CN107820517A - 生产酵母突变体的方法及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及生产酵母突变体的方法，涉及酵母突变体及其用途。为了提供在乙醇发酵中在给定糖含量下产生低乙醇含量和较高甘油含量并且同时可快速获得的酵母，根据本发明提出了至少一个酵母株在第一诱变步骤中与第一诱变剂接触并且在第二诱变步骤中与第二诱变剂接触，所述第一和第二诱变剂互相不同并且选自下组：核苷酸‑烷基化剂、核苷酸‑脱氨基剂和UV辐射，并且第一选择步骤在第一和第二诱变步骤之间进行且第二选择步骤在第二诱变步骤之后进行，其中在各种情况中来自在先诱变步骤的突变体暴露于选自下组的选择因素：(a)高渗培养基和(b)醇脱氢酶抑制剂。

Description

生产酵母突变体的方法及其用途
本申请涉及生产酵母突变体的方法，其间至少一个酵母株在第一诱变步骤中与第一诱变剂接触并且在第二诱变步骤中与第二诱变剂接触，以及通过该方法产生的酵母和这类酵母的用途。
近年来，许多葡萄种植区在酿酒葡萄成熟期的气温急剧上升，其也增加了通过这种方式成熟的葡萄的糖含量。在用于生产葡萄酒的乙醇发酵的情况下，通过使用酵母株将该糖，特别是葡萄糖转化为乙醇作为主要的发酵产物。近年来，在用于生产葡萄酒的乙醇发酵的情况下，出现了如下问题：因为葡萄中葡萄糖含量增加，生产的葡萄酒呈现升高的酒精含量。消费者不希望这样的高酒精含量，即使在不同的年份，消费者更喜欢单独葡萄酒中的酒精含量尽可能一致。酒精含量较低的葡萄酒的需求量也在近期有所增加。此外，葡萄酒中的乙醇代表着这样一种成分，其一方面是必需和可取的，但是在含量较高的情况下，可能会导致葡萄酒的风味品质受损。高甘油浓度，例如超过10克/升，对葡萄酒的风味特性有积极作用。
提供这些性质的尝试包括使用已知的酵母，其在汁(must)中针对相同量的糖产生较少乙醇。一些这样的酵母是已知的；特别是用于生产高品质的葡萄酒，然而，希望有一些不同的酵母可供选择，其产生可显着影响葡萄酒风味特性的其他次生物质而不是乙醇。
生产这种酵母的尝试具体包括有意的遗传修饰和常规培育以及基于常规培育的选择过程。在WO 2011/080411中公开了产生具有所需性质的酵母的这种方法的示例。具体遗传修饰的生物体的缺点是消费者对这些生物体存在高度怀疑。培育方法和基于常规培育和纯选择过程的方法也可能是可行的，但是方法耗时非常长因此成本非常高。或者，野生酵母也被分离并测试所需的性质。这种分离描述于EP 2 634 247 B1中。这个过程成本也是非常高，它的成功是不确定的。
在本文中，本发明的目的在于制备在乙醇发酵过程中在给定的糖含量下产生比前述使用的株低的乙醇含量和高的甘油含量的酵母，并且它们可同时快速获得。
该目的通过上述类型的方法实现，其中第一和第二诱变剂彼此不同，并且选自以下组：核苷酸-烷基化剂，核苷酸-脱氨基剂和UV辐射，并且第一选择步骤在第一和第二诱变步骤之间进行，并且在第二诱变步骤之后进行第二选择步骤，由此将从相应的前述诱变步骤得到的突变体暴露于选自下组的选择因素：(a)高渗培养基和(b)醇脱氢酶抑制剂。
已经看到，在这种方法中，在其间进行两个诱变步骤，由此在每个诱变步骤之后额外进行选择步骤，产生酵母，其在给定糖浓度下的酒精发酵过程中比所用的初始株一方面提供较低的乙醇含量，另一方面在相同条件下产生较高的甘油浓度。两者都对使用这种酵母产生的葡萄酒的味道有积极作用。
本文所用的术语“酵母”优选是指酵母属的酵母，特别优选涉及酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)或贝酵母(Saccharomyces bayanus)。这也包括亚种，如酿酒酵母亚种贝酵母。
