JP2008500050A - 結晶構造決定のための重原子含有非天然アミノ酸の部位特異的蛋白質組込み - Google Patents

結晶構造決定のための重原子含有非天然アミノ酸の部位特異的蛋白質組込み Download PDF

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Abstract

直交ｔＲＮＡにヨウ素化又は臭素化アミノ酸を優先的に負荷する直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼを含む翻訳系及び他の組成物を提供する。前記シンテターゼをコードする核酸と、重原子含有アミノ酸（例えば臭素化又はヨウ素化アミノ酸）を組込んだ蛋白質を生産するための方法及びキットも記載する。直交ｔＲＮＡ／アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ対を使用することにより蛋白質（例えば重原子が部位特異的に組込まれた蛋白質）の構造を決定する方法も記載する。

Description

（関連出願とのクロスリファレンス）
本願は仮特許出願ＵＳＳＮ６０／５７４，５５４（出願日２００４年５月２５日、発明の名称「構造決定のための重原子含有非天然アミノ酸の部位特異的蛋白質組込み（ＳＩＴＥ ＳＰＥＣＩＦＩＣ ＩＮＣＯＲＰＯＲＡＴＩＯＮ ＯＦ ＨＥＡＶＹ ＡＴＯＭ−ＣＯＮＴＡＩＮＩＮＧ ＵＮＮＡＴＵＲＡＬ ＡＭＩＮＯ ＡＣＩＤＳ ＩＮＴＯ ＰＲＯＴＥＩＮＳ ＦＯＲ ＳＴＲＵＣＴＵＲＥ ＤＥＴＥＲＭＩＮＡＴＩＯＮ）」、発明者Ｊｉａｎｍｉｎｇ Ｘｉｅら）、及びＵＳＳＮ６０／６０２，０４８（出願日２００４年８月１６日、発明の名称「構造決定のための重原子含有非天然アミノ酸の部位特異的蛋白質組込み（ＳＩＴＥ ＳＰＥＣＩＦＩＣ ＩＮＣＯＲＰＯＲＡＴＩＯＮ ＯＦ ＨＥＡＶＹ ＡＴＯＭ−ＣＯＮＴＡＩＮＩＮＧ ＵＮＮＡＴＵＲＡＬ ＡＭＩＮＯ ＡＣＩＤＳ ＩＮＴＯ ＰＲＯＴＥＩＮＳ ＦＯＲ ＳＴＲＵＣＴＵＲＥ ＤＥＴＥＲＭＩＮＡＴＩＯＮ）」、発明者Ｊｉａｎｍｉｎｇ Ｘｉｅら）の優先権と特典を主張する非仮特許出願であり、前記各特許出願の開示内容全体を参考資料として全目的で本明細書に組込む。
（連邦政府支援研究開発から創出された発明の権利に関する陳述）
本発明は国立衛生研究所助成番号ＧＭ６２１５９及びエネルギー省助成番号ＤＥ−ＦＧ０２−０３ＥＲ４６０５１として米国政府助成下に創出された。従って、米国政府は本発明に所定の権利をもつことができる。
（発明の技術分野）
本発明は翻訳生化学の分野に関する。本発明は終止セレクターコドン等のセレクターコドンに応答して非天然アミノ酸（例えば重原子含有アミノ酸）を蛋白質に組込む直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ、及び直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼと直交ｔＲＮＡの対の組成物に関する。本発明は更に前記対を使用して細胞で蛋白質を生産する方法及び関連キットにも関する。更に、本発明は対象蛋白質に組込まれる非天然アミノ酸を使用して蛋白質結晶構造を決定するための新規組成物及び方法にも関する。
蛋白質の内部の異常シグナルを使用して単波長異常分散（ＳＡＤ）実験により結晶構造決定のための位相情報を誘導することができる（Ｈｅｎｄｒｉｃｋｓｏｎ ａｎｄ Ｔｅｅｔｅｒ（１９８１）“Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｔｈｅ ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｒａｍｂｉｎ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ ｄｉｒｅｃｔｌｙ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ａｎｏｍａｌｏｕｓ ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ ｏｆ ｓｕｌｆｕｒ”Ｎａｔｕｒｅ ２９０：１０７−１１３及びＤｅｂｒｅｃｚｅｎｉら（２００３）“Ｉｎ−ｈｏｕｓｅ ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ ｏｆ ｔｈｅ ｓｕｌｆｕｒ ａｎｏｍａｌｏｕｓ ｓｉｇｎａｌ ａｎｄ ｉｔｓ ｕｓｅ ｆｏｒ ｐｈａｓｉｎｇ”Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ Ｄ ５９：６８８−６９６）。しかし、蛋白質中に存在する硫黄又は他の原子に由来する異常シグナルは弱いため、冗長度の高いデータが緊要であり（Ｄａｕｔｅｒら（１９９９）“Ｃａｎ ａｎｏｍａｌｏｕｓ ｓｉｇｎａｌ ｏｆ ｓｕｌｆｕｒ ｂｅｃｏｍｅ ａ ｔｏｏｌ ｆｏｒ ｓｏｌｖｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｒｙｓｔａｌ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ？”Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２８９：８３−９２）、屋内ＳＡＤフェージングの使用は制限されている。Ｕ、Ｂａ、Ｘｅ、Ｔｅ、及びＩ等の重原子はＣｕＫα波長で強い異常シグナルをもつが、蛋白質中の厳密な位置に配置することは一般に難しい。
屋内発生装置で一般に使用されるＣｕＫα波長（１．５４１８Å）におけるヨウ素の異常シグナル（δｆ”）は６．８５ｅ−であり、セレン（１．１４ｅ−）の６倍、硫黄（０．５６ｅ−）の１２倍である（Ｄａｕｔｅｒら（２００２）“Ｊｏｌｌｙ ＳＡＤ”Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ Ｄ ５８：４９４−５０６）。従って、ヨウ素原子を蛋白質に選択的に導入すると、セレン又は硫黄フェージングに必要な高いデータ冗長度と高い溶媒濃度を下げることができる（Ｄａｕｔｅｒら（１９９９）Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２８９：８３−９２）。本明細書に記載するような重原子の遺伝子組込み（例えばヨードＰｈｅの遺伝子組込み）はＳＡＤフェージング用の現行の重原子導入アプローチに勝る多数の利点がある。現行方法の１例では該当イオンを含有する溶液に結晶を浸漬することにより蛋白質の表面の結合水分子をハロゲン化物又は金属イオンで置換する（Ｄａｕｔｅｒら（２０００）“Ｎｏｖｅｌ ａｐｐｒｏａｃｈ ｔｏ ｐｈａｓｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎｓ：ｄｅｒｉｖａｔｉｚａｔｉｏｎ ｂｙ ｓｈｏｒｔ ｃｒｙｏ−ｓｏａｋｉｎｇ ｗｉｔｈ ｈａｌｉｄｅｓ”Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ Ｄ ５６（ Ｐｔ ２）：２３２−２３７及びＮａｇｅｍら（２００１）“Ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｒｙｓｔａｌ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｓｏｌｕｔｉｏｎ ｂｙ ｆａｓｔ ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｎｅｇａｔｉｖｅｌｙ ａｎｄ ｐｏｓｉｔｉｖｅｌｙ ｃｈａｒｇｅｄ ａｎｏｍａｌｏｕｓ ｓｃａｔｔｅｒｅｒｓ”Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ Ｄ ５７：９９６−１００２）。しかし、このアプローチは位相を誘導する前に位置を決定しなければならない低占有率点を多数生じる可能性がある。別法として、テルロメチオニン（ＴｅＭｅｔ）組込み（Ｂｏｌｅｓら（１９９４）“Ｂｉｏ−ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｅｌｌｕｒｏｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ ｉｎｔｏ ｂｕｒｉｅｄ ｒｅｓｉｄｕｅｓ ｏｆ ｄｉｈｙｄｒｏｆｏｌａｔｅ ｒｅｄｕｃｔａｓｅ”Ｎａｔ Ｓｔｒｕｃｔ Ｂｉｏｌ １：２８３−２８４及びＢｕｄｉｓａら（１９９７）“Ｂｉｏｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｅｌｌｕｒｏｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ ｉｎｔｏ ｐｒｏｔｅｉｎｓ：ａ ｐｒｏｍｉｓｉｎｇ ｎｅｗ ａｐｐｒｏａｃｈ ｆｏｒ Ｘ−ｒａｙ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ”Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２７０：６１６−６２３）はＣｕＫａ波長で有意異常シグナル（δｆ”＝６．４ｅ−）が得られるが、ＴｅＭｅｔの酸化感受性が高く、宿主生物に毒性であり、ＴｅＭｅｔによるＭｅｔの定量的置換が困難であるという欠点がある。
Ｈｅｎｄｒｉｃｋｓｏｎ ａｎｄ Ｔｅｅｔｅｒ（１９８１）"Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｔｈｅ ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｒａｍｂｉｎ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ ｄｉｒｅｃｔｌｙ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ａｎｏｍａｌｏｕｓ ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ ｏｆ ｓｕｌｆｕｒ"Ｎａｔｕｒｅ ２９０：１０７−１１３ Ｄｅｂｒｅｃｚｅｎｉら（２００３）"Ｉｎ−ｈｏｕｓｅ ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ ｏｆ ｔｈｅ ｓｕｌｆｕｒ ａｎｏｍａｌｏｕｓ ｓｉｇｎａｌ ａｎｄ ｉｔｓ ｕｓｅ ｆｏｒ ｐｈａｓｉｎｇ"Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ Ｄ ５９：６８８−６９６ Ｄａｕｔｅｒら（１９９９）"Ｃａｎ ａｎｏｍａｌｏｕｓ ｓｉｇｎａｌ ｏｆ ｓｕｌｆｕｒ ｂｅｃｏｍｅ ａ ｔｏｏｌ ｆｏｒ ｓｏｌｖｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｒｙｓｔａｌ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ？"Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２８９：８３−９２ Ｄａｕｔｅｒら（２００２）"Ｊｏｌｌｙ ＳＡＤ"Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ Ｄ ５８：４９４−５０６ Ｄａｕｔｅｒら（１９９９）Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２８９：８３−９２ Ｄａｕｔｅｒら（２０００）"Ｎｏｖｅｌ ａｐｐｒｏａｃｈ ｔｏ ｐｈａｓｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎｓ：ｄｅｒｉｖａｔｉｚａｔｉｏｎ ｂｙ ｓｈｏｒｔ ｃｒｙｏ−ｓｏａｋｉｎｇ ｗｉｔｈ ｈａｌｉｄｅｓ"Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ Ｄ ５６（ Ｐｔ ２）：２３２−２３７ Ｎａｇｅｍら（２００１）"Ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｒｙｓｔａｌ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｓｏｌｕｔｉｏｎ ｂｙ ｆａｓｔ ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｎｅｇａｔｉｖｅｌｙ ａｎｄ ｐｏｓｉｔｉｖｅｌｙ ｃｈａｒｇｅｄ ａｎｏｍａｌｏｕｓ ｓｃａｔｔｅｒｅｒｓ"Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ Ｄ ５７：９９６−１００２ Ｂｏｌｅｓら（１９９４）"Ｂｉｏ−ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｅｌｌｕｒｏｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ ｉｎｔｏ ｂｕｒｉｅｄ ｒｅｓｉｄｕｅｓ ｏｆ ｄｉｈｙｄｒｏｆｏｌａｔｅ ｒｅｄｕｃｔａｓｅ"Ｎａｔ Ｓｔｒｕｃｔ Ｂｉｏｌ １：２８３−２８４ Ｂｕｄｉｓａら（１９９７）"Ｂｉｏｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｅｌｌｕｒｏｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ ｉｎｔｏ ｐｒｏｔｅｉｎｓ：ａ ｐｒｏｍｉｓｉｎｇ ｎｅｗ ａｐｐｒｏａｃｈ ｆｏｒ Ｘ−ｒａｙ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ"Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２７０：６１６−６２３
特に、本発明は重原子の効率的な部位特異的蛋白質組込みを可能にすることにより上記問題を解消する組成物及び方法を提供する。例えば、ヨードＰｈｅをユニークコドン、ｔＲＮＡ、及びアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼで遺伝的にコードすることにより、このアミノ酸を蛋白質の任意所望位置に定量的且つ効率的に組込むことができる。更に、表面又は内部位置で大きな疎水性残基をヨードＰｈｅで置換することにより、蛋白質構造の摂動が最小限になると思われる。本発明の完全な理解は以下の記載を精読することにより得られよう。
本発明は直交ｔＲＮＡに重原子含有アミノ酸（例えばヨードＰｈｅ又はブロモＰｈｅ）を優先的に負荷する新規直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼを提供する。本発明は直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼと直交ｔＲＮＡを使用して蛋白質産物を生産する新規翻訳系も提供する。重原子含有アミノ酸（例えば臭素化又はヨウ素化アミノ酸）を組込んだ蛋白質を生産するための関連キット及び方法も記載する。これらの技術及び組成物は本明細書に記載するような多数の用途、特に蛋白質構造決定に利用される。
１側面において、本発明は直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ＲＳ）を含む翻訳系を提供する。１分類の態様では、Ｏ−ＲＳは配列番号３もしくは４のアミノ酸配列又は配列番号１−２及びその相補的ポリヌクレオチド配列から構成される群から選択されるポリヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列を含む。所定態様では、Ｏ−ＲＳは天然チロシルアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（ＴｙｒＲＳ）のアミノ酸配列と少なくとも９０％一致しており、Ｍ．ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ ＴｙｒＲＳのＴｙｒ３２に対応する位置のロイシン、Ｍ．ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ ＴｙｒＲＳのＧｌｕ１０７に対応する位置のセリン又はグルタミン酸、Ｍ．ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ ＴｙｒＲＳのＡｓｐ１５８に対応する位置のプロリン、Ｍ．ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ ＴｙｒＲＳのＩｌｅ１５９に対応する位置のロイシン又はアルギニン及びＭ．ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ ＴｙｒＲＳのＬｅｕ１６２に対応する位置のグルタミン酸又はアルギニンから構成される群から選択される２個以上（例えば３個以上、４個以上、又は５個）のアミノ酸を含むアミノ酸配列を含む。Ｏ−ＲＳは場合によりＭ．ｊａｎｎａｓｃｈｉｉアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼに由来する。所定態様では、直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼが配列番号６−９のいずれか１種を含まないという条件で、Ｏ−ＲＳは配列番号３又は配列番号４のアミノ酸配列を含むポリペプチドの効率の少なくとも５０％の効率で直交ｔＲＮＡを臭素化又はヨウ素化アミノ酸で優先的にアミノアシル化する。臭素化又はヨウ素化アミノ酸は例えばＬ−２−ヨードフェニルアラニン、Ｌ−３−ヨードフェニルアラニン、Ｌ−２−ヨードチロシン、Ｌ−３−ヨードチロシン、Ｌ−２−ブロモフェニルアラニン、Ｌ−３−ブロモフェニルアラニン、Ｌ−２−ブロモチロシン、又はＬ−３−ブロモチロシンとすることができる。好適分類の態様では、臭素化又はヨウ素化アミノ酸はＬ−４−ブロモフェニルアラニン（ブロモＰｈｅ）又はＬ−４−ヨードフェニルアラニン（ヨードＰｈｅ）である。
１分類の態様では、翻訳系は細胞、例えば大腸菌細胞に含まれる。Ｏ−ＲＳは場合により細胞中の１個以上の核酸によりコードされる。同様に、Ｏ−ＲＳにより優先的に負荷される直交ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）も場合により細胞中の１個以上の核酸によりコードされる。他の態様では、翻訳系はｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳系、例えば細胞抽出液を含む。
翻訳系は一般に更に直交ｔＲＮＡ、例えばＯ−ＲＳにより臭素化又はヨウ素化アミノ酸を優先的に負荷されるＯ−ｔＲＮＡを含む。所定態様では、Ｏ−ｔＲＮＡは配列番号５のポリヌクレオチド配列又はその保存変異体を含むか又は前記配列によりコードされる。Ｏ−ｔＲＮＡは場合により終止コドン（例えばアンバーコドン）であるセレクターコドンを認識する（即ちその認識配列を含む）。
翻訳系は場合によりＯ−ＲＳにより例えば臭素化又はヨウ素化アミノ酸を優先的に負荷されるＯ−ｔＲＮＡにより認識されるセレクターコドンを含むターゲット核酸を含む。翻訳系は更にターゲット核酸によりコードされる蛋白質を含むことができ、前記蛋白質は臭素化又はヨウ素化アミノ酸（例えばブロモＰｈｅ又はヨードＰｈｅ）を含む。
１一般分類の態様は配列番号３もしくは配列番号４のアミノ酸配列又はその保存変異体を含む直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼを含む組成物を提供する。組成物は場合により更にＯ−ＲＳにより臭素化又はヨウ素化アミノ酸（例えばヨードＰｈｅ又はブロモＰｈｅ）で優先的にアミノアシル化される直交ｔＲＮＡを含む。例えば、Ｏ−ｔＲＮＡは配列番号５のポリヌクレオチド配列又はその保存変異体を含むか又は前記配列によりコードされることができる。
組成物は細胞（例えば真核又は非真核細胞、例えば大腸菌細胞）、例えばＯ−ＲＳがその中に存在する細胞を含むことができる。Ｏ−ＲＳは場合により細胞中の１個以上の核酸によりコードされる。組成物は翻訳系を組込むことができる。細胞を組込んでおり、Ｏ−ＲＳが細胞中の１個以上の核酸によりコードされる組成物において、細胞は更にセレクターコドンを認識する直交ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）と臭素化又はヨウ素化アミノ酸を含むことができ、例えばＯ−ＲＳはＯ−ｔＲＮＡを臭素化又はヨウ素化アミノ酸で優先的にアミノアシル化する。所定態様では、細胞は該当蛋白質をコードするターゲット核酸を含み、ターゲット核酸はＯ−ｔＲＮＡにより認識されるセレクターコドンをコードする。細胞は更にターゲット核酸によりコードされる蛋白質を含むことができ、前記蛋白質は臭素化又はヨウ素化アミノ酸を含む。
関連一般分類の態様は配列番号３もしくは配列番号４のアミノ酸配列もしくはその保存変異体をコードするポリヌクレオチド配列又は配列番号１もしくは配列番号２のポリヌクレオチド配列もしくはその相補的ポリヌクレオチド配列を含む核酸を提供する。ベクター（例えば発現ベクター）は本発明の核酸を含むか又はコードすることができる。
キットも本発明の特徴である。例えば、特定位置に臭素化又はヨウ素化アミノ酸を組込んだ蛋白質を生産するためのキットが提供され、前記キットは細胞で機能し、セレクターコドンを認識する直交ｔＲＮＡと、直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼを含む細胞を１個以上の容器にパッケージングしたものである。直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼは天然チロシルアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（ＴｙｒＲＳ）のアミノ酸配列と少なくとも９０％一致しており、Ｍ．ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ ＴｙｒＲＳのＴｙｒ３２に対応する位置のロイシン、Ｍ．ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ ＴｙｒＲＳのＧｌｕ１０７に対応する位置のセリン又はグルタミン酸、Ｍ．ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ ＴｙｒＲＳのＡｓｐ１５８に対応する位置のプロリン、Ｍ．ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ ＴｙｒＲＳのＩｌｅ１５９に対応する位置のロイシン又はアルギニン及びＭ．ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ ＴｙｒＲＳのＬｅｕ１６２に対応する位置のグルタミン酸又はアルギニンから構成される群から選択される２個以上（例えば３個以上、４個以上、又は５個）のアミノ酸を含むアミノ酸配列を含む。１態様では、キットは更に臭素化又はヨウ素化アミノ酸（例えばブロモＰｈｅ又はヨードＰｈｅ）と、蛋白質を生産するための説明書と、適切な細胞増殖培地と、対象蛋白質をコードするターゲット核酸を導入すると共にセレクターコドンを細胞に付加するための試薬、及び／又は同等物を含む。
重原子含有アミノ酸（例えば臭素化又はヨウ素化アミノ酸、例えばブロモＰｈｅ又はヨードＰｈｅ）を特定位置に組込んだ蛋白質を細胞（例えば大腸菌等の非真核細胞又は真核細胞）で生産する方法も本発明の特徴である。例えば、本方法は、少なくとも１個のセレクターコドンを含み且つ蛋白質をコードする核酸と、細胞で機能し、セレクターコドンを認識する直交ｔＲＮＡと、直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼを含む細胞を提供する段階を含む。Ｏ−ＲＳは天然チロシルアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（ＴｙｒＲＳ）のアミノ酸配列と少なくとも９０％一致しており、Ｍ．ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ ＴｙｒＲＳのＴｙｒ３２に対応する位置のロイシン、Ｍ．ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ ＴｙｒＲＳのＧｌｕ１０７に対応する位置のセリン又はグルタミン酸、Ｍ．ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ ＴｙｒＲＳのＡｓｐ１５８に対応する位置のプロリン、Ｍ．ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ ＴｙｒＲＳのＩｌｅ１５９に対応する位置のロイシン又はアルギニン及びＭ．ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ ＴｙｒＲＳのＬｅｕ１６２に対応する位置のグルタミン酸又はアルギニンから構成される群から選択される２個以上（例えば３個以上、４個以上、又は５個）のアミノ酸を含むアミノ酸配列を含む。Ｏ−ＲＳは場合により配列番号３−４のいずれか１種を含むアミノ酸配列を含む。同様に、Ｏ−ｔＲＮＡは場合により配列番号５に記載のポリヌクレオチド配列又はその保存変異体を含むか又は前記配列によりコードされる。細胞を適当な培地で増殖させる。臭素化又はヨウ素化アミノ酸（又は他の重原子含有アミノ酸）を提供し、少なくとも１個のセレクターコドンによる核酸の翻訳中に蛋白質の特定位置に組込むことにより、蛋白質を生産する。
１側面では、本発明は蛋白質構造の決定方法を提供する。本方法では、直交ｔＲＮＡと、直交ｔＲＮＡを重原子含有アミノ酸で優先的にアミノアシル化する直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼを含む翻訳系で特定位置に重原子含有アミノ酸を組込んだ蛋白質を発現させることにより前記蛋白質を提供する。重原子含有アミノ酸を組込んだ蛋白質を結晶化させることにより、重原子含有蛋白質結晶を作製する。単波長（例えば１．５４１８Å）で重原子含有蛋白質結晶からの回折データを収集する段階と、フリーデル対間の異常差を測定する段階を含むプロセスにより蛋白質の構造を決定する。
蛋白質は例えば本明細書に記載するようなｉｎ ｖｉｖｏ又はｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳系で発現させることができる。所定態様では、直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼは配列番号３もしくは配列番号４のアミノ酸配列又はその保存変異体を含む。同様に、直交ｔＲＮＡは配列番号５のポリヌクレオチド配列又はその保存変異体を含むことができる。
重原子含有アミノ酸は原則的に適切な任意重原子含有アミノ酸とすることができ、例えばその導入により蛋白質構造の有意摂動を生じると予想されないものが挙げられる。例えば、重原子含有アミノ酸は臭素化又はヨウ素化アミノ酸とすることができる。１好適分類の態様では、臭素化又はヨウ素化アミノ酸はＬ−４−ブロモフェニルアラニン又はＬ−４−ヨードフェニルアラニンである。
（定義）
特に定義しない限り、本明細書で使用する全科学技術用語は本発明が属する分野の当業者に通常理解されている通りの意味をもつ。以下の定義は当分野における定義を補足するものであり、本願を対象としており、関連又は非関連事例（例えば同一名義特許又は出願）に帰属すべきものではない。本発明の試験の実施には本明細書に記載するものと類似又は等価の任意方法及び材料を使用することができるが、好ましい材料及び方法は本明細書に記載する。従って、本明細書で使用する用語は特定態様のみの説明を目的とし、限定的ではない。
本明細書と特許請求の範囲で使用する単数形はそうでないことが内容から明白である場合を除き、複数形も含む。従って、例えば「細胞」と言う場合には２個以上の細胞の組合せを含み、「細菌」と言う場合には細菌混合物を含み、他の用語についても同様である。
直交ｔＲＮＡ：本明細書で使用する直交ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）とは該当翻訳系に直交なｔＲＮＡである。Ｏ−ｔＲＮＡはアミノ酸を負荷された状態で存在することもできるし、負荷されない状態で存在することもできる。当然のことながら、本発明のＯ−ｔＲＮＡは翻訳中にセレクターコドンに応答して成長中のポリペプチドに天然又は非天然のいずれかに拘わらず原則的に任意アミノ酸を挿入するために有利に使用される。
直交アミノ酸シンテターゼ：本明細書で使用する直交アミノ酸シンテターゼ（Ｏ−ＲＳ）とは該当翻訳系においてＯ−ｔＲＮＡをアミノ酸で優先的にアミノアシル化する酵素である。
直交：本明細書で使用する「直交」なる用語は細胞又は他の翻訳系に内在する対応分子に比較して低効率で細胞又は翻訳系の内在成分と共働するか、あるいは細胞又は翻訳系の内在成分と対合したときに機能できない分子（例えば直交ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）及び／又は直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ＲＳ））を意味する。ｔＲＮＡ及びアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼに関して直交とは、適切な（例えば相同又は類似）内在ｔＲＮＡが相補的内在ｔＲＮＡシンテターゼと対合したときに比較して直交ｔＲＮＡが内在ｔＲＮＡシンテターゼと共働できないか又は低効率（例えば２０％未満、１０％未満、５％未満、又は１％未満の効率）でしか共働できず、あるいは、適切な内在ｔＲＮＡシンテターゼが相補的内在ｔＲＮＡと対合したときに比較して直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼが内在ｔＲＮＡと共働できないか又は低効率でしか共働できないことを意味する。直交分子は細胞又は翻訳系内に機能的に正常な天然相補的内在分子をもたない。例えば、細胞中の直交ｔＲＮＡがこの細胞の任意内在ＲＳによりアミノアシル化される効率は内在ｔＲＮＡが内在ＲＳによりアミノアシル化される効率に比較して低いか又は検出不能である。別の例では、直交ＲＳが該当細胞中の任意内在ｔＲＮＡをアミノアシル化する効率は相補的内在ＲＳが内在ｔＲＮＡをアミノアシル化する効率に比較して低いか又は検出不能である。第１の直交分子と対合したときに機能する第２の直交分子を細胞に導入することができる。例えば、直交ｔＲＮＡ／ＲＳ対は対照（例えば対応（類似）するｔＲＮＡ／ＲＳ内在対、又は活性直交対（例えばトリプトファニル又はチロシル直交ｔＲＮＡ／ＲＳ対））の効率に比較して所定の効率（例えば４５％の効率、５０％の効率、６０％の効率、７０％の効率、７５％の効率、８０％の効率、９０％の効率、９５％の効率、又は９９％以上の効率）で細胞中で共働する導入相補成分を含む。
コグネイト：「コグネイト」なる用語は共働する成分、例えば直交ｔＲＮＡと前記直交ｔＲＮＡを優先的にアミノアシル化する直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼを意味する。これらの成分は「相補的」であると言うこともできる。
優先的にアミノアシル化する：Ｏ−ＲＳはＯ−ＲＳが発現系で任意内在ｔＲＮＡに負荷するよりも効率的にＯ−ｔＲＮＡにアミノ酸を負荷するときにコグネイトＯ−ｔＲＮＡを「優先的にアミノアシル化する」。即ち、Ｏ−ｔＲＮＡと所与の任意内在ｔＲＮＡがほぼ等モル比で翻訳系に存在するとき、Ｏ−ＲＳは内在ｔＲＮＡに負荷するよりも高頻度でＯ−ｔＲＮＡに負荷する。Ｏ−ＲＳにより負荷されるＯ−ｔＲＮＡとＯ−ＲＳにより負荷される内在ｔＲＮＡの相対比は高いことが好ましく、Ｏ−ｔＲＮＡと内在ｔＲＮＡが等モル濃度で翻訳系に存在する場合にはＯ−ＲＳがＯ−ｔＲＮＡに排他的、又はほぼ排他的に負荷することが好ましい。Ｏ−ｔＲＮＡとＯ−ＲＳが等モル濃度で存在する場合にＯ−ＲＳにより負荷されるＯ−ｔＲＮＡと内在ｔＲＮＡの相対比は１：１を上回り、好ましくは少なくとも約２：１、より好ましくは５：１、更に好ましくは１０：１、更に好ましくは２０：１、更に好ましくは５０：１、更に好ましくは７５：１、更に好ましくは９５：１、９８：１、９９：１、１００：１、５００：１、１，０００：１、５，０００：１又はそれ以上である。
（ａ）Ｏ−ＲＳが内在ｔＲＮＡに比較してＯ−ｔＲＮＡを優先的にアミノアシル化するとき、及び（ｂ）Ｏ−ＲＳがＯ−ｔＲＮＡを任意天然アミノ酸でアミノアシル化する場合に比較してそのアミノアシル化が非天然アミノ酸に特異的であるときにＯ−ＲＳは「Ｏ−ｔＲＮＡを非天然アミノ酸で優先的にアミノアシル化する」。即ち、非天然アミノ酸と天然アミノ酸がＯ−ＲＳとＯ−ｔＲＮＡを含む翻訳系に等モル量で存在するとき、Ｏ−ＲＳは天然アミノ酸よりも高頻度で非天然アミノ酸をＯ−ｔＲＮＡに負荷する。非天然アミノ酸を負荷されたＯ−ｔＲＮＡと天然アミノ酸を負荷されたＯ−ｔＲＮＡの相対比は高いことが好ましい。Ｏ−ＲＳはＯ−ｔＲＮＡに排他的、又はほぼ排他的に非天然アミノ酸を負荷することがより好ましい。天然アミノ酸と非天然アミノ酸の両者が等モル濃度で翻訳系に存在するとき、Ｏ−ｔＲＮＡの非天然アミノ酸負荷とＯ−ｔＲＮＡの天然アミノ酸負荷の相対比は１：１を上回り、好ましくは少なくとも約２：１、より好ましくは５：１、更に好ましくは１０：１、更に好ましくは２０：１、更に好ましくは５０：１、更に好ましくは７５：１、更に好ましくは９５：１、９８：１、９９：１、１００：１、５００：１、１，０００：１、５，０００：１又はそれ以上である。
セレクターコドン：「セレクターコドン」なる用語は翻訳プロセスでＯ−ｔＲＮＡにより認識され、一般に内在ｔＲＮＡにより認識されないコドンを意味する。Ｏ−ｔＲＮＡアンチコドンループはｍＲＮＡ上のセレクターコドンを認識し、そのアミノ酸を（例えば非天然アミノ酸、例えば重原子含有アミノ酸）をポリペプチドのこの部位に組込む。セレクターコドンとしては例えばナンセンスコドン（例えばアンバー、オーカー及びオパールコドン等の終止コドン）、４塩基以上のコドン、レアコドン、天然又は非天然塩基対から誘導されるコドン及び／又は同等物を挙げることができる。
サプレッサーｔＲＮＡ：サプレッサーｔＲＮＡは例えばセレクターコドンに応答してポリペプチド鎖にアミノ酸を組込むためのメカニズムを提供することにより、所与翻訳系でメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の読取りを変更するｔＲＮＡである。例えば、サプレッサーｔＲＮＡは例えば終止コドン、４塩基コドン、レアコドン等を読み飛ばすことができる。
