CN116419767A - 用于标记生物分子的试剂 - Google Patents

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CN116419767A CN202180071310.0A CN202180071310A CN116419767A CN 116419767 A CN116419767 A CN 116419767A CN 202180071310 A CN202180071310 A CN 202180071310A CN 116419767 A CN116419767 A CN 116419767A
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琳达·G·李
史蒂文·孟肯
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Altima Genomics
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Abstract

本公开提供了用于标记底物例如核苷酸、蛋白质、抗体、脂质和细胞的标记试剂。本文提供的标记试剂可包括荧光标记和半刚性接头。本文还提供了使用包含此类标记试剂的材料的核酸测序方法。还提供了用于使用能量转移同时标记多种底物的标记试剂。

Description

用于标记生物分子的试剂
交叉引用
本申请要求2020年8月18日提交的美国临时专利申请号63/067,172和2021年3月17日提交的美国临时专利申请号63/162,371的权益，其各自的全部内容通过引用而并入本文中。
背景技术
对细胞和生物分子的检测、定量和测序对于分子生物学和医学应用(例如，诊断)可能是重要的。基因检测可能对许多诊断方法有用。例如，由罕见的遗传学改变(例如，序列变异)或表观遗传标志物的变化(例如癌症和部分或完全非整倍性)引起的病症可以用脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)序列信息进行检测或更准确地表征。
核酸测序是可用于为核酸样本提供序列信息的过程。这样的序列信息可能有助于诊断和/或治疗患有病况的受试者。例如，受试者的核酸序列可用于对遗传性疾病进行鉴定、诊断和潜在地开发疗法。作为另一个实例，对病原体的研究可能导致对接触传染性疾病的治疗。
核酸测序可以包括荧光标记的部分的使用。此类部分可以用有机荧光染料标记。检测方案的灵敏度可以通过使用兼具高消光系数和量子产率的染料来改善，这些特性的乘积可以称为染料的“亮度”。染料亮度可能会因淬灭现象而减弱，包括通过生物材料淬灭、通过与其他染料邻近而淬灭和通过溶剂淬灭。亮度损失的其他途径包括光漂白、对分子氧的反应性和化学分解。
发明内容
本公开提供了改进的光学(例如，荧光)标记试剂和核酸加工方法，该方法包括使用光学(例如，荧光)标记的部分。本文提供的材料和方法可包括有机荧光染料的使用。本文提供的材料可允许优化的分子淬灭以促进有效的核酸加工和检测。分子淬灭机制可包括光诱导电子转移、光诱导空穴转移、Forster能量转移、Dexter淬灭等。许多类型的淬灭的通用解决方案需要染料与淬灭剂部分的物理分离，但现有解决方案在易用性、成本、溶剂依赖性和多分散性方面各有优缺点。因此，本公开认识到需要解决这些限制的材料和方法并提供了包含改进的接头部分的材料。
在一个方面，本公开提供了一种荧光标记试剂，其包括：(a)荧光染料部分；和(b)接头，所述接头与所述荧光染料部分连接并被配置为与底物偶联以荧光标记所述底物，其中所述接头包括至少五个非蛋白质氨基酸。
在一些实施方案中，所述荧光标记试剂还包括第二荧光染料，其中所述荧光染料和所述第二荧光染料通过所述接头而连接并且能够进行能量转移。在一些实施方案中，所述能量转移通过荧光共振能量转移(FRET)介导。
在一些实施方案中，所述至少五个非蛋白质氨基酸的至少一个子集包括环体系。在一些实施方案中，所述至少五个非蛋白质氨基酸的至少一个子集包括水溶性基团。在一些实施方案中，所述水溶性基团选自吡啶鎓基团、咪唑鎓基团、季铵基团、磺酸根、硫酸根、磷酸根、羟基基团、胺、亚胺、腈、酰胺、巯基、羧酸、聚醚、醛、硼酸和硼酸酯。在一些实施方案中，所述水溶性基团是羟基基团。
在一些实施方案中，所述至少五个非蛋白质氨基酸的至少一个子集是羟脯氨酸部分。在一些实施方案中，所述接头包括五个或更多个羟脯氨酸部分。在一些实施方案中，所述接头包括十个或更多个羟脯氨酸部分。在一些实施方案中，所述接头包括二十个或更多个羟脯氨酸部分。在一些实施方案中，所述接头包括三十个或更多个羟脯氨酸部分。在一些实施方案中，所述接头还包括一个或更多个甘氨酸部分。
在一些实施方案中，所述接头包括重复单元。在一些实施方案中，所述重复单元包括所述至少五个非蛋白质氨基酸部分中的一个或更多个。在一些实施方案中，所述重复单元包括至少五个非蛋白质氨基酸部分。在一些实施方案中，所述重复单元包括至少十个非蛋白质氨基酸部分。在一些实施方案中，所述重复单元包括十个羟脯氨酸部分。在一些实施方案中，所述重复单元包括甘氨酸部分。在一些实施方案中，所述重复单元重复至少三次。
在一些实施方案中，当所述荧光标记试剂与所述底物偶联时，所述接头在所述荧光染料部分和所述底物之间提供至少约30埃
Figure BDA0004184559620000031
的平均物理间隔。在一些实施方案中，当所述荧光标记试剂与所述底物偶联时，所述接头在所述荧光染料部分和所述底物之间提供至少约60埃/>
Figure BDA0004184559620000032
的平均物理间隔。在一些实施方案中，当所述荧光标记试剂与所述底物偶联时，所述接头在所述荧光染料部分和所述底物之间提供至少约90埃/>
Figure BDA0004184559620000033
的平均物理间隔。
在一些实施方案中，所述荧光标记试剂还包括可切割性基团，所述可切割性基团被配置为被切割以将所述荧光标记试剂或其部分与所述底物分离。在一些实施方案中，所述可切割性基团被配置为被切割以将所述荧光标记试剂的包括所述荧光染料部分和所述接头的第一部分的第一部分与所述荧光标记试剂的包括所述接头的第二部分的第二部分分离。在一些实施方案中，所述可切割性基团选自叠氮基甲基基团、二硫键、烃基二硫基甲基基团和2-硝基苄氧基基团。在一些实施方案中，所述可切割性基团是二硫键。在一些实施方案中，所述可切割性基团是通过应用由三(2-羧乙基)膦(TCEP)、二硫苏糖醇(DTT)、四氢吡喃基(THP)、紫外(UV)光及其组合组成的组中的一个或更多个成员可切割的。
在一些实施方案中，所述荧光标记试剂包括选自
Figure BDA0004184559620000034
中的部分。
在一些实施方案中，所述底物是核苷酸、多核苷酸、蛋白质、脂质、细胞、糖、多糖或抗体。在一些实施方案中，所述底物是核苷酸，并且所述荧光标记试剂通过所述核苷酸的核碱基而附接到所述核苷酸。在一些实施方案中，所述底物是蛋白质。在一些实施方案中，所述底物是荧光淬灭剂、荧光供体或荧光受体。
在一个方面，本公开提供了一种标记的底物，其包括所述底物和本文中任何地方所述的所述荧光标记试剂或其衍生物，其中所述荧光标记试剂与所述底物偶联。
在一些实施方案中，所述底物是核苷酸、多核苷酸、蛋白质、脂质、细胞、糖、多糖或抗体。在一些实施方案中，所述底物是蛋白质。在一些实施方案中，所述蛋白质是细胞的组分。在一些实施方案中，所述底物是核苷酸，并且所述荧光标记试剂通过所述核苷酸的核碱基而附接到所述核苷酸。
在一些实施方案中，所述标记的底物包括与其偶联的附加荧光标记试剂，其中所述附加荧光标记试剂包括附加荧光染料部分和与所述附加荧光染料部分连接的附加接头，其中所述附加接头包括至少五个非蛋白质氨基酸。在一些实施方案中，所述荧光标记试剂和所述附加荧光标记试剂包括相同的化学结构。在一些实施方案中，所述荧光标记试剂和所述附加荧光标记试剂包括不同的化学结构。在一些实施方案中，所述标记的底物包括与其偶联的三种或更多种荧光标记试剂。
在一些实施方案中，所述底物是荧光淬灭剂、荧光供体或荧光受体。
在一些实施方案中，所述标记的底物相对于另一标记的底物减少了淬灭，所述另一标记的底物包括所述底物和另一荧光标记试剂，所述另一荧光标记试剂包括所述荧光染料部分和另一接头，所述另一接头不包括所述至少二十个非蛋白质氨基酸。
在一些实施方案中，所述标记的底物在激发和光学检测时比另一标记的底物提供更高的信号水平，所述另一标记的底物包括所述底物和另一荧光标记试剂，所述另一荧光标记试剂包括所述荧光染料部分和另一接头，所述另一接头不包括所述至少二十个非蛋白质氨基酸。
在另一个方面，本公开提供了一种荧光标记试剂，其包括：(a)多个荧光染料部分；和(b)多个接头，其中所述多个接头中的第一接头与所述多个荧光染料部分中的第一荧光染料部分连接，并且其中所述多个接头中的第二接头与所述多个荧光染色部分中的第二荧光染料部分连接，其中所述荧光标记试剂被配置为与底物偶联以荧光标记所述底物，并且其中所述第一接头包括第一非蛋白质氨基酸，并且所述第二接头包括第二非蛋白质氨基酸。
在一些实施方案中，所述第一荧光染料部分和所述第二荧光染料部分具有相同的化学结构。在一些实施方案中，所述多个荧光染料部分中的每个荧光染料部分具有相同的化学结构。在一些实施方案中，所述多个荧光染料部分中的每个荧光染料部分在相同波长处或附近发荧光。在一些实施方案中，所述第一荧光染料部分和所述第二荧光染料部分具有不同的化学结构。
在一些实施方案中，所述多个接头与一个或更多个赖氨酸部分连接。在一些实施方案中，所述荧光标记试剂包括与所述多个接头的至少一个子集连接的两个或更多个赖氨酸部分。在一些实施方案中，所述荧光标记试剂包括与所述多个接头的至少一个子集连接的三个或更多个赖氨酸部分。在一些实施方案中，所述第一接头与所述两个或更多个赖氨酸部分中的第一赖氨酸部分连接，并且所述第二接头与所述两个或更多个赖氨酸部分中的第二赖氨酸部分连接。在一些实施方案中，所述第一赖氨酸部分与所述第二赖氨酸部分连接。
在一些实施方案中，所述荧光标记试剂包括三个或更多个荧光染料部分和三个或更多个接头。
在一些实施方案中，所述第一接头和所述第二接头具有相同的化学结构。在一些实施方案中，所述多个接头中的每个接头具有相同的化学结构。在一些实施方案中，所述第一接头和所述第二接头具有不同的化学结构。
在一些实施方案中，所述第一接头包括包含第一多个非蛋白质氨基酸的第一多个氨基酸，其中所述第一多个非蛋白质氨基酸包括所述第一非蛋白质氨基酸。在一些实施方案中，所述第一多个非蛋白质氨基酸的至少一个子集包括环体系。在一些实施方案中，所述第一多个非蛋白质氨基酸包括至少五个非蛋白质氨基酸。在一些实施方案中，所述第一多个非蛋白质氨基酸包括至少十个非蛋白质氨基酸。在一些实施方案中，所述第一多个非蛋白质氨基酸包括至少二十个非蛋白质氨基酸。在一些实施方案中，所述第一多个非蛋白质氨基酸包括至少一个羟脯氨酸部分。在一些实施方案中，所述第一多个非蛋白质氨基酸包括至少五个羟脯氨酸部分。在一些实施方案中，所述第一多个非蛋白质氨基酸包括至少十个羟脯氨酸部分。在一些实施方案中，所述第一多个非蛋白质氨基酸包括至少二十个羟脯氨酸部分。
在一些实施方案中，所述第二接头包括包含第二多个非蛋白质氨基酸的第二多个氨基酸，其中所述第二多个非蛋白质氨基酸包括所述第二非蛋白质氨基酸。在一些实施方案中，所述第二多个非蛋白质氨基酸的至少一个子集包括环体系。在一些实施方案中，所述第二多个非蛋白质氨基酸包括至少五个非蛋白质氨基酸。在一些实施方案中，所述第二多个非蛋白质氨基酸包括至少十个非蛋白质氨基酸。在一些实施方案中，所述第二多个非蛋白质氨基酸包括至少二十个非蛋白质氨基酸。在一些实施方案中，所述第二多个非蛋白质氨基酸包括至少一个羟脯氨酸部分。在一些实施方案中，所述第二多个非蛋白质氨基酸包括至少五个羟脯氨酸部分。在一些实施方案中，所述第二多个非蛋白质氨基酸包括至少十个羟脯氨酸部分。在一些实施方案中，所述第二多个非蛋白质氨基酸包括至少二十个羟脯氨酸部分。
在一些实施方案中，所述第一非蛋白质氨基酸或所述第二非蛋白质氨基酸包括环体系。在一些实施方案中，所述第一非蛋白质氨基酸或所述第二非蛋白质氨基酸包括水溶性基团。在一些实施方案中，所述水溶性基团选自吡啶鎓基团、咪唑鎓基团、季铵基团、磺酸根、硫酸根、磷酸根、羟基基团、胺、亚胺、腈、酰胺、巯基、羧酸、聚醚、醛、硼酸和硼酸酯。在一些实施方案中，所述水溶性基团是羟基基团。
在一些实施方案中，所述第一接头或所述第二接头包括三个或更多个羟脯氨酸部分。在一些实施方案中，所述第一接头或所述第二接头包括十个或更多个羟脯氨酸部分。在一些实施方案中，所述多个接头中的每个接头包括三个或更多个羟脯氨酸部分。在一些实施方案中，所述多个接头中的每个接头包括十个或更多个羟脯氨酸部分。在一些实施方案中，所述第一接头或所述第二接头还包括甘氨酸部分。在一些实施方案中，所述第一接头或所述第二接头还包括磺基丙氨酸部分。
在一些实施方案中，所述第一接头或所述第二接头包括重复单元。在一些实施方案中，所述重复单元包括一个或更多个非蛋白质氨基酸部分。在一些实施方案中，所述重复单元包括五个或更多个非蛋白质氨基酸部分。在一些实施方案中，所述重复单元包括十个或更多个非蛋白质氨基酸部分。在一些实施方案中，所述重复单元包括十个羟脯氨酸部分。在一些实施方案中，所述重复单元包括甘氨酸部分。在一些实施方案中，所述重复单元重复至少三次。
在一些实施方案中，当所述荧光标记试剂与所述底物偶联时，所述第一接头在所述第一荧光染料部分和所述底物之间提供至少约30埃
Figure BDA0004184559620000071
的平均物理间隔。在一些实施方案中，当所述荧光标记试剂与所述底物偶联时，所述第一接头在所述第一荧光染料部分和所述底物之间提供至少约60埃/>
Figure BDA0004184559620000072
的平均物理间隔。在一些实施方案中，当所述荧光标记试剂与所述底物偶联时，所述第一接头在所述第一荧光染料部分和所述底物之间提供至少约90埃/>
Figure BDA0004184559620000073
的平均物理间隔。
在一些实施方案中，当所述荧光标记试剂与所述底物偶联时，所述第二接头在所述第二荧光染料部分和所述底物之间提供至少约30埃
Figure BDA0004184559620000074
的平均物理间隔。在一些实施方案中，当所述荧光标记试剂与所述底物偶联时，所述第二接头在所述第二荧光染料部分和所述底物之间提供至少约60埃/>
Figure BDA0004184559620000075
的平均物理间隔。在一些实施方案中，当所述荧光标记试剂与所述底物偶联时，所述第二接头在所述第二荧光染料部分和所述底物之间提供至少约90埃/>
Figure BDA0004184559620000076
的平均物理间隔。
在一些实施方案中，所述荧光标记试剂还包括可切割性基团，所述可切割性基团被配置为被切割以将所述荧光标记试剂或其部分与所述底物分离。在一些实施方案中，所述可切割性基团被配置为被切割以将所述荧光标记试剂的包括所述多个荧光染料部分和所述多个接头的第一部分与所述荧光标记试剂的第二部分分离。在一些实施方案中，所述可切割性基团选自叠氮基甲基基团、二硫键、烃基二硫基甲基基团和2-硝基苄氧基基团。在一些实施方案中，所述可切割性基团是二硫键。在一些实施方案中，所述可切割性基团是通过应用由三(2-羧乙基)膦(TCEP)、二硫苏糖醇(DTT)、四氢吡喃基(THP)、紫外(UV)光及其组合组成的组中的一个或更多个成员可切割的。
在一些实施方案中，所述荧光标记试剂包括选自
Figure BDA0004184559620000081
中的部分。
在一些实施方案中，所述底物是核苷酸、多核苷酸、蛋白质、脂质、细胞、糖、多糖或抗体。在一些实施方案中，所述底物是核苷酸，并且所述荧光标记试剂通过所述核苷酸的核碱基而附接到所述核苷酸。在一些实施方案中，所述底物是蛋白质。在一些实施方案中，所述底物是荧光淬灭剂、荧光供体或荧光受体。
在另一个方面，本公开提供了一种标记的底物，其包括所述底物和本文所述的荧光标记试剂或其衍生物，其中所述荧光标记试剂与所述底物偶联。
在一些实施方案中，所述底物是核苷酸、多核苷酸、蛋白质、脂质、细胞、糖、多糖或抗体。在一些实施方案中，所述底物是蛋白质。在一些实施方案中，所述蛋白质是细胞的组分。在一些实施方案中，所述底物是核苷酸，并且所述荧光标记试剂通过所述核苷酸的核碱基而附接到所述核苷酸。
在一些实施方案中，所述标记的底物包括与其偶联的附加荧光标记试剂，其中所述附加荧光标记试剂包括附加荧光染料部分和与所述附加荧光染料部分连接的附加接头，其中所述附加接头包括非蛋白质氨基酸。在一些实施方案中，所述荧光标记试剂和所述附加荧光标记试剂包括相同的化学结构。在一些实施方案中，所述荧光标记试剂和所述附加荧光标记试剂包括不同的化学结构。在一些实施方案中，所述标记的底物包括与其偶联的三种或更多种荧光标记试剂。
在一些实施方案中，所述底物是荧光淬灭剂、荧光供体或荧光受体。
在一些实施方案中，所述标记的底物相对于另一标记的底物减少了淬灭，所述另一标记的底物包括所述底物和另一荧光标记试剂，所述另一荧光标记试剂包括所述多个荧光染料部分且不包括与所述第一接头或所述第二接头具有相同化学结构的接头。
在一些实施方案中，所述标记的底物在激发和光学检测时比另一标记的底物提供更高的信号水平，所述另一标记的底物包括所述底物和另一荧光标记试剂，所述另一荧光标记试剂包括所述多个荧光染料部分且不包括与所述第一接头或所述第二接头具有相同化学结构的接头。
在另一方面，本公开提供了一种组合物，其包括溶液，所述溶液包含荧光标记的核苷酸，其中所述荧光标记的核苷酸包括荧光标记试剂，所述荧光标记试剂包括通过接头而与核苷酸连接的荧光染料部分，其中所述接头包括至少五个非蛋白质氨基酸。在一些实施方案中，所述至少五个非蛋白质氨基酸的至少一个子集包括环体系。在一些实施方案中，所述至少五个非蛋白质氨基酸的至少一个子集包括水溶性基团。在一些实施方案中，所述水溶性基团选自吡啶鎓基团、咪唑鎓基团、季铵基团、磺酸根、硫酸根、磷酸根、羟基基团、胺、亚胺、腈、酰胺、巯基、羧酸、聚醚、醛、硼酸和硼酸酯。在一些实施方案中，所述水溶性基团是羟基基团。在一些实施方案中，所述至少五个非蛋白质氨基酸的至少一个子集是羟脯氨酸部分。
在一些实施方案中，所述接头包括至少十个非蛋白质氨基酸。在一些实施方案中，所述接头包括至少二十个非蛋白质氨基酸。在一些实施方案中，所述接头包括至少三十个非蛋白质氨基酸。在一些实施方案中，所述接头包括至少一个羟脯氨酸部分。在一些实施方案中，所述接头包括至少五个羟脯氨酸部分。在一些实施方案中，所述接头包括至少十个羟脯氨酸部分。
所述接头包括至少二十个羟脯氨酸部分。在一些实施方案中，所述接头包括至少三十个羟脯氨酸部分。在一些实施方案中，所述接头还包括一个或更多个甘氨酸部分。
在一些实施方案中，所述接头包括重复单元。在一些实施方案中，所述重复单元包括一个或更多个非蛋白质氨基酸部分。在一些实施方案中，所述重复单元包括至少五个非蛋白质氨基酸部分。在一些实施方案中，所述重复单元包括至少十个非蛋白质氨基酸部分。在一些实施方案中，所述重复单元包括至少一个羟脯氨酸部分。在一些实施方案中，所述重复单元包括至少五个羟脯氨酸部分。在一些实施方案中，所述重复单元包括十个羟脯氨酸部分。在一些实施方案中，所述重复单元包括甘氨酸部分。在一些实施方案中，所述重复单元重复至少三次。
在一些实施方案中，所述荧光标记试剂还包括可切割性基团，所述可切割性基团被配置为被切割以将所述荧光染料部分与所述核苷酸分离。在一些实施方案中，所述可切割性基团选自叠氮基甲基基团、二硫键、烃基二硫基甲基基团和2-硝基苄氧基基团。在一些实施方案中，所述可切割性基团是二硫键。在一些实施方案中，所述可切割性基团是通过应用由三(2-羧乙基)膦(TCEP)、二硫苏糖醇(DTT)、四氢吡喃基(THP)、紫外(UV)光及其组合组成的组中的一个或更多个成员可切割的。
在一些实施方案中，所述接头包含选自
Figure BDA0004184559620000101
Figure BDA0004184559620000102
中的部分。
在一些实施方案中，所述接头在所述荧光染料部分和所述核苷酸之间提供至少约30埃
Figure BDA0004184559620000111
的平均物理间隔。在一些实施方案中，所述接头在所述荧光染料部分和所述核苷酸之间提供至少约60埃/>
Figure BDA0004184559620000112
的平均物理间隔。在一些实施方案中，所述接头在所述荧光染料部分和所述核苷酸之间提供至少约90埃/>
Figure BDA0004184559620000113
的平均物理间隔。
在一些实施方案中，所述溶液包含多个荧光标记的核苷酸，其中所述多个所述荧光标记的核苷酸中的每个荧光标记的核苷酸包括(i)荧光标记试剂，所述荧光标记试剂包括相同类型的荧光染料部分和相同类型的接头，和(ii)相同类型的核苷酸。在一些实施方案中，所述多个荧光标记的核苷酸中的每个荧光标记的核苷酸的每个所述接头具有相同的分子量。在一些实施方案中，所述溶液还包含多个未标记的核苷酸，其中所述多个未标记的核苷酸中的每个核苷酸与所述多个荧光标记的核苷酸中的每个所述核苷酸是相同类型。在一些实施方案中，所述溶液中所述多个荧光标记的核苷酸与所述多个未标记的核苷酸的比例为至少约1:4。在一些实施方案中，所述比例为至少约1:1。
在另一方面，本公开提供了一种方法，该方法包括将本文所述的组合物提供给与核酸链偶联的模板核酸分子。
在一些实施方案中，所述方法还包括使所述模板核酸分子和所述组合物经受足以将所述荧光标记的核苷酸掺入与所述模板核酸分子偶联的所述核酸链中的条件。在一些实施方案中，所述方法还包括检测来自所述荧光标记的核苷酸的信号。在一些实施方案中，所述方法还包括使所述荧光标记的核苷酸与切割试剂接触，所述切割试剂被配置为从所述核苷酸切割所述多个荧光染料部分。在一些实施方案中，所述方法还包括，在所述使所述荧光标记的核苷酸与所述切割试剂接触之后，使所述模板核酸分子和所述组合物经受足以将附加荧光标记的核苷酸掺入与所述模板核酸分子偶联的所述核酸链中的条件。
在一些实施方案中，所述模板核酸分子被固定在支持物上。
在另一方面，本公开提供了一种组合物，该组合物包括溶液，所述溶液包含荧光标记的核苷酸，其中所述荧光标记的核苷酸包括荧光标记试剂，所述荧光标记试剂包括通过多个接头而与核苷酸连接的多个荧光染料部分，其中所述多个接头中的第一接头与所述多个荧光染料部分中的第一荧光染料部分连接，并且其中所述多个接头中的第二接头与所述多个荧光染料部分中的第二荧光染料部分连接，并且其中所述第一接头包括第一非蛋白质氨基酸并且所述第二接头包括第二非蛋白质氨基酸。
在一些实施方案中，所述第一荧光染料部分和所述第二荧光染料部分具有相同的化学结构。在一些实施方案中，所述多个荧光染料部分中的每个荧光染料部分具有相同的化学结构。在一些实施方案中，所述多个荧光染料部分中的每个荧光染料部分在相同波长处或附近发荧光。在一些实施方案中，所述第一荧光染料部分和所述第二荧光染料部分具有不同的化学结构。
在一些实施方案中，所述荧光标记试剂包括与所述多个接头连接的一个或更多个赖氨酸部分。在一些实施方案中，所述荧光标记试剂包括与所述多个接头的至少一个子集连接的两个或更多个赖氨酸部分。在一些实施方案中，所述荧光标记试剂包括与所述多个接头的至少一个子集连接的三个或更多个赖氨酸部分。在一些实施方案中，所述第一接头与所述两个或更多个赖氨酸部分中的第一赖氨酸部分连接，并且所述第二接头与所述两个或更多个赖氨酸部分中的第二赖氨酸部分连接。在一些实施方案中，所述第一赖氨酸部分与所述第二赖氨酸部分连接。
在一些实施方案中，所述荧光标记试剂包括三个或更多个荧光染料部分和三个或更多个接头。在一些实施方案中，所述第一接头和所述第二接头具有相同的化学结构。在一些实施方案中，所述多个接头中的每个接头具有相同的化学结构。在一些实施方案中，所述第一接头和所述第二接头具有不同的化学结构。
在一些实施方案中，所述第一接头包括包含第一多个非蛋白质氨基酸的第一多个氨基酸，其中所述第一多个非蛋白质氨基酸包括所述第一非蛋白质氨基酸。在一些实施方案中，所述第一多个非蛋白质氨基酸的至少一个子集包括环体系。在一些实施方案中，所述第一多个非蛋白质氨基酸包括至少五个非蛋白质氨基酸。在一些实施方案中，所述第一多个非蛋白质氨基酸包括至少十个非蛋白质氨基酸。在一些实施方案中，所述第一多个非蛋白质氨基酸包括至少二十个非蛋白质氨基酸。
在一些实施方案中，所述第二接头包括包含第二多个非蛋白质氨基酸的第二多个氨基酸，其中所述第二多个非蛋白质氨基酸包括所述第二非蛋白质氨基酸。在一些实施方案中，所述第二多个非蛋白质氨基酸的至少一个子集包括环体系。在一些实施方案中，所述第二多个非蛋白质氨基酸包括至少五个非蛋白质氨基酸。在一些实施方案中，所述第二多个非蛋白质氨基酸包括至少十个非蛋白质氨基酸。在一些实施方案中，所述第二多个非蛋白质氨基酸包括至少二十个非蛋白质氨基酸。
在一些实施方案中，所述第一非蛋白质氨基酸或所述第二非蛋白质氨基酸包括环体系。在一些实施方案中，所述第一非蛋白质氨基酸或所述第二非蛋白质氨基酸包括水溶性基团。在一些实施方案中，所述水溶性基团选自吡啶鎓基团、咪唑鎓基团、季铵基团、磺酸根、硫酸根、磷酸根、羟基、胺、亚胺、腈、酰胺、巯基、羧酸、聚醚、醛、硼酸和硼酸酯。在一些实施方案中，所述水溶性基团是羟基基团。
在一些实施方案中，所述第一接头或所述第二接头包括三个或更多个羟脯氨酸部分。在一些实施方案中，所述第一接头或所述第二接头包括十个或更多个羟脯氨酸部分。在一些实施方案中，所述第一接头或所述第二接头包括二十个或更多个羟脯氨酸部分。在一些实施方案中，所述第一接头或所述第二接头包括三十个或更多个羟脯氨酸部分。
在一些实施方案中，所述多个接头中的每个接头包括三个或更多个羟脯氨酸部分。在一些实施方案中，所述多个接头中的每个接头包括十个或更多个羟脯氨酸部分。在一些实施方案中，所述多个接头中的每个接头包括二十个或更多个羟脯氨酸部分。在一些实施方案中，所述多个接头中的每个接头包括三十个或更多个羟脯氨酸部分。在一些实施方案中，所述第一接头或所述第二接头还包括甘氨酸部分。在一些实施方案中，所述第一接头或所述第二接头还包括磺基丙氨酸部分。
在一些实施方案中，所述第一接头或所述第二接头包括重复单元。在一些实施方案中，所述重复单元包括一个或更多个非蛋白质氨基酸部分。在一些实施方案中，所述重复单元包括五个或更多个非蛋白质氨基酸部分。在一些实施方案中，所述重复单元包括十个或更多个非蛋白质氨基酸部分。在一些实施方案中，所述重复单元包括至少一个羟脯氨酸部分。在一些实施方案中，所述重复单元包括至少五个羟脯氨酸部分。在一些实施方案中，所述重复单元包括十个羟脯氨酸部分。在一些实施方案中，所述重复单元包括甘氨酸部分。在一些实施方案中，所述重复单元重复至少三次。
在一些实施方案中，所述荧光标记的核苷酸还包括可切割性基团，所述可切割性基团被配置为被切割以将所述荧光标记的核苷酸的包括所述多个荧光染料部分的所述第一部分与所述荧光标记的核苷酸的包括所述核苷酸的第二部分分离。在一些实施方案中，所述可切割性基团选自叠氮基甲基基团、二硫键、烃基二硫基甲基基团和2-硝基苄氧基基团。在一些实施方案中，所述可切割性基团是二硫键。在一些实施方案中，所述可切割性基团是通过应用由三(2-羧乙基)膦(TCEP)、二硫苏糖醇(DTT)、四氢吡喃基(THP)、紫外(UV)光及其组合组成的组中的一个或更多个成员可切割的。
在一些实施方案中，所述荧光标记的核苷酸包括选自
Figure BDA0004184559620000141
中的部分。
在一些实施方案中，所述第一接头在所述第一荧光染料部分和所述核苷酸之间提供至少约30埃
Figure BDA0004184559620000142
的平均物理间隔。在一些实施方案中，所述第一接头在所述第一荧光染料部分和所述核苷酸之间提供至少约60埃/>
Figure BDA0004184559620000143
的平均物理间隔。在一些实施方案中，所述第一接头在所述第一荧光染料部分和所述核苷酸之间提供至少约90埃/>
Figure BDA0004184559620000144
的平均物理间隔。
在一些实施方案中，所述第二接头在所述第二荧光染料部分和所述核苷酸之间提供至少约30埃
Figure BDA0004184559620000145
的平均物理间隔。在一些实施方案中，所述第二接头在所述第二荧光染料部分和所述核苷酸之间提供至少约60埃/>
Figure BDA0004184559620000151
的平均物理间隔。在一些实施方案中，所述第二接头在所述第二荧光染料部分和所述核苷酸之间提供至少约90埃/>
Figure BDA0004184559620000152
的平均物理间隔。
在一些实施方案中，所述溶液包含多个荧光标记的核苷酸，其中所述多个所述荧光标记的核苷酸中的每个荧光标记的核苷酸包括(i)荧光标记试剂，所述荧光标记试剂包括多个相同类型的荧光染料部分和多个相同类型的接头，和(ii)相同类型的核苷酸。在一些实施方案中，所述多个荧光标记的核苷酸中的每个荧光标记的核苷酸的每个所述接头具有相同的分子量。在一些实施方案中，所述溶液还包含多个未标记的核苷酸，其中所述多个未标记的核苷酸中的每个核苷酸与所述多个荧光标记的核苷酸中的每个所述核苷酸是相同类型。在一些实施方案中，所述溶液中所述多个荧光标记的核苷酸与所述多个未标记的核苷酸的比例为至少约1:4。在一些实施方案中，所述比例为至少约1:1。
在另一方面，本公开提供了一种方法，该方法包括将本文所述的组合物提供给与核酸链偶联的模板核酸分子。
在一些实施方案中，所述方法还包括使所述模板核酸分子和所述组合物经受足以将所述荧光标记的核苷酸掺入与所述模板核酸分子偶联的所述核酸链中的条件。在一些实施方案中，所述方法还包括检测来自所述荧光标记的核苷酸的信号。在一些实施方案中，所述方法还包括使所述荧光标记的核苷酸与切割试剂接触，所述切割试剂被配置为从所述核苷酸切割所述多个荧光染料部分。在一些实施方案中，所述方法还包括，在所述使所述荧光标记的核苷酸与所述切割试剂接触之后，使所述模板核酸分子和所述组合物经受足以将附加荧光标记的核苷酸掺入与所述模板核酸分子偶联的所述核酸链中的条件。
在一些实施方案中，所述模板核酸分子被固定在支持物上。
在另一个方面，本公开提供了一种方法，该方法包括：(a)提供本文所述的荧光标记试剂；以及(b)使所述荧光标记试剂与底物接触以产生荧光标记的底物。
在一些实施方案中，所述方法还包括用一种或更多种附加荧光标记试剂重复(a)和(b)一次或更多次，以提供包括所述荧光标记试剂和所述一种或更多种附加荧光标记试剂的荧光标记的底物。在一些实施方案中，用至少两种附加荧光标记试剂重复(a)和(b)至少两次。在一些实施方案中，所述至少两种附加荧光标记试剂和所述荧光标记试剂具有相同的化学结构。在一些实施方案中，所述至少两种附加荧光标记试剂中的至少一种和所述荧光标记试剂具有不同的化学结构。
在一些实施方案中，所述方法还包括使所述荧光标记的底物与切割试剂接触，所述切割试剂被配置为从所述荧光标记的底物切割所述荧光标记试剂或其部分以产生有痕底物。在一些实施方案中，所述方法还包括在产生所述有痕底物之前，使所述荧光标记的底物和核酸分子经受足以将所述荧光标记的底物掺入所述核酸分子中的条件。在一些实施方案中，所述方法还包括在产生所述有痕底物之前，使附加底物和所述核酸分子经受足以在邻近所述底物的位置处将所述附加底物掺入所述核酸分子中的条件。在一些实施方案中，所述方法还包括在产生所述有痕底物之后，使附加底物和所述核酸分子经受足以在邻近所述有痕底物的位置处将所述附加底物掺入所述核酸分子中的条件。在一些实施方案中，所述附加底物不包括所述荧光标记试剂。在一些实施方案中，所述附加底物包括所述荧光标记试剂。在一些实施方案中，所述方法还包括在产生所述有痕底物之前，检测来自所述荧光标记的底物的信号。
在一些实施方案中，所述底物是核苷酸、多核苷酸、蛋白质、脂质、细胞、糖、多糖或抗体。在一些实施方案中，所述底物是蛋白质。在一些实施方案中，所述蛋白质是细胞的组分。在一些实施方案中，所述蛋白质是抗体。
在一些实施方案中，所述荧光标记的底物被固定到支持物上。
在另一方面，本公开提供了一种试剂盒，其包括本文所述的多种荧光标记试剂。
在一些实施方案中，所述多种荧光标记试剂与一个或更多个底物偶联。在一些实施方案中，所述多种荧光标记试剂与单个底物偶联。在一些实施方案中，所述一个或更多个底物中的底物包括与其偶联的所述多种荧光标记试剂中的至少两种荧光标记试剂。在一些实施方案中，所述一个或更多个底物是不同类型的。在一些实施方案中，所述一个或更多个底物包括一个或更多个蛋白质或抗体。在一些实施方案中，所述一个或更多个底物包括一个或更多个核苷酸。在一些实施方案中，所述一个或更多个底物包括多个第一类型的核苷酸和多个第二类型的核苷酸。在一些实施方案中，所述一个或更多个底物还包括多个第三类型的核苷酸和多个第四类型的核苷酸。
在一些实施方案中，所述多种荧光标记试剂中的每种荧光标记试剂包括相同的化学结构。在一些实施方案中，所述多种荧光标记试剂包括具有第一化学结构的第一荧光标记试剂和具有第二化学结构的第二荧光标记试剂，其中所述第一化学结构和所述第二化学结构不同。在一些实施方案中，所述第一荧光标记试剂包括第一荧光染料部分，且所述第二荧光标记试剂包括第二荧光染料部分，其中所述第一荧光染料部分和所述第二荧光染料部分具有不同的化学结构。
本公开内容的另一方面提供了非暂时性计算机可读介质，所述计算机可读介质包含机器可执行代码，所述机器可执行代码在由一个或更多个计算机处理器执行时实现上述或本文其他地方的任何方法。
本公开内容的另一方面提供了包含一个或更多个计算机处理器和与之耦合的计算机存储器的系统。所述计算机存储器包含机器可执行代码，所述机器可执行代码在由一个或更多个计算机处理器执行时实现上述或本文其他地方的任何方法。
通过以下在其中仅示出和描述了本公开内容的说明性实施方案的详细描述，本公开内容的其他方面和优点对于本领域技术人员将变得显而易见。将会认识到，本公开内容能够具有其他和不同的实施方案，并且其若干细节能够在各个明显的方面进行修改，所有这些都不偏离本公开内容。因此，附图和说明书在本质上应被认为是说明性而非限制性的。
援引并入
本说明书中提及的所有出版物、专利和专利申请均通过引用而并入本文中，其程度如同明确地且单独地指出每个单独的出版物、专利或专利申请通过引用而并入。在通过引用并入的出版物和专利或专利申请与本说明书中包含的公开内容相抵触的程度下，本说明书旨在取代和/或优先于任何此类矛盾的材料。
附图说明
本发明的新颖特征在所附权利要求中具体阐述。通过参考以下对其中利用到本发明原理的说明性实施方案加以阐述的详细描述以及附图(本文也称为“图”)，将会获得对本发明特征和优点的更好理解，在这些附图中：
图1示出了用于构建包含炔丙基衍生的核苷酸、接头和染料的标记的核苷酸的方法的示例。
图2A和2B示出了用于制备包括dGTP类似物的标记的核苷酸的示例性方法。
图3A-3C示出了用于制备包括鸟嘌呤类似物的标记的核苷酸的示例性方法。
图4示出了可用于构建染料标记的核苷酸的组分。
图5示出了示例性荧光标记试剂。
图6示出了用于制备包含鸟嘌呤类似物的标记的核苷酸的示例性方法。
图7示出了示例性测序程序。
图8示出了用于评估标记的核苷酸的基于珠的测定的示意图。
图9示出了不同标记的dUTP的基于珠的测定的结果。
图10示出了不同标记的dATP的基于珠的测定的结果。
图11示出了不同标记的dGTP的基于珠的测定的结果。
图12示出了不同标记的核苷酸的耐受性。
图13示出了用于评估淬灭的测定的示意图。
图14示出了红色染料接头的淬灭结果。
图15示出了绿色染料接头的淬灭结果。
图16A和16B示出了掺入包括同聚区域的模板中的示例。
图16C示出了使用标记的核苷酸对具有同聚区域的模板进行测序而检测到的信号。
图17A示出了利用包括20％荧光团标记的dNTP的核苷酸群的测序分析的示例性结果。
图17B示出了作为同聚物长度的函数的荧光信号强度。
图18示出了利用包括100％荧光团标记的dNTP的核苷酸群的测序分析的示例性结果。
图19A-19D示出了使用荧光标记的核苷酸对含胞嘧啶的、含腺嘌呤的、含胸腺嘧啶的和含鸟嘌呤的同聚物序列测量的信号。
图20示出了用不同荧光标记的部分标记的牛血清白蛋白的荧光。
图21A和21B示出了包括两个或更多个荧光染料部分的荧光标记试剂的部分的示例，而图21C示出了它们各自的量子产率。图21D示出了包括两个或更多个荧光染料部分的荧光标记试剂的部分的附加示例。
图21E示出了包括九个荧光染料部分的荧光标记试剂的部分。
图22A和22B示出了用不同的荧光标记部分标记的链霉亲和素(图22A)和小鼠抗体(图22B)的测量亮度。
图23示出了用于包含在光学标记试剂中的示例性染料结构。
图24示出了包括不同可切割性部分的标记的含尿嘧啶的核苷酸的测序数据。
图25示出了不同标记的含尿嘧啶的核苷酸的亮度(左图)和同聚物掺入(右图)。
图26示出了绿色和红色染料的相对荧光。
图27A-27B示出了作为同聚物长度的函数的相对荧光。
图28A和28B示出了用不同标记分数进行的测序测定的测序数据。
图29示出了被编程或以其他方式配置为实现本文提供的方法的计算机系统。
图30示出了串联标记的供体-受体荧光团对的激发光谱、发射光谱和荧光强度之间的关系的示例。
图31示出了示例性标记试剂。
图32示出了用于使用一个发射激光标记多种分子的多种标记试剂。
图33示出了两种示例性标记试剂。
具体实施方式
虽然本文已经示出和描述了本发明的各种实施方案，但对于本领域技术人员显而易见，这样的实施方案仅以示例的方式提供。本领域技术人员可在不偏离本发明的情况下想到许多变化、改变和替代。应当理解，可以使用本文中所述的本发明的实施方案的各种替代方案。
在值被描述为范围的情况下，应当理解，此类公开包括对此类范围内的所有可能的子范围的公开，以及对落入此类范围内的具体数值的公开，而不管是否明确地陈述具体数值或具体子范围。
术语“约”和“大约”通常应表示对于给定值或值范围可接受的误差或变差程度，例如，在给定值或值范围的百分之20(％)以内、15％以内、10％以内或5％以内的误差或变差程度。
如本文所用，术语“受试者”通常是指可以从中衍生出生物样本(例如，正在进行或将进行加工或分析的生物样本)的个体或实体。受试者可以是动物(例如，哺乳动物或非哺乳动物)或植物。受试者可以是人、狗、猫、马、猪、鸟、非人灵长类动物、猿猴、家畜、伴侣动物、运动动物或啮齿动物。受试者可以是患者。受试者可能患有或疑似患有疾病或病症，例如癌症(例如，乳腺癌、结直肠癌、脑癌、白血病、肺癌、皮肤癌、肝癌、胰腺癌、淋巴瘤、食道癌或宫颈癌)或传染性疾病。可替代地或附加地，可能已知受试者先前已患有疾病或病症。受试者可能患有或疑似患有遗传性病症，诸如软骨发育不全、α-1抗胰蛋白酶缺乏症、抗磷脂综合征、孤独症、常染色体显性多囊肾病、进行性神经性腓骨肌萎缩症(Charcot-Marie-tooth)、猫叫综合征、克罗恩病、囊性纤维化、痛性脂肪病(Dercum disease)、唐氏综合征、杜安综合征(Duane syndrome)、杜氏肌营养不良、因子V莱顿易栓症(factor V Leidenthrombophilia)、家族性高胆固醇血症、家族性地中海热、脆性x综合征、戈谢病、血色素沉着症、血友病、前脑无裂畸形、亨廷顿病、克兰费尔特综合征、马方综合征、强直性肌营养不良、神经纤维瘤病、努南综合征、成骨不全、帕金森病、苯丙酮尿症、波伦异常、卟啉症、早老症、色素性视网膜炎、重度联合免疫缺陷、镰状细胞病、脊髓性肌萎缩、泰-萨克斯病(Tay-Sachs)、地中海贫血、三甲基胺尿症、特纳综合征、腭心面综合征、WAGR综合征或威尔逊病。受试者可能正在接受疾病或病症的治疗。受试者可能对给定的疾病或病症有症状或无症状。受试者可以是健康的(例如，没有疑似患有疾病或病症)。受试者可能具有给定疾病的一种或更多种风险因素。受试者可能具有给定的体重、身高、体重指数或其他身体特征。受试者可能具有给定的民族或种族遗产、出生地或居住地、国籍、疾病或缓解状态、家族病史或其他特征。
如本文所用，术语“生物样本”通常是指从受试者获得的样本。生物样本可以直接或间接地从受试者获得。可以通过任何合适的方法从受试者获得样本，包括但不限于吐出、擦拭、抽血、活检、获得排泄物(例如，尿液、粪便、痰液、呕吐物或唾液)、切除、刮擦和穿刺。样本可以通过例如静脉内或动脉内进入循环系统、收集分泌的生物样本(例如，粪便、尿液、唾液、痰液等)、呼吸或手术提取组织(例如，活检)而从受试者获得。样本可以通过非侵入性方法获得，包括但不限于：刮擦皮肤或子宫颈、擦拭脸颊或收集唾液、尿液、粪便、月经、泪液或精液。可替代地，样本可以通过侵入性程序获得，例如活检、针吸或静脉切开术。样本可以包括体液，例如但不限于血液(例如，全血、红细胞、白血球或白细胞、血小板)、血浆、血清、汗液、泪液、唾液、痰液、尿液、精液、粘液、滑液、母乳、初乳、羊水、胆汁、骨髓、组织液或细胞外液或脑脊液。例如，可以通过穿刺方法获得样本以获得包含血液和/或血浆的体液。此类样本可以包含细胞和无细胞核酸材料。可替代地，样本可以从任何其他来源获得，包括但不限于血液、汗液、毛囊、颊组织、泪液、月经、粪便或唾液。生物样本可以是组织样本，例如肿瘤活检。样本可以从本文提供的任何组织获得，包括但不限于皮肤、心脏、肺、肾、乳腺、胰腺、肝脏、肠、脑、前列腺、食管、肌肉、平滑肌、膀胱、胆囊、结肠或甲状腺。本文提供的获得方法包括活检方法，包括细针抽吸、芯针活检、真空辅助活检、粗芯活检(large corebiopsy)、切取活检、切除活检、钻取活检、刮取活检或皮肤活检。生物样本可包括一种或更多种细胞。生物样本可包含一种或更多种核酸分子，例如一种或更多种脱氧核糖核酸(DNA)和/或核糖核酸(RNA)分子(例如，被包括在细胞内或不被包括在细胞内)。核酸分子可被包括在细胞内。可替代地或附加地，核酸分子可以不被包括在细胞内(例如，无细胞核酸分子)。生物样本可以是无细胞样本。
如本文所用，术语“无细胞样本”通常是指基本上无细胞的样本(例如，基于体积少于10％的细胞)。无细胞样本可以衍生自任何来源(例如，如本文所述的)。例如，无细胞样本可以衍生自血液、汗液、尿液或唾液。例如，无细胞样本可以衍生自组织或体液。无细胞样本可以衍生自多种组织或体液。例如，来自第一组织或流体的样本可以与来自第二组织或流体的样本组合(例如，在获得样本时或获得样本之后)。在一个实例中，可以从受试者(例如，在相同或不同时间)收集第一流体和第二流体并且可以将第一流体和第二流体组合以提供样本。无细胞样本可包含一种或更多种核酸分子，例如一种或更多种DNA或RNA分子。
可以处理不是无细胞样本的样本(例如，包含一种或更多种细胞的样本)以提供无细胞样本。例如，可以从受试者获得包括一种或更多种细胞以及不被包括在细胞内的一种或更多种核酸分子(例如，DNA和/或RNA分子)(例如，无细胞核酸分子)的样本。可以对样本进行处理(例如，如本文所述的)以将细胞和其他材料与不被包括在细胞内的核酸分子分离，从而提供无细胞样本(例如，包括不被包括在细胞内的核酸分子)。然后可以对无细胞样本进行进一步分析和处理(例如，如本文提供的)。不被包括在细胞内的核酸分子(例如，无细胞核酸分子)可以衍生自细胞和组织。例如，无细胞核酸分子可衍生自(例如，身体组织的)肿瘤组织或降解的细胞。无细胞核酸分子可包含任何类型的核酸分子(例如，如本文所述的)。无细胞核酸分子可以是双链的、单链的或其组合。无细胞核酸分子可以通过分泌或细胞死亡过程，例如细胞坏死、细胞凋亡等而释放到体液中。无细胞核酸分子可以从癌细胞(例如，循环肿瘤DNA(ctDNA))释放到体液中。无细胞核酸分子也可以是在母体血流中自由循环的胎儿DNA(例如，无细胞胎儿核酸分子，例如cffDNA)。可替代地或附加地，无细胞核酸分子可以从健康细胞释放到体液中。
生物样本可直接从受试者获得并分析而无需任何中间处理，诸如样本纯化或提取。例如，可以通过进入受试者的循环系统、从受试者(例如，通过针)取出血液并将取出的血液转移到容器中来直接从受试者获得血液样本。容器可包含试剂(例如抗凝剂)，以便血液样本可用于进一步分析。此类试剂可用于在分析之前处理该容器或另一容器中的样本或衍生自样本的分析物。在另一个实例中，可以使用拭子接近受试者口咽表面上的上皮细胞。在从受试者获得生物样本之后，包含生物样本的拭子可以与流体(例如，缓冲液)接触以从拭子收集生物流体。
可以从受试者获得包含一种或更多种核酸分子的任何合适的生物样本。适合于根据本文提供的方法使用的样本(例如，生物样本或无细胞生物样本)可以是待测试个体的任何材料，包括组织、细胞、降解的细胞、核酸、基因、基因片段、表达产物、基因表达产物和/或基因表达产物片段。生物样本可以是固体物质(例如，生物组织)或可以是流体(例如，生物流体)。通常，生物流体可包括与活生物体相关联的任何流体。生物样本的非限制性实例包括从受试者的任何解剖部位(例如，组织、循环系统、骨髓)获得的血液(或血液组分，例如，白细胞、红细胞、血小板)、从受试者的任何解剖部位获得的细胞、皮肤、心脏、肺、肾、呼吸、骨髓、粪便、精液、阴道流体、衍生自肿瘤组织的组织液、乳腺、胰腺、脑脊液、组织、咽拭子、活检，胎盘液、羊水、肝脏、肌肉、平滑肌、膀胱、胆囊、结肠、肠、脑、腔液、痰液、脓、微生物区、胎粪、母乳、前列腺、食管、甲状腺、血清、唾液、尿液、胃液和消化液、泪液、眼液、汗液、粘液、耳垢、油、腺体分泌物、脊髓液、毛发、指甲、皮肤细胞、血浆、鼻拭子或鼻咽冲洗液、脊髓液、脐血、强液(emphatic fluid)和/或其他排泄物或身体组织。提供了用于确定样本适用性和/或充分性的方法。样本可包括但不限于血液、血浆、组织、细胞、降解的细胞、无细胞核酸分子和/或来自细胞或衍生自个体细胞的生物材料，例如无细胞核酸分子。样本可以是细胞、组织或无细胞生物材料的异质或同质群体。可以使用能够提供适用于本文所述的分析方法的样本的任何方法来获得生物样本。
样本(例如，生物样本或无细胞生物样本)可以经受一个或更多个过程以准备用于分析，包括但不限于过滤、离心、选择性沉淀、透化、分离、搅拌、加热、纯化和/或其他过程。例如，可以过滤样本以去除污染物或其他材料。在一个实例中，可以处理包含细胞的样本以将细胞与样本中的其他材料分离。此类过程可用于制备仅包含无细胞核酸分子的样本。此类过程可以由多步离心过程组成。可以获得多个样本，例如来自同一受试者的多个样本(例如，以相同或不同方式从相同或不同身体位置获得的，和/或在相同或不同时间(例如，相隔数秒、数分钟、数小时、数天、数周、数月或数年)获得的)或来自不同受试者的多个样本，以供如本文所述的分析。在一个实例中，第一样本在受试者经受治疗方案或程序之前从该受试者获得，且第二样本在该受试者经受治疗方案或程序之后从该受试者获得。可替代地或附加地，可同时或大约同时从同一受试者获得多个样本。从同一受试者获得的不同样本可以以相同或不同的方式获得。例如，第一样本可以通过活检来获得，且第二样本可以通过抽血来获得。以不同方式获得的样本可以由不同的医疗专业人员、使用不同的技术、在不同的时间和/或在不同的位置获得。从同一受试者获得的不同样本可以从身体的不同区域获得。例如，第一样本可以从身体的第一区域(例如，第一组织)获得并且第二样本可以从身体的第二区域(例如，第二组织)获得。
