CN117586895A - 一株适合花果香低醇啤酒发酵的酵母菌株 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一株适合花果香低醇啤酒发酵的酵母菌株，所述菌株为阿氏丝孢酵母菌株(Trichosporon asahii)JNB‑FB‑6，属于生物工程技术领域。所述阿氏丝孢酵母菌株(Trichosporon asahii)JNB‑FB‑6于2022年6月15日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC M 2022890。所述阿氏丝孢酵母具有较好的氮源利用能力，可满足低醇啤酒发酵的要求，且发酵速度较快。与商业低醇酵母相比，阿氏丝孢酵母菌株发酵得到的啤酒中菠萝味、奶香味、成熟水果味等香味较足，香气醇厚，酒体协调，在此基础上，还增加了浆果味。所述阿氏丝孢酵母菌株更适合低酒精度啤酒的发酵，且可加入其他食品饮料的生产中以丰富风味物质增加香气，具有广阔的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及一株适合花果香低醇啤酒发酵的酵母菌株，属于生物工程技术领域。
背景技术
如今，啤酒市场已经接近饱和，虽然啤酒有促进血液循环、增进食欲等功效，但是产品结构单一，已经满足不了市场多样化的需求。近几年，人们对于健康保健的关注不断增强，意识到酒精的负面影响，逐渐开始追求娱乐与休闲。低醇啤酒渐渐走进人们的生活，它们仍具有啤酒的色、香、味及较低的卡路里，但是酒精含量较低，能够大幅度减少酒精带来的危害，符合酒类向低度化发展和饮料向保健型发展的潮流。受到了广大消费者的青睐。在这种社会背景下，世界各大啤酒公司看好低醇啤酒的市场前景，凭借绝对的资金实力及管理实力进入啤酒市场，各大集团更加关注低度啤酒的开发，陆续生产低度啤酒,尤其是东部沿海地区和西南地区，低热量、低醇、低苦味、爽口型的市场占有率越来越高，已经成为市场主流。低醇啤酒越来越受到关注原因主要是：(1)激烈的市场竞争，通过推出新产品迎合消费者，提升竞争力；(2)特殊场合、特殊职业及特殊人群的要求，例如操作机械、运动、司机、妇女儿童等；(3)保健功效，例如减小对肝的刺激、提供维生素、矿物质、多酚或可溶性膳食纤维等一些有价值的化合物等。
野生酵母不同于酿酒酵母，可以分泌β-D-葡萄糖苷酶、β-D-木糖苷酶及α-L-鼠李糖苷酶等，从而形成不同的代谢产物，释放不同的挥发性香气成分。野生酵母的风味物质主要依赖于酶的作用，其中最常见的是β-葡萄糖苷酶。香气化合物存在游离态和结合态两种形态，游离态可以直接挥发产生香气，而结合态水解成为游离态后释放出香气物质。糖苷结合态香气物质由苷元和糖基组成，β-葡萄糖苷酶催化糖苷键，水解形成萜烯类物质。通过水解的方式，野生酵母可以提升风味物质的含量，起到改善风味的作用。野生酵母是芳香物质的主要来源，对酸、醇有不同程度的酯化能力，可以产生醇、醛、酯等多种代谢产物，这些代谢产物是酒体芳香的关键化合物，能够促进酒体丰满。因此，野生酵母能够积极改变酒体的化学成分，对啤酒的品质及感官风味有特别的贡献，可在很大程度上丰富传统酿酒酵母酿制的啤酒的风味，在啤酒生产中应用潜力巨大。野生酵母对啤酒风味的形成有重要影响，不同的酿酒酵母菌株之间，高级醇、酯的生成量差异很大。
在低醇啤酒领域对于啤酒的风味、口感等还有进一步提升的空间，对于低醇啤酒发酵菌株还有更大的需求。
发明内容