抑圧活性：本明細書で使用する「抑圧活性」なる用語は一般に、読み飛ばさないと翻訳終結又は誤訳（例えばフレームシフト）をもたらすコドン（例えばアンバーコドン又は４塩基以上のコドン等のセレクターコドン）の翻訳読み飛ばしを行うｔＲＮＡ（例えばサプレッサーｔＲＮＡ）の能力を意味する。サプレッサーｔＲＮＡの抑圧活性は第２のサプレッサーｔＲＮＡ又は対照系（例えばＯ−ＲＳをもたない対照系）に比較して観察される翻訳読み飛ばし活性の百分率として表すことができる。
本発明は抑圧活性を定量することが可能な種々の手段を提供する。該当セレクターコドン（例えばアンバーコドン）に対する特定Ｏ−ｔＲＮＡ及びＯ−ＲＳの抑圧百分率とは、Ｏ−ｔＲＮＡ、Ｏ−ＲＳ及びセレクターコドンをもたないポジティブ対照構築物に比較して、Ｏ−ＲＳとＯ−ｔＲＮＡを含む該当翻訳系で発現され、そのコーディング核酸中にセレクターコドンを含む所与試験マーカー（例えばＬａｃＺ）の活性百分率を意味する。従って、例えば、セレクターコドンをもたない活性ポジティブ対照マーカーが所与翻訳系において該当マーカーアッセイに関連する単位で表した観測活性Ｘをもつ場合には、セレクターコドンを含む試験構築物の抑圧百分率は、Ｏ−ｔＲＮＡとＯ−ＲＳを更に含む翻訳系で発現される以外はポジティブ対照マーカーが発現される条件とほぼ同一の環境条件下で試験マーカー構築物が示すＸの百分率である。一般に、試験マーカーを発現する翻訳系は更にＯ−ＲＳとＯ−ｔＲＮＡにより認識されるアミノ酸を含む。場合により、抑圧百分率測定値は、Ｏ−ｔＲＮＡ、Ｏ−ＲＳ及び／又はＯ−ｔＲＮＡ及び／又はＯ−ＲＳにより認識される該当アミノ酸を含まない系で試験マーカーと同一のセレクターコドンを含む「バックグラウンド」又は「ネガティブ」対照マーカー構築物に試験マーカーを比較することにより精確にすることができる。このネガティブ対照は該当翻訳系におけるマーカーからのバックグラウンドシグナル効果を考慮するように抑圧百分率測定値を正規化するのに有用である。
抑圧効率は当分野で公知の多数のアッセイの任意のものにより測定することができる。例えば、β−ガラクトシダーゼレポーターアッセイを使用することができ、例えば本発明のＯ−ｔＲＮＡを含むプラスミドと共に修飾ｌａｃＺプラスミド（構築物はｌａｃＺ核酸配列中にセレクターコドンをもつ）を適当な生物（例えば直交成分を使用することができる生物）に由来する細胞に導入する。コグネイトシンテターゼ（ポリペプチド又は発現されるとコグネイトシンテターゼをコードするポリヌクレオチドとして）も導入することができる。細胞を培地で所望密度（例えばＯＤ６００＝約０．５）まで増殖させ、例えばＢｅｔａＦｌｕｏｒ（登録商標）β−ガラクトシダーゼアッセイキット（Ｎｏｖａｇｅｎ）を使用してβ−ガラクトシダーゼアッセイを実施する。比較可能な対照（例えば所望位置にセレクターコドンではなく対応するセンスコドンをもつ修飾ｌａｃＺ構築物から観察される値）に対するサンプルの活性百分率として抑圧百分率を計算することができる。
翻訳系：「翻訳系」なる用語は成長中のポリペプチド鎖（蛋白質）にアミノ酸を組込む成分を意味する。翻訳系の成分としては例えばリボソーム、ｔＲＮＡ、シンテターゼ、ｍＲＮＡ等を挙げることができる。本発明のＯ−ｔＲＮＡ及び／又はＯ−ＲＳは例えば非真核細胞（例えば細菌（例えば大腸菌））、又は真核細胞（例えば酵母細胞、哺乳動物細胞、植物細胞、藻類細胞、真菌細胞、昆虫細胞、及び／又は同等物）でｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｉｎ ｖｉｖｏ翻訳系に付加するか又はその一部とすることができる。
非天然アミノ酸：本明細書で使用する「非天然アミノ酸」なる用語は２０種の標準天然アミノ酸の１種又は微量天然アミノ酸セレノシステインもしくはピロリジン以外の任意アミノ酸、修飾アミノ酸、及び／又はアミノ酸類似体（例えば重原子含有アミノ酸）を意味する。
〜に由来：本明細書で使用する「〜に由来」なる用語は特定分子もしくは生物から単離されているか又は特定分子もしくは生物からの情報を使用して作製された成分を意味する。
ポジティブ選択又はスクリーニングマーカー：本明細書で使用する「ポジティブ選択又はスクリーニングマーカー」なる用語は、このマーカーが存在する（例えば発現、活性化等される）と、このマーカーに対応する形質を含む細胞（例えばポジティブ選択マーカーをもつ細胞）が前記形質をもたない細胞から識別されるマーカーを意味する。
ネガティブ選択又はスクリーニングマーカー：本明細書で使用する「ネガティブ選択又はスクリーニングマーカー」なる用語は、このマーカーが存在する（例えば発現、活性化等される）と、（例えば選択性質又は形質をもつ細胞に対して）前記性質又は形質をもたない細胞を識別することができるマーカーを意味する。
レポーター：本明細書で使用する「レポーター」なる用語は該当系のターゲット成分を同定及び／又は選択するために使用することができる成分を意味する。例えば、レポーターとしては蛋白質、例えば抗生物質耐性又は感受性を付与する酵素（例えばβ−ラクタマーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）等）、蛍光スクリーニングマーカー（例えば緑色蛍光蛋白質（例えばＧＦＰ）、ＹＦＰ、ＥＧＦＰ、ＲＦＰ等）、発光マーカー（例えばホタルルシフェラーゼ蛋白質）、アフィニティースクリーニングマーカー、又はポジティブもしくはネガティブ選択マーカー遺伝子（例えばｌａｃＺ、β−ｇａｌ／ｌａｃＺ（β−ガラクトシダーゼ）、Ａｄｈ（アルコールデヒドロゲナーゼ）、ｈｉｓ３、ｕｒａ３、ｌｅｕ２、ｌｙｓ２等）を挙げることができる。
真核生物：本明細書で使用する「真核生物」なる用語は系統発生分類の真核生物に属する生物を意味し、例えば動物（例えば哺乳動物、昆虫、爬虫類、鳥類等）、繊毛虫、植物（例えば単子葉植物、双子葉植物、藻類等）、真菌類、酵母、鞭毛虫、微胞子虫、原生生物等が挙げられる。
非真核生物：本明細書で使用する「非真核生物」なる用語は真核生物以外の生物を意味する。例えば、非真核生物は系統発生分類の真正細菌（例えばＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ等）、又は系統発生分類の古細菌（例えばＭｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ（Ｍｊ）、Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ ｍａｚｅｉ（Ｍｍ）、Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍ（Ｍｔ）、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ ｍａｒｉｐａｌｕｄｉｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｐｙｒｕｓ ｋａｎｄｌｅｒｉ、Ｈａｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ（例えばＨａｌｏｆｅｒａｘ ｖｏｌｃａｎｉｉ及びＨａｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ種ＮＲＣ−１）、Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ ｆｕｌｇｉｄｕｓ（Ａｆ）、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｕｓ（Ｐｆ）、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉ（Ｐｈ）、Ｐｙｒｏｂａｃｕｌｕｍ ａｅｒｏｐｈｉｌｕｍ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ａｂｙｓｓｉ、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓ（Ｓｓ）、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ ｔｏｋｏｄａｉｉ、Ａｅｕｒｏｐｙｒｕｍ ｐｅｒｎｉｘ（Ａｐ）、Ｔｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ、Ｔｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａ ｖｏｌｃａｎｉｕｍ等）に属することができる。
保存変異体：翻訳成分に関して本明細書で使用する「保存変異体」なる用語は翻訳成分を意味し、例えば類似する基本成分（例えばＯ−ｔＲＮＡ又はＯ−ＲＳ）と同様に機能するが、参照Ｏ−ｔＲＮＡ又はＯ−ＲＳに比較して配列に変異をもつ保存変異体Ｏ−ｔＲＮＡ又は保存変異体Ｏ−ＲＳが挙げられる。例えば、Ｏ−ＲＳは相補的Ｏ−ｔＲＮＡ又は保存変異体Ｏ−ｔＲＮＡを非天然アミノ酸（例えば重原子含有アミノ酸）でアミノアシル化するが、Ｏ−ｔＲＮＡと保存変異体Ｏ−ｔＲＮＡは同一配列をもたない。保存変異体は保存変異体が対応するＯ−ｔＲＮＡ又はＯ−ＲＳに相補的である限り、例えば配列の１カ所、２カ所、３カ所、４カ所、又は５カ所以上に変異をもつことができる。
選択又はスクリーニング物質：本明細書で使用する「選択又はスクリーニング物質」なる用語はこのような物質が存在すると、集団から所定成分を選択／スクリーニングすることができる物質を意味する。例えば、選択又はスクリーニング物質としては限定されないが、栄養素、抗生物質、光波長、抗体、発現されたポリヌクレオチド等が挙げられる。選択物質は例えば濃度、強度等を変動させることができる。
〜に応答して：本明細書で使用する「〜に応答して」なる用語は本発明のｔＲＮＡがセレクターコドンを認識し、ｔＲＮＡに担持される該当アミノ酸（例えば重原子含有アミノ酸等の非天然アミノ酸）を成長中のポリペプチド鎖に組込むプロセスを意味する。
コードする：本明細書で使用する「コードする」なる用語は第１の分子又は配列鎖とは異なる第２の分子又は配列鎖の生産を導くためにポリマー巨大分子又は配列鎖中の情報を使用する任意プロセスを意味する。本明細書ではこの用語を広義に使用し、種々に適用することができる。１側面では、「コードする」なる用語は新規に合成された相補的姉妹鎖をＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼによりコードするための鋳型として２本鎖ＤＮＡ分子の一方の鎖を使用する半保存的ＤＮＡ複製プロセスを意味する。
別の側面では、「コードする」なる用語は第１の分子とは異なる化学的性質をもつ第２の分子の生産を導くためにある分子中の情報を使用する任意プロセスを意味する。例えば、ＤＮＡ分子は（例えばＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ酵素を含む転写プロセスにより）ＲＮＡ分子をコードすることができる。また、ＲＮＡ分子は翻訳プロセスと同様にポリペプチドをコードすることができる。翻訳プロセスについて使用する場合には、「コードする」なる用語はアミノ酸をコードする三重項コドンにも適用する。所定側面では、ＲＮＡ分子は例えばＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼを含む逆転写プロセスによりＤＮＡ分子をコードすることができる。別の側面では、ＤＮＡ分子はポリペプチドをコードすることができ、この場合に使用する「コードする」とは当然のことながら転写プロセスと翻訳プロセスの両者を含む。
重原子：「重原子」とは結晶中に存在する場合に重原子をもたない対応する結晶の回折パターンに比較して結晶の回折パターンに測定可能な差を生じ得る原子である。例えば、ＳＡＤ又はＭＡＤフェージング技術で使用される重原子は一般に標準Ｘ線源で検出し易く、従って、簡便な波長で異常シグナルを発生するエネルギーで共鳴シグナルをもつ。別例として、単一又は多重同形置換フェージング技術で使用される重原子は一般に存在する他の原子の原子数よりも原子数が著しく多い（例えば蛋白質又は蛋白質結晶中に存在するＣ、Ｎ、Ｏ及びＳよりも原子数が多い）。
フリーデル対：「フリーデル対」とはバイフット対のメンバーであり、指数ｈ，ｋ，ｌと−ｈ，−ｋ，−ｌで表される。
核酸：「核酸」又は「ポリヌクレオチド」なる用語はヌクレオチド鎖に対応させることができるモノマー単位の任意物理的連鎖を意味し、例えばヌクレオチドポリマー（例えば典型的ＤＮＡ又はＲＮＡポリマー）、ＰＮＡ、修飾オリゴヌクレオチド（例えば生物ＲＮＡ又はＤＮＡには一般的でないヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド、例えば２’−Ｏ−メチル化オリゴヌクレオチド）等が挙げられる。核酸は例えば１本鎖でも２本鎖でもよい。特に指定しない限り、本発明の特定核酸配列は場合により指定配列以外に相補的配列も含むか又はコードする。
ポリペプチド：「ポリペプチド」とは２個以上のアミノ酸残基を含むポリマー（例えばペプチド又は蛋白質）である。ポリマーは更にラベル、クエンチャー、保護基等の非アミノ酸エレメントを含むことができ、場合によりグリコシル化等の修飾を含むことができる。ポリペプチドのアミノ酸残基は天然でも非天然でもよく、置換されていなくても、修飾されていなくても、置換されていても、修飾されていてもよい。
アミノ酸配列：「アミノ酸配列」は状況に応じてアミノ酸残基のポリマー（蛋白質、ポリペプチド等）又はアミノ酸ポリマーを表す文字列である。
ポリヌクレオチド配列：「ポリヌクレオチド配列」又は「ヌクレオチド配列」は状況に応じてヌクレオチドのポリマー（オリゴヌクレオチド、ＤＮＡ、核酸等）又はヌクレオチドポリマーを表す文字列である。任意特定ポリヌクレオチド配列から所与核酸又は相補的ポリヌクレオチド配列（例えば相補的核酸）を決定することができる。
任意所与ポリマー成分（アミノ酸残基、組込まれたヌクレオチド等）の位置を前記所与ポリマー中の実際の位置ではなく、選択されたアミノ酸又はヌクレオチド中の同一残基位置により記載する場合に、所与アミノ酸又はヌクレオチドポリマーのナンバリングは選択されたアミノ酸ポリマー又は核酸の「ナンバリングに対応する」。
その他の各種用語は本明細書中に定義又は他の方法で説明する。
少数の例外を除き、全公知生物の遺伝コードは同一の２０種の標準アミノ酸をコードするが、ユニークｔＲＮＡ／アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ対、アミノ酸源、及びアミノ酸に特異的なユニークセレクターコドンさえあれば生物のレパートリーに新規アミノ酸を追加することができる（Ｆｕｒｔｅｒ（１９９８）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ．，７：４１９−４２６）。先に、本発明者らは夫々大腸菌（Ｗａｎｇら，（２０００）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１２２：５０１０−５０１１；Ｗａｎｇら，（２００１）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９２：４９８−５００；Ｗａｎｇら，（２００３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，１００：５６−６１；Ｃｈｉｎら，（２００２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，９９：１１０２０−１１０２４）と酵母（Ｃｈｉｎ ａｎｄ Ｓｃｈｕｌｔｚ，（２００２）ＣｈｅｍＢｉｏＣｈｅｍ，３：１１３５−１１３７；Ｃｈｉｎら（２００３）Ｓｃｉｅｎｃｅ ３０１：９６４−９６７）において新規特性をもつ各種アミノ酸を遺伝的にコードするためにアンバーナンセンスコドン、ＴＡＧを直交Ｍ．ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ及び大腸菌ｔＲＮＡ／シンテターゼ対と併用できることを示している。
重原子含有アミノ酸等の付加合成アミノ酸を遺伝コードにｉｎ ｖｉｖｏ付加するためには、翻訳機構で効率的に機能することができるが、対が翻訳系に内在性のシンテターゼとｔＲＮＡから独立して機能するという意味で該当翻訳系に対して「直交性」のアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼとｔＲＮＡの新規直交対が必要である。直交対の所望特徴としては、内在ｔＲＮＡによりデコードされない特定新規コドン（例えばセレクターコドン）のみをデコード又は認識するｔＲＮＡと、そのコグネイトｔＲＮＡを特定非天然アミノ酸（例えば重原子含有アミノ酸）のみで優先的にアミノアシル化（又は負荷）するアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼが挙げられる。Ｏ−ｔＲＮＡは内在シンテターゼによりアミノアシル化されないことも望ましい。例えば大腸菌では、直交対は例えば大腸菌に存在する４０種の内在ｔＲＮＡのいずれをも実質的にアミノアシル化しないアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼと、例えば大腸菌に存在する２１種の内在シンテターゼのいずれによっても実質的にアミノアシル化されない直交ｔＲＮＡを含む。
本発明では、アンバーコドンに応答して重原子含有アミノ酸ヨードＰｈｅ及びブロモＰｈｅを蛋白質に効率的且つ選択的に組込む新規直交シンテターゼ／ｔＲＮＡ対の作製について報告する。
１側面では、本発明は直交ｔＲＮＡシンテターゼと、直交ｔＲＮＡ−アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ対（例えば非天然アミノ酸、例えば重原子含有アミノ酸を該当蛋白質に組込むために使用することができるＯ−ｔＲＮＡ／Ｏ−ＲＳ対）を含む組成物及びキットを提供する。関連方法も記載する。本発明の代表的な直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼはそのＯ−ｔＲＮＡをヨードＰｈｅ又はブロモＰｈｅで優先的にアミノアシル化（又は負荷）する。Ｏ−ｔＲＮＡ／Ｏ−ＲＳ対はＯ−ｔＲＮＡにより認識されるセレクターコドンを含むポリヌクレオチドによりコードされる蛋白質へのヨードＰｈｅ又はブロモＰｈｅの例えばｉｎ ｖｉｖｏ組込みを媒介することができる。Ｏ−ｔＲＮＡのアンチコドンループはｍＲＮＡ上のセレクターコドンを認識し、そのアミノ酸（例えばヨードＰｈｅ又はブロモＰｈｅ）をポリペプチドの対応位置に組込む。
重原子含有アミノ酸（例えばヨードＰｈｅ又はブロモＰｈｅ）の効率的な部位特異的蛋白質組込みはＸ線結晶解析による蛋白質構造解析を容易にする。蛋白質の重原子修飾は位相決定を実施するために一般に使用されており、本発明の方法及び組成物を使用する重原子の部位特異的組込みは修飾部位と重原子数の選択にフレキシビリティを提供する。更に、本明細書に記載する方法による重原子含有蛋白質のｉｎ ｖｉｖｏ生産は修飾蛋白質の収率を改善することができる。
例えば、本明細書に記載するＯ−ｔＲＮＡ／Ｏ−ＲＳ対を使用してヨードＰｈｅを組込むと、ＳＡＤフェージングを容易にすることができる。従って、本発明はＯ−ｔＲＮＡ／Ｏ−ＲＳ対を使用して重原子を蛋白質に組込む蛋白質構造の決定方法も提供する。重原子は例えばＳＡＤにより位相決定で使用される。
直交ｔＲＮＡ、直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ、及びその対
１種以上の非天然アミノ酸を含む蛋白質の生産に適した翻訳系は例えば国際公開第ＷＯ２００２／０８６０７５号、発明の名称「直交ｔＲＮＡ−アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ対を作製するための方法及び組成物（Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ ｆｏｒ ｔｈｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ ｔＲＮＡ−ａｍｉｎｏａｃｙｌ ｔＲＮＡ ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ ｐａｉｒｓ）」及びＷＯ２００２／０８５９２３号、発明の名称「非天然アミノ酸のインビボ組込み（Ｉｎ ｖｉｖｏ ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｕｎｎａｔｕｒａｌ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ）」に記載されている。更に、国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０１１７８６号（出願日２００４年４月１６日）参照。これらの各出願はその開示内容全体を参考資料として本明細書に組込む。このような翻訳系は一般に直交ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）と、直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ＲＳ）と、非天然アミノ酸（本発明ではヨードＰｈｅ又はブロモＰｈｅ等の重原子含有アミノ酸がこのような非天然アミノ酸の例である）を含む細胞（例えば大腸菌等の非真核細胞又は酵母等の真核細胞とすることができる）を含み、Ｏ−ＲＳはＯ−ｔＲＮＡを非天然アミノ酸でアミノアシル化する。本発明の直交対はＯ−ｔＲＮＡ（例えばサプレッサーｔＲＮＡ、フレームシフトｔＲＮＡ等）とＯ−ＲＳを含む。本発明は個々の成分も提供する。
一般に、直交対がセレクターコドンを認識し、セレクターコドンに応答してアミノ酸を負荷するとき、直交対はセレクターコドンを「抑圧」すると言う。即ち、翻訳系の（例えば細胞の）内在機構により認識されないセレクターコドンは通常翻訳されないので、非抑圧下で核酸から翻訳されるポリペプチドの生産を阻止することができる。本発明のＯ−ｔＲＮＡはセレクターコドンを認識し、本明細書の配列表（例えば配列番号５）に記載するポリヌクレオチド配列を含むか又は前記配列によりコードされるＯ−ｔＲＮＡに比較してコグネイトシンテターゼの存在下でセレクターコドンに応答して少なくとも例えば約４５％、５０％、６０％、７５％、８０％、又は９０％以上の抑圧効率を含む。Ｏ−ＲＳはＯ−ｔＲＮＡを重原子含有アミノ酸等の該当非天然アミノ酸でアミノアシル化する。翻訳系（例えば細胞）は例えば該当ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む核酸を介して成長中のポリペプチド鎖に非天然アミノ酸を組込むためにＯ−ｔＲＮＡ／Ｏ−ＲＳ対を使用し、ポリヌクレオチドはＯ−ｔＲＮＡにより認識されるセレクターコドンを含む。
本発明の所定態様では、翻訳系は直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ＲＳ）と、直交ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）と、重原子含有アミノ酸（例えば臭素化又はヨウ素化アミノ酸）と、該当ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む核酸を含む細胞（例えば大腸菌細胞）を含み、ポリヌクレオチドはＯ−ｔＲＮＡにより認識されるセレクターコドンを含む。翻訳系は無細胞系でもよく、例えば各種市販「ｉｎ ｖｉｔｒｏ」転写／翻訳系の任意のものを本明細書に記載するようなＯ−ｔＲＮＡ／ＯＲＳ対及び非天然アミノ酸と併用することができる。
１態様では、Ｏ−ＲＳとＯ−ｔＲＮＡの併用による抑圧効率はＯ−ＲＳの不在下のＯ−ｔＲＮＡの抑圧効率の例えば約５倍、１０倍、１５倍、２０倍、又は２５倍以上である。１側面では、Ｏ−ＲＳとＯ−ｔＲＮＡの併用による抑圧効率は本明細書の配列表に記載するような直交シンテターゼ対の抑圧効率の少なくとも例えば約３５％、４０％、４５％、５０％、６０％、７５％、８０％、又は９０％以上である。
細胞又は他の翻訳系は場合により２種以上の非天然アミノ酸（例えば（例えば臭素化又はヨウ素化アミノ酸と別の非天然アミノ酸（例えば別の重原子含有アミノ酸、又は別種の非天然アミノ酸））を組込むことができるように、複数のＯ−ｔＲＮＡ／Ｏ−ＲＳ対を含む。例えば、細胞は更に別の付加Ｏ−ｔＲＮＡ／Ｏ−ＲＳ対と第２の非天然アミノ酸を含むことができ、この付加Ｏ−ｔＲＮＡは第２のセレクターコドンを認識し、この付加Ｏ−ＲＳはＯ−ｔＲＮＡを第２の非天然アミノ酸で優先的にアミノアシル化する。例えば、Ｏ−ｔＲＮＡ／Ｏ−ＲＳ対（Ｏ−ｔＲＮＡは例えばアンバーセレクターコドンを認識する）を含む細胞は更に第２の直交対を含むことができ、第２のＯ−ｔＲＮＡは別のセレクターコドン（例えばオパール、４塩基コドン等）を認識する。各直交対は異なるセレクターコドンの認識を助長できるように異なる起源に由来することが望ましい。
Ｏ−ｔＲＮＡ及び／又はＯ−ＲＳは天然に存在するものでもよいし、例えば種々の生物の任意のものに由来するｔＲＮＡのライブラリー及び／又はＲＳのライブラリーを作製するか及び／又は種々の利用可能な突然変異ストラテジーの任意のものを使用することにより、天然に存在するｔＲＮＡ及び／又はＲＳの突然変異により誘導してもよい。例えば、直交ｔＲＮＡ／アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ対を作製する１ストラテジーは例えば宿主細胞以外の起源又は多重起源に由来する（宿主に対して）異種のｔＲＮＡ／シンテターゼ対を宿主細胞に導入する方法である。異種シンテターゼ候補の特性としては、例えば宿主細胞ｔＲＮＡに負荷しないことが挙げられ、異種ｔＲＮＡ候補の特性としては、例えば宿主細胞シンテターゼによりアミノアシル化されないことが挙げられる。直交対を作製するための第２のストラテジーはＯ−ｔＲＮＡ又はＯ−ＲＳをスクリーニング及び／又は選択するための突然変異体ライブラリーを作製する方法である。これらのストラテジーを組み合わせてもよい。
直交ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）
本発明の直交ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）はＯ−ｔＲＮＡにより認識されるセレクターコドンを含むポリヌクレオチドによりコードされる蛋白質への重原子含有アミノ酸（例えば臭素化又はヨウ素化アミノ酸）等の非天然アミノ酸の例えばｉｎ ｖｉｖｏ又はｉｎ ｖｉｔｒｏ組込みを媒介することが望ましい。所定態様では、本発明のＯ−ｔＲＮＡは本明細書の配列表（例えば配列番号５）のＯ−ｔＲＮＡ配列に記載するポリヌクレオチド配列を含むか又は前記配列によりコードされるＯ−ｔＲＮＡに比較してコグネイトシンテターゼの存在下でセレクターコドンに応答して少なくとも例えば約４５％、５０％、６０％、７５％、８０％、又は９０％以上の抑圧効率を含む。
抑圧効率は当分野で公知の多数のアッセイの任意のものにより測定することができる。例えば、β−ガラクトシダーゼレポーターアッセイを使用することができ、例えば本発明のＯ−ｔＲＮＡを含むプラスミドと共に修飾ｌａｃＺプラスミド（構築物はｌａｃＺ核酸配列中にセレクターコドンをもつ）を適当な生物（例えば直交成分を使用することができる生物）に由来する細胞に導入する。コグネイトシンテターゼも（ポリペプチド又は発現されるとコグネイトシンテターゼをコードするポリヌクレオチドとして）導入することができる。細胞を培地で所望密度（例えばＯＤ６００＝約０．５）まで増殖させ、例えばＢｅｔａＦｌｕｏｒ（登録商標）β−ガラクトシダーゼアッセイキット（Ｎｏｖａｇｅｎ）を使用してβ−ガラクトシダーゼアッセイを実施する。比較可能な対照（例えば所望位置にセレクターコドンではなく対応するセンスコドンをもつ修飾ｌａｃＺ構築物から観察される値）に対するサンプルの活性百分率として抑圧百分率を計算することができる。
本発明のＯ−ｔＲＮＡの１例を本明細書の配列表に記載する。代表的Ｏ−ｔＲＮＡ及びＯ−ＲＳ分子の配列については本明細書の実施例及び図面も参照されたい。更に、本明細書の「核酸及びポリペプチド配列と変異体」のセクションも参照。Ｏ−ＲＳ ｍＲＮＡ又はＯ−ｔＲＮＡ分子等のＲＮＡ分子では、所与配列又はその相補配列に対してチミン（Ｔ）がウラシル（Ｕ）で置換されている（コーディングＤＮＡでは逆）。塩基に付加修飾を加えてもよい。
本発明は本発明の特定Ｏ−ｔＲＮＡに対応するＯ−ｔＲＮＡの保存変異体も含む。例えば、Ｏ−ｔＲＮＡの保存変異体としては、例えば本明細書の配列表に記載するような特定Ｏ−ｔＲＮＡと同様に機能し、適当な自己相補性によりｔＲＮＡ Ｌ形構造を維持するが、例えば本明細書の配列表、図面又は実施例に記載する配列と同一配列をもたない（と共に野生型ｔＲＮＡ分子以外のものであることが望ましい）分子が挙げられる。本明細書の「核酸及びポリペプチド配列と変異体」のセクションも参照。
Ｏ−ｔＲＮＡを含む組成物は更に直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ＲＳ）を含むことができ、Ｏ−ＲＳはＯ−ｔＲＮＡを重原子含有アミノ酸（例えば臭素化又はヨウ素化アミノ酸）等の非天然アミノ酸で優先的にアミノアシル化する。所定態様では、Ｏ−ｔＲＮＡを含む組成物は更に（例えばｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｉｎ ｖｉｖｏ）翻訳系を含むことができる。該当ポリペプチドをコードし、Ｏ−ｔＲＮＡにより認識されるセレクターコドンを含むポリヌクレオチドを含む核酸、又はこれらの１種以上の組み合わせも細胞に加えることができる。本明細書の「直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ」のセクションも参照。
組換え直交ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）の作製方法は例えば国際特許出願第ＷＯ２００２／０８６０７５号、発明の名称「直交ｔＲＮＡ−アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ対を作製するための方法及び組成物（Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ ｔＲＮＡ−ａｍｉｎｏａｃｙｌ ｔＲＮＡ ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ ｐａｉｒｓ）」、ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０２２１８７、発明の名称「直交リシルｔＲＮＡとアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼの対の組成物及びその使用（Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ ｏｆ ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ ｌｙｓｙｌ−ｔＲＮＡ ａｎｄ ａｍｉｎｏａｃｙｌ−ｔＲＮＡ ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ ｐａｉｒｓ ａｎｄ ｕｓｅｓ ｔｈｅｒｅｏｆ）」、並びにＵＳＳＮ６０／４７９，９３１及び６０／４９６，５４８、発明の名称「真核遺伝コードの拡張（Ｅｘｐａｎｄｉｎｇ ｔｈｅ Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｃｏｄｅ）」に記載されている。Ｆｏｒｓｔｅｒら，（２００３）“Ｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ ｐｅｐｔｉｄｏｍｉｍｅｔｉｃ ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅｓ ｂｙ ｔｒａｎｓｌａｔｉｎｇ ｇｅｎｅｔｉｃ ｃｏｄｅｓ ｄｅｓｉｇｎｅｄ ｄｅ ｎｏｖｏ” ＰＮＡＳ １００（１１）：６３５３−６３５７；及びＦｅｎｇら，（２００３）“Ｅｘｐａｎｄｉｎｇ ｔＲＮＡ ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｔＲＮＡ ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ ｂｙ ａ ｓｉｎｇｌｅ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｃｈａｎｇｅ”ＰＮＡＳ １００（１０）：５６７６−５６８１も参照。
直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ＲＳ）
本発明のＯ−ＲＳは重原子含有アミノ酸（例えば臭素化又はヨウ素化アミノ酸、例えばブロモＰｈｅ又はヨードＰｈｅ）等の非天然アミノ酸でＯ−ｔＲＮＡを優先的にｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｉｎ ｖｉｖｏアミノアシル化する。本発明のＯ−ＲＳはＯ−ＲＳを含むポリペプチド及び／又はＯ−ＲＳ又はその一部をコードするポリヌクレオチドにより翻訳系（例えば細胞）に提供することができる。例えば、Ｏ−ＲＳの１例は本明細書の配列表（例えば配列番号３−４）及び実施例に記載するアミノ酸配列又はその保存変異体を含む。別の例では、Ｏ−ＲＳ、又はその一部は本明細書の配列表もしくは実施例に記載する配列を含むアミノ酸をコードするポリヌクレオチド配列又はその相補的ポリヌクレオチド配列によりコードされる。本明細書の「核酸及びポリペプチド配列と変異体」のセクションも参照。
直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ＲＳ）を含む組成物は更にＯ−ｔＲＮＡを含むことができ、Ｏ−ＲＳはＯ−ｔＲＮＡを臭素化又はヨウ素化アミノ酸（例えばブロモＰｈｅ又はヨードＰｈｅ）等の非天然アミノ酸で優先的にアミノアシル化する。所定態様では、Ｏ−ＲＳを含む組成物は更に（例えばｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｉｎ ｖｉｖｏ）翻訳系を含むことができる。該当ポリペプチドをコードし、Ｏ−ｔＲＮＡにより認識されるセレクターコドンを含むポリヌクレオチドを含む核酸、又はこれらの１種以上の組み合わせも細胞に加えることができる。
