BRPI0516385B1 - Composto ou sal do mesmo contendo aminoácidos não naturais e polipeptídeos, métodos para produção e derivatização de um polipeptídeo - Google Patents

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Abstract

composições contendo aminoácidos não naturais e polipeptídeos, métodos envolvendo os mesmos e usos dos mesmos. revela-se no presente aminoácidos não naturais e polipeptídeos que incluem pelo menos um aminoácido não natural, e métodos de produção de tais aminoácidos não naturais e polipeptídeos. os aminoácidos não naturais, por eles mesmos, ou como partem de um polipeptídeo, podem incluir uma ampla faixa de possíveis funcionalidades, mas tipicamente, têm pelo menos um grupo oxima, carbonila, dicarbonila, e/ou hidroxilamina. também estão aqui revelados polipeptídeos de aminoácido não natural que são adicionalmente modificados no modo pós-traducional, métodos para realizar essas modificações, e métodos de purificar tais polipeptídeos. tipicamente, os polipeptídeos de aminoácido não natural modificados incluem pelo menos um grupo oxima, carbonila, dicarbonila e/ou hidroxilamina.também se apresentam métodos para uso de tais polipeptídeos de aminoácido não natural e polipeptídeos de aminoácido não natural modificados, incluindo uso terapêutico, de diagnóstico, e outros usos biotecnológicos.

Description

REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDOS CORRELATOS
[001]Este pedido reivindica prioridade ao pedido de patente provisório U.S. No. de série 60/638.418, depositado em 22 de dezembro de 2004, pedido de patente provisório n°. de Série U.S. 60/.638.527, depositado em 22 de dezembro de 2004, pedido de patente provisório n° 60/639.195, depositado em 22 de dezembro de 2004, pedido de patente provisório U.S 60/696.210, depositado em 1 de julho de 2005 e pedido de patente provisório U.S. n° 60.696.068, depositado em 1 de julho de 2005, cuja descrição está ora incorporada por referência em sua totalidade.
FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO
[002]A capacidade de se incorporar aminoácidos não geneticamente codificados (ou seja, "aminoácidos não naturais") a proteínas, permite a introdução de grupos funcionais químicos que poderiam proporcionar alternativas valiosas aos grupos funcionais que ocorrem naturalmente tais como -NH2 épsilon de lisina, o grupo sulfidrila -SH de cisteína, o grupo imino de histidina, etc. Sabe-se que determinados grupos funcionais químicos são inertes aos grupos funcionais encontrados nos 20 aminoácidos comuns geneticamente codificados, mas eles reagem nítida e eficientemente para formar ligações estáveis.
[003]Estão agora disponíveis métodos para introduzir seletivamente grupos funcionais químicos que não são encontrados em proteínas, que sejam quimicamente inertes a todos os grupos funcionais encontrados nos 20 aminoácidos comuns geneticamente codificados e que podem ser usados para reagir eficiente e seletivamente com reagentes compreendendo alguns grupos funcionais, para formar ligações covalentes estáveis
SUMÁRIO DA INVENÇÃO
[004]Estão descritos métodos, composições, técnicas e estratégias para preparação, purificação, caracterização e uso de aminoácidos não naturais, polipeptídeos de aminoácido não natural, e polipeptídeos de aminoácido não natural modificado. Em um aspecto, são métodos, composições, técnicas e estratégias para derivatização de um aminoácido não natural e/ou um polipeptídeo de aminoácido não natural. Numa modalidade, tais métodos, composições, técnicas e estratégias envolveram derivatização química, em outras modalidades, a derivatização biológica, em outras modalidades, derivatização física, em outras modalidades, uma combinação de derivatizações. Em modalidades adicionais ou ulteriores, tais derivatizações são régio-seletivas. Em modalidades adicionais ou ulteriores, tais derivatizações são régio-específicas. Em modalidades adicionais ou ulteriores, tais derivatizações são rápidas a temperatura ambiente. Em modalidades adicionais ou ulteriores, tais derivatizações ocorrem a um pH entre cerca de 4 e cerca de 10. Em modalidades adicionais ou ulteriores, com adição de um acelerador, tais derivações são estequiométricas, próxima da estequiométrica ou similar à estequiométrica, em, tanto reagente contendo aminoácido não natural e o reagente de derivatização. Em modalidades adicionais ou ulteriores, são proporcionados métodos que, com adição de um acelerador, permitem a incorporação estequiométrica, próxima da estequiométrica ou similar à estequiométrica de um desejado grupo sobre um polipeptídeo de aminoácido não natural. Em modalidades adicionais ou ulteriores são proporcionadas estratégias, misturas de reação, condições sintéticas que, com adição de um acelerador, permitem a incorporação estequiométrica, quase estequiométrica ou similar à estequiométrica de um desejado grupo sobre um polipeptídeo de aminoácido não natural.
[005]Em um aspecto, trata-se de aminoácidos não naturais par a derivatização química de peptídeos e proteínas com base na ligação de oxima. Em modalidades adicionais ou ulteriores, o aminoácido não natural é incorporado a um polipeptídeo, ou seja, tais modalidades são polipeptídeo de aminoácido não naturais. Em modalidades adicionais ou ulteriores, os aminoácidos não naturais são funcionalizados em suas cadeias laterais tal que sua reação com uma molécula de derivatização gera uma ligação oxima. Em modalidades adicionais ou ulteriores trata-se de polipeptídeos de aminoácido não naturais que podem reagir com uma molécula de derivatização para gerar um polipeptídeo de aminoácido não natural contendo oxima. Em modalidades adicionais ou ulteriores, os aminoácidos não naturais são selecionados de aminoácidos com cadeias laterais carbonila, dicarbonila, acetal, hidroxilamina ou oxima. Em modalidades adicionais ou ulteriores os aminoácidos não naturais são selecionados de aminoácidos com cadeias laterais carbonila, dicarbonila, hidroxilamina ou oxima protegidas ou mascaradas. Em modalidades adicionais ou ulteriores, os aminoácidos não naturais compreendem uma cadeia lateral oxima-mascaradas. Em modalidades adicionais ou ulteriores, os aminoácidos não naturais compreendem cadeias laterais carbonila ou dicarbonila onde o carbonila ou dicarbonila é selecionado de uma cetona ou um aldeído. Numa outra modalidade, estão aminoácidos não naturais contendo um grupo funcional que é capaz de formar uma oxima com tratamento com um co-reagente adequadamente funcionalizado. Numa modalidade adicional ou ulterior, os aminoácidos não naturais assemelham-se a um aminoácido natural em estrutura, porém contém um dos supracitados grupos funcionais. Numa modalidade adicional ou ulterior os aminoácidos não naturais assemelham-se a fenilalanina ou tirosina (aminoácidos aromáticos); enquanto numa modalidade separada, os aminoácidos não naturais assemelham-se a alanina e leucina (aminoácidos hidrofóbicos). Numa modalidade, os aminoácidos não naturais têm propriedades que são distintas daquelas dos aminoácidos naturais. Numa modalidade, tais propriedades distintas são a reatividade química da cadeia lateral, numa modalidade adicional esta reatividade química distinta permite que a cadeia lateral dos aminoácidos não naturais passe por uma reação, enquanto sendo uma unidade de um polipeptídeo mesmo se as cadeias laterais do aminoácido de ocorrência natural no mesmo polipeptídeo não passe pela reação supracitada. Numa modalidade adicional, a cadeia lateral do aminoácido não natural possui uma química ortogonal aos aminoácidos de ocorrência natural. Numa modalidade ulterior, a cadeia lateral do aminoácido não natural compreende uma fração contendo eletrófilo; Numa modalidade adicional, a fração contendo eletrófilo na cadeia lateral dos aminoácidos não naturais podem sofrer ataque nucleofílico para gerar uma proteína derivatizada de oxima. Em quaisquer modalidades supracitadas, neste parágrafo, o aminoácido não natural pode existir como uma molécula separada ou pode ser incorporado ao polipeptídeo em qualquer extensão; no último caso, o polipeptídeo pode ainda incorporar aminoácido de ocorrências naturais ou não naturais.
[006]Num outro aspecto, estão moléculas hidroxilamina-substituídas para a produção de polipeptídeos de aminoácido não natural derivatizados com base numa ligação oxima. Numa modalidade adicional, estão moléculas hidroxilamina- substituídas usadas para derivatizar polipeptídeos de aminoácido não natural contendo carbonila ou dicarbonila, via formação de uma ligação oxima entre a molécula de derivatização e o polipeptídeo de aminoácido não natural contendo carbonila ou dicarbonila. Em modalidades adicionais, os polipeptídeos de aminoácido não natural contendo carbonila ou dicarbonila são polipeptídeos de aminoácido não natural contendo grupo -ceto. Numa modalidade adicional ou ulterior, os aminoácidos não naturais contendo carbonila ou dicarbonila compreendem cadeias laterais selecionadas de uma cetona ou um aldeído. Em modalidades adicionais ou ulteriores, as moléculas hidroxilamina substituídas compreendem um grupo selecionado dentre um rótulo; um corante; um polímero; um polímero hidrossolúvel; um derivado de polietileno glicol; um foto-reticulador; um composto citotóxico; uma droga; um rótulo de afinidade; um rótulo de foto-afinidade; um composto reativo; uma resina; uma segunda proteína ou polipeptídeo ou análogo de polipeptídeo; um anticorpo ou fragmento de anticorpo; um quelante de metal; um co-fator; um ácido graxo; um carboidrato; um polinucleotídeo; um DNA; um RNA; um polinucleotídeo anti-sentido; um sacarídeo; um dendrímero hidrossolúvel; uma ciclodextrina; um biomaterial; uma nanopartícula; um rótulo de spin; um fluoróforo; uma fração contendo metal; uma fração radioativa; um grupo funcional inédito; um grupo que interage por covalência ou por não covalência com outras moléculas; uma fração foto-aprisionada; uma fração excitável por radiação actínica, um ligante, uma fração foto-isomerizável; biotina; um derivado de biotina; um análogo de biotina; uma fração que incorpora um átomo pesado; um grupo quimicamente clivável; um grupo foto-clivável; uma cadeia lateral alongada; um açúcar ligado a carbono; um agente redox-ativo; um amino tioácido; uma fração tóxica; uma fração isotopicamente rotulada; uma sonda biofísica; um grupo fosforescente; um grupo quimioluminescente; um grupo com densidade de elétrons; um grupo magnético; um grupo intercalado; um cromóforo; um agente de transferência de energia; um agente biologicamente ativo; um rótulo detectável; uma molécula pequena; um ácido ribonucléico inibidor, um radionucleotídeo; um agente capturador de nêutrons, um derivado de biotina; ponto(s) quântico(s); um nanotransmissor, um radiotransmissor, uma abzima, um ativador de complexo ativado, um vírus, um adjuvante, um aglican, um alergan, uma angiostatina, um anti-hormônio, um antioxidante, um aptâmero, um RNA orientador, uma saponina, um vetor bilateral, uma macromolécula, um mimótopo, um receptor, uma micela inversa, e quaisquer combinações destes. Em modalidades adicionais ou ulteriores, as moléculas hidroxilamina-substituídas são moléculas de polietileno glicol (PEG) hidroxilamina-substituídas. Numa modalidade adicional, a cadeia lateral do aminoácido não natural tem uma química ortogonal àquelas dos aminoácidos de ocorrência natural que permitem ao aminoácido não natural reagir seletivamente com as moléculas hidroxilamina-substituídas. Numa modalidade adicional, a cadeia lateral do aminoácido não natural compreende uma fração contendo eletrófilo, que reage seletivamente com a molécula contendo hidroxilamina; numa modalidade adicional, a fração contendo eletrófilo na cadeia lateral do aminoácido não natural pode sofrer ataque nucleofílico gerando uma proteína derivatizada de oxima. Num aspecto ulterior, relacionado com as modalidades descritas neste parágrafo, estão os polipeptídeos de aminoácido não naturais modificados resultantes da reação da molécula derivatizada com os polipeptídeos de aminoácido não natural. Outras modalidades incluem quaisquer modificações adicionais dos polipeptídeos de aminoácido não natural já modificados.
[007]Num outro aspecto estão moléculas carbonila- ou dicarbonila- substituídas para produção dos polipeptídeos de aminoácido não natural derivatizados com base numa ligação oxima. Numa modalidade ulterior, encontram-se moléculas carbonila ou dicarbonila-substituídas usadas para derivatizar polipeptídeos de aminoácido não natural contendo oxima, via uma reação de troca de oxima entre a molécula de derivatização e o peptídeo ou proteína contendo oxima. Numa modalidade adicional estão moléculas carbonila ou dicarbonila-substituídas que podem sofrer troca de oxima com um polipeptídeo de aminoácido não natural contendo oxima numa faixa de pH entre cerca de 4 e cerca de 8. Numa modalidade adicional estão moléculas carbonila ou dicarbonila- substituídas usadas para derivatizar polipeptídeos de aminoácido não natural contendo oxima ou contendo hidroxilamina via formação de uma ligação oxima entre a molécula de derivatização e os polipeptídeos de aminoácido não natural contendo oxima (formando assim, uma nova ligação oxima via reação do tipo troca) ou contendo hidroxilamina. Numa modalidade ulterior as moléculas carbonila- ou dicarbonila-substituídas são moléculas aldeído-substituídas. Numa modalidade adicional, as moléculas carbonila- ou dicarbonila-substituídas compreendem um grupo selecionado dentre: rótulo; um corante; um polímero; um polímero hidrossolúvel; um derivado de polietileno glicol; um foto-reticulador; um composto citotóxico; uma droga; um rótulo de afinidade; um rótulo de foto-afinidade; um composto reativo; uma resina; uma segunda proteína ou polipeptídeo ou análogo de polipeptídeo; um anticorpo ou fragmento de anticorpo; um quelante de metal; um co- fator; um ácido graxo; um carboidrato; um polinucleotídeo; um DNA; um RNA; um polinucleotídeo anti-sentido; um sacarídeo; um dendrímero hidrossolúvel; uma ciclodextrina; um biomaterial; uma nanopartícula; um rótulo de spin; um fluoróforo; uma fração contendo metal; uma fração radioativa; um grupo funcional inédito; um grupo que interage por covalência ou por não covalência com outras moléculas; uma fração foto-aprisionada; uma fração excitável por radiação actínica, um ligante, uma fração foto-isomerizável; biotina; um derivado de biotina; um análogo de biotina; uma fração que incorpora um átomo pesado; um grupo quimicamente clivável; um grupo foto-clivável; uma cadeia lateral alongada; um açúcar ligado a carbono; um agente redox-ativo; um amino tioácido; uma fração tóxica; uma fração isotopicamente rotulada; uma sonda biofísica; um grupo fosforescente; um grupo quimioluminescente; um grupo com densidade de elétrons; um grupo magnético; um grupo intercalado; um cromóforo; um agente de transferência de energia; um agente biologicamente ativo; um rótulo detectável; uma molécula pequena; um ácido ribonucléico inibidor, um radionucleotídeo; um agente capturador de nêutrons, um derivado de biotina; ponto(s) quântico(s); um nanotransmissor;, um radiotransmissor, uma abzima, um ativador de complexo ativado, um vírus, um adjuvante, um aglican, um alergan, uma angiostatina, um anti-hormônio, um antioxidante, um aptâmero, um RNA orientador, uma saponina, um vetor de dois lados, uma macromolécula, um mimótopo, um receptor, uma micela inversa, e quaisquer combinações destes. Em modalidades adicionais ou ulteriores as moléculas aldeído-substituídas são moléculas de polietileno glicol (PEG) aldeído- substituídas. Numa modalidade adicional, a cadeia lateral do aminoácido não natural possui a química ortogonal daquela dos aminoácidos de ocorrência natural que permitem ao aminoácido não natural reagir seletivamente com as moléculas carbonil- ou dicarbonila-substituídas. Numa modalidade adicional, a cadeia lateral do aminoácido não natural compreende uma fração, a guisa de exemplo um grupo oxima ou hidroxilamina, que reage seletivamente com a molécula contendo carbonila- ou dicarbonila; numa modalidade ulterior, a fração nucleofílica na cadeia lateral do aminoácido não natural pode passar por ataque eletrofílico para gerar uma proteína derivatizada de oxima. Num aspecto ulterior relacionado com as modalidades descritas neste parágrafo, estão polipeptídeos de aminoácido não natural modificados, resultantes da reação da molécula de derivatização com os polipeptídeos de aminoácido não natural. Mais modalidades incluem quaisquer outras modificações dos polipeptídeos de aminoácido não natural, já modificados.
[008]Num outro aspecto estão ligantes mono-, bi- e multifuncionais, para geração dos polipeptídeos de aminoácido não natural com base na ligação oxima. Numa modalidade, estão ligadores moleculares (bi- e multifuncionais) que podem ser empregados para conectar polipeptídeos de aminoácido não natural contendo carbonila- ou dicarbonila. Numa modalidade adicional estão ligadores moleculares (bi- e multifuncionais) que podem ser usados para conectar polipeptídeos de aminoácido não natural contendo oxima ou hidroxilamina a outras moléculas. Numa outra modalidade, os polipeptídeos de aminoácido não natural contendo carbonila ou dicarbonila compreendem uma cadeia lateral cetona e/ou aldeído. Numa modalidade utilizando um polipeptídeo de aminoácido não natural contendo oxima ou hidroxilamina, o ligante molecular contém um grupo carbonila ou dicarbonila em um de seus terminais; em outras modalidades, o grupo carbonila ou dicarbonila é selecionado de um grupo aldeído ou um grupo cetona. Em modalidades adicionais ou ulteriores as moléculas do ligante substituído com hidroxilamina são moléculas de ligante polietileno glicol (PEG) hidroxilamina-substituídas. Em modalidades adicionais ou ulteriores, as moléculas ligantes carbonil- ou dicarbonila substituídas são moléculas de ligante polietileno glicol (PEG) carbonil- ou dicarbonila substituídas. Numa outra modalidade, a frase "outras moléculas"inclui, a guisa de exemplo apenas, proteínas, outros polímeros e pequenas moléculas. Em modalidades adicionais ou ulteriores, os ligantes moleculares contendo hidroxilamina compreendem os mesmos grupos ou grupos equivalentes de todos os terminais de modo que com a reação com um polipeptídeo de aminoácido não natural contendo carbonila ou dicarbonila, o produto resultante é a homo-multimerização do polipeptídeo de aminoácido não natural contendo carbonila ou dicarbonila. Numa modalidade ulterior, a homo-multimerizacao é uma homo-dimerização. Em modalidades adicionais ou ulteriores, os ligantes moleculares contendo carbonila ou dicarbonila compreendem os mesmos ou grupos equivalentes de todos os terminais, de modo que, com a reação com um polipeptídeo de aminoácido não natural contendo oxima ou hidroxilamina, o produto resultante é a homo-multimerização do polipeptídeo de aminoácido não natural contendo oxima- ou hidroxilamina. Em modalidades adicionais, a homo-multimerizacao é uma homo-dimerização. Numa outra modalidade, a cadeia lateral do aminoácido não natural possui uma química ortogonal àquela dos aminoácidos de ocorrência natural que permitem ao aminoácido não natural reagir seletivamente com as moléculas ligantes hidroxilamina-substituídas. Numa outra modalidade, a cadeia lateral do aminoácido não natural possui uma química ortogonal àquela dos aminoácidos de ocorrência natural que permitem ao aminoácido não natural reagir seletivamente, com as moléculas ligantes carbonila- ou dicarbonila-substituídas. Numa outra modalidade, a cadeia lateral do aminoácido não natural compreende uma fração contendo eletrófilo, que reage seletivamente com a molécula ligante contendo hidroxilamina; Numa outra modalidade a fração contendo eletrófilo na cadeia lateral do aminoácido não natural pode sofrer ataque nucleofílico pela molécula ligante contendo hidroxilamina para gerar uma proteína oxima-derivatizada. Num aspecto ulterior, relacionado às modalidades escritas neste parágrafo, estão os polipeptídeos de aminoácido não natural "modificados ou não modificados" ligados, resultantes da reação da molécula ligante com os polipeptídeos de aminoácido não natural. Mais modalidades incluem quaisquer modificações adicionais dos polipeptídeos de aminoácido não natural "modificados ou "não modificados"já ligados.
[009]Num aspecto, encontram-se métodos para derivatizar proteínas via condensação dos reagentes carbonila ou dicarbonila e hidroxilamina gerando um produto baseado em oxima. Incluídos neste aspecto estão métodos para a derivatização de proteínas com base na condensação de reagentes contendo carbonila- ou dicarbonila- e hidroxilamina- para gerar um aduto de proteína derivatizado de oxima. Em modalidades adicionais ou ulteriores estão métodos para derivatizar proteínas contendo grupo ceto com moléculas de polietileno glicol (PEG) hidroxilamina funcionalizadas. Em ainda outros aspectos adicionais estão métodos para derivatizar proteínas contendo oxima via uma reação de troca de oxima entre uma molécula de derivatização contendo carbonila ou dicarbonila e o peptídeo ou proteína contendo oxima. Em aspectos adicionais ou ulteriores ainda, a molécula hidroxilamina-substituída pode incluir proteínas, outros polímeros e pequenas moléculas.
[0010]Em um outro aspecto, estão métodos para a síntese química de moléculas hidroxilamina substituídas para a derivatização de proteínas ceto- substituídas. Num outro aspecto, estão métodos para a síntese química das moléculas hidroxilamina-substituídas para a derivatização de proteínas aldeído substituídas. Numa modalidade, a molécula hidroxilamina substituída pode compreender peptídeos, outros polímeros (não ramificados e ramificados) e pequenas moléculas. Numa modalidade estão métodos para preparação de moléculas hidroxilamina substituídas adequadas para derivatização de polipeptídeos de aminoácido não natural contendo carbonila- ou dicarbonila incluindo, a guisa de exemplo, apenas polipeptídeos de aminoácido não natural contendo ceto. Numa modalidade adicional ou ulterior os aminoácidos não naturais são incorporados especificamente ao sítio, durante a tradução de proteínas in vivo. Numa modalidade adicional ou ulterior, as moléculas hidroxilamina-substituídas permitem a derivatização sítio-específico deste aminoácido não natural contendo carbonila- o dicarbonila via ataque nucleofílico do grupo carbonila ou dicarbonila para formar um polipeptídeo derivatizado de oxima num modo sítio-específico. Numa modalidade adicional ou ulterior, o método para preparação das moléculas hidroxilamina- substituídas proporciona acesso a uma ampla gama de polipeptídeo derivatizados especificamente ao sítio. Numa modalidade adicional ou ulterior estão métodos para sintetizar moléculas de polietileno glicol (PEG) hidroxilamina-funcionalizadas.
[0011]Num outro aspecto, encontram-se métodos para a síntese química de moléculas carbonila ou dicarbonila substituídas para derivatização dos polipeptídeos de aminoácido não natural oxima substituídos. Numa modalidade, a molécula carbonila ou dicarbonila-substituída é uma molécula ceto-substituída. Numa outra modalidade, as moléculas carbonila- ou dicarbonila-substituídas incluem proteínas, polímeros (não ramificados e ramificados e moléculas pequenas. Numa modalidade adicional ou ulterior tais métodos complementam a tecnologia que permite a incorporação específica ao sítio dos aminoácidos não naturais durante a tradução in vivo de proteínas. Numa modalidade adicional ou ulterior estão métodos gerais para preparação de moléculas carbonila- ou dicarbonila-substituídas adequadas para reação com polipeptídeos de aminoácido não natural contendo oxima para proporcionar polipeptídeos de aminoácido não natural derivatizados. Numa modalidade adicional ou ulterior estão métodos para sintetizar moléculas de polietileno glicol (PEG) carbonila- ou dicarbonila substituídas.
[0012]Num outro aspecto estão métodos para a derivatização química de polipeptídeos de aminoácido não natural carbonila ou dicarbonila substituídos usando um ligante bifuncional contendo hidroxilamina. Numa modalidade, estão métodos para ligação de um ligante hidroxilamina substituído a uma proteína carbonila- ou dicarbonila substituída via uma reação de condensação para gerar uma ligação oxima. Numa modalidade adicional ou ulterior, o aminoácido não natural carbonila- ou dicarbonila-substituído é um aminoácido não natural ceto- substituído. Numa modalidade adicional ou ulterior, os polipeptídeos de aminoácido não natural são derivatizados específicos ao sítio e/ou com controle preciso de estrutura tridimensional, usando um ligante bifuncional contendo hidroxilamina. Numa modalidade, tais métodos são empregados para ligar ligantes moleculares (incluindo, sem limitação, a ligantes mono- bi- e multifuncionais) a polipeptídeos de aminoácido não natural contendo carbonila- ou dicarbonila (incluindo sem limitação, a contendo aldeído e contendo ceto), onde pelo menos um dos terminais do ligante contém um grupo hidroxilamina, que pode ligar aos polipeptídeos de aminoácido não natural contendo carbonila- ou dicarbonila via uma ligação oxima. Numa modalidade adicional ou ulterior, esses ligantes são empregados para conectar os polipeptídeos de aminoácido não natural contendo carbonila- ou dicarbonila a outras moléculas, incluindo, a guisa de exemplo, proteínas, outros polímeros (ramificados e não ramificados) e pequenas moléculas.
[0013]Em algumas modalidades, o polipeptídeo de aminoácido não natural é ligado a um polímero hidrossolúvel. Em algumas modalidades, o polímero hidrossolúvel compreende uma fração polietileno glicol. Em algumas modalidades, o polímero 'bifuncional é ligado a um segundo polipeptídeo. Em algumas modalidades, o segundo polipeptídeo é idêntico ao primeiro polipeptídeo, em outras modalidades, o segundo polipeptídeo é um polipeptídeo diferente. Em algumas modalidades, o polipeptídeo de aminoácido não natural compreende pelo menos dois aminoácidos ligados a um polímero hidrossolúvel compreendendo uma fração poli(etileno glicol).
[0014]Em algumas modalidades, o polipeptídeo de aminoácido não natural compreende uma substituição, adição ou deleção que aumenta a finidade do polipeptídeo de aminoácido não natural para um receptor. Em algumas modalidades, o polipeptídeo de aminoácido não natural compreende uma substituição, adição ou deleção que aumenta a estabilidade do polipeptídeo de aminoácido não natural. Em algumas modalidades, o polipeptídeo de aminoácido não natural compreende uma substituição, adição ou deleção, que aumenta a solubilidade aquosa do polipeptídeo de aminoácido não natural. Em algumas modalidades, o polipeptídeo de aminoácido não natural compreende uma substituição, adição ou deleção que aumenta a solubilidade do polipeptídeo de aminoácido não natural, produzido numa célula hospedeira. Em algumas modalidades o polipeptídeo de aminoácido não natural compreende uma substituição, adição ou deleção, que modula a resistência à protease, meia-vida no soro, imunogenicidade, e/ou expressão relativa ao polipeptídeo de aminoácido em substituição adição ou deleção.
[0015]Em algumas modalidades, o polipeptídeo de aminoácido não natural é um agonista, agonista parcial, antagonista, antagonista parcial, ou agonista inverso. Em algumas modalidades, o agonista, agonista parcial, antagonista, antagonista parcial ou agonista inverso compreende um aminoácido não natural ligado a um polímero hidrossolúvel. Em algumas modalidades, o polímero aquoso compreende uma fração polietileno glicol. Em algumas modalidades, o polipeptídeo compreendendo um aminoácido não natural ligado a um polímero hidrossolúvel, por exemplo, pode evitar a dimerização do correspondente receptor. Em algumas modalidades, o polipeptídeo compreendendo um aminoácido não natural ligado a um polímero hidrossolúvel, modula a ligação do polipeptídeo a um parceiro de ligação, ligante ou receptor. Em algumas modalidades, o polipeptídeo compreendendo um aminoácido não natural ligado a um polímero hidrossolúvel modula uma ou mais propriedades ou atividades do polipeptídeo.
[0016]Em algumas modalidades, o códon seletor é selecionado do grupo consistindo em um códon âmbar, códon ocre, códon opala, um códon singular, um códon raro, um códon não natural, um códon de cinco bases, e um códon de quatro bases.
[0017]Também se descrevem aqui, métodos para preparação de um polipeptídeo de aminoácido não natural ligado a um polímero hidrossolúvel. Em algumas modalidades, o método compreende o contato de um polipeptídeo isolado compreendendo um aminoácido não natural com um polímero hidrossolúvel dotado de uma fração que reage com o aminoácido não natural. Em algumas modalidades, o aminoácido não natural incorporado é reativo para um polímero hidrossolúvel que é de outro modo não reativo para quaisquer dos 2 aminoácidos comuns. Em algumas modalidades, o polímero hidrossolúvel compreende uma fração polietileno glicol. O peso molecular do polímero pode ser de uma ampla faixa, incluindo, sem limitação, entre cerca de 100 Da e cerca de 100.000 Da ou mais. O peso molecular do polímero pode estar entre cerca de 100 Da e cerca de 100.000 Da, incluindo, sem limitação, a 100.000 Da, 95.000 Da, 90.000 Da, 85.000 Da, 80.000 Da, 75.000 Da, 70.00 Da, 65.000 Da, 60.000 Da, 55.000 Da, 50.000 Da, 45.000 Da, 40.000 Da, 35.000 Da. 30.000 Da, 25.000 Da, 20.000 Da, 15.000 Da, 10.000 Da, 9.000 Da, 8.000 Da, 7.000 Da, 6.000 Da, 5000 Da, 4.000 Da, 3.000 Da, 2.000 Da, 1.000 Da, 900 Da, 800 Da, 700 Da, 600 Da, 500 Da, 400 Da, 300 Da, 200 Da, e 100 Da. Em algumas modalidades, o peso molecular do polímero fica entre cerca de 100 Da e 50.000 Da. Em algumas modalidades, o peso molecular do polímero fica entre cerca de 100 Da e 40.000 Da. Em algumas modalidades, o peso molecular do polímero fica entre cerca de 1.000 Da e 40.000 Da. Em algumas modalidades, o peso molecular do polímero fica entre cerca de 5.000 Da e 40.000 Da. Em algumas modalidades, o peso molecular do polímero fica entre cerca de 10.000 Da e 40.000 Da. Em algumas modalidades, a molécula de polietileno glicol é um polímero ramificado. O peso molecular do PEG de cadeia ramificada pode ser entre cerca de 1.000 Da, e cerca de 100.000 Da, incluindo, sem limitação, a 100.000 Da, 95.000 Da, 90.000 Da, 85.000 Da, 80.000 Da, 75.000 Da, 70.000 Da, 65.000 Da, 60.000 Da, 55.000 DA, 50.000 Da, 45.000 Da, 40.000 Da, 35.000 Da, 30.000 Da, 25.000 Da, 20.000 Da, 15.000 Da, 10.000 Da, 9.000 Da, 8.000 Da, 7.000 Da, 6.000 Da, 5000 Da, 4.000 Da, 3.000 Da, 2.000 Da e 1.000 Da. Em algumas modalidades, o peso molecular de PEG de cadeia ramificada fica entre cerca de 1.000 Da e 50.000 Da. Em algumas modalidades, o peso molecular do PEG de cadeia ramificada fica entre cerca de 1.000 Da e 40.000 Da. Em algumas modalidades, o peso molecular do PEG de cadeia ramificada fica entre cerca de 5.000 Da e 40.000 Da. Em algumas modalidades, o peso molecular do PEg de cadeia ramificada fica entre cerca de 5.000 Da e 20.000 Da.
[0018]Também se descrevem aqui, composições compreendendo um polipeptídeo compreendendo pelo menos um dos aminoácidos não naturais aqui descritos e um veículo farmaceuticamente aceitável. Em algumas modalidades, o aminoácido não natural é ligado a um polímero hidrossolúvel. Também são descritas aqui, composições farmacêuticas compreendendo um veículo farmaceuticamente aceitável e um polipeptídeo, onde pelo menos um aminoácido é substituído com um aminoácido não natural. Em algumas modalidades, o aminoácido não natural compreende uma fração sacarídeo. Em algumas modalidades, o polímero hidrossolúvel é ligado ao polipeptídeo via uma fração sacarídeo. Também se descrevem aqui, prodrogas dos aminoácidos não naturais, polipeptídeos de aminoácido não naturais e polipeptídeos de aminoácido não natural modificados. Ainda estão descritas no presente, composições compreendendo tais prodrogas e um veículo farmaceuticamente aceitável. Também estão aqui descritos metabólitos dos aminoácidos não naturais, polipeptídeos de aminoácido não natural, e polipeptídeos de aminoácido não natural modificados, tais metabólitos podem ter uma atividade desejada que complemente ou fica em sinergia com a atividade dos aminoácidos não naturais, polipeptídeos de aminoácido não natural, e polipeptídeos de aminoácido não natural modificados. Também está aqui descrito o uso dos aminoácidos não naturais, polipeptídeos de aminoácido não natural, e polipeptídeos de aminoácido não natural modificados descritos para proporcionar um metabólito desejado a um organismo, incluindo um paciente em necessidade de tal metabólito.
[0019]Também estão descritas células compreendendo um polinucleotídeo codificando o polipeptídeo compreendendo um códon seletor. Em algumas modalidades, as células compreendem um RNA sintetase ortogonal e/ou um tRNA ortogonal para substituição e um aminoácido não natural ao polipeptídeo. Em algumas modalidades, as células estão numa cultura de célula, enquanto em outras modalidades, as células de parte de um organismo multicelular, incluindo anfíbios, répteis, pássaros e mamíferos. Em quaisquer das modalidades de célula, modalidades adicionais incluem expressão do polinucleotídeo na produção do polipeptídeo de aminoácido não natural. Em algumas modalidades estão organismos que podem utilizar os aminoácidos não naturais aqui descritos na produção de um polipeptídeo de aminoácido não natural, incluindo um polipeptídeo de aminoácido não natural modificado. Em outras modalidades, tem-se organismos contendo os aminoácidos não naturais, os polipeptídeos de aminoácido não natural e/ou os polipeptídeos de aminoácido não natural modificados aqui descritos. Tais organismos incluem organismos unicelulares e multicelulares, incluindo anfíbios, répteis, pássaros e mamíferos. Em algumas modalidades, o polipeptídeo de aminoácido não natural é produzido in vitro. Em algumas modalidades, o polipeptídeo de aminoácido não natural é produzido num lisado celular. Em algumas modalidades, o polipeptídeo de aminoácido não natural é produzido por tradução ribossomal.
[0020]Também se descreve aqui métodos de preparação de um polipeptídeo compreendendo um aminoácido não natural. Em algumas modalidades, os métodos compreendem culturas de células compreendendo um polinucleotídeo ou polinucleotídeos codificando um polipeptídeo, um RNA sintetase ortogonal e/ou tRNA ortogonal sob condições que permitem a expressão do polipeptídeo, e purificação do polipeptídeo das células e/ou meio de cultura.
[0021]Também se descrevem aqui bibliotecas dos aminoácidos não naturais aqui descritos ou bibliotecas dos polipeptídeos de aminoácido não natural, ou bibliotecas dos polipeptídeos de aminoácido não natural modificados aqui descritos, ou combinação de bibliotecas destes. Também se descreve aqui arranjos contendo pelo menos um aminoácido não natural, pelo menos um polipeptídeo de aminoácido não natural, e/ou pelo menos um aminoácido não natural modificado. Também estão aqui descritos arranjos contendo pelo menos um polinucleotídeo codificando um polipeptídeo compreendendo um códon seletor. Os arranjos aqui descritos podem ser usados para selecionar a produção dos polipeptídeos de aminoácido não natural num organismo (seja por detecção da transcrição do polinucleotídeo codificando o polipeptídeo ou por detecção da tradução do polipeptídeo).
[0022]Também estão aqui descritos métodos para classificação de bibliotecas aqui descritas para uma desejada atividade, ou para uso dos arranjos descritos para seleção das bibliotecas aqui descritas, ou para outras bibliotecas dos compostos e/ou polipeptídeos e/ou polinucleotídeo para uma desejada atividade. Também se descreve o uso de tais dados de atividade da classificação de biblioteca para desenvolver e descobrir novos agentes terapêuticos, bem como os próprios agentes terapêuticos.
[0023]Também se descreve aqui métodos de aumentar a meia-vida terapêutica, meia vida no soro, ou tempo de circulação de um polipeptídeo. Em algumas modalidades, os métodos compreendem a substituição de pelo menos um aminoácido não natural para quaisquer um ou mais aminoácidos num polipeptídeo de ocorrência natural, e/ou acoplamento do polipeptídeo a um polímero hidrossolúvel.
[0024]Também estão aqui descritos métodos de tratamento de um paciente em necessidade de tal tratamento com uma quantidade eficaz de uma composição farmacêutica compreendendo um polipeptídeo compreendendo um aminoácido não natural e um veículo farmaceuticamente aceitável. Em algumas modalidades, o aminoácido não natural é acoplado a um polímero hidrossolúvel.
[0025]Em modalidades adicionais ou alternativas, têm-se métodos para tratamento de um distúrbio, condição ou doença compreendendo o método a administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um polipeptídeo de aminoácido não natural compreendendo pelo menos um aminoácido não natural selecionado do grupo consistindo doe um aminoácido não natural contendo oxima, um aminoácido não natural contendo carbonila, um aminoácido não natural contendo dicarbonila e um aminoácido não natural contendo hidroxilamina. Em outras modalidades, tais aminoácidos não naturais foram biossinteticamente incorporados ao polipeptídeo como aqui descrito. Em modalidades adicionais ou alternativas, tal polipeptídeo de aminoácido não natural compreende pelo menos um aminoácido não natural selecionado de aminoácidos de Fórmula I-XVIII, XXX- XXXIV(A&B), ou XXXX-XXXXIII.
[0026]Em modalidades adicionais ou alternativas, estão métodos para tratamento de um distúrbio, condição ou doença, compreendendo o método a administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um polipeptídeo de aminoácido não natural compreendendo pelo menos um aminoácido não natural contendo oxima e o resultante polipeptídeo de aminoácido não natural contendo oxima biossintético aumenta a biodisponibilidade do polipeptídeo em relação ao polipeptídeo de aminoácido de ocorrência natural homólogo.
[0027]Em modalidades adicionais ou alternativas, estão métodos para tratamento de um distúrbio, condição ou doença, compreendendo o método a administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um polipeptídeo de aminoácido não natural compreendendo pelo menos um aminoácido não natural contendo oxima e o resultante polipeptídeo de aminoácido não natural contendo oxima biossintético aumenta o perfil de segurança do polipeptídeo em relação ao polipeptídeo de aminoácido de ocorrência natural homólogo.
[0028]Em modalidades adicionais ou alternativas, estão métodos para tratamento de um distúrbio, condição ou doença, compreendendo o método a administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um polipeptídeo de aminoácido não natural compreendendo pelo menos um aminoácido não natural contendo oxima e o resultante polipeptídeo de aminoácido não natural contendo oxima biossintético aumenta a solubilidade em água do polipeptídeo, em relação ao polipeptídeo de aminoácido de ocorrência natural homólogo.
[0029]Em modalidades adicionais ou alternativas, estão métodos para tratamento de um distúrbio, condição ou doença, compreendendo o método a administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um polipeptídeo de aminoácido não natural compreendendo pelo menos um aminoácido não natural contendo oxima e o resultante polipeptídeo de aminoácido não natural contendo oxima biossintético aumenta a meia-vida terapêutica do polipeptídeo, em relação ao polipeptídeo de aminoácido de ocorrência natural homólogo.
[0030]Em modalidades adicionais ou alternativas, estão métodos para tratamento de um distúrbio, condição ou doença, compreendendo o método a administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um polipeptídeo de aminoácido não natural compreendendo pelo menos um aminoácido não natural contendo oxima e o resultante polipeptídeo de aminoácido não natural contendo oxima biossintético aumenta a meia-vida no soro do polipeptídeo, em relação ao polipeptídeo de aminoácido de ocorrência natural homólogo.
[0031]Em modalidades adicionais ou alternativas, estão métodos para tratamento de um distúrbio, condição ou doença, compreendendo o método a administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um polipeptídeo de aminoácido não natural compreendendo pelo menos um aminoácido não natural contendo oxima e o resultante polipeptídeo de aminoácido não natural contendo oxima biossintético prolonga o tempo de circulação do polipeptídeo, em relação ao polipeptídeo de aminoácido de ocorrência natural homólogo.
[0032]Em modalidades adicionais ou alternativas, estão métodos para tratamento de um distúrbio, condição ou doença, compreendendo o método a administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um polipeptídeo de aminoácido não natural compreendendo pelo menos um aminoácido não natural contendo oxima e o resultante polipeptídeo de aminoácido não natural contendo oxima biossintético modula a atividade biológica do polipeptídeo, em relação ao polipeptídeo de aminoácido de ocorrência natural homólogo.
[0033]Em modalidades adicionais ou alternativas, estão métodos para tratamento de um distúrbio, condição ou doença, compreendendo o método a administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um polipeptídeo de aminoácido não natural compreendendo pelo menos um aminoácido não natural contendo oxima e o resultante polipeptídeo de aminoácido não natural contendo oxima biossintético modula a imunogenicidade do polipeptídeo, em relação ao polipeptídeo de aminoácido de ocorrência natural homólogo.
[0034]Deve ficar entendido que, os métodos e composições aqui descritos não estão limitados à metodologia particular, protocolos, linhas de célula, construtores, e reagentes aqui descritos, e como tal, podem variar. Deve ficar entendido também, que, terminologia empregada destina-se à descrição das modalidades particulares somente, e não pretende limitar o escopo dos métodos e composições aqui descritos que serão limitados apenas pelas reivindicações apensas.
[0035]Como aqui empregado e nas reivindicações apensa, as formas singulares "a", "um, uma", e "o, a" incluem as referencias no plural, a menos que o contexto indique claramente o contrário.
[0036]A menos que, de outro modo indicado, todos os termos técnicos e científicos aqui empregados têm o mesmo significado dos normalmente entendidos os de habilidade habitual na técnica para os quais pertence a invenção aqui descrita. Embora quaisquer métodos, dispositivos e materiais similares ou equivalente aos descritos no presente, possam ser usados na prática ou na prova das invenções aqui descritas, os métodos preferidos, dispositivos e materiais são agora descritos.
[0037]Todas as publicações e patentes mencionadas no presente documento são ora incorporadas a título de referência com a finalidade de descrever e divulgar as construções, por exemplo, e metodologias que são descritas nas publicações, que podem ser usadas em conexão com a invenção que está sendo descrita. As publicações discutidas na presente invenção são dadas somente para a sua divulgação antes da data de depósito do presente pedido. Nada nessas publicações, deve ser considerado como uma admissão de que os inventores não tenham o direito de pré-datar tal divulgação em virtude da invenção anterior ou por qualquer outro motivo.
[0038]O termo "rótulo de afinidade", como aqui empregado refere-se a um rótulo que, reversível ou irreversivelmente liga-se a uma outra molécula, seja para modificá-la, destruí-la ou formar um composto com ela. À guisa de exemplo, rótulos de afinidade incluem, enzimas e seus substratos, ou anticorpos e seus antígenos.
[0039]Os termos "alcóxi", "alquilamino" e "alquiltio"são usados em seu sentido convencional, e referem-se a grupos alquila ligados a moléculas via um átomo de oxigênio, um grupo amino, um átomo de enxofre respectivamente.
[0040]O termo "alquila", por ele mesmo ou como parte de uma outra molécula, significa, a menos que de outro modo indicado, uma cadeia linear ou ramificada, ou radical hidrocarboneto cíclico, ou combinação destes, que podem ser totalmente saturados, uno- ou poli-insaturado e podem incluir radicais di- e multivalentes, com o número de átomos de carbono indicados (ou seja, C1-C10 significa um a dez carbonos. Exemplos de radicais hidrocarboneto saturado incluem, sem limitação, a grupos tais como metila, etila, n-propila, isopropila, n- butila, terc-butila, isobutila, sec-butila, cicloexila, (cicloexil)metila, ciclopropilmetila, homólogos e isômeros de, por exemplo, n-pentila, n-hexila, n-heptila, n-octila, e similar. Um grupo alquila insaturado é um que tem uma ou mais ligações duplas ou triplas. Exemplos de grupos alquila insaturados, incluem, sem limitação, vinila, 2- propenila, crotila, 2-isopentenila, 2-(butadienila), 2,4-pentadienila, 3-(1,4- pentadienila), etinila, 1- e 3-propinila, 3-butinila, e os maiores homólogos e isômeros. O termo "alquila" a menos que de outro modo observado, também significa a inclusão dos derivados de alquila indicados em mais detalhe a seguir, tal como "heteroalquila", "haloalquila" e "homoalquila".
[0041]O termo "alquileno" por si próprio ou como parte de uma outra molécula significa um radical divalente derivado de um alcano, como exemplificado por -(Ch2-)n, onde n pode ser1 a cerca de 24. À guisa de exemplo apenas, tais grupos incluem, sem limitação, grupos com 10 ou menos átomos de carbono tais como as estruturas -CH2CH2- e- CH2CH2CH2CH2-. Um "alquila inferior" ou "alquileno inferior"é um alquila de cadeia mais curta ou grupo alquileno, geralmente com oito ou menos átomos de carbono. O termo "alquileno", a menos que especificado diferentemente, também significa a inclusão dos grupos descritos aqui como "heteroalquileno".
[0042]O termo "aminoácido"refere-se a aminoácidos de ocorrência natural e não natural, bem como análogos de aminoácido e miméticos de aminoácido que funcionam num modo similar aos aminoácidos de ocorrência natural. Naturalmente, aminoácidos codificados são 20 aminoácidos comuns (alanina, arginina, asparagina, ácido aspártico, cisteína, glutamina, ácido glutâmico, glicina, histidina, isoleucina, leucina, lisina, metionina, fenilalanina, prolina, serina, treonina, triptofano, tirosina e valina) e pirolisina e selenocisteína. Análogos de aminoácido refere-se a compostos que têm a mesma estrutura química básica como um aminoácido de ocorrência natural, a guisa de exemplo apenas, um carbono a, que é ligado a um hidrogênio, um grupo carboxila, um grupo amino e um grupo R. tais análogos podem ter grupos R modificados (a guisa de exemplo, norleucina), ou podem ter cadeias centrais peptídicas modificadas, embora ainda dotados da mesma estrutura química básica de um aminoácido de ocorrência natural. Exemplos não limitantes de aminoácidos análogos incluem homo-serina, norleucina, sulfóxido de metionina, metionina metil sulfônio.
[0043]Aminoácidos podem ser referidos aqui por, ou seu nome, seus três símbolos de letra comumente conhecidos ou pelo símbolo de uma letra recomendado por IUPAC-IUB Biochemical Nomenclature Commission. Adicionalmente, nucleotídeos, podem ser referidos por seus códigos de única letra normalmente aceitos.
[0044]Um "grupo de modificação do terminal amino" refere-se a qualquer molécula que pode ser ligada a um grupo amino terminal. À guisa de exemplo, tais grupos amino terminais podem estar na extremidade de moléculas poliméricas, onde tais moléculas polimérica incluem, sem limitação, a polipeptídeos, polinucleotídeos e polissacarídeos. Grupos de modificação terminal incluem, sem limitação, vários polímeros hidrossolúveis, peptídeos ou proteínas. À guisa de exemplo apenas, grupos de modificação terminal incluem polietileno glicol ou soro albumina. Grupos de modificação no terminal podem ser usados para modificar características terapêuticas da molécula polimérica, incluindo, sem limitação, ao aumento da meia- vida no soro dos peptídeos.
[0045]Por "fragmento de anticorpo" significa qualquer forma de um anticorpo diferente da forma de comprimento total. Fragmentos de anticorpo aqui incluem anticorpos que são componentes menores que existem dentro dos anticorpos de comprimento total, e anticorpos que foram engenheirados. Fragmentos de anticorpo incluem sem limitação a Fv, Fc, Fab, e (Fab')2, Fv (scFv de cadeia simples, diacorpos, triacorpos, tetracorpos, anticorpos híbridos bifuncionais, CDR1, CDR2, CDR3, combinações de cDR's, regiões variáveis, regiões estruturais, regiões constantes, cadeias pesadas, cadeias leves e regiões variáveis, e moléculas que não-anticorpo "de levantamento" alternativas, anticorpos biespecíficos e similar (Maynard & Georgiou 2000, Annu, Res. Biomed. Eng. 2:339-76; Hudson, 19987, Curr. Opin, Biotechnol. 9:395-402). Uma outra subestrutura funcional é um Fv (scFv) de cadeia simples, compota de regiões variáveis da imunoglobulina de cadeia pesada e leve, covalentemente ligada por um ligante peptídico (S-z Hu et al., 1996 Cancer Research, 56, 3055-3061). Essas pequenas proteínas (Mr 25.000) retém especificidade e afinidade para antígeno num único polipeptídeo e podem proporcionar um bloqueio de construção conveniente para moléculas específicas para antígeno, maiores. A menos que de outro modo observado, as descrições e reivindicações que utilizam o termo "anticorpo" ou "anticorpos" incluem especificamente "fragmento de anticorpo" e fragmentos de anticorpo".
[0046]O termo "aromático"ou "arila" como aqui usado refere-se a uma estrutura em anel fechado que tem pelo menos um anel com um sistema de elétron- pi conjugado e inclui tanto grupos aril carbocíclico e aril heterociclico (ou "hetroarila" ou "heteroaromático"). O grupo carbocíclico ou heterocíclico pode conter de 5 a 20 átomos no anel. O termo inclui anéis monocíclicos ligados covalentemente ou grupos policíclicos de anel fundido (ou seja, anéis que dividem pares adjacentes de átomos de carbono). Um grupo aromático pode ser não substituído ou substituído. Exemplos não limitantes de grupos aromáticos ou arila incluem fenila, 1-naftila, 2- naftila, 2-naftila, 4-bifenila, antracenila e fenantracenila. Substituintes para cada um dos acima citados sistemas de anel arila e heteroarila são selecionados do grupo de substituintes aceitáveis descritos.
[0047]Por motivo de rapidez o termo "aromático"ou "arila" quando empregados em combinação com outros termos (incluindo, sem limitação, a arilóxi, ariltióxi, aralquila) inclui tanto, anéis arila e heteroarila, conforme acima. Assim. o termo "aralquila" ou "alcarila" significa a inclusão dos radicais em que um grupo arila é ligado a um grupo alquila (incluindo sem limitação a benzila, fenetila, piridilmetila e similar), incluindo os grupos alquila em que um átomo de carbono (incluindo sem limitação a grupo metileno) foi substituído por um heteroátomo, à guisa de exemplo apenas, por um átomo de oxigênio. Exemplos de tais grupos arila incluem, sem limitação, a fenoximetila, 2-piridiloximetila, 3-(1-naftilóxi)propila e similar.
[0048]O termo "arileno" como aqui empregado refere-se a um radical arila divalente. Exemplos não limitantes de "arileno" incluem fenileno, piridinileno, pirimidinileno e tiofenileno. Substituintes para grupos arileno são selecionados do grupo de substituintes aceitáveis aqui descritos.
[0049]Um "polímero bifuncional"também referido como um "ligante bifuncional"refere-se a um polímero compreendendo dois grupos funcionais que são capazes de reagir especificamente com outras frações formando ligações covalentes ou não covalentes. Tais frações podem incluir sem limitação, a grupos laterais em aminoácidos não naturais ou naturais ou peptídeos, que contém tais aminoácidos não naturais ou naturais. À guisa de exemplo, um ligante bifuncional pode ter um grupo funcional reativo com um grupo num primeiro peptídeo, e um outro grupo funcional que é reativo com um grupo num segundo peptídeo, formando assim, um conjugado que inclui o primeiro peptídeo, o ligante bifuncional e o segundo peptídeo. Muitos procedimentos e moléculas de ligação para a ligação de diversos compostos a peptídeos são conhecidos. Veja, por exemplo, o pedido de patente européia No. 188.256; patentes U.S. Nos. 4.671.958, 4.659.839, 4.414.148, 4.699.784, 4.680.338 e 4.569.789 que são incorporadas ao presente documento a título de referência. Um “polímero multifuncional” se refere a um polímero que compreende dois ou mais grupos funcionais que são capazes de reagir especificamente com outras frações. Tais frações podem incluir, sem limitação, os grupos laterais em aminoácidos não naturais ou naturais ou peptídeos que contém tais aminoácidos não naturais ou naturais (incluindo sem limitação, aos grupos laterais aminoácido) para formar ligações covalentes ou não covalentes. Um polímero bifuncional ou polímero multifuncional pode ter qualquer comprimento ou peso molecular desejado e pode ser selecionado para produzir um espaçamento ou conformação desejada específica entre uma ou mais moléculas ligadas a um composto e moléculas a que ele se liga ou ao composto.
[0050]O termo "biodisponibilidade" como aqui empregado refere-se à taxa e extensão à qual uma substância em sua fração ativa é derivada de uma forma de dosagem farmacêutica, e torna-se disponível no sítio de ação ou na circulação geral. Aumentos na biodisponibilidade referem-se ao aumento da taxa e extensão de uma substância ou de sua fração ativa é liberada de uma forma de dosagem farmacêutica e torna-se disponível no local de ação ou na circulação geral. À guisa de exemplo, um aumento na biodisponibilidade pode ser indicativa de um aumento na concentração da substância ou sua fração ativa no sangue, quando comprado a outras substâncias ou frações ativas. Um exemplo não limitante de um método para avaliação de aumentos na biodisponibilidade é dado nos Exemplos 88-92. Este método pode ser usado para avaliar a biodisponibilidade de qualquer polipeptídeo.
[0051]O termo “molécula biologicamente ativa”, “fração biologicamente ativa" ou “agente biologicamente ativo” quando usado no presente documento significa qualquer substância que pode afetar qualquer propriedade física ou bioquímica de um sistema biológico, trajeto, molécula, ou interação referente a um organismo, inclusive, sem limitação, vírus, bactérias, bacteriófago, transpóson, príon, insetos, fungos, plantas animais e seres humanos. Mais especificamente, conforme empregado no presente, moléculas biologicamente ativas incluem, sem limitação, qualquer substância destinada a diagnóstico, cura, mitigação, tratamento, ou prevenção de doença em seres humanos ou outros animais, ou para aumentar de outro modo qualquer o bem-estar físico ou mental de seres humanos ou animais. Exemplos de moléculas biologicamente ativas incluem, sem limitação, peptídeos, proteínas, enzimas, drogas de moléculas pequenas, drogas pesadas, drogas leves, carboidratos, átomos ou moléculas inorgânicas, corantes, lipídios, nucleosídeos, rádionuclídeos, oligonucleotídeos, toxinas, células, vírus, lipossomas, micropartículas e micelas. Classes de agentes biologicamente ativos que são adequados para uso com os métodos e composições aqui descritos, incluem, sem limitação, drogas, prodrogas, radionuclídeos, agentes de imageamento, polímeros, antibióticos, fungicidas, agentes antivirais, agentes antiinflamatórios, agentes antitumorais, agentes cardiovasculares, agentes ansiolíticos, hormônios, fatores de crescimento, agentes esteróides, toxinas derivadas de modo microbiano e semelhantes.
[0052]Por "modulação da atividade biológica"significa aumento ou diminuição da reatividade de um polipeptídeo, alterando a seletividade do polipeptídeo, intensificando u diminuindo a seletividade do substrato do polipeptídeo. A análise da atividade biológica modificada pode ser realizada por comparação da atividade biológica do polipeptídeo com a do polipeptídeo natural.
[0053]O termo "biomaterial" como aqui empregado refere-se a um material biologicamente derivado, incluindo, sem limitação, a material obtido de bio-reatores e/ou de métodos e técnicas recombinantes.
[0054]O termo "sonda biofísica"como aqui empregado refere-se a sondas que podem detectar ou monitorar alterações estruturais em moléculas. Tais moléculas incluem, sem limitação, a proteínas, e a "sonda biofísica"pode ser usada para detectar ou monitorar a interação de proteínas oco outras macromoléculas. Ex s de sondas biofísicas incluem, sem limitação, rótulos-spin, um fluoróforo, e grupos fotoativáveis.
[0055]O termo "biossinteticamente" conforme aqui usado, refere-se a qualquer método que utiliza um sistema de tradução (celular ou não celular), inclusive o uso de pelo menos um dos seguintes componentes: um polinucleotídeo, um códon, um tRNA e um ribossoma. À guisa de exemplo, aminoácidos não naturais podem ser "biossinteticamente incorporados" aos polipeptídeos de aminoácido não natural usando os métodos e técnicas descritos no parágrafo VIII "In vivo generation of polypeptides comprising non-natural amino acids", e no exemplo não limitante 14. Adicionalmente, os métodos para seleção de aminoácidos não naturais úteis que podem ser "biossinteticamente incorporados" aos polipeptídeos de aminoácido não natural estão descritos nos exemplos não limitantes 15-16.
[0056]O termo "análogo de biotina" ou também referido como "mímico de biotina" como aqui empregado, é qualquer molécula, diferente de biotina, que se liga com alta afinidade a avidina e/ou estreptavidina.
[0057]O termo "carbonila" como aqui usado refere-se a um grupo contendo em uma fração, selecionada do grupo consistindo de -C(O)-, -S(O)-, -S(O)2- e -C(S)- incluindo sem limitação, a grupos contendo pelo menos um grupo cetona, e/ou pelo menos um grupo aldeído, e/o pelo menos um grupo éster, e/ou pelo menos um grupo ácido carboxílico, e/ pelo menos um grupo tioéster. Tais grupos carbonila incluem cetonas, aldeídos, ácidos carboxílicos, ésteres e tioésteres. Além disso, tais grupos podem ser parte de moléculas lineares, ramificadas ou cíclicas.
[0058]O termo "grupo de modificação do terminal carbóxi"refere-se a qualquer molécula, que ode ser ligada a u grupo carbóxi terminal. À guisa de exemplo, tais grupos carbóxi terminais podem estar na extremidade das moléculas poliméricas, onde tais moléculas poliméricas incluem, sem limitação, polipeptídeo, polinucleotídeos e polissacarídeos. Grupos de modificação no terminal incluem, sem limitação, os vários polímeros hidrossolúveis, peptídeos ou proteínas. À guisa de exemplo apenas, grupos de modificação terminal incluem, polietileno glicol ou albumina do soro. Grupos de modificação terminal podem ser usados para modificar características terapêuticas da molécula polimérica, incluindo, sem imitação, ao aumento da meia-vida no soro de peptídeos.
[0059]O termo "grupo quimicamente clivável" também referido como "quimicamente instável"como aqui usado, refere-se a um grupo que rompe ou cliva, mediante exposição a ácido, base, agentes de oxidação, agentes redutores, iniciadores químicos, ou iniciadores de radical.
[0060]O termo "grupo quimioluminescente" como aqui empregado refere-se a um grupo que emite luz como resultado de uma reação química sem adição de calor. À guisa de exemplo apenas, luminol (5-amino-2,3-diidro-1,4-ftalazinodiona) reage com oxidantes como peróxido de hidrogênio (H2O2) na presença de uma base e de um catalisador de metal para preparação de um produto no estado excitado (3-aminoftalato, 3-APA).
[0061]O termo "cromóforo"como aqui empregado refere-se a uma molécula, que absorve luz de comprimentos de onda visíveis, comprimento de onda UV, ou comprimentos de onda IV.
[0062]O termo "co-fator" como aqui empregado refere-se a um átomo ou molécula essencial para ação de uma molécula grande. Co-fatores incluem, sem limitação, a íons inorgânicos, coenzimas, proteínas ou alguns outros fatores necessários para atividade das enzimas. Exemplos incluem heme em hemoglobina, magnésio em clorofila e íons metálicos para proteínas.
[0063]"Co-dobramento”, conforme empregado no presente se refere a processos, reações ou métodos de redobramento que empregam pelo menos duas moléculas, que interagem entre si e resultam na transformação de moléculas desdobradas ou inadequadamente dobradas em moléculas adequadamente dobradas. À guisa de exemplo apenas, "co-dobramento" emprega pelo menos dois polipeptídeos que interagem entre si resultando na transformação de polipeptídeos inadequadamente dobrados ou, de todo, não dobrados, em polipeptídeos nativos adequadamente dobrados. Tais polipeptídeos podem conter aminoácidos naturais e/ou pelo menos um aminoácido não natural.
[0064]Uma “janela de comparação”, conforme empregado no presente refere-se a um segmento de qualquer uma das posições contíguas usadas para comparar uma sequência a uma sequência de referência do mesmo número de posições contíguas após as duas sequências serem otimamente alinhadas. Tais posições contíguas incluem, sem limitação, a um grupo consistindo desde 20 a aproximadamente 600 unidades seqüenciais, geralmente de aproximadamente 50 a aproximadamente 200, unidades seqüenciais, e cerca de 100 a cerca de 150 unidades seqüenciais. À guisa de exemplo apenas, tais sequências incluem polipeptídeos e polipeptídeo contendo aminoácidos não naturais, com as unidades sequências, incluindo, sem limitação, aminoácidos não naturais e naturais. Além disso, à guisa de exemplo, tais sequências incluem polinucleotídeos com nucletotídeos sendo as unidades seqüenciais correspondentes. Métodos de alinhamento das sequências para comparação são conhecidos dos versados na técnica. O alinhamento ótimo de sequências para comparação pode ser conduzido, inclusive, sem limitação, pelo algoritmo de homologia local de Smith e Waterman (1970) Adv. Appl. Math. 2: 482c, pelo algoritmo de alinhamento de homologia de Needleman e Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48: 443, pelo método de busca por similaridade de Pearson e Lipman (1988) Proc. Nat’l. Acad. Sci. USA 85: 2444, por implementações computadorizadas destes algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA, e TFASTA no Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI), ou por alinhamento manual e inspeção visual (veja, por exemplo, Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology (1995 supplement)).
[0065]Um exemplo de um algoritmo que é adequado para se determinar a porcentagem de identidade de sequências e a analogia entre sequências são os algoritmos BLAST e BLAST 2.0, que são descritos em Altschul et al. (1997) Nuc. Acids Res. 25: 3389-3402, e Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215: 403-410, respectivamente. O software para se conduzir as análises por BLAST é disponível ao público através do National Center for Biotechnology Information. Os parâmetros W, T e X do algoritmo de BLAST determinam a sensibilidade e a velocidade do alinhamento. O programa BLASTN (para sequências de nucleotídeo) usa como default um comprimento de palavra (W) de 11, e uma expectativa (E) de 10, M = 5, N = -4 e uma comparação dos dois filamentos. Para sequências de aminoácidos, o programa BALSTP usa como default um comprimento de palavra de 3, uma expectativa (E) de 10 e a matriz de contagem BLOSUM62 (ver Henikoff and Henikoff (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 10915) alinhamentos (B) de 50, expectativa (E) de 10, M = 5, N = -4 e uma comparação dos dois filamentos. O algoritmo BLAST é tipicamente conduzido com o filtro de “baixa complexidade” desligado.
[0066]O algoritmo BLAST também executa uma análise estatística da analogia entre duas sequências (veja, por exemplo, Karlin e Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5873-5787). Uma medida de analogia fornecida pelo algoritmo BLAST é a probabilidade da soma (P(N)), que proporciona uma indicação da probabilidade pela qual uma correspondência entre duas sequências de nucleotídeos ou de aminoácidos ocorreria por acaso. Um ácido nucléico pode ser considerado análogo a uma seqüência de referência, por exemplo, caso a menor probabilidade de soma, em comparação com o ácido nucléico de teste ao ácido nucléico de referência fosse inferior a aproximadamente 0,2, inferior a aproximadamente 0,01 ou inferior a aproximadamente 0,001.
[0067]O termo “variantes modificadas no modo conservador” se aplica tanto a aminoácido natural como não natural e sequências de ácido nucléico natural e não natural, e combinações destas. No tocante a sequências de ácidos nucléicos específicas, “variantes modificadas de modo conservador” se refere àqueles ácidos nucléicos naturais e não naturais, que codificam sequências de aminoácidos idênticas ou essencialmente idênticas e sequências de aminoácido não natural, ou aos casos em que o ácido nucléico natural e não natural, não codifica uma seqüência de aminoácido natural ou não natural, a sequências essencialmente idênticas. Devido à degeneração do código genético, um grande número de ácidos nucléicos funcionalmente idênticos codifica qualquer proteína dada. Os códons GCA, GCC, GCG e GCU codificam todos eles o aminoácido alanina. Assim, em qualquer posição em que uma alanina é especificada por um códon, o códon pode ser alterado em qualquer um dos códons correspondentes descritos sem alterar o polipeptídeo codificado. Tais variações de ácido nucléico são “variações silenciosas”, que são uma espécie de variações modificadas de modo conservador. Assim, à guisa de exemplo, toda seqüência de ácido nucléico natural ou não natural, no presente, que codifica um polipeptídeo natural ou não natural, também descreve qualquer variação silenciosa possível do ácido nucléico natural ou não natural. Os versados na técnica reconhecerão que cada códon em um ácido nucléico natural ou não natural (exceto AUG, que é habitualmente é o único códon para metionina e TGG que é habitualmente o único códon para o triptofano) podem ser modificados para resultar em uma molécula funcionalmente idêntica. Conseqüentemente, cada variação silenciosa de um ácido nucléico natural e não natural, que codifica um polipeptídeo natural e não natural é implícita em cada seqüência descrita.
[0068]No tocante às sequências de aminoácidos, substituições, deleções ou adições individuais, a uma seqüência de ácido nucléico, de peptídeo, de polipeptídeo ou de proteína que altera, acrescenta ou deleta um único aminoácido natural ou não natural, ou uma pequena porcentagem de aminoácidos naturais ou não naturais na seqüência codificada, é uma “variante modificada de modo conservador” em que a alteração resulta na deleção de um aminoácido, adição de um aminoácido, ou substituição de um aminoácido natural ou não-natural com um aminoácido quimicamente similar. As tabelas de substituições conservadoras que fornecem aminoácidos naturais funcionalmente similares são conhecidas dos versados na técnica. Tais variantes modificadas de modo conservador são em adição e sem exclusão de variantes polimórficas, homólogos inter-espécies e alelos dos métodos e composições aqui descritos.
[0069]Cada um dos oito grupos a seguir, contém aminoácidos que são substituições conservadoras entre si: 1) Alanina (A), Glicina (G); 2) Ácido aspártico (D), Ácido glutâmico (E); 3) Asparagina (N), Glutamina (Q); 4) Arginina (R), Lisina (K); 5) Isoleucina (I), Leucina (L), Metionina (M), Valina (V); 6) Fenilalanina (F), Tirosina (Y), Triptofano (W); 7) Serina (S), Treonina (T); e 8) Cisteína (C), Metionina (M) (veja, por exemplo, Creighton, Proteins: Structures and Molecular Properties (W. H Freeman & Co.; 2a. edição (dezembro de 1993).
[0070]Os termos "cicloalquila" e "heterocicloalquila", por si próprios ou em combinação com outros termos, representam, a menos que de outro modo indicado, versões cíclicas de alquila" e "heteroalquila", respectivamente. Assim, um cicloalquila ou heterocicloalquila inclui ligações de anel saturado, parcialmente insaturado e totalmente insaturado. Adicionalmente, para heterocicloalquila, um heteroátomo pode ocupar a posição na qual é ligado o heterociclo ao restante da molécula. O heteroátomo pode incluir, mas não está limitado, a oxigênio nitrogênio ou enxofre. Exemplos de cicloalquila, incluem, sem limitação, a ciclopentila, cicloexila, 1-cicloexenila, 3-cicloexenila, cicloeptila e similar. Exemplos de heterocicloalquila incluem, sem limitação, a 1-(2,2,5,6-tetraidropiridila), 1-piperidinila, 2-piperidinila, 3-piperidinila, 4-morfolinila, 3-morfolinila, tetraidrofuran-2-ila, tetraidrofuran-3-ila, tetraidrotien-2-ila, tetraidrotien-3-ila, 1-piperazinila, 2-piperazinila e similar. Adicionalmente, o termo abrange estruturas multicíclicas, incluindo sem limitação, a estruturas de anel bicíclico e tricíclico. Similarmente, o termo "heterocicloalquileno" por ele mesmo, ou como parte de uma outra molécula significa um radical divalente derivado de heterocicloalquila, e o termo "cicloalquileno" por ele mesmo, ou como parte de uma outra molécula, significa um radical divalente derivado de cicloalquila.
[0071]O termo "ciclodextrina" como aqui empregado refere-se a carboidratos cíclicos consistindo em pelo menos seis a oito moléculas de glicose numa formação de anel. A parte eterna do anel contém grupos hidrossolúveis; no centro no anel está uma cavidade relativamente não polar capaz de acomodar pequenas moléculas.
[0072]O termo "citotóxico"como aqui empregado refere-se a u composto que danifica células.
[0073]"Agente de desnaturação"ou "desnaturante" como aqui empregado refere-se a qualquer composto ou material, que ocasionará uma desdobragem reversível de um polímero. À guisa de exemplo apenas, "agente de desnaturação"ou "desnaturante" podem causar um desdobramento reversível de uma proteína. A resistência de um agente de desnaturação ou desnaturante será determinada, tanto pelas propriedades e concentração do agente de desnaturação ou desnaturante particular. A guisa de exemplo, agentes de desnaturação, ou desnaturantes, incluem, sem limitação, caotropos, detergentes, orgânicos, solventes miscíveis em água, fosfolipídeos, ou uma combinação destes. Exemplos não limitantes de caotropos incluem, sem limitação, a uréia, guanidina, e tiocianato de sódio. Exemplos não limitantes de detergentes podem incluir, sem limitação, detergentes fortes, tais como dodecil sulfato de sódio, ou éteres de polioxietileno (por exemplo Tween ou Triton), Sarkoxyl, detergentes brandos não iônicos (por exemplo, digitonina), detergentes brandos catiônicos tais como N-2,3-(dioleioxi)- propil-N,N,N-trimetilamônio, detergentes brados iônicos (por exemplo, colato de sódio ou desoxicolato de sódio) ou detergentes zwiterionicos incluindo, sem limitação, a sulfobetaínas (Zwittergent), sulfato de 3-(3-colamidopropil) dimetilamônio-1-propano (CHAPS), e sulfonato de 3-(3- colamidopropil)dimetilamônio-2-hidróxi-1-propano (CHAPSO). Exemplos não limitantes de solventes orgânicos não miscíveis incluem, sem limitação, a acetonitrila, alcanóis inferiores (especialmente alcanóis C2 - C4 tais como etanol ou isopropanol) ou alcanodióis inferiores ( C2 - C4alcanodióis tais como etileno glicol) podem ser usados como desnaturantes. Exemplos não limitantes de fosfolipídios incluem, sem limitação, fosfolipídios de ocorrência natural, tais como fosfatidil etanolamina, fosfatidil colina, fosfatidil serina e fosfatidil inositol ou derivados de fosfolipídio sintéticos ou variantes tais como di-hexanoil fosfatidilcolina ou di heptanoil fosfatidilcolina.
[0074]O termo "rótulo detectável"como aqui empregado refere-se a um rótulo que pode ser visto usando técnicas analíticas incluindo, sem limitação, a fluorescência, quimiluminescência, elétron-spin, ressonância, espectroscopia de absorbância ultravioleta/visível, espectrometria de massa, ressonância nuclear magnética, ressonância magnética, e métodos eletroquímicos.
[0075]O termo "dicarbonila" como aqui empregado refere-se a um grupo contendo pelo menos duas frações selecionadas do grupo consistindo de -C(O)- - S(O)-, -S(O)2-, e -C(S)-, incluindo, sem limitação, grupos 1,2-dicarbonila, um grupo 1,3-dicarbonila, e grupos 1,4-dicarbonila e grupos contendo pelo menos um grupo cetona, e/ou pelo menos um grupos aldeído, e/ou pelo menos um grupo éster, e/ou pelo menos um grupo ácido carboxílico, e/ou pelo menos um grupo tioéster. Tais grupos dicarbonila incluem, dicetonas, cetoaldeídos, cetoácidos, cetoésteres e cetotioésteres. Além disso, tais grupos podem constituir parte de moléculas lineares, ramificadas ou cíclicas. As duas frações no grupo dicarbonila podem ser iguais ou diferentes, e podem incluir substituintes que produziriam, à guisa de exemplo, apenas um éster, uma cetona, um aldeído, um tioéster, ou uma amida em quaisquer das duas frações.
[0076]O termo "droga" como aqui empregado refere-se a qualquer substância empregada na prevenção, diagnose, alívio, tratamento ou cura de uma doença ou condição.
[0077]O termo "corante" como aqui empregado refere-se a uma substância solúvel, colorante, contendo um cromóforo.
[0078]O termo "quantidade eficaz" refere-se a uma quantidade suficiente de um agente ou um composto sendo administrado, que aliviará, em alguma extensão um ou mais dos sintomas a doença ou condição em tratamento. O resultado pode ser redução e/ou alívio dos sinais, sintomas ou causas de uma doença ou qualquer outra alteração desejada de um sistema biológico. À guisa de exemplo, um agente ou um composto em administração inclui, sem limitação, um polipeptídeo de aminoácido natural, polipeptídeo de aminoácido não natural, polipeptídeo de aminoácido natural modificado, ou polipeptídeo de aminoácido não modificado. Composições contendo tais polipeptídeos de aminoácido natural, polipeptídeos de aminoácido não natural, polipeptídeos de aminoácido natural modificados, ou polipeptídeos de aminoácido não natural modificados podem ser administrados para tratamentos profiláticos, de melhora, e/ou terapêuticos. Uma quantidade "eficaz" adequada em qualquer caso individual pode ser determinada com o uso de técnicas tais como um teste de escala de dose.
[0079]O termo "grupo denso de elétron"como aqui empregado refere-se a um grupo que dissemina elétrons quando irradiado com um feixe de elétron. Tais grupos incluem, sem limitação, a molibdato de amônio, iodedo de cádmio, subnitrato de bismuto, 99%, carboidrazida, cloreto férrico hexaidratado, hexametileno tetramina, 98,5%, tricloreto de índio anidro, nitrato de lantânio, acetato de chumbo triidratado, citrato de chumbo triidratado, nitrato de chumbo, ácido periódico, ácido fosfomolibdico, ácido fosfotungstítico, ferricianeto de potássio, ferrocianeto de potássio, vermelho rutênio, nitrato de prata, proteinato de prata (Ag Assay: 8,0-8,5%) "Strong", tetrafenilporfina de prata (S-TPPS), cloroaurato de sódio, tungstato de sódio, nitrato de tálio, tio-semicarbazida (TSC) acetato de uranila, nitrato de uranila, e sulfato de vanadila.
[0080]O termo "agente de transferência de energia" como aqui empregado refere-se a uma molécula que pode, ou doar ou aceitar energia de uma outra molécula. À guisa de exemplo apenas, transferência de energia por ressonância fluorescente (FRET) é um processo de acoplamento dipolo-dipolo pelo qual, a energia no estado excitado de uma molécula doadora de fluorescência é transferida não-radiativamente para uma molécula receptora não excitada que, então emite fluorescentemente a energia doada a um comprimento de onda maior.
[0081]Os termos "intensifica" ou "intensificação"significa aumento ou prolongamento ou na potência ou na duração de um desejado efeito. À guisa de exemplo "intensificação"do efeito dos agentes terapêuticos refere-se à capacidade de aumentar ou prolongar, seja na potência ou duração do efeito dos agentes terapêuticos ou durante tratamento de uma doença distúrbio ou condição. Uma "quantidade intensificadora eficaz: como aqui empregado refere-se a uma quantidade adequada par intensificar o efeito de um agente terapêutico no tratamento de uma doença, distúrbio ou condição. quando empregado num paciente, quantidades eficazes para este uso dependerá da gravidade e do curso da doença, distúrbio ou condição, terapia anterior, estado de saúde do paciente e resposta aos medicamentos e do julgamento do médico atendente.
[0082]Como aqui empregado, o termo "eucarioto" refere-se a organismos pertencentes ao domínio filogenético Eucarya, incluindo, sem limitação, a animais (incluindo sem limitação, mamíferos, insetos, répteis, pássaros, etc., ciliados, plantas (incluindo sem limitação, monocotilédones, dicotilédones, e algas), fungos, leveduras, flagelados, microsporídias, e protistas.
[0083]O termo "ácido graxo" como aqui empregado refere-se a ácidos carboxílicos com cerca de C6 ou cadeia lateral de hidrocarboneto maior.
[0084]O termo "fluoróforo"como aqui empregado refere-se a uma molécula que, com excitação, emite fótons e é, portanto, fluorescente.
[0085]Os temos "grupo funcional""fração ativa", "grupo de ativação", grupo de partida", sítio reativo", " grupo quimicamente reativo" e "fração quimicamente reativa" como aqui empregado refere-se a partes ou unidades de uma molécula na qual ocorrem reações químicas. Os termos encerram um pouco de sinonímia na técnica química e são empregados, no presente, para indicar as partes da molécula que realiza alguma função ou atividade e são reativos com outras moléculas.
[0086]O termo "halogênio"inclui flúor, cloro, iodo e bromo.
[0087]O termo "haloacila" como aqui empregado refere-se a grupos ácido, a contendo frações de halogênio, incluindo, sem limitação, a -C(O)CH3, -C(O)CF3, - C(O)CH2OCH3 e similar.
[0088]O termo "haloalquila" como aqui empregado refere-se a grupos alquila que contém frações halogênio, incluindo sem limitação, a -CF3 e -CH2CF3 e similar.
[0089]O termo "heteroalquila" como aqui empregado refere-se a cadeia linear ou ramificada, ou radicais hidrocarboneto cíclicos, ou combinações destes, consistindo de um grupo alquila e pelo menos um heteroátomo selecionado do grupo consistindo de O, N, Si e S, e onde os átomos de nitrogênio e enxofre podem, opcionalmente, ser oxidados e o heteroátomo nitrogênio pode ser, opcionalmente, quaternizado. O(s) heteroátomo(s) O, N e S e Si podem ser colocados em qualquer posição interna do grupo heteroalquila ou na posição à qual o grupo alquila é ligado ao restante da molécula. Exemplos incluem, sem limitação, -CH2-CH2-O-CH3, -CH2- CH2-NH-CH3, -CH2-CH2-N(CH3)-CH3, -CH2-S-CH2-CH3, -CH2-CH2-S(O)2-CH3, - CH=CH-O-CH3, -Si(CH3)3 , -CH2-CH=N-OCH3, e -CH=CH-N(CH3)-CH3-. Além disso até dois heteroátomos podem ser consecutivos como, por exemplo, -CH2-NH-OCH3, e -CH2-O-Si(CH3)3.
[0090]O termo "heteroalquileno" como aqui empregado refere-se a um radical divalente derivado de heteroalquila, como exemplificado, se limitação por - CH2-CH2-S-CH2-CH2- e -CH2-S-CH2-CH2-NH-CH2. Para grupos heeroalquileno, heteroátomos iguais ou diferentes também podem ocupar quaisquer ou ambos os terminais da cadeia (incluindo, porém sem limitação a alquileneóxi, alquilenodióxi, alquilenoamino, alquilenodiamino, amino-oxialquileno, e similar) Ainda para grupos de ligação alquileno e heteroalquileno, nenhuma orientação do grupo de ligação é implicado pela orientação em que a fórmula do grupo de ligação é escrita. À guisa de exemplo, a fórmula -C(O)2R'- representa tanto -C(O)2R'- como -R'C(O)2-.
[0091]O termo "heteroarila" ou "heteroaromático"como aqui usado refere-se a grupos arila que contém pelo menos um heteroátomo selecionado dentre N, O e S, onde os átomos de nitrogênio e enxofre podem ser opcionalmente oxidados, e os átomos de nitrogênio, podem ser opcionalmente quaternizados, Grupos heteroarila podem ser substituídos ou não substituídos. Um grupo heteroarila pode ser ligado ao restante da molécula através de um heteroátomo. Exemplos não limitantes de grupos heteroarila incluem 1-pirrolila, 2-pirrolila, 3-pirrolila, 3-pirazolila, 2-imidazolila, 4-imiazolila, pirazinila, 2-oxazolila, 4-oxazolila, 2-fenil-4-oxazolila, 5-oxazolila, 3- isoxazolila, 4-isoxazolila, 5-isoxazolila, 2-tiazolila, 4-tiazolila, 5-tiazolila, 2-furila, 3- furila, 2-tienila, 3-tienila, 2-piridila, 3-piridila, 4-piridila, 2-pirimidila, 4-pirimidila, 5- benzotiazolila, purinila, 2-benzimidazolila, 5-indolila, 1-isoquinolila, 5-isoquinolila, 2- quinoxalinila, 5-quinoxalinila, 3-quinolila e 6quinolila.
[0092]O termo "homoalquila" como aqui empregado refere-se a grupos alquila que são grupos hidrocarboneto.
[0093]O termo "idêntico"como aqui empregado refere-se a duas ou mais sequências ou subsequências que são iguais. Além disso, o termo "substancialmente idêntico"como aqui empregado refere-se a duas ou mais sequências que têm uma porcentagem de unidades seqüenciais que são iguais, quando comparado e alinhado para correspondência máxima numa janela de comparação, ou região nomeada como medido usando algoritmos de comparação ou por alinhamento manual e inspeção visual. À guisa de exemplo apenas, duas ou mais seqüência podem ser "substancialmente idênticas"caso as unidades sequências sejam cerca de 60% idêntica,s cerca de 65% idênticas, cerca de 70% idênticas, cerca de 75% idênticas, cerca de 80% idênticas, cerca de 85% idênticas, cerca de 90% idênticas, ou cerca de 95% idênticas sobre uma região específica. Tais porcentagens descrêem a identidade percentual" de duas ou mais sequências. A identidade de uma seqüência pode existir numa região, que é pelo menos cerca de 75-100 de unidades seqüenciais em comprimento, sobre uma região que é cerca de 50 de unidades seqüenciais em comprimento ou, onde não especificado, por toda a seqüência. Esta definição também se refere ao complemento de uma seqüência de teste. A guisa de exemplo apenas, duas ou mais sequências de polipeptídeo são idênticas, quando os resíduos de aminoácido são iguais, enquanto duas ou mais sequências de polipeptídeo são "substancialmente idênticas"se os resíduos de aminoácido forem cerca de 60% idênticos, cerca de 65% idênticos, cerca de 70% idênticos, cerca de 75% idênticos, cerca de 80% idênticos, cerca de 85% idênticos, cerca de 90% idênticos, ou cerca de 95% idênticos sobre uma região específica. A identidade pode existir numa região que é pelo menos cerca de 75-100 aminoácidos em comprimento, sobre uma região que é cerca de 50 aminoácidos em comprimento, ou onde não especificado, por toda a seqüência integral de uma seqüência de polipeptídeo. Além disso a guisa de exemplo apenas, duas ou mais sequências de polinucleotídeo são idênticas quando os resíduos de ácido nucléico são iguais, enquanto duas ou mais sequências de polinucleotídeo são "substancialmente idênticas"caso os resíduos de ácido nucléico forem cerca de 60% idênticos, cerca de 65% idênticos, cerca de 70% idênticos, cerca de 75% idênticos, cerca de 80% idênticos, cerca de 85% idênticos, cerca de 90% idênticos, ou cerca de 95% idênticos sobre uma dada região. a identidade pode existir sobre uma região que é pelo menos cerca de 75-100 ácido nucléicos em comprimento, sobre uma região que tem cerca de 50 ácidos nucléicos em comprimento, o onde não especificado, por toda a seqüência integral de uma seqüência de polinucleotídeo.
[0094]Para comparação das sequências, tipicamente uma sequência age como uma sequência de referência, para a qual sequências teste são comparadas. Quando do uso de um algoritmo de comparação de seqüência, seqüências de teste e de referência, são programadas num computador, coordenadas subseqüentes são nomeadas, caso necessário, e parâmetros de programa de algoritmo de seqüência são nomeados. Parâmetros de programa de default podem ser usados, ou parâmetros alternativos podem ser indicados. O algoritmo da comparação de seqüência então calcula as identidades de seqüência percentuais parra as sequências teste, relativo à seqüência de referência, com base nos parâmetros do programa.
[0095]O termo "imunogenicidade" como aqui empregado refere-se a uma resposta do anticorpo para administração de uma droga terapêutica. A imunogenicidade no tocante a polipeptídeos de aminoácido não natural terapêuticos pode ser obtida usando ensaios quantitativos e qualitativos para detectar anticorpos de polipeptídeos de aminoácido que não, não naturais, em fluidos biológicos. Tais ensaios, incluem, sem limitação a Radioimunoensaio(RIA), Ensaio Imunoabsorvente ligado a enzima(ELISA), Imunoensaio Luminescente (LIA) e Imunoensaio Fluorescente (FIA). A análise da imunogenicidade no tocante a polipeptídeos de aminoácido não natural terapêuticos envolve a comparação da resposta do anticorpo com administração dos polipeptídeos de aminoácido não natural terapêuticos para a resposta ao anticorpo com administração dos polipeptídeos de aminoácido natural terapêuticos.
[0096]O termo "agente de intercalação" também referido como um "grupo de intercalação"como aqui empregado refere-se a um agente químico que pode inserir ao espaço intramolecular de uma molécula do espaço intermolecular entre moléculas. À guisa de exemplo apenas, um agente de intercalação ou grupo pode ser uma molécula, que se insere às bases empilhadas da hélice dupla de DNA.
[0097]O termo "isolado" como aqui empregado refere-se à separação e remoção de um componente de interesse dos componentes sem interesse. Substâncias isolada podem estar ou no estado seco ou semi-seco, ou em solução, incluindo sem limitação, a uma solução aquosa. O componente isolado pode estar num estado homogêneo ou o componente isolado pode ser uma parte de uma composição farmacêutica que compreende veículos farmaceuticamente aceitáveis adicionais e/ou excipientes. A pureza e homogeneidade pode ser determinada usando técnicas de química analítica incluindo, sem limitação, eletroforese de gel de poliacrilamida ou cromatografia líquida de alto desempenho. Além disso, quando um componente de interesse é isolado e é a espécie predominante presente numa preparação, o componente é descrito aqui como substancialmente purificado. O termo "purificado" como aqui empregado refere-se a um componente de interesse que é pelo menos 85% puro, pelo menos 90% puro, pelo menos 95% puro, pelo menos 99% ou mais puro. À guisa de exemplo apenas, ácidos nucléicos ou proteínas são "isolados" quando tais ácidos nucléicos ou proteínas são isentos de pelo menos alguns dos coes celulares com os quais ele/ela está associado(a) no estado natural, ou que o ácido nucléico ou proteína tenha sido concentrado(a) a um nível maior do que a concentração de sua produção in vivo ou in vitro. Também, à guisa de exemplo, um gene é isolado quando separado dos quadros de leitura abertos que flanqueiam o gene e codificam uma proteína diferente do gene de interesse.
[0098]O termo "rótulo"como aqui empregado refere-se a uma substância que é incorporada a um composto sendo prontamente detectado, pelo que sua distribuição física pode ser detectada e/ou monitorada.
[0099]O termo “ligação” é empregado no presente, para referir-se a ligações ou fração química formados como resultado de uma reação química entre o grupo funcional de um linker e uma outra molécula. Tais ligações podem incluir, sem limitação, ligações covalentes e ligações não covalentes, embora tais frações químicas possam incluir, sem limitação, ésteres, carbonatos, iminas, ésteres de fosfato, hidrazonas, acetais ortoésteres, ligações peptídicas, e ligações de oligonucleotídeos. Ligações hidroliticamente estáveis significam que as ligações são substancialmente estáveis em água e não reagem com água a valores de pH úteis, incluindo, sem limitação, em condições fisiológicas durante um período prolongado de tempo, talvez até mesmo indefinidamente. Ligações hidroliticamente instáveis ou degradáveis significam que as ligações são degradáveis em água ou em soluções aquosas, incluindo, por exemplo, sangue. Ligações enzimaticamente instáveis ou degradáveis significam que a ligação pode ser degradada por uma ou mais enzimas. À guisa de exemplo apenas, PEG e polímeros correlatos podem incluir ligações degradáveis na cadeia central do polímero ou no grupo linker entre a cadeia central do polímero e um ou mais dos grupos funcionais terminais da molécula de polímero. Tais ligações degradáveis incluem sem limitação, a ligações éster formadas pela reação de ácidos carboxílicos de PEG ou de ácidos carboxílicos de PEG ativados com grupos álcool em um agente biologicamente ativo, geralmente são hidrolisados em condições fisiológicas para liberar o agente biologicamente ativo. Outras ligações hidroliticamente degradáveis incluem, sem limitação, ligações carbonato; ligações imina resultantes da reação de uma amina e um aldeído; ligações éster de fosfato formadas por reação de um álcool com um grupo fosfato; ligações hidrazona que são produtos de reação de uma hidrazida e um aldeído; ligações acetal que são o produto de reação de um aldeído e um álcool; ligações ortoéster que são o produto de reação de um formiato e um álcool; ligações peptídeo formadas por um grupo amino, incluindo, sem limitação, em uma extremidade de um polímero tal como PEG, e um grupo carboxila de um peptídeo; e ligações oligonucleotídeo formadas por um grupo fosforamidita, inclusive, sem limitação, na extremidade de um polímero, e um grupo 5’-hidroxila de um oligonucleotídeo.
[00100]Os termos “meio” ou "meios" incluem qualquer meio de cultura, usado para crescimento e coleta de células e/ou produtos expressados e/ou secretados por tais células. Tal "meio" ou "meios" incluem, sem limitação, solução, sólido, semi-sólido ou suportes rígidos que possam servir de suporte ou contenção de qualquer célula hospedeira ou, incluindo, células hospedeiras bacterianas, células hospedeiras eucarióticas, células hospedeiras de mamíferos, células hospedeiras de levedura, células hospedeiras de insetos, células hospedeiras vegetais, células CHO, células hospedeiras procarióticas, células hospedeiras de E. coli ou de Pseudomonas, e conteúdo celular. Tal "meio" ou "meios" abrangem tampões ou reagentes que contenham lisados de células hospedeiras, tal como no caso em que um polipeptídeo produzido intracelularmente e as células hospedeiras são lisadas ou destruídas para liberar o polipeptídeo.
[00101]O termo "metabólito"como aqui empregado refere-se a um derivado de um composto, à guisa de exemplo, polipeptídeo de aminoácido natural, um polipeptídeo de aminoácido não natural, um polipeptídeo de aminoácido natural modificado, ou um polipeptídeo de aminoácido não natural modificado, que é formado quando o composto, à guisa de exemplo, polipeptídeo de aminoácido natural, polipeptídeo de aminoácido não natural, polipeptídeo de aminoácido natural modificado ou polipeptídeo de aminoácido não natural modificado, é metabolizado. O ermo "metabólito farmaceuticamente atiço"ou "metabólito ativo" refere-se a um derivado biologicamene ativo de um composto, à guisa de exemplo, polipeptídeo de aminoácido natura, um polipeptídeo de aminoácido não natural, um polipeptídeo de aminoácido natural modificado ou um polipeptídeo de aminoácido não natural modificado, que é formado, quando um tal composto, à guisa de exemplo, um polipeptídeo de aminoácido natural, um polipeptídeo de aminoácido não natural, um polipeptídeo de aminoácido natural modificado ou um polipeptídeo de aminoácido não natural modificado, é metabolizado.
[00102]O termo "metabolizado", como aqui empregado refere-se à soma dos processos pelos quais uma dada substância é alterada por um organismo. Tais processos, incluem, sem limitação, reações de hidrólise e reações catalisadas por enzimas. Mais informações acerca do metabolismo podem ser obtidas de The Pharmacological Basis of therapeutics, 9aEdition, McGraw-Hill (1996). À guisa de exemplo apenas, os metabólitos de polipeptídeos de aminoácido natural, polipeptídeos de aminoácido não natural, polipeptídeos de aminoácido natural modificados ou polipeptídeos de aminoácido não natural modificados podem ser identificados, seja por administração dos polipeptídeos de aminoácido natural, polipeptídeos de aminoácido não natural, polipeptídeos de aminoácido natural modificados ou polipeptídeos de aminoácido não natural modificados a um hospedeiro e análise de amostras de tecido do hospedeiro, ou por incubação dos polipeptídeos de aminoácido natural, polipeptídeos de aminoácido não natural, polipeptídeos de aminoácido natural modificados, ou polipeptídeos de aminas não natural modificados com células hepáticas in vitro e análise dos compostos resultantes.
[00103]O termo "quelante metálico"como aqui empregado refere-se a uma molécula que forma um complexo metálico com íons metálicos. À guisa de exemplo, tais moléculas podem formar duas ou mais ligações coordenadas, com um íon metálico central e podem formar estruturas de anel.
[00104]O termo "fração contendo metal" como aqui empregado refere-se a um grupo contendo um íon metálico, um átomo ou partícula. Tais frações incluem, sem limitação, cisplatina, íons metais quelados (tais como níquel, ferro e platina) e nanopartículas metálicas (tais como níquel, ferro e platina).
[00105]O termo "fração contendo metal" como aqui empregado, refere-se a um grupo incorporando um íon de átomo que é comumente mais pesado do que o carbono. Tais íons ou átomos incluem, sem limitação, silício, tungstênio, ouro, chumbo e urânio.
[00106]O termo "modificado" como aqui empregado refere-se à presença de uma alteração em um aminoácido natural, um aminoácido não natural, um polipeptídeo de aminoácido natural ou um polipeptídeo de aminoácido não natural. Tais alterações ou modificações podem ser obtidas por modificações pós-síntese de aminoácidos naturais, aminoácidos não naturais, polipeptídeos de aminoácido natural ou polipeptídeos de aminoácido não natural ou por co-traducional ou por modificações pós-trducionais de aminoácidos naturais, aminoácidos não naturais, polipeptídeo de aminoácido natural ou polipeptídeos de aminoácido não natural. A forma "modificada ou não modificada" significa que o aminoácido natural, aminoácido não natural, polipeptídeo de aminoácido natural ou polipeptídeo de aminoácido não natural que está em debate, sejam opcionalmente modificado, ou seja, o aminoácido natural, aminoácido não natural, polipeptídeo de aminoácido natural ou polipeptídeo de aminoácido não natural em debate podem ser modificados ou não modificados.
[00107]Como aqui empregado, o termo “modulação da meia-vida sérica” significa a alteração positiva ou negativa na meia-vida circulante de uma molécula biologicamente ativa modificada, em relação à sua forma não modificada. À guisa de exemplo, as moléculas modificadas biologicamente ativas, incluem, sem limitação, aminoácido natural, aminoácido não natural, polipeptídeo de aminoácido natural ou polipeptídeo de aminoácido não natural. A guisa de exemplo, a meia-vida sérica é medida tirando-se amostras de sangue em diversos pontos no tempo depois da administração da molécula biologicamente ativa e molécula modificada biologicamente ativa, determinando-se a concentração daquela molécula em cada amostra. A correlação da concentração sérica com o tempo permite o cálculo da meia-vida sérica. A guisa de exemplo, a meia-vida sérica modulada, pode ter um aumento na meia-vida sérica, nos casos, por exemplo, em que se permite um regime de dosagem satisfatório e evita um efeito tóxico. Em algumas modalidades, tais aumentos no soro podem ser de pelo menos duas vezes, pelo menos cerca de três vezes, de pelo menos aproximadamente cinco vezes, ou de pelo menos aproximadamente dez vezes. Um exemplo não limitante de um método para se avaliar incrementos na media-vida séria é dado nos Exemplos 88-92. Este método pode ser usado para se avaliar a meia-vida sérica de qualquer polipeptídeo.
[00108]O termo “modulação da meia-vida terapêutica”, conforme empregado significa a alteração positiva ou negativa na meia vida da quantidade terapeuticamente efetiva da molécula modificada biologicamente ativa, em relação à sua forma não modificada. As moléculas modificadas, biologicamene ativas, incluem, sem limitação, aminoácido natural, aminoácido não natural, polipeptídeo de aminoácido natural ou polipeptídeo de aminoácido não natural.
[00109]A guisa de exemplo, a meia-vida terapêutica é medida medindo-se as propriedades farmacocinéticas e/ou farmacodinâmicas da molécula em diversos pontos no tempo após administração. Um aumento da meia-vida terapêutica permite, de preferência, um regime de dosagem benéfico específico, uma dose total benéfica específica, uma dose total benéfica particular, ou evita um efeito indesejável. Em algumas modalidades, um aumento de meia-vida terapêutica pode resultar no aumento da potência, do aumento ou da redução da ligação da molécula modificada ao seu alvo, do aumento ou da redução em um outro parâmetro ou mecanismo de ação da molécula não modificada ou num aumento ou redução em um outro parâmetro ou mecanismo de ação da molécula não modificada ou um rompimento aumentado ou reduzido de moléculas por enzimas, tais como à guisa de exemplo apenas, proteases. Um exemplo não limitante de um método para avaliar incrementos na meia-vida terapêutica e dado nos exemplos 88-92. Este método pode ser empregado na avaliação da meia-vida terapêutica de qualquer polipeptídeo.
[00110]O termo "nanopartícula"como aqui empregado refere-se a uma partícula que tem um tamanho de partícula entre cerca de 500 nm a cerca de 1 nm.
[00111]O termo "quase-estequiométrico"como aqui empregado refere-se à relação dos moles dos compostos que participam numa reação química seno de cerca de 0,75 a cerca de 1,5.
[00112]Como aqui empregado, o ermo "não-eucarioto"refere-se a organismos não eucarióticos. A guisa de exemplo, um organismo não eucariótico pode pertencer à Eubactéria (que inclui, sem limitação, Escherichia coli, Thermus thermophilus, ou Bacillus searothermophilus, Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas putida), domínio filogenético ou a Archaea, que inclui, sem limitação, Methanococcus jannaschii, Methanobacterium thermoautotrophicum, Archaeoglobus fulgidus, Pyrococcus furiosus, Pyrococcus horikoshii, Aeuropyrum pernix, ou Halobacterium, al como Haloferax volcanii e Halobacterium espécies NRC-1 ou domínio filogenético.
[00113]Um "aminoácido não natural" refere-s a um aminoácido que não é um dos 20 aminoácidos comuns ou pirolisina ou selenocisteína. Outros termos que podem ser usados sinonimicamente, como termo "aminoácido não natural"é aminoácido codificado de modo não natural"aminoácido que não natural""aminoácido de ocorrência não natural" e várias versões hifenizadas e não hifenizadas destes. O termo "aminoácido não natural" inclui, sem limitação, aos aminoácidos que ocorrem naturalmente por modificação de um aminoácido naturalmente codificado (incluindo sem limitação aos 20 aminoácidos comuns ou pirolisina e selenocisteína), mas não eles mesmos incorporados naturalmente em uma cadeia polipeptídica em crescimento pelo complexo de tradução. Exemplos de tais aminoácidos não naturalmente codificados incluem, sem limitação, N-acetil- glicosaminil-L-serina, N-acetil glicosaminil-L-treonina e O-fosfo-tirosina. Adicionalmente, o termo "aminoácido não natural" inclui, sem limitação, os aminoácidos que não ocorrem naturalmente e podem ser obtidos sinteticamente ou podem ser obtidos por modificação dos aminoácidos não naturais.
[00114]O termo "ácido nucléico"como aqui empregado, se refere a desóxi- ribonucleotídeos, desóxi-ribonucleosídeos, ribonucleosídeos, ou ribonucleotídeos e seus polímeros, ou na forma de um único filamento ou de dois filamentos. A guisa de exemplo, tais ácidos nucléicos e polímeros de ácido nucléico, que contêm i) análogos conhecidos de nucleotídeos naturais que têm propriedades de ligação análogas às do ácido nucléico de referência e são metabolizados de um modo análogo ao dos nucleotídeos que ocorrem naturalmente. (ii) análogos de oligonucleotídeos que incluem PNA (ácido peptidonucléico), análogos de DNA usados na tecnologia de anti-sentido (fosforotioatos, fosforoamidatos e semelhantes); (iii) variantes conservadoramente modificadas destes (inclusive, sem limitação, substituições de códons degenerados) e sequências complementares assim como a seqüência explicitamente indicada. A guisa de exemplo, substituições de códons degenerados podem ser efetuadas gerando-se sequências em que a terceira posição de um ou mais códons selecionados (ou de todos) é substituída com resíduos de base mista e/ou desoxi-inosina (Batzer et al., Nucleic Acid Res. 19: 5081 (1991); Ohtsuka et al., J. Biol. Chem. 260: 2605-2608 (1985); Rossolini et al., Mol. Cell. Probes 8: 91-98 (1994)).
[00115]O termo "agente de oxidação"como aqui empregado refere-se a um composto ou material que é capaz de remover um elétron de um composto que está sendo oxidado. À guisa de exemplo, agentes oxidantes adequados incluem sem limitação, glutationa oxidada, cistina, cistamina, ditiotreitol oxidado, eritreitol oxidado e oxigênio. Os versados na técnica observarão prontamente que uma ampla variedade de agentes oxidantes serão adequados para uso nos métodos e composições aqui descritos.
[00116]O termo "farmaceuticamente aceitável"como aqui empregado refere- se a um material incluindo, sem limitação, um sal, veículo, ou diluente que não abrroga a atividade biológica ou propriedades do composto, e é relativamente não tóxico, ou seja, o material pode ser administrado a um indivíduo sem ocasionar efeitos biológicos indesejáveis ou interagir num modo prejudicial com quaisquer componentes da composição em que ele está contido.
[00117]O termo "rótulo de foto-afinidade, como aqui empregado refere-se a um rótulo com um grupo, que, com exposição à luz, forma uma ligação com uma molécula, para a qual o rótulo tem uma afinidade. À guisa de exemplo, uma tal ligação pode ser covalente ou não covalente.
[00118]O termo "fração foto-encerrada" como aqui empregado refere-se a um grupo que, com iluminação e determinados comprimentos de onda, liga covalentemente ou não, outros íons ou moléculas.
[00119]O termo "grupo foto-clivável"como aqui empregado refere-se a um grupo que rompe-se com exposição à luz.
[00120]O termo "foto-reticulador" como aqui empregado refere-se a um composto compreendendo dois ou mais grupos funcionais que, com exposição à luz, são reativos e formam uma ligação covalente ou não covalente com duas ou mais moléculas monoméricas ou polimérica.
[00121]O termo “fração fotoisomerizável” como aqui empregado refere-se a um grupo onde, com a iluminação com alterações na fonte de luz de uma forma isomérica, forma uma outra.
[00122]O termo "polialquileno glicol", como aqui empregado, refere-se a poliéter polióis poliméricos lineares ou ramificados. Tais polialquileno glicóis, incluindo, sem limitação, polietileno glicol, polipropileno glicol, polibutileno glicol e seus derivados. Outras modalidades exemplares, por exemplo, em catálogos de fornecedores comerciais tais como o catálogo de Shearwater Corporation “Poliethylene Glycol and Derivatives for Biomedical Applications” (2001). À guisa de exemplo apenas, tais poliéter polióis poliméricos têm pesos moleculares médios entre cerca de inclusive, sem limitação, entre cerca de 100 Da e cerca de 100.000 Da ou mais. O peso molecular do polímero pode estar entre cerca de 100 Da e cerca de 100.000 Da, incluindo, sem limitação, a 100.000 Da, 95.000 Da, 90.000 Da, 85.000 Da, 80.000 Da, 75.000 Da, 70.00 Da, 65.000 Da, 60.000 Da, 55.000 Da, 50.000 Da, 45.000 Da, 40.000 Da, 35.000 Da. 30.000 Da, 25.000 Da, 20.000 Da, 15.000 Da, 10.000 Da, 9.000 Da, 8.000 Da, 7.000 Da, 6.000 Da, 5000 Da, 4.000 Da, 3.000 Da, 2.000 Da, 1.000 Da, 900 Da, 800 Da, 700 Da, 600 Da, 500 Da, 400 Da, 300 Da, 200 Da, e 100 Da. Em algumas modalidades, o peso molecular do polímero fica entre cerca de 100 Da e 50.000 Da. Em algumas modalidades, o peso molecular do polímero fica entre cerca de 100 Da e 40.000 Da. Em algumas modalidades, o peso molecular do polímero fica entre cerca de 1.000 Da e 40.000 Da. Em algumas modalidades, o peso molecular do polímero fica entre cerca de 5.000 Da e 40.000 Da. Em algumas modalidades, o peso molecular do polímero fica entre cerca de 10.000 Da e 40.000 Da. Em algumas modalidades, a molécula de polietileno glicol é um polímero ramificado. O peso molecular do PEG de cadeia ramificada pode ser entre cerca de 1.000 Da, e cerca de 100.000 Da, incluindo, sem limitação, a 100.000 Da, 95.000 Da, 90.000 Da, 85.000 Da, 80.000 Da, 75.000 Da, 70.000 Da, 65.000 Da, 60.000 Da, 55.000 DA, 50.000 Da, 45.000 Da, 40.000 Da, 35.000 Da, 30.000 Da, 25.000 Da, 20.000 Da, 15.000 Da, 10.000 Da, 9.000 Da, 8.000 Da, 7.000 Da, 6.000 Da, 5000 Da, 4.000 Da, 3.000 Da, 2.000 Da e 1.000 Da. Em algumas modalidades, o peso molecular de PEG de cadeia ramificada fica entre cerca de 1.000 Da e 50.000 Da. Em algumas modalidades, o peso molecular do PEG de cadeia ramificada fica entre cerca de 1.000 Da e 40.000 Da. Em algumas modalidades, o peso molecular do PEG de cadeia ramificada fica entre cerca de 5.000 Da e 40.000 Da. Em algumas modalidades, o peso molecular do PEG de cadeia ramificada fica entre cerca de 5.000 Da e 20.000 Da.
[00123]O termo "polímero"como aqui empregado refere-se a uma molécula composta de subunidades repetidas. Tais moléculas incluem, sem limitação, polipeptídeos, polinucleotídeos, ou polissacarídeos ou polialquileno glicóis.
[00124]Os termos "polipeptídio", "peptídeo"e proteína" são usados permutavelmente no presente referido-se a um polímero de resíduos de aminoácido. Ou seja, uma descrição direcionada a um polipeptídeo aplica-se igualmente a uma descrição de um peptídeo, uma descrição de uma proteína e vice-versa. Os termos aplicam-se a polímeros de aminoácido de ocorrência natural, bem como a polímeros de aminoácido em que um ou mais resíduos de aminoácido é um aminoácido não natural. Adicionalmente, tais "polipeptídeos", "peptídeos"e proteínas"incluem cadeias de aminoácido de qualquer comprimentos, incluindo proteínas de comprimento total, onde os resíduos de aminoácido são ligados por pontes peptídicas covalentes.
[00125]O termo "pós-traducionalmente modificado" refere-se a qualquer modificação de um aminoácido natural ou não natural, que ocorre após um tal aminoácido ter sido incorporado tradicionalmente à cadeia polipeptídica. Tais modificações incluem sem limitação a modificações co-traducionais in vivo, modificações co-traducionais in vitro (tais como o sistema de tradução isento de célula), modificações pós-traducinais in vivo e modificações pós-traducionais in vitro.
[00126]Os termos "prodroga" ou "droga farmaceuticamente aceitável"como aqui empregado refere-se a um agente que é convertido numa droga de origem in vivo ou in vitro, que não abrroga a atividade biológica ou propriedades da droga, e é relativamente não tóxico, ou seja, o material pode ser administrado a um indivíduo sem ocasionar efeitos biológicos indesejáveis, ou interagir num modo prejudicial com quaisquer componentes da composição, em que ele está contido. Prodrogas são em geral, precursores de droga, que, seguinte administração a um indivíduo e subseqüente absorção, são convertida numa espécie ativa, ou uma espécie mais ativa via algum processo, tal como conversão por um trajeto metabólico. Algumas prodrogas têm um grupo químico presente na prodroga que o torna menos ativa, e/ou confere solubilidade ou alguma outra propriedade à droga. Uma vez o grupo químico ser clivado e/ou modificado da prodroga a droga ativa é gerada. Prodrogas são convertidas numa droga ativa dentro do corpo por meio de reações enzimáticas ou não enzimática. Prodrogas podem fornecer propriedades físico-químicas tais como melhor solubilidade, características de distribuição aperfeiçoadas, tais como especificidade ao alvo de uma célula, tecido órgão ou ligante particular, e valor terapêutico melhorado da droga. Os benefícios de tais prodrogas, incluem, sem limitação (i) facilidade de administração comparado com a droga de origem; (ii) a prodroga pode ser biodisponível para administração oral, enquanto a droga de origem não o é; e (iii) a prodroga também pode ter melhor solubilidade nas composições farmacêuticas, comparada com a droga de origem. Uma prodroga inclui um derivado farmacologicamente inativo, ou de atividade reduzida de uma droga ativa. Prodrogas podem ser destinadas a modular a proporção doe uma droga ou molécula biologicamente ativa que atinge um desejado sítio de ação através da manipulação das propriedades de uma droga, tal como propriedades físico-químicas, biofarmaceuticas ou farmacocinéticas. Um exemplo, sem limitação, de uma prodroga seria um polipeptídeo de aminoácido não natural administrado como um éster a “prodroga”)) a fim de facilitar a transmissão através da membrana celular, onde a solubilidade em água é prejudicial à mobilidade, porém que a seguir, é metabolicamente hidrolisada ao ácido carboxílico, a entidade ativa, uma vez dentro da célula onde a solubilidade em água é benéfica. Prodrogas podem ser produzidas como derivados reversíveis de droga, para uso como modificadores para intensificar o transporte da droga para os tecidos específicos ao sítio.
[00127]O termo "quantidade profilaticamente eficaz", como aqui empregado refere-se àquela quantidade de uma composição contendo pelo menos um polipeptídeo de aminoácido não natural ou pelo menos um polipeptídeo de aminoácido não natural modificado, profilaticamente aplicado a um paciente, que terá algum alívio de um ou mais modos sintomas de uma doença, condição ou distúrbio em tratamento. Em tais aplicações profiláticas, tais quantidades podem depender do estado de saúde do paciente, peso e similar. Considera-se inserido na habilidade da técnica, a determinação de tais quantidades profilaticamente eficazes por experimentação rotineira, incluindo, sem limitação, a teste clínico de escalação de dose.
[00128]O termo "protetor”, como aqui empregado refere-se à presença de um "grupo protetor" ou fração que previne a reação do grupo funcional quimicamente reativo sob determinadas condições de reação. O grupo protetor irá variar dependendo do tipo de grupo quimicamente reativo sendo protegido. À guisa de exemplo apenas, (i) caso o grupo quimicamente reativo seja uma amina ou uma hidrazida, o grupo protetor pode ser selecionado de terc-butiloxicarbonila (t-Boc) e 9- fluorenilmetoxicarbonila (Fmoc); (ii) caso o grupo quimicamente reativo seja um tiol, o grupo protetor pode ser dissulfeto de ortopiridila; e (iii) caso o grupo quimicamente reativo seja um ácido carboxílico, ta como ácido butanóico ou propiônico, ou um grupo hidroxila, o grupo protetor pode ser benzila ou um grupo alquila tal como metila, etila, ou terc-butila.
[00129]A guisa de exemplo apenas, grupos de bloqueio/protetores também pode ser selecionados de:
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[00130]Adicionalmente, grupos protetores incluem, sem limitação, grupos fotoinstáveis tais como Nvoc e MeNvoc e outros grupos protetores conhecidos da técnica. Outros grupos protetores estão descritos em Greene and Wuts, Protective Groups in Organic Synthesis, 3a. Ed. John Wiiley & sons, New York, NY, 1999, ora incorporado por referência de modo integral.
[00131]O termo “fração radioativa” como aqui empregada refere-se a um grupo cujo núcleo emite radiação nuclear, tal como partículas alfa, beta ou gama; onde as partículas alfa são núcleo de hélio, partículas beta são elétrons, e partículas gama são fótons de alta energia.
[00132]O termo "composto reativo" como aqui empregado refere-se a um composto que, sob condições adequadas é reativo no tocante a outro átomo, molécula ou composto.
[00133]O termo "célula hospedeira recombinante"também referido como "células hospedeira", refere-se a uma célula que inclui um polinucleotídeo exógeno, onde os métodos usados para inserir o polinucleotídeo exógeno a uma célula incluem, sem limitação a, absorção direta, transdução, conjugação-f, ou outros métodos conhecidos na técnica para criar células hospedeiras recombinantes. O polinucleotídeo exógeno pode ser um vetor não integrado, incluindo sem limitação, a um plasmídeo, ou alternativamente, pode ser integrado ao genoma hospedeiro.
[00134]O termo "agente redox-ativo" como aqui empregado refere-se a uma molécula que, oxida ou reduz uma outra molécula, pela qual o agente redox ativo torna-se reduzido ou oxidado. Exemplos de agente redox ativo inclui, sem limitação, ferroceno, quinonas, complexos de Ru2+/3+, complexos Co2+/3+, e Os2+/3+.
[00135]O termo “agente redutor” conforme usado no presente refere-se a um composto ou material que é capaz de adicionar um elétron a um composto sendo reduzido, Agentes redutores adequados incluem, sem limitação, ditiotreitol (DTT), 2-mercapto etanol, ditioeritritol, cisteína, cisteamina (2-amino-etano-tiol), e glutationa reduzida. Tais agentes redutores podem ser usados, à guisa de exemplo, para manter os grupos sulfidrila no estado reduzido e reduzir pontes dissulfeto intraou intermoleculares.
[00136]“Redobramento”, conforme empregado no presente descreve qualquer processo, reação ou método que transforma um estado desdobrado ou inadequadamente dobrado em uma conformação nativa ou adequadamente dobrada. À guisa de exemplo apenas, o redobramento transforma polipeptídeos contendo pontes dissulfeto de um estado inadequadamente dobrado ou não dobrado em uma conformação nativa ou adequadamente dobrada com relação a pontes dissulfeto. Tais polipeptídeos contendo pontes dissulfeto podem ser polipeptídeos de aminoácido natural ou polipeptídeos de aminoácido não natural.
[00137]O termo "resina" como aqui empregado refere-se a microesferas poliméricas insolúveis de alto peso molecular. À guisa de exemplo apenas, tais microesferas podem ser usadas como suporte para a síntese peptídica na fase sólida, ou sítios para ligação de moléculas antes da purificação.
[00138]O termo "sacarídeo"como aqui empregado significa uma série de carboidratos incluindo, sem limitação, açúcares, monossacarídeos, oligossacarídeos e polissacarídeos.
[00139]O termo "segurança"ou "perfil de segurança", como aqui empregado refere-se a efeitos colaterais que podem estar correlacionados com a administração de uma droga relativa ao número de vezes que a droga foi administrada. A guisa de exemplo, uma droga que foi administrada muitas vezes e produziu apenas efeitos brandos ou nenhum efeito de todo, é tida como tendo excelente perfil de segurança. Um exemplo não limitante de um método para se avaliar o perfil de segurança é dado no Exemplo 92. Este método pode ser usada para avaliar o perfil de segurança de qualquer polipeptídeo.
[00140]A frase "hibridiza seletivamente para" ou “hibridiza especificamente para" como aqui empregado refere-se à ligação, duplexação ou hibridização de uma molécula a uma dada seqüência de nucleotídeo sob condições de hibridização rigorosas quando aquela seqüência está presente numa mistura complexa incluindo, sem limitação, DNA ou RNA celular total ou biblioteca.
[00141]O termo "rótulo spin" como aqui empregado refere-se a moléculas que, contém um átomo ou um grupo de átomos apresentando um spin de elétron sem pareamento (ou seja, um grupo paramagnético estável) que pode ser detectado por espectroscopia de ressonância eletrônica de spin e pode ser ligado a outra molécula. Tais moléculas de rótulos-spin incluem, sem limitação, radicais nitrila e nitróxidos e podem ser rótulos-spin simples ou rótulos-spin duplos.
[00142]O termo "estequiométrico"como aqui empregado refere-se à relação dos moles de compostos que participam numa reação química sendo aproximadamente 0,9 a aproximadamente 1,1.
[00143]O termo "similar ao estequiométrico"como aqui empregado refere-se à reação química que torna-se estequiométrica ou próxima da estequiométrica com mudanças nas condições de reação ou na presença de aditivos. Tais mudanças nas condições de reação incluem, sem limitação, aumento da temperatura ou mudança no pH. Tais aditivos incluem aceleradores.