如本文所用的生物样本(例如，包含一种或更多种核酸分子的生物样本)当提供在反应容器中时可能不被纯化。此外，对于包含一种或更多种核酸分子的生物样本，当将生物样本提供给反应容器时可能不提取所述一种或更多种核酸分子。例如，当将生物样本提供给反应容器时，可能不将生物样本的核糖核酸(RNA)和/或脱氧核糖核酸(DNA)分子从生物样本中提取。此外，当将生物样本提供给反应容器时，生物样本中存在的靶核酸(例如，靶RNA或靶DNA分子)可能不被浓缩。可替代地，可以纯化生物样本和/或可以将核酸分子从生物样本中的其他材料中分离。
如本文所述的生物样本可包含靶核酸。如本文所用，术语“模板核酸”、“靶核酸”、“核酸分子”、“核酸序列”、“核酸片段”、“寡核苷酸”、“多核苷酸”和“核酸”通常是指任何长度的核苷酸的聚合形式，例如脱氧核糖核苷酸(dNTP)或核糖核苷酸(rNTP)或其类似物，并且可以可互换地使用。核酸可以具有任何三维结构，并且可以执行任何已知或未知的功能。核酸分子可具有至少约10个核酸碱基(“碱基”)、20个碱基、30个碱基、40个碱基、50个碱基、100个碱基、200个碱基、300个碱基、400个碱基、500个碱基、1千碱基(kb)、2kb、3kb、4kb、5kb、10kb、50kb或更多碱基的长度。寡核苷酸通常由四种核苷酸碱基的特定序列组成：腺嘌呤(A)；胞嘧啶(C)；鸟嘌呤(G)；和胸腺嘧啶(T)(当多核苷酸是RNA时，尿嘧啶(U)替代胸腺嘧啶(T))。寡核苷酸可包括一种或更多种非标准核苷酸、核苷酸类似物和/或修饰的核苷酸。核酸的非限制性实例包括DNA、RNA、基因组DNA(例如，gDNA，例如剪切的gDNA)、无细胞DNA(例如，cfDNA)、合成DNA/RNA、基因或基因片段的编码区或非编码区、由连锁分析定义的位点(基因座)、外显子、内含子、信使RNA(mRNA)、转移RNA、核糖体RNA、短干扰RNA(siRNA)、短发夹RNA(shRNA)、微-RNA(miRNA)、核酶、互补DNA(cDNA)、重组核酸、分支核酸、质粒、载体、任何序列的分离的DNA、任何序列的分离的RNA、核酸探针和引物。核酸可以包含一个或更多个修饰的核苷酸，例如甲基化的核苷酸和核苷酸类似物。如果存在，可以在核酸组装之前或之后对核苷酸结构进行修饰。核酸的核苷酸序列可能被非核苷酸组分中断。核酸可以在聚合后例如通过与报道剂缀合或结合而被进一步修饰。
可扩增如本文所述的靶核酸或样本核酸以产生扩增的产物。靶核酸可以是靶RNA或靶DNA。当靶核酸是靶RNA时，靶RNA可以是任何类型的RNA，包括本文别处描述的RNA类型。靶RNA可以是病毒RNA和/或肿瘤RNA。病毒RNA可能对受试者具有致病性。致病性病毒RNA的非限制性实例包括人类免疫缺陷病毒I(HIV I)、人类免疫缺陷病毒n(HIV 11)、正粘病毒、埃博拉病毒、登革病毒、流感病毒(例如，H1N1、H3N2、H7N9或H5N1)、疱疹病毒、甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒(例如，装甲RNA-HCV病毒)、丁型肝炎病毒、戊型肝炎病毒、庚型肝炎病毒、爱泼斯坦-巴尔病毒、单核细胞增多症病毒、巨细胞病毒、SARS病毒、西尼罗热病毒、脊髓灰质炎病毒和麻疹病毒。
生物样本可包含多种靶核酸分子。例如，生物样本可以包含来自单个受试者的多种靶核酸分子。在另一个实例中，生物样本可以包含来自第一受试者的第一靶核酸分子和来自第二受试者的第二靶核酸分子。
如本文所用，术语“核苷酸”通常是指包括碱基(例如核碱基)、糖部分和磷酸部分的物质。核苷酸可包含具有附接的磷酸基团的游离碱。包括具有三个附接的磷酸基团的碱基的物质可被称为核苷三磷酸。当核苷酸被添加到生长的核酸分子链中时，核苷酸的近端磷酸酯与生长的链之间的磷酸二酯键的形成可能伴随着高能磷酸键的水解和作为焦磷酸的两个远端磷酸的释放。核苷酸可以是天然存在的或非天然存在的(例如，修饰的或工程化的核苷酸)。
如本文所用，术语“核苷酸类似物”可以包括但不限于可以是或可以不是天然存在的核苷酸的核苷酸。例如，核苷酸类似物可以衍生自经典核苷酸和/或包括与经典核苷酸的结构相似性，经典核苷酸为例如包括腺嘌呤(A)的、包括胸腺嘧啶(T)的、包括胞嘧啶(C)的、包括尿嘧啶(U)的或包括鸟嘌呤(G)的核苷酸。核苷酸类似物可包含相对于天然核苷酸的一个或更多个差异或修饰。核苷酸类似物的实例包括肌苷、二氨基嘌呤、5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-氯尿嘧啶、5-碘尿嘧啶、次黄嘌呤、黄嘌呤、脱氮黄嘌呤、脱氮鸟嘌呤、异胞嘧啶、异鸟嘌呤、4-乙酰胞嘧啶、5-(羧基羟甲基)尿嘧啶、5-羧甲基氨基甲基-2-硫代尿苷、5-羧甲基氨基甲基尿嘧啶、二氢尿嘧啶、β-D-半乳糖基辫苷、N6-异戊烯基腺嘌呤、1-甲基鸟嘌呤、1-甲基肌苷、2,2-二甲基鸟嘌呤、2-甲基腺嘌呤、2-甲基鸟嘌呤、3-甲基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、N6-腺嘌呤、7-甲基鸟嘌呤、5-甲基氨基甲基尿嘧啶、5-甲氧基氨基甲基-2-硫代尿嘧啶、β-D-甘露糖基辫苷、5'-甲氧基羧甲基尿嘧啶、5-甲氧基尿嘧啶、2-甲硫基-D46-异戊烯基腺嘌呤、尿嘧啶-5-氧基乙酸酸(v)、怀丁氧苷(wybutoxosine)、假尿嘧啶、辫苷、2-硫代胞嘧啶、5-甲基-2-硫代尿嘧啶、2-硫代尿嘧啶、4-硫代尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、尿嘧啶-5-氧基乙酸甲酯、尿嘧啶-5-氧基乙酸(v)、5-甲基-2-硫代尿嘧啶、3-(3-氨基-3-N-2-羧丙基)尿嘧啶、(acp3)w、2,6-二氨基嘌呤、乙炔基核苷酸碱基、1-丙炔基核苷酸碱基、叠氮基核苷酸碱基、硒代磷酸酯(phosphoroselenoate)核酸及其修饰形式(例如，通过氧化、还原和/或添加取代基，例如烷基、羟烷基、羟基或卤素部分)。核酸分子(例如，多核苷酸、双链核酸分子、单链核酸分子、引物、衔接子等)可以在碱基部分(例如，在通常可用于与互补核苷酸形成氢键的一个或更多个原子处和/或在通常不能与互补核苷酸形成氢键的一个或更多个原子处)、糖部分或磷酸骨架处进行修饰。在一些情况下，核苷酸可包括在其磷酸部分中的修饰，包括对三磷酸部分的修饰。此外，修饰的非限制性实例包括更长长度的磷酸链(例如，具有4、5、6、7、8、9、10个或更多个磷酸部分的磷酸链)、具有巯基部分的修饰(例如，α-硫代三磷酸和β-硫代三磷酸)，以及具有硒部分的修饰(例如硒代磷酸酯核酸)。核苷酸或核苷酸类似物可包含选自核糖、脱氧核糖及其修饰形式(例如，通过氧化、还原和/或添加取代基，例如烷基、羟烷基、羟基或卤素部分)中的糖。核苷酸类似物还可包含修饰的接头部分(例如，代替磷酸部分)。核苷酸类似物还可以包含胺修饰的基团，例如氨基烯丙基-dUTP(aa-dUTP)和氨基己基丙烯酰胺-dCTP(aha-dCTP)，以允许胺反应性部分例如N-羟基琥珀酰亚胺酯(NHS)的共价附接。本公开的寡核苷酸中标准DNA碱基对或RNA碱基对的替代物可以提供例如，更高密度(比特/立方毫米)、更高的安全性(抵抗天然毒素的意外或有意的合成)、在分光-程序化聚合酶中更容易区和/或较低的二级结构。核苷酸类似物可能能够与用于核苷酸检测的可检测性部分反应或结合。
如本文所用，术语“同聚物”通常是指包含相同单体单元的聚合物或聚合物的部分。同聚物可具有同聚物序列。核酸同聚物可以指包含相同核苷酸或其任何核苷酸变体的连续重复的多核苷酸或寡核苷酸。例如，同聚物可以是聚(dA)、聚(dT)、聚(dG)、聚(dC)、聚(rA)、聚(U)、聚(rG)或聚(rC)。同聚物可以是任何长度。例如，同聚物可具有至少2、3、4、5、10、20、30、40、50、100、200、300、400、500或更多个核酸碱基的长度。同聚物可具有10至500、或15至200、或20至150个核酸碱基。同聚物可具有至多500、400、300、200、100、50、40、30、20、10、5、4、3或2个核酸碱基的长度。分子，例如核酸分子，可以包括一个或更多个同聚物部分和一个或更多个非同聚物部分。分子可以完全由同聚物、多种同聚物或同聚物和非同聚物的组合形成。在核酸测序中，可以将多个核苷酸掺入核酸链的同聚物区中。此类核苷酸可以是非终止的以允许掺入连续的核苷酸(例如，在单核苷酸流期间)。
术语“扩增(amplifying)”、“扩增(amplification)”和“核酸扩增”可互换地使用，并且通常是指生成核酸或模板的一个或更多个拷贝。例如，DNA的“扩增”通常是指生成DNA分子的一个或更多个拷贝。扩增子可以是通过扩增程序从起始模板核酸分子产生的单链或双链核酸分子。此类扩增程序可以包括延伸或连接程序的一个或更多个循环。扩增子可包含核酸链，其至少一部分可与起始模板的至少一部分基本相同或基本互补。当起始模板是双链核酸分子时，扩增子可包含与一条链的至少一部分基本相同并且与任一链的至少一部分基本互补的核酸链。无论初始模板是单链的或是双链的，扩增子都可以是单链的或双链的。核酸的扩增可以是线性的、指数的或其组合。扩增可以基于乳液或可以基于非乳液。核酸扩增方法的非限制性实例包括逆转录、引物延伸、聚合酶链反应(PCR)、连接酶链反应(LCR)、解旋酶依赖性扩增、不对称扩增、滚环扩增和多重置换扩增(MDA)。在使用PCR的情况下，可以使用任何形式的PCR，非限制性实例包括实时PCR、等位基因特异性PCR、组装PCR、不对称PCR、数字PCR、乳液PCR、拨出(dial-out)PCR、解旋酶依赖性PCR、巢式PCR、热启动PCR、反向PCR、甲基化特异性PCR、微型引物PCR、多重PCR、巢式PCR、重叠延伸PCR、热不对称交错PCR和降落(touchdown)PCR。此外，扩增可以在包括参与或促进扩增的各种组分(例如，引物、模板、核苷酸、聚合酶、缓冲剂组分、辅因子等)的反应混合物中进行。在一些情况下，反应混合物包括缓冲剂，该缓冲剂允许核苷酸的背景不依赖性掺入。非限制性实例包括镁离子、锰离子和异柠檬酸盐缓冲剂。这样的缓冲剂的其他实例在Tabor,S.等人，C.C.PNAS,1989,86,4076-4080和美国专利号5,409,811和5,674,716中描述，其各自通过引用而以其整体并入本文中。
扩增可以是克隆扩增。如本文所用，术语“克隆”通常是指核酸的群体，其中大部分(例如，大于约50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％)的其成员具有至少约50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％彼此相同的序列。核酸分子的克隆群体的成员可彼此具有序列同源性。此类成员可与模板核酸分子具有序列同源性。克隆群体的成员可以是双链的或单链的。一个群体的成员可能不是100％相同或互补的，例如，在合成过程期间可能发生“错误”，以至给定群体的少数可能与该群体的大多数不具有序列同源性。例如，群体中至少50％的成员可以彼此或与参考核酸分子(即，用作序列比较的基础的确定序列的分子)基本相同。群体中至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少99％或更多的成员可以与参考核酸分子基本相同。如果两个分子之间的同一性百分比为至少60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％、99.9％或更大，则可以认为所述两个分子基本上相同(或同源)。如果两个分子之间的互补性百分比为至少60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％、99.9％或更大，则可以认为所述两个分子基本上互补。可能发生非同源核酸的低水平或非显著水平的混合，因此克隆群体可能包含少数(例如，少于30％，例如，少于10％)不同的核酸。
从单个分子进行克隆扩增的有用方法包括滚环扩增(RCA)(Lizardi等人，Nat.Genet.19:225-232(1998)，其通过引用并入本文中)、桥式PCR(Adams和Kron，Methodfor Performing Amplification of Nucleic Acid with Two Primers Bound to aSingle Solid Support,Mosaic Technologies,Inc.(Winter Hill,Mass.)；WhiteheadInstitute for Biomedical Research,Cambridge,Mass.,(1997)；Adessi等人，Nucl.Acids Res.28:E87(2000)；Pemov等人，Nucl.Acids Res.33:e11(2005)；或美国专利号5,641,658，其各自通过引用并入本文中)、聚合酶克隆(polony)传代(Mitra等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 100:5926-5931(2003)；Mitra等人，Anal.Biochem.320:55-65(2003)，其各自通过引用并入本文中)以及使用乳液在珠上的克隆扩增(Dressman等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 100:8817-8822(2003)，其通过引用并入本文中)或与基于珠的衔接子文库连接(Brenner等人，Nat.Biotechnol.18:630-634(2000)；Brenner等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97:1665-1670(2000))；Reinartz等人，Brief Funct.GenomicProteomic 1:95-104(2002)，其各自通过引用并入本文中)。由克隆扩增提供的增强的信噪比不仅仅胜过于循环测序要求的缺点。
如本文所用，术语“聚合作用酶(polymerizing enzyme)”或“聚合酶(polymerase)”通常是指能够催化聚合反应的任何酶。聚合作用酶可用于通过掺入核苷酸或核苷酸类似物来延伸与模板链配对的核酸引物。聚合作用酶可以通过延伸现有核苷酸链的3'端，通过产生磷酸二酯键而一次一个地添加与模板链匹配的新核苷酸来添加新的DNA链。本文使用的聚合酶可具有链置换活性或非链置换活性。聚合酶的实例包括但不限于核酸聚合酶。示例性聚合酶是Φ29DNA聚合酶或其衍生物。聚合酶可以是聚合作用酶(polymerization enzyme)。在一些情况下，使用转录酶或连接酶(即，催化键的形成的酶)。聚合酶的实例包括DNA聚合酶、RNA聚合酶、热稳定性聚合酶、野生型聚合酶、修饰的聚合酶、大肠杆菌(E.coli)DNA聚合酶I、T7 DNA聚合酶、噬菌体T4 DNA聚合酶Φ29(phi29)DNA聚合酶、Taq聚合酶、Tth聚合酶、Tli聚合酶、Pfu聚合酶、Pwo聚合酶、VENT聚合酶、DEEPVENT聚合酶、EX-Taq聚合酶、LA-Taq聚合酶、Sso聚合酶、Poc聚合酶、Pab聚合酶、Mth聚合酶、ES4聚合酶、Tru聚合酶、Tac聚合酶、Tne聚合酶、Tma聚合酶、Tea聚合酶、Tih聚合酶、Tfi聚合酶、铂Taq聚合酶、Tbr聚合酶、Tfl聚合酶、Pfu-turbo聚合酶、Pyrobest聚合酶、Pwo聚合酶、KOD聚合酶、Bst聚合酶、Sac聚合酶、Klenow片段、具有3’至5'核酸外切酶活性的聚合酶及其变体、修饰产物及衍生物。在一些情况下，聚合酶是单亚基聚合酶。聚合酶可具有高持续合成能力，即聚合酶将核苷酸连续掺入核酸模板中而不释放核酸模板的能力。在一些情况下，聚合酶是经修饰以接受三磷酸双脱氧核苷酸的聚合酶，例如具有667Y突变的Taq聚合酶(参见例如，Tabor等人,PNAS,1995,92,6339-6343，其全部内容通过引用并入本文中用于所有目的)。在一些情况下，聚合酶是具有修饰的核苷酸结合的聚合酶，其可用于核酸测序，非限制性实例包括ThermoSequenas聚合酶(GE Life Sciences)、AmpliTaq FS(ThermoFisher)聚合酶和测序Pol聚合酶(Jena Bioscience)。在一些情况下，聚合酶被基因工程化为区分双脱氧核苷酸，例如Sequenase DNA聚合酶(ThermoFisher)。
聚合酶可以是家族A聚合酶或家族B DNA聚合酶。家族A聚合酶包括例如，Taq、Klenow和Bst聚合酶。家族B聚合酶包括，例如，Vent(exo-)和Therminator聚合酶。已知家族B聚合酶比家族A聚合酶接受更多不同的核苷酸底物。家族A聚合酶广泛用于通过合成方法测序，可能是由于它们的高持续合成能力和保真度。
如本文所用，术语“互补序列”通常是指与另一序列杂交的序列。两条单链核酸分子之间的杂交可能涉及形成在某些条件下稳定的双链结构。如果两条单链多核苷酸通过顺序上相邻的两个或更多个碱基配对而彼此结合，则可以认为它们是杂交的。双链结构的一条链中的大部分核苷酸可以与另一条链上的核苷进行沃森-克里克碱基配对。杂交还可包括核苷类似物的配对，例如脱氧肌苷、具有2-氨基嘌呤碱基的核苷等，其可用于降低探针的简并性，无论这种配对是否涉及氢键的形成。
如本文所用，术语“变性”通常是指将双链分子(例如，DNA)分离成单链分子。变性可以是完全变性或部分变性。在部分变性中，通过DNA中双链区域旁侧的两条脱氧核糖核酸(DNA)链的变性，可以在双链分子中形成单链区域。
如本文所用，术语“解链温度”或“熔点”通常是指样本中核酸分子链的至少一部分与互补链的至少一部分分离时的温度。解链温度可以是双链核酸分子已部分或完全变性时的温度。解链温度可以是指给定核酸分子的多个序列中的序列的温度，或多个序列的温度。双链核酸分子的不同区域可具有不同的解链温度。例如，双链核酸分子可以包括具有第一熔点的第一区域和具有高于第一熔点的第二熔点的第二区域。因此，双链核酸分子的不同区域可以在不同温度下解链(例如，部分变性)。核酸分子或其区域(例如，核酸序列)的熔点可以通过实验确定(例如，通过解链分析或其他程序)或可以基于核酸分子的序列和长度来估计。例如，可以使用软件程序诸如MELTING来估计核酸序列的解链温度(Dumousseau M,Rodriguez N,Juty N,Le Novère N,MELTING,a flexible platform to predict themelting temperatures of nucleic acids.BMC Bioinformatics.2012May 16；13:101.doi:10.1186/1471-2105-13-101)。因此，如本文所述的熔点可以是估计的熔点。核酸序列的真实熔点可基于与目标核酸序列相邻的序列或其缺乏以及其他因素而变化。
如本文所用，术语“测序”通常是指产生或鉴定生物分子例如核酸分子或多肽的序列的过程。此类序列可以是核酸序列，其可以包括核酸碱基(例如，核碱基)的序列。测序可以是例如，单分子测序、合成法测序、杂交法测序或连接法测序。可以使用固定在支持物(例如，流动池或一个或更多个珠)上的模板核酸分子进行测序。测序测定可产生与一种或更多种模板核酸分子对应的一种或更多种测序读段。
如本文所用，术语“读段”通常是指核酸序列，例如测序读段。测序读段可以是通过核酸测序测定获得的核酸碱基(例如，核苷酸)或碱基对的推断序列。测序读段可以由核酸测序仪生成，例如大规模平行阵列测序仪(例如，Illumina或Pacific Biosciences ofCalifornia)。测序读段可对应于受试者基因组的部分，或在一些情况下全部。测序读段可以是测序读段集合的部分，其可以通过(例如，与参考基因组)例如比对而组合以产生受试者的基因组序列。
如本文所用，术语“检测器”通常是指能够检测或测量信号例如指示掺入的核苷酸或核苷酸类似物的存在或不存在的信号的装置。检测器可以包括可以检测和/或测量信号的光学和/或电子组件。涉及检测器的检测方法的非限制性实例包括光学检测、光谱检测、静电检测和电化学检测。光学检测方法包括但不限于荧光测定法和紫外-可见光吸光度。光谱检测方法包括但不限于质谱、核磁共振(NMR)光谱和红外光谱。静电检测方法包括但不限于基于凝胶的技术，例如凝胶电泳。电化学检测方法包括但不限于在对扩增产物进行高效液相色谱分离后对扩增产物的电化学检测。
如本文所用，术语“支持物”通常是指其上可固定试剂诸如核酸分子的任何固体或半固体制品。核酸分子可以被合成、附接、连接或以其他方式固定。核酸分子可以通过任何方法而被固定在支持物上，包括但不限于物理吸附、通过离子键或共价键形成或其组合。支持物可以是二维的(例如，平面的2D支持物)或3维的。在一些情况下，支持物可以是流动池的组件和/或可以被包括在测序仪器内或被适配成由测序仪器接收。支持物可以包括聚合物、玻璃或金属材料。支持物的实例包括膜、平面支持物、微量滴定板、珠(例如，磁珠)、过滤器、测试条、载玻片、盖玻片和试管。支持物可以包括有机聚合物，例如聚苯乙烯、聚乙烯、聚丙烯、聚氟乙烯、聚氧乙烯和聚丙烯酰胺(例如，聚丙烯酰胺凝胶)，以及其共聚物和接枝物。支持物可包括胶乳或葡聚糖。支持物也可以是无机物，例如玻璃、二氧化硅、金、可控孔度玻璃(CPG)或反相二氧化硅。支持物的构造可以是例如，珠、球、粒子、颗粒、凝胶、多孔基质或支持物的形式。在一些情况下，支持物可以是单个固体或半固体制品(例如，单颗粒)，而在其他情况下，支持物可以包含多个固体或半固体制品(例如，颗粒的集合)。支持物可以是平面的、基本上平面的或非平面的。支持物可以是多孔的或非多孔的。支持物可能具有溶胀或非溶胀特性。支持物可成形为包括一个或更多个孔、凹陷或其他容器、器皿、特征或位置。多个支持物可以在不同位置配置成阵列。支持物可以是可寻址的(例如，用于试剂的机器人递送)，或通过检测方法，例如通过激光照射和共焦或偏转光聚集进行扫描。例如，支持物可以与检测器进行光学和/或物理通信。可替代地，支持物可以与检测器物理地分开一段距离。扩增支持物(例如，珠)可以放置在另一个支持物内或上(例如，在第二支持物的孔内)。
如本文所用，术语“偶联”通常是指两个或更多个对象之间的缔合，所述缔合可能是暂时的或基本上永久的。第一对象可以可逆地或不可逆地偶联到第二对象。例如，核酸分子可以可逆地偶联到颗粒。可逆偶联可以包括例如可释放的偶联(例如，其中第一对象可以从与其偶联的第二对象释放)。例如，与第二对象可释放地偶联的第一对象可以在例如施加刺激时与所述第二对象分离，该刺激可包括光刺激(例如，紫外光)、热刺激、化学刺激(例如，还原剂)或任何其他有用的刺激。偶联可以包括固定到支持物(例如，如本文所述)。类似地，偶联可以包括附接，例如将第一对象附接至第二对象。偶联可包括影响两个对象之间缔合的任何相互作用，包括例如，共价键，非共价相互作用(例如，静电相互作用[例如，氢键合、离子相互作用和卤素键合]、π相互作用[例如，π-π相互作用、极性-π相互作用、阳离子-π相互作用和阴离子-π相互作用]、基于范德华力的相互作用[例如，偶极-偶极相互作用、偶极-诱导偶极相互作用和诱导偶极-诱导偶极相互作用]、疏水相互作用)、磁相互作用(例如，磁偶极-偶极相互作用、间接偶极-偶极偶联)、电磁相互作用、吸附或任何其他有用的相互作用。例如，颗粒可以通过静电相互作用而偶联到平面支持物。在另一个实例中，颗粒可以通过磁相互作用而偶联到平面支持物。在另一个实例中，颗粒可以通过共价相互作用而偶联到平面支持物。类似地，核酸分子可以通过共价相互作用而偶联到颗粒。可替代地或附加地，核酸分子可以通过非共价相互作用而偶联到颗粒。第一对象和第二对象之间的偶联可包含不稳定部分，例如包含酯、邻二醇、磷酸二酯、肽、糖苷、砜、Diels-Alder或类似键的部分。第一对象和第二对象之间偶联的强度可由离解常数Kd表示，其指示包括第一对象和第二对象的偶联的对象离解成未偶联的第一对象和第二对象的倾向，并且可以表示为离解(例如，未偶联)的对象与偶联的对象的比例。较小的离解常数通常表示偶联的对象之间的偶联更强。
偶联的对象及其相应的未偶联的组分可以以彼此处于动态平衡存在。例如，包括多个偶联的对象(每个偶联的对象包括第一对象和第二对象)的溶液还可包括多个第一对象和多个第二对象。在给定的时间点，给定的第一对象和给定的第二对象可以相互偶联，或者对象可以未偶联；整个溶液中偶联的组分和未偶联的组分的相对浓度将取决于第一对象和第二对象之间的偶联强度(反映在离解常数中)。例如，结合部分可偶联到核酸分子以提供结合复合物。在包含多种结合复合物的溶液中，每种结合复合物包括与核酸分子偶联的结合部分，所述多种结合复合物可与其组成核酸分子和结合部分平衡存在。给定核酸分子和给定结合部分之间的缔合可以使得在给定时间点，至少50％，例如至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或更多的核酸分子可以是多种结合复合物中的结合复合物的组分。
如本文所用，术语“标记”通常是指能够与物质例如核苷酸类似物偶联的部分。标记可以包括亲和部分。在一些情况下，标记可以是发射可被检测的信号(或减少已发射的信号)的可检测性标记。在一些情况下，此类信号可以指示一种或更多种核苷酸或核苷酸类似物的掺入。在一些情况下，标记可与核苷酸或核苷酸类似物偶联，该核苷酸或核苷酸类似物可用于引物延伸反应。在一些情况下，标记可在引物延伸反应后与核苷酸类似物偶联。在一些情况下，标记可以特异性地与核苷酸或核苷酸类似物反应。偶联可以是共价的或非共价的(例如，通过离子相互作用、范德华力等)。在一些情况下，偶联可以通过接头进行，该接头可以是可切割的，例如光可切割的(例如，在紫外光下可切割的)，化学可切割的(例如，通过还原剂，例如二硫苏糖醇(DTT)、三(2-羧乙基)膦(TCEP)、三(羟丙基)膦(THP)，或酶促可切割的(例如，通过酯酶、脂肪酶、肽酶或蛋白酶)。在一些情况下，标记可以是发光的；即荧光或磷光。例如，标记可以是或包含荧光部分(例如，染料)。染料和标记可以被掺入核酸序列中。染料和标记也可以被掺入或附接到接头，例如用于将一个或更多个珠彼此连接的接头。例如，标记例如荧光部分可以通过接头(例如，如本文所述)而与核苷酸或核苷酸类似物连接。染料的非限制性实例包括SYBR绿、SYBR蓝、DAPI、碘化丙啶、Hoechst、SYBR金、溴化乙啶、吖啶、原黄素、吖啶橙、吖啶黄素、荧光香豆素(fluorcoumanin)、椭圆玫瑰树碱、道诺霉素、氯喹、偏端霉素D、色霉素、乙菲啶、光神霉素、多吡啶钌、氨茴霉素、菲啶和吖啶、碘化丙啶、碘化己啶、二氢乙啶、乙啶同二聚体-1和乙啶同二聚体-2、单叠氮化乙啶、ACMA、Hoechst33258、Hoechst 33342、Hoechst 34580、DAPI、吖啶橙、7-AAD、放线菌素D、LDS751、羟芪巴脒(hydroxystilbamidine)、SYTOX Blue、SYTOX Green、SYTOX Orange、POPO-1、POPO-3、YOYO-1、YOYO-3、TOTO-1、TOTO-3、JOJO-1、LOLO-1、BOBO-1、BOBO-3、PO-PRO-1、PO-PRO-3、BO-PRO-1、BO-PRO-3、TO-PRO-1、TO-PRO-3、TO-PRO-5、JO-PRO-1、LO-PRO-1、YO-PRO-1、YO-PRO-3、PicoGreen、OliGreen、RiboGreen、SYBR Gold、SYBR Green I、SYBR Green II、SYBR DX、SYTO标记(例如SYTO-40、SYTO-41、SYTO-42、SYTO-43、SYTO-44和SYTO-45(蓝色)、SYTO-13、SYTO-16、SYTO-24、SYTO-21、SYTO-23、SYTO-12、SYTO-11、SYTO-20、SYTO-22、SYTO-15、SYTO-14和SYTO-25(绿色)、SYTO-81、SYTO-80、SYTO-82、SYTO-83、SYTO-84和SYTO-85(橙色)、以及SYTO-64、SYTO-17、SYTO-59、SYTO-61、SYTO-62、SYTO-60和SYTO-63(红色))、荧光素、异硫氰酸荧光素(FITC)、四甲基异硫氰酸罗丹明(TRITC)、罗丹明、四甲基罗丹明、R-藻红蛋白、Cy-2、Cy-3、Cy-3.5、Cy-5、Cy5.5、Cy-7、Texas Red、Phar-Red、别藻蓝蛋白(APC)、Sybr GreenI、Sybr Green II、Sybr Gold、CellTracker Green、7-AAD、乙啶同二聚体I、乙啶同二聚体II、乙啶同二聚体III、溴化乙啶、伞形酮、曙红、绿色荧光蛋白、赤藓红、香豆素、甲基香豆素、芘、孔雀绿、芪、萤光黄、cascade blue、二氯三嗪胺荧光素、丹酰氯、荧光镧系络合物(例如包含铕和铽的那些络合物)、羧基四氯荧光素、5-羧基荧光素和/或6-羧基荧光素(FAM)、VIC、5-碘乙酰胺基荧光素(或6-碘乙酰胺基荧光素)、5-{[2-5-(乙酰基巯基)-琥珀酰基]氨基}荧光素和5-{[3-5-(乙酰基巯基)-琥珀酰基]氨基}荧光素(SAMSA-荧光素)、丽丝胺罗丹明B磺酰氯、5-羧基罗丹明和/或6-羧基罗丹明(ROX)、7-氨基-甲基-香豆素、7-氨基-4-甲基香豆素-3-乙酸(AMCA)、BODIPY荧光团、8-甲氧基芘-1,3,6-三磺酸三钠盐、3,6-二磺酸-4-氨基-萘二甲酰亚胺、藻胆蛋白、AlexaFluor标记(例如AlexaFluor 350、405、430、488、532、546、555、568、594、610、633、635、647、660、680、700、750和790染料)、DyLight标记(例如，DyLight 350、405、488、550、594、633、650、680、755和800染料)、黑洞淬灭剂染料(Biosearch Technologies)(例如BH1-0、BHQ-1、BHQ-3和BHQ-10)、QSY染料荧光淬灭剂(Molecular Probes/Invitrogen)(例如QSY7、QSY9、QSY21和QSY35)、Dabcyl、Dabsyl、Cy5Q、Cy7Q、暗花青染料(GE Healthcare)、Dy-淬灭剂(Dyomics)(例如DYQ-660和DYQ-661)、ATTO荧光淬灭剂(ATTO-TEC GmbH)(例如ATTO 540Q、ATTO580Q、ATTO612Q、Atto532[例如Atto532琥珀酰亚胺酯]和Atto633)，以及其他荧光团和/或淬灭剂。附加的实例被包括在本文提供的结构中。包括在本文提供的结构中的染料被设想为与本文所述的任何接头和底物组合使用。可以通过施加与电磁光谱的可见区域(例如，约430-770纳米(nm))对应的能量来激发荧光染料。可以使用任何有用的设备进行激发，例如激光和/或发光二极管。包括但不限于反射镜、波片、滤光器、单色器、光栅、分束器和透镜的光学元件可用于将光向或从荧光染料导向。荧光染料可发射在电磁波谱的可见区域(例如，约430-770nm)中的光(例如，荧光)。荧光染料可以在单一波长或波长范围内被激发。荧光染料可被电磁波谱的可见部分的红色区域(约625-740nm)的光激发(例如，在电磁波谱的可见部分的红色区域中具有激发最大值)。可替代地或附加地，荧光染料可以是被电磁波谱的可见部分的绿色区域(约500-565nm)的光可激发的(例如，在电磁波谱的可见部分的绿色区域中具有激发最大值)。荧光染料可在电磁波谱的可见部分的红色区域(约625-740nm)中发射信号(例如，在电磁波谱的可见部分的红色区域中具有发射最大值)。可替代地或附加地，荧光染料可在电磁波谱的可见部分的绿色区域(约500-565nm)中发射信号(例如，在电磁波谱的可见部分的绿色区域中具有发射最大值)。
标记可以是淬灭剂分子。如本文所用，术语“淬灭剂”通常是指可以是能量受体的分子。淬灭剂可以是可以减少发射的信号的分子。例如，模板核酸分子可被设计为发射可检测性信号。包含淬灭剂的核苷酸或核苷酸类似物的掺入可以减少或消除信号，然后检测到该减少或消除。来自标记(例如，荧光部分，例如与核苷酸或核苷酸类似物连接的荧光部分)的发光也可以(例如，通过掺入可能包含或不包含标记的其他核苷酸)被淬灭。在一些情况下，如本文别处所述，用淬灭剂标记可在核苷酸或核苷酸类似物掺入之后(例如，在掺入包含荧光部分的核苷酸或核苷酸类似物之后)发生。在一些情况下，标记可能是不自淬灭或不表现邻近淬灭的类型。不自淬灭或不表现邻近淬灭的标记类型的非限制性实例包括双满(Bimane)衍生物，诸如单溴代双满。如本文所用，术语“邻近淬灭”通常是指一种现象，其中彼此靠近的一种或更多种染料与它们单独表现出的荧光相比可能表现出较低的荧光。在一些情况下，染料可经受邻近淬灭，其中供体染料和受体染料彼此在1nm至50nm之内。淬灭剂的实例包括但不限于，黑洞淬灭剂染料(Biosearch Technologies)(例如，BH1-0、BHQ-1、BHQ-3和BHQ-10)、QSY染料荧光淬灭剂(Molecular Probes/Invitrogen)(例如，QSY7、QSY9、QSY21和QSY35)、Dabcyl、Dabsyl、Cy5Q、Cy7Q、暗花青染料(GE Healthcare)、Dy-淬灭剂(Dyomics)(例如，DYQ-660和DYQ-661)和ATTO荧光淬灭剂(ATTO-TEC GmbH)(例如，ATTO540Q、ATTO 580Q和ATTO 612Q)。荧光团供体分子可以与淬灭剂联合使用。可与淬灭剂联合使用的荧光团供体分子的实例包括但不限于荧光团诸如Cy3B、Cy3或Cy5；Dy-淬灭剂(Dyomics)(例如，DYQ-660和DYQ-661)；和ATTO荧光淬灭剂(ATTO-TEC GmbH)(例如ATTO540Q、580Q和612Q)。
如本文所用，术语“标记分数”通常是指流动溶液中染料标记的核苷酸或核苷酸类似物与单一经典类型的天然/未标记的核苷酸或核苷酸类似物的比例。标记分数可以表示为标记的核苷酸或核苷酸类似物的浓度除以标记的和未标记的核苷酸或核苷酸类似物的浓度总和。标记分数可以表示为溶液(例如，核苷酸流)中包含的标记的核苷酸的百分比。标记分数可以是至少约0.5％、1％、2％、3％、4％、5％、10％、15％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更高。例如，标记分数可以是至少约20％。标记分数可以为约100％。标记分数也可以表示为溶液中包含的标记的核苷酸与未标记的核苷酸的比例。例如，标记的核苷酸与未标记的核苷酸的比例可为至少约1:5、1:4、1:3、1:2、1:1、2:1、3:1、4:1、5:1，或更高。例如，标记的核苷酸与未标记的核苷酸的比例可为至少约1:4。例如，标记的核苷酸与未标记的核苷酸的比例可为至少约1:1。例如，标记的核苷酸与未标记的核苷酸的比例可为至少约5:1。
如本文所用，术语“标记的分数”通常是指在用染料标记的核苷酸或核苷酸类似物和天然核苷酸或核苷酸类似物的混合物处理引物模板后产生的标记的核酸(例如，DNA)的实际分数。标记的分数可以与标记分数大致相同。例如，如果核苷酸流中20％的核苷酸被标记，则(例如，在核酸测序期间)被掺入到生长的核酸链中的核苷酸的约20％可以被标记。可替代地，标记的分数可以大于标记分数。例如，如果核苷酸流中20％的核苷酸被标记，则(例如，在核酸测序期间)被掺入到生长的核酸链中的核苷酸的多于20％可以被标记。可替代地，标记的分数可以小于标记分数。例如，如果核苷酸流中20％的核苷酸被标记，则(例如，在核酸测序期间)被掺入到生长的核酸链中的核苷酸的少于20％可以被标记。
当包含少于100％的标记的核苷酸或核苷酸类似物的溶液用于掺入过程例如测序过程(例如，如本文所述)时，标记的(“亮”)和未标记的(“暗”)核苷酸或核苷酸类似物可以被掺入生长的核酸链中。如本文所用，术语“耐受性”通常是指标记的分数(例如，“亮”掺入分数)与标记分数(例如，溶液中的“亮”分数)的比例。例如，如果使用0.2的标记分数而导致标记的分数为0.4，则耐受性为2。类似地，如果使用溶液中的2.5％标记的分数(bf，亮溶液分数)进行掺入过程诸如测序过程且5％是标记的(bi，亮掺入分数)，则耐受性可以是2(例如，耐受性)。对于低标记分数(例如，10％或更低的标记分数)，该模型可能是线性的。对于更高的标记分数，耐受性可能会考虑竞争性暗掺入。耐受性可以是指亮掺入分数与暗掺入分数的比例(bi/di)相比于亮溶液分数与暗溶液分数的比例(bf/df)的比较：
Figure BDA0004184559620000401
其中di＝1-bi(例如，假设100％亮分数被归一化为1，则暗掺入分数和亮掺入分数总和为1)
尽管di不能容易地测量，但bi亮掺入分数可以被测量(例如，如本文所述)，并通过拟合亮溶液分数(bf)与亮掺入分数(bi)的曲线而用于测定耐受性：
Figure BDA0004184559620000402
“正”耐受性数(>1)表示在50％的标记分数下，多于50％被标记。“负”耐受性数(<1)表示在50％的标记分数下，少于50％被标记。
如本文所用，术语“背景”通常是指相邻核苷酸的序列或背景已被观察到影响掺入反应中的耐受性。酶的性质、pH和其他因素也可能影响耐受性。将背景效应减少到最低值极大地简化了碱基测定。
如本文所用，术语“切痕(scar)”通常是指在切割光学(例如，荧光)染料，任选地以及将光学染料附接到核苷酸或核苷酸类似物的接头的全部或部分后留在先前标记的核苷酸或核苷酸类似物上的残基。切痕的实例包括但不限于羟基部分(例如，由对叠氮基甲基基团、烃基二硫基甲基键或2-硝基苄氧基键的切割产生)、巯基部分(例如，由对二硫键的切割产生)和苄基部分。例如，切痕可包含芳香族基团，例如苯基或苄基基团。切痕的大小和性质可能影响后续掺入。
如本文所用，术语“错误掺入”通常是指当DNA聚合酶掺入不是模板碱基的正确沃森克里克配偶体的标记的或未标记的核苷酸时发生的情况。在掺入事件中缺乏所有四种碱基竞争的方法中，错误掺入可能更频繁地发生，并导致链丢失，从而限制测序方法的读段长度。
如本文所用，术语“错配延伸”通常是指当DNA聚合酶掺入不是模板碱基的正确沃森克里克配偶体的标记的或未标记的核苷酸，然后接着渗入后续碱基的正确沃森克里克配偶体时发生的情况。错配延伸通常会导致前导定相并限制测序方法的读段长度。
关于淬灭，与不同核苷酸(例如，生长的核酸链中的邻近核苷酸，或核酸链中被一个或更多个其他核苷酸隔开的核苷酸)连接的两个染料部分之间的染料-染料淬灭可能强烈依赖于所述两个染料部分之间的距离。两个染料部分之间的距离可以至少部分地取决于将所述两个染料部分与各自的核苷酸或核苷酸类似物连接的接头的性质，包括接头组成和功能性长度。接头的特征，包括组成和功能性长度，可能受温度、溶剂、pH和盐浓度(例如，在溶液中)的影响。淬灭也可能基于所用染料的性质而变化。淬灭也可以发生在染料部分和核碱基部分之间(例如，在荧光染料和与其缔合的核苷酸的核碱基之间)。控制淬灭现象可能是本文所述方法的关键特征。
关于流，核苷酸流可以由标记的和未标记的核苷酸或核苷酸类似物(例如，单一经典类型的核苷酸或核苷酸类似物)的混合物组成。例如，包含多个光学(例如，荧光)标记的核苷酸和多个未标记的核苷酸的溶液可以与例如测序模板(如本文所述)接触。多个光学标记的核苷酸和多个未标记的核苷酸可各自包含相同的经典核苷酸或核苷酸类似物。流可以仅包括标记的核苷酸或核苷酸类似物。可替代地，流可以仅包括未标记的核苷酸或核苷酸类似物。流可以包括不同类型(例如，A和G)的核苷酸或核苷酸类似物的混合物。
洗涤流(例如，包含缓冲剂的溶液)可用于去除未被掺入核酸复合物(例如，测序模板，如本文所述)中的任何核苷酸。切割流(例如，包含切割试剂的溶液)可用于从光学(例如，荧光)标记的核苷酸或核苷酸类似物去除染料部分(例如，荧光染料部分)。在一些情况下，可以使用不同的切割试剂来去除不同的染料(例如，荧光染料)。在其他情况下，可以使用相同的切割试剂来去除不同的染料(例如，荧光染料)。从光学标记的核苷酸或核苷酸类似物上切割染料部分可以包括切割将核苷酸或核苷酸类似物与染料部分连接的接头的全部或部分。
如本文所用，术语“循环”通常是指其中使用与每种经典核苷酸(例如，dATP、dCTP、dGTP和dTTP或dUTP，或其修饰形式)对应的核苷酸流、洗涤流和切割流的过程(例如，提供给测序模板，如本文所述)。多个循环可用于对核酸分子进行测序和/或扩增。核苷酸流的顺序可以变化。
定相可以是前导或滞后定相。前导定相通常是指这样的现象，其中链的群体显示核苷酸流的掺入在预期的循环之前(例如，由于系统中的污染)。滞后定相是指这样的现象，其中链的群体显示核苷酸流的掺入在预期的循环之后(例如，由于在较早的循环中未完成的延伸)。
本文所述的化合物和化学部分，包括接头，可包含一个或更多个不对称中心，因此产生对映异构体、非对映异构体和其他立体异构形式，其根据绝对立体化学定义为(R)或(S)，以及根据相对立体化学定义为(D)或(L)。D/L体系将分子与手性分子甘油醛关联，且通常用于描述生物分子，包括氨基酸。除非另有说明，否则本公开旨在涵盖本文公开的化合物的所有立体异构形式。当本文所述的化合物包含烯烃双键时，除非另有说明，否则本公开旨在包括E和Z几何异构体(例如，顺式或反式)。同样，也旨在包括所有可能的异构体，以及它们的外消旋和旋光纯形式，以及所有互变异构形式。术语“几何异构体”是指烯烃双键的E和Z几何异构体(例如，顺式或反式)。术语“位置异构体”是指围绕中心环的结构异构体，例如围绕苯环的邻位异构体、间位异构体和对位异构体。立体异构体的分离可通过色谱法或通过形成非对映异构体并通过重结晶或色谱法或其任何组合来进行。(Jean Jacques,AndreCollet,Samuel H.Wilen,“Enantiomers,Racemates and Resolutions”,John Wiley andSons,Inc.,1981,通过引用并入本文中用于本公开)。立体异构体也可以通过立体选择性合成获得。
本文所述的化合物和化学部分，包括接头，可以作为互变异构体存在。“互变异构体”是指其中质子可能从分子的一个原子转移到同一分子的另一个原子的分子。在可能发生互变异构化的情况中，将存在互变异构体的化学平衡。除非另有说明，否则本文所述的化学结构旨在包括作为所述结构的不同互变异构体的结构。例如，用烯醇部分描述的化学结构还包括烯醇部分的酮互变异构形式。互变异构体的确切比例取决于几个因素，包括物理状态、温度、溶剂和pH。互变异构平衡的一些实例包括：
Figure BDA0004184559620000431
本文所述的化合物和化学部分，包括接头和染料，可以以不同的富集同位素形式提供。例如，化合物可以富含2H、3H、11C、13C和/或14C的含量。例如，接头、底物(例如，核苷酸或核苷酸类似物)或染料可在至少一个位置被氘化。在一些实例中，接头、底物(例如，核苷酸或核苷酸类似物)或染料可被完全氘化。此类氘化形式可以通过美国专利号5,846,514和6,334,997中描述的程序制备，这些专利中的每一个的全部内容均通过引用并入本文。如美国专利号5,846,514和6,334,997所述，氘化可以改进代谢稳定性和或功效，从而增加药物作用的持续时间。
除非另有说明，否则本文描绘和描述的结构旨在包括仅因一个或更多个同位素富集原子的存在而不同的化合物。例如，除了氢被氘或氚置换或碳被富集13C-或14C-的碳置换之外具有本结构的化合物和化学部分在本公开的范围内。
本公开的化合物和化学部分可在构成此类化合物的一个或更多个原子处包含非天然比例的原子同位素。例如，化合物或化学部分诸如接头、底物(例如，核苷酸或核苷酸类似物)或染料或其组合可以用一种或更多种同位素例如氘(2H)、氚(3H)、碘-125(125I)或碳14(14C)标记。用2H、11C、13C、14C、15C、12N、13N、15N、16N、16O、17O、14F、15F、16F、17F、18F、33S、34S、35S、36S、35Cl、37Cl、79Br、81Br和125I的同位素替换都被涵盖。本文所述的化合物和化学部分的所有同位素变体，无论是否具有放射性，都被包含在本公开的范围内。
用于光学检测的接头
本公开提供了一种光学(例如荧光)标记试剂，其包括染料(例如，荧光染料)和接头，所述接头与染料连接并被配置为与底物偶联以光学(例如，荧光)标记所述底物。底物可以是将被光学标记的任何合适的分子、分析物、细胞、组织或表面。实例包括细胞，包括真核细胞、原核细胞、健康细胞和患病细胞；细胞受体；抗体；蛋白质；脂质；代谢物；糖类；多糖类；探针；试剂；核苷酸和核苷酸类似物(例如，如本文所述)；多核苷酸；和核酸分子。例如，底物可以是核苷酸或核苷酸类似物。在另一实施例中，底物可以是蛋白质，例如抗体，例如作为细胞组分的蛋白质(例如，抗体)。接头和底物之间的缔合可以是任何合适的缔合，包括共价键或非共价键。例如，光学标记试剂的接头可以经由核苷酸的核碱基(例如核酸分子中的核苷酸)、经由例如炔丙基或炔丙基氨基部分而与底物(例如，核苷酸或核苷酸类似物)偶联。在另一个实施例中，光学标记试剂的接头可以经由多肽或蛋白质的氨基酸而与底物(例如，蛋白质，例如抗体)偶联。在一些情况下，接头和底物之间的缔合可能是生物素-亲和素相互作用。在其他情况下，接头和底物之间的缔合可以经由炔丙基氨基部分。在一些情况下，接头和底物之间的缔合可以经由酰胺键(例如，肽键)。标记试剂可包括可切割性部分，该可切割性部分被配置为被切割以将标记试剂或其部分从与其附接的底物分离。
在一个方面，本公开提供了一种标记试剂(例如，荧光标记试剂)，其包括光学可检测性部分，例如荧光染料部分。标记试剂可以包括多个光学可检测性部分，例如多个荧光染料部分，其可以具有相同或不同的化学结构，并且可以在相同或不同波长下产生信号(例如，发荧光)。标记试剂还可以包括与光学可检测性部分(例如，荧光染料部分)连接的接头。接头可包括一种或更多种组分，包括一种或更多种半刚性部分、间隔物部分、可切割性部分等。接头可包括至少一个非蛋白质氨基酸，例如至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30或更多个非蛋白质氨基酸。例如，接头可包括至少10个非蛋白质氨基酸，例如至少10个羟脯氨酸。在另一个实例中，接头可包括至少20个非蛋白质氨基酸。接头的非蛋白质氨基酸可以被包括在接头的任何有用部分中，并且可以按顺序被包括或由一个或更多个其他化学部分分开(例如，如本文所述)。接头可以被配置为与底物偶联以光学(例如，荧光)标记该底物。例如，底物可以是核苷酸或核苷酸类似物、核酸分子、多核苷酸、蛋白质、抗体、细胞、糖、多糖、脂质或本文所述的任何其他底物。标记试剂可包括可切割性部分，该可切割性部分被配置为被切割以将标记试剂或其部分与底物分离。
在另一个方面，本公开提供了一种标记试剂(例如，荧光标记试剂)，其包括光学可检测性部分，例如荧光染料部分。标记试剂可以包括多个光学可检测性部分，例如多个荧光染料部分，其可以具有相同或不同的化学结构，并且可以在相同或不同波长下产生信号(例如，发荧光)。标记试剂还可以包括与光学可检测性部分(例如，荧光染料部分)连接的接头。接头可以包括一个或更多个组分，包括一个或更多个半刚性部分、间隔物部分、可切割性部分等。例如，接头可以包括半刚性部分。接头的半刚性部分可以在与标记试剂偶联的底物和光学可检测性部分之间提供物理间隔，所述物理间隔可促进例如用标记试剂有效标记底物、有效检测与底物偶联的标记试剂、用附加的标记试剂有效地标记底物(例如，在掺入核酸模板的同聚区域中的情况下，如本文所述)等。半刚性部分可在与标记试剂偶联的底物和标记试剂的光学可检测性部分之间提供平均至少9埃
