CN101506375A

CN101506375A - 可逆的终止子核苷酸和使用方法

Info

Publication number: CN101506375A
Application number: CNA2007800249296A
Authority: CN
Inventors: 琳达·G·李; 杰勒德·索恩
Original assignee: Applera Corp
Current assignee: Applied Biosystems Inc
Priority date: 2006-06-30
Filing date: 2007-06-14
Publication date: 2009-08-12
Also published as: US20100047796A1; EP2044217A2; US7824887B2; WO2008005673A2; US7553949B2; JP2009542220A; WO2008005673A3; US20080050780A1; AU2007269408A1; CA2656525A1; US20110046359A1

Abstract

本发明公开了可逆终止子核苷酸以及使用方法。

Description

可逆的终止子核苷酸和使用方法

1.介绍

利用可逆的终止子核苷酸测序多核苷酸的方法典型地包括多个鉴定单个碱基和重新产生测序引物的3’末端的步骤，所述测序引物是允许鉴定所述多核苷酸的每个连续碱基所需要的。这些步骤典型地包括将可逆的终止子结合在所述引物的3’末端，洗掉未结合的可逆终止子和其它测序试剂，检测附着到所结合的可逆终止子上的标记，从所结合的终止子上去除所述标记，并且从所述可逆终止子去除封闭基团。因此，目前利用可逆终止子的多核苷酸测序方法是费时费力的，并且具有与鉴定每个碱基相关的高成本。因此，在本领域中，存在对于可逆终止子核苷酸和减少鉴定多核苷酸的每个碱基所需要的步骤数目的应用方法的需求。

2.附图简述

图1提供一种示例性可逆终止子核苷酸的结构，其包含染料标记、磷酸酯(phosphate)封闭基团和可断裂的接头，所述可断裂的接头包含磷酸酯引发部分；

图2提供一种可断裂的接头的实例，其包含荧光标记和磷酸酯引发部分；和

图3提供一种可断裂的接头的实例，其包含荧光标记和磷酸酯引发部分。

3.详述

本部分详细描述本发明的各种不同的实施方案。应该使用标题帮助组织本发明的不同组成部分。

本发明公开的是用于对多核苷酸进行测序包括单分子测序的组合物和方法。本发明公开的组合物包括可逆终止子核苷酸，其可以通过聚合酶以模板依赖性/引导性方式结合在多核苷酸的3′末端。在一些实施方案中，所述可逆终止子核苷酸通常包含在糖部分的3′-位置的羟基，在糖部分的2′-位置的封闭基团，和附着到碱基上的标记。当结合可逆终止子核苷酸时，封闭基团使得所述多核苷酸不能通过聚合酶延伸。在一些实施方案中，所结合的可逆终止子还通常是针对3′-5′核酸外切酶或聚合酶的“校正活性”抗性的。

3.2 定义

当用于本文时，下述术语意欲具有下述意义：

“核苷”是指由嘌呤、脱氮嘌呤或嘧啶核苷碱基例如腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、尿嘧啶、胸腺嘧啶、7-脱氮腺嘌呤、7-脱氮鸟嘌呤组成的化合物，所述核苷碱基在1′位置与戊糖糖的异头碳连接，所述戊糖如核糖、2′-脱氧核糖或2′，3′-二-脱氧核糖。当核苷碱基是嘌呤或7-脱氮嘌呤时，戊糖在嘌呤或脱氮嘌呤的9-位置附着，并且当核苷碱基是嘧啶时，戊糖在嘧啶的1-位置附着(参见，例如，Kornberg和Baker，DNA复制(DNA Replication)，第2版.(Freeman 1992))。当用于本文时，术语“核苷酸”是指核苷的磷酸酯，例如，单-、二-或三磷酸酯，其中最常见的酯化位点是附着到戊糖的C-5位置的羟基基团。“核苷酸5′-三磷酸酯”是指在5′位置具有三磷酸酯基团的核苷酸。当用于本文时，术语“核苷/核苷酸”是指一组包括核苷和/或核苷酸二者的化合物。

“核碱基(nucleobase)聚合物或寡聚物”是指通过连接(linkage)相连的两个或多个核碱基，所述连接允许得到的核碱基聚合物或寡聚物与具有互补核碱基序列的多核苷酸杂交。核碱基聚合物或寡聚物包括，但不限于，多核苷酸和寡核苷酸(例如，DNA和RNA聚合物和寡聚物)，多核苷酸和寡核苷酸类似物以及多核苷酸和寡核苷酸模拟物，诸如聚酰胺或肽核酸。核碱基聚合物或寡聚物在大小上可以从几个核碱基，2-40个核碱基到几百个核碱基，到数千个核碱基或更多而变化。

“多核苷酸或寡核苷酸”是指核碱基聚合物或寡聚物，其中核碱基通过糖磷酸酯连接(糖-磷酸酯骨架)连接。示例性的多核苷酸和寡核苷酸包括2′-脱氧核糖核苷酸的聚合物(DNA)和核糖核苷酸的聚合物(RNA)。多核苷酸可以完全由核糖核苷酸组成，完全由2′-脱氧核糖核苷酸组成或它们的组合组成。

在一些实施方案中，核碱基聚合物是多核苷酸类似物或寡核苷酸类似物。“多核苷酸类似物或寡核苷酸类似物”意指核碱基聚合物或寡聚物，其中核碱基由包含一个或多个糖磷酸酯类似物的糖磷酸酯骨架连接。典型的糖磷酸酯类似物包括，但不限于，糖烷基磷酸酯，糖亚磷酰胺，糖烷基-或取代的烷基磷酸三酯，糖硫代磷酸酯，糖二硫代磷酸酯，糖磷酸酯和糖磷酸酯类似物，其中所述糖不是2′-脱氧核糖或核糖，核碱基聚合物具有带正电荷的糖-胍基互连，诸如在美国专利号6,013,785和美国专利号5,696,253中描述的那些(还参见，Dagani，1995，化学和工程新闻(Chem.& Eng.News)4-5：1153；Dempey等，1995，美国化学学会杂志(J.Am.Chem.Soc.)117：6140-6141)。其中糖是2′-脱氧核糖的这样的带正电荷的类似物称为＂DNGs＂，而其中糖是核糖的那些称为＂RNGs＂。在多核苷酸和寡核苷酸类似物的定义中特别包含的是锁定核酸(LNAs；参见，例如，Elayadi等，2002，生物化学(Biochemistry)41：9973-9981；Koshkin等，1998，美国化学学会杂志(J.Am.Chem.Soc.)120：13252-3；Koshkin等，1998，四面体通讯(Tetrahedron Letters)，39：4381-4384；Jumar等，1998，生物有机和医学化学通讯(Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters)8：2219-2222；Singh和Wengel，1998，化学通讯(Chem.Commun.)，12：1247-1248；WO 00/56746；WO 02/28875；和，WO 01/48190)。

在一些实施方案中，核碱基聚合物是多核苷酸模拟物或寡核苷酸模拟物。“多核苷酸模拟物或寡核苷酸模拟物”是指这样的核碱基聚合物或寡聚物，其中一个或多个骨架糖-磷酸酯连接用糖-磷酸酯类似物替代。这样的模拟物能够与互补多核苷酸或寡核苷酸、或多核苷酸或寡核苷酸类似物或者与其他多核苷酸或寡核苷酸模拟物杂交，并且可以包括包含一个或多个下述连接的骨架：具有烷基胺侧链的带正电荷的聚酰胺骨架，如在美国专利号5786461，5766855，5719262，5539082和WO 98/03542中所述(还参见，Haaima等，1996，Angewandte Chemie Int′l Ed.英文版35：1939-1942；Lesnick等，1997，核苷酸(Nucleotid.)16：1775-1779；D′Costa等，1999，有机通讯(Org.Lett.)1：1513-1516；Nielsen，1999，现代生物技术观点(Curr.Opin.Biotechnol.)10：71-75)；不带电荷的聚酰胺骨架，如在WO 92/20702和美国专利号5539082中所述；不带电荷的吗啉代-氨基磷酸酯骨架，如在美国专利号5698685，5470974，5378841，和5185144中所述(还参见，Wages等，1997，生物技术(BioTechniques)23：1116-1121)；基于肽的核酸模拟物骨架(参见，例如，美国专利号5,698,685)；氨基甲酸酯骨架(参见，例如，Stirchak和Summerton，1987，有机化学杂志(J.Org.Chem.)52：4202)；酰胺骨架(参见，例如，Lebreton，1994，Synlett.1994年2月：137)；甲基羟胺骨架(参见，例如，Vasseur等，1992，美国化学学会杂志(J.Am.Chem.Soc.)114：4006)；3′-thioformacetal骨架(参见，例如，Jones等，1993，有机化学杂志(J.Org.Chem.)58：2983)和氨基磺酸酯骨架(参见，例如，美国专利号5,470,967)。所有前述参考文献都通过引用结合于此。

“肽核酸”或＂PNA＂是指多核苷酸或寡核苷酸模拟物，其中核碱基通过氨基连接(不带电荷的聚酰胺骨架)相连，诸如在下述一个或多个美国专利号中所述：美国专利号5539082，5527675，5623049，5714331，5718262，5736336，5773571，5766855，5786461，5837459，5891625，5972610，5986053，6107470，6451968，6441130，6414112和6403763；所述这些通过引用结合于此。术语“肽核酸”或＂PNA＂还应该应用于任何寡聚物或聚合物，其包含在下述出版物中描述的那些多核苷酸模拟物的两个或多个亚基：Lagriffoul等，1994，生物有机和医学化学通讯(Bioorganic & MedicinalChemistry Letters)，4：1081-1082；Petersen等，1996，生物有机和医学化学通讯(Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters)，6：793-796；Diderichsen等，1996，Tett.Lett.37：475-478；Fujii等，1997，生物有机和医学化学通讯(Bioorg.Med.Chem.Lett.)7：637-627；Jordan等，1997，生物有机和医学化学通讯(Bioorg.Med.Chem.Lett.)7：687-690；Krotz等，1995，Tett.Lett.36：6941-6944；Lagriffoul等，1994，生物有机和医学化学通讯(Bioorg.Med.Chem.Lett.)4：1081-1082；Diederichsen，1997，生物有机和医学化学通讯(Bioorg.Med.Chem.25 Letters)，7：1743-1746；Lowe等，1997，化学学会杂志(J.Chem.Soc.)Perkin Trans.1，1：539-546；Lowe等，1997，化学学会杂志(J.Chem.Soc.)Perkin Trans.11：547-554；Lowe等，1997，化学学会杂志(J.Chem.Soc.)Perkin Trans.11：555-560；Howarth等，1997，7.有机化学杂志(I.Org.Chem.)62：5441-5450；Altmann等，1997，生物有机和医学化学通讯(Bioorg.Med.Chem.Lett.)，7：1119-1122；Diederichsen，1998，生物有机和医学化学通讯(Bioorg.Med.Chem.Lett.)，8：165-168；Diederichsen等，1998，Angew.Chem.mt.Ed.，37：302-305；Cantin等，1997，Tett.Lett.，38：4211-4214；Ciapetti等，1997，四面体(Tetrahedron)，53：1167-1176；Lagriffoule等，1997，欧洲化学(Chem.Eur.)1.3：912-919；Kumar等，2001，有机通讯(Organic Letters)3(9)：1269-1272；和Shah等在WO96/04000中公开的基于肽的核酸模拟物(PENAMs)。

