ES2639938T3 - Métodos y composiciones para la secuenciación de ácidos nucleicos - Google Patents

Abstract

Un método de secuenciación por síntesis (SBS) basado en fluorescencia para determinar la secuencia de un polinucleótido que comprende detectar en una reacción de secuenciación la incorporación de tres tipos diferentes de conjugados de nucleótidos detectables en un polinucleótido y determinar la incorporación de un cuarto tipo de nucleótido basado en el patrón de detección de los tres tipos diferentes de nucleótidos detectables en el polinucleótido determinando con ello la secuencia de un polinucleótido, en el que la incorporación de tres tipos diferentes de conjugados de nucleótidos detectables se detecta a partir de un estado de señal; y en el que se detecta un primer nucleótido conjugado, unido a un primer fluoróforo, en un primer canal; se detecta un segundo nucleótido conjugado, unido a un segundo fluoróforo, en un segundo canal; se detecta un tercer conjugado de nucleótidos en el primer canal y en el segundo canal, en el que el tercer conjugado de nucleótidos es una mezcla de conjugados que se diferencian por su unión a un tercer fluoróforo detectado en el primer canal o un cuarto fluoróforo detectado en el segundo canal; y en el que la incorporación del cuarto tipo de nucleótido se determina a partir de un estado oscuro.

Description

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DESCRIPCION

Metodos y composiciones para la secuenciacion de acidos nucleicos Antecedentes

La deteccion de analitos, tales como las secuencias de acidos nucleicos que estan presentes en una muestra biologica, se ha utilizado como un metodo para identificar y clasificar microorganismos, diagnosticar enfermedades infecciosas, detectar y caracterizar anomalfas geneticas, identificar cambios geneticos asociados al cancer, estudiar la susceptibilidad genetica frente a enfermedades, y medir la respuesta frente a diversos tipos de tratamiento. Una tecnica comun para detectar analitos, tales como las secuencias de acido nucleico en una muestra biologica, es la secuenciacion de acidos nucleicos.

La metodologfa de la secuenciacion de acidos nucleicos ha evolucionado significativamente desde los metodos de degradacion qmmica utilizados por Maxam y Gilbert y los metodos de alargamiento de cadenas utilizados por Sanger. Hoy en dfa se utilizan varias metodologfas de secuenciacion que permiten el procesamiento paralelo de miles de acidos nucleicos, todos en una unica secuencia. La instrumentacion que realiza tales metodos es tfpicamente grande y costosa ya que los metodos actuales suelen basarse en grandes cantidades de reactivos costosos y conjuntos multiples de filtros opticos para registrar la incorporacion de los acidos nucleicos en las reacciones de secuenciacion.

Se ha puesto de manifiesto que la necesidad de tecnologfas de secuenciacion de ADN de alto rendimiento, mas pequenas y menos costosas sera beneficiosa para obtener los frutos de la secuenciacion del genoma. La asistencia sanitaria personalizada se esta moviendo hacia la vanguardia y se beneficiara de estas tecnologfas; la secuenciacion del genoma de un individuo para identificar posibles mutaciones y anormalidades sera crucial para identificar si una persona tiene una enfermedad en particular, seguido del desarrollo de terapias posteriores adaptadas a esa persona. Para acomodar un esfuerzo tan potente, la secuenciacion debe avanzar y ser accesible a tecnologfas de alto rendimiento no solo por sus capacidades de alto rendimiento, sino tambien en terminos de facilidad de uso, eficiencia de tiempo y costo, y accesibilidad de los clmicos a los instrumentos y reactivos.

El documento WO 2009/054922 describe un metodo para determinar la identidad de cada una de una serie de residuos de nucleotidos consecutivos en un acido nucleico que comprende:

a) poner en contacto una pluralidad de acidos nucleicos con (i) un analogo de didesoxinucleotido (ddNTP), que comprende un fluoroforo separable unido a una base, en el que cada base tiene un fluoroforo diferente unido y en el que el fluoroforo unido a cada tipo de base difiere en su espectros de excitacion o emision del fluoroforo unido a los otros tipos de bases, (ii) un analogo de desoxinucleotido trifosfato (dNTP), una polimerasa de acido nucleico y al menos dos cebadores,

b) identificar el fluoroforo del analogo de ddNTP que ha formado el enlace fosfodiester, identificando asf la identidad del nucleotido consecutivo,

c) separar el fluoroforo del analogo de ddNTP que ha formado el enlace fosfodiester;

d) repetir iterativamente las etapas a) hasta c);

e) repetir los pasos a) y b).

El documento CN 101 570 784 describe un metodo de secuenciacion de ligacion de ADN basado en la codificacion de la combinacion de senales que utiliza la codificacion de combinacion de senales. El documento CN 101 565 746 describe un metodo de secuenciacion de ADN para codigos combinados de senales con una comprobacion de paridad.

El documento WO2009/097368A describe metodos y composiciones para adquirir la informacion de la secuencia nucleotfdica de secuencias diana usando menos marcadores para distinguir entre nucleotidos, detectando nucleotidos en multiples posiciones de deteccion en una secuencia diana.

Sumario

Las reacciones de secuenciacion basadas en fluorescencia existentes distinguen entre la incorporacion de diferentes nucleotidos en una hebra de acido nucleico creciente uniendo un resto fluorescente a cada uno de los cuatro nucleotidos A, T, C y G. Tfpicamente, cada uno de los restos fluorescentes excita y emite a diferentes longitudes de onda y, por lo tanto, la secuencia diana es determinada. Por el contrario, la presente descripcion proporciona la determinacion de una secuencia, por ejemplo, una secuencia de acido nucleico, utilizando un conjunto colorante mmimo, fuentes de luz de excitacion mmimas y filtros de emision optica minima, al tiempo que permite la diferenciacion de la incorporacion de los cuatro nucleotidos en una reaccion de secuenciacion. La presente descripcion proporciona metodos y composiciones susceptibles a cualquier sistema fluorescente en el que se desea detectar mas de un analito. Sin embargo, se encuentran ventajas particulares cuando se aplican los metodos de la presente invencion a metodologfas de secuenciacion tales como las secuencias por metodologfas de smtesis.

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Los instrumentos y sistemas para detectar la secuenciacion de fluorescencia de cuatro colores son grandes y costosos de ejecutar, no solo debido al coste del instrumento, sino tambien a los reactivos, y por lo tanto no son muy atractivos para ubicaciones mas pequenas y mas limitadas de capital. Los metodos y composiciones que reducinan los costes y/o el tamano asociados con la deteccion de fluorescencia de cuatro colores, por ejemplo para la secuenciacion de genomas, proporcionanan a los investigadores herramientas mas eficientes en terminos de eficiencia de tiempo, menor uso de reactivos, instrumentacion menos costosa y similares para uso en sus empresas de investigacion.

Las realizaciones de la presente descripcion proporcionan esas opciones proporcionando a los investigadores metodos y composiciones para la determinacion de una secuencia polimerica, por ejemplo una secuencia de acido nucleico, que comprende usar un conjunto de colorantes mmimo, fuentes de luz mmimas y filtros de excitacion/emision mmimos, mientras se permite la diferenciacion de los tipos de monomeros (por ejemplo, nucleotidos diferentes) incorporados en una reaccion de secuenciacion.

Las realizaciones descritas en este documento proporcionan la determinacion de la secuencia de un acido nucleico en base a la temporizacion de eventos y la memorializacion de dichos eventos en un "espacio de tiempo". La presente descripcion proporciona realizaciones para el uso de un colorante, o una pluralidad de colorantes del mismo o similar espectro de emision/emision, o dos o mas colorantes de diferentes espectros de fluorescencia, para determinar la presencia de analitos, por ejemplo nucleotidos, en una muestra, utilizando eventos de imagenes basadas en el espacio de tiempo. Como se describe en este documento, las reacciones de secuenciacion de espacio de tiempo utilizan una o mas qmmicas y eventos o etapas de formacion de imagenes para diferenciar entre una pluralidad de analitos, por ejemplo cuatro nucleotidos, que se incorporan en una hebra de acido nucleico en crecimiento durante una reaccion de secuenciacion.

En algunas realizaciones, se pueden detectar menos de cuatro colores diferentes en una mezcla que tiene cuatro nucleotidos diferentes, mientras que todavfa resulta en la determinacion de los cuatro nucleotidos diferentes, por ejemplo en una reaccion de secuenciacion. Como primer ejemplo, se puede detectar un par de tipos de nucleotidos a la misma longitud de onda, pero se distinguen basandose en una diferencia de intensidad para un miembro del par comparado con el otro, o basandose en un cambio en un miembro del par (por ejemplo, mediante modificacion qmmica, modificacion fotoqmmica o modificacion ffsica) que hace que aparezca o desaparezca la senal aparente en comparacion con la senal detectada para el otro miembro del par. Como segundo ejemplo, se pueden detectar tres de cuatro tipos de nucleotidos diferentes bajo condiciones particulares mientras que un cuarto tipo de nucleotido carece de un marcador que sea detectable en esas condiciones, o se detecte mmimamente bajo esas condiciones (por ejemplo, deteccion minima debido a fluorescencia de fondo, etc.). La incorporacion de los tres primeros tipos de nucleotidos en un acido nucleico se puede determinar basandose en la presencia de sus respectivas senales y la incorporacion del cuarto tipo de nucleotido en el acido nucleico se puede determinar basandose en la ausencia o deteccion minima de cualquier senal. Como un tercer ejemplo, un tipo de nucleotido puede incluir marcador o marcadores que se detectan en dos canales diferentes, mientras que otros tipos de nucleotidos se detectan en no mas de uno de los canales.

En un aspecto de la presente invencion, se proporciona un metodo de secuenciacion basada en fluorescencia por smtesis (SBS), segun se define en la reivindicacion 1, que utiliza un primer tipo de nucleotido que se detecta en un primer canal (por ejemplo, dATP que tiene un marcador que se detecta en el primer canal cuando es excitado por una primera longitud de onda de excitacion), un segundo tipo de nucleotido que se detecta en un segundo canal (por ejemplo dCTP que tiene un marcador que se detecta en el segundo canal cuando se excita por una segunda longitud de onda de excitacion), un tercer tipo de nucleotido que se detecta tanto en el primer como en el segundo canal (por ejemplo dTTP que tiene al menos un marcador que se detecta en ambos canales cuando se excita por la primera y/o segunda longitud de onda de excitacion) y un cuarto tipo de nucleotido que carece de un marcador que no es, o es mmimamente detectado en cualquier canal (por ejemplo, dGTP que no tiene marcador).

De esta manera, se puede tratar una serie de caractensticas del acido nucleico con los cuatro tipos de nucleotidos de tal manera que se produzca un evento de extension sustancialmente en todas las caractensticas antes de un evento de deteccion y las caractensticas se detecten en tan solo un evento de imagen, en tan poco como dos eventos de imagen durante el evento de deteccion. Una primera imagen obtenida usando la primera longitud de onda de excitacion y emision en el primer canal puede detectar y mostrar caractensticas que incorporan el primer y/o tercer tipo de nucleotidos (p. ej., A y/o T). Una segunda imagen obtenida usando la segunda longitud de onda de excitacion y emision en el segundo canal puede detectar y mostrar caractensticas que incorporan el segundo y/o tercer tipo de nucleotido (p. ej., C y/o T). La identificacion inequvoca del tipo de nucleotido incorporado en cada caractenstica se puede determinar, por ejemplo, comparando las dos imagenes para llegar a lo siguiente: caractensticas que aparecen (es decir, se detectan) al maximo en el primer canal que incorpora el primer tipo de nucleotido (p. ej., A), caractensticas que se muestran al maximo en el segundo canal que incorpora el segundo tipo de nucleotido (p. ej., C), caractensticas que aparecen en ambos canales que incorporan el tercer tipo de nucleotido (p. ej., T) y caractensticas que no se muestran o que son mmimamente detectables en cualquiera de los canales que incorporan el cuarto tipo de nucleotido (p. ej., G).

Alternativamente, la incorporacion de los cuatro nucleotidos se puede determinar usando solamente un evento de formacion de imagenes combinado. Por ejemplo, la incorporacion de los tipos de nucleotidos marcados puede

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determinate exponiendo los nucleotidos incorporados a dos longitudes de onda de excitacion de una vez (por ejemplo, simultaneamente) y capturando los espectros de emision en una imagen combinada. La identificacion inequvoca de los tipos de nucleotidos incorporados podna determinate como se ha indicado anteriormente; las caractensticas que aparecen en un canal de la imagen combinada indican la incorporacion de ese tipo nucleotfdico marcado (por ejemplo, A), las caractensticas que aparecen en el segundo canal de la imagen combinada indican la incorporacion de ese tipo nucleotfdico marcado (por ejemplo, C) y las caractensticas que aparecen en ambos canales indicana la incorporacion de un tercer tipo de nucleotidos (por ejemplo, T). Como uno de los tipos de nucleotidos no esta marcado (por ejemplo, G) la incorporacion se determina por la ausencia de, o por las caractensticas mmimamente medibles, en ambos canales para ese nucleotido no marcado. Observese que la localizacion de las caractensticas que incorporan G en este ejemplo se puede determinar a partir de otros ciclos (donde al menos uno de los otros tres tipos de nucleotidos se incorpora).

En la presente descripcion, se proporcionan metodos para determinar la secuencia de un polinucleotido que comprende detectar en una reaccion de secuenciacion la incorporacion de tres tipos diferentes de conjugados de nucleotidos detectables en un polinucleotido y determinar la incorporacion de un cuarto tipo de nucleotido basado en el patron de deteccion de los tres tipos diferentes de nucleotidos detectables en el polinucleotido, determinando con ello la secuencia de un polinucleotido, en el que la incorporacion de tres tipos diferentes de conjugados de nucleotidos detectables se detecta a partir de un estado de senal y en el que la incorporacion del cuarto tipo de nucleotido se determina a partir de un estado de oscuridad.

En otra realizacion, la presente descripcion proporciona metodos para determinar la secuencia de un polinucleotido que comprende aplicar a una muestra de polinucleotido para secuenciar una solucion que comprende cuatro tipos de nucleotidos modificados en los que tres tipos de nucleotidos modificados estan conjugados con uno o mas restos de deteccion y uno o mas enlazantes colocados entre el nucleotido y uno o mas restos de deteccion, y en el que un cuarto tipo de nucleotido carece de un resto de deteccion, detectando un patron de incorporacion de dichos nucleotidos modificados en una reaccion de secuenciacion capturando de este modo un primer patron detectable, aplicando una o mas composiciones a la reaccion de secuenciacion, por lo tanto, cambiando el primer patron detectable, detectando un segundo patron detectable y determinando la secuencia de la muestra polinucleotfdica basada en los patrones detectables.

En algunas realizaciones, el polinucleotido para la secuenciacion comprende uno o mas de acidos desoxirribonucleicos, acidos desoxirribonucleicos modificados, acidos ribonucleicos y acidos ribonucleicos modificados. En algunas realizaciones, el polinucleotido para la secuenciacion es una preparacion de biblioteca de ADN genomico. En algunas realizaciones, el conjugado de nucleotidos comprende tipos de nucleotidos seleccionados del grupo que consiste en dATP, dTTP, dUTP, dCTP, dGTP o sus analogos de nucleotidos no naturales. En algunas realizaciones, el analogo de nucleotido no natural comprende un resto terminador reversible y se selecciona del grupo que consiste en rbATP, rbTTP, rbCTP, rbUTP y rbGTP. En algunas realizaciones, la incorporacion de nucleotidos es una secuencia por smtesis, secuencia por ligacion y secuencia por hibridacion o una combinacion de los mismos. En algunas realizaciones, los tres conjugados de tipo nucleotido se detectan detectando un resto fluorescente. En algunas realizaciones, el resto fluorescente es el mismo para los tres conjugados de nucleotidos mientras que en otras realizaciones el resto fluorescente es uno o mas restos fluorescentes diferentes. En algunas realizaciones, el uno o mas restos fluorescentes diferentes son detectados por el mismo filtro de emision. En algunas realizaciones, el resto fluorescente comprende un resto de sistema de transferencia de energfa de resonancia fluorescente. En algunas realizaciones, la incorporacion del cuarto nucleotido se determina por falta de deteccion. En algunas realizaciones, los conjugados de acido nucleico detectables se detectan por fluorescencia. En algunas realizaciones, la fluorescencia se detecta mediante un primer y un segundo evento de formacion de imagenes, en otras realizaciones, los primeros y segundos eventos de formacion de imagenes se separan en el tiempo. En algunas realizaciones, el primer evento de formacion de imagenes detecta un patron de fluorescencia que es diferente del patron de fluorescencia detectado por el segundo evento de formacion de imagenes. En algunas realizaciones, la incorporacion de uno o mas nucleotidos esta determinada por la diferencia en el patron de fluorescencia entre el primer y segundo eventos de formacion de imagenes. En algunas realizaciones, uno o mas conjugados de tipo nucleotfdico comprenden ademas una o mas secuencias enlazantes, en otras realizaciones la una o mas secuencias enlazantes comprenden uno o mas de un enlazante escindible y un enlazante espaciador. En algunas realizaciones, el enlazante escindible comprende uno o mas grupos de enlace escindibles seleccionados del grupo que consiste en un disulfuro, un diol, un diazo, un ester, una sulfona, una azida, un alilo y un eter de sililo, mientras que en realizaciones preferidas el grupo de union escindible es un disulfuro. En algunas realizaciones, el enlazador espaciador es uno o mas de polietilenglicol o sus concatameros y el acido 2-{2-[3-(2-amino-etilcarbomil)- fenoxil-1-azido-etoxi}-etoxi-acetico. En algunas realizaciones, uno o mas enlazantes espaciadores comprenden ademas uno o mas grupos de enlace escindibles en los que el grupo de enlace escindible se selecciona del grupo que consiste en un disulfuro, un diol, un diazo, un ester, una sulfona, una azida, un alilo y un eter de sililo. En algunas realizaciones, el enlazante espaciador es polietilenglicol o sus concatameros, mientras que en otras realizaciones el enlazante espaciador es el acido 2-{2-[3-(2-amino-etilcarbomil)-fenoxil-1-azido-etoxi}-etoxi-acetico. En algunas realizaciones, uno o mas conjugados de nucleotidos comprenden un enlazador de polietilenglicol y un enlazante de acido 2-{2-[3-(2-amino-etilcarbomil)-fenoxil-1-azido-etoxi}-etoxi-acetico que puede o no puede comprender ademas un hapteno y un resto fluorescente. En algunas realizaciones, el hapteno se selecciona del grupo que consiste en biotina, digoxigenina y dinitrofenol. En algunas realizaciones, uno o mas conjugados de

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nucleotidos comprende un conjugado de estreptavidina-resto fluorescente, mientras que en otras realizaciones, uno o mas conjugados de nucleotidos comprenden un conjugado anticuerpo anti-hapteno-resto fluorescente seleccionado del grupo que consiste en anti-digoxigenina y anti-dinitrofenol. En algunas realizaciones, el conjugado de nucleotidos que comprende un enlazante de polietilenglicol y un enlazador de acido 2-{2-[3-(2-amino- etilcarbomil)-fenoxil-1-azido-etoxi}-etoxi-acetico comprende ademas dos restos fluorescentes. En algunas realizaciones, los dos restos fluorescentes constituyen un sistema de transferencia de energfa de resonancia de fluorescencia.

