KR102154021B1

KR102154021B1 - 향기성분 고생산성 사카로마이세스 세레비지애 afy-5 효모 및 이를 이용한 주류의 제조 방법

Info

Publication number: KR102154021B1
Application number: KR1020180168228A
Authority: KR
Inventors: 이하연; 권혜정; 박지선; 임재길; 안문섭
Original assignee: 강원도
Priority date: 2018-12-24
Filing date: 2018-12-24
Publication date: 2020-09-09
Also published as: KR20200078907A

Abstract

본 발명은 향기성분을 고농도로 생산하는 사카로마이세스 세레비지애 AFY-5 효모 및 이를 이용한 주류의 제조 방법에 관한 것이다.

Description

향기성분 고생산성 사카로마이세스 세레비지애 AFY-5 효모 및 이를 이용한 주류의 제조 방법 {SACCHAROMYCES CEREVISIAE AFY-5 STRAIN WITH HIGH PRODUCTIVITY OF FLAVOR COMPONENTS AND PROCESS FOR PREPARING ALCOHOLIC LIQUORS USING THE SAME}

향기성분을 고농도로 생산하는 사카로마이세스 세레비지애 AFY-5 효모 및 이를 이용한 주류의 제조 방법에 관한 것이다.

사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae) 균주는 맥주를 포함한 다양한 주류에 활용된다. 사카로마이에스 세레비지애 균주는 다양한 서브 타입이 존재하는 것으로 알려져 있고, 그 성질 또한 서로 상이하고 다양하다.

맥주의 맛과 향에는 많은 향기성분들이 관여하는데, 그 중 균주에 의해 생산될 수 있는 요소(urea) 및 황화수소는 포유동물에 독성을 일으키거나 맥주의 풍미를 감소시킬 수 있다. 이를 제거하기 위해 제조 시 다른 공정을 추가하거나, 첨가제를 추가할 수 있지만, 비용이나 시간 상 효율적이지 않다. 또한 추가 공정이나 첨가제에 의해서 맥주의 풍미가 감소될 수 있다.

맛과 향이 우수한 맥주효모 균주를 얻기 위해 유전적 변형을 가하는 방법을 이용할 수 있을 것이나, 이는 많은 시간과 노동력을 요구하고, 이러한 방식으로 균주가 선발되었을지라도 선발된 균주들이 흔히 원래의 모균주가 갖고 있었던 우수한 발효적 특성들을 유실하는 경우가 많고, 유전자 조작 효모의 안전성에 대한 우려와 같은 단점이 존재한다.

따라서, 주류 제조에 있어서 유익한 향기성분을 고농도로 생산하지만 불쾌한 풍미의 원인물질은 생산하지 않으면서 안전한 균주를 얻을 필요가 있다.

본 발명의 일 양상은 서열번호 1의 염기 서열로 이루어진 26S rRNA를 포함하는 균주를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 양상은 일 양상에 따른 균주를 흡광도 OD₆₀₀ 값 0.1 내지 0.3로 맥아즙에 접종하는 단계; 15 ℃ 내지 45 ℃에서 5 내지 30일간 발효시키는 제1 발효 단계; 및 당류을 첨가하여 15 ℃ 내지 45 ℃에서 2 내지 30일간 발효시키는 제 2 발효 단계를 포함하는 주류 제조방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 양상은 일 양상에 따른 균주를 이용하여 제조된 주류 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명에서 사용되는 모든 기술용어는, 달리 정의되지 않는 이상, 본 발명의 관련 분야에서 통상의 당업자가 일반적으로 이해하는 바와 같은 의미로 사용된다. 또한, 본 명세서에는 바람직한 방법이나 시료가 기재되나, 이와 유사하거나 동등한 것들도 본 발명의 범주에 포함된다. 또한, 본 명세서에 기재된 수치는 명시하지 않아도 “약”의 의미를 포함하는 것으로 간주한다. 본 명세서에 참고문헌으로 기재되는 모든 간행물의 내용은 전체가 본 명세서에 참고로 통합된다.

일 양상은, 서열번호 1의 염기 서열로 이루어진 26S rRNA를 포함하는 균주를 제공한다.

상기 균주는 효모(yeast)로서, 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae), 보다 구체적으로 사카로마이세스 세레비지애 AFY-5일 수 있다. 상기 26S rRNA는 구체적으로는, 서열번호 1의 염기 서열로 표시되는 유전자로부터 전사되는 rRNA일 수 있다.

일 구체예에서, 상기 균주는 수탁번호 KACC 93320P로 기탁된 것일 수 있다.

일 구체예에서, 상기 균주는 주류 제조에 사용하기 위한 것일 수 있다. 상기 주류는 맥주, 약주, 청주, 탁주, 과실주, 소주, 증류주, 또는 발효주일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

일 구체예에서, 상기 주류는 바람직하게는 맥주일 수 있다.

일 구체예에서, 상기 균주는 당도 1 w/w% 이상의 배양 조건에 적용하기 위한 것일 수 있다.

