CN111378681A - 生产达玛烯二醇-ii糖苷的重组菌及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种生产达玛烯二醇‑II糖苷3β‑O‑Glc‑DM的方法及重组菌的构建方法，由上述方法获得的重组菌，以及上述重组菌在制备3β‑O‑Glc‑DM中的用途。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体而言，本发明涉及一种产达玛烯二醇-II糖苷 3β-O-Glc-DM的重组菌的构建方法，由上述方法获得的重组菌，以及上述重组菌 在制备达玛烯二醇-II糖苷3β-O-Glc-DM中的用途。
背景技术
人参(Panax ginseng C.A.Meyer)是传统名贵药材，具有抗癌、抗衰老、抗 糖尿病、抗高血压、免疫调节和神经保护等多种药理活性，其中人参皂苷是人参 的主要生物活性成分。迄今为止，已从人参属植物中分离鉴定了150多种天然人 参皂苷。人参皂苷的结构和功能的多样性取决于苷元结构以及糖基配体的类型、 数量和位置。根据苷元骨架不同，可分为达玛烷型四环三萜类皂苷和齐墩果烷型 五环三萜类皂苷。达玛烷型皂苷在人参皂苷中占绝大多数，其进一步分为原人参 二醇(PPD)型和原人参三醇(PPT)型人参皂苷。PPD型人参皂苷通过PPD在 C3-OH和/或C20-OH处的糖基化合成，而PPT型人参皂苷通过PPT在C6-OH和/ 或C20-OH处的糖基化合成。此外，羟基和糖基的位置和数量差异导致了人参皂苷的生物活性的多样性。
据报道，达玛烷型人参皂苷的细胞毒活性与其苷元的羟基数量呈负相关。而 从人参属植物中从未分离到过以达玛烯二醇-II(DM)为底物的三萜类皂苷。DM 作为PPD的直接前体，具有比PPD和PPT更少的羟基，仅在C3和C20位具有两 个羟基，故推测C3位糖基化的DM和C20位糖基化的DM可能具有比PPD型和 PPT型人参皂苷更高的细胞毒活性。体外药理学活性检测表明3β-O-Glc-DM对多 株结肠癌细胞系具有生长抑制作用；体内药理学评价结果显示无论单独或与5-FU 联合使用，3β-O-Glc-DM对C26结肠癌异种移植瘤的生长抑制作用明显高于对照 组Rg3和Compound K。
近年来，研究人员已从人参属植物中克隆并鉴定了多种UDP-糖基转移酶 (UGT)基因，其中，来源于人参属植物的PgUGT74AE2能够选择性地催化PPD、 Compound K的C3-OH发生糖基化反应，分别生成Rh2和F2。人参皂苷生物合成 相关UGT研究为通过代谢工程生产天然或非天然人参皂苷奠定了基础。
本发明从人参中分别克隆得到编码达玛烯二醇-II合酶(DS)和PgUGT74AE2 的基因。将PgUGT74AE2在大肠杆菌BL21(DE3)中进行异源表达，通过体外酶 促反应得到DM糖苷3β-O-Glc-DM。通过将密码子优化的DS和PgUGT74AE2基 因导入己糖激酶2基因敲除的酿酒酵母，利用酵母酵母内源性萜类生物合成基因， 构建了3β-O-Glc-DM的生物合成途径。通过CRISPR/Cas9系统将DS和 PgUGT74AE2基因整合到酵母基因组中，过表达3β-O-Glc-DM生物合成途径上游 的几种关键酶，下调竞争性分支代谢途径和过表达转录激活因子HAC1等策略， 优化重组菌的生物合成途径，以提高3β-O-Glc-DM的产量。本研究为生产 3β-O-Glc-DM提供了一种有效的方法，可为新药研究提供候选化合物。
发明内容
本发明人已经发现，在产DM的重组菌中，当达玛烯二醇-II合酶(DS) 与绿色荧光蛋白(GFP)融合表达时，重组菌中DM的产量明显提高。
本发明人还发现，人参糖基转移酶PgUGT74AE2能够选择性地催化DM 的C3-OH，生成3β-O-Glc-DM。
进一步，本发明人发现将糖酵解途径关键酶己糖激酶2敲除，能够调整糖 酵解途径代谢流，从而增加重组菌中DM的产量。
为了获得产3β-O-Glc-DM的重组菌以及构建该菌株的方法，本发明在以下段 落中提供了：
[1]一种构建重组菌的方法，所述方法包括如下步骤：将酿酒酵母中的己 糖激酶2基因敲除，并向所述酿酒酵母中导入DS与GFP的融合蛋白的编码基 因表达盒和人参PgUGT74AE2的编码基因表达盒。
[2]根据[1]所述的方法，所述方法还包括如下步骤：提高所述酿酒酵母中 的3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶的活性。
[3]根据[1]或[2]任一所述的方法，所述方法还包括以下一种或多种：
提高酿酒酵母中的异戊烯基焦磷酸异构酶IDI1的活性；
提高酿酒酵母中的法尼基焦磷酸合酶ERG20的活性；
提高酿酒酵母中的角鲨烯单加氧酶ERG1的活性；
提高酿酒酵母中的鲨烯合酶ERG9的活性；
降低酿酒酵母中的羊毛甾醇合酶ERG7的活性；
增加酿酒酵母中的分子伴侣BiP的水平；
增加酿酒酵母中的转录因子HAC1的水平；或者
增加酿酒酵母中的二硫键异构酶PDI1的水平。
[4]根据[1]-[3]中任一所述的方法，其中，所述DS与GFP的融合蛋白的 编码基因表达盒包含由SEQ ID NO:1所示的DS与GFP的融合蛋白的编码基 因。
[5]根据[1]-[4]中任一所述的方法，其中，所述PgUGT74AE2的编码基因 表达盒包含由SEQ ID NO:2所示的PgUGT74AE2的编码基因。
[6]根据[2]所述的方法，其中，通过向所述酿酒酵母中导入3-羟基-3-甲基 戊二酰辅酶A还原酶编码基因tHMG1表达盒，来提高所述酿酒酵母中的3-羟 基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶的活性。
[7]根据[3]-[6]中任一所述的方法，其中，
通过向酿酒酵母中导入异戊烯基焦磷酸异构酶IDI1的编码基因表达盒， 来进行所述提高酿酒酵母中的异戊烯基焦磷酸异构酶IDI1的活性；
通过向酿酒酵母中导入法尼基焦磷酸合酶ERG20的编码基因表达盒，来 进行所述提高酿酒酵母中的法尼基焦磷酸合酶ERG20的活性；
通过向酿酒酵母中导入角鲨烯单加氧酶ERG1的编码基因表达盒，来进行 所述提高酿酒酵母中的角鲨烯单加氧酶ERG1的活性；
通过向酿酒酵母中导入鲨烯合酶ERG9的编码基因表达盒，来进行所述提 高酿酒酵母中的鲨烯合酶ERG9的活性；
通过向酿酒酵母中导入羊毛甾醇合酶ERG7反义片段的表达盒，来进行所 述降低酿酒酵母中的羊毛甾醇合酶ERG7的活性；
通过向酿酒酵母中导入分子伴侣BiP的编码基因表达盒，来进行所述增加 酿酒酵母中的分子伴侣BiP的水平；
通过向酿酒酵母中导入转录因子HAC1的编码基因表达盒，来进行所述增 加酿酒酵母中的转录因子HAC1的水平；或者
通过向酿酒酵母中导入二硫键异构酶PDI1的编码基因表达盒，来进行所 述增加酿酒酵母中的二硫键异构酶PDI1的水平。
[8]根据[7]所述的方法，其特征在于：
编码IDI1的核苷酸序列为由SEQ ID NO:4所示的序列；
编码ERG20的核苷酸序列为由SEQ ID NO:5所示的序列；
编码ERG1的核苷酸序列为由SEQ ID NO:6所示的序列；
编码ERG9的核苷酸序列为由SEQ ID NO:7所示的序列；
编码ERG7反义片段的核苷酸序列为由SEQ ID NO:8所示的序列；
编码BiP的核苷酸序列为由SEQ ID NO:8所示的序列；
编码HAC1的核苷酸序列为由SEQ ID NO:10所示的序列；或者
编码PDI1的核苷酸序列为由SEQ ID NO:11所示的序列。
[9]根据[1]-[8]中任一所述的方法，其中，将所述表达盒整合到酿酒酵母 基因组，优选地采用CRISPR/Cas9来进行所述表达盒的整合。
[10]由[1]-[9]中任一所述的方法得到的重组菌。
[11]由[9]所述重组菌在生产3β-O-Glc-DM中的应用。
[12]一种生产3β-O-Glc-DM的方法，所述方法包括对如[9]所述的重组菌 进行发酵得到3β-O-Glc-DM。
发明详述
本发明的第一方面是提供了一种构建重组菌的方法，所述方法包括如下步 骤：将酿酒酵母中的己糖激酶2基因敲除，并向所述酿酒酵母中导入达玛烯二 醇-II合酶与GFP的融合蛋白(以下简称为DS-GFP)的编码基因表达盒和人 参糖基转移酶PgUGT74AE2的编码基因表达盒。
在本发明中，达玛烯二醇-II合酶可为人参来源的达玛烯二醇-II合酶。在 一个优选实施方式中，可使用人参达玛烯二醇-II合酶基因ds(No.AB265170.1)。
绿色荧光蛋白GFP是从维多利亚多管水母中分离到的一种荧光蛋白，该 蛋白在450nm-490nm的蓝光激发下可以发出绿色荧光，这使它成为一种理想 的报告分子。众多研究将目的蛋白与GFP融合表达，通过观察绿色荧光对目 的蛋白进行亚细胞定位，并探索其生物学功能。在本发明中，GFP编码基因可 为任何能够编码GFP的多核苷酸。
在本发明中，可将GFP融合在达玛烯二醇-II合酶的C端。
在本发明中，GFP可与达玛烯二醇-II合酶直接相连，或者GFP与达玛烯 二醇-II合酶之间还可存在间隔序列，例如，2～40个氨基酸、优选5～20个氨基 酸。在本发明的优选实施方式中，可将GFP融合在达玛烯二醇-II合酶的C端。
在一个优选实施方式中，DS-GFP的编码基因为由SEQ ID NO:1所示的序 列(其描述于梁会超等，人参达玛烯二醇-II合酶在酿酒酵母中的表达、定位 及功能研究，药学学报，Acta Pharmaceutica Sinica 2016，51(6)：998-1003 中记载的方法制备，以引用的方式将其整体并入本文)。
在本发明的一个实施方式中，所述DS-GFP表达盒进一步具体包含启动子 TEF1、DS-GFP的编码基因、终止子CYC1。
在本发明的优选实施方式中，根据人参糖基转移酶PgUGT74AE2(No. JX898529.1)的cDNA序列信息，根据酿酒酵母密码子偏爱性，合成优化的基 因PgUGT74AE2序列(SEQ IDNO:2)。
在本发明的一个实施方式中，所述人参糖基转移酶PgUGT74AE2编码基 因表达盒进一步具体包含启动子TDH3、PgUGT74AE2编码基因、终止子ADH2。
在本发明中，通过本领域已知手段进行酿酒酵母中己糖激酶2基因的敲除。 例如，采用同源重组的方式，敲除己糖激酶2基因HXK2。
在本发明中，可使用基因HXK2缺失的双倍体和单倍体酿酒酵母突变株， 优选使用单倍体酿酒酵母突变株。
在本发明的进一步的实施方式中，所述方法还包括如下步骤：提高所述酿 酒酵母中的3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶的活性。
3-羟基-3-甲基-戊二酰CoA还原酶(HMGR)是甲羟戊酸代谢途径中的第 一个关键酶，催化3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A生成甲羟戊酸，该反应也是人 参皂苷生物合成途径的第一个限速步骤。HMGR含有N端跨膜结构域和C端 催化结构域，分别发挥定位和催化作用。细胞中HMGR过量表达会导致甲羟 戊酸代谢途径的反馈抑制，即HMGR催化的下游产物会激活锚定在内质网膜 上的HMGR进入降解途径，因此其跨膜结构域的定位作用在HMGR降解途径 中发挥重要作用。有鉴于此，通过去除跨膜结构域，截短HMGR基因并进行 过表达，可以有效降低甲羟戊酸代谢途径的反馈抑制作用，从而促进下游产物 的生物合成。在酿酒酵母中，甲羟戊酸途径中的HMGR有两个成员，分别为 Hmg1p和Hmg2p，由基因HMG1和HMG2编码，其中HMG1编码的Hmg1p 发挥主要作用。编码HMGR催化结构域的基因tHMG1的cDNA序列(No.NM_001182434.1)为由SEQ ID NO:3所示的序列。
在本发明中，过表达HMGR催化结构域，既增加了上游前体2,3-氧化鲨 烯的供应，同时也避免了由下游产物积累导致的反馈抑制，最终使重组菌中 DM的含量显著提高。
因此，在本发明的优选方式中，提高3-羟基-3-甲基-戊二酰CoA还原酶的 活性水平的方法可为导入3-羟基-3-甲基-戊二酰CoA还原酶编码基因tHMG1 表达盒。
在本发明的一个实施方式中，所述3-羟基-3-甲基-戊二酰CoA还原酶编码 基因表达盒进一步具体包含启动子PGK1、tHMG1、终止子ADH1。
在本发明的方法中，所述方法进一步包括以下一种或多种：
提高酿酒酵母中的异戊烯基焦磷酸异构酶IDI1的活性；
提高酿酒酵母中的法尼基焦磷酸合酶ERG20的活性；
提高酿酒酵母中的角鲨烯单加氧酶ERG1的活性；
提高酿酒酵母中的鲨烯合酶ERG9的活性；
降低酿酒酵母中的羊毛甾醇合酶ERG7的活性；
增加酿酒酵母中的分子伴侣BiP的水平；
增加酿酒酵母中的转录因子HAC1的水平；或者
增加酿酒酵母中的二硫键异构酶PDI1的水平。
在具体的实施方式中，通过向酿酒酵母中导入异戊烯基焦磷酸异构酶IDI1 的编码基因表达盒，来提高酿酒酵母中的异戊烯基焦磷酸异构酶IDI1的活性；
通过向酿酒酵母中导入法尼基焦磷酸合酶ERG20的编码基因表达盒，来 提高酿酒酵母中的法尼基焦磷酸合酶ERG20的活性；
通过向酿酒酵母中导入角鲨烯单加氧酶ERG1的编码基因表达盒，来提高 酿酒酵母中的角鲨烯单加氧酶ERG1的活性；
通过向酿酒酵母中导入鲨烯合酶ERG9的编码基因表达盒，来提高酿酒酵 母中的鲨烯合酶ERG9的活性；
通过向酿酒酵母中导入羊毛甾醇合酶ERG7反义片段的表达盒，来降低酿 酒酵母中的羊毛甾醇合酶ERG7的活性；
通过向酿酒酵母中导入分子伴侣BiP的编码基因表达盒，来增加酿酒酵母 中的分子伴侣BiP的水平；
通过向酿酒酵母中导入转录因子HAC1的编码基因表达盒，来增加酿酒酵 母中的转录因子HAC1的水平；或者
通过向酿酒酵母中导入二硫键异构酶PDI1的编码基因表达盒，来增加酿 酒酵母中的二硫键异构酶PDI1的水平。
在一个实施方式中，所述异戊烯基焦磷酸异构酶IDI1的编码基因表达盒 可包括启动子TDH3、异戊烯基焦磷酸异构酶IDI1的编码基因、终止子TPI1。
在一个实施方式中，编码IDI1的核苷酸序列为由SEQ ID NO:4所示的序 列。
在一个实施方式中，所述法尼基焦磷酸合酶ERG20的编码基因表达盒可 包括启动子PGK1、法尼基焦磷酸合酶ERG20的编码基因、终止子ADH1。
在一个实施方式中，编码ERG20的核苷酸序列为由SEQ ID NO:5所示的 序列。
在一个实施方式中，所述角鲨烯单加氧酶ERG1的编码基因表达盒可包括 启动子PGK1、角鲨烯单加氧酶ERG1的编码基因、终止子ADH1。
在一个实施方式中，编码ERG1的核苷酸序列为由SEQ ID NO:6所示的 序列。
在一个实施方式中，所述鲨烯合酶ERG9的编码基因表达盒可包括启动子 TEF1、鲨烯合酶ERG9的编码基因、终止子TPI1。
在一个实施方式中，编码ERG9的核苷酸序列为由SEQ ID NO:7所示的 序列。
在一个实施方式中，所述羊毛甾醇合酶ERG7反义片段的编码基因表达盒 可包括启动子TEF1、羊毛甾醇合酶ERG7反义片段的基因、终止子CYC1。
在一个实施方式中，编码ERG7反义片段的核苷酸序列为由SEQ ID NO:8 所示的序列。
在一个实施方式中，所述分子伴侣BiP的编码基因表达盒可包括启动子 TEF1、分子伴侣BiP的编码基因、终止子CYC1。
在一个实施方式中，编码BiP的核苷酸序列为由SEQ ID NO:9所示的序 列。
在一个实施方式中，所述转录因子HAC1的编码基因表达盒可包括启动子 TEF1、转录因子HAC1的编码基因、终止子CYC1。
在一个实施方式中，编码HAC1的核苷酸序列为由SEQ ID NO:10所示的 序列。
在一个实施方式中，所述二硫键异构酶PDI1的编码基因表达盒可包括启 动子TEF1、二硫键异构酶PDI1的编码基因、终止子CYC1。
在一个实施方式中，编码PDI1的核苷酸序列为由SEQ ID NO:11所示的 序列。
在本发明的实施方式中，可将上述表达盒分别整合进酿酒酵母细胞的基因 组。也可将上述各表达盒彼此连接并整合进酿酒酵母细胞的基因组。例如，可 将所有的表达盒串联连接并整合进酿酒酵母细胞的基因组。或者，可将上述表 达盒构建成多个表达模块，然后整合进酿酒酵母细胞的基因组。在本发明中， 表达模块是指可操作地连接的两个以上表达盒。在本发明中，表达盒和/或表 达模块可整合进一个或多个位点。在本发明中，优选采用CRISPR/Cas9来进 行表达盒和/或表达模块的整合。
在优选的实施方式中，可将达玛烯二醇-II合酶与GFP的融合蛋白的编码 基因表达盒、人参糖基转移酶PgUGT74AE2的编码基因表达盒和3-羟基-3-甲 基戊二酰辅酶A还原酶编码基因表达盒整合进酿酒酵母基因组δ1位点。可将 异戊烯基焦磷酸异构酶IDI1的编码基因表达盒、法尼基焦磷酸合酶ERG20的 编码基因表达盒、角鲨烯单加氧酶ERG1的编码基因表达盒、鲨烯合酶ERG9 的编码基因表达盒以及羊毛甾醇合酶ERG7反义片段的表达盒整合到酿酒酵母 基因组δ4位点。可将分子伴侣BiP的编码基因表达盒、转录因子HAC1的编码基因表达盒以及二硫键异构酶PDI1的编码基因表达盒整合到酿酒酵母基因 组rDNA位点。
在优选的实施方式中，可将达玛烯二醇-II合酶与GFP的融合蛋白的编码 基因表达盒、人参糖基转移酶PgUGT74AE2的编码基因表达盒和3-羟基-3-甲 基戊二酰辅酶A还原酶编码基因表达盒进一步构建成表达模块，并整合进酿酒 酵母基因组δ1位点。可将异戊烯基焦磷酸异构酶IDI1的编码基因表达盒、法 尼基焦磷酸合酶ERG20的编码基因表达盒、角鲨烯单加氧酶ERG1的编码基 因表达盒、鲨烯合酶ERG9的编码基因表达盒以及羊毛甾醇合酶ERG7反义片 段的表达盒进一步构建成表达模块，并整合到酿酒酵母基因组δ4位点。可将分子伴侣BiP的编码基因表达盒、转录因子HAC1的编码基因表达盒以及二硫 键异构酶PDI1的编码基因表达盒构建成表达模块，并整合到酿酒酵母基因组 rDNA位点。
在进一步的优选方式中，本发明构建了基于酿酒酵母基因组δ1位点的 CRISPR/Cas9系统，利用该系统中的核酸内切酶Cas9介导的双链断裂，通过 同源重组机制，获得本发明的酵母工程菌。
本发明的酿酒酵母可为本领域可获得的任何酿酒酵母。例如，可商购的酿 酒酵母INVSc1、酿酒酵母BY4742、酿酒酵母YPH499或酿酒酵母W303-1B 等。
