KR101423769B1 - 비-천연 아미노산 및 폴리펩티드를 함유하는 조성물, 그와관련된 방법 및 그의 용도 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 비천연 아미노산 및 하나 이상의 이 비천연 아미노산을 포함하는 폴리펩티드, 및 이러한 비천연 아미노산 및 폴리펩티드를 제조하는 방법에 관한 것이다. 상기 비천연 아미노산은 그 자체로 또는 폴리펩티드의 일부로, 광범위한 잠재적인 작용도를 포함하는데, 특히 하나 이상의 옥심, 카르보닐, 디카르보닐, 및/또는 히드록실아민기를 갖는다. 본 발명은 또한 번역후 더 변형된 비천연 아미노산 폴리펩티드, 이러한 변형을 수행하는 방법, 이러한 폴리펩티드를 정제하는 방법에 관한 것이다. 대체로, 상기 변형된 비천연 아미노산 폴리펩티드는 하나 이상의 옥심, 카르보닐, 디카르보닐, 및/또는 히드록실아민기를 포함한다. 본 발명은 또한 이러한 비천연 아미노산 폴리펩티드 및 변형된 비천연 아미노산 폴리펩티드의, 치료, 진단, 및 기타 생명공학적인 용도를 포함하는 사용 방법에 관한 것이다.
아미노산, 천연, 옥심, 폴리뉴클레오디드

Description

비-천연 아미노산 및 폴리펩티드를 함유하는 조성물, 그와 관련된 방법 및 그의 용도{COMPOSITIONS CONTAINING, METHODS INVOLVING, AND USES OF NON-NATURAL AMINO ACIDS AND POLYPEPTIDES}
-관련 출원-
이 출원은 2004년 12월 22일자 미합중국 가출원 제60/638,418호, 2004년 12월 22일자 미합중국 가출원 제60/638,527호, 2005년 7월 1일자 미합중국 가출원 제60/696,302호, 및 2005년 7월 1일자 미합중국 가출원 제60/696,068호의 이익을 향유하며, 이들 출원의 전문이 본 명세서에 포함된다.
단백질 내로 비-유전적으로 코딩되는 아미노산 (즉, "비-천연 아미노산")을 삽입하는 능력은 리신의 엡실론 -NH2, 시스테인의 술프히드릴 -SH, 히스티딘의 이미노기와 같은 천연 관능기의 가치있는 대체 수단을 제공할 수 있는 화학적 관능기를 도입할 수 있게 한다. 특정 화학적 관능기는 20가지 통상의 유전적으로 코딩되는 아미노산에 불활성이지만 비-천연 아미노산 상으로 도입될 수 있는 관능기와 반응하여 깨끗하고 효율적으로 안정한 결합을 형성하는 것으로 알려져 있다.
단백질에서 발견되지 않고, 20가지 통상의 유전적으로 코딩되는 아미노산에서 발견되는 모든 관능기에 화학적으로 불활성이며, 특정 관능기를 포함하는 물질 과 효율적 및 선택적으로 반응하여 안정한 공유 결합을 형성하는데 사용될 수 있는 화학적 관능기를 선택적으로 도입하는 방법이 현재 이용되고 있다.
-본 발명의 요약-
본 명세서에는 비-천연 아미노산, 비-천연 아미노산 폴리펩티드 및 변형된 비-천연 아미노산 폴리펩티드의 방법, 조성물, 그들을 제조, 정제, 특성화 및 사용하는 기술 및 전략이 기재되어 있다. 하나의 측면은 비-천연 아미노산 및 비-천연 아미노산 폴리펩티드의 방법, 조성물, 및 그들의 유도 방법이다. 하나의 실시태양에서, 그와 같은 방법, 조성물, 기술 및 전략은 화학적 유도를 포함하고, 다른 실시태양에서는 생물학적 유도를, 다른 실시태양에서는 물리적 유도를, 또 다른 실시태양에서는 그러한 유도의 조합을 포함한다. 또 다른 또는 추가의 실시태양에서, 그와 같은 유도는 레지오선택성이다. 또 다른 또는 추가의 실시태양에서, 그와 같은 유도는 실온에서 신속하게 일어난다. 또 다른 또는 추가의 실시태양에서, 그와 같은 유도는 수용액 중에서 일어난다. 또 다른 또는 추가의 실시태양에서, 그와 같은 유도는 pH 약 4 내지 약 10 사이에서 일어난다. 또 다른 또는 추가의 실시태양에서, 그와 같은 유도는 가속화제의 첨가 하에 유도체가 비-천연 아미노산 함유 화합물 및 유도 화합물과 관련하여 화학양론적으로, 거의 화학양론적으로 또는 화학양론-유사하게 일어난다. 또 다른 또는 추가의 실시태양에서, 가속화제의 첨가 하에목적하는 기를 비-천연 아미노산 폴리펩티드 상으로 화학양론적으로, 거의 화학양론적으로 또는 화학양론-유사하게 도입시키는 방법이 제공된다. 또 다른 또는 추가의 실시태양에서, 가속화제의 첨가 하에 목적하는 기를 비-천연 아미노산 폴리 펩티드 상으로 화학양론적으로, 거의 화학양론적으로 또는 화학양론-유사하게 도입시키는 전략, 반응 혼합물, 합성 조건이 제공된다.
하나의 측면에서, 옥심-결합에 기초하여 펩티드 및 단백질을 화학적으로 유도하기 위한 비-천연 아미노산이 제공된다. 또 다른 또는 추가의 실시태양에서, 비-천연 아미노산은 폴리펩티드 내로 삽입되며, 이와 같은 실시태양은 비-천연 아미노산 폴리펩티드이다. 또 다른 또는 추가의 실시태양에서, 비-천연 아미노산은 유도화 분자와 반응하여 옥심 결합을 생성하도록 그들의 측쇄에서 관능화된다. 또 다른 또는 추가의 실시태양은 유도화 분자와 반응하여 옥심-함유 비-천연 아미노산 폴리펩티드를 생성할 수 있는 비-천연 아미노산 폴리펩티드이다. 또 다른 또는 추가의 실시태양에서, 비-천연 아미노산은 카르보닐, 디카르보닐, 아세탈, 히드록실아민 또는 옥심 측쇄를 갖는 아미노산으로부터 선택되는 비-천연 아미노산이다. 또 다른 또는 추가의 실시태양에서, 비-천연 아미노산은 보호된 또는 차폐된 카르보닐, 디카르보닐, 히드록실아민 또는 옥심 측쇄를 갖는 아미노산으로부터 선택되는 비-천연 아미노산이다. 또 다른 또는 추가의 실시태양에서, 비-천연 아미노산은 옥심-차폐된 측쇄를 포함한다. 또 다른 또는 추가의 실시태양에서, 비-천연 아미노산은 케톤 또는 알데히드로부터 선택되는 카르보닐 또는 디카르보닐 측쇄를 포함한다. 또 다른 실시태양은 적절히 관능화된 공-반응물로 처리할 때 옥심을 형성할 수 있는 관능기를 함유하는 비-천연 아미노산이다. 또 다른 또는 추가의 실시태양에서, 비-천연 아미노산은 구조에 있어서는 천연 아미노산과 유사하지만 상기한 관능기 중의 하나를 함유한다. 또 다른 또는 추가의 실시태양에서, 비-천연 아 미노산은 페닐알라닌 또는 티로신 (방향족 아미노산)과 유사하고; 다른 실시태양에서 비-천연 아미노산은 알라닌 또는 류신 (소수성 아미노산)과 유사하다. 하나의 실시태양에서, 비-천연 아미노산은 천연 아미노산의 특성과 구별되는 특성을 갖는다. 하나의 실시태양에서, 그와 같은 구별되는 특성은 측쇄의 화학적 반응성이고, 또 다른 실시태양에서 구별되는 화학적 반응성은 동일 폴리펩티드 내의 천연 아미노산 단위의 측쇄는 반응을 하지 않음에도 불구하고 비-천연 아미노산 단위의 측쇄는 폴리펩티드의 단위로 있으면서 반응을 하게하는 특성이다. 또 다른 실시태양에서, 비-천연 아미노산의 측쇄는 천연 아미노산의 측쇄에 오르쏘고날한 화학적 특성을 갖는다. 또 다른 실시태양에서, 비-천연 아미노산의 측쇄는 친전자체-함유 잔기를 포함하며, 또 다른 실시태양에서 비-천연 아미노산 측쇄 상의 그와 같은 친전자체-함유 잔기는 친핵 공격하여 옥심-유도된 단백질을 생성할 수 있다. 상기 어떠한 실시태양에서나, 비-천연 아미노산은 개별적인 분자로서 존재하거나 또는 임의의 길이의 폴리펩티드 내로 삽입될 수 있으며, 삽입되는 경우, 폴리펩티드는 다른 천연 또는 비-천연 아미노산을 포함할 수 있다.
또 다른 측면에서, 옥심-결합에 기초하여 유도된 비-천연 아미노산 폴리펩티드를 제조하기 위한 히드록실아민-치환된 분자가 제공된다. 또 다른 실시태양에서, 유도화 분자 및 카르보닐- 또는 디카르보닐-함유 비-천연 아미노산 폴리펩티드 사이의 옥심-결합을 통하여 카르보닐- 또는 디카르보닐-함유 비-천연 아미노산 폴리펩티드를 유도하는데 사용되는 히드록실아민-치환된 분자가 제공된다. 또 다른 실시태양에서, 상기 카르보닐- 또는 디카르보닐-함유 비-천연 아미노산 폴리펩티드 는 케토-함유 비-천연 아미노산 폴리펩티드이다. 또 다른 또는 추가의 실시태양에서, 카르보닐- 또는 디카르보닐-함유 비-천연 아미노산은 케톤 또는 알데히드로부터 선택되는 측쇄를 포함한다. 또 다른 또는 추가의 실시태양에서, 히드록실아민-치환된 분자는 표지, 염료, 중합체, 수용성 중합체, 폴리에틸렌 글리콜 유도체, 광가교결합제, 세포독성 화합물, 약물, 친화도 표지, 광친화도 표지, 반응성 화합물, 수지, 제2의 단백질 또는 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 유사체, 항체 또는 항체 단편, 금속 킬레이트제, 조인자, 지방산, 탄수화물, 폴리뉴클레오티드, DNA, RNA, 안티센스 폴리뉴클레오티드, 사카라이드, 수용성 덴드리머, 시클로덱스트린, 생물질, 나노입자, 스핀 표지, 형광물질, 금속-함유 잔기, 방사성 잔기, 신규 관능기, 다른 분자와 공유적으로 또는 비공유적으로 상호작용하는 기, 포토케이지드 잔기, 화학선 여기가능한 잔기, 리간드, 광이성화성 잔기, 비오틴, 비오틴 유사체, 중량급 원자를 포함하는 잔기, 화학적으로 절단가능한 기, 광-절단가능한 기, 신장된 측쇄, 탄소-결합 당, 산화환원 활성제, 아미노 티오산, 독성 잔기, 동위원소 표지된 잔기, 생물리학적 프로브, 인광 기, 화학발광 기, 전자밀도가 높은 기, 자성 기, 인터캘레이팅 기, 발색단, 에너지 전달기, 생물학적 활성제, 검출가능한 표지, 소분자, 억제성 리보핵산, 방사성 핵종, 중성자 포획제, 비오틴 유도체, 콴텀 도트, 나노트랜스미터, 라디오트랜스미터, 아브자임, 활성화된 복합 활성화제, 바이러스, 보조제, 아글리칸, 알러간, 안지오스타틴, 항호르몬, 항산화제, 압타머, 가이드 RNA, 사포닌, 셔틀 벡터, 거대 분자, 미모토우프, 수용체, 역상 미셀 및 그들의 조합으로부터 선택되는 기를 포함한다. 또 다른 또는 추가의 실시태양에서, 히드록 실아민-치환된 분자는 히드록실아민-치환된 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 분자이다. 또 다른 실시태양에서, 비-천연 아미노산의 측쇄는 비-천연 아미노산이 히드록실아민-치환된 분자와 선택적으로 반응하게 하는, 천연 아미노산의 측쇄에 오르쏘고날한 화학적 특성을 갖는다. 또 다른 실시태양에서, 비-천연 아미노산의 측쇄는 히드록실아민-함유 분자와 선택적으로 반응하는 친전자체-함유 잔기를 포함하며, 또 다른 실시태양에서 비-천연 아미노산 측쇄 상의 친전자체-함유 잔기는 친핵 공격하여 옥심-유도된 단백질을 생성할 수 있다. 또 다른 측면에서, 이 문단에 기재된 실시태양과 관련하여 유도화 분자를 비-천연 아미노산 폴리펩티드와 반응시켜 얻는 변형된 비-천연 아미노산 폴리펩티드가 제공된다. 또 다른 실시태양은 이미 변형된 비-천연 아미노산 폴리펩티드를 추가로 변형시킨 것을 포함한다.
또 다른 측면에서, 옥심-결합에 기초하여 유도된 비-천연 아미노산 폴리펩티드를 생성하기 위한 카르보닐- 또는 디카르보닐-치환된 분자가 제공된다. 또 다른 실시태양에서, 유도화 분자 및 옥심-함유 펩티드 또는 단백질 사이에서 옥심-교환 반응을 통해 옥심-함유 비-천연 아미노산 폴리펩티드를 유도하는데 사용되는 카르보닐- 또는 디카르보닐-치환된 분자가 제공된다. 또 다른 실시태양에서, 카르보닐- 또는 디카르보닐-치환된 분자는 pH 약 4 내지 약 8의 범위에서 옥심-함유 비-천연 아미노산 폴리펩티드와 옥심 교환 반응을 할 수 있다. 또 다른 실시태양에서, 유도화 분자 및 옥심-함유 (교환형 반응으로 새로운 옥심 결합을 형성함) 또는 히드록실아민-함유 비-천연 아미노산 폴리펩티드 사이에서 옥심 결합의 형성을 통하여 옥심-함유 또는 히드록실아민-함유 비-천연 아미노산 폴리펩티드를 유도하는데 사용되는 카르보닐- 또는 디카르보닐-치환된 분자가 제공된다. 또 다른 실시태양에서, 카르보닐- 또는 디카르보닐-치환된 분자는 알데히드 치환된 분자이다. 또 다른 실시태양에서, 카르보닐- 또는 디카르보닐-치환된 분자는 표지, 염료, 중합체, 수용성 중합체, 폴리에틸렌 글리콜 유도체, 광가교결합제, 세포독성 화합물, 약물, 친화도 표지, 광친화도 표지, 반응성 화합물, 수지, 제2의 단백질 또는 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 유사체, 항체 또는 항체 단편, 금속 킬레이트제, 조인자, 지방산, 탄수화물, 폴리뉴클레오티드, DNA, RNA, 안티센스 폴리뉴클레오티드, 사카라이드, 수용성 덴드리머, 시클로덱스트린, 생물질, 나노입자, 스핀 표지, 형광물질, 금속-함유 잔기, 방사성 잔기, 신규 관능기, 다른 분자와 공유적으로 또는 비공유적으로 상호작용하는 기, 포토케이지드 잔기, 화학선 여기가능한 잔기, 리간드, 광이성화성 잔기, 비오틴, 비오틴 유사체, 중량급 원자를 포함하는 잔기, 화학적으로 절단가능한 기, 광-절단가능한 기, 신장된 측쇄, 탄소-결합 당, 산화환원 활성제, 아미노 티오산, 독성 잔기, 동위원소 표지된 잔기, 생물리학적 프로브, 인광 기, 화학발광 기, 전자밀도가 높은 기, 자성 기, 인터캘레이팅 기, 발색단, 에너지 전달기, 생물학적 활성제, 검출가능한 표지, 소분자, 억제성 리보핵산, 방사성 핵종, 중성자 포획제, 비오틴 유도체, 콴텀 도트, 나노트랜스미터, 라디오트랜스미터, 아브자임, 활성화된 복합 활성화제, 바이러스, 보조제, 아글리칸, 알러간, 안지오스타틴, 항호르몬, 항산화제, 압타머, 가이드 RNA, 사포닌, 셔틀 벡터, 거대 분자, 미모토우프, 수용체, 역상 미셀 및 그들의 조합으로부터 선택되는 기를 포함한다. 또 다른 또는 추가의 실시태양에서, 알데히드-치환된 분자는 알데히드-치환 된 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 분자이다. 또 다른 실시태양에서, 비-천연 아미노산의 측쇄는 비-천연 아미노산이 카르보닐- 또는 디카르보닐-치환된 분자와 선택적으로 반응하게 하는, 천연 아미노산의 측쇄에 오르쏘고날한 화학적 특성을 갖는다. 또 다른 실시태양에서, 비-천연 아미노산의 측쇄는 카르보닐- 또는 디카르보닐-치환된 분자와 선택적으로 반응하는 잔기, 예컨대, 옥심 또는 히드록실아민 기를 포함하며, 또 다른 실시태양에서, 비-천연 아미노산 측쇄 상의 친핵성 잔기는 친전자 공격하여 옥심-유도된 단백질을 생성할 수 있다. 또 다른 측면에서, 이 문단에 기재된 실시태양과 관련하여 유도화 분자를 비-천연 아미노산 폴리펩티드와 반응시켜 얻는 변형된 비-천연 아미노산 폴리펩티드가 제공된다. 또 다른 실시태양은 이미 변형된 비-천연 아미노산 폴리펩티드를 추가로 변형시킨 것을 포함한다.
또 다른 측면에서, 옥심-결합에 기초하여 유도된 비-천연 아미노산 폴리펩티드의 생성을 위한 일-, 이- 및 다-관능성 링커가 제공된다. 하나의 실시태양에서, 분자 링커 (이- 및 다-관능성)를 사용하여 카르보닐- 또는 디카르보닐-함유 비-천연 아미노산 폴리펩티드를 다른 분자에 연결시킬 수 있다. 또 다른 실시태양에서, 분자 링커 (이- 및 다-관능성)를 사용하여 옥심- 또는 히드록실아민-함유 비-천연 아미노산 폴리펩티드를 다른 분자에 연결시킬 수 있다. 다른 실시태양에서, 카르보닐- 또는 디카르보닐-함유 비-천연 아미노산 폴리펩티드는 케톤 및(또는) 알데히드 측쇄를 포함한다. 옥심- 또는 히드록실아민-함유 비-천연 아미노산 폴리펩티드를 사용하는 실시태양에서, 분자 링커는 그의 말단 중 하나에 카르보닐 또는 디카르보닐 기를 함유하며, 또 다른 실시태양에서 카르보닐 또는 디카르보닐 기는 알데 히드 기 또는 케톤 기로부터 선택된다. 또 다른 또는 추가의 실시태양에서, 히드록실아민-치환된 링커 분자는 히드록실아민-치환된 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 링커 분자이다. 또 다른 또는 추가의 실시태양에서, 카르보닐- 또는 디카르보닐-치환된 링커 분자는 카르보닐- 또는 디카르보닐-치환된 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 링커 분자이다. 또 다른 실시태양에서, "다른 분자"란 단지 예시적인 의미에서 단백질, 다른 중합체 및 소분자를 포함한다. 또 다른 또는 추가의 실시태양에서, 히드록실아민-함유 분자 링커는 카르보닐- 또는 디카르보닐-함유 비-천연 아미노산 폴리펩티드와의 반응시에 카르보닐- 또는 디카르보닐-함유 비-천연 아미노산 폴리펩티드의 호모다합체가 생성되도록 모든 말단에서 동일 또는 대등한 기를 포함한다. 또 다른 실시태양에서, 카르보닐- 또는 디카르보닐-함유 분자 링커는 옥심- 또는 히드록실아민-함유 비-천연 아미노산 폴리펩티드와의 반응시에 옥심- 또는 히드록실아민-함유 비-천연 아미노산 폴리펩티드의 호모다합체가 생성되도록 모든 말단에서 동일 또는 대등한 기를 포함한다. 또 다른 실시태양에서, 호모다합체는 호모이합체이다. 또 다른 실시태양에서, 비-천연 아미노산의 측쇄는 비-천연 아미노산이 히드록실아민-치환된 링커 분자와 선택적으로 반응하게 하는, 천연 아미노산의 측쇄에 오르쏘고날한 화학적 특성을 갖는다. 또 다른 실시태양에서, 비-천연 아미노산의 측쇄는 비-천연 아미노산이 카르보닐- 또는 디카르보닐-치환된 링커 분자와 선택적으로 반응하게 하는, 천연 아미노산의 측쇄에 오르쏘고날한 화학적 특성을 갖는다. 또 다른 실시태양에서, 비-천연 아미노산의 측쇄는 히드록실아민-함유 링커 분자와 선택적으로 반응하는 친전자체-함유 잔기를 포함하며, 또 다른 실시태양 에서 비-천연 아미노산 측쇄 상의 친전자체-함유 잔기는 히드록실아민-함유 링커 분자에 의한 친핵성 공격을 받아 옥심-유도된 단백질을 생성한다. 또 다른 측면에서, 상기 실시태양과 관련하여 링커 분자와 비-천연 아미노산 폴리펩티드로부터 얻어지는 "변형 또는 비변형된" 비-천연 아미노산 폴리펩티드가 제공된다. 또 다른 실시태양은 이미 변형된 비-천연 아미노산 폴리펩티드를 추가로 변형시킨 것을 포함한다.
하나의 측면은, 카르보닐 또는 디카르보닐과 히드록실아민 반응물의 축합을 통하여 옥심-기초 생성물을 생성함으로써 단백질을 유도하는 방법이다. 여기에는 카르보닐- 또는 디카르보닐- 및 히드록실아민- 반응물의 축합에 기초하여 옥심-유도 단백질 부가물을 생성하는 단백질의 유도 방법이 포함된다. 또 다른 또는 추가의 실시태양은 케토-함유 단백질을 히드록실아민-관능화된 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 분자로 유도하는 방법이다. 또 다른 추가의 실시태양은 카르보닐- 또는 디카르보닐-함유 유도화 분자와 옥심-함유 펩티드 또는 단백질 사이의 옥심 교환 반응을 통하여 옥심-함유 단백질을 유도하는 방법이다. 추가의 또는 또 다른 실시태양에서, 히드록실아민-치환된 분자는 단백질 또는 다른 중합체, 및 소분자를 포함할 수 있다.
또 다른 측면으로서, 케토-치환된 단백질을 유도하기 위하여 히드록실아민-치환된 분자를 화학적으로 합성하는 방법이 제공된다. 또 다른 측면에서, 알데히드-치환된 단백질을 유도하기 위하여 히드록실아민-치환된 분자를 화학적으로 합성하는 방법이 제공된다. 하나의 실시태양에서,히드록실아민-치환된 분자는 펩티드, 다른 중합체(비-분지 및 분지) 및 소분자를 포함한다. 하나의 실시태양으로서, 카르보닐- 또는 디카르보닐-함유 비-천연 아미노산 폴리펩티드, 예컨대, 케토-함유 비-천연 아미노산 폴리펩티드를 유도하기 위하여 적절한 히드록실아민-치환된 분자의 제조 방법이 제공된다. 또 다른 또는 추가의 실시태양에서, 비-천연 아미노산은 단백질의 생체내 번역시에 위치-특이적으로 삽입된다. 또 다른 또는 추가의 실시태양에서, 히드록실아민-치환된 분자는 카르보닐- 또는 디카르보닐 기를 친핵 공격하여 옥심-유도된 폴리펩티드를 위치-특이적 방식으로 형성하는 것을 통하여 카르보닐- 또는 디카르보닐-함유 비-천연 아미노산의 위치-특이적 유도를 가능하게 한다. 또 다른 또는 추가의 실시태양에서, 히드록실아민-치환된 분자의 제조 방법은 아주 다양한 위치-특이적으로 유도된 폴리펩티드를 얻게 한다. 또 다른 또는 추가의 실시태양은 히드록실아민-관능화된 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 분자를 합성하는 방법이다.