二倍体酵母株优选用作本发明方法中的第一诱变步骤的前述的株。在进行突变的情况下，二倍体不丢失，因此最终产生的酵母突变体也是二倍体。二倍体酵母的优点是它们的性质保持几代相对稳定，因此特别适合作为纯酵母。然而，这种性质会导致非特异性突变，例如通过辐射或诱变剂触发，这似乎没有意义。现在惊奇地看到，通过将这种非特异性突变的手段，即核苷酸-烷基化剂，核苷酸脱氨基剂或UV辐射与选择和重复突变以及进一步选择相结合，产生具有所需性质的酵母突变体，即，减少乙醇生产和增加甘油生产。
术语“核苷酸-烷基化剂”描述了在烷基和DNA碱基之间形成共价键的物质。这种修饰的碱基可导致碱基错配，从而导致点突变。已知多种引起这种烷基化的物质。
术语“核苷酸-脱氨基剂”描述了从DNA碱基分割氨基的物质。这种分割也导致碱基错配，即点突变。已知多种引起这种脱氨基化的物质。
这里使用的术语“UV辐射”是指400nm至100nm波长范围内的电磁辐射，特别是290nm至100nm波长范围内的UV-C辐射。280nm至240nm，特别是254nm的波长范围是优选的。优选的辐射强度为1000μJ/cm2至3000μJ/cm2，特别优选为2000μJ/cm2。这种辐射对DNA的影响导致形成嘧啶二聚体，特别是胸腺嘧啶二聚体。这些二聚体影响DNA的三维结构，并在复制过程中阻断DNA聚合酶。
本文所用的术语“高渗培养基”涉及含有渗透活性物质(包括盐、糖或糖醇)以产生渗透压高于308mOsmol/l的浓度的培养基。培养基以液体形式或通过加入琼脂以固化形式存在。合适的渗透活性物质是本领域技术人员已知的。
“醇脱氢酶抑制剂”是能够抑制醇脱氢酶的物质，即阻滞其活性，使得酵母中不再有乙醛被将乙醛转化为乙醇的催化剂所转化。所述抑制剂本身不被转化。具有这种性质的许多物质是本领域技术人员已知的。
在一个实施方式中，进行详尽的测试步骤，其中在所述方法中获得的酵母突变体根据在相同条件下与乙醇发酵过程中使用的上述酵母株相比是否产生更多的甘油和更少的乙醇进行测试和选择。
应当理解，相同条件意味着所用的酵母突变体和前述酵母株在相同的培养基中，相同气氛和相同温度下尽可能同时孵育，然后测定甘油和乙醇的浓度。确定甘油浓度的合适方法是本领域技术人员已知的。用于测试步骤的培养基优选选自从酿酒葡萄获得的葡萄汁和模仿葡萄汁的条件的人工汁培养基。本领域技术人员已知多种这样的人工汁培养基。
在一个实施方式中，核苷酸-烷基化剂选自以下：硫酸二甲酯(DMS)，甲磺酸乙酯(EMS)，甲磺酸甲酯(MMS)，1-甲基-3-硝基-1-亚硝基胍(MNNG)，甲基亚硝基氰胺(MNC)，甲基亚硝基脲(MNU)和DNA甲基转移酶。已知所有这些物质使它们烷化DNA碱基，并且认识到这些物质特别适用于酿酒酵母和贝酵母的诱变。甲磺酸乙酯(EMS)优选用于本发明的方法。
在一个实施方式中，核苷酸-脱氨基剂选自以下：无机亚硝酸盐，有机亚硝酸盐和亚硝酸。已经看到，这些核苷酸-脱氨基酶产生了对酿酒酵母和贝酵母进行突变的足够的诱变条件，而另一方面，它们促进了其的存活。亚硝酸钠优选用于本发明的方法。
在一个实施方式中，第一诱变剂是核苷酸-烷基化剂或核苷酸-脱氨基剂。已经看到，在这些条件下，可以在第一个诱变步骤和选择步骤之后获得大量的酵母突变体，其可以用于进一步的诱变。
在一个实施方式中，第一诱变剂是核苷酸-烷基化剂，并且第二诱变剂是核苷酸-脱氨基剂或UV辐射。可以通过核苷酸-烷基化剂作为第一诱变剂的特殊组合获得特别大量的可以在第二个诱变步骤中使用的酵母突变体。第二种诱变剂优选为核苷酸-脱氨基剂。
在一个实施方式中，通过加入以下物质之一获得高渗培养基：以下的氯化物和硫酸盐：钠，钾，镁，钙，和糖(包括果糖和葡萄糖)，以及包括山梨糖醇和甘露醇的糖醇。技术人员已知，在述及酵母时，术语高渗涉及高渗水溶液具有比酵母细胞质更高的渗透压的事实，即它的渗透压大于308mOsmol/l。在500至700mOsmol/l范围内的渗透压是优选的。