Un aspecto adicional de la presente descripcion proporciona una composicion para uso en el metodo SBS descrito anteriormente para secuenciar un acido nucleico y como se define en la reivindicacion 12, que comprende tres tipos de nucleotidos modificados detectables por un resto fluorescente y un cuarto tipo de nucleotido modificado, en el que dicho cuarto tipo de nucleotido modificado no es detectable por un resto fluorescente y en el que la incorporacion de los cuatro tipos de nucleotidos modificados en la composicion en una reaccion de secuenciacion se determina mediante la deteccion fluorescente de los tres tipos de nucleotidos modificados detectables en la composicion. En algunas realizaciones, el acido nucleico de composicion comprende ADN de una preparacion de biblioteca de ADN. En algunas realizaciones, el tipo de nucleotido modificado comprende un resto terminador reversible y se selecciona del grupo que comprende rbATP, rbTTP, rbUTP, rbCTP y rbGTP. En algunas realizaciones, la reaccion de secuenciacion es una secuencia por smtesis, secuencia por ligacion o secuencia por hibridacion. En algunas realizaciones, el resto fluorescente es el mismo para los tres nucleotidos modificados. En algunas realizaciones, el resto fluorescente es uno o mas restos fluorescentes diferentes que se detectan preferiblemente por el mismo filtro de emision. En algunas realizaciones, la incorporacion de tres tipos de nucleotidos modificados se determina mediante un primer patron de formacion de imagenes fluorescentes y un segundo patron de formacion de imagenes fluorescentes. En algunas realizaciones, la incorporacion del cuarto tipo de nucleotido esta determinada por los patrones de formacion de imagenes de fluorescencia de los otros tres tipos de nucleotidos. En algunas realizaciones, las composiciones descritas en la presente memoria que comprenden uno o mas de los tipos de nucleotidos modificados comprenden ademas una o mas secuencias enlazanteas. En algunas realizaciones, la una o mas secuencias enlazantes comprenden uno o mas de un enlazante escindible y un enlazante espaciador, en el que el enlazante escindible comprende uno o mas grupos de enlace escindibles seleccionados del grupo que consiste en un disulfuro, un diol, un diazo, un ester, una sulfona, una azida, un alilo y un eter de sililo, preferiblemente el grupo de enlace escindible es disulfuro. En algunas realizaciones, el enlazador espaciador es uno o mas de polietilenglicol o sus concatameros y el acido 2-{2-[3-(2-amino-etilcarbomil)fenoxiM-azido-etoxi}-etoxi- acetico, en el que los concatameros de polietilenglicol incluyen entre cuatro y doce moleculas de polietilenglicol. En algunas realizaciones, el uno o mas enlazantes espaciadores comprenden ademas uno o mas grupos de enlace escindibles como se ha descrito anteriormente. En algunas realizaciones, uno o mas de tres tipos de nucleotidos modificados comprenden un enlazante de polietilenglicol y un enlazador de acido 2-{2-[3-(2-amino-etilcarbomil)- fenoxil-1-azido-etoxi}-etoxi-acetico, mientras que algunas realizaciones preferidas comprenden ademas un hapteno y un resto fluorescente. En algunas realizaciones, el hapteno se selecciona del grupo que consiste en biotina, digoxigenina y dinitrofenol. En algunas realizaciones, el hapteno se detecta mediante un conjugado de pareja de union de hapteno-resto fluorescente o un conjugado de anticuerpo anti-hapteno-resto fluorescente. En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-hapteno se selecciona entre anti-digoxigenina y anti-dinitrofenol. En algunas realizaciones, dicha pareja de union de hapteno es estreptavidina. En algunas realizaciones, dichos tipos de nucleotidos modificados detectables por un resto fluorescente se conjugan con uno o mas de un enlazante escindible y un enlazante espaciador o una combinacion de los mismos, en el que un enlazante se conjuga con un resto fluorescente o un hapteno, y en el que un nucleotido modificado que no es detectable por un resto fluorescente no esta conjugado de esa manera.

Una realizacion adicional, segun se describe en el presente documento, proporciona un metodo para determinar una pluralidad de secuencias de acido nucleico que comprende proporcionar una muestra que comprende una pluralidad de diferentes acidos nucleicos, comprendiendo cada acido nucleico una plantilla y un cebador; realizar un ciclo de una reaccion de secuenciacion, en el que el ciclo comprende extender los cebadores para los acidos nucleicos en la muestra para formar una pluralidad de cebadores extendidos que tienen al menos cuatro tipos de nucleotidos diferentes, formando asf una muestra extendida, adquiriendo una primera coleccion de senales de la muestra extendida, en la que no mas de tres de los diferentes tipos de nucleotidos en los cebadores extendidos estan en un estado de senal y en el que al menos uno de los diferentes tipos de nucleotidos en los cebadores extendidos esta en estado oscuro; tratar la muestra extendida con un reactivo modificador, en el que se modifica al menos uno de los diferentes tipos de nucleotidos en los cebadores extendidos, produciendo de este modo una muestra modificada, y adquiriendo una segunda coleccion de senales de la muestra modificada, en la que al menos uno de los diferentes tipos de nucleotidos esta en estado diferente en la primera coleccion de senales comparada con la segunda coleccion de senales; y determinando las secuencias para la pluralidad de diferentes acidos nucleicos mediante la evaluacion de la primera coleccion de senales y la segunda coleccion de senales de los ciclos. En algunas realizaciones, la pluralidad de acidos nucleicos diferentes esta unida a un sustrato. En algunas realizaciones, la extension de los cebadores comprende la adicion catalizada por polimerasa de los diferentes tipos de nucleotidos. En algunas realizaciones, los diferentes tipos de nucleotidos comprenden restos de bloqueo reversibles, con lo que se anade un tipo de nucleotido unico a cada uno de los cebadores extendidos en cada uno de los ciclos. En algunas realizaciones, la extension de los cebadores comprende la adicion catalizada por ligasa de oligonucleotidos que comprenden los diferentes tipos de nucleotidos. Como se discute en este documento, durante la adquisicion de la

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primera coleccion de senales de la muestra extendida, no mas de dos de los diferentes tipos de nucleotidos en los cebadores extendidos estan en un estado de senal, mientras que alternativamente durante la adquisicion de la primera coleccion de senales de la muestra extendida, al menos dos de los diferentes tipos de nucleotidos en los cebadores extendidos estan en un estado oscuro. En algunas realizaciones, uno de los diferentes tipos de nucleotidos en los cebadores extendidos se encuentra en estado oscuro durante la adquisicion de la primera coleccion de senales de la muestra extendida. En algunas realizaciones, el tratamiento de la muestra extendida con un reactivo modificador comprende eliminar un marcador de un tipo de nucleotido o anadir un marcador a un tipo de nucleotido. En algunas realizaciones, al menos dos de los diferentes tipos de nucleotidos en los cebadores extendidos se modifican por el tratamiento de la muestra extendidacon un reactivo modificador, mientras que en otras realizaciones no mas de 3 de los diferentes tipos de nucleotidos en los cebadores extendidos se modifican por el tratamiento de la muestra extendida con un reactivo modificador. En algunas realizaciones, la extension de los cebadores para los acidos nucleicos en la muestra forma una pluralidad de cebadores extendidos que no tienen mas de cuatro tipos de nucleotidos diferentes, mientras que en otras realizaciones la extension de los cebadores para los acidos nucleicos en la muestra forma una pluralidad de cebadores extendidos que tienen al menos cinco tipos de nucleotidos diferentes. En algunas realizaciones, dos de los diferentes tipos de nucleotidos complementan el mismo nucleotido en el acido nucleico y en el que un primer de los dos tipos de nucleotidos diferentes esta en un estado de senal durante la adquisicion de la primera coleccion de senales y en el que un segundo de los dos tipos de nucleotidos diferentes esta en un estado oscuro durante la adquisicion de la primera coleccion de senales. En algunas realizaciones, el primer de los dos tipos de nucleotidos diferentes esta en estado oscuro durante la adquisicion de la segunda coleccion de senales. En algunas realizaciones, el segundo de los dos tipos de nucleotidos diferentes esta en un estado de senal durante la adquisicion de la segunda coleccion de senales. En realizaciones preferidas, se repite una o mas veces un ciclo de reaccion de secuenciacion como el descrito anteriormente.

En otra realizacion, la presente descripcion proporciona un metodo para determinar la secuencia de un polinucleotido que comprende detectar por eventos de formacion de imagenes la incorporacion de tres tipos diferentes de conjugados de nucleotidos detectables en un polinucleotido y determinar la incorporacion de un cuarto tipo de nucleotido basado en el patron de deteccion de los tres tipos diferentes de nucleotidos detectables en el polinucleotido, donde la deteccion comprende menos eventos de formacion de imagenes que los diferentes tipos de conjugados de nucleotidos detectables. En algunas realizaciones, el polinucleotido comprende uno o mas de acidos desoxirribonucleicos, acidos desoxirribonucleicos modificados, acidos ribonucleicos o acidos ribonucleicos modificados. En algunas realizaciones, el conjugado de nucleotidos comprende los tipos de nucleotidos seleccionados del grupo que consiste en dATP, dTTP, dUTP, dCTP, dGTP o analogos de nucleotidos no naturales de los mismos, en los que el analogo de nucleotido no natural comprende un resto terminador reversible y se selecciona del grupo que consiste en rbATP, rbTTP, rbCTP, rbUTP y rbGTP. En algunas realizaciones, la incorporacion de nucleotidos es una secuencia por smtesis, secuencia por ligacion o secuencia por hibridacion. En algunas realizaciones, los tres conjugados de tipo nucleotido se detectan detectando un resto fluorescente, en el que el resto fluorescente es el mismo para los tres conjugados de nucleotidos o en el que el resto fluorescente es uno o mas restos fluorescentes diferentes. En algunas realizaciones, uno o mas restos fluorescentes diferentes son detectados por el mismo filtro de emision. En algunas realizaciones, el resto fluorescente comprende un resto de sistema de transferencia de energfa de resonancia fluorescente. La incorporacion del cuarto nucleotido se determina por falta de deteccion. En algunas realizaciones, los conjugados de acido nucleico detectables se detectan por fluorescencia en la que la fluorescencia es detectada por los eventos de formacion de imagenes. En algunas realizaciones, los eventos de formacion de imagenes comprenden un primer y un segundo evento de formacion de imagenes, por ejemplo, que estan separados en el tiempo. En algunas realizaciones, el primer evento de formacion de imagenes detecta un patron de fluorescencia que es diferente del patron de fluorescencia detectado por el segundo evento de formacion de imagenes. En algunas realizaciones, la incorporacion de uno o mas nucleotidos esta determinada por la diferencia en el patron de fluorescencia entre el primer y segundo eventos de formacion de imagenes. En algunas realizaciones, uno o mas conjugados de tipo nucleotidico comprenden ademas una o mas secuencias enlazantes que comprenden uno o mas de un enlazante escindible y un enlazante espaciador. En algunas realizaciones, el enlazante escindible comprende uno o mas grupos de enlace escindibles seleccionados del grupo que consiste en un disulfuro, un diol, un diazo, un ester, una sulfona, una azida, un alilo y un eter de sililo, preferiblemente el grupo de enlace escindible es un disulfuro. En algunas realizaciones, el enlazador espaciador es uno o mas de polietilenglicol o sus concatameros y el acido 2-{2-[3-(2-amino-etilcarbomil)-fenoxil-1-azido-etoxi}-etoxi- acetico. En algunas realizaciones, uno o mas enlazantes espaciadores comprenden ademas uno o mas grupos de enlace escindibles en los que el grupo de enlace escindible se selecciona del grupo que consiste en un disulfuro, un diol, un diazo, un ester, una sulfona, una azida, un alilo y un eter de sililo. En algunas realizaciones, el enlazador espaciador es polietilenglicol o sus concatameros o el acido 2-{2-[3-(2-amino-etilcarbomil)-fenoxil-1-azido-etoxi}- etoxi-acetico o ambos. En algunas realizaciones, el conjugado de nucleotidos que comprende un enlazante de polietilenglicol y un enlazante de acido 2-{2-[3-(2-amino-etilcarbomil)-fenoxil-1-azido-etoxi}-etoxi-acetico comprende ademas un hapteno y un resto fluorescente, en el que el hapteno se selecciona del grupo que consiste en biotina, digoxigenina y dinitrofenol. En algunas realizaciones, uno o mas conjugados de nucleotidos comprenden un conjugado de estreptavidina-resto fluorescente. En algunas realizaciones, uno o mas conjugados de nucleotidos comprenden un conjugado de anticuerpo anti-hapteno-resto fluorescente seleccionado del grupo que consiste en anti-digoxigenina y anti-dinitrofenol. En algunas realizaciones, el conjugado de nucleotidos que comprende un enlazante de polietilenglicol y un enlazante de acido 2-{2-[3-(2-amino-etilcarbomil)-fenoxil-1-azido-etoxi}-etoxi-acetico

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comprende ademas dos restos fluorescentes. En algunas realizaciones, los dos restos fluorescentes constituyen un sistema de transferencia de energfa de resonancia de fluorescencia. En algunas realizaciones, uno o mas conjugados de nucleotidos comprenden ademas un hapteno o un resto fluorescente, en el que el hapteno se selecciona del grupo que consiste en biotina,digoxigenina y dinitrofenol. En algunas realizaciones, uno o mas conjugados de nucleotidos comprenden un conjugado de estreptavidina-resto fluorescente. En algunas realizaciones, la deteccion de uno o mas conjugados de nucleotidos comprende un conjugado de anticuerpo anti- hapteno-resto fluorescente seleccionado del grupo que consiste en anti-digoxigenina y anti-dinitrofenol.

Figuras

La Figura 1 muestra mapas de calor tipo nube ejemplares, o diagramas de nubes, para ciclos en una reaccion de secuenciacion. Las graficas representan el compuesto de imagen 1 (eje x) e imagen 2 (eje y), de tal manera que las representaciones representan la imagen de fluorescencia despues de un ciclo completo. La ubicacion de A, C, G y T en el diagrama de nubes se demuestra en el mapa del diagrama de nube inferior.

La Figura 2 muestra graficas ejemplares que informan del porcentaje de tasas de error (eje Y) (parte superior) y de los ciclos basales en blanco (parte inferior) en una reaccion de secuenciacion en un ciclo por base de ciclo (eje X).

La Figura 3 muestra A) los espectros de emision para dos colorantes ejemplares y B) un diagrama de nubes ejemplar para un ciclo de secuenciacion cuando se practica la realizacion de usar dos colorantes de diferentes espectros de fluorescencia para la secuenciacion.

La Figura 4 muestra A) los espectros de emision para dos conjuntos de colorantes ejemplares y B) un diagrama de nubes ejemplar para un ciclo de secuenciacion cuando se practica la realizacion de usar dos conjuntos de colorantes de diferentes espectros de emision para la secuenciacion.

La Figura 5 muestra A) la tasa de error de los ciclos basales para un experimento usando un colorante en una reaccion de secuenciacion, B) patrones fluorescentes ejemplares para cada uno de los nucleotidos modificados en un primer evento de imagen (Imagen 1) usando solo un colorante, C) patrones ejemplares fluorescentes para cada uno de los nucleotidos modificados en un segundo evento de imagen (imagen 2) utilizando solo un colorante, y D) un diagrama de nubes combinando el primer y segundo eventos de formacion de imagenes de una reaccion de secuenciacion en la que solo se utilizan un colorante y dos eventos de formacion de imagenes para diferenciar entre los cuatro nucleotidos diferentes presentes para su incorporacion durante una reaccion de secuenciacion.

Descripcion detallada

Las tecnologfas actuales basadas en la fluorescencia utilizadas para diferenciar entre diferentes analitos en una muestra, tal como se encuentran en las tecnologfas de secuenciacion (es decir, tecnologfas de secuenciacion por fluorescencia) se basan, por ejemplo, en la calidad de una senal generada por un resto de deteccion asociado con un tipo particular de nucleotido. Por ejemplo, las tecnologfas de secuenciacion fluorescente tradicionales utilizan fragmentos fluorescentes claramente identificables, cada uno unido a uno de los cuatro nucleotidos A, T, C y G que se utilizan en una reaccion de secuenciacion. Los nucleotidos marcados fluorescentemente utilizados durante una reaccion de secuenciacion, independientemente de su metodo de utilizacion, son tfpicamente excitados y medidos por uno de cuatro filtros opticos (es decir, uno para cada colorante distinto) en un instrumento de secuenciacion fluorescente. La tecnologfa de secuenciacion por smtesis (SBS), asf como la tecnologfa de secuenciacion de terminadores de colorante que utiliza dideoxinucleotidos, son ejemplares de las tecnologfas de secuenciacion basadas en fluorescencia de cuatro canales. La instrumentacion de secuenciacion basada en fluorescencia es tfpicamente grande, costosa y poco atractiva para los medios mas pequenos y mas limitados de capital. Las nuevas tecnologfas de secuenciacion usualmente utilizan metodos, sistemas y composiciones innovadores para avanzar en la precision (es decir, menos errores), tener mayor capacidad de procesamiento (es decir, mas secuencias de genomas por penodo de tiempo dado) y/o reducir costos (es decir, <$ 10.000/genoma), y deseablemente tener una ocupacion de espacio que no exceda el pequeno espacio en la mesa de trabajo de un investigador.

La presente descripcion proporciona soluciones para avanzar en el campo de la secuenciacion de acidos nucleicos. En las realizaciones se describen metodos y composiciones que utilizan restos de deteccion mmimos, por ejemplo preferiblemente un colorante, o una pluralidad de colorantes con caractensticas de deteccion similares, al detectar y diferenciar multiples analitos diferentes, tales como diferentes tipos de nucleotidos, en una muestra, por ejemplo para secuenciacion de muestras. Ademas, la presente descripcion proporciona metodos para determinar la incorporacion de cuatro nucleotidos en una reaccion de secuenciacion utilizando menos de cuatro filtros de deteccion y menos etapas de formacion de imagenes. El uso de menos de cuatro filtros y, por lo tanto, menos etapas de formacion de imagenes permite realizar la secuenciacion en formatos mas pequenos, ya que hay que tener menos filtros de excitacion y emision. Se contempla que los metodos y sistemas descritos en la presente memoria disminuyen las necesidades de hardware del instrumento, disminuyen el tamano del instrumento, el uso de reactivos y los costes al tiempo que aumentan la produccion de datos.

En realizaciones particulares, se proporcionan metodos para determinar una secuencia de subunidades monomericas en un polfmero. Los metodos se ejemplifican en este documento con respecto a polfmeros de acido nucleico y sus subunidades nucleotfdicas, pero pueden llevarse a cabo para otros polfmeros y sus subunidades.

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Aunque los metodos pueden usarse para muestras que tienen una unica secuencia polimerica, los metodos proporcionan ventajas particulares cuando se usan para distinguir varios tipos de subunidades diferentes en una muestra que tiene polfmeros con muchas secuencias diferentes (es decir, una muestra de polfmero multiplex). Por ejemplo, en algunas realizaciones los metodos proporcionan la capacidad de distinguir un numero de diferentes tipos de subunidades en una muestra que es mayor que el numero de diferentes tipos de senales que se adquieren de la muestra. En el caso de una muestra de acido nucleico, se puede realizar una etapa de adquisicion de datos en la muestra para adquirir una coleccion de menos de cuatro tipos de senal diferentes y, sin embargo, la ubicacion de la secuencia para los cuatro tipos de nucleotidos diferentes puede determinarse para la muestra.

Varios aspectos de los metodos, individualmente o en combinacion, proporcionan la capacidad de distinguir una serie de diferentes tipos de subunidades (por ejemplo, diferentes tipos de nucleotidos, diferentes tipos de didesoxinucleotidos, tipos de didesoxinucleotidos modificados, tipos de nucleotidos modificados unidos de forma reversible, etc.) en una muestra de polfmero que es mayor que el numero de tipos de senal diferentes adquiridos a partir de la muestra de polfmero. Los aspectos pueden incluir, pero no se limitan a, correlacionar uno o mas tipos de subunidades monomericas con un estado oscuro, correlacionar uno o mas tipos de subunidades monomericas con un estado de senal, correlacionar uno o mas tipos de subunidades monomericas con un estado gris o correlacionar uno o mas tipo de subunidades monomericas con un cambio de estado entre un estado oscuro, estado gris o estado de senal. Un "estado de senal", cuando se usa en referencia a un evento de deteccion, significa una condicion en la que se produce una senal espedfica en el evento de deteccion. Por ejemplo, una subunidad de nucleotidos puede estar en un estado de senal y ser detectable cuando esta unida a un marcador fluorescente que se detecta en una etapa de deteccion de fluorescencia por excitacion y emision de ese marcador fluorescente en un metodo de secuenciacion. La expresion "estado oscuro", cuando se usa en referencia a un evento de deteccion, significa una condicion en la que no se produce una senal espedfica en el evento de deteccion. Por ejemplo, una subunidad de nucleotidos puede estar en estado oscuro cuando el nucleotido carece de un marcador fluorescente y/o no emite fluorescencia que se detecta espedficamente en un paso de deteccion fluorescente de un metodo de secuenciacion. La deteccion del estado oscuro tambien puede incluir cualquier fluorescencia de fondo que pueda estar presente sin un marcador fluorescente. Por ejemplo, algunos componentes de reaccion pueden demostrar una fluorescencia minima cuando se excitan a ciertas longitudes de onda. Como tal, aunque no haya un resto fluorescente presente puede haber fluorescencia de fondo de tales componentes. Ademas, la fluorescencia de fondo puede ser debida a la dispersion de luz, por ejemplo a partir de reacciones de secuenciacion adyacentes, que pueden ser detectadas por un detector. Como tal, un "estado oscuro" puede incluir una fluorescencia de fondo tal como cuando un resto fluorescente no esta espedficamente incluido, tal como cuando un nucleotido que carece de un marcador fluorescente se utiliza en los metodos descritos en la presente memoria. Sin embargo, se contempla que dicha fluorescencia de fondo es diferenciable desde un estado de senal y, como tal, la incorporacion de nucleotidos de un nucleotido no marcado (o nucleotido "oscuro") es todavfa discernible. La expresion "estado gris", cuando se usa en referencia a un evento de deteccion, significa una condicion en la que se produce una senal atenuada en el evento de deteccion. Por ejemplo, una poblacion de nucleotidos de un tipo particular puede estar en un estado gris cuando una primera subpoblacion de los nucleotidos unidos a un marcador fluorescente se detecta en un paso de deteccion de fluorescencia de un metodo de secuenciacion mientras que una segunda subpoblacion de los nucleotidos carece del marcador fluorescente y no emite fluorescencia que se detecta espedficamente en la etapa de deteccion de fluorescencia.