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的物理间隔。例如，半刚性部分可在与标记试剂偶联的底物和标记试剂的光学可检测性部分之间提供平均至少/>
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或更大的物理间隔。该平均间隔可随着环境条件而变化，包括例如溶剂(或缺乏溶剂)、温度、pH、压力等。在一个实例中，接头的半刚性部分可包括二级结构，例如螺旋结构，其在底物和光学可检测性部分之间建立并保持一定程度的物理间隔。例如，接头的半刚性部分可以包括二级结构，例如包括3个或更多个脯氨酸和/或羟脯氨酸的螺旋结构。接头可包括至少一个非蛋白质氨基酸，例如至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30或更多个非蛋白质氨基酸。例如，接头可包括至少10个非蛋白质氨基酸，例如至少10个羟脯氨酸。在另一个实例中，接头可包括至少20个非蛋白质氨基酸。接头的非蛋白质氨基酸可以被包括在接头的任何有用部分中，并且可以按顺序被包括或由一个或更多个其他化学部分分开(例如，如本文所述)。例如，接头可包括由另一部分分开的第一半刚性部分和第二半刚性部分，其中第一半刚性部分和第二半刚性部分包括二级结构，例如螺旋结构。接头可以被配置为与底物偶联以光学(例如，荧光)标记该底物。所述底物可以是例如核苷酸或核苷酸类似物、多核苷酸、核酸分子、蛋白质、抗体、细胞、糖、多糖、脂质或本文所述的任何其他底物。标记试剂可包括可切割性部分，该可切割性部分被配置为被切割以将标记试剂或其部分从底物分离。
在另一个方面，本公开提供了一种标记试剂(例如，荧光标记试剂)，其包括光学可检测性部分，例如荧光染料部分。标记试剂可以包括多个光学可检测性部分，例如多个荧光染料部分，其可以具有相同或不同的化学结构，并且可以在相同或不同波长下产生信号(例如，发荧光)。标记试剂可以包括一般结构：(可切割性接头部分)–(半刚性接头部分)-(光学可检测性部分)。该一般结构的每个组分可以由一个或更多个附加部分(包括一个或更多个间隔物部分)分开。在一些情况下，标记试剂可以包括支架，所述支架允许包含多个半刚性接头部分和/或光学可检测性部分(例如，荧光染料部分)。例如，标记试剂可以包括分支或树枝状结构。标记试剂还可以包括一个或更多个附加的特征，包括一个或者多个间隔物部分。标记试剂可包括至少一个非蛋白质氨基酸，例如至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30或更多个非蛋白质氨基酸。例如，接头可包括至少10个非蛋白质氨基酸，例如至少10个羟脯氨酸。在另一个实例中，接头可包括至少20个非蛋白质氨基酸。接头的非蛋白质氨基酸可以被包括在接头的任何有用部分中，并且可以按顺序被包括或由一个或更多个其他化学部分分开(例如，如本文所述)。半刚性接头部分中可包括一个或更多个非蛋白质氨基酸。例如，半刚性接头部分可以包括二级结构，例如包括一个或更多个脯氨酸和/或羟脯氨酸的螺旋部分。标记试剂可以被配置为与底物偶联以光学(例如，荧光)标记该底物。所述底物可以是例如核苷酸或核苷酸类似物、多核苷酸、核酸分子、蛋白质、抗体、细胞、糖、多糖、脂质或本文所述的任何其他底物。标记试剂可包括可切割性部分，该可切割性部分被配置为被切割以将标记试剂或其部分与底物分离。
接头可以包括一个或更多个具有半刚性结构的区域。例如，接头可以包括至少一个具有半刚性结构的区域，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或更多个具有半刚性结构的区域。接头的具有半刚性结构的区域可以与接头的具有半刚性结构的另一区域相邻。可替代地或附加地，接头的具有半刚性接头的区域可以与接头的不具有半刚性结构的另一区域相邻。类似地，光学(例如，荧光)标记试剂可以包括一个或更多个具有半刚性结构的区域。例如，光学(例如，荧光)标记试剂可以包括至少一个具有半刚性结构的区域，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或更多个具有半刚性结构的区域。光学(例如，荧光)标记试剂的半刚性结构可以被包括在相同或不同的接头中。例如，光学(例如，荧光)标记试剂可以包括具有第一半刚性结构的第一接头和具有第二半刚性结构的第二接头，其中第一半刚性结构和第二半刚性结构可以具有相同或不同的化学结构。具有相同或不同化学结构的两个或更多个半刚性结构可以与标记试剂的结构的单独部分偶联。例如，标记试剂可以包括支架(例如包括一个或更多个赖氨酸部分的支架)，多个不同的半刚性结构可以在不同位置偶联到该支架以提供分支或树枝状标记试剂结构。可替代地或附加地，光学(例如，荧光)标记试剂的给定接头可以包括多个半刚性结构(例如，彼此相邻或由一个或更多个其他部分分开，例如由不促成半刚性结构的一个或更多个氨基酸分开)。例如，第一半刚性结构可以通过至少一个甘氨酸部分而与第二半刚性结构分开。
接头或其部分的半刚性性质可至少部分地归因于包括一系列环体系(例如，脂肪族环和芳香族环)的结构。如本文所用，环(例如，环结构)是包含以闭合的、基本上环状的方式连接的任何数量的原子的环状部分，如有机化学领域中所使用的。环可以由任何数量的原子定义。例如，环可以包括3-12个原子，例如3-12个碳原子。在某些实例中，环可以是五元环(即，五边形)或六元环(例如，六边形)。环可以是芳香族的或非芳香族的。环可以是脂肪族的。环可包括一个或更多个双键。
环(例如，环结构)可以是可以包含一个或更多个环结构的环体系(例如，多环体系)的组分。例如，环体系可包含单环。在另一个实例中，环体系可以是双环或桥接体系。环结构可以是由碳原子形成的碳环或其组分。碳环可以是饱和的、不饱和的或芳香族的环，其中环的每个原子都是碳。碳环包括3至10元单环、4至12元双环(例如，6至12元双环)和5至12元桥环。双环碳环的每个环可选自饱和的、不饱和的和芳香族的环。例如，双环碳环可包括与饱和的或不饱和的环(例如环己烷、环戊烷或环己烯)稠合的芳香族环(例如，苯基)。双环碳环可包括饱和的、不饱和的和芳香族的双环的任何组合，只要价态允许。双环碳环可包括环大小的任何组合，例如4-5元稠环体系、5-5元稠环体系、5-6元稠环体系和6-6元稠环体系。碳环可以是例如，环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环己烯基、金刚烷基、苯基、茚满基或萘基。饱和碳环不包括多重键(例如，双键或三键)。饱和碳环可以是例如，环丙烷、环丁烷、环戊烷或环己烷。不饱和碳环包括至少一个多重键(例如，双键或三键)但不是芳香族碳环。不饱和碳环可以是例如，环己二烯、环己烯或环戊烯。碳环的其他实例包括但不限于，环丙烷、环丁烷、环戊烷、环戊二烯、环己烷、环庚烷、环庚烯、萘和金刚烷。芳香族碳环(例如，芳基部分)可以是例如，苯基、萘基或二氢萘基。
在一些情况下，环可包括一个或更多个杂原子，例如一个或更多个氧、氮、硅、磷、硼或硫原子。环可以是包含一个或更多个杂原子的杂环或其组分。杂环可以是饱和的、不饱和的或芳香族的环，其中至少一个原子是杂原子。杂原子包括3至10元单环、6至12元双环和6至12元桥环。双环杂环可包括饱和的、不饱和的和芳香族的双环的任何组合，只要价态允许。例如，杂芳环(例如，吡啶基)可以与饱和环或不饱和环(例如，环己烷、环戊烷、吗啉、哌啶或环己烯)稠合。双环杂环可包括环大小的任何组合，例如4-5元稠环体系、5-5元稠环体系、5-6元稠环体系和6-6元稠环体系。不饱和杂环包括至少一个多重键(例如，双键或三键)但不是芳香族杂环。不饱和杂环可以是例如，二氢吡咯、二氢呋喃、噁唑啉、吡唑啉或二氢吡啶。杂环的其他实例包括但不限于，吲哚、苯并噻吩、苯并噻唑、苯并噁唑、苯并咪唑、噁唑并吡啶、咪唑并吡啶、噻唑并吡啶、呋喃、噁唑、吡咯、吡唑、咪唑、噻吩、噻唑、异噻唑和异噁唑。杂芳基部分可以是芳香族单环结构，例如5至7元环，其包括至少一个杂原子，例如1至4个杂原子。可替代地，杂芳基部分可以是具有两个或更多个环状环的多环环体系，其中两个或更多个原子是两个邻接环共有的，其中至少一个环是杂芳族的。杂芳基包括例如，吡咯、呋喃、噻吩、咪唑、噁唑、噻唑、吡唑、吡啶、吡嗪、哒嗪和嘧啶等。
环可以是取代的或未取代的。取代基将环的一个或更多个原子或环的可取代的杂原子(例如，NH或NH2)上的氢原子替代。取代是根据环体系的各种组分的允许价态并提供稳定的化合物(例如，不会通过例如重排、消除或环化进行自发转化的化合物)。取代基可以替代单个氢原子或多个氢原子(例如，在相同环原子或不同环原子上)。环上的取代基可以是例如，卤素、羟基、氧代、硫代、巯基、酰胺基、氨基、羧基、次氮基、氰基、硝基、亚氨基、肟基、肼基、烷氧基、烯基、炔基、芳基、芳烷基、芳烯基、芳炔基、环烷基、环烷基烷基、烷基环烷基、杂环烷基、杂环基、烷基杂环基或任何其他有用的取代基。取代基可以是水溶性的。水溶性取代基的实例包括但不限于，吡啶鎓、咪唑鎓、季铵基团、磺酸根、硫酸根、磷酸根、醇、胺、亚胺、腈、酰胺、巯基、羧酸、聚醚、醛、硼酸和硼酸酯。
接头或其半刚性部分可以具有任何数量的环，包括至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30或更多个环。在一些情况下，环可以共享一条边(例如，是双环环体系的组分)。通常，接头的环部分可向接头提供一定程度的物理刚性和/或可用于将接头的一端上的染料(例如，荧光染料)与待标记的底物和/或与与底物缔合和/或与接头缔合的第二染料(例如，荧光染料)物理地分隔。环可以是氨基酸(例如，非蛋白质氨基酸，如本文所述)的组分。例如，接头可以包括脯氨酸部分。在另一个实例中，接头可以包括羟脯氨酸部分。例如，接头或其半刚性部分可以包括至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30或更多个脯氨酸或羟脯氨酸部分。
在一些情况下，接头可以包括“完全刚性的”(例如，基本上不可弯曲的)部分。例如，接头可以包括区域，该区域包括可能不被任何sp2或sp3碳原子分隔的环体系。通常，sp2和sp3碳原子(例如，环体系之间)为接头或其部分提供一定程度的物理柔性。具体地，sp3碳原子可以赋予明显柔性。非限制性地，柔性可以允许聚合酶接受用接头和染料(例如，荧光染料)修饰的底物(例如，核苷酸或核苷酸类似物)，或以其他方式改善标记的体系的性能。然而，在多重染料体系(例如，包括多种荧光标记试剂的体系，例如包括与两种或更多种荧光标记试剂偶联的两个或更多个核苷酸的多核苷酸)中，过度柔性的接头可能破坏刚性特征并允许两种染料(例如，荧光染料)变成紧密缔合并被淬灭。因此，接头或其部分的环体系可以通过有限数量的sp3键而彼此连接，例如通过不多于两个sp3键(例如，0、1或2个sp3键)，以例如赋予接头或其部分一定程度的刚性。例如，接头或其部分的至少两个环体系可以通过不多于两个sp3键(例如，通过0、1或2个sp3键)而彼此连接。例如，接头或其部分的至少两个环体系可以通过不多于两个sp2键，例如通过不多于1个sp2键而彼此连接。接头或其部分的环体系可以通过有限数量的原子(例如通过不多于2个原子)而彼此连接。例如，接头或其部分的至少两个环体系可以通过不多于2个原子(例如通过仅1个原子或不通过原子(例如，直接连接)而彼此连接。
接头或其部分的一系列环体系可包括芳香族环和/或脂肪族环。接头或其部分的至少两个环体系可以在没有中间碳原子的情况下彼此直接连接。接头可包括至少一个可包括环体系的氨基酸，例如脯氨酸或羟脯氨酸部分。例如，接头可以包括羟脯氨酸。接头可以包括至少一个非蛋白质氨基酸(例如，如本文所述)，例如羟脯氨酸。接头可以按顺序包括多个包括环体系的氨基酸。例如，接头可以按顺序包括至少两个氨基酸，其中所述至少两个氨基酸中的每一个都包括环体系(例如，具有相同或不同结构的环体系)。所述至少两个氨基酸可以包括至少两个非蛋白质氨基酸，例如羟脯氨酸。在另一个实例中，接头可以按顺序包括至少三个氨基酸，其中所述至少三个氨基酸中的每一个都包括环体系(例如，具有相同或不同结构的环体系)。所述至少三个氨基酸可以包括至少三个非蛋白质氨基酸。例如，接头可以包括至少三个羟脯氨酸，例如至少3、4、5、6、7、8、9、10或更多个羟脯氨酸。可以按顺序包括两个或更多个非蛋白质氨基酸。例如，两个或更多个非蛋白质氨基酸可以彼此相邻，而没有中间特征或其他化学结构。例如，可以按顺序包括3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30或更多个非蛋白质氨基酸。接头可以包括包括环体系的氨基酸的第一序列和包括环体系的氨基酸的第二序列，其中第一序列和第二序列可以由不包括环体系的一个或更多个部分(例如一个或更多个甘氨酸)分开。例如，接头可以包括羟脯氨酸的第一序列和羟脯氨酸的第二序列，其中第一序列和第二序列可由至少一个甘氨酸分开。在另一个实例中，接头可以包括包括环体系的氨基酸的第一序列、包括环体系的氨基酸的第二序列、和包括环体系的氨基酸的第三序列，其中第一序列、第二序列和第三序列可由不包括环体系的一个或更多个部分(例如一个或更多个甘氨酸)分开。光学(例如，荧光)标记试剂可以包括一个或更多个接头，例如，各自包括两个或更多个氨基酸(例如，非蛋白质氨基酸)的一个或更多个接头。例如，光学标记试剂可以包括包括第一氨基酸序列的第一接头和包括第二氨基酸序列的第二接头，其中第一序列包括两个或更多个包括环体系的氨基酸(例如，非蛋白质氨基酸)且第二序列包括两个或更多个包括环体系的氨基酸(例如，非蛋白质氨基酸)。在一个实例中，光学标记试剂可以包括第一接头和第二接头，所述第一接头包括羟脯氨酸的第一序列，所述第二接头包括羟脯氨酸的第二序列。第一接头和第二接头可以与支架的不同部分连接。第一接头可以直接或间接地偶联到第一光学可检测性部分，且第二接头可以间接或直接地偶联到第二光学可检测性部分，其中第一光学可检测性部分和第二光学可检测性部分可以是相同或不同的类型。
本文提供的标记试剂的接头或其部分可以包括二级结构，例如螺旋结构。例如，标记试剂可以包括聚脯氨酸或聚羟脯氨酸螺旋。包括脯氨酸和/或羟脯氨酸的螺旋结构可以按顺序包括三个或更多个脯氨酸和/或羟脯氨酸。例如，光学标记试剂可以包括第一接头和第二接头，所述第一接头包括包括第一羟脯氨酸序列的第一二级结构(例如，螺旋结构)，且所述第二接头包括包括第二羟脯氨酸序列的第二二级结构(例如，螺旋结构)。第一接头和第二接头可以与支架的不同部分连接。第一接头可以直接或间接地偶联到第一光学可检测性部分，且第二接头可以间接或直接地偶联到第二光学可检测性部分，其中第一光学可检测性部分和第二光学可检测性部分可以是相同或不同的类型。在包括脯氨酸和/或羟脯氨酸或其衍生物的螺旋结构中，给定的脯氨酸、羟脯氨酸或其衍生物可在与其连接的部分之间提供约
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的物理间隔。例如，包括三个脯氨酸、羟脯氨酸或类似结构的螺旋结构或半螺旋结构可以在与它们连接的部分之间提供约/>
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的物理间隔。在一些情况下，二级结构诸如螺旋结构可以在与它们连接的部分之间提供至少约/>
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的物理间隔，例如至少约/>
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或更大的物理间隔。在一些情况下，几个这样的二级结构将被包括在单个接头部分中，任选地被一个或更多个特征例如另一个化学部分分开。例如，包括脯氨酸、羟脯氨酸或其衍生物的两个螺旋结构可被甘氨酸分开。在一些情况下，光学标记试剂中将包括但可能不一定按顺序包括多个二级结构。例如，光学标记试剂可以包括包括第一螺旋结构的第一接头和包括第二螺旋结构的第二接头。第一接头或第二接头还可包括第三螺旋结构，并且在一些情况下，还包括第四螺旋结构。
接头的结构特征，包括环的数量、接头或其部分的刚性等，可以组合以在光学可检测性部分(例如，荧光染料部分)和由标记试剂标记的底物(例如，蛋白质、核苷酸或核苷酸类似物、细胞等)之间建立功能性距离。在一些情况下，该距离对应于接头的长度(和/或功能性长度)。标记试剂或其部分的功能性长度可以是平均值，表示在各种分子和溶剂运动之间的平均值。在一些情况下，功能性长度基于在其中测量或估计该长度的溶液的温度、溶剂、pH和/或盐浓度中的一项或更多项而变化。可以在其中测量来自底物的光学(例如，荧光)信号的溶液中测量功能性长度。功能性长度可以是功能性长度分布(例如，在旋转、振动和平移运动上)的平均值或总体值并且可以基于例如温度、溶剂、pH和/或盐浓度而不同。功能性长度可以被估计(例如，基于键长和空间考虑因素，例如通过使用化学绘图或建模程序)和/或测量(例如，使用分子成像和/或晶体学技术)。对于包括一个或更多个接头(例如将一个或更多个染料部分与底物连接的一个或更多个接头)的光学(例如，荧光)标记试剂，可以在染料部分和底物之间建立一个或更多个不同的功能性距离。
标记试剂可以在光学可检测性部分(例如，荧光染料)和由标记试剂标记的底物(例如，蛋白质、核苷酸或核苷酸类似物、细胞等)之间建立任何合适的功能性长度。在一些情况下，功能性长度为至多约500纳米(nm)、约200nm、约100nm、约75nm、约50nm、约40nm、约30nm、约20nm、约10nm、约5nm、约2nm、约1.0nm、约0.5nm、约0.3nm、约0.2nm或更小。在一些情况下，功能性长度为至少约0.2纳米(nm)、至少约0.3nm、至少约0.5nm、至少约1.0nm、至少约2nm、至少约5nm、至少约10nm、至少约20nm、至少约30nm、至少约40nm、至少约50nm、至少约75nm、至少约100nm、至少约200nm、至少约500nm或更大。在一些情况下，功能性长度为约0.5nm至约50nm。在一些情况下，功能性长度可为至少约
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或更大。
光学(例如，荧光)标记试剂的许多应用(例如，核酸测序反应和蛋白质/细胞标记)可以在水溶液中进行。在一些情况下，具有过高的碳原子和氢原子比例和/或缺乏带电化学基团的接头可能水溶性不足以在水溶液中有用。因此，标记试剂可以包括一个或更多个水溶性基团。水溶性基团可在任何有用位置掺入标记试剂中。例如，标记试剂的接头或其半刚性部分可以包括一个或更多个水溶性基团。标记试剂还可以或可替代地在光学可检测性部分(例如，如本文所述的荧光染料部分)的附接点处或附近包括一个或更多个水溶性基团。可替代地或附加地，标记试剂可以在与底物(例如，蛋白质、核苷酸或核苷酸类似物、细胞等)的附接点处或附近包括水溶性基团。可替代地或附加地，标记试剂可以在光学可检测性部分(例如，如本文所述的荧光染料部分)和底物(例如，蛋白质、核苷酸或核苷酸类似物、细胞等)的附接点之间包括水溶性基团。标记试剂或其接头的一个或更多个环可以包括其中掺入的或与其附接的水溶性基团。例如，标记试剂的给定环(例如标记试剂的接头部分中包括的环)可以包括一个或更多个水溶性部分。例如，接头的环可以包括两个水溶性部分。水溶性基团可以是环结构的骨架的组成部分。可替代地或附加地，水溶性基团可以附加到环结构上(例如，作为取代基)。例如，标记试剂可以包括至少一个羟脯氨酸，该羟脯氨酸包括五元环，该环具有与其附接的羟基。标记试剂的水溶性部分可以是相同或不同的类型。例如，标记试剂可以包括至少一个第一类型的水溶性部分和至少一个不同于第一类型的第二类型的水溶性部分。在一个实例中，标记试剂可以包括给定类型的多个水溶性部分，例如多个羟基部分。在一些情况下，水溶性基团可能带正电。合适的水溶性基团的实例包括但不限于，吡啶鎓、咪唑鎓、季铵基团、磺酸根、硫酸根、磷酸根、醇、胺、亚胺、腈、酰胺、巯基、羧酸、聚醚、醛和硼酸或硼酸酯。
水溶性基团可以是使光学(例如，荧光)标记试剂的logP降低(包括使其更负)的任何官能团。LogP是分子在水和正辛醇之间的分配系数。油脂性分子更有可能分配到辛醇中，给出大的正logP值。LogP的公式可以表示为log P辛醇/水＝log([溶质]辛醇/[溶质]水)，其中[溶质]辛醇是辛醇中的溶质(即，标记试剂)的浓度且[溶质]水是水中的溶质的浓度。因此，与辛醇相比，越多化合物分配到水中，logP越负。LogP可以通过实验测量或通过使用软件算法来预测。水溶性基团可以具有任何合适的LogP值。在一些情况下，LogP小于约2、小于约1.5、小于约1、小于约0.5、小于约0、小于约-0.5、小于约-1、小于约-1.5、小于约-2或更低。在一些情况下，LogP为约2.0至约-2.0。
接头可包括一个或更多个不对称(例如，手性)中心(例如，如本文所述)。设想到接头的所有立体化学异构体，包括外消旋体和对映体纯接头。
标记试剂或其组分和/或可与其偶联的底物(例如，蛋白质、核苷酸或核苷酸类似物、细胞等)可以包括一个或更多个同位素(例如，放射性)标记(例如，如本文所述)。设想到接头的所有同位素变体。
标记试剂可以包括具有规则重复单元的聚合物。可替代地，标记试剂可以包括没有规则重复单元的共聚物。重复单元可以包括氨基酸(例如，非蛋白质氨基酸)序列。例如，重复单元可以包括至少3个脯氨酸、羟脯氨酸或其衍生物，例如至少3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33或更多个脯氨酸、羟脯氨酸或其衍生物。重复单元可以包括两个或更多个不同的氨基酸。例如，重复单元可以包括第一氨基酸(X)和第二氨基酸(Y)。可以包括第一氨基酸或第二氨基酸中的一种或更多种。例如，标记试剂可以包括具有式(XnYm)i的部分，其中n是至少1，m是至少1并且i是至少2，并且X和Y是不同的氨基酸。在一个实例中，X可以是甘氨酸，n是1，且Y是羟脯氨酸。在这种情况下，m可以是至少3(例如，3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更大)且i可以是例如至少2(例如，2、3、4、5、6、7、8或更大)。此类接头组分的实例如下所示：
Figure BDA0004184559620000561
上面示出的结构包括10个羟脯氨酸部分和一个甘氨酸部分，并且在本文中称为“H”或“hyp10”。可替代的表示可以包括Hyp10、hyp10和Hyp10。注意，表示hyp10还可以包括不含甘氨酸部分的10个羟脯氨酸的序列。在一些情况下，包括甘氨酸的hyp10序列可以可替代地表示为hyp10-Gly或类似物。一种或更多种这样的结构可以被包括在标记试剂或其接头部分中。例如，hyp10结构可以是接头中的重复单元。按顺序的两个hyp10结构在本文中可称为hyp20。这样的结构可以包括20个羟脯氨酸部分，并且在一些情况下，还可以包括一个或更多个甘氨酸。类似地，按顺序的三个hyp10结构在本文中可以称为hyp30。这样的结构可以包括30个羟脯氨酸部分，并且在一些情况下，还可以包括一个或更多个甘氨酸。例如，hyp30序列可以包括三组由甘氨酸分开的十个羟脯氨酸。可替代地，hyp30结构可以包括三十个羟脯氨酸，而没有中间结构。包括不同数量的羟脯氨酸(例如hypn或hypn)的相关结构也可以被包括在标记试剂中。本文别处提供了此类结构的其他细节。如本文所述，设想到hyp10、hyp20和hyp30的所有立体异构体及其组合。
聚合物或共聚物结构可被包括在标记试剂的接头部分中。聚合物或共聚物结构可以根据任何有用的方法制备，并且可以不是聚合过程的结果。通常，聚合过程可产生具有各种聚合度和分子量的产物。相反，本文提供的标记试剂可以具有限定的(即，已知的)分子量。
标记试剂可以包括直链和/或邻接链。例如，标记试剂可以具有一般结构：(任选的可切割性接头部分)-(半刚性接头部分)-(光学可检测性部分)。每个部分可由一个或更多个附加特征分开，所述附加特征包括例如间隔物部分。标记试剂可以包括与中心结构(例如，如本文所述的支架)连接的多个直链和/或邻接链。标记试剂的接头部分可以包括分支点，其有助于将多个光学可检测性部分连接到给定接头部分。可替代地，标记试剂的接头部分可以被配置为连接到单个光学可检测性部分。
图5示出了包括在标记试剂中的示例性结构。示例性结构包括接头，该接头包括三个由甘氨酸分开的十个羟脯氨酸的序列。十个羟脯氨酸部分在本文可以表示为Hyp10、hyp10、Hyp10或hyp10。包括三个由甘氨酸分开的十个羟脯氨酸的序列的接头可以表示为例如，Hyp10-Gly-Hyp10-Gly-Hyp10-Gly，或者，在替代方案中，Gly-Hyp10-Gly-Hyp10-Gly-Hyp10。包括三个由甘氨酸分开的十个羟脯氨酸的序列的接头也可以表示为例如Hyp30、hyp30、Hyp30或hyp30。该结构还包括通过甘氨酸而与接头偶联的光学染料部分。在图5中包括的光学染料部分在约532纳米(nm)处发荧光。然而，可以使用任何其他有用的染料部分(例如，如本文所述)。图5所示的结构还包括用于与一个或更多个附加部分附接的柄，包括可切割性接头部分和/或间隔物部分，所述结构可经由这些部分而连接到底物(例如，如本文所述)。在一些情况下，接头可以不包括可切割性接头部分，并且柄可以提供与底物的连接。在一些情况下，所示结构或类似结构可连接到支架，任选地具有中间可切割性部分，该支架可促进在单个标记试剂中包含多个光学可检测性部分。
分支和树枝状标记试剂
在一些情况下，标记试剂可以包括分支结构。标记试剂可以能够用多个光学可检测性部分(例如，荧光染料)标记底物(例如，如本文所述)。例如，标记试剂可以包括支架，该支架被配置为通过多个单独的接头部分将多个光学可检测性部分连接到单个底物。这样的支架可包括多个连接点(例如，“柄”)以附接接头部分，该接头部分可各自偶联到一个或更多个光学可检测性部分。例如，支架可以包括两个或更多个氨基部分，所述氨基部分可以用接头官能化。在一个实例中，支架可以包括赖氨酸。支架可以包括重复部分，例如两个或更多个相同部分。例如，支架可以包括两个或更多个赖氨酸。标记试剂可以包括多个分支点。例如，标记试剂可以包括树枝化基元(dendron)或树枝状大分子结构。
因此，在一个方面，本公开提供了标记试剂(例如，荧光标记试剂)，其包括多个光学可检测性部分(例如，荧光染料部分)和多个接头。多个光学可检测性部分可以包括与包括接头的多个接头相同数量的光学可检测性部分。可替代地，标记试剂可以包括比光学可检测性部分更多的接头，或比接头更多的光学可检测性部分。在一个实例中，标记试剂包括两个光学可检测性部分和两个接头。在另一个实例中，标记试剂包括三个光学可检测性部分和三个接头。标记试剂可以包括至少两个接头，例如至少2、3、4、5、6、7、8、9或更多个接头。类似地，标记试剂可以包括至少两个光学可检测性部分，例如至少2、3、4、5、6、7、8、9或更多个光学可检测性部分。多个接头可以包括第一接头和第二接头，所述第一接头与多个光学可检测性部分中的第一光学可检测性部分(例如，第一荧光染料部分)偶联(例如，连接)，并且所述第二接头与多个光学可检测性部分中的第二光学可检测性部分(例如，第二荧光染料部分)偶联(例如，连接)。第一光学可检测性部分和第二光学可检测性部分可以具有相同的化学结构(例如，可以在相同波长处或附近发荧光)。当标记试剂包括三个或更多个光学可检测性部分时，每个光学可检测性部分可以具有相同的化学结构(例如，可以在相同的波长处或附近发荧光)。可替代地，第一光学可检测性部分和第二光学可检测性部分可以具有不同的化学结构(例如，可以在不同的波长发荧光)。标记试剂可以被配置为与底物(例如，如本文所述)偶联以标记(例如，荧光标记)该底物。例如，底物可以是蛋白质、抗体、糖、多糖、核苷酸、核苷酸类似物、多核苷酸、核酸分子、细胞、细胞表面标志物或任何其他有用的部分(例如，如本文所述)。所述多个接头可连接至支架，这种支架包括一个或更多个赖氨酸(例如，1、2、3或更多个赖氨酸)。第一接头可连接到第一赖氨酸部分，且第二接头可连接到第二赖氨酸部分，该第二赖氨酸部分可以连接到第一赖氨酸部分。标记试剂还可包括可切割性基团(例如，如本文所述)，所述可切割性基团可将底物连接到标记试剂的支架。第一接头和第二接头可以具有相同或不同的结构。例如，第一接头可以包括第一半刚性部分，且第二接头可以包括具有与第一半刚性部分相同结构的第二半刚性部分。第一接头和/或第二接头可以具有本文所述的任何有用的特征，包括氨基酸(例如，非蛋白质氨基酸)、环结构、水溶性基团、可切割性接头部分、半刚性部分、二级结构(例如，螺旋结构)等。第一接头和/或第二接头可以包括一个或更多个氨基酸，例如一个或更多个非蛋白质氨基酸。例如，第一接头可以包括第一氨基酸(例如，第一非蛋白质氨基酸)，且第二接头可以包括第二氨基酸(例如，第二非蛋白质氨基酸)。第一氨基酸和第二氨基酸可以是相同或不同的类型。在一个实例中，第一接头可以包括至少一个羟脯氨酸或其衍生物，且第二接头可以包括至少一个羟脯氨酸或其衍生物。例如，第一接头和/或第二接头可以包括至少2个羟脯氨酸，例如至少3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30或更多个羟脯氨酸。第一接头和/或第二接头可以包括相同或不同数量的任何给定物质。例如，第一接头可以包括至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30或更多个氨基酸(例如，非蛋白质氨基酸)。类似地，第二接头可以包括至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30或更多个氨基酸(例如，非蛋白质氨基酸)。例如，第一接头和/或第二接头可以包括hyp10部分(例如，如本文所述的10个羟脯氨酸)、hyp20部分(例如，如本文所述的20个羟脯氨酸)或hyp30部分(例如，如本文所述的30个羟脯氨酸)。第一接头和/或第二接头可以包括至少一个甘氨酸。类似地，第一接头和/或第二接头可以包括至少一个磺基丙氨酸部分。第一接头和/或第二接头可以包括重复单元(例如，如本文所述)，该重复单元可以包括一个或更多个非蛋白质氨基酸(例如，2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30或更多个非蛋白质氨基酸)，例如一个或更多个羟脯氨酸。
图21A示出了包括在标记试剂中的示例性支架结构。支架结构包括多个赖氨酸部分，每个赖氨酸部分包括氨基，通过该氨基可以连接接头部分。所示的支架包括三个赖氨酸部分，这使得能够掺入四个接头部分。在图中，每个接头部分具有相同的化学结构，并且连接到具有相同结构的光学可检测性部分；然而，可以使用接头和光学可检测性部分的任何有用组合(例如，如本文所述)。三赖氨酸支架还包括可活化的酯部分，其可连接到标记试剂的其他组分，例如可切割性部分和任选的间隔物部分。可替代地，可活化的酯可促进与底物的直接连接(例如，如本文所述)。
图21B示出了包含在标记试剂中的结构的其他实例。上图示出了包括包含单个赖氨酸的支架的结构，其使得能够掺入两个接头和两个光学可检测性部分。在图中，每个接头部分具有相同的化学结构，并且连接到具有相同结构的光学可检测性部分；然而，可以使用接头和光学可检测性部分的任何有用组合(例如，如本文所述)。显示了基于单赖氨酸的结构的三个实例：其中光学可检测性部分(例如，染料)与赖氨酸的氨基直接连接的结构、其中光学可检测性部分通过hyp10部分(例如，包括至少10个羟脯氨酸的接头)而与赖氨酸的氨基连接的结构、以及其中光学可检测性部分通过hyp30部分(例如，包括至少30个羟脯氨酸的接头)而与赖氨酸的氨基连接的结构。下图示出了包括包含两个赖氨酸的支架的结构，其使得能够掺入三个接头和三个光学可检测性部分。如在上图中，尽管示出的每个接头部分具有相同的化学结构，并且连接到具有相同结构的光学可检测性部分，但可以使用接头和光学可检测性部分的任何有用组合(例如，如本文所述)。示出了基于二赖氨酸的结构的两个实例：其中光学可检测性部分(例如，染料)与赖氨酸的氨基直接连接的结构，以及其中光学可检测性部分通过hyp10部分(例如，包括至少10个羟脯氨酸的接头)而与赖氨酸的氨基连接的结构。图21C示出了与图21B所示的每个结构以及游离光学可检测性部分(此处，Atto532)对应的相对量子产率。图21D示出了包括三赖氨酸(例如Lys-Lys-Lys)主链的附加结构。所述结构包括具有与三赖氨酸主链直接偶联的光学可检测性部分的接头，以及具有经由hyp10或hyp30部分而与三赖氨酸主链偶联的光学可检测性部分的接头。如在前面的实例中，尽管示出的每个接头部分具有相同的化学结构，并且连接到具有相同结构的光学可检测性部分，但可以使用接头和光学可检测性部分的任何有用组合(例如，如本文所述)。
图21E示出了包含在标记试剂中的结构，其包括与第四二赖氨酸偶联的三个二赖氨酸。所述结构包括九个接头和九个光学可检测性部分。尽管接头和光学可检测性部分被显示为具有相同的化学结构，但可以使用接头和光学可检测性部分的任何组合(例如，如本文所述)。图21E中的染料部分用“*”符号表示；然而，可以使用任何有用的光学可检测性部分。尽管光学可检测性部分表示为单个荧光染料部分，但也可以使用染料对。例如，染料对可以包括荧光供体和荧光受体。染料对可以包括第一染料和第二染料。示例性染料对可以包括AF488和Atto532染料。为了评估染料对之间的能量转移，抗体可以用生物素进行标记，然后与链霉亲和素-藻红蛋白(SAPE)混合。该混合物可用于标记细胞，其可使用流式细胞术进行分析。可替代地，链霉亲和素标记的磁珠可以用来代替细胞。生物素化的BSA可被过量添加到珠中，然后被洗涤。然后可以使用流式细胞术来测量亮度。
氨基酸
标记试剂可以在标记试剂的一个或更多个部分中包括多个氨基酸。例如，氨基酸或多个氨基酸，例如一个或更多个赖氨酸，可以用作支架，该支架可以与一个或更多个接头附接(例如，如本文所述)。可替代地或附加地，标记试剂的接头可以包括一个或更多个氨基酸(例如，如本文所述)。标记试剂可以包括任何有用数量的氨基酸，例如至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40或更多个氨基酸。标记试剂的氨基酸的至少一个子集可以按顺序(例如，彼此相邻)被包括。标记试剂可以包括多个不同的氨基酸子集，例如多个不同氨基酸序列。如本文所述，氨基酸可以以二级结构例如螺旋结构排列。例如，标记试剂(例如，标记试剂的接头)可以包括包括二级结构的部分，例如螺旋结构，例如包括多个脯氨酸、羟脯氨酸或其衍生物的螺旋结构。包括多个接头的标记试剂可以包括多个氨基酸子集，并且标记试剂的每个接头可以包括共享的或不同的化学结构(例如，相同的氨基酸序列)。
氨基酸可以是天然氨基酸或非天然氨基酸。氨基酸可以是蛋白质氨基酸或非蛋白质氨基酸。如本文所用，“蛋白质氨基酸”通常是指可在翻译过程中被掺入蛋白质中的遗传编码的氨基酸。蛋白质氨基酸包括精氨酸、组氨酸、赖氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、硒代半胱氨酸、甘氨酸、脯氨酸、丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、酪氨酸、缬氨酸、硒代半胱氨酸和吡咯赖氨酸。如本文所用，“非蛋白质氨基酸”是一种不是蛋白质氨基酸的氨基酸。非蛋白质氨基酸可以是天然存在的氨基酸或非天然存在的氨基酸。非蛋白质氨基酸包括蛋白质中不存在的和/或非天然编码的或不存在于生物体的遗传密码中的氨基酸。非蛋白质氨基酸的实例包括但不限于，羟脯氨酸、硒代蛋氨酸、羟丁赖氨酸(hypusine)、2-氨基异丁酸、αγ-氨基丁酸、鸟氨酸、瓜氨酸、β-丙氨酸(3-氨基丙酸)、δ-氨基乙酰丙酸、4-氨基苯甲酸、脱氢丙氨酸、羧基谷氨酸、焦谷氨酸、正缬氨酸、正亮氨酸、别异亮氨酸、叔亮氨酸(t-leucine)、哌可酸(pipecolic acid)、别苏氨酸、高半胱氨酸、高丝氨酸、α-氨基-正庚酸、α,β-二氨基丙酸、α,γ-二氨基丁酸、β-氨基-正丁酸、β-氨基异丁酸、异缬氨酸、肌氨酸、N-乙基甘氨酸、N-丙基甘氨酸、N-异丙基甘氨酸、N-甲基丙氨酸、N-乙基丙氨酸、N-甲基β-丙氨酸、N-乙基β-丙氨酸、异丝氨酸和α-羟基-γ-氨基丁酸。非蛋白质氨基酸的其他实例包括本文所述的非天然氨基酸。非蛋白质氨基酸可包含环结构。例如，非蛋白质氨基酸可以是反式-4-氨基甲基环己烷羧酸或4-肼基苯甲酸。此类化合物可以用FMOC(芴基甲氧基碳酰氯)进行FMOC保护并用于固相肽合成。这些化合物的结构如下所示：
Figure BDA0004184559620000631
在标记试剂或其接头包括多个氨基酸，例如多个非蛋白质氨基酸的情况下，与环部分相邻的胺部分(例如，肼部分中的胺部分)可用作水增溶性基团。为了合成水溶性肽，可以制备包含交替的非水溶性氨基酸和水溶性氨基酸(例如羟脯氨酸)的混合接头。其他部分可用于增加水溶性。例如，将氨基酸与草氨酸酯部分连接可以通过额外的氢键提供水溶性，而不添加任何sp3键。草氨酸酯前体2-氨基-2-氧代乙酸的结构如下所示：
Figure BDA0004184559620000632
在一些情况下，接头的组分(例如，单体单元)可具有氨基基团、羧基基团和水增溶性部分。在一些情况下，单体可能被解构为两个“半单体”。即，通过使用两个不同的单元，一个单元包含两个氨基，另一个单元包含两个羧基，可以构建氨基酸部分，该氨基酸部分可以是接头的单元(例如，重复单元)。一个或两个单元可以包括一个或更多个水增溶性部分。例如，至少一个单元可以包括水溶性基团(例如，如本文所述)。例如，2,5-二氨基对苯二酚可以是一个半单体(A)，且2,5-二羟基对苯二甲酸可以是另一个半单体(B)。这样的方案如下所示：
Figure BDA0004184559620000633
如上所示，A是二胺，且B是二酸。因此，非蛋白质(例如，非天然)氨基酸可由二胺和二酸构建。此类结构的附加实例如下所示：
Figure BDA0004184559620000641
基于两个半单体的聚合物(例如，如上所示)可以通过固相合成来构建。因为半单体在连接部分可以是同双官能的，在一些情况下不需要FMOC保护。例如，可以将二羧酸附加到固体支持物上，然后与适当的偶联剂(HBTU/HOBT/三甲吡啶)一起加入过量的二胺。在洗掉过量试剂后，可以将过量的二羧酸与偶联剂一起加入。由流体相试剂的一分子与两种固相附接试剂反应组成的副产物可能导致合成的截断。这些副产物可以在从支持物上切割并通过HPLC纯化后与产物分离。
半单体方法的优点可以是在生成聚合物方面灵活性增加。二胺(A)可以在后续步骤中被不同的二胺(A')替代，从而以重复或非重复的方式改变聚合物的性能。此类方案可以促进聚合物诸如ABA’BABA’B的构建。
根据上述方案使用的半单体的附加实例包括2,5-二氨基吡啶和2,5-二羧基吡啶，其两者均如下所示，以及如下所示的其他部分：
二胺：
Figure BDA0004184559620000642
二羧酸：
Figure BDA0004184559620000643
如上所述，氨基酸(例如，非蛋白质氨基酸，其可以是非天然氨基酸)可由二胺和二羧酸构建。氨基酸(例如，非蛋白质氨基酸，其可以是非天然氨基酸)也可由氨基硫醇和巯基羧酸构建。氨基硫醇和巯基羧酸的实例如下所示：
氨基硫醇：
Figure BDA0004184559620000651
/>
巯基羧酸:
Figure BDA0004184559620000652
由氨基硫醇和巯基羧酸构建的氨基酸(例如，非天然氨基酸)的实例如下所示：
Figure BDA0004184559620000653
如上所示，使用氨基硫醇和巯基羧酸构建的氨基酸可以包括二硫键。如本文别处所述，二硫键可以是使用切割试剂(例如，如本文所述)可切割的。因此，由氨基硫醇和巯基羧酸构建的氨基酸可用作接头的可切割性部分。由氨基硫醇和羧酸构建的氨基酸可以是接头(例如，如本文所述)的组分，其可以将标记部分(例如，荧光染料)偶联至底物(例如，核苷酸或核苷酸类似物)。各种结构允许不同的疏水性以供掺入并且可以在与切割试剂(例如，如本文所述)相互作用后提供不同的“切痕”部分。两个或更多个氨基酸，例如由氨基硫醇和巯基羧酸构建的两个或更多个氨基酸，可以被包括在接头中。例如，两个或更多个氨基酸可以被包括在接头中并且被不多于2个sp3碳原子隔开，例如被不多于2个sp2碳原子或不多于2个原子隔开。在由氨基硫醇和巯基羧酸形成的两个或更多个氨基酸在接头内彼此连接的情况下，因为将有多个可能的切割位点，所以切割可能更快。包含此类组分的接头的部分的实例如下所示：
Figure BDA0004184559620000654
如上所述，两个半单体可以组合以提供氨基酸(例如，非蛋白质氨基酸，例如非天然氨基酸)。因此，非天然氨基酸可包括任何已知的非天然氨基酸，以及可如本文所述构建的任何非天然氨基酸。
可以将诸如本文所述的那些半单体构建成多肽聚合物。用氨基酸的两个重复单元构建的核苷酸的实例如下所示：
Figure BDA0004184559620000661
在一些情况下，在肽偶联之前或之后，含氮环中的氮可以被季铵化以提供吡啶鎓部分，从而改进最终产物的水溶性。以这种方式生成的示例性接头序列如下所示：
Figure BDA0004184559620000662
可以与半单体方法一起使用的水增溶性键包括，例如，具有对称官能团的那些，例如仲酰胺、双酰肼和脲。此类部分的实例如下所示：
Figure BDA0004184559620000663
氨基酸接头亚单元可以通过肽合成方法而组装成聚合物。例如，称为SPPS(固相肽合成)或通过液相合成的固体支持方法可用于将氨基酸组装成接头。SPPS方法可以使用固相珠，其中初始步骤是通过其羧酸部分而附接C端氨基酸，使其游离胺就绪以供偶联。肽合成可以通过使FMOC胺保护的单体与肽偶联试剂(例如HBTU和有机碱)一起流动来启动。可以洗掉多余的试剂并引入下一种单体。在已附加了一个或更多个氨基酸后，可以将最终的肽从珠上切割并通过HPLC纯化。液相合成可以使用相同的试剂(珠除外)，但在每个步骤之后进行纯化。任一逐步聚合过程的优点在于所得接头可具有可通过质谱法确认的确定的分子量。
标记试剂可以包括氨基酸的任何有用组合，包括天然和非天然氨基酸和/或蛋白质氨基酸和非蛋白质氨基酸的任何组合。如本文所述，标记试剂可包括羟脯氨酸序列，例如hyp10、hyp20、hyp30或类似部分(例如，hypn)。
可切割性部分
标记试剂可包括一个或更多个可切割性部分(例如，如本文所述)。可切割性部分可包括可切割性基团，例如二硫键部分。可切割性部分可包括用于与底物附接的化学柄(例如，如本文所述)。因此，可切割性部分可在与标记试剂所附接的底物相邻的位置处被包括在标记试剂中。可切割性部分可经由例如接头组分的游离羧基部分与可切割性部分(例如，可切割性接头部分)的氨基部分之间的反应而与标记试剂的接头组分偶联。
可切割性接头部分的实例包括但不限于如下所示的结构E、B和Y：
Figure BDA0004184559620000671
在以上所示的结构中，二硫键部分可以被切割(例如，如本文所述)以提供巯基切痕。还设想到以上所示结构的变化。例如，一个或更多个取代基，例如一个或更多个烷基、羟基、烷氧基或卤素部分，可以与任何上述结构中的环结构或可用碳原子附接。类似地，尽管图示了羧基和二硫键部分的对位附接，但也可以使用间位和邻位附接。此外，任选取代的烷基可以被掺入在环结构和二硫键部分之间。可切割性接头部分可以在可切割性接头部分的羧基部分与附接到底物(例如，如本文所述的蛋白质、核苷酸或核苷酸类似物、细胞等)的胺部分之间反应时附接到底物，以提供经由酰胺部分而与可切割性接头部分附接的底物。例如，底物可以是包括炔丙基氨基部分的核苷酸或核苷酸类似物，并且包括本文所述的染料和接头的荧光标记试剂可被配置为经由炔丙基氨基部分而与底物缔合。此类底物的实例如下所示：
Figure BDA0004184559620000681
光学可检测性部分
如本文所述，标记试剂可以包括一个或更多个光学可检测性部分。包括在给定标记试剂中的多个光学可检测性部分(例如，荧光染料部分)可以具有相同或不同的化学结构。类似地，包括在给定标记试剂中的多个光学可检测性部分(例如，荧光染料部分)可以在相同波长处或附近发荧光，或者可以在不同波长处或附近发荧光。给定的接头组分(例如，半刚性接头组分)可以被配置为与单个光学可检测性部分偶联。可替代地，给定的接头组分(例如，半刚性接头组分)可以被配置为与两个或更多个可具有相同或不同化学结构的光学可检测性部分偶联。标记试剂可包括经由例如支架(例如赖氨酸或聚赖氨酸支架)(例如，如本文所述)而与多个光学可检测性部分偶联的多个接头。与标记试剂偶联的光学可检测性部分可促进对可与标记试剂附接的底物的光学(例如，荧光)标记。例如，标记试剂可用于用一个或更多个光学可检测性部分来光学标记蛋白质、核苷酸、核苷酸类似物、多核苷酸、抗体、细胞、糖、多糖、脂质、细胞表面标志物或任何其他有用的底物(例如，如本文所述)。当偶联到底物时，相对于包括单个光学可检测性部分的标记试剂，包括被配置为提供类似光学信号(例如，被配置为在相同波长处或附近发荧光)的多个光学可检测性部分的标记试剂可提供增强的信号。