[00144]A frase "condições de hibridização rigorosas" refere-se à hibridização de sequências de DNA, RNA, PNA ou outros mímicos de ácido nucléico, ou suas combinações, sob condições de baixa resistência iônica e alta temperatura. À guisa de exemplo, sob condições rigorosas, uma sonda genética irá hibridizar a seu alvo numa mistura complexa de ácido nucléico (incluindo, sem limitação, DNA ou RNA celular total ou biblioteca) mas não hibridiza para outras sequências na mistura complexa. Condições rigorosas são dependentes da seqüência e serão diferentes em diferentes circunstâncias. À guisa de exemplo, sequências maiores hibridizam, especificamente a temperaturas maiores, Condições de hibridização rigorosas incluem, sem limitação, a (i) cerca de 5-10°C mais baixo do que o ponto de fusão térmico (Tm) para a seqüência específica numa resistência iônica definida e pH; (ii) a concentração de sal é cerca de 0,01 M a cerca de 1,0 M a cerca de 1,0 M em pH de aproximadamente 7,0 a aproximadamente 8,3 e a temperatura é de pelo menos cerca de 30°C para sondas curtas (incluindo sem limitação, 10 a 50 nucleotídeos) e pelo menos cerca de 60°C para sondas longas (incluindo, sem limitação, maior do que 50 nucleotídeos); (iii) a adição de agentes desestabilizantes incluindo, sem limitação, formamida, (iv) 50% formamida, 5X SSC e 1% SDS, incubação a 42°C ou 5X SSC, 1% SDS, incubação a 65°C com lavagem em SSC 0,2X e SDS 0,1% a 65°c entre cerca de 5 minutos a cerca de 120 minutos. À guisa de exemplo apenas, a detecção de hibridização seletiva ou específica, inclui, sem limitação, a um sinal positivo de fundo pelo menos duas vezes. Uma orientação extensiva à hibridização de ácidos nucléicos é dada em Tijssen, Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology - Hybridization with Nucleic Probes, "Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid assays" (1993).
[00145]O termo "indivíduo" como aqui empregado refere-se a um animal, que é o objeto de tratamento, observação ou experimento. À guisa de exemplo apenas, um indivíduo pode ser, porém não está limitado, a um mamífero incluindo, sem limitação, um ser humano.
[00146]O termo “substancialmente purificado” refere-se a um componente de interesse, que pode estar substancialmente, ou essencialmente, isento de outros componentes que normalmente acompanham o componente ou interagem com ele, antes da purificação. À guisa de exemplo apenas, um componente de interesse pode ser "substancialmente purificado" quando a preparação do componente de interesse contém menos de aproximadamente 30%, menos de aproximadamente 25%, menos de aproximadamente 20%, menos de aproximadamente 15%, menos de aproximadamente 10%, menos de aproximadamente 5%, menos de aproximadamente 4%, menos de aproximadamente 3%, menos de aproximadamente 2%, ou menos de aproximadamente 1% (em peso seco) dos componentes contaminantes. Assim, um componente "substancialmente purificado" de interesse pode ter um nível de pureza de cerca de 70%, cerca de 75%, cerca de 80%, cerca de 85%, cerca de 90%, cerca de 95%, cerca de 96%, cerca de 97%, cerca de 98%, cerca de 99% ou mais. À guisa de exemplo, um polipeptídeo de aminoácido natural ou um polipeptídeo de aminoácido não natural pode ser purificado de uma célula nativa, ou célula hospedeira no caso polipeptídeos de aminoácido natural recombinantemente produzidos ou polipeptídeos de aminoácido não natural. À guisa de exemplo, uma preparação de um polipeptídeo de aminoácido natural ou um polipeptídeo de aminoácido não natural pode ser "substancialmente purificada" quando a preparação contiver menos que aproximadamente 30%, menos que aproximadamente 25%, menos que aproximadamente 20%, menos que aproximadamente 15%, menos que aproximadamente 10%, menos que aproximadamente 5%, menos que aproximadamente 4%, menos que aproximadamente 3%, menos que aproximadamente 2%, ou menos que aproximadamente 1% (do peso seco) do material contaminante. À guisa de exemplo, quando um polipeptídeo de aminoácido natura, ou um polipeptídeo de aminoácido não natural é recombinantemente produzido pelas células hospedeiras, o polipeptídeo de aminoácido natural ou polipeptídeo de aminoácido não natural pode estar presente em cerca de 30%, cerca de 25%, cerca de 20%, cerca de 15%, cerca de 10%, cerca de 5%, cerca de 4%, cerca de 3%, cerca de 2% ou cerca de % ou menos do peso seco das células. A guisa de exemplo, quando um polipeptídeo de aminoácido natural ou um polipeptídeo de aminoácido não natural é recombinantemente produzido pelas células hospedeiras, o polipeptídeo de aminoácido natural ou polipeptídeo de aminoácido não natural pode estar presente no meio de cultura a aproximadamente 5 g/L, a aproximadamente 4 g/L, a aproximadamente 3 g/L, a aproximadamente 2 g/L, a aproximadamente 1 g/L, a aproximadamente 750 mg/L, a aproximadamente 500 mg/L, a aproximadamente 250 mg/L, a aproximadamente 100 mg/L, a aproximadamente 50 mg/L, a aproximadamente 10 mg/L, ou a aproximadamente 1 mg/L ou menos do peso seco das células. À guisa de exemplo, os polipeptídeos de aminoácido natural ou polipeptídeo de aminoácido não natural "substancialmente purificados"têm um nível de pureza de aproximadamente 30%, de aproximadamente 35%, de aproximadamente 40%, de aproximadamente 45%, de aproximadamente 50%, de aproximadamente 55%, de aproximadamente 60%, de aproximadamente 65%, de aproximadamente 70%, de aproximadamente 75%, aproximadamente 80%, aproximadamente 85%, de aproximadamente 90%, de aproximadamente 95%, de aproximadamente 99% ou mais, conforme determinado por métodos adequados que incluem, sem limitação, análise SDS/PAGE, RP-HPLC, SEC, e eletroforese capilar. O termo "substituintes"também referido como "substituintes não interferentes" refere-se a grupos que podem ser usados para substituir um outro grupo na molécula. Tais grupos incluem, sem limitação a halo, C1-C10 alquila, C2-C10 alquenila, C2-10 alquinila, C1-10 alcóxi, C5-12 aralquila, C3-12 cicloalquila, C4-12 cicloalquenila, fenila, fenila substituído, toluolila, xilenila, bifenila, C2-12alcoxialquila, C5-12 alcoxialquila, C5-12 alcoxiarila, C5-12 ariloxialquila, C7-12oxiarila, C1-6 alquilsulfidrila, C1-10alquilsulfonila, -(CH2)m-O-(C1-10 alquila) onde m é de 1 a 8, arila, arila substituído, alcóxi substituído, fluoralquila, radical heterocíclico, radical heterocíclico substituído, nitroalquila, -NO2, -CN, -NRC(O)-(C1-10 alquila), -C(O)-(C1- 10) alquila), C2-10 alquiltioalquila, -C(O)O-(C1-10 alquila) -OH, SO2, =S, -CCOH, -NR2, carbonila, -C(O)-(C1-10) alquila)CF3 - C(O)-CF3, -C(O)NR2 -(C1-10 arila)-S-(C6-10 arila), -C(O)-(C6-10 arila), -(CH2)m-O-(CH2)m-O-(C1-10 alquila) onde cada m é de 1 a 8, - C(O)NR2, -C(S)NR2, -SO2NR2, -NRC(O)NR2, -NRC(S)NR2, sais destes, e similar. Cada grupo R na relação precedente inclui, sem limitação, H, alquila, ou alquila substituído, arila ou arila substituído, ou alcarila.
[00147]Nos casos onde os grupos substituintes são especificados por suas fórmulas químicas convencionais, escritas da esquerda para a direita, eles também abrangem os substituintes quimicamente idênticos que resultariam da escrita da estrutura da direita para a esquerda, por exemplo, -CH2O- é equivalente a -OCH2-.
[00148]À guisa de exemplo apenas, os substituintes para radicais alquila e heteroalquila (incluindo os grupos referidos como alquileno, alquenila, heteroalquileno, heteroalquenila, alquinila, cicloalquila, heterocicloalquila, cicloalquenila e heterocicloalquenila) incluem sem limitação a: -OR, =O, =NR, =N- OR, -NR2, -SR, -halogênio, -SiR3, -OC(O)R, -C(O)R, -CO2R, -CONR2, -OC(O)NR2, - NRC(O)R, -NRC(O)NR2, -NR(O)2R, -NR-C(NR2)=NR, -S(O)R, -S(O2R, -S(O)2NR2, - NRSO2R, -CN e -NO2. Cada grupo R na relação precedente inclui, sem limitação, hidrogênio, heteroalquila substituído, ou não substituído, arila substituído, ou não substituído, incluindo, sem limitação, a arila substituído, com 1-3 halogênios, grupos alquila, alcóxi ou tioalcóxi substituído ou não substituídos, ou grupos aralquila. Quando dois grupos R são ligados ao mesmo átomo de nitrogênio, eles podem ser combinados com o átomos de nitrogênio para formar um anel de 5-, 6-, ou 7- membros. Por exemplo, -NR2 pretende incluir, sem limitação, a 1-pirrolidinila e 4- morfolinila.
[00149]A guisa de exemplo, substituintes para grupos arila e heteroarila, incluem, sem limitação, a -OR, =O, =NR, =N-OR, -NR2, -SR, -halogênio, -SiR3, - OC(O)R, -C(O)R, -CO2R, -CONR2, -OC(O)NR2, -NRC(O)R, -NRC(O)NR2, -NR(O)2R, -NR-C(NR2)=NR, -S(O)R, -S(O2R, -S(O)2NR2, -NRSO2R, -CN -NO2, -R, -N3, - CH(Ph)2, flúor(C1-4)alcóxi, e flúor(C1-4)alquila, numa numeração variando de zero ao número total de valências abertas no sistema de anel aromático, e onde cada grupo R na lista precedente inclui, sem limitação , hidrogênio, alquila, heteroalquila, arila e heteroarila.
[00150]O termo "quantidade terapeuticamente eficaz" como aqui empregado refere-se à quantidade de uma composição contendo pelo menos um polipeptídeo de aminoácido não natural e/ou pelo menos um polipeptídeo de aminoácido não natural modificado, administrado a um paciente que já sofre de uma doença, condição ou distúrbio, suficiente para curar ou pelo menos parcialmente parar ou aliviar em alguma extensão um ou mais dos sintomas da doença condição ou distúrbio em tratamento. A eficácia de tais composições é dependente de condições tais como da gravidade e curso da doença distúrbio ou condição, terapia precedente, do estado de saúde do paciente, e resposta às drogas, e do julgamento do médico atendente. À guisa de exemplo apenas, quantidade terapeuticamente eficazes podem ser determinadas por experimentação rotineira, incluindo, sem limitação a um teste clínico de escalamento de dose.
[00151]O termo "tioalcóxi"como aqui empregado refere-se a grupos alquila contendo enxofre, ligados a moléculas via um átomo de oxigênio.
[00152]O termo "ponto de fusão térmico"ou Tm é a temperatura (sob resistência iônica definida, pH e concentração nucléica ) à qual 50% das sondas complementares a um alvo hibridizam para a seqüência alvo em equilíbrio.
[00153]O termo "fração tóxica"como aqui empregado refere-se a um composto que pode causar dano ou morte.
[00154]Os ermos "tratar", "tratando" ou "tratamento", como aqui empregado, referem-se alívio, abatimento, ou melhora de sintomas da doença ou condição prevenção de sintomas adicionais, melhora ou prevenção das causas metabólicas adjacentes de sintomas inibição da doença ou condição, por exemplo, interrupção do desenvolvimento da doença, ou condição, alívio da doença ou condição, ocasionando a regressão da doença ou condição, alívio de uma condição ocasionada pela doença ou condição, ou parada dos sintomas da doença ou condição. Os termos "tratar", "tratando" ou "tratamento" incluem, sem limitação, tratamentos profiláticos e/ou terapêuticos.
[00155]Como aqui empregado, o termo “polímero hidrossolúvel” se refere a qualquer polímero que é solúvel em solventes aquosos. Tais polímeros hidrossolúveis incluem, sem limitação, polietileno glicol aldeído propiônico de polietileno glicol, derivados seus mono alcóxi C1-C10 ou arilóxi (descritos na patente U.S. No. 5.252.714 que é incorporada ao presente documento a título de referência), monometóxi-polietileno glicol, polivinil pirrolidona, álcool polivinílico, poliaminoácidos, anidro maléico de éter divinílico, N-(2-hidroxipropil)-metacrilamida, dextrana, derivados de dextrana incluindo sulfato de dextrana, polipropileno glicol, copolímero de óxido de polipropileno/óxido de etileno, poliol polióxietilado, heparina, fragmentos de heparina, polissacarídeos, oligossacarídeos, glicanas, celulose e derivados de celulose, incluindo, sem limitação, metilcelulose e carboximetil celulose, albumina sérica, amido e derivados de amido, polipeptídeos, polialquileno glicol e seus derivados, copolímeros de polialquileno glicóis e de seus derivados, éteres polivinil etílicos e alfa-beta-poli[(2-hidroxietil)-DL-aspartamida e similares, ou suas misturas.
[00156]O acoplamento desses polímeros hidrossolúveis a polipeptídeos de aminoácido natural ou polipeptídeo de aminoácido não natural, pode resultar em alterações que incluem, sem limitação, um aumento ou modulação da meia-vida sérica, ou um aumento ou modulação da meia-vida terapêutica em relação à forma não modificada, maior biodisponibilidade, modulação da atividade biológica, tempo de circulação prolongado, imunogenicidade modulada, modulação das características de associação física tais como agregação e formação de multímeros, alteração da ligação a receptor, e alteração da dimerização ou multimerização de receptor. Além, disso, esses polímeros hidrossolúveis podem ter ou não sua própria atividade biológica.
[00157]A menos que de outro modo indicado, métodos convencionais para espectroscopia de massa, RMN, HPLC, química de proteína, bioquímica, técnicas e farmacologia de DNA recombinante, são empregados no contexto da habilidade da técnica.
[00158]Compostos, (incluindo sem limitação aos aminoácidos não naturais, polipeptídeos de aminoácido não natural e polipeptídeo de aminoácido não natural modificados, e reagentes para produção dos compostos supracitados) aqui apresentados, incluem compostos isotopicamente rotulados, os quais são idênticos aos citados, nas várias fórmulas e estruturas aqui apresentadas, porém pelo fato de que um ou mais átomos são substituídos por um átomo tendo uma massa atômica ou número de massa diferente da massa atômica ou número de massa, normalmente encontrado na natureza. Exemplos de isótopos que podem ser incorporados aos presentes compostos incluem isótopos de hidrogênio, carbono, nitrogênio, oxigênio, flúor e cloro, tais como H2, H3, C13, C14, N15, O18, O17, S35, F18, Cl36, respectivamente. Alguns compostos isotopicamente rotulados aqui descritos, por exemplo, os para os quais isótopos radioativos tais como H3 e C14são incorporados, são de utilidade nos ensaios de distribuição de droga e/ou tecido substrato. Adicionalmente, substituição com isótopos como deutério, ou seja, H2 pode render algumas vantagens terapêuticas resultantes de maior estabilidade metabólica, por exemplo, meia-vida aumentada in vivo ou reduzidos requisitos de dosagem.
[00159]Alguns dos compostos presentes (incluindo sem limitação) aos aminoácidos não naturais, polipeptídeos de aminoácido não natural e polipeptídeos de aminoácido não natural modificados, e reagentes para produzir os supracitados compostos) têm átomos de carbono assimétricos e podem portanto, existir como enantiômeros ou diastereoisômeros. Misturas diastereoisoméricas podem ser separadas em seus diastereoisômeros individuais com base em suas diferenças físico-químicas pelos métodos conhecidos, por exemplo, por cromatografia e/ou cristalização fracionada. Enantiômeros podem ser separados por conversão da mistura enantiomérica numa mistura diastereoisomérica, por reação com um composto opcionalmente ativo apropriado, por exemplo, álcool, separação dos diastereoisômeros e conversão (por exemplo, hidrólise) dos diastereoisômeros individuais nos correspondentes enantiômeros puros. Todos esses isômeros, inclusive diastereoisômeros, enantiômeros, e misturas destes são considerados como parte das composições aqui descritas.
[00160]Em modalidades adicionais ou ulteriores, os compostos aqui descritos (incluindo, sem limitação aos aminoácidos não naturais, polipeptídeos de aminoácido não natural, e polipeptídeos de aminoácido não natural modificados, e reagentes para produzir os supracitados compostos) são empregados na forma de prodrogas. Em modalidades adicionais ou ulteriores, os compostos aqui descritos (inclusive sem limitação, aos aminoácidos não naturais, polipeptídeos de aminoácido não natural, e polipeptídeos de aminoácido não natural modificados, e reagentes para produção dos compostos supracitados) são metabolizados com administração a um organismo em necessidade de produzir um metabólito que é então usado na produção de um efeito desejado, incluindo um efeito terapêutico desejado. Em modalidades adicionais ou ulteriores, estão metabólitos ativos, de aminoácidos não naturais e polipeptídeos de aminoácido não natural "modificados" ou não modificados".
[00161]Os métodos e formulações aqui descritos incluem o uso de N-óxido, formas cristalinas (também conhecidas como polimorfas), ou os sais farmaceuticamente aceitáveis de aminoácidos não naturais, polipeptídeos de aminoácido não natural e polipeptídeos de aminoácido não natural modificado. Em algumas modalidades, aminoácidos não naturais, polipeptídeos de aminoácido não natural e polipeptídeos de aminoácido não natural modificados podem existir como tautômeros. Todos os tautômeros estão incluídos no escopo dos aminoácidos não naturais, polipeptídeos de aminoácido não natural e polipeptídeos de aminoácido não natural modificados, aqui apresentados. Além disso, os aminoácidos não naturais polipeptídeos de aminoácido não natural e polipeptídeos de aminoácido não natural modificados aqui descritos podem existir nas formas não solvatadas, bem como solvatadas, com os solventes farmaceuticamente aceitáveis tais como água, etanol e similar. Também se considera as formas solvatadas dos aminoácidos não naturais, polipeptídeos de aminoácido não natural e polipeptídeos de aminoácido não natural modificados aqui apresentados.
[00162]Alguns compostos presentes (incluindo, sem limitação aos aminoácidos não naturais, polipeptídeos de aminoácido não natural e polipeptídeos de aminoácido não natural modificados e reagentes para produzir os compostos supracitados podem existir em várias formas tautoméricas. Todas essas formas tautoméricas são consideradas como parte das composições aqui descritas. Ainda, por exemplo, todas as formas ceto-enólicas de quaisquer compostos (incluindo, porém, sem limitação aos aminoácidos não naturais, polipeptídeos de aminoácido não natural e polipeptídeos de aminoácido não natural modificados e reagentes para produzir os compostos supracitados) aqui são considerados como parte das composições aqui descritas.
[00163]Alguns compostos presentes (incluindo, sem limitação aos aminoácidos não naturais, polipeptídeos de aminoácido não natural, polipeptídeos de aminoácido não natural modificados e reagentes para produzir quaisquer dos compostos supracitados) são ácidos e podem formar um sal com u cátion farmaceuticamente aceitável. Alguns dos compostos presentes (incluindo sem limitação aos aminoácidos não naturais, polipeptídeos de aminoácido não natural e polipeptídeos de aminoácido não natural modificados e reagentes para produzir os compostos supracitados) podem ser básicos e por conseqüência, podem formar um sal com um ânion farmaceuticamente aceitável. Todos esses sais, incluindo sais duplos encontram-se no escopo das composições aqui descritas e podem ser preparados por métodos convencionais. Por exemplo, podem ser preparados sais por contato de entidades ácidas e básicas, seja como meio aquoso, não aquoso ou parcialmente aquoso. Os sais são recuperados mediante uso de pelo menos uma das seguintes técnicas: filtração, precipitação com um não-solvente seguido por filtração, evaporação, do solvente, ou no caso de solução aquosa, liofilização.
[00164]Os sais farmaceuticamente aceitáveis dos polipeptídeos de aminoácido não natural aqui apresentados podem ser formados quando um próton ácido presente nos polipeptídeos de aminoácido não natural de origem, é o substituído com um íon metálico, a guisa de exemplo um íon de metal alcalino, um íon de metal alcalino terroso, ou um íon alumínio; ou coordena-se com uma base orgânica. Além disso, as formas de sal dos polipeptídeos de aminoácido não natural apresentados podem ser preparadas usando sais dos materiais de partida ou intermediários. Os polipeptídeos de aminoácido não natural aqui descritos podem ser preparados como sal de adição de ácido farmaceuticamente aceitável (que é um tipo de sal farmaceuticamente aceitável) por reação da base livre com os polipeptídeos de aminoácido não natural aqui descritos com um ácido inorgânico ou orgânico aceitável. Alternativamente, os polipeptídeos de aminoácido não natural aqui descritos podem ser preparados como sais de adição de base farmaceuticamente aceitáveis, (que é um tipo de um sal farmaceuticamente aceitável), por reação da forma de ácido livre ou polipeptídeos de aminoácido não natural aqui descritos com uma base inorgânica ou orgânica farmaceuticamente aceitável.
[00165]O tipo de sais farmaceuticamente aceitáveis incluem sem limitação a: (1) sais de adição de ácido, formados com ácidos inorgânicos, tais como ácido clorídrico, acido bromídrico, ácido sulfúrico, ácido nítrico, ácido fosfórico e similar, ou formado com ácidos orgânicos tais como ácido acético, ácido propiônico, ácido hexanóico, ácido ciclopentanopropionico, ácido glicólico, ácido pirúvico, ácido láctico, ácido malônico, ácido succínico, ácido málico, ácido maléico, ácido fumárico, ácido tartárico, ácido cítrico, ácido benzóico, ácido 3-(4-hidroxibenzoil) benzóico, ácido cinâmico, ácido mandélico, ácido metanossulfônico, ácido etanossulfônico, ácido 1,2-etanodissulfonico, ácido 2-hidroxietanossulfônico, ácido benzenossulfônico, ácido 2-naftalenossulfônico, ácido 4-metilbiciclo-[2.2.2]oct-2-eno- 1-carboxílico, ácido glicoheptanóico, ácido 4,4'-metilenobis-(33-hidróxi-2-eno-1- carboxílico), ácido 3-fenilpropiônico, ácido trimetilacético, ácido butilacético terciário, ácido lauril sulfúrico, ácido glucônico, ácido glutâmico, ácido hidroxinaftóico, ácido salicílico, ácido esteárico ácido mucônico, e similar; (2) sais formados quando um próton ácidos presente no composto de origem, ou é substituído por um íon metálico por exemplo, um íon de metal alcalino, um íon de metal alcalino terroso, ou um íon alumínio, ou coordenadas com uma base orgânica. Bases orgânicas aceitáveis incluem etanolamina, dietanolamina, trietanolamina, trometamina, N-metilglucamina e similar. Bases inorgânicas aceitáveis incluem, hidróxido doe alumínio, hidróxido de cálcio, hidróxido de potássio, carbonato de sódio, hidróxido de sódio e similar.
[00166]Os contra-íons correspondentes dos sais farmaceuticamente aceitáveis do polipeptídeo de aminoácido não natural podem ser analisados e identificados usando vários métodos incluindo, sem limitação, a cromatografia de troca iônica, cromatografia iônica, eletroforese capilar, plasma indutivamente acoplado, espectroscopia de absorção atômica, espectrometria de massa, ou quaisquer combinações destes. Além disso, a atividade terapêutica de tais sais farmaceuticamente aceitáveis do polipeptídeo de aminoácido não natural, podem ser testada usando as técnicas e métodos descritos nos exemplos 87-91.
[00167]Deve ficar entendido que, uma referência a um sal inclui as formas de adição do solvente ou formas cristalinas do mesmo, particularmente solvatos ou polimorfos. Solvatos contém ou quantidades estequiométricas ou não estequiométricas de um solvente, e são o mais das vezes, formados durante o processo de cristalização com solventes farmaceuticamente aceitáveis, tais como água, etanol e similar. Hidratos são formados quando o solvente é água, ou alcoolatos são formados, quando o solvente é álcool. Polimorfos incluem as diferentes disposições compactas de cristal da mesma composição elementar de um composto. Polimorfos normalmente têm diferentes padrões de difração de raios- X, espectros infravermelho, pontos de fusão, densidade, dureza, formato do cristal, propriedades ópticas e elétricas, estabilidade e solubilidade. Vários fatores tais como solvente de recristalização, velocidade de cristalização, e temperatura de armazenagem podem ocasionar uma única forma dominante de cristal.
[00168]A classificação e caracterização dos poliformos de sais farmaceuticamente aceitáveis dos polipeptídeos de aminoácido não natural e/ ou solvatos, pode ser realizada usando uma série de técnicas incluindo, sem limitação, a análise térmica, difração por raios-X, espectroscopia, sorção de vapor, e microscopia, Métodos de análise térmica englobam processos de degradação termoquímica ou termo-física, incluindo, sem limitação a transições polimorfas e tais métodos são usados para analisar a relação entre formas polimórficas, determinar perda de peso para encontrar a temperatura de transição vítrea ou para testes de compatibilidade excipientes. Tais métodos incluem sem limitação a Calorimetria de Varredura Diferencial (DSC), Calorimetria de Varredura Diferencial Modulada (MDCS), Análise Termogravimétrica (TGA) e Análise Termogravimétrica e Infravermelho (TG/IR). Métodos de difração por raios-X incluem, sem limitação, difratômetros de cristal único e de pó, e fontes de síncrotron. As várias técnicas espectroscópicas usadas incluem, sem limitação, a Raman, FTIR, UVIS e RMN (estado líquido e sólido). As várias técnicas microscópicas incluem, sem limitação, microscopia de luz polarizada. Microscopia Eletrônica de Varredura (SEM) com Análise de Raios-X de Energia Dispersiva (EDX), Microscopia Eletrônica de Varredura Ambiental com EDX (em atmosfera e vapor d’água ou gás), microscopia de IV, e microscopia Raman.
DESCRIÇÃO SUCINTA DAS FIGURAS
[00169]Pode-se ter um melhor entendimento dos aspectos e vantagens dos presentes métodos e composições, com referência à descrição detalhada a seguir que descreve modalidades ilustrativas, nas quais os princípios dos métodos, composições, dispositivos e aparelhos da Requerente são utilizados e com referência aos desenhos anexos nos quais:
[00170]A figura 1 apresenta uma representação esquemática da relação de alguns aspectos dos métodos, composições, estratégias e técnicas aqui descritas.
[00171]A figura 2 apresenta exemplos não limitantes ilustrativos dos tipos de aminoácidos não naturais aqui descritos. Tais aminoácidos não naturais podem ser empregados ou incorporados em quaisquer métodos, composições, técnicas e estratégias para preparação, purificação, caracterização e uso dos aminoácidos não naturais, polipeptídeos de aminoácido não natural e polipeptídeos de aminoácido não natural modificados, aqui descritos.
[00172]A figura 3 apresenta exemplos não limitantes, ilustrativos dos tipos de aminoácidos não naturais aqui descritos. Tais aminoácidos não naturais podem ser usados ou incorporados em quaisquer métodos, composições, técnicas e estratégias para preparação, purificação, caracterização e uso dos aminoácidos não naturais, polipeptídeos de aminoácido não natural e polipeptídeos de aminoácido não natural modificados aqui descritos.
[00173]A figura 4 apresenta um exemplo ilustrativo, não limitante da metodologia sintética usada para produzir os aminoácidos não naturais aqui descritos. Tais aminoácidos não naturais podem ser usados ou incorporados em quaisquer métodos composições, técnicas e estratégias para preparação, purificação, caracterização e uso dos aminoácidos não naturais, polipeptídeos de aminoácido não natural, e polipeptídeos de aminoácido não natural modificados aqui descritos.
[00174]A figura 5 apresenta exemplos ilustrativos, não limitantes da metodologia sintética usada para produzir os aminoácidos não naturais aqui descritos. Tais aminoácidos não naturais podem ser usados ou incorporados em quaisquer métodos composições, técnicas e estratégias para preparação, purificação, caracterização e uso dos aminoácidos não naturais, polipeptídeos de aminoácido não natural, e polipeptídeos de aminoácido não natural modificados aqui descritos
[00175]A figura 6 apresenta exemplos ilustrativos, não limitantes da metodologia sintética usada para produzir os aminoácidos não naturais aqui descritos. Tais aminoácidos não naturais podem ser usados ou incorporados em quaisquer métodos composições, técnicas e estratégias para preparação, purificação, caracterização e uso dos aminoácidos não naturais, polipeptídeos de aminoácido não natural, e polipeptídeos de aminoácido não natural modificados aqui descritos.
[00176]A figura 7 apresenta exemplos ilustrativos, não limitantes da modificação pós-traducional dos polipeptídeos de aminoácido não natural contendo carbonila com reagentes contendo hidroxilamina para formar polipeptídeos de aminoácido não natural contendo oxima modificados. Tais polipeptídeos de aminoácido não natural podem ser usados ou incorporados em quaisquer métodos composições, técnicas e estratégias para preparação, purificação, caracterização e uso dos aminoácidos não naturais, polipeptídeos de aminoácido não natural, e polipeptídeos de aminoácido não natural modificados aqui descritos.
[00177]A figura 8 apresenta exemplos ilustrativos, não limitantes de aditivos que podem ser usados para incrementar a reação dos polipeptídeos de aminoácido não natural contendo carbonila com reagentes contendo hidroxilamina para formar polipeptídeos de aminoácido não natural contendo oxima modificados.
[00178]A figura 9 apresenta exemplos ilustrativos, não limitantes da modificação pós-traducional dos polipeptídeos de aminoácido não natural contendo oxima, com reagentes contendo carbonila, para formar polipeptídeos de aminoácido não natural contendo oxima modificados. Tais polipeptídeos de aminoácido não natural; podem ser usados ou incorporados em quaisquer métodos composições, técnicas e estratégias para preparação, purificação, caracterização e uso dos aminoácidos não naturais, polipeptídeos de aminoácido não natural, e polipeptídeos de aminoácido não natural modificados aqui descritos.
[00179]A figura 10 apresenta um exemplo ilustrativo, não limitante da modificação pós-traducional dos polipeptídeos de aminoácido não natural contendo hidroxilamina com reagentes contendo carbonila, para formar polipeptídeos de aminoácido não natural contendo oxima modificados. Tais polipeptídeos de aminoácido não natural; podem ser usados ou incorporados em quaisquer métodos composições, técnicas e estratégias para preparação, purificação, caracterização e uso dos aminoácidos não naturais, polipeptídeos de aminoácido não natural, e polipeptídeos de aminoácido não natural modificados aqui descritos.
[00180]A figura 11 apresenta exemplos ilustrativos, não limitantes de reagentes contendo PEG que podem ser empregados para modificar polipeptídeos de aminoácido não natural para formar polipeptídeos de aminoácido não natural ligados a oxima, contendo PEG.
[00181]A figura 12 apresenta exemplos ilustrativos, não limitantes da síntese de reagentes contendo PEG que podem ser empregados para modificar polipeptídeos de aminoácido não natural para formar polipeptídeos de aminoácido não natural ligados a oxima, contendo PEG.
[00182]A figura 13 apresenta um exemplo ilustrativo, não limitante da síntese de reagentes contendo PEG com base em amida, que podem ser empregados para modificar polipeptídeos de aminoácido não natural para formar polipeptídeos de aminoácido não natural ligados a oxima, contendo PEG.
[00183]A figura 14 apresenta um exemplo ilustrativo, não limitante da síntese de reagentes contendo PEG com base em carbamato, que podem ser empregados para modificar polipeptídeos de aminoácido não natural para formar polipeptídeos de aminoácido não natural ligados a oxima, contendo PEG.
[00184]A figura 15 apresenta um exemplo ilustrativo, não limitante da síntese de um reagente contendo PEG com base em carbamato, que pode ser empregado para modificar polipeptídeos de aminoácido não natural para formar polipeptídeos de aminoácido não natural ligados a oxima, contendo PEG.
[00185]A figura 16 apresenta exemplos ilustrativos, não limitantes da síntese de reagentes contendo PEG simples, que podem ser empregados para modificar polipeptídeos de aminoácido não natural para formar polipeptídeos de aminoácido não natural ligados a oxima, contendo PEG.
[00186]A figura 17 apresenta exemplos ilustrativos, não limitantes de reagentes contendo PEG ramificados, que podem ser empregados para modificar polipeptídeos de aminoácido não natural para formar polipeptídeos de aminoácido não natural ligados a oxima, contendo PEG e ao uso desse reagente para modificar um polipeptídeo de aminoácido não natural com base em carbonila.
[00187]A figura 18 apresenta um exemplo ilustrativo, não limitante da síntese de um grupo ligante bifuncional que pode ser empregado para modificar e ligar polipeptídeos de aminoácido não natural.
[00188]A figura 19 apresenta exemplos ilustrativos, não limitantes de grupos ligantes multifuncionais que podem ser empregados para modificar e ligar polipeptídeos de aminoácido não natural.
[00189]A figura 20 apresenta uma ilustração, não limitante do uso de um grupo ligante bifuncional para modificar e ligar um polipeptídeo de aminoácido não natural a um grupo PEG.
[00190]A figura 21 apresenta exemplos ilustrativos, não limitantes do uso de grupos ligantes bifuncionais para modificar e ligar polipeptídeos de aminoácido não natural a um grupo PEG.
[00191]A figura 22 apresenta uma ilustração, não limitante do uso de um grupo ligante bifuncional para ligar coesos dois polipeptídeos de aminoácido não natural para formar um homodímero.
[00192]A figura 23 apresenta uma ilustração, não limitante do uso de um grupo ligante bifuncional para ligar coesos dois polipeptídeos de aminoácido não natural para formar um heterodímero.
[00193]A figura 24 apresenta uma ilustração, não limitante da síntese de um aminoácido não natural contendo carbonila. Tais aminoácidos não naturais podem ser empregados ou incorporados em quaisquer métodos, composições, técnicas e estratégias para preparação, purificação, caracterização e uso dos aminoácidos não naturais, polipeptídeos de aminoácido não natural e polipeptídeos de aminoácido não natural modificados aqui descritos.
[00194]A figura 25 apresenta uma ilustração, não limitante da síntese de um aminoácido não natural contendo carbonila. Tais aminoácidos não naturais podem ser empregados ou incorporados em quaisquer métodos, composições, técnicas e estratégias para preparação, purificação, caracterização e uso dos aminoácidos não naturais, polipeptídeos de aminoácido não natural e polipeptídeos de aminoácido não natural modificados aqui descritos.
[00195]A figura 26 apresenta uma ilustração, não limitante da síntese de um aminoácido não natural contendo carbonila.
[00196]A figura 27 apresenta uma ilustração, não limitante da síntese de um aminoácido não natural contendo dicarbonila. Tais aminoácidos não naturais podem ser empregados ou incorporados em quaisquer métodos, composições, técnicas e estratégias para preparação, purificação, caracterização e uso dos aminoácidos não naturais, polipeptídeos de aminoácido não natural e polipeptídeos de aminoácido não natural modificados aqui descritos.
[00197]A figura 28 apresenta uma ilustração, não limitante da síntese de um aminoácido não natural contendo dicarbonila. Tais aminoácidos não naturais podem ser empregados ou incorporados em quaisquer métodos, composições, técnicas e estratégias para preparação, purificação, caracterização e uso dos aminoácidos não naturais, polipeptídeos de aminoácido não natural e polipeptídeos de aminoácido não natural modificados aqui descritos.
[00198]A figura 29 apresenta uma ilustração, não limitante da síntese de um aminoácido não natural contendo dicarbonila. Tais aminoácidos não naturais podem ser empregados ou incorporados em quaisquer métodos, composições, técnicas e estratégias para preparação, purificação, caracterização e uso dos aminoácidos não naturais, polipeptídeos de aminoácido não natural e polipeptídeos de aminoácido não natural modificados aqui descritos.
[00199]A figura 30 apresenta uma ilustração, não limitante da síntese de um aminoácido não natural contendo dicarbonila. Tais aminoácidos não naturais podem ser empregados ou incorporados em quaisquer métodos, composições, técnicas e estratégias para preparação, purificação, caracterização e uso dos aminoácidos não naturais, polipeptídeos de aminoácido não natural e polipeptídeos de aminoácido não natural modificados aqui descritos.
[00200]A figura 31 apresenta uma ilustração, não limitante da síntese de um aminoácido não natural contendo dicarbonila. Tais aminoácidos não naturais podem ser empregados ou incorporados em quaisquer métodos, composições, técnicas e estratégias para preparação, purificação, caracterização e uso dos aminoácidos não naturais, polipeptídeos de aminoácido não natural e polipeptídeos de aminoácido não natural modificados aqui descritos.
[00201]A figura 32 apresenta uma ilustração, não limitante da síntese de um aminoácido não natural contendo dicarbonila. Tais aminoácidos não naturais podem ser empregados ou incorporados em quaisquer métodos, composições, técnicas e estratégias para preparação, purificação, caracterização e uso dos aminoácidos não naturais, polipeptídeos de aminoácido não natural e polipeptídeos de aminoácido não natural modificados aqui descritos.
[00202]A figura 33 apresenta uma ilustração, não limitante da síntese de um aminoácido não natural contendo dicarbonila. Tais aminoácidos não naturais podem ser empregados ou incorporados em quaisquer métodos, composições, técnicas e estratégias para preparação, purificação, caracterização e uso dos aminoácidos não naturais, polipeptídeos de aminoácido não natural e polipeptídeos de aminoácido não natural modificados aqui descritos.
[00203]A figura 34 apresenta uma ilustração, não limitante da síntese de um aminoácido não natural contendo dicarbonila. Tais aminoácidos não naturais podem ser empregados ou incorporados em quaisquer métodos, composições, técnicas e estratégias para preparação, purificação, caracterização e uso dos aminoácidos não naturais, polipeptídeos de aminoácido não natural e polipeptídeos de aminoácido não natural modificados aqui descritos.
[00204]A figura 35 apresenta uma ilustração, não limitante de aminoácidos não naturais contendo carbonila e dicarbonila. Tais aminoácidos não naturais podem ser empregados ou incorporados em quaisquer métodos, composições, técnicas e estratégias para preparação, purificação, caracterização e uso dos aminoácidos não naturais, polipeptídeos de aminoácido não natural e polipeptídeos de aminoácido não natural modificados aqui descritos.
[00205]A figura 36 apresenta uma ilustração, não limitante da síntese de aminoácidos não naturais. Tais aminoácidos não naturais podem ser empregados ou incorporados em quaisquer métodos, composições, técnicas e estratégias para preparação, purificação, caracterização e uso dos aminoácidos não naturais, polipeptídeos de aminoácido não natural e polipeptídeos de aminoácido não natural modificados aqui descritos.
[00206]A figura 37 apresenta uma ilustração, não limitante da síntese de aminoácidos não naturais contendo carbonila e dicarbonila. Tais aminoácidos não naturais podem ser empregados ou incorporados em quaisquer métodos, composições, técnicas e estratégias para preparação, purificação, caracterização e uso dos aminoácidos não naturais, polipeptídeos de aminoácido não natural e polipeptídeos de aminoácido não natural modificados aqui descritos.
[00207]A figura 38 apresenta uma ilustração, não limitante da síntese de aminoácidos não naturais contendo carbonila e dicarbonila. Tais aminoácidos não naturais podem ser empregados ou incorporados em quaisquer métodos, composições, técnicas e estratégias para preparação, purificação, caracterização e uso dos aminoácidos não naturais, polipeptídeos de aminoácido não natural e polipeptídeos de aminoácido não natural modificados aqui descritos.
[00208]A figura 39 apresenta uma ilustração, não limitante da síntese de aminoácidos não naturais contendo carbonila e dicarbonila. Tais aminoácidos não naturais podem ser empregados ou incorporados em quaisquer métodos, composições, técnicas e estratégias para preparação, purificação, caracterização e uso dos aminoácidos não naturais, polipeptídeos de aminoácido não natural e polipeptídeos de aminoácido não natural modificados aqui descritos.
[00209]A figura 40 apresenta uma ilustração, não limitante de aminoácidos não naturais contendo dicarbonila. Tais aminoácidos não naturais podem ser empregados ou incorporados em quaisquer métodos, composições, técnicas e estratégias para preparação, purificação, caracterização e uso dos aminoácidos não naturais, polipeptídeos de aminoácido não natural e polipeptídeos de aminoácido não natural modificados aqui descritos.
[00210]A figura 41 apresenta uma ilustração, não limitante de aminoácidos não naturais contendo dicarbonila. Tais aminoácidos não naturais podem ser empregados ou incorporados em quaisquer métodos, composições, técnicas e estratégias para preparação, purificação, caracterização e uso dos aminoácidos não naturais, polipeptídeos de aminoácido não natural e polipeptídeos de aminoácido não natural modificados aqui descritos.
[00211]A figura 42 apresenta uma ilustração, não limitante de aminoácidos não naturais contendo dicarbonila. Tais aminoácidos não naturais podem ser empregados ou incorporados em quaisquer métodos, composições, técnicas e estratégias para preparação, purificação, caracterização e uso dos aminoácidos não naturais, polipeptídeos de aminoácido não natural e polipeptídeos de aminoácido não natural modificados aqui descritos.
[00212]A figura 43 apresenta uma ilustração, não limitante de (a) aminoácidos não naturais contendo 1,3-cetoaldeído protegido ou desprotegido, e (b) aminoácidos não naturais contendo 1,3-cetocarboxilil(tio)éster. Tais aminoácidos não naturais podem ser empregados ou incorporados em quaisquer métodos, composições, técnicas e estratégias para preparação, purificação, caracterização e uso dos aminoácidos não naturais, polipeptídeos de aminoácido não natural e polipeptídeos de aminoácido não natural modificados aqui descritos.
[00213]A figura 44 apresenta uma ilustração, não limitante de aminoácidos não naturais contendo hidrazida. Tais aminoácidos não naturais podem ser empregados ou incorporados em quaisquer métodos, composições, técnicas e estratégias para preparação, purificação, caracterização e uso dos aminoácidos não naturais, polipeptídeos de aminoácido não natural e polipeptídeos de aminoácido não natural modificados aqui descritos.
[00214]A figura 45 apresenta uma ilustração, não limitante de aminoácidos não naturais contendo hidrazida. Tais aminoácidos não naturais podem ser empregados ou incorporados em quaisquer métodos, composições, técnicas e estratégias para preparação, purificação, caracterização e uso dos aminoácidos não naturais, polipeptídeos de aminoácido não natural e polipeptídeos de aminoácido não natural modificados aqui descritos.
[00215]Figuras 46A e 46B apresentam ilustrações, não limitantes de aminoácidos não naturais contendo oxima, e a Figura 46C representa exemplos não limitantes, ilustrativos de aminoácidos não naturais contendo hidrazina. Tais aminoácidos não naturais podem ser empregados ou incorporados em quaisquer métodos, composições, técnicas e estratégias para preparação, purificação, caracterização e uso dos aminoácidos não naturais, polipeptídeos de aminoácido não natural e polipeptídeos de aminoácido não natural modificados aqui descritos.
[00216]A figura 47 apresenta uma ilustração, não limitante da conjugação em etapa única a polipeptídeos de aminoácido não natural e uma conjugação em duas etapas a polipeptídeos de aminoácido não natural. À guisa de exemplo, essa conjugação inclui a PEGuilação a polipeptídeos de aminoácido não natural.
[00217]A figura 48 apresenta uma ilustração, não limitante da síntese de compostos mPEG-hidroxilamina. Tais aminoácidos não naturais podem ser empregados ou incorporados em quaisquer métodos, composições, técnicas e estratégias para preparação, purificação, caracterização e uso dos aminoácidos não naturais, polipeptídeos de aminoácido não natural e polipeptídeos de aminoácido não natural modificados aqui descritos.
[00218]A figura 49 apresenta uma ilustração, não limitante da síntese de compostos mPEG-hidroxilamina. Tais aminoácidos não naturais podem ser empregados ou incorporados em quaisquer métodos, composições, técnicas e estratégias para preparação, purificação, caracterização e uso dos aminoácidos não naturais, polipeptídeos de aminoácido não natural e polipeptídeos de aminoácido não natural modificados aqui descritos.
[00219]A figura 50 apresenta uma ilustração, não limitante da síntese de compostos mPEG-hidroxilamina. Tais aminoácidos não naturais podem ser empregados ou incorporados em quaisquer métodos, composições, técnicas e estratégias para preparação, purificação, caracterização e uso dos aminoácidos não naturais, polipeptídeos de aminoácido não natural e polipeptídeos de aminoácido não natural modificados aqui descritos.
[00220]A figura 51 apresenta uma ilustração, não limitante da síntese de compostos mPEG-hidroxilamina. Tais aminoácidos não naturais podem ser empregados ou incorporados em quaisquer métodos, composições, técnicas e estratégias para preparação, purificação, caracterização e uso dos aminoácidos não naturais, polipeptídeos de aminoácido não natural e polipeptídeos de aminoácido não natural modificados aqui descritos.
[00221]A figura 52 apresenta uma ilustração, não limitante da síntese de compostos mPEG-hidroxilamina. Tais aminoácidos não naturais podem ser empregados ou incorporados em quaisquer métodos, composições, técnicas e estratégias para preparação, purificação, caracterização e uso dos aminoácidos não naturais, polipeptídeos de aminoácido não natural e polipeptídeos de aminoácido não natural modificados aqui descritos.
[00222]A figura 53 apresenta uma ilustração, não limitante da síntese de compostos mPEG-hidroxilamina. Tais aminoácidos não naturais podem ser empregados ou incorporados em quaisquer métodos, composições, técnicas e estratégias para preparação, purificação, caracterização e uso dos aminoácidos não naturais, polipeptídeos de aminoácido não natural e polipeptídeos de aminoácido não natural modificados aqui descritos.
[00223]A figura 54 apresenta uma ilustração, não limitante da síntese de compostos mPEG-hidroxilamina. Tais aminoácidos não naturais podem ser empregados ou incorporados em quaisquer métodos, composições, técnicas e estratégias para preparação, purificação, caracterização e uso dos aminoácidos não naturais, polipeptídeos de aminoácido não natural e polipeptídeos de aminoácido não natural modificados aqui descritos.
[00224]A figura 55 apresenta uma ilustração, não limitante da síntese de compostos mPEG-hidroxilamina. Tais aminoácidos não naturais podem ser empregados ou incorporados em quaisquer métodos, composições, técnicas e estratégias para preparação, purificação, caracterização e uso dos aminoácidos não naturais, polipeptídeos de aminoácido não natural e polipeptídeos de aminoácido não natural modificados aqui descritos.
[00225]A figura 56 apresenta uma ilustração, não limitante da síntese de compostos mPEG-hidroxilamina. Tais aminoácidos não naturais podem ser empregados ou incorporados em quaisquer métodos, composições, técnicas e estratégias para preparação, purificação, caracterização e uso dos aminoácidos não naturais, polipeptídeos de aminoácido não natural e polipeptídeos de aminoácido não natural modificados aqui descritos.
[00226]A figura 57 apresenta uma ilustração, não limitante da síntese de compostos mPEG-hidroxilamina. Tais aminoácidos não naturais podem ser empregados ou incorporados em quaisquer métodos, composições, técnicas e estratégias para preparação, purificação, caracterização e uso dos aminoácidos não naturais, polipeptídeos de aminoácido não natural e polipeptídeos de aminoácido não natural modificados aqui descritos.
[00227]A figura 58 apresenta uma ilustração, não limitante da síntese de compostos mPEG-hidroxilamina. Tais aminoácidos não naturais podem ser empregados ou incorporados em quaisquer métodos, composições, técnicas e estratégias para preparação, purificação, caracterização e uso dos aminoácidos não naturais, polipeptídeos de aminoácido não natural e polipeptídeos de aminoácido não natural modificados aqui descritos.
[00228]A figura 59 apresenta uma ilustração, não limitante da síntese de compostos mPEG-hidroxilamina. Tais aminoácidos não naturais podem ser empregados ou incorporados em quaisquer métodos, composições, técnicas e estratégias para preparação, purificação, caracterização e uso dos aminoácidos não naturais, polipeptídeos de aminoácido não natural e polipeptídeos de aminoácido não natural modificados aqui descritos.
[00229]A figura 60 apresenta uma ilustração, não limitante da síntese de compostos hidroxilamina. Tais aminoácidos não naturais podem ser empregados ou incorporados em quaisquer métodos, composições, técnicas e estratégias para preparação, purificação, caracterização e uso dos aminoácidos não naturais, polipeptídeos de aminoácido não natural e polipeptídeos de aminoácido não natural modificados aqui descritos.
[00230]A figura 61 apresenta uma ilustração, não limitante da síntese de compostos mPEG-hidroxilamina. Tais aminoácidos não naturais podem ser empregados ou incorporados em quaisquer métodos, composições, técnicas e estratégias para preparação, purificação, caracterização e uso dos aminoácidos não naturais, polipeptídeos de aminoácido não natural e polipeptídeos de aminoácido não natural modificados aqui descritos.
[00231]A figura 62A apresenta uma ilustração, não limitante da síntese de compostos hidroxilamina; A figura 62B apresenta ilustrações, não limitantes da síntese de compostos mPEG. Tais aminoácidos não naturais podem ser empregados ou incorporados em quaisquer métodos, composições, técnicas e estratégias para preparação, purificação, caracterização e uso dos aminoácidos não naturais, polipeptídeos de aminoácido não natural e polipeptídeos de aminoácido não natural modificados aqui descritos.
[00232]A figura 63 apresenta uma ilustração, não limitante de (A) modificação dos polipeptídeos de aminoácido não natural por conversão química em polipeptídeos de aminoácido não natural contendo carbonila (inclusive dicarbonila) e (B) a modificação de polipeptídeos de aminoácido não natural por conversão química em polipeptídeos de aminoácido não natural contendo hidroxilamina. Tais aminoácidos não naturais podem ser empregados ou incorporados em quaisquer métodos, composições, técnicas e estratégias para preparação, purificação, caracterização e uso dos aminoácidos não naturais, polipeptídeos de aminoácido não natural e polipeptídeos de aminoácido não natural modificados aqui descritos.
[00233]A figura 64 apresenta uma ilustração, não limitante da síntese de compostos mPEG-hidroxilamina. Tais aminoácidos não naturais podem ser empregados ou incorporados em quaisquer métodos, composições, técnicas e estratégias para preparação, purificação, caracterização e uso dos aminoácidos não naturais, polipeptídeos de aminoácido não natural e polipeptídeos de aminoácido não natural modificados aqui descritos.
[00234]A figura 65 apresenta uma ilustração, não limitante da síntese de compostos mPEG-hidroxilamina. Tais aminoácidos não naturais podem ser empregados ou incorporados em quaisquer métodos, composições, técnicas e estratégias para preparação, purificação, caracterização e uso dos aminoácidos não naturais, polipeptídeos de aminoácido não natural e polipeptídeos de aminoácido não natural modificados aqui descritos.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO I. Introdução
[00235]Recentemente, foi relatada uma tecnologia inteiramente nova nas ciências de proteínas que promete superar muitas das limitações associadas com modificações específicas a sítio de proteínas. Mais especificamente, foram acrescentados novos componentes à maquinaria biossintética de proteínas do procarionte Escherichia coli (E. coli) (L. Wang, et al., (2001), Science 292:498-500, por exemplo) e do eucarionte Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) (J. Chin et al., Science 301:964-7 (2003), por exemplo), o que permitiu a incorporação de aminoácidos não naturais a proteínas in vivo. Uma série de novos aminoácidos com propriedades químicas, físicas ou biológicas inéditas, incluindo rótulos de foto- afinidade e aminoácidos fotoisomerizáveis, ceto-aminoácidos, e aminoácidos glicosilados, foi incorporada eficientemente e com alto grau de fidelidade a proteínas em E. coli e em levedura em resposta ao códon âmbar, TAG, usando esta metodologia. ver, por exemplo,J. W. Chin et al., (2002), Journal of the American Chemical Society124: 9026-9027; J. W Chin, & P. G. Schultz, (2002), ChemBioChem 3(11): 1135-1137; J. W. Chin, et al., (2002), PNAS United States of America 99: 11020-11024; e L. Wang, & P. G. Schultz, (2002), Chem. Comm., 1:111. Todas as referências são integralmente incorporadas ao presente, a título de referência. Estes estudos demonstraram que é possível se introduzir seletiva e rotineiramente grupos químicos funcionais que não são encontrados em proteínas, e que são quimicamente inertes a todos os grupos funcionais encontrados nos 20 aminoácidos habituais geneticamente codificados e que podem ser usados para reagir eficiente e seletivamente para formar ligações covalentes estáveis.
II. Relatório
[00236]A figura 1 apresenta uma síntese as composições métodos e técnicas aqui descritos. Em um nível encontram-se as ferramentas (métodos, composições, técnicas para criar e utilizar um polipeptídeo compreendendo pelo menos um aminoácido não natural ou aminoácido não natural modificado, com um grupo carbonila, dicarbonila oxima ou hidroxilamina.
[00237]Tais aminoácidos não naturais podem conter funcionalidade adicional, incluindo, sem limitação, a um rótulo, um corante; um polímero; um polímero hidrossolúvel; um derivado de polietileno glicol; um foto-reticulador; um composto citotóxico; uma droga; um rótulo de afinidade; um rótulo de foto-afinidade; um composto reativo; uma resina; uma segunda proteína ou polipeptídeo ou análogo de polipeptídeo; um anticorpo ou fragmento de anticorpo; um quelante de metal; um co-fator; um ácido graxo; um carboidrato; um polinucleotídeo; um DNA; um RNA; um polinucleotídeo anti-sentido; um sacarídeo; um dendrímero hidrossolúvel; uma ciclodextrina; um biomaterial; uma nanopartícula; um rótulo de spin; um fluoróforo; uma fração contendo metal; uma fração radioativa; um grupo funcional inédito; um grupo que interage por covalência ou por não covalência com outras moléculas; uma fração foto-aprisionada; uma fração excitável por radiação actínica, um ligante, uma fração foto-isomerizável; biotina; um derivado de biotina; um análogo de biotina; uma fração que incorpora um átomo pesado; um grupo quimicamente clivável; um grupo foto-clivável; uma cadeia lateral alongada; um açúcar ligado a carbono; um agente redox-ativo; um amino tioácido; uma fração tóxica; uma fração isotopicamente rotulada; uma sonda biofísica; um grupo fosforescente; um grupo quimioluminescente; um grupo com densidade de elétrons; um grupo magnético; um grupo intercalado; um cromóforo; um agente de transferência de energia; um agente biologicamente ativo (em cujo caso, o agente biologicamente ativo pode incluir um agente com atividade terapêutica e o polipeptídeo de aminoácido não natural ou polipeptídeo de aminoácido não natural modificado podem ser prestar ou como um agente co-terapêutico ou como um meio para fornecimento do agente terapêutico a um sítio desejado no interior de um organismo); um rótulo detectável; uma molécula pequena; um ácido ribonucléico inibidor, um radionucleotídeo; um agente capturador de nêutrons, um derivado de biotina; ponto(s) quântico(s); um nanotransmissor;, um radiotransmissor, uma abzima, um ativador de complexo ativado, um vírus, um adjuvante, um aglican, um alergan, uma angiostatina, um anti- hormonio, um antioxidante, um aptâmero, um RNA orientador, uma saponina, um vetor bilateral, uma macromolécula, um mimótopo, um receptor, uma micela inversa, e quaisquer combinações destes. Observe que, as várias funcionalidades supra não têm a intenção de implicar no fato dos membros de uma funcionalidade não poderem ser classificados como membros de uma outra funcionalidade. De fato, existirá uma sobreposição, dependendo das circunstâncias particulares. À guisa de exemplo, apenas, um polímero hidrossolúvel se prolongará no escopo com um derivado de polietileno glicol, contudo, a sobreposição não é completa e assim ambas as funcionalidades são citadas supra.
[00238]Como mostrado na Figura 1, em um aspecto, estão métodos para seleção e projeto de um polipeptídeo para modificação usando os métodos, composições e técnicas aqui descritas. O novo polipeptídeo pode ser planejado de novo, incluindo, à guisa de exemplo apenas, como parte de processo de seleção de alta produção (em cujo caso, numerosos polipeptídeos podem ser planejados, sintetizados, caracterizados e/ou testados), ou com base nos interesses do pesquisadores. O novo polipeptídeo também pode ser planejado com base na estrutura de um polipeptídeo conhecido ou parcialmente caracterizado. À guisa de exemplo, apenas, a Superfamília do Gene do Hormônio do Crescimento (ver abaixo) foi submetido a intensos estudos pela comunidade científica; um novo polipeptídeo pode ser planejado com base na estrutura de um membro ou membros desta superfamília de gene. Os princípios para seleção de quais aminoácidos substituir e/ou modificar estão descritos em separado no presente documento. A escolha de qual modificação se deve empregar também está aqui descrita, e pode ser empregada para satisfazer a necessidade do pesquisador ou usuário final. Tais necessidades podem incluir, sem limitação, a manipulação da eficácia terapêutica do polipeptídeo, melhora do perfil de segurança do polipeptídeo, ajuste da fármaco- cinética, farmacologia e/ou farmacodiânmica do polipeptídeo, tal como por exemplo, aumento da solubilidade em água, biodisponibilidade, aumento da meia-vida séria, aumento da meia-vida terapêutica, modulação da imunogenicidade, modulação da atividade biológica, ou prolongamento do tempo de circulação. Além disso, tais modificações incluem, à guisa de exemplo, garantia de funcionalidade adicional ao polipeptídeo, incorporando um identificador, rótulo ou sinal detectável ao polipeptídeo, facilitando as propriedades de isolamento do polipeptídeo e qualquer combinação das modificações supracitadas.
[00239]Também se descrê aqui, aminoácidos não naturais que têm ou podem ser modificados para conter um grupo oxima, carbonila, dicarbonila ou hidroxilamina. Incluído neste aspecto estão métodos para produção, purificação, caracterização e uso desses aminoácidos não naturais. Em mais um aspecto estão métodos estratégias e técnicas para incorporação de pelo menos um de tal aminoácido não natural a um polipeptídeo. Também se inclui neste aspecto, métodos para produção, purificação, caracterização e uso de tais polipeptídeo, contendo pelo menos um aminoácido não natural. Também estão incluídos neste aspeto, composições e métodos para produção, purificação, caracterização e uso de oligonucleotídeos (incluindo DNA e RNA) que podem ser usados para produzir, pelo menos em parte um polipeptídeo contendo pelo menos um aminoácido não natural. Também estão incluídos neste aspecto composições e métodos para produção, purificação, caracterização e uso de células que podem expressar tais oligonucleotídeos que podem ser usados para produzir, pelo menos em parte, um polipeptídeo contendo pelo menos um aminoácido não natural.
[00240]Assim, os polipeptídeo compreendendo pelo menos um aminoácido não natural ou aminoácido não natural modificado com um grupo carbonila, dicarbonila, oxima ou hidroxilamina são proporcionados e descritos no presente documento. Em algumas modalidades, os polipeptídeos com pelo menos um aminoácido não natural ou aminoácido não natural modificado com um grupo carbonila, dicarbonila, oxima ou hidroxilamina incluem pelo menos uma modificação pós-traducional em algum lugar do polipeptídeo. Em algumas modalidades, a modificação co-traducional ou pós-traducional ocorre via maquinário celular (por exemplo, glicosilação, acetilação, acilação, modificação lipídica, palmitoilação, adição de palmitato, fosforilação, modificado por ligação a glicolipídio, e similar), em muitos exemplos tais modificações co-traducionais ou pós-traducionais com base em maquinário celular ocorrem em sítios do aminoácido de ocorrência natural no polipeptídeo, contudo, em algumas modalidades, as modificações co-traducionais ou pós-traducionais com base em maquinário celular ocorrem em sítios do aminoácido não natural no polipeptídeo.
[00241]Numa outra modalidade, a modificação pós-traducional não utiliza o maquinário celular, mas a funcionalidade é de outro modo, proporcionada pela ligação de uma molécula (incluindo, sem limitação, a um rótulo, um corante; um polímero; um polímero hidrossolúvel; um derivado de polietileno glicol; um foto- reticulador; um composto citotóxico; uma droga; um rótulo de afinidade; um rótulo de foto-afinidade; um composto reativo; uma resina; uma segunda proteína ou polipeptídeo ou análogo de polipeptídeo; um anticorpo ou fragmento de anticorpo; um quelante de metal; um co-fator; um ácido graxo; um carboidrato; um polinucleotídeo; um DNA; um RNA; um polinucleotídeo anti-sentido; um sacarídeo; um dendrímero hidrossolúvel; uma ciclodextrina; um biomaterial; uma nanopartícula; um rótulo de spin; um fluoróforo; uma fração contendo metal; uma fração radioativa; um grupo funcional inédito; um grupo que interage por covalência ou por não covalência com outras moléculas; uma fração foto-aprisionada; uma fração excitável por radiação actínica, um ligante, uma fração foto-isomerizável; biotina; um derivado de biotina; um análogo de biotina; uma fração que incorpora um átomo pesado; um grupo quimicamente clivável; um grupo foto-clivável; uma cadeia lateral alongada; um açúcar ligado a carbono; um agente redox-ativo; um amino tioácido; uma fração tóxica; uma fração isotopicamente rotulada; uma sonda biofísica; um grupo fosforescente; um grupo quimioluminescente; um grupo com densidade de elétrons; um grupo magnético; um grupo intercalado; um cromóforo; um agente de transferência de energia; um agente biologicamente ativo, um rótulo detectável; uma molécula pequena; um ácido ribonucléico inibidor, um radionucleotídeo; um agente capturador de nêutrons, um derivado de biotina; ponto(s) quântico(s); um nanotransmissor;, um radiotransmissor, uma abzima, um ativador de complexo ativado, um vírus, um adjuvante, um aglican, um alergan, uma angiostatina, um anti- hormonio, um antioxidante, um aptâmero, um RNA orientador, uma saponina, um vetor bilateral, uma macromolécula, um mimótopo, um receptor, uma micela inversa, e quaisquer combinações destes), compreendendo um segundo grupo reativo a pelo menos um aminoácido não natural compreendendo um primeiro grupo reativo (incluindo sem limitação, a um aminoácido não natural contendo um grupo acetona, aldeído, acetal, hemiacetal, oxima, ou hidroxilamina funcional), que utiliza metodologia química aqui descrita ou outros adequados para os grupos reativos particulares. Em algumas modalidades, a modificação co-traducional, ou pós- traducional é feita in vivo numa célula eucariótica ou numa célula não eucariótica. Em algumas modalidades, a modificação pós-traducional é feita in vitro e não utiliza o maquinário celular. Também se inclui neste aspecto métodos para produção, purificação, caracterização e uso de tais polipeptídeo contendo pelo menos um de tais aminoácidos não naturais co-traducional ou pós-traducionalmente modificados.
[00242]Também se inclui no escopo dos métodos, composições, estratégias e técnicas aqui descritas, reagentes capazes de reagir com um aminoácido não natural (contendo um grupo carbonila ou dicarbonila, grupo oxima, grupo hidroxilamina, ou formas mascaradas ou protegidas destes) que constituem parte de um polipeptídeo de modo a produzir quaisquer modificações pós-traducinais supracitadas. Em geral, o aminoácido não natural pós-traducionalmente modificado resultante conterá pelo menos um grupo oxima, o resultante aminoácido não natural contendo oxima modificado resultante sofrerá subseqüentes reações de modificação. Também se incluem neste aspecto, métodos para produção, purificação, caracterização e uso desses reagentes que são capazes de quaisquer modificações pós-traducionais desse tipo dos referidos aminoácidos não naturais.
[00243]Em algumas modalidades, o polipeptídeo inclui pelo menos uma modificação co-traducional ou pós-traducional que é feita in vivo pela célula hospedeira, onde a modificação pós-traducional não é normalmente feita por um outro tipo de célula hospedeira. Em algumas modalidades, o polipeptídeo inclui pelo menos uma modificação co-traducional ou pós-traducional, que é feita in vivo por uma célula eucariótica, onde a modificação co-traducional ou pós-traducional, não é normalmente feita por uma célula não-eucariótica, Exemplos dessas modificações co-traducionais ou pós-traducionais incluem, sem limitação, glicosilação, acetilação, acilação, modificação com lipídio, palmitoilação, adição de palmitato, fosforilação, modificação ligada a glicolipídio. e similar. Em uma modalidade, a modificação co-traducional ou pós-traducional compreende a ligação de um oligossacarídeo a uma asparagina por uma ligação GlcNAc-asparagina (incluindo sem limitação, onde o oligossacarídeo compreende (GlcNAc-Man)2-Man- GlcNAc-GlcNAc, e similar). Numa outra modalidade, a modificação co-traducional ou pós-traducional, compreende a ligação de um oligossacarídeo ( incluindo sem limitação a Gal-GalNAc, Gal-GlcNAc, etc.) a uma serina ou treonina por uma ligação GalNAc-serina, uma ligação GalNAc-treonina, uma ligação GlcNAc-serina, ou uma ligação GlcNAc-treonina. Em algumas modalidades, uma proteína ou polipeptídeo pode compreende uma seqüência de secreção ou localização, um epitopo tag, um FLAG tag, uma poli histidina tag, uma fusão GST, e/ou similar. Também se inclui neste aspecto, métodos para produção, purificação, caracterização e uso de tais polipeptídeos contendo pelo menos uma de tais modificações co-traducional ou pós- traducional. Numa outra modalidade, o polipeptídeo de aminoácido não natural glicosilado é produzido numa forma não glicosilada. Uma tal forma não glicosilada de um aminoácido não natural glicosilado pode ser produzida por métodos que incluem reação química ou enzimática de grupos oligossacarídeos de um polipeptídeo de aminoácido não natural isolado ou substancialmente purificado ou não purificado glicosilado; produção do aminoácido não natural num hospedeiro, que não glicosila um tal polipeptídeo de aminoácido não natural (tal como um hospedeiro, incluindo procariotos ou eucariotos engenheirados ou mutacionados para não glicosilarem um tal polipeptídeo), a introdução de um inibidor de glicosilação ao meio de cultura celular em que um tal polipeptídeo de aminoácido não natural está sendo produzido por um eucarioto que, normalmente iria glicosilar esse polipeptídeo, ou uma combinação de quaisquer desses métodos. Também se descrevem aqui, tais formas não glicosiladas de polipeptídeos de aminoácido não natural, normalmente, glicosilados (por normalmente glicosilados, quer-se dizer um polipeptídeo que iria ser glicosilado, quando produzido sob condições em que os polipeptídeos de ocorrência natural são glicosilados). Naturalmente, que tais formas não glicosiladas dos polipeptídeos de aminoácido não natural, normalmente, glicosilados (ou de fato qualquer polipeptídeo aqui descrito) podem estar numa forma não purificada, uma forma substancialmente purificada ou numa forma isolada.
[00244]Em algumas modalidades, o polipeptídeo de aminoácido não natural inclui pelo menos uma modificação pós-traducional que é produzida na presença de um acelerador, onde a modificação pós-traducional é estequiométrica, similar à estequiométrica ou quase-estequiométrica. Em outras modalidades, o polipeptídeo está em contato com um reagente de Fórmula (XIX) na presença de um acelerador. Em outras modalidades, o acelerador é selecionado do grupo consistindo em:
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[00245]O polipeptídeo de aminoácido não natural pode conter pelo menos um, pelo menos dois, pelo menos três, pelo menos quatro, pelo menos cinco, pelo menos seis, pelo menos sete, pelo menos oito, pelo menos nove, ou dez ou mais aminoácidos não naturais contendo ou um grupo carbonila ou dicarbonila, grupo oxima, grupo hidroxilamina, ou formas protegidas destes. Os aminoácidos não naturais podem ser iguais ou diferentes, por exemplo, podem existir 1, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, ou mais sítios diferentes na proteína que compreendem 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 ou mais diferentes aminoácidos não naturais. Em algumas modalidades pelo menos um, porém pouco menos que todos, de um dado aminoácido presente numa versão de ocorrência natural da proteína é substituído com um aminoácido não natural.
[00246]Os métodos e composições aqui proporcionados e descritos incluem polipeptídeos compreendendo pelo menos um aminoácido não natural contendo um grupo carbonila ou dicarbonila, grupo oxima, grupo hidroxilamina, ou formas protegidas ou mascaradas destes. A introdução de pelo menos um aminoácido não natural a um polipeptídeo pode permitir a aplicação de químicas conjugadas envolvendo reações químicas específica, incluindo, sem limitação, com um ou mais aminoácidos não naturais, enquanto não reagindo com os 20 aminoácidos de ocorrência comum. Uma vez incorporadas as cadeias laterais do aminoácido não natural também podem ser modificadas por utilização de metodologias químicas aqui descritas ou adequadas para grupos funcionais particulares ou substituintes presentes no aminoácido naturalmente codificado.
[00247]Os métodos e composições do aminoácido não natural aqui descrito proporcionam conjugados de substancias tendo uma ampla gama de grupos funcionais substituintes ou frações, com outras substancias, incluindo, sem limitação, a um rótulo, um corante; um polímero; um polímero hidrossolúvel; um derivado de polietileno glicol; um foto-reticulador; um composto citotóxico; uma droga; um rótulo de afinidade; um rótulo de foto-afinidade; um composto reativo; uma resina; uma segunda proteína ou polipeptídeo ou análogo de polipeptídeo; um anticorpo ou fragmento de anticorpo; um quelante de metal; um co-fator; um ácido graxo; um carboidrato; um polinucleotídeo; um DNA; um RNA; um polinucleotídeo anti-sentido; um sacarídeo; um dendrímero hidrossolúvel; uma ciclodextrina; um biomaterial; uma nanopartícula; um rótulo de spin; um fluoróforo; uma fração contendo metal; uma fração radioativa; um grupo funcional inédito; um grupo que interage por covalência ou por não covalência com outras moléculas; uma fração foto-aprisionada; uma fração excitável por radiação actínica, um ligante, uma fração foto-isomerizável; biotina; um análogo de biotina; uma fração que incorpora um átomo pesado; um grupo quimicamente clivável; um grupo foto-clivável; uma cadeia lateral alongada; um açúcar ligado a carbono; um agente redox-ativo; um amino tioácido; uma fração tóxica; uma fração isotopicamente rotulada; uma sonda biofísica; um grupo fosforescente; um grupo quimioluminescente; um grupo com densidade de elétrons; um grupo magnético; um grupo intercalado; um cromóforo; um agente de transferência de energia; um agente biologicamente ativo, um rótulo detectável; uma molécula pequena; um ácido ribonucléico inibidor, um radionucleotídeo; um agente capturador de nêutrons, um derivado de biotina; ponto(s) quântico(s); um nanotransmissor; um radiotransmissor, uma abzima, um ativador de complexo ativado, um vírus, um adjuvante, um aglican, um alergan, uma angiostatina, um anti-hormonio, um antioxidante, um aptâmero, um RNA orientador, uma saponina, um vetor bilateral, uma macromolécula, um mimótopo, um receptor, uma micela inversa, e quaisquer combinações destes.
[00248]Em algumas modalidades, os aminoácidos não naturais, polipeptídeos de aminoácido não natural, ligantes e reagentes aqui descritos, incluindo os compostos de Fórmulas (I)-(XXXIII) são estáveis em solução aquosa sob condições suavemente ácidas (incluindo sem limitação a pH 2 a 8), Numa outra modalidade, tais compostos serão estáveis por pelo menos um mês, sob condições brandamente acidas. Numa outra modalidade, tais compostos são estáveis por pelo menos 2 semanas sob condições brandamente acidas. Numa outra modalidade, tais compostos são estáveis por pelo menos 5 dias sob condições brandamente acidas.
[00249]Num outro aspecto das composições, métodos, técnicas e estratégias aqui descritas, estão métodos para estudo ou uso de quaisquer polipeptídeos de aminoácido não natural "modificados ou não modificados" supracitados. Incluem-se neste aspecto, a guisa de exemplo, usos terapêuticos, de diagnóstico, com base em ensaio, industriais, cosméticos, na área da botânica, ambiental, produção de energia, produtos ao consumidor, e/ou militares que se beneficiariam de um polipeptídeo compreendendo um polipeptídeo de aminoácido não natural ou proteína "modificado" ou não modificado" .
III - Localização dos polipeptídeos de aminoácido não natural
[00250]Os métodos e composições aqui descritos incluem a incorporação de um ou mais aminas a um polipeptídeo. Um ou mais aminoácidos não naturais podem ser incorporados a uma ou mais posições particulares, que não rompem a atividade do polipeptídeo. Isto pode ser feito fazendo-se substituições "conservadoras" incluindo, sem limitação, substituição de aminoácidos hidrofóbicos com aminoácidos hidrofóbicos não naturais ou naturais, aminoácidos volumosos, com aminoácidos volumosos não naturais ou naturais, aminoácidos hidrofílicos com aminas hidrofílicos não naturais ou naturais) e/ou inserção do aminoácido não natural num local que não é solicitado para atividade.
[00251]Uma gama de abordagens bioquímica e estruturais podem ser empregadas para seleção dos sítios desejados para substituição com um aminoácido não natural no polipeptídeo. Qualquer posição da cadeia polipeptídica é adequada para seleção da incorporação de um aminoácido não natural, e a seleção pode ser baseada no planejamento racional ou por seleção aleatória para qualquer fim desejado. A seleção dos sítios desejados pode ser baseada na produção de um polipeptídeo de aminoácido não natural (que pode ser adicionalmente modificado ou permanecer não modificado) com qualquer propriedade desejada ou atividade, incluindo sem limitação, agonistas, super- agonistas, agonistas parciais, agonistas inversos, antagonistas, moduladores de ligação ao receptor, moduladores da atividade do receptor, moduladores da ligação aos pares ligantes, moduladores da atividade do par, moduladores da conformação do par de ligações, formação de dímero ou multímero, nenhuma alteração a atividade ou propriedade comparado com a molécula nativa, ou manipulação de qualquer propriedade física ou química do polipeptídeo tal como solubilidade, agregação, ou estabilidade. Por exemplo, os locais no polipeptídeo necessários para atividade biológica de um polipeptídeo podem ser identificados mediante métodos incluindo, sem limitação, análise por mutação de ponto, varredura de alanina ou métodos de varredura homólogos. Resíduos diferentes daqueles identificados como críticos para a atividade biológica por métodos, incluindo, sem limitação, a alanina ou mutagênese de varredura homóloga podem ser bons candidatos para substituição com um aminoácido não natural dependendo da atividade desejada que se tenha em mente para o polipeptídeo. Alternativamente, os sítios identificados como críticos para a atividade biológica também podem ser bons candidatos para substituição com um aminoácido não natural, novamente dependendo da atividade desejada que se pensa para o polipeptídeo. Uma outra alternativa, seria simplesmente fazer substituições seriais em cada posição na cadeia polipeptídica com um aminoácido não natural e observar o efeito nas atividades do polipeptídeo. Quaisquer meios, técnicas ou métodos para seleção de uma posição para substituição com um aminoácido não natural em qualquer polipeptídeo é adequado para emprego nos métodos, técnicas e composições aqui descritos.
[00252]A estrutura e atividade dos mutantes de ocorrência natural de um polipeptídeo que contém deleções, podem também ser examinadas para se determinar regiões da proteína que são prováveis de ser tolerantes à substituição com um aminoácido não natural. Uma vez que os resíduos que são prováveis de ser intolerantes à substituição com os aminoácidos não naturais terem sido eliminados, o impacto de substituições propostas em cada uma das posições restantes podem ser examinado usando métodos incluindo, sem limitação, a estrutura tridimensional do polipeptídeo relevante, e quaisquer ligantes associados ou proteínas de ligação. A cristalografia por raios-X e estruturas de RMN de muitos polipeptídeos estão disponíveis em Protein Data Bank (PDB, www.rcsb.org), uma base de dados centralizada contendo dados estruturais tridimensionais de grandes moléculas de proteínas e ácidos nucléicos, pode ser usada para identificar posições de aminoácido passíveis de substituição com aminoácidos não naturais. Alem disso, modelos podem ser feitos, investigando a estrutura secundária e terciária dos polipeptídeos, caso os dados estruturais tridimensionais não estejam disponíveis. Assim, a identidade das posições dos aminoácidos que pode ser substituída com os aminoácidos não naturais pode ser prontamente obtida.
[00253]Sítios exemplares de incorporação de um aminoácido não natural incluem, sem limitação, sem limitação, os que são excluídos das regiões de ligação aos receptores potenciais, ou regiões para ligação a proteínas de ligação ou ligantes podem ser total ou parcialmente expostos a solvente, terem mínima interação de ligação a hidrogênio ou nenhuma de todo com resíduos próximos, podem ser minimamente expostos a resíduos reativos nas proximidades, e/ou podem estar em regiões que são altamente flexíveis como previsto pela estrutura de cristal tridimensional de um dado polipeptídeo com seus receptores, ligante ou proteínas de ligação associados.
[00254]Uma ampla gama de aminoácidos não naturais pode ser substituída para, ou incorporados a, uma dada posição num polipeptídeo. À guisa de exemplo, um determinado aminoácido não natural pode ser selecionado para incorporação como base num exame da estrutura de cristal tridimensional de um polipeptídeo com seu ligante, receptor e/ou proteínas de ligação associados, uma preferência para substituição conservadora.
[00255]Numa modalidade, os métodos aqui descritos incluem a incorporação ao polipeptídeo, o aminoácido não natural, onde o aminoácido não natural compreende um primeiro grupo reativo, e o contato do polipeptídeo com uma molécula, (incluindo, porém sem limitação, a um rótulo, um corante; um polímero; um polímero hidrossolúvel; um derivado de polietileno glicol; um foto-reticulador; um composto citotóxico; uma droga; um rótulo de afinidade; um rótulo de foto-afinidade; um composto reativo; uma resina; uma segunda proteína ou polipeptídeo ou análogo de polipeptídeo; um anticorpo ou fragmento de anticorpo; um quelante de metal; um co-fator; um ácido graxo; um carboidrato; um polinucleotídeo; um DNA; um RNA; um polinucleotídeo anti-sentido; um sacarídeo; um dendrímero hidrossolúvel; uma ciclodextrina; um biomaterial; uma nanopartícula; um rótulo de spin; um fluoróforo; uma fração contendo metal; uma fração radioativa; um grupo funcional inédito; um grupo que interage por covalência ou por não covalência com outras moléculas; uma fração foto-aprisionada; uma fração excitável por radiação actínica, um ligante, uma fração foto-isomerizável; biotina; um análogo de biotina; uma fração que incorpora um átomo pesado; um grupo quimicamente clivável; um grupo foto-clivável; uma cadeia lateral alongada; um açúcar ligado a carbono; um agente redox-ativo; um amino tioácido; uma fração tóxica; uma fração isotopicamente rotulada; uma sonda biofísica; um grupo fosforescente; um grupo quimioluminescente; um grupo com densidade de elétrons; um grupo magnético; um grupo intercalado; um cromóforo; um agente de transferência de energia; um agente biologicamente ativo, um rótulo detectável; uma molécula pequena; um ácido ribonucléico inibidor, um radionucleotídeo; um agente capturador de nêutrons, um derivado de biotina; ponto(s) quântico(s); um nanotransmissor; um radiotransmissor, uma abzima, um ativador de complexo ativado, um vírus, um adjuvante, um aglican, um alergan, uma angiostatina, um anti-hormonio, um antioxidante, um aptâmero, um RNA orientador, uma saponina, um vetor bilateral, uma macromolécula, um mimótopo, um receptor, uma micela inversa, e quaisquer combinações destes), compreendendo um segundo grupo reativo. Em algumas modalidades o primeiro grupo reativo, é uma fração carbonila ou dicarbonila e o segundo grupo reativo é uma fração oxima, ocorrendo uma reação de troca de oxima. Em algumas modalidades, o primeiro grupo reativo é uma fração oxima e o segundo grupo reativo é fração carbonila ou dicarbonila, ocorrendo uma reação de troca de oxima.
[00256]Em alguns casos, a(s) substituição(ões) de aminoácido não natural ou incorporação(ões) serão combinada(s) com outras adições, substituições, ou deleções no polipeptídeo para afetar outros aspectos químicos, físicos farmacológicos e/ou biológicos. Em alguns casos, as outras adições, substituições ou deleções podem aumentar a estabilidade (incluindo, sem limitação, a resistência a degradação proteolítica) do polipeptídeo ou aumentar a afinidade do polipeptídeo para seu receptor apropriado, ligante e/ou proteínas de ligação. Em alguns casos, as outras adições, substituições ou deleções podem aumentar a solubilidade (incluindo, sem limitação, quando expressado em E. coli ou outras células hospedeiras) do polipeptídeo. Em algumas modalidades, são selecionados sítios para substituição com um aminoácido naturalmente codificado ou não natural, além de um outro sítio para incorporação de um aminoácido não natural para fins de aumento da solubilidade do polipeptídeo, seguinte a expressão em E. coli ou outras células hospedeiras recombinantes. Em algumas modalidades, os polipeptídeos compreendem uma outra adição, substituição, ou deleção que modula a afinidade para ligantes associados, proteínas de ligação e/ou receptor, modula (incluindo, sem limitação, aumentos ou reduções), dimerização do receptor, estabiliza dímeros do receptor, circulando a meia-vida, modula a liberação ou biodisponibilidade, facilita a purificação ou melhora ou altera uma via de administração particular. Similarmente, o polipeptídeo de aminoácido não natural pode compreender sequências de clivagem química ou enzimática, sequências de clivagem de protease, grupos reativos, domínios de ligação ao anticorpo (incluindo, sem limitação, FLAG, ou poli- His) ou outras sequências baseadas na afinidade (incluindo, sem limitação, FLAG, poli-His, GST, etc.) ou moléculas de ligação (incluindo, sem limitação, biotina) que melhora a detecção (incluindo, sem limitação, GFP), purificação, transportes através dos tecidos ou membranas celulares, liberação de prodroga ou ativação, redução do tamanho ou outros aspectos característicos do polipeptídeo.
IV. Família de Supergenes do Hormônio do Crescimento como Exemplo
[00257]Os métodos, composições, estratégias e técnicas, aqui descritos, não estão limitados a um dado tipo, classe ou família de polipeptídeos ou proteínas. De fato, virtualmente quaisquer polipeptídeos podem ser planejados ou modificados para inclusão de pelo menos um aminoácido não natural "modificado ou não modificado" aqui descrito. A guisa de exemplo, apenas, o polipeptídeo pode ser homólogo a uma proteína terapêutica selecionada do grupo consistindo de alfa-1, antitripsina, angiostatina, fator anti-hemolítico, anticorpo, fragmento de anticorpo, apoliproteína, apoproteína, fator natriurético atrial, polipeptídeo natriurético atrial, peptídeo atrial, C-X-C quimiocina, T39765, NAP-2, ENA-78, gro-a, gro-b, gro-c, IP- 10, GCP-2, NAP-4, SDF-1, PF4, MIG, calcitonina, ligante c-kit, citocina, CC quimiocina, proteína 1- quimioatrativa de monócito, proteína-2 quimioatrativa de monócito, proteína 3 quimioatrativa de monócito, proteína-1 alfa inflamatória de monócito, proteína beta inflamatória de monócito, RANTES, 1309, R83915, R91733, HCC1, T58847, D31065, T64262, CD40, ligante CD40, ligante c-kit, colágeno, fator estimulante de colônia (CSF), fator 5a complementar, inibidor complementar, receptor 1 complementar, citocina, peptídeo 78 ativador de neutrófilo epitelial, MIP- 16, MCP-1, fator de crescimento epidérmico (EGF), peptídeo ativador de neutrófilo epitelial, eritropoietina (EPO), toxina esfoliante, Fator IX, Fator VII, Fator VIII, Fator X, fator de crescimento de fibroblasto (FGF), fibrinogênio, fibronectina, proteína de feixe de quatro hélices, G-CSF, glp-1, GM-CSF, glicocerebrosidase, gonadotropina, fator de crescimento, receptor do fator de crescimento, grf, proteína de ouriço, hemoglobina, fator de crescimento de hepatócito (hGF), hirudina, hormônio do crescimento humano (hGH), albumina sérica humana, ICAM-1, receptor de ICAM-1, LFA-1, receptor de LFA-1, insulina, fator de crescimento semelhante à insulina (IGF), IGF-I, IGF-II, interferon (IFN), IFN-alfa, IFN-beta, IFN-gama, interleucina, (IL, IL-1, IL- 2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, fator de crescimento de ceratinócito (KGF), lactoferrina, fator inibidor de leucemia, luciferase, neurturina, fator inibidor de neutrófilo (NIF), oncostatina M, proteína osteogênica, produto oncogênico, paracitonina, hormonio da paratireóide, PD-ECSF, PDGF, hormônio peptídico, pleiotropina, proteína A, proteína G, pth, exotoxina A pirogênica, exotoxina B pirogênica, exotoxina C pirogênica, pyy, relaxina, renina, SCF, proteína biossintética pequena, receptor I de complemento solúvel, I-CAM 1 solúvel, receptor de interleucina solúvel, receptor de TNF solúvel, somatomedina, somatostatina, somatotropina, super-antígenos de estreptoquinase, enterotoxina estafilocócica, SEA, SEB, SEC1, SEC2, SEC3, SED, SEE receptor do hormônio esteróide, suiperóxido dismutase, toxina da síndrome do choque tóxico, alfa 1 timosina, ativador plasminogenico de tecido, fator de crescimento de tumor (TGF), fator de necrose de tumor, fator alfa de necrose de tumor, fator beta de necrose de tumor, receptor do fator de necrose de tumor (TNFR), proteína VLA-4, proteína VCAM-1, fator de crescimento endotelial vascular (VEGF), uroquinase, mos, ras, faf, met, p53 tat, fos, myc, jun, myb, rel, receptor de estrogênio, receptor de progesterona, receptor de testosterona, receptor de aldosterona, receptor de LDL e corticosterona.
[00258]Assim, a descrição que se segue da família de supergenes do hormônio do crescimento (GH é dada para fins ilustrativos e à guisa de exemplo apenas, e, de modo algum como imitante do escopo dos métodos, composições, estratégias e técnicas aqui descrita. Alem disso, referências a polipeptídeos do GH neste pedido destinam-se ao uso do termo genérico como um exemplo de qualquer membro da família do supergene do GH. Assim, fica entendido que, as modificações e químicas aqui descritas com referência aos polipeptídeos ou proteínas do GH, podem ser igualmente aplicadas a qualquer membro da família do supergene do GH, incluindo aquelas de modo específico, aqui descritas.
[00259]As seguintes proteínas incluem as codificadas pelos genes da família do supergene do hormônio do crescimento (GH) (Bazan, F. Immunology Today 11: 350-354 (1990); Bazan, J.F. Science 257:410-411 (1992), Mott, H. R. e Campbell, I.D. Current Opinion in Structural Biology 5: 114- 121 (1995); Silvennoinen, O. e Ihle, J.N. (1996) Signaling By The Hematopoietic Cytokine Receptors): hormônio do crescimento, prolactina, lactogênio placentário, eritropoietina (EPO), trombopoietina (TPO), interleucina-2 (IL-2), IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12 (subunidade p35), IL-13, IL-15, oncostatina M, fator neurotrófico ciliar, fator inibidor de leucemia, interferon alfa, interferon beta, interferon gama, interferon ômega, interferon tau, interferon épsilon, fator estimulante de colônia de granulócitos (G- CSF), fator estimulante de colônia de granulócitos-macrófagos (GM-CSF), fator estimulante de colônia de macrófagos (M-CSF) e cardiotrofina-1 (CT-1) (“a família de supergenes GH”). Antecipa-se que, membros adicionais desta família de genes serão identificados no futuro, através da clonagem e sequenciamento genéticos. Membros da família de supergenes GH têm estruturas secundárias e terciárias semelhantes, apesar do fato deles apresentarem geralmente uma identidade limitada de sequências de aminoácidos ou de DNA. As características estruturais compartilhadas permitem que sejam facilmente identificados novos membros da família de gene, e também, que sejam similarmente aplicados os métodos e composições de aminoácido não natural aqui descritos.
[00260]Estruturas de uma série de citocinas, incluindo G-CSF (Zink et al., FEBS Lett. 314:435 (1992); Zink et al., Biochemistry 33: 8453 (1994); Hill et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5167 (1993)), GM-CSF (Diederichs, K., et al. Science 154: 1779-1782 (1991); Walter et al, J. Mol. Biol. 224:1075-1085 (1992)), IL-2 (Bazan, J. F. e McKay, D. B. Science 257: 410-413 (1992), IL-4 (Redfield et al., Biochemistry 30: 11029-11035 (1991); Powers et al., Science 256:1673-1677 (1992)), e IL-5 (Milburn et al., Nature 363: 172-176 (1993)) foram determinadas por difração de raios X e estudos de RMN e mostraram uma conservação surpreendente com a estrutura de GH, apesar de uma ausência de homologia significativa entre sequências primárias. IFN é considerado como sendo um membro desta família com base na modelagem e outros estudos (Lee et al., J. Interferon Cytokine Res. 15: 341 (1995); Murgolo et al., Proteins 17: 62 (1993); Radhakrishnan et al., Structure 4: 1453 (1996); Klaus et al., J. Mol. Biol. 274: 661 (1997)). Um grande número de citocinas adicionais e fatores de crescimento incluindo fator neurotrófico ciliar (CNTF), fator inibidor de leucemia (LIF), trombopoietina (TPO), oncostatina M, fator estimulador de colônia de macrófagos (M-CSF), IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-9, IL- 12, IL13, IL-15, e fator estimulante de colônia de granulócitos (G-CSF), bem como os IFN's como alfa, beta, ômega, tau, épsilon e gama, interferon, pertencem a esta família (revisto em Mott and Campbell, Current Opinion in Structural Biology 5: 114121 (1995; Silvennoinen, e Ihle,(1996) Signaling By The Hematopoietic Cytokine Receptors). Todas as citocinas supra e fatores do crescimento estão agora considerados compreendendo uma grande família de genes.
[00261]Além de compartilhar estruturas secundárias e terciárias análogas, os membros desta família compartilham as propriedades de que eles devem oligomerizar receptores de superfície celular para ativar trajetos de sinalização intracelular. Alguns membros da família GH, inclusive, sem limitação, GH e EPO, se ligam a um tipo único de receptor e fazem com que ele forme homodímeros. Outros membros da família, incluindo, sem limitação, IL-2, IL-4 e IL-6 se ligam a mais de um tipo de receptor e fazem os receptores formar heterodímeros ou agregados de ordem superior (Davis et al., (1993), Science 260: 1805-1808; Paonessa et al., (1995), EMBO J. 14: 1942-1951; Mott e Campbell, Current Opinion in Structural Biology 5: 114-121 (1995)). Estudos de mutagênese mostraram que, tal como GH, estas outras citocinas e fatores de crescimento contêm uma multiplicidade de sítios de ligação a receptores, tipicamente dois, e que se ligam a seus receptores cognatos em seqüência (Mott e Campbell, Current Opinion in Structural Biology 5: 114-121 (1995); Matthews et al., (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 9471-9476). Tal como GH, os sítios de ligação a receptor primário para estes outros membros da família ocorrem principalmente nas quatro hélices alfa e no laço A-B. Os aminoácidos específicos nos feixes de hélices que participam na ligação a receptores diferem entre membros da família. A maioria dos receptores de superfície celular que interagem com membros da família de supergenes GH são estruturalmente relacionados e compreendem uma segunda família grande de múltiplos genes. Veja, por exemplo, a patente U.S. No. 6.608.183, que é incorporada ao presente documento a título de referência.
[00262]Uma conclusão geral a que se chega a partir dos estudos mutacionais de diversos membros da família de supergenes GH é que os laços que ligam as hélices alfa geralmente tendem a não se envolver na ligação ao receptor. Particularmente, parece que o laço B-C curto é não essencial para a ligação ao receptor na maioria, se não em todos, os membros da família. Por esta razão, o laço B-C pode ser substituído com aminoácidos não naturais, conforme descrito no presente, em membros da família de supergenes GH. O laço A-B, o laço C-D (e o laço D-E de membros semelhantes a interferon/IL-10 da superfamília GH) podem também ser substituídos com um aminoácido não natural. Os aminoácidos próximos da hélice A e distais à hélice final também tendem a não se envolver na ligação ao receptor e podem, portanto, ser sítios para a introdução de aminoácidos não naturais. Em algumas modalidades, um aminoácido não natural é substituído em qualquer posição no interior de uma estrutura de laço incluindo, sem limitação, os primeiros 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 ou mais aminoácidos do laço A-B, B-C, C-D ou D-E. Em algumas modalidades, um aminoácido não natural é substituído no interior dos últimos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 ou mais aminoácidos do laço A-B, B-C, C-D ou D-E.
[00263]Determinados membros da família GH, inclusive, sem limitação, EPO, IL-2, IL-3, IL-4, IL-6, G-CSF, GM-CSF, TPO, IL-10, p35 de IL-12, IL-13, IL-15 e interferon beta contêm açúcares ligados a N e/ou ligados a O. Os sítios de glicosilação nas proteínas ocorrem quase que, exclusivamente nas regiões de laços e não nos feixes de hélices alfa. Como as regiões de laço geralmente não estão envolvidas na ligação ao receptor, e como elas constituem sítios para a ligação covalente de grupos açúcar, elas podem ser sítios úteis para a introdução de substituições de aminoácidos não naturais nas proteínas. Os aminoácidos que compreendem sítios de glicosilação ligados a N e a O nas proteínas podem ser sítios para substituições com aminoácidos não naturais, pois estes aminoácidos têm as superfícies expostas. Portanto, a proteína natural pode tolerar grupos de açúcar volumosos ligados às proteínas nestes sítios e os sítios de glicosilação tendem a estar localizados além dos sítios de ligação ao receptor.
[00264]Membros adicionais da família de genes GH, provavelmente, serão descobertos no futuro. Novos membros da família de supergenes GH podem ser identificados por análises de estruturas secundárias e terciárias auxiliadas por computador das sequências previstas de proteína, e por técnicas de seleção projetadas para a identificação de moléculas que se ligam a um alvo específico. Os membros da família de supergenes GH tipicamente possuem quatro ou cinco hélices anfipáticas ligadas por aminoácidos não helicoidais (as regiões do laço). As proteínas podem conter uma seqüência de sinal hidrofóbica no seu terminal N para promover a secreção da célula. Tais membros que serão mais tarde descobertos da família de supergenes GH são também incluídos nos métodos e composições aqui descritos.
V. Aminoácidos não Naturais
[00265]Os aminoácidos não naturais empregados nos métodos e composições aqui descritos têm pelo menos uma das seguintes quatro propriedades: (1) pelo menos um grupo funcional na cadeia lateral do aminoácido não natural tem pelo menos uma característica e/ou atividade e/ou reatividade ortogonal à reatividade química dos 20 aminoácidos geneticamente codificados (ou seja, alanina, arginina, asparagina, ácido aspártico, cisteína, glutamina, ácido glutâmico, glicina, histidina, isoleucina, leucina, lisina, metionina, fenilalanina, prolina, serina, treonina, triptofano, tirosina e valina) ou pelo menos ortogonal à reatividade química dos aminoácidos de ocorrência natural presentes no polipeptídeo que inclui o aminoácido não natural; (2) os aminoácidos não naturais introduzidos são substancialmente quimicamente inertes no tocante aos 20 aminoácidos geneticamente codificados, comuns; (3) o aminoácido não natural pode ser estavelmente incorporado a um polipeptídeo, preferivelmente com a estabilidade medida com os aminoácidos de ocorrência natural ou sob condições fisiológicas típicas, e ale, disso, e preferivelmente tal incorporação pode ocorrer via um sistema in vivo; e (4) o aminoácido não natural inclui um grupo funcional oxima ou um grupo funcional que pode ser transformado num grupo oxima por reação com um reagente, por exemplo, sob condições que não destroem as propriedades biológicas do polipeptídeo que inclui o aminoácido não natural (a menos que, naturalmente uma tal destruição das propriedades biológicas seja a finalidade da modificação/transformação), ou onde a transformação pode ocorrer sob condições aquosas a um pH entre cerca de 4 e cerca de 8, ou onde o sítio reativo do aminoácido não natural seja um sítio eletrofílico. Exemplos não limitantes, ilustrativos do aminoácido que satisfaz essas quatro propriedades para os aminoácidos não naturais que podem ser empregados com as composições e métodos aqui descritos são apresentados nas Figuras 2, 3, 35 e 40-43. Qualquer número de aminoácidos não naturais pode ser introduzido ao polipeptídeo. Aminoácidos não naturais podem também incluir oximas protegidas ou mascaradas ou grupos protetores ou mascarados que podem ser transformados no grupo oxima após desproteção do grupo protetor ou desmascaramento do grupo mascarado. Aminoácidos não naturais podem também incluir grupos carbonila ou dicarbonila protetores ou mascarados, que podem ser transformados num grupo carbonila ou dicarbonila, após desproteção do grupo protetor ou desmascaramento do grupo mascarado e, por esse meio ser disponível para reagir com hidroxilaminas ou oximas formando grupos oxima.
[00266]Aminoácidos não naturais que podem ser empregados nos métodos e composições aqui descritas incluem, sem limitação, aos aminoácidos compreendendo um reticulador foto-ativável, aminoácidos spin-rotulados, aminoácidos fluorescentes aminoácidos que se ligam a metais, aminoácidos que contém metais, aminoácidos radioativos, aminoácidos com grupos funcionais inéditos, aminoácidos que interagem por covalência ou não covalência com outras moléculas, aminoácidos foto-encerrados e/ou fotoisomerizáveis, aminoácidos compreendendo biotina ou análogo de biotina, aminoácidos glicosilados tais como serina substituído com açúcar, outros aminoácidos modificados por carboidrato, aminoácidos contendo ceto, aminoácidos contendo aldeído, aminoácidos compreendendo polietileno glicol ou poliéteres, aminoácidos substituídos com átomo pesado, aminoácidos quimicamente cliváveis ou fotocliváveis, aminoácidos com uma cadeia lateral alongada em comparação com os aminoácidos naturais, incluindo, sem limitação, poliéteres ou hidrocarbonetos de cadeia longa, incluindo, sem limitação, tendo mais de aproximadamente 5 ou mais de aproximadamente 10 carbonos, aminoácidos contendo açúcar ligado a carbono, aminoácidos redox- ativos, aminoácidos contendo amino tioácidos, e aminoácidos compreendendo uma ou mais frações tóxicas.
[00267]Em algumas modalidades, os aminoácidos não naturais compreendem uma fração sacarídeo. Exemplos de tais aminoácidos incluem N- acetil-L-glucosaminil-L-serina, N-acetil-L-galactosaminil-L-serina, N-acetil-L- glucosaminil-L-treonina, N-acetil-L-glucosaminil-L-asparagina e O-manosaminil-L- serina. Exemplos de tais aminoácidos também incluem exemplos em que a ligação N ou O que ocorre naturalmente entre o aminoácido e o sacarídeo é substituída por uma ligação covalente não habitualmente encontrada na natureza - incluindo, sem limitação, um alceno, uma oxima, um tioéter, uma amida e similares. Exemplos de tais aminoácidos também incluem sacarídeos que não são habitualmente encontrados em proteínas de ocorrência natural, como 2-desóxi-glicose, 2-desóxi- galactose e similar.
[00268]As frações químicas por meio de aminoácidos não naturais que podem ser incorporadas aos polipeptídeos, oferecem uma variedade de vantagens e manipulações dos polipeptídeos. A reatividade única de um grupo funcional carbonila ou dicarbonila, por exemplo, (incluindo um grupo funcional ceto- ou aldeído-) permite a modificação seletiva de proteínas com qualquer um de uma série de reagentes contendo hidrazina ou hidroxilamina in vitro e in vivo. Um aminoácido não natural contendo átomo pesado, por exemplo, pode ser útil para dados estruturais de raios X em fase. A introdução específica ao sítio de átomos pesados usando-se aminoácidos não naturais também proporciona seletividade e flexibilidade na escolha de posições para átomos pesados. Os aminoácidos não naturais fotorreativos (inclusive, sem limitação, aminoácidos com cadeias secundárias de benzofenona e arilazidas (inclusive, sem limitação, fenilazida)), por exemplo, permite uma fotorreticulação eficiente de polipeptídeos in vivo e in vitro. Exemplos de aminoácidos não naturais fotorreativos incluem, sem limitação, p-azido-fenilalanina e p-benzoil-fenilalanina. O polipeptídeo com os aminoácidos não naturais fotorreativos pode então, ser reticulado à vontade, por excitação do controle temporal que fornece o grupo fotorreativo. Em um exemplo, sem limitação, o grupo metila de um aminoácido não natural pode ser substituído com um grupo isotopicamente rotulado, incluindo, sem limitação, metila, como uma sonda de estrutura e dinâmica local, incluindo, sem limitação, com o uso de ressonância magnética nuclear e espectroscopia vibracional.
A. Estrutura e Síntese De Aminoácidos Não Naturais: Grupos Carbonila, Similar à Carbonila, Carbonila Mascarado, e Carbonila Protetores
[00269]Aminoácidos com um grupo reativo eletrofílico permite a ligação de uma serie de reações a moléculas via várias reações químicas, incluindo, sem limitação, reações de adição nucleofílicas. Tais grupos eletrofílicos reativos incluem um grupo carbonila- ou dicarbonila (incluindo um grupo ceto- ou aldeído), um grupo similar à carbonila ou grupo similar à carbonila, (que possui reatividade similar à carbonila ou dicarbonila e é estruturalmente similar a um grupo carbonila- ou dicarbonila), um grupo carbonila- ou dicarbonila mascarado (que pode ser prontamente convertido num grupo carbonila - ou dicarbonila) ou um grupo carbonila- ou dicarbonila protetor (que possui reatividade similar ao grupo carbonila- ou dicarbonila com desproteção). Tais aminoácidos incluem aminoácidos com a estrutura de Fórmula (I):
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onde: A é opcional e, quando presente é alquileno inferior, alquileno inferior substituído, cicloalquileno inferior, cicloalquileno inferior substituído, alquenileno inferior, alquenileno inferior substituído, alquinileno, heteroalquileno inferior, heteroalquileno substituído, heterocicloalquileno inferior, heterocicloalquileno inferior substituído, arileno, arileno substituído, heteroarileno, heteroarileno substituído, alcarileno, alcarileno substituído, aralquileno ou aralquileno substituído, B é opcional, e quando presente é um ligante selecionado do grupo consistindo de alquileno inferior, alquileno inferior substituído, alquenileno inferior, alquenileno inferior substituído, heteroalquileno inferior, heteroalquileno inferior substituído, -O-, -O-(alquileno ou alquileno substituído)-, -S-, -S-(alquileno ou alquileno substituído)-, -S(O)k- onde k é 1, 2, ou 3, -S(O)k(alquileno ou alquileno substituído)-, -C(O)-, -NS(O)2, -OS(O)2-, -C(O)-(alquileno ou alquileno substituído)-, - C(S)-, -C(S)-(alquileno ou alquileno substituído)-, -N(R')-, NR'-(alquileno ou alquileno substituído),- -C(O)N(R')-, -CON(R')-(alquileno ou alquileno substituído)- -CSN(R')-, - CSN(R')-alquileno ou alquileno substituído)-, -N(R')CO-(alquileno ou alquileno substituído)- -N(R')C(O)O-, -S(O)KN(R')-, N(R')C(O)N(R')-, -N(R')C(S)N(R')-, - N(R')S(O)KN(R')-, -N(R')-N=, -C(R')=N-, -C(R')=N-N(R')-, C(R')=N-N=, -C(R')2N=N-, e -C(R')2-N(R')-N(R')-, onde cada R'é independentemente H, alquila ou alquila substituído;
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R é H, alquila, alquila substituído, cicloalquila, ou cicloalquila substituído; cada R" é independentemente H, alquila, alquila substituído, ou um grupo protetor, ou, quando mais de um grupo R" está presente, dois R" formam, opcionalmente, um heterocicloalquila; R1 é H, um grupo amino protetor, resina, aminoácido, polipeptídeo, ou polinucleotídeo, e R2 é OH, um grupo éster protetor, resina, aminoácido, polipeptídeo ou polinucleotídeo; cada um de R3 e R4 é independentemente H, halogênio, alquila inferior, ou alquila inferior substituído, ou R3 e R4 ou dois grupos R3 formam, opcionalmente, um cicloalquila ou um heterocicloalquila; ou os grupos -A-B-J-R formam, juntos um cicloalquila ou heterocicloalquila bicíclico ou tricíclico compreendendo pelo menos um grupo carbonila, incluindo um grupo dicarbonila, grupo carbonila protetor, incluindo um grupo dicarbonila protetor, ou grupo carbonila mascarado, incluindo um grupo dicarbonila mascarado; ou o grupo -J-R forma junto um cicloalquila ou heterocicloalquila monocíclico ou bicíclico, compreendendo pelo menos um grupo carbonila, incluindo ou um grupo dicarbonila; pelo menos um grupo carbonila protetor, incluindo um grupo dicarbonila protetor, pelo menos um grupo carbonila mascarado, incluindo um grupo dicarbonila mascarado, com a condição de que, quando A é fenileno e cada R3 é H, B está presente; e que, quando A é -(CH2)4- e cada R3 é H, B não é -NHC(O)(CH2CH2) -; e que quando A e B estão ausentes e cada R3 é H, R não é metila. Tais aminoácidos não naturais podem estar na forma de um sal, ou podem ser incorporados a um polipeptídeo de aminoácido não natural, polímero, polissacarídeo, ou um polinucleotídeo e, opcionalmente, traducionalmente modificados.
[00270]Em algumas modalidades, os compostos de Fórmulas (I) são estáveis em solução aquosa sob condições suavemente ácidas, por pelo menos um mês. Numa outra modalidade, os compostos de fórmula (I) serão estáveis por pelo menos 2 semanas sob condições brandamente acidas. Numa outra modalidade, tais compostos são estáveis por pelo menos 5 dias sob condições brandamente acidas. Em algumas modalidades, tais condições ácidas são pH 2 a 8.
[00271]Em algumas modalidades, dos compostos de Fórmula (I), B é alquileno inferior, alquileno inferior substituído, -O-(alquileno ou alquileno substituído), -C(R')=N-N(R')-, -N(R')CO-, -C(O)-, -C(R')=N-, -C(O)-(alquileno ou alquileno substituído)-, -CON(R')-(alquileno ou alquileno substituído)-, S(alquileno ou alquileno substituído)-, -S(O)(alquileno ou alquileno substituído)-, ou -S(O)2(alquileno ou alquileno substituído)-. Em algumas modalidades dos compostos de fórmula (I), B é -O(CH2)-, -CH=N-, -CH=N-NH, -NHCH2-, NHCO-, -C(O)-, -C(O)-(CH2)-, -CONH- (CH2)-, -SCH2-, -S(=O)CH2-, ou -S(O)2CH2-. Em algumas modalidades dos compostos de fórmula (I), R é C1-6 alquila ou cicloalquila. Em algumas modalidades dos compostos de Fórmula (I) R é -CH3, -CH(CH3)2, ou ciclopropila. Em algumas modalidades dos compostos de Fórmula (I), R1 é H, terc-butiloxicarbonila (Boc), 9- fluorenilmetoxicarbonila (Fmoc), N-acetila, tetrafluoraceteila (TFA), ou benziloxicarbonila (CBZ). Em algumas modalidades dos compostos de fórmula (I), R1 é uma resina, aminoácido, polipeptídeo ou polinucleotídeo. Em algumas modalidades dos compostos de Fórmula (I), R2 é uma resina, aminoácido, polipeptídeo ou polinucleotídeo. Em algumas modalidades dos compostos de fórmula I, R2 é um polinucleotídeo. Em algumas modalidades dos compostos de Fórmula (I), R2 é ácido ribonucléico, (RNA. Em algumas modalidades dos compostos de Fórmula (I), R2 é tRNA. Em algumas modalidades dos compostos de Fórmula (I), o tRNA reconhece especificamente, um códon de seleção. Em algumas modalidades dos compostos de Fórmula (I) o códon de seleção é selecionado do grupo consistindo em um códon âmbar, códon ocre, códon opala, um códon singular, um códon raro, um códon não natural, um códon de cinco bases, e um códon de quatro bases. Em algumas modalidades dos compostos de Fórmula (I) R2 é um tRNA supressor.
[00272]Em algumas modalidades dos compostos de Fórmula (I),
Figure img0005
é selecionado do grupo consistindo em: (i) A é alquileno inferior substituído, C4-arileno, arileno substituído, heteroarileno, heteroarileno substituído, alcarileno, alcarileno substituído, aralquileno ou aralquileno substituído; B é opcional, e quando presente, é um ligante divalente selecionado do grupo consistindo de: alquileno inferior, alquileno inferior substituído, alquenileno inferior, alquenileno inferior substituído, -O-, -O-(alquileno ou alquileno substituído)-, -S-, -S-(O)- S(O)2-, NS(O)2-, -OS(O)2-,-C(O)-, -C(O)-(alquileno ou alquileno substituído)-, -C(S)-, -N(R')-, -C(O)N(R')-(alquileno ou alquileno substituído)- - CSN(R')-, -N(R')CO-(alquileno ou alquileno substituído)- -N(R')C(O)O-, N(R')C(S)-, - S(O)N(R'), -S(O)2N(R'), -N(R')C(O)N(R')-, -N(R')C(S)N(R')-, -N(R')S(O)N(R')- - N(R')S(O2)N(R')-, -N(R')-N=, -C(R')=N-N(R')-, -C(R')=N-N=, -C(R')2N=N-, e -C(R')2- N(R')-N(R')-; (ii) A é opcional, e quando presente, é alquileno inferior substituído, C4- arileno, arileno substituído, heteroarileno, heteroarileno substituído, alcarileno, alcarileno substituído, aralquileno ou aralquileno substituído; B é um ligante divalente selecionado do grupo consistindo de: alquileno inferior substituído, alquenileno inferior, alquenileno inferior substituído, -O-, -O- (alquileno ou alquileno substituído)-, -S-, -S-(O)- S(O)2-, NS(O)2-, -OS(O)2-,-C(O)-, - C(O)-(alquileno ou alquileno substituído)-, -C(S)-, -N(R')-, -C(O)N(R')-(alquileno ou alquileno substituído)- -CSN(R')-, -N(R')CO-(alquileno ou alquileno substituído)- - N(R')C(O)O-, N(R')C(S)-, -S(O)N(R'), -S(O)2N(R'), -N(R')C(O)N(R')-, -N(R')C(S)N(R')- , -N(R')S(O)N(R')- -N(R')S(O2)N(R')-, -N(R')-N=, -C(R')=N-N(R')-, -C(R')=N-N=, - C(R')2N=N-, e -C(R')2-N(R')-N(R')-, (iii) A é alquileno inferior; B é opcional, e quando presente, é um ligante divalente selecionado do grupo consistindo de: alquileno inferior, alquileno inferior substituído, alquenileno inferior, alquenileno inferior substituído, -O-, -O-(alquileno ou alquileno substituído)-, -S-, -S-(O)- S(O)2-, NS(O)2-, -OS(O)2-,-C(O)-, -C(O)-(alquileno ou alquileno substituído)-, -C(S)-, -N(R')-, -C(O)N(R')-, -CSN(R')-, -CON(R')-(alquileno ou alquileno substituído)- -N(R')C(O)O-, N(R')C(S)-, -S(O)N(R'), -S(O)2N(R'), - N(R')C(O)N(R')-, -N(R')C(S)N(R')-, -N(R')S(O)N(R')- -N(R')S(O2)N(R')-, -N(R')-N=, - C(R')=N-N(R')-, -C(R')=N-N=, -C(R')2N=N-, e -C(R')2-N(R')-N(R')-, e (iv) A é fenileno; B é um ligante divalente selecionado do grupo consistindo de: alquileno inferior, alquenileno inferior substituído, alquenileno inferior substituído, -O-, -O- (alquileno ou alquileno substituído)-, -S-, -S-(O)- S(O)2-, NS(O)2-, -OS(O)2-,-C(O)-, - C(O)-(alquileno ou alquileno substituído)-, -C(S)-, -N(R')-, -C(O)N(R'), -C(O)N(R')- (alquileno ou alquileno substituído)- -CSN(R')-, -N(R')CO-(alquileno ou alquileno substituído)- -N(R')C(O)O-, N(R')C(S)-, -S(O)N(R'), -S(O)2N(R'), -N(R')C(O)N(R')-, - N(R')C(S)N(R')-, -N(R')S(O)N(R')- -N(R')S(O2)N(R')-, -N(R')-N=, -C(R')=N-N(R')-, - C(R')=N-N=, -C(R')2N=N-, e -C(R')2-N(R>N(R')-;
Figure img0006
cada R'é independentemente H, alquila ou alquila substituído; R1 é opcional, e quando presente é H, um grupo amino protetor, resina, aminoácido, polipeptídeo, ou polinucleotídeo, e R2 é opcional e, quando presente, é OH, um grupo éster protetor, resina, aminoácido, polipeptídeo ou polinucleotídeo; e cada R3e R4 é independentemente H, halogênio, alquila inferior, ou alquila inferior substituído; R é H, alquila, alquila substituído, cicloalquila ou cicloalquila substituído; Além disso, incluem-se aminoácidos com a estrutura da Fórmula (II):
Figure img0007
onde: A é opcional e, quando presente é alquileno inferior, alquileno inferior substituído, cicloalquileno inferior, cicloalquileno inferior substituído, alquenileno inferior, alquenileno inferior substituído, alquinileno, heteroalquileno inferior, heteroalquileno substituído, heterocicloalquileno inferior, heterocicloalquileno inferior substituído, arileno, arileno substituído, heteroarileno, heteroarileno substituído, alcarileno, alcarileno substituído, aralquileno ou aralquileno substituído, B é opcional, e quando presente é um ligante selecionado do grupo consistindo de alquileno inferior, alquileno inferior substituído, alquenileno inferior, alquenileno inferior substituído, heteroalquileno inferior, heteroalquileno inferior substituído, -O-, -O-(alquileno ou alquileno substituído)-, -S-, -S-(alquileno ou alquileno substituído)-, -S(O)k- onde k é 1, 2, ou 3, -S(O)k(alquileno ou alquileno substituído)-, -C(O)-, -NS(O)2, -OS(O)2-, -C(O)-(alquileno ou alquileno substituído)-, - C(S)-, -C(S)-(alquileno ou alquileno substituído)-, -N(R')-, NR'-(alquileno ou alquileno substituído),- -C(O)N(R')-, -CON(R')-(alquileno ou alquileno substituído)- -CSN(R')-, - CSN(R')-alquileno ou alquileno substituído)-, -N(R')CO-(alquileno ou alquileno substituído)- -N(R')C(O)O-, -S(O)KN(R')-, N(R')C(O)N(R')-, -N(R')C(S)N(R')-, - N(R')S(O)KN(R')-, -N(R')-N=, -C(R')=N-, -C(R')=N-N(R')-, C(R')=N-N=, -C(R')2N=N-, e -C(R')2-N(R')-N(R')-, onde cada R'é independentemente H, alquila ou alquila substituído, R é H, alquila, alquila substituído, cicloalquila, ou cicloalquila substituído; R1 é H, um grupo amino protetor, resina, aminoácido, polipeptídeo, ou polinucleotídeo, e R2 é OH, um grupo éster protetor, resina, aminoácido, polipeptídeo ou polinucleotídeo; com a condição de que, quando A é fenileno, B esteja presente, e que, e quando A é -(CH2)4- B não seja -NHC(O)(CH2CH2) -; e que quando A e B estão ausentes e, R não seja metila. Tais aminoácidos não naturais podem estar na forma de um sal, ou podem ser incorporados a um polipeptídeo de aminoácido não natural, polímero, polissacarídeo, ou um polinucleotídeo e, opcionalmente, traducionalmente modificados.
