JP4444113B2 - ケトアミノ酸の部位特異的蛋白質組込み方法 - Google Patents

ケトアミノ酸の部位特異的蛋白質組込み方法 Download PDF

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Description

（関連出願とのクロスリファレンス）
本願は米国仮特許出願第６０／４１９，２６５号(出願日２００２年１０月１６日)、及び米国仮特許出願第６０／４２０，９９０号(出願日２００２年１０月２３日）の優先権を主張し、その明細書の開示内容全体を本明細書に組込む。
（連邦政府支援研究開発から創出された発明の権利に関する陳述）
本発明は米国国立研究所により交付された助成番号第ＧＭ６２１５９号及びエネルギー省により交付された助成番号第ＤＥ−ＦＧ０３−００ＥＲ４５８１２号として政府助成下に創出された。米国政府は本発明に所定の権利を有する。
（発明の技術分野）
本発明は翻訳生化学の分野に関する。本発明はケトアミノ酸を蛋白質に組込む直交ｔＲＮＡ、直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ及びその対の作製方法と組成物に関する。本発明はこのような対を使用して細胞で蛋白質を生産する方法と関連組成物にも関する。
全公知生物の遺伝コードは蛋白質生合成の構成単位として同一の２０種の標準アミノ酸をコードする。これらのアミノ酸（稀なケースではセレノシステイン（例えば非特許文献１参照）又はピロリジン（例えば非特許文献２；非特許文献３参照）も含む）の側鎖は驚くほど少数の官能基−−窒素塩基、カルボン酸及びアミド、アルコール及びチオール基と、残余の単純なアルカン又は疎水性基からなる。遺伝的にコードされるアミノ酸に新規アミノ酸（例えば金属キレート性、蛍光、レドックス活性、光活性又はスピン標識側鎖をもつアミノ酸）を付加することができるならば、蛋白質及び恐らく生体自体の構造と機能の操作能が著しく広がると考えられる。最近、大腸菌の翻訳機構に新規成分を付加することにより、多数の非天然アミノ酸を高い忠実度で蛋白質に部位特異的にｉｎ ｖｉｖｏ組込むことができたと報告された。例えば非特許文献４；非特許文献５；及び非特許文献６参照。
ケト基は有機化学で遍在性であり、付加反応や脱炭酸反応からアルドール縮合に至る多数の反応に関与している。更に、カルボニル基のユニークな反応性により、他のアミノ酸側鎖の存在下にヒドラジド及びヒドロキシルアミン誘導体で選択的に修飾することができる。例えば非特許文献７；非特許文献８；及び非特許文献９参照。この重要な官能基は補因子（例えば非特許文献１０参照）や代謝産物（例えば非特許文献１１参照）に存在し、更に蛋白質の翻訳後修飾として（例えば非特許文献１２参照）存在するが、標準アミノ酸の側鎖には存在しない。アミノ酸にカルボニル側鎖を付加すると、このアミノ酸を含む蛋白質を付加反応や脱炭酸反応からアルドール縮合に至る多数の反応に関与させることができ、例えばヒドラジド及びヒドロキシルアミン誘導体で選択的に修飾することができる。
ケト基はカルボニル基又は酸性Ｃα位への付加反応に関与することができるため、２０種の標準アミノ酸には存在しないユニークな化学反応性を提供する。この基は多様な化学試薬による蛋白質の選択的修飾で天然アミノ酸システインに代用できる。システインの反応性チオール基は種々の生体物理学的プローブを蛋白質に結合するために広く使用されている。例えば非特許文献１３；非特許文献１４；非特許文献１５；非特許文献１６；非特許文献１７；非特許文献１８；非特許文献１９；及び非特許文献２０参照。しかし、蛋白質には利用可能なシステイン残基が２個以上存在することと、遊離チオールの存在下で形成されるジスルフィドの交換反応により、単一システイン残基の標識は困難なことが多い
。そこで、直交反応性をもつ非蛋白質産生アミノ酸を利用できるならば、単一システインを選択的に標識できない場合や、２種の異なるラベルが必要な場合や、ジスルフィド結合が十分に安定でない場合にも蛋白質の選択的修飾が可能になる。カルボニル基は水溶液中で温和な条件下にヒドラジド、ヒドロキシルアミン、及びセミカルバジドと容易に反応し、夫々生理条件下で安定なヒドラゾン、オキシム、及びセミカルバゾン結合を形成する。例えば非特許文献２１；非特許文献２２参照。
カルボニル基をペプチド及び蛋白質に選択的に組込むために数種の方法が開発されている。まず、Ｎ末端セリン又はスレオニンを過ヨウ素酸塩で酸化することによりペプチドのＮ末端にアルデヒドが導入され、ヒドラゾン結合を介してビオチン及び蛍光レポーターとカップリングされた。例えば非特許文献２３参照。しかし、この方法は蛋白質のＮ末端修飾に限られている。その後、固相ペプチド合成を使用してヒドラジド又はヒドロキシルアミンを含むペプチドセグメントを製造した後に分枝鎖アルデヒドコアマトリックスと反応させてペプチドデンドリマーを形成したり（例えば非特許文献２４；非特許文献２５参照）、ケト含有ペプチドセグメントと反応させて合成蛋白質を形成する方法が実施されている（例えば非特許文献２６参照）。このアプローチは一般に１００残基未満のペプチド又は小蛋白質には適用できるが、大型のペプチド又は蛋白質の合成に伴う問題により制限されている。
ケト基を蛋白質に組込むためにｉｎ ｖｉｔｒｏ生合成法も使用されている。例えばＣｏｒｎｉｓｈ，Ｖ．Ｗ．ら，（１９９６），前出参照。この方法では、ケト基を含む非天然アミノ酸をアンバーサプレッサーｔＲＮＡに化学的にアシル化する。蛋白質生合成を補助することが可能なｉｎ ｖｉｔｒｏ抽出液中でアシル化ｔＲＮＡと突然変異体遺伝子を融合すると、ＵＡＧコドンに応答して非天然アミノ酸が選択的に組込まれる。この方法はサプレッサーｔＲＮＡを非天然アミノ酸で化学的にｉｎ ｖｉｔｒｏアミノアシル化する必要があり、アシル化ｔＲＮＡが翻訳中に化学量論的試薬として消費され、再生できないため、蛋白質収率が低い。
遺伝コードを更に拡張し、例えば細胞中で蛋白質に組込むことが可能なケトアミノ酸により非天然アミノ酸構造のダイバーシティを増すためには、生合成機構の改良及び／又は付加成分を開発することが必要であり、例えばケトアミノ酸を利用することと再生することが可能な直交ｔＲＮＡ、直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ及び／又はユニークコドンを開発することが必要である。本発明は以下の開示から明らかなように、前記及び他の必要を満たすものである。
Ｂｏｃｋ，Ａ．ら，（１９９１）Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５：５１５−５２０ Ｓｒｉｎｉｖａｓａｎ，Ｇ．ら，（２００２）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９６：１４５９−１４６２ Ｈａｏ，Ｂ．ら，（２００２）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９６：１４６２−１４６６ Ｗａｎｇ，Ｌ．ら，（２００１）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９２：４９８−５００ Ｗａｎｇ，Ｌ．ら，（２００２）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２４：１８３６−１８３７ Ｚｈａｎｇ，Ｚ．ら，（２００２）Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．４１：２８４０−２８４２ Ｃｏｒｎｉｓｈ，Ｖ．Ｗ．ら，（１９９６）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１８：８１５０−８１５１ Ｇｅｏｇｈｅｇａｎ，Ｋ．Ｆ．＆ Ｓｔｒｏｈ，Ｊ．Ｇ．（１９９２）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．Ｃｈｅｍ．３：１３８−１４６ Ｍａｈａｌ，Ｌ．Ｋ．ら，（１９９７）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７６：１１２５−１１２８ Ｂｅｇｌｅｙ，Ｔ．Ｐ．ら，（１９９７）ｉｎ Ｔｏｐ．Ｃｕｒｒ．Ｃｈｅｍ．，ｅｄｓ．Ｌｅｅｐｅｒ，Ｆ．Ｊ．＆ Ｖｅｄｅｒａｓ，Ｊ．Ｃ．（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ），Ｖｏｌ．１９５，ｐｐ．９３−１４２ Ｄｉａｚ，Ｅ．ら，（２００１）Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．６５：５２３−５６９ Ｏｋｅｌｅｙ，Ｎ．Ｍ．＆ ｖａｎ ｄｅｒ Ｄｏｎｋ，Ｗ．Ａ．（２０００）Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．７，Ｒ１５９−Ｒ１７１ Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｔ．Ｅ．（１９８６）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１３１：８３−１０６ Ａｌｔｅｎｂａｃｈ，Ｃ．ら，（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４８：１０８８−９２ Ｂｒｉｎｋｌｅｙ，Ｍ．（１９９２）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．Ｃｈｅｍ．３：２−１３ Ｇｉｕｌｉａｎｏ，Ｋ．Ａ．ら，（１９９５）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｂｉｏｍｏｌ．Ｓｔｒｕｃｔ．２４：４０５−３４ Ｍａｎｎｕｚｚｕ，Ｌ．Ｍ．ら，（１９９６）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７１：２１３−６ Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ｂ．ら，（１９９８）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８１：２６９−２７２ Ｌｌｏｐｉｓ，Ｊ．ら，（２０００）ＭｅｔｈｏｄｓＥｎｚｙｍｏｌ．３２７：５４６−６４ Ｇａｉｅｔｔａ，Ｇ．ら，（２００２）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９６：５０３−７ Ｊｅｎｃｋｓ，Ｗ．Ｐ．（１９５９）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．８１，４７５−４８１ Ｓｈａｏ，Ｊ．＆ Ｔａｍ，Ｊ．Ｐ．（１９９５）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１７：３８９３−３８９９ Ｇｅｏｇｈｅｇａｎ，Ｋ．Ｆ．＆ Ｓｔｒｏｈ，Ｊ．Ｇ．（１９９２）Ｂｉｏｃｏｎｉｕｇ．Ｃｈｅｍ．３：１３８−１４６ Ｓｈａｏ，Ｊ．＆ Ｔａｍ，Ｊ．Ｐ．（１９９５）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１７：３８９３−３８９９ Ｒｏｓｅ，Ｋ．（１９９４）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１６：３０−３３ Ｃａｎｎｅ，Ｌ．Ｅ．ら，（１９９５）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１７：２９９８−３００７
本発明は例えば終止コドン、ナンセンスコドン、４塩基以上のコドン等のセレクターコドンに応答して成長中のポリペプチド鎖にケトアミノ酸を例えばｉｎ ｖｉｖｏで組込むための直交成分の組成物と作製方法を提供する。例えば、本発明はケトアミノ酸を成長中のポリペプチド鎖に組込むために使用することができる直交ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）、直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ＲＳ）及びその対を提供する。
一般に、本発明の直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ＲＳ）は配列番号１８のアミノ酸配列を含むポリペプチドの効率の少なくとも例えば約４５％、５０％、６０％
、７５％、８０％、又は９０％以上の効率でＯ−ｔＲＮＡをケトアミノ酸で優先的にアミノアシル化する。所定態様では、Ｏ−ＲＳは配列番号１８〜２０のいずれか１種又はその保存変異体を含むアミノ酸配列を含む。
Ｏ−ＲＳを含む組成物は場合により更に直交ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）を含むことができ、Ｏ−ｔＲＮＡはセレクターコドンを認識する。所定態様では、Ｏ−ｔＲＮＡは配列番号２１のポリヌクレオチド配列を含むか又はこれによりコードされる。Ｏ−ＲＳを含む組成物は場合により細胞（例えば大腸菌細胞等の非真核細胞、又は真核細胞）、及び／又は翻訳系を含むことができる。
本発明は翻訳系を含む細胞（例えば非真核細胞、又は真核細胞）も提供し、翻訳系は直交ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）と；直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ＲＳ）と；ケトアミノ酸を含む。一般に、Ｏ−ＲＳは配列番号１８のアミノ酸配列を含むポリペプチドの効率の少なくとも例えば約４５％、５０％、６０％、７５％、８０％、又は９０％以上の効率でＯ−ｔＲＮＡを第１のケトアミノ酸で優先的にアミノアシル化する。Ｏ−ｔＲＮＡは第１のセレクターコドンを認識し、Ｏ−ＲＳはＯ−ｔＲＮＡをケトアミノ酸，例えばｐ−アセチル−Ｌ−フェニルアラニンで優先的にアミノアシル化する。所定態様では、Ｏ−ｔＲＮＡは配列番号２１に記載のポリヌクレオチド配列又はその相補的ポリヌクレオチド配列を含むか又はこれによりコードされる。所定態様では、Ｏ−ＲＳは配列番号１８〜２０のいずれか１種に記載のアミノ酸配列又はその保存変異体を含む。場合により、本発明の細胞は該当ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む核酸を含み、ポリヌクレオチドはＯ−ｔＲＮＡにより認識されるセレクターコドンを含む。
本発明の細胞は場合により直交ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）、直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ＲＳ）、ケトアミノ酸、及び該当ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む核酸を含む大腸菌細胞を含み、ポリヌクレオチドはＯ−ｔＲＮＡにより認識されるセレクターコドンを含む。一般に、Ｏ−ＲＳは配列番号１８のアミノ酸配列を含むポリペプチドの効率の少なくとも例えば約４５％、５０％、６０％、７５％、８０％、又は９０％以上の効率でＯ−ｔＲＮＡをケトアミノ酸で優先的にアミノアシル化する。
本発明の所定態様では、本発明のＯ−ｔＲＮＡは配列番号２１に記載のポリヌクレオチド配列又はその相補的ポリヌクレオチド配列を含むか又はこれによりコードされる。本発明の所定態様では、Ｏ−ＲＳは配列番号１８〜２０に記載のアミノ酸配列又はその保存変異体を含む。
本発明のＯ−ｔＲＮＡ及び／又はＯ−ＲＳは種々の生物（例えば真核及び／又は非真核生物）の任意のものに由来することができる。所定態様では、Ｏ−ＲＳ及びＯ−ｔＲＮＡはＭｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ ｊａｎｎａｓｃｈｉｉに由来する。
ポリペプチドとポリヌクレオチドも本発明の特徴である。本発明のポリペプチドは配列番号１８〜２０に記載のアミノ酸、及び又はその保存変異体を含む人工（例えば人為的に作製した非天然）ポリペプチドを含む。本発明のポリヌクレオチドは配列番号１８〜２０に記載のアミノ酸を含むポリペプチドをコードする人工ポリヌクレオチドを含む。
本発明のポリヌクレオチドを含むベクターも本発明の特徴である。例えば、本発明のベクターはプラスミド、コスミド、ファージ、ウイルス、発現ベクター及び／又は同等物を含むことができる。本発明のベクターを含む細胞も本発明の特徴である。
特定位置にケトアミノ酸を組込んだ蛋白質を細胞（例えば大腸菌細胞等の非真核細胞、又は真核細胞）で生産する方法も本発明の特徴である。例えば、方法は少なくとも１個の
セレクターコドンを含み且つ蛋白質をコードする核酸を導入した細胞を適当な培地で増殖させる段階と、ケトアミノ酸を提供する段階と、少なくとも１個のセレクターコドンによる核酸の翻訳中に蛋白質の特定位置にケトアミノ酸を組込むことにより、蛋白質を生産する段階を含む。細胞は更に、細胞で機能し、セレクターコドンを認識する直交ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）と；配列番号１８のアミノ酸配列を含むポリペプチドの効率の少なくとも例えば約４５％、５０％、６０％、７５％、８０％、又は９０％以上の効率でＯ−ｔＲＮＡをケトアミノ酸（例えばｐ−アセチル−Ｌ−フェニルアラニン）で優先的にアミノアシル化する直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ＲＳ）を含む。所定態様では、Ｏ−ＲＳは配列番号１８〜２０のいずれか１種を含むアミノ酸配列を含む。所定態様では、Ｏ−ｔＲＮＡは配列番号２１に記載のポリヌクレオチド配列又はその相補的ポリヌクレオチド配列を含むか又はこれによりコードされる。
〔定義〕
本発明を詳細に記載する前に、本発明は特定生物系に限定されず、当然のことながら種々のものに適用できると理解すべきである。同様に、本明細書で使用する用語は特定態様のみの説明を目的とし、限定的でないことも理解すべきである。本明細書と特許請求の範囲で使用する単数形はそうでないことが内容から明白である場合を除き、複数形も含む。従って、例えば「細胞」と言う場合には２個以上の表面の組合せを含み、「細菌」と言う場合には細菌混合物を含み、他の用語についても同様である。
本欄及び本明細書の他の欄で定義しない限り、本明細書で使用する全科学技術用語は本発明が属する分野の当業者に通常理解されている通りの意味である。
直交：本明細書で使用する「直交」なる用語は細胞又は他の翻訳系に内在する対応する分子に比較して低効率で細胞の内在成分と共に機能するか、又は細胞の内在成分と共に機能することができない分子（例えば直交ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）及び／又は直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ＲＳ））を意味する。ｔＲＮＡ及びアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼに関して直交とは、内在ｔＲＮＡが内在ｔＲＮＡシンテターゼと共に機能する場合に比較して直交ｔＲＮＡが内在ｔＲＮＡシンテターゼと共に機能できないか又は低効率でしか機能できず、あるいは、内在ｔＲＮＡシンテターゼが内在ｔＲＮＡと共に機能する場合に比較して直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼが内在ｔＲＮＡと共に機能できないか又は低効率でしか機能できず、例えば２０％未満、１０％未満、５％未満、又は１％未満の効率でしか機能できないことを意味する。直交分子は細胞中に機能的内在相補的分子をもたない。例えば、該当翻訳系における直交ｔＲＮＡが該当翻訳系の任意内在ＲＳによりアミノアシル化される効率は内在ｔＲＮＡが内在ＲＳによりアミノアシル化される効率に比較して低いか又はゼロである。別の例では、直交ＲＳが該当翻訳系における任意内在ｔＲＮＡをアミノアシル化する効率は内在ＲＳが内在ｔＲＮＡをアミノアシル化する効率に比較して低いか又はゼロである。
コグネイト：「コグネイト」なる用語は共同機能する成分、例えば直交ｔＲＮＡと直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼを意味する。これらの成分は相補的と言うこともできる。
優先的にアミノアシル化する：「優先的にアミノアシル化する」なる用語はＯ−ＲＳが天然ｔＲＮＡ又はＯ−ｔＲＮＡを作製するために使用する出発材料をアミノアシル化する場合に比較してＯ−ＲＳがＯ−ｔＲＮＡをケトアミノ酸でアミノアシル化する効率が例えば約７０％、約７５％、約８５％、約９０％、約９５％、又は約９９％以上であることを意味する。
セレクターコドン：「セレクターコドン」なる用語は翻訳プロセスでＯ−ｔＲＮＡによ
り認識されるが、一般に内在ｔＲＮＡにより認識されないコドンを意味する。Ｏ−ｔＲＮＡアンチコドンループはｍＲＮＡ上のセレクターコドンを認識し、そのアミノ酸（例えばケトアミノ酸等の非天然アミノ酸）をポリペプチドのこの部位に組込む。セレクターコドンとしては例えばナンセンスコドン（例えばアンバー、オーカー及びオパールコドン等の終止コドン）、４塩基以上のコドン、天然又は非天然塩基対から誘導されるコドン及び／又は同等物を挙げることができる。
サプレッサーｔＲＮＡ：サプレッサーｔＲＮＡは例えばセレクターコドンに応答してポリペプチド鎖にアミノ酸を組込むためのメカニズムを提供することにより、所与翻訳系でメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の読取りを改変するｔＲＮＡである。例えば、サプレッサーｔＲＮＡは例えば終止コドン、４塩基コドン、レアコドン、及び／又は同等物を読み飛ばすことができる。
抑圧活性：「抑圧活性」なる用語はｔＲＮＡ（例えばサプレッサーｔＲＮＡ）がセレクターコドンを読み飛ばす能力を意味する。
翻訳系：「翻訳系」なる用語は成長中のポリペプチド鎖（蛋白質）に天然アミノ酸を組込むために必要な成分を意味する。翻訳系の成分としては例えばリボソーム、ｔＲＮＡ、シンテターゼ、ｍＲＮＡ等を挙げることができる。本発明の成分はｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｉｎ ｖｉｖｏ翻訳系（例えば非真核細胞（例えば細菌（例えば大腸菌）、始原菌）、又は真核細胞（例えば酵母細胞、哺乳動物細胞、植物細胞、藻類細胞、真菌細胞、昆虫細胞、及び／又は同等物））に加えることができる。
非天然アミノ酸：本明細書で使用する「非天然アミノ酸」なる用語は２０種の標準天然アミノ酸の１種又はセレノシステイン又はピロリジン以外の任意アミノ酸、修飾アミノ酸、及び／又はアミノ酸類似体（例えばケトアミノ酸）を意味する。
に由来：本明細書で使用する「に由来」なる用語は特定分子又は生物から単離されているか又はその情報を使用して作製されている成分を意味する。
ポジティブ選択又はスクリーニングマーカー：本明細書で使用する「ポジティブ選択又はスクリーニングマーカー」なる用語は、このマーカーが存在する（例えば発現、活性化等される）結果として、この形質をもたない細胞からこの形質をもつ細胞（例えばポジティブ選択マーカーをもつ細胞）を識別するマーカーを意味する。
ネガティブ選択又はスクリーニングマーカー：本明細書で使用する「ネガティブ選択マーカー」なる用語はこのマーカーが存在する（例えば発現、活性化等される）結果として、（例えば特性又は形質をもつ細胞から）特性又は形質をもたない細胞を識別できるマーカーを意味する。
レポーター：本明細書で使用する「レポーター」なる用語は該当システムのターゲット成分を選択するために使用することができる成分を意味する。例えば、レポーターとしては蛋白質、例えば抗生物質耐性又は感受性を付与する酵素（例えばβ−ラクタマーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）等）、蛍光スクリーニングマーカー（例えば緑色蛍光蛋白質（例えばＧＦＰ）、ＹＦＰ、ＥＧＦＰ、ＲＦＰ等）、ルミネッセントマーカー（例えばホタルルシフェラーゼ蛋白質）、アフィニティースクリーニングマーカー、又はポジティブもしくはネガティブ選択マーカー遺伝子（例えばｌａｃＺ、β−ｇａｌ／ｌａｃＺ（βガラクトシダーゼ）、Ａｄｈ（アルコールデヒドロゲナーゼ）、ｈｉｓ３、ｕｒａ３、ｌｅｕ２、ｌｙｓ２等）を挙げることができる。
真核生物：本明細書で使用する「真核生物」なる用語は系統発生分類の真核生物に属する生物を意味し、例えば動物（例えば哺乳動物、昆虫、爬虫類、鳥類等）、繊毛虫、植物（例えば単子葉植物、双子葉植物、藻類等）、真菌類、酵母、鞭毛虫、微胞子虫、原生生物等が挙げられる。
非真核生物：本明細書で使用する「非真核生物」なる用語は真核生物以外の生物を意味する。例えば、非真核生物は系統発生分類の真正細菌（例えばＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ，Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ，Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ等）、又は系統発生分類の始原菌（例えばＭｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ（Ｍｊ），Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ ｍａｚｅｉ（Ｍｍ），Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍ（Ｍｔ），Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ ｍａｒｉｐａｌｕｄｉｓ，Ｍｅｔｈａｎｏｐｙｒｕｓ ｋａｎｄｌｅｒｉ，Ｈａｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ（例えばＨａｌｏｆｅｒａｘ ｖｏｌｃａｎｉｉ及びＨａｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ種ＮＲＣ−１）、Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ ｆｕｌｇｉｄｕｓ（Ａｆ），Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｕｓ（Ｐｆ），Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉ（Ｐｈ），Ｐｙｒｏｂａｃｕｌｕｍ
ａｅｒｏｐｈｉｌｕｍ，Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ａｂｙｓｓｉ，Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ
ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓ（Ｓｓ），Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ ｔｏｋｏｄａｉｉ，Ａｅｕｒｏｐｙｒｕｍ ｐｅｒｎｉｘ（Ａｐ），Ｔｈｅｒｍｏｐｌａｓｍ ａａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ，Ｔｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａ ｖｏｌｃａｎｉｕｍ等）に属するものが挙げられる。
保存変異体：「保存変異体」なる用語は翻訳成分を意味し、例えば保存変異体の元の成分（例えばＯ−ｔＲＮＡ又はＯ−ＲＳ）と同様に機能するが、配列に変異をもつ保存変異体Ｏ−ｔＲＮＡ又は保存変異体Ｏ−ＲＳが挙げられる。例えば、Ｏ−ＲＳは相補的Ｏ−ｔＲＮＡ又は保存変異体Ｏ−ｔＲＮＡを非天然アミノ酸（例えばケトアミノ酸）でアミノアシル化するが、Ｏ−ｔＲＮＡと保存変異体Ｏ−ｔＲＮＡは同一配列をもたない。保存変異体は保存変異体が対応するＯ−ｔＲＮＡ又はＯ−ＲＳに相補的である限り、例えば配列の１カ所、２カ所、３カ所、４カ所、又は５カ所以上に変異をもつことができる。
選択又はスクリーニング物質：本明細書で使用する「選択又はスクリーニング物質」なる用語はこのような物質が存在すると、集団から所定成分を選択／スクリーニングすることができる物質を意味する。例えば、選択又はスクリーニング物質としては限定されないが、栄養素、抗生物質、光波長、抗体、発現ポリヌクレオチド等が挙げられる。選択物質は例えば濃度、強度等を変動させることができる。
に応答して：Ｏ−ｔＲＮＡ及びＯ−ＲＳ成分による翻訳に関して本明細書で使用する「に応答して」なる用語は本発明のｔＲＮＡがセレクターコドンを認識し、ｔＲＮＡと結合したケトアミノ酸を成長中のポリペプチド鎖に組込むのを媒介するプロセスを意味する。
〔図面の簡単な説明〕
図１は各種発現条件下で蓄積されたＺドメインのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。左側のレーンは分子量マーカーである。
図２は（Ａ）はｐ−アセチル−Ｌ−フェニルアラニンを含む無傷の突然変異体蛋白質Ｚドメインの高分解能ＦＴ−ＩＣＲ質量スペクトルを示す。蛋白質の各種電荷状態に対応する一連のピークを観察することができる。各系列で、８＋電荷状態について示すように最初のメチオニンをもたない蛋白質、そのアセチル化形態、及び無傷の蛋白質に対応する３個のピークが存在する。挿入図は７＋同位体クラスターに由来するＺドメイン蛋白質の分子ピークの拡大図である。（Ｂ）はＮＨ２末端ペプチドＭＴＳＶＤＮＹ＊ＩＮＫのタンテ
ム質量スペクトルを示す。ｐ−アセチル−Ｌ−フェニルアラニン（Ｙ＊）を含むペプチドの部分配列ＴＳＶＤＮＹ＊ＩＮは注釈付きｂ又はｙイオン系列から割り当てることができる。
