly，MA；目录号F-540S）和引物114117-27A至114117-27D（SEQ ID NO:823、824、825、826）进行。
SOEPCR的外侧引物（114117-27A和114117-27D）包含与PDC1启动子的下游区和PDC1编码区的下游区同源的5'和3'～50bp区。利用标准遗传学技术（Methods in Yeast Genetics，2005，Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，第201-202页）将完整的盒PCR片段转化进入BY4700pdc6::PGPM1-sadB-ADH1t并将转化子在30℃下维持于缺乏尿嘧啶且补充了2%葡萄糖的合成的完全培养基上。利用引物114117-36D和135（SEQ ID NO834和835），以及112590-49E和112590-30F（SEQ ID NO832和836），通过PCR对转化子进行了筛选，以验证PDC1编码区的缺失在PDC1基因座处的整合。通过按照标准规程在30℃涂布于补充2%葡萄糖和5-FOA的合成完全培养基上，对所述URA3r标记进行回收利用。通过将来自上述5-FOA平板的菌落接种至SD-URA培养基上，生长的被抑制确认了标记的移除。所得的经鉴定的菌株“NYLA67”具有如下基因型：BY4700pdc6::PGPM1-sadB-ADH1tpdc1::PPDC1-ilvD-FBA1t。
HIS3缺失
为了删除内源的HIS3编码区，从URA3r2模板DNA（SEQ ID NO:837）PCR扩增了his3::URA3r2盒。URA3r2包含来自pRS426（ATCC77107）的URA3标记，该标记两翼为500bp的同源重复序列，以允许体内同源重组和URA3标记的移除。PCR系利用PhusionDNA聚合酶和引物114117-45A和114117-45B（SEQ ID NO:838和839）进行，其产生了～2.3kb的PCR产物。每种引物的HIS3部分来源于HIS3启动子上游的5'区和编码区下游的3'区，从而使URA3r2标记的整合导致HIS3编码区的置换。利用标准遗传技术（Methods in Yeast Genetics，2005，Cold SpringHarbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，第201-202页）将PCR产物转化到NYLA67中，并且在合成完全培养基上，在30℃下选择转化子，所述培养基缺乏尿嘧啶且补充2%的葡萄糖。通过在30℃下将转化子接种到缺乏组氨酸且补充2%葡萄糖的合成完全培养基上来筛选转化子以验证正确整合。通过按照标准规程在30℃下涂布于补充2%葡萄糖和5-FOA的合成完全培养基上，对所述URA3r标记进行回收利用。通过将来自上述5-FOA平板的菌落接种至SD-URA培养基上，生长的抑制确认了标记的移除。所得经鉴定的菌株称为NYLA73，它具有基因型：BY4700pdc6::PGPM1-sadB-ADH1tpdc1::PPDC1-ilvD-FBA1tΔhis3。
HXK2缺失
hxk2::URA3r盒通过PCR从URA3r2模板（如上所述）中扩增，所述PCR使用Phusion DNA聚合酶和引物384和385（SEQ ID NO:840和841），生成～2.3kb的PCR产物。各引物的HXK2部分来源于HXK2启动子上游5'区和编码区下游3'区，使得URA3r2标记的整合导致HXK2编码区的替换。使用标准遗传技术（Methods in Yeast Genetics，2005，ColdSpring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，第201-202页）将PCR产物转化到NYLA73中，并且在缺乏尿嘧啶并补充有2%葡萄糖的合成完全培养基上，在30℃下选择转化子。通过使用引物N869和N871（SEQ ID NO:842和843）的PCR筛选转化子以验证在HXK2基因座上发生的HXK2编码区替换整合正确。通过按照标准规程在30℃涂布于补充2%葡萄糖和5-FOA的合成完全培养基上对所述URA3r2标记进行回收利用。通过从5-FOA平板上涂布接种菌落到SD-URA培养基上以验证生长缺失来证实标记的移除，并且通过使用引物N946和N947（SEQ ID NO:844和845）的PCR来验证正确的标记移除。所得经鉴定的菌株称为NYLA83，它具有基因型：BY4700pdc6::PGPM1-sadB-ADH1tpdc1::PPDC1-ilvD-FBA1tΔhis3Δhxk2。
pdc5::kanMX整合盒和PDC5缺失的构建
利用PhusionDNA聚合酶和引物PDC5::KanMXF和PDC5::KanMXR（SEQ ID NO:846和847），从菌株YLR134W染色体DNA（ATCC No.4034091）经PCR扩增了pdc5::kanMX4盒，产生了～2.2kbPCR产物。各引物的PDC5部分来源于PDC5启动子上游的5'区和编码区下游的3'区，从而使kanMX4标记的整合导致PDC5编码区的置换。将PCR产物转化到NYLA83中并如上所述选择和筛选转化子。经鉴定的正确转化子称为NYLA84，它具有基因型：BY4700pdc6::PGPM1-sadB-ADH1tpdc1::PPDC1-ilvD-FBA1tΔhis3Δhxk2pdc5::kanMX4。
使用标准遗传技术（Methods in Yeast Genetics，2005，Cold SpringHarbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY）将质粒载体pLH468和pLH475-JEA1同时转化进入菌株NYLA84（BY4700pdc6::PGPM1-sadB-ADH1tpdc1::PPDC1-ilvD-FBA1t Δhis3 Δhxk2 pdc5::kanMX4）并且将所得菌株在30℃下培养于缺乏组氨酸和尿嘧啶且补充1%乙醇的合成完全培养基上。
实例35（假想例）
在丙酮酸脱羧酶、己糖激酶2和醛脱氢酶中包含修饰的啤酒糖酵母宿 主菌株的构建
本实例描述了一种或多种醛脱氢酶的灭火，其消除或降低了异丁酸的形成。例如对ALD2的破坏，但是本方法可用于破坏任何醛脱氢酶。所得的NYLA84衍生菌株被用作表达载体pLH475-JEA1和pLH468的宿主。
ALD2缺失：
ald2::URA3r盒通过PCR从URA3r2模板（如上所述）中扩增，所述PCR使用Phusion DNA聚合酶和引物T001与T002（SEQ ID NO:848和849），生成～2.3kb的PCR产物。各引物的ALD2部分来自于ALD2基因的5'序列和3'序列，从而使URA3r2标记的整合导致了对ALD2编码区的置换。使用标准遗传技术（Methods in Yeast Genetics，2005，Cold SpringHarbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，第201-202页）将PCR产物转化到NYLA84中，并且在缺乏尿嘧啶并补充有1%乙醇的合成完全培养基上在30℃下选择转化子。通过使用引物T003和T004（SEQ ID NO:850和851）进行PCR筛选转化子以验证在ALD2基因座上发生的ALD2编码区置换整合正确。通过按照标准规程在30℃下涂布于补充了1%乙醇和5-FOA的合成的完全培养基上，对上述URA3r2标记进行回收利用。通过从5-FOA平板上涂布接种菌落到SE-URA培养基上以验证生长缺失来证实标记的移除，并且通过使用引物T004和T005（SEQ ID NO:851和852）进行PCR来验证正确的标记移除。所得的经鉴定菌株命名为NYLA84 Δald2并且基因型为：BY4700pdc6::PGPM1-sadB-ADH1t pdc1::PPDC1-ilvD-FBA1t Δhis3 Δhxk2 Δald2。