针对目前存在的问题，本发明提供了一株阿氏丝孢酵母菌株，此菌株适宜酿造低醇啤酒，且能够产生多种风味物质，酿造的啤酒赋有多种果香，酒体更加馥郁，苹果酸及乳酸含量高，使得啤酒口感浓郁。
本发明的第一个目的是提供一株阿氏丝孢酵母菌株(Trichosporon asahii)JNB-FB-6，已于2022年6月15日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M2022890，保藏地址为中国.武汉.武汉大学。
在一种实施方式中，所述阿氏丝孢酵母菌株包含如下性质：
(1)菌落呈乳白色，中央略突起，边缘不整齐，长绒毛状，菌体呈椭圆或多边形，生长较快；
(2)起酵速度快；
(3)具有较高的产β-葡萄糖苷酶的能力
(4)ITS序列如SEQ ID NO.1所示；
(5)对碳源有较低的利用率；
(6)对氮源有较高的利用率。
在一种实施方式中，所述阿氏丝孢酵母菌株JNB-FB-6适宜酿造低醇啤酒。
本发明的第二个目的是提供一种含有所述阿氏丝孢酵母菌株JNB-FB-6的微生物菌剂。
在一种实施方式中，所述微生物菌剂中阿氏丝孢酵母菌株JNB-FB-6的含量不少于5×108CFU/mL或5×108CFU/g。
在一种实施方式中，所述微生物菌剂的制备方法为：取300～600μL的菌株JNB-FB-6接种于10～50mL YPD液体培养基中，20～30℃下活化2至3代，待菌株JNB-FB-6达到108CFU/mL以上活菌数时，5000～10000r/min下离心10～20min，去除上清液后，在无菌环境下依次加入缓冲液和冻干保护剂，待细胞浓度不低于106CFU/mL时，真空冷冻干燥处理得到固体菌剂。
本发明的第三个目的是提供一种发酵低醇啤酒的方法，所述方法是在啤酒发酵过程中添加所述阿氏丝孢酵母菌株JNB-FB-6进行发酵。
在一种实施方式中，具体步骤为：
(1)将麦汁进行糖化得到糖化液；
(2)将糖化液煮沸并加入啤酒花；
(3)将步骤(2)制备得到的麦汁灭菌后冷却至室温，按6×106CFU/mL的接种量将活化后的阿氏丝孢酵母菌株JNB-FB-6接种于麦汁中在10～30℃下主发酵。
在一种实施方式中，所述步骤(1)中的糖化液制备方法具体为：将6°P麦汁在50℃投料，迅速升温至65～70℃，70～72℃保温35～40min，保温结束后再迅速升温至75～80℃，保温5～10min。
在一种实施方式中，所述步骤(2)的煮沸过程为：将糖化液煮沸后保持沸腾状态60min，分别在煮沸的第0min、30min和50min添加0.2％啤酒花，总共添加0.6％的啤酒花。
在一种实施方式中，将步骤(2)得到的麦汁在105℃灭菌10min进行灭菌。
在一种实施方式中，发酵至二氧化碳失重小于0.1g/mL时，主发酵结束。
在一种实施方式中，所述低醇啤酒中酒精度小于1.5％v/v。
本发明的第四个目的是提供所述含有所述阿氏丝孢酵母菌株JNB-FB-6的微生物菌剂在低醇啤酒酿造中的应用。
本发明的第五个目的是提供所述阿氏丝孢酵母菌株JNB-FB-6或所述微生物菌剂在提升食品、饮品风味物质中的应用。
在一种实施方式中，所述食品、饮品包括由发酵类食品或发酵类饮品。
在一种实施方式中，所述风味物质包括但不限于乙酸异丁酯、丙酸乙酯、癸酸乙酯、乙酸苯乙酯、正己酸乙酯、乙酸乙酯。
本发明的第六个目的是提供所述阿氏丝孢酵母菌或所述微生物制剂在酿酒领域中的应用。
本发明的有益效果：