일 구체예에서, 상기 균주는 산도 pH 3.0 이상의 배양 조건에 적용하기 위한 것일 수 있다.

상기 배양 조건은 주류 제조시 요구되는 균주의 발효 조건을 의미하는 것일 수 있다. 상기 당도는 1 w/w% 이상, 5 w/w% 이상, 10 w/w% 이상, 15 w/w% 이상, 20 w/w% 이상, 30 w/w% 이상, 40 w/w% 이상, 1 내지 60 w/w%, 5 내지 60 w/w%, 10 내지 60 w/w%, 15 내지 60 w/w%, 20 내지 60 w/w%, 30 내지 60 w/w%, 40 내지 60 w/w%, 1 내지 50 w/w%, 5 내지 50 w/w%, 10 내지 50 w/w%, 15 내지 50 w/w%, 20 내지 50 w/w%, 30 내지 50 w/w%, 40 내지 50 w/w%, 또는 1 내지 40 w/w%일 수 있다. 상기 당은 단당류, 이당류, 올리고당, 다당류 또는 이의 유도체를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 상기 당은 글루코오스, 프룩토오스, 갈락토오스, 수크로오스, 락토오스, 말토오스, 트레할로오스, 프룩토올리고당, 갈락토올릭고당, 전분, 글리코겐, 셀룰로오스, 키틴, 펙틴, 스타키오스, 소르보오스, 자일로오스, 리보오스, 마이오이니시토스, 또는 마이오이니시톨을 포함하나 이에 제한되지 않는다.

일 구체예에 따른 균주는 고농도를 포함하여, 광범위한 범위의 당도가 요구되는 주류 제조 조건에서도 배양이 가능하므로, 다양한 주류 제조 방법에 적용할 수 있다. 상기 고농도는 80 w/w% 이하, 70 w/w% 이하, 60 w/w% 이하, 또는 50 w/w% 이하이면서, 20 w/w% 이상, 30 w/w% 이상 또는 40 w/w% 이상인 당 농도를 의미하는 것일 수 있다. 산도는 pH 3.0 이상, pH 3.5 이상, pH 4.0 이상, pH 4.5 이상, pH 5.0 이상, pH 5.5 이상, pH 6.0 이상, pH 3 내지 8.0, pH 3.5 내지 8.0, pH 4.0 내지 8.0, pH 4.5 내지 8.0, pH 5.0 내지 8.0, pH 5.5 내지 8.0, pH 6.0 내지 8.0, pH 3.0 내지 7.0, pH 3.5 내지 7.0, pH 4.0 내지 7.0, pH 4.5 내지 7.0, pH 5.0 내지 7.0, pH 5.5 내지 7.0, pH 6.0 내지 7.0, 또는 pH 3.0 내지 6.0일 수 있다. 일 구체예에 따른 균주는 넓은 범위의 산도 조건에서 배양이 가능하여 배양이 용이하고, 다양한 주류 제조 방법에 적용 가능하다. 또한, 일 구체예에 따른 균주는 낮은 pH 조건에서도 배양이 가능하여 잡균 오염을 차단함으로써 발효주의 안정성을 획득할 수 있다. 상기 낮은 pH 조건은 pH 3.0 내지 5.0, pH 3.0 내지 4.0, 또는 pH 3.0 내지 3.5를 의미할 수 있다.

일 구체예에서, 상기 균주는 15 ℃ 내지 45 ℃의 배양 조건에서 적용하기 위한 것일 수 있다. 일 구체예에 따른 균주는 저온에서 고온까지 생육 온도 범위가 넓어 배양이 용이하고, 다양한 주류 제조 방법에 적용 가능하다. 상기 저온은 15 ℃ 내지 30 ℃, 15 ℃ 내지 25 ℃ 또는 15 ℃ 내지 20 ℃를 의미하는 것일 수 있다. 상기 고온은 35 ℃ 내지 45 ℃ 또는 40 ℃ 내지 45 ℃를 의미하는 것일 수 있다.

일 구체예에서, 상기 균주는 요소(urea)를 생산하지 않는 것일 수 있다.

일 구체예에서, 상기 균주는 α-아밀라아제(α-Amylase), β-글루코시다아제 (β-glucosidase), 프로테아제 (protease), 및 글루카나아제(glucanase) 활성을 갖는 것일 수 있다.

일 구체예에 따른 균주는 요소를 생산하지 않아서, 상기 균주를 이용하여 제조된 주류는 요소를 포함하지 않을 수 있다. 일 구체예에 따른 균주는 α-아밀라아제, β-글루코시다아제, 프로테아제, 및 글루카나아제의 높은 활성을 가지면서, 발암 물질인 요소를 생성하지 않으므로 효율성 및 안정성이 모두 높다.

일 구체예에서, 상기 균주는 황화수소(H₂S)를 생산하지 않는 것일 수 있다. 따라서, 균주에 의해 생산된 주류는 황화수소를 포함하지 않을 수 있고, 주류 생산시 발효 공정 중에 황화수소로부터 유래되는 불쾌한 향을 포함하지 않을 수 있다.