光学可检测性部分可包括染料(例如，荧光染料)。染料(例如，荧光染料)的非限制性实例包括SYBR绿、SYBR蓝、DAPI、碘化丙啶、Hoechst、SYBR金、溴化乙啶、吖啶、原黄素、吖啶橙、吖啶黄素、荧光香豆素、椭圆玫瑰树碱、道诺霉素、氯喹、偏端霉素D、色霉素、乙菲啶、光神霉素、多吡啶钌、氨茴霉素、菲啶和吖啶、碘化丙啶、碘化己啶、二氢乙啶、乙啶同二聚体-1和乙啶同二聚体-2、单叠氮化乙啶、ACMA、Hoechst 33258、Hoechst 33342、Hoechst34580、DAPI、吖啶橙、7-AAD、放线菌素D、LDS751、羟芪巴脒、SYTOX Blue、SYTOX Green、SYTOX Orange、POPO-1、POPO-3、YOYO-1、YOYO-3、TOTO-1、TOTO-3、JOJO-1、LOLO-1、BOBO-1、BOBO-3、PO-PRO-1、PO-PRO-3、BO-PRO-1、BO-PRO-3、TO-PRO-1、TO-PRO-3、TO-PRO-5、JO-PRO-1、LO-PRO-1、YO-PRO-1、YO-PRO-3、PicoGreen、OliGreen、RiboGreen、SYBR Gold、SYBRGreen I、SYBR Green II、SYBR DX、SYTO染料(例如，SYTO-40、SYTO-41、SYTO-42、SYTO-43、SYTO-44和SYTO-45(蓝色)；SYTO-13、SYTO-16、SYTO-24、SYTO-21、SYTO-23、SYTO-12、SYTO-11、SYTO-20、SYTO-22、SYTO-15、SYTO-14和SYTO-25(绿色)；SYTO-81、SYTO-80、SYTO-82、SYTO-83、SYTO-84和SYTO-85(橙色)；SYTO-64、SYTO-17、SYTO-59、SYTO-61、SYTO-62、SYTO-60和SYTO-63(红色))、荧光素、异硫氰酸荧光素(FITC)、四甲基异硫氰酸罗丹明(TRITC)、罗丹明、四甲基罗丹明、R-藻红蛋白、Cy-2、Cy-3、Cy-3.5、Cy-5、Cy5.5、Cy-7、Texas Red、Phar-Red、别藻蓝蛋白(APC)、Sybr Green I、Sybr Green II、Sybr Gold、CellTracker Green、7-AAD、乙啶同二聚体I、乙啶同二聚体II、乙啶同二聚体III、溴化乙啶、伞形酮、曙红、绿色荧光蛋白、赤藓红、香豆素、甲基香豆素、芘、孔雀绿、芪、荧光黄、cascade blue、二氯三嗪基胺荧光素、丹酰氯，荧光镧系络合物例如包括铕和铽的那些络合物、羧基四氯荧光素、5-羧基荧光素和/或6-羧基荧光素(FAM)、VIC、5-碘乙酰胺基荧光素(或6-碘乙酰胺基荧光素)、5-{[2-5-(乙酰基巯基)-琥珀酰基]氨基}荧光素和5-{[3-5-(乙酰基巯基)-琥珀酰基]氨基}荧光素(SAMSA-荧光素)、丽丝胺罗丹明B磺酰氯、5羧基罗丹明和/或6羧基罗丹明(ROX)、7-氨基-甲基-香豆素、7-氨基-4-甲基香豆素-3-乙酸(AMCA)、BODIPY荧光团、8-甲氧基芘-1,3,6-三磺酸三钠盐、3,6-二磺酸-4-氨基-萘二甲酰亚胺、藻胆蛋白、AlexaFluor染料(例如，AlexaFluor 350、405、430、488、532、546、555、568、594、610、633、635、647、660、680、700、750和790染料)、DyLight染料(例如，DyLight 350、405、488、550、594、633、650、680、755和800染料)、黑洞淬灭剂染料(Biosearch Technologies)(例如，BH1-0、BHQ-1、BHQ-3和BHQ-10)、QSY染料荧光淬灭剂(来自Molecular Probes/Invitrogen)(例如QSY7、QSY9、QSY21和QSY35)、Dabcyl、Dabsyl、Cy5Q、Cy7Q、暗花青染料(GE Healthcare)、Dy-淬灭剂(Dyomics)(例如，DYQ-660和DYQ-661)、ATTO荧光淬灭剂(ATTO-TEC GmbH)(例如，ATTO 540Q、580Q、612Q、532和633)，以及其他荧光团和淬灭剂(例如，如本文所述)。染料的其他实例示于图23中。
荧光染料可以在单一波长或波长范围内被激发。在一些情况下，光学标记试剂可以包括光学可检测性部分，其被配置为在电磁波谱的红色区域(例如，(约625-740nm))发荧光。例如，标记试剂可以包括荧光染料，所述荧光染料可在电磁波谱的可见部分的红色区域(约625-740nm)中发射信号(例如，在电磁波谱的可见部分的红色区域中具有发射最大值)。可替代地或附加地，光学标记试剂可以包括光学可检测性部分，其被配置为在电磁波谱的绿色区域(例如，约500-565nm)发荧光。例如，标记试剂可以包括荧光染料，所述荧光染料可在电磁波谱的可见部分的绿色区域(约500-565nm)中发射信号(例如，在电磁波谱的可见部分的绿色区域中具有发射最大值)。类似地，荧光染料可被电磁波谱的可见部分的红色区域(约625-740nm)的光激发(例如，在电磁波谱的可见部分的红色区域中具有激发最大值)。可替代地或附加地，荧光染料可被电磁波谱的可见部分的绿色区域(约500-565nm)的光激发(例如，在电磁波谱的可见部分的绿色区域中具有激发最大值)。在一个实例中，光学标记试剂可以包括多个光学可检测性部分，其被配置为在电磁波谱的可见部分的红色区域中发荧光，所述多个光学可检测性部分可以具有相同或不同的结构。在另一个实例中，光学标记试剂可以包括多个光学可检测性部分，其被配置为在电磁波谱的可见部分的绿色区域中发荧光，所述多个光学可检测性部分可以具有相同或不同的结构。
在一些情况下，标记可以是不自淬灭或不表现出邻近淬灭的类型。不自淬灭或不表现出邻近淬灭的标记类型的非限制性示例包括双满衍生物，例如单溴代双满。包括在本文提供的结构中的附加染料也可以与本文提供的任何接头和本文所述的任何底物组合使用，而不管它们的公开内容的背景如何。在一些情况下，光学可检测性部分可包括染料对(例如，两个或更多个染料结构)。包括任何有用的光学可检测性部分或光学可检测性部分的任何组合的标记试剂可例如用于标记核苷酸或核苷酸类似物以用于测序测定。例如，用红色荧光染料标记的核苷酸进行的测序测定和用绿色荧光染料标记的核苷酸进行的测序测定可以具有测序质量和信噪比以及其他性能指标。
标记的底物
光学(例如，荧光)标记试剂可被配置为与底物(例如核苷酸或核苷酸类似物(例如，如本文所述))缔合。可替代地或附加地，光学(例如，荧光)标记试剂可以被配置为与底物(诸如蛋白质、细胞、脂质或抗体)缔合。例如，光学标记试剂可被配置为与蛋白质缔合。蛋白质底物可以是任何蛋白质，并且可以包括任何有用的修饰、突变或标记，包括任何同位素标记。例如，蛋白质可以是抗体，例如单克隆抗体。与一种或更多种光学(例如，荧光)标记试剂(例如，如本文所述)缔合的蛋白质可以是例如，可用于标记细胞的抗体(例如，单克隆抗体)，该标记的细胞可通过使用流式细胞术进行分析和分选。
光学(例如，荧光)标记试剂(例如，如本文所述)可以减少淬灭(例如，在与例如在核酸测序过程中掺入到生长的核酸链中的核苷酸或核苷酸类似物偶联的染料之间)。例如，由底物(例如，可以被掺入生长的核酸链中的核苷酸或核苷酸类似物)发射的光学(例如，荧光)信号可以与和底物缔合的光学(例如，荧光)标记的数量(例如，与底物相邻或接近而掺入的光学标记的数量)成比例。例如，包括相同或不同类型的底物(例如，相同或不同类型的核苷酸或核苷酸类似物)的多种光学标记试剂可以彼此接近地(例如，在核酸测序过程中)掺入生长的核酸链中。在此类系统中，由集体底物发射的信号可以与掺入的染料标记的底物的数量大致成比例(例如，成线性比例)。换句话说，淬灭可能不显著地影响发射的信号。这可以在其中使用100％标记分数的系统中是可观察到的。在少于100％的底物被标记(例如，核苷酸流中少于100％的核苷酸被标记)的情况下，由掺入多个生长的核酸链(例如，如本文所述，偶联到与支持物偶联的测序模板的多个生长的核酸链)中的底物(例如，核苷酸或核苷酸类似物)发射的光学(例如，荧光)信号可以与生长的核酸链的同聚物区域的长度成比例。类似地，在少于100％的底物被标记(例如，连续核苷酸流的每一个中少于100％的核苷酸被标记)的情况下，由掺入多个生长的核酸链(例如，如本文所述，偶联到与支持物偶联的测序模板的多个生长的核酸链)中的底物(例如，核苷酸或核苷酸类似物)发射的光学(例如，荧光)信号可以与生长的核酸链的杂聚和/或同聚物区域的长度成比例。在一些此类情况下，测量的光学(例如，荧光)信号的强度可以与底物已经掺入其中的杂聚和/或同聚区域的长度成线性比例。例如，当将光学(例如，荧光)信号相对于底物已经掺入其中的杂聚和/或同聚区域的底物的长度作图时，测量的光学(例如，荧光)信号可以以大约1.0的斜率成线性比例。
光学(例如，荧光)标记试剂(例如，如本文所述)可以减少蛋白质系统中的淬灭。当标记蛋白质时，荧光团与蛋白质之比(F/P)为约3时可能开始发生淬灭。通过使用本文提供的光学标记试剂，可以获得更高的F/P比例，从而获得更亮的试剂。这可用于分析蛋白质(例如，通过使用成像)和/或用于分析用与一种或更多种光学(例如，荧光)标记试剂缔合的蛋白质(例如，抗体)标记的细胞。
本文提供的标记试剂或其组分的实例包括在例如图1、2A、2B、6、7、8、3A-3C、14A、14B、16和17中。附加的实例包括在本文别处，包括在下面的实施例中。任何有用的标记试剂可用于标记任何目标底物。
在一个方面，本公开提供了一种标记的底物，其包括底物(例如，如本文所述)和光学标记试剂(例如，如本文所述)或其衍生物，其中光学标记试剂偶联到底物。底物可以是例如，核苷酸、多核苷酸、蛋白质、脂质、细胞、糖、多糖或抗体。例如，底物可以是蛋白质。可替代地或附加地，底物可以是细胞的组分。在另一个实例中，底物可以是核苷酸或核苷酸类似物，并且光学标记试剂可以通过核苷酸的核碱基而偶联到该核苷酸。底物可以是荧光淬灭剂、荧光供体或荧光受体。所述标记的底物相对于另一标记的底物可减少淬灭，所述另一标记的底物包括底物和另一荧光标记试剂，所述另一荧光标记试剂包括一个或更多个光学可检测性部分但不包括本文提供的接头。类似地，所述标记的底物相对于另一标记的底物可在激发和光学检测时提供更高的信号水平，所述另一标记的底物包括底物和另一荧光标记试剂，所述另一荧光标记试剂包括一个或更多个光学可检测性部分但不包括本文提供的接头。
底物可以包括与其偶联的附加光学标记试剂(例如，荧光标记试剂)。附加光学标记试剂可以包括光学可检测性部分(例如，荧光染料部分)和连接到光学可检测性部分的接头。附加光学标记试剂的接头和光学可检测性部分可通过可切割性接头部分(例如，如本文所述)而偶联到底物。附加光学标记试剂可以包括支架，所述支架可以偶联到多个接头和光学可检测性部分(例如，如本文所述)。与底物偶联的第一光学标记试剂的光学可检测性部分和与同一底物偶联的第二光学标记试剂的光学可检测性部分可以具有相同的化学结构。可替代地或附加地，与底物偶联的第一光学标记试剂的光学可检测性部分和与同一底物偶联的第二光学标记试剂的光学可检测性部分可以具有不同的化学结构。
在一方面，本公开提供了包括荧光标记试剂或其衍生物(例如，如本文所述)的寡核苷酸分子。寡核苷酸分子可包含相同类型的一种或更多种附加荧光标记试剂(例如，包括具有相同化学结构的接头、包括相同化学结构的染料，和/或与相同类型的底物(例如，核苷酸)缔合)。寡核苷酸分子的荧光标记试剂和一种或更多种附加荧光标记试剂可以与核苷酸缔合。例如，荧光标记试剂可以与寡核苷酸分子的核苷酸的核碱基连接。荧光标记试剂和一种或更多种附加荧光标记试剂可与寡核苷酸分子的相邻核苷酸连接。可替代地或附加地，荧光标记试剂和一种或更多种附加荧光标记试剂可与寡核苷酸分子的核苷酸相连，所述核苷酸被不与荧光标记试剂相连的一个或更多个核苷酸分隔。寡核苷酸分子可以是单链分子。可替代地，寡核苷酸分子可以是双链或部分双链的分子。双链或部分双链的分子可包含与单链或双链缔合的荧光标记试剂。寡核苷酸分子可以是脱氧核糖核酸分子。寡核苷酸分子可以是核糖核酸分子。可以通过核酸测序过程(例如，如本文所述)产生和/或修饰寡核苷酸分子。
荧光标记试剂可包括可切割性基团(例如，如本文所述)，其被配置为被切割以将荧光标记试剂的荧光染料与和其缔合的底物(例如，核苷酸)分离。例如，标记试剂可包括可切割性基团，所述可切割性基团包括叠氮基甲基基团、二硫键、烃基二硫基甲基基团或2-硝基苄氧基基团。可切割性基团可被配置为通过应用由三(2-羧乙基)膦(TCEP)、二硫苏糖醇(DTT)、四氢吡喃基(THP)、紫外(UV)光及其组合组成的组中的一个或更多个成员而被切割。包括荧光标记试剂的寡核苷酸分子可被配置为(例如，在适当的能量范围下激发时，如本文所述)发射荧光信号。
在另一方面，本公开提供了包括多个接头(例如，如本文所述)的试剂盒。接头可以是本文提供的光学标记试剂的组分。接头可连接至支架，例如赖氨酸或聚赖氨酸支架。接头可包括可切割性基团(例如，如本文所述)，其被配置为被切割以将接头与可与其附接的底物分离。接头可包括一个或更多个氨基酸，例如一个或更多个非蛋白质氨基酸。例如，接头可包括至少一个羟脯氨酸。接头可以包括hyp10、hyp20、hyp30或其他hypn部分。可替代地或另加地，接头可包括非天然氨基酸(例如，如本文所述)。接头可被配置为在光学可检测性部分和底物之间提供例如至少约
Figure BDA0004184559620000741
的功能性间隔，例如至少
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或更大(例如，如本文所述)。接头可以连接到光学可检测性部分(例如，荧光染料；如本文所述)和/或与底物缔合(例如，如本文所述)。例如，接头可与荧光染料连接并与底物偶联，所述底物选自核苷酸、蛋白质、脂质、细胞和抗体。例如，接头可与光学可检测性部分(例如，荧光染料)和底物(例如，核苷酸)连接。
接头可包括多个氨基酸，例如多个非蛋白质(例如，非天然)氨基酸。例如，接头可包括多个羟脯氨酸(例如，hyp10部分或其他hypn部分)。接头可包括可切割性基团，所述可切割性基团被配置为被切割以将接头的第一部分与接头的第二部分分离。可切割性基团可选自叠氮基甲基基团、二硫键、烃基二硫基甲基基团和2-硝基苄氧基基团。可切割性基团可以是通过应用由三(2-羧乙基)膦(TCEP)、二硫苏糖醇(DTT)、四氢吡喃基(THP)、紫外(UV)光及其组合组成的组中的一个或更多个成员可切割的。接头可包括可切割性接头部分，其包括选自
Figure BDA0004184559620000751
中的部分。
试剂盒的多个接头可包括与第一底物(例如，第一核苷酸)缔合的第一接头以及与第二底物(例如，第二核苷酸)缔合的第二接头。第一底物和第二底物可以是不同类型的(例如，不同的经典核苷酸)。第一底物和第二底物可以是包含不同类型的核碱基(例如，A、C、G、U和T)的核苷酸。第一接头和第二接头可包含相同的化学结构。类似地，第一接头可与第一荧光染料连接且第二接头可与第二荧光染料连接。第一荧光染料和第二荧光染料可以是不同类型的。例如，第一荧光染料和第二荧光染料可以在不同的波长发荧光和/或具有不同的最大激发波长。第一荧光染料和第二荧光染料可以在相似的波长发荧光和/或具有相似的最大激发波长，而不管它们是否共享相同的化学结构。
试剂盒的多个接头可进一步包括与第三底物缔合的第三接头和与第四底物缔合的第四接头。第一底物、第二底物、第三底物和第四底物可以是不同类型的。例如，第一底物、第二底物、第三底物和第四底物可以是包含不同类型的核碱基(例如，A、C、G和U/T)的核苷酸。第一接头和第三接头可包含不同的化学结构。第一接头和第三接头可包含相同的化学基团，例如相同的可切割性基团(例如，如本文所述)。例如，第一接头和第三接头可各自包含包括二硫键的部分。类似地，第一接头和第四接头可包含不同的化学结构。第一接头和第四接头可包含相同的化学基团，例如相同的可切割性基团(例如，如本文所述)。例如，第一接头和第四接头可各自包含包括二硫键的部分。
在一个实例中，第一接头包括hyp10部分和第一可切割性部分，第二接头包括hyp10部分和第二可切割性部分，第三接头包括第三可切割性部分并且不包括hyp10部分，且第四接头包括第四可切割性部分并且不包括hyp10部分。第二可切割性部分可以具有与第一可切割性部分不同的化学结构。可替代地，第二可切割性部分和第一可切割性部分可具有相同的化学结构。第三可切割性部分和第四可切割性部分可具有相同的化学结构。可替代地，第三可切割性部分和第四可切割性部分可具有不同的化学结构。在一个实例中，第一接头和第二接头各自具有第一化学结构并且第三接头和第四接头各自具有第二化学结构，该第二结构不同于第一化学结构。在另一个实例中，第一接头、第二接头、第三接头和第四接头都具有相同的化学结构。在另一个实例中，第一接头、第二接头、第三接头和第四接头都具有不同的化学结构。
试剂盒中的一个或更多个接头可以是标记试剂的组分。因此，在一个方面，本公开提供了一种包括多种标记试剂(例如，如本文所述)的试剂盒。多种标记试剂可以具有相同的化学结构。可替代地，多种标记试剂可以至少包括具有第一化学结构的第一多种标记试剂和具有与第一化学结构不同的第二化学结构的第二多种标记试剂。试剂盒的标记试剂可以具有任何有用的特征，如本文所述。例如，试剂盒的标记试剂可以包括可切割性部分，该可切割性部分被配置为被切割以将底物与标记试剂的部分分离(例如，如本文所述)；半刚性接头部分，该半刚性接头部分包括例如一个或更多个羟脯氨酸序列(例如，如本文所述的hyp10、hyp20或hyp30部分)；光学可检测性部分(例如，荧光染料部分，如本文所述)；以及支架，所述支架可与接头偶联(例如，赖氨酸、二赖氨酸或其他聚赖氨酸结构，如本文所述)。
光学标记试剂的使用方法
有几种可以被减少的不同类型的淬灭，以及可以使用本文所述的光学(例如，荧光)标记试剂进行的不同类型的应用。
本文描述的方法可用于减少淬灭，包括G-淬灭。染料(例如，荧光染料)与核苷酸的附接(例如，通过本文提供的接头)可导致对许多染料的染料淬灭，特别是当染料与鸟苷核苷酸附接时。染料淬灭可发生在染料和与其缔合的核苷酸之间，以及染料部分之间，例如与不同核苷酸(例如，相邻核苷酸或被一个或更多个其他核苷酸隔开的核苷酸)偶联的染料部分之间。使用本文提供的接头可以减轻淬灭，从而允许更灵敏地检测含有G的序列。此外，与G-同聚物区域邻近的染料标记的核苷酸可以显示降低的荧光。需要将染料附接到dGTP的任何核酸测序方法都可以从这些接头中受益，包括单分子检测、使用3'封闭核苷酸的测序和杂交法测序。
本文所述的方法可用于减少相同DNA链上相邻或邻近核苷酸(例如，被一个、两个或更多个其他核苷酸隔开的核苷酸)上的染料-染料淬灭。需要在相邻或邻近核苷酸上的染料的方法可能导致邻近淬灭；也就是说，彼此相邻的两种染料的亮度比一种染料亮度的两倍低，或者通常甚至比单一染料亮度低。使用本文提供的接头可以减轻淬灭，从而允许对多种染料的定量检测。例如，在测序方法诸如大多数天然核苷酸流测序中，标记的染料的分数通常小于5％，因为由于淬灭问题，同聚物在较高分数处的信号与同聚物长度不是线性的。本文所述的试剂可以允许更多(例如，大于5％，在一些情况下最高达100％)的核苷酸被标记，同时促进对掺入的核苷酸的灵敏且准确的检测。
与缺少接头的染料-核苷酸相比，本文提供的标记的核苷酸(例如，染料-接头-核苷酸)的使用可导致通过聚合酶(例如，如本文所述)更有效地掺入生长的核酸链中(例如，增加的耐受性)(例如，在核酸测序期间)。结果可能是使用较少量的染料标记的核苷酸来获得相同的信号。
本文提供的标记的核苷酸(例如，染料-接头-核苷酸)的使用可导致较少的由聚合酶所致的错误掺入(例如，如本文所述)(例如，在核酸测序期间)。结果可能是模板链的损失更少，因此得到更长的测序读段。
本文提供的标记的核苷酸(例如，染料-接头-核苷酸)的使用可导致更少的错配延伸(例如，在核酸测序期间)，并因此减少前导定相。
本文所述的方法可用于在多重染料应用中减少染料-染料淬灭。杂交测定也可以从防止淬灭的接头中受益。淬灭效应可能导致靶标与信号的非线性。
本文所述的方法可与寡聚体和树枝状聚合物组合使用以进行信号放大。非淬灭接头可允许合成非常亮的聚合物以标记抗体。这些亮抗体可以在流式细胞术中用于细胞表面标记或用于抗原检测方法，例如侧向流动测试和荧光免疫测定。
本公开的光学(例如，荧光)标记试剂可以用作分子标尺。底物可以是荧光淬灭剂、荧光供体或荧光受体。在一些情况下，底物是核苷酸。接头可以在核碱基上附接到核苷酸，如下所示，其中染料是Atto633：
Figure BDA0004184559620000781
以上显示的结构是光学(例如，荧光)标记试剂，其包括可切割性(通过二硫键)部分以及通过吡啶鎓接头而与dGTP类似物(dGTP-SS-py-Atto633)附接的荧光染料。本文别处提供了光学标记试剂的附加示例。
本文所述的标记的核苷酸(例如，染料-接头-核苷酸)可用于合成法测序方法中，在基于流动的方案中使用染料标记的核苷酸和天然核苷酸的混合物。与天然核苷酸相比，此类方法通常使用低百分比的标记的核苷酸。然而，与流动混合物中的天然核苷酸相比，使用低百分比(例如，少于20％)的标记的核苷酸可能有多个缺点：(a)由于一小部分模板提供序列信息，该方法需要高模板拷贝数；(b)标记的核苷酸和未标记的核苷酸之间DNA聚合酶延伸率的可变性可能导致背景依赖性标记分数，从而增加了将单碱基掺入与多碱基掺入区分开的难度；和(c)标记部分的低分数可导致标记的产物群体中的高二项式噪声。主要使用天然核苷酸的基于流动的测序方法进一步描述于美国专利号8,772,473中，其全部内容通过引用并入本文中用于所有目的。
通常，包括多个光学可检测性部分和/或染料标记的核苷酸的高标记分数的标记试剂的使用可以改善信号对比度。例如，随着标记分数增加，信噪比效应可能会显著降低。本文提供的包括半刚性接头的标记试剂可允许每个流中染料标记的核苷酸与天然核苷酸的标记分数足够高(例如，20-100％标记)以避免或减少例如各种测序方案的前述缺点的影响。这种更高百分比的标记可以产生更大的光学(例如，荧光)信号，从而导致较低的模板需求。如果使用100％标记，则可以基本上消除二项式噪声和背景变化。本文描述的解决方案克服的关键技术障碍是相邻或附近核苷酸上的染料标记的核苷酸必须表现出最小的淬灭。综合优势的总体结果可能是更准确的DNA测序。高标记分数(例如，20-100％标记)的使用可通过使用非淬灭或最低淬灭标记的核苷酸(例如，如本文所述)来促进。可以使用本文提供的标记试剂标记的标记的核苷酸来减少染料分子之间的淬灭。
用于标记掺入的核苷酸的标记试剂或其部分切割时产生的切痕可能对随后的掺入事件构成挑战。例如，通过切割标记试剂将切痕引入生长的核酸链可防止随后标记或未标记的核苷酸在相邻或附近位置的掺入。用于测序反应的不同聚合酶在切痕后可能具有不同的掺入耐受性。可用于使用标记的核苷酸的测序反应的聚合酶的实例包括例如Bst3.0、Pol19、Pol 22、Pol47、Pol49、和Pol50。
本公开提供了一种用于对核酸分子进行测序的方法。该方法可以包括在足以使引物与核酸分子杂交的条件下使核酸分子与引物接触，从而产生测序模板。然后可以使测序模板与聚合酶(例如，如本文所述)和包括多个光学(例如，荧光)标记的核苷酸(例如，如本文所述)的溶液(例如，核苷酸流)接触。多个光学(例如，荧光)标记的核苷酸中的每个光学(例如，荧光)标记的核苷酸可以包括相同的化学结构(例如，每个标记的核苷酸可以包括相同类型的染料、相同类型的接头，以及相同类型的核苷酸或核苷酸类似物)。多个光学标记的核苷酸中的光学标记的核苷酸可以在与与核酸分子杂交的引物相邻的多个位置处与核酸分子互补。因此，可以将多个光学标记的核苷酸中的一个或更多个光学标记的核苷酸掺入测序模板中。在核酸分子包括同聚区域的情况下，可以掺入多个核苷酸(例如，标记的和未标记的核苷酸)。可以通过使用非终止的核苷酸来促进彼此相邻的多个核苷酸的掺入。然后可以将包括多个光学标记的核苷酸的溶液从测序模板中洗掉(例如，使用洗涤流，如本文所述)。可以测量来自测序模板的光学(例如，荧光)信号。当两个或更多个标记的核苷酸掺入同聚区域时，测量的光学(例如，荧光)信号的强度可能大于如果多个光学(例如，荧光)标记的核苷酸中的单个光学(例如，荧光)标记的核苷酸已被掺入测序模板中可测量的光学(例如，荧光)信号。这种方法可特别适用于同聚物或核酸的同聚部分(即，在一行中具有多个相同的碱基)的测序。多个光学标记的核苷酸中的光学标记的核苷酸可包括染料(例如，荧光染料)和连接至染料和核苷酸的接头(例如，如本文所述)。接头可以包括(i)一个或更多个水溶性基团和(ii)两个或更多个环体系，其中所述两个或更多个环体系中的至少两个通过不多于两个sp3碳原子，例如通过不多于2个原子彼此连接。接头可包括非蛋白质氨基酸，其包括两个或更多个环体系中的一个环体系。例如，接头可包括羟脯氨酸或由例如二胺和二羧酸或氨基硫醇和巯基羧酸构成的氨基酸。接头可被配置为在染料和核苷酸之间建立至少约0.5纳米的功能性长度。
测量的光学(例如，荧光)信号的强度可以与掺入测序模板中的光学(例如，荧光)标记的核苷酸的数量成比例(例如，其中使用100％标记分数)。换句话说，淬灭可能不会显著影响发射的信号。例如，强度可以与掺入测序模板的光学(例如，荧光)标记的核苷酸的数量成线性比例。当相对于掺入到测序模板中的光学(例如，荧光)标记的核苷酸数量作图时，测量的光学(例如，荧光)信号的强度可以与大约1.0的斜率成线性比例。在少于100％的底物被标记(例如，核苷酸流中少于100％的核苷酸被标记)的情况下，由掺入多个生长的核酸链(例如，如本文所述，偶联到与支持物偶联的测序模板的多个生长的核酸链)中的底物(例如，核苷酸或核苷酸类似物)发射的光学(例如，荧光)信号可以与生长的核酸链的同聚物区域的长度成比例。类似地，在少于100％的底物被标记(例如，连续核苷酸流的每一个中少于100％的核苷酸被标记)的情况下，由掺入多个生长的核酸链(例如，如本文所述，偶联到与支持物偶联的测序模板的多个生长的核酸链)中的底物(例如，核苷酸或核苷酸类似物)发射的光学(例如，荧光)信号可以与生长的核酸链的杂聚和/或同聚物区域的长度成比例。在一些此类情况下，测量的光学(例如，荧光)信号的强度可以与底物已经掺入其中的杂聚和/或同聚区域的长度成线性比例。例如，当将光学(例如，荧光)信号相对于底物已掺入其中的杂聚和/或同聚区域的底物中的长度作图时，测量的光学(例如，荧光)信号可以与大约1.0的斜率成线性比例。
包含多个光学(例如，荧光)标记的核苷酸的溶液也可以包含未标记的核苷酸(例如，标记分数可能小于100％)。例如，溶液中至少约20％的核苷酸可以被光学标记，并且溶液中至少约80％的核苷酸可以不被光学标记。在一些情况下，溶液中的大部分核苷酸可以被光学标记(例如，约50-100％)。替代地，可以仅使用标记的核苷酸(例如，100％标记分数)。
在一些情况下，多个光学(例如，荧光)标记的核苷酸中的两个或更多个光学(例如，荧光)标记的核苷酸被掺入到测序模板(例如，到同聚区域)中。在一些情况下，多个光学(例如，荧光)标记的核苷酸中的三个或更多个光学(例如，荧光)标记的核苷酸被掺入到测序模板中。在给定核苷酸流期间掺入到测序模板的光学标记的核苷酸的数量可能取决于核酸分子的同聚性质。在一些情况下，多个光学(例如，荧光)标记的核苷酸中的第一光学(例如，荧光)标记的核苷酸掺入多个光学(例如，荧光)标记的核苷酸的第二光学(例如，荧光)标记的核苷酸的四个位置内。
光学(例如，荧光)标记的核苷酸可包括可切割性基团以促进光学(例如，荧光)标记(例如，如本文所述)的切割。在一些情况下，方法可以进一步包括，在掺入一个或更多个光学(例如，荧光)标记的核苷酸并洗掉残留溶液之后，切割掺入到测序模板(例如，如本文所述)中的一个或更多个光学(例如，荧光)标记的核苷酸的光学(例如，荧光)标记。切割流之后可以是附加的洗涤流。
在一些情况下，核苷酸流和洗涤流之后可以是包含未标记的核苷酸和无标记的核苷酸的“追踪”流。追踪流可用于完成测序模板的给定核苷酸位置或多个位置的测序反应(例如，跨越固定到支持物的多个此类模板)。追踪流可以在来自模板的光学信号的检测之前。可替代地，追踪流可以在来自模板的光学信号的检测之后。追踪流可以在切割流之前。可替代地，追踪流可以在切割流之后。追踪流之后可以是洗涤流。
本文提供的方法还可用于对核酸分子的杂聚物和/或杂聚区域(即，非同聚部分)测序。因此，本文所述的方法可用于对具有任何程度的杂聚或同聚性质的核酸分子测序。
关于同聚物，同聚物区域处的核苷酸流可以将几个核苷酸掺入一行。使包含含有同聚物区域的核酸分子(例如，与未延伸引物杂交的核酸分子)的测序模板与包含多个核苷酸(例如，标记的和未标记的核苷酸)的溶液接触，其中多个核苷酸中的每个核苷酸是相同类型的，可能导致多个核苷酸中的多个核苷酸被掺入测序模板中。在一些情况下，掺入至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9或至少10个核苷酸(即，在核酸分子的同聚区域中)。掺入到测序模板中的多个核苷酸可包含多个标记的核苷酸(例如，光学标记的，例如荧光标记的)，如本文所述。在这种情况下，掺入到同聚物区域中的一个或更多个所述核苷酸可以被标记，并且可以占据与掺入到同聚物区域中的其他标记的核苷酸相邻或不相邻的位置。从核酸分子获得的信号强度可以与掺入的标记的核苷酸的数量成比例(例如，使用100％的标记分数)。例如，从包含两个标记的核苷酸的核酸分子获得的光学信号(例如，荧光信号)的强度可能具有比从包含一个标记的核苷酸的核酸分子获得的光学信号更大的强度。此外，从核酸分子获得的信号强度可能取决于核酸分子内标记的核苷酸的相对位置。例如，在非相邻位置中包含两个标记的核苷酸的核酸分子可以提供与在相邻位置中包含两个标记的核苷酸的核酸分子不同的信号强度。可以通过仔细选择接头和染料(例如，荧光染料)来优化此类系统中的淬灭。在一些情况下，光学信号(例如，荧光)与同聚物长度的关系图可以是线性的。例如，对于包括掺入标记的核苷酸的同聚物区域的生长的核酸链的集合，测量的光学信号可以与同聚物区域的核苷酸长度大致成线性比例。
在另一方面，本公开提供了一种对核酸分子进行测序的方法。该方法可以包括在足以使引物与核酸分子杂交的条件下使核酸分子与引物接触，从而产生测序模板。然后，可以使测序模板与聚合酶和包含多个第一光学(例如，荧光)标记的核苷酸(和任选地，多个第一未标记的核苷酸)的第一溶液接触。多个第一光学(例如，荧光)标记的核苷酸中的每个第一光学(例如，荧光)标记的核苷酸是相同类型的。多个第一光学(例如，荧光)标记的核苷酸中的第一光学(例如，荧光)标记的核苷酸可以在邻近引物的位置与待测序的核酸分子互补。多个第一光学(例如，荧光)标记的核苷酸中的第一光学(例如，荧光)标记的核苷酸因此可以掺入到测序模板中以产生延伸的引物。然后可以将包含多个第一光学(例如，荧光)标记的核苷酸的第一溶液从测序模板中洗掉(例如，使用洗涤溶液)。然后可以测量由测序模板发射的第一光学(例如，荧光)信号(例如，如本文所述)。然后可以使测序模板与聚合酶和包含多个第二光学(例如，荧光)标记的核苷酸(以及，任选地，多个第二未标记的核苷酸)的第二溶液接触。多个第二光学(例如，荧光)标记的核苷酸中的每个第二光学(例如，荧光)标记的核苷酸可以是相同类型的。多个第二光学(例如，荧光)标记的核苷酸中的第二光学(例如，荧光)标记的核苷酸可以在邻近延伸的引物的位置与待测序的核酸分子互补。多个第二光学(例如，荧光)标记的核苷酸中的第二光学(例如，荧光)标记的核苷酸因此可以掺入到测序模板中。然后可以将包含多个第二光学(例如，荧光)标记的核苷酸的第二溶液从测序模板中洗掉。然后可以测量由测序模板发射的第二光学(例如，荧光)信号。在一些情况下，第二光学(例如，荧光)信号的强度可以大于第一光学(例如，荧光)信号的强度。
多个第一光学标记的核苷酸中的第一光学标记的核苷酸可包括第一染料(例如，荧光染料)和连接至第一染料和第一核苷酸的第一接头(例如，如本文所述)。类似地，多个第二光学标记的核苷酸中的第二光学标记的核苷酸可包括第二染料(例如，荧光染料)和连接至第二染料和第二核苷酸的第二接头(例如，如本文所述)。第一接头可以包括第一半刚性部分，该半刚性部分可以包括一个或更多个氨基酸(例如，非蛋白质氨基酸)。类似地，第二接头可以包括第二半刚性部分，该半刚性部分可以包括一个或更多个氨基酸(例如，非蛋白质氨基酸)。例如，第一接头可以包括至少一个羟脯氨酸(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30或更多个羟脯氨酸，如本文所述)。第一和第二半刚性部分可以具有相同或不同的结构。第一接头和/或第二接头可连接至可切割性基团，所述可切割性基团被配置为用切割试剂(例如，如本文所述)切割，以将核苷酸从包括与其偶联的接头的标记试剂的全部或部分中分离。第一接头和第二接头可具有相同的结构。替代地，第一接头和第二接头可具有不同的结构。第一接头和第二接头可包括共享的结构基序，例如共享的可切割组分(例如，如本文所述)。
包含多个第一光学(例如，荧光)标记的核苷酸的第一溶液可以不包含任何未标记的核苷酸(例如，可以使用100％标记分数)。替代地，包含多个第一光学(例如，荧光)标记的核苷酸的第一溶液也可以包含第一未标记的核苷酸。例如，第一溶液的约20％的核苷酸可以未标记。在一些情况下，第一溶液的至少20％的核苷酸可以被光学标记，例如至少50％或至少80％。未标记的核苷酸可包括与光学标记的核苷酸相同的核苷酸部分(例如，经典核苷酸部分)。类似地，包含多个第二光学(例如，荧光)标记的核苷酸的第二溶液可以不包含任何未标记的核苷酸(例如，可以使用100％标记分数)。替代地，包含多个第一光学标记的核苷酸的第二溶液也可以包含第二未标记的核苷酸。例如，第二溶液的约20％的核苷酸可以未标记。在一些情况下，第二溶液的至少20％的核苷酸可以被光学标记，例如至少50％或至少80％。未标记的核苷酸可包括与光学标记的核苷酸相同的核苷酸部分(例如，经典核苷酸部分)。
多个第一光学(例如，荧光)标记的核苷酸可以不同于多个第二光学(例如，荧光)标记的核苷酸。例如，多个第一光学(例如，荧光)标记的核苷酸和多个第二光学(例如，荧光)标记的核苷酸可以包括相同的光学(例如，荧光)标记(例如，相同的染料)和不同的核苷酸。替代地，多个第一光学(例如，荧光)标记的核苷酸和多个第二光学(例如，荧光)标记的核苷酸可以包括不同的光学(例如，荧光)标记(例如，不同的染料)和相同的核苷酸。在一些情况下，多个第一光学(例如，荧光)标记的核苷酸和多个第二光学(例如，荧光)标记的核苷酸可以包括不同的光学(例如，荧光)标记(例如，不同的染料)和不同的核苷酸。第一多个光学标记的核苷酸中的第一染料和第二多个光学标记的核苷酸中的第二染料可以在大致相同的波长或波长范围内发射信号(例如，无论第一染料和第二染料是否具有相同或不同的化学结构)。例如，第一染料和第二染料都可以在电磁光谱的可见部分的绿色区域中发射信号。
在一些情况下，可以将两个或更多个第一光学(例如，荧光)标记的核苷酸掺入测序模板中(例如，在核酸分子的同聚区域中)。在一些情况下，可以将两个或更多个第二光学(例如，荧光)标记的核苷酸掺入测序模板中。
还可以提供附加的光学(例如，荧光)标记的核苷酸并将其掺入测序模板中(例如，在连续的核苷酸流中，如本文所述)。例如，该方法可以进一步包括使测序模板与聚合酶和包含多个第三光学(例如，荧光)标记的核苷酸的第三溶液接触，其中多个第三光学(例如，荧光)标记的核苷酸中的每个第三光学(例如，荧光)标记的核苷酸是相同类型的，并且其中多个第三光学(例如，荧光)标记的核苷酸中的第三光学(例如，荧光)标记的核苷酸与在与核酸分子杂交的进一步延伸的引物相邻的位置处与核酸分子互补，从而将多个第三光学(例如，荧光)标记的核苷酸中的第三光学(例如，荧光)标记的核苷酸掺入测序模板中；将包含多个第三光学(例如，荧光)标记的核苷酸的第三溶液从测序模板洗掉；和测量由测序模板发射的第三光学(例如，荧光)信号。在一些情况下，第三光学信号的强度可以大于第一光学(例如，荧光)信号的强度和第二光学(例如，荧光)信号的强度。该过程可以用第四溶液等重复。第三和第四溶液可以包含光学(例如，荧光)标记的核苷酸，其具有与第一和第二溶液不同的核苷酸，使得每个经典核苷酸(A、C、G和U/T)可以按顺序提供给测序模板。可以将其中每个经典核苷酸提供给测序模板的循环重复一次或多次以测序和/或扩增核酸分子。
多个第三光学标记的核苷酸中的第三光学标记的核苷酸可包括第三染料(例如，荧光染料)和连接至第三染料和第三核苷酸的第三接头(例如，如本文所述)。第三接头可以包括第三半刚性部分，该半刚性部分可以包括一个或更多个氨基酸(例如，非蛋白质氨基酸)。例如，第三接头可以包括至少一个羟脯氨酸(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30或更多个羟脯氨酸，如本文所述)。第三接头可连接至可切割性基团，所述可切割性基团被配置为用切割试剂(例如，如本文所述)切割，以将核苷酸从包括与其偶联的接头的标记试剂的全部或部分中分离。第一接头和第三接头可具有相同的结构。替代地，第一接头和第三接头可以具有不同的结构。第一接头和第三接头可包括共享的结构基序，例如共享的可切割组分(例如，如本文所述)。类似地，第二接头和第三接头可以具有相同的结构。替代地，第二接头和第三接头可以具有不同的结构。第二接头和第三接头可包括共享的结构基序，例如共享的可切割组分(例如，如本文所述)。第三染料可具有与第一染料相同或不同的结构。类似地，第三染料可以具有与第二染料相同或不同的结构。第三染料和第一和/或第二染料可以在大致相同的波长或波长范围(例如，无论这些染料是否具有相同或不同的化学结构)下发射。此外，第三核苷酸可以与第一核苷酸的类型相同或不同，或者第三核苷酸可以与第二核苷酸的类型相同或不同。
该方法可以进一步包括，在将给定溶液(例如，核苷酸流)洗掉(例如，使用洗涤溶液)之后，切割其相应核苷酸的光学(例如，荧光)标记。例如，在洗掉第一溶液后，可以切割掺入测序模板的第一光学(例如荧光)标记的核苷酸的光学(例如，荧光)标记(例如，使用切割试剂切割第一光学标记的核苷酸的接头的可切割性基团，如本文所述)。例如，掺入测序模板中的第一光学标记的核苷酸的荧光染料可在测序模板与第二光学标记的核苷酸接触之前被切割(例如，在第二核苷酸流中，如本文所述)。因此，可以在将一个或更多个第二光学标记的核苷酸掺入测序模板之前从一个或更多个第一光学标记的核苷酸检测信号。掺入测序模板中的第一光学标记的核苷酸的荧光染料的分离可提供包含第一光学标记的核苷酸或其衍生物的接头的一部分的切痕核苷酸。类似地，在洗掉第二溶液(例如，第二核苷酸流)之后，可以切割掺入到测序模板的第二光学(例如，荧光)标记的核苷酸的光学(例如，荧光)标记。第一和第二接头的所有部分可以在各自的切割过程中被切割。
在另一方面，本文提供了一种对核酸分子进行测序的方法。该方法可以包括提供包含多个光学(例如，荧光)标记的核苷酸的溶液，其中该多个光学(例如，荧光)标记的核苷酸中的每个光学(例如，荧光)标记的核苷酸是相同类型的。多个荧光标记的核苷酸中给定的光学(例如，荧光)标记的核苷酸可以包含通过具有确定分子量的半刚性水溶性接头连接到核苷酸的光学(例如，荧光)染料。连接染料和核苷酸的接头可以在染料和核苷酸之间提供至少约0.5纳米(nm)的功能性长度。然后可以在足以使引物与待测序的核酸分子杂交以产生测序模板的条件下使核酸分子与引物接触。然后可以使测序模板与聚合酶和包含多个光学(例如，荧光)标记的核苷酸的溶液接触，其中多个光学(例如，荧光)标记的核苷酸中的光学(例如，荧光)标记的核苷酸在与引物相邻的位置处与待测序的核酸分子互补。多个光学(例如，荧光)标记的核苷酸中的一个或更多个光学(例如，荧光)标记的核苷酸因此可以掺入到测序模板中。可以将包含多个光学(例如，荧光)标记的核苷酸的溶液从测序模板洗掉(例如，使用洗涤溶液)。然后可以测量由测序模板发射的光学(例如，荧光)信号。
接头可以具有本文提供的任何有用的特征。例如，接头可以包括半刚性部分。接头可以包括或偶联到可切割性基团(例如，如本文所述)。接头可以包括氨基酸(例如，如本文所述的非蛋白质氨基酸)。例如，接头可以包括一个或更多个羟脯氨酸部分(例如，如本文所述)，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30或更多个羟脯氨酸。接头可在荧光染料和核苷酸之间建立至少约
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的功能性长度，例如至少约/>
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或更大(例如，如本文所述)。
测量的光学(例如，荧光)信号可以与掺入测序模板中的光学(例如，荧光)标记的核苷酸的数量成比例。例如，在使用100％标记分数的情况下(例如，溶液中的所有核苷酸都被标记)，淬灭可能不会减少发射的信号。在此类系统中，测量的光学(例如，荧光)信号可以与掺入测序模板中的光学(例如，荧光)标记的核苷酸的数量成线性比例。当相对于掺入到测序模板中的光学(例如，荧光)标记的核苷酸数量作图时，测量的光学(例如，荧光)信号可以与大约1.0的斜率成线性比例。在少于100％的核苷酸被标记(例如，溶液中少于100％的核苷酸被标记)的情况下，由掺入多个生长的核酸链(例如，如本文所述，偶联到与支持物偶联的测序模板的多个生长的核酸链)中的核苷酸发射的光学(例如，荧光)信号可以与生长的核酸链的同聚物区域的长度成比例。类似地，在少于100％的核苷酸被标记的情况下，由掺入多个生长的核酸链(例如，如本文所述，偶联到与支持物偶联的测序模板的多个生长的核酸链)中的核苷酸发射的光学(例如，荧光)信号可以与生长的核酸链的杂聚和/或同聚物区域的长度成比例。在一些此类情况下，测量的光学(例如，荧光)信号的强度可以与核甘酸已经掺入其中的杂聚和/或同聚区域的长度成线性比例。例如，当将光学(例如，荧光)信号相对于核甘酸已掺入其中的杂聚和/或同聚区域的核甘酸中的长度作图时，测量的光学(例如，荧光)信号可以与大约1.0的斜率成线性比例。
在一些情况下，包含光学(例如，荧光)标记的核苷酸的溶液也包含未标记的核苷酸。未标记的核苷酸可包括相同的核苷酸部分(例如，相同的经典核苷酸)。在一些实施方案中，溶液中约5％、约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％或约100％的核苷酸被荧光标记。在一些情况下，溶液中至少约5％、至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％或更多的核苷酸被荧光标记。在一些情况下，溶液中至少约5％、至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％或更多的核苷酸未被荧光标记。
多个标记的核苷酸可沿核酸分子掺入彼此邻近的位置。在一些情况下，第一光学(例如，荧光)标记的核苷酸在第二光学(例如，荧光)标记的核苷酸(例如，相同或不同的核苷酸类型的第二光学标记的核苷酸)的4个位置内、3个位置内、2个位置内或相邻渗入。在一些情况下，该方法进一步包括在测量光学(例如，荧光)信号(例如，如本文所述)之后从核苷酸切割光学(例如，荧光)标记。切割光学(例如，荧光)标记可能会留下切痕(例如，如本文所述)。核酸测序测定可用于评估染料标记的核苷酸。该测定可以使用具有已知序列的核酸模板，该序列可以包括一个或更多个同聚区域。模板可以通过衔接子固定在支持物上(例如，如本文所述)。具有与衔接子或其一部分至少部分互补的序列的引物可以与衔接子或其一部分杂交，并通过掺入标记的和未标记的核苷酸(例如，如本文所述)提供用于产生具有与模板的序列互补的序列的核酸链的起点。测序测定可以使用四种不同的四核苷酸流，其包括可以循环方式重复的不同经典核碱基(例如，循环1：A、G、C、U；循环2A、G、C、U等)。每个核苷酸流可包括包含单一经典类型的核碱基的核苷酸(或其类似物)，其中一些可包括本文提供的光学标记试剂。标记分数(例如，流中包括的附接到光学标记试剂的核苷酸的百分比)可以在例如0.5％至100％之间变化。不同的核苷酸流的标记分数可能不同。可以不终止核苷酸以促进掺入同聚区域。模板可以与核苷酸流接触，然后是一个或更多个洗涤流(例如，如本文所述)。模板还可以与包括切割试剂的切割流(例如，如本文所述)接触，所述切割试剂被配置为切割与掺入到生长的核酸链中的标记的核苷酸附接的光学标记试剂的一部分。洗涤流可用于去除切割试剂并制备模板以与随后的核苷酸流接触。在每次核苷酸流之后，可以从掺入生长的核酸链中的标记的核苷酸检测发射。
示例性测序程序700在图7中提供。在过程702中，提供了配置用于核苷酸掺入的模板和引物。随后进行第一测序循环704。第一测序循环704包括四个流过程704a、704b、704c和704d，每个流过程有多个流。核苷酸1、2、3和4可各自包括不同经典类型(例如，A、G、C和U)的核碱基。给定的核苷酸流可以包括标记的核苷酸(例如，用本文提供的光学标记试剂标记的核苷酸)和未标记的核苷酸。每个核苷酸流的标记分数可能不同。即，图7中的A、B、C和D可以相同或不同并且可以在0％至100％的范围内(例如，如本文所述)。用于标记核苷酸1、2、3和4的标记和接头可以是相同的或不同的类型。例如，核苷酸1可以具有包括可切割性接头和hyp10接头的接头以及第一绿色染料，并且核苷酸2可以具有包括可切割性接头但不包括hyp10接头的接头和第二绿色染料。第一绿色染料可以与第一绿色染料相同或不同。与不同核苷酸相关的可切割性接头可以相同或不同。流过程704a可以包括核苷酸流(例如，包括多个核苷酸1类型的核苷酸的流，其中的A％可以被标记)。在该流中，标记的和未标记的核苷酸可被掺入生长的链中(例如，使用聚合酶)。第一洗涤流(“洗涤流1”)可用于去除未掺入的核苷酸和相关试剂。可以向与掺入的核苷酸附接的所有或部分光学标记试剂提供包括切割试剂的切割流。例如，标记的核苷酸可包括可切割性接头部分，其可在与切割试剂接触时被切割以提供有痕的核苷酸。第二洗涤流(“洗涤流2”)可用于去除切割试剂和切割的材料。核苷酸流过程704a还可包括“追踪”过程，其中可流过仅包括核苷酸1类型的未标记的核苷酸的核苷酸流。此类追踪过程之后可以是洗涤流。追踪过程及其伴随的洗涤流可能发生在初始核苷酸流和洗涤流1之后，或在切割流和洗涤流2之后。下一个核苷酸流过程704b然后可以类似的方式开始和进行。在完成过程704b、704c和704d之后，可以完成第一流循环704。可以开始第二流循环706。循环706可以包括相同或不同顺序的相同流过程。可以进行附加的循环直到模板的全部或部分已被测序。可以在对于每个核苷酸流过程的核苷酸流和初始洗涤流之后和切割流之前进行经由发射检测的掺入的核苷酸的检测(例如，流过程704a可以包括在洗涤流1和切割流之间的检测过程等)。通过此类测序过程询问的模板可以被固定到支持物上(例如，如本文所述)。多个此类模板(例如，至少约100、200、500、1000、10000、100,000、500,000、1,000,000或更多模板)可以这种方式(例如，以克隆方式)同时被询问。在此类系统中，核苷酸的掺入可以被检测为多个模板的平均值，这可以允许使用小于100％的标记分数。
在一些情况下，对于任何前述方法，核苷酸是鸟嘌呤(G)并且接头减少核苷酸和染料(例如，荧光)染料之间的淬灭。
在一些情况下，对于任何前述方法，包括本文提供的接头的光学(例如，荧光)标记的核苷酸比包括相同核苷酸和光学(例如，荧光)染料但不包括接头的另一种光学(例如，荧光)标记的核苷酸更有效地掺入到测序模板中。在一些情况下，对于任何前述方法，包括本文提供的接头的光学(例如，荧光)标记的核苷酸以比包括相同核苷酸和光学(例如，荧光)染料但不包括接头的另一种光学(例如，荧光)标记的核苷酸以更高的保真度掺入到测序模板中。
对于本文提供的任何测序方法，所使用的聚合酶可以是家族A聚合酶，例如Taq、Klenow或Bst聚合酶。替代地，对于本文提供的任何测序方法，聚合酶可以是家族B聚合酶，例如Vent(exo-)或TherminatorTM聚合酶。聚合酶可以是例如，Bst3.0、Pol19、Pol22、Pol47、Pol49、Pol50或任何其他有用的聚合酶。
在一方面，本公开提供了使用本文所述的光学(例如，荧光)标记的核苷酸对核酸分子进行测序的方法。一种方法可以包括提供多个核酸分子，该多个核酸分子可以包括一个集落或多个集落或作为其一部分。多个核酸分子可以与模板序列具有序列同源性。该方法可以包括在足以将多个核苷酸的子集掺入与多个核酸分子互补的多个生长的核酸链中的条件下，使多个核酸分子与包含多个核苷酸的溶液(例如，包含多个光学标记的核苷酸的溶液)接触。在一些情况下，多个核苷酸的子集的至少约20％是光学(例如，荧光)标记的核苷酸(例如，如本文所述)。例如，多个核苷酸的子集中的至少约20％、25％、50％、75％、90％或大部分可以是标记的核苷酸。在一些情况下，100％的核苷酸可以是标记的核苷酸。该方法可以包括检测来自掺入多个生长的核酸链中的标记的核苷酸的一个或更多个信号或信号变化，其中该一个或更多个信号或信号变化指示已掺入多个生长的核酸链中的标记的核苷酸。
