KR101207123B1 - 변형된 인간 성장 호르몬 폴리펩티드 및 이의 용도 - Google Patents

변형된 인간 성장 호르몬 폴리펩티드 및 이의 용도 Download PDF

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리차드 디마치
안나-마리아 에이. 헤이스 푸트남
트로이 윌슨
비-쳉 심
데이비드 리츠징거
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암브룩스, 인코포레이티드
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Abstract

변형된 인간 성장 호르몬 폴리펩티드 및 이의 용도가 제공된다.

Description

변형된 인간 성장 호르몬 폴리펩티드 및 이의 용도{MODIFIED HUMAN GROWTH HORMONE POLYPEPTIDES AND THEIR USES}
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2004년 2월 2일 출원된 미국 가출원 60/541,528, 2004년 6월 18일 출원된 미국 가출원 60/581,314, 2004년 6월 18일 출원된 미국 가출원 60/581, 175, 2004년 6월 18일 출원된 미국 가출원 60/580,885 및 2004년 12월 22일 출원된 미국 가출원 60/638,616에 대한 우선권을 주장하며, 위 문헌들의 명세서는 본 명세서에 그 전문이 인용된다.
본 발명은 하나 이상의 비-천연적으로 코딩된 아미노산으로 변형된 성장 호르몬 폴리펩티드에 관한 것이다.
성장 호르몬 (GH) 수퍼유전자 (supergene) 패밀리 (문헌[Bazan, F. Immunology Today 11: 350-354 (1991); Mott, H. R. and Campbell, I. D. Current Opinion in Structural Biology 5: 114-121 (1995); Silvemloinen, O. and Thule, J. N. (1996) SIGNALING BY THE HEMATOPOIETIC CYTOKINE RECEPTORS] 참조)은 유사한 구조적 특징을 갖는 한 단백질 집합을 나타낸다. 이러한 단백질 패밀리의 각 구성원은 그 일반적 구조가 도 1에 도시된 4 개의 나선 다발을 포함한다. 상기 패밀 리의 구성원 중에는 아직 밝혀져야 할 구성원들이 훨씬 더 많지만, 상기 패밀리의 일부 구성원은 다음을 포함한다: 성장 호르몬, 프로락틴 (prolactin), 태반 락토겐 (placental lactogen), 에리트로포이에틴 (erythropoietin; EPO), 트롬보포이에틴 (thrombopoietin; TPO), 인터루킨-2 (IL-2), IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12 (p35 서브유닛 (subunit)), IL-13, IL-15, 온코스타틴 (oncostatin) M, 섬모 신경영양 인자 (ciliary neurotrophic factor), 백혈병 억제 인자, 알파 인터페론, 베타 인터페론, 감마 인터페론, 오메가 인터페론, 타우 인터페론, 엡실론 인터페론, 과립구-콜로니 자극 인자 (granulocyte-colony stimulating factor; G-CSF), 과립구-마크로파지 콜로니 자극 인자 (granulocyte-macrophage colony stimulating factor; GM-CSF), 마크로파지 콜로니 자극 인자 (M-CSF) 및 카디오트로핀-1 (cardiotrophin-1; CT-1) ("GH 수퍼유전자 패밀리"). 일반적으로, GH 수퍼유전자 패밀리의 구성원은 아미노산 또는 DNA 서열 동일성이 제한되어 있다는 사실에도 불구하고 유사한 2차 구조 및 3차 구조를 갖는다. 이러한 공유되는 구조적 특징으로 인해 상기 유전자 패밀리의 신규한 구성원을 용이하게 동정할 수 있다. 패밀리 구성원 hGH, EPO, IFNα-2 및 G-CSF의 일반적 구조는 도 2, 3, 4 및 5에 각각 도시되어 있다.
GH 수퍼유전자 패밀리 중 한 구성원은 인간 성장 호르몬 (hGH)이다. 인간 성장 호르몬은 정상 인간 성장 및 발현의 조절에 많이 참여하고 있다. 이러한 자연 발생 단일 사슬 뇌하수체 호르몬은 191 개의 아미노산 잔기로 이루어져 있고, 대략 22 kDa의 분자량을 갖는다. hGH는 선형 성장 (체인성 (somatogenesis)), 수유, 마 크로파지의 활성화 및 인슐린 유사 효과 및 당뇨병 유발 효과 등을 비롯한 다수의 생물학적 효과를 나타낸다 (문헌[Chawla, R., et al., Ann. Rev. Med. 34: 519-547 (1983); Isaksson, O., et al., Ann. Rev. Pltysiol., 47: 483-499 (1985); Hughes, J. and Friese, H., Ann. Rev. Physiol., 47: 469-482 (1985)] 참조).
hGH의 구조는 공지되어 있고 (문헌[Goeddel, D., et al., Nature 281: 544-548 (1979)] 참조), hGH의 3차원 구조는 x선 결정학에 의해 해석되었다 (문헌[de Vos, A., et al., Science 255: 306-312 (1992)] 참조). 단백질은 루프에 의해 결합된, N-말단으로부터 출발하여 A-D로 명명되는 4 개의 양친매성 알파 나선 다발을 포함하는 치밀한 구형 구조를 갖는다. 또한, hGH는 분자 내 두 개의 디술피드 결합 (disulfide bond) (C53은 C165와 짝을 이루고, C182는 C189와 짝을 이룸)에 참여하는 4 개의 시스테인 잔기를 함유한다. 이 호르몬은 글리코실화 (glycosylation)되지 않고, 대장균에서 분비된 형태로 발현되었다 (문헌[Chang, C., et al., Gene 55: 189-196 (1987)] 참조).
hGH의 다수의 천연 발생 돌연변이체가 동정되었다. 이들은 hGH-V (본 명세서에 참고 문헌으로 인용되는 문헌[Seeberg, DNA 1: 239 (1982)], 미국 특허 제 4,446,235호, 제 4,670,393호 및 제 4,665,180호 참조) 및 hGH의 잔기 32-46이 결실된 20-kD hGH (문헌[Kostyo et al., Biochem. Biop1lys. Acta 925: 314 (1987); Lewis, U., et al., J. Biol. Chem., 253: 2679-2687 (1978)] 참조)를 포함한다. 또한, 전사 후 과정, 번역 후 과정, 분비 과정, 대사 과정 및 다른 생리학적 과정으로부터 발생하는 다수의 hGH 변이체들이 보고되었다 (문헌[Baumann, G., Endocrine Reviews 12: 424 (1991)] 참조).
hGH의 생물학적 효과는 특이적 세포 수용체와의 상호작용으로부터 유도된다. 이 호르몬은 태반 락토겐 및 프로락틴을 포함하는 동족 단백질 패밀리의 구성원이다. 그러나, hGH는 광범위한 종 특이성을 나타내고 클로닝된 체인성 수용체 (문헌[Leung, D., et al., Nature 330: 537-543 (1987)] 참조) 또는 프로락틴 (문헌[Boutin, J., et al., Cell 53; 69-77 (1988)] 참조) 수용체에 결합한다는 점에서 상기 패밀리 구성원들 중에서도 특이하다. 구조적 및 생화학적 연구를 토대로, 젖분비자극 (lactogenic) 및 체인성 결합 도메인에 대한 기능 지도가 제안되었다 (문헌[Cunningham, B. and Wells, J., Proc. Natl. Acad. Sci. 88: 3407 (1991)] 참조). hGH 수용체는 몇몇 다른 성장 인자 수용체, 예를 들면 인터루킨 (IL)-3, IL-4 및 IL-6 수용체, 과립구 마크로파지 콜로니-자극 인자 (GM-CSF) 수용체, 에리트로포이에틴 (EPO) 수용체, 뿐만 아니라 G-CSF 수용체를 포함하는 혈액생성 (hematopoietic)/시토킨/성장 인자 수용체 패밀리의 구성원이다. 문헌[Bazan, Proc. Natl. Acad. Sci USA 87: 6934-6938 (1990)]을 참조할 수 있다. 시토킨 수용체 패밀리의 구성원은 막횡단 영역 바로 밖에 위치한 트립토판-세린-X-트립토판-세린 모티프 및 4 개의 보존된 시스테인 잔기를 함유한다. 이러한 보존된 서열은 단백질-단백질 상호작용에 관여하는 것으로 생각된다. 예를 들면, 문헌[Chiba et al., Biochim. Biophys. Res. Comm. 184: 485-490 (1992)]을 참조할 수 있다. hGH와 그의 수용체의 세포 외 도메인 (hGHbp) 사이의 상호작용은 가장 충분히 이해되고 있는 호르몬-수용체 상호작용 중 하나이다. 고 해상도 X선 결정학 데이터 (문 헌[Cunningham, B., et al., Science, 254: 821-825 (1991)] 참조)는 hGH가 2 개의 수용체 결합 부위를 갖고, 별개의 부위들을 사용하여 분자 상에 두 개의 수용체 분자를 순차적으로 결합시킨다는 것을 밝혀내었다. 두 개의 수용체 결합 부위는 사이트 (Site) I 및 사이트 II로 지칭된다. 사이트 I은 나선 D의 카르복시 말단 종결부 및 A-B 루프 및 나선 A의 일부를 포함하는 한편, 사이트 II는 나선 A의 아미노 말단 영역 및 나선 C의 부분을 포함한다. GH의 그의 수용체에 대한 결합은 순차적으로 일어나며, 사이트 I 결합이 먼저 일어난다. 그 다음, 사이트 II는 제2 GH 수용체를 끌어들여 수용체를 이량체화하고, 호르몬에 대한 세포 반응을 일으키는 세포 내 신호 전달 경로를 활성화시킨다. G120R 치환이 사이트 II로 도입된 hGH 뮤테인 (mutein)은 단일 hGH 수용체에 결합할 수 있지만, 2 개의 수용체를 이량체화할 수 없다. 생각컨대, 뮤테인은 세포 내 신호 전달 경로를 활성화시키지 않고 수용체 부위를 차지함으로써 시험관 내 hGH 길항제로서 작용한다 (문헌[Fuh, G., et al., Science 256: 1677-1680 (1992)] 참조).
재조합 hGH는 치료제로 사용되고, 다수의 적응증의 치료에 승인되었다. hGH 결핍은 왜소증을 유발하며, 예를 들면, 이는 10 년 넘게 호르몬을 외인성 투여함으로써 성공적으로 치료되었다. 또한, hGH는 hGH 결핍 외에도 신부전 (아동), 터너 증후군, 및 AIDS 환자의 악액질 치료에 승인되었다. 최근, 식약청 (Food and Drug Administration; FDA)은 hGH를 비-GH-의존성 저신장 치료에 승인하였다. 또한, 현재, hGH는 노화, 노인의 쇠약, 단장 증후군 및 울혈성 심부전의 치료용으로 조사 중이다.
현재, 시장에서 재조합 hGH는 매일 주사가능한 제품으로서 판매되고 있으며, 5 가지 주요 제품은 다음과 같다: 휴마트로프 (Humatrope)TM (일라이 릴리 앤드 캄파니 (Eli Lilly & Co.)), 뉴트로핀 (Nutropin)TM (제넨테크 (Genentech)), 노르디트로핀 (Norditropin)TM (노보-노르디스크 (Novo-Nordisk)), 제노트로핀 (Genotropin)TM (화이자 (Pfizer)) 및 사이젠/세로스팀 (Saizen/Serostim)TM (세로노 (Serono)). 그러나, 성장 호르몬을 치료제로 사용하는 데 있어서 큰 어려움은, 단백질이 짧은 생체 내 반감기를 갖기 때문에, 최대 유효성을 위해서는 이를 매일 피하 주사해야 한다는 점이다 (문헌[MacGillivray, et al., J Cliva. Endocrinol. Metab. 81: 1806-1809 (1996)] 참조). 생산 비용을 낮추고, 환자에 대한 투여를 용이하게 하고, 효능 및 안정성 프로파일을 개선하고, 경쟁력 있는 이점을 제공하는 다른 성질을 생성함으로써 hGH 아고니스트 및 길항제의 투여를 개선하는 수단을 개발하기 위한 많은 노력이 집중되고 있다. 예를 들면, 종래, 제넨테크 및 알컴스 (Alkermes)는 소아 성장 호르몬 결핍용 hGH에 대한 데포 (depot) 제제인 뉴트로핀 데포 (Nutropin Depot)TM를 판매하였다. 이러한 데포는 투여 빈도를 낮추었지만 (일일 1 회가 아닌 2-3 주마다 1 회), 또한, 생체이용률 감소 및 주사 부위에서의 통증과 같은 바람직하지 못한 부작용이 연루되어, 2004년 시장에서 철수되었다. 또한, 또 다른 제품인 페그비소만트 (Pegvisomant)TM (화이자)는 최근 FDA에 의해 승 인을 받았다. 페그비소만트TM는 선단 비대증 치료에 처방되는 높은 선택성의 성장 호르몬 수용체 길항제로서 기능하는 hGH의 유전자 조작된 유사체이다 (문헌[van der Lely, et al., The Lancet 358: 1754-1759 (2001)] 참조). 비록 페그비소만트TM의 몇몇 아미노산 측쇄 잔기는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 중합체를 사용하여 유도체화되지만, 이 제품은 여전히 일일 1 회 투여되기 때문에, 이는 제약상 성질이 최적화되지 않음을 시사한다. PEG화 (PEGylation) 및 데포 제제 외에, hGH의 흡입 및 경구 투여 형태를 비롯한 다른 투여 경로들이 임상 전 조기 단계 및 임상 개발 중에 있지만, 어떠한 것도 아직 FDA로부터 승인을 받은 것이 없다. 따라서, 성장 호르몬 활성을 나타내면서도 또한 긴 혈청 반감기를 제공하여, 더욱 최적의 치료 수준을 갖는 hGH 및 증가된 치료 반감기를 나타내는 폴리펩티드에 대한 수요가 존재한다.
친수성 중합체 폴리(에틸렌 글리콜) (PEG로 약칭됨)을 공유 부착시키는 것은 수 용해도를 증가시키거나, 생체이용률을 증가시키거나, 혈청 반감기를 증가시키거나, 치료적 반감기를 증가시키거나, 면역원성을 조절하거나, 생물학적 활성을 조절하거나 또는 단백질, 펩티드 및 특히 소수성 분자를 비롯한 많은 생물 활성 분자의 순환 시간을 연장시키는 방법이다. PEG는 약제, 인공 이식물, 및 생체적합성, 독성 결여 및 면역원성 결여가 중요한 다른 적용분야에 광범위하게 사용되었다. PEG의 원하는 성질을 최대화시키기 위해서는, 생물 활성 분자에 부착된 PEG 중합체(들)의 총 분자량 및 수화 상태가 모 분자의 생체활성에 악영향을 미치지 않으면서 전형적 으로 PEG 중합체 부착과 관련된 유리한 특징, 예를 들면 수 용해도 및 순환 반감기 증가를 제공하도록 충분히 높아야 한다.
흔히, PEG 유도체는 화학 반응성 작용기, 예를 들면 리신, 시스테인 및 히스티딘 잔기, N-말단 및 탄수화물 부분(moiety)을 통해 생물 활성 분자에 결합된다. 종종, 단백질 및 다른 분자는 중합체 부착에 이용가능한 제한된 수의 반응성 부위를 갖는다. 종종, 중합체 부착을 통한 변형에 가장 적합한 부위는 수용체 결합에 중요한 역할을 수행하고, 분자의 생물학적 활성의 보유에 필요하다. 그 결과, 중합체 사슬의 생물 활성 분자 상의 이러한 반응성 부위에 대한 무차별적인 부착은 종종 중합체-변형된 분자의 생물학적 활성을 현저하게 감소시키거나 또는 심지어 전체의 손실을 유발시킨다. 문헌[R. Clark et al., (1996), J. Biol. Chem., 271: 21969-21977]을 참조할 수 있다. 원하는 이점을 표적 분자에 제공하는 충분한 중합체 분자량을 갖는 컨쥬게이션물을 형성하기 위해, 선행 기술 접근은 전형적으로 다수의 중합체 아암 (arm)을 분자에 랜덤하게 부착시킴으로써 모 분자의 생체활성이 감소될 위험을 증가시키거나 또는 심지어 모 분자의 생체활성을 전체적으로 손실시켰다.
단백질에 PEG 유도체 부착을 위한 유전자자리를 형성하는 반응성 부위는 단백질의 구조에 의해 지시된다. 효소를 비롯한 단백질은 일반적 구조 H2N--CHR--COOH를 갖는 알파-아미노산의 다양한 서열로 구성된다. 한 아미노산의 알파 아미노 잔기 (H2N--)는 인접 아미노산의 카르복실 부분 (--COOH)에 결합되어 아미드 결합을 형성하고, 이는 -(NH-CHR-CO)n-(여기서, 아래 첨자 "n"은 수백 또는 수천일 수 있음)로 나타낼 수 있다. R에 의해 나타낸 단편은 단백질 생물학적 활성 및 PEG 유도체의 부착을 위한 반응성 부위를 함유할 수 있다.
예를 들면, 아미노산 리신의 경우, 엡실론 위치, 뿐만 아니라 알파 위치에 --NH2 부분이 존재한다. 엡실론 --NH2는 염기성 pH 조건 하에서 자유롭게 반응한다. PEG를 사용한 단백질 유도체화 분야에서 많은 기술들은 단백질 중에 존재하는 리신 잔기의 엡실론--NH2 잔기에 부착하기 위한 PEG 유도체를 개발하는 데 주력하였다. 문헌["Polyethylene Glycol and Derivatives for Advanced PEGylation", Nektar Molecular Engineering Catalog, 2003, pp. 1-17]을 참조할 수 있다. 그러나, 이러한 PEG 유도체는 모두, 종종 단백질의 표면에 존재하는 다수의 리신 잔기 중에 선택적으로 놓일 수 없다는 공통된 제약을 갖는다. 이는 리신 잔기가 예를 들면, 효소 활성 부위에 존재하는 단백질 활성에 중요한 경우, 또는 리신 잔기가 수용체 결합 부위의 경우와 같이 단백질과 다른 생물학적 분자의 상호작용을 조절하는 데 작용하는 경우 상당한 제약이 된다.
단백질 PEG화에 대한 현존하는 방법 중 동일하게 중요한 두 번째 곤란한 문제는 PEG 유도체가 바람직한 것들이 아닌 잔기와 원치 않는 부 반응을 할 수 있다는 점이다. 히스티딘은 구조적으로 --N(H)--로 표현되는 반응성 이미노 부분을 함유하지만, 엡실론--NH2와 반응하는 많은 화학적 반응성 종도 --N(H)--와 반응할 수 있다. 유사하게, 아미노산 시스테인의 측쇄는 구조적으로 -SH로 표현되는 유리 술 프히드릴 기를 갖는다. 일부 경우, 또한, 리신의 엡실론 --NH2기에서 지시된 PEG 유도체는 시스테인, 히스티딘 또는 다른 잔기와 반응한다. 이는 PEG-유도체화된 생체활성 분자로 된 복잡한 이질적인 혼합물을 생성하고, 표적화되는 생체활성 분자의 활성 파괴 위험을 일으킬 수 있다. 화학적 작용기가 단백질 내 단일 부위에 도입되게 한 다음, 우수하게 정의되고 예측가능한 단백질 표면 상의 특이적 부위에서 하나 이상의 PEG 중합체가 생체활성 분자에 선택적으로 커플링할 수 있게 하는 PEG 유도체를 개발하는 것이 바람직할 것이다.
리신 잔기 외에도, 당 분야에서는 시스테인, 히스티딘 및 N-말단을 비롯한 다른 아미노산 측쇄를 표적화하는 활성화된 PEG 시약을 개발하는 데 상당한 노력을 기울였다. 예를 들면, 본 명세서에 참고 문헌으로 인용되는 미국 특허 제 6,610,281호, 및 문헌["Polyethylene Glycol and Derivatives for Advanced PEGylation", Nektar Molecular Engineering Catalog, 2003, pp. 1-17]을 참조할 수 있다. 시스테인 잔기는 부위-지정 돌연변이발생 (site-directed mutagenesis) 및 당분야에 공지된 다른 기술을 사용하여 단백질의 구조에 부위-선택적으로 도입될 수 있고, 생성되는 유리 술프히드릴 부분은 티올-반응성 작용기를 갖는 PEG 유도체와 반응할 수 있다. 그러나, 이 방법은 유리 술프히드릴 기의 도입이 생성되는 단백질의 발현, 폴딩 (folding) 및 안정성을 복잡하게 할 수 있다는 점에서 복잡하다. 따라서, 하나 이상의 PEG 중합체를 단백질에 선택적으로 커플링할 수 있으며, 동시에 단백질 중에서 전형적으로 발견되는 술프히드릴 및 다른 화학적 작용기와 상용가능한 (즉, 이와 원치 않는 부 반응을 일으키지 않음) 화학적 작용기를 생체활성 분자에 도입시키는 수단을 갖는 것이 바람직할 것이다.
상기 선행 기술의 예로부터 알 수 있는 바와 같이, 단백질의 측쇄, 특히 리신 아미노산 측쇄 상의 --NH2 부분 및 시스테인 측쇄 상의 -SH 부분에 부착시키기 위해 개발된 이러한 많은 유도체들은 그들의 합성 및 용도에 문제가 있는 것으로 증명되었다. 일부는 단백질과, 가수분해되기 쉬워 분해되거나, 붕괴되거나, 또는 수성 환경, 예를 들면 혈류에서 불안정한 것인 불안정한 결합을 형성한다. 일부는 더욱 안정한 결합을 형성하지만, 결합이 형성되기 전에 가수분해되며, 이는 PEG 상의 반응성 기 유도체가 단백질이 부착될 수 있기 전에 불활성화될 수 있다는 것을 의미한다. 일부는 다소 독성을 갖기 때문에 생체 내에서 사용하기에는 적합성이 떨어진다. 일부는 반응이 느려 실시하기에 유용하지 못하다. 일부는 단백질의 활성을 담당하는 부위에 부착됨으로써 단백질 활성을 손상시킨다. 일부는 이들이 부착되는 부위에 특이적이지 않고, 이는 또한 바람직한 활성을 손상시키고 결과의 재현성에 손실을 가져올 수 있다. 폴리(에틸렌 글리콜) 부분을 사용하여 단백질을 변형시키는 것과 관련한 난관을 극복하기 위해, 더욱 안정하거나 (예를 들면, 본 명세서에 참고 문헌으로 인용되는 미국 특허 제 6,602,498호 참조) 또는 분자 및 표면 상의 티올 부분과 선택적으로 반응하는 (예를 들면, 본 명세서에 참고 문헌으로 인용되는 미국 특허 제 6,610,281호 참조) PEG 유도체가 개발되었다. 안정한 화학 결합을 형성하도록 선택적으로 반응할 필요가 있을 때까지 생리적 환경에서 화학적 불활성 을 띠는 PEG 유도체가 당분야에 필요하다.
최근, 단백질 과학에서는 단백질의 부위-특이적 변형과 관련된 많은 제한을 극복할 수 있게 하는 완전히 신규한 기술이 보고되었다. 구체적으로, 신규한 성분을 원핵생물인 에스케리치아 콜라이 (Escherichia coli; E. coli) (예를 들면, 문헌[L. Wang, et al., (2001), Science 292: 498-500] 참조) 및 비-유전적으로 코딩된 아미노산을 생체 내 단백질에 도입시킬 수 있게 진핵생물인 사카로마이세스 세레비지애 (Sacchroniyces cerevisiae; S. cerevisiae) (예를 들면, 문헌[J. Chin et al., Science 301: 964-7 (2003)] 참조)의 단백질 생합성 기구에 패밀리하였다. 광친화성 표지 및 광이성화가능한 (photoisomerizable) 아미노산, 케토 아미노산, 및 글리코실화된 아미노산을 비롯한 신규한 화학적, 물리적 또는 생물학적 성질을 갖는 다수의 신규한 아미노산을 이 방법론을 사용하여 엠버 코돈 (amber codon), TAG에 대응하여 대장균 및 효모 중 단백질에 유효하게 높은 적합도 (fidelity)로 도입시켰다. 예를 들면, 문헌[J. W. Chin et al., (2002), Journal of the American Chemical Society 124: 9026-9027; J. W. Chin, & P. G. Schultz, (2002), ChemBioChem 11: 1135-1137; J. W. Chin, et al., (2002), PNAS United States of America 99: 11020-11024; and, L. Wang, & P. G. Schultz, (2002), Chem. Comm., 1-10]을 참조할 수 있다. 이 연구는 유전자에 코딩된 20개의 일반 아미노산에서 발견되는 작용기 모두에 화학적으로 불활성이고, 유효하게 선택적으로 반응하여 안정한 공유 결합을 형성하는 데 사용될 수 있는 단백질에서 발견되지 않는 화학적 작용기, 예를 들면 케톤 기, 알킨 기 및 아지드 부분을 선택적으로 통상 적으로 도입시키는 것이 가능하다는 것을 입증하였다.
비-유전적으로 코딩된 아미노산을 단백질에 도입시키는 능력은 자연 발생 작용기, 예를 들면 리신의 엡실론-NH2, 시스테인의 술프히드릴-SH, 히스티딘의 이미노 기 등에 가치있는 대안을 제공할 수 있는 화학적 작용기를 도입할 수 있게 한다. 특정한 화학적 작용기는 유전자에 코딩된 20 개의 일반 아미노산에서 발견되는 작용기에 대해 불활성을 나타내는 것으로 공지되어 있지만, 분명히 효율적으로 반응하여 안정한 결합을 형성한다. 예를 들면, 아지드 및 아세틸렌 기는 수성 조건에서 촉매량의 구리의 존재 하에서 휘스겐 (Huisgen) [3 + 2] 시클로부가(cycloaddition) 반응을 하는 것으로 당분야에 공지되어 있다. 예를 들면, 문헌[Tornoe, et al., (2002) Org. Chem. 67: 3057-3064; and, Rostovtsev, et al., (2002) Angew. Chem. Int. Ed. 41: 2596-2599]을 참조할 수 있다. 예를 들면, 아지드 부분을 단백질 구조에 도입시킴으로써, 단백질 중에서 발견되는 아민, 술프히드릴, 카르복실산, 히드록실 기에 대해 화학적 불활성을 띠지만 또한 아세틸렌 부분과 원활하고 효율적으로 반응하여 시클로부가 생성물을 형성하는 작용기를 도입시킬 수 있다. 중요하게는, 아세틸렌 부분의 부재 하에서, 아지드는 다른 단백질 측쇄의 존재 하에서 생리학적 조건 하에서 화학적으로 불활성이고 반응성을 갖지 않는다.
본 발명은 특히,GH 폴리펩티드의 활성 및 생성과 관련된 문제점을 해결하고, 또한 생물학적 또는 약리학적 특성, 예컨대 치료적 반감기가 개선된 hGH의 생성을 해결한다.
본 발명의 개요
본 발명은 1 이상의 비-천연적으로 코딩된 아미노산을 포함하는, hGH 폴리펩티드를 비롯한 GH 수퍼유전자 패밀리 구성원을 제공한다.
일부 실시양태에서, hGH 폴리펩티드는 하나 이상의 번역 후 변형물을 포함한다. 일부 실시양태에서, hGH 폴리펩티드는 링커 (linker), 중합체 또는 생물 활성 분자에 결합된다. 일부 실시양태에서, hGH 폴리펩티드는 이작용 중합체, 이작용 링커 또는 하나 이상의 추가 hGH 폴리펩티드에 연결되어 있다.
일부 실시양태에서, 비-천연적으로 코딩된 아미노산은 수용성 중합체에 결합된다. 일부 실시양태에서, 수용성 중합체는 폴리(에틸렌 글리콜) 부분을 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리(에틸렌 글리콜) 분자는 이작용 중합체이다. 일부 실시양태에서, 이작용 중합체는 제2 폴리펩티드에 결합된다. 일부 실시양태에서, 제2 폴리펩티드는 hGH 폴리펩티드이다.
일부 실시양태에서, hGH 폴리펩티드는 폴리(에틸렌 글리콜) 부분을 포함하는 수용성 중합체에 결합된 2 개 이상의 아미노산을 포함한다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 아미노산은 비-천연적으로 코딩된 아미노산이다.
hGH의 영역은 다음과 같이 나타낼 수 있으며, 여기서 hGH 중 아미노산 위치는 중간 열에 나타낸다.
나선 A 나선 B 나선 C 나선 D
[1-5]-[6-33]-[34-74]-[75-96]-[97-105]-[106-129]-[130-153]-[154-183]-[184-191] N-말단 A-B 루프 B-C 루프 C-D 루프 C-말단
일부 실시양태에서, 하나 이상의 비-천연적으로 코딩된 아미노산은 다음과 같은 hGH 중의 2차 구조에 대응하는 다음의 영역 중 하나 이상의 임의의 위치에 도입된다: 서열 번호 2로부터의 1-5 (N-말단), 6-33 (A 나선), 34-74 (A 나선과 B 나선 사이의 영역, A-B 루프), 75-96 (B 나선), 97-105 (B 나선과 C 나선 사이의 영역, B-C 루프), 106-129 (C 나선), 130-153 (C 나선과 D 나선 사이의 영역, C-D 루프), 154-183 (D 나선), 184-191 (C-말단) 또는 서열 번호 1 또는 서열 번호 3의 대응하는 아미노산. 다른 실시양태에서, 비-천연적으로 코딩된 아미노산은 hGH 서열 번호 2로부터의 잔기 1-5, 32-46, 97-105, 132-149 및 184-191 또는 서열 번호 1 또는 서열 번호 3의 대응하는 아미노산으로 이루어진 군으로부터 선택된 위치에서 치환된다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 비-천연적으로 코딩된 아미노산은 hGH 중 다음의 위치 중 하나 이상에서 도입된다: 위치 1 앞 (즉, N-말단에서), 1, 2, 3, 4, 5, 8, 9, 11, 12, 15, 16, 19, 22, 29, 30, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 52, 55, 57, 59, 65, 66, 69, 70, 71, 74, 88, 91, 92, 94, 95, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 111, 112, 113, 115, 116, 119, 120, 122, 123, 126, 127, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 158, 159, 161, 168, 172, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192 (즉, 단백질의 카르복실 말단에서) (서열 번호 2, 또는 서열 번호 1 또는 서열 번호 3의 대응하는 아 미노산).
일부 실시양태에서, 하나 이상의 비-천연적으로 코딩된 아미노산은 다음의 위치 중 하나 이상에서 치환된다: 29, 30, 33, 34, 35, 37, 39, 40, 49, 57, 59, 66, 69, 70, 71, 74, 88, 91, 92, 94, 95, 98, 99, 101, 103, 107, 108, 111, 122, 126, 129, 130, 131, 133, 134, 135, 136, 137, 139, 140, 141, 142, 143, 145, 147, 154, 155, 156, 159, 183, 186 및 187 (서열 번호 2, 또는 서열 번호 1 또는 서열 번호 3의 대응하는 아미노산).
일부 실시양태에서, 하나 이상의 비-천연적으로 코딩된 아미노산은 다음의 위치 중 하나 이상에서 치환된다: 29, 33, 35, 37, 39, 49, 57, 69, 70, 71, 74, 88, 91, 92, 94, 95, 98, 99, 101, 103, 107, 108, 111, 129, 130, 131, 133, 134, 135, 136, 137, 139, 140, 141, 142, 143, 145, 147, 154, 155, 156, 186 및 187 (서열 번호 2, 또는 서열 번호 1 또는 서열 번호 3의 대응하는 아미노산).
일부 실시양태에서, 하나 이상의 비-천연적으로 코딩된 아미노산은 다음의 위치 중 하나 이상에서 치환된다: 35, 88, 91, 92, 94, 95, 99, 101, 103, 111, 131, 133, 134, 135, 136, 139, 140, 143, 145 및 155 (서열 번호 2, 또는 서열 번호 1 또는 서열 번호 3의 대응하는 아미노산).
일부 실시양태에서, 하나 이상의 비-천연적으로 코딩된 아미노산은 다음의 위치 중 하나 이상에서 치환된다: 30, 74, 103 (서열 번호 2, 또는 서열 번호 1 또는 서열 번호 3의 대응하는 아미노산). 일부 실시양태에서, 하나 이상의 비-천연적으로 코딩된 아미노산은 다음의 위치 중 하나 이상에서 치환된다: 35, 92, 143, 145 (서열 번호 2, 또는 서열 번호 1 또는 서열 번호 3의 대응하는 아미노산).
일부 실시양태에서, 비자연 발생 아미노산은 다음의 위치를 포함하며 이에 한정되지 않는 위치 중 하나 이상에서 수용성 중합체에 결합된다: 위치 1 앞 (즉, N-말단에서), 1, 2, 3, 4, 5, 8, 9, 11, 12, 15, 16, 19, 22, 29, 30, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 52, 55, 57, 59, 65, 66, 69, 70, 71, 74, 88, 91, 92, 94, 95, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 111, 112, 113, 115, 116, 119, 120, 122, 123, 126, 127, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 158, 159, 161, 168, 172, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192 (즉, 단백질의 카르복실 말단에서) (서열 번호 2, 또는 서열 번호 1 또는 서열 번호 3의 대응하는 아미노산). 일부 실시양태에서, 다음의 위치 중 하나 이상에서 비자연 발생 아미노산은 수용성 중합체에 결합된다: 30, 35, 74, 92, 103, 143, 145 (서열 번호 2, 또는 서열 번호 1 또는 서열 번호 3의 대응하는 아미노산). 일부 실시양태에서, 다음의 위치 중 하나 이상에서 비자연 발생 아미노산은 수용성 중합체에 결합된다: 35, 92, 143, 145 (서열 번호 2, 또는 서열 번호 1 또는 서열 번호 3의 대응하는 아미노산).
인간 GH 길항제는 1, 2, 3, 4, 5, 8, 9, 11, 12, 15, 16, 19, 22, 103, 109, 112, 113, 115, 116, 119, 120, 123 및 127 위치에서의 치환, 위치 1(즉, N-말단에서)에서의 부가, 또는 이의 임의의 조합(서열 번호 2, 또는 서열 번호 1, 3의 상응 하는 아미노산, 또는 임의의 다른 GH 서열)을 가진 것들을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
일부 실시양태에서, hGH 폴리펩티드는 hGH 폴리펩티드 수용체에 대한 hGH 폴리펩티드의 친화성을 조절하는 치환, 부가 또는 결실을 포함한다. 일부 실시양태에서, hGH 폴리펩티드는 hGH 폴리펩티드의 안정성을 증가시키는 치환, 부가 또는 결실을 포함한다. 일부 실시양태에서, hGH 폴리펩티드는 hGH 서열 번호 2에서 F10A, F10H, F10I; M14W, M14Q, M14G; H18D; H21N; G120A; R167N; D171S; E174S; F176Y, I179T 또는 그의 임의의 조합물로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 치환을 포함한다. 일부 실시양태에서, hGH 폴리펩티드는 hGH 폴리펩티드의 면역원성을 조절하는 치환, 부가 또는 결실을 포함한다. 일부 실시양태에서, hGH 폴리펩티드는 hGH 폴리펩티드의 혈청 반감기 또는 순환 시간을 조절하는 치환, 부가 또는 결실을 포함한다.
일부 실시양태에서, hGH 폴리펩티드는 hGH 폴리펩티드의 수용성을 증가시키는 치환, 부가 또는 결실을 포함한다. 일부 실시양태에서, hGH 폴리펩티드는 숙주 세포에서 생산된 hGH 폴리펩티드의 용해도를 증가시키는 치환, 부가 또는 결실을 포함한다. 일부 실시양태에서, hGH 폴리펩티드는 숙주 세포 중에서 또는 시험관 내 합성된 hGH 폴리펩티드의 발현을 증가시키는 치환, 부가 또는 결실을 포함한다. 일부 실시양태에서, hGH 폴리펩티드는 아미노산 치환 G120A를 포함한다. 이러한 치환을 포함하는 hGH 폴리펩티드는 아고니스트 활성을 보유하고, 숙주 세포에서의 발현 수준을 유지시키거나 또는 개선시킨다. 일부 실시양태에서, hGH 폴리펩티드는 hGH 폴리펩티드의 프로테아제 내성을 증가시키는 치환, 부가 또는 결실을 포함한다.
일부 실시양태에서, hGH 폴리펩티드 중의 아미노산 치환은 자연 발생 또는 비자연 발생 아미노산을 사용하여 이루어질 수 있으며, 단 하나 이상의 치환은 비-천연적으로 코딩된 아미노산을 사용하여 이루어진다.
일부 실시양태에서, 비-천연적으로 코딩된 아미노산은 카르보닐 기, 아미노옥시 기, 히드라진 기, 히드라지드 기, 세미카르바지드 기, 아지드 기 또는 알킨 기를 포함한다.
일부 실시양태에서, 비-천연적으로 코딩된 아미노산은 카르보닐 기를 포함한다. 일부 실시양태에서, 비-천연적으로 코딩된 아미노산은 다음의 구조를 갖는다.
Figure 112006059749857-pct00001
상기 식 중,
n은 0-10이고, R1은 알킬, 아릴, 치환된 알킬 또는 치환된 아릴이고, R2는 H, 알킬, 아릴, 치환된 알킬 및 치환된 아릴이고, R3은 H, 아미노산, 폴리펩티드 또는 아미노 말단 변형 기이고, R4는 H, 아미노산, 폴리펩티드 또는 카르복시 말단 변형 기이다.
일부 실시양태에서, 비-천연적으로 코딩된 아미노산은 아미노옥시 기를 포함한다. 일부 실시양태에서, 비-천연적으로 코딩된 아미노산은 히드라지드 기를 포함 한다. 일부 실시양태에서, 비-천연적으로 코딩된 아미노산은 히드라진 기를 포함한다. 일부 실시양태에서, 비-천연적으로 코딩된 아미노산 잔기는 세미카르바지드 기를 포함한다.
일부 실시양태에서, 비-천연적으로 코딩된 아미노산 잔기는 아지드 기를 포함한다. 일부 실시양태에서, 비-천연적으로 코딩된 아미노산은 다음의 구조를 갖는다.
Figure 112006059749857-pct00002
상기 식 중,
n은 0-10이고, R1은 알킬, 아릴, 치환된 알킬, 치환된 아릴이거나 또는 존재하지 않고, X는 O, N, S이거나 또는 존재하지 않고, m은 0-10이고, R2는 H, 아미노산, 폴리펩티드 또는 아미노 말단 변형 기이고, R3은 H, 아미노산, 폴리펩티드 또는 카르복시 말단 변형 기이다.
일부 실시양태에서, 비-천연적으로 코딩된 아미노산은 알킨 기를 포함한다. 일부 실시양태에서, 비-천연적으로 코딩된 아미노산은 다음의 구조를 갖는다.
Figure 112006059749857-pct00003
상기 식 중,
n은 0-10이고, R1은 알킬, 아릴, 치환된 알킬 또는 치환된 아릴이고, X는 O, N, S이거나 또는 존재하지 않고, m은 0-10이고, R2는 H, 아미노산, 폴리펩티드 또는 아미노 말단 변형 기이고, R3은 H, 아미노산, 폴리펩티드 또는 카르복시 말단 변형 기이다.
일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 hGH 폴리펩티드 아고니스트, 부분 아고니스트, 길항제, 부분 길항제 또는 역 (inverse) 아고니스트이다. 일부 실시양태에서, hGH 폴리펩티드 아고니스트, 부분 아고니스트, 길항제, 부분 길항제 또는 역 아고니스트는 수용성 중합체에 결합된 비-천연적으로 코딩된 아미노산을 포함한다. 일부 실시양태에서, 수용성 중합체는 폴리(에틸렌 글리콜) 부분을 포함한다. 일부 실시양태에서, hGH 폴리펩티드 아고니스트, 부분 아고니스트, 길항제, 부분 길항제 또는 역 아고니스트는 비-천연적으로 코딩된 아미노산 및 하나 이상의 번역 후 변형물, 링커, 중합체 또는 생물 활성 분자를 포함한다. 일부 실시양태에서, 수용성 중합체에 결합된 비-천연적으로 코딩된 아미노산은 hGH 폴리펩티드의 사이트 II 영역 (AC 나선 다발 면, 나선 A의 아미노 말단 영역 및 나선 C의 부분을 포함하는 단백질의 영역) 내에 존재한다. 일부 실시양태에서, 수용성 중합체에 결합된 비-천연적으로 코딩된 아미노산을 포함하는 hGH 폴리펩티드는 hGH 폴리펩티드 길항제가 제2 hGH 폴리펩티드 수용체 분자에 결합하는 것을 방지함으로써 hGH 폴리펩티드 수용체의 이량체화를 방지한다. 일부 실시양태에서, 서열 번호 2 (hGH)에서 G120을 글 리신 이외의 아미노산으로 치환한다. 일부 실시양태에서, 서열 번호 2에서 G120을 아르기닌으로 치환한다. 일부 실시양태에서, 서열 번호 2에서 G120을 비-천연적으로 코딩된 아미노산으로 치환한다. 일부 실시양태에서, 서열 번호 29 (hG-CSF)에서 L70을 루신 이외의 다른 아미노산으로 치환한다.
또한, 본 발명은 엄격한 조건 하에서 서열 번호 21 또는 22에 혼성화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 단리된 핵산을 제공하며, 여기서 상기 폴리뉴클레오티드는 하나 이상의 셀렉터 (selector) 코돈을 포함한다. 일부 실시양태에서, 셀렉터 코돈은 엠버 코돈, 오커 (ochre) 코돈, 오팔 (opal) 코돈, 유니크 코돈, 희귀 코돈 및 4 염기 코돈으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
또한, 본 발명은 수용성 중합체에 결합된 hGH 폴리펩티드를 제조하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 이 방법은 비-천연적으로 코딩된 아미노산을 포함하는 단리된 hGH 폴리펩티드를 비-천연적으로 코딩된 아미노산과 반응하는 부분을 포함하는 수용성 중합체와 접촉시키는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, hGH 폴리펩티드에 도입되는 비-천연적으로 코딩된 아미노산은 20 개의 일반 아미노산 중 어느 것에도 반응성이 없는 수용성 중합체에 대해 반응성을 갖는다. 일부 실시양태에서, hGH 폴리펩티드에 도입되는 비-천연적으로 코딩된 아미노산은 20 개의 일반 아미노산 중 어느 것에도 반응성이 없는 링커, 중합체 또는 생물 활성 분자에 대해 반응성을 갖는다.
일부 실시양태에서, 수용성 중합체에 결합된 hGH 폴리펩티드는 카르보닐 함유 아미노산을 포함하는 hGH 폴리펩티드를 아미노옥시, 히드라진, 히드라지드 또는 세미카르바지드 기를 포함하는 폴리(에틸렌 글리콜) 분자와 반응시킴으로써 제조된다. 일부 실시양태에서, 아미노옥시, 히드라진, 히드라지드 또는 세미카르바지드 기는 아미드 결합을 통해 폴리(에틸렌 글리콜) 분자에 결합된다.
일부 실시양태에서, 수용성 중합체에 결합된 hGH 폴리펩티드는 카르보닐기를 포함하는 폴리(에틸렌 글리콜) 분자를 아미노옥시, 히드라진, 히드라지드 또는 세미카르바지드 기를 포함하는 비-천연적으로 코딩된 아미노산을 포함하는 폴리펩티드와 반응시킴으로써 제조된다.
일부 실시양태에서, 수용성 중합체에 결합된 hGH 폴리펩티드는 알킨 함유 아미노산을 포함하는 hGH 폴리펩티드를 아지드 부분을 포함하는 폴리(에틸렌 글리콜) 분자와 반응시킴으로써 제조된다. 일부 실시양태에서, 아지드 또는 알킨 기는 아미드 결합을 통해 폴리(에틸렌 글리콜) 분자에 결합된다.
일부 실시양태에서, 수용성 중합체에 결합된 hGH 폴리펩티드는 아지드 함유 아미노산을 포함하는 hGH 폴리펩티드를 알킨 부분을 포함하는 폴리(에틸렌 글리콜) 분자와 반응시킴으로써 제조된다. 일부 실시양태에서, 아지드 또는 알킨 기는 아미드 결합을 통해 폴리(에틸렌 글리콜) 분자에 결합된다.
일부 실시양태에서, 폴리(에틸렌 글리콜) 분자는 약 0.1 kDa 내지 약 100 kDa의 분자량을 갖는다. 일부 실시양태에서, 폴리(에틸렌 글리콜) 분자는 0.1 kDa 내지 50 kDa의 분자량을 갖는다.
일부 실시양태에서, 폴리(에틸렌 글리콜) 분자는 분지형 중합체이다. 일부 실시양태에서, 폴리(에틸렌 글리콜) 분지형 중합체의 각각의 분지는 1 kDa 내지 100 kDa 또는 1 kDa 내지 50 kDa의 분자량을 갖는다.
일부 실시양태에서, hGH 폴리펩티드에 결합된 수용성 중합체는 폴리알킬렌 글리콜 부분을 포함한다. 일부 실시양태에서, hGH 폴리펩티드에 도입되는 비-천연적으로 코딩된 아미노산 잔기는 카르보닐 기, 아미노옥시 기, 히드라지드 기, 히드라진, 세미카르바지드 기, 아지드 기 또는 알킨 기를 포함한다. 일부 실시양태에서, hGH 폴리펩티드에 도입되는 비-천연적으로 코딩된 아미노산 잔기는 카르보닐 부분을 포함하고, 수용성 중합체는 아미노옥시, 히드라지드, 히드라진 또는 세미카르바지드 부분을 포함한다. 일부 실시양태에서, hGH 폴리펩티드에 도입되는 비-천연적으로 코딩된 아미노산 잔기는 알킨 부분을 포함하고, 수용성 중합체는 아지드 부분을 포함한다. 일부 실시양태에서, hGH 폴리펩티드에 도입되는 비-천연적으로 코딩된 아미노산 잔기는 아지드 부분을 포함하고, 수용성 중합체는 알킨 부분을 포함한다.
또한, 본 발명은 비-천연적으로 코딩된 아미노산을 포함하는 hGH 폴리펩티드 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 조성물을 제공한다. 일부 실시양태에서, 비-천연적으로 코딩된 아미노산은 수용성 중합체에 결합된다.
또한, 본 발명은 셀렉터 코돈을 포함하는 hGH 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 세포를 제공한다. 일부 실시양태에서, 이 세포는 비-천연적으로 코딩된 아미노산을 hGH 폴리펩티드에 치환시키기 위한 오르토고날 (orthogonal) RNA 합성효소 및(또는) 오르토고날 tRNA를 포함한다.
또한, 본 발명은 비-천연적으로 코딩된 아미노산을 포함하는 hGH 폴리펩티드 의 제조 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 이 방법은 hGH 폴리펩티드의 발현을 가능하게 하는 조건 하에서 hGH 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드(들), 오르토고날 RNA 합성효소 및(또는) 오르토고날 tRNA를 포함하는 세포를 배양하는 단계 및 상기 세포 및(또는) 배양 배지로부터 hGH 폴리펩티드를 정제하는 단계를 포함한다.
또한, 본 발명은 hGH 폴리펩티드의 치료적 반감기, 혈청 반감기 또는 순환 시간을 증가시키는 방법을 제공한다. 또한, 본 발명은 hGH 폴리펩티드의 면역원성 조절 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 이 방법은 자연 발생 hGH 폴리펩티드에서 임의의 하나 이상의 아미노산을 비-천연적으로 코딩된 아미노산으로 치환하고(치환하거나) hGH 폴리펩티드를 링커, 중합체, 수용성 중합체 또는 생물 활성 분자에 결합시키는 것을 포함한다.
또한, 본 발명은 유효량의 본 발명의 hGH 분자를 사용하여 치료를 필요로 하는 환자를 치료하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 이 방법은 비-천연적으로 코딩된 아미노산을 포함하는 hGH 폴리펩티드 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 치료적 유효량의 약학 조성물을 환자에게 투여하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 비-천연적으로 코딩된 아미노산은 수용성 중합체에 결합된다.
또한, 본 발명은 하나 이상의 아미노산이 비-천연적으로 코딩된 아미노산으로 치환되는 것을 제외하고, 서열 번호 1, 2, 3의 서열 또는 임의의 다른 GH 폴리펩티드 서열을 포함하는 hGH 폴리펩티드를 제공한다. 일부 실시양태에서, 비-천연적으로 코딩된 아미노산은 수용성 중합체에 결합된다. 일부 실시양태에서, 수용성 중합체는 폴리(에틸렌 글리콜) 부분을 포함한다. 일부 실시양태에서, 비-천연적으로 코딩된 아미노산은 카르보닐 기, 아미노옥시 기, 히드라지드 기, 히드라진 기, 세미카르바지드 기, 아지드 기 또는 알킨 기를 포함한다. 일부 실시양태에서, 비-천연적으로 코딩된 아미노산은 서열 번호 3 (hGH)으로부터 잔기 1-5, 82-90, 117-134 및 169-176으로 이루어진 군으로부터 선택된 위치에서 치환된다.
또한, 본 발명은 약학적으로 허용가능한 담체 및 서열 번호 1, 2, 3의 서열 또는 임의의 다른 GH 폴리펩티드 서열을 포함하는 hGH 폴리펩티드를 포함하는 약학 조성물을 제공하며, 여기서 하나 이상의 아미노산은 비-천연적으로 코딩된 아미노산에 의해 치환된다. 일부 실시양태에서, 비-천연적으로 코딩된 아미노산은 사카라이드 부분을 포함한다. 일부 실시양태에서, 수용성 중합체는 사카라이드 부분을 통해 폴리펩티드에 결합된다. 일부 실시양태에서, 링커, 중합체 또는 생물 활성 분자는 사카라이드 부분을 통해 hGH 폴리펩티드에 결합된다.
또한, 본 발명은 단일 아미노산에서 폴리펩티드에 공유 결합에 의해 결합된 수용성 중합체를 포함하는 hGH 폴리펩티드를 제공한다. 일부 실시양태에서, 수용성 중합체는 폴리(에틸렌 글리콜) 부분을 포함한다. 일부 실시양태에서, 수용성 중합체에 공유 결합된 아미노산은 폴리펩티드 중에 존재하는 비-천연적으로 코딩된 아미노산이다. 일부 실시양태에서, 비-천연적으로 코딩된 아미노산은 위치 35, 92, 143 또는 145에서 치환된다.
본 발명은 하나 이상의 링커, 중합체 또는 생물 활성 분자를 포함하는 hGH 폴리펩티드를 제공하며, 여기서 상기 링커, 중합체 또는 생물 활성 분자는 폴리펩 티드에 리보좀으로 도입된 비-천연적으로 코딩된 아미노산의 작용기를 통해 폴리펩티드에 부착된다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 모노PEG화된다. 또한, 본 발명은 미리 선택된 부위에서 폴리펩티드 내로 리보좀을 통해 도입되는 하나 이상의 비-천연적으로 코딩된 아미노산에 부착되는 링커, 중합체 또는 생물 활성 분자를 포함하는 hGH 폴리펩티드를 제공한다.
도 1 - 4 개의 나선 다발 단백질에 대한 일반적 구조도가 도시된다.
도 2 - 4 개의 나선 다발 단백질 성장 호르몬 (GH)에 대한 일반적 구조도가 도시된다.
도 3 - 4 개의 나선 다발 단백질 에리트로포이에틴 (EPO)에 대한 일반적 구조도가 도시된다.
도 4 - 4 개의 나선 다발 단백질 인터페론 알파-2 (IFNα-2)에 대한 일반적 구조도가 도시된다.
도 5 - 4 개의 나선 다발 단백질 과립구 콜로니 자극 인자 (G-CSF)에 대한 일반적 구조도가 도시된다.
도 6 - 각각의 다음의 위치에서 비-천연적으로 코딩된 아미노산 p-아세틸 페닐알라닌을 포함하는 hGH의 발현을 나타내는 쿠마시 블루 (Coomassie blue) 염색 SDS-PAGE가 도시된다: Y35, F92, Y111, G131, R134, K140, Y143 또는 145.
도 7의 패널 A 및 B - IM9 세포 상에서 야생형 (wild-type) hGH (패널 A) 및 비-천연적으로 코딩된 아미노산을 포함하는 hGH (패널 B)의 생물학적 활성을 나타 내는 도면이 도시된다.
도 8 - 비-천연적으로 코딩된 아미노산에 PEG (5, 20 및 30 kDa)를 공유 결합시킴으로써 PEG화된 비-천연적으로 코딩된 아미노산을 포함하는 hGH의 생산을 나타내는 쿠마시 블루 염색 SDS-PAGE가 도시된다.
도 9 - IM9 세포 상의 비-천연적으로 코딩된 아미노산을 포함하는 hGH의 다양한 PEG화된 형태의 생물학적 활성을 나타내는 도면이 도시된다.
도 10의 패널 A - 이 도면은 표시된 트립신 분절 부위 및 화살표로 표시된 비천연 아미노산 치환, F92pAF를 갖는 hGH의 1차 구조를 도시한다 (문헌[Becker et al. Biotechnol Appl Biochem. (1988) 10(4): 326-337]으로부터 변형된 도면). 도 10, 패널 B - PEG화된 비-천연적으로 코딩된 아미노산을 포함하는 hGH 폴리펩티드로부터 생성된 펩티드 (A로 표지화됨), 비-천연적으로 코딩된 아미노산을 포함하는 hGH 폴리펩티드로부터 생성된 펩티드 (B로 표지화됨), 및 WHO rhGH로부터 생성된 펩티드 (C로 표지화됨)의 중첩된 트립신 지도가 도시된다. 도 10, 패널 C - 패널 B로부터의 피크 9의 확대도가 도시된다.
도 11, 패널 A 및 패널 B는 정제된 PEG-hGH 폴리펩티드의 쿠마시 블루 염색 SDS-PAGE 분석을 도시한다.
도 12 - IM9 세포 상의 hGH 이량체 분자의 생물학적 활성을 나타내는 도면이 도시된다.
도 13의 패널 A - G120R 치환을 갖는 hGH 길항제에 의한 pSTAT5의 인산화를 측정하는 IM-9 분석시험 데이터의 도면이 도시된다. 도 13, 패널 B - 동일한 위치 (G120)에서 도입되는 비천연 아미노산을 갖는 hGH 폴리펩티드에 의한 pSTAT5의 인산화를 측정하는 IM-9 분석시험 데이터의 도면이 도시된다.
도 14 - 도 13, 패널 B에 도시된 hGH 길항제의 이량체도 IM-9 분석시험에서 생물학적 활성이 결여됨을 나타내는 도면이 도시된다.
도 15 - 쥐에서 PEG화된 비-천연적으로 코딩된 아미노산을 포함하는 hGH 폴리펩티드의 혈청 반감기와 PEG화되지 않은 hGH 폴리펩티드의 경우를 비교한 도면이 도시된다.
도 16 - 쥐에서 PEG화된 비-천연적으로 코딩된 아미노산을 포함하는 hGH 폴리펩티드의 혈청 반감기를 비교한 도면이 도시된다.
도 17 - 쥐에서 PEG화된 비-천연적으로 코딩된 아미노산을 포함하는 hGH 폴리펩티드의 혈청 반감기를 비교한 도면이 도시된다. 쥐에게 2.1 mg/kg을 1 회 투여하였다.
도 18의 패널 A - PEG화된 비-천연적으로 코딩된 아미노산을 포함하는 hGH 폴리펩티드 (위치 35, 92)의 단일 투여량을 투여한 후 쥐 체중 증가에 대한 영향을 나타내는 도면이 도시된다. 도 18의 패널 B - PEG화된 비-천연적으로 코딩된 아미노산을 포함하는 hGH 폴리펩티드 (위치 35, 92)의 단일 투여량을 투여한 후 순환 혈장 IGF-1 수치에 대한 영향을 나타내는 도면이 도시된다. 도 18의 패널 C - PEG화된 비-천연적으로 코딩된 아미노산을 포함하는 hGH 폴리펩티드 (위치 92, 134, 145, 131, 143)의 단일 투여량을 투여한 후 쥐 체중 증가에 대한 영향을 나타내는 도면이 도시된다. 도 18의 패널 D - PEG화된 비-천연적으로 코딩된 아미노산을 포 함하는 hGH 폴리펩티드 (위치 92, 134, 145, 131, 143)의 단일 투여량을 투여한 후 순환 혈장 IGF-1 수치에 대한 영향을 나타내는 도면이 도시된다. 도 18의 패널 E - 쥐에서 PEG화된 비-천연적으로 코딩된 아미노산을 포함하는 hGH 폴리펩티드 (위치 92, 134, 145, 131, 143)의 혈청 반감기를 비교한 도면이 도시된다.
정의
본 발명은 본 명세서에 기재된 특정 방법론, 프로토콜, 세포주, 구성체 (construct) 및 시약에 한정되지 않으며 변화할 수 있다는 점이 이해되어야 한다. 또한, 본 명세서에 사용된 용어는 오직 특정 실시양태를 설명하기 위한 것이며, 오직 첨부되는 청구 범위에 의해서만 한정되는 본 발명의 범위를 제한하려는 것이 아님을 이해해야 한다.
본 명세서에 및 첨부되는 청구 범위에 사용된 단수 형태는 달리 명시하지 않는 한 복수 언급을 포함한다. 따라서, 예를 들면, "hGH"에 대한 언급은 하나 이상의 상기 단백질에 대한 언급이고, 당업자에게 공지된 이의 등가물을 포함한다.
달리 정의하지 않는 한, 본 명세서에 사용된 모든 기술 용어 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 당업자에게 공통으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 비록 본 명세서에 기재된 것들과 유사하거나 또는 등가의 임의의 방법, 장치 및 물질들을 본 발명의 실시 또는 시험에 사용할 수 있지만, 지금부터 바람직한 방법, 장치 및 물질을 기재한다.
본 명세서에 언급된 모든 공보 및 특허는 예를 들면, 본 발명과 관련하여 사용될 수 있는, 공보에 기재되는 작제물 및 방법론을 기재하고 개시할 목적으로 본 명세서에 참고 문헌으로 인용된다. 본 명세서에서 논의되는 공보는 본 출원의 출원일 전에 이들의 개시내용을 단독으로 제공한다. 본 명세서 중 어떤 것도 발명자들이 선행 발명을 통해 또는 임의의 다른 이유로 이러한 공보의 개시내용을 앞서 추정하게끔 허용하는 승인으로서 해석되어서는 안 된다.
용어 "실질적으로 정제된"은 그의 자연 발생 환경, 즉 본래의 세포, 또는 재조합으로 생산된 hGH 폴리펩티드의 경우 숙주 세포에서 발견되는 단백질을 정상적으로 동반하거나 또는 이와 상호작용하는 성분을 실질적으로 또는 필수적으로 함유하지 않을 수 있는 hGH 폴리펩티드를 지칭한다. 실질적으로 세포 물질을 함유하지 않을 수 있는 hGH 폴리펩티드는 약 30 % 미만, 약 25 % 미만, 약 20 % 미만, 약 15 % 미만, 약 10 % 미만, 약 5 % 미만, 약 4 % 미만, 약 3 % 미만, 약 2 % 미만 또는 약 1 % 미만 (건조 중량 기준)의 오염 단백질을 갖는 단백질로 된 제제를 포함한다. hGH 폴리펩티드 또는 그의 변이체가 숙주 세포에 의해 재조합으로 생산되는 경우, 단백질은 세포의 건조 중량의 약 30 %, 약 25 %, 약 20 %, 약 15 %, 약 10 %, 약 5 %, 약 4 %, 약 3 %, 약 2 %, 또는 약 1 % 이하로 존재할 수 있다. hGH 폴리펩티드 또는 그의 변이체가 숙주 세포에 의해 재조합으로 생산되는 경우, 단백질은 세포의 건조 중량의 약 5 g/L, 약 4 g/L, 약 3 g/L, 약 2 g/L, 약 1 g/L, 약 750 mg/L, 약 500 mg/L, 약 250 mg/L, 약 100 mg/L, 약 50 mg/L, 약 10 mg/L 또는 약 1 mg/L 이하로 배양 배지 중에 존재할 수 있다. 따라서, 본 발명의 방법에 의해 생산된 "실질적으로 정제된" hGH 폴리펩티드는 적합한 방법, 예를 들면 SDS/PAGE 분석, RP-HPLC, SEC, 및 모세관 전기영동에 의해 결정시 약 30 % 이상의 순도 수준 (purity level), 약 35 % 이상, 약 40 % 이상, 약 45 % 이상, 약 50 % 이상, 약 55 % 이상, 약 60 % 이상, 약 65 % 이상, 약 70 % 이상, 구체적으로 약 75 %, 80 %, 85 % 이상의 순도 수준, 더욱 구체적으로 약 90 % 이상의 순도 수준, 약 95 % 이상의 순도 수준, 약 99 % 이상의 순도 수준 또는 그 이상을 가질 수 있다.
"재조합 숙주 세포" 또는 "숙주 세포"는 삽입에 사용되는 방법, 예를 들면 직접적 섭취, 형질도입, f-교배, 또는 재조합 숙주 세포를 생성하는 당분야에 공지된 다른 방법에 관계없이 외인성 폴리뉴클레오티드를 포함하는 세포를 지칭한다. 외인성 폴리뉴클레오티드는 비삽입(nonintegrated vector) 벡터, 예를 들면 플라스미드로서 유지되거나, 또는 별법으로, 숙주 게놈내로 삽입될 수 있다.
본 명세서에 사용된 용어 "배지(들)"은 세균 숙주 세포, 효모 숙주 세포, 곤충 숙주 세포, 식물 숙주 세포, 진핵 숙주 세포, 포유류 숙주 세포, CHO 세포 또는 대장균을 비롯한 임의의 숙주 세포, 및 세포 내용물을 지지하거나 또는 함유할 수 있는 임의의 배양 배지, 용액, 고체, 반고체 또는 강성 지지체를 포함한다. 따라서, 이 용어는 숙주 세포가 성장하는 배지, 예를 들면 증식 단계 전후 배지를 비롯한 hGH 폴리펩티드가 분비되는 배지를 포함할 수 있다. 또한, 이 용어는 예를 들면, hGH 폴리펩티드가 세포 내 생산되고, 숙주 세포가 용해되거나 또는 붕괴되어 hGH 폴리펩티드를 방출하는 경우 숙주 세포 용해물(lysate)을 함유하는 완충제 또는 시약을 포함할 수 있다.
단백질 리폴딩(refolding)에 대해 본 명세서에 사용된 "환원제"는 환원된 상태에서 술프히드릴 기를 유지시키고, 세포 내 또는 세포 간 디술피드 결합을 감소 시키는 임의의 화합물 또는 물질로 정의된다. 적합한 환원제는 디티오트레이톨 (DTT), 2-머캅토에탄올, 디티오에리트리톨, 시스테인, 시스테아민 (2-아미노에탄티올) 및 환원된 글루타티온을 포함하며 이에 한정되지 않는다. 매우 다양한 환원제가 본 발명의 방법 및 조성물에 사용하기 적합하다는 점이 당업자에게 명백히 이해될 것이다.
단백질 리폴딩에 관하여 본 명세서에 사용된 "산화제"는 산화되는 화합물로부터 전자를 제거할 수 있는 임의의 화합물 또는 물질로 정의된다. 적합한 산화제는 산화된 글루타티온, 시스틴, 시스타민, 산화된 디티오트레이톨, 산화된 에리트레이톨 및 산소를 포함하며 이에 한정되지 않는다. 매우 다양한 환원제가 본 발명의 방법에 사용하기 적합하다는 점이 당업자에게 명백히 이해될 것이다.
본 명세서에 사용된 "변성제 (denaturing agent)" 또는 "변성화제 (denaturant)"는 단백질의 가역적 언폴딩 (unfolding)을 일으키는 임의의 화합물 또는 물질로 정의된다. 변성제 또는 변성화제의 강도는 특정 변성제 또는 변성화제의 성질 및 농도 양쪽 모두에 의해 결정되게 된다. 적합한 변성제 또는 변성화제는 케이오트로프 (chaotrope), 계면활성제 (detergent), 유기 용매, 수혼화성 용매, 인지질, 또는 2 개 이상의 이러한 약제의 조합물일 수 있다. 적합한 케이오트로프는 우레아, 구아니딘 및 소듐 티오시아네이트를 포함하며 이에 한정되지 않는다. 유용한 계면활성제는 강한 계면활성제, 예를 들면 소듐 도데실 술페이트, 또는 폴리옥시에틸렌 에테르 (예를 들면, 트윈 또는 트리톤 (Triton) 계면활성제), 사르코실 (Sarkosyl), 온화한 비이온성 계면활성제 (예를 들면, 디지토닌 (digitonin)), 온화한 양이온성 계면활성제, 예를 들면 N->2,3-(디올레이옥시)-프로필-N,N,N-트리메틸암모늄, 온화한 이온성 계면활성제 (예를 들면, 소듐 콜레이트 또는 소듐 데옥시콜레이트) 또는 술포베타인 (쯔비터젠트 (Zwittergent)), 3-(3-클로라미도프로필)디메틸암모니오-1-프로판 술페이트 (CHAPS) 및 3-(3-클로라미도프로필)디메틸암모니오-2-히드록시-1-프로판 술포네이트 (CHAPS)를 포함하며 이에 한정되지 않는 쯔비터이온성 계면활성제를 포함할 수 있으며 이에 한정되지 않는다. 유기 수혼화성 용매, 예를 들면 아세토니트릴, 저급 알칸올 (특히 C2-C4 알칸올, 예를 들면 에탄올 또는 이소프로판올), 또는 저급 알칸디올 (특히 C2-C4 알칸디올, 예를 들면 에틸렌-글리콜)은 변성화제로서 사용될 수 있다. 본 발명에 유용한 인지질은 자연 발생 인지질, 예를 들면 포스파티딜에탄올아민, 포스파티딜콜린, 포스파티딜세린 및 포스파티딜이노시톨 또는 합성 인지질 유도체 또는 변이체, 예를 들면 디헥사노일포스파티딜콜린 또는 디헵타노일포스파티딜콜린일 수 있다.
본 명세서에 사용된 "리폴딩"은 디술피드 결합 함유 폴리펩티드가 디술피드 결합에 대해 부적합하게 폴딩된 또는 언폴딩된 상태로부터 본래의 또는 적합하게 폴딩된 배위로 형질전환되는 임의의 방법, 반응 또는 방법을 설명한다.
본 명세서에 사용된 "코폴딩 (cofolding)"은 구체적으로, 서로 상호작용하는 2 개 이상의 폴리펩티드를 사용하여 언폴딩된 또는 부적합하게 폴딩된 폴리펩티드를 본래의 적합하게 폴딩된 폴리펩티드로 형질전환시키는 리폴딩 방법, 반응 또는 방법을 지칭한다.
본 명세서에 사용된 "성장 호르몬" 또는 "GH"는 생물학적 활성, 및 재조합 (cDNA, 게놈 DNA, 합성 DNA 또는 핵산의 다른 형태로부터 생산되든), 합성, 형질전환(transgenic) 및 유전자 활성화 방법을 포함하며 이에 한정되지 않는 합성 또는 제조 방법에 관계없이 인간 성장 호르몬, 뿐만 아니라 GH 유사체, GH 이소형(isoform), GH 모사체, GH 단편, 혼성 GH 단백질, 융합 단백질 올리고머 및 다량체, 그의 동족체, 글리코실화 패턴 변이체, 및 뮤테인의 하나 이상의 생물학적 활성을 갖는 폴리펩티드 및 단백질을 포함한다.
용어 "hGH 폴리펩티드"는 하나 이상의 아미노산 치환, 부가 또는 결실을 포함하는 hGH 폴리펩티드를 포함한다. 예시적인 치환은 예를 들면, 본래의 hGH의 위치 41에서의 리신의 치환 또는 위치 176에서의 페닐알라닌의 치환을 포함한다. 일부 경우, 치환이 위치 41에서 이루어진 경우 또는 위치가 176인 경우 티로신 잔기에서 이루어진 경우 치환물은 이소루신 또는 아르기닌 잔기일 수 있다. 위치 F10은 예를 들면, A, H 또는 I로 치환될 수 있다. 위치 M14는 예를 들면, W, Q 또는 G로 치환될 수 있다. 다른 예시적인 치환은
R167N, D171S, E174S, F176Y, I179T;
R167E, D171S, E174S, F176Y;
F10A, M14W, H18D, H21N;
F10A, M14W, H18D, H21N, R167N, D171S, E174S, F176Y, I179T;
F10A, M14W, H18D, H21N, R167N, D171A, E174S, F176Y, I179T;
F1OH, M14G, H18N, H21N;
F10A, M14W, H18D, H21N, R167N, D171A, T175T, I179T; 또는
F10I, M14Q, H18E, R167N, D171S, I179T
를 포함하며 이에 한정되지 않는 임의의 치환 또는 그들의 조합물을 포함한다. 예를 들면, 본 명세서에 참고 문헌으로 인용되는 미국 특허 제 6,143,523호를 참조할 수 있다.
아고니스트 활성을 증가시키고, 프로테아제 내성을 증가시키고, 폴리펩티드를 길항제로 전환시키는 등의 치환을 비롯한 자연 발생 hGH 중 매우 다양한 아미노산 위치에서의 예시적인 치환이 기재되었으며, 용어 "hGH 폴리펩티드"에 포괄된다.
아고니스트 hGH 서열은 예를 들면, 다음의 변형물 H18D, H21N, R167N, D171S, E174S, I179T를 포함하는 자연 발생 hGH 서열을 포함한다. 예를 들면, 본 명세서에 참고 문헌으로 인용되는 미국 특허 제 5,849,535호를 참조할 수 있다. 추가적인 아고니스트 hGH 서열은
H18D, Q22A, F25A, D26A, Q29A, E65A, K168A, E174S;
H18A, Q22A, F25A, D26A, Q29A, E65A, K168A, E174S; 또는
H18D, Q22A, F25A, D26A, Q29A, E65A, K168A, E174A를 포함한다. 예를 들면, 본 명세서에 참고 문헌으로 인용되는 미국 특허 제 6,022,711호를 참조할 수 있다. H18A, Q22A, F25A, D26A, Q29A, E65A, K168A, E174A에서의 치환을 포함하는 hGH 폴리펩티드는 사이트 I에서 hGH 수용체에 대한 친화성을 강화시킨다. 예를 들면, 본 명세서에 참고 문헌으로 인용되는 미국 특허 제 5,854,026호를 참조할 수 있다. 프로테아제에 대한 증가된 내성을 갖는 hGH 서열은 C-D 루프 내에 하나 이상의 아미 노산 치환을 포함하는 hGH 폴리펩티드를 포함하며 이에 한정되지 않는다. 일부 실시양태에서, 치환은 R134D, T135P, K140A 및 그의 임의의 조합물을 포함하며 이에 한정되지 않는다. 예를 들면, 문헌[Alam et al. (1998) J. Biotechnol. 65: 183-190]을 참조할 수 있다.
인간 성장 호르몬 길항제는 예를 들면, G120 (예를 들면, G120R, G120K, G120W, G120Y, G120F 또는 G120E)에서 치환을 갖는 것들을 포함하고, 치환 H18A, Q22A, F25A, D26A, Q29A, E65A, K168A, E174A를 갖는 것들을 추가로 포함한다. 예를 들면, 본 명세서에 참고 문헌으로 인용되는 미국 특허 제 6,004,931호를 참조할 수 있다. 일부 실시양태에서, hGH 길항제는 GH가 길항제로 작용하게 하는 영역 106-108 또는 127-129에서의 하나 이상의 치환을 포함한다. 예를 들면, 본 명세서에 참고 문헌으로 인용되는 미국 특허 제 6,608,183호를 참조할 수 있다. 일부 실시양태에서, hGH 길항제는 hGH 분자의 사이트 II 결합 영역에 존재하는 수용성 중합체에 결합된 비-천연적으로 코딩된 아미노산을 포함한다. 일부 실시양태에서, hGH 폴리펩티드는 G120에서의 치환과 함께 치환: H18D, H21N, R167N, K168A, D171S, K172R, E174S, I179T를 추가로 포함한다. (예를 들면, 미국 특허 제 5,849,535호 참조)
완전한 전장 자연 발생 GH 아미노산 서열, 뿐만 아니라 성숙 자연 발생 GH 아미노산 서열 및 천연 발생 돌연변이체의 경우, 각각 본 명세서의 서열 번호 1, 서열 번호 2 및 서열 번호 3을 참조할 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 hGH 폴리펩티드는 서열 번호 1, 또는 서열 번호 2, 또는 서열 번호 3 또는 성장 호르몬 폴리펩티드의 임의의 다른 서열과 실질적으로 동일하다. hGH의 다수의 천연 발생 돌연변이체가 동정되었다. 이들은 hGH-V (본 명세서에 참고 문헌으로 인용되는 문헌[Seeberg, DNA 1: 239 (1982)]; 미국 특허 제 4,446,235호, 제 4,670,393 호 및 제 4,665,180호 참조) 및 hGH의 잔기 32-46의 결실을 함유하는 20-ka hGH (서열 번호 3) (문헌[Kostyo et al., Biochem. Biophys. Acta 925: 314 (1987); Lewis, U., et al., J. Biol. Chem., 253: 2679-2687 (1978)] 참조)를 포함한다. 태반 성장 호르몬은 문헌[Igout, A., et al., Nucleic Acids Res. 17 (10): 3998 (1989))]에 기재되어 있다. 또한, 단백질분해로 분절된 또는 2 사슬 변이체를 비롯한 전사 후, 번역 후, 분비성, 대사 과정 및 다른 생리학적 방법으로부터 발생하는 다수의 hGH 변이체들이 보고되었다 (문헌[Baumann, G., Endocrine Reviews 12: 424 (1991)] 참조). Cys-Cys 디술피드 결합을 통해 직접 결합된 hGH 이량체는 문헌[Lewis, U. J., et al., J. Biol. Chem. 252: 3697-3702 (1977); Brostedt, P. and Roos, P., Prep. Biochem. 19: 217-229 (1989)]에 기재되어 있다. hGH 돌연변이체 및 돌연변이체 hGH 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자는 공지되어 있고, 본 명세서에 참고 문헌으로 인용되는 미국 특허 제 5,534,617호, 제 5,580,723호, 제 5,688,666호, 제 5,750,373호, 제 5,834,250호, 제 5,834,598호, 제 5,849,535호, 제 5,854,026호, 제 5,962,411호, 제 5,955,346호, 제 6,013,478호, 제 6,022,711호, 제 6,136,563호, 제 6,143,523호, 제 6,428,954호, 제 6,451,561호, 제 6,780,613호 및 미국 특허 출원 공보 2003/0153003에 개시된 것들을 포함하며 이에 한정되지 않는다.
hGH의 상업적 제제는 다음의 명칭 하에 시판된다: 휴마트로프TM (일라이 릴리 앤드 캄파니), 뉴트로핀TM (제넨테크), 노르디트로핀TM (노보-노르디스크), 제노트로핀TM (화이자) 및 사이젠/세로스팀TM (세로노).
또한, 용어 "hGH 폴리펩티드"는 약학적으로 허용가능한 염 및 전구약, 및 이러한 염의 전구약, 자연 발생 hGH의 다형체, 수화물, 용매화물, 생물학적 활성 단편, 생물학적 활성 변이체 및 입체이성체, 뿐만 아니라 자연 발생 hGH의 아고니스트, 모사체 및 길항제 변이체 및 그의 폴리펩티드 융합체를 포함한다. 아미노 말단, 카르복실 말단 또는 양쪽 모두에서 추가적인 아미노산을 포함하는 융합체는 용어 "hGH 폴리펩티드"에 포괄된다. 예시적인 융합체는 예를 들면, 메티오닌이 재조합 발현으로부터 유도되는 것인 hGH의 N-말단에 결합되는 메티오닐 성장 호르몬, 정제용 융합체 (폴리-히스티딘 또는 친화성 에피토프를 포함하며 이에 한정되지 않음), 혈청 알부민 결합 펩티드를 갖는 융합체 및 혈청 단백질, 예를 들면 혈청 알부민을 갖는 융합체를 포함하며 이에 한정되지 않는다.
다양한 참조문헌들이 중합체 컨쥬게이션 또는 글리코실화에 의한 폴리펩티드의 변형을 개시하고 있다. 용어 "hGH 폴리펩티드"는 중합체, 예를 들면 PEG에 컨쥬게이션된 폴리펩티드를 포함하고, 시스테인, 리신 또는 다른 잔기의 하나 이상의 추가 유도체화를 포함할 수 있다. 또한, hGH 폴리펩티드는 링커 또는 중합체를 포함할 수 있고, 여기서 상기 링커 또는 중합체는 컨쥬게이션되는 아미노산이 본 발명에 따른 비천연 아미노산이거나 또는 당분야에 공지된 기술, 예를 들면 리신 또 는 시스테인에 대한 커플링을 이용하여 천연적으로 코딩된 아미노산에 컨쥬게이션시킬 수 있다.
hGH 폴리펩티드의 중합체 컨쥬게이션은 보고되었다. 예를 들면, 본 명세서에 참고문헌으로 인용되는 미국 특허 제5,849,535호, 제6,136,563호 및 제6,608,183호를 참조할 수 있다. 미국 특허 제4,904,584호는 하나 이상의 리신 잔기가 결실되거나 또는 임의의 다른 아미노산 잔기로 치환되어 있는 리신을 가지 않은 PEG화된 폴리펩티드를 개시하고 있다. WO 99/67291은 단백질 상의 하나 이상의 아미노산 잔기가 결실되고, 단백질이 단백질에 컨쥬게이션하기에 충분한 조건 하에서 PEG와 접촉하는 것인 단백질을 PEG와 컨쥬게이션시키는 방법을 개시하고 있다. WO 99/03887은 성장 호르몬 슈퍼패밀리에 속하는 폴리펩티드의 PEG화된 변이체를 개시하고 있으며, 여기서 시스테인 잔기는 폴리펩티드의 특수 영역에 위치한 비본질적 아미노산 잔기로 치환되었다. WO 00/26354는 대응하는 모 폴리펩티드에 비해 하나 이상의 추가 글리코실화 부위를 포함하는 감소된 알레르기성을 갖는 글리코실화된 폴리펩티드 변이체를 생산하는 방법을 개시하고 있다.
또한, 용어 "hGH 폴리펩티드"는 폴리펩티드의 N-결합 또는 O-결합 글리코실화 형태를 포함한다. 단일 뉴클레오티드 변화를 보유하는 변이체는 hGH 폴리펩티드의 생물 활성 변이체로도 간주된다. 또한, 스플라이스 변이체 또한 포함된다. 또한, 용어 "hGH 폴리펩티드"는 화학적 수단에 의해 연결되어 있거나 융합 단백질로서 발현되어 있는, 임의의 하나 이상의 hGH 폴리펩티드 또는 임의의 다른 폴리펩티드, 단백질, 탄수화물, 중합체, 소분자, 리간드 또는 임의의 유형의 다른 활성 분 자의 헤테로이량체, 호모이량체, 헤테로다량체, 또는 호모다량체뿐만 아니라 예를 들어, 생물 활성을 여전히 유지하는 특정한 결실 또는 다른 변형을 보유하는 폴리펩티드 동족체를 포함한다.