일 구체예에서, 상기 균주는 세룰레닌(cerulenin)에 내성을 갖는 것일 수 있다. 일 구체예에 따른 균주는 세룰레닌에 내성을 가지므로, 에틸 카프로에이트를 고농도로 생산하는 것일 수 있다. 에틸 카프로에이트는 지방산의 일종인 카프론산과 주류의 주성분인 에탄올이 효모에 의해 에스테르화 반응을 일으켜 만들어진 물질로서 숙성된 과일향을 내어 일본의 사케뿐만 아니라, 중국의 백주 및 우리나라의 전통 증류식 소주, 탁주 등의 주류에서도 중요한 성분으로 알려져 있다. 에틸 카프로에이트(Ethyl caproate)는 카프론산과 에탄올이 효모에 의하여 에스테르화 반응을 통하여 만들어지는 물질로 숙성된 과일향이 나며, 일본의 사케뿐만 아니라 우리나라 전통 증류식 소주와, 탁주, 중국 백주 등 주류에서 중요한 성분으로 알려진 향기성분이다. 항생제의 일종인 세룰레닌은 효모의 지방산합성효소(Fatty Acid Synthase; FAS)를 특이적으로 저해하여 결과적으로 효모의 증식을 억제한다. 즉 세룰레닌에 내성이 있는 효모는 FAS를 저해 받지 않아 세룰레닌이 첨가된 배지에서도 증식하며, 중쇄지방산의 합성량이 증가하여 이에 따라 에틸 카프로에이트의 함량도 증가한다고 알려져 있다(Eiji ICHIKAWA,　et al.,　Agric. Biol. Chem., 55(8), 2153-2154, 1991] 및 [ARIKAWA YUKIHIKO,　et　al.,　Journal　of　Bioscience　and　Bioengineering, 90(6), 675-677, 2000]). 따라서, 상기 균주를 이용하여 향미가 풍부한 고품질의 주류를 제조할 수 있다.

일 구체예에서, 상기 균주는 글루코오스, 갈락토오스, 알파-메틸-D-글루코시드(α-Methyl-D-Glucoside), D-말토오스, D-사카로오스 및 D-라피노오스로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 탄소원을 이용하는 것일 수 있다. 일 구체예에 따른 균주는 상기 기술된 바와 같은 탄소원을 이용하되, D-트레할로오스는 이용하지 않는 것일 수 있다. 상기 균주는 일반적인 주류 제조용 균주와 상이한 탄소원 이용능을 가지므로, 이를 발효시켜 제조되는 주류의 풍미와 품질에서 차별성을 갖고, 우수한 주류를 제조하기 위해 이용될 수 있다.

일 구체예에서, 상기 균주는 에틸 카프로에이트(ethyl caproate), 에틸 카프레이트(ethyl caprate), 에틸 라우레이트(ethyl laurate), 이소아밀 데카노에이트(isoamyl decanoate), 이소아밀 카프릴에이트(isoamyl caprylate), 데실 아세테이트(decyl acetate), 페네틸 아세테이트(phenethyl acetate), 및 2-페닐에탄올(2-phenylethanol)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 성분을 고농도로 생산하는 것일 수 있다. 일 구체예에 따른 균주는 상기 화합물을 종래에 알려진 균주, 예를 들어, WB-06 균주에 비해 1.5 배 이상, 2 배 이상, 또는 3 배 이상 높은 농도로 생산할 수 있는 것일 수 있다.

일 구체예에서, 상기 에틸 카프로에이트, 에틸 카프레이트, 에틸 라우레이트, 이소아밀 데카노에이트, 데실 아세테이트, 및 페네틸 아세테이트로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 화합물은 2 배 이상 생산될 수 있고, 에틸 카프로에이트, 에틸 라우레이트 또는 이들의 조합이 3 배 이상 생산될 수 있다.

다른 양상은 서열번호 1의 염기 서열로 이루어진 26S rRNA를 포함하는 주류 제조용 균주로서,

상기 균주는 글루코오스, 갈락토오스, 알파-메틸-D-글루코시드(α-Methyl-D-Glucoside), D-말토오스, D-사카로오스 및 D-라피노오스로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 탄소원; 당도 1 w/w% 이상; 산도 pH 3.0 이상; 및 15 ℃ 내지 45 ℃의 배양 조건 중 선택된 하나 이상의 배양 조건에 적용하기 위한 것이고,

상기 균주는, 상기 균주로부터 생산된 요소 및 황화수소를 포함하지 않고, 에틸 카프로에이트, 에틸 카프레이트, 에틸 라우레이트, 이소아밀 데카노에이트, 이소아밀 카프릴에이트, 데실 아세테이트, 페네틸 아세테이트, 및 2-페닐에탄올로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 화합물을 고농도로 포함하는 주류를 제조하기 위한 것일 수 있다.

또 다른 양상은 일 양상에 따른 균주를 흡광도(OD₆₀₀) 값 0.1 내지 0.3로 맥아즙에 접종하는 단계; 15 ℃ 내지 45 ℃에서 5 내지 30일간 발효시키는 제1 발효 단계; 및 당류을 첨가하여 15 ℃ 내지 45 ℃에서 2 내지 30일간 발효시키는 제 2 발효 단계를 포함하는 주류 제조방법을 제공한다.