多个核苷酸中的光学(例如，荧光)标记的核苷酸可以是非终止的。在此类情况下，生长的链可在期间掺入一个或更多个连续核苷酸(例如，溶液中多个核苷酸的互补碱基不存在于与核酸分子杂交的引物相邻的多个位置处)。从光学(例如，荧光)标记的核苷酸检测到的一个或更多个信号或信号变化可指示连续核苷酸已掺入多个生长的核酸链中。从检测到的信号或信号变化确定多个荧光团的方法在本文别处描述。
可替代地，可以终止光学(例如，荧光)标记的核苷酸。在这种情况下，每个生长的链中在每个流循环中可以掺入不多于一个核苷酸直到合成终止。从光学(例如，荧光)标记的核苷酸检测到的一个或更多个信号或信号变化可指示核苷酸已掺入多个生长的核酸链中。在检测之前、期间或之后，可以切割标记的核苷酸的终止基团(例如，以促进同聚物的测序，和/或减少潜在的背景和/或淬灭问题)。
可替代地或另加地，光学(例如，荧光)标记的核苷酸可以包括终止和非终止核苷酸的混合物。在这种情况下，生长的链中可以掺入一个或更多个产生延伸的引物的连续核苷酸。然后可以将包括多个终止和非终止核苷酸的溶液从测序模板中洗掉。多个核苷酸的未标记的核苷酸可包括与多个核苷酸的标记核苷酸相同类型的核苷酸部分(例如，相同的经典核苷酸)。
在一方面，本公开提供了包括一个或更多个荧光标记的核苷酸的组合物及其使用方法。组合物可包括包含荧光标记的核苷酸(例如，如本文所述)的溶液。荧光标记的核苷酸可以包括荧光标记试剂(例如，如本文所述)，该荧光标记试剂包括通过接头(例如，如本文所述)连接到核苷酸或核苷酸类似物(例如，如本文所述)的荧光染料。接头可以包括本文所述的任何有用特征。例如，接头可以包括半刚性部分。接头可以包括多个氨基酸(例如，非蛋白质氨基酸)。例如，接头可以包括多个羟脯氨酸。例如，接头可以包括至少一个羟脯氨酸，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30或更多个羟脯氨酸。荧光标记的核苷酸可被配置为发射荧光信号。标记试剂可包括可切割性基团(例如，叠氮基甲基基团、二硫键、烃基二硫基甲基基团和2-硝基苄氧基基团)，其被配置为被切割以将荧光染料与核苷酸分离。
溶液(例如，核苷酸流)可以包含多个荧光标记的核苷酸，其中的每个可以包含相同类型的荧光染料、相同类型的接头和相同类型的核苷酸。多个荧光标记的核苷酸中的每个荧光标记的核苷酸的每个接头可以具有相同的分子量(例如，它们可能不包含具有一定分子量范围的聚合物)。该溶液还可以包含多个未标记的核苷酸，其中多个未标记的核苷酸中的每个核苷酸与多个荧光标记的核苷酸中的每个核苷酸的类型相同。溶液中多个荧光标记的核苷酸与多个未标记的核苷酸的比例可为至少约1:4(例如，标记分数可为至少20％)。例如，该比例可为至少1:1(例如，标记分数可为至少50％)。可替代地，该溶液可以不包含任何未标记的核苷酸并且标记分数可为100％。
可以将溶液(例如，核苷酸流)提供给与核酸链偶联的模板核酸分子。模板核酸分子可以固定在支持物上(例如，如本文所述)。例如，模板核酸分子可以通过衔接子固定在支持物上。例如，模板核酸分子可以通过与其杂交的引物固定在支持物上。核酸链可以与模板核酸分子的一部分至少部分互补。模板核酸分子和与其偶联的核酸链可以经受足以将溶液的荧光标记的核苷酸掺入与模板核酸分子偶联的核酸链的条件。荧光标记的核苷酸的掺入可以使用聚合酶(例如，如本文所述)来完成。溶液的多于一个荧光标记的核苷酸可被掺入，例如掺入到模板核酸分子的同聚区域。可替代地或附加地，未标记的核苷酸可被掺入(例如，与荧光标记的核苷酸相邻)，例如掺入到模板核酸分子的同聚区域。可以从掺入到核酸链中的荧光标记的核苷酸检测信号(例如，荧光信号)。在检测信号之前，可以使用洗涤溶液去除未掺入到核酸链中的荧光标记的核苷酸。在检测信号之后，可将掺入到核酸链中的荧光标记的核苷酸与被配置为从核苷酸切割荧光染料的切割试剂接触。切割试剂可被配置为切割接头以提供附接到接头的一部分的核苷酸，该部分可以包括巯基部分、芳香族部分或其组合。核酸链，例如与多个模板核酸分子偶联的多个核酸链的核酸链，可以与仅包括相同核苷酸类型的未标记的核苷酸的追踪流接触(例如，在检测信号之前或之后)。与模板核酸分子偶联的核酸链也可以与一种或更多种附加的洗涤流接触。与模板核酸分子偶联的核酸链可以与包括附加的荧光标记的核苷酸的附加的溶液接触，例如包括不同类型的核苷酸的附加的荧光标记的核苷酸。附加的荧光标记的核苷酸的染料可以与荧光标记的核苷酸的染料为同一类型。类似地，附加的荧光标记的核苷酸的接头可以与荧光标记的核苷酸的接头为同一类型。
在另一方面，本公开提供了一种方法，包括提供荧光标记试剂(例如，如本文所述)。荧光标记试剂可包括荧光染料和与荧光染料连接的接头。荧光标记试剂可以具有本文提供的任何有用特征。例如，标记试剂可包括可连接多个接头的支架。标记试剂的接头可以包括半刚性部分。接头可以包括多个氨基酸(例如，非蛋白质氨基酸)。例如，接头可以包括多个羟脯氨酸。例如，接头可以包括至少一个羟脯氨酸，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30或更多个羟脯氨酸。荧光标记试剂可被配置为发射荧光信号。
底物可与荧光标记试剂接触以产生荧光标记的底物，其中与荧光染料连接的接头与底物缔合。底物可以是核苷酸或核苷酸类似物(例如，如本文所述)。替代地，底物可以是蛋白质、脂质、细胞或抗体，或本文所述的任何其他底物。荧光标记的底物可被配置为发射荧光信号(例如，在合适的能量范围激发时)，该信号可以被检测(例如，使用基于成像的检测)。标记试剂可包括可切割性基团(例如，叠氮基甲基基团、二硫键、烃基二硫基甲基基团和2-硝基苄氧基基团)，其被配置为被切割以将荧光染料与底物分离。荧光标记的底物可以与切割试剂接触，该切割试剂被配置为从荧光标记的底物切割荧光标记试剂或其一部分以产生有痕底物。有痕底物可包含巯基部分、芳香族部分或其组合。在产生有痕底物之前，荧光标记的底物和核酸分子可以经受足以将荧光标记的底物掺入核酸分子的条件。掺入可以使用聚合酶(例如，如本文所述)来完成。可以将多于一种荧光标记的底物掺入到例如核酸分子的同聚区域中。例如，可以将附加的荧光标记的底物掺入到与荧光标记的底物掺入的位置相邻的位置。可替代地或附加地，未标记的底物(例如，与荧光标记的核苷酸的核苷酸相同类型的核苷酸)也可以掺入到核酸分子中，例如掺入到核酸分子的相邻位置。可以在产生有痕底物之前或之后进行附加的荧光标记的底物的掺入。类似地，可以在有痕底物产生之前或之后进行未标记的底物的掺入。
核酸分子，例如多个核酸分子的核酸分子，可以与仅包含相同类型的未标记的底物的追踪流接触(例如，在检测来自核酸分子的信号之前或之后)。核酸分子也可以与一种或更多种附加的洗涤流接触。核酸分子可以与包含附加的荧光标记的底物的附加的溶液接触，例如包括不同类型的核苷酸的附加的荧光标记的底物。附加的荧光标记的底物的染料可以与荧光标记的底物的染料为同一类型。类似地，附加的荧光标记的底物的接头可以与荧光标记的底物的接头为同一类型。
核酸分子可以固定在支持物上(例如，如本文所述)。例如，核酸分子可以通过衔接子固定在支持物上。例如，核酸分子可以通过与其杂交的引物固定在支持物上。核酸分子可包括与第二核酸链的一部分至少部分互补的第一核酸链。第二核酸链可包括模板核酸序列或其互补序列。
本公开的标记的核苷酸可在涉及高分数的经标记的核苷酸的测序操作期间使用。例如，本公开提供了一种方法，该方法包括在足以将多个核苷酸中的第一标记的核苷酸和第二标记的核苷酸掺入到与核酸分子至少部分互补的生长的链中的条件下使核酸分子(例如，模板核酸分子)与包含多个核苷酸的溶液接触。第一标记的核苷酸和第二标记的核苷酸可以是相同的经典碱基类型。第一核苷酸可包含荧光染料(例如，如本文所述)，该荧光染料可通过接头(例如，如本文所述)与第一核苷酸缔合。第二核苷酸可包含相同的荧光染料(例如，通过与缔合第一核苷酸和荧光染料的接头具有相同化学结构的接头与第二核苷酸缔合)。与核苷酸(例如，第一和/或第二核苷酸)偶联的荧光染料可以是可切割的(例如，在应用切割试剂时)。多个核苷酸中的至少约20％可以是标记的核苷酸。例如，多个核苷酸的至少20％可以与荧光标记试剂(例如，如本文所述)缔合。例如，多个核苷酸的至少约50％、70％、80％、90％、95％或99％可以是标记的核苷酸。例如，多个核苷酸的所有核苷酸都可以是标记的核苷酸(例如，标记分数可为100％)。可以从第一标记的核苷酸和第二标记的核苷酸(例如，如本文所述)检测一个或更多个信号或信号变化。一个或更多个信号或信号变化可包括荧光信号或信号变化。一个或更多个信号或信号变化可以指示第一标记的核苷酸和第二标记的核苷酸的掺入。可以解析一个或更多个信号或信号变化以确定核酸分子的序列或其部分。解析一个或更多个信号或信号变化可以包括确定来自溶液的掺入生长的链中的连续核苷酸的数量。连续核苷酸的数量可选自2、3、4、5、6、7或8个核苷酸。解析一个或更多个信号或信号变化可包括处理溶液的耐受性。第三核苷酸也可掺入生长的链中(例如，在检测一个或更多个信号或信号变化之前或之后)。第三核苷酸可以是溶液的多个核苷酸中的核苷酸。可替代地，第三核苷酸可以在单独的溶液中提供，例如在“追踪”流中(例如，如本文所述)。第三核苷酸可以是未标记的。可替代地，第三核苷酸可以是标记的。第一标记的核苷酸和第三核苷酸可以是相同的经典碱基类型。可替代地，第一标记的核苷酸和第三核苷酸可以是不同的经典碱基类型。
该方法还可包括切割与第一标记的核苷酸偶联的荧光染料。荧光染料可以通过应用切割试剂来切割，该切割试剂被配置为切割缔合第一标记的核苷酸和荧光染料的接头。核酸分子可以在足以将第二多个核苷酸中的第三标记的核苷酸掺入生长的链中的条件下与包含第二多个核苷酸的第二溶液接触。第二多个核苷酸中的至少约20％可以是标记的核苷酸(例如，如本文所述)。一个或更多个第二信号或信号变化可从第三标记的核苷酸(例如，如本文所述)检测。可以解析一个或更多个第二信号或信号变化以确定核酸分子的第二序列或其部分。第一标记的核苷酸和第三标记的核苷酸可以是不同的经典碱基类型(例如，A、C、U/T或G)。第三标记的核苷酸可包含荧光染料。荧光染料可以通过接头(例如，如本文所述)与第三标记的核苷酸偶联，该接头可以具有与将荧光染料连接到第一标记的核苷酸的接头相同的化学结构或不同的化学结构。
可替代地，该方法可包括在足以将第二多个核苷酸中的第三标记的核苷酸掺入生长的链中的条件下，使核酸分子与包含第二多个核苷酸的第二溶液接触。第二多个核苷酸中的至少约20％可以是标记的核苷酸(例如，如本文所述)。一个或更多个第二信号或信号变化可从第三标记的核苷酸(例如，如本文所述)检测。可以解析一个或更多个第二信号或信号变化以确定核酸分子的第二序列或其部分。第一标记的核苷酸和第三标记的核苷酸可以是不同的经典碱基类型(例如，A、C、U/T或G)。第三标记的核苷酸可包含荧光染料。荧光染料可以通过接头(例如，如本文所述)与第三标记的核苷酸偶联，该接头可以具有与将荧光染料连接到第一标记的核苷酸的接头相同的化学结构或不同的化学结构。可以在没有从第一标记的核苷酸或第二标记的核苷酸切割荧光染料的情况下进行核酸分子与第二溶液接触。在没有从第一标记的核苷酸或第二标记的核苷酸切割荧光染料的情况下，该过程可以重复一次或多次，例如1、2、3、4、5次或更多次，每次使用不同的核苷酸溶液。这些不同的核苷酸溶液中的一种或更多种可以包含至少20％的标记的核苷酸。
本公开还提供了一种方法，该方法包括在足以将多个非终止的核苷酸中的标记的核苷酸和第二核苷酸掺入与核酸分子或其一部分至少部分地互补的生长的链中的条件下，使核酸分子与包含多个非终止的核苷酸的溶液接触。标记的核苷酸和第二核苷酸可以是相同的经典碱基类型。可替代地，标记的核苷酸和第二核苷酸可以是不同的经典碱基类型。标记的核苷酸可包含荧光染料(例如，如本文所述)，该荧光染料可通过接头(例如，如本文所述)与标记的核苷酸缔合。第二核苷酸可以是标记的核苷酸。例如，第二核苷酸可包含相同的荧光染料(例如，通过与缔合第一核苷酸和荧光染料的接头具有相同的化学结构的接头与第二核苷酸缔合)。可替代地，第二核苷酸可能不与荧光染料偶联(例如，第二核苷酸可能未被标记)。与核苷酸(例如，第一和/或第二核苷酸)偶联的荧光染料可以是可切割的(例如，在应用切割试剂时)。多个非终止的核苷酸可包含相同经典碱基类型的核苷酸。所述多个核苷酸中的至少约20％可以是标记的核苷酸。例如，多个核苷酸的至少20％可以与荧光标记试剂(例如，如本文所述)缔合。例如，多个非终止的核苷酸的至少约50％、70％、80％、90％、95％或99％可以是标记的核苷酸。例如，基本上所有的多个非终止的核苷酸都可以是标记的核苷酸。例如，多个非终止的核苷酸的所有核苷酸都可以是标记的核苷酸(例如，标记分数可为100％)。一个或更多个信号或信号变化可从标记的核苷酸(例如，如本文所述)检测。一个或更多个信号或信号变化可包括荧光信号或信号变化。一个或更多个信号或信号变化可以指示标记的核苷酸的掺入。可以解析一个或更多个信号或信号变化以确定核酸分子的序列或其部分。解析一个或更多个信号或信号变化可以包括确定来自溶液的掺入生长的链中的连续核苷酸的数量。连续核苷酸的数量可选自2、3、4、5、6、7或8个核苷酸。解析一个或更多个信号或信号变化可包括处理溶液的耐受性。第三核苷酸也可掺入生长的链中(例如，在检测一个或更多个信号或信号变化之前或之后)。第三核苷酸可以是溶液的多个非终止的核苷酸中的核苷酸。可替代地，第三核苷酸可以在单独的溶液中提供，例如在“追踪”流中(例如，如本文所述)。第三核苷酸可以是未标记的。可替代地，可以标记第三核苷酸。标记的核苷酸和第三核苷酸可以是相同的经典碱基类型。可替代地，标记的核苷酸和第三核苷酸可以是不同的经典碱基类型。
该方法还可包括切割与标记的核苷酸偶联的荧光染料。荧光染料可以通过应用切割试剂来切割，该切割试剂被配置为切割缔合标记的核苷酸和荧光染料的接头。核酸分子可以在足以将第二多个非终止的核苷酸中的第三标记的核苷酸掺入生长的链中的条件下与包含第二多个非终止的核苷酸的第二溶液接触。第二多个非终止的核苷酸的至少约20％可以是标记的核苷酸(例如，如本文所述)。一个或更多个第二信号或信号变化可从第三标记的核苷酸(例如，如本文所述)检测。可以解析一个或更多个第二信号或信号变化以确定核酸分子的第二序列或其部分。第一标记的核苷酸和第三标记的核苷酸可以是不同的经典碱基类型(例如，A、C、U/T或G)。第三标记的核苷酸可包含荧光染料。荧光染料可以通过接头(例如，如本文所述)与第三标记的核苷酸偶联，该接头可以具有与将荧光染料连接到第一标记的核苷酸的接头相同的化学结构或不同的化学结构。
可替代地，该方法可包括在足以将第二多个非终止的核苷酸中的第三标记的核苷酸掺入生长的链中的条件下，使核酸分子与包含第二多个非终止的核苷酸的第二溶液接触。第二多个核苷酸中的至少约20％可以是标记的核苷酸(例如，如本文所述)。一个或更多个第二信号或信号变化可从第三标记的核苷酸(例如，如本文所述)检测。可以解析一个或更多个第二信号或信号变化以确定核酸分子的第二序列或其部分。第一标记的核苷酸和第三标记的核苷酸可以是不同的经典碱基类型(例如，A、C、U/T或G)。第三标记的核苷酸可包含荧光染料。荧光染料可以通过接头(例如，如本文所述)与第三标记的核苷酸偶联，该接头可以具有与将荧光染料连接到第一标记的核苷酸的接头相同的化学结构或不同的化学结构。可以在没有从第一标记的核苷酸或第二标记的核苷酸切割荧光染料的情况下进行核酸分子与第二溶液接触。在没有从第一标记的核苷酸或第二标记的核苷酸切割荧光染料的情况下，该过程可以重复一次或多次，例如1、2、3、4、5次或更多次，每次使用不同的核苷酸溶液。这些不同的核苷酸溶液中的一种或更多种可以包含至少20％的标记的核苷酸。
光学标记试剂的合成方法
在一些情况下，本文提供的接头可以使用肽合成化学来制备。
例如，可以使用肽合成化学来制备包含吡啶鎓部分的接头。此类方法可以使用四种双官能试剂来制备接头，即：(a)R1A、(b)BB、(c)AA和(d)AR2。试剂A与B反应而生成吡啶鎓基团；R1和R2是异双官能附接基团。合成从基团R1A(或R2A)开始。将过量的BB加入到R1A以形成R1A-BB。将产物在极性较小的溶剂(例如，乙酸乙酯或四氢呋喃)中沉淀并洗涤以除去过量的BB。伴随着加热将过量的AA加入在N-甲基吡咯烷酮(NMP)中，以产生R1A-BB-AA。将产物在极性较小的溶剂中沉淀并洗涤。合成继续进行，直到形成特定长度的接头。在最后步骤中附加基团AR2。
1)R1A+10BB→R1A-BB(洗掉过量的BB)
2)R1A-BB+10AA→R1A-BB-AA(洗掉过量的AA)
3)R1A-BB-AA+10BB→R1A-BB-AA-BB(洗掉过量的BB)
4)R1A-BB-AA-BB+AR2→R1A-BB-AA-BB-AR2(使用终止试剂)
用于制备光学标记试剂(例如，如本文所述)的合成方法在别处和以下实施例中描述。
构建标记的核苷酸的方法
在一方面，本公开提供了用于构建标记的核苷酸(例如，光学标记的核苷酸)的方法。
可以使用模块化化学结构单元来构建标记的核苷酸。核苷酸或核苷酸类似物可以用例如炔丙基氨基部分衍生化以提供用于与接头或可检测性标记(例如，染料)附接的柄。一种或更多种可检测性标记，例如一种或更多种染料，可以通过共价键而附接至核苷酸或核苷酸类似物。可替代地或附加地，一种或更多种可检测性标记可以通过非共价键而附接到核苷酸或核苷酸类似物。可检测性标记可通过接头(例如，如本文所述)而附接至核苷酸或核苷酸类似物。接头可包括一个或更多个部分。例如，接头可包括第一部分，该第一部分内包含二硫键以促进(例如，在测序过程期间)切割接头和释放可检测性标记。可以使用顺序肽键来添加附加的接头部分。接头部分可以具有各种长度和电荷。接头部分可以包括一种或更多种不同的组分，例如一个或更多个不同的环体系，和/或重复单元(例如，如本文所述)。接头的实例包括但不限于，氨基乙基-SS-丙酸(epSS)、氨基乙基-SS-苯甲酸、氨基己基-SS-丙酸、hyp10和hyp20。
用于构建标记的核苷酸的方法的示例显示在图1、2A和2B中。如图1所示，标记的核苷酸可由核苷酸、染料和一个或更多个接头部分构建。一个或更多个接头部分一起包括如本文所述的接头。用炔丙基氨基部分官能化的核苷酸可以通过肽键而附接到第一接头部分。该第一接头部分可包含可切割性部分，例如二硫键部分。第一接头部分也可以以线性或支化方式附接到一个或更多个附加的接头部分。例如，第二接头部分可以包括两个或更多个环体系，其中两个或更多个环体系中的至少两个被不多于两个sp3碳原子分开，例如被不多于两个原子分开。例如，两个或更多个环体系中的至少两个可以通过sp2碳原子而彼此连接。接头可包括非蛋白质氨基酸，其包括两个或更多个环体系中的一个环体系。例如，第二接头部分可以包括两个或更多个羟脯氨酸部分。接头部分上的胺柄可用于附接接头和染料，例如在可见电磁波谱的红色或绿色部分发荧光的染料。图1中产生的标记的核苷酸包括修饰的脱氧腺苷三磷酸部分、包括包含二硫键部分的第一接头部分和包含至少两个环体系的第二接头部分的接头，以及染料。
标记的核苷酸的构建可以从核苷酸末端或染料末端开始。从染料末端构建允许使用未标记的、未活化的氨基酸部分，而从核苷酸末端构建可能需要胺保护的、羧基活化的氨基酸部分。
图2A和2B示出了包括炔丙基氨基官能化dGTP部分、包括二硫化物基团的第一接头部分、为hyp10的第二接头部分和染料部分Atto633的标记的核苷酸的示例性合成。该合成的细节在下面的实施例2中提供。
标记的核苷酸的核苷酸或核苷酸类似物可包括一个或更多个修饰，例如对核碱基的一个或更多个修饰。可替代地，标记的核苷酸的核苷酸或核苷酸类似物可包括一个或更多个不在核碱基上的修饰。修饰可包括但不限于，一个或更多个接头或标记部分的共价附接、烷基化、胺化、酰胺化、酯化、羟基化、卤化、硫酸化和/或磷酸化。
标记的核苷酸的核苷酸或核苷酸类似物可以包括一个或更多个修饰，这些修饰被配置成在标记的核苷酸掺入到生长的核酸链中时防止随后的核苷酸添加到与标记的核苷酸相邻的位置。例如，标记的核苷酸可包括终止或封闭基团(例如，二甲氧基三苯甲基、亚磷酰胺或硝基苄基分子)。在一些情况下，终止或封闭基团可以是可切割的。
串联标记
本公开提供了用于串联标记的试剂和方法。串联标记可以包括荧光标记试剂之外的附加荧光标记试剂。参与串联标记或能量转移中的荧光标记试剂在本文中可称为“串联标记试剂”。在一些情况下，串联标记可以包括两种或更多种串联标记试剂。串联标记可以包括两种串联标记试剂之间的能量转移。在一些情况下，两种串联标记试剂之间的能量转移可以包括
Figure BDA0004184559620001021
共振能量转移或荧光共振能量转移(FRET)、共振能量转移、或电子能量转移(EET)。在一些情况下，两种串联标记试剂之间的能量转移可以包括两种标记试剂之间无辐射或非辐射的能量转移。在其他情况下，两种串联标记试剂之间的能量转移也可以包括两种标记试剂之间的辐射能量转移。
在一些情况下，串联标记试剂可以包括荧光团。在一些情况下，荧光团可以吸收紫外(UV)(波长约：200–400nm)或可见光范围(波长约：400–800nm)中的光，并将吸收的光的部分作为辐射重新发射。在一些情况下，串联标记试剂可以包括发色团。在一些情况下，发色团可以吸收紫外和可见光范围内的光，并重新发射在可见光范围中吸收的光。在其他情况下，串联标记试剂也可以包括磷光剂或化学发光剂。
在一些情况下，荧光团可以包括染料，例如荧光染料。在一些情况下，荧光染料可以包括化学化合物。化学化合物可以是有机的或无机的。染料或荧光染料可包括本文及其所述的任何染料或荧光染料。
在一些情况下，荧光团可以包括有机荧光染料。在一些情况下，有机荧光染料可以包括π共轭聚合物。在一些情况下，π共轭聚合物可以包括允许电子离域的π轨道网络。电子离域可使π共轭聚合物能够吸收紫外至近红外(IR)范围的光，并将吸收的光作为荧光重新发射。在一些情况下，π轨道网络可能不局限于离散的原子集合，并且电子离域可能散布在不同的聚合物亚单元。这样的性质可以允许亚单元在能量转移中协同作用。在一些情况下，π共轭聚合物的分子消光系数为约1x10^6M-1cm-1。在一些情况下，π-共轭聚合物可以包括Brilliant Violet，如Chattopadhyay等人，Cytometry A.2012Jun；81(6):456-66.和美国专利号10,641,777中所述，其各自的全部内容通过引用并入本文中。可替代地或附加地，荧光染料可以包括无机化合物。
在一些情况下，荧光团可以包括肽、多肽、蛋白质或其衍生物。这样的肽、多肽、蛋白质或衍生物可以包括荧光蛋白。在一些情况下，荧光蛋白可以包括藻红蛋白(PE)或APC。在一些情况下，PE的消光系数可以为约1.96x10^6cm-1M-1，且量子效率为约0.82。在一些情况下，APC的消光系数可以为约7x10^5cm-1M-1，且量子效率为约0.68。荧光团可以包括纳米颗粒。这样的纳米颗粒可以包括量子点。量子点可以被EV紫光激发，并重新发射525nm至800nm波长的光。
在一些情况下，串联标记机制可以包括供体串联标记试剂和受体串联标记试剂。在一些情况下，供体串联标记试剂和受体串联标记试剂可以属于同一类分子(例如，供体荧光染料和受体荧光染料)。在其他情况下，供体串联标记试剂和受体串联标记试剂可以属于两类不同的分子(例如，供体荧光蛋白和受体荧光染料)。供体串联标记试剂可以包括本文所述的任何串联标记试剂。受体串联标记试剂可以包括本文所述的任何串联标记试剂。在一些情况下，供体标记试剂可以包括供体荧光团，并且受体标记试剂可以包括受体荧光团。
在一些情况下，能量转移可以通过FRET而在供体串联标记试剂和受体串联标记试剂之间发生。在FRET中，处于电子激发状态的供体荧光团可以将其激发能量转移到受体荧光团。受体荧光团可以将转移的能量作为辐射或荧光重新发射成光。这种能量转移可能取决于供体荧光团和受体荧光团的接近度和取向。由于供体荧光团和受体荧光团可以具有不同的激发和发射光谱，因此通过使用FRET，供体-受体荧光团对可以提供与单独的供体或受体荧光团不同的激发光谱和发射光谱的组合。
在FRET中，能量转移可以通过无辐射或非辐射能量转移而发生。一种这样的无辐射或非辐射能量转移可以包括偶极-偶极分子间偶联。在一些情况下，这种能量转移的效率与介于供体荧光团和受体荧光团之间距离的六次方成反比，如其所述。在其他情况下，供体荧光团也可以通过辐射能量转移而将其激发能量转移到受体荧光团。
根据
Figure BDA0004184559620001041
的理论，能量转移速率KT由以下等式给出：KT＝(1/τD)·[R0/r]6
其中τD是在没有受体荧光团的情况下供体荧光团的荧光寿命，R0是供体和受体荧光团对之间的
Figure BDA0004184559620001042
临界距离，且r是供体和受体荧光团分隔的距离。FRET中的能量转移效率与介于供体荧光团和受体荧光团之间距离的六次方成反比。
能量转移效率ET是由供体荧光团吸收的光子转移到受体荧光团的分数的量度。这可能与供体荧光团和受体荧光团分隔的距离r有关，如以下等式所示：
ET＝(R0/r)6·1/τD，或
ET＝1–(τDA/τD)
其中τDA是在受体荧光团存在时供体的荧光寿命。
在一些情况下，供体荧光团和受体荧光团相隔一定距离以允许FRET发生。这样的距离可以是约1纳米(nm)、约1.1nm、约1.2nm、约1.3nm、约1.4nm、约1.5nm、约1.6nm、约1.7nm、约1.8nm、约1.9nm、约2nm、约2.1nm、约2.2nm、约2.3nm、约2.4nm、约2.5nm、约2.6nm、约2.7nm、约2.8nm、约2.9nm、约3nm、约3.1nm、约3.2nm、约3.3nm、约3.4nm、约3.5nm、约3.6nm、约3.7nm、约3.8nm、约3.9nm、约4nm、约4.1nm、约4.2nm、约4.3nm、约4.4nm、约4.5nm、约4.6nm、约4.7nm、约4.8nm、约4.9nm、约5nm、约5.1nm、约5.2nm、约5.3nm、约5.4nm、约5.5nm、约5.6nm、约5.7nm、约5.8nm、约5.9nm、约6nm、约6.1nm、约6.2nm、约6.3nm、约6.4nm、约6.5nm、约6.6nm、约6.7nm、约6.8nm、约6.9nm、约7nm、约7.1nm、约7.2nm、约7.3nm、约7.4nm、约7.5nm、约7.6nm、约7.7nm、约7.8nm、约7.9nm、约8nm、约8.1nm、约8.2nm、约8.3nm、约8.4nm、约8.5nm、约8.6nm、约8.7nm、约8.8nm、约8.9nm、约9nm、约9.1nm、约9.2nm、约9.3nm、约9.4nm、约9.5nm、约9.6nm、约9.7nm、约9.8nm、约9.9nm、约10nm、或大于约10nm。这样的距离也可以是约1至1.1nm、约1.05至1.15nm、约1.2至1.3nm、约1.15至1.25nm、约1.3至1.4nm、约1.25至1.35nm、约1.4至1.5nm、约1.35至1.45nm、约1.5至1.6nm、约1.45至1.55nm、约1.6至1.7nm、约1.55至1.65nm、约1.7至1.8nm、约1.65至1.75nm、约1.8至1.9nm、约1.75至1.85nm、约1.9至2nm、约1.85至1.95nm、约2至2.1nm、约1.95至2.05nm、约2.1至2.2nm、约2.05至2.15nm、约2.2至2.3nm、约2.15至2.25nm、约2.3至2.4nm、约2.25至2.35nm、约2.4至2.5nm、约2.35至2.45nm、约2.5至2.6nm、约2.45至2.55nm、约2.6至2.7nm、约2.55至2.65nm、约2.7至2.8nm、约2.65至2.75nm、约2.8至2.9nm、约2.75至2.85nm、约2.9至3nm、约2.85至2.95nm、约3至3.1nm、约2.95至3.05nm、约3.1至3.2nm、约3.05至3.15nm、约3.2至3.3nm、约3.15至3.25nm、约3.3至3.4nm、约3.25至3.35nm、约3.4至3.5nm、约3.35至3.45nm、约3.5至3.6nm、约3.45至3.55nm、约3.6至3.7nm、约3.55至3.65nm、约3.7至3.8nm、约3.65至3.75nm、约3.8至3.9nm、约3.75至3.85nm、约3.9至4nm、约3.85至3.95nm、约4至4.1nm、约3.95至4.05nm、约4.1至4.2nm、约4.05至4.15nm、约4.2至4.3nm、约4.15至4.25nm、约4.3至4.4nm、约4.25至4.35nm、约4.4至4.5nm、约4.35至4.45nm、约4.5至4.6nm、约4.45至4.55nm、约4.6至4.7nm、约4.55至4.65nm、约4.7至4.8nm、约4.65至4.75nm、约4.8至4.9nm、约4.75至4.85nm、约4.9至5nm、约4.85至4.95nm、约5至5.1nm、约4.95至5.05nm、约5.1至5.2nm、约5.05至5.15nm、约5.2至5.3nm、约5.15至5.25nm、约5.3至5.4nm、约5.25至5.35nm、约5.4至5.5nm、约5.35至5.45nm、约5.5至5.6nm、约5.45至5.55nm、约5.6至5.7nm、约5.55至5.65nm、约5.7至5.8nm、约5.65至5.75nm、约5.8至5.9nm、约5.75至5.85nm、约5.9至6nm、约5.85至5.95nm、约6至6.1nm、约5.95至6.05nm、约6.1至6.2nm、约6.05至6.15nm、约6.2至6.3nm、约6.15至6.25nm、约6.3至6.4nm、约6.25至6.35nm、约6.4至6.5nm、约6.35至6.45nm、约6.5至6.6nm、约6.45至6.55nm、约6.6至6.7nm、约6.55至6.65nm、约6.7至6.8nm、约6.65至6.75nm、约6.8至6.9nm、约6.75至6.85nm、约6.9至7nm、约6.85至6.95nm、约7至7.1nm、约6.95至7.05nm、约7.1至7.2nm、约7.05至7.15nm、约7.2至7.3nm、约7.15至7.25nm、约7.3至7.4nm、约7.25至7.35nm、约7.4至7.5nm、约7.35至7.45nm、约7.5至7.6nm、约7.45至7.55nm、约7.6至7.7nm、约7.55至7.65nm、约7.7至7.8nm、约7.65至7.75nm、约7.8至7.9nm、约7.75至7.85nm、约7.9至8nm、约7.85至7.95nm、约8至8.1nm、约7.95至8.05nm、约8.1至8.2nm、约8.05至8.15nm、约8.2至8.3nm、约8.15至8.25nm、约8.3至8.4nm、约8.25至8.35nm、约8.4至8.5nm、约8.35至8.45nm、约8.5至8.6nm、约8.45至8.55nm、约8.6至8.7nm、约8.55至8.65nm、约8.7至8.8nm、约8.65至8.75nm、约8.8至8.9nm、约8.75至8.85nm、约8.9至9nm、约8.85至8.95nm、约9至9.1nm、约8.95至9.05nm、约9.1至9.2nm、约9.05至9.15nm、约9.2至9.3nm、约9.15至9.25nm、约9.3至9.4nm、约9.25至9.35nm、约9.4至9.5nm、约9.35至9.45nm、约9.5至9.6nm、约9.45至9.55nm、约9.6至9.7nm、约9.55至9.65nm、约9.7至9.8nm、约9.65至9.75nm、约9.8至9.9nm、约9.75至9.85nm、或约9.9至10nm。在一些情况下，使用本文所述的接头(例如，hyp10或hyp20接头)连接供体荧光团和受体荧光团可通过将荧光团物理上定位得足够接近以允许FRET发生而促进能量转移。这样的距离可以是本文描述的任何距离。
在一些情况下，供体荧光团的发射光谱和受体荧光团的激发光谱可能重叠，以允许FRET发生。这样的重叠可能是5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％。在一些情况下，供体荧光团的发射光谱和受体荧光团的激发光谱可能重叠约1至10％、5至15％、10至20％、15至25％、20至30％、25至35％、30至40％、35至45％、40至50％、45至55％、50至60％、55至65％、60至70％、65至75％、70至80％、75至85％、80至90％、85至95％、或90至100％。在其他情况下，供体荧光团的发射光谱和受体荧光团的激发光谱可能不重叠，以允许FRET发生。在一些情况下，供体荧光团的选择可以决定供体荧光团的发射光谱和受体荧光团的激发光谱是否需要重叠。例如，当使用π共轭聚合物(例如，Brilliant Violet)作为供体荧光团时，供体荧光团的发射光谱和受体荧光团的激发光谱可能不重叠，以允许FRET发生。在其他情况下，例如，当使用PE或APC作为供体荧光团时，供体荧光团的发射光谱和受体荧光团的激发光谱可以以本文所述的程度重叠，从而允许FRET发生。在一些情况下，供体荧光团和受体荧光团之间转移的能量可能为约5％、约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、或约100％。在其他情况下，供体荧光团和受体荧光团之间转移的能量可以为约1至10％、5至15％、10至20％、15至25％、20至30％、25至35％、30至40％、35至45％、40至50％、45至55％、50至60％、55至65％、60至70％、65至75％、70至80％、75至85％、80至90％、85至95％、或90至100％。供体荧光团可包括本文所述的任何染料或荧光染料、其任何衍生物以及本文及其任何组合。
在一些情况下，供体荧光团的最大激发波长(Exmax)可以为约300nm、301nm、302nm、303nm、304nm、305nm、306nm、307nm、308nm、309nm、310nm、311nm、312nm、313nm、314nm、315nm、316nm、317nm、318nm、319nm、320nm、321nm、322nm、323nm、324nm、325 nm、326 nm、327nm、328 nm、329 nm、330 nm、331 nm、332nm、333 nm、334 nm、335 nm、336 nm、337 nm、338nm、339 nm、340nm、341 nm、342 nm、343 nm、344 nm、345 nm、346 nm、347 nm、348nm、349nm、350 nm、351 nm、352 nm、353 nm、354 nm、355 nm、356nm、357 nm、358 nm、359 nm、360nm、361 nm、362 nm、363 nm、364nm、365 nm、366 nm、367 nm、368 nm、369 nm、370 nm、371nm、372nm、373 nm、374 nm、375 nm、376 nm、377 nm、378 nm、379 nm、380nm、381 nm、382nm、383 nm、384 nm、385 nm、386 nm、387 nm、388nm、389 nm、390 nm、391 nm、392 nm、393nm、394 nm、395 nm、396nm、397 nm、398 nm、399 nm、400 nm、401 nm、402 nm、403 nm、404nm、405 nm、406 nm、407 nm、408 nm、409 nm、410 nm、411 nm、412nm、413 nm、414 nm、415 nm、416 nm、417 nm、418 nm、419 nm、420nm、421 nm、422 nm、423 nm、424 nm、425 nm、426 nm、427 nm、428nm、429 nm、430 nm、431 nm、432 nm、433 nm、434 nm、435 nm、436nm、437 nm、438 nm、439 nm、440 nm、441 nm、442 nm、443 nm、444nm、445 nm、446 nm、447 nm、448 nm、449 nm、450 nm、451 nm、452nm、453 nm、454 nm、455 nm、456 nm、457 nm、458 nm、459 nm、460nm、461 nm、462 nm、463 nm、464 nm、465 nm、466 nm、467 nm、468nm、469 nm、470 nm、471 nm、472 nm、473 nm、474 nm、475 nm、476nm、477 nm、478 nm、479 nm、480 nm、481 nm、482 nm、483 nm、484nm、485 nm、486 nm、487 nm、488 nm、489 nm、490 nm、491 nm、492nm、493 nm、494 nm、495 nm、496 nm、497 nm、498 nm、499 nm、500nm、501 nm、502 nm、503 nm、504 nm、505 nm、506 nm、507 nm、508nm、509 nm、510 nm、511 nm、512 nm、513 nm、514 nm、515 nm、516nm、517 nm、518 nm、519 nm、520 nm、521 nm、522 nm、523 nm、524nm、525 nm、526 nm、527 nm、528 nm、529 nm、530 nm、531 nm、532nm、533 nm、534 nm、535 nm、536 nm、537 nm、538 nm、539 nm、540nm、541 nm、542 nm、543 nm、544 nm、545 nm、546 nm、547 nm、548nm、549 nm、550 nm、551 nm、552 nm、553 nm、554 nm、555 nm、556nm、557nm、558nm、559nm、560nm、561nm、562nm、563nm、564nm、565nm、566nm、567nm、568nm、569nm、570nm、571nm、572nm、573nm、574nm、575nm、576nm、577nm、578nm、579nm、580nm、581nm、582nm、583nm、584nm、585nm、586nm、587nm、588nm、589nm、590nm、591nm、592nm、593nm、594nm、595nm、596nm、597nm、598nm、599nm、600nm、601nm、602nm、603nm、604nm、605nm、606nm、607nm、608nm、609nm、610nm、611nm、612nm、613nm、614nm、615nm、616nm、617nm、618nm、619nm、620nm、621nm、622nm、623nm、624nm、625nm、626nm、627nm、628nm、629nm、630nm、631nm、632nm、633nm、634nm、635nm、636nm、637nm、638nm、639nm、640nm、641nm、642nm、643nm、644nm、645nm、646nm、647nm、648nm、649nm、650nm、651nm、652nm、653nm、654nm、655nm、656nm、657nm、658nm、659nm、660nm、661nm、662nm、663nm、664nm、665nm、666nm、667nm、668nm、669nm、670nm、671nm、672nm、673nm、674nm、675nm、676nm、677nm、678nm、679nm、680nm、681nm、682nm、683nm、684nm、685nm、686nm、687nm、688nm、689nm、690nm、691nm、692nm、693nm、694nm、695nm、696nm、697nm、698nm、699nm、700nm、701nm、702nm、703nm、704nm、705nm、706nm、707nm、708nm、709nm、710nm、711nm、712nm、713nm、714nm、715nm、716nm、717nm、718nm、719nm、720nm、721nm、722nm、723nm、724nm、725nm、726nm、727nm、728nm、729nm、730nm、731nm、732nm、733nm、734nm、735nm、736nm、737nm、738nm、739nm、740nm、741nm、742nm、743nm、744nm、745nm、746nm、747nm、748nm、749nm或750nm。在一些情况下，供体荧光团的Exmax可以包括335nm、404nm、405nm、407nm、415nm、482nm、488nm、494nm、495nm、496nm、532nm、561nm、633nm、635nm、640nm、650nm或696nm。
在一些情况下，供体荧光团的最大发射波长(Emmax)可以为约300nm、301nm、302nm、303nm、304nm、305nm、306nm、307nm、308nm、309nm、310nm、311nm、312nm、313nm、314nm、315nm、316nm、317nm、318nm、319nm、320nm、321nm、322nm、323nm、324nm、325nm、326nm、327nm、328nm、329nm、330nm、331nm、332nm、333nm、334nm、335nm、336nm、337nm、338nm、339nm、340nm、341nm、342nm、343nm、344nm、345nm、346nm、347nm、348nm、349nm、350nm、351nm、352nm、353nm、354nm、355nm、356nm、357nm、358nm、359nm、360nm、361nm、362nm、363nm、364nm、365nm、366nm、367nm、368nm、369nm、370nm、371nm、372nm、373nm、374nm、375nm、376nm、377nm、378nm、379nm、380nm、381nm、382nm、383nm、384nm、385nm、386nm、387nm、388nm、389nm、390nm、391nm、392nm、393nm、394nm、395nm、396nm、397nm、398nm、399nm、400nm、401nm、402nm、403nm、404nm、405nm、406nm、407nm、408nm、409nm、410nm、411nm、412nm、413nm、414nm、415nm、416nm、417nm、418nm、419nm、420nm、421nm、422nm、423nm、424nm、425nm、426nm、427nm、428nm、429nm、430nm、431nm、432nm、433nm、434nm、435nm、436nm、437nm、438nm、439nm、440nm、441nm、442nm、443nm、444nm、445nm、446nm、447nm、448nm、449nm、450nm、451nm、452nm、453nm、454nm、455nm、456nm、457nm、458nm、459nm、460nm、461nm、462nm、463nm、464nm、465nm、466nm、467nm、468nm、469nm、470nm、471nm、472nm、473nm、474nm、475nm、476nm、477nm、478nm、479nm、480nm、481nm、482nm、483nm、484nm、485nm、486nm、487nm、488nm、489nm、490nm、491nm、492nm、493nm、494nm、495nm、496nm、497nm、498nm、499nm、500nm、501nm、502nm、503nm、504nm、505nm、506nm、507nm、508nm、509nm、510nm、511nm、512nm、513nm、514nm、515nm、516nm、517nm、518nm、519nm、520nm、521nm、522nm、523nm、524nm、525 nm、526 nm、527 nm、528 nm、529 nm、530nm、531 nm、532nm、533 nm、534 nm、535 nm、536 nm、537 nm、538 nm、539 nm、540nm、541nm、542 nm、543 nm、544 nm、545 nm、546 nm、547 nm、548nm、549 nm、550 nm、551 nm、552nm、553 nm、554 nm、555 nm、556nm、557 nm、558 nm、559 nm、560 nm、561 nm、562 nm、563nm、564nm、565 nm、566 nm、567 nm、568 nm、569 nm、570 nm、571 nm、572nm、573 nm、574nm、575 nm、576 nm、577 nm、578 nm、579 nm、580nm、581 nm、582 nm、583 nm、584 nm、585nm、586 nm、587 nm、588nm、589 nm、590 nm、591 nm、592 nm、593 nm、594 nm、595 nm、596nm、597 nm、598 nm、599 nm、600 nm、601 nm、602 nm、603 nm、604nm、605 nm、606 nm、607 nm、608 nm、609 nm、610 nm、611 nm、612nm、613 nm、614 nm、615 nm、616 nm、617 nm、618 nm、619 nm、620nm、621 nm、622 nm、623 nm、624 nm、625 nm、626 nm、627 nm、628nm、629 nm、630 nm、631 nm、632 nm、633 nm、634 nm、635 nm、636nm、637 nm、638 nm、639 nm、640 nm、641 nm、642 nm、643 nm、644nm、645 nm、646 nm、647 nm、648 nm、649 nm、650 nm、651 nm、652nm、653 nm、654 nm、655 nm、656 nm、657 nm、658 nm、659 nm、660nm、661 nm、662 nm、663 nm、664 nm、665 nm、666 nm、667 nm、668nm、669 nm、670 nm、671 nm、672 nm、673 nm、674 nm、675 nm、676nm、677 nm、678 nm、679 nm、680 nm、681 nm、682 nm、683 nm、684nm、685 nm、686 nm、687 nm、688 nm、689 nm、690 nm、691 nm、692nm、693 nm、694 nm、695 nm、696 nm、697 nm、698 nm、699 nm、700nm、701 nm、702 nm、703 nm、704 nm、705 nm、706 nm、707 nm、708nm、709 nm、710 nm、711 nm、712 nm、713 nm、714 nm、715 nm、716nm、717 nm、718 nm、719 nm、720 nm、721 nm、722 nm、723 nm、724nm、725 nm、726 nm、727 nm、728 nm、729 nm、730 nm、731 nm、732nm、733 nm、734 nm、735 nm、736 nm、737 nm、738 nm、739 nm、740nm、741 nm、742 nm、743 nm、744 nm、745 nm、746 nm、747 nm、748nm、749 nm、750 nm、751 nm、752 nm、753 nm、754 nm、755 nm、756nm、757nm、758nm、759nm、760nm、761nm、762nm、763nm、764nm、765nm、766nm、767nm、768nm、769nm、770nm、771nm、772nm、773nm、774nm、775nm、776nm、777nm、778nm、779nm、780nm、781nm、782nm、783nm、784nm、785nm、786nm、787nm、788nm、789nm、790nm、791nm、792nm、793nm、794nm、795nm、796nm、797nm、798nm、799nm或800nm。
