KR20220076925A - 신규한 피키아 쿠드리아브제비 n373 균주 및 이의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 신규한 피키아 쿠드리아브제비 N373 균주에 관한 것으로, 보다 상세하게는 상기 피키아 쿠드리아브제비 N373 균주 및 이를 이용한 약주의 제조방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 피키아 쿠드리아브제비 N373은 저온 생육 및 발효능이 우수하고, 지방산 및 아미노산 생합성 저해제에 대한 저항성이 우수한 특징을 가진다. 또한 상기 균주로 제조한 약주는 관능성이 우수한 것을 확인하였다. 따라서 본 발명의 피키아 쿠드리아브제비 N373 균주는 발효주 등을 포함한 발효 식품 분야에서 다양하게 활용될 수 있다.

Description

신규한 피키아 쿠드리아브제비 N373 균주 및 이의 용도{Novel Pichia kudriavzevii N373 and use thereof}

본 발명은 신규한 피키아 쿠드리아브제비 N373 균주에 관한 것으로, 보다 상세하게는 상기 피키아 쿠드리아브제비 N373 균주 및 이를 이용한 약주의 제조방법에 관한 것이다.

현재 증가하는 주류 소비량에 비해 전통주 소비가 감소하고 있다. 2014년 이후 정체 및 감소하고 있는 원인으로는 전통주의 낮은 접근성과 가격 경쟁력, 기술개발의 부족 등이 있다. 이에 반해 프리미엄 전통주의 경우에는 소비가 늘어나는 현상을 보이고 있으나 아직까지 다른 주류들에 비해 소비량이 미미한 실정이다.

약주는 전통주의 하나로, 녹말이 포함된 재료인 쌀, 밀을 원료로 하여 국 및 물을 이용해 만든 술덧을 여과하여 만든 것이다. 우리나라의 주류 분류에 의하면 쌀 중량대비 누룩 사용량이 1% 이상이면 탁주와 약주, 1% 미만이면 청주로 분류하고 있다(주세법 시행령, 2020). 술지개미까지 면포로 짜낸 탁주와 다르게 고형분을 제거함으로써 깔끔하고, 고유의 향미를 잘 나타내는 것이 특징이다.

약주 및 탁주의 경우 대부분 실온(20-25℃) 발효를 하게 되는데 효모의 빠른 생육을 통해 비교적 짧은 시간에 양조가 가능한 것이 특징이다. 하지만 저온에서 발효를 하면 pH가 낮아져 술을 부패시키는 유해균들을 억제할 수 있으며 유기산 및 휘발성 향기성분의 경우에도 상온 발효와는 차이를 보인다. 저온 발효는 primary aroma의 손실을 방지하고 secondary aroma(ethyl, acetate esters 등)의 합성을 증가시키는 것으로 알려져 있다. 또한, 저온 발효 환경에서 효모는 향기성분 관련 반응뿐만 아니라 단백질 전사, 세포막의 유동성, RNA 구조의 안정성, 효소 활성 등 효모의 성장에 있어서 많은 영향을 준다고 보고되어 있다. 따라서 저온 내성이 있는 균주를 이용하여 저온 발효를 하게 되면 부패를 방지하며 관능적으로 특징적인 약주를 만들 수 있다.

약주의 발효에 관여하는 미생물들은 다음과 같다. 쌀의 당화를 위해 Aspergillus 속, Rhizopus 속, Mucor 속 등의 곰팡이가 amylase를 생성함으로서 전분을 작은 분자의 당류로 분해한다. 이후 Saccharomyces cerevisiae 및 여러 미생물들의 작용으로 알코올과 수많은 유기물들이 생성된다. 특히 주류에서는 발효에 어떠한 효모가 관여하는가에 따라 그 결과물은 많은 차이를 보인다. 이를 이용해 알코올 발효에 특화된 S. cerevisiae 와 non-Saccharomyces 균주를 혼합하여 발효하게 되면 다양한 향기성분을 가진 약주를 만들 수 있다. 향기 성분은 또한 관능적인 부분에 큰 영향을 주기 때문에 전체적인 기호도에 영향을 준다고 알려져 있다.

향기성분의 경우 대부분 alcohol 및 ester에서 대다수 생성되는데, 그 중에서도 전통주의 대표적인 향미라 할 수 있는 ethyl caproate, 장미향을 띄는 2-phenethyl alcohol, 파인애플향의 ethyl acetate, 바나나향을 내는 isoamyl acetate 등이 있고, 아로마 향을 내는 terpene류 등이 있다.

이에 본 발명자들은 국내 자생하는 감, 자두, 포도, 아로니아 및 누룩에서 효모를 분리하고, 이의 특성을 확인함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서 본 발명의 목적은, 수탁번호 KACC93340P로 수탁된 양조용 피키아 쿠드리아브제비(Pichia kudriavzevii) N373 균주 및 이를 이용한 관능성이 우수한 약주의 제조방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 수탁번호 KACC93340P로 수탁된 피키아 쿠드리아브제비 N373 균주를 제공한다.

또한 본 발명은 수탁번호 KACC93340P로 수탁된 피키아 쿠드리아브제비 N373 균주, 원료미 및 발효제를 배양하는 단계;를 포함하는 관능성이 우수한 약주의 제조방법을 제공한다.

본 발명에 따른 피키아 쿠드리아브제비 N373은 저온 생육 및 발효능이 우수하고, 지방산 및 아미노산 생합성 저해제에 대한 저항성이 우수한 특징을 가진다. 또한 상기 균주로 제조한 약주는 관능성이 우수한 것을 확인하였다. 따라서 본 발명의 피키아 쿠드리아브제비 N373 균주는 발효주 등을 포함한 발효 식품 분야에서 다양하게 활용될 수 있다.

도 1은 약주의 제조 공정을 나타낸 도이다.
도 2는 1차 선별된 균주 79종의 PCR-RFLP 패턴 분석 결과를 나타낸 도이다.
도 3은 최종 선별된 균주 W153, N373, G818 및 A159의 계통분석 결과를 나타낸 도이다.
도 4는 최종 선별된 균주 W153, N373, G818 및 A159의 효소 활성을 분석한 결과를 나타낸 도이다.
도 5는 본 발명에 따른 균주를 단독 또는 혼합하여 제조한 약주의 휘발성 향기 성분을 분석한 결과를 나타낸 도이다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명의 양태에 따르면, 본 발명은 수탁번호 KACC73340P로 수탁된 피키아 쿠드리아브제비(Pichia kudriavzevii) N373 균주를 제공한다.

본 발명의 구체예에서, 상기 피키아 쿠드리아브제비 N373 균주는 누룩으로부터 분리된 것이 바람직하다.

본 발명에 있어서, 누룩(Nuruk)은 술을 만들 때 사용하는 발효제를 의미하며, 술을 만드는 효소를 갖는 곰팡이를 곡류에 번식시켜 제조된 것이다.

본 발명에 따른 피키아 쿠드리아브제비 N373 균주의 ITS Ⅰ-5.8S rDNA-ITS Ⅱ 영역의 염기서열을 토대로 계통분석을 실시하였고, 그 결과 동일한 종의 공지 균주 및 산업화되어 이미 사용되고 있는 균주와는 다른 새로운 균주임을 확인하였다. 이를 피키아 쿠드리아브제비 N373 균주로 명명하고, 국립농업과학원 농업유전자원센터에 2020년 9월 17일자로 기탁하였으며, 수탁번호 KACC93340P를 부여받았다.