상기 흡광도(OD₆₀₀)의 값은 0.1 내지 0.3, 0.12 내지 0.28, 0.15 내지 0.25, 또는 0.18 내지 0.22일 수 있다.

용어 "맥아즙"은 엿기름을 갈아 더운물과 섞어서 당화한 액체를 의미하는 것일 수 있다.

제1 발효 단계의 온도는 15 ℃ 내지 45 ℃, 15 ℃ 내지 40 ℃, 15 ℃ 내지 35 ℃, 15 ℃ 내지 30 ℃, 15 ℃ 내지 25 ℃, 15 ℃ 내지 20 ℃, 15 ℃ 내지 19 ℃, 16 ℃ 내지 19 ℃, 17 ℃ 내지 19 ℃, 또는 17.5 ℃ 내지 18.5 ℃일 수 있다. 상기 제1 발효 단계는 5 내지 30일, 5 내지 20일, 5 내지 15일, 5 내지 12일, 5 내지 10일 또는 6 내지 8일간 이루어지는 것일 수 있다.

제2 발효 단계에서 사용되는 당류는 단당류, 이당류, 올리고당, 다당류 또는 이의 유도체를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 상기 당은 글루코오스, 프룩토오스, 갈락토오스, 수크로오스, 락토오스, 말토오스, 트레할로오스, 프룩토올리고당, 갈락토올릭고당, 전분, 글리코겐, 셀룰로오스, 키틴, 펙틴, 스타키오스, 소르보오스, 자일로오스, 리보오스, 마이오이니시토오스, 또는 마이오이니시톨을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 일 구체예에서, 상기 당류는 글루코오스, 갈락토오스, 알파-메틸-D-글루코시드, D-말토오스, D-사카로오스 및 D-라피노오스로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상일 수 있다.

상기 제2 발효 단계의 온도는 15 ℃ 내지 45 ℃, 15 ℃ 내지 40 ℃, 15 ℃ 내지 35 ℃, 15 ℃ 내지 30 ℃, 15 ℃ 내지 25 ℃, 15 ℃ 내지 23 ℃, 18 ℃ 내지 21 ℃, 또는 19.5 ℃ 내지 20.5 ℃일 수 있다. 상기 제2 발효 단계는 2 내지 30일, 2 내지 20일, 2 내지 15일, 2 내지 12일, 2 내지 10일 또는 2 내지 7일간 이루어지는 것일 수 있다.

일 구체예에서, 상기 방법은 맥주의 제조 방법일 수 있다.

일 구체예에서, 상기 맥아즙은, 맥아를 43 ℃ 내지 47 ℃에서 5 내지 15 분간 숙성하는 제1 숙성 단계; 50 ℃ 내지 55 ℃에서 30 분 내지 50분 간 숙성하는 제2 숙성 단계; 60 ℃ 내지 65 ℃에서 50 분 내지 70분 간 숙성하는 제3 숙성 단계; 75 ℃ 내지 80 ℃에서 5 분 내지 15분 간 숙성하는 제 4 숙성단계; 및 상기 숙성물에 홉을 첨가하고 50 내지 70분간 가열하는 단계를 더 포함할 수 있다. 상기 가열은 상기 숙성물에 상기 숙성물의 끓는점 이상의 온도, 예를 들어, 80 ℃ 이상, 100 ℃ 이상, 80 ℃ 내지 150 ℃, 80 ℃ 내지 120 ℃, 100 ℃ 내지 150 ℃ 또는 100 ℃ 내지 150 ℃의 온도를 가하는 것을 의미할 수 있다. 상기 가열하는 단계는 끓이는 단계를 의미할 수 있다. 상기 숙성물에 홉을 첨가하기 전에 여과하는 단계를 더 포함할 수 있다. 각 단계에서의 온도, 숙성 시간 또는 가열 시간은 생산량, 맥아의 상태, 홉의 상태, 목적하는 풍미 등에 따라 달라질 수 있다.

또 다른 양상은 일 양상에 따른 균주를 이용하여 제조된 주류 조성물을 제공한다.

상기 제조 방법 및 주류 조성물에 대해서 언급된 용어 또는 요소 중 청구된 균주에 대한 설명에서 언급된 것과 같은 것은, 앞에서 청구된 균주에 대한 설명에서 언급된 바와 같은 것으로 이해된다.

일 양상에 따른 균주는 광범위한 당도, 산도 또는 온도 조건에서 배양이 가능하므로 다양한 주류를 제조하는데 이용될 수 있다. 또한 상기 균주는 다양한 향기 성분을 고농도로 생산하고, 요소 또는 황화수소와 같은 해로운 물질 및 불쾌한 향의 원인을 생산하지 않으므로 안전하고 품질이 우수한 주류를 제조하는데 이용될 수 있다.

다른 양상에 따른 주류 제조 방법을 이용하여, 우수한 품질의 주류, 구체적으로 맥주를 제조할 수 있다.