本发明所述的编码基因表达盒是整合进酿酒酵母基因组中；或者，这些 编码基因表达盒以质粒的形式存在于酿酒酵母细胞中。
在一些实施方式中，质粒载体选自pESC-HIS、pESC-URA、pESC-TRP 和pESC-TRP(invitrogen，美国)。
本发明中的达玛烯二醇-II合酶、GFP、糖基转移酶PgUGT74AE2、3-羟基 -3-甲基戊二酰辅酶A还原酶、异戊烯基焦磷酸异构酶、法尼基焦磷酸合酶、 角鲨烯单加氧酶、鲨烯合酶、羊毛甾醇合酶、分子伴侣BiP、转录因子HAC1 或二硫键异构酶PDI1可为：
(a)天然存在的野生型酶；
(b)野生型酶的多肽经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而 形成的、或是添加信号肽序列后形成的，并具有相应活性的多肽；
(c)序列中含有(a)或(b)中所述多肽序列的多肽；
(d)氨基酸序列与野生型酶的氨基酸序列的一致性≥85％或≥90％(较佳 地≥95％)，并具有野生型酶活性的多肽。
在本发明中，所使用的编码基因可为编码上述(a)-(d)中任一项的天 然多核苷酸序列(例如，cDNA序列、基因组序列或RNA等)，或其简并的变 异体。如本文所用，“简并的变异体”在本发明中是指能够编码上述(a)-(d) 中任一项的蛋白，但与天然多核苷酸序列有差别的多核苷酸序列。优选使用密 码子优化的DNA序列。多核苷酸通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成 的方法获得。
外源基因表达盒在酿酒酵母中可整合入基因组中进行表达，也可以游离 于基因组外的质粒形式表达。
酿酒酵母游离型载体可为商购的载体，或具有相同功能的任何载体。例 如，游离型载体可为pESC系列载体，包括pESC-HIS、pESC-URA、pESC-TRP 和pESC-TRP；pYES2；或pAUR123(invitrogen，美国)。
将外源基因整合入酵母基因组的方法主要为同源重组。同源重组的方法 包括，扩增整合位点的上下游序列作为上游同源臂或下游同源臂，构建目的基 因表达盒(包含启动子、目的基因和终止子)，通常在上游同源臂中还含有筛 选标记基因，然后将上述构件按照上游同源臂、基因表达盒和下游同源臂的顺 序进行连接，以形成可用于同源重组的片段；将获得的用于同源重组的片段导 入酿酒酵母中，根据筛选标记筛选阳性转化子，从而获得整合型重组酿酒酵母。
酿酒酵母基因组中的整合位点可选自以下位点：δ位点，酿酒酵母染色体 上多个δ基因中的1-10个随机位置；rDNA位点，酿酒酵母染色体上多个核糖 体基因中的1-10个随机位置；HIS3位点，酿酒酵母染色体上组氨酸生物合成 途径中HIS3基因位置；或者，Trp1位点，酿酒酵母染色体上色氨酸生物合成 途径中Trp1基因位置。
可用的酿酒酵母基因整合筛选标记可为本领域技术人员已知的任何筛选 标记，只要向同一酿酒酵母菌株整合不同片段时所使用的筛选标记彼此不同即 可。常见的筛选标记有营养缺陷型筛选标记和抗性筛选标记。其中，营养缺陷 型筛选标记可选自LEU、HIS、URA或TRP。抗性筛选标记可为G418或HYG。
启动子可为在酿酒酵母中能够使用的任何启动子。例如，启动子可选自 由以下启动子所组成的组：pPGK、pADH1、pTDH3、pTEF2、pPDC1以及pTPI1。 终止子可为在酿酒酵母中能够使用的任何终止子。例如，终止子可选自由以下 终止子所组成的组：PGK1t、ADH1t以及FBA1t。
采用本领域已知的方法将同源重组片段或重组质粒导入酿酒酵母中。其中， 转化酿酒酵母的方法可使用本领域技术人员已知的各种转化方法，例如电转化 法、醋酸锂化学转化法等。
降低酿酒酵母中麦角甾醇合酶的活性水平可通过降低麦角甾醇合酶基因 erg7的表达水平或降低麦角甾醇合酶蛋白活性的方式。
在本发明的重组菌株的构建方法中，可使用本领域技术人员已知的任何方 法来使靶基因(例如erg7基因)的表达水平下降或使麦角甾醇合酶活性下降 (包括使靶基因失活)，此类方法包括但不限于：基因敲除、定点突变或RNA 干扰(RNAi)。
在本发明的涉及RNAi的实施方式中，对于实现RNAi的方法也没有特别 限定，可采用本领域技术人员所熟知的各种RNAi技术，例如，可以通过使用 小干扰RNA(siRNA)、反义核酸、微RNA(microRNA)等来阻碍靶基因(例 如erg7基因)的转录或翻译，从而引起靶基因的表达水平下降。
本发明第二方面是提供了由本发明第一方面所述的方法制备的重组菌。
本发明第三方面是第二方面所述的重组菌在生产3β-O-Glc-DM中的应用。
本发明第四方面是提供了一种生产3β-O-Glc-DM的方法，所述方法包括对 第二方面所述的重组菌进行发酵得到3β-O-Glc-DM。
在本发明中，对重组菌的发酵可根据本领域中的各种已知方法进行。
有益技术效果
本发明通过将达玛烯二醇-II合酶基因和人参糖基转移酶PgUGT74AE2基 因转入己糖激酶HXK2基因敲除的酿酒酵母，获得了产达玛烯二醇-II糖苷 3β-O-Glc-DM的重组菌。在此基础上，通过采用CRISPR/Cas9技术促进外源基 因在酿酒酵母基因组中的整合，过表达上游关键酶异戊烯基焦磷酸异构酶、法 尼基焦磷酸合酶、角鲨烯单加氧酶和鲨烯合酶，采用反义技术下调羊毛甾醇合 酶的表达，过表达转录因子HAC1，使工程菌中3β-O-Glc-DM的产量进一步提 高。本发明首次获得了产稀有人参皂苷3β-O-Glc-DM的高产工程菌，为其大 规模生产奠定了基础。
附图说明
图1示出了敲除元件LoxP-KanMX-LoxP的构建示意图。
图2示出了酿酒酵母初级代谢相关基因HXK2(己糖激酶2)基因左右同 源臂扩增电泳图。其中，1:HXK2左同源臂；2:HXK2右同源臂
图3示出了KanMX基因表达盒扩增电泳图。
图4示出了敲除元件LoxP-KanMX-LoxP的电泳结果。其中，1:HXK2基 因敲除元件
图5示出了基因敲除菌株验证的诊断PCR引物的示意图。
图6示出了HXK2基因敲除菌株的电泳验证结果。其中，泳道1和泳道5引 物：HXK2-1F/KanMX-R；泳道2和泳道6引物：KanMX-F/HXK2-2R；泳道3 和泳道7引物：HXK2-1F/HXK2-2R；泳道4和泳道8引物：HXK2-YF/YR。 其中，Y-△HXK2：敲除HXK2基因的YPH499；WT：YPH499基因组。
图7示出了整合模块Ⅰ和Ⅱ的电泳结果。
图8示出了整合模块Ⅳ、Ⅴ和Ⅵ的电泳结果。
图9示出了整合模块Ⅶ、Ⅷ和Ⅸ的电泳结果。
图10示出了各整合模块构建示意图。
图11示出了Cas9表达盒元件PTEF1-Cas9-TCYC1(1)和融合元件 gRNA-PTEF1-Cas9-TCYC1(2)的电泳结果。
图12示出了标准品3β-O-Glc-DM的标准曲线。
图13示出了重组菌中3β-O-Glc-DM的HPLC检测结果。
图14示出了重组菌中3β-O-Glc-DM的LC-MS检测结果。
图15示出了重组菌Y1C的基因型以及高产菌株筛选结果。图15A示出了 重组菌Y1C的基因型；图15B示出了重组菌Y1C-1至Y1C-20的3β-O-Glc-DM 的产量。
图16示出了重组菌Y1CS的基因型以及高产菌株筛选结果。图16A示出 了重组菌Y1CS的基因型；图16B示出了重组菌Y1CS-1至Y1CS-20的 3β-O-Glc-DM的产量。
图17示出了重组菌Y1CSB、Y1CSH和Y1CSP的基因型以及高产菌株筛 选结果。图17A示出了重组菌Y1CSB、Y1CSH和Y1CSP的基因型；图17B示出了重组菌Y1CSB-1至Y1CSB-10、Y1CSH-1至Y1CSH-10、以及Y1CSP-1 至Y1CSP-10的3β-O-Glc-DM的产量。
图18示出了产3β-O-Glc-DM酵母重组菌的摇瓶培养产量检测结果。
图19示出了产3β-O-Glc-DM酵母重组菌的高密度发酵产量检测结果。
具体实施方式
下文描述了本发明的示例性实施方式，本领域技术人员应该明了的是，以 下实施方式并不限制本发明的特定实施方式，应理解为包括本发明的精神和范 围内的所有变体、等同物或替代物。多种调整和其它实施方式在本领域普通技 术人员的能力范围内，并预期落入本发明的范围内。
除非另有说明，下文所使用的实验方法均为本领域技术人员所熟知的常规 方法，例如，可利用下列著作中描述的标准程序来实施：Sambrook等，《分子 克隆实验指南》(第3版)(Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor LaboratoryPress，Cold Spring Harbor，N.Y.，USA，2001)；Davis等， 《分子生物学基本方法》(BasicMethods in Molecular Biology，Elsevier Science Publishing，Inc.，New York，USA，1995)；以及Juan S.Bonifacino等，《细胞 生物学实验室指南》(Current Protocols inCell Biology，John Wiley and Sons， Inc.)。
实施例
借助于下述实施例可更好地理解本发明，这些实施例仅用于举例说明本发 明，不应被解释为对本发明的限制。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1.酵母基因敲除元件LoxP-KanMX-LoxP的构建
基因敲除元件包括两端与目的基因5′和3′非编码区同源的部分，中间含 有卡那霉素抗性基因(KanMX)作为报告基因，用于筛选基因缺失突变株。以 质粒pUC6为模板，利用引物KAN-F/R，扩增得到Kan抗性基因表达盒(kanMX)。 利用重叠延伸PCR(OE-PCR)技术，将靶基因的左右同源臂及Kan抗性基因 表达盒(kanMX)分别进行融合，得到目的基因敲除元件。LoxP-KanMX-LoxP 敲除元件的获得如图1所示。
根据GenBank Nucleotide(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/)查找并获取酿酒酵母初级代谢相关基因HXK2(己糖激酶2)的核苷酸序列 (NC_001139.9)，根据序列信息设计引物(表1)，分别以HXK2-1F/R和2F/R 作为上下游引物，以酿酒酵母INVSc1基因组DNA为模板，利用高保真酶扩 增上述各个目的基因的左右同源臂(序列分别为SEQ ID NO:12和SEQ ID NO: 13)(图2)，条带大小约360～400bp。
表1基因敲除元件的引物序列
根据质粒pUC6序列信息设计引物(表2)，以该质粒为模板，用表2中的 引物KAN-F和KAN-R扩增Kan抗性表达盒(kanMX)(SEQ ID NO:14)(图 3)，目的条带大小为1613bp，其表达的氨基糖苷磷酸转移酶能够使卡那霉素 失活，从而作为抗性标记对基因敲除菌进行筛选。
表2抗性基因克隆引物序列
PCR扩增体系如下(50μL)：
PCR扩增条件如下：
98℃，30s；
98℃，10s；55-60℃，30s；72℃，1kb/15-30s；30循环；
72℃，5min；
4℃，∞；
1.0％的琼脂糖凝胶电泳检测上述PCR产物。
回收得到的目的基因左右同源臂和抗性基因表达盒，利用OE-PCR，以引 物CF/CR扩增获得目的基因敲除元件。
OE-PCR反应体系(50uL)：
OE-PCR扩增条件：
95℃，30s；
95℃，10s；50-60℃，30s；72℃，1kb/15-30s；10循环；
95℃，10s；55℃，30s；72℃，1kb/15-30s；20循环；
72℃，5min；
4℃，∞；
电泳结果显示，融合片段的实际大小与理论值一致(图4)。
取4μL OE-PCR产物与1μL克隆载体pEASY-Blunt simple vector连接，转 化Trans1-T1感受态细胞；筛选阳性转化子，提取质粒，对质粒进行测序，获 得目的基因敲除元件LoxP-KanMX-LoxP全序列，并将构建成功的质粒命名为 pEASY-HXK2。
实施例2酿酒酵母的转化及敲除菌株的筛选
将酵母基因敲除元件LoxP-KanMX-LoxP转入酿酒酵母YPH499感受态细 胞。利用LiAC/ssDNA/PEG酵母转染法，依次加入下述转染混合物：
用50μL ddH2O取代目的基因敲除元件作为对照。取适量酿酒酵母 YPH499感受态细胞，加入上述体系进行酵母转化实验。转化后，将实验组和 对照组细胞液分别用玻璃棒涂布于含抗生素G418(0.3mg/ml)的固体培养基 平板，30℃，培养2d，直至转化子出现。(注意：加入PEG3350后，充分混 悬细胞液；ssDNA需提前采用100℃处理10min解链，并立即置于冰上冷却)。
挑取G418抗性平板上的长势良好的相应转化子，提取酿酒酵母转化子基 因组DNA作为模板，选取相应诊断PCR引物HXK2-1F/HXK2-2R、 HXK2-1F/M-A、M-B/HXK2-2R、HXK2-YF/HXK2-YR(表1和表3)，筛选基 因敲除的阳性转化子。诊断PCR引物设计如图5所示。
表3诊断PCR引物序列
利用诊断PCR筛选基因敲除的阳性转化子，分别取诊断PCR样品5uL进 行琼脂糖凝胶电泳检测，结果显示，利用同源重组机制，成功筛选到了基因 HXK2缺失的双倍体和单倍体酿酒酵母突变株(图6)。
如图6所示，以转化了HXK2敲除元件的酿酒酵母YPH499单菌落及其相应 野生型酵母基因组DNA为模板，以3对诊断引物HXK2-1F/KanMX-R、 KanMX-F/HXK2-2R、HXK2-1F/2R进行PCR诊断试验，与对照组相比，转化组分 别出现了与敲除元件理论大小相符的条带，说明敲除元件已发生同源重组，置换 掉基因组上的目的基因HXK2；同时，以基因自身引物HXK2-YF/YR进行验证时， 转化组未出现目的基因的相应条带，说明转化组出现的1.0Kb左右模糊的条带为 非特异扩增而非双倍体基因单敲除，综合以上结果，表明利用同源重组机制，敲除元件成功置换掉酿酒酵母基因组上的目的基因，获得了酿酒酵母HXK2基因缺 陷菌株，命名为Y-△HXK2。
本实施例中所构建的酿酒酵母基因缺陷型菌株见表4。
表4基因缺陷型酿酒酵母菌株
为了考察基因敲除后酿酒酵母在不同培养基中的生长状态，对Y-△HXK2进行 了时间生长曲线的测定。取上述遗传改造的酿酒酵母和野生型酿酒酵母接种于2 mL YPD液体培养基中，30℃，220rpm，振荡培养14h，使其处于对数生长期后 期并以此为种子液。将种子液分别以初始OD600为0.4的比例接种于30mL YPD、 YPG液体培养基中，并设置3组平行。菌液于30℃，220rpm振荡培养，分别在4 h、8h、12h、16h等时间点测定不同培养基中所获得的基因缺陷型酿酒酵母菌液 的紫外分光光度计600nm处的吸光度(OD)值。实验结果显示，敲除菌Y-△HXK2 在上述两种培养基中的生长速度均略高于对照菌YPH499，表明敲除HXK2基因不 影响YPH499的正常生长。
实施例3基因表达盒的构建
基因DS-GFP、PgUGT74AE2和tHMG1表达盒的构建
根据GenBank注册信息，获得来源于人参的达玛烯二醇-II合酶基因DS的 cDNA(No.AB265170.1)序列信息，根据酿酒酵母密码子偏爱性，合成优化的DS 基因以及DS-GFP序列(SEQ ID NO:1)，得到质粒pESC-HIS-DS-GFP(按照梁会 超等，人参达玛烯二醇-II合酶在酿酒酵母中的表达、定位及功能研究，药学学报， Acta Pharmaceutica Sinica 2016，51(6)：998-1003中记载的方法制备，以引用的 方式将其整体并入本文)。
以质粒pESC-HIS-DS-GFP为模板，以表5中的引物DS-TEF1-F和DS-CYC1-R， PCR扩增得到synDS-GFP基因(3036bp)；以酿酒酵母INVSc1基因组DNA作为 模板，分别以表5中的重叠延伸引物A-TEF1-delta1-F/TEF1-DS-R和 CYC1-DS-F/CYC1-PGK1-R，扩增得到酿酒酵母启动子TEF1(430bp，SEQ ID NO: 15)、终止子CYC1(189bp，SEQ ID NO:16)序列片段。利用OE-PCR，以表5 中的引物A-TEF1-delta1-F和CYC1-PGK1-R进行OE-PCR，融合得到synDS-GFP基因表达盒元件：PTEF1-synDS-GFP-TCYC1。
根据GenBank注册信息，获得来源于人参的糖基转移酶基因PgUGT74AE2(No.JX898529.1)的cDNA序列信息，根据酿酒酵母密码子偏爱性，合成优 化的基因PgUGT74AE2序列(SEQ ID NO:2)，获得质粒pUC57-PgUGT74AE2。
以质粒pUC57-PgUGT74AE2为模板，以表5中的引物UGT74AE2-TDH3-F 和UGT74AE2-ADH2-R，扩增得到synPgUGT74AE2基因(1356bp)；以酿酒 酵母INVSc1基因组DNA为模板，分别以表5中的引物 TDH3-ADH1-F/TDH3-UGTPg1-R和ADH2-UGTPg1-F/ADH2-HIS-R，扩增得 到酿酒酵母启动子TDH3(800bp，SEQ ID NO:17)、终止子ADH2(566bp， SEQ ID NO:18)序列片段。利用OE-PCR，以表5中的引物TDH3-ADH1-F和 ADH2-HIS-R进行OE-PCR，融合得到synDS-GFP基因表达盒元件： PTDH3-synPgUGT74AE2-TADH2。
根据GenBank注册的酿酒酵母3-羟基-3-甲基戊二酰CoA还原酶基因 HMG1的cDNA序列(No.NM_001182434.1)设计引物 tHMG1-PGK1-F/tHMG1-ADH1-R。
以酿酒酵母INVSc1基因组DNA为模板，以表5中的引物tHMG1-PGK1-F 和tHMG1-ADH1-R，扩增得到编码HMGR催化结构域的tHMG1基因(1634bp， SEQ ID NO:3)；以酿酒酵母INVSc1基因组DNA为模板，分别以表5中的引 物PGK1-CYC1-F/PGK1-tHMG1-R和ADH1-tHMG1-F/ADH1-R，扩增得到酿酒 酵母启动子PGK1(750bp，SEQ ID NO:19)、终止子ADH1(158bp，SEQID NO:20)序列片段。利用OE-PCR，以引物PGK1-CYC1-F和ADH1-R进行 OE-PCR，融合得到tHMG1基因表达盒元件：PPGK1-tHMG1-TADH1。
