JP2003169666A

JP2003169666A - 新規酵母及びその利用

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Publication number: JP2003169666A
Application number: JP2001369641A
Authority: JP
Inventors: Tadao Asano; 忠男浅野; Naotaka Kurose; 直孝黒瀬; Junichi Hiramatsu; 順一平松
Original assignee: Takara Holdings Inc
Current assignee: Takara Holdings Inc
Priority date: 2001-12-04
Filing date: 2001-12-04
Publication date: 2003-06-17
Anticipated expiration: 2021-12-04
Also published as: JP4393028B2

Abstract

(57)【要約】【課題】新規酵母及びその取得方法、並びに該新規酵
母を用いるリンゴ酸、コハク酸、及び酢酸イソアミルが
バランスよく高生成される酒類、食品の製造方法を提供
する。【解決手段】ｐＨ２．７以下の選択培地で増殖能が高
いことを特徴とする新規酵母。ｐＨ２、７以下の選択培
地で増殖能が高い菌株を分離することを特徴とする該新
規酵母の取得方法。該新規酵母を用いることを特徴とす
る酒類、食品の製造方法。【効果】リンゴ酸及びコハク酸をバランスよく高生成
する新規酵母を取得することができ、該酵母を用いて、
従来から行われている方法で製造することにより得るこ
とができる酒類、食品は従来にはない好ましいものであ
る。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、新規酵母、新規酵
母の取得方法、及び酒類、食品の製造方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃ
ｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）の一株で
ある清酒酵母を馴養、交雑、又は変異処理することによ
り、親株より有機酸を多く生成する株を取得する育種例
には、以下の報告がある。リンゴ酸高生成株としては、
コハク酸デヒドロゲナーゼの阻害剤であるジメチルサク
シネートの感受性酵母（特開平３−１７５９７５号公
報）、シクロヘキシミド耐性酵母（日本醸造協会誌、第
８８巻、第８号、第６４５〜６４７頁、１９９３年）、
及びコハク酸デヒドロゲナーゼの阻害剤であるテノイル
トリフルオロアセトン又はオキシカルボキシン耐性酵母
（特開平６−１２１６７０号公報）が知られている。こ
れらの酵母は、親株に比べてリンゴ酸を、それぞれ約３
倍、約５〜７倍、及び約２倍生成することが述べられて
いる。また、爽快な酸味を生成する泡なし清酒酵母（特
開平５−３１７０３６号公報）、及びメタ重亜硫酸カリ
ウムに対する馴養株（特開平７−２０３９５１号公報）
が知られている。

【０００３】しかし、これらの酵母は特定の有機酸は著
量生成するが、他の性質、例えば、清酒製造における日
本酒度の切れ及びアルコール濃度は親株より劣ってい
る。また、吟醸香の成分の一つである酢酸イソアミルの
生成、及び吟醸香の強弱の指標である酢酸イソアミルの
イソアミルアルコールに対する比（Ｅ／Ａ比）について
は述べられていない。昨今の清酒需要が低下する中で、
その需要を喚起する方法の一つとして、特定の好ましい
香味成分によるものだけでなく、複数の成分がバランス
よく含まれる清酒が考えられる。前述のような好ましい
香味成分の多くは、酵母のアルコール発酵に伴って生成
されるものであり、このような酵母の開発が望まれてい
た。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】本発明はこのような状
況にかんがみて行われたものであり、リンゴ酸及びコハ
ク酸をバランスよく高生成する新規酵母及びその取得方
法、並びに該新規酵母を用いるリンゴ酸、コハク酸、及
び酢酸イソアミルがバランスよく高生成される酒類、食
品の製造方法を提供することにある。

【０００５】

【課題を解決するための手段】本発明を概説すれば、本
発明の第１の発明は、ｐＨ２．７以下の選択培地で増殖
能が高い菌株であることを特徴とする新規酵母に関し、
第２の発明は第１の発明の酵母の取得方法に関し、第３
の発明は、第１の発明の酵母を用いる酒類、食品の製造
方法に関する。

【０００６】本発明者らは、糖の中間代謝産物耐性を選
択の指標として変異株を取得すれば有機酸生成の変化し
た酵母が取得できるのではないかと考えた。そこで、通
常の酵母が生育できない濃度の酸を含有する平板培地に
生育してくる変異株を分離し、該変異株の麹汁培養試験
を実施したところ、有機酸を高生成し、酸度が高い変異
株を見出した。更に、該変異株を用いて酒類、食品の製
造を行ったところ、リンゴ酸、コハク酸、及び吟醸香の
成分である酢酸イソアミルをバランスよく高含有し、並
びにアルコール濃度等の他の成分がその親株とそん色な
いことを見出し、本発明を完成した。