도 1은 일 구체예에 따른 균주의 유전적 계통을 계통도로서 도시한 것이다.

이하, 본 발명을 하기 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 이에 의해 본 발명의 범위가 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 사카로마이세스 세레비지애 AFY -5의 동정 및 성질 확인

1-1. 사카로마이세스 세레비지애 AFY -5의 동정

춘천시 신북읍 샘밭장터에서 구입한 과일 10 g, 누룩 10 g, 및 막걸리 10 mL 각각을 증류수 90 mL에 첨가하여 1시간 동안 교반하여 각 원료의 성분을 추출한 다음, 그 추출액을 YPD 브로스(broth)에 접종하여 25 ℃에서 2시간 배양하였다. 그 후, 곰팡이의 생육을 억제하기 위하여 0.35 % 소듐 프로피오네이트가 첨가된 YPD agar 배지에서 25 ℃, 48시간 배양한 후, 단일 콜로니를 획득하여 각 독립적으로 추가 배양하였다. 상기 단일 콜로니의 배양물로부터 수득된 균주로부터 Yeast DNA prep kit를 이용하여 DNA를 추출하고, LR0R (5'-ACCCGCTGAACTTAAGC　-3') 및 LR7 (5'-TACTACCACCAAGATCT-3') 프라이머를 이용하여 ITS 부위를 PCR로 증폭하였다. 증폭된 부위를 정제한 후, ㈜마크로젠에 염기서열분석을 의뢰하여 염기서열을 결정하였다. AFY-5 균주는 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae) 균주와 99 % 일치하는 것으로 보였다. 상기와 같이 동정된 균주를 사카로마이세스 세레비지애 AFY-5로 명명하고, 이를 기탁기관인 국립농업과학원에 기탁하였다(기탁번호 : KACC 93320P). 분석된 ITS 부위의 염기서열(26S rRNA 염기서열)은 서열번호 1에 나타내었다.

1-2. 내당성 , 내산성 평가

내당성을 평가하기 위하여 글루코오스 및 말토오스를 각각 1, 5, 10, 15, 20, 30, 및 40 w/w% 첨가한 YP(효모 추출물 1 %, 펩톤 2 %, agar 2 %)배지에서, 내산성을 평가하기 위해서 pH를 각각 3.0, 3.5, 4.0, 4.5, 5.0, 5.5, 및 6.0로 맞춘 YP(효모 추출물 1 %, 펩톤 2 %, agar 2 %)배지를 이용하였다. 모든 실험은 96-well plate에 제작한 배지에 균주는 Repicator로 펀칭하여 접종하였으며, 25 ℃에서 48시간 배양 한 후, 콜로니 크기(mm)를 측정하여 1 mm는 +, 2 mm 는 ++, 3 mm는 +++, 4 mm는 ++++, 및 5 mm는 +++++로 하기의 표 1에 나타내었다.

글루코오스	1	5	10	15	20	30	40
AFY-5	++++	++++	++++	++++	++++	++++	+++

말토오스	1	5	10	15	20	30	40
AFY-5	+++	++++	++++	+++	+++	+++	+++

상기 표 1 및 2에서 알 수 있는 바와 같이, AFY-5 균주는 각각 40 % 글루코오스 및 말토오스와 같은 고농도의 당이 함유된 환경에서도 생육이 우수한 내당성 균주로서 양조적성이 뛰어난 것을 확인하였다.

pH	3.0	3.5	4.0	4.5	5.0	5.5	6.0
AFY-5	++++	++++	++++	++++	++++	++++	++++

상기 표 3에서 알 수 있는 바와 같이, AFY-5 균주는 pH 3.0 내지 6.0의 넓은 범위 내에서 생육이 가능하였다. 특히, 초기 발효에서 pH 3.0 내지 5.0과 같은 낮은 pH 조건에서도 균주 생육이 가능하여 잡균 오염의 유리하여 발효주의 안전성을 확보할 수 있음을 확인하였다.

1-3. 온도별 생육 평가

온도별 평가를 위하여 YP 배지에서 각 15, 20, 25, 30, 35, 40, 및 45℃에서 48시간 배양한 후, 콜로니 크기(mm)를 측정하였다.

℃	15	20	25	30	35	40	45
AFY-5	++++	++++	++++	++++	++++	++++	+++

상기 표 4에서 알 수 있는 바와 같이, AFY-5 균주는 저온에서 고온까지 생육 온도 범위가 넓어 발효 온도 조작에 있어서 장점을 가짐을 알 수 있다.

