KR20090089189A

KR20090089189A - 신규한 전분분해활성 및 알코올 발효능을 갖는 효모 및이를 이용한 전통주의 제조방법

Info

Publication number: KR20090089189A
Application number: KR1020080014604A
Authority: KR
Inventors: 정건섭; 주민노; 홍성욱
Original assignee: 연세대학교 산학협력단
Priority date: 2008-02-18
Filing date: 2008-02-18
Publication date: 2009-08-21

Abstract

본 발명은 신규한 전분분해활성 및 알코올 발효능을 갖는 효모 및 이를 이용한 전통주의 제조방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는, 원형질체 융합 방법을 통해 전분분해활성 및 알코올 발효능을 동시에 가지고 있어 공지의 효모보다 우수한 알코올 생성능을 갖는 새로운 효모융합체를 개발하고, 이를 전통주 제조에 적용함으로써, 전통주 제조에 따른 생산공정을 간소화하고 생산비용을 절감할 수 있는 전분분해활성 및 알코올 발효능을 갖는 효모 및 이를 이용한 전통주의 제조방법에 관한 것이다.

전분분해활성, 알코올 발효능, 원형질체 융합, 효모, 전통주

Description

신규한 전분분해활성 및 알코올 발효능을 갖는 효모 및 이를 이용한 전통주의 제조방법{Novel yeast strain having starch assimilation and alcohol fermenting ability, and method for preparing traditional rice wines by using the strain}

우리나라의 전통적인 발효주는 원료와 제조방법, 관능적 특성에 따라 25여종으로 구분되며, 그 중 가장 대표적인 발효주로는 탁주와 약주가 알려져 있다. 탁주 와 약주는 원료 상에 큰 차이가 없으며 곡류나 국()의 첨가량을 약간씩 달리하여 발효 숙성시킨 술덧을 체로 걸러서 외관이 백탁한 상태인 것을 막걸리 또는 탁주라고 하고, 발효된 술덧을 여과한 맑은 술을 약주라고 분류한다. 전통 발효주는 알코올에서 유래되는 쓴맛과 발효 중에 생성되는 유기산에 의한 상큼한 신맛, 단백질 분해산물인 아미노산 맛, 산과 알코올의 에스테르화(esterification) 산물인 향기, 전분분해 산물인 당류 등이 잘 조화를 이룬 독특한 풍미를 지닌 술이다.

전통 발효주의 발효에는 효모가 이용되는데, 효모는 술, 빵, 맥주 이외에 된장, 간장과 같은 장류의 발효에도 이용되며, 단백질과 비타민을 풍부하게 함유하고 있기 때문에 약용, 식용 및 사료용으로 널리 이용되고 있다. 효모는 39속으로 분류되고, 그 중 사카로마이세스 속(Saccharomyces)의 효모가 술 제조에 많이 사용되고 있다. 효모는 세포막을 투과(透過)하여 세포 안으로 흡수된 영양성분을 이용하는 단세포생물이다. 그러나 효모의 세포막은 전분이나 단백질과 같은 고분자물질은 투과시키지 못하기 때문에 포도당과 같은 단당류나 아미노산, 암모니아와 같은 저분자물질로의 전환을 필요로 한다.

또한, 누룩은 전분질 원료에 자연계 존재하는 곰팡이가 배양된 것을 말하거나 혹은 전분분해에 이용되는 대표적인 곰팡이를 배양한 것을 말한다. 누룩은 제조방법에 따라 자연 중에 존재하는 미생물에 의하여 만들어지는 재래누룩과 살균한 전분질 원료에 순수배양한 아스퍼질러스 카와키(Aspergillus kawachii), 아스퍼질러스 오리재(Aspergillus oryzae) 등을 접종하여 만든 개량누룩으로 분류된다.재래 누룩은 누룩 중에 생육하는 여러 균주가 작용하여 다양한 풍미의 술이 제조되고, 개량누룩은 잡균의 오염이 없어 균일한 품질의 술이 제조되는 특색이 있다. 이와 같이 누룩에는 아스퍼질러스 오리재(Aspergillus oryzae), 아스퍼질러스 나이거(Aspergillus niger), 아스퍼질러스 가와키(Aspergillus kawachii), 아스퍼질러스 쉬로우사미(Aspergillus shirousamii), 리조퍼스 트리티키(Rhizopus tritici) 등의 곰팡이와 사카로마이세스 세레비지애(Sacchromyces cerevisiae) 등의 효모, 그리고 고초균, 젖산균 등의 많은 미생물이 생육하며, 누룩의 종류에 따라 생육 미생물이나 미생물이 생산하는 효소 및 유기산 생성량 등이 상이하여 탁주와 약주의 맛, 향기, 색 등의 품질적인 차이가 생긴다고 보고되어 있다.

오늘날 전통주 발효 공정은 포도당과 같은 저분자 물질을 이용하는 효모가 전분질인 곡류를 기질로 이용하기 위해서는 누룩의 사용이 반드시 필요하다. 그러나 이 과정에서의 필수조건인 누룩의 생산설비와 생산비용 문제, 그리고 첨가되는 누룩에 의한 누룩취로 인하여 기호성이 떨어지는 단점이 있다.

한편, 종래의 미생물 육종·개량 방법은 우수한 형질을 가진 균주를 분리하거나 돌연변이를 유발시킨 후 목적에 알맞은 성질의 균주를 선택하는 방법들이 사용되어 왔으나, 최근에는 이전과는 다른 원형질체 융합과 유전자 조작기술 등을 이용한 새로운 미생물 육종방법이 개발되었다.