本发明的阿氏丝孢酵母菌株(Trichosporon asahii)JNB-FB-6与其他非酿酒酵母相比氮源利用能力较好，满足低醇啤酒发酵的要求，且发酵速度较快。将此阿氏丝孢酵母菌株应用于啤酒酿造中，制备得到的啤酒中挥发性风味物质种类丰富、含量高，赋予了啤酒菠萝味、奶香味、成熟水果味、浆果味等多种香味，使得酒体更加馥郁，感官品评得分也较高、风味更好，从多方面大大改善低醇啤酒的品质。对于低醇啤酒品质的提升具有重要意义，且在发酵类食品或饮品风味物质的提升中也具有巨大潜力。
生物材料保藏
阿氏丝孢酵母菌株，分类学命名为阿氏丝芽孢酵母JNB-FB-6 Trichosporonasahii JNB-FB-6；已于2022年6月15日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO:M 2022890，保藏地址为中国.武汉.武汉大学。
附图说明
图1为菌株杜氏小管产气情况；
图2为菌株培养2d碳源利用能力；
图3为菌株培养2d氮源利用能力；
图4和图5为菌株不同温度下的生长情况；
图6为菌落生长形态图；
图7为啤酒感官品评雷达图。
具体实施方式
本发明所采用的菌株主要为商业啤酒酵母LA01、工业啤酒酵母G03、野生酵母12株(6、17、25、32、46、48、51、53、66、78、86、89号)，由实验室保藏。
β-葡萄糖苷酶活测定：从斜面挑取酵母菌种，接种到YPD培养基，28℃、180r/min培养72h后，以10％的接种量将扩培液接种到山楂汁中，28℃、180r/min培养72h，8228×g离心8min后取上清液，制成β取葡萄糖苷酶提取液，用于复筛以及酶学特性研究，4℃条件下保存。将100μL β-葡萄糖苷酶提取液、375μL柠檬酸－磷酸缓冲液(pH 5.0)和125μL 1mmol/L的对硝基苯-β-D-葡萄糖苷(4’nitrophenyl-β-D-glucopyranoside,p-NPG)混合，40℃水浴30min后加入0.5mL 1mol/L Na2CO3终止反应，于400nm处用酶标仪测定反应液的吸光值。β-葡萄糖苷酶活性单位(U)定义为：40℃、pH 5.0条件下1min内催化生成1μmol对硝基苯酚所要的酶量。
YPD培养基(g/L)：葡萄糖20.0，蛋白胨20.0，酵母粉10.2。
碳源利用能力评价用培养基：YNB培养基6.7mg/mL，选择添加8％葡萄糖或8％麦芽糖或8％果糖或8％蔗糖或5％甘油为碳源。
氮源利用能力评价用培养基：YNB培养基6.7mg/mL，5％葡萄糖，选择添加8％胰蛋白胨或8％硫酸铵或8％氯化铵。
啤酒发酵培养基：啤酒酿造选用麦汁，麦芽粉碎后在70-72℃糖化40min，糖化结束后加酒花煮沸1小时，酒花添加量为0.03％，根据需求调节糖度为5-6°P。
提取活化好的12株酵母菌株的基因组DNA，用酵母ITS通用引物ITS1(TCCGTAGGTGAACCTGCGG)、ITS4(TCCTCCGCTTATTGATATGC)扩增目的基因。PCR产物经1.0％琼脂糖凝胶电泳检测后进行测序分析(天霖生物科技有限公司)。测序结果在GenBank中进行BLAST比对。
PCR工作条件：94℃预变性5min，94℃变性45s，55℃退火40s，72℃延伸60s，35个循环；72℃延伸10min。
