JP5589186B2 - 真正細菌宿主細胞における直交翻訳成分の発現システム - Google Patents

真正細菌宿主細胞における直交翻訳成分の発現システム Download PDF

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Description

（関連出願とのクロスリファレンス）
本願は米国仮特許出願第６０／７８０，９７３号（出願日２００６年３月９日）、米国仮特許出願第６０／７８３，４９７号（出願日２００６年３月１７日）、及び米国仮特許出願第６０／８５５，３３６号（出願日２００６年１０月２９日）の優先権と特典を主張し、各々言及によりその開示内容全体を全目的で本明細書に組込む。
（連邦政府支援研究開発から創出された発明の権利に関する陳述）
本発明はエネルギー省助成番号ＥＲ４６０５１として米国政府助成下に創出された。米国政府は本発明に所定の権利をもつことができる。
（発明の技術分野）
本発明は蛋白質化学、例えば翻訳生化学の分野に関する。本発明は１個以上の非天然アミノ酸を含むポリペプチドのｉｎ ｖｉｖｏ作製用組成物及び方法に関する。
蛋白質構造及び機能の研究は従来、天然アミノ酸のＲ基を使用して利用可能な化学的性質に依存している。残念ながら、細菌からヒトに至る全公知生物は同一の２０種類の標準アミノ酸をコードする（稀な例外としてセレノシステイン（例えばＢｏｃｋら，（１９９１），Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ５：５１５−２０参照）とピロリジン（例えばＳｒｉｎｉｖａｓａｎら，（２００２），Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９６：１４５９−６２参照）も挙げられる）。Ｒ基のこの限られた選択は蛋白質構造及び機能の研究を制約しており、研究は天然アミノ酸の化学的性質により制限されている。
新規物理化学的及び生物学的性質をもつ化学的に多様な非天然アミノ酸を原核生物と真核生物の両者で蛋白質にｉｎ ｖｉｖｏ部位特異的に組込む一般方法が開発されている（Ｗａｎｇら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９２，４９８−５００（２００１）；Ｃｈｉｎら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３０１，９６４−９６７（２００３）；Ｗａｎｇ ａｎｄ Ｓｃｈｕｌｔｚ，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．４４，３４−６６（２００５））。この方法は蛋白質翻訳で効率的に機能するが、宿主生物で異種ｔＲＮＡ、ＲＳ、アミノ酸又はコドンのいずれとも交差反応しない各非天然アミノ酸のユニークなコドン−ｔＲＮＡ対及び対応するアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（ａａＲＳ、又は簡単にＲＳ）に依存している。このような直交ｔＲＮＡ−ＲＳ対の使用により、ユニークな化学的（Ｗａｎｇら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ｓｃｉ．Ａｃａｄ．ＵＳＡ．１００，５６−６１（２００３））及び光化学的反応性（Ｃｈｉｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９９，１１０２０−１１０２４（２００２）；Ｗｕら，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ，１２６，１４３０６−１４３０７（２００４））をもつアミノ酸、糖鎖付加アミノ酸（Ｚｈａｎｇら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３０３，３７１−３７３（２００４））、蛍光アミノ酸（Ｗａｎｇ ａｎｄ Ｓｃｈｕｌｔｚ，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．４４：３４−６６（２００５））、金属結合アミノ酸（Ｗａｎｇ ａｎｄ Ｓｃｈｕｌｔｚ，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．４４：３４−６６（２００５））並びにレドックス活性アミノ酸（Ａｌｆｏｎｔａら，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２５：１４６６２−１４６６３（２００３））等の多数の構造的に多様なアミノ酸を遺伝的にコードすることが可能になった。大腸菌で新規アミノ酸をコードするには特定突然変異体ＭｊｔＲＮＡ−Ｔｙｒ（ＣＵＡ）−ＭｊＴｙｒＲＳ対が特に有用であった（Ｗａｎｇ ａｎｄ Ｓｃｈｕｌｔｚ，Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．８：８８３−８９０（２００１））。
Ｂｏｃｋら，（１９９１），Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ５：５１５−２０ Ｓｒｉｎｉｖａｓａｎら，（２００２），Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９６：１４５９−６２ Ｗａｎｇら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９２，４９８−５００（２００１） Ｃｈｉｎら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３０１，９６４−９６７（２００３） Ｗａｎｇ ａｎｄ Ｓｃｈｕｌｔｚ，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．４４，３４−６６（２００５） Ｗａｎｇら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ｓｃｉ．Ａｃａｄ．ＵＳＡ．１００，５６−６１（２００３） Ｃｈｉｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９９，１１０２０−１１０２４（２００２） Ｗｕら，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ，１２６，１４３０６−１４３０７（２００４） Ｚｈａｎｇら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３０３，３７１−３７３（２００４） Ａｌｆｏｎｔａら，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２５：１４６６２−１４６６３（２００３） Ｗａｎｇ ａｎｄ Ｓｃｈｕｌｔｚ，Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．８：８８３−８９０（２００１）
しかし、この技術は多様な非天然アミノ酸のｉｎ ｖｉｖｏ組込みに成功しているが、非天然アミノ酸を組込んだ突然変異体蛋白質を作製する際の発現システムの効率は最適化されておらず、セレクターコドンを抑圧するための直交システムの抑圧効率は不良な場合がある。直交翻訳系の抑圧効率を改善するための試薬を開発することが当分野で必要とされている。本発明は以下の開示から明らかなように、上記及び他の必要を満たすものである。
本発明はセレクターコドン（例えばアンバーナンセンスコドン）により遺伝的にコードされる特定部位に１個以上の非天然アミノ酸を組込んだ突然変異体蛋白質の効率的な細菌発現に有用な改良型発現ベクターシステムを提供する。これらのシステムにより、真正細菌（例えば大腸菌）における非天然アミノ酸の蛋白質組込み効率は有意に改善される。本発明の新規発現ベクター構成要素は種々の大腸菌発現ベクターバックボーン及び大腸菌株に広く適合可能であると共に、直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ又は直交サプレッサーｔＲＮＡの発現に加えて他の該当蛋白質又はｔＲＮＡの発現に容易に応用される。
本発明により利用されるこれらの直交翻訳技術は当分野で公知である。しかし、本発明は使用される特定直交翻訳成分（即ち特定直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ又は特定直交サプレッサーｔＲＮＡ）に関して如何なる点でも限定されない。実際に、本発明は直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ又はサプレッサーｔＲＮＡの発現に限定されない細菌発現ベクターシステムで広く利用される改良型組成物及び方法を提供する。
所定側面では、本発明は各種核酸構築物を提供する。これらの態様としては、例えば以下のものが挙げられる。
構築物Ａ：大腸菌プロリンｔＲＮＡ遺伝子から誘導されるプロモーター及びターミネーターヌクレオチド配列と、発現可能なヌクレオチド配列をもつ構築物であり、プロモーター及びターミネーター配列はいずれも発現可能なヌクレオチド配列と機能的に連結されており、発現可能なヌクレオチド配列はプロモーター及びターミネーターヌクレオチド配列に対して異種である。
構築物Ｂ：配列番号１３のヌクレオチド配列をもつ改変型大腸菌ｇｌｎＳプロモーターであるプロモーターヌクレオチド配列と、発現可能なヌクレオチド配列をもつ構築物であり、改変型大腸菌ｇｌｎＳプロモーターヌクレオチド配列は発現可能なヌクレオチド配列と機能的に連結されている。
所定側面では、構築物Ａ及びＢの構成要素を同一ベクターで使用し、その場合には発現可能なヌクレオチド配列は相互に異なる。
構築物Ｃ：直交ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）をコードするヌクレオチド配列と、直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ＲＳ）をコードするヌクレオチド配列をもつ構築物であり、Ｏ−ＲＳはＯ−ｔＲＮＡを非天然アミノ酸で優先的にアミノアシル化する。
構築物Ｄ：複数のｔＲＮＡ遺伝子ヌクレオチド配列を含むポリシストロン性オペロンをもつ構築物であり、少なくとも１個のｔＲＮＡ遺伝子は天然ｔＲＮＡオペロンに由来する天然ポリヌクレオチドリンカーから誘導される異種ポリヌクレオチドリンカーにより少なくとも１個の隣接ｔＲＮＡ遺伝子から分離されている。
所定態様では、構築物Ａ、Ｂ及びＣを同時に使用する場合には、Ａの発現可能なヌクレオチド配列はＯ−ｔＲＮＡをコードし、Ｂの発現可能なヌクレオチド配列はＯ−ＲＳをコードする。
これらの構築物の所定態様では、大腸菌プロリンｔＲＮＡ遺伝子は大腸菌ｐｒｏＫ、ｐｒｏＬ及びｐｒｏＭ ｔＲＮＡ遺伝子から選択される。所定態様では、大腸菌プロリンｔＲＮＡプロモーター及びターミネーター配列は夫々配列番号３２（プロモーター）及び３３（ターミネーター）に記載の大腸菌ｐｒｏＫのプロモーター及びターミネーター配列から誘導される。所定態様では、構築物Ａの発現可能なヌクレオチド配列は複数の１種以上のヌクレオチド配列を含むポリシストロン性オペロンである。所定態様では、構築物Ａの発現可能なヌクレオチド配列はｔＲＮＡをコードし、例えばｔＲＮＡは１種以上の古細菌ｔＲＮＡから誘導されるか、又はｔＲＮＡは配列番号１（ＭｊｔＲＮＡ−Ｔｙｒ（ＣＵＡ））のヌクレオチド配列によりコードされる。所定態様では、発現可能なヌクレオチド配列は配列番号１（ＭｊｔＲＮＡ−Ｔｙｒ（ＣＵＡ））の複数のヌクレオチド配列を含むポリシストロン性オペロンである。所定側面では、発現可能なヌクレオチド配列は複数のポリシストロン性オペロンである。
構築物Ｂを使用する場合には、発現可能なヌクレオチド配列はポリペプチド、例えばアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼをコードすることができる。所定側面では、構築物Ｂの発現可能なヌクレオチド配列は直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ＲＳ）をコードし、前記Ｏ−ＲＳは対応するＯ−ｔＲＮＡを非天然アミノ酸で優先的にアミノアシル化する。所定側面では、Ｏ−ＲＳはＭｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ ｊａｎｎａｓｃｈｉｉアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ、例えばＭｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ ｊａｎｎａｓｃｈｉｉチロシルｔＲＮＡシンテターゼから誘導される。これらの側面では、場合によりＯ−ＲＳは配列番号２に記載の野生型Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ ｊａｎｎａｓｃｈｉｉチロシルｔＲＮＡシンテターゼ（野生型Ｍｊ−ｔＲＮＡ−Ｔｙｒ ＲＳ）のアミノ酸配列に対してアミノ酸２８６位又は２８６位に類似する位置にアスパラギン酸→アルギニン置換をもつ。
本発明のこれらの構築物は宿主細胞、例えば大腸菌細胞等の真正細菌宿主細胞で使用することができる。
構築物Ｄを使用する場合には、ポリシストロン性オペロンは複数の同一の異種ポリヌクレオチドリンカーを含むことができる。これらの場合の所定の例では、異種ポリヌクレオチドリンカーの少なくとも２個は相互に異なる。Ｄのこのポリシストロン性オペロンは複数の異種ポリヌクレオチドリンカーを含むことができる。所定態様では、Ｄの異種ポリヌクレオチドリンカーは５’末端チミジンヌクレオチド、３’末端アデノシンヌクレオチド、又は５’末端チミジンヌクレオチドと３’末端アデノシンヌクレオチドの両者を含むことができる。異種ポリヌクレオチドリンカーはｖａｌＵとｖａｌＸ；ｉｌｅＴとａｌａＴ；ｓｅｒＶとａｒｇＶ；ｖａｌＶとｖａｌＷ；ｇｌｙＴとｔｈｒＴ；ｍｅｔＴとｌｅｕＷ；ｇｌｎＷとｍｅｔＵ；ｈｉｓＲとｌｅｕＴ；ｇｌｎＵとｇｌｎＷ；ｌｅｕＰとｌｅｕＶ；ｇｌｎＶとｇｌｎＸ；ａｌａＷとａｌａＸ；ｉｌｅＵとａｌａＵ；ｉｌｅＶとａｌａＶ；ｍｅｔＵとｇｌｎＶ；ｇｌｙＷとｃｙｓＴ；ａｒｇＸとｈｉｓＲ；及びａｒｇＹとａｒｇＺから選択される内在大腸菌ｔＲＮＡ遺伝子間に位置する天然ポリヌクレオチドリンカーから誘導することができる。所定側面では、Ｄの異種ポリヌクレオチドリンカーは配列番号１４（ｖａｌＵ／ｖａｌＸリンカー）又は１５（ｉｌｅＴ／ａｌａＴリンカー）のヌクレオチド配列から誘導される。
他の側面では、本発明は少なくとも１個の非天然アミノ酸を特定位置に組込んだ該当ポリペプチドの発現用翻訳系を提供する。本発明のこれらの系は、
（ａ）非天然アミノ酸と；
（ｂ）直交ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）をコードするヌクレオチド配列と、Ｏ−ｔＲＮＡを非天然アミノ酸で優先的にアミノアシル化する直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ＲＳ）をコードするヌクレオチド配列を含む核酸構築物と；
（ｃ）該当ポリペプチドをコードし、Ｏ−ｔＲＮＡにより認識される少なくとも１個のセレクターコドンを含むポリヌクレオチドであって、ポリヌクレオチドが発現されると、ポリヌクレオチドにおけるセレクターコドンの位置がポリペプチドを生産するようにポリペプチドにおける非天然アミノ酸の特定位置を制御するように構成された前記ポリヌクレオチドを含む。
本発明のこれらの系では、核酸構築物は以下の任意１種以上の構成要素を含むことができる。
（１）大腸菌プロリンｔＲＮＡ遺伝子から誘導されるプロモーター及びターミネーターヌクレオチド配列（ここで、プロモーター及びターミネーター配列はいずれもＯ−ｔＲＮＡを含むか又はコードするヌクレオチド配列と機能的に連結されており、Ｏ−ｔＲＮＡはプロモーター及びターミネーターヌクレオチド配列に対して異種である）；
（２）配列番号１３のヌクレオチド配列をもつ改変型大腸菌ｇｌｎＳプロモーターに対応するヌクレオチド配列（ここで、改変型大腸菌ｇｌｎＳヌクレオチド配列はＯ−ＲＳをコードするヌクレオチド配列と機能的に連結されている）；又は
（３）複数のＯ−ｔＲＮＡ遺伝子ヌクレオチド配列を含み、少なくとも１個のＯ−ｔＲＮＡ遺伝子が天然ｔＲＮＡオペロンに由来する天然ポリヌクレオチドリンカーから誘導される異種ポリヌクレオチドリンカーにより少なくとも１個の隣接Ｏ−ｔＲＮＡ遺伝子から分離されているポリシストロン性オペロン。
これらの系では、大腸菌プロリンｔＲＮＡ遺伝子は大腸菌ｐｒｏＫ、ｐｒｏＬ及びｐｒｏＭ ｔＲＮＡ遺伝子から選択することができる。大腸菌プロリンｔＲＮＡプロモーター及びターミネーター配列は夫々配列番号３２（プロモーター）及び３３（ターミネーター）に記載の大腸菌ｐｒｏＫのプロモーター及びターミネーター配列から誘導することができる。ポリシストロン性オペロンは複数の同一の異種ポリヌクレオチドリンカーを含むことができ、例えば異種ポリヌクレオチドリンカーの少なくとも２個は相互に異なる。これらの系では、異種ポリヌクレオチドリンカーは５’末端チミジンヌクレオチド、又は３’末端アデノシンヌクレオチド、又は５’末端チミジンヌクレオチドと３’末端アデノシンヌクレオチドの両者を含むことができる。異種ポリヌクレオチドリンカーはｖａｌＵとｖａｌＸ；ｉｌｅＴとａｌａＴ；ｓｅｒＶとａｒｇＶ；ｖａｌＶとｖａｌＷ；ｇｌｙＴとｔｈｒＴ；ｍｅｔＴとｌｅｕＷ；ｇｌｎＷとｍｅｔＵ；ｈｉｓＲとｌｅｕＴ；ｇｌｎＵとｇｌｎＷ；ｌｅｕＰとｌｅｕＶ；ｇｌｎＶとｇｌｎＸ；ａｌａＷとａｌａＸ；ｉｌｅＵとａｌａＵ；ｉｌｅＶとａｌａＶ；ｍｅｔＵとｇｌｎＶ；ｇｌｙＷとｃｙｓＴ；ａｒｇＸとｈｉｓＲ；及びａｒｇＹとａｒｇＺから選択される内在大腸菌ｔＲＮＡ遺伝子間に位置する天然ポリヌクレオチドリンカーから誘導することができる。所定側面では、異種ポリヌクレオチドリンカーは配列番号１４（ｖａｌＵ／ｖａｌＸリンカー）又は１５（ｉｌｅＴ／ａｌａＴリンカー）のヌクレオチド配列から誘導される。
これらの系では、Ｏ−ｔＲＮＡは１種以上の古細菌ｔＲＮＡから誘導することができる。系の所定の側面では、Ｏ−ｔＲＮＡをコードする前記ヌクレオチド配列はＯ−ｔＲＮＡをコードする複数のヌクレオチド配列を含むポリシストロン性オペロンである。所定側面では、Ｏ−ｔＲＮＡをコードする前記ヌクレオチド配列は配列番号１（ＭｊｔＲＮＡ−Ｔｙｒ（ＣＵＡ））のヌクレオチド配列を含む。系の他の側面では、Ｏ−ｔＲＮＡをコードするヌクレオチド配列は配列番号１（ＭｊｔＲＮＡ−Ｔｙｒ（ＣＵＡ））の複数のヌクレオチド配列を含むポリシストロン性オペロンである。
他の側面では、翻訳系はＭｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ ｊａｎｎａｓｃｈｉｉアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ、例えばＭｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ ｊａｎｎａｓｃｈｉｉチロシルｔＲＮＡシンテターゼから誘導されるＯ−ＲＳを利用することができる。所定側面では、このＯ−ＲＳは配列番号２に記載の野生型Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ ｊａｎｎａｓｃｈｉｉチロシルｔＲＮＡシンテターゼ（野生型Ｍｊ−ｔＲＮＡＴｙｒＲＳ）のアミノ酸配列に対してアミノ酸２８６位又は２８６位に類似する位置にアスパラギン酸→アルギニン置換をもつ。
この系の所定側面では、成分は宿主細胞、例えば大腸菌細胞等の真正細菌宿主細胞に含まれる。
他の側面では、本発明は少なくとも１個の非天然アミノ酸を特定位置に組込んだ該当ポリペプチドを宿主細胞で作製する方法を提供する。これらの方法は、
（ａ）（ｉ）非天然アミノ酸と；（ｉｉ）直交ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）をコードするヌクレオチド配列と、Ｏ−ｔＲＮＡを非天然アミノ酸で優先的にアミノアシル化する直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ＲＳ）をコードするヌクレオチド配列を含む核酸構築物と；（ｉｉｉ）該当ポリペプチドをコードし、Ｏ−ｔＲＮＡにより認識される少なくとも１個のセレクターコドンを含み、セレクターコドンの位置が該当ポリペプチドにおける非天然アミノ酸の特定位置に相関するポリヌクレオチドと；（ｉｖ）（ｉ）、（ｉｉ）及び（ｉｉｉ）を含む宿主細胞を準備する段階と；
（ｂ）宿主細胞を増殖させる段階と；
（ｃ）宿主細胞でポリペプチドの翻訳中にポリペプチドの特定位置に非天然アミノ酸を組込むことにより、非天然アミノ酸を特定位置に組込んだ該当ポリペプチドを作製する段階を含む。
これらの方法では、Ｏ−ｔＲＮＡは１種以上の古細菌ｔＲＮＡから誘導することができる。前記方法で使用される構築物は１種以上のＯ−ｔＲＮＡ種をコードする複数のヌクレオチド配列を含むポリシストロン性オペロンを利用することができる。使用されるＯ−ｔＲＮＡは配列番号１（ＭｊｔＲＮＡ−Ｔｙｒ（ＣＵＡ））のヌクレオチド配列を含むことができ、あるいは配列番号１（ＭｊｔＲＮＡ−Ｔｙｒ（ＣＵＡ））の複数のヌクレオチド配列を含むポリシストロン性オペロンを含むことができる。この方法の所定側面では、Ｏ−ＲＳはＭｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ ｊａｎｎａｓｃｈｉｉアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ例えばＭｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ ｊａｎｎａｓｃｈｉｉチロシルｔＲＮＡシンテターゼから誘導することができる。所定側面では、Ｏ−ＲＳは配列番号２に記載の野生型Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ ｊａｎｎａｓｃｈｉｉチロシルｔＲＮＡシンテターゼ（野生型Ｍｊ−ｔＲＮＡＴｙｒＲＳ）のアミノ酸配列に対してアミノ酸２８６位又は２８６位に類似する位置にアスパラギン酸→アルギニン置換をもつ。
これらのポリペプチド作製方法は各種核酸構築物を利用することができ、構築物は
（Ｉ）大腸菌プロリンｔＲＮＡ遺伝子から誘導されるプロモーター及びターミネーターヌクレオチド配列（ここで、プロモーター及びターミネーター配列はいずれもＯ−ｔＲＮＡをコードするヌクレオチド配列と機能的に連結されており、Ｏ−ｔＲＮＡをコードするヌクレオチド配列はプロモーター及びターミネーターヌクレオチド配列に対して異種である）；
（ＩＩ）配列番号１３のヌクレオチド配列をもつ改変型大腸菌ｇｌｎＳプロモーターに対応するヌクレオチド配列（ここで、改変型大腸菌ｇｌｎＳヌクレオチド配列はＯ−ＲＳをコードするヌクレオチド配列と機能的に連結されている）；並びに
（ＩＩＩ）複数のＯ−ｔＲＮＡ遺伝子ヌクレオチド配列を含み、少なくとも１個のＯ−ｔＲＮＡ遺伝子が天然ｔＲＮＡオペロンに由来する天然ポリヌクレオチドリンカーから誘導される異種ポリヌクレオチドリンカーにより少なくとも１個の隣接Ｏ−ｔＲＮＡ遺伝子から分離されているポリシストロン性オペロン
のいずれも使用することができる。
（Ｉ）を使用する場合には、大腸菌プロリンｔＲＮＡ遺伝子は大腸菌ｐｒｏＫ、ｐｒｏＬ及びｐｒｏＭ ｔＲＮＡ遺伝子から選択することができる。大腸菌ｐｒｏＫを使用する場合には、配列番号３２（プロモーター）と３３（ターミネーター）を利用することができる。
（ＩＩＩ）のポリシストロン性オペロンを使用する場合には、複数の同一の異種ポリヌクレオチドリンカーを利用することができ、あるいは異種ポリヌクレオチドリンカーの少なくとも２個は相互に異なる。所定側面では、（ＩＩＩ）のポリシストロン性オペロンは５’末端チミジンヌクレオチド、３’末端アデノシンヌクレオチド、又は５’末端チミジンヌクレオチドと３’末端アデノシンヌクレオチドの両者を使用する。更に、異種ポリヌクレオチドリンカーはｖａｌＵとｖａｌＸ；ｉｌｅＴとａｌａＴ；ｓｅｒＶとａｒｇＶ；ｖａｌＶとｖａｌＷ；ｇｌｙＴとｔｈｒＴ；ｍｅｔＴとｌｅｕＷ；ｇｌｎＷとｍｅｔＵ；ｈｉｓＲとｌｅｕＴ；ｇｌｎＵとｇｌｎＷ；ｌｅｕＰとｌｅｕＶ；ｇｌｎＶとｇｌｎＸ；ａｌａＷとａｌａＸ；ｉｌｅＵとａｌａＵ；ｉｌｅＶとａｌａＶ；ｍｅｔＵとｇｌｎＶ；ｇｌｙＷとｃｙｓＴ；ａｒｇＸとｈｉｓＲ；及びａｒｇＹとａｒｇＺから選択される内在大腸菌ｔＲＮＡ遺伝子間に位置する天然ポリヌクレオチドリンカーから誘導することができる。特に、配列番号１４（ｖａｌＵ／ｖａｌＸリンカー）又は１５（ｉｌｅＴ／ａｌａＴリンカー）のヌクレオチド配列を使用することができる。所定側面では、宿主細胞は真正細菌宿主細胞、例えば大腸菌宿主細胞である。
他の側面では、本発明は非天然アミノ酸を組込んだ蛋白質の作製方法を提供する。これらの方法は本発明の新規ベクターシステムを使用し、非天然アミノ酸を組込んだ蛋白質の作製を改善することができる。少なくとも１個の非天然アミノ酸を特定位置に組込んだ該当ポリペプチドを作製するためのこれらの方法は宿主細胞で実施され、
（ａ）（ｉ）非天然アミノ酸と；
（ｉｉ）直交ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）をコードするヌクレオチド配列を含む核酸構築物と；
（ｉｉｉ）Ｏ−ｔＲＮＡを非天然アミノ酸で優先的にアミノアシル化する直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ＲＳ）をコードするヌクレオチド配列を含む核酸構築物と；
（ｉｖ）該当ポリペプチドをコードし、Ｏ−ｔＲＮＡにより認識される少なくとも１個のセレクターコドンを含み、セレクターコドンの位置が該当ポリペプチドにおける非天然アミノ酸の特定位置に相関するポリヌクレオチドと；
（ｖ）（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）及び（ｉｖ）を含む宿主細胞を準備する段階を含む。
これらの方法では、（ｉｉ）及び（ｉｉｉ）の核酸構築物が以下の３種の構成要素：
（Ｉ）大腸菌プロリンｔＲＮＡ遺伝子から誘導されるプロモーター及びターミネーターヌクレオチド配列（ここで、プロモーター及びターミネーター配列はいずれもＯ−ｔＲＮＡをコードするヌクレオチド配列と機能的に連結されており、Ｏ−ｔＲＮＡをコードするヌクレオチド配列はプロモーター及びターミネーターヌクレオチド配列に対して異種である）；
（ＩＩ）配列番号１３のヌクレオチド配列をもつ改変型大腸菌ｇｌｎＳプロモーターに対応するプロモーターヌクレオチド配列（ここで、改変型大腸菌ｇｌｎＳヌクレオチド配列はＯ−ＲＳをコードするヌクレオチド配列と機能的に連結されている）；並びに
（ＩＩＩ）複数のＯ−ｔＲＮＡ遺伝子ヌクレオチド配列を含み、少なくとも１個のＯ−ｔＲＮＡ遺伝子が天然ｔＲＮＡオペロンに由来する天然ポリヌクレオチドリンカーから誘導される異種ポリヌクレオチドリンカーにより少なくとも１個の隣接Ｏ−ｔＲＮＡ遺伝子から分離されているポリシストロン性オペロン
のうちの少なくとも１種を集合的に含むことが必要である。
本方法は（ｂ）宿主細胞を増殖させ；（ｃ）宿主細胞でポリペプチドの翻訳中にポリペプチドの特定位置に非天然アミノ酸を組込むことにより、非天然アミノ酸を特定位置に組込んだ該当ポリペプチドを作製することにより実施される。
場合により、Ｏ−ｔＲＮＡをコードするヌクレオチド配列は１種以上の古細菌ｔＲＮＡから誘導される。Ｏ−ｔＲＮＡは１種以上のＯ−ｔＲＮＡ種をコードする複数のヌクレオチド配列を含むポリシストロン性オペロンとして準備することができる。所定側面では、Ｏ−ｔＲＮＡをコードするヌクレオチド配列は配列番号１（ＭｊｔＲＮＡ−Ｔｙｒ（ＣＵＡ））のヌクレオチド配列を含む。ポリシストロン性オペロンは場合により配列番号１（ＭｊｔＲＮＡ−Ｔｙｒ（ＣＵＡ））の複数のヌクレオチド配列を利用することができる。
他の側面では、Ｏ−ＲＳはＭｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ ｊａｎｎａｓｃｈｉｉチロシルｔＲＮＡシンテターゼ等のＭｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ ｊａｎｎａｓｃｈｉｉアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼから誘導される。場合により、Ｏ−ＲＳは配列番号２に記載の野生型Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ ｊａｎｎａｓｃｈｉｉチロシルｔＲＮＡシンテターゼ（野生型Ｍｊ−ｔＲＮＡＴｙｒＲＳ）のアミノ酸配列に対してアミノ酸２８６位又は２８６位に類似する位置にアスパラギン酸→アルギニン置換をもつ。
これらの方法の他の態様では、（Ｉ）の核酸構築物は大腸菌ｐｒｏＫ、ｐｒｏＬ及びｐｒｏＭ ｔＲＮＡから選択される大腸菌プロリンｔＲＮＡを含む。更に、（Ｉ）の構築物は夫々配列番号３２（プロモーター）及び３３（ターミネーター）に記載の大腸菌ｐｒｏＫのプロモーター及びターミネーター配列を使用することができる。
他の態様では、（ＩＩＩ）の核酸構築物は複数の同一の異種ポリヌクレオチドリンカーを使用する。場合により、異種ポリヌクレオチドリンカーの少なくとも２個は相互に異なる。
場合により、これらの方法における（ＩＩＩ）のポリシストロン性オペロンは５’末端チミジンヌクレオチド、３’末端アデノシンヌクレオチド、又は５’末端チミジンヌクレオチドと３’末端アデノシンヌクレオチドの両者を使用する。この場合に使用する異種ポリヌクレオチドリンカーはｖａｌＵとｖａｌＸ；ｉｌｅＴとａｌａＴ；ｓｅｒＶとａｒｇＶ；ｖａｌＶとｖａｌＷ；ｇｌｙＴとｔｈｒＴ；ｍｅｔＴとｌｅｕＷ；ｇｌｎＷとｍｅｔＵ；ｈｉｓＲとｌｅｕＴ；ｇｌｎＵとｇｌｎＷ；ｌｅｕＰとｌｅｕＶ；ｇｌｎＶとｇｌｎＸ；ａｌａＷとａｌａＸ；ｉｌｅＵとａｌａＵ；ｉｌｅＶとａｌａＶ；ｍｅｔＵとｇｌｎＶ；ｇｌｙＷとｃｙｓＴ；ａｒｇＸとｈｉｓＲ；及びａｒｇＹとａｒｇＺから選択される内在大腸菌ｔＲＮＡ遺伝子間に位置する天然ポリヌクレオチドリンカーから誘導することができる。例えば、異種ポリヌクレオチドリンカーは配列番号１４（ｖａｌＵ／ｖａｌＸリンカー）又は１５（ｉｌｅＴ／ａｌａＴリンカー）のヌクレオチド配列から誘導することができる。場合により、これらの方法は大腸菌等の真正細菌宿主細胞で実施される。
他の側面では、本発明は更に少なくとも１個の非天然アミノ酸を特定位置に組込んだ該当ポリペプチドの発現用翻訳系を提供する。本質的に、これらの系は、
（ａ）非天然アミノ酸と；
（ｂ）直交ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）をコードするヌクレオチド配列と、Ｏ−ｔＲＮＡを非天然アミノ酸で優先的にアミノアシル化する直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ＲＳ）をコードするヌクレオチド配列を含む核酸構築物と；
（ｃ）該当ポリペプチドをコードし、Ｏ−ｔＲＮＡにより認識される少なくとも１個のセレクターコドンを含むポリヌクレオチドであって、ポリヌクレオチドが発現されると、ポリヌクレオチドにおけるセレクターコドンの位置がポリペプチドを生産するようにポリペプチドにおける非天然アミノ酸の特定位置を制御するように構成された前記ポリヌクレオチドを含む。
場合により、これらの系成分を宿主細胞に組込む。
更に他の態様では、本発明は少なくとも１個の非天然アミノ酸を特定位置に組込んだ該当ポリペプチドの作製方法を提供する。本質的に、これらの方法は
（ａ）（ｉ）非天然アミノ酸と；
（ｉｉ）直交ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）をコードするヌクレオチド配列と、Ｏ−ｔＲＮＡを非天然アミノ酸で優先的にアミノアシル化する直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ＲＳ）をコードするヌクレオチド配列を含む核酸構築物と；
（ｉｉｉ）該当ポリペプチドをコードし、Ｏ−ｔＲＮＡにより認識される少なくとも１個のセレクターコドンを含み、セレクターコドンの位置が該当ポリペプチドにおける非天然アミノ酸の特定位置に相関するポリヌクレオチドと；
（ｉｖ）（ｉ）、（ｉｉ）及び（ｉｉｉ）を含む宿主細胞を含む翻訳系を準備する段階を使用する。
これらの方法は更に、（ｂ）宿主細胞を増殖させる段階と；（ｃ）宿主細胞でポリペプチドの翻訳中にポリペプチドの特定位置に非天然アミノ酸を組込むことにより、非天然アミノ酸を特定位置に組込んだ該当ポリペプチドを作製する段階を必要とする。
（定義）
本発明を詳細に記載する前に、本発明は特定生物系に限定されず、当然のことながら種々のものに適用できると理解すべきである。同様に、本明細書で使用する用語は特定態様のみの記載を目的とし、限定的でないことも理解すべきである。本明細書と特許請求の範囲で使用する単数形はそうでないことが内容から明白である場合を除き、複数形も含む。従って、例えば「細胞」と言う場合には２個以上の細胞の組合せを含み、「ポリヌクレオチド」と言う場合には実際問題としてそのポリヌクレオチドの多数のコピーを含む。
本欄及び以下に特に定義しない限り、本明細書で使用する全科学技術用語は本発明が属する分野の当業者に通常理解されている通りの意味をもつ。明細書及び特許請求の範囲における本発明の記載では、以下の用語は下記定義に従って使用される。
直交：本明細書で使用する「直交」なる用語は細胞又は翻訳系に内在する対応分子に比較して低効率で細胞の内在成分と共働するか、あるいは細胞の内在成分と共働できない分子（例えば直交ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）及び／又は直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ＲＳ））を意味する。ｔＲＮＡ及びアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼに関して直交とは、内在ｔＲＮＡが内在ｔＲＮＡシンテターゼと共働する能力に比較して直交ｔＲＮＡが内在ｔＲＮＡシンテターゼと共働できないか又は低効率（例えば２０％未満、１０％未満、５％未満、又は１％未満の効率）でしか共働できず、あるいは、内在ｔＲＮＡシンテターゼが内在ｔＲＮＡと共働する能力に比較して直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼが内在ｔＲＮＡと共働できないか又は低効率でしか共働できないことを意味する。直交分子は細胞内に機能的に正常な相補的内在分子をもたない。例えば、細胞中の直交ｔＲＮＡがこの細胞の任意内在ＲＳによりアミノアシル化される効率は内在ｔＲＮＡが内在ＲＳによりアミノアシル化される効率に比較して低いか又はゼロである。別の例では、直交ＲＳが該当細胞の任意内在ｔＲＮＡをアミノアシル化する効率は内在ｔＲＮＡが内在ＲＳによりアミノアシル化される効率に比較して低いか又はゼロである。第１の直交分子と共働する第２の直交分子を細胞に導入することができる。例えば、直交ｔＲＮＡ／ＲＳ対は対照（例えば対応するｔＲＮＡ／ＲＳ内在対、又は活性直交対（例えばチロシル直交ｔＲＮＡ／ＲＳ対））の効率に比較して所定の効率（例えば４５％の効率、５０％の効率、６０％の効率、７０％の効率、７５％の効率、８０％の効率、９０％の効率、９５％の効率、又は９９％以上の効率）で細胞において共働する導入相補成分を含む。