다른 측면에서, 옥심-치환된 비-천연 아미노산 폴리펩티드를 유도하기 위하여 카르보닐- 또는 디카르보닐-치환된 분자를 화학적으로 합성하는 방법이 제공된다. 하나의 실시태양에서, 카르보닐- 또는 디카르보닐-치환된 분자는 케토-치환된 분자이다. 하나의 실시태양에서, 카르보닐- 또는 디카르보닐-치환된 분자는 알데히드-치환된 분자이다. 다른 실시태양에서, 카르보닐- 또는 디카르보닐-치환된 분자는 단백질, 중합체(비-분지 및 분지 중합체) 및 소분자를 포함한다. 또 다른 또는 추가의 실시태양에서, 그와 같은 방법은 단백질의 생체내 번역 동안 비-천연 아미노산의 위치-특이적 삽입을 가능하게 하는 기술을 보조한다. 또 다른 또는 추가 의 실시태양에서, 옥심-함유 비-천연 아미노산 폴리펩티드와 반응하여 위치-특이적 으로 유도된 비-천연 아미노산 폴리펩티드를 제공하기에 적절한 카르보닐- 또는 디카르보닐-치환된 분자를 제조하는 방법이 제공된다. 또 다른 또는 추가의 실시태양은 카르보닐- 또는 디카르보닐-치환된 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 분자를 합성하는 방법이다.
또 다른 측면에서, 카르보닐- 또는 디카르보닐-치환된 비-천연 아미노산 폴리펩티드를 히드록실아민-함유 이관능성 링커를 사용하여 화학적으로 유도하는 방법이 제공된다. 하나의 실시태양은 옥심 결합을 형성시키는 축합 반응을 통해 히드록실아민-치환된 링커를 카르보닐- 또는 디카르보닐-치환된 단백질에 부착시키는 방법이다. 또 다른 또는 추가의 실시태양에서, 카르보닐- 또는 디카르보닐-치환된 비-천연 아미노산은 케토-치환된 비-천연 아미노산이다. 또 다른 또는 추가의 실시태양에서, 비-천연 아미노산 폴리펩티드는 히드록실아민-함유 이관능성 링커를 사용하여 위치-특이적으로 및(또는) 삼차원 구조의 정확한 제어하에 유도된다. 하나의 실시태양에서, 그와 같은 방법은 카르보닐- 또는 디카르보닐-함유 비-천연 아미노산 폴리펩티드 (케토-함유 및 알데히드-함유 종을 포함하나 이에 국한되는 것은 아님)에 분자 링커 (일-, 이- 및 다-관능성 링커를 포함하나, 이에 국한되는 것은 아님)를 부착시키는데 사용되며, 이때 링커 말단 중의 적어도 하나는 옥심 결합을 통해 카르보닐- 또는 디카르보닐-함유 비-천연 아미노산 폴리펩티드에 결합할 수 있는 히드록실아민 기를 함유한다. 또 다른 또는 추가의 실시태양에서, 이들 링커는 카르보닐- 또는 디카르보닐-함유 비-천연 아미노산 폴리펩티드를 다른 분 자, 예컨대, 단백질, 중합체(비-분지 및 분지 중합체) 및 소분자에 연결시키는데 사용된다.
일부 실시태양에서, 비-천연 아미노산 폴리펩티드는 수용성 중합체에 연결된다. 일부 실시태양에서, 수용성 중합체는 폴리에틸렌 글리콜 잔기를 포함한다. 일부 실시태양에서, 폴리에틸렌 글리콜 분자는 이관능성 중합체이다. 일부 실시태양에서, 이관능성 중합체는 제2의 폴리펩티드에 연결된다. 일부 실시태양에서, 제2의 폴리펩티드는 제1의 폴리펩티드와 동일하고, 다른 실시태양에서 제2의 폴리펩티드는 제1의 폴리펩티드와 상이하다. 일부 실시태양에서, 비-천연 아미노산 폴리펩티드는 폴리(에틸렌 글리콜) 잔기를 포함하는 수용성 중합체에 결합된 두 개 이상의 아미노산을 포함한다.
일부 실시태양에서, 비-천연 아미노산 폴리펩티드는 수용체에 대한 비-천연 아미노산 폴리펩티드의 친화도를 증가시키는 치환, 부가 또는 결실을 포함한다. 일부 실시태양에서, 비-천연 아미노산 폴리펩티드는 비-천연 아미노산 폴리펩티드의 안정성을 증가시키는 치환, 부가 또는 결실을 포함한다. 일부 실시태양에서, 비-천연 아미노산 폴리펩티드는 비-천연 아미노산 폴리펩티드의 수용해도를 증가시키는 치환, 부가 또는 결실을 포함한다. 일부 실시태양에서, 비-천연 아미노산 폴리펩티드는 생성된 비-천연 아미노산 폴리펩티드의 숙주 세포 내에서의 용해성을 증가시키는 치환, 부가 또는 결실을 포함한다. 일부 실시태양에서, 비-천연 아미노산 폴리펩티드는 치환, 부가 또는 결실이 없는 아미노산 폴리펩티드에 비하여 프로테아제 내성, 혈청 반감기, 면역원성 및(또는) 발현을 조절하는 치환, 부가 또는 결실을 포함한다.
일부 실시태양에서, 비-천연 아미노산 폴리펩티드는 효능제, 부분적 효능제, 길항제, 부분적 길항제 또는 역효능제이다. 일부 실시태양에서, 효능제, 부분적 효능제, 길항제, 부분적 길항제 또는 역효능제는 수용성 중합체에 결합된 비-천연 아미노산을 포함한다. 일부 실시태양에서, 수용성 중합체는 폴리에틸렌 글리콜 잔기를 포함한다. 일부 실시태양에서, 수용성 중합체에 결합된 비-천연 아미노산을 포함하는 폴리펩티드는, 예를 들어, 상응하는 수용체의 이합체화를 방지할 수 있다. 일부 실시태양에서, 수용성 중합체에 결합된 비-천연 아미노산을 포함하는 폴리펩티드는 폴리펩티드가 결합 파트너, 리간드 또는 수용체에 결합하는 것을 조절한다. 일부 실시태양에서, 수용성 중합체에 결합된 비-천연 아미노산을 포함하는 폴리펩티드는 폴리펩티드의 하나 이상의 특성 또는 활성을 조절한다.
일부 실시태양에서, 셀렉터 코돈은 암버 코돈, 오커 코돈, 오팔 코돈, 독특한 코돈, 희귀 코돈, 비천연 코돈, 5-염기 코돈 및 4-염기 코돈으로 구성되는 군으로부터 선택된다.
본 명세서에는 또한 수용성 중합체에 결합된 비-천연 아미노산 폴리펩티드의 제조 방법이 기재되어 있다. 일부 실시태양에서, 그와 같은 방법은 비-천연 아미노산을 포함하는 단리된 폴리펩티드를 비-천연 아미노산과 반응하는 잔기를 포함하는 수용성 중합체와 접촉시키는 것을 포함한다. 일부 실시태양에서, 삽입되는 비-천연 아미노산은 20종의 통상의 아미노산 중 어느 것과도 반응성이지 않은 수용성 중합체에 반응성이다. 일부 실시태양에서, 수용성 중합체는 폴리에틸렌 글리콜 잔 기를 포함한다. 중합체의 분자량은 광범위할 수 있고, 약 100 Da 내지 약 100,000 Da 또는 그 이상일 수 있으나, 이에 국한되는 것은 아니다. 중합체의 분자량은 약 100 Da 내지 약 100,000 Da 사이이며, 100,000 Da, 95,000 Da, 90,000 Da, 85,000 Da, 80,000 Da, 75,000 Da, 70,000 Da, 65,000 Da, 60,000 Da, 55,000 Da, 50,000 Da, 45,000 Da, 40,000 Da, 35,000 Da, 30,000 Da, 25,000 Da, 20,000 Da, 15,000 Da, 10,000 Da, 9,000 Da, 8,000 Da, 7,000 Da, 6,000 Da, 5,000 Da, 4,000 Da, 3,000 Da, 2,000 Da, 1,000 Da, 900 Da, 800 Da, 700 Da, 600 Da, 500 Da, 400 Da, 300 Da, 200 Da 및 100 Da을 포함하나, 이에 국한되는 것은 아니다. 일부 실시태양에서, 중합체의 분자량은 약 100 Da 내지 50,000 Da이다. 일부 실시태양에서, 중합체의 분자량은 약 100 Da 내지 40,000 Da이다. 일부 실시태양에서, 중합체의 분자량은 약 5,000 Da 내지 40,000 Da이다. 일부 실시태양에서, 중합체의 분자량은 약 10,000 Da 내지 40,000 Da이다. 일부 실시태양에서, 폴리에틸렌 글리콜 분자는 분지된 중합체이다. 분지쇄 PEG의 분자량은 약 1,000 Da 내지 약 100,000 Da이고, 100,000 Da, 95,000 Da, 90,000 Da, 85,000 Da, 80,000 Da, 75,000 Da, 70,000 Da, 65,000 Da, 60,000 Da, 55,000 Da, 50,000 Da, 45,000 Da, 40,000 Da, 35,000 Da, 30,000 Da, 25,000 Da, 20,000 Da, 15,000 Da, 10,000 Da, 9,000 Da, 8,000 Da, 7,000 Da, 6,000 Da, 5,000 Da, 4,000 Da, 3,000 Da, 2,000 Da 및 1,000 Da을 포함하나, 이에 국한되는 것은 아니다. 일부 실시태양에서, 분지된 PEG의 분자량은 약 1,000 Da 내지 50,000 Da이다. 일부 실시태양에서, 분지쇄 PEG의 분자량은 약 1,000 Da 내지 40,000 Da이다. 일부 실시태양에서, 분지쇄 PEG의 분자량 은 약 5,000 Da 내지 40,000 Da이다. 일부 실시태양에서, 분지쇄 PEG 의 분자량은 약 5,000 Da 내지 20,000 Da이다.
본 발명은 또한 본 명세서에서 기재된 적어도 하나의 비-천연 아미노산을 포함하는 폴리펩티드 및 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 조성물에 관한 것이다. 일부 실시태양에서, 비-천연 아미노산은 수용성 중합체에 결합되어 있다. 또한, 약제학적으로 허용가능한 담체와 함께 적어도 하나의 아미노산이 비-천연 아미노산으로 치환된 폴리펩티드를 포함하는 약제학적 조성물이 제공된다. 일부 실시태양에서, 비-천연 아미노산은 사카라이드 잔기를 포함한다. 일부 실시태양에서, 수용성 중합체는 사카라이드 잔기를 통해 폴리펩티드에 결합되어 있다. 본 명세서에는 또한 비-천연 아미노산, 비-천연 아미노산 폴리펩티드 및 변형된 비-천연 아미노산 폴리펩티드의 전구약물이 기재되어 있으며, 또한 그러한 전구약물과 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 조성물이 기재되어 있다. 또한, 본 명세서에는 비-천연 아미노산, 비-천연 아미노산 폴리펩티드 및 변형된 비-천연 아미노산 폴리펩티드의 대사물질이 기재되어 있으며, 그와 같은 대사물질은 비-천연 아미노산, 비-천연 아미노산 폴리펩티드 및 변형된 비-천연 아미노산 폴리펩티드의 활성을 보조하거나 그와 상승작용할 수 있는 목적하는 활성을 가질 수 있다. 본 발명은 또한 본 명세서에서 기재된 비-천연 아미노산, 비-천연 아미노산 폴리펩티드 및 변형된 비-천연 아미노산 폴리펩티드가 목적하는 대사물질을 필요로 하는 환자를 포함하는 생물체에 그와 같은 대사물질을 제공하는 용도에 관한 것이다.
본 발명은 셀렉터 코돈을 포함하는, 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티 드를 포함하는 세포에 관한 것이다. 일부 실시태양에서, 세포는 비-천연 아미노산을 폴리펩티드 내로 치환하기 위해 오르쏘고날 RNA 신써타제 및(또는) 오르쏘고날 tRNA를 포함한다. 일부 실시태양에서 세포는 세포 배양액내에 존재하는 반면, 다른 실시태양에서 세포는 양서류, 파충류, 조류 및 포유류를 포함하는 다세포 생물의 일부이다. 세포 실시태양 중 어느 것에서나, 추가의 실시태양은 폴리뉴클레오티드를 발현시켜 비-천연 아미노산 폴리펩티드를 생산하는 것을 포함한다. 다른 실시태양은 상기 비-천연 아미노산을 이용하여 변형된 비-천연 아미노산 폴리펩티드를 포함하는 비-천연 아미노산 폴리펩티드를 생산할 수 있는 생물체이다. 다른 실시태양은 본 명세서에서 기재된 비-천연 아미노산, 비-천연 아미노산 폴리펩티드 및(또는) 변형된 비-천연 아미노산 폴리펩티드를 함유하는 생물체이다. 그와 같은 생물체는 단세포 생물 및 양서류, 파충류, 조류 및 포유류를 포함하는 다세포 생물체이다. 일부 실시태양에서, 비-천연 아미노산 폴리펩티드는 시험관 내에서 생산된다. 일부 실시태양에서, 비-천연 아미노산 폴리펩티드는 세포 용해물 중에서 생산된다. 일부 실시태양에서, 비-천연 아미노산 폴리펩티드는 리보오좀 번역에 의해 생산된다.
본 명세서에는 비-천연 아미노산을 포함하는 폴리펩티드를 제조하는 방법이 기재되어 있다. 일부 실시태양에서, 그와 같은 방법은 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 오르쏘고날 RNA 신써타제 및(또는) 오르쏘고날 tRNA를 포함하는 세포를 폴리펩티드가 발현되는 조건하에 배양하고, 세포 및(또는) 배양액으로부터 폴리펩티드를 정제해내는 것을 포함한다.
본 발명은 또한 본 명세서에서 기재된 비-천연 아미노산의 라이브러리, 비-천연 아미노산 폴리펩티드의 라이브러리, 변형된 비-천연 아미노산 폴리펩티드의 라이브러리, 또는 이들 라이브러리의 조합에 관한 것이다. 본 발명은 또한 적어도 하나의 비-천연 아미노산, 적어도 하나의 비-천연 아미노산 폴리펩티드 및(또는) 적어도 하나의 변형된 비-천연 아미노산을 함유하는 어레이에 관한 것이다. 본 발명은 또한 셀렉터 코돈을 포함하는, 폴리펩티드를 코딩하는 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드를 함유하는 어레이에 관한 것이다. 본 명세서에 기재된 바와 같은 어레이는 생물체 내에서 비-천연 아미노산 폴리펩티드가 생산되는지를 (폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 전사를 검출하거나 폴리펩티드의 번역을 검출하여) 스크리닝하는데 사용될 수 있다.
본 발명은 또한 목적하는 활성을 위하여 본 명세서에서 기재된 라이브러리를 스크리닝하는 방법, 본 명세서에 기재된 어레이를 사용하여 본 명세서에 기재된 라이브러리를 스크리닝하는 방법, 또는 목적하는 활성을 위하여 화합물, 폴리펩티드 및(또는) 폴리뉴클레오티드의 다른 라이브러리를 스크리닝하는 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 라이브러리 스크리닝으로부터의 활성 데이터를 사용하여 새로운 치료제를 개발 및 발견하는 용도 및 그와 같은 치료제 자체에 관한 것이다.
본 발명은 또한 폴리펩티드의 치료 반감기, 혈청 반감기 또는 순환 시간을 증가시키는 방법에 관한 것이다. 일부 실시태양에서, 그와 같은 방법은 천연 폴리펩티드 중 하나 이상의 아미노산을 적어도 하나의 비-천연 아미노산으로 치환하는 것 및 폴리펩티드를 수용성 중합체에 커플링시키는 것을 포함한다.
본 발명은 또한 치료를 요하는 환자를 비-천연 아미노산을 포함하는 폴리펩티드 및 약제학적으로 허용가능한 담체를 함유하는 치료 유효량의 약제학적 조성물로 치료하는 방법에 관한 것이다. 일부 실시태양에서, 비-천연 아미노산은 수용성 중합체에 커플링된다.
또 다른 또는 추가의 실시태양은 옥심-함유 비-천연 아미노산, 카르보닐-함유 비-천연 아미노산, 디카르보닐-함유 비-천연 아미노산 및 히드록실아민-함유 비-천연 아미노산으로 구성되는 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 비-천연 아미노산을 포함하는 폴리펩티드 치료 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 장애, 증상 또는 질병의 치료 방법에 관한 것이다. 다른 실시태양에서, 비-천연 아미노산은 본 명세서에 기재된 바와 같이 생합성 방법으로 폴리펩티드 내로 삽입되어 있다. 또 다른 또는 추가의 실시태양에서, 그와 같은 비-천연 아미노산 폴리펩티드는 화학식 I - XVIII, XXX - XXXIV (A 및 B) 또는 XXXX - XXXXIII의 아미노산으로부터 선택되는 적어도 하나의 비-천연 아미노산을 포함한다.
또 다른 또는 추가의 실시태양은 적어도 하나의 옥심-함유 비-천연 아미노산을 포함하는 비-천연 아미노산 폴리펩티드 치료 유효량을 투여하는 것을 포함하며, 생성된 생합성 옥심-함유 비-천연 아미노산 폴리펩티드는 천연의 상동 아미노산 폴리펩티드에 비하여 폴리펩티드의 생이용성을 증가시키는 것인, 장애, 증상 또는 질병의 치료 방법에 관한 것이다.
또 다른 또는 추가의 실시태양은 적어도 하나의 옥심-함유 비-천연 아미노산을 포함하는 비-천연 아미노산 폴리펩티드 치료 유효량을 투여하는 것을 포함하며, 생성된 생합성 옥심-함유 비-천연 아미노산 폴리펩티드는 천연의 상동 아미노산 폴리펩티드에 비하여 폴리펩티드의 안전성 프로파일을 증가시키는 것인, 장애, 증상 또는 질병의 치료 방법에 관한 것이다.
또 다른 또는 추가의 실시태양은 적어도 하나의 옥심-함유 비-천연 아미노산을 포함하는 비-천연 아미노산 폴리펩티드 치료 유효량을 투여하는 것을 포함하며, 생성된 생합성 옥심-함유 비-천연 아미노산 폴리펩티드는 천연의 상동 아미노산 폴리펩티드에 비하여 폴리펩티드의 수용해성을 증가시키는 것인, 장애, 증상 또는 질병의 치료 방법에 관한 것이다.
또 다른 또는 추가의 실시태양은 적어도 하나의 옥심-함유 비-천연 아미노산을 포함하는 비-천연 아미노산 폴리펩티드 치료 유효량을 투여하는 것을 포함하며, 생성된 생합성 옥심-함유 비-천연 아미노산 폴리펩티드는 천연의 상동 아미노산 폴리펩티드에 비하여 폴리펩티드의 치료 반감기를 증가시키는 것인, 장애, 증상 또는 질병의 치료 방법에 관한 것이다.
또 다른 또는 추가의 실시태양은 적어도 하나의 옥심-함유 비-천연 아미노산을 포함하는 비-천연 아미노산 폴리펩티드 치료 유효량을 투여하는 것을 포함하며, 생성된 생합성 옥심-함유 비-천연 아미노산 폴리펩티드는 천연의 상동 아미노산 폴리펩티드에 비하여 폴리펩티드의 혈청 반감기를 증가시키는 것인, 장애, 증상 또는 질병의 치료 방법에 관한 것이다.
또 다른 또는 추가의 실시태양은 적어도 하나의 옥심-함유 비-천연 아미노산을 포함하는 비-천연 아미노산 폴리펩티드 치료 유효량을 투여하는 것을 포함하며, 생성된 생합성 옥심-함유 비-천연 아미노산 폴리펩티드는 천연의 상동 아미노산 폴리펩티드에 비하여 폴리펩티드의 순환 시간을 연장시키는 것인, 장애, 증상 또는 질병의 치료 방법에 관한 것이다.
또 다른 또는 추가의 실시태양은 적어도 하나의 옥심-함유 비-천연 아미노산을 포함하는 비-천연 아미노산 폴리펩티드 치료 유효량을 투여하는 것을 포함하며, 생성된 생합성 옥심-함유 비-천연 아미노산 폴리펩티드는 천연의 상동 아미노산 폴리펩티드에 비하여 폴리펩티드의 생물학적 활성을 조절하는 것인, 장애, 증상 또는 질병의 치료 방법에 관한 것이다.
또 다른 또는 추가의 실시태양은 적어도 하나의 옥심-함유 비-천연 아미노산을 포함하는 비-천연 아미노산 폴리펩티드 치료 유효량을 투여하는 것을 포함하며, 생성된 생합성 옥심-함유 비-천연 아미노산 폴리펩티드는 천연의 상동 아미노산 폴리펩티드에 비하여 폴리펩티드의 면역원성을 조절하는 것인, 장애, 증상 또는 질병의 치료 방법에 관한 것이다.
본 명세서에 기재된 방법 및 조성물은 기재된 특정 방법, 프로토콜, 세포주, 구조물 및 시약 등으로 한정되는 것이 아니라 그 자체로 변화할 수 있는 것임을 이해하여야 한다. 본 명세서에서 사용된 용어 또한 단지 특정 실시태양을 설명하기 위한 것으로서 기재된 방법 및 조성물의 범위로 한정하려는 것은 아니며, 그들의 범위는 하기 특허청구의 범위에 의해 한정되는 것임을 이해하여야 한다.
본 명세서 및 특허청구 범위에서, 문맥상 명확한 경우를 제외하고는 단수 형태는 복수의 형태도 포함한다.
달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에 사용되는 모든 기술적 과학적 용어는 본 발명이 속하는 당업계의 통상의 전문가에게 보통 이해되는 의미를 갖는다. 본 명세서에 기재된 것과 유사하거나 균등한 방법, 장치 및 물질이 본 명세서에 기재된 본 발명의 실시 및 시험을 위하여 사용될 수 있다.
본 명세서에 언급된 모든 간행물 및 특허 문헌의 전문이 기재 및 개시의 목적으로 본 명세서에서 포함되며, 예를 들어, 간행물에 기재된 구조물 및 방법이 본 발명에 사용될 수 있다. 본 명세서에서 논의된 간행물은 본 출원의 출원일 전에 개시된 것에 한하여 제공된다. 기재된 간행물 어느 것도 본 발명이 선행 발명으로서 또는 다른 어떤 이유에서건 그를 선행할 자격이 없다는 것을 시인하는 것이 아니다.
본 명세서에서 "친화도 표지"란 다른 분자를 변형시키거나 파괴하거나 함께 화합물을 형성하기 위해 그에 가역적 또는 비가역적으로 결합하는 표지를 이른다. 예를 들어, 친화도 표지는 효소와 그의 기질, 항체와 그의 항원을 포함한다.
본 명세서에서 "알콕시," "알킬아미노" 및 "알킬티오"는 통상의 의미로 사용되며, 각각 산소 원자, 아미노 기, 황 원자를 통하여 분자에 결합된 알킬 기를 이른다.
용어 "알킬"은 그 자체로 또는 다른 분자의 일부로서, 달리 언급이 없는 한, 직쇄 또는 분지쇄, 또는 시클릭 탄화수소 라디칼, 또는 그들의 조합을 의미하고, 완전히 포화, 모노 또는 폴리-불포화될 수 있으며, 기재한 수의 탄소 원자를 갖는 (즉, Cl-ClO은 1 내지 10개의 탄소 원자를 의미함) 이가 및 다가 라디칼을 포함할 수 있다. 포화 탄화수소 라디칼의 예는 메틸, 에틸, n-프로필, 이소프로필, n-부틸, t-부틸, 이소부틸, sec-부틸, 시클로헥실, (시클로헥실)메틸, 시클로프로필메틸, 이들의 동족체 및 이성체, 예를 들어, n-펜틸, n-헥실, n-헵틸, n-옥틸 등을 포함하나, 이에 국한되는 것은 아니다. 불포화 알킬 기는 하나 이상의 이중 결합 또는 삼중 결합을 갖는 것이다. 불포화 알킬 기의 예는 비닐, 2-프로페닐, 크로틸, 2-이소펜테닐, 2-(부타디에닐), 2,4-펜타디에닐, 3-(l,4-펜타디에닐), 에티닐, 1- 및 3-프로피닐, 3-부티닐 및 보다 고급의 동족체 및 이성체를 포함하나, 이에 국한되는 것은 아니다. "알킬"은 달리 언급이 없는 한, 구체적으로 기재된 알킬의 유도체, 예를 들어, "헤테로알킬", "할로알킬" 및 "호모알킬"을 포함한다.