表5基因克隆引物序列
取4μL OE-PCR产物与1μL克隆载体pEASY-Blunt-Zero vector连接，转 化Trans1-T1感受态细胞；筛选阳性转化子，提取质粒，分别命名为 pEASY-DS-GFP，pEASY-PgUGT74AE2，pEASY-tHMG1。经测序后，目的片 段的测序结果与理论序列一致。
基因IDI1、ERG20、ERG1、ERG9和ERG7-表达盒的构建
根据GenBank注册的酿酒酵母异戊烯基焦磷酸异构酶IDI1基因的DNA 序列(No.NC_001148.4)设计引物IDI1-TDH3-F和IDI1-TPI1-R(表6)。
以酿酒酵母YPH499基因组DNA为模板，以表6的引物IDI1-TDH3-F和 IDI1-TPI1-R，PCR扩增得到IDI1基因(867bp，SEQ ID NO:4)；以酿酒酵母 YPH499基因组DNA为模板，分别以重叠延伸引物 TDH3-TY4-1-F/TDH3-IDI1-R和TPI1-IDI1-F/TPI1-PGK1-R，扩增得到酿酒酵母 启动子TDH3(800bp，SEQ ID NO:17)、终止子TPI1(422bp，SEQ ID NO:21) 序列片段。利用OE-PCR，以引物TDH3-TY4-1-F和TPI1-PGK1-R进行OE-PCR， 融合得到IDI1基因表达盒元件：PTDH3-IDI1-TTPI1。
根据GenBank注册的酿酒酵母法尼基焦磷酸合酶基因ERG20的DNA序 列(No.NC_001142.9)设计引物ERG20-PGK1-F/ERG20-ADH1-R(表6)。
以酿酒酵母YPH499基因组DNA为模板，以表6中的引物ERG20-PGK1-F 和ERG20-ADH1-R，PCR扩增得到ERG20基因(1059bp，SEQ ID NO:5)； 以酿酒酵母YPH499基因组DNA为模板，分别以表6中的重叠延伸引物 PGK1-TPI1-F/PGK1-ERG20-R和ADH1-ERG20-F/ADH1-TEF1-R，扩增得到酿 酒酵母启动子PGK1(750bp，SEQ ID NO:19)、终止子ADH1(158bp，SEQID NO:20)序列片段。利用OE-PCR，以引物PGK1-TPI1-F和ADH1-TEF1-R 进行OE-PCR，融合得到ERG20基因表达盒元件：PPGK1-ERG20-TADH1。
根据GenBank注册的酿酒酵母角鲨烯单加氧酶基因ERG1的DNA序列(No.NC_001139.9)设计引物ERG1-PGK1-F/ERG1-ADH1-R(表6)。
以酿酒酵母YPH499基因组DNA为模板，以表6中的引物 ERG1-PGK1-F/ERG1-ADH1-R，PCR扩增得到ERG1基因(1491bp，SEQ ID NO: 6)；以酿酒酵母YPH499基因组DNA为模板，分别以表6中的重叠延伸引物 PGK1-CYC1-F/PGK1-ERG1-R和ADH1-ERG1-F/ADH1-TEF1-R，扩增得到酿酒 酵母启动子PGK1(750bp，SEQ ID NO:19)、终止子ADH1(158bp，SEQ ID NO:20)序列片段。利用OE-PCR，以引物PGK1-CYC1-F和ADH1-TEF1-R 进行OE-PCR，融合得到ERG1基因表达盒元件：PPGK1-ERG1-TADH1。
根据GenBank注册的酿酒酵母鲨烯合酶基因ERG9的DNA序列(No. NC_001140.6)设计引物ERG9-TEF1-F/ERG9-CYC1-R(表6)。
以酿酒酵母YPH499基因组DNA为模板，以表6中的引物 ERG9-TEF1-F/ERG9-CYC1-R，PCR扩增得到ERG9基因(1335bp，SEQ ID NO: 7)；以酿酒酵母YPH499基因组DNA为模板，分别以表6中的重叠延伸引物 TEF1-ADH1-F/TEF1-ERG9-R和CYC1-ERG9-F/CYC1-PGK1-R，扩增得到酿酒 酵母启动子TEF1(430bp，SEQ ID NO:15)、终止子CYC1(189bp，SEQ ID NO:16)序列片段。利用OE-PCR，以引物TEF1-ADH1-F和CYC1-PGK1-R 进行OE-PCR，融合得到ERG9基因表达盒元件：PTEF1-ERG9-TCYC1。
以质粒pESC-URA-ERG7-为模板(王庆华等，利用反义RNA技术抑制酿 酒酵母羊毛甾醇合酶基因的表达，药学学报，Acta Pharmaceutic Sinica 2015,50 (1)：118-122中记载的方法制备，以引用的方式将其整体并入本文)，以表6 中的引物ERG7-TEF1-F/ERG7-CYC1-R扩增ERG7反义基因长片段(2247bp， SEQ ID NO:8)；以酿酒酵母基因组DNA为模板，分别以表6中所列的引物 TEF1-ADH1-F/TEF1-ERG7-R和CYC1-ERG7-F/CYC1-LEU-R，扩增酿酒酵母 启动子TEF1(430bp，SEQ ID NO:15)、终止子CYC1(189bp，SEQ ID NO:16) 序列片段。利用OE-PCR，以引物TEF1-ADH1-F和CYC1-LEU-R进行OE-PCR， 融合得到ERG7反义基因表达盒元件：PTEF1-ERG7--TCYC1。
表6基因克隆引物序列
取4μL OE-PCR产物与1μL克隆载体pEASY-Blunt-Zero vector连接，转 化Trans1-T1感受态细胞；筛选阳性转化子，提取质粒，分别命名为pEASY-IDI1， pEASY-ERG1，pEASY-ERG20，pEASY-ERG9，pEASY-ERG7。测序确证目的 片段的序列与预期一致。
基因BiP、HAC1和PDI1表达盒的构建
根据GenBank注册的酿酒酵母分子伴侣BiP基因的DNA序列(No. NC_001142.9)设计引物BIP-TEF1-F和BIP-CYC1-R(表7)。
以酿酒酵母YPH499基因组DNA为模板，以表7中的引物BIP-TEF1-F 和BIP-CYC1-R，PCR扩增得到BiP基因(2049bp，SEQ ID NO:9)；以酿酒 酵母基因组DNA为模板，分别以表7中的重叠延伸引物GJ-F/TEF1-BIP-R和 CYC1-BIP-F/GJ-R，扩增得到酿酒酵母启动子TEF1(430bp，SEQ ID NO:15)、 终止子CYC1(189bp，SEQ ID NO:16)序列片段。利用OE-PCR，以引物GJ-F 和GJ-R进行OE-PCR，融合得到BiP基因表达盒元件：PTEF1-BiP-TCYC1。
根据GenBank注册的酿酒酵母转录因子HAC1基因的DNA序列(No. NC_001138.5)设计引物HAC1-TEF1-F和HAC1-CYC1-R(表7)。
以酿酒酵母YPH499基因组DNA为模板，以表7中的引物HAC1-TEF1-F 和HAC1-CYC1-R，PCR扩增得到HAC1基因(717bp，SEQ ID NO:10)；以 酿酒酵母YPH499基因组DNA为模板，分别以表7中的重叠延伸引物 GJ-F/TEF1-HAC1-R和CYC1-HAC1-F/GJ-R，扩增得到酿酒酵母启动子TEF1 (430bp，SEQ ID NO:15)、终止子CYC1(189bp，SEQ ID NO:16)序列片段。 利用OE-PCR，以引物GJ-F和GJ-R进行OE-PCR，融合得到BiP基因表达盒 元件：PTEF1-HAC1-TCYC1。
根据GenBank注册的酿酒酵母分子伴侣(二硫键异构酶)PDI1基因的DNA 序列(No.NC_001135.5)设计引物PDI1-TEF1-F和HAC1-CYC1-R(表7)。
以酿酒酵母YPH499基因组DNA为模板，以表7中的引物PDI1-TEF1-F 和PDI1-CYC1-R，PCR扩增得到PDI1基因(1569bp，SEQ ID NO:11)；以酿 酒酵母YPH499基因组DNA为模板，分别以重叠延伸引物GJ-F/TEF1-PDI1-R 和CYC1-PDI1-F/GJ-R，扩增得到酿酒酵母启动子TEF1(430bp，SEQ ID NO: 15)、终止子CYC1(189bp，SEQ ID NO:16)序列片段。利用OE-PCR，以引 物GJ-F和GJ-R进行OE-PCR，融合得到PDI1基因表达盒元件： PTEF1-PDI1-TCYC1。
表7基因克隆及质粒构建引物序列
取4μL OE-PCR产物与1μL克隆载体pEASY-Blunt-Zero vector连接，转 化Trans1-T1感受态细胞；筛选阳性转化子，提取质粒，分别命名为pEASY-BiP， pEASY-HAC1，pEASY-PDI1。测序确证目的片段序列与预期一致。
实施例4基因组整合模块的构建 整合模块Ⅰ δ1-1-PTEF1-synDS-GFP-TCYC1-PPGK1-tHMG1-TADH1的构建
以酿酒酵母INVSc1基因组DNA为模板，分别以表8中所列的引物 Delta1-2F和Delta2-1R，扩增得到酿酒酵母基因组Delta1(δ1)位点序列片段 (410bp，SEQ ID NO:22)，将其连接到pEASY-Blunt-Simple vector，得到质粒 pEASY-INδ。以质粒pEASY-INδ为模板，以表8中所列的引物Delta1-2F和 Delta1-TEF1-2R扩增得到基因组整合位点δ1-1片段，通过OE-PCR，以表8 中的引物Delta1-2F和CYC1-PGK1-R将δ1-1片段和PTEF1-synDSGFP-TCYC1进行融合，得到元件δ1-1-PTEF1-synDS-GFP-TCYC1。
参照OE-PCR反应体系和条件，以元件δ1-1-PTEF1-synDS-GFP-TCYC1和 PPGK1-tHMG1-TADH1为模板，以表8中所列的引物Delta1-2F和ADH1-TDH3-R 进行第二轮OE-PCR，融合得到整合模块Ⅰ δ1-1-PTEF1-synDS-GFP-TCYC1-PPGK1-tHMG1-TADH1。取4μL第二轮OE-PCR产物 与1μL克隆载体pEASY-Blunt-Zero vector连接，转化Trans1-T1感受态细胞； 筛选阳性转化子，提取质粒并测序验证，重组质粒命名为pEASY-3。凝胶电泳 及DNA测序结果显示，扩增片段与理论序列相符(图7)。
整合模块Ⅱ overlap-PTDH3-synPgUGT74AE2-TADH2-HIS-δ1-2的构建
以质粒pEASY-3为模板，以表8中所列引物B-400F和ADH1-TDH3-R扩 增得到455bp的tHMGR基因表达盒3′端的片段用于OE-PCR，参照OE-PCR 反应体系和条件，以元件PTDH3-synPgUGT74AE2-TADH2和上述扩增得到的片段 为模板，以表8中所列引物B400-F和ADH2-HIS-R进行OE-PCR，融合得到 元件overlap-PTDH3-synPgUGT74AE2-TADH2。
以质粒pESC-HIS为模板，以表8中所列引物HIS-ADH2-F和HIS-Delta2-R 扩增得到抗性标记基因HIS表达盒序列(1169bp，SEQ ID NO:23)；以质粒 pEASY-INδ为模板，以表8中所列引物Delta2-HIS-1F和Delta2-1R扩增得到 基因组整合位点δ1-2片段。参照OE-PCR反应体系和条件，以表8中的引物 HIS-ADH2-F和Delta2-1R将δ1-2片段和基因HIS表达盒序列融合，得到 HIS-δ1-2。
参照OE-PCR反应体系和条件，以元件 overlap-PTDH3-synPgUGT74AE2-TADH2和HIS-δ1-2为模板，以表8中所列引物 B400-F和Delta2-1R进行第二轮OE-PCR，融合得到整合模块Ⅱ overlap-PTDH3-synPgUGT74AE2-TADH2-HIS-δ1-2。取4μL第二轮OE-PCR产物 与1μL克隆载体pEASY-Blunt-Zero vector连接，转化Trans1-T1感受态细胞； 筛选阳性转化子，提取质粒并测序验证，重组质粒命名为pEASY-1。凝胶电泳 及DNA测序结果显示，扩增片段与理论序列相符(图7)。
整合模块Ⅳ δ4-1-PTDH3-IDI1-TTPI1-PPGK1-ERG20-TADH1的构建
以酿酒酵母YPH499基因组DNA为模板，分别以表8中所列的引物TY4-F1 和TY4-R2，扩增得到酿酒酵母基因组Delta4(δ4)位点序列片段(371bp，SEQ ID NO:24)，将其连接到pEASY-Blunt-Simple vector，得到质粒pEASY-TY4。 以质粒pEASY-TY4为模板，以表8中所列的引物TY4-F1和TY4-1-TDH3-R 扩增得到基因组整合位点δ4-1片段，通过OE-PCR，以表8中的引物TY4-F1 和TPI1-PGK1-R将δ4-1片段和PTDH3-IDI1-TTPI1进行融合，得到元件 δ4-1-PTDH3-IDI1-TTPI1。
参照OE-PCR反应体系和条件，以元件δ4-1-PTDH3-IDI1-TTPI1和 PPGK1-ERG20-TADH1为模板，以表8中所列的引物TY4-F1和ADH1-TEF1-R进 行第二轮OE-PCR，融合得到整合模块Ⅳδ4-1-PTDH3-IDI1-TTPI1-PPGK1-ERG20-TADH1。取4μL第二轮OE-PCR产物与1μL 克隆载体pEASY-Blunt-Zero vector连接，转化Trans1-T1感受态细胞；筛选阳 性转化子，提取质粒并测序验证，重组质粒命名为pEASY-S28。凝胶电泳及 DNA测序结果显示，扩增片段与理论序列相符(图8)。
整合模块Ⅵ PPGK1-ERG1-TADH1-PTEF1-ERG7--TCYC1-LEU-δ4-2的构建
以质粒pESC-LEU为模板，以表8中所列引物LEU-CYC1-F和 LEU-TY4-2-R扩增得到抗性标记基因LEU2表达盒序列(2178bp，SEQ ID NO: 25)；以质粒pEASY-TY4为模板，以表8中所列引物TY4-2-LEU-F和TY4-2R 扩增得到基因组整合位点δ4-2片段。参照OE-PCR反应体系和条件，以引物 LEU-CYC1-F/TY4-2R将δ4-2片段和基因LEU2表达盒序列融合，得到LEU2-δ4-2。
参照OE-PCR反应体系和条件，以元件PPGK1-ERG1-TADH1， PTEF1-ERG7--TCYC1和LEU2-δ4-2为模板，以表8中所列的引物PGK1-CYC1-F 和TY4-2R进行第二轮OE-PCR，融合得到整合模块Ⅵ PPGK1-ERG1-TADH1-PTEF1-ERG7--TCYC1-LEU2-δ4-2。取4μL第二轮OE-PCR产物 与1μL克隆载体pEASY-Blunt-Zero vector连接，转化Trans1-T1感受态细胞； 筛选阳性转化子，提取质粒并测序验证，重组质粒命名为pEASY-S1319。凝胶 电泳及DNA测序结果显示，扩增片段与理论序列相符(图8)。
整合模块Ⅴ overlap-PTEF1-ERG9-TCYC1-overlap的构建
以质粒pEASY-S28为模板，以表8中所列的引物S28-400F/TEF1-ERG9-R 扩增得到515bp的ERG20基因表达盒3′端的片段作为用于OE-PCR的第一片 段；以质粒pEASY-S1319为模板，以表8中所列的引物PGK1-CYC1-F和 S1319-400R扩增得到548bp的ERG1基因表达盒5′端的片段作为用于OE-PCR 的第二片段；参照OE-PCR反应体系和条件，以元件PTEF1-ERG9-TCYC1和上述 扩增得到的两个片段为模板，以表8中所列的引物S28-400F和S1319-400R进行OE-PCR，融合得到整合模块Ⅴoverlap-PTEF1-ERG9-TCYC1-overlap。取4μL 第二轮OE-PCR产物与1μL克隆载体pEASY-Blunt-Zero vector连接，转化 Trans1-T1感受态细胞；筛选阳性转化子，提取质粒并测序验证，重组质粒命 名为pEASY-S813。凝胶电泳及DNA测序结果显示，扩增片段与理论序列相 符(图8)。
重组载体prDNA-TRP的构建
以酿酒酵母YPH499基因组DNA为模板，分别以表8中所列的引物 rDNA1-MQWD-F和rDNA2-MQWD-R，扩增得到酿酒酵母基因组rDNA位点 序列(1264bp，SEQ ID NO:26)，将其连接到pEASY-Blunt-Simple vector，得 到质粒pEASY-rDNA。以质粒pEASY-rDNA为模板，以表8中所列的引物 GJ-RDNA1-2U-F和rDNA1-MQWD-R扩增得到基因组整合位点rDNA-1片段； 以表8中所列的引物rDNA2-TRP-F和GJ-RDNA2-PUC-R扩增得到基因组整合 位点rDNA-2片段；以质粒pESC-TRP为模板，以表8中所列的引物 TRP-MQWD-F和TRP-rDNA2-R扩增得到抗性标记基因TRP表达盒序列 (1365bp，SEQ ID NO:27)；以质粒pESC-TRP为模板，以表8中所列的引物 PUC-GJ-RDNA2-F和2U-GJ-RDNA1-R扩增得到质粒骨架序列。参照eFusion 反应体系和条件，将上述四个片段进行无缝连接；将连接产物转化Trans1-T1 感受态细胞；筛选阳性转化子，提取质粒并测序验证，重组质粒命名为形成质 粒prDNA-TRP。
表8基因组整合模块引物序列
整合模块Ⅶ rDNA1-PTEF1-BiP-TCYC1-rDNA2的构建
使用限制性内切酶Sal I和Xho I对质粒prDNA-TRP和pEASY-BiP(实施 例3中得到)进行双酶切处理；使用胶回收试剂盒切胶回收酶切后的目标基因 片段和质粒载体；通过T4DNA连接酶，将PTEF1-BiP-TCYC1连接到prDNA-TRP， 获得重组prDNA-TRP-BiP；使用限制性内切酶BamH I和Sac I双酶切处理质 粒prDNA-TRP-BiP，获得整合模块ⅦrDNA1-PTEF1-BiP-TCYC1-rDNA2。凝胶电 泳及DNA测序结果显示，扩增片段与理论序列相符(图9)。