直交チロシルｔＲＮＡ：本明細書で使用する直交チロシルｔＲＮＡ（チロシル−Ｏ−ｔＲＮＡ）とは該当翻訳系に直交性のｔＲＮＡであり、ｔＲＮＡは（１）天然に存在するチロシルｔＲＮＡと同一であるか又は実質的に類似しているか、（２）自然又は人工突然変異誘発により天然に存在するチロシルｔＲＮＡから誘導されるか、（３）（１）又は（２）の野生型又は突然変異体チロシルｔＲＮＡ配列の配列を考慮する任意プロセスにより誘導されるか、（４）野生型又は突然変異体チロシルｔＲＮＡと相同であるか；（５）チロシルｔＲＮＡシンテターゼ（例えば配列番号２、４、６、８又は１０のシンテターゼ）の基質として指定する任意特定ｔＲＮＡと相同であるか、あるいは（６）例えば配列番号１のＯ−ｔＲＮＡでチロシルｔＲＮＡシンテターゼの基質として指定する任意特定ｔＲＮＡの保存変異体である。チロシルｔＲＮＡはアミノ酸を負荷した状態でも負荷しない状態でも存在することができる。更に当然のことながら、「チロシル−Ｏ−ｔＲＮＡ」は場合によりコグネイトシンテターゼにより夫々チロシン又はロイシン以外のアミノ酸（例えば非天然アミノ酸）を負荷（アミノアシル化）される。実際に、当然のことながら、本発明のチロシル−Ｏ−ｔＲＮＡは翻訳中にセレクターコドンに応答して成長中のポリペプチドに天然又は人工のいずれかに拘わらずほぼ任意アミノ酸を挿入するために有利に使用される。
直交チロシルアミノ酸シンテターゼ：本明細書で使用する直交チロシルアミノ酸シンテターゼ（チロシル−Ｏ−ＲＳ）とは該当翻訳系においてチロシル−Ｏ−ｔＲＮＡをアミノ酸で優先的にアミノアシル化する酵素である。チロシル−Ｏ−ＲＳがチロシル−Ｏ−ｔＲＮＡに負荷するアミノ酸は天然、非天然又は人工のいずれかを問わずに任意アミノ酸とすることができ、本発明では限定しない。シンテターゼは場合により天然に存在するチロシルアミノ酸シンテターゼと同一又は相同であるか、あるいは例えば配列番号４、６、８又は１０にＯ−ＲＳとして指定するシンテターゼと同一又は相同である。例えば、Ｏ−ＲＳは配列番号４、６、８又は１０のチロシル−Ｏ−ＲＳの保存変異体とすることができ、及び／又は配列番号４、６、８又は１０のＯ−ＲＳと配列が少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、９９％又はそれ以上一致するものを利用できる。
コグネイト：「コグネイト」なる用語は共働する成分、例えば直交ｔＲＮＡと直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼを意味する。これらの成分は相補的と言う場合もある。
優先的にアミノアシル化する：本明細書で直交翻訳系に関して使用する場合に、Ｏ−ＲＳはＯ−ＲＳが発現系で任意内在ｔＲＮＡに負荷するよりも効率的にＯ−ｔＲＮＡにアミノ酸を負荷するときにコグネイトＯ−ｔＲＮＡを「優先的にアミノアシル化する」。即ち、Ｏ−ｔＲＮＡと所与の任意内在ｔＲＮＡがほぼ等モル比で翻訳系に存在するとき、Ｏ−ＲＳは内在ｔＲＮＡに負荷するよりも高頻度でＯ−ｔＲＮＡに負荷する。Ｏ−ＲＳにより負荷されるＯ−ｔＲＮＡとＯ−ＲＳにより負荷される内在ｔＲＮＡの相対比は高いことが好ましく、従って、Ｏ−ｔＲＮＡと内在ｔＲＮＡが等モル濃度で翻訳系に存在する場合にはＯ−ＲＳはＯ−ｔＲＮＡに排他的、又はほぼ排他的に負荷することが好ましい。Ｏ−ｔＲＮＡとＯ−ＲＳが等モル濃度で存在する場合にＯ−ＲＳにより負荷されるＯ−ｔＲＮＡと内在ｔＲＮＡの相対比は１：１を上回り、好ましくは少なくとも約２：１、より好ましくは５：１、更に好ましくは１０：１、更に好ましくは２０：１、更に好ましくは５０：１、更に好ましくは７５：１、更に好ましくは９５：１、９８：１、９９：１、１００：１、５００：１、１，０００：１、５，０００：１又はそれ以上である。
（ａ）Ｏ−ＲＳが内在ｔＲＮＡに比較してＯ−ｔＲＮＡを優先的にアミノアシル化するとき、及び（ｂ）Ｏ−ＲＳがＯ−ｔＲＮＡを任意天然アミノ酸でアミノアシル化する場合に比較してそのアミノアシル化が非天然アミノ酸に特異的であるときにＯ−ＲＳは「Ｏ−ｔＲＮＡを非天然アミノ酸で優先的にアミノアシル化する」。即ち、非天然アミノ酸と天然アミノ酸がＯ−ＲＳとＯ−ｔＲＮＡを含む翻訳系に等モル量で存在するとき、Ｏ−ＲＳは天然アミノ酸よりも高頻度で非天然アミノ酸をＯ−ｔＲＮＡに負荷する。非天然アミノ酸を負荷されたＯ−ｔＲＮＡと天然アミノ酸を負荷されたＯ−ｔＲＮＡの相対比は高いことが好ましい。Ｏ−ＲＳはＯ−ｔＲＮＡに排他的、又はほぼ排他的に非天然アミノ酸を負荷することがより好ましい。天然アミノ酸と非天然アミノ酸の両者が等モル濃度で翻訳系に存在するとき、Ｏ−ｔＲＮＡの非天然アミノ酸負荷とＯ−ｔＲＮＡの天然アミノ酸負荷の相対比は１：１を上回り、好ましくは少なくとも約２：１、より好ましくは５：１、更に好ましくは１０：１、更に好ましくは２０：１、更に好ましくは５０：１、更に好ましくは７５：１、更に好ましくは９５：１、９８：１、９９：１、１００：１、５００：１、１，０００：１、５，０００：１又はそれ以上である。
セレクターコドン：「セレクターコドン」なる用語は翻訳プロセスでＯ−ｔＲＮＡにより認識され、内在ｔＲＮＡにより認識されないコドンを意味する。Ｏ−ｔＲＮＡアンチコドンループはｍＲＮＡ上のセレクターコドンを認識し、そのアミノ酸（例えば非天然アミノ酸）をポリペプチドのこの部位に組込む。セレクターコドンとしては例えば終止コドン（例えばアンバー、オーカー及びオパールコドン）等のナンセンスコドン、４塩基以上のコドン、レアコドン、天然又は非天然塩基対から誘導されるコドン及び／又は同等物を挙げることができる。
サプレッサーｔＲＮＡ：サプレッサーｔＲＮＡは例えばセレクターコドンに応答してポリペプチド鎖にアミノ酸を組込むためのメカニズムを提供することにより、所与翻訳系でメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の読取りを変更するｔＲＮＡである。例えば、サプレッサーｔＲＮＡは例えば終止コドン（例えばアンバー、オーカー又はオパールコドン）、４塩基コドン、レアコドン等を読み飛ばすことができる。
抑圧活性：本明細書で使用する「抑圧活性」なる用語は一般に、読み飛ばさないと翻訳終結又は誤訳（例えばフレームシフト）をもたらすコドン（例えばアンバーコドンや４塩基以上のコドンであるセレクターコドン）の翻訳読み飛ばしを行うｔＲＮＡ（例えばサプレッサーｔＲＮＡ）の能力を意味する。サプレッサーｔＲＮＡの抑圧活性は第２のサプレッサーｔＲＮＡ又は対照系（例えばＯ−ＲＳをもたない対照系）に比較して観測される翻訳読み飛ばし活性の百分率として表すことができる。
本発明は抑圧活性を定量することが可能な種々の方法を提供する。該当セレクターコドン（例えばアンバーコドン）に対する特定Ｏ−ｔＲＮＡ及びＯ−ＲＳの抑圧百分率とは、Ｏ−ｔＲＮＡ、Ｏ−ＲＳ及びセレクターコドンをもたない陽性対照構築物に比較して、Ｏ−ＲＳとＯ−ｔＲＮＡを含む該当翻訳系で発現され、そのコーディング核酸中にセレクターコドンを含む所与試験マーカー（例えばＬａｃＺ）の活性百分率を意味する。従って、例えば、セレクターコドンをもたない活性陽性対照マーカー構築物が所与翻訳系において該当マーカーアッセイに関連する単位で表した観測活性Ｘをもつ場合には、セレクターコドンを含む試験構築物の抑圧百分率は、Ｏ−ｔＲＮＡとＯ−ＲＳを更に含む翻訳系で発現される以外は陽性対照マーカーが発現される環境条件とほぼ同一の環境条件下で試験マーカー構築物が示すＸの百分率である。一般に、試験マーカーを発現する翻訳系は更にＯ−ＲＳとＯ−ｔＲＮＡにより認識されるアミノ酸を含む。場合により、抑圧百分率測定値は、Ｏ−ｔＲＮＡ、Ｏ−ＲＳ及び／又はＯ−ｔＲＮＡ及び／又はＯ−ＲＳにより認識される該当アミノ酸を含まない系で試験マーカーと同一のセレクターコドンを含む「バックグラウンド」又は「陰性」対照マーカー構築物に試験マーカーを比較することにより精密化することができる。この陰性対照は該当翻訳系におけるマーカーからのバックグラウンドシグナル効果を考慮するように抑圧百分率測定値を正規化するのに有用である。
抑圧効率は当分野で公知の多数のアッセイの任意のものにより測定することができる。例えば、β−ガラクトシダーゼレポーターアッセイを使用することができ、例えば本発明のＯ−ｔＲＮＡを含むプラスミドと共に修飾ｌａｃＺプラスミド（構築物はｌａｃＺ核酸配列中にセレクターコドンをもつ）を適当な生物（例えば直交成分を使用することができる生物）に由来する細胞に導入する。コグネイトシンテターゼも（ポリペプチド又は発現時にコグネイトシンテターゼをコードするポリヌクレオチドとして）導入することができる。細胞を培地で所望密度（例えばＯＤ６００＝約０．５）まで増殖させ、例えばＢｅｔａＦｌｕｏｒ（登録商標）β−ガラクトシダーゼアッセイキット（Ｎｏｖａｇｅｎ）を使用してβ−ガラクトシダーゼアッセイを実施する。比較可能な対照（例えば所望位置にセレクターコドンではなく対応するセンスコドンをもつ修飾ｌａｃＺ構築物から観測される値）に対するサンプルの活性百分率として抑圧百分率を計算することができる。
翻訳系：「翻訳系」なる用語は成長中のポリペプチド鎖（蛋白質）にアミノ酸を組込む成分を意味する。翻訳系の成分としては例えばリボソーム、ｔＲＮＡ、シンテターゼ、ｍＲＮＡ等を挙げることができる。本発明のＯ−ｔＲＮＡ及び／又はＯ−ＲＳは、例えば非真核細胞（例えば細菌（例えば大腸菌））、又は真核細胞（例えば酵母細胞、哺乳動物細胞、植物細胞、藻類細胞、真菌細胞、昆虫細胞、及び／又は同等物）でｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｉｎ ｖｉｖｏ翻訳系に付加するか又はその一部とすることができる。
非天然アミノ酸：本明細書で使用する「非天然アミノ酸」なる用語は２０種類の標準天然アミノ酸の１種又はセレノシステインもしくはピロリジン以外の任意アミノ酸、修飾アミノ酸、及び／又はアミノ酸類似体を意味する。例えば、本発明では非天然アミノ酸ｐ−ベンゾイル−Ｌ−フェニルアラニン（Ｂｐａ）、パラ−アセチル−Ｌ−フェニルアラニン（ｐＡｃＰｈｅ）、パラ−アジド−Ｌ−フェニルアラニン（ｐＡｚＰｈｅ）及びパラ−ヨード−Ｌ−フェニルアラニン（ｐＩＰｈｅ）を利用する。
〜に応答して：本明細書で使用する「〜に応答して」なる用語は本発明のＯ−ｔＲＮＡがセレクターコドンを認識し、ｔＲＮＡと結合した非天然アミノ酸を成長中のポリペプチド鎖に組込むのを媒介するプロセスを意味する。
ポリペプチド：ポリペプチドは必ずしもそうでなくてもよいが、一般に共有ペプチド結合により結合した任意長のアミノ酸（天然又は非天然又はその組み合わせ）の任意オリゴマーである。ポリペプチドは任意起源に由来することができ、例えば天然に存在するポリペプチド、組換え分子遺伝技術により作製されたポリペプチド、細胞もしくは翻訳系に由来するポリペプチド、又は無細胞合成手段により作製されたポリペプチドが挙げられる。ポリペプチドはそのアミノ酸配列（例えばその成分アミノ酸の一次構造）により特徴付けられる。本明細書で使用するポリペプチドのアミノ酸配列は全長配列に限定されず、部分配列でも完全配列でもよい。更に、ポリペプチドは特定生理活性の有無により限定されない。本明細書で使用する「蛋白質」なる用語はポリペプチドと同義である。「ペプチド」なる用語は限定されないが、例えば２〜２５アミノ酸長の小ポリペプチドを意味する。
保存変異体：翻訳成分に関して本明細書で使用する「保存変異体」なる用語は類似する基本成分（例えばＯ−ｔＲＮＡ又はＯ−ＲＳ）と同様に機能するが、参照Ｏ−ｔＲＮＡ又はＯ−ＲＳに比較して配列に変異をもつ翻訳成分（例えば保存変異体Ｏ−ｔＲＮＡ又は保存変異体Ｏ−ＲＳ）を意味する。例えば、Ｏ−ＲＳ、又はこのＯ−ＲＳの保存変異体はコグネイトＯ−ｔＲＮＡを非天然アミノ酸（例えばＮ−アセチルガラクトサミン部分を含むアミノ酸）でアミノアシル化する。この例では、Ｏ−ＲＳと保存変異体Ｏ−ＲＳは同一アミノ酸配列をもたない。保存変異体はこの保存変異体が対応するＯ−ｔＲＮＡ又はＯ−ＲＳに相補的である限り、例えば配列の１カ所、２カ所、３カ所、４カ所、又は５カ所以上に変異をもつことができる。
所定態様では、保存変異体Ｏ−ＲＳは親Ｏ−ＲＳに比較して１カ所以上の保存アミノ酸置換を含む。所定態様では、保存変異体Ｏ−ＲＳは親Ｏ−ＲＳに比較して１カ所以上の保存アミノ酸置換を含むと共に、更にＯ−ＲＳ生理活性を維持し、例えば保存変異体Ｏ−ＲＳは親Ｏ−ＲＳ分子の生理活性の少なくとも１０％を維持し、あるいは、少なくとも２０％、少なくとも３０％、又は少なくとも４０％を維持する。所定の好ましい態様では、保存変異体Ｏ−ＲＳは親Ｏ−ＲＳ分子の生理活性の少なくとも５０％を維持する。保存変異体Ｏ−ＲＳの保存アミノ酸置換はアミノ酸結合ポケットを含むＯ−ＲＳの任意ドメインに生じることができる。
ポリヌクレオチド又は核酸：本明細書で使用する「核酸」、「核酸配列」、「ヌクレオチド配列」、「オリゴヌクレオチド」、「ポリヌクレオチド」又は「核酸分子」等の用語は一般に糖−リン酸主鎖と結合した塩基のオリゴマー（例えばオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチド）とそのフラグメント又は部分を意味し、更に１本鎖でも２本鎖でもよく、センス鎖でもアンチセンス鎖でもよいゲノム又は合成起源のＤＮＡ又はＲＮＡを意味する。核酸、ポリヌクレオチド及びヌクレオチドなる用語は具体的には生体に存在する５種類の塩基（即ちアデニン、グアニン、チミン、シトシン及びウラシル）以外の塩基から構成される核酸や、非天然主鎖構造をもつ核酸（例えばＰＮＡ分子）も意味する。
核酸分子（例えばＤＮＡ又はＲＮＡ）は「５’末端」と「３’末端」をもつと言うが、これは１個のモノヌクレオチド五炭糖環の５’リン酸をホスホジエステル結合により１方向にその隣接環の３’酸素と結合するようにヌクレオチドモノマーを反応させてオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドを形成するためである。従って、ポリヌクレオチドは一般に５’リン酸を含む１個の「５’末端」と３’酸素を含む１個の「３’末端」をもつ。ポリヌクレオチドはもっと大きい核酸の内側にある場合でも５’及び３’方向性をもつと言うことができる。線状又は環状のいずれに拘わらずＤＮＡ分子内では、別々のエレメントを「下流」ないし３’エレメントの「上流」ないし５’側にあると言う。この用語は転写がＤＮＡ鎖に沿って５’→３’方向に進行するという事実を反映している。
遺伝子：本明細書で使用する「遺伝子」なる用語は最も一般には、天然又は組換えにより機能的に連結されているときに所定産物又は機能を提供するポリヌクレオチドエレメントの組合わせを意味する。「遺伝子」なる用語は本明細書では遺伝子のｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ｃＲＮＡ及びゲノムＤＮＡ形態を含めて広義に解釈する。所定側面では、遺伝子はポリペプチドの生産に必要なコーディング配列（例えば「オープンリーディングフレーム」又は「コーディング領域」）を含み、他の側面では、遺伝子はポリペプチドをコードしない。ポリペプチドをコードしない遺伝子の例としてはリボソームＲＮＡ遺伝子（ｒＲＮＡ）と転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）遺伝子が挙げられる。
「遺伝子」なる用語は場合により遺伝子座に存在する非コーディング調節領域を意味する場合がある。例えば、核酸のコーディング領域に加え、「遺伝子」なる用語はコーディング領域の５’及び３’末端に隣接する全長ｍＲＮＡの転写ヌクレオチド配列も意味する。これらの非コーディング領域はサイズが可変であり、一般にコーディング領域の５’及び３’末端の両方に伸びる。コーディング領域の５’及び３’に位置し、ｍＲＮＡ上に含まれる配列を５’及び３’非翻訳配列（５’ＵＴ及び３’ＵＴ）と言う。５’及び３’ＵＴのどちらも翻訳開始、転写後開裂及びポリアデニル化等の調節機能を果たすことができる。「遺伝子」なる用語は遺伝子のｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ及びゲノム形態を含む。
所定側面では、遺伝子のゲノム形態又はゲノムクローンは転写ｍＲＮＡの配列に加え、転写産物の外側に位置する他の非転写配列を含む。ｍＲＮＡ転写単位の外側に位置する調節領域を「５’又は３’フランキング配列」と言う場合がある。遺伝子の機能的ゲノム形態は一般に転写調節に必要な調節因子を含む。例えば、「プロモーター」なる用語は限定されないが、一般には正確な転写開始を可能にするために十分な転写開始部位の５’側のＤＮＡ領域を表すために通常は使用される。所定態様では、プロモーターは構成的に活性であり、別の態様では、プロモーターは条件付きで活性である（例えば、所定生理条件下のみで転写が開始される）。原核生物では、プロモーターの活性は隣接「オペレーター」配列により調節することができる。所定態様では、３’フランキング領域は転写終結を調節する別の配列（「ターミネーター」配列と言う場合もある）を含む。一般に、「調節エレメント」なる用語は核酸配列の発現の所定側面を制御する任意遺伝子エレメントを意味する。
発現可能なヌクレオチド配列：本明細書で使用する「発現可能なヌクレオチド配列」なる用語は転写（例えばＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼにより転写）され、転写産物を生成することが可能な任意ヌクレオチド配列を意味する。転写産物の配列は限定されず、蛋白質をコードするもの（例えばアミノアシル−ｔＲＮＡシンテターゼをコードするもの）でもよいし、非蛋白質をコードするもの（例えばｔＲＮＡ分子をコードするもの）でもよい。
機能的に連結：核酸に関して本明細書で使用する「機能的に組み合わせて」、「機能的順序で」、「機能的に連結」、「機能的に結合」等の用語は相互に機能的関係で配置された核酸配列の連結を意味する。例えば、機能的に連結されたプロモーター配列、オープンリーディングフレーム及びターミネーター配列はＲＮＡ分子の正確な生産をもたらす。所定側面では、機能的に連結された核酸エレメントはオープンリーディングフレームの転写をもたらし、最終的にポリペプチドの生産（例えばオープンリーディングフレームの発現）をもたらす。
オペロン：本明細書で使用する「オペロン」なる用語は原核生物における遺伝子発現を制御する遺伝子単位（例えば染色体領域）を意味する。オペロンは一般に１個以上のポリペプチド又はＲＮＡをコードする１個以上の遺伝子と、遺伝子の転写を制御する１個以上の隣接調節領域を含む。調節領域は一般にプロモーターとオペレーターを含む。原核生物遺伝子のコーディング領域は伝統的に「シストロン」と呼ばれる。複数のシストロンを含むオペロンを「ポリシストロン性」と言う。ポリシストロン性オペロンにおける遺伝子は一般に機能的に関連しており、一般に単一単位として同時転写され、協調的に発現される。
構築物：本明細書で使用する「構築物」なる用語は核酸セグメントを細胞に導入することができる任意ポリヌクレオチド又は他の分子について使用する。「ベクター」又は「ビヒクル」なる用語を「ベクター」と同義に使用する場合もある。ベクターは場合によりベクター増殖及び操作に関与する部分（例えば複製に必要な配列、薬剤又は抗生物質耐性を付与する遺伝子、マルチクローニングサイト、クローニングした遺伝子の発現を可能にする機能的に連結されたプロモーター／エンハンサーエレメント等）を含む。ベクターは多くの場合にはプラスミド、バクテリオファージ、又は植物もしくは動物ウイルスに由来する。「クローニングベクター」又は「シャトルベクター」又は「サブクローニングベクター」はサブクローニング段階を助長する機能的に連結された部分（例えばマルチ制限エンドヌクレアーゼサイトを含むマルチクローニングサイト）を含む。
発現ベクター：本明細書で使用する「発現ベクター」なる用語は特定宿主生物におけるコーディング配列の発現を助長する機能的に連結されたポリヌクレオチド配列を含む組換えベクター（例えば細菌発現ベクター）を意味する。原核生物における発現を助長するポリヌクレオチド配列は一般に例えばプロモーター、転写終結配列（即ちターミネーター配列）、オペレーター（場合により）、及びリボソーム結合部位と、多くの場合には他の配列を含む。
コードする：本明細書で使用する「コードする」なる用語は第１の分子又は配列鎖とは異なる第２の分子又は配列鎖の生産を誘導するためにポリマー巨大分子又は配列鎖中の情報を使用する任意プロセスを意味する。本明細書ではこの用語を広義に使用し、種々に適用することができる。１側面では、「コードする」なる用語は新規に合成された相補的姉妹鎖をＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼによりコードするための鋳型として２本鎖ＤＮＡ分子の一方の鎖を使用する半保存的ＤＮＡ複製プロセスを意味する。
別の側面では、「コードする」なる用語は第１の分子とは異なる化学的性質をもつ第２の分子の生産を誘導するためにある分子中の情報を使用する任意プロセスを意味する。例えば、ＤＮＡ分子は（例えばＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ酵素を使用する転写プロセスにより）ＲＮＡ分子をコードすることができる。また、ＲＮＡ分子は翻訳プロセスのようにポリペプチドをコードすることもできる。翻訳プロセスについて使用する場合には、「コードする」なる用語はアミノ酸をコードするトリプレットコドンにも適用する。所定側面では、ＲＮＡ分子は例えばＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼを使用する逆転写プロセスによりＤＮＡ分子をコードすることができる。別の側面では、ＤＮＡ分子はポリペプチドをコードすることができ、この場合に使用する「コードする」とは当然のことながら転写プロセスと翻訳プロセスの両者を意味する。
異種：本明細書でポリヌクレオチド又はポリペプチドに関して使用する「異種」又は「外来」なる用語は生体系に転位又は人工的に供給されており、（例えば部分の配列、ゲノム位置又は配置に関して）天然構成でないか又はこの特定生体系に固有ではない分子を意味する。この用語は該当材料が天然源以外の資源に由来することを意味する場合もあるし、部分の非天然構成、遺伝子位置又は配置をもつ分子を意味する場合もある。「外来」及び「異種」なる用語は「組換え」と同義に使用する場合もある。
組換え：核酸又はポリペプチドに関して「組換え」なる用語は材料（例えば組換え核酸、遺伝子、ポリヌクレオチド、ポリペプチド等）が人為的介入により改変されていることを意味する。一般に、組換え分子の部分の配置は天然構成ではなく、あるいは組換えポリヌクレオチド又はポリペプチドの一次配列は何らかの方法で操作されている。組換え材料を得るための改変はその天然環境又は状態にある材料に実施することもできるし、その天然環境又は状態から取り出した材料に実施することもできる。例えば、天然核酸はその起源である細胞内で実施される人為的介入により改変される場合又はこのように改変されたＤＮＡから転写される場合に組換え核酸となる。遺伝子配列オープンリーディングフレームはその核酸配列が天然コンテクストから取り出され、任意型の人工核酸ベクターにクローニングされている場合に組換えである。組換えなる用語は組換え材料を含む生物を意味する場合もある。組換え分子、特に組換え核酸を作製するためのプロトコール及び試薬は当分野で周知であり、日常的に実施されている（例えばＭａｎｉａｔｉｓら（ｅｄｓ．），Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ，［１９８２］；Ｓａｍｂｒｏｏｋら（ｅｄｓ．），Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｖｏｌｕｍｅｓ １−３，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ，［１９８９］；及びＡｕｓｕｂｅｌら（ｅｄｓ．），Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１−４，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ ［１９９４］参照）。
天然又は内在：異種又は外来分子に対して、「天然」又は「内在」分子は該当生体系、種又は染色体に固有である。「天然」又は「内在」遺伝子はこの遺伝子が自然界で通常存在している染色体以外のソースによりコードされる核酸エレメントを含まない遺伝子である。内在遺伝子、転写産物又はポリペプチドはその天然染色体遺伝子座によりコードされ、人工的に細胞に供給されない。
宿主細胞：「宿主細胞」なる用語はベクター等の異種核酸を含み、核酸の複製及び／又は発現を補助する細胞を意味する。宿主細胞は大腸菌等の原核細胞でもよいし、酵母、昆虫、両生類、鳥類又は哺乳動物細胞等の真核細胞でもよい。宿主細胞は植物細胞が好ましい。本発明に関して、特に好ましい宿主細胞の１例は大豆宿主細胞である。
真核生物：本明細書で使用する「真核生物」なる用語は真核生物界に属する生物を意味する。真核生物はその構成が一般に多細胞であり（但し、例えば酵母のように多細胞でないものもある）、膜結合核と他の膜結合オルガネラが存在し、遺伝物質が線状であり（即ち染色体が線状）、オペロンが存在せず、イントロン、メッセージキャッピング及びポリＡ ｍＲＮＡが存在し、更に他の生化学的特徴（例えば特徴的リボソーム構造）により一般に原核生物から区別できる。真核生物としては例えば動物（例えば哺乳動物、昆虫、爬虫類、鳥類等）、繊毛虫、植物（例えば単子葉植物、双子葉植物、藻類等）、真菌類、酵母、鞭毛虫、微胞子虫、原生生物等が挙げられる。
原核生物：本明細書で使用する「原核生物」なる用語はモネラ界（原核生物界とも言う）に属する生物を意味する。原核生物はその構成が単細胞であり、出芽又は分裂による無性生殖であり、膜結合核又は他の膜結合オルガネラをもたず、染色体が環状であり、オペロンが存在し、イントロン、メッセージキャッピング及びポリＡ ｍＲＮＡが存在せず、更に他の生化学的特徴（例えば特徴的リボソーム構造）により一般に真核生物から区別できる。原核生物は真正細菌及び古細菌亜界を含む。シアノバクテリア（藍藻類）とマイコプラズマをモネラ界の別々の分類にする場合もある。
細菌：本明細書で使用する「細菌」及び「真正細菌」なる用語は「古細菌」から区別できる原核生物を意味する。同様に、古細菌は真正細菌から区別できる原核生物を意味する。真正細菌と古細菌は多数の形態学的及び生化学的基準により区別することができる。例えば、リボソームＲＮＡ配列の相違、ＲＮＡポリメラーゼ構造、イントロンの有無、抗生物質感受性、細胞壁ペプチドグリカン及び他の細胞壁成分の有無、膜脂質構造の分岐の有無、並びにヒストン及びヒストン様蛋白質の有無を使用して生物を真正細菌又は古細菌に分類する。
真正細菌の例としては、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ及びＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓが挙げられる。古細菌の例としては、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ（Ｍｊ）、Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ ｍａｚｅｉ（Ｍｍ）、Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍ（Ｍｔ）、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ ｍａｒｉｐａｌｕｄｉｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｐｙｒｕｓ ｋａｎｄｌｅｒｉ、Ｈａｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ（例えばＨａｌｏｆｅｒａｘ ｖｏｌｃａｎｉｉ及びＨａｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ種ＮＲＣ−１）、Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ ｆｕｌｇｉｄｕｓ（Ａｆ）、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｕｓ（Ｐｆ）、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉ（Ｐｈ）、Ｐｙｒｏｂａｃｕｌｕｍ ａｅｒｏｐｈｉｌｕｍ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ａｂｙｓｓｉ、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓ（Ｓｓ）、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ ｔｏｋｏｄａｉｉ、Ａｅｕｒｏｐｙｒｕｍ ｐｅｒｎｉｘ（Ａｐ）、Ｔｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ及びＴｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａ ｖｏｌｃａｎｉｕｍが挙げられる。
から誘導：本明細書で使用する「から誘導」なる用語は特定分子もしくは生物から単離された成分、あるいは特定分子もしくは生物又は特定分子もしくは生物からの情報を使用して作製された成分を意味する。例えば、第２のポリペプチドから誘導されるポリペプチドは第２のポリペプチドのアミノ酸配列と同一又は実質的に同様のアミノ酸配列を含むことができる。ポリペプチドの場合には、誘導種は例えば自然突然変異誘発、人工的特異的突然変異誘発又は人工的ランダム突然変異誘発により得ることができる。ポリペプチドを誘導するために使用される突然変異誘発は意図的に特異的でも意図的にランダムでもよいし、各々の混合でもよい。第１のポリペプチドから誘導される別のポリペプチドを作製するためのポリペプチドの突然変異誘発は（例えばポリメラーゼの非忠実性に起因する）ランダムなイベントとすることができ、誘導されたポリペプチドの同定は例えば本明細書に記載するような適当なスクリーニング法により実施することができる。ポリペプチドの突然変異誘発は一般にポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの操作を伴う。
同様に、「から誘導」なる用語はポリヌクレオチドにも適用することができる。ソースポリヌクレオチドから誘導されるポリヌクレオチドはソースヌクレオチド配列と同一又は実質的に同様のヌクレオチド配列を含むことができる。ポリヌクレオチドの場合には、誘導種は例えば自然突然変異誘発、人工的特異的突然変異誘発又は人工的ランダム突然変異誘発により得ることができる。ポリヌクレオチドを誘導するために使用される突然変異誘発は意図的に特異的でも意図的にランダムでもよいし、各々の混合でもよい。所定側面では、誘導ポリヌクレオチドはソースポリヌクレオチドを異種コンテクスト（即ちその天然又は内在コンテクストと異なるコンテクスト）に挿入することにより作製される。例えば、内在プロモータードメインを取り出し、通常では関連していない別のヌクレオチド配列と機能的に組合わせて配置することにより内在遺伝子プロモーターから遺伝子プロモーターを誘導することができる。
ポジティブ選択又はスクリーニングマーカー：本明細書で使用する「ポジティブ選択又はスクリーニングマーカー」なる用語は、このマーカーが存在する（例えば発現、活性化等される）場合に、該当形質をもたない細胞からこの形質を含む細胞（例えばポジティブ選択マーカーをもつ細胞）を識別するマーカーを意味する。
ネガティブ選択又はスクリーニングマーカー：本明細書で使用する「ネガティブ選択又はスクリーニングマーカー」なる用語は、このマーカーが存在する（例えば発現、活性化等される）場合に、（例えば選択性質又は形質をもつ細胞に対して）選択性質又は形質をもたない細胞を識別することができるマーカーを意味する。
選択又はスクリーニング物質：本明細書で使用する「選択又はスクリーニング物質」なる用語はこのような物質が存在すると、集団から所定成分を選択／スクリーニングすることができる物質を意味する。例えば、選択又はスクリーニング物質としては限定されないが、例えば栄養素、抗生物質、光波長、抗体、発現されたポリヌクレオチド等が挙げられる。選択物質は例えば濃度、強度等を変動させることができる。
レポーター：本明細書で使用する「レポーター」又は同等の用語は一般的な意味では、レポーターの検出が所定の他の分子又は性質の有無に相関する被験系で容易に検出することができる任意成分を意味し、あるいは該当系でターゲットを同定、選択及び／又はスクリーニングするために使用することができる任意成分を意味する。特定用途に使用するために最適なレポーターの選択は所期用途と当業者に公知の他の変数により異なる。所定側面では、レポーターはレポーター遺伝子である。
多様なレポーター分子及び遺伝子が当分野で公知である。レポーター毎にこのレポーターを検出する特定アッセイがある。レポーター検出アッセイは酵素アッセイでもよいし、免疫的性格のアッセイ（例えばＥＬＩＳＡ又は免疫組織化学分析）や比色アッセイでもよい。更に、レポーターとしては例えば蛋白質、例えば抗生物質耐性又は感受性を付与する酵素（例えばβ−ラクタマーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）等）、蛍光マーカー（例えば緑色蛍光蛋白質（例えばＧＦＰ）、ＹＦＰ、ＥＧＦＰ、ＲＦＰ等）、発光マーカー（例えばホタルルシフェラーゼ蛋白質）、アフィニティースクリーニングマーカー、酵素活性（例えばｌａｃＺ（β−ガラクトシダーゼ））、又は他のポジティブもしくはネガティブ選択マーカー遺伝子（例えばＡＤＨ（アルコールデヒドロゲナーゼ）、ｈｉｓ３、ｕｒａ３、ｌｅｕ２、ｌｙｓ２等）を挙げることができる。
〔図面の簡単な説明〕
図１はｐ−ベンゾイル−Ｌ−フェニルアラニン（Ｂｐａ）、パラ−アセチル−Ｌ−フェニルアラニン（ｐＡｃＰｈｅ）、パラ−アジド−Ｌ−フェニルアラニン（ｐＡｚＰｈｅ）及びパラ−ヨード−Ｌ−フェニルアラニン（ｐＩＰｈｅ）の４種類の非天然アミノ酸の構造と対応する名称を示す。