본 명세서에 기재된 hGH에서의 아미노산 위치에 대한 모든 언급은 달리 명시하지 않는 한 (즉, 서열 번호 1, 서열 번호 3, 또는 다른 hGH 서열을 기준으로 비교하는 것으로 언급되는 경우) 서열 번호 2에서의 위치를 기준으로 한다. 당업자는 서열 번호 1, 2, 3 또는 임의의 다른 GH 서열 중의 위치에 대응하는 아미노산 위치를 임의의 다른 hGH 분자, 예를 들면 hGH 융합체, 변이체, 단편 등에서 용이하게 동정할 수 있다는 점을 명확히 이해할 것이다. 예를 들면, 서열 정렬 프로그램, 예를 들면 BLAST는 서열 번호 1, 2, 3, 또는 다른 GH 서열 중의 위치에 대응하는 단백질에서 특정 위치를 정렬하고 동정하는 데 사용될 수 있다. 또한, 서열 번호 1, 2, 3 또는 다른 GH 서열을 기준으로 본 명세서에 기재된 아미노산의 치환, 결실 또는 부가도 본 명세서에 기재되거나 또는 당분야에 공지된 hGH 융합체, 변이체, 단편 등에서의 대응하는 위치에서의 치환, 결실 또는 부가를 지칭하는 것으로 의도되며, 본 발명에 명시적으로 포함된다.
용어 "hGH 폴리펩티드"는 하나 이상의 아미노산 치환, 부가 또는 결실을 포함하는 4 개의 나선 다발 폴리펩티드를 포함한다. 본 발명의 hGH 폴리펩티드는 하나 이상의 비천연 아미노산 변형물과 함께 하나 이상의 천연 아미노산을 사용한 변형물을 포함할 수 있다. 자연 발생 hGH 폴리펩티드 중 매우 다양한 아미노산 위치에서의 예시적인 치환은 예를 들면, 아고니스트 활성을 증가시키거나, 폴리펩티드 의 용해도를 증가시키거나, 폴리펩티드를 길항제로 전환시키는 등을 포함하며 이에 한정되지 않는 hGH 폴리펩티드의 생물학적 활성 중 하나 이상을 조절하는 치환을 포함하며 이에 한정되지 않고, 용어 "hGH 폴리펩티드"에 포함된다.
인간 GH 길항제는 1, 2, 3, 4, 5, 8, 9, 11, 12, 15, 16, 19, 22, 103, 109, 112, 113, 115, 116, 119, 120, 123 및 127에서 치환을 갖는 것들 또는 위치 1에서 (즉, N-말단에서)의 부가 또는 그의 임의의 조합물 (서열 번호 2, 또는 서열 번호 1, 서열 번호 3 또는 임의의 다른 GH 서열에서의 대응하는 아미노산)을 포함하며 이에 한정되지 않는다. 일부 실시양태에서, hGH 길항제는 GH가 길항제로 작용하게 하는 영역 1-5 (N-말단), 6-33 (A 나선), 34-74 (A 나선과 B 나선 사이의 영역, A-B 루프), 75-96 (B 나선), 97-105 (B 나선과 C 나선 사이의 영역, B-C 루프), 106-129 (C 나선), 130-153 (C 나선과 D 나선 사이의 영역, C-D 루프), 154-183 (D 나선), 184-191 (C-말단)에서의 하나 이상의 치환을 포함한다. 다른 실시양태에서, 비-천연적으로 코딩된 아미노산의 예시적인 도입 부위는 나선 A 및 나선 C의 부분의 아미노 말단 영역을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, G120을 비-천연적으로 코딩된 아미노산, 예를 들면 p-아지도-L-페닐알라닌 또는 O-프로파르길-L-티로신으로 치환한다. 다른 실시양태에서, 상기 나열된 치환은 hGH 폴리펩티드를 hGH 길항제가 되게 하는 추가 치환과 합쳐진다. 예를 들면, 비-천연적으로 코딩된 아미노산은 본 명세서에서 동정된 위치 중 하나에서 치환되고, G120 (예를 들면, G120R, G120 K, G120W, G120Y, G120F 또는 G120E)에서 동시 치환이 도입된다. 일부 실시양태에서, hGH 길항제는 hGH 분자의 수용체 결합 영역 중에서 존재하는 수용성 중합체에 연결 된 비-천연적으로 코딩된 아미노산을 포함한다.
일부 실시양태에서, hGH 폴리펩티드는 hGH 폴리펩티드의 생물학적 활성을 조절하는 부가, 치환 또는 결실을 추가로 포함한다. 예를 들면, 부가, 치환 또는 결실은 hGH 폴리펩티드 수용체에 대한 친화성을 조절하거나, 수용체 이량체화를 조절하거나 (증가 또는 감소를 포함하며 이에 한정되지 않음), 수용체 이량체를 안정화시키거나, 순환 반감기를 조절하거나, 치료적 반감기를 조절하거나, 폴리펩티드의 안정성을 조절하거나, 투여량을 조절하거나, 방출 또는 생체이용률을 조절하거나, 정제를 용이하게 하거나 또는 특정 투여 경로를 개선하거나 변화시킬 수 있다. 유사하게, hGH 폴리펩티드는 프로테아제 분절 서열, 반응성 기, 항체 결합 도메인 (FLAG 또는 폴리-His를 포함하며 이에 한정되지 않음) 또는 다른 친화성 기재 서열 (FLAG, 폴리-His, GST 등을 포함하며 이에 한정되지 않음) 또는 폴리펩티드의 검출 (GFP를 포함하며 이에 한정되지 않음), 정제 또는 다른 형질을 개선시키는 연결된 분자 (바이오틴을 포함하며 이에 한정되지 않음)를 포함할 수 있다.
또한, 용어 "hGH 폴리펩티드"는 비-천연적으로 코딩된 아미노산 측쇄를 통해 동일하거나 또는 상이한 비-천연적으로 코딩된 아미노산 측쇄, 또는 천연적으로 코딩된 아미노산 측쇄에 직접 연결되거나 또는 링커를 통해 간접적으로 연결된 것들을 포함하며 이에 한정되지 않는 호모이량체, 헤테로이량체, 호모다량체 및 헤테로다량체를 포함한다. 예시적인 링커는 수용성 중합체, 예를 들면 폴리(에틸렌 글리콜) 또는 폴리덱스트란 또는 폴리펩티드를 포함하며 이에 한정되지 않는다.
"비-천연적으로 코딩된 아미노산"은 20 개의 일반 아미노산 중 하나 또는 피 로리신 (pyrolysine) 또는 셀레노시스테인 (selenocysteine)이 아닌 아미노산을 지칭한다. 용어 "비-천연적으로 코딩된 아미노산"과 동의어로 사용될 수 있는 다른 용어들로는 "비천연 아미노산," "비천연 아미노산," "비자연 발생 아미노산" 및 그들의 다양한 하이픈으로 연결된 형식 및 하이픈으로 연결되지 않은 형식이 있다. 또한, 용어 "비-천연적으로 코딩된 아미노산"은 천연적으로 코딩된 아미노산 (20 개의 일반 아미노산 또는 피로리신 및 셀레노시스테인을 포함하며 이에 한정되지 않음)의 변형물 (예를 들면, 번역 후 변형물)에 의해 발생하지만, 그 자체로는 번역 복합체(complex)에 의해 성장 폴리펩티드 사슬에 천연적으로 도입되지 않는 아미노산을 포함하며 이에 한정되지 않는다. 이러한 비자연 발생 아미노산의 예는 N-아세틸글루코사미닐-L-세린, N-아세틸글루코사미닐-L-트레오닌 및 O-포스포티로신을 포함하며 이에 한정되지 않는다.
"아미노 말단 변형기"는 폴리펩티드의 아미노 말단에 부착될 수 있는 임의의 분자를 지칭한다. 유사하게, "카르복시 말단 변형기"는 폴리펩티드의 카르복시 말단에 부착될 수 있는 임의의 분자를 지칭한다. 말단 변형 기는 펩티드의 혈청 반감기를 증가시키는 다양한 수용성 중합체, 펩티드 또는 단백질, 예를 들면 혈청 알부민, 또는 다른 부분(moiety)들을 포함하며 이에 한정되지 않는다.
용어 "작용기", "활성 부분", "활성화 기", "이탈기", "반응성 부위", "화학적 반응성 기" 및 "화학적 반응성 부분"은 당분야 및 본 명세서에서 분자의 독특한 정의가능한 부분 또는 단위를 지칭하는 것으로 사용된다. 이 용어들은 화학 분야에서는 다소 동일한 의미이며, 본 명세서에서는 일부 기능 또는 활성을 수행하고, 다 른 분자와 반응성을 갖는 분자의 부분을 나타내는 데 사용된다.
본 명세서에 사용된 용어 "결합" 또는 "링커"는 정상적으로 화학적 반응의 결과로 형성되고, 전형적으로 공유 결합인 기 또는 결합을 지칭한다. 가수분해로 안정한 결합은 결합이 수중에서 실질적으로 안정하고, 생리학적 조건 하에서 장기간 동안, 아마도 심지어 무기한 동안을 포함하며 이에 한정되지 않는 조건에서 유용한 pH 값에서 물과 반응하지 않는 것을 의미한다. 가수분해로 불안정한 또는 분해가능한 결합은 결합이 예를 들면, 혈액을 비롯한 물 또는 수용액에서 분해가능하다는 것을 의미한다. 효소적으로 불안정한 또는 분해가능한 결합은 결합이 하나 이상의 효소에 의해 분해될 수 있다는 것을 의미한다. 당분야에서 이해되고 있듯이, PEG 및 관련 중합체는 중합체 골격과 중합체 분자의 말단 작용기 중 하나 이상 사이 링커기 또는 중합체 골격 중에서 분해가능한 결합을 포함할 수 있다. 예를 들면, PEG 카르복실산 또는 활성화된 PEG 카르복실산을 생물학적 활성제 상에서 알코올 기와 반응시킴으로써 형성된 에스테르 결합은 일반적으로 이러한 약제를 방출시키는 생리학적 조건 하에서 가수분해된다. 다른 가수분해로 분해가능한 결합은 카르보네이트 결합, 아민 및 알데히드의 반응으로부터 유래하는 이민 결합, 알코올을 포스페이트기에 반응시킴으로써 형성되는 에스테르 결합, 히드라지드 및 알데히드의 반응 생성물인 히드라존 결합, 알데히드 및 알코올의 반응 생성물인 아세탈 결합, 포르메이트 및 알코올의 반응 생성물인 오르토에스테르 결합, 중합체, 예를 들면 PEG의 말단을 포함하며 이에 한정되지 않는 아민 기 및 펩티드의 카르복실기에 의한 펩티드 결합, 및 중합체의 말단을 포함하며 이에 한정되지 않는 포스포라미다 이트 기, 및 올리고뉴클레오티드의 5' 히드록실 기에 의해 형성된 올리고뉴클레오티드 결합을 포함하며 이에 한정되지 않는다.
용어 "생물 활성 분자", "생물 활성 부분" 또는 "생물학적 활성제"는 본 명세서에 사용된 경우 바이러스, 세균, 진균류, 식물, 동물 및 인간을 포함하며 이에 한정되지 않는 생물학적 유기체의 임의의 물리적 또는 생화학적 성질에 영향을 미칠 수 있는 임의의 물질을 의미한다. 특히, 본 명세서에 사용된 생물 활성 분자는 인간 또는 다른 동물의 질환의 진단, 치유, 완화, 치료 또는 예방하거나 또는 인간 또는 동물의 신체적 또는 정신적 안녕을 강화시키기 위한 임의의 물질을 포함하며 이에 한정되지 않는다. 생물 활성 분자의 예는 펩티드, 단백질, 효소, 소형 분자 약물, 염료, 지질, 뉴클레오시드, 올리고뉴클레오티드, 세포, 바이러스, 리포좀, 미세입자 및 마이셀(micelle)을 포함하며 이에 한정되지 않는다. 본 발명에 사용하기 적합한 생물학적 활성제의 부류는 항생제, 살진균제, 항바이러스제, 항염증제, 항종양제, 심혈관 약제, 항불안제, 호르몬, 성장 인자, 스테로이드성 약제 등을 포함하며 이에 한정되지 않는다.
"이작용 중합체"는 다른 잔기 (아미노산 측기(side group)를 포함하며 이에 한정되지 않음)와 특이적으로 반응하여 공유 또는 비공유 결합을 형성할 수 있는 2 개의 별개의 작용기를 포함하는 중합체를 지칭한다. 특정 생물학적 활성 성분 상의 기와 반응성을 갖는 한 작용기, 및 제2 생물학적 성분 상의 기와 반응성을 갖는 또 다른 기를 갖는 이작용 링커를 사용하여 제1 생물학적 활성 성분, 이작용 링커 및 제2 생물학적 활성 성분을 포함하는 컨쥬게이션물을 형성할 수 있다. 펩티드에 다 양한 화합물을 부착시키기 위한 많은 절차 및 링커 분자들이 공지되어 있다. 예를 들면, 본 명세서에 참고 문헌으로 인용되는 유럽 특허 출원 제188,256호, 미국 특허 제 4,671,958호, 제 4,659,839호, 제 4,414,148호, 제 4,699,784호, 제 4,680,338호, 제 4,569,789호 및 제 4,589,071호를 참조할 수 있다. "다작용성 중합체"는 다른 잔기 (아미노산 측기를 포함하며 이에 한정되지 않음)와 특이적으로 반응하여 공유 또는 비공유 결합을 형성할 수 있는 2 개 이상의 별개의 작용기를 포함하는 중합체를 지칭한다.
치환체 기가 왼쪽으로부터 오른쪽으로 쓰여진 그들의 통상적인 화학식에 의해 특정되는 경우, 이들은 오른쪽에서 왼쪽으로 쓰여진 구조 유래하는 화학적으로 동일한 치환체도 동등하게 포함하며, 예를 들면, 구조 -CH2O-는 구조 -OCH2-와 일치한다.
용어 "치환체"는 "비간섭 (non-interfering) 치환체"를 포함하며 이에 한정되지 않는다. "비간섭 치환체"는 안정한 화합물을 생성하는 기이다. 적합한 비간섭 치환체 또는 라디칼은 할로, C1-C10 알킬, C2-C10 알케닐, C2-C10 알키닐, C1-C10 알콕시, C1-C12 아랄킬, C1-C12 알크아릴, C3-C12 시클로알킬, C3-C12 시클로알케닐, 페닐, 치환된 페닐, 톨루오일, 크실레닐, 바이페닐, C2-C12 알콕시알킬, C2-C12 알콕시아릴, C7-C12 아릴옥시알킬, C7-C12 옥시아릴, C1-C6 알킬술피닐, C1-C10 알킬술포닐, --(CH2)m --O--(C1-C10 알킬) (여기서, m은 1 내지 8임), 아릴, 치환된 아릴, 치환된 알콕시, 플루오로알킬, 헤테로시클릭 라디칼, 치환된 헤테로시클릭 라디칼, 니트로알킬, --NO2, --CN, --NRC(O)--(C1-C10 알킬), --C(O)--(C1-C10 알킬), C2-C10 알킬 티오알킬, --C(O)O--(C1-C10 알킬), --OH, --SO2, =S, --COOH, --NR2 카르보닐, --C(O)--(C1-C10 알킬)-CF3, --C(O)-CF3, --C(O)NR2, --(C1-C10 아릴)-S--(C6-C10 아릴), --C(O)--(C1-C10 아릴), --(CH2)m --O--(--(CH2)m--0--(C1-C10 알킬) (여기서, 각각의 m은 1 내지 8임), --C(O)NR2, --C(S)NR2-- SO2NR2, --NRC(O) NR2, --NRC(S) NR2, 그의 염 등을 포함하며 이에 한정되지 않는다. 본 명세서에 사용된 각각의 R은 H, 알킬 또는 치환된 알킬, 아릴 또는 치환된 아릴, 아랄킬 또는 알크아릴이다.
용어 "할로겐"은 불소, 염소, 요오드 및 브롬을 포함한다.
용어 "알킬"은 달리 언급이 없으면, 그 자체로 또는 또 다른 치환체의 일부로서 완전히 포화되거나, 일포화되거나 또는 다포화될 수 있고, 지정된 탄소 원자의 수를 갖는 2가 및 다가 라디칼 (즉, C1-C10은 1 내지 10 개의 탄소를 의미함)을 포함할 수 있는 직쇄형 또는 분지형 사슬, 또는 시클릭 탄화수소 라디칼, 또는 그의 조합물을 의미한다. 포화 탄화수소 라디칼의 예는 기, 예를 들면 메틸, 에틸, n-프로필, 이소프로필, n-부틸, t-부틸, 이소부틸, sec-부틸, 시클로헥실, (시클로헥실)메틸, 시클로프로필메틸, n-펜틸, n-헥실, n-헵틸, n-옥틸 등 및 이들 동족체 및 이성체를 포함하며 이에 한정되지 않는다. 불포화된 알킬 기는 하나 이상의 이중 결합 또는 삼중 결합을 갖는 것이다. 불포화된 알킬 기의 예는 비닐, 2-프로페 닐, 크로틸, 2-이소펜테닐, 2-(부타디에닐), 2,4-펜타디에닐, 3-(1,4-펜타디에닐), 에티닐, 1-프로피닐 및 3-프로피닐, 3-부티닐, 및 고급 동족체 및 이성체를 포함하며 이에 한정되지 않는다. 또한, 용어 "알킬"은 달리 언급이 없으면, 이하 더 상세히 정의되는 알킬의 유도체, 예를 들면 "헤테로알킬"을 포함한 것을 의미한다. 탄화수소 기로 특정된 알킬 기를 "호모알킬"이라 칭한다.
용어 "알킬렌"은 그 자체로 또는 또 다른 치환체로 일부로서 구조 -CH2CH2- 및 -CH2CH2CH2CH2-에 의해 예시되고 이에 한정되지 않는 알칸으로부터 유도된 2가 라디칼을 의미하며, 하기에서 "헤테로알킬렌"으로 설명되는 기를 추가로 포함한다. 전형적으로, 알킬 (또는 알킬렌) 기는 1 내지 24 개의 탄소 원자를 갖고, 본 발명에서는 10 개 이하의 탄소 원자를 갖는 기가 바람직하다. "저급 알킬" 또는 "저급 알킬렌"은 일반적으로 8 개 이하의 탄소 원자를 갖는 짧은 사슬 알킬 또는 알킬렌 기이다.
용어 "알콕시," "알킬아미노" 및 "알킬티오" (또는 티오알콕시)는 그들의 통상적인 의미로 사용되며, 각각 산소 원자, 아미노 기 또는 황 원자를 통해 분자의 잔여부에 부착된 알킬 기를 지칭한다.
용어 "헤테로알킬"은 달리 언급이 없으면, 그 자체로 또는 또 다른 용어와 함께 언급된 수의 탄소 원자 및 0, N, Si 및 S로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 헤테로원자로 이루어진 안정한 직쇄형 또는 분지형 사슬, 또는 시클릭 탄화수소 라디칼 또는 그들의 조합물을 의미하며, 여기서 상기 질소 및 황 원자는 임의 적으로 산화될 수 있고, 질소 헤테로원자는 임의적으로 4급화될 수 있다. 헤테로원자(들) O, N 및 S 및 Si는 헤테로알킬 기의 임의의 내부 위치 또는 알킬 기가 분자의 잔여부에 부착되는 위치에 위치할 수 있다. 이의 예는 -CH2-CH2-O-CH3, -CH2-CH2-NH-CH3, -CH2-CH2-N(CH3)-CH3, -CH2-S-CH2-CH3, -CH2-CH2, -S(O)-CH3, -CH2-CH2-S(O)2-CH3, CH=CH-O-CH3, -Si(CH3)3, -CH2-CH=N-OCH3 및 -CH=CH-N(CH3)-CH3를 포함하며 이에 한정되지 않는다. 2 개 이하의 헤테로원자는 연속적일 수 있으며, 예를 들면, -CH2-NH-OCH3 및 -CH2-0-Si(CH3)3과 같다. 유사하게, 용어 "헤테로알킬렌"은 그 자체로 또는 또 다른 치환체의 일부로서 -CH2-CH2-S-CH2-CH2- 및 -CH2-S-CH2-CH2-NH-CH2-에 의해 예시되며 이에 한정되지 않는 헤테로알킬로부터 유도된 2가 라디칼을 의미한다. 또한, 헤테로알킬렌 기의 경우, 동일하거나 또는 상이한 헤테로원자는 사슬 말단의 한쪽 또는 양쪽 모두를 차지할 수 있다 (알킬렌옥시, 알킬렌디옥시, 알킬렌아미노, 알킬렌디아미노, 아미노옥시알킬렌 등을 포함하며 이에 한정되지 않음). 게다가, 알킬렌 및 헤테로알킬렌 결합 기의 경우, 결합 기의 화학식이 쓰여지는 방향은 결합 기의 배향을 내포하지 않는다. 예를 들면, 화학식 -C(O)2R'-는 -C(O)2R'- 및 -R'C(O)2- 양쪽 모두를 나타낸다.
용어 "시클로알킬" 및 "헤테로시클로알킬"은 달리 언급이 없으면, 그 자체로 또는 다른 용어와 함께, 각각 "알킬" 및 "헤테로알킬" 시클릭 형식을 나타낸다. 따라서, 시클로알킬 또는 헤테로시클로알킬은 포화된 고리 결합 및 불포화된 고리 결 합을 포함한다. 또한, 헤테로시클로알킬의 경우, 헤테로원자는 헤테로시클이 분자의 잔여부에 부착되는 위치를 차지할 수 있다. 시클로알킬의 예는 시클로펜틸, 시클로헥실, 1-시클로헥세닐, 3-시클로헥세닐, 시클로헵틸 등을 포함하며 이에 한정되지 않는다. 헤테로시클로알킬의 예는 1-(1,2,5,6-테트라히드로피리딜), 1-피페리디닐, 2-피페리디닐, 3-피페리디닐, 4-모르폴리닐, 3-모르폴리닐, 테트라히드로푸란-2-일, 테트라히드로푸란-3-일, 테트라히드로티엔-2-일, 테트라히드로티엔-3-일, 1-피페라지닐, 2-피페라지닐 등을 포함하며 이에 한정되지 않는다. 또한, 이 용어는 바이시클릭 및 트리시클릭 고리 구조를 포함한다. 유사하게, 용어 "헤테로시클로알킬렌"은 그 자체로 또는 또 다른 치환체의 일부로서 헤테로시클로알킬로부터 유도된 2가 라디칼을 의미하고, 용어 "시클로알킬렌"은 그 자체로 또는 또 다른 치환체의 일부로서 시클로알킬로부터 유도된 2가 라디칼을 의미한다.
본 명세서에 사용된 용어 "수용성 중합체"는 수성 용매 중에서 가용성인 임의의 중합체를 지칭한다. hGH 폴리펩티드에 수용성 중합체를 결합함으로써, 변형되지 않은 형태에 비해 증가된 또는 조절된 혈청 반감기 또는 증가된 또는 조절된 치료적 반감기, 조절된 면역원성, 조절된 물리적 회합 특징, 예를 들면 응집 및 다량체 형성, 변화된 수용체 결합 및 변화된 수용체 이량체화 또는 다량체화를 포함하며 이에 한정되지 않는 변화를 일으킬 수 있다. 수용성 중합체는 그 자신의 생물학적 활성을 가질 수 있거나 또는 가질 수 없다. 적합한 중합체는 폴리에틸렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜 프로피온알데히드, 그의 모노 C1-C10 알콕시 또는 아릴옥시 유도체 (본 명세서에 참고 문헌으로 인용되는 미국 특허 제 5,252,714호에 기재됨), 모노메톡시-폴리에틸렌 글리콜, 폴리비닐 피롤리돈, 폴리비닐 알코올, 폴리아미노산, 디비닐에테르 말레산 무수물, N-(2-히드록시프로필)-메타크릴아미드, 덱스트란, 덱스트란 술페이트를 비롯한 덱스트란 유도체, 폴리프로필렌 글리콜, 폴리프로필렌 옥시드/에틸렌 옥시드 공중합체, 폴리옥시에틸화된 폴리올, 헤파린, 헤파린 단편, 폴리사카라이드, 올리고사카라이드, 글리칸, 메틸셀룰로오스 및 카르복시메틸 셀룰로오스를 포함하며 이에 한정되지 않는 셀룰로오스 및 셀룰로오스 유도체, 전분 및 전분 유도체, 폴리펩티드, 폴리알킬렌 글리콜 및 그의 유도체, 폴리알킬렌 글리콜의 공중합체 및 그의 유도체, 폴리비닐 에틸 에테르, 및 알파-베타-폴리[(2-히드록시에틸)-DL-아스파르트아미드 등, 또는 그들의 혼합물을 포함하며 이에 한정되지 않는다. 이러한 수용성 중합체의 예는 폴리에틸렌 글리콜 및 혈청 알부민을 포함하며 이에 한정되지 않는다.
본 명세서에 사용된 용어 "폴리알킬렌 글리콜" 또는 "폴리(알켄 글리콜)"은 폴리에틸렌 글리콜 (폴리(에틸렌 글리콜)), 폴리프로필렌 글리콜, 폴리부틸렌 글리콜 및 그의 유도체를 지칭한다. 용어 "폴리알킬렌 글리콜"은 선형 및 분지형 중합체 양쪽 모두 및 0.1 kDa 내지 100 kDa의 평균 분자량을 포함한다. 다른 예시적인 실시양태들은 예를 들면, 상업적 공급업체 카탈로그, 예를 들면 쉐어워터 코퍼레이션 (Shearwater Corporation)의 카탈로그 ["Polyethylene Glycol and Derivatives for Biomedical Applications" (2001)]에 나열되어 있다.
용어 "아릴"은 달리 언급이 없으면, 함께 융합되거나 또는 공유 결합된 단일 고리 또는 다중 고리 (바람직하게는, 1 내지 3 개의 고리)일 수 있는 다포화, 방향족, 탄화수소 치환체를 의미한다. 용어 "헤테로아릴"은 N, O 및 S로부터 선택된 1 내지 4 개의 헤테로원자를 함유하고, 여기서 상기 질소 및 황 원자가 임의적으로 산화되고, 질소 원자(들)가 임의적으로 4급화되는 아릴 기 (또는 고리)를 지칭한다. 헤테로아릴 기는 헤테로원자를 통해 분자의 잔여부에 부착될 수 있다. 아릴 및 헤테로아릴 기의 비제한적인 예는 페닐, 1-나프틸, 2-나프틸, 4-바이페닐, 1-피롤릴, 2-피롤릴, 3-피롤릴, 3-피라졸릴, 2-이미다졸릴, 4-이미다졸릴, 피라지닐, 2-옥사졸릴, 4-옥사졸릴, 2-페닐-4-옥사졸릴, 5-옥사졸릴, 3-이속사졸릴, 4-이속사졸릴, 5-이속사졸릴, 2-티아졸릴, 4-티아졸릴, 5-티아졸릴, 2-푸릴, 3-푸릴, 2-티에닐, 3-티에닐, 2-피리딜, 3-피리딜, 4-피리딜, 2-피리미딜, 4-피리미딜, 5-벤조티아졸릴, 푸리닐, 2-벤즈이미다졸릴, 5-인돌릴, 1-이소퀴놀릴, 5-이소퀴놀릴, 2-퀴녹살리닐, 5-퀴녹살리닐, 3-퀴놀릴 및 6-퀴놀릴을 포함한다. 상기 언급된 각각의 아릴 및 헤테로아릴 고리계에 대한 치환체는 하기하는 허용되는 치환체의 군으로부터 선택된다.
간략히, 용어 "아릴"이 다른 용어들 (아릴옥시, 아릴티옥시, 아릴알킬을 포함하며 이에 한정되지 않음)과 함께 사용되는 경우 상기한 아릴 및 헤테로아릴 고리 양쪽 모두를 포함한다. 따라서, 용어 "아릴알킬"은 아릴 기가, 탄소 원자 (메틸렌기를 포함하며 이에 한정되지 않음)가 예를 들면, 산소 원자 (페녹시메틸, 2-피리딜옥시메틸, 3-(1-나프틸옥시)프로필 등을 포함하며 이에 한정되지 않음)에 의해 치환된 알킬 기를 비롯한 알킬 기 (벤질, 펜에틸, 피리딜메틸 등을 포함하며 이에 한정되지 않음)에 부착된 라디칼을 포함한 것을 의미한다.
상기 용어들 ("알킬," "헤테로알킬," "아릴" 및 "헤테로아릴"을 포함하며 이에 한정되지 않음) 각각은 지시된 라디칼 치환된 형태 및 비치환된 형태 양쪽 모두를 포함한 것을 의미한다. 각각의 타입의 라디칼에 대한 예시적인 치환체를 하기에 제공한다.
알킬 및 헤테로알킬 라디칼 (종종, 알킬렌, 알케닐, 헤테로알킬렌, 헤테로알케닐, 알키닐, 시클로알킬, 헤테로시클로알킬, 시클로알케닐, 및 헤테로시클로알케닐로 지칭되는 기 포함)에 대한 치환체는 0 내지 (2m' + 1) (여기서, m'는 이러한 라디칼 중의 총 탄소 원자의 수임) 범위의 수의 -OR', =O, =NR', =N-OR', -NR'R", -SR', -할로겐, -SiR'R''R''', -OC(O)R', -C(O)R', -CO2R', -CONR'R'', -OC(O)NR'R'', -NR''C(O)R', -NR'-C(O)NR''R''', -NR''C(O)2R', -NR-C(NR'R''R''')=NR'''', -NR-C(NR'R'')=NR''', -S(O)R', -S(O)2R', -S(O)2NR'R'', -NRSO2R', -CN 및 -NO2로부터 선택되며 이에 한정되지 않는 다양한 기 중 하나 이상일 수 있다. R', R", R"' 및 R""는 각각 독립적으로 수소, 치환되거나 또는 비치환된 헤테로알킬, 1-3 개의 할로겐으로 치환된 아릴을 포함하며 이에 한정되지 않는 치환되거나 또는 비치환된 아릴, 치환되거나 또는 비치환된 알킬, 알콕시 또는 티오알콕시 기 또는 아릴알킬 기를 지칭한다. 본 발명의 화합물이 하나 이상의 R 기를 포함하는 경우, 예를 들면, 각각의 R 기는 R', R", R"' 및 R"" 기 중 하나 이상이 존재하는 경우 독립적으로 R', R", R"' 및 R"" 기로부터 선택된다. R' 및 R"가 동일한 질소 원자에 부착된 경우, 이들은 질소 원자와 합쳐져 5원, 6원 또는 7원 고리를 형성할 수 있다. 예를 들면, -NR'R"는 1-피롤리디닐 및 4-모르폴리닐을 포함하며 이에 한정되지 않는 것을 의미한다. 치환체의 상기 논의로부터, 당업자는 용어 "알킬"이 수소 기 이외의 기에 결합된 탄소 원자를 포함하는 기, 예를 들면 할로알킬 (-CF3 및 -CH2CF3를 포함하며 이에 한정되지 않음) 및 아실 (-C(O)CH3, -C(O)CF3, -C(O)CH2OCH3 등을 포함하며 이에 한정되지 않음)을 포함한 것을 의미함을 이해할 것이다.
알킬 라디칼에 대해 기재된 치환체와 유사하게, 아릴 및 헤테로아릴 기에 대한 치환체는 다양하고, 0 내지 방향족 고리계 상의 총 개방 원자가 수 범위의 수로 다음으로부터 선택되며 이에 한정되지 않는다: 할로겐, -OR', =O, =NR', =N-OR', -NR'R'', -SR', -할로겐, -SiR'R''R''', -OC(O)R', -C(O)R', -CO2R', -CONR'R'', -OC(O)NR'R'', -NR''C(O)R', -NR'-C(O)NR''R''', -NR'''C(O)2R', -NRC(NR'R''R''')=NR'''', -NR-C(NR'R'')=NR''', -S(O)R', -S(O)2R', -S(O)2NR'R'', -NRSO2R', -CN 및 -NO2, -R', -N3, -CH(Ph)2, 플루오로(C1-C4)알콕시, 및 플루오로 (C1-C4)알킬 (여기서, R', R", R"' 및 R""는 수소, 알킬, 헤테로알킬, 아릴 및 헤테로아릴로부터 독립적으로 선택됨). 본 발명의 화합물이 하나 이상의 R 기를 포함하는 경우, 예를 들면, 각각의 R 기는 R', R", R"' 및 R"" 기 중 하나 이상이 존재하는 경우 독립적으로 R', R", R"' 및 R"" 기로부터 선택된다.
본 명세서에 사용된 용어 "조절된 혈청 반감기"는 그의 변형되지 않은 형태를 기준으로 변형된 생물 활성 분자의 순환 반감기에서의 양성 또는 음성적 변화를 의미한다. 혈청 반감기는 생물 활성 분자의 투여 후 다양한 시점에서 혈액 샘플을 취하고, 각각의 샘플 중에서 분자의 농도를 결정함으로써 측정된다. 혈청 농도와 시간의 상관 관계는 혈청 반감기를 계산할 수 있게 한다. 증가된 혈청 반감기는 바람직하게는 약 2 배 이상이지만, 예를 들면, 만족스러운 투여 요법을 가능케 하거나 또는 독성 효과를 피하는 경우 이보다 적은 증가도 유용할 수 있다. 일부 실시양태에서, 증가는 약 3 배 이상, 약 5 배 이상 또는 약 10 배 이상이다.
본 명세서에 사용된 용어 "조절된 치료적 반감기"는 그의 변형되지 않은 형태를 기준으로 치료적 유효량의 변형된 생물 활성 분자의 반감기의 양성적 변화 또는 음성적 변화를 의미한다. 치료적 반감기는 투여 후 다양한 시점에서 분자의 약동학적 및(또는) 약역학적 성질을 측정함으로써 측정된다. 바람직하게는, 증가된 치료적 반감기는 유익한 특정 투여 요법, 유익한 특정 총 투여량을 가능하게 하거나 또는 원치 않는 효과를 피할 수 있게 한다. 일부 실시양태에서, 치료적 반감기의 증가는 증가된 효능, 변형된 분자의 그의 표적에 대한 결합의 증가 또는 감소, 또는 변형되지 않은 분자의 작용 기전 또는 또 다른 매개변수의 증가로부터 비롯된다.
용어 "단리된"은 핵산 또는 단백질에 적용되는 경우, 핵산 또는 단백질이 천연 상태에서 회합되는 다른 세포 성분들을 실질적으로 함유하지 않는 것을 나타낸다. 이는 균질한 상태에서 이루어질 수 있다. 단리된 물질은 건조 또는 반건조 상 태이거나, 또는 수용액을 포함하며 이에 한정되지 않는 용액 중에 존재할 수 있다. 전형적으로, 순도 및 균질성은 분석 화학 기술, 예를 들면 폴리아크릴아미드 겔 전기영동 또는 고성능 액체 크로마토그래피를 사용하여 결정된다. 제제 중에 존재하는 우세한 종인 단백질은 실질적으로 정제된다. 특히, 단리된 유전자는 유전자를 플랭킹 (flanking)하고, 해당 유전자 외의 단백질을 코딩하는 오픈 리딩 프레임 (open reading frame)으로부터 분리된다. 용어 "정제된"은 핵산 또는 단백질이 전기영동 겔에서 실질적으로 한 밴드를 생성하는 것을 나타낸다. 특히, 이는 핵산 또는 단백질의 순도가 85 % 이상, 90 % 이상, 95 % 이상, 99 % 이상인 것을 의미한다.
용어 "핵산"은 단일 가닥 또는 이중 가닥 형태의 데옥시리보뉴클레오티드, 데옥시리보뉴클레오시드, 리보뉴클레오시드, 또는 리보뉴클레오티드 및 그의 중합체를 지칭한다. 특별히 달리 한정하지 않으면, 이 용어는 기준 핵산과 기준 핵산과 유사한 결합 성질을 갖고, 자연 발생 뉴클레오티드와 유사한 방식으로 대사되는 천연 뉴클레오티드의 공지된 유사체를 함유하는 핵산을 포함한다. 특별히 달리 한정하지 않으면, 이 용어는 또한 PNA (펩티도핵산)를 포함하는 올리고뉴클레오티드 유사체, 안티센스 (antisense) 기술에 사용되는 DNA의 유사체 (포스포로티오에이트, 포스포로아미데이트 등)를 지칭한다. 달리 언급이 없으면, 또한, 특정 핵산 서열은 보존적으로 변형된 그의 변이체 (축퇴 코돈 치환을 포함하며 이에 한정되지 않음) 및 상보적 서열, 뿐만 아니라 명시적으로 지시된 서열을 내재적으로 포함한다. 구체적으로, 축퇴 코돈 치환은 하나 이상의 선택된 (또는 모든) 코돈의 제 3 위치가 혼합된 염기 및(또는) 데옥시이노신 잔기로 치환되는 서열을 생성함으로써 수행될 수 있다 (문헌[Batzer et al., Nucleic Acids Res. 19: 5081 (1991); Ohtsuka et al., J. Biol. Chem. 260: 2605-2608 (1985); and Cassol et al. (1992); Rossolini et al., Mol. Cell. Probes 8: 91-98 (1994)] 참조).
용어 "폴리펩티드," "펩티드" 및 "단백질"은 아미노산 잔기의 중합체를 지칭하는 것으로 본 명세서에 상호교환적으로 사용된다. 즉, 폴리펩티드에 관한 설명은 펩티드에 관한 설명 및 단백질에 관한 설명에 동일하게 적용되고, 이의 역도 성립한다. 이 용어들은 자연 발생 아미노산 중합체, 뿐만 아니라 하나 이상의 아미노산 잔기가 비-천연적으로 코딩된 아미노산인 아미노산 중합체에 적용된다. 본 명세서에 사용된 용어들은 전장 단백질 (즉, 항원)을 비롯한 임의의 길이로 된 아미노산 사슬을 포함하며, 여기서 아미노산 잔기는 공유 펩티드 결합에 의해 결합된다.
용어 "아미노산"은 자연 발생 및 비자연 발생 아미노산, 뿐만 아니라 자연 발생 아미노산과 유사한 방식으로 기능하는 아미노산 유사체 및 아미노산 모사체를 지칭한다. 천연적으로 코딩된 아미노산은 20 개의 일반 아미노산 (알라닌, 아르기닌, 아스파라진, 아스파르트산, 시스테인, 글루타민, 글루탐산, 글리신, 히스티딘, 이소루신, 루신, 리신, 메티오닌, 페닐알라닌, 프롤린, 세린, 트레오닌, 트립토판, 티로신 및 발린) 및 피로리신 및 셀레노시스테인이다. 아미노산 유사체는 자연 발생 아미노산과 동일한 기본 화학 구조, 즉 수소에 결합된 α 탄소, 카르복실 기, 아미노 기, 및 R 기, 예를 들면 호모세린, 노르루신, 메티오닌 술폭시드, 메티오닌 메틸 술포늄을 갖는 화합물을 지칭한다. 이러한 유사체는 변형된 R 기 (예를 들면, 노르루신) 또는 변형된 펩티드 골격을 갖지만, 자연 발생 아미노산과 동일한 기본 화학 구조를 보유한다.
본 명세서에 아미노산은 IUPAC-IUB 생화학적 학명 위원회 (Biochemical Nomenclature Commission)에 의해 권장되는 통상 공지된 세 글자 기호 또는 한 글자 기호에 의해 지칭될 수 있다. 마찬가지로, 뉴클레오티드도 통상 허용되는 한 글자 코드에 의해 지칭될 수 있다.
"보존적으로 변형된 변이체"는 아미노산 및 핵산 서열 양쪽 모두에 적용된다. 특정 핵산 서열에 대해, "보존적으로 변형된 변이체"는 동일하거나 또는 필수적으로 동일한 아미노산 서열을 코딩하는 핵산을 지칭하거나, 또는 핵산이 아미노산 서열을 코딩하지 않는 경우 필수적으로 동일한 서열을 지칭한다. 유전자 코드의 축퇴성 (degeneracy)으로 인해, 다수의 기능적으로 동일한 핵산이 임의의 주어진 단백질을 코딩한다. 예를 들면, 코돈 GCA, GCC, GCG 및 GCU는 모두 아미노산 알라닌을 코딩한다. 따라서, 알라닌이 한 코돈에 의해 특정되는 모든 위치에서, 코돈은 코딩된 폴리펩티드를 변화시키지 않고 임의의 대응하는 코돈으로 변화될 수 있다. 이러한 핵산 변이는 보존적으로 변형된 변이의 한 종인 "침묵 변이 (silent variation)"이다. 또한, 본 명세서에서 폴리펩티드를 코딩하는 모든 핵산 서열은 핵산의 모든 가능한 침묵 변이를 기재한다. 당업자는 핵산 중의 각각의 코돈 (본래 메티오닌에 대한 유일한 코돈인 AUG 및 본래 트립토판에 대한 유일한 코돈인 TGG 제외)이 변형되어 기능적으로 동일한 분자를 생성할 수 있다는 것을 이해할 것이다. 따라서, 폴리펩티드를 코딩하는 핵산의 각 침묵 변이는 각각의 기재되는 서열 에 내재한다.
아미노산 서열에 관해, 당업자는, 단일 아미노산 또는 코딩된 서열 중 적은 %의 아미노산을 변화시키거나, 부가하거나 또는 결실하는 핵산, 펩티드, 폴리펩티드, 또는 단백질 서열에 대한 개개의 치환, 결실 또는 부가가, 이러한 변화가 아미노산을 화학적으로 유사한 아미노산으로 치환시키는 경우 "보존적으로 변형된 변이체"라는 것을 이해할 것이다. 기능적으로 유사한 아미노산을 제공하는 보존적 치환 표는 당분야에 공지되어 있다. 본 발명의 다형체 변이체, 종간 동족체 및 대립유전자 외에도 이러한 보존적으로 변형된 변이체가 존재하며, 이러한 변이체는 본 발명의 다형체 변이체, 종간 동족체 및 대립유전자를 배제하지 않는다.
다음의 8 개의 군 각각은 서로 보존적 치환인 아미노산을 함유한다.
1)알라닌 (A), 글리신 (G);
2) 아스파르트산 (D), 글루탐산 (E);
3) 아스파라진 (N), 글루타민 (Q);
4) 아르기닌 (R), 리신 (K);
5) 이소루신 (1), 루신 (L), 메티오닌 (M), 발린 (V);
6) 페닐알라닌 (F), 티로신 (Y), 트립토판 (W);
7) 세린 (S), 트레오닌 (T); 및
8) 시스테인 (C), 메티오닌 (M)
(예를 들면, 문헌[Creighton, Proteins: Structures and Molecular Properties (W H Freeman & Co.; 2nd Edition (December 1993)] 참조)
2 개 이상의 핵산 또는 폴리펩티드 서열의 내용 중에서 용어 "동일한" 또는 %"동일성"은 동일한 2 개 이상의 서열 또는 부분서열 (subsequence)을 지칭한다. 하기 서열 비교 알고리즘 중 하나를 사용하거나 또는 수동 정렬 및 육안 조사에 의해 측정시 비교 창, 또는 지정된 영역에 대한 최대 대응에 대해 비교하고 정렬할 때, 동일한 (즉, 특정화된 영역에 대해 약 60 % 동일성, 임의적으로 약 65 %, 약 70 %, 약 75 %, 약 80 %, 약 85 %, 약 90 % 또는 약 95 % 동일성) 아미노산 잔기 또는 뉴클레오티드 %를 갖는 경우, 서열은 "실질적으로 동일하다". 또한, 이 정의는 시험 서열의 상보체를 지칭한다. 동일성은 길이가 약 50 개 이상의 아미노산 또는 뉴클레오티드인 영역, 또는 길이가 75-100 개의 아미노산 또는 뉴클레오티드인 영역에 걸쳐 존재할 수 있거나, 또는 특정되지 않은 경우, 전체 서열 또는 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드에 걸쳐 존재할 수 있다.
서열 비교시, 전형적으로 한 서열이 기준 서열로 작용하고, 이에 시험 서열을 비교한다. 서열 비교 알고리즘을 사용하여, 시험 서열 및 기준 서열을 컴퓨터에 입력하는 경우, 부분서열 좌표가 지정되고, 필요에 따라, 서열 알고리즘 프로그램 매개변수가 지정된다. 디폴트 (Default) 프로그램 매개변수를 사용하거나, 또는 대체 매개변수를 지정할 수 있다. 그 다음, 서열 비교 알고리즘은 프로그램 매개변수를 기초로 기준 서열에 대한 시험 서열의 % 서열 동일성을 계산한다.
본 명세서에 사용된 "비교 창"은 20 내지 600 개, 통상적으로 약 50 내지 약 200 개, 더욱 통상적으로 약 100 내지 약 150 개의 인접 위치 수 중 하나로 이루어진 군으로부터 선택된 절편에 대한 기준을 포함하며, 여기서 서열은 두 개의 서열 이 최적으로 정렬된 후 동일한 수의 인접 위치의 기준 서열과 비교될 수 있다. 비교를 위한 서열의 정렬 방법은 당분야에 공지되어 있다. 비교를 위한 서열의 최적의 정렬은 문헌[Smith and Waterman (1970) Adv. Appl. Math. 2: 482c]의 국소 상동성 알고리즘, 문헌[Needleman and Wunsch (1970) J Mol. Biol. 48: 443]의 상동성 정렬 알고리즘, 문헌[Pearson and Lipman (1988) Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 85; 2444]의 유사성 방법 탐색, 이들 알고리즘의 컴퓨터화된 실행 ([Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI]에서의 GAP, BESTFIT, FASTA 및 TFASTA), 또는 수동 정렬 및 육안 조사(예를 들면, 문헌[Ausubelet al., Current Protocols in Molecular Biology (1995 supplement)] 참조)를 포함하며 이에 한정되지 않는 것에 의해 수행될 수 있다.
% 서열 동일성 및 서열 유사성을 결정하기 적합한 알고리즘의 한 예로는 각각 문헌[Altschul et al. (1977) Nuc. Acids Res. 25: 3389-3402, and Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215: 403-410]에 기재되어 있는 BLAST 및 BLAST 2.0 알고리즘이 있다. BLAST 분석 수행용 소프트웨어는 국립 생명공학 정보 센터 (National Center for Biotechnology Information)를 통해 공개적으로 입수가능하다. BLAST 알고리즘 매개변수 W, T 및 X는 정렬의 감도 및 속도를 결정한다. BLASTN 프로그램 (뉴클레오티드 서열의 경우)은 디폴트로서 단어 길이 (wordlength; W) 11, 기대값 (E) 10, M = 5, N = -4 및 양쪽 가닥의 비교를 사용한다. 아미노산 서열의 경우, BLASTP 프로그램은 디폴트로서 단어 길이 3 및 기대값 (E) 10, 및 BLOSUM62 스코어링 (스코어링) 메트릭스 (문헌[Henikoff and Henikoff (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 10915] 참조) 정렬 (B) 50, 기대값 (E) 10, M = 5, N = -4 및 양쪽 가닥의 비교를 사용한다. 전형적으로, BLAST 알고리즘은 턴 오프된 (turned off) "저 복잡성 (complexity)" 필터를 사용하여 수행된다.
또한, BLAST 알고리즘은 2 개의 서열 사이의 유사성을 통계적으로 분석한다 (예를 들면, 문헌[Karlin and Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5873-5787] 참조). BLAST 알고리즘에 의해 제공되는 유사성의 한 기준은 2 개의 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열 사이의 매칭 (matching)이 우연히 발생하는 확률의 지표를 제공하는 최소 합계 확률 (P(N))이다. 예를 들면, 기준 핵산에 대해 시험 핵산을 비교할 때 최소 합계 확률이 약 0.2 미만, 더욱 바람직하게는 약 0.01 미만, 가장 바람직하게는 약 0.001 미만인 경우, 핵산은 기준 서열과 유사한 것으로 간주된다.
어구 "에 선택적으로 (또는 특이적으로) 혼성화한다"는 서열이 착물 혼합물 (총 세포 또는 라이브러리 DNA 또는 RNA를 포함하며 이에 한정되지 않음) 중에 존재하는 경우 엄격한 혼성화 조건 하에서 특정 뉴클레오티드 서열에만 분자를 결합시키거나, 이중체화하거나 또는 혼성화하는 것을 지칭한다.
구 "엄격한 혼성화 조건"은 당분야에 공지된 바와 같이 낮은 이온 강도 및 고온 조건을 지칭한다. 전형적으로, 엄격한 조건 하에서, 프로브는 핵산의 착물 혼합물 (총 세포 또는 라이브러리 DNA 또는 RNA를 포함하며 이에 한정되지 않음) 중의 그의 표적 부분서열에 혼성화하지만, 착물 혼합물 중의 다른 서열에는 혼성화하지 않는다. 엄격한 조건은 서열 의존성이고, 상이한 환경 중에서는 상이할 수 있 다. 서열이 길수록 특이적으로 더 높은 온도에서 혼성화한다. 핵산의 혼성화에 대한 광범위한 안내는 문헌[Tijssen, Techzques in Biochemistry and Molecular Biology--Hybridization with Nucleic Probes, "Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid assays" (1993)]에서 발견된다. 일반적으로, 엄격한 조건은 정해진 이온 강도 pH에서 특이적 서열에 대한 융점 (Tm)보다 약 5-10 ℃ 낮게 선택된다. Tm은 표적에 상보적인 프로브의 50 %가 평형 상태에서 표적 서열에 혼성화하는 (표적 서열이 과량으로 존재함에 따라, Tm에서, 평형 상태에서 프로브의 50 %가 존재함) 온도 (정해진 이온 강도, pH 및 핵산 농도 하에서)이다. 엄격한 조건은 염 농도가 pH 7.0 내지 8.3에서 약 1.0 M 미만, 전형적으로 약 0.01 내지 1.0 M의 나트륨 이온 농도 (또는 다른 염)이고, 온도가 짧은 프로브 (10 내지 50 개의 뉴클레오티드를 포함하며 이에 한정되지 않음)의 경우 약 30 ℃ 이상이고, 긴 프로브 (50 개 초과의 뉴클레오티드를 포함하며 이에 한정되지 않음)의 경우 약 60 ℃ 이상인 것일 수 있다. 또한, 엄격한 조건은 탈안정화제, 예를 들면 포름아미드의 첨가를 사용하여 얻을 수 있다. 선택적 또는 특이적 혼성화의 경우, 양성 신호는 배경 (background) 혼성화의 2 배 이상, 임의적으로 10 배일 수 있다. 예시적인 엄격한 혼성화 조건은 다음과 같을 수 있다: 50 % 포름아미드, 5 X SSC, 및 1 % SDS, 42 ℃에서 인큐베이션, 또는 5 X SSC, 1 % SDS, 65 ℃에서 인큐베이션과 65 ℃에서 0.2 X SSC 및 0.1 % SDS로 세척. 이러한 세척은 5, 15, 30, 60, 120 분 이상 수행될 수 있다.
본 명세서에 사용된 용어 "진핵생물"은 계통발생적 도메인 진핵생물류 (Eucarya), 예를 들면 동물 (포유류, 곤충, 파충류, 조류 등을 포함하며 이에 한정되지 않음), 섬모충, 식물 (외떡잎 식물, 쌍떡잎 식물, 해조류 등을 포함하며 이에 한정되지 않음), 진균류, 효모, 편모충, 미포자충, 원생생물 등에 속하는 유기체를 지칭한다.
본 명세서에 사용된 용어 "비-진핵생물"은 비-진핵생물 유기체를 지칭한다. 예를 들면, 비-진핵생물 유기체는 유박테리아 (Eubacteria) (에스케리치아 콜라이, 써모스 써모필루스 (thermos thermophilus), 바실러스 스테아로써모필루스 (Bacillus stearothermophilus), 슈도모나스 플루오레센스 (Pseudomonas fluorescens), 슈도모나스 에루기노사 (Pseudomonas aeruginosa), 슈도도모나스 푸티다 (Pseudomonas putida) 등을 포함하며 이에 한정되지 않음) 계통발생적 도메인, 또는 아키아 (Archaea) (메타노코쿠스 잔나스키이 (Methanococcus jannaschii), 메타노박테리움 써모오토트로피쿰 (Methanobacterium thermoautotrophicum), 할로박테리움 (Halobacterium), 예를 들면 할로페락스 볼카니이 (Haloferax volcanii) 및 할로박테리움 종 NRC-1, 아키오글로부스 풀기더스 (Archaeoglobus fulgidus), 피로코쿠스 푸리오서스 (Pyrococcus furiosus), 피로코쿠스 호리코쉬이이 (Pyrococcus horikoshii), 애우로피룸 페르닉스 (Aeuropyrum pernix) 등을 포함하며 이에 한정되지 않음) 계통발생적 도메인에 속할 수 있다.
본 명세서에 사용된 용어 "피험자"는 치료, 관찰 또는 실험의 대상인 동물, 바람직하게는, 포유류, 가장 바람직하게는 인간을 지칭한다.
본 명세서에 사용된 용어 "유효량"은 치료되는 질환, 조건 또는 장애의 증상 중 하나 이상을 일정한 정도로 경감시키는 투여되는 (변형된) 비천연 아미노산 폴리펩티드의 양을 지칭한다. 본 명세서에 기재된 (변형된) 비천연 아미노산 폴리펩티드를 함유하는 조성물은 예방 치료, 강화 치료 및(또는) 치료적 치료의 목적으로 투여될 수 있다.
용어 "강화시키다" 또는 "강화"는 원하는 효과의 효능 또는 기간을 늘리거나 또는 연장하는 것을 의미한다. 따라서, 치료제의 효과를 강화시키는 것과 관련하여, 용어 "강화"는 한 시스템에 대한 다른 치료제의 효능 또는 기간을 늘리거나 또는 연장시킬 수 있는 능력을 지칭한다. 본 명세서에 사용된 "강화-유효량"은 원하는 시스템에서 또 다른 치료제의 효과를 강화시키는 데 적합한 양을 지칭한다. 환자에게 사용되는 경우, 이러한 용도에 유효한 양은 심도 및 질환, 장애 또는 상태의 과정, 이전 요법, 환자의 건강 상태 및 약물에 대한 반응 및 의사의 판단에 따라 좌우되게 된다.
본 명세서에 사용된 용어 "변형된"은 폴리펩티드 상의 번역 후 변형의 존재를 지칭한다. "(변형된)"의 형태를 갖는 용어는 논의되는 폴리펩티드가 임의적으로 변형된 것인, 즉 논의되는 폴리펩티드가 변형되거나 또는 변형되지 않을 수 있다는 것을 의미한다.
용어 "번역 후 변형된" 및 "변형된"은 폴리펩티드 사슬에 도입된 후 이러한 아미노산에 발생하는 천연 또는 비천연 아미노산의 임의의 변형을 지칭한다. 이 용어는 오직 예시를 위한 것인 공번역 (co-translation) 생체 내 변형물, 번역 후 생 체 내 변형물 및 번역 후 시험관 내 변형물을 포함한다.
예방적 적용시, (변형된) 비천연 아미노산 폴리펩티드를 함유하는 조성물을 특정 질환, 장애 또는 상태에 걸리기 쉽거나 또는 걸릴 위험이 있는 환자에게 투여한다. 이러한 양은 "예방적 유효량"으로 정의된다. 이러한 사용시, 또한, 정확한 양은 환자의 건강 상태, 체중 등에 따라 좌우된다. 통상의 실험 (예를 들면, 투여량 증가 (dose escalation) 임상 시험)에 의해서 이러한 예방적 유효량을 결정하는 것은 당분야의 지식 내에 속하는 것으로 고려된다.
용어 "보호된"은 특정한 반응 조건 하에서 화학적 반응성 작용기의 반응을 방지하는 "보호기" 또는 부분의 존재를 지칭한다. 보호기는 보호되는 화학적 반응성 기의 타입에 따라 변화한다. 예를 들면, 화학적 반응성 기가 아민 또는 히드라지드인 경우, 보호기는 tert-부틸옥시카르보닐 (t-Boc) 및 9-플루오레닐메톡시카르보닐 (Fmoc)의 군으로부터 선택될 수 있다. 화학적 반응성가 티올인 경우, 보호기는 오르토피리딜디술피드일 수 있다. 화학적 반응성 기가 카르복실산, 예를 들면 부탄산 또는 프로피온산, 또는 히드록실 기인 경우, 보호기는 벤질 또는 알킬 기, 예를 들면 메틸, 에틸, 또는 tert-부틸일 수 있다. 또한, 당분야에 공지된 다른 보호기들도 본 명세서에 기재된 방법 및 조성물에 또는 이와 함께 사용될 수 있다.
예로써, 차단기/보호기는 하기로부터 선택될 수 있다.
Figure 112006059749857-pct00004
다른 보호기는 그 전문이 본 명세서에 참고 문헌으로 인용되는 문헌[Greene and Wuts, Protective Groups in Organic Synthesis, 3rd Ed., John Wiley & Sons, New York, NY, 1999]에 기재되어 있다.
치료적 적용시, (변형된) 비천연 아미노산 폴리펩티드를 함유하는 조성물을 이미 질환, 상태 또는 장애를 앓고 있는 환자에게 질환, 장애 또는 상태의 증상을 치유하거나 또는 적어도 부분적으로 정지시키기 충분한 양으로 투여한다. 이러한 양은 "치료적 유효량"으로 정의되고, 심도 및 질환, 장애 또는 상태의 과정, 이전 요법, 환자의 건강 상태 및 약물에 대한 반응 및 의사의 판단에 따라 좌우되게 된다. 이러한 치료적 유효량을 통상의 실험 (예를 들면, 투여량 증가 임상 시험)에 의한 결정하는 것은 당분야의 지식 내에 속하는 것으로 고려된다.
용어 "치료(하는 것)"은 예방적 치료 및(또는) 치료적 치료를 지칭하는 데 사용된다.
달리 언급이 없으면, 당업계의 기술에 속하는 질량 분광법, NMR, HPLC, 단백질 화학, 생화학, 재조합 DNA 기술 및 약리학 통상적인 방법이 사용된다.
상세한 설명
I. 도입
본 발명에서는 하나 이상의 비천연 아미노산을 포함하는 4 개의 나선 다발 분자가 제공된다. 본 발명의 특정한 실시양태에서, 하나 이상의 비천연 아미노산을 갖는 hGH 폴리펩티드는 하나 이상의 번역 후 변형물을 포함한다. 한 실시양태에서, 하나 이상의 번역 후 변형물은 제2 반응성 기를 포함하는 표지, 염료, 중합체, 수용성 중합체, 폴리에틸렌 글리콜의 유도체, 광가교결합제 (photocrosslinker), 세포독성 화합물, 약물, 친화성 표지, 광친화성 표지, 반응성 화합물, 수지, 제2 단백질 또는 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 유사체, 항체 또는 항체 단편, 금속 킬레이트화제 (metal chelator), 보조인자, 지방산, 탄수화물, 폴리뉴클레오티드, DNA, RNA, 안티센스 폴리뉴클레오티드, 억제성 리보핵산, 생물소재, 나노입자, 스핀 표지, 형광발색단 (fluorophore), 금속 함유 부분, 방사능 부분, 신규한 작용기, 다른 분자와 공유적으로 또는 비공유적으로 상호작용하는 기, 포토케이징된 (photocaged) 부분, 광이성화가능한 부분, 바이오틴, 바이오틴의 유사체, 바이오틴 유사체, 중 원자를 도입시킨 부분, 화학적으로 분절가능한 기, 광분절성 (photocleavable) 기, 연장된 측쇄, 탄소-결합 당, 산화환원 활성제, 아미노 티오 산, 독성 부분, 동위 원소로 표지화된 부분, 생체물리적 프로브, 형광 기, 화학발광 (chemiluminescent) 기, 고 전자 밀도 기, 부분(moiety) 기, 삽입성 (intercalating) 기, 발색단 (chromophore), 에너지 전달제, 생물학적 활성제, 검출가능한 표지, 소형 분자 또는 상기 또는 임의의 다른 바람직한 화합물 또는 물질의 임의의 조합물을 포함하며 이에 한정되지 않는 분자를 특정 반응성 기에 적합한 것으로 당업자에게 공지되어 있는 화학 방법론을 사용하여 제1 반응성 기를 포함하는 하나 이상의 비천연 아미노산에 부착시킨 것을 포함한다. 예를 들면, 제1 반응성 기는 알키닐 부분 (비천연 아미노산 중 p-프로파르길옥시페닐알라닌을 포함하며 이에 한정되지 않으며, 여기서 프로파르길기는 때때로 아세틸렌 부분으로도 지칭됨)이고, 제2 반응성 기는 아지도 부분이고, [3 + 2] 시클로부가 화학 방법론이 사용된다. 또 다른 예에서, 제1 반응성 기는 아지도 부분 (비천연 아미노산 중의 p-아지도-L-페닐알라닌을 포함하며 이에 한정되지 않음)이고, 제2 반응성 기는 알키닐 부분이다. 본 발명의 변형된 hGH 폴리펩티드의 특정한 실시양태에서, 하나 이상의 번역 후 변형물을 포함하는 하나 이상의 비천연 아미노산 (케토 작용기를 함유하는 비천연 아미노산을 포함하며 이에 한정되지 않음)은 하나 이상의 번역 후 변형물이 사카라이드 부분을 포함하는 경우 사용된다. 특정한 실시양태에서, 번역 후 변형물은 진핵 세포 또는 비진핵 세포 중에서 생체 내 생성된다.
특정한 실시양태에서, 단백질은 한 숙주 세포에 의해 생체 내 생성되는 하나 이상의 번역 후 변형물을 포함하며, 여기서 번역 후 변형물은 또 다른 숙주 세포 타입에 의해서는 정상적으로 생성되지 않는다. 특정한 실시양태에서, 단백질은 진 핵 세포에 의해 생체 내 생성되는 하나 이상의 번역 후 변형물을 포함하며, 여기서 번역 후 변형물은 비진핵 세포에 의해서는 정상적으로 생성되지 않는다. 번역 후 변형물의 예는 아세틸화, 아실화, 지질-변형, 팔미토일화, 팔미테이트 부가, 인산화, 당지질-결합 변형물 등을 포함하며 이에 한정되지 않는다. 한 실시양태에서, 번역 후 변형물은 GlcNAc-아스파라진 결합에 의해 올리고사카라이드를 아스파라진에 부착시킨 것을 포함한다 (올리고사카라이드가 (GlcNAc-Man)2-Man-GIcNAc-GlcNAc 등을 포함하는 경우를 포함하며 이에 한정되지 않음). 또 다른 실시양태에서, 번역 후 변형물은 GalNAc-세린, GalNAc-트레오닌, GlcNAc-세린, 또는 GlcNAc-트레오닌 결합에 의해 올리고사카라이드 (Gal-GalNAc, Gal-GlcNAc 등을 포함하며 이에 한정되지 않음)를 세린 또는 트레오닌에 부착시킨 것을 포함한다. 특정한 실시양태에서, 본 발명의 단백질 또는 폴리펩티드는 분비 또는 국소화된 서열, 에피토프 태그 (tag), FLAG 태그, 폴리히스티딘 태그, GST 융합 등을 포함할 수 있다.
본 발명의 단백질 또는 폴리펩티드는 하나 이상, 2 개 이상, 3 개 이상, 4 개 이상, 5 개 이상, 6 개 이상, 7 개 이상, 8 개 이상, 9 개 이상 또는 10 개 이상의 비천연 아미노산을 함유할 수 있다. 비천연 아미노산은 동일하거나 또는 상이할 수 있으며, 예를 들면, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 개 이상의 상이한 비천연 아미노산을 포함하는 단백질 중에서 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 개 이상의 상이한 부위가 존재할 수 있다. 특정한 실시양태에서, 단백질 자연 발생 형식 중에 존재하는 하나 이상의, 그러나 전부에는 못 미치는 특정 아미노산은 비천연 아미노 산으로 치환된다.
본 발명은 하나 이상의 비-천연적으로 코딩된 아미노산을 포함하는 GH 수퍼유전자 패밀리의 구성원, 특히 hGH를 기초로 하는 방법 및 조성물을 제공한다. 하나 이상의 비-천연적으로 코딩된 아미노산을 GH 수퍼유전자 패밀리 구성원에 도입시키는 것은 통상 발생하는 20 개의 아미노산과 반응하지 않으면서 하나 이상의 비-천연적으로 코딩된 아미노산을 포함하며 이에 한정되지 않는 것과 특이적으로 화학 반응하는 것을 포함하는 컨쥬게이션 화학 작용을 적용할 수 있게 한다. 일부 실시양태에서, 비-천연적으로 코딩된 아미노산을 포함하는 GH 수퍼유전자 패밀리 구성원은 비-천연적으로 코딩된 아미노산의 측쇄를 통해 수용성 중합체, 예를 들면 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)에 결합된다. 본 발명은 케톤, 아지드 또는 아세틸렌 부분을 포함하며 이에 한정되지 않는 20 개의 천연적으로 도입된 아미노산에서는 발견되지 않는 작용기 또는 치환체를 함유하는 아미노산을 포함하며 이에 한정되지 않는 비유전자로 코딩된 아미노산을 셀렉터 코돈에 대응하여 단백질에 선택적으로 도입시키고, 이러한 아미노산을 적합한 반응성 PEG 유도체를 사용하여 추후 변형시키는 것을 포함하는 것인 PEG 유도체를 사용하여 단백질을 선택적으로 변형시키는 데에 매우 효과적인 방법을 제공한다. 아미노산 측쇄는 도입된 후, 천연적으로 코딩된 아미노산에 존재하는 특정 작용기 또는 치환체에 적합한 것으로 당업자에게 공지된 화학 방법론을 사용하여 변형될 수 있다. 수용성 중합체를 단백질에 도입시키는 데 매우 다양한 공지된 화학 방법론들이 본 발명에 사용하기 적합하다. 이러한 방법론은 각각 아세틸렌 또는 아지드 유도체를 포함하며 이에 한정되지 않는 것과 의 휘스겐 [3 + 2] 시클로부가 반응 (예를 들면, 문헌[Padwa, A. in Comprehensive Organic Synthesis, Vol. 4, (1991) Ed. Trost, B. M., Pergamon, Oxford, p. 1069-1109; and, Huisgen, R. in 1,3-Dipolar Cycloaddition Chemistry, (1984) Ed. Padwa, A., Wiley, New York, p. 1-176] 참조)을 포함하며 이에 한정되지 않는다.
휘스겐 [3 + 2] 시클로부가 방법은 친핵성 치환 반응이 아닌 시클로부가를 포함하기 때문에, 단백질은 극히 높은 선택성으로 변형될 수 있다. 반응은 실온에서 수성 조건에서 우수한 위치선택성 (regioselectivity) (1,4 > 1,5)으로 촉매량의 Cu (I) 염을 반응 혼합물에 첨가함으로써 수행될 수 있다. 예를 들면, 문헌[Tornoe, et al., (2002) Org. Chem. 67: 3057-3064; and, Rostovtsev, et al., (2002) Angew. Chem. Int. Ed. 41: 2596-2599]; 및 WO 03/101972를 참조할 수 있다. [3 + 2] 시클로부가를 통해 본 발명의 단백질에 부가시킬 수 있는 분자는 아지도 또는 아세틸렌 유도체를 포함하며 이에 한정되지 않는 적합한 작용기 또는 치환체를 갖는 거의 모든 분자를 포함한다. 이러한 분자들은 각각 p-아지도-페닐알라닌을 포함하며 이에 한정되지 않는 아지도 기 또는 p-프로파르길옥시페닐알라닌을 포함하며 이에 한정되지 않는 아세틸렌 기를 갖는 비천연 아미노산에 부가될 수 있다.
일반적으로, 휘스겐 [3 + 2] 시클로부가로부터 유래하는 5원 고리는 환원 환경에서 가역적이지 않고, 장기간 동안 수성 환경에서 가수분해에 안정하다. 결과적으로, 매우 다양한 물질의 물리적 및 화학적 특징은 본 발명의 활성 PEG 유도체를 사용하여 요구되는 수성 조건 하에서 변형될 수 있다. 훨씬 더 중요하게는, 아지드 및 아세틸렌 부분이 서로 특이적 (그리고, 예를 들면, 유전자에 코딩된 20 개의 일반 아미노산 중 어느 것과도 반응하지 않음)이기 때문에, 단백질은 극히 높은 선택성으로 하나 이상의 특이적 부위에서 변형될 수 있다.
또한, 본 발명은 하나 이상의 아세틸렌 또는 아지드 부분을 갖는 PEG 유도체 및 관련된 친수성 중합체의 수용성이고, 가수분해로 안정한 유도체를 제공한다. 아세틸렌 부분을 함유하는 PEG 중합체 유도체는 셀렉터 코돈에 대응하여 단백질에 선택적으로 도입된 아지드 부분과의 커플링에 매우 선택적이다. 유사하게, 아지드 부분을 함유하는 PEG 중합체 유도체는 셀렉터 코돈에 대응하여 단백질에 선택적으로 도입된 아세틸렌 부분의 커플링에 매우 선택적이다.
더욱 구체적으로, 아지드 부분은 알킬 아지드, 아릴 아지드 및 이러한 아지드의 유도체를 포함하며 이에 한정되지 않는다. 알킬 및 아릴 아지드의 유도체는 아세틸렌-특이적 반응성이 유지되는 한 다른 치환체를 포함할 수 있다. 아세틸렌 부분은 알킬 및 아릴 아세틸렌 및 이들의 유도체를 포함한다. 알킬 및 아릴 아세틸렌의 유도체는 아지드-특이적 반응성이 유지되는 한 다른 치환체를 포함할 수 있다.
본 발명은 매우 다양한 작용기, 치환체 또는 부분(moiety) 갖는 물질과, 표지, 염료, 중합체, 수용성 중합체; 폴리에틸렌 글리콜의 유도체, 광가교결합제, 세포독성 화합물, 약물, 친화성 표지, 광친화성 표지, 반응성 화합물, 수지, 제2 단백질 또는 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 유사체, 항체 또는 항체 단편, 금속 킬레이 트화제, 보조인자, 지방산, 탄수화물, 폴리뉴클레오티드, DNA, RNA, 안티센스 폴리뉴클레오티드, 억제성 리보핵산, 생물소재, 나노입자, 스핀 표지, 형광발색단, 금속 함유 부분, 방사능 부분, 신규한 작용기, 다른 분자와 공유적으로 또는 비공유적으로 상호작용하는 기, 포토케이징된 부분, 광이성화가능한 부분, 바이오틴, 바이오틴의 유사체, 바이오틴 유사체, 중 원자를 도입시킨 부분, 화학적으로 분절가능한 기, 광분절성 기, 연장된 측쇄, 탄소-결합 당, 산화환원 활성제, 아미노 티오산, 독성 부분, 동위 원소로 표지화된 부분, 생체물리적 프로브, 형광 기, 화학발광 기, 고 전자 밀도 기, 부분 기, 삽입성 기, 발색단, 에너지 전달제, 생물학적 활성제, 검출가능한 표지, 소형 분자, 또는 상기 또는 임의의 다른 바람직한 화합물 또는 물질의 임의의 조합물을 포함하며 이에 한정되지 않는 다른 물질의 컨쥬게이션물을 제공한다. 또한, 본 발명은 아지드 또는 아세틸렌 부분을 갖는 물질과 대응하는 아세틸렌 또는 아지드 부분을 갖는 PEG 중합체 유도체의 컨쥬게이션물을 포함한다. 예를 들면, 아지드 부분을 함유하는 PEG 중합체는 아세틸렌 작용가를 함유하는 비유전자로 코딩된 아미노산을 함유하는 단백질 중의 위치에서 생물 활성 분자에 커플링할 수 있다. PEG 및 생물 활성 분자가 커플링됨으로써 발생하는 결합은 휘스겐 [3 + 2] 시클로부가 생성물을 포함하며 이에 한정되지 않는다.
PEG가 생물소재의 표면을 변형시키는 데 사용될 수 있다는 점은 당분야에 잘 정립되어 있다 (예를 들면, 본 명세서에 참고 문헌으로 인용되는 미국 특허 제 6,610,281호, 문헌[Mehvar, R., J. Pharmaceut. Sci., 3 (1); 125-136 (2000)] 참조). 또한, 본 발명은 휘스겐 [3 + 2] 시클로부가 결합을 통해 표면에 커플링된 본 발명의 아지드함유 중합체 또는 아세틸렌 함유 중합체 중 하나 이상 및 하나 이상의 반응성 아지드 또는 아세틸렌 부위를 갖는 표면을 포함하는 생물소재를 포함한다. 또한, 생물소재 및 다른 물질들이 아지드 또는 아세틸렌 결합 이외의 결합, 예를 들면 카르복실산, 아민, 알코올 또는 티올 부분을 포함하는 결합을 통해 아지드-활성화된 중합체 유도체 또는 아세틸렌-활성화된 중합체 유도체에 커플링되어 후속 반응에 이용가능한 아지드 또는 아세틸렌 부분을 남길 수 있다.
본 발명은 본 발명의 아지드함유 중합체 또는 아세틸렌 함유 중합체를 합성하는 방법을 포함한다. 아지드 함유 PEG 유도체의 경우, 아지드는 중합체의 탄소 원자에 직접 결합될 수 있다. 별법으로, 아지드 함유 PEG 유도체는 생성되는 중합체가 그의 말단에서 아지드 부분을 갖도록 한 말단에서 아지드 부분을 갖는 결합제를 통상적인 활성화된 중합체에 부착시킴으로써 제조될 수 있다. 아세틸렌 함유 PEG 유도체의 경우, 아세틸렌은 중합체의 탄소 원자에 직접 결합할 수 있다. 별법으로, 아세틸렌 함유 PEG 유도체는 생성되는 중합체가 그의 말단에서 아세틸렌 부분을 갖도록 한 말단에서 아세틸렌 부분을 갖는 결합제를 통상적인 활성화된 중합체에 부착시킴으로써 제조될 수 있다.
더욱 구체적으로, 아지드 함유 PEG 유도체의 경우, 하나 이상의 활성 히드록실 부분을 갖는 수용성 중합체는 그 위에 하나 이상의 반응성 기, 예를 들면 메실레이트, 트레실레이트, 토실레이트 또는 할로겐 이탈기를 갖는 치환된 중합체를 생성하는 반응을 수행한다. 술포닐 산 할리드, 할로겐 원자 및 다른 이탈기를 함유하는 PEG 유도체의 제조 및 용도는 숙련된 작업자에게 공지되어 있다. 그 다음, 생성 되는 치환된 중합체는 중합체의 말단에서 더 많은 반응성 기 아지드 부분을 치환하는 반응을 수행한다. 별법으로, 하나 이상의 친핵성 또는 친전자성 활성 부분을 갖는 수용성 중합체는 공유 결합이 PEG 중합체와 결합제 사이에서 형성되고, 아지드 부분이 중합체의 말단에 위치하도록 한 말단에서 아지드를 갖는 결합제와 반응을 수행한다. 아민, 티올, 히드라지드, 히드라진, 알코올, 카르복실레이트, 알데히드, 케톤, 티오에스테르 등을 비롯한 친핵성 및 친전자성 부분은 숙련된 작업자에게 공지되어 있다.
더욱 구체적으로, 아세틸렌 함유 PEG 유도체의 경우, 하나 이상의 활성 히드록실 부분을 갖는 수용성 중합체는 아세틸렌 부분을 함유하는 전구체로부터 할로겐 또는 다른 활성화된 이탈기를 옮겨 놓는 반응을 수행한다. 별법으로, 하나 이상의 친핵성 또는 친전자성 활성 부분을 갖는 수용성 중합체는 공유 결합이 PEG 중합체와 결합제 사이에서 형성되고, 아세틸렌 부분이 중합체의 말단에 위치하도록 한 말단에서 아세틸렌를 갖는 결합제와 반응을 수행한다. 유기 합성과 관련한 할로겐 부분, 활성화된 이탈기, 친핵성 및 친전자성 부분의 용도 및 PEG 유도체의 제조 및 용도도 역시 당분야에 숙련된 작업자들에게 잘 정립되어 있다.
또한, 본 발명은 수용성 중합체, 예를 들면 아지드 또는 아세틸렌 부분을 함유하는 PEG 및 PEG 유도체를 포함하며 이에 한정되지 않는 변형된 단백질에 다른 물질을 부가하는 단백질의 선택적 변형 방법을 제공한다. 생체적합성, 안정성, 용해도, 및 면역원성 결여가 중요하고, 동시에 종래 당분야에 공지된 것보다 PEG 유도체를 단백질에 부착시키는 선택적 수단을 많이 제공하는 경우, 아지드 함유 PEG 유도체 및 아세틸렌 함유 PEG 유도체는 표면 및 분자의 성질을 개선하는 데 사용될 수 있다.
II. 성장 호르몬 수퍼유전자 패밀리
다음의 단백질은 성장 호르몬 (GH) 수퍼유전자 패밀리의 유전자에 의해 코딩되는 것들을 포함한다 (문헌[Bazan, F., Immunology Today 11: 350-354 (1991); Bazan, J. F. Science 257: 410-411 (1992); Mott, H. R. and Campbell, I. D., Current Opinion in Structural Biology 5: 114-121 (1995); Silvennoinen, O. and Ihle, J. N., SIGNALLING BY THE HEMATOPOIETIC CYTOKINE RECEPTORS (1996)] 참조): 성장 호르몬, 프로락틴, 태반 락토겐, 에리트로포이에틴 (EPO), 트롬보포이에틴 (TPO), 인터루킨-2 (IL-2), IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12 (p35 서브유닛), IL-13, IL-15, 온코스타틴 M, 섬모 신경영양 인자 (CNTF), 백혈병 억제 인자 (LIF), 알파 인터페론, 베타 인터페론, 엡실론 인터페론, 감마 인터페론, 오메가 인터페론, 타우 인터페론, 과립구-콜로니 자극 인자 (G-CSF), 과립구-마크로파지 콜로니 자극 인자 (GM-CSF), 마크로파지 콜로니 자극 인자 (M-CSF) 및 카디오트로핀-1 (CT-1) ("GH 수퍼유전자 패밀리"). 앞으로, 유전자 클로닝 및 시퀀싱을 통해 이 유전자 패밀리의 추가적인 구성원이 동정될 것으로 기대된다. GH 수퍼유전자 패밀리의 구성원은 일반적으로 제한된 아미노산 또는 DNA 서열 동일성을 갖는다는 사실에도 불구하고 유사한 2차 및 3차 구조를 갖는다. 공유되는 구조적 특징은 상기 유전자 패밀리의 신규한 구성원이 용이하게 동정될 수 있게 하고, 본 명세서에 기재된 비천연 아미노산 방법 및 조성물에 유사하게 적용된다. GH 수퍼유전자 패밀리의 구성원 사이의 주어진 정도의 구조적 상동성 하에서, 비-천연적으로 코딩된 아미노산은 본 발명을 사용하여 임의의 GH 수퍼유전자 패밀리의 구성원에 도입될 수 있다. 이 단백질 패밀리의 각각의 구성원은 4 개의 나선 다발을 포함하고, 이의 일반적 구조를 도 1에 도시한다. 패밀리 구성원 hGH, EPO, IFNα-2 및 G-CSF의 일반적 구조를 각각 도 2, 3, 4 및 5에 도시한다.
G-CSF를 비롯한 다수의 시토킨의 구조 (문헌[Zink et al., FEBS Lett. 314: 435 (1992); Zink et al., Biochemistry 33: 8453 (1994); Hill et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5167 (1993)] 참조), GM-CSF (문헌[Diederichs, K., et al. Science 154: 1779-1782 (1991); Walter et al., J. Mol. Biol. 224: 1075-1085 (1992)] 참조), IL-2 (문헌[Bazan, J. F. Science 257: 410-411 (1992); McKay, D. B. Science 257: 412 (1992)] 참조), IL-4 (문헌[Redfield et al., Biochemistry 30: 11029-11035 (1991); Powers et al., Science 256: 1673-1677 (1992)] 참조), 및 IL-5 (문헌[Milburn et al., Nature 363: 172-176 (1993)] 참조)는 X선 회절 및 NMR 연구에 의해 결정되었으며, 상당한 1차 서열 상동성이 결여되어 있음에도 불구하고 GH 구조와 현저히 보존적임을 나타낸다. IFN은 모델링 및 다른 연구를 기초로 이 패밀리의 구성원인 것으로 간주되고 있다 (문헌[Lee et al., J. Growth hormone Cytokine Res. 15: 341 (1995); Murgolo et al., Proteins 17: 62 (1993); Radhakrishnan et al., Structure 4: 1453 (1996); Klaus et al., J. Mol. Biol. 274: 661 (1997)] 참조). EPO는 모델링 및 돌연변이발생 연구를 기초로 이 패밀리의 구성원인 것으로 간주되고 있다 (문헌[Boissel et al., J. Biol. Chem. 268: 15983-15993 (1993); Wen et al., J. Biol. Chem. 269: 22839-22846 (1994)] 참조). 현재, 상기 시토킨 및 성장 인자 모두는 하나의 큰 유전자 패밀리를 포함하는 것으로 여겨지고 있다.