図３は（Ａ）、（Ｂ）、及び（Ｃ）はｐ−アセチル−Ｌ−フェニルアラニンを含む突然変異体Ｚドメインのフルオレセインヒドラジド１によるｉｎ ｖｉｔｒｏ標識を示す。（Ａ）はフルオレセインヒドラジド１によるｐ−アセチル−Ｌ−フェニルアラニンの標識反応を示す。（Ｂ）はフルオレセインヒドラジド１で標識した野生型（ｗｔ）及び突然変異体Ｚドメインの銀染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（上部）分析と蛍光イメージング（下部）を示す。（Ｃ）はフルオレセインヒドラジド１で標識したｗｔ及び突然変異体Ｚドメインの蛍光スペクトルを示す。
図４は（Ａ）及び（Ｂ）はｐ−アセチル−Ｌ−フェニルアラニンを含む突然変異体Ｚドメインのビオチンヒドラジド２によるｉｎ ｖｉｔｒｏ標識を示す。（Ａ）は使用したビオチンヒドラジド誘導体６−（（６（（ビオチニル）アミノ）ヘキサノイル）アミノ）ヘキサン酸ヒドラジド（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）の構造を示す。（Ｂ）はビオチンヒドラジド２により標識したｗｔ及び突然変異体Ｚドメインのウェスタンブロッティング分析を示す。
図５は（Ａ）及び（Ｂ）は選択及びスクリーニング用アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼプラスミドシステムを示す。（Ａ）はプラスミドｐＲＥＰ／ＹＣ−ＪＹＣＵＡを示す。増幅可能な蛍光レポーターをＦＡＣＳスクリーニングに使用し、アンバー終止コドン（黒部分）が抑圧されると、その遺伝子をａｒａプロモーター（ＰＢＡＤ）の制御下においたＴ７ ＲＮＡポリメラーゼが生産され、ＧＦＰｕｖ遺伝子の発現を誘導する。クロラムフェニコールレポーター（Ｃｍｒ）をポジティブ選択に使用し、アンバー終止コドン（黒部分）が抑圧されるとクロラムフェニコール細菌耐性を付与する。プラスミドｐＲＥＰ／ＹＣ−ＪＹＣＵＡはＭ．ｊａｎｎａｓｃｈｉｉに由来する直交アンバーサプレッサーｔＲＮＡＴｙｒをコードするＭｊＹｔＲＮＡＣＵＡ遺伝子と、ｐ１５Ａ複製起点と、テトラサイクリン選択マーカー（Ｔｅｔｒ）を含む。（Ｂ）は構成的に発現されるＭ．ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ由来チロシルｔＲＮＡシンテターゼ遺伝子（ＭｊＹＲＳ）と、カナマイシン選択マーカー（Ｋｎｒ）と、ＣｏｌＥ１複製起点を含むプラスミドｐＢＫ−ＪＹＲＳを示す。ｐＢＫライブラリープラスミドは図示する制限部位を使用して実施例４に要約するように構築される。
図６はポジティブ選択とネガティブＦＡＣＳスクリーニングを使用したアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼの進化方法の１例を示す。蛍光及び非蛍光細胞を夫々十字丸と白丸で示す。「ＵＡＡ」は非天然アミノ酸を表す。
図７はＭｊＹＲＳ変異体のＦＡＣＳネガティブスクリーニングを示す。ＧＦＰｕｖを殆ど又は全く産生しない細胞に対応するイベントを四角で囲む。これらの細胞は非天然アミノ酸の不在下に増殖し、大腸菌内で天然アミノ酸の基質として利用できないＭｊＹＲＳ変異体を含む。
図８は非天然アミノ酸基質のみを受用するＭｊＹＲＳ変異体を含む細胞の長波長紫外線照射を示す。非天然アミノ酸の存在下（＋）又は不在下（−）に細胞を増殖させた。
カルボニル基は有機化学で最も万能な官能基であるが、遺伝的にコードされるアミノ酸には存在しない。蛋白質生合成のこの自然の制約を解決するためには、アンバーナンセンスコドンに応答して高い翻訳忠実度でケトアミノ酸を大腸菌で蛋白質にｉｎ ｖｉｖｏ組
込むことができる直交ｔＲＮＡ−シンテターゼ対が必要である。このアミノ酸の１つの利点は例えば小分子フルオロフォア、ビオチン誘導体等の種々の分子の任意１種で蛋白質を選択的にｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｉｎ ｖｉｖｏ修飾できる点である。この遺伝的にコードされる新規アミノ酸はｉｎ ｖｉｔｒｏ及び生きた細胞の両者で蛋白質構造及び機能の操作能を拡張する。
ケトアミノ酸等の付加的合成アミノ酸を遺伝コードにｉｎ ｖｉｖｏ付加するためには、翻訳機構で効率的に機能することができるが、宿主細胞に内在性のシンテターゼとｔＲＮＡから独立して機能するという意味で「直交性」のアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼとｔＲＮＡの新規直交対が必要である。対の所望特性としては、内在ｔＲＮＡによりデコードされない特定新規コドン（例えばセレクターコドン）のみをデコード又は認識するｔＲＮＡと、そのｔＲＮＡを特定ケトアミノ酸のみで優先的にアミノアシル化（又は負荷）するアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼが挙げられる。Ｏ−ｔＲＮＡは一般に内在シンテターゼでもアミノアシル化されない。例えば大腸菌では、直交対は例えば大腸菌に存在する４０種の内在ｔＲＮＡのいずれとも交差反応しないアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼと、例えば大腸菌に存在する２１種の内在シンテターゼのいずれでもアミノアシル化されない直交ｔＲＮＡを含む。
本発明は付加的直交ｔＲＮＡ−アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ対、例えばケトアミノ酸を組込むために使用することができるＯ−ｔＲＮＡ／Ｏ−ＲＳ対の組成物とその同定及び作製方法を提供する。本発明のＯ−ｔＲＮＡはＯ−ｔＲＮＡにより例えばｉｎ ｖｉｖｏ認識されるセレクターコドンを含むポリヌクレオチドによりコードされる蛋白質へのケトアミノ酸の組込みを媒介することが可能である。Ｏ−ｔＲＮＡのアンチコドンループはｍＲＮＡ上でセレクターコドンを認識し、そのアミノ酸（例えばケトアミノ酸）をポリペプチドのこの部位に組込む。本発明の直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼはそのＯ−ｔＲＮＡを特定ケトアミノ酸のみで優先的にアミノアシル化（又は負荷）する。
〔直交ｔＲＮＡ／直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼとその対〕
１種以上の非天然アミノ酸（例えばケトアミノ酸）を含む蛋白質の生産に適した翻訳系は国際特許出願第ＷＯ２００２／０８６０７５号、発明の名称「直交ｔＲＮＡ−アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ対を作製するための方法及び組成物（ＭＥＴＨＯＤＳ ＡＮＤ
ＣＯＭＰＯＳＩＴＩＯＮ ＦＯＲ ＴＨＥ ＰＲＯＤＵＣＴＩＯＮ ＯＦ ＯＲＴＨＯＧＯＮＡＬ ｔＲＮＡ−ＡＭＩＮＯＡＣＹＬ ｔＲＮＡ ＳＹＮＴＨＥＴＡＳＥ ＰＡＩＲＳ）」及びＷＯ２００２／０８５９２３号、発明の名称「非天然アミノ酸のインビボ組込み（ＩＮＣＯＲＰＯＲＡＴＩＯＮ ＯＦ ＵＮＮＡＴＵＲＡＬ ＡＭＩＮＯ ＡＣＩＤＳ）」に記載されている。同出願はその開示内容全体を参考資料として本明細書に組込む。このような翻訳系は一般に直交ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）と、直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ＲＳ）と、ケトアミノ酸を含む細胞（例えば非真核細胞又は真核細胞）を含み、直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ＲＳ）は配列番号１８のアミノ酸配列を含むポリペプチドの効率の少なくとも例えば約４５％、５０％、６０％、７５％、８０％、又は９０％以上の効率でＯ−ｔＲＮＡをケトアミノ酸で優先的にアミノアシル化する。本発明の直交対はＯ−ｔＲＮＡ（例えばサプレッサーｔＲＮＡ、フレームシフトｔＲＮＡ等）とＯ−ＲＳを含む。個々の成分も本発明で提供される。
Ｏ−ＲＳは配列番号１８のアミノ酸配列を含むポリペプチドの効率の少なくとも例えば約４５％、５０％、６０％、７５％、８０％、又は９０％以上の効率でＯ−ｔＲＮＡをケトアミノ酸でアミノアシル化する。細胞は例えば該当ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む核酸を介して成長中のポリペプチド鎖にケトアミノ酸を組込むためにこれらの成分を使用し、ポリヌクレオチドはＯ−ｔＲＮＡにより認識されるセレクターコドンを含む。本発明の所定態様では、細胞は直交ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）と、直交アミノア
シルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ＲＳ）と、ケトアミノ酸と、該当ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む核酸を含む大腸菌細胞を含み、ポリヌクレオチドはＯ−ｔＲＮＡにより認識されるセレクターコドンを含み、Ｏ−ＲＳは配列番号１８のアミノ酸配列を含むポリペプチドの効率の少なくとも例えば約４５％、５０％、６０％、７５％、８０％、又は９０％以上の効率でＯ−ｔＲＮＡをケトアミノ酸で優先的にアミノアシル化する。翻訳系はｉｎ ｖｉｔｒｏ系でもよい。
Ｏ−ｔＲＮＡ及び／又はＯ−ＲＳは天然に存在するものでもよいし、例えば種々の生物からｔＲＮＡライブラリー及び／又はＲＳライブラリーを作製する天然ｔＲＮＡ及び／又はＲＳの突然変異により誘導してもよい。例えば、直交ｔＲＮＡ／アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ対を作製する１ストラテジーは例えば宿主細胞以外の起源又は多重起源に由来する（宿主に対して）異種ｔＲＮＡ／シンテターゼ対を宿主細胞に導入する。異種シンテターゼ候補の特性としては、例えば宿主細胞ｔＲＮＡに負荷しないことが挙げられ、異種ｔＲＮＡ候補の特性としては、例えば宿主細胞シンテターゼによりアミノアシル化されないことが挙げられる。更に、異種ｔＲＮＡは全宿主細胞シンテターゼに対して直交性であり、即ち宿主細胞シンテターゼは異種ｔＲＮＡをアミノアシル化しない。
直交対を作製するための第２のストラテジーはＯ−ｔＲＮＡ又はＯ−ＲＳをスクリーニング及び／又は選択するための突然変異体ライブラリーを作製する方法である。これらのストラテジーを組み合わせてもよい。
〔直交ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）〕
本発明の直交ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）はＯ−ｔＲＮＡにより例えばｉｎ ｖｉｖｏ又はｉｎ ｖｉｔｒｏ認識されるセレクターコドンを含むポリヌクレオチドによりコードされる蛋白質へのケトアミノ酸の組込みを媒介する。
本発明のＯ−ｔＲＮＡの１例は配列番号２１である。代表的Ｏ−ｔＲＮＡ及びＯ−ＲＳ分子の配列については本明細書の表２と実施例３参照。本明細書の「核酸及びポリペプチド配列と変異体」のセクションも参照。ｔＲＮＡ分子では、チミン（Ｔ）はウラシル（Ｕ）に置換される。塩基に付加修飾を加えてもよい。本発明はＯ−ｔＲＮＡの保存変異体も含む。例えば、Ｏ−ｔＲＮＡの保存変異体としては、配列番号２１のＯ−ｔＲＮＡと同様に機能し、ｔＲＮＡ Ｌ−形構造を維持するが、同一配列ではない（と共に野生型ｔＲＮＡ分子でもない）分子が挙げられる。本明細書の「核酸及びポリペプチド配列と変異体」のセクションも参照。
直交ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）の作製方法も本発明の特徴である。本方法により作製されたＯ−ｔＲＮＡも本発明の特徴である。本発明の所定態様では、Ｏ−ｔＲＮＡは突然変異体ライブラリーを作製することにより作製することができる。突然変異体ｔＲＮＡのライブラリーは当分野で公知の種々の突然変異誘発技術を使用して作製することができる。例えば、突然変異体ｔＲＮＡは部位特異的突然変異、ランダム点突然変異、相同組換え、ＤＮＡシャフリング又は他の再帰的突然変異誘発法、キメラ構築又はその任意組み合わせにより作製することができる。
ｔＲＮＡの所望ループ又は領域（例えばアンチコドンループ、アクセプターステム、Ｄアーム又はループ、可変ループ、ＴΨＣアーム又はループ、ｔＲＮＡ分子の他の領域又はその組合せ）の特定位置（例えば非保存位置又は保存位置）、ランダム位置又は両者の組合せに付加突然変異を導入することができる。一般に、ｔＲＮＡの突然変異としてはセレクターコドンの認識を可能にするような突然変異体ｔＲＮＡのライブラリーの各メンバーのアンチコドンループの突然変異が挙げられる。この方法は更にＯ−ｔＲＮＡの３’末端への付加配列（ＣＣＡ）の付加を含むことができる。一般に、Ｏ−ｔＲＮＡは所望ＲＳに
対するその親和性を維持しながら、出発材料（例えば複数のｔＲＮＡ配列）に比較して所望生物に対する直交性が改善されている。
一般に、Ｏ−ｔＲＮＡは第１の種の細胞集団を例えばネガティブ選択することにより得られ、細胞は複数の潜在的Ｏ−ｔＲＮＡのメンバーを含む。ネガティブ選択は細胞に内在性のアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（ＲＳ）によりアミノアシル化される潜在的Ｏ−ｔＲＮＡライブラリーのメンバーを含む細胞を排除する。こうして、第１の種の細胞に直交性のｔＲＮＡプールが得られる。
所定態様において、ネガティブ選択では、ネガティブ選択マーカー、例えば抗生物質耐性を付与する酵素（例えばβ−ラクタマーゼ）、検出可能な産物を付与する酵素（例えばβ−ガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ））、例えば毒性物質（例えばバルナーゼ）をコードするポリヌクレオチドの非必須位置（例えば機能的バルナーゼを依然として産生する位置）等にセレクターコドンを導入する。スクリーニング／選択は場合により選択物質（例えばアンピシリン等の抗生物質）の存在下に細胞集団を増殖させることにより実施される。１態様では、選択物質の濃度を変動させる。
例えば、サプレッサーｔＲＮＡの活性を測定するためには、セレクターコドンのｉｎ ｖｉｖｏ抑圧（例えばネガティブ選択マーカー（例えばβ−ラクタマーゼ遺伝子（ｂｌａ））をコードするポリヌクレオチドに導入されたナンセンス又はフレームシフト突然変異）に基づく選択システムを使用する。例えば、ポリヌクレオチド変異体（例えば所定位置にセレクターコドンを含むｂｌａ変異体）を構築する。細胞（例えば細菌）をこれらのポリヌクレオチドで形質転換する。内在大腸菌シンテターゼにより効率的に負荷することができない直交ｔＲＮＡの場合には、抗生物質耐性（例えばアンピシリン耐性）はプラスミドで形質転換されていない細菌と同等以下のはずである。ｔＲＮＡが非直交性の場合、又はｔＲＮＡに負荷することが可能な異種シンテターゼをシステムで同時発現させる場合には、より高レベルの抗生物質（例えばアンピシリン）耐性が観察される。プラスミドで形質転換されていない細胞と同等の抗生物質濃度のＬＢ寒天プレートで増殖することができない細胞（例えば細菌）を選択する。
毒性物質（例えばリボヌクレアーゼバルナーゼ）の場合には、複数の潜在的ｔＲＮＡのメンバーが内在宿主（例えば大腸菌シンテターゼ）によりアミノアシル化されるとき（即ち、宿主、例えば大腸菌シンテターゼに非直交のとき）には、セレクターコドンは抑圧され、産生される毒性ポリヌクレオチド産物は細胞死を生じる。直交ｔＲＮＡ又は非機能的ｔＲＮＡを含む細胞は生存する。
１態様では、所望生物に直交性のｔＲＮＡプールを次にポジティブ選択し、セレクターコドンを例えばβ−ラクタマーゼ遺伝子等の薬剤耐性遺伝子によりコードされるポジティブ選択マーカーに配置する。ポジティブ選択は細胞に直交性のｔＲＮＡプールのメンバーをコードするか又は含むポリヌクレオチドと、ポジティブ選択マーカーをコードするポリヌクレオチドと、コグネイトＲＳをコードするポリヌクレオチドを含む細胞で実施される。所定態様では、第２の細胞集団はネガティブ選択により排除されなかった細胞を含む。ポリヌクレオチドを細胞で発現させ、選択物質（例えばアンピシリン）の存在下に細胞を増殖させる。次に、同時発現させたコグネイトシンテターゼによりアミノアシル化され、このセレクターコドンに応答してアミノ酸を挿入することができるｔＲＮＡを選択する。一般に、これらの細胞は非機能的ｔＲＮＡ、又は該当シンテターゼにより効率的に認識することができないｔＲＮＡをもつ細胞に比較して高い抑圧効率を示す。非機能的ｔＲＮＡ、又は該当シンテターゼにより効率的に認識されないｔＲＮＡを含む細胞は抗生物質に感受性である。従って、（ｉ）内在宿主（例えば大腸菌）シンテターゼの基質ではなく；（ｉｉ）該当シンテターゼによりアミノアシル化することができ；（ｉｉｉ）翻訳で機能的
なｔＲＮＡは両者選択後に生存している。
上記方法における選択（例えばポジティブ選択、ネガティブ選択又はポジティブ選択とネガティブ選択の両者）のストリンジェンシーは場合により選択ストリンジェンシーの変動を含む。例えば、バルナーゼは極毒性蛋白質であるので、異なる数のセレクターコドンをバルナーゼ遺伝子に導入するか及び／又は誘導プロモーターを使用することによりネガティブ選択のストリンジェンシーを制御することができる。別の例では、選択又はスクリーニング物質（例えばアンピシリン）の濃度を変動させる。本発明の１側面では、初期回に所望活性を低くできるのでストリンジェンシーを変動させる。即ち、初期回には低ストリンジェンシー選択基準を適用し、後期回の選択では高ストリンジェンシー基準を適用する。所定態様では、ネガティブ選択、ポジティブ選択又はポジティブ選択とネガティブ選択の両者を複数回反復する。複数の異なるネガティブ選択マーカー、ポジティブ選択マーカー又はポジティブ選択とネガティブ選択の両者のマーカーを使用することができる。所定態様では、ポジティブ選択マーカーとネガティブ選択マーカーを同一とすることができる。
本発明ではケトアミノ酸を利用する直交翻訳成分（例えばＯ−ｔＲＮＡ、Ｏ−ＲＳ、及びＯ−ｔＲＮＡ／Ｏ−ＲＳ対）を作製するために他の型の選択／スクリーニングも使用することができる。例えば、ネガティブ選択マーカー、ポジティブ選択マーカー又はポジティブ選択とネガティブ選択の両者のマーカーとしては、適切な反応体の存在下で蛍光発光するか又は発光反応を触媒するマーカーが挙げられる。別の態様では、蛍光活性化細胞ソーティング（ＦＡＣＳ）又は発光によりマーカーの産物を検出する。本明細書の実施例４参照。場合により、マーカーはアフィニティースクリーニングマーカーを含む。Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，Ｊ．Ａ．ら，（１９９３）Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｃｅｌｌ ｓｏｒｔｉｎｇ ｏｆ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ ａ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｆｒａｇｍｅｎｔ ｏｎ ｔｈｅ ｅｘｔｅｒｎａｌ ｓｕｒｆａｃｅ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ ＳＡ．９０：１０４４４−８参照。
更に組換え直交ｔＲＮＡの作製方法も例えば国際特許出願第ＷＯ２００２／０８６０７５号，前出に記載されている。Ｆｏｒｓｔｅｒら，（２００３）Ｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ
ｐｅｐｔｉｄｏｍｉｍｅｔｉｃ ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅｓ ｂｙ ｔｒａｎｓｌａｔｉｎｇ ｇｅｎｅｔｉｃ ｃｏｄｅｓ ｄｅｓｉｇｎｅｄ ｄｅ ｎｏｖｏ ＰＮＡＳ １００（１１）：６３５３−６３５７；及びＦｅｎｇら，（２００３），Ｅｘｐａｎｄｉｎｇ ｔＲＮＡ ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｔＲＮＡ ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ ｂｙ ａ ｓｉｎｇｌｅ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｃｈａｎｇｅ，ＰＮＡＳ １００（１０）：５６７６−５６８１も参照。
〔直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ＲＳ）〕
本発明のＯ−ＲＳはＯ−ｔＲＮＡをケトアミノ酸で優先的にｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｉｎ
ｖｉｖｏアミノアシル化する。一般に、本発明のＯ−ＲＳは配列番号１８のアミノ酸配列を含むポリペプチドの効率の少なくとも例えば約４５％、５０％、６０％、７５％、８０％、又は９０％以上の効率でＯ−ｔＲＮＡをケトアミノ酸で優先的にアミノアシル化する。Ｏ−ＲＳを含む組成物は更に直交ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）を含み、Ｏ−ｔＲＮＡはセレクターコドンを認識し、ケトアミノ酸の組込みを媒介する。所定態様では、Ｏ−ＲＳを含む組成物は更に翻訳系（例えばｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｉｎ ｖｉｖｏ）を含むことができる。本発明のＯ−ＲＳはＯ−ＲＳを含むポリペプチド及び／又はＯ−ＲＳ又はその一部をコードするポリヌクレオチドにより翻訳系（例えば細胞）に提供することができる。例えば、Ｏ−ｔＲＮＡをケトアミノ酸でアミノアシル化するＯ−ＲＳは配列番号１８〜２０のいずれか１種に記載のアミノ酸配列又はその保存変異体を含む。別の例では、Ｏ−Ｒ
Ｓ、又はその一部は配列番号１８〜２０のいずれか１種を含むアミノ酸をコードするポリヌクレオチド配列又はその相補的ポリヌクレオチド配列によりコードされる。他の非天然アミノ酸の付加成分としては例えば配列番号１〜１７のポリヌクレオチド配列によりコードされるＯ−ＲＳ又はその一部が挙げられる。例えば代表的Ｏ−ＲＳ分子の配列については本明細書の表２と実施例３参照。本明細書の「核酸及びポリペプチド配列と変異体」のセクションも参照。
Ｏ−ｔＲＮＡにより認識されるセレクターコドンを含む該当ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む核酸、又はこれらの１種以上の組み合わせも細胞に加えることができる。本明細書の「直交ｔＲＮＡ」のセクションも参照。
Ｏ−ｔＲＮＡと併用するための直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ＲＳ）、例えばＯ−ＲＳの同定方法も本発明の特徴である。Ｏ−ＲＳは所望非天然アミノ酸（例えばケトアミノ酸）のみにＯ−ｔＲＮＡを負荷し、２０種の標準アミノ酸には負荷しないようにシンテターゼの基質特異性を改変するように操作することができる。非天然アミノ酸に基質特異性をもつ直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼの作製方法はシンテターゼを例えばシンテターゼの活性部位、シンテターゼの編集メカニズム部位、各種シンテターゼドメインを組み合わせることにより各種部位等で突然変異させる段階と、選択プロセスを適用する段階を含む。ポジティブ選択後にネガティブ選択を行う併用ストラテジーを使用する。ポジティブ選択では、ポジティブマーカーの非必須位置に導入したセレクターコドンが抑圧されると、細胞はポジティブ選択圧下で生存する。従って、天然及び非天然アミノ酸両者の存在下で生存細胞は直交サプレッサーｔＲＮＡに天然又は非天然アミノ酸を負荷する活性シンテターゼをコードする。ネガティブ選択では、ネガティブマーカーの非必須位置に導入したセレクターコドンが抑圧されると、天然アミノ酸特異性をもつシンテターゼは除去される。ネガティブ選択とポジティブ選択の生存細胞は直交サプレッサーｔＲＮＡを非天然アミノ酸のみでアミノアシル化（負荷）するシンテターゼをコードする。その後、これらのシンテターゼを例えばＤＮＡシャフリング又は他の再帰的突然変異誘発法により更に突然変異誘発することができる。
突然変異体Ｏ−ＲＳのライブラリーは当分野で公知の種々の突然変異誘発技術を使用して作製することができる。例えば、突然変異体ＲＳは部位特異的突然変異、ランダム点突然変異、相同組換え、ＤＮＡシャフリング又は他の再帰的突然変異誘発法、キメラ構築又はその任意組み合わせにより作製することができる。例えば、突然変異体ＲＳのライブラリーは２種以上の他の例えばサイズとダイバーシティーの小さい「サブライブラリー」から作製することができる。ＲＳのキメラライブラリーも本発明に含まれる。なお、場合により各種生物（例えば真正細菌又は始原細菌等の微生物）に由来するｔＲＮＡシンテターゼのライブラリー（例えば天然ダイバーシティーを含むライブラリー）（例えば米国特許第６，２３８，８８４号（Ｓｈｏｒｔら）；米国特許第５，７５６，３１６号（Ｓｃｈａｌｌｅｎｂｅｒｇｅｒら）；米国特許第５，７８３，４３１号（Ｐｅｔｅｒｓｅｎら）；米国特許第５，８２４，４８５号（Ｔｈｏｍｐｓｏｎら）；米国特許第５，９５８，６７２号（Ｓｈｏｒｔら）参照）を構築し、直交対についてスクリーニングしてもよい。
シンテターゼにポジティブ及びネガティブ選択／スクリーニングストラテジーを実施した後、これらのシンテターゼを更に突然変異誘発させることができる。例えば、Ｏ−ＲＳをコードする核酸を単離することができ；（例えばランダム突然変異誘発、部位特異的突然変異誘発、組換え又はその任意組み合わせにより）突然変異Ｏ−ＲＳをコードする１組のポリヌクレオチドを核酸から作製することができ；Ｏ−ｔＲＮＡを非天然アミノ酸（例えばケトアミノ酸）で優先的にアミノアシル化する突然変異Ｏ−ＲＳが得られるまでこれらの個々の段階又はこれらの段階の組み合わせを繰り返すことができる。本発明の１側面では、段階を複数回、例えば少なくとも２回実施する。
本発明の方法では、Ｏ−ｔＲＮＡ、Ｏ−ＲＳ、又はその対を作製するために付加レベルの選択／スクリーニングストリンジェンシーを使用することもできる。選択又はスクリーニングストリンジェンシーはＯ−ＲＳを作製するための方法の一方又は両方の段階で変動させることができる。これは例えば選択／スクリーニング物質の使用量等の変動とすることができる。付加回のポジティブ及び／又はネガティブ選択を実施することもできる。選択又はスクリーニングは更にアミノ酸浸透率の変化、翻訳効率の変化、翻訳忠実度の変化等の１種以上を含むこともできる。一般に、１種以上の変化は蛋白質を生産するために直交ｔＲＮＡ−ｔＲＮＡシンテターゼ対を使用する生物で１個以上の遺伝子の突然変異に基づく。
Ｏ−ＲＳの作製、シンテターゼの基質特異性の改変、Ｏ−ＲＳの他の例に関するその他の詳細についてはＷＯ２００２／０８６０７５，前出参照。ＦＡＣＳシステムによるＯ−ＲＳの改変基質特異性の選択／スクリーニングについては本明細書の実施例４参照。
〔資源及び宿主生物〕
本発明の翻訳成分は一般に非真核生物に由来する。例えば、直交Ｏ−ｔＲＮＡは非真核生物（又は生物組み合わせ）、例えばＭｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ、Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍ、Ｈａｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ（例えばＨａｌｏｆｅｒａｘ ｖｏｌｃａｎｉｉ及びＨａｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ種ＮＲＣ−１）、Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ ｆｕｌｇｉｄｕｓ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｕｓ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉ、Ａｅｕｒｏｐｙｒｕｍ ｐｅｒｎｉｘ、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ ｍａｒｉｐａｌｕｄｉｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｐｙｒｕｓ ｋａｎｄｌｅｒｉ、Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ ｍａｚｅｉ（Ｍｍ）、Ｐｙｒｏｂａｃｕｌｕｍ ａｅｒｏｐｈｉｌｕｍ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ａｂｙｓｓｉ、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓ（Ｓｓ）、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ ｔｏｋｏｄａｉｉ、Ｔｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ、Ｔｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａ ｖｏｌｃａｎｉｕｍ等の始原菌や、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ，Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ，Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｐｈｉｌｕｓ等の真正細菌に由来することができ、直交Ｏ−ＲＳは非真核生物（又は生物組み合わせ）、例えばＭｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ、Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍ、Ｈａｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ（例えばＨａｌｏｆｅｒａｘ ｖｏｌｃａｎｉｉ及びＨａｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ種ＮＲＣ−１）、Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ ｆｕｌｇｉｄｕｓ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｕｓ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉ、Ａｅｕｒｏｐｙｒｕｍ ｐｅｒｎｉｘ、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ
ｍａｒｉｐａｌｕｄｉｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｐｙｒｕｓ ｋａｎｄｌｅｒｉ、Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ ｍａｚｅｉ、Ｐｙｒｏｂａｃｕｌｕｍ ａｅｒｏｐｈｉｌｕｍ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ａｂｙｓｓｉ、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓ、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ ｔｏｋｏｄａｉｉ、Ｔｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ、Ｔｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａ ｖｏｌｃａｎｉｕｍ等の始原菌や、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ，Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ，Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｐｈｉｌｕｓ等の真正細菌に由来することができる。１態様では、例えば植物、藻類、原生動物、真菌類、酵母、動物（例えば哺乳動物、昆虫、節足動物等）等の真核資源もＯ−ｔＲＮＡｓ及び／又はＯ−ＲＳ資源として使用することができる。
Ｏ−ｔＲＮＡ／Ｏ−ＲＳ対の個々の成分は同一生物に由来するものでも異なる生物に由来するものでもよい。１態様では、Ｏ−ｔＲＮＡ／Ｏ−ＲＳ対は同一生物に由来する。あるいは、Ｏ−ｔＲＮＡ／Ｏ−ＲＳ対のＯ−ｔＲＮＡとＯ−ＲＳは異なる生物に由来する。
Ｏ−ｔＲＮＡ、Ｏ−ＲＳ又はＯ−ｔＲＮＡ／Ｏ−ＲＳ対はｉｎ ｖｉｖｏ又はｉｎ ｖｉｔｒｏ選択又はスクリーニングすることができ、及び／又はケトアミノ酸を組込んだポリペプチドを生産するために細胞（例えば非真核細胞、又は真核細胞）で使用することができる。非真核細胞は種々の資源に由来することができ、例えばＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ
ｃｏｌｉ、Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｐｈｉｌｕｓ等の真正細菌や、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ、Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍ、Ｈａｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ（例えばＨａｌｏｆｅｒａｘ ｖｏｌｃａｎｉｉ及びＨａｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ種ＮＲＣ−１）、Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ ｆｕｌｇｉｄｕｓ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｕｓ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉ、Ａｅｕｒｏｐｙｒｕｍ ｐｅｒｎｉｘ、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ ｍａｒｉｐａｌｕｄｉｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｐｙｒｕｓ ｋａｎｄｌｅｒｉ、Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ ｍａｚｅｉ（Ｍｍ）、Ｐｙｒｏｂａｃｕｌｕｍ ａｅｒｏｐｈｉｌｕｍ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ａｂｙｓｓｉ、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓ（Ｓｓ）、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ ｔｏｋｏｄａｉｉ、Ｔｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ、Ｔｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａ ｖｏｌｃａｎｉｕｍ等の始原菌が挙げられる。真核細胞は種々の資源に由来することができ、例えば植物（例えば単子葉植物、又は双子葉植物等の複雑な植物）、藻類、原生生物、真菌、酵母（例えばＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、動物（例えば哺乳動物、昆虫、節足動物等）等が挙げられる。本発明の翻訳成分を導入した細胞の組成物も本発明の特徴である。
〔セレクターコドン〕
本発明のセレクターコドンはケトアミノ酸を組込むように蛋白質生合成機構の遺伝コドン枠を拡張する。例えば、セレクターコドンとしては例えばユニーク３塩基コドン、ナンセンスコドン、（例えばアンバーコドン（ＵＡＧ）又はオパールコドン（ＵＧＡ）等の終止コドン）、非天然コドン、少なくとも４塩基のコドン、レアコドン等が挙げられる。例えば１個以上、２個以上、３個以上等の多数のセレクターコドンを所望遺伝子に導入することができる。複数の異なるセレクターコドンを使用することにより、これらの異なるセレクターコドンを使用して複数の非天然アミノ酸（例えばケトアミノ酸と他の非天然アミノ酸）を同時に組込むことが可能な複数の直交ｔＲＮＡ／シンテターゼを使用することができる。
１態様では、本発明の方法はケトアミノ酸のｉｎ ｖｉｖｏ細胞組込みに終止コドンであるセレクターコドンを使用する。例えば、終止コドンを認識するＯ−ｔＲＮＡを作製し、Ｏ−ＲＳによりケトアミノ酸でアミノアシル化する。このＯ−ｔＲＮＡは天然宿主のアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼにより認識されない。慣用部位特異的突然変異誘発を使用して該当ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの該当部位に終止コドンを導入することができる。例えばＳａｙｅｒｓ，Ｊ．Ｒ．ら（１９８８）５’，３’Ｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ ｉｎ ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ−ｂａｓｅｄ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ，７９１−８０２参照。Ｏ−ＲＳ、Ｏ−ｔＲＮＡ及び該当ポリペプチドをコードする核酸を例えばｉｎ ｖｉｖｏ融合すると、終止コドンに応答してケトアミノ酸が組込まれ、特定位置にケトアミノ酸を含む蛋白質が得られる。本発明の１態様では、セレクターコドンとして使用される終止コドンはアンバーコドンＵＡＧ、及び／又はオパールコドンＵＧＡである。１例では、ＵＡＧとＵＧＡの両者をセレクターコドンとして使用する遺伝コードは例えば大腸菌に最も多量に存在する天然終結シグナルであるオーカーナンセンスコードＵＡＡを維持しながら、２２種のアミノ酸をコードすることができる。
ケトアミノ酸のｉｎ ｖｉｖｏ組込みは宿主細胞をさほど変化させずに行うことができ
る。例えば大腸菌等の非真核細胞では、ＵＡＧコドンの抑圧効率はＯ−ｔＲＮＡ（例えばアンバーサプレッサーｔＲＮＡ）と（ＵＡＧコドンに結合してリボソームから増殖中のペプチドの放出を開始する）放出因子１（ＲＦ１）の競合に依存するので、例えばＯ−ｔＲＮＡ（例えばサプレッサーｔＲＮＡ）の発現レベルを増加するか又はＲＦ１欠損株を使用することにより抑圧効率を調節することができる。真核細胞では、ＵＡＧコドンの抑圧効率はＯ−ｔＲＮＡ（例えばアンバーサプレッサーｔＲＮＡ）と（終止コドンと結合してリボソームから増殖中のペプチドの放出を開始する）真核放出因子１（例えばｅＲＦ）の競合に依存するので、例えばＯ−ｔＲＮＡ（例えばサプレッサーｔＲＮＡ）の発現レベルを増加することにより抑圧効率を調節することができる。
ケトアミノ酸はレアコドンでコードすることもできる。例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏ蛋白質合成反応でアルギニン濃度を下げると、レアアルギニンコドンＡＧＧはアラニンでアシル化された合成ｔＲＮＡによるＡｌａの挿入に有効であることが分かっている。例えばＭａら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３２：７９３９（１９９３）参照。この場合には、合成ｔＲＮＡは大腸菌に少量種として存在する天然ｔＲＮＡＡｒｇと競合する。更に、生物によっては全三重項コドンを使用しないものもある。Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ ｌｕｔｅｕｓで割り当てられないコドンＡＧＡがｉｎ ｖｉｔｒｏ転写／翻訳抽出物へのアミノ酸挿入に使用されている。例えばＫｏｗａｌ ａｎｄ Ｏｌｉｖｅｒ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ．Ｒｅｓ．，２５：４６８５（１９９７）参照。本発明の成分はこれらのレアコドンをｉｎ ｖｉｖｏ使用するために作製することができる。
セレクターコドンは更に拡張コドン（例えば４塩基以上のコドン、例えば４、５、６、又は７塩基以上のコドン）も含む。４塩基コドンの例としては例えばＡＧＧＡ、ＣＵＡＧ、ＵＡＧＡ、ＣＣＣＵ等が挙げられる。５塩基コドンの例としては例えばＡＧＧＡＣ、ＣＣＣＣＵ、ＣＣＣＵＣ、ＣＵＡＧＡ、ＣＵＡＣＵ、ＵＡＧＧＣ等が挙げられる。本発明の方法はフレームシフト抑圧に基づく拡張コドンの使用を含む。４塩基以上のコドンは例えば１又は複数の非天然アミノ酸（例えばケトアミノ酸）を同一蛋白質に挿入することができる。他の態様では、アンチコドンループは例えば少なくとも４塩基コドン、少なくとも５塩基コドン、又は少なくとも６塩基コドン又はそれ以上をデコードすることができる。４塩基コドンは２５６種が考えられるので、４塩基以上のコドンを使用すると同一細胞で多重非天然アミノ酸をコードすることができる。Ａｎｄｅｒｓｏｎら，（２００２）Ｅｘｐｌｏｒｉｎｇ ｔｈｅ Ｌｉｍｉｔｓ ｏｆ Ｃｏｄｏｎ ａｎｄ Ａｎｔｉｃｏｄｏｎ Ｓｉｚｅ，Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｙ，９：２３７−２４４；及びＭａｇｌｉｅｒｙ，（２００１）Ｅｘｐａｎｄｉｎｇ ｔｈｅ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｃｏｄｅ：Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ Ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒｓ ｏｆ
Ｆｏｕｒ−ｂａｓｅ Ｃｏｄｏｎｓ ａｎｄ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ“Ｓｈｉｆｔｙ”Ｆｏｕｒ−ｂａｓｅ Ｃｏｄｏｎｓ ｗｉｔｈ ａ Ｌｉｂｒａｒｙ Ａｐｐｒｏａｃｈ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３０７：７５５−７６９参照。
例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏ生合成法を使用して非天然アミノ酸を蛋白質に組込むために４塩基コドンが使用されている。例えばＭａら，（１９９３）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３２：７９３９；及びＨｏｈｓａｋａら，（１９９９）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．．１２１：３４参照。２個の化学的にアシル化したフレームシフトサプレッサーｔＲＮＡで２−ナフチルアラニンとリジンのＮＢＤ誘導体をストレプトアビジンに同時にｉｎ ｖｉｔｒｏ組込むためにＣＧＧＧとＡＧＧＵが使用されている。例えばＨｏｈｓａｋａら，（１９９９）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１２１：１２１９４参照。ｉｎ ｖｉｖｏ試験では、ＭｏｏｒｅらはＮＣＵＡアンチコドンをもつｔＲＮＡＬｅｕ誘導体がＵＡＧＮコドン（ＮはＵ、Ａ、Ｇ又はＣであり得る）を抑圧する能力を試験し、四重項ＵＡＧＡはＵＣＵＡアンチコドンをもつｔＲＮＡＬｅｕにより１３〜２６％の効率でデコードすることができるが、０又は−１フレームでは殆どデコードできないことを見出した。Ｍｏｏｒ
ｅら，（２０００）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２９８：１９５参照。１態様では、レアコドン又はナンセンスコドンに基づく拡張コドンを本発明で使用し、他の望ましくない部位でのミスセンス読み飛ばしとフレームシフト抑圧を減らすことができる。
所与系で、内在系が該当天然３塩基コドンを使用しない（又は殆ど使用しない）場合にセレクターコドンは更に天然３塩基コドンの１種を含むことができる。例えば、このような系としては例えば天然３塩基コドンを認識するｔＲＮＡをもたない系、及び／又は３塩基コドンがレアコドンである系が挙げられる。
セレクターコドンは場合により非天然塩基対を含む。これらの非天然塩基対は更に既存遺伝アルファベットを拡張する。塩基対が１個増えると、三重項コドン数は６４から１２５に増す。第３の塩基対の性質としては安定的且つ選択的な塩基対合、高い忠実度でポリメラーゼによるＤＮＡへの効率的な酵素組込み、及び発生期の非天然塩基対の合成後の効率的な持続的プライマー伸長が挙げられる。方法と組成物に適応可能な非天然塩基対については、例えばＨｉｒａｏら，（２００２）Ａｎ ｕｎｎａｔｕｒａｌ ｂａｓｅ ｐａｉｒ ｆｏｒ ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｎｇ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ａｎａｌｏｇｕｅｓ ｉｎｔｏ ｐｒｏｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０：１７７−１８２参照。Ｗｕ，Ｙ．ら，（２００２）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２４：１４６２６−１４６３０も参照。他の関連文献は以下に挙げる。
ｉｎ ｖｉｖｏ使用では、非天然ヌクレオシドは膜透過性であり、リン酸化され、対応する三リン酸塩を形成する。更に、増加した遺伝情報は安定しており、細胞酵素により破壊されない。Ｂｅｎｎｅｒらによる従来の報告ではカノニカルワトソンクリック対とは異なる水素結合パターンを利用しており、そのうちで最も注目される例はイソＣ：イソＧ対である。例えばＳｗｉｔｚｅｒら，（１９８９）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１１１：８３２２；及びＰｉｃｃｉｒｉｌｌｉら，（１９９０）Ｎａｔｕｒｅ，３４３：３３；Ｋｏｏｌ，（２０００）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．．４：６０２参照。これらの塩基は一般に天然塩基とある程度まで誤対合し、酵素複製することができない。Ｋｏｏｌらは水素結合を塩基間の疎水性パッキング相互作用に置き換えることにより塩基対の形成を誘導できることを立証した。Ｋｏｏｌ，（２０００）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．，４：６０２；及びＧｕｃｋｉａｎ ａｎｄ Ｋｏｏｌ，（１９９８）Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．，３６，２８２５参照。上記全要件を満足する非天然塩基対を開発しようとして、Ｓｃｈｕｌｔｚ，Ｒｏｍｅｒｂｅｒｇらは一連の非天然疎水性塩基を体系的に合成し、試験した。ＰＩＣＳ：ＰＩＣＳ自己対は天然塩基対よりも安定であり、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩのＫｌｅｎｏｗフラグメント（ＫＦ）によりＤＮＡに効率的に組込むことができる。例えばＭｃＭｉｎｎら，（１９９９）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１２１：１１５８６；及びＯｇａｗａら，（２０００）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１２２：３２７４参照。生物機能に十分な効率と選択性でＫＦにより３ＭＮ：３ＭＮ自己対を合成することができる。例えばＯｇａｗａら，（２０００）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１２２：８８０３参照。しかし、どちらの塩基も後期複製用チェーンターミネーターとして機能するに止まっている。ＰＩＣＳ自己対を複製するために使用できる突然変異体ＤＮＡポリメラーゼが最近開発された。更に、７ＡＩ自己対も複製することができる。例えばＴａｅら，（２００１）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１２３：７４３９参照。Ｃｕ（ＩＩ）と結合すると安定な対を形成する新規メタロ塩基対Ｄｉｐｉｃ：Ｐｙも開発された。Ｍｅｇｇｅｒｓら，（２０００）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．．１２２：１０７１４参照。拡張コドンと非天然コドンは天然コドンに本質的に直交性であるので、本発明の方法はその直交ｔＲＮＡを作製するためにこの性質を利用することができる。
翻訳バイパス系を使用してケトアミノ酸を所望ポリペプチドに組込むこともできる。１
翻訳バイパス系では、大きい配列を遺伝子に挿入するが、蛋白質に翻訳しない。この配列はリボソームに配列を飛び越させて挿入の下流の翻訳を再開するための合図として機能する構造を含む。
〔非天然アミノ酸〕
本明細書で使用する非天然アミノ酸とはセレノシステイン及び／又はピロリジンと２０種の遺伝的にコードされる以下のαアミノ酸、即ちアラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、スレオニン、トリプトフアン、チロシン、バリン以外の任意アミノ酸、修飾アミノ酸又はアミノ酸類似体を意味する。αアミノ酸の一般構造は式Ｉ：

により表される。
非天然アミノ酸は一般に式Ｉをもつ任意構造であり、式中、Ｒ基は２０種の天然アミノ酸で使用されている以外の任意置換基である。２０種の天然アミノ酸の構造については、例えばＬ．Ｓｔｒｙｅｒ著Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，第３版，１９８８，Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋを参照されたい。なお、本発明の非天然アミノ酸は上記２０種のαアミノ酸以外の天然化合物でもよい。
本発明の非天然アミノ酸は場合により側鎖が天然アミノ酸と異なるので、天然蛋白質で形成されると同様に他のアミノ酸（例えば天然又は非天然アミノ酸）とアミド結合を形成する。他方、非天然アミノ酸は天然アミノ酸と異なる側鎖基をもつ。
非天然アミノ酸を蛋白質に組込むには、ケトアミノ酸を組込むことができることが特に重要である。ケト基はカルボニル基又は酸性Ｃα位への付加反応に関与することができるため、２０種の標準アミノ酸には存在しないユニークな化学反応性を提供する。カルボニル基は水溶液中で温和な条件下に例えばヒドラジド、ヒドロキシルアミン、セミカルバジドと容易に反応し、夫々生理条件下で安定な例えばヒドラゾン、オキシム、及びセミカルバゾン結合を形成する。例えばＪｅｎｃｋｓ，Ｗ．Ｐ．（１９５９）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．８１，４７５−４８１；Ｓｈａｏ，Ｊ．＆ Ｔａｍ，Ｊ．Ｐ．（１９９５）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１７：３８９３−３８９９参照。ケトアミノ酸を介して蛋白質は多様な他のヒドラジド又はヒドロキシルアミン誘導体（糖類、蛍光ラベル、ビオチン誘導体、スピンラベル、金属キレート剤、架橋剤、ポリエーテル、脂肪酸、毒素等）で選択的に標識することができる。例えば、参考資料として本明細書に組込む２００３年１０月１５日付け出願、発明の名称「糖蛋白質合成（Ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）」（代理人整理番号５４Ａ−０００６１０ＵＳ）における例えばケトアミノ酸を介する糖誘導体の付加参照。
付加的な他の非天然アミノ酸については、例えば式Ｉ中のＲは場合によりアルキル、アリール、アシル、ケト、アジド、ヒドロキシル、ヒドラジン、シアノ、ハロ、ヒドラジド、アルケニル、アルキニル、エーテル、チオール、セレノ、スルホニル、硼酸、ボロン酸、ホスホ、ホスホノ、ホスフィン、複素環、エノン、イミン、アルデヒド、エステル、チオ酸、ヒドロキシルアミン、アミノ基等又はその任意組合せを含む。本発明のグルタミン類似体としては限定されないが、α−ヒドロキシ誘導体、γ置換誘導体、環状誘導体、アミド置換グルタミン誘導体が挙げられる。他の該当非天然アミノ酸としては限定されない
が、光架橋基を含むアミノ酸、スピン標識アミノ酸、蛍光アミノ酸、金属結合性アミノ酸、金属含有アミノ酸、放射性アミノ酸、新規官能基をもつアミノ酸、他の分子と共有又は非共有的に相互作用するアミノ酸、フォトケージド及び／又は光異性化可能なアミノ酸、ビオチン又はビオチン類似体含有アミノ酸、グリコシル化アミノ酸、ポリエチレングリコール又はポリエーテルを含むアミノ酸、重原子置換アミノ酸、化学分解性又は光分解性アミノ酸、天然アミノ酸に比較して延長側鎖（例えばポリエーテル又は例えば約５もしくは約１０炭素長を上回る長鎖炭化水素）をもつアミノ酸、炭素結合糖含有アミノ酸、アミノチオ酸含有アミノ酸、及び１個以上の毒性部分を含むアミノ酸が挙げられる。
新規側鎖を含む非天然アミノ酸に加え、非天然アミノ酸は更に場合により例えば式ＩＩ及びＩＩＩ：

の構造により表されるような修飾主鎖構造を含み、式中、Ｚは一般にＯＨ、ＮＨ２、ＳＨ、ＮＨ−Ｒ’又はＳ−Ｒ’を含み、ＸとＹは同一でも異なっていてもよく、一般にＳ又はＯであり、ＲとＲ’は場合により同一又は異なり、一般に式Ｉをもつ非天然アミノ酸について上記に記載したＲ基と同一の基及び水素から選択される。例えば、本発明の非天然アミノ酸は場合により式ＩＩ及びＩＩにより表されるようにアミノ又はカルボキシル基に置換を含む。この種の非天然アミノ酸としては限定されないが、例えば２０種の標準天然アミノ酸に対応する側鎖又は非天然側鎖をもつα−ヒドロキシ酸、α−チオ酸、α−アミノチオカルボキシレートが挙げられる。更に、α−炭素の置換は場合によりＬ、Ｄ又はα，α−ジ置換アミノ酸（例えばＤ−グルタミン酸、Ｄ−アラニン、Ｄ−メチル−Ｏ−チロシン、アミノ酪酸等）を含む。他の代替構造としては環状アミノ酸（例えばプロリン類似体や、３、４、６、７、８及び９員環プロリン類似体）、β及びγアミノ酸（例えば置換β−アラニン及びγ−アミノ酪酸）が挙げられる。
本発明の所定態様では、ケトアミノ酸はチロシン又はフェニルアラニンアミノ酸の誘導体である。多数の非天然アミノ酸（例えばケトアミノ酸）は天然アミノ酸（例えばチロシン、フェニルアラニン等）をベースとする。チロシン類似体としてはパラ置換チロシン、オルト置換チロシン、及びメタ置換チロシンが挙げられ、置換チロシンはケト基（例えばアセチル基）、ベンゾイル基、アミノ基、ヒドラジン、ヒドロキシルアミン、チオール基、カルボキシ基、イソプロピル基、メチル基、Ｃ６−Ｃ２０直鎖又は分枝鎖炭化水素、飽和又は不飽和炭化水素、Ｏ−メチル基、ポリエーテル基、ニトロ基等を含む。更に、多重置換アリール環も考えられる。フェニルアラニン類似体の例としては限定されないが、パラ置換フェニルアラニン、オルト置換フェニルアラニン、及びメタ置換フェニルアラニンが挙げられ、置換基はケト基、ヒドロキシ基、メトキシ基、メチル基、アリル基、アルデヒド基等を含む。非天然アミノ酸の具体例としては限定されないが、ｐ−アセチル−Ｌ−フェニルアラニン、ｍ−アセチル−フェニルアラニン、ｐ−アシル−Ｌ−フェニルアラニン、Ｏ−メチル−Ｌ−チロシン、Ｌ−３−（２−ナフチル）アラニン、３−メチル−フェニルアラニン、Ｏ−４−アリル−Ｌ−チロシン、４−プロピル−Ｌ−チロシン、トリ−Ｏ−アセチル−ＧｌｃＮＡｃβ−セリン、Ｌ−Ｄｏｐａ、フッ素化フェニルアラニン、イソプロピル−Ｌ−フェニルアラニン、ｐ−アジド−Ｌ−フェニルアラニン、ｐ−ベンゾイル
−Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−ホスホセリン、ホスホノセリン、ホスホノチロシン、ｐ−ヨードフェニルアラニン、ｐ−ブロモフェニルアラニン、ｐ−アミノ−Ｌ−フェニルアラニン、及びイソプロピル−Ｌ−フェニルアラニン等が挙げられる。各種非天然アミノ酸の構造は例えば本明細書の図１や、ＷＯ２００２／０８５９２３，前出の図１６、１７、１８、１９、２６、及び２９に示される。
〔非天然アミノ酸の化学的合成〕
上記非天然アミノ酸の多くは例えばＳｉｇｍａ（米国）やＡｌｄｒｉｃｈ（Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，ＷＩ，米国）から市販されている。市販されていないものは場合により各種刊行物に記載されている方法や当業者に公知の標準方法を使用して合成される。有機合成技術については例えばＦｅｓｓｅｎｄｏｎとＦｅｓｓｅｎｄｏｎ著Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（１９８２，第２版，Ｗｉｌｌａｒｄ Ｇｒａｎｔ Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｓｔｏｎ Ｍａｓｓ．）；Ｍａｒｃｈ著Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（第３版，１９８５，Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）；及びＣａｒｅｙとＳｕｎｄｂｅｒｇ著Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（第３版，Ｐａｒｔｓ Ａ ａｎｄ Ｂ，１９９０，Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ
Ｙｏｒｋ）を参照されたい。非天然アミノ酸の合成について記載しているその他の刊行物としては例えばＷＯ２００２／０８５９２３，前出，Ｍａｔｓｏｕｋａｓら，（１９９５）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，３８，４６６０−４６６９；Ｋｉｎｇ，Ｆ．Ｅ．＆ Ｋｉｄｄ，Ｄ．Ａ．Ａ．（１９４９）Ａ Ｎｅｗ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ Ｇｌｕｔａｍｉｎｅ ａｎｄ ｏｆ γ−Ｄｉｐｅｐｔｉｄｅｓ ｏｆ Ｇｌｕｔａｍｉｃ Ａｃｉｄ
ｆｒｏｍ Ｐｈｔｈｙｌａｔｅｄ Ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅｓ．Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，３３１５−３３１９；Ｆｒｉｅｄｍａｎ，Ｏ．Ｍ．＆ Ｃｈａｔｔｅｒｒｊｉ，Ｒ．（１９５９）Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ Ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ ｏｆ Ｇｌｕｔａｍｉｎｅ ａｓ Ｍｏｄｅｌ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅｓ ｆｏｒ Ａｎｔｉ−Ｔｕｍｏｒ Ａｇｅｎｔｓ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．８１，３７５０−３７５２；Ｃｒａｉｇ，Ｊ．Ｃ．ら（１９８８）Ａｂｓｏｌｕｔｅ Ｃｏｎｆｉｇｕｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ
Ｅｎａｎｔｉｏｍｅｒｓ ｏｆ ７−Ｃｈｌｏｒｏ−４［［４−（ｄｉｅｔｈｙｌａｍｉｎｏ）−１−ｍｅｔｈｙｌｂｕｔｙｌ］ａｍｉｎｏｌ）ｑｕｉｎｏｌｉｎｅ（Ｃｈｌｏｒｏｑｕｉｎｅ）．Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．５３，１１６７−１１７０；Ａｚｏｕｌａｙ，Ｍ．，Ｖｉｌｍｏｎｔ，Ｍ．＆ Ｆｒａｐｐｉｅｒ，Ｆ．（１９９１）Ｇｌｕｔａｍｉｎｅ ａｎａｌｏｇｕｅｓ ａｓ Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ Ａｎｔｉｍａｌａｒｉａｌｓ，．Ｅｕｒ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２６，２０１−５；Ｋｏｓｋｉｎｅｎ，Ａ．Ｍ．Ｐ．＆ Ｒａｐｏｐｏｒｔ，Ｈ．（１９８９）Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ４−Ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｅｄ Ｐｒｏｌｉｎｅｓ ａｓ Ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌｌｙ Ｃｏｎｓｔｒａｉｎｅｄ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄ Ａｎａｌｏｇｕｅｓ．Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．５４，１８５９−１８６６；Ｃｈｒｉｓｔｉｅ，Ｂ．Ｄ．＆ Ｒａｐｏｐｏｒｔ，Ｈ．（１９８５）Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ Ｏｐｔｉｃａｌｌｙ Ｐｕｒｅ Ｐｉｐｅｃｏｌａｔｅｓ ｆｒｏｍ Ｌ−Ａｓｐａｒａｇｉｎｅ．Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｔｏ ｔｈｅ
Ｔｏｔａｌ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ（＋）−Ａｐｏｖｉｎｃａｍｉｎｅ ｔｈｒｏｕｇｈ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄ Ｄｅｃａｒｂｏｎｙｌａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｉｍｉｎｉｕｍ Ｉｏｎ Ｃｙｃｌｉｚａｔｉｏｎ．Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．１９８９：１８５９−１８６６；Ｂａｒｔｏｎら，（１９８７）Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ Ｎｏｖｅｌ α−Ａｍｉｎｏ−Ａｃｉｄｓ ａｎｄ Ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ Ｕｓｉｎｇ Ｒａｄｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ：Ｓｙｎｔｌａｅｓｉｓ ｏｆ Ｌ−ａｎｄ Ｄ−α−Ａｍｉｎｏ−Ａｄｉｐｉｃ Ａｃｉｄｓ，Ｌ−α−ａｍｉｎｏｐｉｍｅｌｉｃ Ａｃｉｄ ａｎｄ
Ａｐｐｒｏｐｒｉａｔｅ Ｕｎｓａｔｕｒａｔｅｄ Ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ．Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．４３：４２９７−４３０８；及びＳｕｂａｓｉｎｇｈｅら，（１９９２）Ｑｕｉｓｑｕａｌｉｃ ａｃｉｄ ａｎａｌｏｇｕｅｓ：ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ｂｅｔａ−ｈｅｔｅｒｏｃｙｃｌｉｃ ２−ａｍｉｎｏｐｒｏｐａｎｏｉｃ

ａｃｉｄ ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ａｃｔｉｖｉｔｙ ａｔ ａ ｎｏｖｅｌ ｑｕｉｓｑｕａｌａｔｅ−ｓｅｎｓｉｔｉｚｅｄ ｓｉｔｅ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３５：４６０２−７．Ｓｅｅ ａｌｓｏ ＷＯ２００２／０８５９２３が挙げられる。
〔非天然アミノ酸の細胞取込み〕
非天然アミノ酸取込みは非天然アミノ酸を例えば蛋白質に組込むように設計及び選択する場合に一般に検討される問題の１つである。例えば、αアミノ酸は電荷密度が高いのでこれらの化合物は細胞浸透性になりにくいと思われる。天然アミノ酸は種々の程度のアミノ酸特異性を示す一連の蛋白質輸送系を介して細菌に取込まれる。非天然アミノ酸が細胞に取込まれる場合にどの非天然アミノ酸が取込まれるかは迅速なスクリーニングにより調べることができる。例えば２００３年１０月１５日付け出願、発明の名称「糖蛋白質合成（Ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）」（代理人整理番号５４Ａ−０００６１０ＵＳ）の毒性アッセイ；及びＬｉｕ，Ｄ．Ｒ．＆ Ｓｃｈｕｌｔｚ，Ｐ．Ｇ．（１９９９）Ｐｒｏｇｒｅｓｓ ｔｏｗａｒｄ ｔｈｅ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ａｎ ｏｒｇａｎｉｓｍ ｗｉｔｈ ａｎ ｅｘｐａｎｄｅｄ ｇｅｎｅｔｉｃ ｃｏｄｅ．ＰＮＡＳ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ９６−４７８０−４７８５参照。取込みは種々の方法で容易に分析されるが、細胞取込み経路に利用可能な非天然アミノ酸を設計する代替方法は、アミノ酸をｉｎ ｖｉｖｏ生産する生合成経路を提供する方法である。
〔非天然アミノ酸の生合成〕
細胞にはアミノ酸と他の化合物を生産するために多数の生合成経路が元々存在している。特定非天然アミノ酸の生合成法は自然界（例えば細胞中）には存在しないと思われるが、本発明はこのような方法を提供する。例えば、非天然アミノ酸の生合成経路は場合により新規酵素を付加するか又は既存宿主細胞経路を改変することにより宿主細胞で作製される。付加新規酵素は場合により天然酵素でも人工的に作製した酵素でもよい。例えば（ＷＯ２００２／０８５９２３，前出の実施例に記載されているような）ｐ−アミノフェニルアラニンの生合成は他の生物に由来する公知酵素の組合せの付加に依存している。これらの酵素の遺伝子はこの遺伝子を含むプラスミドで細胞を形質転換することにより細胞に導入することができる。遺伝子は細胞で発現されると、所望化合物を合成するための酵素経路を提供する。場合により付加される酵素種の例は下記実施例に記載する。付加酵素配列は例えばＧｅｎｂａｎｋに登録されている。場合により人工的に作製した酵素も同様に細胞に付加する。このように、非天然アミノ酸を生産するように細胞機構と細胞資源を操作する。
生合成経路で使用する新規酵素の生産方法又は既存経路を進化させる方法は種々のものが入手可能である。例えば、場合により例えばＭａｘｙｇｅｎ，Ｉｎｃ．（世界ウェブサイトｗｗｗ．ｍａｘｙｇｅｎ．ｃｏｍから入手可能）により開発されたような再帰的組換えを使用して新規酵素及び経路を開発する。例えばＳｔｅｍｍｅｒ（１９９４），Ｒａｐｉｄ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｂｙ ＤＮＡ ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ，Ｎａｔｕｒｅ ３７０（４）：３８９−３９１；及びＳｔｅｍｍｅｒ，（１９９４），ＤＮＡ ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ ｂｙ ｒａｎｄｏｍ ｆｒａｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ ａｎｄ ｒｅａｓｓｅｍｂｌｙ：Ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．，９１：１０７４７−１０７５１参照。同様に、場合によりＧｅｎｅｎｃｏｒ（世界ウェブサイトｇｅｎｅｎｃｏｒ．ｃｏｍで入手可能）により開発されたＤｅｓｉｇｎＰａｔｈ（登録商標）を代謝経路組換えに使用し、例えば大腸菌でケトアミノ酸を生産するように経路を組換える。この技術は例えば機能ゲノミクスと分子進化及び設計により同定した新規遺伝子の組合せを使用して宿主生物で既存経路を再構築する。Ｄｉｖｅｒｓａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（世界ウェブサイトｄｉｖｅｒｓａ．ｃ
ｏｍで入手可能）も例えば新規経路を作製するために遺伝子ライブラリーと遺伝子経路を迅速にスクリーニングするための技術を提供している。
一般に、本発明の組換え生合成経路で生産される非天然アミノ酸は効率的蛋白質生合成に十分な濃度（例えば天然細胞量）で生産されるが、他のアミノ酸の濃度を変化させたり細胞資源を枯渇させる程ではない。このようにｉｎ ｖｉｖｏ生産される典型濃度は約１０ｍＭ〜約０．０５ｍＭである。特定経路に所望される酵素を生産するために使用される遺伝子を含むプラスミドで細菌を形質転換し、非天然アミノ酸が生産されたら、場合によりｉｎ ｖｉｖｏ選択を使用してリボソーム蛋白質合成と細胞増殖の両者に合うように非天然アミノ酸の生産を更に最適化させる。
〔核酸及びポリペプチド配列と変異体〕
上記及び下記に記載するように、本発明は核酸ポリヌクレオチド配列（例えばＯ−ｔＲＮＡ及びＯ−ＲＳ）及びポリペプチドアミノ酸配列（例えばＯ−ＲＳ）と、例えば前記配列を含む組成物と方法を提供する。前記配列（例えばＯ−ｔＲＮＡ及びＯ−ＲＳ）の例を本明細書に開示する（表２、例えば配列番号１〜２１参照）。しかし、当業者に自明の通り、本発明は本明細書（例えば実施例）に開示する配列に限定されない。当業者に自明の通り、本発明は本明細書に記載する機能をもつ（例えばＯ−ｔＲＮＡ又はＯ−ＲＳをコードする）多数の非関連配列も提供する。
本発明はポリペプチド（Ｏ−ＲＳ）とポリヌクレオチド（例えばＯ−ｔＲＮＡ）、Ｏ−ＲＳ又はその部分をコードするポリヌクレオチド、アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼクローンを単離するために使用されるオリゴヌクレオチド等を提供する。本発明のポリヌクレオチドとしては、１個以上のセレクターコドンをもつ本発明の該当ポリペプチドをコードするものが挙げられる。更に、本発明のポリヌクレオチドとしては、例えば配列番号１〜１７、２１に記載のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド；そのポリヌクレオチド配列に相補的であるか又はこれをコードするポリヌクレオチドが挙げられる。本発明のポリヌクレオチドは更に配列番号１８〜２０を含むアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを含む。本発明のポリヌクレオチドは更に本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。同様に、実質的に核酸の全長にわたって高ストリンジェント条件下で上記ポリヌクレオチドとハイブリダイズする人工核酸も本発明のポリヌクレオチドである。１態様では、組成物は本発明のポリペプチドと賦形剤（例えば緩衝液、水、医薬的に許容可能な賦形剤等）を含む。本発明は本発明のポリペプチドに対して特異的に免疫反応性の抗体又は抗血清も提供する。人工ポリヌクレオチドとは天然に存在しない人造ポリヌクレオチドである。
本発明のポリヌクレオチドは配列番号１〜１７及び／又は２１の配列と例えば少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％以上一致する人工ポリヌクレオチド（但し、天然ポリヌクレオチド以外のもの）も含む。ポリヌクレオチドは天然ｔＲＮＡのポリヌクレオチドと例えば少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％以上一致する人工ポリヌクレオチドも含む。
所定態様では、ベクター（例えばプラスミド、コスミド、ファージ、ウイルス等）に本発明のポリヌクレオチドを組込む。１態様では、ベクターは発現ベクターである。別の態様では、発現ベクターは本発明のポリヌクレオチドの１種以上と機能的に連結したプロモーターを含む。別の態様では、本発明のポリヌクレオチドを組込んだベクターを細胞に導入する。
当業者に自明の通り、開示配列の多数の変異体も本発明に含まれる。例えば、機能的に
同一配列となるような開示配列の保存変異体も本発明に含まれる。少なくとも１種の開示配列にハイブリダイスする核酸ポリヌクレオチド配列の変異体も本発明に含むものとする。例えば標準配列比較法により本明細書に開示する配列のユニークサブ配列であるとみなされる配列も本発明に含まれる。
〔保存変異〕
遺伝コードの縮重により、「サイレント置換」（即ちコードされるポリペプチドに変化を生じない核酸配列の置換）はアミノ酸をコードする全核酸配列の暗黙の特徴である。同様に、「保存アミノ酸置換」はアミノ酸配列中の１又は数個のアミノ酸を高度に類似する特性をもつ別のアミノ酸で置換するものであり、このような置換も開示構築物と高度に類似するとは自明である。各開示配列のこのような保存変異は本発明の特徴である。
特定核酸配列の「保存変異」とは同一又は本質的に同一のアミノ酸配列をコードする核酸を意味し、核酸がアミノ酸配列をコードしない場合には本質的に同一の配列を意味する。当業者に自明の通り、コードされる配列中の単一アミノ酸又は低百分率（一般に５％未満、より一般には４％、２％又は１％未満）のアミノ酸を置換、付加又は欠失させる個々の置換、欠失又は付加の結果としてアミノ酸１個を欠失するか、アミノ酸１個が付加されるか、又はアミノ酸１個が化学的に類似するアミノ酸１個で置換される場合には、これらの改変は「保存改変変異」である。従って、本発明の明記ポリペプチド配列の「保存変異」はポリペプチド配列のアミノ酸の低百分率、一般に５％未満、より一般には２％又は１％未満を同一保存置換基の保存性ケトアミノ酸で置換する置換を含む。最後に、非機能的配列の付加のように核酸分子のコードされる活性を変えない配列の付加も基本核酸の保存変異である。
機能的に類似するアミノ酸を示す保存置換表は当分野で周知である。相互に「保存置換」を含む天然アミノ酸を含むグループの例を以下に示す。

〔核酸ハイブリダイゼーション〕
比較ハイブリダイゼーションを使用して本発明の核酸の保存変異を含む本発明の核酸（例えば配列番号１〜１７，２１）を同定することができ、この比較ハイブリダイゼーション法は本発明の核酸を識別する好適な方法である。更に、高、超高及び超々高ストリンジェンシー条件下で配列番号１〜１７，２１に示す核酸とハイブリダイズするターゲット核酸も本発明の特徴である。このような核酸の例としては所定核酸配列と比較して１又は数個のサイレント又は保存核酸置換をもつものが挙げられる。
完全にマッチする相補的ターゲットに比較して少なくとも１／２の割合でプローブにハイブリダイズする場合、即ちマッチしないターゲット核酸の任意のものとのハイブリダイゼーションに観測されるシグナル対ノイズ比の少なくとも約５倍〜１０倍で完全にマッチするプローブが完全にマッチする相補的ターゲットと結合する条件下におけるプローブとターゲットのハイブリダイゼーションに比較してシグナル対ノイズ比が少なくとも１／２である場合に試験核酸はプローブ核酸に特異的にハイブリダイズすると言う。
核酸は一般に溶液中で会合するときに「ハイブリダイズ」する。核酸は水素結合、溶媒
排除、塩基スタッキング等の種々の十分に特性決定された物理化学的力によりハイブリダイズする。核酸ハイブリダイゼーションの詳しい手引きはＴｉｊｓｓｅｎ（１９９３）Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ −Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｐｒｏｂｅｓ ｐａｒｔ Ｉ，ｃｈａｐｔｅｒ ２，“Ｏｖｅｒｖｉｅｗ ｏｆ ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ
ｔｈｅ ｓｔｒａｔｅｇｙ ｏｆ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｐｒｏｂｅ ａｓｓａｙｓ，”（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）及びＡｕｓｕｂｅｌ，前出に記載されている。Ｈａｍｅｓ ａｎｄ Ｈｉｇｇｉｎｓ（１９９５）Ｇｅｎｅ Ｐｒｏｂｅｓ １
ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ ａｔ Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，英国（Ｈａｍｅｓ ａｎｄ Ｈｉｇｇｉｎｓ １）及びＨａｍｅｓ ａｎｄ Ｈｉｇｇｉｎｓ（１９９５）Ｇｅｎｅ Ｐｒｏｂｅｓ ２ ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ ａｔ Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，英国（Ｈａｍｅｓ ａｎｄ Ｈｉｇｇｉｎｓ ２）はオリゴヌクレオチドを含むＤＮＡとＲＮＡの合成、標識、検出及び定量について詳細に記載している。
サザン又はノーザンブロットでフィルター上で１００を越える相補的残基をもつ相補的核酸のハイブリダイゼーションを行うためのストリンジェントハイブリダイゼーション条件の１例は、５０％ホルマリンにヘパリン１ｍｇを加え、４２℃で一晩のハイブリダイゼーションである。ストリンジェント洗浄条件の１例は６５℃、０．２×ＳＳＣで１５分間である（ＳＳＣ緩衝液の説明についてはＳａｍｂｒｏｏｋ，前出参照）。多くの場合には高ストリンジェンシー洗浄の前に低ストリンジェンシー洗浄でバックグラウンドプローブシグナルを除去する。低ストリンジェンシー洗浄の１例は４０℃、２×ＳＳＣで１５分間である。一般に、シグナル対ノイズ比が特定ハイブリダイゼーションアッセイで無関係プローブに観測されるよりも５倍（以上）である場合に特異的ハイブリダイゼーションが検出されたとみなす。
サザン及びノーザンハイブリダイゼーション等の核酸ハイブリダイゼーション実験に関して「ストリンジェントハイブリダイゼーション洗浄条件」は配列依存的であり、種々の環境パラメーターにより異なる。核酸ハイブリダイゼーションの詳しい手引きはＴｉｊｓｓｅｎ（１９９３），前出やＨａｍｅｓ ａｎｄ Ｈｉｇｇｉｎｓ １及び２に記載されている。ストリンジェントハイブリダイゼーション及び洗浄条件は任意試験核酸について経験により容易に決定することができる。例えば高ストリンジェントハイブリダイゼーション及び洗浄条件を決定するには、総合選択基準に合致するまで（例えばハイブリダイゼーション又は洗浄における温度上昇、塩濃度低下、界面活性剤濃度増加及び／又はホルマリン等の有機溶媒濃度増加により）ハイブリダイゼーション及び洗浄条件を漸増させる。例えばマッチしないターゲットとプローブのハイブリダイゼーションに観測されるシグナル対ノイズ比の少なくとも約５倍でプローブが完全にマッチする相補的ターゲットと結合するまでハイブリダイゼーション及び洗浄条件を漸増させる。
「超ストリンジェント」条件は特定プローブの熱融点（Ｔｍ）に等しくなるように選択する。Ｔｍは（規定イオン強度及びｐＨ下で）試験配列の５０％が完全にマッチするプローブとハイブリダイズする温度である。本発明の趣旨では、一般に規定イオン強度及びｐＨで特定配列のＴｍよりも約５℃低くなるように「高ストリンジェント」ハイブリダイゼーション及び洗浄条件を選択する。
「超高ストリンジェンシー」ハイブリダイゼーション及び洗浄条件は完全にマッチする相補的ターゲット核酸とプローブを結合させる場合のシグナル対ノイズ比がマッチしないターゲット核酸の任意のものとのハイブリダイゼーションに観測されるシグナル対ノイズ比の少なくとも１０倍になるまでハイブリダイゼーション及び洗浄条件のストリンジェン
シーを増す条件である。完全にマッチする相補的ターゲットのシグナル対ノイズ比の少なくとも１／２で前記条件下でプローブとハイブリダイズする場合にターゲット核酸は超高ストリンジェンシー条件下でプローブと結合すると言う。
同様に、該当ハイブリダイゼーションアッセイのハイブリダイゼーション及び／又は洗浄条件を漸増させることにより更に高いレベルのストリンジェンシーを決定することもできる。例えば完全にマッチする相補的ターゲット核酸とプローブを結合させる場合のシグナル対ノイズ比がマッチしないターゲット核酸の任意のものとのハイブリダイゼーションに観測されるシグナル対ノイズ比の少なくとも１０倍、２０倍、５０倍、１００倍又は５００倍以上になるまでハイブリダイゼーション及び洗浄条件のストリンジェンシーを増す。完全にマッチする相補的ターゲットのシグナル対ノイズ比の少なくとも１／２で前記条件下でプローブとハイブリダイズする場合にターゲット核酸は超々高ストリンジェンシー条件下でプローブと結合すると言う。
ストリンジェント条件下で相互にハイブリダイズしない核酸でも、これらの核酸によりコードされるポリペプチドが実質的に同一である場合には実質的に同一である。これは、例えば遺伝コードに許容される最大コドン縮重を使用して核酸のコピーを作製する場合に該当する。
〔ユニークサブ配列〕
１側面では、本発明は本明細書に開示するＯ−ｔＲＮＡ及びＯ−ＲＳの配列から選択される核酸にユニークサブ配列を含む核酸を提供する。ユニークサブ配列は任意公知Ｏ−ｔＲＮＡ及びＯ−ＲＳ核酸配列に対応する核酸に比較してユニークである。例えばデフォルトパラメーターに設定したＢＬＡＳＴを使用してアラインメントを実施することができる。任意ユニークサブ配列は例えば本発明の核酸を同定するためのプローブとして有用である。
同様に、本発明は本明細書に開示するＯ−ＲＳの配列から選択されるポリペプチド中にユニークサブ配列を含むポリペプチドを含む。この場合には、ユニークサブ配列は公知ポリペプチド配列の任意のものに対応するポリペプチドに比較してユニークである。
本発明はＯ−ＲＳの配列から選択されるポリペプチド中のユニークサブ配列をコードするユニークコーディングオリゴヌクレオチドとストリンジェント条件下でハイブリダイズするターゲット核酸も提供し、この場合、ユニークサブ配列は対照ポリペプチド（例えば本発明のシンテターゼを得るために例えば突然変異させた親配列）の任意のものに対応するポリペプチドに比較してユニークである。ユニーク配列は上記のように決定する。
〔配列比較、一致度及び相同度〕
２種以上の核酸又はポリペプチド配列に関して「一致」又は「一致度」百分率なる用語は２種以上の配列又はサブ配列を最大限に対応するように対比及び整列させ、以下に記載する配列比較アルゴリズム（又は当業者に入手可能な他のアルゴリズム）の１種を使用するか又は目視により測定した場合に相互に同一であるか又は同一のアミノ酸残基もしくはヌクレオチドの百分率が特定値であることを意味する。
２種以上の核酸又はポリペプチド（例えばＯ−ｔＲＮＡもしくはＯ−ＲＳをコードするＤＮＡ、又はＯ−ＲＳのアミノ酸配列）に関して「実質的に一致」なる用語は２種以上の配列又はサブ配列を最大限に対応するように対比及び整列させ、配列比較アルゴリズムを使用するか又は目視により測定した場合にヌクレオチド又はアミノ酸残基一致度が少なくとも約６０％、約８０％、約９０〜９５％、約９８％、約９９％以上であることを意味する。このような「実質的に一致」する配列は一般に実際の起源が記載されていなくても「
相同」であるとみなす。少なくとも約５０残基長の配列の領域にわたって「実質的一致」が存在することが好ましく、少なくとも約１００残基長の配列の領域がより好ましく、少なくとも約１５０残基又は比較する２配列の全長にわたって配列が実質的に一致していることが最も好ましい。
蛋白質及び／又は蛋白質配列は共通の祖先蛋白質又は蛋白質配列から天然又は人工的に誘導される場合に「相同」である。同様に、核酸及び／又は核酸配列は共通の祖先核酸又は核酸配列から天然又は人工的に誘導される場合に相同である。例えば、入手可能な任意突然変異誘発法により任意天然核酸を改変し、１個以上のセレクターコドンを加えることができる。この突然変異誘発した核酸は発現されると、１種以上の非天然アミノ酸を含むポリペプチドをコードする。突然変異法は当然のことながら更に１個以上の標準コドンを変異させ、得られる突然変異体蛋白質の１個以上の標準アミノ酸も変異させることができる。相同性は一般に２種以上の核酸又は蛋白質（又はその配列）間の配列類似度から推定される。相同性の判定に有用な配列間類似度の厳密な百分率は該当核酸及び蛋白質により異なるが、通常は２５％程度の低い配列類似度を使用して相同性を判定する。もっと高いレベルの配列類似度、例えば３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％又は９９％以上を使用して相同性を判定することもできる。配列類似度百分率の決定方法（例えばデフォルトパラメーターを使用するＢＬＡＳＴＰ及びＢＬＡＳＴＩＮ）は本明細書に記載し、一般に入手可能である。
配列比較及び相同性決定には、一般に一方の配列を参照配列としてこれに試験配列を比較する。配列比較アルゴリズムを使用する場合には、試験配列と参照配列をコンピューターに入力し、必要に応じてサブ配列座標を指定し、配列アルゴリズムプログラムパラメーターを指定する。こうすると、配列比較アルゴリズムは指定プログラムパラメーターに基づいて参照配列に対して試験配列の配列一致度百分率を計算する。
比較のための最適な配列アラインメントは例えばＳｍｉｔｈ ＆ Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２（１９８１）の局所相同性アルゴリズム、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ＆ Ｗｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３（１９７０）の相同性アラインメントアルゴリズム、Ｐｅａｒｓｏｎ ＆ Ｌｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：２４４４（１９８８）の類似性探索法、これらのアルゴリズムのコンピューターソフトウェア（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩのＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ及びＴＦＡＳＴＡ）、又は目視（一般にＡｕｓｕｂｅｌら，後出参照）により実施することができる。
配列一致度及び配列類似度百分率を決定するのに適したアルゴリズムの１例はＡｌｔｓｃｈｕｌら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０（１９９０）に記載されているＢＬＡＳＴアルゴリズムである。ＢＬＡＳＴ分析を実施するためのソフトウェアはＮａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）から公共入手可能である。このアルゴリズムはデータベース配列中の同一長さの単語と整列した場合に所定の正の閾値スコアＴと一致するか又はこれを満足するクエリー配列中の長さＷの短い単語を識別することによりまず高スコア配列対（ＨＳＰ）を識別する。Ｔを隣接単語スコア閾値と言う（Ａｌｔｓｃｈｕｌら，前出）。これらの初期隣接単語ヒットをシードとして検索を開始し、これらの単語を含むもっと長いＨＳＰを探索する。次に、累積アラインメントスコアを増加できる限り、単語ヒットを各配列に沿って両方向に延長する。ヌクレオチド配列の場合にはパラメーターＭ（１対のマッチ残基のリウォードスコア、常に＞０）及びＮ（ミスマッチ残基のペナルティースコア、常に＜０）を使用して累積スコアを計算する。アミノ
酸配列の場合には、スコアリングマトリクスを使用して累積スコアを計算する。累積アラインメントスコアがその最大到達値から量Ｘだけ低下するか、累積スコアが１カ所以上の負スコア残基アラインメントの累積によりゼロ以下になるか、又はどちらかの配列の末端に達したら各方向の単語ヒットの延長を停止する。ＢＬＡＳＴアルゴリズムパラメーターＷ、Ｔ及びＸはアラインメントの感度と速度を決定する。ＢＬＡＳＴＩＮプログラム（ヌクレオチド配列用）は語長（Ｗ）１１、期待値（Ｅ）１０、カットオフ１００、Ｍ＝５、Ｎ＝４、及び両鎖の比較をデフォルトとして使用する。アミノ酸配列用として、ＢＬＡＳＴＰプログラムは語長（Ｗ）３、期待値（Ｅ）１０、及びＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリクスをデフォルトとして使用する（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ ＆ Ｈｅｎｉｋｏｆｆ（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：１０９１５参照）。