図２はＭｊｔＲＮＡ−Ｔｙｒ（ＣＵＡ）遺伝子のｐｒｏＫプロモーター及びターミネーター、ＢｐａＲＳ遺伝子のＤ２８６Ｒ突然変異、ＢｐａＲＳ遺伝子の突然変異形ｇｌｎＳプロモーター、及び／又はｔＲＮＡ遺伝子のマルチコピーを含むプラスミドの（野生型β−ガラクトシダーゼに対する）抑圧効率を示す棒グラフである。誤差線は標準偏差を示し、ｎ＝３である。
図３は指定の抑圧プラスミドから発現させたアンバーサプレッサーＭｊｔＲＮＡ−Ｔｙｒ（ＣＵＡ）のノーザンブロット分析の化学発光画像を示す。
図４は野生型ｇｌｎＳプロモーターと突然変異形ｇｌｎＳプロモーターの制御下で発現させたＢｐａＲＳのウェスタンブロット分析後の化学発光画像を示す。ブロットは抗Ｈｉｓ（Ｃ末端）抗体−ＨＲＰコンジュゲート（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用した。
図５はｐＳｕｐ−ＢｐａＲＳ−６ＴＲＮのプラスミドマップを示す。他の合成遺伝子をその対応するｐＢＫプラスミドからこのプラスミドのＮｄｅＩ／ＰｓｔＩ部位にサブクローニングした。
図６はＢｐａ、ｐＡｃＰｈｅ、ｐＡｚＰｈｅ及びｐＩＰｈｅ組込み用新規システムの抑圧効率を示す。誤差線は標準偏差を示し、ｎ＝３である。。
図７はＢｐａの不在下又は存在下で発現させたＳｅｒ−４の代わりにＢｐａを含む突然変異体ミオグロビンのウェスタンブロット後の化学発光画像を示す。ブロットは抗Ｈｉｓ（Ｃ末端）抗体−ＨＲＰコンジュゲート（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用した。
図８は本発明で使用される各種ポリヌクレオチド及びポリペプチド配列を示す。
本発明はセレクターコドン（例えばアンバーナンセンスコドン）により遺伝的にコードされる特定部位に１個以上の非天然アミノ酸を組込んだ突然変異体蛋白質の効率的な細菌発現に有用な改良型発現ベクターシステムを提供する。これらのシステムは非天然アミノ酸のｉｎ ｖｉｖｏ組込みに当分野で公知の直交翻訳技術を利用する。本発明は使用される特定直交翻訳成分（即ち特定直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ又は特定直交サプレッサーｔＲＮＡ）に関して如何なる点でも限定されない。更に、所定態様では、本発明は直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ又はサプレッサーｔＲＮＡに限定されない細菌発現ベクターシステムで広く利用される改良型組成物及び方法を提供する。
本発明は真正細菌（例えば大腸菌）における非天然アミノ酸の蛋白質組込み効率を有意に改善し、セレクターコドンにより遺伝的に指定される特定部位に非天然アミノ酸を組込んだ突然変異体蛋白質の高収率発現をもたらす新規発現ベクター構成要素を提供する。本発明の実施又は使用に効率改善メカニズムの解明は不要であるが、該当蛋白質への非天然アミノ酸の組込み効率の改善は直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼとサプレッサーｔＲＮＡの発現の改善に（少なくとも部分的に）起因すると予想される。
本発明の新規発現ベクター構成要素は種々の大腸菌発現ベクターバックボーン及び大腸菌株に広く適合可能であると共に、直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ又は直交サプレッサーｔＲＮＡの発現に加えて他の該当蛋白質又はｔＲＮＡの発現に容易に応用される。
所定側面では、本発明により提供される新規発現ベクター構成要素は別個のプラスミドで独立して使用される。他の側面では、単独の新規構成要素又は構成要素の組み合わせを複数のプラスミドで使用する。更に他の態様では、複数のこれらの構成要素を同一プラスミドで併用する。本発明は１個以上の非天然アミノ酸を組込んだ突然変異体蛋白質の発現を改善するために使用することができ、場合により、任意特定該当ポリペプチド又はｔＲＮＡの発現を改善するためにより広く使用することができる細菌発現ベクターシステムに多数の改善を提供する。
本発明は例えば細菌発現ベクターシステムに以下の改善を提供する。
（Ａ）本発明は直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ遺伝子と直交サプレッサーｔＲＮＡ遺伝子を同一プラスミドに担持した発現ベクターを提供する。従来はこれらの２成分を各々別個のプラスミドに担持していたが、こうすることにより、これらの直交成分の発現を簡単にする。
（Ｂ）本発明は異種ｔＲＮＡ配列、例えば直交ＭｊｔＲＮＡ−Ｔｙｒ（ＣＵＡ）遺伝子又は他の任意直交ｔＲＮＡ遺伝子を発現するために大腸菌プロリンｔＲＮＡオペロンに由来する改良型プロモーター及びターミネーター配列を提供する。プロモーター及びターミネーター配列を誘導するために使用される大腸菌プロリンｔＲＮＡ遺伝子は大腸菌ｐｒｏＫ、ｐｒｏＬ又はｐｒｏＭ ｔＲＮＡ遺伝子とすることができる。
（Ｃ）本発明はｔＲＮＡ遺伝子の発現用改良型組換えポリシストロン性オペロンを提供し、オペロンの任意２個のｔＲＮＡ遺伝子は天然ｔＲＮＡポリシストロン性オペロンのリンカー、例えば大腸菌ｖａｌＵ及びｖａｌＸ遺伝子間、あるいは例えばｉｌｅＴ及びａｌａＴ遺伝子間に天然に存在するリンカーから誘導される異種リンカー配列により分離されている。
（Ｄ）本発明はオープンリーディングフレーム、例えば直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼをコードするオープンリーディングフレームの発現改善のために大腸菌ｇｌｎＳプロモーターから誘導される新規プロモーター配列を提供する。
Ｏ−ｔＲＮＡ及びＯ−ＲＳ遺伝子の同時発現用ベクターシステム
所定側面では、本発明は直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ遺伝子と直交サプレッサーｔＲＮＡ遺伝子を同一プラスミドに担持した発現ベクターを提供する。従来はＯ−ｔＲＮＡ遺伝子とＯ−ＲＳ遺伝子を別々に担持する２個の別個の発現ベクターで宿主細胞を同時形質転換することが必要であったが、この特徴により従来技術を改善する。
実施例に記載するように、Ｏ−ｔＲＮＡ種とＯ−ＲＳ種の同時発現に適した一連の類縁発現ベクターを構築する。これらのプラスミドは以下の通りである。
ｐＹＲ−ＢｐａＲＳ１
ｐＹＲ−ＢｐａＲＳ５
ｐＹＲ−ＢｐａＲＳ５（Ｄ２８６Ｒ）
ｐＹＲ−ＢｐａＲＳ−ＴＲＮ
ｐＹＲ−ＢｐａＲＳ−ＴＲＮ（Ｄ２８６Ｒ）
ｐＹＲ−ＢｐａＲＳ−３ＴＲＮ（Ｄ２８６Ｒ）
ｐＹＲ−ＢｐａＲＳ−６ＴＲＮ（Ｄ２８６Ｒ）
ｐＳｕｐ−ＢｐａＲＳ−６ＴＲＮ（Ｄ２８６Ｒ）
ｐＳｕｐ−ｐＡｃＰｈｅＲＳ−６ＴＲＮ
ｐＳｕｐ−ｐＡｚＰｈｅＲＳ−６ＴＲＮ
ｐＳｕｐ−ｐＩＰｈｅＲＳ−６ＴＲＮ。
これらのプラスミドの各々が本発明の特徴である。しかし、本発明はこれらのプラスミドに限定されず、当業者に自明の通り、これらのプラスミドの変異体の構築も当然本発明の範囲に含まれる。
例えば、本発明の如何なるプラスミドも特定非天然アミノ酸を組込んだ蛋白質を作製するために特定Ｏ−ｔＲＮＡ又はＯ−ＲＳ種の発現に限定されない。後記実施例では、ＭｊｔＲＮＡ−Ｔｙｒ（ＣＵＡ）（配列番号１）と、ｐ−ベンゾイル−Ｌ−フェニルアラニン（Ｂｐａ）、パラ−アセチル−Ｌ−フェニルアラニン（ｐＡｃＰｈｅ）、パラ−アジド−Ｌ−フェニルアラニン（ｐＡｚＰｈｅ）及びパラ−ヨード−Ｌ−フェニルアラニン（ｐＩＰｈｅ）にｔＲＮＡ負荷特異性をもつ４種類の異なるＯ−ＲＳ種の使用に成功したことを記載している（図１と図８の配列番号４、６、８及び１０参照）。
これらの上記実施例に例証されるように、本発明は他のＯ−ｔＲＮＡ及びＯ−ＲＳ種にも広く応用できる。実際に、本発明は該当する任意Ｏ−ｔＲＮＡ又は任意Ｏ−ＲＳ、特に真正細菌細胞で最適に機能する直交翻訳成分の発現に利用される。所定側面では、本発明は特に天然古細菌（例えばＭｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ）アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼから誘導されるＯ−ＲＳ種又は古細菌ｔＲＮＡから誘導されるＯ−ｔＲＮＡ種で利用される。本発明で利用される多様なＯ−ｔＲＮＡ及びＯ−ＲＳ種が当分野で公知であり、多数の文献に記載されている。例えば、国際公開ＷＯ２００２／０８６０７５、発明の名称「直交ｔＲＮＡ−アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ対を作製するための方法及び組成物（ＭＥＴＨＯＤＳ ＡＮＤ ＣＯＭＰＯＳＩＴＩＯＮ ＦＯＲ ＴＨＥ ＰＲＯＤＵＣＴＩＯＮ ＯＦ ＯＲＴＨＯＧＯＮＡＬ ｔＲＮＡ−ＡＭＩＮＯＡＣＹＬ−ｔＲＮＡ ＳＹＮＴＨＥＴＡＳＥ ＰＡＩＲＳ）」；ＷＯ２００２／０８５９２３、発明の名称「非天然アミノ酸のインビボ組込み（ＩＮ ＶＩＶＯ ＩＮＣＯＲＰＯＲＡＴＩＯＮ ＯＦ ＵＮＮＡＴＵＲＡＬ ＡＭＩＮＯ ＡＣＩＤＳ）」；ＷＯ２００４／０９４５９３、発明の名称「真核遺伝コードの拡張（ＥＸＰＡＮＤＩＮＧ ＴＨＥ ＥＵＫＡＲＹＯＴＩＣ ＧＥＮＥＴＩＣ ＣＯＤＥ）」；ＷＯ２００５／０１９４１５（出願日２００４年７月７日）；ＷＯ２００５／００７８７０（出願日２００４年７月７日）；ＷＯ２００５／００７６２４（出願日２００４年７月７日）；及びＷＯ２００６／１１０１８２（出願日２００５年１０月２７日、発明の名称「非天然アミノ酸のインビボ組込み用直交翻訳成分（ＯＲＴＨＯＧＯＮＡＬ ＴＲＡＮＳＬＡＴＩＯＮ ＣＯＭＰＯＮＥＮＴＳ ＦＯＲ ＴＨＥ ＩＮ ＶＩＶＯ ＩＮＣＯＲＰＯＲＡＴＩＯＮ ＯＦ ＵＮＮＡＴＵＲＡＬ ＡＭＩＮＯ ＡＣＩＤＳ）」）参照。これらの各出願は言及によりその開示内容全体を本明細書に組込む。非天然アミノ酸を組込む直交翻訳系と、その作製及び使用方法のその他の詳細については、各々言及によりその開示内容全体を本明細書に組込むＷａｎｇ ａｎｄ Ｓｃｈｕｌｔｚ “Ｅｘｐａｎｄｉｎｇ ｔｈｅ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｃｏｄｅ，”Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ Ｃｈｅｍｉｅ Ｉｎｔ．Ｅｄ，４４（１）：３４−６６（２００５），Ｘｉｅ ａｎｄ Ｓｃｈｕｌｔｚ，“Ａｎ Ｅｘｐａｎｄｉｎｇ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｃｏｄｅ，”Ｍｅｔｈｏｄｓ ３６（３）：２２７−２３８（２００５）；Ｘｉｅ ａｎｄ Ｓｃｈｕｌｔｚ，“Ａｄｄｉｎｇ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄｓ ｔｏ ｔｈｅ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ，”Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ９（６）：５４８−５５４；及びＷａｎｇら，“Ｅｘｐａｎｄｉｎｇ ｔｈｅ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｃｏｄｅ，”Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｂｉｏｍｏｌ．Ｓｔｒｕｃｔ．，ｅｐｕｂ Ｊａｎ １３，２００６も参照。
従来技術（例えば本明細書に引用する技術）は公知Ｏ−ＲＳ及びＯ−ｔＲＮＡ種の多数の変異体（例えば保存変異体）及びフラグメントの構築及び使用の手引きについても記載している。これらの変異体及びフラグメントも本発明の発現ベクターで利用される。従来技術は同様に本発明で利用される新規Ｏ−ＲＳ及びＯ−ｔＲＮＡ種の同定と構築の手引きについても記載している。
プラスミド構築及び真正細菌宿主細胞
実施例６に記載するように、本明細書に記載するプラスミドはｐＡＣＹＣ１８４ベクターバックボーンに基づく。しかし、本発明のプラスミドはこの特定バックボーンベクターの使用に限定されない。当業者に自明の通り、（他の公共入手可能なプラスミド又は市販プラスミドを含む）各種プラスミドの任意１種を使用して本発明のプラスミドを構築することができる。例えば、プラスミドｐＡＣＹＣ１７７及びｐＲＡＲＥ２ベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ；ｉｎＮｏｖａｔｉｏｎｓ，Ｎｏ．１２，Ｊｕｎｅ ２００１参照）を本発明で使用することもできる。所定側面では、適合可能な複製起点（例えばｐ１５Ａ複製起点）と少なくとも１個の選択マーカーを担持する任意プラスミドを本発明で使用することができる。プラスミドｐＳＣ１０１の誘導体も本発明で使用することができる。
同じく実施例６に記載するように、本発明により提供されるプラスミドを使用してＯｎｅ Ｓｈｏｔ（登録商標）ＴＯＰ−１０エレクトロコンピテント大腸菌（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（登録商標））を形質転換した。しかし、１個以上の非天然アミノ酸を組込んだ蛋白質を作製するために宿主細胞として使用する真正細菌株はこの特定宿主細胞に限定されない。当業者に自明の通り、非天然アミノ酸を組込んだ蛋白質を作製するために（他の市販プラスミド及び使用者により作製された株を含む）各種宿主細胞の任意１種を容易に使用することができる。例えば、大腸菌株ＤＨ１０Ｂ（登録商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（登録商標））、Ｅｌｅｃｔｒｏｃｏｍｐ（登録商標）ＧｅｎｅＨｏｇｓ（登録商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（登録商標））、ＢＬ２１ Ｏｎｅ Ｓｈｏｔ（登録商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（登録商標））、及びＢＬ２１（ＤＥ３）Ｏｎｅ Ｓｈｏｔ（登録商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（登録商標））等の他の宿主細胞が挙げられる。実際に、内在ｔＲＡＮサプレッサー遺伝子をもたない任意大腸菌株が適切な宿主細胞である。大腸菌以外に他の真正細菌種も本発明で利用される。例えば、枯草菌株も本発明のベクターの宿主細胞として使用できると考えられる。
Ｏ−ｔＲＮＡの発現用改良型プロモーター及びターミネーター配列
直交翻訳系の抑圧効率を改善するために、天然大腸菌ｔＲＮＡプロモーター及びターミネーターをもつ新規アンバーサプレッサーｔＲＮＡオペロンを構築した。大腸菌ｔＲＮＡ遺伝子の調査の結果、大腸菌プロリンｔＲＮＡは古細菌ｔＲＮＡと同一のＣ１−Ｇ７２対をもち、この塩基対が大腸菌でＭｊＴｙｒＲＳによるＭｊｔＲＮＡ−Ｔｙｒ（ＣＵＡ）の選択的認識の主要な同一性決定因子であることが判明した（Ｗａｎｇ ａｎｄ Ｓｃｈｕｌｔｚ，Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．，８：８８３−８９０（２００１））。
この知見に鑑み、モノシストロン性ｐｒｏＫオペロンの同一長（７７ヌクレオチド）大腸菌ｐｒｏＫ遺伝子を異種Ｏ−ｔＲＮＡ遺伝子で置換した合成アンバーサプレッサーｔＲＮＡ遺伝子を構築した。ｐＹＲ−ＢｐａＲＳ１の元のサプレッサーｔＲＮＡオペロンをｐｒｏＫプロモーター（配列番号３２）とｐｒｏＫターミネーター（配列番号３３）の制御下のＭｊｔＲＮＡ−Ｔｙｒ（ＣＵＡ）遺伝子で置換することにより改良型発現ベクター（ｐＹＲ−ＢｐａＲＳ５）を作製した。この発現構築物はｐＹＲ−ＢｐａＲＳ１ベクターの活性に比較してＯ−ｔＲＮＡの発現の２倍の増加を示し（図３参照）、その結果、抑圧効率は有意に改善された（図２参照）。
従って、本発明は大腸菌プロリンｔＲＮＡ遺伝子ｐｒｏＫから誘導されるプロモーター及びターミネーターヌクレオチド配列によりポリシストロン性ｔＲＮＡの発現を誘導する該当ｔＲＮＡの発現用改良型発現ベクターを提供する。
実施例１に記載するように、この改良型ベクターを実証するために使用した特定ｔＲＮＡは直交ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）、より具体的にはＭｊｔＲＮＡ−Ｔｙｒ（ＣＵＡ）であった。しかし、ｔＲＮＡ発現効率の改善はＭｊｔＲＮＡ−Ｔｙｒ（ＣＵＡ）にもＯ−ｔＲＮＡにも限定されない。実際に、本発明のこの特徴は任意該当ｔＲＮＡの発現を改善するために使用することができる。
大腸菌では、翻訳中に３種類のｔＲＮＡ種にプロリンを負荷する。ｐｒｏＫ ｔＲＮＡ遺伝子に加え、大腸菌は他の２種類のプロリルｔＲＮＡ遺伝子も使用する。これらはｐｒｏＬとｐｒｏＭである。ｐｒｏＫ遺伝子座とのそれらの構造類似性により、本発明の改良型発現ベクターの構築にはｐｒｏＬ（配列番号３４）のプロモーター配列とｐｒｏＬ及びｐｒｏＭ（夫々配列番号３５及び３６）のターミネーター配列も利用できると考えられる。発現改善を達成するために種々の大腸菌プロリルｔＲＮＡ遺伝子から誘導されるプロモーターとターミネーターの組み合わせも利用できる点も本発明の特徴である。例えば、ｐｒｏＫ（配列番号３２）のプロモーター配列をｐｒｏＬ（配列番号３５）のターミネーター配列と併用することができる。
改良型ポリシストロン性オペロン構造
本発明はｔＲＮＡ遺伝子の発現用の改良型組換えポリシストロン性オペロンを提供する。これらのポリシストロン性オペロンは該当ｔＲＮＡ遺伝子のマルチコピー（例えば３コピー）を含み、ｔＲＮＡ配列は天然ｔＲＮＡポリシストロン性オペロンのリンカー、例えば、大腸菌ｖａｌＵ及びｖａｌＸ遺伝子間（配列番号１４）、あるいは、例えば大腸菌ｉｌｅＴ及びａｌａＴ ｔＲＮＡ遺伝子間（配列番号１５）に天然に存在するリンカーから誘導される異種リンカー配列により分離されている。
従って、本発明はポリシストロン性ｔＲＮＡオペロンの発現用の改良型発現ベクターを提供し、オペロンは少なくとも２個の発現されたｔＲＮＡ配列を分離する少なくとも１個の異種ｔＲＮＡリンカーを含む。所定態様では、実施例３に記載するように、オペロンで発現された３個以上のｔＲＮＡ配列を分離するために複数のｔＲＮＡリンカーを使用する。その場合には、発現された各ｔＲＮＡ対の間で使用されるｔＲＮＡリンカーは（実施例３のように）異なるものでもよいし、各ｔＲＮＡ遺伝子間で同一リンカーでもよい。
本発明は大腸菌ｖａｌＵ及びｖａｌＸ遺伝子リンカー（配列番号１４）、又は大腸菌ｉｌｅＴ及びａｌａＴ ｔＲＮＡ遺伝子リンカー（配列番号１５）の使用に限定されない。実際に、他の天然ｔＲＮＡリンカーも本発明で利用される。例えば、下記天然大腸菌ｔＲＮＡ遺伝子間に位置する以下の各リンカーが本発明で利用され、組換えオペロンで発現されるｔＲＮＡ配列の種類に関係なく、組換えシステムで使用されるリンカーはこのｔＲＮＡ配列に対して異種である。これらの有用なｔＲＮＡリンカーを以下に挙げる。
所定態様では、本発明で利用される好ましいｔＲＮＡリンカーはＴ（−１）及びＡ（７７）ヌクレオチドの一方又は両方を含む。ｔＲＮＡリンカーにおけるこれらの２個のヌクレオチド位置はその天然（即ち内在）コンテクストにあるときにｔＲＮＡ前駆体の効率的な５’及び３’プロセシングに最適であることが分かっている。例えば、Ｌｉ ａｎｄ Ｄｅｕｔｓｃｈｅｒ，“Ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ ｐａｔｈｗａｙｓ ｆｏｒ Ｅ．ｃｏｌｉ ｔＲＮＡ ｐｒｅｃｕｒｓｏｒｓ：Ａ ｒａｎｄｏｍ ｍｕｌｔｉｅｎｚｙｍｅ ｐｒｏｃｅｓｓ ｉｎ ｖｉｖｏ”Ｃｅｌｌ ８６：５０３−５１２（１９９６）；及びＺａｈｌｅｒら，“Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ５’ ｌｅａｄｅｒ ｏｆ ｐｒｅ−ｔＲＮＡ ｓｕｂｓｔｒａｔｅｓ ｂｙ ｔｈｅ ａｃｔｉｖｅ ｓｉｔｅ ｏｆ ｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ Ｐ，”ＲＮＡ ９：７３４−７４５（２００３）参照。他の態様では、本発明で利用されるｔＲＮＡリンカーは（天然又は人工）制限部位を含む。
所定態様では、本発明は場合によりタンデム構成の複数の同一ポリシストロン性オペロンを含む構築物を提供する。従って、単一ポリシストロン性オペロンが発現可能なヌクレオチド配列（例えばｔＲＮＡ遺伝子）３コピーを含む場合には、オペロン２個から合計６個のｔＲＮＡ遺伝子配列が発現されることになる。この種の遺伝子クラスター構造を実施例３と図５に実証する。
実施例３に記載する改良型組換えポリシストロン性オペロンは直交ｔＲＮＡ ＭｊｔＲＮＡ−Ｔｙｒ（ＣＵＡ）を発現する。しかし、本発明はＭｊｔＲＮＡ−Ｔｙｒ（ＣＵＡ）の発現に限定されない。本発明は直交ｔＲＮＡ種の発現にも限定されない。実際に、本発明の改良型ポリシストロン性オペロンは任意の所望ｔＲＮＡ種を発現させるために使用することができる。
ポリペプチド発現用の改良型大腸菌ｇｌｎＳプロモーター
本発明はオープンリーディングフレームの改良発現用として、大腸菌ｇｌｎＳプロモーターから誘導される新規プロモーター配列を提供する。実施例２に記載するように、Ｐｌｕｍｂｒｉｄｇｅ ａｎｄ Ｓｏｌｌ（Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ ６９：５３９−５４１（１９８７））に記載の突然変異体ｇｌｎＳプロモーター（配列番号１２）を本発明の発現ベクターにサブクローニングした。サブクローニングしたｇｌｎＳプロモーター領域を配列決定した処、（Ｐｌｕｍｂｒｉｄｇｅ ａｎｄ Ｓｏｌｌに記載の置換に加えて）プロモーター配列に偶発的に欠失が導入されていることが判明した。この別の改変型新規ｇｌｎＳプロモーター変異体をｇｌｎＳ−ＴＮＲと命名した（配列番号１３に示す）。驚くべきことに、この突然変異の結果、システムの翻訳効率は野生型ｇｌｎＳプロモーター活性に比較して改善されることがウェスタンブロットにより判明した（図４参照）。
実施例２及び５に記載するように、ｇｌｎＳ−ＴＮＲプロモーターを使用して直交シンテターゼＢｐａＲＳ、ｐＡｃＰｈｅＲＳ、ｐＡｚＰｈｅＲＳ及びｐＩＰｈｅＲＳを発現させた。しかし、本発明は特定直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ又はアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ一般の発現に限定されない。この改良型プロモーターは任意の所望ポリペプチドオープンリーディングフレームの細菌発現に広く利用される。
直交ｔＲＮＡ／アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ技術
本発明の新規組成物及び方法は直交ｔＲＮＡと直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼの対に関連する活性を理解することにより理解し易くなる。付加的な非天然アミノ酸を遺伝コードに付加するためには、宿主翻訳機構で効率的に機能することができるが、翻訳系に内在性のシンテターゼ及びｔＲＮＡから独立して機能するという意味で該当翻訳系に対して「直交性」のアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼと適切なｔＲＮＡを含む新規直交対が必要である。直交対の所望特徴としては、内在ｔＲＮＡによりデコードされない特定コドン（例えばセレクターコドン）のみをデコード又は認識するｔＲＮＡと、そのコグネイトｔＲＮＡをただ１種類の特定非天然アミノ酸で優先的にアミノアシル化（又は「負荷」）するアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼが挙げられる。Ｏ−ｔＲＮＡは更に一般に内在シンテターゼによりアミノアシル化されない。例えば大腸菌では、直交対は例えば大腸菌に存在する４０種類の内在ｔＲＮＡのいずれとも交差反応しないアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼと、例えば大腸菌に存在する２１種類の内在シンテターゼのいずれでもアミノアシル化されない直交ｔＲＮＡを含む。今日までに、当分野で公知の直交翻訳技術を使用して広範な構造的に多様な非天然アミノ酸が蛋白質に組込まれている。
非天然アミノ酸をポリペプチドに部位特異的に組込むことができるならば、これらの蛋白質の高度に選択的な翻訳後修飾を可能にすることにより蛋白質の研究を助長できると共に、新規性質をもつ蛋白質の作製が可能になる。例えば、１個以上の非天然アミノ酸を組込んだ蛋白質の発現は特異的標識による蛋白質の試験を容易にし、酵素の触媒機能を改変し、生理活性を改善又は基質に対する交差反応性を低減し、蛋白質を他の蛋白質、小分子又は生体分子と架橋し、蛋白質分解を低減又は排除し、（例えば、導入した反応部位のペグ化又は他の修飾により）蛋白質のｉｎ ｖｉｖｏ半減期を改善すること等が可能になる。
１個以上の非天然アミノ酸を組込んだ蛋白質の作製に適した直交翻訳系と、直交翻訳系の一般作製方法は当分野で公知である。例えば、国際公開ＷＯ２００２／０８６０７５、発明の名称「直交ｔＲＮＡ−アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ対を作製するための方法及び組成物（ＭＥＴＨＯＤＳ ＡＮＤ ＣＯＭＰＯＳＩＴＩＯＮＳ ＦＯＲ ＴＨＥ ＰＲＯＤＵＣＴＩＯＮ ＯＦ ＯＲＴＨＯＧＯＮＡＬ ｔＲＮＡ−ＡＭＩＮＯＡＣＹＬ−ｔＲＮＡ ＳＹＮＴＨＥＴＡＳＥ ＰＡＩＲＳ）」；ＷＯ２００２／０８５９２３、発明の名称「非天然アミノ酸のインビボ組込み（ＩＮ ＶＩＶＯ ＩＮＣＯＲＰＯＲＡＴＩＯＮ ＯＦ ＵＮＮＡＴＵＲＡＬ ＡＭＩＮＯ ＡＣＩＤＳ）」；ＷＯ２００４／０９４５９３、発明の名称「真核遺伝コードの拡張（ＥＸＰＡＮＤＩＮＧ ＴＨＥ ＥＵＫＡＲＹＯＴＩＣ ＧＥＮＥＴＩＣ ＣＯＤＥ）」；ＷＯ２００５／０１９４１５（出願日２００４年７月７日）；ＷＯ２００５／００７８７０（出願日２００４年７月７日）；ＷＯ２００５／００７６２４（出願日２００４年７月７日）；及びＷＯ２００６／１１０１８２（出願日２００５年１０月２７日、発明の名称「非天然アミノ酸のインビボ組込み用直交翻訳成分（ＯＲＴＨＯＧＯＮＡＬ ＴＲＡＮＳＬＡＴＩＯＮ ＣＯＭＰＯＮＥＮＴＳ ＦＯＲ ＴＨＥ ＩＮ ＶＩＶＯ ＩＮＣＯＲＰＯＲＡＴＩＯＮ ＯＦ ＵＮＮＡＴＵＲＡＬ ＡＭＩＮＯ ＡＣＩＤＳ）」）参照。これらの各出願は言及によりその開示内容全体を本明細書に組込む。非天然アミノ酸を組込む直交翻訳系と、その作製及び使用方法のその他の詳細については、各々言及によりその開示内容全体を本明細書に組込むＷａｎｇ ａｎｄ Ｓｃｈｕｌｔｚ“Ｅｘｐａｎｄｉｎｇ ｔｈｅ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｃｏｄｅ，”Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ Ｃｈｅｍｉｅ Ｉｎｔ．Ｅｄ．，４４（１）：３４−６６（２００５），Ｘｉｅ ａｎｄ Ｓｃｈｕｌｔｚ，“Ａｎ Ｅｘｐａｎｄｉｎｇ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｃｏｄｅ，”Ｍｅｔｈｏｄｓ ３６（３）：２２７−２３８（２００５）；Ｘｉｅ ａｎｄ Ｓｃｈｕｌｔｚ，“Ａｄｄｉｎｇ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄｓ ｔｏ ｔｈｅ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ，”Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ９（６）：５４８−５５４；Ｗａｎｇら，“Ｅｘｐａｎｄｉｎｇ ｔｈｅ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｃｏｄｅ，”Ａｎｎａ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｂｉｏｍｏｌ．Ｓｔｒｕｃｔ．，３５：２２５−２４９（２００６）；及びＸｉｅ ａｎｄ Ｓｃｈｕｌｔｚ，“Ａ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｔｏｏｌｋｉｔ ｆｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎｓ−ａｎ ｅｘｐａｎｄｅｄ ｇｅｎｅｔｉｃ ｃｏｄｅ，”Ｎａｔ．Ｒｅｖ．ＭｏＩ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，７（１０）：７７５−７８２（２００６；ｅｐｕｂ Ａｕｇ ２３，２００６）も参照。
このような翻訳系は一般に直交ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）と、直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ＲＳ）と、非天然アミノ酸を含む細胞（例えば大腸菌等の非真核細胞又は酵母等の真核細胞とすることができる）を含み、Ｏ−ＲＳはＯ−ｔＲＮＡを非天然アミノ酸でアミノアシル化する。本発明の直交対はＯ−ｔＲＮＡ（例えばサプレッサーｔＲＮＡ、フレームシフトｔＲＮＡ等）とコグネイトＯ−ＲＳを含むことができる。
一般に、直交対がセレクターコドンを認識し、セレクターコドンに応答してアミノ酸を負荷するとき、直交対はセレクターコドンを「抑圧」すると言う。即ち、翻訳系の（例えば細胞の）内在機構により認識されないセレクターコドンは通常負荷されないため、そうでなければ核酸から翻訳されるはずのポリペプチドの生産が阻止される。直交対システムでは、Ｏ−ＲＳはＯ−ｔＲＮＡを非天然アミノ酸でアミノアシル化する。負荷されたＯ−ｔＲＮＡはセレクターコドンを認識し、セレクターコドンに起因する翻訳阻止を抑圧する。細胞は例えば該当ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む核酸を介して成長中のポリペプチド鎖に非天然アミノ酸を組込むためにＯ−ｔＲＮＡ／Ｏ−ＲＳ対を使用し、ポリヌクレオチドはＯ−ｔＲＮＡにより認識されるセレクターコドンを含む。所定の望ましい側面では、細胞は付加Ｏ−ｔＲＮＡ／Ｏ−ＲＳ対を含むことができ、付加Ｏ−ｔＲＮＡは付加Ｏ−ＲＳにより別の非天然アミノ酸を負荷される。例えば、Ｏ−ｔＲＮＡの一方は４塩基コドンを認識することができ、他方は終止コドンを認識することができる。あるいは、複数の異なる終止コドン又は複数の異なる４塩基コドンが異なるセレクターコドンを特異的に認識することもできる。
所定態様では、系は直交ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）と、直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ＲＳ）と、非天然アミノ酸と、該当ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む核酸を含む細胞（例えば大腸菌細胞又は酵母細胞）からなり、ポリヌクレオチドはＯ−ｔＲＮＡにより認識されるセレクターコドンを含む。翻訳系は無細胞系でもよく、例えば各種市販「ｉｎ ｖｉｔｒｏ」転写／翻訳系の任意のものを本明細書に記載するようなＯ−ｔＲＮＡ／ＯＲＳ対及び非天然アミノ酸と組み合わせることができる。
上記のように、所定態様では、２種以上の非天然アミノ酸をポリペプチドに組込むことができるように、細胞又は他の翻訳系に複数のＯ−ｔＲＮＡ／Ｏ−ＲＳ対が存在する。例えば、細胞は更に別の付加Ｏ−ｔＲＮＡ／Ｏ−ＲＳ対と第２の非天然アミノ酸を含むことができ、この付加Ｏ−ｔＲＮＡは第２のセレクターコドンを認識し、この付加Ｏ−ＲＳはＯ−ｔＲＮＡを第２の非天然アミノ酸で優先的にアミノアシル化する。例えば、Ｏ−ｔＲＮＡ／Ｏ−ＲＳ対（Ｏ−ｔＲＮＡは例えばアンバーセレクターコドンを認識する）を含む細胞は更に第２の直交対を含むことができ、第２のＯ−ｔＲＮＡは別のセレクターコドン（例えばオパールコドン、４塩基コドン等）を認識する。各直交対は異なるセレクターコドンの認識を助長できるように異なる起源に由来することが望ましい。
Ｏ−ｔＲＮＡ及び／又はＯ−ＲＳは天然に存在するものでもよいし、例えば種々の生物の任意のものに由来するｔＲＮＡのライブラリー及び／又はＲＳのライブラリーを作製するか及び／又は種々の利用可能な突然変異ストラテジーの任意のものを使用することにより、天然に存在するｔＲＮＡ及び／又はＲＳの突然変異により誘導してもよい。例えば、直交ｔＲＮＡ／アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ対を作製するための１つのストラテジーは例えば宿主細胞以外の起源又は多重起源に由来する（宿主に対して）異種のｔＲＮＡ／シンテターゼ対を宿主細胞に導入する方法である。異種シンテターゼ候補の特性としては、例えば宿主細胞ｔＲＮＡに負荷しないことが挙げられ、異種ｔＲＮＡ候補の特性としては、例えば宿主細胞シンテターゼによりアミノアシル化されないことが挙げられる。更に、異種ｔＲＮＡは全宿主細胞シンテターゼに対して直交性である。
直交対を作製するための第２のストラテジーはＯ−ｔＲＮＡ又はＯ−ＲＳをスクリーニング及び／又は選択するための突然変異体ライブラリーを作製する方法である。これらのストラテジーを組み合わせてもよい。
直交ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）
直交ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）はＯ−ｔＲＮＡにより認識されるセレクターコドンを含むポリヌクレオチドによりコードされる蛋白質への非天然アミノ酸の例えばｉｎ ｖｉｖｏ又はｉｎ ｖｉｔｒｏでの組込みを媒介することが望ましい。抑圧効率は当分野で公知の多数のアッセイの任意のものにより測定することができる。例えば、β−ガラクトシダーゼレポーターアッセイを使用することができ、例えば本発明のＯ−ｔＲＮＡを含むプラスミドと共に修飾ｌａｃＺプラスミド（構築物はｌａｃＺ核酸配列中にセレクターコドンをもつ）を適当な生物（例えば直交成分を使用することができる生物）に由来する細胞に導入する。コグネイトシンテターゼも（ポリペプチド又は発現時にコグネイトシンテターゼをコードするポリヌクレオチドとして）導入することができる。細胞を培地で所望密度（例えばＯＤ６００＝約０．５）まで増殖させ、例えばＢｅｔａＦｌｕｏｒ（登録商標）β−ガラクトシダーゼアッセイキット（Ｎｏｖａｇｅｎ）を使用してβ−ガラクトシダーゼアッセイを実施する。比較可能な対照（例えば所望位置にセレクターコドンではなく対応するセンスコドンをもつ修飾ｌａｃＺ構築物から観測される値）に対するサンプルの活性百分率として抑圧百分率を計算することができる。