"알킬렌"은 그 자체로서 또는 다른 분자의 일부로서 알칸으로부터 유도된 이가 라디칼을 의미하여, 예를 들어, (-CH2-)n (n는 1 내지 약 24일 수 있음)로 표시된다. 그와 같은 기의 예는 -CH2CH2- 및 - CH2CH2CH2CH2- 등으로 표시되는 탄소 원자수 10 이하의 기를 포함하나, 이에 국한되는 것은 아니다. "저급 알킬" 또는 "저급 알킬렌"은 일반적으로 8개 이하의 탄소 원자를 갖는 짧은 알킬 또는 알킬렌 기이다. "알킬렌"은 달리 언급이 없는 한, 본 명세서에서 "헤테로알킬렌"으로 정의된 기를 포함하는 것이다.
"아미노산"이란 천연 및 비-천연 아미노산 뿐만 아니아, 천연 아미노산과 유사한 방식으로 기능하는 아미노산 유사체 및 아미노산 미메틱을 이른다. 천연적으 로 코딩되는 아미노산은 20갸지 통상의 아미노산 (알라닌, 아르기니, 아스파라긴, 아스파르트산, 시스테인, 글루타민, 글루탐산, 글리신, 히스티딘, 이소류신, 류신, 리신, 메티오닌, 페닐알라닌, 프롤린, 세린, 트레오닌, 트립토판, 티로신 및 발린) 및 파이로리신 및 셀레노시스테인이다. 아미노산 유사체는 천연 아미노산과 동일한 기본적 화학 구조, 예를 들어, 수소에 결합된 α-탄소, 카르복실 기, 아미노 기 및 R 기를 갖는 화합물이다. 그와 같은 유사체는 변형된 R 기를 갖거나 (예컨대 , 노르류신) 변형된 펩티드 골격을 가질 수 있는 한편, 천연 아미노산과 동일한 기본적 화학 구조를 갖는다. 아미노산 유사체의 비제한적인 예는 호모세린, 노르류신, 메티오닌 술폭시드, 메티오닌 메틸 술포늄을 포함한다.
본 명세서에서 아미노산은 그들의 명칭, 통상적인 3글자 기호 또는 IUPAC-IUB 생화학 명명 위원회에 의해 권장되는 1글자 부호로 표시될 수 있다. 또한 뉴클레오티드는 통상적으로 사용되는 1글자 부호로 사용된다.
"아미노 말단 변형 기"는 말단 아민 기에 결합될 수 있는 임의의 분자를 이른다. 예를 들어, 말단 아민기는 중합체 분자의 말단에 존재할 수 있는 반변, 그와 같은 중합체 분자는 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드 및 폴리사카라이드를 포함하나, 이에 국한되는 것은 아니다. 말단 변형기는 여러가지 수용성 중합체, 펩티드 또는 단백질을 포함하나, 이에 국한되는 것은 아니다. 말단 변형기의 예는 폴리에틸렌 글리콜 또는 혈청 알부민을 포함하나 이에 국한되는 것은 아니다. 말단 변형기는 펩티드의 혈청 반감기를 증가시키는 등의 중합체 분자의 치료 특성을 변화시키기 위해 사용될 수 있으나, 이에 국한되는 것은 아니다.
"항체 단편"이란 전장 항체가 아닌 임의의 항체 형태를 이른다. 항체 단편은 전장 항체 내에 존재하는 항체의 작은 부분, 및 엔지니어링된 항체를 포함한다. 항체 단편은 Fv, Fc, Fab, 및 (Fab')2, 단쇄 Fv (scFv), 다이아바디, 트리아바디, 테트라바디, 이관능성 하이브리드 항체, CDRl, CDR2, CDR3, CDR 조합체, 가변영역, 프레임워크 영역, 불변 영역, 중쇄, 경쇄, 가변 영역, 스캐폴드 비-항체 분자, 이중특이적 항체 등을 포함하나, 이에 국한되는 것은 아니다[참조: Maynard & Georgiou, 2000, Annu. Rev. Biomed. Eng. 2:339-76; Hudson, 1998, Curr. Opin. Biotechnol. 9:395-402]. 또 다른 기능적 소구조물은 펩티드 링커에 의해 공유결합 연결된 이뮤노글로불린 중쇄 및 경쇄의 가변 영역으로 이루어진 단쇄 Fv (scFv)이다[참조: S-z Hu et al., 1996, Cancer Research, 56, 3055-3061]. 이들 작은 (Mr 25,000) 단백질은 일반적으로 단일 폴리펩티드 내에 항원에 대한 특이성 및 친화도를 보유하며, 보다 큰 항원 특이적 분자의 편리한 기본 단위를 제공할 수 있다. 달리 언급이 없는 한, "항체(들)"을 사용하는 문장 또는 청구항은 구체적으로 "항체 단편(들)"을 포함한다.
본 명세서에서 "방향족" 또는 "아릴"은 컨쥬게이트된 파이 전자계를 갖는 적어도 하나의 고리를 갖는 닫힌 고리 구조로서, 카르보시클릭 아릴 및 헤테로시클릭 아릴(또는 "헤테로아릴" 또는 "헤테로방향족") 기를 포함한다. 카르보시클릭 또는 헤테로시클릭 방향족 기는 5 내지 20개의 고리 원자를 함유할 수 있다. 이 용어는 공유결합된 모노시클릭 고리들 및 융합환 폴리시클릭 (즉, 인접한 탄소 원자쌍을 공유하는 고리들) 기를 포함한다. 방향족 기는 치환되거나 비치환될 수 있다. " 방향족" 또는 "아릴" 기의 비제한적인 예는 페닐, 1-나프틸, 2-나프틸, 4-비페닐, 안트라세닐 및 페난트라세닐을 포함한다. 상기 아릴 및 헤테로아릴 고리계 각각에 대한 치환체는 본 명세서에서 허용가능한 치환기로 구성되는 군으로부터 선택된다.
간결함을 위하여, 용어 "방향족" 또는 "아릴"이 다른 용어들과 조합되어 사용될 때 (예를 들어, 아릴옥시, 아릴티옥시, 아르알킬), 이들은 정의된 바와 같은 아릴 및 헤테로아릴을 모두 포함한다. 따라서, "아르알킬" 또는 "알크아릴"이란 아릴 기가 알킬기에 부착된 라디칼(예를 들어, 벤질, 펜에틸, 피리딜메틸 등)을 포함하며, 또한 알킬 기 중의 탄소 원자 (예컨대, 메틸렌 기)가 헤테로 원자, 예를 들어, 산소 원자로 치환된 것을 포함한다. 그와 같은 알킬 기의 예는 페녹시메틸, 2-피리딜옥시메틸, 3-(l-나프틸옥시)프로필 등을 포함하나, 이에 국한되는 것은 아니다.
본 명세서에서 "아릴렌"이란 2가 아릴 라디칼을 이른다. "아릴렌"의 비제한적인 예는 페닐렌, 피리디닐렌, 피리미디닐렌 및 티오페닐렌을 포함한다. 아릴렌 기의 치환기는 본 명세서에 기재된 허용가능한 치환기로부터 선택된다.
"이관능성 중합체" 또는 "이관능성 링커"는 다른 잔기와 특이적으로 반응하여 공유 또는 비공유 결합을 형성할 수 있는 두 개의 관능기를 포함하는 중합체를 이른다. 그와 같은 잔기는 천연 또는 비-천연 아미노산 또는 그러한 천연 또는 비-천연 아미노산을 함유하는 폴리펩티드 상의 측쇄를 포함한다. 단지 예를 들자면, 이관능성 링커는 제1 펩티드 상의 기와 반응성인 관능기 및 제2 펩티드 상의 기와 반응성인 관능기를 함유하므로, 제1 펩티드, 이관능성 링커 및 제2 펩티드의 컨쥬 게이트를 형성할 수 있다. 펩티드에 다양한 분자를 부착시키기 위한 많은 방법 및 링커 분자가 알려져 있다[참조: 유럽 특허 출원 제 188,256호; 미합중국 특허 제 4,671,958호, 제4,659,839호, 제4,414,148호, 제4,699,784호; 제680,338호 및 제4,569,789호. 전문이 본 명세서에 포함됨]. "다관능성 중합체" 또는 "다관능성 링커"는 다른 잔기와 특이적으로 반응하여 공유 또는 비공유 결합을 형성할 수 있는 두 개 이상의 관능기를 포함하는 중합체를 이른다. 그와 같은 잔기는 천연 또는 비-천연 아미노산 또는 그러한 천연 또는 비-천연 아미노산을 함유하는 폴리펩티드 상의 측쇄를 포함하여 공유 또는 비공유 결합을 형성할 수 있는 기를 포함하나 이에 국한되는 것은 아니다. 이관능성 또는 다관능성 중합체는 목적하는 어느 길이 또는 분자량이어도 무방하며, 화합물에 결합된 하나 이상의 분자 및 그것이 결합하고 있는 분자 또는 화합물 사이에 특정의 목적하는 공간 또는 구조를 제공하도록 선택될 수 있다.
본 명세서에서 "생이용성"이란 물질 또는 그의 활성 잔기가 약제학적 투여 형태로부터 전달되어 작용 위치에서 또는 전체 순환에서 이용될 수 있게 되는 속도또는 정도를 이른다. 생이용성의 증가는 물질 또는 그의 활성 잔기가 약제학적 투여 형태로부터 전달되어 작용 위치에서 또는 전체 순환에서 이용될 수 있게 되는 속도 또는 정도가 증가하는 것을 이른다. 예를 들어, 생이용성의 증가는 다른 물 질 또는 활성 잔기와 비교한 그 물질 또는 활성 잔기의 혈중 농도의 증가로 나타낼 수 있다. 생이용성의 증가를 평가하는 방법의 비제한적인 예는 실시예 88 내지 92에 주어졌다. 이 방법은 어느 폴리펩티드의 생이용성을 평가하는데나 사용할 수 있다.
"생물학적 활성 분자", "생물학적 활성 잔기" 또는 "생물학적 활성제"는 바이러스, 세균, 박테리오파아지, 트랜스포손, 프리온, 곤충, 진균, 식물 및 인간을 포함하는 유기체와 관련하여 생물학적 계, 경로, 분자 또는 상호작용의 물리적 또는 생화학적 특성에 영향을 줄 수 있는 물질을 의미한다. 특히, 본 명세서에서 생물학적 활성 분자는 인간 또는 다른 동물의 질병을 진단, 치유, 완화, 치료 또는 예방하기 위한 물질, 또는 인간 또는 동물의 신체적 또는 정신적 건강 상태를 증진시키기 위한 물질을 포함하나, 이에 국한되는 것은 아니다. 생물학적 활성 분자의 예는 펩티드, 단백질, 효소, 소분자 약물, 경질 약물, 연질 약물, 탄수화물, 무기 원소 또는 분자, 염료, 지질, 뉴클레오시드, 방사성 핵종, 올리고뉴클레오티드, 독소, 세포, 바이러스, 리포조옴, 미세입자 및 미셀을 포함하나 이에 국한되는 것은 아니다. 본 명세서에 기재된 방법 및 조성물에 사용하기에 적절한 생물학적 활성제의 종류는 약물, 전구약물, 방사성 핵종, 조영제, 중합체, 항생제, 항진균제, 항바이러스제, 소염제, 항종양제, 심혈관계 약물, 항불안제, 호르몬, 성장 인자, 스테로이드제, 미생물 유도 독소 등이 있으나, 이에 국한되는 것은 아니다.
"생물학적 활성을 조절한다"는 것은 폴리펩티드의 반응성을 증가 또는 감소 시키고, 폴리펩티드의 선택성을 변화시키고, 폴리펩티드의 기질 선택성을 증진 또는 저하시키는 것을 포함한다. 변형된 생물학적 활성의 분석은 비-천연 아미노산 폴리펩티드의 활성을 천연 폴리펩티드의 활성과 비교하여 수행할 수 있다.
본 명세서에서 "생물질"이란 생물학적으로 유래된 물질을 이르며, 생물 반응 기 및(또는) 재조합 방법 및 기술로 얻어진 물질을 포함하나, 이에 국한되는 것은 아니다.
본 명세서에서 "생물리적 프로브"란 분자 내 구조적 변화를 검출 또는 모니터링할 수 있는 프로브를 이른다. 그와 같은 분자는 단백질을 포함하나, 이에 국한되는 것은 아니며, "생물리학적 프로브"는 단백질과 다른 거대 분자와의 상호작용을 검출 또는 모니터링하는데 사용할 수 있다. 생물리학적 프로브의 예는 스핀 표지, 형광물질 및 광활성화 기를 포함하나, 이에 국한되는 것은 아니다.
본 명세서에서 "생합성적으로"라 함은 폴리뉴클레오티드, 코돈, tRNA 및 리보조옴 성분 중 적어도 하나를 사용하는 것을 포함하여, 번역계(세포성 또는 비세포성)를 사용한 방법을 이르는 것이다. 예를 들어, "비-천연 아미노산을 포함하는 폴리펩티드의 생체내 생산"이라는 제하의 섹션 VIII 및 비제한적인 실시예 14에 기재된 방법 및 기술을 사용하여 비-천연 아미노산을 비-천연 아미노산 폴리펩티드 내로 생합성적으로 삽입할 수 있다. 추가로, 비-천연 아미노산 폴리펩티드 내로 생합성적으로 삽입될 수 있는 유용한 비-천연 아미노산을 선택하는 방법은 비제한적 실시예 15-16에 기재되어 있다.
"비오틴 유사체" 또는 "비오틴 미믹"은 아비딘 및(또는) 스트렙타비딘과 고친화도로 결합하는 비오틴 이외의 분자이다.
본 명세서에서 "카르보닐"이란 -C(O)-, -S(O)-, -S(O)2- 및 -C(S)-로 구성되는 군으로부터 선택되는 잔기를 함유하는 기를 의미하며, 적어도 하나의 케톤 기, 및(또는) 적어도 하나의 알데히드 기 및(또는) 적어도 하나의 에스테르 기 및(또는) 적어도 하나의 카르복실산 기 및(또는) 적어도 하나의 티오에스테르 기를 함유하는 기를 포함하나, 이에 국한되는 것은 아니다. 그와 같은 카르보닐 기는 케톤, 알데히드, 카르복실산, 에스테르 및 티오에스테르를 포함한다. 또한, 그와 같은 기는 직쇄, 분지쇄 또는 시클릭 분자의 일부일 수 있다.
"카르복시 말단 변형기"란 말단 카르복시 기에 결합할 수 있는 임의의 분자를 이른다. 예를 들어, 말단 카르복시 기는 중합체 분자의 말단에 존재할 수 있으며, 그러한 중합체 분자는 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드 및 폴리사카라이드를 포함하나, 이에 국한되는 것은 아니다. 예를 들어, 말단 변형기는 폴리에틸렌 글리콜 또는 혈청 알부민을 포함한다. 말단 변형기는 펩티드의 혈청 반감기를 증가시는 것을 포함하여 중합체 분자의 치료 특성을 변형시키는데 사용될 수 있다.
"화학적으로 절단가능한" 또는 "화학적으로 반응하기 쉬운"이란 산, 염기, 산화제, 환원제, 화학적 개시제, 라디칼 개시제 등에 노출될 때 파괴되거나 절단되는 기를 이르는 것이다.
본 명세서에서 "화학발광 기"는 열을 가함이 없이 화학적 반응의 결과로서 빛을 발하는 기를 의미한다. 단지 예를 들자면, 루미놀 (5-아미노-2,3-디히드로 -l,4-프탈라진디온)은 염기 및 금속 촉매의 존재하에 과산화수소(H2O2)와 같은 산화제와 반응하여 여기 상태의 생성물 (3-아미노프탈레이트, 3-APA)를 생성한다.
"발색단"은 가시 파장, UV 파장 및 IR 파장의 빛을 흡수하는 분자를 의미한 다.
본 명세서에서 "조인자"는 큰 분자의 작용에 필수적인 원소 또는 분자를 의미한다. 조인자는 무기 이온, 조효소, 단백질 또는 효소의 활성에 필요한 다른 인자를 포함하나, 이에 국한되는 것은 아니다. 예를 들어, 헤모글로빈 중의 헴, 엽록소 중의 마그네슘, 단백질 중의 금속 이온 등이 있다.
"동시접힘"은 서로 상호작용하여 풀려지거나 잘못 접힌 분자를 적절하게 접혀지도록하는 적어도 두 분자 사이의 재접힘 과정, 반응 또는 방법을 이르는 것이다. 단지 예를 들면, "동시접힘"은 서로 상호작용하여 풀려지거나 잘못 접힌 분자를 천연 그대로 적절하게 접혀지도록하는 적어도 두 폴리펩티드를 포함한다. 그와 같은 폴리펩티드는 천연 아미노산 및(또는) 적어도 하나의 비-천연 아미노산을 함유할 수 있다.
본 명세서에서 "비교 윈도우"는 두 서열을 최적으로 정렬시킨 후에 어느 한 서열을 동일한 수의 연속된 위치의 표준 서열과 비교하는데 사용되는, 임의의 연속되는 위치의 분절을 의미한다. 그와 같은 연속되는 위치는 약 20 내지 약 600 개의 서열 단위, 약 50 내지 약 200 개의 서열 단위, 및 약 100 내지 약 150 개의 서열 단위를 포함하나, 이에 국한되는 것은 아니다. 예를 들어, 그와 같은 서열은 비-천연 아미노산을 함유하는 폴리펩티드이며, 서열 단위는 천연 및 비-천연 아미노산을 포함하나, 이에 국한되는 것은 아니다. 또한, 그와 같은 서열은 폴리뉴클레오티드를 포함하며, 뉴클레오티드가 상응하는 서열 단위이다. 비교를 위해 서열을 정렬하는 방법은 당업계에 잘 알려져 있다. 비교를 위해 서열을 최적으로 정렬 할 수 있으며, 이는 국소적 상동성 알고리듬(Smith and Waterman (1970) Adv. Appl. Math. 2:482c), 상동성 정렬 알고리듬(Needleman and Wunsch (1970) J. MoI. Biol. 48:443), 유사도 방법 검색(Pearson and Lipman (1988) Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 85:2444), 이들 알고리듬의 컴퓨터화 대입(GAP, BESTFIT, FASTA, and TFASTA in the Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI), 또는 매뉴얼 정렬 및 시각적 검사에 의할 수 있다[참조: Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology (1995 supplement)].
예를 들어, 퍼센트 서열 일치도 및 서열 유사성을 측정하는데 사용될 수 있는 알고리듬은 BLAST 및 BLAST 2.0 알고리듬으로서, 이들은 문헌[Altschul et al. (1997) Nuc. Acids Res. 25:3389-3402, and Altschul et al. (1990) J. MoI. Biol. 215:403-410]에 각각 기재되어 있다. BLAST 분석을 수행하기 위한 소프트웨어는 기관(National Center for Biotechnology Information)을 통해 공중 이용가능하다. BLAST 알고리듬 파라미터 W, T 및 X는 정렬의 감도 및 속도를 결정한다. BLASTN 프로그램 (뉴클레오티드 서열용)은 디폴트로서 단어길이 (W) = 11, 기대값 (E) = 10, M = 5, N = -4 및 양 가닥의 비교를 이용한다. 아미노산 서열을 위한 BLASTP 프로그램은 디폴트로서 단어길이 = 3, 기대값 (E) = 10, 및 BLOSUM62 스코어링 매트릭스 (Henikoff and Henikoff (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915) 정렬 (B) = 50, 기대값 (E) = 10, M = 5, N = -4 및 양 가닥의 비교를 사용한다. BLAST 알고리듬은 전형적으로는 "낮은 복잡도(low complexity)" 필터를 꺼놓은 채 사용한다.
BLAST 알고리듬은 또한 두 서열 간의 통계적 유사도 분석을 수행한다[참조: Karlin and Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5787]. BLAST 알고리듬에 의해 제공되는 하나의 유사도 측정은 최소 합계 확률 (P(N))인데, 이는두 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열간의 매치가 우연적으로 일어날 확률을 나타내는 것이다. 예를 들어, 표준 핵산에 대한 시험 핵산의 비교에서 최소 합계 확률이 약 0.2 미만, 또는 약 0.01 미만, 또는 약 0.001 미만이면 시험 핵산은 표준 핵산에 유사한 것이다.
"보존적으로 변형된 변이체"는 천연 및 비-천연 아미노산 및 천연 및 비-천연 핵산 서열 및 그들의 조합에 모두 적용된다. 특정 핵산 서열에 있어서, "보존적으로 변형된 변이체"는 동일하거나 본질적으로 동일한 천연 및 비-천연 아미노산 서열을 코딩하는 천연 및 비-천연 핵산, 또는 천연 및 비-천연 핵산이 천연 및 비-천연 아미노산을 코딩하지 않을 때에는 본질적으로 동일한 서열을 의미한다. 예를들어, 유전자 코드의 축퇴성으로 인해 다수의 기능적으로 동일한 핵산이 하나의 단백질을 코딩한다. 예를 들어, 코돈 GCA, GCC, GCG 및 GCU는 모두 아미노산 알라닌을 코딩한다. 따라서, 코돈에 의해 알라닌이 특정된 각 위치에서 코딩된 폴리펩티드를 변화시키지 않으면서 상기한 코돈 중의 어느 하나로 변화될 수 있다. 그와 같은 핵산 변이느 "침묵 변이"로서, 보존적으로 변형된 변이의 한 유형이다. 따라서, 본 명세서에 기재된 천연 및 비-천연 폴리펩티드를 코딩하는 천연 및 비-천연 핵산 서열은 그 천연 및 비-천연 서열의 가능한 침묵 변이를 포함하는 것이다. 당 업자는 천연 및 비-천연 핵산 중의 각 코돈(일반적으로 메티오닌에 대한 유일한 코돈인 AUG, 트립토판에 대해 유일한 코돈인 TGG는 제외)이 기능적으로 동일한 분자를 생성하도록 변형될 수 있다는 것을 알 것이다. 따라서, 천연 및 비-천연 폴리펩티드를 코딩하는 천연 및 비-천연 핵산의 침묵 변이는 각 기재된 서열에서 숨어있다.
