ES2895184T3 - Composiciones para secuenciación de ácido nucleico - Google Patents

Abstract

Una composición para determinar la secuencia de un polinucleótido en un método de secuenciación por síntesis basado en fluorescencia, que comprende: a) un conjugado de primer rbNTP - primer tinte fluorescente detectable en un primer canal; b) un conjugado de segundo rbNTP - segundo tinte fluorescente detectable en un segundo canal; c) un tercer conjugado de rbNTP detectable en el primer canal y el segundo canal, en donde el tercer conjugado de rbNTP es una mezcla de un conjugado de tercer rbNTP - tercer tinte fluorescente detectable en el primer canal y un conjugado de tercer rbNTP - cuarto tinte fluorescente detectable en el segundo canal; y d) un cuarto rbNTP que carece de un resto fluorescente; en donde los cuatro tintes fluorescentes comprenden diferentes restos fluorescentes; en donde el primero y el tercer tinte fluorescentes tienen espectros de emisión de fluorescencia similares y forman un primer conjunto de tintes fluorescentes; y en donde los dos conjuntos de tintes fluorescentes tienen diferentes espectros de emisión de fluorescencia; y en donde uno de los dos tintes fluorescentes en cada conjunto de tintes fluorescentes emite a una intensidad detectablemente mayor que el otro tinte fluorescente en el conjunto de tintes fluorescentes.

Description

DESCRIPCIÓN

Composiciones para secuenciación de ácido nucleico

ANTECEDENTES

La detección de analitos tales como secuencias de ácido nucleico que están presentes en una muestra biológica se han utilizado como método para identificar y clasificar microorganismos, diagnosticar enfermedades infecciosas, detectar y caracterizar anomalías genéticas, identificar cambios genéticos asociados con cáncer, estudiar susceptibilidad genética a enfermedades y medir la respuesta a varios tipos de tratamientos. Una técnica común para detectar analitos tales como secuencias de ácido nucleico en una muestra biológica es la secuenciación de ácido nucleico.

La metodología de secuenciación del ácido nucleico ha evolucionado de manera significativa desde los métodos de degradación química utilizados por Maxam y Gilbert, y los métodos de estiramiento de hebras utilizados por Sanger. Hoy en día, se usan varias tecnologías de secuenciación que permiten el procesamiento paralelo de miles de ácidos nucleicos en una sola operación de secuenciación. La instrumentación que implementa dichos métodos es típicamente grande y costosa, ya que los métodos actuales típicamente se basan en grandes cantidades de reactivos costosos y múltiples conjuntos de filtros ópticos para registrar la incorporación de ácido nucleico a reacciones de secuenciación.

Ha quedado claro que la necesidad de tecnologías de secuenciación de ADN menos costosas, más pequeñas y de gran rendimiento será beneficiosa, para obtener la retribución de la secuenciación del genoma. La asistencia sanitaria personalizada está haciendo avances y se beneficiará de dichas tecnologías; la secuenciación de un genoma individual para identificar posibles mutaciones y anomalías será crucial en identificar si una persona presenta una enfermedad particular, que será seguida de terapias subsiguientes adaptadas a ese individuo. Para dar lugar a tal esfuerzo, la secuenciación debe progresar y tornarse susceptible a tecnologías de alto rendimiento no solamente por sus capacidades de alto rendimiento sino también en términos de facilidad de uso, tiempo y eficiencia de costes, y acceso clínico a instrumentos y reactivos.

El documento WO2009/097368 se refiere a un método de secuenciación por ligadura, y sugiere la distinción entre los cuatro nucleótidos posibles usando menos de cuatro etiquetas únicas, p. ej., usando dos etiquetas diferentes, en donde se detecta un nucleótido a través de una combinación de dos etiquetas y se detecta otro mediante la ausencia de etiquetas.

COMPENDIO

La invención se define mediante el alcance de las reivindicaciones anejas.

Las reacciones de secuenciación basadas en fluorescencia existentes distinguen entre la incorporación de distintos nucleótidos en una hebra de ácido nucleico creciente, acoplando un resto fluorescente a cada uno de los cuatro nucleótidos, A T C y G. Típicamente, cada uno de los restos fluorescentes excita y emite a distintas longitudes de onda y por lo tanto se determina la secuencia diana. A la inversa, la presente descripción da a conocer la determinación de una secuencia, por ejemplo, una secuencia de ácido nucleico, usando un conjunto de tinte mínimo, fuentes de luz de excitación mínimas y filtros de emisión óptica mínimos, que aún permiten la diferenciación de la incorporación de los cuatros nucleótidos en una reacción de secuenciación. La presente invención da a conocer métodos y composiciones susceptibles a cualquier sistema fluorescente en donde se desea más de un analito para detección. No obstante, las ventajas particulares se encuentran al aplicar los métodos de la presente invención a metodologías de secuenciación tales como secuencia por metodologías de síntesis.

Los instrumentos y sistemas para detectar secuenciación de fluorescencia de cuatro colores son grandes y costosos de implementar, no solo el coste del instrumento sino también los reactivos, y por lo tanto no son muy atractivos para sitios más pequeños y con capital limitado. Los métodos y composiciones que reducirían los costes y/o el tamaño asociados con la detección por fluorescencia de cuatro colores, por ejemplo, para secuenciar genomas, proporcionarían a los investigadores herramientas más eficientes en términos de eficiencia de tiempo, menor uso de reactivos, instrumentación menos costosa y más pequeña, y similares para uso en sus esfuerzos de investigación.

Las realizaciones de la presente invención dan a conocer aquellas opciones, proporcionando a los investigadores métodos y composiciones para determinar la secuencia de un polímero, por ejemplo, una secuencia de ácido nucleico, que comprende usar un conjunto de tinte mínimo, fuentes de luz mínimas y filtros de excitación/emisión mínimos, aun permitiendo la diferenciación de los tipos de monómeros (p. ej., nucleótidos distintos) incorporados en una reacción de secuenciación.

Las realizaciones descritas en este documento proporcionan la determinación de la secuencia de un ácido nucleico en base a los tiempos de los eventos y a la memorización de esos eventos de "espacio de tiempo". La presente invención da a conocer realizaciones para uso de un tinte o una pluralidad de tintes de los mismos espectros de excitación/emisión o similares, o dos o más tintes de diferentes espectros de fluorescencia, para determinar la presencia de analitos, por ejemplo, nucleótidos, en una muestra, usando eventos de captura de imágenes basados en espacio de tiempo. Como se describe en este documento, las reacciones de secuenciación en el espacio de tiempo utilizan una o más químicas y eventos de obtención de imágenes o pasos para diferenciar entre una pluralidad de analitos, por ejemplo, cuatro nucleótidos, que se incorporan en una hebra de ácido nucleico creciente durante una reacción de secuenciación.

En algunas realizaciones, se pueden detectar menos de cuatros colores diferentes en una mezcla que tiene cuatro nucleótidos diferentes, e incluso dar como resultado la determinación de los cuatro nucleótidos diferentes, por ejemplo, en una reacción de secuenciación. Como primer ejemplo, se puede detectar un par de tipos de nucleótidos en la misma longitud de onda, pero distinguirse en base a un diferencia en intensidad para un miembro del par comparado con el otro, o en base a un cambio a un miembro del par (p. ej., mediante modificación química, modificación fotoquímica o modificación física) que causa que la señal aparente aparezca o desaparezca en comparación con la señal detectada para el otro miembro del par. Como segundo ejemplo, se pueden detectar tres o cuatros tipos de nucleótidos diferentes bajo condiciones particulares, mientras que un cuarto tipo de nucleótido carece de una etiqueta que es detectable bajo esas condiciones, o es mínimamente detectada bajo esas condiciones (p. ej., detección mínima debido a fluorescencia de fondo, etc.). La incorporación de los primeros tres tipos de nucleótidos en un ácido nucleico se puede determinar en base a la presencia de sus señales respectivas, y la incorporación del cuarto tipo de nucleótido en el ácido nucleico se puede determinar en base a la ausencia o detección mínima de cualquier señal. Como tercer ejemplo, un tipo de nucleótido puede incluir una etiqueta(s) que se detecta en dos canales diferentes, mientras que otros tipos de nucleótidos se detectan en no más de uno de los canales.

Las tres configuraciones ilustrativas antes mencionadas no se consideran mutuamente exclusivas y se pueden usar en varias combinaciones. Una realización ilustrativa que combina los tres ejemplos es un método SBS basado en fluorescencia que utiliza un primer tipo de nucleótido que es detectado en un primer canal (p. ej., dATP que tiene una etiqueta que es detectada en el primer canal cuando es excitada por una primera longitud de onda de excitación), un segundo tipo de nucleótido que es detectado en un segundo canal (p. ej., dCTP que tiene una etiqueta que es detectada en el segundo canal cuando es excitada por una segunda longitud de onda de excitación), un tercer tipo de nucleótido que es detectado tanto en el primero como en el segundo canal (p. ej., dTTP que tiene por lo menos una etiqueta que es detectada en ambos canales cuando es excitada por la primera y/o la segunda longitud de onda de excitación) y un cuarto tipo de nucleótido que carece de una etiqueta que no es detectada, o es detectada mínimamente, en cualquiera de los canales (p. ej., dGTP que no tiene etiqueta).

En este ejemplo, una variedad de rasgos de ácido nucleico se puede tratar con los cuatro tipos de nucleótidos de modo tal que ocurra un evento de extensión prácticamente en todos los rasgos antes de un evento de detección, y los rasgos se detecten en tan solo un evento de obtención de imágenes, en tan solo dos eventos de obtención de imágenes durante el evento de detección. Una primera imagen obtenida usando la primera longitud de onda de excitación y emisión en el primer canal puede detectar y exhibir rasgos que incorporan el primer y/o el tercer tipo de nucleótido (p. ej., A y/o T). Una segunda imagen obtenida usando la segunda longitud de onda de excitación y emisión en el segundo canal puede detectar y exhibir rasgos que incorporan el segundo y/o tercer tipo de nucleótido (p. ej., C y/o T). La identificación no ambigua del tipo de nucleótido incorporado en cada rasgo se puede determinar, por ejemplo, comparando las dos imágenes para llegar a lo siguiente: rasgos que aparecen (es decir, se detectan) en forma máxima en el primer canal que incorporan el primer tipo de nucleótido (p. ej., A), rasgos que aparecen en forma máxima en el segundo canal que incorporan el segundo tipo de nucleótido (p. ej., C), rasgos que aparecen en ambos canales que incorporan el tercer tipo de nucleótido (p. ej., T) y rasgos que no aparecen, o que son mínimamente detectables, en cualquiera de los canales que incorporan el cuarto tipo de nucleótido (p. ej., G).

Alternativamente, la incorporación de los cuatro nucleótidos se puede determinar usando solamente un evento de obtención de imágenes combinado. Por ejemplo, la incorporación de los tipos de nucleótidos etiquetados se puede determinar exponiendo los nucleótidos incorporados a dos longitudes de onda de excitación al mismo tiempo (p. ej., simultáneamente) y capturando los espectros de emisión en una imagen combinada. La identificación no ambigua de los tipos de nucleótidos incorporados podrían determinarse como se estableció anteriormente; los rasgos que aparecen en un canal de la imagen combinada indicarían la incorporación de ese tipo de nucleótido etiquetado (p. ej., A), los rasgos que aparecen en el segundo canal de la imagen combinada indicarían la incorporación de ese tipo de nucleótido etiquetado (p. ej., C) y los rasgos que aparecen en ambos canales indicarían la incorporación de un tercer tipo de nucleótido (p. ej., T). Dado que uno de los tipos de nucleótidos no está etiquetado (p. ej., G), la incorporación se determina por la ausencia, o la presencia mínimamente mensurable, de rasgos en ambos canales para ese nucleótido no etiquetado. Cabe destacar que la ubicación de los rasgos que incorporan G en este ejemplo se puede determinar a partir de otros ciclos (en donde se incorpora por lo menos uno de los otros tres tipos de nucleótidos).

En una realización de la presente invención, se dan a conocer métodos para determinar la secuencia de un polinucleótido, que comprenden detectar en una reacción de secuenciación la incorporación de los tres tipos diferentes de conjugados de nucleótidos detectables en un polinucleótido y determinar la incorporación de un cuarto tipo de nucleótido en base al patrón de detección de los tres tipos diferentes de nucleótidos detectables en el polinucleótido, determinando así la secuencia de un polinucleótido, en donde la incorporación de tres tipos diferentes de conjugados de nucleótidos detectables se detecta a partir de un estado de señalización y en donde la incorporación del cuarto tipo de nucleótido se determina a partir de un estado de oscuridad.

En otra realización, la presente invención da a conocer métodos para determinar la secuencia de un polinucleótido, que comprenden aplicar a una muestra de polinucleótido para secuenciación una disolución que comprende cuatro tipos de nucleótidos modificados, en donde tres tipos de nucleótidos modificados se conjugan a uno o más restos de detección y uno o más enlazadores posicionados entre el nucleótido y uno o más de los restos de detección, y en donde un cuarto tipo de nucleótido carece de un resto de detección, detectando un patrón de incorporación de dichos nucleótidos modificados en una reacción de secuenciación, capturando de este modo un primer patrón detectable, aplicando una o más composiciones a la reacción de secuenciación para cambiar así el primer patrón detectable, detectando un segundo patrón detectable y determinando la secuencia de la muestra de polinucleótido en los patrones detectables.

En algunas realizaciones, el polinucleótido para secuenciación comprende uno o más de ácidos desoxirribonucleicos, ácidos desoxirribonucleicos modificados, ácidos ribonucleicos y ácidos ribonucleicos modificados. En algunas realizaciones, el polinucleótido para secuenciación es una preparación de biblioteca de ADN genómico. En algunas realizaciones, el conjugado de nucleótidos comprende tipos de nucleótidos seleccionados del grupo que consiste en dATP, dTTP, dUTP, dCTP, dGTP o sus análogos de nucleótidos no naturales. En algunas realizaciones, el análogo de nucleótido no natural comprende un resto finalizador reversible y se selecciona del grupo que consiste en rbATP, rbTTP, rbCTP, rbUTP y rbGTP. En algunas realizaciones, la incorporación de nucleótidos consiste en una secuencia por síntesis, secuencia por ligadura y secuencia por hibridación, o una combinación de éstas. En algunas realizaciones, los conjuntos de tres tipos de nucleótidos se detectan detectando un resto fluorescente. En algunas realizaciones, el resto fluorescente es el mismo para los tres conjugados de nucleótidos, mientras que en otras realizaciones, el resto fluorescente es uno o más restos fluorescentes distintos. En algunas realizaciones, uno o más de los restos fluorescentes distintos se detectan mediante el mismo filtro de emisión. En algunas realizaciones, el resto fluorescente comprende un resto de sistema de transferencia de energía de resonancia fluorescente. En algunas realizaciones, la incorporación del cuarto nucleótido se determina por la ausencia de detección. En algunas realizaciones, los conjugados de ácido nucleico detectables se detectan por fluorescencia. En algunas realizaciones, la fluorescencia se detecta mediante un primero y un segundo eventos de obtención de imágenes, en otras realizaciones, el primero y el segundo eventos de obtención de imágenes están separados en el tiempo. En algunas realizaciones, el primer evento de obtención imágenes detecta un patrón de fluorescencia que es distinto del patrón de fluorescencia detectado por el segundo evento de obtención de imágenes. En algunas realizaciones, la incorporación de uno o más nucleótidos se determina por la diferencia en el patrón de fluorescencia entre el primero y el segundo eventos de obtención de imágenes. En algunas realizaciones, los conjugados de uno o más de los tipos de nucleótidos comprenden además una o más secuencias enlazadoras, en otras realizaciones, una o más de las secuencias enlazadoras comprenden uno o más de un enlazador escindible y un enlazador espaciador. En algunas realizaciones, el enlazador escindible comprende uno o más grupos de enlace escindibles seleccionados del grupo que consiste en un disulfuro, un diol, un diazo, un éster, una sulfona, una azida, un alil y un silil éter, mientras que en realizaciones preferidas el grupo de enlace escindible es un disulfuro. En algunas realizaciones, el enlazador espaciador es uno o más de polietilenglicol o sus concatémeros y ácido 2-{2-[3-(2-amino-etilcarbomil)-fenoxil-1-azidoetoxi}-etoxi-acético. En algunas realizaciones, uno o más de los enlazadores espaciadores comprenden además uno o más grupos de enlace escindibles en donde el grupo enlazador escindible se selecciona del grupo que consiste un disulfuro, un diol, un diazo, un éster, una sulfona, una azida, un alil y un silil éter. En algunas realizaciones, el enlazador espaciador es polietilenglicol o sus concatémeros, mientras que en otras realizaciones el enlazador espaciador es ácido 2-{2-[3-(2-amino-etilcarbomil)-fenoxil-1-azido-etoxi}-etoxi-acético. En algunas realizaciones, uno o más de los conjugados de nucleótidos comprenden un enlazador de polietilenglicol y un enlazador de ácido 2-{2-[3-(2-aminoetilcarbomil)-fenoxil-1-azido-etoxi}-etoxi-acético que puede o no comprender además un hapteno y un resto fluorescente. En algunas realizaciones, el hapteno se selecciona del grupo que consiste en biotina, digoxigenina y dinitrofenol. En algunas realizaciones, uno o más de los conjugados de nucleótidos comprenden un conjugado de resto fluorescente de estreptavidina, mientras que, en otras realizaciones, uno o más de los conjugados de nucleótidos comprenden un anticuerpo conjugado del resto fluorescente de anticuerpo anti-hapteno seleccionado del grupo que consiste en anti-digoxigenina y anti-dinitrofenol. En algunas realizaciones, el conjugado de nucleótidos que comprende un enlazador de polietilenglicol y un enlazador de ácido 2-{2-[3-(2-amino-etilcarbomil)-fenoxil-1-azido-etoxi}-etoxiacético comprende además dos restos fluorescentes. En algunas realizaciones, los dos restos fluorescentes constituyen un sistema de transferencia de energía de resonancia de fluorescencia.