在一个实施方式中，醇脱氢酶抑制剂选自以下：吡唑、3-甲基吡唑、4-甲基吡唑和乙酰水杨酸。已经看到，这些醇脱氢酶抑制剂特别适合于选择需要减少乙醇生产的酵母，包括酿酒酵母和贝酵母。特别优选使用吡唑。
在一个实施方式中，选择因素之一选自组(a)，并且选择因素之一选自组(b)。在根据本发明的方法中，可以通过组合两种不同的选择因素来生产更多的突变体，这些选择因素对于减少的乙醇生产和增加的甘油产生具有更好的性质。
在一个实施方式中，第一选择因素选自组(a)，并且第二选择因素选自组(b)。
在另一个实施方式中，第一选择因素选自组(b)，并且第二选择因素选自组(a)。
在一个实施方式中，在第一选择步骤之后进行测试步骤，在此期间测试在第一选择步骤之后获得的中间酵母突变体，以观察它们是否在与所使用的前述酵母株相同的条件下在乙醇发酵过程中产生更多的甘油，由此仅对符合该条件的中间酵母突变体进行第二诱变步骤和第二选择步骤。
优选还测试在乙醇发酵过程中产生更多甘油的这些中间突变体是否比前述所使用的酵母株产生更少的乙醇，由此仅对生产更多甘油和更少乙醇的中间酵母突变体进行第二诱变步骤和第二选择步骤。
应当理解，相同条件意味着所用的酵母中间突变体和前述酵母株在相同的培养基中，相同气氛和相同温度下尽可能同时孵育，然后测定甘油的浓度并且优选也测定乙醇的浓度。测定甘油浓度和测定乙醇浓度的合适方法是本领域技术人员已知的。
前述目的也通过根据上述方法获得的酵母突变体实现，并且以保藏号DSM 29822保藏在德国微生物菌种保藏中心(Leibnitz-lnstitut DSMZ-Deutsche Sammlung vonMikroorganismen und Zellkulturen GmbH)。这是一种酿酒酵母亚种贝酵母，分类名称：酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。申请人使用的参考标志是NP12B8或本文也是Nitrite Pyra 12 B8或NO2Pyral2B8。
该株在含有10g酵母提取物，10g细菌蛋白胨，5gNaCl用H2O配制成1L的pH值设为7的培养基中增殖。为此，将培养基在121℃下灭菌20分钟，并且在灭菌之后，pH值在6和7之间。繁殖在30℃的温度下有氧地进行。孵育发生持续24小时。
当来自雷司令(Riesling)葡萄的汁(通过加糖获得90°Oe(21.6％白利度)的汁重量)，NOPA值为107mg/ml(+/-5mg/l)时，酵母以4x106/ml的剂量施用，在15-25℃的发酵温度下35分钟后，该酵母突变体产生具有以下比例的乙醇、葡萄糖、果糖、琥珀酸和甘油的葡萄酒：
乙醇：90-106g/l
葡萄糖：0.18-0.42g/l
果糖：0.95-5.55g/l
琥珀酸：2-5g/l
甘油：10-16g/l
该酵母突变体的特征还在于具有如图4所示的特征性DNA分布的事实，其在DE 102006 022 569中的验证过程中描述，该验证方法一般针对微生物描述，使用在第一PCR反应中描述的引物A-not，C-not，G-not，T-not，并且使用在第二PCR反应中描述的引物T-not-A，T-not-T，T-not-G以及之后也如DE 10 2006 022 569中所述的凝胶电泳。
在该方法中，“NO2Pyra12B8”在图4中指以保藏号DSM 29822保藏在德国微生物菌种保藏中心的酵母，“O.Freddo”指酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)亚种贝酵母株LW317-30，其在世界范围内以“Oenoferm Freddo F3”的名称销售并且“阴性对照”指不含DNA的样品。使用来自热科学公司(Thermo Scientific)(Fermentas)的GeneRuler DNA梯标混合物作为长度标准。