Ｏ−ｔＲＮＡは公知Ｏ−ｔＲＮＡの保存変異体から誘導することもできる。例えば、Ｏ−ｔＲＮＡの保存変異体としては、例えば本明細書の配列表に記載するような特定Ｏ−ｔＲＮＡと同様に機能し、適当な自己相補性によりｔＲＮＡ Ｌ形構造を維持するが、例えば本明細書の配列表、図面又は実施例に記載する配列と同一の配列をもたない分子が挙げられる（更に野生型ｔＲＮＡ分子以外のものであることが望ましい）。
Ｏ−ｔＲＮＡを含む組成物は更に直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ＲＳ）を含むことができ、Ｏ−ＲＳはＯ−ｔＲＮＡを非天然アミノ酸で優先的にアミノアシル化する。所定態様では、Ｏ−ｔＲＮＡを含む組成物は更に（例えばｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｉｎ ｖｉｖｏ）翻訳系を含むことができる。該当ポリペプチドをコードし、Ｏ−ｔＲＮＡにより認識されるセレクターコドンを含むポリヌクレオチドを含む核酸、又はこれらの１種以上の組み合わせも細胞に加えることができる。
直交ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）の作製方法は公知である。本発明の所定態様では、Ｏ−ｔＲＮＡは突然変異体ライブラリーを作製することにより作製することができる。突然変異体ｔＲＮＡのライブラリーは当分野で公知の種々の突然変異誘発技術を使用して作製することができる。例えば、突然変異体ｔＲＮＡは部位特異的突然変異、ランダム点突然変異、相同組換え、ＤＮＡシャフリングもしくは他の再帰的突然変異誘発法、キメラ構築又はその任意組み合わせにより作製することができる。
ｔＲＮＡの所望ループ又は領域（例えばアンチコドンループ、受容体ステム、Ｄアームもしくはループ、可変ループ、ＴＰＣアームもしくはループ、ｔＲＮＡ分子の他の領域、又はその組合せ）の特定位置（例えば非保存位置又は保存位置）、ランダム位置又は両者の組合せに付加突然変異を導入することができる。一般に、ｔＲＮＡの突然変異としてはセレクターコドンの認識を可能にするように突然変異体ｔＲＮＡライブラリーの各メンバーのアンチコドンループを突然変異させる方法が挙げられる。この方法はＯ−ｔＲＮＡに付加配列を付加する段階を更に含むことができる。一般に、Ｏ−ｔＲＮＡは所望ＲＳに対するその親和性等を維持しながら、出発材料（例えば複数のｔＲＮＡ配列）に比較して所望生物に対する直交性が改善されている。
前記方法は場合によりｔＲＮＡ及び／又はアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼの配列の類似性（及び／又は推定相同性）を分析し、特定生物に対して直交性であると思われるＯ−ｔＲＮＡ、Ｏ−ＲＳ及び／又はその対の潜在候補を決定する段階を含む。本明細書に記載する当分野で公知のコンピュータープログラム（例えばＢＬＡＳＴ及びｐｉｌｅｕｐプログラム）を分析に使用することができる。１例では、大腸菌で使用するための潜在的直交翻訳成分を選択するためには、真正細菌生物に密接な配列類似性を示さないシンテターゼ及び／又はｔＲＮＡを選択する。
一般に、Ｏ−ｔＲＮＡは複数の潜在的Ｏ−ｔＲＮＡのメンバーを含む第１の種の細胞の集団に例えばネガティブ選択を実施することにより得られる。ネガティブ選択は細胞に内在性のアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（ＲＳ）によりアミノアシル化される潜在的Ｏ−ｔＲＮＡライブラリーのメンバーを含む細胞を排除する。こうして、第１の種の細胞に直交性のｔＲＮＡプールが得られる。
所定態様において、ネガティブ選択では、ネガティブ選択マーカー（例えば抗生物質耐性を付与する酵素（例えばβ−ラクタマーゼ）、検出可能な産物を付与する酵素（例えばβ−ガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ））、例えば毒性物質（例えばバルナーゼ））をコードするポリヌクレオチドの（例えば機能的バルナーゼを依然として産生する）非必須位置等にセレクターコドンを導入する。場合により選択物質（例えばアンピシリン等の抗生物質）の存在下で細胞集団を増殖させることによりスクリーニング／選択を実施する。１態様では、選択物質の濃度を変動させる。
例えば、サプレッサーｔＲＮＡの活性を測定するためには、セレクターコドン（例えばネガティブ選択マーカー（例えばβ−ラクタマーゼ遺伝子（ｂｌａ））をコードするポリヌクレオチドに導入されたナンセンス（例えば終止）又はフレームシフト突然変異）のｉｎ ｖｉｖｏ抑圧に基づく選択システムを使用する。例えば、所定位置（例えばＡ１８４）にセレクターコドンをもつポリヌクレオチド変異体（例えばｂｌａ変異体）を構築する。細胞（例えば細菌）をこれらのポリヌクレオチドで形質転換する。内在大腸菌シンテターゼにより効率的に負荷することができない直交ｔＲＮＡの場合には、抗生物質耐性（例えばアンピシリン耐性）はプラスミドで形質転換されていない細菌と同等以下のはずである。ｔＲＮＡが非直交性の場合、又はｔＲＮＡに負荷することが可能な異種シンテターゼをシステムで同時発現させる場合には、より高レベルの抗生物質（例えばアンピシリン）耐性が観測される。プラスミドで形質転換されていない細胞と同等の抗生物質濃度のＬＢ寒天プレートで増殖することができない細胞（例えば細菌）を選択する。
毒性物質（例えばリボヌクレアーゼ又はバルナーゼ）の場合には、複数の潜在的ｔＲＮＡのメンバーが内在宿主（例えば大腸菌）シンテターゼによりアミノアシル化されるとき（即ち、宿主（例えば大腸菌）シンテターゼに非直交性であるとき）には、セレクターコドンは抑圧され、生産される毒性ポリヌクレオチド産物は細胞死を生じる。直交ｔＲＮＡ又は非機能的ｔＲＮＡを含む細胞は生存する。
１態様では、所望生物に直交性のｔＲＮＡプールに次にポジティブ選択を実施し、セレクターコドンを例えばβ−ラクタマーゼ遺伝子等の薬剤耐性遺伝子によりコードされるポジティブ選択マーカーに配置する。ポジティブ選択は細胞に直交性のｔＲＮＡプールのメンバーをコードするか又は前記メンバーを含むポリヌクレオチドと、ポジティブ選択マーカーをコードするポリヌクレオチドと、コグネイトＲＳをコードするポリヌクレオチドを含む細胞で実施される。所定態様では、第２の細胞集団はネガティブ選択により排除されなかった細胞を含む。ポリヌクレオチドを細胞で発現させ、選択物質（例えばアンピシリン）の存在下で細胞を増殖させる。次に、同時発現させたコグネイトシンテターゼによりアミノアシル化され、このセレクターコドンに応答してアミノ酸を挿入することができるｔＲＮＡを選択する。一般に、これらの細胞は非機能的ｔＲＮＡ、又は該当シンテターゼにより効率的に認識することができないｔＲＮＡを含む細胞に比較して高い抑圧効率を示す。非機能的ｔＲＮＡ又は該当シンテターゼにより効率的に認識されないｔＲＮＡを含む細胞は抗生物質に感受性である。従って、（ｉ）内在宿主（例えば大腸菌）シンテターゼの基質ではなく；（ｉｉ）該当シンテターゼによりアミノアシル化することができ；（ｉｉｉ）翻訳で機能的なｔＲＮＡが両者選択後に生存している。
従って、スクリーニングされる状況に応じて同一マーカーがポジティブマーカーにもネガティブマーカーにもなる。即ち、マーカーがポジティブスクリーニングされる場合にはポジティブマーカーであり、ネガティブスクリーニングされる場合にはネガティブマーカーである。
上記方法における選択（例えばポジティブ選択、ネガティブ選択又はポジティブ選択とネガティブ選択の両者）のストリンジェンシーは場合により選択ストリンジェンシーの変動を含む。例えば、バルナーゼは極毒性蛋白質であるので、異なる数のセレクターコドンをバルナーゼ遺伝子に導入するか及び／又は誘導プロモーターを使用することによりネガティブ選択のストリンジェンシーを制御することができる。別の例では、選択又はスクリーニング物質の濃度（例えばアンピシリン濃度）を変動させる。本発明の１側面では、初期ラウンド中の所望活性は低いと思われるのでストリンジェンシーを変動させる。即ち、初期ラウンドでは低ストリンジェンシー選択基準を適用し、後期ラウンドの選択では高ストリンジェンシー基準を適用する。所定態様では、ネガティブ選択、ポジティブ選択又はネガティブ選択とポジティブ選択の両方を複数回反復することができる。複数の異なるネガティブ選択マーカー、ポジティブ選択マーカー又はネガティブ選択マーカーとポジティブ選択マーカーの両方を使用することができる。所定態様では、ポジティブ選択マーカーとネガティブ選択マーカーを同一にすることができる。
本発明ではセレクターコドンに応答して非天然アミノ酸を負荷する直交翻訳成分（例えばＯ−ｔＲＮＡ、Ｏ−ＲＳ、及びＯ−ｔＲＮＡ／Ｏ−ＲＳ対）を作製するために他の型の選択／スクリーニングを使用することもできる。例えば、ネガティブ選択マーカー、ポジティブ選択マーカー又はポジティブ選択マーカーとネガティブ選択マーカーの両方として、適切な反応体の存在下で蛍光発光するか又は発光反応を触媒するマーカーを使用することができる。別の態様では、蛍光活性化細胞ソーティング（ＦＡＣＳ）又は発光によりマーカーの産物を検出する。場合により、マーカーはアフィニティースクリーニングマーカーを含む。Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，Ｊ．Ａ．ら，（１９９３）Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｃｅｌｌ ｓｏｒｔｉｎｇ ｏｆ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ ａ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｆｒａｇｍｅｎｔ ｏｎ ｔｈｅ ｅｘｔｅｒｎａｌ ｓｕｒｆａｃｅ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ．９０：１０４４４−８も参照。
組換え直交ｔＲＮＡのその他の作製方法も例えば国際出願公開ＷＯ２００２／０８６０７５、発明の名称「直交ｔＲＮＡ−アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ対を作製するための方法及び組成物（ＭＥＴＨＯＤＳ ＡＮＤ ＣＯＭＰＯＳＩＴＩＯＮＳ ＦＯＲ ＴＨＥ ＰＲＯＤＵＣＴＩＯＮ ＯＦ ＯＲＴＨＯＧＯＮＡＬ ｔＲＮＡ ＡＭＩＮＯＡＣＹＬ−ｔＲＮＡ ＳＹＮＴＨＥＴＡＳＥ ＰＡＩＲＳ）」；ＷＯ２００４／０９４５９３、発明の名称「真核遺伝コードの拡張（ＥＸＰＡＮＤＩＮＧ ＴＨＥ ＥＵＫＡＲＹＯＴＩＣ ＧＥＮＥＴＩＣ ＣＯＤＥ）」；及びＷＯ２００５／０１９４１５（出願日２００４年７月７日）に記載されている。Ｆｏｒｓｔｅｒら，（２００３）Ｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ ｐｅｐｔｉｄｏｍｉｍｅｔｉｃ ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅｓ ｂｙ ｔｒａｎｓｌａｔｉｎｇ ｇｅｎｅｔｉｃ ｃｏｄｅｓ ｄｅｓｉｇｎｅｄ ｄｅ ｎｏｖｏ ＰＮＡＳ １００（１１）：６３５３−６３５７；及びＦｅｎｇら，（２００３），Ｅｘｐａｎｄｉｎｇ ｔＲＮＡ ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｔＲＮＡ ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ ｂｙ ａ ｓｉｎｇｌｅ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｃｈａｎｇｅ，ＰＮＡＳ １００（１０）：５６７６−５６８１も参照。
直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ＲＳ）
本発明で利用されるＯ−ＲＳはｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｉｎ ｖｉｖｏでＯ−ｔＲＮＡを非天然アミノ酸で優先的にアミノアシル化する。Ｏ−ＲＳはＯ−ＲＳを含むポリペプチド及び／又はＯ−ＲＳ又はその一部をコードするポリヌクレオチドにより翻訳系（例えば細胞）に提供することができる。例えば、Ｏ−ＲＳは当分野で公知のようなアミノ酸配列、又はその保存変異体を含む。別の例では、Ｏ−ＲＳ、又はその一部は本明細書の配列表もしくは実施例に記載する配列を含むアミノ酸をコードするポリヌクレオチド配列、又はその相補的ポリヌクレオチド配列によりコードされる。例えば、有用なＯ−ＲＳ分子の配列については図８参照。
Ｏ−ｔＲＮＡと併用する直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ＲＳ）（例えばＯ−ＲＳ）の同定方法は公知である。例えば、１方法は第１の種の細胞集団について選択（例えばポジティブ選択）を実施する段階を含み、前記細胞は１）複数のアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（ＲＳ）のメンバー（例えば複数のＲＳは突然変異体ＲＳ、第１の種以外の種に由来するＲＳ又は突然変異体ＲＳと第１の種以外の種に由来するＲＳの両方を含むことができる）と；２）（例えば１種以上の種に由来する）直交ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）と；３）（例えばポジティブ）選択マーカーをコードし、少なくとも１個のセレクターコドンを含むポリヌクレオチドを各々含む。複数のＲＳのメンバーを含まないか又はその量の少ない細胞に比較して抑圧効率の高い細胞について細胞を選択又はスクリーニングする。抑圧効率は本明細書に記載するような当分野で公知の技術により測定することができる。抑圧効率の高い細胞はＯ−ｔＲＮＡをアミノアシル化する活性ＲＳを含む。第１の種に由来する第１組のｔＲＮＡの活性ＲＳによる（ｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｉｎ ｖｉｖｏ）アミノアシル化レベルを第２の種に由来する第２組のｔＲＮＡの活性ＲＳによる（ｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｉｎ ｖｉｖｏ）アミノアシル化レベルと比較する。アミノアシル化レベルは検出可能な物質（例えば標識非天然アミノ酸）により測定することができる。第１組のｔＲＮＡに比較して第２組のｔＲＮＡをより効率的にアミノアシル化する活性ＲＳを一般に選択することにより、Ｏ−ｔＲＮＡと併用する効率的（最適化）直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼが得られる。この方法により同定されたＯ−ＲＳも本発明の特徴である。
アミノアシル化を測定するためには多数のアッセイの任意のものを使用することができる。これらのアッセイはｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｉｎ ｖｉｖｏで実施することができる。例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏアミノアシル化アッセイは例えばＨｏｂｅｎ ａｎｄ Ｓｏｌｌ（１９８５）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１１３：５５−５９に記載されている。アミノアシル化はレポーターを直交翻訳成分と併用し、蛋白質をコードする少なくとも１個のセレクターコドンを含むポリヌクレオチドを発現する細胞でレポーターを検出することにより測定することもできる。ＷＯ２００２／０８５９２３、発明の名称「非天然アミノ酸のインビボ組込み（ＩＮ ＶＩＶＯ ＩＮＣＯＲＰＯＲＡＴＩＯＮ ＯＦ ＵＮＮＡＴＵＲＡＬ ＡＭＩＮＯ ＡＣＩＤＳ）」；及びＷＯ２００４／０９４５９３、発明の名称「真核遺伝コードの拡張（ＥＸＰＡＮＤＩＮＧ ＴＨＥ ＥＵＫＡＲＹＯＴＩＣ ＧＥＮＥＴＩＣ ＣＯＤＥ）」も参照。
同定されたＯ−ＲＳを更に操作し、所望非天然アミノ酸のみをＯ−ｔＲＮＡに負荷し、２０種類の標準アミノ酸のいずれをも負荷しないようにシンテターゼの基質特異性を改変することができる。非天然アミノ酸に対して基質特異性をもつ直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼの作製方法は例えばシンテターゼの活性部位、シンテターゼの編集メカニズム部位、シンテターゼの各種ドメインを組み合わせることによる各種部位等でシンテターゼを突然変異させる段階と、選択プロセスを適用する段階を含む。ポジティブ選択後にネガティブ選択を行う併用に基づくストラテジーを使用する。ポジティブ選択では、ポジティブマーカーの非必須位置に導入したセレクターコドンが抑圧されると、細胞はポジティブ選択圧下で生存する。従って、天然アミノ酸と非天然アミノ酸の両者の存在下で生存細胞は直交サプレッサーｔＲＮＡに天然又は非天然アミノ酸を負荷する活性シンテターゼをコードする。ネガティブ選択では、ネガティブマーカーの非必須位置に導入したセレクターコドンが抑圧されると、天然アミノ酸特異性をもつシンテターゼは除去される。ネガティブ選択とポジティブ選択の生存細胞は直交サプレッサーｔＲＮＡを非天然アミノ酸のみでアミノアシル化（負荷）するシンテターゼをコードする。その後、これらのシンテターゼを更に突然変異誘発（例えばＤＮＡシャフリング又は他の再帰的突然変異誘発法）に付すことができる。
突然変異体Ｏ−ＲＳのライブラリーは当分野で公知の種々の突然変異誘発技術を使用して作製することができる。例えば、突然変異体ＲＳは部位特異的突然変異、ランダム点突然変異、相同組換え、ＤＮＡシャフリングもしくは他の再帰的突然変異誘発法、キメラ構築又はその任意組み合わせにより作製することができる。例えば、突然変異体ＲＳのライブラリーは２個以上の他の例えばサイズとダイバーシティーの小さい「サブライブラリー」から作製することができる。ＲＳのキメラライブラリーも本発明に含まれる。なお、場合により各種生物（例えば真正細菌又は古細菌等の微生物）に由来するｔＲＮＡシンテターゼのライブラリー（例えば天然ダイバーシティーを含むライブラリー）（例えば米国特許第６，２３８，８８４号（Ｓｈｏｒｔら）；米国特許第５，７５６，３１６号（Ｓｃｈａｌｌｅｎｂｅｒｇｅｒら）；米国特許第５，７８３，４３１号（Ｐｅｔｅｒｓｅｎら）；米国特許第５，８２４，４８５号（Ｔｈｏｍｐｓｏｎら）；米国特許第５，９５８，６７２号（Ｓｈｏｒｔら）参照）を構築し、直交対についてスクリーニングする。
シンテターゼにポジティブ及びネガティブ選択／スクリーニングストラテジーを実施した後、これらのシンテターゼを更に突然変異誘発することができる。例えば、Ｏ−ＲＳをコードする核酸を単離し；（例えばランダム突然変異誘発、部位特異的突然変異誘発、組換え又はその任意組み合わせにより）突然変異Ｏ−ＲＳをコードする１組のポリヌクレオチドを核酸から作製し；Ｏ−ｔＲＮＡを非天然アミノ酸で優先的にアミノアシル化する突然変異Ｏ−ＲＳが得られるまでこれらの個々の段階又はこれらの段階の組み合わせを繰り返すことができる。本発明の所定側面では、前記段階を複数回、例えば少なくとも２回実施する。
Ｏ−ｔＲＮＡ、Ｏ−ＲＳ、又はその対を作製するための本発明の方法では、付加レベルの選択／スクリーニングストリンジェンシーを使用することもできる。選択又はスクリーニングストリンジェンシーはＯ−ＲＳの作製方法の一方又は両方の段階で変動させることができる。これは例えば選択／スクリーニング物質の使用量等の変動とすることができる。付加ラウンドのポジティブ及び／又はネガティブ選択を実施することもできる。選択又はスクリーニングは更にアミノ酸浸透率の変化、翻訳効率の変化、翻訳忠実度の変化等の１種以上を含むこともできる。一般に、１種以上の変化は蛋白質を生産するために直交ｔＲＮＡ−ｔＲＮＡシンテターゼ対を使用する生物における１個以上の遺伝子の突然変異に基づく。
Ｏ−ＲＳの作製と、シンテターゼの基質特異性の改変に関するその他の一般的な詳細については国際公開ＷＯ２００２／０８６０７５、発明の名称「直交ｔＲＮＡ−アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ対を作製するための方法及び組成物（ＭＥＴＨＯＤＳ ＡＮＤ ＣＯＭＰＯＳＩＴＩＯＮＳ ＦＯＲ ＴＨＥ ＰＲＯＤＵＣＴＩＯＮ ＯＦ ＯＲＴＨＯＧＯＮＡＬ ｔＲＮＡ ＡＭＩＮＯＡＣＹＬ−ｔＲＮＡ ＳＹＮＴＨＥＴＡＳＥ ＰＡＩＲＳ）」；及びＷＯ２００４／０９４５９３、発明の名称「真核遺伝コードの拡張（ＥＸＰＡＮＤＩＮＧ ＴＨＥ ＥＵＫＡＲＹＯＴＩＣ ＧＥＮＥＴＩＣ ＣＯＤＥ）」に記載されている。言及によりその開示内容全体を本明細書に組込むＷａｎｇ ａｎｄ Ｓｃｈｕｌｔｚ“Ｅｘｐａｎｄｉｎｇ ｔｈｅ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｃｏｄｅ，”Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ Ｃｈｅｍｉｅ Ｉｎｔ．Ｅｄ．，４４（１）：３４−６６（２００５）も参照。
資源及び宿主生物
本発明で利用される直交翻訳成分（Ｏ−ｔＲＮＡとＯ−ＲＳ）はＯ−ｔＲＮＡ／Ｏ−ＲＳ成分と宿主系が直交に作用するという条件で他の任意種に由来する宿主翻訳系で使用するために任意生物（又は生物組み合わせ）に由来することができる。直交対のＯ−ｔＲＮＡとＯ−ＲＳは同一生物に由来する必要はない。所定側面では、直交成分は真正細菌宿主系で使用するために古細菌遺伝子（即ち古細菌）に由来する。
例えば、直交Ｏ−ｔＲＮＡは古細菌生物、例えばＭｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ、Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍ、Ｈａｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ（例えばＨａｌｏｆｅｒａｘ ｖｏｌｃａｎｉｉ及びＨａｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ種ＮＲＣ−１）、Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ ｆｕｌｇｉｄｕｓ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｕｓ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉ、Ａｅｕｒｏｐｙｒｕｍ ｐｅｒｎｉｘ、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ ｍａｒｉｐａｌｕｄｉｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｐｙｒｕｓ ｋａｎｄｌｅｒｉ、Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ ｍａｚｅｉ（Ｍｍ）、Ｐｙｒｏｂａｃｕｌｕｍ ａｅｒｏｐｈｉｌｕｍ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ａｂｙｓｓｉ、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓ（Ｓｓ）、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ ｔｏｋｏｄａｉｉ、Ｔｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ、Ｔｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａ ｖｏｌｃａｎｉｕｍ等の古細菌や、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ，Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ，Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｐｈｉｌｕｓ等の真正細菌に由来することができ、直交Ｏ−ＲＳは生物又は生物組み合わせ、例えばＭｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ、Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍ、Ｈａｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ（例えばＨａｌｏｆｅｒａｘ ｖｏｌｃａｎｉｉ及びＨａｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ種ＮＲＣ−１）、Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ ｆｕｌｇｉｄｕｓ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｕｓ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉ、Ａｅｕｒｏｐｙｒｕｍ ｐｅｒｎｉｘ、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ ｍａｒｉｐａｌｕｄｉｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｐｙｒｕｓ ｋａｎｄｌｅｒｉ、Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ ｍａｚｅｉ、Ｐｙｒｏｂａｃｕｌｕｍ ａｅｒｏｐｈｉｌｕｍ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ａｂｙｓｓｉ、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓ、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ ｔｏｋｏｄａｉｉ、Ｔｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ、Ｔｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａ ｖｏｌｃａｎｉｕｍ等の古細菌や、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ，Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ，Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｐｈｉｌｕｓ等の真正細菌に由来することができる。１態様では、例えば植物、藻類、原生動物、真菌類、酵母、動物（例えば哺乳動物、昆虫、節足動物等）等の真核資源もＯ−ｔＲＮＡ及びＯ−ＲＳの資源として使用することができる。
Ｏ−ｔＲＮＡ／Ｏ−ＲＳ対の個々の成分は同一生物に由来するものでも異なる生物に由来するものでもよい。１態様では、Ｏ−ｔＲＮＡ／Ｏ−ＲＳ対は同一生物に由来する。あるいは、Ｏ−ｔＲＮＡ／Ｏ−ＲＳ対のＯ−ｔＲＮＡとＯ−ＲＳは異なる生物に由来する。
Ｏ−ｔＲＮＡ、Ｏ−ＲＳ又はＯ−ｔＲＮＡ／Ｏ−ＲＳ対はｉｎ ｖｉｖｏ又はｉｎ ｖｉｔｒｏで選択又はスクリーニングすることができ、及び／又は非天然アミノ酸を組込んだポリペプチドを生産するために細胞（例えば真正細菌細胞）で使用することができる。使用する真正細菌細胞は限定されないが、例えば大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｐｈｉｌｕｓ等である。本発明の翻訳成分を含む真正細菌細胞の組成物も本発明の特徴である。
別の種で使用するためにある種のＯ−ｔＲＮＡ及び／又はＯ−ＲＳをスクリーニングする方法については、国際出願公開ＷＯ２００４／０９４５９３、発明の名称「真核遺伝コードの拡張（ＥＸＰＡＮＤＩＮＧ ＴＨＥ ＥＵＫＡＲＹＯＴＩＣ ＧＥＮＥＴＩＣ ＣＯＤＥ）」（出願日２００４年４月１６日）も参照。
所定側面では、Ｏ−ｔＲＮＡ、Ｏ−ＲＳ又はＯ−ｔＲＮＡ／Ｏ−ＲＳ対はｉｎ ｖｉｖｏ又はｉｎ ｖｉｔｒｏで選択又はスクリーニングすることができ、及び／又は非天然アミノ酸を組込んだポリペプチドを生産するために細胞（例えば真核細胞）で使用することができる。使用する真核細胞は限定されず、例えばＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）等の適切な任意酵母細胞を使用することができる。本発明の翻訳成分を含む真核細胞の組成物も本発明の特徴である。
（例えば、Ｏ−ＲＳとＯ−ｔＲＮＡと非天然アミノ酸を含む）直交翻訳系は非天然アミノ酸を組込んだ蛋白質を生産するために培養宿主細胞を利用することができるが、本発明の直交翻訳系は無傷の生存可能な宿主細胞を必要とするものではない。例えば、直交翻訳系は細胞抽出液の存在下で無細胞系を利用することができる。実際に、蛋白質生産に無細胞ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写／翻訳系を使用することは確立した技術である。本明細書に記載する直交翻訳系成分を使用して非天然アミノ酸を組込んだ蛋白質を生産するようにこれらのｉｎ ｖｉｔｒｏ系を応用することは当然本発明の範囲に含まれる。
セレクターコドン
直交翻訳系のセレクターコドンは蛋白質生合成機構の遺伝コドン枠を拡張する。例えば、セレクターコドンとしては例えばユニーク３塩基コドン、ナンセンスコドン（例えばアンバーコドン（ＵＡＧ）又はオパールコドン（ＵＧＡ）等の終止コドン）、非天然コドン、少なくとも４塩基のコドン、レアコドン等が挙げられる。例えば１個以上、２個以上、４個以上等の多数のセレクターコドンを所望遺伝子に導入することができる。複数の異なるセレクターコドンを使用することにより、これらの異なるセレクターコドンを使用して（例えば少なくとも１個の非天然アミノ酸を含む）複数の非天然アミノ酸の同時部位特異的組込みを可能にする複数の直交ｔＲＮＡ／シンテターゼ対を使用することができる。
１態様では、本方法は細胞でポリペプチドに非天然アミノ酸をｉｎ ｖｉｖｏ組込むために終止コドンであるセレクターコドンを使用する。例えば、終止コドンを認識し、Ｏ−ＲＳにより非天然アミノ酸でアミノアシル化されるＯ−ｔＲＮＡを作製する。このＯ−ｔＲＮＡは天然に存在する宿主のアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼにより認識されない。慣用部位特異的突然変異誘発法を使用して該当ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの該当部位に終止コドンを導入することができる。例えばＳａｙｅｒｓ，Ｊ．Ｒ．ら，（１９８８），５’，３’Ｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ ｉｎ ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ−ｂａｓｅｄ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．７９１−８０２参照。Ｏ−ＲＳ、Ｏ−ｔＲＮＡ及び該当ポリペプチドをコードする核酸を例えばｉｎ ｖｉｖｏで併用すると、非天然アミノ酸は終止コドンに応答して組込まれ、特定位置に非天然アミノ酸を組込んだポリペプチドが得られる。本発明の１態様では、セレクターコドンとして使用される終止コドンはアンバーコドンＵＡＧ及び／又はオパールコドンＵＧＡである。１例では、セレクターコドンとしてＵＡＧとＵＧＡの両者を使用する遺伝コードは存在度が最も高い終結シグナルであるオーカーナンセンスコドンＵＡＡを保存しながら２２種類のアミノ酸をコードすることができる。
非天然アミノ酸のｉｎ ｖｉｖｏ組込みは宿主細胞をさほど撹乱せずに実施することができる。例えば、大腸菌等の非真核細胞では、ＵＡＧコドンの抑圧効率はＯ−ｔＲＮＡ（例えばアンバーサプレッサーｔＲＮＡ）と（ＵＡＧコドンと結合してリボソームから成長中のペプチドの放出を開始する）放出因子１（ＲＦ１）の競合に依存するので、例えばＯ−ｔＲＮＡ（例えばサプレッサーｔＲＮＡ）の発現レベルを増加するか又はＲＦ１欠損株を使用することにより抑圧効率を調節することができる。真核細胞では、ＵＡＧコドンの抑圧効率はＯ−ｔＲＮＡ（例えばアンバーサプレッサーｔＲＮＡ）と（終止コドンと結合してリボソームから成長中のペプチドの放出を開始する）真核放出因子（例えばｅＲＦ）の競合に依存するので、例えばＯ−ｔＲＮＡ（例えばサプレッサーｔＲＮＡ）の発現レベルを増加することにより抑圧効率を調節することができる。更に、付加化合物、例えばジチオスレイトール（ＤＴＴ）等の還元剤も加えてもよい。
非天然アミノ酸はレアコドンでコードすることもできる。例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏ蛋白質合成反応でアルギニン濃度を下げると、レアアルギニンコドンＡＧＧはアラニンでアシル化された合成ｔＲＮＡによるＡｌａの挿入に有効であることが分かっている。例えばＭａら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３２：７９３９（１９９３）参照。この場合には、合成ｔＲＮＡは大腸菌に少量種として存在する天然ｔＲＮＡＡｒｇと競合する。更に、生物によっては全トリプレットコドンを使用しないものもある。Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ ｌｕｔｅｕｓで割り当てられないコドンＡＧＡがｉｎ ｖｉｔｒｏ転写／翻訳抽出物へのアミノ酸挿入に利用されている。例えばＫｏｗａｌ ａｎｄ Ｏｌｉｖｅｒ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ．Ｒｅｓ．，２５：４６８５（１９９７）参照。本発明の成分はこれらのレアコドンをｉｎ ｖｉｖｏ使用するために作製することができる。