整合模块Ⅷ rDNA1-PTEF1-HAC1-TCYC1-rDNA2的构建
使用限制性内切酶Sal I和Xho I对质粒prDNA-TRP和pEASY-HAC1(实 施例3中得到)进行双酶切处理；使用胶回收试剂盒切胶回收酶切后的目的基 因片段和质粒载体；通过T4DNA连接酶，将PTEF1-HAC1-TCYC1连接到 prDNA-TRP，获得重组prDNA-TRP-HAC1；使用限制性内切酶BamH I和Sac I双酶切处理质粒prDNA-TRP-HAC1，获得整合模块Ⅷ rDNA1-PTEF1-HAC1-TCYC1-rDNA2。凝胶电泳及DNA测序结果显示，扩增片段 与理论序列相符(图9)。
整合模块Ⅸ rDNA1-PTEF1-PDI1-TCYC1-rDNA2的构建
使用限制性内切酶Sal I和Xho I对质粒prDNA-TRP和pEASY-PDI1(实 施例3中得到)进行双酶切处理；使用胶回收试剂盒切胶回收酶切后的目标基 因片段和质粒载体；通过T4DNA连接酶，将PTEF1-PDI1-TCYC1连接到 prDNA-TRP，获得重组prDNA-TRP-PDI1；使用限制性内切酶BamH I和Sac I双酶切处理质粒prDNA-TRP-PDI1，获得整合模块Ⅸ rDNA1-PTEF1-PDI1-TCYC1-rDNA2。凝胶电泳及DNA测序结果显示，扩增片段与 理论序列相符(图9)。
各整合模块构建示意图如图10所示。
其中，所用的双酶切体系和酶切条件如下所示：
双酶切体系(100μL)：
37℃酶切过夜。
其中，所用的连接体系和连接条件如下所示：
连接体系(20μL)：
室温下，连接30min，立即转化大肠杆菌Trans1-T1感受态细胞；筛选阳 性转化子并提取质粒。
其中，所用的eFusion连接体系和连接条件如下所示：
连接体系(15μL)：
室温下，连接30min，立即转化大肠杆菌Trans1-T1感受态细胞；筛选阳 性转化子并提取质粒。
Cas9表达质粒的构建
利用来源于化脓性链球菌(Streptococcus pyogenes)的密码子人源化Cas9蛋白，构建基于酿酒酵母基因组δ1位点的CRISPR-Cas9表达系统。
以质粒FM-1(Zhang等，2016，Fungal Genet Biol，86：47–57)为模板，以 表9所列引物Cas9-TEF1-F/Cas9-ADH2-R进行PCR，扩增得到来源于化脓性链球 菌的密码子人源化Cas9基因序列(4272bp，SEQ ID NO:28)；以酿酒酵母基因组 YPH499为模板，分别以表9所列引物TEF1-SUP4t-MSC-F/TEF1-Cas9-R、 ADH2-Cas9-F/ADH2-pESC-R，扩增得到酿酒酵母启动子TEF1p(430bp，SEQ ID NO:15)、终止子ADH2t(566bp，SEQ ID NO:29)序列片段。以表9所列引物 TEF1-SUP4t-MSC-F和ADH2-pESC-R进行OE-PCR，融合得到Cas9基因表达盒 元件：PTEF1-Cas9-TCYC1。凝胶电泳及DNA测序结果显示，扩增片段与理论序列相 符(图11)。
人工合成δ1位点特异性gRNA表达盒序列片段(458bp，SEQ ID NO:30)， 其中含有RNA聚合酶Ⅲ核仁小RNA(snoRNA)启动子SNR52p以及酵母tRNA 基因终止子SUP4t，将其连接于质粒pUC57，命名为pUC57-sgRNA。以质粒 pUC57-sgRNA为模板，分别以表9所列引物SNR52p-MSC-pESC-F/ SUP4t-MSC-TEF1-R，扩增δ1位点特异性gRNA表达盒序列片段。以pESC-URA 为模板，以表9所列引物pESC-ADH2-F/pESC-SNR52P-MCS-R，扩增获得质粒骨 架片段。
参照OE-PCR反应体系和条件，以元件PTEF1-Cas9-TCYC1和gRNA表达盒序列 为模板，以表9所列引物SNR52p-MSC-pESC-F和ADH2-pESC-R进行第二轮 OE-PCR，融合得到DNA元件gRNA-PTEF1-Cas9-TCYC1。凝胶电泳及DNA测序结果 显示，扩增片段与理论序列相符(图11)。
参照eFusion反应体系和条件，将DNA元件gRNA-PTEF1-Cas9-TCYC1与质粒骨 架片段进行无缝连接；将连接产物转化Trans1-T1感受态细胞；筛选阳性转化子， 提取质粒并测序验证，重组质粒命名为p-Cas9-δ。
表9构建CRISPR-Cas9表达质粒引物表
表10构建的重组质粒
实施例5酿酒酵母转化及重组菌筛选
采用LiAc/SS Carrier DNA/PEG转化法，将整合模块Ⅰ δ1-1-PTEF1-synDS-GFP-TCYC1-PPGK1-tHMG1-TADH1和整合模块Ⅱ overlap-PTDH3-synPgUGT74AE2-TADH2-HIS-δ1-2转化酿酒酵母突变株Y-△HXK2， 构建产3β-O-Glc-DM的酵母重组菌Y1；同时将整合模块Ⅰ δ1-1-PTEF1-synDS-GFP-TCYC1-PPGK1-tHMG1-TADH1、整合模块Ⅱ overlap-PTDH3-synPgUGT74AE2-TADH2-HIS-δ1-2和Cas9表达质粒p-Cas9-δ转化 酿酒酵母突变株Y-△HXK2，构建酵母重组菌Y1C。在SD营养缺陷型培养基 上筛选阳性转化子。分别从SD平板上挑取转化子，提取基因组DNA作为模 板，选择相应特异引物进行PCR扩增，验证基因模块的正确导入。
将整合模块Ⅳδ4-1-PTDH3-IDI1-TTPI1-PPGK1-ERG20-TADH1、整合模块Ⅴoverlap-PTEF1-ERG9-TCYC1-overlap和整合模块Ⅵ PPGK1-ERG1-TADH1-PTEF1-ERG7--TCYC1-LEU-δ4-2转化酿酒酵母重组菌Y1C19(在 工程菌Y1基础上转入上述整合模块Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ)，构建酵母重组菌Y1CS。在 SD营养缺陷型培养基上筛选阳性转化子。分别从SD平板上挑取转化子，提 取基因组DNA作为模板，选择相应特异引物进行PCR扩增，验证基因模块的 正确导入。
分别将整合模块ⅦrDNA1-PTEF1-BiP-TCYC1-rDNA2、整合模块Ⅷ rDNA1-PTEF1-HAC1-TCYC1-rDNA2、整合模块ⅨrDNA1-PTEF1-PDI1-TCYC1-rDNA2 转化酿酒酵母重组菌Y1CS6，构建酵母重组菌Y1CSB、Y1CSH、Y1CSP。在 SD营养缺陷型培养基上随机筛选阳性转化子。分别从SD平板上挑取转化子， 提取基因组DNA作为模板，选择相应特异引物进行PCR扩增，验证基因模块 的正确导入。
实施例6 3β-O-Glc-DM的标准曲线绘制
精密称取标准品3β-O-Glc-DM 5.0mg，甲醇溶解，配制为1.0mg/mL母液， 将其分别配制1.0mg/mL、0.5mg/mL、0.25mg/mL、0.125mg/mL、0.0625mg/mL 五份标准液，在色谱条件(HPLC条件检测条件：Cosmosil C18反相柱，4.6×150 mm，流速为1mL/min，紫外检测波长为203nm，进样10μL；流动相条件为： 0min，58％ACN；30min，58％ACN)下进样10μL，每个样品进样3次，以 峰面积的均值为纵坐标，样品浓度为横坐标，作标准曲线。
以峰面积的均值为纵坐标，样品浓度为横坐标，绘制标准曲线(图12)。 3β-O-Glc-DM在0.0625～1.0mg/mL范围内的线性回归方程是y＝4573.4x-11.19， R2＝0.9997。
实施例7产3β-O-Glc-DM重组菌的确证及优化
提取重组菌发酵产物，进行HPLC和LC-MS检测。HPLC结果显示，重 组菌和培养基提取物中均出现与3β-O-Glc-DM标准品紫外吸收和Rt一致的化 合物(图13)。LC-MS结果显示此化合物的碎片离子峰与3β-O-Glc-DM标准 品一致(图14)。
HPLC条件检测条件：Cosmosil C18反相柱，4.6×150mm，流速为1mL/min， 紫外检测波长为203nm，进样10μL。流动相条件为：0min，58％ACN；30min， 58％ACN。
分别随机挑取酵母重组菌Y1和Y1C的20个阳性转化子，于10mL YPD 培养基，30℃，200rpm，培养12h；测定OD600(10～20)，取适量培养液，转 接于50mL YPD培养基使其终OD600为0.2。在30℃和220rpm条件下，培养 重组菌Y1和Y1C 3d，分别离心收集菌体。
取重组菌干菌1.0g，加入100mL 70％乙醇，70℃回流1h，自然冷却，抽 滤去除菌体残渣，提取液减压蒸干，用100mL水溶解，分别用100mL水饱 和正丁醇萃取3次，每次静置1h。合并萃取液并蒸干正丁醇，用2mL甲醇溶 解产物，0.22μm滤膜过滤后进样10μL，进行HPLC检测，根据标准曲线测 定重组菌体内3β-O-Glc-DM含量。结果表明，重组菌Y1的20株转化子中， 只有两株菌有3β-O-Glc-DM产生；利用CRISPR/Cas9技术介导所得到的酵母 重组菌中，3β-O-Glc-DM产量明显提高，其中19号重组菌株产量最高。重组 菌Y1C的基因型以及筛选结果见图15。
分别随机挑取酵母重组菌Y1CS的20个阳性转化子，进行重组菌发酵和 产物提取检测。经HPLC检测，根据标准曲线测定重组菌体内3β-O-Glc-DM含 量。结果表明，通过过表达3β-O-Glc-DM生物合成途径上游关键酶，重组菌 中3β-O-Glc-DM产量进一步提高，其中6号酵母重组菌株产量最高。重组菌 Y1CS的基因型以及筛选结果见图16。
分别随机选取酵母重组菌Y1CSB、Y1CSH、Y1CSP的10个阳性转化子， 进行重组菌发酵和产物提取检测。经HPLC检测，根据标准曲线测定各株重组 菌体内3β-O-Glc-DM含量。结果表明，通过在酵母重组菌Y1CS过表达转录因 子HAC1，3β-O-Glc-DM产量明显提高，其中3号酵母重组菌株3β-O-Glc-DM 产量最高。重组菌Y1CSB、Y1CSH、Y1CSP的基因型以及筛选结果见图17。
实施例8产3β-O-Glc-DM工程菌摇瓶培养产量检测
分别于YPD固体平板活化产3β-O-Glc-DM酵母重组菌Y1、Y1C、Y1CS 和Y1CSH，30℃，200rpm，培养24h；挑取单菌落接种于10mLYPD液体培 养基，30℃，200rpm，培养12h后，转接于100mL YPD培养基使其终OD600为0.2。在30℃和220rpm条件下，培养酵母重组菌，其中分别在培养48h、 72h和96h时，向培养基中补加5mL补料培养基，继续培养至第6d，分别 离心收集菌体和发酵液，将菌体冷干。
称取干菌1.0g，加入100mL 70％乙醇，70℃回流1h，自然冷却，抽滤去 除菌体残渣，提取液减压蒸干，用100mL水溶解，分别用100mL水饱和正 丁醇萃取3次，每次静置1h。合并萃取液并蒸干正丁醇，用2mL甲醇溶解产 物，0.22μm滤膜过滤后进样10μL，进行HPLC检测，根据标准曲线测定重 组菌体内3β-O-Glc-DM含量。
取100mL离心后的发酵液上清，分别用100mL水饱和正丁醇萃取3次， 每次静置1h。合并萃取液并蒸干正丁醇，用2mL甲醇溶解产物，0.22μm滤 膜过滤后进样10μL，进行HPLC检测，根据标准曲线测定发酵液中 3β-O-Glc-DM含量。
通过HPLC定量分析得出，酵母重组菌Y1的3β-O-Glc-DM总产量为14.8 mg/L；采用CRISPR/Cas9技术，介导外源基因整合到酵母基因组而获得的酵 母重组菌Y1C的3β-O-Glc-DM总产量为115.3mg/L，相比Y1产量提高7.79 倍。通过过表达3β-O-Glc-DM生物合成途径上游关键酶，获得的酵母重组菌 Y1CS的3β-O-Glc-DM总产量为261.9mg/L，相比Y1C产量提高2.27倍。通 过在酵母重组菌中过表达转录激活因子HAC1，获得的酵母重组菌Y1CSH的 3β-O-Glc-DM总产量为414.8mg/L，相比Y1CS产量提高1.58倍(图18)。
实施例9利用指数流加补料高密度发酵产3β-O-Glc-DM工程菌
在SD营养缺陷固体培养基上活化工程菌Y1CSH，挑取单菌落接种于100mL YPD液体培养基中，在30℃，220rpm条件下进行种子液培养。将种子液按10％ 的接种量接入含1LYPD发酵培养基的3L发酵罐(上海保兴生物设备有限公 司)。发酵温度为30℃，通气量为3L/min，溶氧(DO)值为30％，搅拌速率为300～900 rpm。通过5M氨水维持pH 5.5±0.2。在发酵20h后，开始进行指数流加补料， 其中补料培养基含有578g/L葡萄糖,9g/L KH2PO4,5.12g/LMgSO4·7H2O,3.5g/L K2SO4,0.28g/L Na2SO4,2.1g/L腺嘌呤,2.5g/L尿嘧啶,5g/L赖氨酸,10mL/L微量 元素溶液(15g EDTA，10.2g ZnSO4·7H2O，0.5g MnCl2·4H2O，0.5g CuSO4，0.86g C℃l2·6H2O，0.56g Na2MoO4·2H2O，3.84g CaCl2·2H2O和5.12g FeSO4·7H2O定 容至1L蒸馏水，过滤除菌，4℃保存)和12mL/L维生素溶液(0.05g生物素，1 g泛素钙，1g烟酸，25g肌醇，1g盐酸硫胺素，1g盐酸吡哆醇和0.2g氨基 苯甲酸定容至1L蒸馏水，过滤除菌，4℃保存)。葡萄糖浓度控制在1.0g/L以下， 乙醇浓度不高于5.0g/L。
每24h取样一次，并测定生物量及产物含量。生物量在96h之前持续增加， 随后到达平台期，168h时发酵液OD600达到最高值1522。3β-O-Glc-DM产量随细 胞生长不断增加，在144h时达到最高值2.4g/L(图19)。此外，在发酵过程中， 发酵罐壁上不断积累菌块，在192h收罐后从罐壁上收集获得2.49g(干重，DCW) 菌块，其中含产物3β-O-Glc-DM 180mg(72.3mg/g DCW)。
对本领域技术人员显而易见的是，在不偏离本发明的精神或范围下，能够 对本发明的方法、重组菌进行各种各样的修改和变化。因此，本发明覆盖了其 修改和变化，只要它们落入所附权利要求和它们的等同方案的范围内。
序列表
<110> 中国医学科学院药物研究所
<120> 生产达玛烯二醇-II糖苷的重组菌及其应用
<160> 30
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 3036
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atgtggaagc taaaggtagc tcaaggaaat gatccatatt tgtatagcac taacaacttt 60
gttggcagac aatattggga gtttcagccc gatgctggta ctccagaaga gagggaagag 120
gttgaaaaag cacgcaagga ttatgtaaac aacaagaagc ttcatggtat tcatccatgt 180
agtgatatgc tgatgcgcag gcagcttatt aaagaaagtg gaatcgatct cctaagcata 240
ccgccgttga gattagatga aaacgaacaa gtgaactacg atgcagttac aaccgctgtg 300
aagaaagctc ttcgattgaa ccgggcaatt caagcacacg atggtcactg gccagctgaa 360
aatgcaggct ctttacttta tacacctccc cttatcattg ccctatatat cagcggaacg 420
attgacacta ttctgacaaa acaacacaag aaggaactga ttcgcttcgt ttacaaccat 480
caaaatgagg atggtggatg gggatcctat attgaggggc acagcacgat gattgggtca 540
gtacttagct acgtgatgtt acgtttgcta ggagaaggat tagctgaatc tgatgatgga 600
aatggtgcag ttgagagagg ccggaagtgg atacttgatc atggaggtgc agccggcata 660
ccctcttggg gaaagactta tctagcggtg cttggagtat atgagtggga agggtgtaac 720
ccacttccac cagaattttg gctttttcca tctagttttc cttttcatcc agcaaaaatg 780
tggatctact gccggtgcac ttacatgcca atgtcgtatt tgtatgggaa gagatatcat 840
ggaccaataa ccgatcttgt tttatctttg aggcaagaaa tttacaacat tccttatgag 900
cagataaagt ggaatcaaca gcgccataac tgttgcaagg aggatctcta ctaccctcat 960
acccttgtac aagacctggt ttgggatggt cttcactact ttagtgaacc attcctcaaa 1020
cgttggccct tcaacaaact gcgaaaaaga ggtctaaaaa gagttgttga actaatgcgc 1080
tatggtgcca ccgagaccag attcataacc acaggaaatg gggaaaaagc tttacaaata 1140
atgagttggt gggcagaaga tcccaatggt gatgagttta agcatcatct tgctagaatc 1200