PNAs的一些实例是其中核碱基附着在N-(2-氨基乙基)-甘氨酸骨架上的那些，即，肽样的、酰胺-连接的单位(参见，例如，美国专利号5719262；Buchardt等，1992，WO 92/20702；Nielsen等，1991，科学(Science)254：1497-1500)。

在一些实施方案中，核碱基聚合物是嵌合寡核苷酸。“嵌合寡核苷酸”意指这样的核碱基聚合物或寡聚物，其包含多种不同的多核苷酸、多核苷酸类似物和多核苷酸模拟物。例如，嵌合寡聚物可以包括与RNA序列连接的DNA序列。其他嵌合寡核苷酸的实例包括与PNA序列连接的DNA序列，和与PNA序列连接的RNA序列。

在一些实施方案中，核碱基聚合物是嵌合寡核苷酸。“嵌合寡核苷酸”意指包含多种不同的多核苷酸、多核苷酸类似物和多核苷酸模拟物的核碱基聚合物或寡聚物。例如，嵌合寡聚物可以包含与RNA序列连接的DNA序列。嵌合寡核苷酸的其他实例包括与PNA序列连接的DNA序列和与PNA序列连接的RNA序列。

在一些实施方案中，所公开方法的不同成分，包括但不限于引物、可逆终止子核苷酸、和其他反应区室(reaction compartment)，可以包括可检测部分。“可检测部分”，“检测部分”或“标记”是指使得其所附着的分子是可利用已知的检测系统(例如，分光镜的、放射性的、酶的、化学的、光化学的、生物化学的、免疫化学的、色谱的、物理的(例如沉积、离心、密度)、电泳的、重量分析的或磁性系统)检测或鉴定的部分。标记的非限制性实例包括量子点(quantum dot)、同位素标记(例如，放射性的或重同位素)、磁性标记；旋转标记、电标记；热标记；有色标记(例如，发色团)、发光标记(例如，荧光剂、化学发光剂)、酶标记(例如，辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、萤光素酶、β-半乳糖苷酶)(Ichiki，等，1993，免疫学杂志(J.Immunol.)150(12)：5408-5417；Nolan，等，1988，美国国家科学院学报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)85(8)：2603-2607))，抗体标记，和化学修饰的标记。另外，在一些实施方案中，这样的标记包括配体-结合配偶体对的成分(例如，抗原-抗体(包括单链抗体和抗体片段，例如，FAb，F(ab)’₂，Fab′，Fv，等)(基础免疫学(Fundamental Immunology)47-105(William E.Paul编，第5版，Lippincott Williams & Wilkins2003))，激素-受体结合，神经递质-受体结合，聚合酶-启动子结合，底物-酶结合，抑制剂-酶结合(例如，硫氰酸胺(sulforhodamine)-缬氨酰-丙氨酰-天冬氨酰-氟甲基酮(SR-VAD-FMK-胱天蛋白酶结合)，变构剂-酶结合，生物素-链霉抗生物素蛋白结合，地高辛-抗地高辛结合，碳水化合物-凝集素结合，膜联蛋白V-磷脂酰丝氨酸结合(Andree等，1990，生物的化学杂志(J.Biol.Chem.)265(9)：4923-8；van Heerde等，1995，Thromb.Haemost.73(2)：172-9；Tait等，1989，生物的化学杂志(J.Biol.Chem.)264(14)：7944-9)，核酸退火或杂交，或贡献或接受电子对与配位复合物的中央金属原子形成配位共价键的分子。在各种示例性实施方案中，结合配体的解离常数可以小于约10^-4-10^-6M^-1，小于约10-5-10^-9M^-1，或小于约10^-7-10^-9M^-1。

“荧光标记”、“荧光部分”和“荧光团”是指可以通过其内在的荧光性质检测的分子。适当的荧光标记的实例包括，但不限于，荧光素，罗丹明，四甲基罗丹明，伊红，藻红，香豆素，甲基-香豆素，芘，孔雀绿，1，2-二苯乙烯，萤光黄，Cascade蓝，德克萨斯红，IAEDANS，EDANS，BODIPYFL，LC Red 640，藻红蛋白，LC Red 705，Oregon绿，Alexa-Fluor染料(Alexa Fluor 350，Alexa Fluor 430，Alexa Fluor 488，Alexa Fluor 546，AlexaFluor 568，Alexa Fluor 594，Alexa Fluor 633，Alexa Fluor 660，Alexa Fluor680)，Cascade蓝，Cascade黄和R-藻红蛋白(PE)，FITC，罗丹明，德克萨斯红(Pierce，罗克福德，伊利诺斯州)，Cy5，Cy5.5，Cy7(安玛西亚生命科学(Amersham Life Science)，Pittsburgh，PA)和串联缀合物，诸如但不限于，Cy5PE，Cy5.5PE，Cy7PE，Cy5.5APC，Cy7APC。在一些实施方案中，适当的荧光标记还包括，但不限于，绿色荧光蛋白(GFP；Chalfie，等，1994，科学(Science)263(5148)：802-805)，EGFP(克隆技术实验室公司(ClontechLaboratories Inc)，帕洛阿尔托，加利福尼亚州)，蓝色荧光蛋白(BFP；量子生物技术公司(Quantum Biotechnologies，Inc.)蒙特利尔，加拿大；Heim等，1996，现代生物学(Curr.Biol.)6：178-182；Stauber，1998，生物技术(Biotechniques)24(3)：462-471；)，增强的黄色荧光蛋白(EYFP；克隆技术实验室公司(Clontech Laboratories Inc)，帕洛阿尔托，加利福尼亚州)，和renilla(WO 92/156/3；WO 95/07463；WO 98/14605；WO 98/26277；WO99/49019；美国专利号5292658，5418155，5683888，5741668，5777079，5804387，5874304，5876995，和5925558)。荧光标记的其它实例在Haugland，荧光探针和研究手册(Handbook of Fluorescent Probes and Research)，第9版，分子探针公司(Molecule Probes，Inc.)Eugene，OR(ISBN0-9710636-0-5)中找到。

在本文中，“微粒”、“微球体”、“微珠”、“珠子”和语法等价物意指小的分散的合成颗粒。如本领域已知的，珠子的组合物可以取决于使用它们的测定的类型而不同，因此，选择微珠组合物是在操作者的能力范围之内的。适当的珠子组合物包括在肽、核酸和有机合成中使用的那些，其包括但不限于，塑料、陶瓷、玻璃、聚苯乙烯、甲基苯乙烯、丙烯酸聚合物、顺磁性材料(美国专利号4358388，4654267，4774265，5320944，5356713)，氧化钍溶胶，碳石墨，二氧化钛，乳胶或交联的葡聚糖诸如琼脂糖(Sepharose)，琼脂糖(agarose)，纤维素，羧甲基纤维素，羟乙基纤维素，蛋白质样聚合物，尼龙，球蛋白，DNA，交联的胶束和特氟隆(Teflon)都是可以使用的(参见，例如，Bangs实验室的微球检测指导(MicrosphereDetection Guide from Bangs Laboratories)，Fishers，IN)，珠子还可以从，例如，Bio-Rad实验室(Bio-Rad Laboratories)(里士满，加利福尼亚)，LKB(瑞典)，法玛西亚(Pharmacia)(皮斯卡塔韦，新泽西州)，IBF(法国)，Dynal公司(Great Neck，纽约)商购获得。在一些实施方案中，珠子可以包含交联剂，诸如但不限于，联乙烯苯、乙二醇二甲基丙烯酸酯，三羟甲基丙烷三甲基丙烯酸酯，N，N′亚甲基-二-丙烯酰胺，已二酸，癸二酸，琥珀酸，柠檬酸，1，2，3，4-丁烷四羧酸，或1，10癸烷二羧酸或本领域已知的其它功能等价的试剂。在许多示例性实施方案中，珠子可以是球体的、非球体的、卵形的、不规则形状的等。微粒的平均直径可以由操作者的判断力选择。然而，通常微粒的平均直径可以在纳米(例如，约100nm)-毫米(例如，约1mm)范围内，其中优选约0.2μm-约200μm的珠子，特别优选约0.5-约10μm的珠子，尽管在一些实施方案中，可以使用更小或更大的珠子，如下文所述。

在一些实施方案中，微粒可以是多孔的，由此增加可用于另一种分子、部分或化合物(例如，引物)附着的表面积。因此，微粒可以具有另外的表面官能团，以促进附着和/或结合。这些基团可以包括羧酸酯、酯，醇、尿素、醛、胺、氧化硫、氧化氮或卤化物。将另一种分子或部分附着到珠子上的方法是本领域已知的(参见，例如，美国专利号.6268222，6649414)。在一些实施方案中，微粒可以进一步包含标记。

“延长的多核苷酸”是指在其上已经添加了或另外结合了(例如，共价结合)一个或多个额外的核苷酸的多核苷酸。

“模板多核苷酸”是指引物可以与之杂交并且延伸的多核苷酸。因此，模板多核苷酸包括与引物至少部分互补的亚序列。模板多核苷酸可以基本上来源于任何来源。为了举例说明，模板核酸任选地来源于或分离自，例如，培养的微生物、未培养的微生物、复合的生物混合物、组织、血清、收集的血清或组织、多种类聚生体(consortia)、远古的、化石的或其它无生命的生物残留物、环境分离物、土壤、地下水、废物装置、深海环境等。此外，模板多核苷酸任选地包括或来源自，例如，单个的cDNA分子，克隆的cDNAs组，cDNA文库，提取的RNAs，天然RNAs，体外转录的RNAs，表征的或未表征的基因组DNAs，克隆的基因组DNAs，基因组DNA文库，酶断裂的DNAs或RNAs，化学断裂的DNAs或RNAs，物理断裂的DNAs或RNAs，等。模板核酸还可以利用本领域公知的技术化学合成。另外，模板核酸任选地与基因的至少一部分相对应或与其互补。当用于本文时，“基因”是指与生物功能相关的DNA的任何片段。因此，基因包括编码序列，并且任选地包括它们的表达所需要的调控序列。基因还任选地包括不表达的DNA片段，其例如，形成其它蛋白的识别序列。

当额外的核苷酸(或其它类似分子，例如，可逆终止子核苷酸)结合到核酸上时，多核苷酸被“延伸”或“延长”。例如，多核苷酸任选地通过核苷酸结合的聚合酶延伸，所述聚合酶典型地在多核苷酸的3′末端添加核苷酸。

“可延伸的多核苷酸”是指在其上可以添加或者共价键合至少一个其它核苷酸的核苷酸，例如，在当所述可延伸的多核苷酸被结合时由聚合酶催化的反应中。可延伸的多核苷酸典型地通过在糖部分的3′-位置添加另一个核苷酸而延伸。

“不可延伸的”核苷酸是指这样的核苷酸，即，当结合到多核苷酸中时，其至少基本上抑制所述多核苷酸的进一步延伸。

当用于本文时，“平行反应”是指包括适于同时进行多个反应的多个分立区域的反应。事实上，可以平行分析任何数目的多核苷酸。例如，在许多示例性实施方案中，可以通过所公开的方法平行分析数百、数千、几十万、数百万、和甚至更大数目的多核苷酸。在许多示例性实施方案中，平行分析的多核苷酸的数目可以是至少2，100，500，1000，10000，50000，100000，300000，500000，或1000000，并且甚至更多。