セレクターコドンは更に拡張コドン（例えば４、５、６塩基以上のコドン等の４塩基以上のコドン）も含むことができる。４塩基コドンの例としては例えばＡＧＧＡ、ＣＵＡＧ、ＵＡＧＡ、ＣＣＣＵ等が挙げられる。５塩基コドンの例としては例えばＡＧＧＡＣ、ＣＣＣＣＵ、ＣＣＣＵＣ、ＣＵＡＧＡ、ＣＵＡＣＵ、ＵＡＧＧＣ等が挙げられる。本発明の方法はフレームシフト抑圧に基づく拡張コドンの使用を含む。４塩基以上のコドンは例えば１又は複数の非天然アミノ酸を同一蛋白質に挿入することができる。他の態様では、アンチコドンループは例えば少なくとも４塩基コドン、少なくとも５塩基コドン、又は少なくとも６塩基コドン又はそれ以上をデコードすることができる。４塩基コドンは２５６種が考えられるので、４塩基以上のコドンを使用すると同一細胞で複数の非天然アミノ酸をコードすることができる。Ａｎｄｅｒｓｏｎら，（２００２）Ｅｘｐｌｏｒｉｎｇ ｔｈｅ Ｌｉｍｉｔｓ ｏｆ Ｃｏｄｏｎ ａｎｄ Ａｎｔｉｃｏｄｏｎ Ｓｉｚｅ，Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｙ，９：２３７−２４４；及びＭａｇｌｉｅｒｙ，（２００１）Ｅｘｐａｎｄｉｎｇ ｔｈｅ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｃｏｄｅ：Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ Ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒｓ ｏｆ Ｆｏｕｒ−ｂａｓｅ Ｃｏｄｏｎｓ ａｎｄ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ “Ｓｈｉｆｔｙ” Ｆｏｕｒ−ｂａｓｅ Ｃｏｄｏｎｓ ｗｉｔｈ ａ Ｌｉｂｒａｒｙ Ａｐｐｒｏａｃｈ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３０７：７５５−７６９も参照。
例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏ生合成法を使用して非天然アミノ酸を蛋白質に組込むために４塩基コドンが使用されている。例えばＭａら，（１９９３）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３２，７９３９；及びＨｏｈｓａｋａら，（１９９９）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１２１：３４参照。２個の化学的にアシル化されたフレームシフトサプレッサーｔＲＮＡを用いて２−ナフチルアラニンとリジンのＮＢＤ誘導体をストレプトアビジンに同時にｉｎ ｖｉｔｒｏで組込むためにＣＧＧＧとＡＧＧＵが使用されている。例えばＨｏｈｓａｋａら，（１９９９）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１２１：１２１９４参照。ｉｎ ｖｉｖｏ試験では、ＭｏｏｒｅらはＮＣＵＡアンチコドンをもつｔＲＮＡＬｅｕ誘導体がＵＡＧＮコドン（ＮはＵ、Ａ、Ｇ又はＣであり得る）を抑圧する能力を試験し、４塩基ＵＡＧＡはＵＣＵＡアンチコドンをもつｔＲＮＡＬｅｕにより１３〜２６％の効率でデコードすることができるが、０又は−１フレームでは殆どデコードできないことを見出した。Ｍｏｏｒｅら，（２０００）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２９８：１９５参照。１態様では、レアコドン又はナンセンスコドンに基づく拡張コドンを本発明で使用し、他の望ましくない部位でのミスセンス読み飛ばしとフレームシフト抑圧を減らすことができる。４塩基コドンは各種直交系でセレクターコドンとして使用されている。例えば、ＷＯ２００５／０１９４１５；ＷＯ２００５／００７８７０；及びＷＯ２００５／００７６２４参照。言及によりその開示内容全体を本明細書に組込むＷａｎｇ ａｎｄ Ｓｃｈｕｌｔｚ“Ｅｘｐａｎｄｉｎｇ ｔｈｅ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｃｏｄｅ，”Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ Ｃｈｅｍｉｅ Ｉｎｔ．Ｅｄ．，４４（１）：３４−６６（２００５）も参照。下記実施例ではアンバーセレクターコドンを利用しているが、４塩基Ｏ−ｔＲＮＡと各種非天然アミノ酸Ｏ−ＲＳについて従来記載されている突然変異と同様の突然変異を含むように改変したシンテターゼを使用するように下記実施例を変更することにより、４塩基以上のコドンも使用することができる。
所与系では、セレクターコドンは更に天然３塩基コドンの１種を含むことができ、内在系はこの天然塩基コドンを使用しない（又は殆ど使用しない）。例えば、天然３塩基コドンを認識するｔＲＮＡをもたない系、及び／又は３塩基コドンがレアコドンである系がこれに該当する。
セレクターコドンは場合により非天然塩基対を含む。これらの非天然塩基対は更に既存遺伝子アルファベットを拡張する。塩基対が１個増えると、トリプレットコドン数は６４から１２５に増す。第３の塩基対の性質としては安定的且つ選択的な塩基対合、高い忠実度でポリメラーゼによるＤＮＡへの効率的な酵素組込み、及び新生非天然塩基対の合成後の効率的な持続的プライマー伸長が挙げられる。方法と組成物に適応可能な非天然塩基対については、例えばＨｉｒａｏら，（２００２）Ａｎ ｕｎｎａｔｕｒａｌ ｂａｓｅ ｐａｉｒ ｆｏｒ ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｎｇ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ａｎａｌｏｇｕｅｓ ｉｎｔｏ ｐｒｏｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０：１７７−１８２に記載されている。Ｗｕ，Ｙ．ら，（２００２）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２４：１４６２６−１４６３０も参照。他の関連刊行物は以下に挙げる。
ｉｎ ｖｉｖｏ使用では、非天然ヌクレオシドは膜透過性であり、リン酸化され、対応する三リン酸塩を形成する。更に、増加した遺伝情報は安定しており、細胞内酵素により破壊されない。Ｂｅｎｎｅｒらによる従来の報告はカノニカルワトソンクリック対とは異なる水素結合パターンを利用しており、そのうちで最も注目される例はイソＣ：イソＧ対である。例えばＳｗｉｔｚｅｒら，（１９８９）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１１１：８３２２；及びＰｉｃｃｉｒｉｌｌｉら，（１９９０）Ｎａｔｕｒｅ，３４３：３３；Ｋｏｏｌ，（２０００）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．，４：６０２参照。これらの塩基は一般に天然塩基とある程度まで誤対合し、酵素複製することができない。Ｋｏｏｌらは水素結合を塩基間の疎水性パッキング相互作用に置き換えることにより塩基対の形成を誘導できることを立証した。Ｋｏｏｌ，（２０００）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．，４：６０２；及びＧｕｃｋｉａｎ ａｎｄ Ｋｏｏｌ，（１９９８）Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．，３６，２８２５参照。上記全要件を満足する非天然塩基対を開発する目的でＳｃｈｕｌｔｚ，Ｒｏｍｅｓｂｅｒｇらは一連の非天然疎水性塩基を体系的に合成し、試験した。ＰＩＣＳ：ＰＩＣＳ自己対は天然塩基対よりも安定しており、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩのＫｌｅｎｏｗフラグメント（ＫＦ）によりＤＮＡに効率的に組込むことができる。例えばＭｃＭｉｎｎら，（１９９９）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１２１：１１５８６；及びＯｇａｗａら，（２０００）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１２２：３２７４参照。生体機能に十分な効率と選択性でＫＦにより３ＭＮ：３ＭＮ自己対を合成することができる。例えばＯｇａｗａら，（２０００）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１２２：８８０３参照。しかし、どちらの塩基も後期複製用チェーンターミネーターとして作用するものである。ＰＩＣＳ自己対を複製するために使用できる突然変異体ＤＮＡポリメラーゼが最近開発された。更に、７ＡＩ自己対も複製することができる。例えばＴａｅら，（２００１）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１２３：７４３９参照。Ｃｕ（ＩＩ）と結合すると安定な対を形成する新規メタロ塩基対Ｄｉｐｉｃ：Ｐｙも開発された。Ｍｅｇｇｅｒｓら，（２０００）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１２２：１０７１４参照。拡張コドンと非天然コドンは天然コドンに本質的に直交性であるので、本発明の方法は天然コドンに直交性のｔＲＮＡを作製するためにこの性質を利用することができる。
翻訳バイパス系を使用して非天然アミノ酸を所望ポリペプチドに組込むこともできる。１翻訳バイパス系では、大きい配列が遺伝子に挿入されるが、蛋白質に翻訳されない。この配列はリボソームに配列を飛び越させて挿入の下流の翻訳を再開するための合図として機能する構造を含む。
非天然アミノ酸
本明細書で使用する非天然アミノ酸とはセレノシステイン及び／又はピロリジンと２０種類の遺伝的にコードされる以下のα−アミノ酸、即ちアラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシン、バリン以外の任意アミノ酸、修飾アミノ酸又はアミノ酸類似体を意味する。α−アミノ酸の一般構造は式Ｉ：

により表される。
非天然アミノ酸は一般に式Ｉをもつ任意構造であり、式中、Ｒ基は２０種類の天然アミノ酸で使用されている以外の任意置換基である。２０種類の天然アミノ酸の構造については、例えばＬ．Ｓｔｒｙｅｒ著Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，第３版，１９８８，Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ参照。なお、本発明の非天然アミノ酸は上記２０種類のα−アミノ酸以外の天然化合物でもよい。
本発明の非天然アミノ酸は一般に側鎖が天然アミノ酸と異なるので、天然蛋白質と同様に他のアミノ酸（例えば天然又は非天然アミノ酸）とアミド結合を形成する。一方、非天然アミノ酸は天然アミノ酸と異なる側鎖基をもつ。
図１は本発明の実施例で使用される非天然アミノ酸の構造を示す。これらの非天然アミノ酸は適切なＯ−ＲＳとＯ−ｔＲＮＡを使用して蛋白質に組込むことができる。例えば、ｐ−ベンゾイル−Ｌ−フェニルアラニン（Ｂｐａ）は配列番号１のＯ−ｔＲＮＡと配列番号４のコグネイトＯ−ＲＳを含む直交翻訳系を使用して組込むことができる。パラ−アセチル−Ｌ−フェニルアラニン（ｐＡｃＰｈｅ）は配列番号１のＯ−ｔＲＮＡと配列番号６のコグネイトＯ−ＲＳを含む直交翻訳系を使用して組込むことができる。パラ−アジド−Ｌ−フェニルアラニン（ｐＡｚＰｈｅ）は配列番号１のＯ−ｔＲＮＡと配列番号８のコグネイトＯ−ＲＳを含む直交翻訳系を使用して組込むことができる。パラ−ヨード−Ｌ−フェニルアラニン（ｐＩＰｈｅ）は配列番号１のＯ−ｔＲＮＡと配列番号１０のコグネイトＯ−ＲＳを含む直交翻訳系を使用して組込むことができる。
しかし、ここで使用する非天然アミノ酸は本発明の広い適用可能性を例証するものに過ぎず、本発明は図１に示すこれらのアミノ酸の使用に限定されない。
例えば第１の直交対と共に適切な第２のＯ−ＲＳ／Ｏ−ｔＲＮＡ対を使用して複数の異なる非天然アミノ酸を該当ポリペプチドに同時に組込むことができ、第１の直交対と第２の直交対は異なるセレクターコドンを使用する。
他の非天然アミノ酸では、例えば、式ＩにおけるＲは場合によりアルキル、アリール、アシル、ヒドラジン、シアノ、ハロ、ヒドラジド、アルケニル、エーテル、硼酸、ボロン酸、ホスホ、ホスホノ、ホスフィン、エノン、イミン、エステル、ヒドロキシルアミン、アミン基等又はその任意組合せを含む。他の該当非天然アミノ酸としては限定されないが、光架橋基をもつアミノ酸、スピン標識アミノ酸、蛍光アミノ酸、金属結合性アミノ酸、金属含有アミノ酸、放射性アミノ酸、新規官能基をもつアミノ酸、他の分子と共有又は非共有的に相互作用するアミノ酸、フォトケージド及び／又は光異性化可能なアミノ酸、ビオチン又はビオチン類似体を含有するアミノ酸、ケト含有アミノ酸、グリコシル化アミノ酸、アミノ酸側鎖と結合した糖部分、ポリエチレングリコール又はポリエーテルを含むアミノ酸、重原子置換アミノ酸、化学分解性又は光分解性アミノ酸、天然アミノ酸に比較して延長側鎖（例えばポリエーテル又は例えば約５もしくは約１０炭素長を上回る長鎖炭化水素等）をもつアミノ酸、炭素結合糖含有アミノ酸、アミノチオ酸含有アミノ酸、並びに１個以上の毒性部分を含むアミノ酸が挙げられる。
別の側面では、本発明は下式ＩＶ：

により表される一般構造をもつ非天然アミノ酸を提供する。
この構造をもつ非天然アミノ酸は一般にＲ１が２０種類の天然アミノ酸の１種（例えば、チロシン又はフェニルアラニン）で使用される置換基であり、Ｒ２が置換基である任意構造である。従って、この種のアミノ酸は天然アミノ酸誘導体とみなすことができる。
非天然アミノ酸は場合により例えば式ＩＩ及びＩＩＩ：


の構造により表されるような修飾主鎖構造も含み、上記式中、Ｚは一般にＯＨ、ＮＨ２、ＳＨ、ＮＨ−Ｒ’又はＳ−Ｒ’を含み、ＸとＹは同一でも異なっていてもよく、一般にＳ又はＯであり、ＲとＲ’は場合により同一又は異なり、一般に式Ｉをもつ非天然アミノ酸について上記に記載したＲ基と同一の基及び水素から選択される。例えば、本発明の非天然アミノ酸は場合により式ＩＩ及びＩＩＩにより表されるようにアミノ又はカルボキシル基に置換を含む。この種の非天然アミノ酸としては限定されないが、例えば２０種類の標準天然アミノ酸に対応する側鎖又は非天然側鎖をもつα−ヒドロキシ酸、α−チオ酸、α−アミノチオカルボキシレートが挙げられる。更に、α炭素の置換は場合によりＬ、Ｄ又はα，α−ジ置換アミノ酸（例えばＤ−グルタミン酸、Ｄ−アラニン、Ｄ−メチル−Ｏ−チロシン、アミノ酪酸等）を含む。他の代替構造としては環状アミノ酸（例えばプロリン類似体や、３、４、６、７、８及び９員環プロリン類似体）、β及びγアミノ酸（例えば置換β−アラニン及びγ−アミノ酪酸）が挙げられる。
所定側面では、本発明はＬ配置の非天然アミノ酸を利用する。しかし、本発明はＬ配置非天然アミノ酸の使用に限定されない。本発明ではこれらの非天然アミノ酸のＤエナンチオマーも利用できると考えられる。
チロシン類似体としてはパラ置換チロシン、オルト置換チロシン、及びメタ置換チロシンが挙げられ、置換チロシンはアルキニル基、アセチル基、ベンゾイル基、アミノ基、ヒドラジン、ヒドロキシルアミン、チオール基、カルボキシ基、イソプロピル基、メチル基、Ｃ６−Ｃ２０直鎖又は分岐鎖炭化水素、飽和又は不飽和炭化水素、Ｏ−メチル基、ポリエーテル基、ニトロ基等を含む。更に、多置換アリール環も考えられる。本発明のグルタミン類似体としては限定されないが、α−ヒドロキシ誘導体、γ置換誘導体、環状誘導体及びアミド置換グルタミン誘導体が挙げられる。フェニルアラニン類似体の例としては限定されないが、パラ置換フェニルアラニン、オルト置換フェニルアラニン、及びメタ置換フェニルアラニンが挙げられ、置換基はアルキニル基、ヒドロキシ基、メトキシ基、メチル基、アリル基、アルデヒド、ニトロ、チオール基又はケト基等を含む。非天然アミノ酸の特定例としては限定されないが、ｐ−エチルチオカルボニル−Ｌ−フェニルアラニン、ｐ−（３−オキソブタノイル）−Ｌ−フェニルアラニン、１，５−ダンシル−アラニン、７−アミノ−クマリンアミノ酸、７−ヒドロキシ−クマリンアミノ酸、ニトロベンジル−セリン、Ｏ−（２−ニトロベンジル）−Ｌ−チロシン、ｐ−カルボキシメチル−Ｌ−フェニルアラニン、ｐ−シアノ−Ｌ−フェニルアラニン、ｍ−シアノ−Ｌ−フェニルアラニン、ビフェニルアラニン、３−アミノ−Ｌ−チロシン、ビピリジルアラニン、ｐ−（２−アミノ−１−ヒドロキシエチル）−Ｌ−フェニルアラニン、ｐ−イソプロピルチオカルボニル−Ｌ−フェニルアラニン、３−ニトロ−Ｌ−チロシン及びｐ−ニトロ−Ｌ−フェニルアラニンが挙げられる。更に、ｐ−プロパルギルオキシフェニルアラニン、３，４−ジヒドロキシ−Ｌ−フェニルアラニン（ＤＨＰ）、３，４，６−トリヒドロキシ−Ｌ−フェニルアラニン、３，４，５−トリヒドロキシ−Ｌ−フェニルアラニン、４−ニトロ−フェニルアラニン、ｐ−アセチル−Ｌ−フェニルアラニン、Ｏ−メチル−Ｌ−チロシン、Ｌ−３−（２−ナフチル）アラニン、３−メチルフェニルアラニン、Ｏ−４−アリル−Ｌ−チロシン、４−プロピル−Ｌ−チロシン、３−ニトロ−チロシン、３−チオール−チロシン、トリ−Ｏ−アセチル−ＧｌｃＮＡｃβ−セリン、Ｌ−Ｄｏｐａ、フッ素化フェニルアラニン、イソプロピル−Ｌ−フェニルアラニン、ｐ−アジド−Ｌ−フェニルアラニン、ｐ−アシル−Ｌ−フェニルアラニン、ｐ−ベンゾイル−Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−ホスホセリン、ホスホノセリン、ホスホノチロシン、ｐ−ヨードフェニルアラニン、ｐ−ブロモフェニルアラニン、ｐ−アミノ−Ｌ−フェニルアラニン、及びイソプロピル−Ｌ−フェニルアラニン等が挙げられる。直交翻訳系を使用して組込むことができる各種非天然アミノ酸の構造は公知である。各々言及によりその開示内容全体を本明細書に組込む本明細書の引用文献も参照。
非天然アミノ酸の化学的合成
上記非天然アミノ酸の多くは例えばＳｉｇｍａ（米国）やＡｌｄｒｉｃｈ（Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，ＷＩ，米国）から市販されている。市販されていないものは場合により各種刊行物に記載されている方法や当業者に公知の標準方法を使用して合成される。有機合成技術については例えばＦｅｓｓｅｎｄｏｎとＦｅｓｓｅｎｄｏｎ著Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（１９８２，第２版，Ｗｉｌｌａｒｄ Ｇｒａｎｔ Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｓｔｏｎ Ｍａｓｓ．）；Ｍａｒｃｈ著Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（第３版，１９８５，Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）；及びＣａｒｅｙとＳｕｎｄｂｅｒｇ著Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（第３版，Ｐａｒｔｓ Ａ ａｎｄ Ｂ，１９９０，Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）参照。非天然アミノ酸の合成について記載しているその他の刊行物としては例えばＷＯ２００２／０８５９２３、発明の名称「非天然アミノ酸のインビボ組込み（Ｉｎ ｖｉｖｏ ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｕｎｎａｔｕｒａｌ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄｓ）」；Ｍａｔｓｏｕｋａｓら，（１９９５）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，３８，４６６０−４６６９；Ｋｉｎｇ ａｎｄ Ｋｉｄｄ，（１９４９）Ａ Ｎｅｗ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ Ｇｌｕｔａｍｉｎｅ ａｎｄ ｏｆ γ−Ｄｉｐｅｐｔｉｄｅｓ ｏｆ Ｇｌｕｔａｍｉｃ Ａｃｉｄ ｆｒｏｍ Ｐｈｔｈｙｌａｔｅｄ Ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅｓ．Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，３３１５−３３１９；Ｆｒｉｅｄｍａｎ ａｎｄ Ｃｈａｔｔｅｒｒｊｉ（１９５９）Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ Ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ ｏｆ Ｇｌｕｔａｍｉｎｅ ａｓ Ｍｏｄｅｌ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅｓ ｆｏｒ Ａｎｔｉ−Ｔｕｍｏｒ Ａｇｅｎｔｓ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．８１，３７５０−３７５２；Ｃｒａｉｇら（１９８８）Ａｂｓｏｌｕｔｅ Ｃｏｎｆｉｇｕｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｅｎａｎｔｉｏｍｅｒｓ ｏｆ ７−Ｃｈｌｏｒｏ−４［［４−（ｄｉｅｔｈｙｌａｍｉｎｏ）−１−ｍｅｔｈｙｌｂｕｔｙｌ］ａｍｉｎｏ］ｑｕｉｎｏｌｉｎｅ（Ｃｈｌｏｒｏｑｕｉｎｅ）．Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．５３，１１６７−１１７０；Ａｚｏｕｌａｙら（１９９１）Ｇｌｕｔａｍｉｎｅ ａｎａｌｏｇｕｅｓ ａｓ Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ Ａｎｔｉｍａｌａｒｉａｌｓ，．Ｅｕｒ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２６，２０１−５；Ｋｏｓｋｉｎｅｎ ａｎｄ Ｒａｐｏｐｏｒｔ（１９８９）Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ４−Ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｅｄ Ｐｒｏｌｉｎｅｓ ａｓ Ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌｌｙ Ｃｏｎｓｔｒａｉｎｅｄ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄ Ａｎａｌｏｇｕｅｓ．Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．５４，１８５９−１８６６；Ｃｈｒｉｓｔｉｅ ａｎｄ Ｒａｐｏｐｏｒｔ（１９８５）Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ Ｏｐｔｉｃａｌｌｙ Ｐｕｒｅ Ｐｉｐｅｃｏｌａｔｅｓ ｆｒｏｍ Ｌ−Ａｓｐａｒａｇｉｎｅ．Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｔｏ ｔｈｅ Ｔｏｔａｌ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ（＋）−Ａｐｏｖｉｎｃａｍｉｎｅ ｔｈｒｏｕｇｈ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄ Ｄｅｃａｒｂｏｎｙｌａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｉｍｉｎｉｕｍ Ｉｏｎ Ｃｙｃｌｉｚａｔｉｏｎ．Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．１９８９：１８５９−１８６６；Ｂａｒｔｏｎら，（１９８７）Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ Ｎｏｖｅｌ α−Ａｍｉｎｏ−Ａｃｉｄｓ ａｎｄ Ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ Ｕｓｉｎｇ Ｒａｄｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ：Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ Ｌ−ａｎｄ Ｄ−α−Ａｍｉｎｏ−Ａｄｉｐｉｃ Ａｃｉｄｓ，Ｌ−α−ａｍｉｎｏｐｉｍｅｌｉｃ Ａｃｉｄ ａｎｄ Ａｐｐｒｏｐｒｉａｔｅ Ｕｎｓａｔｕｒａｔｅｄ Ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ．Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．４３：４２９７−４３０８；及びＳｕｂａｓｉｎｇｈｅら，（１９９２）Ｑｕｉｓｑｕａｌｉｃ ａｃｉｄ ａｎａｌｏｇｕｅｓ：ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ｂｅｔａ−ｈｅｔｅｒｏｃｙｃｌｉｃ ２−ａｍｉｎｏｐｒｏｐａｎｏｉｃ ａｃｉｄ ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ａｃｔｉｖｉｔｙ ａｔ ａ ｎｏｖｅｌ ｑｕｉｓｑｕａｌａｔｅ−ｓｅｎｓｉｔｉｚｅｄ ｓｉｔｅ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３５：４６０２−７が挙げられる。国際公開ＷＯ２００４／０５８９４６、発明の名称「蛋白質アレー（ＰＲＯＴＥＩＮ ＡＲＲＡＹＳ）」（出願日２００３年１２月２２日）も参照。
非天然アミノ酸の細胞取込み
細胞による非天然アミノ酸取り込みは例えば蛋白質に組込むように非天然アミノ酸を設計及び選択する場合に一般に考慮される問題の１つである。例えば、α−アミノ酸は電荷密度が高いため、これらの化合物は細胞に浸透しにくいと思われる。天然アミノ酸は異なる程度のアミノ酸特異性を示すことが多い一連の蛋白質輸送システムにより細胞に取り込まれる。非天然アミノ酸が細胞に取り込まれる場合にはどの非天然アミノ酸が取り込まれるかを判断する迅速なスクリーニングを実施することができる。例えば国際公開ＷＯ２００４／０５８９４６、発明の名称「蛋白質アレー（ＰＲＯＴＥＩＮ ＡＲＲＡＹＳ）」（出願日２００３年１２月２２日）；及びＬｉｕ ａｎｄ Ｓｃｈｕｌｔｚ（１９９９）Ｐｒｏｇｒｅｓｓ ｔｏｗａｒｄ ｔｈｅ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ａｎ ｏｒｇａｎｉｓｍ ｗｉｔｈ ａｎ ｅｘｐａｎｄｅｄ ｇｅｎｅｔｉｃ ｃｏｄｅ．ＰＮＡＳ ９６：４７８０−４７８５における毒性アッセイ参照。取込みは種々のアッセイで容易に分析されるが、細胞取込み経路に利用可能な非天然アミノ酸を設計する代替方法は、アミノ酸をｉｎ ｖｉｖｏ生産する生合成経路を提供する方法である。
非天然アミノ酸の生合成
細胞にはアミノ酸と他の化合物を生産するために多数の生合成経路が元々存在している。特定非天然アミノ酸の生合成法は自然界（例えば細胞中）には存在しないと思われるが、本発明はこのような方法を提供する。例えば、非天然アミノ酸の生合成経路は場合により新規酵素を付加するか又は既存宿主細胞経路を改変することにより宿主細胞で作製される。付加新規酵素は場合により天然酵素又は人工的に進化させた酵素である。例えば、（ＷＯ２００２／０８５９２３、前出の実施例に記載されているような）ｐ−アミノフェニルアラニンの生合成は他の生物に由来する公知酵素の組合せの付加に依存している。これらの酵素の遺伝子はこれらの遺伝子を含むプラスミドで細胞を形質転換することにより細胞に導入することができる。これらの遺伝子は細胞で発現されると、所望化合物を合成するための酵素経路を提供する。場合により付加される酵素種の例は下記実施例に記載する。その他の酵素配列は例えばＧｅｎｂａｎｋに登録されている。人工的に進化させた酵素も場合により同様に細胞に付加する。このように、非天然アミノ酸を生産するように細胞機構と細胞資源を操作する。
実際に、生合成経路で使用する新規酵素を生産するため又は非天然アミノを生産するように既存経路をｉｎ ｖｉｔｒｏもしくはｉｎ ｖｉｖｏで進化させるためには種々の方法の任意のものを使用することができる。非天然アミノ酸を生産するため（又は、実際に新規基質特異性もしくは他の該当活性をもつようにシンテターゼを進化させるため）には、酵素及び他の生合成経路成分を進化させる方法として入手可能な多数の方法を本発明に適用することができる。例えば、非天然アミノ酸を生産（又は新規シンテターゼを生産）するように新規酵素及び／又は前記酵素の経路をｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｉｎ ｖｉｖｏで開発するためには、場合によりＤＮＡシャフリングを使用する。例えばＳｔｅｍｍｅｒ（１９９４），Ｒａｐｉｄ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｂｙ ＤＮＡ ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ，Ｎａｔｕｒｅ ３７０（４）：３８９−３９１；及びＳｔｅｍｍｅｒ，（１９９４），ＤＮＡ ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ ｂｙ ｒａｎｄｏｍ ｆｒａｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ ａｎｄ ｒｅａｓｓｅｍｂｌｙ：Ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９１：１０７４７−１０７５１参照。関連アプローチは所望特性をもつ酵素を迅速に進化させるために類縁（例えば相同）遺伝子のファミリーをシャフリングする。このような「ファミリー遺伝子シャフリング」法の１例はＣｒａｍｅｒｉら（１９９８）“ＤＮＡ ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ ｏｆ ａ ｆａｍｉｌｙ ｏｆ ｇｅｎｅｓ ｆｒｏｍ ｄｉｖｅｒｓｅ ｓｐｅｃｉｅｓ ａｃｃｅｌｅｒａｔｅｓ ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ”Ｎａｔｕｒｅ，３９１（６６６４）：２８８−２９１に記載されている。（生合成経路成分であるか又はシンテターゼであるかを問わずに）新規酵素は例えばＯｓｔｅｒｍｅｉｅｒら（１９９９）“Ａ ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ ａｐｐｒｏａｃｈ ｔｏ ｈｙｂｒｉｄ ｅｎｚｙｍｅｓ ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｏｆ ＤＮＡ ｈｏｍｏｌｏｇｙ”Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ １７：１２０５に記載されているような「ハイブリッド酵素作製用インクリメンタルトランケーション（ｉｎｃｒｅｍｅｎｔａｌ ｔｒｕｎｃａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｔｈｅ ｃｒｅａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｙｂｒｉｄ ｅｎｚｙｍｅｓ：ＩＴＣＨＹ）」として知られるＤＮＡ組換え法を使用して作製することもできる。このアプローチは１種以上のｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｉｎ ｖｉｖｏ組換え法の基質として使用することができる酵素又は他の経路変異体のライブラリーを作製するために使用することもできる。Ｏｓｔｅｒｍｅｉｅｒら（１９９９）“Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｂｙ Ｉｎｃｒｅｍｅｎｔａｌ Ｔｒｕｎｃａｔｉｏｎ，”Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９６：３５６２−６７，及びＯｓｔｅｒｍｅｉｅｒら（１９９９），“Ｉｎｃｒｅｍｅｎｔａｌ Ｔｒｕｎｃａｔｉｏｎ ａｓ ａ Ｓｔｒａｔｅｇｙ ｉｎ ｔｈｅ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｏｆ Ｎｏｖｅｌ Ｂｉｏｃａｔａｌｙｓｔｓ，” Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ａｎｄ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，７：２１３９−４４も参照。別のアプローチは例えば非天然アミノ酸（又は新規シンテターゼ）の生産に関連する生合成反応を触媒する能力について選択する酵素又は他の経路変異体のライブラリーを作製するために指数的集合突然変異誘発を使用する。このアプローチでは、該当配列中の小群の残基を並行してランダムに突然変異させ、機能的蛋白質をもたらすアミノ酸を各変異位置で同定する。非天然アミノ酸（又は新規シンテターゼ）の生産用新規酵素を作製するように本発明に応用することができるこのような方法の例はＤｅｌｅｇｒａｖｅ ａｎｄ Ｙｏｕｖａｎ（１９９３）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １１：１５４８−１５５２に記載されている。更に別のアプローチでは、例えばＡｒｋｉｎ ａｎｄ Ｙｏｕｖａｎ（１９９２）“Ｏｐｔｉｍｉｚｉｎｇ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｍｉｘｔｕｒｅｓ ｔｏ ｅｎｃｏｄｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｓｕｂｓｅｔｓ ｏｆ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ ｆｏｒ ｓｅｍｉ−ｒａｎｄｏｍ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ”Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０：２９７−３００；又はＲｅｉｄｈａａｒ−Ｏｌｓｏｎら（１９９１）“Ｒａｎｄｏｍ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｕｓｉｎｇ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｃａｓｓｅｔｔｅｓ”Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．２０８：５６４−８６の一般突然変異誘発法を使用することにより、酵素及び／又は経路成分操作にドープ又は縮重オリゴヌクレオチドを使用するランダム又は半ランダム突然変異誘発を使用することができる。ポリヌクレオチドリアセンブリと部位飽和突然変異誘発を使用する更に別のアプローチ（「非確率論的」突然変異誘発と呼ぶことが多い）を使用すると、酵素及び／又は経路成分を作製した後に、（例えば非天然アミノ酸のｉｎ ｖｉｖｏ生産のための）１種以上のシンテターゼ又は生合成経路機能を実施する能力についてスクリーニングすることができる。例えばＷＯ００／４６３４４、発明の名称「遺伝子ワクチン及び酵素の非確率論的作製（ＮＯＮ−ＳＴＯＣＨＡＳＴＩＣ ＧＥＮＥＲＡＴＩＯＮ ＯＦ ＧＥＮＥＴＩＣ ＶＡＣＣＩＮＥＳ ＡＮＤ ＥＮＺＹＭＥＳ）」、発明者Ｓｈｏｒｔ参照。
