KR102054571B1 - 클러스터에서 표면 프라이머의 향상된 이용 - Google Patents

클러스터에서 표면 프라이머의 향상된 이용 Download PDF

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Abstract

표면 증폭 공정 동안 표면 프라이머의 이용을 향상시키기 위한 방법 및 조성물이 본 명세서에서 제시된다. 상기 방법은 개선된 밀도의 표면 증폭에 유용하다. 본 명세서에서 제공되는 방법 및 조성물은 더 밝지만, 표준 클러스터 증폭을 사용하여 현재 달성되는 것과 동일한 밀도의 클러스터의 형성을 가능하게 한다.

Description

클러스터에서 표면 프라이머의 향상된 이용
인간 유전 변이를 목록화하고 이러한 변이와 질환에 대한 감수성의 상관관계를 보여주는 작업은 어려우면서 비용이 많이 든다. 이러한 비용의 극단적인 감소가 건강 및 질환에 대한 이해를 증진시키는 데 필수적이다. 서열결정 비용의 감소는 현장에서 다수의 기술적 진보를 필요로 할 것이다. 게놈 분석의 비용을 감소시킬 수 있는 기술적 진보는, (1) 라이브러리 생성; (2) 고도의 병렬화(highly-parallel) 클론 증폭 및 분석; (3) 강력한 사이클 서열결정 생화학의 개발; (4) 초고속 영상화 기술의 개발; 및 (5) 짧은 판독물로부터 서열 조립에 대한 알고리즘의 개발을 포함한다.
고도의 병렬화 방식으로 클론 증폭물을 형성하는 것은 비용 효과적인 서열결정에 중요하다. 서열결정은 일반적으로, 골라낸 개별 박테리아 콜로니로부터 성장한 플라스미드로 전통적으로 제조된 DNA 분자의 클론 집단 상에서 실행된다. 인간 게놈 프로젝트에서, 각각의 클론은 개별적으로 골라내어져서 성장되고, 클론 밖으로 DNA가 추출되거나 증폭된다. 최근에, 특히 어레이-기반 접근법을 사용하여 DNA 클론의 고도의 병렬화(highly-parallelized) 분석을 가능하게 하는 다수의 혁신이 있었다. 가장 간단한 접근법에서, 라이브러리는 본질적으로 클론인 단일 분자 수준에서 분석될 수 있다. 단일 분자 서열결정의 주요 이점은, 각각의 분자가 개별적으로 판독되므로 주기적인 서열결정이 비동기적으로 일어날 수 있다는 점이다. 그에 반해서, 클론 증폭물의 분석은 각각의 서열결정 사이클의 거의 정량적인 완료를 필요로 하여, 그렇지 않으면 백그라운드 노이즈가 점진적으로 커져서 각각의 뒤이은 사이클이 판독 길이를 심하게 제한하게 된다. 이와 같이, 클론 분석은 서열결정 생화학의 견고성에 더 큰 부담을 주고, 잠재적으로 판독 길이를 제한할 수 있다.
따라서, 유전체 분석을 개선하고 서열결정 분석에 대해 보다 비용 효과적인 방법을 제공하는 방법을 개발할 필요가 존재한다. 본 발명은 이러한 필요성을 만족시키고, 또한 관련 이점을 제공한다.
본 명세서에서 제공되는 방법 및 조성물은 개선된 밀도의 표면 증폭을 가능하게 한다. 표면 증폭 공정 동안 표면 프라이머의 이용을 향상시키기 위한 방법이 본 명세서에 기재되어 있다. 상기 방법은 개선된 밀도의 표면 증폭에 유용하다. 본 명세서에서 제공되는 방법 및 조성물은 더 밝지만, 표준 클러스터 증폭을 사용하여 현재 달성되는 것과 동일한 밀도의 클러스터의 형성을 가능하게 한다. 더 밝은 클러스터는 다수의 이점, 예를 들어 판독물의 더 양호한 품질, 더 긴 판독 길이에 대한 지원, 서열결정에 대한 더 빠른 스캔 시간, 및 시스템 견고성의 증가를 가질 수 있다.
(a) 상부에 고정화된 복수의 정방향 및 역방향 증폭 프라이머를 가지는 고체 지지체를 제공하되, 상기 복수의 증폭 프라이머의 하위세트는 절단 부위를 포함하는 것인 단계; (b) 상기 지지체 상의 프라이머의 하위세트를 사용하여 주형을 증폭시켜 복수의 이중 가닥 핵산 분자를 제공하되, 각각의 이중 가닥 핵산 분자의 모든 가닥은 이들의 5' 말단에서 고체 지지체에 부착되어 있는 것인 단계; (c) 상기 절단 부위에서 프라이머의 하위세트를 절단하는 단계; 및 (d) 상기 절단된 가닥에 부분-변성 조건을 적용하여 증폭 산물의 비고정화된 가닥의 일부와 상보적인 고정화된 증폭 프라이머의 혼성화를 촉진시킨 다음, 고정화된 증폭 프라이머를 연장시켜 증폭 산물의 비고정화된 가닥의 복사체를 생성하는 단계를 포함하는, 핵산 서열결정 반응을 위한 고정화된 주형을 제조하기 위한 방법 및 조성물이 본 명세서에서 제시된다.
일부 실시형태에서, 상기 부분-변성 조건은 재조합효소/중합효소 증폭 반응의 하나 이상의 성분을 첨가하여 가닥 침투를 촉진하는 것을 포함한다. 일부 실시형태에서, 부분-변성 조건은 주형에 주형 워킹(walking)에 적합한 조건을 적용하는 것을 포함한다.
일부 실시형태에서, 단계 (d)는 용액 중 프라이머를 적용하여 고정화된 증폭 산물의 비고정화된 말단에 프라이머의 혼성화를 촉진시키는 것을 포함한다.
하나 이상의 실시형태의 상세내용은 첨부된 도면 및 하기 설명에 제시되어 있다. 다른 특성, 목적, 및 이점은 설명 및 도면으로부터, 그리고 청구범위로부터 명백해질 것이다.
도 1은 일 실시형태에 따른 증폭 방법을 나타내는 개략도.
도 2는 일 실시형태에 따른 증폭 방법을 나타내는 개략도.
도 3은 다양한 방법에 따라 증폭된 SyBr 녹색 염색 클러스터의 비교 결과.
도 4는 다양한 방법에 따라 증폭된 클러스터의 비교 결과. 상부 패널은 뉴클레오타이드 혼입의 제1 사이클 후 영상화 스캔을 나타낸다. 하부 패널은 각각의 레인에서 클러스터의 Cy3 및 Cy5 염색을 나타낸다.
도 5는 쌍 형성 말단 턴(end turn)을 생성하기 위한 대안적인 접근법을 나타내는 개략도.
도 6은 도 5에 나타낸 접근법에서 추가적인 단계를 나타내는 개략도.
표면 증폭 공정 동안 표면 프라이머의 이용을 향상시키기 위한 방법 및 조성물이 본 명세서에서 제시된다. 상기 방법은 개선된 밀도의 표면 증폭에 유용하다. 본 명세서에서 제공되는 방법 및 조성물은 더 밝지만, 표준 클러스터 증폭을 사용하여 현재 달성되는 것과 동일한 밀도의 클러스터의 형성을 가능하게 한다.
현재 이용가능한 서열결정 기술은 표면 증폭을 이용하여 고체 지지체 상에서 증폭된 핵산의 클러스터를 형성한다. 가장 일반적인 접근법은 브릿지(bridge) 증폭을 포함하며, 등온 증폭은 또한 배제 증폭(exclusion amplification; ExAmp)이라고도 지칭되는 역학적 배제 증폭(kinetic exclusion amplification; KEA)을 사용하여 실행될 수 있다. 이들 증폭 방법은 둘 다 고체 지지체 상에 고정화된 2가지 상이한 표면 프라이머, 즉 정방향 및 역방향 프라이머를 이용한다. 그러나, 브릿지 및 ExAmp 클러스터 증폭 공정 둘 다 2가지 표면 프라이머를 비효율적으로 사용한다. 현재 추정치는 표면 프라이머의 10% 미만이 증폭 후 주형 가닥으로 전환된다는 것이다. 기존 표면 프라이머의 보다 강력한 이용을 가능하게 하는 표면 증폭의 개선된 방법에 대한 필요성이 존재한다. 표면 프라이머의 더 많은 부분을 이용할 수 있는 방법은 서열결정 동안 생성된 클러스터의 밝기 및 신호-제한 서열결정 플랫폼에서 향상된 서열결정 품질 면에서 많은 이익을 제공할 것이다.
표면 프라이머의 점유를 향상시키고, 핵산 증폭 산물의 밀도가 더 높은 클러스터를 가능하게 하며, 합성에 의한 서열결정 동안 크게 개선된 신호를 생성하기 위한 방법이 본 명세서에서 제시된다. 본 명세서에 제시된 특정 실시형태에서, 증폭 방법은 표준 브릿지 또는 ExAmp 증폭 절차를 실행하는 단계를 포함한다. 표준 증폭이 완료된 후, 2개의 표면 프라이머 중 1개는 절단되고 고체 지지체로부터 제거된다. 증폭된 분자는 단지 하나의 말단에서 제약된 상태로 있지만, dsDNA 형태로 남아 있다. 그 다음, 후속 증폭 라운드가 부분 변성 조건 하에서 일어나서 증폭 산물의 비고정화된 가닥의 일부와 상보적인 고정화된 증폭 프라이머의 혼성화를 촉진시킨 다음, 고정화된 증폭 프라이머를 연장시켜 증폭 산물의 비고정화된 가닥의 복사체를 생성한다.