初始时描述的问题也通过根据上述方法获得的酵母突变体来解决，当处于90°Oe(21.6％白利度)和NOPA值＝107mg/l(+/-5mg/l)条件下的汁用4x106/ml的剂量发酵时，在15-25℃的发酵温度下35天后，突变体产生具有以下比例的乙醇和甘油的葡萄酒：
乙醇 70-150g/l
甘油 10-20g/l
还可以通过在生产酒精饮料的方法中使用根据上述方法获得的酵母突变体或以保藏号DSM 29822保藏在德国微生物菌种保藏中心的酵母突变体或根据上述方法获得的酵母突变体来解决上述问题，当处于90°Oe(21.6％白利度)和NOPA值＝107mg/l(+/-5mg/l)条件下的汁用4x106/ml的剂量发酵时，在15-25℃的发酵温度下35天后，酵母产生具有以下比例的乙醇和甘油的葡萄酒：
乙醇 70-150g/l，
甘油 10-20g/l。
在一个实施方式中，所述用途使得酒精饮料由葡萄汁生产。应当理解，它包括用于从白葡萄和红葡萄的汁生产酒精饮料，包括通过放血(saignée)方法(blanc de noir)和其桃红(rosé)形式从红葡萄获得的白汁。
从以下对优选实施方式和实施例的描述可以清楚本发明的其它优点、特征和潜在应用。
图1：诱变和选择步骤的示意图
图2：在第一诱变和第一选择步骤之后的发酵进程
图3：在第二诱变和第二选择步骤之后的发酵进程
图4：以保藏号DSM29822保藏的酵母突变体的DNA概况
实施例
进行各种突变试验以产生酵母突变体，其在指定的初始葡萄糖浓度的葡萄酒或培养基中产生低乙醇浓度和增加的甘油浓度。
初步测试
在使用溴化乙锭进行的初步测试中，其通过移码产生突变，可能显示在该过程中，可能仅产生几个有活力的酵母，其尤其是呼吸链受损，并且显示出线粒体DNA的一般变化。这种酵母不适于发酵。
进一步可能表明，重复使用相同的诱变剂导致在第二次诱变步骤和后续选择之后获得少量酵母突变体或完全没有酵母突变体。
进行图1所示的诱变方案，其中“++”表示获得了超过100个具有所需性质的酵母突变体，“+”是指得到1至99个具有所需性质的酵母突变体，“-”是指没有获得具有所需性质的酵母突变体，并且“0”是指完全没有获得酵母突变体。根据所需性质，这里应理解，在乙醇发酵过程中，突变体在相同条件下比前述使用的酵母株产生更多的甘油和更少的乙醇。
在测试发酵期间可以确定甘油的生产通常在发酵开始后立即发生，并且通常持续长达10天。大部分甘油是通过发酵前100g糖/升培养基产生的，此后甘油产生减慢，但原则上并不完全停止。
相比之下，已经发现生产乙醇的乙醇发酵持续长达三周，使得乙醇发酵和甘油生产在发酵期间稍有重叠。
下面详细说明不同的诱变和/或选择步骤和测试方法。
概述
选择诱变和选择步骤，从而它们基于葡萄酒的生产方法。
在第一诱变和第一选择后，选择10,000个突变体并测试其甘油产量。在以这种方式筛选的10,000个突变体中，选择具有最高甘油浓度的400个，并再次测试其甘油产量。
将具有可重现性增加的甘油产生的突变体进行小规模葡萄酒发酵，然后进行感官分析。还进行了乙醇测定。
选择具有最佳感官特征，最高甘油产量，最低乙醇浓度和最佳发酵能力的突变体进行第二诱变步骤。在此过程中，通过品尝和评估氧化记忆，酸度，苦味和整体印象来主观地确定感官特征。发酵能力，继而发酵速度，是由发酵过程中的重量损失和发酵持续直到消耗糖(特别是葡萄糖)的时间所度量的。
之后，如果某一突变体在35天后至少70％的存在的糖，那么认为该突变体是合适的。
采用核苷酸-烷基化剂的诱变步骤
甲磺酸乙酯(EMS)用作核苷酸-烷基化剂。将酵母株的集落从琼脂平板接种到5mlYPD培养基中，并在28℃下培养过夜。然后通过离心沉淀细胞并用pH值为7的100mM磷酸钾缓冲液洗涤两次。然后将细胞重悬于10ml pH值为7的100mM磷酸钾缓冲液中。加入37.5μl纯EMS至500μl细胞悬液。将悬液在振荡器上在30℃下孵育1小时。通过加入1ml 5％硫代硫酸钠(重量％)终止反应。然后将酵母细胞用5％硫代硫酸钠水溶液洗涤一次。离心后，沉淀重新悬浮于500μl YPD培养基中。