配列一致度百分率の計算に加え、ＢＬＡＳＴアルゴリズムは２配列間の類似性の統計分析も実施する（例えばＫａｒｌｉｎ ＆ Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：５８７３−５７８７（１９９３）参照）。ＢＬＡＳＴアルゴリズムにより提供される類似性の１尺度は２種のヌクレオチド又はアミノ酸配列間に偶然にマッチが起こる確率を示す最小合計確率（Ｐ（Ｎ））である。例えば試験核酸を参照核酸に比較した場合の最小合計確率が約０．１未満、より好ましくは約０．０１未満、最も好ましくは約０．００１未満である場合に核酸は参照核酸に類似しているとみなす。
〔突然変異誘発及び他の分子生物学技術〕
本発明のポリヌクレオチドとポリペプチド及び本発明で使用されるポリヌクレオチドとポリペプチドは分子生物学技術を使用して操作することができる。分子生物学技術について記載している一般教科書としてはＢｅｒｇｅｒ ａｎｄ Ｋｉｍｍｅｌ，Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ｖｏｌｕｍｅ １５２ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ（Ｂｅｒｇｅｒ）；Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（第３版），Ｖｏｌ．１−３，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ
Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，２００１（「Ｓａｍｂｒｏｏｋ」）及びＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら編，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，ａ ｊｏｉｎｔ
ｖｅｎｔｕｒｅ ｂｅｔｗｅｅｎ Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．ａｎｄ Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，（２００３年補遺）（「Ａｕｓｕｂｅｌ」））が挙げられる。これらの教科書は突然変異誘発、ベクターの使用、プロモーター及び他の多くの関連事項について記載しており、例えばケトアミノ酸（及び場合により別の非天然アミノ酸）、直交ｔＲＮＡ、直交シンテターゼ及びその対を含む蛋白質を生産するためのセレクターコドンを含む遺伝子の作製についても記載している。
例えばｔＲＮＡ分子を突然変異させるため、ｔＲＮＡのライブラリーを作製するため、シンテターゼのライブラリーを作製するため、ケトアミノ酸及び／又は別の非天然アミノ酸をコードするセレクターコドンを該当蛋白質又はポリペプチドに挿入するために、本発明では各種突然変異誘発を使用する。これらの例としては限定されないが、部位特異的、ランダム点突然変異誘発、相同組換え、ＤＮＡシャフリング又は他の再帰的突然変異誘発法、キメラ構築、ウラシル含有鋳型を使用する突然変異誘発、オリゴヌクレオチド特異的突然変異誘発、ホスホロチオエート修飾ＤＮＡ突然変異誘発、ギャップデュプレクスＤＮＡを使用する突然変異誘発等、又はその任意組み合わせが挙げられる。他の利用可能な方法としては点ミスマッチ修復、修復欠損宿主株を使用する突然変異誘発、制限−選択及び制限−精製、欠失突然変異誘発、完全遺伝子合成による突然変異誘発、２本鎖切断修復等が挙げられる。例えばキメラ構築物を使用する突然変異誘発も本発明に含まれる。１態様
では、天然分子又は改変もしくは突然変異させた天然分子の公知情報（例えば配列、配列比較、物性、結晶構造等）により突然変異誘発を実施することができる。
本発明のポリヌクレオチド又は本発明のポリヌクレオチドを組込んだ構築物（例えばクローニングベクター又は発現ベクター等の本発明のベクター）で宿主細胞を遺伝子組換え（例えば形質転換、形質導入又はトランスフェクション）する。例えば、直交ｔＲＮＡ、直交ｔＲＮＡシンテターゼ、及び誘導体化すべき蛋白質のコーディング領域を所望宿主細胞で機能的な遺伝子発現制御エレメントに機能的に連結する。典型的なベクターは転写及び翻訳ターミネーターと、転写及び翻訳開始配列と、特定ターゲット核酸の発現の調節に有用なプロモーターを含む。ベクターは場合により少なくとも１個の独立ターミネーター配列と、真核生物又は原核生物又は両者（例えばシャトルベクター）でカセットの複製を可能にする配列と、原核系と真核系の両者の選択マーカーを含む包括的発現カセットを含む。ベクターは原核生物、真核生物、又は好ましくは両者での複製と組込みに適している。Ｇｉｌｉｍａｎ ＆ Ｓｍｉｔｈ，Ｇｅｎｅ ８：８１（１９７９）；Ｒｏｂｅｒｔｓら，Ｎａｔｕｒｅ，３２８：７３１（１９８７）；Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ，Ｂ．ら，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒ．Ｐｕｒｉｆ．６４３５：１０（１９９５）；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｂｅｒｇｅｒ（いずれも前出）参照。ベクターは例えばプラスミド、細菌、ウイルス、裸のポリヌクレオチド又はポリヌクレオチドコンジュゲートの形態とすることができる。ベクターはエレクトロポレーション（Ｆｒｏｍら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２，５８２４（１９８５））、ウイルスベクターによる感染、核酸を小ビーズもしくは粒子のマトリックスに埋込むか又は表面に付着させて小粒子形態で高速射入する方法（Ｋｌｅｉｎら，Ｎａｔｕｒｅ ３２７，７０−７３（１９８７）、及び／又は同等物の標準方法により細胞及び／又は微生物に導入する。
クローニングに有用な細菌とバクテリオファージのカタログは例えばＡＴＣＣから入手でき、例えばＡＴＣＣから刊行されたＴｈｅ ＡＴＣＣ Ｃａｔａｌｏｇｕｅ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉａ ａｎｄ Ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ（１９９２）Ｇｈｅｒｎａら（編）が挙げられる。その他のシーケンシング、クローニング及び分子生物学の他の側面の基本手順と基礎理論事項もＳａｍｂｒｏｏｋ（前出），Ａｕｓｕｂｅｌ（前出）及びＷａｔｓｏｎら（１９９２）Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＤＮＡ Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ
Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｂｏｏｋｓ，ＮＹに記載されている。更に、Ｍｉｄｌａｎｄ Ｃｅｒｔｉｆｉｅｄ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｍｉｄｌａｎｄ，ＴＸ ｍｃｒｃ．ｃｏｍ）、Ｔｈｅ Ｇｒｅａｔ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｇｅｎｅ Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｒａｍｏｎａ，ＣＡ，世界ウェブｇｅｎｃｏ．ｃｏｍで入手可能）、ＥｘｐｒｅｓｓＧｅｎ Ｉｎｃ．（Ｃｈｉｃａｇｏ，ＩＬ，世界ウェブｅｘｐｒｅｓｓｇｅｎ．ｃｏｍで入手可能）、Ｏｐｅｒｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．（Ａｌａｍｅｄａ，ＣＡ）、その他多数の各種販売会社からほぼ任意核酸（及び標準又は標準外を問わずほぼ任意標識核酸）をオーダーメード又は標準注文することができる。
組換え宿主細胞は例えばスクリーニング段階、プロモーター活性化又は形質転換細胞選択等の操作に合うように適宜改変した慣用栄養培地で培養することができる。これらの細胞を場合によりトランスジェニック生物で培養することができる。（例えば後期核酸単離のための）例えば細胞単離及び培養に関する他の有用な文献としてはＦｒｅｓｈｎｅｙ（１９９４）Ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌｓ，ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ
Ｂａｓｉｃ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ，第３版，Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋとその引用文献；Ｐａｙｎｅら（１９９２）Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ ｉｎ Ｌｉｑｕｉｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆
Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ；Ｇａｍｂｏｒｇ ａｎｄ Ｐｈｉｌｌｉｐｓ（ｅｄｓ）（１９９５）Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ，Ｔｉｓｓｕｅ ａｎｄ Ｏｒｇａｎ
Ｃｕｌｔｕｒｅ；Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｌａ
ｂ Ｍａｎｕａｌ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ（Ｂｅｒｌｉｎ Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）及びＡｔｌａｓ ａｎｄ Ｐａｒｋｓ（ｅｄｓ）Ｔｈｅ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｄｉａ（１９９３）ＣＲＣ
Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，ＦＬが挙げられる。
〔該当蛋白質及びポリペプチド〕
少なくとも１種のケトアミノ酸を組込んだ該当蛋白質又はポリペプチドも本発明の特徴である。本発明は本発明の組成物と方法を使用して生産された少なくともケトアミノ酸を組込んだポリペプチド又は蛋白質にも関する。ケトアミノ酸の１つの利点は種々の化学反応に関与できることである。カルボニル基は水溶液中で温和な条件下に例えばヒドラジド、ヒドロキシルアミン、セミカルバジド、及び／又は同等物と容易に反応し、夫々生理条件下で安定な例えばヒドラゾン、オキシム、及びセミカルバゾン結合を形成する。例えばＪｅｎｃｋｓ，Ｗ．Ｐ．（１９５９），前出；Ｓｈａｏ，Ｊ．＆ Ｔａｍ，Ｊ．Ｐ．（１９９５），前出参照。例えば蛋白質構造及び機能のプローブを作製するため、触媒もしくは治療特性の高い蛋白質を作製するため、又は固相化もしくは可溶性蛋白質を使用してバイオアッセイを実施するために、ケトアミノ酸を介して多様な他のヒドラジド又はヒドロキシルアミン誘導体（糖類、蛍光ラベル、ビオチン誘導体、スピンラベル、金属キレート剤、架橋剤、ポリエーテル、脂肪酸、毒素等）で蛋白質を選択的に標識することができる。例えば、２００３年１０月１５日付け出願、発明の名称「糖蛋白質合成（Ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）」（代理人整理番号５４Ａ−０００６１０ＵＳ）参照。本発明の所定態様では、賦形剤（例えば医薬的に許容可能な賦形剤）を蛋白質に添加することができる。場合により、本発明の蛋白質は翻訳後修飾を含む。
ケトアミノ酸を特定位置に組込んだ蛋白質を細胞で生産する方法も本発明の特徴である。例えば、方法は、少なくとも１個のセレクターコドンを含み且つ蛋白質をコードする核酸を導入した細胞を適当な培地で増殖させる段階と、ケトアミノ酸を提供する段階と、少なくとも１個のセレクターコドンによる核酸の翻訳中に蛋白質の特定位置にケトアミノ酸を組込むことにより、蛋白質を生産する段階を含む。細胞は更に、細胞で機能し、セレクターコドンを認識する直交ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）と；Ｏ−ｔＲＮＡをケトアミノ酸で優先的にアミノアシル化する直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ＲＳ）を含む。所定態様では、Ｏ−ＲＳは配列番号１８のアミノ酸配列を含むポリペプチドの効率の少なくとも例えば約４５％、５０％、６０％、７５％、８０％、又は９０％以上の効率でＯ−ｔＲＮＡをケトアミノ酸で優先的にアミノアシル化する。この方法により生産された蛋白質も本発明の特徴である。
本発明はケトアミノ酸を組込んだ蛋白質を含む組成物も提供する。所定態様では、蛋白質は治療用蛋白質、診断用蛋白質、産業用酵素、又はその部分と少なくとも７５％一致するアミノ酸配列を含む。
本発明の組成物と本発明の方法により作製された組成物は場合により細胞に導入する。本発明のＯ−ｔＲＮＡ／Ｏ−ＲＳ対又は個々の成分をその後、宿主系の翻訳機構で使用することができ、その結果として、ケトアミノ酸は蛋白質に組込まれる。ＷＯ２００２／０８５９２３，前出はこのプロセスを記載しており、参考資料として本明細書に組込む。例えば、Ｏ−ｔＲＮＡ／Ｏ−ＲＳ対を宿主（例えば大腸菌）に導入すると、前記対はセレクターコドンに応答して外部から増殖培地に添加することができるケトアミノ酸のｉｎ ｖｉｖｏ蛋白質組込みを誘導する。場合により、本発明の組成物はｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳系に導入してもよいし、ｉｎ ｖｉｖｏ系に導入してもよい。
本発明の細胞は非天然アミノ酸を組込んだ蛋白質を大量の有用な量で合成することができる。１側面では、組成物は場合により、ケトアミノ酸を含む蛋白質を例えば少なくとも
１０μｇ、少なくとも５０μｇ、少なくとも７５μｇ、少なくとも１００μｇ、少なくとも２００μｇ、少なくとも２５０μｇ、少なくとも５００μｇ、少なくとも１ｍｇ、少なくとも１０ｍｇ以上、又はｉｎ ｖｉｖｏ蛋白質生産方法で達成可能な量で含有する（組換え蛋白質生産及び精製に関する詳細は本明細書に記載する）。別の側面では、蛋白質は場合により例えば細胞溶解液、緩衝液、医薬緩衝液、又は他の懸濁液中（例えば約１ｎｌ〜約１００Ｌの任意の容量中）に例えば少なくとも１０μｇ蛋白質／ｌ、少なくとも５０μｇ蛋白質／ｌ、少なくとも７５μｇ蛋白質／ｌ、少なくとも１００μｇ蛋白質／ｌ、少なくとも２００μｇ蛋白質／ｌ、少なくとも２５０μｇ蛋白質／ｌ、少なくとも５００μｇ蛋白質／ｌ、少なくとも１ｍｇ蛋白質／ｌ、又は少なくとも１０ｍｇ蛋白質／ｌ以上の濃度で組成物中に存在する。少なくとも１種のケトアミノ酸を組込んだ蛋白質の細胞における大量（例えば他の方法、例えばｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳で一般に可能な量よりも多量）の生産も本発明の特徴である。
ケトアミノ酸の組込みは例えば寸法、酸性度、求核性、水素結合、疎水性、プロテアーゼ標的部位接近性等を改変するように例えば蛋白質構造及び／又は機能を調整するために実施することができる。ケトアミノ酸を含む蛋白質は触媒性又は物性を強化するか又は全く新規にすることができる。例えば、ケトアミノ酸を蛋白質に組込むことにより、場合により毒性、生体分布、構造的性質、分光学的性質、化学及び／又は光化学的性質、触媒能、半減期（例えば血清半減期）、他の分子との（例えば共有又は非共有）反応性等の性質を改変する。少なくとも１種のケトアミノ酸を組込んだ蛋白質を含む組成物は例えば新規治療、診断、触媒酵素、産業用酵素、結合蛋白質（例えば抗体）、及び例えば蛋白質構造と機能の研究に有用である。例えばＤｏｕｇｈｅｒｔｙ，（２０００） Ｕｎｎａｔｕｒａｌ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄｓ ａｓ Ｐｒｏｂｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ，４：６４５−６５２参照。
本発明の１側面では、組成物は少なくとも１個、例えば少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、又は１１個以上の非天然アミノ酸、例えばケトアミノ酸及び／又は他の非天然アミノ酸を組込んだ少なくとも１種の蛋白質を含む。非天然アミノ酸は同一でも異なっていてもよく、例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０種以上の異なる非天然アミノ酸を含む１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０個以上の異なる部位が蛋白質に存在することができる。別の側面では、組成物は蛋白質に存在する特定アミノ酸の全部よりは少ないが少なくとも１種をケトアミノ酸で置換した蛋白質を含む。２個以上の非天然アミノ酸を組込んだ所与蛋白質では、非天然アミノ酸は同一でも異なっていてもよい（例えば蛋白質は２種以上の異なる型の非天然アミノ酸を組込んでもよいし、２個の同一非天然アミノ酸を組込んでもよい）。３個以上の非天然アミノ酸を組込んだ所与蛋白質では、非天然アミノ酸は同一でも異なっていてもよいし、同一種の複数の非天然アミノ酸と少なくとも１種の別の非天然アミノ酸の組み合わせでもよい。
ケトアミノ酸（及び例えば１個以上のセレクターコドンを含む対応する任意コーディング核酸）を組込んだほぼ任意蛋白質（又はその部分）は本明細書に記載する組成物と方法を使用して生産することができる。数十万種の公知蛋白質を同定しようとするのではなく、例えば該当翻訳系に１個以上の適当なセレクターコドンを組込むように利用可能な任意突然変異法を調整することにより、１種以上の非天然アミノ酸を組込むように公知蛋白質の任意のものを改変することができる。公知蛋白質の一般的な配列寄託機関としてはＧｅｎＢａｎｋ、ＥＭＢＬ、ＤＤＢＪ及びＮＣＢＩが挙げられる。他の寄託機関もインターネットを検索することにより容易に確認できる。
一般に、蛋白質は入手可能な任意蛋白質（例えば治療用蛋白質、診断用蛋白質、産業用酵素、又はその部分等）と例えば少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は少なくとも９９％以上一致し、１種以上のケトアミノ酸を含む。１種以上のケトアミノ酸を組込むために修飾することができる治療用、診断用、及び他の蛋白質の例は限定されないが、ＷＯ２００２／０８５９２３，前出に記載されている。１種以上のケトアミノ酸を組込むために修飾することができる治療用、診断用、及び他の蛋白質の例は限定されないが、例えばα１アンチトリプシン、アンジオスタチン、抗血友病因子、抗体（抗体の詳細については後述する）、アポリポ蛋白質、アポ蛋白質、心房性ナトリウム利尿因子、心房性ナトリウム利尿ポリペプチド、心房性ペプチド、Ｃ−Ｘ−Ｃケモカイン（例えばＴ３９７６５、ＮＡＰ−２、ＥＮＡ−７８、Ｇｒｏ−ａ、Ｇｒｏ−ｂ、Ｇｒｏ−ｃ、ＩＰ−１０、ＧＣＰ−２、ＮＡＰ−４、ＳＤＦ−１、ＰＦ−４、ＭＩＧ）、カルシトニン、ＣＣケモカイン（例えば単球化学誘引蛋白質−１、単球化学誘引蛋白質−２、単球化学誘引蛋白質−３、単球炎症性蛋白質−１α、単球炎症性蛋白質−１β、ＲＡＮＴＥＳ、Ｉ３０９、Ｒ８３９１５、Ｒ９１７３３、ＨＣＣ１、Ｔ５８８４７、Ｄ３１０６５、Ｔ６４２６２）、ＣＤ４０リガンド、Ｃキットリガンド、コラーゲン、コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、補体因子５ａ、補体阻害剤、補体受容体１、サイトカイン（例えば上皮好中球活性化ペプチド−７８、ＧＲＯα／ＭＧＳＡ、ＧＲＯβ、ＧＲＯγ、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１δ、ＭＣＰ−１）、表皮増殖因子（ＥＧＦ）、エリスロポエチン（「ＥＰＯ」、１種以上の非天然アミノ酸の組込みによる改変の好適ターゲット）、表皮剥離毒素Ａ及びＢ、ＩＸ因子、ＶＩＩ因子、ＶＩＩＩ因子、Ｘ因子、繊維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、フィブリノーゲン、フィブロネクチン、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、グルコセレブロシダーゼ、ゴナドトロピン、増殖因子、ヘッジホッグ蛋白質（例えばソニック、インディアン、デザート）、ヘモグロビン、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、ヒルジン、ヒト血清アルブミン、インスリン、インスリン様増殖因子（ＩＧＦ）、インターフェロン（例えばＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−γ）、インターロイキン（例えばＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２等）、ケラチノサイト増殖因子（ＫＧＦ）、ラクトフェリン、白血病阻害因子、ルシフェラーゼ、ニュールチュリン、好中球阻害因子（ＮＩＦ）、オンコスタチンＭ、骨形成蛋白質、副甲状腺ホルモン、ＰＤ−ＥＣＳＦ、ＰＤＧＦ、ペプチドホルモン（例えばヒト増殖ホルモン）、プレイオトロピン、プロテインＡ、プロテインＧ、発熱外毒素Ａ、Ｂ及びＣ、リラキシン、レニン、ＳＣＦ、可溶性補体受容体Ｉ、可溶性Ｉ−ＣＡＭ１、可溶性インターロイキン受容体（ＩＬ−１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５）、可溶性ＴＮＦ受容体、ソマトメジン、ソマトスタチン、ソマトトロピン、ストレプトキナーゼ、スーパー抗原即ちブドウ球菌エンテロトキシン（ＳＥＡ、ＳＥＢ、ＳＥＣ１、ＳＥＣ２、ＳＥＣ３、ＳＥＤ、ＳＥＥ）、スーパーオキシドジスムターゼ、毒素性ショック症候群毒素（ＴＳＳＴ−１）、チモシンα１、組織プラスミノーゲンアクチベーター、腫瘍壊死因子β（ＴＮＦβ）、腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦＲ）、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＥＦ）、ウロキナーゼ等が挙げられる。
本明細書に記載するケトアミノ酸ｉｎ ｖｉｖｏ組込み用組成物及び方法を使用して生産することができる蛋白質の１類としては転写モジュレーターとその一部が挙げられる。転写モジュレーターの例としては細胞増殖、分化、制御等を調節する遺伝子及び転写モジュレーター蛋白質が挙げられる。転写モジュレーターは原核生物、ウイルス及び真核生物（例えば真菌類、植物、酵母、昆虫、及び哺乳動物を含む動物）に存在し、広範な治療ターゲットを提供する。自明の通り、発現及び転写アクチベーターは例えば受容体との結合、シグナル導入カスケードの刺激、転写因子の発現調節、プロモーターやエンハンサーとの結合、プロモーターやエンハンサーと結合する蛋白質との結合、ＤＮＡ巻き戻し、プレｍＲＮＡスプライシング、ＲＮＡポリアデニル化及びＲＮＡ分解等の多数のメカニズムにより転写を調節する。
本発明の蛋白質（例えば１種以上のケトアミノ酸を組込んだ蛋白質）の１類としては発現アクチベーター（例えばサイトカイン、炎症性分子、増殖因子、その受容体、及び腫瘍遺伝子産物、例えばインターロイキン（例えばＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−８等）、インターフェロン、ＦＧＦ、ＩＧＦ−Ｉ、ＩＧＦ−ＩＩ、ＦＧＦ、ＰＤＧＦ、ＴＮＦ、ＴＧＦ−α、ＴＧＦ−β、ＥＧＦ、ＫＧＦ、ＳＣＦ／ｃ−キット、ＣＤ４０Ｌ／ＣＤ４０、ＶＬＡ−４／ＶＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−１／ＬＦＡ−１及びヒアルリン／ＣＤ４４）と、シグナル伝達分子及び対応する腫瘍遺伝子産物（例えばＭｏｓ、Ｒａｓ、Ｒａｆ及びＭｅｔ）と、転写アクチベーター及びサプレッサー（例えばｐ５３、Ｔａｔ、Ｆｏｓ、Ｍｙｃ、Ｊｕｎ、Ｍｙｂ、Ｒｅｌ、及びステロイドホルモン受容体（例えばエストロゲン、プロゲステロン、テストステロン、アルドステロン、ＬＤＬ受容体リガンド及びコルチコステロン））が挙げられる。
少なくとも１種のケトアミノ酸を組込んだ酵素（例えば産業用酵素）又はその部分も本発明により提供される。酵素の例としては限定されないが、例えばアミダーゼ、アミノ酸ラセマーゼ、アシラーゼ、デハロゲナーゼ、ジオキシゲナーゼ、ジアリールプロパンペルオキシダーゼ、エピメラーゼ、エポキシドヒドロラーゼ、エステラーゼ、イソメラーゼ、キナーゼ、グルコースイソメラーゼ、グリコシダーゼ、グリコシルトランスフェラーゼ、ハロペルオキシダーゼ、モノオキシゲナーゼ（例えばｐ４５０）、リパーゼ、リグニンペルオキシダーゼ、ニトリルヒドラターゼ、ニトリラーゼ、プロテアーゼ、ホスファターゼ、スブチリシン、トランスアミナーゼ及びヌクレアーゼが挙げられる。
ケトアミノ酸を組込むことができる多数の蛋白質が市販されており（例えばＳｉｇｍａ
ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓ ２００２カタログ及び価格表参照）、対応する蛋白質配列と遺伝子及び、一般に多くのその変異体は周知である（例えばＧｅｎｅｂａｎｋ参照）。例えば１種以上の該当治療、診断又は酵素特性に関して蛋白質を改変するように本発明に従って１種以上のケトアミノ酸を挿入することにより前記蛋白質の任意のものを改変することができる。治療関連特性の例としては血清半減期、貯蔵半減期、安定性、免疫原性、治療活性、（例えば非天然アミノ酸（例えばケトアミノ酸）へのレポーター基（例えばラベル又はラベル結合部位）の付加による）検出性、ＬＤ５０又は他の副作用の低減、経胃体内導入性（例えば経口利用性）等が挙げられる。診断関連特性の例としては貯蔵半減期、安定性、診断活性、検出性、特異性等が挙げられる。該当酵素特性の例としては貯蔵半減期、安定性、酵素活性、産生能、特異性等が挙げられる。
他の各種蛋白質も本発明の１種以上のケトアミノ酸を組込むように改変することができる。例えば、本発明は１種以上のワクチン蛋白質の１種以上の天然アミノ酸をケトアミノ酸で置換することができ、このような蛋白質は例えば感染性真菌（例えばＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ、Ｃａｎｄｉｄａ種）；細菌、特に病原細菌モデルとして利用できる大腸菌や医学的に重要な細菌（例えばＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｉ（例えばａｕｒｅｕｓ）又はＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｉ（例えばｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ））；原生動物（例えば胞子虫類（例えばＰｌａｓｍｏｄｉａ）、根足虫類（例えばＥｎｔａｍｏｅｂａ）及び鞭毛虫類（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ、Ｔｒｉｃｈｏｍｏｎａｓ、Ｇｉａｒｄｉａ等））；ウイルス（例えば（＋）ＲＮＡウイルス（例えばポックスウイルス（例えばワクシニア）、ピコルナウイルス（例えばポリオ）、トガウイルス（例えば風疹）、フラビウイルス（例えばＨＣＶ）、及びコロナウイルス）、（−）ＲＮＡウイルス（例えばラブドウイルス（例えばＶＳＶ）、パラミクソウイルス（例えばＲＳＶ）、オルトミクソウイルス（例えばインフルエンザ）、ブンヤウイルス及びアレナウイルス）、ｄｓＤＮＡウイルス（例えばレオウイルス）、ＲＮＡ→ＤＮＡウイルス（即ちレトロウイルス、例えばＨＩＶ及びＨＴＬＶ）、及び所定のＤＮＡ→ＲＮＡウイルス（例えばＢ型肝炎））に由来する。
昆虫耐性蛋白質（例えばＣｒｙ蛋白質）、澱粉及び脂質産生酵素、植物及び昆虫毒素、毒素耐性蛋白質、マイコトキシン解毒蛋白質、植物成長酵素（例えばリブロース１，５−ビスリン酸カルボキシラーゼ／オキシゲナーゼ、「ＲＵＢＩＳＣＯ」）、リポキシゲナーゼ（ＬＯＸ）及びホスホエノールピルビン酸（ＰＥＰ）カルボキシラーゼ等の農業関連蛋白質もケトアミノ酸修飾に適切なターゲットである。
所定態様では、本発明の方法及び／又は組成物における該当蛋白質又はポリペプチド（又はその部分）は核酸によりコードされる。一般に、核酸は少なくとも１個のセレクターコドン、少なくとも２個のセレクターコドン、少なくとも３個のセレクターコドン、少なくとも４個のセレクターコドン、少なくとも５個のセレクターコドン、少なくとも６個のセレクターコドン、少なくとも７個のセレクターコドン、少なくとも８個のセレクターコドン、少なくとも９個のセレクターコドン、１０個以上のセレクターコドンを含む。
該当蛋白質又はポリペプチドをコードする遺伝子は本明細書の「突然変異誘発及び他の分子生物学技術」のセクションに記載する当業者に周知の方法を使用して例えばケトアミノ酸を組込むための１個以上のセレクターコドンを付加するように突然変異誘発することができる。例えば、１個以上のセレクターコドンを付加するように該当蛋白質の核酸を突然変異誘発し、１種以上のケトアミノ酸を挿入できるようにする。本発明は例えば少なくとも１種のケトアミノ酸を組込んだ任意蛋白質のこのような任意変異体（例えば突然変異体、変形）を含む。同様に、本発明は対応する核酸、即ち１種以上のケトアミノ酸をコードする１個以上のセレクターコドンを組込んだ任意核酸も含む。