“部分”或“基团”是指某种事物诸如分子可以分割的部分中的一种(例如，官能团、取代基团等)。例如，核苷酸典型地包含碱性基团(例如，腺嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶、鸟嘌呤、尿嘧啶、或类似的碱性基团)、糖部分(例如，包含糖环或其类似物的部分)、和一个或多个磷酸基团。

“杂环”是指这样的单环或双环，其是饱和的、不饱和的、或芳香环，并且其包含独立选自下列各项的一个或多个杂原子：氮、氧和硫。杂环可以通过任何杂原子或碳原子附着到本发明的核苷酸的糖部分或其类似物上。示例性的杂环包括吗啉基，吡咯烷酮基(pyrrolidinonyl)，吡咯烷基，哌啶基，乙内酰脲基，戊内酰胺基，环氧乙烷基，氧杂环丁烷基，四氢呋喃基，四氢吡喃基，四氢吡啶基，四氢嘧啶基(tetrahydroprimidinyl)，四氢苯硫基，四氢吡喃基，四氢嘧啶基，四氢苯硫基，四氢吡喃基，呋喃基，苯并呋喃基，苯硫基，苯并苯硫基，吡咯基，吲哚基，异吲哚基，氮杂吲哚基，吡啶基，喹啉基，异喹啉基，噁唑基，异噁唑基，苯并噁唑基，吡唑基，咪唑基，苯并咪唑基，噻唑基，苯并噻唑基，异噻唑基，哒嗪基，嘧啶基，吡嗪基，三嗪基，噌啉基，2，3-二氮杂萘基，喹唑啉基等。

“碳环”是指饱和的或不饱和的(但不是芳香的)碳环，诸如环丙烷、环丁烷、环戊烷、环己烷、环庚烷、环己烯等。

“烷基”是指直链的、支链的或环状饱和的烃部分，并且包括所有的位置异构物，例如，甲基，乙基，丙基，1-甲基乙基，丁基，1-甲基丙基，2-甲基丙基，1，1-二甲基乙基，戊基，1-甲基丁基，2-甲基丁基，3-甲基丁基，2，2-二甲基丙基，1-乙基丙基，己基，1，1-二甲基丙基，1，2-二甲基丙基，1-甲基戊基，2-甲基戊基，3-甲基戊基，4-甲基戊基，1，1-二甲基丁基，1，2-二甲基丁基，1，3-二甲基丁基，2，2-二甲基丁基，2，3-二甲基丁基，3，3-二甲基丁基，1-乙基丁基，2-乙基丁基，1，1，2-三甲基丙基，1，2，2-三甲基丙基，1-乙基-1-甲基丙基和1-乙基-2-甲基丙基，正己基，环己基，正庚基，正辛基，2-乙基己基，正壬基，正癸基等。烷基基团典型地包含约1-20个碳原子，并且更典型地包含约2-15个碳原子。烷基基团可以是取代的或未被取代的。

“烯基基团”是指直链的、支链的或环状不饱和的烃部分，其包含一个或多个碳-碳双键。示例性的烯基基团包括乙烯基，2-丙烯基，2-丁烯基，3-丁烯基，1-甲基-2-丙烯基，2-甲基-2-丙烯基，2-戊烯基，3-戊烯基，4-戊烯基，1-甲基-2-丁烯基，2-甲基-2-丁烯基，3-甲基-2-丁烯基，1-甲基-3-丁烯基，2-甲基-3-丁烯基，3-甲基-3-丁烯基，1，1-二甲基-2-丙烯基，1，2-二甲基-2-丙烯基，1-乙基-2-丙烯基，2-己烯基，3-己烯基，4-己烯基，5-己烯基，1-甲基-2-戊烯基，2-甲基-2-戊烯基，3-甲基-2-戊烯基，4-甲基-2-戊烯基，1-甲基-3-戊烯基，2-甲基-3-戊烯基，3-甲基-3-戊烯基，4-甲基-3-戊烯基，1-甲基-4-戊烯基，2-甲基-4-戊烯基，3-甲基-4-戊烯基，4-甲基-4-戊烯基，1，1-二甲基-2-丁烯基，1，1-二甲基-3-丁烯基，1，2-二甲基-2-丁烯基，1，2-二甲基-3-丁烯基，1，3-二甲基-2-丁烯基，1，3-二甲基-3-丁烯基，2，2-二甲基-3-丁烯基，2，3-二甲基-2-丁烯基，2，3-二甲基-3-丁烯基，3，3-二甲基-2-丁烯基，1-乙基-2-丁烯基，1-乙基-3-丁烯基，2-乙基-2-丁烯基，2-乙基-3-丁烯基，1，1，2-三甲基-2-丙烯基，1-乙基-1-甲基-2-丙烯基，1-乙基-2-甲基-2-丙烯基，等。所有的烯基基团典型地包含约1-20个碳原子，并且更典型地包含约2-15个碳原子。烯基基团可以是取代的或未被取代的。

“炔基基团”是指直链的、支链的或环状不饱和的烃部分，其包含一个或多个碳-碳三键。代表性的炔基基团包括，例如，2-丙炔基，2-丁炔基，3-丁炔基，1-甲基-2-丙炔基，2-戊炔基，3-戊炔基，4-戊炔基，1-甲基-2-丁炔基，1-甲基-3-丁炔基，2-甲基-3-丁炔基，1，1-二甲基-2-丙炔基，1-乙基-2-丙炔基，2-己炔基，3-己炔基，4-己炔基，5-己炔基，1-甲基-2-戊炔基，1-甲基-3-戊炔基，1-甲基-4-戊炔基，2-甲基-3-戊炔基，2-甲基-4-戊炔基，3-甲基-4-戊炔基，4-甲基-2-戊炔基，1，1-二甲基-2-丁炔基，1，1-二甲基-3-丁炔基，1，2-二甲基-3-丁炔基，2，2-二甲基-3-丁炔基，3，3-二甲基-1-丁炔基，1-乙基-2-丁炔基，1-乙基-3-丁炔基，2-乙基-3-丁炔基1-乙基-1-甲基-2-丙炔基，等。炔基基团典型地包含约1-20个碳原子，并且更典型地包含约2-15个碳原子。炔基基团可以是取代的或未被取代的。

“烷氧基基团”是指包含氧原子的烷基基团，并且包括，例如，甲氧基、乙氧基、丙氧基、丁氧基、戊氧基、庚氧基、辛氧基等。

“卤基团”是指包含卤素原子诸如F，Cl，Br，或I的基团。

“芳基基团”是指源自芳香化合物的原子或部分的取代基团。示例性的芳基基团包括，例如，苯基基团、苄基基团，甲苯基基团，二甲苯基基团，等。芳基基团任选地包括多个芳香环(例如，联苯基基团等)。另外，芳基基团可以是取代的或未被取代的。

“芳氧基基团”是指包含氧原子的芳基基团，并且包括，例如，苯氧基、氯苯氧基、甲基苯氧基、甲氧基苯氧基、丁基苯氧基、戊基苯氧基、苄氧基等。

“烷基-芳基基团”是指包含烷基和芳基部分的基团。

“醚基团”是指包含附着到单个氧原子上的两个碳原子的直链的、支链的或环状的部分。示例性的醚基团包括，例如，甲氧基甲基，甲氧基乙基，甲氧基丙基，乙氧基乙基，等。

“硫醚基团”是指包含附着到单个硫原子上的两个碳原子的直链，支链或环状的部分，并且包括，例如，甲硫基甲基，甲硫基乙基，甲硫基丙基，等。

“烷基胺基团”是指包含至少一个烷基基团的氨基基团。

“烯基胺基团”是指包含至少一个烯基基团的氨基基团。

“炔基胺基团”是指包含至少一个炔基基团的氨基基团。

“酯基团”是指一类包括通式RCOOR′的有机化合物，其中R和R′独立地选自烷基基团、烯基基团、炔基基团、芳基基团、或它们的组合。

“聚氨基酸”是指包含两个或多个氨基酸残基的化合物或组。示例性的聚氨基酸包括肽、多肽、蛋白等。

“醛基团”是指包含式CHO的有机基团。

“醇基团”是指包含至少一个羟基基团的有机基团。

“甲硅烷基基团”是指一类包含通式SiRR′R＂的化合物，其中R，R′，和R＂独立地是H、烷基基团、烯基基团、炔基基团、芳基基团、或这样的基团的组合。

“磷酸酯类似物”是指可以由磷酸酶诸如碱性磷酸酶裂解的部分。

多核苷酸的“序列”是指核酸中的核苷酸的顺序和身份(identity)。序列典型地以5′到3′方向读取。

“附着的”是指包括但不限于下述各项的相互作用：共价结合、离子结合、化学吸附、物理吸附和它们的组合。

“接头”或“间隔臂(spacer)”是指将化合物或取代基团共价或非共价(例如，离子地等)附着到例如固体支持物、另一种化合物或基团等上的化学部分。例如，接头任选地将标记(例如，荧光染料、放射性同位素等)附着到2′-终止子核苷酸等上。接头典型地是双官能化学部分，并且在某些实施方案中，它们包括可裂解的附着，其可以通过例如，热、酶、化学试剂、电磁辐射等裂解，以从例如固体支持物、另一种化合物等上释放物质或化合物。接头的认真选择允许裂解在与化合物的稳定性和测定方法相容的适当条件下进行。通常，接头没有特别的生物活性，除了例如将化学种类连接在一起或在这样的种类之间保持某些最小距离或其它空间关系之外。然而，可以选择接头的成分，以影响连接的化学种类的一些性质，诸如三维构象、净电荷、疏水性等。接头分子的其它描述提供在，例如，Lyttle等(1996)核酸研究(Nucleic Acids Res.)24(14)：2793，Shchepino等(2001)核苷，核苷酸和核酸(Nucleosides，Nucleotides，& Nucleic Acids)20：369，Doronina等(2001)核苷，核苷酸和核酸(Nucleosides，Nucleotides，& Nucleic Acids)20：1007，Trawick等(2001)生物缀合物化学(BioconjugateChem.)12：900，Olejnik等(1998)酶学方法(Methods in Enzymology)291：135，Pljevaljcic等(2003)美国化学学会杂志(J.Am.Chem.Soc.)125(12)：3486，Ward，等，美国专利号4,711,955，Stavrianopoulos，美国专利号4,707,352，和Stavrianopoulos，美国专利号4,707,440中，其分别通过引用结合。

“修饰的”酶是指包含这样的序列的酶，在所述序列中，至少一个氨基酸与参照序列诸如天然的或野生型的酶或酶的另一种修饰形式不同，例如，当两个序列关于最大相同性进行比对时。示例性的修饰包括单体插入、删除和取代。修饰的酶(例如，聚合酶)可以通过各种生成方法产生。尽管基本上可以使用任何方法来产生修饰的酶，但是某些代表性的技术包括重组(例如，通过循环重组、合成重组等)编码一个或多个母体酶的两个或更多个核酸，或者通过突变编码酶的一个或多个核酸，例如，使用循环集团诱变(recursive ensemble mutagenesis)，盒诱变，随机诱变，体内诱变，位点定向诱变等进行突变。编码母体酶的核酸典型地包括这样的基因，即，通过转录和翻译机制，其产生与母体酶例如酶的天然形式相对应的氨基酸序列。修饰的酶还包括嵌合酶，其具有源自两个或更多个母体的可以鉴定的组成序列(例如，结构和/或功能性结构域等)。在修饰的酶的定义中还包括相对于参照序列包含化学修饰(例如，附着的取代基、改变的取代基等)的那些。