[00273]Além disso, incluem-se os aminoácidos com a estrutura da Fórmula (III):
Figure img0008
onde: B é um ligante selecionado do grupo consistindo de alquileno inferior, alquileno inferior substituído, alquenileno inferior, alquenileno inferior substituído, heteroalquileno inferior, heteroalquileno inferior substituído, -O-, -O-(alquileno ou alquileno substituído)-, -S-, -S-(alquileno ou alquileno substituído)-, -S(O)k- onde k é 1, 2, ou 3, -S(O)k(alquileno ou alquileno substituído)-, -C(O)-, -NS(O)2, -OS(O)2-, - C(O)-(alquileno ou alquileno substituído)-, -C(S)-, -C(S)-(alquileno ou alquileno substituído)-, -N(R')-, NR'-(alquileno ou alquileno substituído)-, -C(O)N(R')-, - CON(R')-(alquileno ou alquileno substituído)- -CSN(R')-, -CSN(R')-alquileno ou alquileno substituído)-, -N(R')CO-(alquileno ou alquileno substituído)- -N(R')C(O)O-, - S(O)KN(R')-, N(R')C(O)N(R')-, -N(R')C(S)N(R')-, -N(R')S(O)KN(R')-, -N(R')-N=, - C(R')=N-, -C(R')=N-N(R')-, C(R')=N-N=, -C(R')2N=N-, e -C(R')2-N(R')-N(R')-, onde cada R'é independentemente H, alquila ou alquila substituído, R é H, alquila, alquila substituído, cicloalquila, ou cicloalquila substituído; R1 é H, um grupo amino protetor, resina, aminoácido, polipeptídeo, ou polinucleotídeo, e R2 é OH, um grupo éster protetor, resina, aminoácido, polipeptídeo ou polinucleotídeo; cada Ra é independentemente selecionado do grupo consistindo de H, halogênio, alquila, alquila substituído, -N(R')2, -C(O)kR' onde k é 1, 2, ou 3, - C(O)N(R')2, -OR', e -S(O)kR', onde R'é independentemente H, alquila ou alquila substituído.
[00274]Tais aminoácidos não naturais podem estar na forma de um sal, ou podem ser incorporados a um polipeptídeo de aminoácido não natural, polímero, polissacarídeo, ou um polinucleotídeo e, opcionalmente, traducionalmente modificados.
[00275]Além disso, incluem-se os seguintes aminoácidos:
Figure img0009
[00276]Tais aminoácidos não naturais podem ser, opcionalmente, um grupo amino protetor, carboxila protetor e/ou podem estar na forma de um sal, ou podem ser incorporados a um polipeptídeo de aminoácido não natural, polímero, polissacarídeo, ou um polinucleotídeo e, opcionalmente, traducionalmente modificados.
[00277]Além disso, incluem-se os seguintes aminoácidos com a estrutura da fórmula (IV)
Figure img0010
onde: -NS(O)2, -OS(O)2-, opcional, e quando presente é um ligante selecionado do grupo consistindo de alquileno inferior, alquileno inferior substituído, alquenileno inferior, alquenileno inferior substituído, heteroalquileno inferior, heteroalquileno inferior substituído, -O-, -O-(alquileno ou alquileno substituído)-, -S-, -S-(alquileno ou alquileno substituído)-, -S(O)k- onde k é 1, 2, ou 3, -S(O)k(alquileno ou alquileno substituído)-, -C(O)-, -C(O)-(alquileno ou alquileno substituído)-, -C(S)-, -C(S)- (alquileno ou alquileno substituído)-, -N(R')-, NR'-(alquileno ou alquileno substituído),- -C(O)N(R')-, -CON(R')-(alquileno ou alquileno substituído)-, -CSN(R')-, -CSN(R')-alquileno ou alquileno substituído)-, -N(R')CO-(alquileno ou alquileno substituído)- -N(R')C(O)O-, -S(O)KN(R')-, N(R')C(O)N(R')-, -N(R')C(S)N(R')-, - N(R')S(O)KN(R')-, -N(R')-N=, -C(R')=N-, -C(R')=N-N(R')-, C(R')=N-N=, -C(R')2N=N-, e -C(R')2-N(R')-N(R')-, onde cada R' é independentemente H, alquila ou alquila substituído, R é H, alquila, alquila substituído, cicloalquila, ou cicloalquila substituído; R1 é H, um grupo amino protetor, resina, aminoácido, polipeptídeo, ou polinucleotídeo, e R2 é OH, um grupo éster protetor, resina, aminoácido, polipeptídeo ou polinucleotídeo; cada Ra é independentemente selecionado do grupo consistindo de H, halogênio, alquila, alquila substituído, -N(R')2, -C(O)kR' onde k é 1, 2, ou 3, - C(O)N(R')2, -OR', e -S(O)kR', onde R'é independentemente H, alquila ou alquila substituído; e -N(R')2, -C(O)kR'onde k é 1, 2 oi 3, -C(O)N(R')2, OR' e -S(O)KR', onde R'é independentemente H, alquila ou alquila substituído e n é 0 a 8; com a condição de que, quando A é -(CH2)4-, B não seja - NHC(O)(CH2CH2)-. Tais aminoácidos não naturais podem estar na forma de um sal, ou podem ser incorporados a um polipeptídeo de aminoácido não natural, polímero, polissacarídeo, ou um polinucleotídeo e, opcionalmente, traducionalmente modificados.
[00278]Além disso, incluem-se os seguintes aminoácidos:
Figure img0011
onde tais compostos são, opcionalmente, um grupo amino protetor, opcionalmente carboxila protetor, opcionalmente, amino e/ou carboxila protetores, ou um sal destes, ou podem ser incorporados a um polipeptídeo de aminoácido não natural, polímero, polissacarídeo, ou um polinucleotídeo e, opcionalmente, traducionalmente modificados.
[00279]Além disso, incluem-se os seguintes aminoácidos na estrutura da fórmula (VIII):
Figure img0012
onde: A é opcional e, quando presente é alquileno inferior, alquileno inferior substituído, cicloalquileno inferior, cicloalquileno inferior substituído, alquenileno inferior, alquenileno inferior substituído, alquinileno, heteroalquileno inferior, heteroalquileno substituído, heterocicloalquileno inferior, heterocicloalquileno inferior substituído, arileno, arileno substituído, heteroarileno, heteroarileno substituído, alcarileno, alcarileno substituído, aralquileno ou aralquileno substituído, B é opcional, e quando presente é um ligante selecionado do grupo consistindo de alquileno inferior, alquileno inferior substituído, alquenileno inferior, alquenileno inferior substituído, heteroalquileno inferior, heteroalquileno inferior substituído, -O-, -O-(alquileno ou alquileno substituído)-, -S-, -S-(alquileno ou alquileno substituído)-, -S(O)k- onde k é 1, 2, ou 3, -S(O)k(alquileno ou alquileno substituído)-, -C(O)-, -NS(O)2, -OS(O)2-, -C(O)-(alquileno ou alquileno substituído)-, - C(S)-, -C(S)-(alquileno ou alquileno substituído)-, -N(R')-, NR'-(alquileno ou alquileno substituído), -(O)N(R')-, -CON(R')-(alquileno ou alquileno substituído)- -CSN(R')-, - CSN(R')-alquileno ou alquileno substituído)-, -N(R')CO-(alquileno ou alquileno substituído)- -N(R')C(O)O-, -S(O)KN(R')-, N(R')C(O)N(R')-, -N(R')C(S)N(R')-, - N(R')S(O)KN(R')-, -N(R')-N=, -C(R')=N-, -C(R')=N-N(R')-, C(R')=N-N=, -C(R')2N=N-, e -C(R')2-N(R')-N(R')-, onde cada R'é independentemente H, alquila ou alquila substituído; R1 é H, um grupo amino protetor, resina, aminoácido, polipeptídeo, ou polinucleotídeo, e R2 é OH, um grupo éster protetor, resina, aminoácido, polipeptídeo ou polinucleotídeo; Tais aminoácidos não naturais podem estar na forma de um sal, ou podem ser incorporados a um polipeptídeo de aminoácido não natural, polímero, polissacarídeo, ou um polinucleotídeo e, opcionalmente, pós-traducionalmente modificados.
[00280]Além disso, incluem-se os seguintes aminoácidos com a estrutura da Fórmula (IX):
Figure img0013
onde: B é opcional, e quando presente é um ligante selecionado do grupo consistindo de alquileno inferior, alquileno inferior substituído, alquenileno inferior, alquenileno inferior substituído, heteroalquileno inferior, heteroalquileno inferior substituído, -O-, -O-(alquileno ou alquileno substituído)-, -S-, -S-(alquileno ou alquileno substituído)-, -S(O)k- onde k é 1, 2, ou 3, -S(O)k(alquileno ou alquileno substituído)-, -C(O)-, -NS(O)2, -OS(O)2-, -C(O)-(alquileno ou alquileno substituído)-, - C(S)-, -C(S)-(alquileno ou alquileno substituído)-, -N(R')-, NR'-(alquileno ou alquileno substituído),- -C(O)N(R')-, -CON(R')-(alquileno ou alquileno substituído)- -CSN(R')-, - CSN(R')-alquileno ou alquileno substituído)-, -N(R')CO-(alquileno ou alquileno substituído)- -N(R')C(O)O-, -S(O)KN(R')-, N(R')C(O)N(R')-, -N(R')C(S)N(R')-, - N(R')S(O)KN(R')-, -N(R')-N=, -C(R')=N-, -C(R')=N-N(R')-, C(R')=N-N=, -C(R')2N=N-, e -C(R')2-N(R')-N(R')-, onde cada R'é independentemente H, alquila ou alquila substituído, R é H, alquila, alquila substituído, cicloalquila, ou cicloalquila substituído; R1 é H, um grupo amino protetor, resina, aminoácido, polipeptídeo, ou polinucleotídeo, e R2 é OH, um grupo éster protetor, resina, aminoácido, polipeptídeo ou polinucleotídeo; onde cada Ra é independentemente selecionado do grupo consistindo de H, halogênio, alquila, alquila substituído, -N(R')2, -C(O)kR' onde k é 1, 2, ou 3, - C(O)N(R')2, -OR', e -S(O)kR', onde R'é independentemente H, alquila ou alquila substituído; Tais aminoácidos não naturais podem estar na forma de um sal, ou podem ser incorporados a um polipeptídeo de aminoácido não natural, polímero, polissacarídeo, ou um polinucleotídeo e, opcionalmente, traducionalmente modificados.
[00281]Além disso, incluem-se os seguintes aminoácidos:
Figure img0014
onde tais compostos são, opcionalmente, um grupo amino protetor, opcionalmente carboxila protetor, opcionalmente, amino e/ou carboxila protetores, ou um sal destes, ou podem ser incorporados a um polipeptídeo de aminoácido não natural, polímero, polissacarídeo, ou um polinucleotídeo e, opcionalmente, traducionalmente modificados.
[00282]Além disso, incluem-se os seguintes aminoácidos com a estrutura da fórmula (X):
Figure img0015
onde: B é opcional, e quando presente é um ligante selecionado do grupo consistindo de alquileno inferior, alquileno inferior substituído, alquenileno inferior, alquenileno inferior substituído, heteroalquileno inferior, heteroalquileno inferior substituído, -O-, -O-(alquileno ou alquileno substituído)-, -S-, -S-(alquileno ou alquileno substituído)-, -S(O)k- onde k é 1, 2, ou 3, -S(O)k(alquileno ou alquileno substituído)-, -C(O)-, -NS(O)2, -OS(O)2-, -C(O)-(alquileno ou alquileno substituído)-, - C(S)-, -C(S)-(alquileno ou alquileno substituído)-, -N(R')-, NR'-(alquileno ou alquileno substituído),- -C(O)N(R')-, -CON(R')-(alquileno ou alquileno substituído)- -CSN(R')-, - CSN(R')-alquileno ou alquileno substituído)-, -N(R')CO-(alquileno ou alquileno substituído)- -N(R')C(O)O-, -S(O)KN(R')-, N(R')C(O)N(R')-, -N(R')C(S)N(R')-, - N(R')S(O)KN(R')-, -N(R')-N=, -C(R')=N-, -C(R')=N-N(R')-, C(R')=N-N=, -C(R')2N=N-, e -C(R')2-N(R')-N(R')-, onde cada R'é independentemente H, alquila ou alquila substituído, R é H, alquila, alquila substituído, cicloalquila, ou cicloalquila substituído; R1 é H, um grupo amino protetor, resina, aminoácido, polipeptídeo, ou polinucleotídeo, e R2 é OH, um grupo éster protetor, resina, aminoácido, polipeptídeo ou polinucleotídeo; cada Ra é independentemente selecionado do grupo consistindo de H, halogênio, alquila, alquila substituído, -N(R')2, -C(O)kR' onde k é 1, 2, ou 3, - C(O)N(R')2, -OR', e -S(O)kR', onde R'é independentemente H, alquila ou alquila substituído; e n é 0 a 8. Tais aminoácidos não naturais podem estar na forma de um sal, ou podem ser incorporados a um polipeptídeo de aminoácido não natural, polímero, polissacarídeo, ou um polinucleotídeo e, opcionalmente, pós-traducionalmente modificados.
[00283]Além disso, incluem-se os seguintes aminoácidos:
Figure img0016
onde tais compostos são, opcionalmente, um grupo amino protetor, opcionalmente carboxila protetor, opcionalmente, amino e/ou carboxila protetores, ou um sal destes, ou podem ser incorporados a um polipeptídeo de aminoácido não natural, polímero, polissacarídeo, ou um polinucleotídeo e, opcionalmente, pós- traducionalmente modificados.
[00284]Além das estruturas de monocarbonila, os aminoácidos não naturais aqui descritos podem incluir grupos tais como dicarbonila, similar à dicarbonila, dicarbonila mascarado e grupos dicarbonila protetores.
[00285]Os aminoácidos a seguir, por exemplo, estão incluídos com a estrutura da Fórmula (V):
Figure img0017
onde: A é opcional e, quando presente é alquileno inferior, alquileno inferior substituído, cicloalquileno inferior, cicloalquileno inferior substituído, alquenileno inferior, alquenileno inferior substituído, alquinileno, heteroalquileno inferior, heteroalquileno substituído, heterocicloalquileno inferior, heterocicloalquileno inferior substituído, arileno, arileno substituído, heteroarileno, heteroarileno substituído, alcarileno, alcarileno substituído, aralquileno ou aralquileno substituído; B é opcional, e quando presente é um ligante selecionado do grupo consistindo de alquileno inferior, alquileno inferior substituído, alquenileno inferior, alquenileno inferior substituído, heteroalquileno inferior, heteroalquileno inferior substituído, -O-, -O-(alquileno ou alquileno substituído)-, -S-, -S-(alquileno ou alquileno substituído)-, -S(O)k- onde k é 1, 2, ou 3, -S(O)k(alquileno ou alquileno substituído)-, -C(O)-, -NS(O)2, -OS(O)2-, -C(O)-(alquileno ou alquileno substituído)-, - C(S)-, -C(S)-(alquileno ou alquileno substituído)-, -N(R')-, NR'-(alquileno ou alquileno substituído)-, -C(O)N(R')-, -CON(R')-(alquileno ou alquileno substituído)-, -CSN(R')-, -CSN(R')-alquileno ou alquileno substituído)-, -N(R')CO-(alquileno ou alquileno substituído)-, -N(R')C(O)O-, -S(O)KN(R')-, N(R')C(O)N(R')-, -N(R')C(S)N(R')-, - N(R')S(O)KN(R')-, -N(R')-N=, -C(R')=N-, -C(R')=N-N(R')-, C(R')=N-N=, -C(R')2N=N-, e -C(R')2-N(R')-N(R')-, onde cada R'é independentemente H, alquila ou alquila substituído; R é H, alquila, alquila substituído, cicloalquila ou cicloalquila substituído; R1 é H, um grupo amino protetor, resina, aminoácido, polipeptídeo, ou polinucleotídeo, e R2 é OH, um grupo éster protetor, resina, aminoácido, polipeptídeo ou polinucleotídeo; Tais aminoácidos não naturais podem estar na forma de um sal, ou podem ser incorporados a um polipeptídeo de aminoácido não natural, polímero, polissacarídeo, ou um polinucleotídeo e, opcionalmente, pós-traducionalmente modificados.
[00286]Além disso, incluem-se os seguintes aminoácidos com a estrutura da Fórmula (VI):
Figure img0018
onde: B é opcional, e quando presente é um ligante selecionado do grupo consistindo de alquileno inferior, alquileno inferior substituído, alquenileno inferior, alquenileno inferior substituído, heteroalquileno inferior, heteroalquileno inferior substituído, -O-, -O-(alquileno ou alquileno substituído)-, -S-, -S-(alquileno ou alquileno substituído)-, -S(O)k- onde k é 1, 2, ou 3, -S(O)k(alquileno ou alquileno substituído)-, -C(O)-, -NS(O)2, -OS(O)2-, -C(O)-(alquileno ou alquileno substituído)-, - C(S)-, -C(S)-(alquileno ou alquileno substituído)-, -N(R')-, NR'-(alquileno ou alquileno substituído)-, -C(O)N(R')-, -CON(R')-(alquileno ou alquileno substituído)-, -CSN(R')-, -CSN(R')-alquileno ou alquileno substituído)-, -N(R')CO-(alquileno ou alquileno substituído)-, -N(R')C(O)O-, -S(O)KN(R')-, N(R')C(O)N(R')-, -N(R')C(S)N(R')-, - N(R')S(O)KN(R')-, -N(R')-N=, -C(R')=N-, -C(R')=N-N(R')-, C(R')=N-N=, -C(R')2N=N-, e -C(R')2-N(R')-N(R')-, onde cada R'é independentemente H, alquila ou alquila substituído, R é H, alquila, alquila substituído, cicloalquila, ou cicloalquila substituído; R1 é H, um grupo amino protetor, resina, aminoácido, polipeptídeo, ou polinucleotídeo, e R2 é OH, um grupo éster protetor, resina, aminoácido, polipeptídeo ou polinucleotídeo; onde cada Ra é independentemente selecionado do grupo consistindo de H, halogênio, alquila, alquila substituído, -N(R')2, -C(O)kR' onde k é 1, 2, ou 3, - C(O)N(R')2, -OR', e -S(O)kR', onde R'é independentemente H, alquila ou alquila substituído; Tais aminoácidos não naturais podem estar na forma de um sal, ou podem ser incorporados a um aminoácido não natural, polipeptídeo, polímero, polissacarídeo ou um polinucleotídeo e, opcionalmente pós-traducionalmente modificados.
[00287]Além disso, incluem-se os seguintes aminoácidos:
Figure img0019
onde tais compostos são, opcionalmente, amino-protetores, e carboxila- protetores ou um sal destes. Tais aminoácidos não naturais podem estar na forma de um sal, ou podem ser incorporados a um polipeptídeo de aminoácido não natural, polímero, polissacarídeo, ou um polinucleotídeo e, opcionalmente, pós- traducionalmente modificados.
[00288]Além disso, os seguintes aminoácidos com a estrutura da Fórmula (VII) estão incluídos:
Figure img0020
onde: B é opcional, e quando presente é um ligante selecionado do grupo consistindo de alquileno inferior, alquileno inferior substituído, alquenileno inferior, alquenileno inferior substituído, heteroalquileno inferior, heteroalquileno inferior substituído, -O-, -O-(alquileno ou alquileno substituído)-, -S-, -S-(alquileno ou alquileno substituído)-, -S(O)k- onde k é 1, 2, ou 3, -S(O)k(alquileno ou alquileno substituído)-, -C(O)-, -NS(O)2, -OS(O)2-, -C(O)-(alquileno ou alquileno substituído)-, - C(S)-, -C(S)-(alquileno ou alquileno substituído)-, -N(R')-, NR'-(alquileno ou alquileno substituído)-, -C(O)N(R')-, -CON(R')-(alquileno ou alquileno substituído)-, -CSN(R')-, -CSN(R')-alquileno ou alquileno substituído)-, -N(R')CO-(alquileno ou alquileno substituído)-, -N(R')C(O)O-, -S(O)KN(R')-, N(R')C(O)N(R')-, -N(R')C(S)N(R')-, - N(R')S(O)KN(R')-, -N(R')-N=, -C(R')=N-, -C(R')=N-N(R')-, C(R')=N-N=, -C(R')2N=N-, e -C(R')2-N(R')-N(R')-, onde cada R'é independentemente H, alquila ou alquila substituído, R é H, alquila, alquila substituído, cicloalquila, ou cicloalquila substituído; R1 é H, um grupo amino protetor, resina, aminoácido, polipeptídeo, ou polinucleotídeo, e R2 é OH, um grupo éster protetor, resina, aminoácido, polipeptídeo ou polinucleotídeo; cada Ra é independentemente selecionado do grupo consistindo de H, halogênio, alquila, alquila substituído, -N(R')2, -C(O)kR' onde k é 1, 2, ou 3, - C(O)N(R')2, -OR', e -S(O)kR', onde R'é independentemente H, alquila ou alquila substituído; e n é 0 a 8.
[00289]Tais aminoácidos não naturais podem estar na forma de um sal, ou podem ser incorporados a um aminoácido não natural, polipeptídeo, polímero, polissacarídeo ou um polinucleotídeo e, opcionalmente pós-traducionalmente modificados.
[00290]Além disso, incluem-se os seguintes aminoácidos:
Figure img0021
onde tais compostos são opcionalmente, amino protetores e carboxila protetores, ou um sal dos mesmos ou podem ser incorporados a um polipeptídeo de aminoácido não natural, polímero, polissacarídeo ou um polinucleotídeo e, opcionalmente pós-traducionalmente modificados.
[00291]Além disso, incluem-se os seguintes aminoácidos com a estrutura da Fórmula (XXX)
Figure img0022
onde: A é opcional e, quando presente é alquileno inferior, alquileno inferior substituído, cicloalquileno inferior, cicloalquileno inferior substituído, alquenileno inferior, alquenileno inferior substituído, alquinileno, heteroalquileno inferior, heteroalquileno substituído, heterocicloalquileno inferior, heterocicloalquileno inferior substituído, arileno, arileno substituído, heteroarileno, heteroarileno substituído, alcarileno, alcarileno substituído, aralquileno ou aralquileno substituído, R é H, alquila, alquila substituído, cicloalquila, ou cicloalquila substituído; R1 é H, um grupo amino protetor, resina, aminoácido, polipeptídeo, ou polinucleotídeo, e R2 é OH, um grupo éster protetor, resina, aminoácido, polipeptídeo ou polinucleotídeo; X1 é C, S ou S(O); e L é alquileno, alquileno ou alquileno substituído, N(R')(alquileno) ou N(R')|(alquileno substituído), onde R'é alquila, alquila substituído, cicloalquila ou cicloalquila substituído.
[00292]Tais aminoácidos não naturais podem estar na forma de um sal, ou podem ser incorporados a um aminoácido não natural, polipeptídeo, polímero, polissacarídeo ou um polinucleotídeo e, opcionalmente pós-traducionalmente modificados.
[00293]Além disso, incluem-se os seguintes aminoácidos com a estrutura da Fórmula (XXX-A):
Figure img0023
onde: A é opcional e, quando presente é alquileno inferior, alquileno inferior substituído, cicloalquileno inferior, cicloalquileno inferior substituído, alquenileno inferior, alquenileno inferior substituído, alquinileno, heteroalquileno inferior, heteroalquileno substituído, heterocicloalquileno inferior, heterocicloalquileno inferior substituído, arileno, arileno substituído, heteroarileno, heteroarileno substituído, alcarileno, alcarileno substituído, aralquileno ou aralquileno substituído, R é H, alquila, alquila substituído, cicloalquila, ou cicloalquila substituído; R1 é H, um grupo amino protetor, resina, aminoácido, polipeptídeo, ou polinucleotídeo, e R2 é OH, um grupo éster protetor, resina, aminoácido, polipeptídeo ou polinucleotídeo; L é alquileno, alquileno substituído, N(R')(alquileno) ou N(R')(alquileno substituído), onde R'é alquila, alquila substituído, cicloalquila ou cicloalquila substituído.
[00294]Tais aminoácidos não naturais podem estar na forma de um sal, ou podem ser incorporados a um aminoácido não natural, polipeptídeo, polímero, polissacarídeo ou um polinucleotídeo e, opcionalmente pós-traducionalmente modificados.
[00295]Além disso, incluem-se os seguintes aminoácidos com a estrutura da Fórmula (XXX-B):
Figure img0024
onde: A é opcional e, quando presente é alquileno inferior, alquileno inferior substituído, cicloalquileno inferior, cicloalquileno inferior substituído, alquenileno inferior, alquenileno inferior substituído, alquinileno, heteroalquileno inferior, heteroalquileno substituído, heterocicloalquileno inferior, heterocicloalquileno inferior substituído, arileno, arileno substituído, heteroarileno, heteroarileno substituído, alcarileno, alcarileno substituído, aralquileno ou aralquileno substituído, R é H, alquila, alquila substituído, cicloalquila, ou cicloalquila substituído; R1 é H, um grupo amino protetor, resina, aminoácido, polipeptídeo, ou polinucleotídeo, e R2 é OH, um grupo éster protetor, resina, aminoácido, polipeptídeo ou polinucleotídeo; L é alquileno, alquileno substituído, N(R')(alquileno) ou N(R')|(alquileno substituído), onde R'é alquila, alquila substituído, cicloalquila ou cicloalquila substituído.
[00296]Tais aminoácidos não naturais podem estar na forma de um sal, ou podem ser incorporados a um aminoácido não natural, polipeptídeo, polímero, polissacarídeo ou um polinucleotídeo e, opcionalmente pós-traducionalmente modificados.
[00297]Além disso, estão incluídos os seguintes aminoácidos com a estrutura da Fórmula (XXXI):
Figure img0025
onde: A é opcional e, quando presente é alquileno inferior, alquileno inferior substituído, cicloalquileno inferior, cicloalquileno inferior substituído, alquenileno inferior, alquenileno inferior substituído, alquinileno, heteroalquileno inferior, heteroalquileno substituído, heterocicloalquileno inferior, heterocicloalquileno inferior substituído, arileno, arileno substituído, heteroarileno, heteroarileno substituído, alcarileno, alcarileno substituído, aralquileno ou aralquileno substituído, R é H, alquila, alquila substituído, cicloalquila, ou cicloalquila substituído; R1 é H, um grupo amino protetor, resina, aminoácido, polipeptídeo, ou polinucleotídeo, e R2 é OH, um grupo éster protetor, resina, aminoácido, polipeptídeo ou polinucleotídeo; X1 é C, S ou S(O); e n é 0, 1, 2, 3, 4, ou 5; e cada um de R8 e R9 em cada grupo CR8R9é independentemente selecionado do grupo consistindo de H, alcóxi, alquilamina, halogênio, alquila, arila, ou quaisquer dentre R8 e R9 podem formar, juntos, =O ou um cicloalquila ou qualquer grupo aos grupos R8 adjacentes, podem formar juntos, um cicloalquila.
[00298]Tais aminoácidos não naturais podem estar na forma de um sal, ou podem ser incorporados a um aminoácido não natural, polipeptídeo, polímero, polissacarídeo ou um polinucleotídeo e, opcionalmente pós-traducionalmente modificados.
[00299]Além disso estão incluídos os seguintes aminoácidos com a seguinte estrutura de Fórmula (XXXI-A):
Figure img0026
onde: A é opcional e, quando presente é alquileno inferior, alquileno inferior substituído, cicloalquileno inferior, cicloalquileno inferior substituído, alquenileno inferior, alquenileno inferior substituído, alquinileno, heteroalquileno inferior, heteroalquileno substituído, heterocicloalquileno inferior, heterocicloalquileno inferior substituído, arileno, arileno substituído, heteroarileno, heteroarileno substituído, alcarileno, alcarileno substituído, aralquileno ou aralquileno substituído, R é H, alquila, alquila substituído, cicloalquila, ou cicloalquila substituído; R1 é H, um grupo amino protetor, resina, aminoácido, polipeptídeo, ou polinucleotídeo, e R2 é OH, um grupo éster protetor, resina, aminoácido, polipeptídeo ou polinucleotídeo; n é 0, 1, 2, 3, 4, ou 5; e cada R8 e R9 em cada grupo CR8R9é independentemente selecionado do grupo consistindo de H, alcóxi, alquilamina, halogênio, alquila, arila ou quaisquer R8 e R9 podem, juntos, formar =O ou um cicloalquila, ou qualquer a grupos R8 adjacentes, podem, juntos, formar um cicloalquila.
[00300]Tais aminoácidos não naturais podem estar na forma de um sal, ou podem ser incorporados a um aminoácido não natural, polipeptídeo, polímero, polissacarídeo ou um polinucleotídeo e, opcionalmente pós-traducionalmente modificados.
[00301]Além disso, estão incluídos os seguintes aminoácidos com a estrutura da Fórmula (XXXI-B):
Figure img0027
onde: A é opcional e, quando presente é alquileno inferior, alquileno inferior substituído, cicloalquileno inferior, cicloalquileno inferior substituído, alquenileno inferior, alquenileno inferior substituído, alquinileno, heteroalquileno inferior, heteroalquileno substituído, heterocicloalquileno inferior, heterocicloalquileno inferior substituído, arileno, arileno substituído, heteroarileno, heteroarileno substituído, alcarileno, alcarileno substituído, aralquileno ou aralquileno substituído, R é H, alquila, alquila substituído, cicloalquila, ou cicloalquila substituído; R1 é H, um grupo amino protetor, resina, aminoácido, polipeptídeo, ou polinucleotídeo, e R2 é OH, um grupo éster protetor, resina, aminoácido, polipeptídeo ou polinucleotídeo; n é 0, 1, 2, 3, 4, ou 5; e cada R8 e R9 em cada grupo CR8R9é independentemente selecionado do grupo consistindo de H, alcóxi, alquilamina, halogênio, alquila, arila ou quaisquer R8 e R9 podem, juntos, formar =O ou um cicloalquila, ou qualquer a grupos R8 adjacentes, podem, juntos, formar um cicloalquila.
[00302]Tais aminoácidos não naturais podem estar na forma de um sal, ou podem ser incorporados a um aminoácido não natural, polipeptídeo, polímero, polissacarídeo ou um polinucleotídeo e, opcionalmente pós-traducionalmente modificados.
[00303]Além disso, estão incluídos os seguintes aminoácidos com a estrutura da Fórmula (XXXII):
Figure img0028
onde: A é opcional e, quando presente é alquileno inferior, alquileno inferior substituído, cicloalquileno inferior, cicloalquileno inferior substituído, alquenileno inferior, alquenileno inferior substituído, alquinileno, heteroalquileno inferior, heteroalquileno substituído, heterocicloalquileno inferior, heterocicloalquileno inferior substituído, arileno, arileno substituído, heteroarileno, heteroarileno substituído, alcarileno, alcarileno substituído, aralquileno ou aralquileno substituído, R é H, alquila, alquila substituído, cicloalquila, ou cicloalquila substituído; R1 é H, um grupo amino protetor, resina, aminoácido, polipeptídeo, ou polinucleotídeo, e R2 é OH, um grupo éster protetor, resina, aminoácido, polipeptídeo ou polinucleotídeo; X1 é C, S ou S(O); e L é alquileno, alquileno substituído, N(R')(alquileno) ou N(R')(alquileno substituído), onde R'é H, alquila, alquila substituído, cicloalquila, ou cicloalquila substituído.
[00304]Tais aminoácidos não naturais podem estar na forma de um sal, ou podem ser incorporados a um aminoácido não natural, polipeptídeo, polímero, polissacarídeo ou um polinucleotídeo e, opcionalmente pós-traducionalmente modificados.
[00305]Estão ainda incluídos os seguintes aminoácidos com a estrutura da Fórmula (XXXII-A):
Figure img0029
onde: A é opcional e, quando presente é alquileno inferior, alquileno inferior substituído, cicloalquileno inferior, cicloalquileno inferior substituído, alquenileno inferior, alquenileno inferior substituído, alquinileno, heteroalquileno inferior, heteroalquileno substituído, heterocicloalquileno inferior, heterocicloalquileno inferior substituído, arileno, arileno substituído, heteroarileno, heteroarileno substituído, alcarileno, alcarileno substituído, aralquileno ou aralquileno substituído, R é H, alquila, alquila substituído, cicloalquila, ou cicloalquila substituído; R1 é H, um grupo amino protetor, resina, aminoácido, polipeptídeo, ou polinucleotídeo, e R2 é OH, um grupo éster protetor, resina, aminoácido, polipeptídeo ou polinucleotídeo; L é alquileno, alquileno substituído, N(R') (alquileno) ou N(R')(alquileno substituído), onde R'é H, alquila, alquila substituído, cicloalquila, ou cicloalquila substituído.
[00306]Tais aminoácidos não naturais podem estar na forma de um sal, ou podem ser incorporados a um aminoácido não natural, polipeptídeo, polímero, polissacarídeo ou um polinucleotídeo e, opcionalmente pós-traducionalmente modificados.
[00307]Além disso, estão incluídos os seguintes aminoácidos com a estrutura da Fórmula (XXXII-B):
Figure img0030
onde: A é opcional e, quando presente é alquileno inferior, alquileno inferior substituído, cicloalquileno inferior, cicloalquileno inferior substituído, alquenileno inferior, alquenileno inferior substituído, alquinileno, heteroalquileno inferior, heteroalquileno substituído, heterocicloalquileno inferior, heterocicloalquileno inferior substituído, arileno, arileno substituído, heteroarileno, heteroarileno substituído, alcarileno, alcarileno substituído, aralquileno ou aralquileno substituído, R é H, alquila, alquila substituído, cicloalquila, ou cicloalquila substituído; R1 é H, um grupo amino protetor, resina, aminoácido, polipeptídeo, ou polinucleotídeo, e R2 é OH, um grupo éster protetor, resina, aminoácido, polipeptídeo ou polinucleotídeo; L é alquileno, alquileno substituído, N(R') (alquileno) ou N(R')(alquileno substituído), onde R'é H, alquila, alquila substituído, cicloalquila, ou cicloalquila substituído.
[00308]Tais aminoácidos não naturais podem estar na forma de um sal, ou podem ser incorporados a um aminoácido não natural, polipeptídeo, polímero, polissacarídeo ou um polinucleotídeo e, opcionalmente pós-traducionalmente modificados.
[00309]Adicionalmente, estão incluídos aminoácidos com a estrutura da Fórmula (XXXX):
Figure img0031
onde: A é opcional e, quando presente é alquileno inferior, alquileno inferior substituído, cicloalquileno inferior, cicloalquileno inferior substituído, alquenileno inferior, alquenileno inferior substituído, alquinileno, heteroalquileno inferior, heteroalquileno substituído, heterocicloalquileno inferior, heterocicloalquileno inferior substituído, arileno, arileno substituído, heteroarileno, heteroarileno substituído, alcarileno, alcarileno substituído, aralquileno ou aralquileno substituído,
Figure img0032
onde (a) indica ligação ao grupo A e (b) indica ligação aos respectivos grupos carbonila, R3 e R4sao independentemente escolhidos dentre H, halogênio, alquila, alquila substituído, cicloalquila, ou cicloalquila substituído, ou R3 e R4 ou dois grupos R3 ou dois grupos R4, formam, opcionalmente um cicloalquila ou um heterocicloalquila; R é H, alquila, alquila substituído, cicloalquila, ou cicloalquila substituído; T3 é uma ligação, C(R)(R), O ou S e R é H, halogênio, alquila, alquila substituído, cicloalquila ou cicloalquila substituído; R1 é H, um grupo amino protetor, resina, aminoácido, polipeptídeo, ou polinucleotídeo, e R2 é OH, um grupo éster protetor, resina, aminoácido, polipeptídeo ou polinucleotídeo; Tais aminoácidos não naturais podem estar na forma de um sal, ou podem ser incorporados a um aminoácido não natural, polipeptídeo, polímero, polissacarídeo ou um polinucleotídeo e, opcionalmente pós-traducionalmente modificados.
[00310]Além disso, incluem-se aminoácidos com a estrutura da Fórmula (XXXXI):
Figure img0033
onde:
Figure img0034
onde (a) indica ligação ao grupo A e (b) indica ligação aos respectivos grupos carbonila, R3 e R4 são independentemente escolhidos dentre H, halogênio, alquila, alquila substituído, cicloalquila, ou cicloalquila substituído, ou R3 e R4 ou dois grupos R3 ou dois grupos R4, formam, opcionalmente um cicloalquila ou um heterocicloalquila; R é H, alquila, alquila substituído, cicloalquila, ou cicloalquila substituído; T3 é uma ligação, C(R)(R), O ou S e R é H, halogênio, alquila, alquila substituído, cicloalquila ou cicloalquila substituído; R1 é H, um grupo amino protetor, resina, aminoácido, polipeptídeo, ou polinucleotídeo, e R2 é OH, um grupo éster protetor, resina, aminoácido, polipeptídeo ou polinucleotídeo; cada Ra é independentemente selecionado do grupo consistindo de H, halogênio, alquila, alquila substituído, -N(R')2, -C(O)kR' onde k é 1, 2, ou 3, - C(O)N(R')2, -OR', e -S(O)kR', onde R'é independentemente H, alquila ou alquila substituído; Tais aminoácidos não naturais podem estar na forma de um sal, ou podem ser incorporados a um aminoácido não natural, polipeptídeo, polímero, polissacarídeo ou um polinucleotídeo e, opcionalmente pós-traducionalmente modificados.
[00311]Além disso, incluem-se aminoácidos com a estrutura da Fórmula (XXXXII):
Figure img0035
onde: R é H, halogênio, alquila, alquila substituído, cicloalquila ou cicloalquila substituído; e T3 é O, ou S.
[00312]Tais aminoácidos não naturais podem estar na forma de um sal, ou podem ser incorporados a um aminoácido não natural, polipeptídeo, polímero, polissacarídeo ou um polinucleotídeo e, opcionalmente pós-traducionalmente modificados.
[00313]Além disso, incluem-se aminoácidos com a estrutura da Fórmula (XXXXIII):
Figure img0036
onde: R é H, halogênio, alquila, alquila substituído, cicloalquila ou cicloalquila substituído.
[00314]Além disso, incluem-se os aminoácidos com a estrutura da Fórmula (XXXXIII):
Figure img0037
[00315]Tais aminoácidos não naturais podem estar na forma de um sal, ou podem ser incorporados a um aminoácido não natural, polipeptídeo, polímero, polissacarídeo ou um polinucleotídeo e, opcionalmente pós-traducionalmente modificados.
[00316]A funcionalidade carbonila ou dicarbonila podem ser reagidas seletivamente com um reagente contendo hidroxilamina sob condições brandas numa solução aquosa para formar a correspondente ligação oxima, que é estável sob condições fisiológicas. Ver, por exemplo, Jencks, W. P., J. Am. Chem. Soc. 81, 475-481 (1959); Shao, J. e Tam, J. P., J. Am. Chem. Soc. 117: (14)3893-3899 (1995). Além disso, a reatividade singular do grupo carbonila ou dicarbonila, permite a modificação seletiva na presença das outras cadeias secundárias do aminoácido. Ver, por exemplo, Cornish, V. W., et al., J. Am. Chem. Soc. 118:8150-8151 (1996); Geoghegan, K. F. & Stroh, J. G., Bioconjug. Chem. 3: 138- 146 (1992); Mahal, L. K., et al., Science 276:1125-1128 (1997).
[00317]A síntese de para-acetil-(+/-)-fenilalanina e m-acetil-(+/-(fenilalanina está descrita em Zhang, Z, et al., Bioichemistry 42:6735-6746 (2003), ora incorporado por referência. Outros aminoácidos contendo carbonila ou dicarbonila podem ser de modo similar, preparados. Além disso, sínteses não limitantes exemplares de aminoácido não natural aqui incluídas estão apresentadas nas Figuras 4, 24-34 e 36-39.
[00318]Em algumas modalidades, um polipeptídeo compreendendo um aminoácido não natural é quimicamente modificado, a fim de gerar um grupo funcional carbonila ou dicarbonila reativo. Por exemplo, uma funcionalidade aldeído útil para reações de conjugação pode ser gerada de uma funcionalidade com grupos amino e hidroxila adjacentes. Onde a molécula biologicamente ativa for um polipeptídeo, por exemplo, uma serina ou treonina N-terminal (que pode estar normalmente presente ou pode ser exposta via digestão química ou enzimática) pode ser usada para gerar uma funcionalidade aldeído sob condições de clivagem oxidativas suaves usando periodato. Ver, por exemplo, Gaertner, et al., Bioconjug. Chem. 3:262-268 (1992); Geoghegan, K. & Stroh, J., Bioconjug. Chem. 3:18-146 (1992); Gaertner et al., J. Biol. Chem. 269:72245-7230 (1994). Contudo, métodos conhecidos na técnica estão restritos ao aminoácido no N-terminal do peptídeo ou proteína.
[00319]Adicionalmente, a guisa de exemplo, um aminoácido não natural portando grupos hidroxila e amino adjacentes pode ser incorporado a um polipeptídeo como uma funcionalidade aldeído "mascarada". Por exemplo, 5- hidroxilisina porta um grupo hidroxila adjacente à amina épsilon. Condições de reação para gerar o aldeído, envolvem, tipicamente, adição de excesso molar de metaperiodato de sódio sob condições brandas para se evitar oxidação em outros sítios no polipeptídeo. O pH da reação de oxidação é tipicamente cerca de 7,0 Uma reação típica, envolve a adição de aproximadamente excesso 1,5 molar de metaperiodato de sódio a uma solução tamponada do polipeptídeo, seguido por incubação por aproximadamente 10 minutos no escuro. Ver, por exemplo, Patente U.S. n° 6.423.685.
B. Estrutura e Síntese de Aminoácidos não naturais: Aminoácidos Contendo Hidroxilamina
[00320]Aminoácidos não naturais contendo um grupo hidroxilamina (também denominados um aminoóxi) permitem a reação com uma série de grupos eletrofílicos para formar conjugados (incluindo, sem limitação, com PEG ou com outros polímeros hidrossolúveis). À semelhança das hidrazinas, hidrazidas e semicarbazidas, a nucleofilicidade incrementada do grupo aminoóxi permite que ele reaja eficientemente e seletivamente, com uma série de moléculas que contém grupos carbonila - ou dicarbonila, incluindo, sem limitação, cetonas, aldeídos ou outros grupos funcionais com reatividade química similar. Ver por exemplo, Shao, J. e Tam, J.J. Am. Chem. Soc. 117-3893-3899 (1995); H. Hasng e C. Bertozzi, Acc. Chem. REs. 34(9): 727-736 (2001). Embora o resultado da reação com um grupo hidrazina é a correspondente hidrazona, resulta, contudo, uma oxima em geral, da reação de um grupo aminoóxi com um grupo contendo carbonila ou dicarbonila, tal como a guisa de exemplo, uma cetona, aldeído ou outros grupos funcionais com semelhante reatividade química.
[00321]Assim, sob determinadas modalidades aqui descrias encontram-se aminoácidos não naturais com cadeias alterais compreendendo um grupo hidroxilamina, um grupo similar à hidroxilamina (que possui reatividade similar a um grupo hidroxilamina e é estruturalmente similar a um grupo hidroxilamina) um grupo hidroxilamina mascarado (que pode ser prontamente convertido num grupo hidroxilamina) ou um grupo hidroxilamina protetor (que possui reatividade similar a um grupo hidroxilamina com a desproteção). Tais aminoácidos incluem aminoácidos com a estrutura da Fórmula:
Figure img0038
onde: A é opcional e, quando presente é alquileno inferior, alquileno inferior substituído, cicloalquileno inferior, cicloalquileno inferior substituído, alquenileno inferior, alquenileno inferior substituído, alquinileno, heteroalquileno inferior, heteroalquileno substituído, heterocicloalquileno inferior, heterocicloalquileno inferior substituído, arileno, arileno substituído, heteroarileno, heteroarileno substituído, alcarileno, alcarileno substituído, aralquileno ou aralquileno substituído, B é opcional, e quando presente é um ligante selecionado do grupo consistindo de alquileno inferior, alquileno inferior substituído, alquenileno inferior, alquenileno inferior substituído, heteroalquileno inferior, heteroalquileno inferior substituído, -O-, -O-(alquileno ou alquileno substituído)-, -S-, -S-(alquileno ou alquileno substituído)-, -S(O)k- onde k é 1, 2, ou 3, -S(O)k(alquileno ou alquileno substituído)-, -C(O)-, -NS(O)2, -OS(O)2-, -C(O)-(alquileno ou alquileno substituído)-, -C(S)-, -C(S)-(alquileno ou alquileno substituído)-, -N(R')-, NR'-(alquileno ou alquileno substituído),- -C(O)N(R')-, -CON(R')-(alquileno ou alquileno substituído)- - CSN(R')-, -CSN(R')-alquileno ou alquileno substituído)-, -N(R')CO-(alquileno ou alquileno substituído)- -N(R')C(O)O-, -S(O)KN(R')-, N(R')C(O)N(R')-, -N(R')C(S)N(R')- , -N(R')S(O)KN(R')-, -N(R')-N=, -C(R')=N-, -C(R')=N-N(R')-, C(R')=N-N=, -C(R')2N=N-, e -C(R')2-N(R')-N(R')-, onde cada R'é independentemente H, alquila ou alquila substituído, K é -NR6R7 ou -N=CR6R7; R1 é H, um grupo amino protetor, resina, aminoácido, polipeptídeo, ou polinucleotídeo, e R2 é OH, um grupo éster protetor, resina, aminoácido, polipeptídeo ou polinucleotídeo; cada um de R3 e R4 é independentemente H, halogênio, alquila inferior, ou alquila inferior substituído, ou R3 e R4 ou dois grupos R3 formam, opcionalmente, um cicloalquila ou um heterocicloalquila; cada um de R6 e R7 é independentemente selecionado do grupo consistindo de H, alquila, alquila substituído, alquenila, alquenila substituído, alcóxi, alcóxi substituído, óxido de polialquileno, óxido de polialquileno substituído, arila, arila substituído, heteroarila, heteroarila substituído, alcarila, alcarila substituído, aralquila e aralquila substituído, -C(O)R", -C(O)2R", -C(O)N(R")2, onde cada R"é independentemente hidrogênio, alquila, alquila substituído, alquenila, alquenila substituído, alcóxi, alcóxi substituído, arila, arila substituído, heteroarila, alcarila, alcarila substituído, aralquila ou aralquila substituído, ou R6 ou R7 é L-X, onde: X é selecionado do grupo consistindo de um rótulo, um corante, um polímero, um polímero hidrossolúvel, um derivado de polietileno glicol; um foto- reticulado; um composto citotóxico, uma droga, um rótulo de afinidade, um rótulo de foto-afinidade, um composto reativo, uma resina, uma segunda proteína, um polipeptídeo ou análogo de polipeptídeo, um anticorpo ou fragmento de anticorpo, um quelante metálico, um co-fator, um ácido graxo, um carboidrato, um polinucleotídeo, um DNA, um RNA, um polinucleotídeo anti-sentido, um sacarídeo, um dendrímero hidrossolúvel, uma ciclodextrina, um biomaterial, uma nanopartícula um rótulo em spin, um fluoróforo, uma fração contendo metal, uma fração radioativa, um novo grupo funcional, um grupo que, interage, covalente ou não covalentemente com outras moléculas, uma fração foto-encerrada; uma fração fotoisomerizável, biotina, um análogo de biotina, uma fração que incorpora um átomo pesado, um grupo quimicamente clivável, um grupo fotoclivável, uma cadeia lateral alongada, um açúcar ligado a carbono, um agente redox-ativo, um amino-tioácido, uma fração tóxica, uma fração isotopicamente rotulada, uma sonda biofísica, um grupo fosforescente, um grupo quimioluminescente, um grupo denso em elétron, um grupo magnético, um grupo de intercalação, um cromóforo, um agente de transferência de energia, um agente biologicamente ativo, um rótulo detectável, e qualquer combinação dos acima, e L é opcional, e quando presente é um ligante selecionado do grupo consistindo de alquileno, alquileno substituído, alquenileno, alquenileno substituído, -O-, -O-(alquileno ou alquileno substituído)-, -S-, -S-(alquileno ou alquileno substituído)-, -S(O)k- onde k é 1, 2, ou 3, -S(O)k(alquileno ou alquileno substituído)-. -C(O)-, -C(O)-(alquileno ou alquileno substituído)-, -C(S)-, -C(S)-(alquileno ou alquileno substituído)-, -N(R')-, NR'-(alquileno ou alquileno substituído), -C(O)N(R')-, -CON(R')-(alquileno ou alquileno substituído)-, -CSN(R')-, -CSN(R')-alquileno ou alquileno substituído)-, -N(R')CO-(alquileno ou alquileno substituído)-, -N(R')C(O)O-, -S(O)kN(R')-, N(R')C(O)N(R')-, -N(R')C(S)N(R')-, -N(R')S(O)kN(R')-, -N(R')-N=, - C(R')=N-, -C(R')=N-N(R')-, -C(R')=N-N=, -C(R')2N=N-, e -C(R')2-N(R')-N(R')-, onde cada R'é independentemente H, alquila ou alquila substituído.
[00322]Tais aminoácidos não naturais podem estar na forma de um sal, ou podem ser incorporados a um polipeptídeo de aminoácido não natural, polímero, polissacarídeo ou um polinucleotídeo e, opcionalmente, pós-traducionalmente modificado.
[00323]Em algumas modalidades dos compostos de Fórmula (XIV), A é fenileno ou fenileno substituído. Em algumas modalidades dos compostos de Fórmula (XIV), B é -(alquileno ou alquileno substituído)-, -O-(alquileno ou alquileno substituído)-, S-(alquileno ou alquileno substituído)- ou -C(O)-(alquileno ou alquileno substituído)-. Em algumas modalidades dos compostos de Fórmula (XIV), B é - O(CH2)2, -S(CH2)2, -NH(CH2)2-, -C(O)-(CH2)2 ou (CH2)n- onde n é 1 a 4. Em algumas modalidades dos compostos de fórmula (XIV) R1 é H, terc-butiloxicarbonila (Boc), 9-fluorenilmetoxicarbonila (Fmoc), N-acetila, tetrafluoraceteila (TFA), ou benziloxicarbonila (CBZ). Em algumas modalidades dos compostos de fórmula (XIV), R1 é uma resina, aminoácido, polipeptídeo ou polinucleotídeo. Em algumas modalidades dos compostos de Fórmula (XIV), R2 é OH, O-metila, O-etila, ou O- terc-butila. Em algumas modalidades dos compostos de Fórmula (XIV) R2 é OH, O- metila, O-etila, ou O-terc-butila, onde R2 é uma resina, aminoácido, polipeptídeo ou polinucleotídeo. Em algumas modalidades dos compostos de fórmula (XIV), R2 é um polinucleotídeo. Em algumas modalidades dos compostos de Fórmula (XIV), R2 é ácido ribonucléico, (RNA). Em algumas modalidades dos compostos de Fórmula (XIV), R2 é tRNA. Em algumas modalidades dos compostos de Fórmula (XIV), o tRNA reconhece especificamente, um códon de seleção. Em algumas modalidades dos compostos de Fórmula (XIV) o códon de seleção é selecionado do grupo consistindo em um códon âmbar, códon ocre, códon opala, um códon singular, um códon raro, um códon não natural, um códon de cinco bases, e um códon de quatro bases. Em algumas modalidades dos compostos de Fórmula (XIV) R2 é um tRNA supressor. Em algumas modalidades dos compostos de Fórmula (XIV) cada um dentre R6 e R7 é independentemente selecionado do grupo consistindo de H, alquila, alquila substituído, alcóxi, alcóxi substituído, óxido de polialquileno, óxido de polialquileno substituído, arila substituído, heteroarila, heteroarila substituído, alcarila, alcarila substituído, aralquila e alquila substituído. Em algumas modalidades dos compostos de Fórmula (XIV) cada qual dentre R6 e R7 é independentemente selecionado do grupo consistindo em H, metila, fenila e -[(alquileno ou alquileno substituído)-O-(hidrogênio, alquila, ou alquila substituído)]x, onde x é de 1-50. Em algumas modalidades dos compostos de Fórmula (XIV) K é -NR6R7.
[00324]Em algumas modalidades dos compostos de Fórmula (XIV) X é um agente biologicamente ativa selecionado dentre o grupo consistindo em um peptídeo, proteína, enzima, anticorpo, droga, corante lipídio, nucleosídeos, oligonucleotídeo, célula, vírus lipossoma, micropartícula e micela. Em algumas modalidades dos compostos de Fórmula (XIV), X é uma droga selecionada do grupo consistindo em um antibiótico, fungicida, agente antiviral, agente antiinflamatório, agente anti-tumor, agente cardiovascular, agente ansiolítico, hormônio, fator de crescimento, agente esteroidal. Em algumas modalidades dos compostos de Fórmula (XIV), X e uma enzima selecionada dentre o grupo consistido de peroxidase de rábano de cavalo, fosfatase alcalina, β-galactosidase, e glicose oxidase. Em algumas modalidades dos compostos de Fórmula (XIV), X é um rótulo detectável, selecionado do grupo consistindo em fluorescente, fosforescente, quimioluminescente, quelante, denso de elétron, magnético, intercalação, radioativo, cromóforo, e fração de transferência de energia.
[00325]Em algumas modalidades, os compostos de Fórmula (XIV) são estáveis em solução aquosa por pelo menos um mês, em condições suavemente acidas. Numa outra modalidade, os compostos de fórmula (XIV) serão estáveis por pelo menos 2 semanas sob condições suavemente acidas. Numa outra modalidade, tais compostos de Fórmula (XIV) serão estáveis por pelo menos 5 dias sob condições suavemente ácidas. Em algumas modalidades, tais condições ácidas são pH 2 a 8.
[00326]Tais aminoácidos incluem os aminoácidos com a estrutura da Fórmula (XV):
Figure img0039
onde: A é opcional e, quando presente é alquileno inferior, alquileno inferior substituído, cicloalquileno inferior, cicloalquileno inferior substituído, alquenileno inferior, alquenileno inferior substituído, alquinileno, heteroalquileno inferior, heteroalquileno substituído, heterocicloalquileno inferior, heterocicloalquileno inferior substituído, arileno, arileno substituído, heteroarileno, heteroarileno substituído, alcarileno, alcarileno substituído, aralquileno ou aralquileno substituído, B é opcional, e quando presente é um ligante selecionado do grupo consistindo de alquileno inferior, alquileno inferior substituído, alquenileno inferior, alquenileno inferior substituído, heteroalquileno inferior, heteroalquileno inferior substituído, -O-, -O-(alquileno ou alquileno substituído)-, -S-, -S-(alquileno ou alquileno substituído)-, -S(O)k- onde k é 1, 2, ou 3, -S(O)k(alquileno ou alquileno substituído)-, -C(O)-, -NS(O)2, -OS(O)2-, -C(O)-(alquileno ou alquileno substituído)-, - C(S)-, -C(S)-(alquileno ou alquileno substituído)-, -N(R')-, NR'-(alquileno ou alquileno substituído),- -C(O)N(R')-, -CON(R')-(alquileno ou alquileno substituído)- -CSN(R')-, - CSN(R')-alquileno ou alquileno substituído)-, -N(R')CO-(alquileno ou alquileno substituído)- ,-N(R')C(O)O-, -S(O)KN(R')-, N(R')C(O)N(R')-, -N(R')C(S)N(R')-, - N(R')S(O)KN(R')-, -N(R')-N=, -C(R')=N-, -C(R')=N-N(R')-, C(R')=N-N=, -C(R')2N=N-, e -C(R')2-N(R')-N(R')-, onde cada R'é independentemente H, alquila ou alquila substituído, R1 é H, um grupo amino protetor, resina, aminoácido, polipeptídeo, ou polinucleotídeo, e R2 é OH, um grupo éster protetor, resina, aminoácido, polipeptídeo ou polinucleotídeo; cada um de R3 e R4 é independentemente H, halogênio, alquila inferior, ou alquila inferior substituído, ou R3 e R4 ou dois grupos R3 formam, opcionalmente, um grupo cicloalquila ou heterocicloalquila.
[00327]Tais aminoácidos não naturais podem estar na forma de um sal, ou podem ser incorporados a um polipeptídeo de aminoácido não natural, polímero, polissacarídeo, ou um polinucleotídeo e, opcionalmente, traducionalmente modificados.
[00328]Um aminoácido representativo, sem limitação, possui a seguinte estrutura:
Figure img0040
[00329]Um aminoácido não natural como este, pode estar na forma de um sal, ou pode ser incorporado a um polipeptídeo de aminoácido não natural, polímero, polissacarídeo, ou um polinucleotídeo e, opcionalmente, traducionalmente modificado.
[00330]Aminoácidos contendo aminoóxi podem ser preparados de precursores de aminoácido prontamente disponíveis (homoserina, serina e treonina). Ver, por exemplo, M. Carrasco e R. Brown, J. Orgânico. Chem. 68: 8853-8858 (2003). Alguns aminoácidos contendo aminoóxi, tais como ácido L-2-amino-4- (aminoóxi)-butírico, foram isolados de fontes naturais (Rosenthal, G. et al., Life Sci. 60: 1635-1641 (1997). Outros aminoácidos contendo aminoóxi podem ser de modo similar, preparados. Alem disso, a síntese exemplar sem limitação, de um aminoácido não natural aqui descrito está apresentada na Figura 5.
C. Síntese Química de Aminoácidos não Naturais: Aminoácidos Contendo Oxima
[00331]Aminoácidos não naturais contendo um grupo oxima permitem a reação com uma série de reagentes que contém determinados grupos reativos carbonila- ou dicarbonila (incluindo, sem limitação, cetonas, aldeídos ou outros grupos com reatividade similar), para formar novos aminoácidos não naturais, compreendendo um novo grupo oxima. Uma tal reação de troca de oxima permite funcionalização adicional dos polipeptídeos de aminoácido não natural (por exemplo, métodos sintéticos químicos in vivo, in vitro aqui descritos).
[00332]Assim, em determinadas modalidades aqui descritas, estão aminoácidos não naturais com cadeias laterais compreendendo um grupo oxima, um grupo similar a oxima (que possui reatividade similar a um grupo oxima e é estruturalmente similar a um grupo oxima), um grupo oxima mascarado (que podem ser prontamente convertido num grupo oxima) ou um grupo oxima protetor (que possui reatividade similar a um grupo oxima com a desproteção) Tais aminoácidos incluem aminoácidos com a estrutura de Fórmula (XI);
Figure img0041
onde: A é opcional e, quando presente é alquileno inferior, alquileno inferior substituído, cicloalquileno inferior, cicloalquileno inferior substituído, alquenileno inferior, alquenileno inferior substituído, alquinileno, heteroalquileno inferior, heteroalquileno substituído, heterocicloalquileno inferior, heterocicloalquileno inferior substituído, arileno, arileno substituído, heteroarileno, heteroarileno substituído, alcarileno, alcarileno substituído, aralquileno ou aralquileno substituído, B é opcional, e quando presente é um ligante selecionado do grupo consistindo de alquileno inferior, alquileno inferior substituído, alquenileno inferior, alquenileno inferior substituído, heteroalquileno inferior, heteroalquileno inferior substituído, -O-, -O-(alquileno ou alquileno substituído)-, -S-, -S-(alquileno ou alquileno substituído)-, -S(O)k- onde k é 1, 2, ou 3, -S(O)k(alquileno ou alquileno substituído)-, -C(O)-, -NS(O)2, -OS(O)2-, -C(O)-(alquileno ou alquileno substituído)-, -C(S)-, -C(S)-(alquileno ou alquileno substituído)-, -N(R')-, NR'-(alquileno ou alquileno substituído),- -C(O)N(R')-, -CON(R')-(alquileno ou alquileno substituído)- - CSN(R')-, -CSN(R')-alquileno ou alquileno substituído)-, -N(R')CO-(alquileno ou alquileno substituído)- ,-N(R')C(O)O-, -S(O)KN(R')-, N(R')C(O)N(R')-, - N(R')C(S)N(R')-, -N(R')S(O)KN(R')-, -N(R')-N=, -C(R')=N-, -C(R')=N-N(R')-, C(R')=N- N=, -C(R')2N=N-, e -C(R')2-N(R')-N(R')-, onde cada R'é independentemente H, alquila ou alquila substituído, R é H, alquila, alquila substituído, cicloalquila ou cicloalquila substituído; R1 é H, um grupo amino protetor, resina, aminoácido, polipeptídeo, ou polinucleotídeo, e R2 é OH, um grupo éster protetor, resina, aminoácido, polipeptídeo ou polinucleotídeo; cada um de R3 e R4 é independentemente H, halogênio, alquila inferior, ou alquila inferior substituído, ou R3 e R4 ou dois grupos R3 formam, opcionalmente, um grupo cicloalquila ou heterocicloalquila. R5 é H, alquila, alquila substituído, alquenila, alquenila substituído, alquinila, alquinila substituído, alcóxi, alcóxi substituído, alquilalcóxi, alquilalcóxi substituído, óxido de polialquileno, óxido de polialquileno substituído, arila, arila substituído, heteroarila, heteroarila substituído, alcarila, alcarila substituído, aralquila, aralquila substituído, ON(R")2-(alquileno ou alquileno substituído), C(O)SR"-(alquileno ou alquileno substituído), -(alquileno ou alquileno substituído)-S-S-(arila ou arila substituído), -C(O)R", -C(O)2R", ou -C(O)N(R")2, onde cada R"é independentemente hidrogênio, alquila, alquila substituído, alquenila, alquenila substituído, alcóxi, alcóxi substituído, arila, arila substituído, heteroarila, alcarila, alcarila substituído, aralquila ou aralquila substituído; ou R5 é L-X, onde: X é selecionado do grupo consistindo de um rótulo, um corante, um polímero, um polímero hidrossolúvel, um derivado de polietileno glicol; um foto- reticulado; um composto citotóxico, uma droga, um rótulo de afinidade, um rótulo de foto-afinidade, um composto reativo, uma resina, uma segunda proteína, um polipeptídeo ou análogo de polipeptídeo, um anticorpo ou fragmento de anticorpo, um quelante metálico, um co-fator, um ácido graxo, um carboidrato, um polinucleotídeo, um DNA, um RNA, um polinucleotídeo anti-sentido, um sacarídeo, um dendrímero hidrossolúvel, uma ciclodextrina, um biomaterial, uma nanopartícula um rótulo giratório, um fluoróforo, uma fração contendo metal, uma fração radioativa, um novo grupo funcional, um grupo que, interage, covalente ou não covalentemente com outras moléculas, uma fração foto-encerrada; uma fração fotoisomerizável, biotina, um análogo de biotina, uma fração que incorpora um átomo pesado, um grupo quimicamente clivável, um grupo fotoclivável, uma cadeia lateral alongada, um açúcar ligado a carbono, um agente redox-ativo, um amino-tioácido, uma fração tóxica, uma fração isotopicamente rotulada, uma sonda biofísica, um grupo fosforescente, um grupo quimioluminescente, um grupo denso em elétron, um grupo magnético, um grupo de intercalação, um cromóforo, um agente de transferência de energia, um agente biologicamente ativo, um rótulo detectável, e qualquer combinação dos acima, e L é opcional, e quando presente é um ligante selecionado do grupo consistindo de alquileno, alquileno substituído, alquenileno, alquenileno substituído, -O-, -O-(alquileno ou alquileno substituído)-, -S-, -S-(alquileno ou alquileno substituído)-, -S(O)k- onde k é 1, 2, ou 3, -S(O)k(alquileno ou alquileno substituído)-. -C(O)-, -C(O)-(alquileno ou alquileno substituído)-, -C(S)-, -C(S)-(alquileno ou alquileno substituído)-, -N(R')-, NR'-(alquileno ou alquileno substituído), -C(O)N(R')-, -CON(R')-(alquileno ou alquileno substituído)-, -CSN(R')-, -CSN(R')-alquileno ou alquileno substituído)-, -N(R')CO-(alquileno ou alquileno substituído)- -N(R')C(O)O-, O-N=CR'-(alquileno ou alquileno substituído)-, C(O)NR'-(alquileno ou alquileno substituído)-(alquileno ou alquileno substituído)-, -S(O)k-(alquileno ou alquileno substituído)-S-, S-S-(alquileno ou alquileno substituído)-, -S(O)kN(R')-, N(R')C(O)N(R')-, -N(R')C(S)N(R')-, -N(R')S(O)kN(R')-, -N(R')-N=, -C(R')=N-, -C(R')=N- N(R')-, -C(R')=N-N=, -C(R')2N=N-, e -C(R')2-N(R')-N(R')-, onde cada R'é independentemente H, alquila ou alquila substituído, com a condição de que, quando A e B estão ausentes, R não é metila.
[00333]Tais aminoácidos não naturais podem estar na forma de um sal, ou podem ser incorporados a um polipeptídeo de aminoácido não natural, polímero, polissacarídeo ou um polinucleotídeo e, opcionalmente, pós-traducionalmente modificados.
[00334]Em algumas modalidades dos compostos de Fórmula (XI), B é -O- alquileno ou alquileno substituído)-. Em algumas modalidades dos compostos de Fórmula (XI), B é -OCH2). Em algumas modalidades dos compostos de fórmula (XI) R é C1-6 alquila.
[00335]Em algumas modalidades dos compostos de Fórmula (XI), R é -CH3. Em algumas modalidades dos composto de Fórmula (XI), R1 é H, terc-butiloxicarbonila (Boc), 9-fluorenilmetoxicarbonila (Fmoc), N- acetila, tetrafluoraceteila (TFA), ou benziloxicarbonila (CBZ). Em algumas modalidades dos compostos de fórmula (XI), R1 é uma resina, aminoácido, polipeptídeo ou polinucleotídeo. Em algumas modalidades dos compostos de Fórmula (XI), R2 é OH, O-metila, O-etila, ou O-terc-butila. Em algumas modalidades dos compostos de Fórmula (XI) R2 é uma resina, aminoácido, polipeptídeo ou polinucleotídeo. Em algumas modalidades dos compostos de fórmula (XI), R2 é um polinucleotídeo. Em algumas modalidades dos compostos de Fórmula (XI), R2 é ácido ribonucléico, (RNA). Em algumas modalidades dos compostos de Fórmula (XI), R2 é tRNA. Em algumas modalidades dos compostos de Fórmula (XI), o tRNA reconhece especificamente, um códon de seleção. Em algumas modalidades dos compostos de Fórmula (XI) o códon de seleção é selecionado do grupo consistindo em um códon âmbar, códon ocre, códon opala, um códon singular, um códon raro, um códon não natural, um códon de cinco bases, e um códon de quatro bases. Em algumas modalidades dos compostos de Fórmula (XI) R2 é um tRNA supressor. Em algumas modalidades dos compostos de Fórmula (XI) R5 é alquilalcóxi, alquilalcóxi substituído, óxido de polialquileno, óxido de polialquileno substituído ou -C(O)2R". Em algumas modalidades dos compostos de Fórmula (XI) R5 é -[(alquileno ou alquileno substituído)-O-(hidrogênio, alquila, ou alquila substituído)]x, onde x é de 150. Em algumas modalidades dos compostos de Fórmula (XI) R5 é -(CH2CH2)-O- CH3 ou COOH.
[00336]Em algumas modalidades, os compostos de Fórmula (I) são estáveis em solução aquosa por pelo menos um mês, em condições suavemente acidas. Numa outra modalidade, os compostos de fórmula (I) serão estáveis por pelo menos 2 semanas sob condições suavemente acidas. Numa outra modalidade, tais compostos de Fórmula (I) serão estáveis por pelo menos 5 dias sob condições suavemente ácidas. Em algumas modalidades, tais condições ácidas são pH 2 a 8.
[00337]Os aminoácidos de Fórmula (XI) incluem os aminoácidos com a estrutura da Fórmula (XII):
Figure img0042
onde: B é opcional, e quando presente é um ligante selecionado do grupo consistindo de alquileno inferior, alquileno inferior substituído, alquenileno inferior, alquenileno inferior substituído, heteroalquileno inferior, heteroalquileno inferior substituído, -O-, -O-(alquileno ou alquileno substituído)-, -S-, -S-(alquileno ou alquileno substituído)-, -S(O)k- onde k é 1, 2, ou 3, -S(O)k(alquileno ou alquileno substituído)-, -C(O)-, -NS(O)2, -OS(O)2-, -C(O)-(alquileno ou alquileno substituído)-, - C(S)-, -C(S)-(alquileno ou alquileno substituído)-, -N(R')-, NR'-(alquileno ou alquileno substituído),- -C(O)N(R')-, -CON(R')-(alquileno ou alquileno substituído)- -CSN(R')-, - CSN(R')-alquileno ou alquileno substituído)-, -N(R')CO-(alquileno ou alquileno substituído)- ,-N(R')C(O)O-, -S(O)KN(R')-, N(R')C(O)N(R')-, -N(R')C(S)N(R')-, - N(R')S(O)KN(R')-, -N(R')-N=, -C(R')=N-, -C(R')=N-N(R')-, C(R')=N-N=, -C(R')2N=N-, e -C(R')2-N(R')-N(R')-, onde cada R'é independentemente H, alquila ou alquila substituído, R é H, alquila, alquila substituído, cicloalquila ou cicloalquila substituído; R1 é H, um grupo amino protetor, resina, aminoácido, polipeptídeo, ou polinucleotídeo, e R2 é OH, um grupo éster protetor, resina, aminoácido, polipeptídeo ou polinucleotídeo; R5 é H, alquila, alquila substituído, alquenila, alquenila substituído, alquinila, alquinila substituído, alcóxi, alcóxi substituído, alquilalcóxi, alquilalcóxi substituído, óxido de polialquileno, óxido de polialquileno substituído, arila, arila substituído, heteroarila, heteroarila substituído, alcarila, alcarila substituído, aralquila, aralquila substituído, -ON(R")2-(alquileno ou alquileno substituído), C(O)SR"-(alquileno ou alquileno substituído), -(alquileno ou alquileno substituído)-S-S-(arila ou arila substituído), -C(O)R", -C(O)2R", ou -C(O)N(R")2 , onde cada R"é independentemente hidrogênio, alquila, alquila substituído, alquenila, alquenila substituído, alcóxi, alcóxi substituído, arila, arila substituído, heteroarila, alcarila, alcarila substituído, aralquila ou aralquila substituído; ou R5 é L-X, onde: X é selecionado do grupo consistindo de um rótulo, um corante, um polímero, um polímero hidrossolúvel, um derivado de polietileno glicol; um foto- reticulado; um composto citotóxico, uma droga, um rótulo de afinidade, um rótulo de foto-afinidade, um composto reativo, uma resina, uma segunda proteína, um polipeptídeo ou análogo de polipeptídeo, um anticorpo ou fragmento de anticorpo, um quelante metálico, um co-fator, um ácido graxo, um carboidrato, um polinucleotídeo, um DNA, um RNA, um polinucleotídeo anti-sentido, um sacarídeo, um dendrímero hidrossolúvel, uma ciclodextrina, um biomaterial, uma nanopartícula um rótulo giratório, um fluoróforo, uma fração contendo metal, uma fração radioativa, um novo grupo funcional, um grupo que, interage, covalente ou não covalentemente com outras moléculas, uma fração foto-encerrada; uma fração fotoisomerizável, biotina, um análogo de biotina, uma fração que incorpora um átomo pesado, um grupo quimicamente clivável, um grupo fotoclivável, uma cadeia lateral alongada, um açúcar ligado a carbono, um agente redox-ativo, um amino-tioácido, uma fração tóxica, uma fração isotopicamente rotulada, uma sonda biofísica, um grupo fosforescente, um grupo quimioluminescente, um grupo denso em elétron, um grupo magnético, um grupo de intercalação, um cromóforo, um agente de transferência de energia, um agente biologicamente ativo, um rótulo detectável, e qualquer combinação dos acima, e L é opcional, e quando presente é um ligante selecionado do grupo consistindo de alquileno, alquileno substituído, alquenileno, alquenileno substituído, -O-, -O-(alquileno ou alquileno substituído)-, -S-, -S-(alquileno ou alquileno substituído)-, -S(O)k- onde k é 1, 2, ou 3, -S(O)k(alquileno ou alquileno substituído)-, -C(O)-, -C(O)-(alquileno ou alquileno substituído)-, -C(S)-, -C(S)-(alquileno ou alquileno substituído)-, -N(R')-, NR'-(alquileno ou alquileno substituído), -C(O)N(R')-, -CON(R')-(alquileno ou alquileno substituído)-, -CSN(R')-, -CSN(R')-alquileno ou alquileno substituído)-, -N(R')CO-(alquileno ou alquileno substituído)- -N(R')C(O)O-, O-N=CR'-(alquileno ou alquileno substituído)-, C(O)NR'-(alquileno ou alquileno substituído)-(alquileno ou alquileno substituído)-, -S(O)k-(alquileno ou alquileno substituído)-S-, S-S-(alquileno ou alquileno substituído)-, -S(O)kN(R')-, N(R')C(O)N(R')-, -N(R')C(S)N(R')-, -N(R')S(O)kN(R')-, -N(R')-N=, -C(R')=N-, -C(R')=N- N(R')-, -C(R')=N-N=, -C(R')2N=N-, e -C(R')2-N(R')-N(R')-, onde cada R'é independentemente H, alquila ou alquila substituído.
[00338]Tais aminoácidos não naturais podem estar na forma de um sal, ou podem ser incorporados a um polipeptídeo de aminoácido não natural, polímero, polissacarídeo ou um polinucleotídeo e, opcionalmente, pós-traducionalmente modificados.
[00339]Tais aminoácidos incluem os aminoácidos com a estrutura da Fórmula (XIII):
Figure img0043
onde: R é H, alquila, alquila substituído, cicloalquila ou cicloalquila substituído; R1 é H, um grupo amino protetor, resina, aminoácido, polipeptídeo, ou polinucleotídeo, e R2 é OH, um grupo éster protetor, resina, aminoácido, polipeptídeo ou polinucleotídeo; R5 é H, alquila, alquila substituído, alquenila, alquenila substituído, alquinila, alquinila substituído, alcóxi, alcóxi substituído, alquilalcóxi, alquilalcóxi substituído, óxido de polialquileno, óxido de polialquileno substituído, arila, arila substituído, heteroarila, heteroarila substituído, alcarila, alcarila substituído, aralquila, aralquila substituído, -ON(R")2-(alquileno ou alquileno substituído), C(O)SR"-(alquileno ou alquileno substituído), -(alquileno ou alquileno substituído)-S-S-(arila ou arila substituído), -C(O)R", -C(O)2R", ou -C(O)N(R")2, onde cada R"é independentemente hidrogênio, alquila, alquila substituído, alquenila, alquenila substituído, alcóxi, alcóxi substituído, arila, arila substituído, heteroarila, alcarila, alcarila substituído, aralquila ou aralquila substituído; ou R5 é L-X, onde: X é selecionado do grupo consistindo de um rótulo, um corante, um polímero, um polímero hidrossolúvel, um derivado de polietileno glicol; um foto- reticulado; um composto citotóxico, uma droga, um rótulo de afinidade, um rótulo de foto-afinidade, um composto reativo, uma resina, uma segunda proteína, um polipeptídeo ou análogo de polipeptídeo, um anticorpo ou fragmento de anticorpo, um quelante metálico, um co-fator, um ácido graxo, um carboidrato, um polinucleotídeo, um DNA, um RNA, um polinucleotídeo anti-sentido, um sacarídeo, um dendrímero hidrossolúvel, uma ciclodextrina, um biomaterial, uma nanopartícula um rótulo giratório, um fluoróforo, uma fração contendo metal, uma fração radioativa, um novo grupo funcional, um grupo que, interage, covalente ou não covalentemente com outras moléculas, uma fração foto-encerrada; uma fração fotoisomerizável, biotina, um análogo de biotina, uma fração que incorpora um átomo pesado, um grupo quimicamente clivável, um grupo fotoclivável, uma cadeia lateral alongada, um açúcar ligado a carbono, um agente redox-ativo, um amino-tioácido, uma fração tóxica, uma fração isotopicamente rotulada, uma sonda biofísica, um grupo fosforescente, um grupo quimioluminescente, um grupo denso em elétron, um grupo magnético, um grupo de intercalação, um cromóforo, um agente de transferência de energia, um agente biologicamente ativo, um rótulo detectável, e qualquer combinação dos acima, e L é opcional, e quando presente é um ligante selecionado do grupo consistindo de alquileno, alquileno substituído, alquenileno, alquenileno substituído, -O-, -O-(alquileno ou alquileno substituído)-, -S-, -S-(alquileno ou alquileno substituído)-, -S(O)k- onde k é 1, 2, ou 3, -S(O)k(alquileno ou alquileno substituído)-. -C(O)-, -C(O)-(alquileno ou alquileno substituído)-, -C(S)-, -C(S)-(alquileno ou alquileno substituído)-, -N(R')-, NR'-(alquileno ou alquileno substituído), -C(O)N(R')-, -CON(R')-(alquileno ou alquileno substituído)-, -CSN(R')-, -CSN(R')-alquileno ou alquileno substituído)-, -N(R')CO-(alquileno ou alquileno substituído)- -N(R')C(O)O-, O-N=CR'-(alquileno ou alquileno substituído)-, C(O)NR'-(alquileno ou alquileno substituído)-(alquileno ou alquileno substituído)-, -S(O)k-(alquileno ou alquileno substituído)-S-, S-S-(alquileno ou alquileno substituído)-, -S(O)kN(R')-, N(R')C(O)N(R')-, -N(R')C(S)N(R')-, -N(R')S(O)kN(R')-, -N(R')-N=, -C(R')=N-, -C(R')=N- N(R')-, -C(R')=N-N=, -C(R')2N=N-, e -C(R')2-N(R')-N(R')-, onde cada R'é independentemente H, alquila ou alquila substituído.
[00340]Tais aminoácidos não naturais podem estar na forma de um sal, ou podem ser incorporados a um polipeptídeo de aminoácido não natural, polímero, polissacarídeo ou um polinucleotídeo e, opcionalmente, pós-traducionalmente modificados.
[00341]Exemplos não limitantes desses aminoácidos incluem os aminoácidos com as seguintes estruturas:
Figure img0044
[00342]Tais aminoácidos não naturais podem estar na forma de um sal, ou podem ser incorporados a um polipeptídeo de aminoácido não natural, polímero, polissacarídeo ou um polinucleotídeo e, opcionalmente, pós-traducionalmente modificados.
[00343]Além disso, tais aminoácidos incluem os aminoácidos com a estrutura de Fórmula (XIV):
Figure img0045
onde: A é opcional e, quando presente é alquileno inferior, alquileno inferior substituído, cicloalquileno inferior, cicloalquileno inferior substituído, alquenileno inferior, alquenileno inferior substituído, alquinileno, heteroalquileno inferior, heteroalquileno substituído, heterocicloalquileno inferior, heterocicloalquileno inferior substituído, arileno, arileno substituído, heteroarileno, heteroarileno substituído, alcarileno, alcarileno substituído, aralquileno ou aralquileno substituído, B é opcional, e quando presente é um ligante selecionado do grupo consistindo de alquileno inferior, alquileno inferior substituído, alquenileno inferior, alquenileno inferior substituído, heteroalquileno inferior, heteroalquileno inferior substituído, -O-, -O-(alquileno ou alquileno substituído)-, -S-, -S-(alquileno ou alquileno substituído)-, -S(O)k- onde k é 1, 2, ou 3, -S(O)k(alquileno ou alquileno substituído)-, -C(O)-, -NS(O)2, -OS(O)2-, -C(O)-(alquileno ou alquileno substituído)-, - C(S)-, -C(S)-(alquileno ou alquileno substituído)-, -N(R')-, NR'-(alquileno ou alquileno substituído),- -C(O)N(R')-, -CON(R')-(alquileno ou alquileno substituído)- -CSN(R')-, - CSN(R')-alquileno ou alquileno substituído)-, -N(R')CO-(alquileno ou alquileno substituído)- -N(R')C(O)O-, -S(O)KN(R')-, N(R')C(O)N(R')-, -N(R')C(S)N(R')-, - N(R')S(O)KN(R')-, -N(R')-N=, -C(R')=N-, -C(R')=N-N(R')-, C(R')=N-N=, -C(R')2N=N-, e -C(R')2-N(R')-N(R')-, onde cada R'é independentemente H, alquila ou alquila substituído, K é -NR6R7 ou -N=CR6R7; R1 é H, um grupo amino protetor, resina, aminoácido, polipeptídeo, ou polinucleotídeo, e R2 é OH, um grupo éster protetor, resina, aminoácido, polipeptídeo ou polinucleotídeo; cada um de R3 e R4 é independentemente H, halogênio, alquila inferior, ou alquila inferior substituído, ou R3 e R4 ou dois grupos R3 formam, opcionalmente, um cicloalquila ou um heterocicloalquila; cada um de R6 e R7 é independentemente selecionado do grupo consistindo de H, alquila, alquila substituído, alquenila, alquenila substituído, alcóxi, alcóxi substituído, óxido de polialquileno, óxido de polialquileno substituído, arila, arila substituído, heteroarila, heteroarila substituído, alcarila, alcarila substituído, aralquila e aralquila substituído, -C(O)R", -C(O)2R", -C(O)N(R")2, onde cada R"é independentemente hidrogênio, alquila, alquila substituído, alquenila, alquenila substituído, alcóxi, alcóxi substituído, arila, arila substituído, heteroarila, alcarila, alcarila substituído, aralquila ou aralquila substituído, ou R6 ou R7 é L-X, onde: X é selecionado do grupo consistindo de um rótulo, um corante, um polímero, um polímero hidrossolúvel, um derivado de polietileno glicol; um foto- reticulado; um composto citotóxico, uma droga, um rótulo de afinidade, um rótulo de foto-afinidade, um composto reativo, uma resina, uma segunda proteína, um polipeptídeo ou análogo de polipeptídeo, um anticorpo ou fragmento de anticorpo, um quelante metálico, um co-fator, um ácido graxo, um carboidrato, um polinucleotídeo, um DNA, um RNA, um polinucleotídeo anti-sentido, um sacarídeo, um dendrímero hidrossolúvel, uma ciclodextrina, um biomaterial, uma nanopartícula um rótulo em spin, um fluoróforo, uma fração contendo metal, uma fração radioativa, um novo grupo funcional, um grupo que, interage, covalente ou não covalentemente com outras moléculas, uma fração foto-encerrada; uma fração fotoisomerizável, biotina, um análogo de biotina, uma fração que incorpora um átomo pesado, um grupo quimicamente clivável, um grupo fotoclivável, uma cadeia lateral alongada, um açúcar ligado a carbono, um agente redox-ativo, um amino-tioácido, uma fração tóxica, uma fração isotopicamente rotulada, uma sonda biofísica, um grupo fosforescente, um grupo quimioluminescente, um grupo denso em elétron, um grupo magnético, um grupo de intercalação, um cromóforo, um agente de transferência de energia, um agente biologicamente ativo, um rótulo detectável, e qualquer combinação dos acima, e L é opcional, e quando presente é um ligante selecionado do grupo consistindo de alquileno, alquileno substituído, alquenileno, alquenileno substituído, -O-, -O-(alquileno ou alquileno substituído)-, -S-, -S-(alquileno ou alquileno substituído)-, -S(O)k- onde k é 1, 2, ou 3, -S(O)k(alquileno ou alquileno substituído)-. -C(O)-, -C(O)-(alquileno ou alquileno substituído)-, -C(S)-, -C(S)-(alquileno ou alquileno substituído)-, -N(R')-, NR'-(alquileno ou alquileno substituído), -C(O)N(R')-, -CON(R')-(alquileno ou alquileno substituído)-, -CSN(R')-, -CSN(R')-alquileno ou alquileno substituído)-, -N(R')CO-(alquileno ou alquileno substituído)-, -N(R')C(O)O-, -S(O)kN(R')-, N(R')C(O)N(R')-, -N(R')C(S)N(R')-, -N(R')S(O)kN(R')-, -N(R')-N=, - C(R')=N-, -C(R')=N-N(R')-, -C(R')=N-N=, -C(R')2N=N-, e -C(R')2-N(R')-N(R')-, onde cada R'é independentemente H, alquila ou alquila substituído.
[00344]Tais aminoácidos não naturais podem estar na forma de um sal, ou podem ser incorporados a um polipeptídeo de aminoácido não natural, polímero, polissacarídeo ou um polinucleotídeo e, opcionalmente, pós-traducionalmente modificados.
[00345]Tais aminoácidos incluem ainda aminoácidos com a estrutura da Fórmula (XVI):
Figure img0046
A é opcional e, quando presente é alquileno inferior, alquileno inferior substituído, cicloalquileno inferior, cicloalquileno inferior substituído, alquenileno inferior, alquenileno inferior substituído, alquinileno, heteroalquileno inferior, heteroalquileno substituído, heterocicloalquileno inferior, heterocicloalquileno inferior substituído, arileno, arileno substituído, heteroarileno, heteroarileno substituído, alcarileno, alcarileno substituído, aralquileno ou aralquileno substituído, B é opcional, e quando presente é um ligante selecionado do grupo consistindo de alquileno inferior, alquileno inferior substituído, alquenileno inferior, alquenileno inferior substituído, heteroalquileno inferior, heteroalquileno inferior substituído, -O-, -O-(alquileno ou alquileno substituído)-, -S-, -S-(alquileno ou alquileno substituído)-, -S(O)k- onde k é 1, 2, ou 3, -S(O)k(alquileno ou alquileno substituído)-, -C(O)-, -NS(O)2, -OS(O)2-, -C(O) -(alquileno ou alquileno substituído)-, -C(S)-, -C(S)-(alquileno ou alquileno substituído)-, -N(R')-, NR'-(alquileno ou alquileno substituído),- -C(O)N(R')-, -CON (R')-(alquileno ou alquileno substituído)- - CSN(R')-, -CSN(R')-alquileno ou alquileno substituído)-, -N(R')CO-(alquileno ou alquileno substituído)- -N(R')C(O)O-, -S(O)KN(R')-, N(R')C(O)N(R')-, -N(R')C(S)N(R')- , -N(R')S (O)KN(R')-, -N(R')-N=, -C(R')=N-, -C(R')=N-N(R')-, C(R')=N-N=, -C(R')2N=N-, e -C(R')2-N(R')-N(R')-, onde cada R'é independentemente H, alquila ou alquila substituído, R1 é H, um grupo amino protetor, resina, aminoácido, polipeptídeo, ou polinucleotídeo, e R2 é OH, um grupo éster protetor, resina, aminoácido, polipeptídeo ou polinucleotídeo; cada um de R6 e R7 é independentemente selecionado do grupo consistindo de H, alquila, alquila substituído, alquenila, alquenila substituído, alcóxi, alcóxi substituído, óxido de polialquileno, óxido de polialquileno substituído, arila, arila substituído, heteroarila, heteroarila substituído, alcarila, alcarila substituído, aralquila e aralquila substituído, -C(O)R", -C(O)2R", -C(O)N(R")2, onde cada R"é independentemente hidrogênio, alquila, alquila substituído, alquenila, alquenila substituído, alcóxi, alcóxi substituído, arila, arila substituído, heteroarila, alcarila, alcarila substituído, aralquila ou aralquila substituído, ou R6 ou R7 é L-X, onde: X é selecionado do grupo consistindo de um rótulo, um corante, um polímero, um polímero hidrossolúvel, um derivado de polietileno glicol; um foto- reticulado; um composto citotóxico, uma droga, um rótulo de afinidade, um rótulo de foto-afinidade, um composto reativo, uma resina, uma segunda proteína, um polipeptídeo ou análogo de polipeptídeo, um anticorpo ou fragmento de anticorpo, um quelante metálico, um co-fator, um ácido graxo, um carboidrato, um polinucleotídeo, um DNA, um RNA, um polinucleotídeo anti-sentido, um sacarídeo, um dendrímero hidrossolúvel, uma ciclodextrina, um biomaterial, uma nanopartícula um rótulo em spin, um fluoróforo, uma fração contendo metal, uma fração radioativa, um novo grupo funcional, um grupo que, interage, covalente ou não covalentemente com outras moléculas, uma fração foto-encerrada; uma fração fotoisomerizável, biotina, um análogo de biotina, uma fração que incorpora um átomo pesado, um grupo quimicamente clivável, um grupo fotoclivável, uma cadeia lateral alongada, um açúcar ligado a carbono, um agente redox-ativo, um amino-tioácido, uma fração tóxica, uma fração isotopicamente rotulada, uma sonda biofísica, um grupo fosforescente, um grupo quimioluminescente, um grupo denso em elétron, um grupo magnético, um grupo de intercalação, um cromóforo, um agente de transferência de energia, um agente biologicamente ativo, um rótulo detectável, e qualquer combinação dos acima, e L é opcional, e quando presente é um ligante selecionado do grupo consistindo de alquileno, alquileno substituído, alquenileno, alquenileno substituído, -O-, -O-(alquileno ou alquileno substituído)-, -S-, -S-(alquileno ou alquileno substituído)-, -S(O)k- onde k é 1, 2, ou 3, -S(O)k(alquileno ou alquileno substituído)-. -C(O)-, -C(O)-(alquileno ou alquileno substituído)-, -C(S)-, -C(S)-(alquileno ou alquileno substituído)-, -N(R')-, NR'-(alquileno ou alquileno substituído), -C(O)N(R')-, -CON(R')-(alquileno ou alquileno substituído)-, -CSN(R')-, -CSN(R')-alquileno ou alquileno substituído)-, -N(R')CO-(alquileno ou alquileno substituído)-, -N(R')C(O)O-, -S(O)kN(R')-, N(R')C(O)N(R')-, -N(R')C(S)N(R')-, -N(R')S(O)kN(R')-, -N(R')-N=, - C(R')=N-, -C(R')=N-N(R')-, -C(R')=N-N=, -C(R')2N=N-, e -C(R')2-N(R')-N(R')-, onde cada R'é independentemente H, alquila ou alquila substituído.
[00346]Tais aminoácidos não naturais podem estar na forma de um sal, ou podem ser incorporados a um polipeptídeo de aminoácido não natural, polímero, polissacarídeo ou um polinucleotídeo e, opcionalmente, pós-traducionalmente modificados.
[00347]Além disso, tais aminoácidos incluem os aminoácidos com a estrutura da Fórmula (XVII):
Figure img0047
onde: B é opcional, e quando presente é um ligante selecionado do grupo consistindo de alquileno inferior, alquileno inferior substituído, alquenileno inferior, alquenileno inferior substituído, heteroalquileno inferior, heteroalquileno inferior substituído, -O-, -O-(alquileno ou alquileno substituído)-, -S-, -S-(alquileno ou alquileno substituído)-, -S(O)k- onde k é 1, 2, ou 3, -S(O)k(alquileno ou alquileno substituído)-, -C(O)-, -NS(O)2, -OS(O)2-, -C(O) -(alquileno ou alquileno substituído)-, -C(S)-, -C(S)-(alquileno ou alquileno substituído)-, -N(R')-, NR'-(alquileno ou alquileno substituído),- -C(O)N(R')-, -CON(R')-(alquileno ou alquileno substituído)- - CSN(R')-, -CSN(R')-alquileno ou alquileno substituído)-, -N(R')CO-(alquileno ou alquileno substituído)- ,-N(R')C(O)O-, -S(O)KN(R')-, N(R')C(O)N(R')-, - N(R')C(S)N(R')-, -N(R')S(O)KN(R')-, -N(R')-N=, -C(R')=N-, -C(R')=N-N(R')-, C(R')=N- N=, -C(R')2N=N-, e -C(R')2-N(R')-N(R')-, onde cada R'é independentemente H, alquila ou alquila substituído, R1 é H, um grupo amino protetor, resina, aminoácido, polipeptídeo, ou polinucleotídeo, e R2 é OH, um grupo éster protetor, resina, aminoácido, polipeptídeo ou polinucleotídeo; cada um de R6 e R7 é independentemente selecionado do grupo consistindo de H, alquila, alquila substituído, alquenila, alquenila substituído, alcóxi, alcóxi substituído, óxido de polialquileno, óxido de polialquileno substituído, arila, arila substituído, heteroarila, heteroarila substituído, alcarila, alcarila substituído, aralquila e aralquila substituído, -C(O)R", -C(O)2R", -C(O)N(R")2, onde cada R"é independentemente hidrogênio, alquila, alquila substituído, alquenila, alquenila substituído, alcóxi, alcóxi substituído, arila, arila substituído, heteroarila, alcarila, alcarila substituído, aralquila ou aralquila substituído, ou R6 ou R7 é L-X, onde: X é selecionado do grupo consistindo de um rótulo, um corante, um polímero, um polímero hidrossolúvel, um derivado de polietileno glicol; um foto- reticulado; um composto citotóxico, uma droga, um rótulo de afinidade, um rótulo de foto-afinidade, um composto reativo, uma resina, uma segunda proteína, um polipeptídeo ou análogo de polipeptídeo, um anticorpo ou fragmento de anticorpo, um quelante metálico, um co-fator, um ácido graxo, um carboidrato, um polinucleotídeo, um DNA, um RNA, um polinucleotídeo anti-sentido, um sacarídeo, um dendrímero hidrossolúvel, uma ciclodextrina, um biomaterial, uma nanopartícula um rótulo em spin, um fluoróforo, uma fração contendo metal, uma fração radioativa, um novo grupo funcional, um grupo que, interage, covalente ou não covalentemente com outras moléculas, uma fração foto-encerrada; uma fração fotoisomerizável, biotina, um análogo de biotina, uma fração que incorpora um átomo pesado, um grupo quimicamente clivável, um grupo fotoclivável, uma cadeia lateral alongada, um açúcar ligado a carbono, um agente redox-ativo, um amino-tioácido, uma fração tóxica, uma fração isotopicamente rotulada, uma sonda biofísica, um grupo fosforescente, um grupo quimioluminescente, um grupo denso em elétron, um grupo magnético, um grupo de intercalação, um cromóforo, um agente de transferência de energia, um agente biologicamente ativo, um rótulo detectável, e qualquer combinação dos acima, e L é opcional, e quando presente é um ligante selecionado do grupo consistindo de alquileno, alquileno substituído, alquenileno, alquenileno substituído, -O-, -O-(alquileno ou alquileno substituído)-, -S-, -S-(alquileno ou alquileno substituído)-, -S(O)k- onde k é 1, 2, ou 3, -S(O)k(alquileno ou alquileno substituído)-. -C(O)-, -C(O)-(alquileno ou alquileno substituído)-, -C(S)-, -C(S)-(alquileno ou alquileno substituído)-, -N(R')-, NR'-(alquileno ou alquileno substituído), -C(O)N(R')-, -CON(R')-(alquileno ou alquileno substituído)-, -CSN(R')-, -CSN(R')-alquileno ou alquileno substituído)-, -N(R')CO-(alquileno ou alquileno substituído)-, -N(R')C(O)O-, -S(O)kN(R')-, N(R')C(O)N(R')-, -N(R')C(S)N(R')-, -N(R')S(O)kN(R')-, -N(R')-N=, - C(R')=N-, -C(R')=N-N(R')-, -C(R')=N-N=, -C(R')2N=N-, e -C(R')2-N(R')-N(R')-, onde cada R'é independentemente H, alquila ou alquila substituído.
[00348]Exemplos não limitantes desses aminoácidos incluem os aminoácidos com as seguintes estruturas:
Figure img0048
[00349]Tais aminoácidos não naturais podem estar na forma de um sal, ou podem ser incorporados a um polipeptídeo de aminoácido não natural, polímero, polissacarídeo ou um polinucleotídeo e, opcionalmente pós-traducionalmente modificados.
[00350]Adicionalmente tais aminoácidos incluem aminoácidos com a estrutura da Fórmula (XVIII);
Figure img0049
B é opcional, e quando presente é um ligante selecionado do grupo consistindo de alquileno inferior, alquileno inferior substituído, alquenileno inferior, alquenileno inferior substituído, heteroalquileno inferior, heteroalquileno inferior substituído, -O-, -O-(alquileno ou alquileno substituído)-, -S-, -S-(alquileno ou alquileno substituído)-, -S(O)k- onde k é 1, 2, ou 3, -S(O)k(alquileno ou alquileno substituído)-, -C(O)-, -NS(O)2, -OS(O)2-, -C(O)-(alquileno ou alquileno substituído)-, -C(S)-, -C(S)-(alquileno ou alquileno substituído)-, -N(R')-, NR'-(alquileno ou alquileno substituído),- -C(O)N(R')-, -CON(R')-(alquileno ou alquileno substituído)- - CSN(R')-, -CSN(R')-alquileno ou alquileno substituído)-, -N(R')CO-(alquileno ou alquileno substituído)- ,-N(R')C(O)O-, -S(O)KN(R')-, N(R')C(O)N(R')-, - N(R')C(S)N(R')-, -N(R')S(O)KN(R')-, -N(R')-N=, -C(R')=N-, -C(R')=N-N(R')-, C(R')=N- N=, -C(R')2N=N-, e -C(R')2-N(R')-N(R')-, onde cada R'é independentemente H, alquila ou alquila substituído, R1 é H, um grupo amino protetor, resina, aminoácido, polipeptídeo, ou polinucleotídeo, e R2 é OH, um grupo éster protetor, resina, aminoácido, polipeptídeo ou polinucleotídeo; cada um de R6 e R7 é independentemente selecionado do grupo consistindo de H, alquila, alquila substituído, alquenila, alquenila substituído, alcóxi, alcóxi substituído, óxido de polialquileno, óxido de polialquileno substituído, arila, arila substituído, heteroarila, heteroarila substituído, alcarila, alcarila substituído, aralquila e aralquila substituído, -C(O)R", -C(O)2R", -C(O)N(R")2, onde cada R"é independentemente hidrogênio, alquila, alquila substituído, alquenila, alquenila substituído, alcóxi, alcóxi substituído, arila, arila substituído, heteroarila, alcarila, alcarila substituído, aralquila ou aralquila substituído, ou R6 ou R7 é L-X, onde: X é selecionado do grupo consistindo de um rótulo, um corante, um polímero, um polímero hidrossolúvel, um derivado de polietileno glicol; um foto- reticulado; um composto citotóxico, uma droga, um rótulo de afinidade, um rótulo de foto-afinidade, um composto reativo, uma resina, uma segunda proteína, um polipeptídeo ou análogo de polipeptídeo, um anticorpo ou fragmento de anticorpo, um quelante metálico, um co-fator, um ácido graxo, um carboidrato, um polinucleotídeo, um DNA, um RNA, um polinucleotídeo anti-sentido, um sacarídeo, um dendrímero hidrossolúvel, uma ciclodextrina, um biomaterial, uma nanopartícula um rótulo em spin, um fluoróforo, uma fração contendo metal, uma fração radioativa, um novo grupo funcional, um grupo que, interage, covalente ou não covalentemente com outras moléculas, uma fração foto-encerrada; uma fração fotoisomerizável, biotina, um análogo de biotina, uma fração que incorpora um átomo pesado, um grupo quimicamente clivável, um grupo fotoclivável, uma cadeia lateral alongada, um açúcar ligado a carbono, um agente redox-ativo, um amino-tioácido, uma fração tóxica, uma fração isotopicamente rotulada, uma sonda biofísica, um grupo fosforescente, um grupo quimioluminescente, um grupo denso em elétron, um grupo magnético, um grupo de intercalação, um cromóforo, um agente de transferência de energia, um agente biologicamente ativo, um rótulo detectável, e qualquer combinação dos acima, e L é opcional, e quando presente é um ligante selecionado do grupo consistindo de alquileno, alquileno substituído, alquenileno, alquenileno substituído, -O-, -O-(alquileno ou alquileno substituído)-, -S-, -S-(alquileno ou alquileno substituído)-, -S(O)k- onde k é 1, 2, ou 3, -S(O)k(alquileno ou alquileno substituído)-. -C(O)-, -C(O)-(alquileno ou alquileno substituído)-, -C(S)-, -C(S)-(alquileno ou alquileno substituído)-, -N(R')-, NR'-(alquileno ou alquileno substituído), -C(O)N(R')-, -CON(R')-(alquileno ou alquileno substituído)-, -CSN(R')-, -CSN(R')-alquileno ou alquileno substituído)-, -N(R')CO-(alquileno ou alquileno substituído)-, -N(R')C(O)O-, -S(O)kN(R')-, N(R')C(O)N(R')-, -N(R')C(S)N(R')-, -N(R')S(O)kN(R')-, -N(R')-N=, - C(R')=N-, -C(R')=N-N(R')-, -C(R')=N-N=, -C(R')2N=N-, e -C(R')2-N(R')-N(R')-, onde cada R'é independentemente H, alquila ou alquila substituído, e cada Ra é independentemente selecionado do grupo consistindo de H, halogênio, alquila, alquila substituído, -N(R')2, -C(O)kR' onde k é 1, 2, ou 3, - C(O)N(R')2, -OR', e -S(O)kR', onde R'é independentemente H, alquila ou alquila substituído; e n é 0 a 8.
[00351]Tais aminoácidos não naturais podem estar na forma de um sal, ou podem ser incorporados a um polipeptídeo de aminoácido não natural, polímero, polissacarídeo, ou um polinucleotídeo e, opcionalmente, traducionalmente modificados.
[00352]Exemplos não limitantes de tais aminoácidos incluem os aminoácidos com as seguintes estruturas:
Figure img0050
[00353]Tais aminoácidos não naturais podem estar na forma de um sal, ou podem ser incorporados a um polipeptídeo de aminoácido não natural, polímero, polissacarídeo, ou um polinucleotídeo e, opcionalmente, traducionalmente modificados.
[00354]Aminoácidos não naturais com base em oxima podem ser sintetizados por métodos já descritos na técnica, ou pelos métodos aqui descritos, incluindo: (a) reação de um aminoácido não natural contendo hidroxilamina com um reagente contendo carbonila- ou dicarbonila-; (b) reação de um aminoácido não natural contendo carbonila- ou dicarbonila com um reagente contendo hidroxilamina; ou (c) reação de um aminoácido não natural contendo oxima com alguns reagentes contendo carbonila- ou dicarbonila, incluindo a guisa de exemplo, um reagente contendo cetona, ou um reagente contendo aldeído. As figuras 5 e 6 exemplificam representações não limitantes dessa metodologia sintética.
D. Absorção Celular dos Aminoácidos não Naturais
[00355]A absorção dos aminoácidos não naturais por uma célula eucariótica é um problema tipicamente considerado quando do planejamento e seleção dos aminoácidos não naturais, incluindo, sem limitação, para incorporação a uma proteína. Por exemplo, a densidade de alta carga de um a-aminoácido sugere que, esses compostos são improváveis de serem permeáveis à célula. Aminoácidos não naturais são transportados para uma célula eucariótica via uma multitude de sistemas de transporte com base em proteína. Uma rápida seleção pode ser feita que avalie quais aminoácidos não naturais, caso hajam, são assimilados pelas células (exemplos 15 & 16 presentes ilustram exemplos não limitantes de testes feitos com aminoácidos não naturais (ver por exemplo, ensaios de toxicidade, na Publicação de Patente U.S. n° 2004/198637 intitulado "Protein Arrays", que está ora incorporado por referência em sua totalidade e Liu, D.R. & Schultz, .G. (1999), Progress toward the evolution of an organism with an expanded genetic code PNAS United States 96:4780-4785. Embora a absorção seja analisada facilmente com vários ensaios, uma alternativa no planejamento de aminoácidos não naturais que sejam passíveis de trajetos de absorção celular é providenciar passos biossintéticos para criar aminoácidos in vivo.
[00356]Tipicamente, o aminoácido não natural produzido via absorção celular conforme aqui descrito, é produzido numa concentração suficiente para a biossíntese eficiente de proteínas, incluindo sem limitação, uma quantidade celular natural, mas não a um tal grau que afete a concentração dos outros aminoácidos ou exaurir as reservas celulares. Concentrações típicas produzidas deste modo são cerca de 10 mM a cerca de 0,05 mM.
E. Biossíntese dos Aminoácidos não naturais
[00357]Muitos passos biossintéticos já existem em células para a produção de aminoácidos e outros compostos. Embora um método biossintético para um dado aminoácido não natural particular, possa não existir naturalmente, inclusive, sem limitação, numa célula, os métodos e composições aqui descritos proporcionam tais métodos, Por exemplo, passos biossintéticos para os aminoácidos não naturais podem ser gerados na célula hospedeira por adição de novas enzimas ou modificação dos passos de célula hospedeira existente. Novas enzimas adicionais incluem enzimas de ocorrência natural, ou enzimas artificialmente envolvidas. Por exemplo, a biossíntese de para-aminofenilalanina (como apresentado no exemplo em WO 2002/085923 intitulado "In vivo incorporation of unnatural amino acids") confia na adição de uma combinação de enzimas conhecidas de outros organismos. Os genes para estas enzimas podem ser introduzidos em uma célula eucariótica por transformação da célula com um plasmídeo compreendendo os genes. Os genes, quando expressos na célula, fornecem um passo enzimático para a síntese do composto desejado. Exemplos dos tipos de enzimas que são opcionalmente acrescentadas são dados nos exemplos abaixo. Encontram-se sequências de enzimas adicionais, por exemplo, no GenBank. As enzimas artificialmente criadas são também opcionalmente adicionadas em uma célula do mesmo modo. Deste modo são manipulados a maquinaria celular e os recursos de uma célula para a produção de aminoácidos não naturais.
[00358]Uma variedade de métodos está disponível para a produção de enzimas inéditas para uso nos trajetos biossintéticos ou para a criação de trajetos existentes. A recombinação recorrente, por exemplo, inclusive, sem limitação, conforme a desenvolvida por Maxygen, Inc. (disponível no World Wide Web no site maxygen.com) é usada opcionalmente para o desenvolvimento de enzimas e trajetos inéditos. Veja, por exemplo, Stemmer (1994), Rapid evolution of a protein in vitro by DNA shuffling,Nature 370(4):389-391; e, Stemmer, (1994), DNA shuffling by random fragmentation and reassembly: In vitro recombination for molecular evolution, Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 91: 10747-10751. De modo análogo DesignPathTM, desenvolvido por Genencor (disponível no World Wide Web no site genencor.com) é opcionalmente usado para a construção de trajetos metabólicos, inclusive, sem limitação, para a construção de um trajeto para criar O-metil-L-tirosina em uma célula. Esta tecnologia reconstrói trajetos existentes em organismos hospedeiros usando uma combinação de genes novos, inclusive, sem limitação, identificados através de genômica funcional, e evolução e projeto molecular. Diversa Corporation (disponível no World Wide Web no site diversa.com) também propõe tecnologia para uma rápida seleção das bibliotecas de genes e passos de genes, inclusive, sem limitação, para criar novos passos para produção eficiente biossintética dos aminoácidos não naturais.
[00359]Tipicamente, os aminoácidos não naturais produzidos com um passo biossintético como aqui descrito, é produzido em uma concentração suficiente para a biossíntese eficiente da proteína, inclusive, sem limitação, uma quantidade celular natural, mas não a um tal ponto que afete a concentração dos demais aminoácidos ou esgotar os recursos celulares. As concentrações típicas produzidas in vivo deste modo são de aproximadamente 10 mM a aproximadamente 0,05 mM. Quando uma célula é transformada com um plasmídeo que compreende os genes usados para produzir as enzimas desejadas para um trajeto específico e é gerado um aminoácido não natural, seleções in vivo são opcionalmente usadas para otimizar ainda mais a produção do aminoácido não natural tanto para a síntese da proteína ribossomal como para o crescimento celular.
F. Metodologia Sintética Adicional
[00360]Os aminoácidos não naturais aqui descritos podem ser sintetizados usando metodologias descritas na técnica ou por uso das técnicas aqui descritas ou por uma combinação destas. Como um auxílio, a tabela a seguir proporciona vários eletrófilos de partida e nucleófilos que podem ser combinados para criar um desejado grupo funcional. A informação providenciada visa ser ilustrativa e não limitante das técnicas sintéticas aqui descritas. Tabela 1: Exemplos de Ligações Covalentes e Precursores Desta
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[00361]Em geral, eletrófilos de carbono são suscetíveis de atacar por nucleófilos complementares, incluindo nucleófilos de carbono onde um ataque por nucleófilo traz um par de elétrons ao eletrófilo carbono de modo a formar uma nova ponte entre o nucleófilo e o eletrófilo de carbono.
[00362]Exemplos não limitantes de nucleófilos de carbono incluem, sem limitação, reagentes de alquila, alquenila, arila e alquinila de Grignard, organo-lítio, organo-zinco, alquil-, alquenila, aril- e alquinil-estanho (organo-estananos), reagentes alquil-, alquenil-, aril- e alquinil-borano (organo-boranos e organo- boronatos); esses nucleófilos de carbono têm a vantagem de serem cineticamente estáveis em água ou solventes orgânicos polares. Outros exemplos não limitantes de nucleófilos de carbono incluem reagentes ilidas, enol e enolato de fósforo, esses nucleófilos de carbono possuem a vantagem de serem relativamente fáceis de serem gerados dos precursores do conhecimento da técnica da química orgânica sintética. Nucleófilos de carbono, quando empregados em conjunto com eletrófilos de carbono, engendram novas pontes carbono-carbono entre o nucleófilo de carbono e eletrófilo de carbono.
[00363]Exemplos sem limitação, de nucleófilos que não de carbono adequados para acoplamento a eletrófilos de carbono incluem, sem limitação, aminas primárias e secundárias, tióis, tiolatos, e tioéteres, álcoois, alcóxidos, azidas, semicarbazidas e similar. Esses nucleófilos que não de carbono, quando empregados em conjunto com eletrófilos de carbono, tipicamente geral ligações de heteroátomo (C-X-C) onde o X é um heteroátomo, incluindo, sem limitação, oxigênio, enxofre ou nitrogênio.
VI . Polipeptídeos com Aminoácidos não naturais
[00364]Por conveniência, a forma, propriedades e outras características dos compostos aqui descritos foram descritas genericamente e/ou com exemplos específicos. Contudo, a forma, propriedades e outras características descritas neste parágrafo, não devem ser limitadas apenas às descrições genéricas ou exemplos específicos fornecidos neste parágrafo, ao invés, a forma, propriedades e outras características descritos neste parágrafo, aplicam-se igualmente bem a todos os compostos que se enquadrem no escopo das Fórmulas I-XVIII, XXX-XXXIV (A&B) e XXXX-XXXXIII, incluindo quaisquer sub-fórmulas ou compostos específicos que se enquadrem no escopo das Fórmulas I-XVIII, XXX-IIIIV (A & B), e XXXX-XXXXIII descritas no relatório descritivo, reivindicações e desenhos.
[00365]As composições e métodos aqui descritos propiciam a incorporação der pelo menos um aminoácido não natural a um polipeptídeo. O aminoácido não natural pode estar presente em qualquer local no polipeptídeo, incluindo qualquer posição terminal ou posição interna do polipeptídeo. Preferivelmente. o aminoácido não natural não destrói a atividade e/ou estrutura terciária do polipeptídeo em relação ao polipeptídeo de aminoácido de ocorrência natural homólogo, a menos que tal destruição da atividade e/ou estrutura terciária do aminoácido não natural ao polipeptídeo possa modificar em algum grau a atividade (por exemplo, manipulação da eficácia terapêutica do polipeptídeo, melhora do perfil de segurança do polipeptídeo, ajuste das farmacocinéticas, farmacologias, e ou farmacodinâmica do polipeptídeo (por exemplo, aumentando a solubilidade em água, biodisponibilidade, aumentando à meia-vida sérica, aumentando a meia-vida terapêutica, modulação da imunogenicidade, modulação da atividade biológica, ou prolongamento do tempo de circulação), proporcionando funcionalidade adicional ao polipeptídeo, incorporando um identificador, rótulo ou sinal detectável ao polipeptídeo, facilitando as propriedades de isolamento do polipeptídeo, e qualquer combinação das modificações supracitadas) e/ou estrutura terciária do polipeptídeo em relação ao polipeptídeo de aminoácido de ocorrência natural homólogo sem ocasionar completa destruição da atividade e/ou estrutura terciárias. Tais modificações da atividade e/ou estrutura terciária são freqüentemente um dos objetivos de se realizar tais incorporações, embora a incorporação do aminoácido não natural ao polipeptídeo também possa ter pouco efeito sobre a atividade e/ou estrutura terciária do polipeptídeo em relação ao pólo de aminoácido de ocorrência natural homólogo. Em correspondência, os polipeptídeos de aminoácido não natural, composições compreendendo os polipeptídeos de aminoácido não natural, métodos para preparação de tais polipeptídeos e composições polipeptídicas, métodos para purificação, isolamento e caracterização de tais polipeptídeos e composições polipeptídicas e métodos para emprego de tais polipeptídeos e composições polipeptídicas são considerados enquadrados no escopo da presente descrição. Adicionalmente, os polipeptídeos de aminoácido não natural aqui descritos também podem ser ligados a um outro polipeptídeo (incluindo a guisa de exemplo, um polipeptídeo de aminoácido não natural ou um polipeptídeo de aminoácido de ocorrência natural).
[00366]Os polipeptídeos de aminoácido não natural aqui descritos podem ser produzidos por via biossintética ou não biossintética. Por biossintética significa qualquer método que utiliza um sistema de tradução (celular ou não celular), inclusive o uso de pelo menos um dos seguintes componentes: um polinucleotídeo, um códon, um tRNA e um ribossomo. Por via não biossintética significa qualquer método que não utiliza um sistema de tradução: esta abordagem pode ainda se dividida em métodos que utilizam métodos sintéticos de peptídeo no estado sólido, métodos sintéticos de peptídeo de fase sólida, métodos que utilizam pelo menos uma enzima, e métodos que não utilizam pelo menos uma enzima; além do que, quaisquer destas subdivisões podem superar-se e muitos métodos podem utilizar uma combinação dessas subdivisões.
[00367]Os métodos, composições, estratégias e técnicas aqui descritas não estão limitadas a um tipo, classe ou família particular dos polipeptídeos ou proteínas. De fato, virtualmente, qualquer polipeptídeo pode incluir pelo menos um aminoácido não natural aqui descrito. A guisa de exemplo apenas, o polipeptídeo pode ser homólogo a uma proteína terapêutica, selecionada do grupo consistindo de : alfa-1, antitripsina, angiostatina, fator anti-hemolítico, anticorpo, fragmento de anticorpo, apoliproteína, apoproteína, fator natriurético atrial, polipeptídeo natriurético atrial, peptídeo atrial, C-X-C quimiocina, T39765, NAP-2, ENA-78, gro-a, gro-b, gro-c, IP- 10, GCP-2, NAP-4, SDF-1, PF4, MIG, calcitonina, ligante c-kit, citocina, CC quimiocina, proteína 1- quimioatrativa de monócito, proteína-2 quimioatrativa de monócito, proteína 3 quimioatrativa de monócito, proteína-1 alfa inflamatória de monócito, proteína beta inflamatória de monócito, RANTES, 1309, R83915, R91733, HCC1, T58847, D31065, T64262, CD40, ligante CD40, ligante c-kit, colágeno, fator estimulante de colônia (CSF), fator 5a complementar, inibidor complementar, receptor 1 complementar, citocina, peptídeo 78 ativador de neutrófilo epitelial, MIP- 16, MCP-1, fator de crescimento epidérmico (EGF), peptídeo ativador de neutrófilo epitelial, eritropoietina (EPO), toxina esfoliante, Fator IX, Fator VII, Fator VIII, Fator X, fator de crescimento de fibroblasto (FGF), fibrinogênio, fibronectina, proteína de feixe de quatro hélices, G-CSF, glp-1, GM-CSF, glicocerebrosidase, gonadotropina, fator de crescimento, receptor do fator de crescimento, grf, proteína de ouriço, hemoglobina, fator de crescimento de hepatócito (hGF), hirudina, hormônio do crescimento humano (hGH), albumina sérica humana, ICAM-1, receptor de ICAM-1, LFA-1, receptor de LFA-1, insulina, fator de crescimento semelhante à insulina (IGF), IGF-I, IGF-II, interferon (IFN), IFN-alfa, IFN-beta, IFN-gama, interleucina, (IL, IL-1, IL- 2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, fator de crescimento de ceratinócito (KGF), lactoferrina, fator inibidor de leucemia, luciferase, neurturina, fator inibidor de neutrófilo (NIF), oncostatina M, proteína osteogênica, produto oncogênico, paracitonina, hormônio da paratireóide , PD-ECSF, PDGF, hormônio peptídico, pleiotropina, proteína A, proteína G, pth, exotoxina A pirogênica, exotoxina B pirogênica, exotoxina C pirogênica, pyy, relaxina, renina, SCF, proteína biossintética pequena, receptor I de complemento solúvel, I-CAM 1 solúvel, receptor de interleucina solúvel, receptor de TNF solúvel, somatomedina, somatostatina, somatotropina, super-antígenos de estreptoquinase, enterotoxina estafilocócica, SEA, SEB, SEC1, SEC2, SEC3, SED, SEE receptor do hormônio esteróide, superóxido dismutase, toxina da síndrome do choque tóxico, alfa 1 timosina, ativador plasminogênico de tecido, fator de crescimento de tumor (TGF), fator de necrose de tumor, fator alfa de necrose de tumor, fator beta de necrose de tumor, receptor do fator de necrose de tumor (TNFR), proteína VLA-4, proteína VCAM-1, fator de crescimento endotelial vascular (VEGF), uroquinase, mos, ras, faf, met, p53, tat, fos, myc, jun, myb, rel, receptor de estrogênio, receptor de progesterona, receptor de testosterona, receptor de aldosterona, receptor de LDL e corticosterona. Numa modalidade adicional ou relacionada, o polipeptídeo de aminoácido não natural pode também ser homólogo a qualquer membro de polipeptídeo da família de supergenes do hormônio do crescimento.