实例36
重组啤酒糖酵母在NYLA84中的异丁醇生产
HPLC方法
对葡萄糖和发酵副产物组成的分析是本领域的技术人员所熟知的。例如，一种使用Shodex SH-1011柱和Shodex SH-G保护柱（二者均可购自Waters Corporation，Milford，MA）并联合折射率（RI）检测的高效液相色谱（HPLC）方法。用0.01MH2SO4作为流动相，以0.5mL/分钟流量和50℃的柱温实现色谱分离。异丁醇保留时间为47.6分钟。
重组啤酒糖酵母在NYLA84中的异丁醇生产
本实例的目的是描述在酵母菌株NYLA84中的异丁醇生产。所述酵母菌株包含PDC1、PDC5和pDC6（编码丙酮酸脱羧酶的三种同工酶基因）的缺失，以及编码己糖激酶2的HXK2的缺失。所述菌株还包含用于异源表达AlsS（乙酰乳酸合酶）、KARI（酮酸还原异构酶）、DHAD（二羟酸脱水酶）、KivD（酮异戊酸脱羧酶）、SadB（仲醇脱氢酶）和HADH（马肝醇脱氢酶）的构建体。
菌株的构建
通过标准的PEG/乙酸锂介导的转化方法将质粒pLH468和pLH475-JEA1引入NYLA84。在缺乏葡萄糖、组氨酸和尿嘧啶的合成完全培养基上选择了转化子。乙醇（1%v/v）被用作碳源。三天后，转化子被接种到补充2%葡萄糖和0.5%乙醇作为碳源的缺乏组氨酸和尿嘧啶的合成完全培养基上。冻存瓶通过使用45%的甘油将对数期培养物稀释至15%（w/v）的最终甘油浓度而制备。
异丁醇的生产
将冻存瓶用于接种80ml缺乏组氨酸和尿嘧啶的合成完全培养基上（补充2%葡萄糖和0.5%乙醇作为碳源）。
发酵条件：
准备了1升的发酵罐并以0.4L水消毒。冷却后，加入过滤除菌的培养基，以在800mL接种后培养基中得到下列的最终浓度：
培养基（最终浓度）：
6.7g/L酵母氮源w/o氨基酸（Difco）
2.8g/L不含组氨酸、亮氨酸、色氨酸和尿嘧啶的Yeast Synthetic Drop-out Medium Supplement（Sigma Y2001）
20mL/L1%（w/v）L-亮氨酸
4mL/L1%（w/v）L-色氨酸
1mL/L麦角固醇/吐温/乙醇溶液
0.2mL/LSigmaDF204
10g/L葡萄糖
用KOH将发酵罐控制在pH5.5下，30%dO，温度为30℃，气流为0.2SLPM（或0.25vvm）。接种时，气流最初设置为0.01SLPM，然后一旦确立了生长即提高至0.2SLPM。葡萄糖通过人工添加始终维持在5-15g/L。
在0.25vvm下连续向该发酵罐供应空气。持续通气导致了异丁醇从发酵罐中的水相显著地发生汽提。为了定量因汽提导致的异丁醇损失的量，来自发酵罐的尾气被直接送至一台质谱仪（Prima dB，Thermo ElectronCorp.，Madison，WI）并定量所述气流中异丁醇的量。对质荷比为74或42的异丁醇峰进行连续监测，以定量上述气流中异丁醇的量。
上述发酵过程中，利用HPLC对水相中的葡萄糖和有机酸进行了监测。此外还用葡萄糖分析仪（YSI，Inc.，Yellow Springs，OH）对葡萄糖进行了快速监测。在定期从该发酵罐中移取水相之后，通过HPLC对该水相中的异丁醇进行定量，如本文HPLC方法中所描述。针对反提取导致的异丁醇损失进行校正的有效滴度为7.5g/L。异丁酸的滴度为1.28g/L（图14）。
实例37（假想例）
重组啤酒糖酵母在NYLA84 Δald2中的异丁醇生产
本实例的目的是描述在酵母菌株NYLA84中的异丁醇生产。例如对ALD2的破坏，但是本实例可用于破坏任何醛脱氢酶。NYLA84 Δald2酵母菌株包含PDC1、PDC5和PDC6（编码丙酮酸脱羧酶的三种同工酶的基因）的缺失，编码己糖激酶2的HXK2的缺失，以及编码醛脱氢酶的ALD2的缺失。所述菌株还包含用于异源表达AlsS（乙酰乳酸合酶）、KARI（酮酸还原异构酶）、DHAD（二羟酸脱水酶）、KivD（酮异戊酸脱羧酶）和SadB（仲醇脱氢酶）的构建体。
菌株的构建
通过标准的PEG/乙酸锂介导的转化方法将质粒pLH468和pLH475-JEA1引入NYLA84Δald2。在缺乏葡萄糖、组氨酸和尿嘧啶的合成完全培养基上选择了转化子。乙醇（1%v/v）被用作碳源。三天后，将转化子接种到缺乏组氨酸和尿嘧啶的合成完全培养基上（补充2%葡萄糖和0.5%乙醇作为碳源）。冻存瓶通过使用45%的甘油将对数期培养物稀释至15%（w/v）的最终甘油浓度而制备。
异丁醇的生产
将冻存瓶用于接种80ml缺乏组氨酸和尿嘧啶的合成完全培养基上（补充0.25%葡萄糖和0.5%乙醇作为碳源）。准备了1升的发酵罐并以0.4L水消毒。冷却后，加入过滤除菌的培养基，以在800mL接种后培养基中得到下列的最终浓度：
培养基（最终浓度）：
6.7g/L酵母氮源w/o氨基酸（Difco）
2.8g/L不含组氨酸、亮氨酸、色氨酸和尿嘧啶的Yeast Synthetic Drop-out Medium Supplement（Sigma Y2001）
20mL/L1%（w/v）L-亮氨酸
4mL/L1%（w/v）L-色氨酸
1mL/L麦角固醇/吐温/乙醇溶液
0.2mL/LSigmaDF204
10g/L葡萄糖
发酵罐在pH5.5用KOH设置为对照，30%dO，温度为30℃，气流为0.2SLPM（或0.25vvm）。接种时，气流最初设置为0.01SLPM，然后一旦确立了生长即提高至0.2SLPM。葡萄糖通过人工添加始终维持在5-15g/L。
为了定量因汽提导致的异丁醇损失的量，来自发酵罐的尾气被直接送至质谱仪（Prima dB质谱仪，Thermo Electron Corp.，Madison，WI）以定量所述气体物流中异丁醇的量。对质荷比为74或42的异丁醇峰进行连续监测，以定量所述气体物流中异丁醇的量。所述发酵过程中，利用HPLC对水相中的葡萄糖和有机酸进行监测。此外还用葡萄糖分析仪（YSI，Inc.，Yellow Springs，OH）对葡萄糖进行快速监测。在定期从该发酵罐中移取水相之后，通过HPLC对该水相中的异丁醇和异丁酸进行定量。
实例38
异丁酸生产分析
将菌株接种到缺失组氨酸和尿嘧啶的合成完全培养基，其补充有0.05%乙醇。一旦培养物已经达到了稳定期，则将其继代培养进入新鲜培养基中（起始OD=0.2）。对于PNY2205（实例13），对培养基补充以0.05%乙醇以满足C2需求，其在不具备磷酸酮醇酶途径的PDCKO酵母中被观察到。对于PNY2209（实例13），将细胞继代培养进入具有或不具有乙醇的培养基中。对于ald6Δ克隆（PNY2216和同基因的克隆，实例24），使用了不具有乙醇的培养基。将培养物生长于旋盖式摇瓶中（20mL培养基，处于125mL烧瓶中）。在接种后立即采集培养物上清液，并在48小时后再度采集。通过HPLC分析这些培养物上清液（描述于US20070092957，以引用的方式并入本文）来测定葡萄糖消耗和异丁酸浓度。