有机酸具体测定步骤为：取适量啤酒样品于8000r/min离心6min，取上清液10mL，用0.45μm滤膜进行过滤，经过C18小柱过滤后，上机待测。工作条件：有机酸含量检测中色谱柱型号为Waters X select HSS T3(4.6mm×250mm)，紫外检测器型号为Waters 1525HPLC，检测波长为206nm。磷酸二氢钾缓冲液为流动相，浓度为0.02mol/L，流动相流速为0.5mL/min，pH为2.5，柱温设置为40℃。
实施例1：低醇啤酒发酵酵母的性能及筛选
(1)β-葡萄糖苷酶活性进行测定
将12株酵母菌株分别活化后，按1％接种量接种于YPD培养基中培养24h，培养结束后测定发酵液中β-葡萄糖苷酶活性，结果如表1所示：48号菌的酶活性最高，6号菌的β-葡萄糖苷酶活性次之，该菌株也具有较好的产香能力。综合各株菌的β-葡萄糖苷酶活性，高于3mU/mL的有6、17、48、51号四个菌株。
表1.酵母菌株的同源性及其β-葡萄糖苷酶活性
(2)酵母发酵温度及产气情况
温度是影响酵母生长的重要因素，酵母代谢会产生CO2等物质。通过杜氏小管对12株酵母菌株温度的耐受性进行了测定，筛选得到适合酵母发酵的温度。
结果如表2和图1所示：
在4℃的条件下，除48号菌株轻微产气，其余菌株均不产气；
在10℃的条件下，6、17、32、46、48、51、53号菌株在48h内产气充满杜氏小管，而其余菌株均不能产气；
在16℃的条件下，所有菌株在48h内产气充满杜氏小管；
在20℃的条件下，除66号菌株产气较少，其余菌株在24h内产气充满杜氏小管；
在25℃的条件下，除66号菌株不能产气，其余菌株在24h内产气充满杜氏小管；
在28℃的条件下，17、25、32、46、48、53、66号菌株在24h内产气充满杜氏小管，而其余菌株均不能产气；
在37℃的条件下，25、46、48、53号菌株在24h内产气充满杜氏小管，32号菌株轻微产气，而其余菌株均不能产气。
因此，16-20℃的温度条件适合12株野生菌株发酵产气，过高与过低的温度都会影响菌株的产气情况。
表2.菌株产气情况分类图
注：“-”为不产气，“+”为产气高度小于1/2，“++”为产气高度大于1/2，“+++”为产气充满杜氏小管。
通过平板划线对12株野生酵母菌株温度的耐受性进行了测定，观察生长情况。结果如表3和表4所示。在4℃和10℃的条件下，所有菌株均不生长；在37℃的条件下，25、46、48、51、53在24h内生长，而其余菌株均不生长；在16℃的条件下，所有菌株均在48h内生长，生长较为缓慢；在20℃、25℃和28℃的条件下，所有菌株均在24h内生长，其中在28℃的条件下菌株生长过于激烈。综上所述，20-25℃的温度条件比较适合野生菌株生长。
结合产气情况与生长情况，确定酵母的最适发酵温度为20-25℃。
(3)酵母对碳源的利用能力
糖类物质是酵母生长繁殖的基础物质，为微生物的生长提供碳源影响物质。同样，糖类物质也是生产酒精的重要底物，不同酵母的碳源利用率千差万别，测定12株野生酵母于5种不同碳源培养基中的碳源利用能力，将活化后的菌株接种于含有不同碳源的YNB培养基中，接种量为1％，28℃条件培养48h，培养后测定培养基中剩余的碳源含量，取200μL上清液，加入1mL 2mol/L HCl，100℃煮沸30min，加入1mL 2mol/L NaOH终止反应，用Glucoseoxidase assay kit测定反应液中的葡萄糖含量，计算各菌株的碳源利用能力，结果如图2所示。