본 발명의 구체예에서, 상기 피키아 쿠드리아브제비 N373 균주는 서열번호 2의 염기서열을 포함하는 것이 바람직하다. 상기 서열번호 2의 염기서열은 피키아 쿠드리아브제비 N373 균주의 ITS I-5.8S rDNA-ITS II 영역의 염기서열로, 균주의 동정에 사용되었던 서열이다.

본 발명의 구체예에서, 상기 피키아 쿠드리아브제비 N373 균주는 저온에 대한 내성을 갖는 것이 바람직하다. 상기 저온에 대한 내성은 저온에서 생육 및 발효능이 우수한 것을 의미한다.

본 발명의 구체예에서, 상기 피키아 쿠드리아브제비 N373 균주는 지방산 생합성 억제제인 세루레닌(cerulenin)에 대한 저항성; 또는 아미노산 생합성 억제제인 플루오로페닐알라닌(fluorophenylalanine)에 대한 저항성;을 갖는 것이 바람직하다. 지방산 및 아미노산 생합성 억제제에 대해 저항성이 높은 균주를 양조에 활용하는 경우 다량의 고급 알코올 및 향기성분을 생성한다. 특히, 상기 세루레닌 저항성이 강한 균주는 한국 전통 주류의 대표적 향기성분인 ethyl carproate을 최대 5배까지도 많이 생산하며, 플루오로페닐알라닌에 대한 저항성이 강한 균주는 장미향을 내는 phenethyl alcohol 및 phenethyl acetate의 생성을 증가시킨다고 알려져 있다.

본 발명에서, 본 발명의 목적을 달성할 수 있는 한, 수탁번호 KACC93340P로 수탁된, 신규한 피키아 쿠드리아브제비 N373 균주 자체 또는 이의 배양액을 이용할 수 있다.

또한, 상기 균주의 배양액을 획득하는 데 필요한 방법은, 당업계에 공지된 임의의 방법을 이용할 수 있으며, 이에 제한되지 않는다는 것은 당업자에게 명확하다.

본 발명에 따른 피키아 쿠드리아브제비 N373 균주는 저온 생육 및 발효능이 우수하고, 지방산 및 아미노산 생합성 저해제에 대한 저항성이 우수한 특징을 가지는바, 발효주 등을 포함한 발효 식품 분야에서 다양하게 활용될 수 있다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 수탁번호 KACC93340P로 수탁된 피키아 쿠드리아브제비 N373 균주, 전분질 및 발효제를 배양하는 단계;를 포함하는 관능성이 우수한 약주의 제조방법을 제공한다.

본 발명의 구체예에서, 상기 전분질은 밑술을 제조하는 데 이용할 수 있는 한, 임의의 전분 함유 주원료일 수 있으며, 바람직하게는 멥쌀, 찹쌀, 현미, 백미, 흑미, 보리, 옥수수, 찰옥수수, 감자, 고구마, 보리, 찰보리, 콩, 밀, 찰밀 및 녹두로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있고, 더 바람직하게는 멥쌀이나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 구체예에서, 상기 발효제는 밑술을 제조하는 데 이용할 수 있는 한, 임의의 발효제일 수 있으며, 바람직하게는 입국, 누룩, 조효소제 및 정제효소제로 이루어진 군에서 선택된 1 종 이상일 수 있고, 더 바람직하게는 입국이며, 가장 바람직하게는 쌀입국이나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에 있어서, 상기 입국은 술을 만드는 효소를 갖는 곰팡이를 곡류에 번식시킨 것을 의미한다. 상기 입국은 청주, 소주, 감주, 미림 된장 등의 제조에 필요한 당화 효소를 충분히 포함하여야 한다. 상기 입국은 증자된 쌀 또는 보리 등의 곡류에 백국균을 접종하여 통상적인 방법에 따라 제조할 수 있다.

예를 들어, 증자한 쌀에 백국균을 접종하고 항온항습기 내에서 33℃ 및 습도 95 %로 유지하면서 48 시간 동안 백국균을 번식시켜 입국을 제조할 수 있다.

본 발명의 구체예에서, 상기 방법으로 제조된 약주는 젖산(lactic acid) 함량이 증진된 것이다. 상기 젖산은 약주에서 부드러운 신맛을 나타내며, 약주의 관능성에 큰 영향을 미치는 유기산이다.

본 발명의 구체예에서, 상기 방법으로 제조된 약주는 에틸 아세테이트(ethyl acetate) 함량이 증진된 것이 바람직하다. 상기 에틸 아세테이트는 관능성이 높은 향기 성분으로, 약주에서 과일향 또는 꽃향을 나타낸다.

본 발명의 피키아 쿠드리아브제비 N373을 이용한 약주 제조방법은 제조된 약주의 향미를 현저히 증진시킬 수 있는바, 전통주 소비량을 증가시키는 데에 크게 기여할 것으로 보인다.

이하, 실험예 및 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실험예 및 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실험예 및 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

[실험예]

실험예 1. 실험 재료 및 사용 균주

1-1. 실험 재료

본 실험에 사용한 백미는 2018년에 생산되었으며 2019년 7월 11일 전라북도 농협양곡(주)익산통합미곡종합처리장에서 도정된 멥쌀 100%(신동진 품종, 익산, 국내산)를 구입하여 사용하였다. 입국은 ㈜조은곡식(Choeun-goksik Co. Ltd, Hwaseong, Korea)에서 쌀입국(Aspergillus luchuensis, sp 60) 제품을 구입하였다. 또한 양조 용수로 사용된 물은 시판되고 있는 생수(Icis, lottechilsung, Cheongju, Korea)를 사용하였다.

1-2. 사용 균주 및 균의 배양

본 실험에 사용한 균주는 경북대학교 식품공학부 미생물 공학실이 보유한 감, 머루, 포도, 아로니아, 누룩, 자두에서 분리한 효모 500여주를 이용하였고, 대조 균주로는 와인 상업효모인 Saccharomyces cerevisiae W-3을 사용하였다. 모든 균주는 YPD(1% yeast, 2% peptone, 2% dextrose) broth 배지에서 30℃, 150 rpm으로 2회 계대 배양하여 원료 대비 5%를 배양하였으며, 효모의 활성이 가장 뛰어난 시점에 원심분리(SUPRA 22k PLUS, Hanil co., Daejeon, Korea) 후 접종하여 발효를 진행하였다.

실험예 2. 균주의 저온 내성 및 발효능 분석

균주를 YPD broth 배지에 접종 후 배양(15℃, 48 h)하고 분광광도계(UV-1601, Shimazdu Co., Kyoto, Japan)를 사용하여 600 nm에서 흡광도를 측정해 생육이 우수한 균주를 선별하였다. 이후 쌀 당화액에 배양(15℃, 96 h)하여 gas생성 및 sniffing test를 통해 발효능이 우수한 균주를 1차 선별하였다.

실험예 3. 휘발성 향기성분 생성능

3-1. β-glucosidase 효소 활성

β-glucosidase 활성 측정은 Swangkeaw’s method를 변형하여 수행하였다(Swangkeaw et al., 2011). 1차 선별 균주를 YPD broth 배지에서 48시간 동안 배양 후 1 mL를 취하여 10000 rpm에서 3분간 원심분리하였다. 상등액 0.2 mL, 20 mM pNPG(ρ-nitrophenyl-β-d-glucopyranoside) 0.2 mL 및 0.1 M citrate phosphate buffer(pH 5.0) 0.4 mL를 혼합한 뒤 항온수조(40℃)에서 30분간 반응시켰다. 마지막으로 2 M sodium carbonate 0.8 mL를 첨가하여 반응을 종료시킨 후 분광광도계를 사용하여 405 nm에서 흡광도를 측정하였다. 1 unit(U)의 β-glucosidase 효소 활성은 분당 1 μmol의 pNPG를 가수분해하는 효소의 양으로 정의하였다.