表35：异丁酸在ald6Δ菌株中的摩尔收率。
菌株 异丁酸摩尔收率（摩尔/摩尔消耗的葡萄糖）
PNY2205* 0.09
PNY2209* 0.07
PNY2209 0.09
PNY2216和5种其它同基因的克隆 0.03
*表示培养物培养基补充有0.05%乙醇
实例39
新菌株中提高的异丁醇生产和降低的副产物生产
本实例的目的在于描述以新构建的菌株进行的小规模培养实验，所述菌株使用pK9G9.OLE1p.ilvD来供应异丁醇途径基因。
使用质粒pK9G9.OLE1p.ilvD来转化新的宿主菌株PNY1528、PNY2243、PNY2237和pNY2238并针对异丁醇生产进行测试。通过在尿嘧啶缺失合成完全培养基（具有1%的乙醇作为碳源的）上进行选择来获得转化子。将转化子点覆于尿嘧啶缺失合成完全培养基上（具有2%葡萄糖和0.05%乙醇作为碳源）。将菌斑用于接种液体培养基（合成完全培养基，缺失尿嘧啶，具有0.3%葡萄糖和0.3%乙醇作为碳源）。为测试异丁醇生产，将液体培养物分转培养至合成完全培养基（缺失尿嘧啶，包含2%葡萄糖和0.05%乙醇作为碳源），其还包含BME维生素混合物（Sigma目录号B6891）。在30℃下将培养物在密封的血清瓶中（10ml培养基，在15ml瓶内）振荡孵育（250rpm，在Infors Multitron摇床中）。在48小时后，过滤培养物培养基（Spin-X柱）并通过HPLC进行分析（如此前美国申请公布20070092957中所描述）。途径副产物异丁酸盐（酯）的摩尔收率在携带ald6Δ的菌株中降低了50%。基于PNY2238的菌株据发现具有更高的葡萄糖消耗和异丁醇滴度（下表中示出的克隆K的结果）。
表36：异丁酸在ald6Δ菌株中的摩尔收率。
*表示培养物培养基补充有0.05%乙醇
全部菌株包含质粒pK9G9.OLE1p.ilvD。对于PNY2237-和pNY2238衍生的菌株，所给出的数据是两组生物重复的平均值。
实例40
位点饱和基因文库的构建和对所得的PNY2259中变体的异丁醇生产 的筛选
包含编码了在第309位的全部20种单个氨基酸变动（表37）的引物的反向引物混合物（本实例中称为K9_309r）和正向引物K9_131T_080211f：GGACTTGATGTCACTATGATC（本实例中称为K9_131Tf）用于产生靶向于K9KARI的第309位的单位点饱和文库。包含变体K9SB2的质粒（pHR81-ILV5p.K9SB2.TEF1（M4）p.ilvD（SEQ IDNO:930，又称为“pLH744”）。
简而言之，通过常规的PCR制备了巨引物。巨引物的PCR混合物由45μl的SuperMix（Invitrogen，Carlsbad，CA，10572063）、2.0μlK9_131Tf（20μM）、2.0μlK9_309r（20μM）和1.0μl模板（50ng/μl）组成。制备所述巨引物的PCR程序为：起始温度为95℃下1.0分钟，随后为35个加热/冷却循环。每个循环由95℃下20秒，55℃下20秒以及72℃下1.0分钟组成。随后使用该巨引物将突变引入K9SB2，其使用了实例5中示出的相同工序。对来自单位点饱和文库的克隆进行了测序。
所得的独特变体与pLH744一起针对异丁醇生产和副产物的形成而受到了分析（每种突变体进行三组）。酵母途径质粒制备于PNY2259中（MATa ura3Δ::loxP his3Δpdc6Δpdc1Δ::P[PDC1]-DHAD|ilvD_Sm-PDC1t-P[FBA1]-ALS|alsS_Bs-CYC1t pdc5Δ::P[PDC5]-ADH|sadB_Ax-PDC5tgpd2Δ::loxP fra2Δ::P[PDC1]-ADH|adh_Hl-ADH1t adh1Δ::UAS（PGK1）P[FBA1]-kivD_Lg（y）-ADH1t yprcΔ15Δ::P[PDC5]-ADH|adh_Hl-ADH1tymr226cΔald6Δ::loxP；实例22），其通过转化KARI质粒而容纳于宿主中。将转化的细胞在不含组氨酸和尿嘧啶的合成培养基（1%乙醇作为碳源）上涂平板。将三个转化子转移至相同培养基的新鲜平板。在48孔平板中（Axygen，Union City，CA391-05-061）针对厌氧条件下的异丁醇生产测试了所述转化子。
来自SE-Ura平板上的转化的酵母菌落在5-7天后出现。来自各个变体的三个菌落点覆于新鲜的SE-Ura平板上，并在30℃下孵育3天。
生长培养基和工序
在酵母菌株的生长工序期间使用了两种类型的培养基：有氧预培养培养基和厌氧培养培养基。除非另行申明，否则全部化学物均获自Sigma（St.Louis，MO）。
有氧预培养培养基（SE-Ura）：6.7g/L无氨基酸酵母氮基（Difco，291940，Sparks，MD），1.4g/L酵母合成drop-out培养基补充物，无组氨酸、亮氨酸、色氨酸和尿嘧啶，具有0.2%乙醇，0.2%葡萄糖，0.01%w/v亮氨酸，0.002%w/v组氨酸和0.002%w/v色氨酸。
厌氧培养培养基（SEG-Ura-His）：50mMMES（pH5.5），6.7g/L无氨基酸酵母氮基（Difco，291940，Sparks，MD），1.4g/L酵母合成drop-out培养基补充物，无组氨酸、亮氨酸、色氨酸和尿嘧啶，具有0.1%乙醇，3%葡萄糖，0.01%亮氨酸，0.002%w/v组氨酸，0.002%色氨酸，30mg/L烟酸，30mg/L硫胺素和10mg/L麦角固醇，在50/50v/v的Tween/乙醇溶液中制成。
点覆的细胞接种于48孔平板中。各孔包含1.5mL的有氧培养基。以可透式铝箔覆盖平板内并在30℃下过夜振荡培养。随后测量了细胞密度（OD600）。计算出了用于对各孔制备具有最终OD600=0.2的1.5mL细胞悬液（在厌氧培养基中）的细胞量并使用厌氧培养基进行制备1.5mL细胞悬液并加入各孔。使用无氧室根据制造商的规程（Coy Laboratory ProductsInc.Grass Lake，MI）来去除48孔平板中的氧气。随后将细胞在30℃中振荡生长两天。随后测量了细胞密度（OD600）。生长最佳的突变体在48孔平板中进行了相同的两天生长以进行异丁醇生产测量。在两天的厌氧生长后，随即测量了细胞密度（OD600）。在4,000g下对细胞离心5分钟并收集上清液以使用LC/MS进行异丁醇测量。
对具有K9KARI突变体的酵母菌株的LC/MS分析
在厌氧生长时期结束时取样用于LCMS分析。使用具有WatersAcQuity UPLC HSS T3分离柱（Waters，Milford，MA）的Waters AcQuityUPLC分离设备和AcQuity TQD三重四极杆质谱仪（Waters，Milford，MA）进行LCMS分析。使用水（+0.1%甲酸）和乙腈（+0.1%甲酸）的反相梯度来分离化合物，其以99%的水相起始并以99%的有机相结束，流速为0.5mL/分钟。使用Waters Masslynx4.1软件（Waters，Milford，MA）分析色谱图。使用Waters Quanlynx软件（Waters，Milford，MA）计算异丁醇的微摩尔收率，其使用了对标准物的三次重复分析的校准曲线。