“固体支持物”是指可以衍生具有或另外附着化学部分诸如多核苷酸等的固体材料。示例性的固体支持物包括平板，珠子，微珠，纤维，须晶，梳状晶簇(comb)，杂交芯片，膜，单晶，陶瓷层，载玻片，自我组装的单层等。

“裂解”是指从另一种物质或化合物或部分释放物质或化合物或部分的过程。

3.3 详述

应该理解，包括附图的前述概述和以下的详述二者都只是示例性的和解释性的，并且不限制这一公开内容。在这一公开内容中，单数的使用包括复数，除非另外特别阐明。此外，“或”的使用意指“和/或”，除非另外指明。类似地，“包含”(＂comprise，＂＂comprises，＂＂comprising＂)，包括(＂include，＂＂includes，＂和＂including＂)不意欲是限制性的。

本文公开的是对多核苷酸进行测序包括单分子测序的组合物和方法。本发明公开的组合物包括可逆终止子核苷酸，其可以通过聚合酶以模板依赖性/指导性方式结合在多核苷酸的3′末端。在一些实施方案中，所述可逆终止子核苷酸通常包含在糖部分3′-位置的羟基基团，在糖部分2′-位置的封闭基团，和附着到碱基上的标记。当结合可逆终止子核苷酸时，所述封闭基团使得所述多核苷酸不能通过聚合酶延伸。在一些实施方案中，所结合的可逆终止子还通常是对3′-5′核酸外切酶或聚合酶的“校正活性”有抗性的。

在结合之后，可以检测可逆终止子核苷酸的标记，以鉴定终止子核苷酸的碱基，并且因此鉴定模板多核苷酸的对应的碱基。为了允许下一轮的延伸，可以将所述多核苷酸在去除封闭基团和标记的条件下用一种或多种试剂处理。因此，封闭基团和标记可以在相同条件下去除。当去除标记和封闭基团后，所述多核苷酸的3′末端可以以模板依赖性方式进一步延伸。

示例性可逆终止子核苷酸的结构如式I所示：

其中

R₁代表H，OH，亲水基团或疏水基团；

B代表核碱基，其包含至少一个碳环、至少一个杂环(具有或不具有环外的杂原子)、或至少一个芳基基团、或它们的组合；

BG代表可逆的封闭基团；

Z代表O，CH₂，或S；

代表单键或双键。

在一些实施方案中，可逆终止子核苷酸可以包括附着在5′位置的至少1，2，或3个磷酸酯基团和/或磷酸酯类似物。在一些实施方案中，可逆终止子核苷酸包括标记。在一些实施方案中，R₁和BG可以分别在2′和3′位置。

式I的B基团的非限制性实例包括腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤、胸腺嘧啶、尿嘧啶、5-丙炔基-尿嘧啶、2-硫-5-丙炔基-尿嘧啶、5-甲基胞嘧啶、假异胞嘧啶、2-硫代尿嘧啶和2-硫代胸腺嘧啶、2-氨基嘌呤、N9-(2-氨基-6-氯嘌呤)，N9-(2，6-二氨基嘌呤)，次黄嘌呤，N9-(7-脱氮-鸟嘌呤)，N9-(7-脱氮-8-氮杂-鸟嘌呤)，N8-(7-脱氮-8-氮杂-腺嘌呤)，异C和异G。适当的B基团的其它非限制性实例包括在下列各项中公开的核碱基：美国专利号5432272，6001983，6037120，61040496，6357163，6617106，6977161；美国专利公布号20040106108，20050037398，20060078936；EP1358352，EP1590482；和WO9220702，WO9220703，WO0233126和WO04065550。因此，熟练的技术人员应该理解，式I的B基团可以是任何天然存在的或合成的核碱基，其适合以序列-特异性方式与多核苷酸杂交。

封闭基团(BG)可以是适于基本上抑制多核苷酸延伸的任何部分，其包含式I的3′可逆终止子核苷酸。BG抑制延伸的机制可以是通过各种方法，包括但不限于，电荷(例如，正电荷或负电荷)或立体化学抑制。在一些实施方案中，BG可以任选地使得多核苷酸基本上抗3′-5′核酸外切酶和/或聚合酶的“校正活性”。除了基本上抑制延伸，式I的BG是可逆的。在本文中，“可逆”意指BG基本上可以被去除，以产生适合以模板指导方式进行引物延伸的3′末端。BG的去除可以使用各种方法和试剂实现，包括但不限于，酶，诸如碱性磷酸酶。

在一些实施方案中，BG可以是SO₃。

在一些实施方案中，BG可以是C(O)R₉，其中R₉表示H，烷基基团，苄基基团，芳基基团，烯基基团，炔基基团，或它们的组合。

在一些实施方案中，BG可以包含式II：

其中

当X代表O，S，NR₃，CR₃R₄，或SiR₃R₄时；

Y代表CR₅R₆R₇，SiR₅R₆R₇，OR₅，SR₅，或NHR₅；

R₂代表H，OH，NHR₈，SR₈，烷基基团，苄基基团，芳基基团，烯基基团，炔基基团，烷氧基基团，或它们的组合；和

R₃，R₄，R₅，R₆，R₇，和R₈独立选自H，烷基基团，苄基基团，芳基基团，烯基基团，炔基基团，或它们的组合。

在一些实施方案中，BG可以包含式III：

其中

X代表CR₃R₄R₅，SiR₃R₄R₅，OR₃，SR₃，或NHR₃；

R₂代表H，NHR₆，SR₆，烷基基团，苄基基团，芳基基团，烯基基团，炔基基团，烷氧基基团，或它们的组合；和

R₃，R₄，R₅，和R₆独立地选自H，烷基基团，苄基基团，芳基基团，烯基基团，炔基基团，或它们的组合。

在一些实施方案中，BG可以是磷酸酯(-PO₄)。

在一些实施方案中，BG可以是SO₃。

在一些实施方案中，BG可以是C(O)R。

合成BG基团和它们的等价物的方法是本领域已知的。

本发明公开的可逆终止子任选地包含至少一个标记。在一些实施方案中，标记可以附加在可逆终止子的核碱基(B)上，例如，在碳环、杂环或芳基基团上(例如，通过嘧啶的C-5，胞苷的N-4，嘌呤的N-7，腺苷的N-6，嘌呤的C-8，或本领域内的另一个附着位点)。在一些实施方案中，标记可以通过酰胺、酯、硫酯、醚、硫醚、碳-碳、或其它类型的共价键附着。在一些实施方案中，标记可以附着到可逆终止子核苷酸的糖部分(例如，核糖)或其类似物上。在一些实施方案中，标记可以附着到BG上，诸如，式II和III的BG或磷酸上，诸如，通过酰胺、酯、硫酯、醚、硫醚、碳-碳或其它的键附着。在一些实施方案中，标记可以通过本文所述的接头附加到可逆终止子核苷酸上。

在许多示例性实施方案中，标记包括荧光染料(例如，罗丹明染料(例如，R6G，R110，TAMRA，ROX，等)，荧光素染料(例如，JOE，VIC，TET，HEX，FAM，等)，卤代萤光素染料，花青染料(例如，CY3，CY3.5，CY5，CY5.5，等)，染料(例如，FL，530/550，TR，TMR，等)，ALEXA

染料(例如，488，532，546，568，594，555，653，647，660，680，等)，二氯罗丹明染料，能量转移染料(例如，BIGDYE^TMv 1染料，BIGDYE^TMv2染料，BIGDYE^TMv 3染料，等)，萤光染料(例如，萤光黄，等)，CASCADE

Oregon绿，等。其它示例性染料提供在Haugland，荧光探针和研究产物的分子探针手册(Molecular Probes Handbook of Fluorescent Probesand Research Products)，第9版.(2003)和其更新材料中。荧光染料通常易于从各种商业供应商获得，其包括，例如，分子探针公司(Molecular Probes，Inc.)(Eugene，OR)，安玛西亚生物科学公司(Amersham Biosciences Corp.)(皮斯卡塔韦，新泽西州)，Applera公司/应用生物系统部(Applied BiosystemsGroup)(福斯特城，加利福尼亚州)。其它示例性的标记包括，例如，生物素，弱荧光标记(Yin等.(2003)应用环境微生物学(Appl EnvironMicrobiol.)69(7)：3938；Babendure等.(2003)分析生物化学(Anal.Biochem.)317(1)：1；和Jankowiak等.(2003)毒性化学研究(Chem ResToxicol.)16(3)：304)，非荧光标记，比色标记，化学发光标记(Wilson等.(2003)Analyst.128(5)：480；Roda等.(2003)发光(Luminescence)18(2)：72)，拉曼标记，电化学标记，生物发光标记(Kitayama等.(2003)光化学和光生物学(Photochem Photobiol.)77(3)：333；Arakawa等.(2003)分析生物化学(Anal.Biochem.)314(2)：206；和Maeda(2003)药物生物医学分析杂志(J.Pharm.Biomed.Anal.)30(6)：1725)，和α-甲基-PEG标记试剂，如在，例如，于2002年11月22日提交的美国临时专利申请号60/428,484中所述。

在一些实施方案中，标记包括放射性同位素，诸如³H，¹⁴C，²²Na，³²P，³³P，³⁵S，⁴²K，³⁵Ca，⁵⁹Fe，¹²⁵I，²⁰³Hg，等。在一些实施方案中，标记可以包括至少一个质量-修饰基团，其包括但不限于，氘，F，Cl，Br，I，S，N₃，XY，CH₃，SPO₄，BH₃，SiY₃，Si(CH₃)₃，Si(CH₃)₂(C₂H₅)，Si(CH₃)(C₂H₅)₂，Si(C₂H₅)₃，(CH₂)_nCH₃，(CH₂)_nNY₂，CH₂CONY₂，(CH₂)_nOH，CH₂F，CHF₂，CF₃，和硫代磷酸酯基团，其中X是O，NH，NY，S，NHC(S)，OCO(CH)_nCOO，NHCO(CH₂)_nCOO，OSO₂2O，OCO(CH₂)_n，NHC(S)NH，OCO(CH₂)_nS，OCO(CH₂)S，NC₄4O₂H₂S，OPO(O-烷基)，或OP(O-烷基)；其中n是1-20闭区间内的整数；并且，Y是H，氘，烷基基团，烷氧基基团、芳基基团、聚氧基亚甲基基团，单烷基化聚氧基亚甲基基团，聚乙烯亚胺基团，聚酰胺基团，聚酯基团，烷基化的甲硅烷基基团，杂寡聚物，聚氨基酸，杂寡聚物/聚氨基酸基团，或聚乙二醇基团。

可以使用许多接头，以任选地将标记和BG连接到可逆终止子核苷酸上，并且这对于本领域技术人员是显而易见的。接头通常是在空间和电子学上适于结合到多核苷酸中的结构。在一些实施方案中，接头可以包括醚，硫醚，甲酰胺，磺胺，尿素，氨基甲酸酯，肼，或其它部分。在一些实施方案中，接头可以包括约1-约25个选自例如C，N，O，P，Si，S，等的非氢原子，并且基本上包括示例性基团的任何组合，诸如醚、硫醚、胺、酯、甲酰胺、磺胺、酰肼键、芳香或杂芳香键。在一些实施方案中，接头包括单碳-碳键和甲酰胺或硫醚键的组合。在一些实施方案中，可以使用接头的更长的线性片段，最长的线性片段典型地包含约3-约15个非氢原子，其包括一个或多个杂原子。