원형질체 융합은 독자적으로 갖고 있는 sexual mating이 아닌, 화학적 또는 전기적 방법으로 원형질체를 융합시켜서 지금까지의 교잡으로는 획득할 수 없는 것을 인위적으로 융합시켜서 새로운 융합체를 얻는 방법이다. 이 방법은 세포의 동종 간에는 물론 이종간에도 재조합 균주의 출현빈도가 높은 장점을 가지고 있기 때문에 산업적으로도 실용균주의 육종이 가능하고 생물학 및 분자생물학의 연구에도 넓게 이용되는 등 학문적으로 관심이 높아지고 있는 기술이며, 한번에 보다 많은 유전자를 도입할 수 있기 때문에, 알코올 발효와 같이 많은 유전자가 관여하는 대사계의 개량에 유리한 방법이다. 또한 원형질체 융합으로 육종한 균주는 유전자변형체(genetically modified organism, GMO)의 법적 규제를 받지 않고 사용이 가능하므로 실용효모의 육종에 적합하다고 보고된 바 있다.

현재까지 전통주 발효 공정에서 효모융합 방법을 이용하여 전분분해활성과 알코올 발효능이 동시에 존재하는 효모융합체를 개발하고 이를 응용한 산업화는 아직 되어있지 않다.

본 발명의 목적은 원형질체 융합 방법으로 우수한 전분분해활성 및 알코올 발효능을 갖는 새로운 효모융합체 및 그 제조방법을 개발하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 신규 효모융합체를 이용하여 전통주를 제조함으로써 생산공정이 간단하고, 생산비용을 절감할 수 있는 개선된 전통주의 제조방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 신규 효모융합체를 이용하여 제조한 전통주 특유의 누룩취가 없고, 관능성이 향상된 전통주를 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 전분분해활성 및 알코올 발효능을 갖는 효모융합체 사카로마이세스 속(Saccaromyces sp.) FA776 KCCM 10926P를 제공한다.

본 발명은 또한

전분 분해능이 우수한 모균주 및 알코올 발효능이 우수한 모균주를 각각 선발하는 단계;

상기 모균주를 원형질체 완충용액에 첨가하여 원형질체를 형성하는 단계; 및

상기 원형질체를 세포 융합하는 단계를 포함하는 전분분해활성 및 알코올 발효능을 갖는 효모의 제조방법을 제공한다.

본 발명은 또한 상기 신규 효모를 이용한 전통주의 제조방법을 제공한다.

본 발명은 또한 상기 신규 효모를 이용하여 제조한 전통주를 제공한다.

본 발명은 종래의 전통주 제조에 있어서 전분분해활성을 갖는 곰팡이와 알코올 발효능을 갖는 곰팡이의 혼합 배양액을 이용함에 따른 생산비용의 증가 및 누룩취로 인한 기호성 저하의 단점을 해소한 것으로, 본 발명의 신규 효모는 원형질체 융합 방법으로 제조되어 전분분해활성과 알코올 발효능을 동시에 가지고 있고, 그 효과에 있어서도 공지의 효모에 비해 알코올 발효능이 높고 전통주 특유의 누룩취가 없어 생산비용을 절감하고 관능성이 향상된 전통주를 제공하는 효과가 있다.

이하, 본 발명의 구성을 구체적으로 설명한다.

본 발명은 전분분해활성 및 알코올 발효능을 갖는 효모융합체 사카로마이세스 속(Saccaromyces sp.) FA776 KCCM 10926P에 관한 것이다.

본 발명의 신규 효모융합체 사카로마이세스 속(Saccaromyces sp.) FA776 KCCM 10926P은 모균주의 원형질체 융합을 통해 개발된 것으로, 신규 효모 개발을 위한 모균주의 원형질체 융합방법은 특별히 제한하지는 않으나, 모균주의 선발, 모균주의 단수체 유도, 돌연변이를 통한 영양요구성 변이주의 생산, 이들의 원형질체 형성 및 원형질체의 융합을 거쳐 신규한 본 발명의 효모를 개발하는 것이 바람직하 다.

본 발명은 또한

상기 원형질체를 세포 융합하는 단계를 포함하는 전분분해활성 및 알코올 발효능을 갖는 효모의 제조방법에 관한 것이다.

상기 방법에 있어서, 전분 분해능이 우수한 모균주 및 알코올 발효능이 우수한 모균주의 종류는 특별히 제한되지 않으나, 전분 분해능이 우수한 모균주는 사카로마이세스 디아스타티커스(Saccharomyces diastaticus) KCTC 1804이고, 알코올 발효능이 우수한 모균주는 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae) KOY-1인 것이 바람직하다.

또한 상기 방법에 있어서, 전분 분해능이 우수한 모균주 또는 알코올 발효능이 우수한 모균주가 이배체인 경우, 이배체인 모균주를 단수체로 유도하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 상기 단수체로 유도하는 단계는 특별히 제한되지 않으나, 이배체인 모균주를 포자전형성(presporulation) 배지에서 25 내지 35℃에서 1 내지 2일간 배양한 후, 포자형성(sporulation) 배지에서 25 내지 35℃에서 3 내지 5일간 배양하는 것이 바람직하다.

또한 상기 방법에 있어서, 전분 분해능이 우수한 모균주 또는 알코올 발효능이 우수한 모균주가 영양요구성 마커를 포함하고 있지 않은 경우, 영양요구성 마커 를 포함하고 있지 않은 모균주를 돌연변이 유발 용액을 사용하여 영양요구성 변이주를 제조하는 단계를 추가로 포함하는 것이 바람직하다.

상기 전분분해활성 및 알코올 발효능을 갖는 효모의 제조방법을 다음과 같이 단계별로 설명한다.

a) 제1단계: 모균주의 선발

모균주로, 전분 분해능이 우수한 사카로마이세스 디아스타티커스(Saccharomyces diastaticus) KCTC 1804와, ㈜ 국순당으로부터 분양받은 알코올 발효능이 우수한 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae) KOY-1을 사용한다.

b) 제2단계: 단수체 유도 단계

본 발명의 신규 효모의 모균주에 있어, 사카로마이세스 디아스타티커스(Saccharomyces diastaticus) KCTC 1804는 단수체의 상태이나, 알코올 발효능이 우수한 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae) KOY-1는 이배체이므로, 단수체 유도과정을 거치는 것이 바람직하다.