表37：反向引物
Figure BDA0000419940220001971
表38：一些变体的列表以及在两天的厌氧生长后的OD 600 和异丁醇滴 度（mM）
Figure BDA0000419940220001981
实例41
K9SB2_SH（K9SB2_短），K9SB2的截短版本的构建
使用
Figure BDA0000419940220001982
High-Fidelity PCR试剂盒（目录号E0553L，NewEngland Biolabs）通过PCR来制备编码K9SB2的缺少最初五个N末端氨基酸（MEECK）的版本的基因。引物Kshort1（AAACCGGTTTAAACAGTATGGCTAAGATTTACTACCAAGAAGACTG；SEQ ID NO:903）和YGrev（TTCTGTTTTATCAGACCGCTTC；SEQ IDNO:904）由Integrated DNA Technologies，Inc（CoralvilleIA）合成。除引物、dNTP mix（目录号18427-013，Invitrogen，Carlsbad，CA）、模板和ddH2O之外，此处使用的试剂由上文标出的试剂盒供应。PCR混合物由1μl处于pBAD.KARI中的K9SB2（20ng/μl；质粒制备描述于实例17；SEQ ID NO:428）、2μl各种引物（20μM储液）、10μl的5×PhusionHF缓冲液、2μl5mMdNTP混合物、0.5μl聚合酶和28μlddH2O组成。对PCR反应使用以下条件进行PCR反应：起始温度为98℃下2分钟，随后是30轮加热/冷却循环。每个循环由98℃下10秒，48℃下30秒以及72℃下1.5分钟组成。在温度循环完成后，将样品保持在72℃下10分钟或更长，然后在4℃下等待回收。通过琼脂糖凝胶电泳（1%琼脂糖，1×TBE缓冲液）将所述反应产物与模板分离并使用IllustraGFXTMPCRDNA和Gel BandPurification试剂盒（目录号28-9034-70，GE Healthcare Sciences，Piscataway，NJ）根据制造商的建议加以回收。所纯化的PCR产物使用PmeI和SfiI进行消化并连接进入pBAD-ps-JEA1（SEQ ID NO:905）的对应位点，并证实了K9SB2_SH在pBAD.KARI（SEQ ID NO:929）中的所得构建体的序列。
实例42
用于研究K9SB2和其它KARI酶的酵母表达质粒的生成
pHR81-ILV5p-K9SB2-TEF（M4）-IlvD（pLH744；SEQ ID NO:930） 的构建：
通过PmeI和SfiI消化从pHR81-ILV5p-K9SB2中切下K9SB2基因，并连接与pHR81-ILV5p-K9D3-TEF（M4）-IlvD（pBP2090）在PmeI和SfiI位点进行连接。经连接的载体命名为pHR81-ILV5p-K9SB2-TEF（M4）-IlvD（pLH744），并且通过测序证实这一载体。
K9SB2_SH_DHAD（SEQ ID NO:931）的构建
将经过消化的K9SB2_SHPCR产物（描述于实例41）连接进入pLH744的PmeI和Sfi并通过测序加以证实。
K9SB2_SH_81（SEQ ID NO:932）的构建
将经过消化的K9SB2_SHPCR产物（描述于实例41）连接进入pHR81-PIlv5-KARI-K9.G9的PmeI和Sfi并通过测序加以证实。
K9SB2衍生物的酵母表达质粒的构建
通过将来自pBAD.KARI质粒的对应KARI基因亚克隆进入质粒pLH744和质粒pHR81-PIlv5-KARI-K9.G9的PmeI和SfiI位点来生成用于表39中列出的变体（描述于实例17和21）的酵母表达质粒。通过测序证实构建体。
表39：亚克隆进入酵母表达质粒的K9SB2衍生物
K9SB2衍生物 别名 氨基酸序列ID 核酸序列ID
K9SB2-K90M K9_David 431 432
K9SB2-G55D K9_Eliza 433 946
K9SB2-Q91L K9_Frank 440 947
K9SB2-A303D K9_Grace 445 948
K9SB2-A303D K9_Ingrid 455 949
K9SB2-F67I K9_Jarvis 437 950
K9SB2-A56G-K90N K9Kelly 452 951
K9SB2-G55C K9_Norman 481 952
K9SB2-P135S K9_Ophelia 488 953
K9SB2-F53L K9_Pat 441 954
K9SB2-Q94I K9_Quentin 495 955
K9SB2-F67L K9_Ralph 496 956
K9SB2-K8N-K90M-T141I K9_Sophia 502 957
K9SB2-E13V-M94I-T141I K9_Tiberius 509 958
K9SB2-A56V K9_Ursala 511 959
K9SB2-I84L K9_Victor 514 960
K9SB2-W59C K9_Watson 520 961
K9SB2-T93A K9_Xavier 641 642
截短版本的K9SB2衍生物的酵母表达质粒的构建
N末端经截短的版本的K9SB2衍生物如实例41所描述并加以改进而制备。引物Kshort1被代之以5'-磷酰化的引物KPSH1（AAACAGTATGGCT AAG ATT TAC TAC CAA GAA GAC TG；SEQ ID NO:906），其由Integrated DNA Technologies，Inc（Coralville IA）合成。在该PCR中，K9SB2被代之以变体的汇合混合物（pBAD.KARI质粒），其列于表39中。所纯化的PCR产物以SfiI进行消化并且连接进入pHR81-PIlv5-KARI-K9.G9的PmeI和SfiI位点。使用TempliPhiTM（GEHealthcare）和引物pHR81-F（ACACCCAGTATTTTCCCTTTCC）和pHR81-Rev（CTA GTGTAC AGA TGT ATG TCG G）（SEQ ID NO:924和925）进行了DNA测序鉴定各个截短的衍生物。所鉴定的变体在表40中示出。随后将截短版本的编码序列亚克隆进入质粒pLH744的PmeI和SfiI位点。
表40：截短版本的K9SB2衍生物
变体 氨基酸序列ID 核酸序列ID
K9_David_SH 196 263
K9_Eliza_SH 266 907
K9_Frank_SH 267 908
K9_Grace_SH 389 909
K9_Ingrid_SH 405 910
K9_Jarvis_SH 781 911
K9_Kelly_SH 782 912
K9_Norman_SH 783 913
K9_Ophelia_SH 835 914
K9_Pat_SH 853 915
K9_Quentin_SH 854 916
K9_Ralph_SH 855 917
K9_Ursala_SH 856 918