接头部分的非限制性实例包括取代的(例如，官能化的)或未被取代的基团，诸如咪唑/生物素接头，聚亚甲基基团，亚芳基基团，烷基亚芳基基团，亚芳基烷基基团，芳硫基基团，酰氨基烷基基团，炔基烷基基团，烯基烷基基团，烷基基团，烷氧基基团，硫基，氨基烷基基团，吗啉衍生的磷酸酯，肽核酸(例如，N-(2-氨基乙基)甘氨酸，等)，等。(参见，例如，美国专利号.4711958，5047519，5175269，5328824，6339392；和美国专利公布号20020151711。标记和接头的其它实例提供在Hermanson，生物缀合物技术(Bioconjugate Techniques)，Elsevier Science(1996)中。

在一些实施方案中，适当的接头包括可以光致断裂的部分，诸如2-硝基苄基部分，α-取代的2-硝基苄基部分(例如，1-(2-硝基苯基)乙基部分)，3，5-二甲氧基苄基部分，硫代异羟肟酸，7-硝基二氢吲哚部分，9-苯基呫吨基部分，苯偶姻部分，羟基苯甲酰甲基部分，NHS-ASA部分，等。示例性的可光致断裂的接头在美国专利公布号20030099972中描述。在一些实施方案中，接头包括金属，诸如铂原子，(参见，例如，美国专利号5714327)。许多不同长度的接头可从许多供应商处商购获得，其包括，例如，Qiagen/操纵子技术公司(Qiagen/Operon Technologies，Inc.)(Alameda，CA)，BD生物科学BD克隆技术公司(BD Biosciences Clontech)(帕洛阿尔托，加利福尼亚)，和分子生物科学(Molecular BioSciences)(玻尔得，科罗拉多州)。

在一些实施方案中，适当的接头可以是可断裂的接头。当用于本文时，＂可断裂的接头＂是指能够在电子级联自我消除反应中断裂的接头。在许多示例性实施方案中，接头的断裂可以导致从本发明公开的可逆终止子核苷酸上去除标记和/或BG。可断裂接头的实例在美国专利公布号20060003383中公开。

在一些实施方案中，可断裂接头包含接头部分和引发部分。所述接头部分，所述引发部分，和任选的标记和/或BG可以以允许它们发挥它们各自的功能的任何方式连接到接头部分上。引发部分包括可以通过专门的引发剂断裂或“激活”的底物。引发部分的激活引发自发的重排，其导致接头的断裂和标记和/或BG的释放。在一些实施方案中，标记和/或BG从可逆终止子核苷酸的释放可以由环闭合机制引起。在一些实施方案中，接头通过消除反应断裂。各种消除反应，包括但不限于，1，4-，1，6-和1，8-消除反应已经用于设计前药，并且可以适用于本发明所述的组合物和方法中，(参见，例如，WO02083180，Gopin等.Angew Chem int Ed.32：327-332(2003)，Niculescu-Duvaz等.医学化学杂志(J Med Chem.)41：5297-5309(1998)，Florent等.医学化学杂志(J Med Chem.)41：3572-3581(1998)，Niculescu-Duvaz等.医学化学杂志(J Med Chem.)42：2485-2489(1999)，Greenwald等.医学化学杂志(JMed Chem.)42：3657-3667(1999)，de Groot等.生物有机医学化学通信(Bioorg Med Chem Lett).12：2371-2376(2002)，Ghosh等.四面体通讯(Tetrahedron Letters)41：4871-4874(2000)，Dubowchik等.生物缀合物化学(Bioconjugate Chem.)13：855-869(2002)，Michel等.Atta-ur-Rahman(编)21：157-180(2000)，Dinaut等.化学通讯(Chem Commun.)1386-1387(2001)，Ohwada等.生物有机医学化学通讯(Bioorg Med Chem Lett.)12：2775-2780(2002)，de Groot等.有机化学杂志(J Org Chem.)66：8815-8830(2001)，Leu等.医学化学杂志(J Med Chem.)42：3623-3628(1999)，Sauerbrei等.Angew Chem Int Ed.37：1143-1146(1998)，Veinberg等.生物有机医学化学通讯(Bioorg Med Chem Lett.)14：1007-1010(2004)，Greenwald等.生物缀合物化学(Bioconjugate Chem.)14：395-403(2003)，和Lee等.Angew Chem Int Ed..43：1675-1678(2004)。

可以使用激活引发部分的任何方式，条件是用于激活引发部分的方式能够产生可检测的变化，诸如，荧光的减少和/或去除BG和/或引物延伸。激活的具体方式，并且因此引发部分的选择可以部分取决于具体的断裂反应，以及其它因素。

在一些实施方案中，激活基于引发部分的断裂。在这些实施方案中，所述引发部分包括通过化学试剂或裂解酶裂解的裂解位点。在非限制性示例性实施方案中，引发部分可以包括通过硫酸酯酶裂解的裂解位点(例如，SO₃及其类似物)，酯酶(例如，C(O)R₉及其类似物)，或磷酸酶(例如，PO₄及其类似物(Parent等.现代遗传和发育学观点(Current Opinion in Genetics&Development)1997；7(3)：386-391；Ellis等.应用和环境微生物学(Applied&Environmental Microbiology)2002；68(1)：31-36；Bogaerts等.环境毒性和化学(Environmental Toxicology & Chemistry)1998；17(8)：1600-1605；Choudhury.组织化学和细胞化学杂志(Journal of Histochemistry andCytochemistry)1972；20(7)：507-517)。作为特别的实例，引发部分可以包括通过磷酸酶如碱性磷酸酶裂解的裂解位点。

引发部分还可以包括促进裂解酶的特异性、亲和性和/或动力学的其它残基和/或特征。取决于具体的裂解酶的需要，这样的裂解酶“识别部分”可以包括裂解位点，或备选地，所述裂解位点可以在识别部分之外。

引发部分的化学组成特别取决于裂解酶的需要。例如，如果裂解酶是磷酸酶，则所述引发部分可以包括由特别的磷酸酶识别并断裂的磷酸酯或磷酸酯类似物。如果所述断裂酶是核酸酶，则引发部分可以包括由特别的核酸酶识别并断裂的寡核苷酸(或其类似物)。如果所述断裂酶是糖苷酶，则引发部分可以包括由特别的糖苷酶识别并断裂的碳水化合物(参见，例如，Florent等.医学化学杂志(J Med Chem.)41：3572-3581(1998)，Ghosh等.四面体通讯(Tetrahedron Letters)41：4871-4874(2000)，Michel等.Atta-ur-Rahman(ed.)21：157-180(2000)，和Leu等.医学化学杂志(JMedChem.)42：3623-3628(1999))。由脂肪酶和酯酶如磷酸酶识别并裂解的示例性结构，也是公知的，并且包括在下列各项中公开的结构：Ohwada等.生物有机医学化学通讯(Bioorg Med Chem Lett.)12：2775-2780(2002)，Sauerbrei等.Angew Chem Int Ed.37：1143-1146(1998)，Greenwald等.医学化学杂志通讯(JMed Chem Lett.)43：475-487(2000)，Dillon等.生物有机医学化学通讯(Bioorg Med Chem Lett.)14：1653-1656(1996)，和Greenwald等.医学化学杂志(JMed Chem.)47：726-734(2004))。由蛋白酶/蛋白水解酶识别并裂解的示例性结构在下列各项中公开：Niculescu-Duvaz等.医学化学杂志(J Med Chem.)41：5297-5309(1998)，Niculescu-Duvaz等.医学化学杂志(J.Med Chem.)42：2485-2489(1999)，Greenwald等.医学化学杂志(J Med Chem.)42：3657-36670(1999)，de Groot等.生物有机医学化学通讯(Bioorg Med Chem Lett.)12：2371-2376(2002)，Dubowchik等.生物缀合物化学(Bioconjugate Chem.)13：855-869(2002)，和de Groot等.有机化学杂志(J Org Chem.)66：8815-8830(2001)。由催化抗体识别并裂解的示例性结构在Gopin等.Angew Chem Int Ed.42：327-332(2003)，Dinaut等.化学通讯(Chem Commun.)1386-1387(2001)中公开。

接头部分，引发部分和任选的标记和BG以允许它们发挥它们各自的功能的任何方式连接到接头部分上。在一些实施方案中，引发部分，标记和/或BG分别独立于彼此地，直接连接到接头部分上。在其它实施方案中，引发部分，标记和/或BG可以是，独立于彼此地，通过一个或多个任选的连接间接相连到接头部分上。任选的连接可以包括离去基团，其在底物化合物断裂时，与附着于其上的部分一起从接头的骨架上释放。例如，在一些实施方案中，所述标记可以通过包含离去基团的连接附着到接头部分的骨架上，而BG可以通过稳定的连接附着到接头部分的骨架上，所述稳定的连接例如在断裂反应后不从接头骨架上解离的连接。

在一些实施方案中，所述引发部分还作为接头部分。在这些实施方案中，专门的引发剂对引发部分的裂解还导致接头的断裂和标记和/或BG的释放。

在一些实施方案中，所述引发部分还作为BG。在这些实施方案中，专门的引发剂对引发部分的裂解导致接头的断裂和BG的去除。因此，在这些实施方案中，接头断裂和BG去除可以在单一步骤中在相同条件下发生。结果，附着到可断裂接头上的标记和BG可以在单一步骤中在相同条件下去除。也可以作为BG的引发部分的实例包括但不限于，-PO₄，SO₃，和C(O)R9。

包含磷酸酯BG和引发部分的可逆终止子核苷酸的实例显示在图1中，其中可断裂接头附加在胞嘧啶碱基上。在可断裂接头上的磷酸酯作为引发部分。磷酸酯引发部分的裂解引起接头的断裂和染料从胞嘧啶碱基上的去除。在核糖糖2′位置的磷酸酯BG的裂解允许其它的核苷酸添加到3′位置。包含磷酸酯引发部分的可断裂接头的其它实例显示在图2和图3中，其中可断裂接头包含荧光染料。制备这些和其它示例性可断裂接头的方法在美国专利公布号20060003383中公开。