ケトアミノ酸を組込んだ蛋白質を生産するためには、直交ｔＲＮＡ／ＲＳ対によるケトアミノ酸のｉｎ ｖｉｖｏ組込みに適した宿主細胞及び生物を使用することができる。直交ｔＲＮＡ、直交ｔＲＮＡシンテターゼ、及び誘導体化すべき蛋白質をコードするベクターを発現する１種以上のベクターで宿主細胞を遺伝子組換え（例えば形質転換、形質導入又はトランスフェクション）する。これらの成分の各々を同一ベクターに配置してもよいし、各々別々のベクターに配置してもよいし、２成分を第１のベクターに配置し、第３の成分を第２のベクターに配置してもよい。ベクターは例えばプラスミド、細菌、ウイルス、裸のポリヌクレオチド又はポリヌクレオチドコンジュゲートの形態とすることができる。
〔免疫反応性によるポリペプチドの定義〕
本発明のポリペプチドは（例えば本明細書に記載する翻訳系で合成される蛋白質の場合にはケトアミノ酸を含み、又は例えば新規シンテターゼの場合には標準アミノ酸の新規配列を含む）種々の新規ポリペプチドを提供するので、ポリペプチドは例えばイムノアッセイで認識することができる新規構造特徴も提供する。本発明のポリペプチドに特異的に結合する抗血清の作製と、このような抗血清に結合するポリペプチドも本発明の特徴である。本明細書で使用する「抗体」なる用語は限定されないが、検体（抗原）と特異的に結合してこれを認識する１又は複数の免疫グロブリン遺伝子又はそのフラグメントにより実質的にコードされるポリペプチドを意味する。例えばポリクローナル、モノクローナル、キメラ、及び１本鎖抗体等が挙げられる。Ｆａｂフラグメントやファージディスプレイを含む発現ライブラリーにより生産されるフラグメント等の免疫グロブリンフラグメントも本明細書で使用する「抗体」なる用語に含まれる。抗体構造及び用語については、例えばＰａｕｌ，Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，４ｔｈ Ｅｄ．，１９９９，Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ参照。
イムノアッセイ用抗血清を作製するためには、免疫原性ポリペプチドの１種以上を本明細書に記載するように作製し、精製する。例えば、組換え蛋白質を組換え細胞で生産する
ことができる。（マウスの仮想遺伝子一致により結果の再現性が高いのでこのアッセイで使用する）近交系マウスに標準アジュバント（例えばフロイントアジュバント）と共に免疫原性蛋白質を標準マウス免疫プロトコールに従って免疫する（抗体作製、イムノアッセイフォーマット及び特異的免疫反応性を測定するために使用可能な条件の標準解説については例えばＨａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ（１９８８）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ参照。蛋白質、抗体、抗血清等に関するその他の詳細はＷＯ２００２／０８５９２３，前出に記載されている。
〔キット〕
キットも本発明の特徴である。例えば、少なくとも１種のケトアミノ酸を含む蛋白質を細胞で生産するためのキットが提供され、キットはＯ−ｔＲＮＡをコードするポリヌクレオチド配列、及び／又はＯ−ｔＲＮＡ、及び／又はＯ−ＲＳをコードするポリヌクレオチド配列、及び／又はＯ−ＲＳを含む。１態様では、キットは更にケトアミノ酸を含む。別の態様では、キットは更に蛋白質を生産するための説明書を含む。
以下、実施例により本発明を例証するが、これらの実施例により本発明を限定するものではない。当然のことながら、本明細書に記載する実施例及び態様は例証の目的に過ぎず、これらの記載に鑑みて種々の変形又は変更が当業者に想到され、このような変形又は変更も本願の精神及び範囲と特許請求の範囲に含むものとする。
〔ケトアミノ酸の部位特異的蛋白質組込み〕
カルボニル基は有機化学で最も万能な官能基であるが、遺伝的にコードされるアミノ酸には存在しない。蛋白質生合成のこの自然の制約を解決するために、アンバーナンセンスコドンに応答して高い翻訳忠実度でケトアミノ酸であるｐ−アセチル−Ｌ−フェニルアラニンを大腸菌で蛋白質にｉｎ ｖｉｖｏ組込むことができる直交ｔＲＮＡ−シンテターゼ対を開発した。この新規アミノ酸の有用性を立証するために、小分子フルオロフォア及びビオチン誘導体で蛋白質を選択的にｉｎ ｖｉｔｒｏ修飾した。この遺伝的にコードされる新規アミノ酸はｉｎ ｖｉｔｒｏ及び生きた細胞の両者で蛋白質構造及び機能の操作能を大幅に拡張すると思われる。
全公知生物の遺伝コードは蛋白質生合成の構成単位として同一の２０種の標準アミノ酸をコードする。これらのアミノ酸（稀なケースではセレノシステイン（例えばＢｏｃｋ，Ａ．，Ｆｏｒｃｈｈａｍｍｅｒ，Ｋ．，Ｈｅｉｄｅｒ，Ｊ．，Ｌｅｉｎｆｅｌｄｅｒ，Ｗ．，Ｓａｗｅｒｓ，Ｇ．，Ｖｅｐｒｅｋ，Ｂ．＆ Ｚｉｎｏｎｉ，Ｆ．（１９９１）Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５：５１５−５２０参照）又はピロリジン（例えばＳｒｉｎｉｖａｓａｎ，Ｇ．，Ｊａｍｅｓ，Ｃ．Ｍ．＆ Ｋｒｚｙｃｋｉ，Ｊ．Ａ．（２００２）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９６：１４５９−１４６２；Ｈａｏ，Ｂ．，Ｇｏｎｇ，Ｗ．，Ｆｅｒｇｕｓｏｎ，Ｔ．Ｋ．，Ｊａｍｅｓ，Ｃ．Ｍ．，Ｋｒｚｙｃｋｉ，Ｊ．Ａ．＆ Ｃｈａｎ，Ｍ．Ｋ．（２００２）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９６：１４６２−１４６６参照）も含む）の側鎖は驚くほど少数の官能基−−窒素塩基、カルボン酸及びアミド、アルコール及びチオール基と、残余の単純なアルカン又は疎水性基からなる。遺伝的にコードされるアミノ酸に新規アミノ酸（例えば金属キレート性、蛍光、レドックス活性、光活性又はスピン標識側鎖をもつアミノ酸）を付加することができるならば、蛋白質及び恐らく生体自体の構造と機能の操作能が著しく広がると考えられる。最近、大腸菌の翻訳機構に新規成分を付加することにより、多数の非天然アミノ酸を高い忠実度で蛋白質に部位特異的にｉｎ ｖｉｖｏ組込むことができたと報告された。例えばＷａｎｇ，Ｌ．，Ｂｒｏｃｋ，Ａ．，Ｈｅｒｂｅｒｉｃｈ，Ｂ．＆ Ｓｃｈｕｌｔｚ，Ｐ．Ｇ．（２００１）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９２：４９８−５００；Ｗａｎｇ，Ｌ．，Ｂｒｏｃｋ，Ａ．＆ Ｓｃｈｕｌｔｚ，Ｐ．Ｇ．（
２００２）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２４：１８３６−１８３７；及びＺｈａｎｇ，Ｚ．，Ｗａｎｇ，Ｌ．，Ｂｒｏｃｋ，Ａ．＆ Ｓｃｈｕｌｔｚ，Ｐ．Ｇ．（２００２）Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．４１：２８４０−２８４２参照。このアプローチは例えば大腸菌の遺伝コードにケト含有アミノ酸を付加するように一般化することができ、ケト基のユニークな反応性を使用して多用な物質で蛋白質を選択的にｉｎ ｖｉｔｒｏ修飾することができる。
ケト基は有機化学で遍在性であり、付加反応や脱炭酸反応からアルドール縮合に至る多数の反応に関与している。更に、カルボニル基のユニークな反応性により、他のアミノ酸側鎖の存在下にヒドラジド及びヒドロキシルアミン誘導体で選択的に修飾することができる。例えばＣｏｒｎｉｓｈ，Ｖ．Ｗ．，Ｈａｈｎ，Ｋ．Ｍ．＆ Ｓｃｈｕｌｔｚ，Ｐ．Ｇ．（１９９６）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１８：８１５０−８１５１；Ｇｅｏｇｈｅｇａｎ，Ｋ．Ｆ．＆ Ｓｔｒｏｈ，Ｊ．Ｇ．（１９９２）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．Ｃｈｅｍ．３：１３８−１４６；及びＭａｈａｌ，Ｌ．Ｋ．，Ｙａｒｅｍａ，Ｋ．Ｊ．＆ Ｂｅｒｔｏｚｚｉ，Ｃ．Ｒ．（１９９７）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７６：１１２５−１１２８参照。この重要な官能基は補因子（例えばＢｅｇｌｅｙ，Ｔ．Ｐ．，Ｋｉｎｓｌａｎｄ，Ｃ．，Ｔａｙｌｏｒ，Ｓ．，Ｔａｎｄｏｎ，Ｍ．，Ｎｉｃｅｗｏｎｇｅｒ，Ｒ．，Ｗｕ，Ｍ．，Ｃｈｉｕ，Ｈ．，Ｋｅｌｌｅｈｅｒ，Ｎ．，Ｃａｍｐｏｂａｓｓｏ，Ｎ．＆ Ｚｈａｎｇ，Ｙ．（１９９７）ｉｎ Ｔｏｐ．Ｃｕｒｒ．Ｃｈｅｍ．，ｅｄｓ．Ｌｅｅｐｅｒ，Ｆ．Ｊ．＆ Ｖｅｄｅｒａｓ，Ｊ．Ｃ．（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ），Ｖｏｌ．１９５，ｐｐ．９３−１４２参照）や代謝産物（例えばＤｉａｚ，Ｅ．，Ｆｅｒｒａｎｄｅｚ，Ａ．，Ｐｒｉｅｔｏ，Ｍ．Ａ．＆ Ｇａｒｃｉａ，Ｊ．Ｌ．（２００１）Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．６５：５２３−５６９参照）に存在し、更に蛋白質の翻訳後修飾基として（例えばＯｋｅｌｅｙ，Ｎ．Ｍ．＆ ｖａｎ
ｄｅｒ Ｄｏｎｋ，Ｗ．Ａ．（２０００）Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．７，Ｒ１５９−Ｒ１７１参照）存在するが、標準アミノ酸の側鎖には存在しない。この官能基を大腸菌でｐ−アセチル−Ｌ−フェニルアラニンとして遺伝的にコードするために、アンバーナンセンスコドンに応答してこのアミノ酸を大腸菌で蛋白質に部位特異的に挿入することが可能なｔＲＮＡ−シンテターゼを開発した。重要な点として、このｔＲＮＡ−シンテターゼ対は２０種の標準アミノ酸のその対応部分に直交性であり、即ち、直交シンテターゼは直交ｔＲＮＡを非天然アミノ酸でのみアミノアシル化し、得られるアシル化ｔＲＮＡはアンバーコドンのみに応答して非天然アミノ酸を挿入する。
〔材料と方法〕
ｐ−アセチル−Ｌ−フェニルアラニンの製造：Ｆｍｏｃ−４−アセチル−Ｌ−フェニルアラニンをＲＳＰ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄ Ａｎａｌｏｇｕｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｗｏｒｃｅｓｔｅｒ，ＭＡ）から購入した。この化合物（１．０ｇ，２．３ｍｍｏｌ）にピペリジン４ｍＬ（ＤＭＦ中２０％）を加えて２時間室温で撹拌した。溶媒を蒸発させると、白色粉末が得られた。次に、固形分を冷水（０．１％ＴＦＡ）１０ｍＬに再懸濁し、上清を濾取した。分取逆相ＨＰＬＣ（Ｍｉｃｒｏｓｏｒｂ Ｃ１８，Ｒａｉｎｉｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ Ｃｏ．，Ｉｎｃ．，Ｗｏｂｕｒｎ，ＭＡ）を使用して所望生成物を反応混合物から分離した（０．１％ＴＦＡ添加Ｈ２Ｏ中５→３０％ＣＨ３ＣＮを使用して３０分間）。溶出液（ｔＲ＝１２分）を凍結乾燥すると、白色固体が得られた（０．４５ｇ，８８％）。１Ｈ ＮＭＲ（Ｄ２０）：δ７．８５−７．２８（ｍ，４Ｈ），４．２３（ｄｄ，１Ｈ，５．４Ｈｚ），３．２（ｍ，２Ｈ），２．７（ｓ，３Ｈ）。ＬＲＭＳ，Ｃ１１Ｈ１３ＮＯ３計算値（Ｍ＋＋１）：２０８．０９。実測値（ＥＳＩ）：２０８．４７。
ｐ−アセチル−（±）−フェニルアラニンの合成：例えばＣｌｅｌａｎｄ，Ｇ．Ｈ．（１９６９）Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．３４：７４４−７４７参照。ＮＢＳ（Ｎ−ブロモスクシンイミド）を使用前に再結晶させた。ＮＢＳ（１８．５ｇ，１０５ｍｍｏｌ）を４−メ
チルアセトフェノン（１３．４ｇ，１００ｍｍｏｌ）の四塩化炭素（４００ｍＬ）溶液に撹拌下に加えた後、ＡＩＢＮ（２’，２’−アゾビスイソブチロニトリル）（０．４３ｇ，２．５ｍｍｏｌ）を加えた。次に反応混合物を４時間加熱還流した。反応（ＴＬＣ：８：１／ヘキサン：ＥｔＯＡｃ）の完了後、溶液を水（１×１００ｍＬ）、１ＭＨＣｌ水溶液（３×１００ｍＬ）、０．５％ＮａＨＣＯ３水溶液（３×１００ｍＬ）及びブライン（１×１００ｍＬ）で洗浄した。有機層を合わせて無水ＭｇＳＯ４で乾燥し、溶媒を蒸発させると、黄色固体が得られ、ヘキサンで再結晶させると、所望１−（４−ブロモエチル−フェニル）エタノンが固体として得られた（１６．８ｇ，７８％）。ペンタンで洗浄したナトリウム片（２．３ｇ，０．１ｍｏｌ）に無水エタノール（５０ｍｌ）をアルゴン雰囲気下で１５分間滴下し、溶液を更に１５分間撹拌した。次に固体アセトアミドマロン酸ジエチル（２．７ｇ，１０ｍｍｏｌ）を撹拌下に３０分間加えた後に、無水エタノール中１−（４−ブロモエチル−フェニル）エタノン（２．１ｇ，１０ｍｍｏｌ）を９０分間滴下した。混合物を一晩加熱還流し、冷却した後、ジエチルエーテル（１５０ｍＬ）と水（１００ｍＬ）を溶液に加えた。有機層を分離し、０．５％ＮａＨＣＯ３（３×１００ｍＬ）とブライン（１×１００ｍＬ）で順次洗浄した。無水ＭｇＳＯ４で乾燥後、溶媒を減圧除去すると、茶色ガム状固体が得られた。ヘキサン−ジクロロメタン（４：１）を残渣に加え、不溶性材料を濾別し、１０：１ジクロロメタン−ベンゼンで十分に洗浄すると、２−アセチルアミノ−２−（４−アセチル−ベンジル）マロン酸ジエチルエステルが黄色固体として得られた（３．３ｇ，９５％粗収率）。この化合物にジオキサン中４Ｍ ＨＣｌを加えて一晩撹拌した。次に混合物を蒸発乾涸し、水で再結晶させると、ｐ−アセチル−（±）−フェニルアラニン（１３．２ｇ，６４％総収率）が白色固体として得られた。１ＨＮＭＲ（４００ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ）：δ７．８５−７．２８（ｍ，４Ｈ），４．２７（ｄｄ，１Ｈ，５．４ＨＺ），３．３０（ｍ，２Ｈ），２．６８（ｓ，３Ｈ）。１３Ｃ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ）：δ１９５．８，１７４．３，１４５．９，１３３．１，１２８．９，１２７．８，６０．２，３８．３，２６．５。ＬＲＭＳ，Ｃ１１Ｈ１３ＮＯ３計算値（Ｍ＋＋１）：２０８．０９。実測値（ＥＳＩ）：２０８．０７。
突然変異体シンテターゼ進化：従来記載されている通りに１ｍＭ ｐ−アセチル−Ｌ−フェニルアラニンの存在下にポジティブ選択を実施した。例えばＷａｎｇ，Ｌ．，Ｂｒｏｃｋ，Ａ．，Ｈｅｒｂｅｒｉｃｈ，Ｂ．＆ Ｓｃｈｕｌｔｚ，Ｐ．Ｇ．（２００１）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９２：４９８−５００参照。ネガティブ選択には、プラスミドｐＬＷＪ１７Ｂ３を使用してｌｐｐプロモーターとｒｒｎＣターミネーターの制御下にｍｕｔＲＮＡＴｙｒ ＣＵＡ（本明細書では「ｍｕｔＲＮＡＴｙｒ」と呼ぶ）を発現させ、アラビノースプロモーターの制御下にＧｌｎ２、Ａｓｐ４４、及びＧｌｙ６５に３個のアンバーコドンをもつバルナーゼ遺伝子を発現させた。クロラムフェニコールでポジティブ選択後に、突然変異体ＴｙｒＲＳをコードするｐＢＫプラスミドを単離し、ｐＬＷＪ１７Ｂ３を組込んだ大腸菌ＤＨ１０Ｂコンピテント細胞に形質転換した。０．２％アラビノース、５０μｇ／ｍｌカナマイシン、及び３５μｇ／ｍｌクロラムフェニコールを添加したＬＢ（Ｌｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ）プレートで細胞を増殖させた。８時間後に細胞をプレートから取出し、ｐＢＫプラスミドを更に数回の選択で精製した。３回のポジティブ選択と２回のネガティブ選択を交互に行った後に、ｐ−アセチル−Ｌ−フェニルアラニンの不在下で９μｇ／ｍｌクロラムフェニコールと、ｐ−アセチル−Ｌ−フェニルアラニンの存在下で１２０μｇ／ｍｌクロラムフェニコールのＩＣ５０値を示す１１個の突然変異体ＴｙｒＲＳが同定された。各突然変異体ＴｙｒＲＳのコドン使用は異なるが、これらの突然変異体ＴｙｒＲＳの蛋白質配列は３個の独立クローンＬＷ１、ＬＷ５及びＬＷ６で収束した。
蛋白質発現及び精製：プラスミドｐＬＥＩＺを使用してバクテリオファージＴ５プロモーターとｔ０ターミネーターの制御下に７位にアンバーコドンとＣＯＯＨ末端Ｈｉｓ６タグをもつＺドメイン遺伝子を発現させ、ｌｐｐプロモーターとｒｒｎＣターミネーターの制御下にｍｕｔＲＮＡＴｙｒ ＣＵＡ遺伝子を発現させた。クローンＬＷ１から単離された突然変異体シンテターゼ遺伝子（ＬＷ１ＲＳ）は構成的大腸菌ＧｌｎＲＳプロモーター及
びターミネーターの制御下にプラスミドｐＢＫＬＷ１ＲＳでコードされた。１％グリセロールと０．３ｍＭロイシンを含有する最少培地（ＧＭＭＬ培地）に２５μｇ／ｍＬカナマイシン、３４μｇ／ｍＬクロラムフェニコール、及び１．０ｍＭ ｐ−アセチル−（±）−フェニルアラニンを添加し、ｐＬＥＩＺとｐＢＫ−ＬＷ１ＲＳで共形質転換した大腸菌ＤＨ１０Ｂ細胞を増殖させた。細胞がＯＤ６００＝０．５に達したら、イソプロピル−ｐ−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）（１ｍＭ）を添加して蛋白質発現を誘導した。５時間後に細胞をペレット化し、製造業者のプロトコール（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）に従って変性条件下に蛋白質をＮｉ２＋アフィニティークロマトグラフィーにより精製した。次に蛋白質をＰＤ−１０カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）で脱塩し、水中溶出させた。蛋白質収率をブラッドフォードアッセイ（ＢＣＡ ｋｉｔ，Ｂｉｏｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）により測定した。蛋白質アリコートをＳＤＳ−ＰＡＧＥと質量分析に使用した。
フルオレセインヒドラジドとビオチンヒドラジドによるｉｎ ｖｉｔｒｏ蛋白質修飾：精製ｗｔ及び突然変異体Ｚドメイン蛋白質を１×ＰＢＳ緩衝液（１００ｍＭリン酸カリウム，ｐＨ６．５，０．５Ｍ塩化ナトリウム）で透析により交換した。フルオレセインヒドラジド１（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）又はビオチンヒドラジド２（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）をＤＭＦに溶かし、シランコーティングエッペンドルフチューブに入れた各蛋白質０．５ｍｇに終濃度１ｍＭまで添加した。最終容量０．５ｍｌまでＰＢＳ緩衝液（ｐＨ６．５）を加えた。反応混合物を２５℃に１８時間維持した。ＰＤ−１０カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）を使用して未反応色素又はビオチンを蛋白質から除去し、蛋白質を１×ＰＢＳ緩衝液で溶出させた。標識効率を測定するために、標識用反応溶液をまずＰＤ−１０カラムで脱塩し、蛋白質をＰＢＳ緩衝液で溶出させた。次に蛋白質試料を逆相ＨＰＬＣにより分析した（Ａｇｉｌｅｎｔ ＺＯＲＢＡＸ ＳＢ−Ｃ１８，４．６ｍｍ×２５０ｍｍ，流速１．０ｍＬ／分，５０ｍＭ ＴＥＡＡ水溶液，ｐＨ７．０中１０→４０％ＣＨ３ＣＮを使用して７０分間）。無標識突然変異体Ｚドメインの保持時間（ｔＲ）は３９．３分であり、フルオレセインヒドラジド標識突然変異体ＺドメインのｔＲは４０．７分であり、ビオチンヒドラジド標識突然変異体ＺドメインのｔＲは４０．９分であった。
蛍光スペクトル測定：全蛍光発光スペクトルは励起４９０ｎｍ；夫々励起及び発光帯域４ｎｍ及び４ｎｍ；ＰＭＴ電圧９５０Ｖ；及び走査速度１ｎｍ／秒でＦｌｕｏｒｏＭａｘ−２フルオロメーターを使用して記録した。各標識蛋白質１０ｎｇを使用した。報告するスペクトルは３回の走査の平均を表す。
〔結果〕
ケトアミノ酸：ケト基はカルボニル基又は酸性Ｃα位への付加反応に関与することができるため、２０種の標準アミノ酸には存在しないユニークな化学反応性を提供する。この基は多様な化学試薬による蛋白質の選択的修飾で天然アミノ酸システインに代用できる。システインの反応性チオール基は種々の生体物理学的プローブを蛋白質に結合するために広く使用されている。例えばＣｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｔ．Ｅ．（１９８６）Ｍｅｔｈｏｄｓ
Ｅｎｚｙｍｏｌ．１３１：８３−１０６；Ａｌｔｅｎｂａｃｈ，Ｃ．，Ｍａｒｔｉ，Ｔ．，Ｋｈｏｒａｎａ，Ｈ．Ｇ．＆ Ｈｕｂｂｅｌｌ，Ｗ．Ｌ．（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４８：１０８８−９２；Ｂｒｉｎｋｌｅｙ，Ｍ．（１９９２）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．Ｃｈｅｍ．３：２−１３；Ｇｉｕｌｉａｎｏ，Ｋ．Ａ．，Ｐｏｓｔ，Ｐ．Ｌ．，Ｈａｈｎ，Ｋ．Ｍ．＆ Ｔａｙｌｏｒ，Ｄ．Ｌ．（１９９５）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｂｉｏｍｏｌ．Ｓｔｒｕｃｔ．２４：４０５−３４；Ｍａｎｎｕｚｚｕ，Ｌ．Ｍ．，Ｍｏｒｏｎｎｅ，Ｍ．Ｍ．＆ Ｉｓａｃｏｆｆ，Ｅ．Ｙ．（１９９６）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７１：２１３−６；Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ｂ．Ａ．，Ａｄａｍｓ，Ｓ．Ｒ．＆ Ｔｓｉｅｎ
，Ｒ．Ｙ．（１９９８）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８１：２６９−２７２；Ｌｌｏｐｉｓ，Ｊ．，Ａｄａｍｓ，Ｓ．Ｒ．，ＭｃＣａｆｆｅｒｙ，Ｊ．Ｍ．，Ｔｅｔｅｒ，Ｋ．，Ｋｕｌｏｍａａ，Ｍ．Ｓ．，Ｍａｃｈｅｎ，Ｔ．Ｅ．，Ｍｏｏｒｅ，Ｈ．Ｐ．，Ｔｓｉｅｎ，Ｒ．Ｙ．＆ Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ｂ．Ａ．（２０００）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．３２７：５４６−６４；及びＧａｉｅｔｔａ，Ｇ．，Ｄｅｅｒｉｎｃｋ，Ｔ．Ｊ．，Ａｄａｍｓ，Ｓ．Ｒ．，Ｂｏｕｗｅｒ，Ｊ．，Ｔｏｕｒ，Ｏ．，Ｌａｉｒｄ，Ｄ．Ｗ．，Ｓｏｓｉｎｓｋｙ，Ｇ．Ｅ．，Ｔｓｉｅｎ，Ｒ．Ｙ．＆ Ｅｌｌｉｓｍａｎ，Ｍ．Ｈ．（２００２）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９６：５０３−７参照。しかし、蛋白質には利用可能なシステイン残基が２個以上存在することと、遊離チオールの存在下で形成されるジスルフィドの交換反応により、単一システイン残基の標識は困難なことが多い。そこで、直交反応性をもつ非蛋白質産生アミノ酸を利用できるならば、単一システインを選択的に標識できない場合や、２種の異なるラベルが必要な場合や、ジスルフィド結合が十分に安定でない場合にも蛋白質の選択的修飾が可能になる。カルボニル基は水溶液中で温和な条件下にヒドラジド、ヒドロキシルアミン、及びセミカルバジドと容易に反応し、夫々生理条件下で安定なヒドラゾン、オキシム、及びセミカルバゾン結合を形成する。例えばＪｅｎｃｋｓ，Ｗ．Ｐ．（１９５９）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．８１，４７５−４８１；Ｓｈａｏ，Ｊ．＆
Ｔａｍ，Ｊ．Ｐ．（１９９５）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１７：３８９３−３８９９参照。
カルボニル基をペプチド及び蛋白質に選択的に組込むために数種の方法が開発されている。まず、Ｎ末端セリン又はスレオニンを過ヨウ素酸塩で酸化することによりペプチドのＮ末端にアルデヒドが導入され、ヒドラゾン結合を介してビオチン及び蛍光レポーターとカップリングされた。例えば、Ｇｅｏｇｈｅｇａｎ，Ｋ．Ｆ．＆ Ｓｔｒｏｈ，Ｊ．Ｇ．（１９９２）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．Ｃｈｅｍ．３：１３８−１４６参照。しかし、この方法は蛋白質のＮ末端修飾に限られている。その後、固相ペプチド合成を使用してヒドラジド又はヒドロキシルアミンを含むペプチドセグメントを製造した後に分枝鎖アルデヒドコアマトリックスと反応させてペプチドデンドリマーを形成したり（例えばＳｈａｏ，Ｊ．＆ Ｔａｍ，Ｊ．Ｐ．（１９９５）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１７：３８９３−３８９９；Ｒｏｓｅ，Ｋ．（１９９４）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１６：３０−３３参照）、ケト含有ペプチドセグメントと反応させて合成蛋白質を形成する方法が実施されている（例えばＣａｎｎｅ，Ｌ．Ｅ．，Ｆｅｒｒｅ−Ｄ’Ａｍａｒｅ，Ａ．Ｒ．，Ｂｕｒｌｅｙ，Ｓ．Ｋ．＆ Ｋｅｎｔ，Ｓ．Ｂ．Ｈ．（１９９５）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１７：２９９８−３００７参照）。このアプローチは一般に１００残基未満のペプチド又は小蛋白質には適用できるが、大型のペプチド又は蛋白質の合成に伴う問題により制限されている。
ケト基を蛋白質に組込むためにｉｎ ｖｉｔｒｏ生合成法も使用されている。例えば、Ｃｏｒｎｉｓｈ，Ｖ．Ｗ．，Ｈａｈｎ，Ｋ．Ｍ．＆ Ｓｃｈｕｌｔｚ，Ｐ．Ｇ．（１９９６）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１８：８１５０−８１５１参照。この方法では、ケト基を含む非天然アミノ酸をアンバーサプレッサーｔＲＮＡに化学的にアシル化する。蛋白質生合成を補助することが可能なｉｎ ｖｉｔｒｏ抽出液中でアシル化ｔＲＮＡと突然変異体遺伝子を融合すると、ＵＡＧコドンに応答して非天然アミノ酸が選択的に組込まれる。この方法はサプレッサーｔＲＮＡを非天然アミノ酸で化学的にｉｎ ｖｉｔｒｏアミノアシル化する必要があり、アシル化ｔＲＮＡが翻訳中に化学量論的試薬として消費され、再生できないため、蛋白質収率が低い。ｐ−アセチル−Ｌフェニルアラニンに対して特異性をもつ直交ｔＲＮＡ−シンテターゼ対を開発することにより、ＵＡＧコドンに応答して生きた大腸菌細胞でケトアミノ酸を蛋白質に直接組込むことができる。大腸菌で発現させることができる限り、ターゲット蛋白質にサイズ制約はなく、多量の突然変異体蛋白質を発現させることができる。更に、標識試薬が細胞浸透性で非毒性である限り、ラベルを全細胞に選択的に導入することができる。
ｐ−アセチル−Ｌ−フェニルアラニンに対して特異性をもつ突然変異体シンテターゼの進化：Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ ｊａｎｎａｓｃｈｉｉチロシルｔＲＮＡシンテターゼ（ＴｙｒＲＳ）と突然変異体チロシンアンバーサプレッサーｔＲＮＡ（ｍｕｔＲＮＡＴｙｒ ＣＵＡ）を直交ｔＲＮＡ−シンテターゼ対の作製用出発点として使用した。従来、この対は大腸菌で直交性であることが示されている。例えば、Ｗａｎｇ，Ｌ．，Ｍａｇｌｉｅｒｙ，Ｔ．Ｊ．，Ｌｉｕ，Ｄ．Ｒ．＆ Ｓｃｈｕｌｔｚ，Ｐ．Ｇ．（２０００）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２２：５０１０−５０１１；及びＷａｎｇ，Ｌ．＆ Ｓｃｈｕｌｔｚ，Ｐ．Ｇ．（２００１）Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．８：８８３−８９０参照。ｐ−アセチル−Ｌ−フェニルアラニンを負荷し、２０種の標準アミノ酸を負荷しないようにＴｙｒＲＳのアミノ酸特異性を変化させるために、Ｍ．ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ ＴｙｒＲＳ突然変異体のライブラリーを作製し、スクリーニングした。相同Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ＴｙｒＲＳの結晶構造（例えば、Ｂｒｉｃｋ，Ｐ．，Ｂｈａｔ，Ｔ．Ｎ．＆ Ｂｌｏｗ，Ｄ．Ｍ．（１９８９）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２０８：８３−９８参照）を使用して結合チロシンのアリール環のパラ位から６．５Å以内にある残基を同定した。Ｍ．ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ ＴｙｒＲＳの活性部位の５個の対応する残基（Ｔｙｒ３２，Ｇｌｕ１０７，Ａｓｐ１５８，Ｉｌｅ１５９及びＬｅｕｌ６２）をポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によりランダムに突然変異させ、１．６×１０９のサイズのライブラリーを作製した。例えばＷａｎｇ，Ｌ．，Ｂｒｏｃｋ，Ａ．，Ｈｅｒｂｅｒｉｃｈ，Ｂ．＆ Ｓｃｈｕｌｔｚ，Ｐ．Ｇ．（２００１）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９２：４９８−５００参照。このＴｙｒＲＳ突然変異体ライブラリーをまず大腸菌に導入したプラスミドｐＹＣ−Ｊ１７（例えば、Ｗａｎｇ，Ｌ．，Ｂｒｏｃｋ，Ａ．，Ｈｅｒｂｅｒｉｃｈ，Ｂ．＆ Ｓｃｈｕｌｔｚ，Ｐ．Ｇ．（２００１）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９２：４９８−５００参照）上でコードされるクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）遺伝子の非必須位置（Ａｓｐ１１２）におけるアンバー終止コドンの抑圧に基づき、１ｍＭ