En realizaciones particulares, el metodo para secuenciar un polfmero se lleva a cabo en ciclos, en el que un ciclo individual incluye una o mas etapas usadas para distinguir un monomero en una posicion particular en el polfmero. Un ciclo puede comprender un evento de deteccion en algunas realizaciones. Sin embargo, un ciclo de secuenciacion no necesita incluir un evento de deteccion, por ejemplo, si la deteccion se lleva a cabo despues de que se llevan a cabo etapas para distinguir uno o mas monomeros en un polfmero. Por ejemplo, un evento de deteccion puede ocurrir a la mitad de un ciclo, al final de un ciclo, al final de 1 A ciclos, al final de dos ciclos, al final de 2 A ciclos, al final de tres ciclos, etc. Un aspecto adicional de los metodos que pueden proporcionar la capacidad de distinguir un numero de diferentes tipos de subunidades en una muestra polimerica, que es mayor que el numero de diferentes tipos de senal adquiridos a partir de la muestra de polfmero, es el uso de dos o mas etapas de adquisicion de senal y al menos una etapa de modificacion de nucleotidos durante un ciclo de secuenciacion individual. Como tal, un metodo de secuenciacion puede incluir varios ciclos de adicion de nucleotidos y los ciclos pueden incluir etapas ortogonales de adquisicion de senales de la muestra de secuenciacion, modificando despues uno o mas nucleotidos en la muestra de secuenciacion para cambiar su estado (por ejemplo, entre un estado de senal, estado de oscuridad o estado gris) y, a continuacion, adquirir un segundo conjunto de senales de la muestra de secuenciacion. Varios ejemplos se exponen con mas detalle a continuacion en los que tipos de nucleotidos particulares estan en un estado de senal debido a un marcador fluorescente unido, tipos de nucleotidos particulares estan en un estado oscuro debido a la ausencia del marcador, se convierten nucleotidos en particular de un estado de senal a un estado oscuro mediante la escision de un enlazante que une un marcador fluorescente y/o nucleotidos particulares se convierten de un estado oscuro a un estado de senal por union de un receptor (por ejemplo, anticuerpo o estreptavidina) que recluta un marcador fluorescente al nucleotido que de otro modo no tema el marcador.

En lugar de detectar diferencias en la calidad de una senal fluorescente, por ejemplo, tal como se practica para algunas tecnologfas de secuenciacion fluorescentes, la presente descripcion proporciona la deteccion de multiples

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analitos diferentes (es dedr, nucleotidos, protemas o fragmentos de los mismos) en una reaccion distinguiendo entre diferencias en la deteccion de un resto fluorescente o dos restos fluorescentes de espectros de excitacion/emision iguales o similares (es decir, excitados por el mismo laser y emision capturados por el mismo filtro optico), en momentos diferentes durante una reaccion, por ejemplo antes y despues de un cambio en las condiciones de reaccion. En algunas realizaciones, los metodos para detectar y determinar un analito comprenden detectar la salida de fluorescencia en dos momentos diferentes durante un ciclo de reaccion.

Tfpicamente, se llevara a cabo un ciclo de reaccion suministrando al menos cuatro tipos de nucleotidos a una muestra de acido nucleico en presencia de una polimerasa, por ejemplo una ADN o ARN polimerasa, durante una reaccion de extension del cebador. La presencia de al menos cuatro tipos de nucleotidos proporciona una ventaja de aumentar la fidelidad de la polimerasa en comparacion con el uso de menos de cuatro tipos de nucleotidos. El uso de etapas ortogonales para convertir uno o mas tipos de nucleotidos incorporados de un estado a otro, permite que multiples tipos de nucleotidos esten presentes simultaneamente durante una reaccion de extension de polimerasa, aumentando asf la fidelidad, permitiendo tambien que se detecte un unico tipo de marcador en cada ciclo, lo que sirve para proporcionar una optica mas simplificada. El uso de una optica simplificada es preferencial en comparacion con sistemas que se basan en una optica mas compleja para registrar la salida de multiples marcadores diferentes para distinguir diferentes tipos de nucleotidos que estan presentes simultaneamente en una reaccion de extension. Se contempla ademas que en algunas realizaciones menos que cuatro tipos diferentes de nucleotidos puedan estar presentes durante una reaccion de extension de polimerasa.

A continuacion se describen algunas realizaciones ilustrativas. Las composiciones y sus metodos de uso no se limitan a estas realizaciones.

En algunas realizaciones, los metodos para secuenciar un acido nucleico comprenden el uso de un resto fluorescente para la deteccion directa o indirecta de tres tipos diferentes de nucleotidos y un tipo de nucleotido que no se detecta por la presencia de una senal fluorescente sino que se detecta por la falta o ausencia de una senal fluorescente. En algunas realizaciones, los metodos para secuenciar un acido nucleico comprenden el uso de dos o mas restos fluorescentes diferentes que comprenden los mismos o similares espectros de excitacion/emision para la deteccion directa o indirecta de tres tipos diferentes de nucleotidos y un tipo de nucleotido que no es detectado por la presencia de una senal fluorescente, sino que se detecta por una falta o ausencia de senal fluorescente. Los mismos o similares espectros de excitacion y emision son tales que un laser excita los dos o mas restos fluorescentes diferentes y un filtro optico capta sus senales de fluorescencia emitidas. La deteccion de la fluorescencia para determinar la secuencia de una muestra de acido nucleico se realiza en un espacio de tiempo, por ejemplo en momentos diferentes durante una reaccion de secuenciacion (es decir, antes y despues de un cambio en las condiciones de reaccion tales como escision enzimatica, cambio en el pH ambiental, adicion de reactivos adicionales), proporcionando patrones de fluorescencia tales como patrones de transiciones de fluorescencia, sus patrones acumulativos determinando la secuencia de la diana del acido nucleico. Como tal, los metodos descritos en la presente memoria son eficaces en terminos de tiempo y de coste y permiten simplificar la instrumentacion de secuenciacion asociada.

Una aplicacion ejemplar de la utilizacion de las diferencias del patron de fluorescencia en el espacio de tiempo para determinar una secuencia de acido nucleico diana es una secuencia por metodologfas y tecnologfas de smtesis (SBS). Como tal, las realizaciones descritas en este documento encuentran utilidad particular en la secuenciacion mediante aplicaciones de fluorescencia de smtesis. Aunque las realizaciones descritas en este documento son ejemplares de metodos innovadores de secuenciacion fluorescente, las realizaciones descritas tambien encuentran utilidad para una variedad de otras aplicaciones en las que se desea la deteccion de mas de un analito (es decir, un nucleotido, una protema o fragmentos de los mismos) en una muestra.

En las realizaciones de desarrollo para la secuenciacion usando un conjunto de colorantes mmimo, la experimentacion revelo estrategias alternativas para distinguir entre incorporaciones de nucleotidos usando solo uno o dos restos fluorescentes. Estas estrategias proporcionan que los cuatro tipos de nucleotidos esten simultaneamente presentes en un ciclo de secuencia, y para el uso de colorantes mmimos y conjuntos de filtros opticos. En algunas realizaciones, no se utilizan mas de tres restos fluorescentes para determinar la incorporacion de los cuatro tipos de nucleotidos que estan presentes durante una reaccion, usando uno o dos filtros de excitacion y emision. En realizaciones preferidas, no se utiliza mas de un resto fluorescente (o dos o tres de los mismos o similares espectros de excitacion/emision) para determinar la incorporacion de los cuatro tipos de nucleotidos que estan presentes durante una reaccion, usando un rango de excitacion de luz y un filtro de emision de deteccion. Se entendera que, en algunas realizaciones, pueden usarse mas de un resto fluorescente (o fragmentos de mas de un rango de excitacion o rango de emision).

En algunas realizaciones, la secuenciacion utilizando un conjunto de colorantes mmimo se realiza sobre un sustrato, tal como un vidrio, un plastico, un chip semiconductor o un sustrato derivado compuesto. En algunas realizaciones, se proporciona una especie de acido nucleico sobre un sustrato, por ejemplo, para la secuenciacion de una diana unica. En otras realizaciones, la secuenciacion tambien puede estar en un formato multiplex, en el que se detectan y secuencian multiples objetivos de acidos nucleicos en paralelo, por ejemplo en un formato de tipo de celda de flujo o de matriz. Las realizaciones descritas en la presente memoria son particularmente ventajosas cuando se practica una secuenciacion paralela o una secuenciacion paralela masiva. Las plataformas que practican la secuenciacion

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paralela fluorescente incluyen, pero no se limitan a, las ofrecidas por Illumina, Inc. (p. ej., HiSeq, Genome Analyzer, MiSeq, plataformas iScan), Life Technologies (por ejemplo SOLiD), Helicos Biosciences (p. ej., Heliscope), 454/Roche Life Sciences (Branford, CT) y Pacific Biosciences (por ejemplo, SMART). Las celulas de flujo, los chips y otros tipos de superficies que pueden acomodar multiples especies de acidos nucleicos son ejemplares de los sustratos utilizados para la secuenciacion paralela. En los formatos multiplex, en los que se secuencian multiples especies de acidos nucleicos en paralelo, las secuencias diana amplificadas clonalmente (por ejemplo, mediante PCR en emulsion (emPCR) o amplificacion en puente) tfpicamente se inmovilizan covalentemente sobre un sustrato. Por ejemplo, cuando se practica la PCR en emulsion, el objetivo de interes se inmoviliza en unas perlas, mientras que las dianas amplificados clonalmente se inmovilizan en canales de una celula de flujo o localizaciones espedficas en una matriz o chip.

Las celulas de flujo para su uso con las composiciones y los metodos que se describen en este documento pueden usarse en la secuenciacion de varias maneras. Por ejemplo, una muestra de ADN, tal como una biblioteca de ADN, se puede aplicar a una celula de flujo o dispositivo flrndico que comprende uno o mas canales de flujo grabados, en el que la celula de flujo puede comprender ademas una poblacion de moleculas de sonda unidas covalentemente a su superficie. Las sondas fijadas en los canales de la celula de flujo estan situadas ventajosamente en diferentes posiciones direccionables en el canal y las moleculas de la biblioteca de ADN pueden anadirse a los canales de la celula de flujo en las que las secuencias complementarias pueden unirse (como se describe en la presente memoria descriptiva ademas como se describe en el documento WO 2012/096703). Otro ejemplo de una celula de flujo para uso en la presente solicitud comprende una celula de flujo CMOS como se describe en la Solicitud de Patente de EE.UU. US2013/0058051. Pueden realizarse amplificaciones de puente como se describe en este documento seguido por la secuenciacion por metodos de smtesis y composiciones como se describe en la presente memoria. Los metodos para crear y utilizar las celulas de flujo para la secuenciacion son conocidos en la tecnica. Se contempla que los metodos y composiciones como se describen en la presente memoria descriptiva no esten limitados a ninguna fabricacion o metodo particular de metodologfas de secuenciacion dirigidas a celdas de flujo.

La secuenciacion utilizando los metodos y composiciones descritos en la presente memoria tambien puede realizarse en una placa de microvaloracion, por ejemplo en placas o laminas de reaccion de alta densidad (Margulies et al, 2005, Nature 437 (7057): 376-380). Por ejemplo, los objetivos genomicos pueden ser preparados por tecnologfas emPCR. Las placas de reaccion o laminas pueden crearse a partir de material de fibra optica capaz de capturar y registrar la luz generada a partir de una reaccion, por ejemplo a partir de una reaccion fluorescente o luminiscente. El material de nucleo puede grabarse para proporcionar pocillos de reaccion discretos capaces de contener al menos una perla de reaccion de emPCR. Dichas laminas/placas pueden contener mas de 1,6 millones de pocillos. Las laminas/placas creadas pueden cargarse con las perlas de reaccion de secuenciacion secuencial emPCR y montarse en un instrumento en el que se proporcionan los reactivos de secuenciacion y se produce la secuenciacion.

Se proporciona un ejemplo de sustratos dispuestos para la secuenciacion de dianas que utilizan composiciones y metodos como se describen en la presente memoria cuando se practican sustratos modelados que comprenden nanobolas de ADN en un chip o lamina, tal como se realiza por Complete Genomics (Mountain View, CA). Como se describe en Drmanac et al., 2010, Science 327 (5961): 78-81, una oblea de silicio se puede recubrir con capas con dioxido de silicio y titanio y posteriormente ser modelado usando fotolitograffa y tecnicas de grabado en seco. La oblea se puede tratar con HMDS y recubrirse con una capa fotorresistente para definir regiones discretas para la silanizacion y posterior union covalente de nanobolas de aDn para la secuenciacion. Cualquier experto en la tecnica apreciara que existen muchos metodos para crear laminas/chips con posiciones discretas para la inmovilizacion de acidos nucleicos para uso en metodologfas de secuenciacion y los presentes metodos no estan limitados por el metodo en el que se prepara un sustrato para la secuenciacion.

Para fines de ilustracion y no destinados a limitar realizaciones como se describe en la presente memoria, un ciclo de secuenciacion de estrategia general puede describirse mediante una secuencia de etapas. El ejemplo siguiente se basa en una secuencia por reaccion de secuenciacion de smtesis, sin embargo los metodos como se describen en este documento no se limitan a ninguna metodologfa de reaccion de secuenciacion particular.

Los cuatro tipos de nucleotidos A, C, T y G, nucleotidos tfpicamente modificados disenados para reacciones de secuenciacion tales como nucleotidos bloqueados reversiblemente (rb) (p. ej., rbA, rbT, rbC, rbG) en los que tres de los cuatro tipos estan marcados fluorescentemente, son simultaneamente anadidos junto con otros componentes de reaccion, a una localizacion en la que se localiza la secuencia plantilla de interes y tiene lugar la reaccion de secuenciacion (por ejemplo, la celula de flujo, el chip, la lamina, etc.). Despues de la incorporacion de un nucleotido en una cadena de acido nucleico de secuencia creciente basada en la secuencia diana, la reaccion se expone a luz y se observa y registra la fluorescencia; esto constituye un primer evento de formacion de imagenes y un primer patron de deteccion de fluorescencia. Despues del primer evento de formacion de imagenes, se pueden anadir uno o mas reactivos qmmicos adicionales a la reaccion de secuenciacion, por lo que el reactivo o los reactivos anadidos pueden cambiar la intensidad de la fluorescencia u otro aspecto qrnmico de la primera reaccion, lo que provoca un cambio identificable y mensurable en la fluorescencia (es decir, un cambio de transicion de la fluorescencia). La ubicacion de la reaccion se ilumina una vez mas y se captura y registra cualquier cambio en la fluorescencia; constituyendo un segundo evento de formacion de imagenes (es decir, un segundo patron de deteccion de fluorescencia). Los bloqueadores presentes en los nucleotidos incorporados se eliminan y se lavan junto con otros

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reactivos presentes despues del segundo evento de formation de imagenes en preparation para el siguiente ciclo de secuenciacion. Reactivos qmmicos ejemplares incluyen, pero no se limitan a, reactivos de escision, conjugados de pareja de union-resto fluorescente u otros reactivos que pueden causar directa o indirectamente un cambio identificable y medible en la fluorescencia desde el primer evento de formacion de imagenes al segundo evento de formacion de imagenes. Se comparan los patrones de fluorescencia de los dos eventos de formacion de imagenes y se determina la incorporation de nucleotidos y, por lo tanto, se determina la secuencia del acido nucleico diana para ese ciclo en particular. El ciclo de estrategia general ejemplar utiliza preferiblemente un resto fluorescente (o mas de uno de igual o similar excitacion/emision) y un filtro de detection de emisiones para determinar la incorporacion de los cuatro tipos de nucleotidos diferentes en una reaction de secuenciacion.

Una via para diferenciar entre las diferentes estrategias para detectar la incorporacion de nucleotidos en una reaccion de secuenciacion utilizando un colorante fluorescente (o dos o mas colorantes de los mismos o similares espectros de excitacion/emision) es caracterizando las incorporaciones en terminos de la presencia o ausencia relativa, o niveles intermedios, de transition de fluorescencia que se produce durante un ciclo de secuenciacion. Como tal, las estrategias de secuenciacion pueden ser ejemplificadas por su perfil fluorescente para un ciclo de secuenciacion. Para las estrategias descritas en la presente memoria, "1" y "0" denota un estado fluorescente en el que un nucleotido esta en un estado de senal (por ejemplo, detectable por fluorescencia) (1) o si un nucleotido se encuentra en estado oscuro (por ejemplo, no detectado o detectado mmimamente en una etapa de formacion de imagenes) (0). Un estado "0" no se refiere necesariamente a una falta total, o ausencia de senal. Aunque en algunas realizaciones puede haber una falta total o ausencia de senal (por ejemplo, fluorescencia). Tambien se contempla que la senal de fluorescencia minima o disminuida (por ejemplo, la senal de fondo) se incluya en el alcance de un estado "0" mientras se pueda distinguir de manera fiable un cambio en la fluorescencia de la primera a la segunda imagen (o viceversa).

En una realization, se ejemplifica una estrategia ejemplar para detectar y determinar la incorporacion de nucleotidos en una reaccion de secuenciacion usando un colorante fluorescente (o dos colorantes de los mismos o similares espectros de excitacion/emision) y dos eventos de formacion de imagenes mediante las siguientes cuadriculas y tablas. Las cuadriculas representan la representation espacial teorica de los datos de secuenciacion tal como se visualiza en el mapa de calor, o diagramas de nubes, por ejemplo, como se ve en la Figura 1.

C (0:1)

™ \ , c \ /

<D V

S’

ro \

E

G(0:0) &

Imagen 1

T(1:1)

A (1:0)

Imagen 1 Imagen 2

A

1 0

C

0 1

G

0 0

T

1 1

En algunas realizaciones de secuenciacion por smtesis (SBS), se anaden simultaneamente cuatro tipos de trifosfato de nucleotido modificado, en este caso trifosfatos de nucleotido bloqueados reversiblemente (rbNTP) a una reaccion de SBS. Los rbNTPs compiten por la incorporacion en la hebra de acido nucleico en crecimiento durante la extension dirigida por plantilla de un cebador. Se contempla que la extension competitiva en presencia de una variedad suficiente de tipos de nucleotidos para complementar todos los tipos de nucleotidos en el acido nucleico plantilla mejora la fidelidad de incorporacion en comparacion con la adicion de nucleotidos uno a la vez a una reaccion de secuenciacion. Los cuatro tipos rbNTP poseen un terminador 3' que comprende, en la position ribosa de la muestra 3', tanto funcionalidades alcoxilo como azido que se pueden separar por escision con un reactivo fosfina, creando de este modo un nucleotido bloqueado de forma reversible y una vez mas funcional para la posterior elongation (es decir, totalmente funcional o ff). Los nucleotidos totalmente funcionales, ffNTP, estan comercialmente disponibles en Illumina, Inc. y son ejemplares de nucleotidos bloqueados reversiblemente, o rbNTPs. En realizaciones preferidas, tres de los cuatro rbNTP comprenden marcadores fluorescentes unidos mediante enlazantes. Los enlazantes pueden comprender uno o mas grupos de escision, o ningun grupo de escision. Por

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ejemplo, un enlazante que asocia uno o mas rbNTP a un fluoroforo puede comprender una azida y/o un grupo alcoxi, por ejemplo sobre el mismo carbono, de tal manera que los enlazantes puedan escindirse despues de cada ciclo de incorporacion por medio de un reactivo de fosfina como se menciona anteriormente, liberando de este modo el resto fluorescente para un alargamiento posterior de la secuencia.

Por ejemplo, la timina rbNTP inicial (rbTTP) puede marcarse fluorescentemente a traves de un enlazante en el que el enlazante comprende un sitio de escision de azida/alcoxi. Otro rbNTP inicialmente marcado fluorescentemente, por ejemplo adenina o rbATP, comprende un enlazante que ademas del grupo alcoxi/azida comprende ademas un segundo sitio de escision como un grupo disulfuro situado entre, por ejemplo, el grupo alcoxi/azida y el marcador fluorescente. El marcador fluorescente asociado con rbATP puede ser el mismo que el marcador fluorescente asociado con rbTTP, o puede ser un marcador fluorescente similar en que comparten caractensticas de espectros de excitacion y emision similares. Un tercer rbNTP, por ejemplo citosina o rbCTP, comprende un resto hapteno, tal como una biotina, en el extremo de un enlazante que contiene alcoxi/azida. En este ejemplo, el rbCTP de partida no esta marcado fluorescentemente y por lo tanto no fluoresce en un primer evento de formacion de imagenes. Sin embargo, el tratamiento subsiguiente con una estreptavidina marcada fluorescentemente provoca la union del conjugado de estreptavidina-resto fluorescente al resto de biotina en el conjugado de rbCTP y despues de dicho tratamiento las posiciones en las que se incorporo rbCTP se fluorescen cuando se exponen a la longitud de onda apropiada de luz y se registra la fluorescencia durante el segundo evento de formacion de imagenes. El cuarto rbNTP, en este caso guanina o rbGTP carece de un resto fluorescente y puede o no estar conjugado con un enlazante, se considera un rbNTP "oscuro" y no fluoresce, o tiene fluorescencia disminuida o minima, en ambos eventos de formacion de imagenes.