이 패밀리의 구성원은 유사한 2차 및 3차 구조를 공유하는 것 외에도, 세포 표면 수용체를 반드시 올리고머화시켜 세포 내 신호 전달 경로를 활성화시키는 성질을 공유한다. GH 및 EPO를 포함하며 이에 한정되지 않는 일부 GH 패밀리 구성원은 단일 타입의 수용체에 결합하여 호모이량체를 형성하게 한다. IL-2, IL-4 및 IL-6을 포함하며 이에 한정되지 않는 다른 패밀리 구성원은 하나 이상의 타입의 수용체에 결합하여 수용체가 헤테로이량체 또는 고차 응집물을 형성하게 한다 (문헌[Davis et al., (1993), Science 260: 1805-1808; Paonessa et al., (1995), EMBO J. 14: 1942-1951; Mott and Campbell, Current Opinion in Structural Biology 5: 114-121 (1995)] 참조). 돌연변이발생 연구는 이러한 다른 시토킨 및 성장 인자들이 GH와 마찬가지로, 다수의 수용체 결합 부위, 전형적으로 2 개의 수용체 결합 부위를 함유하고, 그들의 동계 수용체에 순차적으로 결합한다는 점을 밝혀냈다 (문헌[Mott and Campbell, Current Opinion in Structural Biology 5: 114-121 (1995); Matthews et al., (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 9471-9476] 참조). 이러한 다른 패밀리 구성원에 대한 1차 수용체 결합 부위는 GH와 마찬가지로, 주로 4 개의 알파 나선 및 A-B 루프에서 발생한다. 상기 패밀리 구성원 사이에서, 수용체 결합에 참여하는 나선 다발 중의 특이적 아미노산은 상이하다. GH 수퍼유전자 패밀리의 구성원과 상호작용하는 세포 표면 수용체의 대부분은 구조적으로 관련되어 있고, 다수의 제2 대형 유전자 패밀리을 포함한다. 예를 들면, 본 명세서에 참고 문헌으로 인용되는 미국 특허 제 6,608,183호를 참조할 수 있다.
다양한 GH 수퍼유전자 패밀리의 구성원의 돌연변이 연구로부터 도달된 일반적인 결론은, 일반적으로 알파 나선을 결합하는 루프는 수용체 결합에 관여하지 않는 경향이 있다는 점이다. 특히, 짧은 B-C 루프는 전부는 아니더라도, 대부분의 패밀리 구성원에서 수용체 결합에 대해 필수적이지 않은 것으로 보인다. 이러한 이유로, B-C 루프는 GH 수퍼유전자 패밀리의 구성원에서 본 명세서에 기재된 바와 같이 비-천연적으로 코딩된 아미노산으로 치환될 수 있다. 또한, A-B 루프, C-D 루프 (및 GH 슈퍼패밀리의 인터페론/IL-10 유사 구성원의 D-E 루프)도 비자연 발생 아미노산으로 치환될 수 있다. 또한, 나선 A에 근접하고, 최종 나선에 멀리 떨어져 있는 아미노산도 수용체 결합에 관여하지 않는 경향이 있고, 또한 비자연 발생 아미노산을 도입시키기 위한 부위일 수 있다. 일부 실시양태에서, 비-천연적으로 코딩된 아미노산은 A-B, B-C, C-D 또는 D-E 루프 중 처음 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 개 이상의 아미노산을 포함하며 이에 한정되지 않는 루프 구조 내 임의의 위치에서 치환된다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 비-천연적으로 코딩된 아미노산은 A-B, B-C, C-D 또는 D-E 루프 중 마지막 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 개 이상의 아미노산 내에서 치환된다.
EPO, IL-2, IL-3, IL-4, IL-6, G-CSF, GM-CSF, TPO, IL-10, IL-12 p35, IL-13, IL-15 및 베타 인터페론을 포함하며 이에 한정되지 않는 GH 패밀리의 특정한 구성원은 N-결합 및(또는) O-결합 당을 함유한다. 단백질 중의 글리코실화 부위는 알파 나선 다발이 아니라 루프 영역에서 거의 우세적으로 발생한다. 일반적으로, 루프 영역은 수용체 결합에 관여하지 않고, 당 기의 공유 부착에 대한 부위이기 때문에, 이들은 비자연 발생 아미노산 치환을 단백질에 도입시키기 유용한 부위일 수 있다. 단백질 중에서 N-결합 글리코실화 부위 및 O-결합 글리코실화 부위를 포함하는 아미노산은 표면 노출되기 때문에 비자연 발생 아미노산 치환 부위일 수 있다. 따라서, 천연 단백질은 이들 부위에서 단백질에 부착되는 용적이 큰 (bulky) 당 기를 용인할 수 있고, 글리코실화 부위는 수용체 결합 부위로부터 떨어져 위치하는 경향이 있을 수 있다.
앞으로, 추가적인 GH 수퍼유전자 패밀리의 구성원이 발견될 가능성이 크다. 예측되는 단백질 서열의 컴퓨터-보조 2차 및 3차 구조 분석을 통해 신규한 GH 수퍼유전자 패밀리의 구성원이 동정될 수 있다. 전형적으로, GH 수퍼유전자 패밀리의 구성원은 비-나선 아미노산에 의해 결합된 4 개의 또는 5 개의 양친매성 나선 (루프 영역)을 갖는다. 단백질은 그들의 N-말단에서 소수성 신호 서열을 함유하여 세포로부터의 분비를 촉진할 수 있다. 또한, 이러한 추후 발견될 GH 수퍼유전자 패밀리의 구성원도 본 발명 내에 포함된다.
따라서, 성장 호르몬 수퍼유전자 패밀리의 설명은 예시의 목적으로, 오직 예로써 제공되며, 본 명세서에 기재된 방법, 조성물, 전략 및 기술을 범위를 한정하고자 하는 것이 아니다. 또한, 본 출원에서 GH 폴리펩티드에 대한 참조는 임의의 GH 수퍼유전자 패밀리의 구성원의 예로서 일반적 용어를 사용하고자 한다. 따라서, hGH 폴리펩티드 또는 단백질에 대해 본 명세서에 기재된 변형 및 화학 작용은 본 발명에서 구체적으로 나열된 것들을 비롯한 임의의 GH 수퍼유전자 패밀리의 구성원에 동일하게 적용될 수 있다는 점이 이해된다.
III. 본 발명에 사용하기 위한 일반적 핵산 재조합 방법
본 발명의 다수의 실시양태에서, 본 발명의 hGH 폴리펩티드를 코딩하는 핵산은 단리되고, 클로닝되고, 종종, 재조합 방법을 사용하여 변화된다. 이러한 실시양태는 단백질 발현시 또는 변이체, 유도체, 발현 카세트 (cassette), 또는 hGH 폴리펩티드로부터 유도된 다른 서열 생성 중을 포함하며 이에 한정되지 않는 때에 사용된다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 폴리펩티드를 코딩하는 서열은 이종 프로모터 (heterologous promoter)에 작동가능하게 결합된다. hGH의 단리 및 숙주 세포에서의 GH의 생산은 예를 들면, 본 명세서에 참고 문헌으로 인용되는 미국 특허 제 4,601,980호, 제 4,604,359호, 제 4,634,677호, 제 4,658,021호, 제 4,898,830호, 제 5,424,199호, 제 5,795,745호, 제 5,854,026호, 제 5,849,535호, 제 6,004,931호, 제 6,022,711호, 제 6,143,523호 및 제 6,608,183호에 기재되어 있다.
비-천연적으로 코딩된 아미노산을 포함하는 hGH 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 서열 번호 2 (hGH)에 도시된 아미노산 서열을 갖는 것을 포함하며 이에 한정되지 않는 모 폴리펩티드의 아미노산 서열을 기초로 합성될 수 있으며, 그 다음, 관련 아미노산 잔기(들)의 도입 (즉, 도입 또는 치환) 또는 제거 (즉, 결실 또는 치환)에 영향을 주기 위해 뉴클레오티드 서열을 변화시킨다. 뉴클레오티드 서열은 통상적인 방법에 따라 부위-지정 돌연변이발생에 의해 편리하게 변형될 수 있다. 별법으로, 뉴클레오티드 서열은 올리고뉴클레오티드 합성기를 사용하는 것을 포함하며 이에 한정되지 않는 화학적 합성에 의해 제조될 수 있으며, 여기서 상기 올리고뉴클레오티드는 원하는 폴리펩티드의 아미노산 서열을 기초로 디자인되며, 바람직하게는, 재조합 폴리펩티드가 생성되는 숙주 세포에서 유리한 코돈을 선택한다. 예를 들면, 원하는 폴리펩티드 부분에 대한 몇몇 소형 올리고뉴클레오티드 코딩은 PCR, 결찰 (ligation) 또는 결찰 연쇄 반응에 의해 합성되고, 조립될 수 있다. 예를 들면, 본 명세서에 참고 문헌으로 인용되는 문헌[Barany, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 88: 189-193 (1991)], 미국 특허 제 6,521,427호를 참조할 수 있다.
본 발명은 재조합 유전체학 분야의 통상의 기술을 사용한다. 본 발명에 사용되는 일반적 방법을 개시하는 기본서는 문헌[Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual (3rd ed. 2001); Kriegler, Gene Transfer and Expression: A Laboratory Manual (1990); and Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., eds., 1994)]을 포함한다.
분자 생물학적 기술을 설명하는 일반 연구서는 문헌[Berger and Kimmel, Guide to Molecular Cloning Techniques. Methods in Enzymology volume 152 Academic Press, Inc., San Diego, CA (Berger); Sambrook et al., Molecular Cloning - A Laboratory Manual (2nd Ed.), Vol. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, 1989 ("Sambrook") and Current Protocols in Molecular Biology, F. M. Ausubel et al., eds., Current Protocols, a joint venture between Greene Publishing Associates, Inc. and John Wiley & Sons, Inc., (supplemented through 1999) ("Ausubel")]을 포함한다. 이러한 연구서들은 비천연 아미노산, 오르토고날 tRNAs, 오르토고날 합성효소 및 그들의 쌍을 포함하는 단백질을 생산하기 위한 셀렉터 코돈을 포함하는 유전자를 포함하며 이에 한정되지 않는 것과 관련된 돌연변이발생, 벡터의 용도, 프로모터 및 많은 다른 관련 주제를 기재하고 있다.
다양한 타입의 돌연변이발생은, tRNAs의 라이브러리 생성, 합성효소의 라이브러리 생성, 셀렉터 코돈 생성, 본 발명의 단백질 또는 폴리펩티드에서 비천연 아미노산을 코딩하는 셀렉터 코돈 삽입을 포함하며 이에 한정되지 않는 다양한 목적을 위해 본 발명에 사용된다. 이들은 부위-지정, 랜덤 점 돌연변이발생, 동족 재조합, DNA 셔플링 (shuffling) 또는 다른 반복적 (recursive) 돌연변이발생 방법, 키메라 구성, 주형을 함유하는 우라실을 사용한 돌연변이발생, 올리고뉴클레오티드-지향 돌연변이발생, 포스포로티오에이트-변형된 DNA 돌연변이발생, 갭화된 (gapped) 이중체 DNA를 사용한 돌연변이발생 등 또는 그의 임의의 조합물을 포함하며 이에 한정되지 않는다. 추가적인 적합한 방법은 점 미스매치 복구 (point mismatch repair), 복구-결핍 숙주 균주를 사용한 돌연변이발생, 제한-선택 및 제한-정제, 결실 돌연변이발생, 총 유전자 합성에 의한 돌연변이발생, 이중 가닥 절단 복구 (double-strand break repair) 등을 포함한다. 관련 키메라 구성체를 포함하며 이에 한정되지 않는 돌연변이발생도 본 발명에 포함된다. 한 실시양태에서, 서열, 서열 비교, 물리적 성질, 결정 구조 등을 포함하며 이에 한정되지 않는 자연 발생 분자 또는 변화된 또는 돌연변이된 자연 발생 분자의 공지된 정보는 돌연변이 발생을 안내할 수 있다.
본 명세서에서 발견되는 본문 및 예들은 이러한 절차를 기재한다. 다음의 문헌 내에 언급된 공보 및 참조 문헌에서 추가적인 정보가 발견된다: 문헌[Ling et al., Approaches to DNA mutagenesis: an overview, Anal Biochem. 254 (2): 157-178 (1997); Dale et al., Oligonucleotide-directed random mutagenesis using the phosphorothioate method, Methods Mol. Biol. 57: 369-374 (1996); Smith, In vitro mutagenesis, Ann. Rev. Genet. 19: 423-462 (1985); Botstein & Shortle, Strategies and applications of in vitro mutagenesis, Science 229: 1193-1201 (1985); Carter, Site-directed mutagenesis, Biochem. J. 237: 1-7 (1986); Kunkel, The efficiency of oligonucleotide directed mutagenesis, in Nucleic Acids & Molecular Biology (Eckstein, F. and Lilley, D. M. J. eds., Springer Verlag, Berlin) (1987); Kunkel, Rapid and efficient site-specific mutagenesis without phenotypic selection, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 488-492 (1985); Kunkel et al., Rapid and efficient site-specific mutagenesis without phenotypic selection, Methods in Enzymol. 154, 367-382 (1987); Bass et al., Mutant Trp repressors with new DNA-binding specificities, Science 242: 240-245 (1988); Methods in Enzymol. 100: 468-500 (1983); Methods in Enzymol. 154: 329-350 (1987); Zoller & Smith, Oligonucleotide-directed mutagenesis using M13-derived vectors: an efficient and general procedure for the production of point mutations in any DNA fragment, Nucleic Acids Res. 10: 6487-6500 (1982); Zoller & Smith, Oligonucleotide-directed mutagenesis of DNA fragments cloned into M13 vectors, Methods in Enzymol. 100: 468-500 (1983); Zoller & Smith, Oligonucleotide-directed mutagenesis: a simple method using two oligonucleotide primers and a single-stranded DNA template, Methods in Enzymol. 154: 329-350 (1987); Taylor et al., The use of phosphorothioate-modified DNA in restriction enzyme reactions to prepare nicked DNA, Nucl. Acids Res. 13: 8749-8764 (1985); Taylor et al., The rapid generation of oligonucleotide-directed mutations at high frequency using phosphorothioate-modified DNA, Nucl. Acids Res. 13: 8765-8787 (1985); Nakamaye & Eckstein, Inhibition of restriction endonuclease Nci I cleavage by phosphorothioate groups and its application to oligonucleotide-directed mutagenesis, Nucl. Acids Res. 14: 9679-9698 (1986); Sayers et al., Y-T Exonucleases in phosphorothioate-based oligonucleotide-directed mutagenesis, Nucl. Acids Res. 16: 791-802 (1988); Sayers et al., Strand specific cleavage of phosphorothioate-containing DNA by reaction with restriction endonucleases in the presence of ethidium bromide, (1988) Nucl. Acids Res. 16: 803-814; Kramer et al., The gapped duplex DNA approach to oligonucleotide-directed mutation construction, Nucl. Acids Res. 12: 9441-9456 (1984); Kramer & Fritz Oligonucleotide-directed construction of mutations via gapped duplex DNA, Methods in Enzymol. 154: 350-367 (1987); Kramer et al., Improved enzymatic in vitro reactions in the gapped duplex DNA approach to oligonucleotide-directed construction of mutations, Nucl. Acids Res. 16: 7207 (1988); Fritz et al., Oligonucleotide-directed construction of mutations: a gapped duplex DNA procedure without enzymatic reactions in vitro, Nucl. Acids Res. 16: 6987-6999 (1988); Kramer et al., Point Mismatch Repair, Cell 38: 879-887 (1984); Carter et al., Improved oligonucleotide site-directed mutagenesis using M13 vectors, Nucl. Acids Res. 13: 4431-4443 (1985); Carter, Improved oligotiucleotide-directed mutagenesis using M13 vectors, Methods in Enzymol. 154: 382-403 (1987); Eghtedarzadeh & Henikoff, Use of oligonucleotides to generate large deletions, Nucl. Acids Res. 14: 5115 (1986); Wells et al., Importance of Hydrogen-bond formation in stabilizing the transition state of subtilisin, Phil. Trans. R. Soc. Lond. A 317: 415-423 (1986); Nambiar et al., Total synthesis and cloning of a gene coding for the ribonuclease S protein, Science 223: 1299-1301 (1984); Sakamar and Khorana, Total synthesis and expression of a gene for the α-subunit of bovine rod outer segment guanine nucleotide-binding protein (transducin), Nucl. Acids Res. 14: 6361-6372 (1988); Wells et al., Cassette mutagenesis: an efficient method for generation of multiple mutations at defined sites, Gene 34: 315-323 (1985); Grundstrom et al., Oligonucleotide-directed mutagenesis by 'shot-gun' gene synthesis, Nucl. Acids Res. 13: 3305-3316 (1985); Mandecki, Oligonucleotide- directed double-strand break repair in plasmids of Escherichia coli: a method for site-specific mutagenesis, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83: 7177-7181 (1986); Arnold, Protein engineering for unusual environments, Current Opinion in Biotechnology 4: 450-455 (1993); Sieber, et al., Nature Biotechnology, 19: 456-460 (2001); W. P. C. Stemmer, Nature 370, 389-91 (1994); and, I. A. Lorimer, I. Pastan, Nucleic Acids Res. 23, 3067-8 (1995)]. 또한, 많은 상기 방법에 대한 추가적인 상세 설명은 다양한 돌연변이발생 방법을 사용한 문제 해결 (trouble-shooting) 문제점에 대한 유용한 조절을 기재하고 있는 문헌[Methods in Enzymology Volume 154]에서 찾을 수 있다.
또한, 본 발명은 오르토고날 tRNA/RS 쌍을 통한 비천연 아미노산의 생체 내 도입을 위한 진핵 숙주 세포, 비진핵 숙주 세포 및 유기체에 관한 것이다. 숙주 세포는, 예를 들면, 클로닝 벡터 또는 발현 벡터일 수 있는 본 발명의 벡터를 포함하며 이에 한정되지 않는 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 본 발명의 폴리뉴클레오티드 또는 구성체를 사용하여 유전자 조작된다 (형질전환, 형질도입 또는 형질감염을 포함하며 이에 한정되지 않음). 벡터는 예를 들면, 플라스미드, 세균, 바이러스, 네이키드 (naked) 폴리뉴클레오티드 또는 컨쥬게이션된 폴리뉴클레오티드일 수 있다. 전기천공법 (electroporation) (문헌[From et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 5824 (1985)] 참조), 바이러스 벡터에 의한 감염, 작은 비드 또는 입자의 메트릭스 내, 또는 표면 상에서 핵산을 사용하여 작은 입자에 의한 고속 탄동 침투 (ballistic penetration) (문헌[Klein et al., Nature 327, 70-73 (1987)] 참 조)를 비롯한 표준 방법에 의해 벡터에 세포 및(또는) 미생물을 도입시킨다.
유전자 조작된 숙주 세포는 예를 들면, 단계를 스크리닝하거나, 프로모터를 활성화하거나 또는 형질전환체 (transformant)를 선택하는 것과 같이 활성에 적합하게 변형된 통상적인 영양 배지 중에서 배양될 수 있다. 임의적으로, 이러한 세포들은 형질전환 유기체로 배양될 수 있다. 세포 단리 및 배양 (예를 들면, 후속 핵산 단리)을 포함하며 이에 한정되지 않는 것에 대한 다른 유용한 참조 문헌은 문헌[Freshney (1994) Culture of Animal Cells, a Manual of Basic Technique, third Edition, Wiley-Liss, New York] 및 여기에 인용된 참조 문헌[Payne et al. (1992) Plant Cell and Tissue Culture in Liquid Systems John Wiley & Sons, Inc. New York, NY; Gamborg and Phillips (eds.) (1995) Plant Cell. Tissue and Organ Culture; Fundamental Methods Springer Lab Manual, Springer-Verlag (Berlin Heidelberg New York) and Atlas and Parks (eds.) The Handbook of Microbiological Media (1993) CRC Press, Boca Raton, FL]을 포함한다.
표적 핵산을 세포에 도입시키는 몇몇 공지된 방법이 이용가능하며, 이들 중 임의의 것이 본 발명에 사용될 수 있다. 이들은 수용 세포와 DNA를 함유하는 세균 원형질체의 융합, 전기천공법, 추진체 포격 (projectile bombardment), 및 바이러스 벡터를 사용한 감염 (또한, 이하에서 논의됨) 등을 포함한다. 세균 세포를 본 발명의 DNA 구성체를 함유하는 다수의 플라스미드를 증폭시키는 데 사용할 수 있다. 세균은 로그 상으로 성장하고, 세균 내 플라스미드는 당분야에 공지된 다양한 방법 (예를 들면, 문헌[Sambrook] 참조)에 의해 단리될 수 있다. 또한, 세균으로부 터 플라스미드를 정제하기 위한 수많은 키트가 상업적으로 입수가능하다 (예를 들면, 양쪽 모두 파마시아 바이오테크 (Pharmacia Biotech)로부터 입수되는 이지프렙 (EasyPrep)TM, 플렉시프렙 (FlexiPrep)TM; 스트라타진 (Stratagene)으로부터 입수되는 스트라타클린 (StrataClean)TM; 및 퀴아겐 (Qiagen)으로부터 입수되는 퀴아프렙 (QIAprep)TM). 그 다음, 단리되고 정제된 플라스미드를 추가 조작하여 형질감염 세포에 사용하거나 또는 관련된 벡터에 도입시켜 유기체를 감염시키는 다른 플라스미드를 생산한다. 전형적인 벡터는 전사 및 번역 종결제 (terminator), 전사 및 번역 개시 서열, 및 특정 표적 핵산의 발현의 조절에 유용한 프로모터를 함유한다. 임의적으로, 벡터는 하나 이상의 독립적인 종결제 서열, 진핵생물 중에서 카세트의 복제를 허용하는 서열, 또는 원핵생물 또는 양쪽 모두 (셔틀 (shuttle) 벡터를 포함하며 이에 한정되지 않음) 및 원핵 및 진핵 시스템 양쪽 모두에 대한 선택 마커 (marker)를 함유하는 일반 발현 카세트를 포함한다. 벡터는 원핵생물, 진핵생물 또는 바람직하게는, 양쪽 모두에서 복제 및 통합에 적합하다. 문헌[Giliman & Smith, Gene 8: 81 (1979); Roberts, et al., Nature, 328: 731 (1987); Schneider, B., et al., Protein Expr. Purif. 6435: 10 (1995); Ausubel, Sambrook, Berger (all supra)]을 참조할 수 있다. 클로닝에 유용한 세균 및 박테리오파지 (bacteriophage)의 부류는 예를 들면, ATCC에 의해 예를 들면, ATCC에 의해 공개된 문헌[The ATCC Catalogue of Bacteria and Bacteriophage (1992) Gherna et al. (eds)]에 제공되어 있다. 또한, 분자 생물학 및 기초적인 이론적 고려사항의 시퀀 싱, 클로닝 및 다른 측면에 대한 추가적인 기본 절차는 문헌[Watson et al. (1992) Recombinant DNA Second Edition Scientific American Books, NY]에서 찾을 수 있다. 또한, 필수적으로 임의의 핵산 (및 표준 또는 비표준이든 거의 모든 표지된 핵산)을 다양한 상업적 공급원, 예를 들면 밀란드 써티파이드 리에이젼트 캄파니 (Midland Certified Reagent Company) (텍사스 미드랜드 소재, 월드 와이드 웹 (World Wide Web) 상의 mcrc.com에서 이용가능함), 더 크레이트 아메리칸 진 캄파니 (The Great American Gene Company) (캘리포니아주 라모마 소재, 월드 와이드 웹 상의 genco.cm에서 이용가능함), 익스프레스젠 인크. (ExpressGen Inc.) (일리노이주 시카고 소재, 월드 와이드 웹 상의 expressgen.cm에서 이용가능함), 오페론 테크놀로지스 인크. (Operon Technologies Inc.) (캘리포니아주 알라메다 소재) 및 많은 다른 회사들 중 임의의 곳으로부터 고객 주문하거나 또는 표준 주문할 수 있다.
셀렉터 코돈
본 발명의 셀렉터 코돈은 단백질 생합성 기구의 유전자 코돈 골격 (framework)을 확장시킨다. 예를 들면, 셀렉터 코돈은 유니크한 3 개의 염기 코돈, 넌센스 (nonsense) 코돈, 예를 들면 엠버 코돈 (UAG) 또는 오팔 코돈 (UGA)을 포함하며 이에 한정되지 않는 정지 코돈, 비천연 코돈, 4 개 이상의 염기 코돈, 희귀 코돈 등을 포함하며 이에 한정되지 않는다. 적어도 부분적인 hGH 폴리펩티드를 코딩하는 단일 폴리뉴클레오티드에서 하나 이상, 2 개 이상, 3 개 초과, 4 개, 5 개, 6 개, 7 개, 8 개, 9 개, 10 개 이상을 포함하며 이에 한정되지 않는 원하는 유전 자로 도입될 수 있는 셀렉터 코돈의 수가 광범위한 범위로 존재한다는 점이 당업자에게 자명하다.
한 실시양태에서, 본 방법은 비천연 아미노산을 진핵 세포에 생체 내 도입시키기 위해 정지 코돈인 셀렉터 코돈을 사용하는 것을 포함한다. 예를 들면, UAG를 포함하며 이에 한정되지 않는 정지 코돈을 인지하는 O-tRNA가 생산되고, 원하는 비천연 아미노산을 사용하여 O-RS에 의해 아미노아실화된다. 이 O-tRNA는 자연 발생 숙주의 아미노아실-tRNA 합성효소에 의해 인식된다. 통상적인 부위-지정 돌연변이발생을 사용하여 해당 폴리펩티드의 해당 부위에 TAG를 포함하며 이에 한정되지 않는 정지 코돈을 도입시킬 수 있다. 예를 들면, 문헌[Sayers, J.R., et al. (1988), 5',3' Exonuclease if a phosphorothioate-based oligonucleotide-directed mutagenesis. Nucleic Acids Res, 791-802]을 참조할 수 있다. 해당 폴리펩티드를 코딩하는 O-RS, O-tRNA 및 핵산이 생체 내에서 합쳐지는 경우, 비천연 아미노산은 UAG 코돈에 대응하여 도입되어 특수화된 위치에서 비천연 아미노산을 함유하는 폴리펩티드를 제공한다.
생체 내 비천연 아미노산의 도입은 진핵 숙주 세포의 큰 혼란 (perturbation) 없이 수행될 수 있다. 예를 들면, UAG 코돈에 대한 억제 효율은 엠버 억제제 tRNA를 포함하며 이에 한정되지 않는 O-tRNA와 진핵 방출 인자 (eRF를 포함하며 이에 한정되지 않음) (이는 정지 코돈에 결합하고, 리보좀으로부터 성장 펩티드의 방출을 개시함) 사이의 경쟁에 따라 좌우되기 때문에, 이러한 억제 효율은 O-tRNA 및(또는) 억제제 tRNA의 발현량 증가를 포함하며 이에 한정되지 않는 것 에 의해 조절될 수 있다.
또한, 셀렉터 코돈은 4 개 이상의 염기 코돈, 예를 들면, 4 개, 5 개, 6 개 이상의 염기 코돈을 포함하며 이에 한정되지 않는 연장된 코돈을 포함한다. 4 개의 염기 코돈의 예는 AGGA, CUAG, UAGA, CCCU 등을 포함하며 이에 한정되지 않는다. 5 개의 염기 코돈의 예는 AGGAC, CCCCU, CCCUC, CUAGA, CUACU, UAGGC 등을 포함하며 이에 한정되지 않는다. 본 발명의 한 특징은 프레임쉬프트 (frameshift) 억제를 기초로 하여 연장된 코돈을 사용하는 것을 포함한다. 4 개 이상의 염기 코돈은 하나 또는 다수의 비천연 아미노산을 포함하며 이에 한정되지 않는 것을 동일한 단백질에 삽입시킬 수 있다. 예를 들면, 안티코돈 (anticodon) 루프, 예를 들면 8-10 nt 이상의 안티코돈 루프를 갖는 특수 프레임쉬프트 억제제 tRNAs를 포함하며 이에 한정되지 않는 돌연변이된 O-tRNAs의 존재 하에서, 4 개 이상의 염기 코돈을 단일 아미노산으로서 판독한다. 다른 실시양태에서, 안티코돈 루프는 4 개 이상의 염기 코돈, 5 개 이상의 염기 코돈, 또는 6 개 이상의 염기 코돈 또는 그 이상을 포함하며 이에 한정되지 않는 것들을 디코딩 (decoding)할 수 있다. 256 개의 가능한 4 개 염기 코돈이 존재하기 때문에, 다수의 비천연 아미노산은 4 개 이상의 염기 코돈을 사용하여 동일한 세포에서 코딩될 수 있다. 문헌[Anderson et al., (2002) Exploirag the Limits of Codon and Anticodon Size, Chemistry and Biology, 9: 237-244; Magliery, (2001) Expanding the Genetic Code: Selection of Efficient Suppressors of Four-base Codons and Identification of "Shifty" Four-base Codons with a Library Approach in Escherichia coli, J. Mol. Biol. 307: 755- 769]을 참조할 수 있다.
예를 들면, 4 개-염기 코돈은 시험관 내 생합성 방법을 사용하여 비천연 아미노산을 단백질에 도입시키는 데 사용되었다. 예를 들면, 문헌[Ma et al., (1993) Biochemistry. 32: 7939; and Hohsaka et al., (1999) J. Am. Chem. Soc. 121: 34]을 참조할 수 있다. CGGG 및 AGGU는 2-나프틸알라닌 및 리신의 NBD 유도체를 2 개의 화학적으로 아실화된 프레임쉬프트 억제제 tRNAs를 사용하여 동시에 스트렙타비딘 (streptavidin)에 시험관 내 도입시키는 데 사용되었다. 예를 들면, 문헌[Hohsaka et al., (1999) J. Am. Chem. Soc., 121: 12194]을 참조할 수 있다. 생체 내 연구에서, 무어 (Moore) 등은 UAGN 코돈 (N은 U, A, G 또는 C일 수 있음)을 억제하는 NCUA 안티코돈을 갖는 tRNALeu 유도체의 능력을 조사하였고, 4중체 UAGA가UCUA 안티코돈을 갖는 tRNALeu에 의해, 0 또는 -1 프레임 (frame)에서 약간 디코딩하면서 13 내지 26 %의 효율로 디코딩될 수 있다는 것을 발견하였다. 문헌[Moore et al., (2000) J. Mol. Biol., 298: 195]을 참조할 수 있다. 한 실시양태에서, 희귀 코돈 또는 넌센스 코돈을 기초로 하는 연장된 코돈이 본 발명에 사용될 수 있으며, 이는 다른 원치 않는 부위에서의 미스센스 리드쓰루 (missense readthrough) 및 프레임쉬프트 억제를 감소시킬 수 있다.
또한, 주어진 시스템에 대해, 셀렉터 코돈은 3 개의 천연 염기 코돈 중 하나를 포함할 수 있으며, 여기서 내인성 시스템은 천연 염기 코돈을 사용하지 않는다 (또는 거의 사용하지 않음). 예를 들면, 이는 3 개의 천연 염기 코돈을 인식하는 tRNA가 결여된 시스템 및(또는) 3 개의 염기 코돈이 희귀 코돈인 시스템을 포함한 다.
임의적으로, 셀렉터 코돈은 비천연 염기쌍을 포함한다. 이러한 비천연 염기쌍은 현존하는 유전자 알파벳을 추가로 연장시킨다. 한 여분의 염기쌍은 64 내지 125의 3중 코돈의 수를 증가시킨다. 세 번째 염기쌍의 성질은 안정한 선택적 염기쌍화, 중합효소에 의해 고 적합도를 사용한 DNA로의 효과적인 효소 도입, 및 초기 (nascent) 비천연 염기쌍의 합성 후 효과적인 연속되는 프라이머 연장을 포함한다. 본 방법 및 조성물에 적합될 수 있는 비천연 염기쌍의 설명은 예를 들면, 문헌[Hirao, et al., (2002) An unnatural base pair for incorporating amino acid analogues into protein, Nature Biotechnology. 20: 177-182]을 포함한다. 다른 관련 공보는 하기에 나열된다.
생체 내에서 사용시, 비천연 뉴클레오시드는 막 투과성을 갖고, 인산화되어 대응하는 트리포스페이트를 형성한다. 또한, 증가된 유전 정보는 안정하고 세포 효소에 의해 파괴되지 않는다. 베너 (Benner) 및 다른 사람들에 의해 이루어진 종래의 노력에서, 이들은 가장 주목할만한 예가 이소-C:이소-G 쌍인 정규 와트슨-크릭 (Watson-Crick) 쌍의 경우와 상이한 수소 결합 패턴을 이용하였다. 예를 들면, 문헌[Switzer et al., (1989) J. Am. Chem. Soc., 111: 8322; and Piccirilli et al., (1990) Nature, 343: 33; Kool, (2000) Curr. Opin. Chem. Biol., 4: 602]을 참조할 수 있다. 일반적으로, 이들 염기는 어는 정도 천연 염기와 미스페어링 (mispairing)하고, 효소적으로 복제될 수 없다. 쿨 (Kool) 및 그의 동료들은 염기들 사이의 소수성 패킹 (packing) 상호작용이 수소 결합을 대체하여 염기쌍의 형성 을 유도할 수 있다는 점을 입증하였다. 문헌[Kool, (2000) Curr. Opin. Chem. Biol., 4: 602; and Guckian and Kool, (1998) Angew. Chem. Int. Ed. Engl., 36, 2825]을 참조할 수 있다. 모든 상기 요건을 만족시키는 비천연 염기쌍을 개발하려는 노력으로, 슐츠 (Schultz), 로메스버그 (Romesberg) 및 동료들은 일련의 비천연 소수성 염기들을 체계적으로 합성하고 연구하였다. PICS:PICS 자가 쌍 (self-pair)은 천연 염기쌍보다 안정한 것으로 발견되었으며, 에스케리치아 콜라이 DNA 중합효소 I (KF)의 클레나우 (Klenow) 단편에 의해 DNA로 유효하게 도입될 수 있다. 예를 들면, 문헌[McMinn et al., (1999) J. Am. Chem. Soc., 121: 11586; and Ogawa et al., (2000) J. Am. Chem. Soc., 122: 3274]을 참조할 수 있다. 3MN:3MN 자가 쌍은 생물학적 기능에 충분한 효율 및 선택성을 사용하여 KF에 의해 합성될 수 있다. 예를 들면, 문헌[Ogawa et al., (2000) J. Am. Chem. Soc. 122: 8803]을 참조할 수 있다. 그러나, 양쪽 모두의 염기는 추가 복제시 사슬 종결제로 작용한다. 최근, 돌연변이체 DNA 중합효소는 PICS 자가 쌍을 복제하는 데 사용될 수 있는 것으로 밝혀졌다. 또한, 7AI 자가 쌍도 복제될 수 있다. 예를 들면, 문헌[Tae et al., (2001) J. Am. Chem. Soc., 123: 7439]을 참조할 수 있다. 또한, 신규한 금속성 염기쌍, Dipic:Py도 개발되었으며, 이는 Cu (II) 결합시 안정한 쌍을 형성한다. 문헌[Meggers et al., (2000) J. Am. Chem. Soc., 122: 10714]을 참조할 수 있다. 연장된 코돈 및 비천연 코돈은 본질적으로 천연 코돈에 직교하기 때문에, 본 발명의 방법은 이 성질을 이용하여 이들에 대한 오르토고날 tRNA를 생성할 수 있다.
또한, 번역 우회 (translational bypassing) 시스템을 사용하여 원하는 폴리 펩티드에서 비천연 아미노산을 도입시킬 수 있다. 번역 우회 시스템에서, 대형 서열은 유전자로 도입되지만, 단백질로 번역되지 않는다. 이 서열은 리보좀을 유도하여 서열을 뛰어넘고 (hop over), 삽입의 번역 하류 (downstream)를 재개하는 계기로서 작용하는 구조를 함유한다.
특정한 실시양태에서, 본 발명의 방법 및(또는) 조성물 중의 단백질 또는 해당 폴리펩티드 (또는 그의 부분)는 핵산에 의해 코딩된다. 전형적으로, 핵산은 하나 이상, 2 개 이상, 3 개 이상, 4 개 이상, 5 개 이상, 6 개 이상, 7 개 이상, 8 개 이상, 9 개 이상, 10 개 이상의 셀렉터 코돈을 포함한다.
예를 들면, 비천연 아미노산의 도입을 위해 하나 이상의 셀렉터 코돈을 포함하는 당업자에게 공지되고 본 명세서에 기재된 방법을 사용하여 단백질 또는 해당 폴리펩티드에 대한 유전자 코딩에 돌연변이를 생성시킬 수 있다. 예를 들면, 해당 단백질에 대한 핵산에 돌연변이발생하여 하나 이상의 셀렉터 코돈을 포함하며, 하나 이상의 비천연 아미노산의 도입을 제공한다. 본 발명은 예를 들면, 하나 이상의 비천연 아미노산을 비롯한 임의의 단백질 형식인 돌연변이체를 포함하며 이에 한정되지 않는 임의의 이러한 변이체를 포함한다. 유사하게, 또한, 본 발명은 대응하는 핵산, 즉 하나 이상의 비천연 아미노산을 코딩하는 하나 이상의 셀렉터 코돈을 갖는 임의의 핵산을 포함한다.
해당 단백질, 예를 들면 hGH 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자는 폴리펩티드의 임의의 원하는 위치에서 용이하게 돌연변이되어 시스테인을 도입시킬 수 있다. 시스테인은 반응성 분자, 수용성 중합체, 단백질 또는 매우 다양한 다른 분자를 해 당 단백질에 도입시키는 데 널리 사용된다. 시스테인을 hGH 폴리펩티드의 원하는 위치에 도입시키기 적합한 방법은 당분야에 공지되어 있으며, 예를 들면 본 명세서에 참고 문헌으로 인용되는 미국 특허 제 6,608,183호에 기재된 것들 및 표준 돌연변이발생 기술이 있다.
IV. 비-천연적으로 코딩된 아미노산
매우 광범위한 비-천연적으로 코딩된 아미노산이 본 발명에 사용하기 적합하다. 임의의 다수의 비-천연적으로 코딩된 아미노산을 hGH 폴리펩티드에 도입시킬 수 있다. 일반적으로, 도입된 비-천연적으로 코딩된 아미노산은 유전자로 코딩된 20 개의 일반 아미노산 (즉, 알라닌, 아르기닌, 아스파라진, 아스파르트산, 시스테인, 글루타민, 글루탐산, 글리신, 히스티딘, 이소루신, 루신, 리신, 메티오닌, 페닐알라닌, 프롤린, 세린, 트레오닌, 트립토판, 티로신 및 발린)에 대해 실질적으로 화학적으로 불활성이다. 일부 실시양태에서, 비-천연적으로 코딩된 아미노산은 20 개의 일반 아미노산 (아지도, 케톤, 알데히드 및 아미노옥시 기를 포함하며 이에 한정되지 않음)에서 발견되지 않는 작용기와 유효하게 선택적으로 반응하여 안정한 컨쥬게이션물을 형성하는 측쇄 작용기를 포함한다. 예를 들면, 아지도 작용기를 함유하는 비-천연적으로 코딩된 아미노산을 포함하는 hGH 폴리펩티드는 중합체 (폴리(에틸렌 글리콜)을 포함하며 이에 한정되지 않음) 또는 별법으로, 알킨 부분을 함유하는 제2 폴리펩티드와 반응하여 안정한 컨쥬게이션물을 형성함으로써 아지드 및 알킨 작용기의 선택적 반응이 휘스겐 [3 + 2] 시클로부가 생성물을 형성할 수 있게 할 수 있다.
알파-아미노산의 일반적 구조는 다음과 같이 표현된다 (하기 화학식 I 참조).
Figure 112006059749857-pct00005
상기 식 중,
R 기는 20 개의 천연 아미노산에 사용되는 것 이외의 임의의 치환체이다.
전형적으로, 비-천연적으로 코딩된 아미노산은 상기 나열된 화학식을 갖는 임의의 구조이며, 본 발명에 사용하기 적합할 수 있다. 전형적으로, 본 발명의 비-천연적으로 코딩된 아미노산은 측쇄의 구조 중 오직 천연 아미노산만 다르기 때문에, 자연 발생 폴리펩티드에서 형성되는 것과 동일한 방식으로 천연적으로 또는 비-천연 코딩 것을 포함하며 이에 한정되지 않는 다른 아미노산과 아미드 결합을 형성한다. 그러나, 비-천연적으로 코딩된 아미노산은 천연 아미노산과 구별되는 측쇄 기를 갖는다. 예를 들면, R은 임의적으로 알킬-, 아릴-, 아실-, 케토-, 아지도-, 히드록실-, 히드라진, 시아노-, 할로-, 히드라지드, 알케닐, 알키닐, 에테르, 티올, 셀레노-, 술포닐-, 보레이트, 보로네이트, 포스포, 포스포노, 포스핀, 헤테로시클릭, 에논 (enone), 이민, 알데히드, 에스테르, 티오산, 히드록실아민, 아미노 기 등 또는 그의 임의의 조합물을 포함한다. 본 발명에 사용하기 적합할 수 있는 다른 해당 비자연 발생 아미노산은 광활성화가능한 가교 결합제, 스핀 표지화된 아 미노산, 형광 아미노산, 금속결합 아미노산, 금속 함유 아미노산, 방사능 아미노산, 신규한 작용기를 갖는 아미노산, 다른 분자와 공유적으로 또는 비공유적으로 상호작용하는 아미노산, 포토케이징되고(포토케이징되거나) 광이성화가능한 아미노산, 바이오틴 또는 바이오틴 유사체를 포함하는 아미노산, 글리코실화된 아미노산, 예를 들면 당 치환된 세린, 다른 탄수화물 변형된 아미노산, 케토 함유 아미노산, 폴리에틸렌 글리콜 또는 폴리에테르를 포함하는 아미노산, 중 원자 치환된 아미노산, 화학적으로 분절가능하고(분절가능하거나) 광분절성인 아미노산, 약 5 개 또는 약 10 개를 초과하는 탄소를 포함하며 이에 한정되지 않는 장 사슬 탄화수소 또는 폴리에테르를 포함하며 이에 한정되지 않는 천연 아미노산에 비해 연장된 측쇄를 갖는 아미노산, 탄소-결합 당 함유 아미노산, 산화환원 활성 아미노산, 아미노 티오산 함유 아미노산 및 하나 이상의 독성 부분을 포함하는 아미노산을 포함하는 아미노산을 포함하며 이에 한정되지 않는다.
본 발명에 사용하기 적합할 수 있고 수용성 중합체와의 반응에 유용한 예시적인 비-천연적으로 코딩된 아미노산은 카르보닐, 아미노옥시, 히드라진, 히드라지드, 세미카르바지드, 아지드 및 알킨 반응성 기를 갖는 것들을 포함하며 이에 한정되지 않는다. 일부 실시양태에서, 비-천연적으로 코딩된 아미노산은 사카라이드 부분을 포함한다. 이러한 아미노산의 예는 N-아세틸-L-글루코사미닐-L-세린, N-아세틸-L-갈락토사미닐-L-세린, N-아세틸-L-글루코사미닐-L-트레오닌, N-아세틸-L-글루코사미닐-L-아스파라진 및 O-만노사미닐-L-세린을 포함한다. 또한, 이러한 아미노산의 예는 아미노산과 사카라이드 사이의 자연 발생 N-결합 또는 0-결합이 알켄, 옥심, 티오에테르, 아미드 등을 포함하며 이에 한정되지 않는 천연 상태에서는 통상 발견되지 않는 공유 결합에 의해 대체된 예들을 포함한다. 또한, 이러한 아미노산의 예는 자연 발생 단백질에서는 통상 발견되지 않는 사카라이드, 예를 들면 2-데옥시-글루코오스, 2-데옥시갈락토오스 등을 포함한다.
본 명세서에 제공된 많은 비-천연적으로 코딩된 아미노산은 예를 들면, 시그마-알드리치 (Sigma-Aldrich) (미국 미소우리주 세인트 루이스 소재), 노나바이오켐 (Novabiochem) (독일 다름스타드트 소재의 이엠디 바이오사이언시즈 (EMD Biosciences)의 분사), 또는 펩테크 (Peptech) (미국 메세사추세츠주 버링톤 소재)로부터 상업적으로 입수가능하다. 상업적으로 입수가능하지 않은 것들은 임의적으로 본 명세서에 제공된 바와 같이 또는 당업자에게 공지된 표준 방법을 사용하여 합성된다. 유기 합성기술의 경우, 예를 들면, 문헌[Organic Chemistry by Fessendon and Fessendon, (1982, Second Edition, Willard Grant Press, Boston Mass.); Advanced Organic Chemistry by March (Third Edition, 1985, Wiley and Sons, NewYork); and Advanced Organic Chemistry by Carey and Sundberg (Third Edition, Parts A and B, 1990, Plenum Press, New York)]을 참조할 수 있다. 또한, 본 명세서에 참고 문헌으로 인용되는 미국 특허 출원 공보 2003/0082575 및 2003/0108885를 참조할 수 있다. 또한, 신규한 측쇄를 함유하는 비천연 아미노산 외에도, 본 발명에 사용하기에 적합할 수 있는 비천연 아미노산은 하기 화학식 II 및 화학식 III의 구조에 의해 도시되는 구조를 포함하며 이에 한정되지 않는 변형된 골격 구조를 포함한다.
Figure 112006059749857-pct00006
Figure 112006059749857-pct00007
상기 식 중,
Z는 전형적으로 OH, NH2, SH, NH-R' 또는 S-R'를 포함하고, 동일하거나 또는 상이할 수 있는 X 및 Y는 전형적으로 S 또는 O를 포함하고, 임의적으로 동일하거나 또는 상이할 수 있는 R 및 R'는 전형적으로 화학식 I을 갖는 비천연 아미노산에 대해 상기한 R 기에 대한 구성성분으로 된 동일한 목록, 뿐만 아니라 수소로부터 선택된다. 예를 들면, 본 발명의 비천연 아미노산은 임의적으로 화학식 II 및 화학식 III에 도시되는 바와 같이 아미노 또는 카르복실기에서의 치환을 포함한다. 이 타입의 비천연 아미노산은 20 개의 일반 천연 아미노산에 대응하는 측쇄 또는 비천연 측쇄를 포함하며 이에 한정되지 않는 것을 갖는 α-히드록시 산, α-티오산, α-아미노티오카르복실레이트를 포함하며 이에 한정되지 않는다. 또한, α-탄소에서의 치환은 임의적으로 L, D 또는 α-α-이치환된 아미노산, 예를 들면 D-글루타메이 트, D-알라닌, D-메틸-O-티로신, 아미노부티르산 등을 포함하며 이에 한정되지 않는다. 다른 구조적 대체물은 시클릭 아미노산, 예를 들면 프롤린 유사체, 뿐만 아니라 3, 4, 6, 7, 8원 및 9원 고리 프롤린 유사체, β 및 γ 아미노산, 예를 들면 치환된 β-알라닌 및 γ-아미노 부티르산을 포함한다.
많은 비천연 아미노산은 천연 아미노산, 예를 들면 티로신, 글루타민, 페닐알라닌 등을 기초로 하고, 본 발명에 사용하기 적합하다. 티로신 유사체는 파라-치환된 티로신, 오르토-치환된 티로신 및 메타 치환된 티로신을 포함하며 이에 한정되지 않으며, 여기서 치환된 티로신은 케토기 (아세틸 기를 포함하며 이에 한정되지 않음), 벤조일 기, 아미노 기, 히드라진, 히드록시아민, 티올 기, 카르복시 기, 이소프로필 기, 메틸 기, C6-C20 직쇄형 사슬 또는 분지형 탄화수소, 포화된 또는 불포화된 탄화수소, O-메틸 기, 폴리에테르 기, 니트로 기, 알키닐기 등을 포함하며 이에 한정되지 않는 것을 포함한다. 또한, 다중 치환된 아릴 고리도 고려된다. 본 발명에 사용하기 적합할 수 있는 글루타민 유사체는 α-히드록시 유도체, γ-치환된 유도체, 시클릭 유도체 및 아미드 치환된 글루타민 유도체를 포함하며 이에 한정되지 않는다. 본 발명에 사용하기 적합할 수 있는 예시적인 페닐알라닌 유사체는 파라-치환된 페닐알라닌, 오르토-치환된 페닐알라닌, 및 메타-치환된 페닐알라닌을 포함하며 이에 한정되지 않으며, 여기서 치환체는 히드록시 기, 메톡시 기, 메틸 기, 알릴 기, 알데히드, 아지도, 요오도, 브로모, 케토기 (아세틸 기를 포함하며 이에 한정되지 않음), 벤조일, 알키닐 기 등을 포함하며 이에 한정되지 않는 것들을 포함한다. 본 발명에 사용하기 적합할 수 있는 비천연 아미노산의 구체적인 예는 p-아세틸-L-페닐알라닌, O-메틸-L-티로신, L-3-(2-나프틸)알라닌, 3-메틸-페닐알라닌, O-4-알릴-L-티로신, 4-프로필-L-티로신, 트리-O-아세틸-GlcNAc-세린, L-도파 (L-Dopa), 불소화된 페닐알라닌, 이소프로필-L-페닐알라닌, p-아지도-L-페닐알라닌, p-아실-L-페닐알라닌, p-벤조일-L-페닐알라닌, L-포스포세린, 포스포노세린, 포스포노티로신, p-요오도-페닐알라닌, p-브로모페닐알라닌, p-아미노-L-페닐알라닌, 이소프로필-L-페닐알라닌 및 p-프로파르길옥시-페닐알라닌 등을 포함하며 이에 한정되지 않는다. 본 발명에 사용하기 적합할 수 있는 다양한 비천연 아미노산의 구조의 예는 예를 들면, "In vivo incorporation of unnatural amino acids" 표제의 WO 2002/085923에 제공되어 있다. 또한, 추가적인 메티오닌 유사체에 대해서는 문헌[Kiick et al., (2002) Incorporation of azides into recombinant proteins for chemoselective modification by the Staudifzger ligation, PNAS 99: 19-24]을 참조할 수 있다.
한 실시양태에서, 비천연 아미노산 (예를 들면, p-(프로파르길옥시)-페닐알라닌)을 포함하는 hGH 폴리펩티드의 조성물이 제공된다. 또한, p-(프로파르길옥시)-페닐알라닌을 포함하고, 단백질 및(또는) 세포를 포함하며 이에 한정되지 않는 다양한 조성물이 제공된다. 한 측면에서, p-(프로파르길옥시)-페닐알라닌 비천연 아미노산을 포함하는 조성물은 오르토고날 tRNA를 추가로 포함한다. 비천연 아미노산은 오르토고날 tRNA에 결합할 수 있으며 (공유 결합을 포함하며 이에 한정되지 않음), 이는 아미노-아실 결합을 통해 오르토고날 tRNA에 공유 결합하는 것, 오르 토고날 tRNA의 말단 리보오스 당의 3' OH 또는 2' OH에 공유 결합하는 것 등을 포함하며 이에 한정되지 않는다.
비천연 아미노산을 통해 단백질로 도입될 수 있는 화학적 기는 다양한 이점 및 이러한 단백질의 조작을 제공한다. 예를 들면, 케토 작용기의 유니크한 반응성은 임의의 다수의 히드라진 함유 시약 또는 히드록실아민 함유 시약을 사용하여 단백질을 시험관 내 및 생체 내에서 선택적으로 변형시킨다. 예를 들면, 중 원자 비천연 아미노산은 X선 구조 데이터를 위상화하는 데 유용할 수 있다. 또한, 비천연 아미노산을 사용한 중 원자의 부위-특이적 도입은 중 원자의 위치를 선택하는 데 있어 선택성 및 융통성을 제공한다. 예를 들면, 광반응성 비천연 아미노산 (벤조페논 및 아릴아지드 (페닐아지드를 포함하며 이에 한정되지 않음) 측쇄를 갖는 아미노산을 포함하며 이에 한정되지 않음)은 단백질의 효과적인 생체 내 및 시험관 내 광가교 결합 (photocrosslinking)을 가능하게 한다. 광반응성 비천연 아미노산의 예는 p-아지도-페닐알라닌 및 p-벤조일-페닐알라닌을 포함하며 이에 한정되지 않는다. 그 다음, 광반응성 기 제공 일시적 조절 (temporal control)의 흥분에 의해 광반응성 비천연 아미노산을 갖는 단백질을 마음대로 가교 결합시킬 수 있다. 일례로, 비천연 아미노의 메틸 기는 핵 부분 공명 및 진동 분광학을 포함하며 이에 한정되지 않는 것을 사용하여 국소 구조의 프로브 및 원동력으로서 동위 원소로 표지화된 메틸 기를 포함하며 이에 한정되지 않는 것으로 치환될 수 있다. 예를 들면, 알키닐 또는 아지도 작용기는 [3 + 2] 시클로부가 반응을 통해 분자를 사용하여 단백질을 선택적으로 변형시킨다.
아미노 말단에서 폴리펩티드로 도입된 비천연 아미노산은 α-아미노산 중에 정상적으로 존재하는 NH2 기와 상이한 제2 반응성 기 및 20 개의 천연 아미노산에서 사용된 것 이외의 임의의 치환체인 R 기로 구성될 수 있다 (화학식 I 참조). 유사한 비천연 아미노산은 α-아미노산 중에 정상적으로 존재하는 COOH 기와 상이한 제2 반응성 기를 갖는 카르복실 말단에서 도입될 수 있다 (화학식 I 참조).
비천연 아미노산의 화학적 합성
본 발명에 사용하기 적합한 많은 비천연 아미노산들이 예를 들면, 시그마 (미국) 또는 알드리치 (미국 위스콘신 소재의 밀와우케)로부터 상업적으로 입수가능하다. 상업적으로 입수가능하지 않은 것들은 임의적으로 본 명세서에 제공된 바와 같이 또는 다양한 공보에서 제공된 바와 같이 또는 당업자에게 공지된 표준 방법을 사용하여 합성된다. 유기 합성기술의 경우, 예를 들면, 문헌[Organic Chemistry by Fessendon and Fessendon, (1982, Second Edition, Willard Grant Press, Boston Mass.); Advanced Organic Chemistry by March (Third Edition, 1985, Wiley and Sons, New York); and Advanced Organic Chemistry by Carey and Sundberg (Third Edition, Parts A and B, 1990, Plenum Press, New York)]을 참조할 수 있다. 또한, 본 명세서에 참고 문헌으로 인용되는 미국 특허 출원 공보 2003/0082575 및 2003/0108885를 참조할 수 있다. 비천연 아미노산의 합성을 기재하는 추가적인 공보는 예를 들면, "in vivo incorporation of Unnatural Amino Acids" 표제의 WO 2002/085923, 문헌[Matsoukas et al., (1995) J. Med. Chem., 38, 4660-4669; King, F. E. & Kidd, D. A. A. (1949) A New Synthesis of Glutamine and of γ-Dipeptides of Glutamic Acid from Phthylated Internediates. J. Chem. Soc., 3315-3319; Friedman, O. M. & Chatterrji, R. (1959) Synthesis of Derivatives of Glutamine as Model Substrates for Anti-Tumor Agents. J. Am. Chem. Soc. 81, 3750-3752; Craig, J. C. et al. (1988) Absolute Configuration of the Enantiomers of 7-Chloro-4 [[4-(diethylamino)-1-methylbutyl]amino]quinoline (Chloroquine). J. Org. Chem. 53, 1167-1170; Azoulay, M., Vilmont, M. & Frappier, F. (1991) Glutamine analogues as Potential Ayatimalarials,. Eur. J. Med. Chem. 26, 201-5; Koskinen, A. M. P. & Rapoport, H. (1989) Synthesis of 4-Substituted Prolines as Conformationally Constrained Amino Acid Analogues. J. Org. Chem. 54, 1859-1866; Christie, B. D. & Rapoport, H. (1985) Synthesis of Optically Pure Pipecolates from L-Asparagine. Application to the Total Synthesis of (+)-Apovincamine through Amino Acid Decarbonylation and Iminium Ion Cyclization. J. Org. Chem. 1989: 1859-1866; Barton et al., (1987) Synthesis of Novel α-Amino-Acids and Derivatives Using Radical Chemistry: Synthesis of L- and D-α-Amino-Adipic Acids, L-α-aminopinelic Acid and Appropriate Unsaturated Derivatives. Tetrahedron Lett. 43: 4297-4308; and, Subasinghe et al., (1992) Quisqualic acid analogues: synthesis of beta-heterocyclic 2-aminopropanoic acid derivatives and their activity at a novel quisqualate-sensitized site. J. Med. Chem. 35: 4602-7]을 포함한다. 또한, 2003년 12월 22일 출원된 "Protein Arrays" 표제의 특허 출원 10/744,899 및 2002년 12월 22일 출원된 60/435,821을 참조할 수 있다.
A. 카르보닐 반응성 기
카르보닐 반응성 기를 갖는 아미노산은 다양한 반응으로 특히, 친핵성 부가 또는 알돌 축합 반응을 통해 분자 (PEG 또는 다른 수용성 분자를 포함하며 이에 한정되지 않음)를 결합시킨다.
예시적인 카르보닐 함유 아미노산은 다음과 같이 도시될 수 있다.
Figure 112006059749857-pct00008
상기 식 중,
n은 0-10이고, R1은 알킬, 아릴, 치환된 알킬 또는 치환된 아릴이고, R2는 H, 알킬, 아릴, 치환된 알킬 및 치환된 아릴이고, R3은 H, 아미노산, 폴리펩티드 또는 아미노 말단 변형 기이고, R4는 H, 아미노산, 폴리펩티드 또는 카르복시 말단 변형 기이다. 일부 실시양태에서, n은 1이고, R1은 페닐이고, R2는 단순 알킬 (즉, 메틸, 에틸, 또는 프로필)이고, 케톤 부분은 알킬 측쇄를 기준으로 파라 위치에 위치한다. 일부 실시양태에서, n은 1이고, R1은 페닐이고, R2는 단순 알킬 (즉, 메틸, 에틸, 또는 프로필)이고, 케톤 부분은 알킬 측쇄를 기준으로 메타 위치에 위치한 다.
p-아세틸-(+/-)-페닐알라닌 및 m-아세틸-(+/-)-페닐알라닌의 합성은 본 명세서에 참고 문헌으로 인용되는 문헌[Zhang, Z., et al., Biochemistry 42: 6735-6746 (2003)]에 기재되어 있다. 다른 카르보닐 함유 아미노산은 당업자에 의해 유사하게 제조될 수 있다.
일부 실시양태에서, 비-천연적으로 코딩된 아미노산을 포함하는 폴리펩티드는 화학적으로 변형되어 반응성 카르보닐 작용기를 생성한다. 예를 들면, 컨쥬게이션 반응에 유용한 알데히드 작용가는 인접 아미노 및 히드록실 기를 갖는 작용가로부터 생성될 수 있다. 생물 활성 분자가 폴리펩티드인 경우, 예를 들면, N-말단 세린 또는 트레오닌 (이는 정상적으로 존재하거나 또는 화학적 또는 효소적 소화를 통해 노출될 수 있음)을 사용하여, 페리오데이트를 사용하는 온화한 산화 분절 조건 하에서 알데히드 작용가를 생성시킬 수 있다. 예를 들면, 문헌[Gaertner, et al., Bioconjug. Chem. 3: 262-268 (1992); Geoghegan, K. & Stroh, J., Bioconjug Chem. 3: 138-146 (1992); Gaertner et al., J. Biol. Chem. 269: 7224-7230 (1994)]을 참조할 수 있다. 그러나, 당분야에 공지된 방법은 펩티드 또는 단백질의 N-말단에서의 아미노산에 한정된다.
본 발명에서, 인접 히드록실 및 아미노 기를 갖는 비-천연적으로 코딩된 아미노산은 "차폐된 (masked)" 알데히드 작용가로서 폴리펩티드에 도입될 수 있다. 예를 들면, 5-히드록시리신은 엡실론 아민에 인접한 히드록실 기를 갖는다. 전형적으로, 알데히드 생성 반응 조건은 온화한 조건 하에서 과잉의 몰의 소듐 메타페리 오데이트를 첨가하여 폴리펩티드 내 다른 부위의 산화를 피하는 것을 포함한다. 산화 반응의 pH는 전형적으로 약 7.0이다. 전형적인 반응은 약 1.5 과잉 몰의 소듐 메타 페리오데이트를 폴리펩티드의 완충 용액에 첨가한 후, 약 10 분 동안 암실에서 인큐베이션하는 것을 포함한다. 예를 들면, 본 명세서에 참고 문헌으로 인용되는 미국 특허 제 6,423,685호를 참조할 수 있다.
카르보닐 작용기는 온화한 조건 하에서 수용액 중에서 히드라진 함유 시약, 히드라지드 함유 시약, 히드록실아민 함유 시약 또는 세미카르바지드 함유 시약과 선택적으로 반응하여 각각 생리학적 조건 하에서 안정한 대응하는 히드라존, 옥심, 또는 세미카르바존 결합을 형성할 수 있다. 예를 들면, 문헌[Jencks, W. P., J. Am. Claem. Soc. 81, 475-481 (1959); Shao, J. and Tam, J. P., J. Am. Chem. Soc. 117: 3893-3899 (1995)]을 참조할 수 있다. 더욱이, 카르보닐기의 유니크한 반응성은 다른 아미노산 측쇄 하에서 선택적 변형을 가능케 한다. 예를 들면, 문헌[Cornish, V. W., et al., J. Am. Chem. Soc. 118: 8150-8151 (1996); Geoghegan, K. F. & Stroh, J. G., Bioconjug. Chem. 3: 138-146 (1992); Mahal, L. K., et al., Science 276: 1125-1128 (1997)]을 참조할 수 있다.
B. 히드라진, 히드라지드 또는 세미카르바지드 반응성 기
친핵성 기, 예를 들면 히드라진, 히드라지드 또는 세미카르바지드를 함유하는 비-천연적으로 코딩된 아미노산은 다양한 친전자성 기와 반응하여 (PEG 또는 다른 수용성 중합체를 포함하며 이에 한정되지 않는 것과의) 컨쥬게이션물을 형성하게 한다.
예시적인 히드라진, 히드라지드 또는 세미카르바지드 함유 아미노산은 다음과 같이 도시될 수 있다.
Figure 112006059749857-pct00009
상기 식 중,
n은 0-10이고, R1은 알킬, 아릴, 치환된 알킬 또는 치환된 아릴이거나 또는 존재하지 않고, X는 O, N 또는 S이거나 또는 존재하지 않고, R2는 H, 아미노산, 폴리펩티드 또는 아미노 말단 변형 기이고, R3은 H, 아미노산, 폴리펩티드 또는 카르복시 말단 변형 기이다.
일부 실시양태에서, n은 4이고, R1은 존재하지 않고, X는 N이다. 일부 실시양태에서, n은 2이고, R1은 존재하지 않고, X는 존재하지 않는다. 일부 실시양태에서, n은 1이고, R1은 페닐이고, X는 O이고, 산소 원자는 아릴 고리 상의 지방족 기에 파라로 위치한다.
히드라지드 함유 아미노산, 히드라진 함유 아미노산 및 세미카르바지드 함유 아미노산은 상업적 공급원으로부터 입수가능하다. 예를 들면, L-글루타메이트-γ-히드라지드는 시그마 케미칼 (Sigma Chemical) (미소우리주 세인트 루이스 소재)로부터 입수가능하다. 상업적으로 입수가능하지 않는 다른 아미노산은 당업자에 의해 제조될 수 있다. 예를 들면, 본 명세서에 참고 문헌으로 인용되는 미국 특허 제 6,281,211호를 참조할 수 있다.
히드라지드, 히드라진 또는 세미카르바지드 작용가를 갖는 비-천연적으로 코딩된 아미노산을 함유하는 폴리펩티드는 유사한 화학적 반응성을 갖는 알데히드 또는 다른 작용기를 함유하는 다양한 분자와 유효하게 선택적으로 반응할 수 있다. 예를 들면, 문헌[Shao, J. and Tam, J., S; Am. Chem. Soc. 117: 3893-3899 (1995)]을 참조할 수 있다. 히드라지드, 히드라진 및 세미카르바지드 작용기의 유니크한 반응성은 20 개의 일반 아미노산 (세린 또는 트레오닌의 히드록실 기 또는 리신 및 N-말단의 아미노 기를 포함하며 이에 한정되지 않음)에 존재하는 친핵성 기에 비해 알데히드, 케톤 및 다른 친전자성 기에 대한 상당히 큰 반응성을 갖게 한다.
C. 아미노옥시 함유 아미노산
아미노옥시 (또한, 히드록실아민으로도 불림) 기를 함유하는 비-천연적으로 코딩된 아미노산은 다양한 친전자성 기와 반응하여 (PEG 또는 다른 수용성 중합체를 포함하며 이에 한정되지 않는 것과의) 컨쥬게이션물을 형성시킨다. 히드라진, 히드라지드 및 세미카르바지드와 마찬가지로, 아미노옥시 기의 강화된 친핵성은 유사한 화학적 반응성을 갖는 알데히드 또는 다른 작용기를 함유하는 다양한 분자와 유효하게 선택적으로 반응할 수 있게 한다. 예를 들면, 문헌[Shao, J. and Tam, J., J. Am. Chem. Soc. 117: 3893-3899 (1995); H. Hang and C. Bertozzi, Acc. Chem. Res. 34: 727-736 (2001)]을 참조할 수 있다. 히드라진 기와의 반응의 결과, 대응하는 히드라존이 생성되지만, 일반적으로 옥심은 아미노옥시 기와 카르보닐 함유 기, 예를 들면 케톤의 반응으로부터 발생한다.
아미노옥시 기를 함유하는 예시적인 아미노산은 다음과 같이 도시될 수 있다.
Figure 112006059749857-pct00010
상기 식 중,
n은 0-10이고, R1은 알킬, 아릴, 치환된 알킬 또는 치환된 아릴이거나 또는 존재하지 않고, X는 O, N, S이거나 또는 존재하지 않고, m은 0-10이고, Y는 =C(O)이거나 또는 존재하지 않고, R2는 H, 아미노산, 폴리펩티드 또는 아미노 말단 변형 기이고, R3은 H, 아미노산, 폴리펩티드 또는 카르복시 말단 변형 기이다. 일부 실시양태에서, n은 1이고, R1은 페닐이고, X는 O이고, m은 1이고, Y는 존재한다. 일부 실시양태에서, n은 2이고, R1 및 X는 존재하지 않고, m은 0이고, Y는 존재하지 않는다.
아미노옥시 함유 아미노산은 용이하게 입수가능한 아미노산 전구체 (호모세린, 세린 및 트레오닌)로부터 제조될 수 있다. 예를 들면, 문헌[M. Carrasco and R. Brown, J Org. Chem. 68: 8853-8858 (2003)]을 참조할 수 있다. 특정한 아미노옥시 함유 아미노산, 예를 들면 L-2-아미노-4-(아미노옥시)부티르산은 천연 공급원 으로부터 단리되었다 (문헌[Rosenthal, G. et al., Life Sci. 60: 1635-1641 (1997)] 참조). 다른 아미노옥시 함유 아미노산은 당업자에 의해 제조될 수 있다.
D. 아지드 및 알킨 반응성 기
아지드 및 알킨 작용기의 유니크한 반응성으로 인해 이들은 폴리펩티드 및 다른 생물학적 분자의 선택적 변형에 극히 유용하다. 유기 아지드, 특히 지방족 아지드, 및 알킨은 공통의 반응 화학 조건에 대해 일반적으로 안정하다. 특히, 아지드 및 알킨 작용기 양쪽 모두는 자연 발생 폴리펩티드에서 발견되는 20 개의 일반 아미노산의 측쇄 (즉, R 기) 에 대해 불활성이다. 그러나, 좀더 면밀히 살펴보면, 아지드 및 알킨 기의 "스프링 로딩 (spring-loaded)" 특성이 드러나며, 이들은 휘스겐 [3 + 2] 시클로부가 반응을 통해 선택적으로 유효하게 반응하여 대응하는 트리아졸을 생성한다. 예를 들면, 문헌[Chin J., et al., Science 301: 964-7 (2003); Wang, Q., et al., J. Am. Chem. Soc. 125, 3192-3193 (2003); Chin, J. W., et al., J. Am. Chem. Soc. 124: 9026-9027 (2002)]을 참조할 수 있다.
휘스겐 시클로부가 반응은 친핵성 치환이 아닌 선택적 시클로부가 반응을 포함하기 때문에 (예를 들면, 문헌[Padwa, A., in COMPREHENSIVE Organic Synthesis, Vol. 4, (ed. Trost, B. M., 1991), p. 1069-1109; Huisgen, R. in 1,3-DIPOLAR CYCLOADDITION CHEMISTRY, (ed. Padwa, A., 1984), p. 1-176] 참조), 아지드 및 알킨 함유 측쇄를 갖는 비-천연적으로 코딩된 아미노산의 도입은 생성된 폴리펩티드가 비-천연적으로 코딩된 아미노산의 위치에서 선택적으로 변형되게 한다. 아지드 또는 알킨 함유 hGH 폴리펩티드를 포함하는 시클로부가 반응은 실온에서 수성 조건 하에서 Cu (II)를 Cu (I)로 환원시키는 환원제의 존재 하에서, 동일 반응계에서, 촉매량으로 Cu (II) (촉매량의 CuSO4의 형태를 포함하며 이에 한정되지 않음)를 첨가함으로써 수행될 수 있다. 예를 들면, 문헌[Wang, Q., et al., J. Am. Chem Soc. 125, 3192-3193 (2003); Tornoe, C. W., et al., J. Org. Chem. 67: 3057-3064 (2002); Rostovtsev, et al., Angew. Chem. Int. Ed. 41: 2596-2599 (2002)]을 참조할 수 있다. 예시적인 환원제는 아스코르베이트, 금속성 구리, 퀴닌, 히드로퀴논, 비타민 K, 글루타티온, 시스테인, Fe2 +, Co2 + 및 인가된 전기 전위를 포함하며 이에 한정되지 않는 것을 포함한다.
일부 경우, 아지드와 알킨 사이의 휘스겐 [3 + 2] 시클로부가 반응이 바람직한 경우, hGH 폴리펩티드는 알킨 부분을 포함하는 비-천연적으로 코딩된 아미노산을 포함하고, 아미노산에 부착되는 수용성 중합체는 아지드 부분을 포함한다. 별법으로, 반대 (converse) 반응 (즉, 아미노산 상의 아지드 부분 및 수용성 중합체 상에 존재하는 알킨 부분과의 반응)도 수행할 수 있다.
또한, 아지드 작용기는 아릴 에스테르를 함유하고 아릴 포스핀 부분을 사용하여 적합하게 작용화된 수용성 중합체와 선택적으로 반응하여 아미드 결합을 생성할 수 있다. 아릴 포스핀 기는 동일 반응계에서 아지드를 환원시킨 다음, 생성되는 아민은 근접한 에스테르 결합과 유효하게 반응하여 대응하는 아미드를 생성시킨다. 예를 들면, 문헌[E. Saxon and C. Bertozzi, Science 287, 2007-2010 (2000)]을 참조할 수 있다. 아지드 함유 아미노산은 알킬 아지드 (2-아미노-6-아지도-1-헥산산 을 포함하며 이에 한정되지 않음) 또는 아릴 아지드 (p-아지도-페닐알라닌)일 수 있다.
아릴 에스테르 및 포스핀 부분을 함유하는 예시적인 수용성 중합체는 다음과 같이 도시될 수 있다.
Figure 112006059749857-pct00011
상기 식 중,
X는 O, N, S이거나 또는 존재하지 않을 수 있고, Ph는 페닐이고, W는 수용성 중합체이고, R은 H, 알킬, 아릴, 치환된 알킬 및 치환된 아릴 기일 수 있다. 예시적인 R 기는 -CH2, -C(CH3)3, -OR', -NR'R", -SR', -할로겐, -C(O)R', -CONR'R", -S(O)2R', -S(O)2NR'R", -CN 및 -NO2를 포함하며 이에 한정되지 않는다. R', R", R"' 및 R""는 각각 독립적으로 수소, 치환되거나 또는 비치환된 헤테로알킬, 1-3 개의 할로겐으로 치환된 아릴을 포함하며 이에 한정되지 않는 치환되거나 또는 비치환된 아릴, 치환되거나 또는 비치환된 알킬, 알콕시 또는 티오알콕시 기 또는 아릴알킬 기를 지칭한다. 본 발명의 화합물이 하나 이상의 R 기를 포함하는 경우, 예를 들면, 각각의 R 기는 이들 기 중 하나 이상이 존재하는 경우 각각의 R', R", R"' 및 R"" 기로서 독립적으로 선택된다. R' 및 R"가 동일한 질소 원자에 부착되는 경우, 이들은 질소 원자와 합쳐져 5원, 6원 또는 7원 고리를 형성할 수 있다. 예를 들면, -NR'R"는 1-피롤리디닐 및 4-모르폴리닐을 포함하며 이에 한정되지 않는 것 을 의미한다. 치환체의 상기 논의로부터, 당업자는 용어 "알킬"이, 수소 기 이외의 기에 결합된 탄소 원자를 포함하는 기, 예를 들면 할로알킬 (-CF3 및 -CH2CF3를 포함하며 이에 한정되지 않음) 및 아실 (-C(O)CH3, -C(O)CF3, -C(O)CH2OCH3 등을 포함하며 이에 한정되지 않음)을 포함한 것을 의미한다는 점을 이해할 것이다.
또한, 아지드 작용기는 티오에스테르를 함유하고 아릴 포스핀 부분을 사용하여 적합하게 작용화된 수용성 중합체와 선택적으로 반응하여 아미드 결합을 생성할 수 있다. 아릴 포스핀 기가 동일 반응계에서 아지드를 환원시킨 다음, 생성되는 아민이 티오에스테르 결합과 반응하여 대응하는 아미드를 형성한다. 티오에스테르 및 포스핀 부분을 함유하는 예시적인 수용성 중합체는 다음과 같이 도시될 수 있다.
Figure 112006059749857-pct00012
상기 식 중,
n은 1-10이고, X는 O, N, S이거나 또는 존재하지 않을 수 있고, Ph는 페닐이고, W는 수용성 중합체이다.
예시적인 알킨 함유 아미노산은 다음과 같이 도시될 수 있다.
Figure 112006059749857-pct00013
상기 식 중,
n은 0-10이고, R1은 알킬, 아릴, 치환된 알킬 또는 치환된 아릴이거나 또는 존재하지 않고, X는 O, N, S이거나 또는 존재하지 않고, m은 0-10이고, R2는 H, 아미노산, 폴리펩티드 또는 아미노 말단 변형 기이고, R3은 H, 아미노산, 폴리펩티드 또는 카르복시 말단 변형 기이다. 일부 실시양태에서, n은 1이고, R1은 페닐이고, X는 존재하지 않고, m은 0이고, 아세틸렌 부분은 알킬 측쇄를 기준으로 파라 위치에 위치한다. 일부 실시양태에서, n은 1이고, R1은 페닐이고, X는 O이고, m은 1이고, 프로파르길옥시 기는 알킬 측쇄를 기준으로 파라 위치에 위치한다 (즉, O-프로파르길-티로신). 일부 실시양태에서, n은 1이고, R1 및 X는 존재하지 않고, m은 0이다 (즉, 프로프아릴글리신).
알킨 함유 아미노산은 상업적으로 입수가능하다. 예를 들면, 프로파르길글리신은 펩테크 (메세사추세츠주 버링톤 소재)로부터 상업적으로 입수가능하다. 별법으로, 알킨 함유 아미노산은 표준 방법에 따라 제조될 수 있다. 예를 들면, p-프로파르길옥시페닐알라닌은 예를 들면, 문헌[Deiters, A., et al., J. Acid. Cliem. Soc. 125: 11782-11783 (2003)]에 기재된 바와 같이 합성될 수 있고, 4-알키닐-L-페닐알라닌은 문헌[Kayser, B., et al., Tetrahedron 53 (7): 2475-2484 (1997)]에 기재된 바와 같이 합성될 수 있다. 다른 알킨 함유 아미노산은 당업자에 의해 제조될 수 있다.
예시적인 아지드 함유 아미노산은 다음과 같이 도시될 수 있다.
Figure 112006059749857-pct00014
상기 식 중,
n은 0-10이고, R1은 알킬, 아릴, 치환된 알킬, 치환된 아릴이거나 또는 존재하지 않고, X는 O, N, S이거나 또는 존재하지 않고, m은 0-10이고, R2는 H, 아미노산, 폴리펩티드 또는 아미노 말단 변형 기이고, R3은 H, 아미노산, 폴리펩티드 또는 카르복시 말단 변형 기이다. 일부 실시양태에서, n은 1이고, R1은 페닐이고, X는 존재하지 않고, m은 0이고, 아지드 부분은 알킬 측쇄에 대해 파라 위치에 위치한다. 일부 실시양태에서, n은 0-4이고, R1 및 X는 존재하지 않고, m = 0이다. 일부 실시양태에서, n은 1이고, R1는 페닐이고, X는 O이고, m은 2이고, β-아지도에톡시 부분은 알킬 측쇄를 기준으로 파라 위치에 위치한다.
아지드 함유 아미노산은 상업적 공급원으로부터 입수가능하다. 예를 들면, 4-아지도페닐알라닌은 켐-임프렉스 인터네쇼날, 인크. (Chem-Impex International, Inc.) (일리노이주 우드 다일 소재)로부터 입수할 수 있다. 상업적으로 입수가능하지 않은 아지드 함유 아미노산의 경우, 아지드 기는 적합한 이탈기 (할리드, 메실레이트, 토실레이트를 포함하며 이에 한정되지 않음)의 치환 또는 적합하게 보호된 락톤의 개방을 포함하며 이에 한정되지 않는 당업자에게 공지된 표준 방법을 사용하여 비교적 용이하게 제조될 수 있다. 예를 들면, 문헌[Advanced Organic Chemistry by March (Third Edition, 1985, Wiley and Sons, New York)]을 참조할 수 있다.
E. 아미노티올 반응성 기
베타-치환된 아미노티올 작용기의 유니크한 반응성은 이들을 티아졸리딘의 형성을 통해 알데히드 기를 함유하는 폴리펩티드 및 다른 생물학적 분자의 선택적 변형에 극히 유용하게 한다. 예를 들면, 문헌[J. Shao and J. Tam, J. Am. Chem. Soc. 1995, 117 (14) 3893-3899]을 참조할 수 있다. 일부 실시양태에서, 베타-치환된 아미노티올 아미노산은 hGH 폴리펩티드을 도입한 다음, 알데히드 작용가를 포함하는 수용성 중합체와 반응할 수 있다. 일부 실시양태에서, 수용성 중합체, 약물 컨쥬게이션물 또는 다른 유료하중 (payload)을 티아졸리딘의 형성을 통해 베타-치환된 아미노티올 아미노산을 포함하는 hGH 폴리펩티드에 커플링시킬 수 있다.