ccagattttt tgtggattgc tgaggatgga atgacagtac agagttttgg tagtcaacta 1260
tgggactgta ttcttgctac tcaagcaatt atcgccacca atatggttga agaatacgga 1320
gattctctta agaaggcgca tttcttcatc aaagaatcgc agataaaaga aaatccaaga 1380
ggagacttcc taaaaatgtg tcgacagttt accaaaggtg cgtggacttt ctctgatcaa 1440
gatcatggtt gcgttgtctc ggactgcaca gctgaagcgc taaagtgcct actgttactt 1500
tcacaaatgc cacaggatat tgtcggagaa aaacctgagg ttgagcgatt atatgaggct 1560
gtgaatgttc ttctctattt gcagagtcgt gtaagtggtg gtttcgcagt ttgggagcct 1620
ccagttccaa aaccatattt ggagatgttg aatccttcag aaatttttgc agacattgtt 1680
gttgagagag agcacattga atgcactgca tctgtaatca aaggtctgat ggcatttaaa 1740
tgcttgcatc ctgggcatcg tcagaaagag atagaggatt ctgtggcgaa agccatccgt 1800
tatcttgaaa gaaaccaaat gcctgatggt tcatggtatg gcttttgggg aatttgtttc 1860
ctctatggga cattttttac cctatctggg tttgcttctg ctgggaggac ttatgacaac 1920
agtgaagcag ttcgtaaggg tgttaaattt ttcctttcaa cacaaaatga agaaggtggt 1980
tggggggaga gtcttgaatc atgcccaagc gaaaaattta caccactcaa gggaaacaga 2040
acaaatctag tacaaacatc atgggctatg ctaggtctta tgtttggtgg acaggccgag 2100
agagatccga cacctctgca tagagcagca aagttgttga tcaatgcgca aatggataat 2160
ggagatttcc ctcaacagga aattactgga gtatactgta aaaatagtat gttacattat 2220
gcggagtaca gaaatatatt tcctctttgg gcactcggag aatatcggaa acgtgtttgg 2280
ttgcctaagc accagcagct caaaattgcg gccgcgatgg tgagcaaggg cgaggagctg 2340
ttcaccgggg tggtgcccat cctggtcgag ctggacggcg acgtaaacgg ccacaagttc 2400
agcgtgtccg gcgagggcga gggcgatgcc acctacggca agctgaccct gaagttcatc 2460
tgcaccaccg gcaagctgcc cgtgccctgg cccaccctcg tgaccaccct gacctacggc 2520
gtgcagtgct tcagccgcta ccccgaccac atgaagcagc acgacttctt caagtccgcc 2580
atgcccgaag gctacgtcca ggagcgcacc atcttcttca aggacgacgg caactacaag 2640
acccgcgccg aggtgaagtt cgagggcgac accctggtga accgcatcga gctgaagggc 2700
atcgacttca aggaggacgg caacatcctg gggcacaagc tggagtacaa ctacaacagc 2760
cacaacgtct atatcatggc cgacaagcag aagaacggca tcaaggtgaa cttcaagatc 2820
cgccacaaca tcgaggacgg cagcgtgcag ctcgccgacc actaccagca gaacaccccc 2880
atcggcgacg gccccgtgct gctgcccgac aaccactacc tgagcaccca gtccgccctg 2940
agcaaagacc ccaacgagaa gcgcgatcac atggtcctgc tggagttcgt gaccgccgcc 3000
gggatcactc tcggcatgga cgagctgtac aagtaa 3036
<210> 2
<211> 1356
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
atgttgtcca agactcacat catgttcatc ccatttccag ctcaaggtca tatgtctcca 60
atgatgcaat tcgctaagag attggcttgg aagggcgtta gaattaccat cgttttgcca 120
gctcaaatca gagattccat gcaaatcacc aactccttga ttaacaccga gtgtatcagc 180
ttcgatttcg ataaagacga cggaatgcca tactctatgc aagcttacat gggcgttgtt 240
aagttgaagg tcaccaacaa gttgtccgat ctattggaga agcaaaagac caacggttac 300
ccagttaact tgctagttgt cgattccttg tatccatcta gagtcgagat gtgtcatcag 360
ttgggcgtta aaggcgctcc atttttcact cattcttgcg cagttggagc tatatattat 420
aacgctcatt tgggcaagtt gaagattcca ccagaagaag gtctaacttc cgtttctttg 480
ccatctatcc cattgttagg tagagacgat ttgccaatca tcagaacagg cacttttcca 540
gacctattcg aacatttggg caaccaattc tcagacttgg ataaggcaga ttggatcttc 600
ttcaacacct tcgataagtt ggagaacgaa gaagctaagt ggttatcttc tcagtggcct 660
attacctcta tcggtccatt gattccatcc atgtacttgg acaagcaatt gccaaacgat 720
aagggtaacg gcattaactt gtacaaggca gacgttggat cttgcattaa atggttggac 780
gctaaagatc caggttcagt tgtttacgct tcttttggtt ccgttaagca caacttcggt 840
gacgattata tggacgaagt tgcttgggga ttgttgcaca gcaagtacaa cttcatttgg 900
gtcgttatcg aaccagaaag aaccaagttg tcttccgatt tcttggcaga agcagaagaa 960
aagggtttaa tcgtttcttg gtgtccacag ttggaagttt tgtctcacaa gtccatcggt 1020
tctttcatga ctcattgcgg ttggaactct acagttgaag ctttatcttt gggcgttcca 1080
atggttgcag ttccacaaca attcgaccaa ccagttaacg ccaaatacat tgttgatgtt 1140
tggcaaattg gcgttagagt tccaattgga gaagacggtg ttgttttaag aggtgaagtc 1200
gctaattgca tcaaagacgt tatggaaggc gaaattggag acgaattgag aggtaacgct 1260
ttgaagtgga agggtttagc agttgaagct atggaaaaag gcggttcttc cgataagaac 1320
atcgacgagt ttatttccaa gctagtttcc tcctaa 1356
<210> 3
<211> 1634
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
atggaccaat tggtgaaaac tgaagtcacc aagaagtctt ttactgctcc tgtacaaaag 60
gcttctacac cagttttaac caataaaaca gtcatttctg gatcgaaagt caaaagttta 120
tcatctgcgc aatcgagctc atcaggacct tcatcatcta gtgaggaaga tgattcccgc 180
gatattgaaa gcttggataa gaaaatacgt cctttagaag aattagaagc attattaagt 240
agtggaaata caaaacaatt gaagaacaaa gaggtcgctg ccttggttat tcacggtaag 300
ttacctttgt acgctttgga gaaaaaatta ggtgatacta cgagagcggt tgcggtacgt 360
aggaaggctc tttcaatttt ggcagaagct cctgtattag catctgatcg tttaccatat 420
aaaaattatg actacgaccg cgtatttggc gcttgttgtg aaaatgttat aggttacatg 480
cctttgcccg ttggtgttat aggccccttg gttatcgatg gtacatctta tcatatacca 540
atggcaacta cagagggttg tttggtagct tctgccatgc gtggctgtaa ggcaatcaat 600
gctggcggtg gtgcaacaac tgttttaact aaggatggta tgacaagagg cccagtagtc 660
cgtttcccaa ctttgaaaag atctggtgcc tgtaagatat ggttagactc agaagaggga 720
caaaacgcaa ttaaaaaagc ttttaactct acatcaagat ttgcacgtct gcaacatatt 780
caaacttgtc tagcaggaga tttactcttc atgagattta gaacaactac tggtgacgca 840
atgggtatga atatgatttc taaaggtgtc gaatactcat taaagcaaat ggtagaagag 900
tatggctggg aagatatgga ggttgtctcc gtttctggta actactgtac cgacaaaaaa 960
ccagctgcca tcaactggat cgaaggtcgt ggtaagagtg tcgtcgcaga agctactatt 1020
cctggtgatg ttgtcagaaa agtgttaaaa agtgatgttt ccgcattggt tgagttgaac 1080
attgctaaga atttggttgg atctgcaatg gctgggtctg ttggtggatt taacgcacat 1140
gcagctaatt tagtgacagc tgttttcttg gcattaggac aagatcctgc acaaaatgtt 1200
gaaagttcca actgtataac attgatgaaa gaagtggacg gtgatttgag aatttccgta 1260
tccatgccat ccatcgaagt aggtaccatc ggtggtggta ctgttctaga accacaaggt 1320
gccatgttgg acttattagg tgtaagaggc ccgcatgcta ccgctcctgg taccaacgca 1380
cgtcaattag caagaatagt tgcctgtgcc gtcttggcag gtgaattatc cttatgtgct 1440
gccctagcag ccggccattt ggttcaaagt catatgaccc acaacaggaa acctgctgaa 1500
ccaacaaaac ctaacaattt ggacgccact gatataaatc gtttgaaaga tgggtccgtc 1560
acctgcatta aatcctaaac ttagtcatac gtcattggta ttctcttgaa aaagaagcac 1620
aacagcacca tgtg 1634
<210> 4
<211> 867
<212> DNA
<213> 酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)
<400> 4
atgactgccg acaacaatag tatgccccat ggtgcagtat ctagttacgc caaattagtg 60
caaaaccaaa cacctgaaga cattttggaa gagtttcctg aaattattcc attacaacaa 120
agacctaata cccgatctag tgagacgtca aatgacgaaa gcggagaaac atgtttttct 180
ggtcatgatg aggagcaaat taagttaatg aatgaaaatt gtattgtttt ggattgggac 240
gataatgcta ttggtgccgg taccaagaaa gtttgtcatt taatggaaaa tattgaaaag 300
ggtttactac atcgtgcatt ctccgtcttt attttcaatg aacaaggtga attactttta 360
caacaaagag ccactgaaaa aataactttc cctgatcttt ggactaacac atgctgctct 420
catccactat gtattgatga cgaattaggt ttgaagggta agctagacga taagattaag 480
ggcgctatta ctgcggcggt gagaaaacta gatcatgaat taggtattcc agaagatgaa 540
actaagacaa ggggtaagtt tcacttttta aacagaatcc attacatggc accaagcaat 600
gaaccatggg gtgaacatga aattgattac atcctatttt ataagatcaa cgctaaagaa 660
aacttgactg tcaacccaaa cgtcaatgaa gttagagact tcaaatgggt ttcaccaaat 720
gatttgaaaa ctatgtttgc tgacccaagt tacaagttta cgccttggtt taagattatt 780
tgcgagaatt acttattcaa ctggtgggag caattagatg acctttctga agtggaaaat 840
gacaggcaaa ttcatagaat gctataa 867
<210> 5
<211> 1059
<212> DNA
<213> 酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)
<400> 5
atggcttcag aaaaagaaat taggagagag agattcttga acgttttccc taaattagta 60
gaggaattga acgcatcgct tttggcttac ggtatgccta aggaagcatg tgactggtat 120
gcccactcat tgaactacaa cactccaggc ggtaagctaa atagaggttt gtccgttgtg 180
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gatatgatgg acaagtccat taccagaaga ggccaaccat gttggtacaa ggttcctgaa 360
gttggggaaa ttgccatcaa tgacgcattc atgttagagg ctgctatcta caagcttttg 420
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gacttgagta agttctccct aaagaagcac tccttcatag ttactttcaa gactgcttac 600
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gatttgaaac aagccagaga tgtcttgatt ccattgggtg aatacttcca aattcaagat 720
gactacttag actgcttcgg taccccagaa cagatcggta agatcggtac agatatccaa 780
gataacaaat gttcttgggt aatcaacaag gcattggaac ttgcttccgc agaacaaaga 840