アミノアシル化を測定するためには多数のアッセイの任意のものを使用することができる。これらのアッセイはｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｉｎ ｖｉｖｏで実施することができる。例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏアミノアシル化アッセイは例えばＨｏｂｅｎ ａｎｄ Ｓｏｌｌ（１９８５）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１１３：５５−５９に記載されている。アミノアシル化は直交翻訳成分と共にレポーターを使用し、蛋白質をコードする少なくとも１個のセレクターコドンを含むポリヌクレオチドを発現する細胞でレポーターを検出することにより測定することもできる。ＷＯ２００２／０８５９２３、発明の名称「非天然アミノ酸のインビボ組込み（Ｉｎ ｖｉｖｏ ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｕｎｎａｔｕｒａｌ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ）」；及び国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０１１７８６号（出願日２００４年４月１６日）も参照。
本明細書の実施例にはＯ−ｔＲＮＡと併用する直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ＲＳ）の同定方法を記載する。要約すると、方法の１例は第１の種の細胞集団について選択（例えばポジティブ選択）を実施する段階を含み、前記細胞は１）複数のアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（ＲＳ）のメンバー（例えば複数のＲＳは突然変異体ＲＳ、第１の種以外の種に由来するＲＳ又は突然変異体ＲＳと第１の種以外の種に由来するＲＳの両方を含むことができる）と；２）（例えば１種以上の種に由来する）直交ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）と；３）（例えばポジティブ）選択マーカーをコードし、少なくとも１個のセレクターコドンを含むポリヌクレオチドを各々含む。複数のＲＳのメンバーを含まないか又はその量の少ない細胞に比較して抑圧効率の高い細胞について細胞を選択又はスクリーニングする。抑圧効率は当分野で公知の技術及び本明細書に記載するように測定することができる。抑圧効率の高い細胞はＯ−ｔＲＮＡをアミノアシル化する活性ＲＳを含む。第１の種に由来する第１組のｔＲＮＡの活性ＲＳによる（ｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｉｎ ｖｉｖｏ）アミノアシル化レベルを第２の種に由来する第２組のｔＲＮＡの活性ＲＳによる（ｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｉｎ ｖｉｖｏ）アミノアシル化レベルと比較する。アミノアシル化レベルは検出可能な物質（例えば標識アミノ酸又は非天然アミノ酸、例えば標識臭素化又はヨウ素化アミノ酸）により測定することができる。第１組のｔＲＮＡに比較して第２組のｔＲＮＡをより効率的にアミノアシル化する活性ＲＳを一般に選択することにより、Ｏ−ｔＲＮＡと併用する効率的（最適化）直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼが得られる。
同定されたＯ−ＲＳを更に操作し、所望非天然アミノ酸（例えば重原子含有アミノ酸）のみをＯ−ｔＲＮＡに負荷し、２０種の標準アミノ酸を負荷しないようにシンテターゼの基質特異性を改変することができる。非天然アミノ酸に基質特異性をもつ直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼの作製方法は例えばシンテターゼの活性部位、シンテターゼの編集メカニズム部位、各種シンテターゼドメインを組み合わせることにより各種部位等でシンテターゼを突然変異させる段階と、選択プロセスを適用する段階を含む。場合によりポジティブ選択後にネガティブ選択を行う併用に基づくストラテジーを使用する。ポジティブ選択では、ポジティブマーカーの非必須位置に導入したセレクターコドンが抑圧されると、細胞はポジティブ選択圧下で生存する。従って、天然及び非天然アミノ酸両者の存在下で生存細胞は直交サプレッサーｔＲＮＡに天然又は非天然アミノ酸を負荷する活性シンテターゼをコードする。ネガティブ選択では、ネガティブマーカーの非必須位置に導入したセレクターコドンが抑圧されると、天然アミノ酸特異性をもつシンテターゼは除去される。ネガティブ選択とポジティブ選択後に生存している細胞は直交サプレッサーｔＲＮＡを非天然アミノ酸のみでアミノアシル化（負荷）するシンテターゼをコードする。その後、これらのシンテターゼを例えばＤＮＡシャフリング又は他の帰納的突然変異誘発法により更に突然変異誘発することができる。
突然変異体Ｏ−ＲＳのライブラリーは当分野で公知の種々の突然変異誘発技術を使用して作製することができる。例えば、突然変異体ＲＳは部位特異的突然変異、ランダム点突然変異、相同組換え、ＤＮＡシャフリング又は他の帰納的突然変異誘発法、キメラ構築又はその任意組み合わせにより作製することができる。例えば、突然変異体ＲＳのライブラリーは２種以上の他の例えばサイズとダイバーシティーの小さい「サブライブラリー」から作製することができる。ＲＳのキメラライブラリーも本発明に含まれる。なお、場合により各種生物（例えば真正細菌又は古細菌等の微生物）に由来するｔＲＮＡシンテターゼのライブラリー（例えば天然ダイバーシティーを含むライブラリー）（例えば米国特許第６，２３８，８８４号（Ｓｈｏｒｔら）；米国特許第５，７５６，３１６号（Ｓｃｈａｌｌｅｎｂｅｒｇｅｒら）；米国特許第５，７８３，４３１号（Ｐｅｔｅｒｓｅｎら）；米国特許第５，８２４，４８５号（Ｔｈｏｍｐｓｏｎら）；米国特許第５，９５８，６７２号（Ｓｈｏｒｔら）参照）を構築し、直交対についてスクリーニングしてもよい。
シンテターゼにポジティブ及びネガティブ選択／スクリーニングストラテジーを実施した後、これらのシンテターゼを更に突然変異誘発させることができる。例えば、Ｏ−ＲＳをコードする核酸を単離することができ；（例えばランダム突然変異誘発、部位特異的突然変異誘発、組換え又はその任意組み合わせにより）突然変異Ｏ−ＲＳをコードする１組のポリヌクレオチドを核酸から作製することができ；Ｏ−ｔＲＮＡを非天然アミノ酸（例えば重原子含有アミノ酸）で優先的にアミノアシル化する突然変異Ｏ−ＲＳが得られるまでこれらの個々の段階又はこれらの段階の組み合わせを繰り返すことができる。本発明の１側面では、段階を複数回、例えば少なくとも２回実施する。
Ｏ−ｔＲＮＡ、Ｏ−ＲＳ、又はその対を作製するために、本発明の方法では付加レベルの選択／スクリーニングストリンジェンシーを使用することもできる。選択又はスクリーニングストリンジェンシーはＯ−ＲＳを作製するための方法の一方又は両方の段階で変動させることができる。これは例えば選択／スクリーニング物質の使用量等の変動とすることができる。付加ラウンドのポジティブ及び／又はネガティブ選択を実施することもできる。選択又はスクリーニングは更にアミノ酸浸透率の変化、翻訳効率の変化、翻訳忠実度の変化等の１種以上を含むこともできる。一般に、１種以上の変化は蛋白質を生産するために直交ｔＲＮＡ−ｔＲＮＡシンテターゼ対を使用する生物における１個以上の遺伝子の突然変異に基づく。
Ｏ−ＲＳの作製と、シンテターゼの基質特異性の改変に関するその他の一般的な詳細は例えばＷＯ２００２／０８６０７５、発明の名称「直交ｔＲＮＡ−アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ対を作製するための方法及び組成物（Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ ｔＲＮＡ−ａｍｉｎｏａｃｙｌ ｔＲＮＡ ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ ｐａｉｒｓ）」、並びに国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０１１７８６号（出願日２００４年４月１６日）及びＰＣＴ／ＵＳ２００４／０２２１８７号、発明の名称「直交リシルｔＲＮＡとアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼの対の組成物及びその使用（Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ ｏｆ ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ ｌｙｓｙｌ−ｔＲＮＡ ａｎｄ ａｍｉｎｏａｃｙｌ−ｔＲＮＡ ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ ｐａｉｒｓ ａｎｄ ｕｓｅｓ ｔｈｅｒｅｏｆ）」（出願日２００４年７月７日）に記載されている。
資源及び宿主生物
本発明の翻訳成分は非真核生物に由来することができる。例えば、直交Ｏ−ｔＲＮＡは非真核生物（又は生物組み合わせ）、例えばＭｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ、Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍ、Ｈａｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ（例えばＨａｌｏｆｅｒａｘ ｖｏｌｃａｎｉｉ及びＨａｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ種ＮＲＣ−１）、Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ ｆｕｌｇｉｄｕｓ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｕｓ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉ、Ａｅｕｒｏｐｙｒｕｍ ｐｅｒｎｉｘ、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ ｍａｒｉｐａｌｕｄｉｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｐｙｒｕｓ ｋａｎｄｌｅｒｉ、Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ ｍａｚｅｉ、Ｐｙｒｏｂａｃｕｌｕｍ ａｅｒｏｐｈｉｌｕｍ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ａｂｙｓｓｉ、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓ、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ ｔｏｋｏｄａｉｉ、Ｔｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ、Ｔｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａ ｖｏｌｃａｎｉｕｍ等の古細菌や、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ，Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ，Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｐｈｉｌｕｓ等の真正細菌に由来することができ、直交Ｏ−ＲＳは非真核生物（又は生物組み合わせ）、例えばＭｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ、Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍ、Ｈａｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ（例えばＨａｌｏｆｅｒａｘ ｖｏｌｃａｎｉｉ及びＨａｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ種ＮＲＣ−１）、Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ ｆｕｌｇｉｄｕｓ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｕｓ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉ、Ａｅｕｒｏｐｙｒｕｍ ｐｅｒｎｉｘ、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ ｍａｒｉｐａｌｕｄｉｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｐｙｒｕｓ ｋａｎｄｌｅｒｉ、Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ ｍａｚｅｉ、Ｐｙｒｏｂａｃｕｌｕｍ ａｅｒｏｐｈｉｌｕｍ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ａｂｙｓｓｉ、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓ、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ ｔｏｋｏｄａｉｉ、Ｔｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ、Ｔｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａ ｖｏｌｃａｎｉｕｍ等の古細菌や、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ，Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ，Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｐｈｉｌｕｓ等の真正細菌に由来することができる。１態様では、例えば植物、藻類、原生動物、真菌類、酵母、動物（例えば哺乳動物、昆虫、節足動物等）等の真核資源もＯ−ｔＲＮＡ及びＯ−ＲＳ資源として使用することができる。
Ｏ−ｔＲＮＡ／Ｏ−ＲＳ対の個々の成分は同一生物に由来するものでも異なる生物に由来するものでもよい。１態様では、Ｏ−ｔＲＮＡ／Ｏ−ＲＳ対は同一生物に由来する。あるいは、Ｏ−ｔＲＮＡ／Ｏ−ＲＳ対のＯ−ｔＲＮＡとＯ−ＲＳは異なる生物に由来する。
Ｏ−ｔＲＮＡ、Ｏ−ＲＳ又はＯ−ｔＲＮＡ／Ｏ−ＲＳ対はｉｎ ｖｉｖｏ又はｉｎ ｖｉｔｒｏ選択又はスクリーニングすることができ、及び／又は臭素化又はヨウ素化アミノ酸又は他の該当非天然アミノ酸を組込んだポリペプチドを生産するために細胞（例えば非真核細胞、又は真核細胞）で使用することができる。非真核細胞は種々の資源の任意のものに由来することができ、例えばＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｐｈｉｌｕｓ等の真正細菌や、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ、Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍ、Ｈａｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ（例えばＨａｌｏｆｅｒａｘ ｖｏｌｃａｎｉｉ及びＨａｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ種ＮＲＣ−１）、Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ ｆｕｌｇｉｄｕｓ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｕｓ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉ、Ａｅｕｒｏｐｙｒｕｍ ｐｅｒｎｉｘ、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ ｍａｒｉｐａｌｕｄｉｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｐｙｒｕｓ ｋａｎｄｌｅｒｉ、Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ ｍａｚｅｉ、Ｐｙｒｏｂａｃｕｌｕｍ ａｅｒｏｐｈｉｌｕｍ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ａｂｙｓｓｉ、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓ、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ ｔｏｋｏｄａｉｉ、Ｔｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ、Ｔｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａ ｖｏｌｃａｎｉｕｍ等の古細菌が挙げられる。真核細胞は種々の資源の任意のものに由来することができ、例えば植物（例えば単子葉植物、又は双子葉植物等の複雑な植物）、藻類、原生生物、真菌、酵母（例えばＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、動物（例えば哺乳動物、昆虫、節足動物等）等が挙げられる。例えば、適切な昆虫宿主細胞としては限定されないが、鱗翅目、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ、Ｂｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉ、Ｈｅｌｉｏｔｈｉｓ ｖｉｒｅｓｃｅｎｓ、Ｈｅｌｉｏｔｈｉｓ ｚｅａ、Ｍａｍｅｓｔｒａ ｂｒａｓｓｉｃａｓ、Ｅｓｔｉｇｍｅｎｅ ａｃｒｅａ、及びＴｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉ昆虫細胞が挙げられ、昆虫細胞株の例としては特にＢＴ１−ＴＮ−５Ｂ１−４（Ｈｉｇｈ Ｆｉｖｅ）、ＢＴＩ−ＴＮ−ＭＧ１、Ｓｆ９、Ｓｆ２１、ＴＮ−３６８、Ｄ．Ｍｅ１−２、及びＳｃｈｎｅｉｄｅｒ Ｓ−２細胞が挙げられる。重原子含有アミノ酸を組込んだ蛋白質を発現させるためには、このような昆虫細胞に場合により蛋白質とセレクターコドンをコードする組換えバキュロウイルスベクターを感染させる。各種バキュロウイルス発現システムが当分野で公知であり、及び／又は市販されており、例えばＢａｃｕｌｏＤｉｒｅｃｔ（登録商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）やＢＤ ＢａｃｕｌｏＧｏｌｄ（登録商標）バキュロウイルス発現ベクターシステム（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ）が挙げられる。本発明の翻訳成分を含む細胞の組成物も本発明の特徴である。
別の種で使用するためにある種でＯ−ｔＲＮＡ及び／又はＯ−ＲＳをスクリーニングすることについては、国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０１１７８６号（出願日２００４年４月１６日）も参照。
セレクターコドン
本発明のセレクターコドンは蛋白質生合成機構の遺伝コドン枠を拡張する。例えば、セレクターコドンとしては例えばユニーク３塩基コドン、ナンセンスコドン（例えばアンバーコドン（ＵＡＧ）又はオパールコドン（ＵＧＡ）等の終止コドン）、非天然コドン、少なくとも４塩基のコドン（例えばＡＧＧＡ）、レアコドン等が挙げられる。例えば１個以上、２個以上、３個以上等の多数のセレクターコドンを所望遺伝子に導入することができる。複数の異なるセレクターコドンを使用することにより、これらの異なるセレクターコドンを使用して複数の異なる非天然アミノ酸の同時部位特異的組込みを可能にする複数の直交ｔＲＮＡ／シンテターゼ対を使用することができる。同様に、複数部位（例えば２個以上、３個以上等）に所与非天然アミノ酸の部位特異的組込みを可能にするように、所与セレクターコドンの２個以上のコピーを所望遺伝子に導入することもできる。
１態様では、本方法は重原子含有アミノ酸を細胞に例えばｉｎ ｖｉｖｏ組込むために終止コドンであるセレクターコドンを使用する。例えば、終止セレクターコドンを認識し、Ｏ−ＲＳにより重原子含有アミノ酸でアミノアシル化されるＯ−ｔＲＮＡを作製する。このＯ−ｔＲＮＡは翻訳系の内在アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼにより認識されない。慣用部位特異的突然変異誘発を使用して該当ポリペプチドをコードするターゲットポリヌクレオチドの該当部位にセレクターコドンを導入することができる。例えばＳａｙｅｒｓ，Ｊ．Ｒ．ら（１９８８），“５’，３’Ｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ ｉｎ ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ−ｂａｓｅｄ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ．”Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ，７９１−８０２も参照。Ｏ−ＲＳ、Ｏ−ｔＲＮＡ及び該当ポリペプチドをコードする核酸を例えばｉｎ ｖｉｖｏで併用すると、セレクターコドンに応答して重原子含有アミノ酸が組込まれ、特定位置に重原子含有アミノ酸を含むポリペプチドが得られる。
重原子含有アミノ酸等の非天然アミノ酸のｉｎ ｖｉｖｏ組込みは宿主細胞をさほど撹乱せずに実施することができる。例えば、大腸菌等の非真核細胞では、終止セレクターコドン（例えばＵＡＧコドン）の抑圧効率はＯ−ｔＲＮＡ（例えばアンバーサプレッサーｔＲＮＡ）と（ＵＡＧコドンと結合してリボソームから成長中のペプチドの放出を開始する）放出因子１（ＲＦ１）の競合に依存するので、例えばＯ−ｔＲＮＡ（例えばサプレッサーｔＲＮＡ）の発現レベルを増加するか又はＲＦ１欠損株を使用することにより抑圧効率を調節することができる。真核細胞では、ＵＡＧコドンの抑圧効率はＯ−ｔＲＮＡ（例えばアンバーサプレッサーｔＲＮＡ）と（終止コドンと結合してリボソームから成長中のペプチドの放出を開始する）真核放出因子１（例えばｅＲＦ）の競合に依存するので、例えばＯ−ｔＲＮＡ（例えばサプレッサーｔＲＮＡ）の発現レベルを増加することにより抑圧効率を調節することができる。更に、例えばジチオスレイトール（ＤＴＴ）等の還元剤等の放出因子作用を調節する付加成分も加えてもよい。
例えば重原子含有アミノ酸等の非天然アミノ酸をレアコドンでコードすることもできる。例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏ蛋白質合成反応でアルギニン濃度を下げると、レアアルギニンコドンＡＧＧはアラニンでアシル化された合成ｔＲＮＡによるＡｌａの挿入に有効であることが分かっている。例えばＭａら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３２：７９３９（１９９３）参照。この場合には、合成ｔＲＮＡは大腸菌に少量種として存在する天然ｔＲＮＡＡｒｇと競合する。更に、生物によっては全三重項コドンを使用しないものもある。Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ ｌｕｔｅｕｓで割り当てられないコドンＡＧＡがｉｎ ｖｉｔｒｏ転写／翻訳抽出物へのアミノ酸挿入に使用されている。例えばＫｏｗａｌ ａｎｄ Ｏｌｉｖｅｒ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ．Ｒｅｓ．，２５：４６８５（１９９７）参照。本発明の組成物はこれらのレアコドンをｉｎ ｖｉｖｏ使用するために作製することができる。
セレクターコドンは更に拡張コドン（例えば４、５、６塩基以上のコドン等の４塩基以上のコドン）も含むことができる。４塩基コドンの例としては例えばＡＧＧＡ、ＣＵＡＧ、ＵＡＧＡ、ＣＣＣＵ等が挙げられる。５塩基コドンの例としては例えばＡＧＧＡＣ、ＣＣＣＣＵ、ＣＣＣＵＣ、ＣＵＡＧＡ、ＣＵＡＣＵ、ＵＡＧＧＣ等が挙げられる。本発明の方法はフレームシフト抑圧に基づく拡張コドンの使用を含む。４塩基以上のコドンは例えば１又は複数の非天然アミノ酸を同一蛋白質に挿入することができる。他の態様では、アンチコドンループは例えば少なくとも４塩基コドン、少なくとも５塩基コドン、又は少なくとも６塩基コドン又はそれ以上をデコードすることができる。４塩基コドンは２５６種が考えられるので、４塩基以上のコドンを使用すると同一細胞で複数の非天然アミノ酸をコードすることができる。Ａｎｄｅｒｓｏｎら（２００２）“Ｅｘｐｌｏｒｉｎｇ ｔｈｅ Ｌｉｍｉｔｓ ｏｆ Ｃｏｄｏｎ ａｎｄ Ａｎｔｉｃｏｄｏｎ Ｓｉｚｅ”Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｙ，９：２３７−２４４及びＭａｇｌｉｅｒｙ（２００１）“Ｅｘｐａｎｄｉｎｇ ｔｈｅ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｃｏｄｅ：Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ Ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒｓ ｏｆ Ｆｏｕｒ−ｂａｓｅ Ｃｏｄｏｎｓ ａｎｄ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ“Ｓｈｉｆｔｙ”Ｆｏｕｒ−ｂａｓｅ Ｃｏｄｏｎｓ ｗｉｔｈ ａ Ｌｉｂｒａｒｙ Ａｐｐｒｏａｃｈ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ”Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３０７：７５５−７６９も参照。
例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏ生合成法を使用して非天然アミノ酸を蛋白質に組込むために４塩基コドンが使用されている。例えばＭａら（１９９３）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３２，７９３９、及びＨｏｈｓａｋａら（１９９９）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１２１：３４参照。２個の化学的にアシル化されたフレームシフトサプレッサーｔＲＮＡを用いて２−ナフチルアラニンとリジンのＮＢＤ誘導体をストレプトアビジンに同時にｉｎ ｖｉｔｒｏ組込むためにＣＧＧＧとＡＧＧＵが使用されている。例えばＨｏｈｓａｋａら（１９９９）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１２１：１２１９４参照。ｉｎ ｖｉｖｏ試験では、ＭｏｏｒｅらはＮＣＵＡアンチコドンをもつｔＲＮＡＬｅｕ誘導体がＵＡＧＮコドン（ＮはＵ、Ａ、Ｇ又はＣであり得る）を抑圧する能力を試験し、四重項ＵＡＧＡはＵＣＵＡアンチコドンをもつｔＲＮＡＬｅｕにより１３〜２６％の効率でデコードすることができるが、０又は−１フレームでは殆どデコードできないことを見出した。Ｍｏｏｒｅら（２０００）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２９８：１９５参照。１態様では、レアコドン又はナンセンスコドンに基づく拡張コドンを本発明で使用し、他の望ましくない部位でのミスセンス読み飛ばしとフレームシフト抑圧を減らすことができる。
所与系では、セレクターコドンは更に天然３塩基コドンの１種を含むことができ、内在系はこの天然塩基コドンを使用しない（又は殆ど使用しない）。例えば、天然３塩基コドンを認識するｔＲＮＡをもたない系、及び／又は３塩基コドンがレアコドンである系がこれに該当する。
セレクターコドンは場合により非天然塩基対を含む。これらの非天然塩基対は更に既存遺伝アルファベットを拡張する。塩基対が１個増えると、三重項コドン数は６４から１２５に増す。第３の塩基対の性質としては安定的且つ選択的な塩基対合、高い忠実度でポリメラーゼによるＤＮＡへの効率的な酵素組込み、及び合成途上の非天然塩基対の合成後の効率的な持続的プライマー伸長が挙げられる。方法と組成物に応用可能な非天然塩基対については、例えばＨｉｒａｏら（２００２）“Ａｎ ｕｎｎａｔｕｒａｌ ｂａｓｅ ｐａｉｒ ｆｏｒ ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｎｇ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ａｎａｌｏｇｕｅｓ ｉｎｔｏ ｐｒｏｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ”Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０：１７７−１８２参照。Ｗｕ，Ｙ．ら（２００２）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２４：１４６２６−１４６３０も参照。他の関連文献は以下に挙げる。
ｉｎ ｖｉｖｏ使用では、非天然ヌクレオシドは膜透過性であり、リン酸化され、対応する三リン酸塩を形成する。更に、増加した遺伝情報は安定しており、細胞内酵素により破壊されない。Ｂｅｎｎｅｒらによる従来の報告はカノニカルワトソンクリック対とは異なる水素結合パターンを利用しており、そのうちで最も注目される例はイソＣ：イソＧ対である。例えばＳｗｉｔｚｅｒら（１９８９）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１１１：８３２２；Ｐｉｃｃｉｒｉｌｌｉら（１９９０）Ｎａｔｕｒｅ，３４３：３３；及びＫｏｏｌ（２０００）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．，４：６０２参照。これらの塩基は一般に天然塩基とある程度まで誤対合し、酵素複製することができない。Ｋｏｏｌらは水素結合を塩基間の疎水性パッキング相互作用に置き換えることにより塩基対の形成を誘導できることを立証した。Ｋｏｏｌ（２０００）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．，４：６０２；及びＧｕｃｋｉａｎ ａｎｄ Ｋｏｏｌ（１９９８）Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．，３６，２８２５参照。上記全要件を満足する非天然塩基対を開発する目的でＳｃｈｕｌｔｚ，Ｒｏｍｅｒｂｅｒｇらは一連の非天然疎水性塩基を体系的に合成し、試験した。ＰＩＣＳ：ＰＩＣＳ自己対は天然塩基対よりも安定であり、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩのＫｌｅｎｏｗフラグメント（ＫＦ）によりＤＮＡに効率的に組込むことができる。例えばＭｃＭｉｎｎら（１９９９）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１２１：１１５８６；及びＯｇａｗａら（２０００）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１２２：３２７４参照。生体機能に十分な効率と選択性でＫＦにより３ＭＮ：３ＭＮ自己対を合成することができる。例えばＯｇａｗａら（２０００）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１２２：８８０３参照。しかし、どちらの塩基も後期複製用チェーンターミネーターとして作用するものである。ＰＩＣＳ自己対を複製するために使用できる突然変異体ＤＮＡポリメラーゼが最近開発された。更に、７ＡＩ自己対も複製することができる。例えばＴａｅら（２００１）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１２３：７４３９参照。Ｃｕ（ＩＩ）と結合すると安定な対を形成する新規メタロ塩基対Ｄｉｐｉｃ：Ｐｙも開発された。Ｍｅｇｇｅｒｓら（２０００）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１２２：１０７１４参照。拡張コドンと非天然コドンは天然コドンに本質的に直交性であるので、本発明の方法は天然コドンに直交性のｔＲＮＡを作製するためにこの性質を利用することができる。
翻訳バイパス系を使用して重原子含有アミノ酸又は他の非天然アミノ酸を所望ポリペプチドに組込むこともできる。１翻訳バイパス系では、大きい配列が遺伝子に挿入されるが、蛋白質に翻訳されない。この配列はリボソームに配列を飛び越させて挿入の下流の翻訳を再開するための合図として機能する構造を含む。
非天然アミノ酸
本明細書で使用する非天然アミノ酸とはセレノシステイン及び／又はピロリジンと２０種の遺伝的にコードされる以下のαアミノ酸、即ちアラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、スレオニン、トリプトフアン、チロシン、バリン以外の任意アミノ酸、修飾アミノ酸又はアミノ酸類似体を意味する。αアミノ酸の一般構造は式Ｉ：

により表される。
非天然アミノ酸は一般に式Ｉをもつ任意構造であり、式中、Ｒ基は２０種の天然アミノ酸で使用されている以外の任意置換基である。２０種の天然アミノ酸の構造については、例えばＬ．Ｓｔｒｙｅｒ著Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，第３版，１９８８，Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋを参照されたい。なお、本発明の非天然アミノ酸は上記２０種のαアミノ酸以外の天然化合物（又は、当然のことながら人工的に製造した合成化合物）でもよい。
本発明の非天然アミノ酸は一般に側鎖が天然アミノ酸と異なるので、天然蛋白質と同様に他のアミノ酸（例えば天然又は非天然アミノ酸）とアミド結合を形成する。一方、非天然アミノ酸は天然アミノ酸と異なる側鎖基をもつ。