비천연 아미노산의 세포 흡수 (uptake)
진핵 세포에 의한 비천연 아미노산 흡수는 비천연 아미노산을 단백질에 도입시키기 위한 경우를 포함하며 이에 한정되지 않는 비천연 아미노산을 디자인하고 선택하는 경우 전형적으로 고려되는 문제이다. 예를 들면, α-아미노산의 높은 전하 밀도는 이러한 화합물들이 세포 불투과성이기 쉽다는 점을 암시한다. 천연 아미노산은 단백질 기재 수송 시스템의 수집을 통해 진핵 세포로 흡수된다. 존재한다면 어떤 비천연 아미노산이 세포에 의해 흡수되는지 평가하는 신속한 스크리닝을 수행 할 수 있다. 예를 들면, 2003년 12월 22일 출원된 "Protein Arrays" 표제의 특허 출원 10/744,899 및 2002년 12월 22일 출원된 60/435,821; 및 문헌[Liu, D. R. & Schultz, P. G. (1999) Progress toward the evolution of an organism with an expanded genetic code. PNAS United States 96: 4780-4785]에서의 독성 분석시험을 참조할 수 있다. 비록 흡수는 다양한 분석시험을 사용하여 용이하게 분석되지만, 세포 흡수 경로를 따르는 비천연 아미노산을 디자인하는 것에 대한 대안은 생합성 경로를 제공하여 생체 내에서 아미노산을 생성하는 것이다.
비천연 아미노산의 생합성
세포에서 아미노산 및 다른 화합물을 생산하는 많은 생합성 경로들이 이미 존재한다. 특정 비천연 아미노산에 대한 생합성 방법이 진핵 세포를 포함하며 이에 한정되지 않는 자연계에 존재할 수 있으며, 본 발명은 이러한 방법을 제공한다. 예를 들면, 비천연 아미노산에 대한 생합성 경로는 신규한 효소를 첨가하거나 또는 존재하는 숙주 세포 경로를 변형시킴으로써 숙주 세포에서 임의적으로 생성된다. 추가적인 신규한 효소로는 임의적으로 자연 발생된 효소 또는 인공적으로 발현된 효소가 있다. 예를 들면, p-아미노페닐알라닌의 생합성 ("In vivo incorporation of unnatural amino acids" 표제의 WO 2002/085923에서 실시예로서 제공됨)은 다른 유기체로부터 공지된 효소의 조합물의 첨가에 의존한다. 이들 효소에 대한 유전자는 유전자를 포함하는 플라스미드를 사용하여 세포를 형질전환시킴으로써 진핵 세포에 도입될 수 있다. 유전자는 세포에서 발현되는 경우, 효소적 경로를 제공하여 원하는 화합물을 합성한다. 임의적으로 첨가되는 효소 타입의 예는 하기 실시예에 서 제공된다. 추가적인 효소 서열은 예를 들면, 진뱅크 (Genbank)에서 찾을 수 있다. 또한, 인공적으로 발현된 효소는 임의적으로 동일한 방식으로 세포에 첨가된다. 이 방식으로, 세포 기구 및 세포 공급원을 유전자 조작하여 비천연 아미노산을 생산한다.
다양한 방법들이 생합성 경로에서의 사용을 위해 신규한 효소를 생산하거나 또는 현존하는 경로를 발전시키는 데 이용가능하다. 임의적으로, 예를 들면, 멕시겐, 인크. (Maxygen, Inc.) (월드 와이드 웹 상의 maxygen.cm에서 입수가능)에 의해 개발된 것을 포함하며 이에 한정되지 않는 반복적 재조합을 사용하여 신규한 효소 및 경로를 개발한다. 예를 들면, 문헌[Stemmer (1994), Rapid evolution of a protein in vitro by DNA shuffling, Nature 370 (4): 389-391; and, Stemmer, (1994), DNA shuffling by random fragmentation and reassembly: In vitro recombination for molecular evolution, Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 91: 10747-10751]을 참조할 수 있다. 유사하게, 제너코르 (Genencor) (월드 와이드 웹 상의 genencor.cm에서 입수가능함)에 의해 개발된 디자인패쓰 (DesignPath)TM는 임의적으로 세포에서 경로를 조작하여 0-메틸-L-티로신을 생성하는 것을 포함하며 이에 한정되지 않는 대사 경로 조작에 사용된다. 이 기술은 기능적 게놈을 통해 동정된 것을 포함하며 이에 한정되지 않는 신규한 유전자의 조합물, 및 분자 진화 및 디자인을 사용하여 숙주 유기체 중에 현존하는 경로를 재구성한다. 또한, 다이벌사 코퍼레이션 (Diversa Corporation) (월드 와이드 웹 상의 diversa.cm에서 입수가 능)도 유전자 및 유전자 경로의 라이브러리를 신속하게 스크리닝하여 신규한 경로를 제공하는 것을 포함하며 이에 한정되지 않는 기술을 제공한다.
전형적으로, 본 발명의 유전자 조작된 생합성 경로를 사용하여 생산된 비천연 아미노산은 다른 아미노산의 농도에 영향을 미치거나 또는 세포 공급원을 고갈시키는 정도는 아닌 천연 세포 양을 포함하며 이에 한정되지 않는 양으로 효과적인 단백질 생합성에 충분한 농도로 생산된다. 이 방식으로 생체 내에서 생산되는 전형적인 농도는 약 10 mM 내지 약 0.05 mM이다. 세포를 특이적 경로에 바람직한 효소를 생산하는 데 사용되는 유전자를 포함하는 플라스미드로 형질전환시키고, 비천연 아미노산을 생성시킨 후, 임의적으로, 생체 내 선택을 사용하여 리보좀 단백질 합성 및 세포 성장 양쪽 모두를 위한 비천연 아미노산의 생산을 추가로 최적화시킨다.
비천연 아미노산을 갖는 폴리펩티드
비천연 아미노산의 도입은 단백질 구조 및(또는) 기능의 변화를 적합 (tailoring)시키거나, 크기, 산도, 친핵성, 수소 결합, 소수성, 프로테아제 표적 부위의 접근성을 변화시키거나, 기에 대한 표적화 (단백질 어레이에 대한 경우를 포함하며 이에 한정되지 않음)를 변화시키는 등을 포함하며 이에 한정되지 않는 다양한 목적을 위해 수행될 수 있다. 비천연 아미노산을 포함하는 단백질은 강화되거나 또는 심지어 완전히 신규한 촉매적 성질 또는 생체물리적 성질을 가질 수 있다. 예를 들면, 비천연 아미노산을 단백질에 포함시킴으로써 다음의 성질들은 임의적으로 변형된다: 독성, 생체분포 (biodistribution), 구조적 성질, 분광학적 성질, 화 학적 및(또는) 광화학적 성질, 촉매 작용 능력, 반감기 (혈청 반감기를 포함하며 이에 한정되지 않음), 공유적으로 또는 비공유적으로 반응할 수 있는 것을 포함하며 이에 한정되지 않는 다른 분자와 반응할 수 있는 능력 등. 하나 이상의 비천연 아미노산을 포함하는 단백질을 포함하는 조성물은 신규한 치료제, 진단제, 촉매 작용 효소, 공업용 효소, 결합 단백질 (항체를 포함하며 이에 한정되지 않음), 및 단백질 구조 및 기능의 연구를 포함하며 이에 한정되지 않는 것들에 유용하다. 예를 들면, 문헌[Dougherty, (2000) Unnatural Amino Acids as Probes of Protein Structure and Function, Current Opinion in Chemical Biology. 4: 645-652]을 참조할 수 있다.
본 발명의 한 측면에서, 본 조성물은 2 개 이상, 3 개 이상, 4 개 이상, 5 개 이상, 6 개 이상, 7 개 이상, 8 개 이상, 9 개 이상 또는 10 개 이상을 포함하며 이에 한정되지 않는 하나 이상의 비천연 아미노산을 갖는 하나 이상의 단백질을 포함한다. 비천연 아미노산은 동일하거나 또는 상이할 수 있고, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 개 이상 또는 10 개 이상의 상이한 비천연 아미노산을 포함하는 단백질 중의 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 개 이상 또는 10 개 이상의 상이한 부위가 존재할 수 있는 경우를 포함하며 이에 한정되지 않는다. 또 다른 측면에서, 조성물은 단백질 중에 존재하는 특정 아미노산 중 하나 이상을 갖는 단백질을 포함하며, 단백질 중에 존재하는 특정 아미노산 중의 전부가 비천연 아미노산으로 치환되지는 않는다. 하나 이상의 비천연 아미노산을 갖는 주어진 단백질의 경우, 비천연 아미노산은 동일하거나 또는 상이할 수 있다 (이 단백질이 2 개 이상의 상이한 타입의 비천 연 아미노산 또는 2 가지 동일한 비천연 아미노산을 포함할 수 있는 경우를 포함하며 이에 한정되지 않음). 2 개를 초과하는 비천연 아미노산을 갖는 주어진 단백질의 경우, 비천연 아미노산은 동일하거나, 상이하거나 또는 하나 이상의 상이한 비천연 아미노산을 갖는 동일한 종류로 된 다수의 비천연 아미노산의 조합물일 수 있다.
하나 이상의 비천연 아미노산을 갖는 단백질 또는 해당 폴리펩티드는 본 발명의 한 측면을 이룬다. 또한, 본 발명은 본 발명의 조성물 및 방법을 사용하여 생산된 하나 이상의 비천연 아미노산을 갖는 폴리펩티드 또는 단백질을 포함한다. 또한, 부형제 (약학적으로 허용가능한 부형제를 포함하며 이에 한정되지 않음)도 단백질과 함께 존재할 수 있다.
하나 이상의 비천연 아미노산을 갖는 단백질 또는 해당 폴리펩티드를 진핵 세포에서 생산함으로써, 이러한 단백질 또는 폴리펩티드는 전형적으로 번역 후 진핵 세포 변형물을 포함하게 된다. 특정한 실시양태에서, 단백질은 하나 이상의 비천연 아미노산, 및 진핵 세포에 의해 생체 내 생성된 하나 이상의 번역 후 변형물을 포함하며, 여기서 이러한 번역 후 변형물은 원핵 세포에 의해서는 생성되지 않는다. 예를 들면, 변역 후 변형은 아세틸화, 아실화, 지질-변형, 팔미토일화, 팔미테이트 부가, 인산화, 당지질-결합 변형, 글리코실화 등을 포함하며 이에 한정되지 않는 것들을 포함한다. 한 측면에서, 번역 후 변형은 GlcNAc-아스파라진 결합에 의해 올리고사카라이드 ((GlcNAc-Man)2-Man-GlcNAc-GlcNAc)를 포함하며 이에 한정되지 않음)를 아스파라진에 부착시키는 것을 포함한다. 진핵 단백질의 N-결합 올리고사카라이드의 일부 예를 나열한 하기 표 1을 참조할 수 있다(또한, 추가적인 기가 존재할 수 있으며, 이는 나타내지 않음). 또 다른 측면에서, 번역 후 변형은 GalNAc-세린 또는 GalNAc-트레오닌 결합, 또는 GlcNAc-세린 또는 GlcNAc-트레오닌 결합에 의해 올리고사카라이드 (Gal-GalNAc, Gal-GlcNAc 등을 포함하며 이에 한정되지 않음)를 세린 또는 트레오닌에 부착시키는 것을 포함한다.
Figure 112006059749857-pct00015
또한, 또 다른 측면에서, 변역 후 변형은 전구체 (칼시토닌 전구체, 칼시토닌 유전자 관련 펩티드 전구체, 전전구부갑상선 (prepropara갑상선) 호르몬, 전전구인슐린 (preproinsulin), 전구인슐린 (proinsulin), 전전구-오피오멜라코르틴 (prepro-opiomelanocortin), 전구-오피오멜라코르틴 (pro-opiomelanocortin) 등을 포함하며 이에 한정되지 않음)의 단백질분해성 처리, 다중서브유닛 (multisubunit) 단백질 또는 거대분자 어셈블리로의 어셈블리 (assembly), 세포 중의 또 다른 부위로 (소기관, 예를 들면 소포체, 골지 장치, 핵, 리소좀, 퍼옥시좀, 미토콘드리아, 엽록체, 액포 등으로 또는 분비성 경로를 통하는 것을 포함하며 이에 한정되지 않음) 번역시키는 것을 포함한다. 특정한 실시양태에서, 단백질은 분비 또는 국소화된 서열, 에피토프 태그, FLAG 태그, 폴리히스티딘 태그, GST 융합 등을 포함한다. 본 명세서에 참고 문헌으로 인용되는 미국 특허 제 4,963,495호 및 제 6,436,674호는 hGH 폴리펩티드의 분비를 개선시키기 위해 디자인된 구성체를 상술한다.
비천연 아미노산의 한 이점은 추가 분자를 부가시키는 데 사용될 수 있는 추가 화학 기를 제공한다는 것이다. 이러한 변형은 진핵 세포 또는 비진핵 세포에서 생체 내에서, 또는 시험관 내에서 이루어질 수 있다. 따라서, 특정한 실시양태에서, 번역 후 변형은 비천연 아미노산을 통해 이루어진다. 예를 들면, 번역 후 변형은 친핵성-친전자성 반응을 통해 이루어질 수 있다. 현재, 단백질의 선택적 변형에 사용되는 대부분의 반응은 α-할로케톤과 히스티딘 또는 시스테인 측쇄과의 반응을 포함하며 이에 한정되지 않는 친핵성 반응 파트너와 친전자성 반응 파트너 사이의 공유 결합 형성을 포함한다. 이러한 경우들에서, 선택성은 단백질 중의 친핵성 기의 접근성 및 수에 의해 결정된다. 본 발명의 단백질에서, 다른 더 많은 선택적 반응들, 예를 들면 시험관 내 및 생체 내에서 비천연 케토-아미노산과 히드라지드 또는 아미노옥시 화합물의 반응을 사용할 수 있다. 예를 들면, 문헌[Cornish, et al., (1996) Am. Chem. Soc., 118: 8150-8151; Mahal, et al., (1997) Science, 276: 1125-1128; Wang, et al., (2001) Science 292: 498-500; Chin, et al., (2002) Am. Chem. Soc. 124: 9026-9027; Chin, et al., (2002) Proc. Natl. Acad. Sci., 99: 11020-11024; Wang, et al., (2003) Proc. Natl. Acad. Sci., 100: 56-61; Zhang, et al., (2003) Biochemistry, 42: 6735-6746; and, Chin, et al., (2003) Science, in press]을 참조할 수 있다. 이는 형광 발색단, 가교 결합제, 사카라이드 유도체 및 세포독성 분자를 비롯한 시약으로 된 숙주를 사용하여 거의 모든 단백질을 선택적으로 표지화할 수 있게 한다. 또한, 본 명세서에 참고 문헌으로 인용되는 2003년 1월 16일 출원된 "Glycoprotein synthesis" 표제의 미국 특허 출원 10/686,944를 참조할 수 있다. 또한, 아지도 아미노산을 통하는 것을 포함하며 이에 한정되지 않는 번역 후 변형은 스타우딘저 결찰 (Staudinger ligation) (트리아릴포스핀 시약을 사용하는 것을 포함하며 이에 한정되지 않음)을 통해 이루어질 수 있다. 예를 들면, 문헌[Kiick et al., (2002) Incorporation of azides into recombinant proteins for chemoselective modification by the Staudinger ligation, PNAS 99: 19-24]을 참조할 수 있다.
본 발명은 아지드 또는 알키닐 기를 함유하는 비천연 아미노산을 포함하며 이에 한정되지 않는 아미노산을 셀렉터 코돈에 대응하여 단백질에 유전자 도입시키는 것을 포함하는 단백질의 선택적 변형에 대한 또 다른 매우 효과적인 방법을 제공한다. 그 다음, 이러한 아미노산 측쇄는 알키닐 또는 아지드 유도체 각각을 포함하며 이에 한정되지 않는 것을 사용하여 휘스겐 [3 + 2] 시클로부가 반응을 포함하며 이에 한정되지 않는 것에 의해 변형될 수 있다 (예를 들면, 문헌[Padwa, A. in Comprehensive Organic Synthesis, Vol. 4, (1991) Ed. Trost, B. M., Pergamon, Oxford, p. 1069-1109; and, Huisgen, R. in 1, 3-Dipolar Cycloaddition Chemistry (1984) Ed. Padwa, A., Wiley, New York, p. 1-176] 참조). 이 방법은 친핵성 치환이 아닌 시클로부가를 포함하기 때문에, 단백질은 극히 높은 선택성으로 변형될 수 있다. 이 반응은 실온에서 수성 조건에서 우수한 위치선택성 (1,4 > 1,5)으로 촉매량의 Cu (I) 염을 반응 혼합물에 첨가함으로써 수행될 수 있다. 예를 들면, 문헌[Tornoe, et al., (2002) Ore. Chem. 67: 3057-3064; and, Rostovtsev, et al., (2002) Angew. Chem. Int. Ed. 41: 2596-2599]을 참조할 수 있다. 사용될 수 있는 또 다른 방법은 비스비소 (bisarsenic) 화합물 상에서 테트라시스테인 모티프와 리간드 교환을 하는 것이다 (예를 들면, 문헌[Griffin, et al., (1998) Science 281: 269-272] 참조).
[3 + 2] 시클로부가를 통해 본 발명의 단백질에 부가될 수 있는 분자는 아지드 또는 알키닐 유도체를 갖는 거의 모든 분자를 포함한다. 이 분자는 염료, 형광발색단, 가교 결합제, 사카라이드 유도체, 중합체 (폴리에틸렌 글리콜의 유도체를 포함하며 이에 한정되지 않음), 광가교결합제, 세포독성 화합물, 친화성 표지, 바이오틴의 유사체, 수지, 비드, 제2 단백질 또는 폴리펩티드 (또는 그 이상), 폴리뉴클레오티드(들) (DNA, RNA 등을 포함하며 이에 한정되지 않음), 금속 킬레이트화제, 보조인자, 지방산, 탄수화물 등을 포함하며 이에 한정되지 않는다. 이러한 분자들은 각각 p-프로파르길옥시페닐알라닌을 포함하며 이에 한정되지 않는 알키닐 기 또는 p-아지도-페닐알라닌을 포함하며 이에 한정되지 않는 아지도 기를 갖는 비천연 아미노산에 부가될 수 있다.
V. 비유전자로 코딩된 아미노산을 포함하는 hGH 폴리펩티드의 세포 내 생성
본 발명의 hGH 폴리펩티드는 변형된 tRNA 및 tRNA 합성효소를 사용하여 생체 내 생성되어 자연 발생 시스템에서는 코딩되지 않는 아미노산에 부가되거나 또는 이를 치환할 수 있다.
자연 발생 시스템에서 코딩되지 않는 아미노산을 사용하여 tRNAs 및 tRNA 합성효소를 생성하는 방법은 예를 들면, 본 명세서에 참고 문헌으로 인용되는 미국 특허 출원 공보 2003/0082575 (일련 번호 10/126,927) 및 2003/0108885 (일련 번호 10/126,931)에 기재되어 있다. 이러한 방법은 번역 시스템에 대해 내인성인 합성효소 및 tRNAs와 독립적으로 기능하는 (따라서, 때때로 "직교"라고도 지칭됨) 번역 기구를 생성하는 것을 포함한다. 전형적으로, 번역 시스템은 오르토고날 tRNA (O-tRNA) 및 오르토고날 아미노아실 tRNA 합성효소 (O-RS)를 포함한다. 전형적으로, O-RS는 번역 시스템에서 하나 이상의 비자연 발생 아미노산을 사용하여 O-tRNA를 우선적으로 아미노아실화하고, O-tRNA는 이 시스템 중에서 다른 tRNAs에 의해 인식되지 못하는 하나 이상의 셀렉터 코돈을 인식한다. 따라서, 번역 시스템은 코딩된 셀렉터 코돈에 대응하여 상기 시스템 중에서 생산된 단백질에 비-천연적으로 코딩된 아미노산을 삽입함으로써 코딩된 폴리펩티드 중의 위치에 아미노산을 "치환"시킨다.
매우 다양한 오르토고날 tRNAs 및 아미노아실 tRNA 합성효소가 특정 합성 아미노산을 폴리펩티드에 삽입하는 것으로 당분야에 기재되었으며, 이들은 일반적으로 본 발명에 사용하기 적합하다. 예를 들면, 케토-특이적 O-tRNA/아미노아실-tRNA 합성효소는 문헌[Wang, L., et al., Pfoc. Natl. Acad. Sci. USA 100; 56-61 (2003) and Zhang, Z. et al., Biochem. 42 (22): 6735-6746 (2003)]에 기재되어 있다. 예시적인 O-RS 또는 그의 부분은 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되고, 각각 본 명세서에 참고 문헌으로 인용되는 미국 특허 출원 공보 2003/0082575 및 2003/0108885에 개시된 아미노산 서열을 포함한다. 또한, O-RSs와 함께 사용되는 대응하는 O-tRNA 분자도 본 명세서에 참고 문헌으로 인용되는 미국 특허 출원 공보 2003/0082575 (일련 번호 10/126,927) 및 2003/0108885 (일련 번호 10/126,931)에 기재되어 있다.
아지드-특이적 O-tRNA/아미노아실-tRNA 합성효소 시스템의 예는 문헌[Chin, J. W., et al., J. Am. Chem. Soc. 124: 9026-9027 (2002)]에 기재되어 있다. p-아지도-L-Phe에 대한 예시적인 O-RS 서열은 본 명세서에 참고 문헌으로 인용되는 미국 특허 출원 공보 2003/0108885 (일련 번호 10/126,931)에 개시된 뉴클레오티드 서열인 서열 번호: 14-16 및 29-32 및 아미노산 서열인 서열 번호: 46-48 및 61-64를 포함하며 이에 한정되지 않는다. 본 발명에 사용하기 적합한 예시적인 O-tRNA 서열은 본 명세서에 참고 문헌으로 인용되는 미국 특허 출원 공보 2003/0108885 (일련 번호 10/126,931)에 개시된 뉴클레오티드 서열인 서열 번호: 1-3을 포함하며 이에 한정되지 않는다. 비-천연 코딩 특정 아미노산에 대해 쌍 특이적인 0-tRNA/아미노아실-tRNA 합성효소의 다른 예는 본 명세서에 참고 문헌으로 인용되는 미국 특허 출원 공보 2003/0082575 (일련 번호 10/126,927)에 기재되어 있다. S. 세레비시에 중에 케토 함유 아미노산 및 아지드 함유 아미노산 양쪽 모두를 도입시키는 O-RS 및 O-tRNA는 문헌[Chin, J. W., et al., Science 301: 964-967 (2003)]에 기재되어 있다.
O-tRNA/아미노아실-tRNA 합성효소의 용도는 비-천연적으로 코딩된 아미노산을 코딩하는 특이적 코돈을 선택하는 것을 포함한다. 임의의 코돈을 사용할 수 있지만, 일반적으로는 O-tRNA/아미노아실-tRNA 합성효소가 발현되는 세포에서 거의 사용되지 않거나 또는 완전히 사용되지 않는 코돈을 선택하는 것이 바람직하다. 예를 들면, 예시적인 코돈은 거의 사용되지 않거나 또는 사용되지 않는 넌센스 코돈, 예를 들면 정지 코돈 (엠버, 오우커 및 오팔), 4 개 이상의 염기 코돈 및 다른 천연 3 개의-염기 코돈을 포함한다.
특이적인 셀렉터 코돈(들)을 당분야에 공지된 돌연변이발생 방법 (부위-특이적 돌연변이발생, 카세트 돌연변이발생, 제한 선택 돌연변이발생 등을 포함하며 이에 한정되지 않음)을 사용하여 hGH 폴리뉴클레오티드 코딩 서열 중 적합한 위치에 도입시킬 수 있다.
비-천연적으로 코딩된 아미노산을 도입시키는 데 사용될 수 있는 단백질 생합성 기구의 성분, 예를 들면 O-RSs, O-tRNAs, 및 오르토고날 O-tRNA/O-RS 쌍을 생성하는 방법은 문헌[Wang, L., et al., Science 292: 498-500 (2001); Chin, J. W., et al., J. Am. Chem. Soc. 124: 9026-9027 (2002); Zhang, Z. et al., Biochemistry 42: 6735-6746 (2003)]에 기재되어 있다. 비-천연적으로 코딩된 아미노산의 생체 내 도입 방법 및 이를 위한 조성물은 본 명세서에 참고 문헌으로 인용되는 미국 특허 출원 공보 2003/0082575 (일련 번호 10/126,927)에 기재되어 있다. 또한, 유기체의 생체 내 번역 시스템에 사용하기 위해 오르토고날 tRNA-tRNA 합성효소 쌍을 선택하는 방법은 본 명세서에 참고 문헌으로 인용되는 미국 특허 출원 공보 2003/0082575 (일련 번호 10/126,927) 및 2003/0108885 (일련 번호 10/126,931)에 기재되어 있다.
하나 이상의 재조합 오르토고날 아미노아실-tRNA 합성효소 (O-RS)를 생성하는 방법은: (a) 원핵생물 유기체, 예를 들면 메타노코쿠스 잔나스키이, 메타노박테리움 써모오토트로피쿰, 할로박테리움, 에스케리치아 콜라이, A. 풀기더스, P. 푸리오서스, P. 호리코쉬이, A. 페르닉스, T. 써모필루스, 등, 또는 진핵생물 유기체를 포함하며 이에 한정되지 않는 제1 유기체로부터의 하나 이상의 아미노아실-tRNA 합성효소 (RS)로부터 유도된 (임의적으로, 돌연변이체) RSs의 라이브러리를 생성하는 단계, (b) (임의적으로, 돌연변이체) RSs의 라이브러리 중에서 비-천연적으로 코딩된 아미노산 및 천연 아미노산의 존재 하에서 오르토고날 tRNA (O-tRNA)를 아미노아실화하는 구성원을 선택 (및(또는) 스크리닝)함으로써, 활성 (임의적으로, 돌연변이체) RSs의 풀을 제공하는 단계, 및(또는) (c) 비-천연적으로 코딩된 아미노산의 부재 하에서 O-tRNA를 우선적으로 아미노아실화하는 활성 RSs (돌연변이체 RSs를 포함하며 이에 한정되지 않음)에 대한 풀을 (임의적으로, 음성 선택을 통해) 선택함으로써 비-천연적으로 코딩된 아미노산을 사용하여 O-tRNA를 우선적으로 아미노아실화하는 하나 이상의 재조합 O-RS를 제공하는 단계를 포함한다.
한 실시양태에서, 상기 RS는 비활성 RS이다. 이러한 비활성 RS는 활성 RS를 돌연변이화함으로써 생성될 수 있다. 예를 들면, 이러한 비활성 RS는 약 1 개 이상, 약 2 개 이상, 약 3 개 이상, 약 4 개 이상, 약 5 개 이상, 약 6 개 이상 또는 약 10 개 이상의 아미노산을 알라닌을 포함하며 이에 한정되지 않는 상이한 아미노산으로 돌연변이시킴으로써 생성될 수 있다.
돌연변이체 RSs의 라이브러리는 단백질 3차원 RS 구조에 기초한 합리적 (rational) 디자인, 또는 랜덤 또는 합리적 디자인 기술에서의 RS 뉴클레오티드의 돌연변이발생을 포함하며 이에 한정되지 않는 당분야에 공지된 다양한 기술을 사용하여 생성될 수 있다. 예를 들면, 돌연변이체 RSs는 부위-특이적 돌연변이, 랜덤 돌연변이, 다양성 (diversity) 생성 재조합 돌연변이, 키메라 구성체, 합리적 디자인, 및 본 명세서에 기재되거나 또는 당분야에 공지된 다른 방법에 의해 생성될 수 있다.
한 실시양태에서, 비-천연적으로 코딩된 아미노산 및 천연 아미노산의 존재 하에서 오르토고날 tRNA (O-tRNA)를 아미노아실화하는 것을 포함하며 이에 한정되지 않는 활성이 있는 구성원에 대해 (임의적으로, 돌연변이체) RSs의 라이브러리를 선택 (및(또는) 스크리닝)하는 것은, 항생제 내성 유전자 등을 포함하며 이에 한정되지 않는 양성 선택 또는 스크리닝 마커 (여기서, 양성 선택 및(또는) 스크리닝 마커는 엠버, 오우커, 또는 오팔 코돈을 포함하며 이에 한정되지 않는 하나 이상의 셀렉터 코돈을 포함함), 및 (임의적으로, 돌연변이체) RSs의 라이브러리를 다수의 세포에 도입시키는 단계; 선택제의 존재 하에서 다수의 세포를 성장시키는 단계; 및 양성 선택 또는 스크리닝 마커 중에서 하나 이상의 셀렉터 코돈을 억제함으로써 선택제 및(또는) 스크리닝제의 존재 하에서 생존 (또는 특이적 반응을 나타내는)하는 세포를 동정함으로써 활성 (임의적으로, 돌연변이체) RSs의 풀을 함유하는 양성적으로 선택된 세포로 된 부분집합을 제공하는 단계를 포함한다. 임의적으로, 선택제 및(또는) 스크리닝제 농도는 변할 수 있다.
한 측면에서, 양성 선택 마커는 클로람페니콜 아세틸트란스퍼라아제 (chloramphenicol acetyltransferase; CAT) 유전자이고, 셀렉터 코돈은 CAT 유전자 중의 엠버 정지 코돈이다. 임의적으로, 양성 선택 마커는 β-락타마아제 (lactamase) 유전자이고, 셀렉터 코돈은 β-락타마아제 유전자 중의 엠버 정지 코돈이다. 또 다른 측면에서, 양성 스크리닝 마커는 형광 또는 발광 스크리닝 마커 또는 친화성 기재 스크리닝 마커 (세포 표면 마커를 포함하며 이에 한정되지 않음)를 포함한다.
한 실시양태에서, 비-천연적으로 코딩된 아미노산의 부재 하에서 O-tRNA를 우선적으로 아미노아실화하는 활성 RSs (임의적으로, 돌연변이체)에 대한 풀을 음성적으로 선택하거나 또는 스크리닝하는 것은, 양성 선택 또는 스크리닝으로부터 양성 선택 또는 스크리닝으로부터 활성 (임의적으로, 돌연변이체) RSs의 풀을 사용하여 음성 선택 또는 스크리닝 마커 (여기서, 음성 선택 또는 스크리닝 마커는 하나 이상의 셀렉터 코돈 (클로람페니콜 아세틸트란스퍼라아제 (CAT) 유전자를 포함하며 이에 한정되지 않는 항생제 내성 유전자를 포함하며 이에 한정되지 않음)을 포함함)를 제2 유기체로 된 다수의 세포에 도입시키는 단계; 및 비-천연적으로 코딩된 아미노산 및 스크리닝제 또는 선택제로 보충되는 제1 배지에서 생존하거나 또는 특이적 스크리닝 반응을 나타내지만 비-천연적으로 코딩된 아미노산 및 선택제 또는 스크리닝제로 보충되지 않는 제2 배지에서 생존하지 못하거나 또는 특이적 반응을 나타내지 않는 세포를 동정하여 생존하는 세포 또는 스크리닝된 세포에 하나 이상의 재조합 O-RS를 제공하는 단계를 포함한다. 예를 들면, CAT 동정 프로토콜은 임의적으로 적합한 O-RS 재조합의 결정시 양성 선택 및(또는) 음성 스크리닝으로 작용한다. 예를 들면, 클론의 풀은 임의적으로 하나 이상의 비-천연적으로 코딩된 아미노산을 함유하거나 또는 함유하지 않는 CAT (이는 하나 이상의 셀렉터 코돈을 포함)를 함유하는 성장 배지 상에서 복제된다. 따라서, 비-천연적으로 코딩된 아미노산을 함유하는 배지에서 우세적으로 성장하는 콜로니는 재조합 O-RS를 함유하는 것으로 간주된다. 한 측면에서, 선택제 (및(또는) 스크리닝제)의 농도는 변화한다. 일부 측면에서, 제1 유기체와 제2 유기체는 상이하다. 따라서, 제1 유기체 및(또는) 제2 유기체는 임의적으로 원핵생물, 진핵생물, 포유류, 에스케리치아 콜라이, 진균류, 효모, 아케아박테리움 (archaebacterium), 에우박테리움, 식물, 곤충, 단세포 생물 (protist) 등을 포함한다. 다른 실시양태에서, 스크리닝 마커는 형광 또는 발광 스크리닝 마커 또는 친화성 기재 스크리닝 마커를 포함한다.
또 다른 실시양태에서, 활성 (임의적으로, 돌연변이체) RSs에 대한 풀을 스크리닝하거나 또는 선택 (음성적으로 선택하는 것을 포함하며 이에 한정되지 않음)하는 것은 양성 선택 단계 (b)로부터 활성 돌연변이체 RSs의 풀을 단리시키는 단계; 음성 선택 또는 스크리닝 마커 (여기서, 음성 선택 또는 스크리닝 마커는 하나 이상의 셀렉터 코돈 (하나 이상의 셀렉터 코돈을 포함하는 리보뉴클레아제 바르나아제 (ribonuclease barnase) 유전자를 포함하며 이에 한정되지 않는 독성 마커 유전자를 포함하며 이에 한정되지 않음)을 포함함), 및 활성 (임의적으로, 돌연변이체) RSs의 풀을 제2 유기체로 된 다수의 세포에 도입시키는 단계; 비-천연적으로 코딩된 아미노산으로 보충되지 않는 제1 배지에서 생존하거나 또는 특이적 스크리닝 반응을 나타내지만, 비-천연적으로 코딩된 아미노산으로 보충되는 제2 배지에서는 생존하지 못하거나 또는 특이적 스크리닝 반응을 나타내지 않는 세포를 동정하여 생존하거나 또는 스크리닝된 세포에 비-천연적으로 코딩된 아미노산에 특이적인 하나 이상의 재조합 O-RS를 제공하는 것을 포함한다. 한 측면에서, 하나 이상의 셀렉터 코돈은 약 2 개 이상의 셀렉터 코돈을 포함한다. 임의적으로, 이러한 실시양태는 하나 이상의 셀렉터 코돈이 2 개 이상의 셀렉터 코돈을 포함하고, 제1 유기체와 제2 유기체가 상이한 (여기서, 각각의 유기체는 임의적으로, 원핵생물, 진핵생물, 포유류, 에스케리치아 콜라이, 진균류, 효모, 아케아박테리움, 에우박테리움, 식물, 곤충, 단세포 생물 등을 포함하며 이에 한정되지 않음) 경우를 포함할 수 있다. 또한, 일부 측면은 음성 선택 마커가 리보뉴클레아제 바르나아제 유전자 (하나 이상의 셀렉터 코돈을 포함함)를 포함하는 경우를 포함한다. 다른 측면은 스크리닝 마커가 임의적으로 형광 또는 발광 스크리닝 마커 또는 친화성 기재 스크리닝 마커를 포함하는 경우를 포함한다. 본 명세서의 실시양태에서, 스크리닝 및(또는) 선택은 임의적으로, 스크리닝 및(또는) 선택 엄격성 (stringency)의 변이를 포함한다.
한 실시양태에서, 하나 이상의 재조합 오르토고날 아미노아실-tRNA 합성효소 (O-RS)를 생산하는 방법은 (d) 하나 이상의 재조합 O-RS를 단리시키는 단계; (e) 하나 이상의 재조합 O-RS로부터 유도된 O-RS (임의적으로, 돌연변이화됨)의 제2 집합을 생성하는 단계; 및 (f) O-tRNA를 우선적으로 아미노아실화하는 능력을 포함하는 돌연변이된 O-RS가 얻어질 때까지 단계 (b) 및 단계 (c)를 반복하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 임의적으로, 단계 (d)-(f)를 약 2 회 이상을 포함하며 이에 한정되지 않는 횟수로 반복한다. 한 측면에서, 하나 이상의 재조합 O-RS로부터 유도된 돌연변이화된 O-RS의 제2 집합은 랜덤 돌연변이발생, 부위-특이적 돌연변이발생, 재조합 또는 그들의 조합을 포함하며 이에 한정되지 않는 돌연변이발생에 의해 생성될 수 있다.
상기한 방법에서 양성 선택/스크리닝 단계 (b), 음성 선택/스크리닝 단계 (c) 또는 양성 및 음성 선택/스크리닝 단계 (b) 및 (c) 양쪽 모두를 포함하며 이에 한정되지 않는 선택/스크리닝 단계의 엄격성은 임의적으로 선택/스크리닝 엄격성을 변화시키는 것을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 양성 선택/스크리닝 단계 (b), 음성 선택/스크리닝 단계 (c) 또는 양성 및 음성 선택/스크리닝 단계 (b) 및 (c) 양쪽 모두는 리포터 (reporter)를 사용하는 것을 포함하며, 여기서 리포터는 형광-활성화 세포 분류 (fluorescence-activated cell sorting; FACS)에 의해 검출되거나 또는 발광에 의해 검출된다. 임의적으로, 리포터는 세포 표면, 파지 디스플레이 (phage display) 등에서 디스플레이되고, 비-천연적으로 코딩된 아미노산 또는 유사체를 포함하는 친화성 또는 촉매 활성을 기초로 선택된다. 한 실시양태에서, 돌연변이된 합성효소는 세포 표면, 파지 디스플레이 등에서 디스플레이된다.
재조합 오르토고날 tRNA (O-tRNA)를 생산하는 방법은 (a) 제1 유기체로부터 억제제 tRNA를 포함하며 이에 한정되지 않는 하나 이상의 tRNA로부터 유도된 돌연변이체 tRNAs의 라이브러리를 생성하는 단계, (b) 제1 유기체로부터의 RS의 부재 하에서 제2 유기체로부터 아미노아실-tRNA 합성효소 (RS)에 의해 아미노아실화된 (임의적으로, 돌연변이체) tRNAs에 대한 라이브러리를 선택 (음성적으로 선택하는 것을 포함하며 이에 한정되지 않음)하거나 또는 스크리닝하여 tRNAs (임의적으로, 돌연변이체)의 풀을 제공하는 단계; 및 (c) 도입된 오르토고날 RS (O-RS)에 의해 아미노아실화된 구성원에 대한 tRNAs (임의적으로, 돌연변이체)의 풀을 선택하거나 또는 스크리닝함으로써 하나 이상의 재조합 O-tRNA (여기서, 하나 이상의 재조합 O-tRNA는 셀렉터 코돈을 인식하고, 제2 유기체로부터 RS에 의해 유효하게 인식되지 않으며, O-RS에 의해 우선적으로 아미노아실화됨)를 제공하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 tRNA는 억제제 tRNA이고(이거나) 천연 및(또는) 비천연 염기로 된 유니크한 3 개의 염기 코돈을 포함하거나, 또는 넌센스 코돈, 희귀 코돈, 비천연 코돈, 4 개 이상의 염기를 포함하는 코돈, 엠버 코돈, 오우커 코돈 또는 오팔 정지 코돈이다. 한 실시양태에서, 재조합 O-tRNA는 개선된 직교성을 갖는다. 일부 실시양태에서, O-tRNA가 변형될 필요 없이 제2 유기체로부터 제1 유기체로 임의적으로 개입된다는 점이 명확이 이해될 것이다. 다양한 실시양태에서, 제1 유기체 및 제2 유기체는 동일하거나 또는 상이하고, 임의적으로 원핵생물 (메타노코쿠스 잔나스키이, 메타노박테리움 써모오토트로피쿰, 에스케리치아 콜라이, 할로박테리움 등을 포함하며 이에 한정되지 않음), 진핵생물, 포유류, 진균류, 효모, 아키박테리움, 유박테리움, 식물, 곤충, 원생생물 등을 포함하며 이에 한정되지 않는 것들로부터 선택된다. 또한, 재조합 tRNA는 비-천연적으로 코딩된 아미노산에 의해 임의적으로 아미노아실화되며, 여기서 비-천연적으로 코딩된 아미노산은 천연적으로 또는 유전자 조작을 통해 생체 내 생합성된다. 임의적으로, 비-천연적으로 코딩된 아미노산을 적어도 제1 유기체 또는 제2 유기체에 대한 성장 배지에 첨가한다.
한 측면에서, 아미노아실-tRNA 합성효소에 의해 아미노아실화된 (임의적으로, 돌연변이체) tRNAs에 대한 라이브러리를 선택 (음성적으로 선택하는 것을 포함하며 이에 한정되지 않음)하거나 또는 스크리닝하는 단계 (단계 (b))는 독성 마커 유전자 (여기서, 독성 마커 유전자는 셀렉터 코돈 (또는 이러한 마커 유전자가 하나 이상의 셀렉터 코돈을 포함하는 것인 유기체에 필수적인 유전자 또는 독성 약제 또는 항균제를 생산하게 하는 유전자) 및 (임의적으로, 돌연변이체) tRNAs의 라이브러리 중 하나 이상을 포함함)을 제2 유기체로부터의 다수의 세포에 도입시키고, 하나 이상의 오르토고날 tRNA 또는 비기능적 tRNA를 포함하는 (임의적으로, 돌연변이체) tRNAs의 풀을 포함하는 생존하는 세포를 선택하는 것을 포함한다. 예를 들면, 생존하는 세포는 비교 비율 세포 밀도 분석시험을 사용함으로써 선택될 수 있다.
또 다른 측면에서, 독성 마커 유전자는 2 개 이상의 셀렉터 코돈을 포함할 수 있다. 본 방법의 또 다른 실시양태에서, 독성 마커 유전자는 리보뉴클레아제 바르나아제 유전자이며, 여기서 리보뉴클레아제 바르나아제 유전자는 하나 이상의 엠버 코돈을 포함한다. 임의적으로, 리보뉴클레아제 바르나아제 유전자는 2 개 이상의 엠버 코돈을 포함할 수 있다.
한 실시양태에서, 도입된 오르토고날 RS (O-RS)에 의해 아미노아실화된 구성원에 대해 (임의적으로, 돌연변이체) tRNAs의 풀을 선택하거나 또는 스크리닝하는 것은, 양성 선택 또는 스크리닝 마커 유전자 (여기서, 양성 마커 유전자는 약물 내성 유전자 (하나 이상의 셀렉터 코돈, 예를 들면 하나 이상의 엠버 정지 코돈을 포함하는 β-락타마아제 유전자를 포함하며 이에 한정되지 않음) 또는 유기체에 필수적인 유전자, 또는 O-RS와 함께 독성 약제를 해독하는 유전자를 포함함), 및 (임의적으로, 돌연변이체) tRNAs의 풀을 제2 유기체로부터의 다수의 세포에 도입시키는 단계, 및 항생제를 포함하며 이에 한정되지 않는 선택제 또는 스크리닝제의 존재 하에서 성장하는 생존하거나 또는 스크리닝된 세포를 동정함으로써 하나 이상의 재조합 tRNA (여기서, 하나 이상의 재조합 tRNA는 O-RS에 의해 아미노아실화되고, 하나 이상의 셀렉터 코돈에 대응하여 양성 마커 유전자에 의해 코딩된 번역 생성물에 아미노산을 삽입함)를 갖는 세포의 풀을 제공하는 단계를 포함할 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 선택제 및(또는) 스크리닝제의 농도는 변화한다.
특이적 O-tRNA/O-RS 쌍을 생성하는 방법이 제공된다. 이 방법은 (a) 제1 유기체로부터 하나 이상의 tRNA로부터 유도된 돌연변이체 tRNAs의 라이브러리를 생성하는 단계, (b) 제1 유기체로부터의 RS의 부재 하에서 제2 유기체로부터 아미노아실-tRNA 합성효소 (RS)에 의해 아미노아실화된 (임의적으로, 돌연변이체) tRNAs에 대한 라이브러리를 음성적으로 선택하거나 또는 스크리닝함으로써 (임의적으로, 돌연변이체) tRNAs의 풀을 제공하는 단계; (c) 도입된 오르토고날 RS (O-RS)에 의해 아미노아실화된 구성원에 대한 (임의적으로, 돌연변이체) tRNAs의 풀을 선택하거나 또는 스크리닝함으로써 하나 이상의 재조합 O-tRNA를 제공하는 단계를 포함한다. 하나 이상의 재조합 O-tRNA는 셀렉터 코돈을 인식하고, 제2 유기체로부터 RS에 의해 유효하게 인식되지 않으며, O-RS에 의해 우선적으로 아미노아실화된다. 또한, 이 방법은 (d) 제 3 유기체로부터 하나 이상의 아미노아실-tRNA 합성효소 (RS)로부터 유도된 (임의적으로, 돌연변이체) RSs의 라이브러리를 생성하는 단계; (e) 비-천연적으로 코딩된 아미노산 및 천연 아미노산의 존재 하에서 하나 이상의 재조합 O-tRNA를 우선적으로 아미노아실화하는 구성원에 대한 돌연변이체 RSs의 라이브러리를 선택하거나 또는 스크리닝하여 활성 (임의적으로, 돌연변이체) RSs의 풀을 제공하는 단계; 및 (f) 비-천연적으로 코딩된 아미노산의 부재 하에서 하나 이상의 재조합 O-tRNA를 우선적으로 아미노아실화하는 활성 (임의적으로, 돌연변이체) RSs에 대한 풀을 음성적으로 선택하거나 또는 스크리닝함으로써, 하나 이상의 특이적 O-tRNA/O-RS 쌍 (여기서, 하나 이상의 특이적 O-tRNA/O-RS 쌍은 비-천연적으로 코딩된 아미노산 및 하나 이상의 재조합 O-tRNA에 특이적인 하나 이상의 재조합 O-RS를 포함함)을 제공하는 단계를 포함한다. 이 방법에 의해 생산된 특이적인 0-tRNA/O-RS 쌍이 포함된다. 예를 들면, 특이적 O-tRNA/O-RS 쌍은 mutRNATyr-mutTyrRS 쌍, 예를 들면 mutRNATyr-SS12TyrRS 쌍, mutRNALeu-mutLeuRS 쌍, mutRNAThr-mutThrRS 쌍, mutRNAGlu-mutGluRS 쌍 등을 포함하며 이에 한정되지 않는 것들을 포함할 수 있다. 또한, 이러한 방법은 제1 유기체와 제 3 유기체가 동일한 (메타노코쿠스 잔나스키이를 포함하며 이에 한정되지 않음) 경우를 포함한다.
또한, 제2 유기체의 세포 내 번역 시스템에 사용하기 위해 오르토고날 tRNA-tRNA 합성효소 쌍을 선택하는 방법도 본 발명에 포함된다. 이 방법은 마커 유전자, tRNA 및 제1 유기체로부터 단리되거나 또는 유도된 아미노아실-tRNA 합성효소 (RS)를 제2 유기체로부터의 세포의 제1 집합으로 도입시키고, 상기 마커 유전자 및 tRNA를 제2 유기체로부터의 중복 (duplicate) 세포 집합에 도입시키고, 중복 세포 집합에서는 생존하지 못하는 제1 집합에서 생존하는 세포를 선택하거나 또는 중복 세포 집합에서는 이러한 반응을 제공하지 못하는 특이적 스크리닝 반응을 나타내는 세포를 스크리닝하는 것을 포함하며, 여기서 상기 제1 집합 및 중복 세포 집합은 선택제 또는 스크리닝제의 존재 하에서 성장하고, 상기 생존하는 또는 스크리닝된 세포는 제2 유기체의 세포 내 번역 시스템에서 사용되는 오르토고날 tRNA-tRNA 합성효소 쌍을 포함한다. 한 실시양태에서, 비교 및 선택 또는 스크리닝은 세포 내 상보성 분석시험을 포함한다. 선택제 또는 스크리닝제의 농도는 변화할 수 있다.
본 발명의 유기체는 다양한 유기체 및 다양한 조합물을 포함한다. 예를 들면, 본 발명의 방법의 제1 유기체 및 제2 유기체는 동일하거나 또는 상이할 수 있다. 한 실시양태에서, 상기 유기체는 임의적으로 메타노코쿠스 잔나스키이, 메타노박테리움 써모오토트로피쿰, 할로박테리움, 에스케리치아 콜라이, A. 풀기더스, P. 푸리오서스, P. 호리코쉬이, A. 페르닉스, T. 써모필루스 등을 포함하며 이에 한정되지 않는 원핵생물 유기체이다. 별법으로, 이러한 유기체는 임의적으로 식물 (착물 식물, 예를 들면 외떡잎 식물, 또는 쌍떡잎 식물을 포함하며 이에 한정되지 않음), 해조류, 원생생물, 진균류 (효모 등을 포함하며 이에 한정되지 않음), 동물 (포유류, 곤충, 절지 동물 등을 포함하며 이에 한정되지 않음)을 포함하며 이에 한정되지 않는 진핵생물 유기체 등을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 제2 유기체는 메타노코쿠스 잔나스키이, 메타노박테리움 써모오토트로피쿰, 할로박테리움, 에스케리치아 콜라이, A. 풀기더스, 할로박테리움, P. 푸리오서스, P. 호리코쉬이, A. 페르닉스, T. 써모필루스 등을 포함하며 이에 한정되지 않는 원핵생물 유기체이다. 별법으로, 제2 유기체는 효모, 동물 세포, 식물 세포, 진균류, 포유류 세포 등을 포함하며 이에 한정되지 않는 진핵생물 유기체일 수 있다. 다양한 실시양태에서, 제1 유기체와 제2 유기체는 상이하다.
VI. hGH 폴리펩티드 중 비자연 발생 아미노산의 위치
본 발명은 하나 이상의 비자연 발생 아미노산을 hGH 폴리펩티드에 도입시키는 것을 고려한다. 하나 이상의 비자연 발생 아미노산은 폴리펩티드의 활성을 파괴하지 않는 특정 위치에서 도입될 수 있다. 이는 소수성 아미노산을 소수성 아미노산으로 치환 (용적이 큰(bulky) 아미노산의 경우 용적이 큰 아미노산으로, 친수성 아미노산의 경우 친수성 아미노산으로)하는 것을 포함하며 이에 한정되지 않는 "보존적" 치환을 수행하고(수행하거나) 비자연 발생 아미노산을 활성이 요구되지 않는 위치에 삽입시킴으로써 수행될 수 있다.
hGH의 영역은 다음과 같이 나타낼 수 있으며, 여기서 hGH 중 아미노산 위치는 중간 열에 나타낸다. (서열 번호 2).
나선 A 나선 B 나선 C 나선 D
[1-5]-[6-33]-[34-74]-[75-96]-[97-105]-[106-129]-[130-153]-[154-183]-[184-191] N-말단 A-B 루프 B-C 루프 C-D 루프 C-말단
다양한 생화학적 및 구조적 방법을 사용하여, hGH 폴리펩티드 내에서 비-천연적으로 코딩된 아미노산으로 치환하고자 하는 원하는 부위를 선택할 수 있다. 폴리펩티드 사슬 중 어떠한 위치가 비-천연적으로 코딩된 아미노산을 도입시키기 위해 선택하기에 적합하고, 이러한 선택은 임의의 원하는 특정 목적 또는 이러한 원하는 특정 목적 없이 랜덤 선택에 의해 또는 합리적 디자인에 기초할 수 있다는 점이 당업자에게 자명하다. 원하는 부위의 선택은 아고니스트, 슈퍼-아고니스트 (super-agonist), 역 아고니스트, 길항제, 수용체 결합 조절제, 수용체 활성 조절제, 이량체 또는 다량체 형성을 포함하며 이에 한정되지 않는 임의의 원하는 성질 또는 활성을 갖는 hGH 분자를 생성하거나, 본래의 분자에 비한 활성 또는 성질을 변화시키지 않거나, 또는 폴리펩티드의 임의의 물리적 또는 화학적 성질, 예를 들면 용해도, 응집, 또는 안정성을 조작하기 위한 것일 수 있다. 예를 들면, hGH 폴리펩티드의 생물학적 활성에 요구되는 폴리펩티드 중의 위치는 당분야에 공지된 알라닌 스캐닝 또는 동족체 스캐닝 방법을 사용하여 확인될 수 있다. 예를 들면, 문헌[Cunningham, B. and Wells, J., Science, 244: 1081-1085 (1989)] (hGH 생체활성에 중요한 14 개의 잔기 동정) 및 문헌[Cunningham, B., et al. Science 243: 1330-1336 (1989)] (동족체 스캐닝 돌연변이발생을 사용하여 항체 및 수용체 에피토프 동정)을 참조할 수 있다. 알라닌 또는 동족체 스캐닝 돌연변이발생에 의한 생물학적 활성에 중요한 것으로 확인된 것들 이외의 잔기는 폴리펩티드에 대해 얻으려 하는 원하는 활성에 따라 비-천연적으로 코딩된 아미노산을 사용한 치환에 우수한 후보일 수 있다. 별법으로, 생물학적 활성에 중요한 것으로 확인된 부위도 역시 폴리펩티드에 대해 얻으려 하는 원하는 활성에 따라 비-천연적으로 코딩된 아미노산을 사용한 치환에 우수한 후보일 수 있다. 또 다른 대안은 폴리펩티드 사슬 상의 각각의 위치에서 비-천연적으로 코딩된 아미노산으로 간단히 연속 치환하고, 폴리펩티드의 활성에 대한 영향을 관찰하는 것이다. 비천연 아미노산을 사용하여 임의의 폴리펩티드에 치환하기 위한 위치를 선택하는 임의의 수단, 기술 또는 방법이 본 발명에 사용하기 적합하다는 점은 당업자에게 자명하다.
또한, 결실을 포함하는 hGH 폴리펩티드의 천연 발생 돌연변이체의 구조 및 활성을 조사하여 비-천연적으로 코딩된 아미노산을 사용한 치환에 내성을 가지기 쉬운 단백질의 영역을 결정할 수 있다. hGH에 대해 예를 들면, 문헌[Kostyo et al., Biochem. BiopAlys. Acta, 925: 314 (1987); Lewis, U., et al., J. Biol. Chem., 253: 2679-2687 (1978)]을 참조할 수 있다. 유사한 방식으로, 프로테아제 소화 및 단일클론 항체를 사용하여 hGH 폴리펩티드 수용체의 결합을 담당하는 hGH 폴리펩티드의 영역을 확인할 수 있다. 예를 들면, 문헌[Cunningham, B., et al. Science 243: 1330-1336 (1989); Mills, J., et al., Endocrinology, 107: 391-399 (1980); Li, C., Mol. Cell. Biochem., 46: 31-41 (1982)] (hGH에 대한 활성의 손실 없이 잔기 134-149 사이의 아미노산이 결실될 수 있다는 것을 시사함)을 참조할 수 있다. 비-천연적으로 코딩된 아미노산을 사용한 치환을 허용하지 않을 것 같은 잔기를 일단 제거하면, 각각의 잔여 위치에서 제안된 치환의 영향을 hGB 및 이의 결합 단백질의 3차원 결정 구조로부터 조사할 수 있다. hGH에 대해 문헌[de Vos, A., et al., Science, 255: 306-312 (1992)]을 참조할 수 있고, hGH의 모든 결정 구조는 단백질 및 핵산의 대형 분자의 3차원 구조적 데이터를 함유하는 중앙집중식 데이터베이스 (centralized database)인 프로테인 데이터 뱅크 (Protein Data Bank) (3HHR, 1AXI 및 1HWG 포함) (PDB, 월드 와이드 웹 상의 rcsb.org에서 입수가능)에서 입수가능하다. 따라서, 당업자는 비-천연적으로 코딩된 아미노산으로 치환될 수 있는 아미노산 위치를 용이하게 확인할 수 있다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 hGH 폴리펩티드는 폴리펩티드의 나선 또는 베타 시트 2차 구조를 붕괴시키지 않는 단백질의 영역에 위치한 하나 이상의 비자연 발생 아미노산을 포함한다.
비-천연적으로 코딩된 아미노산의 도입의 예시적인 잔기는 가능한 수용체 결합 영역 (사이트 I 및 사이트 II를 포함하며 이에 한정되지 않음)으로부터 제외된 것들일 수 있고, 완전히 또는 부분적으로 용매 노출될 수 있고, 이웃 잔기와 최소 수소 결합 상호작용을 갖거나 갖지 않을 수 있고, 이웃하는 반응성 기에 최소한으로 노출될 수 있고, 4 개의 나선 다발 폴리펩티드와 그의 수용체의 3차원 결정 구조에 의해 예측되는 바와 같이 높은 유연성을 가진 영역(C-D 루프를 포함하며 이에 한정되지 않음) 또는 구조적 강성을 가진 영역 (B 나선을 포함하며 이에 한정되지 않음)에 존재할 수 있다.
일부 실시양태에서, 하나 이상의 비-천연적으로 코딩된 아미노산은 다음과 같은 hGH 중의 2차 구조에 대응하는 다음의 영역 중 하나 이상의 임의의 위치에서 도입된다: 서열 번호 2로부터의 1-5 (N-말단), 6-33 (A 나선), 34-74 (A 나선과 B 나선 사이의 영역, A-B 루프), 75-96 (B 나선), 97-105 (B 나선과 C 나선 사이의 영역, B-C 루프), 106-129 (C 나선), 130-153 (C 나선과 D 나선 사이의 영역, C-D 루프), 154-183 (D 나선), 184-191 (C-말단). 다른 실시양태에서, 본 발명의 hGH 폴리펩티드는 N-말단 (1-5), A-B 루프 (32-46)의 N-말단 종결부, B-C 루프 (97-105), C-D 루프 (132-149), 및 C-말단 (184-191)으로 이루어진 군으로부터 선택된 hGH 중 하나 이상의 영역에 위치한 하나 이상의 아미노산이 치환된 하나 이상의 비자연 발생 아미노산을 포함한다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 비-천연적으로 코딩된 아미노산은 hGH의 다음의 위치 중 하나 이상에서 도입된다: 위치 1 앞 (즉, N-말단에서), 1, 2, 3, 4, 5, 8, 9, 11, 12, 15, 16, 19, 22, 29, 30, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 52, 55, 57, 59, 65, 66, 69, 70, 71, 74, 88, 91, 92, 94, 95, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 111, 112, 113, 115, 116, 119, 120, 122, 123, 126, 127, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 158, 159, 161, 168, 172, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192 (즉, 단백질의 카르복실 말단에서) (서열 번호 2, 또는 서열 번호 1 또는 서열 번호 3의 대응하는 아미노산).
하나 이상의 비-천연적으로 코딩된 아미노산의 예시적인 도입 부위는 서열 번호 2로부터의 29, 30, 33, 34, 35, 37, 39, 40, 49, 57, 59, 66, 69, 70, 71, 74, 88, 91, 92, 94, 95, 98, 99, 101, 103, 107, 108, 111, 122, 126, 129, 130, 131, 133, 134, 135, 136, 137, 139, 140, 141, 142, 143, 145, 147, 154, 155, 156, 159, 183, 186 및 187 또는 그의 임의의 조합물 또는 서열 번호 1 또는 서열 번호 3의 대응하는 아미노산을 포함한다.
하나 이상의 비-천연적으로 코딩된 아미노산의 도입에 대한 예시적인 부위로 된 부분집합은 서열 번호 2로부터의 29, 33, 35, 37, 39, 49, 57, 69, 70, 71, 74, 88, 91, 92, 94, 95, 98, 99, 101, 103, 107, 108, 111, 129, 130, 131, 133, 134, 135, 136, 137, 139, 140, 141, 142, 143, 145, 147, 154, 155, 156, 186 및 187 또는 그의 임의의 조합물 또는 서열 번호 1 또는 서열 번호 3의 대응하는 아미노산을 포함한다. hGH의 결정 구조 및 그의 hGH 수용체와의 상호작용을 조사한 결과는 이들 아미노산 잔기의 측쇄가 용매에 완전히 또는 부분적으로 접근가능하고, 비-천연적으로 코딩된 아미노산의 측쇄가 단백질 표면으로부터 용매로 향할 수 있다는 점을 시사한다.
하나 이상의 비-천연적으로 코딩된 아미노산을 위한 예시적인 위치는 서열 번호 2로부터의 35, 88, 91, 92, 94, 95, 99, 101, 103, 111, 131, 133, 134, 135, 136, 139, 140, 143, 145 및 155 또는 그의 임의의 조합물 또는 서열 번호 1 또는 서열 번호 3의 대응하는 아미노산을 포함한다. hGH의 결정 구조 및 그의 hGH 수용체와의 상호작용을 조사한 결과는 이들 아미노산 잔기의 측쇄가 용매에 완전히 또는 부분적으로 노출되고, 본래의 잔기의 측쇄가 용매로 향한다는 점을 시사한다.
하나 이상의 비-천연적으로 코딩된 아미노산의 도입에 대한 예시적인 부위로 된 부분집합은 서열 번호 2로부터의 30, 74, 103 또는 그의 임의의 조합물 또는 서열 번호 1 또는 서열 번호 3의 대응하는 아미노산을 포함한다. 하나 이상의 비-천연적으로 코딩된 아미노산의 도입에 대한 예시적인 부위로 된 또 다른 부분집합은 서열 번호 2로부터의 35, 92, 143, 145 또는 그의 임의의 조합물 또는 서열 번호 1 또는 서열 번호 3의 대응하는 아미노산을 포함한다.
일부 실시양태에서, 비자연 발생 아미노산은 다음의 위치를 포함하며 이에 한정되지 않는 위치들 중 하나 이상에서 수용성 중합체에 결합된다: 위치 1 앞 (즉, N-말단에서), 1, 2, 3, 4, 5, 8, 9, 11, 12, 15, 16, 19, 22, 29, 30, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 52, 55, 57, 59, 65, 66, 69, 70, 71, 74, 88, 91, 92, 94, 95, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 111, 112, 113, 115, 116, 119, 120, 122, 123, 126, 127, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 158, 159, 161, 168, 172, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192 (즉, 단백질의 카르복실 말단에서) (서열 번호 2, 또는 서열 번호 1 또는 서열 번호 3의 대응하는 아미노산). 일부 실시양태에서, 다음의 위치 중 하나 이상에서 비자연 발생 아미노산은 수용성 중합체에 결합된다: 30, 35, 74, 92, 103, 143, 145 (서열 번호 2, 또는 서열 번호 1 또는 서열 번호 3의 대응하는 아미노산). 일부 실시양태에서, 다음의 위치 중 하나 이상에서 비자연 발생 아미노산은 수용성 중합체에 결합된다: 35, 92, 143, 145 (서열 번호 2, 또는 서열 번호 1 또는 서열 번호 3의 대응하는 아미노산).
인간 GH 길항제는 다음에서 치환을 갖는 것들을 포함하며 이에 한정되지 않는다: 1, 2, 3, 4, 5, 8, 9, 11, 12, 15, 16, 19, 22, 103, 109, 112, 113, 115, 116, 119, 120, 123 및 127 또는 위치 1에서 (즉, N-말단에서)의 부가 또는 그의 임의의 조합물 (서열 번호 2, 또는 서열 번호 1, 서열 번호 3 또는 임의의 다른 GH 서열에서의 대응하는 아미노산).
매우 다양한 비-천연적으로 코딩된 아미노산은 hGH 폴리펩티드 중에서 주어진 위치를 치환하거나 또는 이러한 위치로 도입될 수 있다. 일반적으로, 도입을 위한 특정 비-천연적으로 코딩된 아미노산은 hGH 폴리펩티드와 그의 수용체의 3차원 결정 구조, 보존적 치환에 대한 선호성 (즉, Phe, Tyr 또는 Trp를 아릴 기재 비-천연적으로 코딩된 아미노산, 예를 들면 p-아세틸페닐알라닌 또는 O-프로파르길티로신으로 치환), 및 hGH 폴리펩티드에 도입시키고자 하는 특이적 컨쥬게이션 화학 (예를 들면, 알킨 부분을 갖는 수용성 중합체를 사용한 휘스겐 [3 + 2] 시클로부가 또는 아릴 에스테르를 가짐으로써 포스핀 기를 도입하는 수용성 중합체를 사용한 아미드 결합 형성에 영향을 미치고자 하는 경우, 4-아지도페닐알라닌을 도입시킴)의 조사를 기초로 선택된다.
한 실시양태에서, 본 방법은 제1 반응성 기를 포함하는 비천연 아미노산을 단백질에 도입시키고, 이러한 단백질을 제2 반응성 기를 포함하는 분자 (표지, 염료, 중합체, 수용성 중합체, 폴리에틸렌 글리콜의 유도체, 광가교결합제, 세포독성 화합물, 약물, 친화성 표지, 광친화성 표지, 반응성 화합물, 수지, 제2 단백질 또는 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 유사체, 항체 또는 항체 단편, 금속 킬레이트화제, 보조인자, 지방산, 탄수화물, 폴리뉴클레오티드, DNA, RNA, 안티센스 폴리뉴클레오티드, 억제성 리보핵산, 생물소재, 나노입자, 스핀 표지, 형광발색단, 금속 함유 기, 방사능 기, 신규한 작용기, 다른 분자와 공유적으로 또는 비공유적으로 상호작용하는 기, 포토케이징된 기, 광이성화가능한 기, 바이오틴, 바이오틴의 유사체, 바이오틴의 유사체, 바이오틴 유사체, 중 원자를 도입시킨 기, 화학적으로 분절가능한 기, 광분절성 기, 연장된 측쇄, 탄소-결합 당, 산화환원 활성제, 아미노 티오산, 독성 기, 동위 원소로 표지화된 기, 생체물리적 프로브, 형광 기, 화학발광 기, 고 전자 밀도 기, 잔기 기, 삽입성 기, 발색단, 에너지 전달제, 생물학적 활성제, 검출가능한 표지, 소형 분자 또는 상기 또는 임의의 다른 바람직한 화합물 또는 물질의 임의의 조합물을 포함하며 이에 한정되지 않음)와 접촉시키는 것을 추가로 포함한다. 제1 반응성 기는 제2 반응성 기와 반응하여 [3 + 2] 시클로 부가를 통해 분자를 비천연 아미노산에 부착시킨다. 한 실시양태에서, 제1 반응성 기는 알키닐 또는 아지도 부분이고, 제2 반응성 기는 아지도 또는 알키닐 부분이다. 예를 들면, 제1 반응성 기는 알키닐 부분 (비천연 아미노산 중의 p-프로파르길옥시페닐알라닌을 포함하며 이에 한정되지 않음)이고, 제2 반응성 기는 아지도 부분이다. 또 다른 예에서, 제1 반응성 기는 아지도 부분 (비천연 아미노산 중의 p-아지도-L-페닐알라닌을 포함하며 이에 한정되지 않음)이고, 제2 반응성 기는 알키닐 부분이다.
일부 경우, 비-천연적으로 코딩된 아미노산 치환(들)은 hGH 폴리펩티드를 사용한 다른 부가, 치환 또는 결실과 조합되어 hGH 폴리펩티드의 다른 생물학적 형질에 영향을 미치게 된다. 일부 경우, 다른 부가, 치환 또는 결실은 hGH 폴리펩티드의 안정성 (단백질분해성 분해에 대한 내성을 포함하며 이에 한정되지 않음)을 증가시키거나 또는 hGH 폴리펩티드의 그의 수용체에 대한 친화성을 증가시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, hGH 폴리펩티드는 서열 번호 2 중에서 F10A, F10H, F10I; M14W, M14Q, M14G; H18D; H21N; G120A; R167N; D171S; E174S; F176Y, I179T 또는 그의 임의의 조합물로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 치환을 포함한다. 일부 경우, 다른 부가, 치환 또는 결실은 hGH 폴리펩티드의 용해도 (대장균 또는 다른 숙주 세포 중에서 발현되는 경우를 포함하며 이에 한정되지 않음)를 증가시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 부가, 치환 또는 결실은 대장균 재조합 숙주 세포에서 발현된 후 폴리펩티드 용해도를 증가시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 대장균 재조합 숙주 세포에서 발현된 후 폴리펩티드 용해도를 증가시키게 되는 비천연 아미노산의 도입을 위한 또 다른 부위 외에도 천연적으로 코딩된 아미노산 또는 비천연 아미노산을 사용한 치환을 위한 부위도 선택된다. 일부 실시양태에서, hGH 폴리펩티드는 hGH 폴리펩티드 수용체에 대한 친화성을 조절하거나, 수용체 이량체화를 조절 (증가 또는 감소를 포함하며 이에 한정되지 않음)하거나, 수용체 이량체를 안정화시키거나, 순환 반감기를 조절하거나, 방출 또는 생체이용률을 조절하거나, 정제를 용이하게 하거나 또는 특정 투여 경로를 개선하거나 변화시키는 또 다른 부가, 치환 또는 결실을 포함한다. 예를 들면, 하나 이상의 비-천연적으로 코딩된 아미노산을 본 명세서에 나타낸 집합으로서 도입시키는 것 외에도, 하기 치환들 중 하나 이상을 도입시켜 hGH 변이체의 그의 수용체에 대한 친화성을 증가시킨다: F10A, F10H 또는 F10I; M14W, M14Q, 또는 M14G; H18D; H21N; R167N; D171S; E174S; F176Y 및 I179T. 유사하게, hGH 폴리펩티드는 프로테아제 분절 서열, 반응성 기, 항체 결합 도메인 (FLAG 또는 폴리-His를 포함하며 이에 한정되지 않음) 또는 다른 친화성 기재 서열 (FLAG, 폴리-His, GST 등을 포함하며 이에 한정되지 않음) 또는 폴리펩티드의 검출 (GFP를 포함하며 이에 한정되지 않음), 정제 또는 다른 형질을 개선시키는 결합된 분자 (바이오틴을 포함하며 이에 한정되지 않음)를 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 비-천연적으로 코딩된 아미노산의 치환은 hGH 길항제를 생성한다. 하나 이상의 비-천연적으로 코딩된 아미노산의 도입에 대한 예시적인 부위로 된 부분집합은 다음을 포함한다: 1, 2, 3, 4, 5, 8, 9, 11, 12, 15, 16, 19, 22, 103, 109, 112, 113, 115, 116, 119, 120, 123, 127, 또는 위치 1 앞 부가 (서열 번호 2, 또는 서열 번호 1, 서열 번호 3 또는 임의의 다른 GH 서열에서의 대응하는 아미노산). 일부 실시양태에서, hGH 길항제는 GH가 길항제로 작용할 수 있게 하는 영역 1-5 (N-말단), 6-33 (A 나선), 34-74 (A 나선과 B 나선 사이의 영역, A-B 루프), 75-96 (B 나선), 97-105 (B 나선과 C 나선 사이의 영역, B-C 루프), 106-129 (C 나선), 130-153 (C 나선과 D 나선 사이의 영역, C-D 루프), 154-183 (D 나선), 184-191 (C-말단)에서의 하나 이상의 치환을 포함한다. 다른 실시양태에서, 비-천연적으로 코딩된 아미노산의 예시적인 도입 부위는 나선 A 및 나선 C의 부분의 아미노 말단 영역을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, G120을 비-천연적으로 코딩된 아미노산, 예를 들면 p-아지도-L-페닐알라닌 또는 O-프로파르길-L-티로신으로 치환시킨다. 다른 실시양태에서, 상기 나열된 치환은 hGH 폴리펩티드를 hGH 길항제가 되게 하는 추가적인 치환과 합쳐진다. 예를 들면, 비-천연적으로 코딩된 아미노산은 본 명세서에서 동정된 위치 중 하나에서 치환되고, G120 (예를 들면, G120R, G120 K, G120W, G120Y, G120F 또는 G120E)에서 동시 치환이 도입된다. 일부 실시양태에서, hGH 길항제는 hGH 분자의 수용체 결합 영역 중에서 존재하는 수용성 중합체에 결합된 비-천연적으로 코딩된 아미노산을 포함한다.
일부 경우, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 개 이상의 아미노산은 하나 이상의 비-천연적으로 코딩된 아미노산으로 치환된다. 일부 경우, hGH 폴리펩티드는 자연 발생 아미노산에 대해 하나 이상의 비-천연적으로 코딩된 아미노산으로 된 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 개 이상의 치환을 추가로 포함한다. 예를 들면, 일부 실시양태에서, hGH 중 다음의 영역에서의 2 개 이상의 잔기는 하나 이상의 비-천연적으로 코딩된 아미노산으로 치환된다: 1-5 (N-말단): 32-46 (A-B 루프의 N-말단 종결부); 97-105 (B-C 루프); 및 132-149 (C-D 루프); 및 184-191 (C-말단). 일부 실시양태에서, hGH 중 다음의 영역에서의 2 개 이상의 잔기는 하나 이상의 비-천연적으로 코딩된 아미노산으로 치환된다: 1-5 (N-말단), 6-33 (A 나선), 34-74 (A 나선과 B 나선 사이의 영역, A-B 루프), 75-96 (B 나선), 97-105 (B 나선과 C 나선 사이의 영역, B-C 루프), 106-129 (C 나선), 130-153 (C 나선과 D 나선 사이의 영역, C-D 루프), 154-183 (D 나선), 184-191 (C-말단). 일부 경우, 두 개 이상의 비-천연 코딩 잔기는 하나 이상의 저 분자량 선형 또는 분지형 PEGs (질량이 대략 ~ 5-20 kDa 이하)에 결합되어 단일 고 분자량 PEG에 부착된 종에 비해 결합 친화성 및 동등한 혈청 반감기를 강화시킨다.
일부 실시양태에서, 다음의 hGH 잔기 중 2 개 이하는 위치 29, 30, 33, 34, 35, 37, 39, 40, 49, 57, 59, 66, 69, 70, 71, 74, 88, 91, 92, 94, 95, 98, 99, 101, 103, 107, 108, 111, 122, 126, 129, 130, 131, 133, 134, 135, 136, 137, 139, 140, 141, 142, 143, 145, 147, 154, 155, 156, 159, 183, 186 및 187에서 하나 이상의 비-천연적으로 코딩된 아미노산으로 치환된다. 일부 경우, 다음 중 임의의 치환이 이루어진다: K38X* 및 K140X*, K41X* 및 K145X*, Y35X* 및 E88X*, Y35X* 및 F92X*, Y35X* 및 Y143X*, F92X* 및 Y143X* (여기서, X*는 비-천연적으로 코딩된 아미노산을 나타냄). 2 개 이상의 비-천연적으로 코딩된 아미노산의 도입에 바람직한 부위는 다음의 잔기의 조합물을 포함한다: 29, 33, 35, 37, 39, 49, 57, 69, 70, 71, 74, 88, 91, 92, 94, 95, 98, 99, 101, 103, 107, 108, 111, 129, 130, 131, 133, 134, 135, 136, 137, 139, 140, 141, 142, 143, 145, 147, 154, 155, 156, 186 및 187. 2 개 이상의 비-천연적으로 코딩된 아미노산의 도입에 특히 바람직한 부위는 다음의 잔기의 조합물을 포함한다: 35, 88, 91, 92, 94, 95, 99, 101, 103, 111, 131, 133, 134, 135, 136, 139, 140, 143, 145 및 155.
hGH에서 2 개 이상의 비-천연적으로 코딩된 아미노산의 도입에 바람직한 부위는 다음의 잔기의 조합물을 포함한다: 서열 번호 2로부터의 위치 1 앞 (즉, N-말단에서), 1, 2, 3, 4, 5, 8, 9, 11, 12, 15, 16, 19, 22, 29, 30, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 52, 55, 57, 59, 65, 66, 69, 70, 71, 74, 88, 91, 92, 94, 95, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 111, 112, 113, 115, 116, 119, 120, 122, 123, 126, 127, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 158, 159,161, 168,172, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192 (즉, 단백질의 카르복실 말단에서) 또는 그의 임의의 조합물.
VII. 비-진핵생물 및 진핵생물에서의 발현
클로닝된 hGH 폴리뉴클레오티드의 높은 수준의 발현을 얻기 위해서는, 전형적으로 본 발명의 hGH 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를, 전사를 지시하는 강한 프로모터를 함유하는 발현 벡터, 전사/번역 종결제, 및 단백질을 코딩하는 핵산의 경우, 번역 개시를 위한 리보좀 결합 부위에 서브클로닝 (subcloning)한다. 적합한 세균 프로모터는 당분야에 공지되어 있고, 예를 들면, 문헌[Sambrook et al. and Ausubel et al.]에 기재되어 있다.
본 발명의 hGH 폴리펩티드 발현용 세균 발현 시스템은 대장균, 바실러스 균속 (Bacillus sp.) 및 살모넬라 (Salmonella)를 포함하며 이에 한정되지 않는 것에서 입수가능하다 (문헌[Palva et al., Gene 22: 229-235 (1983); Mosbach et al., Nature 302: 543-545 (1983)] 참조). 이러한 발현 시스템용 키트는 상업적으로 입수가능하다. 포유류 세포, 효모 및 곤충 세포용 진핵 발현 시스템은 당분야에 공지되어 있고, 또한 상업적으로도 입수가능하다. 오르토고날 tRNAs 및 아미노아실 tRNA 합성효소 (상기한 바와 같음)를 사용하여 본 발명의 hGH 폴리펩티드를 발현시키는 경우, 발현을 위한 숙주 세포는 오르토고날 성분을 사용할 수 있는 그들의 능력을 기초로 선택된다. 예시적인 숙주 세포는 그람-양성 (Gram-positive) 세균 (B. 브레비스 (brevis), B. 서브틸리스 (subtilis), 또는 스트렙토마이세스 (Streptomyces)를 포함하며 이에 한정되지 않음) 및 그람-음성 세균 (대장균, 수도모나스 플루오레센스, 수도모나스 에루기노사, 수도모나스 푸티다), 뿐만 아니라 효모 및 다른 진핵세포를 포함한다. O-tRNA/O-RS 쌍을 포함하는 세포는 본 명세서에 기재된 바와 같이 사용될 수 있다.
본 발명의 진핵 숙주 세포 또는 비진핵 숙주 세포는 비천연 아미노산을 많은 유용한 양으로 포함하는 단백질을 합성할 수 있는 능력을 제공한다. 한 측면에서, 임의적으로 조성물은 10 마이크로그램 이상, 50 마이크로그램 이상, 75 마이크로그램 이상, 100 마이크로그램 이상, 200 마이크로그램 이상, 250 마이크로그램 이상, 500 마이크로그램 이상, 1 밀리그램 이상, 10 밀리그램 이상, 100 밀리그램, 1 그램 이상을 포함하며 이에 한정되지 않는 비천연 아미노산을 포함하는 단백질, 또는 세포 내 단백질 생산 방법 (재조합 단백질 생산 및 정제에 대한 상세한 설명은 본 명세서에 제공됨)을 사용하여 얻어질 수 있는 양을 포함한다. 또 다른 측면에서, 임의적으로 단백질은 세포 용해물, 완충제, 제약상 완충제 또는 다른 액체 현탁액을 포함하며 이에 한정되지 않는 것 (약 1 nl 내지 약 100 L 중 임의의 것을 포함하며 이에 한정되지 않는 부피를 포함하며 이에 한정되지 않음) 중의 1 리터 당 10 마이크로그램 이상, 50 마이크로그램 이상, 75 마이크로그램 이상, 100 마이크로그램 이상, 200 마이크로그램 이상, 250 마이크로그램 이상, 500 마이크로그램 이상, 1 밀리그램 이상 또는 10 밀리그램 이상의 단백질을 포함하며 이에 한정되지 않는 농도의 조성물 중에서 존재한다. 진핵 세포에서 하나 이상의 비천연 아미노산을 포함하는 단백질을 대량 (전형적으로, 시험관 내 번역을 포함하며 이에 한정되지 않는 다른 방법을 사용하여 가능한 것보다 큰 것을 포함하며 이에 한정되지 않음) 생산하는 것은 본 발명의 한 특징이다.