아미노산 서열과 관련하여, 코딩된 서열 중 단일의 천연 및 비-천연 아미노산 또는 작은 부분의 천연 및 비-천연 아미노산을 변화, 첨가 또는 결실하는, 핵산, 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질 서열에 대한 개개의 치환, 첨가 또는 결실은, 그러한 변화가 아미노산의 결실, 아미노산 첨가 또는 천연 및 비-천연 아미노산의 화학적으로 유사한 아미노산으로의 치환을 가져오는 경우 "보존적으로 변형된 변이체"라 한다. 기능적으로 유사한 아미노산을 제공하는 보존적 치환의 표는 당업계에 잘 알려져 있다. 그와 같은 보존적으로 변형된 변이체는 다형성 변이체, 종간 상동체 및 대립체를 제외하지 않는다. 하기 여덟 개의 군은 각각 서로에 대해 보존적인 아미노산을 함유한다:
1) 알라닌 (A), 글리신 (G);
2) 아스파르트산 (D), 글루탐산 (E);
3) 아스파라긴 (N), 글루타민 (Q);
4) 아르기닌 (R), 리신 (K);
5) 이소류신 (I), 류신 (L), 메티오닌 (M), 발린 (V);
6) 페닐알라닌 (F), 티로신 (Y), 트립토판 (W);
7) 세린 (S), 트레오닌 (T); 및
8) 시스테인 (C), 메티오닌 (M)
[참조: Creighton, Proteins -.Structures and Molecular Properties (W H Freeman & Co.; 2nd edition (December 1993)]
"시클로알킬" 및 "헤테로시클로알킬"은 그 자체로 또는 다른 용어들과 조합되어, 달리 언급이 없는 한, 각각 "알킬" 및 "헤테로알킬"의 시클릭 형태를 이른다. 따라서, 시클로알킬 또는 헤테로시클로알킬은 포화, 부분적 불포화 및 완전 불포화된 고리 결합을 포함한다. 또한, 헤테로시클로알킬에 있어서, 헤테로원자는 헤테로시클이 분자의 나머지 부분에 열결되는 위치를 점할 수 있다. 헤테로원자는 산소, 질소 또는 황을 포함하나, 이에 국한되는 것은 아니다. 시클로알킬의 예는 시클로펜틸, 시클로헥실, 1-시클로헥세닐, 3-시클로헥세닐, 시클로헵틸 등을 포함하나, 이에 국한되는 것은 아니다. 헤테로시클로알킬의 예는 l-(l,2,5,6-테트라히드로피리딜), 1-피페리디닐, 2-피페리디닐, 3-피페리디닐, 4-모르폴리닐, 3-모르폴리닐, 테트라히드로푸란-2-일, 테트라히드로푸란-3-일, 테트라히드로티엔-2-일, 테테트라히드로티엔-3-일, 1-피페라지닐, 2-피페라지닐 등을 포함하나, 이에 국한되는 것은 아니다. 또는 용어는 멀티시클릭 구조, 예컨대 비시클릭 및 트리시클릭 고리 구조를 포함하나, 이에 국한되는 것은 아니다. 마찬가지로, "헤테로시클로알킬렌"은 그 자체로 또는 다른 분자의 일부로서 헤테로시클로알킬로부터 유도된 이가 라디칼을 의미하며, "시클로알킬렌"은 그 자체로 또는 다른 분자의 일부로서 시클로알킬로부터 유도된 이가 라디칼을 의미한다.
본 명세서에서 "시클로덱스트린"이란 고리 구조속에 적어도 6 내지 8개의 글루코스 분자로 이루어진 시클릭 탄수화물을 이른다. 고리의 바깥 부분은 수용성 기를 함유하며, 고리의 중심에 작은 분자를 수용할 수 있는 비교적 비극성 동공이 존재한다.
본 명세서에서 "세포독성"이란 세포에 해독을 끼치는 화합물을 이른다.
"변성제"란 중합체를 가역적으로 펼칠 수 있는 임의의 화합물 또는 물질을 의미한다. 예를 들어, "변성제" 또는 "변성화제"는 단백질의 가역적 풀림을 일으킬 수 있다. 변성제 또는 변성화제의 강도는 특정 변성제 또는 변성화제의 성질 및 농도에 의해 결정될 것이다. 예를 들어, 변성제 또는 변성화제는 케이오트로프 (chaotrope), 세척제, 유기물, 수혼화성 용매, 인지질 또는 이들의 조합을 포함하나, 이에 국한되는 것은 아니다. 케이오트로프의 비제한적인 예는 우레아, 구아니딘, 나트륨 티오시아네이트를 포함하나, 이에 국한되는 것은 아니다. 세척제의 비제한적인 예는 나트륨 도데실 술페이트와 같은 강력 세척제, 또는 폴리옥시에틸렌 에테르 (예를 들어, 트윈(Tween) 또는 트리톤(Triton) 세척제), 사르코실, 온화한 비-이온성 세척제 (예를 들어, 디지토닌), N-2,3-(디올레옥시)-프로필-N,N,N-트리메틸암모늄과 같은 온화한 양이온성 세척제, 온화한 이온성 세척제 (예를 들어, 나트륨 콜레이트 또는 나트륨 데옥시콜레이트) 또는 양쪽성이온성 세척제 (술포베타인(Zwittergent), 3-(3-클로로아미도프로필)디메틸암모니오-l-프로판 술페이트 (CHAPS) 및 3-(3-클로로아미도프로필)디메틸암모니오-2-히드록시-l-프로판 술포네이트 (CHAPSO))를 포함하나, 이에 국한되지는 않음)을 포함하나, 이에 국한되는 것 은 아니다. 유기 수혼화성 용매의 비제한적인 예는 아세토니트릴, 저급 알칸올 (특히, 에탄올 또는 이소프로판올과 같은 C2 - C4 알칸올), 또는 저급 알칸디올 (에틸렌 글리콜과 같은 C2 - C4 알칸디올)을 포함하나, 이에 국한되는 것은 아니다. 인지질의 비제한적인 예는 포스파티딜에탄올아민, 포스파티딜콜린, 포스파티딜세린, 포스파티딜이노시톨과 같은 천연 인지질, 디헥사노일포스파티딜콜린 또는 디헵타노일포스파티딜콜린과 같은 합성 인지질 유도체 또는 변이체를 포함하나, 이에 국한되는 것은 아니다.
본 명세서에서 "검출가능한 표지"란 형광, 화학발광, 전자-스핀 공명, 자외/가시광 흡수 분석, 질량 분석, 핵자기 공명, 자기 공명 및 전기화학적 방법을 비제한적인 예로서 포함하는 분석 기술로 관찰될 수 있는 표지를 이른다.
본 명세서에서 "디카르보닐"은 -C(O)-, -S(O)-, -S(O)2- 및 -C(S)-로 구성되는 군으로부터 선택되는 적어도 두 개의 잔기를 함유하는 기(비제한적인 예로서 1,2-디카르보닐 기, 1,3-디카르보닐 기, 1,4-디카르보닐 기를 포함함), 적어도 하나의 케톤기, 및(또는) 적어도 하나의 알데히드 기, 및(또는) 적어도 하나의 에스테르 기, 및(또는) 적어도 하나의 카르복실산 기 및(또는) 적어도 하나의 티오에스테르 기를 함유하는 기를 말한다. 그러한 디카르보닐 기는 디케톤, 케토알데히드, 케토산, 케토에스테르 및 케토바이오에스테르를 포함한다. 또한, 그와 같은 기는 직쇄, 분지쇄 또는 시클릭 분자의 일부일 수 있다. 디카르보닐 기 중의 두 개의 잔기는 동일하거나 상이할 수 있으며, 예컨대 에스테르, 케톤, 알데히드, 티오에스 테르 또는 아미드를 두 잔기 중의 어느 한 쪽에서 생산할 수 있는 치환기를 포함할 수 있다.
본 명세서에서 "약물"이란 질병 또는 증상을 예방, 진단, 왼화, 치료 또는 치유하는데 사용되는 물질을 이른다.
본 명세서에서 "염료"란 발색단을 포함하는 수용성 착색 물질을 의미한다.
"유효량"이란 치료되는 질병 또는 증상의 하나 이상의 증후를 어느 정도 완화시키기에 충분한, 투여되는 제제 또는 화합물의 양을 의미한다. 결과는 질병의 신호, 증후 또는 원인의 감소 또는 다른 유익한 생물학적 계의 목적하는 변화일 수 있다. 예컨대, 투여되는 제제 또는 화합물은 천연 아미노산 폴리펩티드, 비-천연 아미노산 폴리펩티드, 변형된 천연 아미노산 폴리펩티드 또는 변형된 비-천연 아미노산 폴리펩티드를 포함하나, 이에 국한되는 것은 아니다. 그와 같은 천연 아미노산 폴리펩티드, 비-천연 아미노산 폴리펩티드, 변형된 천연 아미노산 폴리펩티드 또는 변형된 비-천연 아미노산 폴리펩티드를 함유하는 조성물은 예방, 개선 및(또는) 치료의 목적으로 투여될 수 있다. 개체에 있어서의 유효한 양은 투여량 상승 연구와 같은 기법으로 결정할 수 있다.
"전자밀도가 높은 기"란 전자 비임을 조사할 때 전자를 산란하는 기를 말한다. 그와 같은 기는 암모늄 몰리브데이트, 비스무트 서브니트레이트 카드뮴 요오다이드, 99%, 카보히드라지드, 염화철 육수화물, 헥사메틸렌 테트라민, 98.5%, 삼염화인듐 무수물, 란타늄 니트레이트, 아세트산납 삼수화물, 질산납, 과요오드산, 포스포몰리브덴산, 포스포텅스텐산, 칼륨 페리시아나이드, 칼륨 페로시아나이드, 루테늄 레드, 질산은, 은 프로테이네이트 (Ag 분석: 8.0 내지 8.5%) "강", 은 테트라페닐포르핀 (S-TPPS), 나트륨 클로로오레이트, 나트륨 텅스테이트, 질산탈륨, 티오세미카바지드 (TSC), 우라닐 아세테이트, 우라닐 니트레이트, 및 바나딜 술페이트를 포함하나, 이에 국한되는 것은 아니다.
"에너지 전달제"란 다른 분자에 에너지를 내주거나 그로부터 에너지를 수용할 수 있는 분자를 이른다. 예를 들어, 형광 공명 에너지 전달제 (FRET)는 형광 공여 분자의 여기상태 에너지가 여기되지 않은 수용체 분자에 비방사 방식으로 전달되고, 이 분자가 공여된 에너지를 긴 파장에서 형광 발산하는 것인 쌍극-쌍극 커플링 과정에 의한다.
"증진하다" 또는 "증진하는"이란 목적하는 효과를 강도 또는 지속 기간의 면에서 증가 또는 연장하는 것을 말한다. 예컨대, 치료제의 효과 증진이란 질병, 장애 또는 증상의 치료에 있어서 강도 또는 지속 시간의 면에서 치료제의 효과를 증가 또는 연장시키는 것을 의미한다. 본 명세서에서 "증진 유효량"이란 질병, 장애 또는 증상의 치료에 있어서 강도 또는 지속 시간의 면에서 치료제의 효과를 증진시키기에 충분한 양을 이른다. 환자에 사용될 때, 유효량은 질병, 장애 또는 증상 의 정도 및 경과, 이전의 치료, 환자의 건강 상태 및 약물에 대한 반응, 및 담당의의 판단에 따라 달라질 것이다.
본 명세서에서 "진핵생물"은 계통 영역 유카리아 (Eucarya)에 속하는 생물로서, 동물 (비제한적인 예로서 포유류, 곤충, 파충류 및 조류 포함), 섬모충, 식물 (비제한적인 예로서, 단자엽, 쌍자엽 식물 및 조류 포함), 진균, 효모, 편모충, 미 세포자충 및 원생생물을 포함하나, 이에 국한되는 것은 아니다.
본 명세서에서 "지방산"이란 약 C6 이상의 탄화수소 측쇄를 갖는 카르복실산을 말한다.
"형광물질"이란 여기 시에 광자를 방출하며, 따라서 형광을 내는 분자를 이른다.
"관능기," "활성 잔기," "활성화 기," "이탈기," "반응성 위치," "화학적 반응성 기," "화학적 반응성 잔기" 등은 화학적 반응이 일어나는 분자의 부분 또는 단위를 이른다. 이 용어들은 화학 분야에서 어느 정도 유사한 단어로서, 본 명세서에서는 어떠한 기능 또는 활성을 수행하거나 다른 분자와 반응성인 분자의 부분 또는 단위를 지칭하는데 사용한다.
"할로겐"은 불소, 염소, 요오드 및 브롬을 포함한다.
본 명세서에서 "할로아실"이란 할로겐 잔기를 함유하는 아실 기를 의미하여, -C(O)CH3, -C(O)CF3, -C(O)CH2OCH3 등을 포함하나, 이에 국한되는 것은 아니다.
본 명세서에서 "할로알킬"이란 할로겐 잔기를 함유하는 일킬 기를 의미하며, -CF3 및 -CH2CF3 등을 포함하나, 이에 국한되는 것은 아니다.
본 명세서에서 "헤테로알킬"은 알킬 기 및 적어도 하나의 O, N, Si 및 S로 구성되는 군으로부터 선택되는 헤테로원자로 이루어지는 직쇄, 분지쇄 또는 시클릭 탄화수소 라디칼 또는 이들의 조합을 의미하며, 여기서 질소 및 황 원자는 임의로 산화될 수 있고, 질소는 임의로는 4급화될 수 있다. 헤테로원자 O, N, S 및 Si는 헤테로알킬기의 내부 위치 어디에나 위치할 수 있거나, 알킬 기가 분자의 나머지 부분에 부착되는 위치에 존재할 수 있다. 예는 -CH2-CH2-O-CH3, -CH2-CH2-NH-CH3, -CH2-CH2-N(CH3)-CH3, -CH2-S-CH2-CH3, -CH2-CH2-S(O)-CH3, -CH2-CH2-S(O)2-CH3, -CH=CH-O-CH3, -Si(CH3)3, -CH2-CH=N-OCH3 및 -CH=CH-N(CH3)-CH3를 포함하나, 이에 국한되는 것은 아니다. 또한, 두 개 이하의 헤테로원자가 -CH2-NH-OCH3 및 -CH2-O-Si(CH3)3에서와 같이 연속적일 수 있다..
"헤테로알킬렌"이란 헤테로알킬로부터 유도된 2가의 기를 의미하며, -CH2-CH2-S-CH2CH2- 및 -CH2-S-CH2-CH2-NH-CH2-를 포함하나, 이에 국한되는 것은 아니다. 헤테로알킬렌 기에 있어서, 동일하거나 상이한 헤테로 원자가 쇄 말단의 한 쪽 또는 양 쪽을 점유할 수 있으며, 예로서 알킬렌옥시, 알킬렌디옥시, 알킬렌아미노, 알킬렌디아미노, 아미노옥시알킬렌 등을 포함하나, 이에 국한되는 것은 아니다. 또한, 알킬렌 및 헤테로알킬렌 결합 기에 있어서, 결합 기의 화학식이 쓰여진 방향에 의해서 결합 기의 배향이 암시되지는 않는다. 예를 들어, 화학식 -C(O)2R'-는 -C(O)2R'- 및 -R'C(O)2-를 둘 다 나타낸다.
"헤테로아릴" 또는 "헤테로방향족"은 N, O 및 S로부터 선택되는 적어도 하나의 헤테로 원자를 함유하는 아릴 기로서, 여기서, 질소 및 황 원자는 임의로 산화되거나, 질소 원자는 임의로는 4급화될 수 있다. 헤테로아릴 기는 치환되거나 비치환될 수 있다. 헤테로아릴 기는 헤테로원자를 통해 분자의 나머지 부분에 부착 될 수 있다. 헤테로아릴 기의 비제한적 예는 1-피롤릴, 2-피롤릴, 3-피롤릴, 3-피라졸릴, 2-이미다졸릴, 4-이미다졸릴, 피라지닐, 2-옥사졸릴, 4-옥사졸릴, 2-페닐-4-옥사졸릴, 5-옥사졸릴, 3-이소옥사졸릴, 4-이소옥사졸릴, 5-이소옥사졸릴, 2-티아졸릴, 4-티아졸릴, 5-티아졸릴, 2-푸릴, 3-푸릴, 2-티에닐, 3-티에닐, 2-피리딜, 3-피리딜, 4-피리딜, 2-피리미딜, 4-피리미딜, 5-벤조티아졸릴, 푸리닐, 2-벤즈이미다졸릴, 5-인돌릴, 1-이소퀴놀릴, 5-이소퀴놀릴, 2-퀴녹살리닐, 5-퀴녹살리닐, 3-퀴놀릴 및 6-퀴놀릴을 포함하나, 이에 국한되는 것은 아니다.
본 명세서에서, "호모알킬"이란 탄화수소 기인 알킬 기를 의미한다.
본 명세서에서 "동일한"이란 두 개 이상의 서열이 일치하는 것을 의미한다. 또한, 실질적으로 "동일하다"는 것은 두 개 이상의 서열이 비교 윈도우 상에 최대로 일치되도록 비교 및 정렬되거나, 비교 알고리듬을 사용하여 영역을 지정하거나 매뉴얼 정렬하고 시각 검사하였을 때, 일정 퍼센트의 일치하는 연속 단위를 갖는 것을 이른다. 예를 들어, 두 개 이상의 서열이 특정 영역에 걸쳐 연속 서열 단위가 약 60% 일치, 약 70% 일치, 약 75% 일치, 약 80% 일치, 약 85% 일치, 약 90% 일치 또는 약 95% 일치할 때 "실질적으로 동일하다"라 한다. 그와 같은 퍼센트는 둘 이상의 서열의 "퍼센트 일치도"이다. 서열의 일치는 길이에 있어서 적어도 약 75 내지 100의 연속 단위인 영역, 또는 길이에 있어서 약 50개 연속 단위인 영역에 걸쳐 존재할 수 있으며, 달리 언급이 없으면, 전 서열에 걸쳐 존재할 수 있다. 예를 들어, 둘 이상의 폴리펩티드 서열은 아미노산 잔기가 동일할 때 동일하다고 하는 반면, 아미노산 잔기가 특정 영역에 걸쳐 약 60% 일치, 약 65% 일치, 약 70% 일치, 약 75% 일치, 약 80% 일치, 약 85% 일치, 약 90% 일치, 약 95% 일치할 때 "실질적으로 동일하다"라 한다. 일치는 길이에 있어서 적어도 약 75 내지 100 개 아미노산인 영역, 길이에 있어서 적어도 약 50 개 아미노산인 영역, 또는 특정되지 않은 경우, 폴리펩티드의 전 서열에 걸쳐 존재할 수 있다. 또한, 예를 들어, 둘 이상의 폴리뉴클레오티드 서열은 핵산 잔기가 일치할 때 동일하다고 하는 반면, 핵산 잔기가 특정 영역에 걸쳐 약 60% 일치, 약 65% 일치, 약 70% 일치, 약 75% 일치, 약 80% 일치, 약 85% 일치, 약 90% 일치, 약 95% 일치할 때 "실질적으로 동일하다"라 한다. 일치는 길이에 있어서 적어도 약 75 내지 100 개 핵산인 영역, 길이에 있어서 적어도 약 50 개 핵산인 영역, 또는 특정되지 않은 경우 폴리뉴클레오티드의 전 서열에 걸쳐 존재할 수 있다.
서열 비교를 위하여, 일반적으로 하나의 서열을 표준 서열로 하고, 여기에 시험 서열을 비교한다. 서열 비교 알고리듬을 사용할 때, 시험 및 표준 서열을 컴퓨터에 넣고, 필요에 따라 서브서열 좌표를 지정하고, 서열 알고리듬 프로그램 파라미터를 지정한다. 디폴트 프로그램 파라미터를 사용하거나, 다른 파라미터를 지정할 수 있다. 서열 비교 알고리듬은 프로그램 파라미터에 기초하여 표준 서열에 대한 시험 서열의 퍼센트 일치도를 계산한다.
본 명세서에서 "면역원성"이란 치료 약물의 투여에 대한 항체 반응을 이르는 것이다. 치료용 비-천연 아미노산 폴리펩티드에 대한 면역원성은 생물 체액 중 항-비-천연 아미노산 폴리펩티드 항체의 검출을 위한 정성 및 정량 분석을 통하여 얻을 수 있다. 그와 같은 분석법은 방사성 면역분석 (RIA), 효소-결합 면역흡수 분 석 (ELISA), 발광 면역분석 (LIA), 형광 면역분석 (FIA)을 포함하나, 이에 국한되는 것은 아니다. 치료용 비-천연 아미노산 폴리펩티드에 대한 면역원성의 분석은 치료용 천연 아미노산 폴리펩티드를 투여할 때의 항체 반응에 대하여 치료용 비-천연 아미노산 폴리펩티드를 투여할 때의 항체 반응을 비교하는 것을 포함한다.
본 명세서에서 "인터캘레이팅제" 또는 "인터캘레이팅 기"는 한 분자의 분자내 공간 또는 분자들 사이의 분자간 공간에 삽입될 수 있는 화학종을 이른다. 인터캘레이팅제는 DNA 이중 나선 구조의 쌓여진 틈으로 삽입될 수 있는 분자일 수 있다.
"단리된"이란 관심이 없는 성분으로부터 관심있는 성분을 분리 및 회수하는 것을 이른다. 단리된 물질은 건조, 반건조 또는 수용액 등에 용해된 상태일 수 있다. 단리된 성분은 균질한 상태이거나, 추가의 약제학적으로 허용가능한 담체 및(또는) 부형제를 포함하는 약제학적 조성물의 일부일 수 있다. 순도 및 균질도는 비제한적인 예로서 폴리아크릴아미드 겔 전기영동, 고성능 액체 크로마토그래피를 포함하는 분석화학 기술로 측정할 수 있다. 또한, 목적하는 성분이 분리되고 제제중에 우세한 종으로 존재할 때 성분이 실질적으로 정제되었다고 한다. 본 명세서에서 "정제된"이란 목적하는 성분이 약 85% 순수, 약 90% 순수, 약 95% 순수, 약 99% 또는 그 이상으로 순수하다는 것을 말한다. 예를 들어, 핵산 또는 단백질은 천연 상태에서 함께 존재했던 세포 성분이 적어도 어느 정도 제거되었을 때 또는 생체내 또는 시험관내 농도보다 더 큰 정도로 농축되었을 때 "단리되었다"라 한다. 예를 들어, 유전자는 그를 플랭킹하고 목적하는 유전자 이외의 단백질을 코딩하는 오픈 리딩 프레임으로부터 분리되었을 때 단리되었다고 한다.
"표지"란 화합물내로 삽입되어 쉽게 검출됨으로써 그의 물리적 분포가 검출 및(또는) 모니터링될 수 있는 물질을 이른다.
본 명세서에서 "결합"이란 링커의 관능기와 다른 분자 사이의 화학적 반응으로부터 형성된 결합 또는 화학적 잔기를 이른다. 그 결합은 비제한적으로는 공유 결합 및 비공유결합을 포함할 수 있는 한편, 각각의 화학적 잔기는 에스테르, 카르보네이트, 이민 포스페이트 에스테르, 히드라존, 아세탈, 오르토에스테르, 펩티드 결합 및 올리고뉴클레오티드 결합을 포함하나, 이에 국한되는 것은 아니다. 가수분해적으로 안정한 결합은 결합이 물 중에서 본질적으로 안정하며, 비제한적인 예로서 생리적 조건과 같은 유용한 pH 범위에서 물과 장기간 동안, 가능하게는 영원히반응하지 않는 것을 말한다. 가수분해적으로 불안정 또는 분해가능한 결합은 결합이 물 또는 예컨대 혈액과 같은 수성 용액중에서 분해되는 것을 말한다. 효소적으로 불안정 또는 분해가능한 결합은 결합이 하나 이상의 효소에 의해 분해될 수 있는 것을 말한다. 예컨대, PEG 및 관련 중합체는 중합체 골격 중에 또는 중합체 골격과 중합체 분자의 말단의 하나 이상의 관능기 사이에서 링커 중에 분해가능한 기를 가질 수 있다. 그와 같은 분해가능한 기는 비제한적인 예로서 PEG 카르복실산 또는 활성화된 PEG 카르복실산과 생물학적 활성제 상의 알콜의 반응에 의해 생성된 에스테르 결합을 포함할 수 있으며, 그러한 에스테르 기는 일반적으로 생리적 조건하에 가수분해되어 생물학적 활성제를 방출한다. 다른 가수분해적으로 분해가능한 결합은 비제한적인 예로서 카로보네이트 결합; 아민과 알데히드의 반응에 의 한 이민 결합; 알콜과 포스페이트 기의 반응에 의한 포스페이트 에스테르 결합; 히드라지드와 알데히드의 반응 산물인 히드라존; 알데히드와 알콜의 반응 산물인 아세탈; 포르메이트와 알콜의 반응 산물인 오르토에스테르 결합; 비제한적인 예로서 PEG와 같은 중합체의 말단의 아미노 기와 펩티드의 카르복실 기의 반응 산물인 펩티드 결합; 비제한적인 예로서 중합체 말단의 포스포르아미다이트 기와 올리고뉴클레오티드의 5' 히드록실 기에 의해 형성된 올리고뉴클레오티드 결합을 포함하나, 이에 국한되는 것은 아니다.