일 실시형태에 따른 방법의 일반적인 서술이 도 1에 예시되어 있다. 도 1에 나타낸 바와 같이, 초기 표면 증폭 공정은 표면 상에 존재하는 정방향 및 역방향 프라이머 둘 다를 이용하여 실행된다. 정방향 및 역방향 프라이머는 도 1에 "P7"과 "P5"로서 명명되어 있지만, 본 명세서에서 제시된 방법이 임의의 표면-결합 정방향 및 역방향 증폭 프라이머를 이용하여 실행될 수 있음을 이해할 것이다. 초기 표면 증폭 공정은, 예를 들어 도 1에서 또한 ExAmp라고도 지칭되는 브릿지 증폭 또는 재조합효소/중합효소 증폭(recombinase/polymerase amplification; RPA)을 통해 당업계에 공지된 임의의 적합한 증폭 절차를 사용하여 실행될 수 있다. 증폭의 초기 라운드 다음, 표면-결합 정방향 및 역방향 프라이머의 대부분은 연장되지 않은 상태로 남아 있다. 이론에 구속되고자 하는 것은 아니지만, 브릿지 및/또는 RPA 증폭 동안 표면 프라이머의 낮은 이용은 입체 장해, 또는 2개의 표면 프라이머에 대하여 "브릿지"하는 주형 분자에 대한 필요성으로 인한 다른 물리적 제약으로 인한 것일 수 있다.
그 다음, 도 1에 예시된 바와 같이, 표면-결합 프라이머의 서브세트는 표면으로부터 절단된다. 절단된 표면-결합 프라이머의 서브세트는, 예를 들어 정방향 프라이머, 또는 대안적으로 역방향 프라이머일 수 있다. 일부 실시형태에서, 정방향 또는 역방향 프라이머 모두가 표면으로부터 절단되지 않을 것을 이해할 것이다. 예를 들어, 역방향 프라이머(P5)의 절단 후, P5 프라이머의 일부는 여전히 표면에 결합된 상태로 남아 있을 수 있다. 일부 실시형태에서, 원래 결합된 정방향 프라이머의 90%, 80%, 70%, 60%, 50%, 40%, 30%, 20%, 10% 미만, 또는 5% 미만이 표면에 결합된 상태로 남아 있다. 일부 실시형태에서, 원래 결합된 역방향 프라이머의 90%, 80%, 70%, 60%, 50%, 40%, 30%, 20%, 10% 미만, 또는 5% 미만이 표면에 결합된 상태로 남아 있다.
도 1에 나타낸 실시형태에서, 절단 단계는 비연장된 P5 프라이머 및 연장된 P5 프라이머 둘 다를 절단한다. 따라서, 절단 후, 절단된 프라이머의 일부는 선형화된 브릿지 구조를 통해 고체 지지체에 묶인 상태로 남아 있다. 절단된 비연장 프라이머는 용액 중에 존재할 것이며, 원한다면 세척 단계에 의해 고체 지지체로부터 제거될 수 있다.
용어 P5 및 P7이 역방향 및 정방향 프라이머를 말하기 위해 본 설명 전반에 걸쳐 사용되어 있지만, 본 명세서에서 제시된 방법은 단지 역방향 프라이머의 절단으로 제한되지 않음을 이해할 것이다. 도면에 기재된 것에 대한 대안적인 실시형태에서, 정방향 프라이머가 절단될 수 있으며, 고체 지지체 상에 고정화된 역방향 프라이머를 남길 수 있다.
다수의 절단가능한 올리고뉴클레오타이드, 절단가능한 링커 및 절단가능한 접근법 중 임의의 하나가 본 명세서에 제시된 방법에서 이용될 수 있다. 고체 지지체로부터 올리고뉴클레오타이드를 절단하기 위한 방법은, 전문이 참고로 포함되어 있는 미국 특허 제8,715,966호의 개시내용에 의해 예시된 바와 같이, 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 올리고뉴클레오타이드 프라이머는 화학적, 광화학적, 효소적, 또는 고체 지지체로부터 올리고뉴클레오타이드 프라이머의 전부 또는 일부를 절단하는 임의의 다른 적합한 방법을 통해 절단될 수 있다. 절단 부위는, 예를 들어 올리고뉴클레오타이드 합성 동안 미리 결정된 부위에 위치할 수 있다. 일부 실시형태에서, 화학적 절단은 하나 이상의 다이올 단위를 올리고뉴클레오타이드 합성 동안 프라이머로, 또는 올리고뉴클레오타이드를 고체 지지체와 결합시키는 링커로 혼입시킨 다음, 다이올-함유 올리고뉴클레오타이드를 화학적 절단제, 예컨대 과요오드산염으로 처리함으로써 달성될 수 있다. 일부 실시형태에서, 효소적 절단은 고정화된 올리고뉴클레오타이드를 절단하거나 상기 올리고뉴클레오타이드에 닉(nick)을 형성할 수 있는 임의의 효소에 의해 일어날 수 있다. 일부 실시형태에서, 제한 효소(restriction endonuclease) 또는 닉킹 엔도뉴클레아제(nicking endonuclease)가 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, 어베이직(abasic) 부위가 데옥시우리딘(I) 또는 미국 특허 제8,715,966호의 포함된 자료에 기재된 바와 같이 임의의 다른 비천연 또는 변형된 데옥시리보뉴클레오타이드를 혼입시킴으로써 올리고뉴클레오타이드에서 생성될 수 있다. 예를 들어, 데옥시우리딘(U), 8-옥소-구아닌, 또는 데옥시이노신은 올리고뉴클레오타이드 합성 동안 미리 결정된 부위로 혼입될 수 있으며, 그 다음 어베이직 부위는 데옥시우리딘에 대해서는 우리실 DNA 글리코실라제(uracil DNA glycosylase: UDG), 8-옥소-구아닌에 대해서는 FPG 글리코실라제, 그리고 데옥시이노신에 대해서는 AlkA 글리코실라제를 사용하여 생성될 수 있다. 그 다음, 어베이직 부위를 포함하는 폴리뉴클레오타이드 가닥은 엔도뉴클레아제(예를 들어, 엔도IV 엔도뉴클레아제, AP 리아제, FPG 글리코실라제/AP 리아제, 엔도 VIII 글리코실라제/AP 리아제), 열 또는 알칼리로 처리함으로써 절단될 수 있다. 추가적으로 또는 대안적으로, 절단 전략은 미국 특허 제8,715,966호의 포함된 자료에 기재된 바와 같이, 리보뉴클레오타이드, 광화학적 절단, 헤미메틸화 DNA, 또는 PCR 정지제의 사용을 포함할 수 있다.
절단 단계 후, 초기 증폭 공정의 증폭 산물은 고정화된 가닥 및 비고정화된 가닥을 포함하고, 그 다음 비고정화된 가닥은 고체 지지체 상에 고정화된 나머지 프라이머를 사용하여 추가로 증폭될 수 있다. 예를 들어, 도 1에 나타낸 바와 같이, 이중-가닥 증폭 산물은 부분적으로 변성 조건을 거쳐 비연장된 프라이머(P7)에 대한 비고정화된 가닥(P7'으로서 나타냄)의 일부의 혼성화를 촉진시킨다. 그 다음 P7 프라이머는 연장에 적합한 조건 하에서 중합효소에 의해 연장될 수 있으며, 따라서 비고정화된 주형 가닥의 새로운 복사체를 생성한다. 주형을 부분적으로 변성시키는 단계, 새로운 비연장된 프라이머에 혼성화하는 단계, 및 연장 단계가 원하는 만큼 다수 회 반복될 수 있다. 이용가능한 표면 프라이머가 실질적으로 전부 소모될 때까지 상기 공정은 다수 회 반복될 수 있다. 일부 실시형태에서, 공정을 통한 순환은, 예를 들어 화학적 변성 또는 온도 순환을 통해 제어될 수 있다. 일부 실시형태에서, 화학적 조건의 온도를 순환시킬 필요 없이 공정이 계속적으로 반복될 수 있게 하는 조건 하에서 순환은 계속된다. 따라서, 주형을 부분적으로 변성시키는 단계, 및 고정화된 프라이머에 혼성화하는 단계는 당업계에 공지된 다수의 방법 중 임의의 하나를 사용하여 일어날 수 있다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 재조합효소 프라이머 증폭(recombinase primer amplification; RPA)은 가닥 침투 및 고정화된 프라이머의 후속 연장을 촉진시키는 데 사용된다. RPA에서 사용하기 위한 방법 및 성분은 미국 특허 제5,223,414호 및 제7,399,590호, 및 미국 특허출원 공개 제2013/0225421호에 기재되어 있으며, 이들 각각의 내용은 전문이 참고로 포함되어 있다.