【０００７】

【発明の実施の形態】以下に、本発明を具体的に説明す
る。本発明における酵母の種類には特に限定はない。こ
の中でサッカロミセス・セレビシエに属する酵母を用い
るのが好ましく、特に、清酒酵母、焼酎酵母、ワイン酵
母、ビール酵母、等の醸造用酵母、パン酵母、等の酒
類、食品の製造に用いられているものが好適に用いるこ
とができる。酒類、食品の製造に用いられている酵母の
菌株は、常法により用いられているものを使用でき、例
えば、清酒酵母では、財団法人日本醸造協会Ｋ−７０１
号（以下、Ｋ−７０１株という）、Ｋ−９０１号等を、
焼酎酵母では協会焼酎酵母２号等を挙げることができ
る。また、野生株、変異処理株、馴養株、交雑株、細胞
融合株、プラスミド等による形質転換株も含まれる。

【０００８】本発明では、酵母を後述の選択培地に培養
後、分離することにより所望の新規酵母を取得すること
ができるが、選択培地に培養する前に、酵母に馴養、変
異処理等を行う方が効率的に得ることができ、特に変異
処理が好適である。変異処理は、公知の変異誘導方法に
より行うことができる。その例としては、紫外線若しく
は放射線を照射させる物理的方法、又はＮ−メチル−Ｎ
´−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン、エチルメタンス
ルホネート（以下、ＥＭＳという）等の薬剤を適宜用い
ることにより行えばよく、有効な変異処理としてはＥＭ
Ｓ処理を挙げることができる。

【０００９】本発明においてはｐＨ２．７以下の選択培
地を用いる。選択培地をｐＨ２．７以下にするために
は、リンゴ酸、フマル酸、乳酸、オキサロ酢酸、イソク
エン酸、ピルビン酸、コハク酸等の有機酸、及び塩酸、
硫酸、硝酸、リン酸等の無機酸を添加すればよい。これ
らの酸の中でリンゴ酸、フマル酸、乳酸、オキサロ酢
酸、イソクエン酸、ピルビン酸、コハク酸、塩酸を用い
ることが好ましい。選択培地に添加する酸は任意の一種
類を添加すればよい。その結果得られる菌株は酸の種類
に関係なく同様の性質を有する菌株を取得することがで
き、リンゴ酸及びコハク酸がバランスよく高生成され
る。しかし、いずれの酸を添加した培地を用いる場合に
おいても、ｐＨ２．７以下にする必要がある。ｐＨが
２．７超では菌株間の増殖能の差を区別し難く、効率よ
く分離することができない。酸の添加量はｐＨ２．７以
下となる量で適宜選択すればよく、ｐＨ２．３〜２．７
の範囲となるように添加するのが好適である。ｐＨ２．
３未満では、所望の酵母が十分増殖できない場合があ
り、効率よく取得することができない。選択培地の炭素
源、窒素源等の栄養源は、酵母の培養に用いることがで
きるものであれば特に限定はない。このため、酵母の培
養に用いられている培地を用い、酸を所望のｐＨとなる
ように添加すればよい。この培地の例として、ＹＰＤ培
地（１ｗ／ｖ％酵母エキス、２ｗ／ｖ％ポリペプトン、
２ｗ／ｖ％グルコース）、ＳＤ培地〔イーストニトロゲ
ンベース（アミノ酸不含）０．６７ｗ／ｖ％、グルコー
ス２．０ｗ／ｖ％〕、ＹＭ培地（０．３ｗ／ｖ％酵母エ
キス、０．３ｗ／ｖ％麦芽エキス、０．５ｗ／ｖ％ポリ
ペプトン、２ｗ／ｖ％グルコース）、麹汁培地等を挙げ
ることができる。

【００１０】このような選択培地を用いて酵母の培養を
行い、増殖能が高い菌株を分離する。本発明でいう増殖
能とは、ＤＮＡ合成及び細胞分裂を伴い、細胞数が増加
する能力のことをいう。選択培地で培養後に増殖能が高
い菌株を分離する。増殖能は平板培地上のコロニーを観
察し、それが大きいほど増殖能が高いと判定できる。ま
た、平板培養法により分離したコロニーを、親株を対照
とし、選択培地で液体培養後、培養液の６６０ｎｍにお
ける吸光度（以下、ＯＤ₆₆₀という）を測定し、それが
大きいほど増殖能が高いと判定することもできる。