본 명세서에서 "배지"는 세포 및(또는) 그에 의해 발현 및(또는) 방출되는 생성물을 생육 및 수확하는데 사용되는 임의의 배양 배지를 이른다. 그와 같은 배지는 비제한적인 예로서 세균 숙주세포, 효모 숙주세포, 곤충 숙주세포, 식물 숙주세포, 진핵 숙주세포, 포유류 숙주세포, CHO 세포, 원핵 숙주세포, 이. 콜라이 또는 슈도모나스 숙주세포를 지지 또는 함유할 수 있는 용액, 고체, 반고체, 또는 경질 지지체를 의미한다. 그러한 배지는 또한 비제한적인 예로서 세포내 생산된 폴리펩티드 및 숙주세포가 용해되고 파괴되어 방출한 숙주세포 용해물을 함유하는 완충액 또는 시약을 포함한다.
"대사물질"이란 비제한적인 예로서 천연 아미노산 폴리펩티드, 비-천연 아미노산 폴리펩티드, 변형된 천연 아미노산 폴리펩티드 또는 변형된 비-천연 아미노산 폴리펩티드가 대사될 때 형성되는, 천연 아미노산 폴리펩티드, 비-천연 아미노산 폴리펩티드, 변형된 천연 아미노산 폴리펩티드 또는 변형된 비-천연 아미노산 폴리펩티드와 같은 화합물의 유도체를 이른다. "약제학적으로 활성인 대사물질" 또는 "활성 대사물질"은 비제한적인 예로서 천연 아미노산 폴리펩티드, 비-천연 아미노산 폴리펩티드, 변형된 천연 아미노산 폴리펩티드 또는 변형된 비-천연 아미노산 폴리펩티드가 대사될 때 형성되는, 천연 아미노산 폴리펩티드, 비-천연 아미노산 폴리펩티드, 변형된 천연 아미노산 폴리펩티드 또는 변형된 비-천연 아미노산 폴리펩티드와 같은 화합물의 생물학적으로 활성인 유도체를 이른다.
본 명세서에서 "대사된"이란 특정 물질이 생물체에 의해 변화되는 과정의 총합을 의미한다. 그와 같은 과정은 비제한적인 예로서 가수분해 반응 및 효소에 의해 촉매화되는 반응을 의미한다. 대사에 관한 추가의 정보는 문헌[The Pharmacological Basis of Therapeutics, 9th Edition, McGraw-Hill (1996)]으로부터 얻을 수 있다. 예컨대, 천연 아미노산 폴리펩티드, 비-천연 아미노산 폴리펩티드, 변형된 천연 아미노산 폴리펩티드 또는 변형된 비-천연 아미노산 폴리펩티드의 대사물질은 숙주에 천연 아미노산 폴리펩티드, 비-천연 아미노산 폴리펩티드, 변형된 천연 아미노산 폴리펩티드 또는 변형된 비-천연 아미노산 폴리펩티드를 투여하고 숙주로부터의 조직 샘플을 분석하거나, 천연 아미노산 폴리펩티드, 비-천연 아미노산 폴리펩티드, 변형된 천연 아미노산 폴리펩티드 또는 변형된 비-천연 아미노산 폴리펩티드를 시험관 내에서 간세포와 함께 인큐베이션시킨 후 생성된 화합물을 분석하여 확인할 수 있다.
"금속 킬레이트제"는 금속 이온과 함께 금속 착물을 형성하는 분자를 이른다. 그와 같은 분자는, 예를 들어, 중심 금속 이온과 함께 2개 이상의 배위 결합을 형성하며 고리 구조를 형성할 수 있다.
"금속-함유 잔기"는 금속 이온, 원자 또는 입자를 함유하는 기를 이른다. 그와 같은 잔기는 비제한적인 예로서 시스플라틴, 킬레이트된 금속 이온(예를 들어, 니켈, 철 및 백금), 금속 나노입자(예를 들어, 니켈, 철 및 백금)을 포함한다.
"중량급 원자를 포함하는 잔기"는 일반적으로 탄소 보다 무거운 원자의 이온을 포함하는 기를 의미한다. 그와 같은 이온 또는 원자는 비제한적인 예로서 실리콘, 텅스텐, 금, 납 및 우라늄을 포함한다.
본 명세서에서 "변형된"이란 천연 아미노산, 비-천연 아미노산, 천연 아미노산 폴리펩티드 또는 비-천연 아미노산 폴리펩티드에 변화가 존재하는 것을 의미한다. 그와 같은 변화, 또는 변형은 천연 아미노산, 비-천연 아미노산, 천연 아미노산 폴리펩티드 또는 비-천연 아미노산 폴리펩티드를 합성 후에 변형시키거나, 천연 아미노산, 비-천연 아미노산, 천연 아미노산 폴리펩티드 또는 비-천연 아미노산 폴리펩티드를 번역과 동시에 또는 번역 후에 변형시켜 얻을 수 있다. "변형되거나 비변형된"이란 논의되는 천연 아미노산, 비-천연 아미노산, 천연 아미노산 폴리펩티드 또는 비-천연 아미노산 폴리펩티드가 임의로 변형되는 것, 다시 말해서, 천연 아미노산, 비-천연 아미노산, 천연 아미노산 폴리펩티드 또는 비-천연 아미노산 폴리펩티드가 변형되거나 변형되지 않을 수 있다는 것을 의미한다.
본 명세서에서 "조절된 혈청 반감기"는 변형된 생물학적 활성 분자의 비-변형된 형태와 비교한 순환 반감기의 양성적 또는 음성적 변화를 말한다. 예를 들어, 변형된 생물학적 활성 분자는 비제한적인 예로서 천연 아미노산, 비-천연 아미노산, 천연 아미노산 폴리펩티드 또는 비-천연 아미노산 폴리펩티드를 포함한다. 예컨대, 혈청 반감기는 생물학적 활성 분자 또는 변형된 생물학적 활성 분자를 투여한 후 여러 시간대에서 혈액 샘플을 취하고, 각 샘플에서 그 분자의 농도를 측정함으로써 측정될 수 있다. 혈청 농도와 시간과의 상관 관계로 혈청 반감기를 계산할 수 있다. 예를 들어, 조절된 혈청 반감기는 증가될 수 있으며, 이때 투약 계획을 개선시키거나 독성 효과를 피할 수 있다. 혈청 반감기의 그와 같은 증가는 적어도 약 2배, 적어도 약 3배, 적어도 약 5배 또는 적어도 약 10배일 수 있다. 혈청 반감기의 증가를 평가하는 비제한적인 예가 실시예 88 내지 92에 주어져 있다. 이 방법은 어느 폴리펩티드의 혈청 반감기를 측정하는데나 사용할 수 있다.
본 명세서에서 "조절된 치료 반감기"란 치료 유효량의 변형된 생물학적 활성 분자의 그의 비변형된 형태와 비교한 반감기에 있어서의 양성적 또는 음성적 변화를 의미한다. 예를 들어, 변형된 생물학적 활성 분자는 천연 아미노산, 비-천연 아미노산, 천연 아미노산 폴리펩티드 또는 비-천연 아미노산 폴리펩티드를 포함하나, 이에 국한되는 것은 아니다. 예컨대, 치료 반감기는 투여 후 여러 시간대에서 분자의 약물동태학 및 약물역학적 특성을 측정하여 측정할 수 있다. 증가된 치료 반감기는 유리한 투약 계획, 유리한 총 투여량을 가능하게 하며, 부작용을 피할 수 있게 한다. 예를 들어, 증가된 치료 반감기는 증가된 강도, 변형된 분자의 그의 표적에 대한 결합의 증가 또는 감소, 다른 파라미터 또는 비-변형된 분자의 작용 메카니즘의 증가 또는 감소, 또는 프로테아제와 같은 효소에 의한 분자의 분해의 증가 또는 감소에 기인한다. 치료 반감기의 증가를 평가하는 방법의 비제한적인 예는 실시예 88 내지 92에 주어졌다. 이 방법은 어느 폴리펩티드의 치료 반감기를 측정하는데나 사용할 수 있다.
본 명세서에서 "나노입자"란 입자 크기가 약 500 nm 내지 약 1 nm인 입자를 말한다.
본 명세서에서 "화학양론에 근사한"이란 화학 반응에 참여하는 화합물의 몰 비율이 약 0.75 내지 약 1.5인 것을 의미한다.
본 명세서에서 "비-진핵"이란 비-진핵 생물을 이른다. 예로서, 비-진핵생물은 진정세균 계통 영역, 비제한적인 예로서, 에스케리치아 콜라이(Escherichia coli), 써무스 써모필러스(Thermus thermophilus) 또는 바실러스 스테아로써모필러스(Bacillus stearothermophilus), 슈도모나스 플루오레센스(Pseudomonas fluorescens), 슈도모나스 에어루기노사 (Pseudomonas aeruginosa), 슈도모나스 푸티다(Pseudomonas putida); 또는 시원세균 계통 영역, 비제한적인 예로서, 메타노코커스 자나쉬(Methanococcus jannaschii), 메타노박테리움 써모오토트로피쿰( Methanobacterium thermoautotrophicum), 아키오글로버스 풀지두스(Archaeoglobus fulgidus), 파이로코커스 퓨리오수스(Pyrococcus furiosus), 파이로코커스 호리코시(Pyrococcus horikoshii), 이유로피럼 페르닉스(Aeuropyrum pernix); 또는 할로박테리아, 예컨대, 하로페락스 볼카니 (Haloferax volcanii) 및 할로박테리움 종 NRC-1에 속할 수 있다.
"비-천연 아미노산"은 20가지 통상의 아미노산 또는 파이로리신 또는 셀레노시스테인이 아닌 아미노산을 이른다. "비-천연 아미노산"과 유사한 의미로 사용될 수 있는 다른 용어는 "비-천연적으로 코딩되는 아미노산," "비자연 아미노산," "자 연적으로 존재하지 않는 아미노산" 등으로, 하이픈을 사용하거나 사용하지 않은 각종 변화된 형태로 사용될 수 있다. "비-천연 아미노산"은 비제한적인 예로서 천연적으로 코딩되는 아미노산 (비제한적인 예로서 20가지 통상의 아미노산 또는 파이로리신 또는 셀레노시스테인)의 변형에 의해 자연적으로 생겨나나 그 자체가 번역계에 의해 성장하는 폴리펩티드 내로 삽입되지는 않는 아미노산을 포함한다. 천연적으로 코딩되지 않는 천연 아미노산의 예는 N-아세틸글루코사미닐-L-세린, N-아세틸글루코사미닐-L-트레오닌, 및 O-포스포티로신을 포함하나, 이에 국한되는 것은 아니다. 또한, "비-천연 아미노산"은 천연적으로 발생하지 않으며 합성하여 얻거나 비-천연 아미노산을 변형시켜 얻을 수 있는 아미노산을 포함한다.
"핵산"이란 데옥시리보뉴클레오티드, 데옥시리보뉴클레오시드, 리보뉴클레오시드, 리보뉴클레오티드 및 단일- 또는 이중 가닥 형태의 그들의 중합체를 의미한다. 예를 들어, 그와 같은 핵산 및 핵산 중합체는 (i) 표준 핵산과 유사한 결합 특성을 가지며 천연 뉴클레오티드와 유사한 방식으로 대사되는 천연 뉴클레오티드의 유사체; (ii) PNA (펩티도핵산), 안티센스 기술에 사용되는 DNA 유사체 (포스포로티오에이트, 포스포로아미데이트, 등)와 같은 올리고뉴클레오티드 유사체; (iii) 그들의 보존적으로 변형된 변이체 (비제한적인 예로서 축퇴된 코돈 치환) 및 상보적 서열 및 명확히 특정된 서열을 포함하나, 이에 국한되는 것은 아니다. 축퇴 코돈 치환은 하나 이상의 선택된(또는 모든) 코돈의 제3 위치가 혼합-염기 및(또는) 데옥시이노신 잔기로 치환된 서열을 생성시켜 얻을 수 있다[참조: Batzer et al., Nucleic Acid Res. 19:5081 (1991); Ohtsuka et al., J. Biol. Chem. 260:2605- 2608 (1985); and Rossolini et al., MoI. Cell. Probes 8:91-98 (1994))].
"산화제"는 산화되는 화합물로부터 전자를 제거할 수 있는 화합물 또는 물질을 의미한다. 산화제의 예는 산화된 글루타티온, 시스틴, 시스타민, 산화된 디티오트레이톨, 산화된 에리트레이톨 및 산소를 포함하나, 이에 국한되는 것은 아니다. 아주 다양한 종류의 산화제가 본 명세서에 기재된 방법 및 조성물에 적절히 사용될 수 있다.
"약제학적으로 허용가능한"이란 비제한적인 예로서 염, 담체 또는 부형제를 포함하는 물질을 말하며, 이들은 화합물의 생물학적 활성 또는 특성을 방해하지 않고, 비교적 비독성, 다시 말해서, 개체에 투여할 때 바람직하지 않은 생물학적 효과를 나타내거나 그것이 함유된 조성물 중 어떠한 성분과 유해한 방식으로 상호작용하지 않는다.
본 명세서에서 "광친화도 표지"란 빛에 노출되었을 때 그것이 친화성을 나타내는 분자와 결합을 형성하는 기를 갖는 표지를 말한다. 그와 같은 결합은 공유 결합 또는 비공유결합일 수 있다.
"포토케이지드 잔기"란 특정 파장으로 조사할 때 다른 이온 또는 분자와 공유 또는 비-공유 결합하는 기를 말한다.
"광분해가능한"이란 빛에 노출될 때 파괴되는 기를 의미한다.
본 명세서에서 "광가교결합제"는 빛에 노출될 때 반응성으로 되어 둘 이상의 단량체 또는 중합체 분자와 공유 결합 또는 비-공유 결합을 형성하는 둘 이상의 관능기를 갖는 화합물을 의미한다.
본 명세서에서 "광이성화가능한 잔기"는 빛을 조사할 때 하나의 이성질체에서 다른 이성질체로 변화하는 기를 이른다.
본 명세서에서 "폴리알킬렌 글리콜"은 직쇄 또는 분지쇄 중합체성 폴리에테르 폴리올을 이른다. 그와 같은 폴리알킬렌 글리콜의 비제한적인 예는 폴리에틸렌 글리콜, 폴리프로필렌 글리콜, 폴리부틸렌 글리콜 및 그들의 유도체를 포함한다. 다른 예시적 실시태양은, 예를 들어, 시판 제품의 카탈로그(예를 들어, Shearwater Corporation's catalog "Polyethylene Glycol and Derivatives for Biomedical Applications" (2001))에서 찾아볼 수 있다. 예를 들어, 그와 같은 중합체성 폴리에테르 폴리올의 평균 분자량은 약 0.1 kDa 내지 약 100 kDa이다. 예를 들어, 그와 같은 중합체성 폴리에테르 폴리올의 평균 분자량은 약 100 Da 내지 약 100,000 Da 또는 그 이상이다. 중합체의 분자량은 약 100 Da 내지 약 100,000 Da 범위로서, 비제한적으로는, 100,000 Da, 95,000 Da, 90,000 Da, 85,000 Da, 80,000 Da, 75,000 Da, 70,000 Da, 65,000 Da, 60,000 Da, 55,000 Da, 50,000 Da, 45,000 Da, 40,000 Da, 35,000 Da, 30,000 Da, 25,000 Da, 20,000 Da, 15,000 Da, 10,000 Da, 9,000 Da, 8,000 Da, 7,000 Da, 6,000 Da, 5,000 Da, 4,000 Da, 3,000 Da, 2,000 Da, 1,000 Da, 900 Da, 800 Da, 700 Da, 600 Da, 500 Da, 400 Da, 300 Da, 200 Da 및 100 Da이다. 일부 실시태양에서, 중합체의 분자량은 약 100 Da 내지 50,000 Da이다. 일부 실시태양에서, 중합체의 분자량은 약 100 Da 내지 40,000 Da이다. 일부 실시태양에서, 중합체의 분자량은 약 1,000 Da 내지 40,000 Da이다. 일부 실시태양에서, 중합체의 분자량은 약 5,000 Da 내지 40,000 Da이다. 일부 실시태양에 서, 중합체의 분자량은 약 10,000 Da 내지 40,000 Da이다. 일부 실시태양에서, 폴리에틸렌 글리콜 분자는 분지된 중합체이다. 분지쇄 PEG의 분자량은 약 1,000 Da 내지 약 100,000 Da 범위일 수 있으며, 비제한적으로는 100,000 Da, 95,000 Da, 90,000 Da, 85,000 Da, 80,000 Da, 75,000 Da, 70,000 Da, 65,000 Da, 60,000 Da, 55,000 Da, 50,000 Da, 45,000 Da, 40,000 Da, 35,000 Da, 30,000 Da, 25,000 Da, 20,000 Da, 15,000 Da, 10,000 Da, 9,000 Da, 8,000 Da, 7,000 Da, 6,000 Da, 5,000 Da, 4,000 Da, 3,000 Da, 2,000 Da 및 1,000 Da이다. 일부 실시태양에서, 분지쇄 PEG의 분자량은 약 1,000 Da 내지 50,000 Da이다. 일부 실시태양에서, 분지쇄 PEG의 분자량은 약 1,000 Da 내지 40,000 Da이다. 일부 실시태양에서, 분지쇄 PEG의 분자량은 약 5,000 Da 내지 40,000 Da이다. 일부 실시태양에서, 분지쇄 PEG의 분자량은 약5,000 Da 내지 20,000 Da이다.
본 명세서에서 "중합체"란 반복되는 소단위로 이루어지는 분자를 이른다. 그와 같은 분자는 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드, 폴리사카라이드 또는 폴리알킬렌 글리콜을 포함하나, 이에 국한되는 것은 아니다.
"폴리펩티드," "펩티드" 및 "단백질"은 아미노산 잔기의 중합체를 말한다. 즉, 폴리펩티드에 대한 기술 사항은 동등하게 펩티드 및 단백질에도 적용되며, 반대의 경우도 마찬가지이다. 이 용어는 천연 아미노산 중합체 뿐만 아니라 하나 이상의 아미노산 잔기가 비-천연 아미노산인 아미노산 중합체에도 사용된다. 또한, 그러한 "폴리펩티드," "펩티드" 및 "단백질"은 전장 단백질을 포함하여, 아미노산 잔기들이 공유 펩티드 결합에 의해 연결되어 있는 어떠한 길이의 아미노산 사슬이 나 포함한다.
"번역 후 변형된"이란 천연 또는 비-천연 아미노산이 폴리펩티드 쇄내로 번역되어 삽입된 후에 일어난 변형을 이른다. 그와 같은 변형은 번역과 동시의 생체내 변형, 번역과 동시의 시험관내 변형 (예, 무세포 번역계), 번역 후 생체내 변형, 번역 후 시험관내 변형을 포함하나, 이에 국한되는 것은 아니다.
본 명세서에서 "전구약물" 또는 "약제학적으로 허용가능한 전구약물"이란 생체내 또는 시험관내에서 패런트 약물로 전환되는 화합물로서, 이들은 화합물의 생물학적 활성 또는 특성을 방해하지 않고, 비교적 비독성, 다시 말해서, 개체에 투여할 때 바람직하지 않은 생물학적 효과를 나타내거나 그것이 함유된 조성물 중 어떠한 성분과 유해한 방식으로 상호작용하지 않는다. 전구약물은 일반적으로 개체내에 투여되어 흡수된 후에 대사 경로에 따른 전환과 같은 과정을 통해 활성 또는 보다 활성인 종으로 전환되는 약물 전구체이다. 몇몇 전구약물은 그를 보다 덜 활성이게 하고/하거나 약물에 용해도 또는 다른 특성을 부여하는 기를 가질 수 있다. 그러한 화학적 기가 전구약물로부터 절단 또는 변형되면 활성 약물이 생성된다. 전구약물은 효소 또는 비효소적 반응을 통해 체내에서 활성 약물로 전환된다. 전구약물은 우수한 용해도, 향상된 전달 특성, 예컨대 특정 세포, 조직, 기관 또는 리간드를 특이적으로 표적화하는 것, 개선된 치료 효과와 같은 개선된 생리화학적 특성을 제공한다. 그와 같은 전구약물의 잇점은 (i) 패런트 약물에 비교하여 투여의 용이성, (ii) 패런트 약물이 그러하지 않는 반면, 전구약물은 경구 투여시 생이용성이 있음, (iii) 패런트 약물에 비교하여 전구약물은 약제학적 조성물 중에서 개선된 용해도를 나타낸다는 것이다. 전구약물은 활성 약물의 약물학적으로 비활성, 감소된 활성의 유도체를 포함한다. 전구약물은 약물의 물리화학적, 생약학적 또는 약물동태학적 특성을 조작하여 목적하는 작용 위치에 도달하는 약물 또는 생물학적 활성 분자의 양을 조절하도록 설계될 수 있다. 비제한적인 예로서, 전구약물은 수용성이 이동도에 치명적인 세포막 통과를 촉진하기 위하여 에스테르("전구약물")로 투여되고, 일단 수용성인 것이 유리한 세포 안에서는 활성 종인 카르복실산으로 대사 가수분해되는 비-천연 아미노산 폴리펩티드일 수 있다. 전구약물은 위치-특이적 조직으로 약물 수송을 증진시키는 변형제로 사용하기 위한, 가역적 약물 유도체로 설계될 수 있다.
본 명세서에서 "예방적 유효량"이란 치료되는 질병, 증상 또는 장애의 하나 이상의 증상을 완화시키도록 환자에 예방적으로 투여되는, 적어도 하나의 천연 아미노산 폴리펩티드 또는 적어도 하나의 비-천연 아미노산 폴리펩티드를 함유하는 조성물의 양이다. 예방적 용도에서, 유효량은 환자의 건강 상태, 체중 등에 따라 달라질 수 있다. 투여량 증가 임상 시험과 같은 통상의 시험으로 예방적 유효량을 결정하는 것은 당업자의 기술 범위내이다.
"보호된"이란 특정 반응 조건하에 화학적으로 반응성인 관능기가 반응하는 것을 막는 "보호기" 또는 잔기가 존재하는 것을 말한다. 보호기는 보호되는 화학적으로 반응성인 기의 종류에 따라 달라질 것이다. 예를 들어, (i) 화학적으로 반응성인 기가 아민 또는 히드라지드인 경우, 보호기는 tert-부틸옥시카르보닐(t-Boc) 및 9-플루오레닐메톡시카르보닐(Fmoc)로부터 선택되고; (ii) 화학적으로 반 응성인 기가 티올인 경우, 보호기는 오르쏘피리딘디술피드일 수 있고; (iii) 화학적으로 반응성인 기가 부탄산, 프로판산과 같은 카르복실산, 또는 히드록시인 경우 보호기는 벤질 또는 메틸, 에틸 또는 tert-부틸과 같은 알킬일 수 있다.
예를 들어, 차단/보호기는 하기로부터 선택될 수 있다.
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또한, 보호기는 Nvoc 및 MeNvoc과 같은 광불안정기 및 기타 당업계에 공지된 보호기를 포함하나, 이에 국한되는 것은 아니다. 다른 보호기는 전문이 본 명세서에 포함되는 문헌[Greene and Wuts, Protective Groups in Organic Synthesis, 3rd Ed., John Wiley & Sons, New York, NY, 1999]에 기재되어 있다.
본 명세서에서 "방사성 잔기"는 그의 핵이 알파, 베타, 감마 입자와 같은 핵 방사선을 자발적으로 방출하는 기로서, 알파 입자는 헬륨 핵이고, 베타 입자는 전자이며, 감마 입자는 고에너지 광자이다.
"반응성 화합물"은 적절한 조건하에 다른 원자, 분자 또는 화합물과 반응성을 나타내는 화합물이다.