K9_Watson_SH 857 858
K9_Xavier_SH 859 919
K9_Zeke_SH（K9SB2-K90M-T93A）和K9_Annabel_SH（K9SB2- K90M-T93I）的构建
K9_Zeke_SH（SEQ ID NO:860，蛋白质SEQ ID NO:861）和K9_Annabel_SH（SEQ ID NO:862，蛋白质SEQ ID NO:863）通过定点诱变衍生自K9_David_SH，所述定点诱变使用Lightning Site-Directed Mutagenesis试剂盒（目录号210518；Agilent Technologies，Stratagene Products Division，La Jolla，CA）进行。除引物、模板和ddH2O外，所使用的全部试剂与上文指出的试剂盒一起供应。引物由IntegratedDNA Technologies，Inc（Coralville IA）合成。
对于K9_Zeke_SH，所使用的引物为oMT93A（GATCCCAGATGAAATGCAGGCTGCCATGTACAAAAACGACATCG；SEQ ID NO:920）和oMT93Arev（CGATGTCGTTTTTGTACATGGCAGCCTGCATTTCATCTGGGATC；SEQ ID NO:921）。所述反应混合物包含1μl处于pHR81-PIlv5-KARI-K9.G9-衍生载体中的K9_David_SH（20ng/μl）、1μl的各种引物（150ng/ul）、5μl10×反应缓冲液、1μldNTP混合物、1.5μlQuikSolution、1ul QuikChangeLightning酶和38.5μlddH2O。对于K9_Annabel_SH，引物被代之以oMT93I（GATCCCAGATGAAATGCAGGCTATCATGTACAAAAACGACATCG；SEQ ID NO:922）和oMT93Irev（CGATGTCGTTTTTGTACATGATAGCCTGCATTTCATCTGGGATC；SEQ ID NO:923）。
对于两个反应均使用以下的条件：起始温度为95℃下2分钟，随后为18轮加热/冷却循环。每个循环由95℃下20秒，60℃下10秒，68℃分钟下6分钟组成。在温度循环完成后，将样品保持在4℃下等待回收。向各反应中加入2μl的DpnI并在37℃下孵育所述混合物1小时。根据制造商的说明，将2μl的各个诱变反应物转化进入One
Figure BDA0000419940220002012
Stbl3TM化学感受态大肠杆菌（Invitrogen，目录号C7373-03）。将转化子涂布于包含LB培养基和100μg/ml氨苄青霉素（目录号L1004，Teknova Inc.Hollister，CA）的琼脂平板上，并在37℃下过夜孵育。随后选取多个转化子用于TempliPhiTMDNA sequencingTM（GEHealthcare），其使用了引物pHR81-F（ACACCCAGTATTTTCCCTTTCC；SEQ ID NO:924）和pHR81-Rev（CTA GTG TAC AGA TGT ATG TCG G；SEQ ID NO:925）。将具有经证实的序列的变体（K9_Zeke_SH和K9_Annabel_SH，处于pHR81-PIlv5-KARI-K9.G9衍生载体）亚克隆进入pLH744的PmeI和SfiI位点（SEQ IDNO:930）。
实例43
在厌氧条件下生长于48孔平板中的K9SB2及衍生物的异丁醇生产
K9SB2、K9SB2_SH和K9SB2-T93A的酵母表达质粒（使用来自于pLH744的质粒制备，如实例42中所述）在厌氧条件下生长于48孔平板中的酵母的异丁醇生产。通过转化包含KARI变体的编码序列的质粒并在不含尿嘧啶的合成培养基上涂平板（1%乙醇作为碳源）而将异丁醇生产菌株制备于宿主PNY2259中（MATa ura3Δ::loxP his3Δpdc6Δpdc1Δ::P[PDC1]-DHAD|ilvD_Sm-PDC1t-P[FBA1]-ALS|alsS_Bs-CYC1t pdc5Δ::P[PDC5]-ADH|sadB_Ax-PDC5t gpd2Δ::loxP fra2Δ::P[PDC1]-ADH|adh_Hl-ADH1tadh1Δ::UAS（PGK1）P[FBA1]-kivD_Lg（y）-ADH1t yprcΔ15Δ::P[PDC5]-ADH|adh_Hl-ADH1t ymr226cΔald6Δ::loxP）。来自在SE-Ura平板上进行的转化的酵母菌落在30℃下孵育3-5天后出现。来自各个变体的至少三个菌落点覆于新鲜的SE-Ura平板上，并在30℃下孵育。
酵母驯化条件：
有氧驯化培养基：SE-Ura培养基，具有2g/l乙醇。
厌氧驯化培养基：SEG–Ura，具有30g/l葡萄糖和1g/l乙醇，补充以10mg/l麦角固醇、50mMMES缓冲液（pH5.5）、30mg/l硫胺素以及30mg/l烟酸。
48孔平板：Axygen目录号P-5ML-48-C-S，总体积5mL/孔，培养体积为1.5mL/孔。
以透气粘性膜（VWR；目录号60941-086）覆盖平板以用于有氧驯化。在30℃下以225rpm振荡平板。对于厌氧驯化，透气膜覆盖的新鲜接种平板通过在无氧室中平衡2小时来排净氧气。随后将平板覆层换成粘性铝覆层（VWR；目录号89049-034）并将各平板与新鲜的除氧剂包（Mitsubishi Gas Chemical America，Inc；New York，NY；目录10-01）一起置于气密性塑料盒中（Mitsubishi Gas Chemical America，Inc；NewYork，NY；目录50-25）。将整个组装物（密封气密性塑料盒中的平板和除氧剂包）从无氧室中移出并在30℃下以225rpm振荡。
实验规程
将SE–Ura琼脂平板上的单酵母菌落划线于新鲜的SE–Ura琼脂平板上并在30℃孵育直至生长出浓密菌斑。以含有这些细胞的接种环接种48孔平板中的液体预培养物来进行初始的有氧驯化。在过夜振荡后，通过将各孔的0.15ml转移至平底96孔平板并使用Molecular Devices（Sunnyvale，CA）酶标仪在600nm下测量各孔的吸光度来测量各培养物孔的OD600。基于实验测定的校准线而进行的线性转换被应用于这些酶标仪测出的光密度，以此将它们转化成为与基于比色皿的分光光度计可比较的吸光度值。
将各有氧预培养孔经计算的样份接种到具有1.5ml的SEG-Ura培养基的新鲜48孔平板，从而达到了0.2的起始OD600（比色皿分光光度计吸光度单位）。在对新鲜平板接种的过程中，对所述有氧预培养平板进行离心，从各孔中去除上清液并将各孔中的细胞重悬浮于新鲜的SEG–Ura培养基中。将这一厌氧驯化平板振荡3天。通过HPLC测量所述培养物上清液中的异丁醇浓度（表41）。
表41：在第一轮厌氧传代循环中达到的异丁醇滴度
Figure BDA0000419940220002031