aagactttag acgaaaatta cggtaagaag gactcagtcg cagaagccaa atgcaaaaag 900
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gatttgaagg ccaaaatttc tcaggtcgat gagtctcgtg gcttcaaagc tgatgtctta 1020
actgcgttct tgaacaaagt ttacaagaga agcaaatag 1059
<210> 6
<211> 1491
<212> DNA
<213> 酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)
<400> 6
atgtctgctg ttaacgttgc acctgaattg attaatgccg acaacacaat tacctacgat 60
gcgattgtca tcggtgctgg tgttatcggt ccatgtgttg ctactggtct agcaagaaag 120
ggtaagaaag ttcttatcgt agaacgtgac tgggctatgc ctgatagaat tgttggtgaa 180
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attccatacc cttacaaggc cgatatccct aaagttgaaa aattgaagga cttggtcaaa 360
gatggtaatg acaaggtctt ggaagacagc actattcaca tcaaggatta cgaagatgat 420
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aaagcccact tgacatttat ctgtgacggt atcttttcac gtttcagaaa ggaattgcac 660
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taccaaatca gtccagaaga aacaagaatc ctttgtgctt acaactctcc aaaggtccca 840
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ccagctagac aaaacgacgt cactggtatg tgtgttatcg gtgacgctct aaatatgaga 1020
catccattga ctggtggtgg tatgactgtc ggtttgcatg atgttgtctt gttgattaag 1080
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cctttgcaat tgaccagggt tttcttcgct gtcgcttttt acaccattta cttgaacatg 1380
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<211> 1335
<212> DNA
<213> 酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)
<400> 7
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cactgtttcg aactgttgaa cttgacctcc agatcgtttg ctgctgtgat cagagagctg 180
catccagaat tgagaaactg tgttactctc ttttatttga ttttaagggc tttggatacc 240
atcgaagacg atatgtccat cgaacacgat ttgaaaattg acttgttgcg tcacttccac 300
gagaaattgt tgttaactaa atggagtttc gacggaaatg cccccgatgt gaaggacaga 360
gccgttttga cagatttcga atcgattctt attgaattcc acaaattgaa accagaatat 420
caagaagtca tcaaggagat caccgagaaa atgggtaatg gtatggccga ctacatctta 480
gatgaaaatt acaacttgaa tgggttgcaa accgtccacg actacgacgt gtactgtcac 540
tacgtagctg gtttggtcgg tgatggtttg acccgtttga ttgtcattgc caagtttgcc 600
aacgaatctt tgtattctaa tgagcaattg tatgaaagca tgggtctttt cctacaaaaa 660
accaacatca tcagagatta caatgaagat ttggtcgatg gtagatcctt ctggcccaag 720
gaaatctggt cacaatacgc tcctcagttg aaggacttca tgaaacctga aaacgaacaa 780
ctggggttgg actgtataaa ccacctcgtc ttaaacgcat tgagtcatgt tatcgatgtg 840
ttgacttatt tggccggtat ccacgagcaa tccactttcc aattttgtgc cattccccaa 900
gttatggcca ttgcaacctt ggctttggta ttcaacaacc gtgaagtgct acatggcaat 960
gtaaagattc gtaagggtac tacctgctat ttaattttga aatcaaggac tttgcgtggc 1020
tgtgtcgaga tttttgacta ttacttacgt gatatcaaat ctaaattggc tgtgcaagat 1080
ccaaatttct taaaattgaa cattcaaatc tccaagatcg aacagtttat ggaagaaatg 1140
taccaggata aattacctcc taacgtgaag ccaaatgaaa ctccaatttt cttgaaagtt 1200
aaagaaagat ccagatacga tgatgaattg gttccaaccc aacaagaaga agagtacaag 1260
ttcaatatgg ttttatctat catcttgtcc gttcttcttg ggttttatta tatatacact 1320
ttacacagag cgtga 1335
<210> 8
<211> 2247
<212> DNA
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<400> 8
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cgtttgcggc ttgctgaggg gttaaatatt cccagctttc tcggcctagc tcatcagttc 120
tcagtctcca aagacgtgga tctgtctttg gtagaccgat tgtgtcagaa taaaattctg 180
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aggattcaga aatgtacaat gagatggaca aaaactaagc atgaaaaatg aggaagccga 600
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taaacacaca ctattttttt tttttaaaaa atatttgtat ttcctaacat gacagggcac 1500
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<210> 9
<211> 2049
<212> DNA
<213> 酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)
<400> 9
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<210> 10
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<210> 11
<211> 1569
<212> DNA
<213> 酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)
<400> 11
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<212> DNA
<213> 酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)
<400> 12
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<212> DNA
<213> 酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)
<400> 13
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<213> 酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)
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<213> 酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)
<400> 19
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<211> 410
<212> DNA
<213> 酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)
<400> 22
ggaagctgaa acgtctaacg gatcttgatt tgtgtggact tccttagaag taaccgaagc 60
acaggcgcta ccatgagaaa tgggtgaatg ttgagataat tgttgggatt ccattgttga 120
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tcctcaaaat ggaatctata tttctacata ctaatattac gattattcct cattccgttt 240
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tttttttttt cccctagcgg atgactcttt ttttttctta gcgattggca ttatcacata 420
atgaattata cattatataa agtaatgtga tttcttcgaa gaatatacta aaaaatgagc 480
aggcaagata aacgaaggca aagatgacag agcagaaagc cctagtaaag cgtattacaa 540
atgaaaccaa gattcagatt gcgatctctt taaagggtgg tcccctagcg atagagcact 600
cgatcttccc agaaaaagag gcagaagcag tagcagaaca ggccacacaa tcgcaagtga 660
ttaacgtcca cacaggtata gggtttctgg accatatgat acatgctctg gccaagcatt 720
ccggctggtc gctaatcgtt gagtgcattg gtgacttaca catagacgac catcacacca 780
ctgaagactg cgggattgct ctcggtcaag cttttaaaga ggccctactg gcgcgtggag 840
taaaaaggtt tggatcagga tttgcgcctt tggatgaggc actttccaga gcggtggtag 900
atctttcgaa caggccgtac gcagttgtcg aacttggttt gcaaagggag aaagtaggag 960
atctctcttg cgagatgatc ccgcattttc ttgaaagctt tgcagaggct agcagaatta 1020
ccctccacgt tgattgtctg cgaggcaaga atgatcatca ccgtagtgag agtgcgttca 1080
aggctcttgc ggttgccata agagaagcca cctcgcccaa tggtaccaac gatgttccct 1140
ccaccaaagg tgttcttatg tagtgacac 1169
<210> 24
<211> 371
<212> DNA
<213> 酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)
<400> 24
tgttggaacg agagtaatta atagtgacat gagttgctat ggtaacaatc taatgcttac 60
atcgtatatt aatgtacaac tcgtatacgt ttaagtgtga ttgcgcctat tgcagaagga 120
atgttaaacg agaagctcag acaatactga agctgtgtta aagacctatt agttgaacat 180
gttatggtag gtacatatat gaggaatatg agtcgtcaca tcaatgtata gtaactaccg 240
gaatcactat tatattggtc atgattaata tgaccaatcg gcgtgtgttt tatatacctc 300
tcttatttag tataagaaga tcagtactca cttcttcatt aatactaatt tttaacctct 360
aattatcaac a 371
<210> 25
<211> 2178
<212> DNA
<213> 酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)
<400> 25
ctccatcaaa tggtcaggtc attgagtgtt ttttatttgt tgtatttttt tttttttaga 60
gaaaatcctc caatattaaa attaggaata gtagtttcat gattttctgt tacacctaac 120
tttttgtgtg gtgccctcct ccttgtcaat attaatgtta aagtgcaatt ctttttcctt 180
atcacgttga gccattagta tcaatttgct tacctgtatt cctttacatc ctcctttttc 240
tccttcttga taaatgtatg tagattgcgt atatagtttc gtctacccta tgaacatatt 300
ccattttgta atttcgtgtc gtttctatta tgaatttcat ttataaagtt tatgtacaaa 360
tatcataaaa aaagagaatc tttttaagca aggattttct taacttcttc ggcgacagca 420
tcaccgactt cggtggtact gttggaacca cctaaatcac cagttctgat acctgcatcc 480
aaaacctttt taactgcatc ttcaatggcc ttaccttctt caggcaagtt caatgacaat 540
ttcaacatca ttgcagcaga caagatagtg gcgatagggt tgaccttatt ctttggcaaa 600
tctggagcag aaccgtggca tggttcgtac aaaccaaatg cggtgttctt gtctggcaaa 660
gaggccaagg acgcagatgg caacaaaccc aaggaacctg ggataacgga ggcttcatcg 720
gagatgatat caccaaacat gttgctggtg attataatac catttaggtg ggttgggttc 780
ttaactagga tcatggcggc agaatcaatc aattgatgtt gaaccttcaa tgtagggaat 840
tcgttcttga tggtttcctc cacagttttt ctccataatc ttgaagaggc caaaacatta 900
gctttatcca aggaccaaat aggcaatggt ggctcatgtt gtagggccat gaaagcggcc 960
attcttgtga ttctttgcac ttctggaacg gtgtattgtt cactatccca agcgacacca 1020
tcaccatcgt cttcctttct cttaccaaag taaatacctc ccactaattc tctgacaaca 1080
acgaagtcag tacctttagc aaattgtggc ttgattggag ataagtctaa aagagagtcg 1140
gatgcaaagt tacatggtct taagttggcg tacaattgaa gttctttacg gatttttagt 1200