非天然アミノ酸を蛋白質に組込むにあたって特に重要な点は、重原子含有アミノ酸、一般にＲが重原子を含む式Ｉのアミノ酸を組込めることである。適切な重原子としては限定されないが、Ｉ、Ｂｒ、Ｕ、Ｈｇ、Ａｇ、Ｐｔ、Ｐｂ、Ａｕ、Ｐｄ、Ｉｒ、Ｏｓ、Ｃｄ、Ｂａ、Ｘｅ、Ｔｅ、及びＳｅが挙げられる。好ましい重原子含有アミノ酸としては臭素化及びヨウ素化アミノ酸、例えばｐ−ヨード−Ｌ−フェニルアラニン（ヨードＰｈｅ又はＬ−４−ヨードフェニルアラニンとも言う；図６Ａ）、Ｌ−３−ヨードフェニルアラニン（図６Ｂ）、Ｌ−２−ヨードフェニルアラニン（図６Ｃ）、Ｌ−３−ヨードチロシン（図６Ｄ）、Ｌ−２−ヨードチロシン、ｐ−ブロモ−Ｌ−フェニルアラニン（ブロモＰｈｅ又はＬ−４−ブロモフェニルアラニンとも言う）、Ｌ−３−ブロモフェニルアラニン、Ｌ−２−ブロモフェニルアラニン、Ｌ−３−ブロモチロシン、及びＬ−２−ブロモチロシンが挙げられる。他の重原子含有アミノ酸としてはＩ又はＢｒ以外の重原子で置換したＰｈｅ及びＴｙｒや、任意重原子で置換した他の天然及び非天然アミノ酸が挙げられる。
他の非天然アミノ酸では、例えば、式ＩにおけるＲは場合によりアルキル、アリール、アシル、ケト、アジド、ヒドロキシル、ヒドラジン、シアノ、ハロ、ヒドラジド、アルケニル、アルキニル、エーテル、チオール、セレノ、スルホニル、硼酸、ボロン酸、ホスホ、ホスホノ、ホスフィン、複素環、エノン、イミン、アルデヒド、エステル、チオ酸、ヒドロキシルアミン、アミン基等又はその任意組合せを含む。他の該当非天然アミノ酸としては限定されないが、光架橋基をもつアミノ酸、スピン標識アミノ酸、蛍光アミノ酸、金属結合性アミノ酸、金属含有アミノ酸、放射性アミノ酸、新規官能基をもつアミノ酸、他の分子と共有又は非共有的に相互作用するアミノ酸、フォトケージド及び／又は光異性化可能なアミノ酸、ビオチン又はビオチン類似体を含有するアミノ酸、ケト含有アミノ酸、グリコシル化アミノ酸、ポリエチレングリコール又はポリエーテルを含むアミノ酸、化学分解性又は光分解性アミノ酸、天然アミノ酸に比較して延長側鎖（例えばポリエーテル又は例えば約５もしくは約１０炭素長を上回る長鎖炭化水素等）をもつアミノ酸、炭素結合糖含有アミノ酸、レドックス活性アミノ酸、アミノチオ酸含有アミノ酸、及び１個以上の毒性部分を含むアミノ酸が挙げられる。所定態様では、非天然アミノ酸は光架橋基をもつ。１態様では、非天然アミノ酸はアミノ酸側鎖に結合した糖部分及び／又は他の糖鎖修飾をもつ。
新規側鎖を含む非天然アミノ酸に加え、非天然アミノ酸は場合により例えば式ＩＩ及びＩＩＩ：

の構造により表されるような修飾主鎖構造を含み、式中、Ｚは一般にＯＨ、ＮＨ２、ＳＨ、ＮＨ−Ｒ’又はＳ−Ｒ’を含み、ＸとＹは同一でも異なっていてもよく、一般にＳ又はＯであり、ＲとＲ’は場合により同一又は異なり、一般に式Ｉをもつ非天然アミノ酸について上記に記載したＲ基と同一の基及び水素から選択される。例えば、本発明の非天然アミノ酸は場合により式ＩＩ及びＩＩＩにより表されるようにアミノ又はカルボキシル基に置換を含む。この種の非天然アミノ酸としては限定されないが、例えば２０種の標準天然アミノ酸に対応する側鎖又は非天然側鎖をもつα−ヒドロキシ酸、α−チオ酸、α−アミノチオカルボキシレートが挙げられる。更に、α−炭素の置換は場合によりＬ、Ｄ又はα，α−ジ置換アミノ酸（例えばＤ−グルタミン酸、Ｄ−アラニン、Ｄ−メチル−Ｏ−チロシン、アミノ酪酸等）を含む。他の代替構造としては環状アミノ酸（例えばプロリン類似体や、３、４、６、７、８及び９員環プロリン類似体）、β及びγアミノ酸（例えば置換β−アラニン及びγ−アミノ酪酸）が挙げられる。本発明のその他の非天然アミノ酸構造としては例えばメチレン又はアミノ基がα炭素に隣接してサンドイッチされているホモβ型構造が挙げられ、例えばホモβ−チロシン、α−ヒドラジノチロシンの異性体が挙げられる。例えば、下記参照。
多くの非天然アミノ酸は天然アミノ酸（例えばチロシン、グルタミン、フェニルアラニン等）をベースとする。例えば、チロシン類似体としてはパラ置換チロシン、オルト置換チロシン、及びメタ置換チロシンが挙げられ、置換チロシンはアセチル基、ベンゾイル基、アミノ基、ヒドラジン、ヒドロキシルアミン、チオール基、カルボキシ基、イソプロピル基、メチル基、Ｃ６−Ｃ２０直鎖又は分枝鎖炭化水素、飽和又は不飽和炭化水素、Ｏ−メチル基、ポリエーテル基、ニトロ基等を含む。更に、多置換アリール環も考えられる。本発明のグルタミン類似体としては限定されないが、α−ヒドロキシ誘導体、γ置換誘導体、環状誘導体及びアミド置換グルタミン誘導体が挙げられる。フェニルアラニン類似体の例としては限定されないが、パラ置換フェニルアラニン、オルト置換フェニルアラニン、及びメタ置換フェニルアラニンが挙げられ、置換基はヒドロキシ基、メトキシ基、メチル基、アリル基、アルデヒド又はケト基等を含む。非天然アミノ酸の特定例としては限定されないが、ホモグルタミン、３，４−ジヒドロキシ−Ｌ−フェニルアラニン、ｐ−アセチル−Ｌ−フェニルアラニン、ｐ−プロパルギルオキシフェニルアラニン、Ｏ−メチル−Ｌ−チロシン、Ｌ−３−（２−ナフチル）アラニン、３−メチルフェニルアラニン、Ｏ−４−アリル−Ｌ−チロシン、４−プロピル−Ｌ−チロシン、トリ−Ｏ−アセチル−ＧｌｃＮＡｃβ−セリン、Ｌ−Ｄｏｐａ、フッ素化フェニルアラニン、イソプロピル−Ｌ−フェニルアラニン、ｐ−アジド−Ｌ−フェニルアラニン、ｐ−アシル−Ｌ−フェニルアラニン、ｐ−ベンゾイル−Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−ホスホセリン、ホスホノセリン、ホスホノチロシン、ｐ−アミノ−Ｌ−フェニルアラニン、及びイソプロピル−Ｌ−フェニルアラニン等が挙げられる。
非天然アミノ酸の化学的合成
上記非天然アミノ酸の多くは例えばＳｉｇｍａ（米国）やＡｌｄｒｉｃｈ（Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，ＷＩ，米国）から市販されている。例えば、臭素化及びヨウ素化フェニルアラニン及びチロシンはＳｉｇｍａ，Ｓｙｎｔｈｅｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．（世界ウェブｓｙｎｔｈｅｔｅｃｈ．ｃｏｍ）やＡｄｖａｎｃｅｄ Ａｓｙｍｍｅｔｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．（ａｄｖａｎｃｅｄａｓｙｍｍｅｔｒｉｃｓ．ｃｏｍ）から市販されている。市販されていないものは場合により各種刊行物に記載されている方法や当業者に公知の標準方法を使用して合成される。有機合成技術については例えばＦｅｓｓｅｎｄｏｎ ａｎｄ Ｆｅｓｓｅｎｄｏｎ著Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（１９８２，第２版，Ｗｉｌｌａｒｄ Ｇｒａｎｔ Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｓｔｏｎ Ｍａｓｓ．）；Ｍａｒｃｈ著Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（第３版，１９８５，Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）；及びＣａｒｅｙ ａｎｄ Ｓｕｎｄｂｅｒｇ著Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（第３版，Ｐａｒｔｓ Ａ ａｎｄ Ｂ，１９９０，Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）を参照されたい。非天然アミノ酸の合成について記載しているその他の刊行物としては例えばＷＯ２００２／０８５９２３、発明の名称「非天然アミノ酸のインビボ組込み（Ｉｎ ｖｉｖｏ ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｕｎｎａｔｕｒａｌ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄｓ）」；Ｍａｔｓｏｕｋａｓら（１９９５）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，３８，４６６０−４６６９；Ｋｉｎｇ，Ｆ．Ｅ． ａｎｄ Ｋｉｄｄ，Ｄ．Ａ．Ａ．（１９４９）“Ａ Ｎｅｗ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ Ｇｌｕｔａｍｉｎｅ ａｎｄ ｏｆ γ−Ｄｉｐｅｐｔｉｄｅｓ ｏｆ Ｇｌｕｔａｍｉｃ Ａｃｉｄ ｆｒｏｍ Ｐｈｔｈｙｌａｔｅｄ Ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅｓ”Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，３３１５−３３１９；Ｆｒｉｅｄｍａｎ，Ｏ．Ｍ． ａｎｄ Ｃｈａｔｔｅｒｒｊｉ，Ｒ．（１９５９）“Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ Ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ ｏｆ Ｇｌｕｔａｍｉｎｅ ａｓ Ｍｏｄｅｌ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅｓ ｆｏｒ Ａｎｔｉ−Ｔｕｍｏｒ Ａｇｅｎｔｓ”Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．８１，３７５０−３７５２；Ｃｒａｉｇ，Ｊ．Ｃ．ら（１９８８）“Ａｂｓｏｌｕｔｅ Ｃｏｎｆｉｇｕｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｅｎａｎｔｉｏｍｅｒｓ ｏｆ ７−Ｃｈｌｏｒｏ−４［［４−（ｄｉｅｔｈｙｌａｍｉｎｏ）−１−ｍｅｔｈｙｌｂｕｔｙｌ］ａｍｉｎｏ］ｑｕｉｎｏｌｉｎｅ（Ｃｈｌｏｒｏｑｕｉｎｅ）”Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．５３，１１６７−１１７０；Ａｚｏｕｌａｙ，Ｍ．，Ｖｉｌｍｏｎｔ，Ｍ． ａｎｄ Ｆｒａｐｐｉｅｒ，Ｆ．（１９９１）“Ｇｌｕｔａｍｉｎｅ ａｎａｌｏｇｕｅｓ ａｓ Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ Ａｎｔｉｍａｌａｒｉａｌｓ”Ｅｕｒ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２６，２０１−５；Ｋｏｓｋｉｎｅｎ，Ａ．Ｍ．Ｐ． ａｎｄ Ｒａｐｏｐｏｒｔ，Ｈ．（１９８９）“Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ４−Ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｅｄ Ｐｒｏｌｉｎｅｓ ａｓ Ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌｌｙ Ｃｏｎｓｔｒａｉｎｅｄ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄ Ａｎａｌｏｇｕｅｓ”Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．５４，１８５９−１８６６；Ｃｈｒｉｓｔｉｅ，Ｂ．Ｄ． ａｎｄ Ｒａｐｏｐｏｒｔ，Ｈ．（１９８５）“Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ Ｏｐｔｉｃａｌｌｙ Ｐｕｒｅ Ｐｉｐｅｃｏｌａｔｅｓ ｆｒｏｍ Ｌ−Ａｓｐａｒａｇｉｎｅ．Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｔｏ ｔｈｅ Ｔｏｔａｌ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ（＋）−Ａｐｏｖｉｎｃａｍｉｎｅ ｔｈｒｏｕｇｈ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄ Ｄｅｃａｒｂｏｎｙｌａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｉｍｉｎｉｕｍ Ｉｏｎ Ｃｙｃｌｉｚａｔｉｏｎ”Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．１９８９：１８５９−１８６６；Ｂａｒｔｏｎら，（１９８７）“Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ Ｎｏｖｅｌ α−Ａｍｉｎｏ−Ａｃｉｄｓ ａｎｄ Ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ Ｕｓｉｎｇ Ｒａｄｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ：Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ Ｌ−ａｎｄ Ｄ−α−Ａｍｉｎｏ−Ａｄｉｐｉｃ Ａｃｉｄｓ，Ｌ−α−ａｍｉｎｏｐｉｍｅｌｉｃ Ａｃｉｄ ａｎｄ Ａｐｐｒｏｐｒｉａｔｅ Ｕｎｓａｔｕｒａｔｅｄ Ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ”Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．４３：４２９７−４３０８；及びＳｕｂａｓｉｎｇｈｅら（１９９２）“Ｑｕｉｓｑｕａｌｉｃ ａｃｉｄ ａｎａｌｏｇｕｅｓ：ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ｂｅｔａ−ｈｅｔｅｒｏｃｙｃｌｉｃ ２−ａｍｉｎｏｐｒｏｐａｎｏｉｃ ａｃｉｄ ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ａｃｔｉｖｉｔｙ ａｔ ａ ｎｏｖｅｌ ｑｕｉｓｑｕａｌａｔｅ−ｓｅｎｓｉｔｉｚｅｄ ｓｉｔｅ”Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３５：４６０２−７が挙げられる。国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ０３／４１３４６号、発明の名称「蛋白質アレー（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｒｒａｙｓ）」（出願日２００３年１２月２２日）も参照されたい。
非天然アミノ酸の細胞取込み
細胞による非天然アミノ酸取り込みは例えば蛋白質に組込むように非天然アミノ酸を設計及び選択する場合に一般に考慮される問題の１つである。例えば、αアミノ酸の電荷密度が高いと、これらの化合物は細胞に浸透しにくいと思われる。天然アミノ酸は異なる程度のアミノ酸特異性を示すことが多い一連の蛋白質輸送システムにより細胞に取り込まれる。非天然アミノ酸が細胞に取り込まれる場合にはどの非天然アミノ酸が取り込まれるかを判断する迅速なスクリーニングを実施することができる。例えば国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ０３／４１３４６号、発明の名称「蛋白質アレー（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｒｒａｙｓ）」（出願日２００３年１２月２２日）；及びＬｉｕ，Ｄ．Ｒ． ａｎｄ Ｓｃｈｕｌｔｚ，Ｐ．Ｇ．（１９９９）“Ｐｒｏｇｒｅｓｓ ｔｏｗａｒｄ ｔｈｅ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ａｎ ｏｒｇａｎｉｓｍ ｗｉｔｈ ａｎ ｅｘｐａｎｄｅｄ ｇｅｎｅｔｉｃ ｃｏｄｅ”ＰＮＡＳ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ９６：４７８０−４７８５における毒性アッセイ参照。取込みは種々の方法で容易に分析されるが、細胞取込み経路に利用可能な非天然アミノ酸を設計する代替方法は、アミノ酸をｉｎ ｖｉｖｏ生産する生合成経路を提供する方法である。
非天然アミノ酸の生合成
細胞にはアミノ酸と他の化合物を生産するために多数の生合成経路が元々存在している。特定非天然アミノ酸の生合成法は自然界（例えば細胞中）には存在しないと思われるが、本発明はこのような方法を提供する。例えば、非天然アミノ酸の生合成経路は場合により新規酵素を付加するか又は既存宿主細胞経路を改変することにより宿主細胞で作製される。付加新規酵素は場合により天然酵素又は人工的に進化させた酵素である。例えば、（ＷＯ２００２／０８５９２３、前出の実施例に記載されているような）ｐ−アミノフェニルアラニンの生合成は他の生物に由来する公知酵素の組合せの付加に依存している。これらの酵素の遺伝子はこれらの遺伝子を含むプラスミドで細胞を形質転換することにより細胞に導入することができる。これらの遺伝子は細胞で発現されると、所望化合物を合成するための酵素経路を提供する。場合により付加される酵素種の例は下記実施例に記載する。その他の酵素配列は例えばＧｅｎｂａｎｋから入手できる。人工的に進化させた酵素も場合により同様に細胞に付加する。このように、非天然アミノ酸を生産するように細胞機構と細胞資源を操作する。
実際に、生合成経路で使用する新規酵素を生産するため又は非天然アミノをｉｎ ｖｉｔｒｏもしくはｉｎ ｖｉｖｏで生産するように既存経路を進化させるためには種々の方法の任意のものを使用することができる。非天然アミノ酸を生産するため（又は、実際に新規基質特異性もしくは他の該当活性をもつようにシンテターゼを進化させるため）には、酵素又は他の生合成経路成分を進化させる方法として入手可能な多数の方法を本発明に適用することができる。例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｉｎ ｖｉｖｏで非天然アミノ酸を生産（又は新規シンテターゼを生産）するように新規酵素及び／又は前記酵素の経路を開発するためには、場合によりＤＮＡシャフリングを使用する。例えばＳｔｅｍｍｅｒ（１９９４）“Ｒａｐｉｄ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｂｙ ＤＮＡ ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ”Ｎａｔｕｒｅ ３７０（４）：３８９−３９１；及びＳｔｅｍｍｅｒ，（１９９４）“ＤＮＡ ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ ｂｙ ｒａｎｄｏｍ ｆｒａｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ ａｎｄ ｒｅａｓｓｅｍｂｌｙ：Ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ”Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．，９１：１０７４７−１０７５１参照。関連アプローチは所望特性をもつ酵素を迅速に進化させるために関連（例えば相同）遺伝子のファミリーをシャフリングする。このような「ファミリー遺伝子シャフリング」法の１例はＣｒａｍｅｒｉら（１９９８）“ＤＮＡ ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ ｏｆ ａ ｆａｍｉｌｙ ｏｆ ｇｅｎｅｓ ｆｒｏｍ ｄｉｖｅｒｓｅ ｓｐｅｃｉｅｓ ａｃｃｅｌｅｒａｔｅｓ ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ”Ｎａｔｕｒｅ，３９１（６６６４）：２８８−２９１に記載されている。（生合成経路成分であるか又はシンテターゼであるかを問わずに）新規酵素は例えばＯｓｔｅｒｍｅｉｅｒら（１９９９）“Ａ ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ ａｐｐｒｏａｃｈ ｔｏ ｈｙｂｒｉｄ ｅｎｚｙｍｅｓ ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｏｆ ＤＮＡ ｈｏｍｏｌｏｇｙ”Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ １７：１２０５に記載されているような「ハイブリッド酵素作製用インクリメンタルトランケーション（ｉｎｃｒｅｍｅｎｔａｌ ｔｒｕｎｃａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｔｈｅ ｃｒｅａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｙｂｒｉｄ ｅｎｚｙｍｅｓ：ＩＴＣＨＹ）として知られるＤＮＡ組換え法を使用して作製することもできる。このアプローチは１種以上のｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｉｎ ｖｉｖｏ組換え法の基質として使用することができる酵素又は他の経路変異体のライブラリーを作製するために使用することもできる。Ｏｓｔｅｒｍｅｉｅｒら（１９９９）“Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｂｙ Ｉｎｃｒｅｍｅｎｔａｌ Ｔｒｕｎｃａｔｉｏｎ”Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９６：３５６２−６７，及びＯｓｔｅｒｍｅｉｅｒら（１９９９），“Ｉｎｃｒｅｍｅｎｔａｌ Ｔｒｕｎｃａｔｉｏｎ ａｓ ａ Ｓｔｒａｔｅｇｙ ｉｎ ｔｈｅ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｏｆ Ｎｏｖｅｌ Ｂｉｏｃａｔａｌｙｓｔｓ”Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ａｎｄ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，７：２１３９−４４も参照。別のアプローチは例えば非天然アミノ酸（又は新規シンテターゼ）の生産に関連する生合成反応を触媒する能力について選択する酵素又は他の経路変異体のライブラリーを作製するために指数的集合突然変異誘発を使用する。このアプローチでは、該当配列中の小群の残基を並行してランダム化し、機能的蛋白質をもたらすアミノ酸を各変異位置で同定する。非天然アミノ酸（又は新規シンテターゼ）の生産用新規酵素を作製するように本発明に応用することができるこのような方法の例はＤｅｌｅｇｒａｖｅ ａｎｄ Ｙｏｕｖａｎ（１９９３）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １１：１５４８−１５５２に記載されている。更に別のアプローチでは、例えばＡｒｋｉｎ ａｎｄ Ｙｏｕｖａｎ（１９９２）“Ｏｐｔｉｍｉｚｉｎｇ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｍｉｘｔｕｒｅｓ ｔｏ ｅｎｃｏｄｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｓｕｂｓｅｔｓ ｏｆ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ ｆｏｒ ｓｅｍｉ−ｒａｎｄｏｍ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ”Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０：２９７−３００；又はＲｅｉｄｈａａｒ−Ｏｌｓｏｎら（１９９１）“Ｒａｎｄｏｍ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｕｓｉｎｇ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｃａｓｓｅｔｔｅｓ”Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．２０８：５６４−８６の一般突然変異誘発法を使用することにより、酵素及び／又は経路成分操作にドープ又は縮重オリゴヌクレオチドを使用するランダム又は半ランダム突然変異誘発を使用することができる。ポリヌクレオチドリアセンブリと部位飽和突然変異誘発を使用する更に別のアプローチ（「非確率論的」突然変異誘発と呼ぶことが多い）を使用すると、酵素及び／又は経路成分を作製した後に、（例えば非天然アミノ酸のｉｎ ｖｉｖｏ生産のための）１種以上のシンテターゼ又は生合成経路機能を実施する能力についてスクリーニングすることができる。例えばＳｈｏｒｔ“Ｎｏｎ−Ｓｔｏｃｈａｓｔｉｃ Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｖａｃｃｉｎｅｓ ａｎｄ Ｅｎｚｙｍｅｓ”ＷＯ００／４６３４４参照。
このような突然変異法の代替方法は生物の全ゲノムを組換え、得られた子孫を特定経路機能について選択する方法である（「全ゲノムシャフリング」と呼ぶことが多い）。このアプローチは、例えばゲノム組換えと非天然アミノ酸（又はその中間体）の生産能に関する生物（例えば大腸菌又は他の細胞）の選択により本発明に適用することができる。例えば、非天然アミノ酸をｉｎ ｖｉｖｏ生産するように細胞で既存及び／又は新規経路を進化させるための経路設計には、以下の文献に教示されている方法を適用することができる：Ｐａｔｎａｉｋら（２００２）“Ｇｅｎｏｍｅ ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ ｏｆ ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｏｒ ｉｍｐｒｏｖｅｄ ａｃｉｄ ｔｏｌｅｒａｎｃｅ”Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０（７）：７０７−７１２；及びＺｈａｎｇら（２００２）“Ｇｅｎｏｍｅ ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ ｌｅａｄｓ ｔｏ ｒａｐｉｄ ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃ ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ ｉｎ ｂａｃｔｅｒｉａ”Ｎａｔｕｒｅ，Ｆｅｂｒｕａｒｙ ７，４１５（６８７２）：６４４−６４６。
例えば所望化合物を生産するように生物及び代謝経路を操作するための他の技術も利用可能であり、同様に非天然アミノ酸の生産に適用することができる。有用な経路操作アプローチを教示している文献の例としては、Ｎａｋａｍｕｒａ ａｎｄ Ｗｈｉｔｅ（２００３）“Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｆｏｒ ｔｈｅ ｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ １，３ ｐｒｏｐａｎｅｄｉｏｌ”Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１４（５）：４５４−９；Ｂｅｒｒｙら（２００２）“Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｔｏ ｉｍｐｒｏｖｅ ｂｏｔｈ ｔｈｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｕｓｅ ｏｆ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｉｎｄｉｇｏ”Ｊ．Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２８：１２７−１３３；Ｂａｎｔａら（２００２）“Ｏｐｔｉｍｉｚｉｎｇ ａｎ ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ ｍｅｔａｂｏｌｉｃ ｐａｔｈｗａｙ：Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｔｈｅ ｃｏｆａｃｔｏｒ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｏｆ Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ２，５−ｄｉｋｅｔｏ−Ｄ−ｇｌｕｃｏｎｉｃ ａｃｉｄ ｒｅｄｕｃｔａｓｅ ｆｏｒ ｕｓｅ ｉｎ ｖｉｔａｍｉｎ Ｃ ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ”Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，４１（２０），６２２６−３６；Ｓｅｌｉｖｏｎｏｖａら（２００１）“Ｒａｐｉｄ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ Ｎｏｖｅｌ Ｔｒａｉｔｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ”Ａｐｐｌｉｅｄ ａｎｄ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，６７：３６４５、及び他の多数の文献が挙げられる。
使用する方法に関係なく、一般に本発明の人工生合成経路を使用して生産される非天然アミノ酸は効率的な蛋白質生合成に十分な濃度（例えば天然細胞量）で生産されるが、他の細胞内アミノ酸濃度を有意に変化させたり細胞資源を枯渇させる程ではない。このようにｉｎ ｖｉｖｏ生産される典型濃度は約１０ｍＭ〜約０．０５ｍＭである。特定経路に所望される酵素を生産するように細胞を操作し、非天然アミノ酸を作製したら、場合によりｉｎ ｖｉｖｏ選択を使用してリボソーム蛋白質合成と細胞増殖の両方に適合するように非天然アミノ酸の生産を更に最適化させる。
重原子含有アミノ酸を組込むための直交成分
本発明はセレクターコドン（例えば終止コドン、ナンセンスコドン、４塩基以上のコドン等）に応答して成長中のポリペプチド鎖に重原子含有アミノ酸（例えば臭素化又はヨウ素化アミノ酸、例えばヨードＰｈｅ又はブロモＰｈｅ）を例えばｉｎ ｖｉｖｏ又はｉｎ ｖｉｔｒｏで組込むための直交成分の組成物と作製方法を提供する。例えば、本発明は直交ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）、直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ＲＳ）及びその対を提供する。これらの対は成長中のポリペプチド鎖に重原子含有アミノ酸を組込むために使用することができる。
本発明の組成物は直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ＲＳ）を含み、前記Ｏ−ＲＳはＯ−ｔＲＮＡを臭素化又はヨウ素化アミノ酸で優先的にアミノアシル化する。所定態様では、Ｏ−ＲＳは配列番号３もしくは４を含むアミノ酸配列又はその保存変異体を含む。所定態様では、Ｏ−ＲＳは配列番号１もしくは２を含むポリヌクレオチド配列又はその保存変異体によりコードされるアミノ酸配列を含む。本発明の所定態様では、Ｏ−ＲＳは配列番号３又は４のアミノ酸配列を含むポリペプチドがＯ−ｔＲＮＡを臭素化又はヨウ素化アミノ酸で優先的にアミノアシル化する効率の少なくとも５０％（例えば少なくとも６０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、又は少なくとも９０％以上）の効率でＯ−ｔＲＮＡを臭素化又はヨウ素化アミノ酸で優先的にアミノアシル化する。本発明のＯ−ＲＳは配列番号６−９のいずれかのアミノ酸配列を含むＯ−ＲＳを特異的に排除することができる。所定態様では、Ｏ−ＲＳは天然チロシルアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（ＴｙｒＲＳ）のアミノ酸配列と少なくとも９０％一致しており、Ｍ．ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ ＴｙｒＲＳのＴｙｒ３２に対応する位置のＬｅｕ、Ｍ．ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ ＴｙｒＲＳのＧｌｕ１０７に対応する位置のＳｅｒ又はＧｌｕ、Ｍ．ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ ＴｙｒＲＳのＡｓｐ１５８に対応する位置のＰｒｏ、Ｍ．ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ ＴｙｒＲＳのＩｌｅ１５９に対応する位置のＬｅｕ又はＡｒｇ、及びＭ．ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ ＴｙｒＲＳのＬｅｕ１６２に対応する位置のＧｌｕ又はＡｒｇから構成される群から選択される２個以上（例えば３個以上、４個以上、又は５個）のアミノ酸を含むアミノ酸配列をもつ。
Ｏ−ＲＳを含む組成物は場合により更に直交ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）を含むことができ、前記Ｏ−ｔＲＮＡはセレクターコドンを認識する。一般に、本発明のＯ−ｔＲＮＡは本明細書の配列表及び実施例に記載するポリヌクレオチド配列を含むか又は前記配列によりコードされるＯ−ｔＲＮＡに比較してコグネイトシンテターゼの存在下でセレクターコドンに応答して少なくとも例えば約４５％、５０％、６０％、７５％、８０％、又は９０％以上の抑圧効率を含む。１態様では、Ｏ−ＲＳとＯ−ｔＲＮＡの併用による抑圧効率はＯ−ＲＳの不在下のＯ−ｔＲＮＡの抑圧効率の例えば５倍、１０倍、１５倍、２０倍、２５倍以上である。
Ｏ−ＲＳを含む組成物は場合により細胞（例えば大腸菌細胞等の非真核細胞、又は真核細胞）、及び／又は翻訳系を含むことができる。