通过所述第一轮厌氧驯化起始了后续的厌氧驯化，如下进行：将各种厌氧培养物孔的计算样份接种到具有1.5mLSEG–Ura培养基的新鲜48-孔平板，从而达到0.2的初始OD600（比色皿分光光度计吸光度单位）。在接种该新鲜平板的过程中，对所述生长平板进行离心，从各孔中去除上清液，并将各孔中的细胞重悬浮于新鲜的SEG–Ura培养基中，用于最小化一组驯化向下一组中的代谢物携带污染。将后续的（第二轮）厌氧驯化平板振荡2天。通过HPLC测量所述培养物上清液中的异丁醇浓度（表42）。
表42：在第二轮厌氧传代循环中达到的异丁醇滴度
Figure BDA0000419940220002041
实例44
K9G9、K9SB2和K9SB2_SH的动力学表征
K9G9、K9SB2、K9SB2_SH通过pBAD.KARI质粒在大肠杆菌菌株Bw25113（ΔilvC）中过表达并进行纯化以用于动力学参数的精密测量。
表达、纯化和辅因子动力学分析如实例18中所描述而进行，具有如下的改进。表达培养物在20mL的LB（具有100μg/mL氨苄青霉素和0.2%（w/v）阿拉伯糖）在125mL的通气盖烧瓶中生长。对表达培养基以1/10体积的8小时培养物进行接种。对于K9SB2，将表达培养物生长18小时，对于K9SB2_SH生长24小时。
表43：比较以NADH和NADPH进行反应的动力学参数
Figure BDA0000419940220002042
实例45
K9SB2和衍生物的异丁醇生产
在48孔平板中进行了异丁醇生产分析，如实例42中所描述，具有如下改进。有氧和厌氧驯化培养基与实例19中所描述的相同，但是添加了0.01%w/v组氨酸。使用Cary300分光光度计（Agilent Technology，Wilmington，DE）测量了有氧预培养物的OD600值。使用具有M-20转子的Heraeus Multifug X1R（Thermo Scientific，Waltham，MA）来沉淀有氧预培养物孔并弃去耗尽的驯化培养基。将具有细胞团块的平板转移进入Coy无氧袋（Grass Lake，MI）并向各个团块加入100μL的厌氧驯化培养基。在48-孔平板接受1.5mL等分试样之前所述对厌氧驯化培养基脱气至少24小时；这一过程在该无氧袋中进行。使用适当体积的细胞重悬液接种厌氧培养平板并且使用粘性铝箔覆盖。将平板置于MCG2.5LAnaeroPack系统中（MCG，Japan）。密封该盒并从无氧袋中移取并置于30℃的培养箱中以220rpm振荡80小时。每种变体分析了三组转化子，对于K9D3和K92B2分析了六组转化子（表44）。
表44：异丁醇滴度
变体 SEQ ID NO: 异丁醇滴度，mM
K9D3 645 76.4±9.7
K9SB2 427 93.8±3.3
K9_Frank 440 27.8±0.5
K9_Grace 445 89.4±15.5
K9_Ingrid 455 88.3±5.4
K9_Jarvis 437 91.8±5.8
K9_Kelly 452 40.9±4.5
K9_Norman 481 66.2±10.6
K9_Ophelia 488 28.3±5.3
K9_Pat 441 77.1±25.6
K9_Quentin 495 80.1±10.8
K9_Ralph 496 82.1±21.3
K9_Sophia 502 25.3±13.4
K9_Tiberius 509 11.4±10.4
K9_Ursala 511 57.3±26.2
K9_Victor 514 93.0±11.4
在血清瓶中进行了异丁醇生产分析以选择变体，如实例19中所描述，具有如下改进。KARI变体通过来自pLH744的质粒表达于酵母中，所述质粒如实例42中所描述而制备。将组氨酸加入有氧预培养和厌氧生长培养基中达到最终浓度0.01%w/v。各变体分析了三组或四组转化子（表45、46和47）。
表45：异丁醇滴度实验1
Figure BDA0000419940220002061
表46：异丁醇滴度实验2
Figure BDA0000419940220002062
表47：异丁醇滴度
变体 SEQ ID NO: 传代 小时 异丁醇滴度，mM
K9SB2 427 2 50 66.2±1.8
Annabel_SH 862 2 50 74.4±2.4
Zeke_SH 860 2 50 76.8±8.3
Figure BDA0000419940220002071
Figure BDA0000419940220002081
Figure BDA0000419940220002091
Figure BDA0000419940220002101
Figure BDA0000419940220002111
Figure BDA0000419940220002121
Figure BDA0000419940220002141
Figure BDA0000419940220002151
Figure BDA0000419940220002161
Figure BDA0000419940220002171
Figure BDA0000419940220002191
Figure BDA0000419940220002201
Figure BDA0000419940220002221
Figure BDA0000419940220002231
Figure BDA0000419940220002241
Figure BDA0000419940220002251
Figure BDA0000419940220002281
Figure BDA0000419940220002291
Figure BDA0000419940220002301
Figure BDA0000419940220002311

Claims (74)

1.重组宿主细胞，包含工程化的异丁醇生产途径以及
a.下列中的至少一个：
i.具有酮醇酸还原异构酶（KARI）活性的异源多肽，其选自：
1.与来源于角双歧杆菌（Bifidobacterium angulatum）、齿双歧杆菌（Bifidobacterium dentium）、运动发酵单胞菌（Zymomonasmobilis）、拜氏梭菌（Clostridium beijerinckii）或粪厌氧棒状菌（Anaerostipes caccae）的KARI酶或其活性片段具有至少约90%同一性的多肽；
2.与SEQ ID NO:27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、或65具有至少约90%同一性或至少约95%同一性的多肽；或
ii.编码a）的具有KARI活性的异源多肽的异源多核苷酸；和
b.至少一个宿主细胞修饰，其增强所述工程化的异丁醇生产途径的性能。
2.根据权利要求1所述的重组宿主细胞，其中a）和b）的组合引起异丁醇生产途径性能中的协同提高。
3.根据权利要求1或权利要求2所述的重组宿主细胞，其中所述宿主细胞修饰包括降低或消除的醛脱氢酶表达或活性和降低或消除的乙酰乳酸还原酶表达或活性。
4.根据权利要求3所述的重组宿主细胞，包含降低或消除的醛脱氢酶表达或活性和降低或消除的乙酰乳酸还原酶表达或活性，并且其中所述具有KARI活性的异源多肽针对NADH具有小于300μM的KM。
5.根据权利要求1所述的重组宿主细胞，其中所述具有KARI活性的异源多肽与SEQ ID NO:27、29、141、143、275、或277具有至少约90%或至少约95%同一性。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的重组宿主细胞，其中所述具有KARI活性的异源多肽包含对应于SEQ ID NO:27的S56和S58的氨基酸中的替换。