RPA에서 사용하기 위한 시약은 앰플리콘 형성을 촉진시키고, 일부 경우에 앰플리콘 형성 속도를 증가시키는 성분을 추가로 포함할 수 있다. 예에는 재조합효소가 있다. 재조합효소는 반복된 침투/연장을 가능하게 함으로써 앰플리콘 형성을 촉진시킬 수 있다. 더 구체적으로, 재조합효소는 중합효소에 의한 표적 핵산의 침투, 및 앰플리콘 형성을 위한 주형으로서 표적 핵산을 사용하여 중합효소에 의한 프라이머의 연장을 촉진시킨다. 이 공정은 침투/연장의 각각의 라운드로부터 생성된 앰플리콘이 후속 라운드에서 주형의 역할을 하는 연쇄 반응으로서 반복될 수 있다. 변성 사이클(예를 들어, 가열 또는 화학적 변성을 통함)이 요구되지 않으므로, 상기 공정은 표준 PCR보다 더 신속하게 일어날 수 있다. 이와 같이, 재조합효소-촉진 증폭은 등온으로 수행될 수 있다. 증폭을 촉진시키기 위하여 재조합효소-촉진 증폭 시약 중에 ATP, 또는 다른 뉴클레오타이드(또는 일부 경우에 이의 비가수분해 유사체)를 포함하는 것이 일반적으로 바람직하다. 재조합효소 및 단일 가닥 결합(single stranded binding; SSB) 단백질의 혼합물은 특히 유용한데, 이는 SSB가 증폭을 추가로 촉진시킬 수 있기 때문이다. 재조합효소-촉진 증폭에 대한 예시적인 제형은 트위스트디엑스(TwistDx; 영국 캠브리지 소재)에 의해 트위스트앰프(TwistAmp) 키트로서 시판되는 것을 포함한다. 재조합효소-촉진 증폭 시약의 유용한 성분 및 반응 조건은 미국 특허 제5,223,414호 및 제7,399,590호에 제시되어 있으며, 이들 각각은 본 명세서에 참고로 포함되어 있다.
앰플리콘 형성을 촉진시키고 일부 경우에는 앰플리콘 형성 속도를 증가시키는 증폭 시약에 포함될 수 있는 성분의 또 다른 예는 헬리카제이다. 헬리카제는 앰플리콘 형성의 연쇄 반응을 가능하게 함으로써 앰플리콘 형성을 촉진시킬 수 있다. 이 공정은, (예를 들어, 가열 또는 화학적 변성을 통한) 변성 사이클이 필요하지 않으므로, 표준 PCR보다 더 신속하게 일어날 수 있다. 이와 같이, 헬리카제-촉진 증폭은 등온으로 수행될 수 있다. 헬리카제 및 단일 가닥 결합(SSB) 단백질의 혼합물은 특히 유용한데, 이는 SSB가 증폭을 추가로 촉진시킬 수 있기 때문이다. 헬리카제-촉진 증폭에 대한 예시적인 제형은 바이오헬릭스(Biohelix; 미국 매사추세츠주 베벌리 소재)의 아이소앰프(IsoAmp) 키트로서 시판되는 것을 포함한다. 또한, 헬리카제 단백질을 포함하는 유용한 제형의 예는 미국 특허 제7,399,590호 및 미국 특허 제7,829,284호에 기재되어 있으며, 이들 각각은 본 명세서에 참고로 포함되어 있다. 추가적으로 또는 대안적으로, 토포아이소머라제가 헬리카제 및/또는 재조합효소와 유사한 방식으로 사용될 수 있다.
상기 기재한 RPA 방법에 대하여 대안적으로 또는 추가적으로, 새로운 고정화된 프라이머에 대하여 주형을 부분적으로 변성하고 혼성화하는 단계는 주형 워킹 기술을 사용하여 일어날 수 있다. 일부 실시형태에서, 주형 워킹은 표면 올리고(전형적으로 60% 초과의 AT 프라이머)의 낮은 Tm을 사용하여 DMA의 말단의 호흡(breathing)을 촉진시켜 가닥이 프라이머로부터 프라이머로 워킹이 일어날 수 있게 한다. 주형 워킹을 위하여 표면 올리고뉴클레오타이드 및 조건을 설계하는 방법은 미국 특허출원 공개 제2013/0225421호의 포함된 자료에 기재되어 있다.
RPA 및 주형 워킹에 대하여 대안적으로 또는 추가적으로, 새로운 고정화된 프라이머에 대하여 주형을 부분적으로 변성하고 혼성화하는 단계는 변성 조건과 혼성화 조건 사이에서 순환하는 순환 방법을 사용하여 일어날 수 있다. 예를 들어, 온도 순환, 및 화학적 변성제 등의 순환은 당업계에 공지되어 있으며, 이들은 본 명세서에 제시된 방법에서 사용될 수 있다.
상기 기재된 실시형태에 대하여 추가적으로 또는 대안적으로, 용액 프라이머는 RPA 혼합체로 제공되어 용액 중 주형/프라이머 이중가닥을 형성할 수 있다. 일례가 도 2에 예시되어 있다. 도 2에 나타낸 바와 같이, 프라이머 세트(P5) 중 하나의 절단 후, RPA는 용액 중 P5 프라이머의 존재 하에서 실행된다. 따라서, 연장이 주형의 양쪽 말단으로부터 일어난다. 하나의 연장 반응이 수행되어 고정화된 P7 프라이머를 연장한다. 추가적으로, 가닥 침투, 혼성화 및 연장이 수행되어 용액상의 P5 프라이머를 연장하여 고정화된 가닥의 상보적 복사체를 형성한다. 그 다음, 이는, 도 2에 나타낸 바와 같이, P7 프라이머를 더 잘 점유하고 증폭을 가속화시키는 데 사용될 수 있는 P5 가닥의 추가의 복사체를 형성할 것이다. 특정 실시형태에서, 새로운 세트의 프라이머가 용액 중에 첨가된다. 일부 실시형태에서, 절단된 프라이머는 절단 반응 후 수집되고 용액 중에서 증폭을 촉진시키는 데 사용된다.
상기 기재된 방법은 하기 도면 및 실시예에 더 자세히 기재되어 있다. 도면 및 실시예에서, 용어 "측방 부스트(sideways boost)"는 표면 프라이머 중 하나의 절단 후, 나머지 고정화된 프라이머를 사용하여 증폭의 두번째 라운드를 수행하는 것을 말한다. 일부 실시형태에서, 측방 부스트는 용액 중에 첨가된 프라이머를 이용하여 실행된다.
본원에서 제안된 증폭의 두번째 라운드는 미국 특허출원 공개 제2013/0225421호의 포함된 자료에 기재된 주형 워킹 증폭 기술(또한, "와일드파이어(wildfire)" 증폭이라 지칭됨)과 일부 유사점을 가진다. 그러나, 하기 기재된 바와 같은 몇 가지 중요한 차이점이 있다. 와일드파이어는 단일 분자로부터 표면 DNA의 전체 증폭을 수행하기 위하여 주형 워킹을 사용한다. 대조적으로, 제안된 증폭 방법은 추가적인 강도 부스트로서 사용되어, 2개의 프라이머 표면 증폭에 의해 이미 제조된 클러스터 내에서 수백 내지 수천개의 분자를 추가로 증폭시킨다. 따라서, 생성된 클러스터는 증폭 산물로 훨씬 더 밀집되어 있으며, 클러스터 내 뉴클레오타이드의 영상화는 브릿지 증폭을 단독으로 또는 와일드파이어 증폭을 단독으로 사용하여 예상되는 것보다 몇 배 더 강력하다. 실제로, 표면 증폭에서 사용되는 프라이머 중 하나를 절단하는 것은 반직관적인데, 이는 정방향 및 역방향 프라이머 둘 다를 사용하는 증폭이 단일 고정화된 프라이머를 이용하는 선형 증폭에 비하여 기하급수적으로 진행할 것으로 예상되기 때문이다. 하기 실시예 섹션에서 입증된 바와 같이, 놀랍게도, 표준 브릿지 또는 ExAmp 표면 증폭을 프라이머 중 하나의 절단과, 그 다음 측방 부스트와 조합하는 것은 몇 배 더 강력한 증폭 산물을 산출하여, 표면 프라이머의 상당히 더 높은 이용을 가능하게 하고 광학 스캐닝 분석 동안 몇 배 더 밝은 클러스터를 생성한다는 것이 발견되었다. 향상된 점유가 브릿지 증폭 프라이머 중 하나의 절단으로부터 일어난다는 것은 예상되지 않았다.
쌍 형성 말단 서열결정(Paired End Sequencing)에 대한 실시형태
일부 서열결정 방법은 쌍 형성 말단 서열결정을 포함하며, 이는 예를 들어 미국 특허 제7,754,429호 및 제8,017,335호(이들 각각은 본 명세서에 참고로 포함되어 있음)에 기재된 바와 같은 제1 판독물의 반대 가닥에 대한 제2 서열결정 판독물을 수반한다. 전형적인 실시형태에서, 쌍 형성 말단 방법은 2개의 표면-결합 프라이머를 사용하여 서열결정된 가닥의 복사체를 생성한다. 상보적 가닥을 재생시키는 이러한 공정은 종종 쌍 형성 말단 턴(paired-end turn)으로 지칭된다. 그러나, 상기 기재된 방법에서, 2가지 프라이머 유형 중 하나는 고체 지지체의 표면으로부터 절단되고, 쌍 형성 말단 접근법은 전통적인 기법을 사용하여 가능하지 않을 수 있다.
상보적 가닥을 재생시키는 대안으로서, 대안적인 접근법이 본 명세서에 기재된 증폭 방법, 예컨대 본 명세서에 참고로 포함되어 있는 미국 특허 제8,192,930호에 기재된 접근법 중 임의의 하나와 함께 사용될 수 있다.
또한, 제2 판독물을 위한 상보적 가닥을 생성하기 위한 대안적인 방법이 본 명세서에서 제공된다. 일부 실시형태에서, 방법은 모든 증폭 단계에 걸쳐 차단되는 제3 표면 프라이머를 제공하는 단계를 포함할 수 있지만, 쌍 형성 말단 턴을 생성하기 전에 차단이 해제된다. 이러한 추가적인 표면 프라이머에 대한 상보적 서열은, 예를 들어 라이브러리에 대한 어댑터에 존재할 수 있지만, 클러스터 증폭 동안 삽입물과 함께 단순히 증폭될 것이다. 표면 프라이머의 차단 해제 후에만, 상기 서열이 쌍 형성 말단 턴 분자를 생성하기 위해 이용가능하게 될 것이다.