aaaccttgtt caggtctaac actaccggta ccccatttag gaccacccac agcacctaac 1260
aaaacggcat cagccttctt ggaggcttcc agcgcctcat ctggaagtgg aacacctgta 1320
gcatcgatag cagcaccacc aattaaatga ttttcgaaat cgaacttgac attggaacga 1380
acatcagaaa tagctttaag aaccttaatg gcttcggctg tgatttcttg accaacgtgg 1440
tcacctggca aaacgacgat cttcttaggg gcagacatta gaatggtata tccttgaaat 1500
atatatatat atattgctga aatgtaaaag gtaagaaaag ttagaaagta agacgattgc 1560
taaccaccta ttggaaaaaa caataggtcc ttaaataata ttgtcaactt caagtattgt 1620
gatgcaagca tttagtcatg aacgcttctc tattctatat gaaaagccgg ttcgcggcct 1680
ctcacctttc ctttttctcc caatttttca gttgaaaaag gtatatgcgt caggcgacct 1740
ctgaaattaa caaaaaattt ccagtcatcg aatttgattc tgtgcgatag cgcccctgtg 1800
tgttctcgtt atgttgagga aaaaaataat ggttgctaag agattcgaac tcttgcatct 1860
tacgatacct gagtattccc acagttaact gcggtcaaga tatttcttga atcaggcgcc 1920
ttagaccgct cggccaaaca accaattact tgttgagaaa tagagtataa ttatcctata 1980
aatataacgt ttttgaacac acatgaacaa ggaagtacag gacaattgat tttgaagaga 2040
atgtggattt tgatgtaatt gttgggattc catttttaat aaggcaataa tattaggtat 2100
gtagatatac tagaagttct cctcgaccgg tcgatatgcg gtgtgaaata ccgcacagat 2160
gcgtaaggag aaaatacc 2178
<210> 26
<211> 1264
<212> DNA
<213> 酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)
<400> 26
atgagagtag caaacgtaag tctaaaggtt gttttatagt agttaggatg tagaaaatgt 60
attccgatag gccattttac atttggaggg acggttgaaa gtggacagag gaaaaggtgc 120
ggaaatggct gattttgatt gtttatgttt tgtgtgatga ttttacattt ttgcatagta 180
ttaggtagtc agatgaaaga tgaatagaca taggagtaag aaaacataga atagttaccg 240
ttattggtag gagtgtggtg gggtggtata gtccgcattg ggatgttact ttcctgttat 300
ggcatggatt tccctttagg gtctctgaag cgtatttccg tcaccgaaaa aggcagaaaa 360
agggaaactg aagggaggat agtagtaaag tttgaatggt ggtagtgtaa tgtatgatat 420
ccgttggttt tggtttcggt tgtgaaaagt tttttggtat gatattttgc aagtagcata 480
tatttcttgt gtgagaaagg tatattttgt atgttttgta tgttcccgcg cgtttccgta 540
ttttccgctt ccgcttccgc agtaaaaaat agtgaggaac tgggttaccc ggggcacctg 600
tcactttgga aaaaaaatat acgctaagat ttttggagaa tagcttaaat tgaagttttt 660
ctcggcgaga aatacgtagt taaggcagag cgacagagag ggcaaaagaa aataaaagta 720
agattttagt ttgtaatggg agggggggtt tagtcatgga gtacaagtgt gaggaaaagt 780
agttgggagg tacttcatgc gaaagcagtt gaagacaagt tcgaaaagag tttggaaacg 840
aattcgagta ggcttgtcgt tcgttatgtt tttgtaaatg gcctcgtcaa acggtggaga 900
gagtcgctag gtgatcgtca gatctgccta gtctctatac agcgtgttta attgacatgg 960
gttgatgcgt attgagagat acaatttggg aagaaattcc cagagtgtgt ttcttttgcg 1020
tttaacctga acagtctcat cgtgggcatc ttgcgattcc attggtgagc agcgaaggat 1080
ttggtggatt actagctaat agcaatctat ttcaaagaat tcaaacttgg gggaatgcct 1140
tgttgaatag ccggtcgcaa gactgtgatt cttcaagtgt aacctcctct caaatcagcg 1200
atatcaaacg taccattccg tgaaacaccg gggtatctgt ttggtggaac ctgattagag 1260
gaaa 1264
<210> 27
<211> 1365
<212> DNA
<213> 酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)
<400> 27
cgcgcgtttc ggtgatgacg gtgaaaacct ctgacacatg cagctcccgg agacggtcac 60
agcttgtctg taagcggatg ccgggagcag acaagcccgt cagggcgcgt cagcgggtgt 120
tggcgggtgt cggggctggc ttaactatgc ggcatcagag cagattgtac tgagagtgca 180
ccataaacga cattactata tatataatat aggaagcatt taatagacag catcgtaata 240
tatgtgtact ttgcagttat gacgccagat ggcagtagtg gaagatattc tttattgaaa 300
aatagcttgt caccttacgt acaatcttga tccggagctt ttcttttttt gccgattaag 360
aattaattcg gtcgaaaaaa gaaaaggaga gggccaagag ggagggcatt ggtgactatt 420
gagcacgtga gtatacgtga ttaagcacac aaaggcagct tggagtatgt ctgttattaa 480
tttcacaggt agttctggtc cattggtgaa agtttgcggc ttgcagagca cagaggccgc 540
agaatgtgct ctagattccg atgctgactt gctgggtatt atatgtgtgc ccaatagaaa 600
gagaacaatt gacccggtta ttgcaaggaa aatttcaagt cttgtaaaag catataaaaa 660
tagttcaggc actccgaaat acttggttgg cgtgtttcgt aatcaaccta aggaggatgt 720
tttggctctg gtcaatgatt acggcattga tatcgtccaa ctgcatggag atgagtcgtg 780
gcaagaatac caagagttcc tcggtttgcc agttattaaa agactcgtat ttccaaaaga 840
ctgcaacata ctactcagtg cagcttcaca gaaacctcat tcgtttattc ccttgtttga 900
ttcagaagca ggtgggacag gtgaactttt ggattggaac tcgatttctg actgggttgg 960
aaggcaagag agccccgaaa gcttacattt tatgttagct ggtggactga cgccagaaaa 1020
tgttggtgat gcgcttagat taaatggcgt tattggtgtt gatgtaagcg gaggtgtgga 1080
gacaaatggt gtaaaagact ctaacaaaat agcaaatttc gtcaaaaatg ctaagaaata 1140
ggttattact gagtagtatt tatttaagta ttgtttgtgc acttgcctat gcggtgtgaa 1200
ataccgcaca attgaaagga gaaaataccg catcaggaaa ttgtaaacgt taatattttg 1260
ttaaaattcg cgttaaattt ttgttaaatc agctcatttt ttaaccaata ggccgaaatc 1320
ggcaaaatcc cttataaatc aaaagaatag accgagatag ggttg 1365
<210> 28
<211> 4272
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 28
atggactata aggaccacga cggagactac aaggatcatg atattgatta caaagacgat 60
gacgataaga tggccccaaa gaagaagcgg aaggtcggta tccacggagt cccagcagcc 120
gacaagaagt acagcatcgg cctggacatc ggcaccaact ctgtgggctg ggccgtgatc 180
accgacgagt acaaggtgcc cagcaagaaa ttcaaggtgc tgggcaacac cgaccggcac 240
agcatcaaga agaacctgat cggagccctg ctgttcgaca gcggcgaaac agccgaggcc 300
acccggctga agagaaccgc cagaagaaga tacaccagac ggaagaaccg gatctgctat 360
ctgcaagaga tcttcagcaa cgagatggcc aaggtggacg acagcttctt ccacagactg 420
gaagagtcct tcctggtgga agaggataag aagcacgagc ggcaccccat cttcggcaac 480
atcgtggacg aggtggccta ccacgagaag taccccacca tctaccacct gagaaagaaa 540
ctggtggaca gcaccgacaa ggccgacctg cggctgatct atctggccct ggcccacatg 600
atcaagttcc ggggccactt cctgatcgag ggcgacctga accccgacaa cagcgacgtg 660
gacaagctgt tcatccagct ggtgcagacc tacaaccagc tgttcgagga aaaccccatc 720
aacgccagcg gcgtggacgc caaggccatc ctgtctgcca gactgagcaa gagcagacgg 780
ctggaaaatc tgatcgccca gctgcccggc gagaagaaga atggcctgtt cggaaacctg 840
attgccctga gcctgggcct gacccccaac ttcaagagca acttcgacct ggccgaggat 900
gccaaactgc agctgagcaa ggacacctac gacgacgacc tggacaacct gctggcccag 960
atcggcgacc agtacgccga cctgtttctg gccgccaaga acctgtccga cgccatcctg 1020
ctgagcgaca tcctgagagt gaacaccgag atcaccaagg cccccctgag cgcctctatg 1080
atcaagagat acgacgagca ccaccaggac ctgaccctgc tgaaagctct cgtgcggcag 1140
cagctgcctg agaagtacaa agagattttc ttcgaccaga gcaagaacgg ctacgccggc 1200
tacattgacg gcggagccag ccaggaagag ttctacaagt tcatcaagcc catcctggaa 1260
aagatggacg gcaccgagga actgctcgtg aagctgaaca gagaggacct gctgcggaag 1320
cagcggacct tcgacaacgg cagcatcccc caccagatcc acctgggaga gctgcacgcc 1380
attctgcggc ggcaggaaga tttttaccca ttcctgaagg acaaccggga aaagatcgag 1440
aagatcctga ccttccgcat cccctactac gtgggccctc tggccagggg aaacagcaga 1500
ttcgcctgga tgaccagaaa gagcgaggaa accatcaccc cctggaactt cgaggaagtg 1560
gtggacaagg gcgcttccgc ccagagcttc atcgagcgga tgaccaactt cgataagaac 1620
ctgcccaacg agaaggtgct gcccaagcac agcctgctgt acgagtactt caccgtgtat 1680
aacgagctga ccaaagtgaa atacgtgacc gagggaatga gaaagcccgc cttcctgagc 1740
ggcgagcaga aaaaggccat cgtggacctg ctgttcaaga ccaaccggaa agtgaccgtg 1800
aagcagctga aagaggacta cttcaagaaa atcgagtgct tcgactccgt ggaaatctcc 1860
ggcgtggaag atcggttcaa cgcctccctg ggcacatacc acgatctgct gaaaattatc 1920
aaggacaagg acttcctgga caatgaggaa aacgaggaca ttctggaaga tatcgtgctg 1980
accctgacac tgtttgagga cagagagatg atcgaggaac ggctgaaaac ctatgcccac 2040
ctgttcgacg acaaagtgat gaagcagctg aagcggcgga gatacaccgg ctggggcagg 2100
ctgagccgga agctgatcaa cggcatccgg gacaagcagt ccggcaagac aatcctggat 2160
ttcctgaagt ccgacggctt cgccaacaga aacttcatgc agctgatcca cgacgacagc 2220
ctgaccttta aagaggacat ccagaaagcc caggtgtccg gccagggcga tagcctgcac 2280
gagcacattg ccaatctggc cggcagcccc gccattaaga agggcatcct gcagacagtg 2340
aaggtggtgg acgagctcgt gaaagtgatg ggccggcaca agcccgagaa catcgtgatc 2400
gaaatggcca gagagaacca gaccacccag aagggacaga agaacagccg cgagagaatg 2460
aagcggatcg aagagggcat caaagagctg ggcagccaga tcctgaaaga acaccccgtg 2520
gaaaacaccc agctgcagaa cgagaagctg tacctgtact acctgcagaa tgggcgggat 2580
atgtacgtgg accaggaact ggacatcaac cggctgtccg actacgatgt ggaccatatc 2640
gtgcctcaga gctttctgaa ggacgactcc atcgacaaca aggtgctgac cagaagcgac 2700
aagaaccggg gcaagagcga caacgtgccc tccgaagagg tcgtgaagaa gatgaagaac 2760