La estrategia ejemplar mencionada anteriormente se puede describir adicionalmente de acuerdo con la construccion rbNTP, por ejemplo:

rbTTP-enlazante CS1-FM

rbATP-enlazante CS1-CS2-FM

rbCTP-enlazante-CSI-B

rbGTP

en donde CS1 es un primer sitio de escision (por ejemplo, azida/alcoxi), CS2 es un segundo sitio de escision (por ejemplo, enlace SS), Fm es un resto fluorescente y B es biotina. Se contempla que uno de los sitios de escision es opcional. Un sitio de escision opcional (por ejemplo, dos sitios de escision presentes en un enlazante) puede proporcionar funcionalidad adicional a un ciclo de secuenciacion incluyendo, pero sin limitarse a, escision de todos los restos fluorescentes en un ciclo subsiguiente, reacciones de escision alternativas en ciclos subsiguientes de secuenciacion y/o combinando reacciones de escision en uno o mas ciclos de secuenciacion, o combinaciones de los mismos.

Un esquema de deteccion ejemplar para un ciclo de secuenciacion para el analisis en tiempo real de la secuencia por incorporacion de nucleotidos de smtesis utilizando la estrategia antes mencionada comprende dos eventos de formacion de imagenes y en realizaciones particulares no mas de dos eventos de formacion de imagenes. Los rbNTPs conjugados, rbTTP, rbATP y rbCTP y rbGTP no conjugados (o tal vez conjugados solo con el enlazante) se anaden simultaneamente al comienzo de un ciclo de secuenciacion. La luz de la longitud de onda de excitacion para el resto fluorescente se aplica a la reaccion de secuenciacion y se registra una primera imagen (imagen 1). La primera imagen registra fluorescencia (1) para las incorporaciones de rbATP y rbTTP, pero ninguna fluorescencia o una fluorescencia minima para la incorporacion de rbCTP o rbGTP. Despues del primer evento de formacion de imagenes, se anade DTT por ejemplo a la reaccion que escinde CS2 (enlace disulfuro) en el enlazante de rbATP liberando de este modo el FM y el rbATP de transicion de detectable (1) a indetectable (0) para el segundo evento de formacion de imagenes. La escision de rbATP y el paso de transicion fluorescente resultante proporcionan la diferenciacion de rbATP de los otros eventos de incorporacion de rbNTP durante un ciclo de secuenciacion. Adicionalmente, despues de la primera etapa de formacion de imagenes, se anade a la reaccion una estreptavidina (SA)-FM. La SA se une a la B de la composicion rbCTP haciendo transicion de rbCTP de indetectable (0) a detectable (1) y permitiendo la deteccion de las localizaciones en las que se incorporo rbCTP en la reaccion y proporcionando la diferenciacion de los eventos de incorporacion de rbCTP durante un ciclo de secuenciacion. En este ejemplo, no hay cambios de transicion para rbTTP o rbGTP. Como tal, despues de la aplicacion de la DTT ejemplar y del SA-FM se toma una segunda imagen del ciclo de secuenciacion que da como resultado senales fluorescentes para incorporaciones de rbTTP y rbCTP y ninguna fluorescencia para las incorporaciones de rbATP y rbGTP. Despues de la segunda imagen, se utilizan las transiciones de fluorescencia, o la falta de ellas, para determinar que nucleotido se incorporo en que localizacion en la secuencia por reaccion de smtesis. Cada ciclo posterior sigue el mismo patron de extension de polimerasa-imagen 1-tratamiento qmmico-imagen 2-ciclo siguiente hasta que la operacion de secuenciacion se haya completado. El ciclo puede incluir opcionalmente una etapa de determinacion de nucleotidos. Adicionalmente o alternativamente, la determinacion de nucleotidos o la secuencia de nucleotidos puede ocurrir despues de que uno o mas ciclos esten completos. Tambien se pueden incluir otras

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10

15

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40

etapas por ciclo incluyendo, pero no limitandose a, desbloqueo, lavado y/o pasos adicionales usados en metodos de secuencia por smtesis conocidos en la tecnica.

Se contempla que cualquier numero de sitios de escision potenciales y sus compuestos de escision se pueden utilizar en la estrategia mencionada anteriormente, y los mencionados son solo a modo de ejemplo. Por ejemplo, se pueden usar agentes reductores ademas de DTT (por ejemplo, TCEP, BME, etc.) o reactivos que participan en las reacciones de intercambio de tiol-disulfuro para liberar un resto fluorescente como se ha descrito anteriormente. Ademas, tambien pueden utilizarse parejas de union a haptenos ademas de biotina-estreptavidina (por ejemplo, digoxigenina, dinitrofenol y anticuerpos de los mismos). Ademas, pueden utilizarse uno o mas restos fluorescentes. Sin embargo, si se utilizan dos o mas, es preferible que tengan los mismos o similares espectros de absorcion y emision. Las realizaciones preferidas utilizan un resto fluorescente para la detection de todos los nucleotidos incorporados, o un filtro optico que detecta la emision de una pluralidad de restos fluorescentes.

Se contempla que los reactivos de reaction (es decir, reactivos de escision, reactivos de marcado, etc.) anadidos entre los eventos de formation de imagenes se pueden proporcionar por separado, por ejemplo secuencialmente o combinados y anadidos como un reactivo completo (por ejemplo, una mezcla maestra que comprenda todos los productos qmmicos necesarios para la escision completa, el marcado, etc.). Las realizaciones preferidas comprenden la adicion de una solution reactiva completa o mezcla maestra entre las etapas de formacion de imagenes.

En otra realization a modo de ejemplo, se ejemplifica una segunda estrategia para detectar y determinar la incorporation de nucleotidos en una reaccion de secuenciacion utilizando un colorante fluorescente (o dos colorantes de los mismos o similares espectros de excitacion/emision) y dos eventos de formacion de imagenes por la siguiente tabla y cuadricula de deteccion.

imagen1

Imagen 1 Imagen 2

A

1 1

C

0 1

G

0 0

T

0,5 0,5

Para la segunda estrategia, como se ejemplifica en la primera, se anaden simultaneamente las cuatro composiciones de nucleotido trifosfato (rbNTPs) completamente funcionales a una reaccion SBS. Los rbNTPs compiten por su incorporacion en la hebra de acido nucleico en crecimiento. Los rbNTPs poseen un terminador 3' que comprende tanto funcionalidades alcoxi como azido que son removibles por escision con un reactivo de fosfina creando de este modo un nucleotido que es una vez mas funcional para un alargamiento adicional. En realizaciones preferidas, tres de los cuatro rbNTp comprenden marcadores fluorescentes unidos mediante enlazantes. Los enlazantes pueden comprender uno o mas sitios de escision. Por ejemplo, un enlazante que une uno o mas rbNTP a un fluoroforo puede comprender una azida y/o un grupo alcoxi, por ejemplo sobre el mismo carbono, de modo que los enlazantes puedan ser escindidos despues de cada ciclo de incorporacion por medio de un reactivo de fosfina liberando asi el resto fluorescente para la prolongation de la secuencia adicional.

En la segunda estrategia, el grupo inicial de rbNTP timina comprende una mezcla de moleculas de rbTTP. Por ejemplo, un grupo de rbTTP comprende una relation 2:1 de un rbTTP marcado con fluorescencia (es decir, a traves de un enlazante) y rbTTP marcado no fluorescentemente (es decir, rbTTP oscuro). Se contempla que puede usarse cualquier relacion de rbNTP fluorescente:no fluorescente. Por ejemplo, tambien funcionaran relaciones de 2:1, 1:0,5, 0,5:1 y 1:2, cuya diferencia cambiaria la salida de intensidad de la imagen sin cambiar la capacidad de detectar y diferenciar la incorporacion de nucleotidos. Un rbATP marcado fluorescentemente, un rbGTP no marcado u oscuro y un rbCTP marcado con biotina completan la mezcla de nucleotidos. Un tratamiento subsiguiente con una

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15

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30

estreptavidina marcada fluorescentemente provoca la union de estreptavidina-resto fluorescente al resto biotina en el conjugado rbCTP y despues de dicho tratamiento las posiciones en las que se incorporo rbCTP se fluorescen cuando se exponen a la longitud de onda apropiada de luz y la fluorescencia se registra durante el segundo evento de formation de imagen.

La estrategia ejemplar mencionada anteriormente puede comprender las construcciones rbNTP: rbTTP-enlazante FM/rbTTP-oscuro rbATP-enlazante-FM rbCTP-enlazante-B rbGTP-oscuro

Un esquema de detection ejemplar para un ciclo de secuenciacion para el analisis en tiempo real de la secuencia por incorporation de nucleotidos de smtesis utilizando la estrategia antes mencionada comprende dos eventos de formacion de imagenes y en realizaciones particulares no mas de dos eventos de formacion de imagenes. Los cuatro tipos de rbNTP se anaden simultaneamente al comienzo de un ciclo de secuenciacion. La luz de la longitud de onda de excitation para el resto fluorescente se aplica a la reaction de secuenciacion y se registra una primera imagen (imagen 1). La primera imagen incluye fluorescencia (1) para incorporaciones de rbATP y rbTTP (a 50% de intensidad de fluorescencia), pero ninguna fluorescencia para rbCTP, rbGTP y 1/2 de las incorporaciones de rbTTP. Despues de la primera etapa de formacion de imagenes, se anade a la reaccion un fluoroforo SA-FM marcado con estreptavidina. La SA se une a la B de la composition rbCTP haciendo transition de rbCTP de indetectable (0) a detectable (1) durante el segundo evento de formacion de imagenes y permitiendo la deteccion de localizaciones donde rbCTP se incorporo en la reaccion y proporcionando la diferenciacion de eventos de incorporacion de rbCTP durante un ciclo de secuenciacion. En este ejemplo, no hay cambios de transicion para rbTTP, rbATP o rbGTP. Despues de la segunda imagen, se utilizan las transiciones de fluorescencia, o la falta de ellas, para determinar que nucleotido se incorporo en que localization en la secuencia por reaccion de smtesis y se identifica la secuencia de interes. Cada ciclo subsiguiente sigue el mismo patron de prolongation de polimerasa-imagen 1-tratamiento-imagen 2-ciclo siguiente hasta que la secuenciacion total del objetivo deseado este completa. El ciclo puede incluir opcionalmente una etapa de determination de nucleotidos. Adicionalmente o alternativamente, la determination de nucleotidos o la secuencia de nucleotidos puede ocurrir despues de que uno o mas ciclos esten completos. Tambien se pueden incluir otras etapas por ciclo incluyendo, pero no limitandose a, desbloqueo, lavado y/o pasos adicionales usados en los metodos de secuencia por smtesis conocidos en la tecnica.

En otra realization, se ejemplifica una tercera estrategia para detectar y determinar la incorporacion de nucleotidos en una reaccion de secuenciacion utilizando un colorante fluorescente (o dos colorantes de los mismos o similares espectros de excitacion/emision) y dos etapas de formacion de imagenes mediante la siguiente tabla y cuadricula de deteccion.

imagen2

Imagen 1 Imagen 2

A

1 2

C

0 1

G

0 0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

Imagen 1 Imagen 2

T

1 1

Como se ejemplifica en la primera y segunda, las cuatro composiciones de nucleotido trifosfato (rbNTPs) totalmente funcionales se anaden simultaneamente a una reaccion SBS. Los rbNTPs compiten por su incorporacion en la hebra de acido nucleico en crecimiento. Los rbNTPs poseen un terminador 3' que es removible, creando de este modo un nucleotido que es una vez mas funcional para el alargamiento posterior. La tercera estrategia difiere de las estrategias ejemplares anteriores al incorporar, por ejemplo, por conjugado un rbNTP a un enlazante ramificado. En realizaciones preferidas, dos de los cuatro rbNTP comprenden marcadores fluorescentes unidos mediante enlazantes. Los enlazantes pueden comprender uno o mas sitios de escision. Por ejemplo, un enlazante que asocia uno o mas rbNTP a un fluoroforo puede comprender una azida y/o un grupo alcoxi, por ejemplo sobre el mismo carbono, de tal manera que los enlazantes puedan escindirse despues de cada ciclo de incorporacion por medio de un reactivo de fosfina como se describe anteriormente, liberando de este modo el resto fluorescente para la prolongacion posterior de la secuencia.

En la tercera estrategia ejemplar, los complejos rbATP y rbCTP comprenden enlazantes ramificados. Por ejemplo, rbATP comprende un enlazante ramificado en el que una rama termina con un resto fluorescente y una segunda rama termina en una biotina. En este ejemplo, el rbCTP esta tambien complejado con un enlazante ramificado y cada una de dos ramas termina en una biotina. El rbCTP en este ejemplo esta inicialmente sin marcar. Un rbTTP marcado con fluorescencia y un rbGTP sin marcar u oscuro completan la mezcla de nucleotidos. Un tratamiento subsiguiente con una estreptavidina marcada fluorescentemente provoca una union muy fuerte del estreptavidina- colorante a los restos de biotina en los nucleotidos C y A y despues de tal tratamiento las posiciones donde rbCTP y rbATP se incorporaron fluorescen cuando se exponen a la longitud de onda apropiada de luz y la fluorescencia resultante de la interaccion B-SA se registra durante la segunda etapa de formacion de imagenes.

La estrategia ejemplar mencionada anteriormente como tal puede comprender:

rbATP-enlazante FM y B ramificado

rbTTP-FM

rbCTP-enlazante ramificado-(B)2 rbGTP-oscuro

Un esquema de deteccion ejemplar para un ciclo de secuenciacion para el analisis en tiempo real de la secuencia por incorporacion de nucleotidos de smtesis utilizando la estrategia antes mencionada comprende dos etapas de formacion de imagenes y en realizaciones particulares no mas de dos eventos de formacion de imagenes. Todos los rbNTPs se anaden simultaneamente al comienzo de un ciclo de secuenciacion. La luz de la longitud de onda de excitacion para el resto fluorescente se aplica a la reaccion de secuenciacion y se registra una primera imagen (imagen 1). La primera imagen incluye fluorescencia (1) para las incorporaciones de rbATP y rbTTP, pero ninguna fluorescencia (0) para las incorporaciones de rbCTP y rbGTP. Despues de la primera etapa de formacion de imagenes, se anade a la reaccion un fluoroforo SA-FM marcado con estreptavidina. El SA une las dos biotinas (B2) del conjugado de rbCTP, haciendo la transicion de rbCTP de indetectable (0) a detectable (1) y la B en el enlazante bifurcado de rbATP, aumentando de este modo con eficacia la fluorescencia (2) de la incorporacion de rbATP de la imagen 1 y permitiendo la deteccion de localizaciones en las que rbCTP fue incorporado y diferenciando la incorporacion de rbATP, en la hebra de acido nucleico en crecimiento. En este ejemplo, no hay cambios de transicion para rbTTP o rbGTP. Despues de la segunda imagen, se utilizan las transiciones de fluorescencia, o la falta de ellas, para determinar que nucleotido se incorporo en que localizacion en la secuencia por la reaccion de smtesis y se identifica la secuencia de interes. Cada ciclo subsiguiente sigue el mismo patron de extension de polimerasa-imagen 1-tratamiento-imagen 2-ciclo siguiente hasta que se completa la secuenciacion del objetivo deseado. El ciclo puede incluir opcionalmente una etapa de determinacion de nucleotidos. Adicionalmente o alternativamente, la determinacion de nucleotidos o la secuencia de nucleotidos puede ocurrir despues de que uno o mas ciclos esten completos. Se pueden incluir tambien otras etapas por ciclo que incluyen, pero no se limitan a, desbloqueo, lavado y/u otras etapas utilizadas en metodos de secuencia por smtesis conocidos en la tecnica.

En otra realizacion, una cuarta estrategia ejemplar para detectar y determinar la incorporacion de nucleotidos en una reaccion de secuenciacion usa un colorante fluorescente (o dos colorantes de los mismos o similares espectros de excitacion/emision) y solo una etapa de formacion de imagenes como se ejemplifica mediante la siguiente tabla y cuadncula de deteccion.

imagen3

Imagen 1

A

0,33

C

0,66

G

0

T

1,0

La realization ejemplar mencionada anteriormente puede comprender solamente un colorante, o dos colorantes del mismo o similares espectros de excitacion/emision, en los que la concentration de colorante cambia para cada uno 5 de los tres rbNTP marcados. Un estado oscuro indica la incorporation de, en este caso, rbGTP basado en la interpretation de la medicion de fluorescencia de los tres rbNTP marcados fluorescentemente.

La estrategia ejemplar mencionada anteriormente como tal puede comprender:

rbATP-FM (concentracion 0,33X)

rbTTP-FM (concentracion 1,0X)

10 rbCTP-FM (concentracion 0,66X)

rbGTP-oscuro

Un metodo alternativo descrito en la presente invention comprende un colorante (o dos colorantes del mismo espectro de excitacion/emision o similares) y un evento de imagen es el siguiente:

T (!)

Imagen 1

imagen4

Imagen 1

A

0,50

C

0,75

G

0,25

T

1,0

La estrategia ejemplar mencionada anteriormente como tal puede comprender: rbATP-FM (concentracion 0,50X)

5

10

15

20

25

30

35

40

rbTTP-FM (concentracion 1,0X) rbCTP-FM (concentracion 0,75X) rbGTP-FM (concentracion 0,25X)

El metodo mencionado anteriormente puede comprender un colorante o dos colorantes de espectros de excitacion/emision similares, de modo que cada uno de los cuatro rbNTP se marquen con diferentes concentraciones de colorante. En los metodos en los que cada uno de cuatro rbNTP diferentes estan unidos a una concentracion diferente de un colorante (o dos colorantes de espectros de excitacion/emision similares) solo se toma una imagen por ciclo para determinar la incorporacion de nucleotidos. Un ciclo de secuencia ejemplar que practica metodos de eventos de un colorante/una imagen sena la extension de polimerasa-imagen 1-siguiente ciclo.

Un esquema de deteccion ejemplar para un ciclo de secuenciacion para una secuencia de eventos de un colorante/una imagen por incorporacion de nucleotidos de smtesis utilizando las estrategias antes mencionadas comprende una etapa de formacion de imagenes. Todos los rbNTP se anaden simultaneamente al comienzo de un ciclo de secuenciacion. La luz de la longitud de onda de excitacion para el resto fluorescente se aplica a la reaccion de secuenciacion y se registra una primera imagen (imagen 1). Despues de la primera etapa de formacion de imagenes, se lleva a cabo el siguiente ciclo de adicion de reactivo, extension de polimerasa y adquisicion de imagen hasta completar el numero deseado de ciclos. Despues de la primera imagen, la intensidad de fluorescencia puede correlacionarse con las diferentes concentraciones de colorante que se utilizan para determinar que nucleotido se incorporo en que posicion en la secuencia por reaccion de smtesis y se identifica la secuencia de interes. Cada ciclo subsiguiente sigue el mismo patron de extension de polimerasa-imagen 1 -ciclo siguiente hasta que se completa la secuenciacion del objetivo deseado. El ciclo puede incluir opcionalmente una etapa de determinacion de nucleotidos. Adicionalmente o alternativamente, la determinacion de nucleotidos o la secuencia de nucleotidos puede ocurrir despues de que uno o mas ciclos esten completos. Se pueden incluir tambien otras etapas por ciclo que incluyen, pero no se limitan a, desbloqueo, lavado y/u otras etapas utilizadas en metodos de secuencia por smtesis conocidos en la tecnica.

En realizaciones que practican una secuenciacion de eventos de un colorante/una imagen, se proporcionan concentraciones de colorantes que permiten la diferenciacion de la incorporacion de los nucleotidos marcados y/o no marcados. Ademas, cuando se practica una reaccion de secuenciacion de un colorante/una imagen como se ha ejemplificado anteriormente, no es necesario un tratamiento qmmico adicional como se describio anteriormente para realizaciones para una estrategia de secuenciacion de un colorante/dos imagenes.

En otra realizacion ejemplar, una estrategia adicional para detectar y determinar la incorporacion de nucleotidos en una reaccion de secuenciacion comprende el uso de dos colorantes fluorescentes de diferentes espectros de excitacion y emision y 1) un evento de formacion de imagenes que comprende dos espectros de emision o 2) dos eventos de formacion de imagenes secuenciales.