【００１１】分離培養は常法により行えばよい。この例
として、平板培養法、平板塗抹法、等による方法を挙げ
ることができる。直径１００ｍｍのシャーレ１枚当りの
細胞数は、１×１０⁴個〜１×１０⁹個、好ましくは１×
１０⁵個〜１×１０⁶個植菌すればよい。１×１０⁴個未
満では、シャーレ１枚当りの細胞数が少ないために効率
が悪い。一方、１×１０⁹個超では、シャーレ１枚当り
の細胞数が多く、複数のコロニーが接触するので、単一
のコロニーの分離を行うことができない。培養温度及び
時間は、それぞれ酵母が増殖できる温度及び１日〜７日
の範囲で適宜選択すればよく、好ましくは、それぞれ２
０℃〜３０℃及び２晩〜３日の範囲で選択すればよい。
また、酵母又はそれに変異処理を施したものをｐＨ２．
７以下になるように前述の酸を添加してなる液体培地で
短時間培養後、選択培地に塗布してもよい。このように
行うことにより、該液体培地における増殖能が高い菌株
は短い誘導期の後、対数増殖期に入る。このため、短時
間の培養においては、該菌株の細胞数が液体培地中に増
加し、選択培地に塗布する所望の菌株の割合を高くする
ことができる。液体培地における培養時間は、用いる酵
母、変異処理条件等により異なるので、適宜選択すれば
よい。

【００１２】分離した菌株を、拡大培養後、ブリックス
（Ｂｒｉｘ）１０の麹汁培地で培養し、その上清中の有
機酸含量を測定する。その結果、リンゴ酸及びコハク酸
の含量が高い株を選択すればよい。有機酸含量の測定
は、有機酸分析装置等により測定することができる。

【００１３】また、親株に対する、用いる酸の最小生育
阻害濃度を求め、それより高い濃度の酸を含有する培地
を用いて分離することもできる。この方法を用いれば、
直径１００ｍｍのシャーレ１枚に植菌する細胞数を１×
１０⁹個で行うこともでき、所望の菌株をより効率的に
取得することができる。この方法としては特に限定はな
いが、一例を以下の検討例に示す。

【００１４】（検討例）酵母として、Ｋ−７０１株を用
い、リンゴ酸に対する最小生育阻害濃度を求めた。Ｋ−
７０１株をＳＤ液体培地〔イーストニトロゲンベース
（アミノ酸不含）０．６７ｗ／ｖ％、グルコース２．０
ｗ／ｖ％〕５ｍｌに一夜振とう培養して、酵母前培養液
を得た。次に、リンゴ酸を０．０ｍＭ、３００ｍＭ、３
７０ｍＭ、４６０ｍＭ、５２０ｍＭ含有するＹＰＤ平板
培地（１ｗ／ｖ％酵母エキス、２ｗ／ｖ％ポリペプト
ン、２ｗ／ｖ％グルコース、２ｗ／ｖ％寒天）に前培養
したＫ−７０１株を植菌した。３０℃で３日間培養後生
育を観察して生育の程度〔非常に生育した：（＋＋）、
生育した（＋）、生育しない（−）〕を調べた。Ｋ−７
０１株に対するリンゴ酸の最小生育阻害濃度の結果を表
１に示す。

【００１５】

【表１】

【００１６】表１の結果より、Ｋ−７０１株は３７０ｍ
Ｍのリンゴ酸ではコロニーを形成するが、４６０ｍＭ以
上の濃度ではコロニーを形成しない。また、４６０ｍＭ
リンゴ酸含有ＹＰＤ培地のｐＨを測定した結果、ｐＨは
２．７であった。したがって、ＹＰＤ培地において、Ｋ
−７０１株に対するリンゴ酸の最小生育阻害濃度は４６
０ｍＭであり、そのｐＨは２．７であることが明らかに
なった。