由图2可知，在5种不同碳源培养基的培养条件下，各个菌株对葡萄糖利用能力最好，利用能力均超过30％，其次是果糖与蔗糖。不同菌株对同一碳源的利用能力相差较大。6、48号菌株对果糖的利用能力较差，小于10％，低于平均值。6、51、86号菌株对蔗糖的利用能力较差，小于10％，低于平均值。所有菌株对甘油的利用能力都不足10％，基本不利用乳糖和可溶性淀粉。
麦汁中主要可发酵糖为葡萄糖、蔗糖和果糖，6、32、51、53、86号菌株对各个碳源利用能力较差，即对麦汁中的碳源利用率相对较低，所产的酒精量相对也少。
(4)酵母对氮源的利用能力
含氮物质是酵母发酵必需的氮源，与酵母的繁殖密切相关，很大程度影响啤酒的发酵。将活化后的菌株接种于含有不同氮源的YNB培养基中，接种量为1％(v/v)，28℃条件培养48h，测定12株野生酵母于5种不同氮源培养基中的发酵液吸光度，侧面反映酵母的氮源利用能力，结果如图3所示。
由图3可知，在5种不同碳源培养基的培养条件下，各个菌株对胰蛋白胨利用能力最好，OD600均超过8。其次是硫酸铵，除66号菌株，其余菌株OD600均超过3。关于对氯化铵的利用能力，除48号菌株，其余各个菌株OD600在1.5-3之间。
综上所示，6、17、25、51、53、78号菌株对各个氮源都有较好的利用能力。
实施例2：酵母的分子学鉴定和菌落形态
(1)分子学鉴定
提取活化好的12株酵母菌株的基因组DNA，用酵母ITS通用引物ITS1(TCCGTAGGTGAACCTGCGG)、ITS4(TCCTCCGCTTATTGATATGC)扩增目的基因。将PCR产物经1.0％琼脂糖凝胶电泳检测后进行测序分析(天霖生物科技有限公司)。测序结果在GenBank中进行BLAST比对，结果如表3所示。
表3.酵母菌株的同源性
注：“/”为未知。
(2)菌落形态
观察不同稀释梯度菌株在YPD平板上于28℃的条件下恒温培养48h的生长情况，共6个梯度，依次为原浓、10-1、10-3、10-4、10-5、10-6，生长形态如图6所示，所有12株菌株都具有典型的酵母的菌落形态。
对不同菌株进行归类分析，结合平板菌落形态及文献中对该菌株的形态描述，归纳结果如下(表4)。
表4.菌株生长形态
注：“/”为未知。
实施例3：啤酒的发酵及相关指标分析
根据实施例1～2的结果，选择6、17、32、53、66号菌株进行后续啤酒发酵试验。
啤酒发酵步骤为：
制备6°P麦汁，糖化工艺：在50℃投料，迅速升温至70℃，70-72℃保温40min，保温结束后再迅速升温至78℃，保温10min。
煮沸工艺：煮沸时间60min，酒花添加量为0.6％，分3次投入酒花，分别在煮沸0min时、煮沸30min时以及煮沸50min时。
将制备好的麦汁在105℃灭菌10min，后冷却至室温待用。按6×106CFU/mL的接种量将活化后的酵母接种于麦汁中，于20℃培养箱中进行发酵，每天跟踪二氧化碳失重变化，直到失重小于0.1g/mL，主发酵结束，测定发酵参数。发酵体系为300mL。
主酵结束后测定各个酒样的发酵指标，使用啤酒分析仪(安东帕上海商贸有限公司)进行测定发酵液的酒精含量、真实发酵度、真浓、表观发酵度。
双乙酰含量指标检测方法参见GB4928-2008。
乙醛测定方法如下：取适量样品于8000r/min离心6min，取4mL上清液。向顶空进样瓶中依次加入4mL啤酒样品、1.8g氯化钠以及1mL内标工作溶液3-庚酮，盖好橡胶塞，用压盖器将铝帽密封于顶空瓶口，用顶空气相色谱法测量。通过对比乙醛标准样品的峰面积与内标峰面积，半定量分析乙醛的含量。
结果如图表5所示。
表5.啤酒的发酵相关指标测定
注：同一列中不同字母表示显著差异(p<0.05)。