Para los propositos del ejemplo, la Figura 3A muestra dos colorantes ejemplares, un colorante que emite aproximadamente a 590 AMaximo(DEG527) y un colorante que emite aproximadamente a 720 AMaximo(Dy681). A modo de ejemplo, se realizan las siguientes conjugaciones de rbNTP-colorante:

rbATP-DEG527

rbCTP-Dy681

rbTTP-DEG527/Dy681

RbGTP-oscuro

Como tal, el porcentaje de cada nucleotido incorporado conjugado a un fluoroforo particular. En este ejemplo las conjugaciones son:

RbNTP

Dy681 DEG527 Oscuro

rbatp

100%

rbCTP

100%

rbTTP

50% 50%

rbGTP

100%

Como ejemplo, siguiendo protocolos estandar de SBS, los cuatro nucleotidos se anaden simultaneamente a una reaccion SBS. Los rbNTPs compiten por su incorporacion en la hebra de acido nucleico en crecimiento. Como se ha descrito anteriormente, los rbNTP poseen un terminador 3' que es removible por escision para la elongacion posterior. Despues de la incubacion que permite la incorporacion del nucleotido apropiado en la hebra de acido 5 nucleico en crecimiento, la reaccion se expone a la longitud de onda apropiada de luz dependiendo de que imagen, simultanea o secuencial, se desea. Por ejemplo, la reaccion puede exponerse simultaneamente a la longitud de onda de excitacion de ambos colorantes fluorescentes (en este ejemplo, se excita el DEG527 a aproximadamente 532 nm y se excita el Dy681 a aproximadamente 660 nm) provocando de este modo la emision simultanea de los dos colorantes fluorescentes, cuya emision puede ser detectada simultaneamente por dos diferentes filtros de 10 deteccion y optica de imagen. En dicho sistema simultaneo en el que solo se realiza 1 evento de formacion de imagen para dos canales de deteccion diferentes simultaneamente, los estados de imagen para cada canal de deteccion senan:

Imagen 1-verde Imagen 1-rojo

A

1 0

C

0 1

T

0,5 0,5

G

0 0

Alternativamente, despues de la incorporacion del nucleotido marcado apropiado en la hebra de acido nucleico en 15 crecimiento, los dos colorantes fluorescentes pueden excitarse de una manera paso a paso, tal como primero excitar un fluoroforo seguido de un primer evento de formacion de imagenes y luego excitar el segundo fluoroforo seguido de un segundo evento de formacion de imagenes. En dicho sistema de formacion de imagenes paso a paso se llevan a cabo dos eventos de formacion de imagenes y la tabla de deteccion sena, por ejemplo, si DEG527 se excita primero seguido de Dy681 (por ejemplo, viceversa si la emision de fluorescencia roja es la primera imagen seguida 20 de la fluorescencia verde) los estados de imagen para cada evento de imagen senan:

Imagen 1-verde Imagen 2-rojo

A

1 0

C

1

T

0,5 0,5

G

0 0

En cualquier caso, la incorporacion de una A sena detectada con una cierta intensidad solo en el canal verde, la incorporacion de una C sena detectada con una cierta intensidad en el canal rojo solamente, la incorporacion de una T sena detectada en ambos canales verde y rojo a la mitad de la intensidad de A y C, y G sena mmimamente 25 detectado o no detectado en canales verdes o rojos (Figura 3B). Despues la formacion de imagenes etapa por etapa, el colorante fluorescente y el terminador 3' se escinden y se lleva a cabo el siguiente ciclo de secuenciacion.

Este ejemplo no se limita a dos colorantes o combinaciones de conjugados particulares y se podnan usar dos colorantes de diferentes espectros de fluorescencia en un sistema de secuenciacion de dos colorantes, en cualquier combinacion de combinacion de conjugado de rbNTP-colorante. Por ejemplo, los colorantes representados en el 30 ejemplo anterior emitidos en las longitudes de onda rojas y verdes. Sin embargo, los metodos y sistemas no estan limitados por las longitudes de onda de excitacion o emision (por ejemplo, espectros de fluorescencia) de cualquier colorante particular, ya que cualquier colorante que difiera en los espectros de fluorescencia puede ser potencialmente util. Ademas, el ejemplo describe ciertos conjugados de rbNTP-colorante; sin embargo los conjugados no estan limitados a esas combinaciones particulares. Por ejemplo, cualquiera de los tres rbNTP podna 35 estar potencialmente conjugado con cualquiera de los colorantes listados (un nucleotido que permanece no conjugado u oscuro). Ejemplos de colorantes y derivados de los mismos utiles en las realizaciones descritas en este documento incluyen, pero no se limitan a, los descritos a continuacion.

Adicionalmente, uno o mas conjugados de tipo nucleotido descritos en la estrategia anterior podnan comprender ademas uno o mas enlazantes como se describe en realizaciones y estrategias alternativas. Como tal, una o mas reacciones qmmicas o modificadoras podnan incorporarse en una reaccion de secuenciacion en combinacion con la estrategia en la que dos colorantes de diferentes espectros de fluorescencia se conjugan a diferentes tipos de 5 nucleotidos. Por lo tanto, los conjugados de tipo nucleotido en este ejemplo podnan modificarse adicionalmente de cualquier numero de maneras como se describe en la presente memoria sin desvirtuar la realizacion en la que se pueden emplear dos colorantes de diferentes espectros de fluorescencia para determinar la secuencia de un acido nucleico.

En otra realizacion ejemplar, una estrategia adicional para detectar y determinar la incorporacion de nucleotidos en 10 una reaccion de secuenciacion comprende usar dos conjuntos de colorantes fluorescentes en los que cada conjunto de colorantes comprende dos colorantes de espectros de emision de fluorescencia similares o con emision AMaximo desplazado hasta, por ejemplo, 100 nm, en el que uno de los dos colorantes emite a una intensidad detectablemente mayor que el otro colorante en el conjunto y en el que los dos conjuntos de colorantes fluorescentes difieren en los espectros de emision de fluorescencia. En realizaciones preferidas, el colorante en un 15 conjunto de colorantes que es detectablemente de mayor intensidad que el otro colorante en el conjunto es al menos 0,5X, al menos 0,75X, al menos 1X, al menos 2X tan intenso como el colorante de intensidad mas baja. Cuando se practican dos conjuntos de colorantes fluorescentes como se describe en el presente documento, la determinacion de la secuencia puede ser a traves de un evento de formacion de imagenes o dos eventos de formacion de imagenes.

20 Para los propositos del ejemplo, la Figura 4A muestra dos conjuntos de colorantes ejemplares; tanto DEG527 como Atto532 pueden detectarse juntos (emision de fluorescencia desde aproximadamente AMaximo 555-595nm) y Dy681 y SO7181 pueden detectarse juntos (emision de fluorescencia de aproximadamente AMaximo 670-715 nm). A modo de ejemplo, se realizan las siguientes conjugaciones de rbNTP-colorante:

rbATP-DEG527

25 rbCTP-Dy681

rbTTP-Atto532/SO7181

RbGTP-oscuro

Como tal, el porcentaje de cada nucleotido incorporado conjugado a un fluoroforo particular en este ejemplo es:

rbNTP

S07181 Dy681 Atto532 DEG527 Oscuro

rbatp

100%

rbCTP

100%

rbTTP

50% 50%

rbGTP

100%

30 Como ejemplo, siguiendo protocolos estandar de SBS, los cuatro nucleotidos se anaden simultaneamente a una reaccion SBS. Los rbNTP compiten por su incorporacion en la hebra de acido nucleico en crecimiento. Como se ha descrito anteriormente, los rbNTP poseen un terminador 3' que es removible por escision para la elongacion posterior. Despues de la incubacion que permite la incorporacion del nucleotido apropiado en la hebra de acido nucleico en crecimiento, la reaccion se expone a una primera longitud de onda de luz, se realiza un primer evento de 35 formacion de imagenes, entonces la reaccion se expone a la segunda longitud de onda de luz y se realiza un segundo evento de formacion de imagenes.

Por ejemplo, despues de la incorporacion del nucleotido marcado apropiado en la hebra de acido nucleico en crecimiento, los dos conjuntos de colorantes fluorescentes pueden excitarse de una manera paso a paso, tal como primero excitar un conjunto de fluoroforos seguido de un primer evento de formacion de imagenes y luego excitar el 40 segundo conjunto de fluoroforos seguido por un segundo evento de formacion de imagenes. Como ejemplo, si DEG527/Atto532 es excitado primero seguido por Dy681/SO7181 (por ejemplo, viceversa si la emision de fluorescencia roja es la primera imagen seguida de fluorescencia verde) los estados de imagen para cada evento de imagen senan:

Imagen 1-verde

Imagen 2-rojo

5

10

15

20

25

30

35

Imagen 1-verde Imagen 2-rojo

A

1 0

C

0 1

T

>1 >1

G

0 0

Los estados de imagen para T se enumeran como > 1 para cada evento de imagen. La designacion de > 1 supone que el colorante de intensidad mas alta es al menos mayor en intensidad que el del colorante de intensidad mas baja en el par de colorantes.

Alternativamente, la reaccion puede exponerse simultaneamente a la longitud de onda de excitacion de ambos colorantes fluorescentes, provocando de este modo la emision simultanea de los dos colorantes fluorescentes, cuya emision puede ser detectada simultaneamente por dos filtros de deteccion y optica de imagen diferentes. En dicho sistema simultaneo en el que solo se realiza 1 evento de formacion de imagen para dos canales de deteccion diferentes simultaneamente, los estados de imagen para cada canal de deteccion senan:

Imagen 1-verde Imagen 1-rojo

A

1 0

C

0 1

T

>1 >1

G

0 0

En cualquier caso, la incorporacion de una A sena detectada con una cierta intensidad solo en el canal verde y la incorporacion de una C se detectana con una cierta intensidad solo en el canal rojo. Sin embargo, debido al aumento de la intensidad de los colorantes que se conjugan con rbTTP en comparacion con los colorantes de intensidad mas baja conjugados con el rbATP y el rbCTP, se contempla que la incorporacion de una T se detectara tanto en los canales verdes como en los rojos a igual o mayor intensidad de A y C. Una vez mas, en este ejemplo la incorporacion de G sena mmimamente detectada o no detectada en los canales verdes o rojos.

La Figura 4B muestra un mapa de nubes de calor que demuestra la deteccion de rbTTP incorporado en comparacion con rbCTP y rbATP cuando se practican los dos conjuntos de colorantes descritos, en donde un colorante es de intensidad mayor que el otro colorante en el conjunto. Despues de las etapas de formacion de imagenes, el colorante fluorescente y el terminador 3' se escinden y se lleva a cabo el siguiente ciclo de secuenciacion.

Adicionalmente, uno o mas conjugados de tipo nucleotido descritos en este ejemplo podnan comprender ademas uno o mas enlazantes como se describe en realizaciones alternativas. Como tal, se podnan incorporar una o mas reacciones qmmicas o modificadoras en una reaccion de secuenciacion en combinacion con la estrategia en la que dos conjuntos de colorantes de diferentes espectros de emision se conjugan a diferentes tipos de nucleotidos. Por lo tanto, los conjugados de tipo nucleotido en este ejemplo podnan modificarse adicionalmente de cualquier numero de formas como se describe en la presente memoria sin desvirtuar la realizacion en la que se pueden emplear dos conjuntos de colorantes de diferentes espectros de emision para determinar la secuencia de un acido nucleico.

Ademas, este ejemplo no se limita a dos conjuntos de colorantes o combinaciones de conjugados particulares y podnan usarse cualesquiera dos conjuntos de colorantes de diferentes espectros de emision, en cualquier combinacion de combinacion de conjugado de rbNTP-colorante mientras se sigue la estrategia de conjugacion como se describe en la presente memoria (por ejemplo, dos tipos de nucleotidos se conjugan a diferentes colorantes de menor intensidad y un tipo de nucleotido se conjuga con dos colorantes de intensidad mas alta). El ejemplo que describe el uso de dos conjuntos de colorantes para metodos de secuenciacion no esta limitado a ningun conjunto particular de dos colorantes y se pueden usar conjuntos de colorantes de diferentes espectros de fluorescencia en el sistema de secuenciacion como se describe en la presente memoria. Los conjuntos de colorantes adicionales comprenden aquellos que tienen un desplazamiento de Amax de emision de al menos 60 nm, al menos 70 nm, al

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menos 80 nm, al menos 90 nm, al menos 100 nm, preferiblemente al menos 100 nm. Ejemplos de conjuntos de colorantes incluyen, pero no se limitan a, Atto465, 488, 495/Atto514, 520, 532, 550, 565; Atto 520, 532, 550/Atto565, 590, 594, Rho11, Rho 12, Rho 13; Atto 647, 655, 665/Atto 680, 700, 725; Alexa 647, 660, Cy5/Alexa 680, 700, Cy5.5; Alexa532, Cy3/Alexa555, 556, 578, 590, Cy3,5; Alexa 488/Alexa532, 555, 556, 578; Dy 647, 648, 649, 650, 651,652, 654/Dy675, 676, 677, 678, 679, 680, 681,682, 700, 701,703, 704; Dy490, 495, 505/Dy530, 547, 548, 549, 550, 554, 555, 556, 560; Dy530, 547, 548, 549, 550, 554, 555, 556, 560/Dy590, 591,594, 605, 610, 615.

Las estrategias anteriores son de naturaleza ejemplar, describen solo varias de muchas estrategias potenciales y sirven para proporcionar una gma subyacente a los metodos y composiciones innovadores descritos en la presente memoria para utilizar un resto fluorescente, o una pluralidad de restos fluorescentes de los mismos o similares espectros de excitacion/emision, para la secuenciacion de un acido nucleico. Cualquier experto en la materia comprendera que las diferentes estrategias proporcionan una gma para crear estrategias adicionales que utilizan un resto fluorescente o una pluralidad de restos fluorescentes del mismo espectro de excitacion/emision o similar, para secuenciar un acido nucleico y estar todavia dentro del alcance de los metodos descritos en la presente memoria.

En una realization, un conjugado de rbNTP como se describe en la presente invention comprende

la detection del resto 0 restos 'AAA/' enlazante(s) 'A/W' base

imagen5

en el que un resto de deteccion es uno o mas de un resto fluorescente, un hapteno o combinaciones de los mismos, en el que un enlazante es uno o mas de un enlazante espaciador, un enlazante con uno o mas sitios de escision, o combinaciones de los mismos, en donde una base es una de tres nucleotidos modificados (por ejemplo, rbNTPs) en donde X es un monofosfato, difosfato o trifosfato y en donde R1 es -H, -OH, -OCH2N3 o cualquier grupo que puede ser transformado en un -OH, incluyendo carbonilo unido covalentemente al carbono 3'.

En algunas realizaciones, un resto de deteccion es un resto fluorescente. En algunas realizaciones, un resto de deteccion es un hapteno que es detectable a traves de un conjugado de pareja de union-resto fluorescente. En algunas realizaciones, un conjugado de rbNTP comprende uno o ambos de un resto fluorescente y un hapteno unido a un rbNTP a traves de uno o mas enlazantes. En algunas realizaciones, un hapteno es una biotina, digoxigenina (DIG) o dinitrofenol (DNP). En algunas realizaciones, se detecta un hapteno mediante un conjugado de pareja de union-resto fluorescente. En algunas realizaciones, la pareja de union es una molecula pequena o un anticuerpo o fragmento del mismo, por ejemplo estreptavidina, anti-DlG o anti DNP.

Ejemplos de restos fluorescentes, o derivados de los mismos, para uso como restos fluorescentes de acuerdo con las realizaciones descritas incluyen, pero no se limitan a, fluorescema y derivados de fluorescema tales como carboxifluorescema, tetraclorofluorescema, hexaclorofluorescema, carboxinaftofluorescema, isotiocianato de fluorescema, NHS-fluorescema, iodoacetamidofluorescema, maleimida de fluorescema, SAMSA-fluorescema, fluorescema tiosemicarbazida, carbohidrazinometiltioacetil-amino fluorescema, rodamina y derivados de rodamina tales como TRITC, TMR, lisamina rodamina, Texas Red, rodamina B, rodamina 6G, rodamina 10, NHS-rodamina, TMR-iodoacetamida, cloruro de sulfonilo de lisamina rodamina B , sulfonil hidracina de lisamina rodamina B, cloruro de sulfonilo de Texas Red, hidrazida de Texas Red, coumarina y derivados cumarrnicos tales como AMCA, AMCA- NHS, AMCA-sulfo-NHS, AMCA-HPDP, DCIA, AMCE-hidrazida, BODIPY y derivados tales Como BODIPY FL C3-SE, BODIPY 530/550 C3, BODIPY 530/550 C3-SE, BODIPY 530/550 C3 hidrazida, BODIPY 493/503 C3 hidrazida, BODIPY FL C3 hidrazida, BODIPY FL IA, BODIPY 530/551 IA, Br-BODIPY 493/503, Cascade Blue y derivados tales como Cascade Blue acetil azida, Cascade Blue cadaverina, Cascade Blue etilendiamina, hidracida Cascade Blue, Lucifer Yellow y derivados tales como Lucifer Yellow yodoacetamida, Lucifer Yellow CH, cianina y derivados tales como colorantes de cianina basados en indolio, colorantes de cianina basados en benzo-indolio, colorantes de cianina basados en piridio, colorantes de cianina basados en tiozolio, colorantes de cianina basados en quinolinio, colorantes de cianina basados en imidazolio, Cy3, Cy5, quelatos de lantanidos y derivados tales como BCPDA, TBP, TMT, BHHCT, BCOT, quelatos de Europio, quelatos de Terbium, colorantes Alexa Fluor, colorantes DyLight, colorantes Atto, colorantes LightCycler Red, colorantes CAL Flour, JOE y sus derivados, colorantes de Oregon Green, colorantes WellRED, colorantes IRD, colorantes de ficoeritrina y ficobilina, estilbeno, colorantes de DEG (por ejemplo como los descritos en el documento de EE.UU. 2010/0009353), Colorantes NR, colorantes cercanos al infrarrojo y otros conocidos en la tecnica tales como los descritos en Haugland, Molecular Probes Handbook, (Eugene, OR) 6a Editien; el catalogo de Synthegen (Houston, TX.), Lakowicz, Principles of Fluorescence Spectroscopy, 2a edition, Plenum Press New York (1999), Hermanson, Bioconjugate Techniques, 2a edition, documento de EE.UU 2010/0009353 o el documento Wo 98/59066.

En algunas realizaciones, un resto de deteccion se conjuga a un rbNTP a traves de un enlazante. En algunas realizaciones, un conjugado de rbNTP comprende uno o mas de un enlazante. En algunas realizaciones, un enlazante es un enlazante espaciador que esta conjugado en un extremo a un rbNTP y en el otro a un resto de

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deteccion. En algunas realizaciones, un enlazante espaciador comprende uno o mas grupos de escision. Por el contrario, en algunas realizaciones un conector espaciador no contiene ningun grupo de escision. En una realizacion, un enlazador espaciador (por ejemplo, con o sin un grupo de escision) es una molecula de polietilenglicol (PEG) o sus concatameros. Por ejemplo, en algunas realizaciones, un enlazante espaciador comprende concatameros de al menos dos, de al menos tres, de al menos cuatro, de al menos cinco, de al menos seis, de al menos siete, de al menos ocho, de al menos diez o de al menos doce moleculas de PEG.

En realizaciones preferidas, los enlazantes espaciadores utilizados para conjugar un rbNTP con un resto de deteccion, por ejemplo un resto fluorescente o un hapteno, comprenden al menos de cuatro a doce concatameros de PEG (es decir, PEG4, PEG 8, PEG 12). En algunas realizaciones, un enlazante espaciador comprende acido 2-{2- [3-(2-amino-etilcarbomil)-fenoxil-1-azido-etoxi}-etoxi-acetico. En algunas realizaciones, el enlazante espaciador que comprende acido 2-{2-[3-(2-amino-etilcarbomil)-fenoxil-1-azido-etoxi}-etoxi-acetico comprende uno o mas grupos de escision. En algunas realizaciones, un rbNTP esta unido a dos enlazantes espaciadores (por ejemplo, enlazantes separados de un constructo enlazante bifurcado), que pueden ser iguales o diferentes, cada uno de los cuales termina en un resto de deteccion. En algunas realizaciones, dos enlazantes espaciadores comprenden un PEG y un enlazador de acido 2-{2-[3-(2-amino-etilcarbomil)-fenoxil-1-azido-etoxi}-etoxi-acetico, uno o ambos de los cuales pueden o no comprender uno o mas grupos de escision, que terminan en un resto de deteccion. En algunas realizaciones, dos enlazantes espaciadores pueden ser dos enlazantes PEG que pueden ser de longitudes iguales o desiguales (por ejemplo, un PEG4 y el otro PEG12), cada uno de los enlazantes PEG terminando en un resto de deteccion, ademas con o sin un grupo de escision.

Se pueden encontrar ejemplos de enlazantes en, por ejemplo, las patentes de Estados Unidos 7.816.503, 7.771.973, y la solicitud de patente 2010/00317531). Los metodos y composiciones como se describen en este documento no estan limitados por ningun enlazante espaciador particular y las alternativas seran facilmente evidentes para cualquier experto en la tecnica y se consideran dentro del alcance de la presente descripcion.