도 5 및 6은 이러한 쌍 형성 말단 턴 방법의 일 구현예를 예시한다. 도 5에 예시된 바와 같이, 제3 증폭 프라이머(P9로 지명됨)는 클러스터 공정 전체를 통해 고체 지지체 상에 존재하지만, 증폭에 적합한 조건 하에서 연장을 방지하는 가역성 3' 블럭을 가진다. 도면에 나타낸 바와 같이, 라이브러리는 또한 P5' 어댑터 서열과 서열결정된 내부 부분 사이에 위치하는 P9(P9'로 지명됨)의 보체를 포함하는 어댑터를 포함한다. 단일 가닥일 때 절단될 수 있는 절단 부위는 또한 P9'와 P5' 어댑터 서열 사이의 어댑터 부분에 위치한다. 따라서, 제1 서열결정 판독이 완료된 후, 3' 블록은 P9 프라이머로부터 제거되고 절단가능한 부위는 절단되어, P5' 서열을 방출한다. 생성된 절단 및 차단이 해제된 산물은 도 5의 패널 B에 예시되어 있다. 이제 도 6으로 이동하면, P9' 어댑터 서열은 표면 상에서 P9 프라이머에 혼성화될 수 있고, 전형적으로 쌍 형성 말단 턴 방법에서 실행된 바와 같이, 상보적 가닥이 재생될 수 있다.
고체 지지체에 올리고뉴클레오타이드의 부착
본 명세서에 제시된 방법 및 조성물에서, 폴리뉴클레오타이드는 고체 지지체에 고정화된다. 일부 실시형태에서, 폴리뉴클레오타이드는 지지체에 공유적으로 고정화된다. 고체 지지체에의 분자(예를 들어, 핵산)의 고정화를 말할 때, 용어 "고정화된" 및 "부착된"은 본 명세서에서 상호교환적으로 사용되고, 이들 용어 둘 다 명시적으로 또는 문맥에 의해 달리 지시되어 있지 않으면, 직접 또는 간접, 공유 또는 비공유 부착을 포함하는 것으로 의도된다. 본 발명의 특정 실시형태에서, 공유 부착이 바람직할 수 있지만, 일반적으로 필요한 전부는, 예를 들어 핵산 증폭 및/또는 서열결정을 필요로 하는 적용분야에서, 지지체를 사용하는 것으로 의도된 조건 하에서 분자(예를 들어, 핵산)가 지지체에 고정화되거나 부착된 상태로 남아 있는 것이다.
본 발명의 특정 실시형태는, 예를 들어 생체분자, 예컨대 폴리뉴클레오타이드에 공유 부착을 허용하는 반응성 기를 포함하는 중간체 물질의 코팅 또는 층의 적용에 의해, 작용화된 불활성 기재 또는 매트릭스(예를 들어, 유리 슬라이드, 중합체 비드 등)로 구성된 고체 지지체를 사용할 수 있다. 이와 같은 지지체의 예는 불활성 기재, 예컨대 유리 상에 지지된 폴리아크릴아마이드 하이드로겔, 특히 WO 2005/065814 및 US 2008/0280773(이들의 내용은 본 명세서에 전문이 참고로 포함되어 있음)에 기재된 바와 같은 폴리아크릴아마이드 하이드로겔을 포함하지만, 이로 한정되지 않는다. 이와 같은 실시형태에서, 생체분자(예를 들어, 폴리뉴클레오타이드)는 중간체 물질(예를 들어, 하이드로겔)에 직접적으로 공유 부착될 수 있지만, 중간체 물질은 그 자체로 기재 또는 매트릭스(예를 들어, 유리 기재)에 비공유적으로 부착될 수 있다. 용어 "고체 지지체에 공유 부착"은 따라서 이러한 유형의 배열을 포괄하는 것으로 해석되어야 한다.
예시적인 공유 결합은, 예를 들어 클릭 화학(click chemistry) 기법의 사용으로 생성된 것을 포함한다. 예시적인 비공유 결합은, 비특이적 상호작용(예를 들어, 수소 결합, 이온 결합, 반데르발스 상호작용 등) 또는 특이적 상호작용(예를 들어, 친화도 상호작용, 수용체-리간드 상호작용, 항체-에피토프 상호작용, 아비딘-비오틴 상호작용, 스트렙트아비딘-비오틴 상호작용, 렉틴-탄수화물 상호작용 등)을 포함하지만, 이로 한정되지 않는다. 예시적인 결합은 미국 특허 제6,737,236호; 제7,259,258호; 제7,375,234호 및 제7,427,678호; 및 미국 특허출원 공개 제2011/0059865 A1호에 제시되어 있으며, 이들 각각은 본 명세서에 참고로 포함되어 있다.
일부 실시형태에서, 고체 지지체는 패턴화된 표면을 포함한다. "패턴화된 표면"은 고체 지지체의 노출된 층 내부 또는 상에서 상이한 영역의 배열을 말한다. 예를 들어, 하나 이상의 영역은 하나 이상의 증폭 프라이머가 존재하는 특징부일 수 있다. 상기 특징부는 증폭 프라이머가 존재하지 않는 간질(interstitial) 영역에 의해 분리될 수 있다. 일부 실시형태에서, 패턴은 행 및 열로 존재하는 특징부의 x-y 형태일 수 있다. 일부 실시형태에서, 패턴은 특징부 및/또는 간질 영역의 반복 배열일 수 있다. 일부 실시형태에서, 패턴은 특징부 및/또는 간질 영역의 무작위 배열일 수 있다. 본 명세서에 제시된 방법 및 조성물에서 사용될 수 있는 예시적인 패턴화된 표면은 미국 특허출원 일련번호 13/661,524 또는 미국 특허출원 공개 제2012/0316086 A1호에 기재되어 있으며, 이들의 각각은 본 명세서에 참고로 포함되어 있다.
일부 실시형태에서, 고체 지지체는 표면의 구멍(well) 또는 오목한 곳(depression)의 배열을 포함한다. 이는, 포토리소그래피, 스탬핑 기법, 성형 기법 및 마이크로에칭(microetching) 기법(이로 한정되지 않음)을 포함한, 다양한 기법을 사용하여 당업계에 일반적으로 공지된 바와 같이 제작될 수 있다. 당업자에 의해 이해될 바와 같이, 사용되는 기법은 배열 기재의 조성 및 형상에 따라 다를 것이다.
패턴화된 표면의 특징부는 유리, 규소, 플라스틱 또는 패턴화되고 공유 결합된 겔, 예컨대 폴리(N-5-아지도아세트아미딜펜틸)아크릴아마이드-코-아크릴아마이드(PAZAM, 예를 들어 미국 가특허출원 제61/753,833호(이는 본 명세서에 참고로 포함되어 있음) 참조)를 가지는 다른 적합한 고체 지지체 상의 웰(예를 들어, 마이크로웰 또는 나노웰)의 어레이 중의 웰일 수 있다. 공정은 다수의 사이클에 의한 서열결정 실행보다 안정적일 수 있는 서열결정에 사용되는 겔 패드를 형성한다. 웰에 대한 중합체의 공유 결합은 다양한 사용 동안 구조화된 기재의 수명 전체에 걸쳐 구조화된 특징부 중에 겔을 유지하는 데 도움이 된다. 그러나, 다수의 실시형태에서, 겔은 웰에 공유 결합될 필요가 없다. 예를 들어, 일부 조건에서 구조화된 기재의 임의의 부분에 공유 부착되지 않은 무실레인 아크릴아마이드(SFA, 예를 들어 미국 특허출원 공개 제2011/0059865 A1호 참조)가 겔 물질로서 사용될 수 있다.
특정 실시형태에서, 구조화된 기재는 웰(예를 들어, 마이크로웰 또는 나노웰)을 이용하여 고체 지지체 물질을 패턴화하고, 패턴화된 지지체를 겔 물질(예를 들어, PAZAM, SFA 또는 이들의 화학적으로 변형된 변이체, 예컨대 SFA의 아지도화 형태(아지도-SFA))로 코팅한 다음, 예를 들어 화학적 또는 기계적 연마를 통해 겔 코팅된 지지체를 연마함으로써 제조될 수 있으며, 이에 의해 겔이 웰 내에 남아있게 하지만 웰 사이의 구조화된 기재의 표면 상의 간질 영역으로부터 실질적으로 모든 겔을 제거하거나 불활성화시킬 수 있다. 프라이머 핵산은 겔 물질에 부착될 수 있다. 그 다음, 개별적인 표적 핵산이 겔 물질에 부착된 프라이머와의 상호작용을 통해 개별적인 웰을 시딩하도록, 표적 핵산(예를 들어, 단편화된 인간 게놈)의 용액을 연마된 기재와 접촉시킬 수 있지만; 표적 핵산은 겔 물질의 부재 또는 불활성으로 인해 간질 영역을 점유하지 않을 것이다. 간질 영역의 겔의 부재 또는 불활성화가 성장 중인 핵산 콜로니의 바깥쪽으로의 이동을 방지하므로, 표적 핵산의 증폭은 웰에 국한될 것이다. 공정은 편리하게 제조가능하고, 확장가능하며 종래의 마이크로- 또는 나노-제작 방법을 이용한다.