본 발명의 진핵 숙주 세포 또는 비진핵 숙주 세포는 비천연 아미노산을 포함하는 많은 유용한 양의 단백질을 생합성하는 능력을 제공한다. 예를 들면, 비천연 아미노산을 포함하는 단백질은 세포 추출물, 세포 용해물, 배양 배지, 완충제 등 중의 10 ㎍/Liter 이상, 50 ㎍/Liter 이상, 75 ㎍/Liter 이상, 100 ㎍/Liter 이상, 200 ㎍/Liter 이상, 250 ㎍/Liter 이상, 또는 500 ㎍/Liter 이상, 1 mg/Liter 이상, 2 mg/Liter 이상, 3 mg/Liter 이상, 4 mg/Liter 이상, 5 mg/Liter 이상, 6 mg/Liter 이상, 7 mg/Liter, 8 mg/Liter 이상, 9 mg/Liter 이상, 10 mg/Liter 이상, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900 mg/Liter, 1 g/Liter, 5 g/Liter, 10 g/Liter 이상의 단백질을 포함하며 이에 한정되지 않는 농도에서 생산될 수 있다.
I. 발현 시스템, 배양 및 단리
hGH 폴리펩티드는 예를 들면, 효모, 곤충 세포, 포유류 세포 및 세균을 비롯한 임의의 다수의 적합한 발현 시스템에서 발현될 수 있다. 예시적인 발현 시스템의 설명을 이하에 제공한다.
효모 본 명세서에 사용된 용어 "효모"는 hGH 폴리펩티드를 코딩하는 유전자를 발현시킬 수 있는 임의의 다양한 효모를 포함한다. 이러한 효모는 자낭포자형성 (ascosporogenous) 효모 (엔도마이세탈레스 (Endomycetales)), 담자포자 (basidiosporogenous) 효모 및 불완전 진균류 (Fungi imperfecti) (블라스토마이세테스 (Blastomycetes)) 군에 속하는 효모를 포함하며 이에 한정되지 않는다. 자낭포자형성 효모는 2 개의 패밀리, 스퍼모프토라세에 (Spermophthoraceae) 및 사카로마이세타세에 (Saccharornycetaceae)로 나뉜다. 후자는 4 개의 아족, 스키조사카로마이코이데에 (Schizosaccharomycoideae) (예를 들면, 스키조사카로마이세스 (Schizosaccharomyces) 속), 마드소니오이데에 (Nadsonioideae), 리포마이코이데에 (Lipomycoideae) 및 사카로마이코이데에 (Saccharomycoideae) (예를 들면, 피치아 (Pichia) 속, 클루이베로마이세스 (Kluyveromyces) 속 및 사카로마이세스 (Saccharomyces) 속)를 포함한다. 담자포자 효모는 류코스포리디움 (Leucosporidium) 속, 로도스포리디움 (Rhodosporidium) 속, 스포리디오볼루스 (Sporidiobolus) 속, 필로바시디움 (Filobasidium) 속 및 필로바시디엘라 (Filobasidiella) 속을 포함한다. 불완전 진균류 (블라스토마이세테스) 군에 속하는 효모는 2 개의 패밀리, 스포로볼로마이세타세에 (Sporobolomycetaceae) (예를 들면, 스포로볼로마이세스 (Sporobolomyces) 속 및 불레라 (Bullera) 속) 및 크립토코카세에 (Cryptococcaceae) (예를 들면, 칸디다 (Candida) 속)로 나뉜다.
본 발명에 사용하기에 특히 중요한 것으로는 P. 파스토리스 (pastoris), P. 귈러리몬디 (guillerimondii), S. 세레비지에 (cerevisiae), S. 칼스버겐시스 (carlsbergensis), S. 디아스타티쿠스 (diastaticus), S. 더글라시 (douglasii), S. 클루이베리 (kluyveri), S, 노르벤시스 (norbensis), S. 오비포르미스 (oviformis), K. 락티스 (lactis), K. 프라길리스 (fragilis), C. 알비칸스 (albicans), C. 말토사 (maltosa) 및 H. 폴리모르파 (polymorpha)를 포함하며 이에 한정되지 않는 피치아 속, 클루이베로마이세스 속, 사카로마이세스 속, 스키조사카로마이세스 속, 한세눌라 (Hansenula) 속, 토룰롭시스 (Torulopsis) 속 및 칸디다 속에 속하는 종이 있다.
hGH 폴리펩티드의 발현을 위한 적합한 효모의 선택은 당업자의 기술 내에 속한다. 발현용 효모 숙주 선택시, 적합한 숙주는 예를 들면, 우수한 분비 용량, 낮은 단백질분해 활성, 우수한 분비 용량, 우수한 가용성 단백질 생산 및 전체적인 강인성을 갖는 것으로 나타난 것들을 포함할 수 있다. 일반적으로, 효모는 캘리포니아 대학 (University of California) (캘리포니아주 버클리 소재) 생체물리학 및 의료 물리학부 (Department of Biophysics and Medical Physics) 이스트 제네틱 스톡 센터 (Yeast Genetic 저장 Center) 및 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 (American Type Culture 수집물; "ATCC") (버지니아주 만나사스 소재)을 포함하며 이에 한정되지 않는 다양한 공급원으로부터 입수가능하다.
용어 "효모 숙주" 또는 "효모 숙주 세포"는 재조합 벡터 또는 다른 전이 DNA에 대한 수용물 (recipient)로 사용될 수 있거나 또는 사용된 효모를 포함한다. 이 용어는 재조합 벡터 또는 다른 전이 DNA를 수용한 원래의 효모 숙주 세포의 후손을 포함한다. 단일 모 세포의 후손이 우연한 돌연변이 또는 의도적인 돌연변이로 인해 원래의 모체와 형상 또는 총 DNA 보체가 완전히 동일하지 않을 수 있는 것으로 이해된다. 관련 성질, 예를 들면 hGH 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드의 존재에 의해 특성화되는 모체와 충분히 유사한 모 세포의 후손은 이 정의에 의해 의도되는 후손에 포함된다.
염색체 외 레플리콘 (extrachromosomal replicon) 또는 통합 벡터를 비롯한 발현 벡터 및 형질전환 벡터가 많은 효모 숙주로의 형질전환을 위해 개발되었다. 예를 들면, S. 세레비시에 (문헌[Sikorski et al., GENETICS (1998) 112: 19; Ito et al., J. BACTERIOL. (1983) 153: 163; Hinnen et al., PROC. NATL. ACAD. SCI. USA (1978) 75: 1929] 참조); C. 알비칸스 (문헌[Kurtz et al., MoL. CELL. BIOL. (1986) 6: 142] 참조); C. 말토사 (문헌[Kunze et al., J. BASICMICROBIOL. (1985) 25: 141] 참조); H. 폴리모르파 (문헌[Gleeson et al., J. GEN. MICROBIOL. (1986) 132: 3459; Roggenkamp et al., MoL. GEN. GENET. (1986) 202: 302] 참조); K. 프라길리스 (문헌[Das et al., J. BACTERIOL. (1984) 158: 1165] 참조): K. 락티스 (문헌[De Louvencourt et al., J. BACTERIOL. (1983) 154: 737; Van den Berg et al., Bio/TECHNOLOGY (1990) 8: 135] 참조); P. 귈러리몬디 (문헌[Kunze et al., J. BASIC MICROBIOL. (1985) 25: 141] 참조); P. 파스토리스 (미국 특허 제 5,324,639호, 제 4,929,555호 및 제 4,837,148호; 문헌[Cregg et al., MoL. CELL. BIOL. (1985) 5: 3376] 참조); 스키조사카로마이세스 폼브 (Schizosaccharomyces pombe) (문헌[Beach and Nurse, NATURE (1981) 300: 706] 참조); 및 Y. 리폴리티카 (lipolytica) (문헌[Davidow et al., CURR. GENET. (1985) 10: 380 (1985); Gaillardin et al., CURR. GENET. (1985) 10: 49] 참조); A. 니둘란스 (nidulans) (문헌[Ballance et al., BIOCHEM. BIOPHYS. RES. COMMUN. (1983) 112: 284-89; Tilburn et al., GENE (1983) 26: 205-221; and Yelton et al., PROC. NATL. ACAD. Sci. USA (1984) 81: 1470-74] 참조); A. 나이거 (niger) (문헌[Kelly and Hynes, EMBO J. (1985) 4: 475479] 참조); T. 레시아 (reesia) (EP 0 244 234); 및 섬사상 진균류, 예를 들면 뉴로스포라 (Neurospora), 페니실리움 (Penicillium), 톨리포클라디움 (Tolypocladium) (WO 91/00357) (상기 각각의 문헌은 본 명세서에 참고 문헌으로 인용됨)에 대한 발현 벡터가 개발되었다.
효모 벡터에 대한 조절 서열은 당업자에게 공지되어 있고, 알코올 데히드로게나아제 (ADH) (EP 0 284 044); 엔올라아제; 글루코키나아제; 글루코오스-6-포스페이트 이소머라아제; 글리세르알데히드-3-포스페이트-데히드로게나아제 (GAP 또는 GAPDH); 헥소키나아제; 포스포프룩토키나아제; 3-포스포글리세레이트 뮤타아제; 및 피루베이트 키나아제 (PyK) (EP 0 329 203)와 같은 유전자로부터의 프로모터 영역을 포함하며 이에 한정되지 않는다. 또한, 산 포스파타아제를 코딩하는 효모 PH05 유전자도 유용한 프로모터 서열을 제공할 수 있다 (문헌[Myanohara et al., PROC. NATL. ACAD. Sci. USA (1983) 80: 1] 참조). 효모 숙주에 사용될 수 있는 다른 적합한 프로모터 서열은 3-포스포글리세레이트 키나아제 및 다른 해당 효소, 예를 들면 피루베이트 데카르복실라아제, 트리오스포스페이트 이소머라아제, 및 포스포글루코오스 이소머라아제 (문헌[Holland et al., BIOCHEMISTRY (1978) 17: 4900; Hess et al., J. ADV. ENZYME REG. (1968) 7: 149] 참조)에 대한 프로모터를 포함할 수 있다 (문헌[Hitzeman et al., J. BIOL. CHEM. (1980) 255: 2073] 참조). 전사가 성장 조건에 의해 조절되는 추가적인 이점을 갖는 유도성 효모 프로모터는 알코올 데히드로게나아제 2; 이소시토크롬 C; 산 포스파타아제; 메탈로티오네인 (metallothionein); 글리세르알데히드-3-포스페이트 데히드로게나아제; 질소 기전과 관련된 분해성 효소 및 말토오스 및 갈락토오스 이용을 담당하는 효소에 대한 프로모터 영역을 포함할 수 있다. 효모 발현에 사용하기 적합한 벡터 및 프로모터는 EP 0 073 657에 추가로 기재되어 있다.
또한, 효모 인헨서 (enhancer)를 효모 프로모터와 함께 사용할 수 있다. 또한, 합성 프로모터도 효모 프로모터로서 기능할 수 있다. 예를 들면, 효모 프로모터의 상류 활성화 서열 (UAS)이 또 다른 효모 프로모터의 전사 활성화 영역과 결합되어 합성 혼성 프로모터를 생성할 수 있다. 이러한 혼성 프로모터의 예는 GAP 전사 활성화 영역에 결합된 ADH 조절 서열을 포함한다. 본 명세서에 참고 문헌으로 인용되는 미국 특허 제 4,880,734호 및 제 4,876,197호를 참조할 수 있다. 혼성 프로모터의 다른 예는 해당 효소 유전자의 전사 활성화 영역, 예를 들면 GAP 또는 PyK와 조합된 ADH2, GAL4, GAL10 또는 PH05 유전자로 된 조절 서열로 이루어진 프로모터를 포함한다. EP 0 164 556을 참조할 수 있다. 나아가, 효모 프로모터는 효모 RNA 중합효소에 결합하고 전사를 개시할 수 있는 능력을 갖는 비효모 기원의 자연 발생 프로모터를 포함할 수 있다.
효모 발현 벡터의 일부를 포함할 수 있는 다른 조절 요소는 예를 들면, GAPDH 또는 엔올라아제 유전자로부터의 종결제를 포함한다 (문헌[Holland et al., J. BIOL. CHEM. (1981) 256: 1385] 참조). 또한, 2 μ 플라스미드 기원으로부터의 복제 기점은 효모에 적합하다. 효모에 사용하기 적합한 선택 유전자로는 효모 플라스미드에 존재하는 trp1 유전자가 있다. 문헌[Tschemper et al., GENE (1980) 10: 157; Kingsman et al., GENE (1979) 7: 141]을 참조할 수 있다. 이러한 trp1 유전자는 트립토판에서 성장하는 능력이 결여된 효모의 돌연변이체 균주에 선택 마커를 제공한다. 유사하게, Leu2-결핍 효모 균주 (ATCC 20,622 또는 38,626)는 Leu2 유전자를 갖는 공지된 플라스미드에 의해 보완된다.
외인성 DNA를 효모 숙주에 도입시키는 방법은 당업자에게 공지되어 있고, 전형적으로 구상 원시 세포 (spheroplast)의 형질전환 또는 알칼리 양이온으로 처리된 본연 그대로의 효모 숙주 세포의 형질전환을 포함하며 이에 한정되지 않는다. 예를 들면, 효모의 형질전환은 문헌[Hsiao et al., PROC. NATL. ACAD. Scl. USA (1979) 76: 3829 and Van Solingen et al., J. BACT. (1977) 130: 946]에 기재된 방법에 따라 수행될 수 있다. 그러나, 또한 일반적으로 문헌[SAMBROOK ET AL., MOLECULAR CLONING: A LAB. MANUAL (2001)]에 기재된 바와 같이 예를 들면, 핵 주사, 전기천공법 또는 원형질체 융합에 의해 DNA를 세포에 도입시키는 다른 방법도 사용될 수 있다. 그 다음, 효모 숙주 세포를 당업자에게 공지된 표준 기술을 사용하여 배양할 수 있다.
효모 숙주 세포에서 이종 단백질을 발현시키는 다른 방법이 당업자에게 공지되어 있다. 일반적으로, 미국 특허 공보 20020055169, 미국 특허 제 6,361,969호, 제 6,312,923호, 제 6,183,985호, 제 6,083,723호, 제 6,017,731호, 제 5,674,706호, 제 5,629,203호, 제 5,602,034호 및 제 5,089,398호; 재심사된 미국 특허 제RE37,343 및 RE35,749; PCT 공개 특허 출원 WO 99/078621; WO 98/37208; 및 WO 98/26080; 유럽 특허 출원 EP 0 946 736; EP 0 732 403; EP 0 480 480; EP 0 460 071; EP 0 340 986; EP 0 329 203; EP 0 324 274; 및 EP 0 164 556을 참조할 수 있다. 또한, 각각 본 명세서에 참고 문헌으로 인용되는 문헌[Gellissen et al., ANTONIE VAN LEEUWENHOEK (1992) 62 (1-2): 79-93; Romanes et al., YEAST (1992) 8 (6): 423-488; Goeddel, METHODS IN ENZYMOLOGY (1990) 185: 3-7]을 참조할 수 있다.
효모 숙주 균주는 당업자에게 공지되어 있는 표준 공급물 배치 발효 방법을 사용하여 증폭 단계 동안 발효기에서 성장할 수 있다. 발효 방법은 특정 효모 숙주의 탄소 이용 경로 또는 발현 조절 방식에서의 차이를 유발하도록 적합될 수 있다. 예를 들면, 사카로마이세스 효모 숙주의 발효는 단일 글루코오스 공급물, 착물 질소 공급원 (예를 들면, 카세인 가수분해) 및 복합 비타민 보충을 필요로 할 수 있다. 대조적으로, 메탄올자화 (methylotrophic) 효모 P. 파스토리스는 글리세롤, 메탄올 및 미량의 무기질 공급물을 필요로 할 수 있지만, 최적의 성장 및 발현을 위해서는 오직 단순한 암모늄 (질소) 염만을 필요로 할 수 있다. 예를 들면, 본 명세서에 참고 문헌으로 인용되는 미국 특허 제 5,324,639호, 문헌[Elliott et al., J. PROTEIN CHEM. (1990) 9: 95] 및 문헌[Fieschko et al., BIOTECH. BIOENG. (1987) 29: 1113]을 참조할 수 있다.
그러나, 이러한 발효 방법은 사용되는 효모 숙주 균주와는 독립적인 특정한 공통된 특징을 가질 수 있다. 예를 들면, 성장 제한 영양분, 전형적으로 탄소를 증폭기 동안 토멘터 (토멘터)에 첨가하여 최대 성장을 유발시킬 수 있다. 또한, 일반적으로 발효 방법은 적합한 양의 탄소, 질소, 기저 염, 인, 및 다른 소수의 영양분 (비타민, 미량의 무기질 및 염 등)을 함유하도록 디자인된 발효 배지를 사용한다. 피치아를 사용하는 데 적합한 발효 배지의 예는 본 명세서에 참고 문헌으로 인용되는 미국 특허 제 5,324,639호 및 제 5,231,178호에 기재되어 있다.
베큘로바이러스 ( Baculovirus )-감염 곤충 세포
용어 "곤충 숙주" 또는 "곤충 숙주 세포"는 재조합 벡터 또는 다른 전이 DNA에 대한 수용자(recipient)로 사용될 수 있거나 또는 사용된 곤충을 지칭한다. 이 용어는 형질감염된 원래의 곤충 숙주 세포의 후손을 포함한다. 단일 모 세포의 후손이 우연한 돌연변이 또는 의도적인 돌연변이로 인해 원래의 모체와 형상 또는 총 DNA 보체가 완전히 동일하지 않을 수 있을 것으로 이해된다. 관련 성질, 예를 들면 hGH 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드의 존재에 의해 특성화되는 모체와 충분히 유사한 모 세포의 후손은 이 정의에 의해 의도되는 후손에 포함된다.
hGH 폴리펩티드의 발현에 적합한 곤충 세포의 선택은 당업자에게 공지되어 있다. 에데스 에깁티 (Aedes aegypti), 보나빅스 나오리 (Bonabyx naori), 드로소필라 멜라노가스터 (Drosophila melanogaster), 스포돕테라 프루기페르다 (Spodoptera frugiperda) 및 트리초플루시아 니 (Trichoplusia ni)를 비롯한 몇몇 곤충 종은 당 분야에서 잘 기재되어 있고, 상업적으로 입수가능하다. 발현을 위해 곤충 숙주를 선택함에 있어서, 적합한 숙주는 그 중에서도, 우수한 분비 용량, 낮은 단백질분해 활성 및 전체적인 강인성을 갖는 것으로 보이는 것들을 포함할 수 있다. 일반적으로, 곤충은 캘리포니아 대학 (캘리포니아주 버클리 소재) 생체물리학 및 의료 물리학부 인섹트 제네틱 스톡 센터 (Insect Genetic Stock Center) 및 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 ("ATCC") (버지니아주 만나사스 소재)을 포함하며 이에 한정되지 않는 다양한 공급원으로부터 입수가능하다.
일반적으로, 베큘로바이러스-감염 곤충 발현 시스템의 성분은 전이 벡터, 통상 베큘로바이러스의 단편 및 발현될 이종 유전자 삽입에 편리한 제한 부위 양쪽 모두를 함유하는 세균 플라스미드; 전이 벡터 중에서 베큘로바이러스-특이적 단편에 대해 동족인 서열을 갖는 야생형 (wild type) 베큘로바이러스 (이는 베큘로바이러스 게놈으로 이종 유전자의 동족 재조합을 가능케 함); 및 적합한 곤충 숙주 세포 및 성장 배지를 포함한다. 벡터를 구성하고, 세포를 형질감염시키고, 플라크 (plaque)를 선별하고, 배양물 중에서 세포를 성장시키는 등에 사용되는 물질, 방법 및 기술은 당분야에 공지되어 있고, 이러한 기술들을 기재하는 편람도 입수가능하다.
이종 유전자를 전이 벡터에 삽입시킨 후, 벡터 및 야생형 바이러스 게놈을 곤충 숙주 세포로 형질감염시키며, 여기서 벡터 및 바이러스 게놈은 재조합된다. 팩키징된 재조합 바이러스를 발현시키고, 재조합 플라크를 동정하고 정제한다. 베큘로바이러스/곤충 세포 발현 시스템용 물질 및 방법은 예를 들면, 인비트로겐 코퍼레이션 (Invitrogen Corp.) (캘리포니아주 칼스버드 소재)으로부터 키트 형태로 상업적으로 입수가능하다. 이러한 기술들은 일반적으로 당업자에게 공지되어 있고, 본 명세서에 참고 문헌으로 인용되는 문헌[SUMMERS AND SMITH, TEXAS AGRICULTURAL EXPERIMENT STATION BULLETIN No. 1555 (1987)]에 충분히 기재되어 있다. 또한, 문헌[RICHARDSON, 39 METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY: BACULOVIRUS EXPRESSION PROTOCOLS (1995); AUSUBEL ET AL., Current Protocols IN MOLECULAR BIOLOGY 16. 9-16. 11 (1994); KING AND POSSEE, BACULOVIRUS SYSTEM: A LABORATORY GUIDE (1992); and O'REILLY ET AL., BACULOVIRUS EXPRESSION VECTORS: A LABORATORY MANUAL (1992)]을 참조할 수 있다.
실제로, 베큘로바이러스/곤충 세포 발현 시스템을 사용한 다양한 이종 단백질의 생산은 당분야에 공지되어 있다. 예를 들면, 본 명세서에 참고 문헌으로 인용되는 미국 특허 제 6,368,825호, 제 6,342,216호, 제 6,338,846호, 제 6,261,805호, 제 6,245,528호, 제 6,225,060호, 제 6,183,987호, 제 6,168,932호, 제 6,126,944호, 제 6,096,304호, 제 6,013,433호, 제 5,965,393호, 제 5,939,285호, 제 5,891,676호, 제 5,871,986호, 제 5,861,279호, 제 5,858,368호, 제 5,843,733호, 제 5,762,939호, 제 5,753,220호, 제 5,605,827호, 제 5,583,023호, 제 5,571,709호, 제 5,516,657호, 제 5,290,686호; WO 02/06305, WO 01/90390, WO 01/27301, WO 01/05956, WO 00/55345, WO 00/20032 WO 99/51721, WO 99/45130, WO 99/31257, WO 99/10515, WO 99/09193, WO 97/26332, WO 96/29400, WO 96/25496, WO 96/06161, WO 95/20672, WO 93/03173, WO 92/16619, WO 92/03628, WO 92/01801, WO 90/14428, WO 90/10078, WO 90/02566, WO 90/02186, WO 90/01556, WO 89/01038, WO 89/01037, WO 88/07082를 참조할 수 있다.
베큘로바이러스/곤충 세포 발현 시스템에 유용한 벡터는 당분야에 공지되어 있고, 예를 들면, 헬퍼 (helper)-독립적 바이러스 발현 벡터인 베큘로바이러스 오토그라파칼리포르니카 (Autographacalifornica) 핵 폴리헤드로시스 (polyhedrosis) 바이러스 (AcNPV)로부터 유도된 곤충 발현 및 전이 벡터를 포함한다. 통상, 이 시스템으로부터 유도된 바이러스 발현 벡터는 강한 바이러스 다각체 유전자 프로모터를 사용하여 이종 유전자를 발현시킨다. 일반적으로, 문헌[Reilly ET AL., BACULOVIRUS EXPRESSION VECTORS: A LABORATORY MANUAL (1992)]을 참조할 수 있다.
외래 유전자를 베큘로바이러스 게놈에 삽입시키기 전에, 프로모터, 리더 (leader) (필요에 따라), 해당 코딩 서열 및 전사 종결 서열을 포함하는 상기한 성분을 전형적으로 중간 전도 구성체 (intermediate transplacement construct) (전이 벡터)에 조립시킨다. 종종, 중간 전도 구성체는 숙주, 예를 들면 세균에서 안정하게 유지될 수 있는 레플리콘, 예를 들면 염색체 외부 요소 (예를 들면, 플라스미드)에서 유지된다. 레플리콘은 복제 시스템을 갖기 때문에, 이를 클로닝 및 증폭에 적합한 숙주에서 유지되게 한다. 더욱 구체적으로, 플라스미드는 다각체 폴리아데닐화 신호 (문헌[Miller et al., ANN. REV. MICROBIOL. (1988) 42: 177] 참조) 및 대장균 중에서의 선택 및 증식을 위한 원핵 암피실린-내성 (amp) 유전자 및 복제 기점을 함유할 수 있다.
외래 유전자를 AcNPV로 도입시키는 데 통상 사용되는 전이 벡터는 pAc373이다. 또한, 예를 들면, 다각체 출발 코돈을 ATG로부터 ATT로 변화시키고, ATT로부터 BamHI 클로닝 부위 32 염기쌍 하류를 도입시키는 pVL985를 비롯한 당업자에게 공지된 많은 다른 벡터들이 디자인되었다. 문헌[Luckow and Summers, 17 VIROLOGY 31 (1989)]을 참조할 수 있다. 다른 상업적으로 입수가능한 벡터는 예를 들면, PBlueBac4.5/V5-His, pBlueBacHis2, pMelBac, pBlueBac4.5 (인비트로겐 코퍼레이션, 캘리포니아주 칼스버드 소재)를 포함한다.
이종 유전자의 삽입 후, 전이 벡터 및 야생형 베큘로바이러스 게놈은 곤충 세포 숙주로 함께 형질감염된다. 베큘로바이러스 바이러스에서 이종 DNA를 원하는 부위로 도입시키는 방법은 당분야에 공지되어 있다. 문헌[SUMMERS AND SMITH, TEXAS AGRICULTURAL EXPERIMENT STATION BULLETIN No. 1555 (1987); Smith et al., MoL. CELL. BIOL. (1983) 3: 2156; Luckow and Summers, VIROLOGY (1989) 17: 31]을 참조할 수 있다. 예를 들면, 동족 이중 교차 재조합에 의해 유전자, 예를 들면 다각체 유전자로 삽입될 수 있고, 또한 원하는 베큘로바이러스 유전자로 유전자 조작되는 제한 효소 부위로 삽입될 수 있다. 문헌[Miller et al., BIOESSAYS (1989) 4: 91]을 참조할 수 있다.
형질감염은 전기천공법에 의해 수행될 수 있다. 문헌[TROTTER AND WO OD, 39 METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY (1995); Mann and King, J. GEN. VIROL. (1989) 70: 3501]을 참조할 수 있다. 별법으로, 재조합 발현 벡터 및 베큘로바이러스를 사용하여 곤충 세포를 형질감염시키는 데 리포좀을 사용할 수 있다. 예를 들면, 문헌[Liebman et al., BIOTECHNIQUES (1999) 26 (1): 36; Graves et al., BIOCHEMISTRY (1998) 37: 6050; Nomura et al., J. BIOL. CHEM. (1998) 273 (22): 13570; Schmidt et al., PROTEIN EXPRESSION AND PURIFICATION (1998) 12: 323; Siffert et al., Nature GENETICS (1998) 18: 45; TILICNS ET AL., CELL BIOLOGY: A LABORATORY HANDBOOK 145-154 (1998); Cai et al., PROTEIN EXPRESSION AND PURIFICATION (1997) 10: 263; Dolphin et al., Nature GENETICS (1997) 17: 491; Kost et al., GENE (1997) 190: 139; Jakobsson et al., J. BIOL. CHEM. (1996) 271: 22203; Rowles et al., J. BIOL. CHEM. (1996) 271 (37): 22376; Reversey et al., J. BIOL. CHEM. (1996) 271 (39): 23607-10; Stanley et al., J. BIOL. CHEM. (1995) 270: 4121; Sisk et al., J. VIROL. (1994) 68 (2): 766; and Peng et al., BIOTECHNIQUES (1993) 14.2; 274]을 참조할 수 있다. 상업적으로 입수가능한 리포좀은 예를 들면, 셀펙틴 (Cellfectin)® 및 리포펙틴 (Lipofectin)® (인비트로겐 코퍼레이션, 캘리포니아주 칼스버드 소재)을 포함한다. 또한, 인산칼슘 형질감염도 사용할 수 있다. 문헌[TROTTER AND WO OD, 39 METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY (1995); Kitts, NAR (1990) 18 (19): 5667; and Mann and King, J. GEN. VIROL. (1989) 70: 3501]을 참조할 수 있다.
통상, 베큘로바이러스 발현 벡터는 베큘로바이러스 프로모터를 포함한다. 베큘로바이러스 프로모터는 베큘로바이러스 RNA 중합효소를 결합시킬 수 있고 코딩 서열 (예를 들면, 구조적 유전자)의 mRNA로의 하류 (3') 전사를 개시할 수 있는 임의의 DNA 서열이다. 프로모터는 통상 코딩 서열의 5' 말단에 근접하게 위치하는 전사 개시 영역을 갖게 된다. 전형적으로, 이 전사 개시 영역은 RNA 중합효소 결합 부위 및 전사 개시 부위를 포함한다. 또한, 베큘로바이러스 프로모터는 존재하는 경우, 통상 구조적 유전자와 멀리 떨어져 위치하는 인헨서로 불리는 제2 도메인을 가질 수 있다. 더욱이, 발현은 조절적이거나 또는 구성적일 수 있다.
감염 주기 후기에서 풍부하게 전사되는 구조적 유전자는 특히 유용한 프로모터 서열을 제공한다. 그 예는 바이러스 다각체 단백질을 코딩하는 유전자 (문헌[FRIESEN ET AL., The Regulation of Baculovirus Gene Expression in THE MOLECULAR BIOLOGY OF BACULOVIRUSES (1986)]; EP 0 127 839 및 0 155 476 참조) 및 p10 단백질을 코딩하는 유전자 (문헌[Vlak et al., J. GEN. VIROL. (1988) 69: 765] 참조)로부터 유도된 서열을 포함한다.
새로이 형성된 베큘로바이러스 발현 벡터를 감염성 재조합 베큘로바이러스로 팩키징하고, 추후 성장한 플라크를 당업자에게 공지되어 있는 기술에 의해 정제한다. 문헌[Miller et al., BIOESSAYS (1989) 4: 91; SUMMERS AND SMITH, TEXAS AGRICULTURAL EXPERIMENT STATION BULLETIN No. 1555 (1987)]을 참조할 수 있다.
재조합 베큘로바이러스 발현 벡터는 몇몇 곤충 세포의 감염을 위해 개발되었다. 예를 들면, 그 중에서도, 에데스 에깁티 (ATCC 번호 CCL-125), 보나빅스 나오리 (ATCC 번호 CRL-8910), 드로소필라 멜라노가스터 (ATCC 번호 1963), 스포돕테라 프루기페르다 및 트리초플루시아 니에 대한 재조합 베큘로바이러스가 개발되었다. WO 89/046,699, 문헌[Wright, NATURE (1986) 321: 718; Carbonell et al., J. VIROL. (1985) 56: 153; Smith et al., MOL. CELL. BIOL. (1983) 3: 2156]을 참조할 수 있다. 일반적으로, 문헌[Fraser et al., IN VITRO CELL. DEV. BIOL. (1989) 25: 225]을 참조할 수 있다. 더욱 구체적으로, 통상적으로 베큘로바이러스 발현 벡터 시스템에 사용되는 세포주는 Sf9 (스포돕테라 프루기페르다) (ATCC 번호 CRL-1711), Sf21 (스포돕테라 프루기페르다) (인비트로겐 코퍼레이션, 분류 번호 11497-013 (캘리포니아주 칼스버드 소재)), Tri-368 (트리초풀시아 니 (Trichopulsia ni)) 및 하이-화이브 (High-Five) BTI-TN-5B1-4 (트리초풀시아 니)를 포함하며 이에 한정되지 않는다.
베큘로바이러스/발현 중에서 이종 폴리펩티드의 직접 및 융합 발현 양쪽 모두를 위한 세포 및 배양 배지가 상업적으로 입수가능하고, 일반적으로 세포 배양 기술은 당업자에게 공지되어 있다.
대장균 및 다른 원핵생물
세균 발현 기술은 당분야에 공지되어 있다. 세균 숙주에 사용하기 위한 매우 다양한 벡터들이 입수가능하다. 벡터는 단일 카피 또는 낮거나 또는 높은 멀티카피 (multicopy) 벡터일 수 있다. 벡터는 클로닝 및(또는) 발현에 작용할 수 있다. 벡터, 많은 벡터들의 상업적 이용가능성, 및 심지어 벡터 및 그들의 제한 지도 및 특징을 기재하는 편람에 관한 충분한 문헌이 존재한다는 점을 고려할 때, 본 명세서에서 광범위한 논의는 불필요하다. 공지된 바와 같이, 정상적으로, 벡터는 선택을 가능케 하는 마커를 포함하며, 여기서 마커는 세포독성제 내성, 야생성 (prototrophy) 또는 면역성을 제공할 수 있다. 흔히, 다양한 특징을 제공하는 다수의 마커가 존재한다.
세균 프로모터는 세균 RNA 중합효소를 결합시킬 수 있고 코딩 서열 (예를 들면, 구조적 유전자)의 mRNA로의 하류 (3') 전사를 개시할 수 있는 임의의 DNA 서열이다. 프로모터는 통상 코딩 서열의 5' 말단에 근접하게 위치하는 전사 개시 영역을 갖게 된다. 전형적으로, 이 전사 개시 영역은 RNA 중합효소 결합 부위 및 전사 개시 부위를 포함한다. 또한, 세균 프로모터는 RNA 합성이 시작되는 인접 RNA 중합효소 결합 부위와 중첩될 수 있는 오퍼레이터 (operator)로 불리는 제2 도메인을 가질 수 있다. 유전자 억제제 (repressor) 단백질이 오퍼레이터에 결합함으로써 특이적 유전자의 전사를 억제할 수 있음에 따라 오퍼레이터는 음성 조절된 (유도성) 전사를 일으킨다. 구성적 발현은 음성 조절 요소, 예를 들면 오퍼레이터의 부재 하에서 발생할 수 있다. 또한, 양성 조절은 존재하는 경우, 통상 RNA 중합효소 결합 서열에 근접 (5')한 유전자 활성제 단백질 결합 서열에 의해 수행될 수 있다. 유전자 활성제 (activator) 단백질은 에스케리치아 콜라이 (대장균)에서 lac 오페론 (operon)의 초기 전사를 돕는 이화 생성물 활성제 단백질 (CAP)이다 (문헌[Raibaud et al., ANNU. REV. GENET. (1984) 18: 173] 참조). 따라서, 조절된 발현은 양성 또는 음성이므로 전사를 강화시키거나 또는 감소시킨다.
대사 경로 효소를 코딩하는 서열은 특히 유용한 프로모터 서열을 제공한다. 그 예는 당 대사 효소, 예를 들면 갈락토오스, 락토오스 (lac) (문헌[Chang et al., NATURE (1977) 198: 1056] 참조) 및 말토오스로부터 유도된 프로모터 서열을 포함한다. 추가적인 예는 생합성 효소, 예를 들면 트립토판 (trp)으로부터 유도된 프로모터 서열을 포함한다 (본 명세서에 참고 문헌으로 인용되는 문헌[Goeddel et al., Nuc. ACIDSRES. (1980) 8: 4057; Yelverton et al., NucL. ACIDS RES. (1981) 9: 731]; 미국 특허 제 4,738,921호; EP 공보 036 776 및 121 775 참조). 또한, β-갈락토시다아제 (bla) 프로모터 시스템 (본 명세서에 참고 문헌으로 인용되는 문헌[Weissmann (1981) "The cloning of interferon and other mistakes." In Interferon 3 (Ed. I. Gresser)] 참조), 박테리오파지 람다 PL (본 명세서에 참고 문헌으로 인용되는 문헌[Shimatake et al., NATURE (1981) 292: 128] 참조) 및 T5 (본 명세서에 참고 문헌으로 인용되는 미국 특허 제 4,689,406호 참조) 프로모터 시스템도 유용한 프로모터 서열을 제공한다. 본 발명의 바람직한 방법은 강한 프로모터, 예를 들면 T7 프로모터를 사용하여 높은 수준으로 hGH 폴리펩티드를 유도한다. 이러한 벡터의 예는 당분야에 공지되어 있고, 노바겐 (Novagen)으로부터의 pET29 계열, 및 본 명세서에 참고 문헌으로 인용되는 WO 99/05297에 기재된 pPOP 벡터를 포함한다. 이러한 발현 시스템은 숙주 세포 생존 능력 또는 성장 매개변수를 약화시키지 않으면서 숙주에서 hGH 폴리펩티드를 높은 수준으로 생산한다.
또한, 자연계에서 발생하지 않는 합성 프로모터도 세균 프로모터로서 기능한다. 예를 들면, 한 세균 또는 박테리오파지 프로모터의 전사 활성화 서열을 또 다른 세균 또는 박테리오파지 프로모터의 오페론 서열과 결합시켜 합성 혼성 프로모터를 생성할 수 있다 (본 명세서에 참고 문헌으로 인용되는 미국 특허 제 4,551,433호 참조). 예를 들면, tac 프로모터는 trp 프로모터 및 lac 억제제에 의해 조절되는 lac 오페론 서열 양쪽 모두를 포함하는 혼성 trp-lac 프로모터이다 (문헌[Amaml et al., GENE (1983) 25: 167; de Boer et al., PROC. NATL. ACAD. SCI. (1983) 80; 21] 참조). 나아가, 세균 프로모터는 세균 RNA 중합효소를 결합시킬 수 있고 전사를 개시할 수 있는 능력을 갖는 비세균 기원의 자연 발생 프로모터를 포함할 수 있다. 또한, 비세균 기원의 자연 발생 프로모터를 상용가능한 RNA 중합효소와 커플링하여 원핵생물에서 일부 유전자를 높은 수준으로 발현시킬 수 있다. 박테리오파지 T7 RNA 중합효소/프로모터 시스템은 커플링된 프로모터 시스템의 일례이다 (문헌[Studier et al., J. MOL. BIOL. (1986) 189: 113; Tabor et al., Proc Natl. Acad. Sci. (1985) 82: 1074] 참조). 또한, 혼성 프로모터도 박테리오파지 프로모터 및 대장균 오퍼레이터 영역을 포함할 수 있다 (유럽 특허 공보 제 267 851호 참조).
또한, 기능성 프로모터 서열 외에도, 효과적인 리보좀 결합 부위는 원핵생물에서의 외래 유전자의 발현에 유용하다. 대장균에서, 리보좀 결합 부위는 샤인-달가노 (Shine-Dalgarno; SD) 서열로 불리고, 개시 코돈 (ATG) 및 개시 코돈의 3-11 뉴클레오티드 상류에 위치한 길이가 3-9 개의 뉴클레오티드인 서열을 포함한다 (문헌[Shine et al., NATURE (1975) 254: 34] 참조). 이러한 SD 서열은 대장균 16SrRNA의 3' 말단과 SD 서열 사이의 염기 짝지움에 의해 mRNA의 리보좀에 대한 결합을 촉진시키는 것으로 생각된다 (문헌[Steitz et al. "Genetic signals and nucleotide sequences in messenger RNA", In Biological Regulation and Development: Gene Expression (Ed. R. F. Goldberger, 1979)] 참조). 약한 리보좀 결합 부위를 사용하여 진핵 유전자 및 원핵 유전자를 발현시키는 것은 문헌[Sambrook et al. "Expression of cloned genes in Escherichia coli", Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 1989]을 참조할 수 있다.
용어 "세균 숙주" 또는 "세균 숙주 세포"는 재조합 벡터 또는 다른 전이 DNA에 대한 수용자에 사용될 수 있거나 또는 사용된 세균을 지칭한다. 이 용어는 형질감염된 원래의 세균 숙주 세포의 후손을 포함한다. 단일 모 세포의 후손이 우연한 돌연변이 또는 의도적인 돌연변이로 인해 원래의 모체와 형상 또는 총 DNA 보체가 완전히 동일하지 않을 수 있을 것으로 이해된다. 관련 성질, 예를 들면 hGH 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드의 존재에 의해 특성화되는 모체와 충분히 유사한 모 세포의 후손은 이 정의에 의해 의도되는 후손에 포함된다.
hGH 폴리펩티드의 발현에 적합한 숙주 세균의 선택은 당업자에게 공지되어 있다. 발현을 위해 세균 숙주를 선택함에 있어서, 적합한 숙주는 그 중에서도, 우수한 내포체 (inclusion body), 낮은 단백질분해 활성 및 전체적인 강인성을 갖는 것으로 보이는 것들을 포함할 수 있다. 일반적으로, 세균 숙주는 캘리포니아 대학 (캘리포니아주 버클리 소재) 생체물리학 및 의료 물리학부 인섹트 제네틱 스톡 센터 (Bacterial Genetic Stock Center) 및 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 ("ATCC") (버지니아주 만나사스 소재)을 포함하며 이에 한정되지 않는 다양한 공급원으로부터 입수가능하다. 일반적으로, 공업적/제약상 발효는 K 균주 (예를 들면, W3110)로부터 유도된 세균 또는 B 균주 (예를 들면, BL21)로부터 유도된 세균을 사용한다. 이러한 균주들은 그들의 성장 매개변수가 널리 공지되어 있고 강건하기 때문에 특히 유용하다. 또한, 이러한 균주는 비병원성이며, 이는 안정성 및 환경상의 이유로 상업적으로 중요하다. 본 발명의 방법의 한 실시양태에서, 대장균 숙주는 BL21의 균주이다. 본 발명의 방법의 또 다른 실시양태에서, 대장균 숙주는 OMP- 및 LON-를 포함하며 이에 한정되지 않는 프로테아제 마이너스 (minus) 균주이다. 본 발명의 방법의 또 다른 실시양태에서, 숙주 세포 균주는 수도모나스 플루오레센스, 수도모나스 에루기노사, 및 수도모나스 푸티다 종을 포함하며 이에 한정되지 않는 수도모나스이다. 치료적 단백질 생산 방법용 균주 MB101로 지정된 수도모나스 플루오레센스 바이로바 (fluorescens biovar) 1은 숙주 균주로서 다우 케미칼 캄파니 (Dow Chemical Company) (미시간주 미드랜드 소재, 월드 와이드 웹 dow.com 상에서 입수가능)에 의해 입수가능하다. 본 명세서에 인용되는 미국 특허 제 4,755,465호 및 제 4,859,600호는 hGH 생산을 위한 숙주 세포로서 수도모나스 균주를 사용하는 것을 기재하고 있다.
재조합 숙주 세포 균주를 확립한 (즉, 발현 구성체는 숙주 세포로 도입되었고, 적합한 발현 구성체를 갖는 숙주 세포가 단리됨) 후, 재조합 숙주 세포 균주를 hGH 폴리펩티드 생산에 적합한 조건 하에서 배양한다. 당업자에게 자명한 바와 같이, 재조합 숙주 세포 균주의 배양 방법은 사용되는 발현 구성체의 특성 및 숙주 세포의 동일성에 따라 좌우되게 된다. 정상적으로, 재조합 숙주 균주는 당분야에 공지된 방법을 사용하여 배양된다. 전형적으로, 재조합 숙주 세포는 탄소, 질소 및 무기 염의 동화가능한 (assimilatable) 공급원 및 임의적으로, 비타민, 아미노산, 성장 인자 및 당분야에 공지된 다른 단백질 배양 보충물을 함유하는 액체 배지 중에서 배양된다. 임의적으로, 숙주 세포 배양용 액체 배지는 바람직하지 못한 미생물의 성장을 방지하는 항생제 또는 항진균제 및(또는) 발현 벡터를 함유하는 숙주 세포의 선택을 위한 항생제를 포함하며 이에 한정되지 않는 화합물을 함유할 수 있다.
재조합 숙주 세포는 배치 형식 또는 연속 형식으로 배양될 수 있으며, 배치 형식 또는 연속 형식으로 세포를 수확 (hGH 폴리펩티드가 세포 내 축적되는 경우)하거나 또는 배양 상청액을 수확한다. 원핵 숙주 세포에서 생산하는 경우, 배치 배양 및 세포 수확이 바람직하다.
정상적으로, 본 발명의 hGH 폴리펩티드는 재조합 시스템에서의 발현 후 정제된다. hGH 폴리펩티드는 당분야에 공지된 다양한 방법에 의해 숙주 세포로부터 정제될 수 있다. 정상적으로, 세균 숙주 세포에서 생산된 hGH 폴리펩티드는 열등한 가용성이거나 또는 불용성 (내포체의 형태의 경우)이다. 본 발명의 한 실시양태에서, 아미노산 치환은, 본 명세서에 개시된 방법, 뿐만 아니라 당분야에 공지되어 있는 것들을 사용하여 재조합으로 생산된 단백질 용해도를 증가시키려는 목적으로 선택된 hGH 폴리펩티드 중에서 용이하게 이루어질 수 있다. 불용성 단백질의 경우, 단백질은 원심분리에 의해 숙주 세포 용해물로부터 수집될 수 있고, 추가로, 그 후 세포를 균질화할 수 있다. 열등한 가용성 단백질의 경우, 폴리에틸렌 이민 (PEI)을 포함하며 이에 한정되지 않는 화합물을 첨가하여 부분적으로 가용성 단백질의 침전을 유도할 수 있다. 그 다음, 침전된 단백질을 원심분리에 의해 편리하게 수집할 수 있다. 재조합 숙주 세포를 붕괴시키거나 또는 균질화하여, 당업자에게 공지되어 있는 다양한 방법을 사용하여 세포 내에서부터 내포체를 방출시킬 수 있다. 숙주 세포 붕괴 또는 균질화는 효소적 세포 붕괴, 초음파 처리, 다운스 (dounce) 균질화 또는 고압 방출 붕괴를 포함하며 이에 한정되지 않는 공지된 기술을 사용하여 수행될 수 있다. 본 발명의 방법의 한 실시양태에서, 고압 방출 기술을 사용하여 대장균 숙주 세포를 붕괴시켜 hGH 폴리펩티드의 내포체를 방출시킨다. 오직 한 대장균 숙주 세포만이 균질화제 (homogenizer)를 통해 통행하는 것을 사용함으로써 내포체 형태의 불용성 hGH 폴리펩티드의 수율이 증가될 수 있다는 것이 발견되었다. hGH 폴리펩티드의 내포체를 취급하는 경우, 가용화, 기계적 전단 또는 단백질 분해와 같은 요인으로 인한 손실 없이 내포체의 수율을 최대화시키기 위해 반복에 대한 균질화 시간을 최소화하는 것이 유리하다.
그 다음, 당분야에 공지된 임의의 다수의 적합한 가용화제를 사용하여 불용성 또는 침전된 hGH 폴리펩티드를 가용화시킬 수 있다. 바람직하게는, hGH 폴리펩티드는 우레아 또는 구아니딘 히드로클로리드로 가용화된다. 편리하게 다루기 쉬운 배치 크기를 사용하여 큰 배치를 생산할 수 있도록 가용화된 hGH 폴리펩티드-BP의 부피는 최소화되어야 한다. 이 인자는 재조합 숙주가 부피가 수천 리터인 배치에서 성장할 수 있는 대규모 상업적 환경에서 중요할 수 있다. 또한, 대규모 상업적 환경에서 hGH 폴리펩티드를 제조하는 경우, 특히 인간의 제약상 용도의 경우, 기구 및 용기 또는 단백질 생성물 자체에 손상을 줄 수 있는 심한 화학 물질은 가능하면 반드시 피해야 한다. 더욱 심한 변성제 구아니딘 히드로클로리드 대신에 더욱 순한 변성제 우레아를 사용하여 hGH 폴리펩티드 내포체를 가용화시킬 수 있다는 점이 본 발명의 방법에서 밝혀졌다. 우레아의 사용은 hGH 폴리펩티드 내포체를 유효하게 가용화시키면서 hGH 폴리펩티드를 제조하고 정제하는 방법에 사용되는 스테인레스강 장치에 대한 손상 위험을 현저히 감소시킨다.
hGH 폴리펩티드가 융합 단백질로서 생산되는 경우, 융합 서열을 제거하는 것이 바람직하다. 융합 서열의 제거는 효소적 또는 화학적 분절, 바람직하게는 효소적 분절에 의해 수행될 수 있다. 당업자에게 공지된 방법을 사용하여 융합 서열의 효소적 제거를 수행할 수 있다. 융합 서열의 제거를 위한 효소의 선택은 융합의 동일성에 의해 결정되게 되며, 반응 조건은 당업자에게 자명한 바와 같이 효소의 선택에 의해 특정되게 된다. 바람직하게는, 분절된 hGH 폴리펩티드는 공지된 방법에 의해 분절된 융합 서열에 의해 정제된다. 당업자에게 자명한 바와 같이, 이러한 방법은 동일성 및 융합 서열 및 hGH 폴리펩티드의 성질에 의해 결정되게 된다. 정제 방법은 크기-배제 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피 또는 투석 또는 그의 임의의 조합물을 포함하며 이에 한정되지 않는다.
또한, 바람직하게는, hGH 폴리펩티드를 정제하여 단백질 용액으로부터 DNA를 제거한다. DNA는 당분야에 공지된 임의의 적합한 방법, 예를 들면 침전 또는 이온 교환 크로마토그래피에 의해 제거될 수 있으며, 바람직하게는, 예를 들면, 프로타민 (protamine) 술페이트에 한정되지 않는 핵산 침전제를 사용한 침전에 의해 제거된다. 원심분리 또는 여과를 포함하며 이에 한정되지 않는 공지된 표준 방법을 사용하여 침전된 DNA로부터 hGH 폴리펩티드를 분리할 수 있다. 숙주 핵산 분자의 제거는 hGH 폴리펩티드가 인간을 치료하는 데 사용되는 환경에서 중요한 인자이며, 본 발명의 방법은 숙주 세포 DNA를 약학적으로 허용가능한 수준으로 감소시킨다.
또한, 토멘터 (tormentor), 진탕 플라스크, 유동층 생물반응기 (bioreactor), 중공 섬유 생물반응기, 롤러 병 배양 시스템 및 교반된 탱크 생물반응기 시스템을 포함하며 이에 한정되지 않는 소규모 또는 대규모 발효 방법을 단백질 발현에 사용할 수 있다. 이러한 방법들은 각각 배치식, 공급-배치식 또는 연속식 방법으로 수행될 수 있다.
일반적으로, 본 발명의 인간 hGH 폴리펩티드는 당분야의 표준 방법을 사용하여 회수될 수 있다. 예를 들면, 배양 배지 또는 세포 용해물을 원심분리하거나 또는 여과하여 세포 파편 (debris)을 제거할 수 있다. 상청액을 원하는 부피로 눙축시키거나 또는 희석시키거나 또는 추가 정제용 제제를 상태조절하는 데 적합한 완충제로 정용여과할 수 있다. 본 발명의 hGH 폴리펩티드의 추가 정제는 본연 그대로의 형태로부터 hGH 폴리펩티드 변이체의 탈아미드화 형태 및 단축 형태를 분리하는 것을 포함한다.
하기 예시적인 절차 중 임의의 것을 본 발명의 hGH 폴리펩티드를 정제하는 데 사용할 수 있다: 친화성 크로마토그래피; 음이온 교환 또는 양이온 교환 크로마토그래피 (DEAE 세파로오스 (SEPHAROSE)를 사용하는 것을 포함하며 이에 한정되지 않음); 실리카 상에서의 크로마토그래피; 역상 HPLC; 겔 여과 (세파덱스 (SEPHADEX) G-75를 사용하는 것을 포함하며 이에 한정되지 않음); 소수성 상호작용 크로마토그래피; 크기-배제 크로마토그래피, 금속-킬레이트 크로마토그래피; 한외여과/정용여과: 에탄올 침전; 황산암모늄 침전; 크로마토포커싱 (chromatofocusing); 치환 크로마토그래피 (displacement chromatography); 전기영동 절차 (제조용 등점 집초법 (isoelectric focusing)을 포함하며 이에 한정되지 않음), 용해도 차이법 (differential solubility) (황산암모늄 침전을 포함하며 이에 한정되지 않음), SDS-PAGE 또는 추출.
비천연 아미노산을 포함하는 단백질, 비천연 아미노산을 포함하는 단백질에 대한 항체, 비천연 아미노산을 포함하는 단백질에 대한 결합 파트너 등을 포함하며 이에 한정되지 않는 본 발명의 단백질은 당업자에게 공지되고 당업자에 의해 사용되는 표준 절차에 따라 부분적으로 또는 실질적으로 균질하게 정제될 수 있다. 따라서, 본 발명의 폴리펩티드는 황산암모늄 또는 에탄올 침전, 산 또는 염기 추출, 컬럼 크로마토그래피, 친화성 컬럼 크로마토그래피, 음이온 또는 양이온 교환 크로마토그래피, 포스포셀룰로오스 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 히드록시아파티트 (hydroxyapatite) 크로마토그래피, 렉틴 (lectin) 크로마토그래피, 겔 전기영동 등을 포함하며 이에 한정되지 않는 당분야에 공지된 임의의 다수의 방법에 의해 회수되고 정제될 수 있다. 필요에 따라, 폴딩된 성숙 단백질을 정확하게 제조하고자 하는 경우 단백질 리폴딩 단계를 사용할 수 있다. 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC), 친화성 크로마토그래피 또는 다른 적합한 방법을 고 순도가 바람직한 최종 정제 단계에 사용할 수 있다. 한 실시양태에서, 비천연 아미노산 (또는 비천연 아미노산을 포함하는 단백질)에 대항하여 생성된 항체를 하나 이상의 비천연 아미노산(들)을 포함하는 단백질의 친화성 기재 정제를 포함하며 이에 한정되지 않는 것을 위한 정제 시약으로서 사용한다. 폴리펩티드를 부분적으로 또는 균질하게 정제한 후, 필요에 따라, 임의적으로 분석시험 성분, 치료제, 예방, 진단제, 연구 시약 및(또는) 항체 생산용 면역원을 포함하며 이에 한정되지 않는 것으로서 매우 다양한 용도에 사용한다.
본 명세서에 언급된 다른 참고 문헌 외에도, 문헌[R. Scopes, Protein Purification, Springer-Verlag, N. Y. (1982); Deutscher, Methods in Enzymology Vol. 182: Guide to Protein Purification, Academic Press, Inc. N. Y. (1990); Sandana, (1997) Bioseparation of Proteins, Academic Press, Inc.; Bollag et al. (1996) Protein Methods, 2nd Edition Wiley-Liss, NY; Walker, (1996) The Protein Protocols Handbook Humana Press, NJ, Harris and Angal, (1990) Protein Purification Applications: A Practical Approach IRL Press at Oxford, Oxford, England; Harris and Angal, Protein Purification Methods: A Practical Approach IRL Press at Oxford, Oxford, England; Scopes, (1993) Protein Purification: Principles and Practice 3rd Edition Springer Verlag, NY; Janson and Ryden, (1998) Protein Purification: Principles. High Resolution Methods and Applications. Second Edition Wiley-VCH, NY; and Walker (1998), Protein Protocols on CD-ROM Humana Press, NJ] 및 상기 문헌들에 인용된 참고 문헌에 나타낸 집합을 포함하며 이에 한정되지 않는 다양한 정제/단백질 폴딩 방법이 당분야에 공지되어 있다.
전형적으로, 진핵 숙주 세포 또는 비진핵 숙주 세포에서 비천연 아미노산을 사용하여 단백질 또는 해당 폴리펩티드를 생산하는 경우 한 이점은 단백질 또는 폴리펩티드가 그들의 본래의 배위에서 폴딩된다는 것이다. 그러나, 본 발명의 특정한 실시양태에서, 당업자는 합성, 발현 및(또는) 정제 후, 단백질이 관련 폴리펩티드의 원하는 배위와는 상이한 배위를 가질 수 있다는 점을 인식할 것이다. 본 발명의 한 측면에서, 임의적으로 발현된 단백질을 변성시킨 다음, 복원시킨다. 이는 샤프로닌 (chaperonin)을 단백질 또는 해당 폴리펩티드에 첨가하는 것, 단백질을 무질서 유발제 (chaotropic agent), 예를 들면 구아니딘 HCl 중에서 가용화시키는 것, 단백질 디술피드 이소머라아제를 사용하는 것 등을 포함하며 이에 한정되지 않는 당분야에 공지된 방법을 사용하여 수행된다.
일반적으로, 종종, 발현된 폴리펩티드를 변성 및 환원시킨 다음, 폴리펩티드를 바람직한 배위로 리폴딩 (re-folding)시키는 것이 바람직하다. 예를 들면, 구아니딘, 우레아, DTT, DTE 및(또는) 샤프로닌을 해당 번역 생성물에 첨가할 수 있다. 단백질의 환원, 변성 및 복원 방법은 당업자에게 공지되어 있다 (상기 참고 문헌들 및 문헌[Debinski, et al. (1993) J. Biol. Chem., 268: 14065-14070; Kreitman and Pastan (1993) Bioconjug. Chem., 4: 581-585; and Buchner, et al., (1992) Anal. Biochem., 205: 263-270] 참조). 예를 들면, 데빈스키 (Debinski) 등은 구아니딘-DTE 중에서의 내포체 단백질의 변성 및 환원을 기재하고 있다. 단백질은 산화된 글루타티온 및 L-아르기닌을 포함하며 이에 한정되지 않는 것을 함유하는 산화환원 완충제에서 리폴딩될 수 있다. 리폴딩 시약은 하나 이상의 폴리펩티드 또는 다른 발현 생성물과 접촉하도록 유동하거나 또는 이동할 수 있으며, 또는 역의 경우도 성립한다.
hGH 폴리펩티드의 원핵 세포 생산의 경우, 이로써 생산된 hGH 폴리펩티드는 미스폴딩 (misfolding)될 수 있기 때문에 감소된 생물학적 활성을 결하거나 또는 가질 수 있다. 단백질의 생체활성은 "리폴딩"에 의해 회복될 수 있다. 일반적으로, 미스폴딩된 hGH 폴리펩티드는 예를 들면, 하나 이상의 무질서 유발제 (예를 들면, 우레아 및(또는) 구아니딘) 및 디술피드 결합을 환원시킬 수 있는 환원제 (예를 들면, 디티오트레이톨, DTT 또는 2-머캅토에탄올, 2-ME)를 사용하여 폴리펩티드 사슬을 가용화시키고 (여기서, hGH 폴리펩티드도 불용성임), 언폴딩하고, 환원시킴으로써 리폴딩된다. 그 다음, 중등 농도의 케이오트로프에서, 디술피드 결합을 재형성시키는 산화제 (예를 들면, 산소, 시스틴 또는 시스타민)를 첨가한다. 당분야에 공지된 표준 방법, 예를 들면 본 명세서에 참고 문헌으로 인용되는 미국 특허 제 4,511,502호, 제 4,511,503호 및 제 4,512,922호에 기재된 것들을 사용하여 hGH 폴리펩티드를 리폴딩할 수 있다. 또한, hGH 폴리펩티드를 다른 단백질과 코폴딩하여 헤테로이량체 또는 헤테로다량체를 형성할 수 있다. 바람직하게는, 리폴딩 또는 코폴딩 후, hGH 폴리펩티드를 추가 정제한다.
일반적 정제 방법
다양한 단리 단계 중 임의의 하나를, 친화성 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 겔 여과 크로마토그래피, 고성능 액체 크로마토그래피 ("HPLC"), 역상-HPLC ("RP-HPLC"), 확장된 층 (expanded bed) 흡착 또는 임의의 조합물 및(또는) 임의의 적합한 순서의 그들의 반복을 포함하며 이에 한정되지 않는 임의의 단리 단계로부터 유래하는 임의의 hGH 폴리펩티드 혼합물 상에서 또는 hGH 폴리펩티드를 포함하는 세포 용해물 상에서 수행할 수 있다.
본 명세서에 기재된 기술을 수행하는 데 사용되는 장치 및 다른 필요한 물질은 상업적으로 입수가능하다. 펌프, 분획 수집기 (fraction collector), 모니터 (monitor), 레코더 (recorder) 및 전체 시스템은 예를 들면, 어플라이드 바이오시스템스 (Applied Biosystems) (캘리포니아주 포스터 시티 소재), 바이오-라드 라보라토리즈, 인크. (Bio-Rad Laboratories, Inc.) (캘피로니아주 헤라쿨레스 소재), 및 아머샴 바이오사이언시즈, 인크. (Amersham Biosciences, Inc.) (뉴 저지주 피스케이타웨이 소재)로부터 입수가능하다. 또한, 교환 메트릭스 물질, 배지 및 완충제를 포함하며 이에 한정되지 않는 크로마토그래피 물질들도 이러한 회사들로부터 입수가능하다.
평형화, 및 본 명세서에 기재된 컬럼 크로마토그래피 방법에서의 다른 단계, 예를 들면 세척 및 용리를 특수 장치, 예를 들면 펌프를 사용하여 더욱 신속하게 수행할 수 있다. 상업적으로 입수가능한 펌프는 하이로드 (HILOAD)® 펌프 (Pump) P-50, 페리스탈틱 펌프 (Peristaltic Pump) P-1, 펌프 P-901, 및 펌프 P-903 (뉴 저지주 피스케이타웨이 소재의 아머샴 바이오사이언시즈)을 포함하며 이에 한정되지 않는다.
분획 수집기의 예는 레디프락 프렉션 콜렉터 (RediFrac Fraction Collector), FRAC-100 프렉션 콜렉터, FRAC-200 프렉션 콜렉터 및 슈퍼-FRACS 프렉션 콜렉터 (뉴 저지주 피스케이타웨이 소재의 아머샴 바이오사이언시즈)를 포함한다. 또한, pH 및 선형 농도 구배를 형성하는 혼합기도 입수가능하다. 상업적으로 입수가능한 혼합기는 그라디안트 믹서 (Gradient Mixer) GM-1 및 인-라인 혼합기 (In-Line Mixer) (뉴 저지주 피스케이타웨이 소재의 아머샴 바이오사이언시즈)를 포함한다.
임의의 상업적으로 입수가능한 모니터를 사용하여 크로마토그래피 방법을 모니터링할 수 있다. 이러한 모니터는 UV, pH 및 전도성과 같은 정보를 모으는 데 사용될 수 있다. 검출기의 예는 모니터 (Monitor) UV-1, 유니코드 (UVICORD)® S II, 모니터 UV-M II, 모니터 UV-900, 모니터 UPC-900, 모니터 pH/C-900 및 컨덕티비티 모니터 (Conductivity Monitor) (뉴 저지주 피스케이타웨이 소재의 아머샴 바이오사이언시즈)를 포함한다. 실제로, 아머샴 바이오사이언시즈 (뉴 저지주 피스케이타웨이 소재)로부터의 다양한 AKTA® 시스템을 비롯한 전 시스템이 상업적으로 입수가능하다.
본 발명의 한 실시양태에서, 예를 들면, hGH 폴리펩티드는 먼저 우레아 중에서 생성된 정제된 hGH 폴리펩티드를 변성시킨 후, 적합한 pH에서 환원제 (예를 들면, DTT)를 함유하는 TRIS 완충제로 희석시킴으로써 환원되고 변성될 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 우레아 중에서 약 2 M 내지 약 9 M의 농도 범위에서 hGH 폴리펩티드를 변성시킨 후, 약 5.0 내지 약 8.0의 범위의 pH에서 TRIS 완충제 중에서 희석시킨다. 그 다음, 이 실시양태의 리폴딩 혼합물을 인큐베이션할 수 있다. 한 실시양태에서, 리폴딩 혼합물을 실온에서 4 내지 24 시간 동안 인큐베이션한다. 그 다음, 환원되고 변성된 hGH 폴리펩티드 혼합물을 추가로 단리시키거나 또는 정제할 수 있다.
본 명세서에 언급된 바와 같이, 임의의 후속 단리 단계를 수행하기 전에 제1 hGH 폴리펩티드 혼합물의 pH를 조정할 수 있다. 또한, 제1 hGH 폴리펩티드 혼합물 또는 임의의 그들의 후속 혼합물을 당분야에 공지되어 있는 기술을 사용하여 농축시킬 수 있다. 더욱이, 당업자에게 공지되어 있는 기술을 사용하여 다음 단리 단계에 적합한 완충제를 제1 hGH 폴리펩티드 혼합물 또는 임의의 그들의 후속 혼합물을 포함하는 용리 완충제로 교환할 수 있다.
이온 교환 크로마토그래피
한 실시양태에서, 및 하나의 임의적인 추가적인 단계로서, 이온 교환 크로마토그래피는 제1 hGH 폴리펩티드 혼합물 상에서 수행될 수 있다. 일반적으로, 문헌[ION EXCHANGE CHROMATOGRAPHY: PRINCIPLES AND METHODS] (분류 번호 18-1114-21, 아머샴 바이오사이언시즈 (뉴 저지주 피스케이타웨이 소재))을 참조할 수 있다. 상업적으로 입수가능한 이온 교환 컬럼은 하이트랩 (HITRAP)®, 하이프랩 (HIPREP)® 및 하이로드® 컬럼 (Column) (뉴 저지주 피스케이타웨이 소재의 아머샴 바이오사이언시즈)을 포함한다. 이러한 컬럼은 강한 음이온 교환기, 예를 들면 Q 세파로오스® 패스트 플로우 (Fast Flow), Q 세파로오스® 하이 퍼포먼스 (High Performance) 및 Q 세파로오스® XL; 강한 양이온 교환기, 예를 들면 SP 세파로오스® 하이 퍼포먼스, SP 세파로오스® 패스트 플로우 및 SP 세파로오스® XL; 약한 음이온 교환기, 예를 들면 DEAE 세파로오스® 패스트 플로우; 및 약한 양이온 교환기, 예를 들면 CM 세파로오스® 패스트 플로우 (뉴 저지주 피스케이타웨이 소재의 아머샴 바이오사이언시즈)를 사용한다. 정제 방법 중 임의의 단계에서 hGH 폴리펩티드 상에서 양이온 교환 컬럼 크로마토그래피를 수행하여 실질적으로 정제된 hGH 폴리펩티드를 단리시킬 수 있다. 양이온 교환 크로마토그래피 단계는 임의의 적합한 양이온 교환 메트릭스를 사용하여 수행될 수 있다. 유용한 양이온 교환 메트릭스는 섬유질, 다공성, 비다공성, 세립질 (microgranular), 비드형 또는 가교 결합된 양이온 교환 메트릭스 물질을 포함하며 이에 한정되지 않는다. 이러한 양이온 교환 메트릭스 물질은 셀룰로오스, 아가로오스, 덱스트란, 폴리아크릴레이트, 폴리비닐, 폴리스티렌, 실리카, 폴리에테르, 또는 상기로 된 임의의 복합체를 포함하며 이에 한정되지 않는다. hGH 폴리펩티드를 양이온 교환기 메트릭스에 흡착시킨 후, 실질적으로 정제된 hGH 폴리펩티드를, 메트릭스로부터 hGH 폴리펩티드를 치환시키기 충분히 높은 pH 또는 이온 강도를 갖는 완충제와 메트릭스를 접촉시킴으로써 용리시킬 수 있다. 높은 pH에서 실질적으로 정제된 hGH 폴리펩티드를 용리하기에 적합한 완충제는 약 5 mM 이상 내지 약 100 mM 이상의 농도 범위의 시트레이트, 포스페이트, 포르메이트, 아세테이트, HEPES 및 MES 완충제를 포함하며 이에 한정되지 않는다.
역상 크로마토그래피
RP-HPLC를 수행하여 당업자에게 공지되어 있는 적합한 프로토콜에 따라 단백질을 정제할 수 있다. 예를 들면, 문헌[Pearson et al., ANAL BIOCHEM. (1982) 124: 217-230 (1982); Rivier et al., J. CHROM. (1983) 268: 112-119; Kunitani et al., J. CHROM. (1986) 359: 391-402]을 참조할 수 있다. RP-HPLC를 hGH 폴리펩티드 상에서 수행하여 실질적으로 정제된 hGH 폴리펩티드를 단리시킬 수 있다. 이와 관련하여, 약 C3 이상 내지 약 C30 이상, 약 C3 이상 내지 약 C20 이상, 또는 약 C3 이상 내지 약 C18 이상을 포함하며 이에 한정되지 않는 매우 다양한 길이를 갖는 알킬 작용가를 갖는 실리카 유도체화된 수지를 사용할 수 있다. 별법으로, 예를 들면, 스티렌 중합체 수지인 토소하스 암버크롬 (TosoHaas Amberchrome) CG1000sd 수지인 중합체 수지를 사용할 수 있다. 또한, 매우 다양한 알킬 사슬 길이를 갖는 시아노 또는 중합체 수지를 사용할 수 있다. 나아가, RP-HPLC 컬럼을 용매, 예를 들면 에탄올로 세척할 수 있다. 이온쌍 시약 (ion pairing agent) 및 유기 변형제, 예를 들면 메탄올, 이소프로판올, 테트라히드로푸란, 아세토니트릴 또는 에탄올을 함유하는 적합한 용리 완충제를 사용하여 RP-HPLC 컬럼으로부터 hGH 폴리펩티드를 용리시킬 수 있다. 가장 통상적으로 사용되는 이온쌍 시약은 아세트산, 포름산, 과염소산, 인산, 트리플루오로아세트산, 헵타플루오로부티르산, 트리에틸아민, 테트라메틸암모늄, 테트라부틸암모늄, 트리에틸암모늄 아세테이트를 포함하며 이에 한정되지 않는다. 하나 이상의 구배 또는 등용매 조건을 사용하여 용리를 수행할 수 있으며, 구배 조건은 분리 시간 및 피크 폭을 감소시키는 것이 바람직하다. 또 다른 방법은 상이한 용매 농도 범위를 갖는 2 개의 구배를 사용하는 것을 포함한다. 본 명세서에 사용하기 적합한 용리 완충제의 예는 암모늄 아세테이트 및 아세토니트릴 용액을 포함하며 이에 한정되지 않는다.
소수성 상호작용 크로마토그래피 정제 기술
소수성 상호작용 크로마토그래피 (HIC)는 hGH 폴리펩티드 상에서 수행될 수 있다. 일반적으로, 본 명세서에 참고 문헌으로 인용되는 문헌[HYDROPHOBIC INTERACTION CHROMATOGRAPHY HANDBOOK: PRINCIPLES AND METHODS] (분류 번호 18-1020-90, 아머샴 바이오사이언시즈 (뉴 저지주 피스케이타웨이 소재)을 참조할 수 있다. 적합한 HIC 메트릭스는 아가로오스, 가교 결합된 아가로오스, 세파로오스, 셀룰로오스, 실리카, 덱스트란, 폴리스티렌, 폴리(메타크릴레이트) 메트릭스를 비롯한 알킬-치환된 메트릭스 또는 아릴-치환된 메트릭스, 예를 들면 부틸-, 헥실-, 옥틸- 또는 페닐-치환된 메트릭스, 및 폴리에틸렌아민 수지 또는 부틸-치환된 또는 페닐-치환된 폴리(메타크릴레이트) 메트릭스를 포함하며 이에 한정되지 않는 혼합된 형식의 수지를 포함할 수 있으며 이에 한정되지 않는다. 소수성 상호작용 컬럼 크로마토그래피에 대해 상업적으로 입수가능한 공급원은 하이트랩®, 하이프랩® 및 하이로드® 컬럼 (뉴 저지주 피스케이타웨이 소재의 아머샴 바이오사이언시즈)을 포함하며 이에 한정되지 않는다. 간략히, 로딩 (loading) 전, HIC 컬럼을 당업자에게 공지된 표준 완충제, 예를 들면 아세트산/염화나트륨 용액 또는 황산암모늄을 함유하는 HEPES를 사용하여 평형화시킬 수 있다. 그 다음, hGH 폴리펩티드를 로딩시킨 후, 컬럼을 표준 완충제를 사용하여 세척하고, HIC 컬럼 상에서 hGH 폴리펩티드는 보유하면서 원치 않는 물질을 제거하도록 상태조절할 수 있다. 약 3 내지 약 10 컬럼 부피의 표준 완충제, 예를 들면 EDTA 및 평형 완충제보다 낮은 황산암모늄 농도를 함유하는 HEPES 완충제, 또는 아세트산/염화나트륨 완충제 등을 사용하여 hGH 폴리펩티드를 용리시킬 수 있다. 또한, 예를 들면, 인산칼륨의 구배를 사용하여 감소하는 선형 염 구배를 사용하여 hGH 분자를 용리할 수 있다. 그 다음, 예를 들면, 여과, 예를 들면 정용여과 또는 한외여과에 의해 용리물을 농축시킬 수 있다. 정용여과를 사용하여 hGH 폴리펩티드를 용리하는 데 사용되는 염을 제거할 수 있다.
다른 정제 기술
또한, 예를 들면, 겔 여과 (본 명세서에 참고 문헌으로 인용되는 문헌[GEL FILTRATION: PRINCIPLES AND METHODS] (분류 번호 18-1022-18, 뉴 저지주 피스케이타웨이 소재의 아머샴 바이오사이언시즈), HPLC, 확장된 층 흡착, 한외여과, 정용여과, 동결건조 등을 사용하여 또 다른 단리 단계를 제1 hGH 폴리펩티드 혼합물 또는 임의의 그들의 후속 혼합물 상에서 수행하여 임의의 과량의 염을 제거하고, 완충제를 다음 단리 단계 또는 심지어 최종 약물 생성물의 제조에 적합한 완충제로 대체시킬 수 있다. 본 명세서에 기재된 각 단계에서 당업자에게 공지되어 있는 기술을 사용하여 실질적으로 정제된 hGH 폴리펩티드를 비롯한 hGH 폴리펩티드의 수율을 모니터링할 수 있다. 또한, 이러한 기술들을, 마지막 단리 단계 후 실질적으로 정제된 hGH 폴리펩티드의 수율을 평가하는 데 사용할 수 있다. 예를 들면, 다양한 알킬 사슬 길이를 갖는 몇몇 역상 고압 액체 크로마토그래피 컬럼, 예를 들면 시아노 RP-HPLC, C18RP-HPLC, 뿐만 아니라 양이온 교환 HPLC 및 겔 여과 HPLC 중 임의의 것을 사용하여 hGH 폴리펩티드의 수율을 모니터링할 수 있다.
표준 기술, 예를 들면 SDS-PAGE를 사용하거나 또는 웨스턴 블롯 (Western blot) 및 ELISA 분석시험을 사용하여 hGH 폴리펩티드를 측정함으로써 순도를 결정할 수 있다. 예를 들면, 음성 조절 효모 발효 및 양이온 교환 회수로부터 단리된 단백질에 대항하는 다클론 항체를 생성할 수 있다. 또한, 오염 숙주 세포 단백질의 존재에 대한 프로브에 항체를 사용할 수 있다.
RP-HPLC 물질 비다크 (Vydac) C4 (비다크)는 표면이 C4-알킬 사슬을 운반하는 실리카 겔 입자로 이루어져 있다. 단백질 불순물로부터의 hGH 폴리펩티드의 분리는 소수성 상호작용의 강도의 차이를 기초로 한다. 묽은 트리플루오로아세트산 중에서 아세토니트릴 구배를 사용하여 용리를 수행한다. 스테인레스강 컬럼 (2.8 내지 3.2 리터의 비다크 C4 실리카 겔로 충전시킴)을 사용하여 제조용 HPLC를 수행한다. 트리플루오로아세트산을 첨가함으로써 히드록시아파티트 울트로겔 용리액을 산성화시키고, 비다크 C4 컬럼에 로딩한다. 세척 및 용리를 위해, 묽은 트리플루오로아세트산 중에서 아세토니트릴 구배를 사용한다. 분획물을 수집하고, 즉시 포스페이트 완충제로 중성화시킨다. IPC 한계 내에 존재하는 hGH 폴리펩티드 분획물을 풀링 (pooling)한다.
DEAE 세파로오스 (파마시아) 물질은 세파로오스 비드의 표면에 공유 결합된 디에틸아미노에틸 (DEAE)-기로 이루어져 있다. DEAE 기에 대한 hGH 폴리펩티드의 결합은 이온성 상호작용에 의해 매개된다. 아세토니트릴 및 트리플루오로아세트산을 보유되지 않게 컬럼을 통과시킨다. 이러한 물질들을 세척한 후, 미량의 불순물을 낮은 pH에서 아세테이트 완충제를 사용하여 세척 컬럼에 의해 제거한다. 그 다음, 컬럼을 중성 포스페이트 완충제로 세척하고, hGH 폴리펩티드를 증가된 이온 강도를 갖는 완충제로 용리시킨다. 컬럼을 DEAE 세파로오스 패스트 플로우로 패킹시킨다. 컬럼 부피를 겔 1 ml 당 3-10 mg의 hGH 폴리펩티드 범위의 hGH 폴리펩티드 로딩이 이루어지도록 조정한다. 컬럼을 물 및 평형화 완충제 (인산나트륨/인산칼륨)로 세척한다. HPLC 용리액의 풀링된 분획물을 로딩하고, 컬럼을 평형화 완충제로 세척한다. 그 다음, 컬럼을 세척 완충제 (아세트산나트륨 완충제)로 세척한 후, 평형화 완충제로 세척한다. 추후, hGH 폴리펩티드를 용리 완충제 (염화나트륨, 인산나트륨/인산칼륨)를 사용하여 컬럼으로부터 용리시키고, 마스터 용리 프로파일에 따라 단일 분획물에서 수집한다. DEAE 세파로오스 컬럼의 용리액을 특수 전도성을 갖도록 조정한다. 생성되는 약물 물질을 멸균 여과하여 테플론 (Teflon) 병에 넣고, -70 ℃에서 저장한다.
브래드포드 (Bradford) 분석시험, SDS-PAGE, 은 염색된 SDS-PAGE, 쿠마시 염색된 SDS-PAGE, 질량 분석법 (MALDI-TOF를 포함하며 이에 한정되지 않음) 및 당업자에게 공지되어 있는 단백질을 특성화하는 다른 방법들을 포함하며 이에 한정되지 않는 매우 다양한 방법 및 절차들이 하나 이상의 비-천연적으로 코딩된 아미노산을 포함하는 hGH 단백질의 수율 및 순도를 평가하는 데 사용될 수 있다.
VIII. 대체 시스템에서의 발현
비재조합 숙주 세포, 돌연변이발생된 숙주 세포 또는 무세포 시스템에서 비천연 아미노산을 단백질에 도입시키는 데 몇몇 전략들이 사용되었다. 또한, 이러한 시스템은 본 발명의 hGH 폴리펩티드를 제조하는 데 사용하기 적합하다. 반응성 측쇄, 예를 들면 Lys, Cys 및 Tyr을 사용한 아미노산의 유도체화는 리신을 N2-아세틸-리신으로 전환시켰다. 또한, 화학적 합성은 비천연 아미노산을 도입하는 직접적인 방법을 제공한다. 펩티드 단편의 효소적 결찰 및 본래의 화학적 결찰의 최근 개발로, 더 큰 단백질을 제조하는 것이 가능하다. 예를 들면, 문헌[P. E. Dawson and S. B. H. Kent, Annu. Rev. Biochem., 69: 923 (2000)]을 참조할 수 있다. 원하는 비천연 아미노산으로 화학적으로 아실화된 억제제 tRNA를 단백질 생합성을 지지할 수 있는 시험관 내 추출물에 첨가하는 일반적 시험관 내 생합성 방법을 사용하여 100 개가 넘는 비천연 아미노산을 거의 모든 크기의 다양한 단백질에 부위 특이적으로 도입시켰다. 예를 들면, 문헌[V. W. Cornish, D. Mendel and P. G. Schultz, Angew. Chem. Int. Ed. Engl., 1995, 34; 621 (1995); C. J. Noren, S. J. Anthony-Cahill, M. C. Griffith, P. G. Schultz, A general method for site-specific incorporation of unnatural amino acids into proteins, Science 244: 182-188 (1989); and, J. D. Bain, C. G. Glabe, T. A. Dix, A. R. Chamberlin, E. S. Diala, Biosynthetic site-specific incorporation of a 71071-natural amino acid into a polypeptide, J. Am. Chem. Soc. 111: 8013-8014 (1989)]을 참조할 수 있다. 단백질 안정성, 단백질 폴딩, 효소 기전 및 신호 형질도입의 연구를 위해 광범위한 범위의 작용기를 단백질에 도입하였다.