[00368]Os polipeptídeos de aminoácido não natural podem ser ainda modificados conforme descrito, algures neste relatório, ou o polipeptídeo de aminoácido não natural podem ser usados sem mais modificação. A incorporação de um aminoácido não natural a u polipeptídeo pode ser feita por uma série de finalidades, incluindo sem limitação a alterações de adequação, na estrutura protéica, e/ou função, alteração do tamanho, acidez, nucleofilicidade, ligação a hidrogênio, hidrofobicidade, acessibilidade dos sítios da protease alvo, tendo em vista uma fração (incluindo, sem limitação, a um arranjo polipeptídico). Os polipeptídeos que incluem um aminoácido não natural podem ter propriedades catalíticas, propriedades biofísicas incrementadas ou totalmente novas. A guisa de exemplo apenas, as seguintes propriedades podem ser modificadas por inclusão de um aminoácido não natural a um polipeptídeo: toxicidade, biodistribuição, propriedades estruturais, propriedades espectroscópicas, propriedades químicas e/ou fotoquímicas, atividade catalítica, meia-vida (incluindo, sem limitação, meia vida sérica) capacidade de reagir com outras moléculas, tal como, covalentemente ou não covalentemente, e similar. As composições com polipeptídeo incluindo pelo menos um aminoácido não natural são úteis para, sem limitação, novos terapêuticos, diagnósticos, enzimas catalíticas, enzimas industriais, proteínas de ligação (incluindo, sem limitação, anticorpos), e pesquisa incluindo, sem limitação, ao teste de estrutura de proteínas e função. Ver, por exemplo, Dougherty (2000) Unnatural Amino Acids s Probes of Protein Structure and Funcion,Current Opinion in Chemical Biology, 4:645-652.
[00369]Além disso, a cadeia lateral do(s) cote(s) de aminoácido não natural de um polipeptídeo pode fornece uma faixa ampla de funcionalidade adicional ao polipeptídeo, a guisa de exemplo apenas e não como limitação, a cadeia lateral da parte do aminoácido não natural de um polipeptídeo pode incluir quaisquer dos seguintes: um rótulo, um corante; um polímero; um polímero hidrossolúvel; um derivado de polietileno glicol; um foto-reticulador; um composto citotóxico; uma droga; um rótulo de afinidade; um rótulo de foto-afinidade; um composto reativo; uma resina; uma segunda proteína ou polipeptídeo ou análogo de polipeptídeo; um anticorpo ou fragmento de anticorpo; um quelante de metal; um co-fator; um ácido graxo; um carboidrato; um polinucleotídeo; um DNA; um RNA; um polinucleotídeo anti-sentido; um sacarídeo; um dendrímero hidrossolúvel; uma ciclodextrina; um biomaterial; uma nanopartícula; um rótulo de spin; um fluoróforo; uma fração contendo metal; uma fração radioativa; um grupo funcional inédito; um grupo que interage por covalência ou por não covalência com outras moléculas; uma fração foto-aprisionada; uma fração excitável por radiação actínica, um ligante, uma fração fotoisomerizável; biotina; um análogo de biotina; uma fração que incorpora um átomo pesado; um grupo quimicamente clivável; um grupo fotoclivável; uma cadeia lateral alongada; um açúcar ligado a carbono; um agente redox-ativo; um amino tioácido; uma fração tóxica; uma fração isotopicamente rotulada; uma sonda biofísica; um grupo fosforescente; um grupo quimioluminescente; um grupo com densidade de elétrons; um grupo magnético; um grupo intercalado; um cromóforo; um agente de transferência de energia; um agente biologicamente ativo, um rótulo detectável; uma molécula pequena; um ácido ribonucléico inibidor, um radionucleotídeo; um agente capturador de nêutrons, um derivado de biotina; ponto(s) quântico(s); um nanotransmissor; um radiotransmissor, uma abzima, um ativador de complexo ativado, um vírus, um adjuvante, um aglican, um alergan, uma angiostatina, um anti-hormônio, um antioxidante, um aptâmero, um RNA orientador, uma saponina, um vetor bilateral, uma macromolécula, um mimótopo, um receptor, uma micela inversa, e quaisquer combinações dos acima.
[00370]Em um aspecto uma composição inclui pelo menos um polipeptídeo, com pelo menos um, incluindo, sem limitação, pelo menos dois, pelo menos três, pelo menos quatro, pelo menos cinco, pelo menos seis, pelo menos sete, pelo menos oito, pelo menos nove, ou dez ou mais aminoácidos não naturais. Os aminoácidos não naturais podem ser iguais ou diferentes, por exemplo, podem existir 1, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, ou mais sítios diferentes no polipeptídeo que compreende 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 ou mais diferentes ou os mesmos aminoácidos não naturais. Em algumas modalidades uma composição inclui um polipeptídeo com pelo menos um, porém pouco menos que todos, de um dado aminoácido presente no polipeptídeo substituído com um aminoácido não natural. Para um dado polipeptídeo, com mais de um aminoácido não natural, os aminoácidos não naturais podem ser iguais ou diferentes (tal como a guisa de exemplo, apenas, o polipeptídeo pode incluir dois ou mais polipeptídeos de aminoácidos não naturais, ou pode incluir dois dos mesmos aminoácidos não naturais). Para um dado polipeptídeo com mais de dois aminoácidos não naturais, os aminoácidos não naturais podem ser iguais, diferentes ou uma combinação de uma série de aminoácidos não naturais da mesma espécie com pelo menos um aminoácido não natural diferente.
[00371]Embora as modalidades dos polipeptídeos de aminoácido não natural aqui descritas possam ser quimicamente sintetizadas via métodos de síntese peptídica em fase sólida (tal como a guisa de exemplo, numa resina sólida), por métodos de síntese peptídica de fase em solução, e/ou sem auxílio de enzimas, outras modalidades dos polipeptídeos de aminoácido não natural aqui descrias permitem a síntese via membrana celular, extração celular ou sistema de lisado ou via um sistema in vivo, tal como por exemplo, uso doe maquinário celular de uma célula procariótica ou eucariótica. Numa outra modalidade ou modalidade adicional um dos aspectos chave dos polipeptídeos de aminoácido não natural aqui descritos é que eles podem ser sintetizados usando ribossomos. Em modalidades adicionais ou ulteriores dos polipeptídeos de aminoácido não natural aqui descritos estão, polipeptídeos de aminoácido não natural sintetizados por uma combinação dos métodos, incluindo sem limitação a uma combinação das resinas sólidas, sem auxílio de enzimas, via adição de ribossomos, e/ou via um sistema in vivo.
[00372]A síntese dos polipeptídeos de aminoácido não natural via ribossomaos e/ou um sistema in vivo possui vantagens distintas e característica de um polipeptídeo de aminoácido não natural sintetizado numa resina sólida ou sem ajuda de enzimas. Essas vantagens ou características incluem diferentes perfis de impureza: um sistema utilizando ribossomos e/ou sistema in vivoterá impurezas vaporizadas do sistema biológico utilizado, incluindo proteínas da célula hospedeira, partes de membrana, e lipídios, enquanto o perfil de impureza de um sistema que utiliza uma resina sólida e/ou sem auxílio de enzimas pode incluir solventes orgânicos, grupos de proteção, materiais de resina, reagentes de acoplamento e outros químicos usados nos procedimentos sintéticos. Além disso, o padrão isotópico do polipeptídeo de aminoácido não natural sintetizado via ouso de ribossomos e/ou sistema in vivo pode espelhar-se no padrão isotópico do material de estoque utilizado para as células; por outro lado, o padrão isotópico do polipeptídeo de aminoácido não natural sintetizado numa resina sólida e/ou sem auxílio de enzimas pode espelhar-se no padrão isotópico dos aminoácidos utilizados na síntese. Além disso, o aminoácido não natural sintetizado via ouso de ribossomos e/ou sistema in vivo pode ser substancialmente isento de isômeros-D dos aminoácidos e/ou pode ser capaz de incorporar prontamente aminoácidos cisteína internos para a estrutura do polipeptídeo, e/ou pode proporcionar, raramente, polipeptídeos de deleção de aminoácidos internos. Por outro lado, um polipeptídeo de aminoácido não natural sintetizado via uma resina sólida e/ou sem emprego de enzimas pode ter um maior teor de isômeros-D dos aminoácidos e/ou um menor conteúdo de aminoácidos cisteína internos e/ou uma maior percentagem de polipeptídeos de deleção de aminoácido internos. Adicionalmente, o perito na técnica será capaz de diferenciar um polipeptídeo de aminoácido não natural sintetizado mediante uso de um ribossomo e/ou um sistema in vivo de um polipeptídeo de aminoácido não natural sintetizado via uma resina sólida e/ou sem emprego de enzimas.
VII - Composições e Métodos Compreendendo Ácidos nucléicos e Oligonucleotídeos A. Métodos Recombinantes Gerais de Ácido nucléico para Emprego no Presente
[00373]Em numerosas modalidades dos me'todos e composições aqui descritos, os ácidos nucléicos que codificam um polipeptídeo de interesse(incluindo, a guisa de exemplo, um polipeptídeo GH) serão isolados, clonados e freqüentemente alterados usando-se métodos recombinantes. Tais modalidades são usadas, inclusive, sem limitação, para a expressão da proteína ou durante a geração de variantes, derivados, cassetes de expressão, ou de outras sequências derivadas de um polipeptídeo. Em algumas modalidades, as sequências que codificam os polipeptídeos da invenção são ligadas operativamente a um promotor heterólogo.
[00374]Uma seqüência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo compreendendo um aminoácido não natural pode ser sintetizada com base na seqüência de aminoácido do polipeptídeo original, alterando então a seqüência de nucleotídeos de modo a efetuar a introdução (isto é, a incorporação ou substituição) ou remoção (isto é, deleção ou substituição) do(s) resíduo(s) de aminoácidos relevantes. A seqüência de nucleotídeos pode ser convenientemente modificada por mutagênese direcionada ao sítio de acordo com métodos convencionais. Alternativamente, a seqüência de nucleotídeos pode ser preparada por síntese química, inclusive, sem limitação, empregando-se um sintetizador de oligonucleotídeo, sendo os oligonucleotídeos projetados com base na seqüência de aminoácidos do polipeptídeo desejado, e selecionando-se, de preferência, aqueles códons que são favorecidos na célula hospedeira em que o polipeptídeo recombinante será produzido. Diversos oligonucleotídeos pequenos que codificam partes do polipeptídeo desejado, por exemplo, podem ser sintetizados e montados por PCR, ligação ou reação em cadeia de ligação. Veja, por exemplo, Barany, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 88: 189-193 (1991); Patente U.S. No 6.521.427 que são incorporados ao presente documento a título de referência.
[00375]Os métodos de aminoácido não natural e composições aqui descritas utilizam técnicas de rotina no campo da genética recombinante. Textos básicos apresentando os métodos gerais para uso dos métodos e composições de aminoácidos não naturais incluem Sambrook et la., Molecular cloning, A Laboratory Manual (3a. ed. 2001); Kriegler, Gene transfer and Expression: A Laboratory Manual (19990); e Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., eds. 1994).
[00376]Textos gerais que descrevem as técnicas de biologia molecular incluem Berger and Kimmel, Guide to Molecular Cloning Techiques, Methods in Enzymology volume 152 Academic Press, Inc. San Diego, CA (Berger); Sambrook et al., Molecular Cloning - A Laboratory Manual (2a. Ed.), vol. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, 1989 ("Sambrook") e Current Protocols in Molecular Biology, F. M. Ausubel et al., eds. Current Protocols um empreendimento associado entre Greene Publishing Associates, Inc and John Wiley & Sons, Ind., (suplementado em 1999) ("Ausubel")). esses textos descrevem a mutagênese, o uso de vetores, promotores e muitos outros tópicos relevantes relacionados à, inclusive, sem limitação, a geração de genes ou polinucleotídeo que incluem códons de seleção para produção de proteínas incluindo os aminoácidos não naturais tRNAs ortogonais, sintetases ortogonais e pares dos mesmos.
[00377]Vários tipos de mutagênese são usados nos métodos e composições de aminoácido não natural presentes para uma série de finalidades, incluindo, sem limitação, produção de novas sintetases de tRNAs, para mutação de moléculas de tRNA, para mutação de polinucleotídeo codificando sintetases, bibliotecas de tRNAs, na produção de bibliotecas de sintetases, para produzir códons de seleção, para inserção de códons seletores que codificam aminoácidos não naturais numa proteína ou polipeptídeo de interesse. Eles incluem, sem limitação, mutagênese direcionada ao sítio, mutagênese por ponto aleatório, recombinação homóloga, "shuffling" de DNA ou outros métodos de mutagênese iterativos, construção quimérica, mutagênese que utiliza matrizes contendo uracila, mutagênese direcionada a oligonucleotídeo, mutagênese de DNA modificada por fosforotioato, mutagênese usando DNA duplex com intervalo ou similar, ou quaisquer combinações destes. Métodos adicionais adequados incluem ajuste de combinação inadequada de ponto, mutagênese usando cepas hospedeiras deficientes de reparo, seleção por restrição, e purificação por restrição, mutagênese de deleção, mutagênese por síntese genética total, reparo de rompimento de fita dupla, e similar. Mutagêneses, que inclui, sem limitação, e que envolve construtores quiméricos também estão incluídas nos métodos e composições de aminoácidos não naturais aqui descritos. Numa modalidade a mutagênese pode ser orientada por informação conhecida da molécula de ocorrência natural ou molécula de ocorrência naturalmente alterada ou mutacionada, incluindo, sem limitação, comparações de seqüência, propriedades físicas estrutura de cristal e similar.
[00378]Os textos e exemplos aqui vistos descrevem esses e outros procedimentos relevantes. Informação adicional pode ser vista nas seguintes publicações e referências aqui citadas: Ling et al., Approaches to DNA mutagenesis an overview, Anal Biochem. 254(2): 157-178 (1997); Dale et al., Oligonucleotide- directed random mutagenesis using the phosphorothioate method, Methods MoI. Biol. 57:369-374 (1996); Smith, In vitro mutagenesis, Ann. Rev. Genet. 19:423- 462(1985); Botstein & Shortle, Strategies and applications of in vitro mutagenesis, Science 229:1193-1201(1985); Carter, Site-directed mutagenesis, Biochem. J. 237:1-7 (1986); Kunkel, The efficiency of oligonucleotide directed mutagenesis, in Nucleic Acids & Molecular Biology (Eckstein, F. and Lilley, D.MJ. eds., Springer Verlag, Berlin)) (1987); Kunkel, Rapid and efficient site-specific mutagenesis without phenotypic selection, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:488-492 (1985); Kunkel et al., Rapid and efficient site-specific mutagenesis without phenotypic selection, Methods in Enzymol. 154, 367-382 (1987); Bass et al., Mutant Trp repressors with new DNA- binding specificities, Science 242:240-245 (1988); Methods in Enzymol. 100: 468500 (1983); Methods in Enzymol. 154: 329-350 (1987); Zoller & Smith, Oligonucleotide-directed mutagenesis using Ml 3-derived vectors: an efficient and general procedure for the production of point mutations in any DNA fragment, Nucleic Acids Res. 10:6487-6500 (1982); Zoller & Smith, Oligonucleotide-directed mutagenesis of DNA fragments clotted into M13 vectors, Methods in Enzymol. 100:468-500 (1983); Zoller & Smith, Oligonucleotide- directed mutagenesis: a simple method using two oligonucleotide primers and a single-stranded DNA template, Methods in Enzymol. 154:329-350 (1987); Taylor et al., The use of phosphorothioate- modified DNA in restriction enzyme reactions to prepare nicked DNA, Nucl. Acids Res. 13: 8749-8764 (1985); Taylor et al., The rapid generation of oligonucleotide- directed mutations at high frequency using phosphorothioate-modified DNA, Nucl. Acids Res. 13: 8765-8785 (1985); Nakamaye & Eckstein, Inhibition of restriction endonuclease Nd I cleavage by phosphorothioate groups and its application to oligonucleotide-directed mutagenesis, Nucl. Acids Res. 14: 9679- 9698 (1986); Sayers et al., 5'-3'Exonucleases in phosphorothioate-based oligonucleotide-directed mutagenesis, Nucl. Acids Res. 16:791-802 (1988); Sayers et al., Strand specific cleavage of phosphorothioate-containing DNA by reaction with restriction endonucleases in the presence ofethidium bromide, (1988) Nucl. Acids Res. 16: 803-814; Kramer et al., The gapped duplex DNA approach to oligonucleotide-directed mutation construction, Nucl. Acids Res. 12: 9441-9456 (1984); Kramer & Fritz Oligonucleotide-directed construction of mutations via gapped duplex DNA, Methods in Enzymol. 154:350-367 (1987); Kramer et al., Improved enzymatic in vitro reactions in the gapped duplex DNA approach to oligonucleotide-directed construction of mutations, Nucl. Acids Res. 16: 7207 (1988); Fritz et al., Oligonucleotide-directed construction of mutations: a gapped duplex DNA procedure without enzymatic reactions in vitro, Nucl. Acids Res. 16: 6987-6999 (1988); Kramer et al., Point Mismatch Repair, Cell 38:879-887 (1984); Carter et al., Improved oligonucleotide site-directed mutagenesis using M13 vectors, Nucl. Acids Res. 13: 4431-4443 (1985); Carter, Improved oligonucleotide-directed mutagenesis using Ml 3 vectors, Methods in Enzymol. 154: 382-403 (1987); Eghtedarzadeh & Henikoff, Use of oligonucleotides to generate large deletions, Nucl. Acids Res. 14: 5115 (1986); Wells et al., Importance of hydrogen-bond formation in stabilizing the transition state of subtilisin, Phil. Trans. R. Soc. Lond. A 317: 415-423 (1986); Nambiar et al., Total synthesis and cloning of a gene coding for the ribonuclease S protein, Science 223: 1299-1301 (1984); Sakmar and Khorana, Total synthesis and expression of a gene for the a-subunit of bovine rod outer segment guanine nucleotide-binding protein (transducin), Nucl. Acids Res. 14: 6361-6372 (1988); Wells et al., Cassette mutagenesis: an efficient method for generation of multiple mutations at defined sites, Gene 34:315-323 (1985); Grundstr[omicron]m et al., Oligonucleotide-directed mutagenesis by microscale 'shot-gun' gene synthesis, Nucl. Acids Res. 13: 33053316 (1985); Mandecki, Oligonucleotide-directed double-strand break repair in plasmids of Escherichia coli: a method for site-specific mutagenesis, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83:7177-7181 (1986); Arnold, Protein engineering for unusual environments, Current Opinion in Biotechnology 4:450-455 (1993); Sieber, et al., Nature Biotechnology, 19:456- 460 (2001). W. P. C. Stemmer, Nature 370, 389-91 (1994); and, I. A. Lorimer, I. Pastan, Nucleic Acids Res. 23, 3067-8 (1995).
[00379]Detalhes adicionais de quantos de tais métodos podem ser encontrados em Methods in Enzymology Volume 154, que também descreve controles úteis para desarranjos com vários métodos de mutagênese.
[00380]Os métodos e composições aqui descritos também incluem o uso de células hospedeiras eucarióticas, células hospedeiras não eucarióticas e organismos para incorporação in vivo de um aminoácido não natural via pares tRNA/Rs ortogonais. Células hospedeiras são geneticamente construídas, (incluindo, sem limitação, transformadas, traduzidas ou transfectadas) com os polinucleotídeos correspondentes aos polipeptídeos aqui descritos ou construtores, que incluem u polinucleotídeo correspondente aos polipeptídeos incluindo, um vetor correspondente aos polipeptídeos descritos que podem ser, por exemplo, um vetor de clonagem ou um vetor de expressão. Por exemplo, as regiões de codificação para o tRNA ortogonal, o tRNA sintetase ortogonal, e a proteína para derivatização são operavelmente ligados aos elementos de controle de expressão genética, que são funcionais na célula hospedeira desejada.
[00381]O vetor pode estar, por exemplo, na forma de um plasmídeo, cosmídeo um bacteriófago, uma bactéria, um vírus, um polinucleotídeo nu, ou um polinucleotídeo conjugado. Os vetores são introduzidos nas células e/ou microorganismos por métodos padrão incluindo eletroporação (Fromm et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 82, 5824 (1985)) infecção por vetores virais, penetração balística de alta velocidade por partículas pequenas com ácido nucléico seja dentro da matriz de nanopartículas ou partículas ou na superfície (Klein et al., Nature 327, 70-73 (1987) e/ou similar.
[00382]As células hospedeiras construídas podem ser cultivadas num meio com nutriente convencional modificado, conforme o caso para tais atividades, como por exemplo, etapas de seleção, promotores de ativação ou transformantes de seleção. Essas células podem ser, opcionalmente, cultivadas em organismos transgênicos. Outras referências úteis, incluindo, sem limitação, para isolamento de célula e cultura (por exemplo, para subseqüente isolamento de ácido nucléico) incluem Freshney (1994), Culture of Animal Cells, a Manual of Basic Technique, 3a. edição, Wiley-Liss, New York e as referencia aí citadas; Payne et al. (1992) Plant Cell and Tissue Culture in Liquid Systems john Wiley & Sons, Inc. New York, NY; Gamborg and Phillips (eds) (1995) Plant Cell, Tissue and Organ Culture; Fundamental Methods Springer Lab Manual, Springer-Verlag (Berlin Heidelberg New York) and Atlas and Parks (eds) The Handbook of Microbiological Media (1993) CRC Press, Boca Raton, FL.
[00383]Vários métodos conhecidos para introdução de introdução de ácidos nucléicos estão disponíveis, quaisquer podendo ser usados nos métodos e composições aqui descritos. Estes incluem fusão das células recipientes com protoplastos bacterianos contendo o DNA, eletroporação, bombardeamento de projétil, e infecção com vetores virais (aqui debatidos mais tarde) etc. As células bacterianas podem ser usadas para ampliar o número de construtores de Dna contendo plasmídeo correspondendo aos polipeptídeos aqui descritos. As bactérias são crescidas em fase de log e os plasmídeos dentro das bactérias podem ser isolados por uma série de métodos do conhecimento da técnica (ver, por exemplo, Sambrook). Além disso, uma grande quantidade de kits são comercialmente disponíveis para a purificação dos plasmídeos das bactérias (ver, por exemplo, EasyPrep™, FlexiPrep™, ambas de Pharmacia Biotech; StrataClean™ de Stratageene and QIAprep™ de Quiagen). Os plasmídeos isolados e purificados são então ainda manipulados para produzir outros plasmídeos, usados para transfectar às células ou incorporá-las em vetores relacionados para infectar organismos. Vetores típicos contêm terminadores de transcrição e tradução, sequências de transcrição e iniciação de tradução, e promotores úteis para regulação da expressão dos ácidos nucléicos alvo particulares. Os vetores compreendem, opcionalmente, cassetes de expressão genéricos, contendo pelo menos uma sequência terminal independente, sequências que permitem replicação do cassete em eucariotes, ou procariotes, ou ambos, (incluindo sem limitação, a vetores vai-vem) e marcadores de seleção para, sistemas tanto procarióticos como eucarióticos. Vetores são adequados para replicação e integração em procariotes, eucariotos, ou preferivelmente, ambos. Ver Gillam & Smith, Gene 8:81 (1979); Roberts, et al., Natures, 328:731 (1987); Schneider, E. et al., Protein Expr. Purif. 6(1):10-14 (1995); Ausubel, Sambrook Berger (todos acima), Um catálogo de bactérias e bacteriófagos úteis para clonagem é dado por exemplo, em ATCC por exemplo, The ATCC Catalogue of bactéria and bacteriophage (1992 (Gherna et al, (eds) publicado pela ATCC. Procedimentos básicos adicionados para seqüenciamento, clonagem e outros aspectos da biologia molecular e considerações teóricas subjacentes também são vistas em Watson et al., (1992). Recombinant DNA Second Edition Scientific American Books, NY. Além disso, essencialmente qualquer ácido nucléico (e virtualmente qualquer ácido nucléico rotulado, seja padrão ou não) pode ser ordenado sob medida ou padronizado de quaisquer séries de fontes comerciais, tais como Midland Certified Reagent Company (Midland, TX mcrc.com), The Great American Gene Company (Ramona, CA disponível na World Wide Web em genco.com) ExpressGen Inc. (Chicago, IL, disponível em WWW como expressgen.com)., Operon Technologies Inc. (Alameda, CA) e muitos outros).
B. Códons de Seleção
[00384]Códons de seleção abragios nos métodos e composições aqui descritos expandem o quadro de códon genético de maquinário biossintético de proteína. Por exemplo, um códon de seleção inclui, sem limitação, a um único códon de três bases, um códon sem sentido, tal como códon de parada, incluindo, sem limitação, a um códon âmbar (UAG) ou um códon opala (UGA), um códon não natural um códon de quatro ou mais base, um códon raro ou similar. Existe uma ampla faixa no número de códons de seleção que podem ser introduzidos ao gene desejado ou polinucleotídeo, incluindo sem limitação, a um ou mais, dois ou mais, mais de três, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais num único polinucleotídeo codificando pelo menos uma parte de um polipeptídeo de interesse.
[00385]Numa modalidade, os métodos envolvem o uso doe um códon de seleção que é um códon de parada para incorporação de um ou mais aminoácidos não naturais in vivo. Por exemplo, um O-tRNA é produzido reconhecendo o códon de parada, incluindo sem limitação, UAG e é aminoacilado por um O-RS com um desejado aminoácido não natural. Este O-tRNa não é reconhecido pelos amnoacil- tRNA sintetases de hospedeiros de ocorrência natural. Mutagênese direcionada ao sítio convencional pode ser usada para introduzir o códon de parada, incluindo, sem limitação, UAG, no sítio de interesse num polipeptídeo de interesse. Ver, por exemplo, Sayer, J.R., et al., (1988), 5', 3' Exonuclease in phosphorothioate-bases oligonucleotide-directed mutagenesis Nucleic Acid Res, 16(3):791-802. Quando o O-RS, O-tRNA e o ácido nucléico que codifica o polipeptídeo de interesse são combinados in vivo, o aminoácido não natural é incorporado em resposta ao códon UAG para conferir um polipeptídeo contendo o aminoácido não natural na posição específica.
[00386]A incorporação dos aminoácidos não naturais in vivo pode ser feita sem perturbação significativa da célula hospedeira eucariótica. Por exemplo, devido à eficiência de supressão para o códon UAG depender da competição entre o O- trNa, incluindo sem limitação, ao tRNA supressor âmbar, e um fator de liberação eucariótico (incluindo, sem limitação, a eRF) que se liga a um códon de parada e inicia a liberação do peptídeo de crescimento do ribossomo), a eficiência de supressão pode ser modulada por, incluindo, sem limitação, ao aumento do nível de expressão do O-RNA e/ou do tRNA supressor.
[00387]Códons de seleção também compreendem códons prolongados, incluindo, sem limitação, quatro ou mais códons de base, tal como quatro, cinco, seis ou mais códons de base. Exemplos de quatro códons básicos incluem, sem limitação, AGGA, CUAG, UAGA, CCCU e similar. Exemplos de cinco códons de base incluem, sem limitação, AGGAC, CCCCU, CCCUC, CUAGA, CUACU, UAGGC e similar. Uma característica dos métodos e composições aqui descritos inclui o uso de códons prolongados com base na supressão do desvio de quadro. Quatro ou mais códons de base podem inserir, incluindo, sem limitação, um ou múltiplos aminoácidos não naturais à mesma proteína. Por exemplo, na presença de O-tRNAs mutacionados, incluindo, sem limitação, a um tRNAs supressor de desvio de quadro especial, com laços de anticódon, por exemplo, com pelo menos 8-10 laços anticódon nt, os quatro ou mais códons de base é /são lidos como aminoácido simples. Numa outra modalidade, os laços do anticódon podem decodificar, incluindo, sem limitação, a pelo menos um códon de quatro bases, pelo menos um códon de cinco bases, ou pelo menos um códon de seis bases ou mais. Visto serem possíveis 256 códons de quatro bases, aminoácidos não naturais múltiplos podem ser codificados na mesma célula usando um códon de quatro ou mais bases. Ver, Anderson, et al., (2002) Exploring the Limits of Codon and Anticódon Size, Chemistry and Biology, 9:237-244; Magliery (2001), Expanding the Genetic Code: Seleiton of Efficiente Suppressors of Four-base Codons and Identification of "Shifty"Four-base Codons with a Library Approach in Escherichia coli, J. Mol. Biol. 307:755-769.
[00388]Por exemplo, códons de quatro bases podem ser empregados para incorporar aminoácidos não naturais em proteínas usando métodos biossintéticos in vitro. Ver por exemplo, Ma et al., 1993) Biochemistry, 32:7939-7945; e Hohsaka et al., (1999) J. Am. Chem. Soc, 121:34-40. CGGG e AGGU foram usados para incorporar, ao mesmo tempo 2-naftilalanina e um derivado de NBD de lisina em estreptavidina in vitro com dois tRNAs supressões de desvio de quadro quimicamente acilados. Ver, por exemplo, Hohsaka et al, (1999) J. Am. Chem. Soc. 121:12194-12195. Num teste in vivo, Moore et al, examinou a capacidade dos derivados tRnA Leu com anticódons NCUA em suprimir códons UAGN (N pode ser U, A, G ou C) e, descobriram que, o quadrupleto UAGA pode ser decodificado por um tRNA Leu com um anticódon UCUA, com uma eficiência de 13 a 26% com pouca decodificação no quadro 0 ou -1. Ver Moore et al., (2000). J. Mol. Biol. 298:195-205. Numa modalidade, códons prolongados com base nos códons raros ou códons sem sentido podem ser empregados nos métodos e composições aqui descritos, que reduzem a supressão do desvio de quadro e interpretação imprópria em outros sítios indesejados.
[00389]Para um dado sistema, um códon de seleção também pode incluir um dos três códons básicos naturais, onde o sistema endógeno não utiliza (ou utiliza raramente) o códon de base natura. Por exemplo, isto inclui um sistema que carece de um tRNA que reconhece o códon natural de três bases, e/ou um sistema onde o códon de três bases é um códon raro.
[00390]Códons de seleção incluem, opcionalmente, pares de base não naturais. Esses pares de base não naturais expandem ainda o alfabeto genético existente. Um par de bases extra aumenta o número de códons tripletos de 64 para 125. As propriedades de terceiros pares de base incluem, pareamento de base estável e seletiva, eficiente incorporação enzimática ao DNA com alta fidelidade por uma polimerase, e eficiente prolongamento do iniciador em seguida à síntese do par de bases não natural que se origina. Descrições de pares de base não naturais que podem ser adaptados para os métodos e composições incluem, por exemplo, Hirao et al, (2002). An unnatural base pair for incorporating amino ácido analogues into protein, Nature Biotechnology, 20:177-182 e também Wu, Y., et al, (2002) J. Am. Chem. Soc. 124:14626-14630. Outras publicações relevantes estão aqui descritas.
[00391]Para uso in vivo, o nucleosídeo não natural é membrana permeável e é fosforilado para formar o correspondente trifosfato. Além disso, a informação genética acrescentada é estável e não é destruída por enzimas celulares. Esforços prévios por Benner e outros, obtiveram vantagem de padrões de ligação ao hidrogênio que são diferentes daqueles dos pares de Watson-Crick instituídos, sendo o exemplo mais digno de nota, o par iso-Criso. Ver por exemplo, Switzer et al., (1989). J. Am. Chem. Soc., 111:8322-8322; e Piccirilli et al., (1990) Natures, 343:33-37; Kool, (2000) Curr, Opin. Chem. Biol., 4:602-608. Essas bases em geral combinam inadequadamente em algum grau com as bases naturais e não podem ser replicadas enzimaticamente. Kool e colaboradores, demonstraram, que interações de acondicionamento hidrofóbicas entre as bases pode substituir ligação ao hidrogênio para dirigir a formação do par de bases. Ver, Kool, (2000) Curr. Opin. Chem. Biol., 4:602-608; e Guckian and Kool (1998) Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 36(24): 2825-2520. Num esforço em desenvolver um par de bases não natural que satisfaz todos os requisitos supra, Schultz, Romesbert e colaboradores sintetizaram, sistematicamente, e estudaram uma série de bases hidrofóbicas não naturais. Um auto-par PICS:PICS é visto ser mais estável do que pares de base naturais, e pode ser incorporado, eficientemente, ao DNA por fragmento de Klenow de DNA polimerase I de Escherichia coli (KF). Ver, por exemplo, McMinn et al., 1999) J. Am. Chem. Soc., 121:11585-11586; e Ogawa et al., (2000) J. Am. Chem. Soc. 122:3274-3278. Um alto-par 3MN:3MN pode ser sintetizado por KF com eficiência e seletividade suficientes para função biológica. Ver, por exemplo, Ogawa, et al., (2000) J. Am. Chem.Soc. , 122:8803-8804. Contudo, ambas as bases agem como um terminado de cadeia para mais replicação. Um DNA polimerase mutante foi recentemente transformada que pode ser usada na replicação do auto-par PICS. Além disso, um auto-par 7AI pode ser replicado. Ver, por exemplo, Tae et al., (2001). J. Am. Chem. Soc., 123:7439-7440. Um novo par de metalobase, Dipic:Py, também foi desenvolvido, que forma um par estável com a ligação ao Cu(II). Ver, Meggers et al., (2000) J. Am. Chem. Soc., 122:10714-10715. Devido aos códons estendidos e códons não naturais serem intrinsecamente ortogonais aos códons naturais, os métodos de aminoácidos não naturais aqui descritos podem retirar vantagem desta propriedade em gerar tRNAs ortogonais para eles.
[00392]Um sistema de desvio traducional também pode ser usado para incorporar um aminoácido não natural num polipeptídeo desejado. Num sistema de desvio traducional, uma grande seqüência é incorporada a um gene, mas não é traduzida para a proteína. A seqüência contém uma estrutura que serve como sugestão para induzir o ribossomo a "pular" a seqüência e resumir à tradução a jusante da inserção.
[00393]Em algumas modalidades, a proteína ou polipeptídeo de interesse (ou parte destes) nos métodos e composições aqui descritos é codificada(o) por um ácido nucléico. Tipicamente, o ácido nucléico compreende pelo menos um códon de seleção, pelo menos dois códons de seleção, pelo menos três códons de seleção, pelo menos quatro códons de seleção, pelo menos cinco códons de seleção, pelo menos seis códons de seleção, pelo menos sete códons de seleção pelo menos oito códons de seleção, pelo menos nove códons de seleção, dez ou mais códons de seleção.
[00394]Os genes que codificam para proteínas ou polipeptídeos de interesse podem ser submetidos à mutagênese usando-se métodos bem conhecidos dos versados na técnica e descritos no presente documento, para incluir, por exemplo, um ou mais códons de seleção para a incorporação de um aminoácido natural. Um ácido nucléico para uma proteína de interesse é submetido à mutagênese, por exemplo, para incluir um ou mais códons de seleção, provendo a incorporação de um ou mais aminoácidos não naturais. Os métodos e composições aqui descritos incluem qualquer tal variante, incluindo, sem limitação, versões mutantes de qualquer proteína, por exemplo, incluindo pelo menos um aminoácido natural. De modo análogo, os métodos e composições aqui descritos também incluem ácidos nucléicos correspondentes, isto é, qualquer ácido nucléico com um ou mais códons de seleção que codificam um ou mais aminoácidos não naturais. A
[00395]As moléculas de ácido nucléico que codificam um polipeptídeo de interesse incluem, sem limitação, polipeptídeo do GH que pode ser facilmente mutado para se introduzir uma cisteína em qualquer posição desejada do polipeptídeo. A cisteína é amplamente usada para introduzir moléculas reativas, polímeros hidrossolúveis, proteínas ou uma ampla variedade de outras moléculas, em uma proteína de interesse. Os métodos adequados para a incorporação de cisteína em uma posição desejada de um polipeptídeo são conhecidos dos versados na técnica, tais como os descritos na patente U.S. No. 6.608.183, que é incorporada ao presente documento a título de referência e técnicas padrão de mutagênese
VIII - Geração "in vivo" de polipeptídeos compreendendo aminoácidos não naturais
[00396]Por conveniência, a geração in vivo dos polipeptídeos compreendendo os aminoácidos não naturais descritos neste parágrafo foram descritos genericamente e/ou com exemplos específicos. Contudo, a geração in vivo dos polipeptídeos compreendendo aminoácidos não naturais descritos neste parágrafo não devem ser limitados apenas às descrições genéricos ou exemplos específico fornecido neste parágrafo, ao invés, a geração in vivo de polipeptídeos compreendendo aminoácidos não naturais descritos neste parágrafo, aplicam-se igualmente bem a todos os compostos que se enquadrem no escopo das Fórmulas I-XVIII, XXX-XXXIV (A&B) e XXXX-XXXXIII, incluindo quaisquer sub-fórmulas ou compostos específicos que se enquadrem no escopo das Fórmulas I-XVIII, XXXIIIIV (A & B), e XXXX-XXXXIII descritas no relatório descritivo, reivindicações e desenhos.
[00397]Os métodos para a geração de tRNAs e tRNA sintetases que usam aminoácidos que não são codificados em sistemas que ocorrem naturalmente são descritos, por exemplo, nas Publicações de Pedidos de Patentes U.S. 2003/0082575 (No. de Série 10/126.927) e 2003/0108885 (No de Série 10/126.931) que são incorporadas ao presente documento a título de referência. Estes métodos envolvem a geração de uma maquinaria traducional que funciona independentemente das sintetases e de tRNAs endógenos ao sistema de tradução (que são, portanto, às vezes denominados “ortogonais”). Numa modalidade, o sistema de tradução compreende um polinucleotídeo codificando o polipeptídeo; o polinucleotídeo pode ser mRNA que foi transcrito do correspondente DNA, ou o mRNA pode surgir de um vetor viral de RNA, além disso o polinucleotídeo compreende um códon de seleção correspondente ao sítio predestinado de incorporação para o aminoácido não natural. O sistema de tradução ainda compreende um tRNA e também quando adequado compreendendo o aminoácido não natural, onde o tRNA é específico para/reconhece especificamente o códon de seleção supracitado; em outras modalidades, o aminoácido não natural é aminoacilado. Os aminoácidos não naturais incluem os com a estrutura de quaisquer Fórmulas I-XVIII, XXX-XXXIV (A&B), e XXXX-XXXXIII aqui descritos. Numa modalidade adicional ou ulterior o sistema de tradução compreende uma aminoacil sintetase específica para o tRNA e em modalidades adicionais ou ulteriores, o sistema de tradução compreende um tRNA ortogonal e uma aminoacil tRNA sintetase ortogonal. Em modalidades adicionais ou ulteriores, o sistema de tradução compreende pelo menos um dos seguintes: um plasmídeo compreendendo o polinucleotídeo supracitado (tal a guisa de exemplo, na forma do DNA, DNA genômico compreendendo o polinucleotídeo supracitado (tal como a guisa de exemplo, na forma do DNA) ou DNA genômico para o qual o polinucleotídeo supracitado foi integrado (Numa outra modalidade, a integração é uma integração estável). Em modalidades adicionais ou ulteriores do sistema de tradução, o códon de seleção é selecionado do grupo consistindo em um códon âmbar, códon ocre, códon opala, um códon singular, um códon raro, um códon não natural, um códon de cinco bases, e um códon de quatro bases. Em algumas modalidades ou modalidades adicionais o tRNA é um tRNA supressor. Em modalidades adicionais ou ulteriores o polipeptídeo de aminoácido não natural é sintetizado por um ribossomo.
[00398]Em modalidades adicionais ou ulteriores, o sistema de tradução compreende um tRNA ortogonal (O- tRNA) e uma aminoacil tRNA sintetase ortogonal (O-RS). Tipicamente, a O-RS aminoacila de preferência, o O-tRNA com pelo menos um aminoácido no sistema de tradução e o O-tRNA reconhece pelo menos um códon de seleção que não é reconhecido por outros tRNAs no sistema. O sistema de tradução insere, portanto, o aminoácido não natural em um polipeptídeo produzido no sistema, em resposta a um códon de seleção codificado, “substituindo”, assim, um aminoácido não natural em uma posição no polipeptídeo codificado.
[00399]Uma ampla variedade de tRNAs ortogonais e aminoacil tRNA sintetases ortogonais já foi descrita na técnica de inserção de aminoácidos sintéticos específicos em polipeptídeos e são geralmente adequados para uso nos métodos aqui descritos. Por exemplo, O- tRNA/aminoacil- tRNA sintetase ceto-específicos, são descritos em Wang, L., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100: 56-61 (2003) e Zhang, Z. et al., Biochem. 42(22): 6735 -6746 (2003). O-RS exemplares, ou partes delas são codificadas por sequências de polinucleotídeos e incluem sequências de aminoácidos divulgadas nas Publicações de Pedidos de Patentes U.S. 2003/0082575 e 2003/0108885, sendo cada uma incorporada ao presente documento a título de referência. As moléculas de O- tRNA correspondentes para uso com as O-RSs são também descritas nas Publicações de Pedidos de Patentes U.S. 2003/0082575 (No. de série 10/126.927) e 2003/0108885 (No. de série 10/126.931), que são incorporadas ao presente documento a título de referência. Além disso Mehl et al., em J. Am. Chem. Soc. 2003: 125:935-939 e Santoro et al., Nature Biotechnology 2002 Oct; 20:1044-1048, que estão ora incorporados por referência em sua totalidade, discutem métodos de seleção e aminoacil tRNA sintetase e moléculas de tRNA para incorporação dos para-aminofenilalanina aos polipeptídeos.
[00400]As sequências de O- tRNA exemplares adequadas para uso na presente invenção incluem, sem limitação, sequências de nucleotídeos SEQ ID NOs: 1-3, conforme divulgado na Publicação de Pedido de Patente U.S. 2003/0108885 (No. de série 10/126,931), que é incorporada a título de referência. Outros exemplos de pares de O-tRNA/aminoacil-tRNA sintetase específicas a aminoácidos não naturais específicos são descritos na Publicação de Pedido de Patente U.S. 2003/0082575 (No. de série 10/126.927) que é incorporada ao presente documento a título de referência. O-RS e O-tRNA que incorporam tanto aminoácidos contendo ceto como azido em S.cerevisiae são descritos em Chin, J. W., et al, Science 301:964-967 (2003).
[00401]O uso de O- tRNA/aminoacil- tRNA sintetases envolve a seleção de um códon específico que codifica o aminoácido não naturalmente codificado. Embora possa ser usado qualquer códon, é geralmente desejável selecionar um códon que é raramente ou nunca usado na célula em que é expresso o sistema O- tRNA/aminoacil- tRNA sintetase. Os códons exemplares incluem, por exemplo, códons sem sentido, tal como códons de interrupção (âmbar, ocre e opala), códons de quatro ou mais bases e outros códons naturais de três bases que são raramente usados ou nunca.
[00402]O(s) códon(s) seletor(s) específico(s) pode(m) ser introduzido(s) em posições apropriadas na seqüência de codificação do polinucleotídeo usando métodos de mutagênese conhecidos na técnica (inclusive, sem limitação, mutagênese específica ao sítio, mutagênese de cassete, mutagêneses de seleção de restrição etc.).
[00403]Os métodos para a geração de componentes da maquinaria biossintética de proteínas, tais como O-RSs, O-TRNAs e pares ortogonais O- tRNA/O-RS que podem ser usados para a incorporação de um aminoácido não natural, são descritos em Wang, L., et al, Science 292: 498-500 (2001); Chin, J. W., et al, J. Am. Chem. Soc. 124: 9026-9027 (2002); Zhang, Z. et al, Biochemistry 42: 6735-6746 (2003). Os métodos e composições para a incorporação in vivo de aminoácidos não naturais, são descritos na Publicação de Pedido de Patente U.S. 2003/0082575 (No. de série 10/126.927) que é incorporada a título de referência em sua totalidade. Os métodos para a seleção de um par ortogonal tRNA- tRNA sintetase para uso no sistema de tradução in vivo de um organismo são também descritos nas Publicações de Pedidos de Patentes U.S. 2003/0082575 (No. de série 10/126.927) e 2003/0108885 (No. de série 10/126.931), que são incorporadas ao presente documento a título de referência. A Publicação PCT No. WO 04/035743 intitulada “Site Specific Incorporation of Keto Amino Acids into Proteins”, descreve pares RS e tRNA ortogonais para a incorporação de ceto aminoácidos. A Publicação PCT No. WO 04/094593 intitulada “Expanding the Eukaryotic Genetic Code”, que é incorporada integralmente ao presente documento a título de referência, descreve pares de RS e tRNA ortogonais para a incorporação de aminoácidos não naturais em células hospedeiras eucarióticas.
[00404]Os métodos para a produção de pelo menos uma aminoacil- tRNA sintetase (O-RS) ortogonal recombinante compreendem: (a) a geração de uma biblioteca de RSs (opcionalmente mutante) derivada a partir de pelo menos uma aminoacil- tRNA sintetase (RS) de um primeiro organismo, inclusive, sem limitação, um organismo procariótico tal como Methanococcus jannaschii, Methanobacterium thermoautotrophicum, Halobacterium, Escherichia coli, A. fulgidus, P. furiosus, P. horikoshii, A. pernix, T. thermophilus ou semelhantes ou um organismo eucariótico; (b) a seleção (e/ou classificação) da biblioteca de RSs (opcionalmente de RSs mutantes) de membros que aminoacilem um tRNA ortogonal (O- tRNA) na presença de um aminoácido não natural, e de um aminoácido natural, proporcionando assim um grupo de RSs ativas (opcionalmente mutantes); e/ou, (c) a seleção (opcionalmente por meio de seleção negativa) de um grupo de RSs ativas (inclusive, sem limitação, RSs mutantes) que aminoacilem de preferência, o O-tRNA na ausência do aminoácido não natural, proporcionando, assim, a pelo menos uma O-RS recombinante; onde o pelo menos um O-RS recombinante aminoacila o O- tRNA com o aminoácido não natural.
[00405]Em uma modalidade, a RS é uma RS inativa. A RS inativa pode ser gerada por mutação de uma RS ativa. A RS inativa, por exemplo, pode ser gerada por mutação de pelo menos cerca de 1, pelo menos cerca de 2, pelo menos cerca de 3, pelo menos cerca de 4, pelo menos cerca de 5, pelo menos cerca de 6, ou pelo menos cerca de 10 ou mais aminoácidos em aminoácidos diferentes, inclusive, sem limitação, alanina.
[00406]As bibliotecas de RSs mutantes podem ser geradas usando-se diversas técnicas conhecidas na técnica, inclusive, sem limitação, projeto racional baseado na estrutura de RS tridimensional, ou mutagênese de nucleotídeos de RS em uma técnica de projeto aleatório ou racional. A guisa de exemplo, os RSs mutantes podem ser gerados por mutações direcionadas ao sítio, mutações aleatórias, mutações de recombinação que gera diversidade, construções quiméricas, planejamento racional e por outros métodos descritos no presente documento ou conhecidos na técnica.
[00407]Em uma modalidade, a seleção (e/ou classificação) da biblioteca de RSs (opcionalmente RSs mutantes) para membros que sejam ativos, inclusive, sem limitação, que aminoacilem um tRNA ortogonal (O- tRNA) na presença de um aminoácido não natural, e de um aminoácido natural, inclui: a introdução de um marcador positivo de seleção ou teste, inclusive, sem limitação, um gene de resistência a antibiótico, ou semelhantes, e a biblioteca de RSs (opcionalmente mutantes) em uma multiplicidade de células, compreendendo o marcador de seleção positiva e/ou teste pelo menos um códon seletor, inclusive, sem limitação, um códon âmbar, ocre ou opala; o cultivo da multiplicidade de células na presença de um agente de seleção; a identificação das células que sobrevivem (ou apresentem uma resposta específica) na presença do agente de seleção e/ou classificação por supressão do pelo menos um códon de seleção na seleção positiva ou marcador de classificação, propiciando assim, um subconjunto de células positivamente selecionadas que contêm as RSs ativas (opcionalmente mutantes). Opcionalmente, pode-se fazer variar a concentração do agente de seleção e/ou teste.
[00408]Em um aspecto, o marcador de seleção positiva é um gene de cloranfenicol acetiltransferase (CAT) e o códon de seleção é um códon de interrupção âmbar no gene CAT. Opcionalmente, o marcador de seleção positiva é um gene β-lactamase e o códon de seleção é um códon de interrupção âmbar no gene β-lactamase. Em um outro aspecto o marcador de classificação positiva compreende um marcador classificatório fluorescente ou luminescente ou um marcador classificatório com base em afinidade (inclusive, sem limitação, um marcador de superfície celular).
[00409]Em uma modalidade, a operação de seleção ou classificação negativa do conjunto de RSs ativas (opcionalmente mutantes) que aminoacilem, de preferência, o O-tRNA na ausência do aminoácido não natural inclui: a introdução de um marcador de seleção ou classificação negativa com o grupo de RSs ativos (opcionalmente mutantes) provenientes da seleção ou classificação positiva em uma multiplicidade de células de um segundo organismo, compreendendo o marcador de seleção ou classificação negativa pelo menos um códon de seleção (inclusive, sem limitação, um gene de resistência a antibiótico, inclusive, sem limitação, um gene de cloranfenicol acetiltransferase (CAT)); e a identificação de células que sobrevivem ou demonstrem uma resposta específica a teste em um primeiro meio suplementado com o aminoácido não natural e o agente de classificação ou seleção, mas que não sobrevivem nem apresentam uma resposta específica em um segundo meio não suplementado com o aminoácido não natural e o agente de seleção ou classificação, propiciando assim, células sobreviventes ou células selecionadas com a pelo menos uma O-RS recombinante. Um protocolo de identificação de CAT, opcionalmente, atua como uma seleção positiva e/ou uma classificação negativa na determinação de O-RSs recombinantes apropriadas. Um grupo de clones é opcionalmente replicado, por exemplo, em placas de cultura contendo CAT (que compreende pelo menos um códon seletor) seja com um ou mais aminoácidos não naturais ou sem eles. As colônias que crescem, exclusivamente nas placas contendo aminoácidos não naturais são, portanto, consideradas como contendo O-RS recombinante. Em um aspecto, varia a concentração do agente de seleção (e/ou de classificação ). Em alguns aspectos o primeiro e o segundo organismos são diferentes. Assim, o primeiro e/ou segundo organismos compreendem opcionalmente: um procarionte, um eucarionte, um mamífero, uma Escherichia coli, um fungo, uma levedura, uma arque-bactéria (bactéria primitiva), uma eubactéria, uma planta, um inseto, um protista etc. Outros aspectos incluem o marcador de classificação, compreendendo um marcador de classificação fluorescente ou luminescente ou um marcador de classificação por afinidade. Nas modalidades descritas, as classificações e/ou seleções, incluem, opcionalmente variações no rigor da classificação e/ou seleção.
[00410]Em uma modalidade, os métodos para a produção da pelo menos uma aminoacil- tRNA sintetase ortogonal (O-RS) recombinante pode ainda compreender: (d) o isolamento da pelo menos uma O-RS recombinante; (e) a geração de um segundo conjunto de O-RS (opcionalmente mutacionadas) derivadas da pelo menos uma O-RS recombinante; e (f) a repetição das etapas (b) e (c) até se obter uma O-RS mutacionada que compreende uma capacidade de aminoacilar, de preferência, o O-tRNA. Opcionalmente, repetem-se as etapas (d)-(f), inclusive, sem limitação, pelo menos cerca de duas vezes. Em um aspecto, o segundo conjunto de O-RS mutacionadas derivadas da pelo menos uma O-RS recombinante pode ser gerado por mutagênese, inclusive, sem limitação, mutagênese aleatória, mutagênese específica a sítio, recombinante ou uma combinação delas.
[00411]O rigor das etapas de seleção/classificação inclusive, sem limitação, a etapa (b) de seleção/ classificação positiva, a etapa (c) de seleção/classificação negativa ou tanto a etapa (b) de seleção/classificação positiva como a etapa (c) negativa, nos métodos descritos acima, inclui opcionalmente a variação no rigor de seleção/classificação. Em uma outra modalidade, a etapa (b) de seleção/classificação positiva, a etapa (c) de seleção/classificação negativa, ou tanto a etapa (b) de seleção/classificação positiva como a etapa (c) de seleção/classificação negativa compreendem o uso de um repórter, sendo o repórter detectado por triagem de células ativadas por fluorescência (FACS) ou sendo o repórter detectado por luminescência. Opcionalmente, o repórter é disposto sobre uma superfície celular, numa apresentação de fagos ou semelhante, e é selecionado com base em afinidade ou atividade catalítica envolvendo o aminoácido não natural ou um análogo. Em uma modalidade, a sintetase que passou por mutação é disposta sobre uma superfície celular numa apresentação de fago ou similar.
[00412]Os métodos para a produção de tRNA ortogonal (O- tRNA) recombinante incluem: (a) a geração de uma biblioteca de tRNAs mutantes derivados de pelo menos um tRNA, inclusive, sem limitação, um tRNA supressor, de um primeiro organismo; (b) a seleção (inclusive, sem limitação, seleção negativa) ou classificação da biblioteca de tRNAs (opcionalmente mutantes) que sejam aminoacilados por uma aminoacil- tRNA sintetase (RS) de um segundo organismo na ausência de uma RS proveniente do primeiro organismo, provendo, deste modo, um grupo de tRNAs (opcionalmente mutantes); e (c) a seleção ou classificação do conjunto de tRNAs (opcionalmente mutantes) à procura de membros que sejam aminoacilados por uma RS ortogonal (O-RS) introduzida, provendo, deste modo, pelo menos um O- tRNA recombinante; reconhecendo o pelo menos um O- tRNA recombinante um códon de seleção e não sendo reconhecido eficientemente pela RS do segundo organismo e sendo aminoacilado, de preferência, pela O-RS. Em algumas modalidades o pelo menos um tRNA é um tRNA supressor e/ou compreende um códon singular de três bases de bases naturais e/ou não naturais, ou é um códon sem sentido, um códon raro, um códon não natural, um códon que compreende pelo menos 4 bases, um códon âmbar, um códon ocre, ou um códon de interrupção opala. Em uma modalidade, o O-tRNA recombinante possuiu um aperfeiçoamento de ortogonalidade. Deve-se observar que em algumas modalidades, O- tRNA é opcionalmente importado em um primeiro organismo de um segundo organismo sem a necessidade de modificação. Em diversas modalidades, o primeiro e o segundo organismos são ou iguais ou diferentes e são opcionalmente escolhidos, inclusive, sem limitação, de procariontes (inclusive, sem limitação, Methanococcus jannaschii, Methanobacterium thermoautotrophicum, Escherichia coli, Halobacterium etc.), eucariontes, mamíferos, fungos, leveduras, arque-bactérias (bactérias primitivas), eubactérias, plantas, insetos, protistas etc. Além disso, o tRNA recombinante é opcionalmente aminoacilado por um aminoácido não natural, sendo o aminoácido não natural, biossintetizado in vivo ou naturalmente ou através de manipulação genética. O aminoácido não natural é opcionalmente adicionado a um meio de cultura para pelo menos o primeiro ou segundo organismo, onde o aminoácido não natural é capaz de adquirir concentrações intracelulares adequadas que permitem a incorporação ao polipeptídeo de aminoácido não natural.
[00413]Em um aspecto, a seleção (inclusive, sem limitação, seleção negativa) ou a classificação da biblioteca de tRNAs (opcionalmente mutantes) que sejam aminoacilados por uma aminoacil- tRNA sintetase (etapa(b)) inclui a introdução de um gene marcador tóxico, compreendendo o gene marcador tóxico pelo menos um códon de seleção (ou um gene que leva à produção de um agente tóxico ou estático ou um gene essencial ao organismo, compreendendo tal gene marcador pelo menos um códon seletor), e a biblioteca de tRNAs (opcionalmente mutante) em uma multiplicidade de células provenientes do segundo organismo; e a seleção de células sobreviventes, contendo as células sobreviventes o grupo de tRNAs (opcionalmente mutantes) que compreendem pelo menos um tRNA ortogonal ou tRNA não funcional. As células sobreviventes, por exemplo, podem ser selecionadas usando-se uma relação de comparação do ensaio de densidade celular.
[00414]Em um outro aspecto, o gene marcador tóxico pode incluir dois ou mais códons de seleção. Em uma outra modalidade dos métodos, o gene de marcador tóxico é um gene de ribonuclease barnase, compreendendo o gene de ribonuclease barnase pelo menos um códon âmbar. Opcionalmente, o gene de ribonuclease barnase pode incluir dois ou mais códons âmbar.
[00415]Em uma modalidade, a seleção ou classificação do grupo de tRNAs (opcionalmente mutantes) para os membros que sejam aminoacilados por uma RS ortogonal (O-RS) introduzida pode incluir: a introdução de um gene marcador de seleção ou classificação positiva, compreendendo o gene marcador positivo um gene de resistência a droga (inclusive, sem limitação,gene de β-lactamase, compreendendo pelo menos um dos códons de seleção, tal como pelo menos um códon de interrupção âmbar) ou um gene essencial ao organismo, ou um gene que leve à desintoxicação de um agente tóxico juntamente com a O-RS, e o grupo de tRNAs (opcionalmente mutantes) em uma multiplicidade de células do segundo organismo; e a identificação das células sobreviventes ou selecionadas na presença de um agente de seleção ou agente de classificação, inclusive, sem limitação, um antibiótico, provendo, deste modo, um grupamento de células que possuem o pelo menos um tRNA recombinante, sendo o pelo menos um tRNA recombinante aminoacilado pela O-RS e inserindo um aminoácido em um produto de tradução codificado pelo gene marcador positivo, em resposta ao pelo menos um códon seletor. Em uma outra modalidade, a concentração do agente de seleção e/ou classificação varia.
[00416]São propostos métodos para a geração de pares O- tRNA/O-RS específicos. Os métodos incluem: (a) a geração de uma biblioteca de tRNAs mutantes derivados de pelo menos um tRNA proveniente de um primeiro organismo; (b) a seleção ou classificação negativa da biblioteca de tRNAs (opcionalmente mutantes) que sejam aminoacilados por uma aminoacil- tRNA sintetase (RS) proveniente de um segundo organismo na ausência de uma RS proveniente do primeiro organismo, provendo assim um conjunto de tRNAs (opcionalmente mutantes); (c) a seleção ou classificação do conjunto de tRNAs (opcionalmente mutantes) à procura de membros que sejam aminoacilados por uma RS ortogonal (O-RS) introduzida, provendo deste modo, pelo menos um O-tRNA recombinante. O pelo menos um O-tRNA recombinante reconhece um códon de seleção e não é eficientemente reconhecido pela RS proveniente do segundo organismo e é aminoacilado, de preferência, pela O-RS. O método também inclui (d) a geração de uma biblioteca de RSs (opcionalmente mutantes) derivadas de pelo menos uma aminoacil-tRNA sintetase (RS) proveniente de um terceiro organismo; (e) a seleção ou classificação da biblioteca de RSs mutantes à procura de membros que aminoacilem, de preferência, o pelo menos um O- tRNA recombinante na presença de um aminoácido não natural e de um aminoácido natural, provendo, deste modo, um grupamento de RSs ativos (opcionalmente mutantes); e (f) a seleção ou classificação negativa do grupo de RSs ativas (opcionalmente mutantes) que aminoacilem, de preferência, o pelo menos um O-tRNA recombinante na ausência do aminoácido não natural, provendo, deste modo o pelo menos um par O- tRNA/O-RS específico, compreendendo o pelo menos um par O-tRNA/O-RS específico pelo menos uma O-RS recombinante que é específica para o aminoácido não natural e o pelo menos um O-tRNA recombinante. São incluídos os pares O- tRNA/O-RS específicos produzidos pelos métodos descritos. O par O- tRNA/O-RS específico pode, por exemplo, incluir, inclusive, sem limitação, um par muttRNAyr- mutTyrRS, tal como um par mut TRNAyr-SS12TyrRS, um par mutRNALeu- mutLeuRS, um par mut TRNAhr-mutThrRS, um par mutRNAGlu-mutGluRS, ou similares. Adicionalmente, tais métodos incluem casos em que o primeiro e o terceiro organismo são iguais (inclusive, sem limitação, Methanococcus jannaschii).
[00417]Os métodos para a seleção de um par tRNA-tRNA sintetase ortogonal para uso em um sistema de tradução in vivo de um segundo organismo são também incluídos nos métodos presentes. Os métodos incluem: a introdução de um gene marcador, um tRNA e uma aminoacil-tRNA sintetase (RS) isolada ou derivada de um primeiro organismo em um primeiro conjunto de células do segundo organismo; a introdução do gene marcador e do tRNA em um conjunto de células em duplicata provenientes de um segundo organismo; e a seleção de células sobreviventes no primeiro conjunto que falharam na sobrevivência no conjunto de células duplicatas ou seleção de células que apresentassem uma resposta específica à seleção, que falharam em produzir tal resposta no conjunto de células em duplicata, sendo o primeiro conjunto e o conjunto de células em duplicata cultivados na presença de um agente de seleção ou classificação, compreendendo as células sobreviventes ou selecionadas, o par tRNA-tRNA sintetase ortogonal para uso no sistema de tradução in vivo do segundo organismo. Em uma modalidade, a comparação e a seleção incluem um ensaio de complementação in vivo. Pode-se fazer variar a concentração do agente de seleção ou de classificação.
[00418]Os organismos aqui descritos compreendem uma variedade de organismos e uma variedade de combinações. Em uma modalidade, os organismos são opcionalmente um organismo procariótico, inclusive, sem limitação, Methanococcus jannaschii, Methanobacterium thermoautotrophicum, Halobacterium, Escherichia coli, A. fulgidus, P. furiosus, P. horikoshii, A. pernix. T. thermophilus, ou similares. Alternativamente, os organismos opcionalmente compreendem um organismo eucariótico, inclusive, sem limitação, plantas (inclusive, sem limitação, plantas complexas tais como monocotiledôneas, ou dicotiledôneas), algas, protistas, fungos (inclusive, sem limitação, leveduras etc.), animais (inclusive, sem limitação, mamíferos, insetos, artrópodes etc.), ou similares.
A. Expressão em Não-Eucariontes e Eucariontes
[00419]As técnicas aqui apresentadas podem ser aplicadas à expressão nem não eucariontes e em eucariontes dos polipeptídeos de aminoácido não natural aqui descritos.
[00420]Para se obter uma expressão de alto nível de um polipeptídeo clonado, tipicamente se subclonam polinucleotídeos codificando um polipeptídeo desejado em um vetor de expressão que contém um promotor forte para direcionar a transcrição, um terminador de transcrição/tradução e, se for para um ácido nucléico que codifica uma proteína, um sítio de ligação a ribossomo para iniciação traducional. Os promotores bacterianos adequados são descritos, por exemplo, em Sambrook, et al. e Ausubel et al.
[00421]Os sistemas de expressão bacteriana para a expressão de polipeptídeos são disponíveis, inclusive, sem limitação, em E. coli. Bacillus sp., Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas putida, e Salmonella (Palva et al, Gene 22: 229-235 (1983); Mosbach et al, Nature 302: 543-545 (1983)). Kits para tais sistemas de expressão são comercialmente disponíveis. Os sistemas de expressão eucariótica para células de mamíferos, levedura e células de insetos são comercialmente disponíveis. Nos casos em que os tRNAs ortogonais e as aminoacil tRNA sintetases (descritas algures neste documento), são usados para expressar os polipeptídeos, as células hospedeiras para expressão são selecionadas com base na sua capacidade de usar os componentes ortogonais. As células hospedeiras exemplares incluem bactérias Gram-positivas (inclusive, sem limitação, B. brevis, B. subtilis ou Streptomyces) e bactérias Gram-negativas (E. coli, Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas putida), assim como levedura e outras células eucarióticas. As células compreendendo pares O- tRNA/O-RS podem ser usadas conforme aqui descrito.
[00422]Uma célula hospedeira eucariótica ou célula hospedeira não eucariótica aqui descritas, proporciona a capacidade de sintetizar polipeptídeos que compreendem aminoácidos não naturais em grandes quantidades úteis. Em um aspecto a composição inclui opcionalmente, inclusive, sem limitação, pelo menos 10 microgramas, pelo menos 50 microgramas, pelo menos 75 microgramas, pelo menos 100 microgramas, pelo menos 200 microgramas, pelo menos 250 microgramas, pelo menos 500 microgramas, pelo menos 1 miligrama, pelo menos 10 miligramas, pelo menos 100 miligramas, pelo menos um grama, ou mais do polipeptídeo que compreende um aminoácido não natural, ou uma quantidade que pode ser obtida com métodos de produção de polipeptídeo in vivo (detalhes sobre a produção e purificação de proteína recombinante são dados no presente documento). Em um outro aspecto, o polipeptídeo está opcionalmente presente na composição a uma concentração, inclusive, sem limitação, de pelo menos 10 microgramas de polipeptídeo por litro, pelo menos 50 microgramas de polipeptídeo por litro, pelo menos 75 microgramas de polipeptídeo por litro, pelo menos 100 microgramas de polipeptídeo por litro, pelo menos 200 microgramas de polipeptídeo por litro, pelo menos 250 microgramas de polipeptídeo por litro, pelo menos 500 microgramas de polipeptídeo por litro, pelo menos 1 miligrama de polipeptídeo por litro, ou pelo menos 10 miligramas de polipeptídeo por litro ou mais, inclusive, sem limitação, em um lisado de células, um tampão, um tampão farmacêutico, ou outra suspensão líquida (incluindo, sem limitação, em um volume, inclusive, sem limitação, de uma quantidade que vai de aproximadamente 1 nL a aproximadamente 100 L). A produção de grandes quantidades (inclusive, sem limitação, acima da tipicamente possível com outros métodos, inclusive, sem limitação, tradução in vitro) de uma proteína em uma célula eucariótica ou célula não eucariótica que inclui, sem limitação, pelo menos um aminoácido não natural consiste em uma característica dos métodos, técnicas e composições aqui descritos.
[00423]Uma célula hospedeira eucariótica ou uma célula hospedeira não eucariótica aqui descrita proporcionam a capacidade de biossintetizar proteínas que compreendem aminoácidos não naturais em grandes quantidades úteis. Por exemplo, os polipeptídeos que compreendem um aminoácido não natural podem ser produzidos, a uma concentração, inclusive, sem limitação, de pelo menos 10 μg/litro, pelo menos 50 μg/litro, pelo menos 75 μg/litro, pelo menos 100 μg/litro, pelo menos 200 μg/litro, pelo menos 250 μg/litro, ou pelo menos 500 μg/litro, pelo menos 1 mg/litro, pelo menos 2 mg/litro, pelo menos 3 mg/litro, pelo menos 4 mg/litro, pelo menos 5 mg/litro, pelo menos 6 mg/litro, pelo menos 7 mg/litro, pelo menos 8 mg/litro, pelo menos 9 mg/litro, pelo menos 10 mg/litro, pelo menos 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900 mg/litro, 1 g/litro, 5 g/litro, 10 g/litro ou mais de proteína em um extrato de células, lisado de células, meio de cultura, um tampão e/ou semelhantes.
1. Sistemas de Expressão, cultura e isolamento
[00424]As técnicas apresentadas neste parágrafo podem ser aplicada aos sistemas de expressão, cultura e isolamento dos polipeptídeos de aminoácido não natural aqui descritos. Polipeptídeos de aminoácido não natural podem ser expressos em qualquer série de sistemas de expressão adequados incluindo, incluindo, sem limitação, a levedura, células de inseto, células de mamífero e bactérias. A seguir têm-se uma descrição de sistemas de expressão exemplares. Leveduras - Como aqui empregado, o termo "levedura" inclui quaisquer de varais leveduras capazes de expressar um gene codificando o polipeptídeo de aminoácido não natural. Tais leveduras incluem, incluindo, sem limitação, leveduras ascoporogenosas (Endomycetales), leveduras basidiosporogenosas e leveduras pertencentes ao grupo Fungi imperfecti (Blastomycetes).
[00425]As leveduras ascosporogenosas são divididas em duas famílias Spermophthoraceae e Saccharomycetaceae. Esta última é constituída por quatro subfamílias, Schizosaccharomycoideae (gênero Schizosaccharomyces, por exemplo), Nadsonioideae, Lipomycoideae e Saccharomycoideae (gêneros Pichia, Kluyveromyces e Saccharomyces, por exemplo). As leveduras basidiosporogenosas incluem os gêneros Leucosporidium, Rhodosporidium, Sporidiobolus, Filobasidium e Filobasidiella. As leveduras que pertencem ao grupo Fungi Imperfecti (Blastomycetes) são divididas em duas famílias, Sporobolomycetaceae (gêneros Sporobolomyces e Bullera, por exemplo) e Cryptococcaceae (gênero Candida, por exemplo).
[00426]Em algumas modalidades, as espécies dos gêneros Pichia, Kluyveromyces, Saccharomyces, Schizosaccharomyces, Hansenula, Torulopsis e Candida, inclusive, sem limitação, P. pastoris, P. guillerimondii, S. cerevisiae, S. carlsbergensis, S. diastaticus, S. douglasii, S. kluyveri, S, norbensis, S. oviformis, K. lactis, K. fragilis, C. albicans, C. maltosa, e H. polymorpha são usadas nos métodos, técnicas e composições aqui descritos.
[00427]A seleção da levedura adequada para a expressão do polipeptídeo de aminoácido não natural incide na perícia dos versados na técnica. Ao selecionar leveduras hospedeiras para expressão, os hospedeiros adequados podem incluir as que demonstraram ter, por exemplo, boa capacidade de secreção, baixa atividade proteolítica e uma robustez geral. As leveduras são em geral disponíveis de uma variedade de fontes, incluindo, sem limitação, o Yeast Genetic Stock Center, o Department of Biophysics and Medical Physics da Universidade da Califórnia (Berkeley, CA), e a American Type Culture Collection (“ATCC”) (Manassas, VA).
[00428]O termo “levedura hospedeira” ou “célula hospedeira de levedura” inclui levedura que pode ser, ou foi usada como uma receptora para vetores recombinantes ou de outro DNA transferidor. O termo inclui a progênie da célula hospedeira da levedura original que recebeu os vetores recombinantes ou outro DNA transferidor. Deve ficar entendido que a progênie de uma única célula genitora pode não ser necessariamente completamente idêntica em morfologia ou em complemento de DNA genômico ou total ao genitor original, devido a uma mutação acidental ou deliberada. A progênie da célula genitora que é suficientemente semelhante ao genitor para ser caracterizada por uma propriedade relevante, tal como a presença de uma seqüência de nucleotídeo codificando um polipeptídeo de aminoácido não natural, é incluída na progênie destinada por esta definição.
[00429]Os vetores de expressão e de transformação, incluindo réplicons extracromossomais ou vetores de integração foram desenvolvidos para a transformação em muitas leveduras hospedeiras. Os vetores de expressão foram desenvolvidos, por exemplo, para S. cerevisiae (Sikorski et al., GENETICS (1989) 122:19; Ito et al., J. BACTERIOL. (1983) 153: 163; Hinnen et al., PROC. NATL. ACAD. SCI. USA (1978) 75: 1929); C. albicans (Kurtz et al., MOL. CELL. BIOL. (1986) 6: 142); C. maltosa (Kunze et al., J. BASIC MICROBIOL. (1985) 25: 141); H. polymorpha (Gleeson et al., J. GEN. MICROBIOL. (1986) 132: 3459; Roggenkamp et al., MOL. GENETICS AND GENOMICS (1986) 202: 302); K. fragilis (Das et al., J. BACTERIOL. (1984) 158: 1165); K. lactis (De Louvencourt et al., J. BACTERIOL. (1983) 154: 737; Van den Berg et al., BIOTECHNOLOGY (NY) (1990) 8: 135); P. guillerimondii (Kunze et al., J. BASIC MICROBIOL. (1985) 25: 141); P. pastoris (patentes U.S. Nos. 5.324.639; 4.929.555; e 4.837.148; Cregg et al., MOL. CELL. BIOL. (1985) 5: 3376); Schizosaccharomyces pombe (Beach and Nurse et al., NATURE (1981) 300: 706); e Y. lipolytica (Davidow et al, CURR. GENET. (1985) 10:380 (1985); Gaillardin et al., CURR. GENET. (1985) 10:49); A. nidulans (Ballance et al., BIOCHEM. BIOPHYS. RES. COMMUN. (1983) 112: 284-89; Tilburn et al., GENE (1983) 26: 205-221; e Yelton et al., PROC. NATL. ACAD. SCI. USA (1984) 81: 1470-74); A. niger (Kelly e Hynes, EMBO J. (1985) 4: 475-479); T. reesia (EP 0 244 234); e fungos filamentosos tais como, por exemplo, Neurospora, Penicillium, Tolypocladium (WO 91/00357), cada um deles incorporado ao presente, a título de referência em sua totalidade.
[00430]As sequências de controle para vetores de levedura são conhecidas dos versados na técnica e incluem, sem limitação, regiões de promotor provenientes de genes tais como álcool desidrogenase (ADH) (EP 0 284 044); enolase; glicocinase; glicose-6-fosfato isomerase; gliceraldeído-3-fosfato-desidrogenase (GAP ou GAPDH); hexocinase; fosfo-frutocinase; 3-fosfo-glicerato mutase; e piruvato cinase (PyK) (EP 0 329 203). O gene PHO5 de levedura, que codifica a fosfatase ácida, também pode proporcionar sequências promotoras úteis (Miyanohara et al, PROC. NATL. ACAD. SCI. USA (1983) 80:1). Outras sequências promotoras adequadas para uso com leveduras hospedeiras podem incluir os promotores para 3-fosfoglicerato cinase (Hitzeman et al., J. BIOL. CHEM. (1980) 255: 12073; e outras enzimas glicolíticas, tais como piruvato descarboxilase, triosefosfato isomerase, e fosfoglicose isomerase (Holland et al., BIOCHEMISTRY (1978) 17: 4900; Hess et al., J. ADV. ENZYME REG. (1969) 7: 149). Os promotores de levedura indutivos que têm a vantagem adicional de transcrição controlada por condições de crescimento podem incluir as regiões promotoras para álcool desidrogenase 2; isocitocromo C; fosfatase ácida; metalo-tioneína; gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase; enzimas degradantes associadas com o metabolismo do nitrogênio; e enzimas responsáveis pela utilização de maltose e galactose. Vetores e promotores adequados para uso na expressão de levedura são descritos com mais detalhes em EP 0 073 657.
[00431]Podem também ser usados intensificadores de levedura como promotores de levedura. Além disso, promotores sintéticos podem também funcionar como promotores de levedura. As sequências ativadoras a montante (UAS), por exemplo, de um promotor de levedura podem ser unidas com a região de ativação de transcrição de um outro promotor de levedura, criando um promotor híbrido sintético. Exemplos de tais promotores híbridos incluem a seqüência reguladora ADH ligada à região de ativação de transcrição GAP. Ver patentes U.S. Nos. 4.880.734 e 4.876.197. Outros exemplos de promotores híbridos incluem promotores que consistem nas sequências reguladoras dos genes ADH2, GAL4, GAL10, ou PHO5, combinadas com a região de ativação transcricional de um gene de enzima glicolítica tal como GAP ou PyK. Ver EP 0 164 556. Além disso, um promotor de levedura pode incluir promotores de origem não de levedura que ocorrem naturalmente e que têm a capacidade de ligar RNA polimerase de levedura e iniciar a transcrição.
[00432]Outros elementos de controle que podem compreender parte dos vetores de expressão de levedura incluem terminadores, provenientes de GAPDH ou de genes enolase, por exemplo (Holland et al., J. BIOL. CHEM. (1981) 256: 1385). Além disso, a origem de replicação da origem do plasmídeo 2μ é adequada para levedura. Um gene de seleção adequado para uso em levedura é o gene trpl presente no plasmídeo de levedura. Ver Tschumper et al., GENE (1980) 10: 157; Kingsman et al., GENE (1979) 7: 141. O gene trp1 proporciona um marcador de seleção para uma cepa mutante de levedura carecendo da capacidade de se desenvolver em triptofano. De modo análogo, cepas de levedura deficientes em Leu2 (ATCC 20,622 ou 38.626) são complementadas por plasmídeos conhecidos portadores do gene Leu2.
[00433]Métodos de introdução de DNA exógeno em hospedeiras de levedura são conhecidos dos versados na técnica e incluem tipicamente, sem limitação, ou a transformação de esferoplastos ou das células hospedeiras de levedura intactas tratadas com cátions alcalinos. A transformação de levedura pode ser conduzida, por exemplo, de acordo com o método descrito em Hsiao et al., PROC. NATL. ACAD. SCI. USA (1979) 76: 3829 e Van Solingen et al., J. BACT. (1977) 130: 946. No entanto, outros métodos para a introdução de DNA em células tal como por injeção nuclear, eletroporação, ou fusão de protoplastos podem também ser usados conforme descrito em linhas gerais em SAMBROOK ET AL., MOLECULAR CLONING: A LAB. MANUAL (2001). As células hospedeiras de levedura podem então ser cultivadas usando-se técnicas conhecidas dos versados na técnica.
[00434]Outros métodos para a expressão de proteínas heterólogas em células hospedeiras de levedura estão descritos no Pedido de patente U.S. No. 20020055169, patentes U.S. Nos. 6.361.969; 6.312.923; 6.183.985; 6.083.723; 6.017.731; 5.674.706; 5.629.203; 5.602.034; e 5.089.398; patentes U.S. Reexaminadas Nos. RE37,343 e RE35,749; Pedidos de Patentes publicadas PCT WO 99/078621; WO 98/37208; e WO 98/26080; Pedidos de Patente Européia EP 0 946 736; EP 0 732 403; EP 0 480 480; WO 90/10277; EP 0 340 986; EP 0 329 203; EP 0 324 274; e EP 0 164 556, que são incorporadas ao presente documento a título de referência. Ver, também, Gellissen et al., ANTONIE VAN LEEUWENHOEK (1992) 62(l-2): 79-93; Romanos et al., YEAST (1992) 8(6): 423-488; Goeddel, METHODS IN ENZYMOLOGY (1990) 185: 3-7, cada um deles incorporado ao presente a título de referência.
[00435]As cepas de hospedeiras de levedura podem ser cultivadas em fermentadores durante o estágio de amplificação usando-se métodos de fermentação em batelada padrão. Os métodos de fermentação podem ser adaptados para levar em conta diferenças no trajeto de utilização de carbono de um dado hospedeiro, ou modo de controle de expressão. A guisa de exemplo, a fermentação de um hospedeiro da levedura Saccharomyces, por exemplo, pode exigir uma alimentação exclusivamente de glicose, fonte de nitrogênio complexa (hidrolisados de caseína, por exemplo) e suplementação de múltiplas vitaminas, enquanto que, a levedura metilotrófica P. pastoris pode necessitar de glicerol, metanol, e traços de alimentação mineral, mas somente sais simples de amônio (nitrogênio) para um crescimento e expressão ótimos. Ver, por exemplo, patente U.S. No. 5.324.639; Elliott et al., J. PROTEIN CHEM. (1990) 9: 95; e Fieschko et al., BIOTECH. BIOENG. (1987) 29: 1113, ora incorporadas por referência ao presente metabolismo.
[00436]Tais métodos de fermentação, no entanto, podem ter determinadas características comuns independentes da cepa hospedeira de levedura empregada. Um nutriente limitador de crescimento, por exemplo, tipicamente carbono, pode ser acrescentado ao fermentador durante a fase de amplificação para permitir um crescimento máximo. Além disso, os métodos de fermentação geralmente empregam um meio de fermentação destinado a conter quantidades adequadas de carbono, nitrogênio, sais, fósforo e outros nutrientes menos importantes metabólicos, (vitaminas, traços de minerais e sais etc.). Exemplos de meios de fermentação adequados para uso com Pichia são descritos nas patentes U.S. Nos. 5.324.639 e 5.231.178, que são incorporadas ao presente a título de referência.
Células de Inseto Infectadas com Baculovírus
[00437]O termo “hospedeiro de inseto” ou “célula hospedeira de inseto” se refere a um inseto que pode ser, ou ter sido usado como um receptor para vetores recombinantes ou outro DNA de transferência. O termo inclui a progênie da célula hospedeira de inseto original que foi transfectada. Deve ficar subentendido que a progênie de uma única célula progenitora pode não necessariamente ser completamente idêntica em morfologia ou em complemento de DNA genômico ou total ao progenitor original devido à mutação acidental ou deliberada. A progênie da célula original que é suficientemente semelhante ao progenitor para ser caracterizada pela propriedade relevante, tal como a presença de uma seqüência de nucleotídeo que codifica um polipeptídeo de aminoácido não natural, é incluída na progênie objeto desta definição.
[00438]A seleção de células de inseto adequadas para expressão de um polipeptídeo é conhecida dos versados na técnica. Diversas espécies de insetos são bem descritas na técnica e são comercialmente disponíveis incluindo Aedes aegypti, Bombyx mori, Drosophila melanogaster, Spodoptera frugiperda e Trichoplusia ni. Ao se selecionar hospedeiros de inseto para expressão, hospedeiros adequados podem incluir aquelas que mostraram ter, inter alia, uma boa capacidade secretora, uma baixa atividade proteolítica e uma robustez geral. Os insetos são geralmente disponíveis de uma variedade de fontes inclusive, sem limitação, o Insect Genetic Stock Center, Department of Biophysics and Medical Physics, Universidade de Califórnia (Berkeley, CA); e o American Type Culture Collection (“ATCC”) (Manassas, VA).
[00439]Geralmente, os componentes de um sistema de expressão em inseto infectado por baculovírus incluem um vetor de transferência, geralmente um plasmídeo bacteriano, que contém tanto um fragmento do genoma de baculovírus, como um sítio de restrição conveniente para a inserção do gene heterólogo a ser expresso; um baculovírus do tipo selvagem com uma seqüência homóloga ao fragmento específico de baculovírus no vetor de transferência (isto permite a recombinação homóloga do gene heterólogo no genoma do baculovírus); e as células hospedeiras de inseto apropriadas e meio de cultura. Os materiais, métodos e técnicas usados na construção de vetores, na transfecção de células, na coleta de placas, na cultura de células, e semelhantes são conhecidos da técnica, dispondo-se de manuais que descrevem estas técnicas.
[00440]Depois da inserção do gene heterólogo no vetor de transferência o vetor e o genoma viral do tipo selvagem são transfectados em uma célula hospedeira de inseto onde o vetor e o genoma viral recombinam. O vírus recombinante acondicionado é expresso e as placas recombinantes são identificadas e purificadas. Os materiais e métodos para sistemas de expressão baculovírus/célula de inseto são disponíveis em forma de kit de Invitrogen Corp. (Carlsbad, CA). Estas técnicas ilustrativas são descritas em SUMMERS AND SMITH, TEXAS AGRICULTURAL EXPERIMENT STATION BULLETIN NO. 1555 (1987), incorporada ao presente documento a título de referência. Ver também, RICHARDSON, 39 METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY: BACULOVIRUS EXPRESSION PROTOCOLS (1995); AUSUBEL ET AL., CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY 16.9-16.11 (1994); KING AND POSSEE, THE BACULOVIRUS SYSTEM: A LABORATORY GUIDE (1992); e O’REILLY ET AL., BACULOVIRUS EXPRESSION VECTORS: A LABORATORY MANUAL (1992).
[00441]A produção de diversas proteínas heterólogas usando-se sistemas de expressão baculovírus/célula de inseto esta descrita nas referencias a seguir e essas técnicas podem ser adaptadas na produção dos polipeptídeos de aminoácido não natural aqui descritos. Ver por exemplo, patentes U.S. Nos. 6.368.825; 6.342.216; 6.338.846; 6.261.805; 6.245.528. 6.225.060; 6.183.987; 6.168.932; 6.126.944; 6.096.304; 6.013.433; 5.965.393; 5.939.285; 5.891.676; 5.871.986; 5.861.279; 5.858.368; 5.843.733; 5.762.939; 5.753.220; 5.605.827; 5.583.023; 5.571.709; 5.516.657; 5.290.686; WO 02/06305; WO 01/90390; WO 01/27301; WO 01/05956; WO 00/55345; WO 00/20032; WO 99/51721; WO 99/45130; WO 99/31257; WO 99/10515; WO 99/09193; WO 97/26332; WO 96/29400; WO 96/25496; WO 96/06161; WO 95/20672; WO 93/03173; WO 92/16619; WO 92/02628; WO 92/01801; WO 90/14428; WO 90/10078; WO 90/02566; WO 90/02186; WO 90/01556; WO 89/01038; WO 89/01037; WO 88/07082, que são incorporadas ao presente documento a título de referência.
[00442]Os vetores que são úteis em sistemas de expressão baculovírus/célula de inseto são conhecidos na técnica e incluem, por exemplo, vetores de transferência e expressão de inseto derivados do vírus de poliedrose nuclear, do baculovírus Autographacalifornica (AcNPV) que é um vetor de expressão viral independente de auxiliar. Os vetores de expressão viral derivados deste sistema geralmente usam o promotor forte do gene de poliedrina viral para acionar a expressão de genes heterólogos. Ver, de modo geral, O’Reilly et al., BACULOVIRUS EXPRESSION VECTORS: A LABORATORY MANUAL (1992).
[00443]Antes da inserção do gene estranho ao genoma do baculovírus, os componentes descritos acima, compreendendo um promotor, líder (se desejado), seqüência de codificação de interesse e seqüência de terminação da transcrição, são tipicamente montados em um construtor de translocação intermediário (vetor de transferência). Os construtores de translocação intermediários são freqüentemente mantidos em um réplicon, tal como um elemento extra-cromossomal (plasmídeos, por exemplo) capazes de uma manutenção estável num hospedeiro, tal como de bactéria. O réplicon terá um sistema de replicação permitindo assim ser conservado em um hospedeiro adequado para a clonagem e a amplificação. Mais especificamente o plasmídeo pode conter o sinal de poliadenilação de poliedrina (Miller, ANN. REV. MICROBIOL. (1988) 42: 177) e um gene procariótico resistente a ampicilina (amp) e a origem de replicação para a seleção e propagação em E. coli.
[00444]Um vetor de transferência habitualmente usado para a introdução de genes estranhos em AcNPV é pAc373. Muitos outros vetores conhecidos dos versados na técnica foram também planejados, inclusive, por exemplo, pVL985, que altera o códon de iniciação de poliedrina de ATG para ATT e que introduz o sítio de clonagem BamHI 32 pares de bases a jusante de ATT. Ver Luckow e Summers, VIROLOGY 170:31 (1989). Outros vetores comercialmente disponíveis incluem, por exemplo, BlueBac4.5/V5-His; pBlueBacHis2; pMelBac; pBlueBac4.5 (Invitrogen Corp., Carlsbad, CA).
[00445]Após inserção do gene heterólogo, o vetor de transferência e o genoma do baculovírus do tipo selvagem são co-transfectados em uma célula hospedeira de inseto. Os métodos para a introdução de DNA heterólogo ao sítio desejado no vírus baculovírus são conhecidos da técnica. Ver SUMMERS AND SMITH, TEXAS AGRICULTURAL EXPERIMENT STATION BULLETIN NO. 1555 (1987); Smith et al., MOL. CELL. BIOL. (1983) 3: 2156; Luckow e Summers, VIROLOGY (1989) 170: 31-39. A guisa de exemplo, a inserção pode ser ao gene tal como o gene de poliedrina, por uma recombinação de permutação dupla homóloga; a inserção pode ser também efetuada em um sítio de enzima de restrição construído no gene de baculovírus desejado. Ver Miller et al., BIOASSAYS (1989) 11(4): 91.
[00446]A transfecção pode ser efetuada por eletroporação. Ver TROTTER AND WOOD, 39 METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY (1995); Mann e King, J. GEN. VIROL. (1989) 70:3501. Alternativamente, podem ser usados lipossomas para transfecção das células de inseto com o vetor de expressão recombinante e o baculovírus. ver, por exemplo, Liebman et al., BIOTECHNIQUES (1999) 26(1): 36; Graves et al., BIOCHEMISTRY (1998) 37: 6050; Nomura et al., J. BIOL. CHEM. (1998) 273(22): 13570; Schmidt et al., PROTEIN EXPRESSION AND PURIFICATION (1998) 12: 323; Siffert et al., NATURE GENETICS (1998) 18: 45; TILKINS ET AL., CELL BIOLOGY: A LABORATORY HANDBOOK 145-154 (1998); Cai et al., PROTEIN EXPRESSION AND PURIFICATION (1997) 10: 263; Dolphin et al., NATURE GENETICS (1997) 17: 491; Kost et al., GENE (1997) 190: 139; Jakobsson et al., J. BIOL. CHEM. (1996) 271: 22203; Rowles et al., J. BIOL. CHEM. (1996) 271(37): 22376; Reverey et al., J. BIOL. CHEM. (1996) 271(39): 23607-10; Stanley et al., J. BIOL. CHEM. (1995) 270: 4121; Sisk et al., J. VlROL. (1994) 68(2): 766; e Peng et al., BIOTECHNIQUES (1993) 14(2): 274. Lipossomas disponíveis no comercio incluem, por exemplo, Cellfectin® e Lipofectin® (Invitrogen, Corp., Carlsbad, CA). Além disso, pode ser usada a transfecção com fosfato de cálcio. Ver TROTTER AND WOOD, 39 METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY (1995); Kitts, NAR (1990) 18(19): 5667; e Mann e King, J. GEN. ViROL. (1989) 70: 3501.
[00447]Os vetores de expressão de baculovírus geralmente contêm um promotor de baculovírus. Um promotor de baculovírus é qualquer seqüência de DNA capaz de se ligar a uma RNA polimerase de baculovírus e iniciar a transcrição a jusante (3’) de uma seqüência de codificação (um gene estrutural, por exemplo) em mRNA. Um promotor terá uma região de iniciação de transcrição que é geralmente colocada proximal à extremidade 5’ da seqüência de codificação. Esta região de iniciação de transcrição tipicamente inclui um sítio de ligação a RNA polimerase e um sítio de iniciação de transcrição. Um promotor de baculovírus pode também ter um segundo domínio denominado um intensificador, que, se estiver presente, se encontra geralmente distal ao gene estrutural. Além disso, a expressão pode ser ou regulada ou constitutiva.
[00448]Os genes estruturais, abundantemente transcritos posteriormente, no ciclo de infecção proporcionam sequências promotoras especialmente úteis. Os exemplos incluem sequências derivadas do gene que codifica a proteína de poliedron viral (FRIESEN et. al, The Regulation of Baculovirus Gene Expression em THE MOLECULAR BIOLOGY OF BACULOVIRUSES (1986); EP 0 127 839 e 0 155 476) e o gene que codifica a proteína p10 (Vlak et al., J. GEN. VIROL. (1988) 69:765.
[00449]O vetor de expressão de baculovírus recém-formado é acondicionado em um baculovírus recombinante infeccioso e as placas subseqüentemente cultivadas podem ser purificadas por técnicas conhecidas dos versados na técnica. Ver Miller et al., BIOESSAYS (1989) 11(4): 91; SUMMERS AND SMITH, TEXAS AGRICULTURAL EXPERIMENT STATION BULLETIN NO. 1555 (1987).
[00450]Os vetores de expressão de baculovírus recombinante foram desenvolvidos para infecção em diversas células de insetos. Os baculovírus recombinantes foram desenvolvidos, por exemplo, foram desenvolvidos, inter alia, para Aedes aegypti (ATCC No. CCL-125), Bombyx mori (ATCC No. CRL-8910), Drosophila melanogaster (ATCC No. 1963), Spodoptera frugiperda, e Trichoplusia ni. Veja Wright, NATURE (1986) 321: 718; Carbonell et al., J. VIROL. (1985) 56: 153; Smith et al., MOL. CELL. BIOL. (1983) 3: 2156. Veja em linhas gerais, Fraser et al., IN VITRO CELL. DEV. BIOL. (1989) 25:225. Mais especificamente as linhagens de células usadas para os sistemas de vetor de expressão de baculovírus habitualmente incluem, sem limitação, Sf9 (Spodoptera frugiperda) (ATCC No. CRL- 1711), Sf21 (Spodoptera frugiperda) (Invitrogen Corp., Cat. No. 11497-013 (Carlsbad, CA)), Tri-368 (Trichopulsia ni), e High-FiveTM BTI-TN-5B1-4 (Trichopulsia ni).
[00451]As células e os meios de cultura são comercialmente disponíveis, tanto para a expressão direta como de fusão dos polipeptídeos heterólogos em baculovírus/expressão.
Bactérias
[00452]As técnicas de expressão bacteriana são conhecidas dos versados na técnica. Uma ampla variedade de vetores está disponível para uso em hospedeiro bacteriano. Os vetores podem ser vetores de uma única cópia ou de um número alto o baixo de cópias múltiplas. Os vetores podem servir para a clonagem e/ou expressão. Tendo em vista a ampla literatura referente a vetores, a disponibilidade comercial de muitos vetores e mesmo manuais que descrevem vetores e seus mapas de restrição e características, não é necessária uma discussão extensa. Conforme é fato bem conhecido, os vetores normalmente envolvem marcadores que permitem a seleção, marcadores esses que conferem resistência ao agente citotóxico, prototrofia ou imunidade. Freqüentemente, uma multiplicidade de marcadores está presente, que conferem diferentes características.
[00453]Um promotor bacteriano é qualquer seqüência de DNA capaz de se ligar à RNA polimerase bacteriana e de iniciar a transcrição a jusante (3’) de uma seqüência de codificação (gene estrutural, por exemplo) em mRNA. Um promotor terá uma região de iniciação de transcrição que é geralmente colocada proximal à extremidade 5’ da seqüência de codificação. A região de iniciação de transcrição tipicamente inclui um sítio de ligação a RNA polimerase e um sítio de iniciação de transcrição. Um promotor bacteriano pode também ter um segundo domínio denominado um operador, que pode se sobrepor ao sítio de ligação a RNA polimerase adjacente onde começa a síntese de RNA. O operador permite a transcrição regulada (indutiva) negativa, uma vez que a proteína repressora do gene pode se ligar ao operador e deste modo inibir a transcrição de um gene específico. A expressão constitutiva pode ocorrer na ausência de elementos reguladores negativos, tais como o operador. Além disso, a regulação positiva pode ser obtida por uma seqüência de ligação a proteína ativadora de gene, que, se presente, está geralmente proximal (5’) à seqüência de ligação a RNA polimerase. Um exemplo de uma proteína ativadora de gene é a proteína ativadora de catabólitos (CAP) que ajuda a iniciar a transcrição do operon lac em Escherichia coli (E. coli) [Raibaud et al., ANNU. REV. GENET. (1984) 18:173]. A expressão regulada pode, portanto, ser ou positiva ou negativa, ou intensificando, portanto, ou reduzindo a transcrição.
[00454]As sequências que codificam as enzimas do trajeto metabólico proporcionam sequências especialmente úteis. Os Exemplos incluem sequências promotoras derivadas de enzimas metabolizantes de açúcar, tais como galactose, lactose (lac) [Chang et al., NATURE (1977) 198:1056], e maltose. Exemplos adicionais incluem sequências promotoras derivadas de enzimas biossintéticas tais como triptofano (trp) [Goeddel et al., Nuc. ACIDS RES. (1980) 8: 4057; Yelverton et al., NUCL. ACIDS RES. (1981) 9: 731; patente U.S. No. 4.738.921; EPO Pub. Nos. 036 776 e 121 775, que são incorporados ao presente documento a título de referência]. O sistema promotor de β-galactosidase (bla) [Weissmann (1981) “The cloning of interferon and other mistakes.” In Interferon 3 (Ed. I. Gresser)], sistemas de bacteriofago À PL [Shimatake et al., NATURE (1981) 292:128] e de T5 [patente U.S. No. 4.689.406], cada qual incorporado por referência em sua totalidade, sistemas de promotor também proporcionam sequências promotoras úteis. Os métodos preferidos aqui contidos utilizam promotores fortes tais como o promotor T7 para induzir a produção de polipeptídeos em altos níveis. Exemplos de tais vetores incluem a série pET29 de Novagen e os vetores pPOP descritos em WO 99/05297, ora incorporados a título de referência. Tais sistemas de expressão produzem altos níveis de polipeptídeo no hospedeiro sem comprometer a viabilidade ou parâmetros de crescimento.
[00455]Além disso, promotores sintéticos que não ocorrem na natureza também funcionam como promotores bacterianos. As sequências de ativação de transcrição de um promotor bacteriano ou de bacteriófago, por exemplo, podem ser ligadas com as sequências do operon de um outro promotor bacteriano ou de bacteriófago, criando um promotor híbrido sintético [patente U.S. No. 4.551.433. O promotor tac, por exemplo, é um promotor trp-lac híbrido constituído por sequências, tanto do promotor trp como do operon lac e que é regulado pelo repressor lac [Amann et al., GENE (1983) 25: 167; de Boer et al., PROC. NATL. ACAD. SCI. (1983) 80: 21]. Além disso, um promotor bacteriano pode incluir promotores que ocorrem naturalmente de origem não bacteriana que têm a capacidade de se ligar a RNA polimerase bacteriana e iniciar a transcrição. Um promotor de origem não bacteriana que ocorre naturalmente pode também ser acoplado com uma RNA polimerase compatível para produzir níveis altos de expressão de alguns genes em procariontes. O sistema RNA polimerase/promotor de bacteriofase T7 é um exemplo de um sistema promotor acoplado [Studier et al., J. MOL. BIOL. (1986) 189: 113; Tabor et al., Proc Natl. Acad. Sci. (1985) 82: 1074]. Além disso, um promotor híbrido pode também ser constituído por um promotor bacteriófago e uma região operadora de E. coli (EPO Pub. No. 267 851).
[00456]Além de uma seqüência promotora em funcionamento, um sítio de ligação a ribossomo eficiente é também útil para a expressão de genes estranhos em procariontes. Em E. coli, o sítio de ligação a ribossomo é denominado a seqüência de Shine-Dalgarno (SD) e inclui um códon de iniciação (ATG) e uma seqüência de 3-9 nucleotídeos de comprimento localizada 3-11 nucleotídeos a montante do códon de iniciação [Shine et al., NATURE (1975) 254:34]. Pensa-se que a seqüência SD promova a ligação de RNAm ao ribossomo por pareamento de bases entre a seqüência de SD e a extremidade 3’ de RNAt de 16S de E. coli [Steitz et al. “Genetic signals and nucleotide sequences in messenger RNA”, em Biological Regulation and Development: Gene Expression (Ed. R. F. Goldberger, 1979)]. Para expressar genes eucarióticos e genes procarióticos com sítio de ligação fraco a ribossomo [Sambrook et al. “Expression of cloned genes in Escherichia coli”, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 1989].
[00457]O termo “hospedeiro bacteriano” ou “célula hospedeira bacteriana" se refere a uma célula bacteriana que pode ser, ou foi usada como um receptor para vetores recombinantes ou outro DNA de transferência. O termo inclui a progênie da célula hospedeira bacteriana original que foi transfectada. Deve ficar subentendido que a progênie de uma única célula progenitora pode não necessariamente ser completamente idêntica em morfologia ou em complemento de DNA genômico ou total à progenitora original, devido a uma mutação acidental ou deliberada. A progênie da célula de origem que for suficientemente semelhante à original para ser caracterizada pela propriedade relevante, tal como a presença de uma seqüência de nucleotídeo que codifica um polipeptídeo desejado, é incluída nesta definição de progênie.
[00458]A seleção de bactérias hospedeiras adequadas para a expressão de um desejado polipeptídeo, é conhecida dos versados na técnica. Ao se selecionar hospedeiros bacterianos para expressão, os hospedeiros adequados podem incluir,os que demonstram, preferivelmente pelo menos duas das seguintes características inter alia, uma boa capacidade de formação de corpo de inclusão, uma atividade proteolítica baixa e uma robustez geral. Hospedeiros bacterianos são geralmente disponíveis de uma variedade de fontes incluindo, sem limitação, o Bacterial Genetic Stock Center, Department of Biophysics and Medical Physics, Universidade da Califórnia (Berkeley, CA); e a American Type Culture Collection (“ATCC”) (Manassa, VA). A fermentação industrial/farmacêutica geralmente usa bactérias derivadas de cepas K (W3110, por exemplo) ou bactérias derivadas de cepas B (BL21, por exemplo). Estas cepas são especialmente úteis devido aos seus parâmetros de cultura serem extremamente bem conhecidos e por serem robustas. Além disso, estas cepas são não-patogênicas, o que é importante comercialmente por considerações de segurança e meio ambiente. Em uma modalidade, o hospedeiro de E. coli inclui, sem limitação, cepas de BL21, DH10B, ou seus derivados. Em uma outra modalidade dos métodos aqui descritos e abrangidos, o hospedeiro de E. coli é uma cepa de cepa secundária de protease, incluindo, sem limitação, OMP- e LON-. Numa outra modalidade, o hospedeiro bacteriano é uma espécie de Pseudomonas; tal como Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas aeruginosa e Pseudomonas putida. Um exemplo de uma cepa de expressão em Pseudomonas é P. fluorescens biovar I, cepa MB101 (DOW Chemical).
[00459]Uma vez a cepa de célula hospedeira recombinante ser estabelecida (isto é, uma vez introduzido o construtor de expressão na célula hospedeira, e as células hospedeiras com o adequado construtor de expressão serem isoladas), a cepa de célula hospedeira recombinante é dependente da natureza do construtor de expressão utilizado e da identidade da célula hospedeira. As células hospedeiras recombinantes são tipicamente cultivadas em meio líquido contendo fontes assimiláveis de carbono, nitrogênio e sais inorgânicos, e, opcionalmente, contendo vitaminas, aminoácidos, fatores de crescimento e outros suplementos proteináceos de cultura conhecidos dos versados na técnica. O meio líquido para cultura das células hospedeiras pode conter, opcionalmente, antibióticos ou fungicidas para evitar o crescimento de microorganismos indesejáveis e/ou compostos, incluindo, sem limitação, antibióticos para seleção de células hospedeiras contendo o vetor de expressão.
[00460]As células hospedeiras recombinantes podem ser cultivadas em formato contínuo ou em batelada, ou com coleta de células (no caso em que o polipeptídeo desejado se acumula intracelularmente) ou com coleta do sobrenadante da cultura em formatos contínuos ou em batelada. Para a produção em células hospedeiras procarióticas, são preferidas a cultura em batelada e a coleta de células.
[00461]Numa modalidade, os polipeptídeos de aminoácido não natural aqui descritos são purificados após expressão em sistemas recombinantes. Os polipeptídeos podem ser purificados a partir de células hospedeiras, ou do meio de cultura por uma variedade de métodos conhecidos na técnica. Normalmente muitos polipeptídeos produzidos em células hospedeiras bacterianas são fracamente solúveis ou insolúveis (na forma de corpos de inclusão) Numa modalidade, substituições de aminoácido podem ser prontamente realizadas nos polipeptídeos selecionados para finalidade de aumento da solubilidade do polipeptídeo recombinantemente produzido utilizando os métodos aqui apresentados, como é do conhecimento da técnica. No caso de polipeptídeos insolúveis, os polipeptídeos podem ser coletados dos lisados de células hospedeiras por centrifugação e podem ainda ser submetidos à homogeneização das células. No caso de polipeptídeos fracamente solúveis, podem ser acrescentados compostos que incluem, sem limitação, polietileno imina (PEI) para induzir a precipitação de polipeptídeos parcialmente solúveis. Os polipeptídeos precipitados podem então ser convenientemente coletados por centrifugação ou filtração. As células hospedeiras recombinantes podem ser destruídas ou homogeneizadas para liberar os corpos de inclusão no interior das células usando-se uma variedade de métodos conhecidos dos versados na técnica. A destruição ou homogeneização das células hospedeiras podem ser conduzida usando-se técnicas conhecidas que incluem, sem limitação, destruição de células enzimáticas, tratamento com som, homogeneização ("dounce"). Em uma modalidade dos métodos aqui descritos e abrangidos, a técnica de liberação a alta pressão é usada para destruir as células hospedeiras de E. coli para liberar os corpos de inclusão dos polipeptídeos. Descobriu-se que, a produção dos polipeptídeos insolúveis na forma de corpos de inclusão, pode ser aumentada pela utilização apenas uma vez da passagem das células hospedeiras de E. coli pelo homogeneizador. Quando do manuseio dos corpos de inclusão de polipeptídeos é vantajoso minimizar o tempo de homogeneização em repetições, de modo a maximizar a produção dos corpos de inclusão sem haver perda, devido a fatores tais como solubilização, cisalhamento mecânico ou proteólise.
[00462]Polipeptídeos insolúveis ou precipitados podem então ser solubilizados usando-se qualquer um de uma série de agentes de solubilização adequados conhecidos na técnica. A guisa de exemplo, os polipeptídeos são solubilizados com uréia ou cloridrato de guanidina. O volume dos polipeptídeos solubilizados deve ser minimizado de modo que possam ser produzidas grandes bateladas usando-se tamanhos de batelada convenientemente manipuláveis. Este fator pode ser significativo em um ambiente comercial em grande escala onde o hospedeiro recombinante pode ser cultivado em bateladas que têm milhares de litros de volume. Além disso, quando da produção de polipeptídeos em um ambiente comercial em grande escala, especialmente para usos farmacêuticos humanos, deve ser evitado, se possível o emprego de substâncias químicas cáusticas que possam danificar a maquinaria e o recipiente ou o próprio polipeptídeo. Foi demonstrado no método da presente invenção que o agente desnaturante mais brando, uréia, pode ser usado para se solubilizar os corpos de inclusão no polipeptídeo, no lugar de cloridrato de guanidina que é um agente mais cáustico. O uso da uréia reduz significativamente, o risco de dano ao equipamento de aço inoxidável utilizado no processo de fabricação e purificação de um polipeptídeo, solubilizando ao mesmo tempo eficientemente os corpos de inclusão no polipeptídeo.
[00463]No caso de polipeptídeos solúveis, os peptídeos podem ser secretados no espaço periplasmático ou no meio de cultura. Além disso, peptídeos solúveis podem estar presentes no citoplasma das células hospedeiras. Pode ser desejável se concentrar o peptídeo solúvel antes de se proceder às etapas de purificação. As técnicas padrão conhecidas dos versados na técnica podem ser usadas para se concentrar o peptídeo solúvel, a partir de lisados de células ou do meio de cultura, por exemplo. Além disso, podem ser usadas técnicas padrão conhecidas dos versados na técnica para destruir as células hospedeiras e liberar o peptídeo solúvel do espaço periplasmático ou do citoplasma das células hospedeiras.
[00464]Quando o polipeptídeo é produzido em forma de uma proteína de fusão, a seqüência de fusão é preferivelmente removida. A remoção de uma seqüência de fusão pode ser efetuada por clivagem enzimática ou química, preferivelmente clivagem enzimática. A remoção enzimática de sequências de fusão pode ser realizada, usando-se os métodos conhecidos dos versados na técnica. A escolha da enzima para a remoção da seqüência de fusão será determinada pela identidade da fusão e as condições de reação serão especificadas pela escolha da enzima. A clivagem química pode ser produzida usando-se reagentes conhecidos dos versados na técnica, inclusive, sem limitação, brometo de cianogênio, TEV protease e outros reagentes. O polipeptídeo clivado é opcionalmente purificado a partir da seqüência de fusão clivada por métodos do conhecimento da técnica. Tais métodos podem ser determinados pela identidade e propriedades da seqüência de fusão e do polipeptídeo. Os métodos de purificação podem incluir, sem limitação, cromatografia de exclusão por tamanho, cromatografia de interação hidrofóbica, cromatografia de troca de íons ou diálise ou qualquer combinação destes.
[00465]O polipeptídeo pode ainda, ser purificado para se remover o DNA da solução de proteína. O DNA pode ser removido por qualquer método adequado conhecido na técnica, tal como por precipitação ou cromatografia de troca de íons, mas pode ser removido por precipitação com um agente de precipitação de ácido nucléico, tal como, sem limitação, sulfato de protamina. O polipeptídeo pode ser separado do DNA precipitado usando-se métodos padrão bem conhecidos, incluindo, sem limitação, centrifugação ou filtração. A remoção das moléculas de ácido nucléico hospedeiras é um fator importante em um ambiente em que o polipeptídeo deve ser usado para o tratamento de seres humanos e os métodos aqui descritos, reduzem o DNA da célula hospedeira a níveis farmaceuticamente aceitáveis.
[00466]Os métodos para uma fermentação em pequena ou em grande escala podem também ser usados na expressão de proteína, incluindo, sem limitação, fermentadores, frascos de agitação, biorreatores de leito fluidificado, biorreatores de fibra oca, sistemas de cultura em cilindros, e sistemas de biorreatores em tanque agitado. Cada um destes métodos pode ser conduzido em um processo de batelada, de batelada alimentada ou no modo contínuo.
[00467]Formas humanas dos polipeptídeos de aminoácido não natural da invenção podem ser geralmente recuperados usando-se métodos padrão na técnica. O meio de cultura ou o lisado de células, por exemplo, pode ser centrifugado ou filtrado para se remover os detritos celulares. O sobrenadante pode ser concentrado ou diluído até um volume desejado ou filtrado por diálise em um tampão adequado para condicionar o preparado para uma subseqüente purificação. A purificação adicional dos polipeptídeos de aminoácido não natural pode incluir, sem limitação, a separação de formas desamidadas e aparadas de uma variante de polipeptídeo da forma intacta correspondente.
[00468]Qualquer um dos procedimentos exemplares abaixo pode ser empregado para a purificação de um polipeptídeo de aminoácido não natural aqui descrito: cromatografia de afinidade; cromatografia de troca de ânions ou de cátions; (usando-se, inclusive, sem limitação, DEAE SEPHAROSE); cromatografia sobre sílica; cromatografia líquida de alto desempenho (HPLC); HPLC de fase reversa; filtração por gel (usando-se, inclusive, sem limitação, SEPHADEX G-75); cromatografia de interação hidrofóbica; cromatografia de exclusão de tamanho, cromatografia de quelato metálico; ultrafiltração/filtração por diálise; precipitação com etanol; precipitação com sulfato de amônio; cromato-focalização; cromatografia de deslocamento; procedimentos eletroforéticos (inclusive, sem limitação, focalização isoelétrica preparatória), solubilidade diferencial (inclusive, sem limitação precipitação com sulfato de amônio), SDS-PAGE ou extração ou qualquer combinação dos acima.
[00469]Os polipeptídeos abrangidos nos métodos e composições aqui descritos incluem, sem limitação, polipeptídeos que compreendem aminoácidos não naturais, anticorpos e polipeptídeos que compreendem aminoácidos não naturais, parceiros de ligação para polipeptídeos que compreendem aminoácidos não naturais, podem ser purificados, tanto parcialmente como substancialmente até a homogeneidade, de acordo com procedimentos padrão conhecidos pelos versados na técnica e usados por eles. Conseqüentemente, os polipeptídeos podem ser recuperados e purificados por qualquer um de uma série de métodos conhecidos dos versados na técnica, inclusive, sem limitação, precipitação com sulfato de amônio ou etano, extração de ácido ou base, cromatografia de coluna, cromatografia de coluna de afinidade, cromatografia de troca de ânions ou cátions, cromatografia de fosfocelulose, cromatografia de interação hidrofóbica, cromatografia de hidroxilapatita, cromatografia de lectina, eletroforese de gel e semelhantes. Podem ser usadas etapas de redobramento de proteína, conforme desejado, na produção de proteínas maduras corretamente dobradas. A cromatografia líquida de alto desempenho (HPLC), a cromatografia de afinidade ou outros métodos adequados podem ser empregados nas etapas finais de purificação, nos casos em que for desejado um alto grau de pureza. Em uma modalidade, os anticorpos produzidos contra os aminoácidos não naturais (ou polipeptídeos compreendendo aminoácidos não naturais) são usados como reagentes de purificação, incluindo, sem limitação, para a purificação a base de afinidade de polipeptídeos compreendendo um ou mais aminoácidos não naturais. Uma vez purificados, parcialmente ou até a homogeneidade, conforme o caso, os polipeptídeos são opcionalmente usados para uma ampla gama de utilidades, inclusive, sem limitação, como componentes de ensaio, produtos terapêuticos, reagentes de profilaxia, diagnósticos, de pesquisa e/ou como imunógenos para a produção de anticorpos.
[00470]Além das outras referências aqui citadas, uma variedade de métodos de purificação/dobramento de proteína é conhecida dos versados na técnica, inclusive, sem limitação, os apresentados em R. Scopes, Protein Purification, Springer-Verlag, N.Y. (1982); Deutscher, Methods in Enzymology Vol. 182: Guide to Protein Purification, Academic Press, Inc. N. Y. (1990); Sandana, (1997) Bioseparation of Proteins, Academic Press, Inc.; Bollag et al. (1996) Protein Methods, 2a. edição Wiley-Liss, NY; Walker, (1996) The Protein Protocols Handbook Humana Press, NJ, Harris and Angal, (1990) Protein Purification Applications: A Practical Approach IRL Press at Oxford, Oxford, England; Harris e Angal, Protein Purification Methods: A Practical Approach IRL Press at Oxford, Oxford, England; Scopes, (1993) Protein Purification: Principles and Practice 3a. edição Springer Verlag, NY; Janson and Ryden, (1998) Protein Purification: Principles, High Resolution Methods and Applications, Segunda Edição Wiley-VCH, NY; e Walker (1998), Protein Protocols on CD-ROM Humana Press, NJ; e as referências citadas neles.
[00471]Uma vantagem de se produzir polipeptídeos compreendendo pelo menos um aminoácido não natural em uma célula hospedeira eucariótica ou em uma célula hospedeira não eucariótica consiste no fato de que os polipeptídeos serão dobrados em suas conformações nativas. No entanto em determinadas modalidades dos métodos e composições aqui descritos, após a síntese, expressão e/ou purificação, os polipeptídeos podem possuir uma conformação diferente das conformações desejadas dos polipeptídeos relevantes. Em um aspecto da invenção, a proteína expressa é opcionalmente desnaturada e em seguida renaturada. Esta desnaturação e renaturação opcional é feita utilizando-se métodos conhecidos da técnica, inclusive, sem limitação, por adição de uma chaperonina ao polipeptídeo de interesse, por solubilização dos polipeptídeos em um agente caotrópico tal como, sem limitação, cloridrato de guanidina e utilizando dissulfeto de isomerase de proteína.
[00472]Em geral é ocasionalmente desejável se desnaturar e reduzir os polipeptídeos expressos, fazendo-se então os polipeptídeos redobrarem na conformação preferida. À guisa de exemplo, tal redobragem pode ser realizada com adição de guanidina, uréia, DTT, DTE e/ou uma chaperonina, a um produto de tradução de interesse. Os métodos de redução, desnaturação ou renaturação de proteínas são conhecidos dos versados na técnica (veja, as referências acima, e Debinski, et al. (1993) J. Biol. Chem., 268: 14065-14070; Kreitman e Pastan (1993) Bioconjug. Chem., 4: 581-585; e Buchner, et al., (1992) Anal. Biochem., 205: 263-270). Debinski, et al., por exemplo, descreve a desnaturação e redução de proteínas de corpos de inclusão de guanidina-DTE. As proteínas podem ser redobradas em um tampão redox contendo, inclusive, sem limitação, glutatione oxidado e L-arginina. Os reagentes de redobramento podem ser lançados em corrente ou de outro modo, colocados em contato com um ou mais polipeptídeos ou outro produto de expressão ou vice-versa.
[00473]No caso da produção procariótica de um polipeptídeo de aminoácido não natural, o polipeptídeo deste modo produzido, pode ser restaurado por “redobramento”. Em geral um polipeptídeo mal dobrado é redobrado por solubilização (nos casos em que o polipeptídeo for também insolúvel), desdobramento e redução da cadeia polipeptídica usando-se, por exemplo, um ou mais agentes caotrópicos (uréia e/ou guanidina, por exemplo) e um agente redutor capaz de reduzir as pontes dissulfeto (ditiotreitol, DTT ou 2-mercapto-etanol, 2-ME, por exemplo). A uma concentração moderada de caótropo, é então adicionado, um agente oxidante (oxigênio, cistina ou cistamina, por exemplo), o que permite a reforma das pontes dissulfeto. Um polipeptídeo desdobrado ou dobrado erroneamente pode ser redobrado usando-se métodos padrão conhecidos na técnica, tais como os descritos nas patentes U.S. Nos. 4.511.502, 4.511.503, e 4.512.922 estando cada qual, incorporada por referência em sua totalidade. O polipeptídeo também pode ser dobrado em conjunto com outras proteínas formando heterodímeros ou heteromultímeros. Após redobragem ou dobragem em conjunto, o polipeptídeo é opcionalmente, ainda purificado.