3-2. 지방산 및 아미노산 생합성 저해제 저항성 측정

Cerulenin 및 FPA(ρ-Fluorophenylalanine)에 대한 저항성 균주를 선별하였다. 표 1과 같은 배지에 1차 선별 균주의 단일 콜로니를 접종 후 30℃에서 48시간 동안 배양한 후 콜로니 생성 여부로 저항성을 확인하였다(Akita et al., 1990).

Medium	Composition	Concentration(%, w/v)
Cerulenin Agar	Yeast nitrogen base	0.67
	10 mM Cerulenin	0.5
	Glucose	2.0
	Agar	2.0
FPA Agar	Yeast nitrogen base	0.67
	1 M FPA	0.4
	Glucose	2.0
	Agar	2.0

실험예 4. PCR-RFLP(polymerase chain reaction-Restricted Fragment Length Polymorphism)

4-1. DNA 추출

실험 균주의 DNA 분리는 Looke 등(2011)의 방법을 변형하여 사용하였다. YPD 액체 배지에서 30℃, 150 rpm으로 24시간 배양한 후 배양액 100 μL를 취했다. 배양액을 원심분리(10000 rpm, 1 min)한 후 상등액을 제거하였고, 200 mM LiOAc 1% SDS 용액 100 μL을 넣어 현탁하였다. 현탁액은 항온수조(70℃)에서 15분간 반응시킨 후 300 μL의 95% ethanol을 첨가하여 재현탁하였다. 상기 현탁액을 원심분리(12000 rpm, 3 min)한 후 상등액을 제거하여 펠릿을 얻었다. 수득한 펠릿을 70% 에탄올 500 μL로 세척하였다. 세척된 펠릿을 초순수 50 μL로 펠릿을 용해시켰고, 이를 원심분리(12,000 rpm, 15 sec)하여 상등액을 얻었다. 최종적으로 얻은 상등액은 다음 실험에 사용하였다.

4-2. PCR(Polymerase chain reaction)

PCR에 사용한 primer는 Bioneer 사(Daejeon, Korea)에서 구매하여 사용하였으며, 효모의 ITS(internal transcribed spacer) 영역을 universal primer인 ITS1과 ITS4로 양쪽 방향으로 합성하였다. 사용한 primer 염기서열은 표 2와 같으며, PCR 기기는 Tpersnal 48(Biometra Co., Gottingen, Germany)을 사용하였다. PCR에 사용하는 반응액의 양이 총 50 μL가 되도록 조절하였다. 반응액의 조성 및 반응 조건은 표 3 및 4에 각각 나타내었다.

Primer	Sequence
ITS1	5'-TCC GTA GGT GAA CCT GCG G-3'
ITS4	5'-TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC-3'

Composition	Amount(μL)
10X Taq reaction buffer	5.00
Template DNA	2.00
Forward primer(10 pmol/ μL)	2.00
Reverse primer(10 pmol/ μL)	2.00
dNTP mixture(10 mM)	1.00
Taq polymerase(5 U/ μL)	0.25
Distilled water	37.75
Total volume	50.00

Cycles	Denaturation	Annealing	Extension	Frequency
1	95℃/ 3 min	50℃/ 1 min	72℃/ 1 min	1
2	95℃/ 30 s	50℃/ 1 min	72℃/ 1 min	32
3			72℃/ 10 min	1

4-3. 제한효소 처리

PCR-RFLP 패턴 분석을 위해 제한효소 HinfⅠ, HaeⅢ 및 HpaⅠ(Enzynomics Co., Daejeon, Korea)을 사용하였으며, 표 5와 같은 조성으로 37℃에서 1시간 동안 반응시켰다. DNA 단편들은 전기영동을 통해 확인하였다.

Composition	Amount(μL)
PCR product	5.0
Enzyme(HinfⅠ, HaeⅢ, HpaⅠ)	0.5
Enzyme buffer(×10)	1.5
Distilled water	8.0
Total volume	15

4-4. DNA 전기영동

DNA 전기영동은 전압 100 V에서 진행하였고, 1.5% agarose gel(Molecular Biology grade, Korea) 및 0.5× TBE buffer를 사용하였다. 상기 1.5% agarose gel 제조 시 0.01%의 DNA 염색시약(EcoDyeTM, Solgent Co., Daejeon, Korea)을 첨가하여 제조된 것이다. 1.5% agarose gel에 샘플을 DNA를 로딩한 후 35분간 전기영동 후 UV transilluminator(TFX-20M, Vilber Lourmat. Paris, France)로 전기영동 상을 관찰하였다. 균주별 DNA 단편의 크기 측정을 위한 마커로는 100 bp Plus DNA ladder(Biofact, Daejeon, Korea)를 사용하였다.

실험예 5. 효모의 동정

분리된 균주의 동정은 ITS Ⅰ-5.8S rDNA-ITS Ⅱ 영역의 염기서열을 기초로 계통분석을 통하여 실시하였다. DNA 염기서열 결정은 Solgent사(Daejeon, Korea)의 sequencing service를 이용하였으며, 염기서열의 상동성 검사는 National Center for Biotechnology Information(NCBI)의 BLAST를 이용하여 진행하였다.

실험예 6. 약주의 제조

약주 제조에서 각 샘플의 재료 담금 비율은 표 6과 같으며, 구체적인 제조공정은 도 1에 나타내었다.

도 1에 나타낸 바와 같이, 밑술을 만들기 위해 쌀 250g을 세척하여 2시간 물에 침지하고 30분간 물을 뺀 다음 찜통에 30분간 증자하여 고두밥을 만들었다. 고두밥을 꺼내어 잘 펼쳐주면서 식혔다. 발효통에 식은 고두밥과 백국(쌀누룩) 250 g, 생수 1 L를 혼합하고 효모는 총 부피의 2.5%를 YPD 배지에서 배양시켜 집균한 후 접종하고 15℃에서 1단 담금을 진행하였다. 약주 제조에 투입한 효모는 표 7과 같이 단독 균주 또는 혼합 균주를 첨가하였다. 술 발효 5일차에 2단 담금(본담금)을 하였다. 2단 담금은 같은 방식으로 쌀 1.1 kg을 세척, 침지, 증자한 고두밥과 생수 1.3 L를 추가하였다. 담금을 완료한 술덧은 15℃에서 30일 동안 발효시켰다.

재료	혼합량
백국	250 g
멥쌀	1,350 g
생수	2,300 mL
효모	100 mL

균주	비율
Control(S. cerevisiae W-3)	Single strain
W153	Single strain
N373	Single strain
G818	Single strain
W153 : N376	1 : 9
W153 : G818	1 : 9
W153 : A159	1 : 9

실험예 7. 약주의 발효 특성 분석

7-1. 당도

당도는 시료를 8000 rpm에서 10분간 원심분리기로 원심 분리하여 얻은 상등액을 굴절 당도계(Ra250, ATAGO Co., Ltd., Kyoto, Japan)를 사용하여 측정하였다.

7-2. 환원당

환원당은 DNS(dinitrosalicylic acid)법을 이용하여 측정하였다(Ahmed, 2004). 구체적으로, 시료 0.3 mL에 DNS 시약 1 mL를 첨가하여 95℃에서 5분간 중탕한 다음 실온에서 방랭하였다. 그 후 증류수를 7 mL 첨가한 후 분광광도계(Shimazdu Co., UV-1601, Kyoto, Japan)를 사용하여 550 nm에서 흡광도를 측정하였다. 결과는 측정된 흡광도 값을 glucose로 환산하여 나타내었다. Blank는 시료 대신 증류수 0.3 mL를 위와 동일하게 이행하였다.