상기 모균주의 단수체 유도방법은 특별히 제한하지는 않으나, 포자전형성(presporulation) 배지에서 25 내지 35℃에서 1 내지 2일간 배양한 후 포자형성(sporulation) 배지에서 상기와 같은 온도조건으로 3 내지 5일간 배양하여 유도하는 것이 바람직하다.

상기 포자전형성(presporulation) 배지는 5∼15% (w/v) 덱스트로우즈, 0.1∼1% (w/v) 펩톤 및 0.5∼1.5% (w/v) 효모 추출물을 포함하는 것이 바람직하나, 당업자의 수준에서 조성 또는 함량의 가감이 가능하여 이에 특별히 제한하지는 않는다.

상기 포자형성(sporulation) 배지는 0.5∼2% (w/v) 포타슘 아세테이트, 0.1∼1% (w/v) 덱스트로우즈 및 0.05∼1% (w/v) 효모 추출물을 포함하는 것이 바람직하나, 당업자의 수준에서 조성 또는 함량의 가감이 가능하여 이에 특별히 제한하지는 않는다.

상기 모균주 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae) KOY-1의 단수체 유도를 통하여 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae) KH-12를 획득한다.

c) 제3단계: 영양요구성 변이주 제조

상기 모균주인 사카로마이세스 디아스타티커스(Saccharomyces diastaticus) KCTC 1804는 Trp 영양요구성 마커를 포함하고 있는 반면, 상기 단계에서 유도된 단수체인 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae) KH-12는 영양요구성 마커를 포함하고 있지 않아 에틸메탄 설포네이트(EMS)를 사용하여 돌연변이를 유발하여 선별마커를 포함하는 영양요구성 변이주를 제조한다.

상기 EMS 돌연변이 유발 용액의 조성은 특별히 제한하지는 않으나, 에틸메탄 설포네이트(EMS), 인산염 완충용액 및 글루코오스 용액을 포함하는 것이 바람직하다.

상기 영양요구성 변이주의 제조방법은 특별히 제한하지는 않으나, 상기 돌연변이 유발 용액을 90% 이상의 사멸율을 나타내는 100분 내지 130분 동안 처리하는 것이 바람직하다.

상기 돌연변이 유발을 통해 Met 영양요구성 마커를 지닌 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae) KH-12변이주를 획득한다.

d) 제4단계: 원형질체 형성

상기 단계에서 얻은 영양요구성 마커를 보유한 선발균주를 원형질체 완충용액을 첨가하고, 리티카아제(lyticase)를 처리하여 원형질체를 형성한다.

e) 제5단계: 세포융합

상기 원형질체를 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 용액에서 20 내지 40℃의 온도조건에서 20 내지 40분간 방치하여 원형질체 융합을 유도한다.

상기 PEG 용액은 PEG 4,000, 0.01M CaCl₂ 및 1.2M 솔비톨을 포함하는 것이 바람직하나, 이에 특별히 제한하지는 않는다.

f) 제6단계: 전분분해활성 및 알코올 발효능을 동시에 갖는 신규 세포융합체 선발

상기 단계에서 세포융합 과정을 통해 전분 분해능 및 알코올 발효능이 모균주보다 우수하고, 총 DNA 함량이 약 2배인 효모융합체를 최종 선발한다.

상기 효모융합체는 10세대 계대배양 후의 복귀돌연변이체(revertant) 복귀율이 4.64%로 유전적 안정성이 안정적으로 유지된다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 전분배지에서 발효 시 모균주인 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae) KOY-1은 알코올 생성을 못하는 반면, 효모융합체는 13 mg/mL의 알코올을 생성하며, 이는 모균주 중 전분이용성 효모인 사카로마이세스 디아스타티커스(Saccharomyces diastaticus) KCTC 1804에 비해 57% 향상된 알코올 발효능을 나타낸다.

또한, 본 발명의 일 실시예에 따르면, 효모융합체 또는 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae) KOY-1을 각각 사용하여 25℃에서 15일간 발효한 발효주의 최종 알코올 함량은 각각 123.5 내지 134.4 mg/mL, 132.2 내지 140.0 mg/mL으로, 본 발명의 효모융합체는 공지 균주와 상응하는 우수한 알코올 발효능을 가지고 있다.

따라서, 본 발명자들은 우수한 전분분해활성 및 알코올 발효능을 동시에 갖는 효모융합체 사카로마이세스 속(Saccaromyces sp.) FA776 을 2008년 2월 16일자로 사단법인 한국종균협회 한국미생물보존센터에 기탁하여 기탁번호 KCCM 10926P를 받았다.

본 발명은 또한 상기 신규 효모를 이용한 전통주의 제조방법에 관한 것이다.

상기 전통주의 제조방법은 특별히 제한하지는 않으나, 통상의 원료미 1kg 당 0.6 내지 1.2 중량부의 효모융합체 사카로마이세스 속(Saccaromyces sp.) FA776 KCCM 10926P을 누룩으로 사용하여 전통주 발효에 사용하는 것이 바람직하다. 또한, 20 내지 30℃에서 9 내지 11일 동안 발효 후 5 내지 15℃에서 3 내지 7일 동안 발효하는 것이 좋다. 상기 범위의 발효조건에서 전통주의 맛이 좋고, 누룩취가 제거되어 관능적인 면에서 우수한 전통주의 제조가 가능하다.

본 발명은 또한 상기 신규 효모를 이용한 전통주 제조방법에 따라 제조된 전통주에 관한 것이다.

상기 전통주의 주요 아미노산은 알라닌, 프롤린 및 라이신으로 이루어져 있으며, 종래의 균주를 이용한 전통주에 비해 아미노산 함량이 작은 특징이 있다.