このような突然変異法の代替方法は生物の全ゲノムを組換え、得られた子孫を特定経路機能について選択する方法である（「全ゲノムシャフリング」と呼ぶことが多い）。このアプローチは、例えばゲノム組換えと非天然アミノ酸（又はその中間体）の生産能に関する生物（例えば大腸菌又は他の細胞）の選択により本発明に適用することができる。例えば、非天然アミノ酸をｉｎ ｖｉｖｏ生産するように細胞で既存及び／又は新規経路を進化させるための経路設計には、以下の刊行物に教示されている方法を適用することができる：Ｐａｔｎａｉｋら（２００２）“Ｇｅｎｏｍｅ ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ ｏｆ ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｏｒ ｉｍｐｒｏｖｅｄ ａｃｉｄ ｔｏｌｅｒａｎｃｅ”Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０（７）：７０７−７１２；及びＺｈａｎｇら（２００２）“Ｇｅｎｏｍｅ ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ ｌｅａｄｓ ｔｏ ｒａｐｉｄ ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃ ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ ｉｎ ｂａｃｔｅｒｉａ”Ｎａｔｕｒｅ，Ｆｅｂｒｕａｒｙ ７，４１５（６８７２）：６４４−６４６。
例えば所望化合物を生産するための他の生物及び代謝経路組換え技術も利用可能であり、同様に非天然アミノ酸の生産に適用することができる。有用な経路改変アプローチを教示している刊行物の例としては、Ｎａｋａｍｕｒａ ａｎｄ Ｗｈｉｔｅ（２００３）“Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｆｏｒ ｔｈｅ ｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ １，３ ｐｒｏｐａｎｅｄｉｏｌ”Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１４（５）：４５４−９；Ｂｅｒｒｙら（２００２）“Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｔｏ ｉｍｐｒｏｖｅ ｂｏｔｈ ｔｈｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｕｓｅ ｏｆ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｉｎｄｉｇｏ”Ｊ．Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２８：１２７−１３３；Ｂａｎｔａら（２００２）“Ｏｐｔｉｍｉｚｉｎｇ ａｎ ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ ｍｅｔａｂｏｌｉｃ ｐａｔｈｗａｙ：Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｔｈｅ ｃｏｆａｃｔｏｒ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｏｆ Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ２，５−ｄｉｋｅｔｏ−Ｄ−ｇｌｕｃｏｎｉｃ ａｃｉｄ ｒｅｄｕｃｔａｓｅ ｆｏｒ ｕｓｅ ｉｎ ｖｉｔａｍｉｎ Ｃ ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ”Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，４１（２０），６２２６−３６；Ｓｅｌｉｖｏｎｏｖａら（２００１）“Ｒａｐｉｄ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ Ｎｏｖｅｌ Ｔｒａｉｔｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ”Ａｐｐｌｉｅｄ ａｎｄ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，６７：３６４５、及び他の多数の文献が挙げられる。
使用する方法に関係なく、一般に本発明の改変生合成経路を使用して生産される非天然アミノ酸は効率的な蛋白質生合成に十分な濃度（例えば天然の細胞内の量）で生産されるが、他の細胞内アミノ酸濃度を有意に変化させたり細胞内資源を枯渇させる程ではない。このようにｉｎ ｖｉｖｏ生産される典型的な濃度は約１０ｍＭ〜約０．０５ｍＭである。特定経路に所望される酵素を生産するように細胞を改変し、非天然アミノ酸を作製したら、場合によりｉｎ ｖｉｖｏ選択を使用してリボソーム蛋白質合成と細胞増殖の両方に適合するように非天然アミノ酸の生産を更に最適化させる。
本発明で利用される直交成分
非天然アミノ酸の蛋白質組込みはセレクターコドンに応答して非天然アミノ酸を大腸菌に組込む直交対により実施され、直交成分は宿主細胞の翻訳機構の内在大腸菌成分と交差反応しないが、所望非天然アミノ酸を認識し、セレクターコドン（例えば、アンバーナンセンスコドンＴＡＧ）に応答して蛋白質に組込む。本発明で利用される直交成分としては、大腸菌等の真正細菌宿主細胞で直交対として機能するＭｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ ｊａｎｎａｓｃｈｉｉチロシルｔＲＮＡシンテターゼから誘導される直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼと、突然変異体チロシルｔＲＮＡＣＵＡアンバーサプレッサーが挙げられる。この系では、突然変異体アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼはサプレッサーｔＲＮＡを夫々の非天然アミノ酸でアミノアシル化するが、２０種類の標準アミノ酸のいずれでもアミノアシル化しない。
本発明では直交成分の作製方法を利用し、これらの方法はセレクターコドン（例えばアンバー終止コドン、ナンセンスコドン、４塩基以上のコドン等）に応答して成長中のポリペプチド鎖に非天然アミノ酸（限定されないが、例えば図１に示す非天然アミノ酸）を例えばｉｎ ｖｉｖｏで組込む。例えば、本発明では直交ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）、直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ＲＳ）及びその対を利用する。
所定態様では、これらの対は成長中のポリペプチド鎖に非天然アミノ酸を組込むために使用することができ、その後、ポリペプチドは翻訳後修飾される。翻訳後修飾することができる非天然アミノ酸に関するその他の情報については、例えば、各々言及によりその開示内容全体を本明細書に組込むＣｈｉｎら，Ｓｃｉｅｎｃｅ（２００３）３０１：９６４−９６７；Ｚｈａｎｇら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．２００４，１０１：８８８２−８８８７；Ａｎｄｅｒｓｏｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．２００４，１０１：７５６６−７５７１；Ｗａｎｇら，（２００１）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９２：４９８−５００；Ｃｈｉｎら，（２００２）Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ １２４：９０２６−９０２７；Ｃｈｉｎ ａｎｄ Ｓｃｈｕｌｔｚ，（２００２）ＣｈｅｍＢｉｏＣｈｅｍ １１：１１３５−１１３７；Ｃｈｉｎら，（２００２）ＰＮＡＳ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ ９９：１１０２０−１１０２４；Ｗａｎｇ ａｎｄ Ｓｃｈｕｌｔｚ，（２００２）Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍ．，１−１０；Ｗａｎｇ ａｎｄ Ｓｃｈｕｌｔｚ “Ｅｘｐａｎｄｉｎｇ ｔｈｅ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｃｏｄｅ，” Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ Ｃｈｅｍｉｅ Ｉｎｔ．Ｅｄ，４４（１）：３４−６６（２００５）；Ｘｉｅ ａｎｄ Ｓｃｈｕｌｔｚ，“Ａｎ Ｅｘｐａｎｄｉｎｇ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｃｏｄｅ，” Ｍｅｔｈｏｄｓ ３６：２２７−２３８（２００５）；及びＤｅｉｔｅｒｓら，Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ ＆ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｌｅｔｔｅｒｓ １５：１５２１−１５２４（２００５）に記載されている非天然アミノ酸直交システム参照。
国際公開ＷＯ２００２／０８６０７５、発明の名称「直交ｔＲＮＡ−アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ対を作製するための方法及び組成物（ＭＥＴＨＯＤＳ ＡＮＤ ＣＯＭＰＯＳＩＴＩＯＮＳ ＦＯＲ ＴＨＥ ＰＲＯＤＵＣＴＩＯＮ ＯＦ ＯＲＴＨＯＧＯＮＡＬ ｔＲＮＡ ＡＭＩＮＯＡＣＹＬ−ｔＲＮＡ ＳＹＮＴＨＥＴＡＳＥ ＰＡＩＲＳ）」；ＷＯ２００２／０８５９２３、発明の名称「非天然アミノ酸のインビボ組込み（ＩＮ ＶＩＶＯ ＩＮＣＯＲＰＯＲＡＴＩＯＮ ＯＦ ＵＮＮＡＴＵＲＡＬ ＡＭＩＮＯ ＡＣＩＤＳ）」；ＷＯ２００４／０９４５９３、発明の名称「真核遺伝コードの拡張（ＥＸＰＡＮＤＩＮＧ ＴＨＥ ＥＵＫＡＲＹＯＴＩＣ ＧＥＮＥＴＩＣ ＣＯＤＥ）」；ＷＯ２００５／０１９４１５（出願日２００４年７月７日）；ＷＯ２００５／００７８７０（出願日２００４年７月７日）；ＷＯ２００５／００７６２４（出願日２００４年７月７日）；ＷＯ２００６／０３４３３２（出願日２００５年９月２０日）；及びＷＯ２００６／１１０１８２、発明の名称「非天然アミノ酸のインビボ組込み用直交翻訳成分（ＯＲＴＨＯＧＯＮＡＬ ＴＲＡＮＳＬＡＴＩＯＮ ＣＯＭＰＯＮＥＮＴＳ ＦＯＲ ＴＨＥ ＩＮ ＶＩＶＯ ＩＮＣＯＲＰＯＲＡＴＩＯＮ ＯＦ ＵＮＮＡＴＵＲＡＬ ＡＭＩＮＯ ＡＣＩＳ）」、出願日２００５年１０月２７日、発明者Ｓｃｈｕｌｔｚらに記載されている非天然アミノ酸直交システムも参照。
所定態様では、本発明で利用されるＯ−ＲＳは如何なる内在ｔＲＮＡよりも優先的にＯ−ｔＲＮＡを特定非天然アミノ酸でアミノアシル化し、Ｏ−ＲＳはＯ−ｔＲＮＡを優先し、非天然アミノ酸を負荷されるＯ−ｔＲＮＡと同一非天然アミノ酸を負荷される内在ｔＲＮＡの比は１：１を上回り、Ｏ−ＲＳはＯ−ｔＲＮＡに排他的又はほぼ排他的に負荷することがより好ましい。
本発明は更に直交ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）を利用し、Ｏ−ｔＲＮＡはセレクターコドンを認識する。一般に、Ｏ−ｔＲＮＡは本明細書の配列表（例えば配列番号１）に記載するようなポリヌクレオチド配列を含むか又は前記配列によりコードされるＯ−ｔＲＮＡの抑圧効率に比較してコグネイトシンテターゼの存在下でセレクターコドンに応答して少なくとも例えば約４５％、５０％、６０％、７５％、８０％、又は９０％以上の抑圧効率を含む。１態様では、Ｏ−ＲＳとＯ−ｔＲＮＡの併用による抑圧効率はＯ−ＲＳの不在下のＯ−ｔＲＮＡの抑圧効率の例えば５倍、１０倍、１５倍、２０倍、２５倍又はそれ以上である。所定側面では、Ｏ−ＲＳとＯ−ｔＲＮＡの併用による抑圧効率はＭｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ ｊａｎｎａｓｃｈｉｉに由来する直交チロシルｔＲＮＡシンテターゼ対の抑圧効率の少なくとも４５％である。
本発明は翻訳系と蛋白質生産をプログラムするヌクレオチド配列を含む細胞（例えば大腸菌）を利用し、翻訳系は直交ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）と、直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ＲＳ）と、非天然アミノ酸を含む。一般に、Ｏ−ＲＳは如何なる内在ｔＲＮＡよりも優先的にＯ−ｔＲＮＡを非天然アミノ酸でアミノアシル化し、Ｏ−ＲＳはＯ−ｔＲＮＡを優先し、非天然アミノ酸を負荷されるＯ−ｔＲＮＡと非天然アミノ酸を負荷される内在ｔＲＮＡの比は１：１を上回り、Ｏ−ＲＳはＯ−ｔＲＮＡに排他的又はほぼ排他的に負荷することがより好ましい。Ｏ−ｔＲＮＡは第１のセレクターコドンを認識し、Ｏ−ＲＳはＯ−ｔＲＮＡを非天然アミノ酸で優先的にアミノアシル化する。
更に本発明では各種ポリヌクレオチドを利用する。これらのポリヌクレオチドとしては、Ｏ−ＲＳをコードするヌクレオチド配列を含む人工（例えば人為的に作製され、天然には存在しない）ポリヌクレオチドが挙げられる。本発明で利用されるポリヌクレオチドとしては更に核酸の実質的に全長にわたって高ストリンジェント条件下で上記ポリヌクレオチドとハイブリダイズする核酸も挙げられる。本発明ではポリヌクレオチドを含むベクターも利用する。例えば、ベクターとしてはプラスミド、コスミド、ファージ、ウイルス、発現ベクター及び／又は同等物が挙げられる。Ｏ−ｔＲＮＡ／Ｏ−ＲＳ対の成分の作製方法は公知であり、本発明で利用される。本明細書の開示とその引用文献参照。
核酸及びポリペプチド配列と変異体
本明細書に記載するように、本発明では例えばＯ−ｔＲＮＡ及びＯ−ＲＳをコードするポリヌクレオチド配列と、前記ポリヌクレオチドによりコードされる夫々のアミノ酸配列を利用する。本明細書の開示は本発明で利用されるポリヌクレオチド及びポリペプチド配列の例を記載及び参照する。しかし、当然のことながら、本発明は本明細書に開示する配列に限定されない。当業者に自明の通り、本発明は本明細書に記載する機能をもつ多数の類縁配列（例えば、本明細書に開示するＯ−ＲＳの保存変異体をコードするポリヌクレオチド及びポリペプチド）も提供する。
本発明で利用されるポリヌクレオチドは天然に存在するｔＲＮＡのポリヌクレオチドと例えば少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％又はそれ以上一致する人工ポリヌクレオチド（但し、天然に存在するｔＲＮＡ以外のもの）も含む。本発明で利用されるポリヌクレオチドは天然に存在するｔＲＮＡのポリヌクレオチドと例えば少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％又はそれ以上一致する（但し１００％は一致しない）人工ポリヌクレオチドも含む。
所定態様では、本発明で利用されるベクター（例えばプラスミド、コスミド、ファージ、ウイルス等）は本発明で利用されるポリヌクレオチドを含む。所定態様では、ベクターは発現ベクターである。他の態様では、発現ベクターは本発明のポリヌクレオチドの１種以上と機能的に連結されたプロモーターを含む。他の態様では、本発明で利用されるポリヌクレオチドを含むベクターを細胞に組込む。
同様に当業者に自明の通り、本発明では開示配列の多数の変異体も利用される。例えば、本発明では機能的に同一配列となる開示配列の保存変異体も利用される。本発明では少なくとも１種の開示配列とハイブリダイスする核酸ポリヌクレオチド配列の変異体も利用される。
保存変異
遺伝コードの縮重により、「サイレント置換」（即ちコードされるポリペプチドに変化を生じない核酸配列の置換）はアミノ酸配列をコードする全核酸配列の暗黙の特徴である。同様に、「保存アミノ酸置換」はアミノ酸配列中の１個又は少数のアミノ酸を高度に類似する性質をもつ別のアミノ酸で置換するものであり、このような置換も開示構築物と高度に類似することが容易に認められる。各開示配列のこのような保存変異体は本発明の特徴である。
特定核酸配列の「保存変異体」とは同一又は本質的に同一のアミノ酸配列をコードする核酸を意味し、核酸がアミノ酸配列をコードしない場合には本質的に同一の配列を意味する。当業者に自明の通り、コードされる配列中のアミノ酸１個又は低百分率（一般に５％未満、より一般には４％、２％又は１％未満）のアミノ酸を置換、付加又は欠失させる個々の置換、欠失又は付加の結果としてアミノ酸を欠失するか、アミノ酸が付加されるか、又はアミノ酸が化学的に類似するアミノ酸で置換される場合には、これらの変異は「保存修飾変異」である。従って、本発明の指定ポリペプチド配列の「保存変異体」としては、ポリペプチド配列のアミノ酸の低百分率、一般に５％未満、より一般には２％又は１％未満が同一保存置換基のアミノ酸で置換される場合が挙げられる。最後に、非機能的配列の付加のように核酸分子のコードされる活性を変えない配列の付加も基本核酸の保存変異である。
機能的に類似するアミノ酸を示す保存置換表は当分野で周知であり、このようなアミノ酸では、あるアミノ酸残基が類似の化学的性質（例えば芳香族側鎖又は正荷電側鎖）をもつ別のアミノ酸残基に置換しているため、ポリペプチド分子の機能的性質は実質的に変化しない。化学的性質が類似する天然アミノ酸を含む代表的グループを以下に示すが、これらのグループ内の置換は「保存置換」である。
核酸ハイブリダイゼーション
本明細書に記載する核酸の保存変異体を含めて本発明で利用される核酸を同定するためには比較ハイブリダイゼーションを使用することができ、この比較ハイブリダイゼーション法は本発明で利用される核酸を識別する好ましい１方法である。更に、高、超高及び超々高ストリンジェンシー条件下で本明細書に記載又は参照する核酸とハイブリダイズするターゲット核酸も本発明で利用される。このような核酸の例としては所与核酸配列と比較して１又は少数のサイレント又は保存核酸置換をもつものが挙げられる。
試験核酸が完全にマッチする相補的ターゲットに比較して少なくとも５０％の割合でプローブとハイブリダイズする場合、即ちマッチしないターゲット核酸の任意のものとのハイブリダイゼーションに観測されるシグナル対ノイズ比の少なくとも約５倍〜１０倍で完全にマッチするプローブが完全にマッチする相補的ターゲットと結合する条件下におけるプローブとターゲットのハイブリダイゼーションに比較してシグナル対ノイズ比が少なくとも１／２である場合に試験核酸はプローブ核酸と特異的にハイブリダイズすると言う。
核酸は一般に溶液中で会合するときに「ハイブリダイズ」する。核酸は水素結合、溶媒排除、塩基スタッキング等の種々の十分に特性決定された物理化学的力によりハイブリダイズする。核酸ハイブリダイゼーションの詳しい手引きはＴｉｊｓｓｅｎ（１９９３）Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ−−Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｐａｒｔ Ｉ，Ｃｈａｐｔｅｒ ２，“Ｏｖｅｒｖｉｅｗ ｏｆ ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｈｅ ｓｔｒａｔｅｇｙ ｏｆ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｐｒｏｂｅ ａｓｓａｙｓ，”（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）、及びＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｕｓｕｂｅｌら編，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，ａ ｊｏｉｎｔ ｖｅｎｔｕｒｅ ｂｅｔｗｅｅｎ Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．ａｎｄ Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．（２００４年補遺）（「Ａｕｓｕｂｅｌ」）に記載されており、Ｈａｍｅｓ ａｎｄ Ｈｉｇｇｉｎｓ（１９９５）Ｇｅｎｅ Ｐｒｏｂｅｓ １ ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ ａｔ Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄ，（Ｈａｍｅｓ ａｎｄ Ｈｉｇｇｉｎｓ １）と、Ｈａｍｅｓ ａｎｄ Ｈｉｇｇｉｎｓ（１９９５）Ｇｅｎｅ Ｐｒｏｂｅｓ ２ ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ ａｔ Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄ（Ｈａｍｅｓ ａｎｄ Ｈｉｇｇｉｎｓ ２）はオリゴヌクレオチドを含むＤＮＡとＲＮＡの合成、標識、検出及び定量について詳細に記載している。
サザン又はノーザンブロットで１００個を上回る相補的残基をもつ相補的核酸のハイブリダイゼーションをフィルター上で行うためのストリンジェントハイブリダイゼーション条件の１例は、５０％ホルマリンにヘパリン１ｍｇを加え、４２℃で一晩ハイブリダイゼーションを実施する。ストリンジェント洗浄条件の１例は６５℃、０．２×ＳＳＣで１５分間洗浄する（ＳＳＣ緩衝液の説明についてはＳａｍｂｒｏｏｋ，前出参照）。多くの場合には高ストリンジェンシー洗浄の前に低ストリンジェンシー洗浄を実施してバックグラウンドプローブシグナルを除去する。低ストリンジェンシー洗浄の１例は４０℃、２×ＳＳＣで１５分間である。一般に、シグナル対ノイズ比が特定ハイブリダイゼーションアッセイで無関係プローブに観測される比の５倍（以上）である場合に特異的ハイブリダイゼーションが検出されたとみなす。
サザン及びノーザンハイブリダイゼーション等の核酸ハイブリダイゼーション実験において「ストリンジェントハイブリダイゼーション洗浄条件」は配列依存性であり、各種環境パラメーターにより異なる。核酸ハイブリダイゼーションの詳しい手引きはＴｉｊｓｓｅｎ（１９９３），前出やＨａｍｅｓ ａｎｄ Ｈｉｇｇｉｎｓ １及び２に記載されている。ストリンジェントハイブリダイゼーション及び洗浄条件は任意試験核酸について経験により容易に決定することができる。例えば、ストリンジェントハイブリダイゼーション及び洗浄条件を決定するには、一連の選択基準に合致するまで（例えばハイブリダイゼーション又は洗浄における温度上昇、塩濃度低下、界面活性剤濃度増加及び／又はホルマリン等の有機溶媒濃度増加により）ハイブリダイゼーション及び洗浄条件を徐々に増加する。例えば、高ストリンジェントハイブリダイゼーション及び洗浄条件では、マッチしないターゲットとプローブのハイブリダイゼーションに観測されるシグナル対ノイズ比の少なくとも約５倍でプローブが完全にマッチする相補的ターゲットと結合するまでハイブリダイゼーション及び洗浄条件を徐々に増加する。
「超ストリンジェント」条件は特定プローブの熱融点（Ｔｍ）に等しくなるように選択される。Ｔｍは（規定イオン強度及びｐＨ下で）試験配列の５０％が完全にマッチするプローブとハイブリダイズする温度である。本発明の目的には、一般に規定イオン強度及びｐＨで特定配列のＴｍよりも約５℃低くなるように「高ストリンジェント」ハイブリダイゼーション及び洗浄条件を選択する。
「超高ストリンジェンシー」ハイブリダイゼーション及び洗浄条件は完全にマッチする相補的ターゲット核酸とプローブの結合に観測されるシグナル対ノイズ比がマッチしないターゲット核酸の任意のものとのハイブリダイゼーションに観測されるシグナル対ノイズ比の少なくとも１０倍になるまでハイブリダイゼーション及び洗浄条件のストリンジェンシーを増加する条件である。完全にマッチする相補的ターゲット核酸のシグナル対ノイズ比の少なくとも１／２で前記条件下にプローブとハイブリダイズする場合にターゲット核酸は超高ストリンジェンシー条件下でプローブと結合すると言う。
同様に、該当ハイブリダイゼーションアッセイのハイブリダイゼーション及び／又は洗浄条件を徐々に増加することにより更に高レベルのストリンジェンシーを決定することもできる。例えば、完全にマッチする相補的ターゲット核酸とプローブの結合に観測されるシグナル対ノイズ比がマッチしないターゲット核酸の任意のものとのハイブリダイゼーションに観測されるシグナル対ノイズ比の少なくとも１０倍、２０倍、５０倍、１００倍又は５００倍以上になるまでハイブリダイゼーション及び洗浄条件のストリンジェンシーを増加する条件である。完全にマッチする相補的ターゲット核酸のシグナル対ノイズ比の少なくとも１／２で前記条件下にプローブとハイブリダイズする場合にターゲット核酸は超々高ストリンジェンシー条件下でプローブと結合すると言う。
ストリンジェント条件下で相互にハイブリダイズしない核酸でも、これらの核酸によりコードされるポリペプチドが実質的に同一である場合には実質的に同一である。これは、例えば遺伝コードに許容される最大コドン縮重を使用して核酸のコピーを作製する場合に該当する。
ユニークサブ配列
所定側面では、本発明は本明細書に開示又は参照するＯ−ｔＲＮＡ及びＯ−ＲＳの配列から選択される核酸中にユニークサブ配列を含む核酸を利用する。ユニークサブ配列は任意公知Ｏ−ｔＲＮＡ及びＯ−ＲＳ核酸配列に対応する核酸に比較してユニークである。例えばデフォルトパラメーターに設定したＢＬＡＳＴを使用してアラインメントを実施することができる。例えば本発明の核酸を同定するためのプローブとして任意ユニークサブ配列が有用である。
同様に、本発明は本明細書に開示又は参照するＯ−ＲＳの配列から選択されるポリペプチド中にユニークサブ配列を含むポリペプチドを利用する。この場合には、ユニークサブ配列は任意公知ポリペプチド配列に対応するポリペプチドに比較してユニークである。
本発明はＯ−ＲＳの配列から選択されるポリペプチド中のユニークサブ配列をコードするユニークコーディングオリゴヌクレオチドとストリンジェント条件下でハイブリダイズするターゲット核酸も提供し、この場合には、ユニークサブ配列は対照ポリペプチド（例えば本発明のシンテターゼを例えば突然変異により誘導した元の親配列）の任意のものに対応するポリペプチドに比較してユニークである。ユニーク配列は上記のように決定される。
配列比較、一致度及び相同度
２個以上の核酸又はポリペプチド配列に関して「一致」又は「一致度百分率」なる用語は２個以上の配列又はサブ配列を最大限に対応するように対比及び整列させ、以下に記載する配列比較アルゴリズム（又は当業者に入手可能な他のアルゴリズム）の１種を使用するか又は目視により測定した場合に相互に同一であるか又は同一のアミノ酸残基もしくはヌクレオチドの百分率が特定値であることを意味する。
２個以上の核酸又はポリペプチド（例えばＯ−ｔＲＮＡもしくはＯ−ＲＳをコードするＤＮＡ又はＯ−ＲＳのアミノ酸配列）に関して「実質的に一致」なる用語は２個以上の配列又はサブ配列を最大限に対応するように対比及び整列させ、配列比較アルゴリズムを使用するか又は目視により測定した場合にヌクレオチド又はアミノ酸残基一致度が少なくとも約６０％、約８０％、約９０〜９５％、約９８％、約９９％又はそれ以上であることを意味する。このような「実質的に一致」する配列は一般に実際の起源が記載されていなくても「相同」であるとみなす。少なくとも約５０残基長の配列の領域にわたって「実質的一致」が存在していることが好ましく、少なくとも約１００残基長の領域がより好ましく、少なくとも約１５０残基又は比較する２配列の全長にわたって配列が実質的に一致していることが最も好ましい。
蛋白質及び／又は蛋白質配列は共通の祖先蛋白質又は蛋白質配列から天然又は人工的に誘導される場合に「相同」である。同様に、核酸及び／又は核酸配列は共通の祖先核酸又は核酸配列から天然又は人工的に誘導される場合に相同である。例えば、１個以上のセレクターコドンを含むように任意天然核酸を利用可能な任意突然変異誘発法により改変することができる。この突然変異誘発した核酸は発現されると、１個以上の非天然アミノ酸を含むポリペプチドをコードする。突然変異法は当然のことながら更に１個以上の標準コドンを変異させ、得られる突然変異体蛋白質の１個以上の標準アミノ酸も変異させることができる。相同性は一般に２個以上の核酸又は蛋白質（又はその配列）間の配列類似度から推定される。相同性の判定に有用な配列間類似度の厳密な百分率は該当核酸及び蛋白質により異なるが、通常は２５％程度の低い配列類似度を使用して相同性を判定する。例えば３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％又は９９％以上のより高レベルの配列類似度を使用して相同性を判定することもできる。配列類似度百分率の決定方法（例えばデフォルトパラメーターを使用するＢＬＡＳＴＰ及びＢＬＡＳＴＮ）は本明細書に記載し、一般に入手可能である。
配列比較及び相同性判定には、一般にある配列を参照配列としてこれに試験配列を比較する。配列比較アルゴリズムを使用する場合には、試験配列と参照配列をコンピューターに入力し、必要に応じてサブ配列座標を指定し、配列アルゴリズムプログラムパラメーターを指定する。こうすると、配列比較アルゴリズムは指定プログラムパラメーターに基づいて参照配列に対して試験配列の配列一致度百分率を計算する。
比較のための最適な配列アラインメントは例えばＳｍｉｔｈ ａｎｄ Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２（１９８１）の局所相同性アルゴリズム、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３（１９７０）の相同性アラインメントアルゴリズム、Ｐｅａｒｓｏｎ ａｎｄ Ｌｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：２４４４（１９８８）の類似性探索法、これらのアルゴリズムのコンピューターソフトウェア（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩのＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ及びＴＦＡＳＴＡ）、又は目視（一般にＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｕｓｕｂｅｌら編，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，ａ ｊｏｉｎｔ ｖｅｎｔｕｒｅ ｂｅｔｗｅｅｎ Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．ａｎｄ Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．（２００４年補遺）参照）により実施することができる。
配列一致度及び配列類似度百分率を決定するのに適したアルゴリズムの１例はＡｌｔｓｃｈｕｌら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０（１９９０）に記載されているＢＬＡＳＴアルゴリズムである。ＢＬＡＳＴ分析を実施するためのソフトウェアはＮａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎウェブサイトから公共入手可能である。このアルゴリズムはデータベース配列中の同一長さの単語と整列した場合に所定の正の閾値スコアＴと一致するか又はこれを満足するクエリー配列中の長さＷの短い単語を識別することによりまず高スコア配列対（ＨＳＰ）を識別する。Ｔを隣接単語スコア閾値と言う（Ａｌｔｓｃｈｕｌら，前出）。これらの初期隣接単語ヒットをシードとして検索を開始し、これらの単語を含むもっと長いＨＳＰを探索する。次に、累積アラインメントスコアを増加できる限り、単語ヒットを各配列に沿って両方向に延長する。ヌクレオチド配列の場合にはパラメーターＭ（１対のマッチ残基のリウォードスコア、常に＞０）及びＮ（ミスマッチ残基のペナルティースコア、常に＜０）を使用して累積スコアを計算する。アミノ酸配列の場合には、スコアリングマトリクスを使用して累積スコアを計算する。累積アラインメントスコアがその最大到達値から量Ｘだけ低下するか、累積スコアが１カ所以上の負スコア残基アラインメントの累積によりゼロ以下になるか、又はどちらかの配列の末端に達したら各方向の単語ヒットの延長を停止する。ＢＬＡＳＴアルゴリズムパラメーターＷ、Ｔ及びＸはアラインメントの感度と速度を決定する。ＢＬＡＳＴＮプログラム（ヌクレオチド配列用）は語長（Ｗ）１１、期待値（Ｅ）１０、カットオフ１００、Ｍ＝５、Ｎ＝４、及び両鎖の比較をデフォルトとして使用する。アミノ酸配列用として、ＢＬＡＳＴＰプログラムは語長（Ｗ）３、期待値（Ｅ）１０、及びＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリクスをデフォルトとして使用する（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ ａｎｄ Ｈｅｎｉｋｏｆｆ（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：１０９１５参照）。
配列一致度百分率の計算に加え、ＢＬＡＳＴアルゴリズムは２配列間の類似性の統計分析も実施する（例えばＫａｒｌｉｎ ａｎｄ Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：５８７３−５７８７（１９９３）参照）。ＢＬＡＳＴアルゴリズムにより提供される類似性の１尺度は２個のヌクレオチド又はアミノ酸配列間に偶然にマッチが起こる確率を示す最小合計確率（Ｐ（Ｎ））である。例えば、試験核酸を参照核酸に比較した場合の最小合計確率が約０．１未満、より好ましくは約０．０１未満、最も好ましくは約０．００１未満である場合に核酸は参照核酸に類似しているとみなす。
突然変異誘発及び他の分子生物学技術