ｐ−アセチル−Ｌ−フェニルアラニンの存在下にポジティブ選択した。クロラムフェニコール中で生存する細胞はｍｕｔＲＮＡＴｙｒ ＣＵＡを標準アミノ酸又はｐ−アセチル−Ｌ−フェニルアラニンでアミノアシル化する突然変異体シンテターゼをコードするはずである。そこで、突然変異体シンテターゼをコードするＤＮＡを単離し、（プラスミドｐＬＷＪ１７Ｂ３上でコードされる）許容部位に３個のアンバーコドンを含む毒性蛋白質バルナーゼ遺伝子を発現するネガティブ選択株に形質転換した。ｍｕｔＲＮＡＴｙｒ ＣＵＡに天然アミノ酸を負荷する突然変異体シンテターゼをコードする細胞はバルナーゼを産生し、死滅する。ネガティブ選択では増殖培地にｐ−アセチル−Ｌ−フェニルアラニンを添加しなかったので、生存細胞は非天然アミノ酸に対して特異性をもつシンテターゼをコードするはずである。クロラムフェニコール濃度を増加しながらポジティブ選択３回とネガティブ選択２回を交互に行った後に、クロラムフェニコール中での生存がｐ−アセチル−Ｌ−フェニルアラニンの添加に依存する多数のクローンが出現した。ＣＡＴ遺伝子内のＡｓｐ１１２ＴＡＧコドンの抑圧に基づくｉｎ ｖｉｖｏアッセイを使用してこれらのＴｙｒＲＳを特性決定した。例えばＷａｎｇ，Ｌ．＆ Ｓｃｈｕｌｔｚ，Ｐ．Ｇ．（２００１）Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．８：８８３−８９０参照。１１個のＴｙｒＲＳ突然変異体が同定された。選択したシンテターゼとｍｕｔＲＮＡＴｙｒ ＣＵＡを発現する細胞は１％グリセロールと０．３ｍＭロイシンを含有する最少培地プレート（ＧＭＭＬプレート）でｐ−アセチル−Ｌ−フェニルアラニンの不在下では９μｇ／ｍｌクロラムフェニコールで生存し、この非天然アミノ酸の存在下では、細胞はＧＭＭＬプレートで１２０μｇ／ｍｌクロラムフェニコール中で生存した。この結果は選択した突然変異体シンテターゼが天然アミノ酸よりもｐ−アセチル−Ｌ−フェニルアラニンに対して高い活性をもつことを示唆している。これらの突然変異体のＤＮＡを配列決定した処、アミノ酸のコドン使用は異なるが、蛋白質レベルでは３個の独立した突然変異体（ＬＷ１，ＬＷ５，及びＬＷ６）で収束することが判明した。突然変異体シンテターゼの活性部位突然変異を表１に示す。Ｂ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓに由来する相同ＴｙｒＲＳの結晶構造によると、Ｍ．ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ Ｔｙｒ３２及びＡｓｐ１５８の保存側鎖は基質チロシンのヒドロキシ
ル基と水素結合を形成すると思われる。突然変異体シンテターゼではＴｙｒ３２はＬｅｕ又はＡｌａに突然変異し、Ａｓｐ１５８はＧｌｙ１５８に突然変異している。これらの突然変異はチロシンの結合に不利であると同時にｐ−アセチル−Ｌ−フェニルアラニンのメチル基を受用する余地ができる。
ｐ−アセチル−Ｌ−フェニルアラニンを組込んだ突然変異体蛋白質の特性決定：進化型シンテターゼとｍｕｔＲＮＡＴｙｒ ＣＵＡがｐ−アセチル−Ｌ−フェニルアラニンを蛋白質に選択的に組込む能力を試験するために、ＣＯＯＨ末端Ｈｉｓ６タグを付けたブドウ球菌プロテインＡ（例えば、Ｎｉｌｓｓｏｎ，Ｂ．，Ｍｏｋｓ，Ｔ．，Ｊａｎｓｓｏｎ，Ｂ．，Ａｂｒａｈｍｓｅｎ，Ｌ．，Ｅｌｍｂｌａｄ，Ａ．，Ｈｏｌｍｇｒｅｎ，Ｅ．，Ｈｅｎｒｉｃｈｓｏｎ，Ｃ．，Ｊｏｎｅｓ，Ｔ．Ａ．＆ Ｕｈｌｅｎ，Ｍ．（１９８７）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．１：１０７−１３参照）のＺドメインの遺伝子の許容部位（Ｌｙｓ７）をアンバー終止コドンに置換した。Ｚドメインは分子量約７．９ｋＤであるので、その質量はイオンサイクロトロン共鳴質量分析を使用して非常に高確度で測定することができる。ｍｕｔＲＮＡＴｙｒ ＣＵＡ、ＬＷ１ＲＳ及びＺドメイン遺伝子（Ｌｙｓ７ＴＡＧ）で形質転換した細胞を１ｍＭ ｐ−アセチル−（±）−フェニルアラニンの存在下に増殖させた。非天然アミノ酸の添加は細胞の増殖速度に影響しなかった。突然変異体蛋白質をＮｉ２＋アフィニティークロマトグラフィーにより精製すると、総単離収量は最少培地中３．６ｍｇ／Ｌであった。比較のために、突然変異体ＴｙｒＲＳの代わりに野生型（ｗｔ）ＴｙｒＲＳを使用した処、Ｚドメインの収量は最少培地中９．２ｍｇ／Ｌであった。ｐ−アセチル−（±）−フェニルアラニン、ｍｕｔＲＮＡＴｙｒ ＣＵＡ又はＬＷ１ＲＳの不在下ではＺドメインは得られず（図１）、この部位への非天然アミノ酸組込みの忠実度が非常に高いことが判明した。ｐ−アセチル−Ｌフェニルアラニンを他の蛋白質（例えばＣｄｃ４２）に組込むこともできる。図１参照。
ｍｕｔＲＮＡＴｙｒ ＣＵＡ／ｗｔ ＴｙｒＲＳにより発現されたｗｔ Ｚドメイン蛋白質と、ｍｕｔＲＮＡＴｙｒ ＣＵＡ／ＬＷ１ＲＳにより発現された突然変異体Ｚドメイン蛋白質の両者をエレクトロスプレーイオン化フーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴質量分析（ＦＴ−ＩＣＲ ＭＳ）により分析した。ｗｔ Ｚドメイン蛋白質では、無傷の蛋白質と、最初のメチオニンをもたない蛋白質と、最初のメチオニンをもたない蛋白質のアセチル化形態に対応する質量の３個のピークが観察された（Ｎ末端トリプシン消化ペプチドフラグメントのタンデム質量分析により確認）。突然変異体Ｚドメイン蛋白質（図２Ａ）では、無傷の蛋白質の実験モノアイソトピック質量は７９４９．８９３Ｄａであり、理論質量７９４９．８７４Ｄａから２．２ｐｐｍ以内であった。他の２個のピークは夫々最初のメチオニンをもたない蛋白質（ＭＥｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ＝７８１８．８３８Ｄａ，ＭＴｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ＝７８１８．８３３Ｄａ）とそのアセチル化形態（ＭＥｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ＝７８６０．８４３Ｄａ，ＭＴｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ＝７８６０．８４４Ｄａ）に対応する。アンバーコドン位置に他のアミノ酸をもつ突然変異体蛋白質に対応するピークはスペクトルに観察されなかった。無傷の蛋白質質量スペクトルに観察された１５００を上回るシグナル対ノイズ比はｐ−アセチル−Ｌ−フェニルアラニンの組込みの忠実度が９９．８％を上回ることを意味する。トリプシン消化物の液体クロマトマグラフィータンデム質量分析を実施し、ＮＨ２末端ペプチドの配列を確認した。ＮＨ２末端トリプシン消化ペプチドＭＴＳＶＤＮＹ＊ＩＮＫの二重負荷分子イオンに対応する６０６．２３
Ｄａの前駆体イオンを単離し、イオントラップ質量分析計（ＩＴＭＳ）で断片化した。フラグメントイオン質量は図２Ｂに示すように明確に割当られ、ｐ−アセチル−Ｌ−フェニルアラニンの部位特異的組込みが確認された。これらの結果が明白に示すように、進化型シンテターゼはｍｕｔＲＮＡＴｙｒ ＣＵＡと協同して天然アミノ酸ではなくｐ−アセチル−Ｌ−フェニルアラニンを他の位置ではなくアンバーコドンによりコードされる位置に組込む。図２参照。
フルオレセインヒドラジドによる部位特異的蛋白質修飾：ｐ−アセチル−Ｌ−フェニルアラニンのカルボニル基はｉｎ ｖｉｔｒｏ部位特異的蛋白質修飾の化学的ハンドルとして機能することができる。精製突然変異体ｐ−アセチル−Ｌ−フェニルアラニンＺドメイン蛋白質（突然変異体Ｚドメイン）とｗｔ Ｚドメイン蛋白質をＰＢＳ緩衝液中１ｍＭフルオレセインヒドラジド１（図３Ａ）で２５℃にて１８時間処理した。反応後に蛋白質をサイズ排除クロマトグラフィーにより過剰のフルオレセインヒドラジドから分離し、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）で分析した。まずゲルを蛍光イメージングシステムでイメージングした後、銀染色した（図３Ｂ）。突然変異体Ｚドメインのバンドは蛍光シグナルを示すが、ｗｔ Ｚドメインから蛍光を検出することはできない。これらの２種の蛋白質のアリコートを使用して４９０ｎｍ励起で蛍光スペクトルを測定した（図３Ｃ）。ｐ−アセチル−Ｌ−フェニルアラニンを含むＺドメイン蛋白質のみがフルオレセインに類似する蛍光スペクトルを示す。ｗｔ Ｚドメインに蛍光シグナルは検出されないことから、ヒドラジドとケトンの間のみに標識反応が生じ、ｗｔ蛋白質に官能基は存在しないことが分かった。標識産物を四重極型飛行時間質量分析（ＱＴＯＦ ＭＳ）で分析した。８４２５．１６０Ｄａ（ＭＴｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ＝８４２４．９５８Ｄａ）の実験モノアイソトピック質量が得られ、フルオレセインヒドラジドは突然変異体Ｚドメイン蛋白質とモル比１：１で反応したことが確認された。標識の程度を調べるために、反応混合物を高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により分離した。標識Ｚドメインのピーク面積と未標識Ｚドメインのピーク面積の比は９０±５％であった。図３参照。
ビオチンヒドラジドによる部位特異的蛋白質修飾：このアプローチの汎用性を立証するために、Ｚドメインをビオチンヒドラジド誘導体２（図４Ａ）で標識した。精製突然変異体及びｗｔ ＺドメインをＰＢＳ緩衝液中１ｍＭビオチンヒドラジド２で２５℃にて１８時間処理した。ＰＢＳ緩衝液で透析して過剰のビオチンヒドラジドを除去した後、蛋白質をＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけた。分離した蛋白質をニトロセルロース膜に転写し、ビオチン特異的アビジン−ＨＲＰコンジュゲートでプローブした（図４Ｂ）。予想通り、ｐ−アセチル−Ｌ−フェニルアラニンを含む突然変異体Ｚドメインのみが検出され、ビオチンヒドラジドで標識されたことが判明した。ｗｔ Ｚドメインにシグナルは観察されなかった。フルオレセイン標識実験で記載したようにＨＰＬＣ分析により標識効率を測定した処、８０±１０％であった。標識蛋白質はＱＴＯＦ ＭＳ（ＭＥｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ＝８４１６．２３６，ＭＴｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ＝８４１６．１４６Ｄａ）によりビオチンヒドラジド１分子と突然変異体Ｚドメイン１分子から形成された産物であることが確認された。これらの実験はｉｎ ｖｉｔｒｏ蛋白質修飾に対するケトンハンドルの優れた特異性を立証するものである。図４参照。
新規化学官能基であるケト基を蛋白質に部位特異的にｉｎ ｖｉｖｏ組込んだ。この官能基はカルボニル基とヒドラジド誘導体の直交化学反応によりフルオレセインとビオチンで選択的且つ効率的にｉｎ ｖｉｔｒｏ標識することができる。例えば、このアプローチを使用すると、蛋白質構造及び機能のプローブとして利用するため、触媒もしくは治療特性を強化した蛋白質を作製するため、又は固相化もしくは可溶性蛋白質を使用するバイオアッセイを実施するために、多様な他のヒドラジド又はヒドロキシルアミン誘導体（糖類、スピンラベル、金属キレート剤、架橋剤、ポリエーテル、脂肪酸及び毒素など）で蛋白
質を選択的に標識することができる。直交性化学的ハンドルを生きた細胞で蛋白質に直接部位特異的に組込むことができるならば、分子分解時の蛋白質局在、蛋白質移動及び蛋白質のコンホメーション変化のｉｎ ｖｉｖｏイメージングのために小分子フルオロフォアで蛋白質のｉｎ ｖｉｖｏ修飾が可能になる。大腸菌中でｐ−アセチル−Ｌ−フェニルアラニンを含む蛋白質をフルオロフォアでｉｎ ｖｉｖｏ標識することもできる。最後に、特異的又はランダム突然変異誘発により、ケトアミノ酸が例えば触媒又は分子内もしくは分子間蛋白質架橋に関与するシッフ塩基中間体を形成することにより蛋白質機能を直接強化できるか否かを調べることもできる。
参考資料として本明細書に組込む２００３年１０月１５日付け対応出願、発明の名称「糖蛋白質合成（Ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）」（代理人整理番号５４Ａ−０００６１０ＵＳ）も参照されたい。
〔メタ−チロシン類似体のｉｎ ｖｉｖｏ組込み〕
ｍｔＲＮＡＴｙｒ ＣＵＡ（ＷＯ２００２／０８５９２３の実施例１に記載）をメタ−チロシン類似体でアミノアシル化するために直交ＴｙｒＲＳを作製した。
突然変異体ＴｙｒＲＳライブラリープラスミドの作製：ＷＯ２００２／０８５９２３の実施例１に記載されている方法にほぼ従い、メタ置換チロシン誘導体に特異的な突然変異体Ｍ．ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ ＴｒｙＲＳをコードするプラスミドライブラリーを構築した。要約すると、上記実施例１に記載したようにＮＮＫコドンスキームを使用してＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ＴｙｒＲＳの結晶構造中の結合チロシンのアリール環のメタ位から６．９Å以内にあるＭ．ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ ＴｙｒＲＳの活性部位の６個の残基（Ｔｙｒ３２、Ａｌａ６７、Ｈｉｓ７０、Ｇｌｎ１５５、Ａｓｐ１５８、Ａｌａ１６７）をＤＮＡレベルで全２０種のアミノ酸に突然変異させた。構築したプラスミドライブラリーｐＢＫ−ｌｉｂは約１×１０９個の独立クローンを含んでいた。
ｍ−アセチルフェニルアラニンの組込み用直交ｔＲＮＡ−シンテターゼ対の進化：ポジティブ選択３回とネガティブ選択２回を行った後に、クロラムフェニコール中での生存が非天然アミノ酸の添加に依存する５個の候補クローン（ＷＯ２００２／０８５９２３の配列番号１７〜２１及びＷＯ２００２／０８５９２３の配列番号４９〜５３）が出現した。ｍ−アセチルフェニルアラニンの不在下では、３種の突然変異体ＴｙｒＲＳプラスミドのうちの１種を導入した細胞のクロラムフェニコール耐性のＩＣ５０は２０μｇ／ｍｌである。ｍ−アセチルフェニルアラニンの存在下では、同一細胞のクロラムフェニコール耐性のＩＣ５０は１００μｇ／ｍｌである。これらの２つの数値に大差があるのは選択したシンテターゼが細胞内で天然アミノ酸よりもｍ−アセチルフェニルアラニンを特異的に組込むことができるためである。ｍ−メトキシフェニルアラニンのデータも同様であり、５個のクローンを単離した（ＷＯ２００２／０８５９２３の配列番号２２〜２６とＷＯ２００２／０８５９２３の配列番号５４〜５８）。
非天然アミノ酸を組込んだＤＨＦＲの蛋白質発現：上記で選択したｍ−メトキシフェニルアラニン及びｍ−アセチルフェニルアラニンシンテターゼを使用してＷＯ２００２／０８５９２３の実施例１に記載したようにアンバーコドンに応答してＤＨＦＲに該当非天然アミノ酸を組込ませた。陰性対照として、ｔＲＮＡ／シンテターゼの直交対とＤＨＦＲをコードするアンバー突然変異体ベクターの両者を導入した細胞を非天然アミノ酸の不在下に増殖させた。蛋白質発現の結果をＷＯ２００２／０８５９２３の図１０に示す。これらの結果から、ｔＲＮＡ／シンテターゼの直交対は非天然ｍ−メトキシフェニルアラニン及びｍ−アセチルフェニルアラニンを特異的に組込むことが明白に立証された。ＤＨＦＲ蛋
白質の発現収率はどちらの場合も約０．５ｍｇ／Ｌ培養液であった。
１態様では、化合物（例えばヒドラジド誘導体）を使用して蛋白質を少なくとも１種のケトアミノ酸（例えばメタ−チロシン類似体）でｉｎ ｖｉｖｏ標識することができる。
〔非天然アミノ酸組込み用代表的Ｏ−ＲＳ及びＯ−ｔＲＮＡ〕
ケトアミノ酸の組込みを媒介する代表的Ｏ−ｔＲＮＡは配列番号２１を含む（表２参照）。Ｏ−ｔＲＮＡをケトアミノ酸でアミノアシル化するＯ−ＲＳの例としては配列番号１８〜２０が挙げられる（表２参照）。ポリヌクレオチドの例としてはＯ−ＲＳ又はその部分をコードするものが挙げられ、例えば配列番号１〜１７のポリヌクレオチド（他の非天然アミノ酸の組込み）、又は配列番号１８〜２０を含むアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド（ケトアミノ酸の組込み）が挙げられる。
〔蛍光活性化細胞ソーティングを使用したアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼの基質特異性の指向進化〕
蛍光活性化細胞ソーティング（ＦＡＣＳ）を使用すると、大腸菌で産生された蛋白質変異体の大きなライブラリーを迅速にスクリーニングすることができる。Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ ｊａｎｎａｓｃｈｉｉに由来するチロシルｔＲＮＡシンテターゼの基質特異性の進化を誘導するために遺伝蛍光レポーターと共にＦＡＣＳを使用する方法について記載する。システムは新規基質を選択的に認識する酵素変異体を同定するために二重シーブストラテジーを利用する。
蛋白質機能の指向進化用として種々のｉｎ ｖｉｖｏ選択及びスクリーニング方法が開発されている。一般に、ｉｎ ｖｉｖｏ選択ストラテジーは宿主細胞（通常は大腸菌）に選択的増殖効果を付与する能力に基づいて新規結合又は触媒機能を同定する。ｉｎ ｖｉｖｏスクリーニングアプローチは活性アッセイで同定可能なシグナルを発生する能力に基づいて所望活性を検出するという点で選択と相違する。
酵素基質特異性の進化に関して、選択及びスクリーニングアプローチには各々利点と欠点がある。新規基質を選択的に利用するように酵素の特異性を改変するには、新規基質に対する活性が細胞生存を誘導し且つ旧基質に対する活性が細胞死を誘導するような「二重シーブ」ストラテジーが必要である。酵素活性を細胞生存及び死に関連付けることは必ずしも容易ではないので、このようなアプローチの汎用性はこの要件により制限されている。他方、スクリーニングアプローチはアッセイ可能なシグナルに酵素活性を関連付けることができればよい。スクリーニングシステムは二重シーブとして使用するのに容易に適応可能であり、ポジティブ及びネガティブスクリーニングにより夫々基質の存在下と不在下で活性な酵素変異体を同定する。更に、多くの場合にはスクリーニングストリンジェンシーのほうが選択ストリンジェンシーよりも容易に変動させることができる。従って、ｉｎ
ｖｉｖｏスクリーニングアプローチは酵素の基質特異性を進化させるのに汎用性の利点がある。
他方、選択アプローチは選択サイクルを実施するために必要な時間が一般に出発ライブラリーのサイズにより変化しないという利点がある。これに対して、スクリーニングサイクルを実施するために必要な時間はスクリーニングするライブラリーのサイズと共に増加するため、非常に大きなライブラリーのスクリーニングは実際的でない。大きなライブラリーのスクリーニングに必要な時間を短縮するためには高スループット法を使用することができる。このような方法の１つである蛍光活性化細胞ソーティング（ＦＡＣＳ）を使用例すると、蛋白質変異体を導入した個々の細菌細胞を迅速にスクリーニングすることがで
きる。例えばＷｉｎｓｏｎ，Ｍ．Ｋ．＆ Ｄａｖｅｙ，Ｈ．Ｍ．（２０００）．Ｆｌｏｗ
ｃｙｔｏｍｅｔｒｉｃ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２１：２３１−２４０；及びＧｅｏｒｇｉｏｕ，Ｇ．（２００１）．Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｌａｒｇｅ ｌｉｂｒａｒｉｅｓ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｍｕｔａｎｔｓ ｕｓｉｎｇ ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ．Ａｄｖ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｈｅｍ ５５：２１３−３１５参照。スクリーニングは細胞約１０８個／時の速度で実施することができ、大腸菌で現在構築することができる最大蛋白質ライブラリーのサイズをカバーするに十分である。所望酵素活性を進化させるためにＦＡＣＳを使用する主要件は活性を蛍光シグナルの発生に関連付けられるようにすることである。
本実施例では、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ Ｊａｎｎａｓｃｈｉｉに由来するチロシルｔＲＮＡシンテターゼであるＭｊＹＲＳについて基質特異性の指向進化におけるＦＡＣＳの使用を提案する（Ｓａｎｔｏｒｏ，Ｓ．Ｗ．，Ｗａｎｇ，Ｌ．，Ｈｅｒｂｅｒｉｃｈ，Ｂ．，Ｋｉｎｇ，Ｄ．Ｓ．＆ Ｓｃｈｕｌｔｚ，Ｐ．Ｇ．（２００２）．Ａｎ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ｔｈｅ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ａｍｉｎｏａｃｙｌ−ｔＲＮＡ ｓｙｎｔｌｚｅｔａｓｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ．Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，２０：１０４４−１０４８）。このシンテターゼ酵素について、（特異性の拡大ではなく）基質特異性のスイッチにより二重シーブストラテジーを使用する。ポジティブ選択圧は新規基質（例えば非天然アミノ酸）を認識する酵素変異体を選択し、ネガティブ圧は元の基質を認識できない変異体を選択する。アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ進化のために、ポジティブ選択とネガティブスクリーニングを使用する方法を提案する。
〔材料と方法〕
細菌株、遺伝子構築物、及びオリゴヌクレオチドプライマー：アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ進化に使用する材料としては以下のものが挙げられる：大腸菌株ＤＨ１０Ｂ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）；大腸菌における直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ変異体の活性のレポーターとして従来記載されているように（Ｓａｎｔｏｒｏ，Ｓ．Ｗ．，Ｗａｎｇ，Ｌ．，Ｈｅｒｂｅｒｉｃｈ，Ｂ．，Ｋｉｎｇ，Ｄ．Ｓ．＆ Ｓｃｈｕｌｔｚ，Ｐ．Ｇ．（２００２）．Ａｎ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ｔｈｅ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ａｍｉｎｏａｃｙｌ−ｔＲＮＡ ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ．Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，２０：１０４４−１０４８参照）設計及び構築したプラスミドｐＲＥＰ／ＹＣ−ＪＹＣＵＡ（図５Ａ）；アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ遺伝子変異体の発現用ベクターとして従来記載されているように（Ｗａｎｇ，Ｌ．，Ｂｒｏｃｋ，Ａ．，Ｈｅｒｂｅｒｉｃｈ，Ｂ．＆ Ｓｃｈｕｌｔｚ，Ｐ．Ｇ．（２００１）．Ｅｘｐａｎｄｉｎｇ ｔｈｅ ｇｅｎｅｔｉｃ ｃｏｄｅ ｏｆ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９２：４９８−５００参照）設計及び構築したプラスミドｐＢＫ−ＪＹＡ６（図５Ｂ）；標的突然変異誘発ストラテジーを使用して従来記載されているように（例えばＷａｎｇ，Ｌ．，Ｂｒｏｃｋ，Ａ．，Ｈｅｒｂｅｒｉｃｈ，Ｂ．＆ Ｓｃｈｕｌｔｚ，Ｐ．Ｇ．（２００１）．Ｅｘｐａｎｄｉｎｇ ｔｈｅ ｇｅｎｅｔｉｃ ｃｏｄｅ ｏｆ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９２：４９８−５００参照）構築したＭ．ｊａｎｎａｓｃｈｉｉチロシルｔＲＮＡシンテターゼ（ＭｊＹＲＳ）遺伝子変異体のＰＣＲフラグメントライブラリー；及び、ＭｊＹＲＳ遺伝子変異体ライブラリーの増幅用オリゴヌクレオチドＰＣＲプライマー（表３）。プラスミドｐＲＥＰ／ＹＣ−ＪＹＣＵＡ（図５Ａ）はｐ１５Ａ複製起点をもち、ＣｏｌＥｌ複製起点をもつプラスミドｐＢＫ−ＪＹＲＳ（及び変異体；図５Ｂ）と同時に大腸菌で複製できる。このプラスミドはポジティブ選択の基準として使用するクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）レポーターと天然アミノ酸を受用するシンテターゼ変異体に対してスクリーニングするためにＦＡＣＳで使用するＴ７ ＲＮＡポリメラーゼ（Ｔ７ ＲＮＡＰ）／緑色蛍光蛋白質（ＧＦＰｕｖ）レポーター
システムを含む。蛍光レポーターシステムはアミノ酸組込みに基づいてシンテターゼ活性を目視及び蛍光評価するためにも使用される。
シンテターゼの基質特異性の指向進化に使用する他の材料としては以下のものが挙げられる：制限酵素；仔ウシ小腸由来アルカリホスファターゼ（ＣＩＰ）；ＰＣＲ用反応成分（例えば熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ、ＰＣＲ緩衝液、及びデオキシヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）（本明細書に記載する方法にはＰｆｕ ＤＮＡポリメラーゼを使用したが、Ｒｏｃｈｅ製品Ｅｘｐａｎｄキットも特に長いＰＣＲ産物で高いＰＣＲ収率が得られることが判明した））；ＰＣＲ精製キット；ゲル抽出キット；Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ；エレクトロポレーター及び０．２ｃｍエレクトロポレーションキュベット；Ｍａｘｉｐｒｅｐプラスミド精製キット；アガロース及びアガロースゲル電気泳動装置；Ｔｒｉｓ−酢酸ＥＤＴＡ（ＴＡＥ）緩衝液（４０ｍＭ Ｔｒｉｓ−酢酸，１ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．３））；臭化エチジウム；ＳＯＣ培地；ＬＢ培地；グルコースストック溶液（水中２０％；滅菌濾過）；ＩＰＴＧ（イソプロピル−β−Ｄ−チオ−ガラクトピラノシド）（水中１ｍＭ；約−２０℃で保存する必要がある）；ＰＢＳ（リン酸緩衝食塩水）（１０ｍＭリン酸，０．１４Ｍ ＮａＣｌ，２．７ｍＭ ＫＣｌ（２５℃でｐＨ７．４））；Ｍｉｎｉｐｒｅｐプラスミド精製キット；アンピシリンストック溶液（水中１００ｍｇ／ｍＬ；約−２０℃で保存する必要がある）；カナマイシンストック溶液（水中３５ｍｇ／ｍＬ；約−２０℃で保存する必要がある）；ロイシン含有グリセロール最少培地（ＧＭＭＬ；１％グリセロールと０．３ｍＭロイシン含有）；テトラサイクリンストック溶液（７５％ＥｔＯＨ中２５ｍｇ／ｍＬ；約−２０℃で保存する必要がある）；アラビノースストック溶液（水中２０％；滅菌濾過）；非天然アミノ酸ストック溶液（一般に０．３ＭＨＣｌ又はＮａＯＨ中０．３Ｍ；約−２０℃で保存する必要がある）；グリセロール（脱イオン水中１０％；滅菌濾過）；並びに、蛍光計及び石英キュベット。
例えばチロシルｔＲＮＡシンテターゼの指向進化：以下の方法は直交ｔＲＮＡに非天然アミノ酸を効率的且つ特異的に負荷するチロシルｔＲＮＡシンテターゼ変異体を同定するための選択／スクリーニングシステムの使用に関する。このストラテジーは新規アミノ酸を認識する変異体をポジティブに集積するためにクロラムフェニコール選択を使用し、天然アミノ酸の１種を受用する変異体を排除するためにネガティブＦＡＣＳスクリーニングを使用する（図６）。
原則として、アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼの指向進化はＦＡＣＳスクリーニングにより完全に実施することができる。このようなストラテジーでは、クロラムフェニコールポジティブ選択をポジティブスクリーニングに置き換え、非天然アミノ酸の存在下に増殖した蛍光細胞をＦＡＣＳにより採取する。
以下の段階はｐＲＥＰ／ＹＣ−ＪＹＣＵＡレポータープラスミド（図５Ａ）を導入したエレクトロコンピテントＤＨ１０Ｂ−ＤＥ３細胞の作製を要約するものである。エレクトロコンピテント大腸菌ＤＨ１０Ｂ細胞２５μＬをプラスミドｐＲＥＰ／ＹＣ−ＪＹＣＵＡ１０ｎｇで形質転換した。エレクトロポレーター製造業者により推奨されている条件を使用することができる。細胞は形質転換までの全時間冷温に維持する必要がある。更に、細胞は時間と共にコンピテンシーか低下するので、解凍後できるだけ早く氷上でエレクトロポレーションする必要がある。ＳＯＣ培地２００μＬをすぐに加え、３７℃で１時間温和
に振盪（２２５ｒｐｍ）しながら細胞を回収した。２５μｇ／ｍＬテトラサイクリンを添加したＬＢ寒天に回収した細胞をプレーティングし、３７℃で一晩インキュベートした。単一コロニーからエレクトロコンピテントＤＨ１０Ｂ（ｐＲＥＰ／ＹＣ−ＪＹＣＵＡ）細胞を作製した。特に大量の形質転換細胞が必要な場合には、大腸菌の形質転換でコンピテンシーが高いと効率的なプラスミド構築が得られる。エレクトロポレーションは大腸菌の形質転換に簡便な方法であり、スーパーコイルプラスミドＤＮＡ１０８〜１０１０ｃｆｕ／μｇの形質転換効率でエレクトロコンピテント大腸菌株の作製が日常的である。（ライゲーション後に得られるような）非スーパーコイル及びニックプラスミドＤＮＡについては、効率が少なくとも一桁下がる可能性があることに留意されたい。市販エレクトロコンピテントＤＨ１０Ｂ細胞（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）はスーパーコイルプラスミドＤＮＡ１０１０ｃｆｕ／μｇの形質転換効率を保証されているので、ライブラリーを作製するために初期形質転換に使用すると好都合である。その後、スーパーコイルＤＮＡを作製し、非市販株に導入することができる。例えば、エレクトロコンピテント大腸菌の一般作製方法は以下の通りである：（ａ）単一コロニー又はグリセロールストックから、（場合により）適当な抗生物質を添加したＬＢスターター培養液５ｍＬに接種し、２５０ｒｐｍで振盪下に３７℃で一晩インキュベートする；（ｂ）スターター培養液から、適当な抗生物質を添加した２ｘＹＴ培養液１Ｌに接種し、６００ｎｍの光学密度（ＯＤ）が０．５に達するまで増殖させる；（ｃ）培養液を氷冷０．５Ｌ ＧＳ３試験管２本に移し、１℃で５分間１００００ｇにて遠心する。上清をデカントする；（ｄ）細胞を氷冷１０％グリセロール１Ｌに再懸濁し、１℃で５分間７５００ｇにて遠心する。上清をデカントする；（ｅ）ステップ１２ｄを繰返す；（ｆ）細胞をすぐに残留１０％グリセロールに再懸濁し、氷上に保持する。細胞をすぐに形質転換するか又はドライアイスで急速冷凍した後に約−８０℃で保存する。