선택적 압력 도입으로 불리는 세포 내 방법을 개발하여 야생형 합성효소의 무차별 혼합 (promiscuity)을 이용하였다. 예를 들면, 문헌[N. Budisa, C. Minks, S. Alefelder, W. Wenger, F. M. Dong, L. Moroder and R. Huber, FASEB J., 13: 41 (1999)]을 참조할 수 있다. 세포에 특정 천연 아미노산을 공급하는 관련 대사 경로가 작동하지 않는 (switched off) 영양요구성 균주는 제한된 농도의 천연 아미노산을 함유하는 최소 배지에서 성장하고, 표적 유전자의 전사는 억제된다. 정체 성장기의 개시시, 천연 아미노산은 고갈되고, 비천연 아미노산 유사체로 대체된다. 재조합 단백질의 발현 유도는 비천연 유사체를 함유하는 단백질을 축적시킨다. 예를 들면, 이 전략을 사용하여, o, m 및 p-플루오로페닐알라닌은 단백질로 도입되고, 용이하게 확인될 수 있는 UV 스펙트럼 중의 2 개의 특징적인 숄더 (shoulder)를 나타내며 (예를 들면, 문헌[C. Minks, R. Huber, L. Moroder and N. Budisa, Anal. Biochem., 284: 29 (2000)] 참조), 트리플루오로메티오닌을 박테리오파지 T4 리소짐 (lysozyme)에서 메티오닌을 대체하는 데 사용하여 19F NMR에 의해 그의 키토올리고사카라이드 리간드와의 상호작용을 연구하였고 (예를 들면, 문헌[H. Duewel, E. Daub, V. Robinson and J. F. Honek, Biochemistry. 36: 3404 (1997)] 참조), 트리플루오로루신을 루신 대신 도입한 결과, 루신-지퍼 (zipper) 단백질의 열 안정성 및 화학적 안정성이 증가되었다. 예를 들면, 문헌[Y. Tang, G. Ghirlanda, W. A. Petka, T. Nakajima, W. F. DeGrado and D. A. Tirrell, Angew. Chem. Int. Ed. Engl., 40: 1494 (2001)]을 참조할 수 있다. 더욱이, 셀레노메티오닌 (selenomethionine) 및 텔루로메티오닌 (telluromethionine)을 다양한 재조합 단백질에 도입하여 X선 결정학에서의 위상의 해석을 용이하게 한다. 예를 들면, 문헌[W. A. Hendrickson, J.R. Horton and D. M. Lemaster, EMBO J., 9: 1665 (1990); J. O. Boles, K. Lewinski, M. Kunkle, J. D. Odom, B. Dunlap, L. Lebioda and M. Hatada, Nat. Struct. Biol., 1: 283 (1994); N. Budisa, B. Steipe, P. Demange, C. Eckerskorn, J. Kellermann and R. Huber, Eur. J. Biochem., 230: 788 (1995); and, N. Budisa, W. Karnbrock, S. Steinbacher, A. Humm, L. Prade, T. Neuefeind, L. Moroder and R. Huber, J. Mol. Biol. 270; 616 (1997)]을 참조할 수 있다. 또한, 알켄 또는 알킨 작용가를 갖는 메티오닌 유사체를 유효하게 도입함으로써 화학적 수단에 의해 단백질을 추가적으로 변형시켰다. 예를 들면, 본 명세서에 참고 문헌으로 인용되는 문헌[J. C. M. van Hest and D. A. Tirrell, FEBS Lett., 428: 68 (1998); J. C. M. van Hest, K. L. Kiick and D. A. Tirrell, J. Am. Chem. Soc., 122: 1282 (2000); and, K. L. Kiick and D. A. Tirrell, Tetrahedron, 56: 9487 (2000)]; 미국 특허 제 6,586,207호; 미국 특허 공보 2002/0042097을 참조할 수 있다.
이 방법의 성공은 아미노아실-tRNA 합성효소에 의한 비천연 아미노산 유사체의 인식에 따라 좌우되며, 이는 일반적으로, 단백질 번역의 적합도를 보증하는 높은 선택성을 필요로 한다. 이 방법의 범위를 확장하는 한 방법은 아미노아실-tRNA 합성효소의 기질 특이성을 완화시키는 것이며, 이는 제한된 수의 경우에서 달성되었다. 예를 들면, 에스케리치아 콜라이 페닐알라닐-tRNA 합성효소 (PheRS)에서 Gly에 의해 Ala294를 대체하는 경우 기질 결합 포켓의 크기를 증가시켜 p-Cl-페닐알라닌 (p-Cl-Phe)에 의해 tRNAPhe를 아실화시킨다. 문헌[M. Ibba, P. Kast and H. Hennecke, Biochemistry. 33: 7107 (1994)]을 참조할 수 있다. 이 돌연변이체 PheRS를 정박시키는 에스케리치아 콜라이 균주는 페닐알라닌 대신 p-Cl-페닐알라닌 또는 p-Br-페닐알라닌을 도입시킨다. 예를 들면, 문헌[M. Ibba and H. Hennecke, FEBS Lett., 364: 272 (1995); and, N. Sharma, R. Furter, P. Kast and D. A. Tirrell, FEBS Lett., 467: 37 (2000)]을 참조할 수 있다. 유사하게, 에스케리치아 콜라이 티로실-tRNA 합성효소의 아미노산 결합 부위 근처의 점 돌연변이 Phel30Ser는 아자티로신을 티로신보다 유효하게 도입시키는 것으로 밝혀졌다. 문헌[F. Hamano-Takaku, T. Iwama, S. Saito-Yano, K. Takaku, Y. Monden, M. Kitabatake, D. Soll and S. Nishimura, J. Biol. Chem., 275: 40324 (2000)]을 참조할 수 있다.
비천연 아미노산을 생체 내에서 단백질에 도입시키는 또 다른 전략은 교정 (proofreading) 기전을 갖는 합성효소를 변형시키는 것이다. 이러한 합성효소는 식별할 수 없기 때문에 동계 천연 아미노산과 구조적으로 유사한 아미노산을 활성화시킨다. 이러한 오류는 분리 부위에서 정정되며, tRNA로부터 미스차징된 (mischarged) 아미노산을 데아실화하여 단백질 번역의 적합도를 유지시킨다. 상기 합성효소의 교정 활성이 불능인 경우, 잘못 활성화된 구조적 유사체는 수정 (editing) 기능을 벗어나 도입될 수 있다. 최근, 이 접근은 발릴-tRNA 합성효소 (VaIRS)를 사용하여 입증되었다. 문헌[V. Doring, H. D. Mootz, L. A. Nangle, T. L. Hendrickson, V. de Crecy-Lagard, P. Schimmel and P. Marliere, Science, 292: 501 (2001)]을 참조할 수 있다. VaIRS는 Cys, Thr 또는 아미노부티레이트 (Abu)를 사용하여 tRNAVal을 잘못 아미노아실화할 수 있고, 이러한 비동계 아미노산들은 추후 수정 도메인에 의해 가수분해된다. 에스케리치아 콜라이 염색체의 랜덤 돌연변이발생 후, ValRS의 수정 부위에서 돌연변이를 갖는 돌연변이체 에스케리치아 콜라이 균주를 선택하였다. 이러한 수정-결손 VaIRS는 부정확하게 tRNAVal을 Cys로 충전시킨다. Abu는 입체적으로 Cys와 유사하게 때문에 (Cys의 -SH 기는 Abu 중에서 -CH3로 대체됨), 또한, 돌연변이체 VaIRS는 이 돌연변이체 에스케리치아 콜라이 균주가 Abu의 존재 하에서 성장하는 경우 Abu를 단백질에 도입시킨다. 질량 분광 분석은 본래의 단백질의 각각의 발린 위치에서 발린 중 약 24 %가 Abu로 대체됨을 나타내고 있다.
또한, 고체 상 합성 및 반합성 방법도 신규한 아미노산을 함유하는 다수의 단백질을 합성할 수 있게 하였다. 예를 들면, 다음과 같은 공보 및 여기에 인용된 참조 문헌을 참고할 수 있다: 문헌[Crick, F. J. C., Barrett, L. Brenner, S. Watts-Tobin, R. General nature of the genetic code for proteins. Nature, 192: 1227-1232 (1961); Hofmann, K., Bohn, H. Studies on polypeptides. XXXVI. The effect of prazole-imidazole replacements on the S-protein activating potency of an S-peptide fragment, J. Am Chem, 88 (24): 5914-5919 (1966); Kaiser, E. T. Synthetic approaches to biologically active peptides and proteins including enzymes, Acc Chem Res, 47-54 (1989); Nakatsuka, T., Sasaki, T., Kaiser, E. T. Peptide segment coupling catalyzed by the semisynthetic enzyme thiosubtilisin, J Am Chem Soc, 3808-3810 (1987); Schnolzer, M., Kent, S B H. Constructing proteins by dovetailing unprotected synthetic peptides: backbone-engineered HIV protease, Science, 256 (5054): 221-225 (1992); Chaiken, I. M. Seniisynthetic peptides and proteins, CRC Crit Rev Biochem, 11 (3): 255-301 (1981); Offord, R. E. Protein engineering by chemical means? Protein Eng., 1 (3): 151-157 (1987); and, Jackson, D. Y., Burnier, J., Quan, C., Stanley, M., Tom, J., Wells, J. A. A Designed Peptide Ligase for Total Synthesis of Ribonuclease A with Unnatural Catalytic Residues, Science, 266 (5183): 243 (1994)].
보조인자, 스핀 표지 및 올리고뉴클레오티드를 비롯한 다양한 비천연 측쇄를 시험관 내에서 단백질에 도입시키는 데 화학적 변형을 사용하였다. 예를 들면, 문헌[Corey, D. R., Schultz, P. G. Generation of a hybrid sequence-specific single-stranded deoxyribonuclease, Science, 238 (4832): 1401-1403 (1987); Kaiser, E. T., Lawrence D. S., Rokita, S. E. The chemical modification of enzymatic specificity, Annu Rev Biochem, 54: 565-595 (1985); Kaiser, E. T., Lawrence, D. S. Chemical mutation of enzyme active sites, Science, 226 (4674): 505-511 (1984); Neet, K. E., Nanci A, Koshland, D. E. Properties of thiol-subtilisin, J Biol. Chem, 243 (24): 6392-6401 (1968); Polgar, L. B., M. L. A new enzyme containing a synthetically formed active site. Thiol-subtilisin. J. Am Chem Soc, 3153-3154 (1966); and, Pollack, S. J., Nakayama, G. Schultz, P. G. Introduction of nucleophiles and spectroscopic probes into antibody combining sites, Science, 242 (4881): 1038-1040 (1988)]을 참조할 수 있다.
별법으로, 화학적으로 변형된 아미노아실-tRNAs를 사용하는 생합성 방법을 사용하여 몇몇 생체물리적 프로브를 시험관 내에서 합성된 단백질에 도입시켰다. 다음과 같은 공보 및 여기에 인용된 참조 문헌을 참고할 수 있다: 문헌[Brunner, J. New Photolabeling and crosslinking methods, Annu. Rev Biochem, 62: 483-514 (1993); and, Krieg, U. C., Walter, P., Hohnson, A. E. Photocrosslinking of the signal sequence of nascent preprolactin of the 54-kilodalton polypeptide of the signal recognition particle, Proc. Natl. Acad. Sci, 83 (22): 8604- 8608 (1986)].
종래, 화학적으로 아미노아실화된 억제제 tRNAs를 원하는 앰버 넌센스 돌연변이를 함유하는 유전자를 사용하여 프로그래밍된 단백질 합성 반응에 첨가함으로써 비천연 아미노산이 시험관 내에서 부위-특이적으로 도입될 수 있다는 점이 밝혀졌다. 이러한 접근을 사용하여, 특정 아미노산에 대해 영양요구성인 균주를 사용하여 다수의 20 개 일반 아미노산에 근접한 구조적 동족체, 예를 들면 페닐알라닌의 경우 플루오로페닐알라닌으로 치환시킬 수 있다. 예를 들면, 문헌[Noren, C. J., Anthony-Cahill, Griffith, M. C., Schultz, P. G. A general method for site-specific incorporation of unnatural amino acid into proteins, Science, 244: 182-188 (1989); M. W. Nowak, et al., Science 268: 439-42 (1995); Bain, J. D., Glabe, C. G., Dix, T. A., Chamberlin, A. R., Diala, E. S. Biosynthetic site-specific Incorporation of a non-natural amino acid into a polypeptide, J. Am Chem Soc, 111: 8013-8014 (1989); N. Budisa et al., FASEB J. 13: 41-51 (1999); Ellman, J. A., Mendel, D., Anthony-Cahill, S., Noren, C. J., Schultz, P. G. Biosynthetic method for introducing unnatural amino acid site-specifically into proteins, Methods in Enz., 301-336 (1992); and, Mendel, D., Cornish, V. W. & Schultz, P. G. Site-Directed Mutagenesis with an Expanded Genetic Code, Annu Rev Biophys. Biomol Struct. 24, 435-62 (1995)]을 참조할 수 있다.
예를 들면, 정지 코돈 UAG를 인식하고, 비천연 아미노산으로 화학적으로 아미노아실화된 억제제 tRNA를 제조하였다. 통상적인 부위-지정 돌연변이발생을 사용하여 단백질 유전자의 해당 부위에서 정지 코돈 TAG를 도입하였다. 예를 들면, 문헌[Sayers, J.R., Schmidt, W. Eckstein, F. 5',3' Exonuclease in phosphorothioate-based olignoucleotide-directed mutagenesis, Nucleic Acids Res, 16 (3): 791-802 (1988)]을 참조할 수 있다. 아실화된 억제제 tRNA 및 돌연변이체 유전자가 시험관 내 전사/번역 시스템에서 합쳐진 경우, 특수 위치에서 그 아미노산을 함유하는 단백질을 제공하는 UAG 코돈에 대응하여 비천연 아미노산을 도입시켰다. [3H]-Phe를 사용한 실험 및 α-히드록시산을 사용한 실험은 오직 원하는 아미노산이 UAG 코돈에 의해 특정된 위치에서만 도입되고, 단백질 중의 임의의 다른 부위에서는 도입되지 않는다는 점을 입증하였다. 예를 들면, 문헌[Noren, et al, supra: Kobayashi et al., (2003) Nature Structural Biology 10 (6): 425-432; and, Ellman, J. A., Mendel, D., Schultz, P. G. Site-specific incorporation of novel backbone structures into proteins, Science, 255 (5041): 197-200 (1992)]을 참조할 수 있다.
또한, 미세주사 기술을 사용하여 비천연 아미노산을 단백질에 도입시켰다. 예를 들면, 문헌[M. W. Nowak, P. C. Kearney, J.R. Sampson, M. E. Saks, C. G. Labarca, S. K. Silverman, W. G. Zhong, J. Thorson, J. N. Abelson, N. Davidson, P. G. Schultz, D. A. Dougherty and H. A. Lester, Science, 268: 439 (1995); and, D. A. Dougherty, Curr. Opin. Chem. Biol., 4: 645 (2000)]을 참조할 수 있다. 제노푸스 (Xenopus) 난모세포에 시험관 내 제조된 2 개의 RNA 종 (해당 아미노산 위치에서 UAG 정지 코돈을 갖는 표적 단백질을 코딩하는 mRNA 및 원하는 비천연 아미노산으로 아미노아실화된 엠버 억제제 tRNA)을 주사하였다. 그 다음, 난모세포의 번역 기구는 UAG에 의해 특정된 위치에서 비천연 아미노산을 삽입시킨다. 이 방법은 일반적으로 시험관 내 발현 시스템을 따르지 않는 통합 막 단백질의 생체 내 구조-기능 연구을 가능케 하였다. 그 예는 형광 아미노산을 타치키닌 (tachykinin) 뉴로키닌 (neurokinin)-2 수용체에 도입시켜 형광 공명 에너지 전달에 의한 거리를 측정하는 것 (예를 들면, 문헌[G. Turcatti, K. Nemeth, M. D. Edgerton, U. Meseth, F. Talabot, M. Peitsch, J. Knowles, H. Vogel and A. Chollet, J. Biol. Chem., 271: 19991 (1996); the incorporation of biotinylated amino acids to identify surface-exposed residues in ion channels] 참조, 예를 들면, 문헌[J. P. Gallivan, H. A. Lester and D. A. Dougherty, Chem. Biol., 4: 739 (1997); the use of caged tyrosine analogs to monitor conformational changes in an ion channel in real time] 참조, 예를 들면, 문헌[J. C. Miller, S. K. Silverman, P. M. England, D. A. Dougherty and H. A. Lester, Neuron, 20: 619 (1998)] 참조), 및 통문 (gating) 기전 프로빙 (probing)을 위해 이온 채널 골격을 변화시키는 데 알파 히드록시 아미노산을 사용하는 것을 포함한다. 예를 들면, 문헌[P. M. England, Y. Zhang, D. A. Dougherty and H. A. Lester, Cell, 96: 89 (1999); and, T. Lu, A. Y. Ting, J. Mainland, L. Y. Jan, P. G. Schultz and J. Yang, Nat. Neurosci., 4: 239 (2001)]을 참조할 수 있다.
생체 내에서 비천연 아미노산을 단백질에 직접 도입시키는 것은 돌연변이체 단백질의 고 수율, 기술적 용이성, 세포 또는 가능하게는, 생명체에서 돌연변이체 단백질 연구 잠재력 및 이러한 돌연변이체 단백질의 치료적 치료 용도의 이점을 제공한다. 다양한 크기, 산도, 친핵성, 소수성 및 다른 성질을 갖는 비천연 아미노산을 단백질에 포함시킬 수 있는 능력은 단백질의 구조를 합리적으로 체계적으로 조작하여 단백질 기능을 프로빙하고, 신규한 성질을 갖는 신규한 단백질 또는 유기체를 생성할 수 있는 능력을 크게 확장시킬 수 있다. 그러나, 단백질 번역시 고도의 적합도를 달성하는 데 요구되는 tRNA-합성효소 상호작용의 복잡한 특성으로 인해 이 방법은 어렵다.
파라-F-Phe를 부위-특이적으로 도입시키려는 한 시도로, 효모 앰버 억제제 tRNAPheCUA/페닐알라닐-tRNA 합성효소 쌍을 p-F-Phe 내성 Phe 영양요구성 에스케리치아 콜라이 균주에 사용하였다. 예를 들면, 문헌[R. Furter, Protein Sci. 7: 419 (1998)]을 참조할 수 있다.
또한, 무세포 (시험관 내) 번역 시스템을 사용하여 hGH 본 발명의 폴리뉴클레오티드의 발현을 얻는 것도 가능할 수 있다. 주형 (시험관 내 번역)으로서 mRNA 또는 주형 (시험관 내 전사 및 번역이 합쳐짐)으로서 DNA를 포함할 수 있는 이러한 시스템에서, 시험관 내 합성은 리보좀에 의해 지시된다. 무세포 단백질 발현 시스템을 개발하기 위한 상당한 노력이 이루어졌다. 예를 들면, 본 명세서에 참고 문헌으로 인용되는 문헌[Kim, D.-M. and J.R. Swartz, Biotechraology and Bioengineering, 74: 309-316 (2001); Kim, D.-M. and J.R. Swartz, Biotechnology Letters, 22, 1537-1542, (2000); Kim, D.-M., and J.R. Swartz, Biotechnology Progress, 16, 385-390, (2000); Kim, D.-M., and J.R. Swartz, Biotechnology and Bioengineerng, 66, 180-188, (1999); and Patnaik, R. and J.R. Swartz, Biotechnology 24, 862-868, (1998)]; 미국 특허 제 6,337,191호; 미국 특허 공보 2002/0081660; WO 00/55353, WO 90/05785]를 참조할 수 있다. 비-천연적으로 코딩된 아미노산을 포함하는 hGH 폴리펩티드의 발현에 적용될 수 있는 또 다른 접근은 mRNA-펩티드 융합 기술을 포함한다. 예를 들면, 문헌[R. Roberts and J. Szostak, Proc. Natl Acad. Sci. (USA) 94: 12297-12302 (1997); A. Frankel, et al., Chemistry & Biology 10: 1043-1050 (2003)]을 참조할 수 있다. 이 접근에서, 퓨로마이신 (puromycin)에 결합된 mRNA 주형은 리보좀 상에서 펩티드로 번역된다. 하나 이상의 tRNA 분자가 변형된 경우, 비천연 아미노산도 역시 펩티드로 도입될 수 있다. 마지막 mRNA 코돈이 판독된 후, 퓨로마이신은 펩티드의 C-말단을 포획한다. 생성되는 mRNA-펩티드 컨쥬게이션물이 시험관 내 분석시험에서 흥미있는 성질을 갖는 것으로 발견되는 경우, 그의 동일성은 mRNA 서열로부터 용이하게 밝혀질 수 있다. 이 방식으로, 하나 이상의 비-천연적으로 코딩된 아미노산을 포함하는 hGH 폴리펩티드의 라이브러리를 스크리닝하여 원하는 성질을 갖는 폴리펩티드를 동정할 수 있다. 더욱 최근에, 정제된 성분을 사용한 시험관 내 리보좀 번역으로 인해 비-천연적으로 코딩된 아미노산으로 치환된 펩티드를 합성할 수 있는 것으로 보고되었다. 예를 들면, 문헌[A. Forster et al., Proc. Natl Acad. Sci. (USA) 100: 6353 (2003)]을 참조할 수 있다.
IX. hGH 폴리펩티드에 커플링된 거대분자 중합체
본 명세서에 기재된 조성물, 방법, 기술 및 전략을 사용하여 본 명세서에 기재된 비천연 아미노산 폴리펩티드에 대한 다양한 변형을 수행할 수 있다. 이러한 변형은 표지, 염료, 중합체; 수용성 중합체, 폴리에틸렌 글리콜의 유도체, 광가교결합제, 세포독성 화합물, 약물, 친화성 표지; 광친화성 표지, 반응성 화합물, 수지, 제2 단백질 또는 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 유사체, 항체 또는 항체 단편, 금속 킬레이트화제, 보조인자, 지방산, 탄수화물, 폴리뉴클레오티드, DNA, RNA, 안티센스 폴리뉴클레오티드, 억제성 리보핵산, 생물소재, 나노입자, 스핀 표지, 형광발색단, 금속 함유 기, 방사능 기, 신규한 작용기, 다른 분자와 공유적으로 또는 비공유적으로 상호작용하는 기, 포토케이징된 기, 광이성화가능한 기, 바이오틴, 바이오틴의 유사체, 바이오틴 유사체, 중 원자를 도입시킨 기, 화학적으로 분절가능한 기, 광분절성 기; 연장된 측쇄, 탄소-결합 당, 산화환원 활성제, 아미노 티오산; 독성 기, 동위 원소로 표지화된 기, 생체물리적 프로브, 형광 기, 화학발광 기, 고 전자 밀도 기, 부분 기, 삽입성 기, 발색단; 에너지 전달제, 생물학적 활성제, 검출가능한 표지, 소형 분자, 또는 상기 또는 임의의 다른 바람직한 화합물 또는 물질의 임의의 조합물을 포함하며 이에 한정되지 않는 추가의 작용가를 폴리펩티드의 비천연 아미노산 성분에 도입시키는 것을 포함한다. 본 명세서에 기재된 조성물, 방법, 기술 및 전략의 예시적인 비제한적인 예로서, 하기 설명은 거대분자 중합체를 비천연 아미노산 폴리펩티드에 부가하는 것에 초점을 맞출 것이며, 또한, 여기에 기재된 조성물, 방법, 기술 및 전략이 필요에 따라, 당업자가 본 명세서의 개시내용을 사용하여 실시할 수 있는 적합한 변형 사용) 앞서 나열한 것들을 포함하며 이에 한정되지 않는 다른 작용기를 부가하는 것에 적용될 수 있다는 점이 이해된다.
매우 다양한 거대분자 중합체 및 다른 분자를 본 발명의 hGH 폴리펩티드에 결합하여 hGH 폴리펩티드의 생물학적 성질을 조절하고(조절하거나) hGH 분자에 신규한 생물학적 성질을 제공할 수 있다. 이러한 거대분자 중합체는 천연적으로 코딩된 아미노산, 비-천연적으로 코딩된 아미노산 또는 천연 또는 비천연 아미노산으로 된 임의의 작용성 치환체 또는 천연 또는 비천연 아미노산에 부가되는 임의의 치환체 또는 작용기를 통해 hGH 폴리펩티드에 결합될 수 있다.
본 발명은 중합체:단백질 컨쥬게이션물로 된 실질적으로 균질한 제제를 제공한다. 본 명세서에 사용된 "실질적으로 균질한"은 중합체:단백질 컨쥬게이션물 분자가 총 단백질 중의 절반을 초과하여 관찰되는 것을 의미한다. 중합체:단백질 컨쥬게이션물은 생물학적 활성을 갖고, 본 명세서에 제공된 본 발명의 "실질적으로 균질한" PEG화된 hGH 폴리펩티드 제제는 균질한 제제의 이점, 예를 들면, 롯 투 롯 (lot to lot) 약동학 예측성에 대한 임상적 적용의 용이성을 나타내기에 충분히 균질한 것들이다.
또한, 중합체:단백질 컨쥬게이션물 분자의 혼합물 제조를 선택할 수 있으며, 본 명세서에 제공되는 이점은 혼합물 중에 포함되는 모노-중합체:단백질 컨쥬게이션물의 비율을 선택할 수 있다는 것이다. 따라서, 필요에 따라, 다양한 수의 부착된 중합체 부분 (즉, 디-, 트리-, 테트라- 등)를 갖는 다양한 단백질로 된 혼합물을 제조할 수 있고, 본 발명의 방법을 사용하여 제조된 모노-중합체:단백질 컨쥬게이션물과 상기 컨쥬게이션물을 합칠 수 있고, 미리 결정된 비율의 모노-중합체:단백질 컨쥬게이션물을 갖는 혼합물을 가질 수 있다.
선택된 중합체는 부착되는 단백질이 수성 환경, 예를 들면 생리학적 환경 중에서 침전하지 않도록 수용성일 수 있다. 중합체는 분지형 또는 비분지형일 수 있다. 바람직하게는, 최종 생성물 제제의 치료적 사용을 위해, 중합체는 약학적으로 허용가능한 것이다.
단백질 분자에 대한 폴리에틸렌 글리콜 분자의 비율은 반응 혼합물 중 그들의 농도와 같이 변하게 된다. 일반적으로, 최적 비 (최소 과량의 미반응 단백질 또는 중합체가 존재하는 점에서 반응 효율의 측면에서)를 선택된 폴리에틸렌 글리콜의 분자량 및 이용가능한 반응성 기에 따라 결정할 수 있다. 분자량에 관해, 전형적으로 중합체의 분자량이 높을수록, 단백질에 부착될 수 있는 중합체 분자의 수는 적다. 유사하게, 이들 매개변수를 최적화하는 경우 중합체의 분지화를 고려해야 한다. 일반적으로, 분자량이 높을수록 (또는 분지가 많을수록) 중합체:단백질 비가 높다.
본 명세서에 사용되고, PEG:hGH 폴리펩티드 컨쥬게이션물을 고려하는 경우 용어 "치료적 유효량"은 환자에게 이익을 제공하는 헤마토크리트 (hematocrit)에서 증가를 제공하는 양을 지칭한다. 이 양은 개인에 따라 변화하고, 환자의 전체적인 물리적 조건 및 빈혈증의 기초 원인을 비롯한 다수의 인자에 따라 좌우되게 된다. 예를 들면, 만성 신부전을 앓는 환자에 대한 hGH 폴리펩티드의 치료적 유효량은 주당 3 회의 1 kg 당 50 내지 150 단위이다. 요법에 사용되는 hGH 폴리펩티드의 양은 허용되는 비율의 헤마토크리트 증가를 제공하고, 유익한 수준 (통상 약 30 % 이상, 전형적으로 30 % 내지 36 % 범위)에서 헤마토크리트를 유지시킨다. 치료적 유효량의 본 발명의 조성물은 공개적으로 입수가능한 물질 및 절차를 사용하여 당업자에 의해 용이하게 규명될 수 있다.
수용성 중합체는 선형, 갈래형 (forked) 또는 분지형을 포함하며 이에 한정되지 않는 임의의 구조 형태일 수 있다. 전형적으로, 수용성 중합체는 폴리(알킬렌 글리콜), 예를 들면 폴리(에틸렌 글리콜) (PEG)이지만, 다른 수용성 중합체도 사용할 수 있다. 예로써, 본 발명의 특정한 실시양태를 기재하는 데 PEG를 사용한다.
PEG는 상업적으로 입수가능하거나 또는 당분야에 공지된 방법에 따라 에틸렌 글리콜의 개환 (ring-opening) 중합에 의해 제조될 수 있는 공지된 수용성 중합체이다 (문헌[Sandler and Karo, Polymer Synthesis, Academic Press, New York, Vol. 3, pages 138-161] 참조). 용어 "PEG"는 크기 또는 PEG 말단에서의 변형과 관계없이 임의의 폴리에틸렌 글리콜 분자를 포함하는 것으로 널리 사용되며, 다음의 화학식에 의해 hGH 폴리펩티드에 결합되는 것으로 나타낼 수 있다:
XO-(CH2CH2O)n-CH2CH2-Y
상기 식 중,
n은 2 내지 10,000이고, X는 H 또는 C1 -4 알킬을 포함하며 이에 한정되지 않는 말단 변형이다.
일부 경우, 본 발명에 사용되는 PEG는 히드록시 또는 메톡시 (즉, X는 H 또는 CH3임)를 갖는 한 말단에서 종결된다 ("메톡시 PEG"). 별법으로, PEG는 반응성 기를 사용하여 종결되어 이작용 중합체를 형성할 수 있다. 전형적인 반응성 기는 통상 20 개의 일반 아미노산에서 발견되는 작용기와 반응하는 데 사용되는 반응성 기 (말레이미드 기, 활성화된 카르보네이트 (p-니트로페닐 에스테르를 포함하며 이에 한정되지 않음), 활성화된 에스테르 (N-히드록시숙신이미드, p-니트로페닐 에스테르를 포함하며 이에 한정되지 않음) 및 알데히드를 포함하며 이에 한정되지 않음), 뿐만 아니라 20 개의 일반 아미노산에 대해 불활성이지만 비-천연적으로 코딩된 아미노산에 존재하는 상보적 작용기 (아지드 기, 알킨 기를 포함하며 이에 한정되지 않음)와 특이적으로 반응하는 작용기를 포함할 수 있다. 상기 화학식 중에서 Y로 도시되는 PEG의 다른 말단이 자연 발생 아미노산 또는 비-천연적으로 코딩된 아미노산을 통해 hGH 폴리펩티드에 직간접적으로 부착된다는 점이 주목된다. 예를 들면, Y는 폴리펩티드의 아민 기 (리신의 엡실론 아민 또는 N-말단을 포함하며 이에 한정되지 않음)에 대한 아미드, 카르바메이트 또는 우레아 결합일 수 있다. 별법으로, Y는 티올 기 (시스테인의 티올 기를 포함하며 이에 한정되지 않음)에 대한 말레이미드 결합일 수 있다. 별법으로, Y는 통상 20 개의 일반 아미노산을 통해 접근가능하지 않은 잔기에 대한 결합일 수 있다. 예를 들면, PEG 상의 아지드 기는 hGH 폴리펩티드 상의 알킨 기와 반응하여 휘스겐 [3 + 2] 시클로부가 생성물을 형성할 수 있다. 별법으로, PEG 상의 알킨 기는 비-천연적으로 코딩된 아미노산 중에 존재하는 아지드 기와 반응하여 유사한 생성물을 형성할 수 있다. 일부 실시양태에서, 강한 친핵성 물질 (히드라진, 히드라지드, 히드록실아민, 세미카르바지드를 포함하며 이에 한정되지 않음)은 비-천연적으로 코딩된 아미노산 중에 존재하는 알데히드 또는 케톤 기와 반응하여 히드라존, 옥심 또는 세미카르바존을 형성할 수 있으며, 이는 적용가능한 경우, 일부 경우 적합한 환원제의 처리에 의해 추가로 환원될 수 있다. 별법으로, 강한 친핵성 물질은 비-천연적으로 코딩된 아미노산을 통해 hGH 폴리펩티드로 도입될 수 있으며, 수용성 중합체 중에 존재하는 케톤 또는 알데히드기와 우선적으로 반응하는 데 사용될 수 있다.
약 100 달톤 (Da) 내지 100,000 Da을 포함하며 이에 한정되지 않는 (때때로 0.1-50 kDa 또는 10-40 kDa를 포함하며 이에 한정되지 않음) PEG의 임의의 분자 질량을 실시상 바람직한 대로 또는 더욱 바람직한 대로 사용할 수 있다. 또한, 각각의 사슬이 1-100 kDa (1-50 kDa 또는 5-20 kDa을 포함하며 이에 한정되지 않음) 범위의 MW를 갖는 PEG 분자를 포함하며 이에 한정되지 않는 분지형 사슬 PEGs도 사용할 수 있다. 광범위한 범위의 PEG 분자는 본 명세서에 참고 문헌으로 인용되는 문헌[Shearwater Polymers, Inc. catalog, Nektar Therapeutics catalog]을 포함하며 이에 한정되지 않는 곳에 기재되어 있다.
일반적으로, PEG 분자의 하나 이상의 말단은 비-천연적으로 코딩된 아미노산과의 반응에 이용가능하다. 예를 들면, 아미노산 측쇄과의 반응을 위해 알킨 및 아지드 부분을 갖는 PEG 유도체를 사용하여 본 명세서에 기재된 바와 같이 PEG를 비-천연적으로 코딩된 아미노산에 부착시킬 수 있다. 비-천연적으로 코딩된 아미노산이 아지드를 포함하는 경우, PEG는 전형적으로 알킨 부분을 함유하여 [3 + 2] 시클로부가 생성물을 형성시키거나 또는 포스핀 기를 함유하는 활성화된 PEG 종 (즉, 에스테르, 카르보네이트)을 함유하여 아미드 결합을 형성시킨다. 별법으로, 비-천연적으로 코딩된 아미노산이 알킨을 포함하는 경우, PEG는 전형적으로 아지드 부분을 함유하여 [3 + 2] 휘스겐 시클로부가 생성물을 형성시킨다. 비-천연적으로 코딩된 아미노산이 카르보닐 기를 포함하는 경우, PEG는 각각 대응하는 히드라존, 옥심 및 세미카르바존 결합을 형성시키기 위해 전형적으로 강력한 친핵성 물질 (히드라지드, 히드라진, 히드록실아민 또는 세미카르바지드 작용가를 포함하며 이에 한정되지 않음)을 포함한다. 다른 대체물에서, 상기한 반응성 기의 역 배향을 사용할 수 있으며, 즉 비-천연적으로 코딩된 아미노산 중의 아지드 부분을 알킨을 함유하는 PEG 유도체와 반응시킬 수 있다.
일부 실시양태에서, PEG 유도체를 갖는 hGH 폴리펩티드 변이체는 비-천연적으로 코딩된 아미노산의 측쇄 상에 존재하는 화학적 작용가와 반응성을 갖는 화학적 작용가를 함유한다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 약 800 Da 내지 약 100,000 Da의 평균 분자량을 갖는 수용성 중합체 골격을 포함하는 아지드 함유 중합체 유도체 및 아세틸렌 함유 중합체 유도체를 제공한다. 수용성 중합체의 중합체 골격은 폴리(에틸렌 글리콜)일 수 있다. 그러나, 또한, 폴리(에틸렌) 글리콜, 및 폴리(덱스트란) 및 폴리(프로필렌 글리콜)을 포함하는 다른 관련된 중합체를 포함하며 이에 한정되지 않는 매우 다양한 수용성 중합체들도 본 발명을 실시하기에 적합하고, 용어 PEG 또는 폴리(에틸렌 글리콜)의 사용은 모든 이러한 분자를 포괄하고 포함하기 위한 것이라는 점이 이해되어야 한다. 용어 PEG는 이작용 PEG, 멀티아암형 (multiarmed) PEG, 유도체화된 PEG, 갈래형 PEG, 분지형 PEG, 현수 PEG (즉, 중합체 골격에 현수된 하나 이상의 작용기를 갖는 PEG 또는 관련된 중합체), 또는 그 안에 분해가능한 결합을 갖는 PEG를 비롯한 임의의 형태의 폴리(에틸렌 글리콜)을 포함하며 이에 한정되지 않는다.
전형적으로, PEG는 투명하고, 무색 무취이고 수용성이고, 열에 안정하고, 많은 화학적 약제에 대해 불활성이고, 가수분해되거나 또는 약화되지 않으며, 일반적으로 비독성이다. 폴리(에틸렌 글리콜)은 생체이용가능한 것으로 간주되며, 즉 PEG는 해를 가하지 않으면서 생명 조직 또는 유기체와 공존할 수 있다. 더욱 구체적으로, PEG는 실질적으로 비면역원성이며, 즉 PEG는 체내에서 면역 반응을 일으키지 않는 경향을 갖는다. PEG는 체내에서 일부 바람직한 기능을 갖는 분자, 예를 들면 생물학적 활성제에 부착된 경우, 이 약제를 차폐시키는 경향을 갖고, 유기체가 이러한 약제의 존재에 내성을 가질 수 있도록 임의의 면역 반응을 감소시키거나 또는 제거할 수 있다. PEG 컨쥬게이션물은 실질적인 면역 반응을 일으키거나 또는 응고 또는 다른 바람직하지 못한 효과를 일으키는 경향을 갖지 않는다. 화학식 --CH2CH2O--(CH2CH2O)n--CH2CH2-- (여기서, n은 약 3 내지 약 4000, 전형적으로 약 20 내지 약 2000임)을 갖는 PEG가 본 발명에 사용하기 적합하다. 본 발명의 일부 실시양태에서, 약 800 Da 내지 약 100,000 Da의 분자량을 갖는 PEG가 중합체 골격으로서 특히 유용하다.
중합체 골격은 선형 또는 분지형일 수 있다. 일반적으로, 분지형 중합체 골격은 당분야에 공지되어 있다. 전형적으로, 분지형 중합체는 중심 분지 코어 부분 및 중심 분지 코어에 결합된 다수의 선형 중합체 사슬을 갖는다. 통상, PEG는 다양한 폴리올, 예를 들면 글리세롤, 글리세롤 올리고머, 펜타에리트리톨 및 소르비톨에 에틸렌 옥시드를 첨가함으로써 제조될 수 있는 분지 형태로 사용된다. 또한, 중심 분지 부분은 몇몇 아미노산, 예를 들면 리신으로부터 유도될 수 있다. 분지형 폴리(에틸렌 글리콜)을 일반적 형태 R(-PEG-OH)m (여기서, R은 코어 부분, 예를 들면 글리세롤, 글리세롤 올리고머 또는 펜타에리트리톨로부터 유도되고, m은 다수의 아암을 나타냄)으로 나타낼 수 있다. 또한, 멀티아암형 PEG 분자, 예를 들면 각각 그 전문이 본 명세서에 참고 문헌으로 인용되는 미국 특허 제 5,932,462호 제 5,643,575호, 제 5,229,490호, 제 4,289,872호; 미국 특허 출원 2003/0143596; WO 96/21469 및 WO 93/21259에 기재된 것들도 중합체 골격으로서 사용될 수 있다.
또한, 분지형 PEG는 PEG (--YCHZ2)n (여기서, Y는 결합기이고, Z는 정해진 길이의 원자로 된 사슬에 의해 CH에 결합된 활성화된 말단 기임)에 의해 표현되는 갈래형 PEG의 형태로 존재할 수 있다.
또한, 또 다른 분지형 형태인 현수 PEG는 PEG 사슬의 말단에서가 아니라 PEG 골격을 따라 반응성 기, 예를 들면 카르복실 기를 갖는다.
또한, 이러한 PEG의 형태 이외에, 중합체는 골격 상의 약한 또는 분해가능한 결합을 사용하여 제조될 수 있다. 예를 들면, PEG는 가수분해되기 쉬운 중합체 골격 중의 에스테르 결합을 사용하여 제조될 수 있다. 이하 나타내는 바와 같이, 이러한 가수분해는 저 분자량으로 된 단편으로 분절시킨다:
-PEG-CO2-PEG- + H2O → PEG-CO2H + HO-PEG-
용어 폴리(에틸렌 글리콜) 또는 PEG가 본 명세서에 개시된 것들을 포함하며 이에 한정되지 않는 당분야에 공지된 모든 형태를 나타내거나 또는 포함한다는 점은 당업자에게 이해되는 것이다.
또한, 많은 다른 중합체들도 본 발명에 사용하기 적합하다. 일부 실시양태에서, 2 내지 약 300 개의 말단을 갖는 수용성인 중합체 골격은 본 발명에 특히 유용하다. 적합한 중합체의 예는 다른 폴리(알킬렌 글리콜), 예를 들면 폴리(프로필렌 글리콜) ("PPG"), 그들의 공중합체 (에틸렌 글리콜 및 프로필렌 글리콜의 공중합체를 포함하며 이에 한정되지 않음), 그들의 삼원중합체, 그들의 혼합물 등을 포함하며 이에 한정되지 않는다. 비록 중합체 골격의 각 사슬의 분자량은 변할 수 있지만, 전형적으로는 약 800 Da 내지 약 100,000 Da, 종종 약 6,000 Da 내지 약 80,000 Da의 범위이다.
실질적으로, 당업자는 상기 수용성 골격에 대한 목록이 결코 한정적인 것이 아니며 단순히 예시를 위한 것이고, 상기한 품질을 갖는 모든 중합체 물질들이 본 발명에 사용하기 적합한 것으로 고려된다는 점을 인식할 것이다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 중합체 유도체는 "다작용성"이며, 이는 중합체 골격이 2 개 이상의 말단, 및 가능하게는 작용기로 작용화되거나 또는 활성화된 약 300 개의 말단을 갖는다는 점을 의미한다. 다작용성 중합체 유도체는 각각의 말단이 동일하거나 또는 상이할 수 있는 작용기에 결합되는 2 개의 말단을 갖는 선형 중합체를 포함하며 이에 한정되지 않는다.
한 실시양태에서, 중합체 유도체는 다음의 구조를 갖는다.
X-A-POLY-B-N=N=N
상기 식 중,
N=N=N은 아지드 부분이고,
B는 존재하거나 존재하지 않을 수 있는 결합 부분이고,
POLY는 수용성 비항원성 중합체이고,
A는 존재하거나 또는 존재하지 않을 수 있고 B와 동일하거나 또는 상이할 수 있는 결합 부분이고,
X는 제2 작용기이다.
A 및 B에 대한 결합 부분의 예는 18 개 이하, 더욱 바람직하게는 1-10 개의 탄소 원자를 함유하는 다작용화된 알킬 기를 포함하며 이에 한정되지 않는다. 알킬 사슬에 헤테로원자, 예를 들면 질소, 산소 또는 황이 포함될 수 있다. 또한, 알킬 사슬은 헤테로원자에서 분지형일 수 있다. A 및 B에 대한 결합 부분의 다른 예는 10 개 이하, 더욱 바람직하게는 5-6 개의 탄소 원자를 함유하는 다작용화된 아릴 기를 포함하며 이에 한정되지 않는다. 아릴 기는 하나 이상의 탄소 원자, 질소, 산소 또는 황 원자로 치환될 수 있다. 적합한 결합 기의 다른 예는 각각 본 명세서에 참고 문헌으로 인용되는 미국 특허 제 5,932,462호, 제 5,643,575호 및 미국 특허 출원 공보 2003/0143596에 기재된 결합 기를 포함한다. 당업자는 상기 결합 부분에 대한 목록이 결코 한정적인 것이 아니며 단순히 예시를 위한 것이고, 상기한 품질을 갖는 모든 결합 부분이 본 발명에 사용하기 적합한 것으로 고려된다는 점을 인식할 것이다.
X로 사용하기 적합한 작용기의 예는 히드록실, 보호된 히드록실, 알콕실, 활성 에스테르, 예를 들면 N-히드록시숙신이미딜 에스테르 및 1-벤조트리아졸릴 에스테르, 활성 카르보네이트, 예를 들면 N-히드록시숙신이미딜 카르보네이트 및 1-벤조트리아졸릴 카르보네이트, 아세탈, 알데히드, 알데히드 수화물, 알케닐, 아크릴레이트, 메타크릴레이트, 아크릴아미드, 활성 술폰, 아민, 아미노옥시, 보호된 아민, 히드라지드, 보호된 히드라지드, 보호된 티올, 카르복실산, 보호된 카르복실산, 이소시아네이트, 이소티오시아네이트, 말레이미드, 비닐술폰, 디티오피리딘, 비닐피리딘, 요오도아세트아미드, 에폭시드, 글리옥살, 디온, 메실레이트, 토실레이트, 트레실레이트, 알켄, 케톤 및 아지드를 포함하며 이에 한정되지 않는다. 당업자에 의해 이해되는 바와 같이, 아지드 기와의 반응이 일어나지 않도록 선택된 X 부분은 아지드 기와 상용가능해야 한다. 아지드 함유 중합체 유도체는 호모이작용 (homobifunctional) (여기서, 이는 제2 작용기 (즉, X)도 아지드 부분인 것을 의미함), 또는 헤테로이작용 (heterobifunctional) (여기서, 이는 제2 작용기가 상이한 작용기인 것을 의미함)일 수 있다.
용어 "보호된"은 특정한 반응 조건 하에서 화학적 반응성 작용기의 반응을 방지하는 보호기 또는 부분의 존재를 지칭한다. 보호기는 보호되는 화학적 반응성 기의 타입에 따라 변화하게 된다. 예를 들면, 화학적 반응성 기가 아민 또는 히드라지드인 경우, 보호기는 tert-부틸옥시카르보닐 (t-Boc) 및 9-플루오레닐메톡시카르보닐 (Fmoc)의 군으로부터 선택될 수 있다. 화학적 반응성 기가 티올인 경우, 보호기는 오르토피리딜디술피드일 수 있다. 화학적 반응성 기가 카르복실산, 예를 들면 부탄산 또는 프로피온산 또는 히드록실 기인 경우, 보호기는 벤질 또는 알킬 기, 예를 들면 메틸, 에틸 또는 tert-부틸일 수 있다. 또한, 당분야에 공지된 다른 보호기도 본 발명에 사용될 수 있다.
문헌 중의 말단 작용기의 구체적인 예는 N-숙신이미딜 카르보네이트 (예를 들면, 미국 특허 제 5,281,698호, 제 5,468,478호 참조), 아민 (예를 들면, 문헌[Buckmann et al. Makromol. Chem. 182: 1379 (1981), Zaplipsky et al. Eur. Polym. J. 19: 1177 (1983)] 참조), 히드라지드 (예를 들면, 문헌[Andresz et al. Makromol. Chem. 179: 301 (1978)] 참조), 숙신이미딜 프로피오네이트 및 숙신이미딜 부타노에이트 (예를 들면, 문헌[Olson et al. in Poly(ethylene glycol) Chemistry & Biological Applications, pp 170-181, Harris & Zaplipsky Eds., ACS, Washington, D. C., 1997] 참조; 또한, 미국 특허 제 5,672,662호 참조), 숙신이미딜 숙시네이트 (예를 들면, 문헌[Abuchowski et al. Cancer Biochem. Biophys. 7: 175 (1984) and Joppich et al. Macrolol. Chem. 180: 1381 (1979)] 참조), 숙신이미딜 에스테르 (예를 들면, 미국 특허 제 4,670,417호 참조), 벤조트리아졸 카르보네이트 (예를 들면, 미국 특허 제 5,650,234호 참조), 글리시딜 에테르 (예를 들면, 문헌[Pitha et al. Eur. J Biochem. 94: 11 (1979), Elling et al., Biotech. Appl. Biochem. 13: 354 (1991)] 참조), 옥시카르보닐이미다졸 (예를 들면, 문헌[Beauchamp, et al., Anal. Biochem. 131: 25 (1983), Tondelli et al. J. Controlled Release 1: 251 (1985)] 참조), p-니트로페닐 카르보네이트 (예를 들면, 문헌[Veronese, et al., Appl. Biochem. Biotech., 11: 141 (1985); and Sartore et al., Appl. Biochem. Biotech., 27: 45 (1991)] 참조), 알데히드 (예를 들면, 문헌[Harris et al. J. Polym. Sci. Chem. Ed. 22: 341 (1984)], 미국 특허 제 5,824,784호, 미국 특허 제 5,252,714호 참조), 말레이미드 (예를 들면, 문헌[Goodson et al. Bio/Technology 8: 343 (1990), Romani et al. in Chemistry of Peptides and Proteins 2: 29 (1984), and Kogan, Synthetic Comm. 22: 2417 (1992)] 참조), 오르토피리딜-이황 (예를 들면, 문헌[Woghiren, et al. Bioconj. Chem. 4: 314 (1993)] 참조), 아크릴올 (예를 들면, 문헌[Sawhney et al., Macromolecules, 26: 581 (1993)] 참조), 비닐술폰 (예를 들면, 미국 특허 제 5,900,461호 참조)을 포함하며 이에 한정되지 않는다. 상기 모든 참고 문헌 및 특허는 본 명세서에 참고 문헌으로 인용된다.
본 발명의 특정한 실시양태에서, 본 발명의 중합체 유도체는 다음의 구조를 갖는 중합체 골격을 포함한다:
X-CH2CH2O--(CH2CH2O)n--CH2CH2-N=N=N
상기 식 중,
X는 상기한 바와 같은 작용기이고,
n은 약 20 내지 약 4000이다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명의 중합체 유도체는 다음의 구조를 갖는 중합체 골격을 포함한다:
X-CH2CH2O--(CH2CH2O)n--CH2CH2-O-(CH2)m-W-N=N=N
상기 식 중,
W는 1-10 개의 탄소 원자를 포함하는 지방족 또는 방향족 링커 부분이고,
n은 약 20 내지 약 4000이고,
X는 상기한 바와 같은 작용기이다. m은 1 내지 10이다.
본 발명의 아지드 함유 PEG 유도체는 당분야에 공지되고(공지되거나) 본 명세서에 개시되어 있는 다양한 방법에 의해 제조될 수 있다. 한 방법에서, 이하 나타내는 바와 같이, 제1 작용기에 결합된 제1 말단 및 적합한 이탈기에 결합된 제2 말단을 갖는 약 800 Da 내지 약 100,000 Da의 평균 분자량을 갖는 수용성 중합체 골격은 아지드 음이온 (이는 나트륨, 칼륨, tert-부틸암모늄 등을 포함하는 임의의 다수의 적합한 반대이온과 쌍을 이룰 수 있음)과 반응한다. 이러한 이탈기는 친핵성 치환을 수행하고, 아지드 부분에 의해 대체되어 원하는 아지드 함유 PEG 중합체를 제공한다.
X-PEG-L + N3 - → X-PEG-N3
나타낸 바와 같이, 본 발명에 사용하기 적합한 중합체 골격은 화학식 X-PEG-L (여기서, PEG는 폴리(에틸렌 글리콜)이고, X는 아지드 기와 반응하지 않는 작용기이고, L는 적합한 이탈기임)을 갖는다. 적합한 작용기의 예는 히드록실, 보호된 히드록실, 아세탈, 알케닐, 아민, 아미노옥시, 보호된 아민, 보호된 히드라지드, 보호된 티올, 카르복실산, 보호된 카르복실산, 말레이미드, 디티오피리딘, 및 비닐피리딘, 및 케톤을 포함하며 이에 한정되지 않는다. 적합한 이탈기의 예는 클로리드, 브로미드, 요오디드, 메실레이트, 트레실레이트 및 토실레이트를 포함하며 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 아지드 함유 중합체 유도체를 제조하는 또 다른 방법에서, 아지드 작용가를 갖는 결합제를 약 800 Da 내지 약 100,000 Da의 평균 분자량을 갖는 수용성 중합체 골격과 접촉시키며, 여기서 결합제는 PEG 중합체 상에서 화학적 작용가와 선택적으로 반응하여 아지드가 결합 기에 의해 중합체 골격으로부터 분리되는 아지드 함유 중합체 유도체 생성물을 형성하는 화학적 작용가를 갖는다.
예시적인 반응도는 다음과 같이 도시된다:
X-PEG-M + N-링커-N=N=N → PG-X-PEG-링커-N=N=N
상기 식 중,
PEG는 폴리(에틸렌 글리콜)이고,
X는 캡핑 기, 예를 들면 알콕시 또는 상기한 바와 같은 작용기이고,
M은 N 작용기와 유효하게 선택적으로 반응하는 아지드 작용가와 반응성을 갖지 않는 작용기이다.
적합한 작용기의 예는 N이 아민인 경우 M이 카르복실산, 카르보네이트 또는 활성 에스테르이고, N이 히드라지드 또는 아미노옥시 부분인 경우 M이 케톤이고, N이 친핵성 물질인 경우 M이 이탈기인 것을 포함하며 이에 한정되지 않는다.
조 생성물의 정제는 생성물을 침전시킨 후, 필요에 따라 크로마토그래피하는 것을 포함하며 이에 한정되지 않는 공지된 방법에 의해 수행될 수 있다.
더욱 구체적인 예는 아민 중 하나가 보호기 부분, 예를 들면 tert-부틸-Boc에 의해 보호되는 PEG 디아민의 경우로 다음에 도시되고, 생성되는 모노-보호된 PEG 디아민은 아지드 작용가를 갖는 결합 부분과 반응한다:
BocHN-PEG-NH2 + H02C-(CH2)3-N=N=N
이 경우, 아민 기는 다양한 활성화제, 예를 들면 티오닐 클로리드 또는 카르보디이미드 시약 및 N-히드록시숙신이미드 또는 N-히드록시벤조트리아졸을 사용하여 카르복실산 기에 커플링되어 모노아민 PEG 유도체와 아지드를 갖는 링커 부분 사이에 아미드 결합을 생성할 수 있다. 아미드 결합의 성공적인 형성 후, 생성되는 N-tert-부틸-Boc-보호된 아지드 함유 유도체를 생체활성 분자를 변형시키는 데 바로 사용하거나 또는 추가로 다른 유용한 작용기를 안착시키도록 할 수 있다. 예를 들면, N-t-Boc 기는 강한 산 처리에 의해 가수분해되어 오메가-아미노-PEG-아지드를 생성할 수 있다. 생성되는 아민을 중요한 헤테로이작용 시약의 생성을 위한 합성 기회로 사용하여 다른 유용한 작용가, 예를 들면 말레이미드 기, 활성화된 디술피드, 활성화된 에스테르 등을 안착시킬 수 있다.
상이한 분자를 중합체의 각 말단에 부착시키는 경우, 헤테로이작용 유도체가 특히 유용하다. 예를 들면, 오메가-N-아미노-N-아지도 PEG는 활성화된 친전자성 기, 예를 들면 알데히드, 케톤, 활성화된 에스테르, 활성화된 카르보네이트 등을 갖는 분자를 PEG의 한 말단에 부착시키고, 아세틸렌 기를 갖는 분자를 PEG의 다른 말단에 부착시킨다.
본 발명의 또 다른 실시양태에서, 중합체 유도체는 다음의 구조를 갖는다:
X-A-POLY-B-C≡C-R
상기 식 중,
R은 H이거나 또는 알킬, 알켄, 알킬옥시, 또는 아릴 또는 치환된 아릴 기일 수 있고,
B는 존재하거나 존재하지 않을 수 있는 결합 부분이고,
POLY는 수용성 비항원성 중합체이고,
A는 존재하거나 또는 존재하지 않을 수 있고 B와 동일하거나 또는 상이할 수 있는 결합 부분이고,
X는 제2 작용기이다.
A 및 B에 대한 결합 부분의 예는 18 개 이하, 더욱 바람직하게는 1-10 개의 탄소 원자를 함유하는 다작용화된 알킬 기를 포함하며 이에 한정되지 않는다. 알킬 사슬에 헤테로원자, 예를 들면 질소, 산소 또는 황이 포함될 수 있다. 또한, 알킬 사슬은 헤테로원자에서 분지형일 수 있다. A 및 B에 대한 결합 부분의 다른 예는 10 개 이하, 더욱 바람직하게는 5-6 개의 탄소 원자를 함유하는 다작용화된 아릴 기를 포함하며 이에 한정되지 않는다. 아릴 기는 하나 이상의 탄소 원자, 질소, 산소 또는 황 원자로 치환될 수 있다. 적합한 결합 기의 다른 예는 각각 본 명세서에 참고 문헌으로 인용되는 미국 특허 제 5,932,462호, 제 5,643,575호 및 미국 특허 출원 공보 2003/0143596에 기재된 결합 기를 포함한다. 당업자는 상기 결합 부분에 대한 목록이 결코 한정적인 것이 아니며 단순히 예시를 위한 것이고, 상기한 품질을 갖는 모든 결합 부분이 본 발명에 사용하기 적합한 것으로 고려된다는 점을 인식할 것이다.
X로 사용하기 적합한 작용기의 예는 히드록실, 보호된 히드록실, 알콕실, 활성 에스테르, 예를 들면 N-히드록시숙신이미딜 에스테르 및 1-벤조트리아졸릴 에스테르, 활성 카르보네이트, 예를 들면 N-히드록시숙신이미딜 카르보네이트 및 1-벤조트리아졸릴 카르보네이트, 아세탈, 알데히드, 알데히드 수화물, 알케닐, 아크릴레이트, 메타크릴레이트, 아크릴아미드, 활성 술폰, 아민, 아미노옥시, 보호된 아민, 히드라지드, 보호된 히드라지드, 보호된 티올, 카르복실산, 보호된 카르복실산, 이소시아네이트, 이소티오시아네이트, 말레이미드, 비닐술폰, 디티오피리딘, 비닐피리딘, 요오도아세트아미드, 에폭시드, 글리옥살, 디온, 메실레이트, 토실레이트, 및 트레실레이트, 알켄, 케톤 및 아세틸렌을 포함한다. 이해되는 바와 같이, 아세틸렌 기와의 반응이 일어나지 않도록 선택된 X 부분은 아세틸렌 기와 상용가능해야 한다. 아세틸렌 함유 중합체 유도체는 호모이작용 (여기서, 이는 제2 작용기 (즉, X)도 아세틸렌 부분인 것을 의미함), 또는 헤테로이작용 (여기서, 이는 제2 작용기가 상이한 작용기인 것을 의미함)일 수 있다.
본 발명의 또 다른 실시양태에서, 중합체 유도체는 다음의 구조를 갖는 중합체 골격을 포함한다:
X-CH2CH2O--(CH2CH2O)n-CH2CH2-0-(CH2)m-C≡CH
상기 식 중,
X는 상기한 바와 같은 작용기이고,
n은 약 20 내지 약 4000이고,
m은 1 내지 10이다.
각각의 헤테로이작용 PEG 중합체의 구체적인 예는 이하 나타내는 바와 같다.
본 발명의 아세틸렌 함유 PEG 유도체는 당분야에 공지되고(공지되거나) 본 명세서에 개시되어 있는 방법에 의해 제조될 수 있다. 한 방법에서, 제1 작용기에 결합된 제1 말단 및 적합한 친핵성 기에 결합된 제2 말단을 갖는 약 800 Da 내지 약 100,000 Da의 평균 분자량을 갖는 수용성 중합체 골격은 아세틸렌 작용가 및 PEG 상의 친핵성 기와 반응하기 적합한 이탈기 양쪽 모두를 갖는 화합물과 반응한다. 친핵성 부분을 갖는 PEG 중합체 및 이탈기를 갖는 분자가 합쳐지는 경우, 이탈기는 친핵성 치환을 수행하고, 친핵성 부분에 의해 대체되어 원하는 아세틸렌 함유 중합체를 제공한다.
X-PEG-Nu + L-A-C → X-PEG-Nu-A-C≡CR'
나타낸 바와 같이, 반응에 사용하기 바람직한 중합체 골격은 화학식 X-PEG-Nu (여기서, PEG는 폴리(에틸렌 글리콜)이고, Nu는 친핵성 부분이고, X는 Nu, L 또는 아세틸렌 작용가와 반응하지 않는 작용기임)를 갖는다.
Nu의 예는 주로 SN2-타입 기전에 의해 반응하는 아민, 알콕시, 아릴옥시, 술프히드릴, 이미노, 카르복실레이트, 히드라지드, 아민옥시 기를 포함하며 이에 한정되지 않는다. Nu 기의 추가적인 예는 주로 친핵성 부가 반응을 통해 반응하는 작용기를 포함한다. L 기의 예는 클로리드, 브로미드, 요오디드, 메실레이트, 트레실레이트, 및 토실레이트 및 친핵성 치환을 수행할 것으로 예상되는 다른 기, 뿐만 아니라 케톤, 알데히드, 티오에스테르, 올레핀, 알파-베타 불포화된 카르보닐 기, 카르보네이트 및 친핵성 물질에 의한 부가를 수행할 것으로 예상되는 다른 친전자성 기를 포함한다.
본 발명의 또 다른 실시양태에서, A는 1-10 개의 탄소 원자의 지방족 링커 또는 6-14 개의 탄소 원자의 치환된 아릴 고리이다. X는 아지드 기와 반응하지 않는 작용기이고, L은 적합한 이탈기이다.
본 발명의 아세틸렌 함유 중합체 유도체를 제조하는 또 다른 방법에서, 한 말단에서 보호된 작용기 또는 캡핑제를 갖고, 다른 말단에서 적합한 이탈기를 갖는 약 800 Da 내지 약 100,000 Da의 평균 분자량을 갖는 PEG 중합체는 아세틸렌 음이온에 의해 접촉된다.
예시적인 반응도는 다음과 같이 도시된다:
X-PEG-L + -C≡CR' → X-PEG-C≡CR'
상기 식 중,
PEG는 폴리(에틸렌 글리콜)이고,
X는 캡핑 기, 예를 들면 알콕시 또는 상기한 바와 같은 작용기이고,
R'는 H, 알킬, 알콕시, 아릴 또는 아릴옥시 기 또는 치환된 알킬, 알콕실, 아릴 또는 아릴옥시 기이다.
상기 예에서, 이탈기 L은 충분한 농도의 아세틸렌 음이온과 접촉하는 경우 SN2-타입 치환을 수행하도록 충분히 반응성이어야 한다. 아세틸렌 음이온에 의한 이탈기의 SN2 치환을 달성하는 데 필요로 하는 반응 조건은 당분야에 공지되어 있다.
통상, 조 생성물의 정제는 생성물을 침전시킨 후, 필요에 따라 크로마토그래피하는 것을 포함하며 이에 한정되지 않는 공지된 방법에 의해 수행될 수 있다.
수용성 중합체는 본 발명의 hGH 폴리펩티드에 결합될 수 있다. 수용성 중합체는 hGH 폴리펩티드에 도입된 비-천연적으로 코딩된 아미노산 또는 비-천연 코딩 또는 천연적으로 코딩된 아미노산의 임의의 작용기 또는 치환체 또는 비-천연 코딩 또는 천연적으로 코딩된 아미노산에 부가된 임의의 작용기 또는 치환체를 통해 결합될 수 있다. 별법으로, 수용성 중합체는 자연 발생 아미노산 (시스테인, 리신 또는 N-말단 잔기의 아민 기를 포함하며 이에 한정되지 않음)을 통해 비-천연적으로 코딩된 아미노산을 도입하는 hGH 폴리펩티드에 결합된다. 일부 경우, 본 발명의 hGH 폴리펩티드는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 개의 비천연 아미노산을 포함하며, 여기서 하나 이상의 비-천연적으로 코딩된 아미노산(들)이 수용성 중합체(들) (PEG 및(또는) 올리고사카라이드를 포함하며 이에 한정되지 않음)에 결합된다. 일부 경우, 본 발명의 hGH 폴리펩티드는 수용성 중합체에 결합된 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 개 이상의 천연적으로 코딩된 아미노산(들)을 추가로 포함한다. 일부 경우, 본 발명의 hGH 폴리펩티드는 수용성 중합체에 결합된 하나 이상의 비-천연적으로 코딩된 아미노산(들) 및 수용성 중합체에 결합된 하나 이상의 자연 발생 아미노산을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 발명에 사용되는 수용성 중합체는 비컨쥬게이션된 형태에 비해 hGH 폴리펩티드의 혈청 반감기를 강화시킨다.
본 발명의 hGH 폴리펩티드에 결합된 수용성 중합체의 수 (즉, PEG화 또는 글리코실화 정도)를 조정하여 변화된 (증가되거나 또는 감소되는 것을 포함하며 이에 한정되지 않음) 약리학적, 약동학적 또는 약역학적 특징, 예를 들면 생체 내 반감기를 제공할 수 있다. 일부 실시양태에서, hGH의 반감기는 비변형된 폴리펩티드에 비해 약 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 %, 2 배, 5 배, 10 배, 50 배 이상, 또는 약 100 배 이상 증가된다.
강한 친핵성 기 (즉, 히드라지드 , 히드라진, 히드록실아민 또는 세미카르바 지 드)를 함유하는 PEG 유도체
본 발명의 한 실시양태에서, 카르보닐 함유 비-천연적으로 코딩된 아미노산을 포함하는 hGH 폴리펩티드는 PEG 골격에 직접 결합된 말단 히드라진, 히드록실아민, 히드라지드 또는 세미카르바지드 부분을 함유하는 PEG 유도체를 사용하여 변형된다.
일부 실시양태에서, 히드록실아민-말단 PEG 유도체는 다음의 구조를 갖는다:
RO-(CH2CH2O)n-O-(CH2)m-O-NH2
상기 식 중,
R은 단순 알킬 (메틸, 에틸, 프로필 등)이고, m은 2-10이고, n은 100-1,000 (즉, 평균 분자량은 5-40 kDa임)이다.
일부 실시양태에서, 히드라진 함유 PEG 유도체 또는 히드라지드 함유 PEG 유도체는 다음의 구조를 갖는다:
RO-(CH2CH2O)n-O-(CH2)m-X-NH-NH2
상기 식 중,
R은 단순 알킬 (메틸, 에틸, 프로필 등)이고, m은 2-10이고, n은 100-1,000이고, X는 임의적으로 존재하거나 또는 존재하지 않을 수 있는 카르보닐기 (C=O)이다.
일부 실시양태에서, 세미카르바지드 함유 PEG 유도체는 다음의 구조를 갖는다:
RO-(CH2CH2O)n-O-(CH2)m-NH-C(O)-NH-NH2
상기 식 중,
R은 단순 알킬 (메틸, 에틸, 프로필 등)이고, m은 2-10이고, n은 100-1,000이다.
본 발명의 또 다른 실시양태에서, 카르보닐 함유 아미노산을 포함하는 hGH 폴리펩티드는 아미드 결합에 의해 PEG 골격에 결합되는 말단 히드록실아민, 히드라지드, 히드라진 또는 세미카르바지드 부분을 함유하는 PEG 유도체를 사용하여 변형된다.
일부 실시양태에서, 히드록실아민-말단 PEG 유도체는 다음의 구조를 갖는다:
RO-(CH2CH2O)n-O-(CH2)2-NH-CO-(CH2)m-0-NH2
상기 식 중,
R은 단순 알킬 (메틸, 에틸, 프로필 등)이고, m은 2-10이고, n은 100-1,000 (즉, 평균 분자량은 5-40 kDa임)이다.
일부 실시양태에서, 히드라진 함유 또는 히드라지드 함유 PEG 유도체는 다음의 구조를 갖는다:
RO-(CH2CH2O)n-O-(CH2)2-NH-C(O)(CH2)m-X-NH-NH2
상기 식 중,
R은 단순 알킬 (메틸, 에틸, 프로필 등)이고, m은 2-10이고, n은 100-1,000이고, X는 임의적으로 존재하거나 또는 존재하지 않을 수 있는 카르보닐기 (C=O)이다.
일부 실시양태에서, 세미카르바지드 함유 PEG 유도체는 다음의 구조를 갖는다:
RO-(CH2CH2O)n-O-(CH2)2-NH-C(O)(CH2)m-NH-C(O)-NH-NH2
상기 식 중,
R은 단순 알킬 (메틸, 에틸, 프로필 등)이고, m은 2-10이고, n은 100-1,000이다.
본 발명의 또 다른 실시양태에서, 카르보닐 함유 아미노산을 포함하는 hGH 폴리펩티드는 말단 히드라진, 히드록실아민, 히드라지드 또는 세미카르바지드 부분을 함유하는 분지형 PEG 유도체를 사용하여 분지되며, 이러한 분지형 PEG의 각각의 사슬은 10-40 kDa, 더욱 바람직하게는 5-20 kDa 범위의 MW를 갖는다.
본 발명의 또 다른 실시양태에서, 비-천연적으로 코딩된 아미노산을 포함하는 hGH 폴리펩티드는 분지형 구조를 갖는 PEG 유도체를 사용하여 변형된다. 예를 들면, 일부 실시양태에서, 히드라진-말단 PEG 유도체 또는 히드라지드-말단 PEG 유도체는 다음의 구조를 갖는다:
[RO-(CH2CH2O)n-O-(CH2)2-NH-C(O)]2CH(CH2)m-X-NH-NH2
상기 식 중,
R은 단순 알킬 (메틸, 에틸, 프로필 등)이고, m은 2-10이고, n은 100-1,000이고, X는 임의적으로 존재하거나 또는 존재하지 않을 수 있는 카르보닐기 (C=O)이다.
일부 실시양태에서, 세미카르바지드 기를 함유하는 PEG 유도체는 다음의 구조를 갖는다:
[RO-(CH2CH2O)n-O-(CH2)2-C(O)-NH-CH2-CH2]2CH-X-(CH2)m-NH-C(O)-NH-NH2
상기 식 중,
R은 단순 알킬 (메틸, 에틸, 프로필 등)이고, X는 임의적으로 NH, 0, S, C(O)이거나 또는 존재하지 않고, m은 2-10이고, n은 100-1,000이다.
일부 실시양태에서, 히드록실아민 기를 함유하는 PEG 유도체는 다음의 구조를 갖는다:
[RO-(CH2CH2O)n-O-(CH2)2-C(O)-NH-CH2-CH2]2CH-X-(CH2)m-0-NH2
상기 식 중,
R은 단순 알킬 (메틸, 에틸, 프로필 등)이고, X는 임의적으로 NH, O, S, C(O)이거나 또는 존재하지 않고, m은 2-10이고, n은 100-1,000이다.
수용성 중합체(들)가 hGH 폴리펩티드에 결합되는 정도 및 부위는 사이트 1에서 hGH 폴리펩티드의 hGH 폴리펩티드 수용체에 대한 결합을 조절할 수 있다. 일부 실시양태에서, 상기 결합은 hGH 폴리펩티드가 평형 결합 분석시험, 예를 들면 hGH에 대해 문헌[Spencer et al., J. Biol. Chem., 263: 7862-7867 (1988)]에 기재된 것에 의해 측정시 약 400 nM 이하, 150 nM 이하의 Kd, 및 일부 경우 100 nM 이하의 Kd로 사이트 1에서 hGH 폴리펩티드 수용체를 결합시키도록 배치된다.
중합체의 활성화, 뿐만 아니라 펩티드의 컨쥬게이션 방법 및 화학 작용은 문헌에 기재되어 있고, 당분야에 공지되어 있다. 중합체의 활성화에 통상 사용되는 방법은 시아노겐 브로미드, 페리오데이트, 글루타랄데히드, 바이에폭시드, 에피클로로히드린, 디비닐술폰, 카르보디이미드, 술포닐 할리드, 트리클로로트리아진 등을 사용하여 작용기를 활성화시키는 것을 포함하며 이에 한정되지 않는다 (문헌[R. F. Taylor, (1991), PROTEIN IMMOBILISATION. FUNDAMENTAL AND APPLICATIONS, Marcel Dekker, N. Y.; S. S. Wong, (1992), CHEMISTRY OF PROTEIN CONJUGATION AND CROSSLINKING, CRC Press, Boca Raton; G. T. Hermanson et al., (1993), IMMOBILIZED AFFINITY LIGAND TECHNIQUES, Academic Press, N. Y.; Dunn, R. L., et al., Eds. POLYMERIC DRUGS AND DRUG DELIVERY SYSTEMS, ACS Symposium Series Vol. 469, American Chemical Society, Washington, D. C. 1991] 참조).
PEG의 작용화 및 컨쥬게이션에 대한 몇몇 검토 및 논문이 이용가능하다. 예를 들면, 문헌[Harris, Macronol. Claena. Plzys. C25: 325-373 (1985); Scouten, Methods in Enzymology 135: 30-65 (1987); Wong et al., Enzyme Microb. Sechnol. 14: 866-874 (1992); Delgado et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems 9: 249-304 (1992); Zalipsky, Bioconjugate Chem. 6: 150-165 (1995)]을 참조할 수 있다.
또한, 중합체의 활성화 방법은 WO 94/17039, 미국 특허 제 5,324,844호, WO 94/18247, WO 94/04193, 미국 특허 제 5,219,564호, 미국 특허 제 5,122,614호, WO 90/13540, 미국 특허 제 5,281,698호, 및 WO 93/15189에서 찾을 수 있고, 활성화된 중합체와 효소 사이의 컨쥬게이션의 경우 컨쥬게이션 펙터 (Coagulation Factor) VIII (WO 94/15625 참조), 헤모글로빈 (WO 94/09027 참조), 산소 운반 분자 (미국 특허 제 4,412,989호 참조), 리보뉴클레아제 (ribonuclease) 및 슈퍼옥시드 (superoxide) 디스뮤타아제 (문헌[Veronese et al., App. Biochem. Biotech. 11: 141-45 (1985)] 참조)를 포함하며 이에 한정되지 않는다. 인용된 모든 참고 문헌 및 특허는 본 명세서에 참고 문헌으로 인용된다.
비-천연적으로 코딩된 아미노산, 예를 들면 p-아지도-L-페닐알라닌을 함유하는 hGH 폴리펩티드의 PEG화 (즉, 임의의 수용성 중합체의 부가)는 임의의 편리한 방법에 의해 수행된다. 예를 들면, hGH 폴리펩티드는 알킨-종결 mPEG 유도체로 PEG화된다. 간략히, 실온에서 과량의 고체 mPEG(5000)-O-CH2-C≡CH를 교반하면서 p-아지도-L-Phe 함유 hGH 폴리펩티드의 수용액에 첨가한다. 전형적으로, 이 수용액은 반응이 수행되는 pH (일반적으로, 약 pH 4-10) 근처에서 pKa를 갖는 완충제로 완충된다. 예를 들면, pH 7.5에서 PEG화하기 적합한 완충제의 예는 HEPES, 포스페이트, 보레이트, TRIS-HCl, EPPS 및 TES를 포함하며 이에 한정되지 않는다. pH를 연속적으로 모니터링하고, 필요에 따라 조정한다. 전형적으로, 반응을 약 1-48 시간 동안 계속한다.
추후, 반응 생성물을 소수성 상호작용 크로마토그래피하여, 차단되지 않은 PEG가 분자의 양쪽 말단에서 활성화되어 hGH 폴리펩티드 변이체 분자를 가교 결합시키는 경우 형성될 수 있는 PEG화된 hGH 폴리펩티드의 임의의 고 분자량 착물 및 유리 mPEG(5000)-O-CH2-C≡CH로부터 PEG화된 hGH 폴리펩티드 변이체를 분리시킨다. 소수성 상호작용 크로마토그래피 동안의 조건은 임의의 가교 결합된 PEG화된 hGH 폴리펩티드 변이체 착물이 하나 이상의 PEG 기에 컨쥬게이션된 한 hGH 폴리펩티드 변이체 분자를 함유하는 원하는 형태를 따라 용리되면서, 유리 mPEG(5000)-O-CH2-C≡CH가 컬럼을 통해 유동하도록 하는 것이다. 적합한 조건은 가교 결합된 착물 대 원하는 컨쥬게이션물의 상대적 크기에 따라 변화하고, 당업자에 의해 용이하게 결정된다. 원하는 컨쥬게이션물을 함유하는 용리액을 한외여과에 의해 농축시키고, 정용여과에 의해 탈염시킨다.
필요에 따라, 소수성 크로마토그래피로부터 얻은 PEG화된 hGH 폴리펩티드를 친화성 크로마토그래피; 음이온 교환 크로마토그래피 또는 양이온 교환 크로마토그래피 (DEAE 세파로오스를 사용하는 것을 포함하며 이에 한정되지 않음); 실리카 상에서의 크로마토그래피; 역상 HPLC; 겔 여과(세파덱스G-75를 사용하는 것을 포함하며 이에 한정되지 않음); 소수성 상호작용 크로마토그래피; 크기-배제 크로마토그래피, 금속-킬레이트 크로마토그래피; 한외여과/정용여과: 에탄올 침전; 황산암모늄 침전; 크로마토포커싱; 치환 크로마토그래피; 전기영동 절차 (제조용 등점 집초법을 포함하며 이에 한정되지 않음), 용해도 차이법 (황산암모늄 침전을 포함하며 이에 한정되지 않음), SDS-PAGE 또는 추출을 포함하며 이에 한정되지 않는 당업자에게 공지된 하나 이상의 절차에 의해 추가 정제할 수 있다. 겉보기 분자량을 구형 단백질 표준에 비교함으로써 GPC에 의해 추정할 수 있다 (문헌[PROTEIN PURIFICATION METHODS, A PRACTICAL APPROACH (Harris & Angal, Eds.) IRL Press 1989, 293-306] 참조). hGH-PEG 컨쥬게이션물의 순도를 단백질분해성 분해 (트립신 분절을 포함하며 이에 한정되지 않음) 후, 질량 분석법 분석에 의해 평가할 수 있다. 문헌[Pepinsky B., et al., J. Pharmacol. & Exp. Ther. 297 (3): 1059-66 (2001)]을 참조할 수 있다.
본 발명의 hGH 폴리펩티드의 아미노산에 결합된 수용성 중합체는 제한없이 추가로 유도체화되거나 또는 치환될 수 있다.
아지드 함유 PEG 유도체
본 발명의 또 다른 실시양태에서, hGH 폴리펩티드는 비-천연적으로 코딩된 아미노산의 측쇄 상에 존재하는 알킨 부분과 반응하는 아지드 부분을 함유하는 PEG 유도체를 사용하여 변형된다. 일반적으로, PEG 유도체는 1-100 kDa 범위, 일부 실시양태에서 10-40 kDa 범위의 평균 분자량을 갖는다.
일부 실시양태에서, 아지드-말단 PEG 유도체는 다음의 구조를 갖는다:
RO-(CH2CH2O)n-O-(CH2)m-N3
상기 식 중,
R은 단순 알킬 (메틸, 에틸, 프로필 등)이고, m은 2-10이고, n은 100-1,000 (즉, 평균 분자량은 5-40 kDa임)이다.
또 다른 실시양태에서, 아지드-말단 PEG 유도체는 다음의 구조를 갖는다:
RO-(CH2CH2O)n-O-(CH2)m-NH-C(O)-(CH2)p-N3
상기 식 중,
R은 단순 알킬 (메틸, 에틸, 프로필 등)이고, m은 2-10이고, p는 2-10이고, n은 100-1,000 (즉, 평균 분자량은 5-40 kDa임)이다.