本発明のポリヌクレオチドとポリペプチド及び本発明で使用されるポリヌクレオチドとポリペプチドは分子生物学技術を使用して操作することができる。分子生物学技術について記載している一般教科書としてはＢｅｒｇｅｒ ａｎｄ Ｋｉｍｍｅｌ，Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ｖｏｌｕｍｅ １５２ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ（Ｂｅｒｇｅｒ）；Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（第３版），Ｖｏｌ．１−３，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，２００１（「Ｓａｍｂｒｏｏｋ」）及びＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら編，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，ａ ｊｏｉｎｔ ｖｅｎｔｕｒｅ ｂｅｔｗｅｅｎ Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．ａｎｄ Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．（２００４年補遺）（「Ａｕｓｕｂｅｌ」）が挙げられる。これらの教科書は突然変異誘発法、ベクターの使用、プロモーターについて記載しており、更に例えば非天然アミノ酸を組込んだ蛋白質を生産するためのセレクターコドンを含む遺伝子、直交ｔＲＮＡ、直交シンテターゼ及びその対の作製に関連する他の多くの関連事項について記載している。
例えばｔＲＮＡ分子を突然変異させるため、ｔＲＮＡのライブラリーを作製するため、シンテターゼのライブラリーを作製するため、非天然アミノ酸をコードするセレクターコドンを該当蛋白質又はポリペプチドに挿入するために、各種突然変異誘発法を本発明と併用することができる。これらの方法としては限定されないが、部位特異的、ランダム点突然変異誘発、相同組換え、ＤＮＡシャフリングもしくは他の再帰的突然変異誘発法、キメラ構築、ウラシル含有鋳型を使用する突然変異誘発、オリゴヌクレオチド特異的突然変異誘発、ホスホロチオエート修飾ＤＮＡ突然変異誘発、ギャップデュプレクスＤＮＡを使用する突然変異誘発等、又はその任意組み合わせが挙げられる。他の適切な方法としては点ミスマッチ修復、修復欠損宿主株を使用する突然変異誘発、制限−選択及び制限−精製、欠失突然変異誘発、完全遺伝子合成による突然変異誘発、２本鎖切断修復等が挙げられる。例えばキメラ構築物を使用する突然変異誘発も本発明に含まれる。１態様では、天然分子又は改変もしくは突然変異させた天然分子の既知情報（例えば配列、配列比較、物性、結晶構造等）に基づいて突然変異誘発を誘導することができる。
本発明のポリヌクレオチド又はポリヌクレオチドを組込んだ構築物（例えばクローニングベクターや発現ベクター等のベクター）で宿主細胞を遺伝子組換え（例えば形質転換、形質導入又はトランスフェクション）する。例えば、直交ｔＲＮＡ、直交ｔＲＮＡシンテターゼ、及び修飾すべき蛋白質のコーディング領域を所望宿主細胞で機能的な遺伝子発現制御エレメントに機能的に連結する。典型的なベクターは転写及び翻訳ターミネーターと、転写及び翻訳開始配列と、特定ターゲット核酸の発現の調節に有用なプロモーターを含む。ベクターは場合により少なくとも１個の独立ターミネーター配列と、真核生物又は原核生物又は両者（例えばシャトルベクター）でカセットの複製を可能にする配列と、原核系と真核系の両者の選択マーカーを含む包括的発現カセットを含む。ベクターは原核生物、真核生物、又は好ましくは両者での複製及び／又は組込みに適している。Ｇｉｌｉｍａｎ ａｎｄ Ｓｍｉｔｈ，Ｇｅｎｅ ８：８１（１９７９）；Ｒｏｂｅｒｔｓら，Ｎａｔｕｒｅ，３２８：７３１（１９８７）；Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ，Ｂ．ら，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒ．Ｐｕｒｉｆ．６４３５：１０（１９９５）；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｂｅｒｇｅｒ（いずれも前出）参照。ベクターは例えばプラスミド、細菌、ウイルス、裸のポリヌクレオチド又はポリヌクレオチドコンジュゲートの形態とすることができる。ベクターはエレクトロポレーション（Ｆｒｏｍら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２，５８２４（１９８５））、ウイルスベクターによる感染、核酸を小ビーズもしくは粒子のマトリックスに埋込むか又は表面に付着させて小粒子形態で高速射入する方法（Ｋｌｅｉｎら，Ｎａｔｕｒｅ ３２７，７０−７３（１９８７））、及び／又は同等方法等の標準方法により細胞及び／又は微生物に導入する。
大腸菌でアンバー終止コドン（ＵＡＧ）に応答して非天然アミノ酸を蛋白質に部位特異的に組込むための非常に効率的で万能の単一プラスミドシステムを開発した。新規システムでは、Ｍ．ｊａｎｎａｓｃｈｉｉサプレッサーｔＲＮＡｔｙｒ（ＣＵＡ）とチロシルｔＲＮＡシンテターゼの対は大半の大腸菌発現ベクターと適合可能な単一プラスミドでコードされる。最適二次構造とｔＲＮＡプロセシングのためにｐｒｏＫプロモーター及びターミネーターの制御下のモノシストロン性ｔＲＮＡオペロンを構築した。シンテターゼの突然変異形ｇｌｎＳプロモーターを導入すると、抑圧効率と忠実度の両者が有意に増加した。ｔＲＮＡ遺伝子のマルチコピーとシンテターゼの特異的突然変異（Ｄ２８６Ｒ）でも抑圧効率の増加が得られた（Ｋｏｂａｙａｓｈｉら，“Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｂａｓｉｓ ｆｏｒ ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ ｔＲＮＡ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｉｅｓ ｏｆ ｔｙｒｏｓｙｌ−ｔＲＮＡ ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅｓ ｆｏｒ ｇｅｎｅｔｉｃ ｃｏｄｅ ｅｘｐａｎｓｉｏｎ，”Ｎａｔ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．，１０（６）：４２５−４３２［２００３］）。蛋白質機能及び構造の研究におけるそのユニークな有用性が従来認められている数種類の異なる非天然アミノ酸が非常に効率的且つ正確に組込まれたことからこの最適化システムの汎用性も実証された。
クローニングに有用な細菌とバクテリオファージのカタログは例えばＡＴＣＣから発行されており、例えばＡＴＣＣから刊行されたＴｈｅ ＡＴＣＣ Ｃａｔａｌｏｇｕｅ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉａ ａｎｄ Ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ（１９９６）Ｇｈｅｒｎａら（編）が挙げられる。シーケンシング、クローニング及び分子生物学の他の側面のその他の基本手順と基礎理論事項もＳａｍｂｒｏｏｋ（前出）、Ａｕｓｕｂｅｌ（前出）、及びＷａｔｓｏｎら（１９９２）Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＤＮＡ Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｂｏｏｋｓ，ＮＹに記載されている。更に、Ｍｉｄｌａｎｄ Ｃｅｒｔｉｆｉｅｄ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｍｉｄｌａｎｄ，ＴＸ）、Ｔｈｅ Ｇｒｅａｔ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｇｅｎｅ Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｒａｍｏｎａ，ＣＡ）、ＥｘｐｒｅｓｓＧｅｎ Ｉｎｃ．（Ｃｈｉｃａｇｏ，ＩＬ）、Ｏｐｅｒｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．（Ａｌａｍｅｄａ，ＣＡ）及び他の多数の企業等の各種販売会社からほぼ任意核酸（及び標準又は標準外を問わずほぼ任意標識核酸）をオーダーメード又は標準注文することができる。
遺伝子組換えした宿主細胞は例えばスクリーニング段階、プロモーター活性化又は形質転換細胞選択等の操作に合うように適宜改変した慣用栄養培地で培養することができる。これらの細胞は場合によりトランスジェニック生物で培養することができる。（例えばその後の核酸単離のための）例えば細胞単離及び培養に有用な他の文献としては、Ｆｒｅｓｈｎｅｙ（１９９４）Ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌｓ，ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ，第３版，Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋとその引用文献；Ｐａｙｎｅら（１９９２）Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ ｉｎ Ｌｉｑｕｉｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ；Ｇａｍｂｏｒｇ ａｎｄ Ｐｈｉｌｌｉｐｓ（編）（１９９５）Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ，Ｔｉｓｓｕｅ ａｎｄ Ｏｒｇａｎ Ｃｕｌｔｕｒｅ；Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｌａｂ Ｍａｎｕａｌ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ（Ｂｅｒｌｉｎ Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）及びＡｔｌａｓ ａｎｄ Ｐａｒｋｓ（編）Ｔｈｅ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｄｉａ（１９９３）ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，ＦＬが挙げられる。
該当蛋白質及びポリペプチド
特定位置に非天然アミノ酸を組込んだ蛋白質の作製方法も本発明の特徴である。例えば、１方法は、少なくとも１個のセレクターコドンを含み且つ蛋白質をコードする核酸を含む細胞（例えば大腸菌細胞）を適当な培地で増殖させる段階と、非天然アミノ酸を提供する段階を含み、細胞は更に、細胞で機能し、セレクターコドンを認識する直交ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）と；Ｏ−ｔＲＮＡを非天然アミノ酸で優先的にアミノアシル化する直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ＲＳ）を含む。こうして大腸菌で作製された蛋白質はセレクターコドンに対応する位置に非天然アミノ酸を含む。その後、非天然アミノ酸が共有結合的修飾を受ける条件下で前記蛋白質を反応させることにより、翻訳後修飾蛋白質を作製することができる。
所定態様では、Ｏ−ＲＳは発現系において如何なる内在ｔＲＮＡよりもコグネイトＯ−ｔＲＮＡのアミノアシル化を優先する。Ｏ−ｔＲＮＡとＯ−ＲＳが等モル濃度で存在する場合にＯ−ＲＳにより負荷されるＯ−ｔＲＮＡと内在ｔＲＮＡの相対比は１：１を上回り、好ましくは少なくとも約２：１、より好ましくは５：１、更に好ましくは１０：１、更に好ましくは２０：１、更に好ましくは５０：１、更に好ましくは７５：１、更に好ましくは９５：１、９８：１、９９：１、１００：１、５００：１、１，０００：１、５，０００：１又はそれ以上である。
翻訳後修飾される特定位置に非天然アミノ酸を組込んだ蛋白質も本発明の特徴である。蛋白質は細胞（例えば大腸菌細胞）で作製される。Ｏ−ｔＲＮＡ／Ｏ−ＲＳ対も細胞に配置され、宿主細胞の翻訳機構を利用し、セレクターコドンに応答して非天然アミノ酸を融合蛋白質にｉｎ ｖｉｖｏ組込む。Ｏ−ｔＲＮＡ／Ｏ−ＲＳ系が翻訳後修飾可能な多様な非天然アミノ酸を組込むように宿主細胞で機能できることは公知である。例えば、各々言及によりその開示内容全体を本明細書に組込むＣｈｉｎら，Ｓｃｉｅｎｃｅ（２００３）３０１：９６４−９６７；Ｚｈａｎｇら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．２００４，１０１：８８８２−８８８７；Ａｎｄｅｒｓｏｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．２００４，１０１：７５６６−７５７１；Ｗａｎｇら，（２００１）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９２：４９８−５００；Ｃｈｉｎら，（２００２）Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ １２４：９０２６−９０２７；Ｃｈｉｎ ａｎｄ Ｓｃｈｕｌｔｚ，（２００２）ＣｈｅｍＢｉｏＣｈｅｍ １１：１１３５−１１３７；Ｃｈｉｎら，（２００２）ＰＮＡＳ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ ９９：１１０２０−１１０２４；Ｗａｎｇ ａｎｄ Ｓｃｈｕｌｔｚ，（２００２）Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍ．，１−１０；Ｗａｎｇ ａｎｄ Ｓｃｈｕｌｔｚ “Ｅｘｐａｎｄｉｎｇ ｔｈｅ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｃｏｄｅ，” Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ Ｃｈｅｍｉｅ Ｉｎｔ．Ｅｄ．，４４（１）：３４−６６（２００５）；Ｘｉｅ ａｎｄ Ｓｃｈｕｌｔｚ，“Ａｎ Ｅｘｐａｎｄｉｎｇ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｃｏｄｅ，” Ｍｅｔｈｏｄｓ ３６：２２７−２３８（２００５）；及びＤｅｉｔｅｒｓら，Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ ＆ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｌｅｔｔｅｒｓ １５：１５２１−１５２４（２００５）参照。
国際公開ＷＯ２００２／０８６０７５、発明の名称「直交ｔＲＮＡ−アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ対を作製するための方法及び組成物（ＭＥＴＨＯＤＳ ＡＮＤ ＣＯＭＰＯＳＩＴＩＯＮＳ ＦＯＲ ＴＨＥ ＰＲＯＤＵＣＴＩＯＮ ＯＦ ＯＲＴＨＯＧＯＮＡＬ ｔＲＮＡ ＡＭＩＮＯＡＣＹＬ−ｔＲＮＡ ＳＹＮＴＨＥＴＡＳＥ ＰＡＩＲＳ）」；ＷＯ２００２／０８５９２３、発明の名称「非天然アミノ酸のインビボ組込み（ＩＮ ＶＩＶＯ ＩＮＣＯＲＰＯＲＡＴＩＯＮ ＯＦ ＵＮＮＡＴＵＲＡＬ ＡＭＩＮＯ ＡＣＩＤＳ）」；ＷＯ２００４／０９４５９３、発明の名称「真核遺伝コードの拡張（ＥＸＰＡＮＤＩＮＧ ＴＨＥ ＥＵＫＡＲＹＯＴＩＣ ＧＥＮＥＴＩＣ ＣＯＤＥ）」；ＷＯ２００５／０１９４１５（出願日２００４年７月７日）；ＷＯ２００５／００７８７０（出願日２００４年７月７日）；ＷＯ２００５／００７６２４（出願日２００４年７月７日）；ＷＯ２００６／０３４３３２（出願日２００５年９月２０日）；及びＷＯ２００６／１１０１８２、発明の名称「非天然アミノ酸のインビボ組込み用直交翻訳成分（ＯＲＴＨＯＧＯＮＡＬ ＴＲＡＮＳＬＡＴＩＯＮ ＣＯＭＰＯＮＥＮＴＳ ＦＯＲ ＴＨＥ ＩＮ ＶＩＶＯ ＩＮＣＯＲＰＯＲＡＴＩＯＮ ＯＦ ＵＮＮＡＴＵＲＡＬ ＡＭＩＮＯ ＡＣＩＳ）」、出願日２００５年１０月２７日、発明者Ｓｃｈｕｌｔｚらに記載されている非天然アミノ酸直交システムも参照。これらの文献は各々言及によりその開示内容全体を本明細書に組込む。
非天然アミノ酸の組込みは例えば寸法、酸性度、求核性、水素結合、疎水性、プロテアーゼ標的部位接近性、（例えば蛋白質アレーのための）部分へのターゲット、ラベル又は反応基の組込み等を変化させるように例えば蛋白質構造及び／又は機能の変化を適応させるために実施することができる。非天然アミノ酸を組込んだ蛋白質は触媒性又は物性を強化するか又は全く新規にすることができる。例えば、非天然アミノ酸を蛋白質に組込むことにより、場合により毒性、生体分布、構造的性質、分光学的性質、化学及び／又は光化学的性質、触媒能、半減期（例えば血清半減期）、他の分子との（例えば共有又は非共有結合的）反応性等の性質を改変する。少なくとも１個の非天然アミノ酸を組込んだ蛋白質を含有する組成物は例えば新規治療薬、診断薬、触媒酵素、産業用酵素、結合蛋白質（例えば抗体）、及び例えば蛋白質構造と機能の研究に有用である。例えばＤｏｕｇｈｅｒｔｙ，（２０００）“Ｕｎｎａｔｕｒａｌ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄｓ ａｓ Ｐｒｏｂｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ，”Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ，４：６４５−６５２参照。（例えば［３＋２］シクロ付加反応又はスタウディンガーライゲーション修飾により）選択的に翻訳後修飾可能な非天然アミノ酸を組込んだ蛋白質は反応パートナーと結合可能な任意所望官能基を含むように改変することができる。ポリペプチドに組込んだ非天然アミノ酸残基と共有結合する適切な反応性部分を含むという点さえ満足するならば、反応パートナーの種類は限定されない。
所定側面では、組成物は少なくとも１個、例えば少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、又は少なくとも１０個以上の非天然アミノ酸を組込んだ蛋白質を含有する。非天然アミノ酸は同一でも異なっていてもよく、例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０種以上の異なる非天然アミノ酸を組込んだ１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０個以上の異なる部位が蛋白質に存在することができる。別の側面では、組成物は蛋白質に存在する特定アミノ酸の全部よりは少ないが少なくとも１個が非天然アミノ酸である蛋白質を含有する。２個以上の非天然アミノ酸を組込んだ所与蛋白質では、非天然アミノ酸は同一でも異なっていてもよい（例えば蛋白質は２個以上の異なる型の非天然アミノ酸を組込んでもよいし、２個の同一非天然アミノ酸を組込んでもよい）。３個以上の非天然アミノ酸を組込んだ所与蛋白質では、非天然アミノ酸は同一でも異なっていてもよいし、同一種の複数の非天然アミノ酸と少なくとも１個の別の非天然アミノ酸の組み合わせでもよい。
本明細書に記載する組成物と方法を使用して非天然アミノ酸を組込んだほぼ任意蛋白質（又はその部分）（及び例えば１個以上のセレクターコドンを含む対応する任意コーディング核酸）を作製することができる。数十万種の公知蛋白質を列挙するには及ばないが、例えば該当翻訳系に１個以上の適当なセレクターコドンを含むように利用可能な任意突然変異法を調整することにより、１個以上の非天然アミノ酸を組込むように公知蛋白質の任意のものを改変することができる。公知蛋白質の一般的な配列寄託機関としてはＧｅｎＢａｎｋ、ＥＭＢＬ、ＤＤＢＪ及びＮＣＢＩが挙げられる。他の寄託機関もインターネットを検索することにより容易に確認できる。
一般に、蛋白質は入手可能な任意蛋白質（例えば治療用蛋白質、診断用蛋白質、産業用酵素、又はその部分等）と例えば少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は少なくとも９９％以上一致しており、１個以上の非天然アミノ酸を含む。１個以上の非天然アミノ酸を組込むように改変することができる治療用、診断用、及び他の蛋白質の例としては限定されないが、国際公開ＷＯ２００４／０９４５９３、出願日２００４年４月１６日、発明の名称「真核遺伝コードの拡張（Ｅｘｐａｎｄｉｎｇ ｔｈｅ Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｃｏｄｅ）」；及びＷＯ２００２／０８５９２３、発明の名称「非天然アミノ酸のインビボ組込み（ＩＮ ＶＩＶＯ ＩＮＣＯＲＰＯＲＡＴＩＯＮ ＯＦ ＵＮＮＡＴＵＲＡＬ ＡＭＩＮＯ ＡＣＩＤＳ）」に記載されているものが挙げられる。１個以上の非天然アミノ酸を組込むように改変することができる治療用、診断用、及び他の蛋白質の例としては限定されないが、例えばα１アンチトリプシン、アンジオスタチン、抗血友病因子、抗体（抗体の詳細については後述する）、アポリポ蛋白質、アポ蛋白質、心房性ナトリウム利尿因子、心房性ナトリウム利尿ポリペプチド、心房性ペプチド、Ｃ−Ｘ−Ｃケモカイン（例えばＴ３９７６５、ＮＡＰ−２、ＥＮＡ−７８、Ｇｒｏ−ａ、Ｇｒｏ−ｂ、Ｇｒｏ−ｃ、ＩＰ−１０、ＧＣＰ−２、ＮＡＰ−４、ＳＤＦ−１、ＰＦ−４、ＭＩＧ）、カルシトニン、ＣＣケモカイン（例えば単球化学誘引蛋白質−１、単球化学誘引蛋白質−２、単球化学誘引蛋白質−３、単球炎症性蛋白質−１α、単球炎症性蛋白質−１β、ＲＡＮＴＥＳ、Ｉ３０９、Ｒ８３９１５、Ｒ９１７３３、ＨＣＣ１、Ｔ５８８４７、Ｄ３１０６５、Ｔ６４２６２）、ＣＤ４０リガンド、Ｃキットリガンド、コラーゲン、コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、補体因子５ａ、補体阻害剤、補体受容体１、サイトカイン（例えば上皮好中球活性化ペプチド−７８、ＧＲＯα／ＭＧＳＡ、ＧＲＯβ、ＧＲＯγ、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１δ、ＭＣＰ−１）、表皮増殖因子（ＥＧＦ）、エリスロポエチン（「ＥＰＯ」）、表皮剥離毒素Ａ及びＢ、第ＩＸ因子、第ＶＩＩ因子、第ＶＩＩＩ因子、第Ｘ因子、繊維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、フィブリノーゲン、フィブロネクチン、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、グルコセレブロシダーゼ、ゴナドトロピン、増殖因子、ヘッジホッグ蛋白質（例えばソニック、インディアン、デザート）、ヘモグロビン、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、ヒルジン、ヒト血清アルブミン、インスリン、インスリン様増殖因子（ＩＧＦ）、インターフェロン（例えばＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−γ）、インターロイキン（例えばＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２等）、ケラチノサイト増殖因子（ＫＧＦ）、ラクトフェリン、白血病阻害因子、ルシフェラーゼ、ニュールチュリン、好中球阻害因子（ＮＩＦ）、オンコスタチンＭ、骨形成蛋白質、副甲状腺ホルモン、ＰＤ−ＥＣＳＦ、ＰＤＧＦ、ペプチドホルモン（例えばヒト成長ホルモン）、プレイオトロピン、プロテインＡ、プロテインＧ、発熱外毒素Ａ、Ｂ及びＣ、リラキシン、レニン、ＳＣＦ、可溶性補体受容体Ｉ、可溶性Ｉ−ＣＡＭ１、可溶性インターロイキン受容体（ＩＬ−１、２、３、４、５、６、７、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５）、可溶性ＴＮＦ受容体、ソマトメジン、ソマトスタチン、ソマトトロピン、ストレプトキナーゼ、スーパー抗原即ちブドウ球菌エンテロトキシン（ＳＥＡ、ＳＥＢ、ＳＥＣ１、ＳＥＣ２、ＳＥＣ３、ＳＥＤ、ＳＥＥ）、スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）、毒素性ショック症候群毒素（ＴＳＳＴ−１）、チモシンα１、組織プラスミノーゲンアクチベーター、腫瘍壊死因子β（ＴＮＦβ）、腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦＲ）、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＥＦ）、ウロキナーゼ並びに他の多数の蛋白質が挙げられる。
本明細書に記載する非天然アミノ酸のｉｎ ｖｉｖｏ蛋白質組込み用組成物及び方法を使用して作製することができる蛋白質の１類としては転写モジュレーター又はその部分が挙げられる。転写モジュレーターの例としては細胞増殖、分化、制御等を調節する遺伝子及び転写モジュレーター蛋白質が挙げられる。転写モジュレーターは原核生物、ウイルス及び真核生物（例えば真菌、植物、酵母、昆虫、及び哺乳動物を含む動物）に存在し、広範な治療ターゲットを提供する。当然のことながら、発現及び転写アクチベーターは例えば受容体との結合、シグナル伝達カスケードの刺激、転写因子の発現調節、プロモーターやエンハンサーとの結合、プロモーターやエンハンサーと結合する蛋白質との結合、ＤＮＡ巻き戻し、プレｍＲＮＡスプライシング、ＲＮＡポリアデニル化及びＲＮＡ分解等の多数のメカニズムにより転写を調節する。
本発明の蛋白質（例えば１個以上の非天然アミノ酸を組込んだ蛋白質）の１類としてはサイトカイン、炎症性分子、増殖因子、その受容体、及び腫瘍遺伝子産物等の生理活性蛋白質が挙げられ、例えばインターロイキン（例えばＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−８等）、インターフェロン、ＦＧＦ、ＩＧＦ−Ｉ、ＩＧＦ−ＩＩ、ＦＧＦ、ＰＤＧＦ、ＴＮＦ、ＴＧＦ−α、ＴＧＦ−β、ＥＧＦ、ＫＧＦ、ＳＣＦ／ｃ−キット、ＣＤ４０Ｌ／ＣＤ４０、ＶＬＡ−４／ＶＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−１／ＬＦＡ−１及びヒアルリン／ＣＤ４４；シグナル伝達分子及び対応する腫瘍遺伝子産物（例えばＭｏｓ、Ｒａｓ、Ｒａｆ及びＭｅｔ）；並びに転写アクチベーター及びサプレッサー（例えばｐ５３、Ｔａｔ、Ｆｏｓ、Ｍｙｃ、Ｊｕｎ、Ｍｙｂ、Ｒｅｌ、及びステロイドホルモン受容体（例えばエストロゲン、プロゲステロン、テストステロン、アルドステロン、ＬＤＬ受容体リガンド及びコルチコステロン））が挙げられる。
少なくとも１個の非天然アミノ酸を組込んだ酵素（例えば産業用酵素）又はその部分も本発明により提供される。酵素の例としては限定されないが、例えばアミダーゼ、アミノ酸ラセマーゼ、アシラーゼ、デハロゲナーゼ、ジオキシゲナーゼ、ジアリールプロパンペルオキシダーゼ、エピメラーゼ、エポキシドヒドロラーゼ、エステラーゼ、イソメラーゼ、キナーゼ、グルコースイソメラーゼ、グリコシダーゼ、グリコシルトランスフェラーゼ、ハロペルオキシダーゼ、モノオキシゲナーゼ（例えばｐ４５０類）、リパーゼ、リグニンペルオキシダーゼ、ニトリルヒドラターゼ、ニトリラーゼ、プロテアーゼ、ホスファターゼ、スブチリシン、トランスアミナーゼ及びヌクレアーゼが挙げられる。
これらの蛋白質の多くは市販されており（例えばＳｉｇｍａ ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓカタログ）、対応する蛋白質配列と遺伝子及び、一般に多くのその変異体も周知である（例えばＧｅｎｂａｎｋ参照）。例えば１種以上の該当治療、診断又は酵素特性に関して蛋白質を改変するように本発明に従って１個以上の非天然アミノ酸を挿入することにより前記蛋白質の任意のものを改変することができる。治療関連特性の例としては血清半減期、貯蔵半減期、安定性、免疫原性、治療活性、（例えば非天然アミノ酸へのレポーター基（例えばラベル又はラベル結合部位）の付加による）検出性、ＬＤ５０又は他の副作用の低減、胃管を経由して体内に導入できること（例えば経口利用性）等が挙げられる。診断特性の例としては貯蔵半減期、安定性、診断活性、検出性等が挙げられる。該当酵素特性の例としては貯蔵半減期、安定性、酵素活性、産生能等が挙げられる。
他の各種蛋白質も本発明の組成物と方法を使用して１個以上の非天然アミノ酸を組込むように改変することができる。例えば、本発明は例えば感染性真菌（例えばＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ、Ｃａｎｄｉｄａ種）；細菌、特に病原細菌モデルとして利用できる大腸菌や医学的に重要な細菌（例えばＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｉ（例えばａｕｒｅｕｓ）又はＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｉ（例えばｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ））；原生動物（例えば胞子虫類（例えばＰｌａｓｍｏｄｉａ）、根足虫類（例えばＥｎｔａｍｏｅｂａ）及び鞭毛虫類（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ、Ｔｒｉｃｈｏｍｏｎａｓ、Ｇｉａｒｄｉａ等））；ウイルス（例えば（＋）ＲＮＡウイルス（例えばポックスウイルス（例えばワクシニア）、ピコルナウイルス（例えばポリオ）、トガウイルス（例えば風疹）、フラビウイルス（例えばＨＣＶ）、及びコロナウイルス）、（−）ＲＮＡウイルス（例えばラブドウイルス（例えばＶＳＶ）、パラミクソウイルス（例えばＲＳＶ）、オルトミクソウイルス（例えばインフルエンザ）、ブンヤウイルス及びアレナウイルス）、ｄｓＤＮＡウイルス（例えばレオウイルス）、ＲＮＡ→ＤＮＡウイルス（即ちレトロウイルス、例えばＨＩＶ及びＨＴＬＶ）、及び所定のＤＮＡ→ＲＮＡウイルス（例えばＢ型肝炎））に由来する蛋白質において、１種以上のワクチン蛋白質中の１種以上の天然アミノ酸を非天然アミノ酸で置換することができる。
昆虫耐性蛋白質（例えばＣｒｙ蛋白質）、澱粉及び脂質産生酵素、植物及び昆虫毒素、毒素耐性蛋白質、マイコトキシン解毒蛋白質、植物成長酵素（例えばリブロース１，５−ビスリン酸カルボキシラーゼ／オキシゲナーゼ、（ＲＵＢＩＳＣＯ））、リポキシゲナーゼ（ＬＯＸ）及びホスホエノールピルビン酸（ＰＥＰ）カルボキシラーゼ等の農業関連蛋白質も非天然アミノ酸修飾の適切なターゲットである。
所定態様では、該当蛋白質（又はその部分）は核酸によりコードされる。一般に、核酸は少なくとも１個のセレクターコドン、少なくとも２個のセレクターコドン、少なくとも３個のセレクターコドン、少なくとも４個のセレクターコドン、少なくとも５個のセレクターコドン、少なくとも６個のセレクターコドン、少なくとも７個のセレクターコドン、少なくとも８個のセレクターコドン、少なくとも９個のセレクターコドン、１０個以上のセレクターコドンを含む。
該当蛋白質又はポリペプチドをコードする遺伝子は例えば非天然アミノ酸を組込むために１個以上のセレクターコドンを付加するように本明細書の「突然変異誘発及び他の分子生物学技術」のセクションに記載する当業者に周知の方法を使用して突然変異誘発することができる。例えば、１個以上のセレクターコドンを付加するように該当蛋白質の核酸を突然変異誘発し、１個以上の非天然アミノ酸を挿入できるようにする。本発明は例えば少なくとも１個の非天然アミノ酸を組込んだ任意蛋白質のこのような任意変異体（例えば突然変異体、変形）を含む。同様に、本発明は対応する核酸、即ち１個以上の非天然アミノ酸をコードする１個以上のセレクターコドンを含む任意核酸も含む。
翻訳後修飾非天然アミノ酸を組込んだ蛋白質を作製するためには、直交ｔＲＮＡ／ＲＳ対による非天然アミノ酸のｉｎ ｖｉｖｏ組込みに適した宿主細胞及び生物を使用することができる。直交ｔＲＮＡ、直交ｔＲＮＡシンテターゼを発現する１個以上のベクターと、修飾すべき蛋白質をコードするベクターで宿主細胞を遺伝子組換え（例えば形質転換、形質導入又はトランスフェクション）する。これらの成分の各々を同一ベクターに配置してもよいし、各々別々のベクターに配置してもよいし、２成分を第１のベクターに配置し、第３の成分を第２のベクターに配置してもよい。ベクターは例えばプラスミド、細菌、ウイルス、裸のポリヌクレオチド又はポリヌクレオチドコンジュゲートの形態とすることができる。
免疫反応性によるポリペプチドの定義
本発明のポリペプチドは種々の新規ポリペプチド配列（例えば本発明の翻訳系で合成される蛋白質の場合には非天然アミノ酸を含み、例えば新規シンテターゼの場合には標準アミノ酸の新規配列を含むポリペプチド）を提供するので、ポリペプチドは例えばイムノアッセイで認識することができる新規構造特徴も提供する。本発明のポリペプチドに特異的に結合する抗血清の作製及び前記抗血清と結合するポリペプチドも本発明の特徴である。本明細書で使用する「抗体」なる用語は限定されないが、検体（抗原）と特異的に結合してこれを認識する１又は複数の免疫グロブリン遺伝子又はそのフラグメントにより実質的にコードされるポリペプチドを意味する。例としてはポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、及び１本鎖抗体等が挙げられる。Ｆａｂフラグメントやファージディスプレイを含む発現ライブラリーにより作製されたフラグメント等の免疫グロブリンフラグメントも本明細書で使用する「抗体」なる用語に含まれる。抗体構造及び用語については、例えばＰａｕｌ，Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，４ｔｈ Ｅｄ．，１９９９，Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ参照。
イムノアッセイ用抗血清を作製するためには、免疫原性ポリペプチドの１種以上を本明細書に記載するように作製し、精製する。例えば、組換え蛋白質を組換え細胞で作製することができる。（マウスの仮想遺伝子一致により結果の再現性が高いのでこのアッセイで使用する）近交系マウスに標準マウス免疫プロトコールに従って標準アジュバント（例えばフロイントアジュバント）と共に免疫原性蛋白質を免疫する（抗体作製、イムノアッセイフォーマット及び特異的免疫反応性を測定するために使用可能な条件の標準解説については例えばＨａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ（１９８８）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ参照）。蛋白質、抗体、抗血清等に関するその他の詳細は国際公開ＷＯ２００４／０９４５９３、発明の名称「真核遺伝コードの拡張（ＥＸＰＡＮＤＩＮＧ ＴＨＥ ＥＵＫＡＲＹＯＴＩＣ ＧＥＮＥＴＩＣ ＣＯＤＥ）」；ＷＯ２００２／０８５９２３、発明の名称「非天然アミノ酸のインビボ組込み（ＩＮ ＶＩＶＯ ＩＮＣＯＲＰＯＲＡＴＩＯＮ ＯＦ ＵＮＮＡＴＵＲＡＬ ＡＭＩＮＯ ＡＣＩＤＳ）」；ＷＯ２００４／０３５６０５、発明の名称「糖蛋白質合成（ＧＬＹＣＯＰＲＯＴＥＩＮ ＳＹＮＴＨＥＳＩＳ）」；及びＷＯ２００４／０５８９４６、発明の名称「蛋白質アレー（ＰＲＯＴＥＩＮ ＡＲＲＡＹＳ）」に記載されている。