Una realización adicional de la presente invención da a conocer una composición para secuenciar un ácido nucleico, que comprende tres tipos de nucleótidos modificados detectables por un resto fluorescente y un cuarto tipo de nucleótido modificado, en donde dicho cuarto tipo de nucleótido modificado no es detectable por un resto fluorescente, y en donde la incorporación de los cuatro tipos de nucleótidos modificados en la composición en una reacción de secuenciación se determina por detección fluorescente de los tres tipos de nucleótidos modificados detectables en la composición. En algunas realizaciones, el ácido nucleico de la composición comprende ADN de una preparación de una biblioteca de ADN. En algunas realizaciones, el tipo de nucleótido modificado comprende un resto finalizador reversible y se selecciona del grupo que comprende rbATP, rbTTP, rbUTP, rbCTP y rbGTP. En algunas realizaciones, la reacción de secuenciación es la secuencia por síntesis, secuencia por ligadura o secuencia por hibridación. En algunas realizaciones, el resto fluorescente es el mismo para los tres nucleótidos modificados. En algunas realizaciones, el resto fluorescente es uno o más de los restos fluorescentes diferentes que son detectados preferiblemente por el mismo filtro de emisión. En algunas realizaciones, la incorporación de tres tipos de nucleótidos modificados es determinada por un primer patrón de imágenes fluorescentes y un segundo patrón de imágenes fluorescentes. En algunas realizaciones, la incorporación del cuarto tipo de nucleótido es determinada por los patrones de imágenes de fluorescencia de los otros tres tipos de nucleótidos. En algunas realizaciones, las composiciones descritas en este documento que comprenden uno o más de los otros tipos de nucleótidos modificados comprenden además una o más secuencias enlazadoras. En algunas realizaciones, una o más de las secuencias enlazadoras comprenden uno o más de un enlazador escindible y un enlazador espaciador, en donde el enlazador escindible comprende uno o más grupos de enlace escindibles seleccionados del grupo que consiste en un disulfuro, un diol, un diazo, un éster, una sulfona, una azida, un alil y un silil éter, preferiblemente el grupo de enlace escindible es disulfuro. En algunas realizaciones, el enlazador espaciador es uno o más de polietilenglicol o sus concatémeros y ácido 2-{2-[3-(2-amino-etilcarbomil)-fenoxil-1-azido-etoxi}-etoxi-acético, en donde a veces se prefieren los concatémeros de polietilenglicol que incluyen entre cuatro y doce moléculas de polietilenglicol. En algunas realizaciones, uno o más de los enlazadores espaciadores comprenden además uno o más grupos de enlace escindibles, como se describió previamente. En algunas realizaciones, uno o más de los tres tipos de nucleótidos modificados comprenden un enlazador de polietilenglicol y un enlazador de ácido 2-{2-[3-(2-amino-etilcarbomil)-fenoxil-1-azido-etoxi}-etoxi-acético, mientras que algunas realizaciones preferidas comprenden además un hapteno y un resto fluorescente. En algunas realizaciones, el hapteno se selecciona del grupo que consiste en biotina, digoxigenina y dinitrofenol. En algunas realizaciones, el hapteno es detectado por un conjugado de par de unión a hapteno-resto fluorescente o un conjugado de anticuerpo anti-hapteno-resto fluorescente. En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-hapteno se selecciona entre anti-digoxigenina y anti-dinitrofenol. En algunas realizaciones, dicho par de unión a hapteno es estreptavidina. En algunas realizaciones, dichos tipos de nucleótidos modificados detectables por un resto fluorescente se conjugan a uno o más de un enlazador escindible y un enlazador espaciador o una combinación de éstos, en donde un enlazador se conjuga a un resto fluorescente o a un hapteno, y en donde un nucleótido modificado que no es detectable por un resto fluorescente no está así conjugado.

Una realización adicional descrita en este documento da a conocer un método para determinar una pluralidad de secuencias de ácido nucleico, que comprende proporcionar una muestra que comprende una pluralidad de ácidos nucleicos diferentes, en donde cada ácido nucleico comprende un molde y un cebador; realizando un ciclo de una reacción de secuenciación, en donde el ciclo comprende extender los cebadores para los ácidos nucleicos en la muestra a fin de formar una pluralidad de cebadores extendidos que tienen por lo menos cuatro tipos de nucleótidos diferentes, formando así una muestra extendida, adquiriendo una primera colección de señales de la muestra extendida, en donde no más de tres de los cuatro tipos de nucleótidos diferentes en los cebadores extendidos están en un estado de señalización y en donde por lo menos uno de los tipos de nucleótidos diferentes en los cebadores extendidos está en un estado de oscuridad; tratar la muestra extendida con un reactivo modificador, en donde se modifica por lo menos uno de los cuatro tipos de nucleótidos en los cebadores extendidos, produciendo así una muestra modificada, y adquiriendo una segunda colección de señales de la muestra modificada, en donde por lo menos uno de los tipos de nucleótidos diferentes está en un estado diferente en la primera colección de señales comparado con la segunda colección de señales; y determinar las secuencias para una pluralidad de ácidos nucleicos diferentes, evaluando la primera colección de señales y la segunda colección de señales de los ciclos. En algunas realizaciones, la pluralidad de ácidos nucleicos diferentes se une a un sustrato. En algunas realizaciones, la extensión de los cebadores comprende adición catalizada por polimerasa de los tipos de nucleótidos diferentes. En algunas realizaciones, los tipos de nucleótidos diferentes comprenden restos bloqueantes reversibles, mediante los cuales se añade un solo tipo de nucleótido a cada uno de los cebadores extendidos en cada uno de los ciclos. En algunas realizaciones, la extensión de los cebadores comprende adición catalizada por ligasa de oligonucleótidos que comprenden los distintos tipos de nucleótidos. En algunas realizaciones, no más de dos de los tipos de nucleótidos diferentes en los cebadores extendidos está en un estado de señalización durante la adquisición de la primera colección de señales de la muestra extendida, mientras que en otra realización por lo menos dos de los tipos de nucleótidos diferentes en los cebadores extendidos están en un estado de oscuridad durante la adquisición de la primera colección de señales de la muestra extendida. En algunas realizaciones, uno de los tipos de nucleótidos diferentes en los cebadores extendidos está en un estado de oscuridad durante la adquisición de la primera colección de señales de la muestra extendida. En algunas realizaciones, el tratamiento de la muestra extendida con un reactivo modificador comprende eliminar una etiqueta de un tipo de nucleótido o añadir una etiqueta a un tipo de nucleótido. En algunas realizaciones, por lo menos dos de los tipos de nucleótidos diferentes en los cebadores extendidos se modifican mediante el tratamiento de la muestra extendida con un reactivo modificador, mientras que, en otras realizaciones, no más de 3 de los tipos de nucleótidos diferentes en los cebadores extendidos se modifican tratando la muestra extendida con un reactivo modificador. En algunas realizaciones, la extensión de los cebadores para los ácidos nucleicos en la muestra forma una pluralidad de cebadores extendidos que no tienen más de cuatro tipos de nucleótidos diferentes, mientras que, en otras realizaciones, la extensión de los cebadores para los ácidos nucleicos en la muestra forma una pluralidad de cebadores extendidos que tienen por lo menos cinco tipos de nucleótidos diferentes. En algunas realizaciones, dos de los tipos de nucleótidos diferentes complementan el mismo nucleótido en el ácido nucleico y en donde un primero de los dos tipos de nucleótidos diferentes está en un estado de señalización durante la adquisición de la primera colección de señales, y en donde un segundo de los dos tipos de nucleótidos diferentes está en un estado de oscuridad durante la adquisición de la primera colección de señales. En algunas realizaciones, el primero de los dos tipos de nucleótidos diferentes está en un estado de oscuridad durante la adquisición de la segunda colección de señales. En algunas realizaciones, el segundo de los dos tipos de nucleótidos diferentes está en un estado de señalización durante la segunda colección de señales. En realizaciones preferidas, un ciclo de reacción de secuenciación tal como se describió previamente se repite una o más veces.

En otra realización, la presente invención da a conocer un método para determinar la secuencia de un polinucleótido que comprende detectar mediante eventos de obtención de imágenes la incorporación de tres tipos diferentes de conjugados de nucleótidos detectables en un polinucleótido y determinar la incorporación de un cuarto tipo de nucleótido en base al patrón de detección de los tres tipos diferentes de nucleótidos detectables en el polinucleótido, en donde la detección comprende menos eventos de obtención de imágenes que los tipos diferentes de conjugados de nucleótidos. En algunas realizaciones, el polinucleótido comprende uno o más de ácidos desoxirribonucleicos, ácidos desoxirribonucleicos modificados, ácidos ribonucleicos o ácidos ribonucleicos modificados. En algunas realizaciones, el conjugado de nucleótidos comprende tipos de nucleótidos seleccionados del grupo que consiste en dATP, dTTP, dUTP, dCTP, dGTP o sus análogos de nucleótidos no naturales, en donde el análogo de nucleótido no natural comprende un resto finalizador reversible y se selecciona del grupo que consiste en rbATP, rbTTP, rbCTP, rbUTP y rbGTP. En algunas realizaciones, la incorporación del nucleótido es mediante secuencia por síntesis, secuencia por ligadura o secuencia por hibridación. En algunas realizaciones, los conjugados de tres tipos de nucleótidos se detectan detectando un resto fluorescente, en donde el resto fluorescente es el mismo para los tres conjugados de nucleótidos o donde el resto fluorescente es uno o más restos fluorescentes distintos. En algunas realizaciones, uno o más restos fluorescentes distintos son detectados por el mismo filtro de emisión. En algunas realizaciones, el resto fluorescente comprende un resto de sistema de transferencia de energía de resonancia fluorescente. En algunas realizaciones, la incorporación del cuarto nucleótido se determina por la ausencia de detección. En algunas realizaciones, los conjugados de ácido nucleico detectables se detectan por fluorescencia, en donde la fluorescencia se detecta por eventos de obtención de imágenes. En algunas realizaciones, los eventos de obtención de imágenes comprenden un primero y un segundo eventos de obtención de imágenes, por ejemplo, que están separados en tiempo. En algunas realizaciones, el primer evento de obtención de imágenes detecta un patrón de fluorescencia que es distinto del patrón de fluorescencia detectado por el segundo evento de obtención de imágenes. En algunas realizaciones, la incorporación de uno o más nucleótidos se determina por la diferencia en el patrón de fluorescencia entre el primero y el segundo eventos de obtención de imágenes. En algunas realizaciones, uno o más de los conjugados de tipos de nucleótidos comprenden además una o más secuencias enlazadoras que comprenden uno o más de un enlazador escindible y un enlazador espaciador. En algunas realizaciones, el enlazador escindible comprende uno o más grupos de enlace escindibles seleccionados del grupo que consiste en un disulfuro, un diol, un diazo, un éster, una sulfona, una azida, un alil y un silil éter, preferiblemente el grupo de enlace escindible es un disulfuro. En algunas realizaciones, el enlazador espaciador es uno o más de polietilenglicol o sus concatémeros y ácido 2-{2-[3-(2-amino-etilcarbomil)-fenoxil-1-azido-etoxi}-etoxi-acético. En algunas realizaciones, uno o más de los enlazadores espaciadores comprende además uno o más grupos de enlace escindibles en donde el grupo de enlace escindible se selecciona del grupo que consiste en un disulfuro, un diol, un diazo, un éster, una sulfona, una azida, un alilo y un silil éter. En algunas realizaciones, el enlazador espaciador es polietilenglicol o sus concatémeros o ácido 2-{2-[3-(2-amino-etilcarbomil)-fenoxil-1-azido-etoxi}-etoxi-acético, o ambos. En algunas realizaciones, el conjugado de nucleótidos que comprende un enlazador de polietilenglicol y un enlazador de ácido 2-{2-[3-(2-amino-etilcarbomil)-fenoxil-1-azido-etoxi}-etoxi-acético comprende también un hapteno y un resto fluorescente, en donde el hapteno se selecciona del grupo que consiste en biotina, digoxigenina y dinitrofenol. En algunas realizaciones, uno o más de los conjugados de nucleótidos comprende un conjugado de estreptavidina-resto fluorescente. En algunas realizaciones, uno o más de los conjugados de nucleótidos comprenden un conjugado de anticuerpo anti-hapteno-resto fluorescente seleccionado del grupo que consiste en anti-digoxigenina y anti-dinitrofenol. En algunas realizaciones, el conjugado de nucleótidos que comprende un enlazador de polietilenglicol y un enlazador de ácido 2-{2-[3-(2-amino-etilcarbomil)-fenoxil-1-azido-etoxi}-etoxi-acético comprende también dos restos fluorescentes. En algunas realizaciones, los dos restos fluorescentes constituyen un sistema de transferencia de energía de resonancia por fluorescencia. En algunas realizaciones, uno o más de los conjugados de nucleótidos comprenden un hapteno o un resto fluorescente, en donde el hapteno se selecciona del grupo que consiste en biotina, digoxigenina y dinitrofenol. En algunas realizaciones, uno o más de los conjugados de nucleótidos comprenden un conjugado de estreptavidina-resto fluorescente. En algunas realizaciones, la detección de uno o más de los conjugados de nucleótidos comprende un conjugado de anticuerpo anti-hapteno-resto fluorescente seleccionado del grupo que consiste en anti-digoxigenina y anti-dinitrofenol.

FIGURAS

La Figura 1 muestra mapas de calor de tipo nube ilustrativos, o gráficos de nubes, para ciclos en una reacción de secuenciación. Los gráficos representan el compuesto de la imagen 1 (eje x) y la imagen 2 (eje y), de manera tal que los gráficos representan la imagen de fluorescencia después de un ciclo completo. La ubicación de A, C, G y T en el gráfico de nubes se demuestra en el mapa del gráfico de nubes inferior.

La Figura 2 muestra gráficos ilustrativos que indican el porcentaje de tasas de error (eje Y) (superior) y llamadas de bases blanco (inferior) en una reacción de secuenciación en una base de ciclo por ciclo (eje X).

La Figura 3 muestra A) espectros de emisión para dos tintes ilustrativos y B) un gráfico de nubes ilustrativo para un ciclo de secuenciación al poner en práctica la realización que usa dos tintes de espectros de fluorescencia diferentes para secuenciación.

La Figura 4 muestra A) espectros de emisión para dos conjuntos de tinte ilustrativos y B) un gráfico de nubes ilustrativo para un ciclo de secuenciación al poner en práctica la realización que usa dos conjuntos de tintes de diferentes espectros de emisión para secuenciación.

La Figura 5 muestra A) la tasa de error de las llamadas de bases para un experimento que emplea un tinte en una reacción de secuenciación, B) los patrones fluorescentes ilustrativos para cada uno de los nucleótidos modificados en un primer evento de formación de imágenes (Imagen 1) usando solamente un tinte, C) patrones fluorescentes ilustrativos para cada uno de los nucleótidos modificados en un segundo evento de obtención de imágenes (Imagen 2) usando solamente un tinte, y D) un gráfico de nubes que combina el primero y el segundo eventos de obtención de imágenes de una reacción de secuenciación, en donde se usan solamente un tinte y dos eventos de obtención de imágenes para diferenciar entre los cuatro nucleótidos diferentes presentes para incorporación durante una reacción de secuenciación.

DESCRIPCIÓN DETALLADA

Las técnicas basadas en fluorescencia actuales utilizadas para diferenciar entre distintos analitos en una muestra, como sucede con las tecnologías de secuenciación (es decir, tecnologías de secuenciación por fluorescencia) se basan, por ejemplo, en la calidad de una señal generada por un resto de detección asociado con un tipo de nucleótido particular. Por ejemplo, las tecnologías de secuenciación fluorescente tradicionales utilizan restos fluorescentes identificablemente distintos, cada uno unido a uno de los cuatro nucleótidos A, T, C y G que se utilizan en una reacción de secuenciación. Los nucleótidos marcados en forma fluorescente utilizados durante una reacción de secuenciación, más allá de su método de utilización, típicamente son excitados y medidos por uno de cuatro filtros ópticos (es decir, uno por cada tinte distinto) en un instrumento de secuenciación fluorescente. La tecnología de secuencia por síntesis (SBS), así como también la tecnología de secuenciación con finalizador de tinte que emplea didesoxinucleótidos, son ilustrativas de tecnologías de secuenciación basadas en fluorescencia de cuatro canales. La instrumentación de la secuenciación basada en fluorescencia es típicamente grande, costosa y poco atractiva para contextos más pequeños y de capital más limitado. Las nuevas tecnologías de secuenciación típicamente emplean métodos, sistemas y composiciones innovadores con el fin de progresar para adquirir mayor precisión (es decir, menos errores), tener capacidad de alto rendimiento (es decir, más secuencias de genomas en un período de tiempo determinado) y/o reducir costes (es decir, <$10.000/genoma), y convenientemente tener una huella ecológica que no exceda un espacio pequeño en la mesa de trabajo de un investigador.

La presente invención da a conocer soluciones para avanzar en el campo de secuenciación de ácido nucleico. Las realizaciones describen métodos y composiciones que utilizan restos de detección mínimos, por ejemplo preferiblemente un tinte o una pluralidad de tintes con características de detección similares, al detectar y diferenciar múltiples analitos diferentes, como tipos de nucleótidos diferentes, en una muestra, por ejemplo para secuenciación de muestras. A su vez, la presente invención da a conocer métodos para determinar la incorporación de cuatro nucleótidos en una reacción de secuenciación usando menos de cuatro filtros de detección y menos pasos para la obtención de imágenes. El uso de menos de cuatro filtros y, por ende, menos pasos para la obtención de imágenes, permite que la secuenciación se realice en formatos más pequeños, ya que se necesitan menos filtros de excitación y emisión. Se contempla que los métodos y sistemas descritos en este documento reducen las necesidades de instrumentos, reducen el tamaño de un instrumento, el uso de reactivos y los costes, a la vez que aumentan la producción de datos.

En realizaciones particulares, se dan a conocer métodos para determinar una secuencia de subunidades monoméricas en un polímero. Los métodos se ejemplifican en este documento con respecto a polímeros de ácido nucleico y sus subunidades de nucleótidos, pero se pueden llevar a cabo para otros polímeros y sus subunidades. Si bien los métodos se pueden utilizar para muestras que tienen una sola secuencia polimérica, los métodos ofrecen ventajas particulares cuando se usan para distinguir varios tipos de subunidades diferentes en una muestra que tiene polímeros con muchas secuencias distintas (es decir una muestra de polímero multiplex). Por ejemplo, en algunas realizaciones, los métodos proporcionan la capacidad de distinguir un número de tipos de subunidades de diferentes en una muestra que es mayor que el número de tipos de señales diferentes que se adquieren de la muestra. En el caso de una muestra de ácido nucleico, se puede realizar en la muestra un paso de adquisición de datos para adquirir una colección de menos de cuatro tipos de señales diferentes e incluso la ubicación de la secuencia para los cuatro tipos de nucleótidos diferentes se puede determinar para la muestra.

Varios aspectos de los métodos, individualmente o en combinación, proporcionan la capacidad de distinguir un número de tipos de subunidades diferentes (p. ej., tipos de nucleótidos diferentes, tipos de didesoxinucleótidos diferentes, tipos de didesoxinucleótidos modificados, tipos de nucleótidos modificados ligados, etc.) en una muestra de polímero que es mayor que el número de distintos tipos de señales adquiridas de la muestra de polímero. Los aspectos pueden incluir, aunque sin limitarse a ello, correlacionar uno o más tipos de subunidades monoméricas con un estado de oscuridad, correlacionar uno o más tipos de subunidades monoméricas con un estado de señalización, correlacionar uno o más tipos de subunidades monoméricas con un estado gris o correlacionar uno o más tipos de subunidades monoméricas con un cambio de estado entre un estado de oscuridad, un estado gris o un estado de señalización. Un "estado de señalización", cuando se usa con referencia a un evento de detección, significa una condición en la cual se produce una señal específica en el evento de detección. Por ejemplo, una subunidad de nucleótido puede estar en un estado de señalización y ser detectable cuando se acopla a una etiqueta fluorescente que se detecta en un paso de detección de fluorescencia por excitación y emisión de esa etiqueta fluorescente en un método de secuenciación. La expresión "estado de oscuridad", cuando se usa con referencia a un evento de detección, significa una condición en la que no se produce una señal específica en el evento de detección. Por ejemplo, una subunidad de nucleótido puede estar en un estado de oscuridad cuando el nucleótido carece de una etiqueta fluorescente y/o no emite fluorescencia que es específicamente detectada en un paso de detección fluorescente de un método de secuenciación. La detección del estado de oscuridad puede además incluir cualquier fluorescencia de fondo que pueda estar presente o ausente en la etiqueta fluorescente. Por ejemplo, algunos componentes de reacción pueden demostrar fluorescencia mínima cuando se excitan a determinadas longitudes de onda. Como tal, aunque no hay un resto fluorescente presente, puede haber fluorescencia de fondo proveniente de dichos componentes. Además, la fluorescencia de fondo puede deberse a la dispersión de luz, por ejemplo, de reacciones de secuenciación adyacentes, que pueden ser detectadas por un detector. Como tal, "estado de oscuridad" puede incluir dicha fluorescencia de fondo como cuando no se incluye específicamente un resto fluorescente, tal como cuando un nucleótido que carece de una etiqueta fluorescente se utiliza en los métodos descritos en este documento. No obstante, se contempla que dicha fluorescencia de fondo es diferenciable de un estado de señalización y, como tal, la incorporación de nucleótidos de un nucleótido no etiquetado (o nucleótido "oscuro") es aún discernible. La expresión "estado gris", cuando se usa en referencia a un evento de detección, significa una condición en la que se produce una señal atenuada en el evento de detección. Por ejemplo, una población de nucleótidos de un tipo particular puede estar en un estado gris en una primera subpoblación de nucleótidos acoplados a una etiqueta fluorescente que se detecta en un paso de detección de fluorescencia de un método de secuenciación, mientras que una segunda subpoblación de los nucleótidos carece de la etiqueta fluorescente y no emite fluorescencia que es específicamente detectada en el paso de detección fluorescente.