본 발명의 또 다른 실시양태에서, 알킨 함유 아미노산을 포함하는 hGH 폴리펩티드는 말단 아지드 부분을 함유하는 분지형 PEG 유도체를 사용하여 변형되며, 여기서 이러한 분지형 PEG의 각 사슬은 10-40 kDa, 더욱 바람직하게는 5-20 kDa 범위의 MW를 갖는다. 예를 들면, 일부 실시양태에서, 아지드-말단 PEG 유도체는 다음의 구조를 갖는다:
[RO-(CH2CH2O)n-O-(CH2)2-NH-C(O)]2CH(CH2)m-X-(CH2)pN3
상기 식 중,
R은 단순 알킬 (메틸, 에틸, 프로필 등)이고, m은 2-10이고, p는 2-10이고, n은 100-1,000이고, X는 임의적으로 O, N, S 또는 카르보닐기 (C=O)이며, 각각의 경우 존재하거나 또는 존재하지 않을 수 있다
알킨 함유 PEG 유도체
본 발명의 또 다른 실시양태에서, hGH 폴리펩티드는 비-천연적으로 코딩된 아미노산의 측쇄 상에 존재하는 아지드 부분과 반응하게 되는 알킬 부분을 함유하는 PEG 유도체를 사용하여 변형된다.
일부 실시양태에서, 알킨-말단 PEG 유도체는 다음의 구조를 갖는다:
RO-(CH2CH2O)n-O-(CH2)m-C≡CH
상기 식 중,
R은 단순 알킬 (메틸, 에틸, 프로필 등)이고, m은 2-10이고, n은 100-1,000 (즉, 평균 분자량은 5-40 kDa임)이다.
본 발명의 또 다른 실시양태에서, 알킨 함유 비-천연적으로 코딩된 아미노산을 포함하는 hGH 폴리펩티드는 아미드 결합에 의해 PEG 골격에 결합된 말단 아지드 또는 말단 알킨 부분을 함유하는 PEG 유도체를 사용하여 변형된다.
일부 실시양태에서, 알킨-말단 PEG 유도체는 다음의 구조를 갖는다:
RO-(CH2CH2O)n-O-(CH2)m-NH-C(O)-(CH2)p-C≡CH
상기 식 중,
R은 단순 알킬 (메틸, 에틸, 프로필 등)이고, m은 2-10이고, p는 2-10이고, n은 100-1,000이다.
본 발명의 또 다른 실시양태에서, 아지드 함유 아미노산을 포함하는 hGH 폴리펩티드는 말단 알킨 부분을 함유하는 분지형 PEG 유도체를 사용하여 변형되며, 이러한 분지형 PEG의 각 사슬이 10-40 kDa, 더욱 바람직하게는 5-20 kDa 범위의 MW를 갖는다. 예를 들면, 일부 실시양태에서, 알킨-말단 PEG 유도체는 다음의 구조를 갖는다:
[RO-(CH2CH2O)n-O-(CH2)2-NH-C(O)]2CH(CH2)m-X-(CH2)p-C≡CH
상기 식 중,
R은 단순 알킬 (메틸, 에틸, 프로필 등)이고, m은 2-10이고, p는 2-10이고, n은 100-1,000이고, X는 임의적으로 O, N, S 또는 카르보닐기 (C=O)이거나 또는 존재하지 않는다.
포스핀 함유 PEG 유도체
본 발명의 또 다른 실시양태에서, hGH 폴리펩티드는 비-천연적으로 코딩된 아미노산의 측쇄 상에 존재하는 아지드 부분과 반응하게 되는 아릴 포스핀 기를 추가로 포함하는 활성화된 작용기 (에스테르, 카르보네이트를 포함하며 이에 한정되지 않음)를 함유하는 PEG 유도체를 사용하여 변형된다. 일반적으로, PEG 유도체는 1-100 kDa, 일부 실시양태에서 10-40 kDa 범위의 평균 분자량을 갖는다.
일부 실시양태에서, PEG 유도체는 다음의 구조를 갖는다:
Figure 112006059749857-pct00016
상기 식 중,
n은 1-10이고, X는 O, N, S이거나 또는 존재하지 않을 수 있고, Ph는 페닐이고, W는 수용성 중합체이다.
일부 실시양태에서, PEG 유도체는 다음의 구조를 갖는다:
Figure 112006059749857-pct00017
상기 식 중,
X는 O, N, S이거나 또는 존재하지 않을 수 있고, Ph는 페닐이고, W는 수용성 중합체이고, R은 H, 알킬, 아릴, 치환된 알킬 및 치환된 아릴 기일 수 있다. 예시적인 R 기는 -CH2, -C(CH3)3, -OR', -NR'R", -SR', -할로겐, -C(O)R', -CONR'R", -S(O)2R', -S(O)2NR'R", -CN 및 -NO2를 포함하며 이에 한정되지 않는다. R', R", R"' 및 R""는 각각 독립적으로 수소, 치환되거나 또는 비치환된 헤테로알킬, 1-3 개의 할로겐으로 치환된 아릴을 포함하며 이에 한정되지 않는 치환되거나 또는 비치환된 아릴, 치환되거나 또는 비치환된 알킬, 알콕시 또는 티오알콕시 기 또는 아릴알킬 기를 지칭한다. 본 발명의 화합물이 하나 이상의 R 기를 포함하는 경우, 예를 들면, 각각의 R 기는 이들 기 중 하나 이상이 존재하는 경우 각각의 R', R", R"' 및 R"" 기로서 독립적으로 선택된다. R' 및 R"가 동일한 질소 원자에 부착되는 경우, 이들은 질소 원자와 합쳐져 5원, 6원 또는 7원 고리를 형성할 수 있다. 예를 들면, -NR'R"는 1-피롤리디닐 및 4-모르폴리닐을 포함하며 이에 한정되지 않는 것을 의미한다. 치환체의 상기 논의로부터, 당업자는 용어 "알킬"이, 수소 기 이외의 기에 결합된 탄소 원자를 포함하는 기, 예를 들면 할로알킬 (-CF3 및 -CH2CF3를 포함하며 이에 한정되지 않음) 및 아실 (-C(O)CH3, -C(O)CF3, -C(O)CH2OCH3 등을 포함하며 이에 한정되지 않음)을 포함한 것을 의미한다는 점을 이해할 것이다.
다른 PEG 유도체 및 일반적 PEG화 기술
hGH 폴리펩티드에 결합될 수 있는 다른 예시적인 PEG 분자, 뿐만 아니라 PEG화 방법은 예를 들면, 본 명세서에 참고 문헌으로 인용되는 미국 특허 공보 2004/0001838: 2002/0052009; 2003/0162949; 2004/0013637; 2003/0228274; 2003/0220447; 2003/0158333; 2003/0143596; 2003/0114647; 2003/0105275; 2003/0105224; 2003/0023023; 2002/0156047; 2002/0099133; 2002/0086939; 2002/0082345; 2002/0072573; 2002/0052430; 2002/0040076; 2002/0037949; 2002/0002250; 2001/0056171; 2001/0044526; 2001/0027217; 2001/0021763; 미국 특허 제 6,646,110호, 제 5,824,778호, 제 5,476,653호, 제 5,219,564호, 제 5,629,384호, 제 5,736,625호, 제 4,902,502호, 제 5,281,698호, 제 5,122,614호, 제 5,473,034호, 제 5,516,673호, 제 5,382,657호, 제 6,552,167호, 제 6,610,281호, 제 6,515,100호, 제 6,461,603호, 제 6,436,386호, 제 6,214,966호, 제 5,990,237호, 제 5,900,461호, 제 5,739,208호, 제 5,672,662호, 제 5,446,090호, 제 5,808,096호, 제 5,612,460호, 제 5,324,844호, 제 5,252,714호, 제 6,420,339호, 제 6,201,072호, 제 6,451,346호, 제 6,306,821호, 제 5,559,213호, 제 5,612,460호, 제 5,747,646호, 제 5,834,594호, 제 5,849,860호, 제 5,980,948호, 제 6,004,573호, 제 6,129,912호; WO 97/32607, EP 229,108, EP 402,378, WO 92/16555, WO 94/04193, WO 94/14758, WO 94/17039, WO 94/18247, WO 94/28024, WO 95/00162, WO 95/11924, W0 95/13090, WO 95/33490, WO 96/00080, WO 97/18832, WO 98/41562, WO 98/48837, WO 99/32134, WO 99/32139, WO 99/32140, WO 96/40791, WO 98/32466, WO 95/06058, EP 439 508, WO 97/03106, WO 96/21469, WO 95/13312, EP 921 131, WO 98/05363, EP 809 996, WO 96/41813, WO 96/07670, EP 605 963, EP 510 356, EP 400 472, EP 183 503 및 EP 154 316에 기재된 것들을 포함한다. 본 명세서에 기재된 임의의 PEG 분자를 단일 사슬, 분지형 사슬, 멀티아암 사슬, 일작용, 이작용, 다작용성 또는 그의 임의의 조합물을 포함하며 이에 한정되지 않는 임의의 형태로 사용할 수 있다.
혈청 알부민에 대한 친화성 강화
또한, 다양한 분자를 본 발명의 hGH 폴리펩티드에 융합시켜 혈청 중 hGH 폴리펩티드의 반감기를 조절할 수 있다. 일부 실시양태에서, 이 분자를 본 발명의 hGH 폴리펩티드에 결합시키거나 또는 융합시켜 동물의 내인성 혈청 알부민에 대한 친화성을 강화시킨다.
예를 들면, 일부 경우, hGH 폴리펩티드 및 알부민 결합 서열로 된 재조합 융합물이 제조된다. 예시적인 알부민 결합 서열은 연쇄상구균성 (streptococcal) 단백질 G로부터의 알부민 결합 도메인 (예를 들면, 문헌[Makrides et al., J. Pharmacol. Exp. Ther. 277: 534-542 (1996) and Sjolander et al., J, Immunol. Methods 201: 115-123 (1997)] 참조), 또는 알부민 결합 펩티드, 예를 들면 문헌[Dennis, et al., J. Biol. Chem. 277: 35035-35043 (2002)]에 기재된 것들을 포함하며 이에 한정되지 않는다.
다른 실시양태에서, 본 발명의 hGH 폴리펩티드는 지방산으로 아실화된다. 일부 경우, 지방산은 혈청 알부민에 대한 결합을 촉진시킨다. 예를 들면, 문헌[Kurtzhals, et al., Biochem. J. 312; 725-731 (1995)]을 참조할 수 있다.
다른 실시양태에서, 본 발명의 hGH 폴리펩티드는 혈청 알부민 (인간 혈청 알부민을 포함하며 이에 한정되지 않음)에 직접 융합된다. 당업자는 매우 다양한 다른 분자들도 본 발명에서 hGH에 결합되어 혈청 알부민 또는 다른 혈청 성분에 대한 결합을 조절할 수 있다는 점을 인식할 것이다.
X. hGH 폴리펩티드의 글리코실화
본 발명은 사카라이드 부분을 갖는 하나 이상의 비-천연적으로 코딩된 아미노산을 포함하는 hGH 폴리펩티드를 포함한다. 사카라이드 부분은사카라이드 부분은세틸글루코사민을 포함하며 이에 한정되지 않음) 또는 비천연 (3-플루오로갈락토오스를 포함하며 이에 한정되지 않음)일 수 있다. 사카라이드는 N-결합 또는 O-결합 글리코시드 결합 (N-아세틸갈락토오스-L-세린을 포함하며 이에 한정되지 않음) 또는 비천연 결합 (옥심 또는 대응하는 C-결합 또는 S-결합 글리코시드를 포함하며 이에 한정되지 않음)에 의해 비-천연적으로 코딩된 아미노산에 결합될 수 있다.
사카라이드 (글리콜을 포함하며 이에 한정되지 않음) 부분은 생체 내 또는 시험관 내에서 hGH 폴리펩티드에 부가될 수 있다. 본 발명의 일부 실시양태에서, 카르보닐 함유 비-천연적으로 코딩된 아미노산을 포함하는 hGH 폴리펩티드는 아미노옥시 기를 사용하여 유도체화된 다사카라이드를 사용하여 변형되어 옥심 결합을 통해 결합된 대응하는 글리코실화된 폴리펩티드를 생성한다. 사카라이드를 비-천연적으로 코딩된 아미노산에 부착시킨 후, 당전이효소 및 다른 효소로 추가 처리하여 hGH 폴리펩티드에 결합된 올리고사카라이드를 생성할 수 있다. 예를 들면, 문헌[H. Liu, et al. J Ain. Chin. Soc. 125: 1702-1703 (2003)]을 참조할 수 있다.
본 발명의 일부 실시양태에서, 카르보닐 함유 비-천연적으로 코딩된 아미노산을 포함하는 hGH 폴리펩티드는 아미노옥시 유도체로서 제조된 정해진 구조를 갖는 글리칸을 사용하여 바로 변형된다. 당업자는 아지드, 알킨, 히드라지드, 히드라진 및 세미카르바지드를 비롯한 다른 작용가를 사용하여 사카라이드를 비-천연적으로 코딩된 아미노산에 결합시킬 수 있다는 점을 인식할 것이다.
그 다음, 본 발명의 일부 실시양태에서, 아지드 또는 알키닐 함유 비-천연적으로 코딩된 아미노산을 포함하는 hGH 폴리펩티드는 각각 알키닐 또는 아지드 유도체를 포함하며 이에 한정되지 않는 것과의 휘스겐 [3 + 2] 시클로부가 반응을 포함하며 이에 한정되지 않는 것에 의해 변형될 수 있다. 이 방법은 단백질이 극히 높은 선택성으로 변형될 수 있게 한다.
XI. GH 수퍼유전자 패밀리 구성원 이량체 및 다량체
또한, 본 발명은 GH 수퍼유전자 패밀리 구성원 조합물 (hGH를 포함하며 이에 한정되지 않음) 호모이량체, 헤테로이량체, 호모다량체 또는 헤테로다량체 (즉, 3량체, 4량체 등)를 제공하며, 여기서 하나 이상의 비-천연적으로 코딩된 아미노산을 함유하는 GH 수퍼유전자 패밀리 구성원 폴리펩티드, 예를 들면 hGH는 또 다른 GH 수퍼유전자 패밀리 구성원 또는 그의 변이체 또는 비-GH 수퍼유전자 패밀리 구성원 또는 그의 변이체인 임의의 다른 폴리펩티드에 폴리펩티드 골격에 직접 결합하거나 또는 링커를 통해 결합된다. GH 수퍼유전자 패밀리 구성원, 예를 들면 hGH, 이량체 또는 다량체 컨쥬게이션물은 단량체에 비해 증가된 분자량으로 인해, 단량체 GH 수퍼유전자 패밀리 구성원에 비해 상이한 약리학적, 약동학적, 약역학적, 조절된 치료적 반감기 또는 조절된 혈장 반감기를 포함하며 이에 한정되지 않는 신규한 또는 바람직한 성질을 나타낼 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 GH 수퍼유전자 패밀리 구성원, 예를 들면 hGH, 이량체는 GH 수퍼유전자 패밀리 구성원 수용체의 이량체화를 조절한다. 다른 실시양태에서, 본 발명의 GH 수퍼유전자 패밀리 구성원 이량체 또는 다량체는 GH 수퍼유전자 패밀리 구성원 수용체 길항제, 아고니스트 또는 조절제로 작용하게 된다.
일부 실시양태에서, 이량체 또는 다량체를 함유하는 hGH 중에 존재하는 hGH 분자 중 하나 이상은 사이트 II 결합 영역 내에 존재하는 수용성 중합체에 결합된 비-천연적으로 코딩된 아미노산을 포함한다. 이와 같이, 이량체 또는 다량체의 각각의 hGH 분자는 사이트 I 계면을 통해 hGH 폴리펩티드 수용체에 결합하는 것이 접근가능하지만, 사이트 II 계면을 통해 제2 hGH 폴리펩티드 수용체에 결합하는 것은 이용가능하지 않다. 따라서, hGH 폴리펩티드 이량체 또는 다량체는 2 개의 별개의 hGH 폴리펩티드 수용체 각각의 사이트 I 결합 부위를 맞물리게 할 수 있지만, hGH 분자가 사이트 II 영역에 존재하는 비유전자로 코딩된 아미노산에 부착된 수용성 중합체를 가짐에 따라, hGH 폴리펩티드 수용체는 hGH 폴리펩티드 리간드의 사이트 II 영역을 맞물리게 할 수 없고, 상기 이량체 또는 다량체는 hGH 폴리펩티드 길항제로서 작용한다. 일부 실시양태에서, 이량체 또는 다량체를 함유하는 hGH 폴리펩티드에 존재하는 hGH 분자 중 하나 이상은 사이트 I 결합 영역 내에 존재하는 수용성 중합체에 결합된 비-천연적으로 코딩된 아미노산을 포함하여 사이트 II 영역에 결합되게 한다. 별법으로, 일부 실시양태에서, 이량체 또는 다량체를 함유하는 hGH 폴리펩티드에 존재하는 hGH 분자 중 하나 이상은 양쪽 모두가 결합에 이용가능하도록 사이트 I 또는 사이트 II 결합 영역 내에 존재하지 않는 부위에 존재하는 수용성 중합체에 결합된 비-천연적으로 코딩된 아미노산을 포함한다. 일부 실시양태에서, 결합에 이용가능한 사이트 I, 사이트 II, 또는 양쪽 모두를 갖는 hGH 분자의 조합물을 사용한다. 하나 이상이 결합에 이용가능한 사이트 I을 갖고, 하나 이상이 결합에 이용가능한 사이트 II를 갖는 hGH 분자의 조합물은 원하는 활성 또는 성질을 갖는 분자를 제공할 수 있다. 또한, 결합에 이용가능한 사이트 I 및 사이트 II 양쪽 모두를 갖는 hGH 분자의 조합물은 수퍼아고니스트 (super-agonist) hGH 분자를 생산할 수 있다.
일부 실시양태에서, GH 수퍼유전자 패밀리 구성원 폴리펩티드는 Asn-Lys 아미드 결합 또는 Cys-Cys 디술피드 결합을 포함하며 이에 한정되지 않는 것에 의해 직접 결합된다. 일부 실시양태에서, 결합된 GH 수퍼유전자 패밀리 구성원 폴리펩티드 및(또는) 결합된 비-GH 수퍼유전자 패밀리 구성원은 상이한 비-천연적으로 코딩된 아미노산을 포함하여 이량체화를 용이하게 하며, 제1 hGH 폴리펩티드의 한 비-천연적으로 코딩된 아미노산에서 알킨 및 제2 GH 수퍼유전자 패밀리 구성원 폴리펩티드의 제2 비-천연적으로 코딩된 아미노산에서 아지드를 포함하며 이에 한정되지 않는 것들은 휘스겐 [3 + 2] 시클로부가를 통해 컨쥬게이션된다. 별법으로, 케톤 함유 비-천연적으로 코딩된 아미노산을 포함하는 제1 GH 수퍼유전자 패밀리 구성원 및(또는) 케톤 함유 비-천연적으로 코딩된 아미노산을 포함하는 결합된 비-GH 수퍼유전자 패밀리 구성원 폴리펩티드는 히드록실아민 함유 비-천연적으로 코딩된 아미노산을 포함하는 제2 GH 수퍼유전자 패밀리 구성원 폴리펩티드에 컨쥬게이션될 수 있고, 폴리펩티드는 대응하는 옥심의 형성을 통해 반응한다.
별법으로, 두 개의 GH 수퍼유전자 패밀리 구성원 폴리펩티드 및(또는) 결합된 비-GH 수퍼유전자 패밀리 구성원은 링커를 통해 결합된다. 임의의 헤테로이작용 또는 호모이작용 링커는 동일하거나 또는 상이한 1차 서열을 가질 수 있는 두 개의 GH 수퍼유전자 패밀리 구성원 폴리펩티드 및(또는) 결합된 비-GH 수퍼유전자 패밀리 구성원 폴리펩티드를 결합시키는 데 사용될 수 있다. 일부 경우, GH 수퍼유전자 패밀리 구성원 폴리펩티드 및(또는) 결합된 비-GH 수퍼유전자 패밀리 구성원 폴리펩티드를 함께 구속하는 데 사용되는 링커는 이작용 PEG 시약일 수 있다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 다음을 포함하는 아령 구조를 갖는 수용성 이작용 링커를 제공한다: a) 중합체 골격의 적어도 제1 말단 상의 아지드, 알킨, 히드라진, 히드라지드, 히드록실아민 또는 카르보닐 함유 부분; 및 b) 중합체 골격의 제2 말단 상의 적어도 제2 작용기. 제2 작용기는 제1 작용기와 동일하거나 또는 상이할 수 있다. 일부 실시양태에서, 제2 작용기는 제1 작용기와 반응성을 갖지 않는다. 일부 실시양태에서, 본 발명은 분지형 분자 구조로 된 하나 이상의 아암을 포함하는 수용성 화합물을 제공한다. 예를 들면, 분지형 분자 구조는 수지상일 수 있다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 다음의 구조를 갖는 수용성 활성화된 중합체와의 반응에 의해 형성된 하나 이상의 GH 수퍼유전자 패밀리 구성원, 예를 들면 hGH를 포함하는 다량체를 제공한다:
R-(CH2CH2O)n-0-(CH2)m-X
상기 식 중,
n은 약 5 내지 3,000이고, m은 2-10이고, X는 아지드, 알킨, 히드라진, 히드라지드, 아미노옥시 기, 히드록실아민, 아세틸 또는 카르보닐 함유 부분일 수 있고, R은 X와 동일하거나 또는 상이할 수 있는 캡핑 기, 작용기 또는 이탈기이다. R은 예를 들면, 히드록실, 보호된 히드록실, 알콕실, N-히드록시숙신이미딜 에스테르, 1-벤조트리아졸릴 에스테르, N-히드록시숙신이미딜 카르보네이트, 1-벤조트리아졸릴 카르보네이트, 아세탈, 알데히드, 알데히드 수화물, 알케닐, 아크릴레이트, 메타크릴레이트, 아크릴아미드, 활성 술폰, 아민, 아미노옥시, 보호된 아민, 히드라지드, 보호된 히드라지드, 보호된 티올, 카르복실산, 보호된 카르복실산, 이소시아네이트, 이소티오시아네이트, 말레이미드, 비닐술폰, 디티오피리딘, 비닐피리딘, 요오도아세트아미드, 에폭시드, 글리옥살, 디온, 메실레이트, 토실레이트, 및 트레실레이트, 알켄, 및 케톤으로 이루어진 군으로부터 선택된 작용기일 수 있다.
XII. hGH 폴리펩티드 수용체에 대한 hGH 폴리펩티드의 hGH 폴리펩티드 활성 및 친화성의 측정
hGH 수용체는 문헌[McFarland et al., Science, 245: 494-499 (1989) and Leung, D., et al., Nature, 330: 537-543 (1987)]에 기재된 바와 같이 제조될 수 있다. 시험관 내 또는 생체 내 표준 분석시험을 사용하여 hGH 폴리펩티드 활성을 결정할 수 있다. 예를 들면, hGH의 존재 하에서 증식하는 세포주 (예를 들면, hGH 수용체 또는 젖분비자극 수용체를 발현시키는 세포주)를 사용하여 hGH 수용체 결합을 모니터링할 수 있다. 예를 들면, 문헌[Clark, R., et al.,J. Biol. Chem. 271 (36): 21969 (1996); Wada, et al., Mol. Endocrinol. 12: 146-156 (1998); Gout, P. W., et al. Cancer Res. 40, 2433-2436 (1980)]; WO 99/03887을 참조할 수 있다. 비천연 아미노산을 포함하는 비PEG화된 hGH 폴리펩티드의 경우, 비아코어TM 바이오센서 (BIAcoreTM biosensor) (파마시아)를 사용하여 호르몬의 그의 수용체에 대한 친화성을 측정할 수 있다. 예를 들면, 미국 특허 제 5,849,535호; 문헌[Spencer, S. A., et al., J. Biol. Chem., 263: 7862-7867 (1988)]을 참조할 수 있다. hGH 활성 시험용 생체 내 동물 모델은 예를 들면, 문헌[Clark et al.,J. Biol. Chem. 271 (36): 21969-21977 (1996)]에 기재된 것들을 포함한다. 하나 이상의 비-천연적으로 코딩된 아미노산을 포함하는 hGH 폴리펩티드의 이량체화 능력에 대한 분석시험을 문헌[Cunningham, B., et al., Science, 254: 821-825 (1991) and Fuh, G., et al., Science, 256: 1677-1680 (1992)]에 기재된 바와 같이 수행할 수 있다. 인용된 모든 참고 문헌 및 특허는 본 명세서에 참고 문헌으로 인용된다.
상기 분석시험 방법론에 대한 참고 문헌의 편집물은 한정적인 것이 아니며, 당업자는 원하는 최종 결과를 위한 시험에 유용한 다른 분석시험들을 인식할 것이다.
XIII. 효능, 기능적인 생체 내 반감기 및 약동학적 매개변수의 측정
본 발명의 중요한 측면은 폴리펩티드를 수용성 중합체 부분에 컨쥬게이션하거나 또는 컨쥬게이션하지 않고 hGH 폴리펩티드를 구성함으로써 얻어진 연장된 생물학적 반감기이다. hGH 폴리펩티드 혈청 농도의 신속한 감소는 컨쥬게이션된 hGH 폴리펩티드 및 비컨쥬게이션된 hGH 폴리펩티드 및 그의 변이체 처리에 대한 생물학적 반응을 평가하는 데 중요하다. 바람직하게는, 또한, 본 발명의 컨쥬게이션된 hGH 폴리펩티드 및 비컨쥬게이션된 hGH 폴리펩티드 및 그의 변이체는 정맥내 투여 후 연장된 혈청 반감기를 가짐으로써, 예를 들면, ELISA 방법 또는 1차 스크리닝 분석방법에 의한 측정을 가능케 한다. 바이오소스 인터네쇼날 (BioSource International) (캘리포니아주 카마릴로 소재) 또는 디아그노스틱 시스템스 라보라토리즈 (Diagnostic Systems Laboratories) (텍사스주 웹스터 소재)로부터의 ELISA 또는 RIA 키트를 사용할 수 있다. 생체 내 생물학적 반감기의 측정은 본 명세서에 기재된 바와 같이 수행된다.
비-천연적으로 코딩된 아미노산을 포함하는 hGH 폴리펩티드의 효능 및 기능적 생체 내 반감기는 문헌[Clark, R., et al., J. Biol. Chem. 271, 36, 21969-21977 (1996)]에 기재된 프로토콜에 따라 결정될 수 있다.
비-천연적으로 코딩된 아미노산을 포함하는 hGH 폴리펩티드에 대한 약동학적 매개변수는 정상 스프라그-다울리 (Sprague-Dawley) 수컷 쥐 (처리군 당 N = 5 마리 동물)에서 평가될 수 있다. 동물은 쥐 1 마리 당 25 ㎍의 단일 투여량을 정맥내 투여받거나 또는 50 ㎍의 단일 투여량을 피하 투여받게 되고, 일반적으로, 수용성 중합체에 컨쥬게이션되지 않은 비-천연적으로 코딩된 아미노산을 포함하는 hGH 폴리펩티드의 경우 약 6 시간, 및 수용성 중합체에 컨쥬게이션된 비-천연적으로 코딩된 아미노산을 포함하는 hGH 폴리펩티드의 경우 약 4 일 동안의 미리 정해진 시간에 따라 대략 5-7 개의 혈액 샘플을 취하게 된다. hGH 폴리펩티드에 대한 약동학적 데이터는 몇몇 종에서 잘 연구되어 있고, 이를 비-천연적으로 코딩된 아미노산을 포함하는 hGH 폴리펩티드에 대해 얻어진 데이터와 직접 비교할 수 있다. hGH와 관련된 연구에 대해, 문헌[Mordenti J., et al., Pharm. Res. 8 (11): 1351-59 (1991)]을 참조할 수 있다.
당분야에 공지되어 있는 다양한 분석시험에 의해 본 발명에 따른 hGH 폴리펩티드의 특이적 활성을 결정할 수 있다. 본 발명에 따라 수득되고 정제된 hGH 폴리펩티드 뮤테인 또는 그의 단편의 생물학적 활성을 본 명세서에 기재되거나 또는 인용된 방법 또는 당업자에게 공지되어 있는 방법에 의해 시험할 수 있다.
XIV. 투여 및 약학 조성물
임의적으로, 본 발명의 폴리펩티드 또는 단백질 (hGH, 합성효소, 하나 이상의 비천연 아미노산을 포함하는 단백질 등을 포함하며 이에 한정되지 않음)을 적합한 제약상 담체를 포함하며 이에 한정되지 않는 것과 함께 치료적 용도로 사용한다. 예를 들면, 이러한 조성물은 치료적 유효량의 화합물, 및 약학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제를 포함한다. 이러한 담체 또는 부형제는 식염수, 완충 식염수, 덱스트로오스, 물, 글리세롤, 에탄올 및(또는) 그들의 조합물을 포함하며 이에 한정되지 않는다. 이 제제는 투여 방식에 적합하도록 만들어진다. 일반적으로, 단백질을 투여하는 방법은 당분야에 공지되어 있고, 본 발명의 폴리펩티드의 투여에 적용될 수 있다.
임의적으로, 하나 이상의 본 발명의 폴리펩티드를 포함하는 치료용 조성물을 하나 이상의 적합한 시험관 내에서 및(또는) 질환을 갖는 생체 내 동물 모델에서 시험하여 당분야에 공지되어 있는 방법에 따라 효능, 조직 기전을 확인하고, 투여량을 평가한다. 특히, 투여량은 즉, 관련 분석시험에서, 천연 아미노산 동족체 (하나 이상의 비천연 아미노산을 포함하도록 변형된 hGH 폴리펩티드를 천연 아미노산 hGH 폴리펩티드에 비교하는 것을 포함하며 이에 한정되지 않음)에 대한 비천연 물질의 활성, 안정성 또는 다른 적합한 기준에 의해 초기에 결정될 수 있다.
투여는 정상적으로 분자를 혈액 또는 조직 세포와의 최종 접촉점에 도입시키는 데 사용되는 경로 중 임의의 것에 의해 이루어진다. 본 발명의 비천연 아미노산 폴리펩티드는 임의의 적합한 방식으로, 임의적으로 하나 이상의 약학적으로 허용가능한 담체와 함께 투여된다. 본 발명의 내용 중에서 이러한 폴리펩티드를 환자에게 투여하는 적합한 방법이 이용하능하고, 비록 특정 조성물을 투여하는 데 하나 이상의 경로를 사용할 수 있지만, 종종, 특정 경로가 또 다른 경로보다 더욱 즉각적이고 더욱 유효한 작용 또는 반응을 제공할 수 있다.
약학적으로 허용가능한 담체는 부분적으로 투여되는 특정 조성물, 뿐만 아니라 조성물을 투여하는 데 사용되는 특정 방법에 의해 결정된다. 따라서, 본 발명의 약학 조성물로 된 매우 다양한 적합한 제제가 존재한다.
폴리펩티드 조성물은 경구, 정맥내, 복막내, 근육내, 경피, 피하, 국소, 설하, 또는 직장 수단을 포함하며 이에 한정되지 않는 다수의 경로에 의해 투여될 수 있다. 또한, 변형되거나 또는 비변형된 비천연 아미노산 폴리펩티드를 포함하는 조성물을 리포좀을 통해 투여할 수 있다. 일반적으로, 이러한 투여 경로 및 적합한 제제는 당업자에게 공지되어 있다.
또한, 비천연 아미노산을 단독으로 또는 다른 적합한 성분과 함께 포함하는 hGH 폴리펩티드를 흡입을 통해 투여되는 에어로졸 제제 (즉, 이들은 "분무"될 수 있음)로 만들 수 있다. 에어로졸 제제를 가압된 허용되는 추진제, 예를 들면 디클로로디플루오로메탄, 프로판, 질소 등 안에 위치시킬 수 있다.
예를 들면, 관절내 (관절 안), 정맥내, 근육내, 진피내, 복막내 및 피하 경로에 의한 비경구 투여에 적합한 제제는 항산화제, 완충제, 정균제, 및 의도하는 수용물의 혈액과 등장성인 제제를 제공하는 용질을 함유할 수 있는 수성 및 비수성 등장성 멸균 주사 용액, 및 현탁제, 가용화제, 증점제, 안정화제 및 방부제를 포함할 수 있는 수성 및 비수성 멸균 현탁액을 포함한다. 팩키징된 핵산으로 된 제제는 단회 투여 또는 다회 투여 밀봉 용기, 예를 들면 앰플 및 바이알로 제공될 수 있다.
비경구 투여 및 정맥내 투여는 투여에 바람직한 방법이다. 특히, 현재 사용되는 제제와 함께 천연 아미노산 동족체 치료제 (EPO, GH, G-CSF, GM-CSF, IFNs, 인터루킨, 항체 및(또는) 임의의 다른 제약상 전달되는 단백질에 전형적으로 사용되는 것들을 포함하며 이에 한정되지 않음)에 이미 사용되는 투여 경로는 본 발명의 폴리펩티드에 대한 바람직한 투여 경로 및 제제를 제공한다.
본 발명의 내용 중에서, 환자에게 투여되는 투여량은 환자에서의 시간에 따른 유익한 치료적 반응 또는 병원체에 의한 감염 방지, 또는 적용 분야에 따른 다른 적합한 활성을 포함하며 이에 한정되지 않는 것을 갖기에 충분하다. 투여량은 특정 벡터 또는 제제의 효능, 및 사용되는 비천연 아미노산 폴리펩티드의 활성, 안정성 또는 혈청 반감기 및 치료되는 환자의 상태, 뿐만 아니라 환자의 체중 또는 표면적에 의해 결정된다. 또한, 투여량의 크기는 특정 환자에서 특정 벡터, 제제 등의 투여에 동반되는 임의의 유해한 부작용의 존재, 특성 및 정도에 의해 결정된다.
질환 (암, 유전 질환, 당뇨병, AIDS 등을 포함하며 이에 한정되지 않음)의 치료 또는 예방을 위해 투여되는 벡터 또는 제제의 유효량 결정시, 의사는 순환 혈장 수치, 제제 독성, 질환의 진행, 및(또는) 관련되는 경우, 항-비천연 아미노산 폴리펩티드 항체의 생산을 평가한다.
전형적으로, 예를 들면, 70 킬로그램 환자에게 투여되는 투여량은 관련 조성물의 변화된 활성 또는 혈청 반감기에 대해 조정된 현재 사용되는 치료용 단백질의 투여량과 등가의 범위에서 존재한다. 본 발명의 벡터는 항체 투여, 백신 투여, 세포독성제, 천연 아미노산 폴리펩티드, 핵산, 뉴클레오티드 유사체, 생물학적 반응 변형제 등의 투여를 비롯한 임의의 공지된 통상적인 요법에 의해 치료 조건을 보충할 수 있다.
투여시, 본 발명의 제제는 관련 제제의 LD-50 또는 ED-50 및(또는) 환자의 체중 및 환자의 전반적인 건강 상태를 포함하며 이에 한정되지 않는 것에 적용되는 바와 같이 다양한 농도에서의 비천연 아미노산의 임의의 부작용의 관찰에 의해 결정되는 속도로 투여된다. 투여는 단일 투여 또는 분할 투여를 통해 수행될 수 있다.
제제를 주입받은 환자가 고열, 오한 또는 근육통을 일으키는 경우, 적합한 투여량의 아스피린, 이부프로펜, 아세트아미노펜 또는 다른 통증/고열 조절 약물을 투여한다. 아스피린, 아세트아미노펜, 또는 디펜히드라민을 포함하며 이에 한정되지 않는 것들을 추가 주입하기 30 분 전에 주입에 대한 반응, 예를 들면 고열, 근육통 및 오한을 경험하는 환자에게 마취 전 투약한다. 해열제 및 항히스타민제에 빠르게 반응하지 않는 더욱 심한 오한 및 근육통에 대해서는 메페리딘 (meperidine)을 사용한다. 반응의 심도에 따라 세포 주입을 늦추거나 또는 중단한다.
본 발명의 인간 hGH 폴리펩티드는 포유류 피험자에 직접 투여될 수 있다. 투여는 정상적으로 hGH 폴리펩티드를 피험자에 도입시키는 데 사용되는 임의의 경로에 의해 이루어진다. 비록 임의의 주어진 경우에서의 가장 적합한 경로는 치료되는 상태의 특성 및 심도에 따라 좌우되지만, 본 발명의 실시양태에 따른 hGH 폴리펩티드 조성물은 경구, 직장, 국소, 흡입 (에어로졸을 통하는 것을 포함하며 이에 한정되지 않음), 볼 (설하를 포함하며 이에 한정되지 않음), 질, 비경구 (피하, 근육내, 진피내, 관절내, 흉막내, 복막내, 뇌내, 동맥내 또는 정맥내를 포함하며 이에 한정되지 않음), 국소 (즉, 피부 및 기도 표면을 비롯한 점막 표면 양쪽 모두) 및 경피 투여에 적합한 것들을 포함한다. 투여는 국소 또는 전신 투여일 수 있다. 화합물의 제제는 단회 투여 또는 다회 투여 밀봉 용기, 예를 들면 앰플 및 바이알로 제공될 수 있다. 본 발명의 hGH 폴리펩티드는 약학적으로 허용가능한 담체와 함께 단위 투여량 주사가능한 형태 (용액, 현탁액 또는 에멀션을 포함하며 이에 한정되지 않음)의 혼합물로 제조될 수 있다. 또한, 본 발명의 hGH 폴리펩티드는 연속 주입(미니펌프, 예를 들면 삼투압 펌프를 사용하는 것을 포함하며 이에 한정되지 않음), 단일 볼러스 (bolus) 또는 지연 방출 데포 제제에 의해 투여될 수 있다.
투여에 적합한 제제는 항산화제, 완충제, 정균제, 및 제제에 등장성을 제공하는 용질, 및 현탁제, 가용화제, 증점제, 안정화제 및 방부제를 포함할 수 있는 수성 및 비수성 멸균 현탁액을 함유할 수 있 수용액 및 비수용액, 등장성 멸균 용액을 포함한다. 용액 및 현탁액은 종래 기재된 종류의 멸균 분말, 과립 및 정제로부터 제조될 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 약학적으로 허용가능한 담체를 포함할 수 있다. 약학적으로 허용가능한 담체는 부분적으로 투여되는 특정 조성물, 뿐만 아니라 조성물을 투여하는 데 사용되는 특정 방법에 의해 결정된다. 따라서, 본 발명의 약학 조성물 (임의적인 약학적으로 허용가능한 담체, 부형제 또는 안정화제를 포함)로 된 매우 다양한 적합한 제제가 존재한다 (예를 들면, 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences, 17th ed. (1985)] 참조).
적합한 담체는 포스페이트, 보레이트, HEPES, 시트레이트 및 다른 유기산을 함유하는 완충제, 아스코르브산을 비롯한 항산화제, 저 분자량 (약 10 개의 잔기 미만) 폴리펩티드, 단백질, 예를 들면 혈청 알부민, 젤라틴, 또는 면역글로불린; 친수성 중합체, 예를 들면 폴리비닐피롤리돈; 아미노산, 예를 들면 글리신, 글루타민, 아스파라진, 아르기닌, 또는 리신; 모노사카라이드, 디사카라이드, 및 글루코오스, 만노오스 또는 덱스트린을 비롯한 다른 탄수화물; 킬레이트화제, 예를 들면 EDTA; 2가 금속 이온, 예를 들면 아연, 코발트, 또는 구리; 당 알코올, 예를 들면 만니톨 또는 소르비톨; 염 형성 반대 이온, 예를 들면 나트륨 및(또는) 비이온성 게면활성제 (surfactant), 예를 들면 트윈TM, 플루로닉스 (Pluronics)TM 또는 PEG를 포함한다.
또한, 수용성 중합체에 결합된 것들, 예를 들면 PEG를 포함하는 본 발명의 hGH 폴리펩티드는 서방형 시스템에 의해 또는 이의 일부로서 투여될 수 있다. 서방형 조성물은 필름 또는 마이크로캡슐 (microcapsule)을 포함하며 이에 한정되지 않는 성형품의 형태의 반투과성 중합체 메트릭스를 포함하며 이에 한정되지 않는 것을 포함한다. 서방형 메트릭스는 생체이용가능한 물질, 예를 들면 폴리(2-히드록시에틸 메타크릴레이트) (문헌[Langer et al., J. Bionaed. Mater. Res., 15: 167-277 (1981): Langer, Chem. Tech., 12: 98-105 (1982)] 참조), 에틸렌 비닐 아세테이트 (문헌[Langer et al., supra] 참조) 또는 폴리-D-(-)-3-히드록시부티르산 (EP 133,988), 폴리락티드 (폴릴아세트산) (미국 특허 제 3,773,919호; EP 58,481), 폴리글리콜리드 (글리콜산의 중합체), 폴리락티드 코-글리콜리드 (락트산 및 글리콜산의 공중합체) 폴리무수물 (polyanhydride), L-글루탐산 및 감마-에틸-L-글루타메이트의 공중합체 (문헌[U. Sidman et al., Biopolymers, 22, 547-556 (1983)] 참조), 폴리(오르토)에스테르, 폴리펩티드, 히알루론산, 콜라겐, 콘트로이친 술페이트, 카르복실산, 지방산, 인지질, 폴리사카라이드, 핵산, 폴리아미노산, 아미노산, 예를 들면 페닐알라닌, 티로신, 이소루신, 폴리뉴클레오티드, 폴리비닐 프로필렌, 폴리비닐피롤리돈 및 실리콘을 포함한다. 또한, 서방형 조성물은 리포좀으로 포획되는 화합물을 포함한다. 이 화합물을 함유하는 리포좀은 다음과 같이 그 자체로 공지된 방법에 의해 제조된다: DE 3,218,121; 문헌[Epstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 82: 3688-3692 (1985); Hwanget al., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 77: 4030-4034 (1980)]; EP 52,322: EP 36,676: EP 88,046: EP 143,949: EP 142,641: 일본 특허 출원 83-118008; 미국 특허 제 4,485,045호 및 제 4,544,545호; 및 EP 102,324. 인용된 모든 참고 문헌 및 특허는 본 명세서에 참고 문헌으로 인용된다.
리포좀으로 포획되는 hGH 폴리펩티드는 예를 들면, DE 3,218,121; 문헌[Epstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 82; 3688-3692 (1985); Hwang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 77: 4030-4034 (1980)]; EP 52,322: EP 36,676; EP 88,046; EP 143,949; EP 142,641; 일본 특허 출원 83-118008: 미국 특허 제 4,485,045호 및 제 4,544,545호; 및 EP 102,324에 기재된 방법에 의해 제조될 수 있다. 리포좀의 조성 및 크기는 공지되어 있거나 또는 당업자에 의해 용이하게 실험적으로 결정될 수 있다. 리포좀의 일부 예는 예를 들면, 문헌[Park JW, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 1327-1331 (1995); Lasic D and Papahadjopoulos D (eds): MEDICAL APPLICATIONS OF LIPOSOMES (1998); Drummond DC, et al., Liposomal drug delivery systems for cancer therapy, in Teicher B (ed): CANCER DRUG DISCOVERY AND DEVELOPMENT (2002); Park JW, et al., Clin. Cancer Res. 8: 1172-1181 (2002); Nielsen UB, et al., Biochim. Biophys. Acta 1591 (1-3): 109-118 (2002); Mamot C, et al., Cancer Res. 63: 3154-3161 (2003)]에 기재되어 있다. 인용된 모든 참고 문헌 및 특허는 본 명세서에 참고 문헌으로 인용된다.
본 발명의 내용 중에서, 환자에게 투여되는 투여량은 시간이 경과함에 따라 피험자에서 유익한 반응을 일으키기 충분해야 한다. 일반적으로, 투여량 당 비경구로 투여되는 본 발명의 hGH 폴리펩티드의 총 제약상 유효량은 비록 치료적 자유 재량에 따르지만, 환자 체중 1 kg 당 일일 약 0.0 ㎍ 내지 약 100 ㎍, 또는 약 0.05 mg 내지 약 1 mg 범위이다. 또한, 투여 빈도도 치료적 자유 재량에 따르며, 인간에 사용할 수 있는 것으로 승인된 상업적으로 입수가능한 hGH 폴리펩티드 생성물보다 더 빈번하거나 또는 덜 빈번할 수 있다. 일반적으로, 본 발명의 PEG화된 hGH 폴리펩티드는 상기한 투여 경로 중 임의의 것에 의해 투여될 수 있다.
XV. 본 발명의 hGH 폴리펩티드의 치료 용도
본 발명의 hGH 폴리펩티드는 광범위한 장애를 치료하는 데 유용하다.
본 발명의 hGH 아고니스트 폴리펩티드는 성장 결핍 치료, 면역 장애 치료, 및 심장 기능 자극에 유용할 수 있다. 성장 결핍을 갖는 개인은 예를 들면, 터너 증후군을 갖는 개인, GH-결핍 개인 (아동 포함), 그들의 성장판이 닫히기 약 2-3 년 전 그들의 정상 성장 곡선이 늦거나 또는 지연되는 것을 경험하는 아동 (때때로, "짧은 정상 아동 (short normal children)"으로도 공지됨), 및 GH에 대한 인슐린 유사 성장 인자-I (IGF-1) 반응이 화학적으로 (즉, 글루코코르티코이드 처리에 의해) 또는 천연 조건에 의해 차단된 개인, 예를 들면 GH에 대한 IGF-I 반응이 천연적으로 감소된 성인 환자를 포함한다.
아고니스트 hGH 변이체는, 증가가 항체 매개 또는 세포 매개에 의한 것이든, 면역계가 hGH 폴리펩티드로 처리된 숙주에 대해 내인성이거나 또는 공여체로부터 hGH 폴리펩티드에 제공된 숙주 수용물 (골수 이식물 중)로 이식되든, 그의 면역 기능을 증가시킴으로써 포유류의 면역계를 자극시키는 데 작용할 수 있다. "면역성 장애"는 약물 (예를 들면, 화학요법) 치료로 인해 면역성이 감소된 소 비장을 갖는 개인의 경우를 비롯하여, 개인의 면역계가 정상적인 경우보다 감소된 항체 또는 항원에 대한 세포 반응을 갖는 임의의 상태를 포함한다. 면역성 장애를 갖는 개인의 예는 예를 들면, 노인 환자, 화학요법 또는 방사선 요법을 받는 개인, 주요 질병으로부터 회복되거나 또는 수술을 받게 된 개인, AIDS를 앓는 개인, 선천성 및 후천성 B 세포 결핍, 예를 들면 고감마글로불린혈증, 공통 변화된 무감마글로불린혈증, 및 선택적 면역글로불린 결핍 (예를 들면, IgA 결핍)을 갖는 환자, 바이러스 감염된 환자, 예를 들면 환자의 면역 반응보다 짧은 인큐베이션 시간을 갖는 광견병, 및 유전 장애, 예를 들면 디조지 (diGeorge) 증후군를 갖는 개인을 포함한다.
본 발명의 hGH 길항제 폴리펩티드는 거인증 및 선단 비대증, 당뇨병 및 당뇨병으로부터 유발되는 합병증 (당뇨병성 망막병증, 당뇨병성 신경병증), 혈관 안구 질환 (예를 들면, 증식성 혈관신생 포함), 신증, 및 GH-반응성 암 (GH-responsive malignancy)의 치료에 유용할 수 있다.
혈관 안구 질환은 예를 들면, 망막병증 (예를 들면, 미숙 또는 낫모양 세포 빈혈증에 의해 유발됨) 및 근육 퇴행을 포함한다.
GH-반응성 암은 예를 들면, 윌름 종양 (Wilm's tumor), 육종 (예를 들면, 골원성 육종), 유방, 결장, 전립선, 및 갑상선 암, 및 GH 수용체 mRNA를 발현하는 조직의 암 (즉, 태반, 흉선, 뇌, 타액선, 전립선, 골수, 골격근, 기관, 척수, 망막, 림프절, 및 버키트 림프종 (Burkitt's lymphoma), 직장결장 암종, 폐 암종, 림프모구 백혈병 및 흑색종으로부터)을 포함한다.
hGH의 평균 양은 변할 수 있고, 특히, 자격을 갖춘 의사의 권장 및 처방에 기초해야 한다. hGH의 정확한 양은 치료되는 상태의 정확한 타입, 치료되는 환자의 상태, 뿐만 아니라 조성물 중 다른 성분과 같은 인자에 대한 선호 대상의 문제이다.
하기 실시예는 예시를 위해 제공되는 것이며, 이에 본 발명을 제한하려는 것이 아니다.
실시예 1
본 실시예는 비-천연적으로 코딩된 아미노산의 hGH로의 바람직한 도입 부위의 많은 가능한 선택 기준 집합 중 하나를 기재한다.
본 실시예는 hGH 폴리펩티드 내 바람직한 부위가 어떻게 비-천연적으로 코딩된 아미노산의 도입을 위해 선택되는지 나타낸다. 수용체 (hGHbp)의 2 개의 분자로 된 세포 외 도메인과 착화된 hGH로 구성된 결정 구조 3HHR을 사용하여 하나 이상의 비-천연적으로 코딩된 아미노산이 도입될 수 있는 바람직한 위치를 결정하였다. 다른 hGH 구조 (예를 들면, 1AXI)를 사용하여 결정 구조 데이터 집합 사이 1차 구조 요소 및 2차 구조 요소의 가능한 변이를 조사하였다. 이러한 구조들에 대한 좌표는 프로테인 데이터 뱅크 (PDB) (문헌[Berstein et al. J Mol. Biol. 1997, 112, pp 535] 참조)로부터 또는 월드 와이드 웹 상의 rcsb.org에서 입수가능한 더 리서치 콜라보라토리 포 스트락츄얼 바이오인포메틱스 (The Research Collaboratory for Structural Bioinformatics) PDB를 통해 입수가능하다. 구조적 모델 3HHR은 결정 중 장애로 인해 생략된 잔기 148-153 및 C-말단 F191 잔기를 제외하고 hGH로 된 전체 성숙 22 kD 서열을 함유한다. C53 및 C165 및 C182 및 C185에 의해 형성된 2 개의 디술피드 가교가 존재한다. 본 실시예에 사용된 서열 번호는 서열 번호 2에 나타낸 성숙 hGH (22 kDa 변이체)의 아미노산 서열을 따른 것이다.
다음의 기준을 사용하여 비-천연적으로 코딩된 아미노산의 도입을 위해 hGH 중의 각각의 위치를 평가하였다: 잔기는 (a) 3HHR, 1AXI 및 1HWG의 구조적 분석에 기초한 hGHbp (hGHbp 단량체 또는 이량체와 컨쥬게이션된 hGH의 결정학상 구조)의 결합을 방해해서는 안되고, (b) 알라닌 또는 동족체 스캐닝 돌연변이발생에 의해 영향을 받아서는 안되고 (문헌[Cunningham et al. Science (1989) 244: 1081-1085 and Cummingham et al. Science (1989) 243: 1330-1336] 참조), (c) 표면 노출되어야 하고, 주변 잔기와 최소 반 데르 발스 또는 수소 결합 상호작용을 나타내야 하고, (d) hGH 변이체 (예를 들면, Tyr35, Lys38, Phe92, Lys40) 중에서 결실되거나 또는 가변적이어야 하고, (e) 비-천연적으로 코딩된 아미노산으로 치환시 보존적 변화를 일으키고, (f) 높은 가요성 영역 (CD 루프를 포함하며 이에 한정되지 않음) 또는 구조적 강성 영역 (나선 B를 포함하며 이에 한정되지 않음)에서 발견될 수 있다. 또한, hGH 분자 상에서 추가 계산을 수행하며, Cx 프로그램 (문헌[Pintar et al. Bioifaformatics, 18, pp 980] 참조)을 사용하여 각각의 단백질 원자에 대한 돌출 정도를 평가하였다. 그 결과, 일부 실시양태에서, 하나 이상의 비-천연적으로 코딩된 아미노산은 hGH 중의 다음의 위치 중 하나 이상에서 도입되며 이에 한정되지 않는다: 위치 1 앞 (즉, N-말단에서), 1, 2, 3, 4, 5, 8, 9, 11, 12, 15, 16, 19, 22, 29, 30, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 52, 55, 57, 59, 65, 66, 69, 70, 71, 74, 88, 91, 92, 94, 95, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 111, 112, 113, 115, 116, 119, 120, 122, 123, 126, 127, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 158, 159, 161, 168, 172, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192 (즉, 단백질의 카르복실 말단에서) (서열 번호 2, 또는 서열 번호 1 또는 서열 번호 3에서의 대응하는 아미노산).
일부 실시양태에서, 하나 이상의 비-천연적으로 코딩된 아미노산은 다음의 위치 중 하나 이상에서 치환된다: 29, 30, 33, 34, 35, 37, 39, 40, 49, 57, 59, 66, 69, 70, 71, 74, 88, 91, 92, 94, 95, 98, 99, 101, 103, 107, 108, 111, 122, 126, 129, 130, 131, 133, 134, 135, 136, 137, 139, 140, 141, 142, 143, 145, 147, 154, 155, 156, 159, 183, 186 및 187 (서열 번호 2, 또는 서열 번호 1 또는 서열 번호 3의 대응하는 아미노산).
일부 실시양태에서, 하나 이상의 비-천연적으로 코딩된 아미노산은 다음의 위치 중 하나 이상에서 치환된다: 29, 33, 35, 37, 39, 49, 57, 69, 70, 71, 74, 88, 91, 92, 94, 95, 98, 99, 101, 103, 107, 108, 111, 129, 130, 131, 133, 134, 135, 136, 137, 139, 140, 141, 142, 143, 145, 147, 154, 155, 156, 186 및 187 (서열 번호 2, 또는 서열 번호 1 또는 서열 번호 3의 대응하는 아미노산).
일부 실시양태에서, 하나 이상의 비-천연적으로 코딩된 아미노산은 다음의 위치 중 하나 이상에서 치환된다: 35, 88, 91, 92, 94, 95, 99, 101, 103, 111, 131, 133, 134, 135, 136, 139, 140, 143, 145 및 155 (서열 번호 2, 또는 서열 번호 1 또는 서열 번호 3의 대응하는 아미노산).
일부 실시양태에서, 하나 이상의 비-천연적으로 코딩된 아미노산은 다음의 위치 중 하나 이상에서 치환된다: 30, 74, 103 (서열 번호 2, 또는 서열 번호 1 또는 서열 번호 3의 대응하는 아미노산). 일부 실시양태에서, 하나 이상의 비-천연적으로 코딩된 아미노산은 다음의 위치 중 하나 이상에서 치환된다: 35, 92, 143, 145 (서열 번호 2, 또는 서열 번호 1 또는 서열 번호 3의 대응하는 아미노산).
일부 실시양태에서, 비자연 발생 아미노산은 다음의 위치를 포함하며 이에 한정되지 않는 위치 중 하나 이상에서 수용성 중합체에 결합된다: 위치 1 앞 (즉, N-말단에서), 1, 2, 3, 4, 5, 8, 9, 11, 12, 15, 16, 19, 22, 29, 30, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 52, 55, 57, 59, 65, 66, 69, 70, 71, 74, 88, 91, 92, 94, 95, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 111, 112, 113, 115, 116, 119, 120, 122, 123, 126, 127, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 158, 159, 161, 168, 172, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192 (즉, 단백질의 카르복실 말단에서) (서열 번호 2, 또는 서열 번호 1 또는 서열 번호 3의 대응하는 아미노산). 일부 실시양태에서, 다음의 위치 중 하나 이상에서 비자연 발생 아미노산은 수용성 중합체에 결합된다: 30, 35, 74, 92, 103, 143, 145 (서열 번호 2, 또는 서열 번호 1 또는 서열 번호 3의 대응하는 아미노산). 일부 실시양태에서, 다음의 위치 중 하나 이상에서 비자연 발생 아미노산은 수용성 중합체에 결합된다: 35, 92, 143, 145 (서열 번호 2, 또는 서열 번호 1 또는 서열 번호 3의 대응하는 아미노산).
hGH 길항제를 생성하는 일부 부위는 다음을 포함한다: 1, 2, 3, 4, 5, 8, 9, 11, 12, 15, 16, 19, 22, 103, 109, 112, 113, 115, 116, 119, 120, 123, 127, 또는 위치 1 앞 부가 또는 그의 임의의 조합물 (서열 번호 2, 또는 서열 번호 1, 서열 번호 3 또는 임의의 다른 GH 서열에서의 대응하는 아미노산). 이러한 부위를 아고니스트 디자인의 기준 (c)-(e)를 사용하여 선택하였다. 또한, 길항제 디자인은 사이트 I 잔기의 부위-지향 변형을 포함하여 hGHbp에 대한 결합친화성을 증가시킬 수 있다.
실시예 2
본 실시예는 대장균에서 비-천연적으로 코딩된 아미노산을 포함하는 hGH 폴리펩티드의 클로닝 및 발현을 상술한다. 또한, 본 실시예는 변형된 hGH 폴리펩티드의 생물학적 활성을 평가하는 한 방법을 기재한다.
hGH 및 그의 단편을 클로닝하는 방법은 본 명세서에 참고 문헌으로 인용되는 미국 특허 제 4,601,980호, 제 4,604,359호, 제 4,634,677호, 제 4,658,021호, 제 4,898,830호, 제 5,424,199 및 5,795,745호에 상세히 설명되어 있다. 전장 hGH 또는 N-말단 신호 서열이 결여된 hGH의 성숙 형태를 코딩하는 cDNA는 서열 번호 21 및 서열 번호 22에 각각 도시되어 있다.
직교 tRNA (O-tRNA) 및 오르토고날 아미노아실 tRNA 합성효소 (0-RS)를 포함하는 도입된 번역 시스템을 사용하여 비-천연적으로 코딩된 아미노산을 함유하는 hGH를 발현시켰다. O-RS는 비-천연적으로 코딩된 아미노산을 사용하여 O-tRNA를 아미노아실화하였다. 이로써, 번역 시스템은 코딩된 셀렉터 코돈에 대응하여 비-천연적으로 코딩된 아미노산을 hGH에 삽입시켰다.
표 2: O-RS 및 0-tRNA 서열.
서열 번호 4 M. 잔나스키이 mtRNACUA Tyr tRNA
서열 번호 5 HLAD03; 최적화된 앰버 억제제 tRNA tRNA
서열 번호 6 HL325A; 최적화된 AGGA 프레임쉬프트 억제제 tRNA tRNA
서열 번호 7 p-아지도-L-페닐알라닌의 도입을 위한 아미노아실 tRNA 합성효소
p-Az-PheRS (6)		 RS
서열 번호 8 p-벤조일-L-페닐알라닌의 도입을 위한 아미노아실 tRNA 합성효소
p-BpaRS (1)		 RS
서열 번호 9 프로파르길-페닐알라닌의 도입을 위한 아미노아실 tRNA 합성효소
프로파르길-PheRS		 RS
서열 번호 10 프로파르길-페닐알라닌의 도입을 위한 아미노아실 tRNA 합성효소
프로파르길-PheRS 		RS
서열 번호 11 프로파르길-페닐알라닌의 도입을 위한 아미노아실 tRNA 합성효소
프로파르길-PheRS		 RS
서열 번호 12 p-아지도-페닐알라닌의 도입을 위한 아미노아실 tRNA 합성효소
p-Az-PheRS (1)		 RS
서열 번호 13 p-아지도-페닐알라닌의 도입을 위한 아미노아실 tRNA 합성효소
p-Az-PheRS (3)		 RS
서열 번호 14 p-아지도-페닐알라닌의 도입을 위한 아미노아실 tRNA
합성효소
p-Az-PheRS (4)		 RS
서열 번호 15 p-아지도-페닐알라닌의 도입을 위한 아미노아실 tRNA 합성효소
p-Az-PheRS (2)		 RS
서열 번호 16 p-아세틸-페닐알라닌의 도입을 위한 아미노아실 tRNA 합성효소 (LW1) RS
서열 번호 17 p-아세틸-페닐알라닌의 도입을 위한 아미노아실 tRNA 합성효소 (LW5) RS
서열 번호 18 p-아세틸-페닐알라닌의 도입을 위한 아미노아실 tRNA 합성효소 (LW6) RS
서열 번호 19 p-아지도-페닐알라닌의 도입을 위한 아미노아실 tRNA 합성효소 (AzPheRS-5) RS
서열 번호 20 p-아지도-페닐알라닌의 도입을 위한 아미노아실 tRNA 합성효소 (AzPheRS-6) RS
변형된 hGH 유전자 및 오르토고날 아미노아실 tRNA 합성효소/tRNA 쌍 (원하는 비-천연적으로 코딩된 아미노산에 특이적임)을 함유하는 플라스미드를 사용한 대장균의 형질전환은 비-천연적으로 코딩된 아미노산의 hGH 폴리펩티드로의 부위-특이적 도입을 가능케 하였다. 37 ℃에서 0.01-100 mM의 특정 비-천연적으로 코딩된 아미노산을 함유하는 배지 중에서 성장한 형질전환된 대장균은 높은 적합도 및 효율로 변형된 hGH를 발현시켰다. His-태그화된 (tagged) 비-천연적으로 코딩된 아미노산을 함유하는 hGH를 대장균 숙주 세포에 의해 내포체 또는 응집물로서 생산하였다. 응집물을 가용화시키고, 변성 조건 하에서 6 M 구아니딘 HCl 중에서 친화성 정제하였다. 4 ℃에서 밤새 50 mM TRIS-HCl, pH 8.0, 40 μM CuSO4 및 2 % (w/v) 사르코실 중에서 투석에 의해 리폴딩을 수행하였다. 그 다음, 이 물질을 20 mM TRIS-HCl, pH 8.0, 100 mM NaCl, 2 mM CaCl2에 대해 투석한 후, His-태그를 제거하였다. 문헌[Boissel et al., (1993) 268: 15983-93]을 참조할 수 있다. hGH의 정제 방법은 당분야에 공지되어 있고, SDS-PAGE, 웨스턴 블롯 분석, 또는 전자분무-이온화 이온 트랩 (ion trap) 질량 분석법 등에 의해 확인된다.
도 6은 정제된 hGH 폴리펩티드의 SDS-PAGE이다. 제조자에 의해 제공된 표준 His-태그화된 단백질 정제 절차를 통해 프로본드 니켈-킬레이팅 레진 (ProBond Nickel-Chelating Resin) (인비트로겐, 캘리포니아주 칼스버드 소재)을 사용하여 His-태그화된 돌연변이체 hGH 단백질을 정제한 후, 겔에 로딩하기 전에 음이온 교환 컬럼을 사용하여 정제하였다. 레인 (Lane) 1은 분자량 마커를 나타내고, 레인 2는 비천연 아미노산이 도입되지 않은 N-His hGH를 제공한다. 레인 3-10은 각각의 위치 Y35, F92, Y111, G131, R134, K140, Y143 및 K145 각각에서 비천연 아미노산 p-아세틸-페닐알라닌을 포함하는 N-His hGH 돌연변이체를 함유한다.
변형된 hGH 폴리펩티드의 생물학적 활성을 추가로 평가하기 위해, hGH의 하류 마커와 hGH의 수용체의 상호작용을 측정하는 분석시험을 사용하였다. hGH와 그의 내인적으로 생산된 수용체의 상호작용은 인간 IM-9 림프구 세포주에서 전사 패밀리 구성원, STAT5의 신호 변환제 (transducer) 및 활성제를 티로신 인산화시켰다. STAT5, STAT5A 및 STAT5B 중 2 개의 형태를 IM-9 cDNA 라이브러리로부터 동정하였다. 예를 들면, 문헌[Silva et al., Mol. Endocrinol. (1996) 10 (5): 508-518]을 참조할 수 있다. 쥐 성장 호르몬 및 인간 프로락틴 어느 것도 검출가능한 STAT5 인산화를 일으키지 않으므로, IM-9 세포 상의 인간 성장 호르몬 수용체는 인간 성장 호르몬에 대해 선택적이다. 중요하게는, 쥐 GHR (L43R) 세포 외 도메인 및 hGH를 갖는 G120R은 hGH 자극된 pSTAT5 인산화에 대해 유효하게 경쟁한다.
본 발명의 hGH 폴리펩티드를 사용하여 IM-9 세포를 자극하였다. 인간 IM-9 림프구를 ATCC (버지니아주 만나사스 소재)로부터 구입하고, 피루브산나트륨, 페니실린, 스트렙토마이신 (인비트로겐, 샌디에고 칼스버드 소재) 및 10 % 열 비활성화된 우태 혈청 (클론 (clone), 유타주 로간 소재)으로 보충되는 RPMI 1640에서 성장시켰다. 10 분 동안 37 ℃에서 12-점 투여범위의 hGH 폴리펩티드로 자극시키기 전, IM-9 세포를 분석시험 배지 (페놀-레드 (phenol-red) 비함유 RPMI, 10 mM Hepes, 1 % 열 비활성화된 골탄/덱스트란 처리된 FBS, 피루브산나트륨, 페니실린 및 스트렙토마이신)에서 밤새 금식시켰다. 1 시간 동안 얼음 상에서 90 % 얼음 냉각된 메탄올로 퍼미어빌라이제이션 (permeabilization)시키기 전에, 자극된 세포를 1 % 포름알데히드로 고정시켰다. STAT5 인산화 수준을 실온에서 30 분 동안 세포 내 염색에 의해 1차 포스포-STAT5 항체 (셀 시그날링 테크놀로지 (Cell Signaling Technology), 메사추세츠주 비버리 소재)를 사용하여 검출한 후, PE-컨쥬게이션된 2차 항체를 검출하였다. 샘플 획득을 FACS 어레이 (Array) 상에서 수행하며, 획득된 데이터를 플로우조 (Flowjo) 소프트웨어 (트리 트사 인크. (Tree Star Inc.), 오레곤주 에쉬랜드 소재) 상에서 분석하였다. EC50 값을 시그마플롯 (SigmaPlot)을 사용하여 단백질 농도에 대해 평균 형광 강도 (MFI)를 플로팅한 투여량 반응 곡선으로부터 유도하였다.
하기 표 3은 돌연변이체 hGH 폴리펩티드를 사용하여 생성된 IM-9 데이터를 요약한다. 상이한 위치에서 비천연 아미노산 치환을 갖는 다양한 hGH 폴리펩티드 를 상기한 바와 같은 인간 IM-9 세포를 사용하여 시험하였다. 구체적으로, 도 7의 패널 A는 His-태그화된 hGH 폴리펩티드에 대한 IM-9 데이터를 나타내고, 도 7의 패널 B는 Y143에 대한 비천연 아미노산 p-아세틸-페닐알라닌 치환을 포함하는 His-태그화된 hGH에 대한 IM-9 데이터를 나타낸다. 동일한 분석시험을 사용하여 PEG화된 비천연 아미노산을 포함하는 hGH 폴리펩티드의 생물학적 활성을 평가하였다.
Figure 112006059749857-pct00018
실시예 3
본 실시예는 카르보닐 함유 아미노산의 도입 및 아미노옥시 함유 PEG를 사용한 후속 반응을 상술한다.
본 실시예는 대략 5,000 MW의 아미노옥시 함유 PEG와 후속 반응하는 케톤 함유 비-천연적으로 코딩된 아미노산을 도입한 hGH 폴리펩티드의 생성 방법을 나타낸다. 실시예 1 (hGH)의 기준에 따라 동정된 각각의 잔기 35, 88, 91, 92, 94, 95, 99, 101, 103, 111, 120, 131, 133, 134, 135, 136, 139, 140, 143, 145 및 155를, 다음의 구조를 갖는 비-천연적으로 코딩된 아미노산으로 개별적으로 치환한다.
Figure 112006059749857-pct00019
p-아세틸-페닐알라닌을 hGH에 부위-특이적으로 도입시키는 데 사용되는 서열은 서열 번호 2 (hGH) 및 서열 번호 4 (muttRNA, M. 잔나스키이 mtRNACUA Tyr), 및 상기 실시예 2에 기재된 16, 17 또는 18 (TyrRSLW1, 5 또는 6)이다.
카르보닐 함유 아미노산을 포함하는 hGH 폴리펩티드 변이체를 변형시킨 후, 다음의 형태로 된 아미노옥시 함유 PEG 유도체와 반응시켰다:
R-PEG(N)-0-(CH2)n-0-NH2
상기 식 중,
R은 메틸이고, n은 3이고, N은 대략 5,000 MW이다. 25 mM MES (시그마 케미칼, 미소우리주 세인트 루이스 소재) (pH 6.0), 25 mM Hepes (시그마 케미칼, 미소우리주 세인트 루이스 소재) (pH 7.0), 또는 10 mM 아세트산나트륨 (시그마 케미칼, 미소우리주 세인트 루이스 소재) (pH 4.5)에서 10 mg/mL로 용해된 p-아세틸페닐알라닌을 함유하는 정제된 hGH를 10 내지 100 배 과량의 아미노옥시 함유 PEG와 반응시킨 다음, 10-16 시간 동안 실온에서 교반하였다 (문헌[Jencks, W. J Am. Chem. Soc. 1959, 81, pp 475] 참조). 그 다음, 즉시 정제 및 분석하기 위해 PEG-hGH를 적합한 완충제로 희석시켰다.
실시예 4
아미드 결합을 통해 PEG에 결합된 히드록실아민 기로 이루어진 PEG를 사용한 컨쥬게이션.
실시예 3에 기재된 절차를 사용하여 다음의 구조를 갖는 PEG 시약을 케톤 함유 비-천연적으로 코딩된 아미노산에 커플링시켰다:
R-PEG(N)-O-(CH2)2-NH-C(O)(CH2)n-0-NH2
상기 식 중,
R = 메틸이고, n = 4이고, N은 대략 20,000 MW이다. 반응, 정제, 및 분석 조건은 실시예 3에 기재한 바와 같다.
실시예 5
본 실시예는 2 개의 별개의 비-천연적으로 코딩된 아미노산을 hGH 폴리펩티드에 도입시키는 것을 상술한다.
본 실시예는 하기 잔기 중 2 개의 위치에서 케톤 작용가를 포함하는 비-천연적으로 코딩된 아미노산을 도입한 hGH 폴리펩티드의 생성 방법을 나타낸다: E30, E74, Y103, K38, K41, K140 및 K145. hGH 폴리펩티드를 억제제 코돈을 핵산 내 2 개의 별개의 부위에 도입시키는 것을 제외하고 실시예 1 및 2에 기재된 바와 같이 제조하였다.
실시예 6
본 실시예는 hGH 폴리펩티드의 히드라지드 함유 PEG에 대한 컨쥬게이션 및 동일 반응계에서의 후속 환원을 상술한다.
카르보닐 함유 아미노산을 도입한 hGH 폴리펩티드를 실시예 2 및 실시예 3에 기재된 절차에 따라 제조하였다. 다음의 구조를 갖는 히드라지드 함유 PEG를 변형시킨 후, hGH 폴리펩티드에 컨쥬게이션시켰다:
R-PEG(N)-O-(CH2)2-NH-C(O)(CH2)n-X-NH-NH2
상기 식 중,
R = 메틸이고, n = 2이고, N = 10,000 MW이고, X는 카르보닐 (C=O) 기이다. p-아세틸페닐알라닌을 함유하는 정제된 hGH를 0.1-10 mg/mL의 25 mM MES (시그마 케미칼, 미소우리주 세인트 루이스 소재) (pH 6.0), 25 mM Hepes (시그마 케미칼, 미소우리주 세인트 루이스 소재) (pH 7.0), 또는 10 mM 아세트산나트륨 (시그마 케미칼, 미소우리주 세인트 루이스 소재) (pH 4.5) 중에 용해시키고, 1 내지 100 배 과량의 히드라지드 함유 PEG와 반응시키고, 최종 농도 10-50 mM이 되도록 H2O 중에 용해된 저장 1 M NaCNBH3 (시그마 케미칼, 미소우리주 세인트 루이스 소재)를 첨가함으로써 동일 반응계에서 대응하는 히드라존을 환원시켰다. 반응을 암실에서 4 ℃ 내지 RT에서 18-24 시간 동안 수행하였다. 반응을 약 pH 7.6에서 최종 Tris 농도가 50 mM이 되도록 1 M Tris (시그마 케미칼, 미소우리주 세인트 루이스 소재)를 첨가함으로써 반응을 정지시키거나 또는 즉시 정제하기 위해 적합한 완충제로 희석시켰다.
실시예 7
본 실시예는 알킨 함유 아미노산의 hGH 폴리펩티드로의 도입 및 mPEG-아지드를 사용한 유도체화를 상술한다.
다음의 잔기, 35, 88, 91, 92, 94, 95, 99, 101, 131, 133, 134, 135, 136, 140, 143, 145 및 155를 각각 다음의 비-천연적으로 코딩된 아미노산 (hGH; 서열 번호 2)으로 치환시킨다.
Figure 112006059749857-pct00020
p-프로파르길-티로신을 hGH에 부위-특이적으로 도입시키기 위한 서열은 서열 번호 2 (hGH), 서열 번호 4 (muttRNA, M. 잔나스키이 mtRNACUA Tyr), 및 상기 실시예 2에 기재된 9, 10 또는 11이다. 프로파르길 티로신을 함유하는 hGH 폴리펩티드를 대장균에서 발현시키고, 실시예 3에 기재된 조건을 사용하여 정제하였다.
PB 완충제 (100 mM 소듐 포스페이트, 0.15 M NaCl, pH = 8) 및 10 내지 1000 배 과량의 아지드 함유 PEG 중에서 0.1-10 mg/mL로 용해시킨 프로파르길-티로신을 함유하는 정제된 hGH를 반응 혼합물에 첨가하였다. 그 다음, 촉매량의 CuSO4 및 Cu선을 반응 혼합물에 첨가하였다. 혼합물을 인큐베이션 (약 4 시간 실온에서 또는 37 ℃, 또는 밤새 4 ℃를 포함하며 이에 한정되지 않음)한 후, H2O를 첨가하고, 혼합물을 투석 막을 통해 여과하였다. 실시예 3에 기재된 것과 유사한 절차를 포함하며 이에 한정되지 않는 것에 의해 샘플을 첨가에 대해 분석할 수 있다.
본 실시예에서, PEG는 다음의 구조를 갖는다.
R-PEG(N)-O-(CH2)2-NH-C(O)(CH2)n-N3
상기 식 중,
R은 메틸이고, n은 4이고, N은 10,000 MW이다.
실시예 8
본 실시예는 hGH 폴리펩티드 중 대형 소수성 아미노산을 프로파르길 티로신으로 치환하는 것을 상술한다.
다음의 한 hGH 영역; 1-5 (N-말단), 6-33 (A 나선), 34-74 (A 나선과 B 나선 사이의 영역, A-B 루프), 75-96 (B 나선), 97-105 (B 나선과 C 나선 사이의 영역, B-C 루프), 106-129 (C 나선), 130-153 (C 나선과 D 나선 사이의 영역, C-D 루프), 154-183 (D 나선), 184-191 (C-말단) (서열 번호 2) 내에 존재하는 Phe, Trp 또는 Tyr 잔기를 실시예 7에 기재된 바와 같이 하기 비-천연적으로 코딩된 아미노산으로 치환시켰다:
Figure 112006059749857-pct00021
.
PEG를 변형시킨 후, 알킨 함유 아미노산을 포함하는 hGH 폴리펩티드 변이체에 부착시켰다. PEG는 다음의 구조를 갖고, 커플링 절차는 실시예 7에서의 절차를 따른다:
Me-PEG(N)-O-(CH2)2-N3 .
이는 자연 발생 대형 소수성 아미노산 중 하나와 대략 등전자이고, 폴리펩티드 내 별개의 부위에서 PEG 유도체를 사용하여 변형되는 비-천연적으로 코딩된 아미노산을 포함하는 hGH 폴리펩티드 변이체를 생성하게 된다.
실시예 9
본 실시예는 하나 이상의 PEG 링커에 의해 분리된 hGH 폴리펩티드 호모이량체, 헤테로이량체, 호모다량체 또는 헤테로다량체를 생성하는 것을 상술한다.
실시예 7에서 생산된 알킨 함유 hGH 폴리펩티드 변이체를 하기 형태의 이작용 PEG 유도체와 반응시켜 두 개의 hGH 분자가 PEG에 의해 물리적으로 분리된 대응하는 hGH 폴리펩티드 호모이량체를 생성하였다. 유사한 방식으로, hGH 폴리펩티드를 하나 이상의 다른 폴리펩티드에 커플링시켜 헤테로이량체, 호모다량체 또는 헤테로다량체를 형성시킬 수 있다. 커플링, 정제 및 분석을 실시예 7 및 실시예 3에서와 같이 수행하였다:
N3-(CH2)n-C(O)-NH-(CH2)2-O-PEG(N)-O-(CH2)2-NH-C(O)-(CH2)n-N3
상기 식 중,
n은 4이고, PEG는 대략 5,000의 평균 MW를 갖는다.
실시예 10
본 실시예는 사카라이드 부분을 hGH 폴리펩티드에 커플링시키는 것을 상술한다.
다음 중 한 잔기를 실시예 3에 기재한 바와 같이 하기 비천연 코딩된 아미노산으로 치환시킨다: 29, 30, 33, 34, 35, 37, 39, 40, 49, 57, 59, 66, 69, 70, 71, 74, 88, 91, 92, 94, 95, 98, 99, 101, 103, 107, 108, 111, 122, 126, 129, 130, 131, 133, 134, 135, 136, 137, 139, 140, 141, 142, 143, 145, 147, 154, 155, 156, 159, 183, 186 및 187 (hGH, 서열 번호 2).
Figure 112006059749857-pct00022
카르보닐 함유 아미노산을 포함하는 hGH 폴리펩티드 변이체를 변형시킨 후, N-아세틸글루코사민 (GlcNAc)의 β-결합 아미노옥시 유사체와 반응시켰다. hGH 폴리펩티드 변이체 (10 mg/mL) 및 아미노옥시 사카라이드 (21 mM)를 수성 100 mM 아세트산나트륨 완충제 (pH 5.5) 중에서 혼합시키고, 37 ℃에서 7 내지 26 시간 동안 인큐베이션하였다. 150 mM HEPES 완충제 (pH 7.4) 중에서 사카라이드-컨쥬게이션된 hGH 폴리펩티드 (5 mg/mL)를 UDP-갈락토오스 (16 mM) 및 β-1,4-갈락토실트란스퍼라아제 (0.4 단위/mL)와 48 시간 동안 주위 온도에서 인큐베이션함으로써 제2 사카라이드를 먼저 효소적으로 커플링하였다 (문헌[Schanbacher et al. J. Biol. Chem. 1970,245, 5057-5061] 참조).
실시예 11
본 실시예는 PEG화된 hGH 폴리펩티드 길항제의 생성을 상술한다.
다음의 잔기 중 하나: 1, 2, 3, 4, 5, 8, 9, 11, 12, 15, 16, 19, 22, 103, 109, 112, 113, 115, 116, 119, 120, 123, 또는 127 (hGH, 서열 번호 2 또는 서열 번호 1 또는 서열 번호 3에서의 대응하는 아미노산)을 실시예 3에 기재한 바와 같이 하기 비-천연적으로 코딩된 아미노산으로 치환시킨다.
Figure 112006059749857-pct00023
카르보닐 함유 아미노산을 포함하는 hGH 폴리펩티드 변이체를 변형시킨 후, 하기 형태로 된 아미노옥시 함유 PEG 유도체와 반응시켜 폴리펩티드 내 단일 부위에서 PEG 유도체를 사용하여 변형되는 비-천연적으로 코딩된 아미노산을 포함하는 hGH 폴리펩티드 길항제를 생성시켰다. 커플링, 정제 및 분석을 실시예 3에서와 같이 수행하였다:
R-PEG(N)-0-(CH2)n-0-NH2
상기 식 중,
R은 메틸이고, n은 4이고, N은 20,000 MW이다.