【００１７】本発明の新規酵母は、前述の酸をｐＨ２．
７以下になるように添加してなるＳＤ液体培地〔イース
トニトロゲンベース（アミノ酸不含）０．６７ｗ／ｖ
％、グルコース２．０ｗ／ｖ％〕において、３０℃、４
８時間静置培養した培養液のＯＤ₆₆₀が野生株の１．８
倍以上を有するものである。また、該酵母はリンゴ酸及
びコハク酸をバランスよく高生成するものである。本発
明の代表的菌株であるＭＡ−Ｒ１６１株は、Saccharomy
ces cerevisiae ＭＡ−Ｒ１６１株と表示、命名さ
れ、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託セン
ターにＦＥＲＭＰ−１８５５２として寄託されてい
る。

【００１８】ＭＡ−Ｒ１６１株は、Ｋ−７０１株の変異
株であり、それらの菌学的性質を以下に示す。（菌学的性質）１．形態学的性質ＹＰＤ培地（１ｗ／ｖ％酵母エキス、２ｗ／ｖ％ポリペ
プトン、２ｗ／ｖ％グルコース）で３０℃、２日間培養
した後、顕微鏡で観察した。ａ）形：卵円形ｂ）大きさ：長さ４．７〜７．９μｍ、幅３．８〜５．
５μｍ２．増殖の形態：出芽３．生化学的観察ａ）糖の発酵性０．６７ｗ／ｖ％イーストニトロゲンベース（ディフコ
社製）、下記記載の糖（２ｗ／ｖ％）をダーラム管入り
試験管に分注して、当該菌株を接種し、３０℃で５日間
培養して、その炭酸ガスの発生の有無を観察した。グルコース（＋）ガラクトース（＋）スクロース（＋）マルトース（＋）ラクトース（−）メリビオース（−）ラフィノース（＋）ｂ）糖の資化性０．６７ｗ／ｖ％イーストニトロゲンベース（ディフコ
社製）、下記記載の糖（２ｗ／ｖ％）を用いて、オーキ
サノグラフ法により、３０℃で１４日間の生育を観察し
た。グルコース（＋）ガラクトース（＋）スクロース（＋）マルトース（＋）ラクトース（−）ｃ）硝酸塩の同化性：（−）硝酸塩は硝酸カリウムとしてウィッカーハムの炭素化合
物同化試験用培地（ディフコ社製）を用いて、オーキサ
ノグラフ法により生育を観察した。ｄ）ＴＴＣ染色性：赤ｅ）β−アラニン培地、３５℃、３日間培養での生育：
（−）４．高泡の形成清酒の小仕込を行ったところ、高泡の形成は観察されな
かった。以上、形態学的、生化学的結果は、本発明酵母
菌株がサッカロミセス・セレビシエに属する酵母である
ことを示すものである。また、β−アラニン培地、３５
℃での生育が陰性、及び清酒の小仕込試験において、高
泡の形成も認められないことから、該菌株はＫ−７０１
株の変異株であることを示すものである。

【００１９】５．薬剤に対する感受性ジメチルスクシネート（１．５ｖ／ｖ％）を含むＹＭ培
地（０．３ｗ／ｖ％酵母エキス、０．３ｗ／ｖ％麦芽エ
キス、０．５ｗ／ｖ％ペプトン、２ｗ／ｖ％グルコー
ス）を用いて、３０℃で７日間培養した。親株であるＫ
−７０１株と同等に生育してきた株を＋で表した。ジメ
チルスクシネートに対する結果を表２に示す。親株であ
るＫ−７０１株及びその変異株であるＭＡ−Ｒ１６１株
は生育し、感受性を示さなかった。

【００２０】

【表２】

【００２１】６．薬剤に対する耐性シクロヘキシミド（０．５μｇ／ｍｌ）含有ＹＭ培地、
テノイルトリフルオロアセトン（０．１ｍｇ／ｍｌ）、
５０％オキシカルボキシンを含有する農薬プラントバッ
クス〔３．２ｍｇ／ｍｌ：日本曹達（株）製〕含有ＹＮ
ＢＣ培地（０．６７ｗ／ｖ％ディフコ社イーストニトロ
ゲンベース、２ｗ／ｖ％クエン酸、２ｗ／ｖ％寒天、ｐ
Ｈ６．０）、又はメタ重亜硫酸カリウム（０．２ｍｇ／
ｍｌ）含有ＳＤ培地を用いて親株であるＫ−７０１株と
同様に生育してこなかった株を−で示した。薬剤に対す
る耐性の結果を表３に示す。ＭＡ−Ｒ１６１株はいずれ
の薬剤を含有する培地においても生育せず、耐性を示さ
なかった。