在一些情况下，FRET的受体荧光团可以包括FITC、PE、APC、π-共轭聚合物(例如，Brilliant Violet)、Cy-5、Cy-5.5、Cy-7、AlexaFluor染料(例如，Alexa Fluor 488、594、647或700染料)、Atto-633染料、多甲藻黄素-叶绿素-蛋白质、其任何衍生物或本文及其任何组合。受体荧光团可包括本文所述的任何染料或荧光染料、其任何衍生物以及本文及其任何组合。
在一些情况下，受体荧光团的Emmax可以为约400nm、401nm、402nm、403nm、404nm、405nm、406nm、407nm、408nm、409nm、410nm、411nm、412nm、413nm、414nm、415nm、416nm、417nm、418nm、419nm、420nm、421nm、422nm、423nm、424nm、425nm、426nm、427nm、428nm、429nm、430nm、431nm、432nm、433nm、434nm、435nm、436nm、437nm、438nm、439nm、440nm、441nm、442nm、443nm、444nm、445nm、446nm、447nm、448nm、449nm、450nm、451nm、452nm、453nm、454nm、455nm、456nm、457nm、458nm、459nm、460nm、461nm、462nm、463nm、464nm、465nm、466nm、467nm、468nm、469nm、470nm、471nm、472nm、473nm、474nm、475nm、476nm、477nm、478nm、479nm、480nm、481nm、482nm、483nm、484nm、485nm、486nm、487nm、488nm、489nm、490nm、491nm、492nm、493nm、494nm、495nm、496nm、497nm、498nm、499nm、500nm、501nm、502nm、503nm、504nm、505nm、506nm、507nm、508nm、509nm、510nm、511nm、512nm、513nm、514nm、515nm、516nm、517nm、518nm、519nm、520nm、521nm、522nm、523nm、524nm、525nm、526nm、527nm、528nm、529nm、530 nm、531 nm、532 nm、533 nm、534 nm、535 nm、536nm、537 nm、538 nm、539 nm、540 nm、541 nm、542 nm、543 nm、544 nm、545 nm、546 nm、547nm、548 nm、549 nm、550 nm、551 nm、552 nm、553 nm、554 nm、555 nm、556 nm、557 nm、558nm、559 nm、560 nm、561 nm、562 nm、563 nm、564 nm、565 nm、566 nm、567 nm、568 nm、569nm、570 nm、571 nm、572 nm、573 nm、574 nm、575 nm、576 nm、577 nm、578 nm、579 nm、580nm、581 nm、582 nm、583 nm、584 nm、585 nm、586 nm、587 nm、588 nm、589 nm、590 nm、591nm、592 nm、593 nm、594 nm、595 nm、596 nm、597 nm、598 nm、599 nm、600 nm、601 nm、602nm、603 nm、604 nm、605 nm、606 nm、607 nm、608 nm、609 nm、610 nm、611 nm、612 nm、613nm、614 nm、615 nm、616 nm、617 nm、618 nm、619 nm、620 nm、621 nm、622 nm、623 nm、624nm、625 nm、626 nm、627 nm、628 nm、629 nm、630 nm、631 nm、632 nm、633 nm、634 nm、635nm、636 nm、637 nm、638 nm、639 nm、640 nm、641 nm、642 nm、643 nm、644 nm、645 nm、646nm、647 nm、648 nm、649 nm、650 nm、651 nm、652 nm、653 nm、654 nm、655 nm、656 nm、657nm、658 nm、659 nm、660 nm、661 nm、662 nm、663 nm、664 nm、665 nm、666 nm、667 nm、668nm、669 nm、670 nm、671 nm、672 nm、673 nm、674 nm、675 nm、676 nm、677 nm、678 nm、679nm、680 nm、681 nm、682 nm、683 nm、684 nm、685 nm、686 nm、687 nm、688 nm、689 nm、690nm、691 nm、692 nm、693 nm、694 nm、695 nm、696 nm、697 nm、698 nm、699 nm、700 nm、701nm、702 nm、703 nm、704 nm、705 nm、706 nm、707 nm、708 nm、709 nm、710 nm、711 nm、712nm、713 nm、714 nm、715 nm、716 nm、717 nm、718 nm、719 nm、720 nm、721 nm、722 nm、723nm、724 nm、725 nm、726 nm、727 nm、728 nm、729 nm、730 nm、731 nm、732 nm、733 nm、734nm、735 nm、736 nm、737 nm、738 nm、739 nm、740 nm、741 nm、742 nm、743 nm、744 nm、745nm、746 nm、747 nm、748 nm、749 nm、750 nm、751 nm、752 nm、753 nm、754 nm、755 nm、756nm、757 nm、758 nm、759 nm、760 nm、761 nm、762nm、763nm、764nm、765nm、766nm、767nm、768nm、769nm、770nm、771nm、772nm、773nm、774nm、775nm、776nm、777nm、778nm、779nm、780nm、781nm、782nm、783nm、784nm、785nm、786nm、787nm、788nm、789nm、790nm、791nm、792nm、793nm、794nm、795nm、796nm、797nm、798nm、799nm或800nm。在一些情况下，受体荧光团的Emmax可为421nm、448nm、510nm、519nm、520nm、578nm、602nm、612nm、650nm、660nm、667nm、668nm、678nm、695nm、711nm、719nm、785nm或786nm。
在一些情况下，受体荧光团的Emmax可为约300nm、301nm、302nm、303nm、304nm、305nm、306nm、307nm、308nm、309nm、310nm、311nm、312nm、313nm、314nm、315nm、316nm、317nm、318nm、319nm、320nm、321nm、322nm、323nm、324nm、325nm、326nm、327nm、328nm、329nm、330nm、331nm、332nm、333nm、334nm、335nm、336nm、337nm、338nm、339nm、340nm、341nm、342nm、343nm、344nm、345nm、346nm、347nm、348nm、349nm、350nm、351nm、352nm、353nm、354nm、355nm、356nm、357nm、358nm、359nm、360nm、361nm、362nm、363nm、364nm、365nm、366nm、367nm、368nm、369nm、370nm、371nm、372nm、373nm、374nm、375nm、376nm、377nm、378nm、379nm、380nm、381nm、382nm、383nm、384nm、385nm、386nm、387nm、388nm、389nm、390nm、391nm、392nm、393nm、394nm、395nm、396nm、397nm、398nm、399nm、400nm、401nm、402nm、403nm、404nm、405nm、406nm、407nm、408nm、409nm、410nm、411nm、412nm、413nm、414nm、415nm、416nm、417nm、418nm、419nm、420nm、421nm、422nm、423nm、424nm、425nm、426nm、427nm、428nm、429nm、430nm、431nm、432nm、433nm、434nm、435nm、436nm、437nm、438nm、439nm、440nm、441nm、442nm、443nm、444nm、445nm、446nm、447nm、448nm、449nm、450nm、451nm、452nm、453nm、454nm、455nm、456nm、457nm、458nm、459nm、460nm、461nm、462nm、463 nm、464 nm、465 nm、466 nm、467 nm、468 nm、469 nm、470nm、471 nm、472nm、473 nm、474 nm、475 nm、476 nm、477 nm、478nm、479 nm、480 nm、481 nm、482 nm、483nm、484 nm、485 nm、486nm、487 nm、488 nm、489 nm、490 nm、491 nm、492 nm、493 nm、494nm、495 nm、496 nm、497 nm、498 nm、499 nm、500 nm、501 nm、502nm、503 nm、504 nm、505 nm、506 nm、507 nm、508 nm、509 nm、510nm、511 nm、512 nm、513 nm、514 nm、515 nm、516 nm、517 nm、518nm、519 nm、520 nm、521 nm、522 nm、523 nm、524 nm、525 nm、526nm、527 nm、528 nm、529 nm、530 nm、531 nm、532 nm、533 nm、534nm、535 nm、536 nm、537 nm、538 nm、539 nm、540 nm、541 nm、542nm、543 nm、544 nm、545 nm、546 nm、547 nm、548 nm、549 nm、550nm、551 nm、552 nm、553 nm、554 nm、555 nm、556 nm、557 nm、558nm、559 nm、560 nm、561 nm、562 nm、563 nm、564 nm、565 nm、566nm、567 nm、568 nm、569 nm、570 nm、571 nm、572 nm、573 nm、574nm、575 nm、576 nm、577 nm、578 nm、579 nm、580 nm、581 nm、582nm、583 nm、584 nm、585 nm、586 nm、587 nm、588 nm、589 nm、590nm、591 nm、592 nm、593 nm、594 nm、595 nm、596 nm、597 nm、598nm、599 nm、600 nm、601 nm、602 nm、603 nm、604 nm、605 nm、606nm、607 nm、608 nm、609 nm、610 nm、611 nm、612 nm、613 nm、614nm、615 nm、616 nm、617 nm、618 nm、619 nm、620 nm、621 nm、622nm、623 nm、624 nm、625 nm、626 nm、627 nm、628 nm、629 nm、630nm、631 nm、632 nm、633 nm、634 nm、635 nm、636 nm、637 nm、638nm、639 nm、640 nm、641 nm、642 nm、643 nm、644 nm、645 nm、646nm、647 nm、648 nm、649 nm、650 nm、651 nm、652 nm、653 nm、654nm、655 nm、656 nm、657 nm、658 nm、659 nm、660 nm、661 nm、662nm、663 nm、664 nm、665 nm、666 nm、667 nm、668 nm、669 nm、670nm、671 nm、672 nm、673 nm、674 nm、675 nm、676 nm、677 nm、678nm、679 nm、680 nm、681 nm、682 nm、683 nm、684 nm、685 nm、686nm、687 nm、688 nm、689 nm、690 nm、691 nm、692 nm、693 nm、694nm、695nm、696nm、697nm、698nm、699nm、700nm、701nm、702nm、703nm、704nm、705nm、706nm、707nm、708nm、709nm、710nm、711nm、712nm、713nm、714nm、715nm、716nm、717nm、718nm、719nm、720nm、721nm、722nm、723nm、724nm、725nm、726nm、727nm、728nm、729nm、730nm、731nm、732nm、733nm、734nm、735nm、736nm、737nm、738nm、739nm、740nm、741nm、742nm、743nm、744nm、745nm、746nm、747nm、748nm、749nm、750nm、751nm、752nm、753nm、754nm、755nm、756nm、757nm、758nm、759nm、760nm、761nm、762nm、763nm、764nm、765nm、766nm、767nm、768nm、769nm、770nm、771nm、772nm、773nm、774nm、775nm、776nm、777nm、778nm、779nm、780nm、781nm、782nm、783nm、784nm、785nm、786nm、787nm、788nm、789nm、790nm、791nm、792nm、793nm、794nm、795nm、796nm、797nm、798nm、799nm或800nm。
串联标记试剂的其他实例包括例如美国专利号8,927,212、9,616,141和10,641,777中描述的那些，其各自通过引用而整体并入本文用于所有目的。
在一些情况下，供体串联标记试剂和受体串联标记试剂可以在串联标记中缀合或连接。在其他情况下，供体荧光团和受体荧光团可以在串联标记中缀合或连接。在一些情况下，缀合或连接可包括共价相互作用。这样的缀合或连接还可以包括接头。接头可包括本文及其所述的任何接头或衍生物。在一些情况下，接头可以包括hyp10或hyp20接头。连接和缀合可以通过hyp10或hyp20接头中的羟脯氨酸部分之一而发生。在一些情况下，接头(例如hyp10或hyp20接头)可以允许FRET在串联标记中在供体荧光团和受体荧光团之间发生。在其他情况下，接头(例如，hyp10或hyp20接头)可促进FRET在串联标记中在供体荧光团和受体荧光团之间发生。
在一些情况下，本文所述的底物可以通过接头而连接或缀合到供体串联标记试剂。在一些情况下，本文所述的底物可以通过接头而连接或缀合到受体串联标记试剂。接头可包括本文及其所述的任何接头或衍生物。在一些情况下，接头可以包括hyp10或hyp20接头。在一些情况下，本文所述的底物可以通过接头(例如，hyp10或hyp20接头)而连接或缀合到供体串联标记试剂和受体标记试剂。在其他情况下，本文所述的底物可以在没有接头的情况下连接或缀合到供体串联标记试剂。在一些情况下，本文所述的底物可以在没有接头的情况下连接或缀合到受体串联标记试剂。例如，供体串联标记试剂或受体串联标记试剂可以包括底物作为单一化学实体。
在一些情况下，供体-受体荧光团对可包括本文所述的供体荧光团，其与本文所述的任何受体荧光团缀合或连接。在一些情况下，供体-受体荧光团对可包括π-共轭聚合物(例如，Brilliant Violet)作为供体荧光团。在一些情况下，包括π-共轭聚合物作为供体荧光团的供体-受体荧光团对可能在404nm、405nm、407nm或415nm下具有Exmax。在一些情况下，包括π-共轭聚合物作为供体荧光团的供体-受体荧光团对可以被紫色激光激发。在一些情况下，包括π-共轭聚合物作为供体荧光团的供体-受体荧光团对可以在421nm、448nm、510nm、570nm、602nm、603nm、646nm、650nm、711nm、750nm、785nm或786nm下具有Emmax。在其他情况下，包括π-共轭聚合物作为供体荧光团的供体-受体荧光团对的Emmax可以通过使用(Chattopadhyay等人，Cytometry A.2012Jun；81(6):456-66，其全部内容通过引用并入本文中)所述的方法而被修改为本文所述的任何波长。在一些情况下，供体-受体荧光团对可包括APC作为供体荧光团。在一些情况下，包括APC作为供体荧光团的供体-受体荧光团对可以在650nm或696nm下具有Exmax。在一些情况下，包括APC作为供体荧光团的供体-受体荧光团对可以被红色激光激发。在一些情况下，包括APC作为供体的供体-受体荧光团对可包括Cy-7、Atto-633染料、Alexa Fluor 647染料、Alexa Fluor 700染料或本文中的衍生物作为受体荧光团。在一些情况下，包括APC作为供体荧光团的供体-受体荧光团对可能在660nm、668nm、669nm、719nm、785nm、787nm或807nm下具有Emmax。在一些情况下，供体-受体荧光团对可包括PE作为供体荧光团。在一些情况下，包括PE作为供体荧光团的供体-受体荧光团对可以在496nm或565nm下具有Exmax。在一些情况下，包括PE作为供体荧光团的供体-受体荧光团对可由蓝色激光或黄绿色激光激发。在一些情况下，包括PE作为供体的供体-受体荧光团对可包括R-PE、CF-594染料、Cy-5、Cy-5.5、Cy-7、Atto-633染料、Alexa Fluor 647染料或本文中的衍生物作为受体荧光团。在一些情况下，包括PE作为供体荧光团的供体-受体荧光团对可能在610nm、660nm、668nm、669nm、719nm、785nm、787nm或807nm下具有Emmax。在一些情况下，供体-受体荧光团对可以包括本文所述的供体的任何最大激发波长。在其他情况下，供体-受体荧光团对可包括本文所述的受体荧光团的任何最大发射波长。在一些情况下，可以使用本文所述的染料或荧光染料来产生或修改受体荧光团的不同最大发射波长。
在一些情况下，供体荧光团的发射光谱和受体荧光团的发射光谱可以重叠或可以不重叠。在一些情况下，供体荧光团和受体荧光团的发射光谱的重叠可能是1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％。在一些情况下，供体荧光团和受体荧光团的发射光谱可能重叠约1至10％、5至15％、10至20％、15至25％、20至30％、25至35％、30至40％、35至45％、40至50％、45至55％、50至60％、55至65％、60至70％、65至75％、70至80％、75至85％、80至90％、85至95％、或90至100％。在一些情况下，供体荧光团和受体荧光团的发射光谱的重叠可能不重叠。在一些情况下，受体荧光团在串联标记中与供体荧光团配对时，可能会改变光激发和发射的关系。例如，当未配对时，供体荧光团可以用波长Dex的光激发并发射波长Dem的光，而受体荧光团可以使用波长Aex的光激发并发射波长Aem的光。当在串联标记中配对时，供体-受体荧光团对可以用波长Dex的光激发，并发射波长Aem的光。Dem和Aem之间的重叠可以包括本文所述的任何百分比。
在一些情况下，供体-受体荧光团对中供体荧光团和受体荧光团之间的FRET可改变供体荧光团与受体荧光团的斯托克斯位移。在一些情况下，供体-受体荧光团对中供体荧光团和受体荧光团之间的FRET可增加供体荧光团与受体荧光团的斯托克斯位移。斯托克斯位移是分子被光激发和发射光的波长差。在一些情况下，斯托克斯位移是荧光团的Exmax和Emmax的差。例如，供体荧光团可以分别在Dex和Dem处具有Exmax和Emmax，其中Dem>Dex。受体荧光团可以分别在Aex和Aem处具有Exmax和Emmax，其中Aem>Aex。供体荧光团和受体荧光团的斯托克斯位移可以分别为Dex-Dem和Aex-Aem，其中Aex>Dex且Aem>Dem。当供体荧光团和受体荧光团组合而形成供体-受体荧光团从而使用FRET来转移能量时，供体-受体荧光团的斯托克斯位移可能变为Aex-Dem。在一些情况下，供体-受体荧光团的斯托克斯位移可比单独的供体荧光团或受体荧光团的斯托克斯位移大约10nm、20nm、30nm、40nm、50nm、60nm、70nm、80nm、90nm、100nm、110nm、120nm、130nm、140nm、150nm、160nm、170nm、180nm、190nm、200nm、210nm、220nm、230nm、240nm、250nm、260nm、270nm、280nm、290nm、300nm、310nm、320nm、330nm、340nm、350nm、360nm、370nm、380nm、390nm、400nm、410nm、420nm、430nm、440nm、450nm、460nm、470nm、480nm、490nm、500nm、510nm、520nm、530nm、540nm、550nm、560nm、570nm、580nm、590nm、600nm、610nm、620nm、630nm、640nm、650nm、660nm、670nm、680nm、690nm、700nm、710nm、720nm、730nm、740nm或750nm。在一些情况下，供体-受体荧光团的斯托克斯位移可比单独的供体荧光团或受体荧光团的斯托克斯位移大1至20nm、10至30nm、20至40nm、30至50nm、40至60nm、50至70nm、60至80nm、70至90nm、80至100nm、90至110nm、100至120nm、110至130nm、120至140nm、130至150nm、140至160nm、150至170nm、160至180nm、170至190nm、180至200nm、190至210nm、200至220nm、210至230nm、220至240nm、230至250nm、240至260nm、250至270nm、260至280nm、270至290nm、280至300nm、290至310nm、300至320nm、310至330nm、320至340nm、330至350nm、340至360nm、350至370nm、360至380nm、370至390nm、380至400nm、390至410nm、400至420nm、410至430nm、420至440nm、430至450nm、440至460nm、450至470nm、460至480nm、470至490nm、480至500nm、490至510nm、500至520nm、510至530nm、520至540nm、530至550nm、540至560nm、550至570nm、560至580nm、570至590nm、580至600nm、590至610nm、600至620nm、610至630nm、620至640nm、630至650nm、640至660nm、650至670nm、660至680nm、670至690nm、680至700nm、690至710nm、700至720nm、710至730nm、720至740nm、或730至750nm。
在一些情况下，供体荧光团的发射光谱和受体荧光团的发射光谱可能基本相同(例如，供体荧光团和受体荧光团的发射光谱可能重叠至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)。在一些情况下，受体荧光团在串联标记中与供体荧光团配对时，可以保持光激发和发射的关系，如同供体荧光团和受体荧光团未配对时一样。例如，当未配对时，供体荧光团可以用波长Dex的光激发并发射波长Dem的光，而受体荧光团可以使用波长Dex的光激发并发射波长Dem的光。当在串联标记中配对时，供体-受体荧光团对可以用波长Dex的光激发，并发射波长Dem的光。在一些情况下，供体-受体荧光团对可能相比于未配对的供体荧光团或受体荧光团具有增高的荧光强度。
图30示出了在串联标记中供体-受体荧光团对的激发光谱、发射光谱和荧光强度之间的关系的示例。供体荧光团和受体荧光团可以在405nm处具有Exmax。一旦被激发，供体荧光团可以在580nm以高荧光强度发射Emmax的光，且受体荧光团可以以低荧光强度在650nm下发射Emmax的光。在使用相同供体荧光团和受体荧光团的供体-受体荧光团对中，该对在405nm下仍可能具有Exmax。一旦被激发，该对可以在650nm以高荧光强度发射Emmax的光。
在一些情况下，单独的供体荧光团或受体荧光团可以在与串联标记中供体-受体荧光团对相同的波长下发射光。在一些情况下，在串联配对中供体-受体荧光团对每次发射的光子可能比未配对的供体或受体发射的光子更多。在一些情况下，在串联配对中供体-受体荧光团对可以比未配对的供体或受体发射约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、200％、300％、400％、500％、600％、700％、800％900％、1000％、2000％、3000％、4000％、5000％、6000％、7000％、8000％、9000％或10000％更多的光子。在一些情况下，在串联配对中供体-受体荧光团对可以比未配对的供体或受体发射约10至100％、50至200％、100至300％、150至400％、200至500％、250至600％、300至700％、350至800％、400至900％、450至1000％、500至2000％、1500至3000％、2500至4000％、3500至5000％、4500至6000％、5500至7000％、6500至8000％、7500至9000％、或8500至10000％更多的光子。
在一些情况下，在串联标记中供体-受体荧光团对可以比未配对的供体或受体提供10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、200％、300％、400％、500％、600％、700％、800％900％、1000％、2000％、3000％、4000％、5000％、6000％、7000％、8000％、9000％或10000％更高的灵敏度以检测荧光强度。在一些情况下，在串联配对中供体-受体荧光团对可以比未配对的供体或受体提供约10至100％、50至200％、100至300％、150至400％、200至500％、250至600％、300至700％、350至800％、400至900％、450至1000％、500至2000％、1500至3000％、2500至4000％、3500至5000％、4500至6000％、5500至7000％、6500至8000％、7500至9000％、或8500至10000％更高的灵敏度以检测荧光强度。
在一些情况下，串联标记可以包括用激光激发供体-受体荧光团对中的供体荧光团。在一些情况下，激光可以包括紫外激光(355nm)、紫色激光(405nm)、蓝色激光(488nm)、绿色激光(532nm)、黄绿色激光(561nm)或红色激光(633nm)。在一些情况下，串联标记可以允许使用一个激光使1个供体-受体荧光团对发射。在其他情况下，串联标记可以允许使用一个激光使2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50或更多个不同的供体-受体荧光团对发射。在一些情况下，第一供体-受体荧光团对可以区别于第二供体-受体荧光团对。为了可区分，第一供体-受体荧光团对和第二供体-受体荧光团对可以包括两种不同的Emmax。在一些情况下，第一供体-受体荧光团对和第二供体-受体荧光团对可以通过所述对的两个非重叠发射光谱来区分。在其他情况下，第一供体-受体荧光团对和第二供体-受体荧光团对可包括重叠的发射光谱，但可通过其各自的发射光谱的非重叠区域来区分。在一些情况下，每个供体-受体荧光团对可包括独特的Emmax。在一些情况下，串联标记可以允许使用一个激光来使1至10、5至15、10至20、15至25、20至30、25至35、30至40、35至45、40至50个不同的供体-受体荧光团对发射。在一些情况下，可以单独记录由一个激光激发的不同供体-受体荧光团对的发射。在一些情况下，可以同时记录由一个激光激发的不同供体-受体荧光团对的发射。
在一些情况下，每个供体-受体荧光团对可以与一个分子缀合。在一些情况下，这种与具有独特Emmax或发射光谱的供体-受体荧光团对缀合的分子可以与独特的细胞分子或独特的细胞分子组结合。在一些情况下，与具有独特Emmax或发射光谱的供体-受体荧光团对缀合的分子可包括肽、核酸或化学化合物。在一些情况下，肽、核酸或化学化合物可以与核苷酸、核苷酸序列、氨基酸、肽、碳水化合物或脂质结合。在一些情况下，缀合或连接可以包括共价或非共价相互作用。这种缀合或连接还可以包括接头。接头可包括本文所述的任何接头或其衍生物。在一些情况下，接头可以包括hyp10或hyp20接头。连接和缀合可以通过hyp10或hyp10接头中的羟脯氨酸部分之一而发生。在一些情况下，与标记试剂缀合或连接的分子可包括核苷酸、氨基酸、脂质、碳水化合物、本文及其任何衍生物以及本文及其任何组合。例如，荧光染料可与本文所述的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸缀合。在其他情况下，除了供体-受体荧光团对之外的串联标记试剂，例如发色团，可以与另一分子缀合或连接。
在一些情况下，与供体-受体荧光团对缀合的肽可包括抗体。在一些情况下，与供体-受体荧光团对缀合的抗体可包括IgA、IgD、IgE、IgG、IgM、本文及其任何衍生物或本文及其任何组合。在一些情况下，与供体-受体荧光团对缀合的抗体可包括鼠的、人的、嵌合的或人源化的抗体。在其他情况下，与供体-受体荧光团对缀合的抗体可包括多克隆或单克隆抗体。在一些情况下，与供体-受体荧光团对缀合的抗体可包括来自鸡、山羊、豚鼠、仓鼠、马、小鼠、大鼠、绵羊、猴、黑猩猩、人类、骆驼、鲨鱼、兔、羊驼、美洲驼或其任何组合的抗体。在一些情况下，与供体-受体荧光团对缀合的抗体可包括完整的抗体或抗体片段。在一些情况下，与供体-受体荧光团对缀合的抗体可包括IgA1、IgA2、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、本文及其任何衍生物或本文及其任何组合。在一些情况下，与供体-受体荧光团对缀合的抗体可包括双特异性抗体、单克隆抗体、单链可变片段(scFv)、单链抗原结合片段(scFab)、双可变结构域Ig(DVD-Ig)、scFv-IgG融合、scFv-Fc(恒定区)、重链抗体(HcAb)、新抗原受体抗体(IgNAR)、结构域抗体(dAb)、单-dAb(sdAb)、双抗体、胞内抗体(intrabody)、trioMab、F(ab)2双特异性抗体、F(ab)3三特异性抗体，BiTE抗体、DART抗体、tand抗体、微抗体、Bis-scFv、三抗体、四抗体、骆驼Ig、鲨鱼Ig、本文及其片段、本文及其衍生物、或本文及其任何组合。在一些情况下，与供体-受体荧光团对缀合的化学化合物也可以包括本文所述的任何染料或荧光染料。
图31示出了用于串联标记的示例性标记试剂3101。标记试剂3101包括使用接头3105而与供体荧光染料3103和受体荧光染料3104缀合的底物3102(例如，抗体)。例如，底物3102可以结合抗原。接头3105可以是hyp10或hyp20接头。3103和3104相隔距离3106。3106可以是1至10nm，以使得FRET可以发生在3103和3104之间。
在一些情况下，与多个供体-受体荧光团对缀合的多个分子，每对具有独特的Emmax或发射光谱并与独特的细胞分子或独特的细胞分子组结合，可以促进使用一个激光、一个Exmax或一个激发光谱来分析独特的细胞分子或独特的细胞分子组。在其他情况下，这种测定可以包括使用一个激光、一个Exmax或一个激发光谱同时或顺序地记录多个供体-受体荧光团对的荧光强度。例如，可以将多种抗体与细胞一起孵育，每种抗体与具有独特的Emmax或发射光谱的供体-受体荧光团对缀合并且能够结合特异性抗原。孵育可能允许抗体-供体-受体荧光团对与其各自的抗原结合。孵育后可彻底洗涤细胞。这样的洗涤步骤可以去除任何未结合的抗体-供体-受体荧光团对。然后可以使用激光对细胞成像，该激光可以激发抗体-供体-受体荧光团对的荧光强度。荧光强度的存在可以指示细胞中特定抗原的存在。在其他情况下，也可以使用本文及其所述的其他荧光强度方法。
在一些情况下，在串联标记中具有本文所述的接头(例如，hyp10或hyp20接头)的供体-受体荧光团对可用于细胞术。在一些情况下，串联标记可允许使用至少相等数量的供体-受体荧光团对用1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50或更多种不同的标志物来标记细胞。在一些情况下，可以使用一个发射激光来使多于一种或所有标志物可见或可测量。这种可见性或可测量性可源自供体-受体荧光团对的发射。在其他情况下，发射激光的数量可以少于供体-受体荧光团对的数量。在一些情况下，发射激光的数量可以少于供体-受体荧光团对的特有的发射光谱的数量。在一些情况下，一个发射激光可以激发串联标记中每个供体-受体荧光团对的发射。在一些情况下，两个发射激光可以激发串联标记中每个供体-受体荧光团对的发射。在一些情况下，三个发射激光可以激发串联标记中每个供体-受体荧光团对的发射。在一些情况下，四个发射激光可以激发串联标记中每个供体-受体荧光团对的发射。在一些情况下，五个发射激光可以激发串联标记中每个供体-受体荧光团对的发射。在一些情况下，六个发射激光可以激发串联标记中每个供体-受体荧光团对的发射。
图32示出了用于使用一个发射激光标记多种分子的多种标记试剂。标记试剂3201a、3201b、3201c和3201d用于标记不同的靶分子。3201A包含底物3202a，3201b包含底物3202b，3201c包含底物3202c，且3201d包含底物3202d。3202a、3202b、3202c和3202d中的每一个都与不同的靶分子结合。3202a、3202b、3202c和3202d中的每一个通过接头3205而分别连接到供体荧光团3203和受体荧光团3204a、3204b、3204c和3204d。3205可以是hyp10或hyp20接头或本文所述的其他接头。3204a、3204b、3204c和3204d中的每一个都具有不同的Emmax。3203可以通过FRET而将其激发能量转移到3204a、3204b、3204c或3204c。一旦3201a、3201b、3201c或3201d分别通过3202a、3202b、3202c或3202c而与它们各自的靶分子结合，就可以使用一个激光来激发3203，从而将激发能量通过FRET而转移到3204a、32024、3204c和3204d。然后，转移的能量允许3204a、3204b、3204c和3204d在它们各自的Emmax处发射光。因此，一个激光足以标记多种靶分子。
在一些情况下，具有本文所述的接头的供体-受体荧光团对可能比不具有接头的供体-受体荧光团对更耐降解或更稳定。在一些情况下，具有本文所述的hyp10或hyp20接头的供体-受体荧光团对可能比不具有接头的供体-受体荧光团对更耐降解或更稳定。在一些情况下，具有hyp10或hyp20接头的供体-受体荧光团对与不具有接头的供体-受体荧光团对相比可能约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、200％、300％、400％、500％、600％、700％、800％900％、1000％、2000％、3000％、4000％、5000％、6000％、7000％、8000％、9000％、或10000％更耐降解或更稳定。在一些情况下，具有hyp10或hyp20接头的供体-受体荧光团对与不具有接头的供体-受体荧光团对相比可能10至100％、50至200％、100至300％、150至400％、200至500％、250至600％、300至700％、350至800％、400至900％、450至1000％、500至2000％、1500至3000％、2500至4000％、3500至5000％、4500至6000％、5500至7000％、6500至8000％、7500至9000％、或8500至10000％更耐降解或更稳定。
在一些情况下，具有本文所述的接头的供体-受体荧光团对可以与不具有接头的供体-受体荧光团对相比具有更高的亮度。在一些情况下，具有本文所述的hyp10或hyp20接头的供体-受体荧光团对可以与不具有接头的供体-受体荧光团对相比具有更高的亮度。在一些情况下，具有hyp10或hyp20接头的供体-受体荧光团对与不具有接头的供体-受体荧光团对相比可能具有约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、200％、300％、400％、500％、600％、700％、800％900％、1000％、2000％、3000％、4000％、5000％、6000％、7000％、8000％、9000％或10000％更高的亮度。在一些情况下，具有hyp10或hyp20接头的供体-受体荧光团对与没有接头的供体-受体荧光团对相比可能具有10至100％、50至200％、100至300％、150至400％、200至500％、250至600％、300至700％、350至800％、400至900％、450至1000％、500至2000％、1500至3000％、2500至4000％、3500至5000％、4500至6000％、5500至7000％、6500至8000％、7500至9000％、或8500至10000％更高的亮度。
在一些情况下，荧光团的亮度可以通过功率或辐射通量来测量。在一些情况下，荧光团的亮度也可以通过荧光团的摩尔消光系数和量子产率来测量。在一些情况下，摩尔消光系数(ε)被定义为在给定波长下可以被荧光团吸收的光子数，以M-1cm-1测量。量子产率(Φ)计算为荧光团发射的光子数除以被吸收以达到荧光团效率的光子数。荧光团的亮度是ε和Φ的乘积。
在一些情况下，具有本文所述的接头(例如，hyp10或hyp20接头)的供体-受体荧光团对的摩尔消光系数(ε)可为约1x10^4M-1cm-1、2x10^4M-1cm-1、3x10^4M-1cm-1、4x10^4M-1cm-1、5x10^4M-1cm-1、6x10^4M-1cm-1、7x10^4M-1cm-1、8x10^4M-1cm-1、9x10^4M-1cm-1、1x10^5M-1cm-1、2x10^5M-1cm-1、3x10^5M-1cm-1、4x10^5M-1cm-1、5x10^5M-1cm-1、6x10^5M-1cm-1、7x10^5M-1cm-1、8x10^5M-1cm-1、9x10^5M-1cm-1、1x10^6M-1cm-1、2x10^6M-1cm-1、3x10^6M-1cm-1、4x10^6M-1cm-1、5x10^6M-1cm-1、6x10^6M-1cm-1、7x10^6M-1cm-1、8x10^6M-1cm-1、或9x10^6M-1cm-1。在一些情况下，具有本文所述的接头(例如，hyp10或hyp20接头)的供体-受体荧光团对的摩尔消光系数(ε)可为1x10^4至2x10^4M-1cm-1、1.5x10^4至2.5x10^4M-1cm-1、2x10^4至3x10^4M-1cm-1、2.5x10^4至3.5x10^4M-1cm-1、3x10^4至4x10^4M-1cm-1、3.5x10^4至4.5x10^4M-1cm-1、4x10^4至5x10^4M-1cm-1、4.5x10^4至5.5x10^4M-1cm-1、5x10^4至6x10^4M-1cm-1、5.5x10^4至6.5x10^4M-1cm-1、6x10^4至7x10^4M-1cm-1、6.5x10^4至7.5x10^4M-1cm-1、7x10^4至8x10^4M-1cm-1、7.5x10^4至8.5x10^4M-1cm-1、8x10^4至9x10^4M-1cm-1、8.5x10^4至9.5x10^4M-1cm-1、9x10^4至1x10^5M-1cm-1、9.5x10^4至1.5x10^5M-1cm-1、1x10^5至2x10^5M-1cm-1、1.5x10^5至2.5x10^5M-1cm-1、2x10^5至3x10^5M-1cm-1、2.5x10^5至3.5x10^5M-1cm-1、3x10^5至4x10^5M-1cm-1、3.5x10^5至4.5x10^5M-1cm-1、4x10^5至5x10^5M-1cm-1、4.5x10^5至5.5x10^5M-1cm-1、5x10^5至6x10^5M-1cm-1、5.5x10^5至6.5x10^5M-1cm-1、6x10^5至7x10^5M-1cm-1、6.5x10^5至7.5x10^5M-1cm-1、7x10^5至8x10^5M-1cm-1、7.5x10^5至8.5x10^5M-1cm-1、8x10^5至9x10^5M-1cm-1、8.5x10^5至9.5x10^5M-1cm-1、9x10^5至1x10^6M-1cm-1、9.5x10^5至1.5x10^6M-1cm-1、1x10^6至2x10^6M-1cm-1、1.5x10^6至2.5x10^6M-1cm-1、2x10^6至3x10^6M-1cm-1、2.5x10^6至3.5x10^6M-1cm-1、3x10^6至4x10^6M-1cm-1、3.5x10^6至4.5x10^6M-1cm-1、4x10^6至5x10^6M-1cm-1、4.5x10^6至5.5x10^6M-1cm-1、5x10^6至6x10^6M-1cm-1、5.5x10^6至6.5x10^6M-1cm-1、6x10^6至7x10^6M-1cm-1、6.5x10^6至7.5x10^6M-1cm-1、7x10^6至8x10^6M-1cm-1、7.5x10^6至8.5x10^6M-1cm-1、或8x10^6至9x10^6M-1cm-1。
在一些情况下，具有本文所述的接头(例如，hyp10或hyp20接头)的供体-受体荧光团对的量子产率(Φ)可以为至少约0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.1、0.11、0.12、0.13、0.14、0.15、0.16、0.17、0.18、0.19、0.2、0.21、0.22、0.23、0.24、0.25、0.26、0.27、0.28、0.29、0.3、0.31、0.32、0.33、0.34、0.35、0.36、0.37、0.38、0.39、0.4、0.41、0.42、0.43、0.44、0.45、0.46、0.47、0.48、0.49、0.5、0.51、0.52、0.53、0.54、0.55、0.56、0.57、0.58、0.59、0.6、0.61、0.62、0.63、0.64、0.65、0.66、0.67、0.68、0.69、0.7、0.71、0.72、0.73、0.74、0.75、0.76、0.77、0.78、0.79、0.8、0.81、0.82、0.83、0.84、0.85、0.86、0.87、0.88、0.89、0.9、0.91、0.92、0.93、0.94、0.95、0.96、0.97、0.98、0.99、1或更大。在一些情况下，具有本文所述的接头(例如，hyp10或hyp20接头)的供体-受体荧光团对的量子产率(Φ)可以为0.01至0.02、0.015至0.025、0.02至0.03、0.025至0.035、0.03至0.04、0.035至0.045、0.04至0.05、0.045至0.055、0.05至0.06、0.055至0.065、0.06至0.07、0.065至0.075、0.07至0.08、0.075至0.085、0.08至0.09、0.085至0.095、0.09至0.1、0.095至0.105、0.1至0.11、0.105至0.115、0.11至0.12、0.115至0.125、0.12至0.13、0.125至0.135、0.13至0.14、0.135至0.145、0.14至0.15、0.145至0.155、0.15至0.16、0.155至0.165、0.16至0.17、0.165至0.175、0.17至0.18、0.175至0.185、0.18至0.19、0.185至0.195、0.19至0.2、0.195至0.205、0.2至0.21、0.205至0.215、0.21至0.22、0.215至0.225、0.22至0.23、0.225至0.235、0.23至0.24、0.235至0.245、0.24至0.25、0.245至0.255、0.25至0.26、0.255至0.265、0.26至0.27、0.265至0.275、0.27至0.28、0.275至0.285、0.28至0.29、0.285至0.295、0.29至0.3、0.295至0.305、0.3至0.31、0.305至0.315、0.31至0.32、0.315至0.325、0.32至0.33、0.325至0.335、0.33至0.34、0.335至0.345、0.34至0.35、0.345至0.355、0.35至0.36、0.355至0.365、0.36至0.37、0.365至0.375、0.37至0.38、0.375至0.385、0.38至0.39、0.385至0.395、0.39至0.4、0.395至0.405、0.4至0.41、0.405至0.415、0.41至0.42、0.415至0.425、0.42至0.43、0.425至0.435、0.43至0.44、0.435至0.445、0.44至0.45、0.445至0.455、0.45至0.46、0.455至0.465、0.46至0.47、0.465至0.475、0.47至0.48、0.475至0.485、0.48至0.49、0.485至0.495、0.49至0.5、0.495至0.505、0.5至0.51、0.505至0.515、0.51至0.52、0.515至0.525、0.52至0.53、0.525至0.535、0.53至0.54、0.535至0.545、0.54至0.55、0.545至0.555、0.55至0.56、0.555至0.565、0.56至0.57、0.565至0.575、0.57至0.58、0.575至0.585、0.58至0.59、0.585至0.595、0.59至0.6、0.595至0.605、0.6至0.61、0.605至0.615、0.61至0.62、0.615至0.625、0.62至0.63、0.625至0.635、0.63至0.64、0.635至0.645、0.64至0.65、0.645至0.655、0.65至0.66、0.655至0.665、0.66至0.67、0.665至0.675、0.67至0.68、0.675至0.685、0.68至0.69、0.685至0.695、0.69至0.7、0.695至0.705、0.7至0.71、0.705至0.715、0.71至0.72、0.715至0.725、0.72至0.73、0.725至0.735、0.73至0.74、0.735至0.745、0.74至0.75、0.745至0.755、0.75至0.76、0.755至0.765、0.76至0.77、0.765至0.775、0.77至0.78、0.775至0.785、0.78至0.79、0.785至0.795、0.79至0.8、0.795至0.805、0.8至0.81、0.805至0.815、0.81至0.82、0.815至0.825、0.82至0.83、0.825至0.835、0.83至0.84、0.835至0.845、0.84至0.85、0.845至0.855、0.85至0.86、0.855至0.865、0.86至0.87、0.865至0.875、0.87至0.88、0.875至0.885、0.88至0.89、0.885至0.895、0.89至0.9、0.895至0.905、0.9至0.91、0.905至0.915、0.91至0.92、0.915至0.925、0.92至0.93、0.925至0.935、0.93至0.94、0.935至0.945、0.94至0.95、0.945至0.955、0.95至0.96、0.955至0.965、0.96至0.97、0.965至0.975、0.97至0.98、0.975至0.985、0.98至0.99、0.985至0.995、0.99至1。