在一些实施方案中，磷酸酯BG和引发部分可以通过碱性磷酸酶(＂ALP＂)(正磷酸单酯磷酸水解酶[碱性最宜]；(EC 3.1.3.1))裂解。通常，ALPs是催化磷酸单酯酶反应的同型二聚体非特异性金属酶。(Coleman.生物物理生物分子结构年刊(Annu Rev Biophys Biomol Struct.)1992；21：441-483；Holtz等.FEBS Lett.1999；462：7-11；Holtz等.生物的化学杂志(J Biol Chem.)1999；274：8351-8354；Kim等.Clin Chim Acta1989；186；175-188；Manes等.Genomics(基因组学)1990；8：541-554；McComb等.碱性磷酸酶(Alkaline Phosphatase)1979Plenum Press，NY；Trowsdale等.生物化学学会交流(Biochem Soc Trans.)1990；18：178-180)。ALPS的反应条件是本领域公知的，并且适用于该公开方法的ALPs的非限制性实例包括虾碱性磷酸酶(de Backer等.分子生物学杂志(J MoIBiol.)2002年5月17日；318(5)：1265-74；Olsen等比较生物化学生物物理学(Comp Biochem Physiol.)199199B：755-61)，牛肠碱性磷酸酶(Weissig等生物化学杂志(Biochem J.)1993；290：503-508)，和分离自下列各项的的ALPs：Pyrococcus abyssi(Erauso等.微生物学进展(Arch Microbiol).1993；160：338-349；Zappa等.应用环境微生物学(Appl Environ Microbiol.)2001年10月；67(10)：4504-11)，Pyrococcus horikoshii物种(Gonzalez等.极端生物(Extremophiles)1998；2：123-130)，Thermatoga neopolitana(Dong等.酶微生物学技术(Enzyme Microb Technol.)1997；21：335-340)，Thermuscaldophilus GK24(Park等FEMS微生物学通讯(FEMS Microbiol Lett.)1999；180：133-139)，嗜热栖热菌(Thermus thermophilus)(Pantazaki等.应用生物化学生物技术(Appl.Biochem Biotechnol.)1998；75：249-259)，盐盒菌属(Haloarcula)(Goldman等.细菌学杂志(J Bacteriol.)1990；172：7065-7070)，盐杆菌属(Halobacterium)(Bonet等.国际生物化学分子生物学(Biochem Mol Biol Int.)1994；34：1109-1120；Fitt等生物化学杂志(Biochem J.)1979；181：347-353)，中间普雷沃氏菌(Prevotellointermedia)(Ansai等FEBS通讯(FEBS Lett).1998；428：157-160)，杆菌属(Bacillus)(Hulett.分子微生物学(Mol Microbiol.)1996；19：933-939；Mori等生物技术应用生物化学(Biotechnol Appl Biochem)1999；29：235-239；Sharipova等生物化学(莫斯科)(Biochem.(Moscow))1998；63：1178-1182；Sharipova等国际生物化学分子生物学(Biochem Mol Biol Int.)1996；38：753-761；Spencer等细菌学杂志(J Bacteriol.)1981；145：926-933)，弧菌属(Vibrio)(Hauksson等酶学微生物学技术(Enzyme Microb Technol.)2000；27：66-73)，大肠杆菌(Escherichia coli)(Coleman.生物物理学生物分子结构每年综述(Annu Rev Biophys Biomol Struct.)1992；21：441-83；Derman等.细菌学杂志(J Bacteriol.)1991年12月；173(23)：7719-22；Hulett等生物的化学杂志(J Biol Chem.)1991；266：1077-1084；Janeway等生物化学(Biochemistry)1993；32：1601-1609；Kane.现代生物技术观点(Curr OpinBiotechnol.)1995；6：494-500；Karamyshev等分子生物学杂志(JMol Biol.)1998年4月10；277(4)：859-70；Kim等生物技术通讯(Biotechnol Lett.)1998；20：207-210；Murphy等分子生物学杂志(J Mol Biol.)1995；253：604-617；Murphy等生物的化学杂志(J Biol Chem.)1993；268：21497-21500)，拟杆菌属(Bacteroides)(Yamashita等感染免疫学(Infect Immun.)1990；58：2882-2887)，Gadus morhua(Asgeirsson等比较生物化学生物物理学(Comp BiochemPhysiol.)1995；110B：315-329)，锯缘青蟹(Scylla serrata)(生物化学细胞生物学杂志(J Biochem Cell Biol.)2000；32：879-885)，人(Berget等美国国家科学院学报(PNAS USA)1987；84：695-698；Weiss等美国国家科学院学报(PNAS USA)1986；83：7182-7186)，昆虫(Eguchi.比较生物化学生物物理学(CompBiochem Physiol.)1995；111B：151-162)，脉孢菌属(Neurospora)(Morales等Braz J Med Biol Res.2000；33：905-912)，南极菌株TAB5(Antarctic strainTAB5)(Rina等欧洲生物化学杂志(Eur J Biochem)2000；267：1230-1238)。

可逆终止子核苷酸实际上可以用于分析或检测多核苷酸的任何方法中。在许多非限制性实例中，适当的多核苷酸可以是单链的或双链的，或它们的组合，线性的或环形的，染色体或基因或其部分或片段，调节性多核苷酸，来自例如质粒或染色体DNA、基因组DNA、线粒体DNA的限制性片段，来自构建体或构建体文库的DNA(例如，来自YAC，BAC或PAC文库)，RNA(例如，mRNA，rRNA或vRNA)或cDNA或cDNA文库。如本领域已知的，cDNA是通过RNA模板的反转录产生的单链的或双链的DNA。因此，一些实施方案包括反转录酶和适用于将RNA模板反转录成为cDNA的一个或多个引物。反应、进行这样的“RT”反应的试剂和条件是本领域已知的(参见，例如，Blain等，1993，生物的化学杂志(J.Biol.Chem.)5：23585-23592；Blain等，1995，病毒学杂志(J.Virol.)69：4440-4452；PCR基本技术(PCR Essential Techniques)61-63，80-81，(Burke，ed.，J.Wiley&Sons1996)；Gubler等，1983，基因(Gene)25：263-269；Gubler，1987，酶学方法(Methods Enzymol)，152：330-335；Sellner等，1994，病毒学方法杂志(J.Virol.Method.)49：47-58；Okayama等，1982，分子细胞生物学(Mol.Cell.Biol.)2：161-170；和美国专利号5310652，5322770，6300073，它们的这些内容通过引用结合于此。在一些实施方案中，多核苷酸可以包括单个多核苷酸(例如，染色体，质粒)，从该多核苷酸可以克隆扩增和分析一条或多条不同的目的序列。克隆扩增的方法在美国申请系列号11/377,763中公开。

在一些实施方案中，多核苷酸可以以平行方式分析。例如，不连续的或分离的多核苷酸可以作为它们附着在表面的分立区域或分离在多孔平板的孔内的结果进行平行分析。因此，在一些实施方案中，可以平行分析至少100，500，1000，10000，50000，100000，300000，500000，或1000000个多核苷酸。通常，平行反应产生不连续的可以与单个多核苷酸缔合或连接的检测信号。

在一些实施方案中，多核苷酸可以使用可逆终止子核苷酸基于边合成边测序(sequencing-by-synthesis)技术进行测序。所述边合成边测序技术利用核酸的控制合成(例如，引物延伸)和以逐步方式检测每一个结合的可逆终止子核苷酸。例如，在一些实施方案中，在4种可逆终止子核苷酸三磷酸酯和聚合酶的存在下，引物可以杂交到固定在表面上的多核苷酸上，其中所述可逆终止子核苷酸三磷酸酯每一种用光谱解析性荧光染料标记。第一可逆终止子在测序引物3′末端的结合防止进一步延伸。为了检测所结合的可逆终止子，洗掉未结合的可逆终止子，并且通过可逆终止子的荧光标记检测结合的可逆终止子。为了允许下一个延伸和检测循环，将标记和BG从结合的可逆终止子上去除。在实施方案中，其对可逆终止子使用磷酸酯BG和包含磷酸酯引发部分的可断裂接头，使用碱性磷酸酶，诸如虾碱性磷酸酶，如上述，可以在相同条件下去除BG和标记。因此，可以利用酶反应在相同条件下有效地去除标记和BG。在从结合的可逆终止子上去除所述标记和BG之后，在再次引入4种可逆终止子核苷酸三磷酸酯和聚合酶之前，将碱性磷酸酶灭活或洗掉。例如，在一些实施方案中，虾碱性磷酸酶可以通过在65℃温育15分钟而灭活。

在实施所公开的方法时，可以使用分子生物学和重组DNA中的许多常规技术。这些技术是本领域公知的，并且例如在下列各项中公开：现代分子生物学方法(Current Protocols in Molecular Biology)，第I，II，和III卷，1997(F.M.Ausubel编.)；Sambrook等，2001，分子克隆：实验室手册(Molecular Cloning：A Laboratory Manual)，第3版，冷泉港实验室出版社(Cold Spring Harbor Laboratory Press)，冷泉港，纽约；Berger和Kimmel，分子克隆技术指导，酶学方法(Guide to Molecular Cloning Techniques，Methods in Enzymology)第152卷，学院出版社公司(Academic Press，Inc.)，San Diego，Calif.(Berger)，DNA克隆：实践方法(DNA Cloning：A PracticalApproach)，第I和II卷，1985(D.N.Glover编)；寡核苷酸合成(Oligonucleotide Synthesis)，1984(M.L.Gait编)；核酸杂交(Nucleic AcidHybridization)，1985，(Hames和Higgins)；转录和翻译(Transcription andTranslation)，1984(Hames和Higgins编)；动物细胞培养(Animal CellCulture)，1986(R.I.Freshney编.)；固定的细胞和酶(Immobilized Cells andEnzymes)，1986(IRL Press)；Perbal，1984，分子克隆的实践指导(APracticalGuide to Molecular Cloning)；酶学方法(Methods in Enzymology)系列(学院出版社公司(Academic Press，Inc.))；用于哺乳动物细胞的基因转移载体(Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells)，1987(J.H.Miller和M.P.Calos编，冷泉港实验室(Cold Spring Harbor Laboratory))；和酶学方法(Methods in Enzymology)第154和155卷(分别由Wu和Grossman，和Wu，编)。

将多核苷酸共价或非共价附着到固体支持物或表面上的方法也是本领域公知的。固体支持物可以包括各种材料，包括但不限于，塑料、玻璃、陶瓷、金属、树脂、凝胶和膜中的任何一种或多种。固体支持物的示例性类型包括但不限于平板、载玻片、珠子、微珠、须晶、纤维、梳状晶簇、杂交芯片、膜、单晶、陶瓷、和自我装配的单层。

多核苷酸可以通过共价结合附着到固体支持物上，诸如通过用偶联剂缀合，或通过非共价结合，诸如静电相互作用、氢键或抗体-抗原偶联，或通过它们的组合来附着。示例性的偶联剂包括生物素/抗生物素蛋白、生物素/链霉抗生物素蛋白、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)蛋白质A/IgG抗体Fc片段，和链霉抗生物素蛋白/蛋白质A嵌合物(Sano等.(1991)生物/技术(Bio/Technology)9：1378，其通过引用结合)，或这些试剂的衍生物或组合。核酸可以通过可光致断裂的键、静电键、二硫键、肽键、二酯键或这些键的组合而附着到固体支持物上。核酸还通过选择性释放的结合诸如4，4′-二甲氧基三苯甲基或其衍生物任选地附着到固体支持物上。已经发现有用的衍生物包括3或4[二-(4-甲氧基苯基)]-甲基-苯甲酸，N-琥珀酰亚胺基-3或4[二-(4-甲氧基苯基)]-甲基-苯甲酸，N-琥珀酰亚胺基-3或4[二-(4-甲氧基苯基)]-羟甲基-苯甲酸，N-琥珀酰亚胺基-3或4[二-(4-甲氧基苯基)]-氯甲基-苯甲酸，以及这些酸的盐。在一些实施方案中，多核苷酸可以通过在核酸和固体支持物之间的间隔部分附着到固体支持物上。