主酵结束时，以LA01为对照，32号菌株相关发酵指标与之接近，酒精含量在0.4％v/v以下，真发酵度在15％以下，真浓在3.5％w/w以上，表观发酵度在20％w/w以下。6、17、53、66号菌株发酵程度相较较高，酒精含量在1％v/v以上，真发酵度在40％以上，真浓在2.5％w/w以下，表观发酵度在50％w/w以上。所有菌株都满足酒精度小于1.5％v/v的条件，符合发酵低醇啤酒的条件。
双乙酰是啤酒发酵过程中酵母的代谢副产物，是啤酒的重要理化指标，可以衡量啤酒是否成熟。同时，双乙酰也是主要的生青味物质，α-乙酰乳酸分解不完全可能会造成双乙酰含量较高，带来强烈刺激性和不愉快的饭馊味，成熟啤酒的双乙酰的标准值应该控制在0.1g/mL以内，超过正常范围的双乙酰会严重影响啤酒的品质。主酵结束时，所有啤酒样品双乙酰含量都在0.1g/mL的范围内，啤酒样品均已成熟，且没有不良风味。
乙醛是在丙酮酸脱氢酶的作用下由丙酮酸不可逆所形成，是啤酒中含量最高的醛类物质，有强烈刺激感和辛辣味，是啤酒中生青味、青苹果味的主要来源，过高的乙醛含量赋予啤酒不纯正、不协调的口味和气味，严重影响了啤酒风味的稳定性。成熟啤酒的乙醛含量应该控制在10mg/L以内。当乙醛含量超过此值时，啤酒会给人一种不愉快的粗糙苦味感觉。乙醛含量高，其它醛类含量也相对高，是导致成品酒存放后呈现老化味等异味的主要原因之一。从另一方面来讲，在饮料中特别是乳制品饮料中，适量的乙醛也是重要的风味物质，其能够带来黄油味等香气，使乳制品风味更加饱满。主酵结束时，LA01及6号菌株乙醛含量近似，在2.15mg/L左右，其余菌株含量较低，在0.05-0.20mg/L之间。由于啤酒中较低的酒精含量，会影响酒体的醇厚感，适量存在的乙醛能够增加酒体的饱满性和醇厚感。综上所述，6号菌株双乙酰小于0.1g/mL，适量存在乙醛，优于其他5株酵母菌株。
实施例4：啤酒的挥发性风味物质分析
啤酒啤酒中的挥发性风味成分，包括醇类、酯类、酸类、醛类化合物等。酯类及醇类为啤酒中含量较高的两种风味化合物，含量高达总挥发性香气物质的80％。醇类物质使啤酒具有丰满的香味、醇厚的口感和协调的风味，但是过量高级醇的存在导致啤酒产生不协调的异杂味，容易使人“上头”，甚至会带来身体的不适，通常高级醇类总水平应该小于90-110g/mL，其中异戊醇更应该控制在45g/mL以内。酯类物质是影响啤酒风味的重要成分之一，大多数酯类主要表现为水果香，影响啤酒风味的主要酯类物质有乙酸乙酯、乙酸异戊酯、丁酸乙酯等。适量的酯类物质能够改善啤酒风味，但是过量脂类物质的存在会导致啤酒产生不愉快的异味，通常挥发酯类总水平应该控制在25-50mg/L。在醛类物质中，乙醛含量最高，乙醛会赋予啤酒不协调的口味和气味，因此，啤酒中醛类应该在5-10g/mL，避免醛类物质导致啤酒风味老化。酸类物质也是啤酒重要的呈味物质之一，适量的酸可以赋予啤酒柔和清爽的口感。为了啤酒的风味协调，各个风味物质不能太过于突出。
将实施例3中制备得到的啤酒通过GC-MS对啤酒样品中的挥发性化合物进行分析，结果如表6所示。
由表6可知，通过GC-MS检测分析，共检测出挥发性香气物质90余种，主要是以下50种，可大致被分为醇类、酯类、酸类、酮醛类及萜烯类。