본 명세서에서 "재조합 숙주세포" 또는 "숙주세포"는 외래 폴리뉴클레오티드 를 포함하는 세포이며, 외래 폴리뉴클레오티드를 세포에 삽입하는 방법은 직접 수용, 트랜스덕션, f-메이팅 또는 기타 당업계에 알려진 재조합 숙주세포 생성 방법을 포함하나, 이에 국한되는 것은 아니다. 예를 들어, 외래 폴리뉴클레오티드는 플라스미드 등을 포함하는 비통합 벡터이거나, 또는 숙주 게놈 내로 통합될 수 있다.
"산화-환원 활성제"란 다른 분자를 산화 또는 환원시키며, 그에 따라 자신이 환원 또는 산화되는 분자를 이른다. 산화-환원 활성제는 페로센, 퀴논, Ru2+/3+ 착물, Co2+/3+ 착물, Os2+/3+ 착물을 포함하나, 이에 국한되는 것은 아니다.
"환원제"란 환원되는 화합물에 전자를 더해주는 화합물 또는 물질을 말한다. 환원제의 예는 디티오트레이톨 (DTT), 2-머캅토에탄올, 디티오에리트리톨, 시스테인, 시스테아민 (2-아미노에탄티올), 및 환원된 글루타티온을 포함하나, 이에 국한되는 것은 아니다. 그와 같은 환원제는 술프히드릴 기를 환원된 상태로 유지하기 위하여 또는 분자내 또는 분자간 디술파이드 결합을 환원시키는데 사용될 수 있다.
본 명세서에서 "재접힘"이란 부적절하게 접혀진 또는 펼쳐진 상태를 천연적인 또는 적절하게 접혀진 형태로 변환시키는 과정, 반응 또는 방법을 이른다. 예를 들어, 재접힘은 디술파이드 결합 함유 폴리펩티드를 부적절하게 접혀진 또는 펼쳐진 상태에서 디술파이드 결합과 관련하여 천연적인 또는 적절하게 접혀진 형태로 변환시키는 것이다. 그와 같은 디술파이드 결합 함유 폴리펩티드는 천연 아미노산 또는 비-천연 아미노산 폴리펩티드일 수 있다.
본 명세서에서 "수지"란 고분자량 불용성 중합체 비드를 말한다. 예를 들 어, 그와 같은 비드는 고체상 펩티드 합성의 지지체로서 또는 정제 전 분자를 부착하는 위치로서 사용될 수 있다.
본 명세서에서 "사카라이드"는 당, 모노사카라이드, 올리고사카라이드 및 폴리사카라이드를 포함하는 일련의 탄수화물을 이른다.
본 명세서에서 "안전성" 또는 "안전성 프로파일"은 약물이 투여된 횟수와 관련하여 약물의 투여와 관련될 수 있는 부작용을 이르는 것이다. 예를 들어, 약물이 다수 회 투여되고 부작용이 단지 약하거나 없었다면 그 약물은 우수한 안전성 프로파일을 가진 것이다. 안전성 프로파일을 평가하는 방법의 비제한적인 예는 실시예 92에 주어졌다. 이 방법은 어느 폴리펩티드의 안전성 프로파일을 측정하는데나 사용할 수 있다.
본 명세서에서 "선택적으로 혼성화하는" 또는 "특이적으로 혼성화하는"이란 총 세포성 또는 라이브러리 DNA 또는 RNA를 포함하는 복잡한 혼합물 중에 서열이 존재할 때, 엄격한 혼성화 조건하에 어떤 분자가 그 특정 뉴클레오티드 서열에 결합, 이중가닥화 또는 혼성화되는 것을 이른다.
"스핀 표지"란 쌍을 이루지 않은 전자 스핀(즉, 안정한 파라자성 기)을 나타내는 원자 또는 원자군을 함유하는 분자로서, 전자스핀 공명 스펙트럼 분석으로 검출될 수 있고 다른 분자에 부착될 수 있는 것을 말한다. 그와 같은 스핀 표지 분자는 비제한적인 예로서 니트릴 라디칼 및 니트록시드를 포함하며, 단일 스핀 표지 또는 이중 스핀 표지일 수 있다.
"화학양론적"이란 화학 반응에 참여하는 화합물의 몰비가 약 0.9 내지 약 1.1인 것을 이른다.
"화학양론-유사"란 화학 반응이 반응 조건의 변화 또는 첨가제의 존재하에 화학양론 또는 그에 근사하게 되는 것을 이른다. 반응 조건에 있어서의 변화는 온도의 증가 또는 pH의 변화를 포함하나, 이에 국한되는 것은 아니다. 첨가제로서는, 비제한적인 예로서 가속화제를 들 수 있다.
본 명세서에서 "엄격한 혼성화 조건"이란 DNA, RNA, PNA 또는 다른 핵산 미믹의 서열 또는 이들의 조합을 낮은 이온 강도 및 고온의 조건하에 혼성화시키는 것을 이른다. 예를 들어, 엄격한 조건하에 프로브는 핵산 (비제한적으로 총 세포 또는 라이브러리 DNA 또는 RNA 포함)의 복잡한 혼합물 중 표적 서열에는 혼성화되나, 그 혼합물 중의 다른 서열에는 혼성화되지 않는다. 엄격한 조건은 서열-의존적이며, 다른 환경에서는 달라질 것이다. 예를 들어, 보다 긴 서열은 고온에서 특이적으로 혼성화한다. 엄격한 조건의 비제한적인 예로서 (i) 정의된 이온 강도 및 pH에서 특정 서열에 대한 융점 보다 약 5 내지 10 ℃ 낮은 온도; (ii) 약 pH 7.0 내지 약 pH 8.3에서 염 농도 약 0.01 M 내지 약 1.0 M 및 짧은 프로브 (예를 들어, 10 내지 50개 뉴클레오티드 포함)에 대해서는 적어도 약 30 ℃, 긴 프로브 (50 개를 넘는 뉴클레오티드 포함)에 대해서는 약 60℃ 이상; (iii) 비제한적인 예로서, 포름알데히드 등을 포함하는 탈안정화제의 첨가, (iv) 50% 포름아미드, 5X SSC, 및 1% SDS, 42 ℃에서 인큐베이션, 또는 5X SSC, 1% SDS, 65 ℃에서 인큐베이션, 및 0.2X SSC, 및 0.1% SDS, 65 ℃에서 약 5분 내지 약 120분 동안의 세척을 포함한다. 예컨대, 선택적 또는 특이적 혼성화의 검출은 백그라운드의 적어도 두 배에 이르는 양성 신호를 포함한다. 핵산 혼성화에 대한 광범위한 정보가 문헌[Tijssen, Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Hybridization with Nucleic Probes, "Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid assays" (1993)]에 기재되어 있다.
"개체"란 치료, 관찰 또는 실험의 대상이 되는 동물을 이른다. 예를 들어, 개체는 비제한적인 예로서 인간을 포함하는 포유류일 수 있다.
본 명세서에서 "실질적으로 정제된"이란 관심있는 성분에서 정제 전에 일반적으로 그에 부수하거나 상호작용하는 다른 성분이 실질적으로 또는 본질적으로 제거된 상태를 이른다. 예를 들어, 관심있는 성분은 그의 제제가 오염 성분을 약 30% 미만, 약 25% 미만, 약 20% 미만, 약 15% 미만, 약 10% 미만, 약 5% 미만, 약 4% 미만, 약 3% 미만, 약 2% 미만, 또는 약 1% (건조 중량) 미만으로 함유할 때, 실질적으로 정제되었다고 할 수 있다. 예를 들어, 천연 아미노산 폴리펩티드 또는 비-천연 아미노산 폴리펩티드는 자연 세포, 또는 재조합 생산된 천연 아미노산 폴리펩티드 또는 비-천연 아미노산 폴리펩티드일 경우에는 숙주세포로 부터 정제될 수 있다. 예를 들어, 천연 아미노산 폴리펩티드 또는 비-천연 아미노산 폴리펩티드의 제제는 그 제제가 오염 성분을 약 30% 미만, 약 25% 미만, 약 20% 미만, 약 15% 미만, 약 10% 미만, 약 5% 미만, 약 4% 미만, 약 3% 미만, 약 2% 미만, 또는 약 1% (건조 중량) 미만으로 함유할 때, 실질적으로 정제되었다고 할 수 있다. 예를 들어, 천연 아미노산 폴리펩티드 또는 비-천연 아미노산 폴리펩티드가 숙주세포에 의해 재조합 생산될 때, 천연 아미노산 폴리펩티드 또는 비-천연 아미노산 폴리 펩티드는 세포 건조 중량의 약 30%, 약 25%, 약 20%, 약 15%, 약 10%, 약 5%, 약 4%, 약 3%, 약 2%, 또는 약 1% 또는 그 미만으로 존재할 수 있다. 예를 들어, 천연 아미노산 폴리펩티드 또는 비-천연 아미노산 폴리펩티드가 숙주세포에 의해 재조합 생산될 때, 천연 아미노산 폴리펩티드 또는 비-천연 아미노산 폴리펩티드는 배양 배지 중에 세포 건조 중량으로 약 5g/L, 약 4g/L, 약 3g/L, 약 2g/L, 약 lg/L, 약 750mg/L, 약 500mg/L, 약 250mg/L, 약 100mg/L, 약 50mg/L, 약 10mg/L 또는 약 lmg/L 또는 그 미만으로 존재할 수 있다. 예를 들어, "실질적으로 정제된" 천연 아미노산 폴리펩티드 또는 비-천연 아미노산 폴리펩티드의, 비제한적인 예로서 SDS/PAGE 분석, RP-HPLC, SEC, 및 모세관 전기영동 등의 적절한 방법으로 측정한 순도는 약 30%, 약 35%, 약 40%, 약 45%, 약 50%, 약 55%, 약 60%, 약 65%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 약 99% 또는 그 이상일 수 있다.
"치환기" 또는 "비-간섭 치환기"는 분자 상의 다른 기를 대체할 수 있는 기를 말한다. 그와 같은 기는 할로, Cl-C1O 알킬, C2-C1O 알케닐, C2-C1O 알키닐, Cl-C1O 알콕시, C5-C12 아르알킬, C3-C12 시클로알킬, C4-C12 시클로알케닐, 페닐, 치환된 페닐, 톨루올릴, 자일레닐, 비페닐, C2-C12 알콕시알킬, C5-C12 알콕시아릴, C5-C12 아릴옥시알킬, C7-C12 옥시아릴, C1-C6 알킬술피닐, C1-C10 알킬술포닐 , -(CH2)m-0-(Cl-C1O 알킬) (m은 1 내지 8), 아릴, 치환된 아릴, 치환된 알콕시, 플루오로알킬, 헤테로시클릭 라디칼, 치환된 헤테로시클릭 라디칼, 니트로알킬, -NO2, -CN, -NRC(O)-(Cl- C1O 알킬), -C(O)-(Cl-C1O 알킬), C2-C10 알크티오알킬, -C(O)O-(Cl-C1O 알킬), -OH, -SO2, =S, -COOH, -NR2, 카르보닐, -C(O)-(Cl-C1O 알킬)-CF3, -C(O)-CF3, -C(O)NR2, -(C6-C10 아릴)-S-(C6-C10 아릴), -C(O)-(C6-C10 아릴), -(CH2)m-O-(CH2)m-O-(Cl-C1O 알킬) (각 m은 1 내지 8), -C(O)NR2, -C(S)NR2, - SO2NR2, -NRC(O)NR2, -NRC(S)NR2 및 그의 염을 포함하나, 이에 국한되는 것은 아니다. 상기 각 R 기는 H, 알킬 또는 치환된 알킬, 아릴 또는 치환된 아릴, 또는 알크아릴을 포함하나, 이에 국한되는 것은 아니다. 치환기가 좌측에서 우측으로 통상의 화학식으로 쓰여진 경우, 이는 우측에서 좌측으로 쓴 것과 같은 화학적으로 동일한 치환기를 포함하는 것으로 해석된다. 즉, -CH2O-는 -OCH2-와 대등하다.
예를 들어, 알킬 및 헤테로알킬 라디칼 (알킬렌, 알케닐, 헤테로알킬렌, 헤테로알케닐, 알키닐, 시클로알킬, 헤테로시클로알킬, 시클로알케닐 및 헤테로시클로알케닐 등도 포함)에 대한 치환기는 비제한적인 예는 -OR, =0, =NR, =N-0R, -NR2, -SR, -할로겐, -SiR3, - OC(O)R, -C(O)R, -CO2R, -CONR2, -OC(O)NR2, -NRC(O)R, -NRC(O)NR2, -NR(O)2R, -NR-C(NR2)=NR, -S(O)R, -S(O)2R, -S(O)2NR2, -NRSO2R, -CN 및 -NO2를 포함한다. 상기에서 각 R 기는 비제한적인 예로서 수소, 치환된 또는 비치환된 헤테로알킬, 치환된 또는 비치환된 아릴 (1 내지 3개의 할로겐으로 치환된 아릴 포함), 치환된 또는 비치환된 알킬, 알콕시 또는 티오알콕시 기, 또는 아르알킬 기를 포함한다. 두 개의 R 기가 동일한 질소 원자에 결합되어 있을 때, 그들은 그 질소 원자와 함께 5-, 6-, 또는 7-원 고리를 형설할 수 있다. 예를 들어, -NR2는 비제한적인 예로서 1-피롤리디닐 및 4-모르폴리닐을 포함하는 것이다.
아릴 및 헤테로아릴 기에 대한 치환기의 예는 -OR, =0, =NR, =N-OR, -NR2, -SR, -할로겐, -SiR3, -OC(O)R, -C(O)R, -CO2R, -CONR2, -OC(O)NR2, -NRC(O)R, - NRC(O)NR2, -NR(O)2R, -NR-C(NR2)=NR, -S(O)R, -S(O)2R, -S(O)2NR2, -NRSO2R, -CN, -NO2, -R, -N3, -CH(Ph)2, 플루오로(C1-C4)알콕시 및 플루오로(C1-C4)알킬을 포함하며, 0 내지 방향족 고리계 상의 열린 원자가의 수 만큼 존재하며, 각 R 기는 비제한적인 예로서 수소, 알킬, 헤테로알킬, 아릴 및 헤테로아릴을 포함한다.
본 명세서에서 "치료 유효량"이란 치료되는 질병, 증상 또는 장애의 하나 이상의 증상을 치료하거나 적어도 부분적으로 정지시키거나 또는 어느 정도 완화시키도록 이미 질병, 증상 또는 장애가 있는 환자에 투여되는, 적어도 하나의 천연 아미노산 폴리펩티드 또는 적어도 하나의 비-천연 아미노산 폴리펩티드를 함유하는 조성물의 양이다. 환자에 사용될 때, 유효량은 질병, 장애 또는 증상의 정도 및 경과, 이전의 치료, 환자의 건강 상태 및 약물에 대한 반응, 및 담당의의 판단에 따라 달라질 것이다. 투여량 증가 임상 시험과 같은 통상의 시험으로 치료 유효량을 결정하는 것은 당업자의 기술 범위내이다.
본 명세서에서 "티오알콕시"는 산소 원자를 통해 분자에 결합된 황 함유 알 킬 기이다.
"열적 융점" 또는 "Tm"은 표적에 상보적인 프로브의 50%가 평형 상태에서 표적에 혼성화하는 온도 (정의된 이온 강도, pH 및 핵산 농도 하에)를 말한다.
"독성 잔기"는 유해하거나 사멸시킬 수 있는 화합물을 이른다.
"치료한다," "치료" 등은 질병 또는 증상, 증후를 완화, 퇴치 또는 감소시키는 것, 추가의 증후를 방지하는 것, 증후의 원인이 되는 대사 작용을 완화 또는 방지하는 것, 질병 또는 증상을 억제하는 것, 질병 또는 증상이 진행하는 것을 정지시키는 것, 질병 또는 증상을 완화시키는 것, 질병 또는 증상을 퇴보시키는 것, 질병 또는 증상에 의해 나타나는 증상을 완화시키는 것, 질병 또는 증상의 증후를 정지시키는 것을 포함한다. "치료한다," "치료" 등은 비제한적인 의미에서 예방적 및(또는) 치료적 치료를 포함한다.
본 명세서에서 "수용성 중합체"란 수성 용매에 가용성인 중합체를 의미한다. 그와 같은 중합체의 예는 폴리에틸렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜 프로피온알데히드, 모노 C1-C10 알콕시 또는 아릴옥시 유도체 (전문이 본 명세서에 포함되는 미합중국 특허 제5,252,714호), 모노에톡시-폴리에틸렌 글리콜, 폴리비닐 피롤리돈, 폴리비닐 알콜, 폴리아미노산, 디비닐에테르 말레산 무수물, N-(2-히드록시프로필)-메타크릴아미드, 덱스트란, 덱스트란 유도체(덱스트란 술페이트 포함), 폴리프로필렌 글리콜, 폴리프로필렌 옥시드/에틸렌 옥시드 공중합체, 폴리옥시에틸화 폴리올, 헤파린, 헤파린 단편, 폴리사카라이드, 올리고사카라이드, 글리칸, 셀룰로스 및 셀 룰로스 유도체 (메틸셀룰로스 및 카르복시메틸셀룰로스 포함), 혈청 알부민, 전분 및 전분 유도체, 폴리펩티드, 폴리알킬렌 글리콜 및 그의 유도체, 폴리비닐 에틸 에테르, 및 알파, 베타-폴리[(2-히드록시에틸)-DL-아스파르타미드] 및 그의 혼합물을 포함하나, 이에 국한되는 것은 아니다. 예를 들어, 그와 같은 수용성 중합체를 천연 아미노산 폴리펩티드 또는 비-천연 아미노산 폴리펩티드에 커플링시키며, 비제한적인 예로서, 증가된 수용해도, 비변형된 형태에 비하여 증가 또는 조절된 혈청 반감기, 증가 또는 조절된 치료 반감기, 증가된 생이용성, 조절된 생물학적 활성, 연장된 순환 시간, 조절된 면역원성, 조절된 물리적 결합 특성(비제한적인 예로서, 응집 및 다합체 형성), 변화된 수용체 결합, 하나 이상의 결합 파트너에 대한 변화된 결합, 변화된 수용체 이합체화 또는 다합체화와 같은 변화를 일으킨다. 또한, 수용성 중합체는 고유의 생물학적 활성을 가지거나 가지지 않을 수 있다.
달리 언급이 없는 한, 통상적인 질량 스펙트럼 분석, NMR, HPLC, 단백질 화학, 생화학, 재조합 DNA 기술 및 약물학은 당업자 기술 수준 내에서 사용된다.
본 명세서에서 제시된 화합물(비제한적인 예로서, 비-천연 아미노산, 비-천연 아미노산 폴리펩티드, 변형된 비-천연 아미노산 폴리펩티드 및 그와 같은 화합물을 생성하기 위한 화합물)은 동위원소-표지된 화합물, 즉 하나 이상의 원자가 자연에서 보통 발견되는 것과는 상이한 원자량 또는 질량수를 갖는 원자로 대체된 것을 제외하고는 제시된 화합물과 동일한 화합물을 포함한다. 본 발명의 화합물에 혼입될 수 있는 동위원소의 예는 각각 2H, 3H, 13C, 14C, 15N, 18O, 170, 35S, 18F, 36Cl 과 같은 수소, 탄소, 질소, 산소, 불소 및 염소의 동위원소이다. 본 명세서에 기재된 몇몇 동위원소 표지된 화합물, 예컨대, 3H 및 14C 같은 방사성 동위원소 혼입된 화합물은 약물 및(또는) 기질 조직 분포 분석에서 유용하다. 또한, 중수소, 즉 2H와 같은 동위원소로의 치환은 생체내 반감기의 감소와 같은 대사 안정성 증가 또는 필요 투여량 감소와 같은 잇점이 있다.
본 명세서에서 제시된 화합물 (비제한적인 예로서, 비-천연 아미노산, 비-천연 아미노산 폴리펩티드, 변형된 비-천연 아미노산 폴리펩티드 및 그와 같은 화합물을 생성하기 위한 화합물)은 비대칭 탄소 원자를 가지며, 따라서, 거울상이성질체 또는 부분입체이성질체로 존재할 수 있다. 부분입체이성질체 혼합물은 크로마토그래피 또는 분별 결정화와 같은 공지된 방법에 의해 물리 화학적 차이에 기초하여 개개의 부분입체이성질체로 분리될 수 있다. 거울상이성질체는 적절한 광학 활성 화합물 (예를 들어, 알콜)과 반응시켜 거울상이성질체 혼합물을 부분입체이성질체 혼합물로 전환시키고, 부분입체이성질체를 분리하고, 개개의 부분입체이성질체를 상응하는 거울상이성질체로 전환(가수분해)시켜 분리할 수 있다. 부분입체이성질체, 거울상이성질체 및 그의 혼합물을 포함하는 모든 이성질체가 본 명세서에 기재된 조성물의 일부이다.
또 다른 또는 추가의 실시태양에서, 본 명세서에서 제시된 화합물 (비제한적인 예로서, 비-천연 아미노산, 비-천연 아미노산 폴리펩티드, 변형된 비-천연 아미노산 폴리펩티드 및 그와 같은 화합물을 생성하기 위한 화합물)은 전구약물 형태로 사용된다. 또 다른 또는 추가의 실시태양에서, 본 명세서에서 제시된 화합물(비제한적인 예로서, 비-천연 아미노산, 비-천연 아미노산 폴리펩티드, 변형된 비-천연 아미노산 폴리펩티드 및 그와 같은 화합물을 생성하기 위한 화합물)은 그를 필요로 하는 생물체에 투여하였을 때 대사되어 대사물질을 생산하고, 이것이 목적하는 치료 효과를 포함하는 목적하는 효과를 나타낸다. 또 다른 또는 추가의 실시태양은 비-천연 아미노산, 및 변형 또는 비변형된 비-천연 아미노산 폴리펩티드의 활성 대사물질이다.
본 명세서에 기재된 방법 및 조성물은 비-천연 아미노산, 비-천연 아미노산 폴리펩티드, 변형된 비-천연 아미노산 폴리펩티드의 N-옥시드, 결정형(다형으로도 알려짐), 또는 약제학적으로 허용가능한 염을 사용하는 것을 포함한다. 일부 실시태양에서, 비-천연 아미노산, 비-천연 아미노산 폴리펩티드, 변형된 비-천연 아미노산 폴리펩티드는 호변이성질체 형태로 존재할 수 있다. 모든 호변이성질체가 본 명세서에 기재된 비-천연 아미노산, 비-천연 아미노산 폴리펩티드, 변형된 비-천연 아미노산 폴리펩티드의 범주에 든다. 또한, 본 명세서에 기재된 비-천연 아미노산, 비-천연 아미노산 폴리펩티드, 변형된 비-천연 아미노산 폴리펩티드는 물, 에탄올 등과 같은 약제학적으로 허용가능한 용매로 용매화된 형태 뿐만 아니라 비용매화된 형태로 존재할 수 있다. 비-천연 아미노산, 비-천연 아미노산 폴리펩티드, 변형된 비-천연 아미노산 폴리펩티드의 용매화된 형태 또한 본 명세서에 기재된 것으로 간주한다.
본 명세서에서 제시된 화합물 (비제한적인 예로서, 비-천연 아미노산, 비-천 연 아미노산 폴리펩티드, 변형된 비-천연 아미노산 폴리펩티드 및 그와 같은 화합물을 생성하기 위한 화합물)의 일부는 몇 가지 호변이성질체 형태로 존재할 수 있다. 그와 같은 모든 호변이성질체가 본 명세서에 기재된 조성물의 일부인 것으로 간주된다. 예를 들어, 제시된 화합물 (비제한적인 예로서, 비-천연 아미노산, 비-천연 아미노산 폴리펩티드, 변형된 비-천연 아미노산 폴리펩티드 및 그와 같은 화합물을 생성하기 위한 화합물)의 엔올-케토 형태는 본 명세서에 기재된 조성물의 일부인 것으로 간주된다.