En realizaciones particulares, un método para secuenciar un polímero se lleva a cabo en ciclos, en donde un ciclo individual incluye uno o más pasos utilizados para distinguir un monómero en una posición particular en el polímero. Un ciclo puede comprender un evento de detección en algunas realizaciones. No obstante, un ciclo de secuenciación no necesita incluir un evento de detección, por ejemplo, si la detección se lleva a cabo después de que se llevan a cabo pasos para distinguir uno o más monómeros en un polímero. Por ejemplo, un evento de detección puede ocurrir en la mitad de un ciclo, al final de un ciclo, al final de 1 / ciclos, al final de dos ciclos, al final de 21/2 ciclos, al final de tres ciclos, etc. Otro aspecto de los métodos que pueden proporcionar la capacidad de distinguir un número de tipos de subunidades diferentes en una muestra de polímero que es mayor que el número de tipos de señales diferentes adquiridas de la muestra de polímero es el uso de dos o más pasos de adquisición de señales y por lo menos un paso de modificación de nucleótidos durante un ciclo de secuenciación individual. Como tal, un método de secuenciación puede incluir varios ciclos de adición de nucleótidos, y los ciclos pueden incluir pasos ortogonales de adquisición de señales de la muestra de secuenciación, luego modificar uno o más nucleótidos en la muestra de secuenciación para cambiar su estado (p. ej., entre un estado de señalización, estado de oscuridad o estado gris) y luego adquirir un segundo conjunto de señales de la muestra de secuenciación. Se exponen varios ejemplos en detalle a continuación, en donde tipos de nucleótidos particulares están en un estado de señalización debido una etiqueta fluorescente acoplada, tipos de nucleótidos particulares están en un estado de oscuridad debido a la ausencia de la etiqueta, nucleótidos particulares se convierten de un estado de señalización a un estado de oscuridad escindiendo un enlazador que acopla una etiqueta fluorescente y/o nucleótidos particulares se convierten de un estado de oscuridad a un estado de señalización uniendo un receptor (p. ej., anticuerpo o estreptavidina) que capta una etiqueta fluorescente al nucleótido que de lo contrario no tiene la etiqueta.

En lugar de detectar diferencias en la calidad de una señal fluorescente, por ejemplo como en algunas tecnologías de secuenciación fluorescentes, la presente invención proporciona detección de múltiples analitos distintos (es decir, nucleótidos, proteínas o sus fragmentos) en una reacción, distinguiendo entre diferencias en la detección de un resto fluorescente o dos restos fluorescentes de los mismos espectros de excitación/emisión o similares (es decir, son excitados por el mismo láser y la emisión es capturada por el mismo filtro óptico), en distintos momentos durante una reacción, por ejemplo antes y después de un cambio en las condiciones de reacción. En algunas realizaciones, los métodos para detectar y determinar un analito comprenden detectar la producción de fluorescencia en dos momentos distintos durante un ciclo de reacción.

Típicamente, un ciclo de reacción se llevará a cabo suministrando por lo menos cuatro tipos de nucleótidos a una muestra de ácido nucleico en presencia de una polimerasa, por ejemplo, una ADN o ARN polimerasa, durante una reacción de extensión de un cebador. La presencia de por lo menos cuatro tipos de nucleótidos ofrece la ventaja de aumentar la fidelidad de la polimerasa en comparación con el uso de menos de cuatro tipos de nucleótidos. El uso de pasos ortogonales para convertir uno o más tipos de nucleótidos incorporados de un estado a otro permite que múltiples tipos de nucleótidos estén presentes simultáneamente durante una reacción de extensión de polimerasa, aumentando así la fidelidad y a la vez permitiendo que un solo tipo de etiqueta sea detectado en cada ciclo, lo que sirve para proporcionar más óptica simplificada. El uso de óptica simplificada es preferencial comparado con sistemas que se basan en óptica más compleja para registrar la producción de múltiples etiquetas distintas a fin de distinguir diferentes tipos de nucleótidos presentes simultáneamente en una reacción de extensión. Se contempla también que en algunas realizaciones pueden estar presentes menos de cuatros tipos de nucleótidos diferentes durante una reacción de extensión de polimerasa.

Ciertas realizaciones ilustrativas se describen a continuación. Las composiciones y sus métodos de uso no se limitan a estas realizaciones.

En algunas realizaciones, los métodos para secuenciar un ácido nucleico comprenden el uso de un resto fluorescente para detección directa o indirecta de tres tipos de nucleótidos diferentes y un tipo de nucleótido que no es detectado por la presencia de una señal fluorescente, sino que en cambio es detectado por una falta o ausencia de una señal fluorescente. En algunas realizaciones, los métodos para secuenciar un ácido nucleico comprenden el uso de do dos o más restos fluorescentes diferentes que comprenden los mismos espectros de excitación/emisión o similares para detección directa o indirecta de tres tipos de nucleótidos diferentes y un tipo de nucleótido que no es detectado por la presencia de una señal fluorescente, sino que en cambio es detectado por una falta o ausencia de señal fluorescente. Los mismos o similares espectros de excitación y emisión son tales que un láser excita los dos o más restos fluorescentes diferentes y un filtro óptico captura sus señales de fluorescencia emitidas. La detección de fluorescencia para determinar la secuencia de una muestra de ácido nucleico se realiza con espacios de tiempo, por ejemplo, en diferentes momentos durante una reacción de secuenciación (es decir, antes y después de un cambo en las condiciones de reacción, tal como escisión enzimática, cambio en el pH ambiental, adición de reactivos adicionales), proporcionando patrones de fluorescencia tales como patrones de transición de fluorescencia, en donde sus patrones acumulativos determinan la secuencia de la diana de ácido nucleico. Como tales, los métodos descritos en este documento son rentables y eficientes en función del tiempo, y permiten la simplificación de la instrumentación para secuenciación asociada.

Una aplicación ilustrativa del uso de diferencias de patrones de fluorescencia con espacios de tiempo para determinar una secuencia de ácido nucleico diana consiste en las metodologías y tecnologías de secuencia por síntesis (SBS). En cuanto a estas, las realizaciones descritas en el presente documento encuentran utilidad particular en aplicaciones fluorescentes de secuencia por síntesis. Si bien las realizaciones descritas en la presente invención son ilustrativas de métodos innovadores de secuenciación fluorescente, las realizaciones descritas también son útiles para una diversidad de otras aplicaciones en donde se desea la detección de más de un analito (es decir, nucleótido, proteína o sus fragmentos) en una muestra.

En el desarrollo de realizaciones para secuenciar usando un conjunto de tinte mínimo, la experimentación reveló estrategias alternativas para distinguir entre incorporaciones de nucleótidos que usan solamente uno o dos restos fluorescentes. Estas estrategias proporcionan los cuatro tipos de nucleótidos que estarán simultáneamente presentes en el ciclo de una secuencia, y el uso de conjuntos de tintes mínimos y filtros ópticos. En algunas realizaciones, no se utilizan más de tres restos fluorescentes para determinar la incorporación de los cuatro tipos de nucleótidos presentes durante una reacción, usando uno o dos filtros de excitación y emisión. En realizaciones preferidas, no se utiliza más de un resto fluorescente (o dos o tres de los mismos espectros de excitación/emisión o espectros similares) para determinar la incorporación de los cuatro tipos de nucleótidos que están presentes durante una reacción, usando un intervalo de excitación de luz y un filtro de emisión de detección. Se ha de entender que, en algunas realizaciones, se puede emplear más de un resto fluorescente (o restos de más de un intervalo de excitación o intervalo de emisión).

En algunas realizaciones, la secuenciación que usa un conjunto de tintes mínimos se efectúa en un sustrato, tal como un sustrato de vidrio, plástico, chip semiconductor o sustrato derivado de compuesto. En algunas realizaciones, se provee una especie de ácido nucleico en un sustrato, por ejemplo, para secuenciación diana individual. En otras realizaciones, la secuenciación también puede ser en formato multiplex, en donde las dianas de ácido nucleico se detectan y secuencian en paralelo, por ejemplo, en un tipo de formato de celda de flujo o matriz. Las realizaciones descritas en este documento son particularmente ventajosas para poner en práctica la secuenciación paralela o la secuenciación paralela masiva. Las plataformas que implementan secuenciación paralela fluorescente incluyen, aunque sin limitarse a ello, aquellas ofrecidas por Illumina, Inc. (p. ej., plataformas HiSeq, Genome Analyzer, MiSeq, iScan), Life Technologies (p. ej., SOLiD), Helicos Biosciences (p. ej., Heliscope), 454/Roche Life Sciences (Branford, CT) y Pacific Biosciences (p. ej., SMART). Las celdas de flujo, chips y otros tipos de superficies que pueden alojar múltiples especies de ácidos nucleicos son ilustrativas de sustratos utilizados para secuenciación paralela. En formatos multiplex en los que se secuencian múltiples especies de ácido nucleico en paralelo, las secuencias diana ampliadas por clonación (p. ej., mediante PCR en emulsión (cmPCR) o ampliación puente) típicamente se inmovilizan en forma covalente sobre un sustrato. Por ejemplo, cuando se realiza PCR en emulsión, la diana de interés se inmoviliza en una perla, mientras que las dianas ampliadas en forma clonal se inmovilizan en canales de una celda de flujo o sitios específicos en una matriz o chip.

Los flujos de celdas para uso con las composiciones y métodos descritos en este documento se pueden usar en la secuenciación en un número de formas. Por ejemplo, una muestra de ADN tal como una biblioteca de ADN se puede aplicar a una celda de flujo o dispositivo fluido que comprende uno o más canales de flujo grabados, en donde la celda de flujo puede además comprender una población de moléculas de sonda covalentemente unidas a su superficie. Las sondas acopladas en los canales de celdas de flujo están ventajosamente ubicadas en distintos sitios accesibles en el canal, y se pueden añadir moléculas de bibliotecas a los canales de celdas de flujo en donde se pueden unir secuencias complementarias (como se describe en este documento, como se describe además en la solicitud de patente provisional de EE. UU. 61/431.425). Otro ejemplo de una celda de flujo para uso en la presente solicitud comprende una celda de flujo CMOS como se describe en la solicitud de patente de EE. UU. provisional 61/625.051. La ampliación puente se puede realizar como se describe en este documento, secuenciando a través de los métodos y composiciones de síntesis descritos en la presente invención. Los métodos para crear y utilizar celdas de flujo para secuenciación se conocen en la técnica; las referencias a estos se proveen en este documento. Se contempla que los métodos y composiciones descritos en la presente invención no se limitan a ninguna fabricación ni método de metodologías de secuenciación dirigida a celdas de flujo en particular.

La secuenciación que emplea los métodos y composiciones descritos en este documento puede también efectuarse en una placa de microtitulación, por ejemplo, en placas o portaobjetos de reacción de alta densidad (Margulies et al., 2005, Nature 437(7057): 376-380). Por ejemplo, las dianas genómicas se pueden preparar por tecnologías emPCR. Las placas o portaobjetos de reacción se pueden crear a partir de material de fibra óptica capaz de capturar y registrar luz generada a partir de una reacción, por ejemplo, de una reacción fluorescente o luminiscente. El material de núcleo se puede grabar para proporcionar pocilios de reacción discretos capaces de sostener por lo menos una perla de reacción emPCR. Dichos portaobjetos/placas pueden contener más de 1,6 millones de pocillos. Los portaobjetos/placas creados se pueden cargar con las perlas emPCR de reacción de la secuenciación diana y montar a un instrumento en donde se proveen reactivos de secuenciación y tiene lugar la secuenciación.

Un ejemplo de sustratos presentados para secuenciar dianas que usan las composiciones y métodos descritos en este documento se provee al poner en práctica sustratos con patrones que comprenden nanoesferas de ADN en un chip o portaobjetos como Complete Genomics (Mountain View, CA). Como se describe en Drmanac et al., 2010, Science 327(5961): 78-81, una oblea de silicio se puede estratificar con dióxido de silicio y titanio, y posteriormente estamparse usando fotolitografía y técnicas de grabado en seco. La oblea puede tratarse con HMDS y recubrirse con una capa fotorresistente para definir regiones discretas para silanización y posterior acoplamiento covalente de nanoesferas de ADN para secuenciación. Un experto en la técnica apreciará que existen muchos métodos para crear portaobjetos/chips con sitios discretos para inmovilización de ácidos nucleicos para uso en metodologías de secuenciación, y los presentes métodos no están limitados por el método en el que se prepara un sustrato para secuenciación.

Para fines ilustrativos y no limitativos de las realizaciones, se puede describir un ciclo de secuenciación de estrategia general por una secuencia de pasos. El siguiente ejemplo se basa en una reacción de secuenciación de secuencia por síntesis, no obstante, como se describe en este documento, no se limita a ninguna metodología de reacción de secuenciación en particular.

Los cuatro tipos de nucleótidos A, C, T y G, nucleótidos típicamente modificados diseñados para reacciones de secuenciación tales como nucleótidos reversiblemente bloqueados (rb) (p. ej., rbA, rbT, rbC, rbG), en donde tres de los cuatro tipos están fluorescentemente etiquetados, se añaden simultáneamente, junto con otros componentes de reacción, a un sitio en el que se localiza la secuencia molde de interés, y ocurre la reacción de secuenciación (p. ej., celda de flujo, chip, portaobjetos, etc.). Después de la incorporación de un nucleótido a una cadena de ácido nucleico de secuencia creciente basada en la secuencia diana, la reacción se expone a la luz y se observa y registra la fluorescencia; esto constituye un primer evento de obtención de imágenes y un primer patrón de detección de fluorescencia. Después del primer evento de obtención de imágenes, se pueden añadir uno o más reactivos químicos adicionales a la reacción de secuenciación, mediante lo cual el reactivo(s) añadido puede cambiar la intensidad de la fluorescencia o alguno otro aspecto químico de la primera reacción que causa un cambio identificable y mensurable en la fluorescencia (es decir, un cambio de transición de fluorescencia). La ubicación de la reacción es una vez más iluminada, y se captura y registra cualquier cambio en fluorescencia; lo que constituye un segundo evento de obtención de imágenes (es decir, un segundo patrón de detección de fluorescencia). Los bloqueantes presentes en los nucleótidos incorporados se eliminan y lavan junto con otros reactivos presentes después del segundo evento de obtención de imágenes en la preparación para el siguiente ciclo de secuenciación. Los reactivos químicos ilustrativos incluyen, aunque sin limitarse a ello, conjugados par de unión-resto fluorescente, u otros reactivos que pueden causar directa o indirectamente un cambio identificable y mensurable en la fluorescencia desde el primer evento de obtención de imágenes hasta el segundo evento de obtención de imágenes. Los patrones de fluorescencia de los dos eventos de obtención de imágenes se comparan, y se incorpora el nucleótido, y por lo tanto se determina la secuencia del ácido nucleico diana para ese ciclo particular. El ciclo de estrategia general ilustrativo utiliza preferiblemente un resto fluorescente (o más de uno de la misma o similar excitación/emisión) y un filtro de detección de emisión para determinar la incorporación de los cuatro tipos de nucleótidos diferentes en una reacción de secuenciación.

Una vía para diferenciar entre las dos estrategias distintas para detectar la incorporación de nucleótidos en una reacción de secuenciación que emplea un tinte fluorescente (o dos o más tintes de los mismos espectros de excitación/emisión o similares) es caracterizando las incorporaciones en términos de la presencia o ausencia relativa, o los niveles intermedios, de transición de fluorescencia que ocurre durante un ciclo de secuenciación. Como tales, las estrategias de secuenciación se pueden ejemplificar por su perfil fluorescente para un ciclo de secuenciación. Para las estrategias descritas en este documento, "1" y "0" indican un estado fluorescente en el que un nucleótido está en un estado de señalización (p. ej., detectable por fluorescencia) (1) o si un nucleótido está en un estado de oscuridad (p. ej., no se detecta o se detecta en forma mínima en un paso de obtención de imágenes) (0). Un estado "0" no necesariamente se refiere a una falta total, o ausencia de señal. Si bien en algunas realizaciones puede haber una falta total o ausencia de señal (p. ej., fluorescencia). La señal de fluorescencia mínima o disminuida (p. ej., señal de fondo) también se contempla incluida en el alcance de un estado "0" siempre y cuando un cambio en la fluorescencia de la primera imagen a la segunda imagen (o viceversa) pueda distinguirse fiablemente.

En una realización, una estrategia ilustrativa para detectar y determinar la incorporación de nucleótidos en una reacción de secuenciación que usa un tinte fluorescente (o dos tintes de los mismos espectros de excitación/emisión o similares) y dos eventos de obtención de imágenes se ejemplifica mediante las siguientes grillas y tablas. Las grillas representan la ilustración del espacio teórico de los datos de secuenciación visualizados en el mapa de calor, o los gráficos de nubes, por ejemplo, como se observa en la Figura 1.

En algunas realizaciones de secuenciación por síntesis (SBS), cuatros tipos de nucleótido trifosfato modificados, en este caso nucleótido trifosfatos reversiblemente bloqueados (rbNTP), se añaden simultáneamente a una reacción SBS. Los rbNTP compiten para la incorporación en la hebra de ácido nucleico creciente durante la extensión dirigida al molde de un cebador. Se contempla que la extensión competitiva en presencia de una variedad suficiente de tipos de nucleótidos para complementar todos los tipos de nucleótidos en el ácido nucleico de molde mejora la fidelidad de incorporación en comparación con añadir nucleótidos de a uno por vez a una reacción de secuenciación. Los cuatro tipos de rbNTP poseen un 3'-finalizador que comprende, en la posición 3' ribosa de la muestra, ambas funcionalidades alcoxi y azido eliminables por escisión con un reactivo de fosfina, creando así un nucleótido que es reversiblemente bloqueado y una vez más es funcional para mayor estiramiento (es decir, totalmente funcional o ff). Los nucleótidos totalmente funcionales, ffNTP, se comercializan de Illumina, Inc. y son ilustrativos de nucleótidos reversiblemente bloqueados, o rbNTP. En realizaciones preferidas, tres de los cuatro rbNTP comprenden etiquetas fluorescentes acopladas mediante enlazadores. Los enlazadores pueden comprender uno o más grupos de escisión, o ningún grupo de escisión. Por ejemplo, un enlazador que acopla uno o más rbNTP a un fluoróforo puede comprender una azida y/o un grupo alcoxi, por ejemplo, en el mismo carbono, de manera tal que los enlazadores puedan escindirse después de cada ciclo de incorporación mediante un reactivo fosfina como se indicó previamente, liberando de esta manera el resto fluorescente para posterior estiramiento de la secuencia.