在一些实施方案中，多核苷酸可以通过可裂解的附着而附着到固体支持物上。可裂解的附着可以通过在多核苷酸和固体支持物之间附着可裂解的化学部分而产生，其包括，例如，寡肽，寡核苷酸，低聚酰胺，丙烯酰胺低聚物，乙二醇低聚物，约6-20个碳原子之间的烷基链，以及它们的组合。这些部分可以使用，例如，添加的化学试剂、电磁辐射、或酶裂解。由酶可裂解的示例性附着包括可以由蛋白酶裂解的肽键和可以由核酸酶裂解的磷酸二酯键。

化学试剂如β-巯基乙醇，二硫苏糖醇(DTT)和其它还原剂裂解二硫键。可以使用的其它试剂包括氧化剂、水合剂和其它选择性活性化合物。电磁辐射诸如紫外线、红外线和可见光裂解可以光致断裂的键。附着也可以是可逆的，例如，使用热或酶处理，或是可逆的化学或磁性附着。释放和再附着可以使用，例如，磁场或电场进行。

在测序和本发明所述的其它方法中可以使用多种核酸聚合酶。在许多示例性实施方案中，聚合酶可以是热稳定性聚合酶或热降解性聚合酶。适当的热稳定性聚合酶包括，但不限于，分离自下列各项的聚合酶：Thermusantranikianii，水生栖热菌(Thermus aquaticus)，Thermus caldophilus，Thermus chliarophilus，丝状栖热菌(Thermus filiformis)，黄栖热菌(Thermus flavus)，Thermus igniterrae，乳栖热菌(Thermus lacteus)，Thermus oshimai，红栖热菌(Thermus ruber)，红色栖热菌(Thermusrubens)，水管致黑栖热菌(Thermus scotoductus)，Thermus silvanus，栖热菌属(Thermus)物种Z05，栖热菌属物种sps17，嗜热栖热菌(Thermusthermophilus)，海栖热袍菌(Thermotoga maritima)，那不勒斯栖热袍菌(Thermotoga neapolitana)，非洲栖热腔菌(Thermosipho africanus)，Anaerocellum thermophilum，热坚芽孢杆菌(Bacillus caldotenax)，嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)，沃氏火球菌(Pyrococcus woesei)，激烈火球菌(Pyrococcus furiosus)，和Thermococcus litoralis。例如，所述聚合酶任选地在该酶的螺旋O处缺少F-Y突变，或者另外缺少增强酶对3′-脱氧核苷酸的结合的突变。在一些实施方案中，聚合酶包含3′-5′核酸外切酶活性。在一些实施方案中，聚合酶可以是热降解性的，诸如大肠杆菌DNA聚合酶I，大肠杆菌DNA聚合酶I的克列诺片段，T4 DNA聚合酶，T5DNA聚合酶，T7 DNA聚合酶，以及其它。

适用于本发明所述的方法的可商购获得的聚合酶的非限制性实例包括，但不限于，

AmpliTaq CS(铂尔金爱尔默(Perkin-Elmer))，AmpliTaq FS(铂尔金爱尔默(Perkin-Elmer))，Kentaql(AB肽(AB Peptide)，St.Louis，密苏里州)，Taquenase(ScienTech公司，St.Louis，密苏里州))，ThermoSequenase(安玛西亚(Amersham))，Bst聚合酶，VentR(exo^-)DNA聚合酶，Reader^TM Taq DNA聚合酶，VENT^TM DNA聚合酶(新英格兰生物实验室(New England Biolabs))，DEEPVENT^TM DNA聚合酶(新英格兰生物实验室(New England Biolabs))，PFUTurbo^TMDNA聚合酶(Stratagene)，Tth DNA聚合酶，KlenTaq-1聚合酶，SEQUENASE^TM1.0 DNA聚合酶(安玛西亚生物科学(Amersham Biosciences))，和SEQUENASE 2.0 DNA聚合酶(美国生物化学(United States Biochemicals))。

在一些实施方案中，聚合酶可以进行修饰，其可以增强本发明公开的可逆终止子核苷酸的结合。示例性的修饰的聚合酶在美国专利号4889818，5374553，5420029，5455170，5466591，5618711，5624833，5674738，5789224，5795762，5939292；和美国专利公布号20020012970，20040005599中公开。修饰的聚合酶的非限制性实例包括G46E E678G CS5 DNA聚合酶，G46EE678G CS5 DNA聚合酶，E615G Taq DNA聚合酶，ΔZO5R聚合酶，和G46E L329A E678G CS5 DNA聚合酶，其在美国专利公布号20050037398中公开。修饰的聚合酶的生产可以使用本发明所述的和本领域已知的分子生物学和重组DNA的许多常规技术实现。在一些实施方案中，其中未封闭的2′-磷酸酯产生2′-羟基，即，核糖核苷酸，可使用聚合酶突变体，诸如在美国专利号5939292中所述的那些，其结合NTPs以及dNTPs。

本发明公开的方法的产物可以通过宽范围的方法进行分析，其可以依据操作者的判断力进行选择。分析方法包括，但不限于，凝胶电泳，毛细管电泳(CE：例如，3730DNA分析仪，3730x1 DNA分析仪，3100-Avant基因分析仪，和270A-HT毛细管电泳系统(应用生物系统(AppliedBiosystems)，福斯特城，加利福尼亚)(参见，例如，美国专利号.RE37941，5384024，6372106，6372484，6387234，6387236，6402918，6402919，6432651，6462816，6475361，6476118，6485626，6531041，6544396，6576105，6592733，6596140，6613212，6635164，和6706162)，其使用各种聚合物(例如，分离聚合物(例如，POP-4^TM POP-6^TM，或POP-7^TM(应用生物系统(AppliedBiosystems)，福斯特城，加利福尼亚)，线性聚丙烯酰胺(LPA：Klepamik等，2001，电泳(Electrophoresis)22(4)：783-8；Kotler等，2002，电泳(Electrophoresis)23(17)：3062-70；Manabe等，1998，电泳(Electrophoresis)19：2308-2316))，层析，薄层层析，或纸层析，通过激光-诱导的荧光(参见，例如，美国专利号5945526，5863727，5821058，5800996，5332666，5633129，和6,395,486)，放射自显影，化学发光，质谱方法(参见，例如，美国专利号.6225450和510412)，显微毛细管电泳方法(参见，例如，Doherty等，2004，分析化学(Analytical Chemistry)76：5249-5256；Ertl等，2004，分析化学(Analytical Chemistry)76：3749-3755；Haab等，1999，分析化学(AnalyticalChemistry)71：5137-5145(1999)；Kheterpal等，1999，分析化学(AnalyticalChemistry)71：31A-37A；Lagally等，2000，传感器和激发器(Sensors andActuators)B 63：138-146；Lagally等，2001，分析化学(Anal.Chem.)73：565-570；Lagally等，2003，在显微总分析系统中使用便携式PCR-CE微系统进行遗传分析(Genetic Analysis Using a Portable PCR-CE Microsystem，in Micro Total Analysis Systems)第2卷，Northrup等(编)第1283-1286页；Liu等，1999，分析化学(Anal.Chem.)71：566-573；Medintz等，2000，电泳(Electrophoresis)21：2352-2358；Medintz等，2001，基因组研究(GenomeResearch)11：413-421；Paegel等，现代生物技术观点(Current OpinionsinBiotechnology)14：42-50；Scherer等，1999，电泳(Electrophoresis)20：1508-1517；Shi等，1999，分析化学(Analytical Chemistry)71：5354-5361；Wedemayer等，2001，生物技术(BioTechniques)30：122-128；美国专利号.6787015，6787016；美国申请号20020166768，20020192719，20020029968，20030036080，20030087300，20030104466，20040045827，20040096960；EP1305615；和WO 02/08744)。

在一些实施方案中，由本文公开的标记产生的可检测信号可以使用光电倍增管(PMTs)，电荷-偶联的装置(CCDs)，加强的CCDs，光电二极管，离子雪崩光电二极管，光学传感器，扫描探测器，等检测。检测器，诸如这些易于从许多商业来源获得，所述商业来源包括，例如，应用生物系统(Applied Biosystems)(福斯特城，加利福尼亚)。用于实施本发明方法的检测系统进一步在，例如，Skoog等，仪器分析原理(Principles ofInstrumental Analysis)，第5版，Harcourt Brace College Publishers(1998)和Currell，仪器分析：性能特征和质量(Analytical Instrumentation：Performance Characteristics and Quality)，John Wiley & Sons，公司(2000)中描述。

在本发明公开的方法中所用的引物(例如，测序引物)通常应该是足够长，足以在反应条件下引发模板-引导的合成。引物的准确长度可以取决于许多因素，包括但不限于，在引物和多核苷酸之间需要的杂交温度，不同靶多核苷酸序列的复杂性，盐浓度，离子强度，pH和其它缓冲剂条件，以及引物和多核苷酸的序列。选择适用于具体应用的引物的长度和序列的能力在普通技术人员的能力范围内(参见，例如，Sambrook等分子克隆：实验室手册(Molecular Cloning：A Laboratory Manual)9.50-9.51，11.46，11.50(第2版，冷泉港实验室出版社(Cold Spring Harbor Laboratory Press))；Sambrook等，分子克隆：实验室手册(Molecular Cloning：A LaboratoryManual)10.1-10.10(第3版.冷泉港实验室出版社))。在一些实施方案中，引物包含约15-约35个核苷酸，所述核苷酸适于与靶多核苷酸杂交，并且形成适于DNA合成的底物，尽管所述引物可以包含更多或更少的核苷酸。更短的引物通常需要更低的温度与靶序列形成充分稳定的杂交复合物。多核苷酸退火的能力可以由杂交复合物的熔融温度(＂T_m＂)确定。T_m是其中50％的多核苷酸链与其精确的补体形成双链多核苷酸的温度。因此，对于所选择的多核苷酸的T_m随着影响或改变杂交的因素而改变。在一些实施方案中，在其中发生热循环，引物可以设计成具有在约60-75℃范围内的熔融温度(＂T_m＂)。在这一范围内的熔解温度倾向于在引物延伸的起始时保证引物保持退火或与靶多核苷酸杂交。除其它因素外，引物延伸反应所用的实际温度可以特别取决于，例如，引物的浓度。对于使用热稳定性聚合酶诸如Taq DNA聚合酶进行的反应，在示例性实施方案中，引物可以设计成具有在约60-约78℃或约55-约70℃范围内的T_m。不同引物的熔解温度可以是不同的，然而，在备选实施方案中，它们应该都是近似相同的，即，每个引物的T_m，例如，在平行反应中，可以在约5℃或更小的范围内。不同引物的T_ms可以利用本领域公知的熔解技术凭经验确定(参见，例如，Sambrook等分子克隆：实验室手册(Molecular Cloning：A LaboratoryManual)11.55-11.57(第2版，冷泉港实验室出版社))。备选地，可以计算引物的T_m。关于计算引物的T_ms的许多参考文献和辅助在本领域中是可用的，并且包括，例如但不限于，Baldino等.酶学方法(MethodsEnzymology.)168：761-777；Bolton等，1962，美国国家科学院学报(Proc.Natl.Acad.Sci USA)48：1390；Bresslauer等，1986，美国国家科学院学报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)83：8893-8897；Freier等，1986，美国国家科学院学报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)83：9373-9377；Kierzek等，生物化学(Biochemistry)25：7840-7846；Montpetit等，1992，病毒学方法杂志(J.Virol.Methods)36：119-128；Osborne，1991，CABIOS 8：83；Rychlik等，1990，核酸研究(Nucleic Acids Res.)18：6409-6412(erratum，1991，核酸研究(NucleicAcids Res.)19：698)；Rychlik.NIH研究杂志(J.NIH Res.)6：78；Sambrook等.分子克隆：实验室手册(Molecular Cloning：A Laboratory Manual)9.50-9.51，11.46-11.49(第2版，冷泉港实验室出版社(Cold Spring HarborLaboratory Press))；Sambrook等，分子克隆：实验室手册(Molecular Cloning：A Laboratory Manual)10.1-10.10(第3版.冷泉港实验室出版社))；SantaLucia，1998，美国国家科学院学报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)95：1460-1465；Suggs等，1981，在使用纯化的基因的发育生物学(Developmental Biology Using PurifiedGenes)中(Brown等，编.)，第683-693页，学院出版社(Academic Press)；Wetmur，1991，Crit.Rev.Biochem.Mol Biol.26：227-259，其内容通过应用结合。这些方法中的任何一种可以用于确定引物的T_m。