7-3. pH 및 총산도

8000 rpm에서 10분간 원심분리 한 상등액 10 mL을 자동적정장치(DL22 Food & Beverage Analyzer, Mettler-Toledo AG Analytical, Schwerzenbach, Switzerland)이용해 측정하였고, 0.1 N NaOH로 적정하여 소비된 양을 acetic acid로 환산하였다.

7-4. 알코올

알코올 함량은 국세청기술연구소 주류분석규정에 따라 분석하였다. 원심분리(8,000 rpm, 10 min)한 시료를 100 mL 메스플라스크에 취하여 증류 플라스크로 옮기고 15 mL의 초순수로 2회 세척한 후 증류 플라스크에 있던 시료에 더해주었다. 메스플라스크로 증류액을 받아 증류액이 70 mL가 되면 증류를 중지하였다. 여기에 증류수를 첨가해 100 mL 획선 까지 채운 후 잘 혼합하여 균질화하였고, 15℃로 보정하여 비중계로 비중을 측정하여 Gay-Lussac의 주정 환산표를 이용해 알코올 함량을 측정하였다.

실험예 8. 약주의 이화학적 특성 분석

8-1. 유기산 분석

발효가 완료된 약주의 유기산 함량은 원심분리한 상등액을 메탄올과 증류수로 활성화시킨 Sep-pak(Sep-pak plus C18 catridge, Waters Co., USA)과 membrane filter(Millex-HV, 0.45 ㎛, Millipore co., Bedford, USA)로 여과하여 High Perfomanse Liquid Chromatograph(Model 600E, Waters Co., USA)를 사용하여 분석하였다. HPLC(highperformance liquid chromatography) 조건은 표 9에 나타내었다.

Items	Conditions
Instrument	Waters Co. 600E Model
Column	PL Hi-Plex H(φ7.7 mm × 300 mm)
Column temp	65℃
Detector	Refractive Index Detector(RI, Model 410)
Mobile phase	0.005 M Sulfuric acid
Flow rate	0.6 mL/ min
Injection volume	20 μL

8-2. 휘발성 향기성분

휘발성 향기 성분은 불꽃 이온화 검출기(flame ionization detector, FID)를 갖춘 가스크로마토그래피 질량 분석기(7890A GC-MS; Agilent, Santa Clara, USA)를 사용하여 측정하였다. 향기 성분 포집은 head-space 분석법으로 SPME fiber(50/30 ㎛ DVB/CAR/PDMS, Supelco, Bellefonte, PA, USA)를 이용하였으며, 흡착 전 SPME fiber는 240℃에서 1시간 예열을 하여 사용하였다. 시료는 headspace vial(20 mm, PTFE/silicon septum, magnetic cap)에 5 mL를 넣은 후 NaCl을 25%(1.25 g) 첨가한 다음 밀봉하였다. SPME 포집은 준비된 시료를 35℃에서 20분간 water bath에서 교반하여 시료와 headspace의 휘발성 성분이 평형을 이루게 하고 SPME fiber를 주입하여 35℃에서 40분간 포집시켰다. 포집 후 GC-MS에 주입하여 그 조성을 분석하였다. GC-MS의 분석 조건은 표 10과 같으며, 사용된 library는 Wiley9Nist 0.8(Wiley9ist 0.8 library, mass spectral search program, version 5.0, USA)이다(Torrens et al., 2004).

Item	Condition
Instruments	Agilent 7890A with Agilent 5975C inert XL MSD
Column	DB-WAX(60 m × 250 ㎛ × 0.25 mm, Waters)
Column temp.	40℃ -(2℃/min)-> 220℃ -(20℃/min)-> 240℃(5min)
Carrier gas	He(1 mL/ min)
Inlet temp.	240℃
Split ratio	20 : 1

실험예 9. 주성분 분석(principal component analysis, PCA)

약주 제조시 이용한 균주에 따른 휘발성 향기성분 및 주성분의 연관성을 도출하기 위해 주성분 분석을 수행하였다. 구체적으로, 주성분 분석은 휘발성 향기성분을 측정변수로 하고, 약주에 사용된 균주(단독 균주 또는 혼합 균주)에 따른 시료를 각각 관측대상으로 지정하였다. 주성분 분석은 SAS 소프트웨어를 사용하여 수행하였으며, SPME/GC-MS로 확인된 휘발성 화합물의 상관 계수는 Pearson의 상관 분석을 통해 분석하였다.

실험예 10. 효모의 효소 활성 분석

분리·선정된 효모의 효소활성을 검사하기 위하여 API ZYM kit (Biomerieux, France)를 이용하였다. API ZYM kit는 스트립에 20개의 캡슐로 이루어져 있으며, 각 캡슐별로 음성 대조군을 제외한 19가지 기질이 함유되어 있어 미생물이 기질을 가용화하고 배양기간 동안 생성된 대사산물이 첨가된 지시약과 반응하여 변화하는 색을 관찰하는 원리로 효소활성을 측정한다. 먼저 각 효모를 YPD agar 배지에서 하루 동안 키운 다음, 콜로니를 취하여 2 mL의 멸균수에 풀어 각 캡슐에 65 μL씩 분주하여 30℃에서 4시간 동안 배양하였다. 배양이 끝난 스트립에 ZYM A와 ZYM B 시약을 각각 한 방울씩 떨어트려 5분 동안 반응시킨 후 결과를 판독하였다. 판독 결과는 색 변화 정도에 따라 0 내지 5점(0 : 음성, 5 : 최대 강도)으로 나타냈으며, 3 이상이면 양성으로 판정하였다.

실험예 11. 통계처리

모든 실험은 3회 반복하였으며, 그 결과 값을 평균과 표준 편차로 표시하였으며(Mean±SD), SAS 통계처리(Statstical Analysis System, SAS Institute Inc., Cary, NC, USA)를 이용한 분산분석(ANOVA)과 Duncan의 다중범위검증(Duncan's multiple range test, p<0.05)으로 유의성을 검증하였다.

[실시예]

실시예 1. 저온 발효능이 우수한 양조용 균주 선정

1-1. 저온 내성 및 발효능이 우수한 균주 선별

경북대학교 식품공학부 미생물 공학실이 보유한 머루, 포도, 아로니아, 누룩에서 분리한 효모 500여주에서 저온 생육 및 발효능이 우수한 79개의 균주를 1차 선별하였으며 표 11에 나타내었다.

Strain	Growth & fermentation activity	Strain	Growth & fermentation activity	Strain	Growth & fermentation activity
A124	++1)	G439	+	N266	++
A126	+	G441	++	N275	+
A142	+	G442	+	N289	+
A144	+	G444	++	N311	+
A159	++	G463	+	N341	+
A173	++	G471	+	N342	+
A182	+	G472	+	N344	+
A245	+	G473	++	N358	+
A251	++	G475	+	N362	+
A255	+	G478	++	N368	+
A262	+	G479	+	N369	+
A266	+	G483	+	N371	+
A271	+	G557	++	N372	+
A275	+	G571	+	N373	++
A279	++	G573	+	N374	+
A291	+	G576	+	N376	++
A293	+	G578	+	N377	++
A313	+	G581	++	N381	++
A322	++	G583	+	N383	+
A328	+	G818	++	N384	+
G119	+	G836	+	N393	+
G122	+	G838	+	W141	++
G123	+	N247	+	W149	++
G139	+	N249	++	W153	++
G167	++	N253	+	W256	+
G195	++	N254	++
G244	++	N264	+
1)++, Low-temperature resistance and producing a lot of gas; +, low-temperature resistance and producing gas moderately.