Por ejemplo, la rbNTP timina inicial, (rbTTP) puede estar fluorescentemente etiquetada mediante un enlazador, en donde el enlazador comprende un sitio de escisión azida/alcoxi. Otro rbNTP inicialmente etiquetado en forma fluorescente, por ejemplo, adenina o rbATP, comprende un enlazador que además del grupo alcoxi/azida comprende también un segundo sitio de escisión como un grupo disulfuro localizado entre, por ejemplo, el grupo alcoxi/azida y la etiqueta fluorescente. La etiqueta fluorescente asociada con rbATP puede ser la misma que la etiqueta fluorescente asociada con rbTTP, o puede ser una etiqueta fluorescente similar en el sentido que comparten características espectrales de excitación y emisión similares. Un tercer rbNTP, por ejemplo, citosina o rbCTP, comprende un resto hapteno, tal como una biotina, en el término de un enlazador que contiene alcoxi/azida. En este ejemplo, el rbCTP de partida no está fluorescentemente etiquetado y por lo no tanto no luce fluorescente en un primer evento de obtención de imágenes. Sin embargo, el tratamiento subsiguiente con una estreptavidina fluorescentemente etiquetada causa la unión del conjugado estreptavidina-resto fluorescente al resto biotina en el conjugado rbCTP y después de dicho tratamiento, los sitios en los que se incorporó rbCTP lucen fluorescentes cuando se exponen a la longitud de onda de luz adecuada, y se registra la fluorescencia durante el segundo evento de obtención de imágenes. El cuarto rbNTP, en este caso guanina o rbGTP, carece de un resto fluorescente y puede o no conjugarse a un enlazador, se considera un rbNTP "oscuro" y no luce fluorescente, o tiene fluorescencia disminuida o mínima, en ambos eventos de imágenes.

La estrategia ilustrativa anteriormente mencionada puede describirse también de acuerdo con la construcción rbNTP, por ejemplo:

rbTTP-enlazador CS1 -FM

rbATP-enlazador CS1-CS2-FM

rbCTP-enlazador-CS1 -B

rbGTP

en donde CS1 es un primer sitio de escisión (p. ej., azida/alcoxi), CS2 es un segundo sitio de escisión (p. ej., enlace SS), FM es un resto fluorescente y B es biotina. Se contempla que uno de los sitios de escisión es opcional. Un sitio de escisión opcional (p. ej., dos sitios de escisión presentes en un enlazador) puede proveer funcionalidad adicional a un ciclo de secuenciación como, aunque sin limitarse a ello, escisión de todos los restos fluorescentes en un ciclo subsiguiente, reacciones de escisión alternativas en ciclos de secuenciación subsiguientes y/o combinación de reacciones de escisión en uno o más ciclos de secuenciación, o sus combinaciones.

Un esquema de detección ilustrativo para un ciclo de secuenciación para análisis en tiempo real de incorporación de nucleótidos con secuencia por síntesis que utiliza la estrategia antes mencionada comprende dos eventos de obtención de imágenes y, en realizaciones particulares, no más de dos eventos de obtención de imágenes. Los rbNTP, rbTTP, rbATP y rbCTP conjugados y rbGTP no conjugados (o tal vez conjugados a un enlazador solamente) se añaden simultáneamente al comienzo de un ciclo de secuenciación. La luz de longitud de onda de excitación para el resto fluorescente se aplica a la reacción de secuenciación y se registra una primera imagen (imagen 1). La primera imagen registra la fluorescencia (1) para las incorporaciones de rbATP y rbTTP, pero no para la incorporación de fluorescencia o fluorescencia mínima de rbCTP o rbGTP. Después del primer evento de obtención de imágenes, se añade DTT, por ejemplo, a la reacción que escinde CS2 (enlace disulfuro) en el enlazador de rbATP, liberando así el FM y haciendo la transición de rbATP de detectable (1) a no detectable (0) para el segundo evento de obtención de imágenes. La escisión de rbATP y el paso de transición fluorescente resultante proporcionan la diferenciación de rbATP de los otros eventos de incorporación de rbNTP durante un ciclo de secuenciación. Asimismo, tras el primer paso de obtención de imágenes, se añade una estreptavidina (SA)-FM a la reacción. La SA une B de la composición rbCTP, iniciando así la transición de rbCTP de no detectable (0) a detectable (1) y permitiendo la detección de sitios en los que el rbCTP se incorporó en la reacción, y proporcionando diferenciación de eventos de incorporación de rbCTP durante un ciclo de secuenciación. En este ejemplo, no hay cambios de transición para rbTTP ni rbGTP. Como tales, después de la aplicación del DTT y SA-FM ilustrativos, se toma una segunda imagen del ciclo de secuenciación que resulta en señales fluorescentes para incorporaciones de rbTTP y rbCTP y sin fluorescencia para incorporaciones de rbATP y rbGTP. Siguiendo la segunda imagen, las transiciones de fluorescencia, o la ausencia de éstas, se usan para determinar qué nucleótido se incorporó en qué sitio en la reacción de secuencia por síntesis. Cada ciclo subsiguiente sigue el mismo patrón de extensión de polimerasa-imagen 1-tratamiento químico-imagen 2-siguiente ciclo hasta que se completa la operación de secuenciación. El ciclo puede opcionalmente incluir un paso de determinación de nucleótidos. Adicional o alternativamente, la determinación de nucleótidos o la secuencia de nucleótidos pueden ocurrir después de completar uno o más ciclos. También pueden incluirse otros pasos por ciclo como, aunque sin limitarse a ello, desbloqueo, lavado y/o pasos adicionales en los métodos de secuencia por síntesis conocidos en la técnica.

Se contempla que cualquier número de sitios de escisión potencial y sus compuestos de escisión se pueden utilizar en la estrategia antes mencionada, y aquellos mencionados son a modo de ejemplo solamente. Por ejemplo, los agentes reductores además de DTT (p. ej., TCEP, BME, etc.) o reactivos que participan en reacciones de intercambio de tiol-disulfuro se pueden utilizar para liberar un resto fluorescente como se describió anteriormente. Además, los pares de unión a hapteno, además de biotina-estreptavidina (p. ej., digoxigenina, dinitrofenol y anticuerpos) también se pueden utilizar. A su vez, se puede utilizar uno cualquiera o más restos fluorescentes. No obstante, si se usan dos o más, es preferible que tengan los mismos espectros de absorción y emisión, o similares. Las realizaciones preferidas emplean un resto fluorescente para detección de todos los nucleótidos incorporados, o un filtro óptico que detecta emisión de una pluralidad de restos fluorescentes.

Se contempla que los reactivos de reacción (es decir, reactivos de escisión, reactivos de etiquetado, etc.) añadidos entre los eventos de obtención de imágenes pueden proporcionarse por separado, por ejemplo, secuencialmente, o combinarse y añadirse como un reactivo completo (p. ej., una mezcla maestra que comprende todas las sustancias químicas necesarias para completar la escisión, el etiquetado, etc.). Las realizaciones preferidas comprenden la adición de una disolución de reactivo completa o una mezcla maestra entre los pasos de toma de imágenes.

En otra realización ilustrativa, una segunda estrategia para detectar y determinar la incorporación de nucleótidos en una reacción de secuenciación que usa un tinte fluorescente (o dos tintes de los mismos espectros de excitación/emisión o similares) y dos eventos de obtención de imágenes se ejemplifica mediante las siguientes tabla y grilla de detección.

Para la segunda estrategia, como se ejemplifica en la primera, las cuatro composiciones de nucleótido trifosfatos (rbNTP) totalmente funcionales se añaden simultáneamente a una reacción SBS. Los rbNTP compiten para incorporación en la hebra de ácido nucleico creciente. Los rbNTP poseen un 3'-finalizador que comprende funcionalidades tanto alcoxi como azido que son eliminables por escisión con un reactivo fosfina, creando de esta forma un nucleótido que es una vez más funcional para otro estiramiento. En realizaciones preferidas, tres de los cuatro rbNTP comprenden etiquetas fluorescentes acopladas mediante enlazadores. Los enlazadores pueden comprender uno o más sitios de escisión. Por ejemplo, un enlazador que acopla uno o más rbNTP a un fluoróforo puede comprender una azida y/o un grupo alcoxi, por ejemplo, en el mismo carbono, de manera tal que los enlazadores pueden escindirse después de cada ciclo de incorporación mediante un reactivo fosfina, liberando así el resto fluorescente para posterior estiramiento de la secuencia.

En la segunda estrategia, la combinación inicial de rbNTP timina comprende una mezcla de moléculas de rbTTP. Por ejemplo, una combinación de rbTTP comprende una relación 2:1 de un rbTTP fluorescentemente etiquetado (es decir, mediante un enlazador) y un rbTTP no fluorescentemente etiquetado (es decir, rbTTP oscuro). Se contempla que se puede emplear cualquier relación de rbNTP fluorescente: no fluorescente. Por ejemplo, las relaciones 2:1, 1:0,5, 0,5:1 y 1:2 también funcionarían, en donde la diferencia cambiaría los resultados de intensidad de imagen sin cambiar la capacidad de detectar y diferenciar la incorporación de nucleótidos. Un rbATP fluorescentemente etiquetado, un rbGTP no etiquetado u oscuro y un rbCTP etiquetado con biotina completan la mezcla de nucleótidos. Un tratamiento subsiguiente con una estreptavidina fluorescentemente etiquetada causa la unión de la estreptavidina-resto fluorescente con el resto biotina en el conjugado rbCTP, y después de dicho tratamiento, los sitios en los que se incorporó rbCTP lucen fluorescentes cuando se exponen a la longitud de onda de luz apropiada, y se registra la fluorescencia durante el segundo evento de toma de imágenes.

La estrategia ilustrativa antes mencionada puede comprender las construcciones de rbNTP:

rbTTP-enlazador FM/rbTTP-oscuridad

rbATP-enlazador-FM

rbCTP-enlazador-B

rbGTP-oscuridad

Un esquema de detección ilustrativo para un ciclo de secuenciación para análisis en tiempo real de incorporación de nucleótidos con secuencia por síntesis que emplea la estrategia antes mencionada comprende dos eventos de obtención de imágenes y, en realizaciones particulares, no más de dos eventos de obtención de imágenes. Los cuatro tipos de rbNTP se añaden simultáneamente al comienzo de un ciclo de secuenciación. La luz de longitud de onda de excitación para el resto fluorescente se aplica a la reacción de secuenciación y se registra una primera imagen (imagen 1). La primera imagen incluye fluorescencia (1) tanto para incorporaciones de rbATP como de rbTTP (a 50% de intensidad de fluorescencia), pero no fluorescencia para rbCTP, rbGTP, y 1/2 de las incorporaciones de rbTTP. Siguiendo el paso de la primera adquisición de imágenes, se añade un fluoróforo marcado con estreptavidina SA-FM a la reacción. La SA se une a B de la composición de rbCTP, completando así la transición de rbCTP de no detectable (0) a detectable (1) durante el segundo evento de obtención de imágenes y permitiendo la detección de sitios en los que se incorporó rbCTP en la reacción, y proporcionando diferenciación de eventos de incorporación de rbCTP durante un ciclo de secuenciación. En este ejemplo, no hay cambios de transición para rbTTP, rbATP ni rbGTP. Después de la segunda imagen, las transiciones de fluorescencia, o su ausencia, se usan para determinar qué nucleótido se incorporó en qué lugar de la secuencia por reacción de síntesis, y se identifica la secuencia de interés. Cada ciclo subsiguiente sigue el mismo patrón de extensión de polimerasa-imagen 1-tratamiento-imagen 2-siguiente ciclo, hasta completar la secuenciación total de la diana deseada. El ciclo puede opcionalmente incluir un paso de determinación de nucleótidos. Adicional o alternativamente, la determinación de nucleótidos o la secuencia de nucleótidos pueden tener lugar después de que se han completado uno o más ciclos. Otros pasos pueden también incluirse por ciclo como, entre otros, desbloqueo, lavado y/o pasos adicionales utilizados en métodos de secuencia por síntesis conocidos en la técnica.

En otra realización, una tercera estrategia para detectar y determinar la incorporación de nucleótidos en una reacción de secuenciación que usa un tinte fluorescente (o dos tintes de los mismos espectros de excitación/emisión o similares) y dos pasos de toma de imágenes se ejemplifica mediante las siguientes tabla y grilla de detección.

Como se ejemplifica en las primera y segunda composiciones, los cuatro nucleótido trifosfatos (rbNTP) totalmente funcionales se añaden simultáneamente a una reacción SBS. Los rbNTP compiten para incorporación de la hebra de ácido nucleico creciente. Los rbNTP poseen un 3'-finalizador que es eliminable, creando de esta manera un nucleótido que es una vez más funcional para posterior estiramiento. La tercera estrategia difiere de las estrategias ilustrativas previas incorporando, por ejemplo, conjugando un rbNTP a un enlazador ramificado. En realizaciones preferidas, dos de los cuatro rbNTP comprenden etiquetas fluorescentes acopladas mediante enlazadores. Los enlazadores pueden comprender uno o más sitios de escisión. Por ejemplo, un enlazador que acopla uno o más rbNTP a un fluoróforo puede comprender una azida y/o un grupo alcoxi, por ejemplo, en el mismo carbono, de forma tal que los enlazadores puedan escindirse después de cada ciclo de incorporación mediante un reactivo fosfina como se describió previamente, liberando así el resto fluorescente para posterior estiramiento de la secuencia.

En la tercera estrategia ilustrativa, los complejos de rbATP y rbCTP comprenden enlazadores ramificados. Por ejemplo, rbATP comprende un enlazador ramificado en donde una rama termina con un resto fluorescente y una segunda rama termina en una biotina. En este ejemplo, el rbCTP también forma complejo con un enlazador ramificado, y cada una de las ramas termina en una biotina. El rbCTP en este ejemplo inicialmente no está etiquetado. Un rbTTP fluorescentemente etiquetado y un rbGTP no etiquetado u oscuro completan la mezcla de nucleótidos. Un tratamiento subsiguiente con una estreptavidina fluorescentemente etiquetada causa una unión muy fuerte del tinte de estreptavidina a los restos de biotina en los nucleótidos C y A, y después de dicho tratamiento los sitios en donde se incorporaron rbCTP y rbATP lucen fluorescentes al exponerse a la longitud de onda de luz adecuada, y se registra la fluorescencia resultante de la interacción B-SA durante el segundo paso de toma de imágenes.

La estrategia ilustrativa antes mencionada como tal puede comprender:

rbATP-enlazador ramificado FM y B

rbTTP-FM

rbCTP-enlazador ramificado-(B)2

rbGTP-oscuridad

Un esquema de detección ilustrativo para un ciclo de secuenciación para análisis en tiempo real de incorporación de nucleótidos de secuencia por síntesis que utiliza la estrategia antes mencionada comprende dos pasos de obtención de imágenes y, en realizaciones particulares, no más de dos eventos de obtención de imágenes. Todos los rbNTP se añaden simultáneamente al comienzo de un ciclo de secuenciación. La luz de longitud de onda de excitación para el resto fluorescente se aplica a la reacción de secuenciación, y se registra una primera imagen (imagen 1). La primera imagen incluye fluorescencia (1) para incorporaciones de rbATP y rbTTP, pero no fluorescencia (0) para incorporaciones de rbCTP y rbGTP. Después del primer paso de toma de imágenes, se añade un fluoróforo etiquetado con estreptavidina SA-FM a la reacción. La SA une las dos biotinas (B2) del conjugado rbCTP, haciendo la transición de rbCTP de no detectable (0) a detectable (1) y B en el enlazador bifurcado rbATP aumentando de este modo de manera eficaz la fluorescencia (2) de incorporación de rbATP de la imagen 1 y posibilitando la detección de sitios en los que se incorporó rbCTP, y diferenciando la incorporación de rbATP en la hebra de ácido nucleico creciente. En este ejemplo, no hay cambios de transición para rbTTP ni para rbGTP. Después de la segunda toma de imágenes, las transiciones de fluorescencia, o la ausencia de éstas, se usan para determinar qué nucleótido se incorporó en qué ubicación en la reacción de secuencia por síntesis, y se identifica la secuencia de interés. Cada ciclo posterior sigue el mismo patrón de extensión de polimerasa-imagen 1-tratamiento-imagen 2-siguiente ciclo antes de completar la secuenciación de la diana deseada. El ciclo puede opcionalmente incluir un paso de determinación de nucleótidos. Adicional o alternativamente, la determinación de nucleótidos o la secuencia de nucleótidos pueden ocurrir después de completar uno o más ciclos. También se pueden incluir otros pasos por ciclo, como ser, aunque sin limitarse a ello, desbloqueo, lavado y/u otros pasos utilizados en métodos de secuencia por síntesis conocidos en la técnica.

En otra realización, una cuarta estrategia ilustrativa para detectar y determinar la incorporación de nucleótidos en una reacción de secuenciación usa un tinte fluorescente (o dos tintes de los mismos espectros de excitación/emisión o similares) y solamente un paso de obtención de imágenes, como se ejemplifica en las siguientes tabla y grilla de detección.

La realización ilustrativa antes mencionada puede comprender solamente un tinte, o dos tintes de los mismos espectros de excitación/emisión o similares, en donde la concentración de tinte cambia para cada uno de los tres rbNTP etiquetados. Un estado de oscuridad indica la incorporación de, en este caso, rbGTP basado en la interpretación de medición de fluorescencia de los tres rbNTP fluorescentemente etiquetados.

La estrategia ilustrativa antes mencionada como tal puede comprender:

rbATP-FM (concentración 0,33X)

rbTTP- FM (concentración 1,0X)

rbCTP-FM (concentración 0,66X)

rbGTP-oscuridad

Una realización alternativa que comprende un tinte (o dos tintes de los mismos espectros de excitación/emisión o similares) y un evento de obtención de imágenes es la siguiente:

La estrategia ilustrativa antes mencionada como tal puede comprender:

rbATP-FM (concentración 0,50X)

rbTTP- FM (concentración 1,0X)

rbCTP-FM (concentración 0,75X)

rbGTP-FM (concentración 0,25X)

La realización ilustrativa antes mencionada puede comprender un tinte o dos tintes de espectros de excitación/emisión similares de manera tal que cada uno de los cuatro rbNTP se etiqueten con diferentes concentraciones de tinte. En realizaciones en las que cada uno de cuatro rbNTP diferentes se acoplan a una concentración diferente de un tinte (o dos tintes de espectros de excitación/emisión similares), se toma solamente una imagen por ciclo para determinar la incorporación de nucleótidos. Un ciclo de secuencias ilustrativo que pone en práctica métodos de un tinte/un evento de obtención de imágenes sería extensión de polimerasa-imagen 1 -siguiente ciclo.