1-4. 효소 활성 평가

α-아밀라아제(α-Amylase), β-글루코시다아제(β-glucosidase), 프로테아제(protease), 및 글루카나아제(glucanase)인 네 가지 효소에 대한 효소 활성을 agar 플레이트 방법으로 수행하였다. α-아밀라아제 효소활성은 1 % (w/v) 가용성 녹말(soluble starch)이 첨가된 YP agar에 균주를 펀칭하여 접종한 후, 1 % KI 및 0.1 % KI₂로 이루어진 요오드 용액으로 염색하여 염색되지 않는 콜로니를 α-아밀라아제 효소 생성 균주로 판단하였다. β-글루코시다아제 활성은 0.5 % 에스쿨린(esculin)을 첨가 후, pH 5.0으로 조정한 YPD agar를 멸균시킨 다음 0.45 ㎛로 여과한 1 % 구연산 철 암모늄(ferric ammonium citrate) 용액 2 %를 첨가하여 배지를 제조하였다. 상기와 같이 제조된 배지에 균주를 접종하였다. 콜로니 주변에 검은색 환이 생성된 균주를 β-글루코시다아제 양성 균주로 판단하였다. 프로테아제 효소활성은 1 % 스킴 밀크가 첨가된 YM agar에 균주를 접종하여 콜로니 주변에 투명환이 생성되는 균주를 프로테아제 양성 균주로 판단하였다. 글루카나아제 실험은 0.2 % β-글루칸이 첨가된 YPD agar 배지에 균주를 접종하여 배양한 후, 0.1 % congo red 시약으로 염색하여 콜로니 주변의 투명환이 생성된 균주를 글루카네이즈 양성 균주로 판단하였다. 유레아제(Urease)는 Christensen’s urea agar에 접종하여 콜리니 주변에 핑크색 환이 생성된 균주를 유레아즈 양성 균주로 판단하였다.

효소활성	α-아밀라아제	β-글루코시다아제	프로테아제	글루카나아제	유레아제
AFY-5	+++	+++++	+++	++	-

상기 표 5에 나타낸 바와 같이, AFY-5 균주는 α-아밀라아제, β-글루코시다아제, 프로테아제 및 글루카네이즈와 같은 전분 분해효소 활성이 높아 다양한 전분질 및 단백질 원료를 이용하여 발효주를 제조할 수 있으며, 유레아즈 음성 균주로서 발암물질인 요소(urea)를 생성하지 않음을 알 수 있다.

1-5. H ₂ S 생성 및 세룰레닌 ( cerulenin ) 내성 평가

황화수소 생성 여부를 확인하기 위하여 Biggy agar에 균주를 접종하여 25℃에서 48시간 배양 후, 콜로니 색을 확인하여 콜로니 색이 진한 갈색인 것을 양성, 흰색인 것을 음성으로 판단하였다. 에틸 카프로에이트(ethyl caproate) 고생성 균주를 선발하기 위하여 세룰레닌(cerulenin) 내성을 평가하였다. 지방산 합성경로에서 0.37 % 효모 질소 염기(Yeast nitrogen base)에 2 % 글루코오스, 2 % agar를 첨가하여 pH 5.3으로 조정 한 후, 25 ㎛ 세룰레닌을 첨가한 배지에 접종하여 콜로니의 크기를 측정하였다.

구 분	H₂S	세룰레닌
AFY-5	-	+++++

상기 표 6에서 알 수 있는 바와 같이, AFY-5 균주는 황화수소가스 비생성 균주임을 확인하여 발효주의 불쾌한 향을 내는 황화수소를 생성하지 않으며, 세룰레닌에 내성이 있는 것으로 확인되어 에틸 카프로에이트를 다량 생성할 것으로 판단되어 향미가 풍부한 고품질 주류를 제조에 효과적임을 알 수 있다.

실시예 2: 사카로마이세스 세레비지애 AFY -5 균주의 생화학적 성질 확인

상기 동정된 사카로마이세스 세레비지애 AFY-5 균주는 API 20C AUX 키트를 이용하여 탄소원 이용능을 평가하여 그 결과를 하기의 표 7에 나타내었다. 비교군 균주로서 사카로마이세스 세레비지애 WB-06(Fermentis 社)를 이용하였다.

구 분	WB-06	AFY-5
Control	-	-
Glucose	+	+
Glycerol	-	-
2-Keto-D-glucose	-	-
L-Arabinose	-	-
D-Xylose	-	-
Adonitol	-	-
Xylitol	-	-
D-Galactose	+	+
Inositol	-	-
D-Sorbitol	-	-
α-Methyl-D-Glucoside	-	+
N-Acetyl-D-Glucosamine	-	-
D-Celiobiose	-	-
D-Lactose	-	-
D-Maltose	+	+
D-Saccharose	+	+
D-Trehalose	+	-
D-Melezitose	-	-
D-Raffinose	-	+
Hyphae/Pseudo-Hyphae	-	-

상기 표 7에서 알 수 있는 바와 같이, WB-06와 AFY-5 균주 모두 사카로마이세스 세레비지애 균주 계통이지만 탄소원 이용능은 서로 다른 것으로 나타났다. 이러한 상이한 탄소원 이용능은 발효물이 상이하게 수득되는데 일조할 것이다.