7.根据权利要求6所述的重组宿主细胞，其中所述具有KARI活性的异源多肽还包含对应于SEQ ID NO:27的I86、N87、T131、或T191的一个或多个氨基酸的替换。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的重组宿主细胞，其中所述宿主细胞在约48小时后具有至少约3、至少约4、或至少约5克/克细胞的有效异丁醇产率，其中所述48小时中的至少最后约24小时处于厌氧条件下。
9.根据权利要求1-8中任一项所述的重组宿主细胞，其中所述具有KARI活性的异源多肽在pH6.8下针对NADH具有小于约350、小于约100、小于约50、或小于约10μM的KM。
10.根据权利要求1所述的重组宿主细胞，其中所述具有KARI活性的异源多肽包含对应于SEQ ID NO:27的氨基酸A41、S56、S58、I87、T131、T191、R227、或Q246的一个或多个位置处的氨基酸替换。
11.根据权利要求1-10中任一项所述的重组宿主细胞，其中所述宿主细胞修饰包括编码具有醛脱氢酶活性的多肽的内源多核苷酸中缺失、突变、或替换中的至少一个。
12.根据权利要求11所述的重组宿主细胞，其中所述具有醛脱氢酶活性的多肽对应于酶学委员会编号EC1.21.3、EC1.2.1.4、EC1.2.1.5、或它们的组合。
13.根据权利要求11-12中任一项所述的重组宿主细胞，其中所述宿主细胞是啤酒糖酵母（S.cerevisiae），并且所述具有醛脱氢酶活性的多肽是ALD2、ALD3、ALD4、ALD5、ALD6、或它们的同源物。
14.根据权利要求11-12中任一项所述的重组宿主细胞，其中所述宿主细胞是乳酸克鲁维酵母（K.lactis），并且所述具有醛脱氢酶活性的多肽是KLLA0F00440、KLLA0E23057、KLLA0D10021、或KLLA0D09999G。
15.根据权利要求11-12中任一项所述的重组宿主细胞，其中所述宿主细胞是树干毕赤酵母（P.stipitis），并且所述具有醛脱氢酶活性的多肽是ALD2、ALD3、ALD4、ALD5、或ALD7。
16.根据权利要求11-12中任一项所述的重组宿主细胞，其中所述宿主细胞是植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum），并且所述具有醛脱氢酶活性的多肽是AldH。
17.根据权利要求11-12中任一项所述的重组宿主细胞，其中所述宿主细胞是大肠杆菌（E.coli），并且所述具有醛脱氢酶活性的多肽是aldA、aldB、或aldH。
18.根据权利要求1-17中任一项所述的重组宿主细胞，其中所述宿主细胞包含编码具有醛氧化酶活性的多肽的内源多核苷酸中缺失、突变、或替换中的至少一个或多个。
19.根据权利要求18所述的重组宿主细胞，其中所述具有醛氧化酶活性的多肽对应于酶学委员会编号EC1.2.3.1。
20.根据权利要求19所述的重组宿主细胞，其中所述具有醛氧化酶活性的多肽是AOX1、AOX2、或它们的组合。
21.根据权利要求1-20中任一项所述的重组宿主细胞，其中所述宿主细胞包含编码具有乙酰乳酸还原酶活性的多肽的内源多核苷酸中至少一个或多个缺失、突变、或替换。
22.根据权利要求21所述的重组宿主细胞，其中所述内源多核苷酸选自：SEQ ID NO:676、SEQ ID NO:678、SEQ ID NO:680、SEQ IDNO:682、SEQ ID NO:684、SEQ ID NO:686、SEQ ID NO:688、SEQID NO:690、SEQ ID NO:692、SEQ ID NO:694、SEQ ID NO:696、SEQ ID NO:702、SEQ ID NO:704、SEQ ID NO:706、SEQ ID NO:708、SEQ ID NO:710、SEQ ID NO:712、SEQ ID NO:714、SEQ IDNO:716、SEQ ID NO:718、SEQ ID NO:720、SEQ ID NO:722、SEQID NO:724、SEQ ID NO:726、SEQ ID NO:728和SEQ ID NO:730。
23.根据权利要求21所述的重组宿主细胞，其中所述具有乙酰乳酸还原酶活性的多肽是YMR226C。
24.根据权利要求21-23中任一项所述的重组宿主细胞，其中所述宿主细胞是酵母宿主细胞。
25.根据权利要求24所述的重组宿主细胞，其中所述酵母是糖酵母（Saccharomyces）、裂殖酵母（Schizosaccharomyces）、汉逊酵母（Hansenula）、假丝酵母（Candida）、克鲁维酵母（Kluyveromyces）、耶氏酵母（Yarrowia）、伊萨酵母（Issatchenkia）、或毕赤酵母（Pichia）。
26.根据权利要求1或25所述的重组宿主细胞，其中所述宿主细胞是啤酒糖酵母。
27.根据权利要求1-26中任一项所述的重组宿主细胞，其中所述工程化的异丁醇生产途径包括下列底物至产物的转化：
a.丙酮酸至乙酰乳酸；
b.乙酰乳酸至2,3-二羟基异戊酸；
c.2,3-二羟基异戊酸至2-酮异戊酸；
d.2-酮异戊酸至异丁醛；以及
e.异丁醛至异丁醇，
其中每个底物至产物的转化通过由所述宿主细胞重组表达的酶催化。
28.根据权利要求27所述的重组宿主细胞，其中所有底物至产物的转化通过对于所述宿主细胞异源的酶催化。
29.根据权利要求28所述的重组宿主细胞，其中至少一个异源多核苷酸经染色体整合到所述宿主细胞中，所述异源多核苷酸编码对于所述宿主细胞异源的酶中的至少一个。
30.根据权利要求27-29中任一项所述的重组宿主细胞，其中所述底物至产物的转化通过基本上定位于细胞溶胶的酶催化。
31.根据权利要求27-30中任一项所述的重组宿主细胞，其中所述异丁醛至异丁醇的底物至产物的转化通过利用NADH作为辅因子的醇脱氢酶催化。
32.根据权利要求1-31中任一项所述的重组宿主细胞，其中所述宿主细胞还包含降低、破坏或消除的将乙酰乳酸转化成2,3-二羟基-2-甲基丁酸的能力。
33.根据权利要求1-32中任一项所述的重组宿主细胞，其中所述宿主细胞是酵母，并且具有降低、破坏或消除的丙酮酸脱羧酶表达或活性。
34.根据权利要求33所述的重组宿主细胞，其中所述宿主细胞具有降低、破坏或消除的PDC1、PDC5、或PDC6活性、或它们的组合。
35.根据权利要求1-34中任一项所述的重组宿主细胞，其中所述宿主细胞具有降低或消除的NAD-依赖型甘油-3-磷酸脱氢酶表达或活性。
36.根据权利要求35所述的重组宿主细胞，其中所述宿主细胞具有降低的GPD2表达或活性。
37.根据权利要求1-36中任一项所述的重组宿主细胞，其中所述宿主细胞具有降低或消除的FRA2表达或活性。
38.根据权利要求1-37中任一项所述的重组宿主细胞，其中所述宿主细胞在厌氧条件下产生异丁醇，并且其中异丁醇与甘油的摩尔比大于1。
39.根据权利要求1-38中任一项所述的重组宿主细胞，其中所述具有KARI活性的多肽以<10-3的序型HMME值匹配表Z中提供的序型HMM。