【００２２】

【表３】

【００２３】７．酸存在下における増殖能ＳＤ液体培地５ｍｌで３０℃で一晩振とう培養したＭＡ
−Ｒ１６１株の培養液２５μｌを、リンゴ酸、コハク
酸、乳酸、オキサロ酢酸、イソクエン酸、ピルビン酸、
若しくはフマル酸を表４に示す濃度で含有するｐＨ２．
７以下のＳＤ液体培地５ｍｌ、又は塩酸をｐＨ２．７に
なるように添加したＳＤ液体培地５ｍｌに添加し、３０
℃で二晩静置培養した。静置培養後、培養液のＯＤ₆₆₀
を測定した。対照として、親株であるＫ−７０１株を用
いて同様の培養を行った。その結果を表４に示す。ＭＡ
−Ｒ１６１株は、表４に示す酸を含有するｐＨ２．７以
下のＳＤ液体培地において、その親株であるＫ−７０１
株より増殖能が１．８倍以上高かった。

【００２４】

【表４】

【００２５】本発明の新規酵母を用いて、酒類、食品を
製造することができ、その種類は、製造に酵母を用いる
ものであれば特に限定はない。この例として、清酒、焼
酎、ワイン、ビール、雑酒等の酒類、及びパン、発酵調
味料等の食品を挙げることができ、得られる酒類、食品
は、アルコール濃度等の好ましい性質はそのままで、爽
快な口当りや香気の良い酸味がバランスよく付与された
製品となる。例えば、清酒では、アルコール濃度及び日
本酒度は同等で、リンゴ酸の爽快な酸味、コハク酸の旨
味、及び酢酸イソアミルによる吟醸香がバランスよく付
与され、香味に優れたものである。これらの酒類、食品
の製造は常法により行うことができ、清酒、焼酎、ワイ
ン、ビール、又はパン等の用いる原料は特に限定するも
のではない。例えば、穀類では、精白及び／又は未精白
の粳米、糯米、大麦、小麦、ライ麦、ヒエ、アワ、コウ
リャン、ソバ、トウモロコシ、モロコシ、マイロ等の穀
類が挙げられるが、一般的な原料を適宜用いることがで
きる。また、本発明の新規酵母を１種類単独で、又は他
の酵母、かび、細菌等の微生物と２種類以上併用して用
いてもよく、更に該新規酵母にＫ−７０１株等の公知の
サッカロミセス・セレビシエに属する菌株を組合せて酒
類、食品を製造することができる。更に、該新規酵母又
は該公知サッカロミセス・セレビシエをそれぞれ用いて
製造した酒類、食品を混合して新規の酒類、食品も製造
できる。

【００２６】かくして、本発明により、ｐＨ２．７以下
の選択培地で増殖能が高い菌株を分離することにより得
られる新規酵母及びその取得方法、並びに該新規酵母を
用いる酒類、食品の製造方法が提供される。

【００２７】

【実施例】以下、本発明を実施例によって更に具体的に
説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるもの
ではない。

【００２８】実施例１Ｋ−７０１株をＹＰＤ（１ｗ／ｖ％酵母エキス、２ｗ／
ｖ％ポリペプトン、２ｗ／ｖ％グルコース）液体培地５
ｍｌで３０℃にて一夜振とう培養後、遠心分離で集菌
し、滅菌水で洗浄した。洗浄菌体を４．３５ｍｌの０．
２Ｍリン酸バッファー（ｐＨ８．０）に懸濁し、２０ｗ
／ｖ％グルコース溶液を０．５ｍｌ添加してかくはんし
た後、ＥＭＳを０．１５ｍｌ添加して、３０℃にて１時
間穏やかに振とうした。振とう後、そのうちの１ｍｌを
４９ｍｌの６ｗ／ｖ％チオ硫酸ナトリウム溶液に加え
て、室温で１０〜１５分放置後、遠心分離で集菌し、１
ｍｌの滅菌水に懸濁した。そして、該懸濁液０．１ｍｌ
（４×１０⁷個／ｍｌ）を４６０ｍＭリンゴ酸含有ＹＰ
Ｄ平板培地（ｐＨ２．７）１０枚に植菌した。３０℃で
３日間培養後、出現したコロニーの中で大きいコロニー
を形成する９１株を釣菌し、以下に示す麹汁培養試験を
行った。釣菌した菌株を５ｍｌのＹＰＤ液体培地に植菌
し、３０℃で一晩、振とう培養した。次に、各培養液３
ｍｌを集菌し、Ｂｒｉｘ１０．０に調整した麹汁液体培
地に植菌し、１５℃で１０日間発酵させた。次に、発酵
させた培養液を遠心（３，０００ｒｐｍ、５分間）分離
後、上澄を０．４５μｍのフィルターによりろ過し、島
津高速液体クロマトグラフ有機酸分析システム〔島津製
作所（株）製〕にて有機酸分析を行った。その結果、親
株であるＫ−７０１株と比較してリンゴ酸生成量とコハ
ク酸生成量との和が１．２倍以上有する株が１０株得ら
れた。それらの中で顕著に酸度が高いＭＡ−Ｒ１６１株
及びＭＡ−Ｒ１０１株について、表５に示す仕込配合で
総米２００ｇの小仕込試験を実施した。掛米及び麹は、
それぞれ７７ｗ／ｗ％精白のα化米及び７５ｗ／ｗ％精
白の白米を用いて製造した麹を使用し、酵母は５．０ｍ
ｌ中に１０⁹個含むものを用いた。発酵温度は１５℃一
定で、留添仕込後１５日目で遠心分離法により上槽し、
清酒を得た。得られた清酒の分析結果を表６に示す。