本発明は翻訳系を含む細胞（例えば非真核細胞、又は真核細胞）も提供し、前記翻訳系は直交ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）と、直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ＲＳ）と、臭素化又はヨウ素化アミノ酸を含む。Ｏ−ｔＲＮＡは第１のセレクターコドンを認識し、Ｏ−ＲＳはＯ−ｔＲＮＡを臭素化又はヨウ素化アミノ酸で優先的にアミノアシル化する。１態様では、Ｏ−ｔＲＮＡは配列番号５に記載のポリヌクレオチド配列又はその相補的ポリヌクレオチド配列を含むか又は前記配列によりコードされる。１態様では、Ｏ−ＲＳは配列番号３−４に記載のアミノ酸配列又はその保存変異体を含む。所定態様では、Ｏ−ＲＳは配列番号１もしくは２を含むポリヌクレオチド配列又はその保存変異体によりコードされるアミノ酸配列を含む。本発明の所定態様では、Ｏ−ＲＳは配列番号３又は４のアミノ酸配列を含むポリペプチドの効率の少なくとも５０％（例えば少なくとも６０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、又は少なくとも９０％以上）の効率でＯ−ｔＲＮＡを臭素化又はヨウ素化アミノ酸で優先的にアミノアシル化する。本発明のＯ−ＲＳは配列番号６−９のいずれかのアミノ酸配列を含むＯ−ＲＳを特異的に排除することができる。所定態様では、Ｏ−ＲＳは天然チロシルアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（ＴｙｒＲＳ）のアミノ酸配列と少なくとも９０％一致しており、Ｍ．ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ ＴｙｒＲＳのＴｙｒ３２に対応する位置のＬｅｕ、Ｍ．ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ ＴｙｒＲＳのＧｌｕ１０７に対応する位置のＳｅｒ又はＧｌｕ、Ｍ．ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ ＴｙｒＲＳのＡｓｐ１５８に対応する位置のＰｒｏ、Ｍ．ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ ＴｙｒＲＳのＩｌｅ１５９に対応する位置のＬｅｕ又はＡｒｇ、及びＭ．ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ ＴｙｒＲＳのＬｅｕ１６２に対応する位置のＧｌｕ又はＡｒｇから構成される群から選択される２個以上（例えば３個以上、４個以上、又は５個）のアミノ酸を含むアミノ酸配列をもつ。
場合により、本発明の細胞は該当ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む核酸を含み、前記ポリヌクレオチドはＯ−ｔＲＮＡにより認識されるセレクターコドンを含む。本発明の細胞は場合により異なる付加Ｏ−ｔＲＮＡ／Ｏ−ＲＳ対と第２の非天然アミノ酸を更に含むことができ、例えばこのＯ−ｔＲＮＡは第２のセレクターコドンを認識し、このＯ−ＲＳはＯ−ｔＲＮＡを第２の非天然アミノ酸で優先的にアミノアシル化する。
所定態様では、本発明の細胞（例えば大腸菌細胞）は直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ＲＳ）と、直交ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）と、臭素化又はヨウ素化アミノ酸を含む。直交ｔＲＮＡはセレクターコドンを認識し、直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼは直交ｔＲＮＡを臭素化又はヨウ素化アミノ酸で優先的にアミノアシル化する。Ｏ−ＲＳとＯ−ｔＲＮＡは各々一般に細胞中の１個以上の核酸によりコードされる。場合により、細胞は該当ポリペプチドをコードする核酸も含み、前記ポリヌクレオチドはＯ−ｔＲＮＡにより認識されるセレクターコドンを含む。細胞は更にターゲット核酸によりコードされる蛋白質も含むことができ、前記蛋白質は臭素化又はヨウ素化アミノ酸を含む。
本発明の所定態様では、本発明のＯ−ｔＲＮＡは本明細書の配列表もしくは実施例に記載するポリヌクレオチド配列、又はその保存変異体を含むか又は前記配列によりコードされる。本発明の所定態様では、Ｏ−ＲＳは本明細書の配列表に記載するアミノ酸配列又はその保存変異体を含む。１態様では、Ｏ−ＲＳ又はその一部は本明細書の配列表もしくは実施例に記載するアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列、又はその相補的ポリヌクレオチド配列によりコードされる。
本発明のＯ−ｔＲＮＡ及び／又はＯ−ＲＳは種々の生物（例えば真核及び／又は非真核生物）の任意のものに由来することができる。
ポリヌクレオチドも本発明の特徴である。本発明の核酸は配列番号１もしくは２のポリヌクレオチド配列、又はその相補的ポリヌクレオチド配列を含む。本発明のポリヌクレオチドは更に本明細書の配列表に記載するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む人工（例えば人為的に作製され、天然には存在しない）ポリヌクレオチドを含むか、及び／又は前記ポリヌクレオチド配列に相補的である。本発明のポリヌクレオチドは更に核酸の実質的に全長にわたって高ストリンジェント条件下で上記ポリヌクレオチドとハイブリダイズする核酸も含むことができる。上記の任意のものと例えば少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％以上一致する人工ポリヌクレオチド及び／又は上記の任意のものの保存変異体を含むポリヌクレオチドも本発明のポリヌクレオチドに含まれる。
本発明のポリヌクレオチドを含むベクターも本発明の特徴である。例えば、本発明のベクターはプラスミド、コスミド、ファージ、ウイルス、発現ベクター及び／又は同等物を含むことができる。本発明のベクターを含む細胞も本発明の特徴である。
重原子含有アミノ酸（例えば臭素化又はヨウ素化アミノ酸）をＯ−ｔＲＮＡに負荷する直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼの同定方法も提供する。例えば、方法は第１の種の細胞集団に選択を実施する段階を含み、前記細胞は、１）複数のアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（ＲＳ）（例えば複数のＲＳは突然変異体ＲＳ、第１の種以外の種に由来するＲＳ、又は突然変異体ＲＳと第１の種以外の種に由来するＲＳの両方を含むことができる）のメンバーと；２）（例えば１種以上の種に由来する）直交−ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）と；３）ポジティブ選択マーカーをコードし、少なくとも１個のセレクターコドンを含むポリヌクレオチド、又はネガティブ選択マーカーをコードし、少なくとも１個のセレクターコドンを含むポリヌクレオチドを各々含む。重原子含有アミノ酸（例えば臭素化又はヨウ素化アミノ酸）は一般にポジティブ選択の各ラウンド中に供給され、ネガティブ選択の各ラウンド中には供給されない。
複数のＲＳのメンバーを含まないか又はその量の少ない細胞に比較して抑圧効率の高い細胞について細胞（例えば宿主細胞）をポジティブ選択又はスクリーニングする。これらの選択／スクリーニングした細胞はＯ−ｔＲＮＡをアミノアシル化する活性ＲＳを含む。更に、選択／スクリーニングした細胞がＯ−ｔＲＮＡを内在アミノ酸でアミノアシル化しないＲＳを含むように、細胞をネガティブ選択又はスクリーニングする。この方法により同定された直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼも本発明の特徴である。
核酸及びポリペプチド配列と変異体
上記及び下記に記載するように、本発明は核酸ポリヌクレオチド配列（例えばＯ−ｔＲＮＡ及びＯ−ＲＳ）及びポリペプチドアミノ酸配列（例えばＯ−ＲＳ）と、例えば前記配列を含む組成物、キット及び方法を提供する。前記配列（例えばＯ−ｔＲＮＡ及びＯ−ＲＳ）の例を本明細書に開示する（本明細書の配列表及び実施例参照）。しかし、当業者に自明の通り、本発明は例えば実施例や配列表に記載する厳密な配列に限定されない。当業者に自明の通り、本発明は例えば本明細書に記載する機能をもつ（例えば適切なＯ−ｔＲＮＡ又はＯ−ＲＳをコードする）多数の関連及び非関連配列も提供する。
本発明はポリペプチド（Ｏ−ＲＳ）とポリヌクレオチド（例えばＯ−ｔＲＮＡ、Ｏ−ＲＳ又はその部分をコードするポリヌクレオチド、アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼクローンを単離するために使用されるオリゴヌクレオチド等）を提供する。本発明のポリヌクレオチドとしては、１個以上のセレクターコドンをもつ本発明の該当蛋白質又はポリペプチドをコードするものが挙げられる。更に、本発明のポリヌクレオチドとしては、例えば本明細書の配列表に記載するヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドと、そのポリヌクレオチド配列に相補的であるか又は前記配列をコードするポリヌクレオチドが挙げられる。本発明のポリヌクレオチドは更に本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。同様に、核酸の実質的に全長にわたって高ストリンジェント条件下で上記ポリヌクレオチドとハイブリダイズする（天然ポリヌクレオチド以外の）人工核酸も本発明のポリヌクレオチドである。人工ポリヌクレオチドとは人為的に作製され、天然には存在しないポリヌクレオチドである。
本発明のポリヌクレオチドは天然に存在するｔＲＮＡ又は本明細書の配列表もしくは実施例に記載する任意ｔＲＮＡもしくはそのコーディング核酸と例えば少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％以上一致する人工ポリヌクレオチド（但し、天然に存在するｔＲＮＡ以外のもの）も含む。ポリヌクレオチドは天然に存在するｔＲＮＡのポリヌクレオチドと例えば少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％以上一致する人工ポリヌクレオチドも含む。
所定態様では、ベクター（例えばプラスミド、コスミド、ファージ、ウイルス等）に本発明のポリヌクレオチドを組込む。１態様では、ベクターは発現ベクターである。所定態様では、発現ベクターは本発明のポリヌクレオチドの１種以上と機能的に連結されたプロモーターを含む。所定態様では、本発明のポリヌクレオチドを組込んだベクターを細胞に導入する。
同様に当業者に自明の通り、開示配列の多数の変異体も本発明に含まれる。例えば、機能的に同一配列となる開示配列の保存変異体も本発明に含まれる。例えば標準配列比較法により本明細書に開示する配列のユニークサブ配列であるとみなされる配列も本発明に含まれる。
保存変異
遺伝コードの縮重により、「サイレント置換」（即ちコードされるポリペプチドに変化を生じない核酸配列の置換）はアミノ酸をコードする全核酸配列の暗黙の特徴である。同様に、「保存アミノ酸置換」はアミノ酸配列中の１又は数個のアミノ酸を高度に類似する特性をもつ別のアミノ酸で置換するものであり、このような置換も開示構築物と高度に類似することが容易に認められる。各開示配列のこのような保存変異（又は保存変異体）は本発明の特徴である。
特定核酸配列の「保存変異体」又は「保存変異」とは同一又は本質的に同一のアミノ酸配列をコードする核酸を意味し、核酸がアミノ酸配列をコードしない場合には本質的に同一の配列を意味する。当業者に自明の通り、コードされる配列中の単一アミノ酸又は低百分率（一般に５％未満、より一般には４％、２％又は１％未満）のアミノ酸を置換、付加又は欠失させる個々の置換、欠失又は付加の結果としてアミノ酸を欠失するか、アミノ酸が付加されるか、又はアミノ酸が化学的に類似するアミノ酸で置換される場合には、これらの変異は「保存修飾変異」である。従って、本発明の記載ポリペプチド配列の「保存変異体」又は「保存変異」としては、ポリペプチド配列のアミノ酸の低百分率、一般に５％未満、より一般には２％又は１％未満が同一保存置換基のアミノ酸で置換される場合が挙げられる。最後に、非機能的配列の付加のように核酸分子のコードされる活性を変えない配列の付加も基本核酸の保存変異である。
機能的に類似するアミノ酸を示す保存置換表は当分野で周知であり、このようなアミノ酸では、あるアミノ酸残基が同様の化学的性質（例えば芳香族側鎖又は正荷電側鎖）をもつ別のアミノ酸残基に置換しているため、ポリペプチド分子の機能的性質は実質的に変化しない。化学的性質が類似する天然アミノ酸を含む代表的グループを以下に示すが、これらのグループ内の置換は「保存置換」である。

核酸ハイブリダイゼーション
本発明の核酸の保存変異体を含めて本明細書の配列表に記載するような本発明の核酸を同定するためには比較ハイブリダイゼーションを使用することができ、この比較ハイブリダイゼーション法は本発明の核酸を無関係の核酸から識別する方法の１つである。更に、高、超高及び超々高ストリンジェンシー条件下で配列表の配列により表される核酸とハイブリダイズするターゲット核酸も本発明の特徴である。このような核酸の例としては所与核酸配列と比較して１又は数個のサイレント又は保存核酸置換をもつものが挙げられる。
試験核酸が完全にマッチする相補的ターゲットに比較して少なくとも１／２の割合でプローブとハイブリダイズする場合、即ちマッチしないターゲット核酸の任意のものとのハイブリダイゼーションに観測されるシグナル対ノイズ比の少なくとも約５倍〜１０倍で完全にマッチするプローブが完全にマッチする相補的ターゲットと結合する条件下におけるプローブとターゲットのハイブリダイゼーションに比較してシグナル対ノイズ比が少なくとも１／２である場合に試験核酸はプローブ核酸と特異的にハイブリダイズすると言う。
核酸は一般に溶液中で会合するときに「ハイブリダイズ」する。核酸は水素結合、溶媒排除、塩基スタッキング等の種々の十分に特性決定された物理化学的力によりハイブリダイズする。核酸ハイブリダイゼーションの詳しい手引きはＴｉｊｓｓｅｎ（１９９３）Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ−−Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｐｒｏｂｅｓ ｐａｒｔ Ｉ ｃｈａｐｔｅｒ ２，“Ｏｖｅｒｖｉｅｗ ｏｆ ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｈｅ ｓｔｒａｔｅｇｙ ｏｆ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｐｒｏｂｅ ａｓｓａｙｓ，”（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）及びＡｕｓｕｂｅｌ，前出に記載されている。Ｈａｍｅｓ ａｎｄ Ｈｉｇｇｉｎｓ（１９９５）Ｇｅｎｅ Ｐｒｏｂｅｓ １ ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ ａｔ Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄ，（Ｈａｍｅｓ ａｎｄ Ｈｉｇｇｉｎｓ １）及びＨａｍｅｓ ａｎｄ Ｈｉｇｇｉｎｓ（１９９５）Ｇｅｎｅ Ｐｒｏｂｅｓ ２ ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ ａｔ Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄ（Ｈａｍｅｓ ａｎｄ Ｈｉｇｇｉｎｓ ２）はオリゴヌクレオチドを含むＤＮＡとＲＮＡの合成、標識、検出及び定量について詳細に記載している。
サザン又はノーザンブロットで１００個を上回る相補的残基をもつ相補的核酸のハイブリダイゼーションをフィルター上で行うためのストリンジェントハイブリダイゼーション条件の１例は、５０％ホルマリンにヘパリン１ｍｇを加え、４２℃で一晩ハイブリダイゼーションを実施する。ストリンジェント洗浄条件の１例は６５℃、０．２×ＳＳＣで１５分間洗浄する（ＳＳＣ緩衝液の説明についてはＳａｍｂｒｏｏｋ，前出参照）。多くの場合には高ストリンジェンシー洗浄の前に低ストリンジェンシー洗浄を実施してバックグラウンドプローブシグナルを除去する。低ストリンジェンシー洗浄の１例は４０℃、２×ＳＳＣで１５分間である。一般に、シグナル対ノイズ比が特定ハイブリダイゼーションアッセイで無関係プローブに観測される比の５倍（以上）である場合に特異的ハイブリダイゼーションが検出されたとみなす。
サザン及びノーザンハイブリダイゼーション等の核酸ハイブリダイゼーション実験において「ストリンジェントハイブリダイゼーション洗浄条件」は配列依存性であり、各種環境パラメーターにより異なる。核酸ハイブリダイゼーションの詳しい手引きはＴｉｊｓｓｅｎ（１９９３），前出やＨａｍｅｓ ａｎｄ Ｈｉｇｇｉｎｓ １及び２に記載されている。ストリンジェントハイブリダイゼーション及び洗浄条件は任意試験核酸について経験により容易に決定することができる。例えば、高ストリンジェントハイブリダイゼーション及び洗浄条件を決定するには、一連の選択基準に合致するまで（例えばハイブリダイゼーション又は洗浄における温度上昇、塩濃度低下、界面活性剤濃度増加及び／又はホルマリン等の有機溶媒濃度増加により）ハイブリダイゼーション及び洗浄条件を徐々に増加する。例えば、マッチしないターゲットとプローブのハイブリダイゼーションに観測されるシグナル対ノイズ比の少なくとも約５倍でプローブが完全にマッチする相補的ターゲットと結合するまでハイブリダイゼーション及び洗浄条件を徐々に増加する。
「超ストリンジェント」条件は特定プローブの熱融点（Ｔｍ）に等しくなるように選択される。Ｔｍは（規定イオン強度及びｐＨ下で）試験配列の５０％が完全にマッチするプローブとハイブリダイズする温度である。本発明の目的には、一般に規定イオン強度及びｐＨで特定配列のＴｍよりも約５℃低くなるように「高ストリンジェント」ハイブリダイゼーション及び洗浄条件を選択する。
「超高ストリンジェンシー」ハイブリダイゼーション及び洗浄条件は完全にマッチする相補的ターゲット核酸とプローブの結合に観測されるシグナル対ノイズ比がマッチしないターゲット核酸の任意のものとのハイブリダイゼーションに観測されるシグナル対ノイズ比の少なくとも１０倍になるまでハイブリダイゼーション及び洗浄条件のストリンジェンシーを増加する条件である。完全にマッチする相補的ターゲット核酸のシグナル対ノイズ比の少なくとも１／２で前記条件下にプローブとハイブリダイズする場合にターゲット核酸は超高ストリンジェンシー条件下でプローブと結合すると言う。
同様に、該当ハイブリダイゼーションアッセイのハイブリダイゼーション及び／又は洗浄条件を徐々に増加することにより更に高いレベルのストリンジェンシーを決定することもできる。例えば、完全にマッチする相補的ターゲット核酸とプローブの結合に観測されるシグナル対ノイズ比がマッチしないターゲット核酸の任意のものとのハイブリダイゼーションに観測されるシグナル対ノイズ比の少なくとも１０倍、２０倍、５０倍、１００倍又は５００倍以上になるまでハイブリダイゼーション及び洗浄条件のストリンジェンシーを増加する条件である。完全にマッチする相補的ターゲット核酸のシグナル対ノイズ比の少なくとも１／２で前記条件下にプローブとハイブリダイズする場合にターゲット核酸は超々高ストリンジェンシー条件下でプローブと結合すると言う。
ストリンジェント条件下で相互にハイブリダイズしない核酸でも、これらの核酸によりコードされるポリペプチドが実質的に同一である場合には実質的に同一である。これは、例えば遺伝コードに許容される最大コドン縮重を使用して核酸のコピーを作製する場合に該当する。
ユニークサブ配列
１側面では、本発明は本明細書に開示するＯ−ｔＲＮＡ及びＯ−ＲＳの配列から選択される核酸中にユニークサブ配列を含む核酸を提供する。ユニークサブ配列は従来公知の任意ｔＲＮＡ及びＲＳ核酸配列に対応する核酸に比較してユニークである。例えばデフォルトパラメーターに設定したＢＬＡＳＴを使用してアラインメントを実施することができる。任意ユニークサブ配列は例えば本発明の核酸を同定するためのプローブとして有用である。
同様に、本発明は本明細書に開示するＯ−ＲＳの配列から選択されるポリペプチド中にユニークサブ配列を含むポリペプチドを含む。この場合には、ユニークサブ配列は従来公知の任意ＲＳ配列に対応するポリペプチドに比較してユニークである。
本発明はＯ−ＲＳの配列から選択されるポリペプチド中のユニークサブ配列をコードするユニークコーディングオリゴヌクレオチドとストリンジェント条件下でハイブリダイズするターゲット核酸も提供し、この場合には、ユニークサブ配列は対照ポリペプチド（例えば本発明のシンテターゼを例えば突然変異により誘導した元の親配列）の任意のものに対応するポリペプチドに比較してユニークである。ユニーク配列は上記のように決定する。
配列比較、一致度及び相同度
２種以上の核酸又はポリペプチド配列に関して「一致」又は「一致度」百分率なる用語は２種以上の配列又はサブ配列を最大限に対応するように対比及び整列させ、以下に記載する配列比較アルゴリズム（又は当業者に入手可能な他のアルゴリズム）の１種を使用するか又は目視により測定した場合に相互に同一であるか又は同一のアミノ酸残基もしくはヌクレオチドの百分率が特定値であることを意味する。
２種以上の核酸又はポリペプチド（例えばＯ−ｔＲＮＡもしくはＯ−ＲＳをコードするＤＮＡ又はＯ−ＲＳのアミノ酸配列）に関して「実質的に一致」なる用語は２種以上の配列又はサブ配列を最大限に対応するように対比及び整列させ、配列比較アルゴリズムを使用するか又は目視により測定した場合にヌクレオチド又はアミノ酸残基一致度が少なくとも約６０％、約８０％、約９０〜９５％、約９８％、約９９％以上であることを意味する。このような「実質的に一致」する配列は一般に実際の起源が記載されていなくても「相同」であるとみなす。少なくとも約５０残基長の配列の領域、より好ましくは少なくとも約１００残基長の領域にわたって「実質的一致」が存在していることが好ましく、少なくとも約１５０残基又は比較する２配列の全長にわたって配列が実質的に一致していることが最も好ましい。
蛋白質及び／又は蛋白質配列は共通の祖先蛋白質又は蛋白質配列から天然又は人工的に誘導される場合に「相同」である。同様に、核酸及び／又は核酸配列は共通の祖先核酸又は核酸配列から天然又は人工的に誘導される場合に相同である。例えば、１個以上のセレクターコドンを含むように任意天然核酸を利用可能な任意突然変異誘発法により改変することができる。この突然変異誘発した核酸は発現されると、１種以上の非天然アミノ酸（例えば１種以上のヨウ素化又は臭素化アミノ酸）を含むポリペプチドをコードする。突然変異法は当然のことながら更に１個以上の標準コドンを変異させ、得られる突然変異体蛋白質の１個以上の標準アミノ酸も変異させることができる。相同性は一般に２種以上の核酸又は蛋白質（又はその配列）間の配列類似度から推定される。相同性の判定に有用な配列間類似度の厳密な百分率は該当核酸及び蛋白質により異なるが、通常は２５％程度の低い配列類似度を使用して相同性を判定する。例えば３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％又は９９％以上のより高レベルの配列類似度を使用して相同性を判定することもできる。配列類似度百分率の決定方法（例えばデフォルトパラメーターを使用するＢＬＡＳＴＰ及びＢＬＡＳＴＮ）は本明細書に記載し、一般に入手可能である。
配列比較及び相同性判定には、一般に一方の配列を参照配列としてこれに試験配列を比較する。配列比較アルゴリズムを使用する場合には、試験配列と参照配列をコンピューターに入力し、必要に応じてサブ配列座標を指定し、配列アルゴリズムプログラムパラメーターを指定する。こうすると、配列比較アルゴリズムは指定プログラムパラメーターに基づいて参照配列に対して試験配列の配列一致度百分率を計算する。
比較のための最適な配列アラインメントは例えばＳｍｉｔｈ ａｎｄ Ｗａｔｅｒｍａｎ（１９８１）Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２の局所相同性アルゴリズム、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ，Ｊ．（１９７０）Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３の相同性アラインメントアルゴリズム、Ｐｅａｒｓｏｎ ａｎｄ Ｌｉｐｍａｎ（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：２４４４の類似性探索法、これらのアルゴリズムのコンピューターソフトウェア（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩのＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ及びＴＦＡＳＴＡ）、又は目視（一般にＡｕｓｕｂｅｌら，後出参照）により実施することができる。
配列一致度及び配列類似度百分率を決定するのに適したアルゴリズムの１例はＡｌｔｓｃｈｕｌら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０（１９９０）に記載されているＢＬＡＳＴアルゴリズムである。ＢＬＡＳＴ分析を実施するためのソフトウェアはＮａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）から公共入手可能である。このアルゴリズムはデータベース配列中の同一長さの単語と整列した場合に所定の正の閾値スコアＴと一致するか又はこれを満足するクエリー配列中の長さＷの短い単語を識別することによりまず高スコア配列対（ＨＳＰ）を識別する。Ｔを隣接単語スコア閾値と言う（Ａｌｔｓｃｈｕｌら，前出）。これらの初期隣接単語ヒットをシードとして検索を開始し、これらの単語を含むもっと長いＨＳＰを探索する。次に、累積アラインメントスコアを増加できる限り、単語ヒットを各配列に沿って両方向に延長する。ヌクレオチド配列の場合にはパラメーターＭ（１対のマッチ残基のリウォードスコア、常に＞０）及びＮ（ミスマッチ残基のペナルティースコア、常に＜０）を使用して累積スコアを計算する。アミノ酸配列の場合には、スコアリングマトリクスを使用して累積スコアを計算する。累積アラインメントスコアがその最大到達値から量Ｘだけ低下するか、累積スコアが１カ所以上の負スコア残基アラインメントの累積によりゼロ以下になるか、又はどちらかの配列の末端に達したら各方向の単語ヒットの延長を停止する。ＢＬＡＳＴアルゴリズムパラメーターＷ、Ｔ及びＸはアラインメントの感度と速度を決定する。ＢＬＡＳＴＮプログラム（ヌクレオチド配列用）は語長（Ｗ）１１、期待値（Ｅ）１０、カットオフ１００、Ｍ＝５、Ｎ＝４、及び両鎖の比較をデフォルトとして使用する。アミノ酸配列用として、ＢＬＡＳＴＰプログラムは語長（Ｗ）３、期待値（Ｅ）１０、及びＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリクスをデフォルトとして使用する（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ ａｎｄ Ｈｅｎｉｋｏｆｆ（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：１０９１５参照）。
配列一致度百分率の計算に加え、ＢＬＡＳＴアルゴリズムは２配列間の類似性の統計分析も実施する（例えばＫａｒｌｉｎ ａｎｄ Ａｌｔｓｃｈｕｌ（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：５８７３−５７８７参照）。ＢＬＡＳＴアルゴリズムにより提供される類似性の１尺度は２種のヌクレオチド又はアミノ酸配列間に偶然にマッチが起こる確率を示す最小合計確率（Ｐ（Ｎ））である。例えば、試験核酸を参照核酸に比較した場合の最小合計確率が約０．１未満、より好ましくは約０．０１未満、最も好ましくは約０．００１未満である場合に核酸は参照核酸に類似しているとみなす。
突然変異誘発及び他の分子生物学技術
本発明のポリヌクレオチドとポリペプチド及び本発明で使用されるポリヌクレオチドとポリペプチドは分子生物学技術を使用して操作することができる。分子生物学技術について記載している一般教科書としてはＢｅｒｇｅｒ ａｎｄ Ｋｉｍｍｅｌ，Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ｖｏｌｕｍｅ １５２ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ（「Ｂｅｒｇｅｒ」）；Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（第３版），Ｖｏｌ．１−３，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，２００１（「Ｓａｍｂｒｏｏｋ」）及びＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら編，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，ａ ｊｏｉｎｔ ｖｅｎｔｕｒｅ ｂｅｔｗｅｅｎ Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．ａｎｄ Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，（２００４年補遺）（「Ａｕｓｕｂｅｌ」））が挙げられる。これらの教科書は突然変異誘発、ベクターの使用、プロモーターについて記載しており、更に例えば非天然アミノ酸を組込んだ蛋白質を生産するためのセレクターコドンを含む遺伝子の作製や、直交ｔＲＮＡ、直交シンテターゼ及びその対に作製に関する他の多くの関連事項についても記載している。
例えばｔＲＮＡ分子を突然変異させるため、ｔＲＮＡのライブラリーを作製するため、シンテターゼのライブラリーを作製するため、及び／又は非天然アミノ酸をコードするセレクターコドンを該当蛋白質又はポリペプチドに挿入するために、本発明では各種突然変異誘発を使用する。これらの例としては限定されないが、部位特異的突然変異誘発、ランダム点突然変異誘発、相同組換え、ＤＮＡシャフリング又は他の帰納的突然変異誘発法、キメラ構築、ウラシル含有鋳型を使用する突然変異誘発、オリゴヌクレオチド特異的突然変異誘発、ホスホロチオエート修飾ＤＮＡ突然変異誘発、ギャップデュプレクスＤＮＡを使用する突然変異誘発等、又はその任意組み合わせが挙げられる。他の適切な方法としては点ミスマッチ修復、修復欠損宿主株を使用する突然変異誘発、制限−選択及び制限−精製、欠失突然変異誘発、完全遺伝子合成による突然変異誘発、２本鎖切断修復等が挙げられる。例えばキメラ構築物を使用する突然変異誘発も本発明に含まれる。１態様では、天然分子又は改変もしくは突然変異させた天然分子の公知情報（例えば配列、配列比較、物性、結晶構造等）により突然変異誘発を行うことができる。
本発明のポリヌクレオチド又は本発明のポリヌクレオチドを組込んだ構築物（例えばクローニングベクター又は発現ベクター等の本発明のベクター）で宿主細胞を遺伝子組換え（例えば形質転換、形質導入又はトランスフェクション）する。例えば、直交ｔＲＮＡ、直交ｔＲＮＡシンテターゼ、及び修飾すべき蛋白質のコーディング領域を所望宿主細胞で機能的な遺伝子発現制御エレメントに機能的に連結する。典型的なベクターは転写及び翻訳ターミネーターと、転写及び翻訳開始配列と、特定ターゲット核酸の発現の調節に有用なプロモーターを含む。ベクターは場合により少なくとも１個の独立ターミネーター配列と、真核生物又は原核生物又は両者（例えばシャトルベクター）でカセットの複製を可能にする配列と、原核系と真核系の両者の選択マーカーを含む包括的発現カセットを含む。ベクターは原核生物、真核生物、又は好ましくは両者での複製及び／又は組込みに適している。Ｇｉｌｉｍａｎ ａｎｄ Ｓｍｉｔｈ（１９７９）Ｇｅｎｅ ８：８１；Ｒｏｂｅｒｔｓら（１９８７）Ｎａｔｕｒｅ，３２８：７３１；Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ，Ｂ．ら（１９９５）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒ．Ｐｕｒｉｆ．６４３５：１０；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｂｅｒｇｅｒ（いずれも前出）参照。ベクターは例えばプラスミド、細菌、ウイルス、裸のポリヌクレオチド又はポリヌクレオチドコンジュゲートの形態とすることができる。ベクターはエレクトロポレーション（Ｆｒｏｍら（１９８５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２，５８２４）、ウイルスベクターによる感染、核酸を小ビーズもしくは粒子のマトリックスに埋込むか又は表面に付着させて小粒子形態で高速射入する方法（Ｋｌｅｉｎら（１９８７）Ｎａｔｕｒｅ ３２７，７０−７３）、及び／又は同等方法等の標準方法により細胞及び／又は微生物に導入する。
クローニングに有用な細菌とバクテリオファージのカタログは例えばＡＴＣＣから入手でき、例えばＡＴＣＣから刊行されたＴｈｅ ＡＴＣＣ Ｃａｔａｌｏｇｕｅ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉａ ａｎｄ Ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ（１９９６）Ｇｈｅｒｎａら（編）が挙げられる。その他のシーケンシング、クローニング及び分子生物学の他の側面の基本手順と基礎理論事項もＳａｍｂｒｏｏｋ（前出），Ａｕｓｕｂｅｌ（前出）及びＷａｔｓｏｎら（１９９２）Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＤＮＡ Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｂｏｏｋｓ，ＮＹに記載されている。更に、Ｍｉｄｌａｎｄ Ｃｅｒｔｉｆｉｅｄ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｍｉｄｌａｎｄ，ＴＸ ｍｃｒｃ．ｃｏｍ）、Ｔｈｅ Ｇｒｅａｔ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｇｅｎｅ Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｒａｍｏｎａ，ＣＡ，世界ウェブｇｅｎｃｏ．ｃｏｍ参照）、ＥｘｐｒｅｓｓＧｅｎ Ｉｎｃ．（Ｃｈｉｃａｇｏ，ＩＬ，世界ウェブｅｘｐｒｅｓｓｇｅｎ．ｃｏｍ参照）、Ｏｐｅｒｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．（Ａｌａｍｅｄａ，ＣＡ）、その他多数の各種販売会社からほぼ任意核酸（及び標準又は標準外を問わずほぼ任意標識核酸）をオーダーメード又は標準注文することができる。