[00474]A purificação dos polipeptídeos de aminoácido não natural pode ser realizada usando uma serie de técnicas, que incluem, sem limitação, aquelas aqui descritas, à guisa de exemplo, cromatografia de interação hidrofóbica, cromatografia de exclusão por tamanho, cromatografia de troca de íons, cromatografia líquida de alto desempenho de fase reversa, cromatografia de afinidade e semelhantes ou qualquer combinação delas. Uma purificação adicional pode também incluir uma etapa para se secar ou precipitar a proteína purificada.
[00475]Depois da purificação os polipeptídeos de aminoácido não natural podem ser trocados em tampões diferentes e/ou concentrados por qualquer um de uma variedade de métodos conhecidos na técnica, incluindo, sem limitação, ultrafiltração, diafiltração e diálise. O hGH que é proporcionado em forma de uma única proteína purificada pode ser submetido a agregação e precipitação. Em algumas modalidades, os polipeptídeos de aminoácido não natural purificados podem ser pelo menos 90% puros (conforme medido por cromatografia líquida de alto desempenho de fase reversa, RP-HPLC, ou eletroforese sobre dodecil sulfato de sódio-gel de poliacrilamida, SDS-PAGE). Em algumas outras modalidades, os polipeptídeos de aminoácido não natural purificados podem ser pelo menos 95%, ou pelo menos 98%, ou pelo menos 99% ou mais puros. Independentemente do valor numérico exato da pureza dos polipeptídeos de aminoácido não natural, os polipeptídeos de aminoácido não natural são suficientemente puros para emprego como um produto farmacêutico ou para um processamento subseqüente, tal como a conjugação com um polímero hidrossolúvel tal como PEG.
[00476]Em modalidades adicionais, as moléculas dos polipeptídeos de aminoácido não natural podem ser usadas como agentes terapêuticos na ausência de outros ingredientes ativos ou proteínas (diferentes dos excipientes, veículos e estabilizantes, albumina sérica e similar), e, em outras modalidades, as moléculas dos polipeptídeos de aminoácido não natural que eles podem ser complexados com um outro polipeptídeo ou um polímero.
2. Purificação dos Polipeptídeos de aminoácido não natural Métodos de Purificação Gerais
[00477]As técnicas apresentadas neste parágrafo, podem ser aplicadas à purificação geral dos polipeptídeos de aminoácido não natural aqui descritos.
[00478]Qualquer uma de uma variedade de etapas de isolamento pode ser conduzida no extrato de lisado de células, meio de cultura, corpos de inclusão, espaço periplasmático das células hospedeiras, citoplasma das células hospedeiras ou outro material, compreendendo o polipeptídeo desejado ou em quaisquer misturas de polipeptídeo que resultem de qualquer etapa de isolamento inclusive, sem limitação, cromatografia de afinidade, cromatografia de troca de íons, cromatografia de interação hidrofóbica, cromatografia de filtração por gel, cromatografia líquida de alto desempenho (“HPLC”), HPLC de frase reversa (“RP- HPLC”), adsorção de leito expandido ou qualquer combinação e/ou repetição destes e em qualquer ordem adequada.
[00479]O equipamento e outros materiais necessários usados na colocação em prática das técnicas descritas no presente documento são disponíveis no comércio. Bombas, coletores de frações, monitores, gravadores e sistemas inteiros são disponíveis, por exemplo, de Applied Biosystems (Foster City, CA), Bio-Rad Laboratories, Inc. (Hercules, CA), e Amersham Biosciences, Inc. (Piscataway, NJ). Os materiais cromatográficos incluindo, sem limitação, materiais de matriz de troca, meios, e tampões são também disponíveis de tais companhias.
[00480]A etapa de equilíbrio e outras etapas nos processos de cromatografia de coluna, descritos no presente documento, tais como lavagem e eluição, podem ser mais rapidamente efetuados usando-se equipamento especializado tal como uma bomba. As bombas disponíveis no comércio incluem, sem limitação, Bomba HILOAD® P-50, Bomba Peristáltica P-1, Bomba P-901, e Bomba P-903 (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ).
[00481]Exemplos de coletores de fração incluem Coletor de Frações RediFrac, Coletores de Frações FRAC-100 e FRAC-200, e Coletor de Frações SUPERFRAC® (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ). Misturadores são também disponíveis para formar gradientes de pH e de concentração linear. Os misturadores disponíveis no comércio incluem o Misturador de Gradiente Gradient Mixer GM-I e Misturadores Em-Linha (Amersham, Biosciences, Piscataway, NJ).
[00482]O processo cromatográfico pode ser monitorado usando-se qualquer monitor disponível no comércio. Tais monitores podem ser usados para se obter informação tais como UV, pH e condutividade. Exemplos de detectores incluem Monitor UV-I, UVICORD® S II, Monitor UV-M II, Monitor UV-900, Monitor UPC-900, Monitor pH/C-900, e Monitor de Condutividade (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ). Na verdade, sistemas inteiros são disponíveis no comércio inclusive diversos sistemas AKTA® de Amersham Biosciences (Piscataway, NJ).
[00483]Numa modalidade dos métodos e composições aqui descritos, o polipeptídeo pode, por exemplo, ser reduzido e desnaturado, primeiro por desnaturação do polipeptídeo purificado resultante em uréia, seguido por diluição em tampão de TRIS contendo um agente redutor (como DTT) num pH adequado. Numa outra modalidade, o polipeptídeo é desnaturado em uréia numa faixa de concentração entre cerca de 2 M a cerca de 9M, seguido por diluição em tampão de TRIS a um pH na faixa de cerca de 5,0 a cerca de 8,0 A mistura de redobragem desta modalidade pode, então, der incubada. Numa modalidade, a mistura de redobragem é incubada a temperatura ambiente por quatro a vinte e quatro horas. A mistura de polipeptídeo reduzida e desnaturada pode então ser ainda isolada ou purificada.
[00484]Conforme declarado no presente documento, o pH da primeira mistura de polipeptídeo pode ser ajustada antes de realizar qualquer etapa de isolamento subseqüente. Além disso, a primeira mistura de polipeptídeo ou de qualquer mistura subseqüente dele, pode ser concentrada usando-se técnicas conhecidas. Além disso, o tampão de eluição que compreende a primeira mistura de polipeptídeo ou qualquer mistura subseqüente, pode ser trocada com um tampão adequado para a próxima etapa de isolamento usando-se técnicas conhecidas dos versados na técnica.
Cromatografia de Troca de Íons
[00485]As técnicas apresentadas neste parágrafo podem ser aplicadas a cromatografia iônica dos polipeptídeos de aminoácido não natural aqui descritos.
[00486]Em uma modalidade, e como uma etapa adicional, a cromatografia de troca de íon pode ser realizada na primeira mistura de polipeptídeo. Ver, para as considerações gerais ION EXCHANGE CHROMATOGRAPHY: PRINCIPLES AND METHODS (Cat. No. 18-1114-21, Amersham Biosciences (Piscataway, NJ)). As colunas de troca de íons disponíveis no comércio incluem Colunas HITRAP®, HIPREP®, e HILOAD® (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ). Tais colunas utilizam trocadores de ânions fortes tais como Q SEPHAROSE® Fluxo Rápido, Q SEPHAROSE® Alto Desempenho, e Q SEPHAROSE® XL; trocadores de cátions fortes tais como SP SEPHAROSE® Alto Desempenho, SP SEPHAROSE® Fluxo Rápido, e SP SEPHAROSE® XL; trocadores de ânions fracos tais como DEAE SEPHAROSE® ; e trocadores de cátions fracos tais como CM SEPHAROSE® Fluxo Rápido (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ). Pode se realizar uma cromatografia de coluna de troca de ânion ou de cátion podem ser conduzida no polipeptídeo em qualquer estágio do processo de purificação para isolar o polipeptídeo substancialmente purificado. A etapa de cromatografia de troca de cátions pode ser conduzida usando-se qualquer matriz de troca de cátions adequada. As matrizes de troca de cátions úteis incluem, sem limitação, materiais de matriz fibrosos, porosos, não porosos, microgranulares, em esferas, ou reticulados. Tais materiais de matriz de troca de cátions incluem, sem limitação, celulose, agarose, dextrana, poliacrilato, polivinila, poliestireno, sílica, poliéter ou compósitos de qualquer dos precedentes. Seguinte a adsorção do polipeptídeo da matriz de troca de cátion o polipeptídeo substancialmente purificado pode ser eluído mediante contato da matriz com um tampão tendo um pH suficientemente alto ou resistência iônica para deslocar o polipeptídeo da matriz. Tampões adequados para emprego em eluição de alto pH do polipeptídeo substancialmente purificado, incluem, sem limitação, a tampões de citrato, fosfato, formiato, acetato, HEPES e MES variando em concentração de pelo menos cerca de 5 mM a pelo menos cerca de 100 mM.
Cromatografia de Fase Reversa
[00487]As técnicas apresentadas neste parágrafo podem ser aplicadas à cromatografia de fase reversa dos polipeptídeos de aminoácido não natural aqui descritos.
[00488]RP-HPLC pode ser realizada para purificar proteínas de acordo com protocolos adequados que são conhecidos dos versados na técnica. Ver, por exemplo, Pearson et al., ANAL BIOCHEM. (1982) 124: 217-230 (1982); Rivier et al., J. CHROM. (1983) 268: 112-119; Kunitani et al., J. CHROM. (1986) 359: 391-402. RP-HPLC pode ser realizada no polipeptídeo para isolar o polipeptídeo substancialmente purificado. Neste sentido, podem ser usadas resinas derivadas de sílica contendo grupos funcionais alquila com uma gama de comprimentos, inclusive, sem limitação, resinas de pelo menos aproximadamente C3 a pelo menos aproximadamente C30, de 3 pelo menos aproximadamente C3 a pelo menos aproximadamente C20, ou de pelo menos aproximadamente C3 a pelo menos aproximadamente C18. Alternativamente, pode ser usada uma resina polimérica. Pode ser usada, por exemplo, a resina TosoHaas Amberchrome CG1000sd, que é uma resina polimérica de estireno. Resinas ciano ou poliméricas com uma ampla faixa de comprimentos de cadeia alquila também podem ser usadas. Além disso a coluna de RP-HPLC pode ser lavada com um solvente tal como etanol. Um tampão de eluição adequado contendo um agente de pareamento iônico e um modificador orgânico tal como metanol, isopropanol, tetraidrofurano, acetonitrila ou etanol podem ser usados para eluição do polipeptídeo da coluna RP-HPLC. Os agentes de pareamento iônicos mais habitualmente usados incluem, sem limitação, ácido acético, ácido fórmico, ácido perclórico, a ácido fosfórico, ácido trifluoracético, ácido heptaflúor-butírico, trietilamina, acetato de tetrametil amônio, tetrabutil amônio, trietil amônio. A eluição pode ser conduzida usando-se um ou mais gradientes ou condições isocráticas, sendo preferidas condições de gradientes para a redução do tempo de separação e para reduzir a largura de pico. Um outro método envolve o uso de dois gradientes com diferentes faixas de concentração do solvente. Exemplos de tampões de eluição para emprego no presente incluem, sem limitação, soluções de acetato de amônio e acetonitrila.
Técnicas de Purificação de Cromatografia de Interação Hidrofóbica.
[00489]As técnicas apresentadas neste parágrafo podem ser aplicadas à purificação por cromatografia de interação hidrofóbica dos polipeptídeos de aminoácido não natural aqui descritos.
[00490]A cromatografia de interação hidrofóbica (HIC) pode ser realizada no polipeptídeo. Ver, para o sentido geral HYDROPHOBIC INTERACTION CHROMATOGRAPHY HANDBOOK: PRINCIPLES AND METHODS (Cat. No. 18-1020-90, Amersham Biosciences (Piscataway, NJ), ora incorporado por referência ao presente. Matrizes HIC adequadas podem incluir, sem limitação, matrizes alquil- ou aril-substituídas, tais como matrizes butil-, hexil-, octil ou fenil substituídos, incluindo matrizes de agarose, agarose reticulada, sefarose, celulose, sílica, dextrana, poliestireno, poli(metacrilato) e resinas em modo misto, incluindo, sem limitação, a uma resina de polietilenoamina ou uma matriz de polimetacrilato substituída com butila ou fenila. Fontes comercialmente disponíveis para cromatografia de coluna de interação hidrofóbica incluem, sem limitação, colunas HITRAP(R), HIPREP(R) e HILOAD(R) (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ) Em resumo, antes de carregar, a coluna HIC pode ser equilibrada usando tampões padrão dos conhecimentos da técnica comuns, tal como solução de ácido acético/cloreto de sódio ou HEPES contendo sulfato de amônio. Sulfato de amônio pode ser usado como o tampão para carregamento da coluna HIC. Após carrear o polipeptídeo a coluna pode ser lavada usando tampões padrão e condições de remoção de material indesejado, porém retendo o polipeptídeo na coluna HIC. O polipeptídeo pode ser eluído com cerca de 3 a cerca de 10 volumes de coluna de um tampão padrão, tal como um tampão HEPES contendo EDTA e concentração menor de sulfato de amônio que o tampão de equilíbrio, ou um tampão de ácido acético/ cloreto de sódio, dentre outros. Um gradiente de sal linear redutor para uso, por exemplo, um gradiente de fosfato de potássio, também pode ser empregado para eluição das moléculas de polipeptídeo. O eluente pode então ser concentrado, por exemplo, por filtração tal como diafiltração ou ultrafiltração. A diafiltração pode ser utilizada para remover o sal usado para eluição do polipeptídeo.
Outras Técnicas de Purificação.
[00491]As técnicas apresentadas neste parágrafo podem ser aplicadas a outras técnicas de purificação dos polipeptídeos de aminoácido não natural aqui descritos.
[00492]Ainda uma outra etapa de isolamento, por exemplo, é a filtração com gel (GEL FILTRATION: PRINCIPLES AND METHODS (Cat. n° 18-1022-18, Amersham Biosciences, Piscataway, NJ), que está ora incorporado por referência em sua totalidade). Cromatografia de hidroxiapatita (matrizes adequadas incluem, sem limitação, HA-Ultrogel, High Resolution (Calbiochem), CHT hidroxiapatita cerâmica (BioRad), hidroxiapatita HTP Bio-Gel (BioRad), HPLC, adsorção de leito expandido, ultrafiltração, diafiltração, liofilização e similar podem ser realizados na primeira mistura de polipeptídeo ou qualquer mistura subseqüente desta para remove qualquer excesso de sal e substitui o tampão com um tampão adequado para a próxima etapa de isolamento ou até mesmo a formulação do produto de droga final. O rendimento do polipeptídeo incluindo substancialmente polipeptídeo purificado, pode ser monitorado em cada etapa aqui descrita usando várias técnicas, incluem, sem limitação, as aqui descritas. Tais técnicas também podem ser usadas para avaliar o rendimento do polipeptídeo substancialmente purificado, seguinte a última etapa de isolamento. À guisa de exemplo, o rendimento do polipeptídeo pode ser monitorado usando quaisquer de várias colunas de cromatografia líquida de alta pressão de fase reversa, com uma série de comprimento de cadeia alquila tais como RP-HPLC ciano, C18RP-HPLC, bem como HPLC de troca de cátion e HPLC de filtração de gel.
[00493]A pureza pode ser determinada usando técnicas padrão, tais como SDS-PAGE, ou por medição do polipeptídeo usando ensaios Western blot e ELISA. Por exemplo, anticorpos policlonais podem ser gerados contra proteínas isoladas da fermentação de levedura de controle negativo e a recuperação de troca de cátion. Os anticorpos podem também ser usados para provar a presença de proteínas de células hospedeiras contaminantes.
[00494]Em algumas modalidades, o rendimento do polipeptídeo após cada etapa de purificação pode ser de pelo menos cerca de 30%, pelo menos cerca de 35%, pelo menos cerca de 40%, pelo menos cerca de 45%, pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 55%, pelo menos cerca de 60%, pelo menos cerca de 65%, pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 91%, pelo menos cerca de 92%, pelo menos cerca de 93%, pelo menos cerca de 94%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 96%, pelo menos cerca de 97%, pelo menos cerca de 98%, pelo menos cerca de 99%, pelo menos cerca de 99,9%,ou pelo menos cerca de 99,99% do polipeptídeo no material de partida para cada etapa de purificação.
[00495]Material Vydac C4 (Vydac) para RP-HPLC consiste em partículas de gel de sílica, cujas superfícies portam cadeias C4 alquila. A separação do polipeptídeo das impurezas proteináceas está baseada nas diferenças da resistência de interações hidrofóbicas. A eluição é realizada com um gradiente de acetonitrila em ácido trifluoracético diluído. HPLC preparativa é realizada usando uma coluna de aço inoxidável (enchida com 2,8 a 3,2 litros de sílica gel Vydac C4). O eluato Hidroxiapatita Ultrogel é acidulado por adição de ácido trifluoracético e introduzido na coluna Vydac C4. Para lavagem e eluição pode-se usar um gradiente de acetonitrila em ácido trifluoracético diluído. As frações são coletadas e imediatamente neutralizada com tampão de fosfato. As frações polipeptídicas que encontram-se nos limites de IPC são agrupadas.
[00496]Material DEAE Sepharose (Pharmacia) consiste em grupos dietilaminoetila (DEAE), covalentemente ligados à superfície das microesferas de Sepharose. A ligação do polipeptídeo aos grupos DEAE é mediada pro interações iônicas. Acetonitrila e ácido trifluoracético atravessam a coluna sem ficarem retidos. Após essas substâncias terem sido retiradas, impurezas (traços) são removidas por lavagem da coluna com tampão de acetato a um pH baixo. A seguir a coluna é lavada com tampão de fosfato neutro e o polipeptídeo é eluído com um tampão com resistência iônica aumentada. A coluna é acondicionada com DEAE Sephareose de fluxo rápido. O volume da coluna é ajustado para garantir uma carga do polipeptídeo na faixa de 3-10 mg de polipeptídeo/mL de gel. A coluna é lavada com água e tampão de equilíbrio (fosfato de sódio/potássio). As frações agrupadas no eluato de HPLC são introduzidas e a coluna é lavada com tampão de equilíbrio. A seguir a coluna é lavada com tampão de lavagem (tampão de acetato de sódio), seguido por lavagem com tampão de equilíbrio. A seguir o polipeptídeo é eluído da coluna com tampão de eluição (cloreto de sódio, fosfato de sódio/potássio). e coletada numa única fração de acordo com o perfil de eluição mestre. O eluato da coluna DEAE Sepharose é ajustado para a condutividade específica. A substância de droga é filtrada em condições estéreis para recipientes de Teflon e armazenada a -70°C.
[00497]Uma ampla faixa de métodos e procedimentos podem ser usados para se avaliar o rendimento e pureza de um polipeptídeo de um ou mais aminoácidos não naturais, incluindo, sem limitação, ensaio Bradford, SDS-PAGE, SDS-PAGE manchado com prata, SDS-PAGE manchado de coomassie, espectrometria de massa (incluindo, sem limitação, MALDI-TOF) e outros métodos para caracterização de proteínas conhecidos dos versados na técnica.
[00498]Métodos adicionais incluem, sem limitação, etapas de remoção de endotoxinas. As endotoxinas são lipopolissacarídeos (LPs) que estão localizadas na membrana externa de células hospedeiras Gram-negativas,m tal como por exemplo, Escherichia coli. Métodos para reduzir níveis de endotoxina incluem, sem limitação, técnicas de purificação usando suportes de sílica, pó de vidro ou hidroxiapatita, cromatografia de afinidade, exclusão por tamanho, de troca aniônica, cromatografia de interação hidrofóbica uma combinação desses métodos e similar. Modificações ou métodos adicionais podem ser necessários para remover os contaminantes tais como proteínas de co-migração do polipeptídeo de interesse. Métodos para medição de níveis de endotoxina são conhecidos dos versados na técnica e incluem, sem limitação, ensaios Limulus Amebocyte Lysate (LAL).
[00499]Métodos e procedimentos adicionais incluem, sem limitação, SDS- PAGE acoplado com métodos de manchamento de proteína, imunomanchamento, espectrometria de massa de dessorção/ionização a laser auxiliado por matriz (MALDI-EM), espectrometria de massa/cromatografia líquida, focalização isoelétrica, troca aniônica analítica, cromato-focalização e dicroísmo circular.
[00500]Em algumas modalidades, os aminoácidos de Fórmulas I-XVIII, XXX- XXXIV(A&B), e XXXX-XXXXIII, incluindo quaisquer sub-fórmulas ou compostos específicos que se enquadrem no escopo das Fórmulas I-XVIII, XXX-XXXIV(A&B) e XXXX-XXXXIII podem ser biossinteticamente incorporados aos polipeptídeos, desse modo produzindo polipeptídeos de aminoácido não natural. Numa outra modalidade, tais aminoácidos são incorporados a um sítio específico dentro do polipeptídeo. Numa outra modalidade, tais aminoácidos são incorporados ao polipeptídeo usando um sistema de tradução. Numa outra modalidade, esse sistema de tradução compreende: (i) um polinucleotídeo codificando o polipeptídeo,onde o polinucleotídeo compreende um códon seletor correspondente ao sítio previamente indicado de incorporação soa aminoácidos supra, e (ii) um tRNA compreendendo o aminoácido, onde o tRNA é específico para o códon seletor. Em outras modalidades de tais sistemas de tradução, o polipeptídeo é mRNA produzido no sistema de tradução. Em outras modalidades dos sistemas de tradução, o sistema de tradução compreende um plasmídeo ou um fago compreendendo o polinucleotídeo. Em outras modalidades desses sistemas de tradução, o sistema de tradução compreende DNA genômico, compreendendo o polinucleotídeo. Em outras modalidades desses sistemas de tradução, o polinucleotídeo é estavelmente integrado ao DNA genômico. Em outras modalidades desses sistemas de tradução, o sistema de tradução compreende tRNA específico para um códon seletor selecionado do grupo consistindo de um códon âmbar, códon ocre, códon opala, um códon singular, um códon raro, um códon não natural, um códon de cinco bases, e um códon de quatro bases. Em outras modalidades desses sistemas de tradução, o tRNA é um tRNA supressor. Em outras modalidades desse sistema de tradução, o tRNA é aminoacilado aos aminoácidos supra. Em outras modalidades desses sistemas de tradução o sistema de tradução compreende uma aminoacil sintetase específica para o tRNA. Em outras modalidades desses sistemas de tradução, o sistema de tradução compreende um tRNA ortogonal e um tRNA sintetase aminoacil ortogonal. Em outras modalidades de tais sistemas de tradução, o polipeptídeo é sintetizado por um ribossomo e, em modalidades adicionais o sistema de tradução é um sistema de tradução in vivo compreendendo uma célula selecionada do grupo consistindo em uma célula bacteriana, célula arque-bacteriana, e célula eucariótica. Em outras modalidades a célula é uma célula de Escherichia coli, célula de levedura, uma célula de uma espécie de Pseudomonas, célula de mamífero, célula de planta, ou uma célula de inseto. Em outras modalidades desses sistemas de tradução, o sistema de tradução, é um sistema de tradução in vitro compreendendo extrato celular, de uma célula bacteriana, uma célula arque-bacteriana, ou célula eucariótica. Em outras modalidades, o extrato celular é proveniente de uma célula de Escherichia coli, uma célula da espécie Pseudomonas, célula de levedura, célula de mamífero, célula de planta, ou uma célula de inseto. Em outras modalidades, pelo menos uma parte do polipeptídeo é sintetizado por síntese de fase sólida ou peptídeo de fase sem solução ou uma combinação destes, enquanto, em outras modalidades, compreende ainda a ligação do polipeptídeo a um outro polipeptídeo. Em outras modalidades os aminoácidos de Fórmulas I-XVIII, XXX-XXXIV(A&B), e XXXX-XXXXIII, incluindo quaisquer sub-fórmulas ou compostos específicos que se enquadrem no escopo das Fórmulas I-XVIII, XXX-XXXIV(A&B) e XXXX-XXXXIII podem ser biossinteticamente incorporados aos polipeptídeos, onde o polipeptídeo é uma proteína homóloga a uma proteína terapêutica, selecionada do grupo consistindo de: alfa-1, antitripsina, angiostatina, fator anti-hemolítico, anticorpo, fragmento de anticorpo, apoliproteína, apoproteína, fator natriurético atrial, polipeptídeo natriurético atrial, peptídeo atrial, C-X-C quimiocina, T39765, NAP-2, ENA-78, gro-a, gro-b, gro-c, IP-10, GCP-2, NAP-4, SDF-1, PF4, MIG, calcitonina, ligante c-kit, citocina, CC quimiocina, proteína 1- quimioatrativa de monócito, proteína-2 quimioatrativa de monócito, proteína 3 quimioatrativa de monócito, proteína-1 alfa inflamatória de monócito, proteína beta inflamatória de monócito, RANTES, 1309, R83915, R91733, HCC1, T58847, D31065, T64262, CD40, ligante CD40, ligante c-kit, colágeno, fator estimulante de colônia (CSF), fator 5a complementar, inibidor complementar, receptor 1 complementar, citocina, peptídeo 78 ativador de neutrófilo epitelial, MIP-16, MCP-1, fator de crescimento epidérmico (EGF), peptídeo ativador de neutrófilo epitelial, eritropoietina (EPO), toxina esfoliante, Fator IX, Fator VII, Fator VIII, Fator X, fator de crescimento de fibroblasto (FGF), fibrinogênio, fibronectina, proteína de feixe de quatro hélices, G-CSF, glp-1, GM-CSF, glicocerebrosidase, gonadotropina, fator de crescimento, receptor do fator de crescimento, grf, proteína de ouriço, hemoglobina, fator de crescimento de hepatócito (hGF), hirudina, hormônio do crescimento humano (hGH), albumina sérica humana, ICAM-1, receptor de ICAM-1, LFA-1, receptor de LFA-1, insulina, fator de crescimento semelhante à insulina (IGF), IGF-I, IGF-II, interferon (IFN), IFN- alfa, IFN-beta, IFN-gama, interleucina, (IL, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, fator de crescimento de ceratinócito (KGF), lactoferrina, fator inibidor de leucemia, luciferase, neurturina, fator inibidor de neutrófilo (NIF), oncostatina M, proteína osteogênica, produto oncogênico, paracitonina, hormônio da paratireóide, PD-ECSF, PDGF, hormônio peptídico, pleiotropina, proteína A, proteína G, pth, exotoxina A pirogênica, exotoxina B pirogênica, exotoxina C pirogênica, pyy, relaxina, renina, SCF, proteína biossintética pequena, receptor I de complemento solúvel, I-CAM 1 solúvel, receptor de interleucina solúvel, receptor de TNF solúvel, somatomedina, somatostatina, somatotropina, super-antígenos de estreptoquinase, enterotoxina estafilocócica, SEA, SEB, SEC1, SEC2, SEC3, SED, SEE receptor do hormônio esteróide, superóxido dismutase, toxina da síndrome do choque tóxico, alfa 1 timosina, ativador plasminogênico de tecido, fator de crescimento de tumor (TGF), fator de necrose de tumor, fator alfa de necrose de tumor, fator beta de necrose de tumor, receptor do fator de necrose de tumor (TNFR), proteína VLA-4, proteína VCAM-1, fator de crescimento endotelial vascular (VEGF), uroquinase, mos, ras, faf, met, p53 tat, fos, myc, jun, myb, rel, receptor de estrogênio, receptor de progesterona, receptor de testosterona, receptor de aldosterona, receptor de LDL e corticosterona.
B. Modificações Pós-Traducionais in vivo
[00501]Na produção dos polipeptídeos de interesse com pelo menos um aminoácido não natural em células eucarióticas, tais polipeptídeos podem incluir modificações pós-traducionais eucarióticas. Em outras modalidades, uma proteína inclui pelo menos um aminoácido não natural e pelo menos uma modificação pós- traducional, que é feita in vivo por uma célula eucariótica, onde a modificação pós- traducional não é feita por uma célula procariótica. A guisa de exemplo, a modificação pós-traducional inclui sem limitação, acetilação, acilação, modificação lipídica, palmitoilação, adição de palmitato, fosforilação, modificação da ligação glicolipídica, glicosilação e similar. Num aspecto, a modificação pós-traducional inclui ligação de um oligossacarídeo (incluindo, sem limitação, (GlcNAc-Man)2-Man- GlcNAc-GlcNAc)) a um asparagina por uma ligação GlcNAc-asparagina (Ver a Tabela 2), que relaciona alguns exemplos de oligossacarídeos ligados ao N das proteínas eucarióticas (resíduos adicionais também podem estar presente, (não mostrados). Num outro aspecto, a modificação pós-traducional inclui a ligação de um oligossacarídeo (incluindo, sem limitação), Gal-GalNAc, Gal-GlcNAc, etc.) a serina ou treonina por uma ligação GalNAc-serina ou GalNAc-treonina, ou uma ligação GlcNAc serina ou GlcNAc-treonina. TABELA 2: EXEMPLOS DE OLIGOSSACARÍDEOS ATRAVÉS DA LIGAÇÃO GlcNAc-
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[00502]Em ainda um outro aspecto, a modificação pós-traducional inclui processamento proteolítico de conjuntos de precursores (incluindo, sem limitação, precursor de calcitonina, precursor peptídico relacionado ao gene calcitonina, hormônio pepro-paratireóide, prepro-insulina, pró-insulina, prepro- opiomelanocortina, pro-opiomelanocortina e similar), a uma proteína de subunidades múltiplas ou conjunto macromolecular, tradução a um outro sítio na célula (incluindo, sem limitação, organelas, tais como retículo endoplasmático, aparelho de Golgi, o núcleo, lisossomas, peroxissomas, mitocôndria, cloroplastos, vacúolos etc., ou pelo passo secretor). Em algumas modalidades, a proteína compreende uma seqüência de secreção ou de localização, um identificador FLAG, um identificador de poli-histidina, uma fusão GST, ou semelhantes.
[00503]Uma vantagem de um aminoácido não natural é que ele apresenta frações químicas adicionais que podem ser usadas para acrescentar mais moléculas. Essas modificações podem ser feitas in vivo numa célula eucariótica ou não eucariótica, ou in vitro. Portanto, em outras modalidades, a modificação pós- traducional é feita pelo aminoácido não natural. Por exemplo, a modificação pós- traducional pode ser por meio de uma reação nucleofílica-eletrofílica. A maioria das reações atualmente usadas para modificação seletiva de proteínas envolve a formação de ligação covalente entre parceiros de reação nucleofílicos e eletrofílicos, incluindo, sem limitação, reação de a-halocenos com cadeias laterais de histidina ou cisteína. A seletividade nesses casos é determinada pelo número e acessibilidade dos resíduos nucleofílicos na proteína. Nos polipeptídeos aqui descritos ou produzidos pelos métodos aqui descritos, outras reações mais seletivas podem ser feitas, incluindo, sem limitação, a reação de um ceto-aminoácido não natural com hidrazidas ou compostos aminoóxi, in vitro e in vivo. Ver por exemplo, Cornish, et al., (1996) Am. Chem. Soc. 118:8150-8151; Mahal, et al., (1997) Science, 276:11251128; Wang, et al., (2001) Science 292:498-500; Chin, et al., (2002) Am. Chem, Soc. 124:9026-9027; Chin, et al., (2002) Proc. Natl. Acad. ScL 99:11020-11024; Wang, et al., (2003) Proc. Natl. Acad. ScL 100:56-61; Zhang, et al., (2003) Biochemistry. 42:6735-6746; and, Chin, et al., (2003) Science 300:964-967. Isto permite a rotulação seletiva de, virtualmente, qualquer proteína com um hospedeiro de reagentes, incluindo, sem limitação, fluoróforos, agentes de reticulação, derivados de sacarídeo, e moléculas citotóxicas. Ver também Pedido de Patente U.s. n° de série 10/686.944 intitulada Glycoprotein synthesis", depositada em 16 de janeiro de 2003, ora incorporada por referência ao presente. Modificações pós-traducionais incluindo, sem limitação, por meio de um aminoácido azido, também podem ser feitas através da ligação Staudinger (incluindo, sem limitação, reagentes de triarilfosfina). Ver por exemplo, Kiick et al. (2002), Incorporation of azides into recombinant proteins for chemoselective modification by the Staudinger ligtation, PNAS 99(1):19-24.
IX. - Sistemas Alternativos para Produção dos Polipeptídeos de aminoácido não natural
[00504]Várias estratégias foram empregadas para introduzir aminoácidos não naturais em proteínas nas células hospedeiras não recombinantes, células hospedeira mutagenizadas ou em sistemas isento de célula. Os sistemas alternativos, apresentados neste parágrafo podem ser aplicados à produção dos polipeptídeos de aminoácido não natural aqui descrito. À guisa de exemplo, a derivatização dos aminoácidos com cadeias laterais reativas ta como Lys, Cys e Tyr resulta na conversão de lisina em N2-acetil-lisina. A síntese química também proporciona um método retilíneo para incorporar os aminoácidos não naturais. Com o recente desenvolvimento da ligação enzimática e da ligação química nativa de fragmentos peptídicos, foi possível produzir proteínas maiores. Ver por exemplo, P.E. Dawson e S.B. H. Kent. Annu. Rev. Biochem, 69:923 (2000). A ligação peptídica química e ligação química nativa está descrita na Patente U.S. n" 6.184.344, Publicação de patente n" 2004/0138412, Publicação de Patente U.S. n" 2003.0208046, WO 02/098902, e WO 03/042235, ora incorporados por referência em sua totalidade. Um método geral biossintético in vitro em que um tRNA supressor quimicamente acilado com o desejado aminoácido não natural é adicionado a um extrato in vitro capaz de suportar a biossíntese e proteína, foi usado para incorporar especificamente ao sítio mais de 100 aminoácidos não naturais numa série de proteínas de, virtualmente, qualquer tamanho. Ver por exemplo, V. W. Cornish, D. Mendel and P.G. Schultz, Angew. Chem. Int. Ed. Engl.1995, 34:621-633 (1995); C.J. Noren, S. J. Anthony-Cahill, M.C. Griffith, P. G. Schultz, A general method for site-specific incorporation of unnatural amino acids into proteins, Science, 244 182-188 (1989); e J. D. Bain, C.G. Glabe, T.A. Dix. A. R. Chamberlin, E.S. Diala, Biosynthetic site-specific incorporation of a non natural aminoaci intor a polypeptide, J. Am. Chem. Soc, 111 8013-8014 (1989). Uma ampla faixa de grupos funcionais foi introduzida em proteínas para estudo da estabilidade das proteínas, dobragem da proteína, mecanismo enzimático e transdução de sinal.
[00505]Um método in vivo, denominado incorporação por pressão seletiva, foi desenvolvido para explorar a promiscuidade e sintetases do tipo selvagem. Ver, por exemplo, N. Budisa, C. Minks, S. Alefelder, W. Wenger, R. M. dong, L. Moroder e R. Huber FASEB J., 13:41-51 (1999). Uma cepa autotrófica, em que o passo metabólico relevante que supre a célula com um aminoácido natural particular é deletado, é crescida em meio mínimo contendo concentrações limitadas do aminoácido natural, enquanto a transcrição do gene alvo é reprimida. Logo no início de uma fase de crescimento estacionária, o aminoácido natural é esvaziado e substituído com o análogo aminoácido não natural. A indução de expressão da proteína recombinante resulta no acúmulo doe uma proteína contendo o análogo não natural. Por exemplo, usando esta estratégia, o, m e para-fluorfenilalaninas foram incorporadas às proteinase apresentando duas ramificações características no espectro UV podendo ser facilmente identificadas, ver por exemplo, C. Minks, R.Huber, L. Moroder and N. Budisa, Anal Biochem., 284:29-34 (2000), trifluormetionina foi usada para substituir metionina em lisozima no bacteriófago T4 para estudo de suas interações com os ligantes quito-oligossacarídeo por RMN-F19, ver, por exemplo, H. Duewel, E. DAub, V. Robinson e J. F. Honek, Biochemistry, 36:3404-3416 (1997); e trifluorleucina foi incorporado no lugar de leucina, resultando na estabilidade térmica e química aumentada de uma proteína leucina-zipper. Ver por exemplo, Y. Tang, G. Ghirlanda, W. a. Petka, T. Nakajima, W. F. DeGrado and D. A. Tirrell, Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 40(8):1494-1996 (2001). Além disso, selenometionina e telurometionina são incorporados em várias proteínas recombinantes para facilitar a solução de fases na cristalografia de raios-X. Ver, por exemplo, W. A. Hendrickson, J. R. Horton and D. M. Lemaster, EMBO J., 9(5):1665- 1672 (1990); J. O. Boles, K. Lewinski, M. Kunkle, J. D. Odom, B. Dunlap, L. Lebioda and M. Hatada, Nat. Struct. Biol, 1:283-284 (1994); N. Budisa, B. Steipe, P. Demange, C. Eckerskorn, J. Kellermann and R. Huber, Eur. J. Biochem.. 230:788796 (1995); and, N. Budisa, W. Kambrock, S. Steinbacher, A. Humm, L. Prade, T. Neuefeind, L. Moroder and R. Huber, J. MoI. Biol. 270:616-623 (1997). Análogos de metionina com funcionalidades alceno ou alcino também foram incorporados eficientemente, permitindo mais modificação das proteínas por meios químicos. See, por exemplo, J. C. M. vanHest and D. A. Tirrell, FEBS Lett. 428:68-70 (1998); J. C. M. van Hest, K. L. Kiick and D. A. Tirrell, J. Am. Chem. Soc. 122:1282-1288 (2000); and, K. L. Kiick and D. A. Tirrell, Tetrahedron, 56:9487-9493 (2000); U.S.Patent No. 6,586,207; U.S.Patent Publication 2002/0042097, que estão ora incorporados por referência em sua totalidade.
[00506]O sucesso deste método depende do reconhecimento dos análogos do aminoácido não natural por aminoacil-tRNA sintetases, que, em geral requerem alta seletividade para garantir a fidelidade da tradução da proteína. Um modo de expandir o escopo deste método é relaxar a especificidade do substrato das aminoacil-tRNA sintetases, que foi adquirido num número imitado de casos. À guisa de exemplo, a substituição de Ala294 por Gly em fenilalanil-tRNA sintetase de Escherichia coli (PheRS) aumenta o tamanho do bolso de ligação ao substrato, resultando na acilação de tRNAPhe por p-Cl-fenialanina (p-Cl-Phe). Ver, M. Ibba, P. Kast e H. Hennecke Bioquemistry, 33:7107-7112 (1994). Uma cepa de Escherichia coli que abriga este mutante PheRs permite a incorporação de para-Cl-fenilalanina ou para-Br-fenilalanina no lugar de fenilalanina. Ver por exemplo, M. Ibba e H. Hennecke FEBS Lett, 364:272-275 (1995); e N. Sharma, R.Furter P. Kast and D. A. Tirrell, FEBS Lettl, 467:37-40 (2000). Similarmente, uma mutação por ponto Phe130Ser próxima do sítio de ligação a aminoácido de tirosil-tRNA sintetase de Esquerichia coli, permitiu a incorporação de azatirosina ser incorporada mais eficientemente do que tirosina. Ver, F. Hamano-Takaku, T Iwama, S. SAito-Yano, K. Takaku, Y. Monden, M. Kitabatake, D. Soil e S. Nishimura, J. Biol. Chem., 275(51):40324-40328 (2000).
[00507]Uma outra estratégia para incorporação de aminoácidos não naturais a proteínas in vivo é modificar as sintetases que têm mecanismos à prova de leitura. Essas sintetases não podem discriminar e, portanto, ativam os aminoácidos, que são estruturalmente similares aos aminoácidos naturais cognatos. Este erro é corrigido num sítio separado, que desacila o aminoácido mal introduzido do tRNA a fim de manter a fidelidade da tradução de proteína. Caso a atividade à prova de leitura da sintetase seja desabilitada, análogos estruturais que são mal ativados podem escapar da função de edição e ser incorporados. Esta abordagem foi recentemente demonstrada com valil-tRNA sintetase (ValRs). ver, V. Doring, H.D. Mootz, L. A. Nangle, T. L. Hendricson, V. de crecy-Lagard, P. Schimmel and P. Marliere, Science, 292:501-504 (2001). ValRS pode aminoacilar erroneamente tRNAVal com Cys, Thr ou aminobutirado (Abu); esses aminoácidos não cognatos são a seguir hidrolisados pelo domínio da edição. Após mutagênese aleatória do cromossoma de E. coli, uma cepa de E. coli mutante foi selecionada tendo uma mutação no sítio de edição de ValRS. Este ValRs de edição defeituosa carrega incorretamente tRNAVal com Cys. Devido a Abu assemelhar-se estericamente a Cys(grupo -SH de Cys é substituído com -CH3 em Abu), o mutante ValRS também incorpora Abu em proteínas quando esta cepa mutante de E. coli é crescida na presença de Abu. A Análise d espectrometria de massa mostrou que, cerca de 24% de valinas são substituídas pro Abu em cada posição de valina na proteína nativa.
[00508]A síntese de fase sólida e métodos semi-sintéticos também permitiram a síntese de uma série de proteínas contendo novos aminoácidos. Por exemplo, ver as seguintes publicações e referencias aqui citadas, como segue: Crick, F.J.C., Barrett, L. Brenner, S. Watts-Tobin, R. General nature of the genetic code for proteins. Nature, 192(4809): 1227-1232 (1961); Hofmann, K., Bohn, H. Studies on polypeptides. XXXVI. The effect of pyrazole-imidazole replacements on the S-protein activating potency of an S-peptide fragment, J. Am Chem, 88(24):5914- 5919 (1966); Kaiser, E.T. Synthetic approaches to biologically active peptides and proteins including enzymes, Ace Chem Res, 22(2):47-54 (1989); Nakatsuka, T., Sasaki, T., Kaiser, E.T. Peptide segment coupling catalyzed by the semisynthetic enzyme thiosubtilisi, J Am Chem Soc, 109, 3808-3810 (1987); Schnolzer, M., Kent, S B H. Constructing proteins by dovetailing unprotected synthetic peptides: backbone- engineered HIV protease, Science, 256, 221-225 (1992); Chaiken, LM. Semisynthetic peptides and proteins, CRC Crit Rev Biochem, 255-301 (1981); Offord, R.E. Protein engineering by chemical means? Protein Eng., 1 (3):151-157 (1987); and, Jackson, D.Y., Burnier, J., Quan, C, Stanley, M., Tom, J., Wells, J.A. A Designed Peptide Ligase for Total Synthesis of Ribonuclease A with Unnatural Catalytic Residues, Science, 266, 243-247 (1994).
[00509]A modificação química foi usada para introduzir uma série de cadeias laterais não naturais, incluindo co-fatores, rótulos spin e oligonucleotídeos em proteínas in vitro. Ver, por exemplo, Corey, D.R., Schultz, P. G. Generation of a hybrid sequence-specific single-stranded deoxyribonuclease, Science, 238, 1401-1403 (1987); Kaiser, E. T., Lawrence D. S., Rokita, S.E. The chemical modification of enzymatic specificity, Ann. Rev Biochem, 54, 565-595 (1985); Kaiser, E.T., Lawrence, D.S. Chemical mutation of enzyme active sites, Science, 226, 505-511 (1984); Neet, K.E., Nanci A, Koshland, D.E. Properties of thiol-subtilisin, J Biol. Chem, 243(24): 6392-6401 (1968); Polgar, L.B., M.L. A new enzyme containing a synthetically formed active site. Thiol-subtilisin. J. Am Chem Soc, 88(13):3153- 3154 (1966); and, Pollack, SJ., Nakayama, G. Schultz, P. G. Infroduction of nucleophiles and spectroscopic probes into antibody combining sites, Science, 1(242): 1038-1040 (1988).
[00510]Alternativamente, métodos biossintéticos que empregam aminoacil- tRNAs quimicamente modificados foram usados para incorporar várias sondas biofísicas em proteínas sintetizadas in vitro. Ver as seguintes publicações e referencias citadas em: Brunner, J. New Photolabeling and crosslinking methods, Annu. Rev Biochem, 483-514 (1993); and, Krieg, U.C., Walter, P., Hohnson, A.E. Photocrosslinking of the signal sequence of nascent preprolactin of the 54-kilodalton polypeptide of the signal recognition particle, Proc. Natl. Acad. Sci. 83, 8604-8608 (1986).
[00511]Foi demonstrado, previamente, que os aminoácidos não naturais podem ser incorporados especificamente ao sítio em proteínas in vitro por adição de tRNAs supressores quimicamente aminoacilados em reações de síntese de proteína programada com um gene contendo uma desejada mutação sem sentido âmbar. Usando essas abordagens pode- se substituir uma série de 20 aminoácidos comuns com homólogos estruturais próximos, por exemplo, fluorfenilalanina no lugar de fenilalanina, usando cepas auxotróficas para um dado aminoácidos. Ver por exemplo, Noren, CJ., Anthony-Cahill, Griffith, M.C., Schultz, P. G. A general method for site-specific incorporation of unnatural amino acids into proteins, Science. 244: 182-188 (1989); M. W. Nowak, et al., Science 268:439-42 (1995); Bain, J.D., Glabe, C.G., Dix, T.A., Chamberlin, A.R., Diala, E.S. Biosynthetic site-specific Incorporation of a non-natural amino acid into a polypeptide, J. Am Chem Soc. 111:8013-8014 (1989); N. Budisa et al., FASEB J. 13:41-51 (1999); Elhnan, J.A., Mendel, D., Anthony-Cahill, S., Noren, C.J., Schultz, P.G. Biosynthetic method for introducing unnatural amino acids site-specifically into proteins. Methods in Enz., 202, 301-336 (1992); and, Mendel, D., Cornish, V. W. & Schultz, P.G. Site-Directed Mutagenesis with an Expanded Genetic Code, Annu Rev Biophys. Biomol Struct. 24, 435-62 (1995).
[00512]Por exemplo, tRNA um supressor foi preparado reconhecendo o códon de parada UAG e foi quimicamente aminoacilado com um aminoácido não natural. A mutagênese direcionada ao sítio convencional foi usada para introduzir o códon de interrupção TAG, no sítio de interesse no gene da proteína. Ver, por exemplo, Sayeers, J. R. Schmidt, W. Eckstein, F. 5', 3'Exonuclease in phosphorothioate-based oligonucleotide-directed mutagenesis, Nucleic Acids REs, 16(3):791-802 (1998). Quando o tRNa supressor acilado e o gene mutante foram combinados num sistema de transcrição/tradução in vitro, o aminoácido não natural foi incorporado em resposta ao códon UAG que conferiu uma proteína contendo aquele aminoácido na posição especificada. Experimentos usando [H3]-Phe e experimentos com a-hidroxiácidos demonstraram que apenas o aminoácido desejado é incorporado na posição específica pelo códon UAG e que este aminoácido não é incorporado em qualquer outro sítio na proteína. Ver por exemplo, Noren, et al, supra; Kobayashi et al., (2003) Nature Structural Biology 10(6):425-432; and, Ellman, J.A., Mendel, D., Schultz, P.G. Site-specific incorporation of novel backbone structures into proteins, Science, 255, 197-200 (1992).
[00513]Técnicas de microinjeção também foram empregadas para incorporar os aminoácidos não naturais às proteínas. Ver, por exemplo, M. W. Nowak, P. C. Kearney, J. R. Sampson, M. E. Saks, C. G. Labarca, S. K. Silverman, W. G. Zhong, J. Thorson, J. N. Abelson, N. Davidson, P. G. Schultz, D. A. Dougherty and H. A. Lester, Science, 268:439-442 (1995); and, D. A. Dougherty, Curr. Opin. Chem. Biol., 4:645 (2000). Um oócito de "xenopus" foi co-injetado com duas espécies RNA produzidas in vitro: um mRNA codificando a proteína alvo com um códon de interrupção UAG na posição do aminoácido de interesse e um tRNA supressor âmbar aminoacilado com o desejado aminoácido não natural. A maquinaria traducional do oócito então insere o aminoácido não natural na posição especificada pelo UAG. este método permitiu estudos de estrutura-função in vivo de proteínas de membrana integral, que são geralmente não passíveis de sistemas de expressão in vitro. Exemplos incluem, sem limitação, incorporação do aminoácido fluorescente ao receptor de taquiquinina neuroquinina-2 para medir distancias por transferência de energia de ressonância fluorescente. Ver, por exemplo, G. Turcatti, K. Nemeth, M. D. Edgerton, U. Meseth, F. Talabot, M. Peitsch, J. Knowles, H. Vogel and A. Chollet, I Biol. Chem., 271(33):19991-19998 (1996); the incorporation of biotinylated amino acids to identify surface-exposed residues in ion channels, ver, por exemplo, J. P. Gallivan, H. A. Lester and D. A. Dougherty, Chem. Biol., 4(10):739-749 (1997); the use of caged tyrosine analogs to monitor conformational changes in an ion channel in real time, ver por exemplo, J. C. Miller, S. K. Silverman, P. M. England, D. A. Dougherty and H. A. Lester, Neuron, 20:619-624 (1998); e the use of alpha hydroxy amino acids to change ion channel backbones for probing their gating mechanisms. Ver, por exemplo, P. M. England, Y. Zhang, D. A. Dougherty and H. A. Lester, Cell, 96:89-98 (1999); and, T. Lu, A. Y. Ting, J. Mainland, L. Y. Jan, P. G. Schultz and J. Yang, Nat. Neurosci, 4(3):239-246 (2001).
[00514]A capacidade em incorporar os aminoácidos não naturais diretamente em proteínas in vivo oferece as vantagens de alta produção de proteínas mutantes, facilidade técnica, o potencial de estudo de proteínas mutantes em células, ou possivelmente em organismos vivos e o uso dessas proteínas mutantes em tratamentos terapêuticos. A capacidade de inclusão dos aminoácidos não naturais com vários tamanhos acidez variada, nucleofilicidades, hidrofobicidades, e outras propriedades nas proteínas pode expandir, em muito, a capacidade de manipular racional e sistematicamente, as estruturas das proteínas, tanto para provar a função da proteína como criar novas proteínas ou organismos com novas propriedades.
[00515]Numa tentativa de incorporar para-F-Phe especificamente ao sítio, foi usado um par supressor âmbar de levedura tRNAPheCUA/fenilalanil-tRNA sintetase num p-F-Phe resistente, cepa de E. coli Phe auxotrófica. Ver por exemplo, R. Furter, Protein Sci., 7:419-426 (1998).
[00516]Pode ser possível também, obter-se a expressão de um desejado polinucleotídeo usando um sistema traducional isento de célula (in vitro). Nesses sistemas que podem incluir, ou mRNA como uma matriz (tradução in vitro), ou DNA como uma matriz (combinada com transcrição e tradução in vitro), a síntese in vitro é direcionada pelos ribossomos. Esforço considerável tem sido aplicado ao desenvolvimento dos sistemas de expressão de proteína isento de cédula. Ver, por exemplo, Kim, D.- M. and J.R. Swartz, Biotechnology and Bioengineering, 74(4) :309-316 (2001); Kim, D.-M. and J.R. Swartz, Biotechnology Letters, 22, 1537-1542, (2000); Kim, D.-M., and J.R. Swartz, Biotechnology Progress, 16, 385-390, (2000); Kim, D.-M., and J.R. Swartz, Biotechnology and Bioengineering, 66(3): 180-188, (1999); and Patnaik, R. and J.R. Swartz, Biotechniques 24(5): 862-868, (1998); Patente U.S. No. 6.337.191; U.S.Publicação de Patente No. 2002/0081660; WO 00/55353; WO 90/05785, que estão ora incorporados por referencia em sua integridade. Uma outra abordagem que pode ser aplicada à expressão dos polipeptídeos compreendendo um aminoácido não natural inclui, sem limitação a técnica de fusão mRNA-peptídeo, Ver, por exemplo, Roberts, and J. Szostak, Proc, Natl Acad. Sci (USA) 94 12297-12302 (1997); A. Frankel et al., Chemistry & Biology 10, 1043-1050 (2003). Nesta tentativa, uma matriz de mRNA ligada a puromicina é traduzida ao peptídeo no ribossomo. Caso uma ou mais moléculas de tRNA tenham sido modificada, os aminoácidos não naturais podem ser incorporados ao peptídeo também. Após o último códon de mRNA ter sido lido, a puromicina capta o C- terminal do peptídeo. Caso o conjugado mRNA-peptídeo resultante for visto ter propriedades de interesse, num ensaio in vitro, sua identidade pode ser facilmente revelada da seqüência de mRNA. Deste modo, pode-se selecionar bibliotecas dos polipeptídeos compreendendo um ou mais aminoácidos não naturais para identificar os polipeptídeos com as desejadas propriedades. Mais recentemente, traduções de ribossomo in vitro com os componentes purificados foram descritas, as quais permitem a síntese de peptídeos substituídos com aminoácidos não naturais. Ver, por exemplo, A. Forster et al., Proc. Natl Acad. Sci (USA 100(11): 6353-6357 (2003).
X. Modificações Pós-traducionais de Componentes de Um Polipeptídeo de Aminoácido Não Natural
[00517]Por conveniência, as modificações pós-traducionais dos componentes de aminoácido não natural de um polipeptídeo descrito neste parágrafo (XA a XJ) foram descritas genericamente e/ou com exemplos específicos. Contudo, as modificações pós-traducionais dos componentes de aminoácido não natural de um polipeptídeo descritas neste parágrafo não devem ser limitadas apenas às descrições genéricas ou exemplos específicos fornecidos neste parágrafo, ao contrário, a modificação pós-traducional dos componentes de aminoácido não natural de um polipeptídeo, descritos neste parágrafo, aplica-se igualmente bem a todos os compostos que se enquadrem no escopo das Fórmulas I-XVIII, XXX-XXXIV (A&B) e XXXX-XXXXIII, incluindo quaisquer sub-fórmulas ou compostos específicos que se enquadrem no escopo das Fórmulas I-XVIII, XXX-XXXIV (A & B), e XXXX-XXXXIII descritas no relatório descritivo, reivindicações e desenhos aqui descritos.
[00518]Métodos, composições, técnicas e estratégias foram desenvolvidas para incorporar especificamente ao sítio aminoácidos não naturais durante a tradução de proteínas in vivo. Por incorporação de um aminoácido não natural com uma química de cadeia secundária que seja ortogonal àquela dos aminoácidos de ocorrência natural, esta tecnologia torna possível a derivatização específica ao sítio das proteínas recombinantes. Como resultado, uma vantagem maior dos métodos, composições técnicas e estratégias aqui descritas situam-se no fato de que as proteínas derivatizadas podem agora, ser preparadas como produtos homogêneos definidos. Contudo, os métodos, composições, misturas de reação, técnicas e estratégias descritas no presente não estão limitados aos polipeptídeos de aminoácido não natural formados por técnicas de tradução de proteína in vivo, mas inclui os polipeptídeos de aminoácido não natural formados por qualquer técnica, incluindo, a guisa de exemplo, ligação de proteína expressada, síntese química, técnicas com base em ribozima (ver por exemplo, parágrafo intitulado "Expression in Alternate Systems").
[00519]A capacidade em incorporar aminoácidos não naturais em proteína recombinantes, expande, em muito, as químicas que podem ser implementadas para derivatização pós-traducional, onde tal derivatização ocorre, tanto in vivo como in vitro. Mais especificamente, a derivatização de proteína para formar uma ligação oxima numa parte de aminoácido não natural de um polipeptídeo oferece várias vantagens, primeiro, os aminoácidos de ocorrência natural, geralmente, não formam ligações oxima e assim, os reagentes planejados para formar ligações oxima, reagirão especificamente ao sítio com o componente de aminoácido não natural do polipeptídeo (presumindo, é claro, que o aminoácido não natural e o correspondente reagente foram planejados a formar uma ligação oxima, assim, a capacidade de derivatizar proteínas seletivamente ao sítio propicia um único produto homogêneo, em oposição a misturas de proteínas derivatizadas produzidas usando tecnologia da técnica precedente. Em segundo lugar, adutos de oxima são estáveis sob condições biológicas, sugerindo que as proteínas derivatizadas por troca de oxima, sejam candidatos válidos para aplicações terapêuticas. Terceiro, a estabilidade da ligação oxima resultante pode ser manipulada com base na identidade (ou seja, os grupos funcionais e/ou estrutura) do aminoácido não natural para o qual foi formada a ligação oxima. Sendo assim, como se vê no Exemplo 16, a estabilidade do pH da ligação oxima a um aminoácido não natural pode variar de menos que uma hora a significativamente mais de uma semana. Assim, em algumas modalidades, a ligação oxima ao polipeptídeo de aminoácido não natural possui uma meia-vida de decomposição menor que uma hora, em algumas modalidades, menos que 1 dia, em outras modalidades, menos que 2 dias, em outras modalidades, menos que 1 semana e em outras modalidades, mais que 1 semana. Em ainda outras modalidades, a oxima resultante é estável pro pelo menos duas semanas sob condições brandamente acidas, em outras modalidades, a oxima resultante é estável por pelo menos 5 dias, sob condições brandamente acidas. Em outras modalidades, o polipeptídeo de aminoácido não natural é estável por pelo menos 1 dia a um pH entre cerca de 2 e cerca de 8; em outras modalidades, de um pH de cerca de 2 a cerca de 6, em outras modalidades, em um pH de cerca de 2 a cerca de 4. Em outras modalidades, usando as estratégias, métodos, composições, e técnicas aqui descritas o perito na técnica será capaz de sintetizar uma ligação oxima a um polipeptídeo de aminoácido não natural com uma media-vida de decomposição ajustada às necessidades do técnico (por exemplo, para um uso terapêutico tal como liberação controlada, ou para uso de diagnóstico ou uso industrial ou para uso militar.
[00520]Os polipeptídeos de aminoácido não natural descritos supra, são úteis para, sem limitação, novos terapêuticos, diagnósticos, enzimas catalíticas, enzimas industriais, proteínas de ligação (incluindo, sem limitação, anticorpos e fragmentos de anticorpos), e incluindo, sem limitação, ao estudo de estrutura de proteínas e função. Ver, por exemplo, Dougherty (2000) Unnatural Amino Acids s Probes of Protein Structure and Funcion, Current Opinion in Chemical Biology, 4:645-652. Outros usos para os polipeptídeos de aminoácido não natural descritos supra incluem, sem limitação, usos para base de ensaios, na cosmética, biologia de plantas, ambiental, produção de energia e/ou usos militares. Contudo, os polipeptídeos de aminoácido não natural descritos supra podem passar por mais modificações de modo a incorporar novas funcionalidades ou estas modificadas, incluindo manipulação da eficácia terapêutica do polipeptídeo, melhorando o perfil de segurança do polipeptídeo, ajuste da farmacocinética, farmacologia e/ou farmacodinâmica do polipeptídeo (por exemplo, aumento da solubilidade em água, biodisponibilidade, aumento da meia-vida sérica, aumento da meia-vida terapêutica, modulação da imunogenicidade, modulação da atividade biológica, ou prolongamento do tempo de circulação), proporcionando funcionalidade adicional ao polipeptídeo, incorporando um indicador, rótulo, ou sinal detectável ao polipeptídeo, facilitando as propriedades de isolamento do polipeptídeo, e quaisquer combinações das modificações supra.
[00521]Em algumas modalidades, estão métodos para facilitar as propriedades de isolamento de um polipeptídeo compreendendo a utilização de um polipeptídeo de aminoácido não natural biossintético homólogo, compreendendo pelo menos um aminoácido não natural selecionado do grupo consistindo de um aminoácido não natural contendo oxima, um aminoácido não natural contendo carbonila, e um aminoácido não natural contendo hidroxilamina. Em outras modalidades, tais aminoácidos não naturais foram biossinteticamente incorporados ao polipeptídeo como aqui descritos. Em modalidades adicionais ou ulteriores, tais polipeptídeos de aminoácido não natural compreendem pelo menos um aminoácido não natural selecionado dos aminoácidos de Fórmula I-XVIII, XXX-XXXIV(A&B), ou XXXX-XXXXIII.
[00522]Os métodos, composições, estratégias e técnicas aqui descritas não estão limitadas a um tipo, classe ou família particular dos polipeptídeos. De fato, virtualmente, qualquer polipeptídeo pode incluir pelo menos um aminoácido não natural aqui descrito. A guisa de exemplo apenas, o polipeptídeo pode ser homólogo a uma proteína terapêutica, selecionada do grupo consistindo de: alfa-1, antitripsina, angiostatina, fator anti-hemolítico, anticorpo, fragmento de anticorpo, apoliproteína, apoproteína, fator natriurético atrial, polipeptídeo natriurético atrial, peptídeo atrial, C- X-C quimiocina, T39765, NAP-2, ENA-78, gro-a, gro-b, gro-c, IP-10, GCP-2, NAP-4, SDF-1, PF4, MIG, calcitonina, ligante c-kit, citocina, CC quimiocina, proteína 1- quimioatrativa de monócito, proteína-2 quimioatrativa de monócito, proteína 3 quimioatrativa de monócito, proteína-1 alfa inflamatória de monócito, proteína beta inflamatória de monócito, RANTES, 1309, R83915, R91733, HCC1, T58847, D31065, T64262, CD40, ligante CD40, ligante c-kit, colágeno, fator estimulante de colônia (CSF), fator 5a complementar, inibidor complementar, receptor 1 complementar, citocina, peptídeo 78 ativador de neutrófilo epitelial, MIP-16, MCP-1, fator de crescimento epidérmico (EGF), peptídeo ativador de neutrófilo epitelial, eritropoietina (EPO), toxina esfoliante, Fator IX, Fator VII, Fator VIII, Fator X, fator de crescimento de fibroblasto (FGF), fibrinogênio, fibronectina, proteína de feixe de quatro hélices, G-CSF, glp-1, GM-CSF, glicocerebrosidase, gonadotropina, fator de crescimento, receptor do fator de crescimento, grf, proteína de ouriço, hemoglobina, fator de crescimento de hepatócito (hGF), hirudina, hormônio do crescimento humano (hGH), albumina sérica humana, ICAM-1, receptor de ICAM-1, LFA-1, receptor de LFA-1, insulina, fator de crescimento semelhante à insulina (IGF), IGF-I, IGF-II, interferon (IFN), IFN-alfa, IFN-beta, IFN-gama, interleucina, (IL, IL-1, IL-2, IL- 3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, fator de crescimento de ceratinócito (KGF), lactoferrina, fator inibidor de leucemia, luciferase, neurturina, fator inibidor de neutrófilo (NIF), oncostatina M, proteína osteogênica, produto oncogênico, paracitonina, hormônio da paratireóide , PD-ECSF, PDGF, hormônio peptídico, pleiotropina, proteína A, proteína G, pth, exotoxina A pirogênica, exotoxina B pirogênica, exotoxina C pirogênica, pyy, relaxina, renina, SCF, proteína biossintética pequena, receptor I de complemento solúvel, I-CAM 1 solúvel, receptor de interleucina solúvel, receptor de TNF solúvel, somatomedina, somatostatina, somatotropina, super-antígenos de estreptoquinase, enterotoxina estafilocócica, SEA, SEB, SEC1, SEC2, SEC3, SED, SEE receptor do hormônio esteróide, superóxido dismutase, toxina da síndrome do choque tóxico, alfa 1 timosina, ativador plasminogênico de tecido, fator de crescimento de tumor (TGF), fator de necrose de tumor, fator alfa de necrose de tumor, fator beta de necrose de tumor, receptor do fator de necrose de tumor (TNFR), proteína VLA-4, proteína VCAM-1, fator de crescimento endotelial vascular (VEGF), uroquinase, mos, ras, faf, met, p53 tat, fos, myc, jun, myb, rel, receptor de estrogênio, receptor de progesterona, receptor de testosterona, receptor de aldosterona, receptor de LDL e corticosterona. O polipeptídeo de aminoácido não natural pode também ser homólogo a qualquer membro de polipeptídeo da família de supergenes do hormônio do crescimento.
[00523]Tais modificações incluem a incorporação de funciona idade adicional ao componente de aminoácido não natural do polipeptídeo, incluindo, sem limitação, um rótulo, um corante; um polímero; um polímero hidrossolúvel; um derivado de polietileno glicol; um foto-reticulador; um composto citotóxico; uma droga; um rótulo de afinidade; um rótulo de foto-afinidade; um composto reativo; uma resina; uma segunda proteína ou polipeptídeo ou análogo de polipeptídeo; um anticorpo ou fragmento de anticorpo; um quelante de metal; um co-fator; um ácido graxo; um carboidrato; um polinucleotídeo; um DNA; um RNA; um polinucleotídeo anti-sentido; um sacarídeo; um dendrímero hidrossolúvel; uma ciclodextrina; um biomaterial; uma nanopartícula; um rótulo de spin; um fluoróforo; uma fração contendo metal; uma fração radioativa; um grupo funcional inédito; um grupo que interage por covalência ou por não covalência com outras moléculas; uma fração foto-aprisionada; uma fração excitável por radiação actínica, um ligante, uma fração fotoisomerizável; biotina; um análogo de biotina; uma fração que incorpora um átomo pesado; um grupo quimicamente clivável; um grupo fotoclivável; uma cadeia lateral alongada; um açúcar ligado a carbono; um agente redox-ativo; um amino tioácido; uma fração tóxica; uma fração isotopicamente rotulada; uma sonda biofísica; um grupo fosforescente; um grupo quimioluminescente; um grupo com densidade de elétrons; um grupo magnético; um grupo intercalado; um cromóforo; um agente de transferência de energia; um agente biologicamente ativo, um rótulo detectável; uma molécula pequena; um ácido ribonucléico inibidor, um radionucleotídeo; um agente capturador de nêutrons, um derivado de biotina; ponto(s) quântico(s); um nanotransmissor; um radiotransmissor, uma abzima, um ativador de complexo ativado, um vírus, um adjuvante, um aglican, um alergan, uma angiostatina, um anti-hormônio, um antioxidante, um aptâmero, um RNA orientador, uma saponina, um vetor bilateral, uma macromolécula, um mimótopo, um receptor, uma micela inversa, e quaisquer combinações dos acima.
[00524]Além disso, os polipeptídeos de aminoácido não natural podem conter frações que podem ser convertidas em outros grupos funcionais, tais como a guisa de exemplo, carbonilas, dicarbonilas ou hidroxilaminas. A figura 63A ilustra a conversão química dos polipeptídeos de aminoácido não natural em polipeptídeos de aminoácido não natural contendo carbonila ou dicarbonila, enquanto a Figura 63B ilustra a conversão química de polipeptídeos de aminoácido não natural em polipeptídeos de aminoácido não natural contendo hidroxilamina. Os polipeptídeos de aminoácido não natural contendo carbonila ou dicarbonila resultantes e polipeptídeos de aminoácido não natural contendo hidroxilamina podem ser empregados ou incorporados em quaisquer métodos, composições, técnicas e estratégias para preparação, purificação, caracterização, e uso dos aminoácidos não naturais, polipeptídeos de aminoácido não natural e polipeptídeos de aminoácido não natural modificados aqui descritos. A conversão química das frações químicas em outros grupos funcionais, tais como a guisa de exemplo, carbonila, dicarbonilas ou hidroxilaminas podem ser adquirida usando técnicas e materiais conhecidos dos versados na técnica, tais como descrito por exemplo, em March, ADVANCED ORGANIC CHEMISTRY 5A. Ed, (Wiley 2001); e CArey and Sundbert, ADVANCED ORGANIC CHEMISTRY 4a. Ed. Vols. A e B. (Plenum 2000, 2001), (todos os quais ora incorporados ao presente por referencia em sua totalidade).
[00525]Assim, a guisa de exemplo apenas, um polipeptídeo de aminoácido não natural contendo qualquer um dos seguintes aminoácidos podem ser ainda modificados usando os métodos e composições aqui descritos:
Figure img0054
onde: A é opcional e, quando presente é alquileno inferior, alquileno inferior substituído, cicloalquileno inferior, cicloalquileno inferior substituído, alquenileno inferior, alquenileno inferior substituído, alquinileno, heteroalquileno inferior, heteroalquileno substituído, heterocicloalquileno inferior, heterocicloalquileno inferior substituído, arileno, arileno substituído, heteroarileno, heteroarileno substituído, alcarileno, alcarileno substituído, aralquileno ou aralquileno substituído, B é opcional, e quando presente é um ligante selecionado do grupo consistindo de alquileno inferior, alquileno inferior substituído, alquenileno inferior, alquenileno inferior substituído, heteroalquileno inferior, heteroalquileno inferior substituído, -O-, -O-(alquileno ou alquileno substituído)-, -S-, -S-(alquileno ou alquileno substituído)-, -S(O)k- onde k é 1, 2, ou 3, -S(O)k(alquileno ou alquileno substituído)-, -C(O)-, -NS(O)2, -OS(O)2-, -C(O)-(alquileno ou alquileno substituído)-, -C(S)-, -C(S)-(alquileno ou alquileno substituído)-, -N(R')-, NR'-(alquileno ou alquileno substituído),- -C(O)N(R')-, -CON(R')-(alquileno ou alquileno substituído)- - CSN(R')-, -CSN(R')-alquileno ou alquileno substituído)-, -N(R')CO-(alquileno ou alquileno substituído)- -N(R')C(O)O-, -S(O)KN(R')-, N(R')C(O)N(R')-, -N(R')C(S)N(R')- , -N(R')S(O)KN(R')-, -N(R')-N=, -C(R')=N-, -C(R')=N-N(R')-, C(R')=N-N=, -C(R')2N=N-, e -C(R')2-N(R')-N(R')-, onde cada R'é independentemente substituído,
Figure img0055
R é H, alquila, alquila substituído, cicloalquila, ou cicloalquila substituído; cada R"é independentemente H, alquila, alquila substituído, ou um grupo protetor, ou, quando mais de um grupo R"está presente, dois R" formam, opcionalmente, um heterocicloalquila; R1 é H, um grupo amino protetor, resina, aminoácido, polipeptídeo, ou polinucleotídeo, e R2 é OH, um grupo éster protetor, resina, aminoácido, polipeptídeo ou polinucleotídeo; cada um de R3 e R4 é independentemente H, halogênio, alquila inferior, ou alquila inferior substituído, ou R3 e R4 ou dois grupos R3 formam, opcionalmente, um cicloalquila ou um heterocicloalquila; ou os grupos -A-B-J-R formam, juntos um cicloalquila ou heterocicloalquila bicíclico ou tricíclico compreendendo pelo menos um grupo carbonila, incluindo um grupo dicarbonila, grupo carbonila protetor, incluindo um grupo dicarbonila protetor, ou grupo carbonila mascarado, incluindo um grupo dicarbonila mascarado; ou o grupo -J-R forma junto um cicloalquila ou heterocicloalquila monocíclico ou bicíclico, compreendendo pelo menos um grupo carbonila, incluindo ou um grupo dicarbonila; pelo menos um grupo carbonila protetor, incluindo um grupo dicarbonila protetor, pelo menos um grupo carbonila mascarado, incluindo um grupo dicarbonila mascarado,
Figure img0056
onde: A é opcional e, quando presente é alquileno inferior, alquileno inferior substituído, cicloalquileno inferior, cicloalquileno inferior substituído, alquenileno inferior, alquenileno inferior substituído, alquinileno, heteroalquileno inferior, heteroalquileno substituído, heterocicloalquileno inferior, heterocicloalquileno inferior substituído, arileno, arileno substituído, heteroarileno, heteroarileno substituído, alcarileno, alcarileno substituído, aralquileno ou aralquileno substituído, B é opcional, e quando presente é um ligante selecionado do grupo consistindo de alquileno inferior, alquileno inferior substituído, alquenileno inferior, alquenileno inferior substituído, heteroalquileno inferior, heteroalquileno inferior substituído, -O-, -O-(alquileno ou alquileno substituído)-, -S-, -S-(alquileno ou alquileno substituído)-, -S(O)k- onde k é 1, 2, ou 3, -S(O)k(alquileno ou alquileno substituído)-, -C(O)-, -NS(O)2, -OS(O)2-, -C(O)-(alquileno ou alquileno substituído)-, -C(S)-, -C(S)-(alquileno ou alquileno substituído)-, -N(R')-, NR'-(alquileno ou alquileno substituído)-, -C(O)N(R')-, -CON(R')-(alquileno ou alquileno substituído)- - CSN(R')-, -CSN(R')-alquileno ou alquileno substituído)-, -N(R')CO-(alquileno ou alquileno substituído)-, -N(R')C(O)O-, -S(O)KN(R')-, N(R')C(O)N(R')-, - N(R')C(S)N(R')-, -N(R')S(O)KN(R')-, -N(R')-N=, -C(R')=N-, -C(R')=N-N(R')-, C(R')=N- N=, -C(R')2N=N-, e -C(R')2-N(R')-N(R')-, onde cada R'é independentemente H, alquila ou alquila substituído, R é H, alquila, alquila substituído, cicloalquila ou cicloalquila substituído; R1 é H, um grupo amino protetor, resina, aminoácido, polipeptídeo, ou polinucleotídeo, e R2 é OH, um grupo éster protetor, resina, aminoácido, polipeptídeo ou polinucleotídeo; cada um de R3 e R4 é independentemente H, halogênio, alquila inferior, ou alquila inferior substituído, ou R3 e R4 ou dois grupos R3 formam, opcionalmente, um grupo cicloalquila ou heterocicloalquila. R5 é H, alquila, alquila substituído, alquenila, alquenila substituído, alquinila, alquinila substituído, alcóxi, alcóxi substituído, alquilalcóxi, alquilalcóxi substituído, óxido de polialquileno, óxido de polialquileno substituído, arila, arila substituído, heteroarila, heteroarila substituído, alcarila, alcarila substituído, aralquila, aralquila substituído, ON(R")2-(alquileno ou alquileno substituído), C(O)SR"-(alquileno ou alquileno substituído), -(alquileno ou alquileno substituído)-S-S-(arila ou arila substituído), -C(O)R", -C(O)2R", ou -C(O)N(R")2 , onde cada R"é independentemente hidrogênio, alquila, alquila substituído, alquenila, alquenila substituído, alcóxi, alcóxi substituído, arila, arila substituído, heteroarila, alcarila, alcarila substituído, aralquila ou aralquila substituído; ou R5 é L-X, onde X é selecionado do grupo consistindo de um rótulo, um corante, um polímero, um polímero hidrossolúvel, um derivado de polietileno glicol; um foto-reticulado; um composto citotóxico, uma droga, um rótulo de afinidade, um rótulo de foto-afinidade, um composto reativo, uma resina, uma segunda proteína, um polipeptídeo ou análogo de polipeptídeo, um anticorpo ou fragmento de anticorpo, um quelante metálico, um co-fator, um ácido graxo, um carboidrato, um polinucleotídeo, um DNA, um RNA, um polinucleotídeo anti-sentido, um sacarídeo, um dendrímero hidrossolúvel, uma ciclodextrina, um biomaterial, uma nanopartícula um rótulo spin, um fluoróforo, uma fração contendo metal, uma fração radioativa, um novo grupo funcional, um grupo que, interage, covalente ou não covalentemente com outras moléculas, uma fração foto-encerrada; uma fração excitável por radiação actínica, um ligante, uma fração fotoisomerizável, biotina, um análogo de biotina, uma fração que incorpora um átomo pesado, um grupo quimicamente clivável, um grupo fotoclivável, uma cadeia lateral alongada, um açúcar ligado a carbono, um agente redox-ativo, um amino-tioácido, uma fração tóxica, uma fração isotopicamente rotulada, uma sonda biofísica, um grupo fosforescente, um grupo quimioluminescente, um grupo denso em elétron, um grupo magnético, um grupo de intercalação, um cromóforo, um agente de transferência de energia, um agente biologicamente ativo, um rótulo detectável, uma pequena molécula; um ácido ribonucléico inibidor, um radionucleotídeo; um agente capturador de nêutrons, um derivado de biotina; ponto(s) quântico(s); um nanotransmissor; um radiotransmissor, uma abzima, um ativador de complexo ativado, um vírus, um adjuvante, um aglican, um alergan, uma angiostatina, um anti-hormônio, um antioxidante, um aptâmero, um RNA orientador, uma saponina, um vetor bilateral, uma macromolécula, um mimótopo, um receptor, uma micela inversa, e quaisquer combinações dos acima; e L é opcional, e quando presente é um ligante selecionado do grupo consistindo de alquileno, alquileno substituído, alquenileno, alquenileno substituído, -O-, -O- (alquileno ou alquileno substituído)-, -S-, -S-(alquileno ou alquileno substituído)-, - S(O)k- onde k é 1, 2, ou 3, -S(O)k(alquileno ou alquileno substituído)-. -C(O)-, -C(O)- (alquileno ou alquileno substituído)-, -C(S)-, -C(S)-(alquileno ou alquileno substituído)-, -N(R')-, NR'-(alquileno ou alquileno substituído), -C(O)N(R')-, -CON(R')- (alquileno ou alquileno substituído)-, -CSN(R')-, -CSN(R')-alquileno ou alquileno substituído)-, -N(R')CO-(alquileno ou alquileno substituído)-, -N(R')C(O)O-, O- N=CR'-(alquileno ou alquileno substituído)-, C(O)NR'-(alquileno ou alquileno substituído)-(alquileno ou alquileno substituído)-, -S(O)k-(alquileno ou alquileno substituído)-S-, S-S-(alquileno ou alquileno substituído)-, -S(O)kN(R')-, N(R')C(O)N(R')-, -N(R')C(S)N(R')-, -N(R')S(O)kN(R')-, -N(R')-N=, -C(R')=N-, -C(R')=N- N(R')-, -C(R')=N-N=, -C(R')2N=N-, e -C(R')2-N(R')-N(R')-, onde cada R'é independentemente H, alquila ou alquila substituído,
Figure img0057
onde: A é opcional e, quando presente é alquileno inferior, alquileno inferior substituído, cicloalquileno inferior, cicloalquileno inferior substituído, alquenileno inferior, alquenileno inferior substituído, alquinileno, heteroalquileno inferior, heteroalquileno substituído, heterocicloalquileno inferior, heterocicloalquileno inferior substituído, arileno, arileno substituído, heteroarileno, heteroarileno substituído, alcarileno, alcarileno substituído, aralquileno ou aralquileno substituído, B é opcional, e quando presente é um ligante selecionado do grupo consistindo de alquileno inferior, alquileno inferior substituído, alquenileno inferior, alquenileno inferior substituído, heteroalquileno inferior, heteroalquileno inferior substituído, -O-, -O-(alquileno ou alquileno substituído)-, -S-, -S-(alquileno ou alquileno substituído)-, -S(O)k- onde k é 1, 2, ou 3, -S(O)k(alquileno ou alquileno substituído)-, -C(O)-, -NS(O)2, -OS(O)2-, -C(O)-(alquileno ou alquileno substituído)-, -C(S)-, -C(S)-(alquileno ou alquileno substituído)-, -N(R')-, NR'-(alquileno ou alquileno substituído)-, -C(O)N(R')-, -CON(R')-(alquileno ou alquileno substituído)-, - CSN(R')-, -CSN(R')-alquileno ou alquileno substituído)-, -N(R')CO-(alquileno ou alquileno substituído)-, -N(R')C(O)O-, -S(O)KN(R')-, N(R')C(O)N(R')-, - N(R')C(S)N(R')-, -N(R')S(O)KN(R')-, -N(R')-N=, -C(R')=N-, -C(R')=N-N(R')-, C(R')=N- N=, -C(R')2N=N-, e -C(R')2-N(R')-N(R')-, onde cada R'é independentemente H, alquila ou alquila substituído, K é -NR6R7 ou -N=CR6R7; R é H, alquila, alquila substituído, cicloalquila ou cicloalquila substituído; R1 é H, um grupo amino protetor, resina, e R2 é OH, um grupo éster protetor, resina, cada um de R3 e R4 é independentemente H, halogênio, alquila inferior, ou alquila inferior substituído, ou R3 e R4 ou dois grupos R3 formam, opcionalmente, um cicloalquila ou um heterocicloalquila; cada um de R6 e R7 é independentemente selecionado do grupo consistindo de H, alquila, alquila substituído, alquenila, alquenila substituído, alcóxi, alcóxi substituído, óxido de polialquileno, óxido de polialquileno substituído, arila, arila substituído, heteroarila, heteroarila substituído, alcarila, alcarila substituído, aralquila e aralquila substituído, -C(O)R", -C(O)2R", -C(O)N(R")2, onde cada R"é independentemente hidrogênio, alquila, alquila substituído, alquenila, alquenila substituído, alcóxi, alcóxi substituído, arila, arila substituído, heteroarila, alcarila, alcarila substituído, aralquila ou aralquila substituído, ou R6 ou R7 é L-X, onde: X é selecionado do grupo consistindo de um rótulo, um corante, um polímero, um polímero hidrossolúvel, um derivado de polietileno glicol; um foto- reticulador; um composto citotóxico, uma droga, um rótulo de afinidade, um rótulo de foto-afinidade, um composto reativo, uma resina, uma segunda proteína, um polipeptídeo ou análogo de polipeptídeo, um anticorpo ou fragmento de anticorpo, um quelante metálico, um co-fator, um ácido graxo, um carboidrato, um polinucleotídeo, um DNA, um RNA, um polinucleotídeo anti-sentido, um sacarídeo, um dendrímero hidrossolúvel, uma ciclodextrina, um biomaterial, uma nanopartícula um rótulo em spin, um fluoróforo, uma fração contendo metal, uma fração radioativa, um novo grupo funcional, um grupo que, interage, covalente ou não covalentemente com outras moléculas, uma fração foto-encerrada; uma fração excitável por radiação actínica, um ligante, uma fração fotoisomerizável, biotina, um análogo de biotina, uma fração que incorpora um átomo pesado, um grupo quimicamente clivável, um grupo fotoclivável, uma cadeia lateral alongada, um açúcar ligado a carbono, um agente redox-ativo, um amino-tioácido, uma fração tóxica, uma fração isotopicamente rotulada, uma sonda biofísica, um grupo fosforescente, um grupo quimioluminescente, um grupo denso em elétron, um grupo magnético, um grupo de intercalação, um cromóforo, um agente de transferência de energia, um agente biologicamente ativo, um rótulo detectável, uma pequena molécula; um ácido ribonucléico inibidor, um radionucleotídeo; um agente capturador de nêutrons, um derivado de biotina; ponto(s) quântico(s); um nanotransmissor; um radiotransmissor, uma abzima, um ativador de complexo ativado, um vírus, um adjuvante, um aglican, um alergan, uma angiostatina, um anti-hormônio, um antioxidante, um aptâmero, um RNA orientador, uma saponina, um vetor bilateral, uma macromolécula, um mimótopo, um receptor, uma micela inversa, e quaisquer combinações dos acima; e qualquer combinação dos acima, e L é opcional, e quando presente é um ligante selecionado do grupo consistindo de alquileno, alquileno substituído, alquenileno, alquenileno substituído, -O-, -O-(alquileno ou alquileno substituído)-, -S-, -S-(alquileno ou alquileno substituído)-, -S(O)k- onde k é 1, 2, ou 3, -S(O)k(alquileno ou alquileno substituído)-. -C(O)-, -C(O)-(alquileno ou alquileno substituído)-, -C(S)-, -C(S)-(alquileno ou alquileno substituído)-, -N(R')-, NR'-(alquileno ou alquileno substituído), -C(O)N(R')-, -CON(R')-(alquileno ou alquileno substituído)-, -CSN(R')-, -CSN(R')-alquileno ou alquileno substituído)-, -N(R')CO-(alquileno ou alquileno substituído)-, -N(R')C(O)O-, -S(O)kN(R')-, N(R')C(O)N(R')-, -N(R')C(S)N(R')-, -N(R')S(O)kN(R')-, -N(R')-N=, - C(R')=N-, -C(R')=N-N(R')-, -C(R')=N-N=, -C(R')2N=N-, e -C(R')2-N(R')-N(R')-, onde cada R'é independentemente H, alquila ou alquila substituído;
Figure img0058
onde: A é opcional e, quando presente é alquileno inferior, alquileno inferior substituído, cicloalquileno inferior, cicloalquileno inferior substituído, alquenileno inferior, alquenileno inferior substituído, alquinileno, heteroalquileno inferior, heteroalquileno substituído, heterocicloalquileno inferior, heterocicloalquileno inferior substituído, arileno, arileno substituído, heteroarileno, heteroarileno substituído, alcarileno, alcarileno substituído, aralquileno ou aralquileno substituído, ou R é H, alquila, alquila substituído, cicloalquila, ou cicloalquila substituído; R1 é H, um grupo amino protetor, resina, aminoácido, polipeptídeo, ou polinucleotídeo, e R2 é OH, um grupo éster protetor, resina, aminoácido, polipeptídeo ou polinucleotídeo; X1 é C, S ou S(O); e L é alquileno, alquileno ou alquileno substituído, N(R')(alquileno) ou N(R')|(alquileno substituído), onde R'é alquila, alquila substituído, ou
Figure img0059
onde: A é opcional e, quando presente é alquileno inferior, alquileno inferior substituído, cicloalquileno inferior, cicloalquileno inferior substituído, alquenileno inferior, alquenileno inferior substituído, alquinileno, heteroalquileno inferior, heteroalquileno substituído, heterocicloalquileno inferior, heterocicloalquileno inferior substituído, arileno, arileno substituído, heteroarileno, heteroarileno substituído, alcarileno, alcarileno substituído, aralquileno ou aralquileno substituído,
Figure img0060
onde (a) indica ligação ao grupo A e (b) indica ligação aos respectivos grupos carbonila, R3 e R4sao independentemente escolhidos dentre H, halogênio, alquila, alquila substituído, cicloalquila, ou cicloalquila substituído, ou R3 e R4 ou dois grupos R3 ou dois grupos R4, formam, opcionalmente um cicloalquila ou um heterocicloalquila; R é H, halogênio, alquila, alquila substituído, cicloalquila, ou cicloalquila substituído; T3 é uma ligação, C(R)(R), O ou S; e R é H, halogênio, alquila, alquila substituído, cicloalquila ou cicloalquila substituído; R1 é H, um grupo amino protetor, resina, aminoácido, polipeptídeo, ou polinucleotídeo, e R2 é OH, um grupo éster protetor, resina, aminoácido, polipeptídeo ou polinucleotídeo.
[00526]Num aspecto dos métodos e composições aqui descritos têm-se composições incluindo pelo menos um polipeptídeo, com pelo menos um, incluindo, sem limitação, pelo menos dois, pelo menos três, pelo menos quatro, pelo menos cinco, pelo menos seis, pelo menos sete, pelo menos oito, pelo menos nove, ou dez ou mais aminoácidos não naturais que foram pós-traducionalmente modificados. Os aminoácidos não naturais pós-traducionalmente modificados podem ser iguais ou diferentes, por exemplo, podem existir 1, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, ou mais sítios diferentes no polipeptídeo que compreende, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 ou mais diferentes ou os mesmos aminoácidos não naturais pós traducionalmetne modificados. Em algumas modalidades uma composição inclui um polipeptídeo com pelo menos um, porém pouco menos que todos, de um dado aminoácido presente no polipeptídeo substituído com um aminoácido não natural pós-traducionalmente modificado. Para um dado polipeptídeo, com mais de um aminoácido não natural pós- traducionalmente modificado, os aminoácidos não naturais pós-traducionalmente modificados, podem ser iguais ou diferentes (tal como a guisa de exemplo, apenas, o polipeptídeo pode incluir dois ou mais aminoácidos não naturais pós- traducionalmente modificados, ou pode incluir dois dos mesmos aminoácidos não naturais pós-traducionalmente modificados). Para um dado polipeptídeo com mais de dois aminoácidos não naturais pós-traducionalmente modificados, os aminoácidos não naturais pós-traducionalmente modificados podem ser iguais, diferentes ou uma combinação de uma série de aminoácidos não naturais pós- traducionalmente modificados, da mesma espécie com pelo menos um aminoácido não natural pós-traducionalmente modificados diferente.
A. Métodos para Modificação Pós-Traducional de Polipeptídeos de Aminoácido não Natural: Reações de Aminoácidos Não Naturais Contendo Carbonila com Reagentes Contendo Hidroxilamina
[00527]As cadeias laterais dos aminoácidos de ocorrência natural carecem de sítios altamente eletrofílicos. Consequentemente, a incorporação de um aminoácido não natural com uma cadeia lateral contendo eletrófilo, incluindo, a guisa de exemplo, um aminoácido contendo um grupo carbonila ou dicarbonila, tal como cetonas ou aldeídos, torna possível a derivatização específica ao sítio desta cadeia lateral via ataque nucleofílico do grupo carbonila ou dicarbonila. No caso onde o ataque nucleofílico e uma hidroxilamina, uma proteína derivatizada de oxima será gerada. Os métodos para derivatização e/ou modificação adicional podem ser realizados com o polipeptídeo que foi purificado antes da etapa de derivatização ou após essa etapa. Além disso, os métodos para derivatizar e/ou ainda modificar podem ser realizados com polímeros sintéticos, polissacarídeos, ou polinucleotídeos que foram purificados antes ou após tais modificações. Além disso, a etapa de derivatização pode ocorrer sob condições brandamente ácidas ou ligeiramente básicas, incluindo, a guisa de exemplo, entre um pH de aproximadamente 2-8 ou entre um pH de cerca de 4-8.
[00528]Um método de derivatização de polipeptídeo com base na reação de polipeptídeos contendo carbonila ou dicarbonila com uma molécula substituída com hidroxilamina possui vantagens distintas. Primeiro, as hidroxilaminas passam por condensação com compostos contendo carbonila - ou dicarbonila numa faixa de pH de 2-8 (e, em mais modalidades, numa faixa de pH de 4-8) para gerar adutos de oxima. Sob tais condições, as cadeias laterais dos aminoácidos de ocorrência natural são não reativos. Segundo, tal química seletiva torna possível a derivatização específica ao sítio das proteínas recombinantes: as proteínas derivatizadas podem, agora, ser preparadas como produtos homogêneos definidos. Terceiro, as condições brandas necessárias para realização da reação das hidroxilaminas aqui descritas com os polipeptídeos contendo carbonila- ou dicarbonila aqui descritas geralmente, não destroem irreversivelmente a estrutura terciária do polipeptídeo (exceto, naturalmente, onde a finalidade da reação seja destruir tal estrutura terciária). Finalmente, embora o grupo amino da hidroxilamina apreça ser metabolizado por E. coli a condensação das hidroxilaminas com moléculas carbonila- ou dicarbonila gera adutos oxima que são estáveis sob condições biológicas.
[00529]A guisa de exemplo apenas, os seguintes aminoácidos não naturais são o tipo de aminoácidos contendo carbonil- ou dicarbonila que são reativos com os reagentes contendo hidroxilamina aqui descritos, que podem ser usados par modificar ainda os polipeptídeos de aminoácido não natural contendo carbonil- ou dicarbonila.
Figure img0061
onde: A é opcional e, quando presente é alquileno inferior, alquileno inferior substituído, cicloalquileno inferior, cicloalquileno inferior substituído, alquenileno inferior, alquenileno inferior substituído, alquinileno, heteroalquileno inferior, heteroalquileno substituído, heterocicloalquileno inferior, heterocicloalquileno inferior substituído, arileno, arileno substituído, heteroarileno, heteroarileno substituído, alcarileno, alcarileno substituído, aralquileno ou aralquileno substituído, B é opcional, e quando presente é um ligante selecionado do grupo consistindo de alquileno inferior, alquileno inferior substituído, alquenileno inferior, alquenileno inferior substituído, heteroalquileno inferior, heteroalquileno inferior substituído, -O-, -O-(alquileno ou alquileno substituído)-, -S-, -S-(alquileno ou alquileno substituído)-, -S(O)k- onde k é 1, 2, ou 3, -S(O)k(alquileno ou alquileno substituído)-, -C(O)-, -NS(O)2, -OS(O)2-, -C(O)-(alquileno ou alquileno substituído)-, - C(S)-, -C(S)-(alquileno ou alquileno substituído)-, -N(R')-, NR'-(alquileno ou alquileno substituído),- -C(O)N(R')-, -CON(R')-(alquileno ou alquileno substituído)- -CSN(R')-, - CSN(R')-alquileno ou alquileno substituído)-, -N(R')CO-(alquileno ou alquileno substituído)- -N(R')C(O)O-, -S(O)KN(R')-, N(R')C(O)N(R')-, -N(R')C(S)N(R')-, - N(R')S(O)KN(R')-, -N(R')-N=, -C(R')=N-, -C(R')=N-N(R')-, C(R')=N-N=, -C(R')2N=N-, e -C(R')2-N(R')-N(R')-, onde cada R'é independentemente H, alquila ou alquila substituído,
Figure img0062
R é H, alquila, alquila substituído, cicloalquila, ou cicloalquila substituído; cada R" é independentemente H, alquila, alquila substituído, ou um grupo protetor, ou, quando mais de um grupo R" está presente, dois R" formam, opcionalmente, um heterocicloalquila; R1 é H, um grupo amino protetor, resina, e R2 é OH, um grupo éster protetor, resina, e cada um de R3 e R4 é independentemente H, halogênio, alquila inferior, ou alquila inferior substituído, ou R3 e R4 ou dois grupos R3 formam, opcionalmente, um cicloalquila ou um heterocicloalquila; ou os grupos -A-B-J-R formam, juntos um cicloalquila ou heterocicloalquila bicíclico ou tricíclico compreendendo pelo menos um grupo carbonila, incluindo um grupo dicarbonila, grupo carbonila protetor, incluindo um grupo dicarbonila protetor, ou grupo carbonila mascarado, incluindo um grupo dicarbonila mascarado; ou o grupo -J-R forma junto um cicloalquila ou heterocicloalquila monocíclico ou bicíclico, compreendendo pelo menos um grupo carbonila, incluindo ou um grupo dicarbonila; pelo menos um grupo carbonila protetor, incluindo um grupo dicarbonila protetor, pelo menos um grupo carbonila mascarado, incluindo um grupo dicarbonila mascarado.
[00530]Em algumas modalidades, o composto de fórmula (I) é reativo com hidroxilaminas numa solução aquosa sob condições brandamente acidas. Em algumas modalidades, tais condições ácidas são pH 2 a 8.
[00531]A guisa de exemplo apenas, para os fins supracitados, os compostos de Fórmula (I) incluem compostos com a estrutura:
Figure img0063
onde: A é opcional e, quando presente é alquileno inferior, alquileno inferior substituído, cicloalquileno inferior, cicloalquileno inferior substituído, alquenileno inferior, alquenileno inferior substituído, alquinileno, heteroalquileno inferior, heteroalquileno substituído, heterocicloalquileno inferior, heterocicloalquileno inferior substituído, arileno, arileno substituído, heteroarileno, heteroarileno substituído, alcarileno, alcarileno substituído, aralquileno ou aralquileno substituído, R é H, alquila, alquila substituído, cicloalquila, ou cicloalquila substituído; R1 é H, um grupo amino protetor, resina, aminoácido, polipeptídeo, ou polinucleotídeo, e R2 é OH, um grupo éster protetor, resina, aminoácido, polipeptídeo ou polinucleotídeo; X1 é C, S ou S(O); e L é uma ligação, alquileno ou alquileno substituído, N(R')(alquileno) ou N(R')(alquileno substituído), onde R'é independentemente H, alquila ou alquila substituído.
[00532]A guisa de exemplo apenas, para os fins supracitados, os compostos de Fórmula (I) incluem os compostos com a estrutura da Fórmula (XXXX):
Figure img0064
onde: A é opcional e, quando presente é alquileno inferior, alquileno inferior substituído, cicloalquileno inferior, cicloalquileno inferior substituído, alquenileno inferior, alquenileno inferior substituído, alquinileno, heteroalquileno inferior, heteroalquileno substituído, heterocicloalquileno inferior, heterocicloalquileno inferior substituído, arileno, arileno substituído, heteroarileno, heteroarileno substituído, alcarileno, alcarileno substituído, aralquileno ou aralquileno substituído,
Figure img0065
onde (a) indica ligação ao grupo A e (b) indica ligação aos respectivos grupos carbonila, R3 e R4 são independentemente escolhidos dentre H, halogênio, alquila, alquila substituído, cicloalquila, ou cicloalquila substituído, ou R3 e R4 ou dois grupos R3 ou dois grupos R4, formam, opcionalmente um cicloalquila ou um heterocicloalquila; R é H, alquila, alquila substituído, cicloalquila, ou cicloalquila substituído; T3 é uma ligação, C(R)(R), O ou S e R é H, halogênio, alquila, alquila substituído, cicloalquila ou cicloalquila substituído; R1 é H, um grupo amino protetor, resina, aminoácido, polipeptídeo, ou polinucleotídeo, e R2 é OH, um grupo éster protetor, resina, aminoácido, polipeptídeo ou polinucleotídeo.
[00533]Os tipos de polipeptídeos que compreendem tais aminoácidos não naturais contendo carbonila ou dicarbonila são praticamente, ilimitados, desde que o aminoácido não natural contendo carbonila ou dicarbonila esteja localizado no polipeptídeo, de modo que o reagente hidroxilamina possa reagir com o grupo carbonila ou dicarbonila e não criar um aminoácido não natural modificado resultante, que destrua a estrutura terciária do polipeptídeo (exceto, naturalmente, se tal destruição for a finalidade da reação).
[00534]À guisa de exemplo apenas, os seguintes reagentes contendo hidroxilamina são o tipo de reagentes que contém hidroxilamina reativos com os aminoácidos não naturais contendo carbonila- ou dicarbonila aqui descritos, e podem ser usados para modificar mais ainda os polipeptídeos de aminoácido não natural contendo carbonila ou dicarbonila:
Figure img0066
onde cada X é independentemente alquila, alquenila substituído, alquinila, alquinila substituído, alcóxi, alcóxi substituído, alquilalcóxi, alquilalcóxi substituído, óxido de polialquileno, óxido de polialquileno substituído, arila, arila substituído, heteroarila, heteroarila substituído, alcarila, alcarila substituído, aralquila, aralquila substituído, ON(R")2-(alquileno ou alquileno substituído), C(O)SR"-(alquileno ou alquileno substituído), -(alquileno ou alquileno substituído)-S-S-(arila ou arila substituído), -C(O)R", -C(O)2R", ou -C(O)N(R")2, onde cada R"é independentemente hidrogênio, alquila, alquila substituído, alquenila, alquenila substituído, alcóxi, alcóxi substituído, arila, arila substituído, heteroarila, alcarila, alcarila substituído, aralquila ou aralquila substituído; ou cada X é independentemente selecionado do grupo consistindo de um rótulo, um corante, um polímero, um polímero hidrossolúvel, um derivado de polietileno glicol; um foto-reticulado; um composto citotóxico, uma droga, um rótulo de afinidade, um rótulo de foto-afinidade, um composto reativo, uma resina, uma segunda proteína, um polipeptídeo ou análogo de polipeptídeo, um anticorpo ou fragmento de anticorpo, um quelante metálico, um co-fator, um ácido graxo, um carboidrato, um polinucleotídeo, um DNA, um RNA, um polinucleotídeo anti-sentido, um sacarídeo, um dendrímero hidrossolúvel, uma ciclodextrina, um biomaterial, uma nanopartícula um rótulo spin, um fluoróforo, uma fração contendo metal, uma fração radioativa, um novo grupo funcional, um grupo que, interage, covalente ou não covalentemente com outras moléculas, uma fração foto-encerrada; uma fração excitável por radiação actínica, um ligante, uma fração fotoisomerizável, biotina, um análogo de biotina, uma fração que incorpora um átomo pesado, um grupo quimicamente clivável, um grupo fotoclivável, uma cadeia lateral alongada, um açúcar ligado a carbono, um agente redox-ativo, um amino-tioácido, uma fração tóxica, uma fração isotopicamente rotulada, uma sonda biofísica, um grupo fosforescente, um grupo quimioluminescente, um grupo denso em elétron, um grupo magnético, um grupo de intercalação, um cromóforo, um agente de transferência de energia, um agente biologicamente ativo, um rótulo detectável, uma pequena molécula; um ácido ribonucléico inibidor, um radionucleotídeo; um agente capturador de nêutrons, um derivado de biotina; ponto(s) quântico(s); um nanotransmissor; um radiotransmissor, uma abzima, um ativador de complexo ativado, um vírus, um adjuvante, um aglican, um alergan, uma angiostatina, um anti-hormônio, um antioxidante, um aptâmero, um RNA orientador, uma saponina, um vetor bilateral, uma macromolécula, um mimótopo, um receptor, uma micela inversa, e quaisquer combinações dos acima; cada L é independentemente selecionado do grupo consistindo de alquileno, alquileno substituído, alquenileno, alquenileno substituído, -O-, -O- (alquileno ou alquileno substituído)-, -S-, -S-(alquileno ou alquileno substituído)-, - S(O)k- onde k é 1, 2, ou 3, -S(O)k(alquileno ou alquileno substituído)-, -C(O)-, -C(O)- (alquileno ou alquileno substituído)-, -C(S)-, -C(S)-(alquileno ou alquileno substituído)-, -N(R')-, NR'-(alquileno ou alquileno substituído), -C(O)N(R')-, -CON(R')- (alquileno ou alquileno substituído)-, -N(R')CO(alquileno ou alquileno substituído)- (alquileno ou alquileno substituído)-, -OCON(R')-(alquileno ou alquileno substituído)- -CSN(R')-, -CSN(R')-(alquileno ou alquileno substituído)-, -N(R')CO-(alquileno ou alquileno substituído)-, N(R')C(O)O-, N(R')C(O)O-(alquileno ou alquileno substituído)-, S(O)kN(R')-, N(R')C(O)N(R')-, N(R')C(O)N(R')-(alquileno ou alquileno substituído) -N(R')C(S)N(R')- -N(R')S(O)kN(R')-, -N(R')-N=, -C(R')=N-, -C(R')=N- N(R')-, -C(R')=N-N=, -C(R')2N=N-, e -C(R')2-N(R')-N(R')-; L1 é opcional, e quando presente é -C(R')p-NR'-C(O)O-(alquileno ou alquileno substituído)- onde p é 0, 1 ou 2; cada R'é independentemente H, alquila ou alquila substituído; W é -N(R8)2, onde cada R8 é independentemente H ou um grupo amino- protetor, e n é 1 a 3; contando que, L-L1-W propiciem juntos, pelo menos um grupo hidroxilamina capaz de reagir com um grupo carbonila (inclusive um grupo dicarbonila) num aminoácido não natural ou um polipeptídeo de aminoácido não natural "modificado ou não modificado".
[00535]Em algumas modalidades dos compostos de Fórmula (XIX) X é um polímero compreendendo alquila, alquila substituído, alquenila, alquenila substituído, alquinila, alquinila substituído, alcóxi, alcóxi substituído, alquilalcóxi, alquilalcóxi substituído, óxido de polialquileno, óxido de polialquileno substituído, arila, arila substituído, heteroarila, heteroarila substituído, alcarila, alcarila substituído, aralquila, ou aralquila substituído. Em algumas modalidades dos compostos de fórmula (XIX), X é um polímero compreendendo óxido de polialquileno ou óxido de polialquileno substituído. Em algumas modalidades dos compostos de Fórmula (XIX), X é um polímero compreendendo -[(alquileno ou alquileno substituído)-O-(hidrogênio, alquila, ou alquila substituído)]x, onde x é de 20-10.000. Em algumas modalidades dos compostos de Fórmula (XIX), X é m-PEG tendo um peso molecular variando de 2 a 40 KDa. Em algumas modalidades dos compostos de Fórmula (XIX), X é um agente biologicamente ativo selecionado dentre o grupo consistindo em um peptídeo, proteína, enzima, anticorpo, droga, corante lipídio, nucleosídeo, oligonucleotídeo, célula, vírus lipossoma, micropartícula e micela. Em algumas modalidades dos compostos de Fórmula (XIX), X é uma droga selecionada do grupo consistindo em um antibiótico, fungicida, agente antiviral, agente antiinflamatório, agente anti-tumor, agente cardiovascular, agente ansiolítico, hormônio, fator de crescimento, agente esteroidal. Em algumas modalidades dos compostos de Fórmula (XIX), X e uma enzima selecionada dentre o grupo consistido de peroxidase de rábano de cavalo, fosfatase alcalina, β-galactosidase, e glicose oxidase. Em algumas modalidades dos compostos de Fórmula (XIX), X é um rótulo detectável, selecionado do grupo consistindo em fluorescente, fosforescente, quimioluminescente, quelante, denso de elétron, magnético, intercalação, radioativo, cromóforo, e fração de transferência de energia. Em algumas modalidades dos compostos de Fórmula (XIX), L é selecionado do grupo consistindo de -N(R')CO- (alquileno ou alquileno substituído)-, -CON(R')-(alquileno ou alquileno substituído)-, - NR')C(O)(R')-(alquileno ou alquileno substituído)-, -O-CON(R')-(alquileno ou alquileno substituído)-, -O-(alquileno ou alquileno substituído)-, -C(O)N(R')- e - N(R')C(O)0-(alquileno ou alquileno substituído)-.
[00536]Em algumas modalidades dos compostos de Fórmula (XIX) estão compostos com a estrutura da Fórmula (XX):
Figure img0067
Em algumas modalidades dos compostos de Fórmula (XX) estão compostos selecionados do grupo consistindo em:
Figure img0068
outras modalidades tais como grupo m-PEG ou PEG têm um peso molecular variando de 5 a 30 kDa.
[00537]Em algumas modalidades dos compostos de Fórmula (XIV) estão compostos com a estrutura da Fórmula (XXI):
Figure img0069
Em algumas modalidades dos compostos de fórmula (XXI), encontram-se os compostos selecionado do grupo consistindo em:
Figure img0070
[00538]Em algumas modalidades dos compostos de Fórmula (XIX), estão compostos com a estrutura da Fórmula (XXII):
Figure img0071
[00539]Em algumas modalidades dos compostos de Fórmula (XXII), L é - (alquileno ou alquileno substituído)-N(R')C(O)O-(alquileno ou alquileno substituído)-. Em algumas modalidades dos compostos de Fórmula (XXII) estão compostos com a estrutura da Fórmula (XXIII):
Figure img0072
onde outras modalidades dos compostos de Fórmula (XXII) tais como grupos m-PEG têm um peso molecular variando de 5 a 30 kDa.
[00540]Em algumas modalidades dos compostos de Fórmula (XIX), estão compostos com a estrutura da Fórmula (XXIV):
Figure img0073
[00541]Em algumas modalidades dos compostos de Fórmula (XXIV), L é - (alquileno ou alquileno substituído)-N(R')C(O)O-(alquileno ou alquileno substituído)- ou -N(R')C(O)O-(alquileno ou alquileno substituído)-. Em algumas modalidades dos compostos de Fórmula (XXIV) estão compostos com a estrutura da Fórmula (XXV):
Figure img0074
onde outras modalidades dos compostos de fórmula (XXIV) tais grupos m-PEG têm um peso molecular que varia de 5 a 30 kDa.
[00542]Em algumas modalidades dos compostos de Fórmula (XIX), estão compostos com a estrutura da Fórmula (XXVI):
Figure img0075
onde cada R10 e independentemente H ou um grupo amino-protetor.
[00543]Em algumas modalidades dos compostos de Fórmula (XXVI), o óxido de polialquileno é PEG. Em algumas modalidades dos compostos de Fórmula (XXVI), o grupo PEG tem um peso molecular que varia de 5 a 30 kDa. Em outras modalidades dos compostos de Fórmula (XXVI) está o composto correspondente a:
Figure img0076
[00544]Três modalidades ilustrativas dos métodos para acoplamento de uma hidroxilamina a um aminoácido não natural contendo carbonila num polipeptídeo estão apresentadas na Figura 7. Nessas modalidades ilustrativas, é adicionado um reagente derivatizado de hidroxilamina a uma solução tamponada (pH 2-8) de um polipeptídeo de aminoácido não natural contendo carbonila. A reação prossegue na temperatura ambiente durante horas até dias. A fim de acelerar a conjugação, aditivos tais como os apresentados na Figura 8 são adicionado, onde tais compostos também são conhecidos aqui como aceleradores. Em algumas modalidades, os aceleradores ou aditivos são capazes de catálise básica. O polipeptídeo de aminoácido não natural contendo oxima resultante é purificado por HPLC, FPLC ou cromatografia de exclusão de tamanho.
[00545]Numa modalidade, químicas de ligante múltiplos podem reagir específico ao sítio com um polipeptídeo de aminoácido não natural substituído com carbonila- ou dicarbonila. Numa modalidade, os métodos de ligação aqui descritos utilizam ligantes contendo a funcionalidade hidroxilamina em pelo menos um terminal do ligante (mono, bi- ou multifuncional). A condensação do ligante derivatizado de hidroxilamina com uma proteína ceto-substituída gera uma ligação oxima estável. Ligantes bi- e/ou multifuncionais (por exemplo, hidroxilamina com um ou mais de outras químicas de ligação)( permite a conexão sítio-específica de diferentes moléculas) ao polipeptídeo de aminoácido não natural, enquanto ligantes mono-funcionais (hidroxilamina substituída em todos os terminais) facilita a dimerização ou oligomerização específica ao sítio do polipeptídeo de aminoácido não natural. Combinando-se esta estratégia de ligação com a tecnologia de tradução in vivo presente, torna-se possível especificar as estruturas tridimensionais das proteínas quimicamente elaboradas.
[00546]Em algumas modalidades estão métodos para derivatizar um polipeptídeo compreendendo aminoácidos de Fórmulas I-XVIII, XXX-XXXIV(A&B) ou XXXX-XXXXIII, incluindo quaisquer sub-fórmulas ou compostos específicos que se enquadrem no escopo das Fórmulas I-XVIII, XXX-XXXIV (A & B), e XXXX-XXXXIII onde o método compreende o contato do polipeptídeo compreendendo pelo menos um aminoácido da Fórmula I-XVIII, XXX-XXXIV(A&B) ou XXXX-XXXXIII com um reagente de Fórmula (XIX). Em algumas modalidades estão polipeptídeos derivatizados resultantes compreendendo pelo menos um aminoácido contendo oxima correspondentes à Fórmula (XI), enquanto, em outras modalidades, tais polipeptídeos derivatizado são estáveis em solução aquosa por pelo menos mês, sob condições suavemente ácidas. Em outras modalidades, tais polipeptídeos derivatizados são estáveis por pelo menos 2 semanas sob condições brandamente ácidas. Em outras modalidades, ais condições são pH 2 a 8. Em outras modalidades, a estrutura terciária do polipeptídeo derivatizado é preservada. Em outras modalidades tal derivatização de polipeptídeos compreende ainda ligação do polipeptídeo derivatizado a um outro polipeptídeo. Em outras modalidades tais polipeptídeos sendo derivatizados são homólogos a uma proteína terapêutica, selecionada do grupo consistindo de : alfa-1, antitripsina, angiostatina, fator anti- hemolítico, anticorpo, fragmento de anticorpo, apoliproteína, apoproteína, fator natriurético atrial, polipeptídeo natriurético atrial, peptídeo atrial, C-X-C quimiocina, T39765, NAP-2, ENA-78, gro-a, gro-b, gro-c, IP-10, GCP-2, NAP-4, SDF-1, PF4, MIG, calcitonina, ligante c-kit, citocina, CC quimiocina, proteína 1- quimioatrativa de monócito, proteína-2 quimioatrativa de monócito, proteína 3 quimioatrativa de monócito, proteína-1 alfa inflamatória de monócito, proteína beta inflamatória de monócito, RANTES, 1309, R83915, R91733, HCC1, T58847, D31065, T64262, CD40, ligante CD40, ligante c-kit, colágeno, fator estimulante de colônia (CSF), fator 5a complementar, inibidor complementar, receptor 1 complementar, citocina, peptídeo 78 ativador de neutrófilo epitelial, MIP-16, MCP-1, fator de crescimento epidérmico (EGF), peptídeo ativador de neutrófilo epitelial, eritropoietina (EPO), toxina esfoliante, Fator IX, Fator VII, Fator VIII, Fator X, fator de crescimento de fibroblasto (FGF), fibrinogênio, fibronectina, proteína de feixe de quatro hélices, G- CSF, glp-1, GM-CSF, glicocerebrosidase, gonadotropina, fator de crescimento, receptor do fator de crescimento, grf, proteína de ouriço, hemoglobina, fator de crescimento de hepatócito (hGF), hirudina, hormônio do crescimento humano (hGH), albumina sérica humana, ICAM-1, receptor de ICAM-1, LFA-1, receptor de LFA-1, insulina, fator de crescimento semelhante à insulina (IGF), IGF-I, IGF-II, interferon (IFN), IFN-alfa, IFN-beta, IFN-gama, interleucina, (IL, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, fator de crescimento de ceratinócito (KGF), lactoferrina, fator inibidor de leucemia, luciferase, neurturina, fator inibidor de neutrófilo (NIF), oncostatina M, proteína osteogênica, produto oncogênico, paracitonina, hormônio da paratireóide , PD-ECSF, PDGF, hormônio peptídico, pleiotropina, proteína A, proteína G, pth, exotoxina A pirogênica, exotoxina B pirogênica, exotoxina C pirogênica, pyy, relaxina, renina, SCF, proteína biossintética pequena, receptor I de complemento solúvel, I-CAM 1 solúvel, receptor de interleucina solúvel, receptor de TNF solúvel, somatomedina, somatostatina, somatotropina, super-antígenos de estreptoquinase, enterotoxina estafilocócica, SEA, SEB, SEC1, SEC2, SEC3, SED, SEE receptor do hormônio esteróide, superóxido dismutase, toxina da síndrome do choque tóxico, alfa 1 timosina, ativador plasminogênico de tecido, fator de crescimento de tumor (TGF), fator de necrose de tumor, fator alfa de necrose de tumor, fator beta de necrose de tumor, receptor do fator de necrose de tumor (TNFR), proteína VLA-4, proteína VCAM-1, fator de crescimento endotelial vascular (VEGF), uroquinase, mos, ras, raf, met, p53 tat, fos, myc, jun, myb, rel, receptor de estrogênio, receptor de progesterona, receptor de testosterona, receptor de aldosterona, receptor de LDL e corticosterona.
[00547]Em algumas modalidades encontram-se métodos para produção de um dímero de polipeptídeo,compreendendo o método: (i) derivatizar um primeiro polipeptídeo compreendendo um aminoácido de Fórmula (I) com um reagente de Fórmula (XXVI) e (ii) contatar a proteína derivatizada resultante da etapa (i) com uma segunda proteína compreendendo um aminoácido de Fórmula (I), formando assim um dímero compreendendo o primeiro polipeptídeo e o segundo polipeptídeo. Em outras modalidades, encontram-se métodos para produzir um dímero de polipeptídeo, onde o primeiro polipeptídeo e o segundo polipeptídeo compreende um aminoácido correspondente à Fórmula (II). Em algumas modalidades, os polipeptídeos são purificados antes ou após contato com o reagente de Fórmula (XXVI). Em outras modalidades, a proteína derivatizada resultante da etapa (i) compreende pelo menos uma oxima contendo aminoácido correspondente à Fórmula (XXVIII):
Figure img0077
B. Métodos Para Modificação Pós-Traducional De Polipeptídeos De Aminoácido Não Natural: Reações De Aminoácidos Não Naturais Contendo Oxima Com Reagente Contendo Carbonila
[00548]Um método de derivatização de proteína baseado na reação de troca de uma proteína contendo oxima com uma molécula carbonil-ou dicarbonila substituída possui vantagens distintas. Primeiro, estudos indicam que, adutos de oxima a base de ácido passam por troca de oxima por equilíbrio com um composto mais reativo contendo carbonila ou dicarbonila do que um usado para gerar a oxima original. Esta reação de troca ocorre numa faixa de pH de 4-8: sob tais condições, as cadeias laterais dos aminoácidos de ocorrência natural são não reativos. Assim, um método geral para preparação de moléculas substituídas com carbonila ou dicarbonila adequadas para reação com proteínas contendo oxima podem proporcionar acesso a uma ampla série de proteínas derivatizadas específicas ao sítio. No contexto desta tecnologia de tradução in vivo, um método geral para preparar versões carbonila ou dicarbonila-substituídas de moléculas que são tipicamente usadas para derivatizar proteínas (incluindo, à guisa de exemplo, polímeros hidrofílicos tais como polietileno glicol) é valioso e irá proporcionar acesso a uma faixa considerável de polipeptídeos de aminoácido não natural derivatizados especificamente ao sítio. Segundo, tal química seletiva torna possível a derivatização específica ao sito de proteínas recombinantes: as proteínas derivatizadas podem, agora, ser preparadas como produtos homogêneos definidos. Terceiro, as condições brandas necessárias para afetar a reações de troca aqui descritas não destroem irreversivelmente, a estrutura terciária do polipeptídeo (exceto, naturalmente, onde a finalidade da reação seja destruir tal estrutura terciária). Finalmente, as reações de troca geram novos adutos de oxima que são estáveis sob condições biológicas.