【００２９】

【表５】

【００３０】

【表６】

【００３１】表６より、前述の取得方法により分離した
ＭＡ−Ｒ１６１株及びＭＡ−Ｒ１０１株を用いることに
より得られる清酒は、親株のＫ−７０１株を用いた場合
と比べて、日本酒度の切れがよく、滴定酸度、リンゴ
酸、コハク酸、酢酸イソアミル、及びＥ／Ａ比が、それ
ぞれ約１．４倍、約１．４倍〜１．６倍、約１．５〜
１．７倍、約１．６〜２．０倍、及び１．３〜１．５倍
であり、バランスよくこれらの香味成分が増加している
ものであった。また、アルコール濃度は変異株及びＫ−
７０１株ともに同じであり、十分にアルコールが生成さ
れていた。これらの清酒について官能検査を行った結
果、ＭＡ−Ｒ１６１株及びＭＡ−Ｒ１０１株を用いて得
られる清酒は、リンゴ酸による爽快な酸味、コハク酸に
よる旨味を呈するだけでなく、酢酸イソアミルによる吟
醸香が優れた、従来にみられない好ましい香味を呈する
ものであった。特に、この傾向はＭＡ−Ｒ１６１株にお
いて顕著であった。したがって、親株の生育できないｐ
Ｈになるようにリンゴ酸を添加してなる選択培地におい
て生育する変異株は、その親株の特性を保持しながら、
リンゴ酸及びコハク酸をバランスよく高生成する菌株で
あることが明らかになった。さらに、該菌株を用いた酒
類、食品、特に清酒の製造に用いることにより、これら
の有機酸及び香気を親株よりバランスよく多量に生成
し、優れたものを製造できることが明らかになった。

【００３２】実施例２酵母にＫ−７０１株を用い、実施例１と同様に変異処理
を行った。選択培地として３０ｍＭフマル酸含有ＳＤ平
板培地（ｐＨ２．７）に変異処理を行った酵母を直径１
００ｍｍのシャーレ１枚当り１×１０⁶個植菌し、３０
℃で３日間培養した。形成したコロニーのうち、その大
きさが大きいものを５０菌株釣菌し、ＹＰＤ培地（１ｗ
／ｖ％酵母エキス、２ｗ／ｖ％ポリペプトン、５ｗ／ｖ
％グルコース）で拡大培養後、Ｂｒｉｘ１０の麹汁培地
３０ｍｌに６×１０⁸個植菌し、１５℃で１０日間静置
培養した。対照としては、Ｋ−７０１株を用い、Ｂｒｉ
ｘ１０の麹汁培地で同様に培養した。その上清につい
て、実施例１と同様にリンゴ酸及びコハク酸含量を測定
し、Ｋ−７０１株と比較してリンゴ酸生成量とコハク酸
生成量との和が１．２倍以上有する株が３株得られた。
その結果を表７に示す。