遺伝子組換えした宿主細胞は例えばスクリーニング段階、プロモーター活性化又は形質転換細胞選択等の操作に合うように適宜改変した慣用栄養培地で培養することができる。これらの細胞は場合によりトランスジェニック生物で培養することができる。（例えば後期核酸単離又は蛋白質発現及び／又は精製のための）例えば細胞単離及び培養に関する他の有用な文献としてはＦｒｅｓｈｎｅｙ（１９９４）Ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌｓ，ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ，第４版，Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋとその引用文献；Ｈｉｇｇｉｎｓ ａｎｄ Ｈａｍｅｓ（編）（１９９９）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ Ｓｅｒｉｅｓ， Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ；Ｓｈｕｌｅｒら（編）（１９９４）Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍｓ ａｎｄ Ｂｉｏｐｅｓｔｉｃｉｄｅｓ，Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ；Ｐａｙｎｅら（１９９２）Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ ｉｎ Ｌｉｑｕｉｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ；Ｇａｍｂｏｒｇ ａｎｄ Ｐｈｉｌｌｉｐｓ（編）（１９９５）Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ，Ｔｉｓｓｕｅ ａｎｄ Ｏｒｇａｎ Ｃｕｌｔｕｒｅ；Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｌａｂ Ｍａｎｕａｌ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ（Ｂｅｒｌｉｎ Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）及びＡｔｌａｓ ａｎｄ Ｐａｒｋｓ（編）Ｔｈｅ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｄｉａ（１９９３）ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，ＦＬが挙げられる。
該当蛋白質及びポリペプチド
例えば少なくとも１個の重原子含有アミノ酸（例えば少なくとも１個のブロモＰｈｅ又はヨードＰｈｅ等の臭素化又はヨウ素化アミノ酸）を組込んだ該当蛋白質又はポリペプチドと、２種以上の異なる非天然アミノ酸を組込んだポリペプチドも本発明の特徴である。場合により、本発明の蛋白質は翻訳後修飾を含む。賦形剤（例えば医薬的に許容可能な賦形剤）、又はより一般には（例えば１種以上の緩衝液、塩類、沈殿試薬、凍結防止剤等を含有）結晶化溶液も蛋白質に添加することができる。
重原子含有アミノ酸（例えば臭素化又はヨウ素化アミノ酸、例えばブロモＰｈｅ又はヨードＰｈｅ）を特定位置に組込んだ蛋白質を細胞（例えば大腸菌等の非真核細胞又は真核細胞）で生産する方法も本発明の特徴である。例えば、本方法は、少なくとも１個のセレクターコドンを含み且つ蛋白質をコードする核酸と、細胞で機能し、セレクターコドンを認識する直交ｔＲＮＡと、直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼを含む細胞を提供する段階を含む。Ｏ−ＲＳは天然チロシルアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（ＴｙｒＲＳ）のアミノ酸配列と少なくとも９０％一致しており、Ｍ．ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ ＴｙｒＲＳのＴｙｒ３２に対応する位置のロイシン、Ｍ．ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ ＴｙｒＲＳのＧｌｕ１０７に対応する位置のセリン又はグルタミン酸、Ｍ．ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ ＴｙｒＲＳのＡｓｐ１５８に対応する位置のプロリン、Ｍ．ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ ＴｙｒＲＳのＩｌｅ１５９に対応する位置のロイシン又はアルギニン及びＭ．ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ ＴｙｒＲＳのＬｅｕ１６２に対応する位置のグルタミン酸又はアルギニンから構成される群から選択される２個以上（例えば３個以上、４個以上、又は５個）のアミノ酸を含むアミノ酸配列を含む。細胞を適当な培地で増殖させる。臭素化又はヨウ素化アミノ酸（又は他の重原子含有アミノ酸）を提供し、少なくとも１個のセレクターコドンによる核酸の翻訳中に蛋白質の特定位置に組込む。この方法により生産された蛋白質も本発明の特徴である。
本発明は例えば重原子含有アミノ酸（例えば臭素化又はヨウ素化アミノ酸、例えばブロモＰｈｅ又はヨードＰｈｅ）を組込んだ蛋白質を含有する組成物も提供する。所定態様では、蛋白質は既知蛋白質（例えば治療用蛋白質、診断用蛋白質、産業用酵素、又はその部分）のアミノ酸配列と少なくとも７５％一致するアミノ酸配列を含む。場合により、蛋白質は蛋白質結晶を含む。
本発明の組成物と本発明の方法により作製した組成物は場合により細胞に導入する。本発明のＯ−ｔＲＮＡ／Ｏ−ＲＳ対又は個々の成分をその後、宿主系の翻訳機構で使用することができ、その結果として、重原子含有アミノ酸は蛋白質に組込まれる。国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０１１７８６号、出願日２００４年４月１６日、発明の名称「真核遺伝コードの拡張（Ｅｘｐａｎｄｉｎｇ ｔｈｅ Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｃｏｄｅ）」；及びＷＯ２００２／０８５９２３、発明の名称「非天然アミノ酸のインビボ組込み（Ｉｎ ｖｉｖｏ ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｕｎｎａｔｕｒａｌ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ）」はこのプロセスを記載しており、参考資料として本明細書に組込む。例えば、Ｏ−ｔＲＮＡ／Ｏ−ＲＳ対を宿主（例えば大腸菌）に導入すると、前記対はセレクターコドンに応答して外部から増殖培地に添加することができる重原子含有アミノ酸（例えばチロシン又はフェニルアラニンの臭素化又はヨウ素化誘導体等の合成アミノ酸）のｉｎ ｖｉｖｏ蛋白質組込みを誘導する。場合により、本発明の組成物をｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳系に導入してもよいし、ｉｎ ｖｉｖｏ系に導入してもよい。
本発明の細胞は非天然アミノ酸を組込んだ蛋白質を大量の有用な量で合成することができる。１側面では、組成物は場合により、重原子含有アミノ酸（例えば臭素化又はヨウ素化アミノ酸）又は複数の非天然アミノ酸を含む蛋白質を例えば少なくとも１０μｇ、少なくとも５０μｇ、少なくとも７５μｇ、少なくとも１００μｇ、少なくとも２００μｇ、少なくとも２５０μｇ、少なくとも５００μｇ、少なくとも１ｍｇ、少なくとも１０ｍｇ、少なくとも５０ｍｇ、又は少なくとも１００ｍｇ以上含有するか、あるいはｉｎ ｖｉｖｏ蛋白質生産方法で達成可能な量で含有する（組換え蛋白質生産及び精製に関する詳細は本明細書に記載する）。別の側面では、蛋白質は場合により例えば細胞溶解液、緩衝液、医薬緩衝液、又は他の懸濁液中（例えば約１ｎＬ〜約１００Ｌの任意の容量中）に例えば少なくとも１０μｇ蛋白質／ｌ、少なくとも５０μｇ蛋白質／ｌ、少なくとも７５μｇ蛋白質／ｌ、少なくとも１００μｇ蛋白質／ｌ、少なくとも２００μｇ蛋白質／ｌ、少なくとも２５０μｇ蛋白質／ｌ、少なくとも５００μｇ蛋白質／ｌ、少なくとも１ｍｇ蛋白質／ｌ、又は少なくとも１０ｍｇ蛋白質／ｌ以上の濃度で組成物中に存在する。少なくとも１個の重原子含有アミノ酸（例えば少なくとも１個の臭素化又はヨウ素化アミノ酸）を組込んだ蛋白質を細胞で大量（例えば他の方法、例えばｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳で一般に可能な量よりも多量）に生産することも本発明の特徴である。
重原子含有アミノ酸（例えば臭素化又はヨウ素化アミノ酸）の組込みは例えば本明細書に記載するようにＸ線結晶解析による蛋白質の三次元結晶構造の解析を容易にするために実施することができる。従って、上記のように、重原子含有アミノ酸を組込んだ蛋白質は場合により蛋白質結晶の一部である。
本発明の１側面では、組成物は少なくとも１個、例えば少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、又は少なくとも１０個以上の非天然アミノ酸（例えば重原子含有アミノ酸及び／又は他の非天然アミノ酸）を組込んだ少なくとも１種の蛋白質を含有する。非天然アミノ酸は同一でも異なっていてもよく、例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０種以上の異なる非天然アミノ酸を含む１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０個以上の異なる部位が蛋白質に存在することができる。別の側面では、組成物は蛋白質に存在する特定アミノ酸の全部よりは少ないが少なくとも１個が重原子含有アミノ酸で置換された蛋白質を含有する。２個以上の非天然アミノ酸を組込んだ所与蛋白質では、非天然アミノ酸は同一でも異なっていてもよい（例えば蛋白質は２個以上の異なる型の非天然アミノ酸を組込んでもよいし、２個の同一非天然アミノ酸を組込んでもよい）。３個以上の非天然アミノ酸を組込んだ所与蛋白質では、非天然アミノ酸は同一でも異なっていてもよいし、同一種の複数の非天然アミノ酸と少なくとも１個の別の非天然アミノ酸の組み合わせでもよい。
本明細書に記載する組成物と方法を使用し、非天然アミノ酸を組込むか又は複数の異なる非天然アミノ酸（及び例えば１個以上のセレクターコドンを含む対応する任意コーディング核酸）をコードするほぼ任意蛋白質（又はその部分）を生産することができる。数十万種の公知蛋白質を同定しようとするのではなく、例えば該当翻訳系に１個以上の適当なセレクターコドンを含むように入手可能な任意突然変異法を調整することにより、１種以上の非天然アミノ酸を組込むように公知蛋白質の任意のものを改変することができる。公知蛋白質の一般的な配列寄託機関としてはＧｅｎＢａｎｋ、ＥＭＢＬ、ＤＤＢＪ及びＮＣＢＩが挙げられる。他の寄託機関もインターネットを検索することにより容易に確認できる。
一般に、蛋白質は入手可能な任意蛋白質（例えば治療用蛋白質、診断用蛋白質、産業用酵素、又はその部分等）と例えば少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は少なくとも９９％以上一致しており、１個以上の非天然アミノ酸を含む。重原子含有アミノ酸を組込むように、該当構造をもつほぼ任意蛋白質を改変することができる。１個以上の重原子含有アミノ酸を組込むように改変することができる治療用、診断用、及び他の蛋白質の例としては限定されないが、国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０１１７８６号、出願日２００４年４月１６日、発明の名称「真核遺伝コードの拡張（Ｅｘｐａｎｄｉｎｇ ｔｈｅ Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｃｏｄｅ）」、及びＷＯ２００２／０８５９２３、発明の名称「非天然アミノ酸のインビボ組込み（Ｉｎ ｖｉｖｏ ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｕｎｎａｔｕｒａｌ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ）」に記載されているものが挙げられる。１個以上の重原子含有アミノ酸を組込むように改変することができる治療用、診断用、及び他の蛋白質の例としては限定されないが、例えばα１アンチトリプシン、アンジオスタチン、抗血友病因子、抗体（抗体の詳細については後述する）、アポリポ蛋白質、アポ蛋白質、心房性ナトリウム利尿因子、心房性ナトリウム利尿ポリペプチド、心房性ペプチド、Ｃ−Ｘ−Ｃケモカイン（例えばＴ３９７６５、ＮＡＰ−２、ＥＮＡ−７８、Ｇｒｏ−ａ、Ｇｒｏ−ｂ、Ｇｒｏ−ｃ、ＩＰ−１０、ＧＣＰ−２、ＮＡＰ−４、ＳＤＦ−１、ＰＦ−４、ＭＩＧ）、カルシトニン、ＣＣケモカイン（例えば単球化学誘引蛋白質−１、単球化学誘引蛋白質−２、単球化学誘引蛋白質−３、単球炎症性蛋白質−１α、単球炎症性蛋白質−１β、ＲＡＮＴＥＳ、Ｉ３０９、Ｒ８３９１５、Ｒ９１７３３、ＨＣＣ１、Ｔ５８８４７、Ｄ３１０６５、Ｔ６４２６２）、ＣＤ４０リガンド、Ｃキットリガンド、コラーゲン、コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、補体因子５ａ、補体阻害剤、補体受容体１、サイトカイン（例えば上皮好中球活性化ペプチド−７８、ＧＲＯα／ＭＧＳＡ、ＧＲＯβ、ＧＲＯγ、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１δ、ＭＣＰ−１）、表皮増殖因子（ＥＧＦ）、エリスロポエチン（「ＥＰＯ」）、表皮剥離毒素Ａ及びＢ、ＩＸ因子、ＶＩＩ因子、ＶＩＩＩ因子、Ｘ因子、繊維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、フィブリノーゲン、フィブロネクチン、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、グルコセレブロシダーゼ、ゴナドトロピン、増殖因子、ヘッジホッグ蛋白質（例えばソニック、インディアン、デザート）、ヘモグロビン、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、ヒルジン、ヒト血清アルブミン、インスリン、インスリン様増殖因子（ＩＧＦ）、インターフェロン（例えばＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−γ）、インターロイキン（例えばＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２等）、ケラチノサイト増殖因子（ＫＧＦ）、ラクトフェリン、白血病阻害因子、ルシフェラーゼ、ニュールチュリン、好中球阻害因子（ＮＩＦ）、オンコスタチンＭ、骨形成蛋白質、副甲状腺ホルモン、ＰＤ−ＥＣＳＦ、ＰＤＧＦ、ペプチドホルモン（例えばヒト成長ホルモン）、プレイオトロピン、プロテインＡ、プロテインＧ、発熱外毒素Ａ、Ｂ及びＣ、リラキシン、レニン、ＳＣＦ、可溶性補体受容体Ｉ、可溶性Ｉ−ＣＡＭ１、可溶性インターロイキン受容体（ＩＬ−１、２、３、４、５、６、７、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５）、可溶性ＴＮＦ受容体、ソマトメジン、ソマトスタチン、ソマトトロピン、ストレプトキナーゼ、スーパー抗原即ちブドウ球菌エンテロトキシン（ＳＥＡ、ＳＥＢ、ＳＥＣ１、ＳＥＣ２、ＳＥＣ３、ＳＥＤ、ＳＥＥ）、スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）、毒素性ショック症候群毒素（ＴＳＳＴ−１）、チモシンα１、組織プラスミノーゲンアクチベーター、腫瘍壊死因子β（ＴＮＦβ）、腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦＲ）、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＥＦ）、ウロキナーゼ等が挙げられる。
本明細書に記載する重原子含有アミノ酸のｉｎ ｖｉｖｏ組込み用組成物及び方法を使用して生産することができる蛋白質の１分類としては転写モジュレーター又はその部分が挙げられる。転写モジュレーターの例としては細胞増殖、分化、制御等を調節する遺伝子及び転写モジュレーター蛋白質が挙げられる。転写モジュレーターは原核生物、ウイルス及び真核生物（例えば真菌、植物、酵母、昆虫、及び哺乳動物を含む動物）に存在し、広範な治療ターゲットを提供する。当然のことながら、発現及び転写アクチベーターは例えば受容体との結合、シグナル伝達カスケードの刺激、転写因子の発現調節、プロモーターやエンハンサーとの結合、プロモーターやエンハンサーと結合する蛋白質との結合、ＤＮＡ巻き戻し、プレｍＲＮＡスプライシング、ＲＮＡポリアデニル化及びＲＮＡ分解等の多数のメカニズムにより転写を調節する。
本発明の蛋白質（例えば１個以上の重原子含有アミノ酸を組込んだ蛋白質）の１分類としては発現アクチベーター（例えばサイトカイン、炎症性分子、増殖因子、その受容体、及び腫瘍遺伝子産物、例えばインターロイキン（例えばＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−８等）、インターフェロン、ＦＧＦ、ＩＧＦ−Ｉ、ＩＧＦ−ＩＩ、ＦＧＦ、ＰＤＧＦ、ＴＮＦ、ＴＧＦ−α、ＴＧＦ−β、ＥＧＦ、ＫＧＦ、ＳＣＦ／ｃ−キット、ＣＤ４０Ｌ／ＣＤ４０、ＶＬＡ−４／ＶＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−１／ＬＦＡ−１及びヒアルリン／ＣＤ４４）；シグナル伝達分子及び対応する腫瘍遺伝子産物（例えばＭｏｓ、Ｒａｓ、Ｒａｆ及びＭｅｔ）；並びに転写アクチベーター及びサプレッサー（例えばｐ５３、Ｔａｔ、Ｆｏｓ、Ｍｙｃ、Ｊｕｎ、Ｍｙｂ、Ｒｅｌ、及びステロイドホルモン受容体（例えばエストロゲン、プロゲステロン、テストステロン、アルドステロン、ＬＤＬ受容体リガンド及びコルチコステロン））が挙げられる。
少なくとも１個の重原子含有アミノ酸を組込んだ酵素（例えば産業用酵素）又はその部分も本発明により提供される。酵素の例としては限定されないが、例えばアミダーゼ、アミノ酸ラセマーゼ、アシラーゼ、デハロゲナーゼ、ジオキシゲナーゼ、ジアリールプロパンペルオキシダーゼ、エピメラーゼ、エポキシドヒドロラーゼ、エステラーゼ、イソメラーゼ、キナーゼ、グルコースイソメラーゼ、グリコシダーゼ、グリコシルトランスフェラーゼ、ハロペルオキシダーゼ、モノオキシゲナーゼ（例えばｐ４５０類）、リパーゼ、リグニンペルオキシダーゼ、ニトリルヒドラターゼ、ニトリラーゼ、プロテアーゼ、ホスファターゼ、スブチリシン、トランスアミナーゼ及びヌクレアーゼが挙げられる。
これらの蛋白質の多くは市販されており（例えばＳｉｇｍａ ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓ ２００３カタログ及び価格表参照）、対応する蛋白質配列と遺伝子及び、一般に多くのその変異体も周知である（例えばＧｅｎｂａｎｋ参照）。例えば蛋白質構造の決定を容易にするように本発明に従って１個以上の重原子含有アミノ酸又は他の非天然アミノ酸を挿入することにより前記蛋白質の任意のものを改変することができる。
他の各種蛋白質も本発明の１個以上の重原子含有アミノ酸を組込むように改変することができる。例えば、本発明は例えば感染性真菌（例えばＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ、Ｃａｎｄｉｄａ種）；細菌、特に病原細菌モデルとして利用できる大腸菌や医学的に重要な細菌（例えばＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｉ（例えばａｕｒｅｕｓ）又はＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｉ（例えばｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ））；原生動物（例えば胞子虫類（例えばＰｌａｓｍｏｄｉａ）、根足虫類（例えばＥｎｔａｍｏｅｂａ）及び鞭毛虫類（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ、Ｔｒｉｃｈｏｍｏｎａｓ、Ｇｉａｒｄｉａ等））；ウイルス（例えば（＋）ＲＮＡウイルス（例えばポックスウイルス（例えばワクシニア）、ピコルナウイルス（例えばポリオ）、トガウイルス（例えば風疹）、フラビウイルス（例えばＨＣＶ）、及びコロナウイルス）、（−）ＲＮＡウイルス（例えばラブドウイルス（例えばＶＳＶ）、パラミクソウイルス（例えばＲＳＶ）、オルトミクソウイルス（例えばインフルエンザ）、ブンヤウイルス及びアレナウイルス）、ｄｓＤＮＡウイルス（例えばレオウイルス）、ＲＮＡ→ＤＮＡウイルス（即ちレトロウイルス、例えばＨＩＶ及びＨＴＬＶ）、及び所定のＤＮＡ→ＲＮＡウイルス（例えばＢ型肝炎））に由来する蛋白質において、１種以上のワクチン蛋白質中の１個以上の天然アミノ酸を重原子含有アミノ酸で置換することができる。
昆虫耐性蛋白質（例えばＣｒｙ蛋白質）、澱粉及び脂質産生酵素、植物及び昆虫毒素、毒素耐性蛋白質、マイコトキシン解毒蛋白質、植物成長酵素（例えばリブロース１，５−ビスリン酸カルボキシラーゼ／オキシゲナーゼ、「ＲＵＢＩＳＣＯ」）、リポキシゲナーゼ（ＬＯＸ）及びホスホエノールピルビン酸（ＰＥＰ）カルボキシラーゼ等の農業関連蛋白質も重原子含有アミノ酸又は他の非天然アミノ酸修飾に適切なターゲットである。
所定態様では、本発明の方法及び／又は組成物における該当蛋白質又はポリペプチド（又はその部分）は核酸によりコードされる。一般に、核酸は少なくとも１個のセレクターコドン、少なくとも２個のセレクターコドン、少なくとも３個のセレクターコドン、少なくとも４個のセレクターコドン、少なくとも５個のセレクターコドン、少なくとも６個のセレクターコドン、少なくとも７個のセレクターコドン、少なくとも８個のセレクターコドン、少なくとも９個のセレクターコドン、１０個以上のセレクターコドンを含む。
該当蛋白質又はポリペプチドをコードする遺伝子は例えば重原子含有アミノ酸を組込むために１個以上のセレクターコドンを付加するように本明細書の「突然変異誘発及び他の分子生物学技術」のセクションに記載する当業者に周知の方法を使用して突然変異誘発することができる。例えば、１個以上のセレクターコドンを付加するように該当蛋白質の核酸を突然変異誘発し、１個以上の重原子含有アミノ酸を挿入できるようにする。本発明は例えば少なくとも１個の重原子含有アミノ酸を組込んだ任意蛋白質のこのような任意変異体（例えば突然変異体、変形）を含む。同様に、本発明は対応する核酸、即ち１個以上の重原子含有アミノ酸をコードする１個以上のセレクターコドンをもつ任意核酸も含む。
重原子含有アミノ酸酸を組込んだ蛋白質を生産するためには、直交ｔＲＮＡ／ＲＳ対による重原子含有アミノ酸のｉｎ ｖｉｖｏ組込みに適した宿主細胞及び生物を使用することができる。直交ｔＲＮＡ、直交ｔＲＮＡシンテターゼ、及び修飾すべき蛋白質をコードするベクターを発現する１種以上のベクターで宿主細胞を遺伝子組換え（例えば形質転換、形質導入又はトランスフェクション）する。これらの成分の各々を同一ベクターに配置してもよいし、各々別々のベクターに配置してもよいし、２成分を第１のベクターに配置し、第３の成分を第２のベクターに配置してもよい。ベクターは例えばプラスミド、細菌、ウイルス、裸のポリヌクレオチド又はポリヌクレオチドコンジュゲートの形態とすることができる。
免疫反応性によるポリペプチドの定義
本発明のポリペプチドは（例えば本発明の翻訳系で合成される蛋白質の場合には重原子含有アミノ酸を含み、例えば新規シンテターゼの場合には標準アミノ酸の新規配列を含む）種々の新規ポリペプチド配列を提供するので、ポリペプチドは例えばイムノアッセイで認識することができる新規構造特徴も提供する。本発明のポリペプチドに特異的に結合する抗血清の作製及び前記抗血清と結合するポリペプチドも本発明の特徴の１つである。本明細書で使用する「抗体」なる用語は限定されないが、検体（抗原）と特異的に結合してこれを認識する１又は複数の免疫グロブリン遺伝子又はそのフラグメントにより実質的にコードされるポリペプチドを意味する。例えばポリクローナル、モノクローナル、キメラ、及び１本鎖抗体等が挙げられる。Ｆａｂフラグメントやファージディスプレイを含む発現ライブラリーにより生産されるフラグメント等の免疫グロブリンフラグメントも本明細書で使用する「抗体」なる用語に含まれる。抗体構造及び用語については、例えばＰａｕｌ（１９９９）Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，第４版，Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ参照。
イムノアッセイ用抗血清を作製するためには、免疫原性ポリペプチドの１種以上を本明細書に記載するように作製し、精製する。例えば、組換え蛋白質を組換え細胞で生産することができる。（マウスの仮想遺伝子一致により結果の再現性が高いのでこのアッセイで使用する）近交系マウスに標準マウス免疫プロトコールに従って標準アジュバント（例えばフロイントアジュバント）と共に免疫原性蛋白質を免疫する（抗体作製、イムノアッセイフォーマット及び特異的免疫反応性を測定するために使用可能な条件の標準解説については例えばＨａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ（１９８８）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ参照）。蛋白質、抗体、抗血清等に関するその他の詳細はＵＳＳＮ６０／４７９，９３１、６０／４６３，８６９、及び６０／４９６，５４８、発明の名称「真核遺伝コードの拡張（Ｅｘｐａｎｄｉｎｇ ｔｈｅ Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｃｏｄｅ）」；ＷＯ２００２／０８５９２３、発明の名称「非天然アミノ酸のインビボ組込み（Ｉｎ ｖｉｖｏ Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｕｎｎａｔｕｒａｌ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄｓ）」；特許出願、発明の名称「糖蛋白質合成（Ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）」、ＵＳＳＮ６０／４４１，４５０）」（出願日２００３年１月１６日）；及び国際出願ＰＣＴ／ＵＳ０３／４１３４６、発明の名称「蛋白質アレー（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｒｒａｙｓ）」（出願日２００３年１２月２２日）に記載されている。
ｔＲＮＡ及びＯ−ＲＳ及びＯ−ｔＲＮＡ／Ｏ−ＲＳ対の使用
本発明の組成物と本発明の方法により作製された組成物は場合により細胞に導入する。本発明のＯ−ｔＲＮＡ／Ｏ−ＲＳ対又は個々の成分をその後、宿主系の翻訳機構で使用することができ、その結果として、重原子含有アミノ酸は蛋白質に組込まれる。特許出願、発明の名称「非天然アミノ酸のインビボ組込み（Ｉｎ ｖｉｖｏ Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｕｎｎａｔｕｒａｌ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄｓ）」ＷＯ２００２／０８５９２３、発明者Ｓｃｈｕｌｔｚらはこのプロセスを記載しており、参考資料として本明細書に組込む。例えば、Ｏ−ｔＲＮＡ／Ｏ−ＲＳ対を宿主（例えば大腸菌）に導入すると、前記対はセレクターコドン（例えばアンバーナンセンスコドン）に応答して外部から増殖培地に添加することができる重原子含有アミノ酸のｉｎ ｖｉｖｏ蛋白質（例えば該当構造の任意蛋白質）組込みを誘導する。場合により、本発明の組成物はｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳系に導入してもよいし、ｉｎ ｖｉｖｏ系に導入してもよい。重原子含有アミノ酸を組込んだ蛋白質は蛋白質構造、機能等に関する研究を助長するために使用することもできる。
キット
キットも本発明の特徴である。例えば、特定位置に臭素化又はヨウ素化アミノ酸を組込んだ蛋白質を生産するためのキットが提供され、前記キットは細胞で機能し、セレクターコドンを認識する直交ｔＲＮＡと、直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼを含む細胞を１個以上の容器にパッケージングしたものである。直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼは天然チロシルアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（ＴｙｒＲＳ）のアミノ酸配列と少なくとも９０％一致しており、Ｍ．ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ ＴｙｒＲＳのＴｙｒ３２に対応する位置のロイシン、Ｍ．ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ ＴｙｒＲＳのＧｌｕ１０７に対応する位置のセリン又はグルタミン酸、Ｍ．ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ ＴｙｒＲＳのＡｓｐ１５８に対応する位置のプロリン、Ｍ．ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ ＴｙｒＲＳのＩｌｅ１５９に対応する位置のロイシン又はアルギニン及びＭ．ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ ＴｙｒＲＳのＬｅｕ１６２に対応する位置のグルタミン酸又はアルギニンから構成される群から選択される２個以上（例えば３個以上、４個以上、又は５個）のアミノ酸を含むアミノ酸配列を含む。例えば、Ｏ−ＲＳは配列番号３もしくは４のアミノ酸配列又はその保存変異体を含むことができる。１分類の態様では、キットは更に臭素化又はヨウ素化アミノ酸（例えばブロモＰｈｅ又はヨードＰｈｅ）を含む。別の分類の態様では、キットは更に蛋白質を生産するための説明書、適切な細胞増殖培地、対象蛋白質をコードするターゲット核酸を導入すると共にセレクターコドンを細胞に加えるための試薬、及び／又は同等物を含む。キット形態での生産に適したパッケージング材料（例えば容器等）と本発明の任意組成物、系又は装置を組み合わせることもできる。
蛋白質構造決定
上記のように、重原子含有アミノ酸（例えばヨードＰｈｅ又はブロモＰｈｅ）の効率的な部位特異的蛋白質組込みはＸ線結晶解析による蛋白質構造解析を容易にする。蛋白質の重原子修飾は例えば多重同形置換（ＭＩＲ）、単一同形置換（ＳＩＲ）、多波長異常分散（ＭＡＤ）、又は単波長異常分散（ＳＡＤ）法により位相決定を行うために一般に使用されている。例えば本発明の方法及び組成物を使用する重原子の部位特異的組込みは修飾部位と重原子種及び数の選択にフレキシビリティを提供する。本発明の方法及び組成物を使用する重原子組込みは原則的に任意蛋白質の構造決定を容易にするために使用できるが、メチオニン数が少ない蛋白質はセレノメチオニン組込みが困難であったり、他の初期位相決定方法では不十分であるため、このような蛋白質の場合や、シンクロトロンを利用できない場合に特に有利であると思われる。
従って、１分類の態様は蛋白質構造の決定方法を提供する。本方法では、直交ｔＲＮＡと、直交ｔＲＮＡを重原子含有アミノ酸で優先的にアミノアシル化する直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼを含む翻訳系で特定位置に重原子含有アミノ酸を組込んだ蛋白質を発現させることにより前記蛋白質を提供する。重原子含有アミノ酸を組込んだ蛋白質を結晶化させることにより、重原子含有蛋白質結晶を作製する。重原子含有蛋白質結晶から回折データを収集し、例えばＭＩＲ、ＳＩＲ、ＭＡＤ、ＳＡＤ、又はその組合せにより構造を決定するために使用する。
例えば、１好適分類の態様では、ＳＡＤフェージングを使用する。この分類の態様では、単波長で重原子含有蛋白質結晶からの回折データを収集する段階と、結晶中の重原子の存在に起因するフリーデル対間の異常差を測定する段階を含むプロセスにより蛋白質の構造を決定する。要約すると、１個以上の蛋白質結晶にＸ線ビームを照射することにより生じた多数の反射の強度を測定することにより回折データを収集する。各反射を指数ｈ，ｋ，及びｌで表す。一般に、フリーデル対（指数ｈ，ｋ，ｌ及び−ｈ，−ｋ，−ｌで表す反射の対）の強度は等しい。しかし、蛋白質結晶中に重原子が存在している場合にこの重原子の吸収端近傍の波長のＸ線を使用すると、重原子による異常散乱の結果、所定フリーデル対の強度に差が生じる。これらの異常差を使用して位相を計算することができ、測定強度と組合わせると、蛋白質構造モデルを当てはめることが可能な電子密度マップを計算することができる。
蛋白質は例えば本明細書に記載するようなｉｎ ｖｉｖｏ又はｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳系で発現させることができる。所定態様では、直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼは配列番号３もしくは配列番号４のアミノ酸配列又はその保存変異体を含む。同様に、直交ｔＲＮＡは配列番号５のポリヌクレオチド配列又はその保存変異体を含むことができる。
重原子含有アミノ酸は原則的に本明細書に記載する任意重原子含有アミノ酸とすることができる。例えば、重原子含有アミノ酸は臭素化又はヨウ素化アミノ酸（例えばＬ−２−ヨードフェニルアラニン、Ｌ−３−ヨードフェニルアラニン、Ｌ−２−ヨードチロシン、Ｌ−３−ヨードチロシン、Ｌ−２−ブロモフェニルアラニン、Ｌ−３−ブロモフェニルアラニン、Ｌ−２−ブロモチロシン、又はＬ−３−ブロモチロシン）とすることができる。１好適分類の態様では、臭素化又はヨウ素化アミノ酸はＬ−４−ブロモフェニルアラニン又はＬ−４−ヨードフェニルアラニンである。
回折データを収集する波長は原則的に簡便な任意波長とすることができる。例えば、ＣｕＫα波長１．５４１８Åの銅陰極型屋内発生装置を使用して簡便にデータを収集することができる。なお、この波長では臭素からの異常シグナルは弱いので、この波長で使用する重原子としては臭素よりもヨウ素のほうが好ましい。代替又は付加方法として、シンクロトロン又は他の波長可変放射線源からの各種波長の任意波長でデータを収集することができる。例えば、蛋白質に組込まれた特定重原子からの異常シグナルを最大化するか、蛋白質結晶の放射線損傷を最小限にするか、及び／又は同等目的に選択された波長で場合によりデータを収集する。