상기 전통주의 주요 유기산은 젖산 및 시트르산으로 이루어져 있고, 특히 푸마르산 및 숙신산을 각각 2㎍/mL, 60 내지 141㎍/mL 포함하고 있다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시하나, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1> 원형질체 융합에 의한 전분 분해능 및 알코올 발효능이 우수한 신규 효모융합체의 제조

전분 분해능이 우수한 효모로 사카로마이세스 디아스타티커스(Saccharomyces diastaticus) KCTC 1804를 사용하였고, 알코올 발효능이 우수한 사카로마이세스 세 레비지애(Saccharomyces cerevisiae) KOY-1 균주를 모균주로 하여 효모융합체 제조에 사용하였다.

효모의 단수체 유도는 포자전형성 배지(presporulation 배지, 10% (w/v) 덱스트로우즈, 0.3% (w/v) 펩톤, 0.8% (w/v) 효모추출물)에서 30℃, 1일간 배양한 후 포자형성배지(sporulation 배지, 1% (w/v) 포타슘 아세테이트, 0.5% (w/v) 덱스트로우즈, 0.1% (w/v) 효모추출물)에서 30℃, 5일간 배양하였다. 형성된 포자는 말라카이트 그린(malachite green, 32745, Sigma, USA) 염색을 하여 현미경으로 확인한 후 원심분리하여 균체를 회수한 뒤, 6.7mM Tris-HCl buffer(pH 7.8) 3mL에 현탁 하였다. 현탁액에 200U/㎕ lyticase(L-4025, Sigma, USA)를 처리하여 1일간 방치한 다음 초음파 세포 파쇄기(Sonosmasher, Ulsso Hitech Co., Korea)를 이용하여 포자를 분리한 뒤 8mg/mL 스트렙토마이신(S-9137, Sigma, USA)을 0.5mL 첨가하여 1시간 동안 방치하였다. 상등액을 취해 YPD((1% (w/v) 효모추출물, 2% (w/v) 펩톤, 2% (w/v) 덱스트로우즈, 2% (w/v) 아가) 플레이트에 도말한 후 sporulation 배지에 배양하여 포자 형성 유무를 확인하였다.

효모의 단수체 유도는 효모 중의 총 DNA 함량 비교를 통해 확인하였다.

sporulation 배지에서 배양한 후 단수체를 유도한 결과, 말라카이트 그린으로 염색하였을 때 포자는 대조염색과 비교하여 녹색으로 관찰되었다. 알코올 발효능이 우수한 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae) KOY-1의 경우 이배체 상태로 관찰되었고, 전분 분해능이 우수한 사카로마이세스 디아스타티커스(Saccharomyces diastaticus) KCTC 1804의 경우 단수체 상태인 것이 확인되었다. 따라서, 효모의 단수체 유도는 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae) KOY-1에서만 실시하였다.

단수체 유도과정에서 얻어진 사카로마이세스 세레비지애 KH-1∼KH-12의 DNA 함량을 조사한 결과, KH-12의 DNA 함량이 모균주인 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae) KOY-1의 절반 정도임이 확인되었기에, 사카로마이세스 세레비지애 KH-12 균주를 영양요구성 변이주 제조에 사용하였다.

(영양요구성 변이주 제조)

사카로마이세스 디아스타티커스(Saccharomyces diastaticus) KCTC 1804는 Trp의 영양요구성 마커가 있음을 확인하였고 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae) KOY-1에서 분리된 KH-12는 영양요구성 마커를 보유하지 않아 KH-12에 에틸메탄 설포네이트(ethylemethane sulfonate, EMS)를 사용하여 돌연변이를 유발하여 선별마커를 보유한 영양요구성 변이주를 제조하였다.

영양요구성 변이주 제조에 사용된 돌연변이 유발 용액은 9.7M 에틸메탄 설포네이트(220507, Sigma, USA) 0.3mL 와 0.2M 인산염 완충용액(pH 8.0) 9.2mL 그리고 40% (w/v) 글루코오스 용액 0.5mL로 제조하여 사용하였고, EMS 처리는 90% 이상의 사멸율을 나타내는 구간인 120분간 처리하였다. 돌연변이 유발 용액 0.2mL에 6% (w/v) 소듐 티오설페이트 용액 9.8mL을 첨가하여 반응을 중지하였다. 형성된 변이주의 검출은 YPD 플레이트와 SD(0.67% (w/v)　효모추출물, nitrogen base w/o amino acid, 2% (w/v) 덱스트로우즈, 2% (w/v) 한천) 플레이트에 각각 배양하여 콜로니를 얻었다.

획득한 콜로니의 중 Met 영양요구성 마커를 지닌 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae) KH-12 Met^- 변이주를 사용하였다.

(원형질체 형성)

영양요구성 마커를 보유한 선발균주의 원형질체 형성을 위해, 효모를 0.05M Tris-HCl(pH 7.5)로 2회 세척 후 0.05M Tris-HCl buffer(pH 7.5)와 1.2M 솔비톨(T-1378, Sigma, USA)로 구성된 protoplast buffer 10mL에 현탁하였다. 1M 2-머캅토에탄올(M-3148, Sigma, USA) 0.2mL을 첨가하여 30℃, 15분간 처리 후 200U/㎕ lyticase를 첨가하여 30℃, 1시간 처리하였다. protoplast buffer 로 2회 세척한 후 10mM CaCl₂를 포함하는 protoplast buffer 10mL로 재현탁 하였다.