[00549]A guisa de exemplo apenas, os seguintes aminoácidos não naturais ao o tipo aminoácidos contendo oxima reativos com os reagentes contendo carbonila ou dicarbonila aqui descritos que podem ser usados para criar novos polipeptídeos de aminoácido não natural contendo oxima:
Figure img0078
onde: A é opcional e, quando presente é alquileno inferior, alquileno inferior substituído, cicloalquileno inferior, cicloalquileno inferior substituído, alquenileno inferior, alquenileno inferior substituído, alquinileno, heteroalquileno inferior, heteroalquileno substituído, heterocicloalquileno inferior, heterocicloalquileno inferior substituído, arileno, arileno substituído, heteroarileno, heteroarileno substituído, alcarileno, alcarileno substituído, aralquileno ou aralquileno substituído, B é opcional, e quando presente é um ligante selecionado do grupo consistindo de alquileno inferior, alquileno inferior substituído, alquenileno inferior, alquenileno inferior substituído, heteroalquileno inferior, heteroalquileno inferior substituído, -O-, -O-(alquileno ou alquileno substituído)-, -S-, -S-(alquileno ou alquileno substituído)-, -S(O)k- onde k é 1, 2, ou 3, -S(O)k(alquileno ou alquileno substituído)-, -C(O)-, -NS(O)2, -OS(O)2-, -C(O)-(alquileno ou alquileno substituído)-, -C(S)-, -C(S)-(alquileno ou alquileno substituído)-, -N(R')-, NR'-(alquileno ou alquileno substituído),- -C(O)N(R')-, -CON(R')-(alquileno ou alquileno substituído)- - CSN(R')-, -CSN(R')-alquileno ou alquileno substituído)-, -N(R')CO-(alquileno ou alquileno substituído)- ,-N(R')C(O)O-, -S(O)KN(R')-, N(R')C(O)N(R')-, - N(R')C(S)N(R')-, -N(R')S(O)KN(R')-, -N(R')-N=, -C(R')=N-, -C(R')=N-N(R')-, C(R')=N- N=, -C(R')2N=N-, e -C(R')2-N(R')-N(R')-, onde cada R'é independentemente H, alquila ou alquila substituído, R é H, alquila, alquila substituído, cicloalquila ou cicloalquila substituído; R1 é H, um grupo amino protetor, resina, aminoácido, polipeptídeo, ou polinucleotídeo, e R2 é OH, um grupo éster protetor, resina, aminoácido, polipeptídeo ou polinucleotídeo; cada um de R3 e R4 é independentemente H, halogênio, alquila inferior, ou alquila inferior substituído, ou R3 e R4 ou dois grupos R3 formam, opcionalmente, um grupo cicloalquila ou heterocicloalquila. R5 é H, alquila, alquila substituído, alquenila, alquenila substituído, alquinila, alquinila substituído, alcóxi, alcóxi substituído, alquilalcóxi, alquilalcóxi substituído, óxido de polialquileno, óxido de polialquileno substituído, arila, arila substituído, heteroarila, heteroarila substituído, alcarila, alcarila substituído, aralquila, aralquila substituído, ON(R")2-(alquileno ou alquileno substituído), C(O)SR"-(alquileno ou alquileno substituído), -(alquileno ou alquileno substituído)-S-S-(arila ou arila substituído), -C(O)R", -C(O)2R", ou -C(O)N(R")2, onde cada R"é independentemente hidrogênio, alquila, alquila substituído, alquenila, alquenila substituído, alcóxi, alcóxi substituído, arila, arila substituído, heteroarila, alcarila, alcarila substituído, aralquila ou aralquila substituído; ou R5 é L-X, onde X é selecionado do grupo consistindo de um rótulo, um corante, um polímero, um polímero hidrossolúvel, um derivado de polietileno glicol; um foto-reticulado; um composto citotóxico, uma droga, um rótulo de afinidade, um rótulo de foto-afinidade, um composto reativo, uma resina, uma segunda proteína, um polipeptídeo ou análogo de polipeptídeo, um anticorpo ou fragmento de anticorpo, um quelante metálico, um co-fator, um ácido graxo, um carboidrato, um polinucleotídeo, um DNA, um RNA, um polinucleotídeo anti-sentido, um sacarídeo, um dendrímero hidrossolúvel, uma ciclodextrina, um biomaterial, uma nanopartícula um rótulo spin, um fluoróforo, uma fração contendo metal, uma fração radioativa, um novo grupo funcional, um grupo que, interage, covalente ou não covalentemente com outras moléculas, uma fração foto-encerrada; uma fração excitável por radiação actínica, um ligante, uma fração fotoisomerizável, biotina, um análogo de biotina, uma fração que incorpora um átomo pesado, um grupo quimicamente clivável, um grupo fotoclivável, uma cadeia lateral alongada, um açúcar ligado a carbono, um agente redox-ativo, um amino-tioácido, uma fração tóxica, uma fração isotopicamente rotulada, uma sonda biofísica, um grupo fosforescente, um grupo quimioluminescente, um grupo denso em elétron, um grupo magnético, um grupo de intercalação, um cromóforo, um agente de transferência de energia, um agente biologicamente ativo, um rótulo detectável, uma pequena molécula; um ácido ribonucléico inibidor, um radionucleotídeo; um agente capturador de nêutrons, um derivado de biotina; ponto(s) quântico(s); um nanotransmissor; um radiotransmissor, uma abzima, um ativador de complexo ativado, um vírus, um adjuvante, um aglican, um alergan, uma angiostatina, um anti-hormônio, um antioxidante, um aptâmero, um RNA orientador, uma saponina, um vetor bilateral, uma macromolécula, um mimótopo, um receptor, uma micela inversa, e quaisquer combinações dos acima; e L é opcional, e quando presente é um ligante selecionado do grupo consistindo de alquileno, alquileno substituído, alquenileno, alquenileno substituído, -O-, -O- (alquileno ou alquileno substituído)-, -S-, -S-(alquileno ou alquileno substituído)-, - S(O)k- onde k é 1, 2, ou 3, -S(O)k(alquileno ou alquileno substituído)-. -C(O)-, -C(O)- (alquileno ou alquileno substituído)-, -C(S)-, -C(S)-(alquileno ou alquileno substituído)-, -N(R')-, NR'-(alquileno ou alquileno substituído), -C(O)N(R')-, -CON(R')- (alquileno ou alquileno substituído)-, -CSN(R')-, -CSN(R')-alquileno ou alquileno substituído)-, -N(R')CO-(alquileno ou alquileno substituído)-, -N(R')C(O)O-, O- N=CR'-(alquileno ou alquileno substituído)-, C(O)NR'-(alquileno ou alquileno substituído)-(alquileno ou alquileno substituído)-, -S(O)k-(alquileno ou alquileno substituído)-S-, S-S-(alquileno ou alquileno substituído)-, -S(O)kN(R')-, N(R')C(O)N(R')-, -N(R')C(S)N(R')-, -N(R')S(O)kN(R')-, -N(R')-N=, -C(R')=N-, -C(R')=N- N(R')-, -C(R')=N-N=, -C(R')2N=N-, e -C(R')2-N(R')-N(R')-, onde cada R'é independentemente H, alquila ou alquila substituído, A guisa de exemplo apenas os seguintes aminoácidos não naturais também são o tipo de aminoácidos contendo oxima que sal reativos com os reagentes contendo carbonila ou dicarbonila aqui descritos podendo ser usados para criar novos polipeptídeos de aminoácido não natural contendo oxima:
Figure img0079
onde: A é opcional e, quando presente é alquileno inferior, alquileno inferior substituído, cicloalquileno inferior, cicloalquileno inferior substituído, alquenileno inferior, alquenileno inferior substituído, alquinileno, heteroalquileno inferior, heteroalquileno substituído, heterocicloalquileno inferior, heterocicloalquileno inferior substituído, arileno, arileno substituído, heteroarileno, heteroarileno substituído, alcarileno, alcarileno substituído, aralquileno ou aralquileno substituído, B é opcional, e quando presente é um ligante selecionado do grupo consistindo de alquileno inferior, alquileno inferior substituído, alquenileno inferior, alquenileno inferior substituído, heteroalquileno inferior, heteroalquileno inferior substituído, -O-, -O-(alquileno ou alquileno substituído)-, -S-, -S-(alquileno ou alquileno substituído)-, -S(O)k- onde k é 1, 2, ou 3, -S(O)k(alquileno ou alquileno substituído)-, -C(O)-, -NS(O)2, -OS(O)2-, -C(O)-(alquileno ou alquileno substituído)-, -C(S)-, -C(S)-(alquileno ou alquileno substituído)-, -N(R')-, NR'-(alquileno ou alquileno substituído),- -C(O)N(R')-, -CON(R')-(alquileno ou alquileno substituído)-, - CSN(R')-, -CSN(R')-alquileno ou alquileno substituído)-, -N(R')CO-(alquileno ou alquileno substituído)-, -N(R')C(O)O-, -S(O)KN(R')-, N(R')C(O)N(R')-, - N(R')C(S)N(R')-, -N(R')S(O)KN(R')-, -N(R')-N=, -C(R')=N-, -C(R')=N-N(R')-, C(R')=N- N=, -C(R')2N=N-, e -C(R')2-N(R')-N(R')-, onde cada R'é independentemente H, alquila ou alquila substituído, R1 é H, um grupo amino protetor, resina, aminoácido, polipeptídeo, ou polinucleotídeo, e R2 é OH, um grupo éster protetor, resina, aminoácido, polipeptídeo ou polinucleotídeo; cada um de R3 e R4 é independentemente H, halogênio, alquila inferior ou alquila inferior substituído, ou R3e R4 ou dois grupos R3, forma, opcionalmente um cicloalquila ou heterocicloalquila; cada um de R6 e R7 é independentemente selecionado do grupo consistindo de H, alquila, alquila substituído, alquenila, alquenila substituído, alcóxi, alcóxi substituído, óxido de polialquileno, óxido de polialquileno substituído, arila, arila substituído, heteroarila, heteroarila substituído, alcarila, alcarila substituído, aralquila e aralquila substituído, -C(O)R", -C(O)2R", -C(O)N(R")2, onde cada R"é independentemente hidrogênio, alquila, alquila substituído, alquenila, alquenila substituído, alcóxi, alcóxi substituído, arila, arila substituído, heteroarila, alcarila, alcarila substituído, aralquila ou aralquila substituído, ou R6 ou R7 é L-X, onde: X é selecionado do grupo consistindo de um rótulo, um corante, um polímero, um polímero hidrossolúvel, um derivado de polietileno glicol; um foto- reticulado; um composto citotóxico, uma droga, um rótulo de afinidade, um rótulo de foto-afinidade, um composto reativo, uma resina, uma segunda proteína, um polipeptídeo ou análogo de polipeptídeo, um anticorpo ou fragmento de anticorpo, um quelante metálico, um co-fator, um ácido graxo, um carboidrato, um polinucleotídeo, um DNA, um RNA, um polinucleotídeo anti-sentido, um sacarídeo, um dendrímero hidrossolúvel, uma ciclodextrina, um biomaterial, uma nanopartícula um rótulo em spin, um fluoróforo, uma fração contendo metal, uma fração radioativa, um novo grupo funcional, um grupo que, interage, covalente ou não covalentemente com outras moléculas, uma fração foto-encerrada; uma fração fotoisomerizável, biotina, um análogo de biotina, uma fração que incorpora um átomo pesado, um grupo quimicamente clivável, um grupo fotoclivável, uma cadeia lateral alongada, um açúcar ligado a carbono, um agente redox-ativo, um amino-tioácido, uma fração tóxica, uma fração isotopicamente rotulada, uma sonda biofísica, um grupo fosforescente, um grupo quimioluminescente, um grupo denso em elétron, um grupo magnético, um grupo de intercalação, um cromóforo, um agente de transferência de energia, um agente biologicamente ativo, um rótulo detectável, pequena molécula; um ácido ribonucléico inibidor, um radionucleotídeo; um agente capturador de nêutrons, um derivado de biotina; ponto(s) quântico(s); um nanotransmissor; um radiotransmissor, uma abzima, um ativador de complexo ativado, um vírus, um adjuvante, um aglican, um alergan, uma angiostatina, um anti-hormônio, um antioxidante, um aptâmero, um RNA orientador, uma saponina, um vetor bilateral, uma macromolécula, um mimótopo, um receptor, uma micela inversa, e quaisquer combinações dos acima; e L é opcional, e quando presente é um ligante selecionado do grupo consistindo de alquileno, alquileno substituído, alquenileno, alquenileno substituído, -O-, -O-(alquileno ou alquileno substituído)-, -S-, -S- (alquileno ou alquileno substituído)-, -S(O)k- onde k é 1, 2, ou 3, -S(O)k(alquileno ou alquileno substituído)-. -C(O)-, -C(O)-(alquileno ou alquileno substituído)-, -C(S)-, - C(S)-(alquileno ou alquileno substituído)-, -N(R')-, NR'-(alquileno ou alquileno substituído), -C(O)N(R')-, -CON(R')-(alquileno ou alquileno substituído)-, -CSN(R')-, - CSN(R')-alquileno ou alquileno substituído)-, -N(R')CO-(alquileno ou alquileno substituído)-, -N(R')C(O)O-, -S(O)kN(R')-, N(R')C(O)N(R')-, -N(R')C(S)N(R')-, - N(R')S(O)kN(R')-, -N(R')-N=, -C(R')=N-, -C(R')=N-N(R')-, -C(R')=N-N=, -C(R')2N=N-, e -C(R')2-N(R')-N(R')-, onde cada R'é independentemente H, alquila ou alquila substituído, A guisa de exemplo apenas, os seguintes reagentes contendo carbonila ou dicarbonila são o tipo de reagentes contendo carbonila ou dicarbonila reativos com os aminoácidos não naturais contendo oxima aqui descritos podendo ser usados para realizar reações de troca para formar novas ligações oxima e assim, modificar os polipeptídeos de aminoácido não natural contendo oxima:
Figure img0080
onde: cada X é independentemente H, alquila, alquila substituído, alquenila, alquenila substituído, alquinila, alquinila substituído, alcóxi, alcóxi substituído, alquilalcóxi, alquilalcóxi substituído, óxido de polialquileno, óxido de polialquileno substituído, arila, arila substituído, heteroarila, heteroarila substituído, alcarila, alcarila substituído, aralquila, aralquila substituído, ON(R")2-(alquileno ou alquileno substituído), C(O)SR"-(alquileno ou alquileno substituído), -(alquileno ou alquileno substituído)-S-S-(arila ou arila substituído), -C(O)R", -C(O)2R", ou -C(O)N(R")2, onde cada R"é independentemente hidrogênio, alquila, alquila substituído, alquenila, alquenila substituído, alcóxi, alcóxi substituído, arila, arila substituído, heteroarila, alcarila, alcarila substituído, aralquila ou aralquila substituído; ou cada X é independentemente selecionado do grupo consistindo de um rótulo, um corante, um polímero, um polímero hidrossolúvel, um derivado de polietileno glicol; um foto-reticulado; um composto citotóxico, uma droga, um rótulo de afinidade, um rótulo de foto-afinidade, um composto reativo, uma resina, uma segunda proteína, um polipeptídeo ou análogo de polipeptídeo, um anticorpo ou fragmento de anticorpo, um quelante metálico, um co-fator, um ácido graxo, um carboidrato, um polinucleotídeo, um DNA, um RNA, um polinucleotídeo anti-sentido, um sacarídeo, um dendrímero hidrossolúvel, uma ciclodextrina, um biomaterial, uma nanopartícula um rótulo spin, um fluoróforo, uma fração contendo metal, uma fração radioativa, um novo grupo funcional, um grupo que, interage, covalente ou não covalentemente com outras moléculas, uma fração foto-encerrada; uma fração excitável por radiação actínica, um ligante, uma fração fotoisomerizável, biotina, um análogo de biotina, uma fração que incorpora um átomo pesado, um grupo quimicamente clivável, um grupo fotoclivável, uma cadeia lateral alongada, um açúcar ligado a carbono, um agente redox-ativo, um amino-tioácido, uma fração tóxica, uma fração isotopicamente rotulada, uma sonda biofísica, um grupo fosforescente, um grupo quimioluminescente, um grupo denso em elétron, um grupo magnético, um grupo de intercalação, um cromóforo, um agente de transferência de energia, um agente biologicamente ativo, um rótulo detectável, uma pequena molécula; um ácido ribonucléico inibidor, um radionucleotídeo; um agente capturador de nêutrons, um derivado de biotina; ponto(s) quântico(s); um nanotransmissor; um radiotransmissor, uma abzima, um ativador de complexo ativado, um vírus, um adjuvante, um aglican, um alergan, uma angiostatina, um anti-hormônio, um antioxidante, um aptâmero, um RNA orientador, uma saponina, um vetor bilateral, uma macromolécula, um mimótopo, um receptor, uma micela inversa, e quaisquer combinações dos acima; cada L é independentemente selecionado do grupo consistindo de alquileno, alquileno substituído, alquenileno, alquenileno substituído, -O-, -O- (alquileno ou alquileno substituído)-, -S-, -S-(alquileno ou alquileno substituído)-, - S(O)k- onde k é 1, 2, ou 3, -S(O)k(alquileno ou alquileno substituído)-. -C(O)-, -C(O)- (alquileno ou alquileno substituído)-, -C(S)-, -C(S)-(alquileno ou alquileno substituído)-, -N(R')-, NR'-(alquileno ou alquileno substituído), -C(O)N(R')-, -CON(R')- (alquileno ou alquileno substituído)-, -N(R')CO(alquileno ou alquileno substituído)- (alquileno ou alquileno substituído)-, -OCON(R')-(alquileno ou alquileno substituído)- -CSN(R')-, -CSN(R')-(alquileno ou alquileno substituído)-, -N(R')CO-(alquileno ou alquileno substituído)-, N(R')C(O)O-, N(R')C(O)O-(alquileno ou alquileno substituído)-, S(O)kN(R')-, N(R')C(O)N(R')-, N(R')C(O)N(R')-(alquileno ou alquileno substituído), -N(R')C(S)N(R')-,-N(R')S(O)kN(R')-, -N(R')-N=, -C(R')=N-, -C(R')=N- N(R')-, -C(R')=N-N=, -C(R')2N=N-, e -C(R')2-N(R')-N(R')-; L1 é opcional, e quando presente é -C(R')p-NR'-C(O)O-(alquileno ou alquileno substituído)- onde p é 0, 1 ou 2; cada R'é independentemente H, alquila ou alquila substituído; W é -C(=O)R9, onde R9 é H ou OR'; e n é 1 a 3; ou onde L-L1-W formem juntos, um cicloalquila ou heterocicloalquila monocíclico ou bicíclico compreendendo pelo menos um grupo carbonila, inclusive um grupo carbonila, grupo carbonila protetor, incluindo um grupo dicarbonila protetor ou grupo carbonila mascarado, incluindo um grupo dicarbonila mascarado; contanto que, L-L1-W propiciem junto, pelo menos um grupo carbonila (incluindo um grupo dicarbonila) capaz de passar por uma reação de troca de oxima com um grupo oxima num aminoácido não natural ou um polipeptídeo de aminoácido não natural "modificado ou não modificado".
[00550]Duas modalidades ilustrativas dos métodos de realização de uma reação de troca de oxima entre um aminoácido contendo oxima num polipeptídeo e um reagente contendo carbonila estão apresentadas na Figura 9. Nessas modalidades ilustrativas, é adicionado um reagente contendo carbonila a uma solução tamponada (pH 2-8) de um polipeptídeo de aminoácido não natural contendo oxima. A reação prossegue na temperatura ambiente durante horas até dias. O polipeptídeo de aminoácido não natural contendo oxima resultante é purificado por HPLC, FPLC ou cromatografia de exclusão de tamanho.
[00551]Numa modalidade, químicas de ligante múltiplos podem reagir específico ao sítio com um polipeptídeo de aminoácido não natural substituído com oxima. Numa modalidade, os métodos de ligação aqui descritos utilizam ligantes contendo a funcionalidade carbonila ou dicarbonila, em pelo menos um terminal do ligante (mono, bi- ou multifuncional). A condensação do ligante derivatizado de carbonila ou dicarbonila via polipeptídeo de aminoácido não natural substituído com oxima gera uma ligação oxima estável. Ligantes bi- e/ou multifuncionais (por exemplo, carbonila ou dicarbonila com um ou mais de outras químicas de ligação) permite a conexão sítio-específica de diferentes moléculas (por exemplo, outras proteínas polímeros ou pequenas moléculas) ao polipeptídeo de aminoácido não natural, enquanto ligantes mono-funcionais (carbonila- ou dicarbonila- substituída em todos os terminais) facilita a dimerização ou oligomerização específica ao sítio do polipeptídeo de aminoácido não natural. Combinando-se esta estratégia de ligação com a tecnologia de tradução in vivo presente, torna-se possível especificar as estruturas tridimensionais das proteínas quimicamente elaboradas.
C. Métodos para Modificação Pós-Traducional de Polipeptídeos de Aminoácido Não Natural: Reações De Aminoácidos Não Naturais Contendo Hidroxilamina Com Reagentes Contendo Carbonila
[00552]As técnicas de modificação pós-traducional e composições supracitadas também podem ser usada com os aminoácidos não naturais contendo hidroxilamina reagindo com reagentes contendo carbonila - ou dicarbonila para produzir polipeptídeos de aminoácido não natural contendo oxima modificados.
[00553]Um método de derivatização de proteína com base na reação de proteína contendo hidroxilamina com uma molécula carbonila- ou dicarbonila- substituída, possui vantagens distintas. Primeiro, as hidroxilaminas passam por condensação com compostos contendo carbonila- ou dicarbonila numa faixa de pH de 4-8, para gerar adutos de oxima. Sob tais condições, as cadeias laterais dos aminoácidos de ocorrência natural são não reativas. Segundo, tal química seletiva torna possível a derivatização específica ao sítio das proteínas recombinantes: as proteínas derivatizadas podem, agora, ser preparadas como produtos homogêneos definidos. Terceiro, as condições brandas necessárias para realização da reação de reagentes contendo carbonila- ou dicarbonila aqui descritos com os polipeptídeos contendo hidroxilamina aqui descritos, geralmente, não destroem irreversivelmente, a estrutura terciária do polipeptídeo (exceto, naturalmente, onde a finalidade da reação seja destruir tal estrutura terciária). Finalmente, embora o grupo amino da hidroxilamina pareça ser metabolizado por E. coli a condensação dos reagentes contendo carbonila- ou dicarbonila com aminoácidos contendo hidroxilamina gera adutos oxima que são estáveis sob condições biológicas.
[00554]A guisa de exemplo apenas, os seguintes aminoácidos não naturais são o tipo de aminoácidos contendo hidroxilamina que são reativos com os reagentes contendo carbonila- ou dicarbonila- aqui descritos, que podem ser usados par modificar ainda os polipeptídeos de aminoácido não natural contendo hidroxilamina.
Figure img0081
onde: A é opcional e, quando presente é alquileno inferior, alquileno inferior substituído, cicloalquileno inferior, cicloalquileno inferior substituído, alquenileno inferior, alquenileno inferior substituído, alquinileno, heteroalquileno inferior, heteroalquileno substituído, heterocicloalquileno inferior, heterocicloalquileno inferior substituído, arileno, arileno substituído, heteroarileno, heteroarileno substituído, alcarileno, alcarileno substituído, aralquileno ou aralquileno substituído, B é opcional, e quando presente é um ligante selecionado do grupo consistindo de alquileno inferior, alquileno inferior substituído, alquenileno inferior, alquenileno inferior substituído, heteroalquileno inferior, heteroalquileno inferior substituído, -O-, -O-(alquileno ou alquileno substituído)-, -S-, -S-(alquileno ou alquileno substituído)-, -S(O)k- onde k é 1, 2, ou 3, -S(O)k(alquileno ou alquileno substituído)-, -C(O)-, -NS(O)2, -OS(O)2-, -C(O)-(alquileno ou alquileno substituído)-, -C(S)-, -C(S)-(alquileno ou alquileno substituído)-, -N(R')-, NR'-(alquileno ou alquileno substituído),- -C(O)N(R')-, -CON(R')-(alquileno ou alquileno substituído)- - CSN(R')-, -CSN(R')-alquileno ou alquileno substituído)-, -N(R')CO-(alquileno ou alquileno substituído)- -N(R')C(O)O-, -S(O)KN(R')-, N(R')C(O)N(R')-, -N(R')C(S)N(R')- , -N(R')S(O)KN(R')-, -N(R')-N=, -C(R')=N-, -C(R')=N-N(R')-, C(R')=N-N=, -C(R')2N=N-, e -C(R')2-N(R')-N(R')-, onde cada R'é independentemente H, alquila ou alquila substituído, K é -NR6R7 ou -N=CR6R7; R1 é H, um grupo amino protetor, resina, aminoácido, polipeptídeo ou polinucleotídeo; e R2 é OH, um grupo éster protetor, resina, aminoácido, polipeptídeo ou polinucleotídeo; cada um de R3 e R4 é independentemente H, halogênio, alquila inferior, ou alquila inferior substituído, ou R3 e R4 ou dois grupos R3 formam, opcionalmente, um cicloalquila ou um heterocicloalquila.
[00555]Em algumas modalidades dos compostos de Fórmula (XIV) K é NH2.
[00556]Os tipos de polipeptídeos compreendendo tais aminoácidos não naturais contendo hidroxilamina ao praticamente ilimitados, desde que, o aminoácido não natural contendo hidroxilamina esteja localizado no polipeptídeo de modo que o reagente contendo carbonila ou dicarbonila posa reagir com o grupo hidroxilamina e não criar um aminoácido não natural modificado resultante, que destrua a estrutura terciária do polipeptídeo (com exceção, é claro, se tal destruição for a finalidade da reação).
[00557]A guisa de exemplo apenas, os seguintes reagentes contendo carbonila- dicarbonila- são o tipo de reagentes contendo carbonila- ou dicarbonila- reativos com os aminoácidos não naturais contendo hidroxilamina aqui descritos e podem ser usados para modificar mais ainda os polipeptídeos de aminoácido não natural contendo hidroxilamina:
Figure img0082
onde: cada X é independentemente alquila, alquila substituído, alquenila, alquenila substituído, alquinila, alquinila substituído, alcóxi, alcóxi substituído, alquilalcóxi, alquilalcóxi substituído, óxido de polialquileno, óxido de polialquileno substituído, arila, arila substituído, heteroarila, heteroarila substituído, alcarila, alcarila substituído, aralquila, aralquila substituído, ON(R")2-(alquileno ou alquileno substituído), C(O)SR"-(alquileno ou alquileno substituído), -(alquileno ou alquileno substituído)-S-S-(arila ou arila substituído), -C(O)R", -C(O)2R", ou -C(O)N(R")2, onde cada R"é independentemente hidrogênio, alquila, alquila substituído, alquenila, alquenila substituído, alcóxi, alcóxi substituído, arila, arila substituído, heteroarila, alcarila, alcarila substituído, aralquila ou aralquila substituído; ou cada X é independentemente selecionado do grupo consistindo de um rótulo, um corante, um polímero, um polímero hidrossolúvel, um derivado de polietileno glicol; um foto-reticulado; um composto citotóxico, uma droga, um rótulo de afinidade, um rótulo de foto-afinidade, um composto reativo, uma resina, uma segunda proteína, um polipeptídeo ou análogo de polipeptídeo, um anticorpo ou fragmento de anticorpo, um quelante metálico, um co-fator, um ácido graxo, um carboidrato, um polinucleotídeo, um DNA, um RNA, um polinucleotídeo anti-sentido, um sacarídeo, um dendrímero hidrossolúvel, uma ciclodextrina, um biomaterial, uma nanopartícula um rótulo spin, um fluoróforo, uma fração contendo metal, uma fração radioativa, um novo grupo funcional, um grupo que, interage, covalente ou não covalentemente com outras moléculas, uma fração foto-encerrada; uma fração excitável por radiação actínica, um ligante, uma fração fotoisomerizável, biotina, um análogo de biotina, uma fração que incorpora um átomo pesado, um grupo quimicamente clivável, um grupo fotoclivável, uma cadeia lateral alongada, um açúcar ligado a carbono, um agente redox-ativo, um amino-tioácido, uma fração tóxica, uma fração isotopicamente rotulada, uma sonda biofísica, um grupo fosforescente, um grupo quimioluminescente, um grupo denso em elétron, um grupo magnético, um grupo de intercalação, um cromóforo, um agente de transferência de energia, um agente biologicamente ativo, um rótulo detectável, uma pequena molécula; um ácido ribonucléico inibidor, um radionucleotídeo; um agente capturador de nêutrons, um derivado de biotina; ponto(s) quântico(s); um nanotransmissor; um radiotransmissor, uma abzima, um ativador de complexo ativado, um vírus, um adjuvante, um aglican, um alergan, uma angiostatina, um anti-hormônio, um antioxidante, um aptâmero, um RNA orientador, uma saponina, um vetor bilateral, uma macromolécula, um mimótopo, um receptor, uma micela inversa, e quaisquer combinações dos acima; cada L é independentemente selecionado do grupo consistindo de alquileno, alquileno substituído, alquenileno, alquenileno substituído, -O-, -O- (alquileno ou alquileno substituído)-, -S-, -S-(alquileno ou alquileno substituído)-, - S(O)k- onde k é 1, 2, ou 3, -S(O)k(alquileno ou alquileno substituído)-. -C(O)-, -C(O)- (alquileno ou alquileno substituído)-, -C(S)-, -C(S)-(alquileno ou alquileno substituído)-, -N(R')-, NR'-(alquileno ou alquileno substituído), -C(O)N(R')-, -CON(R')- (alquileno ou alquileno substituído)-, -N(R')CO(alquileno ou alquileno substituído)- (alquileno ou alquileno substituído)-, -OCON(R')-(alquileno ou alquileno substituído)- -CSN(R')-, -CSN(R')-(alquileno ou alquileno substituído)-, -N(R')CO-(alquileno ou alquileno substituído)-, N(R')C(O)O-, N(R')C(O)O-(alquileno ou alquileno substituído)-, S(O)kN(R')-, N(R')C(O)N(R')-, N(R')C(O)N(R')-(alquileno ou alquileno substituído) -N(R')C(S)N(R')- -N(R')S(O)kN(R')-, -N(R')-N=, -C(R')=N-, -C(R')=N- N(R')-, -C(R')=N-N=, -C(R')2N=N-, e -C(R')2-N(R')-N(R')-; L1 é opcional, e quando presente é -C(R')p-NR'-C(O)O-(alquileno ou alquileno substituído)- onde p é 0, 1 ou 2; cada R'é independentemente H, alquila ou alquila substituído;
Figure img0083
R é H, alquila, alquila substituído, cicloalquila, ou cicloalquila substituído, cada R"é independentemente H, alquila, alquila substituído, ou um grupo protetor, onde quando mais de um grupo R"está presente, dois R" forma, opcionalmente, um heterocicloalquila; e n é 1 a 3; contanto que, L-L1-W propiciem juntos, pelo menos um grupo carbonila (incluindo um grupo dicarbonila) capaz de reagir com um grupo hidroxilamina num aminoácido não natural ou um polipeptídeo de aminoácido não natural "modificado ou não modificado".
[00558]Em algumas modalidades dos compostos de Fórmula (XIX) encontram-se compostos com a estrutura da Fórmula (XXI);
Figure img0084
[00559]Uma modalidade ilustrativa dos métodos de acoplamento de um reagente contendo carbonila a um aminoácido não natural contendo hidroxilamina num polipeptídeo está apresentada na Figura 10. Nessa modalidade ilustrativa, é adicionado um reagente derivatizado de carbonila a uma solução tamponada (pH 2-8) de um polipeptídeo de aminoácido não natural contendo hidroxilamina. A reação prossegue na temperatura ambiente durante horas até dias. A fim de acelerar a conjugação, aditivos tais como os apresentados na Figura 8 são adicionados. O polipeptídeo de aminoácido não natural contendo oxima resultante é purificado por HPLC, FPLC ou cromatografia de exclusão de tamanho.
[00560]Numa modalidade, químicas de ligante múltiplos podem reagir específico ao sítio com um polipeptídeo de aminoácido não natural substituído com hidroxilamina. Numa modalidade, os métodos de ligação aqui descritos utilizam ligantes contendo a funcionalidade carbonila ou dicarbonila em pelo menos um terminal de ligação (mono, bi- ou multifuncional). A condensação do ligante derivatizado de carbonila- ou dicarbonila com uma proteína hidroxilamina-substituída gera uma ligação oxima estável. Ligantes bi- e/ou multifuncionais (por exemplo, carbonila ou dicarbonila com uma ou mais de outras químicas de ligação) permitem a conexão sítio-específica de diferentes moléculas (por exemplo, outras proteínas polímeros ou pequenas moléculas) ao polipeptídeo de aminoácido não natural, enquanto ligantes mono-funcionais (carbonila ou dicarbonila substituída em todos os terminais) facilita a dimerização ou oligomerização específica ao sítio do polipeptídeo de aminoácido não natural. Combinando-se esta estratégia de ligação com a tecnologia de tradução in vivo presente, torna-se possível especificar as estruturas tridimensionais das proteínas quimicamente elaboradas.
[00561]Em algumas modalidades estão métodos para derivatizar um polipeptídeo compreendendo aminoácidos de Fórmulas XIV-XVI, incluindo quaisquer sub-fórmulas ou compostos específicos que se enquadrem no escopo das Fórmulas XIV-XVI, com um reagente de Fórmula (XIX). Em algumas modalidades, o polipeptídeo é purificado antes de, ou após o contato com o reagente de Fórmula (XIX). Em outras modalidades, o polipeptídeo derivatizado resultante compreende pelo menos um aminoácido contendo oxima correspondente à Fórmula (XXIX).
Figure img0085
onde: A é opcional e, quando presente é alquileno inferior, alquileno inferior substituído, alquenileno inferior, alquenileno inferior substituído, arileno, arileno substituído, heteroarileno, heteroarileno substituído, alcarileno, alcarileno substituído, aralquileno ou aralquileno substituído, B é opcional, e quando presente é um ligante selecionado do grupo consistindo de alquileno inferior, alquileno inferior substituído, alquenileno inferior, alquenileno inferior substituído, -O-, -O-(alquileno ou alquileno substituído)-, -S-, -S- (alquileno ou alquileno substituído)-, -S(O)k- onde k é 1, 2, ou 3, -S(O)k(alquileno ou alquileno substituído)-, -C(O)-, -NS(O)2, -OS(O)2-, -C(O)-(alquileno ou alquileno substituído)-, -C(S)-, -C(S)-(alquileno ou alquileno substituído)-, -N(R')-, NR'- (alquileno ou alquileno substituído),- -C(O)N(R')-, -CON(R')-(alquileno ou alquileno substituído)- -CSN(R')-, -CSN(R')-alquileno ou alquileno substituído)-, -N(R')CO- (alquileno ou alquileno substituído)- -N(R')C(O)O-, -S(O)KN(R')-, N(R')C(O)N(R')-, - N(R')C(S)N(R')-, -N(R')S(O)KN(R')-, -N(R')-N=, -C(R')=N-, -C(R')=N-N(R')-, C(R')=N- N=, -C(R')2N=N-, e -C(R')2-N(R')-N(R')-, onde cada R'é independentemente H, alquila ou alquila substituído, L é um ligante independentemente selecionado do grupo consistindo de alquileno, alquileno substituído, alquenileno, alquenileno substituído, -O-, -O- (alquileno ou alquileno substituído)-, -S-, -S-(alquileno ou alquileno substituído)-, - S(O)k- onde k é 1, 2, ou 3, -S(O)k(alquileno ou alquileno substituído)-. -C(O)-, -C(O)- (alquileno ou alquileno substituído)-, -C(S)-, -C(S)-(alquileno ou alquileno substituído)-, -N(R')-, NR'-(alquileno ou alquileno substituído), -C(O)N(R')-, - CON(R')-(alquileno ou alquileno substituído)-, -N(R')CO(alquileno ou alquileno substituído)-(alquileno ou alquileno substituído)-, -OCON(R')-(alquileno ou alquileno substituído)- -CSN(R')-, -CSN(R')-(alquileno ou alquileno substituído)-, -N(R')CO- (alquileno ou alquileno substituído)-, N(R')C(O)O-, N(R')C(O)O-(alquileno ou alquileno substituído)-, S(O)kN(R')-, N(R')C(O)N(R')-, N(R')C(O)N(R')-(alquileno ou alquileno substituído) -N(R')C(S)N(R')- -N(R')S(O)kN(R')-, -N(R')-N=, -C(R')=N-, - C(R')=N-N(R')-, -C(R')=N-N=, -C(R')2N=N-, e -C(R')2-N(R')-N(R')-, onde cada R'é independentemente H, alquila ou alquila substituído; R1 é opcional, e quando presente, é H, um grupo amino protetor, resina aminoácido, polipeptídeo ou polinucleotídeo; e R2 é opcional, e quando presente é OH, um grupo éster protetor, resina, aminoácido, polipeptídeo ou polinucleotídeo ; cada R3 e R4 é independentemente H, halogênio, alquila inferior, ou alquila inferior substituído; e X é independentemente um rótulo detectável, agente biologicamente ativo ou polímero.
[00562]Em outras modalidades, tais polipeptídeos derivatizados são estáveis por pelo menos 1 mês, sob condições brandamente ácidas. Em outras modalidades, os polipeptídeos derivatizados são estáveis por pelo menos 2 semanas sob condições brandamente acidas. Em outras modalidades tais polipeptídeos derivatizados são estáveis por pelo menos 5 dias sob condições brandamente ácidas. Em outras modalidades, tais condições são pH 2 a 8. Em algumas modalidades, a estrutura terciária do polipeptídeo derivatizado é preservada. Em outras modalidades tal derivatização de polipeptídeos compreende ainda ligação do polipeptídeo derivatizado a um outro polipeptídeo. Em outras modalidades tais polipeptídeos sendo derivatizados são homólogos a uma proteína terapêutica, selecionada do grupo consistindo de: alfa-1, antitripsina, angiostatina, fator anti- hemolítico, anticorpo, fragmento de anticorpo, apoliproteína, apoproteína, fator natriurético atrial, polipeptídeo natriurético atrial, peptídeo atrial, C-X-C quimiocina, T39765, NAP-2, ENA-78, gro-a, gro-b, gro-c, IP-10, GCP-2, NAP-4, SDF-1, PF4, MIG, calcitonina, ligante c-kit, citocina, CC quimiocina, proteína 1- quimioatrativa de monócito, proteína-2 quimioatrativa de monócito, proteína 3 quimioatrativa de monócito, proteína-1 alfa inflamatória de monócito, proteína beta inflamatória de monócito, RANTES, 1309, R83915, R91733, HCC1, T58847, D31065, T64262, CD40, ligante CD40, ligante c-kit, colágeno, fator estimulante de colônia (CSF), fator 5a complementar, inibidor complementar, receptor 1 complementar, citocina, peptídeo 78 ativador de neutrófilo epitelial, MIP-16, MCP-1, fator de crescimento epidérmico (EGF), peptídeo ativador de neutrófilo epitelial, eritropoietina (EPO), toxina esfoliante, Fator IX, Fator VII, Fator VIII, Fator X, fator de crescimento de fibroblasto (FGF), fibrinogênio, fibronectina, proteína de feixe de quatro hélices, G- CSF, glp-1, GM-CSF, glicocerebrosidase, gonadotropina, fator de crescimento, receptor do fator de crescimento, grf, proteína de ouriço, hemoglobina, fator de crescimento de hepatócito (hGF), hirudina, hormônio do crescimento humano (hGH), albumina sérica humana, ICAM-1, receptor de ICAM-1, LFA-1, receptor de LFA-1, insulina, fator de crescimento semelhante à insulina (IGF), IGF-I, IGF-II, interferon (IFN), IFN-alfa, IFN-beta, IFN-gama, interleucina, (IL, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, fator de crescimento de ceratinócito (KGF), lactoferrina, fator inibidor de leucemia, luciferase, neurturina, fator inibidor de neutrófilo (NIF), oncostatina M, proteína osteogênica, produto oncogênico, paracitonina, hormônio da paratireóide , PD-ECSF, PDGF, hormônio peptídico, pleiotropina, proteína A, proteína G, pth, exotoxina A pirogênica, exotoxina B pirogênica, exotoxina C pirogênica, pyy, relaxina, renina, SCF, proteína biossintética pequena, receptor I de complemento solúvel, I-CAM 1 solúvel, receptor de interleucina solúvel, receptor de TNF solúvel, somatomedina, somatostatina, somatotropina, super-antígenos de estreptoquinase, enterotoxina estafilocócica, SEA, SEB, SEC1, SEC2, SEC3, SED, SEE receptor do hormônio esteróide, superóxido dismutase, toxina da síndrome do choque tóxico, alfa 1 timosina, ativador plasminogênico de tecido, fator de crescimento de tumor (TGF), fator de necrose de tumor, fator alfa de necrose de tumor, fator beta de necrose de tumor, receptor do fator de necrose de tumor (TNFR), proteína VLA-4, proteína VCAM-1, fator de crescimento endotelial vascular (VEGF), uroquinase, mos, ras, raf, met, p53 tat, fos, myc, jun, myb, rel, receptor de estrogênio, receptor de progesterona, receptor de testosterona, receptor de aldosterona, receptor de LDL e corticosterona.
D. Exemplo de Adição de Funcionalidade: Polímeros Macromoleculares Acoplados a Polipeptídeos de aminoácido não natural
[00563]Várias modificações aos polipeptídeos de aminoácido não natural aqui descritos podem ser realizadas usando as composições, métodos, técnicas e estratégias aqui descritas. Essas modificações incluem a incorporação de funcionalidade adicional ao componente de aminoácido não natural do polipeptídeo, incluindo sem limitação, a um rótulo, um corante; um polímero; um polímero hidrossolúvel; um derivado de polietileno glicol; um foto-reticulador; um composto citotóxico; uma droga; um rótulo de afinidade; um rótulo de foto-afinidade; um composto reativo; uma resina; uma segunda proteína ou polipeptídeo ou análogo de polipeptídeo; um anticorpo ou fragmento de anticorpo; um quelante de metal; um co- fator; um ácido graxo; um carboidrato; um polinucleotídeo; um DNA; um RNA; um polinucleotídeo anti-sentido; um sacarídeo; um dendrímero hidrossolúvel; uma ciclodextrina; um biomaterial; uma nanopartícula; um rótulo de spin; um fluoróforo; uma fração contendo metal; uma fração radioativa; um grupo funcional inédito; um grupo que interage por covalência ou por não covalência com outras moléculas; uma fração foto-aprisionada; uma fração excitável por radiação actínica, um ligante, uma fração fotoisomerizável; biotina; um análogo de biotina; uma fração que incorpora um átomo pesado; um grupo quimicamente clivável; um grupo fotoclivável; uma cadeia lateral alongada; um açúcar ligado a carbono; um agente redox-ativo; um amino tioácido; uma fração tóxica; uma fração isotopicamente rotulada; uma sonda biofísica; um grupo fosforescente; um grupo quimioluminescente; um grupo com densidade de elétrons; um grupo magnético; um grupo intercalado; um cromóforo; um agente de transferência de energia; um agente biologicamente ativo, um rótulo detectável; uma molécula pequena; um ácido ribonucléico inibidor, um radionucleotídeo; um agente capturador de nêutrons, um derivado de biotina; ponto(s) quântico(s); um nanotransmissor; um radiotransmissor, uma abzima, um ativador de complexo ativado, um vírus, um adjuvante, um aglican, um alergan, uma angiostatina, um anti-hormônio, um antioxidante, um aptâmero, um RNA orientador, uma saponina, um vetor bilateral, uma macromolécula, um mimótopo, um receptor, uma micela inversa, e quaisquer combinações dos acima. Como um exemplo ilustrativo, não limitante das composições, métodos técnicas e estratégias descritos supra, a descrição a seguir focará na adição de polímeros macromoleculares ao polipeptídeo de aminoácido não natural, tendo em vista que, as composições, métodos, técnicas e estratégias descritos aos mesmos também são aplicáveis (com as modificações adequadas, caso necessário, e para as quais, um perito na técnica poderia preparar com as revelações presentes) para adicionar outras funcionalidades, incluindo, sem limitação, aos relacionados supra.
[00564]Uma ampla variedade de polímeros macromoleculares e outras moléculas podem ser acoplados aos polipeptídeos de aminoácido não natural aqui descritos para modular as propriedades biológicas do polipeptídeo de aminoácido não natural (ou o correspondente polipeptídeo de aminoácido natural) e/ou proporcionar novas propriedades biológicas ao polipeptídeo de aminoácido não natural (ou o correspondente polipeptídeo de aminoácido natural). Esses polímeros macromoleculares podem ser acoplados ao polipeptídeo de aminoácido não natural via aminoácido não natural, ou qualquer substituinte do aminoácido não natural ou qualquer substituinte ou grupo funcional adicionado ao aminoácido não natural.
[00565]Polímeros hidrossolúveis podem ser acoplados aos aminoácidos não naturais incorporados aos polipeptídeos (naturais ou sintéticos, polinucleotídeos polissacarídeos ou polímeros sintéticos aqui descritos. Os polímeros hidrossolúveis podem ser acoplados via um aminoácido não natural incorporado ao polipeptídeo ou qualquer grupo funcional ou substituinte de um aminoácido não natural ou qualquer grupo funcional ou substituinte adicionado a um aminoácido não natural. Em alguns casos, os polipeptídeos de aminoácido não natural aqui descritos compreendem um ou mais aminoácidos não naturais acoplados aos polímeros hidrossolúveis e um ou mais aminoácidos de ocorrência natural ligados aos polímeros hidrossolúveis. A ligação covalente de polímeros hidrofílicos a uma molécula biologicamente ativa representa uma tentativa em aumentar a solubilidade me água (tal como num ambiente fisiológico), biodisponibilidade, aumento da meia-vida sérica, aumento da meia-vida terapêutica, modulação da imunogenicidade, modulação da atividade biológica, ou prolongamento do tempo de circulação da molécula biologicamente ativa, incluindo proteínas, peptídeos, e particularmente, moléculas hidrofóbicas. Características importantes adicionais, de tais polímeros hidrofílicos incluem, biocompatibilidade, falta de toxicidade, e falta de imunogenicidade. Preferivelmente, para uso terapêutico da preparação do produto finalizado, o polímero será farmaceuticamente aceitável.
[00566]Exemplos de polímeros hidrofílicos incluem, sem limitação, éteres de polialquila, e seus análogos alcóxi-capeados, (por exemplo, polioxietileno glicol, polioxietileno-propileno glicol, e os análogos metóxi- ou etóxi-capeados dos mesmos, especialmente, polioxietileno glicol, sendo este último também conhecido como polietileno glicol ou PEG); polivinilpirrolidonas, éteres polivinilalquílicos, polioxazolinas, oxazolinas polialquílicas e oxazolinas poliidroxialquílicas, poliacrilamidas, polialquil acrilamidas, e poliidroxialquil acrilamidas (por exemplo, poli-hidróxi propilmetacrilamida e seus derivados); acrilatos de poliidroxialqula, ácidos polissiálicos e seus análogos, sequências peptídicas hidrofílicas; polissacarídeos e seus derivados, incluindo dextrana e derivados de dextrana, por exemplo, carboximetildextrana, sulfatos de dextrana, aminodextrana; celulose e seus derivados, por exemplo, carboximetil celulose, hidroxialquil celulose, quitina e seus derivados, por exemplo, quitosana, succinil quitosana, carboximetilquitina, carboximetil quitosana; ácido hialurônico, e seus derivados, amidos, alginatos, sulfato de condroitina, albumina, pullulan e carboximetil pululan, poliaminoácidos e seus derivados, por exemplo, ácidos poliglutâmico, polilisinas, ácidos poliaspárticos, poliaspartamidas, copolímeros de anidrido maléico, tais como copolímero de anidrido estireno maléico, copolímero de anidrido diviniletil éter maléico, álcoois polivinílicos, seus copolímeros; seus terpolímeros, misturas destes, e os derivados dos precedentes. O polímero hidrossolúvel pode ser qualquer forma estrutura, incluindo, sem limitação, forma linear, em fúrcula ou ramificado. Em algumas modalidades, as estruturas centrais do polímero hidrossolúvel, com de 2 a cerca de 300 terminais, são particularmente úteis. Derivados poliméricos multifuncionais incluem, sem limitação, polímeros lineares com dois terminais, cada terminal sendo ligado a um grupo funcional que pode ser igual ou diferente. Em algumas modalidades, o polímero hidrossolúvel compreende uma fração poli)etileno glicol). O peso molecular do polímero pode ser de uma faixa ampla, incluindo, sem limitação, entre cerca de 100 Da e cerca de 100.000 Da ou mais. O peso molecular do polímero pode estar entre cerca de 100 Da e cerca de 100.000 Da, incluindo, sem limitação, a 100.000 Da, 95.000 Da, 90.000 Da, 85.000 Da, 80.000 Da, 75.000 Da, 70.00 Da, 65.000 Da, 60.000 Da, 55.000 Da, 50.000 Da, 45.000 Da, 40.000 Da, 35.000 Da. 30.000 Da, 25.000 Da, 20.000 Da, 15.000 Da, 10.000 Da, 9.000 Da, 8.000 Da, 7.000 Da, 6.000 Da, 5000 Da, 4.000 Da, 3.000 Da, 2.000 Da, 1.000 Da, 900 Da, 800 Da, 700 Da, 600 Da, 500 Da, 400 Da, 300 Da, 200 Da, e 100 Da. Em algumas modalidades, o peso molecular do polímero fica entre cerca de 100 Da e 50.000 Da. Em algumas modalidades, o peso molecular do polímero fica entre cerca de 100 Da e 40.000 Da. Em algumas modalidades, o peso molecular do polímero fica entre cerca de 1.000 Da e 40.000 Da. Em algumas modalidades, o peso molecular do polímero fica entre cerca de 5.000 Da e 40.000 Da. Em algumas modalidades, o peso molecular do polímero fica entre cerca de 10.000 Da e 40.000 Da. Em algumas modalidades, a molécula de polietileno glicol é um polímero ramificado. O peso molecular do PEG de cadeia ramificada pode ser entre cerca de 1.000 Da, e cerca de 100.000 Da, incluindo, sem limitação, a 100.000 Da, 95.000 Da, 90.000 Da, 85.000 Da, 80.000 Da, 75.000 Da, 70.000 Da, 65.000 Da, 60.000 Da, 55.000 DA, 50.000 Da, 45.000 Da, 40.000 Da, 35.000 Da, 30.000 Da, 25.000 Da, 20.000 Da, 15.000 Da, 10.000 Da, 9.000 Da, 8.000 Da, 7.000 Da, 6.000 Da, 5000 Da, 4.000 Da, 3.000 Da, 2.000 Da e 1.000 Da. Em algumas modalidades, o peso molecular de PEG de cadeia ramificada fica entre cerca de 1.000 Da e 50.000 Da. Em algumas modalidades, o peso molecular do PEG de cadeia ramificada fica entre cerca de 1.000 Da e 40.000 Da. Em algumas modalidades, o peso molecular do PEG de cadeia ramificada fica entre cerca de 5.000 Da e 40.000 Da. Em algumas modalidades, o peso molecular do PEg de cadeia ramificada fica entre cerca de 5.000 Da e 20.000 Da. Os versados nessa técnica reconhecerão que, a relação precedente para cadeias centrais substancialmente hidrossolúveis não é, de modo algum, exclusiva e sim meramente ilustrativa, e que, todos os materiais poliméricos com as qualidades descritas supra estão abrangidos como adequados para emprego nos métodos e composições aqui descritos.
[00567]Como acima, um exemplo de um polímero hidrofílico é poli(etileno glicol) abreviado PEG, que foi usado extensivamente na indústria farmacêutica ou em implantes artificiais e em outras aplicações onde a biocompatibilidade, falta de toxicidade, e falta de imunogenicidade são fatores importantes. As modalidades polímero: polipeptídeo aqui descritas utilizam PEG como um exemplo de polímero hidrofílico entendendo-se que outros polímeros hidrofílicos podem ser similarmente utilizados em tais modalidades.
[00568]PEG é um polímero hidrossolúvel conhecido, comercialmente disponíveis ou pode ser preparado por polimerização de abertura de anel de etileno glicol de acordo com os métodos do conhecimento da técnica (Sandler and Karo, Polymer Synthesis, Academic Press, New York, volume 3, páginas 138-161). PEG é tipicamente límpido, incolor, inodoro, solúvel em água, estável ao calor, inerte a muitos agentes químicos, não hidrolisa ou deteriora, e é, geralmente não tóxico. Poli(etileno glicol) é considerado como biocompatível, o que equivale dizer que PEG é capaz de coexistir com tecidos ou organismos vivos sem ocasionar dano. Mais especificamente, PEG é substancialmente não-imunogênico, o que equivale dizer que PEG não tende a produzir uma resposta imune no corpo. Quando ligado a uma molécula com alguma função desejável no corpo, tal como um agente biologicamente ativo, o PEG tende a mascarar o agente e pode reduzir ou eliminar qualquer resposta imune de modo que um organismo possa tolerar a presença do agente. Conjugados PEG não tem a tendência a produzir uma resposta imune substancial ou ocasionar coagulação ou outros efeitos indesejáveis.
[00569]O termo "PEG"é usado amplamente englobando qualquer molécula de polietileno glicol, a despeito do tamanho ou modificação na extremidade do PEg, e pode ser representado como ligado a um polipeptídeo de aminoácido não natural pela fórmula :
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onde n é 2 a 10.000 e X é H ou uma modificação terminal, incluindo, sem limitação, C1-4 alquila, um grupo protetor, ou um grupo funcional terminal. O termo PEG incluem sem limitação, a poli(etileno glicol) em quaisquer de suas formas, incluindo PEG bifuncional, PEG de múltiplas subdivisões, PEG derivatizado, PEG em forquilha, PEG ramificado (sendo que cada cadeia tem um peso molecular de aproximadamente 1 kDa a aproximadamente 100 kDa, de aproximadamente 1 kDa a aproximadamente 50 kDa, ou de aproximadamente 1 kDA a aproximadamente 20 kDa), PEG pendente (ou seja, PEg ou polímeros relacionados com um ou mais grupos funcionais pendentes à cadeia central polimérica), ou PEG com ligações degradáveis. Numa modalidade, PEG, em que n é de cerca de 20 a cerca de 2000 é adequado para uso nos métodos e composições aqui descritos. Em algumas modalidades o polímero hidrossolúvel compreende uma fração poli(etileno glicol). O peso molecular do polímero pode ser de uma faixa ampla, incluindo, sem limitação, entre cerca de 100 Da e cerca de 100.000 Da ou mais. O peso molecular do polímero pode estar entre cerca de 100 Da e cerca de 100.000 Da, incluindo, sem limitação, a 100.000 Da, 95.000 Da, 90.000 Da, 85.000 Da, 80.000 Da, 75.000 Da, 70.00 Da, 65.000 Da, 60.000 Da, 55.000 Da, 50.000 Da, 45.000 Da, 40.000 Da, 35.000 Da. 30.000 Da, 25.000 Da, 20.000 Da, 15.000 Da, 10.000 Da, 9.000 Da, 8.000 Da, 7.000 Da, 6.000 Da, 5000 Da, 4.000 Da, 3.000 Da, 2.000 Da, 1.000 Da, 900 Da, 800 Da, 700 Da, 600 Da, 500 Da, 400 Da, 300 Da, 200 Da, e 100 Da. Em algumas modalidades, o peso molecular do polímero fica entre cerca de 100 Da e 50.000 Da. Em algumas modalidades, o peso molecular do polímero fica entre cerca de 100 Da e 40.000 Da. Em algumas modalidades, o peso molecular do polímero fica entre cerca de 1.000 Da e 40.000 Da. Em algumas modalidades, o peso molecular do polímero fica entre cerca de 5.000 Da e 40.000 Da. Em algumas modalidades, o peso molecular do polímero fica entre cerca de 10.000 Da e 40.000 Da. Em algumas modalidades, a molécula de polietileno glicol é um polímero ramificado. O peso molecular do PEG de cadeia ramificada pode ser entre cerca de 1.000 Da, e cerca de 100.000 Da, incluindo, sem limitação, a 100.000 Da, 95.000 Da, 90.000 Da, 85.000 Da, 80.000 Da, 75.000 Da, 70.000 Da, 65.000 Da, 60.000 Da, 55.000 DA, 50.000 Da, 45.000 Da, 40.000 Da, 35.000 Da, 30.000 Da, 25.000 Da, 20.000 Da, 15.000 Da, 10.000 Da, 9.000 Da, 8.000 Da, 7.000 Da, 6.000 Da, 5000 Da, 4.000 Da, 3.000 Da, 2.000 Da e 1.000 Da. Em algumas modalidades, o peso molecular de PEG de cadeia ramificada fica entre cerca de 1.000 Da e 50.000 Da. Em algumas modalidades, o peso molecular do PEG de cadeia ramificada fica entre cerca de 1.000 Da e 40.000 Da. Em algumas modalidades, o peso molecular do PEG de cadeia ramificada fica entre cerca de 5.000 Da e 40.000 Da. Em algumas modalidades, o peso molecular do PEg de cadeia ramificada fica entre cerca de 5.000 Da e 20.000 Da. Uma ampla faixa de moléculas PEG estão descritas, incluindo, sem limitação, a Shearwater Polymers, Inc. Catalog. Nekar Therapeutics catalog, ora incorporado por referência.
[00570]N-succinimidil carbonato (ver, por exemplo., Pat. U.S. Nos. 5.281.698, 5.468.478), amina (ver, por exemplo, Buckmann et al. Makromol. Chem. 182:1379 (1981), Zalipsky et al. Eur. Polym. J. 19:1177 (1983)), hidrazida (ver, por exemplo, Andresz et al. Makromol. Chem. 179:301 (1978)), succinimidil propionate e succinimidil butanoato (ver, por exemplo, Olson et al. em Poli(etileno glicol) Chemistry & Biological Applications, pag 170-181, Harris & Zalipsky Eds., ACS, Washington, D. C, 1997; ver também Pat. U.S. No. 5.672.662), succinimidil succinato (ver por exemplo, Abuchowski et al. Cancer Biochem. Biophys. 7:175 (1984) e Joppich et al. Makromol. Chem. 180:1381 (1979), éster succinimidílico (ver, por exemplo, Pat. U.S. No. 4,670,417), benzotriazol carbonato ( ver, por exemplo, U.S. Pat. No. 5,650,234), éter glicidílico (ver, por exemplo, Pitha et al. Eur. J Biochem. 94:11 (1979), Elling et al., Biotech. Appl. Biochem. 13:354 (1991), oxicarbonilimidazolo (ver, por exemplo, Beauchamp, et al., Anal. Biochem. 131:25 (1983), Tondelli et al. J. Controlled Release 1:251 (1985)), p-nitrofenil carbonato (ver, por exemplo, Veronese, et al., Appl. Biochem. Biotech., 11: 141 (1985); e Sartore et al., Appl. Biochem. Biotech., 27:45 (1991)), aldeído (ver, por exemplo, Harris et al. J. Polym. Sci. Chem. Ed. 22:341 (1984), U.S. Pat. No. 5.824.784, U.S. Pat. No. 5.252.714), maleimida (ver, por exemplo, Goodson et al. Bio/Technology 8:343 (1990), Romani et al. in Chemistry of Peptides and Proteins 2:29 (1984)), and Kogan, Synthetic Comm. 22:2417 (1992)), dissulfeto de ortopiridila (ver, por exemplo, Woghiren, et al. Bioconj. Chem. 4:314(1993)), acriloíla (ver, por exemplo, Dawhney et al., Macromolecules, 26:581 (1993)), vinilsulfona (ver, por exemplo, U.S. Pat. No. 5.900.461). Todas as referencias e patentes citadas estão incorporadas por referência em sua totalidade.
[00571]Em alguns casos, um PEG termina em uma extremidade com hidróxi ou metóxi, ou seja, X é H ou CH3 ("metóxi PEG"). Alternativamente, o PEG pode terminar com um grupo reativo, formando assim, um polímero bifuncional. Grupos reativos típicos podem incluir os grupos reativos que são comumente usados para reagir com os grupos funcionais encontrados nos 20 aminoácidos comuns (incluindo, sem limitação, grupos maleimida, carbonatos ativados (incluindo, sem limitação, éster para-nitrofenílico), ésteres ativados (incluindo, sem limitação, a N- hidroxisuccinimida, éster para-nitrofenílico) e aldeídos, bem como grupos funcionais que são inertes aos 20 aminoácidos comuns, mas que reagem especificamente com grupos funcionais complementares presentes nos aminoácidos não naturais (incluindo, sem limitação, grupos oxima, carbonila ou dicarbonila e hidroxilamina).
[00572]Observe-se que, a outra extremidade do PEG que é mostrada na fórmula supra por Y, irá ligar-se, direta ou indiretamente a um polipeptídeo (sintético ou natural), polinucleotídeo, polissacarídeo ou polímero sintético via um aminoácido não natural. Quanto Y é um grupo hidroxilamina, então o reagente de PEG contendo hidroxilamina pode reagir com um aminoácido não natural contendo carbonila- ou dicarbonila num polipeptídeo formando um grupo PEG ligado a um polipeptídeo via ligação oxima. Quando Y é um grupo carbonila- ou dicarbonila- então o reagente PEG contendo carbonila- ou dicarbonila pode reagir com um aminoácido não natural contendo hidroxilamina num polipeptídeo formando um grupo PEG ligado ao polipeptídeo via ligação oxima. Quando Y é um grupo carbonila- ou dicarbonila, então o reagente de PEG contendo carbonila- ou dicarbonila pode reagir também com um aminoácido não natural contendo oxima num polipeptídeo formando um grupo PEG ligado ao polipeptídeo via uma nova ligação oxima. Exemplos de condições de reação apropriadas métodos de purificação e reagentes estão descritos por todo este relatório descritivo e nas Figuras anexas. Por exemplo, A figura 7 apresenta três exemplos da reação de um polipeptídeo de aminoácido não natural contendo carbonila com um reagente de PEG contendo hidroxilamina para formar um polipeptídeo de aminoácido não natural contendo oxima ligado a um grupo PEG. Além disso, a figura 9 apresenta dois exemplos para formar um novo polipeptídeo de aminoácido não natural contendo oxima ligado a um grupo PEG. A figura 10 apresenta um exemplo da reação de um polipeptídeo de aminoácido não natural contendo hidroxilamina com um reagente PEG contendo carbonila, para formar um polipeptídeo de aminoácido não natural contendo oxima ligado a um grupo PEG. À guisa de exemplo apenas, e não como limitação dos tipos ou classes de reagentes de PEG que podem ser usados com as composições, métodos técnicas e estratégias aqui descritos, A figura 11 apresenta mais exemplos ilustrativos de reagentes de PEG contendo hidroxilamina que podem reagir com polipeptídeos de aminoácido não natural contendo carbonila para formar poliaminoácidos contendo oxima ligados ao grupo PEG, bem como exemplos de reagentes de PEG contendo carbonila que podem reagir com polipeptídeos de aminoácido não natural contendo oxima ou polipeptídeos de aminoácido não natural contendo hidroxilamina, para formar novos polipeptídeos de aminoácido não natural contendo oxima ligados aos grupos PEG. A figura 12 apresenta quatro exemplos ilustrativos de métodos sintéticos para formar reagentes de PEG contendo hidroxilamina, ou formas protegidas de reagentes de PEG contendo hidroxilamina ou formas mascaradas de reagentes de PEg contendo hidroxilamina. A figura 13 apresenta um exemplo ilustrativo de métodos sintéticos para formar reagentes de PEG contendo hidroxilamina ligados a amida, ou formas protegidas de reagentes de PEg contendo hidroxilamina ligados a amida, ou formas mascaradas de reagente de PEg contendo hidroxilamina ligados a amida. Figuras 14 e 15, apresentam exemplos ilustrativos de métodos sintéticos para formar reagentes de PEg contendo hidroxilamina ligados a carbamato, ou formas protegidas de reagentes de PeG contendo hidroxilamina ligados a carbamato, ou formas mascaradas de reagentes de PEG contendo hidroxilamina ligados a carbamato. A figura 16 apresenta exemplos ilustrativos de métodos sintéticos para formar reagentes de PEG contendo hidroxilamina simples ou formas protegidas de reagentes de PEg contendo hidroxilamina simples, ou formas mascaradas de reagentes de PEG contendo hidroxilamina simples. Além disso, a Figura 17 apresenta exemplos ilustrativos de reagente contendo hidroxilamina que têm múltipasl ramificações de grupos PEG ligados e ainda mostram a reação de um desse reagentes ramificados multi-PEG-ramificados contendo hidroxilamina com um polipeptídeo de aminoácido não natural contendo carbonila formando um polipeptídeo de aminoácido não natural contendo oxima com um grupo PEG multi- ramificado.
[00573]Derivados heterobifuncionais também são particularmente úteis quando se deseja ligar diferentes moléculas a cada terminal do polímero. Por exemplo, o PEG omega-N-amino-N-acido permitiria a ligação de uma molécula com um grupo eletrofílico ativado tal como um aldeído, cetona, éster ativado, carbonato ativado e etc, a um terminal de PEG e uma molécula com um grupo acetileno ao outro terminal de PEg.
[00574]Em algumas modalidades, um nucleófilo forte (incluindo, sem limitação, hidroxilamina) pode ser reagido com um grupo aldeído ou cetona presente num aminoácido não natural para formar uma oxima, que, em alguns casos pode ser ainda reduzido por tratamento com um agente redutor adequado. Alternativamente, o nucleófilo forte pode ser incorporado ao polipeptídeo via um aminoácido não natural e usado para reagir preferivelmente, com um grupo aldeído ou cetona presente no polímero hidrossolúvel. Geralmente, pelo menos um terminal da molécula PEG é disponível para reação com o aminoácido não natural.
[00575]Assim, em algumas modalidades, o polipeptídeo compreendendo o aminoácido não natural é ligado a um polímero hidrossolúvel, tal como um polietileno glicol (PEG), via cadeias laterais do aminoácido não natural. Os métodos e composições de aminoácido não natural aqui descritos propiciam um método altamente eficiente para modificação seletiva de proteínas com derivados de PEG, envolvendo a incorporação seletiva de aminoácidos não naturais incluindo, sem limitação, aos aminoácidos contendo grupos funcionais ou substituintes não encontrados nos 20 aminoácidos naturalmente incorporados à proteínas, em resposta a um códon de seleção e a subseqüente modificação daqueles aminoácidos com um derivado de PEg reativo adequado. Metodologias de química conhecida de ampla faixa são adequadas para emprego com os métodos e composições dos aminoácidos não naturais aqui descritos na incorporação de um polímero hidrossolúvel à proteína.
[00576]A cadeia central do polímero pode ser linear ou ramificada. Cadeias centrais poliméricas ramificadas são em geral conhecidas da técnica. Tipicamente, um polímero ramificado tem uma fração de núcleo ramificado central e uma série de cadeias poliméricas lineares ligadas ao núcleo de ramificação central. PEG é utilizado nas formas ramificadas que podem ser preparadas por adição de etileneóxido a vários polióis, tais como glicerol, oligômeros de glicerol, pentaeritritol e sorbitol. A fração de ramificação central pode também ser derivada de vários aminoácidos, tais como lisina. O poli(etileno glicol) ramificado pode ser representado na forma geral como R(-PEG-OH)m em que R é derivado de uma fração central, tal como glicerol, oligômeros de glicerol ou pentaeritritol, e m representa o número de ramificações. Moléculas de PEG multi-ramificadas tais como as descritas nas Patentes U.S. n° 5.932.462, 5.643.575, 5.229.490, 4.289.872, Pedido de Patente U.S. 2003/0143596; WO 96/21468; e WO 93/21259, cada qual ora incorporada por referência, em sua totalidade podem ser usadas como a cadeia central do polímero.
[00577]PEG ramificado pode também estar na forma de um PEG em forquilha representado por PEG(-YCHZ2)n, onde Y é um grupo de ligação e Z é um grupo terminal ativado ligado a CH por uma cadeia de átomos de comprimento definido. Numa outra forma ramificada, o PEG pendente, tem grupos reativos tais como carboxila, ao longo da cadeia central PEG ao invés de nas extremidades das cadeias de PEG.
[00578]Além dessa formas de PEg, o polímero também pode ser preparado com ligações fracas ou degradáveis na cadeia central. Por exemplo, PEG pode ser preparado via ligações éster na cadeia central polimérica submetidas à hidrólise. Como se vê, esta hidrólise resulta na clivagem do polímero em fragmentos de moléculas de menor peso molecular:
Figure img0087
Fica entendido pelos versados na técnica, que, o termo polietileno glicol ou PEG representa ou inclui todas as formas conhecidas na técnica incluindo, sem limitação, as aqui reveladas. O peso molecular do polímero pode estar numa faixa ampla, incluindo, sem limitação, entre cerca de 100 Da e cerca de 100.000 Da ou mais. O peso molecular do polímero pode estar entre cerca de 100 Da e cerca de 100.000 Da, incluindo, sem limitação, a 100.000 Da, 95.000 Da, 90.000 Da, 85.000 Da, 80.000 Da, 75.000 Da, 70.00 Da, 65.000 Da, 60.000 Da, 55.000 Da, 50.000 Da, 45.000 Da, 40.000 Da, 35.000 Da. 30.000 Da, 25.000 Da, 20.000 Da, 15.000 Da, 10.000 Da, 9.000 Da, 8.000 Da, 7.000 Da, 6.000 Da, 5000 Da, 4.000 Da, 3.000 Da, 2.000 Da, 1.000 Da, 900 Da, 800 Da, 700 Da, 600 Da, 500 Da, 400 Da, 300 Da, 200 Da, e 100 Da. Em algumas modalidades, o peso molecular do polímero fica entre cerca de 100 Da e 50.000 Da. Em algumas modalidades, o peso molecular do polímero fica entre cerca de 100 Da e 40.000 Da. Em algumas modalidades, o peso molecular do polímero fica entre cerca de 1.000 Da e 40.000 Da. Em algumas modalidades, o peso molecular do polímero fica entre cerca de 5.000 Da e 40.000 Da. Em algumas modalidades, o peso molecular do polímero fica entre cerca de 10.000 Da e 40.000 Da.
[00579]De modo a maximizar as propriedades desejadas de Peg, o peso molecular total e estado de hidratação do polímero PE ou polímeros ligados a molécula biologicamente ativa deve ser suficientemente alto para conferir as características vantajosas tipicamente associadas com ligação do polímero PEG tal como solubilidade em água aumentada e meia-vida circulante, embora não impactando prejudicialmente a bioatividade da molécula de origem.
[00580]Os métodos e composições aqui descritos podem ser usados para produzir preparações substancialmente homogêneas de conjugados polímero:proteína. "Substancialmente homogêneo"como aqui empregado significa que as moléculas do conjugado polímero:proteína são vistas serem maiores do que metade da proteína total. O conjugado polímero:proteína tem atividade biológica e as presentes preparações de polipeptídeo PEGuiladas "substancialmente homogêneas"aqui proporcionadas são as que ao homogêneas o suficiente para apresentar as vantagens de uma preparação homogênea, por exemplo, facilidade em aplicação clínica na capacidade de prognostico do lote para lotes farmacocinéticos.
[00581]Pode-se escolher também preparar uma mistura de moléculas conjugadas polímero:proteína e a vantagem aqui é que pode-se selecionar a proporção de conjugado monopolímero:proteína para inclusão na mistura. Assim, caso desejado, pode-ser preparar uma mistura de várias proteínas com várias frações de polímero ligadas (ou seja, di-, tri-, tetra-, etc) e combinar tais conjugados com o conjugado monopolímero:proteína preparado usando os métodos aqui descritos, e ter uma mistura com uma proporção predeterminada de conjugados monopolímero:proteína.
[00582]A proporção de moléculas de polietileno glicol a moléculas de proteína irá variar como o farão suas concentrações na mistura de reação. Em geral, a relação ótima (em termos de eficiência de reação em que há excesso mínimo não reagido de proteína ou polímero) pode ser determinada pelo peso molecular do polietileno glicol selecionado e do número de grupos reativos disponíveis. Referindo-se ao peso molecular, tipicamente quanto maior for o peso molecular do polímero, menor será o número de moléculas de polímero que podem ser ligadas à proteína. De modo similar a ramificação do polímero deve ser levada em contra, quando da otimização desses parâmetros. Em geral, quanto maior for o peso molecular (ou mais ramificações) maior será a relação polímero:proteína.
[00583]Como aqui empregado, e quando se considera conjugados polímero hidrofílico:polipeptídeo/proteína, o ermo "quantidade terapeuticamente eficaz" refere-se além disso a uma quantidade que confere um aumento no benéfico desejado a um paciente. A quantidade irá variar de um indivíduo para outro e dependerá de uma série de fatores, incluindo condição física geral do paciente e da causa subjacente da doença, distúrbio ou condição em tratamento. Uma quantidade terapeuticamente eficaz das presentes composições pode ser prontamente ajustada pelo perito na técnica usando materiais e procedimentos disponíveis ao público.
[00584]O número de polímero hidrossolúvel ligados a um polipeptídeo de aminoácido não natural "modificado ou não modificado" (ou seja, a extensão da PEGuilaçao ou glicosilação) aqui descritas pode ser ajustada para dar um característica alterada (incluindo, sem limitação, aumentada ou diminuída) farmacológica, farmacocinética ou farmacodinâmica tal como a meia-vida in vivo. Em algumas modalidades, a meia-vida do polipeptídeo é aumentada em pelo menos 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90%, duas vezes, cinco vezes, 10 vezes, 50 vezes, ou pelo menos 100 vezes mais um polipeptídeo não modificado.
[00585]Numa modalidade, um polipeptídeo compreendendo um aminoácido não natural contendo carbonila- ou dicarbonila é modificado com um derivado de PEG contendo uma fração hidroxilamina terminal ligada diretamente à cadeia central de PEG.
[00586]Em algumas modalidades, o derivado de PEG hidroxilamina terminal irá ter a estrutura:
Figure img0088
onde R é um alquila simples (metila, etila, propila, etc), m é 2-10 e n é 100-1.000 (ou seja, peso molecular médio fica entre 5-40 kDa). O peso molecular do polímero pode estar numa ampla faixa, incluindo, sem limitação, entre cerca de 100 Da e cerca de 100.000 Da ou mais. O peso molecular do polímero pode estar entre cerca de 100 Da e cerca de 100.000 Da, incluindo, sem limitação, a 100.000 Da, 95.000 Da, 90.000 Da, 85.000 Da, 80.000 Da, 75.000 Da, 70.00 Da, 65.000 Da, 60.000 Da, 55.000 Da, 50.000 Da, 45.000 Da, 40.000 Da, 35.000 Da. 30.000 Da, 25.000 Da, 20.000 Da, 15.000 Da, 10.000 Da, 9.000 Da, 8.000 Da, 7.000 Da, 6.000 Da, 5000 Da, 4.000 Da, 3.000 Da, 2.000 Da, 1.000 Da, 900 Da, 800 Da, 700 Da, 600 Da, 500 Da, 400 Da, 300 Da, 200 Da, e 100 Da. Em algumas modalidades, o peso molecular do polímero fica entre cerca de 100 Da e 50.000 Da. Em algumas modalidades, o peso molecular do polímero fica entre cerca de 100 Da e 40.000 Da. Em algumas modalidades, o peso molecular do polímero fica entre cerca de 1.000 Da e 40.000 Da. Em algumas modalidades, o peso molecular do polímero fica entre cerca de 5.000 Da e 40.000 Da. Em algumas modalidades, o peso molecular do polímero fica entre cerca de 10.000 Da e 40.000 Da.
[00587]Numa outra modalidade, um polipeptídeo compreendendo um aminoácido contendo carbonila- ou dicarbonila é modificado dom um derivado de PEG contendo uma fração hidroxilamina terminal ligada à cadeia central de PEG pro meio de uma ligação amida.
[00588]Em algumas modalidades, os derivados de PEG hidroxilamina terminais têm a estrutura:
Figure img0089
onde R é um alquila simples (metila, etila, propila, etc), m é 2-10 e n é 100-1.000 (ou seja, peso molecular médio fica entre 5-40 kDa). O peso molecular do polímero pode estar numa ampla faixa, incluindo, sem limitação, entre cerca de 100 Da e cerca de 100.000 Da ou mais. O peso molecular do polímero pode estar entre cerca de 100 Da e cerca de 100.000 Da, incluindo, sem limitação, a 100.000 Da, 95.000 Da, 90.000 Da, 85.000 Da, 80.000 Da, 75.000 Da, 70.00 Da, 65.000 Da, 60.000 Da, 55.000 Da, 50.000 Da, 45.000 Da, 40.000 Da, 35.000 Da. 30.000 Da, 25.000 Da, 20.000 Da, 15.000 Da, 10.000 Da, 9.000 Da, 8.000 Da, 7.000 Da, 6.000 Da, 5000 Da, 4.000 Da, 3.000 Da, 2.000 Da, 1.000 Da, 900 Da, 800 Da, 700 Da, 600 Da, 500 Da, 400 Da, 300 Da, 200 Da, e 100 Da. Em algumas modalidades, o peso molecular do polímero fica entre cerca de 100 Da e 50.000 Da. Em algumas modalidades, o peso molecular do polímero fica entre cerca de 100 Da e 40.000 Da. Em algumas modalidades, o peso molecular do polímero fica entre cerca de 1.000 Da e 40.000 Da. Em algumas modalidades, o peso molecular do polímero fica entre cerca de 5.000 Da e 40.000 Da. Em algumas modalidades, o peso molecular do polímero fica entre cerca de 10.000 Da e 40.000 Da.
[00589]Numa outra modalidade, um polipeptídeo compreendendo um aminoácido contendo carbonila- ou dicarbonila é modificado com um derivado de PEG ramificado contendo uma fração hidroxilamina terminal, com cada cadeia do PEG ramificado com um peso molecular variando desde 10-40 kDa, e, em outras modalidades, de 5-20 kDa. O peso molecular do polímero ramificado pode estar numa ampla faixa, incluindo, sem limitação, entre cerca de 100 Da e cerca de 100.000 Da ou mais. O peso molecular do polímero pode estar entre cerca de 100 Da e cerca de 100.000 Da, incluindo, sem limitação, a 100.000 Da, 95.000 Da, 90.000 Da, 85.000 Da, 80.000 Da, 75.000 Da, 70.00 Da, 65.000 Da, 60.000 Da, 55.000 Da, 50.000 Da, 45.000 Da, 40.000 Da, 35.000 Da. 30.000 Da, 25.000 Da, 20.000 Da, 15.000 Da, 10.000 Da, 9.000 Da, 8.000 Da, 7.000 Da, 6.000 Da, 5000 Da, 4.000 Da, 3.000 Da, 2.000 Da, 1.000 Da, 900 Da, 800 Da, 700 Da, 600 Da, 500 Da, 400 Da, 300 Da, 200 Da, e 100 Da. Em algumas modalidades, o peso molecular do polímero fica entre cerca de 100 Da e 50.000 Da. Em algumas modalidades, o peso molecular do polímero fica entre cerca de 100 Da e 40.000 Da. Em algumas modalidades, o peso molecular do polímero fica entre cerca de 1.000 Da e 40.000 Da. Em algumas modalidades, o peso molecular do polímero fica entre cerca de 5.000 Da e 40.000 Da. Em algumas modalidades, o peso molecular do polímero fica entre cerca de 10.000 Da e 40.000 Da.
[00590]Numa outra modalidade, um polipeptídeo compreendendo um aminoácido não natural é modificado com pelo menos um derivado de PEG com uma estrutura ramificada. Em algumas modalidades, os derivados de PEG contendo um grupo hidroxilamina terão a estrutura:
Figure img0090
onde R é um alquila simples (metila, etila, propila, etc), X é opcionalmente NH, O, S, C(O) ou não está presente, m é 2-10 e n é 100-1.000 O peso molecular do polímero pode estar entre cerca de 1.0000 Da e cerca de 100.000 Da, incluindo, sem limitação, a 100.000 Da, 95.000 Da, 90.000 Da, 85.000 Da, 80.000 Da, 75.000 Da, 70.00 Da, 65.000 Da, 60.000 Da, 55.000 Da, 50.000 Da, 45.000 Da, 40.000 Da, 35.000 Da. 30.000 Da, 25.000 Da, 20.000 Da, 15.000 Da, 10.000 Da, 9.000 Da, 8.000 Da, 7.000 Da, 6.000 Da, 5000 Da, 4.000 Da, 3.000 Da, 2.000 Da, 1.000 Da. Em algumas modalidades, o peso molecular de PEG de cadeia ramificada fica entre cerca de 1.000 Da e 50.000 Da. Em algumas modalidades, o peso molecular de PEG de cadeia ramificada fica entre cerca de 1.000 Da e 40.000 Da. Em algumas modalidades, o peso molecular de PEG de cadeia ramificada fica entre cerca de 5.000 Da e 40.000 Da. Em algumas modalidades, o peso molecular de PEG de cadeia ramificada fica entre cerca de 5.000 Da e 20.000 Da.
[00591]Várias pesquisas e monografias sobre a funcionalização e conjugação de PEG tão disponíveis, Ver, por exemplo, Harris, Macromol. Chem. Phys. C25:325-373 (1985); Scouten Methods in Enzymology 135:30-65 (1987); Wong et al., Enzyme Microb. Technol. 14:866-874 (1992); Delgado et al., Critical Revies in Therapeutic Drug Carrier Systems 9:249-304 (1992); Zalipsky, Bioconjugate Chem. 6:150-165 (1995).
[00592]Métodos para ativação dos polímeros podem ser vistos em WO 94/17039, Patente U.S. n" 5.324.844, WO 94/18247, WO 94/04193, Patente U.S. 5.219.564, Patente U.S. n" 5.122.614, WO 90/13540, Patente U.S. n" 5.281.698 e mais WO 92/15189, para conjugação entre polímeros ativados e enzimas incluindo, sem limitação, a Coagulation FActor VIII (WO 94/15625), hemoglobina (WO 94/09027), molécula portadora de oxigênio) (Patente U.S. n" 4.412.989,(ribonuclease e superóxido dismutase (Veronese et al., App. Bichem. Biotech 11:141-152 (1985)) todas estando ora incorporadas a título de referência.
[00593]Caso necessário, os polipeptídeos de aminoácido não natural PEGuilados aqui descritos, obtidos da cromatografia hidrofóbica podem ser ainda purificados por um ou mais procedimentos do conhecimento da técnica, incluindo, sem limitação, cromatografia de afinidade, cromatografia de troca aniônica ou catiônica (usando, incluindo, sem limitação, DEAE SEPHAROSE); cromatografia em sílica, HPLC de fase reversa, filtração com gel (usando incluindo, sem limitação, SEPHADEX G-75), cromatografia de interação hidrofóbica, por exclusão de tamanho, cromatograia de metal-quelato; ultrafiltração/diafiltração, cromatografia de interação hidrofóbica; cromatografia de exclusão de tamanho, cromatografia de quelato metálico; ultrafiltração/filtração; precipitação com etanol; precipitação com sulfato de amônio; cromato-focalização; cromatografia de deslocamento; procedimentos eletroforéticos (inclusive, sem limitação, focalização isoelétrica preparatória), solubilidade diferencial (inclusive, sem limitação precipitação com sulfato de amônio), ou extração. O peso molecular aparente pode ser estimado por GPC comparando-se a padrões de proteína globular (Preneta AZ, PROTEIN PURIFICATION METHODS, A PRACTICAL APPROACH (Harris & Angal, Eds.), IRL Press 1989, 293-306). A pureza do polipeptídeo de aminoácido não natural:conjugado PEG pode ser avaliada por degradação proteolítica (incluindo, sem limitação, clivagem com tripsina) seguido por análise espectrométrica de massa Pepinsky RB, et al., J. Pharmacol Y Exp. Ther 297(3):1059-66 (2001).
[00594]Um polímero hidrossolúvel ligado a um aminoácido não natural de um polipeptídeo aqui descrito pode ser ainda derivatizado ou substituído sem limitação.
E. Intensificando a Afinidade para albumina sérica
[00595]Várias moléculas também podem ser fundidas aos polipeptídeos de aminoácido não natural aqui descritos para modular a meia-vida no soro. Em algumas modalidades, as moléculas são ligadas ou fundidas aos polipeptídeos de aminoácido não natural "modificados ou não modificados" aqui descritos para intensificar a afinidade para albumina sérica endógena num animal.
[00596]Por exemplo, em alguns casos, é feita uma fusão recombinante de um polipeptídeo e uma seqüência de ligação a albumina. Seqüências de ligação a albumina exemplares , incluem, sem limitação, domínio de ligação a albumina de proteína estreptocócica G (ver por exemplo, Mkrides et al., J. Pharmacol. Exp. Ther 277(1):5434-542 (1996) e Sjolander et al., J. immunol Methods 201:115-123 (1997), ou peptídeos de ligação a albumina tais como os descritos em por exemplo, Dennis, et al., J. Biol. Chem. 277(38):35035-35043 (2002).
[00597]Em outras modalidades, os polipeptídeos de aminoácido não natural "modificados ou não modificados" aqui descritos são acilados com ácido graxo. Em alguns casos, os ácidos graxos promovem a ligação a albumina sérica. Ver por exemplo, Kurtzhals et al., Biochem J. 312:725-731 (1995).
[00598]Em outras modalidades, os polipeptídeos de aminoácido não natural "modificado ou não modificado" aqui descritos, são fundidos diretamente com albumina sérica (incluindo, sem limitação, albumina sérica humana). Os versados na técnica reconhecerão que, uma ampla variedade de outras moléculas também podem ser ligada aos polipeptídeos de aminoácido não natural, modificados ou não modificados como descrito, para modular a ligação a albumina séria ou outros componentes do soro.
F. Glicosilação dos polipeptídeos de aminoácido não natural aqui descritos
[00599]Os métodos e composições aqui descritos incluem polipeptídeos incorporando um ou mais aminoácidos não naturais portando resíduos de sacarídeo. Os resíduos de sacarídeo podem ser ou natural (incluindo, sem limitação, N- acetilglicosamina) ou não naturais (incluindo, sem limitação, 3-flúor galactose). Os sacarídeos podem ser ligados aos aminoácidos não naturais seja por uma ligação N-ou O-glicosídica (incluindo, sem limitação, N-acetilgalactose-L-serina) ou uma ligação não natural (incluindo, sem limitação, uma oxima ou o correspondente C- ou S-glicosídeo).
[00600]As frações sacarídeo (incluindo, sem limitação, glicosila) podem ser adicionadas aos polipeptídeos de aminoácido não natural, seja in vivo ou in vitro. Em algumas modalidades, um polipeptídeo compreendendo um aminoácido não natural contendo carbonila- ou dicarbonila é modificado com um sacarídeo derivatizado com um grupo aminoóxi para gerar o correspondente polipeptídeo glicosilado ligado via ligação oxima. Uma vez ligado ao aminoácido não natural o sacarídeo pode ser ainda elaborado por tratamento com glicosiltransferases e outras enzimas para gear um oligossacarídeo ligado ao polipeptídeo de aminoácido não natural. Ver, por exemplo, H. Liu et al. J. Am. Chem. Soc 125: 1702-1703 (2003).
G. Uso de Grupos de Ligação e Aplicações, Incluindo Dímeros e Multímeros Polipeptídicos
[00601]Além de adição de funcionalidade diretamente ao polipeptídeo de aminoácido não natural, a parte aminoácido não natural do polipeptídeo pode ser primeiro modificada com uma molécula ligante multifuncional (por exemplo, bi-, tri, tetra-) que a seguir é mais modificada. Ou seja, pelo menos uma extremidade da molécula ligante multifuncional reage com pelo menos um aminoácido não natural Em outras modalidades o polipeptídeo e pelo menos uma outra extremidade do ligante multifuncional fica disponível para mais funcionalização. Caso todas as extremidades do ligante multifuncional sejam idênticas, então (dependendo das condições estequiométricas) homomultímeros do polipeptídeo de aminoácido não natural podem ser formados. Caso as extremidades do ligante multifuncional tenham reatividades químicas distintas, então pelo menos uma extremidade do ligante multifuncional será ligada ao polipeptídeo de aminoácido não natural e a outra extremidade pode, a seguir reagir com uma diferente funcionalidade, incluindo à guisa de exemplo apenas, um rótulo, um corante; um polímero; um polímero hidrossolúvel; um derivado de polietileno glicol; um foto-reticulador; um composto citotóxico; uma droga; um rótulo de afinidade; um rótulo de foto-afinidade; um composto reativo; uma resina; uma segunda proteína ou polipeptídeo ou análogo de polipeptídeo; um anticorpo ou fragmento de anticorpo; um quelante de metal; um co- fator; um ácido graxo; um carboidrato; um polinucleotídeo; um DNA; um RNA; um polinucleotídeo anti-sentido; um sacarídeo; um dendrímero hidrossolúvel; uma ciclodextrina; um biomaterial; uma nanopartícula; um rótulo de spin; um fluoróforo; uma fração contendo metal; uma fração radioativa; um grupo funcional inédito; um grupo que interage por covalência ou por não covalência com outras moléculas; uma fração foto-aprisionada; uma fração excitável por radiação actínica, um ligante, uma fração fotoisomerizável; biotina; um análogo de biotina; uma fração que incorpora um átomo pesado; um grupo quimicamente clivável; um grupo fotoclivável; uma cadeia lateral alongada; um açúcar ligado a carbono; um agente redox-ativo; um amino tioácido; uma fração tóxica; uma fração isotopicamente rotulada; uma sonda biofísica; um grupo fosforescente; um grupo quimioluminescente; um grupo com densidade de elétrons; um grupo magnético; um grupo intercalado; um cromóforo; um agente de transferência de energia; um agente biologicamente ativo, um rótulo detectável; uma molécula pequena; um ácido ribonucléico inibidor, um radionucleotídeo; um agente capturador de nêutrons, um derivado de biotina; ponto(s) quântico(s); um nanotransmissor; um radiotransmissor, uma abzima, um ativador de complexo ativado, um vírus, um adjuvante, um aglican, um alergan, uma angiostatina, um anti-hormônio, um antioxidante, um aptâmero, um RNA orientador, uma saponina, um vetor bilateral, uma macromolécula, um mimótopo, um receptor, uma micela inversa, e quaisquer combinações dos acima.
[00602]O grupo de ligação multifuncional tem a estrutura geral (XIX):
Figure img0091
onde: cada X é independentemente NH2, -C(=O)R9, -SR' ou -J-R, onde R9 é H ou
Figure img0092
R é H, alquila, alquila substituído, cicloalquila ou cicloalquila substituído; cada R" é independentemente H, alquila, alquila substituído, ou um grupo protetor, ou quando mais de um grupo R está presente, dois R" formam, opcionalmente um heterocicloalquila; cada R"é independentemente H, alquila ou alquila substituído, cada L é independentemente selecionado do grupo consistindo de alquileno, alquileno substituído, alquenileno, alquenileno substituído, -O-, -O- (alquileno ou alquileno substituído)-, -S-, -S-(alquileno ou alquileno substituído)-, - S(O)k- onde k é 1, 2, ou 3, -S(O)k(alquileno ou alquileno substituído)-. -C(O)-, -C(O)- (alquileno ou alquileno substituído)-, -C(S)-, -C(S)-(alquileno ou alquileno substituído)-, -N(R')-, NR'-(alquileno ou alquileno substituído), -C(O)N(R')-, -CON(R')- (alquileno ou alquileno substituído)-, -N(R')CO(alquileno ou alquileno substituído)- (alquileno ou alquileno substituído)-, -OCON(R')-(alquileno ou alquileno substituído)- -CSN(R')-, -CSN(R')-(alquileno ou alquileno substituído)-, -N(R')CO-(alquileno ou alquileno substituído)-, N(R')C(O)O-, N(R')C(O)O-(alquileno ou alquileno substituído)-, S(O)kN(R')-, N(R')C(O)N(R')-, N(R')C(O)N(R')-(alquileno ou alquileno substituído) -N(R')C(S)N(R')- -N(R')S(O)kN(R')-, -N(R')-N=, -C(R')=N-, -C(R')=N- N(R')-, -C(R')=N-N=, -C(R')2N=N-, e -C(R')2-N(R')-N(R')-; L1 é opcional, e quando presente é -C(R')p-NR'-C(O)O-(alquileno ou alquileno substituído)- onde p é 0, 1 ou 2; W é -N(H)2, -C(=O)R9, SR' ou -J-R; e n é 1 a 3; contando que, X e L-L1-W propiciem juntos, e independentemente, pelo menos um dos seguintes (a) um grupo hidroxilamina capaz de reagir com um grupo carbonila (inclusive um grupo dicarbonila) num aminoácido não natural ou um polipeptídeo de aminoácido não natural "modificado ou não modificado", (b) um grupo carbonila (incluindo um grupo dicarbonila) capaz de reagir com um grupo hidroxilamina, num aminoácido não natural ou um polipeptídeo de aminoácido não natural "modificado ou não modificado", ou (c) um grupo carbonila (incluindo um grupo dicarbonila) capaz de passar por uma reação de troca com um grupo oxima num aminoácido não natural ou um polipeptídeo de aminoácido não natural "modificado ou não modificado".
[00603]A figura 18 apresenta um exemplo ilustrativo, não limitante da síntese de um homoligante bifuncional, em que o ligante tem duas extremidades idênticas, ou seja, grupos hidroxilamina. Um tal ligante pode ser usado para formar um homodímero de um polipeptídeo de aminoácido não natural contendo carbonila- ou dicarbonila para formar duas ligações oxima. Alternativamente, caso uma extremidade desse ligante seja protegida, então um tal ligante parcialmente protegido pode ser usado para ligar a extremidade hidroxilamina não protegida a um polipeptídeo de aminoácido não natural contendo carbonila- ou dicarbonila via uma ligação oxima, deixando a outra extremidade protegida disponível para mais reações de ligação, seguinte à desproteção. Alternativamente, manipulação cuidadosa da estequiometria dos reagentes pode ser proporcionada, num resultado similar (um heterodímero), embora um resultado em que o heterodímero desejado será provavelmente contaminado com algum homo dímero.
[00604]A figura 19 apresenta exemplos não limitantes ilustrativos de dois heteroligantes multifuncionais em que cada ligante possui mais de um tipo de grupo reativo terminal, ou seja, grupos hidroxilamina, oxima e tioéster. Um tal ligante pode ser usado para formar um heterodímero de um polipeptídeo de aminoácido não natural usando a química a base de oxima debatida por todo este relatório descritivo.
[00605]A figura 20 apresenta uma ilustração esquemática de um exemplo não limitante do uso de um ligante hetero-bifuncional para ligação de um grupo PEG a um polipeptídeo de aminoácido não natural numa síntese de múltiplas etapas. Na primeira etapa, como ilustrado na figura, um polipeptídeo de aminoácido não natural contendo carbonila reage com um ligante bifuncional contendo hidroxilamina formando um polipeptídeo de aminoácido não natural contendo oxima modificado. Contudo, o ligante bifuncional ainda reterá um grupo funcional (aqui ilustrado por um objeto conformado) que é capaz de reagir com um reagente com apropriada reatividade (ilustrado na figura por um objeto de conformação combinada) formando um polipeptídeo de aminoácido não natural funcionalizado contendo oxima modificado. Nesta figura ilustrativa particular, a funcionalização é um grupo PEG, mas pode também incluir quaisquer funcionalidades supra, ou neste caso de um ligante tri- ou tetra-funcional, mais de um tipo de funcionalidade ou múltiplos tipos de igual funcionalidade. A figura 21 apresenta exemplos ilustrativos de quatro tipos de grupos de ligação usados para ligar um polipeptídeo de aminoácido não natural contendo hidroxilamina a um grupo PEG. Como mencionado, a funcionalidade de PEG é dada para fins ilustrativos apenas. Assim os grupos ligantes aqui descritos propiciam um meio adicional para modificar ainda mais um polipeptídeo de aminoácido não natural num modo seletivo ao sítio.
[00606]Os métodos e composições aqui descritos também propiciam combinações de polipeptídeo, tal como homodímeros ou heteromúltimeros (ou seja, trímeros tetrâmeros, etc. )à guisa de exemplo, a seguinte descrição focaliza-se nos membros da família de supergenes GH, contudo, os métodos técnicas e composições descritos neste parágrafo, podem ser aplicados, virtualmente qualquer polipeptídeo que poderá proporcionar benefício na forma de dímeros ou multímeros, incluindo, a guisa de exemplo, apenas, alfa-1, antitripsina, angiostatina, fator anti- hemolítico, anticorpo, fragmento de anticorpo, apoliproteína, apoproteína, fator natriurético atrial, polipeptídeo natriurético atrial, peptídeo atrial, C-X-C quimiocina, T39765, NAP-2, ENA-78, gro-a, gro-b, gro-c, IP-10, GCP-2, NAP-4, SDF-1, PF4, MIG, calcitonina, ligante c-kit, citocina, CC quimiocina, proteína 1- quimioatrativa de monócito, proteína-2 quimioatrativa de monócito, proteína 3 quimioatrativa de monócito, proteína-1 alfa inflamatória de monócito, proteína beta inflamatória de monócito, RANTES, 1309, R83915, R91733, HCC1, T58847, D31065, T64262, CD40, ligante CD40, ligante c-kit, colágeno, fator estimulante de colônia (CSF), fator 5a complementar, inibidor complementar, receptor 1 complementar, citocina, peptídeo 78 ativador de neutrófilo epitelial, MIP-16, MCP-1, fator de crescimento epidérmico (EGF), peptídeo ativador de neutrófilo epitelial, eritropoietina (EPO), toxina esfoliante, Fator IX, Fator VII, Fator VIII, Fator X, fator de crescimento de fibroblasto (FGF), fibrinogênio, fibronectina, proteína de feixe de quatro hélices, G- CSF, glp-1, GM-CSF, glicocerebrosidase, gonadotropina, fator de crescimento, receptor do fator de crescimento, grf, proteína de ouriço, hemoglobina, fator de crescimento de hepatócito (hGF), hirudina, hormônio do crescimento humano (hGH), albumina sérica humana, ICAM-1, receptor de ICAM-1, LFA-1, receptor de LFA-1, insulina, fator de crescimento semelhante à insulina (IGF), IGF-I, IGF-II, interferon (IFN), IFN-alfa, IFN-beta, IFN-gama, interleucina, (IL, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, fator de crescimento de ceratinócito (KGF), lactoferrina, fator inibidor de leucemia, luciferase, neurturina, fator inibidor de neutrófilo (NIF), oncostatina M, proteína osteogênica, produto oncogênico, paracitonina, hormônio da paratireóide , PD-ECSF, PDGF, hormônio peptídico, pleiotropina, proteína A, proteína G, pth, exotoxina A pirogênica, exotoxina B pirogênica, exotoxina C pirogênica, pyy, relaxina, renina, SCF, proteína biossintética pequena, receptor I de complemento solúvel, I-CAM 1 solúvel, receptor de interleucina solúvel, receptor de TNF solúvel, somatomedina, somatostatina, somatotropina, super-antígenos de estreptoquinase, enterotoxina estafilocócica, SEA, SEB, SEC1, SEC2, SEC3, SED, SEE receptor do hormônio esteróide, superóxido dismutase, toxina da síndrome do choque tóxico, alfa 1 timosina, ativador plasminogênico de tecido, fator de crescimento de tumor (TGF), fator de necrose de tumor, fator alfa de necrose de tumor, fator beta de necrose de tumor, receptor do fator de necrose de tumor (TNFR), proteína VLA-4, proteína VCAM-1, fator de crescimento endotelial vascular (VEGF), uroquinase, mos, ras, faf, met, p53 tat, fos, myc, jun, myb, rel, receptor de estrogênio, receptor de progesterona, receptor de testosterona, receptor de aldosterona, receptor de LDL e corticosterona.
[00607]Assim, estão abrangidos nos métodos técnicas e composições aqui descritos um polipeptídeo membro da família de supergenes GH contendo um ou mais aminoácidos não naturais ligados a um outro membro da família de supergenes GH ou uma sua variante ou qualquer outro polipeptídeo que é um membro da família de supergenes que não de GH ou uma variante deste, seja diretamente a cadeia central do polipeptídeo ou via um ligante. Devido a seu peso molecular aumentado comparado aos monômeros o membro da família de supergenes GH ou conjugados múltimeros podem apresentar novas ou desejáveis propriedades, incluindo, sem limitação, a diferentes propriedades farmacológicas, farmacocinéticas, farmacodinâmicas, meia-vida terapêutica modulada, ou meia-vida plasmática modulada em relação ao membro da família de supergenes de GH monomérico. Em algumas modalidades, os dímeros do membro da família de supergenes GH aqui descrito irão modular a dimerização do receptor do membro da família de supergenes GH. Em outras modalidades, os dímeros ou múltimeros do membro da família de supergenes GH aqui descritos agirão como um antagonista, agonista ou modulador do receptor do membro da família de supergenes GH.
[00608]Em algumas modalidades, os polipeptídeos do membro da família de supergenes GH estão ligados diretamente, incluindo, sem limitação, via uma ligação Asn-Lys amida ou ligação dissulfeto Cys-C7s. Em algumas modalidades os polipeptídeos do membro da família de supergenes GH ligados, e/ou membro da família de supergenes GH não ligados compreenderão diferentes aminoácidos não naturais para facilitar a dimerização, incluindo, sem limitação, um primeiro membro da família de supergenes GH, e/ou o membro da família de supergenes que não de GH ligados, polipeptídeo compreendendo um aminoácido natural-hidroxilamina conjugado a um segundo polipeptídeo membro da família de supergenes GH compreendendo um aminoácido não natural contendo hidroxilamina e os polipeptídeos são reagidos via formação da correspondente oxima.
[00609]Alternativamente, os dois polipeptídeos membros da família de supergenes GH e/ou o membro da família de supergenes que não de GH ligados, são ligados vim um ligante. Qualquer ligante hetero- ou homo-bifuncional pode ser empregado para ligar os dois membros da família de supergenes GH e/ou o membro da família de supergenes que não de GH ligados, polipeptídeo, que podem ter a mesma ou diferente seqüência primária. Em alguns casos, o ligante usado para encadear o membro da família de supergenes GH e/ou o membro da família de supergenes que não GH ligado, polipeptídeo juntos pode ser um reagente de PEG bifuncional
[00610]Em algumas modalidades os métodos e composições aqui descritos propiciam ligantes bifuncionais hidrossolúveis que tem uma estrutura em halteres incluindo: a) uma azida, um alcino, uma hidrazina, uma hidrazida, uma hidroxilamina, ou uma fração contendo carbonila- ou dicarbonila em pelo mesmos uma primeira extremidade de uma cadeia central polimérica ; e b) pelo menos um segundo grupo funcional numa segunda extremidade da cadeia central polimérica. O segundo grupo funcional pode ser igual ou diferente como o primeiro grupo funcional. O segundo grupo funcional em algumas modalidades, não é reativo com o primeiro grupo funcional. Os métodos e composições aqui descritos propiciam, em algumas modalidades, compostos hidrossolúveis, compreendendo pelo menos uma ramificação de uma estrutura molecular ramificada. Por exemplo, a estrutura molecular ramificada pode ser dendrítica.
[00611]Em algumas modalidades, os métodos e composições aqui descritos propiciam multímero compreendendo um ou mais membros da família de supergenes GH formados por reações com polímeros hidrossolúveis ativados tendo a estrutura:
Figure img0093
onde n é de cerca de 5 a 3.000, m é 2-10, X pode ser uma azida, um alcino, uma hidrazina, uma hidrazida, um grupo aminoóxi, uma hidroxilamina, uma cetila uma fração contendo carbonila- ou dicarbonila e R é um grupo capeador, um grupo funcional, ou um grupo de partida, que pode ser igual ou diferente de X. R pode ser, por exemplo, um grupo funcional selecionado do grupo consistindo de hidroxila, hidroxila protegida, alcoxila, éster N-hidroxissuccinimidílico, éster 1- benzoatriazolílico, carbonato de N-hidroxisuccinimidila, carbonato de 1- benzotriazolila, acetal, aldeído, hidratos de aldeído, alquenila, acrilato, metacrilato, acrilamida, sulfona ativa, amina, aminoóxi, amina protegida, hidrazida, hidrazida protegida, tiol protetor, ácido carboxílico, ácido carboxílico protetor, isocianato, isotiocianato, maleimida, vinilsulfona, ditiopiridina, vinilpiridina, iodoacetamida, epóxido, glioxais, dionas, mesilatos, tosilatos, e tresilato, alceno e cetona.
[00612]A figura 22 apresenta um exemplo ilustrativo, não limitante do uso de um grupo ligante aqui descrito para formar um homo dímero de um polipeptídeo de aminoácido não natural aqui descrito. Neste exemplo ilustrativo, um polipeptídeo de aminoácido não natural contendo carbonila é reagido com um grupo ligante bifuncional com dois grupos hidroxilamina disponíveis sob condições adequadas para formação de polipeptídeos de aminoácido não natural contendo oxima homodíméricos ligados. O método apresentado na figura não está limitado aos polipeptídeos de aminoácido não natural contendo carbonila acoplados aos ligantes bifuncionais contendo hidroxilamina. O polipeptídeo de aminoácido não natural pode ainda conter um grupo oxima capaz de passar por uma reação de troca com um grupo ligante multifuncional contendo carbonila para formar um homomultimero ligado pela estrutura contendo grupos oxima múltiplos, ou o polipeptídeo de aminoácido não natural pode ainda conter um grupo hidroxilamina capaz de passar por uma reação com um grupo ligante multifuncional contendo carbonila formando um homomultímero ligado por uma estrutura contendo grupos oxima múltiplos. Claro está que os homomultímeros podem constituir-se num homo dímero, um homotrímero ou um homotetrâmero.
[00613]A figura 23 apresenta um exemplo não limitante, ilustrativo, do uso de um grupo ligante heterofuncional para formar um heterodímero de polipeptídeos em que pelo menos um dos membros do heterodímero é um polipeptídeo de aminoácido não natural aqui descrito e os outros membros, são opcionalmente polipeptídeos de aminoácido não natural como aqui descritos, outros tipos de polipeptídeos de aminoácido não natural, ou polipeptídeo de aminoácido de ocorrência natural. No exemplo apresentado nesta figura, o grupo ligante contém dois grupos hidroxilamina idênticos, por controle da estequiometria, temperatura e outros parâmetros de reação, o produto dominante de reação do ligante com um polipeptídeo de aminoácido não natural contendo carbonila- é um polipeptídeo de aminoácido não natural contendo oxima modificado, ligado a um ligante com um grupo hidroxilamina disponível. Este último grupo pode ainda reagir com um outro polipeptídeo de aminoácido não natural contendo carbonila- ou dicarbonila para formar um heterodímero bifuncional dos polipeptídeos de aminoácido não natural contendo oxima. Naturalmente, os grupos funcionais no ligante não tem de ser idênticos, tampouco eles tem de ser grupos hidroxilamina. Usando a química detalhada por todo este relatório descritivo, o versado na técnica poderá planejar um ligante em que pelo menos um grupo funcional pode formar um grupo oxima com um polipeptídeo de aminoácido não natural; os outros grupos funcionais no ligante poderiam utilizar outras reações química conhecidas, incluindo química a base de nucleófilo/eletrófilo do conhecimento da química orgânica.
H. Exemplo de Adição de funcionalidade: Facilitando as Propriedades de Isolamento de um Polipeptídeo
[00614]Um polipeptídeo de aminoácido de ocorrência natural ou não natural pode ser difícil de isolar de uma amostra por uma série de motivos, incluindo, sem limitação, solubilidade, ou características de ligação do polipeptídeo. Por exemplo, na preparação de um polipeptídeo para uso terapêutico, um tal polipeptídeo pode ser isolado de um sistema recombinante que foi construído para superprodução do polipeptídeo. Contudo, devido a solubilidade ou características de ligação do polipeptídeo, a obtenção de um nível de pureza desejado provou, ser difícil. Os métodos, composições, técnicas e estratégias aqui descritas propiciam uma solução para esta situação.
[00615]Usando os métodos, composições, técnicas e estratégias aqui descritas, o perito na técnica pode produzir um polipeptídeo de aminoácido não natural contendo oxima homólogo ao polipeptídeo desejado, onde o polipeptídeo de aminoácido não natural contendo oxima melhorou as características de isolamento. Numa modalidade, um polipeptídeo de aminoácido não natural homólogo é produzido biossinteticamente. Numa outra modalidade ou adicional, o aminoácido não natural incorporou a sua estrutura um dos aminoácidos não naturais descritos. Em modalidades adicionais ou ulteriores, o aminoácido não natural é incorporado na posição terminal ou interna e é ainda incorporado especificamente ao sítio.
[00616]Numa modalidade, o aminoácido não natural resultante conforme produzido biossinteticamente, já tem as características de isolamento melhoradas desejada. Em modalidades adicionais ou ulteriores o aminoácido não natural compreende uma ligação oxima a um grupo que providencia as características de isolamento melhoradas. Em modalidades adicionais ou ulteriores o aminoácido não natural é ainda modificado para formar um polipeptídeo de aminoácido não natural contendo oxima modificado, onde a modificação provê uma ligação oxima a um grupo providenciado as características de isolamento desejadas. Em algumas modalidades um tal grupo é diretamente ligado ao aminoácido não natural, e em outras modalidade, um tal grupo é ligado via um grupo de ligação ao aminoácido não natural. Em algumas modalidades, um tal grupo é ligado ao aminoácido não natural por uma reação química simples,s em outras modalidades, uma série de reações químicas é necessária para conectar um tal grupo ao aminoácido não natural. Preferivelmente, o grupo que confere características de isolamento desejadas é ligado especificamente ao sítio ao aminoácido não natural no polipeptídeo de aminoácido não natural e não ligado a um aminoácido de ocorrência natural sob as condições de reação utilizadas.
[00617]Em modalidades adicionais ou ulteriores o resultante polipeptídeo de aminoácido não natural é homologo aos membros da família de supergenes GH; entretanto os métodos técnicas e composições aqui descritas podem ser aplicados a, virtualmente, qualquer polipeptídeo pode incluir pelo menos um aminoácido não natural aqui descrito. À guisa de exemplo apenas, o polipeptídeo pode ser homólogo a uma proteína terapêutica, selecionada do grupo consistindo de: alfa-1, antitripsina, angiostatina, fator anti-hemolítico, anticorpo, fragmento de anticorpo, apoliproteína, apoproteína, fator natriurético atrial, polipeptídeo natriurético atrial, peptídeo atrial, C- X-C quimiocina, T39765, NAP-2, ENA-78, gro-a, gro-b, gro-c, IP-10, GCP-2, NAP-4, SDF-1, PF4, MIG, calcitonina, ligante c-kit, citocina, CC quimiocina, proteína 1- quimioatrativa de monócito, proteína-2 quimioatrativa de monócito, proteína 3 quimioatrativa de monócito, proteína-1 alfa inflamatória de monócito, proteína beta inflamatória de monócito, RANTES, 1309, R83915, R91733, HCC1, T58847, D31065, T64262, CD40, ligante CD40, ligante c-kit, colágeno, fator estimulante de colônia (CSF), fator 5a complementar, inibidor complementar, receptor 1 complementar, citocina, peptídeo 78 ativador de neutrófilo epitelial, MIP-16, MCP-1, fator de crescimento epidérmico (EGF), peptídeo ativador de neutrófilo epitelial, eritropoietina (EPO), toxina esfoliante, Fator IX, Fator VII, Fator VIII, Fator X, fator de crescimento de fibroblasto (FGF), fibrinogênio, fibronectina, proteína de feixe de quatro hélices, G-CSF, glp-1, GM-CSF, glicocerebrosidase, gonadotropina, fator de crescimento, receptor do fator de crescimento, grf, proteína de ouriço, hemoglobina, fator de crescimento de hepatócito (hGF), hirudina, hormônio do crescimento humano (hGH), albumina sérica humana, ICAM-1, receptor de ICAM-1, LFA-1, receptor de LFA-1, insulina, fator de crescimento semelhante à insulina (IGF), IGF-I, IGF-II, interferon (IFN), IFN-alfa, IFN-beta, IFN-gama, interleucina, (IL, IL-1, IL-2, IL- 3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, fator de crescimento de ceratinócito (KGF), lactoferrina, fator inibidor de leucemia, luciferase, neurturina, fator inibidor de neutrófilo (NIF), oncostatina M, proteína osteogênica, produto oncogênico, paracitonina, hormônio da paratireóide , PD-ECSF, PDGF, hormônio peptídico, pleiotropina, proteína A, proteína G, pth, exotoxina A pirogênica, exotoxina B pirogênica, exotoxina C pirogênica, pyy, relaxina, renina, SCF, proteína biossintética pequena, receptor I de complemento solúvel, I-CAM 1 solúvel, receptor de interleucina solúvel, receptor de TNF solúvel, somatomedina, somatostatina, somatotropina, super-antígenos de estreptoquinase, enterotoxina estafilocócica, SEA, SEB, SEC1, SEC2, SEC3, SED, SEE receptor do hormônio esteróide, superóxido dismutase, toxina da síndrome do choque tóxico, alfa 1 timosina, ativador plasminogênico de tecido, fator de crescimento de tumor (TGF), fator de necrose de tumor, fator alfa de necrose de tumor, fator beta de necrose de tumor, receptor do fator de necrose de tumor (TNFR), proteína VLA-4, proteína VCAM-1, fator de crescimento endotelial vascular (VEGF), uroquinase, mos, ras, faf, met, p53 tat, fos, myc, jun, myb, rel, receptor de estrogênio, receptor de progesterona, receptor de testosterona, receptor de aldosterona, receptor de LDL e corticosterona.
[00618]Em modalidades adicionais ou ulteriores o grupo que confere características de isolamento melhoradas melhora a solubilidade em água do polipeptídeo; em outras modalidades o grupo melhora as propriedades de ligação do polipeptídeo; em outras modalidades o grupo melhora as novas propriedades de ligação ao polipeptídeo (incluindo, sem limitação, um grupo biotina ou um grupo de ligação à biotina). Em modalidades onde o grupo melhora a solubilidade em água do polipeptídeo o grupo é selecionado de polímeros hidrossolúveis aqui descritos, incluindo à guisa de exemplo, quaisquer grupos do polímero PEG aqui descritos.
I. Exemplo de Adição de Funcionalidade: Detectando a Presença de um Polipeptídeo
[00619]Um polipeptídeo de aminoácido de ocorrência natural ou não natural pode ser difícil de isolar de uma amostra (incluindo uma amostra in vivo e uma amostra in vitro), por uma série de motivos, incluindo, sem limitação, falta de um reagente ou rótulo que possa, rapidamente, ligar-se ao polipeptídeo. Os métodos, composições, técnicas e estratégias aqui descritas propiciam uma solução para esta situação.
[00620]Usando os métodos, composições, técnicas e estratégias aqui descritas, o perito na técnica pode produzir um polipeptídeo de aminoácido não natural contendo oxima, homólogo ao polipeptídeo desejado, onde o polipeptídeo de aminoácido não natural contendo oxima permite a detecção do polipeptídeo numa amostra in vivo e numa amostra in vitro. Numa modalidade, um polipeptídeo de aminoácido não natural homólogo é produzido biossinteticamente. Numa outra modalidade ou adicional, o aminoácido não natural incorporou a sua estrutura um dos aminoácidos não naturais descritos. Em modalidades adicionais ou ulteriores, o aminoácido não natural é incorporado na posição terminal ou interna e é ainda incorporado especificamente ao sítio.