在一些情况下，具有本文所述的接头的供体-受体荧光团对与没有接头的供体-受体荧光团对相比可能对光降解或光漂白具有更大抗性。在一些情况下，具有本文所述的hyp10或hyp20接头的供体-受体荧光团对与没有接头的供体-受体荧光团对相比可能对光降解或光漂白具有更大抗性。在一些情况下，具有hyp10或hyp20接头的供体-受体荧光团对与没有接头的供体-受体荧光团对相比可能对光降解或光漂白具有约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、200％、300％、400％、500％、600％、700％、800％900％、1000％、2000％、3000％、4000％、5000％、6000％、7000％、8000％、9000％或10000％更大的抗性。在一些情况下，具有hyp10或hyp20接头的供体-受体荧光团对与没有接头的供体-受体荧光团对相比可能对光降解或光漂白具有10至100％、50至200％、100至300％、150至400％、200至500％、250至600％、300至700％、350至800％、400至900％、450至1000％、500至2000％、1500至3000％、2500至4000％、3500至5000％、4500至6000％、5500至7000％、6500至8000％、7500至9000％、或8500至10000％更大的抗性。
在一些情况下，与没有接头的供体-受体荧光团对相比，具有本文所述的接头(例如，hyp10或hyp20接头)的供体-受体荧光团对的稳定性或亮度的增加或降解、光降解或光漂白的减少可以保持，即使荧光团处于固定或透化状态。在一些情况下，与没有接头的供体-受体荧光团对相比，具有本文所述的接头(例如，hyp10或hyp20接头)的供体-受体荧光团对的稳定性或亮度的增加或降解、光降解或光漂白的减少可以保持，即使荧光团保持在约-80℃、-79℃、-78℃、-77℃、-76℃、-75℃、-74℃、-73℃、-72℃、-71℃、-70℃、-69℃、-68℃、-67℃、-66℃、-65℃、-64℃、-63℃、-62℃、-61℃、-60℃、-59℃、-58℃、-57℃、-56℃、-55℃、-54℃、-53℃、-52℃、-51℃、-50℃、-49℃、-48℃、-47℃、-46℃、-45℃、-44℃、-43℃、-42℃、-41℃、-40℃、-39℃、-38℃、-37℃、-36℃、-35℃、-34℃、-33℃、-32℃、-31℃、-30℃、-29℃、-28℃、-27℃、-26℃、-25℃、-24℃、-23℃、-22℃、-21℃、-20℃、-19℃、-18℃、-17℃、-16℃、-15℃、-14℃、-13℃、-12℃、-11℃、-10℃、-9℃、-8℃、-7℃、-6℃、-5℃、-4℃、-3℃、-2℃、-1℃、0℃、1℃、2℃、3℃、4℃、5℃、6℃、7℃、8℃、9℃、10℃、11℃、12℃、13℃、14℃、15℃、16℃、17℃、18℃、19℃、20℃、21℃、22℃、23℃、24℃、25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、37℃、38℃、39℃、40℃、41℃、42℃、43℃、44℃、45℃、46℃、47℃、48℃、49℃、或50℃下。在一些情况下，与没有接头的供体-受体荧光团对相比，具有本文所述的接头(例如，hyp10或hyp20接头)的供体-受体荧光团对的稳定性或亮度的增加或降解、光降解或光漂白的减少可以保持，即使荧光团保持在-80至-70℃、-75至-65℃、-70至-60℃、-65至-55℃、-60至-50℃、-55至-45℃、-50至-40℃、-45至-35℃、-40至-30℃、-35至-25℃、-30至-20℃、-25至-15℃、-20至-10℃、-15至-5℃、-10至0℃、-5至5℃、0至10℃、5至15℃、10至20℃、15至25℃、20至30℃、25至35℃、30至40℃、35至45℃、或40至50℃。在一些情况下，与没有接头的供体-受体荧光团对相比，具有本文所述的接头(例如，hyp10或hyp20接头)的供体-受体荧光团对的稳定性或亮度的增加或降解、光降解或光漂白的减少可以保持，即使荧光团保持在pH 0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14下。在一些情况下，与没有接头的供体-受体荧光团对相比，具有本文所述的接头(例如，hyp10或hyp20接头)的供体-受体荧光团对的稳定性或亮度的增加或降解、光降解或光漂白的减少可以保持，即使荧光团保持在1–5、2–6、3–7、4–8、5–9、6–10、7–11、8–12、9–13或10–14的pH下。
在一些情况下，通过FRET从供体荧光团转移到受体荧光的能量可以通过受体荧光的荧光强度的增加来测量。荧光强度的增加或减少可以通过计算基线荧光强度水平(例如，能量转移之前的荧光强度水平)和能量转移之后的荧光强度水平之间的差来测量。在一些情况下，通过FRET从供体荧光团转移到受体荧光的能量可以通过供体荧光的荧光强度的降低(即，供体荧光团的淬灭)来测量。在其他情况下，通过FRET从供体荧光团转移到受体荧光的能量也可以通过受体荧光的荧光强度的增加和供体荧光的荧光强度的降低来测量。在一些情况下，当测量供体荧光团中荧光强度水平的降低时，非荧光受体分子可以替代受体荧光团。使用非荧光受体分子可以促进对供体荧光团的测量。这种促进可包括缺乏受体分子的荧光干扰。
在一些情况下，供体荧光团可以使用本文所述的接头(例如，hyp10或hyp20接头)而与多于一个受体荧光团配对或缀合。在一些情况下，供体荧光团可与2、3、4、5或更多受体荧光团配对或缀合。例如，供体荧光团可与第二受体荧光团和第三荧光团配对或缀合。使用本文所述的接头(例如，hyp10或hyp20接头)的缀合可允许FRET将能量从供体荧光团转移到每个缀合的受体荧光团。在一些情况下，从供体荧光团转移到每个缀合的受体荧光团的能量可能足以引起每个缀合的受体荧光团的发射。在一些情况下，每个受体荧光团可以通过荧光发射来区分。例如，发射光谱或Exmax。在一些情况下，每个受体荧光团可能没有发射光谱的重叠。在一些情况下，每个受体荧光团可能具有发射光谱的重叠。在其他情况下，重叠可能不大于1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％或70％。重叠也可能为约1至10％、5至15％、10至20％、15至25％、20至30％、25至35％、30至40％、35至45％、40至50％、45至55％、50至60％、55至65％、或60至70％。
在一些情况下，串联标记试剂可以包括多于一个供体-受体荧光团对。在一些情况下，串联标记试剂可包括2、3、4、5、6、7、8、9或10个供体-受体荧光团对。每个供体-受体对可以与本文所述的接头(例如，hyp10或hyp20接头)连接或缀合在一起。在一些情况下，在包括多于一个供体-受体荧光团对的串联标记试剂中，每个供体-受体荧光团对的发射光谱或Emmax可能不同于其他供体-受体荧光团对的发射光谱或Emmax。在一些情况下，在包括多于一个供体-受体荧光团对的串联标记试剂中，一个供体-受体荧光团对的发射光谱或Emmax可能不同于另一个供体-受体荧光团对的发射光谱或Emmax。在一些情况下，第一串联标记试剂可以与第二串联标记试剂区分开。例如，第一串联标记试剂和第二串联标记试剂可以具有不同的发射光谱或Emmax。在其他情况下，第一串联标记试剂可以与第二串联标记试剂区分开，即使它们可能具有相同的Emmax。在一些情况下，串联标记试剂的荧光强度可能相对于供体-受体荧光团对的数量是定量的。例如，第一串联标记试剂可具有一个第一供体-受体荧光团对，且第二串联标记试剂可以具有两个第一供体-受体荧光团对。第一和第二串联标记试剂可以具有相同的Exmax，但是第二串联标记试剂的荧光强度可以两倍于第一串联标记试剂。在一些情况下，串联标记试剂可以包括本文及其所述的供体和受体荧光团的任何组合、数量或配置。
图33示出了两种示例性标记试剂。标记试剂3301包含底物3302(例如，抗体)。3302利用接头3306缀合到供体荧光团3304和受体荧光团3303和3305。3303和3304相隔距离3307。3305和3304相隔距离3308。3307允许FRET在3303和3304之间发生。3308允许FRET在3304和3305之间发生。标记试剂3311包含底物3312(例如，抗体)。3312利用接头3318缀合到供体荧光团3313/3315和受体荧光团3314/3316。3313和3314相隔距离3317a。3315和3316相隔距离3317c。3314和3315相隔距离3317b。3317a允许FRET在3313和3314之间发生。3317c允许FRET在3315和3316之间发生。3317b不允许FRET在3315和3314之间发生。3313和3315可能具有相同的Exmax和Emmax。
计算机系统
本公开提供了被编程为实现本公开的方法的计算机系统。图29示出了被编程或以其他方式配置以进行核酸测序的计算机系统2901。计算机系统2901可以至少部分地基于检测到的光学信号的强度来确定序列读段。计算机系统2901可以调节本公开的各个方面，例如进行核酸测序、序列分析，以及调节核苷酸的瞬时结合和非瞬时结合(例如，掺入)的条件。计算机系统2901可以是用户的电子设备或相对于电子设备远程定位的计算机系统。电子设备可以是移动电子设备。
计算机系统2901包括中央处理单元(CPU，本文也称为“处理器”和“计算机处理器”)2905，其可以是单核或多核处理器，或者是用于并行处理的多个处理器。计算机系统2901还包括存储器或存储器位置2910(例如，随机存取存储器、只读存储器、闪存)、电子存储单元2915(例如，硬盘)、用于与一个或更多个其他系统通信的通信接口2920(例如，网络适配器)，以及外围设备2925，例如高速缓存、其他存储器、数据存储和/或电子显示适配器。存储器2910、存储单元2915、接口2920和外围设备2925通过通信总线(实线)诸如主板而与CPU 29 29605通信。存储单元2915可以是用于存储数据的数据存储单元(或数据储存库)。计算机系统2901可以借助于通信接口2920而可操作地耦合到计算机网络(“网络”)2930。网络2930可以是因特网、互联网和/或外联网，或与因特网通信的内联网和/或外联网。在一些情况下，网络2930是电信和/或数据网络。网络2930可以包括一个或更多个计算机服务器，其可以启用分布式计算，例如云计算。网络2930在一些情况下借助于计算机系统2901可以实现对等网络，其可以使与计算机系统2901耦合的设备能够充当客户端或服务器。
CPU 2905可以执行一系列机器可读指令，其可以体现在程序或软件中。指令可以存储在存储器位置诸如存储器2910中。指令可以被引导到CPU 2905，其随后可以编程或以其他方式配置CPU 2905以实现本公开的方法。由CPU 2905执行的操作的示例可以包括获取、解码、执行和写回。
CPU 2905可以是电路诸如集成电路的部分。系统2901的一个或更多个其他组件可以被包括在电路中。在一些情况下，电路是专用集成电路(ASIC)。
存储单元2915可以存储文件，例如驱动程序、库和保存的程序。存储单元2915可以存储用户数据，例如用户偏好和用户程序。在一些情况下，计算机系统2901可以包括计算机系统2901外部的一个或更多个其他数据存储单元，例如位于通过内联网或因特网而与计算机系统2901通信的远程服务器上。
计算机系统2901可以通过网络2930而与一个或更多个远程计算机系统通信。例如，计算机系统2901可以与用户的远程计算机系统通信。远程计算机系统的实例包括个人计算机(例如，便携式PC)、触屏平板电脑或平板电脑(例如，
Figure BDA0004184559620001341
iPad、/>
Figure BDA0004184559620001342
Galaxy Tab)、电话、智能电话(例如，/>
Figure BDA0004184559620001343
iPhone，支持Android的设备，
Figure BDA0004184559620001344
)或个人数字助理。用户可以经由网络2930访问计算机系统29 29601。
可以通过存储在计算机系统2901的电子存储位置(例如在存储器2910或电子存储单元2915上)的机器(例如计算机处理器)可执行代码的方式来实现本文所述的方法。机器可执行代码或机器可读代码可以以软件的形式提供。在使用期间，代码可以由处理器2905执行。在一些情况下，代码可以从存储单元2915检索并存储在存储器2910上以供处理器2905随时访问。在一些情况下，可以排除电子存储单元2915，并且将机器可执行指令存储在存储器2910中。
代码可以被预编译并配置为与具有适配成执行所述代码的处理器的机器一起使用，或者可以在运行期间进行编译。代码可以被设置在编程语言中，所述编程语言可以被选择为使所述代码能够以预编译或已编译(as compiled)的方式执行。
本文提供的系统和方法(例如计算机系统2901)的方面可以体现在编程中。可以将技术的各个方面视为通常以机器可读介质的类型承载或体现的机器(或处理器)可执行代码和/或关联数据的形式的“产品”或“制品”。机器可执行代码可以存储在电子存储单元上，例如存储器(例如，只读存储器、随机存取存储器、闪存)或硬盘。“存储”类型的介质可以包括计算机、处理器等的任何或所有有形存储器，或其相关模块，例如各种半导体存储器、磁带驱动器、磁盘驱动器等，其可以为软件编程随时提供非暂时性存储。软件的全部或部分有时可以通过因特网或其他各种电信网络进行通信。例如，这样的通信可以使得能够将软件从一个计算机或处理器加载到另一计算机或处理器，例如从管理服务器或主机加载到应用服务器的计算机平台。因此，可以承载软件元件的另一种类型的介质包括光波、电波和电磁波，例如通过有线和光学固网网络以及通过各种空中链路在本地设备之间的物理接口上使用的。运载这种波的物理元件诸如有线或无线链路、光链路等也可以被视为承载软件的介质。如本文所用，除非限于非暂时性有形“存储”介质，否则术语诸如计算机或机器“可读介质”是指参与向处理器提供指令以供执行的任何介质。
因此，机器可读介质例如计算机可执行代码可采取多种形式，包括但不限于有形存储介质、载波介质或物理传输介质。非易失性存储介质包括例如光盘或磁盘，诸如任何计算机中的任何存储设备等，诸如可用于实现如附图中所示的数据库等。易失性存储介质包括动态存储器，诸如这样的计算机平台的主存储器。有形传输介质包括同轴缆线、铜线和光纤，包括构成计算机系统内的总线的线。载波传输介质可以采取电信号或电磁信号或者声波或光波的形式，诸如在射频(RF)和红外(IR)数据通信期间产生的那些。因此，计算机可读介质的常见形式包括例如：软盘、柔性盘、硬盘、磁带、任何其他磁性介质、CD-ROM、DVD或DVD-ROM、任何其他光学介质、穿孔卡片纸带、具有孔洞图案的任何其他物理存储介质、RAM、ROM、PROM和EPROM、FLASH-EPROM、任何其他存储器芯片或匣盒、传送数据或指令的载波、传送此类载波的电缆或链路，或者计算机可以从中读取编程代码和/或数据的任何其他介质。这些形式的计算机可读介质中的许多介质可以参与将一个或更多个指令的一个或更多个序列携载到处理器以供执行。
计算机系统2901可以包括电子显示器2935或与其通信，该电子显示器包括用户接口(UI)2940用于提供例如，核酸序列和光学信号检测的结果(例如，序列读数、强度图等)。UI的实例包括但不限于图形用户接口(GUI)和基于网络的用户接口。
本公开的方法和系统可以通过一种或更多种算法来实现。算法可以在中央处理单元2905执行时通过软件来实现。该算法可以例如，实施本公开的方法和系统，例如至少部分地基于检测的光学信号的强度来确定序列读数。
实施例
实施例1：一般合成原理
以下实施例的某些实施例说明了制备本文所述的接头和标记的底物的各种方法。应当理解，本领域技术人员能够通过类似方法或通过结合本领域技术人员已知的其他方法来制备这些化合物。还应理解，本领域技术人员将能够通过使用合适的起始材料并根据需要修改合成路线以如下所述的类似方式制备其他化合物。通常，起始材料和试剂可从商业供应商获得或根据本领域技术人员已知的来源合成或如本文所述制备。
除非另有说明，本文所述的合成方法中使用的试剂和溶剂均从商业供应商获得。无水溶剂和烘箱干燥的玻璃器皿可用于对水分和/或氧气敏感的合成转化。产量可能未优化。反应时间可能是近似的并且可能未优化。合成过程中使用的材料和仪器可以用适当的替代品代替。除非另有说明，柱色谱和薄层色谱(TLC)可以在反相硅胶上进行。可以获得核磁共振(NMR)和质谱来表征反应产物和/或监测反应进程。
实施例2：dGTP-AP-SS-hyp10-Atto633的合成
本文描述了一种用于构建标记的核苷酸dGTP-AP-SS-hyp10-Atto633的方法。图2A图示了用于合成荧光标记的dGTP试剂的示例性方法。图2B图示了具有染料和接头的完整结构的相同合成。该方法包括在Gly-Hyp10和荧光团Atto633之间形成共价键(过程(a))，酯化以将Atto633-Gly-Hyp10与五氟苯酚偶联(过程(b))，用接头分子epSS取代(过程(c))，酯化以形成Atto633-Gly-Hyp10-epSS-PFP(过程(d))，和用dGTP取代以提供荧光标记的核苷酸(过程(e))。下面提供了合成的细节。
Atto633-Gly-Hyp10的制备。(图2A过程(a))通过在1.5毫升(mL)微量离心管中将25毫克(mg)的11种氨基酸肽溶解在500微升(μL)的0.2摩尔(M)的碳酸氢钠中来制备Gly-Hyp10(本文也称为“hyp10”)在碳酸氢盐中的储备溶液。将7mg的Atto633-NHS称重到另一个微量离心管中并溶解在200μL的二甲基甲酰胺(DMF)中。将300μL体积的肽溶液添加到含有Atto633-NHS的溶液中。将所得溶液混合并加热至50℃保持20分钟(min)。反应程度用反相薄层色谱法(TLC)跟踪。取出反应溶液的1μL等分试样并溶解在40μL的水中，然后在反相TLC上点样。包括与Atto633酸的共点样，并且Atto633也单独运行。将该板用乙腈0.1M醋酸三乙铵(TEAA)的2:1溶液洗脱。Atto633酸和Atto633-NHS两者具有零的Rf，而Gly-Hyp10具有0.4的Rf。通过使用梯度20％→50％乙腈对比0.1M TEAA在16分钟内以2.5mL/min将溶液注射到C18反相柱上来纯化产物。期望的产物是主要产物Atto633-Gly-Hyp10，在15.2分钟时洗脱。将含有期望材料的级分收集在微量离心管中并干燥，产生蓝色固体。在ESI质谱上观察到主峰：针对C87H115N14O24 +计算的m/z，[M]+＝1739.8；实测值：1740.6。
Atto633-Gly-Hyp10-PFP的制备。(图2A过程(b))在1.5mL的微量离心管中将Atto633-Gly-Hyp10悬浮在100μL的DMF中。将吡啶(20μL)和五氟苯基三氟乙酸酯(PFP-TFA,20μL)添加到管中。将反应混合物在加热块中加热至50℃保持20分钟。通过取出1μL的等分试样并加入到1mL的稀HCl(0.4％)来监测反应。当反应完成时，水溶液是无色的。10分钟后，稀HCl溶液呈淡蓝色。加入额外的PFP-TFA(30μL)。在50℃下另外100分钟后，重新测试沉淀，得到无色溶液。将剩余的反应混合物以20μL的份量沉淀到1mL的稀盐酸中。将20μL加入到1mL稀盐酸中，将管向下旋转并丢弃水溶液。重复该过程直至所有产物沉淀。将残余物彻底干燥。干燥后，将固体用1mL甲基叔丁基醚(MTBE)洗涤两次。产物为深蓝色粉末。该产物在电喷雾电离(ESI)-质谱(MS)上产生主峰：针对C93H115F5N14O24 2+计算的m/z，[M+H]2+＝1906.8/2＝953.4；实测值：953.4。
Atto633-Gly-Hyp10-epSS的制备。(图2A过程(c))在微量离心管中将Atto633-Gly-Hyp10-PFP(1.6微摩尔(μmol))溶解在100μL的DMF中。将氨乙基-SS-丙酸溶液(Broadpharm；6mg在200μL的0.1M碳酸氢盐中)与Atto633-gly-hyp10-PFP混合，并在加热块中加热至50℃保持20分钟。将Atto633-Gly-Hyp10-epSS通过反相HPLC使用20％→50％乙腈的梯度在16分钟内从所得反应混合物中纯化。Atto633-Gly-Hyp10在15分钟时洗脱，且Atto633-Gly-Hyp10-epSS在15.6分钟时洗脱。将含有产物Atto633-Gly-Hyp10-epSS的级分合并和干燥。产物在ESI-MS上有主峰：针对C92H124N15O25S2 +计算的m/z，[M]+＝1902.8；实测值：1902.6。
Atto633-Gly-Hyp10-epSS-PFP的制备。(图2A过程(d))在微量离心管中将Atto633-Gly-Hyp10-epSS溶解在100μL的DMF中。添加吡啶(20μL)和PFP-TFA(20μL)，并将混合物在加热块中加热至50℃保持20分钟。稀HCl中的测试等分试样(1μL)产生无色溶液和蓝色沉淀。反应在1mL稀HCl中以20μL等分试样沉淀，将管向下旋转并丢弃水溶液。重复该过程直到所有PFP酯沉淀。将残余物在真空下彻底干燥并用MTBE洗涤。
dGTP-AP-SS-Atto633的制备。(图2A过程(e))将氨基炔丙基dGTP(Trilink；1μmol在100μL的0.2M碳酸氢盐中)的溶液添加到50μL的包含Atto633-gly-hyp10-epSS-PFP的DMF溶液中。将混合物加热至50℃保持10分钟。将产物dGTP-AP-epSS-Atto633通过反相HPLC使用20％→50％乙腈的梯度纯化16分钟。产物在15.3分钟时洗脱。制备型HPLC提供0.65μmol。产物在ESI-MS上产生主峰：针对C106H139N20O37P3S2 2–计算的m/z，[M-H]2-,1220.4；实测值：1220.6。
虽然描述了dGTP-Atto633-Gly-Hyp0-epSS-PFP的合成，但熟练的从业者会认识到，可以使用合适的起始材料以类似方式生产其他荧光标记的核苷酸。
实施例3：染料标记的核苷酸的制备
制备了一组设计用于在约530nm处激发的染料标记的核苷酸。可以使用绿色激光实现在530nm激发，该激光可以是容易获得、高功率且稳定的。有许多在530nm处或附近激发的市售荧光染料廉价且具有各种特性(疏水、亲水、带正电、带负电)。此类染料的合成路线可能比更长波长染料的合成路线更短且更便宜。此外，某些绿色染料可能比红色染料具有明显更少的自淬灭，可能允许使用更高的标记分数(例如，如本文所述)。
用于例如测序应用的可行试剂组由四种经典核苷酸中的每一种或其类似物与在测序中表现良好的可切割性绿色染料组成。可以通过改变标记的核苷酸结构的每个组分以获得具有不同特性的候选标记的核苷酸的阵列来制备最佳组。评估所得核苷酸(例如，如下所述)，并且针对浓度和标记分数(流中标记的核苷酸与未标记的核苷酸的比例)优化某些标记的核苷酸。
图4示出了可用于构建标记的核苷酸的各种组分。核苷酸可以用可切割性接头部分、半刚性接头部分(例如包括一个或更多个氨基酸的接头部分)和荧光染料部分修饰。图4所示的核苷酸是炔丙基氨基官能化的核苷酸(A、C、G和U)，但可以使用具有任何其他有用的化学柄的任何其他有用的核苷酸或的核苷酸类似物。可切割性接头部分包括，例如，显示为“E”、“B”和“Y”的结构。每个可切割性接头部分包括可切割性基团(例如，如本文所述)。例如，可切割性接头部分E、B和Y包括二硫键。接头部分(例如，半刚性接头部分)可以包括一个或更多个氨基酸部分，包括例如一个或更多个羟脯氨酸部分(例如，如本文所述)。例如，接头部分可以包括羟脯氨酸接头(hypn)。图4中所示的“H”接头部分是hyp10部分。在一些情况下，荧光标记的核苷酸可以在化学结构的相同或不同区域中包括多个hyp10部分。例如，接头部分可按顺序包括2个或更多个hyp10部分(例如，hyp20或hyp30部分，其中每一个可包含10个羟脯氨酸部分，以及在一些情况下，另一个部分，例如甘氨酸部分，如本文所述)，所述部分可由一个或更多个其他部分或特征分隔。在一些情况下，接头部分可包括图4所示的“P”部分。接头可包括多个不同部分，包括多个不同氨基酸序列，所述序列包括2个或更多个氨基酸(例如，如本文所述)。在一些情况下，荧光标记的核苷酸可包括分支或树枝状结构(例如，如本文所述)，其包括多个接头部分(例如，在不同分支点与中心结构连接的多组羟脯氨酸部分)，所述接头部分可以相同或不同。荧光标记的核苷酸还可以包括一个或更多个荧光染料部分。荧光染料部分可以是图4中示出为“*”、“#”、“$”的结构或任何其他有用结构。在整个应用中，这些标记用于指代特定的染料结构。然而，无论在何处使用这样的标记，任何其他染料部分都可以被替代，包括本文所述的任何其他荧光染料部分。在一些情况下，染料可表示为
Figure BDA0004184559620001401
该符号旨在表示任何有用的染料部分或染料部分的组合(例如，染料对)。这样的染料可以在530nm处或附近发荧光，或者在电磁光谱的任何其他有用范围内发荧光(例如，如本文所述)。例如，也可以使用红色荧光染料。在整个本申请中包括染料部分的其他实例。荧光标记的核苷酸有许多可能的变体。一些示例性组合包括在图4中。例如，荧光标记的核苷酸可以是U*-YH(例如，包括Y可切割性接头和hyp10部分以及*荧光染料部分的荧光标记的含尿嘧啶的核苷酸)、U*-YHH(例如，包括Y可切割性接头和两个hyp10部分和*荧光染料部分的荧光标记的含尿嘧啶的核苷酸)、U#-E(例如，包括E可切割性接头和#荧光染料部分并且缺少hyp10或类似部分的荧光标记的含尿嘧啶的核苷酸)、G*-B(例如，包括B可切割性接头和*荧光染料部分并且缺少hyp10或类似部分的荧光标记的含鸟嘌呤的核苷酸)等。可根据本文所述的合成路线和原理而制备标记的核苷酸。G*-B-H标记的核苷酸的示例性合成在实施例4中描述。
实施例4：G*-B-H标记的核苷酸的合成
用于制备G*-B-H(参见实施例3)的合成方法示出在图6中。类似的方法可用于制备实施例5和本文其他地方所述的其他标记的核苷酸。由于所使用的组分包括氨基酸，因此有多种途径获得最终产物。合成考虑因素包括在加热或酸性条件下三磷酸酯水解(生成二磷酸酯和单磷酸酯)的趋势，二硫化物在三乙胺和氨存在下分解的趋势，防止使用酸不稳定性保护基团，和防止使用三氟乙酰胺或FMOC保护基团。
PN 40142的制备。在1.5mL微量离心管中将Atto 532琥珀酰亚胺酯(Atto-tec,PN40183；5mg＝4.6μmol)在100μL DMF中的溶液与gly-hyp-hyp-hyp-hyp-hyp-hyp-hyp-hyp-hyp-hyp(来自Genscript的定制合成，PN 40035；8.5mg＝7μmol)在170μL的0.1M碳酸氢盐中的溶液混合。在Phenomenex反相C18半制备柱(Gemini 5μM C18，250x10mm)上使用10％→40％乙腈vs.0.1M的醋酸三乙铵的梯度在16分钟内纯化反应。将含有产物40142的级分合并并浓缩至干。通过稀释级分并测量633nm下的光密度(OD)并使用130,000cm-1M-1的染料的消光系数来确定产率。产率为50％。结构由质谱在负离子模式下确认：针对C81H103N14O31S2 –计算的m/z，1831.6；实测值：1831.8。
PN 40143的制备。在1.5mL微量离心管中将PN 40142(4μmol)悬浮在100μL的DMF中。将吡啶(20μL)和五氟苯基三氟乙酸酯(20μL)添加到DMF溶液中并加热至50℃持续5分钟。将部分(1μL)反应混合物沉淀到0.4％ HCl中；水溶液保持无色，表明完全转化为活性五氟苯基酯。反应的剩余部分沉淀到稀酸溶液中，并用移液管吸出水溶液。残余物用己烷洗涤并干燥成高度着色的固体(PN 40143)。
PN 40146的制备。将PN 40143溶解在100μL的DMF中，并与二硫化物PN 40113(5mg,20μmol)在DMF中混合。将二异丙基乙胺(5μL)加入到混合物中。在反相HPLC上使用20％→50％乙腈vs.0.1MTEAA的梯度在16分钟内纯化混合物。在8.8分钟和9.5分钟时获得两种染料着色的级分。9.5分钟时的级分通过质谱鉴定为期望产物：针对C90H111N15O32S4 2-计算的m/z，1020.84；实测值：1021.1。
PN 40147的制备。在1.5mL微量离心管中将PN 40146悬浮在100μL的DMF中。将吡啶(20μL)和五氟苯基三氟乙酸酯(20μL)添加到DMF溶液中并加热至50℃持续5分钟。将一部分(1μL)反应混合物沉淀到0.4％的HCl中；水溶液保持无色，表明完全转化为活性五氟苯基酯。反应的剩余部分沉淀到稀酸溶液中，并用移液管吸出水溶液。残余物用己烷洗涤并干燥成高度着色的固体(PN 40147)
PN 40150的制备。在1.5mL微量离心管中将PN 40147溶解在50μL的DMF中。制备0.5μmol的7-脱氮-7-炔丙基氨基-2’-脱氧鸟苷-5’-三磷酸酯在50μL的1M碳酸氢盐中的溶液并将其加入管中。在4℃下保持过夜后，产物在HPLC上使用20％→50％乙腈vs.0.1M TEAA梯度在16分钟内纯化，12分钟时的级分包含期望产物：针对C104H129N20O44P3S4 2–计算的m/z，[M-H]2-，1291.33；实测值：1292.4。
实施例5：包括鸟嘌呤或其类似物的染料标记的核苷酸
包括鸟嘌呤或其类似物的核苷酸在测序应用中(例如，如本文所述)在碱基识别准确度方面可能表现更差。这可能与光诱导电子从核碱基转移到与核碱基相连的染料有关，这可能淬灭由染料发射的信号，从而降低信号的动态范围。因此，如本文所提供的，制备和评估各种包括鸟嘌呤或其类似物的染料标记的核苷酸。此类染料标记的核苷酸的实例包括：
Figure BDA0004184559620001431
Figure BDA0004184559620001441
上面显示的几个结构包括hyp10接头，该接头包括自N末端的序列Gly-Hyp-Hyp-Hyp-Hyp-Hyp-Hyp-Hyp-Hyp-Hyp-Hyp。缺乏hyp10接头的G4被高度淬灭。如本文所述，在测序测定中评估剩余的染料标记的核苷酸。在所示结构中，G6提供了最高的准确度。制备G6的合成路线如图3A-3C所示。包括不同数量的羟脯氨酸(包括hyp20和hyp30部分)的其他结构也可以掺入荧光标记试剂中。
实施例6：染料标记的核苷酸的评估
使用基于珠的测定来评估实施例5的染料标记的核苷酸。用与引物链退火的5'-生物素化模板链制备链霉亲和素珠。该引物链被设计为使得通过DNA聚合酶掺入的下一个同源碱基是胸苷。使DNA聚合酶与珠复合物结合。然后将含有不同比例的染料标记的核苷酸(dUTP*)和天然碱基(TTP)的各种混合物提供给珠。洗掉过量的试剂后，使用PE通道(激发＝488nm，发射＝580nm)在流式细胞仪上读取珠的荧光。该测定的示意图在图8中示出。
不同标记dUTP的珠测定结果如图9所示。核苷酸总和的总浓度维持在2μM；10％的标记分数意味着0.2μM的dUTP*和1.8μM的TTP。两种核苷酸的行为明显不同：U#-E的“耐受性”为约1，这意味着在所有测试的比例中，染料标记的核苷酸与天然核苷酸的掺入没有差异；即，50％的标记分数导致50％的珠被标记。另一方面，U*-E具有负耐受性，这意味着在每个比例下，它都低于在零和标记为100％的信号之间绘制的线。负耐受性表明染料标记使核苷酸成为比天然底物更差的底物。该结果与以下观察结果一致：诸如Atto532(由U*-E表示的染料)的带负电荷的染料抑制通过许多聚合酶的掺入，而诸如5-羧罗丹明-6G(由U#-E表示的染料)的染料是两性离子的并且被认为是良好的底物。
使用类似的测定法评估其他标记的核苷酸。图10示出了标记的dATP的珠测定的结果。图11示出了标记的dGTP的珠测定的结果。对于标记的dATP，与A*-B-H和A*-E-H相比，在用于A*-B的100％标记时观察到非常低的荧光。这表明羟脯氨酸接头(H)减轻了核苷酸对染料的淬灭。对于标记的dGTP，观察到类似的结果。这个结果对于标记的dGTP是预期的，因为通过光诱导电子转移的G淬灭是众所周知的。来自二硫化物接头B的淬灭效应也可能导致对标记的dATP和dGTP观察到的较低的荧光。
实施例7：使用染料标记的核苷酸的测序
核酸测序测定可用于评估染料标记的核苷酸(例如，如本文所述)。示例性程序示于图7中。
可以使用配备有发光器件(LED)和/或激光器的仪器进行测序。评估的每个核苷酸可包括配置用于在相似波长上激发和发射的染料(例如，全红光或全绿光发射)。一种或更多种不同的核苷酸类型可以与不同的染料偶联。测序性能可以基于碱基识别质量、相位滞后、相位超前和同聚物完成来评估。
将带有扩增模板的珠引发，固定在支持物上，并与紧密结合的DNA聚合酶一起孵育。然后对珠进行多个测序循环。每个测序循环可包括与U*/T(染料标记的TTP和天然TTP的固定比例)一起孵育、“追踪”过程(仅TTP)、成像和切割过程(10mM的三(羟丙基)膦(THP)))以释放染料。每个过程之间可能有洗涤过程。可以对包括A、C和G的核苷酸或核苷酸类似物重复该过程。该测序程序可以有效地鉴定至少2、3、4、5、6、7、8或更多个核苷酸的同聚区域。
还针对全hyp接头组评估测序，其中染料标记的核苷酸(包括每个经典核苷酸)包括hyp10或hyp20接头。进行该评估以鉴定其中可以使用较高分数且淬灭最少的组。更高的淬灭可能导致更高的切痕化(例如，如本文所述)，这可能降低聚合酶的掺入效率。然而，家族B酶如PolD可能在切痕的情况下表现良好。可以用2.5％和20％的标记分数与染料(例如Atto633)评估测序。
测序可用于评估对各种标记的核苷酸的耐受性。图12示出了用发红光染料标记的核苷酸的归一化珠数据。亮溶液分数(bf)相对于亮掺入分数(bi)作图。曲线符合以下等式：
Figure BDA0004184559620001461
其中df是暗溶液分数。在图12中，G*的计算耐受性为10.6，A*的为2.8，U*的为2.0，且C*的为1.2。正耐受性数字表示在50％的标记分数下，大于50％被标记。耐受性为1的试剂在测序中可能具有最少的“背景”。具有非常负的耐受性(例如，耐受性<<1)的试剂可能具有在与支持物偶联的多个模板之间均匀掺入的问题，因为它们必须以如此低的浓度使用，以至于它们可能低于饱和度并以不均匀速率消耗。
实施例8：淬灭的评估
本文提供的染料标记的核苷酸可以改善核碱基与其所附接的染料之间和/或核酸分子(例如，生长的核酸链)中染料之间的淬灭，例如在核酸分子的同聚区域中。淬灭可以不依赖酶的方式进行评估。
图13示出了用于评估淬灭的示意图。用一个或两个“接头臂核苷酸”构建合成寡核苷酸。接头臂核苷酸是具有含伯胺的接头臂的胸苷类似物。含有接头臂核苷酸的寡核苷酸可以用接头和染料标记并进行HPLC纯化。使用珠标记的测定的优点是不需要对试剂进行精确定量；在每个步骤中都可以使用大量过量并进行珠洗涤，确保只有化学计量量的寡核苷酸与模板结合。每个染料接头都放在两个寡核苷酸上。在APC(红色)通道中的流式细胞仪上测量珠。淬灭百分比由下式确定：％淬灭＝100×(1-Flbis/(2*Flmono))。
图14和15示出了红色染料接头(图14)和绿色染料接头(图15)的淬灭结果。结果表明染料的性质影响淬灭。负电荷(参见Atto532 vs.AttoRho6G)可以改善淬灭，但如果染料非常大且平坦(参见Cy5，Alexa 647)，淬灭可能不会得到改善。hyp10或hyp20接头改善淬灭。如图14所示，hyp10使用Atto633改善淬灭，且花青染料即使使用四个磺酸基团也能淬灭。如图15所示，Atto532上的磺酸基团改善淬灭，Atto532和hyp10的组合也改善淬灭。
实施例9：同聚物的询问
提供了核酸模板，其具有不同长度的包含胞嘧啶的同聚物区域(1C、2C、3C、4C、5C)。将模板与用Atto532荧光团(例如，如本文所述；本文表示为G*)标记的含鸟苷的核苷酸接触。标记的核苷酸可以核苷酸流的形式在溶液中提供(例如，如本文所述)。核苷酸流可以包括100％标记的核苷酸(例如，核苷酸流可以仅包括标记的核苷酸而没有未标记的核苷酸)或可以包括标记的核苷酸和未标记的核苷酸两者(例如，如本文所述)。标记的核苷酸和如果存在的话未标记的核苷酸可以不终止，使得多个核苷酸可以连续掺入与模板中出现的胞嘧啶一样多的位置。可以使用酶(例如聚合酶，例如Bst 3.0)使用具有多胞嘧啶序列的核酸作为模板将标记的核苷酸和/或未标记的核苷酸掺入延伸引物中。模板的多个拷贝可以固定在珠或其他支持物上(例如，如本文所述)。该程序示意性地示于图16A和16B。
在一些情况下，标记的核苷酸连续掺入与模板中出现的胞嘧啶一样多的位置。在其他情况下，少于所有潜在的G*被掺入。当未标记的核苷酸包括在核苷酸流中时，未标记的核苷酸和标记的核苷酸都可被掺入。例如，对于包括含有三个胞嘧啶的同聚区域的模板，掺入的核苷酸可以具有序列GGG、GG*G、GGG*、G*GG、G*G*G、G*GG*、GG*G*或G*G*G*，其中G*表示标记的核苷酸且G表示未标记的核苷酸。掺入的核苷酸的序列可基于例如核苷酸流的标记分数(例如，流中标记的核苷酸与未标记的核苷酸的比例)和用于标记核苷酸的光学(例如，荧光)标记试剂而变化。
标记的多核苷酸产物在Biorad变性丙烯酰胺凝胶上分离，并使用蓝色和绿色LED成像以检测掺入的标记的核苷酸。如图16C所示，使用该方法可以检测1、2、3、4和5个连续的胞嘧啶。
实施例10：使用高分数的标记核苷酸的合成测序
使用本文所述的程序和标记的核苷酸对长度为至少30个核苷酸的模板核酸进行测序。待测序的模板可以固定在支持物上(例如，如本文所述)。通过合成反应对模板进行测序，其中模板按顺序与包含PolD聚合酶(New England Biolabs)和多个单一经典类型的核苷酸(例如T、A、C或G)的溶液(例如，核苷酸流)接触。在每个核苷酸流中，核苷酸群体中的大约20％被如本文上述所述的Atto633标记以提供约20％的标记分数。剩余的核苷酸未被标记。核苷酸流中包含的核苷酸不终止，以允许对模板的同聚区域进行有效测序。在将模板与包括第一经典类型的核苷酸的第一核苷酸流接触后，将模板与洗涤流接触以去除未掺入的核苷酸。收集荧光图像。将与掺入的标记的核苷酸缔合的荧光标记试剂的接头与包含切割试剂的切割流接触，该切割试剂被配置为切割接头的可切割性基团以将荧光标记试剂的荧光染料(例如，Atto633)与掺入的核苷酸分离。附加的洗涤流可用于去除切割流。在一些情况下，包括第一经典类型的未标记的核苷酸的追踪流可以跟随初始核苷酸流并且在成像过程之前或之后。连续地对第二、第三和第四种核苷酸类型重复该过程，然后重复整个循环。
图17A示出了将该方法应用于样本模板的结果。黑色圆圈表示掺入了核苷酸，灰色圆圈表示在特定流循环中没有掺入核苷酸。如图所示，可以高准确度确定流循环中一种或更多种核苷酸的掺入。此外，如图17B所示，信号强度和标记的核苷酸同聚物长度之间的关系在多个模板中可以是基本上线性的(例如，如本文所述)。例如，信号强度可以与模板的同聚区域的长度成比例。这种比例表明淬灭效应已被充分克服。在图17B中，G的斜率是0.96，C的是0.80，A的是079，且T的是0.70。虚线表示实际信号，而实线表示相位校正后的信号。
实施例11：使用100％标记的核苷酸的合成测序
具有至少30个核苷酸长度的模板核酸如实施例13中所述进行测序，但使用其中100％核苷酸被标记的溶液。在图18中，黑色圆圈表示在给定的流循环中掺入碱基，而灰色圆圈表示在给定的流循环中未掺入碱基。如从图18中可以看出，测序方法可用于通过50个流循环来检测碱基掺入。
实施例12：蛋白质标记
用多种光学(例如，荧光)标记试剂(例如，如本文所述)标记蛋白质。例如，可以用三种或更多种光学标记试剂标记蛋白质。与蛋白质缔合的光学标记试剂可以全部包含相同类型的荧光染料。与蛋白质缔合的光学标记试剂可以全部包含相同类型的接头。蛋白质可以是抗体，例如单克隆抗体。
蛋白质用于标记细胞。细胞可以是样本的组分，该样本可以包括多种细胞。可以使用流式细胞术分析和分选样本的细胞。流式细胞术分析可将细胞鉴定为被与多种光学标记试剂缔合的蛋白质标记。在一些情况下，样本的多种细胞可用光学标记试剂(例如，如本文所述)标记。例如，包含被配置为与蛋白质(例如，用多种光学标记试剂标记的蛋白质，例如用多种光学标记试剂标记的抗体)缔合的特定细胞表面特征(例如，抗原)的细胞可以用标记的蛋白质标记并使用流式细胞术进行分析和/或分选。分析和/或分选的细胞可以进行进一步的下游分析和处理，包括例如核酸测序、染色、成像、功能测定、免疫测定、分离/扩增、附加标记、免疫沉淀等。
实施例13：染料和底物分离的影响
使用牛血清白蛋白(BSA)研究光学可检测性部分(例如，荧光染料)和底物之间的功能分离的影响。根据以下方案用Atto532对BSA进行荧光标记：在不存在提供BSA与Atto532部分之间的分离的接头(“Atto532”)的情况下，使用PEG16作为接头以提供BSA与Atto 532部分之间的分离(“Atto532-PEG16”)，使用hyp10部分以提供BSA与Atto 534部分之间的分离(“Ato532-pe10”)，以及使用hyp30部分提供BSA与Atto532部分之间的分离(“Atto532-hyp30”)。使用Millipore离心过滤器从游离染料中纯化标记的BSA。如图20所示，Atto532-hyp30标记方案未显示BSA蛋白上的自淬灭。Atto532-hyp30比Atto532-hyp10表现得更好，表明BSA和染料部分之间增加的物理间隔可能有助于减少淬灭。Atto532-PEG16与单独的Atto532相比没有改善淬灭。
实施例14：染料和底物分离的影响
使用链霉亲和素研究光学可检测性部分(例如，荧光染料)和底物之间的功能分离的影响。将链霉亲和素的等分试样(0.8毫克/25微升(μL)、0.1摩尔(M)碳酸氢盐)与2、4或8微升的染料-PFP(五氟苯基)以12毫摩尔(mM)混合。在室温下1小时后，使用截留分子量为30000道尔顿的离心过滤单元纯化样品。用TE洗涤蛋白质溶液并旋转六次，直到洗脱液无色。使用Denovix Uv/可见分光光度计测量吸收光谱，并测量280和534nm下的吸光度。对于链霉亲和素和Atto532，分别使用41,300和115,000M-1厘米(cm)-1的消光系数测定未校正的蛋白质和荧光团浓度。将样品稀释20倍直到200μL，并测量绿色荧光。图22A示出了用被hyp10接头物理间隔的Atto532标记的链霉亲和素相比在不存在提供链霉亲和素和Atto532部分之间的物理间隔的接头的情况下用Atto532标记的链霉亲和素的亮度。Atto532-hyp10标记的链霉亲和素的亮度是用单独的Atto532标记的链霉素亲和素亮度的近五倍。表1总结了相关参数。
表1.与链霉亲和素标记相关的参数。
Figure BDA0004184559620001501
/>
Figure BDA0004184559620001511
还使用小鼠抗体研究光学可检测性部分(例如，荧光染料)和底物之间的功能分离的影响。将25微升(μL)的0.1摩尔(M)碳酸氢盐中的小鼠IgG(多克隆抗体，SigmaAldrich#PP54)的等分试样(0.2mg)与1、2和4微升染料-PFP(五氟苯基)以12毫摩尔(mM)组合。使用截留分子量为30000道尔顿的离心过滤单元纯化样品中的游离染料。用400μL的TE洗涤蛋白质溶液六次，直到洗脱液无色。使用Denovix UV/可见分光光度计测量吸收光谱，并测量280和534nm下的吸光度。对于小鼠IgG和Atto532，分别使用210,000和115,000M-1cm-1的消光系数来测定未校正的蛋白质和荧光团浓度。将样品稀释20倍直到200μL，并测量绿色荧光。图22B示出了用被hyp10接头物理分离的Atto532标记的小鼠IgG相比在不存在提供小鼠IgG和Atto532部分之间的物理间隔的接头的情况下用Atto532标记的小鼠IgG的亮度。Atto532-hyp10标记的小鼠IgG的亮度超过用单独的Atto532标记的小鼠IgG的两倍。表2总结了相关参数。此外，Atto532-hyp10标记的小鼠IgG的荧光在测量浓度下没有趋于稳定，这表明可能有潜在更高的亮度。
表2.与小鼠IgG标记相关的参数。
Figure BDA0004184559620001521