증폭 및 클러스터링
예를 들어, 일부 실시형태에서, 고정화된 DNA 단편은 미국 특허 제7,985,565호 및 제7,115,400호(이들 각각의 내용은 본 명세서에 전문이 참고로 포함되어 있음)의 개시내용에 의해 예시되는 바와 같이 클러스터 증폭 방법을 사용하여 증폭된다. 미국 특허 제7,985,565호 및 제7,115,400호의 포함된 자료는 고정화된 핵산 분자의 클러스터 또는 "콜로니"로 구성된 어레이를 형성하기 위하여 증폭 산물이 고체 지지체 상에 고정화될 수 있게 하는 고체상 핵산 증폭 방법을 기재한다. 이와 같은 어레이 상의 각각의 클러스터 또는 콜로니는 복수의 동일한 고정화된 폴리뉴클레오타이드 가닥 및 복수의 동일한 고정화된 상보적 폴리뉴클레오타이드 가닥으로부터 형성된다. 이렇게 형성된 어레이는 일반적으로 본 명세서에서 "클러스터링된 어레이"로 지칭된다. 고체상 증폭 반응의 산물, 예컨대 미국 특허 제7,985,565호 및 제7,115,400호에 기재된 것은 고정화된 폴리뉴클레오타이드 가닥 및 고정화된 상보적 가닥의 쌍의 어닐링에 의해 형성된, 소위 "브릿지화된(bridged)" 구조이며, 상기 2개의 가닥은 모두, 바람직하게는 공유 부착을 통해, 5' 말단에서 고체 지지체 상에 고정화된다. 클러스터 증폭 방법은 고정화된 핵산 주형이 고정화된 앰플리콘을 생성하는 데 사용되는 방법의 예이다. 다른 적합한 방법은 또한 본 명세서에서 제공된 방법에 따라서 생성된 고정화된 DNA 단편으로부터 고정화된 앰플리콘을 생성하는 데 사용될 수 있다. 예를 들어 하나 이상의 클러스터 또는 콜로니는, 증폭 프라이머의 각각의 쌍의 하나 또는 2개의 프라이머가 고정화되어 있는지 여부에 상관없이, 고체상 PCR을 통해 형성될 수 있다.
다른 실시형태에서, 고정화된 DNA 단편은 용액 중에서 증폭된다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 고정화된 DNA 단편은 고체 지지체로부터 절단되거나 다르게는 유리된 다음, 증폭 프라이머는 용액 중에서 유리된 분자에 혼성화된다. 다른 실시형태에서, 증폭 프라이머는 하나 이상의 초기 증폭 단계를 위하여 고정화된 DNA 단편에 혼성화된 다음, 용액 중에서 후속 증폭 단계가 수행된다. 따라서, 일부 실시형태에서, 고정화된 핵산 주형은 용액상 앰플리콘을 생성하는 데 사용될 수 있다.
서열결정 방법
본 명세서에 기재된 방법은 다양한 핵산 서열결정 기법과 함께 사용될 수 있다. 특히 적용가능한 기법은 핵산이 이의 상대 위치가 변하지 않도록 어레이 내의 고정된 위치에서 부착되고, 어레이가 반복적으로 영상화되는 것이다. 예를 들어 하나의 뉴클레오타이드 염기 유형을 다른 것과 구별하는 데 사용되는 상이한 표지와 일치하는 상이한 색상 채널에서 영상이 얻어지는 실시형태가 특히 적용가능하다. 일부 실시형태에서, 표적 핵산의 뉴클레오타이드 서열을 결정하는 공정은 자동화된 공정일 수 있다. 바람직한 실시형태는 합성에 의한 서열결정(sequencing-by-synthesis; "SBS") 기법을 포함한다.
SBS 기법은 일반적으로 주형 가닥에 대한 뉴클레오타이드의 반복 첨가를 통한 초기 핵산 가닥의 효소적 연장을 수반한다. 전통적인 SBS 방법에서, 단일 뉴클레오타이드 단량체는 각각의 전달에서 중합효소의 존재 하에 표적 뉴클레오타이드에 제공될 수 있다. 그러나, 본 명세서에 기재된 방법에서, 하나 초과 유형의 뉴클레오타이드 단량체는 전달에서 중합효소의 존재 하에 표적 핵산에 제공될 수 있다.
SBS는 종결자 모이어티를 가지는 뉴클레오타이드 단량체 또는 임의의 종결자 모이어티가 없는 뉴클레오타이드 단량체를 이용할 수 있다. 종결자가 없는 뉴클레오타이드 단량체를 이용하는 방법은, 하기에 더 상세하게 제시되어 있는 바와 같이, 예를 들어 파이로시퀀싱(pyrosequencing) 및 γ-포스페이트-표지화 뉴클레오타이드를 사용한 서열결정을 포함한다. 종결자가 없는 뉴클레오타이드 단량체를 사용하는 방법에서, 각각의 사이클에 첨가되는 뉴클레오타이드의 수는 일반적으로 가변적이며, 주형 서열 및 뉴클레오타이드 전달 방식에 따라서 다르다. 종결자 모이어티를 가지는 뉴클레오타이드 단량체를 이용하는 SBS 기법에 있어서, 종결자는 다이데옥시뉴클레오타이드를 이용하는 전통적인 생어 서열결정(Sanger sequencing)의 경우와 같이 사용된 서열결정 조건 하에서 효율적으로 비가역적일 수 있거나, 종결자는 솔렉사(Solexa; 현재는 일루미나 인코포레이티드(Illumina, Inc.))에 의해 개발된 서열결정 방법의 경우와 같이 가역적일 수 있다.
SBS 기법은 표지 모이어티를 가지는 뉴클레오타이드 단량체 또는 표지 모이어티가 없는 뉴클레오타이드 단량체를 이용할 수 있다. 따라서, 혼입 사건은 표지의 특징, 예컨대 표지의 형광; 뉴클레오타이드 단량체의 특징, 예컨대 분자량 또는 전하; 뉴클레오타이드 혼입의 부산물, 예컨대 파이로포스페이트의 방출; 등을 기반으로 하여 검출될 수 있다. 실시형태에서, 2가지 이상의 상이한 뉴클레오타이드가 서열결정 시약에 존재하는 경우, 상이한 뉴클레오타이드가 서로 구별될 수 있거나, 대안적으로 2가지 이상의 상이한 표지는 사용되는 검출 기법 하에서 구별될 수 없다. 예를 들어, 서열결정 시약에 존재하는 상이한 뉴클레오타이드는 상이한 표지를 가질 수 있으며, 이들은 솔렉사(현재는 일루미나 인코포레이티드)에 의해 개발된 서열결정 방법에 의해 예시된 바와 같이 적절한 광학을 사용하여 구별될 수 있다.
바람직한 실시형태는 파이로시퀀싱 기법을 포함한다. 파이로시퀀싱은 특정 뉴클레오타이드가 초기 가닥에 혼입됨에 따른 무기 파이로포스페이트(PPi)의 방출을 검출한다(문헌[Ronaghi, M., Karamohamed, S., Pettersson, B., Uhlen, M. and Nyren, P. (1996) "Real-time DNA sequencing using detection of pyrophosphate release." Analytical Biochemistry 242(1), 84-9]; [Ronaghi, M. (2001) "Pyrosequencing sheds light on DNA sequencing." Genome Res. 11(1), 3-11]; [Ronaghi, M., Uhlen, M. and Nyren, P. (1998) "A sequencing method based on real-time pyrophosphate." Science 281(5375), 363]; 미국 특허 제6,210,891호; 미국 특허 제6,258,568호 및 미국 특허 제6,274,320호, 이들의 개시내용은 본 명세서에 전문이 참고로 포함되어 있음). 파이로시퀀싱에서, 방출된 PPi는 ATP 설푸릴라제에 의해 아데노신 트라이포스페이트(ATP)로 즉시 전환됨으로써 검출될 수 있고, 생성된 ATP의 수준은 루시퍼라제-생성 광자를 통해 검출된다. 서열결정된 핵산은 어레이에서 특징부에 부착될 수 있고, 어레이는 영상화되어 어레이의 특징부에서 뉴클레오타이드의 혼입으로 인하여 생성된 화학발광 신호를 캡처할 수 있다. 영상은 어레이가 특정 뉴클레오타이드 유형(예를 들어, A, T, C 또는 G)로 처리된 후에 얻어질 수 있다. 각각의 뉴클레오타이드 유형의 첨가 후 얻은 영상은 어레이에서 어떠한 특징부가 검출되는지와 관련하여 상이할 것이다. 영상에서 이러한 차이는 어레이에 대한 특징부의 상이한 서열 내용을 반영한다. 그러나, 각각의 특징부의 상대적인 위치는 영상에서 변하지 않는 상태로 유지될 것이다. 영상은 본 명세서에 제시된 방법을 사용하여 저장되고, 처리된 다음 분석될 수 있다. 예를 들어, 각각의 상이한 뉴클레오타이드 유형으로 어레이를 처리한 후 얻어진 영상은 가역적 종결자-기반 서열결정 방법을 위한 상이한 검출 채널로부터 얻은 영상에 대하여 본 명세서에 예시된 것과 동일한 방법으로 취급될 수 있다.
SBS의 또 다른 예시적인 유형에서, 순환 서열결정은, 예를 들어 WO 04/018497 및 미국 특허 제7,057,026호(이들의 개시내용은 본 명세서에 참고로 포함되어 있음)에 기재된 바와 같은 절단가능하거나 광표백성의 염료 표지를 함유하는 가역적 종결자 뉴클레오타이드의 단계적 첨가에 의해 달성된다. 이러한 접근법은 솔렉사(현재는 일루미나 인코포레이티드)에 의해 상업화되어 있으며, 이는 또한 WO 91/06678 및 WO 07/123,744(이들 각각은 본 명세서에 참고로 포함되어 있음)에 기재되어 있다. 종결 둘 다가 반전될 수 있고 형광 표지가 절단될 수 있는 형광-표지된 종결자의 이용가능성은 효율적인 순환 가역적 종결(cyclic reversible termination; CRT) 서열결정을 촉진시킨다. 중합효소는 또한 동시-조작되어 효율적으로 혼입되고 이러한 변형된 뉴클레오타이드로부터 연장될 수 있다.