Un esquema de detección ilustrativo de un ciclo de secuenciación para incorporación de nucleótidos mediante secuencia por síntesis de un tinte/un evento de obtención de imágenes que utiliza las estrategias antes mencionadas comprende un paso de toma de imágenes. Todos los rbNTP se añaden simultáneamente al comienzo de un ciclo de secuenciación. La luz de longitud de onda de excitación para el primer resto fluorescente se aplica a la reacción de secuenciación y se registra una primera imagen (imagen 1). Después del primer paso de toma de imágenes, se lleva a cabo el siguiente ciclo de adición de reactivo, extensión de polimerasa y adquisición de imágenes hasta que se completa el número de ciclos deseado. Después de la primera imagen, la intensidad de fluorescencia se puede correlacionar con las distintas concentraciones de tinte y usarse para determinar qué nucleótido se incorporó en qué sitio en la reacción de secuencia por síntesis, y se identifica la secuencia de interés. Cada ciclo subsiguiente sigue el mismo patrón de extensión de polimerasa-imagen 1 -siguiente ciclo hasta que se completa la secuenciación de la diana deseada. El ciclo puede opcionalmente incluir un paso de determinación de nucleótidos. Adicional o alternativamente, la determinación de nucleótidos o la secuencia de nucleótidos pueden ocurrir después de completar uno o más ciclos. Otros pasos también pueden incluirse por ciclo, como, aunque sin limitarse a ello, desbloqueo, lavado y/u otros pasos utilizados en los métodos de secuencia por síntesis conocidos en la técnica.

En realizaciones para poner en práctica secuenciación de un tinte/un evento de obtención de imágenes, se proveen concentraciones de tinte que permiten la diferenciación de incorporación de los nucleótidos etiquetados/no etiquetados. Además, al poner en práctica una reacción de secuenciación de un tinte/una imagen como se ejemplificó anteriormente, el tratamiento químico adicional no es necesario como se describió previamente para realizaciones con estrategias de secuenciación de un tinte/dos imágenes.

En otra realización ilustrativa, una estrategia adicional para detectar y determinar la incorporación de nucleótidos en una reacción de secuenciación comprende usar dos tintes fluorescentes de distintos espectros de excitación y emisión, y o bien 1) un evento de obtención de imágenes que comprende dos espectros de emisión o 2) dos eventos de obtención de imágenes secuenciales.

Para los propósitos del ejemplo, la Figura 3A muestra dos tintes ilustrativos, un tinte que emite a alrededor de 590 Amáx (DEG527) y un tinte que emite a alrededor de 720 Amáx (Dy681). Para los fines del ejemplo, se preparan las siguientes conjugaciones de rbNTP-tinte:

rbATP-DEG527

rbCTP-Dy681

rbTTP-DEG527/Dy681

rbGTP-oscuridad

Como tal, el porcentaje de cada nucleótido incorporado se conjuga a un fluoróforo particular. En este ejemplo, las conjugaciones son:

Como ejemplo, después de los protocolos SBS estándar, los cuatro nucleótidos se añaden simultáneamente a una reacción SBS. Los rbNTP compiten para incorporación en la hebra de ácido nucleico creciente. Como se describió previamente, los rbNTP poseen un finalizador en 3' que es eliminable por escisión para posterior estiramiento. Después de la incubación que permite la incorporación del nucleótido apropiado en la hebra de ácido nucleico creciente, la reacción se expone a la longitud de onda de luz apropiada dependiendo de qué imágenes, simultáneas o secuenciales, se desean. Por ejemplo, la reacción se puede exponer simultáneamente a la longitud de onda de excitación de ambos tintes fluorescentes (en este ejemplo, DEG527 se excita a aproximadamente 532 nm y Dy681 se excita a aproximadamente 660 nm) causando así la emisión simultánea de los dos tintes fluorescentes, cuya emisión se puede detectar simultáneamente con dos filtros de detección diferentes y óptica de adquisición de imágenes. En dicho sistema simultáneo, se efectúa solamente un 1 evento de obtención de imágenes para dos canales de detección diferentes simultáneamente, los estados de obtención de imágenes para cada canal de detección serían:

Alternativamente, después de la incorporación del nucleótido etiquetado adecuado a la hebra de ácido nucleico creciente, los dos tintes fluorescentes se pueden excitar gradualmente, como excitando primero un fluoróforo seguido de un primer evento de obtención de imágenes y luego excitando el segundo fluoróforo seguido por un segundo evento de obtención de imágenes. En dicho sistema de obtención de imágenes gradualmente, se realizan dos eventos de obtención de imágenes, y la tabla de detección sería, por ejemplo si DEG527 se excita primero seguido de Dy681 (p. ej., viceversa si se toman primero imágenes de la emisión de fluorescencia roja seguidas de fluorescencia verde), los estados de imágenes para cada evento de obtención de imágenes serían:

En cualquiera de los casos, la incorporación de una A sería detectada a determinada intensidad en el canal verde solamente, la incorporación de una C sería detectada a determinada intensidad en el canal rojo solamente, la incorporación de una T sería detectada tanto en los canales verdes como rojos en la mitad de la intensidad de la A y la C, y G sería detectada mínimamente o no detectada ni en los canales verdes ni rojos (Figura 3B). Después de la obtención de imágenes en forma gradual, el tinte fluorescente y el finalizador en 3' se escinden y se realiza el siguiente ciclo de secuenciación.

Este ejemplo no se limita a dos tintes particulares ni a combinaciones de conjugados, y podrían usarse dos tintes de espectros de fluorescencia diferentes en un sistema de secuenciación de dos tintes, en cualquier combinación o combinación de conjugados rbNTP-tinte. Por ejemplo, los tintes ilustrados en el ejemplo anterior emitidos en las longitudes de onda roja y verde. No obstante, los métodos y sistemas no están limitados por las longitudes de onda de excitación y emisión (p. ej., espectros de fluorescencia) de ningún tinte particular, como tal, cualquier tinte que difiere en espectros de fluorescencia puede ser potencialmente útil. Además, el ejemplo describe ciertos conjugados de rbNTP-tinte; sin embargo, los conjugados no se limitan a esas combinaciones en particular. Por ejemplo, cualquiera de los tres rbNTP podría conjugarse potencialmente a cualquiera de los tintes enumerados (en donde un nucleótido permanece no conjugado u oscuro). Los ejemplos de tintes y sus derivados útiles en las realizaciones descritas en este documento incluyen, aunque sin limitarse a ello, aquellos descritos a continuación.

Además, los conjugados de nucleótidos de uno o más tipos descritos en la estrategia anterior podrían también comprender uno o más enlazadores como se describe en las realizaciones y estrategias alternativas. Como tal, una o más reacciones químicas o de modificación podrían incorporarse a una reacción de secuenciación en combinación con la estrategia en la que dos tintes de espectros de fluorescencia distintos se conjugan a tipos de nucleótidos distintos. Por lo tanto, los conjugados de tipos de nucleótidos de este ejemplo podrían también modificarse en cualquier número de formas como se describe en este documento, sin menoscabar la realización en la que se pueden emplear dos tintes de espectros de fluorescencia distintos para determinar la secuencia de un ácido nucleico.

En otra realización ilustrativa, una estrategia adicional para detectar y determinar la incorporación de nucleótidos en una reacción de secuenciación comprende usar dos conjuntos de tintes fluorescentes en donde cada conjunto de tintes comprende dos tintes de espectros de emisión de fluorescencia similares o con compensación de emisión Amáx hasta, por ejemplo, 100 nm, en donde uno de los dos tintes emite a una intensidad detectablemente superior que el otro tinte en el conjunto, y en donde los dos conjuntos de tinte fluorescentes difieren en espectros de emisión de fluorescencia. En realizaciones preferidas, el tinte en un conjunto de tintes de intensidad detectablemente superior que el otro tinte del conjunto es por lo menos 0,5X, por lo menos 0,75X, por lo menos IX, por lo menos 2X tan intenso como el tinte de intensidad inferior. Cuando se usan dos conjuntos de tintes fluorescentes como se describe en la presente invención, la determinación de la secuencia se puede efectuar mediante un evento de obtención de imágenes o dos eventos de obtención de imágenes.

Para los propósitos del ejemplo, la Figura 4A muestra dos conjuntos de tintes ilustrativos; tanto DEG527 como Atto532 pueden detectarse juntos (emisión de fluorescencia de aproximadamente Amáx 555-595 nm) y Dy681 y SO7181 pueden detectarse juntos (emisión de fluorescencia de aproximadamente Amáx 670-715 nm). Para los propósitos del ejemplo, se preparan las siguientes conjugaciones de rbNTP-tinte:

rbATP-DEG527

rbCTP-Dy681

rbTTP-Atto532/SO7181

rbGTP-oscuridad

Como tal, el porcentaje de cada nucleótido incorporado conjugado a un fluoróforo particular en este ejemplo es:

Como un ejemplo, siguiendo los protocolos SBS estándar, se añaden cuatro de los nucleótidos simultáneamente a una reacción SBS. Los rbNTP compiten para incorporación de la hebra de ácido nucleico creciente. Como se describió previamente, los rbNTP poseen un finalizador en 3' que es eliminable por escisión para posterior estiramiento. Tras la incubación que permite la incorporación del nucleótido adecuado a la hebra de ácido nucleico creciente, la reacción se expone a una primera longitud de onda de luz, se realiza un primer evento de obtención de imágenes, luego la reacción se expone a la segunda longitud de onda de luz y se realiza un segundo evento de obtención de imágenes.

Por ejemplo, después de incorporar el nucleótido etiquetado adecuado en la hebra de ácido nucleico creciente, los dos conjuntos de tintes fluorescentes se pueden excitar en un modo gradual, como puede ser excitando primero un conjunto de fluoróforos seguido de un primer evento de toma de imágenes y luego excitando el segundo conjunto de fluoróforos seguido de un segundo evento de toma de imágenes. Como un ejemplo, si se excita primero DEG527/Atto532 por Dy681/SO7181 (p. ej., viceversa si se toman primero imágenes de la emisión de fluorescencia roja seguida de fluorescencia verde) los estados de toma de imágenes para cada evento de obtención de imágenes serían:

Los estados de imagen para T se enumeran como >1 para cada evento de obtención de imágenes. La designación > 1 asume que el tinte de intensidad mayor es por lo menos mayor en intensidad que aquel del tinte de intensidad inferior en el par de tintes.

Alternativamente, la reacción puede exponerse simultáneamente a la longitud de onda de excitación de ambos tintes fluorescentes, causando emisión simultánea de los dos tintes fluorescentes, en donde la emisión puede detectarse simultáneamente con dos filtros de detección diferentes y óptica de toma de imágenes. En dicho sistema simultáneo, en donde solamente se realiza un evento de obtención de imágenes para dos canales de detección diferentes simultáneamente, los estados de imágenes para cada canal de detección serían:

En cualquier caso, la incorporación de una A sería detectada a una intensidad determinada en el canal verde solamente, y la incorporación de una C sería detectada a una intensidad determinada en el canal rojo solamente. No obstante, debido a la mayor intensidad de los tintes que se conjugan a rbTTP en comparación con los tintes de intensidad inferior a rbATP y rbCTP, se contempla que la incorporación de una T sería detectada tanto en el canal verde como en el rojo a intensidad equivalente o superior de la A y la C. Nuevamente, en este ejemplo, la incorporación de G sería detectada mínimamente o no detectada en el canal verde ni en el canal rojo.

La Figura 4B muestra un mapa térmico de nubes que demuestra la detección de rbTTP incorporado, comparado con rbCTP y rbATP cuando se utilizan los dos conjuntos de tintes, en donde un tinte es de intensidad mayor que el otro tinte del conjunto. Después de los pasos de adquisición de imágenes, el tinte fluorescente y el finalizador en 3' se escinden y se realiza el siguiente ciclo de secuenciación.

Adicionalmente, los conjuntos de nucleótidos de uno o más tipos descritos en este ejemplo podrían también comprender uno o más enlazadores, como se describe en las realizaciones alternativas. Como tales, una o más reacciones químicas o de modificación podrían incorporarse a una reacción de secuenciación en combinación con la estrategia en la que dos conjuntos de tintes de diferentes espectros de emisión se conjugan con diferentes tipos de nucleótidos. En consecuencia, los conjugados de tipos de nucleótidos en este ejemplo podrían además modificarse en cualquier número de formas descritas en este documento sin menoscabar la realización en la que se pueden emplear dos conjuntos de tintes de diferentes espectros de emisión para determinar la secuencia de un ácido nucleico.

Adicionalmente, este ejemplo no se limita a ningún conjunto de dos tintes particular o combinaciones de conjugados, y se podría usar cualquiera de dos conjuntos de tintes de diferentes espectros de emisión, en cualquier combinación de conjugado rbNTP-tinte mientras se siga la estrategia para conjugación descrita en la presente invención (p. ej., dos tipos de nucleótidos se conjugan a diferentes tintes de intensidad inferior y un tipo de nucleótidos se conjuga a dos tintes de intensidad superior). El ejemplo que describe el uso de dos conjuntos de tintes para métodos de secuenciación no se limita a ningún conjunto particular de dos tintes, y se podría usar cualquier conjunto de tintes de diferentes espectros de fluorescencia en el sistema de secuenciación descrito en este documento. Los conjuntos de tinte adicionales comprenden aquellos que tienen compensación de emisión Amáx de por lo menos 60 nm, por lo menos 70 nm, por lo menos 80 nm, por lo menos 90 nm, por lo menos 100 nm, preferiblemente por lo menos 100 nm. Los ejemplos de conjuntos de tintes incluyen, entre otros, Atto465, 488, 495/Atto514, 520, 532, 550, 565; Atto 520, 532, 550/Atto565, 590, 594, Rho11, Rho 12, Rho 13; Atto 647, 655, 665/Atto 680, 700, 725; Alexa 647, 660, Cy5/Alexa 680, 700, Cy5.5; Alexa532, Cy3/Alexa555, 556, 578, 590, Cy3.5; Alexa 488/Alexa532, 555, 556, 578; Dy 647, 648, 649, 650, 651,652, 654/Dy675, 676, 677, 678, 679, 680, 681,682, 700, 701,703, 704; Dy490, 495, 505/Dy530, 547, 548, 549, 550, 554,555, 556, 560; Dy530, 547, 548, 549, 550, 554,555, 556, 560/Dy590, 591,594, 605, 610, 615.

Las estrategias anteriores son ilustrativas por naturaleza, describen solamente varias de muchas estrategias potenciales y sirven para proporcionar un lineamiento básico para los métodos y composiciones innovadores descritos en este documento para utilizar un resto fluorescente, o una pluralidad de restos fluorescentes de los mismos espectros de excitación/emisión o similares, para secuenciación de un ácido nucleico. El experto en la técnica entenderá que las distintas estrategias proporcionan un lineamiento para crear estrategias adicionales usando un resto fluorescente o una pluralidad de restos fluorescentes de los mismos espectros de excitación/emisión o similares, para secuenciar un ácido nucleico e incluso estar dentro del alcance de los métodos descritos en esta invención.

En una realización, un conjugado de rbNTP descrito en este documento comprende

resto(s) de detección 'A / w 'enlazador(es) ■>A/W' base

en donde un resto de detección es uno o más de un resto fluorescente, un hapteno o sus combinaciones, en donde un enlazador es uno o más de un enlazador espaciador, un enlazador con uno o más sitios de escisión, o sus combinaciones, en donde una base es uno de tres nucleótidos modificados (p. ej., rbNTP), en donde X es un monofosfato, difosfato o trifosfato y en donde R1 es -H, - OH, -OCH2N3 o cualquier grupo que pueda transformarse en un -OH, incluido carbonilo covalentemente unido al carbono 3'.

En algunas realizaciones, un resto de detección es un resto fluorescente. En algunas realizaciones, un resto de detección es un hapteno que es detectable mediante un conjugado par de unión-resto fluorescente. En algunas realizaciones, un conjugado de rbNTP comprende uno o ambos de un resto fluorescente y un hapteno enlazado a un rbNTP mediante uno o más enlazadores. En algunas realizaciones, un hapteno es una biotina, digoxigenina (DIG) o dinitrofenol (DNP). En algunas realizaciones, un hapteno se detecta mediante un conjugado par de unión-resto fluorescente. En algunas realizaciones, un par de unión es una molécula pequeña o un anticuerpo o su fragmento, por ejemplo, estreptavidina, anti-DIG o anti DNP.

Los restos fluorescentes ilustrativos, o sus derivados, para uso como restos fluorescentes de acuerdo con las realizaciones descritas incluyen, aunque sin limitarse a ello, fluoresceína y derivados de fluoresceína tales como carboxifluoresceína, tetraclorofluoresceína, hexaclorofluoresceína, carboxinaftofluoresceína, isotiocianato de fluoresceína, NHS-fluoresceína, yodoacetamidofluoresceína, fluoresceína maleimida, SAMSA-fluoresceína, tiosemicarbazida de fluoresceína, carbohidrazinometiltioacetil-amino fluoresceína, rodamina y derivados de rodamina tales como TRITC, TMR, lisamina rodamina, Rojo Texas, rodamina B, rodamina 6G, rodamina 10, NHS-rodamina, TMR-yodoacetamida, lisamina rodamina B cloruro de sulfonilo, lisamina rodamina B sulfonilhidrazina, Rojo Texas cloruro de sulfonilo, Rojo Texas hidrazida, cumarina y derivados de cumarina tales como AMCA, AMCA-NHS, AMCA-sulfo-NHS,AMCA-HPDP, DCIA, AMCE-hidrazida, BODIPY y derivados tales como BODIPY FL C3-SE, BODIPY 530/550 C3, BODIPY 530/550 C3-SE, BODIPY 530/550 C3 hidrazida, BODIPY 493/503 C3 hidrazida, BODIPY FL C3 hidrazida, BODIPY FL IA, BODIPY 530/551 IA, Br-BODIPY 493/503, Cascada Azul y derivdos tales como acetil azida, Cascada Azul cadaverina, Cascada Azul etilendiamina, Cascada Azul hidrazida, Lucifer Amarillo y derivados tales como Lucifer Amarillo yodoacetamida, Lucifer Amarillo CH, cianina y derivados tales como tintes de cianina basados en indolio, tintes cianina basados en benzo-indolio, tintes cianina basados en piridio, tintes cianina basados en tiozolio, tintes cianina basados en quinolinio, tintes cianina basados en imidazolio, Cy 3, Cy5, quelatos de lantánido y derivados tales como BCPDA, TBP, TMT, BHHCT, BCOT, quelatos de europio, quelatos de terbio, tintes Alexa Fluor, tintes DyLight, tintes Atto, tintes LightCycler Red, tintes CAL Flour, JOE y sus derivados, tintes Oregon Green, tintes WellRED, tintes IRD, tintes de ficoeritrina y ficobilina, verde malaquita, estilbeno, tintes DEG (por ejemplo, aquellos descritos en US2010/0009353), tintes NR, tintes casi infrarrojos y otros conocidos en la técnica tales como aquellos descritos en Haugland, Molecular Probes Handbook, (Eugene, OR) 6a edición; The Synthegen catalog (Houston, TX.), Lakowicz, Principles of Fluorescence Spectroscopy, 2a ed., Plenum Press New York (1999), Hermanson, Bioconjugatc Techniques, 2a edición, US2010/0009353 o WO 98/59066.

En algunas realizaciones, un resto de detección se conjuga a un rbNTP mediante un enlazador. En algunas realizaciones, un conjugado de rbNTP comprende uno o más de un enlazador. En algunas realizaciones, un enlazador es un enlazador espaciador que se conjuga en un extremo a un rbNTP y en otro a un resto de detección. En algunas realizaciones, un enlazador espaciador comprende uno o más grupos de escisión. A la inversa, en algunas realizaciones, un enlazador espaciador no contiene ningún grupo de escisión. En una realización, un enlazador espaciador (p. ej., con o sin un grupo de escisión) es una molécula de polietilenglicol (PEG) o sus concatémeros. Por ejemplo, en algunas realizaciones, un enlazador espaciador comprende concatémeros de por lo menos dos, de por lo menos tres, de por lo menos cuatro, de por lo menos cinco, de por lo menos seis, de por lo menos siete, de por lo menos ocho, de por lo menos diez o de por lo menos dos moléculas de PEG.