(세포융합)

원형질체 형성 후, 세포융합을 실시하였다. 효모융합은 Wilson 등의 방법을 기초로 하였다. 효모융합에 사용한 폴리에틸렌 글리콜 용액(PEG)은 PEG 4,000(Yakuri, Japan)을 0.01M CaCl₂와 1.2M 솔비톨이 함유되어 있는 0.05M tris-HCl buffer(pH 7.5)에 용해시켜 40% (w/v) PEG 용액으로 제조하여 사용하였다. 각 효모의 원형질체를 원심분리(1,000×g, 3분)하여 모은 각각의 원형질체를 protoplast buffer에 3×10⁸cell/mL 되도록 현탁하였다. 각각의 세포 현탁액을 1:1 로 혼합한 후 원심분리(1,000×g, 3분)하여 상등액을 제거한 뒤, 침전물에 PEG 용액을 1.5mL 첨가하여 30℃, 30분간 방치하였다. 처리된 현탁액을 원심분리(1,000×g, 3분)하여 상등액을 제거하고 protoplast buffer로 세척한 후 희석하여 원형질체 재생배지(YPD 배지에 삼투안정제로 1.2M 솔비톨, 3% (w/v) 한천을 첨가)에 도말한 뒤 콜로니 형성 유무를 확인하였다.

상기 세포융합과정을 통해 총 5,000여주의 융합체를 획득하였고, 획득한 융합체의 전분분해능을 모균주인 사카로마이세스 디아스타티커스(Saccharomyces diastaticus) KCTC 1804와 비교하여 전분 분해능이 모균주와 비슷하거나 혹은 높아진 효모 10주를 1차 선발하였다. 1차 선발된 융합체 10주의 알코올 발효능을 각각의 모균주인 사카로마이세스 디아스타티커스(Saccharomyces diastaticus) KCTC 1804와 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae) KOY-1과 비교하여 최종적으로 전분배지에서의 알코올 생성능이 가장 우수한 효모융합체 사카로마이세스 속(Saccaromyces sp.) FA776 을 선발하였다(도 1).

(효모융합체의 유전적 안정성 조사)

선발된 융합주의 유전적 안정성을 조사하기 위해 YPD 액체배지에 접종하여 30℃, 진탕배양기에서 150rpm 으로 진탕 배양하였다. 2일 동안 배양한 것을 1세대로 하여 이 과정을 10세대 동안 반복하였다. 10세대의 배양액을 채취하여 적당한 배율로 희석한 후, YPD 고체배지와 SD 고체배지에 도말한 뒤, 각각의 고체배지에 나타난 콜로니 수의 비율로 융합주의 유전적 안정성을 조사하였다.

효모융합체의 유전적 안정성

균주	콜로니		복귀율(%)
	YPD	SD
FA776	646	616	4.64

표 1에 나타난 바와 같이, 선발된 효모융합체 사카로마이세스 속(Saccaromyces sp.) FA776 의 경우 10세대 계대배양 시 4.64%의 비율로 revertant로 복귀하는 것으로 관찰되어 비교적 유전적 안정성이 유지되는 것으로 사료되었다.

(효모융합체의 특성 조사)

효모의 총 DNA 함량의 비교를 통해 두 효모의 융합 여부를 관찰하였다.

선발 효모융합체 및 모균주의 총 DNA 함량

균주	흡광도(600nm)	세포수/mL	DNA 함량(fg/cell)
FA776	0.032	3.75×10⁸	42.67
KCTC 1804	0.016	3.15×10⁸	25.40
KH-12	0.017	3.20×10⁸	26.56
KOY-1	0.029	3.01×10⁸	48.17

표 2에 나타난 바와 같이, 단수체 효모 KH-12는 26.56 fg/cell, KCTC 1804는 25.40 fg/cell의 DNA 함량을 나타내었다. 이들을 사용해서 얻어진 융합체인 효모융합체 사카로마이세스 속(Saccaromyces sp.) FA776 의 DNA 함량은 42.67 fg/cell로 나타났으며 이를 통해 두 효모의 세포융합을 관찰하였다.

선발융합체의 알코올 발효능을 덱스트로우즈 기질 배지인 YPD24 배지(도 2), 전분 기질 배지인 YPS24 배지(도 3)에서 조사하였다.

알코올 발효능이 우수한 모균주인 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae) KOY-1은 YPD 24 배지에서 2일간 발효 시 알코올 생성량은 17mg/mL 이었지만, YPS24 배지(YPD 배지에서 덱스트로우즈를 제거하고, 전분 24% (w/v)를 첨가함)에서는 알코올 생성이 거의 일어나지 않았다. 따라서, 전분을 기질로 한 배지 내에서 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae) KOY-1을 이용한 알코올 발효는 불가능하다는 사실을 관찰하였다.

전분 분해능이 우수한 모균주인 사카로마이세스 디아스타티커스(Saccharomyces diastaticus) KCTC 1804는 YPD24 배지(YPD 배지에서 덱스트로우즈 함량이 24% (w/v)임)에서 2일간 발효 시 알코올 생성량은 11mg/mL이었고, YPS24 배지에서의 알코올 생성량은 7mg/mL이었다. 이는 덱스트로우즈를 기질로 사용한 배지에서의 알코올 생성량은 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae) KOY-1에 비해 떨어지지만, 전분을 기질로 사용한 배지에서는 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae) KOY-1과는 반대로 알코올 발효가 가능하다는 사실을 확인할 수 있었다.

효모융합체 사카로마이세스 속(Saccaromyces sp.) FA776의 경우 덱스트로우즈를 기질로 사용한 YPD24 배지에서 2일간 발효하였을 때의 알코올 생성량은 13mg/mL, 수용성 전분을 기질로 사용한 YPS24 배지에서의 알코올 생성량은 13mg/mL로, 덱스트로우즈를 기질로 사용한 배지에서의 알코올 생성량이 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae) KOY-1과 비슷하였고, 전분을 기질로 사용한 배지에서의 알코올 생성량은 사카로마이세스 디아스타티커스(Saccharomyces diastaticus) KCTC 1804와 비교하였을 때 57% 향상된 알코올 발효능을 가지는 것으로 관찰되었다.