실시예 3. 사카로마이세스 세레비지애 AFY -5 균주를 이용한 맥주 발효

3-1. 맥아즙의 제조

맥아(Pilsner, wheat, Charahell, 산성화 몰트(acidulated malt))를 당화조에 투입하여 약 45℃에서 약 10분, 약 52℃에서 약 40분, 약 63℃에서 약 60분, 약 78℃에서 약 10분 처리하였다. 1차 및 2차 여과후에 자비조에 홉(Hallertaur, Cascade, Saaz)을 첨가 후, 60분 동안 끓였다.

3-2. 맥주 제조

흡광도(OD₆₀₀)의 값이 약 0.2가 되도록 WB-06 및 AFY-5 균주를 맥아즙에 접종하여 약 18℃에서 약 7일간 발효하였다. 제조된 Young beer는 탄산 생성을 위하여 500 mL 내압페트병에 옮기고, 설탕을 첨가하고 약 20℃에서 2 내지 7일간 2차 발효하였고 완성된 맥주는 0℃에 저장하였다.

3-3. 향기 성분의 분석

향기 성분은 실시예 3-2에서 제조된 맥주를 10 mL 바이알에 5 mL씩 담아, 50℃에서 10분 동안 평형시킨 후, 50/30 ㎛ DVB/CAR/PDMS 섬유에 표집하고 SPME（Solid Phase Microextraction)를 이용하여 GC-TOFMS (Leco,Pegasus HT, USA)에 주입하였다. 컬럼은 Rxi-5ms (30 m x 0.25 mm, 0.25 ㎛)를 이용하였고, 샘플은 50 ℃에서 10분간 배양한 후, 50 ℃에서 10분간 추출하였다. 캐리어 가스는 He gas를 이용하여 유속을 1.0 mL/분으로 하였고, 오븐 온도는 40 ℃에서 2분간 유지시킨 후, 10 ℃/분 속도로 250 ℃까지 승온시킨 후, 2분간 유지하였다. Transfer line 온도는 250 ℃로 하였다. 매스 스펙트럼 범위는 33~510 m/z로 하여 분석하였고, 주요 향기성분의 면적%를 계산하여 하기의 표 8에 나타내었다.

화합물	향기 설명	WB-06 균주	AFY-5 균주
에틸 카프로에이트	단맛(sweet), 과일(fruity), 파인애플(pineapple), 왁시(waxy), 풀향(green), 바나나향, 지방 (fatty)	0.136	0.434
에틸 카프레이트	단맛, 왁시, 과일, 사과, 포도, 기름진(oily), 브랜디(brandy)	0.071	0.162
에틸 라우레이트	왁시, 크리미, 비누(soapy) 및 꽃향, 유제품 및 과일향	0.131	0.339
이소아밀 데카노에이트	왁시, 과일, 풀향, 바나나, 크리미, 치즈, 지방	0.008	0.023
이소아밀 카프릴에이트	단맛, 기름진, 과일, 풀향, 비누, 파인애플, 코코넛	0.042	0.067
데실 아세테이트	귤피, 사과, 멜론, 딸기, 샐러리, 및 다른 식용물질들, 데실 아세테이트는 사과, 오랜지 및 럼 향	0.007	0.015
페네틸 아세테이트	약간 풀즙의 향과 함께, 꽃, 장미, 단맛, 꿀, 과일, 열대과일의 바디감 및 풍미	0.115	0.238
2-페닐에탄올	꽃, 건조된 장비 향, 장미수	0.131	0.243

상기 표 8에서 알 수 있는 바와 같이, AFY-5 균주를 이용하여 맥주를 제조하는 경우, 대조군인 WB-06 균주를 이용한 경우에 비해 분석된 대부분의 향기 성분이 0.5 내지 3 배 이상 포함된 것을 확인하였다.

이제까지 본 발명에 대하여 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로, 상기 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

기탁기관명 : 농업생명공학연구원

수탁번호 : KACC93320P

수탁일자 : 20181214

<110> KANGWON PROVINCE <120> SACCHAROMYCES CEREVISIAE AFY-5 STRAIN WITH HIGH PRODUCTIVITY OF FLAVOR COMPONENTS AND PROCESS FOR PREPARING ALCOHOLIC LIQUORS USING THE SAME <130> PAA-18-0108-KR0 <160> 1 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 849 <212> DNA <213> Saccharomyces cerevisiae <400> 1 taaagctaaa tattggcgag agaccgatag cgaacaagta cagtgatgga aagatgaaaa 60 gaactttgaa aagagagtga aaaagtacgt gaaattgttg aaagggaagg gcatttgatc 120 agacatggtg ttttgtgccc tctgctcctt gtgggtaggg gaatctcgca tttcactggg 180 ccagcatcag ttttggtggc aggataaatc cataggaatg tagcttgcct cggtaagtat 240 tatagcctgt gggaatactg ccagctggga ctgaggactg cgacgtaagt caaggatgct 300 ggcataatgg ttatatgccg cccgtcttga aacacggacc aaggagtcta acgtctatgc 360 gagtgtttgg gtgtaaaacc catacgcgta atgaaagtga acgtaggttg gggcctcgca 420 agaggtgcac aatcgaccga tcctgatgtc ttcggatgga tttgagtaag agcatagctg 480 ttgggacccg aaagatggtg aactatgcct gaatagggtg aagccagagg aaactctggt 540 ggaggctcgt agcggttctg acgtgcaaat cgatcgtcga atttgggtat aggggcgaaa 600 gactaatcga accatctagt agctggttcc tgccgaagtt tccctcagga tagcagaagc 660 tcgtatcagt tttatgaggt aaagcgaatg attagaggtt ccggggtcga aatgaccttg 720 acctattctc aaactttaaa tatgtaagaa gtccttgtta cttaattgaa cgtggacatt 780 tgaatgaaga gcttttagtg ggccattttt ggtaagcaga actggcgatg cgggatgaac 840 cgaacgtag 849