本セクションはＭｊＹＲＳ変異体のプラスミドライブラリーの構築と大腸菌ｐＲＥＰ／ＹＣ−ＪＹＣＵＡレポーター株へのその導入を要約する。ＤＮＡオリゴヌクレオチドプライマーｐＢＫ−ＭｊＹＲＳＮ及びｐＢＫ−ＭｊＹＲＳＣ（表３）を使用してＭｊＹＲＳ遺伝子変異体ライブラリーフラグメントを４回の１００μＬ ＰＣＲ反応でＰＣＲ増幅した。例えば、１００μＬ反応のＰＣＲ条件は以下の通りである：１０’ＰＣＲ緩衝液１０μＬ、ｄＮＴＰ（各２ｍＭ）１０μＬ、各プライマー（各１０μＭ）４μＬ、鋳型〜１０ｎｇ、及びＤＮＡポリメラーゼ１．５μＬ。一般に、９５℃で１分間、５０℃で１分間、及び７２℃で２分間のサイクルを使用して２０ＰＣＲサイクルを実施した。ＰＣＲ ＤＮＡ精製キットを使用してＤＮＡを精製した。精製したＰＣＲ ＤＮＡを制限酵素ＮｄｅＩ及びＰｓｔＩで消化した。制限酵素消化及びＣＩＰ処理の標準条件は例えばＮｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓにより記載されている通りとする。消化したＰＣＲフラグメントをアガロースゲル電気泳動後にゲル抽出により精製した。
１％アガロースゲルと０．５μｇ／ｍＬ臭化エチジウムを含有するＴＡＥ緩衝液を使用して標準アガロースゲル電気泳動を実施した。ＤＮＡを長波長紫外光で可視化し、滅菌レザーブレードを使用して切り出し、ゲル抽出によりゲルスライスから取出した。例えばＳａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．＆ Ｒｕｓｓｅｌｌ，Ｄ．Ｗ．（２００１）．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ．第３版．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ
Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．参照。
精製したＤＮＡをアガロースゲル電気泳動により定量した。ベクターｐＢＫ−ＪＹＡ６を制限酵素ＮｄｅＩ及びＰｓｔＩで消化した。場合により、二重及び単一消化ベクターＤＮＡフラグメントを分解させるために十分長い「スタッファーフラグメント」を含む親フラグメントを使用することができる。ＣＩＰ処理はインサートを含むクローン率を増すが、形質転換効率を有意に低下させるので、場合により、ベクターをＣＩＰで処理しない。
消化したベクターを標準アガロースゲル電気泳動後にゲル抽出により精製した。精製したＤＮＡをアガロースゲル電気泳動により定量した。３００μＬ反応液中ベクター少なくとも１０μｇを使用してベクターとインサートＤＮＡを夫々１対１．５のモル比で〜１２時間１６℃でライゲーションした。標準ライゲーション反応条件はＮｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ
Ｂｉｏｌａｂｓにより記載されている通りとする。ライゲーション後に、少量の反応物をアガロースゲル電気泳動により分析し、全出発材料がより大きい産物に変換されていることを確認した。ライゲーション産物をフェノール−クロロホルム２００μＬで３回、クロロホルム２００μＬで２回抽出後にエタノール沈殿により精製した。ＤＮＡペレットを水５０μＬに再溶解した。
ライゲーション産物１μＬを使用してエレクトロコンピテント大腸菌２５μＬのパイロット形質転換を実施した。パイロット形質転換は大規模形質転換を開始する前にライゲーション反応の効率をチェックするために有用である。３５μｇ／ｍＬカナマイシンを添加したＬＢ寒天ブレートに形質転換細胞の１０倍系列希釈液３点をプレーティングし、３７℃で一晩インキュベートした。得られたコロニー数に基づき、予測ライブラリーサイズを計算した。プラスミドＤＮＡを１０〜２０個の独立クローンに対応するミニプレップに調製した。プラスミドを制限マッピングして配列決定し、クローンの高百分率（理想的には＞約７０％、＞約８０％、＞約９０％、＞９５％又はそれ以上）がインサートを含んでおり、ライブラリー内の突然変異の分布が過度に偏っていないことを確認した。
パイロット形質転換の結果が許容可能である場合には、大規模形質転換を実施する。例えば、精製ライゲーション産物をエレクトロコンピテント細胞５００μＬ（希釈せず）と混合した。混合物の５５μＬアリコートを冷０．２ｃｍキュベット１０本に分配し、エレクトロポレーションした。各エレクトロポレーション後に、ＳＯＣ培地１ｍＬをすぐに加えた。形質転換細胞を１５ｍＬコニカルチューブに移し、３７℃で１時間温和に振盪（２２５ｒｐｍ）しながら回収した。４Ｌ振盪フラスコで３５μｇ／ｍＬカナマイシンを添加した２ｘＹＴ培地２Ｌに回収した細胞を移した。
ｐＲ−Ｃライブラリーを含む独立形質転換細胞数の測定用として接種培養液の１００μＬアリコートをすぐに取出した。独立形質転換細胞数を測定するために、新たに接種した培養液から取出した１００μＬアリコートの１０倍系列希釈液３点を調製した。適当な抗生物質を添加したＬＢ寒天プレートに（元のアリコートを含む）各希釈液１０μＬをプレーティングした。得られたコロニー数に基づき、培養液中の合計形質転換細胞数を計算した。
フラスコに移した細胞を振盪（２５０ｒｐｍ）下に３７℃で一晩インキュベートした。ｐＢＫプラスミドＤＮＡをライブラリー培養液５００ｍＬからマキシプレップに調製した。ＤＮＡを水２００μＬに再溶解した。エレクトロコンピテントＤＨ１０Ｂ（ｐＲＥＰ／ＹＣ−ＪＹＣＵＡ）細胞２００μＬを０．２ｃｍキュベット４本でマキシプレップｐＢＫスーパーコイルプラスミドライブラリーＤＮＡ（〜１〜２μｇ）５μＬで形質転換した。各エレクトロポレーション後に、ＳＯＣ培地１ｍＬをすぐに加えた。形質転換細胞を１５ｍＬコニカルチューブに移し、３７℃で１時間温和に振盪（２２５ｒｐｍ）しながら回収した。２Ｌ振盪フラスコで２５μｇ／ｍＬテトラサイクリンと３５μｇ／ｍＬカナマイシンを添加した２ｘＹＴ培地に回収した細胞を移した。独立形質転換細胞数の測定用として接種培養液の１００μＬアリコートをすぐに取出した。この数はライブラリー構築後に得られる独立形質転換細胞数と少なくともほぼ同数である。細胞を３７℃で一晩振盪（２５０ｒｐｍ）下にインキュベートした。
選択とスクリーニングの組み合わせを使用してアミノ酸基質に対する特異性が変化したＭｊＹＲＳ変異体を同定する（図６）。クロラムフェニコール選択を使用して非天然アミ
ノ酸の存在下で活性な変異体を集積させる。ネガティブＦＡＣＳスクリーニングを使用して非天然アミノ酸の不在下で活性な変異体を排除する。選択とＦＡＣＳスクリーニングを使用してアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼの進化を誘導する方法の１例を以下に述べる。大腸菌（ｐＲＥＰ／ＹＣ−ＪＹＣＵＡ，ｐＢＫ−ｌｉｂ）細胞２ｍＬを１００００ｇで１分間遠心によりペレット化した。上清を捨て、細胞をＧＭＭＬ培地１ｍＬに再懸濁した。第１サイクルのポジティブ選択を開始するために、再懸濁した細胞を使用し、２５μｇ／ｍＬテトラサイクリン、３５μｇ／ｍＬカナマイシン、及び１ｍＭ非天然アミノ酸を添加したＧＭＭＬ５００ｍＬに接種した。十分な曝気下にＧＭＭＬ培地で増殖した大腸菌はＯ．Ｄ．（６００ｎｍ）〜１〜２で飽和する。細胞を３時間３７℃にて２５０ｒｐｍで振盪下にインキュベートした。クロラムフェニコールを終濃度７５μｇ／ｍＬまで添加し、細胞が定常相に達するまで（〜４８時間）インキュベートした。
最適クロラムフェニコール濃度は初期ライブラリー中のシンテターゼの活性に依存する。クロラムフェニコールは殺菌性というよりも静菌性であるため、選択効率は集団ダイバーシティーを低下せずにクロラムフェニコール濃度の増加と共に増加すると考えられる。実際に、任意高濃度のクロラムフェニコールを使用すると選択アーチファクトを生じることが多い。逆に、クロラムフェニコール濃度が低過ぎると、選択ストリンジェンシーが不十分になる可能性がある。７５μｇ／ｍＬのクロラムフェニコール濃度は集積実験で有効であることが分かっており、指向進化により従来同定されているＭｊＹＲＳ変異体の大多数で実証されたＩＣ５０を多少下回るので、この濃度を使用する。Ｐａｓｔｒｎａｋ，Ｍ．，Ｍａｇｌｉｅｒｙ，Ｔ．Ｊ．＆ Ｓｃｈｕｌｔｚ，Ｐ．Ｇ．（２０００）．Ａ ｎｅｗ ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ ｔＲＮＡ／ａｍｉｎｏａｃｙｌ−ｔＲＮＡ ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ ｐａｉｒ ｆｏｒ ｅｖｏｌｖｉｎｇ ａｎ ｏｒｇａｎｉｓｍ ｗｉｔｈ ａｎ ｅｘｐａｎｄｅｄ ｇｅｎｅｔｉｃ ｃｏｄｅ．Ｈｅｌｖ Ｃｈｉｍ Ａｃｔａ ８３：２２７７−２２８６；Ｗａｎｇ，Ｌ．，Ｂｒｏｃｋ，Ａ．，Ｈｅｒｂｅｒｉｃｈ，Ｂ．＆ Ｓｃｈｕｌｔｚ，Ｐ．Ｇ．（２００１）．Ｅｘｐａｎｄｉｎｇ ｔｈｅ ｇｅｎｅｔｉｃ ｃｏｄｅ ｏｆ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９２：４９８−５００；Ｗａｎｇ，Ｌ．，Ｂｒｏｃｋ，Ａ．＆ Ｓｃｈｕｌｔｚ，Ｐ．Ｇ．（２００２）．Ａｄｄｉｎｇ Ｌ−３−（２−ｎａｐｈｔｈｙｌ）ａｌａｎｉｎｅ ｔｏ ｔｈｅ ｇｅｎｅｔｉｃ ｃｏｄｅ ｏｆ Ｅ−ｃｏｌｉ．Ｊ Ａｍ Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ １２４：１８３６−１８３７；及びＣｈｉｎ，Ｊ．Ｗ．，Ｓａｎｔｏｒｏ，Ｓ．Ｗ．，Ｍａｒｔｉｎ，Ａ．Ｂ．，Ｋｉｎｇ，Ｄ．Ｓ．，Ｗａｎｇ，Ｌ．＆ Ｓｃｈｕｌｔｚ，Ｐ．Ｇ．（２００２）．Ａｄｄｉｔｉｏｎｏｆ ｐ−Ａｚｉｄｏ−Ｌ−ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ ｔｏ ｔｈｅ ｇｅｎｅｔｉｃ ｃｏｄｅ ｏｆ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ．Ｊ Ａｍ Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ １２４：９０２６−９０２７参照。所与進化実験に別のクロラムフェニコール濃度が最適な場合もあるが、初期実験には約７５μｇ／ｍＬが最適濃度である。
第２サイクルのポジティブ選択を開始するために、第１の選択からの飽和培養液の５００μＬアリコートを使用し、２５μｇ／ｍＬテトラサイクリン、３５μｇ／ｍＬカナマイシン、７５μｇ／ｍＬクロラムフェニコール、及び１ｍＭ非天然アミノ酸を添加したＧＭＭＬ１００ｍＬに接種した。細胞が定常相に達するまで（〜２４〜３６時間）３７℃にて２５０ｒｐｍで振盪下にインキュベートした。
ＦＡＣＳネガティブスクリーニングに備え、細胞の１００μＬアリコートを第２サイクルのポジティブ選択から１００００ｇで１分間遠心によりペレット化した。上清を捨て、細胞をＧＭＭＬ培地１００μＬに再懸濁した。再懸濁した細胞を使用し、２５μｇ／ｍＬテトラサイクリン、３５μｇ／ｍＬカナマイシン、及び０．００２％アラビノースを添加したＧＭＭＬ培地２５ｍＬに接種した。ｐＲＥＰ／ＹＣ−ＪＹＣＵＡ内でアンバー終止コドンを含むＴ７ ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子を制御下に発現させるように０．００２％の
アラビノース濃度を最適化した。この結果、大腸菌宿主の増殖速度に最少の影響しか与えずに（適切に負荷されたサプレッサーｔＲＮＡの存在下に）確実な蛍光シグナルが得られる。細胞が定常相に達するまで（〜２４〜３６時間）３７℃にて２５０ｒｐｍで振盪下にインキュベートした。アラビノースで誘導した細胞の１ｍＬアリコートを１００００ｇで１分間遠心によりペレット化した。細胞をリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）３ｍＬに再懸濁した。ＦＡＣＳを使用して細胞を選別し、例えば蛍光を発生しない細胞〜１０７〜１０８個を選別した（図７）。
これらの実験はＴＳＯオプション付きＢＤＩＳ ＦＡＣＶａｎｔａｇｅサイトメーターを使用して実施した。レーザー励起は３５１及び４８８ｎｍ線（夫々３０及び２５０ｍＷ）を発振するＣｏｈｅｒｅｎｔ Ｅｎｔｅｒｐｒｉｓｅ ＩＩ ４２１水冷アルゴンイオンレーザーを使用して実施した。ＧＦＰｕｖは３５１ｎｍで励起され、５１９／２０ｎｍ帯域フィルターを使用して集光される発光を生じる。ＥＹＦＰは４８８ｎｍで励起され、５８５／４５ｎｍ帯域フィルターを使用して集光される発光を生じる。同等システムで同様の結果が得られる。サイトメーターは小粒子からの散乱を誘発するように特別に設計した。前方散乱（ＦＳＣ）と中間角度側方散乱（ＳＳＣ）の両者が対数スケールで得られる。高感度でのＦＳＣからの低レベルノイズを避けるためにＳＳＣ閾値によりシステムをトリガーした。７０μｍノズルをシステム圧〜３０ｐｓｉで使用した。例えば、一般に〜１０，０００／秒の速度で細胞を選別する。
２５μｇ／ｍＬテトラサイクリンと３５μｇ／ｍＬカナマイシンを添加したＬＢ培地２５ｍＬで採取した細胞を希釈し、３７℃で振盪（２５０ｒｐｍ）下に飽和まで増殖させた。増幅細胞の１００μＬアリコートを１００００ｇで１分間遠心によりペレット化した。細胞をＧＭＭＬ１００μＬに再懸濁した。第３サイクルのポジティブ選択を開始するために、再懸濁した細胞を使用し、２５μｇ／ｍＬテトラサイクリン、３５μｇ／ｍＬカナマイシン、及び１ｍＭ非天然アミノ酸を添加したＧＭＭＬ２５ｍＬに接種した。細胞を３時間３７℃にて２５０ｒｐｍで振盪下にインキュベートした。クロラムフェニコールを終濃度７５μｇ／ｍＬまで添加し（上述のように最適クロラムフェニコール濃度は初期ライブラリー中のシンテターゼの活性に依存する）、細胞が定常相に達するまで（〜４８時間）インキュベーションを続けた。
以下の段階は独立シンテターゼ選択クローンのｉｎ ｖｉｖｏ活性及び特異性を蛍光測定により特性決定する手順を要約するものである。第３サイクルのポジティブ選択からの細胞をＧＭＭＬで細胞密度〜５０個／μＬまで希釈し、２５μｇ／ｍＬテトラサイクリン、３５μｇ／ｍＬカナマイシン、０．００２％アラビノース、０又は１ｍＭ非天然アミノ酸、及び０、３５、７５、又は１００μｇ／ｍＬクロラムフェニコールを添加したＧＭＭＬ／寒天プレート８枚に希釈液の１０μＬアリコートをプレーティングした。プレートを３７℃で４８時間インキュベートした。携帯型長波長紫外線ランプを使用して各プレートの蛍光コロニーと非蛍光コロニーの数を計数した。進化実験が成功の場合には、非天然アミノ酸を添加しないプレートよりも非天然アミノ酸を添加したプレートのほうが多数の蛍光コロニーを検出できる。非天然アミノ酸の不在下よりも存在下のほうが有意に多数の蛍光コロニーが形成されたプレートのうちで最高クロラムフェニコール濃度のプレートから蛍光コロニー１０〜２０個を釣菌した。各コロニーから、２５μｇ／ｍＬテトラサイクリン、３５μｇ／ｍＬカナマイシン、及び０．００２％アラビノースを添加したＧＭＭＬ培地４ｍＬに接種した。接種した各試料２ｍＬを別の試験管に移し、非天然アミノ酸を終濃度１ｍＭまで添加した。全培養液を細胞が定常相に達するまで（〜２４〜３６時間）３７℃で振盪（２５０ｒｐｍ）下にインキュベートした。各培養液から細胞２００μＬを１００００ｇで１分間遠心によりペレット化した。上清を捨てた。この時点で携帯型長波長紫外線ランプを使用して各細胞ペレットから可視蛍光を観測することができる（図８）。非天然アミノ酸の存在下の増殖の結果として明白な蛍光の差を示さない細胞は天然アミノ酸
を受用するＭｊＹＲＳ変異体を含むと思われるので、このような細胞はそれ以上特性決定する必要がない。細胞をＰＢＳ１ｍＬに再懸濁した。各再懸濁細胞混合物の細胞光学密度（６００ｎｍ）を測定した。各細胞混合物２００μＬをキュベットに移し、フルオロメーターを使用して励起波長３９６ｎｍで５０５ｎｍのその蛍光発光強度を測定した。各細胞混合物の蛍光強度をそのＯ．Ｄ．６００で割ることにより細胞蛍光を標準化した。非天然アミノ酸の存在下と不在下で増殖した細胞の標準化細胞蛍光値の比を計算することにより各ＭｊＹＲＳ変異体に対応する非天然アミノ酸依存的蛍光を求めた。シンテターゼ活性及び特異性の分析の代替方法は非天然アミノ酸の存在下と不在下にＧＭＭＬ／寒天プレート上の細胞増殖のクロラムフェニコールＩＣ５０を比較測定する方法である。例えばＳａｎｔｏｒｏ，Ｓ．Ｗ．，Ｗａｎｇ，Ｌ．，Ｈｅｒｂｅｒｉｃｈ，Ｂ．，Ｋｉｎｇ，Ｄ．Ｓ．＆ Ｓｃｈｕｌｔｚ，Ｐ．Ｇ．（２００２）．Ａｎ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｓｙｓｔｅｍ
ｆｏｒ ｔｈｅ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ａｍｉｎｏａｃｙｌ−ｔＲＮＡ ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ．Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，２０：１０４４−１０４８参照。
当然のことながら、本明細書に記載する実施例及び態様は例証の目的に過ぎず、これらの記載に鑑みて種々の変形又は変更が当業者に想到され、このような変形又は変更も本願の精神及び範囲と特許請求の範囲に含むものとする。
以上、明確に理解できるように本発明を多少詳細に記載したが、本発明の真の範囲を逸脱することなく形態や細部に種々の変更が可能であることは以上の開示から当業者に自明である。例えば、上記全技術及び装置は種々に組合せて使用することができる。本明細書に引用した全刊行物、特許、特許出願、及び／又は他の文献はその開示内容全体を全目的で参考資料として組込み、各刊行物、特許、特許出願、及び／又は他の文献を全目的で参考資料として組込むと個々に記載しているものとして扱う。
各種発現条件下で蓄積されたＺドメインのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。左側のレーンは分子量マーカーである。 （Ａ）はｐ−アセチル−Ｌ−フェニルアラニンを含む無傷の突然変異体蛋白質Ｚドメインの高分解能ＦＴ−ＩＣＲ質量スペクトルを示す。蛋白質の各種電荷状態に対応する一連のピークを観察することができる。各系列で、８＋電荷状態について示すように最初のメチオニンをもたない蛋白質、そのアセチル化形態、及び無傷の蛋白質に対応する３個のピークが存在する。挿入図は７＋同位体クラスターに由来するＺドメイン蛋白質の分子ピークの拡大図である。（Ｂ）はＮＨ２末端ペプチドＭＴＳＶＤＮＹ＊ＩＮＫのタンテム質量スペクトルを示す。ｐ−アセチル−Ｌ−フェニルアラニン（Ｙ＊）を含むペプチドの部分配列ＴＳＶＤＮＹ＊ＩＮは注釈付きｂ又はｙイオン系列から割り当てることができる。 ｐ−アセチル−Ｌ−フェニルアラニンを含む突然変異体Ｚドメインのフルオレセインヒドラジド１によるｉｎ ｖｉｔｒｏ標識を示す。図３Ａはフルオレセインヒドラジド１によるｐ−アセチル−Ｌ−フェニルアラニンの標識反応を示す。 ｐ−アセチル−Ｌ−フェニルアラニンを含む突然変異体Ｚドメインのフルオレセインヒドラジド１によるｉｎ ｖｉｔｒｏ標識を示す。図３Ｂはフルオレセインヒドラジド１で標識した野生型（ｗｔ）及び突然変異体Ｚドメインの銀染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（上部）分析と蛍光イメージング（下部）を示す。 ｐ−アセチル−Ｌ−フェニルアラニンを含む突然変異体Ｚドメインのフルオレセインヒドラジド１によるｉｎ ｖｉｔｒｏ標識を示す。図３Ｃはフルオレセインヒドラジド１で標識したｗｔ及び突然変異体Ｚドメインの蛍光スペクトルを示す。 （Ａ）及び（Ｂ）はｐ−アセチル−Ｌ−フェニルアラニンを含む突然変異体Ｚドメインのビオチンヒドラジド２によるｉｎ ｖｉｔｒｏ標識を示す。（Ａ）は使用したビオチンヒドラジド誘導体６−（（６（（ビオチニル）アミノ）ヘキサノイル）アミノ）ヘキサン酸ヒドラジド（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）の構造を示す。（Ｂ）はビオチンヒドラジド２により標識したｗｔ及び突然変異体Ｚドメインのウェスタンブロッティング分析を示す。 （Ａ）及び（Ｂ）は選択及びスクリーニング用アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼプラスミドシステムを示す。（Ａ）はプラスミドｐＲＥＰ／ＹＣ−ＪＹＣＵＡを示す。増幅可能な蛍光レポーターをＦＡＣＳスクリーニングに使用し、アンバー終止コドン（黒部分）が抑圧されると、その遺伝子をａｒａプロモーター（ＰＢＡＤ）の制御下においたＴ７ ＲＮＡポリメラーゼが生産され、ＧＦＰｕｖ遺伝子の発現を誘導する。クロラムフェニコールレポーター（Ｃｍｒ）をポジティブ選択に使用し、アンバー終止コドン（黒部分）が抑圧されるとクロラムフェニコール細菌耐性を付与する。プラスミドｐＲＥＰ／ＹＣ−ＪＹＣＵＡはＭ．ｊａｎｎａｓｃｈｉｉに由来する直交アンバーサプレッサーｔＲＮＡＴｙｒをコードするＭｊＹｔＲＮＡＣＵＡ遺伝子と、ｐ１５Ａ複製起点と、テトラサイクリン選択マーカー（Ｔｅｔｒ）を含む。（Ｂ）は構成的に発現されるＭ．ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ由来チロシルｔＲＮＡシンテターゼ遺伝子（ＭｊＹＲＳ）と、カナマイシン選択マーカー（Ｋｎｒ）と、ＣｏｌＥ１複製起点を含むプラスミドｐＢＫ−ＪＹＲＳを示す。ｐＢＫライブラリープラスミドは図示する制限部位を使用して実施例４に要約するように構築される。 ポジティブ選択とネガティブＦＡＣＳスクリーニングを使用したアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼの進化方法の１例を示す。蛍光及び非蛍光細胞を夫々十字丸と白丸で示す。「ＵＡＡ」は非天然アミノ酸を表す。 ＭｊＹＲＳ変異体のＦＡＣＳネガティブスクリーニングを示す。ＧＦＰｕｖを殆ど又は全く産生しない細胞に対応するイベントを四角で囲む。これらの細胞は非天然アミノ酸の不在下に増殖し、大腸菌内で天然アミノ酸の基質として利用できないＭｊＹＲＳ変異体を含む。 非天然アミノ酸基質のみを受用するＭｊＹＲＳ変異体を含む細胞の長波長紫外線照射を示す。非天然アミノ酸の存在下（＋）又は不在下（−）に細胞を増殖させた。

Claims (25)

  1. 直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ＲＳ）を含む組成物であって、Ｏ−ＲＳが配列番号２１の直交ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）をｐ−アセチル−Ｌ−フェニルアラニンで優先的にアミノアシル化し、
    Ｏ−ＲＳが配列番号１８〜２０のいずれかと少なくとも９０％の配列一致度を有するアミノ酸配列を含み、
    Ｏ−ＲＳが配列番号１８のシンテターゼと比較して位置３２に対応する位置にＡｌａ又はＬｅｕを含むか、又は位置１５８に対応する位置にＧｌｙを含む前記組成物。
  2. Ｏ−ＲＳが配列番号１８〜２０のいずれか１種を含むアミノ酸配列を含む請求項１に記載の組成物。
  3. Ｏ−ＲＳがＭｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ由来のチロシルｔＲＮＡシンテターゼである請求項１に記載の組成物。
  4. 前記Ｏ−ＲＳを含む細胞を含む請求項１に記載の組成物。
  5. 細胞が大腸菌細胞である請求項４に記載の組成物。
  6. 翻訳系を含む請求項１に記載の組成物。
  7. 前記Ｏ−ｔＲＮＡを更に含む請求項１に記載の組成物。
  8. 翻訳系を含む細胞であって、翻訳系が
    直交ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）と；
    直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ＲＳ）と；
    ｐ−アセチル−Ｌ−フェニルアラニンを含み；
    Ｏ−ＲＳがＯ−ｔＲＮＡをｐ−アセチル−Ｌ−フェニルアラニンで優先的にアミノアシル化し、Ｏ−ＲＳが配列番号１８〜２０のいずれかと少なくとも９０％の配列一致度を有し、
    Ｏ−ｔＲＮＡが配列番号２１と少なくとも９０％の配列一致度を有するポリヌクレオチド配列を含み、
    Ｏ−ＲＳが配列番号１８と比較して位置３２に対応する位置にＡｌａ又はＬｅｕを含むか、又は位置１５８に対応する位置にＧｌｙを含む前記細胞。
  9. Ｏ−ｔＲＮＡが配列番号２１に記載のポリヌクレオチド配列を含むか又はその相補的ポリヌクレオチド配列によりコードされ、Ｏ−ＲＳが配列番号１８〜２０のいずれか１種を含むアミノ酸配列を含む請求項８に記載の細胞。
  10. 細胞が非真核細胞である請求項８に記載の細胞。
  11. 非真核細胞が大腸菌細胞である請求項１０に記載の細胞。
  12. 該当ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む核酸を更に含み、ポリヌクレオチドがＯ−ｔＲＮＡにより認識される少なくとも１つのセレクターコドンを含む請求項８に記載の細胞。
  13. 直交ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）と；
    Ｏ−ｔＲＮＡをｐ−アセチル−Ｌ−フェニルアラニンで優先的にアミノアシル化する直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ＲＳ）と；
    ｐ−アセチル−Ｌ−フェニルアラニンと；
    該当ポリペプチドをコードし、Ｏ−ｔＲＮＡにより認識される少なくとも１つのセレクターコドンを含むポリヌクレオチドを含む核酸を含む大腸菌細胞であって、
    Ｏ−ＲＳが配列番号１８〜２０のいずれかと少なくとも９０％の配列一致度を有し、
    Ｏ−ｔＲＮＡが配列番号２１と少なくとも９０％の配列一致度を有するポリヌクレオチド配列を含み、
    Ｏ−ＲＳが配列番号１８と比較して位置３２に対応する位置にＡｌａ又はＬｅｕを含むか、又は位置１５８に対応する位置にＧｌｙを含む前記大腸菌細胞。
  14. Ｏ−ｔＲＮＡが配列番号２１に記載のポリヌクレオチド配列を含むか又はその相補的ポリヌクレオチド配列によりコードされ、Ｏ−ＲＳが配列番号１８〜２０のいずれか１種を含むアミノ酸配列を含む請求項１３に記載の細胞。
  15. 配列番号１８〜２０のいずれか１種を含む人工ポリペプチド。
  16. 請求項１５に記載のポリペプチドをコードする人工ポリヌクレオチド。
  17. 請求項１６に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
  18. ベクターがプラスミド、コスミド、ファージ、又はウイルスを含む請求項１７に記載のベクター。
  19. ベクターが発現ベクターである請求項１７に記載のベクター。
  20. 請求項１７に記載のベクターを含む細胞。
  21. 特定位置にｐ−アセチル−Ｌ−フェニルアラニンを組込んだ該当蛋白質を細胞で生産する方法であって、
    少なくとも１個のセレクターコドンを所定位置に含み、該当蛋白質をコードする核酸を導入した細胞を適当な培地で増殖させる段階と；
    適当な培地にｐ−アセチル−Ｌ−フェニルアラニンを提供する段階を含み；
    細胞が更に、
    細胞で機能し、セレクターコドンを認識する直交ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）と；
    Ｏ−ｔＲＮＡをｐ−アセチル−Ｌ−フェニルアラニンで優先的にアミノアシル化する直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ＲＳ）を含み；
    Ｏ−ＲＳが配列番号１８〜２０のいずれかと少なくとも９０％の配列一致度を有し、
    Ｏ−ｔＲＮＡが配列番号２１と少なくとも９０％の配列一致度を有するポリヌクレオチド配列を含み、
    Ｏ−ＲＳが配列番号１８と比較して位置３２に対応する位置にＡｌａ又はＬｅｕを含むか、又は位置１５８に対応する位置にＧｌｙを含み、
    更に前記核酸中の前記少なくとも１個のセレクターコドンの所定位置が前記該当蛋白質中のｐ−アセチル−Ｌ−フェニルアラニンの前記特定位置に対応するよう該当蛋白質の翻訳中に該当蛋白質の特定位置にｐ−アセチル−Ｌ−フェニルアラニンを組込むことにより、特定位置にｐ−アセチル−Ｌ−フェニルアラニンを組込んだ該当蛋白質を生産する段階を含む前記方法。
  22. Ｏ−ＲＳが配列番号１８〜２０のいずれか１種を含むアミノ酸配列を含む請求項２１に記載の方法。
  23. Ｏ−ｔＲＮＡが配列番号２１に記載のポリヌクレオチド配列を含むか又はその相補的ポリヌクレオチド配列によりコードされる請求項２１に記載の方法。
  24. 細胞が非真核細胞である請求項２１に記載の方法。
  25. 非真核細胞が大腸菌細胞である請求項２４に記載の方法。
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