別の分類の態様では、ＭＡＤフェージングを使用する。この分類の態様では、２種以上の波長で重原子含有蛋白質結晶からの回折データを収集する段階と、異なる波長で収集したデータ間の分散差を測定する段階を含むプロセスにより蛋白質の構造を決定する。例えば、場合により２種の波長（例えば重原子の吸収曲線の変曲点と吸収端から離れた点の波長）で例えば放射線源としてシンクロトロンを使用してデータを収集する。
ＳＡＤ、ＭＩＲ、及びＭＡＤによるフェージングを含む構造決定技術は周知である。例えばＳｔｏｕｔ ａｎｄ Ｊｅｎｓｅｎ（１９８９）Ｘ−ｒａｙ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ：ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ ｇｕｉｄｅ，２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ Ｗｉｌｅｙ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ；Ｌａｄｄ ａｎｄ Ｐａｌｍｅｒ（１９９３）Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｂｙ Ｘ−ｒａｙ ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｙ，３ｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ；Ｂｌｕｎｄｅｌｌ ａｎｄ Ｊｏｈｎｓｏｎ（１９７６）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｙ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ；Ｇｌｕｓｋｅｒ ａｎｄ Ｔｒｕｅｂｌｏｏｄ（１９８５）Ｃｒｙｓｔａｌ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎａｌｙｓｉｓ：Ａ ｐｒｉｍｅｒ，２ｎｄ Ｅｄ．Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ；Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｔａｂｌｅｓ ｆｏｒ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｙ，Ｖｏｌ．Ｆ．Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｙ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ；ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ（２００２）Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｙ Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ；ＭｃＲｅｅ ａｎｄ Ｄａｖｉｄ（１９９９）Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｙ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ；Ｄｒｅｎｔｈ（１９９９）Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｘ−Ｒａｙ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｙ（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｔｅｘｔｓ ｉｎ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ参照。ＭＡＤフェージングも例えばＦａｎｃｈｏｎ ａｎｄ Ｈｅｎｄｒｉｃｋｓｏｎ（１９９１）Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｉｃ Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ，Ｖｏｌｕｍｅ ５ ＩＵＣｒ／Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓの１５章とＭｕｒｔｈｙ（１９９６）Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｉｃ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓの５章に記載されている。ＳＡＤフェージングの他の例は本明細書の実施例と、例えばＤａｕｔｅｒら（２０００）“Ｎｏｖｅｌ ａｐｐｒｏａｃｈ ｔｏ ｐｈａｓｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎｓ：ｄｅｒｉｖａｔｉｚａｔｉｏｎ ｂｙ ｓｈｏｒｔ ｃｒｙｏ−ｓｏａｋｉｎｇ ｗｉｔｈ ｈａｌｉｄｅｓ” Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔ．Ｄ５６：２３２−２３７；Ｄａｕｔｅｒ（２００２）“Ｎｅｗ ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ ｔｏ ｈｉｇｈ−ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ｐｈａｓｉｎｇ” Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｂｉｏｌ．１２：６７４−６７８；Ｃｈｅｎら（１９９１）“Ｃｒｙｓｔａｌ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ａ ｂｏｖｉｎｅ ｎｅｕｒｏｐｈｙｓｉｎ−ＩＩ ｄｉｐｅｐｔｉｄｅ ｃｏｍｐｌｅｘ ａｔ ２．８ Å ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｓｉｎｇｌｅ−ｗａｖｅｌｅｎｇｔｈ ａｎｏｍａｌｏｕｓ ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ ｓｉｇｎａｌ ｏｆ ａｎ ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ ｉｏｄｉｎｅ ａｔｏｍ” Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８８：４２４０−４２４４；及びＧａｖｉｒａら（２００２）“Ａｂ ｉｎｉｔｉｏ ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｉｃ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｉｎｓｕｌｉｎ ｆｒｏｍ ｐｒｏｔｅｉｎ ｔｏ ｅｌｅｃｔｒｏｎ ｄｅｎｓｉｔｙ ｗｉｔｈｏｕｔ ｃｒｙｓｔａｌ ｈａｎｄｌｉｎｇ” Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔ．Ｄ５８：１１４７−１１５４に記載されている。
更に、データ収集、位相決定、モデル構築及び精密化等を容易にするための各種プログラムが公共入手可能である。例としては限定されないが、ＨＫＬ２０００パッケージ（Ｏｔｗｉｎｏｗｓｋｉ ａｎｄ Ｍｉｎｏｒ（１９９７）“Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ ｏｆ Ｘ−ｒａｙ Ｄｉｆｆｒａｃｔｉｏｎ Ｄａｔａ Ｃｏｌｌｅｃｔｅｄ ｉｎ Ｏｓｃｉｌｌａｔｉｏｎ Ｍｏｄｅ” Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ２７６：３０７−３２６）、ＣＣＰ４パッケージ（Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｐｒｏｊｅｃｔ（１９９４）“Ｔｈｅ ＣＣＰ４ ｓｕｉｔｅ：ｐｒｏｇｒａｍｓ ｆｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｙ” Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ Ｄ ５０：７６０−７６３）、ＳＯＬＶＥとＲＥＳＯＬＶＥ（Ｔｅｒｗｉｌｌｉｇｅｒ ａｎｄ Ｂｅｒｅｎｄｚｅｎ（１９９９）Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ Ｄ ５５（Ｐｔ ４）：８４９−８６１）、ＳＨＥＬＸＳとＳＨＥＬＸＤ（Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ ａｎｄ Ｓｈｅｌｄｒｉｃｋ（２００２）“Ｓｕｂｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｓｏｌｕｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ＳＨＥＬＸＤ” Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ Ｄ Ｂｉｏｌ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ ５８：１７７２−１７７９）、Ｒｅｆｍａｃ５（Ｍｕｒｓｈｕｄｏｖら（１９９７）“Ｒｅｆｉｎｅｍｅｎｔ ｏｆ Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ｂｙ ｔｈｅ Ｍａｘｉｍｕｍ−Ｌｉｋｅｌｉｈｏｏｄ Ｍｅｔｈｏｄ” Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ Ｄ ５３：２４０−２５５）、及びＯ（Ｊｏｎｅｓら（１９９１）“Ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ ｂｕｉｌｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ｍｏｄｅｌｓ ｉｎ ｅｌｅｃｔｒｏｎ ｄｅｎｓｉｔｙ ｍａｐｓ ａｎｄ ｔｈｅ ｌｏｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｅｒｒｏｒｓ ｉｎ ｔｈｅｓｅ ｍｏｄｅｌｓ” Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ Ａ ４７（ Ｐｔ ２）：１１０−１１９）が挙げられる。
結晶化前に一般に例えば天然源、ｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳系、該当蛋白質を過剰発現する細胞（例えば細菌、酵母等）（例えばＡｕｓｕｂｅｌ、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、及びＢｅｒｇｅｒ（いずれも前出）参照）等から当分野で周知の多数の方法（例えば硫安又はエタノール沈殿、遠心分離、酸又は塩基抽出、カラムクラマトグラフィー、アフィニティーカラムクラマトグラフィー、アニオン又はカチオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、ゲル濾過、疎水性相互作用クロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、レクチンクロマトグラフィー、ゲル電気泳動等）の任意のものにより蛋白質を精製する。
本明細書に記載する他の方法に加え、各種蛋白質精製法が当分野で周知であり、例えばＲ．Ｓｃｏｐｅｓ，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎ．Ｙ．（１９８２）；Ｄｅｕｔｓｃｈｅｒ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ Ｖｏｌ．１８２：Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．Ｎ．Ｙ．（１９９０）；Ｓａｎｄａｎａ（１９９７）Ｂｉｏｓｅｐａｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．；Ｂｏｌｌａｇら（１９９６）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ，２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，ＮＹ；Ｗａｌｋｅｒ（１９９６）Ｔｈｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ Ｈａｎｄｂｏｏｋ Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，ＮＪ，Ｈａｒｒｉｓ ａｎｄ Ａｎｇａｌ（１９９０）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ ａｔ Ｏｘｆｏｒｄ，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄ；Ｈａｒｒｉｓ ａｎｄ Ａｎｇａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ ａｔ Ｏｘｆｏｒｄ，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄ；Ｓｃｏｐｅｓ（１９９３）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ３ｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｖｅｒｌａｇ，ＮＹ；Ｊａｎｓｏｎ ａｎｄ Ｒｙｄｅｎ（１９９８）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ，Ｈｉｇｈ Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ，ＮＹ；及びＷａｌｋｅｒ（１９９８）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｏｎ ＣＤ−ＲＯＭ Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，ＮＪ；並びにその引用文献に記載されている方法が挙げられる。
蛋白質が細胞内合成、単離又は精製中に変性する場合には蛋白質の活性コンホメーションを得るために必要に応じて周知蛋白質リフォールディング技術を使用することができる。蛋白質の還元、変性及び再生方法も当業者に周知である（上記文献に加え、Ｄｅｂｉｎｓｋｉら（１９９３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６８：１４０６５−１４０７０；Ｋｒｅｉｔｍａｎ ａｎｄ Ｐａｓｔａｎ（１９９３）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．Ｃｈｅｍ．，４：５８１−５８５；及びＢｕｃｈｎｅｒら，（１９９２）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２０５：２６３−２７０参照）。
ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は場合によりポリペプチドの精製を助長するか及び／又は融合ポリペプチドと粒子、固体支持体又は別の試薬の結合を助長するモジュール（例えばドメイン又はタグ）をコードする配列とインフレーム融合することができる。このようなモジュールとしては限定されないが、固相化金属上の精製及び／又は前記金属との結合を可能にするヒスチジン−トリプトファンモジュール（例えばヘキサヒスチジンタグ）等の金属キレート化ペプチド、グルタチオンと結合する配列（例えばＧＳＴ）、ヘマグルチニン（ＨＡ）タグ（インフルエンザヘマグルチニン蛋白質に由来するエピトープに対応；Ｗｉｌｓｏｎ，Ｉ．ら（１９８４）Ｃｅｌｌ ３７：７６７）、マルトース結合蛋白質配列、ＦＬＡＧＳ伸長／アフィニティー精製システムで使用されるＦＬＡＧエピトープ（Ｉｍｍｕｎｅｘ Ｃｏｒｐ，Ｓｅａｔｔｌｅ，ＷＡ）等が挙げられる。プロテアーゼで開裂可能なポリペプチドリンカー配列を精製ドメインと本発明の配列の間に挿入すると、ポリペプチドの精製後、又は精製中にモジュールを除去するのに有用である。
回折品質結晶を得るために蛋白質を結晶化する条件は当分野で公知の技術を使用して経験的に決定することができる。例えばＭｃＰｈｅｒｓｏｎ（１９９９）Ｃｒｙｓｔａｌｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｂｅｒｇｆｏｒｓ（１９９９）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｒｙｓｔａｌｌｉｚａｔｉｏｎ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｌｉｎｅ、及びＭｕｌｌｉｎ（１９９３）Ｃｒｙｓｔａｌｌｉｚａｔｉｏｎ Ｂｕｔｔｅｒｗｏｔｈ−Ｈｅｉｎｅｍａｎｎ参照。
当然のことながら、本明細書に記載する実施例と態様は例証の目的に過ぎず、これらの記載に鑑み、種々の変形又は変更が当業者に示唆され、このような変形又は変更も本願の精神と範囲に含むものとする。従って、以下の実施例は特許請求の範囲に記載する発明を例証するものであり、これを限定するものではない
直交シンテターゼ／ｔＲＮＡ対の作製
アンバーＴＡＧコドンに応答してヨードＰｈｅ（図１Ａ）を蛋白質に選択的に組込むために、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ ｔＲＮＡＴｙｒ ＣＵＡ−ＴｙｒＲＳ対を作製し、使用した。このｔＲＮＡ−シンテターゼ対は大腸菌で全ｔＲＮＡ−シンテターゼ対に直交であり、即ちＭ．ｊａｎｎａｓｃｈｉｉチロシルｔＲＮＡもシンテターゼも大腸菌で内在ｔＲＮＡ又はシンテターゼと交差反応しない。この条件により、ヨードＰｈｅを高い翻訳忠実度で蛋白質に組込むことができる。ＴｙｒＲＳシンテターゼがヨードＰｈｅを選択的に認識する特異性を改変するために、相同Ｂ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ＴｙｒＲＳ−チロシルアデニル酸複合体の結晶構造に基づいて、ＴｙｒＲＳのチロシン結合ポケットの５個の残基（Ｔｙｒ３２，Ｇｌｕ１０７，Ａｓｐ１５８，Ｉｌｅ１５９及びＬｅｕ１６２）（図１Ｂ）をランダムに抽出することにより、Ｍ．ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ ＴｙｒＲＳ突然変異体のライブラリーを作製した（Ｂｒｉｃｋら（１９８９）Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｔｙｒｏｓｙｌ−ｔＲＮＡ ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ ｒｅｆｉｎｅｄ ａｔ ２．３ Ａ ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ．Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｅｎｚｙｍｅ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｔｙｒｏｓｙｌ ａｄｅｎｙｌａｔｅ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ．Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２０８：８３−９８）。次に突然変異体ＴｙｒＲＳライブラリーでポジティブ選択とネガティブ選択を交互に行った。ポジティブ選択はヨードＰｈｅと直交Ｍ．ｊａｎｎａｓｃｈｉｉチロシルｔＲＮＡ−シンテターゼ対の存在下でのＩ型クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）遺伝子の許容部位（Ａｓｐ１１２）におけるアンバー突然変異の抑圧に基づく。ネガティブ選択はヨードＰｈｅの不在下での毒性バルナーゼ遺伝子の許容部位（Ｇｌｎ２，Ａｓｐ４４及びＧｌｙ６５）におけるアンバー突然変異の抑圧に基づく。アンバーコドンに応答してヨードＰｈｅを効率的に組込み、内在アミノ酸は組込まないシンテターゼのみが両者選択後に生存することができる。
ポジティブ選択とネガティブ選択を交互に５回行った後に、ヨードＰｈｅの存在下で１２０μｇ／ｍＬクロラムフェニコール中で存在するが、ヨードＰｈｅの不在下では２０μｇ／ｍＬクロラムフェニコール中で死滅する１個のシンテターゼ変異体が同定された。この突然変異体シンテターゼを使用してヨードＰｈｅの存在下で（Ｃ末端Ｈｉｓ６タグ付き）Ｚドメイン蛋白質（Ｗａｎｇら（２００３）“Ａｄｄｉｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｋｅｔｏ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｇｒｏｕｐ ｔｏ ｔｈｅ ｇｅｎｅｔｉｃ ｃｏｄｅ ｏｆ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ” Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ １００：５６−６１）のＴｙｒ７→ＴＡＧ突然変異体を抑圧すると、全長蛋白質が生成された（図１Ｃ）。ヨードＰｈｅ又は突然変異体シンテターゼの不在下では、Ｚドメイン蛋白質はＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で銀染色により検出されなかった（図１Ｃ）。ヨードＰｈｅの選択的組込みを更にエレクトロスプレーイオン化フーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴質量分析（ＦＴ−ＩＣＲ ＭＳ）により検証した。最初のメチオニンをもたないヨードＰｈｅ置換Ｚドメイン蛋白質では、モノアイソトピック質量の計算値と実測値は夫々７９０２．７２０Ｄａと７９０２．７２８Ｄａである。ヨードＰｈｅ置換Ｚドメイン蛋白質の収量は最少培地中３．８ｍｇ／Ｌであった。比較のために、突然変異体ＴｙｒＲＳの代わりに野生型Ｍ．ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ ＴｙｒＲＳを発現させた場合（チロシンの蛋白質組込み）のＺドメイン蛋白質の収量は４．６ｍｇ／Ｌであった。ヨードＰｈｅ特異的シンテターゼ（配列番号３，対応するヌクレオチド配列は配列番号１；図４Ａ）は以下の突然変異：Ｔｙｒ３２Ｌｅｕ，Ｇｌｕ１０７Ｓｅｒ，Ａｓｐ１５８Ｐｒｏ，Ｉｌｅ１５９Ｌｅｕ及びＬｅｕ１６２Ｇｌｕをもつ。Ｔｙｒ３２→Ｌｅｕ３２及びＡｓｐ１５８→Ｐｒｏ１５８突然変異はチロシンのヒドロキシル基との水素結合を破壊し、ヨードＰｈｅを受容する疎水性ポケットを形成すると思われる。これらの結果から、本発明者らはヨードＰｈｅを蛋白質に大腸菌部位特異的且つ定量的に組込むことができると結論する。
なお、配列表に配列番号３として示すこのヨードＰｈｅ特異的シンテターゼはＯ−ｔＲＮＡ（図５）にブロモＰｈｅも特異的に負荷することができる。Ｏ−ｔＲＮＡにヨードＰｈｅ又はブロモＰｈｅを特異的に負荷することができる別のシンテターゼの配列を図４Ｂと配列表に配列番号４として示す（対応するヌクレオチド配列は配列番号２）。
ＳＡＤフェージングへのヨードＰｈｅ組込みの応用
実施例１に記載したシンテターゼはアンバーＴＡＧコドンに応答してｐ−ヨード−Ｌ−フェニルアラニン（ヨードＰｈｅ）を蛋白質に効率的且つ部位特異的に組込むために使用することができる。異常散乱ヨウ素原子の選択的蛋白質導入は屋内Ｘ線源でのＳＡＤ実験を容易にすると思われる。これを実証するために、バクテリオファージＴ４リゾチームのＰｈｅ１５３→ヨードＰｈｅ突然変異体を作製し、システインとメチオニンによる同等実験よりも著しく少ないデータを使用してその結晶構造を決定することに成功した。ヨードＰｈｅ残基は蛋白質の疎水性コアに存在するが、蛋白質構造に有意程度の摂動を生じなかった。前記及び他の重原子含有アミノ酸を蛋白質に選択的に導入することが可能になると、蛋白質の構造研究は更に容易になる。
ヨードＰｈｅ組込みを蛋白質結晶解析でＳＡＤフェージングに応用できるかどうかを検討するために、バクテリオファージＴ４リゾチームをモデルシステムとして使用した。従来報告されているように蛋白質の安定性を強化するためにＴ４リゾチームのＣｙｓ５４とＣｙｓ９７をＴｈｒとＡｌａに突然変異させた（Ｅｒｉｋｓｓｏｎら（１９９３）“Ｓｉｍｉｌａｒ ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔｓ ｏｆ Ｌｅｕ９９ ａｎｄ Ｐｈｅ１５３ ｗｉｔｈｉｎ ｔｈｅ ｃｏｒｅ ｏｆ Ｔ４ ｌｙｓｏｚｙｍｅ ｈａｖｅ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ａｎｄ ｔｈｅｒｍｏｄｙｎａｍｉｃ ｃｏｎｓｅｑｕｅｎｃｅｓ” Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２２９：７４７−７６９）。Ｔ４リゾチームの大きなローブの疎水性コアの残基であるＴ４リゾチームのＰｈｅ１５３に対応するコドンをＴＡＧに突然変異させた。次に進化型直交シンテターゼ−ｔＲＮＡ対を使用して大腸菌でアンバーコドンをヨードＰｈｅで抑圧した。発現された突然変異体Ｔ４リゾチームをカチオン交換クロマトグラフィーとサイズ排除クロマトグラフィーにより精製した。精製後の収量は最少培地中５．７ｍｇ／Ｌであった。Ｔ４リゾチームとその突然変異体の結晶化について従来報告されていると同一の条件下で結晶を成長させた（Ｅｒｉｋｓｓｏｎら（１９９３）“Ｓｉｍｉｌａｒ ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔｓ ｏｆ Ｌｅｕ９９ ａｎｄ Ｐｈｅ１５３ ｗｉｔｈｉｎ ｔｈｅ ｃｏｒｅ ｏｆ Ｔ４ ｌｙｓｏｚｙｍｅ ｈａｖｅ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ａｎｄ ｔｈｅｒｍｏｄｙｎａｍｉｃ ｃｏｎｓｅｑｕｅｎｃｅｓ” Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２２９：７４７−７６９）。
屋内Ｘ線発生装置でＣｕＫα波長（１．５４１８Å）にて収集したデータからＴ４リゾチームの構造を決定した。同一画像又は時間的に近接してフリーデル対を収集しようとせずに、全体で３６０°のデータを１００°Ｋで最大分解能２．０Åまで収集した。次に、構造決定に必要な最少データ量を設定するために、異なる値のデータ冗長度に相当する６個の異なる振動範囲にデータセットを分割した（表１）。予想通り、Ｐｈｅの代わりにヨードＰｈｅを組込むと、Ｔ４リゾチームの異常シグナル（δｆ”）は有意に増加する。バイフット対の平均比（＜｜ΔＦ｜＞／＜Ｆ＞）は全データセットで約３％であり（表１）、ＨｅｎｄｒｉｃｋｓｏｎとＴｅｅｔｅｒの方法（“Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｔｈｅ ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｒａｍｂｉｎ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ ｄｉｒｅｃｔｌｙ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ａｎｏｍａｌｏｕｓ ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ ｏｆ ｓｕｌｆｕｒ” １９８１，Ｎａｔｕｒｅ ２９０：１０７−１１３）を使用して計算した４％に近似した。これに対して、１３０９個の原子と７個の硫黄原子をもつ天然Ｔ４リゾチームの計算値は０．９％であった。ヨウ素ソーキング法（Ｄａｕｔｅｒら（２０００）“Ｎｏｖｅｌ ａｐｐｒｏａｃｈ ｔｏ ｐｈａｓｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎｓ：ｄｅｒｉｖａｔｉｚａｔｉｏｎ ｂｙ ｓｈｏｒｔ ｃｒｙｏ−ｓｏａｋｉｎｇ ｗｉｔｈ ｈａｌｉｄｅｓ” Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ Ｄ ５６（ Ｐｔ ２）：２３２−２３７及びＮａｇｅｍら（２００１）“Ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｒｙｓｔａｌ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｓｏｌｕｔｉｏｎ ｂｙ ｆａｓｔ ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｎｅｇａｔｉｖｅｌｙ ａｎｄ ｐｏｓｉｔｉｖｅｌｙ ｃｈａｒｇｅｄ ａｎｏｍａｌｏｕｓ ｓｃａｔｔｅｒｅｒｓ” Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ Ｄ ５７：９９６−１００２）等の他の技術では多数の低占有率部位がサブ構造解析を混乱させる恐れがあるが、蛋白質の疎水性コアの内側に一定数のヨウ素を配置することが可能になると、シグナルの強化に加えてこれらの技術よりも著しく有利である。
位相決定の前にパターソンマップと異常差フーリエマップを計算し、異常シグナルを特性決定した。全データセットでパターソンマップのハーカー面に４．４（９０°）を上回る平均冗長度でヨウ素原子の自己ベクトルが明白に認められる（図２Ａ）。冗長度が９．０（１８０°のデータ）を上回ると、付加塩化物イオンの自己ピークが３σレベルで明白になるが、有意硫黄ベクトルは認められなかった。Ｔ４リゾチーム構造（ＰＤＢコード１Ｌ６３；Ｎｉｃｈｏｌｓｏｎら（１９９１）“Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ｂｅｔｗｅｅｎ ｃｈａｒｇｅｄ ｓｉｄｅ ｃｈａｉｎｓ ａｎｄ ｔｈｅ ａｌｐｈａ−ｈｅｌｉｘ ｄｉｐｏｌｅ ｕｓｉｎｇ ｄｅｓｉｇｎｅｄ ｔｈｅｒｍｏｓｔａｂｌｅ ｍｕｔａｎｔｓ ｏｆ ｐｈａｇｅ Ｔ４ ｌｙｓｏｚｙｍｅ” Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３０：９８１６−９８２８）に由来する位相から計算した異常差フーリエマップはヨウ素だけでなく蛋白質に存在する全５個のメチオニン硫黄、３個の推定塩素イオン、及び結晶化条件に含まれる２−ヒドロキシエチルジスルフィド分子についても全データセットで有意密度を示す（図２Ｂ）。
ＳＯＬＶＥ（Ｔｅｒｗｉｌｌｉｇｅｒ ａｎｄ Ｂｅｒｅｎｄｚｅｎ（１９９９）“Ａｕｔｏｍａｔｅｄ ＭＡＤ ａｎｄ ＭＩＲ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｓｏｌｕｔｉｏｎ” Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ Ｄ ５５（ Ｐｔ ４）：８４９−８６１）を使用してヨウ素位置を決定すると共に初期位相を計算した処、平均冗長度が６．８（１３５°のデータ）を上回るデータセットのみから適切な出発位相が得られた（図３Ｂ）。＜ΔＦ＞／＜σΔＦ＞２．６に対応するこの冗長度はサブ構造決定と位相誘導に必要な絶対最小シグナルに近似すると思われ、この空間群（Ｐ３２２１）では完全な天然データセット（６０°）に収集するデータ量又はインバースビーム実験に必要なデータ量の２倍を僅かに上回る量に相当する。付加冗長度、即ち異常シグナルの結果、主に良好な出発位相の生成により、収束が加速し、ＲＥＳＯＬＶＥ（Ｔｅｒｗｉｌｌｉｇｅｒ（２００１）“Ｍａｘｉｍｕｍ−ｌｉｋｅｌｉｈｏｏｄ ｄｅｎｓｉｔｙ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｕｓｉｎｇ ｐａｔｔｅｒｎ ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｏｆ ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｍｏｔｉｆｓ” Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ Ｄ ５７：１７５５−１７６２）の自動構築アルゴリズムで配置される残基が増加する。
ヨウ素化Ｔ４リゾチームの構造はバイローブ混合α／βフォールドであるカノニカルウイルスリゾチーム構造（図３Ａ及びＢ；Ｎｉｃｈｏｌｓｏｎら（１９９１）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３０：９８１６−９８２８及びＷｅａｖｅｒ ａｎｄ Ｍａｔｔｈｅｗｓ（１９８７）“Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ Ｔ４ ｌｙｓｏｚｙｍｅ ｒｅｆｉｎｅｄ ａｔ １．７ Ａ ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ” Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ １９３：１８９−１９９）に一致する。構造のローブ１は完全にαヘリカルであるが、ローブ２は３個のαヘリックス間に挿入されたアンチパラレルβシートから構成される。天然構造と変異構造の唯一の相異はローブ１の中心の１５３位にヨードＰｈｅが組込まれている点である（図３Ａ）。疎水性コアの内側の残基に予想された通り、ヨードＰｈｅは完全に埋没しており、外部溶媒と接触しない（Ｔｕｎｎｅｌｌｅｒで計算）。ヨードＰｈｅ残基は天然Ｐｈｅ１５３に対してごく僅かに歪んでおり、ｃｈｉ１角度は恐らく大きなヨウ素原子を受容するために天然構造に対して２３°回転している（図３Ｃ）。蛋白質の他の全残基は天然構造に比較して殆ど変わっていない。ヨウ素原子の周囲の１０Å球における２６４個の共通原子は二乗平均平方根偏差（ｒｍｓｄ）が１．０８Åであるが、構造中の１６４個の整列したＣα原子のｒｍｓｄは０．２８２Åである。これに結晶の同形性を加味すると、ヨウ素の組込みは構造に全く摂動を生じないと思われる（図３Ｃ）。