tactggcggc agctgctgaa cgccaagctg attacccaga gaaagttcga caatctgacc 2820
aaggccgaga gaggcggcct gagcgaactg gataaggccg gcttcatcaa gagacagctg 2880
gtggaaaccc ggcagatcac aaagcacgtg gcacagatcc tggactcccg gatgaacact 2940
aagtacgacg agaatgacaa gctgatccgg gaagtgaaag tgatcaccct gaagtccaag 3000
ctggtgtccg atttccggaa ggatttccag ttttacaaag tgcgcgagat caacaactac 3060
caccacgccc acgacgccta cctgaacgcc gtcgtgggaa ccgccctgat caaaaagtac 3120
cctaagctgg aaagcgagtt cgtgtacggc gactacaagg tgtacgacgt gcggaagatg 3180
atcgccaaga gcgagcagga aatcggcaag gctaccgcca agtacttctt ctacagcaac 3240
atcatgaact ttttcaagac cgagattacc ctggccaacg gcgagatccg gaagcggcct 3300
ctgatcgaga caaacggcga aaccggggag atcgtgtggg ataagggccg ggattttgcc 3360
accgtgcgga aagtgctgag catgccccaa gtgaatatcg tgaaaaagac cgaggtgcag 3420
acaggcggct tcagcaaaga gtctatcctg cccaagagga acagcgataa gctgatcgcc 3480
agaaagaagg actgggaccc taagaagtac ggcggcttcg acagccccac cgtggcctat 3540
tctgtgctgg tggtggccaa agtggaaaag ggcaagtcca agaaactgaa gagtgtgaaa 3600
gagctgctgg ggatcaccat catggaaaga agcagcttcg agaagaatcc catcgacttt 3660
ctggaagcca agggctacaa agaagtgaaa aaggacctga tcatcaagct gcctaagtac 3720
tccctgttcg agctggaaaa cggccggaag agaatgctgg cctctgccgg cgaactgcag 3780
aagggaaacg aactggccct gccctccaaa tatgtgaact tcctgtacct ggccagccac 3840
tatgagaagc tgaagggctc ccccgaggat aatgagcaga aacagctgtt tgtggaacag 3900
cacaagcact acctggacga gatcatcgag cagatcagcg agttctccaa gagagtgatc 3960
ctggccgacg ctaatctgga caaagtgctg tccgcctaca acaagcaccg ggataagccc 4020
atcagagagc aggccgagaa tatcatccac ctgtttaccc tgaccaatct gggagcccct 4080
gccgccttca agtactttga caccaccatc gaccggaaga ggtacaccag caccaaagag 4140
gtgctggacg ccaccctgat ccaccagagc atcaccggcc tgtacgagac acggatcgac 4200
ctgtctcagc tgggaggcga caaaaggccg gcggccacga aaaaggccgg ccaggcaaaa 4260
aagaaaaagt aa 4272
<210> 29
<211> 566
<212> DNA
<213> 酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)
<400> 29
gcggatctct tatgtcttta cgatttatag ttttcattat caagtatgcc tatattagta 60
tatagcatct ttagatgaca gtgttcgaag tttcacgaat aaaagataat attctacttt 120
ttgctcccac cgcgtttgct agcacgagtg aacaccatcc ctcgcctgtg agttgtaccc 180
attcctctaa actgtagaca tggtagcttc agcagtgttc gttatgtacg gcatcctcca 240
acaaacagtc ggttatagtt tgtcctgctc ctctgaatcg tctccctcga tatttctcat 300
tttccttcgc atgccagcat tgaaatgatc gaagttcaat gatgaaacgg taattcttct 360
gtcatttact catctcatct catcaagtta tataattcta tacggatgta atttttcact 420
tttcgtcttg acgtccaccc tataatttca attattgaac cctcacaaat gatgcactgc 480
aatgtacaca ccctcatata gtttctcagg gcttgatcag ggttccgtag atgggaattt 540
gagaagtata agggagataa cggtaa 566
<210> 30
<211> 458
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 30
cctcttcgct attacgccag ctgggatccg cggccgctct ttgaaaagat aatgtatgat 60
tatgctttca ctcatattta tacagaaact tgatgttttc tttcgagtat atacaaggtg 120
attacatgta cgtttgaagt acaactctag attttgtagt gccctcttgg gctagcggta 180
aaggtgcgca ttttttcaca ccctacaatg ttctgttcaa aagattttgg tcaaacgctg 240
tagaagtgaa agttggtgcg catgtttcgg cgttcgaaac ttctccgcag tgaaagataa 300
atgatctata ctagaagttc tcctcgtttt agagctagaa atagcaagtt aaaataaggc 360
tagtccgtta tcaacttgaa aaagtggcac cgagtcggtg gtgctttttt tgttttttat 420
gtctgtcgac aagcttagtg atcccccaca caccatag 458
Claims (13)
1.一种构建重组菌的方法，所述方法包括如下步骤：将酿酒酵母中的己糖激酶2基因敲除，并向所述酿酒酵母中导入达玛烯二醇-II合酶与GFP的融合蛋白的基因表达盒和人参糖基转移酶PgUGT74AE2的基因表达盒。
2.根据权利要求1的方法，其中，所述达玛烯二醇-II合酶与GFP的融合蛋白的编码基因表达盒包含由SEQ ID NO:1所示的达玛烯二醇-II合酶与GFP的融合蛋白的编码基因。
3.根据权利要求1的方法，其中，所述人参糖基转移酶PgUGT74AE2的编码基因表达盒包含由SEQ ID NO:2所示的人参糖基转移酶PgUGT74AE2的编码基因。
4.根据权利要求1的方法，所述方法还包括如下步骤：提高所述酿酒酵母中的3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶的活性。
5.根据权利要求4的方法，其中，通过向所述酿酒酵母中导入3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶编码基因表达盒，来提高所述酿酒酵母中的3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶的活性。
6.根据权利要求5的方法，其中，所述3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶编码基因表达盒包含由SEQ ID NO:3所示的3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶催化结构域的编码基因tHMG1。
7.根据权利要求1的方法，所述方法还包括以下一种或多种：
提高所述酿酒酵母中的异戊烯基焦磷酸异构酶IDI1的活性；
提高所述酿酒酵母中的法尼基焦磷酸合酶ERG20的活性；
提高所述酿酒酵母中的角鲨烯单加氧酶ERG1的活性；
提高所述酿酒酵母中的鲨烯合酶ERG9的活性；
降低所述酿酒酵母中的羊毛甾醇合酶ERG7的活性；
增加所述酿酒酵母中的分子伴侣BiP的水平；
增加所述酿酒酵母中的转录因子HAC1的水平；或者
增加所述酿酒酵母中的二硫键异构酶PDI1的水平。
8.根据权利要求7的方法，其中，
通过向所述酿酒酵母中导入异戊烯基焦磷酸异构酶IDI1的编码基因表达盒，来提高所述酿酒酵母中的异戊烯基焦磷酸异构酶IDI1的活性；
通过向所述酿酒酵母中导入法尼基焦磷酸合酶ERG20的编码基因表达盒，来提高所述酿酒酵母中的法尼基焦磷酸合酶ERG20的活性；
通过向所述酿酒酵母中导入角鲨烯单加氧酶ERG1的编码基因表达盒，来提高所述酿酒酵母中的角鲨烯单加氧酶ERG1的活性；
通过向所述酿酒酵母中导入鲨烯合酶ERG9的编码基因表达盒，来提高所述酿酒酵母中的鲨烯合酶ERG9的活性；
通过向所述酿酒酵母中导入羊毛甾醇合酶ERG7反义片段的表达盒，来降低所述酿酒酵母中的羊毛甾醇合酶ERG7的活性；
通过向所述酿酒酵母中导入分子伴侣BiP的编码基因表达盒，来增加所述酿酒酵母中的分子伴侣BiP的水平；
通过向所述酿酒酵母中导入转录因子HAC1的编码基因表达盒，来增加所述酿酒酵母中的转录因子HAC1的水平；或者
通过向所述酿酒酵母中导入二硫键异构酶PDI1的编码基因表达盒，来增加所述酿酒酵母中的二硫键异构酶PDI1的水平。
9.根据权利要求8的方法，其中，
编码IDI1的核苷酸序列为由SEQ ID NO:4所示的序列；
编码ERG20的核苷酸序列为由SEQ ID NO:5所示的序列；
编码ERG1的核苷酸序列为由SEQ ID NO:6所示的序列；
编码ERG9的核苷酸序列为由SEQ ID NO:7所示的序列；
编码ERG7反义片段的核苷酸序列为由SEQ ID NO:8所示的序列；
编码BiP的核苷酸序列为由SEQ ID NO:9所示的序列；
编码HAC1的核苷酸序列为由SEQ ID NO:10所示的序列；或者
编码PDI1的核苷酸序列为由SEQ ID NO:11所示的序列。
10.根据权利要求1-9任一项所述的方法，其中，将所述表达盒整合到酿酒酵母基因组采用CRISPR/Cas9技术进行。
11.由权利要求1-10任一项所述的方法制备得到的重组菌。
12.权利要求11所述的重组菌在生产3β-O-Glc-DM中的应用。
13.一种生产3β-O-Glc-DM的方法，所述方法包括，对权利要求11所述的重组菌进行发酵，得到3β-O-Glc-DM。
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
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|---|---|---|---|---|
| CN101679992A (zh) * | 2007-04-20 | 2010-03-24 | 波利门科学生物免疫研究有限公司 | 酵母菌表达系统 |
| CN102925376A (zh) * | 2012-11-13 | 2013-02-13 | 天津工业生物技术研究所 | 生产达玛二烯和原人参二醇的重组微生物及其构建方法 |
| CN103827304A (zh) * | 2011-03-24 | 2014-05-28 | 布特马斯先进生物燃料有限责任公司 | 用于异丁醇生产的宿主细胞和方法 |
| CN103849672A (zh) * | 2012-12-06 | 2014-06-11 | 中国科学院上海生命科学研究院 | 一组糖基转移酶及其应用 |
| CN104450633A (zh) * | 2014-12-04 | 2015-03-25 | 天津大学 | 能提高达玛烯二醇转化效率的融合蛋白质及构建方法及应用 |
| CN105176905A (zh) * | 2015-10-16 | 2015-12-23 | 天津大学 | 合成达玛烯二醇的大肠杆菌基因工程菌株及构建方法 |
| CN105177100A (zh) * | 2014-06-09 | 2015-12-23 | 中国科学院上海生命科学研究院 | 一组糖基转移酶及其应用 |
| CN108690822A (zh) * | 2017-04-12 | 2018-10-23 | 上海医药工业研究院 | 一种生产原人参二醇的基因工程菌及其方法 |
| CN108728423A (zh) * | 2017-04-13 | 2018-11-02 | 中国医学科学院药物研究所 | 枯草芽孢杆菌糖基转移酶及其应用 |
| CN108795786A (zh) * | 2017-05-02 | 2018-11-13 | 智能合成生物中心 | 通过改良酵母细胞器而提高人参皂苷产率 |
| CN108866020A (zh) * | 2017-05-16 | 2018-11-23 | 中国科学院上海生命科学研究院 | 糖基转移酶、突变体及其应用 |
| CN108949601A (zh) * | 2018-07-17 | 2018-12-07 | 天津大学 | 利用木糖生产达玛烯二醇和原人参二醇的重组酿酒酵母菌及构建方法 |
-
2018
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Patent Citations (12)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101679992A (zh) * | 2007-04-20 | 2010-03-24 | 波利门科学生物免疫研究有限公司 | 酵母菌表达系统 |
| CN103827304A (zh) * | 2011-03-24 | 2014-05-28 | 布特马斯先进生物燃料有限责任公司 | 用于异丁醇生产的宿主细胞和方法 |
| CN102925376A (zh) * | 2012-11-13 | 2013-02-13 | 天津工业生物技术研究所 | 生产达玛二烯和原人参二醇的重组微生物及其构建方法 |
| CN103849672A (zh) * | 2012-12-06 | 2014-06-11 | 中国科学院上海生命科学研究院 | 一组糖基转移酶及其应用 |
| CN105177100A (zh) * | 2014-06-09 | 2015-12-23 | 中国科学院上海生命科学研究院 | 一组糖基转移酶及其应用 |
| CN104450633A (zh) * | 2014-12-04 | 2015-03-25 | 天津大学 | 能提高达玛烯二醇转化效率的融合蛋白质及构建方法及应用 |
| CN105176905A (zh) * | 2015-10-16 | 2015-12-23 | 天津大学 | 合成达玛烯二醇的大肠杆菌基因工程菌株及构建方法 |
| CN108690822A (zh) * | 2017-04-12 | 2018-10-23 | 上海医药工业研究院 | 一种生产原人参二醇的基因工程菌及其方法 |
| CN108728423A (zh) * | 2017-04-13 | 2018-11-02 | 中国医学科学院药物研究所 | 枯草芽孢杆菌糖基转移酶及其应用 |
| CN108795786A (zh) * | 2017-05-02 | 2018-11-13 | 智能合成生物中心 | 通过改良酵母细胞器而提高人参皂苷产率 |
| CN108866020A (zh) * | 2017-05-16 | 2018-11-23 | 中国科学院上海生命科学研究院 | 糖基转移酶、突变体及其应用 |
| CN108949601A (zh) * | 2018-07-17 | 2018-12-07 | 天津大学 | 利用木糖生产达玛烯二醇和原人参二醇的重组酿酒酵母菌及构建方法 |
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| HUICHAO LIANG ET AL.: "Production of a bioactive unnatural ginsenoside by metabolically engineered yeasts based on a new UDP-glycosyltransferase from Bacillus subtilis", 《METABOLIC ENGINEERING》 * |
| 梁会超 等: "人参达玛烯二醇-II 合酶在酿酒酵母中的表达、定位及功能研究", 《药学学报》 * |
| 王冬 等: "创建酿酒酵母细胞工厂高效生产人参皂苷前体达玛烯二醇II", 《药学学报》 * |
| 郭钦 等: "重组GAL基因型酿酒酵母菌株的生长、发酵及遗传稳定性研究", 《农业生物技术学报》 * |
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