[00621]Numa modalidade, o polipeptídeo de aminoácido não natural resultante, conforme produzido biossinteticamente, já tem as desejadas características de detecção. Em modalidades adicionais ou ulteriores, o polipeptídeo de aminoácido não natural compreende pelo menos um aminoácido não natural selecionado do grupo consistindo em um aminoácido não natural contendo oxima, um aminoácido não natural contendo carbonila, e um aminoácido não natural contendo hidroxilamina. Em outras modalidades, tais aminoácidos não naturais foram biossinteticamente incorporados ao polipeptídeo como aqui descrito. Em modalidades adicionais ou ulteriores, tais polipeptídeos de aminoácido não natural compreendem pelo menos um aminoácido não natural selecionado dos aminoácidos de Fórmula I-XVIII, XXX-XXXIV(A&B), ou XXXX-XXXXIII. Em modalidades adicionais ou ulteriores, o aminoácido não natural compreende uma ligação oxima a um grupo que proporciona as características de detecção aperfeiçoadas. Em modalidades adicionais ou ulteriores o aminoácido não natural é adicionalmente modificado para formar um polipeptídeo de aminoácido não natural contendo oxima modificado, onde a modificação proporciona uma ligação oxima a um grupo que proporciona as características de detecção melhoradas. Em algumas modalidades, um tal grupo é diretamente ligado ao aminoácido não natural, e em outras modalidades, um tal grupo é ligado, via um grupo ligante ao aminoácido não natural. Em algumas modalidades um tal grupo é conectado ao aminoácido não natural por uma reação química simples, e em outras modalidades, faz-se necessário uma série de reações químicas para conecta um tal grupo ao aminoácido não natural. Preferivelmente, o grupo que confere características de detecção melhoradas é ligado especificamente ao sítio ao aminoácido não natural, no polipeptídeo de aminoácido não natural, não sendo ligado ao aminoácido de ocorrência natural sob as condições de reação utilizadas.
[00622]Em modalidades adicionais ou ulteriores o resultante polipeptídeo de aminoácido não natural é homólogo aos membros da família de supergenes GH, contudo os métodos, técnicas e composições descritos neste parágrafo, podem ser aplicados, virtualmente, a qualquer polipeptídeo que precisa ser detectado numa amostra in vivo e numa amostra in vitro, incluindo, sem limitação: alfa-1 antitripsina, angiostatina, fator anti-hemolítico, anticorpo, fragmento de anticorpo, apoliproteína, apoproteína, fator natriurético atrial, polipeptídeo natriurético atrial, peptídeo atrial, C X-C quimiocina, T39765, NAP-2, ENA-78, gro-a, gro-b, gro-c, IP-10, GCP-2, NAP-4, SDF-1, PF4, MIG, calcitonina, ligante c-kit, citocina, CC quimiocina, proteína 1- quimioatrativa de monócito, proteína-2 quimioatrativa de monócito, proteína 3 quimioatrativa de monócito, proteína-1 alfa inflamatória de monócito, proteína beta inflamatória de monócito, RANTES, 1309, R83915, R91733, HCC1, T58847, D31065, T64262, CD40, ligante CD40, ligante c-kit, colágeno, fator estimulante de colônia (CSF), fator 5a complementar, inibidor complementar, receptor 1 complementar, citocina, peptídeo 78 ativador de neutrófilo epitelial, MIP-16, MCP-1, fator de crescimento epidérmico (EGF), peptídeo ativador de neutrófilo epitelial, eritropoietina (EPO), toxina esfoliante, Fator IX, Fator VII, Fator VIII, Fator X, fator de crescimento de fibroblasto (FGF), fibrinogênio, fibronectina, proteína de feixe de quatro hélices, G-CSF, glp-1, GM-CSF, glicocerebrosidase, gonadotropina, fator de crescimento, receptor do fator de crescimento, grf, proteína de ouriço, hemoglobina, fator de crescimento de hepatócito (hGF), hirudina, hormônio do crescimento humano (hGH), albumina sérica humana, ICAM-1, receptor de ICAM-1, LFA-1, receptor de LFA-1, insulina, fator de crescimento semelhante à insulina (IGF), IGF-I, IGF-II, interferon (IFN), IFN-alfa, IFN-beta, IFN-gama, interleucina, (IL, IL-1, IL-2, IL- 3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, fator de crescimento de ceratinócito (KGF), lactoferrina, fator inibidor de leucemia, luciferase, neurturina, fator inibidor de neutrófilo (NIF), oncostatina M, proteína osteogênica, produto oncogênico, paracitonina, hormônio da paratireóide , PD-ECSF, PDGF, hormônio peptídico, pleiotropina, proteína A, proteína G, pth, exotoxina A pirogênica, exotoxina B pirogênica, exotoxina C pirogênica, pyy, relaxina, renina, SCF, proteína biossintética pequena, receptor I de complemento solúvel, I-CAM 1 solúvel, receptor de interleucina solúvel, receptor de TNF solúvel, somatomedina, somatostatina, somatotropina, super-antígenos de estreptoquinase, enterotoxina estafilocócica, SEA, SEB, SEC1, SEC2, SEC3, SED, SEE receptor do hormônio esteróide, superóxido dismutase, toxina da síndrome do choque tóxico, alfa 1 timosina, ativador plasminogênico de tecido, fator de crescimento de tumor (TGF), fator de necrose de tumor, fator alfa de necrose de tumor, fator beta de necrose de tumor, receptor do fator de necrose de tumor (TNFR), proteína VLA-4, proteína VCAM-1, fator de crescimento endotelial vascular (VEGF), uroquinase, mos, ras, faf, met, p53 tat, fos, myc, jun, myb, rel, receptor de estrogênio, receptor de progesterona, receptor de testosterona, receptor de aldosterona, receptor de LDL e corticosterona.
[00623]Em modalidades adicionais ou ulteriores, o grupo que confere características de detecção melhoradas é selecionado do grupo consistindo de um rótulo, um corante, um rótulo de afinidade, um rótulo de foto-afinidade, um rótulo spin, um fluoróforo, uma fração radioativa, uma fração que incorpora um átomo pesado, uma fração rotulada isotopicamente, uma sonda biofísica, um grupo fosforescente, um grupo quimioluminescente, um grupo denso de elétron, um grupo magnético, um cromóforo, um agente de transferência de energia, um rótulo detectável e quaisquer combinações destes.
J. Exemplo de Adição de Funcionalidade: Melhorando as Propriedades Terapêuticas de um Polipeptídeo
[00624]Um polipeptídeo de aminoácido não natural ou de ocorrência natural, serão capazes de dar um certo benefício terapêutico a um paciente com um distúrbio, doença ou condição particulares. Um tal benéfico terapêutico irá depender de uma série de fatores, incluindo, sem limitação, do perfil de segurança do polipeptídeo e da farmacocinética, farmacologia e/ou farmacodinâmica do polipeptídeo (por exemplo, solubilidade em água, biodisponibilidade, meia-vida sérica, meia-vida terapêutica, imunogenicidade, atividade biológica ou tempo de circulação). Além disso, pode ser de vantagem, proporcionar mais funcionalidade ao polipeptídeo, tal como um composto ou droga citotóxico ligado, ou pode ser desejável unir polipeptídeos adicionais para formar o homo- e heteromultímeros aqui descritos. Tais modificações, preferivelmente, não destroem a atividade e/ou estrutura terciária do polipeptídeo original. Os métodos, composições, técnicas e estratégias aqui descritos providenciam soluções para esses problemas.
[00625]Utilizando os métodos, composições, técnicas e estratégias aqui descritos, o perito na técnica poderá produzir um polipeptídeo de aminoácido não natural contendo oxima homólogo ao polipeptídeo desejado, onde o polipeptídeo de aminoácido não natural contendo oxima possui as desejadas características terapêuticas. Numa modalidade, um polipeptídeo de aminoácido não natural homólogo é produzido biossinteticamente. Numa modalidade adicional ou ulterior o aminoácido não natural incorporou à sua estrutura um dos aminoácidos não naturais aqui descritos. Numa modalidade adicional ou ulterior o aminoácido não natural é incorporado a uma posição terminal ou interna e é, além disso, incorporado especificamente ao sítio.
[00626]Numa modalidade, o resultante aminoácido não natural, conforme produzido biossinteticamente, já possui as desejadas características terapêuticas melhoradas. Em modalidades adicionais ou ulteriores o aminoácido não natural compreende uma ligação oxima a um grupo que proporciona as desejadas características terapêuticas. Em modalidades adicionais ou ulteriores o aminoácido não natural é ainda modificado a formar um polipeptídeo de aminoácido não natural contendo oxima modificado, onde a modificação proporciona uma ligação oxima a um grupo que proporciona as características terapêuticas aperfeiçoadas. Em algumas modalidades, um tal grupo é diretamente ligado ao aminoácido não natural, e em outras modalidades um tal grupo é ligado via um grupo ligante ao aminoácido não natural. Em algumas modalidades, um tal grupo é ligado ao aminoácido não natural por uma reação química simples, em outras modalidades uma série de reações químicas é necessária párea conexão de um tal grupo ao aminoácido não natural. Preferivelmente, o grupo que confere as características terapêuticas melhoradas é ligado especificamente ao sítio ao aminoácido não natural no polipeptídeo de aminoácido não natural, não sendo ligado ao aminoácido de ocorrência natural sob as condições de reação utilizadas.
[00627]Em modalidades adicionais ou ulteriores o resultante polipeptídeo de aminoácido não natural é homólogo aos membros da família de supergenes de GH, contudo, os métodos técnicas e composições descritos neste parágrafo, podem ser aplicados, virtualmente, a qualquer outro polipeptídeo que pode beneficiar-se das características terapêuticas melhoradas, incluindo, à guisa de exemplo, alfa-1 antitripsina, angiostatina, fator anti-hemolítico, anticorpo, fragmento de anticorpo, apoliproteína, apoproteína, fator natriurético atrial, polipeptídeo natriurético atrial, peptídeo atrial, C-X-C quimiocina, T39765, NAP-2, ENA-78, gro-a, gro-b, gro-c, IP- 10, GCP-2, NAP-4, SDF-1, PF4, MIG, calcitonina, ligante c-kit, citocina, CC quimiocina, proteína 1- quimioatrativa de monócito, proteína-2 quimioatrativa de monócito, proteína 3 quimioatrativa de monócito, proteína-1 alfa inflamatória de monócito, proteína beta inflamatória de monócito, RANTES, 1309, R83915, R91733, HCC1, T58847, D31065, T64262, CD40, ligante CD40, ligante c-kit, colágeno, fator estimulante de colônia (CSF), fator 5a complementar, inibidor complementar, receptor 1 complementar, citocina, peptídeo 78 ativador de neutrófilo epitelial, MIP- 16, MCP-1, fator de crescimento epidérmico (EGF), peptídeo ativador de neutrófilo epitelial, eritropoietina (EPO), toxina esfoliante, Fator IX, Fator VII, Fator VIII, Fator X, fator de crescimento de fibroblasto (FGF), fibrinogênio, fibronectina, proteína de feixe de quatro hélices, G-CSF, glp-1, GM-CSF, glicocerebrosidase, gonadotropina, fator de crescimento, receptor do fator de crescimento, grf, proteína de ouriço, hemoglobina, fator de crescimento de hepatócito (hGF), hirudina, hormônio do crescimento humano (hGH), albumina sérica humana, ICAM-1, receptor de ICAM-1, LFA-1, receptor de LFA-1, insulina, fator de crescimento semelhante à insulina (IGF), IGF-I, IGF-II, interferon (IFN), IFN-alfa, IFN-beta, IFN-gama, interleucina, (IL, IL-1, IL- 2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, fator de crescimento de ceratinócito (KGF), lactoferrina, fator inibidor de leucemia, luciferase, neurturina, fator inibidor de neutrófilo (NIF), oncostatina M, proteína osteogênica, produto oncogênico, paracitonina, hormônio da paratireóide, PD-ECSF, PDGF, hormônio peptídico, pleiotropina, proteína A, proteína G, pth, exotoxina A pirogênica, exotoxina B pirogênica, exotoxina C pirogênica, pyy, relaxina, renina, SCF, proteína biossintética pequena, receptor I de complemento solúvel, I-CAM 1 solúvel, receptor de interleucina solúvel, receptor de TNF solúvel, somatomedina, somatostatina, somatotropina, super-antígenos de estreptoquinase, enterotoxina estafilocócica, SEA, SEB, SEC1, SEC2, SEC3, SED, SEE receptor do hormônio esteróide, superóxido dismutase, toxina da síndrome do choque tóxico, alfa 1 timosina, ativador plasminogênico de tecido, fator de crescimento de tumor (TGF), fator de necrose de tumor, fator alfa de necrose de tumor, fator beta de necrose de tumor, receptor do fator de necrose de tumor (TNFR), proteína VLA-4, proteína VCAM-1, fator de crescimento endotelial vascular (VEGF), uroquinase, mos, ras, faf, met, p53 tat, fos, myc, jun, myb, rel, receptor de estrogênio, receptor de progesterona, receptor de testosterona, receptor de aldosterona, receptor de LDL e corticosterona.
[00628]Em modalidades adicionais ou ulteriores, o grupo que confere as características terapêuticas melhoradas melhora a solubilidade em água do polipeptídeo; em outras modalidades, o grupo melhora as propriedades de ligação do polipeptídeo; em outras modalidades, o grupo proporciona novas propriedades de ligação ao polipeptídeo (incluindo, sem limitação, um grupo biotina ou um grupo de ligação à biotina). Em modalidades onde o grupo melhora a solubilidade em água do polipeptídeo, o grupo é selecionado de polímeros hidrossolúveis aqui descritos, incluindo à guisa de exemplo, quaisquer grupos do polímero PEG. Em modalidades adicionais ou ulteriores, o grupo é um composto citotóxico, enquanto em outras modalidades, o grupo é uma droga. Em modalidades adicionais ou ulteriores a droga ligada ou composto citotóxico pode ser clivado do polipeptídeo de aminoácido não natural, de forma a distribuir a droga ou composto citotóxico a um local terapêutico desejado. Em outras modalidades, o grupo é um segundo polipeptídeo, incluindo, à guisa de exemplo, um polipeptídeo de aminoácido não natural contendo oxima, incluindo ainda à guisa de exemplo, um polipeptídeo que possui a mesma estrutura de aminoácido como o primeiro polipeptídeo de aminoácido não natural.
[00629]Em modalidades adicionais ou ulteriores o polipeptídeo de aminoácido não natural contendo oxima é um polipeptídeo de aminoácido não natural contendo oxima modificado. Em modalidades adicionais ou ulteriores o polipeptídeo de aminoácido não natural contendo oxima, aumenta a biodisponibilidade do polipeptídeo em relação ao polipeptídeo de aminoácido de ocorrência natural homólogo. Em modalidades adicionais ou ulteriores, o polipeptídeo de aminoácido não natural contendo oxima aumenta o perfil de segurança do polipeptídeo, em relação ao polipeptídeo de aminoácido de ocorrência natural. Em modalidades adicionais ou ulteriores, o polipeptídeo de aminoácido não natural contendo oxima aumenta a solubilidade em água do polipeptídeo, em relação ao polipeptídeo de aminoácido de ocorrência natural homóloga. Em modalidades adicionais ou ulteriores, o polipeptídeo de aminoácido não natural contendo oxima aumenta a meia-vida sérica do polipeptídeo, em relação ao polipeptídeo de aminoácido de ocorrência natural homólogo. Em modalidades adicionais ou ulteriores, o polipeptídeo de aminoácido não natural contendo oxima aumenta a meia-vida séria do polipeptídeo, em relação ao polipeptídeo de aminoácido de ocorrência natural. Em modalidades adicionais ou ulteriores, o polipeptídeo de aminoácido não natural contendo oxima prolonga o tempo de circulação do polipeptídeo, em relação ao polipeptídeo de aminoácido de ocorrência natural homólogo. Em modalidades adicionais ou ulteriores, o polipeptídeo de aminoácido não natural contendo oxima modula a atividade do polipeptídeo, em relação ao polipeptídeo de aminoácido de ocorrência natural homólogo. Em modalidades adicionais ou ulteriores, o polipeptídeo de aminoácido não natural contendo oxima modula a imunogenicidade do polipeptídeo, em relação ao polipeptídeo de aminoácido de ocorrência natural homólogo.
XI - Utilidades Terapêuticas do Polipeptídeo Modificado
[00630]Por conveniência, os polipeptídeos não naturais "modificados ou não modificados" descritos neste parágrafo foram descritos genericamente e/ou com exemplos específicos. Contudo, os polipeptídeos de aminoácido não natural "modificado ou não modificado" descritos neste parágrafo não devem ser limitados apenas às descrições genéricas ou exemplos específicos fornecidos neste parágrafo, ao contrário, os polipeptídeos não naturais "modificado ou não modificado" descritos neste parágrafo, aplicam-se igualmente bem a todos os polipeptídeos de aminoácido não natural "modificados ou não modificados" compreendendo pelo menos um aminoácido que se enquadre no escopo das Fórmulas I-XVIII, XXX-XXXIV (A&B) e XXXX-XXXXIII, incluindo quaisquer sub- fórmulas ou compostos específicos que se enquadrem no escopo das Fórmulas I-XVIII, XXX-XXXIV (A & B), e XXXX-XXXXIII descritas no relatório descritivo, reivindicações e desenhos aqui descritos.
[00631]Os polipeptídeos de aminoácido não natural "modificados ou não modificados" aqui descritos incluindo seus homo- ou heteromultímeros encontram múltiplos usos, incluindo, sem limitação, usos terapêuticos, de diagnóstico, a base de ensaio, uso industrial, na cosmética, biologia de plantas, meio-ambiente, de produção de energia e/ou usos militares. Como uma ilustração não limitante, são proporcionados os usos terapêuticos a seguir, dos polipeptídeos de aminoácido não natural "modificados ou não modificados"
[00632]Os polipeptídeos de aminoácido não natural "modificados ou não modificados" aqui descritos são úteis para tratamento de uma grande faixa de distúrbios, condições ou doenças. A administração dos polipeptídeos de aminoácido não natural "modificados ou não modificados" aqui escritos resulta em quaisquer atividades demonstradas pelas preparações de polipeptídeo comercialmente disponíveis em humanos. Quantidades médias do polipeptídeo de aminoácido não natural "modificado ou não modificado"poderá variar e, em particular deverá ser baseada nas recomendações do físico qualificado. A quantidade exata do polipeptídeo de aminoácido não natural "modificado ou não modificado"é um assunto de preferência individual a tais fatores como do tipo exato de condição sendo tratada, da condição do paciente sendo trado, bem como de outros ingredientes na composição. A quantidade a ser administrada, pode ser prontamente determinada pelo versado na técnica, com base na terapia, tendo em vista os polipeptídeos de aminoácido não natural "modificados ou não modificados".
A. Administração e Composições farmacêuticas
[00633]Os polipeptídeos de aminoácido não natural "modificados ou não modificados" aqui descritos, incluindo seus homo- e heteromultímeros, encontram múltiplos usos, incluindo, sem limitação, usos terapêutico, de diagnóstico, a base de ensaio, industrial, na cosmética, biologia de planta, meio-ambiente, produção de energia e/ou uso militar. Como uma ilustração não limitante, os seguintes usos terapêuticos dos polipeptídeo de aminoácido não natural "modificados ou não modificados"são proporcionados.
[00634]Os polipeptídeos de aminoácido não natural "modificados ou não modificados" aqui descritos são de utilidade no tratamento de uma grande faixa de distúrbios A administração dos produtos de polipeptídeos de aminoácido não natural "modificados ou não modificados" aqui descritos resulta em quaisquer atividades demonstradas pelas preparações de polipeptídeo de aminoácido não natural "modificado ou não modificado". Quantidades médias do produto de polipeptídeo de aminoácido não natural "modificado ou não modificado"poderão variar e particularmente, deve estar baseada nas recomendações e prescrições de um físico qualificado. A exata quantidade do polipeptídeo de aminoácido não natural "modificado ou não modificado"é um assunto de preferência individual a tais fatores como do tipo exato de condição sendo tratada, da condição do paciente sendo tratado, bem como de outros ingredientes na composição. A quantidade a ser dada pode ser prontamente determinada pelo versado na técnica, com base na terapia, tendo em vista os polipeptídeos de aminoácido não natural "modificados ou não modificados".
[00635]Os polipeptídeos de aminoácido não natural, "modificados ou não modificados" conforme aqui descritos, (incluindo, sem limitação, a sintetases, proteínas compreendendo um ou mais aminoácido não natural etc.( são opcionalmente empregados para uso terapêutico, incluindo, sem limitação, em combinação com um veículo farmaceuticamente aceitável. Tais composições, por exemplo, compreende uma quantidade terapeuticamente eficaz dos polipeptídeos de aminoácido não natural "modificados ou não modificados", como descrito aqui, e um veículo ou excipiente farmaceuticamente aceitável. Um tal veículo ou excipiente, inclui, mas não está limitado, a solução salina, solução salina tamponada, dextrose, água, glicerol, etanol, e/ou combinações destes. A formulação é feita para adequar- se ao modo de administração. Em geral, métodos de administração de proteínas são do conhecimento da técnica e podem ser aplicados à administração dos polipeptídeos de aminoácido não natural, modificados ou não modificados , conforme aqui descrito.
[00636]Composições terapêuticas compreendendo um ou mais dos polipeptídeos de aminoácido não natural modificados ou não modificados, conforme aqui descritos, são opcionalmente testadas em um ou mais modelos animais de doença, in vitro e/ou in vivo para confirmar a eficácia, metabolismo do tecido, e a estimar as dosagens, de acordo com métodos do conhecimento da técnica. Em particular, as dosagens podem ser inicialmente determinadas por atividade, estabilidade ou outras medidas adequadas dos homólogos de aminoácido não natural ou natural (incluindo, sem limitação, comparação de um polipeptídeo modificado a inclusão de um ou mais aminoácidos não naturais a um polipeptídeo de aminoácido não natural), ou seja, num ensaio relevante.
[00637]A administração se dá por qualquer via normalmente empregada para introduzir uma molécula em contato final com sangue ou células de tecido. Os polipeptídeos de aminoácido não natural, modificados ou não modificados, aqui descritos, são administrados em qualquer modo adequado, opcionalmente com um ou mais veículos farmaceuticamente aceitáveis. Métodos adequados de administração dos polipeptídeos de aminoácido não natural, modificados ou não modificados, como aqui descrito, a um paciente, são disponíveis, e, embora mais de uma via possa ser usada para administração de uma dada composição, uma via particular pode, frequentemente proporcionar uma ação ou reação mais imediata e mais eficaz do que uma outra via.
[00638]Veículos farmaceuticamente aceitáveis são determinados, em parte, pela composição particular, sendo administrada, bem como pelo método particular usado na administração da composição. Portanto, há uma ampla série de formulações adequadas de composições farmacêuticas aqui descrias.
[00639]Os polipeptídeos de aminoácido não natural aqui descritos e as composições compreendendo tais polipeptídeos podem ser administrados por quaisquer vias convencionais, adequadas para proteínas ou peptídeos, incluindo, sem limitação, via parenteral, por exemplo, injeções incluindo, sem limitação, subcutânea, ou intravenosa, ou qualquer forma de injeções ou infusões. Composições farmacêuticas de polipeptídeo (incluído os vários polipeptídeos de aminoácido não natural, aqui descrito) podem ser administradas por uma série de vias incluindo, sem limitação, via oral, intravenosa, intraperitonial, intramuscular, transdérmica, subcutânea, tópica, sublingual ou retal. As composições compreendendo os polipeptídeos de aminoácido não natural modificados ou não modificados, conforme aqui descritas podem também ser administradas via lipossomas. Tais vias de administração e formulações adequadas são geralmente, do conhecimento dos versados na técnica. Os polipeptídeos de aminoácido não natural aqui descrito podem ser usados sozinhos ou em combinação com outros componentes adequados, incluindo, sem limitação, a um veículo farmacêutico.
[00640]Os polipeptídeos de aminoácido não natural, modificados ou não modificados, como aqui descritos, sozinhos ou em combinação com outros componentes adequados, também podem ser produzidos em formulações de aerossol, (ou seja, eles podem ser "nebulizados") para serem administrados via inalação. Formulação em aerossol pode ser colocada em propelentes pressurizados aceitáveis, tais como diclorodifluormetano, pronano, nitrogênio e similares.
[00641]As formulações adequadas para administração parenteral, tais como, por exemplo, por intra-articular (nas articulações), por via intravenosa intramuscular, intradérmica, intraperitonial, e subcutânea, incluem soluções para injeção aquosa e não aquosa isotônicas estéreis, que podem conter antioxidantes, tampões, bacteriostatos e solutos que tornam a formulação isotônica com o sangue do paciente desejado, e suspensões estéreis aquosa e não aquosas, podendo incluir agentes de suspensão, solubilizantes, agentes espessantes, estabilizantes e conservantes. As formulações de ácido nucléico embaladas podem ser apresentadas em recipientes vedados de dose única ou em múltiplas doses, tais como ampolas e frascos.
[00642]A administração parenteral e administração intravenosa são métodos preferidos de administração. Em particular as vias de administração já em uso para terapêuticos de homólogo de aminoácido natural (incluindo, sem limitação, aos tipicamente usados para EPO, IFN, GH, G-CSF, GM-CSF, IFNs, interleucinas, anticorpos, e/ou quaisquer ouras proteínas fornecidas farmaceuticamente), juntamente com formulações em uso atual, proporcionam vias preferidas de administração e formulação para os polipeptídeos de aminoácido não natural, modificados ou não modificados conforme aqui descrito.
[00643]A dose administrada a um paciente, nas composições e métodos contextuais aqui descritas, é suficiente para ter a resposta terapêutica benéfica no paciente com o tempo. A dose é determinada pela eficácia da formulação particular, e da atividade, estabilidade ou meia-vida sérica dos polipeptídeos de aminoácido não natural, modificados ou não modificados, empregados e da condição do paciente, bem como do peso corpóreo ou área superficial do paciente em tratamento. A dimensão da dose também é determinada pela existência, natureza e extensão de qualquer efeito colateral adverso que acompanha a administração de uma dada formulação, ou similar num paciente em questão.
[00644]Na determinação da quantidade eficaz da formulação para administração no tratamento ou profilaxia da doença (incluindo, sem limitação, a cânceres, doenças transmissíveis por herança, diabetes, AIDS, ou similar) o médico avalia aos níveis circulantes no plasma, toxicidades da formulação, progresso da doença e/ou onde for o caso, produção de anticorpos anti-polipeptídeo de aminoácido não natural.
[00645]A dose administrada, por exemplo, a um paciente de 70 kg, é tipicamente na faixa equivalente as dosagens de proteínas terapêuticas atualmente usadas, ajustada a atividade alterada ou meia-vida sérica da composição em questão. As formulações farmacêuticas aqui descritas podem suplementar condições de tratamento por qualquer terapia convencional conhecida, incluindo administração de anticorpo, administração de vacina, administração de agentes citotóxicos, polipeptídeos de aminoácido natural, ácidos nucléicos, análogos de nucleotídeo, modificadores da resposta biológica e que tais.
[00646]Para administração, as formulações farmacêuticas aqui descritas são administradas a uma proporção determinada pelo LD-50 ou ED-50 da formulação relevante, e/ou observação de quaisquer efeitos colaterais dos polipeptídeos de aminoácido não natural, modificados ou não modificados, em várias concentrações, incluindo, sem limitação, aplicado à saúde geral do paciente. A administração pode ser realizada por meio de dose única ou dividida.
[00647]Caso um paciente passando por infusão de uma formulação desenvolva febre, calafrios ou dores musculares, ele/ela recebe a dose apropriada de aspirina, ibuprofen, acetaminofen, a outra droga controladora de dor/febre. Os pacientes que experimentam reações à infusão, tais como febre, dores musculares, e calafrios, são pré-medicados 30 minutos antes de futuras infusões, com ou aspirina, acetaminofen, ou incluindo, sem limitação, difenidramina. Meperidina é usada para calafrios e dores musculares mais graves, que não respondem rapidamente aos antipiréticos e anti-histamínicos. A infusão celular é diminuída ou descontinuada dependendo da gravidade da reação.
[00648]Os polipeptídeos de aminoácido não natural modificados ou não modificados, conforme aqui descritos, podem ser administrados diretamente ao mamífero. A administração se dá por quaisquer vias normalmente empregadas para introduzir um polipeptídeo a um indivíduo. Os polipeptídeos de aminoácido não natural, modificados ou não modificados, conforme aqui descritos, incluem, os para administração oral, retal, tópicos, inalação (incluindo, sem limitação, via um aerossol), bucal (incluindo, sem limitação, sublingual), vaginal, via parenteral (incluindo, sem limitação, subcutânea, intramuscular, intradérmica, intra-articular, intrapleural, intraperitonial, intracerebral, intra-arterial, ou intravenosa), tópica( ou seja, tanto à pele como superfícies da mucosa, incluindo superfícies do trajeto aéreo) e administração transdérmica, embora a via mais adequada em qualquer caso dependerá da natureza e gravidade da condição em tratamento.
[00649]A administração pode ser ou local ou sistêmica. As formulações podem se apresentar em recipientes vedados para dose única ou múltipla dose, tais como ampolas e frascos. Os polipeptídeos de aminoácido não natural modificados ou não modificados, conforme aqui descritos, podem ser preparados numa mistura numa forma de dose única injetável (incluindo, sem limitação, solução, suspensão ou emulsão) com um veículo farmaceuticamente aceitável. Os polipeptídeos de aminoácido não natural, modificados ou não modificados conforme aqui descritos, também podem ser administrados r infusão contínua( usando incluindo, sem limitação, minibombas, tais como bombas osmóticas), bolo simples ou formulações de depósito para liberação lenta.
[00650]As formulações adequadas para administração incluem soluções aquosas e não-aquosas, soluções estéreis isotônicas, que podem conter antioxidantes, tampões, bacteriostatos, e solutos, que tornam a formulação isotônica, e suspensões estéreis aquosas e não aquosas que podem incluir um agente de suspensão, solubilizantes, agentes de espessamento, estabilizantes e conservantes. As soluções e suspensões podem ser preparas de pós estéreis, grânulos e comprimidos da classe descrita anteriormente.
[00651]A liofilização é uma técnica habitualmente empregada para apresentação de proteínas, que se presta à remoção de água da preparação de proteína de interesse. A secagem por congelamento, ou liofilização, é um processo pelo qual o material a ser seco é primeiramente congelado e em seguida o gelo ou solvente congelado é removido por sublimação num meio de vácuo. Um excipiente pode ser incluído nas formulações pré-liofilizadas para intensificar a estabilidade durante o processo de liofilização e/ou melhorar a estabilidade do produto liofilizado com a armazenagem. Pikal, M. Biopharm. 3(9)26-30 (1990) e Arakawa et al. Pharm. REs. 8(3):285-291 (1991).
[00652]A secagem por pulverização dos produtos farmacêuticos também é conhecida aos de prática comum na técnica. Por exemplo, ver Broadhead, J. et al., "The Spray drying of Pharmaceuticals", in Drug Dev. Ind. Pharm, 18(11 & 12), 1169-1206 (1992). Além dos farmacêuticos de pequena molécula, uma série de materiais biológicos foram secos por pulverização e estes incluem, enzimas, soros, plasma, microorganismos e leveduras. A secagem por pulverização é uma técnica útil porque ela pode converter uma preparação farmacêutica líquida num pó fino, sem poeira, ou aglomerado num processo de única etapa. A técnica básica compreende as seguintes quatro etapas: a) atomização da solução de alimentação num pulverizador; b) contato pulverização-ar; c) secagem da pulverização; e d) separação do produto seco do ar de secagem. A Patente U.S. n°s. 6.235.710 e 6.001.800, ora incorporadas por referência em sua totalidade, descrevem a preparação de eritropoietina recombinante por meio de secagem por pulverização.
[00653]As composições farmacêuticas aqui descritas podem compreendem um veículo, excipiente ou estabilizante farmaceuticamente aceitável. Veículos farmaceuticamente aceitáveis são determinados, em parte, pela composição particular em administração, bem como pelo método particular empregado para administração da concentração. Consequentemente há uma grande variedade de formulações adequadas de composições farmacêuticas (incluindo, sem limitação, veículos, excipientes ou estabilizantes farmaceuticamente aceitáveis opcionais) para os polipeptídeos de aminoácido não natural modificados ou não modificados, aqui descritos (ver, por exemplo, em Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Nineteenth Ed (Easton, Pa.: Mack Publishing Company, 1995); Hoover, John E. Remington's Pharmaceutica Sciences, Mack Publishing Co., Easton, Pennsylvania 1975; Liberman, H. A. and Lachman, L., Eds. Pharmaceutical Dosage Forms, Marcel Decker, N. Y. 1980; e Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Seventh Ed. (Lippincott Williams & Silkins, 1999)). Veículos adequados incluem tampões contendo succinato, fosfato, borato, HEPES, citrate, imidazol, acetato, bicarbonato e outros ácidos orgânicos, antioxidantes, incluindo sem limitação, a ácido ascórbico, polipeptídeos de baixo peso molecular, incluindo, sem limitação, aos com menos de cerca de 10 resíduos, proteínas, incluindo, sem limitação, albumina sérica, gelatina ou imunoglobulinas, polímeros hidrofílicos, incluindo, sem limitação, polivinilpirrolidona, aminoácidos, incluindo, sem limitação, glicina, glutamina, asparagina, arginina, histidina ou derivados de histidina, metionina, glutamano ou lisina; monossacarídeos, dissacarídeos e outros carboidratos, incluindo, sem limitação, trehalose, sacarose, glicose, manose, ou dextrinas, agente quelantes incluindo, sem limitação,, EDTA, íons metálicos divalentes incluindo, sem limitação,zinco, cobalto ou cobre; álcoois de açúcar, incluindo, sem limitação, manitol ou sorbitol, contra-íons formadores de sal incluindo, sem limitação, sódio, e/ou tensoativos não iônicos, incluindo, sem limitação, Tween™ (incluindo, sem limitação, Tween 80 (polisorbato 80) e Tween 20 (polisorbato 20), Pluronics™ e outros ácidos plurônicos, incluindo, sem limitação, outros ácidos plurônicos, incluindo, sem limitação, ácido plurônico F68 (poloxâmer 188) ou PEG. Tensoativos adequados incluem, por exemplo, incluindo, sem limitação, poliéteres com base em poli)óxido de etileno)-poli(óxido de propileno)-poli(óxido de etileno), ou seja, (PEO- PPO-PEO), ou poli)óxido de propileno )-poli(óxido de etileno)-poli(óxido de propileno) ou seja, (PPO-PEO-PPO) ou uma combinação destes. PEO-PPO-PEO, e PPO-PEO-PPO são comercialmente disponíveis sob as marcas registradas Pluronics™, R-Pluronics™, Tetronis™ e R-Tetronics™ (BASF Wyandotte corp., Wyandotte, Mich) e estão ainda descritos na Patente U.S. 4.820.352 ora incorporada por referência. Outros polímeros de bloco etileno/polipropileno podem ser tensoativos adequados. Um tensoativo ou uma combinação de tensoativos pode ser usada para estabilizar polipeptídeos de aminoácido não natural PEGuilados contra um ou mais fatores de estresse, incluindo, sem limitação, estresse resultante de agitação. Alguns dos acima podem ser referidos com "agentes de volume". Outros podem também ser referidos como "modificadores da tonicidade".
[00654]Os polipeptídeos de aminoácido não natural modificados ou não modificados como descritos no presente, incluindo aqueles ligados a polímeros hidrossolúveis tais como PEG também podem ser administrados, pelos, ou como parte dos, sistemas de liberação controlada. Composições de liberação controlada incluem sem limitação, a matrizes polimérica semipermeáveis na forma de artigos moldados, incluindo, sem limitação, filmes, ou microcápsulas, Matrizes de liberação controlada incluem, dentre materiais biocompatíveis tais como poli(2-hidroxietil metacrilato) (Langer et al, J. Biomed. Mater. Res., 15: 167- 277 (1981); Langer, Chem. Tech., 12: 98-105 (1982), acetate de vinil etileno (Langer et al, supra) ou poli- D-(-)-3- ácido hidroxibutírico (EP 133,988), polilactídeos (ácido poliláctico) (U.S. Patent No. 3,773,919; EP 58,481), poliglicolídeos (polímero de ácido glicólico), polilactídeo co-glicolídeos (copolímeros de ácido láctico e ácido glicólico) polianidridos, copolímeros de ácido L-glutâmico e gama-etil-L-glutamato (U. Sidman et al., Biopolymers, 22, 547-556 (1983), poli(orto)ésteres, polipeptídeos, ácido hialurônicos, colágeno, sulfato de condroitina, ácidos carboxílicos, ácidos graxos, fosfolipídeos, polissacarídeos, ácidos nucléicos, poliaminoácidos, aminoácidos, tais como fenilalanina, tirosina, isoleucina, polinucleotídeos, polivinil propileno, polivinilpirrolidona e silicone.
[00655]Composições de liberação controlada também incluem um composto encerrado em lipossomas. Lipossomas contendo o composto são preparados pelos métodos conhecidos de per se: DE 3,218,121; Epstein et al, Proc. Natl. Acad. ScL U.S.A., 82: 3688-3692 (1985); Hwang et al, Proc. Natl. Acad. Sd. U.S.A., 11: 4030-4034 (1980); EP 52.322; EP 36.676; EP 88.046; EP 143.949; EP 142.641; Pedido de Patente Japones . 83-118008; U.S. Pat. Nos. 4.485.045 e 4.544.545; e EP 102.324.
[00656]Polipeptídeos encerrados em lipossomas podem ser preparados pelos métodos descritos em por exemplo, DE 3,218,121; Epstein et al, Proc. Natl. Acad. Sd. U.S.A., 82: 3688-3692 (1985); Hwang et al, Proc. Natl. Acad. Sd. U.S.A., 77: 4030-4034 (1980); EP 52.322; EP 36.676; EP 88.046; EP 143.949; EP 142.641; Pedido de Patente Japonês, 83-118008; U.S. Patent Nos. 4.485.045 e 4.544.545; e EP 102.324.
[00657]A composição e tamanho dos lipossomas são bem conhecidos ou capazes de ser prontamente determinados empiricamente pelo versado na técnica. Alguns exemplos de lipossomas estão descritos, por exemplo, em Park JW, et al, Proc. Natl. Acad. Sd. USA 92:1327-1331 (1995); Lasic D and Papahadjopoulos D (eds): MEDICAL APPLICATIONS OF LIPOSOMES (1998); Drummond DC, et al, Liposomal drug delivery systems for cancer therapy, in Teicher B (ed): CANCER DRUG DISCOVERY AND DEVELOPMENT (2002); Park JW, et al, Clin. Cancer Res. 8: 1172- 1181 (2002); Nielsen UB, et al, Biochim. Biophys. Ada 1591(l-3):109-118 (2002); Mamot C, et al, Cancer Res. 63: 3154-3161 (2003).
[00658]A dose administrada a um paciente no contexto das composições, formulações e métodos aqui descritos, deverá ser suficiente para causar uma resposta benéfica no indivíduo com o tempo. Em geral, a quantidade terapeuticamente eficaz dos polipeptídeos de aminoácido não natural, modificados ou não modificados, conforme aqui descritos, administrados parenteralmente por dose fica na faixa de cerca de 0,01 μg/kg/dia a cerca de 100 μg/kg/ ou cerca de 0,05 mg/kg a cerca de 1 mg/kg do peso corpóreo do paciente, embora isto esteja sujeito ao critério terapêutico. A freqüência de dosagem também é submetida a critério terapêutico, e pode ser mais freqüente ou menos freqüente do que os produtos comercialmente disponíveis para uso em humanos. Geralmente um conjugado polímero:polipeptídeo, incluindo, à guisa de exemplo apenas, um polipeptídeo PEGuilado, conforme aqui descrito, pode ser administrado por quaisquer vias de administração descritas supra.
EXEMPLOS Exemplo 1
[00659]Este exemplo explica em detalhe a síntese de aminoácido contendo carbonila apresentado na Figura 4. O aminoácido não natural contendo carbonila foi produzido como descrito na Figura 4.
Exemplo 2
[00660]Este exemplo explica em detalhe a síntese de aminoácido contendo hidroxilamina apresentado na Figura 5a. O aminoácido não natural contendo hidroxilamina foi produzido como descrito na Figura 5a.
Exemplo 3
[00661]Este exemplo explica em detalhe a síntese de aminoácido contendo hidroxilamina apresentado na Figura 5b. O aminoácido não natural contendo hidroxilamina foi produzido como descrito na Figura 5b.
Exemplo 4
[00662]Este exemplo explica em detalhe a síntese de aminoácido contendo hidroxilamina apresentado na Figura 5c. O aminoácido não natural contendo hidroxilamina foi produzido como descrito na Figura 5c.
Exemplo 5
[00663]Este exemplo explica em detalhe a síntese de aminoácido contendo oxima apresentado na Figura 5d. O aminoácido não natural contendo oxima foi produzido como descrito na Figura 5d.
Exemplo 6
[00664]Este exemplo explica em detalhe a síntese de aminoácido contendo oxima apresentado na Figura 6a. O aminoácido não natural contendo oxima foi produzido como descrito na Figura 6a.
Exemplo 7
[00665]Este exemplo explica em detalhe a síntese de aminoácido contendo oxima apresentado na Figura 6b. O aminoácido não natural contendo oxima foi produzido como descrito na Figura 6b.
Exemplo 8
[00666]Este exemplo explica em detalhe a síntese de aminoácido contendo oxima apresentado na Figura 6c. O aminoácido não natural contendo oxima foi produzido como descrito na Figura 6c.
Exemplo 9
[00667]Este exemplo explica em detalhe a síntese de aminoácido contendo carbonila apresentado na Figura 24.
Figure img0094
[00668]A uma solução de NaOH (40 mL, 25% vol.) a 0°C adicionou-se éter (60 mL). Foi colocado um protetor de jato de ar em frente ao frasco de reação. Para a mistura resultante adicionou-se N-nitroso-N-metil uréia (6,0 g, 57,9 mmol) em 3 porções em 3 minutos. A reação foi agitada a 0°C por 10 minutos. As camadas de éter dietílico e o hidróxido de sódio foram a seguir deixadas separar. A camada orgânica foi adicionada para a solução de N-Boc-4-hidroximetil-fenilalanina (7,5 g, 25,4 mmol) em THF anidro (20 mL em porções (aproximadamente 6 adições) durante 5 minutos até o material de partida ter desaparecido completamente (monitorado por TLC). 5 gotas de ácido glacial acético foram então adicionados para resfriar a reação. Após os solventes orgânicos serem removidos por evaporação rotativa, adicionou-se acetato de etila. A camada orgânica foi lavada sucessivamente com solução de NaHCO3 saturada, H2O, e salmoura, a seguir seca sobre MgSO4, filtrada e concentrada rendendo o produto (5,9 g 75%) como um pó branco.
Figure img0095
[00669]A uma solução agitada de álcool (6,0 g, 19,4 mmol) e piridina (12 mL, 150 mmol) em cloreto de metileno (400 mL) a 0°C adicionou-se periodinano de Dess-Martin (14,2 g, 33,4 mmol) A mistura foi agitada a temperatura ambiente durante a noite. A reação foi então resfriada com NaHCO3 -Na2S2O3 aquoso saturado (1:1, 300 mL) e extraído com CH2Cl2 . A camada orgânica foi combinada e lavada com água e salmoura em seguida seca sobre Na2SO4, filtrada e concentrada in vacuo. A purificação do resíduo por cromatografia flash (sílica 1:100 - hexano: EtOAc) rendeu o produto aldeído (5,48 g, 92%) como um sólido branco.
Figure img0096
[00670]A uma solução de aldeído (3,07 g, 10 mmol) em EtOH (40 mL) adicionou-se hidrazida acética (1,7 g, 20 mmol). A mistura de reação foi agitada a temperatura ambiente por 30 minutos e concentrou-se. Ao resíduo adicionou-se água (200 mL) seguido por CH2Cl2. A camada orgânica foi separada e concentrada in vacuo. A purificação do resíduo por cromatografia flash (sílica, 3:7 - hexano:EtOAc 1:9) rendeu o produto (3,29 g, 90%) como um sólido branco.
Figure img0097
[00671]A uma solução do éster metílico supra (3,29 g, 9,1 mmol) em dioxano (10 mL) a 0°C adicionou-se LiOH (10 mL, 1N). A mistura foi agitada na mesma temperatura por 1 horas e a seguir arrefecida por adição de ácido cítrico (5 g) e diluída com água. A mistura foi extraída com EtOAc. A camada orgânica foi lavada várias vezes com água e salmoura, e a seguir seca sobre Na2SO4 anidro, filtrada e concentrada rendendo um sólido branco (3,05 g, 96%).
Figure img0098
[00672]A uma solução do ácido supra (3,02 g, 8,6 mmol) em CH2Cl2 (20 mL) a 0°C adicionou-se ácido trifluoracético. A mistura de reação foi agitada a 0°C por 2 horas sendo concentrada. Ao resíduo adicionou-se MeOH (1ML) seguido por adição de HCl (2,0 mL, 4N em dioxano). Adicionou-se então éter (200 mL) para precipitar o produto (2,07 g, 83%) como um sólido amarelo.
Exemplo 10
[00673]Este exemplo explica a síntese de amina contendo dicarbonila apresentado na Figura 25.
Figure img0099
[00674]A uma solução agitada de amina (10 g, 34 mmol) em DMF (70 mL) a 0°C adicionou-se piruvato ácido (5 mL, 72 mmol), cloridrato de 1-(3- dimetilaminopropil)-3-etilcarbodiimida (EDC, 20 g, 104 mmol), 1-hidroxibenzotriazol hidratado (HOBt, 85 g, 71 mmol) e N,N-diisopropiletilamina (DIEA, 35 mL, 200 mmol). A mistura foi agitada a temperatura ambiente por 6 horas sendo resfriada com solução de ácido cítrico aquoso (5%, 500 mL) extraindo-se com EtOAc (500 mL). A camada orgânica foi lavada sucessivamente com água e salmoura, então seca sobre Na2SO4 anidro filtrada e concentrada in vacuo. O resíduo foi purificado por cromatografia flash (sílica, 3:1 - hexano:EtOAc 1:1) rendendo o produto como um sólido (4,78 g, 40%).
Figure img0100
[00675]A uma solução do éster metílico supra (2, 96 g, 8,1 mmol) em dioxano (10 mL) a 0°C adicionou-se LiOH (10 mL, 1N). A mistura foi agitada na mesma temperatura por 3 horas. A reação foi então resfriada com solução de ácido cítrico aquoso (5%) e diluída com EtOAc. A camada orgânica foi separada e lavada continuamente com água e salmoura, a seguir seca sobre Na2SO4 anidro, filtrada e concentrada rendendo o produto como um sólido amarelo (2,87 g, 100%).
Figure img0101
[00676]A uma solução do ácido supra (2,05 g, 5,9 mmol) em CH2Cl2 (10 mL) a 0°C adicionou-se ácido trifluoracético (10 mL). A mistura foi agitada por 2 horas e concentrada in vacuo. Ao resíduo adicionou-se HCl (1 mL, 4N em dioxano) seguido por éter (400 mL). O precipitado foi coletado como um sólido branco (1,38 g, 82%).
Exemplo 11
[00677]Este exemplo explica a síntese de aminoácido contendo dicarbonila apresentado na Figura 26.
Figure img0102
[00678]A uma solução de 4'-metilpropiofenona (20 g, 122 mmol) e N- bromossuccinimida (NBS, 23 g, 130 mmol) em benzeno (300 mL) a 90°C adicionou- se 2,2'-azobis-isobutironitrila (AIBN 0,6 g, 3,6 mmol). A solução resultante foi aquecida ao refluxo durante a noite. A reação foi então resfriada para temperatura ambiente. A solução castanha foi lavada continuamente com água e salmoura, então seca em Na2SO4 anidro, filtrada e concentrada in vacuo. O resíduo foi cristalizado de hexanos rendendo o produto como um sólido amarelo claro (27 g, 87%).
Figure img0103
[00679]A uma solução de EtONa (14,5 g, 203 mmol) em EtOH (400 mL) a 0°C adicionou-se acetamidomalonato de dietila (39 g, 180 mmol) seguido por solução do brometo supra (27 g, 119 mmol) em EtOH (100 mL). A mistura resultante foi aquecida ao refluxo por 1 hora e arrefecida com ácido cítrico (30 g) sendo diluída com água (300 ml). Após a maior parte do solvente ser removida in vacuo, o resíduo foi extraído com EtOAc. A camada orgânica foi lavadas continuamente com água e salmoura, sendo seca sobre Na2SO4 anidro, filtrada e concentrada in vacuo. O resíduo foi purificado por cromatografia flash ( sílica, 10:1 - hexano:EtOAc 3:1) rendendo o produto (37 g, 88%) como um sólido amarelo.
Figure img0104
[00680]A uma solução de cetona (5 g 13,8 mmol) em éter (100 mL) a 0°C adicionou-se Br2 (0,8 mL, 15,6 mmol). A mistura foi agitada a temperatura ambiente por 3 horas e arrefecida com NaHCO3 aquoso saturado. A mistura foi extraída com Et2O. A camada orgânica foi lavada continuamente com água e salmoura sendo seca sobre Na2SO4 anidro, filtrada e concentrada in vacuo rendendo o produto como um sólido amarelo (5,4 g 88%) que foi diretamente usado na próxima etapa sem ulterior purificação.
Figure img0105
[00681]Para a solução de a-bromocetona (5,4 g, 12,2 mmol) e Na2CO3 (2,0 g, 18,9 mmoL) em DMSO (20 mL) adicionou-se KI (2,1 g, 13,2 mmol). A mistura foi agitada a 90°C sob uma atmosfera de nitrogênio por 28 horas. A reação foi então resfriada com água e diluída com EtOAc. A camada orgânica foi separada e lavada continuamente com água e salmoura sendo seca sobre Na2SO4 anidro, filtrada e concentrada in vacuo. O resíduo foi purificado por cromatografia flash (sílica, 6:1 - hexano:EtOAc 1:10 rendendo o produto como um sólido (1,12 g, 24%).
Figure img0106
[00682]A solução de dicetona (1,12 g, 3,0 mmol) em HCl conc. (10 mL) e dioxano (10 mL) foi aquecida ao refluxo durante a note. Após o solvente ser removido in vacuo, MeOH (3 mL) foi adicionado para dissolver o resíduo. Adicionou- se então éter (300 ml) para precipitar o produto (302 mg, 42%) como um sólido amarelo claro.
Exemplo 12
[00683]Este exemplo explica a síntese de aminoácido contendo dicarbonila apresentado na Figura 27.
Figure img0107
[00684]A uma solução de C3H7MgCl (2 M, 50 mmol) em éter (25 mL) a 0°C adicionou-se benzaldeído (5 mL, 42,5 mmol) em éter (50 mL). A solução resultante foi agitada 0°C por 30 minutos. A reação foi então arrefecida com NH4Cl saturado e diluído com éter. A camada orgânica foi separada e lavada continuamente com água e salmoura em seguida seca sobre Na2SO4 anidro filtrada e conc. In vacuo rendendo o produto bruto (7,2 g ) que foi empregado diretamente na próxima reação sem purificação.
Figure img0108
[00685]A uma solução do álcool supra (7,2 mg 43,9 mmol) e piridina (7 mL, 86,7 mmoL) em CH2CI2 (300 mL) a 0°C adicionou-se periodinano de Dess-Martin (19,2 g 45,3 mmol). A mistura resultante foi agitada durante a noite e arrefecida com Na2S2O3 aquoso saturado e NaHCO3 saturado (1:1) A camada orgânica foi lavada continuamente com água e salmoura e seca sobre Na2SO4 anidro, filtrada e concentrada in vacuo. O resíduo foi purificado por cromatografia flash (sílica, 8:1 - hexano:EtOAc 4:1) rendendo o produto como um óleo incolor (6,28 g, 91% em duas etapas).
Figure img0109
[00686]A uma solução da cetona supra (4,43 g, 27,3 mmol) e N- bromossuccinimida (NBS, 5,5 g, 30,9 mmol) em benzeno (150 mL) adicionou-se 2,2'- azobis-isobutironitrila (AIBN, 0,2 g, 1,2 mmoL) a 90°C. A solução resultante foi aquecida ao refluxo durante a noite e a seguir resfriada para temperatura ambiente. A solução castanha foi lavada continuamente com água e salmoura sendo seca sobre Na2SO4 anidro, filtrada e concentrada in vacuo. O resíduo foi cristalizado de hexanos rendendo o produto como um sólido branco (6,21 g, 95%).
Figure img0110
[00687]Para uma solução de EtONa (2,5 g, 34,9 mmol) em EtOH( 200 mL) a 0°C adicionou-se acetamidomalonato de dietila (6,7 g, 30,9 mmol) seguido por uma solução do brometo supra (6,2 g 25,8 mmol) em EtOH (100 mL). A mistura resultante foi aquecida ao refluxo por 1 hora e em seguida resfriada com ácido cítrico (9 g) e diluída com água. Após a maioria do solvente ser removida, o resíduo foi extraído com EtOAc. A camada orgânica foi lavada continuamente com água e salmoura sendo seca sobre Na2SO4 anidro, filtrada, e concentrada in vacuo. O resíduo foi purificado por cromatografia flash (sílica, 4:1 - 2:1 hexano:EtOAc ) rendendo o produto como um sólido amarelo claro (8,92 g 92%).
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[00688]A uma solução da cetona supra (1,4 f, 3,71 mmol ) em HOAc (50 mL) adicionou-se Br2 (0,7 mL, 13,6 mmol). A mistura foi agitada a temperatura ambiente durante a noite sendo resfriada com NaHCO3 aquoso saturado. A mistura foi extraída com Et2O. A camada orgânica foi lavada continuamente com água e salmoura sendo seca sobre Na2SO4 anidro filtrada e concentrada in vacuo. O resíduo foi purificado por cromatografia flash (sílica, 5:1 - 3:1 hexano:EtOAc) rendendo o produto como um sólido amarelo (1,23 g, 73%).
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[00689]A uma solução de a-bromo-cetona (1,12 g 2,46 mmol) e Na2CO3 (0,4 g, 3,77 mmol) em DMSO (30 mL) adicionou-se KI (0,45 g, 13, 2mmol) A mistura foi agitada a 90°C durante a noite sendo resfriada com ácido cítrico (2 g) e água (200 mL). A mistura foi extraída com EtOAc. A camada orgânica foi lavada continuamente com água e salmoura sendo seca sobre Na2SO4 anidro, filtrada e concentrada in vacuo. O resíduo foi purificado por cromatografia flash (sílica 6:1 - 1:10 hexano:EtOAc) rendendo a-hidroxil cetona como um óleo (0,62 g, 64%.
[00690]A uma solução do álcool supra (0,62 g, 1,58 mol) e piridina (0,5 mL, 6,19 mmol) em CH2Cl2 (100 mL) a 0°C adicionou-se periodinano de Dess-Martin (0,9 g 2,12 mmol). A mistura resultante foi agitada durante a noite e arrefecida com Na2S2O3 aquoso saturado e NaHCO3 aq. saturado (1:1). A camada orgânica foi lavada continuamente com água e salmoura sendo seca sobre Na2SO4 anidro, filtrada e concentrada in vacuo. O resíduo foi purificado por cromatografia flash (sílica 9:1 - hexano:EtOAc 3:2) rendendo o produto como um óleo amarelo (287 mg 30% em duas etapas.
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[00691]A mistura da dicetona supra (272 mg, 0,7 mmol) em HCl conc. (10 mL) e dioxano (10 mL) foi aquecida ao refluxo durante a noite. Após remoção do solvente in vacuo, MeOH (1 mL) foi adicionado para dissolver o resíduo. Adicionou- se então éter (200 mL) para precipitar o produto com um sólido amarelo (162 mg, 81%).
Exemplo 13
[00692]Este exemplo explica a síntese do aminoácido contendo dicarbonila apresentado na Figura 28. Os compostos foram sintetizados como apresentado na Figura 28.
Exemplo 14
[00693]Este exemplo explica a clonagem e expressão de um polipeptídeo modificado em E. coli. Um sistema de tradução introduzido compreendendo um tRNA ortogonal (O-RNA) e um aminoacil tRNA sintetase ortogonal (O-RS) é usado para expressar o polipeptídeo contendo um aminoácido não natural. O O-RS preferivelmente, aminoacila o O-tRNA com um aminoácido não natural. Por sua vez o sistema de tradução insere o aminoácido não natural ao polipeptídeo, em resposta a um códon de seleção codificado. As sequências de polinucleotídeo e aminoácido de O-tRnA e O-RS úteis para incorporação dos aminoácidos não naturais são descritas no pedido de Patente U.S. n° de série 10/126.927 intitulado "In Vivo Incorporation of Unnatural Amino Acids" e pedido de Patente U.S. n° de série 10/126.931 intitulado "Methods and Compositions for the Production of Orthogonal tRNA-Aminoacyl tRNA Synthetase Pairs", que estão ora incorporados por referência ao presente. As sequências O-RS e OtRNA a seguir também podem ser usadas:
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[00694]A transformação de E. coli com plasmídeos contendo o gene modificado e o par aminoacil RNA sintetase/tRNA ortogonal (específico para o aminoácido não natural desejado) permite a incorporação específica ao sítio do polipeptídeo de aminoácido não natural. E. coli transformada, cresce a 37°C em meio contendo entre 0,01 - 100 mM do aminoácido não natural particular, expressa polipeptídeo modificado com alta fidelidade e eficiência. O polipeptídeo His- identificado contendo um aminoácido não natural é produzido pelas células hospedeiras de E. coli como corpos de inclusão ou agregados. Os agregados são solubilizados e purificados por afinidade sob condições de desnaturação em guanidina HCl 6M. A redobragem é realizada por diálise a 4°C durante a noite em 50 mM de TRIS-HCl, pH 8,0, 40μM CuSO4, e 2% (peso/volume0 Sarkosila. O material é a seguir dialisado contra 20 mM de Tris -HCl, pH 8,0, 100 mM NaCl, 2 mM CaCl2 seguido por remoção do identificador-His. Ver Boissel et al., J. Biol. Chem. (1993) 268:15983-3. Métodos para purificação dos polipeptídeos são do conhecimento da técnica e são confirmados por SDS-PAGE, análises de Western Blot, ou espectrometria de massa de aprisionamento iônico com eletropulverização- ionização e similares.
Exemplo 15 - Teste dos Aminoácidos não naturais
[00695]Este exemplo proporciona resultados de quatro testes que foram realizados em alguns aminoácidos não naturais ilustrativos como uma ajuda na previsão de suas propriedades para incorporação aos polipeptídeos de aminoácido não natural.
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Exemplo 16 - Teste de Aminoácidos não naturais
[00696]Este exemplo proporciona os resultados dos testes de estabilidade de pH que foram realizados em alguns aminoácidos não naturais ilustrativos como uma ajuda na previsão de suas propriedades para incorporação aos polipeptídeos de aminoácido não natural.
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Exemplo 17
[00697]Este exemplo explica a síntese do aminoácido contendo dicarbonila apresentado na Figura 29
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[00698]A uma solução de aminoácido pAF (10 g, 41,1 mmol) em H2O- dioxano (300 mL, 1:1) adicionou-se NaHCO3 (12 g, 142,9 mmol) e Boc2O (12 g, 55,0 mmol). A mistura foi agitada a temperatura ambiente por 7 horas sendo resfriada com ácido cítrico. A mistura foi extraída com EtOAc. A camada orgânica foi lavada continuamente com água e salmoura sendo seca sobre Na2SO4 anidro, filtrada e concentrada rendendo o N-Boc-pAF como um sólido branco (13,7 g, quantitativo).
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[00699]A NaOH (40 mL, 25% vol) a 0°C adicionou-se éter (60 mL). Um anteparo de rajada de ar é colocado em frente ao frasco de reação. Para a mistura resultante adicionou-se N-nitroso-N-metil uréia (6,0 g, 57,9 mmol) em 3 porções durante 3 minutos. A reação foi agitada a 0°C por 10 minutos. As camadas de éter dietílico e hidróxido de sódio foram então deixadas separarem-se. A camada orgânica foi adicionada para a solução de N-Boc-pAF (5,0 g, 16,2 mmol) em THF anidro (20 mL) em porções (aproximadamente 6 adições ) durante 5 minutos até o material de partida ter desaparecido de vez (monitorado por TLC. 5 gotas de ácido glacial acético foram adicionados para resfriar a reação. Após os solventes orgânicos serem removidos por evaporação rotativa, adicionou-se acetato de etila. A camada orgânica foi lavada continuamente com solução saturada de NaHCO3, água e salmoura sendo seca sobre Na2SO4 anidro, filtrada e concentrada para produzir um pó branco (4,1 g 80%).
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[00700]A t-BuOK (60 mL, 1,0 M em THF) adicionou-se lentamente a solução de pAF protegida (3,82 g, 11,9 mmol) em propionato de metila recém destilado (20 mL, 208 mmol). A mistura resultante foi agitada a temperatura ambiente por 30 minutos e arrefecida com solução de ácido cítrico (10%, 300 mL). A mistura foi extraída com EtOAc . A camada orgânica foi lavada continuamente com água e salmoura sendo seca sobre Na2SO4 anidro, filtrada e concentrada in vacuo. O resíduo foi purificado por cromatografia flash (sílica 4:1 - hexano:EtOAc 1:1) rendendo o oduto como um sólido branco (3,89 g, 87%).
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[00701]A uma solução do éster metílico supra (1,12 g, 2,97 mmol) em dioxano (4 mL) a 0°C adicionou-se LiOH (4 mL, 1 N). A mistura foi agitada a 0°C por 3 horas e arrefecida com solução de ácido cítrico aquoso (5%, 200 mL) e diluída com EtOAc. A camada orgânica foi lavada continuamente com água e salmoura sendo seca sobre Na2SO4 anidro, filtrada e concentrada rendendo um sólido branco (1,02 g, 94%).
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[00702]A uma solução do ácido supra (1,0 g, 2,75 mmol) em CH2Cl2 (10 mL) a 0°C adicionou-se ácido trifluoracético (10 mL). A mistura foi agitada a 0°C por 2 horas sendo concentrada a seguir. Ao resíduo adicionou-se MeOH (1 mL) seguido por HCl (1,5 mL, 4 N em dioxano) Adicionou-se então éter (200 mL) para precipitar o produto (701 mg, 96% ) como um sólido branco.
Exemplo 18
[00703]Este exemplo explica a síntese do aminoácido contendo dicarbonila apresentado na Figura 30
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[00704]A t-BuOK (15 mL, 1,0 M em THF) adicionou-se lentamente a solução do pAF protegido (1,09 g, 3,4 mmol) em difluoracetato de metila (6 mL, 68,7 mmol). A mistura resultante foi agitada a temperatura ambiente por 30 minutos e resfriada com ácido cítrico (5 g, 25,4 mmol) e diluída com água. A mistura foi extraída com EtOAc. A camada orgânica foi lavada continuamente com água e salmoura sendo seca sobre Na2SO4 anidro, filtrada e concentrada O resíduo foi purificado por cromatografia flash (sílica, 20:1 - hexano:EtOAc 3:2) dando o produto como um sólido castanho claro (1,27 g, 94%).
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[00705]A uma solução do éter metílico supra (1,26 g, 3,17 mmol) em dioxano (30 mL) a 0°C adicionou-se LiOH (30 mL, 1N) A mistura foi agitada a 0°C por 0,5 h e arrefecida com ácido cítrico (10 g, 51 mmol) diluindo-se com água. A mistura foi extraída com EtOAc. A camada orgânica foi lavada continuamente com água e salmoura sendo seca sobre Na2SO4 anidro, filtrada e concentrada. O resíduo foi purificado por cromatografia flash (sílica 100:1 - CH2Cl2:MeOH 10:1, HOAc 0,5%) rendendo um óleo castanho (1,19 g, 98%).
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[00706]A uma solução do ácido supra (1,19 g, 3,1 mmol) em CH2Cl2 (15 mL) a 0°C adicionou-se ácido trifluoracético (15 mL). A mistura foi agitada por 0,5 h e concentrada. Ao resíduo adicionou-se MeOH (2 mL), seguido por HCl (2 mL, 4 N em dioxano). Adicionou-se então éter (200 mL) ao produto precipitado (0,82 mg, 82% como um sólido branco.
Exemplo 19
[00707]Este exemplo explica a síntese do reagente de PEG hidroxilamina apresentado na Figura 12a.
Exemplo 20
[00708]Este exemplo explica a síntese de reagente de PEG hidroxilamina apresentado na Figura 12b. O reagente de PEG hidroxilamina foi produzido como descrito na Figura 12b.
Exemplo 21
[00709]Este exemplo explica a síntese de reagente de PEG hidroxilamina apresentado na Figura 12c. O reagente de PEG hidroxilamina foi produzido como descrito na Figura 12c.
Exemplo 22
[00710]Este exemplo explica a síntese de reagente de PEG hidroxilamina apresentado na Figura 12d. O reagente de PEG hidroxilamina foi produzido como descrito na Figura 12d.
Exemplo 23
[00711]Este exemplo explica a síntese de reagente de PEG hidroxilamina apresentado na Figura 13. O reagente de PEG hidroxilamina foi produzido como descrito na Figura 13.
Exemplo 24
[00712]Este exemplo explica a síntese de reagente de PEG hidroxilamina apresentado na Figura 14. O reagente de PEG hidroxilamina foi produzido como descrito na Figura 14.
Exemplo 25
[00713]Este exemplo explica a síntese de reagente de PEG hidroxilamina apresentado na Figura 15. O reagente de PEG contendo hidroxilamina foi produzido como descrito na Figura 15.
Exemplo 26
[00714]Este exemplo explica a síntese de reagente de PEG contendo hidroxilamina apresentado na Figura 16a. O reagente de PEG contendo hidroxilamina foi produzido como descrito na Figura 16a.
Exemplo 27
[00715]Este exemplo explica a síntese de reagente de PEG contendo hidroxilamina apresentado na Figura 16b. O reagente de PEG contendo hidroxilamina foi produzido como descrito na Figura 16b.
Exemplo 28
[00716]Este exemplo explica a síntese de reagente de PEG contendo hidroxilamina apresentado na Figura 18. O reagente de PEG contendo hidroxilamina foi produzido como descrito na Figura 18.
Exemplo 29
[00717]Este exemplo explica a síntese de 1,2-bis(4- (bromometil)fenil)dissulfano apresentado na Figura 36. A um frasco de fundo redondo seco ao forno com barra de agitação sob pressão de gás nitrogênio adicionou-se dissulfeto de para-tolila (5,0 g, 20,3 mmol), N-bromo succinimida (8,6 g, 48,4 mmol) e 60 mL de benzeno anidro. A solução foi aquecida a 95°C. Adicionou- se de uma vez azobis-isobutilnitrila (0,106 g, 0,64 mmol). A reação foi refluxada por 16 horas. Removeu-se o solvente por evaporação rotativa e o sólido castanho foi dissolvido em 100 mL de acetato de etila. A mistura de reação foi lavada continuamente com solução de bicarbonato de soído aquoso saturado (2 X 50 mL), água desionizada (1 x 50 mL) e salmoura (1 x 50 mL). A camada orgânica foi separada e seca sobre MgSO4 anidro, filtrada e concentrada sob pressão reduzida. O produto bruto foi purificado por cromatografia de sílica usando um sistema de cromatografia HORIZON™ de Biotage Inc. rendendo, após concentração das frações apropriadas e remoção de traços de solvente (bomba de vacuo) 1,2-bis(4- bromometil)fenil)dissulfano (2,1 g, 25%) como um sólido branco. Foram obtidos os dados de espectro de RMN H1 e um espectro de massa. A reação foi repetida rendendo 2,0 g 23%) do produto.
Exemplo 30
[00718]Este exemplo explica a síntese de 1,2-bis(4-dietil-2- acetamidomalonato)fenil)dissulfano (2) apresentado na Figura 36. A um frasco de fundo redondo seco ao forno com barra de agitação sob pressão de gás nitrogênio adicionou-se acetamido malonato de dietila (6,48 g, 30 mmol), e 50 mL de EtOH anidro. À solução adicionou-se etóxido de sódio (6,48 g, 30 mmol) de uma vez. A reação resfriada para 0°C. 1,2-bis(4-bromometil)fenil)dissulfano (4,1 g, 10,1 mmol) foi dissolvido em 20 mL de EtOh/THF e adicionada via funil de adição para a solução fria durante 1 hora. Removeu-se o banho de gelo e a reação foi deixada agitar temperatura ambiente por 6 horas. O solvente foi removido por evaporação rotativa e o sólido vermelho dissolvido em 100 mL de acetato de etila. A mistura de reação foi lavada continuamente com ácido cítrico a 5% (2 X 50 mL), água desionizada (1 X 50 mL) e salmoura (1 X 50 ml). A camada orgânica foi separada e seca sobre MgSO4 anidro, filtrada e concentrada sob pressão reduzida. O produto bruto foi purificado por cromatografia de sílica usando um sistema de cromatografia HORIZON™ de Biotage Inc. rendendo, após concentração das frações apropriadas e remoção de traços de solvente (bomba de vacuo) 1,2-bis(4-dietil-2- acetamidomalonato)fenildissulfano (5,0 g, 73%) como um sólido amarelo. Foram obtidos os dados de espectro de RMN H1 traço de HPLC e um espectro de massa.
Exemplo 31
[00719]Este exemplo explica a síntese de fenildissulfano de ácido 1,2- bis(4-(2-amino-3-propanóico (3) apresentado na Figura 36. A um frasco de fundo redondo seco ao forno com barra de agitação sob pressão de as nitrogênio, adicionou-se 1,2-bis(4-dietil-2-acetamidomalonato)fenildissulfano (1,0 g, 1,4 mmol) HCl (8 mL, 12 M) e 8 mL de 1,4-dioxano. A reação foi agitada ao refluxo por 16 horas. Removeu-se o solvente por evaporação rotativa e bomba de vacuo rendendo fenildissulfano de ácido 1,2-bis(4-(2-amino-3-propanóico (0,75 g, 135%) como um óleo límpido. Foram obtidos os dados espectrais de RMN H1 e um espectro de massa.
Exemplo 32
[00720]Este exemplo explica a síntese de fenildissulfano de ácido N,N'- diBoc-1,2-bis(4-(2-amino-3-propanóico) (4) apresentado na Figura 36. A fenildissulfano do ácido 1,2-bis(4-(2-amino-3-propanóico (0,75 g, 1,9 mmol) em um frasco de fundo redondo seco adicionou-se 5 mL de 1,4-dioxano, 5 mL de água desionizada, dicarbonato de di-terc-butila (0,65, g, 3,0 mmol) e bicarbonato de sódio (0,98 g, 12 mmol). A reação of agitada a temperatura ambiente por 16 horas. O solvente foi removido por evaporação rotativa e o óleo límpido dissolvido em 100 mL de acetato de etila. A mistura de reação foi lavada continuamente com solução de ácido cítrico 5% (5 mL X 2), água desionizada (50 mL) e salmoura (50 mL). A camada orgânica foi separada e seca sobre sulfato de magnésio anidro, filtrada e concentrada sob pressão reduzida. O produto bruto foi purificado por cromatografia de sílica usando um sistema de cromatografia HORIZON™ DA Biotage Inc. rendendo, após concentração das frações desejadas e remoção de traços do solvente (bomba de vacuo ), fenildissulfano de ácido N,N"-diBoc-1,2-bis(4-(2-amino- 3-propanóico (0,5 g, 44% do produto bruto, 52% em 2 etapas) como um sólido branco. Obteve-se dados espectrais de RMN H1, traços por HPLC e um espectro de massa.
Exemplo 33
[00721]Este exemplo explica a síntese de ácido N-Boc-2-amino-3-(4- mercaptofenil)propanóico) (5) apresentado na Figura 36. A um frasco de fundo redondo seco ao forno, dotado de barra de agitação sob pressão de gás nitrogênio, adicionou-se fenildissulfato de ácido N,N'-diBoc-1,2-bis(4-(2-amino-3-propanóico) (0,5 g, 0,84 mmol), n-butil fosfino (0,6 mL, 2,44 mmol) e 15 mL de THF anidro. A reação foi agitada a temperatura ambiente por 2 horas. O solvente foi removido por evaporação rotativa e o óleo límpido dissolvido em 50 mL de acetato de etila. A mistura de reação foi lavada continuamente com solução de ácido cítrico 5% (2 X 25 mL), água desionizada (25 mL) e salmoura (25 mL). A camada orgânica foi separada e seca sobre sulfato de magnésio anidro, filtrada e concentrada sob pressão reduzida. O produto bruto foi purificado por cromatografia de sílica usando um sistema de cromatografia HORIZON™ DA Biotage Inc. rendendo, após concentração das frações desejadas e remoção de traços do solvente (bomba de vacuo ), ácido N-Boc-2-amino-3-(4-mercaptofenil)propanóico (0,5 g, 100% como um sólido branco. Obteve-se dados espectrais de RMN H1, traços por HPLC e um espectro de massa.
Exemplo 34
[00722]Este exemplo explica a síntese de cloridrato do ácido 2-amino-3-(4- mercaptofenil)propanóico) (6) apresentado na Figura 36. A um frasco de fundo redondo seco ao forno, dotado de barra de agitação, adicionou-se ácido N-Boc-2- amino-3-(4-mercaptofenil)propanóico) (0,5 g, 1,6 mmol), 10 ml de diclorometano anidro e 3 mL de ácido trifluoracético. A reação foi agitada a temperatura ambiente por 2 horas. O solvente foi removido por evaporação rotativa adicionando-se 1 mL 4,0 M de cloreto de hidrogênio em 1,4-dioxano. O frasco de fundo redondo foi rapidamente revoluteado, a seguir adicionou-se 100 mL de éter dietílico anidro para precipitar cloridrato de ácido 2-amino-3-(4-mercaptofenil)propanóico (0,39g 100%), como um sólido branco. Obteve-se dados espectrais de RMN H1, traços por HPLC e um espectro de massa.
Exemplo 35
[00723]Este exemplo explica a síntese de 2-(4-(2-oxopropiltio)benzil)-2- acetamidomalonato de dietila (7) apresentado na Figura 37. A um frasco de fundo redondo seco ao forno, dotado de barra de agitação, adicionou-se (2) (1,1 g 1,6 mmol), n-Bu3P (1,2 mL, 4,8 mmol) e 25 mL de THF anidro (25 mL). A reação foi agitada a temperatura ambiente por 2 horas. Adicionou-se à reação cloroacetona (0,16 mL, 2,0 mmoL e NaHCO3 (0,98 g, 12 mmol). A reação foi agitada a temperatura ambiente por 2 horas. O solvente foi removido por evaporação rotativa e o sólido branco dissolvido em 100 mL de acetato de etila. A mistura de reação foi lavada continuamente com solução aquosa de bicarbonato de sódio (50 mL X 2), água desionizada) (50 mL) e salmoura (50 mL. A camada orgânica foi separada e seca sobre sulfato de magnésio anidro, filtrada e concentrada sob pressão reduzida. O produto bruto foi purificado por cromatografia de sílica usando um sistema de cromatografia HORIZON™ da Biotage Inc. rendendo, após concentração das frações adequadas e remoção de traços do solvente (bomba de vacuo) 2-(4-(2- oxopropiltio)benzil)-2-acetaminomalonato de dietila (0,62 g 98%) como um sólido branco. Obteve-se dados espectrais de RMN H1, traços por HPLC e um espectro de massa.
Exemplo 36
[00724]Este exemplo explica a síntese de ácido 3-(4-(2-oxopropiltio)fenil)- 2-aminopropanóico (8) apresentado na Figura 37. A um frasco de fundo redondo seco ao forno, dotado de barra de agitação, sob pressão de gás nitrogênio, adicionou-se (7) (0,62 g 1,5 mmol), 10 mL de 1,4-dioxano e 10 mL de HCl 12M. A reação of levada ao refluxo e deixada agitar durante a noite. O solvente foi removido por evaporação rotativa rendendo ácido 3-(4-(2-oxopropiltio) fenil)-2- aminopropanóico (0,40 g, 99% bruto).
Exemplo 37
[00725]Este exemplo explica a síntese de N-BOC 3-(4-(2- oxopropiltio)fenil)-2-aminopropanóico (9) apresentado na Figura 37. A (8) (0,35 g, 1,3 mmol) num frasco de fundo redondo seco ao forno, dotado de barra de agitação sob pressão de gás nitrogênio, adicionou-se dicarbonato de di-terc-butila (0,63g, 3,0 mmol) bicarbonato de sódio (0,98 g, 12 mmol), 8 mL, 1,4-dioxano e 8 mL de água desionizada. A reação foi agitada a temperatura ambiente por 16 horas. O solvente foi removido por evaporação rotativa e o óleo límpido dissolvido em 100 mL de acetato de etila. A mistura de reação foi lavada continuamente com solução der ácido cítrico a 5% (50 mL X 2), água desionizada) (50 mL) e salmoura (50 mL. A camada orgânica foi separada e seca sobre sulfato de magnésio anidro, filtrada e concentrada sob pressão reduzida. O Produto bruto foi purificado por cromatografia de sílica usando um sistema de cromatografia HORIZON™ da Biotage Inc. rendendo, após concentração das frações adequadas e remoção de traços do solvente (bomba de vacuo) ácido N-BOC-3-(4-(2-oxopropiltio)fenil)-2- aminopropanóico (0,30 g 66% do produto bruto) como um sólido branco. Obteve-se dados espectrais de RMN H1, traços por HPLC e um espectro de massa.
Exemplo 38
[00726]Este exemplo explica a síntese de N-BOC 3-(4-(2- oxopropilsulfinil)fenil)-2-aminopropanóico (10) apresentado na Figura 37. A um frasco de fundo redondo seco ao forno, dotado de barra de agitação sob pressão de gás nitrogênio, adicionou-se (9) (150 mg, 0,4 mmol), 8mL de ácido glacial acético e 2 mL de peróxido de hidrogênio a 30% v/v em água. A reação foi agitada a temperatura ambiente por 2 horas. O solvente foi removido por evaporação rotativa e o óleo límpido dissolvido em 50 mL de acetato de etila. A mistura de reação foi lavada continuamente com solução der ácido cítrico a 5% (25 mL X 2), água desionizada) (25 mL) e salmoura (25 mL. A camada orgânica foi separada e seca sobre sulfato de magnésio anidro, filtrada e concentrada sob pressão reduzida. O produto bruto foi purificado por cromatografia de sílica usando um sistema de cromatografia HORIZON™ da Biotage Inc. rendendo, após concentração das frações adequadas e remoção de traços do solvente (bomba de vacuo) ácido N- BOC-3-(4-(2-oxopropilsulfinil)fenil)-2-aminopropanóico (0,13 g 86% do produto bruto). Foram obtidos traços por HPLC e um espectro de massa.
Exemplo 39
[00727]Este exemplo explica a síntese de 3-(4-(2-oxopropilsulfinil)fenil)-2- aminopropanóico (11) apresentado na Figura 37. A um frasco de fundo redondo seco ao forno, dotado de barra de agitação, sob pressão de gás nitrogênio, adicionou-se ácido N-Boc-3-(4-(2-oxopropilsulfinil)fenil)-2-aminopropanóico (10) (0,13 g, 0,35 mmol), 10 mL de diclorometano anidro e 3 mL de ácido trifluoracético. A reação foi agitada a temperatura ambiente por 2 horas. O solvente foi removido por evaporação rotativa e adicionou-se 1 mL de cloreto de hidrogênio 4,0 M em 1,4- dioxano. O frasco de fundo redondo foi rapidamente revoluteado e a seguir adicionou-se 100 mL de éter dietílico anidro a fim de precipitar o ácido 3-(4-(2- oxopropilsulfinil)fenil)-2-aminopropanóico (0,072 g 74% do produto bruto) como um sólido branco. Obteve-se dados espectrais de RMN H1, traços por HPLC e um espectro de massa.
Exemplo 40
[00728]Este exemplo explica a síntese de N-BOC-3-(4-(2- oxopropilsulfonil)fenil)-2-aminopropanóico (12) apresentado na Figura 37. A um frasco de fundo redondo seco ao forno, dotado de barra de agitação, sob pressão de gás nitrogênio, adicionou-se (9) (150 mg, 0,4 mmol), 8 mL de ácido glacial acético e 2 mL de peróxido de hidrogênio 30% v/v em água. A reação foi agitada a temperatura ambiente por 24 horas. O solvente foi removido por evaporação rotativa sendo o óleo límpido dissolvido em 50 mL de acetato de etila. A mistura de reação foi lavada continuamente com solução de ácido cítrico a 5% (25 mL X 2) água desionizada (25 mL) e salmoura (25 mL). A camada orgânica foi separada e seca sobre sulfato de magnésio anidro, filtrada e concentrada sob pressão reduzida. O produto bruto foi purificado por cromatografia de sílica usando um sistema de cromatografia HORIZON™ da Biotage Inc. rendendo, após concentração das frações adequadas e remoção de traços do solvente, (bomba de vacuo) ácido N- BOC-3-(4-(2-oxopropilsulfonil)fenil)-2-aminopropanóico (12) (0,13 g 86% do produto bruto). Foram obtidos traços por HPLC e um espectro de massa.
Exemplo 41
[00729]Este exemplo explica a síntese de 3-(4-(2-oxopropilsulfonil)fenil)-2- aminopropanóico (13) apresentado na Figura 37. A um frasco de fundo redondo seco ao forno, dotado de barra de agitação, adicionou-se ácido N-Boc-3-(4-(2- oxopropilsulfonil)fenil)-2-aminopropanóico (12) (0,13 g, 0,35 mmol), 10 mL de diclorometano anidro e 3 mL de ácido trifluoracético. A reação foi agitada a temperatura ambiente por 2 horas. O solvente foi removido por evaporação rotativa e adicionou-se 1 mL de cloreto de hidrogênio 4,0 M em 1,4-dioxano. O frasco de fundo redondo foi rapidamente revoluteado e a seguir adicionou-se 100 mL de éter dietílico anidro a fim de precipitar o ácido 3-(4-(2-oxopropilsulfonil)fenil)-2- aminopropanóico (0,067 g 65% do produto bruto) como um sólido branco. Obteve- se dados espectrais de RMN H1, traços por HPLC e um espectro de massa.
Exemplo 42
[00730]Este exemplo explica a síntese de 3-(4-(2-oxopropiltio)fenil)-2- aminopropanóico (14) apresentado na Figura 37. A um frasco de fundo redondo seco ao forno, dotado de barra de agitação, adicionou-se ácido N-Boc-3-(4-(2- oxopropiltio)fenil)-2-aminopropanóico (9) (0,10 g, 0,28 mmol), 10 mL de diclorometano anidro e 3 mL de ácido trifluoracético. A reação foi agitada a temperatura ambiente por 2 horas. O solvente foi removido por evaporação rotativa e adicionou-se 1 mL de cloreto de hidrogênio 4,0 M em 1,4-dioxano. O frasco de fundo redondo foi rapidamente revoluteado e a seguir adicionou-se 100 mL de éter dietílico anidro a fim de precipitar o ácido 3-(4-(2-oxopropiltio)fenil)-2- aminopropanóico (0,062 g 85% do produto bruto) como um sólido branco. Obteve- se dados espectrais de RMN H1, traços por HPLC e um espectro de massa.
Exemplo 43
[00731]Este exemplo explica a síntese de ácido N-BOC-3-(4-(2- oxociclopentiltio)fenil)-2-aminopropanóico (15) apresentado na Figura 38. A um frasco de fundo redondo seco ao forno, dotado de barra de agitação, sob pressão de gás nitrogênio, adicionou-se (5) (0,15 g, 0,76 mmol) 2-clorociclopentanona (0,12 mL, 1,25 mmol), bicarbonato de sódio (0,98 g, 12 mmol), 15 mL de THF anidro. A reação foi agitada a temperatura ambiente por 16 horas. O solvente foi removido por evaporação rotativa e o sólido branco dissolvido em 100 mL de acetato de etila. A mistura de reação foi lavada continuamente com solução de bicarbonato de sódio aquoso saturado (50 mL X 2) água desionizada (50 mL) e salmoura (50 mL). A camada orgânica foi separada e seca sobre sulfato de magnésio anidro, filtrada e concentrada sob pressão reduzida. O produto bruto foi purificado por cromatografia de sílica usando um sistema de cromatografia HORIZON™ da Biotage Inc. rendendo, após concentração das frações adequadas e remoção de traços do solvente, (bomba de vacuo) ácido N-BOC-3-(4-(2-oxociclopentiltio)fenil)-2- aminopropanóico (0,15 g 51%) como um sólido branco. Foram obtidos traços por HPLC e um espectro de massa.
Exemplo 44
[00732]Este exemplo explica a síntese de 3-(4-(2-oxociclopentiltio)fenil)-2- aminopropanóico (16) apresentado na Figura 38. A um frasco de fundo redondo seco ao forno, dotado de barra de agitação, adicionou-se ácido N-Boc-3-(4-(2- oxociclopentiltio)fenil)-2-aminopropanóico (15) (0,15 g, 0,39 mmol), 10 mL de diclorometano anidro e 3 mL de ácido trifluoracético. A reação foi agitada a temperatura ambiente por 2 horas. O solvente foi removido por evaporação rotativa e adicionou-se 1 mL de cloreto de hidrogênio 4,0 M em 1,4-dioxano. O frasco de fundo redondo foi rapidamente revoluteado e a seguir adicionou-se 100 mL de éter dietílico anidro a fim de precipitar o ácido 3-(4-(2-oxociclopentiltio)fenil)-2- aminopropanóico (0,108 g 100% ) como um sólido branco. Obteve-se dados espectrais de RMN H1, traços por HPLC e um espectro de massa.
Exemplo 45
[00733]Este exemplo explica a síntese de ácido N-BOC-3-(4-(2- oxobutiltio)fenil)-2-aminopropanóico (18) apresentado na Figura 38. A um frasco de fundo redondo seco ao forno, dotado de barra de agitação, sob pressão de gás nitrogênio, adicionou-se (5) (0,15 g, 0,76 mmol) de 1-bromo-2-butanona (0,12 mL, 1,25 mmol), bicarbonato de sódio (0,98 g, 12 mmol), 15 mL de THF anidro. A reação foi agitada a temperatura ambiente por 16 horas. O solvente foi removido por evaporação rotativa e o sólido branco dissolvido em 100 mL de acetato de etila. A mistura de reação foi lavada continuamente com solução de bicarbonato de sódio aquoso saturado (50 mL X 2) água desionizada (50 mL) e salmoura (50 mL). A camada orgânica foi separada e seca sobre sulfato de magnésio anidro, filtrada e concentrada sob pressão reduzida. O produto bruto foi purificado por cromatografia de sílica usando um sistema de cromatografia HORIZON ™ da Biotage Inc. rendendo, após concentração das frações adequadas e remoção de traços do solvente, (bomba de vacuo) ácido N-BOC-3-(4-(2-oxobutiltio)fenil)-2- aminopropanóico (0,15 g 51%) como um sólido branco. Foram obtidos traços por HPLC e um espectro de massa.
Exemplo 46
[00734]Este exemplo explica a síntese dos Compostos 19-22 apresentados na Figura 38. Os Compostos 19-22 são sintetizados usando metodologia análoga a descrita para os Compostos 10-14.
Exemplo 47
[00735]Este exemplo explica a síntese de ácido 3-(4-(2-oxobutiltio)fenil)-2- aminopropanóico (23) apresentado na Figura 38. A um frasco de fundo redondo seco ao forno, dotado de barra de agitação, adicionou-se ácido N-Boc-3-(4-(2- oxobutiltio)fenil)-2-aminopropanóico (18) (0,15 g, 0,56 mmol), 10 mL de diclorometano anidro e 3 mL de ácido trifluoracético. A reação foi agitada a temperatura ambiente por 2 horas. O solvente foi removido por evaporação rotativa e adicionou-se 1 mL de cloreto de hidrogênio 4,0 M em 1,4-dioxano. O frasco de fundo redondo foi rapidamente revoluteado e a seguir adicionou-se 100 mL de éter dietílico anidro a fim de precipitar o ácido 3-(4-(2-oxobutiltio)fenil)-2-aminopropanóico (0,149 g 100% ) como um sólido branco. Obteve-se dados espectrais de RMN H1, traços por HPLC e um espectro de massa.
Exemplo 48
[00736]Este exemplo explica a síntese dos Compostos 24-27 apresentados na Figura 39. os Compostos 24-27 são sintetizados usando metodologia análoga a descrita para os Compostos 10-14.
Exemplo 49
[00737]Este exemplo explica a síntese do aminoácido contendo dicarbonila apresentado na Figura 31.
Figure img0138
[00738]A t-BuOK (15 mL, 1,0 M em THF) é adicionado lentamente a solução de pAF protegido (1,0 g 3,1 mmol) em trilfuoracetato de metila (5 mL, 50 mmol). A mistura de reação é agitada a temperatura ambiente por 30 minutos e resfriada com ácido cítrico (5 g, 25,4 mmol) sendo diluída com EtOAc. A camada orgânica é lavada continuamente com água e salmoura sendo em seguida seca sobre Na2SO4 , filtrada e concentrada. O resíduo é purificado por cromatografia flash (sílica, 20:1 - hexano:EtOAc 3:2) rendendo o produto (1,07 g 83%) como um sólido castanho claro.
Figure img0139
[00739]À uma solução do éster metílico supra (1,0 g 2,4 mmol) em dioxano (30 mL) a 0°C adicionou-se LiOH (30 mL, 1 N). A mistura é agitada 0°C por 0,5 h e resfriada com ácido cítrico (10 g, 51 mmol) sendo diluída com H2O e salmoura, sendo seca sobre Na2SO4 anidro, filtrada e concentrada. O resíduo é purificado por cromatografia flash (sílica, 100: - CH2Cl2 : MeOH, ,5% HOAc) rendendo um óleo castanho (0,87 g, 98%).
Figure img0140
[00740]A uma solução do ácido supra, (1,0 g 2,5 mmol) em CH2Cl2 (15 mL) a 0°C adicionou-se ácido trifluoracético (15 mL)> A mistura resultante é agitada por 0,5 h e concentrada in vacuo. Ao resíduo adicionou-se MeOH (2 mL) seguido por HCl (2 mL, 4N em dioxano). Adicionou-se então éter (200 mL) ao precipitado (0,56 g, 75%) como um sólido branco.
Exemplo 50
[00741]Este exemplo explica a síntese do aminoácido contendo dicarbonila na Figura 32.
Figure img0141
[00742]A t-BuOK (15 mL, 1,0 M em THF) é adicionado lentamente a solução de pAF protegido (1,0 g 3,1 mmol) em pentafluorpropionato de metila (8 mL, 62 mmol). A mistura de reação é agitada a temperatura ambiente por 1 hora sendo resfriada com ácido cítrico (5 g, 25,4 mmol), e diluída com H2O (100 mL). Após a maioria do solvente ser removida, o resíduo é extraído com EtOAc. A camada orgânica é lavada continuamente com água e salmoura a seguir seca em Na2SO4 anidro, filtrada e concentrada. O resíduo é purificado por cromatografia flash (sílica, 20:1 - EtOAc:hexano 3:2) rendendo o produto (1,1 g 76%) como um sólido castanho claro.
Figure img0142
[00743]À uma solução do éster metílico supra (1,0 g 2,1 mmol) em dioxano (30 mL) a 0°C adicionou-se LiOH (30 mL, 1 N). A mistura resultante é agitada 0°C por 0,5 h e resfriada com ácido cítrico (10 g, 51 mmol) e H2O. A mistura é extraída com EtOAc. A camada orgânica é lavada continuamente com H2O e salmoura, sendo seca sobre Na2SO4 anidro, filtrada e concentrada. O resíduo é purificado por cromatografia flash (sílica, 100:1 - CH2Cl2 : MeOH, 0,5% HOAc) rendendo o produto como um sólido amarelo (0,8 g, 84%).
Figure img0143
[00744]A uma solução do ácido supra, (0,7 g 2,5 mmol) em CH2Cl2 (15 mL) a 0°C adicionou-se ácido trifluoracético (15 mL). A mistura resultante é agitada na mesma temperatura por 0,5 h e concentrada. Ao resíduo adicionou-se MeOH (2 mL) seguido por HCl (2 mL, 4N em dioxano). Adicionou-se então éter (200 mL) ao precipitado (0,62 g, 70%) como um sólido branco.
Exemplo 51
[00745]Este exemplo explica a síntese do aminoácido contendo dicarbonila apresentado na Figura 33.
Figure img0144
[00746]A uma solução agitada do álcool 1 (2,35 g 7,6 mmol) e piridina (1,5 mL, 18,6 mmol) em CH2Cl2 (150 mL a 0°C adicionou-se periodinano de Dess-Martin (3,5 g, 8,3 mmol). A mistura foi agitada a temperatura ambiente durante a noite e resfriada com Na2S2O3-NaHCO3 aquoso saturado (1:1, 100 mL) sendo diluída com CH2Cl2. A camada orgânica foi separada e lavada com água e salmoura e seca sobre Na2SO4 anidro, filtrada e concentrada in vacuo. A purificação do resíduo por cromatografia flash (sílica, 20:1 - hexano:EtOAc 3:1) rendeu o aldeído 2 como um sólido branco (2, 15 g, 92%) ESI-EM m/z: 292 (M+- OH), 232,204, 175, 131, 115 (100).
Figure img0145
[00747]A uma solução agitada de diisopropilamina (0,33 mL, 2,33 mmol) em THF (60 mL) a 0°C, adicionou-se n-butillítio (1,46 mL, 2,34 mmol). A mistura foi agitada a 0°C por 20 minutos e resfriada para -78°C adicionando-se então ciclopentanona. Após agitação da mistura por 20 minutos a -78°C, a solução do aldeído 2 (0,5 g, 1,63 mmol) em THF (20 mL, lavada com 20 mL) foi adicionada. A mistura resultante foi agitada a -78°C por 1,0 h e resfriada com solução de NH4Cl saturado aquoso, Após a maior parte do solvente ser removida o resíduo foi extraído com EtOAc. A camada orgânica foi lavada com água e salmoura sendo seca sobre Na2SO4 anidro, filtrada e concentrada in vacuo. A purificação do resido por cromatografia flash (sílica 10:1 - hexano:EtOAc 1:1) rendeu (3) como um óleo incolor (482 mg, 80%).
Figure img0146
[00748]A uma solução agitada do álcool 3 (0,44 g 1,13 mmol) e piridina (0,6 mL, 7,44 mmol) em CH2Cl2 (150 mL a 0°C adicionou-se periodinano de Dess-Martin (0,6 g, 1,41 mmol). A mistura foi agitada a temperatura ambiente durante a noite e resfriada com Na2S2O3-NaHCO3 aquoso saturado (1:1, 100 mL) sendo extraída com CH2Cl2. A camadas orgânicas foram separadas e lavadas com água e salmoura e secas sobre Na2SO4 anidro, filtradas e concentradas in vacuo. A purificação do resíduo por cromatografia flash (sílica, 20:1 - hexano:EtOAc 2:1) rendeu a dicetona 4 (342 mg, 78%) como um óleo incolor. ESI-EM m/z: 292 (M++ Na), 356, 313, 230, 212, 184, 146 (100).
Figure img0147
[00749]A uma solução do éster metílico 4 (330 mg 0,85 mmol) em dioxano (4 mL) a 0°C adicionou-se LiOH (4 mL, 1 N). A mistura resultante é agitada a 0°C por 30 minutos e resfriada com ácido cítrico aquoso (5%, 100 mL). A mistura é extraída com EtOAc. A camada orgânica é lavada continuamente com H2O e salmoura, sendo seca sobre Na2SO4 anidro, seco, filtrada e concentrada, rendendo o produto como um sólido branco. (310 mg, 97%) ESI-EM m/z: 342, 330 (M+- COOH), 298, 230, 185, 119 (100).
Figure img0148
[00750]A uma solução do ácido 5, (310 mg 0,83 mmol) em CH2Cl2 (4 mL) a 0°C adicionou-se ácido trifluoracético (4 mL). A mistura resultante é agitada a 0°C por 30 minutos e concentrada in vacuo. Ao resíduo adicionou-se MeOH (1 mL) seguido por HCl (1 mL, 4N em dioxano). Adicionou-se então éter (100 mL) ao precipitado (241 mg, 94%) como um sólido branco. ESI-EM m/z: 298 (M+ + Na), 276, 0(M+ - COOH), 184, 119 (100).
Exemplo 52
[00751]Este exemplo explica a síntese do aminoácido contendo dicarbonila apresentado na Figura 34.
Figure img0149
[00752]A uma solução agitada do álcool (6,0 g 19,4 mmol) e piridina (12 mL, 150 mmol) em CH2CI2 (400 mL a 0°C adicionou-se periodinano de Dess-Martin (14,2 g, 33,4 mmol). A mistura foi agitada a temperatura ambiente durante a noite e resfriada com Na2S2O3-NaHCO3 aquoso saturado (1:1, 300 mL) sendo extraída com CH2Cl2. A camadas orgânicas foram combinadas e lavadas com água e salmoura e secas sobre Na2SO4 anidro, filtradas e concentradas in vacuo. A purificação do resíduo por cromatografia flash ( sílica, 1:100 - hexano:EtOAc 1:1) rendeu o aldeído (5,48 g, 92%) como um sólido branco.
Figure img0150
[00753]A uma solução do aldeído supra (3,41 g, 11,1 mmol) em acetona (70 mL) adicionou-se KMnO4 (2,5 g, 15,8 mmol) em água (10 mL). A mistura resultante foi agitada a temperatura ambiente durante a noite. Após a maioria do solvente ser removida, o resíduo foi dissolvido em solução aquosa de ácido cítrico (5%, 300 ml), sendo extraído com EtOAc. As camadas orgânicas foram combinadas e lavadas com água e salmoura e secas sobre Na2SO4 anidro, filtradas e concentradas in vacuo rendendo o produto como um sólido branco (2,83 g, 79%), que foi usado diretamente na próxima etapa sem mais purificação.
Figure img0151
[00754]A uma solução do ácido supra, (2,83 g 8,76 mmol) em DMF (60 mL), adicionou-se 1-amino-2-propanol (1,4 mL 17,9 mmol, cloridrato de 1-(3- dimetilaminopropil)-3-etilcarbodiimida (EDC, 4,1 g, 21,4 mmol), 1-hidroxibenzotriazol hidratado (HOBt, 2,2 g, 18,5 mmol) e N,N-diidropropiletilamina (DIEA, 9 mL, 51,6 mmol). A mistura foi agitada a temperatura ambiente durante a noite sendo resfriada com solução aquosa de ácido cítrico (5%, 200 mL) extraindo-se com EtOAc. As camadas orgânicas foram combinadas e lavadas com água e salmoura e secas sobre Na2SO4 anidro, filtradas e concentradas in vacuo. A purificação do resíduo por cromatografia flash (sílica, 10:1 - hexano:EtOAc 1:1) rendeu o produto (2,45 g, 74%) como um espuma branca.
Figure img0152
[00755]A uma solução agitada do álcool supra (2,44 g 6,4 mmol) e piridina (4 mL, 49,6 mmol) em CH2CI2 (100 mL a 0°C adicionou-se periodinano de Dess-Martin (4,1 g, 9,7 mmol). A mistura foi agitada a temperatura ambiente durante a noite e resfriada com Na2S2O3-NaHCO3 aquoso saturado (1:1, 300 mL) sendo extraída com CH2Cl2. A camada orgânica foi combinada e lavada com água e salmoura e seca sobre Na2SO4 anidro, filtrada e concentrada in vacuo. A purificação do resíduo por cromatografia flash (sílica, 1:1 - hexano:EtOAc 1:3) rendeu o produto (1,84 g, 76%) como um sólido amarelo.
Figure img0153
[00756]A uma solução do éster metílico supra (1,72 g 4,6 mmol) em dioxano (10 mL) a 0°C, adicionou-se LiOH (10 mL, 1 N). A mistura resultante é agitada na mesma temperatura por 3 horas e resfriada com ácido cítrico aquoso (5%). A mistura é extraída com EtOAc. A camada orgânica é lavada continuamente com H2O e salmoura, sendo seca sobre Na2SO4 anidro, seco, filtrada e concentrada, rendendo o produto (1,7 g) como um sólido que foi usado diretamente para a próxima etapa sem mais purificação.
[00757]A uma solução do ácido supra (1,7 g, 4,7 mmol) em CH2Cl2 (15 mL a 0°C adicionou-se ácido trifluoracético (15 mL). A mistura foi agitada na mesma temperatura por 2 horas concentrando-se in vacuo. Ao resido adicionou-se HCl (1,5 mL, 4 N em dioxano), seguido por éter (400 mL). O produto precipitado (1,52 g 90% por 2 etapas) foi coletado como um sólido branco.
Exemplo 53
[00758]Este exemplo explica a síntese do aminoácido contendo hidrazida apresentado na Figura 44.
Figure img0154
[00759]A uma solução de aldeído (410 g, 1,34 mmol) em EtOH (15 mL) adicionou-se hidrazida fórmica (170 mg, 2,83 mmol). A mistura de reação foi agitada a temperatura ambiente por 1 hora. Após a maioria do solvente ser removida, o resíduo foi extraído com CH2Cl2. As camadas orgânicas foram combinadas e concentradas in vacuo. A purificação do resíduo por cromatografia flash (sílica, 1:6 - hexano:EtOAc 1:1) rendeu o produto (390 mg, 83%) como um sólido branco.
Figure img0155
[00760]A uma solução do éster metílico supra (349 mg 1 mmol) em dioxano (7 mL) adicionou-se LiOH (7 mL, 1 N) a 0°C. A mistura resultante é agitada na mesma temperatura por 10 minutos sendo resfriada com ácido cítrico (2,5 g e diluída com água. A mistura é extraída com EtOAc. A camada orgânica é lavada continuamente com H2O e salmoura, sendo seca sobre Na2SO4 filtrada e concentrada, rendendo um sólido branco (290 mg, 87%).
Figure img0156
[00761]A uma solução do ácido supra (290 mg, 0,87 mmol) em CH2Cl2 (20 mL a 0°C adicionou-se ácido trifluoracético (20 mL). A mistura foi agitada por 20 minutos, concentrando-se. Ao resido adicionou-se MeOH (1 mL) seguido por HCl (1,0 mL, 4 N em dioxano), seguido por éter (200 mL). O produto precipitado (195 mg 83%) foi coletado como um sólido amarelo claro.
Exemplo 54
[00762]Este exemplo explica em detalhe a síntese do aminoácido contendo hidrazida apresentado na Figura 45.
Figure img0157
[00763]A uma solução de N-Boc-4-hidroximetil-fenilalanina (11,73 g, 39,8 mmol) em DMF (100 mL). Adicionou-se cloridrato éster metílico de alanina (9,0 g, 64,5 mmol), cloridrato de 1-(3-dimetilaminopropil)-3-etilcarbodiimida (EDC 15,4 g 80,3 mmol), N,N-diisopropiletilamina (DIEA, 30 mL, 172 mmol) e 1- hidroxibenzotriazol hidratado HOBt, 8,4 g, 70,6 mmol). A mistura de reação foi agitada a temperatura ambiente sendo diluída com EtOAc. A camada orgânica foi separada e lavada continuamente com água, ácido cítrico (5%), H2O, NaHCO3, água e salmoura, e a seguir seca sobre Na2SO4 anidro, filtrada e concentrada rendendo o dipeptídeo protegido como um sólido branco (13,74 g, 91%).
Figure img0158
[00764]A uma solução do dipeptídeo protegido supra, (10,33 g, 27,2 mmol), em CH2CI2 (300 mL) a 0°C adicionou-se piridina (8 mL, 99,1 mmol) e periodinano de Dess-Martin (14 g, 33,0 mmol). A mistura de reação foi agitada durante a noite sendo resfriada com NaHCO3/Na2S2O3 aquoso sat. (1:1). A camada orgânica foi lavada continuamente com H2O, ácido cítrico, água e salmoura sendo seco sobre Na2SO4 anidro, filtrada e concentrada. O resíduo foi purificado por cromatografia flash (sílica, 9:1 = hexano:EtOAc 1:1) rendendo o produto (10,12 g, 98%) como um sólido branco.
Figure img0159
[00765]A uma solução do dipeptídeo aldeído (10,1 g, 26,7 mmol) em EtOH (200 mL), adicionou-se hidrazida acética (3,7 g, 45 mmol). A mistura de reação foi agitada a temperatura ambiente por 30 minutos e concentrou-se. Ao resíduo adicionou-se H2O (1 L) e CH2Cl2 (500 mL). A camada orgânica foi separada e concentrada rendendo um sólido branco (11,21 g 97%).
Figure img0160
[00766]A uma solução do éster metílico supra (11,1 g 25,6 mmol) em dioxano (50 mL) a 0°C adicionou-se LiOH (50 mL, 1 N) .A mistura resultante é agitada na mesma temperatura por 30 minutos sendo resfriada com ácido cítrico (20 g) e diluída com água (200 mL). A mistura é extraída com EtOAc. A camada orgânica é lavada continuamente com H2O e salmoura, sendo seca sobre Na2SO4, filtrada e concentrada, rendendo um sólido branco (9,52 g, 88%).
Figure img0161
[00767]A uma solução do ácido supra ( 9,5 g, 22,6 mmol) em CH2Cl2 (50 mL a 0°C) adicionou-se ácido trifluoracético (50 mL). A mistura foi agitada por 1 hora a 0°C, concentrando-se in vacuo. Ao resido adicionou-se HCl (7 mL, 4N em dioxano) seguido por éter (500 mL). O produto precipitado (7,25 g 90%) foi coletado como um sólido branco.
Exemplo 55
[00768]Este exemplo explica a síntese do aminoácido contendo oxima apresentado na Figura 46A.
Figure img0162
[00769]A uma solução de aldeído (3,0 g) em MeOH/H+ adicionou-se 2 equivalentes de cloridrato de hidroxilamina. A mistura de reação foi agitada a temperatura ambiente por 2 horas sendo concentrada. Ao resíduo adicionou-se água (200 mL) seguido por CH2Cl2. As camadas orgânicas foram combinadas e concentradas in vacuo. A purificação do resíduo por cromatografia flash (sílica, 3:7 - hexano:EtOAc 1:9) rendeu o produto (96%) como um sólido.
Figure img0163
[00770]A uma solução do éster metílico supra (3,0 g) em dioxano (10 mL) a 0°C adicionou-se LiOH (10 mL, 1 N) .A mistura resultante é agitada na mesma temperatura por 3 horas, sendo resfriada com ácido cítrico (5 g) e diluída com água. A mistura é extraída com EtOAc. A camada orgânica é lavada continuamente com H2O e salmoura, sendo seca sobre Na2SO4 anidro, filtrada e concentrada, rendendo um sólido. A seguir a uma solução do ácido resultante em CH2Cl2 (20 mL) a 0C adicionou-se ácido trifluoracético (20 mL). A mistura de reação foi agitada a 0°C por 1 hora e concentrou-se. Ao resíduo adicionou-se MeOH (1 mL) seguido por adição de HCl (2,0 mL, 4N em dioxano). Adicionou-se então éter (200 mL) para precipitar o produto (87%) como um sólido.
Exemplo 56
[00771]Este exemplo explica a síntese de aminoácido contendo oxima apresentado na Figura 46B.
Figure img0164
[00772]A uma solução de aldeído (3,0 g) em MeOH/H+ adicionou-se 2 equivalentes de cloridrato de hidroxilamina. A mistura de reação foi agitada a temperatura ambiente por 2 horas sendo concentrada. Ao resíduo adicionou-se água (200 mL) seguido por CH2Cl2. A camada orgânica foi separada e concentrada in vacuo. A purificação do resíduo por cromatografia flash (sílica, 3:7 - hexano:EtOAc 1:9) rendeu o produto (93%) como um sólido.
Figure img0165
[00773]A uma solução do éster metílico supra (3,0 g) em dioxano (10 mL) a 0°C adicionou-se LiOH (10 mL, 1 N) .A mistura foi agitada na mesma temperatura por 3 horas, sendo resfriada com ácido cítrico (5 g) e diluída com água. A mistura foi extraída com EtOAc. A camada orgânica foi lavada continuamente com H2O e salmoura, sendo seca sobre Na2SO4 anidro, filtrada e concentrada, rendendo um sólido. A seguir a uma solução do ácido resultante em CH2Cl2 (20 mL) a 0C adicionou-se ácido trifluoracético (20 mL). A mistura de reação foi agitada a 0°C por 1 hora e concentrou-se. Ao resíduo, adicionou-se MeOH (1 mL) seguido por adição de HCl (2,0 mL, 4N em dioxano). Adicionou-se então éter (200 mL) para precipitar o produto (89%) como um sólido.
Exemplo 57
[00774]Este exemplo explica a síntese aminoácido contendo hidrazina apresentado na Figura 46C.
Figure img0166
[00775]A uma solução de aldeído (3,0 g) em MeOH/H+ adicionou-se 2 equivalentes de metilhidrazina. A mistura de reação foi agitada a temperatura ambiente por 2 horas sendo concentrada. Ao resíduo adicionou-se água (200 mL) seguido por CH2Cl2. A camada orgânica foi separada e concentrada in vacuo. A purificação do resíduo por cromatografia flash (sílica, 3:7 - hexano:EtOAc 1:9) rendeu o produto (93%) como um sólido.
Figure img0167
[00776]A uma solução do éster metílico supra (3,0 g) em dioxano (10 mL) a 0°C adicionou-se LiOH (10 mL, 1 N) .A mistura foi agitada na mesma temperatura por 3 horas, sendo resfriada com ácido cítrico (5 g) e diluída com água. A mistura foi extraída com EtOAc. A camada orgânica foi lavada continuamente com H2O e salmoura, sendo seca sobre Na2SO4 anidro, filtrada e concentrada, rendendo um sólido. A seguir a uma solução do ácido resultante em CH2Cl2 (20 mL) a 0°C adicionou-se ácido trifluoracético (20 mL). A mistura de reação foi agitada a 0°C por 1 hora e concentrou-se. Ao resíduo, adicionou-se MeOH (1 mL) seguido por adição de HCl (2,0 mL, 4N em dioxano). Adicionou-se então éter (200 mL) para precipitar o produto (89%) como um sólido.
Exemplo 58
[00777]Este exemplo explica a síntese de mPEG-hidroxilamina apresentado na Figura 48A.
Figure img0168
[00778]A uma solução de mPEG(30K)-OH (1,0 g, 0,033 mmol) em CH2Cl2 anidro (10 mL) adicionou-se cloroformiato de para-nitrofenil (60 mg, 0,28 mmol). A mistura foi agitada a temperatura ambiente por 15 horas. Adicionou-se éter (200 mL). O precipitado foi filtrado, lavado com éter e seco in vacuo rendendo o produto (1,0 g 100%) como um pó branco.
Figure img0169
[00779]Para uma solução de 3-hidroxietilcarbamao de terc-butila (1,75 g, 10 mmol) em THF (60 mL) adicionou-se N-hidroxiftalimida (3,2 g, 20 mmol), trifenilfosfina (2,0 g, 15 mmol). A mistura de reação foi agitada a temperatura ambiente por 10 minutos sendo resfriada para 0°C. Adicionou-se gota a gota, azodicarboxilato de diisopropila (DIAD, 2,0 mL, 10,5 mmol) via seringa durante 1 hora. O banho de gelo foi removido e a mistura foi agitada durante a noite e concentrada. O sólido branco foi dissolvido em acetato de etila (100 mL). A mistura de reação foi lavada continuamente com solução saturada de bicarbonato de sódio aquoso (100 mL), água (100 L) e salmoura (100 mL), sendo seca em MgSO4, filtrada e concentrada in vacuo. O produto bruto foi purificado por cromatografia flash (sílica, 100:1 - hexano:EtOAc 10:1) rendendo o composto titular (2,6 g, 81%) com um sólido branco.
Figure img0170
[00780]A uma solução do ligante Boc-protegido (2,0 g, 9,1 mmol) em CH2Cl2 (5 ml) adicionou-se ácido trifluoracético (5 mL). A mistura foi agitada a temperatura ambiente por 1 hora, concentrando-se. Ao resido adicionou-se HCl (4N em dioxano, 1,5 mL) seguido por adição de Et2O éter (150 mL). O precipitado foi filtrado, lavado com éter e seco in vacuo rendendo o ligante amina (1,1 g 85%) como um sólido branco.
Figure img0171
[00781]A uma mistura de mPEG(30K) carbonato de para-nitrofenol (1,0 g, 0,033 mmol) e ligante amina (53 mg, 0,21 mmol) em DMF-CH2Cl2 (10 mL, 1:2) adicionou-se diisopropiletilamina (50 μL, 0,28 mmol) e DMAP (5 mg, 0,041 mmol). A mistura resultante foi agitada a temperatura ambiente por 15 horas. Adicionou-se éter (200 mL). O precipitado foi filtrado, lavado com éter e seco in vacuo rendendo o produto (0,83 g 83%) como um pó branco.
Figure img0172
[00782]A uma solução de mPEG ftalimida (30 K, 0,8 g, 0,0266 mmol) em MeOH (5 mL) adicionou-se hidrazina (8,5 μL, 0,27 mmol). A mistura resultante foi agitada a 45°C por 1,0 horas. Após a reação ter sido resfriada para temperatura ambiente, adicionou-se CH2Cl2 (150 mL) e a solução foi lavada com solução de HCl aquoso (0,1 N, 100 mL). A camada aquosa foi extraída com CH2Cl2 (150 mL). As camadas orgânicas foram combinadas e lavada com água (100 mL), sendo seca sobre Na2SO4 anidro, filtrada e concentrada. O resíduo foi dissolvido em CH2Cl2 (5 mL). Adicionou-se éter (200 mL) para precipitar o produto hidroxilamina (0,72 g 90%) como um pó branco.
Exemplo 59
[00783]Este exemplo explica a síntese de mPEG-hidroxilamina apresentada na Figura 48B.
Figure img0173
[00784]A uma solução de mPEG (30K)-OH 1,0 g, 0,033 mmol) em CH2Cl2 anidro (10 ml), adicionou-se cloroformiato de para-nitrofenol (60 mg, 0,28 mmol). A mistura foi agitada a temperatura ambiente por 15 horas. Adicionou-se então éter (200 ml). O precipitado foi filtrado, lavado com éter e seco, in vacuo rendendo o produto 91,0 g, 100%) como um pó branco.
Figure img0174
[00785]A uma solução de 2-hidroxietilcarbamato de terc-butila (2,8 mL, 18 mmol) em THF (60 mL), adicionou-se N-hidroxiftalimida (5,8 g, 36 mmol), trifenilfosfina (3,6 g, 27 mmol). A mistura de reação foi agitada a temperatura ambiente por 10 minutos sendo resfriada para 0°C. Azodicarboxilato de diisopropila (DIAD, 3,6 mL, 19 mmol) foi adicionado gota a gota via seringa em 1 horas. O banho de gelo foi removido e a mistura foi agitada durante a noite e concentrada. O sólido branco dissolvido em acetato de etila (100 mL.). A mistura de reação foi lavada continuamente com solução aquosa saturada de bicarbonato de sódio (2 X 50 mL), H2O (50 mL) e salmoura (50 mL), sendo seca sobre MgSO4 anidro, filtrada e concentrada in vacuo. O produto bruto foi purificado por cromatografia flash usando um sistema de cromatografia HORIZON™ de Biotage Inc. rendendo o composto titular com impurezas (12 g, 206%) com um sólido branco.
Figure img0175
[00786]A uma solução do ligante Boc-protegido bruto (12 g) em CH2Cl2 (5 mL), adicionou-se ácido trifluoracético (5 mL). A mistura resultante foi agitada a temperatura ambiente por 1 hora e concentrada. Ao resíduo adicionou-se HCl (4 N em dioxano, 1,5 mL) seguido por adição de Et2O (150 mL). O precipitado foi filtrado, lavado com éter e seco in vacuo rendendo o ligante amina (3,0 g, 68% em duas etapas) como um sólido branco.
Figure img0176
[00787]A uma mistura de mPEG(30K) carbonato de para-nitrofenol (1,0 g, 0,033 mmol) e ligante amina (50 mg, 0,21 mmol) em DMF-CH2Cl2 (10 mL, 1:2) adicionou-se diisopropiletilamina (50 μL, 0,28 mmol) e 4-DMAP (4 mg, 0,033 mmol). A mistura resultante foi agitada a temperatura ambiente por 15 horas. Adicionou-se éter (200 mL). O precipitado foi filtrado, lavado com éter e seco in vacuo rendendo o produto (0,81 g 81%) como um pó branco.