实施例15：包括多个光学可检测性部分的标记试剂
如前几节所述，标记试剂可包括多个光学可检测性部分(例如，荧光染料部分)。多个光学可检测性部分可连接到标记试剂的支架结构，该支架可包括一个或更多个赖氨酸。图21A、21B、21D和21E示出了这种结构的示例。图21C示出了所选标记试剂的相对量子产率。由于量子产率很难先验地获得，因此使用相同的仪器通过比较具有相似激发和发射波长的化合物来测量量子产率。量子产率比可以如下通过测量荧光比来获得：
Figure BDA0004184559620001522
根据比尔定律替换吸光度并匹配两个样品的吸光度，可提供以下：/>
Figure BDA0004184559620001523
因此，荧光的比率是量子产率的比率。使用Denovix分光光度计测量吸光度和荧光。测量并匹配吸光度最大值(534nm)下的光密度，并测量绿色荧光。量子产率归一化为游离染料Atto532的量子产率，其据报道为0.9。如图21C所示，包括hyp10或hyp30结构的结构的量子产率高于包括直接连接到赖氨酸主链的染料部分的结构的量子产率。
实施例16：可切割性接头部分
如本文所述，标记试剂可包括包含可切割性基团的可切割性部分。在标记试剂中包含可切割性部分可促进标记试剂或其部分与其所偶联的底物分离。
比较了两种标记的含尿嘧啶的核苷酸的性能。使用U*-YH(例如，用包括*染料、Y可切割性接头和hyp10部分的标记试剂标记的含尿嘧啶的核苷酸)或U*-BH(例如，用包括*染色剂、B可切割性接头和hyp110部分的标记试剂标记的含尿嘧啶的核苷酸)进行测序测定。如图24所示，U*-YH在测序测定中表现更好，为阴性挑战(例如，尿嘧啶不旨在被掺入模板的流，被圈出)提供了低但恒定的信号，允许区分阳性信号(由箭头指示)。
还比较了两种包括相同的可切割性接头部分和不同的半刚性部分的标记的含尿嘧啶的核苷酸的性能。使用U*-YH和U*-YHH(例如，用包括*染料、Y可切割性接头和两个hyp10部分的标记试剂标记的含尿嘧啶的核苷酸)进行测序测定。使用流式细胞术和基于凝胶的分析来评估与每个测定相对应的信号亮度。如图25所示，U*-YHH提供了比U*-YH更亮的信号(左图)。如图25的右图所示，对于包含六个连续A的模板(例如，6个尿嘧啶应掺入的同聚区域)，使用每个标记的核苷酸测量一系列产物。然而，U*-YHH的淬灭程度低于U*YH。
实施例17：染料淬灭
本公开的标记试剂可以包括一个或更多个不同的光学可检测性部分(例如，染料)。标记试剂的光学可检测性部分可以在电磁光谱的可见部分的绿色区域发荧光。绿色荧光染料可以是例如，Atto532。可替代地或附加地，标记试剂的光学可检测性部分可以在电磁光谱的可见部分的红色区域发荧光。红色荧光染料可以是例如，Atto633。比较了红色荧光染料和绿色荧光染料的使用。
图26示出了直接与寡聚物偶联的Atto532和Atto633染料的相对荧光(例如，在不存在寡聚物的情况下)。使用流式细胞仪用与珠结合的双链DNA测量荧光。如图26所示，两个绿色染料的亮度是与寡聚物偶联的单一染料的1.3倍，而两个红色染料的亮度仅为与寡聚物偶联的单一染料的0.4倍。因此，绿色染料可能比红色染料具有固有的优势。这种差异可能至少部分归因于Atto633是疏水的，而Atto532是相对亲水的。
图27A-27B示出了作为同聚物长度的函数的相对荧光。图27A中的数据是使用dUTP-SS17-hyp10-Atto633(例如，用红色荧光染料标记的核苷酸)和PolD聚合酶的测序测定制备的。图27A中的标记核苷酸表示为
Figure BDA0004184559620001541
其中/>
Figure BDA0004184559620001542
表示任何类型的荧光染料。如图27A所示，即使掺入了hyp10接头，两个红色染料的荧光亮度也仅为单一染料的1.1倍。这表明红色染料，即使在荧光标记结构中掺入了接头，也可能受到淬灭效应的影响。图27B示出了使用dUTP-B-H-Atto532(例如，用绿色荧光染料标记的核苷酸)和Pol47聚合酶进行测序测定后的相对荧光。图27B中的标记核苷酸表示为/>
Figure BDA0004184559620001543
其中/>
Figure BDA0004184559620001544
表示任何类型的荧光染料。如图所示，当hyp10接头掺入到绿色染料体系中时，两个绿色染料的荧光亮度为单一染料的1.6倍。这表明绿色染料可能比红色染料经历更少的淬灭效应。
实施例18：不同的标记分数
在不同的标记分数下评估标记的核苷酸。标记的核苷酸U*-EPH以15％、30％和60％的标记分数用于测序测定。如图28A和28B所示，在60％标记分数下，通过八个碱基的同聚物的标记保持近似线性。
实施例19：标记的核苷酸系统的优化
使用标记的核苷酸的测序测定可包括使用聚合酶。下表3包括与使用Pol19聚合酶和110mM氯化钠对A*-EH、C*-YH、G*-EH和U*-YH进行的测序测定相对应的参数。
表3.使用Pol19聚合酶对A*-EH、C*-YH、G*-EH和U*-YH进行测序测定的参数。
Figure BDA0004184559620001551
该测定的测量的滞后和超前分别为0.65和0.29。
还使用Pol50聚合酶和170mM氯化钠分别在20％标记分数下使用相同的核苷酸进行了类似的测序测定。表4总结了与该测序测定相对应的参数。
表4.使用Pol50聚合酶对A*-EH、C*-YH、G*-EH和U*-YH进行测序测定的参数。
Figure BDA0004184559620001552
该测定的测量的滞后和超前分别为1.06和1.04。因此，Pol50的表现比Pol19更差。
图19A、19B、19C和19D分别示出了对于上面表3中描述的系统，对含C-、A-、T-和G-核苷酸的同聚区域的性能。对于每个碱基，在同聚序列之前的模板的背景是相同的，允许评估不同核苷酸对同聚区域的性能。每个图的右上图显示了作为同聚物长度函数的测量的信号的曲线图。在这些图中，线性拟合表示对给定同聚物长度的良好响应，同聚物之间的重叠最小。对于n＝7的同聚物(hmer)，尤其是含C的核苷酸，每个核苷酸的信号曲线是相对线性的。每个图的下图显示了每个同聚物长度的信号分布。如这些图所示，随着同聚物长度的增加，信号峰趋于加宽。每个图的左上图中包含的表格总结了未校正数据(最左列)、原始计数(最右列)和错误校正数据(中间列)。图19A-19D证明该系统可以有效地询问同聚物模板序列。
尽管本文已经示出并描述了本发明的优选实施方案，但对本领域技术人员而言显而易见，这些实施方案仅以实例的方式提供。本发明意在不受本说明书中提供的具体实例的限制。虽然已经参考上述说明描述了本发明，但是对本文中实施方案的描述和说明并非意在以限制性含义解释。在不偏离本发明的情况下，本领域技术人员现将想到许多变化、改变和替代。此外，应当理解，本发明的所有方面均不限于本文阐述的具体描述、配置或相对比例，其取决于各种条件和变量。应当理解，本文所述的本发明实施方案的各种替代方案可用于实践本发明。因此，考虑到本发明还应涵盖任何此类替代、修改、变化或等同物。以下权利要求旨在限定本发明的范围，并由此涵盖这些权利要求范围内的方法和结构及其等同物。

Claims (263)

1.一种荧光标记试剂，包括：
(a)荧光染料部分；和
(b)接头，所述接头与所述荧光染料部分连接并被配置为与底物偶联以便荧光标记所述底物，
其中所述接头包括至少五个非蛋白质氨基酸。
2.根据权利要求1所述的荧光标记试剂，还包括第二荧光染料，其中所述荧光染料和所述第二荧光染料通过所述接头而连接并且能够进行能量转移。
3.根据权利要求2所述的荧光标记试剂，其中所述能量转移通过荧光共振能量转移(FRET)介导。
4.根据权利要求1所述的荧光标记试剂，其中所述至少五个非蛋白质氨基酸的至少一个子集包括环体系。
5.根据权利要求1或4所述的荧光标记试剂，其中所述至少五个非蛋白质氨基酸的至少一个子集包括水溶性基团。
6.根据权利要求5所述的荧光标记试剂，其中所述水溶性基团选自吡啶鎓基团、咪唑鎓基团、季铵基团、磺酸根、硫酸根、磷酸根、羟基基团、胺、亚胺、腈、酰胺、巯基、羧酸、聚醚、醛、硼酸和硼酸酯。
7.根据权利要求6所述的荧光标记试剂，其中所述水溶性基团是羟基基团。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的荧光标记试剂，其中所述至少五个非蛋白质氨基酸的至少一个子集是羟脯氨酸部分。
9.根据权利要求1-8中任一项所述的荧光标记试剂，其中所述接头包括五个或更多个羟脯氨酸部分。
10.根据权利要求9所述的荧光标记试剂，其中所述接头包括十个或更多个羟脯氨酸部分。
11.根据权利要求10所述的荧光标记试剂，其中所述接头包括二十个或更多个羟脯氨酸部分。
12.根据权利要求11所述的荧光标记试剂，其中所述接头包括三十个或更多个羟脯氨酸部分。
13.根据权利要求1-12中任一项所述的荧光标记试剂，其中所述接头还包括一个或更多个甘氨酸部分。
14.根据权利要求1-13中任一项所述的荧光标记试剂，其中所述接头包括重复单元。
15.根据权利要求14所述的荧光标记试剂，其中所述重复单元包括所述至少五个非蛋白质氨基酸部分中的一个或更多个。
16.根据权利要求15所述的荧光标记试剂，其中所述重复单元包括至少五个非蛋白质氨基酸部分。
17.根据权利要求16所述的荧光标记试剂，其中所述重复单元包括至少十个非蛋白质氨基酸部分。
18.根据权利要求17所述的荧光标记试剂，其中所述重复单元包括十个羟脯氨酸部分。
19.根据权利要求14-18中任一项所述的荧光标记试剂，其中所述重复单元包括甘氨酸部分。
20.根据权利要求14-19中任一项所述的荧光标记试剂，其中所述重复单元重复至少三次。
21.根据权利要求1-20中任一项所述的荧光标记试剂，其中当所述荧光标记试剂与所述底物偶联时，所述接头在所述荧光染料部分和所述底物之间提供至少约30埃
Figure FDA0004184559610000021
的平均物理间隔。
22.根据权利要求21所述的荧光标记试剂，其中当所述荧光标记试剂与所述底物偶联时，所述接头在所述荧光染料部分和所述底物之间提供至少约60埃
Figure FDA0004184559610000022
的平均物理间隔。
23.根据权利要求22所述的荧光标记试剂，当所述荧光标记试剂与所述底物偶联时，所述接头在所述荧光染料部分和所述底物之间提供至少约90埃
Figure FDA0004184559610000023
的平均物理间隔。
24.根据权利要求1-23中任一项所述的荧光标记试剂，其中所述荧光标记试剂还包括可切割性基团，所述可切割性基团被配置为被切割以将所述荧光标记试剂或其部分与所述底物分离。
25.根据权利要求24所述的荧光标记试剂，其中所述可切割性基团被配置为被切割以将所述荧光标记试剂的包含所述荧光染料部分和所述接头的第一部分的第一部分与所述荧光标记试剂的包括所述接头的第二部分的第二部分分离。
26.根据权利要求24或25所述的荧光标记试剂，其中所述可切割性基团选自叠氮基甲基基团、二硫键、烃基二硫基甲基基团和2-硝基苄氧基基团。
27.根据权利要求26所述的荧光标记试剂，其中所述可切割性基团是二硫键。
28.根据权利要求24-27中任一项所述的荧光标记试剂，其中所述可切割性基团是通过应用由三(2-羧乙基)膦(TCEP)、二硫苏糖醇(DTT)、四氢吡喃基(THP)、紫外(UV)光及其组合组成的组中的一个或更多个成员可切割的。
29.根据权利要求1-28中任一项所述的荧光标记试剂，其中所述荧光标记试剂包括选自
Figure FDA0004184559610000031
Figure FDA0004184559610000032
中的部分。
30.根据权利要求1-29中任一项所述的荧光标记试剂，其中所述底物是核苷酸、多核苷酸、蛋白质、脂质、细胞、糖、多糖或抗体。
31.根据权利要求30所述的荧光标记试剂，其中所述底物是核苷酸并且所述荧光标记试剂通过所述核苷酸的核碱基而附接到所述核苷酸。
32.根据权利要求28所述的荧光标记试剂，其中所述底物是蛋白质。
33.根据权利要求1-32中任一项所述的荧光标记试剂，其中所述底物是荧光淬灭剂、荧光供体或荧光受体。
34.一种标记的底物，包括所述底物和根据权利要求1-29中任一项所述的荧光标记试剂或其衍生物，其中所述荧光标记试剂与所述底物偶联。
35.根据权利要求34所述的标记的底物，其中所述底物是核苷酸、多核苷酸、蛋白质、脂质、细胞、糖、多糖或抗体。
36.根据权利要求35所述的标记的底物，其中所述底物是蛋白质。
37.根据权利要求36所述的标记的底物，其中所述蛋白质是细胞的组分。
38.根据权利要求35所述的标记的底物，其中所述底物是核苷酸并且所述荧光标记试剂通过所述核苷酸的核碱基而附接到所述核苷酸。
39.根据权利要求34-38中任一项所述的标记的底物，其中所述标记的底物包括与其偶联的附加荧光标记试剂，其中所述附加荧光标记试剂包括附加荧光染料部分和与所述附加荧光染料部分连接的附加接头，其中所述附加接头包括至少五个非蛋白质氨基酸。
40.根据权利要求39所述的标记的底物，其中所述荧光标记试剂和所述附加荧光标记试剂包括相同的化学结构。
41.根据权利要求39所述的标记的底物，其中所述荧光标记试剂和所述附加荧光标记试剂包括不同的化学结构。
42.根据权利要求39-41中任一项所述的标记的底物，其中所述标记的底物包括与其偶联的三种或更多种荧光标记试剂。
43.根据权利要求34-42中任一项所述的标记的底物，其中所述底物是荧光淬灭剂、荧光供体或荧光受体。
44.根据权利要求34-43中任一项所述的标记的底物，其中所述标记的底物相对于另一标记的底物减少了淬灭，所述另一标记的底物包括所述底物和另一荧光标记试剂，所述另一荧光标记试剂包括所述荧光染料部分和另一接头，所述另一接头不包括所述至少二十个非蛋白质氨基酸。
45.根据权利要求34-44中任一项所述的标记的底物，其中所述标记的底物在激发和光学检测时比另一标记的底物提供更高的信号水平，所述另一标记的底物包括所述底物和另一荧光标记试剂，所述另一荧光标记试剂包括所述荧光染料部分和另一接头，所述另一接头不包括所述至少二十个非蛋白质氨基酸。
46.一种荧光标记试剂，包括：
(a)多个荧光染料部分；和
(b)多个接头，其中所述多个接头中的第一接头与所述多个荧光染料部分中的第一荧光染料部分连接，并且其中所述多个接头中的第二接头与所述多个荧光染料部分中的第二荧光染料部分连接，
其中所述荧光标记试剂被配置为与底物偶联以荧光标记所述底物，并且
其中所述第一接头包括第一非蛋白质氨基酸，且所述第二接头包括第二非蛋白质氨基酸。
47.根据权利要求46所述的荧光标记试剂，其中所述第一荧光染料部分和所述第二荧光染料部分具有相同的化学结构。
48.根据权利要求47所述的荧光标记试剂，其中所述多个荧光染料部分中的每个荧光染料部分具有相同的化学结构。
49.根据权利要求46-48中任一项所述的荧光标记试剂，其中所述多个荧光染料部分中的每个荧光染料部分在相同波长处或附近发荧光。
50.根据权利要求46所述的荧光标记试剂，其中所述第一荧光染料部分和所述第二荧光染料部分具有不同的化学结构。
51.根据权利要求46-50中任一项所述的荧光标记试剂，其中所述多个接头与一个或更多个赖氨酸部分连接。
52.根据权利要求51所述的荧光标记试剂，其中所述荧光标记试剂包括与所述多个接头的至少一个子集连接的两个或更多个赖氨酸部分。
53.根据权利要求52所述的荧光标记试剂，其中所述荧光标记试剂包括与所述多个接头的至少一个子集连接的三个或更多个赖氨酸部分。
54.根据权利要求52所述的荧光标记试剂，其中所述第一接头与所述两个或更多个赖氨酸部分中的第一赖氨酸部分连接，并且所述第二接头与所述两个或更多个赖氨酸部分中的第二赖氨酸部分连接。
55.根据权利要求54所述的荧光标记试剂，其中所述第一赖氨酸部分与所述第二赖氨酸部分连接。
56.根据权利要求46-55中任一项所述的荧光标记试剂，其中所述荧光标记试剂包括三个或更多个荧光染料部分和三个或更多个接头。
57.根据权利要求46-56中任一项所述的荧光标记试剂，其中所述第一接头和所述第二接头具有相同的化学结构。
58.根据权利要求57所述的荧光标记试剂，其中所述多个接头中的每个接头具有相同的化学结构。
59.根据权利要求46-56中任一项所述的荧光标记试剂，其中所述第一接头和所述第二接头具有不同的化学结构。
60.根据权利要求46-59中任一项所述的荧光标记试剂，其中所述第一接头包括包含第一多个非蛋白质氨基酸的第一多个氨基酸，其中所述第一多个非蛋白质氨基酸包括所述第一非蛋白质氨基酸。
61.根据权利要求60所述的荧光标记试剂，其中所述第一多个非蛋白质氨基酸的至少一个子集包括环体系。
62.根据权利要求60或61所述的荧光标记试剂，其中所述第一多个非蛋白质氨基酸包括至少五个非蛋白质氨基酸。
63.根据权利要求62所述的荧光标记试剂，其中所述第一多个非蛋白质氨基酸包括至少十个非蛋白质氨基酸。
64.根据权利要求63所述的荧光标记试剂，其中所述第一多个非蛋白质氨基酸包括至少二十个非蛋白质氨基酸。
65.根据权利要求60-64中任一项所述的荧光标记试剂，其中所述第一多个非蛋白质氨基酸包括至少一个羟脯氨酸部分。
66.根据权利要求65所述的荧光标记试剂，其中所述第一多个非蛋白质氨基酸包括至少五个羟脯氨酸部分。
67.根据权利要求66所述的荧光标记试剂，其中所述第一多个非蛋白质氨基酸包括至少十个羟脯氨酸部分。
68.根据权利要求67所述的荧光标记试剂，其中所述第一多个非蛋白质氨基酸包括至少二十个羟脯氨酸部分。
69.根据权利要求46-68中任一项所述的荧光标记试剂，其中所述第二接头包括包含第二多个非蛋白质氨基酸的第二多个氨基酸，其中所述第二多个非蛋白质氨基酸包括所述第二非蛋白质氨基酸。
70.根据权利要求69所述的荧光标记试剂，其中所述第二多个非蛋白质氨基酸的至少一个子集包括环体系。
71.根据权利要求69或70所述的荧光标记试剂，其中所述第二多个非蛋白质氨基酸包括至少五个非蛋白质氨基酸。
72.根据权利要求71所述的荧光标记试剂，其中所述第二多个非蛋白质氨基酸包括至少十个非蛋白质氨基酸。
73.根据权利要求72所述的荧光标记试剂，其中所述第二多个非蛋白质氨基酸包括至少二十个非蛋白质氨基酸。
74.根据权利要求69-73中任一项所述的荧光标记试剂，其中所述第二多个非蛋白质氨基酸包括至少一个羟脯氨酸部分。
75.根据权利要求74所述的荧光标记试剂，其中所述第二多个非蛋白质氨基酸包括至少五个羟脯氨酸部分。
76.根据权利要求75所述的荧光标记试剂，其中所述第二多个非蛋白质氨基酸包括至少十个羟脯氨酸部分。
77.根据权利要求76所述的荧光标记试剂，其中所述第二多个非蛋白质氨基酸包括至少二十个羟脯氨酸部分。
78.根据权利要求46-77中任一项所述的荧光标记试剂，其中所述第一非蛋白质氨基酸或所述第二非蛋白质氨基酸包括环体系。
79.根据权利要求46-78中任一项所述的荧光标记试剂，其中所述第一非蛋白质氨基酸或所述第二非蛋白质氨基酸包括水溶性基团。
80.根据权利要求79所述的荧光标记试剂，其中所述水溶性基团选自吡啶鎓基团、咪唑鎓基团、季铵基团、磺酸根、硫酸根、磷酸根、羟基、胺、亚胺、腈、酰胺、巯基、羧酸、聚醚、醛、硼酸和硼酸酯。
81.根据权利要求80所述的荧光标记试剂，其中所述水溶性基团是羟基基团。
82.根据权利要求46-81中任一项所述的荧光标记试剂，其中所述第一接头或所述第二接头包括三个或更多个羟脯氨酸部分。
83.根据权利要求82所述的荧光标记试剂，其中所述第一接头或所述第二接头包括十个或更多个羟脯氨酸部分。
84.根据权利要求82或83所述的荧光标记试剂，其中所述多个接头中的每个接头包括三个或更多个羟脯氨酸部分。
85.根据权利要求84所述的荧光标记试剂，其中所述多个接头中的每个接头包括十个或更多个羟脯氨酸部分。
86.根据权利要求46-85中任一项所述的荧光标记试剂，其中所述第一接头或所述第二接头还包括甘氨酸部分。
87.根据权利要求46-86中任一项所述的荧光标记试剂，其中所述第一接头或所述第二接头还包括磺基丙氨酸部分。
88.根据权利要求46-87中任一项所述的荧光标记试剂，其中所述第一接头或所述第二接头包括重复单元。
89.根据权利要求88所述的荧光标记试剂，其中所述重复单元包括一个或更多个非蛋白质氨基酸部分。
90.根据权利要求89所述的荧光标记试剂，其中所述重复单元包括五个或更多个非蛋白质氨基酸部分。
91.根据权利要求90所述的荧光标记试剂，其中所述重复单元包括十个或更多个非蛋白质氨基酸部分。
92.根据权利要求91所述的荧光标记试剂，其中所述重复单元包括十个羟脯氨酸部分。
93.根据权利要求88-92中任一项所述的荧光标记试剂，其中所述重复单元包括甘氨酸部分。
94.根据权利要求88-93中任一项所述的荧光标记试剂，其中所述重复单元重复至少三次。
95.根据权利要求46-94中任一项所述的荧光标记试剂，其中当所述荧光标记试剂与所述底物偶联时，所述第一接头在所述第一荧光染料部分和所述底物之间提供至少约30埃
Figure FDA0004184559610000091
的平均物理间隔。
96.根据权利要求95所述的荧光标记试剂，其中当所述荧光标记试剂与所述底物偶联时，所述第一接头在所述第一荧光染料部分和所述底物之间提供至少约60埃
Figure FDA0004184559610000092
的平均物理间隔。
97.根据权利要求96所述的荧光标记试剂，当所述荧光标记试剂与所述底物偶联时，所述第一接头在所述第一荧光染料部分和所述底物之间提供至少约90埃
Figure FDA0004184559610000093
的平均物理间隔。
98.根据权利要求46-97中任一项所述的荧光标记试剂，其中当所述荧光标记试剂与所述底物偶联时，所述第二接头在所述第二荧光染料部分和所述底物之间提供至少约30埃
Figure FDA0004184559610000094
的平均物理间隔。
99.根据权利要求98所述的荧光标记试剂，其中当所述荧光标记试剂与所述底物偶联时，所述第二接头在所述第二荧光染料部分和所述底物之间提供至少约60埃
Figure FDA0004184559610000095
的平均物理间隔。
100.根据权利要求99所述的荧光标记试剂，当所述荧光标记试剂与所述底物偶联时，所述第二接头在所述第二荧光染料部分和所述底物之间提供至少约90埃
Figure FDA0004184559610000096
的平均物理间隔。
101.根据权利要求46-100中任一项所述的荧光标记试剂，其中所述荧光标记试剂还包括可切割性基团，所述可切割性基团被配置为被切割以将所述荧光标记试剂或其部分与所述底物分离。
102.根据权利要求101所述的荧光标记试剂，其中所述可切割性基团被配置为被切割以将所述荧光标记试剂的包括所述多个荧光染料部分和所述多个接头的第一部分与所述荧光标记试剂的第二部分分离。
103.根据权利要求101或102所述的荧光标记试剂，其中所述可切割性基团选自叠氮基甲基基团、二硫键、烃基二硫基甲基基团和2-硝基苄氧基基团。
104.根据权利要求103所述的荧光标记试剂，其中所述可切割性基团是二硫键。
105.根据权利要求101-104中任一项所述的荧光标记试剂，其中所述可切割性基团是通过应用由三(2-羧乙基)膦(TCEP)、二硫苏糖醇(DTT)、四氢吡喃基(THP)、紫外(UV)光及其组合组成的组中的一个或更多个成员可切割的。
106.根据权利要求46-105中任一项所述的荧光标记试剂，其中所述荧光标记试剂包括选自
Figure FDA0004184559610000101
Figure FDA0004184559610000102
中的部分。
107.根据权利要求46-106中任一项所述的荧光标记试剂，其中所述底物是核苷酸、多核苷酸、蛋白质、脂质、细胞、糖、多糖或抗体。
108.根据权利要求107所述的荧光标记试剂，其中所述底物是核苷酸并且所述荧光标记试剂通过所述核苷酸的核碱基而附接到所述核苷酸。
109.根据权利要求107所述的荧光标记试剂，其中所述底物是蛋白质。
110.根据权利要求46-107中任一项所述的荧光标记试剂，其中所述底物是荧光淬灭剂、荧光供体或荧光受体。
111.一种标记的底物，包括所述底物和根据权利要求46-106中任一项所述的荧光标记试剂或其衍生物，其中所述荧光标记试剂与所述底物偶联。
112.根据权利要求111所述的标记的底物，其中所述底物是核苷酸、多核苷酸、蛋白质、脂质、细胞、糖、多糖或抗体。
113.根据权利要求112所述的标记的底物，其中所述底物是蛋白质。
114.根据权利要求113所述的标记的底物，其中所述蛋白质是细胞的组分。
115.根据权利要求112所述的标记的底物，其中所述底物是核苷酸并且所述荧光标记试剂通过所述核苷酸的核碱基而附接到所述核苷酸。
116.根据权利要求111-115中任一项所述的标记的底物，其中所述标记的底物包括与其偶联的附加荧光标记试剂，其中所述附加荧光标记试剂包括附加荧光染料部分和与所述附加荧光染料部分连接的附加接头，其中所述附加接头包括非蛋白质氨基酸。
117.根据权利要求116所述的标记的底物，其中所述荧光标记试剂和所述附加荧光标记试剂包括相同的化学结构。
118.根据权利要求116所述的标记的底物，其中所述荧光标记试剂和所述附加荧光标记试剂包括不同的化学结构。
119.根据权利要求116-118中任一项所述的标记的底物，其中所述标记的底物包括与其偶联的三种或更多种荧光标记试剂。
120.根据权利要求111-119中任一项所述的标记的底物，其中所述底物是荧光淬灭剂、荧光供体或荧光受体。
121.根据权利要求111-120中任一项所述的标记的底物，其中所述标记的底物相对于另一标记的底物减少了淬灭，所述另一标记的底物包括所述底物和另一荧光标记试剂，所述另一荧光标记试剂包括所述多个荧光染料部分且不包括与所述第一接头或所述第二接头具有相同化学结构的接头。
122.根据权利要求111-121中任一项所述的标记的底物，其中所述标记的底物在激发和光学检测时比另一标记的底物提供更高的信号水平，所述另一标记的底物包括所述底物和另一荧光标记试剂，所述另一荧光标记试剂包括所述多个荧光染料部分且不包括与所述第一接头或所述第二接头具有相同化学结构的接头。
123.一种组合物，包括溶液，所述溶液包含荧光标记的核苷酸，其中所述荧光标记的核苷酸包括荧光标记试剂，所述荧光标记试剂包括通过接头而与核苷酸连接的荧光染料部分，其中所述接头包括至少五个非蛋白质氨基酸。
124.根据权利要求123所述的组合物，其中所述至少五个非蛋白质氨基酸的至少一个子集包括环体系。
125.根据权利要求123或124所述的组合物，其中所述至少五个非蛋白质氨基酸的至少一个子集包括水溶性基团。
126.根据权利要求125所述的组合物，其中所述水溶性基团选自吡啶鎓基团、咪唑鎓基团、季铵基团、磺酸根、硫酸根、磷酸根、羟基基团、胺、亚胺、腈、酰胺、巯基、羧酸、聚醚、醛、硼酸和硼酸酯。
127.根据权利要求126所述的组合物，其中所述水溶性基团是羟基基团。
128.根据权利要求123-127中任一项所述的组合物，其中所述至少五个非蛋白质氨基酸的至少一个子集是羟脯氨酸部分。
129.根据权利要求123-128中任一项所述的组合物，其中所述接头包括至少十个非蛋白质氨基酸。
130.根据权利要求129所述的组合物，其中所述接头包括至少二十个非蛋白质氨基酸。
131.根据权利要求130所述的组合物，其中所述接头包括至少三十个非蛋白质氨基酸。
132.根据权利要求123-131中任一项所述的组合物，其中所述接头包括至少一个羟脯氨酸部分。
133.根据权利要求132所述的组合物，其中所述接头包括至少五个羟脯氨酸部分。
134.根据权利要求133所述的组合物，其中所述接头包括至少十个羟脯氨酸部分。
135.根据权利要求134所述的组合物，其中所述接头包括至少二十个羟脯氨酸部分。
136.根据权利要求135所述的组合物，其中所述接头包括至少三十个羟脯氨酸部分。
137.根据权利要求123-136中任一项所述的组合物，其中所述接头还包括一个或更多个甘氨酸部分。
138.根据权利要求123-137中任一项所述的组合物，其中所述接头包括重复单元。
139.根据权利要求138所述的组合物，其中所述重复单元包括一个或更多个非蛋白质氨基酸部分。
140.根据权利要求139所述的组合物，其中所述重复单元包括至少五个非蛋白质氨基酸部分。
141.根据权利要求140所述的组合物，其中所述重复单元包括至少十个非蛋白质氨基酸部分。
142.根据权利要求138-141中任一项所述的组合物，其中所述重复单元包括至少一个羟脯氨酸部分。
143.根据权利要求142所述的组合物，其中所述重复单元包括至少五个羟脯氨酸部分。
144.根据权利要求143所述的组合物，其中所述重复单元包括十个羟脯氨酸部分。
145.根据权利要求138-144中任一项所述的组合物，其中所述重复单元包括甘氨酸部分。
146.根据权利要求138-145中任一项所述的组合物，其中所述重复单元重复至少三次。
147.根据权利要求123-146中任一项所述的组合物，其中所述荧光标记试剂还包括可切割性基团，所述可切割性基团被配置为被切割以将所述荧光染料部分与所述核苷酸分离。
148.根据权利要求147所述的组合物，其中所述可切割性基团选自叠氮基甲基基团、二硫键、烃基二硫基甲基基团和2-硝基苄氧基基团。
149.根据权利要求148所述的组合物，其中所述可切割性基团是二硫键。
150.根据权利要求147-149中任一项所述的组合物，其中所述可切割性基团是通过应用由三(2-羧乙基)膦(TCEP)、二硫苏糖醇(DTT)、四氢吡喃基(THP)、紫外(UV)光及其组合组成的组中的一个或更多个成员可切割的。
151.根据权利要求123-150中任一项所述的组合物，其中所述接头包括选自
Figure FDA0004184559610000141
Figure FDA0004184559610000142
中的部分。
152.根据权利要求123-151中任一项所述的组合物，其中所述接头在所述荧光染料部分和所述核苷酸之间提供至少约30埃
Figure FDA0004184559610000143
的平均物理间隔。
153.根据权利要求152所述的组合物，其中所述接头在所述荧光染料部分和所述核苷酸之间提供至少约60埃
Figure FDA0004184559610000144
的平均物理间隔。
154.根据权利要求153所述的组合物，其中所述接头在所述荧光染料部分和所述核苷酸之间提供至少约90埃
Figure FDA0004184559610000145
的平均物理间隔。
155.根据权利要求123-154中任一项所述的组合物，其中所述溶液包含多个荧光标记的核苷酸，其中所述多个所述荧光标记的核苷酸中的每个荧光标记的核苷酸包括(i)荧光标记试剂，所述荧光标记试剂包括相同类型的荧光染料部分和相同类型的接头，以及(ii)相同类型的核苷酸。
156.根据权利要求155所述的组合物，其中所述多个荧光标记的核苷酸中的每个荧光标记的核苷酸的每个所述接头具有相同的分子量。
157.根据权利要求156所述的组合物，其中所述溶液还包含多个未标记的核苷酸，其中所述多个未标记的核苷酸中的每个核苷酸与所述多个荧光标记的核苷酸中的每个所述核苷酸是相同类型。
158.根据权利要求157所述的组合物，其中所述溶液中所述多个荧光标记的核苷酸与所述多个未标记的核苷酸的比例为至少约1:4。
159.根据权利要求158所述的组合物，其中所述比例为至少约1:1。
160.一种方法，包括将根据权利要求121-157中任一项所述的组合物提供给与核酸链偶联的模板核酸分子。
161.根据权利要求160所述的方法，还包括使所述模板核酸分子和所述组合物经受足以将所述荧光标记的核苷酸掺入与所述模板核酸分子偶联的所述核酸链中的条件。
162.根据权利要求161所述的方法，还包括检测来自所述荧光标记的核苷酸的信号。
163.根据权利要求161或162所述的方法，还包括使所述荧光标记的核苷酸与切割试剂接触，所述切割试剂被配置为从所述核苷酸切割所述多个荧光染料部分。
164.根据权利要求163所述的方法，还包括，在所述使所述荧光标记的核苷酸与所述切割试剂接触之后，使所述模板核酸分子和所述组合物经受足以将附加荧光标记的核苷酸掺入与所述模板核酸分子偶联的所述核酸链中的条件。
165.根据权利要求160-164中任一项所述的方法，其中所述模板核酸分子被固定在支持物上。
166.一种组合物，包括溶液，所述溶液包含荧光标记的核苷酸，其中所述荧光标记的核苷酸包括荧光标记试剂，所述荧光标记试剂包括通过多个接头而与核苷酸连接的多个荧光染料部分，其中所述多个接头中的第一接头与所述多个荧光染料部分中的第一荧光染料部分连接，并且其中所述多个接头中的第二接头与所述多个荧光染料部分中的第二荧光染料部分连接，并且其中所述第一接头包括第一非蛋白质氨基酸并且所述第二接头包括第二非蛋白质氨基酸。
167.根据权利要求166所述的组合物，其中所述第一荧光染料部分和所述第二荧光染料部分具有相同的化学结构。
168.根据权利要求167所述的组合物，其中所述多个荧光染料部分中的每个荧光染料部分具有相同的化学结构。
169.根据权利要求166-168中任一项所述的组合物，其中所述多个荧光染料部分中的每个荧光染料部分在相同波长处或附近发荧光。
170.根据权利要求166所述的组合物，其中所述第一荧光染料部分和所述第二荧光染料部分具有不同的化学结构。
171.根据权利要求166-170中任一项所述的组合物，其中所述荧光标记试剂包括与所述多个接头连接的一个或更多个赖氨酸部分。
172.根据权利要求171所述的组合物，其中所述荧光标记试剂包括与所述多个接头的至少一个子集连接的两个或更多个赖氨酸部分。
173.根据权利要求172所述的组合物，其中所述荧光标记试剂包括与所述多个接头的至少一个子集连接的三个或更多个赖氨酸部分。
174.根据权利要求172所述的组合物，其中所述第一接头与所述两个或更多个赖氨酸部分中的第一赖氨酸部分连接，并且所述第二接头与所述两个或更多个赖氨酸部分中的第二赖氨酸部分连接。
175.根据权利要求174所述的组合物，其中所述第一赖氨酸部分与所述第二赖氨酸部分连接。
176.根据权利要求166-175中任一项所述的组合物，其中所述荧光标记试剂包括三个或更多个荧光染料部分和三个或更多个接头。
177.根据权利要求166-176中任一项所述的组合物，其中所述第一接头和所述第二接头具有相同的化学结构。
178.根据权利要求177所述的组合物，其中所述多个接头中的每个接头具有相同的化学结构。
179.根据权利要求166-176中任一项所述的组合物，其中所述第一接头和所述第二接头具有不同的化学结构。
180.根据权利要求166-179中任一项所述的组合物，其中所述第一接头包括包含第一多个非蛋白质氨基酸的第一多个氨基酸，其中所述第一多个非蛋白质氨基酸包括所述第一非蛋白质氨基酸。
181.根据权利要求180所述的组合物，其中所述第一多个非蛋白质氨基酸的至少一个子集包括环体系。
182.根据权利要求180或181所述的组合物，其中所述第一多个非蛋白质氨基酸包括至少五个非蛋白质氨基酸。
183.根据权利要求182所述的组合物，其中所述第一多个非蛋白质氨基酸包括至少十个非蛋白质氨基酸。
184.根据权利要求183所述的组合物，其中所述第一多个非蛋白质氨基酸包括至少二十个非蛋白质氨基酸。
185.根据权利要求166-184中任一项所述的组合物，其中所述第二接头包括包含第二多个非蛋白质氨基酸的第二多个氨基酸，其中所述第二多个非蛋白质氨基酸包括所述第二非蛋白质氨基酸。
186.根据权利要求185所述的组合物，其中所述第二多个非蛋白质氨基酸的至少一个子集包括环体系。
187.根据权利要求185或186所述的组合物，其中所述第二多个非蛋白质氨基酸包括至少五个非蛋白质氨基酸。
188.根据权利要求187所述的组合物，其中所述第二多个非蛋白质氨基酸包括至少十个非蛋白质氨基酸。
189.根据权利要求188所述的组合物，其中所述第二多个非蛋白质氨基酸包括至少二十个非蛋白质氨基酸。
190.根据权利要求166-189中任一项所述的组合物，其中所述第一非蛋白质氨基酸或所述第二非蛋白质氨基酸包括环体系。
191.根据权利要求166-190中任一项所述的组合物，其中所述第一非蛋白质氨基酸或所述第二非蛋白质氨基酸包括水溶性基团。
192.根据权利要求191所述的组合物，其中所述水溶性基团选自吡啶鎓基团、咪唑鎓基团、季铵基团、磺酸根、硫酸根、磷酸根、羟基、胺、亚胺、腈、酰胺、巯基、羧酸、聚醚、醛、硼酸和硼酸酯。
193.根据权利要求192所述的组合物，其中所述水溶性基团是羟基基团。
194.根据权利要求166-193中任一项所述的组合物，其中所述第一接头或所述第二接头包括三个或更多个羟脯氨酸部分。
195.根据权利要求194所述的组合物，其中所述第一接头或所述第二接头包括十个或更多个羟脯氨酸部分。
196.根据权利要求195所述的组合物，其中所述第一接头或所述第二接头包括二十个或更多个羟脯氨酸部分。
197.根据权利要求196所述的组合物，其中所述第一接头或所述第二接头包括三十个或更多个羟脯氨酸部分。
198.根据权利要求194-197中任一项所述的组合物，其中所述多个接头中的每个接头包括三个或更多个羟脯氨酸部分。
199.根据权利要求198所述的组合物，其中所述多个接头中的每个接头包括十个或更多个羟脯氨酸部分。
200.根据权利要求199所述的组合物，其中所述多个接头中的每个接头包括二十个或更多个羟脯氨酸部分。
201.根据权利要求200所述的组合物，其中所述多个接头中的每个接头包括三十个或更多个羟脯氨酸部分。
202.根据权利要求166-201中任一项所述的组合物，其中所述第一接头或所述第二接头还包括甘氨酸部分。
203.根据权利要求166-202中任一项所述的组合物，其中所述第一接头或所述第二接头还包括磺基丙氨酸部分。
204.根据权利要求166-203中任一项所述的组合物，其中所述第一接头或所述第二接头包括重复单元。
205.根据权利要求204所述的组合物，其中所述重复单元包括一个或更多个非蛋白质氨基酸部分。
206.根据权利要求205所述的组合物，其中所述重复单元包括五个或更多个非蛋白质氨基酸部分。
207.根据权利要求206所述的组合物，其中所述重复单元包括十个或更多个非蛋白质氨基酸部分。
208.根据权利要求204-207中任一项所述的组合物，其中所述重复单元包括至少一个羟脯氨酸部分。
209.根据权利要求208所述的组合物，其中所述重复单元包括至少五个羟脯氨酸部分。
210.根据权利要求209所述的组合物，其中所述重复单元包括十个羟脯氨酸部分。
211.根据权利要求204-210中任一项所述的组合物，其中所述重复单元包括甘氨酸部分。
212.根据权利要求204-211中任一项所述的组合物，其中所述重复单元重复至少三次。
213.根据权利要求166-212中任一项所述的组合物，其中所述荧光标记的核苷酸还包括可切割性基团，所述可切割性基团被配置为被切割以将所述荧光标记的核苷酸的包括所述多个荧光染料部分的所述第一部分与所述荧光标记的核苷酸的包括所述核苷酸的第二部分分离。
214.根据权利要求213所述的组合物，其中所述可切割性基团选自叠氮基甲基基团、二硫键、烃基二硫基甲基基团和2-硝基苄氧基基团。
215.根据权利要求214所述的组合物，其中所述可切割性基团是二硫键。
216.根据权利要求213-215中任一项所述的组合物，其中所述可切割性基团是通过应用由三(2-羧乙基)膦(TCEP)、二硫苏糖醇(DTT)、四氢吡喃基(THP)、紫外(UV)光及其组合组成的组中的一个或更多个成员可切割的。
217.根据权利要求166-216中任一项所述的组合物，其中所述荧光标记的核苷酸包括选自
Figure FDA0004184559610000191
Figure FDA0004184559610000192
中的部分。
218.根据权利要求166-217中任一项所述的组合物，其中所述第一接头在所述第一荧光染料部分和所述核苷酸之间提供至少约30埃
Figure FDA0004184559610000201
的平均物理间隔。
219.根据权利要求218所述的组合物，其中所述第一接头在所述第一荧光染料部分和所述核苷酸之间提供至少约60埃
Figure FDA0004184559610000202
的平均物理间隔。
220.根据权利要求219所述的组合物，其中所述第一接头在所述第一荧光染料部分和所述核苷酸之间提供至少约90埃
Figure FDA0004184559610000203
的平均物理间隔。
221.根据权利要求166-220中任一项所述的组合物，其中所述第二接头在所述第二荧光染料部分和所述核苷酸之间提供至少约30埃
Figure FDA0004184559610000204
的平均物理间隔。
222.根据权利要求221所述的组合物，其中所述第二接头在所述第二荧光染料部分和所述核苷酸之间提供至少约60埃
Figure FDA0004184559610000205
的平均物理间隔。
223.根据权利要求222所述的组合物，其中所述第二接头在所述第二荧光染料部分和所述核苷酸之间提供至少约90埃
Figure FDA0004184559610000206
的平均物理间隔。
224.根据权利要求166-223中任一项所述的组合物，其中所述溶液包含多个荧光标记的核苷酸，其中所述多个所述荧光标记的核苷酸中的每个荧光标记的核苷酸包括(i)荧光标记试剂，所述荧光标记试剂包括多个相同类型的荧光染料部分和多个相同类型的接头，以及(ii)相同类型的核苷酸。
225.根据权利要求224所述的组合物，其中所述多个荧光标记的核苷酸中的每个荧光标记的核苷酸的每个所述接头具有相同的分子量。
226.根据权利要求224或225所述的组合物，其中所述溶液还包含多个未标记的核苷酸，其中所述多个未标记的核苷酸中的每个核苷酸与所述多个荧光标记的核苷酸中的每个所述核苷酸是相同类型。
227.根据权利要求226所述的组合物，其中所述溶液中所述多个荧光标记的核苷酸与所述多个未标记的核苷酸的比例为至少约1:4。
228.根据权利要求227所述的组合物，其中所述比例为至少约1:1。
229.一种方法，包括将根据权利要求166-228中任一项所述的组合物提供给与核酸链偶联的模板核酸分子。
230.根据权利要求229所述的方法，还包括使所述模板核酸分子和所述组合物经受足以将所述荧光标记的核苷酸掺入与所述模板核酸分子偶联的所述核酸链中的条件。
231.根据权利要求230所述的方法，还包括检测来自所述荧光标记的核苷酸的信号。
232.根据权利要求230或231所述的方法，还包括使所述荧光标记的核苷酸与切割试剂接触，所述切割试剂被配置为从所述核苷酸切割所述多个荧光染料部分。
233.根据权利要求232所述的方法，还包括，在所述使所述荧光标记的核苷酸与所述切割试剂接触之后，使所述模板核酸分子和所述组合物经受足以将附加荧光标记的核苷酸掺入与所述模板核酸分子偶联的所述核酸链中的条件。
234.根据权利要求229-233中任一项所述的方法，其中所述模板核酸分子被固定在支持物上。
235.一种方法，包括：
(a)提供根据权利要求1-29或46-106中任一项所述的荧光标记试剂；以及
(b)使所述荧光标记试剂与底物接触以产生荧光标记的底物。
236.根据权利要求235所述的方法，还包括用一种或更多种附加荧光标记试剂重复(a)和(b)一次或更多次，以提供包括所述荧光标记试剂和所述一种或更多种附加荧光标记试剂的荧光标记的底物。
237.根据权利要求236所述的方法，其中用至少两种附加荧光标记试剂重复(a)和(b)至少两次。
238.根据权利要求237所述的方法，其中所述至少两种附加荧光标记试剂和所述荧光标记试剂具有相同的化学结构。
239.根据权利要求238所述的方法，其中所述至少两种附加荧光标记试剂中的至少一种和所述荧光标记试剂具有不同的化学结构。
240.根据权利要求235-239中任一项所述的方法，还包括使所述荧光标记的底物与切割试剂接触，所述切割试剂被配置为从所述荧光标记的底物切割所述荧光标记试剂或其部分以产生有痕底物。
241.根据权利要求240所述的方法，还包括，在产生所述有痕底物之前，使所述荧光标记的底物和核酸分子经受足以将所述荧光标记的底物掺入所述核酸分子中的条件。
242.根据权利要求241所述的方法，还包括，在产生所述有痕底物之前，使附加底物和所述核酸分子经受足以在邻近所述底物的位置处将所述附加底物掺入所述核酸分子中的条件。
243.根据权利要求241所述的方法，还包括，在产生所述有痕底物之后，使附加底物和所述核酸分子经受足以在邻近所述有痕底物的位置处将所述附加底物掺入所述核酸分子中的条件。
244.根据权利要求242或243所述的方法，其中所述附加底物不包括所述荧光标记试剂。
245.根据权利要求242或243所述的方法，其中所述附加底物包括所述荧光标记试剂。
246.根据权利要求240-245中任一项所述的方法，还包括，在产生所述有痕底物之前，检测来自所述荧光标记的底物的信号。
247.根据权利要求235-246中任一项所述的方法，其中所述底物是核苷酸、多核苷酸、蛋白质、脂质、细胞、糖、多糖或抗体。
248.根据权利要求247所述的方法，其中所述底物是蛋白质。
249.根据权利要求248所述的方法，其中所述蛋白质是细胞的组分。
250.根据权利要求248或249所述的方法，其中所述蛋白质是抗体。
251.根据权利要求235-250中任一项所述的方法，其中所述荧光标记的底物被固定到支持物上。
252.一种试剂盒，包括根据权利要求1-29或46-106中任一项所述的多种荧光标记试剂。
253.根据权利要求252所述的试剂盒，其中所述多种荧光标记试剂与一个或更多个底物偶联。
254.根据权利要求253所述的试剂盒，其中所述多种荧光标记试剂与单个底物偶联。
255.根据权利要求253所述的试剂盒，其中所述一个或更多个底物中的底物包括与其偶联的所述多种荧光标记试剂中的至少两种荧光标记试剂。
256.根据权利要求253或255所述的试剂盒，其中所述一个或更多个底物是不同类型的。
257.根据权利要求253-256中任一项所述的试剂盒，其中所述一个或更多个底物包括一个或更多个蛋白质或抗体。
258.根据权利要求253-256中任一项所述的试剂盒，其中所述一个或更多个底物包括一个或更多个核苷酸。
259.根据权利要求258所述的试剂盒，其中所述一个或更多个底物包括多个第一类型的核苷酸和多个第二类型的核苷酸。
260.根据权利要求259所述的试剂盒，其中所述一个或更多个底物还包括多个第三类型的核苷酸和多个第四类型的核苷酸。
261.根据权利要求252-260中任一项所述的试剂盒，其中所述多种荧光标记试剂中的每种荧光标记试剂包括相同的化学结构。
262.根据权利要求252-260中任一项所述的试剂盒，其中所述多种荧光标记试剂包括具有第一化学结构的第一荧光标记试剂和具有第二化学结构的第二荧光标记试剂，其中所述第一化学结构和所述第二化学结构不同。
263.根据权利要求262所述的试剂盒，其中所述第一荧光标记试剂包括第一荧光染料部分，且所述第二荧光标记试剂包括第二荧光染料部分，其中所述第一荧光染料部分和所述第二荧光染料部分具有不同的化学结构。
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