바람직하게, 가역적 종결자-기반 서열결정 실시형태에서, 표지는 SBS 반응 조건 하에서 연장을 실질적으로 억제하지 않는다. 그러나, 검출 표지는, 예를 들어 절단 또는 분해에 의해 제거가능할 수 있다. 영상은 배열된 핵산 특징부 내로 표지의 혼입 후 캡처될 수 있다. 특정 실시형태에서, 각각의 사이클은 어레이에 4가지 상이한 뉴클레오타이드 유형을 동시 전달하는 것을 수반하며, 각각의 뉴클레오타이드 유형은 스펙트럼으로 구별되는 표지를 가진다. 그 다음, 4개의 영상이 얻어질 수 있으며, 각각은 4개의 상이한 표지 중 하나에 대해 선택적인 검출 채널을 사용한다. 대안적으로, 상이한 뉴클레오타이드 유형이 순차적으로 첨가될 수 있으며, 어레이의 영상은 각각의 첨가 단계 사이에 얻어질 수 있다. 이와 같은 실시형태에서, 각각의 영상은 특정 유형의 혼입된 뉴클레오타이드를 가지는 핵산 특징부를 나타낼 것이다. 상이한 특징부는 각각의 특징부의 상이한 서열 내용으로 인하여 상이한 영상에 존재 또는 부재할 것이다. 그러나, 특징부의 상대적인 위치는 영상에서 변하지 않는 상태로 유지될 것이다. 이와 같은 가역적 종결자-SBS 방법으로부터 얻은 영상은 본 명세서에 제시된 바와 같이 저장되고, 처리된 다음 분석될 수 있다. 영상 캡처 단계 후, 표지는 제거될 수 있으며, 가역적 종결자 모이어티는 뉴클레오타이드 첨가 및 검출의 후속 사이클을 위하여 제거될 수 있다. 표지가 특정 사이클에서 검출된 후 그리고 후속 사이클 전 표지의 제거는 배경 신호 및 사이클 사이의 크로스토크를 감소시키는 이점을 제공할 수 있다. 유용한 표지 및 제거 방법의 예는 하기에 제시되어 있다.
특정 실시형태에서, 뉴클레오타이드 단량체의 일부 또는 전부는 가역적 종결자를 포함할 수 있다. 이와 같은 실시형태에서, 가역적 종결자/절단가능한 플루어(fluor)는 3' 에스테르 결합을 통해 리보스 모이어티에 결합된 플루어를 포함할 수 있다(문헌[Metzker, Genome Res. 15:1767-1776 (2005)], 이는 본 명세서에 참고로 포함되어 있음). 다른 접근법은 형광 표지의 절단으로부터 종결자 화학성질을 분리하였다(문헌[Ruparel et al., Proc Natl Acad Sci USA 102: 5932-7 (2005)], 이는 본 명세서에 전문이 참고로 포함되어 있음). 루파렐(Ruparel) 등은 연장을 차단하기 위해 작은 3' 알릴기를 사용하지만, 팔라듐 촉매를 이용한 짧은 처리에 의해 용이하게 차단이 해제될 수 있는 가역적 종결자의 개발을 기재하였다. 긴 파장의 UV 광에의 30초 노출에 의해 용이하게 절단될 수 있는 광절단가능한 링커를 통해 염기에 형광단을 부착시켰다. 따라서, 이황화물 환원 또는 광절단은 절단가능한 링커로서 사용될 수 있다. 가역적 종결에 대한 또 다른 접근법은 dNTP 상의 부피가 큰 염료의 배치 후 뒤따르는 자연적인 종결의 사용이다. dNTP 상의 하전된 부피가 큰 염료의 존재는 입체 장애 및/또는 정전 장애를 통해 효과적인 종결자로서 작용할 수 있다. 하나의 혼입 사건의 존재는 염료가 제거되지 않는 한, 추가 혼입을 방지한다. 염료의 절단은 플루어를 제거하고 종결을 효과적으로 반전시킨다. 변형된 뉴클레오타이드의 예는 또한 미국 특허 제7,427,673호, 및 미국 특허 제7,057,026호에 기재되어 있으며, 이들의 개시내용은 본 명세서에 전문이 참고로 포함되어 있다.
본 명세서에 기재된 방법 및 시스템과 함께 이용될 수 있는 추가적인 예시적 SBS 시스템 및 방법이 미국 특허출원 공개 제2007/0166705호, 미국 특허출원 공개 제2006/0188901호, 미국 특허 제7,057,026호, 미국 특허출원 공개 제2006/0240439호, 미국 특허출원 공개 제2006/0281109호, PCT 공개 WO 05/065814, 미국 특허출원 공개 제2005/0100900호, PCT 공개 WO 06/064199, PCT 공개 WO 07/010,251, 미국 특허출원 공개 제2012/0270305호 및 미국 특허출원 공개 제2013/0260372호에 기재되어 있으며, 이들의 개시내용은 본 명세서에 전문이 참고로 포함되어 있다.
일부 실시형태는 4가지 미만의 상이한 표지를 사용하여 4가지의 상이한 뉴클레오타이드의 검출을 이용할 수 있다. 예를 들어, SBS는 미국 특허출원 공개 제2013/0079232호의 포함된 자료에 기재된 방법 및 시스템을 이용하여 실행될 수 있다. 첫번째 예로서, 한 쌍의 뉴클레오타이드 유형은 동일한 파장에서 검출될 수 있지만, 다른 구성원에 비하여 상기 쌍의 하나의 구성원에 대한 강도의 차이를 기반으로, 또는 (예를 들어, 화학적 변형, 광화학적 변형 또는 물리적 변형을 통해) 쌍의 다른 구성원에 대하여 검출된 신호에 비하여 명백한 신호가 나타나거나 사라지게 하는 쌍의 하나의 구성원에 대한 변화를 기반으로 하여 구별될 수 있다. 두번째 예로서, 4가지의 상이한 뉴클레오타이드 유형 중 3가지가 특정 조건 하에서 검출될 수 있는 반면, 4번째 뉴클레오타이드 유형은 상기 해당 조건 하에서 검출가능한 표지가 없거나, 해당 조건 하에서 최소한으로 검출된다(예를 들어, 배경 형광 등으로 인하여 최소한으로 검출됨). 처음 3가지 뉴클레오타이드 유형의 핵산으로의 혼입은 이들 각각의 신호의 존재를 기반으로 하여 결정될 수 있으며, 4번째 뉴클레오타이드 유형의 핵산으로의 혼입은 임의의 신호의 부재 또는 최소한의 검출을 기반으로 결정될 수 있다. 세번째 예로서, 하나의 뉴클레오타이드 유형은 2가지 상이한 채널에서 검출되는 표지(들)를 포함할 수 있는 반면, 다른 뉴클레오타이드 유형은 단지 하나의 채널에서만 검출된다. 상기 언급한 3가지 예시적인 구성은 상호 배타적인 것으로 고려되지 않으며, 다양한 조합으로 사용될 수 있다. 3가지 예 전부를 조합하는 예시적인 실시형태는, 제1 채널에서 검출되는 제1 뉴클레오타이드 유형(예를 들어, 제1 여기 파장에 의해 여기될 때 제1 채널에서 검출되는 표지를 가지는 dATP), 제2 채널에서 검출되는 제2 뉴클레오타이드 유형(예를 들어, 제2 여기 파장에 의해 여기될 때 제2 채널에서 검출되는 표지를 가지는 dCTP), 제 및 제2 채널 둘 다에서 검출되는 제3 뉴클레오타이드 유형(예를 들어, 제1 및/또는 제2 여기 파장에 의해 여기될 때 채널 둘 다에서 검출되는 적어도 하나의 표지를 가지는 dTTP), 및 어떠한 채널에서도 검출되지 않거나 최소한으로 검출되는 표지가 결여된 제4 뉴클레오타이드 유형(예를 들어, 표지를 가지지 않는 dGTP)을 사용하는 형광-기반 SBS 방법이다.
또한, 미국 특허출원 공개 제2013/0079232호의 포함된 자료에 기재된 바와 같이 서열결정 데이터는 단일 채널을 사용하여 얻어질 수 있다. 이와 같은 소위 1-염료 서열결정 접근법에서, 제1 뉴클레오타이드 유형은 표지화되지만, 표지는 제1 영상이 생성된 후에 제거되며, 제2 뉴클레오타이드 유형은 제1 영상이 생성된 후에만 표지화된다. 제3 뉴클레오타이드 유형은 제1 및 제2 영상 둘 다에서 표지를 유지하고, 제4 뉴클레오타이드 유형은 영상 둘 다에서 표지화되지 않은 상태로 유지된다.