采用核苷酸-脱氨基剂的诱变步骤
亚硝酸钠用作核苷酸-脱氨基剂。将酵母株的集落从琼脂平板接种到5ml YPD培养基中，并在28℃下培养过夜。离心收集细胞，用2ml水洗涤两次。洗涤后，将细胞重新悬浮于2ml水，2ml 0.6M pH4.5的乙酸钠缓冲液和2ml 55ml亚硝酸钠溶液的混合物中。将细胞悬液在振荡器上在30℃下孵育8分钟。孵育后，将1ml悬液与9ml pH值为7的0.67M磷酸钾缓冲液混合以停止反应。
采用UV辐射的诱变步骤
将酵母株的集落从琼脂平板接种到含0.3M氯化钠的5ml YPD培养基中，并在28℃下培养过夜。通过离心沉淀细胞，并在不含葡萄糖和果糖的10ml KP培养基中洗涤一次并重悬。在600nm处测量光密度(OD)，将悬液稀释至0.025的光密度并转移到皮氏培养皿中。然后在Hoefer UVC 500交联剂中，以2000μJ/cm2的强度用254nm波长的UV辐射照射皮氏培养皿中的细胞悬液45秒。
采用醇脱氢酶抑制剂的选择步骤
吡唑用于用醇脱氢酶抑制剂的选择。
对于该选择步骤，将从突变步骤获得的酵母细胞铺展到还含有5g/l吡唑的KP培养基的平板上，由此将约2,000至3,000个细胞转移到30×30cm的平板上。将平板在18℃下在微需氧条件下孵育10天。微需氧条件指的是，板周围的气体混合物(气氛)仅具有2至10体积％的氧气，而不是空气中常规的20体积％的氧气。
采用高渗培养基的选择步骤
在该选择步骤中，使用氯化钠产生渗透压。将从诱变步骤获得的酵母细胞转移到含有17.53g/l氯化钠的KP培养基的平板上，由此将约2,000至3,000个细胞施加到30×30cm的平板上。通常假设在高渗培养基中具有生长优势的突变体产生更多的甘油。将平板在18℃下在微需氧条件下孵育10天。微需氧条件指的是，板周围的气体混合物(气氛)仅具有2至10体积％的氧气，而不是空气中常规的20体积％的氧气。
培养基
使用的KP培养基，特别是用于选择步骤的被称为人工汁的培养基每升含有115.5g葡萄糖一水合物，105g果糖，3g酒石酸，0.3g柠檬酸，0.3g苹果酸，0.3g(NH4)2SO4，2g KH2PO4，0.2g MgSO4x7H2O，4mg MnSO4x H2O，4mg ZnSO4x7H2O，0.5mg CuSO4x5H2O，0.5mg K1，0.2mgCoCI2x6H2O，0.5mg(NH4)6Mo7O24，0.5mg H3BO3，300mg肌醇，1mg烟酸，1mg泛酸钙，1mg盐酸吡哆醇，0.04mg生物素，1mg对氨基苯甲酸，247mg L-谷氨酰胺，183mg L-精氨酸，87.7mg L-色氨酸，71mg L-丙氨酸，58.9mg L-谷氨酸，38.4mg L-丝氨酸，37.1mg L-苏氨酸，23.7mg L-亮氨酸，21.8mg L-天冬氨酸，21.8mg L缬氨酸，18.6mg L-苯丙氨酸，16mg L-异亮氨酸，16mgL-组氨酸，15.4mg L-甲硫氨酸，9mg L-酪氨酸，9mg L-甘氨酸，8.3mg L-赖氨酸和6.4mg L-半胱氨酸。
YPD培养基每升含有10g酵母提取物，20g蛋白胨和20g葡萄糖，pH为5.5-6.0。
将15g/l琼脂加入所述培养基中以使所述培养基成板。
甘油产量研究
将来自琼脂平板的酵母集落接种到YPD培养基中以测定甘油产生。在30℃下生长三天后，用20μl以这种方式生长的培养物接种1ml KP培养基。细胞密度没有调整。然后将KP培养物在18℃下在微需氧条件下孵育。十天后，通过离心和过滤移出过量的培养物。然后针对甘油浓度对该过量进行分析。甘油浓度的测定用光度法进行。使用R-Biopharm AG的试剂盒进行测量，由此将测试针对微量滴定板中的测量调整至155μl的总样品体积。
发酵测试