啤酒样品中，辛酸乙酯(苹果味、酸甜味)、癸酸乙酯(肥皂味、水果味)、乙酸乙酯(果香味)、α-石竹烯(木香、柑橘香)等含量较高，最高含量分别为363.1μg/mL、423.2μg/mL、114.26μg/mL以及13.38μg/mL。相较于啤酒酵母LA01所酿造的啤酒，野生酵母代谢新增许多风味物质，例如：乙酸异丁酯(成熟水果味)，含量为0.5μg/mL；丙酸乙酯(菠萝、奶油味)，含量为3μg/mL。除了新增物质，原有的风味物质得到显著提升，其中癸酸乙酯(梨、白兰地味)增加了15-20倍，最高含量可达400μg/mL；乙酸苯乙酯(玫瑰、苹果味)10-20倍，最高含量可达65μg/mL；正己酸乙酯(菠萝、香蕉味)15-30倍，最高含量可达60μg/mL；乙酸乙酯(香甜味)30-40倍，最高含量可达110μg/mL。
综上所述，6、17、66号菌株发酵所得的啤酒风味物质多样且含量较高，赋予了啤酒多种果香，使得酒体更加馥郁。
表6啤酒中香气化合物的含量
注：“/”为未监测到，同一列中不同字母表示显著差异(p<0.05)。
实施例5：啤酒的有机酸含量测定
酸类物质是啤酒的主要风味之一，适量的酸可以赋予啤酒柔和清爽的口感。过少的酸会导致啤酒尝起来迟钝、粘稠，而过多的酸又会导致啤酒口感粗糙、不协调。同时，酸是啤酒中重要的缓冲物质，酸含量会影响pH值的变化和各种酶的作用。
酸类物质可以分为有机酸与无机酸两大类，无机酸主要指盐酸、磷酸、乳酸、碳酸等，而有机酸又可以分为挥发性有机酸与非挥发性有机酸两大类。非挥发性酸包括柠檬酸、乳酸、苹果酸等，而挥发性酸包括丁酸、乙酸、丙酸等。有机酸主要来源于啤酒酿造原料和啤酒发酵过程的酵母代谢作用，是啤酒中主要的呈味物质，不同的有机酸具有不同的风味，例如：苹果酸具有苦涩酸味，其风味阈值为87mg/L；乳酸具有尖利酸味，其风味阈值为47mg/L；乙酸具有刺激性酸味，其风味阈值为100mg/L；柠檬酸具有温和酸味，其风味阈值为350mg/L；丁酸具有奶酪味，其风味阈值为2.5mg/L。
同时，有机酸的存在可以放防止受微生物污染，丙酮酸常被用于抑制微生物。有机酸的缓冲作用还能够延长啤酒的货架期。
对实施例2中得到的啤酒样品进行有机酸检测，主要是以下8种：苹果酸、乳酸、乙酸、柠檬酸、丁二酸、富马酸、丙酸及丁酸。
结果表7所示。由表可知，不同酵母菌组在有机酸的代谢上差别很大。6号菌株苹果酸含量较高，达到2.20mg/mL，其次是丁二酸，以LA01为对照，乳酸减少了3倍，丁酸减少了3倍，柠檬酸减少了10倍，丁二酸提高了10倍，丙酸减少了三倍。17号菌株柠檬酸及丙酸含量较高，达到2mg/mL，其次是乳酸以及丁二酸，以LA01为对照，苹果酸减少了20倍，乳酸减少了3倍，丁二酸提高了5倍，丁酸减少了3倍。32号菌株丙酸含量较高，达到2.14mg/mL，其次是柠檬酸、丁二酸，以LA01为对照，苹果酸减少了15倍，乳酸减少了4倍，丁二酸提高了10倍，丁酸减少了10倍。53号菌株丁二酸含量较高，达到1.32mg/mL，其次是丙酸，以LA01为对照，苹果酸减少了10倍，乳酸减少了3倍，乙酸提高了2倍，柠檬酸减少了3倍，丁二酸提高了10倍，丙酸减少了2倍。66号菌株柠檬酸含量最高，达到2.58mg/mL，其次是丙酸，以LA01为对照，苹果酸减少了10倍，乳酸减少了4倍，柠檬酸提高了2倍，丁二酸提高了10倍，富马酸增加了2倍。综上所述，在8种有机酸中，富马酸及丁酸会带来不良刺激性气味，含量应该越低越好，53、66号菌株其含量相对过高，推测产生不良风味物质。乙酸及富马酸含量较为相似，差异不大，其中挥发酸以丙酸为主。