따라서 전분분해활성을 가진 알코올발효 효모 개발에 관한 최종 효모융합체 사카로마이세스 속(Saccaromyces sp.) FA776 을 선발하고, 2008년 2월 16일자로 사단법인 한국종균협회 한국미생물보존센터에 기탁하여 기탁번호 KCCM 10926P를 받았다.

<실시예 2> 본 발명의 균주를 이용한 발효주의 제조

다음의 단계에 따라 발효주를 제조하였다.

(1) 주모

사면배지에 순수 배양한 효모 5 백금이를 YPD 배지 100mL에 접종한 후 30℃, 진탕 배양기에서 150rpm으로 2일간 배양하여 주모로 사용하였다.

(2) 원료미

원료미를 수세하고 20℃ 상온에서 2시간 동안 침지 한 후, 1시간 동안 물빼기를 하였다. 침지미를 증기솥에서 40분 동안 증자하고 40분 동안 뜸들인 후, 30℃로 냉각하여 사용하였다.

(3) 누룩

대조군으로 (주) 한국효소에서 생산 판매하는 개량누룩(s.p 2000U)을 구입하여 사용하고, 주모로 KOY-1을 접종하였다. 담금시 누룩의 사용량은 현재 주류제조장에서 약주 생산에 이용하는 방법인 누룩의 당화력에 따른 원료의 전분가와 사용량을 적용하여 누룩 1.2g을 원료미 1 kg 대비 100% 누룩 첨가량으로 계산하여 사용하였고 실험구에 사용된 누룩량은 표 3과 같다.

명칭	균주	누룩 함량
KOY-100	KOY-1	1.2g 누룩/1kg 원료미(100%)
KOY-50	KOY-1	0.6g 누룩/1kg 원료미(100%)
FA-100	FA776	1.2g 누룩/1kg 원료미(100%)
FA-50	FA776	0.6g 누룩/1kg 원료미(100%)

KOY-1: Saccharomyces cerevisiae KOY-1

FA776: Saccharomyces sp. FA776

(4) 담금

원료미 1kg당 증류수 1.6L의 비율로 담금하고 표 3에 나타낸 개량누룩 사용량의 비율로 누룩을 첨가하였다. 주모를 1.5×10⁷cell/mL 의 비율로 첨가하여 25℃에서 10일간, 25℃에서 10일간 발효 후 10℃에서 5일간으로 발효기간을 구분하여 담금하였다.

<실험예 1> 알코올 함량 조사

발효주의 알코올 함량 측정은 에탄올 키트(Roche, German)를 이용하여 측정하였다.

도 4에 나타난 바와 같이, 알코올 함량은 발효 1일 후부터 5 내지 8일까지 급격하게 증가한 후 완만하게 상승하여 K-100의 경우 발효 8일째에 140.0mg/mL로 최대치를 보였고 F-100, K-50, F-50의 경우 11일, 11일, 13일째 각각 134.4mg/mL, 132.2mg/mL, 123.5mg/mL로 관찰되었다. 전분 분해능을 가진 효모융합체 사용을 통해 알코올 함량 증가 혹은 발효시간 단축 등의 누룩 사용 대체가능성을 기대했지만, 원료미 대비 누룩량 100% 와 50% 실험군 모두 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae) KOY-1이 융합체인 효모융합체 사카로마이세스 속(Saccaromyces sp.) FA776 보다 최종 알코올 함량과 발효속도 모두 우수하였다. 선발된 효모융합체 사카로마이세스 속(Saccaromyces sp.) FA776 이 전분을 기질로 하는 배지에서 전분 분해 효소에 의해 기질을 이용한 알코올 생산을 한다는 사실은 관찰하였지만, 이때 작용한 전분 분해 효소의 역가는 실제 약주 담금 과정 중 누룩에서 유래된 전분 분해 효소의 역가엔 미치지 못했다는 것을 관찰할 수 있었다.

25℃에서 10일간 발효한 실험구와 25℃에서 10일간 발효 후 10℃에서 5일간 발효한 실험구와 비교한 결과 알코올 함량 차이는 없었다.

<실험예 2> 환원당 함량 조사

약주 발효과정에서 환원당 함량 분석은 dinitrosalicylic acid(DNS)법에 의해 측정하였다. 1% (w/v) 디니트로살리실산(D0550, Sigma, USA), 1% (w/v) 소듐 하이드록사이드(221465, Sigma USA), 0.05% (w/v) 소듐 설페이트(238597, Sigma, USA), 0.2% (v/v) 페놀(Duksan, Korea) 이 함유된 DNS 시약 1mL와 100배 희석한 시료용액 1mL를 혼합하여 끓는 물에서 15분간 반응시킨 후 냉각한 뒤, 3mL의 증류수를 첨가하여 혼합한 후 A₅₄₆에서 흡광도를 측정하고 D(+)-glucose의 표준곡선으로부터 환원당 함량을 산출하였다. 각 실험구의 15일간 발효 과정 중 약주의 환원당 함량의 변화는 도 5와 같다.

도 5에 나타난 바와 같이, 환원당 함량은 발효 담금일 2.64mg/mL로 나타났고 KOY-100의 경우 발효 1일째 70.33mg/mL로 최대치를 보였다. F-100, K-50, F-50의 경우 모두 발효 1일째 각각 90.00mg/mL, 62.41mg/mL, 70.11mg/mL로 최대치를 보였다. 원료 중의 전분질이 당화효소 작용으로 인해 당분으로 분해됨과 동시에 효모의 영양원이나 발효기질로 이용되었기 때문에 발효 4일째까지 환원당 함량이 급격히 감소하여 발효 5일째부터 환원당 함량이 최소치로 유지되는 것을 관찰할 수 있었다. 효모융합체 사카로마이세스 속(Saccaromyces sp.) FA776을 사용한 시험구가 KOY-1을 사용한 실험구보다 환원당 함량이 전체적으로 높게 측정이 되었는데 이는 덱스트로우즈 배지인 YPD24 배지에서 알코올 발효능 측정결과와 마찬가지로 효모융합체 사카로마이세스 속(Saccaromyces sp.) FA776의 당이용성이 KOY-1에 비해 낮다는 것을 관찰하였다.