1-2. 선별된 균주의 분류 및 동정

1차 선별된 균주 79주를 동정을 위해, ITS Ⅰ-5.8S rDNA-ITS Ⅱ영역을 증폭하였으며, PCR-RFLP 패턴 분석을 통해 효모들을 분류하였다. PCR-RFLP 분석에서 같은 패턴을 나타낸 균주별로 ITS Ⅰ-5.8S rDNA-ITS Ⅱ 영역의 염기서열을 분석한 후 NCBI의 BLAST를 이용하여 상동성 조사를 진행하였다. PCR-RFLP 패턴 분석 결과는 도 2에 나타내었고, 균주 동정 결과는 표 12에 나타내었다.

Strains	Number of strains depending on the origin				Isolates
	Grape	Wild grape	Aronia	Nuruk
Saccharomyces cerevisiae	17	4		1	G(119, 122, 123, 139, 167, 195, 439, 441, 442, 444, 473, 479, 483, 557, 573, 581, 583), N358, W(141, 149, 153, 256)
Hanseniaspora vineae	11		1		A271, G(244, 463, 471, 472, 475, 478, 571, 576, 578, 818, 836)
Wickerhamomyces anomalus	1		19	20	A(124, 126, 142, 144, 159, 173, 182, 245, 251, 255, 262, 266, 275, 279, 291, 293, 313, 322, 328), G838, N(247, 249, 253, 254, 264, 266, 275, 289, 311, 341, 342, 344, 368, 369, 371, 372, 374, 377, 383, 384)
Torulaspora delbrueckii				3	N(362, 381, 393)
Pichia kudriavzevii				2	N(373, 376)
Total	29	4	20	26	79

1-3. 분리된 균주의 휘발성 향기성분 생성능 평가

1-3-1. β-glucosidase 효소 활성 분석

β-glucosidase는 비휘발성인 glycoside의 β-1,4 결합을 잘라내어 다양한 휘발성 향기성분을 생성하므로, 높은 β-glucosidase 활성을 가지는 균주일수록 알코올 발효 시 고 향미 생성에 유리한 것으로 알려져 있다(Sarry and Gunata, 2004; Liu et al., 2017).

1차 선별한 79개의 균주를 대상으로 한 β-glucosidase 활성 시험을 실시하였다. β-glucosidase 활성 시험은 효소 활성이 높을수록 pNPG가 pNP(ρ-nitrophenol) 및 glucose로 분해되며, 형광색을 나타내는 pNP로 인해 흡광도가 높게 나타난다. β-glucosidase 활성 시험 결과는 표 13에 나타내었다.

Strain	β-glucosidase activity(U/ mL)	Strain	β-glucosidase activity(U/ mL)	Strain	β-glucosidase activity(U/ mL)
A124	0.910	G439	0.511	N266	0.735
A126	0.756	G441	0.553	N275	0.655
A142	0.766	G442	0.540	N289	0.636
A144	0.793	G444	0.538	N311	0.617
A159	0.922	G463	0.435	N341	0.636
A173	0.792	G471	0.467	N342	0.768
A182	0.790	G472	0.429	N344	0.598
A245	0.813	G473	0.518	N358	0.623
A251	0.667	G475	0.481	N362	0.630
A255	0.685	G478	0.490	N368	0.687
A262	0.837	G479	0.505	N369	0.781
A266	0.551	G483	0.672	N371	0.739
A271	0.650	G557	0.619	N372	0.708
A275	0.688	G571	0.467	N373	1.332
A279	0.633	G573	0.612	N374	0.633
A291	0.878	G576	0.497	N376	1.408
A293	0.853	G578	0.469	N377	0.541
A313	0.850	G581	0.570	N381	1.151
A322	0.852	G583	0.661	N383	0.777
A328	0.706	G818	0.567	N384	0.568
G119	0.513	G836	0.488	N393	0.568
G122	0.490	G838	0.460	W141	0.586
G123	0.508	N247	0.828	W149	0.661
G139	0.500	N249	0.716	W153	0.679
G167	0.502	N253	0.669	W256	0.596
G195	0.467	N254	0.629
G244	0.314	N264	0.615
One unit(U) of enzyme activity was defined as the amount of enzyme that released 1 μmol of pNPG per minute under the experimental conditions

표 13에 나타낸 바와 같이, 대조군보다 높은 흡광도를 나타내는 균주는 37주임을 확인하였다. 특히 A159, N373, N376 및 N381 균주는 흡광도 값이 0.4보다 높은바, β-glucosidase의 활성이 현저히 높은 것을 알 수 있다.

1-3-2. 지방산 및 아미노산 생합성 저해제 저항성 측정

지방산 및 아미노산 생합성 저해제에 대해 저항성이 높은 균주는 많은 양의 고급 알코올과 향기성분을 생성한다. Cerulenin의 저항성이 강한 균주의 경우 한국 전통 주류의 대표적 향기성분인 ethyl carproate을 최대 5배까지도 많이 생산할 수 있으며(Choi et al., 2013), FPA(p-fluorophenylalanine)에 저항성이 높은 균주의 경우 장미향을 내는 phenethyl alcohol과 phenethyl acetate 생성을 증가시킨다고 알려져 있다(Osamu et al., 1990).

Cerulenin(50 μM) 및 FPA(4 mM)의 저항성을 확인한 결과는 표 14 및 15에 각각 나타내었다.

Strain	Cerulenin resistance	Strain	Cerulenin resistance	Strain	Cerulenin resistance
A124	+1)	G439	-	N266	+
A126	+	G441	-	N275	+
A142	+	G442	-	N289	+
A144	+	G444	-	N311	+
A159	+	G463	-	N341	+
A173	+	G471	-	N342	+
A182	+	G472	-	N344	+
A245	+	G473	-	N358	-
A251	+	G475	-	N362	+
A255	+	G478	-	N368	+
A262	+	G479	-	N369	+
A266	+	G483	-	N371	+
A271	+	G557	-	N372	+
A275	+	G571	-	N373	+
A279	+	G573	-	N374	+
A291	+	G576	-	N376	+
A293	+	G578	-	N377	+
A313	+	G581	-	N381	+
A322	+	G583	-	N383	+
A328	+	G818	-	N384	+
G119	-	G836	-	N393	+
G122	-	G838	-	W141	-
G123	-	N247	+	W149	-
G139	-	N249	+	W153	+
G167	-	N253	+	W256	-
G195	-	N254	+
G244	-	N264	+
1)+, cerulenin resistance positive; -, cerulenin resistance negativie

Strain	FPA resistance	Strain	FPA resistance	Strain	FPA resistance
A124	-1)	G439	-	N266	-
A126	-	G441	-	N275	-
A142	-	G442	-	N289	-
A144	-	G444	-	N311	-
A159	-	G463	+	N341	-
A173	-	G471	+	N342	-
A182	-	G472	+	N344	-
A245	-	G473	-	N358	-
A251	-	G475	+	N362	-
A255	-	G478	+	N368	-
A262	-	G479	-	N369	-
A266	-	G483	-	N371	-
A271	-	G557	-	N372	-
A275	-	G571	+	N373	+
A279	-	G573	-	N374	-
A291	-	G576	+	N376	+
A293	-	G578	+	N377	-
A313	-	G581	-	N381	+
A322	-	G583	+	N383	-
A328	-	G818	+	N384	-
G119	-	G836	+	N393	-
G122	-	G838	+	W141	-
G123	-	N247	-	W149	+
G139	-	N249	-	W153	-
G167	-	N253	-	W256	-
G195	-	N254	-
G244	+	N264	-
1)+, ρ-fluoro phenylalanin(FPA) resistance positive; -, ρ-fluoro phenylalanin(FPA) resistance negativie

표 14에 나타낸 바와 같이, A159, N373 및 W153 등 46종의 균주는 Cerulenin 저항성이 있음을 확인하였다.