En algunas realizaciones, un enlazante espaciador comprende uno o mas grupos de escision. Los grupos de escision para uso en los metodos como se describen en este documento pueden incluir, pero no se limitan a, grupos disulfuro, grupos de acido labil, grupos Sieber, grupos indol, grupos t-butilo Sieber, grupos escindibles por electrofilia, grupos escindibles por nucleofilo, grupos fotoescindibles, grupos de escision que se escinden en condiciones reductoras, condiciones oxidativas, escision mediante el uso de grupos de captura de seguridad, escision por mecanismo de eliminacion y grupos escindibles asistidos por metal. Tal como se utiliza en este documento, la expresion "enlazante escindible" se considera equivalente a un enlazante espaciador que comprende uno o mas grupos de escision. Se puede encontrar una discusion de los enlazantes en, por ejemplo, Guiller et al, 2000, Chem. Rev. 100: 2091-2157 y segun lo dispuesto en la patente de EE.UU. 7.771.973. Los metodos y composiciones como se describen en la presente memoria descriptiva no estan limitados por ningun grupo de division particular y las alternativas seran facilmente evidentes para cualquier experto en la tecnica y se consideran dentro del alcance de la presente descripcion.

En algunas realizaciones, los nucleotidos modificados bloqueados reversiblemente como se describe en la presente memoria se unen a una molecula pequena a traves de un enlazante. En algunas realizaciones, el enlazante comprende uno o mas grupos escindibles y puede ser referido como un enlazante escindible. Los grupos escindibles incluyen, pero no se limitan a, disulfuro, diol, diazo, ester, sulfona azida, eteres de alilo y silileter, azida y alcoxi. En realizaciones preferidas, uno o mas de un grupo azida, un grupo alcoxi y un grupo disulfuro esta asociado con el nucleotido bloqueado reversiblemente (rbNTP) con otra molecula, por ejemplo un hapteno o un resto de deteccion, o ambos, para uso en metodos como se describen en la presente memoria. La incorporacion de un enlace disulfuro en un enlazante como se describe en el presente documento se puede llevar a cabo de varias maneras, por ejemplo como se proporciona en este documento, tal como se encuentra en la patente de EE.UU. 7.771.973, o como se describe en Hermanson, Bioconjugate Techniques, Segunda Edicion, Academic Press.

En algunas realizaciones, una composicion que comprende un agente de escision se anade a una reaccion de secuenciacion para escindir un grupo de escision en un conector espaciador de un conjugado rbNTP. El agente de escision anadido depende del grupo de escision presente. Por ejemplo, la escision de enlaces disulfuro u otros grupos de escision reductores se lleva a cabo mediante un agente reductor. La reduccion de un enlace disulfuro da como resultado la liberacion del rbNTP a partir de la molecula unida, por ejemplo un hapteno, un conjugado de hapteno y/o un resto de deteccion tal como un resto fluorescente. Los agentes reductores utiles en la practica de las realizaciones como se describen en este documento incluyen, pero no se limitan a, compuestos de fosfina, fosfinas solubles en agua, fosfinas que contienen nitrogeno y sales y derivados de las mismas, ditioeritritol (DTE), ditiotreitol (DTT) (isomeros cis y trans, respectivamente, de 2,3-dihidroxi-1,4-ditiolbutano), 2-mercaptoetanol o p- mercaptoetanol (BME), 2-mercaptoetanol o aminoetanotiol, glutation, tioglicolato o acido tioglicolico, 2,3- dimercaptopropanol y tris(2-carboxietil)fosfina (TCEP),, tris(hidroximetil)fosfina (THP) y acido p-

[tris(hidroximetil)fosfino]propionico (THPP). En algunas realizaciones, un agente reductor usado para escindir un enlace disulfuro en un enlazante como se describe en este documento es DTT. En algunas realizaciones, la concentracion de un reactivo reductor, por ejemplo DTT, utilizado para escindir un enlace disulfuro es de al menos 1 a 1000 mM, al menos 20 a 800 mM, al menos 40 a 500 mM y preferiblemente al menos 50 a 200 mM. En algunas realizaciones, un agente reductor usado para escindir un enlace disulfuro en un enlazante como se describe en este documento es un reactivo de fosfina, un reactivo de fosfina soluble en agua, un reactivo de fosfina que contiene

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nitrogeno y sales y derivados de los mismos Los reactivos de fosfina ejemplares incluyen, pero no se limitan a, TCEP, THP y los descritos en la publicacion de patente de EE.UU. 2009/0325172 tales como triaril fosfinas, trialquil fosfinas, fosfinas que contienen sulfonato y carboxilato y fosfinas solubles en agua derivatizadas. En algunas realizaciones, la concentracion de una fosfina utilizada para escindir un enlace disulfuro es al menos 0,5-500 mM, al menos de 5 a 50 mM, y preferiblemente al menos de l0 a 40 mM. Los metodos y composiciones como se describen en la presente memoria descriptiva no estan limitados por ningun grupo de division particular y las alternativas seran facilmente evidentes para cualquier experto en la tecnica y se consideran dentro del alcance de la presente descripcion.

En algunas realizaciones, un enlazante como se describe en este documento, que puede o no comprender un sitio de escision, enlaza un rbNTP con un resto fluorescente y un patron de transicion de fluorescencia para detectar la incorporacion del nucleotido en una reaccion de SBS se realiza mediante la adicion de un colorante inhibidor en un ciclo de secuenciacion. Por ejemplo, un rbNTP conjugado a un resto fluorescente a traves de un enlazante (en el que el enlazante puede o no comprender un sitio de escision) se anade a una reaccion de secuenciacion. Se registra una primera imagen con lo que se establece un primer patron de deteccion. Durante una etapa de reaccion intermedia, se anade un colorante de extincion a la reaccion (por ejemplo, en lugarde una pareja de FRET eliminada de la reaccion a traves de una etapa de escision), en el que el colorante de inactivacion inactiva suficientemente la fluorescencia del resto fluorescente anteriormente mencionado dando como resultado un patron de cambio de fluorescencia detectable (por ejemplo, de fluorescencia a ninguna fluorescencia o minima) en una etapa de formacion de imagenes posterior para ese nucleotido. Esta realizacion es una alternativa a un sistema donador/aceptor de FRET como se describe en este documento, en el que la combinacion de dos colorantes da como resultado fluorescencia y la eliminacion de uno de los colorantes, por ejemplo mediante una reaccion de escision, da como resultado la perdida de fluorescencia.

Los colorantes de inactivacion segun se contemplan en este documento incluyen, pero no se limitan a, aquellas sustancias que absorben la energfa de excitacion de un fluoroforo, inactivando eficazmente la fluorescencia del fluoroforo diana, sin embargo no son tipicamente fluorescentes por sf mismos. Ejemplos de colorantes inactivadores incluyen, pero no se limitan a, inactivadores oscuros tales como DABCYL (absorbe en el espectro verde), Iowa negro FQ (absorbe en el espectro verde-amarillo), Iowa negro RQ (absorbe en el espectro rojo anaranjado) IRDye QC-1 (absorbe en el rango de 500-900 nm) y colorantes Black Hole Quencher™ (absorbe en el rango de 500-700 nm). Por ejemplo, el DABCYL se utiliza frecuentemente para inactivar la fluorescencia de la fluorescema y se utilizan los colorantes Black Hole Quencher™ para inactivar la fluorescencia de los colorantes FAM, TET, HEX, JOE, TAMRA, ROX y CY dependiendo de las caractensticas (por ejemplo, absorbancia maxima) del Black Hole Quencher™ particular. En realizaciones adicionales, tales inactivadores oscuros pueden utilizarse en un sistema FRET, en el que la escision del inactivador oscuro durante un paso intermedio da lugar a un cambio de estado de fluorescencia desde fluorescencia inactivada a fluorescencia, estableciendo asf un patron de deteccion para la incorporacion de un nucleotido en un ciclo de reaccion de SBS.

El uso de realizaciones de inactivacion de colorantes como se describe en este documento se contempla para su uso en permutaciones y combinaciones para detectar la incorporacion de un nucleotido en un ciclo de sBs como es reconocido por cualquier experto en la materia. Por ejemplo, un rbNTP puede estar enlazado a un resto fluorescente en el que se utiliza un colorante inactivador para determinar la incorporacion de nucleotidos, un segundo rbNTP puede estar enlazado a una biotina en la que se utiliza la adicion de un resto fluorescente SA para determinar la incorporacion de nucleotidos y un tercer colorante puede estar unido a un resto fluorescente en el que se utiliza una reaccion de escision para determinar la incorporacion de nucleotidos. Los metodos como se describen en este documento no estan limitados por que nucleotido se conjuga a que sistema de deteccion particular, aparte de que su combinacion permite la determinacion de la incorporacion de nucleotidos en una reaccion de secuenciacion.

En algunas realizaciones, el resto de deteccion fluorescente se modifica para proporcionar una diferencia de fluorescencia detectable entre la imagen 1 y la imagen 2. Por ejemplo, un resto fluorescente que esta unido, directa o indirectamente, a un rbNTP, puede ser visualizado durante un primer evento de imagen. Entre el primer y segundo evento de imagen se puede anadir una molecula qmmica, pequena, etc. a la reaccion de secuenciacion de tal manera que la estructura del fluoroforo se modifique haciendo de este modo que el resto fluorescente sea indetectable o mmimamente detectable durante el segundo evento de formacion de imagenes. Por ejemplo, se puede anadir un agente de escision que se dirige a uno o mas enlaces y/o entidades estructurales del resto fluorescente que puede destruir la naturaleza fluorescente del resto fluorescente permitiendo de este modo la deteccion de estados de imagen indicativos de la incorporacion del rbNTP unido. Como tal, las modificaciones del propio resto fluorescente pueden proporcionar cambios detectables en estados de formacion de imagenes que pueden ser ventajosos en metodos como se describen en la presente memoria.

En algunas realizaciones de la presente descripcion, un tipo de nucleotido para uso en una reaccion de secuenciacion es un conjugado de rbNTP que comprende una base, por ejemplo una base natural o modificada. En realizaciones preferidas, una base es una base modificada. En realizaciones preferidas, una base modificada comprende tres grupos fosfato fuera del esqueleto de azucar, como tal es un trifosfato, como se indica por NTP. En realizaciones preferidas, la base modificada se bloquea de forma reversible en la que el NTP comprende un grupo de bloqueo 3' terminador reversible que, una vez eliminado, permite la prolongacion continua en una secuencia por la reaccion de secuenciacion de smtesis. En algunas realizaciones, el grupo de bloqueo 3' comprende un grupo

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azido y/o alcoxi y es removible por escision con un reactivo de fosfina. Dichos nucleotidos se denominan "bloqueados reversiblemente" o "rb", un tipo del cual es un NTP "completamente funcional" o NTP "ft" (comercialmente disponible en Illumina, Inc.). La discusion adicional de rbNTPs se encuentra en, por ejemplo, las patentes de los Estados Unidos 7.816.503 y 7.771.903 y la publicacion de la solicitud de patente de los Estados Unidos US2010/00317531.

Los metodos descritos para la deteccion de acidos nucleicos encuentran utilidad particular cuando se usan en secuenciacion, por ejemplo en la secuenciacion por tecnologfas de smtesis (SBS). La secuenciacion por smtesis comprende generalmente la adicion secuencial de uno o mas nucleotidos marcados fluorescentemente a una cadena polinucleotfdica en crecimiento en la direccion de 5' a 3' usando una polimerasa. La cadena polinucleotfdica extendida es complementaria a la plantilla de acido nucleico fijada sobre el sustrato (por ejemplo, celula de flujo, chip, lamina, etc.), la secuencia diana. En algunas realizaciones, la identidad de un nucleotido incorporado en la cadena extendida se determina despues de dos etapas de formacion de imagenes proporcionando de este modo datos de secuencia de incorporacion en tiempo real.

El metodo descrito para la deteccion de acidos nucleicos tambien es util cuando se usa en secuenciacion mediante ligacion, secuenciacion por hibridacion y otras tecnologfas de secuenciacion en las que se emplean esquemas de modificacion de nucleotidos "oscuros" y/o nucleotidos ortogonales.

La secuencia por ligacion es un metodo de secuenciacion en el que un cebador de secuenciacion es alargado sobre una secuencia diana mediante la ligacion de una sonda que comprende un tipo de nucleotido (por ejemplo, A, T, C o G), en donde la sonda ligada es indicativa de la secuencia del subsiguiente nucleotido en una cadena de nucleotidos diana. La secuenciacion por sondas de ligacion puede comprender sitios de escision que pueden escindirse despues de un evento de ligacion de manera que se puede realizar otra determinacion de la adicion, ligacion e incorporacion del nucleotido de la sonda redonda. Una secuencia ejemplar por metodologfa de ligacion es la codificacion de dibases (por ejemplo, secuenciacion de espacio de color) utilizada por el sistema de secuenciacion AppliedByosistems SOLiD™. La codificacion de di-bases o la secuenciacion de "espacios de color" utiliza sondas problema que comprenden 2 bases espedficas de sonda (por ejemplo, constituidas por todas las combinaciones posibles de los cuatro tipos de nucleotidos diferentes) seguidas por tres bases degeneradas y seis bases universales, en donde cada una de las sondas problema esta unida a uno de los cuatro colorantes fluorescentes diferentes. Las sondas se anaden a una reaccion de secuenciacion que comprende una diana y un cebador de secuenciacion y una ligasa termoestable liga la sonda de di-bases complementaria a las secuencias adyacentes al cebador de secuenciacion tal como se encuentra en la plantilla. La fluorescencia se detecta mediante cuatro imagenes en color, las sondas ligadas se escinden para eliminar el colorante fluorescente y regenerar el fosfato 5' para rondas adicionales de ligacion y deteccion. Cada base de plantilla se ensaya dos veces. Despues de varias rondas de ligacion y deteccion de un cebador de secuenciacion, la hebra sintetica se desnaturaliza, se anade un nuevo cebador de secuenciacion y se inicia de nuevo el proceso de deteccion de ligacion. Los bits de datos del espacio de color fluorescente di- codificados se alinean, se aplican a una rejilla de genoma de referencia de espacio de color y se determina la secuencia (Voelkerding et al., 2009, Clin Chem 55: 641-658).

Los nucleotidos modificados descritos en este documento podnan utilizarse en secuencia mediante tecnologfas de ligacion. Por ejemplo, se pueden asociar sondas de un esquema de codificacion de dos bases en el que cuatro secuencias de dinucleotidos estan asociadas con un color, por ejemplo AA, CC, GG y TT, con un colorante fluorescente azul, otras cuatro secuencias de dinucleotidos estan asociadas con un colorante rojo, otras cuatro un colorante verde son la deteccion es a traves de un sistema de imagenes de cuatro colores podna ser modificado como se describe en el presente documento. La incorporacion de menos de cuatro colorantes, por ejemplo un colorante o dos o mas colorantes de excitacion/emision similares mientras se practican manipulaciones qrnmicas y/o enzimaticas permitina menos eventos de formacion de imagenes, por lo tanto, una optica instrumental mas simplificada. Por ejemplo, una sonda que comprende cuatro secuencias de dinucleotidos tales como AA, CC, GG y TT, que comprende ademas un numero o nucleotidos degenerados y/o universales (opcionalmente), podna comprender ademas un enlazante que contiene un sitio de escision (por ejemplo, un sitio de escision de azida o alcoxi ) que une el dinucleotido con un resto fluorescente. Una sonda que comprende un segundo conjunto de cuatro dinucleotidos, por ejemplo TA, GC, CG y AT, que comprende ademas un numero o nucleotidos degenerados y/o universales (opcionalmente), podna comprender ademas un enlazante que contiene dos sitios de escision (el segundo sitio de escision diferente desde el primero, por ejemplo un enlace SS) que une el dinucleotido con un resto fluorescente. Un conjunto de sondas que comprende un tercer conjunto de cuatro dinucleotidos, por ejemplo CA, AC, GT y TG, que comprende ademas un numero o nucleotidos degenerados y/o universales (opcionalmente), podna ademas comprender un enlazante que contiene un sitio de escision que une el dinucleotido con un resto hapteno (por ejemplo, biotina). El cuarto conjunto de sondas de cuatro dinucleotidos podna comprender nucleotidos adicionales, enlazantes, etc., sin embargo carecena de un resto fluorescente. Las sondas se podnan anadir a la secuenciacion mediante reaccion de ligacion, unirse a la plantilla y se podna registrar una primera imagen para capturar un primer estado de senal. Se podna anadir un reactivo de escision a la reaccion para escindir el segundo sitio de escision (por ejemplo, enlace SS) liberando de este modo el resto fluorescente, pudiendo anadirse una pareja de union de hapteno (por ejemplo, estreptavidina) conjugada a un resto fluorescente y una segunda imagen podna registrarse para capturar un segundo estado de senal. Se podna anadir un agente de escision al primer sitio de escision (por ejemplo, azida/alcoxi) a la reaccion para liberar todos los restos fluorescentes y podna llevarse a

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cabo la siguiente ronda de secuenciacion por ligacion. Se podnan alinear los estados de la senal y determinar las secuencias.

La secuencia por hibridacion comprende el uso de una serie de secuencias cortas de sondas de nucleotidos a las que se anade ADN diana marcado y fragmentado (Drmanac et al., 2002, Adv Biochem Eng Biotechnol 77: 75101; Lizardi et al., 2008, Nat Biotech 26: 649-650). Los fragmented se hibridan con su sonda complementaria en el conjunto y la hibridacion se captura mediante el marcador unido tal como un colorante fluorescente, determinando de este modo la secuencia de la diana. Algunas aplicaciones de secuencia mediante hibridacion utilizan sondas que comprenden analogos universales (por ejemplo, analogos de nucleotidos) y nucleotidos designados y se denominan sondas interrumpidas, cuyo uso se sabe que aumenta la sensibilidad de hibridacion y, por tanto, la deteccion del ensayo de secuenciacion (Patente de EE.UU. 7.071.324). Se pueden encontrar mejoras adicionales en la secuencia por hibridacion en, por ejemplo, las publicaciones de solicitud de patente de EE.UU. 2007/0178516,2010/0063264 y 2006/028783. Sin embargo, independientemente del metodo, son necesarios sistemas de optica a menudo complejos para capturar eventos de hibridacion.

Los nucleotidos modificados descritos en este documento podnan utilizarse en secuencia mediante tecnologfas de hibridacion. Las sondas de acido nucleico de multiples muestras diferentes para la determinacion de secuencias que se hibridizan con sondas agrupadas podnan modificarse para comprender los atributos descritos en este documento para su uso en una secuenciacion de colorante minima, permitiendo asf una optica menos compleja con la determinacion concurrente de secuencias de multiples muestras de ensayo diferentes. Por ejemplo, una sonda de muestra de ensayo (por ejemplo, acidos nucleicos de ensayo fragmentados) podna modificarse para comprender un enlazante que contiene un sitio de escision (por ejemplo, un sitio de escision de azida o alcoxi) que une la sonda con un resto fluorescente. Un segundo conjunto de sondas podna ser modificado para comprender un enlazante que contiene dos sitios de escision (el segundo sitio de escision diferente del primero, por ejemplo un enlace SS) que une la segunda sonda con un resto fluorescente. Un tercer conjunto de sondas podna comprender un enlazante que contiene un sitio de escision que une la sonda de acido nucleico con un resto hapteno (por ejemplo, biotina). Las sondas podnan anadirse a una secuencia por tipo de hibridacion de matriz, reacciones de hibridacion de las sondas de ensayo modificadas a las sondas inmovilizadas en la matriz llevada a cabo, y una primera imagen grabada para capturar un primer estado de senal. Se podna anadir un reactivo de escision a la reaccion para escindir el segundo sitio de escision (por ejemplo, enlace Ss) liberando de este modo el resto fluorescente, pudiendo anadirse una pareja de union a hapteno (por ejemplo, estreptavidina) conjugada a un resto fluorescente y registrandose una segunda imagen para capturar el segundo estado de senal. Se podnan determinar estados de senal, en los que la rejilla del estado de senal de imagen dos podna utilizarse para determinar la localizacion y por lo tanto la secuencia de las multiples sondas de ensayo hibridadas diferentes.

Se han desarrollado y comercializado enfoques de secuenciacion que combinan las bioqmmicas de hibridacion y ligacion, tal como la tecnologfa de secuenciacion genomica practicada por Complete Genomics, Mountain View, CA). Por ejemplo, la ligacion de sonda combinatoria-anclaje, o cpALTM (Drmanac et al., 2010, Science 327 (5961): 78-81) utiliza la bioqmmica de ligacion mientras explota las ventajas de la secuencia por hibridacion. En resumen, la secuenciacion de las nanobolas de ADN diana comprende detectar productos de ligacion que estan formados por un oligonucleotido de anclaje que se hibrida con una secuencia adaptadora que se liga subsiguientemente a una sonda de secuenciacion degenerada marcada fluorescentemente que comprende uno de los cuatro nucleotidos especificados en la posicion problema. La ligacion se produce cuando el nucleotido en la posicion problema es complementario al nucleotido en el sitio de deteccion dentro de la nanobola del ADN diana. El producto de ligacion de ancla/sonda estable resultante se detecta fluorescentemente. Despues de la lectura, se libera todo el complejo anclaje/sonda, se hibrida el siguiente anclaje a la diana de ADN y se repite el proceso. Como con muchas reacciones de secuenciacion, se utilizan cuatro colorantes diferentes detectables, uno para cada nucleotido problema especificado A, C, G y T utilizando una optica de deteccion multiple.