Figure img0177
[00788]A uma solução de mPEG(30K) ftalimida ( 0,8 g, 0,0266 mmol) em MeOH (5 mL) adicionou-se hidrazina (8,5 μL, 0,27 mmol). A mistura resultante foi agitada a 45°C por 1,0 horas. Após a reação ter sido resfriada para temperatura ambiente, adicionou-se CH2Cl2 (150 mL) e a solução foi lavada com solução de HCl aquoso (0,1 N, 100 mL). A camada aquosa foi extraída com CH2Cl2 (150 mL). As camadas orgânicas foram combinadas e lavadas com água (100 mL), sendo secas sobre Na2SO4 anidro, filtradas e concentradas. O resíduo foi dissolvido em CH2Cl2 (5 mL). Adicionou-se éter (200 mL) para precipitar o produto hidroxilamina (0, 68 g 85%) como um pó branco.
Exemplo 60
[00789]Este exemplo explica a síntese de mPEG-hidroxilamina apresentada na Figura 49A.
Figure img0178
[00790]A uma solução de N-(3-bromopropil)ftalimida (4,0 g, 15, 0 mmol) em DMF (50 mL) a 0°C adicionou-se K2CO3 (10 g, 73 mmol) e N-hidroxicarbamato de terc-butila (2,5 g, 18,8 mmol). A mistura de reação foi agitada a temperatura ambiente por 3 horas. A mistura foi diluída com água (200 mL) e extraída com EtOAc (200 mL). A camada orgânica foi lavada com água e salmoura sendo seca sobre Na2SO4 anidro, filtrada e concentrada in vacuo. A purificação do resíduo por cromatografia flash (sílica 20:1 - hexano:EtOAc 3:1) rendeu o produto (3,5 g, 72%) como um óleo incolor.
Figure img0179
[00791]A uma solução da ftalimida supra (500 mg, 1,6, mmol) em EtOH (10 mL) adicionou-se hidrazina (0,25 mL, 8,0 mmol) A mistura de reação resultante foi agitada a temperatura ambiente por 3 horas. Após remoção do precipitado o filtrado foi concentrado. O resíduo foi deixado em alto vacuo durante a noite. A purificação do resíduo por cromatografia flash (sílica 3:1 - hexano:EtOAc 1:1) rendeu o ligante amina (252 mg, 85%) como um sólido branco.
Figure img0180
[00792]A uma solução de mPEG (30K)-OH 1,0 g, 0,033 mmol) em CH2Cl2 anidro (10 ml), adicionou-se cloroformiato de para-nitrofenol (60 mg, 0,28 mmol). A mistura foi agitada a temperatura ambiente por 15 horas. Adicionou-se então éter (200 ml). O precipitado foi filtrado, lavado com éter e seco, in vacuo rendendo o produto (1,0 g, 100%) como um sólido branco.
Figure img0181
[00793]A uma solução de mPEG(30K) supra (3,0 g, 0,1 mmol) em CH2Cl2 anidro (10 ml), adicionou-se diisopropiletilamina (88 μL, 0,5 mmol) e o ligante de amina (76 mg, 0,4 mmol). A mistura resultante foi agitada a temperatura ambiente por 15 horas. Adicionou-se então éter (700 ml) pra a mistura de reação. O precipitado foi filtrado, lavado com éter e seco, in vacuo rendendo o produto (2,8 g, 93%) como um pó branco.
Figure img0182
[00794]A uma solução de mPEG(30K) Boc protegido (2,0 g, 0,067 mmol) em CH2Cl2 anidro a 0°C, adicionou-se ácido trifluoracético (10 mL). A mistura resultante foi agitada a temperatura ambiente por 5 horas. Adicionou-se então éter (500 ml) para a mistura de reação. O precipitado foi filtrado, lavado com éter e seco, in vacuo rendendo o produto (1,8 g, 90%) como um pó branco.
EXEMPLO 61
[00795]Este exemplo explica a síntese de mPEG-hidroxilamina apresentada na Figura 49B.
Figure img0183
[00796]A uma solução de N-hidroxicarbamato de terc-butila (5,0 g, 37,6 mmol) em DMF (30 mL) a 0°C adicionou-se K2CO3 (12 g, 87,6 mmol) e N-(2- bromoetil)ftalimida (10,0 g, 39,7 mmol). A mistura de reação foi agitada a temperatura ambiente por 3 horas. A mistura foi diluída com água (200 mL) e extraída com EtOAc (200 mL). A camada orgânica foi lavada com água e salmoura, seca sobre Na2SO4 anidro filtrada e concentrada in vácuo. A purificação do resíduo por cromatografia flash (sílica, 20:1 - hexano:EtOAc 1:1 rendeu o produto (5,2 g, 55%) como um sólido branco.
Figure img0184
[00797]A uma solução da ftalimida supra (500 mg, 1,6, mmol) em EtOH (10 mL) adicionou-se hidrazina (0,25 mL, 8,0 mmol) A mistura de reação resultante foi agitada a temperatura ambiente por 3 horas. Após remoção do precipitado o filtrado foi concentrado. O resíduo foi deixado em alto vacuo durante a noite. A purificação do resíduo por cromatografia flash (sílica 3:1 - hexano:EtOAc 1:1) rendeu o ligante amina (301 mg, 86%) como um sólido branco.
Figure img0185
[00798]A uma solução de mPEG(30K)-OH ativado supra (1,0 g, 0,033 mmol) em CH2CI2 anidro (10 ml), adicionou-se diisopropiletilamina (58 μg, 0,33 mmol). 4- dimetilaminopiridina (4 mg, 0,033 mmol) e o ligante amina supra (64 mg 0,31 mmol). A mistura resultante foi agitada a temperatura ambiente por 15 horas. Adicionou-se então éter (200 ml) para a mistura de reação. O precipitado foi filtrado, lavado com éter e seco, in vacuo rendendo um pó branco (0,85 g, 85%).
Figure img0186
[00799]A uma solução de mPEG(30K) Boc protegido (0,85 g 0,028 mmol) em CH2CI2 anidro (10 mL) a 0°C, adicionou-se ácido trifluoracético (10 mL). A mistura resultante foi agitada a temperatura ambiente por 5 horas. Adicionou-se então éter (200 ml) para a mistura de reação. O precipitado foi filtrado, lavado com éter e seco, in vacuo rendendo o produto (0,68 g, 80%) como um pó branco.
Exemplo 62
[00800]Este exemplo explica a síntese de mPEG-hidroxilamina apresentada na Figura 50A
Figure img0187
[00801]A uma solução de mono-Boc ftalimida (2,1 g, 6,9 mmol) em piridina (50 mL) a 0°C adicionou-se Boc2O (3,3 g, 15,1 mmol). A mistura resultante foi aquecida a 60°C durante a noite. Após o solvente ser removido in vácuo o resíduo foi diluído com EtOAc (200 mL) e lavado com ácido cítrico (5%, 200 m), água (200 mL) e salmoura (200 mL), a seguir secou-se sobre Na2SO4 anidro, filtrado e concentrado in vácuo. A purificação do resíduo por cromatografia flash (sílica, 20:1 - hexano:EtOAc 3:1) rendeu o produto (2,37 g, 85%) como um óleo amarelo.
Figure img0188
[00802]A uma solução de di-Boc ftalimida (1,21 g, 2,98 mmol) em MeOH (15 ml) a 0°C, adicionou-se amônia em MeOH (15 mL, 7N, 105 mmol). A mistura resultante foi agitada a temperatura ambiente durante a noite. O precipitado foi filtrado sendo concentrado in vácuo. A purificação do resíduo por cromatografia flash (sílica, 10:1 - 6:4 EtOAc:MeOh) rendeu o ligante amina (0,61 g, 74%) como um sólido branco.
Figure img0189
[00803]A uma solução de mPEG(30K)-OH (1,0 g, 0,033 mmol) em CH2Cl2 anidro (10 ml), adicionou-se cloroformiato de para-nitrofenol (60 mg, 0,28 mmol) A mistura resultante foi agitada a temperatura ambiente por 15 horas. Adicionou-se então éter (200 ml) para precipitar o produto mPEG(30K). O precipitado foi filtrado, lavado com éter e seco, in vacuo(1,0 g, 100%).
Figure img0190
I
[00804]A uma solução de mPEG(30K)-OH ativado supra (1,0 g, 0,033 mmol) em CH2Cl2 anidro (10 ml), adicionou-se diisopropiletilamina (58 μg, 0,33 mmol). 4- dimetilaminopiridina (5 mg, 0,041 mmol) e o ligante amina diBoc (90 mg 0,33 mmol). A mistura resultante foi agitada a temperatura ambiente por 15 horas. Adicionou-se então éter (200 ml) para a mistura de reação. O precipitado foi filtrado, lavado com éter e seco, in vacuorendendo um pó branco (0,82 g, 82%).
Figure img0191
[00805]A uma solução de mPEG(30K) Boc protegido (0,82 g 0,027 mmol) em CH2CI2 anidro (8 mL) a 0°C, adicionou-se ácido trifluoracético (8 mL). A mistura resultante foi agitada a temperatura ambiente por 5 horas. Adicionou-se então éter (200 ml) para a mistura de reação. O precipitado foi filtrado, lavado com éter e seco, in vacuo rendendo o produto (0,57 g, 70%) como um pó branco.
Exemplo 63
[00806]Este exemplo explica a síntese de mPEG-hidroxilamina apresentada na Figura 50B
Figure img0192
[00807]A uma solução de mono-Boc ftalimida (1,5 g, 4,7 mmol) em piridina a 0˚C adicionou-se Boc2O (2,2 g, 10,0 mmol). A mistura resultante foi aquecida a 60˚C durante a noite. Após o solvente ser removido in vacuo o resíduo foi diluído com EtOAc (200 mL) e lavado com ácido cítrico (5%, 200 m), água (200 mL) e salmoura (200 mL), a seguir secou-se sobre Na2SO4 anidro, filtrado e concentrado in vácuo. A purificação do resíduo por cromatografia flash (sílica, 20:1 - hexano:EtOAc 3:1) rendeu o produto (1,6 g, 81%) como um óleo.
Figure img0193
[00808]A uma solução de di-Boc ftalimida (1,5 g, 3,6 mmol) em MeOH (15 ml) a 0°C, adicionou-se amônia em MeOH (15 mL, 7N, 105 mmol). A mistura resultante foi agitada a temperatura ambiente durante a noite. O precipitado foi filtrado sendo concentrado in vácuo. A purificação do resíduo por cromatografia flash (sílica, 10:1 - EtOAc:MeOH 6:4) rendeu o ligante amina (0,85 g, 82%) como um sólido branco.
Figure img0194
[00809]A uma solução de mPEG(30K)-OH (1,0 g, 0,033 mmol) em CH2Cl2 anidro (10 ml), adicionou-se cloroformiato de para-nitrofenol (60 mg, 0,28 mmol) A mistura resultante foi agitada a temperatura ambiente por 15 horas. Adicionou-se então éter (200 ml) para precipitar o produto. O precipitado foi filtrado, lavado com éter e seco, in vácuorendendo o produto (1,0 g, 100%) como um pó branco.
Figure img0195
[00810]A uma solução de mPEG(30K) ativado supra (1,0 g, 0,033 mmol) em CH2Cl2 anidro (10 ml), adicionou-se diisopropiletilamina (58 μg, 0,33 mmol). 4- dimetilaminopiridina (5 mg, 0,041 mmol) e o ligante diBoc amina (100 mg 0,34 mmol). A mistura resultante foi agitada a temperatura ambiente por 15 horas. Adicionou-se então éter (200 ml) para a mistura de reação. O precipitado foi filtrado, lavado com éter e seco, in vacuo rendendo um pó branco (0,89 g, 89%).
Figure img0196
[00811]A uma solução de mPEG(30K) Boc protegido (0,89 g 0,030 mmol) em CH2CI2 anidro (8 mL) a 0°C, adicionou-se ácido trifluoracético (8 mL). A mistura resultante foi agitada a temperatura ambiente por 5 horas. Adicionou-se então éter (200 ml) para a mistura de reação. O precipitado foi filtrado, lavado com éter e seco, in vacuo rendendo o produto (0,65 g, 73%) como um pó branco.
Exemplo 64
[00812]Este exemplo explica a síntese de mPEG-hidroxilamina apresentada na Figura 51A.
Figure img0197
[00813]A uma mistura de mPEG(30K) propionaldeído (0,5 g 0,0166 mmol) e ligante amina (73 mg, 0,25 mmol) em MeOH (10 mL) adicionou-se NaCNBH3 (20 mg, 0,30 mmol). A mistura resultante foi agitada a temperatura ambiente por 48 horas. Após a maioria do solvente ter sido removida, adicionou-se éter (200 mL). O precipitado foi filtrado, lavado com éter e seco in vácuo para render um pó branco (0,43 g, 86%).
Figure img0198
[00814]A uma solução do mPEG(30K) di-Boc protegido (0,42 g, 0,014 mmol) em CH2Cl2 anidro (4 mL a 0°C adicionou-se ácido trifluoracético (4 mL). A mistura resultante foi agitada a temperatura ambiente por 8 horas. Adicionou-se éter (100 mL) para a mistura de reação. O precipitado foi filtrado, lavado com éter e seco in vácuo rendendo um pó branco (0,35 g, 83%).
Exemplo 65
[00815]Este exemplo explica a síntese de mPEG-hidroxilamina apresentada na Figura 51B.
Figure img0199
[00816]A uma solução agitada de mPEG(30K) (6,0 g 0,2 mmol) e piridina (0,1 mL, 1,2 mmol) em CH2CI2 (60 mL a 0°C adicionou-se periodinano de DessMartin (0,2 g, 0,47 mmol). A mistura foi agitada a temperatura ambiente durante a noite e resfriada com Na2S2O3-NaHCO3 aquoso saturado (1:1, 100 mL) sendo extraída com CH2Cl2 (400 mL) x 2). As camadas orgânicas foram separadas e lavadas com água e salmoura e secas sobre Na2SO4 anidro, filtradas e concentradas in vacuo. O resíduo é dissolvido em CH2Cl2 (50 mL). Adiciona-se éter (1L) para a solução. O precipitado é filtrado, lavado com éter e seco rendendo um pó branco (4,9 g, 82%).
Figure img0200
[00817]A uma mistura de mPEG(30K) aldeído (0,5 g 0,0166 mmol) e ligante amina (73 mg, 0,25 mmol) em MeOH (10 mL) adicionou-se NaCNBH3 (20 mg, 0,30 mmol). A mistura resultante foi agitada a temperatura ambiente por 48 horas. Após a maioria do solvente ter sido removida, adicionou-se éter (200 mL). O precipitado foi filtrado, lavado com éter e seco in vácuo para render um pó branco (0,43 g, 85%).
Figure img0201
[00818]A uma solução do mPEG(30K) di-Boc protegido (0,42 g, 0,014 mmol) em CH2CI2 anidro (4 mL a 0°C adicionou-se ácido trifluoracético (4 mL). A mistura resultante foi agitada a temperatura ambiente por 8 horas. Adicionou-se éter (100 mL) para a mistura de reação. O precipitado foi filtrado, lavado com éter e seco in vácuo rendendo um pó branco (0,35 g, 83%).
Exemplo 66
[00819]Este exemplo explica a síntese de mPEG-hidroxilamina apresentada na Figura 52A.
Figure img0202
[00820]A uma solução de mPEG(30K)-NH2 (6,0 g, 0,2 mmol) em DMF (60 mL adicionou-se Boc-Ser-OH (205 mg, 1,0 mmol), cloridrato de 1-etil-3-(3- dimetilaminopropil)carbodiimida (EDC, 190 mg, 1,0 mmol) e N,N'-diisopropiletilamina (0,17 mL, 1,0 mmol). A mistura é agitada a temperatura ambiente por 10 h e diluída com EtOAc (500 mL. A mistura resultante é lavada continuamente com NaHCO3 aquoso saturado (300 mL, H2O) (300 mL) e salmoura (300 mL), sendo seca sobre Na2SO4 anidro, filtrada e concentrada in vácuo. O resíduo é dissolvido em cloreto de metileno (50 mL, adicionando-se éter (700 mL). O precipitado é filtrado, lavado com éter e seco in vácuo rendendo um pó branco (5,1 g, 82%).
Figure img0203
[00821]A uma solução do mPEG(30K) supra (3,0, 0,1 mmol) em CH2Cl2 (15 mL) a 0°C adiciona-se ácido trifluoracético (15 mL). A mistura resultante é agitada a temperatura ambiente por 3 h e concentrada. Ao resíduo adiciona-se CH2Cl2 (5 mL) seguido por adição de HCl (4 N em dioxano, 2 mL). Adiciona-se éter (400 mL) ao precipitado diidroxilamina (2,6 g 85%) como um sólido branco.
Figure img0204
[00822]A uma solução do mPEG(30K) supra, (2,0, 0,067 mmol) em H2O- CH3CN (1:1, 20 mL) é adicionado NaIO4 (15 mg, 0,07 mmol). A mistura é agitada a temperatura ambiente por 4 h e diluída com CH2Cl2 (500 mL). A mistura resultante é lavada com H2O (100 mL) e salmoura (100 mL), em seguida seca sobre Na2SO4 anidro, filtrada e concentrada in vacuo. O resíduo é dissolvido em CH2Cl2 (50 mL). Adiciona-se éter (700 mL) ao precipitado que é filtrado, lavado com éter e seco in vácuorendendo um pó branco (1,8 g, 90%).
Figure img0205
[00823]A uma mistura de mPEG(30K) aldeído (0,5 g 0,0166 mmol) e ligante amina (73 mg, 0,25 mmol) em MeOH (10 mL) adicionou-se NaCNBH3 (20 mg, 0,30 mmol). A mistura resultante foi agitada a temperatura ambiente por 48 horas. Após a maioria do solvente ter sido removida, adicionou-se éter (200 mL). O precipitado foi filtrado, lavado com éter e seco in vácuopara render um pó branco (0,43 g, 86%).
Figure img0206
[00824]A uma solução do mPEG(30K) di-Boc protegido (0,42 g, 0,014 mmol) em CH2CI2 anidro (4 mL a 0°C adicionou-se ácido trifluoracético (4 mL). A mistura resultante foi agitada a temperatura ambiente por 8 horas. Adicionou-se éter (100 mL) para a mistura de reação. O precipitado foi filtrado, lavado com éter e seco in vácuorendendo um pó branco (0,35 g, 83%).
Exemplo 67
[00825]Este exemplo explica a síntese de mPEG-hidroxilamina apresentada na Figura 52B.
Figure img0207
[00826]A uma mistura de mPEG propionaldeído (30K, 0,5 g 0,0166 mmol) e ligante amina (70 mg, 0,25 mmol) em MeOH (10 mL) adicionou-se NaCNBH3 (20 mg, 0,30 mmol). A mistura resultante foi agitada a temperatura ambiente por 48 horas. Após a maioria do solvente ter sido removida, adicionou-se éter (200 mL). O precipitado foi filtrado, lavado com éter e seco in vácuo para render um pó branco (0,40 g, 80%).
Figure img0208
[00827]A uma solução do mPEG(30K) di-Boc protegido (0,40 g, 0,013 mmol) em CH2CI2 anidro (4 mL a 0°C adicionou-se ácido trifluoracético (4 mL). A mistura resultante foi agitada a temperatura ambiente por 8 horas. Adicionou-se éter (100 mL) para a mistura de reação . O precipitado foi filtrado, lavado com éter e seco in vácuo rendendo um pó branco (0,35 g, 87%).
Exemplo 68
[00828]Este exemplo explica a síntese de mPEG-hidroxilamina apresentada na Figura 53A.
Figure img0209
[00829]A uma solução agitada de mPEG(30K) (6,0 g 0,2 mmol) e piridina (0,1 mL, 1,2 mmol) em CH2CI2 (60 mL a 0°C adicionou-se periodinano de DessMartin (0,2 g, 0,47 mmol). A mistura foi agitada a temperatura ambiente durante a noite e resfriada com Na2S2O3-NaHCO3 aquoso saturado (1:1, 100 mL) sendo extraída com CH2Cl2 (400 mL) x 2). As camadas orgânicas foram separadas e lavadas com água e salmoura e secas sobre Na2SO4 anidro, filtradas e concentradas in vacuo. O resíduo é dissolvido em CH2Cl2 (50 mL). Adiciona-se éter (1L) para a solução. O precipitado é filtrado, lavado com éter e seco in vacuo rendendo um pó branco (4,9 g, 82%).
Figure img0210
[00830]A uma mistura de mPEG(30K) aldeído (0,5 g 0,0166 mmol) e ligante amina (70 mg, 0,25 mmol) em MeOH (10 mL) adicionou-se NaCNBH3 (20 mg, 0,30 mmol). A mistura resultante foi agitada a temperatura ambiente por 48 horas. Após a maioria do solvente ter sido removida, adicionou-se éter (200 mL). O precipitado foi filtrado, lavado com éter e seco in vácuopara render um pó branco (0,40 g, 80%).
Figure img0211
[00831]A uma solução do mPEG(30K) di-Boc protegido (0,40 g, 0,013 mmol) em CH2Cl2 anidro (4 mL a 0°C adicionou-se ácido trifluoracético (4 mL). A mistura resultante foi agitada a temperatura ambiente por 8 horas. Adicionou-se éter (100 mL) para a mistura de reação. O precipitado foi filtrado, lavado com éter e seco in vácuo rendendo um pó branco (0,35 g, 87%).
Exemplo 69
[00832]Este exemplo explica a síntese de mPEG-hidroxilamina apresentada na Figura 53B.
Figure img0212
[00833]A uma solução de mPEG(30K)-NH2 (6,0 g, 0,2 mmol) em DMF (60 mL adicionou-se Boc-Ser-OH (205 mg, 1,0 mmol), cloridrato de 1-etil-3-(3- dimetilaminopropil)carbodiimida (EDC, 190 mg, 1,0 mmol) e N,N'-diisopropiletilamina (0,17 mL, 1,0 mmol). A mistura é agitada a temperatura ambiente por 10 h e diluída com EtOAc (500 mL. A mistura resultante é lavada continuamente com NaHCO3 aquoso saturado (300 mL) H2O (300 mL) e salmoura (300 mL), sendo seca sobre Na2SO4 anidro, filtrada e concentrada in vácuo.O resíduo é dissolvido em cloreto de metileno (50 mL, adicionando-se éter (700 mL). O precipitado é filtrado, lavado com éter e seco in vácuorendendo um pó branco (5,1 g, 82%).
Figure img0213
[00834]A uma solução do mPEG(30K) supra (3,0, 0,1 mmol) em CH2Cl2 (15 mL) a 0°C adiciona-se ácido trifluoracético (15 mL). A mistura resultante é agitada a temperatura ambiente por 3 h e concentrada. Ao resíduo adiciona-se CH2Cl2 (5 mL) seguido por adição de HCl (4 N em dioxano, 2 mL). Adiciona-se éter (400 mL) ao precipitado diidroxilamina (2,6 g 85%) como um sólido branco.
Figure img0214
[00835]A uma solução do mPEG(30K) supra, (2,0, 0,067 mmol) em H2O- CH3CN (1:1, 20 mL) é adicionado NaIO4 (15 mg, 0,07 mmol). A mistura é agitada a temperatura ambiente por 4 h e diluída com CH2Cl2 (500 mL). A mistura resultante é lavada com H2O (100 mL) e salmoura (100 mL), em seguida seca sobre Na2SO4 anidro, filtrada e concentrada in vacuo. O resíduo é dissolvido em CH2Cl2 (50 mL). Adiciona-se éter (700 mL) ao precipitado que é filtrado, lavado com éter e seco in vácuorendendo um pó branco (1,8 g, 90%).
Figure img0215
[00836]A uma mistura de mPEG(30K) aldeído (0,5 g 0,0166 mmol) e ligante amina (70 mg, 0,25 mmol) em MeOH (10 mL) adicionou-se NaCNBH3 (20 mg, 0,30 mmol). A mistura resultante foi agitada a temperatura ambiente por 48 horas. Após a maioria do solvente ter sido removida, adicionou-se éter (200 mL). O precipitado foi filtrado, lavado com éter e seco in vácuo para render um pó branco (0,40 g, 80%).
Figure img0216
[00837]A uma solução do mPEG(30K) di-Boc protegido (0,40 g, 0,013 mmol) em CH2CI2 anidro (4 mL a 0°C adicionou-se ácido trifluoracético (4 mL). A mistura resultante foi agitada a temperatura ambiente por 8 horas. Adicionou-se éter (100 mL) para a mistura de reação. O precipitado foi filtrado, lavado com éter e seco in vácuo rendendo um pó branco (0,35 g, 87%).
Exemplo 70
[00838]Este exemplo explica a síntese de mPEG-hidroxilamina apresentada na Figura 54A.
Figure img0217
[00839]A uma mistura de mPEG(30K) propionaldeído (0,5 g 0,0166 mmol) e ligante amina (40 mg, 0,16 mmol) em MeOH (10 mL) adicionou-se NaCNBH3 (12 mg, 0,17 mmol). A mistura resultante foi agitada a temperatura ambiente por 60 horas. Após a maioria do solvente ter sido removida, o resíduo foi dissolvido em CH2Cl2 (200 mL) e lavado com ácido cítrico (5%, 100 mL). A camada orgânica foi seca sobre Na2SO4, filtrada e concentrada in vácuopara render um sólido branco (0,42 g, 84%).
Figure img0218
[00840]A uma mistura de mPEG ftalimida (30 K, 0,4 g, 0,013 mmol) em MeOH (4 mL) adicionou-se hidrazina (4,2 μL, 0,13 mmol). A mistura foi agitada a 45°C por 1,0 hora e concentrada. O resíduo foi dissolvido em CH2Cl2 (100 mL) e lavado com HCl aquoso (0,1 N, 100 mL). A camada aquosa foi extraída com CH2Cl2 (100 mL). As camadas orgânicas foram combinada e lavadas com água, a seguir secas sobre Na2SO4 anidro, filtrada e concentrada. O resíduo foi dissolvido em CH2Cl2 (5 mL). Adicionou-se éter (200 mL) para precipitar o produto hidroxilamina (0,34 g 85%) como um pó branco.
Exemplo 71
[00841]Este exemplo explica a síntese de mPEG-hidroxilamina apresentada na Figura 54B.
Figure img0219
[00842]A uma solução agitada de mPEG(30K) (6,0 g 0,2 mmol) e piridina (0,1 mL, 1,2 mmol) em CH2CI2 (60 mL a 0°C adicionou-se periodinano de DessMartin (0,2 g, 0,47 mmol). A mistura foi agitada a temperatura ambiente durante a noite e resfriada com Na2S2O3-NaHCO3 aquoso saturado (1:1, 100 mL) sendo extraída com CH2Cl2 (500 mL) x 2). As camadas orgânicas foram combinadas e lavadas com água e salmoura e secas sobre Na2SO4 anidro, filtradas e concentradas in vacuo. O resíduo é dissolvido em CH2Cl2 (50 mL). Adiciona-se éter (1L) para a solução. O precipitado é filtrado, lavado com éter e seco in vacuo rendendo um pó branco (4,9 g, 82%).
Figure img0220
[00843]A uma mistura de mPEG(30K) aldeído (0,5 g 0,0166 mmol) e ligante amina (40 mg, 0,16 mmol) em MeOH (10 mL) adicionou-se NaCNBH3 (12 mg, 0,17 mmol). A mistura resultante foi agitada a temperatura ambiente por 60 horas. Após a maioria do solvente ter sido removida, o resíduo é dissolvido em CH2Cl2 (200 mL). E lavado com ácido cítrico (5%) 100 mL). A camada orgânica é seca em Na2SO4 anidro, filtrada e concentrada in vácuorendendo um sólido branco (0,42 g, 84%).
Figure img0221
[00844]A uma mistura de mPEG(30 K) ftalimida, 0,4 g, 0,013 mmol) em MeOH (4 mL) adicionou-se H2NNH2 (4,2 μL, 0,13 mmol). A mistura foi agitada a 45°C por 1,0 hora e concentrada. O resíduo foi dissolvido em CH2Cl2 (100 mL) e lavado com HCl aquoso (0,1 N, 100 mL). A camada aquosa foi extraída com CH2Cl2 (100 mL). As camadas orgânicas foram combinadas e lavadas com água, a seguir secas sobre Na2SO4 anidro, filtrada e concentrada. O resíduo foi dissolvido em CH2Cl2 (5 mL). Adicionou-se éter (200 mL) para precipitar o produto hidroxilamina (0,34 g 85%) como um pó branco.
Exemplo 72
[00845]Este exemplo explica a síntese de mPEG-hidroxilamina apresentada na Figura 55.
Figure img0222
[00846]A uma solução de mPEG(30K)-NH2 (6,0 g, 0,2 mmol) em DMF (60 mL adicionou-se Boc-Ser-OH (205 mg, 1,0 mmol), cloridrato de 1-etil-3-(3- dimetilaminopropil)carbodiimida (EDC, 190 mg, 1,0 mmol) e N,N'-diisopropiletilamina (0,17 mL, 1,0 mmol). A mistura é agitada a temperatura ambiente por 10 h e diluída com EtOAc (500 mL. A mistura resultante é lavada continuamente com NaHCO3 aquoso saturado (300 mL), H2O (300 mL) e salmoura (300 mL), sendo seca sobre Na2SO4 anidro, filtrada e concentrada in vácuo. O resíduo é dissolvido em cloreto de metileno (50 mL, adicionando-se éter (700 mL). O precipitado é filtrado, lavado com éter e seco in vácuo rendendo um pó branco (5,1 g, 82%).
Figure img0223
[00847]A uma solução do mPEG(30K) supra (3,0, 0,1 mmol) em CH2Cl2 (15 mL) a 0°C adiciona-se ácido trifluoracético (15 mL). A mistura resultante é agitada a temperatura ambiente por 3 h e concentrada. Ao resíduo adiciona-se CH2Cl2 (5 mL) seguido por adição de HCl (4 N em dioxano, 2 mL). Adiciona-se éter (400 mL) ao precipitado diidroxilamina (2,6 g 85%) como um sólido branco.
Figure img0224
[00848]A uma solução do mPEG(30K) supra, (2,0, 0,067 mmol) em H2O- CH3CN (1:1, 20 mL) é adicionado NaIO4 (15 mg, 0,07 mmol). A mistura é agitada a temperatura ambiente por 4 h e diluída com CH2Cl2 (500 mL). A mistura resultante é lavada com H2O (100 mL) e salmoura (100 mL), em seguida seca sobre Na2SO4 anidro, filtrada e concentrada in vacuo. O resíduo é dissolvido em CH2Cl2 (50 mL). Adiciona-se éter (700 mL) ao precipitado que é filtrado, lavado com éter e seco in vácuorendendo um pó branco (1,8 g, 90%).
Figure img0225
[00849]A uma mistura de mPEG(30K) aldeído (0,5 g 0,0166 mmol) e ligante amina (40 mg, 0,16 mmol) em MeOH (10 mL) adicionou-se NaCNBH3 (12 mg, 0,17 mmol). A mistura resultante foi agitada a temperatura ambiente por 60 horas. Após a maioria do solvente ter sido removida, o resíduo é dissolvido em CH2Cl2 (200 mL) e lavado com ácido cítrico (5%, 100 mL). A camada orgânica é seca sobre Na2SO4, filtrada e concentrada in vácuopara render um sólido branco (0,42 g, 84%).
Figure img0226
[00850]A uma mistura de mPEG(30 K) ftalimida, 0,4 g, 0,013 mmol) em MeOH (4 mL) adicionou-se H2NNH2 (4,2 μL, 0,13 mmol). A mistura foi agitada a 45°C por 1,0 hora e concentrada. O resíduo foi dissolvido em CH2Cl2 (100 mL) e lavado com HCl (0,1 N, 100 mL). A camada aquosa foi extraída com CH2Cl2 (100 mL). As camadas orgânicas foram combinadas e lavadas com água, a seguir secas sobre Na2SO4 anidro, filtrada e concentrada. O resíduo foi dissolvido em CH2Cl2 (5 mL). Adicionou-se éter (200 mL) para precipitar o produto hidroxilamina (0,34 g 85%) como um pó branco.
Exemplo 73
[00851]Este exemplo explica a síntese de mPEG-hidroxilamina apresentada na Figura 56a.
Figure img0227
[00852]A uma mistura de mPEG(30K) propionaldeído (0,5 g 0,0166 mmol) e ligante amina (40 mg, 0,16 mmol) em MeOH (10 mL) adicionou-se NaCNBH3 (12 mg, 0,17 mmol). A mistura resultante foi agitada a temperatura ambiente por 60 horas. Após a maioria do solvente ter sido removida, o resíduo é dissolvido em CH2Cl2 (200 L) e lavado com ácido cítrico (5%), 100 mL). A camada orgânica é seca sobre Na2SO4, filtrada e concentrada in vácuo rendendo um sólido branco (0,41 g, 82%).
Figure img0228
[00853]A uma mistura de mPEG(30 K) ftalimida, 0,4 g, 0,013 mmol) em MeOH (4 mL) adicionou-se H2NNH2 (4,2 μL, 0,13 mmol). A mistura foi agitada a 45°C por 1,0 hora e concentrada. O resíduo foi dissolvido em CH2Cl2 (100 mL) e lavado com HCl (0,1 N, 100 mL). A camada aquosa foi extraída com CH2Cl2 (100 mL). As camadas orgânicas foram combinadas e lavadas com água, a seguir secas sobre Na2SO4 anidro, filtradas e concentradas. O resíduo foi dissolvido em CH2Cl2 (5 mL). Adicionou-se éter (200 mL) para precipitar o produto hidroxilamina (0,34 g 83%) como um pó branco.
Exemplo 74
[00854]Este exemplo explica a síntese de mPEG-hidroxilamina apresentada na Figura 56B.
Figure img0229
[00855]A uma solução agitada de mPEG(30K) (6,0 g 0,2 mmol) e piridina (0,1 mL, 1,2 mmol) em CH2Cl2 (60 mL a 0°C adicionou-se periodinano de DessMartin (0,2 g, 0,47 mmol). A mistura foi agitada a temperatura ambiente durante a noite e resfriada com Na2S2O3-NaHCO3 aquoso saturado (1:1, 100 mL) sendo extraída com CH2Cl2 (500 mL) x 2). As camadas orgânicas foram combinadas e lavadas com água e salmoura e secas sobre Na2SO4 anidro, filtradas e concentradas in vacuo. O resíduo é dissolvido em CH2Cl2 (50 mL). Adiciona-se éter (1L) para a solução. O precipitado é filtrado, lavado com éter e seco in vacuo rendendo um pó branco (4,9 g, 82%).
Figure img0230
[00856]A uma mistura de mPEG(30K) aldeído (0,5 g 0,0166 mmol) e ligante amina (40 mg, 0,16 mmol) em MeOH (10 mL) adicionou-se NaCNBH3 (12 mg, 0,17 mmol). A mistura resultante foi agitada a temperatura ambiente por 60 horas. Após a maioria do solvente ter sido removida, o resíduo é dissolvido em CH2Cl2 (200 mL), e lavado com ácido cítrico (5%) 100 mL). A camada orgânica é seca em Na2SO4 anidro, filtrada e concentrada in vácuorendendo um sólido branco (0,41 g, 82%).
Figure img0231
[00857]A uma mistura de mPEG(30 K) ftalimida, 0,4 g, 0,013 mmol) em MeOH (4 mL) adicionou-se H2NNH2 (4,2 μL, 0,13 mmol). A mistura foi agitada a 45°C por 1,0 hora e concentrada. O resíduo foi dissolvido em CH2Cl2 (100 mL) e lavado com HCl aquoso (0,1 N, 100 mL). A camada aquosa foi extraída com CH2Cl2 (100 mL). As camadas orgânicas foram combinadas e lavadas com água, a seguir secas sobre Na2SO4 anidro, filtrada e concentrada. O resíduo foi dissolvido em CH2Cl2 (5 mL). Adicionou-se éter (200 mL) para precipitar o produto hidroxilamina (0,34 g 83%) como um pó branco.
Exemplo 75
[00858]Este exemplo explica a síntese de mPEG-hidroxilamina apresentada na Figura 57.
Figure img0232
[00859]A uma solução de mPEG(30K)-NH2 (6,0 g, 0,2 mmol) em DMF (60 mL adicionou-se Boc-Ser-OH (205 mg, 1,0 mmol), cloridrato de 1-etil-3-(3- dimetilaminopropil)carbodiimida (EDC, 190 mg, 1,0 mmol) e N,N'-diisopropiletilamina (0,17 mL, 1,0 mmol). A mistura é agitada a temperatura ambiente por 10 h e diluída com EtOAc (500 mL. A mistura resultante é lavada continuamente com NaHCO3 aquoso saturado (300 mL), H2O (300 mL) e salmoura (300 mL), sendo seca sobre Na2SO4 anidro, filtrada e concentrada in vácuo.O resíduo é dissolvido em cloreto de metileno (50 mL, adicionando-se éter (700 mL). O precipitado é filtrado, lavado com éter e seco in vácuorendendo um pó branco (5,1 g, 82%).
Figure img0233
[00860]A uma solução do mPEG(30K) supra (3,0 g, 0,1 mmol) em CH2Cl2 (15 mL) a 0°C adiciona-se ácido trifluoracético (15 mL). A mistura resultante é agitada a temperatura ambiente por 3 h e concentrada. Ao resíduo adiciona-se CH2Cl2 (5 mL) seguido por adição de HCl (4 N em dioxano, 2 mL). Adiciona-se éter (400 mL) ao precipitado diidroxilamina (2,6 g 85%) como um sólido branco.
Figure img0234
[00861]A uma solução do mPEG(30K) supra, (2,0, 0,067 mmol) em H2O- CH3CN (1:1, 20 mL) é adicionado NaIO4 (15 mg, 0,07 mmol). A mistura é agitada a temperatura ambiente por 4 h e diluída com CH2Cl2 (500 mL). A mistura resultante é lavada com H2O (100 mL) e salmoura (100 mL), em seguida seca sobre Na2SO4 anidro, filtrada e concentrada in vacuo. O resíduo é dissolvido em CH2Cl2 (50 mL). Adiciona-se éter (700 mL) ao precipitado que é filtrado, lavado com éter e seco in vácuorendendo um pó branco (1,8 g, 90%).
Figure img0235
[00862]A uma mistura de mPEG(30K) aldeído (0,5 g 0,0166 mmol) e ligante amina (40 mg, 0,16 mmol) em MeOH (10 mL) adicionou-se NaCNBH3 (12 mg, 0,17 mmol). A mistura resultante foi agitada a temperatura ambiente por 60 horas. Após a maioria do solvente ter sido removida, o resíduo é dissolvido em CH2Cl2 (200 mL) e lavado com ácido cítrico (5%, 100 mL). A camada orgânica é seca sobre Na2SO4, filtrada e concentrada in vácuo para render um sólido branco (0,41 g, 82%).
Figure img0236
[00863]A uma mistura de mPEG(30 K) ftalimida, 0,4 g, 0,013 mmol) em MeOH (4 mL) adicionou-se H2NNH2 (4,2 μL, 0,13 mmol). A mistura foi agitada a 45°C por 1,0 hora e concentrada. O resíduo foi dissolvido em CH2Cl2 (100 mL) e lavado com HCl (0,1 N, 100 mL). A camada aquosa foi extraída com CH2Cl2 (100 mL). As camadas orgânicas foram combinadas e lavadas com água, a seguir secas sobre Na2SO4 anidro, filtradas e concentradas. O resíduo foi dissolvido em CH2Cl2 (5 mL). Adicionou-se éter (200 mL) para precipitar o produto hidroxilamina (0,34 g 83%) como um pó branco.
Exemplo 76
[00864]Este exemplo explica a síntese de mPEG-hidroxilamina apresentada na Figura 58A.
Figure img0237
[00865]A uma solução de mPEG(5K)-OH (1,0 g, 0,2 mmol), em CH2Cl2 (40 mL), adicionou-se trietilamina (110 μL, 0,79 mmol) e MsCl (50 μL, 0,64 mmol). A mistura foi agitada a temperatura ambiente por 10 horas sendo concentrada. O produto bruto (1,0 g) foi usado diretamente para a próxima etapa sem purificação.
Figure img0238
[00866]A uma solução do mPEG(5K)-OMs bruto (1,0 g, 0,2 mmol) em CH2Cl2 (10 mL), adicionou-se N-hidroxicarbamato de terc-butila (0,3 g, 2,2 mmol) e trietilamina (0,4 mL, 2,9 mmol). A mistura resultante foi agitada a 45°C por 10 horas e resfriada a temperatura ambiente. Adicionou-se éter (200 mL). O precipitado foi filtrado, lavado e seco in vácuo rendendo o produto (0,42, 42%) como um sólido branco.
Figure img0239
[00867]A uma solução de mPEG(5K)-ONHBoc (0,2 g, 0,04 mmol) em CH2Cl2 (3 mL) a °C foi adicionado ácido trifluoracético (7 mL). A mistura resultante foi agitada a temperatura ambiente por 1 horas e concentrada. Ao resíduo adicionou-se CH2Cl2 (5 mL) seguido por adição de HCl (4 N em dioxano, 2 mL). Adicionou-se éter (300 mL) para precipitar o derivado diidroxilamina PEG (170 mg, 85%) como um sólido branco.
Exemplo 77
[00868]Este exemplo explica em detalhe a síntese de mPeG-hdiroxilamina apresentada na Figura 58B.
Figure img0240
[00869]A uma solução de mPEG(30K)-OH (3,0 g, 0,1 mmol) em CH2Cl2 adicionou-se 2,6-lutidina (60 μL, 0,5 mmol) e Tf2O (65μL, 0,4 mmol). A mistura é agitada a temperatura ambiente por 10 horas. Adiciona-se éter (400 mL) para a mistura. O precipitado é filtrado, lavado com éter e seco in vácuo, rendendo um pó branco (2,7 g, 90%).
Figure img0241
[00870]A uma solução do mPEG(30K)-OTf (2.5 g, 0,083 mmol) em CH2Cl2 (25 mL), adicionou-se N-hidroxicarbamato de terc-butila (110 mg, 0,84 mmol) e diisopropiletilamina (0,2 mL, 1,1 mmol). A mistura resultante foi agitada a temperatura ambiente durante a noite. Adicionou-se éter (200 mL)para precipitar o produto (2,2 g 88%) como um sólido branco.
Figure img0242
[00871]A uma solução de mPEG(30K)-ONHBoc (2,0 g, 0,067 mmol) em CH2Cl2 (15 mL) a °C foi adicionado ácido trifluoracético (15 mL). A mistura resultante foi agitada a temperatura ambiente por 3 horas e foi concentrada. Ao resíduo adicionou-se CH2Cl2 (5 mL) seguido por adição de HCl (4 N em dioxano, 2 mL). Adicionou-se éter (300 mL) para precipitar o derivado diidroxilamina PEG (1,72 g, 86%) como um sólido branco.
Exemplo 78
[00872]Este exemplo explica em detalhe a síntese de mPEG-hdiroxilamina apresentada na Figura 59A.
Figure img0243
[00873]A uma solução de 2-(2-hidroxietoxi)ftalimida (0,5 g 2,4 mmol) em CH2Cl2 (20 mL) adicionou-se fosgênio (20% em tolueno, 8,0 mL, 15, 0 mmol) A mistura de reação foi agitada a temperatura ambiente por 10 horas sendo concentrada in vácuo. O resíduo (0,45 g 70%) foi usado diretamente na próxima reação sem purificação.
Figure img0244
[00874]A uma mistura de mPEG(30K)-NH2 (3 g, 0,1 mmoL) e ligante de cloroformiato (0,27 g 1,0 mmol) em CH2Cl2 (30 mL adicionou-se diisopropiletilamina (0,2 mL, 1,1 mmol). A mistura resultante foi agitada a temperatura ambiente por 15 horas. Adicionou-se éter (500 mL) para a mistura. O precipitado foi filtrado, lavado e seco in vácuorendendo o produto (2,7 g, 90% como um sólido branco.
Figure img0245
[00875]A uma mistura de mPEG(30K)ftalimida (2,1 g 0,07 mmol) em MeOH (15 mL) adicionou-se amônia (7 N em metanol, 15 mL). A mistura de reação foi agitada a temperatura ambiente por 15 horas sendo concentrada. Adicionou-se CH2Cl2 ao resíduo (5 mL) seguido pro adição de HCl (4N em dioxano, 1 mL), éter (300 mL) para precipitar o produto (2,4 g, 89% como um sólido branco.
Exemplo 79
[00876]Este exemplo explica a síntese de mPEG-hidroxilamina apresentada na Figura 59B.
Figure img0246
[00877]A uma solução de ácido (Boc-aminooxi)acético (3,0 g, 16 mmol) em CH2Cl2 (80 mL) adicionou-se N-N'-diisopropilcarbodiimida (DIC, 1,3 mL,8 mmol). A mistura foi agitada a temperatura ambiente por 1 hora e concentrada in vacuo. O produto bruto (4,9 g 84%) foi diretamente usado na próxima etapa sem mais purificação.
Figure img0247
[00878]A uma solução de anidrido (7,3 g 20 mmoL) em DMF (20 mL) adicionou-se mPEG(5K)-NH2 (20 g, 4 mmol) A mistura foi agitada a temperatura ambiente por 10 horas e diluída com água (200 ml). A mistura foi extraída com CH2Cl2 (500 mL). A camada orgânica foi lavada com água e salmoura (100 mL), a seguir seca sobre Na2SO4 anidro, filtrada e concentrada in vacuo. Ao resíduo adicionou-se CH2Cl2 (10 mL), seguido por éter (500 mL). O precipitado foi filtrado, lavado com éter e seco in vácuo rendendo o produto (19,8 g, 99%) como um pó branco.
Figure img0248
[00879]A uma solução de mPEG(5K) Boc protegido (1,0 g, 0,2 mmol) em CH2Cl2 (5 mL) adicionou-se ácido trifluoracético (5 mL). A mistura resultante foi agitada a temperatura ambiente por 1 hora e concentrada. Ao resíduo adicionou-se CH2Cl2 (2 mL) seguido por adição de HCl (4 N em dioxano, 0,1 mL) e éter (40 mL). O precipitado foi filtrado, lavado com éter e seco in vácuorendendo o produto (0,75 g, 75%).
Exemplo 80
[00880]Este exemplo explica a síntese de mPeG-hidroxilamina apresentada na Figura 60A.
Figure img0249
[00881]A uma solução de mPEG(30K)-OH (4,5 g 0,15 mmol) em CH2Cl2 (50 mL) adicionou-se fosgênio (20% em tolueno 1,6 mL, 3,0 mmol). A mistura de reação foi agitada a temperatura ambiente por 10 horas e concentrada in vácuo. O resíduo (4,2 g, 93%) foi usado diretamente na próxima reação sem purificação.
Figure img0250
[00882]Par uma mistura do mPEG(30K) ativado supra II (4,2 g, 0,14 mmol) e o ligante amina VIII (67 mg, 0,28 mmol) em DMF-CH2Cl2 (10 mL, 1:2) adicionou-se diisopropiletilamina (75 μL, 0,42 mol). Após a mistura resultante ser agitada a temperatura ambiente por 15 horas, adicionou-se éter (200 mL), sendo o precipitado filtrado, lavado com éter e seco in vácuorendendo o produto como um pó branco (3,8 g, 90%).
Figure img0251
[00883]A uma solução de mPEG(30K)ftalimida III (3,5 g 0,12 mmol) em MeOH (15 mL) adicionou-se amônia (7 N em metanol, 15 mL). A mistura de reação foi agitada a temperatura ambiente por 15 horas sendo concentrada. Adicionou-se CH2Cl2 ao resíduo (5 mL) seguido por adição de HCl (4N em dioxano, 1 mL), éter (300 mL) para precipitar o produto (3,0 g, 86% como um sólido branco.
Figure img0252
[00884]A uma solução de 2-hidroxietilcarbamato de terc-butila (2,8 mL, 18 mmol) em THF (60 mL), adicionou-se N-hidroxiftalimida (5,8 g, 36 mmol), trifenilfosfina (3,6 g, 27 mmol). A mistura de reação foi agitada a temperatura ambiente por 10 minutos sendo resfriada para 0°C. Azodicarboxilato de diisopropila (DIAD, 3,6 mL, 19 mmol) foi adicionado gota a gota via seringa em 1 hora. O banho de gelo foi removido e a mistura foi agitada durante a noite e concentrada. O sólido branco foi dissolvido em acetato de etila (100 mL.). A mistura de reação foi lavada continuamente com solução aquosa saturada de bicarbonato de sódio (2 X 50 mL), H2O (50 mL) e salmoura (50 mL), sendo seca sobre MgSO4 anidro, filtrada e concentrada in vacuo. O produto bruto foi purificado por cromatografia flash usando um sistema de cromatografia HORIZON™ de Biotage Inc. rendendo o composto titular com impurezas (12 g, 206%) com um sólido branco.
Figure img0253
[00885]A uma solução do ligante Boc-protegido bruto (12 g) em CH2Cl2 (5 ml) adicionou-se ácido trifluoracético (5 mL). A mistura foi agitada a temperatura ambiente por 1 hora, concentrando-se. Ao resido adicionou-se HCl (4N em dioxano, 1,5 mL) seguido por adição de Et2O éter (150 mL). O precipitado foi filtrado, lavado com éter e seco in vacuo rendendo o ligante amina (3,0 g 68% em duas etapas) como um sólido branco.
Exemplo 81
[00886]Este exemplo explica a síntese de mPEG-hidroxilamina apresentada na Figura 60B.
Figure img0254
[00887]A uma solução de mPEG(5K)-OH (10 g, 2,0 mmol), Ph3P (790 mg, 3,0 mmol) e N-hidroxiftalimida (0,49 g, 3,0 mmol) em CH2CI2 -THF (2:3, 45 mL) a 0°C adicionou-se azodicarboxilato de diisopropila DIAD, 409 μL, 2, mmol). Após a mistura ser agitada a temperatura ambiente por 15 horas, adicionou-se éter (1L) para a mistura. O precipitado foi filtrado, lavado com éter e seco in vácuo rendendo m-PEG(5K)-ftalimida (9,8 g 98%) como um pó branco.
Figure img0255
[00888]A uma solução de mPEG(5K) ftalimida (3 g, 0,6 mmol) em MeOH (25 mL) adicionou-se amônia (7 N em metanol, 25 mL). A mistura resultante foi agitada a temperatura ambiente por 15 horas sendo concentrada. Ao resíduo adicionou-se CH2Cl2 (5 mL) seguido por adição de HCl (4N em dioxano, 1 mL). Adicionou-se éter (300 mL) para precipitar o produto hidroxilamina (2,5 g 83%) como um pó branco.
Figure img0256
[00889]A uma solução de mPEG(30K)-OH (6 g, 0,2 mmol), Ph3P (80 mg, 0,3 mmol) e N-hidroxiftalimida (49 mg, 0,3 mmol) em CH2CI2 -THF (2:3, 45 mL) a 0°C adicionou-se azodicarboxilato de diisopropila DIAD, 41 μL, 0,2, mmol). Após a mistura ser agitada a temperatura ambiente por 15 horas, adicionou-se éter (200 mL) para a mistura. O precipitado foi lavado com éter e seco in vácuo rendendo m- PEG(30K)-ftalimida (5,8 g 96%) como um pó branco.
Figure img0257
[00890]A uma solução de mPEG(30K) ftalimida (3 g, 0,1 mmol) em MeOH (20 mL) adicionou-se amônia (7 N em metanol, 20 mL). A mistura resultante foi agitada a temperatura ambiente por 15 horas sendo concentrada. Ao resíduo adicionou-se CH2Cl2 (5 mL) seguido por adição de HCl (4N em dioano, 1 mL). Adicionou-se éter (300 mL) para precipitar o produto mPEG(30K)-ONH2 (2,6 g 87%) como um pó branco.
Exemplo 82
[00891]Este exemplo explica a síntese de mPEG-hidroxilamina apresentada na Figura 61A.
Figure img0258
[00892]A uma solução de 2-(2-(2-aminoetóxi)etóxi) etanamina (5,0 g 33,8 mmol) em DMF (100 mL) adicionou-se ácido Boc-aminoóxi)acético (14,2 g 74,2 mmol), cloridrato de 1-etill-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida (EDC, 28,5 g 0,15 mol) e N,N'-diisopropiletilamina (26 m, 0,15 mol), A mistura foi agitada a temperatura ambiente por 10 horas sendo diluída com EtOAc (500 mL). A mistura resultante foi lavada continuamente com NaHCO3 aquoso saturado (300 mL, água (300 mL) e salmoura (300 mL), sendo seca sobre Na2SO4 anidro, filtrada e concentrada in vácuo. O produto bruto (14,2 g, 85%) foi usado diretamente na próxima reação sem mais purificação.
Figure img0259
[00893]A uma solução do ligante di-Boc supra (3,0 g, 6,1 mmol) em cloreto de metileno (15 mL) a 0°C, adicionou-se ácido trifluoracético (15 mL). A mistura resultante foi agitada a temperatura ambiente por 3 horas e concentrada. Ao resíduo adicionou-se cloreto de metileno (5 ml) seguido por adição de HCl (4 N em dioxano, 2 mL), Adicionou-se éter (400 mL) para precipitar diidroxilamina (1,47 g 82%) como um sólido branco.
Exemplo 83
[00894]Este exemplo explica a síntese de mPEG-hidroxilamina apresentada na Figura 61B.
Figure img0260
[00895]A uma solução de trietileno glicol (1,5 g, 10 mmol) em THF (100 mL) a 0°C adicionou-se ph3P (8,0 g, 30 mmol) em N-hidroxiftalimida (4,9 g, 30 mmol). A mistura adicionou-se lentamente azodicarboxilato de diisopropila DIAD, 4,08 mL, 20 mmol). A mistura resultante foi agitada a 0°C por 4 horas a temperatura ambiente por 2 dias. Adicionou-se éter (25 mL para a mistura de reação. O precipitado foi lavado com éter e seco in vácuo rendendo o produto di-ftalimida (3,72 g, 82%) como um pó branco.
Figure img0261
[00896]A uma solução de di-ftalimida (2,2 g 5,0 mmol) em MeOH (20 ml) adicionou-se amônia (7N em metanol 20 mL). A mistura resultante foi agitada a temperatura ambiente pro 15 horas e concentrada. Ao resíduo adicionou-se CH2Cl2 (5 mL) seguido por adição de HCl (4 N em dioxano, 1 mL), adicionou-se éter (300 mL para precipitar o ligante tri(etileno glicol)diidroxilamina (1,1 g, 87%) como um sólido branco.
Exemplo 84
[00897]Este exemplo explica a síntese de mPEG-hidroxilamina apresentada na Figura 61C.
Figure img0262
[00898]A uma solução de tetraetileno glicol (1,94 g, 10 mmol) em THF (100 mL) a 0°C adicionou-se Ph3P (8,0 g, 30 mmol) em N-hidroxiftalimida (4,9 g, 30 mmol). A mistura adicionou-se lentamente azodicarboxilato de diisopropila DIAD, 4,08 mL, 20 mmol). A mistura resultante foi agitada a 0°C por 4 horas a temperatura ambiente por 2 dias. Adicionou-se éter (25 mL para a mistura de reação. O precipitado foi lavado com éter e seco in vácuo rendendo o produto di-ftalimida (3,58 g, 74%) como um pó branco.
Figure img0263
[00899]A uma solução de di-ftalimida (2,42 g 5,0 mmol) em MeOH (20 ml) adicionou-se amônia (7N em metanol 20 mL). A mistura resultante foi agitada a temperatura ambiente por 15 horas e concentrada. Ao resíduo adicionou-se CH2Cl2 (5 mL) seguido por adição de HCl (4 N em dioxano, 1 mL), adicionou-se éter (300 mL para precipitar o ligante tetra(etileno glicol)diidroxilamina (1,27 g, 85%) como um sólido branco.
Exemplo 85
[00900]Este exemplo explica a síntese de mPEG-hidroxilamina apresentada na Figura 62A.
Figure img0264
[00901]A uma solução de hexa(etileno glicol (2,82 g, 10 mmol) em THF (100 mL) a 0°C adicionou-se Ph3P (8,0 g, 30 mmol) em N-hidroxiftalimida (4,9 g, 30 mmol). A mistura adicionou-se lentamente azodicarboxilato de diisopropila DIAD, 4,08 mL, 20 mmol). A mistura resultante foi agitada a 0°C por 4 horas a temperatura ambiente por 2 dias. Adicionou-se éter (25 mL para a mistura de reação. O precipitado foi lavado com éter e seco in vácuo rendendo o produto di-ftalimida (4,40 77%) como um pó branco.
Figure img0265
[00902]A uma solução de di-ftalimida (2,86 g 5,0 mmol) em MeOH (20 ml) adicionou-se amônia (7N em metanol 20 mL). A mistura resultante foi agitada a temperatura ambiente por 15 horas e concentrada. Ao resíduo adicionou-se CH2Cl2 (5 mL) seguido por adição de HCl (4 N em dioxano, 1 mL), adicionou-se éter (300 mL para precipitar o ligante hexa(etileno glicol)diidroxilamina (1,68 g, 87%) como um sólido branco.
Exemplo 86
[00903]Este exemplo explica a síntese do composto mPEG apresentado na Figura 62B.
Figure img0266
[00904]A uma solução de mPEG-OH (30K 3,0 g, 0,1 mmol) em CH2Cl2 anidro (30 mL0 adicionou-se difosgenio (63 μL, 0,5 mmol). A mistura foi agitada a temperatura ambiente durante a noite. Adicionou-se éter (700 mL para precipitar mPEG. O produto foi filtrado, lavado com éter e seco in vacuo (3,0 g 100%).
[00905]Os exemplos a seguir descrevem métodos para medir e comparar a atividade in vitro e in vivo de um polipeptídeo de aminoácido não natural terapeuticamente modificado para a atividade in vitro e in vivo de um polipeptídeo de aminoácido natural terapeuticamente ativo.
Exemplo 87: Ensaios de Ligação Celular
[00906]Células (3 x 106) são incubadas em duplicata em PBS 1% BSA 100 μl) na ausência ou presença de várias concentrações (volume: 10 μL ou GH não rotulado, hGH ou GM-CSF e na presença de I125-GH (aproximadamente 100.000 cpm ou 1 ng) a 0°C por 90 minutos (volume total: 120 μL). As células são a seguir resuspensas e feitas em camada em FCS resfriado em gelo (200 μl) num tubo centrífugo de plástico de 350 μl (1000 g, 1 minuto). A pelota é coletada por corte da extremidade do tubo e a pelota e o sobrenadante contados em separado num contador gama (Packard).
[00907]A ligação específica (cpm) é determinada como ligação total na ausência de um competidor (média de duplicatas (menos a ligação (cpm) na presença de excesso de 100 vezes de GH não rotulado (ligação não específica). A ligação não específica é medida para cada um dos tipos de célula empregados. Os experimentos são realizados em dias separados usando a mesma preparação de I125-Gh e devem apresentar consistência interna. I125GH demonstra ligação para células produtoras de receptor GH. A ligação é inibida num modo dependente de dose por GH ou hGH natural não rotulado, mas não por GM-CSF ou outro controle negativo. A capacidade de hGH em competir para ligação de I125-GH natural, similar ao GH natural sugere que, os receptores reconhecem ambas as formas igualmente bem.
Exemplo 88: Estudos In Vivo de hGH PEGuilado
[00908]PEG-hGH, hGH não modificado e solução tampão são administrados a camundongos ou a ratos. Os resultados demonstrarão atividade superior e meia-vida prolongada do hGH PEGuilado da presente invenção, comparado com hGH não modificado que é indicado por peso corporal significativamente aumentado.
Exemplo 89: Medição da Meia-Vida in vivo de hGH Conjugado e Não- conjugado e Suas Variantes
[00909]Todos os experimentos com animais são realizados numa instalação confiável AAALAC sob protocolos aprovados pelo Institutional Animal Care and Use Committee of St. Louis University. Os ratos são enjaulados individualmente em gaiolas em compartimentos com um ciclo de 12 horas claro/escuro. Aos animais é dado acesso a ração 5001 de roedores Purina certificada e água à vontade. Para ratos hipofisectomizados, a água potável contém adicionalmente glicose a 5%.
Exemplo 90: Estudos Farmacocinéticos
[00910]A qualidade de cada hGH mutante PEGuilado foi avaliada por três ensaios antes do experimento animal. A pureza do PEG-hGH foi examinada com um gel de acrilamida NuPAG Bis-Tris a 4-12% com tampão MES SDS sob condições não redutoras (Invitrogen, Carlsbad, CA). Os geles foram manchados com azul de Coomassie. A faixa PEG-hGH teve uma pureza maior que 95% com base na varredura de densitometria. O nível de endotoxina em cada PEG-hGH foi testado por um ensaio LAL cinético usando o kit KTA2de Charles River Laboratories (Wilmington , MA), e foi menor do que 5 EU por dose. A atividade biológica de Peg- hGH foi avaliada com um bioensaio IM-9 pSTAT5 e o valor EC50 foi confirmado ser menor do que 15 nM.
[00911]As propriedades farmacocinéticas de compostos do hormônio do crescimento modificados com PEG foram compradas entre si e ao hormônio do crescimento não PEGuilado em ratos Sprague-Dawley (261-425 g) obtidos de Charles River Laboratories. Os cateteres foram cirurgicamente instalados na artéria carótida para coleta de sangue. Seguinte a instalação do cateter bem sucedida, os animais foram enviados a grupos de tratamento (três a seis por grupo ) antes da dosagem. Os animais foram dosados subcutaneamente com 1 mg/kg do composto num volume de dose de 0,41 - 0,55 ml,kg. Amostras de sangue foram coleadas em vários pontos no tempo por meio do cateter inserido e aos tubos de microcentrífuga revestidos com EDTA. O plasma foi coleado após centrifugação, e armazenado a - 80°C até análise. Concentrações do composto foram medida usando kits ELISA de hormônio do crescimento entremeados com anticorpo de, ou BioSource International (Camarillo, CA) ou Diagnostic Systems Laboratories (Webster, TX). AS concentrações foram calculadas usando padrões correspondentes ao análogo que foi dosado. Parâmetros farmacocinéticos foram estimados usando o programa de modelagem WinNonlin (Pharsight, versão 4.1). Análise não compartmental com integração trapezoidal linear-up/log-down foi usada e os dados da concentração foram pesados num modo uniforme.
[00912]Foram obtidas concentrações plasmáticas a intervalos regulares seguinte uma dose subcutânea em ratos. Aos ratos (n = 3-6 por grupo) foi dada uma dose única de bolo de proteína 1 mg/kg. Proteína do tipo selvagem hGH (WHO hGH, polipeptídeo hGH identificado para His (his-hGH), ou polipeptídeo hGH identificado para His compreendendo aminoácido não natural para-acetilfenilalanina ligado covalentemente a PEG de 30kDA em cada um de seis posições diferente foram comparados a WHO hGH e (his)-hGH. Amostras do plasma foram retiradas durante intervalos de tempo regulares e ensaiados para o composto injetado conforme descrito. A tabela 3 abaixo mostra os valores de parâmetro farmacocinético para administração de única dose dos vários polipeptídeo hGH. As curvas de concentração versus tempo foram avaliadas por análise não compartmental (Pharsight, versão 41). Os valores mostram as médias (+/- desvio padrão). Cmax: concentração máxima; terminaltl/2 : meia-vida terminal; AUC0>inf: área sob a curva concentração/tempo extrapolada ao infinito; MRT: tempo de residência médio; Cl/f: depuração no plasma total, aparente; Vz/f: volume aparente de distribuição durante a fase terminal. PEG-pAF92 30 K (his)hGH foi observaddo a prolongar, dramaticamente a circulação, aumento da meia-vida séria e aumento da biodisponibilidade comparado a hGH de controle. Tabela 3: Valores de parâmetro farmacocinéticos para administração de bolo de dose única (1 mg/kg) s.c em ratos Sprague-Dawley machos
Figure img0267
Exemplo 91: Estudos farmacocinéticos
[00913]Ratos Sprague-Dawley machos hipofisectomizados forma obtidos de Charles River Laboratories. As pituitárias foram cirurgicamente removida em 3-4 semanas de idade. Os animais com um ganho de peso corpóreo de 0-8 g durante u período de sete dias antes do início do teste foram incluídos e aleatorizados nos grupos de tratamento. Aos ratos administrou-se, ou uma dose de bolo ou uma dose diária subcutânea. Por todo o teste, os ratos foram pesados diariamente e em seqüência, anestesiados, sangrados e dosados (quando aplicável). O sangue foi coletado do sinus orbital usando um tubo capilar heparinizado e colocado num tubo de microcentrífuga revestido com EDTA. O plasma foi isolado por centrifugação e armazenado a -80°C até análise. As concentrações médias (+/- S.D) no plasma foram plotadas versus intervalos de tempo.
[00914]O peptídeo IGF-1 é um membro da família de somatomedinas ou fatores do crescimento similar à insulina. IGF-1 media muitos efeitos de promoção do crescimento do hormônio do crescimento. As concentrações de IGF-1 foram medidas usando um kit de imunoensaio enzimático de ligação competitiva contra os padrões proporcionados de IGF-1 de rato/camundongo (Diagnostic Systems Laboratories. Aos ratos hipofisectomizados (n = 5-7 por grupo ) deu-se ou uma dose única ou dose diária s.c. Os animais foram pesados em seqüência, anestesiados, sangrados e dosados (quando for o caso), diariamente. Os resultados de peso corpóreo são tirados para tratamentos de placebo, hGH do tipo selvagem (hGH, hGH indicado pra His (his-hGH) e polipeptídeos hGH compreendendo p-acetil- fenilalanina covalentemente ligado a PEG de 30 kDA nas posições 35 e 92. O peso corpóreo ganho no dia 9 para 30KPEG-pAF35(his)hGH foi observado ser estatisticamente diferente (p<0,0005) do composto 30KPEG-pAF92(his)hGH, no fato de ter-se observado maior ganho de peso. O efeito nos níveis de IGF-1 no plasma circulante após administração de uma única dose de polipeptídeos hGH compreendendo um aminoácido não naturalmente codificado, ou seja, PEGuilado, com significante diferença determinada pelo teste t usando duas distribuições de duas extremidades em par, de igual variância.
Exemplo 92: Teste Clínico Humano de Segurança e/ou Eficácia de hGH PEGuilado Compreendendo um Aminoácido Não-Naturalmente codificado
[00915]Objetivo: A fim de comparar a segurança e farmacocinéticas de hGH humano PEGuilado recombinante administrado s.c, compreendendo um aminoácido não naturalmente codificado com um ou mais dos produtos comercialmente disponíveis (incluindo sem limitação, a Humatrope™ (Eli Lilly & Co), Nutropin™ Genentech), Norditropin™ (Novo-Nordisk), Genotropin™ (Pfizer) e Saisen- Serostim™ (Serono)).
[00916]Pacientes: Dezoito voluntários saudáveis variando entre 20-40 anos de idade e pesando entre 60-90 kg são classificados no teste. Os indivíduos não terão valores de laboratório anormais clinicamente significativos para hematologia ou química do soro, e uma seleção toxicológica de urina negativa, teste HIV, e antígeno de superfície G para hepatite. Eles não poderão ter qualquer evidencia dos seguintes: hipertensão; uma história de qualquer doença hematológica primária; histórico de hepatite significativa, doença renal, cardiovascular, gastrintestinal, geniturinária, metabólica doença neurológica; uma história de anemia ou distúrbio de enfermidade; uma sensibilidade conhecida para produtos derivados de bactéria ou mamífero, PEG ou albumina séria humana, consumidor habitual e pesado de bebidas contendo cafeína; participação em qualquer outro teste clínico ou ter feito transfusão de sangue ou doado em 30 dias do início do teste; ter exposição a hGH em três meses do início do teste; ter uma doença em sete dias do início do teste; e ter anormalidades significativas no exame físico de pré-teste ou avaliações laboratoriais clínicos em 14 dias do início do teste. Todos os indivíduos são avaliados quanto a segurança e todas as coletas de sangue para análise farmacocinéticas são coletadas conforme programado. Todos os testes são realizados com aprovação do comitê de ética institucional e consentimento do paciente.
Planejamento do Teste
[00917]Este será um teste de Fase I, de único centro, de rótulo aberto, aleatorizado, de permuta em dois períodos em voluntários machos saudáveis. Dezoito indivíduos são aleatoriamente destinados a um ou dois grupos de seqüência de tratamento (nove indivíduos/grupo). GH é administrado durante dois períodos de dose separados como uma injeção de bolo s.c. na coxa superior usando doses equivalentes de hGH PEGuilado compreendendo um aminoácido não naturalmente codificado e o produto comercialmente disponíveis escolhido. A dose e freqüência de administração do produto comercialmente disponíveis é de acordo com as instruções do fabricante. A dosagem adicional freqüência de dosagem ou outros parâmetros, conforme desejado, usando os produtos comercialmente disponíveis podem ser adicionados ao teste por inclusão de grupos adicionais de indivíduos. Cada período de dosagem é separado por um período de depuração de 14 dias. Os indivíduos são confinados ao centro de teste pelo menos 12 horas antes e 72 horas seguinte a dosagem para cada um dos dois períodos de dosagem, mas não entre os períodos de dosagem. Grupos adicionais de indivíduos podem ser adicionados caso deva acontecer dosagem adicional, freqüência ou outros parâmetros, para serem testados para o hGH PEGuilado, também. Formulações múltiplas de GH que são aprovadas para uso humano podem ser usadas neste teste. Humatrope™ (Eli Lilly & Co), Nutropin™ Genentech), Norditropin™ (Novo-Nordisk), Genotropin™ (Pfizer) e Saisen-Serostim™ (Serono)) são produtos de GH comercialmente disponíveis para uso humano. A formulação experimental de hGH é o hGH PEGuilado compreendendo um aminoácido não naturalmente codificado.
[00918]Amostragem de sangue: amostras de sangue serial é retirada por punção da veia antes e após administração de hGH. As amostras de sangue venoso (5 mL) para determinação das concentrações de GH no soro são obtidas em aproximadamente 30, 20 e 10 minutos antes da dosagem (3 amostras de linha de referência) e em aproximadamente os tempos a seguir após dosagem: 30 minutos e em 1, 2, 5, 8, 12, 15, 18, 24, 30, 36, 48, 60 e 72 horas. Cada mostra de soro é dividida em duas alíquotas. Todas as amostras de soro são armazenadas a -20°C. As amostras de soro são transportadas em gelo seco. Testes clínicos de laboratório (hematologia, química do soro, e urinálise) são realizados imediatamente antes da dose inicial no dia 1, na manhã do dia 4, imediatamente antes da dosagem no dia 16 e na manhã do dia 19.
[00919]Métodos Bioanalíticos Um procedimento de kit ELISA (Diagnostic Systems Laboratory [DSL], Webster TX), é usado para determinar as concentrações de GH no soro.
[00920]Determ inações de Segurança Sinais vitais são registrados imediatamente antes de cada dosagem (dias 1 e 16), e em 6, 24, 48 e 72 horas após cada dosagem. Determinações de segurança são baseados na incidência e no tipo de eventos adversos e nas mudanças nos testes clínicos laboratoriais da linha de referência. Além disso, alterações de pré-teste nas medições de sinal vital, incluindo pressão sanguínea e resultados de exame físicos são avaliados.
[00921 ]Análise de Dados Valores de concentração séria pós-dose são corrigidos para concentrações de GH da linha de referência na pré-dose por subtração de cada um dos valores de pós-dose, a concentração de gH da linha de referência média determinada da média dos níveis de GH de três amostras coletadas em 30, 20 e 10 minutos antes da dosagem. As concentrações de gH séricas na pré-dose não estão incluídas no cálculo do valor médio caso estejam abaixo no nível de quantificação do ensaio. Parâmetros farmacocinéticos são determinados dos dados de concentração no soro corrigidos para concentrações de GH da linha de referência. Parâmetros farmacocinéticos são calculados por métodos independentes de modelo num sistema computacional Digital Equipment Corporation VAS 8600 usando a última versão do sofware BIOAVL. Os seguintes parâmetros farmacocinéticos são determinados: concentração séria de pico (Cmax); tempo para concentração (tmax) sérica de pico; área sob a curva concentração versus tempo (AUC) do tempo zero até o último tempo de amostragem de sangue (AUC0-72) calculada com o uso de regra trapezoidal linear; e meia-vida de eliminação terminal (t1-2) computada da constante de taxa de eliminação. A constante de taxa de eliminação é estimada por regressão linear de pontos de dados consecutivos na região linear terminal do gráfico concentração-tempo log-linear. A média, desvio padrão (SD) e coeficiente de variação (CV) dos parâmetros farmacocinéticos são calculados para cada tratamento. O coeficiente das médias de parâmetros (formulação preservada/formulação não preservada) é calculado.
Resultados de Segurança
[00922]A incidência de eventos adversos é igualmente distribuída por todos os grupos de tratamento. Não há alterações clinicamente significativas da linha de referência ou testes laboratoriais clínicos no pré-teste ou pressões sangüíneas, e nenhuma alteração visível do pré-teste nos resultados de exame físicos e medições de sinal vital. Os perfis de segurança para os dois grupos de tratamento devem parecer similares.
[00923]Resultados Farmacocinéticos: A média dos Perfis de concentração- tempo de GH no soro (não corrigido para níveis GH de referência) em todos os 18 indivíduos após receberem ma única dose de um ou mais dos produtos comercialmente disponíveis de hGH (incluindo, sem limitação, a Humatrope™ (Eli Lilly & Co), Nutropin™ Genentech), Norditropin™ (Novo-Nordisk), Genotropin™ (Pfizer) e Saisen-Serostim™ (Serono)) são comparados ao hGH PEGuilado compreendendo um aminoácido não naturalmente codificado em cada ponto de tempo medido. Todos os indivíduos devem ter concentrações de GH de referência na pré-dose dentro da faixa fisiológica normal. Parâmetros farmacocinéticos são determinados dos dados no soro, corrigidos para concentrações de GH de referência médios na pré-dose e determina-se a Cmax e tmax. A tmax média para comparações clínicas escolheram (Humatrope™ (Eli Lilly & Co), Nutropin™ (Genentech), Norditropin™ (Novo-Nordisk), Genotropin™ (Pfizer) e Saisen- Serostim™ (Serono)) é significantemente mais curta do que a tmax para hGH PEGuilado compreendendo o aminoácido não naturalmente codificado. Valores de meia-vida terminais são significantemente mais curtos para produtos hGH comercialmente disponíveis testados, comparado com a meia-vida terminal para hGH PEGuilado compreendendo um aminoácido não naturalmente codificado.
[00924]Embora o presente estudo seja realizado em indivíduos machos saudáveis, características de absorção similares e perfis de segurança seriam antecipados em outras populações de paciente, tais como pacientes macho ou fêmea com câncer ou falha renal crônica, pacientes com falha renal pediátrica, pacientes em programas de pré-depósito autólogos ou pacientes programados para cirurgia eletiva.
[00925]Concluindo-se, doses únicas administradas s.c de hGH PEGuilado compreendendo aminoácido não naturalmente codificado serão seguras e bem toleradas por indivíduos macho saudáveis. Com base numa incidência comparativa de eventos adversos, valores laboratoriais clínicos, sinais vitais e resultados de exame físicos, os perfis de segurança das formas comercialmente disponíveis de hGH e hGH PEGuilado compreendendo aminoácido não naturalmente codificado serão equivalentes. O hGh PEGuilado compreendendo aminoácido não naturalmente codificado proporcionará potencialmente, grande utilidade clínica a pacientes e profissionais da saúde.
Exemplo 93: Comparação da solubilidade em água de hGH PEGuilado e hGH não-PEGuilado
[00926]A solubilidade em água de proteína do tipo selvagem hGH (WHO hGH), polipeptídeo hGH His-identificado compreendendo aminoácido não natural p- acetil-fenilalanina covalentemente ligado a PEG de 30 kDA na posição 92 são obtidos por determinação da quantidade dos respectivos polipeptídeos que podem dissolver em 100 μL de água. A quantidade de hGH PeGuilado é maior do que as quantidades para hGH WHO e hGH que mostram que a PEGuilação dos polipeptídeos de aminoácido não natural aumenta a solubilidade em água.
Exemplo 94: Estudos in vivo de polipeptídeo de aminoácido não natural terapeuticamente ativo modificado
[00927]Xenoenxertos de tumor de câncer da próstata são implantados em camundongos que são a seguir separados em dois grupos. Um grupo é tratado diariamente com um polipeptídeo de aminoácido não natural terapeuticamente ativo modificado e o outro grupo é tratado diariamente com polipeptídeo de aminoácido não natural terapeuticamente ativo. O tamanho do tumor é medido diariamente e o polipeptídeo de aminoácido não natural terapeuticamente ativo modificado obtém eficácia terapêutica melhorada, comparado ao polipeptídeo de aminoácido não natural terapeuticamente ativo, conforme indicado por uma diminuição no tamanho do tumor para o grupo tratado com o polipeptídeo de aminoácido não natural terapeuticamente ativo modificado.
Exemplo 95: Estudos in vivo de polipeptídeo de aminoácido não natural terapeuticamente ativo modificado
[00928]Xenoenxertos de tumor de câncer da próstata são implantados em camundongos que são a seguir separados em dois grupos. Um grupo é tratado diariamente com um polipeptídeo de aminoácido não natural terapeuticamente ativo modificado e o outro grupo é tratado diariamente com polipeptídeo de aminoácido não natural terapeuticamente ativo. O tamanho do tumor é medido diariamente e o polipeptídeo de aminoácido não natural terapeuticamente ativo modificado obtém eficácia terapêutica melhorada, comparado ao polipeptídeo de aminoácido não natural terapeuticamente ativo, conforme indicado por uma diminuição no tamanho do tumor para o grupo tratado com o polipeptídeo de aminoácido não natural terapeuticamente ativo modificado.
[00929]Fica subentendido que, os exemplos e modalidades aqui descritos são dados para fins ilustrativos apenas, e, que, várias modificações ou alterações à luz dos mesmos, serão sugeridos pelos versados na técnica e devem ser incluídos no espírito e alcance deste pedido, bem como no escopo das reivindicações apensas. Todas as publicações, patentes e pedidos de patente aqui citados estão ora incorporados a título de referência em sua totalidade para os fins aplicáveis. LISTAGEM DE SEQUÊNCIA
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Claims (19)

1. Composto ou um sal do mesmo CARACTERIZADO pelo fato de que compreende a Fórmula (I):
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em que: A é opcional e quando presente é C1-C8 alquileno inferior, C1-C8 alquileno inferior substituído, cicloalquileno inferior, cicloalquileno inferior substituído, alquenileno inferior, alquenileno inferior substituído, alquinileno, heteroalquileno inferior, heteroalquileno substituído, heterocicloalquileno inferior, heterocicloalquileno inferior substituído, arileno, arileno substituído, heteroarileno, heteroarileno substituído, alcarileno, alcarileno substituído, aralquileno ou aralquileno substituído; B é opcional e quando presente é um ligante selecionado a partir do grupo que consiste em C1-C8 alquileno inferior, C1-C8 alquileno inferior substituído, alquenileno inferior, alquenileno inferior substituído, heteroalquileno inferior, heteroalquileno inferior substituído, -O-, -O-(alquileno C1-C10 ou alquileno C1-C10 substituído)-, -S-, -S-(alquileno C1-C10 ou alquileno C1-C10 substituído)-, -S(O)k-, em que k é 1, 2 ou 3, -S(O)k(alquileno C1-C10 ou alquileno C1-C10 substituído)-, - C(O)-, -C(O)-(alquileno C1-C10 ou alquileno C1-C10 substituído)-, -C(S)-, -C(S)- (alquileno C1-C10 ou alquileno C1-C10 substituído)-, -N(R')-, NR'-(alquileno C1-C10 ou alquileno C1-C10 substituído)-, -C(O)N(R')-, -CON(R')-(alquileno C1-C10 ou alquileno C1-C10 substituído)-, -CSN(R')-, -CSN(R')-(alquileno C1-C10 ou alquileno C1-C10 substituído)-, -N(R')CO-(alquileno C1-C10 ou alquileno C1-C10 substituído)- -N(R')C(O)O-, -S(O)KN(R')-, N(R')C(O)N(R')-, -N(R')C(S)N(R')-, -N(R')S(O)KN(R')-, - N(R')-N=, -C(R')=N-, -C(R')=N-N(R')-, -C(R')=N-N=, -C(R')2N=N- e -C(R')2-N(R')- N(R')-, em que cada R'é independentemente H, alquila C1-C10 ou alquila C1-C10 substituída;
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R é H, alquila C1-C10, alquila C1-C10 substituída, cicloalquila ou cicloalquila substituída; cada R"é independentemente H, alquila C1-C10, alquila C1-C10 substituída ou um grupo protetor, em que o grupo protetor é selecionado a partir de alila, benzila, benziloxicarbonila, aliloxicarbonila, metila, etila, terc-butila, terc- butildimetilsilila, (trimetilsilila)etoxicarboniloxi, terc-butiloxicarbonila, éter para- metoxibenzila, tritila, acetila ou 9-fluorenilmetoxicarbonila; R1 é H, um grupo amino protetor, resina, aminoácido, polipeptídeo ou polinucleotídeo, em que o grupo amino protetor é selecionado a partir de terc- butoxicarbonila e 9-fluorenilmetoxicarbonila; e R2 é 0H, um grupo éster protetor, resina, aminoácido, polipeptídeo ou polinucleotídeo, em que o grupo éster protetor é selecionado a partir de benzila, metila, etila e terc-butila; cada um de R3 e R4 é independentemente H, halogênio, alquila inferior C1C8, ou alquila inferior C1-C8 substituída ou R3 e R4 ou dois grupos R3 formam opcionalmente uma cicloalquila ou uma heterocicloalquila; ou os grupos -A-B-J-R formam juntos uma cicloalquila ou heterocicloalquila bicíclica ou tricíclica compreendendo pelo menos um grupo carbonila, incluindo um grupo dicarbonila; ou o grupo -J-R forma junto uma cicloalquila ou heterocicloalquila monocíclica ou bicíclica compreendendo pelo menos um grupo carbonila, incluindo um grupo dicarbonila; com a condição de que quando A é fenileno e cada R3 é H, B está presente; e que quando A é -(CH2)4- e cada R3 é H, B não é -NHC(O)(CH2CH2)-; e que quando A e B estão ausentes e cada R3 é H, R não é metila; em que “alquileno” inclui “heteroalquileno”; em que “cicloalquila inferior” é uma versão cíclica de “alquila inferior”; em que “cicloalquileno inferior” é um radical divalente derivado de cicloalquila inferior; em que “arileno” é um radical arila divalente; em que “substituído” se refere a moléculas com grupos substituintes que podem ser usados para substituir um outro grupo na molécula, em que os grupos substituintes podem ser selecionados dentre halo, C1-C10 alquila, C2-C10 alquenila, C2-10 alquinila, C1-10 alcóxi, C5-12 aralquila, C3-12 cicloalquila, C4-12 cicloalquenila, fenila, toluolila, xilenila, bifenila, C2-12 alcoxialquila, C5-12 alcoxiarila, C5-12 ariloxialquila, C7-12 oxiarila, C1-6 alquilsulfinila, C1-10 alquilsulfonila, -(CH2)m-O-(C1-10 alquila) onde m é de 1 a 8, arila contendo de 5 a 20 átomos no anel, fluoralquila, radical heterocíclico, nitroalquila, -NO2, -CN, - NR'"C(O)-(Ci-io alquila), -C(O)-(Ci-io) alquila), C2-10 alquiltioalquila, -C(O)O-(Ci-io alquila) -OH, SO2, =S, -COOH, -NR"2, carbonila, -C(O)-(Ci-io alquila)CF3, -C(O)-CF3, -C(O)NR"2 -(C1-10 arila)-S-(C6-io arila), -C(O)-(C6-10 arila), -(CH2)m-O-(CH2)m-O-(C1-10 alquila) onde cada m é de 1 a 8, - C(O)NR"2, -C(S)NR'"2, -SO2NR'"2, -NRC(O)NR'"2, -NRC(S)NR'"2 e sais destes, em que cada grupo R" na lista precedente pode ser selecionado dentre H, C1-C10 alquila, arila contendo de 5 a 20 átomos no anel, ou alcarila; em que radicais “alquila substituído” ou “heteroalquila substituído” são substituídos por grupos substituintes que podem ser selecionados dentre -ORiv, =O, =NRiv, =N-ORiv, -NRiv2, -SRiv, -halogênio, -SiRiv3, -OC(O)Riv, -C(O)Riv, -CO2Riv, - CONRiv2, -OC(O)NRiv2, -NRivC(O)Riv, -NRivC(O)NRiv2, -NRiv(O)2Riv, -NRiv-C(NRiv2)= NRiv, -S(O)Riv, -S(O)2Riv, -S(O)2NRiv2, -NRivS02Riv, -CN e -NO2, em que cada grupo Riv na lista anterior pode ser selecionado dentre hidrogênio, heteroalquila, arila contendo de 5 a 20 átomos no anel, C1-C10 alquila, alcoxi ou grupos tioalcoxi, ou grupos aralquila e, quando dois grupos Riv estão ligados ao mesmo átomo de nitrogênio, eles podem ser combinados com o átomo de nitrogênio para formar um anel de 5, 6 ou 7 membros; e em que os grupos “arila substituído” ou “heteroarila substituído” são substituídos por grupos substituintes que podem ser selecionados dentre -ORv, =O, =NRv, =N-ORv, -NRv2, -SRv, -halogênio, -SiRv3, -OC(O)Rv, -C(O)Rv, -CO2Rv, - CONRv2, -OC(O)NRv2, -NRvC(O)Rv, -NRvC(O)NRv2, -NRv(O)2Rv, -NRv-C(NRv2)= NRv, -S(O)Rv, -S(O)2Rv, -S(O)2NRv2, -NRvSO2Rv, -CN, -NO2, -Rv, -N3, -CH(Ph)2, flúor (C1-C4) alcoxi e flúor (C1-C4) alquil, em um número que varia de zero ao número total de valências abertas no sistema de anel aromático, em que cada grupo Rv na lista anterior pode ser selecionado dentre hidrogênio, C1-C10 alquila, heteroalquila, arila contendo de 5 a 20 átomos no anel e heteroarila.
2. Composto, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que A é C1-C8 alquileno inferior substituído ou não substituído ou um arileno não substituído ou substituído selecionado a partir do grupo que consiste em fenileno, piridinileno, pirimidinileno ou tiofenileno.
3. Composto, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que os grupos -A-B-J-R formam juntos uma cicloalquila ou heterocicloalquila bicíclica ou tricíclica compreendendo pelo menos um grupo carbonila, grupo carbonila protetor ou grupo carbonila mascarado.
4. Composto, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que o grupo -JR- forma junto uma cicloalquila ou heterocicloalquila monocíclica ou bicíclica compreendendo pelo menos um grupo carbonila, grupo carbonila protetor ou grupo carbonila mascarado.
5. Método para produção de um polipeptídeo compreendendo pelo menos um aminoácido tendo a estrutura da fórmula (I):
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o método CARACTERIZADO pelo fato de que compreende incorporar o aminoácido de Fórmula (I) a uma posição terminal ou interna dentro do polipeptídeo, em que: A é opcional e quando presente é C1-C8 alquileno inferior, C1-C8 alquileno inferior substituído, cicloalquileno inferior, cicloalquileno inferior substituído, alquenileno inferior, alquenileno inferior substituído, alquinileno, heteroalquileno inferior, heteroalquileno substituído, heterocicloalquileno inferior, heterocicloalquileno inferior substituído, arileno, arileno substituído, heteroarileno, heteroarileno substituído, alcarileno, alcarileno substituído, aralquileno ou aralquileno substituído; B é opcional e quando presente é um ligante selecionado a partir do grupo que consiste em C1-C8 alquileno inferior, C1-C8 alquileno inferior substituído, alquenileno inferior, alquenileno inferior substituído, heteroalquileno inferior, heteroalquileno inferior substituído, -O-, -O-(C1-C10 alquileno ou C1-C10 alquileno substituído)-, -S-, -S-(C1-C10 alquileno ou C1-C10 alquileno substituído)-, -S(O)k-, em que k é 1, 2 ou 3, -S(O)k(C1-C10 alquileno ou C1-C10 alquileno substituído)-, - C(O)-, -C(O)-(C1-C10 alquileno ou C1-C10 alquileno substituído)-, -C(S)-, -C(S)-( C1-C10 alquileno ou C1-C10 alquileno substituído)-, -N(R')-, NR'-(C1-C10 alquileno ou C1-C10 alquileno substituído), -C(O)N(R')-, -CON(R')-(C1-C10 alquileno ou C1-C10 alquileno substituído)-, -CSN(R')-, -CSN(R')-(C1-C10 alquileno ou C1-C10 alquileno substituído)-, -N(R')CO-(C1-C10 alquileno ou C1-C10 alquileno substituído)- -N(R')C(O)O-, -S(O)KN(R')-, -N(R')C(O)N(R')-, -N(R')C(S)N(R')-, - N(R')S(O)KN(R')-, -N(R')-N=, -C(R')=N-, -C(R')=N-N(R')-, -C(R')=N-N=, -C(R')2N=N- e -C(R')2-N(R')-N(R')-, em que cada R'é independentemente H, C1-C10 alquila ou C1C10 alquila substituída;
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R é H, C1-C10 alquila, C1-C10 alquila substituída, cicloalquila ou cicloalquila substituída; cada R"é independentemente H, C1-C10 alquila, C1-C10 alquila substituída ou um grupo protetor, em que o grupo protetor é selecionado a partir de alila, benzila, benziloxicarbonila, aliloxicarbonila, metila, etila, terc-butila, terc- butildimetilsilila, (trimetilsilila)etoxicarboniloxi, terc-butiloxicarbonila, éter para- metoxibenzila, tritila, acetila ou 9-fluorenilmetoxicarbonila; R1 é H, um grupo amino protetor, resina, aminoácido, polipeptídeo ou polinucleotídeo, em que o grupo amino protetor é selecionado a partir de terc- butoxicarbonila e 9-fluorenilmetoxicarbonila; e R2 é OH, um grupo éster protetor, resina, aminoácido, polipeptídeo ou polinucleotídeo, em que o grupo éster protetor é selecionado a partir de benzila, metila, etila e terc-butila; cada um de R3 e R4 é independentemente H, halogênio, C1-C8 alquila inferior ou C1-C8 alquila inferior substituída ou R3 e R4 ou dois grupos R3 formam opcionalmente uma cicloalquila ou uma heterocicloalquila; ou os grupos -A-B-J-R formam juntos uma cicloalquila ou heterocicloalquila bicíclica ou tricíclica compreendendo pelo menos um grupo carbonila, incluindo um grupo dicarbonila; ou o grupo -J-R forma junto uma cicloalquila ou heterocicloalquila monocíclica ou bicíclica compreendendo pelo menos um grupo carbonila, incluindo um grupo dicarbonila; com a condição de que quando A é fenileno e cada R3 é H, B está presente; e quando A é -(CH2)4- e cada R3 é H, B não é -NHC(O)(CH2CH2)-; e que quando A e B estão ausentes e cada R3 é H, R não é metila; em que “alquileno” inclui “heteroalquileno”; em que “cicloalquila inferior” é uma versão cíclica de “alquila inferior”; em que “cicloalquileno inferior” é um radical divalente derivado de cicloalquila inferior; em que “arileno” é um radical arila divalente; em que “substituído” se refere a moléculas com grupos substituintes que podem ser usados para substituir um outro grupo na molécula, em que os grupos substituintes podem ser selecionados a partir de halo, C1-C10 alquila, C2-C10 alquenila, C2-10 alquinila, C1-10 alcóxi, C5-12 aralquila, C3-12 cicloalquila, C4-12 cicloalquenila, fenila, toluolila, xilenila, bifenila, C2-12 alcoxialquila, C5-12 alcoxiarila, C512 ariloxialquila, C7-12 oxiarila, C1-6 alquilsulfinila, C1-10 alquilsulfonila, -(CH2)m-O-(C1-10 alquila) onde m é de 1 a 8, arila contendo de 5 a 20 átomos no anel, fluoralquila, radical heterocíclico, nitroalquila, -NO2, -CN, -NR'"C(O)-(Ci-io alquila), -C(O)-(Ci-io) alquila), C2-10 alquiltioalquila, -C(O)O-(Ci-io alquila) -OH, SO2, =S, -COOH, -NR"2, carbonila, -C(O)-(Ci-io alquila)CF3, -C(O)-CF3, -C(O)NR"2, -(C1-10 arila)-S-(C6-io arila), -C(O)-(C6-10 arila), -(CH2)m-O-(CH2)m-O-(C1-10 alquila) onde cada m é de 1 a 8, - C(O)NR"2, -C(S)NR'"2, -SO2NR'"2, -NR"C(O)NR"2, -NR'"C(S)NR'"2, sais destes, em que cada grupo R" na lista precedente pode ser selecionado dentre H, C1-C10 alquila, arila contendo de 5 a 20 átomos no anel, ou alcarila; em que radicais “alquila substituído” ou “heteroalquila substituído” são substituídos por grupos substituintes que podem ser selecionados dentre -ORiv, =O, =NRiv, =N-ORiv, -NRiv2, -SRiv, -halogênio, -SiRiv3, -OC(O)Riv, -C(O)Riv, -CO2Riv, - CONRiv2, -OC(O)NRiv2, -NRivC(O)Riv, -NRivC(O)NRiv2, -NRiv(O)2Riv, -NRiv-C(NRiv2)= NRiv, -S(O)Riv, -S(O)2Riv, -S(O)2NRiv2, -NRivS02Riv, -CN e -NO2, em que cada grupo Riv na lista anterior pode ser selecionado dentre hidrogênio, heteroalquila, arila contendo de 5 a 20 átomos no anel, C1-C10 alquila, alcoxi ou grupos tioalcoxi, ou grupos aralquila e, quando dois grupos Riv estão ligados ao mesmo átomo de nitrogênio, eles podem ser combinados com o átomo de nitrogênio para formar um anel de 5, 6 ou 7 membros; e em que os grupos “arila substituído” ou “heteroarila substituído” são substituídos por grupos substituintes que podem ser selecionados dentre -ORv, =O, =NRv, =N-ORv, -NRv2, -SRv, -halogênio, -SiRv3, -OC(O)Rv, -C(O)Rv, -CO2Rv, - CONRv2, -OC(O)NRv2, -NRvC(O)Rv, -NRvC(O)NRv2, -NRv(O)2Rv, -NRv-C(NRv2)= NRv, -S(O)Rv, -S(O)2Rv, -S(O)2NRv2, -NRvSO2Rv, -CN, -NO2, -Rv, -N3, -CH(Ph)2, flúor (C1-C4) alcoxi e flúor (C1-C4) alquila, em um número que varia de zero ao número total de valências abertas no sistema de anel aromático, em que cada grupo Rv na lista anterior pode ser selecionado dentre hidrogênio, C1-C10 alquila, heteroalquila, arila contendo de 5 a 20 átomos no anel e heteroarila.
6. Método, de acordo com a reivindicação 5, CARACTERIZADO pelo fato de que o aminoácido é incorporado em um sítio específico ao polipeptídeo usando um sistema de tradução compreendendo: (i) um polinucleotídeo codificando o polipeptídeo, em que o polinucleotídeo compreende um códon de seleção correspondente ao sítio pré-designado de incorporação do aminoácido de Fórmula (I); e (ii) um tRNA compreendendo o aminoácido, em que o tRNA é específico ao códon de seleção.
7. Método, de acordo com a reivindicação 6, CARACTERIZADO pelo fato de que o sistema de tradução compreende um tRNA que é aminoacilado ao aminoácido de Fórmula (I).
8. Método, de acordo com a reivindicação 7, CARACTERIZADO pelo fato de que o sistema de tradução é um sistema de tradução in vivo compreendendo uma célula selecionada a partir do grupo que consiste em uma célula bacteriana, célula arquebacteriana e célula eucariótica.
9. Método, de acordo com a reivindicação 8, CARACTERIZADO pelo fato de que os grupos -A-B-J-R formam juntos uma cicloalquila ou heterocicloalquila bicíclica ou tricíclica compreendendo pelo menos um grupo carbonila, incluindo um grupo dicarbonila, grupo carbonila protetor, incluindo um grupo dicarbonila protetor ou um grupo carbonila mascarado, incluindo um grupo dicarbonila mascarado.
10. Método, de acordo com a reivindicação 8, CARACTERIZADO pelo fato de que o grupo -J-R- forma junto uma cicloalquila ou heterocicloalquila monocíclica ou bicíclica compreendendo pelo menos um grupo carbonila, incluindo um grupo dicarbonila, grupo carbonila protetor, incluindo um grupo dicarbonila ou um grupo carbonila mascarado, incluindo um grupo dicarbonila mascarado.
11. Método para derivatização de um polipeptídeo compreendendo um aminoácido de Fórmula (I), o método CARACTERIZADO pelo fato de que compreende colocar em contato o polipeptídeo com um reagente de Fórmula (XIX), em que a Fórmula (I) corresponde a:
Figure img0276
em que: A é opcional e quando presente é C1-C8 alquileno inferior, C1-C8 alquileno inferior substituído, alquenileno inferior, alquenileno inferior substituído, arileno, arileno substituído, heteroarileno, heteroarileno substituído, alcarileno, alcarileno substituído, aralquileno ou aralquileno substituído; B é opcional e quando presente é um ligante selecionado a partir do grupo que consiste em C1-C8 alquileno inferior, C1-C8 alquileno inferior substituído, alquenileno inferior, alquenileno inferior substituído, -O-, -O-(C1-C10 alquileno ou C1-C10 alquileno substituído)-, -S-, -S-(C1-C10 alquileno ou C1-C10 alquileno substituído)-, -S(O)k-, em que k é 1, 2 ou 3, -S(O)k(C1-C10 alquileno ou C1-C10 alquileno substituído)-, -C(O)-, -C(O)-(C1-C10 alquileno ou C1-C10 alquileno substituído)-, -C(S)-, -C(S)-(C1-C10 alquileno ou C1-C10 alquileno substituído)-, - N(R')-, NR'-(C1-C10 alquileno ou C1-C10 alquileno substituído)-, -C(O)N(R')-, - CON(R')-(C1-C10 alquileno ou C1-C10 alquileno substituído)-, -CSN(R')-, -CSN(R')- (C1-C10 alquileno ou C1-C10 alquileno substituído)-, -N(R')CO-(C1-C10 alquileno ou C1-C10 alquileno substituído)-, -N(R')C(O)O-, -S(O)KN(R')-, -N(R')C(O)N(R')-, - N(R')C(S)N(R')-, -N(R')S(O)KN(R')-, -N(R')-N=, -C(R')=N-, -C(R')=N-N(R')-, -C(R')=N- N=, -C(R')2N=N- e -C(R')2-N(R')-N(R')-, em que cada R'é independentemente H, C1C10 alquila ou C1-C10 alquila substituída;
Figure img0277
R é H, C1-C10 alquila, C1-C10 alquila substituída, cicloalquila ou cicloalquila substituída; cada R'é independentemente H, C1-C10 alquila ou C1-C10 alquila substituída; R1 é H, um grupo amino protetor, resina, aminoácido, polipeptídeo ou polinucleotídeo, em que o grupo amino protetor é selecionado a partir de terc- butoxicarbonila e 9-fluorenilmetoxicarbonila; e R2 é 0H, um grupo éster protetor, resina, aminoácido, polipeptídeo ou polinucleotídeo, em que o grupo éster protetor é selecionado a partir de benzila, metila, etila e terc-butila; cada um de R3 e R4 é independentemente H, halogênio, C1-C8 alquila inferior ou C1-C8 alquila inferior substituída; em que a Fórmula (XIX corresponde a:
Figure img0278
em que: cada X é independentemente um rótulo detectável, agente biologicamente ativo ou polímero; cada L é um ligante independentemente selecionado a partir do grupo que consiste em C1-C10 alquileno, C1-C10 alquileno substituído, alquenileno, alquenileno substituído, -O-, -O-(C1-C10 alquileno ou C1-C10 alquileno substituído)-, -S-, -S-(C1-C10 alquileno ou C1-C10 alquileno substituído)-, -S(O)k-, em que k é 1, 2 ou 3, -S(O)k(C1-C10 alquileno ou C1-C10 alquileno substituído)-, -C(O)-, -C(O)-(C1- C10 alquileno ou C1-C10 alquileno substituído)-, -C(S)-, -C(S)-(C1-C10 alquileno ou C1-C10 alquileno substituído)-, -N(R')-, NR'-(C1-C10 alquileno ou C1-C10 alquileno substituído), -C(O)N(R')-, -CON(R')-(C1-C10 alquileno ou C1-C10 alquileno substituído)-, -(C1-C10 alquileno ou C1-C10 alquileno substituído)-N(R')C(O)O-(C1- C10 alquileno ou C1-C10 alquileno substituído), -O-CON(R')-(C1-C10 alquileno ou C1-C10 alquileno substituído)-, CSN(R')-, -CSN(R')-(C1-C10 alquileno ou C1-C10 alquileno substituído)-, -N(R')CO-(C1-C10 alquileno ou C1-C10 alquileno substituído)-, N(R')C(O)O-, N(R')C(O)O-(C1-C10 alquileno ou C1-C10 alquileno substituído)-, -S(O)kN(R')-, -N(R')C(O)N(R')-, -N(R')C(O)N(R')-(C1-C10 alquileno ou C1-C10 alquileno substituído)-, -N(R')C(S)N(R')-, -N(R')S(O)kN(R')-, -N(R')-N=, - C(R')=N-, -C(R')=N-N(R')-, -C(R')=N-N=, -C(R')2N=N- e -C(R')2-N(R')-N(R')-, em que cada R' é independentemente H, C1-C10 alquila ou C1-C10 alquila substituída; L1 é opcional e quando presente é -C(R')P-NR'-C(O)-(C1-C10 alquileno ou C1-C10 alquileno substituído)-, em que p é 0, 1 ou 2; W é -ON(R1)2 ou -C(=O)R2, em que cada R1 é independentemente H ou um grupo amino protetor e R2 é H ou OR'; e n é 1 a 3; em que “alquileno” inclui “heteroalquileno”; em que “cicloalquila inferior” é uma versão cíclica de “alquila inferior”; em que “cicloalquileno inferior” é um radical divalente derivado de cicloalquila inferior; em que “arileno” é um radical arila divalente; em que “substituído” se refere a moléculas com grupos substituintes que podem ser usados para substituir um outro grupo na molécula, em que os grupos substituintes podem ser selecionados a partir de halo, C1-C10 alquila, C2-C10 alquenila, C2-10 alquinila, C1-10 alcóxi, C5-12 aralquila, C3-12 cicloalquila, C4-12 cicloalquenila, fenila, toluolila, xilenila, bifenila, C2-12 alcoxialquila, C5-12 alcoxiarila, C512 ariloxialquila, C7-12 oxiarila, C1-6 alquilsulfinila, C1-10 alquilsulfonila, -(CH2)m-O-(C1-10 alquila) onde m é de 1 a 8, arila contendo de 5 a 20 átomos no anel, fluoralquila, radical heterocíclico, nitroalquila, -NO2, -CN, -NR'"C(O)-(Ci-io alquila), -C(O)-(Ci-io alquila), C2-10 alquiltioalquila, -C(O)O-(Ci-io alquila) -OH, -SO2, =S, -COOH, -NR"2, carbonila, -C(O)-(Ci-io alquila)CF3, -C(O)-CF3, -C(O)NR"2, -(C1-10 arila)-S-(C6-io arila), -C(O)-(C6-10 arila), -(CH2)m-O-(CH2)m-O-(C1-10 alquila) onde cada m é de 1 a 8, - C(O)NR'"2, -C(S)NR"2, -SO2NR'"2, -NR"C(O)NR"2, -NR"C(S)NR"2, sais destes, em que cada grupo R" na lista precedente pode ser selecionado dentre H, C1-C10 alquila, arila contendo de 5 a 20 átomos no anel, ou alcarila; em que radicais “alquila substituído” ou “heteroalquila substituído” são substituídos por grupos substituintes que podem ser selecionados dentre -ORiv, =O, =NRiv, =N-ORiv, -NRiv2, -SRiv, -halogênio, -SiRiv3, -OC(O)Riv, -C(O)Riv, -CO2Riv, - CONRiv2, -OC(O)NRiv2, -NRivC(O)Riv, -NRivC(O)NRiv2, -NRiv(O)2Riv, -NRiv-C(NRiv2)= NRiv, -S(O)Riv, -S(O)2Riv, -S(O)2NRiv2, -NRivSO2Riv, -CN e -NO2, em que cada grupo Riv na lista anterior pode ser selecionado dentre hidrogênio, heteroalquila, arila contendo de 5 a 20 átomos no anel, C1-C10 alquila, alcoxi ou grupos tioalcoxi, ou grupos aralquila e, quando dois grupos Rivestão ligados ao mesmo átomo de nitrogênio, eles podem ser combinados com o átomo de nitrogênio para formar um anel de 5, 6 ou 7 membros; e em que os grupos “arila substituído” ou “heteroarila substituído” são substituídos por grupos substituintes que podem ser selecionados dentre -ORv, =O, =NRv, =N-ORv, -NRv2, -SRv, -halogênio, -SiRv3, -OC(O)Rv, -C(O)Rv, -CO2Rv, - CONRv2, -OC(O)NRv2, -NRvC(O)Rv, -NRvC(O)NRv2, -NRv(O)2Rv, -NRv-C(NRv2)=NRv, -S(O)Rv, -S(O)2Rv, -S(O)2NRv2, -NRvS02Rv, -CN, -NO2, -Rv, -N3, -CH(Ph)2, flúor (Ci- C4) alcoxi e flúor (C1-C4) alquila, em um número que varia de zero ao número total de valências abertas no sistema de anel aromático, em que cada grupo Rv na lista anterior pode ser selecionado dentre hidrogênio, Ci-Ci0 alquila, heteroalquila, arila contendo de 5 a 20 átomos no anel e heteroarila.
12. Método, de acordo com a reivindicação ii, CARACTERIZADO pelo fato de que o reagente corresponde à Fórmula (XXVII):
Figure img0279
13. Método, de acordo com a reivindicação ii, CARACTERIZADO pelo fato de que o polipeptídeo derivatizado compreende pelo menos um aminoácido contendo oxima tendo a estrutura da Fórmula (XI):
Figure img0280
em que: A é opcional e quando presente é Ci-C8 alquileno inferior, Ci-C8 alquileno inferior substituído, alquenileno inferior, alquenileno inferior substituído, arileno, arileno substituído, heteroarileno, heteroarileno substituído, alcarileno, alcarileno substituído, aralquileno ou aralquileno substituído; B é opcional e quando presente é um ligante selecionado a partir do grupo que consiste em C1-C8 alquileno inferior, C1-C8 alquileno inferior substituído, alquenileno inferior, alquenileno inferior substituído, -O-, -O-(C1-C10 alquileno ou C1-C10 alquileno substituído)-, -S-, -S-(C1-C10 alquileno ou C1-C10 alquileno substituído)-, -S(O)k-, em que k é 1, 2 ou 3, -S(O)k(C1-C10 alquileno ou C1-C10 alquileno substituído)-, -C(O)-, -C(O)-(C1-C10 alquileno ou C1-C10 alquileno substituído)-, -C(S)-, -C(S)-(C1-C10 alquileno ou C1-C10 alquileno substituído)-, - N(R')-, NR'-(C1-C10 alquileno ou C1-C10 alquileno substituído)-, -C(O)N(R')-, - CON(R')-(C1-C10 alquileno ou C1-C10 alquileno substituído)-, -CSN(R')-, -CSN(R')- (C1-C10 alquileno ou C1-C10 alquileno substituído)-, -N(R')CO-(C1-C10 alquileno ou C1-C10 alquileno substituído)-, -N(R')C(O)O-, -S(O)KN(R')-, -N(R')C(O)N(R')-, - N(R')C(S)N(R')-, -N(R')S(O)KN(R')-, -N(R')-N=, -C(R')=N-, -C(R')=N-N(R')-, -C(R')=N- N=, -C(R')2N=N- e -C(R')2-N(R')-N(R')-, em que cada R'é independentemente H, C1C10 alquila ou C1-C10 alquila substituída; R é H, C1-C10 alquila, C1-C10 alquila substituída, cicloalquila ou cicloalquila substituída; R1 é H, um grupo amino protetor, resina, aminoácido, polipeptídeo ou polinucleotídeo; e R2 é OH, um grupo éster protetor, resina, aminoácido, polipeptídeo ou polinucleotídeo; cada um de R3 e R4 é independentemente H, halogênio, C1-C8 alquila inferior, ou C1-C8 alquila inferior substituída; R5 é H, C1-C10 alquila, C1-C10 alquila substituída, alquenila, alquenila substituída, alquinila, alquinila substituída, alcóxi, alcóxi substituído, alquilalcóxi, alquilalcóxi substituído, óxido de polialquileno, óxido de polialquileno substituído, arila contendo 5 a 20 átomos no anel, arila substituída contendo 5 a 20 átomos no anel, heteroarila, heteroarila substituída, alcarila, alcarila substituída, aralquila, aralquila substituída, -C(O)R", -C(O)2R" ou -C(O)N(R")2, em que cada R"é independentemente hidrogênio, C1-C10 alquila, C1-C10 alquila substituído, alquenila, alquenila substituída, alcóxi, alcóxi substituído, arila contendo 5 a 20 átomos no anel, arila substituída contendo 5 a 20 átomos no anel, heteroarila, alcarila, alcarila substituída, aralquila ou aralquila substituída; ou R5 é L-X, onde: X é um rótulo detectável, agente biologicamente ativo ou polímero; e L é opcional e quando presente é um ligante selecionado a partir do grupo que consiste em C1-C10 alquileno, C1-C10 alquileno substituído, alquenileno, alquenileno substituído, -O-, -O-(C1-C10 alquileno ou C1-C10 alquileno substituído)-, -S-, -S-(C1-C10 alquileno ou C1-C10 alquileno substituído)-, -S(O)k-, em que k é 1, 2 ou 3, -S(O)k(C1-C10 alquileno ou C1-C10 alquileno substituído)-, -C(O)-, -C(O)-(C1- C10 alquileno ou C1-C10 alquileno substituído)-, -C(S)-, -C(S)-(C1-C10 alquileno ou C1-C10 alquileno substituído)-, -N(R')-, NR'-(C1-C10 alquileno ou C1-C10 alquileno substituído), -C(O)N(R')-, -CON(R')-(C1-C10 alquileno ou C1-C10 alquileno substituído)-, -CSN(R')-, -CSN(R')-(C1-C10 alquileno ou C1-C10 alquileno substituído)-, -N(R')CO-(C1-C10 alquileno ou C1-C10 alquileno substituído)- - N(R')C(O)O-, -S(O)kN(R')-, N(R')C(O)N(R')-, -N(R')C(S)N(R')-, -N(R')S(O)kN(R')-, - N(R')-N=, -C(R')=N-, -C(R')=N-N(R')-, -C(R')=N-N=, -C(R')2N=N- e -C(R')2-N(R')- N(R')-, em que cada R'é independentemente H, C1-C10 alquila ou C1-C10 alquila substituída; com a condição de que quando A e B estão ausentes, R não é metila; em que “alquileno” inclui “heteroalquileno”; em que “cicloalquila inferior” é uma versão cíclica de “alquila inferior”; em que “cicloalquileno inferior” é um radical divalente derivado de cicloalquila inferior; em que “arileno” é um radical arila divalente; em que “substituído” se refere a moléculas com grupos substituintes que podem ser usados para substituir um outro grupo na molécula, em que os grupos substituintes podem ser selecionados a partir de halo, C1-C10 alquila, C2-C10 alquenila, C2-10 alquinila, C1-10 alcóxi, C5-12 aralquila, C3-12 cicloalquila, C4-12 cicloalquenila, fenila, toluolila, xilenila, bifenila, C2-12 alcoxialquila, C5-12 alcoxiarila, C512 ariloxialquila, C7-12 oxiarila, C1-6 alquilsulfinila, C1-10 alquilsulfonila, -(CH2)m-O-(C1-10 alquila) onde m é de 1 a 8, arila contendo de 5 a 20 átomos no anel, fluoralquila, radical heterocíclico, nitroalquila, -NO2, -CN, -NR'"C(O)-(Ci-io alquila), -C(O)-(Ci-io alquila), C2-10 alquiltioalquila, -C(O)O-(Ci-io alquila), -OH, SO2, =S, -COOH, -NRm2, carbonila, -C(O)-(Ci-io alquila)CF3, -C(O)-CF3, -C(O)NR"2, -(C1-10 arila)-S-(C6-io arila), -C(O)-(C6-10 arila), -(CH2)m-O-(CH2)m-O-(C1-10 alquila) onde cada m é de 1 a 8, - C(O)NR"2, -C(S)NR"2, -SO2NR'"2, -NR"C(O)NR"2, -NR"C(S)NR"2, sais destes, em que cada grupo R" na lista precedente pode ser selecionado dentre H, C1-C10 alquila, arila contendo de 5 a 20 átomos no anel, ou alcarila; em que radicais “alquila substituído” ou “heteroalquila substituído” são substituídos por grupos substituintes que podem ser selecionados dentre -ORiv, =O, =NRiv, =N-ORiv, -NRiv2, -SRiv, -halogênio, -SiRiv3, -OC(O)Riv, -C(O)Riv, -CO2Riv, - CONRiv2, -OC(O)NRiv2, -NRivC(O)Riv, -NRivC(O)NRiv2, -NRiv(O)2Riv, -NRiv-C(NRiv2)= NRiv, -S(O)Riv, -S(O)2Riv, -S(O)2NRiv2, -NRivSO2Riv, -CN e -NO2, em que cada grupo Riv na lista anterior pode ser selecionado dentre hidrogênio, heteroalquila, arila contendo de 5 a 20 átomos no anel, C1-C10 alquila, alcoxi ou grupos tioalcoxi, ou grupos aralquila e, quando dois grupos Riv estão ligados ao mesmo átomo de nitrogênio, eles podem ser combinados com o átomo de nitrogênio para formar um anel de 5, 6 ou 7 membros; e em que os grupos “arila substituído” ou “heteroarila substituído” são substituídos por grupos substituintes que podem ser selecionados dentre -ORv, =O, =NRv, =N-ORv, -NRv2, -SRv, -halogênio, -SiRv3, -OC(O)Rv, -C(O)Rv, -CO2Rv, - CONRv2, -OC(O)NRv2, -NRvC(O)Rv, -NRvC(O)NRv2, -NRv(O)2Rv, -NRv-C(NRv2)=NRv, -S(O)Rv, -S(O)2Rv, -S(O)2NRv2, -NRvS02Rv, -CN, -NO2, -Rv, -N3, -CH(Ph)2, flúor (Ci- C4) alcoxi e flúor (C1-C4) alquila, em um número que varia de zero ao número total de valências abertas no sistema de anel aromático, em que cada grupo Rv na lista anterior pode ser selecionado dentre hidrogênio, Ci-Ci0 alquila, heteroalquila, arila contendo de 5 a 20 átomos no anel e heteroarila.
14. Método, de acordo com a reivindicação ii, CARACTERIZADO pelo fato de que o polipeptídeo está em contato com o reagente da Fórmula (XIX) em uma solução aquosa sob condições suavemente ácidas.
15. Método, de acordo com a reivindicação i4, CARACTERIZADO pelo fato de que as condições são pH 2 a 8.
16. Método, de acordo com a reivindicação ii, CARACTERIZADO pelo fato de que o polipeptídeo está em contato com o reagente da Fórmula (XIX) na presença de um acelerador selecionado a partir do grupo que consiste em:
Figure img0281
17. Método, de acordo com a reivindicação i3, CARACTERIZADO pelo fato de que o aminoácido contendo oxima tem uma estrutura correspondente à Fórmula (XII):
Figure img0282
18. Método, de acordo com a reivindicação 13, CARACTERIZADO pelo fato de que o aminoácido contendo oxima tem uma estrutura correspondente à Fórmula (XIII):
Figure img0283
19. Método, de acordo com a reivindicação 13, CARACTERIZADO pelo fato de que X é um polímero hidrossolúvel ou derivado de polietileno glicol.
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