표 15에 나타낸 바와 같이, G818, N373 균주 등 17종의 균주는 FPA 저항성이 있는 것을 확인하였다.

1-4. 분리된 균주 중 양조에 적합한 균주 최종 선발

PCR-RFLP 분석을 마친 1차 선별 균주 중 각 종의 균주별로 휘발성 향기 생성 실험의 결과값이 높은 균주를 각 1주씩 최종 선별하였다. 최종 선별된 균주ITSⅠ-5.8S-ITSⅡ 영역의 염기서열을 이용하여 계통분석을 수행하였다.

최종 선별된 균주에 대한 정보는 표 16에 나타내었고, 계통분석 결과는 도 3에 나타내었다.

Isolate code	Species	Accession No.	Origin	수탁번호
W153	Saccharomyces cerevisiae	NR_111007	Wild grape	KACC93338P
N373	Pichia kudriavzevii	NR_131315	Nuruk	KACC93340P
G818	Hanseniaspora vineae	NR_165975	Grape	KACC93341P
A159	Wickerhamomyces anomalus	NR_111210	Aronia	KACC93339P

표 16 및 도 3에 나타낸 바와 같이, 최종 선별된 균주 W153, N373, G818 및 A159는 모두 신규한 균주임을 확인하였다. 또한 상기 균주 W153, N373, G818 및 A159는 각각 서열번호 1 내지 4의 염기서열로 표시되는 ITS Ⅰ-5.8S rDNA-ITS Ⅱ 영역을 포함하는 것을 특징으로 한다. 최종 선별된 균주는 2020년 9월 17일자로 국립농업과학원 농업유전자원센터에 수탁하여 수탁번호를 부여받았다.

1-5. API-ZYM 키트를 이용한 효소 활성 분석

API-ZYM 키트를 사용하여, 상기 실시예 1-4에서 최종 선별된 균주 W153, N373, G818 및 A159의 효소 활성을 분석하였으며, 그 결과는 도 4에 나타내었다.

도 4에 나타낸 바와 같이, 상기 실시예 1-4에서 선별된 균주 W153, N373, G818 및 A159는 효소의 활성 패턴이 서로 다른 것을 확인하였다.

실시예 2. 저온 발효능이 우수한 양조용 균주를 이용하여 제조된 약주의 발효 특성 분석

상기 실시예 1에서 최종 선별된 저온 발효능이 우수한 양조용 균주 W153, N373, G818 및 A159를 이용하여 약주를 제조하였다. 약주는 도 1의 과정으로 제조하되, (i) 단독 균주(W153, N373, G818, A159) 또는 (ii) 혼합 균주(W153+N373, W153+G818, W153+A159)를 이용하여 제조하였다. 제조된 약주의 발효 특성을 분석하기 위해 당도, 환원당, pH, 총 산 함량 및 알코올 함량을 측정하였고, 그 결과는 표 17에 나타내었다.

Yeast strain	Soluble solid (˚Brix)	Reducing sugar (mg / ml)	Ethanol (%)	pH	Total acid (%)
control	6.93±0.06d1)2)	0.13±0.00d	12.87±0.13ab	3.83±0.02a	0.64±0.02e
W153	6.83±0.06de	0.09±0.00d	13.12±0.43a	3.80±0.03a	0.62±0.01e
N373	8.63±0.06c	1.81±0.06c	9.53±0.06e	3.60±0.02c	0.90±0.03a
G818	10.07±0.12b	3.93±0.08a	10.55±0.31d	3.82±0.04a	0.82±0.00b
A159	10.37±0.06a	3.00±0.07b	10.53±0.41d	3.75±0.03b	0.80±0.01b
W153+N373	6.67±0.06f	0.12±0.00d	13.02±0.33a	3.33±0.01d	0.72±0.01d
W153+G818	6.73±0.06ef	0.11±0.00d	12.42±0.03bc	3.32±0.02d	0.74±0.02cd
W153+A159	6.93±0.06d	0.12±0.00d	12.37±0.01c	3.35±0.01d	0.75±0.02c
1)All the data were expressed as mean ± SD(n=3). 2)Different letters within the same column indicate significant difference(p<0.05)

표 17에 나타낸 바와 같이, 단독 균주 N373, G818 및 A159로 제조된 약주는 대조군에 비해 당도 및 환원당 함량이 높았고, 당을 이용한 에탄올 발효가 대조군에 비해 적게 진행되어 알코올 함량이 대조군에 비해 낮았다. 단독균주 W153 및 혼합균주로 제조된 약주는 당도 및 환원당 함량이 대조군과 유사한 수준이나, 제조된 약주의 알코올 함량은 더욱 높은 것을 확인하였다.

단독 또는 혼합 균주로 제조된 약주는 pH가 대조군과 유사한 수준이나, 단독 균주 N373, G818 및 A159로 제조된 약주; 및 혼합균주로 제조된 약주;는 대조군에 비해 총 산 함량이 높은 경향을 보였다. 이는 균주마다 생산하는 유기산의 종류나 함량이 다르기 때문이라 할 수 있다. 또한 총 산 함량은 증가하나 pH가 낮아지지 않는 것은 발효 진행에 따라 인해 아미노산이 증가하여 완충작용을 한 것이라 볼 수 있다.

실시예 3. 저온 발효능이 우수한 양조용 균주를 이용하여 제조된 약주의 이화학적 특성 분석

단독 또는 혼합 균주를 이용하여 제조된 약주의 이화학적 특성을 분석하였다. 구체적으로, 약주의 품질에 직접적인 영향을 미치는 유기산 함량 및 휘발성 향기 성분을 분석하였다.

3-1. 유기산 함량 분석

단독 또는 혼합 균주를 이용하여 제조된 약주의 유기산 함량을 분석한 결과는 표 18에 나타내었다.

Yeast strain	Citric acid	Malic acid	Succinic acid		Lactic acid	Acetic acid
Control	1.41±0.01f1)2)	ND3)	1.05±0.02bc	0.12±0.01bc		0.12±0.01f
W153	1.53±0.02de	ND	1.08±0.01b	0.10±0.01bc		0.17±0.02e
N373	1.56±0.01d	ND	0.99±0.01d	0.41±0.02a		0.39±0.02b
G818	2.06±0.02a	ND	0.90±0.02f	ND		0.29±0.02d
A159	1.89±0.01b	ND	0.96±0.02de	0.04±0.01e		0.85±0.04a
W153+N373	1.51±0.02e	ND	0.95±0.02e	0.11±0.02bc		0.36±0.03bc
W153+G818	1.63±0.03c	ND	1.17±0.03a	0.07±0.01d		0.16±0.01ef
W153+A159	1.61±0.02c	ND	1.04±0.01c	0.09±0.02cd		0.34±0.02c
1)All the data were expressed as mean ± SD(n=3). 2)Different letters within the same column indicate significant difference(p<0.05) 3)Not detected.

표 18에 나타낸 바와 같이, 모든 약주에서 다량의 citric acid가 생성되었는데 이는 약주 제조에 사용된 백국(쌀누룩)의 영향으로 보인다. 부드러운 신맛을 나타내는 lactic acid는 N373 단독 발효구에서 가장 높았고, 자극성이 강한 초산(acetic acid)은 W153 단독 발효구에서 가장 낮았다. succinic acid는 모든 단독 또는 혼합 처리구에서 대조군보다 낮았다.