除6号菌株，其余酵母菌株苹果酸及乳酸大大降低，侧面反映出乳酸脱氢酶及苹果酸脱氢酶活性的降低。酵母利用丙酮酸发生歧化反应得到乳酸，通常产生于发酵后期，酵母酵母缓慢，导致乳酸含量的降低，导致风味寡淡。综上所述，6号菌株发酵而成的啤酒口感浓郁，不会平淡。
表7啤酒中有机酸种类及含量
注：同一列中不同字母表示显著差异(p<0.05)。
实施例6：啤酒的感官品评
对实施例2中得到的啤酒样品进行感官品评，感官品评结果如表8所示(显示不同啤酒在不同方面的平均得分)，表8所示(0-8分，强度越高则分值越大)。
表8感官得分
从感官品评的描述结果来看，在色泽和起泡性上，6种啤酒样品区别不大，主要差异体现在香气、风味和典型性上。与商业低醇酵母相比，6、17号菌株菠萝味、奶香味、成熟水果味等，香气醇厚，酒体协调，在此基础上，6号菌株还增加了浆果味。53、66号菌株存在异味，酒体不协调，而32号菌株有不良香气。综上所述，6号菌株发酵而成的啤酒风味更优。
实施例7：含有菌株JNB-FB-6的微生物菌剂的制备
取400μL的菌株JNB-FB-6接种于20mL YPD液体培养基中，28℃下活化2至3代，待菌株JNB-FB-6达到108CFU/mL以上活菌数时，5000～10000r/min下离心10～20min，去除上清液后，在无菌环境下依次加入缓冲液和冻干保护剂，待细胞浓度不低于106CFU/mL时，真空冷冻干燥处理得到固体菌剂。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
Claims (10)
1.一株阿氏丝孢酵母菌(Trichosporon asahii)，已于2022年6月15日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M 2022890。
2.含有权利要求1所述的阿氏丝孢酵母菌株的微生物菌剂。
3.根据权利要求2所述的微生物菌剂，其特征在于，所述微生物菌剂为固体菌剂或液体菌剂。
4.一种生产低醇啤酒的方法，其特征在于，所述方法是在啤酒发酵过程中添加权利要求1所述的阿氏丝孢酵母菌株JNB-FB-6或权利要求2或3所述的微生物制剂进行主发酵。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述方法具体步骤为：
(1)将麦汁进行糖化得到糖化液；
(2)将糖化液煮沸并加入啤酒花；
(3)将步骤(2)制备得到的麦汁灭菌后冷却至室温，将活化后的阿氏丝孢酵母菌株接种于麦汁中在10～30℃下主发酵。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述步骤(3)按不少于5×106CFU/mL的接种量。
7.根据权利要求5或6所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)为：将糖化液煮沸后保持沸腾状态60min，并分别在煮沸的第0min、30min和50min添加0.1～0.3％(w/v)啤酒花，总共添加0.3％～0.9％(w/v)的啤酒花。
8.根据权利要求5～7任一所述的方法，其特征在于，发酵至二氧化碳失重小于0.1g/mL时，主发酵结束。
9.权利要求1所述阿氏丝孢酵母菌或权利要求2或3所述微生物制剂在增加食品或饮品风味中的应用。
10.权利要求1所述阿氏丝孢酵母菌或权利要求2或3所述微生物制剂在酿酒领域中的应用。
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