【００３３】

【表７】

【００３４】表７より、麹汁培地による培養液中のリン
ゴ酸及びコハク酸含量の和は、対照のＫ−７０１株に比
べて、該菌株を変異処理後、３０ｍＭフマル酸含有ＳＤ
平板培地で分離した菌株の方が高い濃度であった。した
がって、フマル酸をｐＨ２．７になるように添加してな
る選択培地を用いて増殖能が高い菌株を分離すると、該
菌株はリンゴ酸及びコハク酸をバランスよく高生成する
ことが明らかになった。また、表４に示す濃度になるよ
うにリンゴ酸、コハク酸、乳酸、オキサロ酢酸、イソク
エン酸、ピルビン酸、又はフマル酸を添加したＳＤ液体
培地、及びｐＨ２．７になるように塩酸を添加したＳＤ
液体培地において、リンゴ酸及びコハク酸生成量が高か
ったクローン番号ＦＵＭ−Ｒ４株及びＦＵＭ−Ｒ２２
株、並びに対照株であるＫ−７０１株を３０℃で２晩静
置培養し、ＯＤ₆₆₀を測定した。その結果、前者の２株
は対照株の１．８倍以上の値であり、選択培地に用いた
酸以外の酸においても増殖能が高いことが明らかになっ
た。

【００３５】実施例３酵母としてＫ−７０１株を用い、実施例１と同様に変異
処理を行った。選択培地として１５０ｍＭ乳酸含有ＳＤ
平板培地（ｐＨ２．７）に変異処理を行った酵母を直径
１００ｍｍのシャーレ１枚当り１×１０⁶個植菌し、３
０℃で３日間培養した。形成したコロニーのうち、その
大きさが大きいものを１００菌株釣菌し、選択培地と同
じ組成の液体培地で拡大培養後、Ｋ−７０１株を対照と
して選択培地と同じ組成の液体培地１０ｍｌに２×１０
⁶個植菌し、３０℃で３日間培養した。培養後、培養液
の６６０ｎｍにおける吸光度を測定し、その値が大きい
２菌株を選択した。該菌株はＢｒｉｘ１０の麹汁培地３
０ｍｌに６×１０⁸個植菌し、１５℃で１０日間静置培
養した。対照としては、Ｋ−７０１株を用い、Ｂｒｉｘ
１０の麹汁培地で同様に培養した。その上清について、
実施例１と同様にリンゴ酸及びコハク酸含量を測定し、
Ｋ−７０１株と比較してリンゴ酸生成量とコハク酸生成
量との和が１．２倍以上有する株が２株得られた。その
結果を表８に示す。

【００３６】

【表８】

【００３７】表８より、麹汁培地による培養液中のリン
ゴ酸及びコハク酸含量の和は、対照のＫ−７０１株に比
べて、該菌株を変異処理後、１５０ｍＭ乳酸含有ＳＤ平
板培地で分離した菌株の方が、高い濃度であった。した
がって、乳酸をｐＨ２．７になるように添加してなる選
択培地を用いて増殖能が高い菌株を分離すると、該菌株
はリンゴ酸及びコハク酸をバランスよく高生成すること
が明らかになった。また、表４に示す濃度になるように
リンゴ酸、コハク酸、乳酸、オキサロ酢酸、イソクエン
酸、ピルビン酸、又はフマル酸を添加したＳＤ液体培
地、及びｐＨ２．７になるように塩酸を添加したＳＤ液
体培地において、リンゴ酸及びコハク酸生成量が高かっ
たクローン番号ＬＡＣ−Ｒ４８株及びＬＡＣ−Ｒ５９
株、並びに対照株であるＫ−７０１株を３０℃で２晩静
置培養し、ＯＤ₆₆₀を測定した。その結果、前者の２株
は対照株の１．８倍以上の値であり、選択培地に用いた
酸以外の酸においても増殖能が高いことがあきらかにな
った。