En realizaciones preferidas, los enlazadores espaciadores utilizados para conjugar un rbNTP a un resto de detección, por ejemplo un resto fluorescente o un hapteno, comprenden por lo menos cuatro a doce concatémeros de PEG (es decir, PEG4, PEG 8, PEG 12). En algunas realizaciones, un enlazador espaciador comprende ácido 2-{2-[3-(2-aminoetilcarbarbomil)-fenoxil-1-azido-etoxi}-etoxi-acético. En algunas realizaciones, el enlazador espaciador que comprende ácido 2-{2-[3-(2-amino-etilcarbomil)-fenoxil-1-azido-etoxi}-etoxi-acético comprende uno o más grupos de escisión. En algunas realizaciones, un rbNTP se acopla a dos enlazadores espaciadores (por ejemplo, enlazadores separados de una construcción de enlazador bifurcado), que puede ser el mismo o diferente, cada uno de los cuales termina un resto de detección. En algunas realizaciones, dos enlazadores espaciadores comprenden un PEG y un enlazador ácido 2-{2-[3-(2-amino-etilcarbomil)-fenoxil-1-azido-etoxi}-etoxi-acético, en donde uno o ambos pueden o no comprender grupos de escisión, terminando en un resto de detección. En algunas realizaciones, dos enlazadores espaciadores pueden ser dos enlazadores PEG que pueden tener igual longitud o no (p. ej., uno PEG4 y el otro PEG 12), en donde cada uno de los enlazadores PEG termina en un resto de detección, además con o sin un grupo de escisión.

Los ejemplos de enlazadores se pueden encontrar en, por ejemplo, las patentes de Estados Unidos 7.816.503, 7.771.973, y en la solicitud de patente 2010/00317531. Los métodos y composiciones descritos en este documento no están limitados a ningún enlazador espaciador particular, y las alternativas serán obvias para el experto en la técnica, y se consideran dentro del alcance de la presente invención.

En algunas realizaciones, un enlazador espaciador comprende uno o más grupos de escisión. Los grupos de escisión para uso en los métodos descritos en este documento pueden incluir, aunque sin limitarse a ello, grupos disulfuro, grupos lábiles ácidos, grupos Sieber, grupos indol, grupos Sieber t-butilo, grupos escindidos de manera electrófila, grupos escindidos de manera nucleófila, grupos fotoescindibles, grupos de escisión que escinden bajo condiciones reductoras, condiciones oxidativas, escisión vía el uso de grupos safety-catch, mecanismo de escisión por eliminación y grupos escindibles asistidos con metales. Como se emplea en este documento, la expresión "enlazador escindible'' se considera equivalente a un enlazador espaciador que comprende uno o más grupos de escisión. Se puede hallar un análisis de enlazadores, por ejemplo, en Guiller et al, 2000, Chem. Rev. 100:2091 -2157 y en la patente de EE. UU.

7.771.973. Los métodos y composiciones descritos en este documento no se limitan a ningún grupo de escisión particular, y las alternativas serán obvias para el experto en la técnica, y se consideran dentro del alcance de la presente invención.

En algunas realizaciones, los nucleótidos reversiblemente bloqueados que se describen en este documento están acoplados a una molécula pequeña mediante un enlazador. En algunas realizaciones, un enlazador comprende uno o más grupos de escisión y puede denominarse enlazador escindible. Los grupos escindibles incluyen, aunque sin limitarse a ello, grupos disulfuro, diol, diazo, éster, sulfona azida, alil y silil éter, azida y alcoxi. En realizaciones preferidas, uno o más de una azida, un alcoxi o un grupo disulfuro asocia un nucleótido reversiblemente bloqueado (rbNTP) con otra molécula, por ejemplo, un hapteno o un resto de detección, o ambos, para uso en los métodos descritos en este documento. La incorporación de un enlace disulfuro en un enlazador descrito en la presente invención se puede lograr en una variedad de formas, por ejemplo, como se describe en este documento, como se halla en la patente de EE. UU. 7.771.973 o como se describe en Hermanson, Bioconjugate Techniques, Segunda Edición, Academic Press.

En algunas realizaciones, una composición que comprende un agente de escisión se añade a una reacción de secuenciación para escindir un grupo escindible en un enlazador espaciador de un conjugado de rbNTP. El agente escindible añadido depende del grupo de escisión presente. Por ejemplo, la escisión de enlaces disulfuro u otros grupos de escisión reductora se obtiene mediante un agente reductor. La reducción de un enlace disulfuro resulta en la liberación del rbNTP de la molécula enlazada, por ejemplo, un hapteno, conjugado de hapteno y/o resto de detección tal como un resto fluorescente. Los agentes reductores útiles para las realizaciones que se describen en este documento incluyen, aunque sin limitarse a ello, compuestos de fosfina, fosfinas solubles en agua, fosfinas que contienen nitrógeno y sales y sus derivados, ditioeritritol (DTE), ditiotreitol (DTT) (isómeros cis y trans, respectivamente, de 2,3-dihidroxi-1,4-ditiolbutano), 2-mercaptoetanol o p-mercaptoetanol (BME), 2-mercaptoetanol o aminoetanotiol, glutatión, tioglicolato o ácido tioglicólico, 2,3-dimercaptopropanol y tris (2-carboxietil)fosfina (TCEP), tris(hidroximetil)fosfina (THP) y ácido p-[tris(hidroximetil)fosfina] propiónico (THPP). En algunas realizaciones, un agente reductor utilizado para escindir un enlace disulfuro en un enlazador descrito en este documento es DTT. En algunas realizaciones, la concentración de un agente reductor, por ejemplo, DTT, utilizada para escindir un enlace disulfuro es por lo menos 1 a 1000 mM, por lo menos 20 a 800 mM, por lo menos 40 a 500 mM y preferiblemente por lo menos 50 a 200 mM. En algunas realizaciones, un agente reductor utilizado para escindir un enlace disulfuro en un enlazador descrito en la presente invención es un reactivo de fosfina, un reactivo de fosfina soluble en agua, un reactivo de fosfina que contiene nitrógeno y sus sales y derivados. Los reactivos de fosfina ilustrativos incluyen, aunque sin limitarse a ello, TCEP, THP y aquellos descritos en la publicación de patente de EE. UU. 2009/0325172 tal como triaril fosfinas, trialquil fosfinas, fosfinas que contienen sulfonato y que contienen carboxilato y fosfinas solubles en agua derivadas. En algunas realizaciones, la concentración de una fosfina utilizada para escindir un enlace disulfuro es por lo menos 0,5-500 mM, por lo menos 5 a 50 mM y preferiblemente por lo menos 10 a 40 mM. Los métodos y composiciones descritos en este documento no se limitan a ningún grupo de escisión particular, y las alternativas serán obvias para el experto en la técnica, y se consideran dentro del alcance de la presente invención.

En algunas realizaciones, un enlazador descrito en la presente invención, que puede o no comprender un sitio de escisión, enlaza un rbNTP a un resto fluorescente, y un patrón de transición de fluorescencia para detectar la incorporación de un nucleótido SBS a una reacción se consigue mediante la adición de un tinte inhibidor a un ciclo de secuenciación. Por ejemplo, un rbNTP conjugado a un resto fluorescente a través de un enlazador (en donde el enlazador puede o no comprender un sitio de escisión) se añade a una reacción de secuenciación. Se registra una primera imagen mediante lo cual se establece un primer patrón de detección. Durante un paso de reacción intermedio, se añade un tinte inhibidor a la reacción (p. ej., en lugar de una pareja FRET eliminada de la reacción vía un paso de escisión), en donde el tinte inhibidor inhibe de manera suficiente la fluorescencia del resto fluorescente antes mencionado, dando como resultado un patrón de cambio detectable (p. ej., fluorescencia a no fluorescencia o fluorescencia mínima) tras un paso de obtención de imágenes subsiguiente para ese nucleótido. Esta realización es una alternativa al sistema donante/aceptor FRET descrito en la presente invención, en donde la combinación de dos tintes resulta en fluorescencia y la eliminación de uno de los tintes, por ejemplo, por una reacción de escisión, resulta en pérdida de fluorescencia.

Los tintes inhibidores contemplados en la presente invención incluyen, aunque sin limitarse a ello, aquellas sustancias que absorben la energía de excitación de un fluoróforo, inhibiendo eficazmente el fluoróforo diana, no obstante, no son típicamente fluorescentes por sí mismos. Los ejemplos de tintes inhibidores incluyen, entre otros, inhibidores oscuros tales como tintes DABCYL (absorbe en el espectro verde), Iowa black FQ (absorbe en el espectro verdeamarillo), Iowa black RQ (absorbe en el espectro anaranjado-rojo), IRDye QC-1 (absorbe en el intervalo de 500-900 nm) y Black Hole Quencher™ (absorbe en el intervalo de 500-700 nm). Por ejemplo, DABCYL a menudo se utiliza para inhibir la fluorescencia de la fluoresceína y los tintes Black Hole Quencher™ se utilizan para inhibir la fluorescencia de los tintes FAM, TET, HEX, JOE, TAMRA, ROX y CY, dependiendo de las características (p. ej., máxima absorbancia) del Black Hole Quencher™ particular. En realizaciones adicionales, dichos inhibidores oscuros se pueden utilizar en un sistema FRET, en donde la escisión del inhibidor oscuro durante un paso intermedio resulta en un cambio de estado de fluorescencia, de fluorescencia inhibida a fluorescencia, estableciendo de este modo un patrón de detección para incorporación de un nucleótido a un ciclo de reacción SBS.

El uso de realizaciones con inhibición de tintes que se describe en la presente memoria se contempla para uso en permutas o combinaciones para detectar la incorporación de un nucleótido a un ciclo SBS, como reconocerá el experto en la técnica. Por ejemplo, un rbNTP puede estar enlazado a un resto fluorescente en donde un tinte inhibidor se utiliza para determinar la incorporación de nucleótidos, un segundo rbNTP puede estar enlazado a una biotina, en donde la adición de SA-resto fluorescente se utiliza para determinar la incorporación de nucleótidos, y un tercer tinte puede estar enlazado a un resto fluorescente, en donde se utiliza una reacción de escisión para determinar la incorporación de nucleótidos. Los métodos descritos en este documento no se limitan a qué nucleótido se conjuga a qué sistema de detección particular, su combinación permite la determinación de la incorporación de nucleótidos a una reacción de secuenciación.

En algunas realizaciones, el resto de detección fluorescente se modifica para proporcionar una diferencia de fluorescencia detectable entre la imagen 1 y la imagen 2. Por ejemplo, se pueden adquirir imágenes de un resto fluorescente que se acopla directa o indirectamente a un rbNTP durante un primer evento de obtención de imágenes. Entre el primero y el segundo eventos de obtención de imágenes, se puede añadir una molécula pequeña, sustancia química, etc. a la reacción de secuenciación, de forma tal que la estructura del fluoróforo se modifique haciendo así que resto fluorescente se torne no detectable o mínimamente detectable durante el segundo evento de obtención de imágenes. Por ejemplo, se puede añadir un agente de escisión que se dirige a uno más enlaces y/o entidades estructurales del resto fluorescente, el cual puede destruir la naturaleza fluorescente y permitir de esta manera la detección de estados de imágenes indicativos de la incorporación del rbNTP acoplado. Como tales, las modificaciones del resto fluorescente propiamente dicho pueden proporcionar cambios detectables en los estados de imágenes que pueden ser ventajosos en los métodos que se describen en este documento.

En algunas realizaciones de la presente invención, un tipo de nucleótido para uso en una reacción de secuenciación es un conjugado de rbNTP que comprende una base, por ejemplo, una base natural o modificada. En realizaciones preferidas, una base es una base modificada. En realizaciones preferidas, una base modificada comprende tres grupos fosfato fuera del esqueleto de azúcar, como trifosfato, según lo ilustrado por NTP. En realizaciones preferidas, la base modificada es reversiblemente bloqueada, en donde el NTP comprende un grupo bloqueante finalizador en 3' reversible que, una vez eliminado, permite la extensión continua en una reacción de secuenciación de secuencia por síntesis. En algunas realizaciones, el grupo bloqueante 3' comprende un grupo azido y/o alcoxi y es eliminable por escisión con un reactivo fosfina. Dichos nucleótidos se denominan "reversiblemente bloqueados" o "rb", de los cuales NTP es un tipo "totalmente funcional" o "ff (comercializado en Illumina, Inc.). Se puede hallar un análisis adicional de los rbNTP, por ejemplo, en las patentes de Estados Unidos 7.816.503 y 7.771.903 y en la publicación de solicitud de patente de Estados Unidos US2010/00317531.

Los métodos descritos para detección de ácido nucleico encuentran particular utilidad cuando se usan para secuenciar, por ejemplo, con tecnologías de secuenciación por síntesis (SBS). La secuenciación por síntesis en general comprende la adición secuencial de uno o más nucleótidos fluorescentemente etiquetados a una cadena de polinucleótidos creciente en la dirección 5' a 3' usando una polimerasa. La cadena de polinucleótidos extendida es complementaria al molde de ácido nucleico fijado en el sustrato (p. ej., celda de flujo, chip, portaobjetos, etc.), la secuencia diana. En algunas realizaciones, la identidad de un nucleótido incorporado en la cadena extendida se determina después de dos pasos de obtención de imágenes, proporcionando así datos de secuencias de incorporación en tiempo real.

El método descrito para detección de ácido nucleico también es útil para secuenciación por ligadura, secuenciación por hibridación y otras tecnologías de secuenciación, en las que se emplean un nucleótido "oscuro" y/o esquemas de modificación ortogonal.

La secuencia por ligadura es un método de secuenciación en el que un cebador de secuenciación se estira en una secuencia diana, ligando una sonda que comprende un tipo de nucleótido (p. ej., A, T, C o G), en donde la sonda ligada es indicativa de la secuencia del nucleótido subsiguiente en una cuerda del nucleótido diana. Las sondas de secuenciación por ligadura pueden comprender sitios de escisión que pueden escindirse después de un evento de ligadura, de manera tal que se puede efectuar la determinación de otra tanda de adición de sonda, ligadura e incorporación de nucleótidos. Una secuencia ilustrativa de la metodología por ligadura es la codificación di-base (p. ej., secuenciación por espacio de color) utilizada por el sistema de secuenciación SOLiD™ de Applied Biosystems. La secuenciación con codificación di-base o "espacio de color " utiliza sondas de interrogación que comprenden 2 bases específicas de sondas (p. ej., compuestas por todas las combinaciones posibles de los cuatro tipos de nucleótidos) seguidas de tres bases degeneradas y seis bases universales, en donde cada una de las sondas de interrogación está enlazada a uno de cuatro tintes fluorescentes distintos. Las sondas se añaden a una reacción de secuenciación que comprende una diana y un cebador de secuenciación, y una ligasa termoestable liga la sonda di-base complementaria a aquellas secuencias adyacentes al cebador de secuenciación como se halla en el molde. La fluorescencia se detecta mediante imágenes de cuatro colores, las sondas ligadas se escinden para eliminar el tinte fluorescente y regenerar el 5' fosfato para tandas de ligadura y detección adicionales. Cada base del molde se interroga dos veces. Después de varias tandas de ligadura y detección de un cebador de secuenciación, la hebra sintética se desnaturaliza, se añade un nuevo cebador de secuenciación y el proceso de detección de la ligadura comienza nuevamente. Los bits de datos del espacio de color fluorescente di-codificado se alinean, se aplican a una grilla del genoma de referencia con espacio de color y se determina la secuencia (Voelkerding et al., 2009, Clin Chem 55:641 -658).

Los nucleótidos modificados descritos en este documento podrían utilizarse en tecnologías de secuencia por ligadura. Por ejemplo, las sondas de un esquema que codifica dos bases en donde cuatro secuencias de nucleótidos se asocian con un color, por ejemplo, AA, CC, GG y TT, se pueden asociar con un tinte fluorescente azul, otras secuencias de cuatro dinucleótidos se asocian con un tinte rojo, otras cuatro con un tinte verde para detección mediante un sistema de imágenes de cuatro colores podrían modificarse como se describe en la presente invención. La incorporación de menos de cuatro tintes, por ejemplo, un tinte o dos o más tintes de excitación/emisión similar mientras se efectúan manipulaciones químicas y/o enzimáticas permitiría menos eventos de obtención de imágenes, por lo tanto, más óptica con instrumentos simplificados. Por ejemplo, una sonda que comprende secuencias de cuatro nucleótidos tales como AA, CC, GG y TT, que además comprende un número de nucleótidos degenerados y/o universales (opcionalmente), podría además comprender un enlazador que contiene un sitio de escisión (por ejemplo, un sitio de escisión alcoxi o azida) enlazado al dinucleótido con un resto fluorescente. Una sonda que comprende un segundo conjunto de cuatro dinucleótidos, por ejemplo, TA, GC, CG y AT, que además comprende un número de nucleótidos degenerados y/o universales (opcionalmente), podría además comprender un enlazador que contiene dos sitios de escisión (el segundo sitio de escisión diferente del primero, por ejemplo, un enlace SS) enlazado al dinucleótido con un resto fluorescente. Un conjunto de sondas que comprende un tercer conjunto de cuatro dinucleótidos, por ejemplo, CA, AC, GT y TG, que además comprende un número de nucleótidos degenerados y/o universales (opcionalmente), podría además comprender un enlazador que contiene un sitio de escisión enlazado al dinucleótido con un resto hapteno (por ejemplo, biotina). El cuarto conjunto de sondas de cuatro dinucleótidos podría comprender nucleótidos, enlazadores adicionales, etc. sin embargo carecería de un resto fluorescente. Las sondas podrían añadirse a la secuenciación por reacción de ligadura, ligarse al molde, y podría registrarse una primera imagen para capturar un primer estado de señalización. Un reactivo de escisión podría añadirse a la reacción para escindir el segundo sitio de escisión (p. ej., enlace SS) liberando así el resto fluorescente, podría añadirse un compañero de unión a hapteno (por ejemplo, estreptavidina) conjugado a un resto fluorescente, y podría registrarse una segunda imagen para capturar un estado de señalización. Un agente de escisión al primer sitio de escisión (p. ej., azida/alcoxi) podría añadirse a la reacción para liberar todos los restos fluorescentes y podría llevarse a cabo la siguiente tanda de secuenciación por ligadura. Los estados de señalización podrían alinearse y determinarse las secuencias.

La secuencia por hibridación comprende el uso de una matriz de secuencias cortas de sondas de nucleótidos a las que se les añade ADN diana etiquetado, fragmentado (Drmanac et al., 2002, Adv Biochem Eng Biotechnol 77:75-101; Lizardi et al., 2008, Nat Biotech 26:649-650). Los fragmentos se hibridan a su sonda complementaria en la matriz, y la hibridación se captura mediante la etiqueta acoplada tal como un tinte fluorescente, determinando así la secuencia de la diana. Algunas aplicaciones de secuencia por hibridación usan sondas que comprenden nucleótidos universales (p. ej., análogos de nucleótidos) y nucleótidos designados, y se denominan sondas ahuecadas, cuyo uso se describe que aumenta la sensibilidad de la hibridación y en consecuencia la detección del ensayo de secuenciación (patente de Ee . UU. 7.071.324). Otras mejoras a la secuencia por hibridación se pueden hallar en, por ejemplo, las publicaciones de solicitud de patente de EE. UU. 2007/0178516, 2010/0063264 y 2006/0287833. Sin embargo, más allá del método a menudo complejo, los sistemas ópticos son necesarios para capturar eventos de hibridación.