일부 실시형태는 결찰 기법에 의한 서열결정을 이용할 수 있다. 이와 같은 기법은 DNA 리가제를 이용하여 올리고뉴클레오타이드를 혼입시키고 이와 같은 올리고뉴클레오타이드의 혼입을 식별한다. 올리고뉴클레오타이드는 전형적으로 올리고뉴클레오타이드가 혼성화하는 서열 중 특정 뉴클레오타이드의 식별과 상관관계가 있는 상이한 표지를 가진다. 다른 SBS 방법에서처럼, 영상은 표지화 서열결정 시약을 이용하여 핵산 특징부의 어레이를 처리한 후에 얻어질 수 있다. 각각의 영상은 특정 유형의 혼입된 표지를 가지는 핵산 특징부를 나타낼 것이다. 상이한 특징부는 각각의 특징부의 상이한 서열 내용으로 인하여 상이한 영상에 존재하거나 부재할 것이지만, 특징부의 상대적인 위치는 영상에서 변하지 않는 상태로 유지될 것이다. 결찰-기반 서열결정 방법으로부터 얻은 영상은 본 명세서에 제시된 바와 같이, 저장되고, 처리된 다음 분석될 수 있다. 본 명세서에 시재된 방법 및 시스템과 함께 이용될 수 있는 예시적인 SBS 시스템 및 방법은 미국 특허 제6,969,488호, 미국 특허 제6,172,218호, 및 미국 특허 제6,306,597호에 기재되어 있으며, 이들의 개시내용은 본 명세서에 전문이 참고로 포함되어 있다.
일부 실시형태는 나노포어 서열결정을 이용할 수 있다(문헌[Deamer, D. W. & Akeson, M. "Nanopores and nucleic acids: prospects for ultrarapid sequencing." Trends Biotechnol. 18, 147-151 (2000)]; [Deamer, D. and D. Branton, "Characterization of nucleic acids by nanopore analysis". Acc. Chem. Res. 35:817-825 (2002)]; [Li, J., M. Gershow, D. Stein, E. Brandin, and J. A. Golovchenko, "DNA molecules and configurations in a solid-state nanopore microscope" Nat. Mater. 2:611-615 (2003)], 이들의 개시내용은 본 명세서에 전문이 참고로 포함되어 있음). 이와 같은 실시형태에서, 표적 핵산은 나노포어를 통과한다. 나노포어는 합성 기공 또는 생물학적 막 단백질, 예컨대 α-헤모리신일 수 있다. 표적 핵산이 나노포어를 통과함에 따라, 각각의 염기-쌍은 기공의 전기 전도도에서 변동을 측정함으로써 식별될 수 있다(미국 특허 제7,001,792호; 문헌[Soni, G. V. & Meller, "A. Progress toward ultrafast DNA sequencing using solid-state nanopores." Clin. Chem. 53, 1996-2001 (2007)]; [Healy, K. "Nanopore-based single-molecule DNA analysis." Nanomed. 2, 459-481 (2007)]; [Cockroft, S. L., Chu, J., Amorin, M. & Ghadiri, M. R. "A single-molecule nanopore device detects DNA polymerase activity with single-nucleotide resolution." J. Am. Chem. Soc. 130, 818-820 (2008)], 이들의 개시내용은 본 명세서에 전문이 참고로 포함되어 있음). 나노포어 서열결정으로부터 얻은 데이터는 본 명세서에 제시된 바와 같이 저장되고, 처리된 다음 분석될 수 있다. 특히, 데이터는 본 명세서에 제시된 광학 영상 및 다른 영상의 예시적인 처리에 따라서 영상으로서 처리될 수 있다.
일부 실시형태는 DNA 중합효소 활성의 실시간 모니터링을 수반하는 방법을 이용할 수 있다. 뉴클레오타이드 혼입은 예를 들어 미국 특허 제7,329,492호 및 미국 특허 제7,211,414호(이들 각각은 본 명세서에 참고로 포함되어 있음)에 기재된 바와 같이, 형광단-보유 중합효소 및 γ-포스페이트-표지화 뉴클레오타이드 사이의 형광 공명 에너지 전이(fluorescence resonance energy transfer; FRET)를 통하여 검출될 수 있거나, 뉴클레오타이드 혼입은 예를 들어 미국 특허 제7,315,019호(이는 본 명세서에 참고로 포함되어 있음)에 기재된 바와 같이 제로-모드 도파관(zero-mode waveguide)을 이용하여 그리고 예를 들어 미국 특허 제7,405,281제 및 미국 특허출원 공개 제2008/0108082제(이들 각각은 본 명세서에 참고로 포함되어 있음)에 기재된 바와 같은 형광 뉴클레오타이드 유사체 및 조작된 중합효소를 사용하여 검출될 수 있다. 조명은 형광으로 표지화된 뉴클레오타이드의 혼입이 낮은 배경으로 관찰될 수 있도록 표면에 묶인 중합효소 주위의 제토리터 규모(zeptoliter-scale)의 부피로 제한될 수 있다(문헌[Levene, M. J. et al. "Zero-mode waveguides for single-molecule analysis at high concentrations." Science 299, 682-686 (2003)]; [Lundquist, P. M. et al. "Parallel confocal detection of single molecules in real time." Opt. Lett. 33, 1026-1028 (2008)]; [Korlach, J. et al. "Selective aluminum passivation for targeted immobilization of single DNA polymerase molecules in zero-mode waveguide nano structures." Proc. Natl. Acad. Sci. USA 105, 1176-1181 (2008)], 이들 개시내용은 본 명세서에 전문이 참조로 포함되어 있음). 이와 같은 방법으로부터 얻은 영상은 본 명세서에 제시된 바와 같이 저장되고, 처리된 다음 분석될 수 있다.
일부 SBS 실시형태는 뉴클레오타이드의 연장 산물로의 혼입시 방출되는 양성자의 검출을 포함한다. 예를 들어, 방출된 양성자의 검출을 기반으로 한 서열결정은 이온 토렌트(Ion Torrent; 미국 코니티컷주 길퍼드 소재, 라이프 테크놀로지스(Life Technologies) 자회사)로부터 상업적으로 입수가능한 전기 검출기 및 연관 기법 또는 US 2009/0026082 A1; US 2009/0127589 A1; US 2010/0137143 A1; 또는 US 2010/0282617 A1(이들 각각은 본 명세서에 참고로 포함되어 있음)에 기재된 서열결정 방법 및 시스템을 사용할 수 있다. 동역학적 배제를 사용하여 표적 핵산을 증폭하기 위한 본 명세서에 제시된 방법은 양성자를 검출하기 위해 사용되는 기재에 용이하게 적용될 수 있다. 보다 구체적으로, 본 명세서에 제시된 방법은 양성자를 검출하기 위해 사용되는 앰플리콘의 클론 집단을 생성하는 데 사용될 수 있다.
상기 SBS 방법은, 다수의 상이한 표적 핵산이 동시에 조작되도록 다중 형태로 유리하게 수행될 수 있다. 특정 실시형태에서, 상이한 표적 핵산은 특정 기재의 표면 상에서 또는 공통 반응 용기에서 처리될 수 있다. 이는 다중 방식으로 서열결정 시약의 편리한 전달, 미반응 시약의 제거 및 혼입 사건의 검출을 가능하게 한다. 표면-결합 표적 핵산을 사용하는 실시형태에서, 표적 핵산은 어레이 형태일 수 있다. 어레이 형태에서, 표적 핵산은 전형적으로 공간적으로 구별가능한 방식으로 표면에 결합될 수 있다. 표적 핵산은 직접 공유 부착, 비드 또는 다른 입자에의 부착, 또는 중합효소 또는 표면에 부착된 다른 분자에의 결합에 의해 결합될 수 있다. 어레이는 각각의 부위(또는 특징부라 지칭함)에서 표적 핵산의 단일 복사체 또는 각각의 부위 또는 특징부에서 존재할 수 있는 동일한 서열을 가지는 다수 복사체를 포함할 수 있다. 다수 복사체는 증폭 방법, 예컨대 하기에 더 상세히 기재된 바와 같은 브리지 증폭 또는 유탁액 PCR에 의해 생성될 수 있다.
본 명세서에 제시된 방법은, 예를 들어 적어도 약 10개 특징부/㎠, 100개 특징부/㎠, 500개 특징부/㎠, 1,000개 특징부/㎠, 5,000개 특징부/㎠, 10,000개 특징부/㎠, 50,000개 특징부/㎠, 100,000개 특징부/㎠, 1,000,000개 특징부/㎠, 5,000,000개 특징부/㎠, 또는 그 이상을 포함하는, 다양한 밀도 중 어느 하나로 특징부를 가지는 어레이를 사용할 수 있다.
본 명세서에 제시된 방법의 이점은 이들 방법이 복수의 표적 핵산을 동시에 신속하고 효율적으로 검출하는 것을 제공한다는 점이다. 따라서, 본 개시내용은 상기 예시된 것과 같은 당업계에 공지된 기법을 사용하여 핵산을 준비하고 검출할 수 있는 통합 시스템을 제공한다. 따라서, 본 개시내용의 통합 시스템은 증폭 시약 및/또는 서열결정 시약을 하나 이상의 고정화된 DNA 단편으로 전달할 수 있는 유체 성분을 포함할 수 있으며, 시스템은 펌프, 밸브, 저장소, 유체 라인과 같은 구성요소를 포함한다. 유동 세포는 표적 핵산의 검출을 위한 통합 시스템에서 구성되고/구성되거나 사용될 수 있다. 예시적인 유동 세포는, 예를 들어 US 2010/0111768 A1 및 미국 특허출원 제13/273,666호(이들 각각은 본 명세서에 참고로 포함되어 있음)에 기재되어 있다. 유동 세포에 대해 예시된 바와 같이, 통합 시스템의 하나 이상의 유동 성분은 증폭 방법 및 검출 방법에 사용될 수 있다. 예로서 핵산 서열결정 실시형태를 취하면, 통합 시스템의 하나 이상의 유동 성분은 본 명세서에 제시된 증폭 방법 및 상기 예시된 것과 같은 서열결정 방법에서 서열결정 시약의 전달에 사용될 수 있다. 대안적으로, 통합 시스템은 별개의 유동 시스템을 포함하여 증폭 방법을 수행하고 검출 방법을 수행할 수 있다. 증폭된 핵산을 형성하고 또한 핵산 서열을 결정할 수 있는 통합 서열결정 시스템의 예는, 미세크(MiSeq)(상표명) 플랫폼(일루미나 인코포레이티드(Illumina, Inc.), 미국 캘리포니아주 샌디에이고 소재) 및 미국 특허출원 제13/273,666호(이는 본 명세서에 참고로 포함되어 있음)에 기재된 장치를 포함하지만, 이로 한정되지 않는다.