正如熟练的技术人员应该理解的，通常，对每条链具有相同序列的RNA:RNA，RNA:DNA，和DNA:DNA杂化物(hybrid)的相对稳定性以及由此的T_m可能不同。通常，RNA:RNA杂化物是最稳定的(最高相对T_m)，并且DNA:DNA杂化物是最不稳定的(最低的相对T_m)。因此，在一些实施方案中，除了上述那些之外，在设计引物时要考虑的另一个因素是引物和靶多核苷酸的结构。例如，在RNA多核苷酸反转录产生cDNA的实施方案中，确定用于反转录反应的DNA引物的适合性应该包括所述RNA多核苷酸对所述引物的T_m的影响。尽管不同杂化物的T_m可以凭经验确定，如上述，但是计算不同杂化物的T_m的方法的实例在Sambrook等分子克隆：实验室手册(Molecular Cloning：A Laboratory Manual)9.51(第2版，冷泉港实验室出版社)中找到。

用于所公开的方法的引物的序列设计成基本上与靶多核苷酸的区域互补。“基本上互补”在这里意指引物的序列包括足够的互补性，以在所述浓度和反应中所用的温度和条件下与靶多核苷酸杂交，并且通过DNA聚合酶延伸。

本文所述的组合物和试剂可以包装在试剂盒中。在一些实施方案中，试剂盒包含一种或多种可逆终止子核苷酸。在一些实施方案中，每个可逆的核苷酸可以包含标记(例如，荧光染料，放射性同位素，质量-修饰基团等)。在一些实施方案中，标记可以通过可断裂接头附着到可逆终止子核苷酸上。在一些实施方案中，可逆终止子核苷酸的BG和引发部分可以在相同条件下通过酶如碱性磷酸酶的作用去除。因此，在一些实施方案中，试剂盒可以包括适于激活引发部分并且从可逆终止子核苷酸上去除BG的引发剂。在一些实施方案中，试剂盒可以包括聚合酶，其包括但不限于，本文所述的修饰的聚合酶。在一些实施方案中，试剂盒可以包括一种或多种测序引物。在一些实施方案中，试剂盒可以进一步包括适用于测序的模板多核苷酸，其可以任选地附着在表面或固体支持物上。在一些实施方案中，试剂盒可以包括一个或多个反应区室，其包括适于实施反应如测序反应的试剂，其依赖于操作者的判断力选择。例如，在一些实施方案中，试剂盒可以包括一个或多个反应区室，其包括一种或多种测序试剂。在一些实施方案中，试剂盒的成分可以与来自商购试剂盒的一种或多种试剂联合使用，其包括但不限于，可从下列各项商购的那些：应用生物系统(AppliedBiosystems)(即，Big Dye终止子循环测序试剂盒)，Epicentre(即，SequiTherm^TM循环测序试剂盒)，安玛西亚(Amersham)(即，DYEnamic直接染料-引物循环测序试剂盒)，Boehringer Mannheim(即，CycleReader^TMDNA测序试剂盒)，Bionexus公司(即，AccuPower DNA测序试剂盒)，和USB循环测序试剂盒(即，Thermo Sequenase^TM循环测序试剂盒)。

在试剂盒中包含的各种成分典型地包含在分开的容器中，然而，在一些实施方案中，一种或多种所述成分可以存在于相同的容器中。另外，试剂盒可以包括本文所述的组合物和试剂的任意组合。在一些实施方案中，试剂盒可以包括对于实施所公开的方法是必需的或任选的其它试剂。这样的试剂包括，但不限于，缓冲液、分子大小标准、对照多核苷酸等。

在本申请中，单数的应用包括复数，除非另外特别指明。本文所用的部分标题仅是用于组织的目的，并不以任何方式解释为限制所述的主题。尽管结合许多实施方案描述了本发明的教导，但是并不意欲将本发明教导限制为这样的实施方案。相反，本发明教导包括各种备选方案、修改和等价物，这是本领域的技术人员应该理解的。

本申请中引用的所有出版物、专利、专利申请和其它文件出于所有目的通过引用完全结合于此，其在如同每一篇单独的出版物、专利、专利申请或其它文件出于所有目的通过引用单独结合的相同程度上。尽管已经举例说明并且描述了许多具体的实施方案，但是应该理解，在不背离本发明的精神和范围的条件下，可以进行各种改变。

Claims

1.一种包含碱基和糖的核苷，其中在所述碱基上附着标记，并且在所述糖上附着保护基团，其中所述标记和所述保护基团可以通过酶从所述核苷上脱离。

2.权利要求1的核苷，其中所述标记和所述保护基团可以在相同条件下从所述核苷上脱离。

3.权利要求1的核苷，其中所述标记和所述保护基团包含磷酸酯部分。

4.权利要求1的核苷，其中所述标记和所述保护基团包含SO₃部分。

5.权利要求1的核苷，其中所述标记和所述保护基团包含C(O)R部分。

6.权利要求1的核苷，其中所述酶是磷酸酶。

7.权利要求6的核苷，其中所述磷酸酶是虾碱性磷酸酶。

8.权利要求1的核苷，其中所述酶是硫酸酯酶。

9.权利要求1的核苷，其中所述酶是酯酶。

10.权利要求1的核苷，其中所述标记是荧光标记。

11.权利要求1的核苷，其中所述标记通过可断裂的接头附着到所述碱基上。

12.权利要求11的核苷，其中所述可断裂的接头包含选自由下列各项组成的组的引发部分：PO₄，SO₃，和C(O)R。

13.权利要求12的核苷，其中所述引发部分是所述酶的底物。

14.一种包含碱基和糖的核苷，其中在所述碱基上附着标记，并且在所述糖上附着保护基团，其中所述标记和所述保护基团分别包含磷酸酯部分，并且可通过碱性磷酸酶脱离。

15.一种包含碱基和糖的核苷酸，其中在所述碱基上附着标记，并且在所述糖上附着保护基团，其中所述标记和所述保护基团可通过酶从所述核苷上脱离。

16.权利要求15的核苷酸，其中所述标记和所述保护基团可以在相同条件下从所述核苷上脱离。

17.权利要求15的核苷酸，其中所述标记和所述保护基团包含磷酸酯部分。

18.权利要求15的核苷酸，其中所述标记和所述保护基团包含SO₃部分。

19.权利要求15的核苷酸，其中所述标记和所述保护基团包含C(O)R部分。

20.权利要求15的核苷酸，其中所述酶是磷酸酶。

21.权利要求20的核苷酸，其中所述磷酸酶是虾碱性磷酸酶。

22.权利要求15的核苷酸，其中所述酶是硫酸酯酶。

23.权利要求15的核苷酸，其中所述酶是酯酶。

24.权利要求15的核苷酸，其中所述标记是荧光标记。

25.权利要求15的核苷酸，其中所述标记通过可断裂的接头附着在所述碱基上。

26.权利要求11的核苷酸，其中所述可断裂的接头包含选自由下列各项组成的组的引发部分：PO₄，SO₃，和C(O)R。

27.权利要求12的核苷酸，其中所述引发部分是所述酶的底物。

28.权利要求12的核苷酸，其中所述核苷酸是5′核苷酸三磷酸酯。

29.一种包含碱基和糖的核苷酸，其中在所述碱基上附着标记，并且在所述糖上附着保护基团，其中所述标记和所述保护基团分别包含磷酸酯部分，并且可通过碱性磷酸酶脱离。

30.一种多核苷酸，其中3’末端核苷酸包含碱基和糖，其中在所述碱基上附着标记，并且在所述糖上附着保护基团，其中所述标记和所述保护基团可以通过酶从所述核苷酸上脱离。

31.权利要求15的多核苷酸，其中所述标记和所述保护基团可以在相同条件下从所述核苷上脱离。

32.权利要求15的多核苷酸，其中所述标记和所述保护基团包含磷酸酯部分。

33.权利要求15的多核苷酸，其中所述标记和所述保护基团包含SO₃部分。

34.权利要求15的多核苷酸，其中所述标记和所述保护基团包含C(O)R部分。

35.权利要求15的多核苷酸，其中所述酶是磷酸酶。

36.权利要求20的多核苷酸，其中所述磷酸酶是虾碱性磷酸酶。

37.权利要求15的多核苷酸，其中所述酶是硫酸酯酶。

38.权利要求15的多核苷酸，其中所述酶是酯酶。

39.权利要求15的多核苷酸，其中所述标记是荧光标记。

40.权利要求15的多核苷酸，其中所述标记通过可断裂的接头附着到所述碱基上。

41.权利要求11的多核苷酸，其中所述可断裂的接头包含选自由下列各项组成的组的引发部分：PO₄，SO₃，和C(O)R。

42.权利要求12的多核苷酸，其中所述引发部分是所述酶的底物。

43.一种延伸引物核酸的方法，所述方法包括：

使与模板多核苷酸杂交的引物与聚合酶和权利要求15-29中任一项的核苷酸在适合于所述聚合酶的条件下接触，以通过将所述核苷酸添加到所述引物的3’末端以模板依赖性方式延伸所述引物。

44.一种对模板多核苷酸进行测序的方法，所述方法包括：

a)使与模板多核苷酸杂交的引物与聚合酶和权利要求19-29中任一项的核苷酸在适合于所述聚合酶的条件下接触，以通过将第一个核苷酸添加到所述引物的3’末端以模板依赖性方式延伸所述引物；和

b)鉴定所述核苷酸的碱基。

45.权利要求44的方法，其中所述碱基通过检测所述标记进行鉴定。

46.权利要求44的方法，所述方法还包括：

使所述延伸的引物与使所述标记和所述保护基团脱离的酶接触。

47.权利要求46的方法，其中所述酶是碱性磷酸酶。

48.权利要求46的方法，其中所述酶是硫酸酯酶。

49.权利要求46的方法，其中所述酶是酯酶。

50.权利要求46的方法，所述方法还包括：

a)使与模板多核苷酸杂交的所述延伸的引物与所述聚合酶和权利要求12-22中任一项的核苷酸在适合于所述聚合酶的条件下接触，以通过将第二个核苷酸添加到所述延伸的引物的3’末端以模板依赖性方式延伸所述引物；和

b)鉴定所述第二个核苷酸的碱基。

51.权利要求43-49中任一项的方法，其中所述模板多核苷酸附着在表面上。