Los nucleótidos modificados descritos en este documento podrían utilizarse en tecnologías de secuencia por hibridación. Las sondas de ácido nucleico de múltiples muestras diferentes para determinación de secuencias que se hibridan a sondas ordenadas podrían modificarse para comprender los atributos descritos en este documento para uso en secuenciación con tinte mínimo, permitiendo de este modo una óptica menos compleja con determinación de secuencias concurrente de múltiples muestras de ensayo distintas. Por ejemplo, la sonda de una muestra de ensayo (p. ej., ácidos nucleicos de ensayo fragmentados) podría modificarse para comprender un enlazador que contiene un sitio de escisión (por ejemplo, un sitio de escisión alcoxi o azida) enlazado a la sonda con un resto fluorescente. Un segundo conjunto de sondas podría modificarse para comprender un enlazador que contiene dos sitios de escisión (el segundo sitio de escisión diferente del primero, por ejemplo, un enlace SS) que se enlaza a la segunda sonda con un resto fluorescente. Un tercer conjunto de sondas podría comprender un enlazador que contiene un sitio de escisión que se enlaza a la sonda de ácido nucleico con un resto hapteno (por ejemplo, biotina). Las sondas podrían añadirse a una secuencia por tipo de matriz de hibridación, podrían llevarse a cabo reacciones de hibridación de las sondas de ensayo modificadas a las sondas inmovilizadas y podría registrarse una primera imagen para capturar un primer estado de señalización. Un reactivo de escisión podría añadirse a la reacción para escindir el segundo sitio de escisión (p. ej., enlace SS) liberando así el resto fluorescente, un par de unión a hapteno (por ejemplo, estreptavidina) conjugado a un resto fluorescente podría añadirse y registrarse una segunda imagen para capturar el segundo estado de señalización. Podrían determinarse los estados de señalización, en donde la grilla de los dos estados de señalización podría utilizarse para determinar la ubicación y en consecuencia la secuencia de múltiples sondas de ensayo hibridadas diferentes.

Se han desarrollado y comercializado planteamientos de secuenciación que combinan bioquímicas de hibridación y ligadura, como la tecnología de secuenciación genómica practicada por Complete Genomics, Mountain View, CA). Por ejemplo, la ligadura de anclaje de sondas combinatoria, o cPAL™ (Drmanac et al., 2010, Science 327(5961): 78-81) utiliza bioquímica de ligadura, a la vez que explota las ventajas de la secuencia por hibridación. En síntesis, la secuenciación de nanoesferas de ADN diana comprende detectar productos de ligadura que se forman mediante un oligonucleótido de anclaje que se hibrida a una secuencia adaptadora que subsiguientemente se liga a una sonda de secuenciación degenerada, fluorescentemente etiquetada que comprende uno de cuatro nucleótidos especificados en la posición de interrogación. La ligadura ocurre cuando el nucleótido en la posición de interrogación es complementario al nucleótido en el sitio de detección dentro de la nanoesfera de ADN diana. El producto de ligadura de sonda/anclaje estable resultante se detecta en forma fluorescente. Después de la lectura, se libera todo el complejo anclaje/sonda, el siguiente anclaje se hibrida a la diana de ADN y el proceso se repite. Al igual que con muchas reacciones de secuenciación, se utilizan cuatro tintes diferencialmente detectables, uno para cada nucleótido de interrogación especificado A, C, G y T que utiliza óptica de detección múltiple.

Los nucleótidos modificados descritos en la presente invención se podrían utilizar en tecnologías de secuenciación de ligadura sonda-anclaje combinatorias. La incorporación de menos de cuatro tintes haría posible que tengan lugar menos eventos de adquisición de imágenes. Por ejemplo, una sonda que comprende un número o nucleótidos degenerados podría además comprender un enlazador que contenga un sitio de escisión (por ejemplo, un sitio de escisión alcoxi o azida) que enlace el nucleótido de interrogación con el resto fluorescente. Una sonda que comprende un segundo conjunto de nucleótidos degenerados podría además comprender un enlazador que contenga dos sitios de escisión que enlacen el nucleótido de interrogación con un resto fluorescente. Un conjunto de sondas que comprende un tercer conjunto de nucleótidos degenerados podría además comprender un enlazador que contenga un sitio de escisión que enlace el nucleótido de interrogación con un resto hapteno (por ejemplo, biotina). El cuarto conjunto de sondas de nucleótidos degenerados podría comprender nucleótidos, enlazadores adicionales, etc., no obstante, carecería de un resto fluorescente. Las sondas podrían añadirse a la reacción cPAL™, ligarse al anclaje/adaptador, y podría registrarse una primera imagen para capturar un primer estado de señalización. Un reactivo de escisión podría añadirse a la reacción para escindir el segundo sitio de escisión (p. ej., enlace SS) liberando así el resto fluorescente, podría añadirse un par de unión a hapteno conjugado a un resto fluorescente y podría registrarse una segunda imagen para capturar un segundo estado de señalización. Podría añadirse a la reacción un agente de escisión al primer sitio de escisión (p. ej., azida/alcoxi) para liberar todos los restos fluorescentes y llevar a cabo la siguiente tanda de cPAL™. Los estados de señalización podrían alinearse y determinarse las secuencias.

Los ácidos nucleicos o polinucleótidos para secuenciación incluyen, aunque sin limitarse a ello, ácidos nucleicos tales como ADN, ARN o APN (ácido peptidonucleico), sus variantes o fragmentos y/o combinaciones de estos. Los polinucleótidos pueden ser de secuencia conocida o desconocida, o bien naturales o artificiales, y pueden ser de cualquier origen (p. ej., eucariota o procariota). Los polinucleótidos pueden derivarse naturalmente, producirse en forma recombinante o sintetizarse químicamente. Los polinucleótidos concatemerizados pueden contener subunidades o sus análogos que pueden o no ocurrir en la naturaleza, o subunidades modificadas. Los métodos descritos en esta invención se pueden utilizar para determinar una secuencia de un polinucleótido. La longitud del ácido nucleico diana para secuenciación puede variar. Por ejemplo, el ácido nucleico para secuenciación puede incluir por lo menos 10, por lo menos 20, por lo menos 30, por lo menos 40, por lo menos 50, por lo menos 100, por lo menos 200, por lo menos 500, por lo menos 1.000, por lo menos 10.000, por lo menos 100.000, por lo menos 1.000.000, por lo menos 10.000.000 nucleótidos. El polinucleótido para secuenciación puede ser genómico en origen o sus fragmentos o variantes. La hebra de ácido nucleico para secuenciación puede ser una molécula de ácido nucleico monocatenaria o puede o no derivar de una molécula de ácido nucleico bicateneria. Las moléculas monocatenarias pueden también producirse, por ejemplo, mediante tecnologías y métodos de síntesis química o in vitro. Las realizaciones descritas en este documento no se limitan a los métodos preparatorios de ácido nucleico, y el experto en la técnica puede poner en práctica cualquier cantidad de métodos con el fin de proporcionar una composición para uso en los métodos descritos. Por ejemplo, en las metodologías de secuencia por síntesis, a menudo se genera una biblioteca que comprende el ácido nucleico diana, y luego se secuencia una porción de la biblioteca de ADN.

El ADN aislado de las muestras, por ejemplo, muestras que contienen ADN genómico, típicamente se modifica antes de la caracterización, por ejemplo, a través de secuenciación que utiliza métodos como los descritos en este documento. Se crean bibliotecas de ADN genómico que pueden secuenciarse poniendo en práctica los métodos descritos en el presente documento. Se produce una biblioteca, por ejemplo, implementando los métodos descritos en el kit de preparación de muestras de ADN Nextera™ (Epicentre® Biotechnologies, Madison WI), los kits de preparación de bibliotecas SOLiD™ (Applied Biosystems™ Life Technologies, Carlsbad CA) y similares. Una muestra de biblioteca de ADN puede además ampliarse para secuenciar, por ejemplo, múltiples técnicas de ampliación con desplazamiento de múltiples hebras (MDA).

Para secuenciación después de MDA, una biblioteca de muestras ampliadas se prepara, por ejemplo, creando una biblioteca de ADN como se describe en los kits Mate Pair Library Prep kit, Genomic DNA Sample Prep o TruSeq™ Sample Preparation y Exome Enrichment kits (Illumina®, Inc., San Diego CA).

Las bibliotecas de ADN se pueden inmovilizar en una celda de flujo y la ampliación puente realizarse en polinucleótidos inmovilizados antes de secuenciar, por ejemplo, por metodologías de secuencia por síntesis. En la ampliación puente, un polinucleótido inmovilizado (p. ej., de una biblioteca de ADN) se hibrida a un cebador de oligonucleótidos inmovilizado. El extremo 3' de la molécula de polinucleótido inmovilizado proporciona el molde para una reacción de estiramiento dirigida al molde, catalizada por polimerasa (p. ej., extensión de cebador) que se extiende desde el cebador de oligonucleótidos inmovilizado. El producto bicatenario resultante "conecta con un puente" los dos cebadores y ambas hebras se acoplan covalentemente al soporte. En el siguiente ciclo, después de la desnaturalización que produce un par de hebras sencillas (el molde inmovilizado y el producto de cebador extendido) inmovilizadas al soporte sólido, ambas hebras inmovilizadas pueden servir como moldes para una nueva extensión de los cebadores. Por lo tanto, la primera y segunda porciones pueden ampliarse para producir una pluralidad de conglomerados. Conglomerados y colonias se utilizan de manera intercambiable para hacer referencia a una pluralidad de copias de una secuencia de ácido nucleico y/o sus complementos acoplados a una superficie. De forma típica, el conglomerado comprende una pluralidad de copias de una secuencia de ácido nucleico y/o sus complementos, acopladas mediante su extremo 5' a la superficie. La ampliación puente y la metodología de conglomeración ilustrativas se describen, por ejemplo, en las publicaciones de patentes PCT. núm. WO00/18957 y WO98/44151, patente de EE. UU núm. 5.641.658; publicación de patente de EE. UU. núm. 2002/0055100; patente de EE. UU. núm. 7.115.400; publicación de patente de EE. UU. núm. 2004/0096853; publicación de patente de EE. UU. núm. 2005/0100900, publicación de patente de EE. UU. núm. 2004/0002090; publicación de patente de EE. UU. núm. 2007/0128624; y publicación de patente de EE. UU. núm. 2008/0009420. Las composiciones y métodos descritos en este documento son particularmente útiles en las metodologías de secuencia por síntesis que utilizan una celda de flujo que comprende clústers.

Los métodos de PCR en emulsión para ampliar ácidos nucleicos antes de la secuenciación también se pueden utilizar en combinación con los métodos y composiciones descritos en la presente invención. PCR en emulsión comprende ampliación PCR de una biblioteca de ADN en escopeta flanqueada adaptadora en una emulsión agua en aceite. La PCR es PCR de múltiples moldes; se emplea solamente un par de cebadores individual. Uno de los cebadores PCR se liga a la superficie (acoplado en 5') de perlas de microescala. Una baja concentración del molde resulta en microvesículas en emulsión que contienen la mayoría de las perlas, que tienen cero o una molécula del molde presente. En microvesículas en emulsión productivas (una microvesícula en emulsión en donde están presentes tanto una perla como una molécula del molde), los amplicones de PCR se pueden capturar a la superficie de la perla. Después de romper la emulsión, los productos de ampliación que portan las perlas se pueden enriquecer selectivamente. Cada perla ampliada en forma clonal portará en su superficie productos PCR correspondientes a la ampliación de una sola molécula de la biblioteca del molde. Diversas realizaciones de métodos PCR en emulsión se establecen en Dressman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100:8817-8822 (2003), en la publicación de patente PCT núm. WO 05/010145 y en las publicaciones de patente de EE. UU. núm. 2005/0130173, 2005/0064460 y US2005/0042648.

Se pueden emplear también nanoesferas de ADN en combinación con los métodos y composiciones descritos en el presente documento. Los métodos para crear y utilizar nanoesferas de ADN para secuenciación genómica se pueden hallar, por ejemplo, en las patentes y publicaciones de EE. UU. 7.910.354, 2009/0264299, 2009/0011943, 2009/0005252, 2009/0155781, 2009/0118488 y como se describe en Drmanac et al., 2010, Science 327(5961): 78­ 81. En síntesis, después de la fragmentación de ADN genómico, tandas consecutivas de ligadura con adaptador, ampliación y digestión resultan en concatémeros de cabeza a cola de múltiples copias de secuencias molde/adaptador de ADN genómico circular que se hacen circular en un ADN monocatenario por ligadura con una ligasa en círculo y un círculo rodante ampliado (como se describe en Lizardi et al., Nat. Genet. 19:225-232 (1998) y en US 2007/0099208 A1). La estructura del adaptador de los concatémeros promueve el bobinado del ADN monocatenario, creando así nanoesferas de ADN compactas. Las nanoesferas de ADN pueden capturarse en sustratos, preferiblemente para crear una matriz ordenada y con patrones, de manera tal que la distancia entre cada nanoesfera se mantenga para permitir la secuenciación de las nanoesferas de ADN separadas.

Un experto en la técnica reconocerá métodos y tecnologías adicionales para ampliar ácidos nucleicos que podrían también utilizarse en combinación con los métodos y composiciones descritos en este documento. Las realizaciones descritas en esta invención no se limitan a ningún método de ampliación de ADN.

Los métodos descritos en el presente documento no se limitan a ningún método de preparación de muestras de secuenciación en particular, y las alternativas serán obvias para el experto en la materia, y se consideran dentro del alcance de la presente invención. No obstante, es particularmente útil aplicar los métodos de la presente invención para secuenciar dispositivos tales como celdas de flujo o matrices para metodologías de secuencia por síntesis u otras tecnologías de secuenciación relacionadas, tales como aquellas implementadas por una o más tecnologías de secuenciación polony (Dover Systems), plataformas fluorescentes de secuenciación por hibridación (Complete Genomics), tecnología sTOP (Industrial Technology Research Institute) y secuenciación por síntesis (Illumina, Life Technologies).

En algunas realizaciones, los métodos expuestos en este documento se pueden usar en una versión modificada de los protocolos del fabricante en un sistema tal como aquellos provistos por Illumina®, Inc. (HiSeq 1000, HiSeq 2000, Genome Analyzers, MiSeq, HiScan, iScan, BeadExpress systems), Applied Biosystems™ Life Technologies (ABI PRISM® Sequence detection systems, SOLiD™ System) u otro instrumento de secuenciación basada en fluorescencia, como se describe además, por ejemplo, en las patentes y las solicitudes de patentes de Estados Unidos 5.888.737, 6.175.002, 5.695.934, 6.140.489, 5.863.722, 2007/007991,2009/0247414, 2010/0111768 y solicitud PCT WO2007/123744, y las solicitudes de patentes de Estados Unidos de series núm. 61/431.425, 61/431.440, 61/431.439, 61/431.429, 61/438.486. Las modificaciones a los métodos comerciales pueden incluir, aunque sin limitarse a ello, alteración de las etiquetas y adición de pasos para cambiar los estados de las etiquetas como se expone en la presente invención.

Los resultados de un instrumento de secuenciación pueden ser de cualquier clase. Por ejemplo, la tecnología actual emplea resultados legibles generadores de luz, como fluorescencia o luminiscencia, sin embargo, los métodos presentes no se limitan al tipo de resultado legible siempre y cuando las diferencias en la señal de salida para una secuencia de interés particular sean potencialmente determinables. Los ejemplos de software de análisis que se pueden utilizar para caracterizar los resultados derivados de los métodos implementados descritos en este documento incluyen, aunque sin limitarse a ello, software de análisis de datos Pipeline, CASAVA y GenomeStudio (Illumina®, Inc.), software de análisis de datos SOLiD™, DNASTAR® SeqMan® NGen® y Partek® Genomics Suite™ (Life Technologies), software de análisis de datos Feature Extraction and Agilent Genomics Workbench (Agilent Technologies), Genotyping Console™, software de análisis de datos Chromosome Analysis Suite (Affymetrix®).

Un experto en la técnica conocerá numerosas alternativas adicionales de software comerciales y académicos para análisis de datos para secuenciar los resultados generados. Las realizaciones descritas en la presente invención no se limitan a ningún método de análisis de datos.

Ejemplos

Los siguientes ejemplos se dan a conocer con el fin de demostrar e ilustrar en más detalle determinadas realizaciones y aspectos de la presente invención y no se han de interpretar como limitativos de su alcance.

Ejemplo 1-Síntesis de rbATP-LN3-DEG527-PEG4-B¡otina

Una construcción de adenina reversiblemente bloqueada, ramificada biotinilada y etiquetada en forma fluorescente para uso en SBS se sintetizó de la siguiente manera:

Lys-DEG527

A una disolución de DEG527 (1 1mg, 14,6 pmol) en DMA seca (2 ml) se le añadieron TSTU (5,3 mg, 17,5 pmol) y diisopropiletilamina (6,3 pl, 36,5 pmol). La mezcla se agitó durante 30 minutos a temperatura ambiente para la activación total del ácido. Se añadió una disolución de Boc-lisina (18 mg, 73 pmol) en TEAB 0,1 M (0,2 ml) a la mezcla de reacción. La mezcla se agitó durante 3 horas hasta que la TLC demostró el consumo completo del éster activado. Los componentes volátiles se evaporaron a presión reducida y el residuo se disolvió en ácido trifluoroacético (0,1 ml), DCM (0,9 ml) y MeOH (0,1 ml). La disolución se agitó a temperatura ambiente durante 1hora hasta que la TLC demostró el consumo total del material de partida. La disolución se concentró hasta sequedad, se redisolvió en TEAB 0,1 M (5 ml) y se purificó por RP-HPLC.

Lys-DEG527-PEG4-Biotina

A una disolución de Lys-DEG527 (14 pmol) y diisopropiletilamina (15 pl, 84 pmol) en DMA seca (5 ml), se le añadió PEG4-biotina-NHS (41 mg, 70 pmol). La mezcla se sonicó durante varios minutos y luego se siguió agitando durante varias horas. La TCL demostró el consumo completo de lys-DEG527. Los componentes volátiles se evaporaron a presión reducida. El residuo se redisolvió en TEAB 0,1 M (5 ml) y se purificó por RP-HPLC.

rbATP-LN3-DEG527-PEG4-Biotina

A una disolución de Lys-DEG527-PEG4-biotina (9 pmol), en DMA seca (2 ml), se le añadieron TSTU (3,3 mg, 10,8 pmol) y diisopropiletilamina (4 pl, 22,5 pmol). La mezcla se agitó durante 30 minutos a temperatura ambiente hasta la activación total del ácido. Se añadió una disolución de LN3-pppA (18 pmol) en TEAB 0,1M (0,2 ml) a la mezcla de reacción. La mezcla se agitó durante 5 horas hasta que la TCL demostró el consumo completo del éster activado. La reacción se extinguió con tampón TEAB (0,1M, 10 ml) y se cargó en una columna DEAE Sephadex (2x5 cm). La columna se eluyó con un gradiente de 0,1 M a 1 M tampón TEAB en 30 min a 25 ml/min. Las reacciones que contenían el producto se combinaron, evaporaron y purificaron por HPLC.