【００３８】実施例４オキサロ酢酸、イソクエン酸、及びピルビン酸を、それ
ぞれ２３ｍＭ、７８ｍＭ、及び３８ｍＭを含有するＳＤ
平板培地（ｐＨは、それぞれ２．５、２．４、及び２．
５）を調製し、これを選択培地として変異株の分離を行
った。酵母としてはＫ−７０１株を親株として実施例１
と同様に変異処理を行い、前述の選択培地に直径１００
ｍｍのシャーレ１枚当り１×１０⁶個塗布した後、３０
℃で３日間培養した。培養後、増殖能が高い株、すなわ
ちコロニーの大きい株を各選択培地につき５０株ずつ釣
菌した。選択株を実施例２と同様に拡大培養、次いでＢ
ｒｉｘ１０の麹汁培地で培養を行い、実施例１と同様に
麹汁培養液中のリンゴ酸及びコハク酸含量の測定を行っ
た。その結果、２３ｍＭオキサロ酢酸、７８ｍＭイソク
エン酸、及び３８ｍＭピルビン酸を含有する各選択培地
から、親株であるＫ−７０１株よりリンゴ酸及びコハク
酸をバランスよく高生成する菌株が、それぞれ３株、１
０株、８株選択することができた。更に、これらの菌株
について、表４に示す濃度になるようにリンゴ酸、コハ
ク酸、乳酸、オキサロ酢酸、イソクエン酸、ピルビン
酸、又はフマル酸を添加したＳＤ液体培地、及びｐＨ
２．７になるように塩酸を添加したＳＤ液体培地におい
て、３０℃で２晩静置培養を行った結果、いずれの菌株
においてもＯＤ₆₆₀は親株のＫ−７０１株の１．８倍以
上であった。したがって、選択した菌株は、選択培地に
用いた酸以外のおいても増殖能が高いことが明らかにな
った。

【００３９】実施例５塩酸をｐＨ２．７になるように添加したＳＤ平板培地を
調製し、これを選択培地として変異株の分離を行った。
酵母としてはＫ−７０１株を親株として実施例１と同様
に変異処理を行い、前述の選択培地に直径１００ｍｍの
シャーレ１枚当り１×１０⁶個塗布した後、３０℃で３
日間培養した。培養後、増殖能が高い株、すなわちコロ
ニーの大きい株を５０株釣菌した。選択株を実施例２と
同様に拡大培養、次いでＢｒｉｘ１０の麹汁培地で培養
を行い、実施例１と同様に麹汁培養液中のリンゴ酸及び
コハク酸含量の測定を行った。その結果、親株であるＫ
−７０１株よりリンゴ酸及びコハク酸をバランスよく高
生成する菌株が、それぞれ１２株選択することができ
た。更に、これらの菌株について、表４に示す濃度にな
るようにリンゴ酸、コハク酸、乳酸、オキサロ酢酸、イ
ソクエン酸、ピルビン酸、又はフマル酸を添加したＳＤ
液体培地、及びｐＨ２．７になるように塩酸を添加した
ＳＤ液体培地において、３０℃で２晩静置培養を行った
結果、いずれの菌株においてもＯＤ₆₆₀は親株のＫ−７
０１株の１．８倍以上であった。したがって、選択した
菌株は、選択培地に用いた酸以外のおいても増殖能が高
いことが明らかになった。

【００４０】

【発明の効果】本発明によれば、リンゴ酸及びコハク酸
をバランスよく高生成する新規酵母を取得することがで
き、該酵母を用いて製造される酒類、食品は従来にはな
い好ましいものである。更に、アルコール発酵能等の他
の性質は親株と同等であるので、従来から行われている
方法で製造することができる。特に、清酒は、リンゴ酸
による爽快な酸味、コハク酸による旨味を呈するだけで
なく、酢酸イソアミルによる吟醸香が優れたものであ
り、複数の香味成分をバランスよく高含有する好ましい
ものである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者平松順一滋賀県大津市瀬田３丁目４番１号寳酒造株式会社中央研究所内Ｆターム(参考） 4B047 LG59 LP19 4B065 AA80X AC05 AC12 AC15 BA18 BA23 BC02 CA42

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】ｐＨ２．７以下の選択培地で増殖能が高
いことを特徴とする新規酵母。
【請求項２】リンゴ酸、フマル酸、乳酸、オキサロ酢
酸、イソクエン酸、ピルビン酸、コハク酸、塩酸から選
択される酸によりｐＨ調整を行う選択培地を用いること
を特徴とする請求項１に記載の新規酵母。
【請求項３】酵母がサッカロミセス・セレビシエ（Ｓ
ａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）に
属する酵母である請求項１又は２に記載の新規酵母。
【請求項４】請求項１〜３のいずれか１項に記載の新
規酵母を取得する方法において、ｐＨ２．７以下の選択
培地で増殖能が高い菌株を分離することを特徴とする請
求項１〜３のいずれか１項に記載の新規酵母の取得方
法。
【請求項５】請求項１〜３のいずれか１項に記載の新
規酵母を用いることを特徴とする酒類、食品の製造方
法。