Claims

서열번호 1의 염기 서열로 이루어진 26S rRNA를 포함하는 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae) AFY-5 균주로서,
상기 균주는 수탁번호 KACC 93320P로 기탁된 것인 균주.
삭제
청구항 1에 있어서, 상기 균주는 주류 제조용 균주.
청구항 3에 있어서, 상기 주류는 맥주인 것인 균주.
청구항 1에 있어서, 상기 균주는 당도 1 w/w% 이상의 배양 조건에 적용하기 위한 것인 균주.
청구항 1에 있어서, 상기 균주는 산도 pH 3.0 이상의 배양 조건에 적용하기 위한 것인 균주.
청구항 1에 있어서, 상기 균주는 15 ℃ 내지 45 ℃의 배양 조건에서 적용하기 위한 것인 균주.
청구항 1에 있어서, 상기 균주는 요소(urea)를 생산하지 않는 것인 균주.
청구항 1에 있어서, 상기 균주는 α-아밀라아제(α-Amylase), β-글루코시다아제 (β-glucosidase), 프로테아제 (protease), 및 글루카나아제(glucanase) 활성을 갖는 것인 균주.
청구항 1에 있어서, 상기 균주는 황화수소(H₂S)를 생산하지 않는 것인 균주.
청구항 1에 있어서, 상기 균주는 세룰레닌(cerulenin)에 내성을 갖는 것인 균주.
청구항 1에 있어서, 상기 균주는 글루코오스, 갈락토오스, 알파-메틸-D-글루코시드(α-Methyl-D-Glucoside), D-말토오스, D-사카로오스 및 D-라피노오스로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 탄소원을 이용하는 것인 균주.
청구항 1에 있어서, 상기 균주는 에틸 카프로에이트(ethyl caproate), 에틸 카프레이트(ethyl caprate), 에틸 라우레이트(ethyl laurate), 이소아밀 데카노에이트(isoamyl decanoate), 이소아밀 카프릴에이트(isoamyl caprylate), 데실 아세테이트(decyl acetate), 페네틸 아세테이트(phenethyl acetate), 및 2-페닐에탄올(2-phenylethanol)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 성분을 고농도로 생산하는 것인 균주.
서열번호 1의 염기 서열로 이루어진 26S rRNA를 포함하는 주류 제조용 균주로서,
상기 균주는 글루코오스, 갈락토오스, 알파-메틸-D-글루코시드(α-Methyl-D-Glucoside), D-말토오스, D-사카로오스 및 D-라피노오스로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 탄소원; 당도 1 w/w% 이상; 산도 pH 3.0 이상; 및 15 ℃ 내지 45 ℃의 배양 조건 중 선택된 하나 이상의 배양 조건에 적용하기 위한 것이고,
상기 균주는, 상기 균주로부터 생산된 요소 및 황화수소를 포함하지 않고, 에틸 카프로에이트, 에틸 카프레이트, 에틸 라우레이트, 이소아밀 데카노에이트, 이소아밀 카프릴에이트, 데실 아세테이트, 페네틸 아세테이트, 및 2-페닐에탄올로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 화합물을 포함하는 주류를 제조하기 위한 것인 균주.
청구항 1의 균주를 흡광도(OD₆₀₀) 값 0.1 내지 0.3로 맥아즙에 접종하는 단계;
15 ℃ 내지 45 ℃에서 5 내지 30일간 발효시키는 제1 발효 단계; 및
당류을 첨가하여 15 ℃ 내지 45 ℃에서 2 내지 30일간 발효시키는 제 2 발효 단계를 포함하는 주류 제조방법.
청구항 15에 있어서, 상기 주류는 맥주인 것인 방법.
청구항 15에 있어서, 상기 맥아즙은, 맥아를 43 ℃ 내지 47 ℃에서 5 내지 15 분간 숙성하는 제1 숙성 단계;
50 ℃ 내지 55 ℃에서 30 분 내지 50분 간 숙성하는 제2 숙성 단계;
60 ℃ 내지 65 ℃에서 50 분 내지 70분 간 숙성하는 제3 숙성 단계;
75 ℃ 내지 80 ℃에서 5 분 내지 15분 간 숙성하는 제 4 숙성단계; 및
상기 숙성물에 홉을 첨가하고 50 내지 70분간 가열하는 단계를 더 포함하는 방법.
청구항 1의 균주를 이용하여 제조된 주류 조성물.