約言すると、これらの例はＳＡＤフェージングのためのヨウ素含有蛋白質製造の新規アプローチに関する。ヨウ素原子を蛋白質に部位特異的且つ定量的に導入することにより現行方法の欠点が解消される。１６４アミノ酸残基の蛋白質であるＴ４リゾチームでは、ＳＡＤフェージングを実施し、屋内Ｘ線源で構造を解析するには１カ所のヨードＰｈｅ置換で十分であった。更に、ヨウ素原子は蛋白質構造に摂動を生じなかった。異常散乱子として硫黄を使用する対応実験よりも著しく少ないデータしか必要としなかった。このアプローチはアンバーコドンに応答して２個以上のヨードＰｈｅを蛋白質に導入するためにも使用できるので、そのＳＡＤフェージング応用は蛋白質サイズに制限されない。メチオニン残基を殆ど又は全く含まない蛋白質にはＳｅＭｅｔ（セレノメチオニン）修飾法を適用できないが、この技術はこのような蛋白質にも有用である。最後に、この方法は高等生物にも適用可能である。実際に、Ｓａｋａｍｏｔｏら（２００２）“Ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ ｏｆ ａｎ ｕｎｎａｔｕｒａｌ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｉｎｔｏ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｉｎ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌｓ” Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ３０：４６９２−４６９９とＣｈｉｎら（２００３）“Ａｎ ｅｘｐａｎｄｅｄ ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ ｇｅｎｅｔｉｃ ｃｏｄｅ” Ｓｃｉｅｎｃｅ ３０１：９６４−９６７は哺乳動物細胞と酵母でアンバーコドンに応答して３−ヨード−Ｌ−チロシンとｐ−ヨード−Ｌ−フェニルアラニンを蛋白質に組込むことができることを示している。
モデル蛋白質は直交ｔＲＮＡシステムを使用してヨードＰｈｅを組込むが、本発明はヨードＰｈｅの使用に限定されない。本明細書に教示する蛋白質結晶構造決定用組成物及び方法は非天然アミノ酸に組込まれた各種重原子を使用することができる。当分野で公知のこの目的に適した任意重原子を非天然アミノ酸に組込むことができる。更に、これらの組成物及び方法で使用される非天然アミノ酸は重原子を組込んだ蛋白質のｉｎ ｖｉｖｏ合成用としてフェニルアラニン構造に限定されない。
ヨードＰｈｅ置換Ｔ４リゾチームの発現及び精製
プラスミドｐＴ４Ｌ１５３ＴＡＧを使用してバクテリオファージＴ５プロモーターとｔ０ターミネーターの制御下でＰｈｅ１５３→ＴＡＧ突然変異体システインフリーＴ４リゾチームを発現させ、ｌｐｐプロモーターとｒｒｎＣターミネーターの制御下でｔＲＮＡＴｙｒ ＣＵＡ遺伝子を発現させた。プラスミドｐＢＫ−ヨードＰｈｅＲＳは構成的大腸菌ＧｌｎＲＳプロモーター及びターミネーターの制御下でヨードＰｈｅ特異的ｔＲＮＡアミノアシルシンテターゼをコードした。１％グリセロールと０．３ｍＭロイシンを含有する最少培地（ＧＭＭＬ培地）に５０μｇ／ｍＬカナマイシン、３４μｇ／ｍＬクロラムフェニコール、及び１．０ｍＭ ｐ−ヨード−Ｌ−フェニルアラニンを添加し、ｐＴ４Ｌ１５３ＴＡＧとｐＢＫ−ヨードＰｈｅＲＳで同時形質転換したエレクトロコンピテントＢＬ２１（ＤＥ３）細胞を３７℃で増殖させた。細胞がＯＤ６００＝０．５に達したら、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシドを最終濃度１ｍＭまで添加して蛋白質発現を誘導した。細胞を更に８時間３０℃で増殖させ、ペレット化し、溶解用緩衝液［３０ｍＭ Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ，ｐＨ７．６，５０ｍＬ溶液当たりＣｏｍｐｌｅｔｅ（プロテアーゼインヒビターカクテル錠，Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ）１錠］２８ｍＬに再懸濁した。細胞を音波処理により溶解させ、再びペレット化した。次に、３０ｍＭ Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ，ｐＨ７．６で予め平衡化しておいたカチオン交換カラム（Ｍｏｎｏ Ｓ ＨＲ １０／１０カラム，Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）に上清をアプライした。蛋白質を０→０．２８Ｍ ＮａＣｌの直線勾配で溶出させた。ピークフラクションをＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。０．２５Ｍ ＮａＣｌで溶出した主ピークからのフラクションをプールし、ゲル濾過カラム（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ７５ ＨＲ １０／３０カラム，Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）にアプライした。蛋白質を２５ｍＭ Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ，１００ｍＭ ＮａＣｌ，ｐＨ７．６で溶出させた。最終精製Ｔ４リゾチームを１００ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４，０．５５Ｍ ＮａＣｌ，ｐＨ６．７で透析した後、結晶化に備えて２５ｍｇ／ｍｌまで濃縮した。蛋白質濃度をブラットフォードアッセイ（ＢＣＡキット，Ｂｉｏｒａｄ）により測定した。
ヨードＰｈｅ置換Ｔ４リゾチームの結晶化
他のＴ４リゾチーム突然変異体について記載されている条件と同様の条件下で液滴蒸気拡散法を使用して突然変異体Ｔ４リゾチームを結晶化した（Ｅｒｉｋｓｓｏｎら（１９９３）Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２２９：７４７−７６９）。結晶化溶液は２．０−２．２Ｍ水性リン酸ナトリウム／カリウム緩衝液（ｐＨ６．７−７．１）に１５ｍＭヒドロキシエチルジスルフィドを添加した。２５ｍｇ／ｍｌ蛋白質溶液１μｌをシラン処理カバースリップ上で結晶化溶液１μｌと混合し、カバースリップを裏返し、結晶化溶液０．５ｍｌを入れたレザバーの上に置いた。４℃で２週間以内に結晶が成長した。データ収集まで凍結防止剤溶液（２．３Ｍリン酸ナトリウム／カリウム緩衝液，０．２５Ｍ ＮａＣｌ，２５％グリセロール）に浸漬し、１００°Ｋまで凍結した。
データ収集
１００°ＫでＯｓｍｉｃミラーとＲＡＸＩＳＩＶ＋＋イメージングプレートシステムを搭載した標準屋内回転型ＲＵ３００ Ｘ線発生装置（Ｒｉｇａｋｕ／ＭＳＣ）でＣｕＫα波長１．５４１８Åにてデータを収集した。結晶をランダムな向きにマウントし、同一画像でバイフット対を収集しようとせずに、１フレーム当たり５分間の照射時間を使用し、振動角０．５°で合計３６０°回転してデータを収集した。最大分解能２．０Åまでデータを収集し、ＨＫＬ２０００パッケージで縮小及びスケーリングした（Ｏｔｗｉｎｏｗｓｋｉ ａｎｄ Ｍｉｎｏｒ（１９９７）“Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ ｏｆ Ｘ−ｒａｙ Ｄｉｆｆｒａｃｔｉｏｎ Ｄａｔａ Ｃｏｌｌｅｃｔｅｄ ｉｎ Ｏｓｃｉｌｌａｔｉｏｎ Ｍｏｄｅ” Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ２７６：３０７−３２６）。結晶は三方晶系空間群Ｐ３２２１に属し、標準Ｔ４リゾチーム結晶と同形である（Ｎｉｃｈｏｌｓｏｎら（１９９１）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３０：９８１６−９８２８）（表１）。サブ構造の決定と初期位相の誘導に必要な最少データを決定するために、３６０、１８０、１４５、９０、６０及び４５°の回転を構成する６個の異なるセットにデータを分割し、その統計を表１に示す。Ｍｏｓｆｌｍのストラテジーオプションを使用してデータセットの最適完全性を計算した（Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｐｒｏｊｅｃｔ（１９９４）“Ｔｈｅ ＣＣＰ４ ｓｕｉｔｅ：ｐｒｏｇｒａｍｓ ｆｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｙ” Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ Ｄ ５０：７６０−７６３）。ＣＣＰ４パッケージを使用して更に結晶解析処理を実施した（Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｐｒｏｊｅｃｔ（１９９４）Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ Ｄ ５０：７６０−７６３）。
構造解析及び精密化
データの標準ＳＡＤフェージングスクリプトとローカルスケーリングを使用してＳＯＬＶＥ（Ｔｅｒｗｉｌｌｉｇｅｒ ａｎｄ Ｂｅｒｅｎｄｚｅｎ（１９９９）Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ Ｄ ５５（ Ｐｔ ４）：８４９−８６１）により初期位相の全サブ構造解析及び決定を行った。その後、溶媒含量５０％でＲＥＳＯＬＶＥ（Ｔｅｒｗｉｌｌｉｇｅｒ ａｎｄ Ｂｅｒｅｎｄｚｅｎ（１９９９）Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ Ｄ ５５（Ｐｔ ４）：８４９−８６１）を使用して溶媒平滑化と自動構築を行った。ＳＯＬＶＥでヨウ素位置を決定できなかった３個のデータセット（４５，６０，９０°）についてＳＨＥＬＸＳとＳＨＥＬＸＤ（Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ ａｎｄ Ｓｈｅｌｄｒｉｃｋ（２００２）“Ｓｕｂｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｓｏｌｕｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ＳＨＥＬＸＤ” Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ Ｄ Ｂｉｏｌ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ ５８：１７７２−１７７９）を試みたが、やはり決定できなかった。ＰＲＯＧＲＧ（ｖａｎ Ａａｌｔｅｎら（１９９６）“ＰＲＯＤＲＧ，ａ ｐｒｏｇｒａｍ ｆｏｒ ｇｅｎｅｒａｔｉｎｇ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｔｏｐｏｌｏｇｉｅｓ ａｎｄ ｕｎｉｑｕｅ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｄｅｓｃｒｉｐｔｏｒｓ ｆｒｏｍ ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅｓ ｏｆ ｓｍａｌｌ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ” Ｊ Ｃｏｍｐｕｔ Ａｉｄｅｄ Ｍｏｌ Ｄｅｓ １０：２５５−２６２）とＯ（Ｊｏｎｅｓら（１９９１）“Ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ ｂｕｉｌｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ｍｏｄｅｌｓ ｉｎ ｅｌｅｃｔｒｏｎ ｄｅｎｓｉｔｙ ｍａｐｓ ａｎｄ ｔｈｅ ｌｏｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｅｒｒｏｒｓ ｉｎ ｔｈｅｓｅ ｍｏｄｅｌｓ” Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ Ａ ４７（Ｐｔ ２）：１１０−１１９）により作成したｐ−ヨード−Ｌ−フェニルアラニン用パラメーターファイルを組込んだＲｅｆｍａｃ５（Ｍｕｒｓｈｕｄｏｖら（１９９７）“Ｒｅｆｉｎｅｍｅｎｔ ｏｆ Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ｂｙ ｔｈｅ Ｍａｘｉｍｕｍ−Ｌｉｋｅｌｉｈｏｏｄ Ｍｅｔｈｏｄ” Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ Ｄ ５３：２４０−２５５）を使用して３０．０〜２．０Åの全データでモデルの精密化と再構築を実施した。ＡＲＰ／ＷＡＲＰパッケージ（Ｌａｍｚｉｎ ａｎｄ Ｗｉｌｓｏｎ（１９９３）“Ａｕｔｏｍａｔｅｄ ｒｅｆｉｎｅｍｅｎｔ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｍｏｄｅｌｓ” Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ Ｄ ４９：１２９−１４７）を使用して自動水モデル構築を実施した。その後、水の異常差パターソンマップと低いＢファクターの検出に基づいて追加した３個の推定Ｃｌイオンで３個の水分子を置換した。更に、異常差フーリエ及び大半の他のＴ４リゾチーム構造に認められるような２−ヒドロキシエチルジスルフィド部分も追加した。最終モデルは夫々Ｒｃｒｙｓｔ０．１５７及びＲｆｒｅｅ０．２０７で収束し、立体化学的特性は優れており、全残基はラマチャンドランプロットの許容領域内に含まれていた（表１）。
上記構造はＰＤＢに登録し、ＰＤＢコード１Ｔ６Ｈとしてアクセスすることができる。
以上、明確に理解できるように本発明を多少詳細に記載したが、本発明の真の範囲を逸脱することなく形態や細部に種々の変更が可能であることは以上の開示から当業者に自明である。例えば、上記全技術及び装置は種々に組合せて使用することができる。本明細書に引用した全刊行物、特許、特許出願、及び／又は他の文献はその開示内容全体を全目的で参考資料として組込み、各刊行物、特許、特許出願、及び／又は他の文献を全目的で参考資料として組込むと個々に記載しているものとして扱う。
図１Ａはｐ−ヨード−Ｌ−フェニルアラニン（ヨードＰｈｅ）の構造を示す。図１ＢはＢ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ＴｙｒＲＳ−チロシルアデニル酸複合体の結晶構造の一部を示す。ランダムに抽出したＭ．ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ ＴｙｒＲＳの５個の残基を括弧内に示す（即ちＴｙｒ３２，Ｇｌｕ１０７，Ａｓｐ１５８，Ｉｌｅ１５９及びＬｅｕ１６２）。結晶構造中で相同Ｂ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ＴｙｒＲＳ残基（Ｔｙｒ３４，Ａｓｎ１２３，Ａｓｐ１７６，Ｐｈｅ１７７及びＬｅｕ１８０）とチロシルアデニル酸の間に観察されたコンタクトに基づいて残基を選択した。図１Ｃは発現されたアンバー突然変異体Ｚドメイン蛋白質のＳＤＳ−ＰＡＧＥと銀染色によりアンバーコドンに応答するヨードＰｈｅ組込みの検証を示すゲルの写真である。Ｎｉ２＋アフィニティークロマトグラフィーにより蛋白質を精製した。 異常データセットのパターソン及び差フーリエマップを示す。図２Ａは４５、６０、９０、１３５、１８０、及び３６０°の収集データについてヨードＰｈｅを組込んだ結晶のパターソンマップの第１ハーカー面を示す。９０°のデータの収集後にヨウ素自己ピークが出現し、１８０°と３６０°のデータセットに存在する付加ピークは結晶中に存在するＣｌ−イオンに由来する自己ピークである。グラフはＣＣＰ４プログラムパッケージからのＦＦＴとＮＰＯを使用して作成した。３．０σのプロットの等高線を描画した後、３．０σ間隔で等高線をプロットする。図２Ｂはリゾチーム構造１Ｌ６３（Ｎｉｃｈｏｌｓｏｎら（１９９１）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３０：９８１６−９８２８）からの位相と異常差振幅を使用した差フーリエマップを示す。ヨウ素位置と多数の硫黄及びイオンを明白に識別することができる。電子密度マップは平均＋３σの等高線であり、ＣＣＰ４パッケージからのプログラムを使用して計算し、ＢｏｂＳｃｒｉｐｔとＲａｓｔｅｒ３Ｄにより作図した（Ｋｒａｕｌｉｓ（１９９１）“ＭＯＬＳＣＲＩＰＴ：ａ ｐｒｏｇｒａｍ ｔｏ ｐｒｏｄｕｃｅ ｂｏｔｈ ｄｅｔａｉｌｅｄ ａｎｄ ｓｃｈｅｍａｔｉｃ ｐｌｏｔｓ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ”Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．２４：９４６−９５０；Ｍｅｒｒｉｔｔ ａｎｄ Ｍｕｒｐｈｙ（１９９４）“Ｒａｓｔｅｒ３Ｄ Ｖｅｒｓｉｏｎ ２．０．Ａ ｐｒｏｇｒａｍ ｆｏｒ ｐｈｏｔｏｒｅａｌｉｓｔｉｃ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｇｒａｐｈｉｃｓ”Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ Ｄ ５０：８６９−８７３；及びＥｓｎｏｕｆ（１９９７）“Ａｎ ｅｘｔｅｎｓｉｖｅｌｙ ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｖｅｒｓｉｏｎ ｏｆ ＭｏｌＳｃｒｉｐｔ ｔｈａｔ ｉｎｃｌｕｄｅｓ ｇｒｅａｔｌｙ ｅｎｈａｎｃｅｄ ｃｏｌｏｒｉｎｇ ｃａｐａｂｉｌｉｔｉｅｓ”Ｊ Ｍｏｌ Ｇｒａｐｈ Ｍｏｄｅｌ １５，１３２−１３４：１１２−１３３）。 ヨードＰｈｅの構造と代表的電子密度を示す。図３Ａは１５３位にヨードＰｈｅを組込んだＴ４リゾチームのリボン図を示す。ヨードＰｈｅはｂａｌｌ ａｎｄ ｓｔｉｃｋ表示で示す。比較のために最終精密化モデルをｂａｌｌ ａｎｄ ｓｔｉｃｋ表示で示す。ＢｏｂｓｃｒｉｐｔとＲａｓｔｅｒ３Ｄにより作図した。 ヨードＰｈｅの構造と代表的電子密度を示す。ヨードＰｈｅはｂａｌｌ ａｎｄ ｓｔｉｃｋ表示で示す。図３Ｂは１３５°のデータに相当するデータセットについてＳＯＬＶＥとＲＥＳＯＬＶＥにより生成した初期位相の位相精密化後のヨードＰｈｅ周囲の初期電子密度を示す。比較のために最終精密化モデルをｂａｌｌ ａｎｄ ｓｔｉｃｋ表示で示す。ＢｏｂｓｃｒｉｐｔとＲａｓｔｅｒ３Ｄにより作図した。 ヨードＰｈｅの構造と代表的電子密度を示す。ヨードＰｈｅはｂａｌｌ ａｎｄ ｓｔｉｃｋ表示で示す。比較のために最終精密化モデルをｂａｌｌ ａｎｄ ｓｔｉｃｋ表示で示す。図３Ｃは天然（Ｎｉｃｈｏｌｓｏｎら（１９９１）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３０：９８１６−９８２８）（１Ｌ６３）及びヨードＰｈｅ Ｔ４リゾチームの疎水性コアの比較を示す。ＢｏｂｓｃｒｉｐｔとＲａｓｔｅｒ３Ｄにより作図した。 ｔＲＮＡ／シンテターゼ直交対で機能し、突然変異体ｔＲＮＡに負荷し、その結果、ｐ−ヨードフェニルアラニン（又はｐ−ブロモフェニルアラニン）を合成途上の蛋白質に例えば本明細書に記載するようにｉｎ ｖｉｖｏで組込むことができる２種のアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ突然変異体遺伝子（ヨードＰｈｅＲＳ ＃１，図４Ａ，及びヨードＰｈｅＲＳ ＃２，図４Ｂ）のヌクレオチド（ＤＮＡ）配列と対応するアミノ酸配列を示す。ヨードＰｈｅＲＳ ＃１ヌクレオチド及びアミノ酸配列は夫々配列番号１及び３であり、ヨードＰｈｅＲＳ ＃２ヌクレオチド及びアミノ酸配列は夫々配列番号２及び４である。 ｐ−ヨードフェニルアラニン（又はｐ−ブロモフェニルアラニン）を蛋白質に例えばｉｎ ｖｉｖｏで組込むために本発明の直交対で機能することができる突然変異体ｔＲＮＡのヌクレオチド配列（配列番号５）を示す。 蛋白質構造決定の目的で直交ｔＲＮＡ／シンテターゼシステムを使用して蛋白質に例えばｉｎ ｖｉｖｏで組込むことができる重原子含有アミノ酸構造の例を示す。図６Ａはｐ−ヨード−Ｌ−フェニルアラニン（ヨードＰｈｅ）、図６ＢはＬ−３−ヨードフェニルアラニン、図６ＣはＬ−２−ヨードフェニルアラニン、図６ＤはＬ−３−ヨードチロシンを示す。

Claims (39)

  1. ａ）配列番号３もしくは配列番号４のアミノ酸配列を含む直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ；
    ｂ）配列番号１−２及びその相補的ポリヌクレオチド配列から構成される群から選択されるポリヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列を含む直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ；
    ｃ）天然チロシルアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（ＴｙｒＲＳ）のアミノ酸配列と少なくとも９０％一致しており、
    ｉ）Ｍ．ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ ＴｙｒＲＳのＴｙｒ３２に対応する位置のロイシン；
    ｉｉ）Ｍ．ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ ＴｙｒＲＳのＧｌｕ１０７に対応する位置のセリンもしくはグルタミン酸；
    ｉｉｉ）Ｍ．ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ ＴｙｒＲＳのＡｓｐ１５８に対応する位置のプロリン；
    ｉｖ）Ｍ．ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ ＴｙｒＲＳのＩｌｅ１５９に対応する位置のロイシンもしくはアルギニン；及び
    ｖ）Ｍ．ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ ＴｙｒＲＳのＬｅｕ１６２に対応する位置のグルタミン酸もしくはアルギニンから構成される群から選択される２個以上のアミノ酸を含むアミノ酸配列を含む直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ；又は
    ｄ）直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼが配列番号６−９のいずれか１種を含まないという条件で、配列番号３もしくは配列番号４のアミノ酸配列を含むポリペプチドの効率の少なくとも５０％の効率で直交ｔＲＮＡを臭素化又はヨウ素化アミノ酸で優先的にアミノアシル化する直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼを含む翻訳系。
  2. 翻訳系が細胞を含む請求項１に記載の翻訳系。
  3. 細胞が大腸菌細胞である請求項２に記載の翻訳系。
  4. 直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼが細胞中の１個以上の核酸によりコードされる請求項２に記載の翻訳系。
  5. 翻訳系がｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳系を含む請求項１に記載の翻訳系。
  6. ｃ）の直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼが
    ｉ）Ｍ．ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ ＴｙｒＲＳのＴｙｒ３２に対応する位置のロイシン；
    ｉｉ）Ｍ．ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ ＴｙｒＲＳのＧｌｕ１０７に対応する位置のセリンもしくはグルタミン酸；
    ｉｉｉ）Ｍ．ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ ＴｙｒＲＳのＡｓｐ１５８に対応する位置のプロリン；
    ｉｖ）Ｍ．ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ ＴｙｒＲＳのＩｌｅ１５９に対応する位置のロイシンもしくはアルギニン；及び
    ｖ）Ｍ．ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ ＴｙｒＲＳのＬｅｕ１６２に対応する位置のグルタミン酸もしくはアルギニンから構成される群から選択される３個以上のアミノ酸を含む請求項１に記載の翻訳系。
  7. ｃ）の直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼがＭ．ｊａｎｎａｓｃｈｉｉアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼに由来する請求項１に記載の翻訳系。
  8. ｄ）の臭素化又はヨウ素化アミノ酸がＬ−４−ブロモフェニルアラニン又はＬ−４−ヨードフェニルアラニンである請求項１に記載の翻訳系。
  9. ｄ）の臭素化又はヨウ素化アミノ酸がＬ−２−ヨードフェニルアラニン、Ｌ−３−ヨードフェニルアラニン、Ｌ−２−ヨードチロシン、Ｌ−３−ヨードチロシン、Ｌ−２−ブロモフェニルアラニン、Ｌ−３−ブロモフェニルアラニン、Ｌ−２−ブロモチロシン、又はＬ−３−ブロモチロシンである請求項１に記載の翻訳系。
  10. 直交ｔＲＮＡを含む請求項１に記載の翻訳系。
  11. 直交ｔＲＮＡが配列番号５のポリヌクレオチド配列を含むか又は前記配列によりコードされる請求項１０に記載の翻訳系。
  12. 直交ｔＲＮＡが終止コドンであるセレクターコドンを認識する請求項１０に記載の翻訳系。
  13. 直交ｔＲＮＡにより認識されるセレクターコドンを含むターゲット核酸を含み、前記直交ｔＲＮＡが直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼにより臭素化又はヨウ素化アミノ酸を優先的に負荷される請求項１０に記載の翻訳系。
  14. ターゲット核酸によりコードされる蛋白質を含み、前記蛋白質が臭素化又はヨウ素化アミノ酸を含む請求項１３に記載の翻訳系。
  15. 配列番号３もしくは配列番号４のアミノ酸配列又はその保存変異体を含む直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼを含む組成物。
  16. 直交ｔＲＮＡを含み、直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼが直交ｔＲＮＡを臭素化又はヨウ素化アミノ酸で優先的にアミノアシル化する請求項１５に記載の組成物。
  17. 臭素化又はヨウ素化アミノ酸がＬ−４−ブロモフェニルアラニン又はＬ−４−ヨードフェニルアラニンである請求項１６に記載の組成物。
  18. 直交ｔＲＮＡが配列番号５のポリヌクレオチド配列を含むか又は前記配列によりコードされる請求項１６に記載の組成物。
  19. 細胞を含み、直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼが細胞中の１個以上の核酸によりコードされる請求項１５に記載の組成物。
  20. 細胞が大腸菌細胞である請求項１９に記載の組成物。
  21. 翻訳系を含む請求項１５に記載の組成物。
  22. 細胞を含み、直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼが細胞中の１個以上の核酸によりコードされ、細胞が更に、
    直交ｔＲＮＡと；
    臭素化又はヨウ素化アミノ酸を含み；
    直交ｔＲＮＡがセレクターコドンを認識し、直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼが直交ｔＲＮＡを臭素化又はヨウ素化アミノ酸で優先的にアミノアシル化する請求項１５に記載の組成物。
  23. 細胞が該当蛋白質をコードするターゲット核酸を含み、ターゲット核酸が直交ｔＲＮＡにより認識されるセレクターコドンを含む請求項２２に記載の組成物。
  24. 細胞がターゲット核酸によりコードされる蛋白質を含み、前記蛋白質が臭素化又はヨウ素化アミノ酸を含む請求項２３に記載の組成物。
  25. ａ）配列番号３もしくは配列番号４のアミノ酸配列もしくはその保存変異体をコードするポリヌクレオチド配列；又は
    ｂ）配列番号１もしくは配列番号２のポリヌクレオチド配列もしくはその相補的ポリヌクレオチド配列を含む核酸。
  26. 請求項２５に記載の核酸を含むか又はコードするベクター。
  27. ベクターが発現ベクターである請求項２６に記載のベクター。
  28. 特定位置に臭素化又はヨウ素化アミノ酸を組込んだ蛋白質の生産用キットであって、
    ａ）細胞で機能し、セレクターコドンを認識する直交ｔＲＮＡと；
    ｂ）天然チロシルアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（ＴｙｒＲＳ）のアミノ酸配列と少なくとも９０％一致しており、
    ｉ）Ｍ．ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ ＴｙｒＲＳのＴｙｒ３２に対応する位置のロイシン；
    ｉｉ）Ｍ．ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ ＴｙｒＲＳのＧｌｕ１０７に対応する位置のセリンもしくはグルタミン酸；
    ｉｉｉ）Ｍ．ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ ＴｙｒＲＳのＡｓｐ１５８に対応する位置のプロリン；
    ｉｖ）Ｍ．ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ ＴｙｒＲＳのＩｌｅ１５９に対応する位置のロイシンもしくはアルギニン；及び
    ｖ）Ｍ．ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ ＴｙｒＲＳのＬｅｕ１６２に対応する位置のグルタミン酸もしくはアルギニンから構成される群から選択される２個以上のアミノ酸を含むアミノ酸配列を含む直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼを含む細胞と；
    臭素化又はヨウ素化アミノ酸を１個以上の容器にパッケージングした前記キット。
  29. 特定位置に臭素化又はヨウ素化アミノ酸を組込んだ蛋白質を細胞で生産する方法であって、
    ａ）少なくとも１個のセレクターコドンを含み、蛋白質をコードする核酸と；
    ｂ）細胞で機能し、セレクターコドンを認識する直交ｔＲＮＡと；
    ｃ）天然チロシルアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（ＴｙｒＲＳ）のアミノ酸配列と少なくとも９０％一致しており、
    ｉ）Ｍ．ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ ＴｙｒＲＳのＴｙｒ３２に対応する位置のロイシン；
    ｉｉ）Ｍ．ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ ＴｙｒＲＳのＧｌｕ１０７に対応する位置のセリンもしくはグルタミン酸；
    ｉｉｉ）Ｍ．ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ ＴｙｒＲＳのＡｓｐ１５８に対応する位置のプロリン；
    ｉｖ）Ｍ．ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ ＴｙｒＲＳのＩｌｅ１５９に対応する位置のロイシンもしくはアルギニン；及び
    ｖ）Ｍ．ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ ＴｙｒＲＳのＬｅｕ１６２に対応する位置のグルタミン酸もしくはアルギニンから構成される群から選択される２個以上のアミノ酸を含むアミノ酸配列を含む直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼを含む細胞を提供する段階と；
    細胞を適当な培地で増殖させる段階と；
    臭素化又はヨウ素化アミノ酸を提供する段階と；
    前記少なくとも１個のセレクターコドンによる核酸の翻訳中に蛋白質の特定位置に臭素化又はヨウ素化アミノ酸を組込むことにより、蛋白質を生産する段階を含む前記方法。
  30. 直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼが配列番号３−４のいずれか１種を含むアミノ酸配列を含む請求項２９に記載の方法。
  31. 直交ｔＲＮＡが配列番号５に記載のポリヌクレオチド配列を含むか又は前記配列によりコードされる請求項２９に記載の方法。
  32. 細胞が非真核細胞である請求項２９に記載の方法。
  33. 非真核細胞が大腸菌細胞である請求項３２に記載の方法。
  34. 臭素化又はヨウ素化アミノ酸がＬ−４−ブロモフェニルアラニン又はＬ−４−ヨードフェニルアラニンである請求項２９に記載の方法。
  35. 直交ｔＲＮＡと、
    直交ｔＲＮＡを重原子含有アミノ酸で優先的にアミノアシル化する直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼを含む翻訳系で特定位置に重原子含有アミノ酸を組込んだ蛋白質を発現させることにより前記蛋白質を提供する段階と；
    前記蛋白質を結晶化させることにより、重原子含有蛋白質結晶を作製する段階と；
    単波長で重原子含有蛋白質結晶からの回折データを収集する段階と、フリーデル対間の異常差を測定する段階を含むプロセスにより蛋白質の構造を決定する段階を含む蛋白質構造の決定方法。
  36. 重原子含有アミノ酸が臭素化又はヨウ素化アミノ酸である請求項３５に記載の方法。
  37. 臭素化又はヨウ素化アミノ酸がＬ−４−ブロモフェニルアラニン又はＬ−４−ヨードフェニルアラニンである請求項３６に記載の方法。
  38. 直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼが配列番号３もしくは配列番号４のアミノ酸配列又はその保存変異体を含む請求項３５に記載の方法。
  39. 単波長が１．５４１８Åである請求項３５に記載の方法。
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