<실험예 3> 산도 변화 조사

여과한 시료 10mL 에 1% (w/v) 페놀프탈레인 지시약을 2-3 방울 떨어뜨렸다. 뷰렛을 이용하여 시료가 미색에서 선홍색으로 변할 때까지 소비된 0.1N NaOH 양을 측정하여 다음 식에 의해 % 젖산으로 산도를 계산하였다.

도 6에 나타난 바와 같이, 산도는 담금 직후 0.02%로 매우 낮은 함량을 나타냈으나 발효 1 내지 3일간 급격히 증가하여 KOY-100의 경우 0.48%에 도달한 후 거의 변화를 보이지 않았고, F-100, K-50, F-50의 경우 각각 0.60%, 0.47%, 0.59%로 최대치를 보였다.

또한, 효모융합체 사카로마이세스 속(Saccaromyces sp.) FA776을 이용한 시험구와 KOY-1을 이용한 시험구에서 약 0.1% 정도의 산도 차이를 관찰하였다. 이를 통해 효모융합체 사카로마이세스 속(Saccaromyces sp.) FA776이 모균주 KOY-1보다 많은 유기산을 생성하는 것을 관찰하였다.

따라서, 향기성분과 관능적 검사 시 시험구간의 차이가 있을 것으로 추정된다. 또한, 알코올 함량 측정 결과에서 효모융합체 사카로마이세스 속(Saccaromyces sp.) FA776을 이용한 실험구가 KOY-1을 이용한 실험구에 비해 알코올 생성 수율이 적게 측정된 이유는 효모융합체가 유기산 생성에 더 많은 포도당을 이용하였기 때문으로 사료된다.

<실험예 4> pH 변화 조사

도 7에 나타난 바와 같이, 담금 직후 pH 5의 값을 나타내고 그 후부터는 모든 시험구가 감소하는 경향을 나타냈다. KOY-100의 경우 발효 2일째 3.61로 최저치를 보였다. F-100, K-50, F-50의 경우 모두 발효 2일째 각각 3.55, 3.53, 3.53으로 최저치를 보였다. 그 후부터 pH가 서서히 증가하여 각 실험구의 최종 pH는 KOY-100의 경우 발효 10일째 4.3으로 최대치를 보였다. F-100, K-50, F-50의 경우 14일, 11일, 15일째 각각 4.5, 4.2, 4.35으로 최대치를 보였다. 담금 직후부터 pH가 감소되는 경향은 발효기간의 경과에 따라 술덧에 생육하는 미생물의 작용으로 유기산의 생성량이 증가되어 담금 직후보다 pH가 저하된 것이다. 그 후 pH가 점차적으로 증가하였는데, 이것은 발효가 진행됨에 따라 생성된 유기산과 알코올이 서로 반응하여 에스테르와 같은 향미 형성 등에 이용되기 때문으로 판단되었다.

<실험예 5> 아미노산 함량 조사

발효주의 아미노산 분석은 high performance liquid chromatography (HPLC, Breeze system)를 이용하여 아미노산의 조성 함량을 분석하였고, 분석조건은 아래와 같다.

Column : Waters AccQ Tag amino acid analysis column(3.9×150mm, 4㎛)

Detector : FID (ex : 250nm, em : 395nm)

Mobile phase : linear gradient : A and B

mobile phase A : Waters AccQ Tag Eluent A (WAT052890)

mobile phase B : 60% Acetonitrile

flow rate : 1.0mL/min

Temp : 40℃

발효온도를 25℃에서 10일간, 25℃에서 10일간 발효 후 10℃에서 5일간 발효를 진행한 약주의 아미노산 함량은 표 4와 같다.

표 4에 나타난 바와 같이, 위의 두 종류 실험구에서 얻어진 발효주의 주요 아미노산은 Ala, Pro, Lys 이었으며 실험구간의 아미노산 경향은 비슷하게 나타났다. 10일간 발효한 실험구보다는 15일간 발효한 실험구의 아미노산 함량이 조금 더 높은 것으로 관찰 되었고, 사용효모간 차이는 효모융합체 사카로마이세스 속(Saccaromyces sp.) FA776이 KOY-1보다 더 적은 아미노산 함량을 보였다.

아미노산 함량은 발효주의 맛에 영향을 주는데, 효모융합체 사카로마이세스 속(Saccaromyces sp.) FA776을 사용한 실험구가 KOY-1을 사용한 실험구보다 아미노산 함량이 적어 약주 내 잔맛이 적을 것으로 예측된다.

<실험예 6> 유기산 함량 조사

발효주의 유기산 분석은 high performance liquid chromatography (HPLC, Breeze system)를 이용하여 유기산의 조성 함량을 분석하였고, 분석조건은 아래와 같다.

Column : Alltech Prevail Organic Acid 3u×2(4.6×150mm, 3㎛)

Detector : UV Detector, 210 nm (2487 UVD)

Mobile phase : 25mM phosphate buffer(pH 2.5)

Isocratic, flow rate 0.5mL/min

Temp. : 40℃

nd: not detected; tr: traceable

표 5에 나타난 바와 같이, 8개의 실험구 모두 젖산 및 시트르산의 함량이 높게 관찰되었다. 특히 KOY-1을 사용한 실험구에서는 푸마르산 및 숙신산이 검출되지 않거나 미량 검출된 반면, 효모융합체 사카로마이세스 속(Saccaromyces sp.) FA776을 사용한 실험구에서는 푸마르산과 숙신산이 각각 2㎍/mL, 60 내지 141㎍/mL 검출되었으며 이 함량은 10일간 25℃에서 발효한 실험구보다 10일간 25℃에서 발효 후 10℃에서 5일간 발효한 실험구의 함량이 2배 가량 증가한 것으로 관찰되었다.