실시예 12
hGH 분자가 직접 결합된 hGH 폴리펩티드 호모이량체, 헤테로이량체, 호모다량체 또는 헤테로다량체의 생성
알킨 함유 아미노산을 포함하는 hGH 폴리펩티드 변이체를, 각각이 실시예 10에 기재되어 있으며 이에 한정되지 않는 부위에서 비-천연적으로 코딩된 아미노산 치환을 포함하는 것인 아지도 함유 아미노산을 포함하는 또 다른 hGH 폴리펩티드 변이체에 직접 커플링시킬 수 있다. 이는 두 개의 hGH 폴리펩티드 변이체가 사이트 II 결합 계면에서 물리적으로 결합된 대응하는 hGH 폴리펩티드 호모이량체를 생성하게 된다. 유사한 방식으로, hGH 폴리펩티드 폴리펩티드를 하나 이상의 다른 폴리펩티드에 커플링시켜 헤테로이량체, 호모다량체 또는 헤테로다량체를 형성시킬 수 있다. 커플링, 정제, 및 분석을 실시예 3, 6 및 7에서와 같이 수행한다.
실시예 13
Figure 112006059749857-pct00024
폴리알킬렌 글리콜 (P-OH)은 알킬 할리드 (A)와 반응하여 에테르 (B)를 형성한다. 이러한 화합물에서, n은 1 내지 9의 정수이고, R'는 직쇄형-사슬 또는 분지형-사슬, 포화된 또는 불포화된 C1 내지 C20 알킬 또는 헤테로알킬 기일 수 있다. 또한, R'는 C3 내지 C7 포화된 또는 불포화된 시클릭 알킬 또는 시클릭 헤테로알킬, 치환되거나 또는 비치환된 아릴 또는 헤테로아릴 기 또는 치환되거나 또는 비치환된 알크아릴 (알킬은 C1 내지 C20 포화된 또는 불포화된 알킬임) 또는 헤테로알크아릴 기일 수 있다. 전형적으로, PEG-OH는 800 내지 40,000 달톤 (Da)의 분자량을 갖는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 또는 모노메톡시 폴리에틸렌 글리콜 (mPEG)이다.
실시예 14
mPEG-OH + Br-CH2-C≡CH → mPEG-O-CH2-C≡CH
20,000 Da의 분자량을 갖는 mPEG-OH (mPEG-OH 20 kDa; 2.0 g, 0.1 mmol, 썬바이오 (Sunbio))를 THF (35 mL) 중에서 NaH (12 mg, 0.5 mmol)로 처리하였다. 그 다음, 크실렌 중의 80 중량% 용액 (0.56 mL, 5 mmol, 50 당량, 알드리치)으로서 용해된 프로파르길 브로미드, 및 촉매량의 KI의 용액을 상기 용액에 첨가하고, 생성되는 혼합물을 2 시간 동안 환류하도록 가열하였다. 그 다음, 물 (1 mL)을 첨가하고, 용매를 진공 하에서 제거하였다. 잔여물에 CH2Cl2 (25 mL)를 첨가하고, 유기층을 분리시키고, 무수 Na2SO4 상에서 건조시키고, 부피를 대략 2 mL로 감소시켰다. 이 CH2Cl2 용액을 디에틸 에테르 (150 mL)에 적가하였다. 생성되는 침전물을 수집하고, 몇 부의 냉각된 디에틸 에테르로 세척하고, 건조시켜 프로파르길-O-PEG를 얻었다.
실시예 15
mPEG-OH + Br-(CH2)3-C≡CH → mPEG-O-(CH2)3-C≡CH
20,000 Da의 분자량을 갖는 mPEG-OH (mPEG-OH 20 kDa; 2.0 g, 0.1 mmol, 썬바이오)를 THF (35 mL) 중에서 NaH (12 mg, 0.5 mmol)로 처리하였다. 그 다음, 50 당량의 5-브로모-1-펜틴 (0.53 mL, 5 mmol, 알드리치) 및 촉매량의 KI를 혼합물에 첨가하였다. 생성되는 혼합물을 16 시간 동안 환류하도록 가열시켰다. 그 다음, 물 (1 mL)을 첨가하고, 용매를 진공 하에서 제거하였다. 잔여물에 CH2Cl2 (25 mL)를 첨가하고, 유기층을 분리시키고, 무수 Na2SO4 상에서 건조시키고, 부피를 대략 2 mL로 감소시켰다. 이 CH2Cl2 용액을 디에틸 에테르 (150 mL)에 적가하였다. 생성되는 침전물을 수집하고, 몇 부의 냉각된 디에틸 에테르로 세척하고, 건조시켜 대응하는 알킨을 얻었다. 5-클로로-1-펜틴을 유사한 반응에 사용할 수 있다.
실시예 16
Figure 112006059749857-pct00025
THF (50 mL) 및 물 (2.5 mL) 중의 3-히드록시벤질알코올 (2.4 g, 20 mmol)의 용액에 먼저 분말 수산화나트륨 (1.5 g, 37.5 mmol)을 첨가한 다음, 크실렌 (3.36 mL, 30 mmol) 중의 80 중량% 용액으로서 용해시킨 프로파르길 브로미드의 용액을 첨가하였다. 반응 혼합물을 6 시간 동안 환류하도록 가열시켰다. 혼합물에 10 % 시트르산 (2.5 mL)을 첨가하고, 용매를 진공 하에서 제거하였다. 잔여물을 에틸 아세테이트 (3 × 15 mL)로 추출하고, 합쳐진 유기층을 포화된 NaCl 용액 (10 mL)으로 세척하고, MgSO4 상에서 건조시키고, 농축시켜 3-프로파르길옥시벤질 알코올을 얻었다.
메탄술포닐 클로리드 (2.5 g, 15.7 mmol) 및 트리에틸아민 (2.8 mL, 20 mmol)을 0 ℃에서 CH2Cl2 중의 화합물 3 (2.0 g, 11.0 mmol)의 용액에 첨가하고, 반응물을 냉장고에 16 시간 동안 위치시켰다. 통상의 워크업으로 메실레이트를 연한 황색 오일로 제공하였다. 이 오일 (2.4 g, 9.2 mmol)을 THF (20 mL) 중에 용해시키고, LiBr (2.0 g, 23.0 mmol)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 1 시간 동안 환류하도록 가열시킨 다음, 실온으로 냉각시켰다. 혼합물에 물 (2.5 mL)을 첨가하고, 용매를 진공 하에서 제거하였다. 잔여물을 에틸 아세테이트 (3 × 15 mL)로 추출하고, 합쳐진 유기층을 포화된 NaCl 용액 (10 mL)으로 세척하고, 무수 Na2SO4 상에서 건조시키고, 농축시켜 원하는 브로미드를 제공하였다.
mPEG-OH 20 kDa (1.0 g, 0.05 mmol, 썬바이오)을 THF (20 mL) 중에 용해시키고, 이 용액을 얼음조 중에서 냉각시켰다. NaH (6 mg, 0.25 mmol)를 격렬하게 교반하면서 몇 분에 걸쳐 첨가한 후, 상기로부터 얻어진 브로미드 (2.55 g, 11.4 mmol) 및 촉매량의 KI를 첨가하였다. 냉각조를 제거하고, 생성되는 혼합물을 12 시간 동안 환류하도록 가열시켰다. 물 (1.0 mL)을 혼합물에 첨가하고, 용매를 진공 하에서 제거하였다. 잔여물에 CH2Cl2 (25 mL)를 첨가하고, 유기층을 분리시키고, 무수 Na2SO4 상에서 건조시키고, 부피를 대략 2 mL로 감소시켰다. 에테르 용액 (150 mL)을 적가하여 백색 침전물을 얻었고, 이를 수집하여 PEG 유도체를 얻었다.
실시예 17
mPEG-NH2 + X-C(O)-(CH2)n-C≡CR' → mPEG-NH-C(O)-(CH2)n-C≡CR'
또한, 앞서 나타낸 바와 같이 말단 작용기를 함유하는 폴리(에틸렌 글리콜) 중합체를 알킨 작용가를 함유하는 반응성 분자에 커플링시킴으로써 말단 알킨 함유 폴리(에틸렌 글리콜) 중합체를 얻을 수 있다. 상기 식 중, n은 1 내지 10이다. 상기 식 중, R'는 H 또는 C1 내지 C4의 작은 알킬 기일 수 있다.
실시예 18
Figure 112006059749857-pct00026
4-펜틴 (2.943 g, 3.0 mmol)을 CH2Cl2 (25 mL) 중에 용해시켰다. N-히드록시숙신이미드 (3.80 g, 3.3 mmol) 및 DCC (4.66 g, 3.0 mmol)를 첨가하고, 이 용액을 밤새 실온에서 교반하였다. 생성되는 조 NHS 에스테르 7을 추가 정제없이 하기 반응에 사용하였다.
5,000 Da의 분자량을 갖는 mPEG-NH2 (mPEG-NH2, 1 g, 썬바이오)를 THF (50 mL) 중에 용해시키고, 혼합물을 4 ℃로 냉각시켰다. NHS 에스테르 7 (400 mg, 0.4 mmol)을 격렬하게 교반하면서 조금씩 첨가하였다. 혼합물을 3 시간 동안 실온으로 가온시키면서 교반하였다. 그 다음, 물 (2 mL)을 첨가하고, 용매를 진공 하에서 제거하였다. 잔여물에 CH2Cl2 (50 mL)를 첨가하고, 유기층을 분리시키고, 무수 Na2SO4 상에서 건조시키고, 부피를 대략 2 mL로 감소시켰다. 이 CH2Cl2 용액을 에테르 (150 mL)에 적가하였다. 생성되는 침전물을 수집하고, 진공에서 건조시켰다.
실시예 19
본 실시예는 또한, 폴리(에틸렌 글리콜)의 메탄술포네이트 또는 메실레이트로도 지칭될 수 있는 폴리(에틸렌 글리콜)의 메탄 술포닐 에스테르의 제조를 나타낸다. 대응하는 토실레이트 및 할리드는 유사한 절차에 의해 제조될 수 있다.
Figure 112006059749857-pct00027
150 mL의 톨루엔 중의 mPEG-OH (MW = 3,400, 25 g, 10 mmol)를 2 시간 동안 질소 하에서 공비 증류시키고, 이 용액을 실온으로 냉각시켰다. 40 mL의 건조 CH2Cl2 및 2.1 mL의 건조 트리에틸아민 (15 mmol)을 용액에 첨가하였다. 이 용액을 얼음조 중에서 냉각시키고, 1.2 mL의 증류된 메탄술포닐 클로리드 (15 mmol)를 적가하였다. 이 용액을 실온에서 질소 하에서 밤새 교반하고, 2 mL의 무수 에탄올을 첨가함으로써 반응물을 켄칭시켰다. 혼합물을 진공 하에서 증발시켜 주로 톨루엔 이외의 용매를 제거하고, 여과시키고, 진공 하에서 또 다시 농축시킨 다음, 100 mL의 디에틸 에테르로 침전시켰다. 여액을 몇 부의 냉각된 디에틸 에테르로 세척하고, 진공에서 건조시켜 메실레이트를 얻었다.
메실레이트 (20 g, 8 mmol)를 75 mL의 THF 중에 용해시키고, 용액을 4 ℃로 냉각시켰다. 냉각된 용액에 소듐 아지드 (1.56 g, 24 mmol)를 첨가하였다. 반응물을 질소 하에서 2 시간 동안 환류하도록 가열시켰다. 그 다음, 용매를 증발시키고, 잔여물을 CH2Cl2 (50 mL)로 희석시켰다. 유기 분획물을 NaCl 용액으로 세척하고, 무수 MgSO4 상에서 건조시켰다. 부피를 20 ml로 감소시키고, 150 mL의 냉각 건조 에테르를 첨가함으로써 생성물을 침전시켰다.
실시예 20
Figure 112006059749857-pct00028
4-아지도벤질 알코올은 본 명세서에 참고 문헌으로 인용되는 미국 특허 제 5,998,595호에 기재된 방법을 사용하여 생산될 수 있다. 메탄술포닐 클로리드 (2.5 g, 15.7 mmol) 및 트리에틸아민 (2.8 mL, 20 mmol)을 0 ℃에서 CH2Cl2 중의 4-아지도벤질 알코올 (1.75 g, 11.0 mmol)의 용액에 첨가하고, 반응물을 냉장고에 16 시간 동안 위치시켰다. 통상의 워크업으로 메실레이트를 연한 황색 오일로 제공하였다. 이 오일 (9.2 mmol)을 THF (20 mL) 중에 용해시키고, LiBr (2.0 g, 23.0 mmol)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 1 시간 동안 환류하도록 가열시킨 다음, 실온으로 냉각시켰다. 혼합물에 물 (2.5mL)을 첨가하고, 용매를 진공 하에서 제거하였다. 잔여물을 에틸 아세테이트 (3 × 15 mL)로 추출하고, 합쳐진 유기층을 포화된 NaCl 용액 (10 mL)으로 세척하고, 무수 Na2SO4 상에서 건조시키고, 농축시켜 원하는 브로미드를 제공하였다.
mPEG-OH 20 kDa (2.0 g, 0.1 mmol, 썬바이오)를 THF (35 mL) 중의 NaH (12 mg, 0.5 mmol)로 처리하고, 브로미드 (3.32 g, 15 mmol)를 촉매량의 KI와 함께 혼합물에 첨가하였다. 생성되는 혼합물을 12 시간 동안 환류하도록 가열시켰다. 물 (1.0 mL)을 혼합물에 첨가하고, 용매를 진공 하에서 제거하였다. 잔여물에 CH2Cl2 (25 mL)를 첨가하고, 유기층을 분리시키고, 무수 Na2SO4 상에서 건조시키고, 부피를 대략 2 mL로 감소시켰다. 에테르 용액 (150 mL)을 적가하여 침전물을 얻었고. 이를 수집하여 mPEG-O-CH2-C6H4-N3를 얻었다.
실시예 21
Figure 112006059749857-pct00029
NH2-PEG-O-CH2CH2CO2H (MW 3,400 Da, 2.0 g)를 NaHC03 (10 mL)의 포화된 수용액 중에 용해시키고, 이 용액을 0 ℃로 냉각시켰다. 3-아지도-1-N-히드록시숙신이미도 프로피오네이트 (5 당량)를 격렬하게 교반하면서 첨가하였다. 3 시간 후, 20 mL의 H2O를 첨가하고, 혼합물을 추가적인 45 분 동안 실온에서 교반하였다. pH를 0.5 N H2SO4를 사용하여 3으로 조정하고, NaCl을 대략 15 중량%의 농도로 첨가하였다. 반응 혼합물을 CH2Cl2 (100 mL × 3)로 추출하고, Na2SO4 상에서 건조시키고, 농축시켰다. 냉각된 디에틸 에테르를 사용하여 침전시킨 후, 생성물을 여과에 의해 수집하고, 진공 하에서 건조시켜 오메가-카르복시-아지드 PEG 유도체를 얻었다.
실시예 22
Figure 112006059749857-pct00030
THF 중에서 -78 ℃에서 냉각된 당분야에 공지되어 있는 바와 같이 제조된 리튬 아세틸리드 (4 당량)의 용액에 THF 중에 용해된 mPEG-OMs의 용액을 격렬하게 교반하면서 적가하였다. 3 시간 후, 반응물을 실온으로 가온시키고, 1 mL의 부탄올을 첨가하여 켄칭시켰다. 그 다음, 20 mL의 H2O를 첨가하고, 혼합물을 추가적인 45 분 동안 실온에서 교반하였다. 0.5 N H2SO4를 사용하여 pH를 3으로 조정하고, NaCl을 대략 15 중량%의 농도로 첨가하였다. 반응 혼합물을 CH2Cl2 (100 mL × 3)로 추출하고, Na2SO4 상에서 건조시키고, 농축시켰다. 냉각된 디에틸 에테르를 사용하여 침전시킨 후, 생성물을 여과에 의해 수집하고, 진공 하에서 건조시켜 1-(부트-3-일옥시)-메톡시폴리에틸렌 글리콜 (mPEG)을 얻었다.
실시예 23
문헌[L. Wang, et al., (2001), Science 292; 498-500, J. W. Chin et al., Science 301: 964-7 (2003)), J. W. Chin et al., (2002), Journal of the American Chemical Society 124: 9026-9027; J. W. Chin, & P. G. Schultz, (2002), Chem Bio Chem 11: 1135-1137; J. W. Chin, et al., (2002), PNAS United States of America 99: 11020-11024: and, L. Wang, & P. G. Schultz, (2002), Chem. Comm., 1-10]에 기재된 방법을 사용하여, 아지드 함유 아미노산 및 아세틸렌 함유 아미노산을 단백질에 부위-선택적으로 도입시켰다. 아미노산을 도입시킨 후, 포스페이트 완충제 (PB) (pH 8) 중에서, 2 mM PEG 유도체, 1 mM CuSO4, 및 ~ 1 mg Cu선의 존재 하에서 4 시간 동안 37 ℃에서 0.01 mM 단백질을 사용하여 시클로부가 반응을 수행하였다.
실시예 24
본 실시예는 p-아세틸-D,L-페닐알라닌 (pAF) 및 m-PEG-히드록실아민 유도체의 합성을 기재한다.
문헌[Zhang, Z., Smith, B. A. C., Wang, L., Brock, A., Cho, C. & Schultz, P. G., Biochemistry, (2003) 42, 6735-6746]에 종래 기재된 절차를 사용하여 라세미 pAF를 합성하였다.
m-PEG-히드록실아민 유도체를 합성하기 위해, 하기 절차를 수행하였다. 실온에서 (RT) 1 시간 동안 교반된 디클로로메탄 (DCM, 70 mL) 중의 (N-t-Boc-아미노옥시) 아세트산 (0.382 g, 2.0 mmol) 및 1,3-디이소프로필카르보디이미드 (0.16 mL, 1.0 mmol)의 용액에, 메톡시-폴리에틸렌 글리콜 아민 (m-PEG-NH2, 7.5 g, 0.25 mmol, Mt. 30 K, 바이오벡트라 (BioVectra)로부터 입수) 및 디이소프로필에틸아민 (0.1 mL, 0.5 mmol)을 첨가하였다. 반응물을 RT에서 48 시간 동안 교반한 다음, 약 100 mL가 되도록 농축시켰다. 혼합물을 냉각된 에테르 (800 mL)에 적가하였다. t-Boc-보호된 생성물을 침전시키고, 여과에 의해 수집하고, 에테르 100 mL로 3 회 세척하였다. 이를 DCM (100 mL) 중에 재용해시키고, 에테르 (800 mL) 중에 2 회 침전시킴으로써 추가 정제하였다. 생성물을 진공에서 건조시켜 7.2 g (96 %)을 얻고, 이를 NMR 및 니히드린 (Nihydrin) 시험에 의해 확인하였다.
상기와 같이 얻어진 보호된 생성물 (7.0 g)의 deBoc을 50 % TFA/DCM (40 mL) 중에서 0 ℃에서 1 시간 동안 수행한 다음, RT에서 1.5 시간 동안 수행하였다. 대부분의 TFA를 진공에서 제거한 후, 디옥산 (1 mL) 중의 4 N HCl을 잔여물에 첨가함으로써 히드록실아민 유도체의 TFA 염을 HCl 염으로 전환시켰다. 침전물을 DCM (50 mL) 중에 용해시키고, 에테르 (800 mL) 중에 재침전시켰다. 최종 생성물 (6.8 g, 97 %)을 여과에 의해 수집하고, 에테르 100 mL로 3 회 세척하고, 진공에서 건조시키고, 질소 하에서 저장하였다. 다른 PEG (5K, 20 K) 히드록실아민 유도체를 동일한 절차를 사용하여 합성하였다.
실시예 25
본 실시예는 비천연 아미노산을 포함하는 hGH 폴리펩티드에 사용되는 발현 방법 및 정제 방법을 기재한다. 숙주 세포를 오르토고날 tRNA, 오르토고날 아미노아실 tRNA 합성효소 및 hGH 구성체를 사용하여 형질전환시켰다.
형질전환된 DH10B (fis3) 세포의 동결된 글리세롤 저장액으로부터의 작은 자상을 먼저 37 ℃에서 100 ㎍/ml의 암피실린을 갖는 2 ml의 정해진 배지 (루신, 이소루신, 미량 금속 및 비타민으로 보충되는 글루코오스 최소 배지)에서 성장시켰다. OD600이 2-5에 도달했을 때, 60 ㎕를 100 ㎍/ml의 암피실린을 갖는 60 ml의 신선한 정해진 배지로 옮기고, 또 다시 37 ℃에서 성장시켜 2-5의 OD600이 되게 하였다. 50 mL의 배양액을 5 리터의 발효기 (사르토리우스 (Sartorius) BBI) 중에서 100 ㎍/ml의 암피실린을 갖는 2 리터의 정해진 배지에 옮겼다. 탄산칼륨을 사용하여, 온도 37 ℃에서, 5 lpm의 공기 흐름 속도, 및 폴리알킬렌 소포제 (defoamer) KFO F119 (루브리졸 (Lubrizol))가 구비된 발포체를 사용하여 발효기 pH를 pH 6.9에서 통제하였다. 교반기 속도를 자동적으로 조정하여 용해 산소 수치를 ≥ 30 %로 유지시키고, 교반기 속도가 그들의 최대 값에 도달한 경우, 순수한 산소를 사용하여 에어 스파징 (air sparging)을 보충하였다. 37 ℃에서 8 시간 후, 지수적으로 증가하는 속도에서 배양물을 정해진 배지의 50 × 농축물에 공급하여 0.15 시간-1의 특이적 성장률을 유지시킨다. OD600이 대략 100에 도달한 경우, 파라-아세틸-페닐알라닌의 라세미 혼합물을 첨가하여 최종 농도가 3.3 mM이 되게 하고, 온도를 28 ℃로 낮추었다. 0.75 시간 후, 이소프로필-b-D-티오갈락토피라노시드를 첨가하여 최종 농도가 0.25 mM이 되게 하였다. 세포를 추가적인 8 시간 동안 28 ℃에서 성장시키고, 펠릿화하고, 추가 가공시까지 -80 ℃에서 동결시켰다.
인비트로겐의 지시 편람에 의해 제공된 표준 His-태그화된 단백질 정제 절차를 통한 프로본드 니켈-킬레이팅 레진 (인비트로겐, 캘리포니아주 칼스버드 소재)을 사용한 후, 음이온 교환 컬럼을 사용하여 His-태그화된 돌연변이체 hGH 단백질을 정제하였다.
정제된 hGH를 8 mg/ml로 농축시키고, 완충제를 반응 완충제 (20 mM 아세트산나트륨, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, pH 4.0)로 교환하였다. MPEG-옥시아민 (Oxyamine) 분말을 PEG:hGH의 20:1 몰비로 hGH 용액에 첨가하였다. 반응을 온화하게 진탕하면서 28 ℃에서 2 일 동안 수행하였다. 음이온 교환 컬럼을 통해 미반응된 PEG 및 hGH로부터 PEG-hGH를 정제하였다.
동물 실험에 돌입하기 전에, 3 개의 분석시험에 의해 각각의 PEG화된 돌연변이체 hGH의 품질을 평가하였다. 비환원 조건 하에서 MES SDS 러닝(running) 완충제 (인비트로겐)를 사용하여 4-12 % 아크릴아미드 NuPAGE Bis-Tris 겔에 러닝시킴으로써 PEG-hGH의 순도를 조사하였다. 겔을 쿠마시 블루로 염색하였다. PEG-hGH 밴드는 밀도측정 스캔 (densitometry scan)을 기초로 95 %를 초과하는 순도를 가졌다. 각각의 PEG-hGH 중의 내독소 수치를 찰스 리버 라보라토리즈 (Charles River Laboratories) (메사추세츠주 윌밍턴 소재)로부터 KTA2 키트를 사용하여 동역학적 LAL 분석시험에 의해 시험하고, 투여량 당 5 EU 미만이었다. PEG-hGH의 생물학적 활성을 IM-9 pSTAT5 생체분석시험 (실시예 2에 언급됨)을 사용하여 평가하고, EC50 값은 15 nM 미만이었다.
실시예 26
본 실시예는 비천연 아미노산을 포함하는 hGH 폴리펩티드의 정제 및 균질성을 평가하는 방법을 기재한다.
도 8은 위치 92에서의 비천연 아미노산을 포함하는 hGH 폴리펩티드의 SDS-PAGE이다. 겔의 레인 3, 4 및 5는 5 kDa, 20 kDa 또는 30 kD PEG 분자에 공유 결합된 위치 92에서 p-아세틸-페닐알라닌을 포함하는 hGH를 보여준다. PEG화된 비천연 아미노산을 포함하는 추가적인 hGH 폴리펩티드를 도 11에 도시한다. 5 ㎍의 각각 PEG-hGH 단백질을 각각의 SDS-PAGE에 로딩하였다. 도 11, 패널 A; 레인 1, 분자량 마커; 레인 2, WHO rhGH 참조 표준 (2 ㎍); 레인 3 및 7, 30KPEG-F92pAF; 레인 4, 30KPEG-Y35pAF; 레인 5, 30KPEG-R134pAF; 레인 6, 20 KPEG-R134pAF; 레인 8, WHO rhGH 참조 표준 (20 ㎍). 도 11, 패널 B; 레인 9, 분자량 마커, 레인 10, WHO rhGH 참조 표준 (2 ㎍); 레인 11, 30KPEG-F92pAF; 레인 12, 30KPEG-K145pAF; 레인 13, 30KPEG-Y143pAF; 레인 14, 30KPEG-G131pAF; 레인 15, 30KPEG-F92pAF/G120R, 레인 16 WHO rhGH 참조 표준 (20 ㎍). 도 9는 IM-9 세포에서의 PEG화된 hGH 폴리펩티드 (5 kDa, 20 kDa, 또는 30 kD PEG)의 생물학적 활성을 나타내며, 실시예 2에 기재된 방법을 수행하였다.
단백질분해성 분해 (트립신 분절을 포함하며 이에 한정되지 않음) 후, 질량 분석법 분석에 의해 hGH-PEG 컨쥬게이션물의 순도를 평가할 수 있다. 문헌[Pepinsky B., et al., J. Phajnracol. & Exp. These. 297 (3): 1059-66 (2001)]을 참조할 수 있다. 또한, 트립신 소화를 수행하는 방법은 문헌[European Pharmacopoeia (2002) 4th Edition, pp. 1938]에 기재되어 있다. 기재된 방법에 대한 변형을 수행하였다. 샘플을 밤새 50 mM TRIS-HCl (pH 7.5) 중에서 투석하였다. rhGH 폴리펩티드를 66:1의 질량 비의 트립신 (TPCK-처리된 트립신, 워싱톤 (Worthington))을 사용하여 4 시간 동안 37 ℃ 수조 중에서 인큐베이션하였다. 샘플을 얼음 상에서 몇 분 동안 인큐베이션하여 소화 반응을 중지시킨 데 이어서, HPLC 분석 동안 4 ℃에서 유지시켰다. 소화된 샘플 (~200 ㎍)을 0.1 % 트리플루오로아세트산 중의 25 × 0.46 cm 비다크 C-8 컬럼 (5-㎛ 비드 크기, 100 Å 다공 크기)에 로딩하고, 70 min에 걸쳐 1 ml/min의 유량에서 30 ℃에서 0 내지 80 % 아세토니트릴의 구배를 사용하여 용리시켰다. 214 nm에서 흡광도에 의해 트립신 펩티드의 용리를 모니터링하였다.
도 10, 패널 A는 표시된 트립신 분절 부위 및 화살표로 특정된 비천연 아미노산 치환 F92pAF를 갖는 hGH의 1차 구조를 도시한다 (문헌[Becker et al. Biotechnol Appl Biochem. (1988) 10 (4): 326-337]으로부터 변형된 도면). 패널 B는 PEG화된 비-천연적으로 코딩된 아미노산을 포함하는 hGH 폴리펩티드로부터 생성된 펩티드 (30 K PEG His6-F92pAF rhGH, A로 표지화됨), hGH 비-천연적으로 코딩된 아미노산을 포함하는 폴리펩티드로부터 생성된 펩티드 (His6-F92pAF rhGH, B로 표지화됨), 및 야생형 hGH로부터 생성된 펩티드 (WHO rhGH, C로 표지화됨)의 중첩된 트립신 지도를 도시한다. WHO rhGH 및 His6-F92pAF rhGH의 트립신 지도의 비교는 오직 2 개의 피크 이동 (shift)인 펩티드 피크 1 및 펩티드 피크 9만을 밝혀내고, 잔여 피크들은 동일하였다. 이러한 차이는 발현된 His6-F92pAF rhGH의 N-말단 상에 His6을 첨가함으로써 발생하며, 그 결과 피크 1 이동이 발생하며, 한편 피크 9에서의 이동은 잔기 92에서 페닐알라닌을 p-아세틸-페닐알라닌으로 치환함으로써 발생한다. 패널 C - 패널 B로부터 피크 9의 확대도를 도시한다. His6-F92pAF 및 30 K PEG His6-F92pAF rhGH 트립신 지도의 비교는 His6-F92pAF rhGH의 PEG화시 피크 9가 사라져, 이러한 변형이 펩티드 9에 대해 특이적임을 밝혀내었다.
실시예 27
본 실시예는 각각 비천연 아미노산을 포함하는 2 개의 hGH 폴리펩티드로부터 형성된 호모이량체를 기재한다.
도 12는 hGH의 PEG화에 대해 실시예 25에 기재된 바와 같이 작용기 및 반응성을 갖는 이작용인 링커와 결합된 이 변형된 폴리펩티드의 호모이량체로 위치 92에서 p-아세틸-페닐알라닌을 치환한 것을 포함하는 His-태그화된 hGH 폴리펩티드로부터의 IM-9 분석시험 결과를 포함한다.
실시예 28
본 실시예는 hGH 길항제로 작용하는 단량체 및 이량체 hGH 폴리펩티드를 기재한다.
G120R 치환이 사이트 II에 도입된 hGH 뮤테인은 단일 hGH 수용체에 결합할 수 있지만, 2 개의 수용체를 이량체화하지 못한다. 생각컨대, 뮤테인은 세포 내 신호 전달 경로를 활성화시키지 않고 수용체 부위를 점유함으로써 시험관 내에서 hGH 길항제로 작용한다 (문헌[Fuh, G., et al., Science 256: 1677-1680 (1992)] 참조). 도 13, 패널 A는 G120R 치환을 갖는 hGH에 의해 pSTAT5의 인산화를 측정하는 IM-9 분석시험 데이터를 도시한다. 동일한 위치 (G120)에서 도입된 비천연 아미노산을 갖는 hGH 폴리펩티드는 도 13, 패널 B에 도시된 바와 같이 hGH 길항제로도 작용하는 분자를 제공한다. hGH의 PEG화에 대해 실시예 25에 기재된 바와 같이 작용기 및 반응성을 갖는 이작용인 링커와 결합된, 도 13, 패널 B에 도시된 hGH 길항제의 이량체를 구성하였다. 도 14는 이 이량체도 IM-9 분석시험시 생물학적 활성이 결여되어 있다는 것을 보여준다.
G120pAF 치환을 포함하는 hGH 폴리펩티드를 PEG 링커에 의해 결합된 G120pAF 변형된 hGH 폴리펩티드의 이량체와 비교하는 추가적인 분석시험을 수행하였다. STAT5의 WHO hGH 유도 인산화는 PEG 링커에 의해 결합된 투여량-반응 범위의 단량체 및 이량체와 경쟁하였다. 또한, 표면 수용체 경쟁 연구를 수행하였으며, 이는 단량체 및 이량체가 IM-9 및 쥐 GHR (L43R)/BAF3 세포 상에서 세포 표면 수용체 결합에 대해 GH와 경쟁한다는 점을 보여주었다. 이량체는 단량체보다 더 강력한 길항제로 작용하였다. 하기 표 4는 이 연구들로부터의 데이터를 나타낸다.
세포주 IM-9 IM-9 쥐 GHR
(L43R)/BAF3
분석시험 pSTAT5의 억제 표면 수용체 경쟁 표면 수용체 경쟁
G120pAF 단량체 IC50 (nM)
3.3 		IC50 (nM)
8.4 		IC50 (nM)
3.1
(G120pAF) 이량체, PEG 링커 0.7 2.7 1.4
실시예 29
본 실시예는 hGH 활성 및 hGH 수용체에 대한 hGH 폴리펩티드의 친화성의 측정을 상술한다.
쥐 GH 수용체의 클로닝 및 정제
쥐 GH 수용체의 세포 외 도메인 (GHR ECD, 아미노산 S29-T238)을 C-말단 6His 태그를 갖는 프레임 중 Nde I 부위와 Hind III 부위 사이 pET20b 벡터 (노바겐)에 클로닝하였다. R에 대한 L43의 돌연변이를 한층 더 근사한 인간 GH 수용체 결합 부위에 도입시켰다 (문헌[Souza et al., Proc Natl Acad Sci U S A. (1995) 92 (4): 959-63] 참조). 30 ℃에서 4-5 시간 동안 0.4 mM IPTG를 도입시킴으로써 재조합 단백질을 BL21 (DE3) 대장균 세포 (노바겐)에서 생산하였다. 세포를 용해시킨 후, 펠릿을 다운스 중에서 재현탁시킴으로써 30 mL의 50 mM Tris (pH 7.6), 100 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 % 트리톤 X-100를 사용하여 4 회 세척하고, 트리톤 X-100을 함유하지 않는 동일한 완충제를 사용하여 2 회 세척하였다. 이 시점에서, 내포체는 95 %를 초과하는 GHR ECD로 이루어지고, 이를 0.1 M Tris (pH 11.5), 2 M 우레아 중에서 가용화하였다. 50 mM Tris (pH 7.8), 1 M L-아르기닌, 3.7 mM 시스타민, 6.5 mM 시스테아민으로 평형화된 S100 (시그마) 겔 여과 컬럼을 통해 내포체 용액 한 엘리콧을 통과시킴으로써 리폴딩을 수행하였다. 가용성 단백질을 함유하는 분획물을 합치고, 50 mM Tris (pH 7.6), 200 mM NaCl, 10 % 글리세롤에 대해 투석하였다. 샘플을 간단히 원심분리하여 임의의 침전물을 제거하고, 제조자의 지시에 따라 한 엘리콧의 탈론 레진 (Talon Resin) (클론테크 (Clontech))을 사용하여 인큐베이션하였다. 5 mM 이미다졸이 보충되는 20 부피의 투석 완충제로 수지를 세척한 후, 단백질을 투석 완충제 중에서 120 mM 이미다졸을 사용하여 용리시켰다. 마지막으로, 샘플을 50 mM Tris (pH 7.6), 30 mM NaCl, 1 mM EDTA, 10 % 글리세롤에 대해 밤새 투석하고, 간단히 원심분리하여 임의의 침전물을 제거하고, 글리세롤 최종 농도가 20 %가 되도록 조정하고, 엘리콧화하고, -80 ℃에서 저장하였다. ε = 65,700 M-1*cm-1의 계산된 소광 계수 (extinction coefficient)를 사용하여 OD(280)에 의해 단백질의 농도를 측정하였다.
GH 의 GHR 에 대한 결합의 비아코어 TM 분석
제조자에 의해 권장되는 표준 아민-커플링 절차를 사용하여 대략 600-800 RUs의 가용성 GHR ECD를 비아코어TM CM5 칩 상에 고정화시켰다. 비록 수용체의 상당 부분이 이 기술에 의해 비활성화되지만, 이러한 수준의 고정화가 약 100-150 RUs의 최대 특이적 GH 결합 반응을 생성하기에 충분하며, 결합 동역학에서는 뚜렷한 변화가 없는 것으로 발견되었다. 예를 들면, 문헌[Cunningham et al. J Mol Biol. (1993) 234 (3): 554-63 and Wells JA. Proc Natl Acad Sci U S A (1996) 93 (1); 1-6]을 참조할 수 있다.
HBS-EP 완충제 (비아코어TM, 파마시아) 중의 다양한 농도의 야생형 또는 돌연변이체 GH (0.1-300 nM)를 40 ㎕/min의 유량에서 4-5 분 동안 GHR 표면 위에 주사하고, 주사 후 15 분 동안 해리를 모니터링하였다. 4.5 M MgCl2의 15 초 펄스에 의해 표면을 재생시켰다. 100 회 이상의 재생 주기 후 단지 최소의 결합 친화성 손실 (1-5 %)이 관찰되었다. 수용체가 고정화되지 않은 기준 세포를 사용하여 임의의 완충제 체적 효과 및 비특이적 결합을 차감시켰다.
GH 적정 실험으로부터 얻은 동역학적 결합 데이터를 비아이벨류에이션 (BiaEvaluation) 4.1 소프트웨어 (비아코어TM)를 사용하여 처리하였다. "2가 분석물 (Bivalent analyte)" 회합 모델은 제안된 순차적인 1:2 (GH:GHR) 이량체화에 따라서 만족스러운 적합성 (fit) (chi2 값은 일반적으로 3 미만)을 제공하였다 (문헌[Wells JA. Proc Natl Acad Sci U S A (1996) 93 (1); 1-6] 참조). 평형 해리 상수 (Kd)를 개개의 속도 상수의 비 (koff/kon)로서 계산하였다.
하기 표 5는 CM5 칩 상에 고정화된 쥐 GHR ECD (L43R)를 사용한 비아코어TM로부터의 결합 매개변수를 나타낸다.
Figure 112006059749857-pct00031
Figure 112006059749857-pct00032
GHR 안정한 세포주
IL-3 의존성 마우스 세포주, BAF3을 IL-3의 공급원으로서 RPMI 1640, 피루브산나트륨, 페니실린, 스트렙토마이신, 10 % 열-비활성화된 우태 혈청, 50 uM 2-머캅토에탄올 및 10 % WEHI-3 세포주 상태조절된 배지 중에서 통상적으로 계대배양하였다. 모든 세포 배양물을 37 ℃에서 5 % CO2의 습한 분위기 중에서 유지시켰다.
BAF3 세포주를 사용하여 쥐 GHR (L43R) 안정한 세포 클론인 2E2-2B12-F4를 정립하였다. 간략히, 1 × 107 중간-교회 (mid-confluent) BAF3 세포를 전장 쥐 GHR (L43R) cDNA를 함유하는 15 ug의 선형화된 pcDNA3.1 플라스미드를 사용하여 전기천공하였다. 800 ㎍/ml의 G418 및 5 nM의 WHO hGH를 함유하는 배지 중에서 희석을 제한함으로써 클로닝하기 전 48 시간 동안 형질감염된 세포를 회수하였다. GHR을 발현하는 형질감염체를 인간 GHR에 대항하는 항체 (알 앤드 디 시스템스 (R & D Systems), 미네소타주 미네아폴리스 소재)를 사용한 표면 염색에 의해 확인하고, FACS 어레이 (비디 바이오사이언시즈 (BD Biosciences), 캘리포니아주 샌디에고 소재) 상에서 분석하였다. 그 다음, 우수한 수준의 GHR을 발현하는 형질감염체를 BrdU 증식 분석시험 (이하 기재하는 바와 같음)에서 WHO hGH에 대한 증식성 활성에 대해 스크리닝하였다. 표면 수용체 발현 및 증식 능력에 대해 끊임없이 프로파일하면서 1.2 mg/ml의 G418 및 5 nM의 hGH의 존재 하에서 원하는 형질감염체를 반복된 서브클로닝을 추가 2 회 실시시, 안정적으로 형질감염된 쥐 GHR (L43R) 세포 클론이 정립되었다. 이렇게 하여 정립된 세포 클론 2E2-2B12-F4를 hGH의 부재 하에서 BAF3 배지와 1.2 mg/ml G418 중에서 통상적으로 유지시켰다.
BrdU 표지화에 의한 증식
단식한 쥐 혈청 GHR (L43R) 발현 BAF3 세포주 2E2-2B12-F4를 96-웰 플레이트에서 5 × 104 세포/웰의 밀도로 플레이팅 (plating)하였다. 세포를 12-점 투여량 범위의 hGH 단백질로 활성화시키고, 동시에 50 uM BrdU (시그마, 미소우리주 세인트 루이스 소재)로 표지화하였다. 배양액 중에서 48 시간 경과 후, 세포를 30 분 동안 실온에서 100 ul의 BD 시토필스/시토펌 (cytofix/cytoperm) 용액 (비디 바이오사이언시즈)을 사용하여 고정/퍼미어빌라이제이션하였다. BrdU 에피토프를 노출시키기 위해, 고정된/퍼미어빌라이제이션된 세포를 1 시간 동안 37 ℃에서 30 ㎍/웰의 DNase (시그마)로 처리하였다. APC-컨쥬게이션된 항-BrdU 항체 (비디 바이오사이언시즈)를 사용한 면역형광 염색으로 FACS 어레이 상에서 샘플을 분석할 수 있었다.
하기 표 6은 pSTAT5 (IM-9) 및 BrdU 증식 분석시험에 대해 프로파일된 PEG hGH 돌연변이체의 생체활성을 나타낸다. WHO hGH는 분석시험 사이의 비교를 위한 개체 (unity)로서 발현된다.
Figure 112006059749857-pct00033
실시예 30
본 실시예는 PEG화된 hGH이 시험관 내 및 생체 내 활성을 측정하는 방법을 기재한다.
세포 결합 분석시험
세포 (3 × 106)를 다양한 농도 (부피: 10 ㎕)의 표지되지 않은 GH, hGH 또는 GM-CSF의 부재 또는 존재 하에서 및 125I-GH (대략 100,000 cpm 또는 1 ng)의 존재 하에서 0 ℃에서 90 분 동안 (총 부피: 120 ㎕) PBS/1 % BSA (100 ㎕) 중에서 2 회 인큐베이션하였다. 그 다음, 세포를 재현탁시키고, 350 ㎕의 플라스틱 원심분리 관에서 200 ㎕의 얼음 냉각 FCS 위에서 레이어링 (layering)시키고, 원심분리하였다 (1000 g; 1 분). 관의 말단을 절단함으로써 펠릿을 수집하고, 펠릿 및 상청액의 수를 별도로 감마 계수기 (펙카드 (Packard))에서 세었다.
특이적 결합 (cpm)은 경쟁자 (중복체의 평균)의 부재 하에서의 총 결합에서 100 배 과량의 표지되지 않은 GH의 존재 하에서의 결합 (cpm) (비특이적 결합)을 차감한 것으로서 결정된다. 각각의 세포 타입에 대한 비특이적 결합을 측정하였다. 실험을 동일한 125I-GH의 제제를 사용하여 매일 운전하고, 이는 내적 일관성을 나타내야 한다. 125I-GH는 수용체 생산 세포에 대한 결합을 나타내었다. 이 결합은 표지되지 않은 천연 GH 또는 hGH에 의해서는 투여량 의존 방식으로 억제되지만, GM-CSF 또는 다른 음성 대조군에 의해서는 투여량 의존 방식으로 억제되지 않았다. 천연 GH와 유사하게, hGH가 천연 125I-GH의 결합과 경쟁하는 능력은 수용체가 양쪽 형태 모두를 동일하게 잘 인식한다는 점을 시사한다.
PEG화된 hGH 의 생체 내 연구
PEG-hGH, 변형되지 않은 hGH 및 완충제 용액을 마우스 또는 쥐에 투여한다. 그 결과는 변형되지 않은 hGH에 비해 본 발명의 PEG화된 hGH가 더 우수한 활성 및 연장된 반감기를 가짐을 나타내며, 이는 상당히 증가된 체중에 의해 표시된다.
컨쥬게이션 된 hGH 및 비컨쥬게이션된 hGH 및 그의 변이체의 생체 내 반감기의 측정
AAALAC 공인된 시설에서 세이트 루이스 대학의 제도적 동물 관리 및 사용 위원회 (Institutional Animal Care and Use Committee of St. Louis University)에 의해 승인된 프로토콜 하에서 모든 동물 실험을 수행하였다. 쥐들을 12-시간 광/암 주기를 갖는 방의 우리에 개별적으로 거주시켰다. 동물이 보증된 퓨리나 (Purina) 설치류 사료 5001 및 물에 자유로이 접근할 수 있게 공급하였다. 뇌하수체 적출 쥐의 경우, 또한 음료수가 5 % 글루코오스를 함유하였다.
약동학적 연구
동물 실험에 돌입하기 전에, 3 개의 분석시험에 의해 각각의 PEG화된 돌연변이체 hGH의 품질을 평가하였다. 비환원 조건 하에서 MES SDS 러닝 완충제 (인비트로겐)를 사용하여 4-12 % 아크릴아미드 NuPAGE Bis-Tris 겔에 러닝시킴으로써 PEG-hGH의 순도를 조사하였다. 겔을 쿠마시 블루로 염색하였다. PEG-hGH 밴드는 밀도측정 스캔을 기초로 95 %를 초과하는 순도를 가졌다. 각각의 PEG-hGH 중의 내독소 수치를 찰스 리버 라보라토리즈 (메사추세츠주 윌밍턴 소재)로부터 KTA2 키트를 사용하여 동역학적 LAL 분석시험에 의해 시험하고, 투여량 당 5 EU 미만이었다. PEG-hGH의 생물학적 활성을 IM-9 pSTAT5 생체분석시험 (실시예 2에 기재됨)을 사용하여 평가하고, EC50 값은 15 nM 미만이었다.
PEG-변형된 성장 호르몬 화합물의 약동학적 성질을 서로 비교하고, 찰스 리버 라보라토리즈로부터 입수한 수컷 스프라그-다울리 쥐 (261-425 g)에서 비PEG화된 성장 호르몬과 비교하였다. 혈액 수집을 위해 카테터를 수술로 내경 동맥에 설치하였다. 성공적인 카테터 설치 후, 투여 전 동물들을 처리군에 배정하였다 (군 당 3 마리 내지 6 마리). 0.41-0.55 ml/kg의 투여 부피 중의 1 mg/kg의 화합물을 동물에 피하 투여하였다. 유치 카테터를 통해 혈액 샘플을 다양한 시점에서 수집하고, EDTA-코팅된 마이크로퓨즈 (microfuge) 관에 넣었다. 원심분리 후 혈장을 수집하고, 분석시까지 -80 ℃에서 저장하였다. 바이오소스 인터네쇼날 (캘리포니아주 카마릴로 소재) 또는 디아그노스틱 시스템스 라보라토리즈 (텍사스주 웹스터 소재)로부터 항체 샌드위치 (sandwich) 성장 호르몬 ELISA 키트를 사용하여 화합물 농도를 측정하였다. 투여된 유사체에 대응하는 표준을 사용하여 농도를 계산하였다. 모델링 프로그램 윈놀린 (WinNonlin) (파르사이트 (Pharsight), 버전 4.1)을 사용하여 약동학적 매개변수를 평가하였다. 라이너-업/로그-다운 (linear-up/log-down) 사다리꼴 적분을 사용하는 비구획 (Noncompartmental) 분석을 사용하고, 균일하게 농도 데이터의 중량을 쟀다.
도 15는 쥐에서 단일 피하 투여 후의 평균 (+/-S.D.) 혈장 농도를 도시한다. 쥐 (군 당 n = 3-4 마리)에게 단일 볼러스 투여량의 1 mg/kg의 hGH 야생형 단백질 (WHO hGH), His-태그화된 hGH 폴리펩티드 (his-hGH), 또는 위치 92에서 30 kD PEG (30KPEG-pAF92(his)hGH)에 공유 결합된 비천연 아미노산을 포함하는 His-태그화된 hGH 폴리펩티드 p-아세틸-페닐알라닌을 제공하였다. 혈장 샘플을 지시된 시간 간격에서 취하고, 상기와 같이 주사된 화합물에 대해 분석시험하였다. 30KPEG-pAF92(his)hGH는 대조군 hGH에 비해 현저하게 연장된 순환을 가졌다.
도 16은 쥐에서 단일 피하 투여 후의 평균 (+/-S.D.) 혈장 농도를 도시한다. 쥐 (군 당 n = 3-6 마리)에게 단일 볼러스 투여량의 1 mg/kg의 단백질을 제공하였다. 각각의 6 개의 상이한 위치에서 30 kD PEG에 공유 결합된 비천연 아미노산 p-아세틸-페닐알라닌을 포함하는 hGH 폴리펩티드를 WHO hGH 및 (his)-hGH와 비교하였다. 혈장 샘플을 지시된 시간 간격에서 취하고, 상기와 같이 주사된 화합물에 대해 분석시험하였다. 표 7은 도 16에 도시된 hGH 폴리펩티드의 단일 투여량 투여에 대한 약동학적 매개변수 값을 도시한다. 비구획 분석 (파르사이트, 버전 4.1)에 의해 농도 대 시간 곡선을 평가하였다. 도시된 값들은 평균 (+/- 표준 편차)이다. Cmax: 최대 농도; 최종 t1 /2: 최종 반감기; AUC0 -> inf: 무한대로 외삽된 농도-시간 곡선 하의 면적; MRT: 평균 체류 시간; Cl/f; 겉보기 총 혈장 청소율 (clearance); Vz/f; 최종 기 동안 겉보기 분포 부피.
Figure 112006059749857-pct00034
약역학적 연구
뇌하수체 적출 수컷 스프라그-다울리 쥐를 찰스 리버 라보라토리즈로부터 입수하였다. 3-4 주 연령의 동물에서 뇌하수체를 수술적으로 제거하였다. 동물을 3 주 동안 체중을 모니터링하면서 순응시켰다. 연구 개시 전, 7 일 동안 체중이 0-8 g 증가된 동물을 포함시키고, 처리군에 랜덤화하였다. 쥐에게 볼러스 투여 또는 일일 피하 투여로 투여하였다. 연구 내내, 쥐의 체중을 매일 순차적으로 재고, 마취시키고, 출혈시키고, 투여하였다 (적용가능한 경우). 헤파린화된 모세관을 사용하여 안와 굴 (orbital sinus)로부터 혈액을 수집하고, EDTA 코팅된 마이크로퓨즈 관에 넣었다. 혈장을 원심분리에 의해 단리시키고, 분석시까지 -80 ℃에서 저장하였다.
도 17은 뇌하수체 적출 쥐에서 단일 피하 투여 후의 평균 (+/-S.D.) 혈장 농도를 도시한다. 쥐 (군 당 n = 5-7 마리)에게 단일 볼러스 투여량의 2.1 mg/kg의 단백질을 제공하였다. 각각 2 개의 상이한 위치 (위치 35, 92)에서 30 kD PEG에 공유 결합된 비천연 아미노산 p-아세틸-페닐알라닌을 포함하는 hGH 폴리펩티드로부터의 결과를 도시한다. 혈장 샘플을 지시된 시간 간격에서 취하고, 상기와 같이 주사된 화합물에 대해 분석시험하였다.
펩티드 IGF-1은 소마토메딘 또는 인슐린 유사 성장 인자 패밀리의 구성원이다. IGF-1은 성장 호르몬의 많은 성장-촉진 효과를 매개한다. 제공된 쥐/마우스 IGF-1 표준 (디아그노식 시스템스 라보라토리즈 (Diagnosic Systems Laboratories))에 대해 길항적인 결합 효소 면역분석시험 키트를 사용하여 IGF-1 농도를 측정하였다. 양쪽 꼬리 (two-tailed) 분포, 짝지워지지 않은 (unpaired) 등분산을 사용하여 t-시험에 의해 유의차를 결정하였다. 도 18, 패널 A는 뇌하수체 적출 쥐에서 화합물의 평가를 도시한다. 쥐 (군 당 n = 5-7 마리)에게 단일 투여 또는 일일 피하 투여를 제공하였다. 동물의 체중을 연속적으로 재고, 마취시키고, 출혈시키고, 일일 투여하였다 (적용가능한 경우). 위약 처리, 야생형 hGH (hGH), His-태그화된 hGH ((his)hGH), 및 위치 35 및 92에서 30 kD PEG에 공유적으로 결합된 p-아세틸-페닐알라닌을 포함하는 hGH 폴리펩티드에 대한 체중 결과를 나타낸다. 도 18, 패널 B - PEG화된 비-천연적으로 코딩된 아미노산을 포함하는 hGH 폴리펩티드의 단일 투여량을 투여한 후, 순환 혈장 IGF-1 수치에 대한 영향을 나타내는 도면이 도시된다. 막대는 표준 편차를 나타낸다. 도 18, 패널 A에서, 제 9 일에 30KPEG-pAF35(his)hGH 화합물에 대한 체중 증가는 더 큰 체중 증가가 관찰되었다는 점에서 30KPEG-pAF92(his)hGH 화합물과 통계적으로 상이하다 (p < 0. 0005).
도 18, 패널 C는 뇌하수체 적출 쥐에서의 화합물의 평가 결과를 도시한다. 쥐 (군 당 n = 11 마리)에게 단일 투여 또는 일일 피하 투여를 제공하였다. 동물의 체중을 연속적으로 재고, 마취시키고, 출혈시키고, 일일 투여하였다 (적용가능한 경우). 위약 처리, 야생형 hGH (hGH), 및 위치 92, 134, 145, 131 및 143에서 30 kD PEG에 공유적으로 결합된 p-아세틸-페닐알라닌을 포함하는 hGH 폴리펩티드에 대한 체중 결과를 나타낸다. 도 18, 패널 D - PEG화된 비-천연적으로 코딩된 아미노산을 포함하는 hGH 폴리펩티드 (위치 92, 134, 145, 131, 143)의 단일 투여량을 투여한 후, 위약 처리 및 야생형 hGH와 비교한 순환 혈장 IGF-1 수치에 대한 영향을 나타내는 도면이 도시된다. 도 18, 패널 E는 PEG화된 비-천연적으로 코딩된 아미노산을 포함하는 hGH 폴리펩티드 (위치 92, 134, 145, 131, 143)에 대응하는 평균 (+/-S.D.) 혈장 농도를 나타낸다. 혈장 샘플을 지시된 시간 간격에서 취하고, 상기와 같이 주사된 화합물에 대해 분석시험하였다. 막대는 표준 편차를 나타낸다.
실시예 31
비-천연적으로 코딩된 아미노산을 포함하는 PEG화 된 hGH 의 안정성 및(또는) 효능의 인간 임상 시험
목적
비-천연적으로 코딩된 아미노산을 포함하는 피하 투여된 PEG화된 재조합 인간 hGH와 상업적으로 입수가능한 hGH 제품 중 하나 이상 (휴마트로프TM (일라이 릴리 앤드 캄파니), 뉴트로핀TM (제넨테크), 노르디트로핀TM (노보-노르디스크), 제노트로핀TM (화이자) 및 사이젠/세로스팀TM (세로노)을 포함하며 이에 한정되지 않음)과의 안정성 및 약동학성을 비교하는 것이다.
환자
20-40 세 및 체중 60-90 kg의 범위의 18 명의 건강한 지원자들을 이 연구에 등록시킨다. 이 피험자들은 혈액학 또는 혈청 화학, 및 음성 뇨 독성 스크린, HIV 스크린 및 B형 간염 표면 항원에 대해 임상적으로 중요한 비정상 실험 값을 갖지 않는다. 이들은 다음 중 임의의 흔적을 갖지 않아야 한다: 고혈압; 임의의 1차 혈액 질환의 병력; 상당한 간, 신장, 심혈관, 위장관, 비뇨생식, 대사, 신경 질환의 병력; 빈혈증 또는 발작 장애의 병력; 세균 또는 포유류 유도 생성물, PEG, 또는 인간 혈청 알부민에 대해 알려진 민감성; 카페인을 함유하는 음료에 대해 심각한 상습적인 소비자; 연구 시작 전 30 일 이내에 임의의 다른 임상 시험에 참가했거나 또는 혈액을 수혈받거나 또는 수혈한 경우; 연구 시작 전 3 개월 이내에 hGH에 노출된 경우; 연구 시작 전 7 일 이내에 질병을 앓은 경우; 및 연구 시작 전 14 일 이내에 연구 전 물리적 조사 또는 임상 실험 평가시 상당한 이상을 가진 경우. 모든 피험자는 안정성에 대해 평가 가능하고, 약동학적 분석에 대한 모든 혈액 수집물을 예정대로 수집한다. 모든 연구는 제도적 윤리 위원회의 승인 및 환자의 동의 하에 수행된다.
연구 디자인
이는 건강한 남성 지원자들에서 페이즈 (Phase) I, 단일-센터 (single-center), 개방-표지, 랜덤화된 2-기간 교차 연구로 이루어진다. 18 명의 피험자를 두 치료 서열 군 중 하나 (군 당 9 명의 피험자)에 랜덤하여 배정하였다. GH를 등가 투여량의 비-천연적으로 코딩된 아미노산을 포함하는 PEG화된 hGH 및 선택된 상업적으로 입수가능한 제품을 사용하여 대퇴부에서 볼러스 피하 주사로서 두 개의 별개의 투여 기간에 걸쳐 투여하였다. 상업적으로 입수가능한 제품의 투여량 및 투여 빈도는 팩키지 표지에 지시된 대로 따랐다. 추가적인 군의 피험자를 포함시킴으로써, 상업적으로 입수가능한 제품을 사용하여 추가적인 투여, 투여 빈도 또는 필요에 따라 다른 매개변수를 연구에 포함시킬 수 있다. 각각의 투여 기간을 14 일 워시아웃 (washout) 기간에 의해 분리하였다. 피험자는 투여 기간 사이가 아닌, 각각의 두 투여 기간 동안 투여 전 12 시간 이상 및 투여 후 72 시간 연구 센터에 있었다. PEG화된 hGH에 대해서도 시험되는 추가적인 투여, 빈도 또는 다른 매개변수가 존재하는 경우 추가적인 군의 피험자를 부가할 수 있다. 인간에 대한 사용이 승인된 다중 GH 제제를 이 연구에 사용할 수 있다. 휴마트로프TM (일라이 릴리 앤드 캄파니), 뉴트로핀TM (제넨테크), 노르디트로핀TM (노보-노르디스크), 제노트로핀TM (화이자) 및 사이젠/세로스팀TM (세로노)은 인간에 사용가능한 것으로 승인된 상업적으로 입수가능한 GH 제품이다. hGH의 실험용 제제는 비-천연적으로 코딩된 아미노산을 포함하는 PEG화된 hGH이다.
혈액 샘플링
hGH 투여 전후 직접적인 정맥 천자에 의해 연속 (serial) 혈액을 빼냈다. 혈청 GH 농도의 결정을 위해 정맥혈 샘플 (5 mL)을 투여 (3 개의 기준 샘플) 전 약 30, 20 및 10 분에서 및 투여 후 대략 다음의 시간에서 얻었다: 30 분 및 1, 2, 5, 8, 12, 15, 18, 24, 30, 36, 48, 60 및 72 시간. 각각의 혈청 샘플을 2 개의 엘리콧으로 나누었다. 모든 혈청 샘플을 -20 ℃에서 저장하였다. 혈청 샘플을 건조 얼음 상에 두었다. 금식 임상 실험실 시험 (혈액학, 혈청 화학 및 뇨검사)을 제1 일에 초기 투여 직전, 제 4 일 아침, 제16 일 투여 직전 및 제19 일 아침에 수행하였다.
생체분석 방법
혈청 GH 농도를 결정하는 데 ELISA 키트 절차 (디아그노스틱 시스템스 라보라토리 (Diagnostic Systems Laboratory) [DSL], 텍사스주 웹스터 소재)를 사용하였다.
안정성 측정
활력 징후를 각각의 투여 직전 (제 1 일 및 제16 일), 및 각각의 투여 후 6, 24, 48 및 72 시간에서 기록하였다. 안정성 결정은 발병률 및 유해한 사건의 타입 및 기준선으로부터의 임상 실험실 시험 변화에 기초한다. 또한, 혈압을 비롯한 활력 징후 측정에서의 전 연구로부터의 변화, 및 물리적 조사 결과를 평가하였다.
데이터 분석
투여 전 기준선 GH 농도에서, 투여 전 30, 20 및 10 분에 수집된 3 개의 샘플로부터의 GH 수치를 평균낸 것으로부터 결정된 각각의 투여 후 값 평균 기준선 GH 농도를 차감함으로써 투여 후 혈청 농도 값을 정정하였다. 투여 전 혈청 GH 농도는, 분석시험의 정량 수치 미만인 경우 평균 값 계산에 포함시키지 않았다. 약동학적 매개변수를 기준선 GH 농도에 대해 보정된 혈청 농도 데이터로부터 결정하였다. 약동학적 매개변수를 가장 최근 버전의 BIOAVL 소프트웨어를 사용하여 디지탈 이큅먼트 코퍼레이션 (Digital Equipment Corporation) VAX 8600 컴퓨터 시스템 상에서 모델 독립적 방법에 의해 계산하였다. 다음의 약동학적 매개변수를 결정하였다: 피크 혈청 농도 (Cmax); 피크 혈청 농도에 대한 시간 (tmax); 선형 사다리꼴 법칙을 사용하여 계산된 0 내지 마지막 혈액 분취 시간 (AUC0 -72)에서의 농도-시간 곡선 (AUC) 하 면적; 및 제거율 상수로부터 산정된 최종 제거 반감기 (t1 /2). 제거율 상수를 로그-선형 농도-시간 플롯의 최종 선형 영역에서의 연속 데이터 점의 선형 회귀에 의해 추정하였다. 각각의 처리군에 대해 약동학적 매개변수의 평균, 표준 편차 (SD) 및 변동 계수 (CV)를 계산하였다. 매개변수 평균의 비 (보존된 제제/비보존된 제제)를 계산하였다.
안정성 결과
유해한 사건의 발생률은 처리군에 동일하게 분포하였다. 기준선 또는 연구 전 임상 실험실 시험 또는 혈압으로부터 임상적으로 중요한 변화가 없고, 연구 전 물리적 조사 결과 및 활력 징후 측정으로부터 뚜렷한 변화가 없었다. 두 처리군에 대한 안정성 프로파일은 유사한 것으로 보여야 한다.
약동학적 결과
모든 18 명의 피험자에서 단일 투여량의 상업적으로 입수가능한 hGH 제품 중 하나 이상 (휴마트로프TM (일라이 릴리 앤드 캄파니), 뉴트로핀TM (제넨테크), 노르디트로핀TM (노보-노르디스크), 제노트로핀TM (화이자) 및 사이젠/세로스팀TM (세로노)을 포함하며 이에 한정되지 않음)을 투여받은 후의 평균 혈청 GH 농도-시간 프로파일 (기준선 GH에 대해 미보정됨)을 측정되는 각각의 시점에서 비-천연적으로 코딩된 아미노산을 포함하는 PEG화된 hGH와 비교하였다. 모든 피험자들은 정상 생리학적 범위 내의 투여 전 기준선 GH 농도를 가져야 한다. 약동학적 매개변수를 투여 전 평균 기준선 GH 농도에 대해 보정된 혈청 데이터로부터 결정하고, Cmax 및 tmax를 결정하였다. 선택된 임상적 콤퍼레이터 (comparator)(들)에 대한 평균 tmax (휴마트로프TM (일라이 릴리 앤드 캄파니), 뉴트로핀TM (제넨테크), 노르디트로핀TM (노보-노르디스크), 제노트로핀TM (화이자), 사이젠/세로스팀TM (세로노))는 비-천연적으로 코딩된 아미노산을 포함하는 PEG화된 hGH에 대한 tmax보다 상당히 짧았다. 시험된 상업적으로 입수가능한 hGH 제품의 경우 비-천연적으로 코딩된 아미노산을 포함하는 PEG화된 hGH에 대한 최종 반감기에 비해 최종 반감기 값이 상당히 짧았다.
비록 본 발명의 연구가 건강한 남성 피험자에서 수행되지만, 유사한 흡수 특징 및 안정성 프로파일이 다른 환자 집단, 예를 들면 암 또는 만성 신부전을 앓는 남성 또는 여성 환자, 소아 신부전 환자, 자가조직 예치식 (autologous predeposit) 프로그램의 환자, 또는 선택 수술이 예정된 환자에서도 기대될 것이다.
결론적으로, 피하 투여된 단일 투여량의 비-천연적으로 코딩된 아미노산을 포함하는 PEG화된 hGH는 건강한 남성 피험자에 안정하고, 이러한 피험자들에 의해 잘 용인된다. 유해한 사건의 동등한 발생률, 임상 실험실 값, 활력 징후 및 물리적 조사 결과를 기초로, 상업적으로 입수가능한 형태의 hGH 및 비-천연적으로 코딩된 아미노산을 포함하는 PEG화된 hGH의 안정성 프로파일은 등가이게 된다. 비-천연적으로 코딩된 아미노산을 포함하는 PEG화된 hGH는 잠재적으로 환자 및 건강 관리 제공자들에게 큰 임상적 유용성을 제공한다.
본 명세서에 기재된 실시예 및 실시양태는 오직 예시를 위한 것이고, 이들의 다양한 변형 또는 변화가 당업자에게 제시될 것이며 본 출원의 기술사상 및 범위 및 첨부되는 청구 범위의 범위 내에 포함된다는 점이 이해된다. 본 명세서에 언급된 모든 공보, 특허 및 특허 출원은 모든 목적으로 그 전문이 본 명세서에 참고 문헌으로 인용된다.
인용된 서열
서열 번호# 서열명
1 hGH의 전장 아미노산 서열
2 hGH(이소형 I)의 성숙 아미노산 서열
3 hGH의 잔기 32-46이 결실된 20-kDa hGH 변이체
21 전장 hGH의 뉴클레오티드 서열
22 성숙 hGH의 뉴클레오티드 서열
SEQUENCE LISTING <110> Cho, Ho S Daniel, Thomas DiMarchi, Richard Hays, Anna-Maria Wilson, Troy Sim, Bee-Cheng Litzinger, David <120> Modified Human Growth Hormone Polypeptides and Their Uses <130> AMBX-0029.00PCT <150> 60/541,528 <151> 2004-02-02 <150> 60/581,314 <151> 2004-06-18 <150> 60/581,175 <151> 2004-06-18 <150> 60/580,885 <151> 2004-06-18 <150> 60/638,616 <151> 2004-12-22 <160> 22 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 217 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Ala Thr Gly Ser Arg Thr Ser Leu Leu Leu Ala Phe Gly Leu Leu 1 5 10 15 Cys Leu Pro Trp Leu Gln Glu Gly Ser Ala Phe Pro Thr Ile Pro Leu 20 25 30 Ser Arg Leu Phe Asp Asn Ala Met Leu Arg Ala His Arg Leu His Gln 35 40 45 Leu Ala Phe Asp Thr Tyr Gln Glu Phe Glu Glu Ala Tyr Ile Pro Lys 50 55 60 Glu Gln Lys Tyr Ser Phe Leu Gln Asn Pro Gln Thr Ser Leu Cys Phe 65 70 75 80 Ser Glu Ser Ile Pro Thr Pro Ser Asn Arg Glu Glu Thr Gln Gln Lys 85 90 95 Ser Asn Leu Glu Leu Leu Arg Ile Ser Leu Leu Leu Ile Gln Ser Trp 100 105 110 Leu Glu Pro Val Gln Phe Leu Arg Ser Val Phe Ala Asn Ser Leu Val 115 120 125 Tyr Gly Ala Ser Asp Ser Asn Val Tyr Asp Leu Leu Lys Asp Leu Glu 130 135 140 Glu Gly Ile Gln Thr Leu Met Gly Arg Leu Glu Asp Gly Ser Pro Arg 145 150 155 160 Thr Gly Gln Ile Phe Lys Gln Thr Tyr Ser Lys Phe Asp Thr Asn Ser 165 170 175 His Asn Asp Asp Ala Leu Leu Lys Asn Tyr Gly Leu Leu Tyr Cys Phe 180 185 190 Arg Lys Asp Met Asp Lys Val Glu Thr Phe Leu Arg Ile Val Gln Cys 195 200 205 Arg Ser Val Glu Gly Ser Cys Gly Phe 210 215 <210> 2 <211> 191 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Phe Pro Thr Ile Pro Leu Ser Arg Leu Phe Asp Asn Ala Met Leu Arg 1 5 10 15 Ala His Arg Leu His Gln Leu Ala Phe Asp Thr Tyr Gln Glu Phe Glu 20 25 30 Glu Ala Tyr Ile Pro Lys Glu Gln Lys Tyr Ser Phe Leu Gln Asn Pro 35 40 45 Gln Thr Ser Leu Cys Phe Ser Glu Ser Ile Pro Thr Pro Ser Asn Arg 50 55 60 Glu Glu Thr Gln Gln Lys Ser Asn Leu Glu Leu Leu Arg Ile Ser Leu 65 70 75 80 Leu Leu Ile Gln Ser Trp Leu Glu Pro Val Gln Phe Leu Arg Ser Val 85 90 95 Phe Ala Asn Ser Leu Val Tyr Gly Ala Ser Asp Ser Asn Val Tyr Asp 100 105 110 Leu Leu Lys Asp Leu Glu Glu Gly Ile Gln Thr Leu Met Gly Arg Leu 115 120 125 Glu Asp Gly Ser Pro Arg Thr Gly Gln Ile Phe Lys Gln Thr Tyr Ser 130 135 140 Lys Phe Asp Thr Asn Ser His Asn Asp Asp Ala Leu Leu Lys Asn Tyr 145 150 155 160 Gly Leu Leu Tyr Cys Phe Arg Lys Asp Met Asp Lys Val Glu Thr Phe 165 170 175 Leu Arg Ile Val Gln Cys Arg Ser Val Glu Gly Ser Cys Gly Phe 180 185 190 <210> 3 <211> 176 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Phe Pro Thr Ile Pro Leu Ser Arg Leu Phe Asp Asn Ala Met Leu Arg 1 5 10 15 Ala His Arg Leu His Gln Leu Ala Phe Asp Thr Tyr Gln Glu Phe Asn 20 25 30 Pro Gln Thr Ser Leu Cys Phe Ser Glu Ser Ile Pro Thr Pro Ser Asn 35 40 45 Arg Glu Glu Thr Gln Gln Lys Ser Asn Leu Glu Leu Leu Arg Ile Ser 50 55 60 Leu Leu Leu Ile Gln Ser Trp Leu Glu Pro Val Gln Phe Leu Arg Ser 65 70 75 80 Val Phe Ala Asn Ser Leu Val Tyr Gly Ala Ser Asp Ser Asn Val Tyr 85 90 95 Asp Leu Leu Lys Asp Leu Glu Glu Gly Ile Gln Thr Leu Met Gly Arg 100 105 110 Leu Glu Asp Gly Ser Pro Arg Thr Gly Gln Ile Phe Lys Gln Thr Tyr 115 120 125 Ser Lys Phe Asp Thr Asn Ser His Asn Asp Asp Ala Leu Leu Lys Asn 130 135 140 Tyr Gly Leu Leu Tyr Cys Phe Arg Lys Asp Met Asp Lys Val Glu Thr 145 150 155 160 Phe Leu Arg Ile Val Gln Cys Arg Ser Val Glu Gly Ser Cys Gly Phe 165 170 175 <210> 4 <211> 77 <212> DNA <213> Methanococcus jannaschii <400> 4 ccggcggtag ttcagcaggg cagaacggcg gactctaaat ccgcatggcg ctggttcaaa 60 tccggcccgc cggacca 77 <210> 5 <211> 88 <212> DNA <213> Halobacterium sp. NRC-1 <400> 5 cccagggtag ccaagctcgg ccaacggcga cggactctaa atccgttctc gtaggagttc 60 gagggttcga atcccttccc tgggacca 88 <210> 6 <211> 89 <212> DNA <213> Halobacterium sp. NRC-1 <400> 6 gcgagggtag ccaagctcgg ccaacggcga cggacttcct aatccgttct cgtaggagtt 60 cgagggttcg aatccctccc ctcgcacca 89 <210> 7 <211> 306 <212> PRT <213> Methanococcus jannaschii <400> 7 Met Asp Glu Phe Glu Met Ile Lys Arg Asn Thr Ser Glu Ile Ile Ser 1 5 10 15 Glu Glu Glu Leu Arg Glu Val Leu Lys Lys Asp Glu Lys Ser Ala Gly 20 25 30 Ile Gly Phe Glu Pro Ser Gly Lys Ile His Leu Gly His Tyr Leu Gln 35 40 45 Ile Lys Lys Met Ile Asp Leu Gln Asn Ala Gly Phe Asp Ile Ile Ile 50 55 60 Leu Leu Ala Asp Leu His Ala Tyr Leu Asn Gln Lys Gly Glu Leu Asp 65 70 75 80 Glu Ile Arg Lys Ile Gly Asp Tyr Asn Lys Lys Val Phe Glu Ala Met 85 90 95 Gly Leu Lys Ala Lys Tyr Val Tyr Gly Ser Thr Phe Gln Leu Asp Lys 100 105 110 Asp Tyr Thr Leu Asn Val Tyr Arg Leu Ala Leu Lys Thr Thr Leu Lys 115 120 125 Arg Ala Arg Arg Ser Met Glu Leu Ile Ala Arg Glu Asp Glu Asn Pro 130 135 140 Lys Val Ala Glu Val Ile Tyr Pro Ile Met Gln Val Asn Thr Tyr Tyr 145 150 155 160 Tyr Leu Gly Val Asp Val Ala Val Gly Gly Met Glu Gln Arg Lys Ile 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Arg Ala Arg Arg Ser Met Glu Leu Ile Ala Arg Glu Asp Glu Asn Pro 130 135 140 Lys Val Ala Glu Val Ile Tyr Pro Ile Met Gln Val Asn Val Ile His 145 150 155 160 Tyr Asp Gly Val Asp Val Ala Val Gly Gly Met Glu Gln Arg Lys Ile 165 170 175 His Met Leu Ala Arg Glu Leu Leu Pro Lys Lys Val Val Cys Ile His 180 185 190 Asn Pro Val Leu Thr Gly Leu Asp Gly Glu Gly Lys Met Ser Ser Ser 195 200 205 Lys Gly Asn Phe Ile Ala Val Asp Asp Ser Pro Glu Glu Ile Arg Ala 210 215 220 Lys Ile Lys Lys Ala Tyr Cys Pro Ala Gly Val Val Glu Gly Asn Pro 225 230 235 240 Ile Met Glu Ile Ala Lys Tyr Phe Leu Glu Tyr Pro Leu Thr Ile Lys 245 250 255 Arg Pro Glu Lys Phe Gly Gly Asp Leu Thr Val Asn Ser Tyr Glu Glu 260 265 270 Leu Glu Ser Leu Phe Lys Asn Lys Glu Leu His Pro Met Asp Leu Lys 275 280 285 Asn Ala Val Ala Glu Glu Leu Ile Lys Ile Leu Glu Pro Ile Arg Lys 290 295 300 Arg Leu 305 <210> 20 <211> 306 <212> PRT <213> Methanococcus jannaschii <400> 20 Met Asp Glu Phe Glu Met Ile Lys Arg Asn Thr Ser Glu Ile Ile Ser 1 5 10 15 Glu Glu Glu Leu Arg Glu Val Leu Lys Lys Asp Glu Lys Ser Ala Gly 20 25 30 Ile Gly Phe Glu Pro Ser Gly Lys Ile His Leu Gly His Tyr Leu Gln 35 40 45 Ile Lys Lys Met Ile Asp Leu Gln Asn Ala Gly Phe Asp Ile Ile Ile 50 55 60 Leu Leu Ala Asp Leu His Ala Tyr Leu Asn Gln Lys Gly Glu Leu Asp 65 70 75 80 Glu Ile Arg Lys Ile Gly Asp Tyr Asn Lys Lys Val Phe Glu Ala Met 85 90 95 Gly Leu Lys Ala Lys Tyr Val Tyr Gly Ser Thr Phe Gln Leu Asp Lys 100 105 110 Asp Tyr Thr Leu Asn Val Tyr Arg Leu Ala Leu Lys Thr Thr Leu Lys 115 120 125 Arg Ala Arg Arg Ser Met Glu Leu Ile Ala Arg Glu Asp Glu Asn Pro 130 135 140 Lys Val Ala Glu Val Ile Tyr Pro Ile Met Gln Val Asn Thr Tyr Tyr 145 150 155 160 Tyr Leu Gly Val Asp Val Ala Val Gly Gly Met Glu Gln Arg Lys Ile 165 170 175 His Met Leu Ala Arg Glu Leu Leu Pro Lys Lys Val Val Cys Ile His 180 185 190 Asn Pro Val Leu Thr Gly Leu Asp Gly Glu Gly Lys Met Ser Ser Ser 195 200 205 Lys Gly Asn Phe Ile Ala Val Asp Asp Ser Pro Glu Glu Ile Arg Ala 210 215 220 Lys Ile Lys Lys Ala Tyr Cys Pro Ala Gly Val Val Glu Gly Asn Pro 225 230 235 240 Ile Met Glu Ile Ala Lys Tyr Phe Leu Glu Tyr Pro Leu Thr Ile Lys 245 250 255 Arg Pro Glu Lys Phe Gly Gly Asp Leu Thr Val Asn Ser Tyr Glu Glu 260 265 270 Leu Glu Ser Leu Phe Lys Asn Lys Glu Leu His Pro Met Asp Leu Lys 275 280 285 Asn Ala Val Ala Glu Glu Leu Ile Lys Ile Leu Glu Pro Ile Arg Lys 290 295 300 Arg Leu 305 <210> 21 <211> 654 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 21 atggctacag gctcccggac gtccctgctc ctggcttttg gcctgctctg cctgccctgg 60 cttcaagagg gcagtgcctt cccaaccatt cccttatcca ggctttttga caacgctatg 120 ctccgcgccc atcgtctgca ccagctggcc tttgacacct accaggagtt tgaagaagcc 180 tatatcccaa aggaacagaa gtattcattc ctgcagaacc cccagacctc cctctgtttc 240 tcagagtcta ttccgacacc ctccaacagg gaggaaacac aacagaaatc caacctagag 300 ctgctccgca tctccctgct gctcatccag tcgtggctgg agcccgtgca gttcctcagg 360 agtgtcttcg ccaacagcct ggtgtacggc gcctctgaca gcaacgtcta tgacctccta 420 aaggacctag aggaaggcat ccaaacgctg atggggaggc tggaagatgg cagcccccgg 480 actgggcaga tcttcaagca gacctacagc aagttcgaca caaactcaca caacgatgac 540 gcactactca agaactacgg gctgctctac tgcttcagga aggacatgga caaggtcgag 600 acattcctgc gcatcgtgca gtgccgctct gtggagggca gctgtggctt ctag 654 <210> 22 <211> 576 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 22 ttcccaacca ttcccttatc caggcttttt gacaacgcta tgctccgcgc ccatcgtctg 60 caccagctgg cctttgacac ctaccaggag tttgaagaag cctatatccc aaaggaacag 120 aagtattcat tcctgcagaa cccccagacc tccctctgtt tctcagagtc tattccgaca 180 ccctccaaca gggaggaaac acaacagaaa tccaacctag agctgctccg catctccctg 240 ctgctcatcc agtcgtggct ggagcccgtg cagttcctca ggagtgtctt cgccaacagc 300 ctggtgtacg gcgcctctga cagcaacgtc tatgacctcc taaaggacct agaggaaggc 360 atccaaacgc tgatggggag gctggaagat ggcagccccc ggactgggca gatcttcaag 420 cagacctaca gcaagttcga cacaaactca cacaacgatg acgcactact caagaactac 480 gggctgctct actgcttcag gaaggacatg gacaaggtcg agacattcct gcgcatcgtg 540 cagtgccgct ctgtggaggg cagctgtggc ttctag 576

Claims (100)

  1. 서열 번호 2의 위치 35에서 비-천연적으로 코딩된 아미노산, 또는 서열 번호 1 또는 서열 번호 3에서 상응하는 아미노산에 공유 결합된 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 부분(moiety)을 포함하는 hGH 폴리펩티드로서,
    상기 비-천연적으로 코딩된 아미노산은 파라-아세틸페닐알라닌(pAF)이며, 상기 hGH 폴리펩티드는 서열 번호 1, 2 또는 3의 서열을 포함하는 것인 hGH 폴리펩티드.
  2. 제1항에 있어서, 상기 PEG는 0.1 kDa 내지 50 kDa의 분자량을 갖는 것인 hGH 폴리펩티드.
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