发酵测试使用的是真正的汁，而不是人工汁，使用通过加入蔗糖(52g)从70°Oe(17.1％白利度)富集至90°Oe(21.6％白利度)的具有107mg/l(+/-5mg/l)的NOPA值的2013陈年雷司令(Riesling)。
对于发酵，其结果如图2所示，使用2013陈年雷司令汁，其富集至91°Oe(21.7％白利度)，并且其NOPA值为124mg/l(+/-5mg/l)。
培养基pH值在3.1和3.2之间。在每种情况下，发酵温度为18℃。发酵试验没有搅拌。
测定产生的甘油、乙醇、葡萄糖和果糖以及总糖/感官分子/发酵能力
通过HPLC进行测试发酵的分析，具有以下参数：
设备：Ultimate 3000 ThermoScientific
柱REZEX ROA有机酸H+Phenomenex
210nm下的UV检测器和R1检测器
溶剂混合物：0.005N H2SO4(等度)
温度：75℃
流速：0.5ml/分钟
还可以通过品尝和评估氧化记录、酸度、苦味和整体印象来主观地确定葡萄酒组成带来的感官特征。
发酵能力，继而发酵速度，是由发酵过程中的重量损失和发酵持续直到消耗糖(特别是葡萄糖)的时间所度量的。
实施例1：
为了确定不同诱变刺激的各种效果，首先进行了使酿酒酵母亚种贝酵母株暴露于UV辐射，EMS或亚硝酸钠的测试。在本实施例中使用的株是在世界范围内以“OenofermFreddo F3”命名的酵母株。
然后通过高渗氯化钠培养基或吡唑培养基进行选择。
图2显示了由EMS或亚硝酸钠突变导致的一些株的研究结果。图2在图中显示了在总共35天内测试发酵期间的重量损失，由此使用的汁总重量通过称重来确定，并且重量损失数据与原始使用的酵母和汁的重量有关。重量损失越大，相应株的发酵能力越好。
表1显示35天后该测试发酵的HPLC分析的结果，由此对每个突变体进行两次独立的发酵试验。
表1：
在图2和表1中，首先用EMS进行诱变步骤，然后用NaCl进行选择的酵母称为“FEMS16 NaCl E7”和“F EMS 16 NaCl B7”。首先用亚硝酸盐暴露于诱变步骤并用NaCl进行选择的株被命名为“FNitrite 8NaCl H10”和“F Nitrite 8NaClA12”，首先用亚硝酸盐进行诱变步骤，然后用吡唑选择的株被命名为“FNitrite 6 Pyra B9”和“F Nitrite 7 Pyra F10”以及首先用EMS进行诱变步骤，然后用吡唑选择的株称为“F EMS 3 Pyra A9”、“F EMS 4 PyraD11”和“F EMS3 Pyra E10”。名称“参比”是指用作比较酵母的酿酒酵母亚种贝酵母株，其也用于前述第一诱变步骤。
可以看出，作为该第一诱变步骤和随后选择步骤的结果，获得了在相同条件下与比较酵母相比产生更少和更多甘油的突变体。基本上，必须考虑到，一部分中间突变体在35天后没有转化所有的糖，所以这些测试中的甘油值仅在有限的程度上是可比的。
实施例2：
在该试样测试中，选择在测试发酵中显示特别高的甘油浓度的实施例1获得的“FEMS 16 NaCI D7”株用于第二诱变步骤和选择步骤。EMS、亚硝酸钠和UV辐射也用于第二诱变步骤。在每种情况下随后选择是用氯化钠或吡唑进行的。可以看出，在之前用EMS突变的株的情况下，在EMS的进一步突变中没有获得活性突变体。
用在第二诱变步骤和第二选择后获得的不同突变体的发酵测试的结果例示于图3中。
“F EMS 16 NaCI D7”和“F EMS 4 Pyra D11”指中间突变体。在该实施例中，它们代表比较值。
“Nitrite Pyra 12 B8”、“Nitrite Pyra 12 H3”和“Nitrite Pyra 25 A1”表示使用亚硝酸钠进行第二诱变步骤和用吡唑进行第二选择步骤的株。UV Pyra 17 A8表示一种株，其用UV辐射进行第二诱变步骤，并用吡唑进行第二选择。