3-2. 휘발성 향기 성분 분석

휘발성 향기 성분은 주류에 각각 다른 특징을 주며, 미각적인 부분에도 크게 기여한다. 단독 또는 혼합 균주를 이용하여 제조된 약주의 휘발성 향기 성분을 분석한 결과는 표 19에 나타내었고, 주성분 분석(principal component analysis) 결과는 도 5에 나타내었다.

Volatile compound	Control	W153	N373	G818	A159	W153+N373	W153+G818	W153+A159
Higher alcohols(mg/L)
1-propanol	30.40±0.33b1)2)	6.82±0.19g	10.01±0.62f	21.41±0.31d	6.78±0.45g	28.38±1.13c	48.46±0.86a	17.12±0.36e
Iso-butanol	241.22±10.90a	144.52±4.81c	83.94±0.64e	39.25±2.84f	25.09±0.98g	181.01±7.40b	146.87±6.87c	114.08±3.78d
Iso-amyl alcohol	158.89±8.89d	245.08±5.25b	200.81±8.18c	196.14±9.31c	110.76±6.46e	204.56±5.63c	262.37±6.86a	48.93±5.12f
Methionol	2.89±0.77d	4.19±0.29c	10.92±0.39a	3.03±0.52d	8.26±0.86b	4.69±0.93c	4.43±0.27c	7.67±0.69b
2-Phenetyl alcohol	85.44±8.63cd	95.92±6.22ab	76.80±4.08d	27.21±2.18f	42.16±1.60e	87.86±6.16bc	80.54±3.58cd	104.26±6.24a
2,3-butandiol	36.75±1.79a	11.35±0.95ef	14.34±1.63d	10.13±0.62f	12.58±0.28de	13.55±0.77d	18.95±0.96c	25.72±1.59b
Esters(μg/L)
Ethyl acetate	26.08±2.69e	28.29±3.19ef	237.70±28.80a	115.95±7.31b	71.74±8.14cd	85.72±7.17c	56.62±5.13d	61.76±3.74d
Iso butyl acetate	8.41±0.67a	9.17±0.77a	2.88±0.35c	1.06±0.16d	2.06±0.30cd	9.07±1.32a	5.45±0.54b	7.97±1.22a
Ethyl butyrate	0.42±0.03a	0.40±0.02ab	0.17±0.02d	0.09±0.01e	0.21±0.02d	0.42±0.02a	0.36±0.01bc	0.33±0.06c
Iso amyl acetate	10.62±1.56a	9.74±0.43ab	7.20±2.03c	4.04±0.36d	0.85±0.17e	8.12±1.27bc	4.60±0.57d	5.02±0.16d
Ethyl hexanoate	0.50±0.02b	0.54±0.01a	0.10±0.03e	0.07±0.01ef	0.05±0.01f	0.49±0.02b	0.30±0.01d	0.35±0.03c
Ethyl octanoate	1.36±0.22a	1.39±0.08a	0.16±0.13d	0.17±0.04d	0.06±0.02d	1.27±0.11a	0.81±0.12c	1.05±0.09b
Ethyl nonanoate	5.84±0.32e	3.81±0.33f	7.17±0.41e	11.54±1.12c	15.88±0.35a	8.75±1.12d	10.60±1.36c	12.98±0.81b
Ethyl decanoate	26.05±1.02ab	22.73±1.31c	4.04±0.47e	19.37±1.39d	1.80±0.08f	23.53±1.35c	28.08±1.98a	23.99±1.19bc
Diethyl succinate	2.59±0.36ab	2.26±0.15bc	0.40±0.06d	1.93±0.27c	0.18±0.05d	2.34±0.24b	2.80±0.09a	2.39±0.08b
Ethyl dodecanoate	2.63±0.15d	1.74±0.09ef	1.60±0.11f	2.08±0.09e	1.49±0.08f	3.17±0.18c	4.41±0.27a	3.74±0.48b
Methyl salicylate	1.43±0.18c	1.48±0.07c	1.65±0.16bc	2.08±0.17a	2.05±0.24a	1.40±0.16c	1.71±0.19bc	1.83±0.15ab
2-phenethyl acetate	3.18±0.28de	5.77±0.35c	1.59±0.26ef	33.76±1.80a	0.26±0.02f	4.08±0.94cd	28.38±1.97b	0.75±0.09f
Ethyl tetradecanoate	2.66±0.13fg	2.38±0.33g	3.39±0.27e	8.44±0.45b	10.51±0.51a	3.07±0.28ef	5.61±0.07c	4.66±0.38d
Ethyl hexadecanoate	10.39±1.26g	14.78±0.96f	17.78±2.47f	38.00±2.33d	95.88±1.07a	29.40±2.39e	43.76±1.48c	50.65±1.93b
1)All the data were expressed as mean ± SD(n=3). 2)Different letters within the same column indicate significant difference(p<0.05)

표 19 및 도 5에 나타낸 바와 같이, 모든 시험구에서 휘발성 향기성분 중 terpene류는 검출되지 않았고, Higher alcohol 및 Ester가 검출되었다. 각 시험구별 약주의 휘발 성분을 살펴보면, 단독 또는 혼합 균주로 제조한 약주는 기호도가 높은 향기 성분의 함량이 대조군에 비해 높은 것을 확인하였다. 상기 기호도가 높은 향기 성분은 과일향, 꽃향 등이며, 그 예로는 Iso-amyl alcohol, 2-Phenetyl alcohol, Ethyl acetate, Iso amyl acetate, Ethyl hexanoate, Ethyl octanoate, Ethyl nonanoate, Ethyl decanoate, 2-phenethyl acetate 및 Ethyl hexadecanoate이 있다. 보다 상세하게는, N373 균주는 대조군에 비해 ethyl acetate이 약 9배 높게 검출되었고, G818 균주는 대조군에 비해 2-phenethyl acetate이 약 10 배 높게 검출되었다. 또한 MCFA(Medium Chain Fatty Acid) ester 중 ethyl nonanoate는 A159 균주에서, ethyl hexanoate 및 ethyl nonanoate는 W153 균주에서 높게 검출되었다. Ethyl tetradecanoate 및 Ethyl hexadecanoate는 A159 균주에서 가장 많이 생성되었고, 특히 Ethyl hexadecanoate는 대조군에 비해 약 9배 높은 것을 확인하였다.

상기 결과는 균주 W153, N373, G818, A159로 제조된 약주는 각각 다양한 휘발성 향기 성분을 가지는바, 특색있는 저도수 약주를 생성할 수 있음을 의미한다. 또한 상기 W153 균주와 다른 균주(N373, G818, A159)의 혼합 발효를 통해 더욱 다채로운 향기 성분을 갖는 약주를 제조할 수 있음을 시사한다.

종합적으로 본 발명자들은 머루, 포도, 아로니아, 누룩으로부터 신규 군주 W153, N373 G818 및 A159를 분리하였다. 상기 균주들은 저온 생육 및 발효능이 우수하고, β-glucosidase 효소 활성이 높으며, 지방산 및 아미노산 생합성 저해제 저항성이 우수한 특징을 가진다. 이로 상기 균주 W153, N373 G818 및 A159로 제조한 약주는 향기 생성이나 관능적인 면에서도 우수한 결과를 보였다. 따라서 본 발명의 균주 W153, N373, G818 및 A159는 발효주 등을 포함한 발효 식품 분야에서 다양하게 활용될 수 있다.

이상, 본 발명내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의해 정의된다고 할 것이다.