40.根据权利要求1-39中任一项所述的重组宿主细胞，其中所述宿主细胞以大于理论收率约25%、约50%、约75%、或约90%的收率生产异丁醇。
41.根据权利要求1-40中任一项所述的重组宿主细胞，其中产生异丁醇，并且其中也产生乙醇。
42.生产异丁醇的方法，包括：
a.提供权利要求1-41中任一项的重组宿主细胞，以及
b.在由此产生异丁醇的条件下，使a）的宿主细胞与碳底物接触。
43.根据权利要求42所述的方法，其中所述接触的至少一部分在厌氧条件下进行。
44.根据权利要求42或43所述的方法，其中所述接触在提取剂存在下进行。
45.根据权利要求44所述的方法，其中所述接触在足量的有机提取剂存在下进行以形成包含水相和有机相的两相体系。
46.根据权利要求42-45中任一项所述的方法，其中与并不包含（i）具有KARI活性的异源多肽或编码具有KARI活性的多肽的异源多核苷酸中的至少一个和（ii）增强所述工程化的异丁醇生产途径性能的至少一个修饰的重组宿主细胞相比，异丁醇的有效速率、有效滴度、或有效收率中的一个或多个是提高的。
47.根据权利要求42-46中任一项所述的方法，其中与并不包含（i）具有KARI活性的异源多肽或编码具有KARI活性的多肽的异源多核苷酸中的至少一个和（ii）增强所述工程化的异丁醇生产途径性能的至少一个修饰的重组宿主细胞相比，DHMB产量、异丁酸产量、或两者均是降低的。
48.根据权利要求42-47中任一项所述的方法，其中所述异丁醇与甘油的摩尔比大于1。
49.发酵组合物，包含所述宿主细胞和根据权利要求42-28中任一项所述的方法产生的异丁醇。
50.生产异丁醇的方法，包括：
a.提供产生异丁醇的重组宿主细胞；
b.在由此产生异丁醇的条件下，使a）的宿主细胞与碳底物接触；
其中所述接触的至少一部分在厌氧条件下进行；并且
其中所述产生的异丁醇与甘油的比率大于1。
51.生产丁醇的方法，包括：
a.使重组酵母在由此产生丁醇的条件下生长，所述重组酵母包含能够将丙酮酸转化成乙酰乳酸的生物合成途径；以及
b.从所述培养物中移除DHMB。
52.组合物，其通过权利要求51的方法产生，其中所述组合物包含丁醇和不超过约0.5mM的DHMB。
53.组合物，包含i）能够产生丁醇的重组酵母，ii）丁醇，和iii）不超过约0.5mM的DHMB。
54.制备重组宿主细胞的方法，包括：
a.提供重组宿主细胞，其包含编码具有醛脱氢酶活性或醛氧化酶活性的多肽的多核苷酸中的修饰；以及
b.用编码异丁醇生物合成途径的多肽的多核苷酸转化所述宿主细胞。
55.降低或消除异丁醛至异丁酸的转化的方法，包括：
a.提供权利要求1-41中任一项的重组宿主细胞；以及
b.对所述宿主细胞施以条件，其中与并不包含降低或消除的醛脱氢酶和/或醛氧化酶活性的重组宿主细胞相比，所述异丁醛至异丁酸的转化是降低或消除的。
56.组合物，包含异丁醇和权利要求1-41中任一项的重组宿主细胞。
57.多肽，所述多肽与SEQ ID NO:29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、417、419、421、423、425、427、429、431、433、434、435、436、437、438、439、440、441、442、443、444、445、446、447、448、449、450、451、452、453、454、455、456、457、458、459、460、461、462、463、464、465、466、467、468、469、470、471、472、473、474、475、476、477、478、479、480、481、482、483、484、485、486、487、488、489、490、491、492、493、494、495、496、497、498、499、500、501、502、503、504、505、506、507、508、509、510、511、512、513、514、515、516、517、518、519、520、521、522、523、524、525、526、527、528、529、530、531、532、533、534、535、536、537、624、626、628、630、632、或它们的活性片段包含至少约90%同一性或至少约95%同一性或至少约99%同一性，其中所述多肽具有酮醇酸还原异构酶活性。
58.多肽，所述多肽与SEQ ID NO:417、419、421、423、425、或427、或它们的活性片段包含至少约90%同一性或至少约95%同一性或至少约99%同一性，其中所述多肽具有酮醇酸还原异构酶活性。
59.多核苷酸，其编码权利要求57或58的多肽。
60.将乙酰乳酸转化成2,3-二羟基异戊酸的方法，包括：
a.提供权利要求57或58的多肽；
b.在由此产生2,3-二羟基异戊酸的条件下，使a）的多肽与乙酰乳酸接触。
61.重组宿主细胞，包含权利要求57、权利要求58的异源多肽或权利要求59的多核苷酸。
62.重组酵母，包含能够将丙酮酸转化成乙酰乳酸的生物合成途径，其中所述酵母产生小于0.01摩尔2,3-二羟基-2-甲基丁酸（DHMB）/摩尔消耗的糖。
63.重组酵母，包含能够将丙酮酸转化成乙酰乳酸的生物合成途径，其中所述酵母以小于约1.0mM/小时的速率产生DHMB。
64.重组酵母，包含能够将丙酮酸转化成乙酰乳酸的生物合成途径，其中所述酵母产生2,3-二羟基-3-异戊酸（DHIV）的量是所述产生DHMB的量的至少约1.5倍。
65.生产丁醇的方法，包括：
a)使重组酵母在由此产生丁醇的条件下生长，所述重组酵母包含能够将丙酮酸转化成乙酰乳酸的生物合成途径；以及
b)测量DHIV和/或DHMB的浓度；
其中步骤a）和b）可同时进行或以任何顺序先后进行。
66.根据权利要求65所述的方法，其中所述测量包括液相色谱-质谱法。
67.提高酮醇酸还原异构酶（KARI）活性的方法，包括：a）提供包含乙酰乳酸、KARI酶和乙酰乳酸还原酶的组合物，以及b）降低DHMB水平。
68.根据权利要求67所述的方法，其中所述降低DHMB水平是通过降低乙酰乳酸还原酶的酶活性而实现的。
69.根据权利要求67所述的方法，其中所述降低DHMB水平是通过从所述组合物中移除DHMB而实现的。
70.提高二羟酸脱水酶（DHAD）活性的方法，包括：a）提供包含二羟基异戊酸（DHIV）和DHAD酶的组合物，以及b）降低DHMB水平。
71.提高宿主细胞中KARI酶产率的方法，其中所述宿主细胞包含工程化的异丁醇生产途径，所述途径包含异源KARI酶和降低、破坏或消除乙酰乳酸还原酶表达或活性的至少一个遗传修饰，并且其中在DHMB存在下，所述KARI酶活性是降低的。
72.根据权利要求71所述的方法，其中所述KARI与大肠杆菌或乳酸乳球菌（L.lactis）的KARI具有至少约90%、至少约95%或至少约99%同一性。
73.根据权利要求71或72所述的方法，其中所述降低、破坏或消除的乙酰乳酸还原酶表达或活性实质上降低所述DHMB的存在。
74.根据权利要求1所述的重组宿主细胞，包含编码具有KARI活性的多肽的异源多核苷酸，所述多肽包含SEQ ID NO:33、或35、或它们的活性片段。
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