キット
キットも本発明の特徴である。例えば、少なくとも１個の非天然アミノ酸を組込んだポリペプチドを作製するためのキットが本発明の特徴であり、前記キットは本発明の少なくとも１種の構築物を含む。例えば、このようなキットはキットコンポーネントを保持するための容器、ポリペプチドを作製するための説明書、Ｏ−ｔＲＮＡをコードするポリヌクレオチド配列を含む核酸、Ｏ−ＲＳをコードするポリヌクレオチドを含む核酸、非天然アミノ酸、非天然アミノ酸の翻訳後修飾用試薬、及びＯ−ｔＲＮＡ／Ｏ−ＲＳの発現に適した大腸菌宿主細胞株から選択される各種コンポーネントを含むことができる。
以下、実施例により本発明を例証するが、これらの実施例により本発明を限定するものではない。本発明の範囲から逸脱せずに変更可能な種々の非必須パラメーターが当業者に自明である。当然のことながら、本明細書に記載する実施例及び態様は例証の目的に過ぎず、これらの記載に鑑みて種々の変形又は変更が当業者に示唆され、このような変形又は変更も本願の精神及び範囲と特許請求の範囲に含むものとする。
非天然アミノ酸を組込んだポリペプチドの発現用単一プラスミドシステムの構築
本実施例はｐ−ベンゾイル−Ｌ−フェニルアラニンの組込み用として、直交アミノアシルｔＲＮＡとアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼの対の両方のメンバーをコードするプラスミドの構築について記載する。
大腸菌宿主細胞で機能する直交翻訳対の両方の成分をコードするヌクレオチド配列を含むプラスミド（ｐＹＲ−ＢｐａＲＳ１と言う）を構築した。即ち、これらの２成分は直交ｔＲＮＡ ＭｊｔＲＮＡ−Ｔｙｒ（ＣＵＡ）と、光架橋性アミノ酸であるｐ−ベンゾイル−Ｌ−フェニルアラニン（Ｂｐａ，図１参照）で直交ｔＲＮＡを特異的にアミノアシル化する突然変異体ＭｊＴｙｒＲＳシンテターゼ（ＢｐａＲＳ）である。Ｃｈｉｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９９：１１０２０−１１０２４（２００２）参照。
このｐＹＲ−ＢｐａＲＳ１プラスミドシステムの抑圧効率を測定するために、ｐＹＲ−ＢｐａＲＳ１とｌａｃＺ遺伝子のリーダー配列の許容位置にアンバー突然変異をもつβ−ガラクトシダーゼをコードするｌａｃＺレポータープラスミドで同時形質転換したＴＯＰ１０大腸菌細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（登録商標））でβ−ガラクトシダーゼ活性を測定した。残念ながら、細胞を１ｍＭ Ｂｐａの存在下で増殖させた場合には、非常に低レベルのβ−ガラクトシダーゼ活性しか観察されなかった（図２）。ｔＲＮＡ遺伝子のフランキング配列を修飾することにより抑圧効率を増加しようとしたが、うまくいかなかった。
この抑圧効率を改善するために、天然大腸菌ｔＲＮＡプロモーター及びターミネーターをもつ新規アンバーサプレッサーｔＲＮＡオペロンを構築した。大腸菌ｔＲＮＡ遺伝子の調査の結果、大腸菌プロリルｔＲＮＡは古細菌ｔＲＮＡと同一のＣ１−Ｇ７２対をもち、この塩基対が大腸菌でＭｊＴｙｒＲＳによるＭｊｔＲＮＡ−Ｔｙｒ（ＣＵＡ）の選択的認識の主要な同一性決定因子であることが判明した（Ｗａｎｇ ａｎｄ Ｓｃｈｕｌｔｚ，Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．８：８８３−８９０（２００１））。この知見に鑑み、モノシストロン性ｐｒｏＫオペロンの同一長（７７ヌクレオチド）大腸菌ｐｒｏＫ遺伝子をＭｊｔＲＮＡ−Ｔｙｒ（ＣＵＡ）遺伝子で置換した合成アンバーサプレッサーｔＲＮＡ遺伝子を構築した。ｐｒｏＫ遺伝子は大腸菌で最も高頻度で使用されるプロリンコドン（ＣＣＧ）を認識するｔＲＮＡをコードする（Ｎａｋａｍｕｒａら，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２８：２９２（２０００））ので、ＭｊｔＲＮＡ−Ｔｙｒ（ＣＵＡ）遺伝子はｐｒｏＫプロモーターの制御下で効率的に転写されると予想した。ｔＲＮＡ転写を強化するためにｐｒｏＫプロモーターの上流に天然に存在するＦＩＳ結合部位も合成遺伝子構築物に加えた（Ｍｕｓｋｈｅｌｉｓｈｖｉｌｉら，ＥＭＢＯ Ｊ．１６：３６５５−３６６５ （１９９７））。ｐＹＲ−ＢｐａＲＳ１の元のサプレッサーｔＲＮＡオペロンをｐｒｏＫプロモーター及びターミネーターの制御下のＭｊｔＲＮＡ−Ｔｙｒ（ＣＵＡ）遺伝子で置換することにより最終発現ベクターｐＹＲ−ＢｐａＲＳ５を作製した。大腸菌に形質転換した処、このプラスミドは（ｌｐｐプロモーターとｒｒｎＣターミネーターの制御下の元のｔＲＮＡ遺伝子に比較して）ＭｊｔＲＮＡ−Ｔｙｒ（ＣＵＡ）の発現を２倍に増加することがノーザン分析により認められた（図３参照）。この発現増加はβ−ガラクトシダーゼ活性アッセイにより測定した場合に（野生型β−ガラクトシダーゼ発現に比較して）８％の抑圧効率に相当する（図２）。
改良型シンテターゼ遺伝子及びプロモーターの作製
本実施例は直交翻訳系成分の改良型発現システムの構築について記載し、シンテターゼ遺伝子及びシンテターゼプロモーターにおける突然変異の効果を検討する。
ＫｏｂａｙａｓｈｉらはＭｊＴｙｒＲＳにおけるＡｓｐ２８６→Ａｒｇ（Ｄ２８６Ｒ）の１アミノ酸置換の結果、主にコグネイトシンテターゼによるアンバーサプレッサーｔＲＮＡのアンチコドン（ＣＵＡ）の認識強化（Ｋｍが５７分の１に低下）により、ＭｊｔＲＮＡ−Ｔｙｒ（ＣＵＡ）のｉｎ ｖｉｔｒｏ総アミノアシル化率が有意に増加（ｋｃａｔ／Ｋｍが６７倍に増加）したと過去に記載している（Ｋｏｂａｙａｓｈｉら，Ｎａｔ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．１０：４２５−４３２（２００３））。この情報を使用し、この同一Ｄ２８６Ｒ突然変異を部位特異的突然変異誘発によりｐＹＲ−ＢｐａＲＳ５のＢｐａＲＳ遺伝子に導入した。実際に、ＢｐａＲＳのＤ２８６Ｒ突然変異体はβ−ガラクトシダーゼ活性を４．５倍に増加した（図２参照）。
−１０領域にＧＡＴＣの代わりにＴＡＴＣ配列をもつ突然変異体ｇｌｎＳプロモーター（配列番号１２）は遺伝子発現を増加することが過去に示されている（Ｐｌｕｍｂｒｉｄｇｅ ａｎｄ Ｓｏｌｌ，Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ ６９：５３９−５４１（１９８７））。この知見に基づき、ｐＹＲ−ＢｐａＲＳ５の野生型ｇｌｎＳプロモーターをＰｌｕｍｂｒｉｄｇｅ ａｎｄ Ｓｏｌｌに記載の突然変異形ｇｌｎＳプロモーターで置換し、システムの効率を改善しようとした。しかし、このプロモーター配列をｐＹＲ−ＢｐａＲＳ５に挿入後に配列決定した処、所期突然変異以外に他の偶発的な欠失突然変異も存在することが判明した。β−ガラクトシダーゼ活性をアッセイした欠失突然変異体のうち、ｇｌｎＳプロモーターの所期１塩基置換（−１１位のＧ→Ｔ）以外に１塩基欠失（−１５位の残基Ａ）をもつ１個の特定変異体ｐＹＲ−ＢｐａＲＳ−ＴＲＮはｐＹＲ−ＢｐａＲＳ５に比較して５倍のβ−ガラクトシダーゼ活性の増加を示した（図２参照）。この新規突然変異体ｇｌｎＳプロモータードメインの全長ヌクレオチド配列を配列決定後にｇｌｎＳ−ＴＲＮと命名し、配列番号１３に示す。
ウェスタンブロット分析によると、突然変異形ｇｌｎＳプロモーターの制御下のＢｐａＲＳ発現は２倍に改善された（図４参照）。ＢｐａＲＳのＤ２８６Ｒ置換を新規突然変異体ｇｌｎＳプロモーターと組み合わせることにより更に１．５倍のβ−ガラクトシダーゼ活性増加が観察され、これはｐＹＲ−ＢｐａＲＳ−ＴＲＮ（Ｄ２８６Ｒ）の５７％の総抑圧効率に対応する。
改良型ｔＲＮＡ発現システムの作製
本実施例は直交翻訳系成分の改良型発現システムの構築について記載し、ポリシストロン性オペロンにＭｊｔＲＮＡ−Ｔｙｒ（ＣＵＡ）のマルチコピーを配置する効果を検討する。
抑圧効率に及ぼすアンバーサプレッサーｔＲＮＡのマルチコピーの効果を検討した。単一ｐｒｏＫプロモーター及びターミネーターの制御下のアンバーサプレッサーｔＲＮＡ遺伝子３コピーを含むポリシストロン性ＭｊｔＲＮＡ−Ｔｙｒ（ＣＵＡ）オペロンを構築した。
天然大腸菌ｔＲＮＡリンカー配列から誘導されるｔＲＮＡリンカー配列によりポリシストロン性オペロンの３個のタンデムＯ−ｔＲＮＡ配列を相互に分離した。これらの特定リンカー配列を選択した理由は、Ｔ（−１）及びＡ（７７）ヌクレオチドを含むためである。ｔＲＮＡリンカーにおけるこれらの２個のヌクレオチド位置はその天然（即ち内在）コンテクストにあるときにｔＲＮＡ前駆体の効率的な５’及び３’プロセシングに最適であることが分かっている。
大腸菌ｖａｌＵ及びｖａｌＸ ｔＲＮＡ遺伝子の間に天然に存在するリンカーから誘導されるｔＲＮＡリンカー（配列番号１４）により組換えポリシストロン性オペロンの第１及び第２のＭｊｔＲＮＡ−Ｔｙｒ（ＣＵＡ）遺伝子を分離する。大腸菌ｉｌｅＴ及びａｌａＴ ｔＲＮＡ遺伝子の間に天然に存在するリンカーから誘導されるｔＲＮＡリンカー（配列番号１５）により組換えポリシストロン性オペロンの第２及び第３のＭｊｔＲＮＡ−Ｔｙｒ（ＣＵＡ）遺伝子を分離する。これらのリンカーを使用すると、これらのポリヌクレオチドが適切な制限部位を含んでいるという別の実際的な利点もある。
サプレッサーｔＲＮＡ遺伝子３コピーを含む合成ポリシストロン性ｔＲＮＡオペロンの同一の２コピーをライゲーションし、ＭｊｔＲＮＡ−Ｔｙｒ（ＣＵＡ）遺伝子６コピーを含む遺伝子クラスターを作製した。ｔＲＮＡ３コピーと６コピーを含む遺伝子クラスターの集合をｐＹＲ−ＢｐａＲＳ−ＴＲＮ（Ｄ２８６Ｒ）にクローニングし、夫々ｐＹＲ−ＢｐａＲＳ−３ＴＲＮ（Ｄ２８６Ｒ）とｐＹＲ−ＢｐａＲＳ−６ＴＲＮ（Ｄ２８６Ｒ）を作製した。大腸菌で発現させた処、これらのプラスミドはＭｊｔＲＮＡ−Ｔｙｒ（ＣＵＡ）発現を夫々３０％及び５０％増加することがノーザン分析により判明した（図３参照）。メッセージ発現のこの増加により、β−ガラクトシダーゼ活性は３０〜４０％増加した（図２参照）。
これらのプラスミドでコードされる大腸菌レアコドンｔＲＮＡは殆どの蛋白質の発現に不要と思われるので、これらの大腸菌ｔＲＮＡ遺伝子をプラスミドｐＹＲ−ＢｐａＲＳ−６ＴＲＮ（Ｄ２８６Ｒ）から除去し、ｐＳｕｐ−ＢｐａＲＳ−６ＴＲＮ（Ｄ２６ＳＲ）（図５参照）を得た。予想通り、ｉｎ ｖｉｖｏ β−ガラクトシダーゼ活性アッセイにより測定したこのプラスミドの抑圧効率はその親プラスミドと同一のままであった（図６参照）。
改良型発現システムを使用する非天然アミノ酸を組込んだモデル蛋白質の発現
本実施例は本発明の改良型発現システムを使用する非天然アミノ酸を組込んだモデル蛋白質マッコウクジラミオグロビンの発現について記載する。
本発明のシステムを使用した非天然アミノ酸の蛋白質組込み収率及び忠実度の改善を更に試験するために、（Ｃｈｉｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９９：１１０２０−１１０２４（２００２）に記載の）マッコウクジラミオグロビンのＳｅｒ−４→Ｂｐａ突然変異体を大腸菌で発現させた。ＴＯＰ１０大腸菌細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（登録商標））をｐＢＡＤ／Ｍｙｃ−Ｈｉｓ／ＭＢ（Ｓ４ＴＡＧ）とｐＳｕｐ−ＢｐａＲＳ−６ＴＲＮ（Ｄ２８６Ｒ）で同時形質転換し、Ｌｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ培地で３７℃にて１ｍＭ Ｂｐａの存在下に増殖させた。上記ｉｎ ｖｉｖｏ β−ガラクトシダーゼアッセイデータと一致し、従来のシステムの突然変異体蛋白質収量２ｍｇ／Ｌに対して、総精製収量４０ｍｇ／Ｌの全長突然変異体ミオグロビンが生成された（Ｃｈｉｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９９：１１０２０−１１０２４（２００２））。アミノ酸の不在下ではＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにより突然変異体蛋白質は全く観察されなかった（図６）。Ｓｅｒ−４の代わりにＢｐａを含む突然変異体ミオグロビンのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析の結果、予想質量計算値１８５２０と良好に一致する平均質量１８５２１が得られた。質量スペクトルに４位の天然アミノ酸組込みの徴候は全く検出されなかった。
本発明の改良型発現システムの広範な適用可能性
本実施例は４種類の異なる非天然アミノ酸を組込んだβ−ガラクトシダーゼの発現について記載し、発現システムは異なる非天然アミノ酸に対する負荷特異性をもつ異なる突然変異体シンテターゼを使用する。
本発明のこの発現システムの汎用性を試験するために、３種類の他の直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼをシステムで試験した。これらのＯ−ＲＳはＯ−ｔＲＮＡ ＭｊｔＲＮＡ−Ｔｙｒ（ＣＵＡ）をｐ−アセチル−Ｌ−フェニルアラニン（ｐＡｃＰｈｅ）、ｐ−アジド−Ｌ−フェニルアラニン（ｐＡｚＰｈｅ）及びｐ−ヨード−Ｌ−フェニルアラニン（ｐＩＰｈｅ）で特異的にアミノアシル化（即ち負荷）する（図１）。これらの非天然アミノ酸は化学標識（Ｗａｎｇら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ｓｃｉ．Ａｃａｄ．ＵＳＡ １００：５６−６１（２００３））、光架橋（Ｃｈｉｎら，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ，１２４：９０２６−９０２７（２００２））、及びＸ線結晶構造解析位相決定（Ｘｉｅら，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２２：１２９７−１３０１（２００４））実験に有用である。夫々のＯ−ＲＳをｐＳｕｐ−ＢｐａＲＳ−６ＴＲＮ（Ｄ２８６Ｒ）のＮｄｅＩ／ＰｓｔＩ部位にサブクローニングすることによりこれらの突然変異体ＭｊＴｙｒＲＳ遺伝子をコードする本発明の発現ベクターを構築し、ベクターｐＳｕｐ−ｐＡｃＰｈｅＲＳ−６ＴＲＮ、ｐＳｕｐ−ｐＡｚＰｈｅＲＳ−６ＴＲＮ及びｐＳｕｐ−ｐＩＰｈｅＲＳ−６ＴＲＮを得た。Ｂｐａの場合と同様に、これらのプラスミドを含む大腸菌細胞をこれらのアミノ酸（１ｍＭ）の存在下で増殖させると、β−ガラクトシダーゼ活性レベルは野生型β−ガラクトシダーゼからの活性レベルと同等であり（図７）、夫々の非天然アミノ酸を組込んだβ−ガラクトシダーゼが生産されたことが分かった。
プラスミド構築
ｐＹＲ−ＢｐａＲＳ１
ｐＲＡＲＥ２プラスミド（Ｎｏｖａｇｅｎ）のＳａｃＩ及びＳｐｅＩ部位にＢｐａＲＳ及びＭｊｔＲＮＡ−Ｔｙｒ（ＣＵＡ）遺伝子を挿入することにより、クロラムフェニコール耐性マーカー、ｌｐｐプロモーターとｒｒｎＣターミネーターの制御下のＭｊｔＲＮＡ−Ｔｙｒ（ＣＵＡ）、及びｇｌｎＳプロモーターの制御下のＢｐａＲＳを含むｐ１５ＡレプリコンであるｐＹＲ−ＢｐａＲＳ１を作製した。
ｐｒｏＫプロモーター及びターミネーターをもつＭｊｔＲＮＡ−Ｔｙｒ（ＣＵＡ）遺伝子
４種類の合成オリゴヌクレオチドをオーバーラップＰＣＲストラテジーで使用し、ｐｒｏＫプロモーター及びターミネーターを含むモノシストロン性ＭｊｔＲＮＡ−Ｔｙｒ（ＣＵＡ）オペロンをＰＣＲにより構築し、単一ＰＣＲ反応で全長ｔＲＮＡオペロンを作製した。
その後、２種類のプライマー：


を使用してＰＣＲアンプリコンをＰＣＲにより増幅した。
得られたアンプリコンをｐＹＲ−ＢｐａＲＳ１のＢｃｌＩ部位とＸｈｏＩ部位（下線部）の間に挿入し、プラスミドｐＹＲ−ＢｐａＲＳ５を作製した。
突然変異体ｇｌｎＳプロモーター
４種類の合成オリゴヌクレオチド：

を使用して突然変異体ｇｌｎＳプロモーターをＰＣＲにより構築した。
ｐＹＲ−ＢｐａＲＳ５のＸｍａＩ部位とＮｄｅＩ部位の間に産物を挿入した。多数のクローンをｉｎ ｖｉｖｏ ＬａｃＺ活性アッセイでスクリーニングし、活性の改善された１個の特定１塩基欠失突然変異体を同定し、配列決定した（ｐＹＲ−ＢｐａＲＳ−ＴＲＮと命名する）。
タンデムｔＲＮＡ遺伝子カセット
大腸菌ゲノムでｖａｌＵ遺伝子とｖａｌＸ遺伝子の間（配列番号１４）及びｉｌｅＴ遺伝子とａｌａＴ遺伝子の間（配列番号１５）に天然に存在する２種類のｔＲＮＡリンカー配列をＭｊｔＲＮＡ−Ｔｙｒ（ＣＵＡ）遺伝子間のスペーサーとして使用した。これらのリンカー配列はＢｓｍＡＩ及びＥａｒＩ制限部位を含んでおり、これにＭｊｔＲＮＡ−Ｔｙｒ（ＣＵＡ）遺伝子をライゲーションした。これらのフランキング配列はｔＲＮＡ前駆体の効率的な５’及び３’プロセシングに最適なＴ（−１）及びＡ（７７）残基も含む。３種類のプライマーセット：

を使用してｔＲＮＡ遺伝子カセットをＰＣＲにより増幅した。
各セットからの産物をＢｓｍＡＩ（セット１）、ＥａｒＩ（セット２）又は両者（セット３）で消化した。これらの３個の制限フラグメントをライゲーションし、２個の異なる天然リンカー配列により接続されたｔＲＮＡ遺伝子３コピーを含むポリシストロン性ｔＲＮＡオペロンを作製した。２個のプライマーセット：

を使用して得られた遺伝子クラスターをＰＣＲ増幅した。
セット４及び５からのＰＣＲ産物をＳｐｈＩで消化し、相互にライゲーションし、各々単一ｐｒｏＫプロモーター及びターミネーターの制御下の３個のｔＲＮＡ遺伝子をコードする２個の同一のポリシストロン性ｔＲＮＡオペロンから構成される１方向タンデムｔＲＮＡ遺伝子アセンブリを作製した。ポリシストロン性ｔＲＮＡオペロンの１又は２個の同一コピーを含む各ｔＲＮＡ遺伝子クラスターをｐＹＲ−ＢｐａＲＳ−ＴＲＮのＡｐａＬＩ及びＸｈｏＩ部位にクローニングし、夫々ｐＹＲ−ＢｐａＲＳ−３ＴＲＮ及びｐＹＲ−ＢｐａＲＳ−６ＴＲＮを得た。
ｐＳｕｐプラスミド
ＳｐｅＩとＤｒｄＩで消化した後にマングビーンヌクレアーゼで処理することにより、ｐＲＡＲＥ２プラスミドで当初にコードされていた１２個の大腸菌ｔＲＮＡ遺伝子の各々をｐＹＲ−ＢｐａＲＳ−６ＴＲＮ（Ｄ２８６Ｒ）から除去した。直鎖化したベクターを再ライゲーションし、ｐＳｕｐ−ＢｐａＲＳ−６ＴＲＮ（Ｄ２８６Ｒ）を作製した。ｐ−アセチル−Ｌ−フェニルアラニン、ｐ−アジド−Ｌ−フェニルアラニン及びｐ−ヨード−Ｌ−フェニルアラニンの突然変異体ＭｊＴｙｒＲＳ遺伝子をそれらの対応するｐＢＫプラスミドからｐＳｕｐ−ＢｐａＲＳ−６ＴＲＮ（Ｄ２８６Ｒ）のＮｄｅＩ及びＰｓｔＩ部位にサブクローニングし、夫々ｐＳｕｐ−ｐＡｃＰｈｅＲＳ−６ＴＲＮ、ｐＳｕｐ−ｐＡｚＰｈｅＲＳ−６ＴＲＮ及びｐＳｕｐ−ｐＩｏｄｏＰｈｅＲＳ−６ＴＲＮを作製した。
ｌａｃＺレポータープラスミド及びｉｎ ｖｉｖｏ β−ガラクトシダーゼ活性アッセイ
ｐＢＡＤ／Ｍｙｃ−Ｈｉｓ／ＬａｃＺ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（登録商標））のｌａｃＺ遺伝子上流に位置するリーダー配列（ＭＤＰＬＶＴＡＡＳＶＬＥＦＧＬＦＥＴ；配列番号５７）の残基１３（下線部）のフェニルアラニンコドン（ＴＴＣ）を部位特異的突然変異誘発によりアンバーコドン（ＴＡＧ）に突然変異させ、ＬａｃＺレポータープラスミドｐＢＡＤ／Ｍｙｃ−Ｈｉｓ／ＬａｃＺ（ＴＡＧ）を作製した。このプラスミドを各サプレッサープラスミドと共に大腸菌ＴＯＰ１０細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（登録商標））に同時形質転換した。０．０２％アラビノースと１ｍＭ非天然アミノ酸を加えたＬｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ（ＬＢ）培地で細胞を３７℃にて一晩インキュベートした。Ｍｉｌｌｅｒ（Ｍｉｌｌｅｒ，Ｊ．Ｈ．Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ．（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９７２））に記載の方法に従ってＬａｃＺ（β−ガラクトシダーゼ）活性を測定した。
一般方法
プラスミドのクローニングと維持にはＸＬ１−Ｂｌｕｅ大腸菌細胞（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を使用した。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）にはＰｆｕＵｌｔｒａ（登録商標）Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ（登録商標））を使用した。部位特異的突然変異誘発にはＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ（登録商標）ＩＩ部位特異的突然変異誘発キット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ（登録商標））を使用した。構築した全プラスミドの配列を配列決定により確認した。
蛋白質発現
４位にアンバーコドン（Ｓｅｒ−４）をもつＣ末端ヘキサヒスチジンタグ付き突然変異体マッコウクジラミオグロビン遺伝子をｐＢＡＤ−ＪＹＡＭＢ−４ＴＡＧからｐＢＡＤ／Ｍｙｃ−Ｈｉｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（登録商標））のＮｃｏＩ及びＫｐｎＩ部位間に挿入し、ｐＢＡＤ／Ｍｙｃ−Ｈｉｓ／ＭＢ（Ｓ４ＴＡＧ）を作製した。プラスミドをｐＳｕｐ−ＢｐａＲＳ−６ＴＲＮ（Ｄ２８６Ｒ）と共に大腸菌ＴＯＰ１０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（登録商標））に同時形質転換した。１００ｍｇ／ｍｌカルベニシリン、５０ｍｇ／ｍｌクロラムフェニコール及び１ｍＭ Ｂｐａを加えたＬＢで細胞を３７℃にてインキュベートした。ＯＤ６００＝０．６で０．２％アラビノースの添加により細胞を誘導し、１２時間インキュベートした。細胞を遠心により回収し、ＢｕｇＢｕｓｔｅｒ（登録商標）試薬（Ｎｏｖａｇｅｎ（登録商標））で溶解させた。封入体から得られた蛋白質を変性条件下に製造業者のプロトコールに従ってＴＡＬＯＮ（登録商標）金属アフィニティー樹脂（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ（登録商標））で精製した。精製した蛋白質を限外濾過により濃縮し、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析により分析した。蛋白質濃度をブラッドフォード法により測定した。
ノーザン分析
各抑圧プラスミドで形質転換した大腸菌ＴＯＰ１０細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（登録商標））をＬＢで３７℃にてインキュベートした。ＯＤ６００＝０．８で細胞を回収した。全ｔＲＮＡを従来記載されているようにフェノール抽出とイソプロパノール分画により単離した（Ｄｅｕｔｓｃｈｅｒ ａｎｄ Ｈｉｌｄｅｒｍａｎ，“Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｐａｒｔｉａｌ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ｍｕｔａｎｔｓ ｗｉｔｈ ｌｏｗ ｌｅｖｅｌｓ ｏｆ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ，”Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１１８：６２１−６２７（１９７４））。ＲＮＡサンプルを１５％変性ポリアクリルアミドゲルで分離し、ＧｅｎｅＳｃｒｅｅｎ Ｐｌｕｓ（登録商標）膜（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ（登録商標））に転写した。膜を５５℃で５’−ビオチン−ＣＣＣＴＧＣＴＧＡＡＣＴＡＣＣＧＣＣ−３’（配列番号５８）と共に一晩インキュベートした。Ｎｏｒｔｈ２Ｓｏｕｔｈ化学発光ハイブリダイゼーション／検出キット（Ｐｉｅｒｃｅ）を製造業者のプロトコールに従って使用してハイブリダイズしたビオチン化プローブを検出した。
ＢＰＡ発現のウェスタン分析
Ｃ末端ヘキサヒスチジンタグ付きＢｐａＲＳ遺伝子をＰＣＲにより構築し、ｐＹＲ−ＢｐａＲＳ５とｐＹＲ−ＢｐａＲＳ−ＴＲＮのＮｄｅＩ及びＰｓｔＩ部位間に挿入し、夫々ｐＹＲ−ＢｐａＲＳ５（Ｃ−Ｈｉｓ）とｐＹＲ−ＢｐａＲＳ−ＴＲＮ（Ｃ−Ｈｉｓ）を作製した。各プラスミドで形質転換した大腸菌Ｔｏｐ１０細胞をＬＢで３７℃にてインキュベートした。細胞をＯＤ６００＝１で回収し、Ｂｕｇｂｕｓｔｅｒ試薬で溶解させた。全蛋白を１０％ポリアクリルアミドゲルで分離し、ＰＶＤＦ膜（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に転写した。膜をＡｎｔｉ−Ｈｉｓ（Ｃ末端）抗体−ＨＲＰコンジュゲート（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）とハイブリダイズさせ、化学発光により検出した。
当然のことながら、本明細書に記載する実施例及び態様は例証の目的に過ぎず、これらの記載に鑑みて種々の変形又は変更が当業者に示唆され、このような変形又は変更も本願の精神及び範囲と特許請求の範囲に含むものとする。
以上、明確に理解できるように本発明を多少詳細に記載したが、本発明の真の範囲を逸脱することなく形態や細部に種々の変更が可能であることは以上の開示から当業者に自明である。例えば、上記全技術及び装置は種々に組合せて使用することができる。本明細書に引用した全刊行物、特許、特許出願、及び／又は他の文献は言及によりその開示内容全体を全目的で組込み、各刊行物、特許、特許出願、及び／又は他の文献を言及により全目的で組込むと個々に記載しているものとして扱う。
ｐ−ベンゾイル−Ｌ−フェニルアラニン（Ｂｐａ）、パラ−アセチル−Ｌ−フェニルアラニン（ｐＡｃＰｈｅ）、パラ−アジド−Ｌ−フェニルアラニン（ｐＡｚＰｈｅ）及びパラ−ヨード−Ｌ−フェニルアラニン（ｐＩＰｈｅ）の４種類の非天然アミノ酸の構造と対応する名称を示す。 ＭｊｔＲＮＡ−Ｔｙｒ（ＣＵＡ）遺伝子のｐｒｏＫプロモーター及びターミネーター、ＢｐａＲＳ遺伝子のＤ２８６Ｒ突然変異、ＢｐａＲＳ遺伝子の突然変異形ｇｌｎＳプロモーター、及び／又はｔＲＮＡ遺伝子のマルチコピーを含むプラスミドの（野生型β−ガラクトシダーゼに対する）抑圧効率を示す棒グラフである。誤差線は標準偏差を示し、ｎ＝３である。 指定の抑圧プラスミドから発現させたアンバーサプレッサーＭｊｔＲＮＡ−Ｔｙｒ（ＣＵＡ）のノーザンブロット分析の化学発光画像を示す。 野生型ｇｌｎＳプロモーターと突然変異形ｇｌｎＳプロモーターの制御下で発現させたＢｐａＲＳのウェスタンブロット分析後の化学発光画像を示す。ブロットは抗Ｈｉｓ（Ｃ末端）抗体−ＨＲＰコンジュゲート（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用した。 ｐＳｕｐ−ＢｐａＲＳ−６ＴＲＮのプラスミドマップを示す。他の合成遺伝子をその対応するｐＢＫプラスミドからこのプラスミドのＮｄｅＩ／ＰｓｔＩ部位にサブクローニングした。 Ｂｐａ、ｐＡｃＰｈｅ、ｐＡｚＰｈｅ及びｐＩＰｈｅ組込み用新規システムの抑圧効率を示す。誤差線は標準偏差を示し、ｎ＝３である。。 Ｂｐａの不在下又は存在下で発現させたＳｅｒ−４の代わりにＢｐａを含む突然変異体ミオグロビンのウェスタンブロット後の化学発光画像を示す。ブロットは抗Ｈｉｓ（Ｃ末端）抗体−ＨＲＰコンジュゲート（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用した。 本発明で使用される各種ポリヌクレオチド及びポリペプチド配列を示す。 本発明で使用される各種ポリヌクレオチド及びポリペプチド配列を示す。 本発明で使用される各種ポリヌクレオチド及びポリペプチド配列を示す。 本発明で使用される各種ポリヌクレオチド及びポリペプチド配列を示す。 本発明で使用される各種ポリヌクレオチド及びポリペプチド配列を示す。 本発明で使用される各種ポリヌクレオチド及びポリペプチド配列を示す。

Claims (11)

  1. 核酸構築物を含む組成物であって、前記構築物が、プロモーター及びターミネーターヌクレオチド配列と、発現可能なヌクレオチド配列とを含み、
    ここで、前記プロモーター及びターミネーター配列は、いずれも前記発現可能なヌクレオチド配列と機能的に連結されており、前記発現可能なヌクレオチド配列は前記プロモーター及びターミネーターヌクレオチド配列に対して異種であり、
    前記プロモーター配列は、配列番号３２に記載の大腸菌ｐｒｏＫのプロモーター配列、又は、配列番号３４に記載の大腸菌ｐｒｏＬのプロモーター配列であり、
    前記ターミネーター配列は、配列番号３３に記載の大腸菌ｐｒｏＫのターミネーター配列、配列番号３５に記載の大腸菌ｐｒｏＬのターミネーター配列、又は、配列番号３６に記載の大腸菌ｐｒｏＭのターミネーター配列であり、
    前記構築物が、古細菌ｔＲＮＡを含む、前記組成物。
  2. 前記発現可能なヌクレオチド配列が、複数の１種以上のヌクレオチド配列を含むポリシストロン性オペロンである、請求項１に記載の組成物。
  3. 前記発現可能なヌクレオチド配列が、ｔＲＮＡをコードする、請求項１又は２に記載の組成物。
  4. 請求項１〜３の何れか１項に記載の組成物を含む宿主細胞。
  5. 少なくとも１個の非天然アミノ酸を特定位置に組込んだ該当ポリペプチドの発現用翻訳系であって、前記系が
    （ａ）非天然アミノ酸と；
    （ｂ）直交ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）をコードするヌクレオチド配列と、前記Ｏ−ｔＲＮＡを前記非天然アミノ酸で優先的にアミノアシル化する直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ＲＳ）をコードするヌクレオチド配列を含む核酸構築物と；
    （ｃ）前記該当ポリペプチドをコードし、前記Ｏ−ｔＲＮＡにより認識される少なくとも１個のセレクターコドンを含むポリヌクレオチドであって、ポリヌクレオチドが発現されると、ポリヌクレオチドにおけるセレクターコドンの位置がポリペプチドを生産するようにポリペプチドにおける非天然アミノ酸の特定位置を制御するように構成された前記ポリヌクレオチドとを含み、
    前記核酸構築物が、プロモーター及びターミネーターヌクレオチド配列を含み、ここで、前記プロモーター及びターミネーター配列はいずれも前記Ｏ−ｔＲＮＡを含むか又はコードする前記ヌクレオチド配列と機能的に連結されており、前記Ｏ−ｔＲＮＡは前記プロモーター及びターミネーターヌクレオチド配列に対して異種であり、
    前記プロモーター配列は、配列番号３２に記載の大腸菌ｐｒｏＫのプロモーター配列、又は、配列番号３４に記載の大腸菌ｐｒｏＬのプロモーター配列であり、
    前記ターミネーター配列は、配列番号３３に記載の大腸菌ｐｒｏＫのターミネーター配列、配列番号３５に記載の大腸菌ｐｒｏＬのターミネーター配列、又は、配列番号３６に記載の大腸菌ｐｒｏＭのターミネーター配列であり、
    前記構築物が、古細菌ｔＲＮＡを含む、翻訳系。
  6. 前記発現可能なヌクレオチド配列が、複数の１種以上のヌクレオチド配列を含むポリシストロン性オペロンである、請求項５に記載の翻訳系。
  7. 前記発現可能なヌクレオチド配列が、ｔＲＮＡをコードする、請求項５又は６に記載の翻訳系。
  8. 請求項５〜７の何れか１項に記載の翻訳系を含む宿主細胞。
  9. 少なくとも１個の非天然アミノ酸を特定位置に組込んだ該当ポリペプチドを宿主細胞で作製する方法であって、
    （ａ）（ｉ）非天然アミノ酸と；
    （ii）直交ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）をコードするヌクレオチド配列を含む核酸構築物と；
    （iii）前記Ｏ−ｔＲＮＡを前記非天然アミノ酸で優先的にアミノアシル化する直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ＲＳ）をコードするヌクレオチド配列を含む核酸構築物と；
    （iv）前記該当ポリペプチドをコードし、前記Ｏ−ｔＲＮＡにより認識される少なくとも１個のセレクターコドンを含み、セレクターコドンの位置が該当ポリペプチドにおける非天然アミノ酸の特定位置に相関するポリヌクレオチドと；
    （ｖ）（ｉ）、（ii）、（iii）及び（iv）を含む宿主細胞を準備し、
    （ii）及び（iii）の前記核酸構築物が、大腸菌プロリンｔＲＮＡ遺伝子から誘導されるプロモーター及びターミネーターヌクレオチド配列を含み、ここで、前記プロモーター及びターミネーター配列はいずれも前記Ｏ−ｔＲＮＡをコードする前記ヌクレオチド配列と機能的に連結されており、前記Ｏ−ｔＲＮＡをコードする前記ヌクレオチド配列は前記プロモーター及びターミネーターヌクレオチド配列に対して異種である、段階と；
    （ｂ）前記宿主細胞を増殖させる段階と；
    （ｃ）前記宿主細胞で前記ポリペプチドの翻訳中に前記ポリペプチドの前記特定位置に前記非天然アミノ酸を組込むことにより、前記非天然アミノ酸を特定位置に組込んだ前記該当ポリペプチドを作製する段階を含み、
    ここで、前記プロモーター配列は、配列番号３２に記載の大腸菌ｐｒｏＫのプロモーター配列、又は、配列番号３４に記載の大腸菌ｐｒｏＬのプロモーター配列であり、
    前記ターミネーター配列は、配列番号３３に記載の大腸菌ｐｒｏＫのターミネーター配列、配列番号３５に記載の大腸菌ｐｒｏＬのターミネーター配列、又は、配列番号３６に記載の大腸菌ｐｒｏＭのターミネーター配列であり、
    前記構築物が、古細菌ｔＲＮＡを含む、前記方法。
  10. 前記発現可能なヌクレオチド配列が、複数の１種以上のヌクレオチド配列を含むポリシストロン性オペロンである、請求項９に記載の方法。
  11. 前記発現可能なヌクレオチド配列が、ｔＲＮＡをコードする、請求項９又は１０に記載の方法。
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