국립농업과학원 농업유전자원센터 KACC93338P 20200917 국립농업과학원 농업유전자원센터 KACC93339P 20200917 국립농업과학원 농업유전자원센터 KACC93340P 20200917 국립농업과학원 농업유전자원센터 KACC93341P 20200917

<110> Kyungpook National University Industry-Academic Cooperation Foundation <120> Novel Pichia kudriavzevii N373 and use thereof <130> 1-328P <160> 4 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 808 <212> DNA <213> Saccharomyces cerevisiae <400> 1 gcggaaggat cattaaagaa atttaataat tttgaaaatg gatttttttg ttttggcaag 60 agcatgagag cttttactgg gcaagaagac aagagatgga gagtccagcc gggcctgcgc 120 ttaagtgcgc ggtcttgcta ggcttgtaag tttctttctt gctattccaa acggtgagag 180 atttctgtgc ttttgttata ggacaattaa aaccgtttca atacaacaca ctgtggagtt 240 ttcatatctt tgcaactttt tctttgggca ttcgagcaat cggggcccag aggtaacaaa 300 cacaaacaat tttatctatt cattaaattt ttgtcaaaaa caagaatttt cgtaactgga 360 aattttaaaa tattaaaaac tttcaacaac ggatctcttg gttctcgcat cgatgaagaa 420 cgcagcgaaa tgcgatacgt aatgtgaatt gcagaattcc gtgaatcatc gaatctttga 480 acgcacattg cgccccttgg tattccaggg ggcatgcctg tttgagcgtc atttccttct 540 caaacattct gtttggtagt gagtgatact ctttggagtt aacttgaaat tgctggcctt 600 ttcattggat gttttttttc caaagagagg tttctctgcg tgcttgaggt ataatgcaag 660 tacggtcgtt ttaggtttta ccaactgcgg ctaatctttt tttatactga gcgtattgga 720 acgttatcga taagaagaga gcgtctaggc gaacaatgtt cttaaagttt gacctcaaat 780 caggtaggag tacccgctga acttaagc 808 <210> 2 <211> 413 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Pichia kudriavzevii <400> 2 tgcgtgagcg gacgaaacaa maacacctaa atgtggaata tagcatatag tcgacaagag 60 aaatctacga aaaacaaaca aaactttcaa caacggatct cttggttctc gcatcgatga 120 agagcgcagc gaaatgcgat acctagtgtg aattgcagcc atcgtgaatc atcgagttct 180 tgaacgcaca ttgcgcccct cggcattccg gggggcatgc ctgtttgagc gtcgtttcca 240 tcttgcgcgt gcgcagagtt gggggagcgg agcggacgac gtgtaaagag cgtcggagct 300 gcgactcgcc tgaaagggag cgaagctggc cgagcgaact agactttttt tcagggacgc 360 ttggcggccg agagcgagtg ttgcgagaca acaaaaagct cgacctcaaa tca 413 <210> 3 <211> 702 <212> DNA <213> Hanseniaspora vineae <400> 3 gagggatcat ttaagaaaat tactgaattt tcgagctgcc tgtgtggctg cagacagaga 60 gctaagcctg tgcgcctgcg cttaattgcg cggctgcggg tggcgttctt gctattggct 120 gtagtttgcg cggtggtttt gatttcattt cacactgtga agattttttc atactttact 180 tctttgggct gttttttcag cccaaaggtt ataaacacaa acaacttttt tttttattac 240 agacaatcaa gaaatttcta ttgaaataaa atattttaaa actttcaaca acggatctct 300 tggttctcgc atcgatgaag aacgtagcga attgcgataa gtaatgtgaa ttgcagattc 360 tcgtgaatca ttgaattttt gaacgcacat tgcgccctct ggtattccag agggcatgcc 420 tgtttgagcg tcatttcctt ctcaaaaacc cagtttttgg ttgtgagtga tactctgtta 480 cagggttaac ttgaaaatgc tatgcccatt tggctgcccc ttctctgagg ggactgcgcg 540 tctgtgcagg atgtaaccaa tgtatttagg tattcatacc aactttcatt gtgcgcgtct 600 tatgcagttg cagtccaccc aacctcggac acactgggct ggctgggcca acagtattca 660 taaagttgac ctcaaatcag gtargaatac ccgctgaact ta 702 <210> 4 <211> 715 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Wickerhamomyces anomalus <400> 4 ctgcggaagg atcattatag tattctattg ccagcgctta attgcgcggc gataaacctt 60 acacacattg tctagttttt ttgaactttg ctttgggtgg tgggtgawcc tgcggaagga 120 tcattcttgt gatttattat tccatggygt gaccggaasg aaaccataac cacwtaaaat 180 gtggaaaata gcaattkttg gccaagagaa ttttrggaaa aacaaacaaa actttcaaca 240 acggatctct tggttctcgc atcgatgaag agcgcagcga aatgcgatac ctagtgtgaa 300 ttgcagccat cgtgaatcat cgagttcttg aacgcacatt gcgcccctcg gcattccggg 360 gggcatgcct gtttgagcgt cgtttccatc ttgcgcgtgc gcagagttgg gggagcggag 420 cggacgacgt gtaaagagcg tcggagctgc gactcgcctg aaagggagcg aaactggccg 480 agcgaactag actttttttc agggacgctt ggcggccgaa agcgagtgtt gcgcagacaa 540 caaaaagctc gacctcaaat cmtggaggaa tacccgctga acttaakcct attcaaaacg 600 gargaaagca ggtttagaag tattttaggc tcggcttaac aacaataaac taaaagtttg 660 acctcaaatc aggtaggact acccgctgaa cttaagcata tcaataagcg gagga 715

Claims (11)

1. 수탁번호 KACC93340P로 수탁된, 피키아 쿠드리아브제비(Pichia kudriavzevii) N373 균주.
2. 제1항에 있어서,
   상기 균주는 누룩으로부터 분리된 것인, 피키아 쿠드리아브제비 N373 균주.
3. 제1항에 있어서,
   상기 균주는 서열번호 2의 염기서열을 포함하는 것인, 피키아 쿠드리아브제비 N373 균주.
4. 제1항에 있어서,
   상기 균주는 저온에 대한 내성을 갖는, 피키아 쿠드리아브제비 N373 균주.
5. 제1항에 있어서,
   상기 균주는 세루레닌(cerulenin)에 대한 저항성을 갖는, 피키아 쿠드리아브제비 N373 균주.
6. 제1항에 있어서,
   상기 균주는 플루오로페닐알라닌(fluorophenylalanine)에 대한 저항성을 갖는, 피키아 쿠드리아브제비 N373 균주.
7. 수탁번호 KACC93340P로 수탁된 피키아 쿠드리아브제비 N373 균주, 전분질 및 발효제를 배양하는 단계;를 포함하는 관능성이 우수한 약주의 제조방법.
8. 제7항에 있어서,
   상기 전분질은 쌀, 찹쌀, 현미, 백미, 흑미, 보리, 옥수수, 찰옥수수, 감자, 고구마, 보리, 찰보리, 콩, 밀, 찰밀 및 녹두로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인, 약주의 제조방법.
9. 제7항에 있어서,
   상기 발효제는 입국, 누룩, 조효소제 및 정제효소제로 이루어진 군에서 선택된 1 종 이상인, 약주의 제조방법.
10. 제7항에 있어서,
    상기 방법으로 제조된 약주는 젖산 함량이 증진된 것인, 약주의 제조방법.
11. 제7항에 있어서,
    상기 방법으로 제조된 약주는 에틸 아세테이트(ethyl acetate) 함량이 증진된 것인, 약주의 제조방법.

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