본 명세서에서 제시된 화합물 (비제한적인 예로서, 비-천연 아미노산, 비-천연 아미노산 폴리펩티드, 변형된 비-천연 아미노산 폴리펩티드 및 그와 같은 화합물을 생성하기 위한 화합물)의 일부는 산 형태이며, 약제학적으로 허용가능한 양이온과 염을 형성할 수 있다. 본 명세서에서 제시된 화합물 (비제한적인 예로서, 비-천연 아미노산, 비-천연 아미노산 폴리펩티드, 변형된 비-천연 아미노산 폴리펩티드 및 그와 같은 화합물을 생성하기 위한 화합물)의 일부는 염기 형태이며, 약제학적으로 허용가능한 음이온과 염을 형성할 수 있다. 이염을 포함하는 모든 염이 본 명세서에 기재된 조성물의 범주 내에 들고, 통상의 방법으로 제조될 수 있다. 예를 들어, 염은 산성 및 염기성 화합물을 수성, 비수성 또는 부분적 수성 매질 둥에서 접촉시켜 제조할 수 있다. 염은 여과, 비용매로 침전시킨 후 여과, 용매 증발, 또는 수용액의 경우 동결 건조 기술 중 하나 이상을 사용하여 회수할 수 있다.
본 명세서에 기재된 비-천연 아미노산 폴리펩티드의 약제학적으로 허용가능한 염은 패런트 비-천연 아미노산 폴리펩티드 중의 산성 양성자가 알칼리 금속 이 온, 알칼리 토금속 이온 또는 알루미늄 이온과 같은 금속 이온으로 치환되거나 유기 염기와 배위할 때 형성된다. 또한, 본 명세서에 기재된 비-천연 아미노산 폴리펩티드의 염 형태는 출발 물질 또는 중간체의 염을 사용하여 제조할 수 있다. 본 명세서에 기재된 비-천연 아미노산 폴리펩티드는 비-천연 아미노산 폴리펩티드의 유리 염기 형태를 약제학적으로 허용가능한 무기 또는 유기 산과 반응시켜 약제학적으로 허용가능한 산 부가염 (약제학적으로 허용가능한 염의 한 유형)으로 제조할 수 있다. 다른 방식으로는, 본 명세서에 기재된 비-천연 아미노산 폴리펩티드는 비-천연 아미노산 폴리펩티드의 유리 산 형태를 약제학적으로 허용가능한 무기 또는 유기 염기와 반응시켜 약제학적으로 허용가능한 염기 부가염(약제학적으로 허용가능한 염의 한 유형)으로 제조할 수 있다.
약제학적으로 허용가능한 염의 유형은 비제한적인 예로서 (1) 산 부가염, 예컨대, 염산, 브롬화수소산, 황산 또는 질산, 인산 등과 같은 무기산, 또는 아세트산, 프로피온산, 헥산산, 시클로펜탄프로피온산, 글리콜산, 피루브산, 락트산, 말론산, 숙신산, 말산, 말레산, 푸마르산, 타르타르산, 시트르산, 벤조산, 3-(4-히드록시벤조일)벤조산, 신남산, 만델산, 메탄술폰산, 에탄술폰산, 1,2-에탄디술폰산, 2-히드록시에탄술폰산, 벤젠술폰산, 2-나프탈렌술폰산, 4-메틸비시클로-[2.2.2]옥트-2-엔-l-카르복실산, 글루코헵톤산, 4,4'-메틸렌비스-(3-히드록시-2-엔-카르복실산), 3-페닐프로피온산, 트리메틸아세트산, 3급 부틸아세트산, 라우릴 황산, 글루콘산, 글루탐산, 히드록시나프토산, 살리실산, 스테아르산, 뮤콘산 등의 유기산과의 산 부가염; (2) 패런트 화합물에 존재하는 산성 양성자가 알칼리 금속 이온, 알 칼리 토금속 이온 또는 알루미늄 이온과 같은 금속 이온으로 치환되거나 유기 염기와 배위할 때 형성되는 염을 포함한다. 허용가능한 유기 염기는 에탄올아민, 디에탄올아민, 트리에탄올아민, 트로메타민, N-메틸글루카민 등을 포함하나, 이에 국한되는 것은 아니다. 허용가능한 무기 염기는 수산화알루미늄, 수산화칼슘 및 수산화칼륨, 탄산나트륨, 수산화나트륨 등을 포함하나, 이에 국한되는 것은 아니다.
비-천연 아미노산 폴리펩티드의 약제학적으로 허용가능한 염의 상응하는 카운터이온은 비제한적인 예로서 이온 교환 크로마토그래피, 이온 크로마토그래피, 모세관 전기영동, 유도 커플링된 플라즈마, 원자흡수 스펙트럼분석, 질량 분석 또는 이들의 조합을 포함하는 각종 방법을 사용하여 분석 및 확인할 수 있다. 또한, 비-천연 아미노산 폴리펩티드의 약제학적으로 허용가능한 염의 치료활성은 실시예 87 내지 91에 기재된 기술 및 방법을 사용하여 시험할 수 있다.
염을 언급하는 경우에, 용매 부가 형태 및 그의 결정 형태, 특히 용매화물 또는 다형체를 포함한다는 것을 이해하여야 한다. 용매화물은 화학양론적 양 또는 비-화학양론적 양의 용매를 함유하며, 종종 물, 에탄올 등과 같은 약제학적으로 허용가능한 용매로 결정화하는 동안에 형성된다. 용매가 물일 때 수화물이 형성되며, 용매가 알콜일 때 알콜레이트가 형성된다. 다형체는 동일한 원소 조성의 화합물의 상이한 결정 쌓임 배열을 포함한다. 다형체는 대개 상이한 X-선 회절 패턴, 적외선 스펙트럼, 융점, 밀도, 경도, 결정 형태, 광학 및 전기적 특성, 안정성 및 용해도를 갖는다. 재결정화 용매, 결정화 속도 및 보관 온도와 같은 각종 인자는 단결정 형태가 우세하게 할 수 있다.
비-천연 아미노산 폴리펩티드의 약제학적으로 허용가능한 염 다형체 및(또는) 용매화물의 스크리닝 및 특성화는 비제한적인 예로서 열분석, X-선 회절, 스펙트럼분석, 증기 흡수, 현미경 관찰과 같은 여러 방법으로 수행할 수 있다. 열 분석 방법은 다형체 전이 등을 포함하는 열화학적 또는 열물리적 과정에 기초한 것으로, 그와 같은 방법은 다형성 형태 사이의 관계를 분석하고, 중량 손실을 측정하고, 유리 전이 온도를 찾고, 응용성 연구를 수행하는데 사용될 수 있다. 그와 같은 방법은, 비제한적인 예로서, 시차주사 열량측정(DSC), 조절 시차주사 열량측정 (MDCS), 열중량 분석 (TGA) 및 열중량 및 적외선 분석 (TG/IR)을 포함한다. X-선 회절 방법은 비제한적인 예로서 단결정 및 분말 회절측정 및 싱크로트론 소스를 포함한다. 사용되는 각종 스펙트럼 분석 기술은 비제한적인 예로서 라만(Raman), FTIR, UVIS, 및 NMR (액체 및 고체상)을 포함한다. 각종 현미경 기술은 비제한적인 예로서 편광 현미경, 에너지 분산 X-선 분석 (EDX)이 있는 주사 전자 현미경 (SEM), EDX (가스 또는 수증기 중)가 있는 주사 전자 현미경, IR 현미경 및 라만 현미경을 포함한다.
본 발명의 방법 및 조성물의 특징 및 잇점을 보다 잘 이해하기 위하여 본 발명의 방법, 조성물, 수단 및 장치가 사용된 예시적 실시태양을 설명하는 하기 기재 사항 및 첨부된 도면을 참조할 수 있을 것이다.
도 1은 본 명세서에 기재된 방법, 조성물, 전략 및 기술적 측면의 관계를 개략적으로 도시하고 있다.
도 2는 본 명세서에 기재된 비-천연 아미노산의 유형의 예시적이고 비제한적인 예를 도시하고 있다. 그러한 비-천연 아미노산은 본 명세서에 기재된 비-천연 아미노산, 비-천연 아미노산 폴리펩티드 및 변형된 비-천연 아미노산 폴리펩티드의 제조, 정제, 특성화 및 사용을 위한 방법, 조성물, 기술 및 전략 중 어느 것에나 사용되거나 포함될 수 있다.
도 3은 본 명세서에 기재된 비-천연 아미노산의 유형의 예시적이고 비제한적인 예를 도시하고 있다. 그러한 비-천연 아미노산은 본 명세서에 기재된 비-천연 아미노산, 비-천연 아미노산 폴리펩티드 및 변형된 비-천연 아미노산 폴리펩티드의 제조, 정제, 특성화 및 사용을 위한 방법, 조성물, 기술 및 전략 중 어느 것에나 사용되거나 포함될 수 있다.
도 4는 본 명세서에 기재된 비-천연 아미노산을 제조하는데 사용되는 합성 방법의 예시적이고 비제한적인 예를 도시하고 있다. 그러한 비-천연 아미노산은 본 명세서에 기재된 비-천연 아미노산, 비-천연 아미노산 폴리펩티드 및 변형된 비-천연 아미노산 폴리펩티드의 제조, 정제, 특성화 및 사용을 위한 방법, 조성물, 기술 및 전략 중 어느 것에나 사용되거나 포함될 수 있다.
도 5는 본 명세서에 기재된 비-천연 아미노산을 제조하는데 사용되는 합성 방법의 예시적이고 비제한적인 예를 도시하고 있다. 그러한 비-천연 아미노산은 본 명세서에 기재된 비-천연 아미노산, 비-천연 아미노산 폴리펩티드 및 변형된 비-천연 아미노산 폴리펩티드의 제조, 정제, 특성화 및 사용을 위한 방법, 조성물, 기술 및 전략 중 어느 것에나 사용되거나 포함될 수 있다.
도 6은 본 명세서에 기재된 비-천연 아미노산을 제조하는데 사용되는 합성 방법의 예시적이고 비제한적인 예를 도시하고 있다. 그러한 비-천연 아미노산은 본 명세서에 기재된 비-천연 아미노산, 비-천연 아미노산 폴리펩티드 및 변형된 비-천연 아미노산 폴리펩티드의 제조, 정제, 특성화 및 사용을 위한 방법, 조성물, 기술 및 전략 중 어느 것에나 사용되거나 포함될 수 있다.
도 7은 카르보닐-함유 비-천연 아미노산 폴리펩티드를 히드록실아민-함유 화합물로 변형시켜 변형된 옥심-함유 비-천연 아미노산 폴리펩티드를 형성하는 번역후 변형의 예시적이고 비제한적인 예를 도시하고 있다. 그러한 비-천연 아미노산 폴리펩티드는 본 명세서에 기재된 비-천연 아미노산, 비-천연 아미노산 폴리펩티드 및 변형된 비-천연 아미노산 폴리펩티드의 제조, 정제, 특성화 및 사용을 위한 방법, 조성물, 기술 및 전략 중 어느 것에나 사용되거나 포함될 수 있다.
도 8은 카르보닐-함유 비-천연 아미노산 폴리펩티드가 히드록실아민-함유 화합물과 반응하여 변형된 옥심-함유 비-천연 아미노산 폴리펩티드를 형성하는 반응을 증진시키는데 사용될 수 있는 첨가제의 예시적이고 비제한적인 예를 도시하고 있다.
도 9는 옥심-함유 비-천연 아미노산 폴리펩티드를 카르보닐-함유 화합물로 변형시켜 변형된 옥심-함유 비-천연 아미노산 폴리펩티드를 형성하는 번역후 변형의 예시적이고 비제한적인 예를 도시하고 있다. 그러한 비-천연 아미노산 폴리펩티드는 본 명세서에 기재된 비-천연 아미노산, 비-천연 아미노산 폴리펩티드 및 변형된 비-천연 아미노산 폴리펩티드의 제조, 정제, 특성화 및 사용을 위한 방법, 조 성물, 기술 및 전략 중 어느 것에나 사용되거나 포함될 수 있다.
도 10은 히드록실아민-함유 비-천연 아미노산 폴리펩티드를 카르보닐-함유 화합물로 변형시켜 변형된 옥심-함유 비-천연 아미노산 폴리펩티드를 형성하는 번역후 변형의 예시적이고 비제한적인 예를 도시하고 있다. 그러한 비-천연 아미노산 폴리펩티드는 본 명세서에 기재된 비-천연 아미노산, 비-천연 아미노산 폴리펩티드 및 변형된 비-천연 아미노산 폴리펩티드의 제조, 정제, 특성화 및 사용을 위한 방법, 조성물, 기술 및 전략 중 어느 것에나 사용되거나 포함될 수 있다.
도 11은 비-천연 아미노산 폴리펩티드를 변형시켜 PEG-함유, 옥심-결합 비-천연 아미노산 폴리펩티드를 형성하는데 사용될 수 있는 PEG-함유 화합물의 예시적이고 비제한적인 예를 도시하고 있다.
도 12는 비-천연 아미노산 폴리펩티드를 변형시켜 PEG-함유, 옥심-결합 비-천연 아미노산 폴리펩티드를 형성하는데 사용될 수 있는 PEG-함유 화합물의 합성의 예시적이고 비제한적인 예를 도시하고 있다.
도 13은 비-천연 아미노산 폴리펩티드를 변형시켜 PEG-함유, 옥심-결합 비-천연 아미노산 폴리펩티드를 형성하는데 사용될 수 있는 아미드-기초 PEG-함유 화합물의 합성의 예시적이고 비제한적인 예를 도시하고 있다.
도 14는 비-천연 아미노산 폴리펩티드를 변형시켜 PEG-함유, 옥심-결합 비-천연 아미노산 폴리펩티드를 형성하는데 사용될 수 있는 카르바메이트-기초 PEG-함유 화합물의 합성의 예시적이고 비제한적인 예를 도시하고 있다.
도 15는 비-천연 아미노산 폴리펩티드를 변형시켜 PEG-함유, 옥심-결합 비- 천연 아미노산 폴리펩티드를 형성하는데 사용될 수 있는 카르바메이트-기초 PEG-함유 화합물의 합성의 예시적이고 비제한적인 예를 도시하고 있다.
도 16은 비-천연 아미노산 폴리펩티드를 변형시켜 PEG-함유, 옥심-결합 비-천연 아미노산 폴리펩티드를 형성하는데 사용될 수 있는 단순 PEG-함유 화합물의 합성의 예시적이고 비제한적인 예를 도시하고 있다.
도 17은 비-천연 아미노산 폴리펩티드를 변형시켜 PEG-함유, 옥심-결합 비-천연 아미노산 폴리펩티드를 형성하는데 사용될 수 있는 분지쇄 PEG-함유 화합물의 합성, 및 그와 같은 화합물을 카르보닐-기초 비-천연 아미노산 폴리펩티드의 변형에 사용하는 것의 예시적이고 비제한적인 예를 도시하고 있다.
도 18은 비-천연 아미노산 폴리펩티드를 변형 및 결합시키는데 사용될 수 있는 이관능성 링커 기의 합성의 예시적이고 비제한적인 예를 도시하고 있다.
도 19는 비-천연 아미노산 폴리펩티드를 변형 및 결합시키는데 사용될 수 있는 다관능성 링커 기의 합성의 예시적이고 비제한적인 예를 도시하고 있다.
도 20은 비-천연 아미노산 폴리펩티드를 변형 및 결합시키는데 사용될 수 있는 이관능성 링커 기의 용도의 예시적이고 비제한적인 예를 도시하고 있다.
도 21은 비-천연 아미노산 폴리펩티드를 변형 및 PEG 기에 결합시키는데 사용될 수 있는 이관능성 링커 기의 용도의 예시적이고 비제한적인 예를 도시하고 있다.
도 22는 두 개의 비-천연 아미노산 폴리펩티드를 결합시켜 호모이합체를 형성하는 이관능성 링커 기의 용도의 예시적이고 비제한적인 예를 도시하고 있다.
도 23은 상이한 두 개의 비-천연 아미노산 폴리펩티드를 결합시켜 헤테로이합체를 형성하는 이관능성 링커 기의 용도의 예시적이고 비제한적인 예를 도시하고 있다.
도 24는 카르보닐-함유 비-천연 아미노산의 합성의 예시적이고 비제한적인 예를 도시하고 있다. 그러한 비-천연 아미노산은 본 명세서에 기재된 비-천연 아미노산, 비-천연 아미노산 폴리펩티드 및 변형된 비-천연 아미노산 폴리펩티드의 제조, 정제, 특성화 및 사용을 위한 방법, 조성물, 기술 및 전략 중 어느 것에나 사용되거나 포함될 수 있다.
도 25는 디카르보닐-함유 비-천연 아미노산의 합성의 예시적이고 비제한적인 예를 도시하고 있다. 그러한 비-천연 아미노산은 본 명세서에 기재된 비-천연 아미노산, 비-천연 아미노산 폴리펩티드 및 변형된 비-천연 아미노산 폴리펩티드의 제조, 정제, 특성화 및 사용을 위한 방법, 조성물, 기술 및 전략 중 어느 것에나 사용되거나 포함될 수 있다.
도 26은 디카르보닐-함유 비-천연 아미노산의 합성의 예시적이고 비제한적인 예를 도시하고 있다.
도 27은 디카르보닐-함유 비-천연 아미노산의 합성의 예시적이고 비제한적인 예를 도시하고 있다. 그러한 비-천연 아미노산은 본 명세서에 기재된 비-천연 아미노산, 비-천연 아미노산 폴리펩티드 및 변형된 비-천연 아미노산 폴리펩티드의 제조, 정제, 특성화 및 사용을 위한 방법, 조성물, 기술 및 전략 중 어느 것에나 사용되거나 포함될 수 있다..
도 28은 디카르보닐-함유 비-천연 아미노산의 합성의 예시적이고 비제한적인 예를 도시하고 있다. 그러한 비-천연 아미노산은 본 명세서에 기재된 비-천연 아미노산, 비-천연 아미노산 폴리펩티드 및 변형된 비-천연 아미노산 폴리펩티드의 제조, 정제, 특성화 및 사용을 위한 방법, 조성물, 기술 및 전략 중 어느 것에나 사용되거나 포함될 수 있다.
도 29는 디카르보닐-함유 비-천연 아미노산의 합성의 예시적이고 비제한적인 예를 도시하고 있다. 그러한 비-천연 아미노산은 본 명세서에 기재된 비-천연 아미노산, 비-천연 아미노산 폴리펩티드 및 변형된 비-천연 아미노산 폴리펩티드의 제조, 정제, 특성화 및 사용을 위한 방법, 조성물, 기술 및 전략 중 어느 것에나 사용되거나 포함될 수 있다.
도 30은 디카르보닐-함유 비-천연 아미노산의 합성의 예시적이고 비제한적인 예를 도시하고 있다. 그러한 비-천연 아미노산은 본 명세서에 기재된 비-천연 아미노산, 비-천연 아미노산 폴리펩티드 및 변형된 비-천연 아미노산 폴리펩티드의 제조, 정제, 특성화 및 사용을 위한 방법, 조성물, 기술 및 전략 중 어느 것에나 사용되거나 포함될 수 있다.
도 31은 디카르보닐-함유 비-천연 아미노산의 합성의 예시적이고 비제한적인 예를 도시하고 있다. 그러한 비-천연 아미노산은 본 명세서에 기재된 비-천연 아미노산, 비-천연 아미노산 폴리펩티드 및 변형된 비-천연 아미노산 폴리펩티드의 제조, 정제, 특성화 및 사용을 위한 방법, 조성물, 기술 및 전략 중 어느 것에나 사용되거나 포함될 수 있다.
도 32는 디카르보닐-함유 비-천연 아미노산의 합성의 예시적이고 비제한적인 예를 도시하고 있다. 그러한 비-천연 아미노산은 본 명세서에 기재된 비-천연 아미노산, 비-천연 아미노산 폴리펩티드 및 변형된 비-천연 아미노산 폴리펩티드의 제조, 정제, 특성화 및 사용을 위한 방법, 조성물, 기술 및 전략 중 어느 것에나 사용되거나 포함될 수 있다.
도 33은 디카르보닐-함유 비-천연 아미노산의 합성의 예시적이고 비제한적인 예를 도시하고 있다. 그러한 비-천연 아미노산은 본 명세서에 기재된 비-천연 아미노산, 비-천연 아미노산 폴리펩티드 및 변형된 비-천연 아미노산 폴리펩티드의 제조, 정제, 특성화 및 사용을 위한 방법, 조성물, 기술 및 전략 중 어느 것에나 사용되거나 포함될 수 있다.
도 34는 디카르보닐-함유 비-천연 아미노산의 합성의 예시적이고 비제한적인 예를 도시하고 있다. 그러한 비-천연 아미노산은 본 명세서에 기재된 비-천연 아미노산, 비-천연 아미노산 폴리펩티드 및 변형된 비-천연 아미노산 폴리펩티드의 제조, 정제, 특성화 및 사용을 위한 방법, 조성물, 기술 및 전략 중 어느 것에나 사용되거나 포함될 수 있다.
도 35는 카르보닐- 및 디카르보닐-함유 비-천연 아미노산의 합성의 예시적이고 비제한적인 예를 도시하고 있다. 그러한 비-천연 아미노산은 본 명세서에 기재된 비-천연 아미노산, 비-천연 아미노산 폴리펩티드 및 변형된 비-천연 아미노산 폴리펩티드의 제조, 정제, 특성화 및 사용을 위한 방법, 조성물, 기술 및 전략 중 어느 것에나 사용되거나 포함될 수 있다.
도 36은 비-천연 아미노산의 합성의 예시적이고 비제한적인 예를 도시하고 있다. 그러한 비-천연 아미노산은 본 명세서에 기재된 비-천연 아미노산, 비-천연 아미노산 폴리펩티드 및 변형된 비-천연 아미노산 폴리펩티드의 제조, 정제, 특성화 및 사용을 위한 방법, 조성물, 기술 및 전략 중 어느 것에나 사용되거나 포함될 수 있다.
도 37은 카르보닐- 및 디카르보닐-함유 비-천연 아미노산의 합성의 예시적이고 비제한적인 예를 도시하고 있다. 그러한 비-천연 아미노산은 본 명세서에 기재된 비-천연 아미노산, 비-천연 아미노산 폴리펩티드 및 변형된 비-천연 아미노산 폴리펩티드의 제조, 정제, 특성화 및 사용을 위한 방법, 조성물, 기술 및 전략 중 어느 것에나 사용되거나 포함될 수 있다.
도 38은 카르보닐- 및 디카르보닐-함유 비-천연 아미노산의 합성의 예시적이고 비제한적인 예를 도시하고 있다. 그러한 비-천연 아미노산은 본 명세서에 기재된 비-천연 아미노산, 비-천연 아미노산 폴리펩티드 및 변형된 비-천연 아미노산 폴리펩티드의 제조, 정제, 특성화 및 사용을 위한 방법, 조성물, 기술 및 전략 중 어느 것에나 사용되거나 포함될 수 있다.
도 39는 카르보닐- 및 디카르보닐-함유 비-천연 아미노산의 합성의 예시적이고 비제한적인 예를 도시하고 있다. 그러한 비-천연 아미노산은 본 명세서에 기재된 비-천연 아미노산, 비-천연 아미노산 폴리펩티드 및 변형된 비-천연 아미노산 폴리펩티드의 제조, 정제, 특성화 및 사용을 위한 방법, 조성물, 기술 및 전략 중 어느 것에나 사용되거나 포함될 수 있다.
도 40은 디카르보닐-함유 비-천연 아미노산의 예시적이고 비제한적인 예를 도시하고 있다. 그러한 비-천연 아미노산은 본 명세서에 기재된 비-천연 아미노산, 비-천연 아미노산 폴리펩티드 및 변형된 비-천연 아미노산 폴리펩티드의 제조, 정제, 특성화 및 사용을 위한 방법, 조성물, 기술 및 전략 중 어느 것에나 사용되거나 포함될 수 있다.
도 41은 디카르보닐-함유 비-천연 아미노산의 예시적이고 비제한적인 예를 도시하고 있다. 그러한 비-천연 아미노산은 본 명세서에 기재된 비-천연 아미노산, 비-천연 아미노산 폴리펩티드 및 변형된 비-천연 아미노산 폴리펩티드의 제조, 정제, 특성화 및 사용을 위한 방법, 조성물, 기술 및 전략 중 어느 것에나 사용되거나 포함될 수 있다.