실시예 1
제1 서열결정 사이클을 이용한 증폭 방법의 비교 분석
본 실시예는, 용액 중 프라이머의 첨가가 있거나 없이, 표준 ExAmp 증폭과 부분 변성 조건 하에서 후속 프라이머 절단 사건 및 증폭을 포함하는 다른 방법과의 비교를 기재한다.
표준 단일 판독물 하이세크(HiSeq) 유동 세포(일루미나)를 2 pM의 CT9814 인간 게놈 라이브러리와 함께 시딩하였다. 15분 동안 증폭시키면서 클러스터를 v1 ExAmp(일루미나, PCX1/2/3)에 의해 생성하였다. 레인을 과요오드산염으로 처리하여 다이올 링커를 절단시킴으로써 P5를 선형화시키고, 따라서 P5 프라이머를 완전히 제거하였다. 그 다음, 클러스터를 38℃까지 가열한 다음 일루미나의 v1 ExAmp 시약(레인 2) 또는 ExAmp 시약 및 P5/SBS3 올리고(레인 3)를 이용하여 10분 동안 플러싱함으로써 신호 부스트를 위하여 처리하였다. 레인 1은 더 이상 처리하지 않고 대조군으로 사용하였다(ExAmp 없는 대조군). 유동 세포를 SYBR 그린(Green)(모레큘러 프로브(Molecular Probes), 0.1M 트리스(Tris)/0.1M 아스코브산나트륨 중 1/5000 희석)으로 염색하고 형광 현미경으로 영상화하였다.
도 3의 상부 패널에 나타낸 바와 같이, 대조군 레인 1의 클러스터는 정상 강도를 가지는 정상 클러스터인 반면, 표면 P5 프라이머를 제거하고 ExAmp와 함께 추가 인큐베이션을 실행한 것은 레인 1에 대해 그레이 스케일을 정규화함으로써 강조된 바와 같이(레인 2, 도 3 하부 패널), 더 밝은 클러스터를 생성하는 것으로 나타났다. 레인 3은 그레이스케일 정규화 후 화이트아웃(white-out) 결과에 의해 나타낸 바와 같이 원래의 클러스터로부터 바깥쪽으로 생성하는 추가 증폭을 나타내었다.
따라서, 측방 부스트를 거치는 클러스터는 각각의 클러스터에서 현저하게 더 높은 증폭 산물을 가지는 것으로 보이며, 이는 훨씬 더 강력한 형광 신호를 생성한다.
실시예 2
서열결정 제1 사이클을 이용한 증폭 방법의 비교 분석
상기 실시예 1에 기재된 분석 후, 유동 세포를 제조하여 55C에서 5분 동안 일루미나 혼입 혼합체 IMX(Illumina Incorporation mix IMX) 상에서 서열결정 프라이머를 혼성화하고 플러싱함으로써 서열결정 혼입의 제1 사이클을 수행하였다. 혼입 혼합체는 중합효소, 및 3'-차단 dNTP의 표지화된 혼합체를 포함한다. 일루미나 세척 완충액 PR2로 세척한 후, 0.1M 트리스/0.1M 아스코브산나트륨의 스캔 혼합체를 유동 세포내로 플러싱하고, 도 4에 나타낸 바와 같이 제1 사이클 영상을 형광 현미경 상에서 취하였다. 각각의 레인에서 클러스터의 Cy3 및 Cy5 염색을 정량화함으로써 추가 영상화 분석을 실행하였다. 도 4의 하부 패널에 나타낸 바와 같이, 정량화는, 측방 부스트만이(레인 2) 대조군에 비하여 적어도 2배 더 밝은 클러스터를 생성한다는 것을 나타낸다. 용액 프라이머를 이용한 측방 부스트(레인 3)는 대조군에 비하여 6배 초과로 더 밝은 클러스터를 생성하였다.
본 출원 전반에 걸쳐, 다양한 간행물, 특허 및/또는 특허 출원이 참조되었다. 이들 간행물의 개시내용은 전문이 본 출원에 있어서 본 명세서에 참고로 포함되어 있다.
용어 "포함하는(comprising)"은 열거된 요소만을 포함하는 것이 아닌, 임의의 추가적인 요소를 추가로 포괄하는, 제한을 두지 않는 것으로 본 명세서에서 의도된다.
다수의 실시형태가 기재되어 있다. 그럼에도 불구하고, 다양한 변형이 이루어질 수 있음이 이해될 것이다. 따라서, 다른 실시형태가 하기 청구범위의 범주 내에 속한다.

Claims (13)

  1. 핵산 서열결정 반응을 위한 고정화된 주형을 제조하기 위한 방법으로서,
    (a) 상부에 고정화된 복수의 정방향 및 역방향 증폭 프라이머를 가지는 고체 지지체를 제공하는 단계로서, 상기 복수의 증폭 프라이머의 하위세트는 절단 부위를 포함하는, 상기 고체 지지체를 제공하는 단계;
    (b) 상기 지지체 상의 증폭 프라이머의 하위세트를 사용하여 표적 핵산 주형을 증폭시켜 복수의 이중 가닥 핵산 분자를 제공하는 단계로서, 각각의 이중 가닥 핵산 분자의 모든 가닥은 이들의 5' 말단에서 고체 지지체에 부착되어 있는, 상기 복수의 이중 가닥 핵산 분자를 제공하는 단계;
    (c) 상기 절단 부위에서 상기 증폭 프라이머의 하위세트를 절단하여, 절단된 비-고정화 가닥 및 상보적 고정화 가닥을 포함하는, 선형화된 증폭 산물을 생성하는 단계; 및
    (d) 상기 증폭 산물에 부분-변성 조건을 적용하여 상기 절단된 비-고정화된 가닥의 3' 말단 부분과, 상보적인 고정화된 증폭 프라이머의 혼성화를 촉진시킨 다음, 고정화된 증폭 프라이머를 연장시켜 증폭 산물의 비고정화된 가닥의 고정화된 복사체를 생성하는 단계를 포함하되,
    상기 증폭 프라이머의 하위세트는 정방향 증폭 프라이머 또는 역방향 증폭 프라이머인, 핵산 서열결정 반응을 위한 고정화된 주형을 제조하기 위한 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 부분-변성 조건은 재조합효소/중합효소 증폭 반응의 하나 이상의 성분을 첨가하여 가닥 침투를 촉진하는 것을 포함하는, 핵산 서열결정 반응을 위한 고정화된 주형을 제조하기 위한 방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 부분-변성 조건은 주형에 주형 워킹(walking)을 위한 조건을 적용하는 것을 포함하는, 핵산 서열결정 반응을 위한 고정화된 주형을 제조하기 위한 방법.
  4. 제1항에 있어서, 단계 (d)는 용액 중 프라이머를 적용하여 고정화된 증폭 산물의 비고정화 말단에 프라이머의 혼성화를 촉진시키는 것을 포함하는, 핵산 서열결정 반응을 위한 고정화된 주형을 제조하기 위한 방법.
  5. 제4항에 있어서, 상기 프라이머의 하위세트는 정방향 증폭 프라이머를 포함하고 용액 중 프라이머는 정방향 증폭 프라이머를 포함하는, 핵산 서열결정 반응을 위한 고정화된 주형을 제조하기 위한 방법.
  6. 제4항에 있어서, 상기 프라이머의 하위세트는 역방향 증폭 프라이머를 포함하고 용액 중 프라이머는 역방향 증폭 프라이머를 포함하는, 핵산 서열결정 반응을 위한 고정화된 주형을 제조하기 위한 방법.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 표적 핵산을 서열결정하는 단계를 추가로 포함하는, 핵산 서열결정 반응을 위한 고정화된 주형을 제조하기 위한 방법.
  8. 제7항에 있어서, 상기 표적 핵산을 서열결정하는 단계는,
    하나 이상의 서열결정 프라이머를 고정화된 핵산 가닥에 혼성화시키는 단계;
    하나 이상의 표지화된 뉴클레오타이드를 신생 가닥 내에 혼입시킴으로써 하나 이상의 서열결정 프라이머를 연장하는 단계; 및
    표지화된 뉴클레오타이드를 검출함으로써, 표적 핵산에 관한 서열 정보를 얻는 단계를 포함하는, 핵산 서열결정 반응을 위한 고정화된 주형을 제조하기 위한 방법.
  9. 제1항에 있어서, 상기 고체 지지체는 평면인, 핵산 서열결정 반응을 위한 고정화된 주형을 제조하기 위한 방법.
  10. 제1항에 있어서, 상기 고체 지지체는 마이크로웰을 포함하는, 핵산 서열결정 반응을 위한 고정화된 주형을 제조하기 위한 방법.
  11. 제7항에 있어서, 상기 표적 핵산은 적어도 10, 20, 50, 100, 200 또는 적어도 500개 뉴클레오타이드의 길이를 가지는, 핵산 서열결정 반응을 위한 고정화된 주형을 제조하기 위한 방법.
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