Los nucleotidos modificados descritos en la presente memoria podnan utilizarse en tecnologfas de secuenciacion de ligacion de anclaje-sonda combinatoria. La incorporacion de menos de cuatro colorantes permitina menos eventos de imagen. Por ejemplo, una sonda que comprende un numero o nucleotidos degenerados podna comprender ademas un enlazante que contiene un sitio de escision (por ejemplo, un sitio de escision de azida o alcoxi) que une el nucleotido problema con un resto fluorescente. Una sonda que comprende un segundo conjunto de nucleotidos degenerados podna comprender ademas un enlazante que contiene dos sitios de escision que unen el nucleotido problema con un resto fluorescente. Un conjunto de sondas que comprende un tercer conjunto de nucleotidos degenerados podna comprender ademas un enlazante que contiene un sitio de escision que une el nucleotido problema con un resto hapteno (por ejemplo, biotina). El cuarto conjunto de sondas de nucleotidos degenerados podna comprender nucleotidos adicionales, enlazantes, etc., sin embargo carecena de un resto fluorescente. Las sondas se podnan anadir a la reaccion cPALTM, ligadas al anclaje/adaptador y se podna registrar una primera imagen para capturar un primer estado de senal. Se podna anadir un reactivo de escision a la reaccion para escindir el segundo sitio de escision (por ejemplo, el enlace SS) liberando de este modo el resto fluorescente, pudiendo anadirse una pareja de union de hapteno (por ejemplo, estreptavidina) conjugada a un resto fluorescente y podna ser registrada una segunda imagen para capturar un segundo estado de senal. Se podna anadir un agente de escision al primer sitio de escision (por ejemplo, azida/alcoxi) a la reaccion para liberar todos los restos fluorescentes y podna llevarse a cabo la siguiente ronda de cPALTM. Se podnan alinear los estados de la senal y determinar las secuencias.

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Los acidos nucleicos o polinucleotidos para la secuenciacion incluyen, pero no se limitan a, acidos nucleicos tales como ADN, ARN o PNA (acido nucleico peptidico), variantes o fragmentos de los mismos y/o concatameros de los mismos. Los polinucleotidos pueden ser de una secuencia conocida o desconocida, de naturaleza natural o artificial y pueden ser de cualquier fuente (por ejemplo, eucariotas o procariotas). Los polinucleotidos pueden derivarse naturalmente, producirse recombinantemente o sintetizarse qmmicamente. Los polinucleotidos concatamerizados pueden contener subunidades o analogos de los mismos que pueden o no pueden producirse en la naturaleza, o subunidades modificadas. Pueden usarse metodos como se describe en este documento para determinar una secuencia de un polinucleotido. La longitud del acido nucleico diana para la secuenciacion puede variar. Por ejemplo, el acido nucleico para la secuenciacion puede incluir al menos 10, al menos 20, al menos 30, al menos 40, al menos 50, al menos 100, al menos 200, al menos 500, al menos 1.000, al menos 10.000, al menos 100.000, al menos 1.000.000, al menos 10.000.000 nucleotidos. El polinucleotido para la secuenciacion puede ser de origen genomico o fragmentos o variantes de los mismos. La cadena de acido nucleico para la secuenciacion puede ser de cadena sencilla y puede o no derivarse de una molecula de acido nucleico bicatenario. Las moleculas de cadena sencilla tambien pueden producirse, por ejemplo, mediante metodos y tecnologfas de smtesis qmmica o in vitro. Las realizaciones como se describen en la presente memoria descriptiva no estan limitadas por los metodos preparatorios del acido nucleico y cualquier numero de metodos puede ser practicado por los expertos en la tecnica para proporcionar una composicion para uso en los metodos descritos. Por ejemplo, en la secuencia mediante metodologfas de smtesis a menudo se genera una biblioteca que comprende los acidos nucleicos diana, y despues se secuencia una parte de la biblioteca de ADN.

El ADN aislado de muestras, por ejemplo muestras que contienen ADN genomico, se modifica tfpicamente antes de la caracterizacion, por ejemplo mediante secuenciacion utilizando metodos como los que se describen en la presente memoria. Se crean bibliotecas de ADN genomico que pueden secuenciarse mediante la practica de los metodos descritos en la presente memoria. Se produce una biblioteca, por ejemplo, realizando los metodos descritos en el kit de preparacion de muestras de ADN Nextera™ (Epicentre® Biotechnologies, Madison WI), kits de preparacion de bibliotecas SOLiD™ (Applied Biosystems™ Life Technologies, Carlsbad, CA) y similares. Una muestra de biblioteca de ADN puede amplificarse adicionalmente para la secuenciacion mediante, por ejemplo, multiples tecnicas de amplificacion de desplazamiento de soporte (mDa).

Para la secuenciacion despues de MDA, se prepara, por ejemplo, una biblioteca de muestras amplificada creando una biblioteca de ADN como se describe en el kit de Mate Pair Library Prep, kits de Preparacion de Muestras de ADN Genomico o kits de Preparacion de Muestras TruSeq™ y Enriquecimiento Exome (Illumina®, Inc., San Diego CA). Las bibliotecas de ADN pueden inmovilizarse en una celula de flujo y una amplificacion de puente realizada sobre los polinucleotidos inmovilizados antes de la secuenciacion, por ejemplo secuencia por metodologfas de smtesis. En la amplificacion de puente, se hibrida un polinucleotido inmovilizado (por ejemplo, de una biblioteca de ADN) a un cebador de oligonucleotido inmovilizado. El extremo 3' de la molecula de polinucleotido inmovilizado proporciona la plantilla para una reaccion de elongacion dirigida por plantilla catalizada por polimerasa (por ejemplo, extension de cebador) que se extiende desde el cebador oligonucleotfdico inmovilizado. El producto de doble hebra resultante "puentea" los dos cebadores y ambas hebras estan unidas covalentemente al soporte. En el ciclo siguiente, despues de la desnaturalizacion que produce un par de hebras simples (la plantilla inmovilizada y el producto de cebador extendido) inmovilizadas al soporte solido, ambas cadenas inmovilizadas pueden servir como plantillas para la extension de un nuevo cebador. De este modo, la primera y segunda partes pueden amplificarse para producir una pluralidad de agrupaciones. Los grupos y colonias se usan indistintamente y se refieren a una pluralidad de copias de una secuencia de acido nucleico y/o complementos de las mismas unidas a una superficie. Tfpicamente, el grupo comprende una pluralidad de copias de una secuencia de acido nucleico y/o complementos de las mismas, unidas a traves de sus extremos 5' a la superficie. La metodologfa de amplificacion y agrupamiento de puentes ejemplares se describe, por ejemplo, en la Publicacion de Patente PCT.

No. WO00/18957 y WO98/44151, patente de EE.UU. No. 5.641.658; Publ. de patente de EE.UU. No. 2002/0055100; patente de EE.UU. No. 7.115.400; Publ. de patente de EE.UU. 2004/0096853; Publ. de patente de EE.UU. N° 2005/0100900, Publ. de patente de EE.UU. 2004/0002090; Publ. de patente de No. 2007/0128624; y Publ. de patente de No. 2008/0009420. Las composiciones y metodos descritos en la presente memoria son particularmente utiles en secuencia mediante metodologfas de smtesis que utilizan una celula de flujo que comprende clusteres.

Tambien pueden usarse metodos de PCR en emulsion para amplificar acidos nucleicos antes de la secuenciacion en combinacion con metodos y composiciones como se describen en la presente memoria. La PCR en emulsion comprende la amplificacion por PCR de una biblioteca de ADN al azar flanqueada con adaptador en una emulsion de agua en aceite. La PCR es una PCR multi-plantilla; solo se utiliza un solo par de cebadores. Uno de los cebadores de PCR esta atado a la superficie (unida por 5') de perlas de microescala. Una concentracion de plantilla baja da como resultado que la mayona de las microvesmulas de emulsion que contienen perlas tengan presentes cero o una moleculas de plantilla. En las microvesmulas de emulsion productiva (una microvesmula de emulsion en la que estan presentes tanto una perla como una molecula plantilla), los amplicones de PCR pueden capturarse en la superficie de la perla. Despues de romper la emulsion, las perlas que llevan productos de amplificacion pueden enriquecerse selectivamente. Cada perla clonalmente amplificada soportara en su superficie productos de PCR correspondientes a la amplificacion de una unica molecula de la biblioteca de plantillas. Se establecen diversas realizaciones de metodos de PCR en emulsion en Dressman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100: 8817-8822

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(2003), Publicacion de patente PCT. No. WO 05/010145, Publ. de patente de EE.UU. Nos. 2005/0130173, 2005/0064460, y US2005/0042648.

Las nanobolas de ADN tambien se pueden usar en combinacion con metodos y composiciones como se describen en la presente memoria. Los metodos para crear y utilizar nanobolas de ADN para la secuenciacion genomica pueden encontrarse en, por ejemplo, las patentes de EE.UU. y publicaciones 7.910.354, 2009/0264299, 2009/0011943, 2009/0005252, 2009/0155781, 2009/0118488 y como se describe en Drmanac et al., 2010, Science 327 (5961): 78-81. Brevemente, despues de la fragmentacion del ADN genomico, las rondas consecutivas de ligacion adaptadora, amplificacion y digestion dan lugar a concatameros de cabeza a cola de multiples copias de las secuencias plantilla/adaptador de ADN genomico circular que se circularizan en ADN monocatenario por ligacion con un ligasa en cfrculo y cfrculo rodante amplificado (como se describe en Lizardi et al., Nat. Genet. 19: 225-232 (1998) y el documento de EE.UU. 2007/0099208 A1). La estructura de adaptador de los concatameros promueve el enrollamiento del ADN de una sola hebra creando asf nanobolas de ADN compacto. Las nanobolas de ADN pueden ser capturadas sobre sustratos, preferiblemente para crear una matriz ordenada o modelada de manera que se mantenga la distancia entre cada nanobola permitiendo de este modo la secuenciacion de las nanobolas de aDn separadas.

Cualquier experto en la tecnica reconocera metodos y tecnologfas adicionales para amplificar acidos nucleicos que tambien podnan usarse en combinacion con los metodos y composiciones descritos en la presente memoria. Las realizaciones descritas en la presente memoria descriptiva no estan limitadas a ningun metodo de amplificacion de ADN.

Los metodos que se describen en la presente memoria descriptiva no estan limitados por ningun metodo de preparacion de muestras de secuenciacion particular y las alternativas seran facilmente evidentes para cualquier experto en la tecnica y se consideran dentro del alcance de la presente descripcion. Sin embargo, se encuentra una utilidad particular cuando se aplican los metodos de la presente invencion a dispositivos de secuenciacion tales como celulas o matrices de flujo para practicar la secuenciacion mediante metodologfas de smtesis u otras tecnologfas de secuenciacion relacionadas tales como las practicadas por una o mas de la tecnologfa de secuenciacion Polony (Dover Systems), secuenciacion por plataformas de hibridacion fluorescente (Complete Genomics), tecnologfa sTOP (Instituto de Investigacion de Tecnologfa Industrial) y secuenciacion por smtesis (Illumina, Life Technologies).

En algunas realizaciones, los metodos expuestos en la presente memoria pueden usarse en una version modificada de los protocolos del fabricante en un sistema tal como los proporcionados por Illumina®, Inc. (sistemas HiSeq 1000, HiSeq 1000, Genome Analyzers, MiSeq, HiScan, iScan, BeadExpress), Applied Biosystems™ Life Technologies (sistemas de deteccion de secuencias ABI PRISM®, SOLiD™ System), u otros instrumentos de secuenciacion basados en fluorescencia, ademas de los descritos en, por ejemplo, las patentes de EE.UU. y las solicitudes de patentes 5.888.737, 6.175.002, 5.695.934, 6.140.489, 5.863.722, 2007/007991, 2009/0247414, 2010/0111768 y la solicitud de patente PCT WO2007/123744, y WO2012/096703. Las modificaciones a los metodos comerciales pueden incluir, pero no se limitan a, la alteracion de los marcadores utilizados y la adicion de etapas para cambiar los estados del marcador como se expone en este documento.

La salida de un instrumento de secuenciacion puede ser de cualquier tipo. Por ejemplo, la tecnologfa actual utiliza tfpicamente una salida legible generadora de luz, tal como fluorescencia o luminiscencia, sin embargo los presentes metodos no estan limitados al tipo de salida legible mientras las diferencias en la senal de salida para una secuencia particular de interes sean potencialmente determinables. Ejemplos de software de analisis que pueden usarse para caracterizar la salida derivada de la practica de metodos tal como se describen en este documento incluyen, pero no se limitan a, el software de analisis de datos Pipeline, CASAVA y GenomeStudio (Illumina®, Inc.), SOLiD™, DNASTAR® SeqMan® NGen® y el software de analisis de datos Partek® Genomics Suite™ (Life Technologies), el software de analisis de datos Feature Extraction and Agilent Workbench (Agilent Technologies), Genotyping Console™, el software de analisis de datos Chromosome Analysis Suite (Affymetrix®).

Cualquier experto en la materia conocera otras numerosas alternativas de software comercial y academicamente disponibles para el analisis de datos para la produccion generada por secuenciacion. Las realizaciones descritas en la presente memoria descriptiva no estan limitadas a ningun metodo de analisis de datos.

Ejemplos

Los siguientes ejemplos se proporcionan con el fin de demostrar e ilustrar adicionalmente ciertas realizaciones y aspectos de la presente descripcion y no se deben interpretar como limitativos del alcance de la misma.

Ejemplo 1-Smtesis de rbATP-LN3-DEG527-PEG4-Biotina

Se sintetizo una construccion de adenina bloqueada reversiblemente, biotinilada, ramificada y marcada con fluorescencia para su uso en SBS como sigue:

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2. Lys-DEG527-PEG4-biotina pppA-LN3

imagen7

Lys-DEG527

A una solution de DEG527 (11 mg, 14,6 pmol) en DMA seco (2 ml) se anadio TSTU (5,3 mg, 17,5 pmol) y diisopropiletilamina (6,3 pl, 36,5 pmol). La mezcla se agito durante 30 minutos a temperatura ambiente hasta la activation completa del acido. Se anadio a la mezcla de reaction una solucion de Boc-lisina (18 mg, 73 pmol) en TEAB 0,1 M (0,2 ml). La mezcla se agito durante 3 horas hasta que TCL mostro un consumo completo del ester activado. Los volatiles se evaporaron a presion reducida y el residuo se disolvio en acido trifluoroacetico (0,1 ml), DCM (0,9 ml) y MeOH (0,1 ml). La solucion se agito a temperatura ambiente durante 1 hora hasta que la TLC mostro el consumo total del material de partida. La solucion se concentro hasta sequedad, se volvio a disolver en TEAB 0,1 M (5 ml) y se purifico mediante RP-HPLC.

Lys-DEG527-PEG4-Biotina

Se anadio PEG4-biotina-NHS (41 mg, 70 pmol) a una solucion de Lys-DEG527 (14 pmol) y diisopropiletilamina (15 pl, 84 pmol) en DMA seco (5 ml). La mezcla se sonico durante varios minutos y luego se agito continuamente durante varias horas. La TCL mostro el consumo completo de lys-DEG527. Los volatiles se evaporaron bajo presion reducida. El residuo se disolvio de nuevo en TEAB 0,1 M (5 ml) y se purifico por RP-HPLC.

rbATP-LN3-DEG527-PEG4-Biotina

A una solucion de Lys-DEG527-PEG4-biotina (9 pmol) en DMA seco (2 ml), se anadio TSTU (3,3 mg, 10,8 pmol) y diisopropiletilamina (4 pl, 22,5 pmol). La mezcla se agito durante 30 minutos a temperatura ambiente hasta la activacion completa del acido. Se anadio una solucion de LN3-pppA (18 pmol) en TEAB 0,1 M (0,2 ml) a la mezcla de reaccion. La mezcla se agito durante 5 horas hasta que la TCl mostro el consumo completo del ester activado. La reaccion se inactivo con tampon TEAB (0,1 M, 10 ml) y se cargo en una columna de DEAE Sephadex (2 x 5 cm). La columna se eluyo con un gradiente de tampon TEAB de 0,1 M a 1 M en 30 min a 25 ml/min. Las fracciones que conteman el producto se combinaron, se evaporaron y se purificaron por HPLC.

Ejemplo 2-Smtesis de rbCTP-LN3-PEG4-Biotina

Se sintetizo un constructo de citosina biotinilado, bloqueado reversiblemente, para su uso en SBS como sigue:

imagen8

rbCTP-LN3-PEG4-Biotina

A una solution de PEG4-biotina-NHS (17,7 mg, 30 pmol) y diisopropiletilamina (8,7 pl, 50 pmol) en DMA seco (3 ml), se anadio una solucion de LN3-pppC (10 pmol) en TEAB 0,1M (0,3 ml). La mezcla se agito a temperatura ambiente 5 durante 5 horas. El progreso de la reaction se controlo mediante RP-HPLC hasta el consumo completo de LN3- pppC. La reaccion se inactivo con tampon TEAB (0,1 M, 10 ml) y se cargo en una columna de Sephadex de DEAE (2 x 5 cm). La columna se eluyo con un gradiente de tampon TEAB de 0,1 M a 1 M en 30 min a 25 ml/min. Las fracciones que conteman el producto se combinaron, se evaporaron y se purificaron por HPLC.

Ejemplo 3-Smtesis de rbATP-LN3-SS-DEG527

10 Se sintetizo una construction de adenina totalmente funcional, marcada fluorescentemente, que comprendia un enlazante escindible para uso en SBS, de la siguiente manera:

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DEG527-SS-enlazante

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A una solucion de DEG527 (12,5 mg, 16 pmol) en DMA seco (2 ml), se anadio TSTU (6 mg, 20 pmol) y diisopropiletilamina (7 pl, 40 pmol). La mezcla se agito durante 30 minutos a temperatura ambiente hasta la activacion completa del acido. Se anadio a la mezcla de reaccion una solucion de SS-enlazador (9 mg, 50 pmol) en TEAB 0,1 M (0,2 ml). La mezcla se agito durante 3 horas hasta que la TCL mostro un consumo completo del ester activado. Los volatiles se evaporaron a presion reducida y el residuo se disolvio en TEAB 0,1 M (5 ml) y se purifico por RP-HPLC.

rbATP-LN3-SS-DEG527

Se anadio TSTU (2,1 mg, 7,1 pmol) y diisopropiletilamina (2,6 pl, 14,8 pmol) a una solucion de DEG527-SS- enlazante (5,9 pmol) en DMA seco (2 ml). La mezcla se agito durante 30 minutos a temperatura ambiente hasta la activacion completa del acido. Se anadio una solucion de LN3-pppA (17,7 pmol) en TEAB 0,1 M (0,2 ml) a la mezcla de reaccion. La mezcla se agito durante 5 horas hasta que la tCl mostro el consumo completo del ester activado. La reaccion se inactivo con tampon TEAB (0,1 M, 10 ml) y se cargo en una columna de Sephadex de DEAE (2 x 5 cm). La columna se eluyo con un gradiente de tampon TEAB de 0,1 M a 1 M en 30 min a 25 ml/min. Las fracciones que conteman el producto se combinaron, se evaporaron y se purificaron por HPLC.

Ejemplo 4-Deteccion de la incorporacion de nucleotidos utilizando la construccion de nucleotidos conjugada con biotina

Se realizaron experimentos para demostrar el uso de un nucleotido conjugado con biotina en reacciones de secuenciacion. La firma del espacio de tiempo de los experimentos siguio el patron de formacion de imagenes de espacio de tiempo

Imagen 1 Imagen 2

A

1 0

C

0 1

G

0 0

T

1 1

Los experimentos se realizaron en un Genome Analyzer IIx configurado en modo de un solo carril. Se siguio una secuencia estandar mediante el programa de incorporacion de enzimologfa de smtesis utilizando la mezcla de nucleotidos bloqueada de forma reversible que incluia un rbGTP no marcado, rbTTP-LN3-NR550 marcado fluorescentemente, rbCTP-LN3-PEG4-biotina biotinilada y rbATP con un enlazante disulfuro (SS) escindible rbATP- LN3-SS-DEG527. La adquisicion y el analisis de datos difirieron de la qrnmica estandar de SBS de 4 colorantes. Brevemente, despues de una etapa de incorporacion de nucleotidos, los agrupamientos se excitaron con laser y se adquirio una imagen fluorescente. Se anadieron componentes de reaccion adicionales a la reaccion para escindir selectivamente el enlace SS de rbATP-LN3-SS-DEG527 y se anadio SA-NR555 para marcar selectivamente rbCTP- LN3-biotina para crear rbCTP-LN3-biotina-SA-NR555. Los agrupamientos se excitaron por laser una segunda vez que se registro una segunda imagen fluorescente. Por lo tanto, la incorporacion de cada una de las cuatro bases es por cambios, o falta de los mismos, de estados de intensidad fluorescente usando colorantes que excitan y emiten en la misma longitud de onda.