表2显示了这些株的HPLC研究结果。这里也可以看出，得到一些产生比实施例1中获得的中间突变体多得多的甘油的株，并且得到一些产生较少甘油的株。总共仅产生少量突变体，其在第二诱变步骤开始时产生比使用的前述中间突变体少得多的乙醇。“NitritePyra 12 H3”株的特征是葡萄糖和果糖都不完全转化，这表明发酵不完全。
在测试发酵35天后获得表2所示的数据，其中进行每个突变体的两次发酵试验，彼此独立进行评估。
表2：
总之，在测试中看到，在35天后，突变体“Nitrite Pyra 12 B8”提供了几乎完全的发酵，并且在两个发酵试验中都产生了超过11g/l的甘油。该突变体对应于以保藏号DSM29822保藏在德国微生物菌种保藏中心的株。
PCT/RO/134表

Claims (13)

1.产生酵母突变体的方法，其中至少一个酵母株在第一诱变步骤中与第一诱变剂接触并且在第二诱变步骤中与第二诱变剂接触，所述方法的特征在于
-所述第一和第二诱变剂互相不同并且选自下组：
核苷酸-烷基化剂、核苷酸-脱氨基剂和UV辐射，并且
-第一选择步骤在所述第一和第二诱变步骤之间进行且第二选择步骤在所述第二诱变步骤之后进行，其中使来自在先诱变步骤的突变体暴露于选自下组的选择因素：
(a)高渗培养基和
(b)醇-脱氢酶抑制剂。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述核苷酸-烷基化剂选自以下：硫酸二甲酯(DMS)，甲磺酸乙酯(EMS)，甲磺酸甲酯(MMS)，1-甲基-3-硝基-1-亚硝基胍(MNNG)，甲基亚硝基氰胺(MNC)，甲基亚硝基脲(MNU)和DNA甲基转移酶。
3.如权利要求1和2中任一项所述的方法，其特征在于，所述核苷酸-脱氨基剂选自以下：无机亚硝酸盐、有机亚硝酸盐和亚硝酸。
4.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其特征在于，所述第一诱变剂是核苷酸-烷基化剂或核苷酸-脱氨基剂。
5.如权利要求1-4中任一项所述的方法，其特征在于，所述第一诱变剂是核苷酸-烷基化剂并且所述第二诱变剂是核苷酸-脱氨基剂或UV辐射。
6.如权利要求1-5中任一项所述的方法，其特征在于，通过加入以下物质之一获得所述高渗培养基：以下的氯化物和硫酸盐：钠，钾，镁，钙，和糖，包括果糖和葡萄糖，以及糖醇，包括山梨糖醇和甘露醇。
7.如权利要求1-6中任一项所述的方法，其特征在于，所述醇脱氢酶抑制剂选自以下：吡唑、3-甲基吡唑、4-甲基吡唑和乙酰水杨酸。
8.如权利要求1-7中任一项所述的方法，其特征在于，所述选择因素之一选自组(a)并且所述选择因素之一选自组(b)。
9.如权利要求1-8中任一项所述的方法，其特征在于，在所述第一选择步骤之后进行测试步骤，其中测试在所述第一选择步骤之后获得的中间酵母突变体是否在相同条件下与初始使用的酵母株相比在乙醇发酵过程中产生更多的甘油，由此仅对符合该标准的中间酵母突变体进行所述第二诱变步骤和所述第二选择步骤。
10.通过如权利要求1-9中任一项所述的方法获得并且以保藏号DSM29822保藏在德国微生物菌种保藏中心的酵母突变体。
11.通过如权利要求1-9中任一项所述的方法获得酵母突变体，其特征在于，在90°Oe(21.6％白利度)和NOPA值＝107mg/l的汁以4x106/ml的剂量发酵期间，在15-25℃的发酵温度下35天后，所述突变体产生具有以下比例的乙醇和甘油的葡萄酒：
乙醇 70-150g/l
甘油 10-20g/l。
12.通过如权利要求1-9中任一项所述的方法获得酵母突变体，或如权利要求10所述的酵母突变体，或如权利要求11所述的酵母突变体在生产酒精饮料的方法中的用途。
13.如权利要求12所述的用途，其特征在于，所述酒精饮料由葡萄汁产生。
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