Ejemplo 2-Síntesis de rbCTP-LN3-PEG4-B¡otina

Una construcción de citosina reversiblemente bloqueada, biotinilada para uso en SBS se sintetizó de la siguiente manera:

rbCTP-LN3-PEG4-Biotina

A una disolución de PEG4-biotina-NHS (17,7 mg, 30 gmol) y diisopropiletilamina (8,7 gl, 50 gmol) en DMA seca (3 ml), se le añadió una disolución de LN3-pppC (10 gmol) en TEAB 0,1 M (0,3 ml). La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 5 horas. El progreso de la reacción se vigiló por RP-HPLC hasta que se consumió la totalidad de LN3-pppC. La reacción se extinguió con tampón TEAB (0,1 M, 10 ml) y se cargó en una columna DEAE Sephadex (2x5 cm). La columna se eluyó con un gradiente de 0,1 M a 1 M tampón TEAB en 30 min a 25 ml/min. Las fracciones que contenían el producto se combinaron, evaporaron y purificaron por HPLC.

Ejemplo 3-Síntesis de rbATP-LN3-SS-DEG527

Una construcción de adenina totalmente funcional, etiquetada en forma fluorescente, que comprende un enlazador escindible para uso en SBS se sintetizó de la siguiente manera:

DEG527-SS-enlazador

A una disolución de DEG527 (12,5 mg, 16 pmol) en DMA seca (2 ml), se le añadieron TSTU (6 mg, 20 pmol) y diisopropiletilamina (7 pl, 40 pmol). La mezcla se agitó durante 30 minutos a temperatura ambiente hasta la activación completa del ácido. Se añadió una disolución de SS-enlazador (9 mg, 50 pmol) en TEAB 0,1 M (0,2 ml) a la mezcla de reacción. La mezcla se agitó durante 3 horas hasta que la TCL demostró el consumo completo del éster activado. Los componentes volátiles se evaporaron a presión reducida y el residuo se disolvió en TEAB 0,1 M (5 ml) y se purificó por RP-HPLC.

rbATP-LN3-SS-DEG527

A una disolución de DEG527-SS-enlazador (5,9 pmol) en DMA seca (2 ml), se le añadieron TSTU (2,1 mg, 7,1 pmol) y diisopropiletilamina (2,6 pl, 14,8 pmol). La mezcla se agitó durante 30 minutos a temperatura ambiente hasta la activación total del ácido. Se añadió una disolución de LN3-pppA (17,7 pmol) en TEAB 0,1M (0,2 ml) a la mezcla de reacción. La mezcla se agitó durante 5 horas hasta que la TCL demostró el consumo completo del éster activado. La reacción se extinguió con tampón TEAB (0,1 M, 10 ml) y se cargó en una columna DEAE Sephadex (2x5 cm). La columna se eluyó con un gradiente de 0,1 M a 1 M tampón TEAB en 30 min a 25 ml/min. Las fracciones que contenían el producto se combinaron, evaporaron y purificaron por HPLC.

Ejemplo 4- Detección de la incorporación de nucleótidos usando una construcción de nucleótido conjugado a biotina

Se realizaron experimentos para demostrar el uso de un nucleótido conjugado a biotina en reacciones de secuenciación. La firma espacio de tiempo de los experimentos siguió el patrón de adquisición de imágenes en espacio de tiempo.

Los experimentos se realizaron en un aparato Genome Analyzer IIx configurado en el modo de un solo carril. Se siguió un programa de enzimología de secuencia por síntesis estándar usando la mezcla de nucleótidos reversiblemente bloqueados que incluía rbGTP no etiquetado, rbTTP-LN3-NR550 fluorescentemente etiquetado, rbCTP-LN3-PEG4-biotina biotinilado y rbATP con un enlazador disulfuro escindible (SS) rbATP-LN3-SS-DEG527. La adquisición y el análisis de los datos difirió de la química SBS de 4 tintes estándar. En síntesis, después de un paso de incorporación de nucleótidos, los clústers se excitaron con láser y se adquirió la imagen fluorescente. Se añadieron componentes de reacción adicionales a la reacción para escindir selectivamente el enlace SS de rbATP-LN3-SS-DEG527 y se añadió SA-NR555 para etiquetar selectivamente rbCTP-LN3-biotina a fin de crear rbCTP-LN3-biotina-SA-NR555. Los clústers se excitaron con láser una segunda vez y se registró una segunda imagen fluorescente. Así, la incorporación de cada una de las cuatro bases se produce por cambios de estados de intensidad fluorescente, o por su ausencia, usando tintes que excitan y emiten en la misma longitud de onda.

Se creó una biblioteca de ADN genómico para uso en una secuenciación de una sola lectura en un aparato Genome Analyzer IIx (Illumina, Inc.). Después de la preparación de la biblioteca se creó una celda de flujo de secuenciación con clústers de secuenciación diana usando el kit TruSeq SR Cluster Kit v2 en Illumina® cBot siguiendo el protocolo del fabricante para secuenciación de una sola lectura. Después de la generación del clúster, la celda de flujo se dispuso en un Genome Analyzer IIx y la muestra se secuenció usando los reactivos de TruSeq SBS Reagent Kit v5 (Illumina®, Inc.).

Se prepararon disoluciones stock de los nucleótidos reversiblemente bloqueados para uso en la reacción de secuenciación; disoluciones stock 100 pM de rbGTP oscuro o no etiquetado, rbATP-LN3-SS-DEG527, rbCTP-PEG4-biotina y rbTTP-LN3-NR550. Se preparó una disolución stock de estreptavidina-NR555 (SA-NR555 a 1mg/ml) en un tampón Binding and Wash (Tris 5 mM pH 7,5, EDTA 0,5 mM, NaCl 1M).

Para el Genome Analyzer IIx, las pociones del reactivo del instrumento se reconfiguraron para una secuencia por síntesis de un solo tinte. Se seleccionó un carril para secuenciación y los otros carriles se desconectaron, asegurando de este modo que los reactivos se desplazaran por un carril de secuenciación y que no se cruzara ningún líquido del otro carril. Los reactivos se dispusieron en el instrumento Genome Analyzer IIx (GAIIx) de la siguiente manera:

Posición Reactivo

1 Mezcla de incorporación (IMX)

2 Blanco

3 Mezcla de exploración (SMX)

4 Blanco

5 Tampón de escisión (PR2)

6 Mezcla de escisión (CLM)

7 Blanco

8 SA-NR555

Se prepararon reactivos para un ensayo de secuenciación de 150 ciclos. Del kit TruSeq SBS Reagent Kit v5, se utilizaron los reactivos CLM, SMX y PR2 según las instrucciones. Para el reactivo IMX que contenía los nucleótidos reversiblemente bloqueados, a 20,1 ml de tampón IMX se le añadió 1 ml de rbATP-SS-DEG527 (concentración final 4 pM), 0,5 ml rbGTP (concentración final 2 pM), 2,5 ml rbCTP-PEG4-biotina (concentración final 10 pM) y 0,25 ml rbTTP-LN3-NR550 (concentración final 1 pM). La disolución de rbNTP se filtró y se añadieron 0,6 ml de polimerasa de alta densidad (HDP, concentración final 15 pg/ml). Se efectuó una dilución 1:200 de SA-NR555 en tampón Binding and Wash.

Los reactivos se cargaron en el Genome Analyzer I Ix y se llevó a cabo el protocolo de secuenciación. En síntesis, a un paso de incorporación estándar (es decir, FirstBase) le siguió la adquisición de imágenes como se describe en el protocolo del fabricante. La adquisición de imágenes fue seguida de inmediato por escisión de disulfuro (adición de CLM) y unión de SA-NR555 (adición de dilución 1:200 de SA-NR555) y una segunda adquisición de imágenes subsiguiente seguida por un paso de desbloqueo e incorporación estándar (es decir, CompleteCycle). La escisión de los enlaces disulfuro que resulta en un cambio del estado de intensidad para rbATP de 1 a 0 fue selectiva y procedió a una tasa rápida de <5 segundos a temperatura ambiente. La unión biotina/estreptavidina también ocurrió rápidamente a una tasa de <25 segundos a temperatura ambiente resultando en un cambio en el estado de intensidad para rbCTP de 0 a 1.

El tiempo del ciclo total excluyendo la adquisición de imágenes fue alrededor de 9,3 minutos. Los ciclos se repitieron para los ciclos restantes.

El flujo general fue el siguiente:

Los resultados ilustrativos se pueden hallar en las Figuras 1 y 2 y en la Tabla 1. La Figura 1 ejemplifica un mapa de calor de estilo nube registrado en distintos ciclos durante una operación de secuenciación. Los mapas de nubes demuestran que la diferenciación de los cuatro nucleótidos fue exitosa (la parte inferior aislada y el mapa de nubes etiquetado de nucleótidos orienta las posiciones de los cuatro nucleótidos dentro del mapa de nubes). La Figura 2 describe un rastreo ilustrativo de porcentajes de tasa de error de incorporación de nucleótidos en una operación de secuenciación de 100 ciclos para el carril seleccionado 4, mosaico 4. Se registró una tasa de error de 0,4% en 100 ciclos para el carril 4, mosaico 4 en una celda de flujo, mientras que la Figura 2 demuestra que no hubo llamadas de base blanco a lo largo de la operación de 100 ciclos para ese carril y mosaico. Se describió separación de fases a 0,27% y pre-separación de fases a 0,43%. La Tabla 1 muestra los resultados del carril 4, mosaicos 1-6.

Tabla 1

Ejemplo 5- Detección de incorporación de nucleótidos usando un tinte

Se realizaron experimentos para demostrar que un tinte se puede usar para determinar la secuencia de un ácido nucleico.

Los nucleótidos utilizados en este experimento incluyeron:

rbATP-LN3-SS-NR550C4

rbTTP-LN3-NR550C4

rbCTP-(LN3)2-Biotina

rbGTP-sin etiqueta

Todas las concentraciones de stock de nucleótidos se conservaron a 100 pM en tampón Tris 10 mM (pH 8,0). El resto fluorescente utilizado para etiquetar los nucleótidos fue NR550C4. Dos espectros de emisión representativos para el tinte en rbATP y rbTTP se muestran en la Figura 5B. El rbGTP no se etiquetó y por lo tanto se consideró el nucleótido "oscuro". Para determinar la incorporación de citosinas en una hebra de ácido nucleico creciente, una mezcla maestra que incluía un conjugado de estreptavidina-NR550C4 se añadió a la reacción como se detalla a continuación.

La síntesis de la composición de NR550C4-SS-enlazador se realizó como se describió previamente para la composición de DEG527-SS-enlazador, excepto que se utilizó el resto fluorescente NR550C4 en lugar del fluoróforo DEG527. La síntesis de la composición de rbATP-LN3-SS-NR550C4 se realizó como se describió previamente para rbATP-LN3-SS-DEG527, no obstante, se usó la composición de NR550C4-SS-enlazador en lugar de la composición de DEG527-SS-enlazador. La síntesis de la composición de rbTTP-LN3-NR550C4 se realizó como se describe para rbATP-LN3-SS-550C4, no obstante, se utilizó rbTTP-LN3 en lugar de rbATP-LN3 y se usó NR550C4 en lugar de NR550C4-SS-enlazador. La síntesis de rbCTP-(LN3)2-Biotina se realizó como se describió previamente rbCTP-LN3-PEG4-Biotina, excepto que se utilizó LN3-Biotina en lugar de biotina durante la reacción de acoplamiento de amida. Se conjugó estreptavidina a NR550C4 por métodos conocidos en la técnica, y se preparó una disolución stock de Estrep-NR550C4 (SA-NR550C4) a 1 mg/ml en un tampón Tris 5 mM pH 7,5, EDTA 0,5 mM y NaCl 1M.

Al reactivo IMX, se le añadieron disoluciones stock de las composiciones de nucleótido para producir las concentraciones finales de 2 pM rbATP-LN3-SS-NR550C4, 10 pM rbCTP-(LN3)2-Biotina, 1 pM rbTTP-LN3-NR550C4 y 2 pM rbGTP-oscuridad. Adicionalmente, se añadieron 15 pg/ml de una polimerasa de alta densidad al reactivo de IMX/nucleótido. Los reactivos CLM, SMX y PR2 fueron aquellos previamente descritos. Se preparó una mezcla maestra, Mezcla de escisión SA-NR550C4-Cleavage Mix, diluyendo SA-NR550C4 hasta una concentración final de 5 pg/ml en THP 2 mM, Tris 5 mM pH 7,4, NaCl 1M, EDTA 0,5 mM y 0,005% Tween.

Se llevaron a cabo experimentos de secuenciación de un tinte en un instrumento de secuenciación MiSeq™ (Illumina, Inc.). La posición de los reactivos en el instrumento fue:

1 -IMX

2- SRE (Mezcla de exploración)

3- PR2

4- CLM

18-SA-NR550C4-Cleavage Mix

El instrumento se fijó a 60°C al comienzo de los experimentos de secuenciación y todos los pasos de secuenciación que incluían pasos de obtención de imágenes se llevaron a cabo a esta temperatura para secuenciación isotérmica. La secuenciación isotérmica se efectuó de manera comparable a la secuenciación realizada en GAIIx como se describió previamente, en donde la adquisición de imágenes tuvo lugar a 22°C.

Para secuenciación MiSeq™, el tiempo del ciclo de química SBS total para un ciclo de incorporación (excluidos los ciclos de adquisición de imágenes) fue 3,37 minutos (1 tinte SBS fue 2,70 minutos y el etiquetado SA y la escisión fue 0,67 segundos). Los ciclos de secuenciación se repitieron básicamente como se describe a continuación:

(!MX)

Primera imagen (incorporación)

I n c o r p o r a c i ó n

• Primera imagen j.

i A 1 í

Estrep-NR550C4-

Mezcla de escisión

(C tM ) (Síi r ;

D e s b l o q u e o e s t á n d a r Segunda imagen SBS (desbloqueo)

Segunda imagen

A 0

T 1

C 1

G O

Los resultados del experimento de secuenciación de un tinte se pueden hallar en las Figuras 5A&D y en la Tabla 2. La separación de fases se describió a 0,17% y la pre-separación de fases a 0,36%. La Tabla 2 muestra los resultados del carril 1, mosaicos 1-4.

Tabla 2

La Figura 5A muestra un ejemplo de rastreo de porcentajes de tasas de error de llamadas de base en una operación de secuenciación de 150 ciclos para un mosaico. Se observó una tasa de error de aproximadamente 2,12% durante 150 ciclos. En base al diseño experimental, las Figuras 5B y C muestran eventos de adquisición de imágenes ilustrativos de patrones de detección que deberían resultar para los diferentes nucleótidos modificados de cada uno de los eventos de obtención de imágenes. Por ejemplo, la Imagen 1 de la Figura 5B muestra que el primer evento de obtención de imágenes debería capturar fluorescencia mínima o ninguna fluorescencia para rbGTP o rbCTP-(LN3)2-Biotina, ya que no se asocian con ningún resto fluorescente antes del primer evento de obtención de imágenes, y la fluorescencia para los nucleótidos etiquetados rbATP y rbTTP ya que se asocian con un resto fluorescente antes del primer evento de adquisición de imágenes. La Imagen 2 de la Figura 6C muestra que después de la adición de la mezcla de escisión SA-NR550C4-Cleavage Mix no debería haber fluorescencia o debería haber fluorescencia mínima del nucleótido modificado rbATP ya que el disulfuro en la composición de rbATP-LN3-SS-NR550C4 debe ser escindido, liberando así el fluoróforo acoplado, y la incorporación del rbCTP en la hebra de ácido nucleico creciente debería ser detectable debido a la unión de la composición de SA-NR550C4 a la biotina en el conjugado rbCTP-(LN3)2-Biotina. El rbGTP y los patrones fluorescentes rbTTP-LN3-NR550C4 deben permanecer iguales para la Imagen 1 y la Imagen 2 al seguir el diseño experimental descrito en este Ejemplo.

La Figura 5D muestra un gráfico de nubes que demuestra que, sorprendentemente, el patrón de detección por fluorescencia no siguió el patrón de imagen propuesto y que cada uno de los nucleótidos pudo diferenciarse del otro cuando se incorporó en una hebra de nucleótidos creciente usando solamente un tinte y dos eventos de adquisición de imágenes en un experimento de secuenciación.

Los resultados descritos en esta invención demuestran que la secuenciación de un ácido nucleico se puede lograr usando tan solo un tinte fluorescente y menos de cuatro eventos de adquisición de imágenes para diferenciar la incorporación de cuatro ácidos nucleicos diferentes en un ciclo de secuenciación.

Claims (10)

REIVINDICACIONES

1. Una composición para determinar la secuencia de un polinucleótido en un método de secuenciación por síntesis basado en fluorescencia, que comprende:

a) un conjugado de primer rbNTP - primer tinte fluorescente detectable en un primer canal;

b) un conjugado de segundo rbNTP - segundo tinte fluorescente detectable en un segundo canal;

c) un tercer conjugado de rbNTP detectable en el primer canal y el segundo canal, en donde el tercer conjugado de rbNTP es una mezcla de un conjugado de tercer rbNTP - tercer tinte fluorescente detectable en el primer canal y un conjugado de tercer rbNTP - cuarto tinte fluorescente detectable en el segundo canal; y

d) un cuarto rbNTP que carece de un resto fluorescente;

en donde los cuatro tintes fluorescentes comprenden diferentes restos fluorescentes;

en donde el primero y el tercer tinte fluorescentes tienen espectros de emisión de fluorescencia similares y forman un primer conjunto de tintes fluorescentes; y

en donde los dos conjuntos de tintes fluorescentes tienen diferentes espectros de emisión de fluorescencia; y en donde uno de los dos tintes fluorescentes en cada conjunto de tintes fluorescentes emite a una intensidad detectablemente mayor que el otro tinte fluorescente en el conjunto de tintes fluorescentes.

2. La composición según la reivindicación 1, en donde los espectros de emisión del primero y tercer tintes fluorescentes tienen una compensación Amáx de hasta 100 nm.

3. La composición según la reivindicación 1, en donde los espectros de emisión del segundo y cuarto tintes fluorescentes tienen una compensación Amáx de hasta 100 nm.

4. La composición según la reivindicación 1, en donde los espectros de emisión de los dos tintes fluorescentes diferentes tienen una compensación Amáx de por lo menos 100 nm.

5. La composición según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde un tinte fluorescente en un conjunto de tintes fluorescentes es por lo menos 0,5X, por lo menos 0,75X, por lo menos 1X o por lo menos 2X tan intenso como el otro tinte fluorescente en el conjunto de tintes fluorescentes.

6. La composición según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde uno o más conjugados de rbNTP comprende además una o más secuencias enlazadoras.

7. La composición según la reivindicación 6, en donde una o más de las secuencias enlazadoras comprende un enlazador escindible y un enlazador espaciador.

8. La composición según la reivindicación 7, en donde el enlazador escindible comprende uno o más grupos de enlace escindibles seleccionados del grupo que consiste en un disulfuro, un diol, un diazo, un éster, una sulfona, una azida, un alil y un silil éter.

9. La composición según la reivindicación 1, en donde los cuatro rbNTP comprenden una base modificada y un grupo bloqueante finalizador en 3' reversible.

10. La composición según la reivindicación 9, en donde el grupo bloqueante en 3' comprende un grupo azido, y/o un grupo alcoxi es eliminable por escisión con un reactivo fosfina.