Se creo una genoteca de ADN genomico para su uso en secuenciacion de lectura unica en un Genome Analyzer IIx (Illumina, Inc.). Despues de la preparacion de la biblioteca, se creo una celula de flujo secuencial con agrupamientos de secuenciacion objetivo usando el TruSeq SR Cluster Kit v2 en el Illumina® cBot siguiendo el protocolo del fabricante para la secuencia de lectura unica. Despues de la generacion del agrupamiento, la celula de flujo se coloco en un Genome Analyzer IIx y la muestra se secuencio usando reactivos de TruSeq SBS Reagent Kit v5 (Illumina®, Inc.).

Se prepararon soluciones madre de los nucleotidos bloqueados reversiblemente para su uso en la reaccion de secuenciacion; 100 pM de soluciones madre de rbGTP oscuro o no marcado, rbATP-LN3-SS-DEG527, rbCTP- PEG4-biotina y rbTTP-LN3-NR550. Se preparo una solucion madre de estreptavidina-NR555 (SA-NR555 a 1 mg/ml) en un tampon de union y de lavado (Tris 5 mM, pH 7,5, EDTA 0,5 mM, NaCl 1M).

Para el Genome Analyzer IIx, las posiciones del reactivo del instrumento fueron reconfiguradas para una secuencia de colorante unica por smtesis. Se selecciono un carril para la secuenciacion y los otros carriles se desconectaron, asegurando de este modo que los reactivos se extrafan a traves de un carril de secuenciacion y que no pudiera ocurrir ningun cruce de ningun lfquido de otro carril. Los reactivos se colocaron en el Genome Analyzer IIx (GAIIx) como sigue:

Position

Reactivo

1

Mezcla de incorporacion (IMX)

2

Blanco

3

Mezcla Scan (SMX)

4

Blanco

5

Tampon de Incorporacion (PR2)

6

Mezcla de escision (CLM)

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Blanco

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SA-NR555

Los reactivos se prepararon para un ensayo de secuenciacion de 150 ciclos. Del TruSeq SBS Reagent Kit v5, los reactivos CLM, SMX y PR2 se utilizaron segun las instrucciones. Para el reactivo IMX que contema los nucleotidos bloqueados reversiblemente, se anadieron a 20,1 ml de tampon IMX 1 ml de rbATP-SS-DEG527 (concentracion final 5 4 |jM), 0,5 ml de rbGTP (concentracion final 2 ^M), 2,5 ml de rbCTP-PEG4-biotina 10 ^M) y 0,25 ml de rbTTP-LN3-

NR550 (concentracion final 1 ^M). La solution de rbNTP se filtro y se anadieron 0,6 ml de polimerasa de alta densidad (HDP, concentracion final de 15 ^g/ml). Se hizo una dilution 1:200 de SA-NR555 en tampon de union y lavado.

Los reactivos se cargaron en el Genome Analyzer IIx y se ejecuto el protocolo de secuenciacion. Brevemente, se 10 siguio una etapa de incorporation estandar (es decir, FirstBase) por formation de imagenes como se describe en el protocolo del fabricante. La obtencion de imagenes se siguio inmediatamente por escision de disulfuro (adicion de CLM) y union de SA-NR555 (adicion de dilucion 1:200 de SA-NR555) y una subsiguiente segunda formacion de imagenes seguida por una etapa estandar de desbloqueo e incorporacion (es decir, CompleteCycle). La escision de las uniones disulfuro que daba como resultado un cambio en el estado de intensidad para rbATP de 1 a 0 fue 15 selectiva y continuo a una velocidad rapida de <5 segundos a temperatura ambiente. La union de biotina/estreptavidina tambien se produce rapidamente a una velocidad de <25 segundos a temperatura ambiente dando como resultado un cambio en el estado de intensidad para rbCTP de 0 a 1.

El tiempo total de ciclo excluyendo la formacion de imagenes fue de alrededor de 9,3 minutos. Se repitio el ciclo para los ciclos restantes. El flujo general es el siguiente:

20

1a imagen de rbNTP (incorporacion)

Incorporacion

t

1a magen

A 1

—►

T 1

/

C 0

/

G 0

/

SBS estandar

(siguiente ciclo)

t /

Desbloqueo estandar«

-► Lavado/escision de SS

2a imagen (desbloqueo)

2a imagen

A

0

T

1

C

1

G

0

Flujo en SA-colorante

Se pueden encontrar resultados ejemplares en las Figuras 1 y 2 y en la Tabla 1. La Figura 1 ejemplifica un mapa de calor de estilo de nube registrado en diferentes ciclos a lo largo de la secuencia de secuenciacion. Los mapas de nubes demuestran que la diferenciacion de los cuatro nucleotidos fue exitosa (el fondo aislado y el mapa de nubes marcado con nucleotidos orientan las posiciones de los cuatro nucleotidos dentro del mapa de nubes). La Figura 2 25 reporta un seguimiento ejemplar de porcentajes de tasa de error de incorporacion de nucleotidos sobre una

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secuencia de secuenciacion de 100 ciclos para el carril 4 seleccionado, losa 4. Se registro una tasa de error de 0,04% sobre 100 ciclos para la pista 4, la losa 4 en una celula de flujo, mientras que la Figura 2 demuestra que no habfa llamadas de base en blanco a lo largo del ciclo de 100 ciclos para ese carril y losa. La separacion de fases se registro al 0,27% y la separacion de fases previa al 0,43%. La Tabla 1 muestra los resultados del carril 4, losa 1-6.

Tabla 1

Carril

Losa Agrupamientos (crudos) % Agrupamientos PF % Alineamiento (PF) Av Puntuacion de Alineamiento (PF) % tasa de error (PF)

4

1 288360 77,64 96,08 121,87 0,51

4

2 285563 78,67 96,04 121,39 0,7

4

3 282653 79,5 96,12 121,97 0,48

4

4

280818 79,07 95,92 121,87 0,4

4

5 283422 78,36 96,05 121,97 0,43

4

6 282958 61,68 60,7 74,58 2,22

Ejemplo 5-Deteccion de la incorporacion de nucleotidos usando un colorante

Se realizaron experimented para demostrar que se puede usar un colorante para determinar la secuencia de un acido nucleico.

Los nucleotidos utilizados en este experimento incluyeron: rbATP-LN3-SS-NR550C4 rbTTP-LN3-NR550C4 rbCTP-(LN3)2-Biotina RbGTP-sin marcador

Todas las concentraciones de la disolucion madre de nucleotidos se almacenaron a 100 pM en tampon Tris 10 mM (pH 8,0). El resto fluorescente usado para marcar los nucleotidos fue NR550C4. En la Figura 5B se muestran dos espectros de emision representativos para el colorante sobre rbATP y rbTTP. El rbGTP no se marco y por lo tanto se considero el nucleotido "oscuro". Para determinar la incorporacion de citosinas en una hebra de acido nucleico en crecimiento, se anadio a la reaccion una mezcla maestra que incluia un conjugado de estreptavidina-NR550C4 como se detalla a continuacion.

La smtesis de la composicion enlazador-NR550C4-SS se realizo como se describio previamente para la composicion de DEG527-SS-enlazador, excepto que se uso el resto fluorescente NR550C4 en lugar del fluoroforo DEG527. La smtesis de la composicion de rbATP-LN3-SS-NR550C4 se realizo como se describio anteriormente para rbATP-LN3-SS-DEG527, sin embargo se uso la composicion de NR550C4-SS-enlazador en lugar de la composicion de DEG527-SS-enlazador. La smtesis de la composicion de rbTTP-LN3-NR550C4 se realizo como se describio para rbATP-LN3-SS-550C4, sin embargo se uso rbTTp-LN3 en lugar de rbATP-LN3 y se uso NR550C4 en lugar de NR550C4-SS-enlazante. La smtesis de la rbCTP-(LN3)2-Biotina se realizo como se describio anteriormente para rbCTP-LN3-PEG4-Biotina, excepto que se uso LN3-Biotina en lugar de biotina durante la reaccion de acoplamiento de amida.

La estreptavidina se conjugo con NR550C4 por metodos conocidos en la tecnica y se preparo una solucion madre de Strep-NR550C4 (SA-NR550C4) a 1 mg/ml en un tampon de Tris 5 mM, pH 7,5, EdTA 0,5 mM y NaCl 1M.

Al reactivo IMX, se anadieron soluciones madre de las composiciones de nucleotidos para producir las concentraciones finales de 2 pM de rbATP-LN3-SS-NR550C4, 10 pM de rbCTP-(LN3)2-Biotina, 1 pM de rbTTP-LN3- NR550C4 y 2 pM de rbGTP-oscuridad. Adicionalmente, se anadio 15 pg/ml de una polimerasa de Alta Densidad al reactivo IMX/nucleotido. Los reactivos CLM, SMX y PR2 fueron como se ha descrito previamente. Se preparo una mezcla maestra, SA-NR550C4-Cleavage Mix, diluyendo SA-NR550C4 hasta una concentracion final de 5 pg/ml en THP 2 mM, Tris 5 mM a pH 7,4, NaCl 1 M, EDTA 0,5 mM y Tween 0,005%.

Los experiments de secuenciacion de un colorante se realizaron en un instrument de secuenciacion MiSeq™ (Illumina, Inc.). La position de los reactivos en el instrument fue:

1- IMX

2- SRE (Scan Mix)

5 3-PR2

4-CLM

18-SA-NR550C4-Mezcla de escision

El instrumento se ajusto a 60°C al comienzo de los experimentos de secuenciacion y todas las etapas de secuenciacion incluyendo las etapas de formation de imagenes se Ilevaron a cabo a esta temperatura para la 10 secuenciacion isotermica. La secuenciacion isotermica se realizo comparativamente a la secuenciacion realizada sobre el GAIIx como se describio anteriormente, donde la formacion de imagenes se llevo a cabo a 22°C.

Para la secuenciacion MiSeq™, el tiempo de ciclo de la qmmica SBS total para un ciclo de incorporation (excluyendo los ciclos de formacion de imagenes) fue de 3,37 minutos (1 colorante SBS fue 2,70 minutos y el marcado de SA y escision fue 0,67 segundos). Los ciclos de secuenciacion se repitieron basicamente como se 15 describe a continuation:

(SRK)

(iMX}

Incorporacion

1a imagen (incorporacion)

1 imaaen

A

! A i

J

i O 0 1 Estrep-NR550C4-

(ciclo siguiente)

: O O < r jMezcla de escision

(CiM)

fSR£} |

Desbloqueo estandar

2a imagen de SBS (desbloqueo)

2a imagen

A

O

T

1

C

1

G

O

Los resultados del experimento de secuenciacion de un colorante se pueden encontrar en las Figuras 5A y D y la Tabla 2. La separation de fases se registro al 0,17% y la separation de fases previa al 0,36%. La Tabla 2 muestra los resultados del carril 1, losas 1-4.

20 Tabla 2

Carril

Losa Agrupamientos (crudos) % Agrupamientos PF % Alineamiento (PF) Puntuacion de Alineamiento Av (PF) % tasa de error (PF)

1

1

331576 71,85 90,85 673,37 2,13

1

2 331383 71,51 91,11 677,41 2,09

1

3 334956 72,19 90,87 676,4 2,07

1

4 333278 72,74 90,97 671,76 2,18

La Figura 5A muestra un ejemplo de seguimiento de los porcentajes de tasa de error de ciclos de base a lo largo de una secuencia de secuenciacion de 150 ciclos para una losa. Se observo una tasa de error de aproximadamente 2,12% sobre 150 ciclos. Basandose en el diseno experimental, las Figuras 5B y C muestran ejemplos de eventos de 25 formacion de imagenes de patrones de detection que deberian resultar para los diferentes nucleotidos modificados para cada uno de los eventos de formacion de imagenes. Por ejemplo, la Figura 5B Imagen 1 muestra que el primer

evento de imagen no debena capturar fluorescencia, o una minima fluorescencia, para rbGTP o rbCTP-(LN3)2- Biotina ya que no estan asociadas con ningun resto fluorescente antes del primer evento de formacion de imagenes y fluorescencia para los nucleotidos marcados con rbATP y rbTTP ya que estan asociados con un resto fluorescente antes del primer evento de formacion de imagenes. La Figura 6C Imagen 2 muestra que despues de la adicion de 5 SA-NR550C4-Mezcla de Separacion no debena haber ninguna fluorescencia, o minima, del nucleotido modificado con rbATP, ya que el disulfuro en la composicion de rbATP-LN3-SS-NR550C4 debena ser escindido liberando asf el fluoroforo unido y la incorporacion de rbCTP en la cadena de acido nucleico en crecimiento sena detectable debido a la union de la composicion de SA-NR550C4 a la biotina en el conjugado rbCTP-(LN3)2-Biotina. Los patrones fluorescentes de rbGTP y rbTTP-LN3-NR550C4 deben permanecer iguales de la Imagen 1 a la Imagen 2 cuando 10 sigan el diseno experimental descrito en este Ejemplo.

La Figura 5D muestra un diagrama de nubes que demuestra que, sorprendentemente, el patron de deteccion de fluorescencia siguio el patron de imagen propuesto y que cada uno de los nucleotidos podfa ser diferenciado entre sf cuando se incorporaba en una hebra de nucleotidos en crecimiento utilizando solamente un colorante y dos eventos de formacion de imagenes en un experimento de secuenciacion.

15 Estos resultados mostrados en esta descripcion demuestran que la secuenciacion de un acido nucleico se puede lograr utilizando tan solo un colorante fluorescente y menos de cuatro eventos de formacion de imagenes para diferenciar la incorporacion de los cuatro acidos nucleicos diferentes en un ciclo de secuenciacion.

Varias modificaciones y variaciones de los metodos y composiciones descritos seran evidentes para los expertos en la tecnica sin apartarse del alcance de la descripcion. Aunque la invencion se ha descrito en conexion con 20 realizaciones preferidas espedficas, debe entenderse que la invencion reivindicada no debe limitarse indebidamente a tales realizaciones espedficas. De hecho, se pretende que varias modificaciones de las realizaciones descritas, que son evidentes para los expertos en los campos relevantes, esten dentro del alcance de las siguientes reivindicaciones.

Claims (17)

1. 5

   10

   15

   20

   25

   30

   35

   40

   45

   REIVINDICACIONES

   1. Un metodo de secuenciacion por smtesis (SBS) basado en fluorescencia para determinar la secuencia de un

   polinucleotido que comprende detectar en una reaccion de secuenciacion la incorporacion de tres tipos diferentes de conjugados de nucleotidos detectables en un polinucleotido y determinar la incorporacion de un cuarto tipo de nucleotido basado en el patron de deteccion de los tres tipos diferentes de nucleotidos detectables en el polinucleotido determinando con ello la secuencia de un polinucleotido, en el que la incorporacion de tres tipos

   diferentes de conjugados de nucleotidos detectables se detecta a partir de un estado de senal; y en el que se

   detecta un primer nucleotido conjugado, unido a un primer fluoroforo, en un primer canal;

   se detecta un segundo nucleotido conjugado, unido a un segundo fluoroforo, en un segundo canal;

   se detecta un tercer conjugado de nucleotidos en el primer canal y en el segundo canal, en el que el tercer conjugado de nucleotidos es una mezcla de conjugados que se diferencian por su union a un tercer fluoroforo detectado en el primer canal o un cuarto fluoroforo detectado en el segundo canal;

   y en el que la incorporacion del cuarto tipo de nucleotido se determina a partir de un estado oscuro.
2. 2. El metodo de la reivindicacion 1, en el que los cuatro fluoroforos son diferentes restos fluorescentes.
3. 3. El metodo de la reivindicacion 1, en el que el primer fluoroforo es identico al tercer fluoroforo, y el segundo fluoroforo es identico al cuarto fluoroforo.
4. 4. El metodo de la reivindicacion 2 o 3, en el que la incorporacion del cuarto nucleotido esta determinada por el patron de deteccion fluorescente de los restos fluorescentes, y en el que el patron de deteccion de fluorescencia se determina mediante un primer y un segundo evento de formacion de imagenes.
5. 5. El metodo de la reivindicacion 4, en el que el primer evento de formacion de imagenes detecta un patron de

   fluorescencia que es diferente del patron de fluorescencia detectado por el segundo evento de formacion de

   imagenes.
6. 6. El metodo de la reivindicacion 5, en el que la incorporacion de uno o mas nucleotidos esta determinada por la diferencia en el patron de fluorescencia entre el primer y segundo eventos de formacion de imagenes.
7. 7. El metodo de la reivindicacion 1, en el que uno o mas conjugados de tipo nucleotidico comprenden ademas una o mas secuencias enlazantes, y

   en el que una o mas secuencias enlazantes comprenden uno o mas de un enlazante escindible y un enlazante espaciador en el que el enlazante escindible comprende uno o mas grupos de enlace escindibles seleccionados del grupo que consiste en un disulfuro, un diol, un diazo, un ester, una sulfona, una azida, un alilo y un eter silflico.
8. 8. El metodo de la reivindicacion 1, en el que los nucleotidos comprenden cuatro tipos de nucleotidos modificados en los que tres tipos de nucleotidos modificados estan conjugados con uno o mas restos de deteccion y uno o mas enlazantes posicionados entre el nucleotido y uno o mas restos de deteccion y en el que un cuarto tipo de nucleotido carece de un resto de deteccion, en el que la deteccion comprende:

   a) detectar un patron de incorporacion de dichos nucleotidos modificados en una reaccion de secuenciacion capturando de este modo un primer patron detectable,

   b) aplicar una o mas composiciones a la reaccion de secuenciacion cambiando de este modo el primer patron detectable, y

   c) detectar un segundo patron detectable, y en el que

   d) se determina la secuencia de la muestra polinucleotfdica en base a los patrones detectables.
9. 9. El metodo de la reivindicacion 8, en el que la incorporacion del cuarto tipo de nucleotido esta determinada por los patrones de deteccion de fluorescencia de los otros tres tipos de nucleotidos tanto en el primer como segundo patrones detectables.
10. 10. El metodo de la reivindicacion 8, en el que uno o mas enlazantes comprenden uno o mas de un enlazante escindible y un enlazante espaciador.
11. 11. El metodo de la reivindicacion 8, en el que la aplicacion de una o mas composiciones anadidas a una reaccion de secuenciacion cambiando de este modo el primer patron detectable comprende la adicion de uno o mas de un compuesto de escision y un conjugado de pareja de union-resto de deteccion.
12. 12. Una composicion para uso en el metodo de la reivindicacion 1, que comprende:

    a) un primer conjugado de nucleotido unido a un primer fluoroforo y detectable en un primer canal;

    b) un segundo conjugado de nucleotido unido a un segundo fluoroforo y detectable en un segundo canal;

    c) un tercer conjugado de nucleotidos, detectable en el primer canal y el segundo canal, en el que el tercer conjugado de nucleotidos es una mezcla de conjugados que se diferencian por estar unidos a un tercer fluoroforo, detectable en el primer canal, o un cuarto fluoroforo, detectable en el segundo canal; y

    5 d) un cuarto conjugado de nucleotido que carece de un resto fluorescente.
13. 13. La composicion de la reivindicacion 12, en la que los cuatro fluoroforos son restos fluorescentes diferentes.
14. 14. La composicion de la reivindicacion 12, en la que el primer fluoroforo es identico al tercer fluoroforo, y el segundo fluoroforo es identico al cuarto fluoroforo.

    imagen1

    Tasas de error por ciclo para el archivo Stats/s_4_0004_rescore.txt

    imagen2

    Aparicion de las bases en blanco por ciclo para el archivo Stats/s_4_0004_rescore.txt

    imagen3

    imagen4

    SWfftO Q

    Longitud de onda

    imagen5

    Intensidad

    A

    lJUlHKH) .............................

    imagen6

    Longitud de onda

    B

    imagen7

    OJP 0,5 1.0 1J5 2,0 2,5

    53 i

    v,-.^071SJ

    Intensidad de fluorescencia ■■ Porcentaje

    A

    Tasas de error por ciclo para el archivo Stats/s_1_0003_rescore.txt

    imagen8

    imagen9

    rbGTP-sin marcador

    rbCTP-LN3-Biotina

    120

    IOC

    eo

    fcC

    40

    20

    0

    $

    -20

    Imagen 1

    rbATP-SS-N R5 50C4

    taTTP-LNl-NR550C4

    8 /u.o
15. 620.0
16. 670.0

    Longitud de onda de emision (nm)

    imagen10

    rbGTP-sin marcador

    rfoATP

    Intensidades corregidas de fases de separacion

    Longitud de onda de emision (nm)

    Intensidad en el Canal 1

    rbTTP-LM 3-'NH550C4

    magen

    rbCTP-LN3-Biotina-SA-NR550C4

    im

    5 70 0
17. 520.0

    57Q.0