<실험예 7> 관능검사

사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae) KOY-1과 효모융합체 사카로마이세스 속(Saccaromyces sp.) FA776을 사용하고 각각의 누룩첨가량을 100%, 50%로 담금하여 발효온도를 25℃에서 10일간, 25℃에서 10일간 발효후 10℃에서 5일간 발효를 진행한 8종류의 발효주를 대상으로 하여 맛, 향기, 색, 종합적 기호도의 정도를 5단계로 나누어 관능검사를 실시한 다음 자료를 Duncan`s multiple range test로 분석하였다.

* 각 수치는 1 내지 5점 범위 내 관능점수의 평균값을 나타낸다. 각 컬럼에서, 같은 문자는 5% 수준에서 유의적인 차이가 없음을 의미한다.

표 6에 나타난 바와 같이, 맛의 경우 1.00에서 3.00의 점수 분포를 나타냈으며 15일간 발효한 F-100, F-50 실험구의 맛이 가장 좋았고 10일간 발효한 K-100의 맛이 가장 나쁜 것으로 나타났으며, 전체적으로 효모융합체 사카로마이세스 속(Saccaromyces sp.) FA776을 사용한 실험구가 KOY-1을 사용한 실험구보다 좋은 관능적 특성을 나타내었다. 색의 경우 3.60에서 1.80의 분포를 보였다. 10일간 발효한 F-50 실험구의 색이 가장 좋았고 15일간 발효한 K-100 실험구의 색이 가장 나쁜 것으로 나타났다. 향의 경우 3.60에서 2.60의 분포를 보였는데, 15일간 발효한 F-50 실험구의 향이 다른 실험구에 비해 월등히 높은 점수를 나타내었다. 종합 기호도의 경우 1.40에서 4.00의 점수 분포를 나타냈으며 15일간 발효한 F-50 실험구가 4.00점으로 기호도가 가장 높게 나타났다.

도 1은 선발된 효모융합체의 특성을 비교한 것으로, (A)는 YPD 배지에서 선발 효모융합체의 유리 글루코오스 함량, (B)는 YPD24 배지에서 선발 효모융합체의 알코올 함량, (C)는 YPS24 배지에서 선발 효모융합체의 알코올 함량이다.

도 2는 덱스트로우즈 배지에서 효모가 생산하는 알코올 함량을 나타낸 것이다.

도 3은 전분 배지에서 효모가 생산하는 알코올 함량을 나타낸 것이다.

도 4는 약주에서 알코올 함량 변화를 나타낸 것이고,

도 5는 약주에서 환원당 함량 변화를 나타낸 것이고,

도 6은 약주에서 총 산도의 변화를 나타낸 것이고,

도 7은 약주에서 pH 변화를 나타낸 것으로,

상기 도 4 내지 도 7에서 (A)는 25℃에서 10일간 발효한 것이고, (B)는 25℃에서 10일 발효 후, 10℃에서 5일간 발효한 것이다.

Claims

전분분해활성 및 알코올 발효능을 갖는 효모융합체 사카로마이세스 속(Saccaromyces sp.) FA776 KCCM 10926P.
전분 분해능이 우수한 모균주 및 알코올 발효능이 우수한 모균주를 각각 선발하는 단계;

상기 모균주를 원형질체 완충용액에 첨가하여 원형질체를 형성하는 단계; 및

상기 원형질체를 세포 융합하는 단계를 포함하는 전분분해활성 및 알코올 발효능을 갖는 효모의 제조방법.
제2항에 있어서,

전분 분해능이 우수한 모균주는 사카로마이세스 디아스타티커스(Saccharomyces diastaticus) KCTC 1804이고, 알코올 발효능이 우수한 모균주는 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae) KOY-1인 것을 특징으로 하는 전분분해활성 및 알코올 발효능을 갖는 효모의 제조방법.
제2항에 있어서,

전분 분해능이 우수한 모균주 또는 알코올 발효능이 우수한 모균주가 이배체인 경우 이배체인 모균주를 단수체로 유도하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징 으로 하는 전분분해활성 및 알코올 발효능을 갖는 효모의 제조방법.
제4항에 있어서,

단수체로 유도하는 단계는 이배체인 모균주를 포자전형성(presporulation) 배지에서 25 내지 35℃에서 1 내지 2일간 배양한 후, 포자형성(sporulation) 배지에서 25 내지 35℃에서 3 내지 5일간 배양하여 것을 특징으로 하는 전분분해활성 및 알코올 발효능을 갖는 효모의 제조방법.
제2항에 있어서,

전분 분해능이 우수한 모균주 또는 알코올 발효능이 우수한 모균주가 영양요구성 마커를 포함하고 있지 않은 경우, 영양요구성 마커를 포함하고 있지 않은 모균주를 돌연변이 유발 용액을 사용하여 영양요구성 변이주를 제조하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 전분분해활성 및 알코올 발효능을 갖는 효모의 제조방법.
제2항에 있어서,

세포 융합체가 효모융합체 사카로마이세스 속(Saccaromyces sp.) FA776 KCCM 10926P인 것을 특징으로 하는 전분분해활성 및 알코올 발효능을 갖는 효모의 제조방법.
제1항의 효모를 이용한 전통주의 제조방법.
제8항에 있어서,

원료미 1kg 당 0.6 내지 1.2 중량부의 효모융합체 사카로마이세스 속(Saccaromyces sp.) FA776 KCCM 10926P를 첨가하는 것을 특징으로 하는 전통주의 제조방법.
제8항에 있어서,

전통주는 20 내지 30℃에서 9 내지 11일 동안 발효 후, 5 내지 15℃에서 3 내지 7일 동안 추가 발효하는 것을 특징으로 하는 전통주의 제조방법.
제8항 내지 제10항 중 어느 한 항에 따라 제조된 전통주.