도 42는 디카르보닐-함유 비-천연 아미노산의 예시적이고 비제한적인 예를 도시하고 있다. 그러한 비-천연 아미노산은 본 명세서에 기재된 비-천연 아미노산, 비-천연 아미노산 폴리펩티드 및 변형된 비-천연 아미노산 폴리펩티드의 제조, 정제, 특성화 및 사용을 위한 방법, 조성물, 기술 및 전략 중 어느 것에나 사용되거나 포함될 수 있다.
도 43은 (a) 보호 또는 비보호된 1,3-케토알데히드-함유 비-천연 아미노산, 및 (b) 1,3-케토카르복실릴 (티오)에스테르-함유 비-천연 아미노산의 예시적이고 비제한적인 예를 도시하고 있다. 그러한 비-천연 아미노산은 본 명세서에 기재된 비-천연 아미노산, 비-천연 아미노산 폴리펩티드 및 변형된 비-천연 아미노산 폴리펩티드의 제조, 정제, 특성화 및 사용을 위한 방법, 조성물, 기술 및 전략 중 어느 것에나 사용되거나 포함될 수 있다.
도 44는 히드라지드-함유 비-천연 아미노산의 예시적이고 비제한적인 예를 도시하고 있다. 그러한 비-천연 아미노산은 본 명세서에 기재된 비-천연 아미노산, 비-천연 아미노산 폴리펩티드 및 변형된 비-천연 아미노산 폴리펩티드의 제조, 정제, 특성화 및 사용을 위한 방법, 조성물, 기술 및 전략 중 어느 것에나 사용되거나 포함될 수 있다.
도 45는 히드라지드-함유 비-천연 아미노산의 예시적이고 비제한적인 예를 도시하고 있다. 그러한 비-천연 아미노산은 본 명세서에 기재된 비-천연 아미노산, 비-천연 아미노산 폴리펩티드 및 변형된 비-천연 아미노산 폴리펩티드의 제조, 정제, 특성화 및 사용을 위한 방법, 조성물, 기술 및 전략 중 어느 것에나 사용되거나 포함될 수 있다.
도 46A 및 46B는 옥심-함유 비-천연 아미노산의 예시적이고 비제한적인 예를 도시하고 있으며, 도 46C는 히드라진-함유 비-천연 아미노산의 예시적이고 비제한적인 예를 도시하고 있다. 그러한 비-천연 아미노산은 본 명세서에 기재된 비-천연 아미노산, 비-천연 아미노산 폴리펩티드 및 변형된 비-천연 아미노산 폴리펩티드의 제조, 정제, 특성화 및 사용을 위한 방법, 조성물, 기술 및 전략 중 어느 것에나 사용되거나 포함될 수 있다.
도 47은 비-천연 아미노산 폴리펩티드로의 일단계 결합 및 비-천연 아미노산 폴리펩티드로의 이단계 결합의 예시적이고 비제한적인 예를 도시하고 있다. 예를 들어, 그와 같은 결합은 비-천연 아미노산 폴리펩티드의 PEG화를 포함한다.
도 48은 mPEG-히드록실아민 화합물의 합성의 예시적이고 비제한적인 예를 도시하고 있다. 그러한 비-천연 아미노산은 본 명세서에 기재된 비-천연 아미노산, 비-천연 아미노산 폴리펩티드 및 변형된 비-천연 아미노산 폴리펩티드의 제조, 정제, 특성화 및 사용을 위한 방법, 조성물, 기술 및 전략 중 어느 것에나 사용되거나 포함될 수 있다.
도 49는 mPEG-히드록실아민 화합물의 합성의 예시적이고 비제한적인 예를 도시하고 있다. 그러한 비-천연 아미노산은 본 명세서에 기재된 비-천연 아미노산, 비-천연 아미노산 폴리펩티드 및 변형된 비-천연 아미노산 폴리펩티드의 제조, 정제, 특성화 및 사용을 위한 방법, 조성물, 기술 및 전략 중 어느 것에나 사용되거나 포함될 수 있다.
도 50은 mPEG-히드록실아민 화합물의 합성의 예시적이고 비제한적인 예를 도시하고 있다. 그러한 비-천연 아미노산은 본 명세서에 기재된 비-천연 아미노산, 비-천연 아미노산 폴리펩티드 및 변형된 비-천연 아미노산 폴리펩티드의 제조, 정제, 특성화 및 사용을 위한 방법, 조성물, 기술 및 전략 중 어느 것에나 사용되거나 포함될 수 있다.
도 51은 mPEG-히드록실아민 화합물의 합성의 예시적이고 비제한적인 예를 도시하고 있다. 그러한 비-천연 아미노산은 본 명세서에 기재된 비-천연 아미노산, 비-천연 아미노산 폴리펩티드 및 변형된 비-천연 아미노산 폴리펩티드의 제조, 정제, 특성화 및 사용을 위한 방법, 조성물, 기술 및 전략 중 어느 것에나 사용되거나 포함될 수 있다.
도 52는 mPEG-히드록실아민 화합물의 합성의 예시적이고 비제한적인 예를 도시하고 있다. 그러한 비-천연 아미노산은 본 명세서에 기재된 비-천연 아미노산, 비-천연 아미노산 폴리펩티드 및 변형된 비-천연 아미노산 폴리펩티드의 제조, 정제, 특성화 및 사용을 위한 방법, 조성물, 기술 및 전략 중 어느 것에나 사용되거나 포함될 수 있다.
도 53은 mPEG-히드록실아민 화합물의 합성의 예시적이고 비제한적인 예를 도시하고 있다. 그러한 비-천연 아미노산은 본 명세서에 기재된 비-천연 아미노산, 비-천연 아미노산 폴리펩티드 및 변형된 비-천연 아미노산 폴리펩티드의 제조, 정제, 특성화 및 사용을 위한 방법, 조성물, 기술 및 전략 중 어느 것에나 사용되거나 포함될 수 있다.
도 54는 mPEG-히드록실아민 화합물의 합성의 예시적이고 비제한적인 예를 도시하고 있다. 그러한 비-천연 아미노산은 본 명세서에 기재된 비-천연 아미노산, 비-천연 아미노산 폴리펩티드 및 변형된 비-천연 아미노산 폴리펩티드의 제조, 정제, 특성화 및 사용을 위한 방법, 조성물, 기술 및 전략 중 어느 것에나 사용되거나 포함될 수 있다.
도 55는 mPEG-히드록실아민 화합물의 합성의 예시적이고 비제한적인 예를 도시하고 있다. 그러한 비-천연 아미노산은 본 명세서에 기재된 비-천연 아미노산, 비-천연 아미노산 폴리펩티드 및 변형된 비-천연 아미노산 폴리펩티드의 제조, 정제, 특성화 및 사용을 위한 방법, 조성물, 기술 및 전략 중 어느 것에나 사용되거나 포함될 수 있다.
도 56은 mPEG-히드록실아민 화합물의 합성의 예시적이고 비제한적인 예를 도시하고 있다. 그러한 비-천연 아미노산은 본 명세서에 기재된 비-천연 아미노산, 비-천연 아미노산 폴리펩티드 및 변형된 비-천연 아미노산 폴리펩티드의 제조, 정제, 특성화 및 사용을 위한 방법, 조성물, 기술 및 전략 중 어느 것에나 사용되거나 포함될 수 있다.
도 57은 mPEG-히드록실아민 화합물의 합성의 예시적이고 비제한적인 예를 도시하고 있다. 그러한 비-천연 아미노산은 본 명세서에 기재된 비-천연 아미노산, 비-천연 아미노산 폴리펩티드 및 변형된 비-천연 아미노산 폴리펩티드의 제조, 정제, 특성화 및 사용을 위한 방법, 조성물, 기술 및 전략 중 어느 것에나 사용되거나 포함될 수 있다.
도 58은 mPEG-히드록실아민 화합물의 합성의 예시적이고 비제한적인 예를 도시하고 있다. 그러한 비-천연 아미노산은 본 명세서에 기재된 비-천연 아미노산, 비-천연 아미노산 폴리펩티드 및 변형된 비-천연 아미노산 폴리펩티드의 제조, 정제, 특성화 및 사용을 위한 방법, 조성물, 기술 및 전략 중 어느 것에나 사용되거나 포함될 수 있다.
도 59는 mPEG-히드록실아민 화합물의 합성의 예시적이고 비제한적인 예를 도시하고 있다. 그러한 비-천연 아미노산은 본 명세서에 기재된 비-천연 아미노산, 비-천연 아미노산 폴리펩티드 및 변형된 비-천연 아미노산 폴리펩티드의 제조, 정제, 특성화 및 사용을 위한 방법, 조성물, 기술 및 전략 중 어느 것에나 사용되거나 포함될 수 있다.
도 60은 히드록실아민 화합물의 합성의 예시적이고 비제한적인 예를 도시하고 있다. 그러한 비-천연 아미노산은 본 명세서에 기재된 비-천연 아미노산, 비-천연 아미노산 폴리펩티드 및 변형된 비-천연 아미노산 폴리펩티드의 제조, 정제, 특성화 및 사용을 위한 방법, 조성물, 기술 및 전략 중 어느 것에나 사용되거나 포함될 수 있다.
도 61은 히드록실아민 화합물의 합성의 예시적이고 비제한적인 예를 도시하고 있다. 그러한 비-천연 아미노산은 본 명세서에 기재된 비-천연 아미노산, 비-천연 아미노산 폴리펩티드 및 변형된 비-천연 아미노산 폴리펩티드의 제조, 정제, 특성화 및 사용을 위한 방법, 조성물, 기술 및 전략 중 어느 것에나 사용되거나 포함될 수 있다.
도 62A는 히드록실아민 화합물의 합성의 예시적이고 비제한적인 예를 도시하고 있으며, 도 62B는 mPEG 화합물의 합성의 예시적이고 비제한적인 예를 도시하고 있다. 그러한 비-천연 아미노산은 본 명세서에 기재된 비-천연 아미노산, 비-천연 아미노산 폴리펩티드 및 변형된 비-천연 아미노산 폴리펩티드의 제조, 정제, 특성화 및 사용을 위한 방법, 조성물, 기술 및 전략 중 어느 것에나 사용되거나 포함될 수 있다.
도 63은 (A) 비-천연 아미노산 폴리펩티드의 화학적 전환에 의한 카르보닐-함유 (디카르보닐-함유 포함) 비-천연 아미노산 폴리펩티드로의 변형, 및 (B) 비-천연 아미노산 폴리펩티드의 화학적 전환에 의한 히드록실아민-함유 비-천연 아미노산 폴리펩티드로의 변형의 예시적이고 비제한적인 예를 도시하고 있다. 그러한 비-천연 아미노산 폴리펩티드는 본 명세서에 기재된 비-천연 아미노산, 비-천연 아미노산 폴리펩티드 및 변형된 비-천연 아미노산 폴리펩티드의 제조, 정제, 특성화 및 사용을 위한 방법, 조성물, 기술 및 전략 중 어느 것에나 사용되거나 포함될 수 있다.
도 64는 PEG-히드록실아민 화합물의 합성의 예시적이고 비제한적인 예를 도시하고 있다. 그러한 비-천연 아미노산은 본 명세서에 기재된 비-천연 아미노산, 비-천연 아미노산 폴리펩티드 및 변형된 비-천연 아미노산 폴리펩티드의 제조, 정제, 특성화 및 사용을 위한 방법, 조성물, 기술 및 전략 중 어느 것에나 사용되거나 포함될 수 있다.
도 65는 PEG-히드록실아민 화합물의 합성의 예시적이고 비제한적인 예를 도시하고 있다. 그러한 비-천연 아미노산은 본 명세서에 기재된 비-천연 아미노산, 비-천연 아미노산 폴리펩티드 및 변형된 비-천연 아미노산 폴리펩티드의 제조, 정제, 특성화 및 사용을 위한 방법, 조성물, 기술 및 전략 중 어느 것에나 사용되거나 포함될 수 있다.
I. 서론
최근에, 단백질 과학에서 완전히 새로운 기술이 보고되었으며, 이는 단백질의 위치-특이적 변형과 관계된 단점을 극복하는 것이다. 구체적으로, 원핵 에스케리치아 콜라이의 단백질 생합성 기구에 새로운 성분이 부가되었고[참조: L. Wang, et al., (2001), Science 292:498-500), 진핵 사카로마이세 세레비지에(S. cerevisiae)에도 그러하며[참조: J. Chin et al., Science 301:964-7 (2003)], 이들은 모두 생체내에서 단백질에 비-천연 아미노산을 도입시키는 것이다. 새로운 화학적, 물리적 또는 생물학적 특성을 갖는 다수의 새로운 아미노산, 및 광친화도 표지, 광이성화가능한 아미노산, 케토 아미노산 및 글리코실화 아미노산이 이. 콜라이 및 효모 중에서 문헌에 기재된 방법에 따라 암버 코돈 TAG에 반응하여 효율적으로 높은 신뢰도로 혼입되어 왔다[참조: J. W. Chin et al., (2002), Journal of the American Chemical Society 124:9026-9027 (전문이 본 명세서에 포함됨); J. W. Chin, & P. G. Schultz, (2002), ChemBioChem 3(11): 1135-1137 (전문이 본 명세서에 포함됨); J. W. Chin, et al., (2002), PNAS United States of America 99(17):11020- 11024 (전문이 본 명세서에 포함됨); and, L. Wang, & P. G. Schultz, (2002), Chem. Comrau 1-11 (전문이 본 명세서에 포함됨)]. 이들 연구는 20 종의 통상의 유전적으로 코딩되는 아미노산의 관능기 모두에 대하여 화학적으로 불활성이며, 효율적으로 그리고 선택적으로 반응하여 안정한 공유 결합을 형성하는데 사용될 수 있는, 단백질에서 발견되지 않는 화학적 관능기를 선택적 및 통상적으로 도입할 수 있다는 것을 입증하였다.
II. 개관
도 1은 본 명세서에 기재된 방법, 조성물 및 기술을 개관하고 있다. 하나의 수준에서, 본 발명은 카르보닐, 디카르보닐, 옥심 또는 히드록실아민 기를 갖는 적어도 하나의 비-천연 아미노산 또는 변형된 비-천연 아미노산을 제조 및 사용하는 수단(방법, 조성물 및 기술)에 관한 것이다. 그와 같은 비-천연 아미노산은 추가의 관능기를 함유할 수 있으며, 관능기는 비제한적인 예로서 표지, 염료, 중합체, 수용성 중합체, 폴리에틸렌 글리콜 유도체, 광가교결합제, 세포독성 화합물, 약물, 친화도 표지, 광친화도 표지, 반응성 화합물, 수지, 제2의 단백질 또는 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 유사체, 항체 또는 항체 단편, 금속 킬레이트제, 조인자, 지방산, 탄수화물, 폴리뉴클레오티드, DNA, RNA, 안티센스 폴리뉴클레오티드, 사카라이드, 수용성 덴드리머, 시클로덱스트린, 생물질, 나노입자, 스핀 표지, 형광물질, 금속-함유 잔기, 방사성 잔기, 신규 관능기, 다른 분자와 공유적으로 또는 비공유적으로 상호작용하는 기, 포토케이지드 잔기, 화학선 여기가능한 잔기, 리간드, 광이성화성 잔기, 비오틴, 비오틴 유사체, 중량급 원자를 포함하는 잔기, 화학적으로 절단가능한 기, 광-절단가능한 기, 신장된 측쇄, 탄소-결합 당, 산화환원 활성제, 아미노 티오산, 독성 잔기, 동위원소 표지된 잔기, 생물리학적 프로브, 인광 기, 화학발광 기, 전자밀도가 높은 기, 자성 기, 인터캘레이팅 기, 발색단, 에너지 전달기, 생물학적 활성제, 검출가능한 표지, 소분자, 억제성 리보핵산, 방사성 핵종, 중성자 포획제, 비오틴 유도체, 콴텀 도트, 나노트랜스미터, 라디오트랜스미터, 아브자임, 활성화된 복합 활성화제, 바이러스, 보조제, 아글리칸, 알러간, 안지오스타틴, 항호르몬, 항산화제, 압타머, 가이드 RNA, 사포닌, 셔틀 벡터, 거대 분자, 미모토우프, 수용체, 역상 미셀 및 그들의 조합을 포함하나, 이에 국한되는 것은 아니다. 상기 열거한 관능기는 어느 한 군에 속하는 관능기가 다른 군으로 분류될 수 없다는 것을 의미하려는 것이 아니다. 사실상, 특정 환경에 따라 중첩이 있을 수 있다. 예를 들어, 수용성 중합체는 그 범위에 있어서 폴리에틸렌 글리콜 유도체와 중첩되지만, 그와 같은 중첩이 완전한 것이 아니므로 두 관능기 군을 모두 기재하였다.
도 1에 도시된 바와 같이, 하나의 측면에서 본 명세서에 기재된 방법, 조성물 및 기술을 사용하여 변형될 폴리펩티드의 선택 및 설계 방법이 제공된다. 새로운 폴리펩티드는, 예컨대, 고-처리용량 스크리닝 과정의 일부(이 경우에 각종 폴리펩티드가 설계, 합성, 특성화 및(또는) 시험될 수 있음)로서 디 노보(de novo) 설계되거나, 연구자의 관심에 기초하여 설계될 수 있다. 새로운 폴리펩티드는 또한 공지 또는 일부 특성화된 폴리펩티드의 구조에 기초하여 설계될 수 있다. 예를 들어, 성장 호르몬 유전자 슈퍼패밀리 (상기 문헌 참조)는 과학계의 심도 깊은 연구 대상이었으며, 새로운 폴리펩티드는 그와 같은 유전자 슈퍼패밀리의 구성원에 기초하여 설계될 수 있다. 어떠한 아미노산을 치환 및(또는) 변형시킬 것인지의 원리는 본 명세서에 별도로 기재되어 있다. 어떠한 변형을 이용할 것이지 또한 본 명세서에 기재되어 있으며, 실험자 또는 최종 사용자의 필요에 따라 요구를 충족시킬 수 있다. 그와 같은 필요는 폴리펩티드 치료 효과의 조작, 폴리펩티드의 안전성 프로파일의 개선, 폴리펩티드의 약물동태학, 약물학 또는 약물역학의 조정, 예컨대, 수용성, 생이용성, 혈청 반감기, 치료 반감기의 증가, 면역원성, 생물학적 활성의 조절, 또는 순환 시간의 연장을 포함하나, 이에 국한되는 것은 아니다. 또한, 그와 같은 변형은 폴리펩티드에 추가의 관능성을 제공하는 것, 태그, 표지 또는 검출 신호를 폴리펩티드 내로 삽입하는 것, 폴리펩티드의 단리 특성을 용이하게 하는 것및 이들의 조합을 포함하나, 이에 국한되는 것은 아니다.
옥심, 카르보닐, 디카르보닐 또는 히드록실아민 기를 갖거나 함유하도록 변형될 수 있는 비-천연 아미노산이 본 명세서에 기재되어 있다. 이와 같은 측면에는, 그와 같은 비-천연 아미노산을 제조, 정제, 특성화 및(또는) 사용하는 방법이 포함된다. 다른 측면으로서, 적어도 하나의 그러한 비-천연 아미노산을 폴리펩티드 내로 삽입하는 방법, 전략 및 기술이 본 명세서에 기재되어 있다. 또한, 적어도 하나의 비-천연 아미노산을 함유하는 폴리펩티드를 제조, 정제, 특성화 및(또는) 사용하는 방법이 포함된다. 또한, 적어도 하나의 비-천연 아미노산을 함유하는 폴리펩티드를 적어도 부분적으로 제조하는데 사용될 수 있는 올리고뉴클레오티드(DNA 및 RNA 포함)를 제조, 정제, 특성화 및(또는) 사용하기 위한 조성물 및 방법이 포함된다. 또한 이러한 측면에 포함되는 것은 적어도 하나의 비-천연 아미노산을 함유하는 폴리펩티드를 적어도 부분적으로 제조하는데 사용될 수 있는 올리고뉴클레오티드(DNA 및 RNA 포함)를 발현할 수 있는 세포를 생산, 정제, 특성화 및(또는) 사용하기 위한 조성물 및 방법이 포함된다.
따라서, 카르보닐, 디카르보닐, 옥심 또는 히드록실아민 기를 갖는 적어도 하나의 비-천연 아미노산 또는 변형된 비-천연 아미노산을 포함하는 폴리펩티드가 제공되고 본 명세서에 기재되어 있다. 특정 실시태양에서, 카르보닐, 디카르보닐, 옥심 또는 히드록실아민 기를 갖는 적어도 하나의 비-천연 아미노산 또는 변형된 비-천연 아미노산은 폴리펩티드 상의 어떤 위치에서 적어도 하나의 번역후 변형을 포함한다. 일부 실시태양에서, 번역과 동시 또는 번역후 변형은 세포 기구(예를 들어, 글리코실화, 아세틸화, 아실화, 지질-변형, 팔미토일화, 팔미테이트 부가, 포스포릴화, 당지질-결합 변형 등)를 통하여 일어나며, 많은 경우에, 그러한 세포 기구-기초한 번역과 동시 또는 번역후 변형은 폴리펩티드 상의 천연 아미노산 위치에서 일어나지만, 일부 실시태양에서는 세포 기구-기초한 번역과 동시 또는 번역후 변형은 폴리펩티드 상의 비-천연 아미노산 위치에서 일어난다.
다른 실시태양에서, 번역후 변형은 세포 기구를 이용하지 않으며, 관능기는 대신 본 명세서에 기재된 화학적 방법이나 특정 반응성 기에 적절한 방법을 이용한 분자의 부착에 의해 제공된다. 부착되는 분자는 표지, 염료, 중합체, 수용성 중합체, 폴리에틸렌 글리콜 유도체, 광가교결합제, 세포독성 화합물, 약물, 친화도 표지, 광친화도 표지, 반응성 화합물, 수지, 제2의 단백질 또는 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 유사체, 항체 또는 항체 단편, 금속 킬레이트제, 조인자, 지방산, 탄수화물, 폴리뉴클레오티드, DNA, RNA, 안티센스 폴리뉴클레오티드, 사카라이드, 수용성 덴드리머, 시클로덱스트린, 생물질, 나노입자, 스핀 표지, 형광물질, 금속-함유 잔기, 방사성 잔기, 신규 관능기, 다른 분자와 공유적으로 또는 비공유적으로 상호작용하는 기, 포토케이지드 잔기, 화학선 여기가능한 잔기, 리간드, 광이성화성 잔기, 비오틴, 비오틴 유사체, 중량급 원자를 포함하는 잔기, 화학적으로 절단가능한 기, 광-절단가능한 기, 신장된 측쇄, 탄소-결합 당, 산화환원 활성제, 아미노 티오산, 독성 잔기, 동위원소 표지된 잔기, 생물리학적 프로브, 인광 기, 화학발광 기, 전자밀도가 높은 기, 자성 기, 인터캘레이팅 기, 발색단, 에너지 전달기, 생물학적 활성제, 검출가능한 표지, 소분자, 억제성 리보핵산, 방사성 핵종, 중성자 포획제, 비오틴 유도체, 콴텀 도트, 나노트랜스미터, 라디오트랜스미터, 아브자임, 활성화된 복합 활성화제, 바이러스, 보조제, 아글리칸, 알러간, 안지오스타틴, 항호르몬, 항산화제, 압타머, 가이드 RNA, 사포닌, 셔틀 벡터, 거대 분자, 미모토우프, 수용체, 역상 미셀 및 그들의 조합을 포함하나, 이에 국한되는 것은 아니다. 일부 실시태양에서, 번역과 동시 또는 번역후 변형은 진핵 세포 또는 비-진핵 세포 생체 내에서 일어난다. 다른 실시태양에서, 번역후 변형은 세포 기구를 이용하지 않고 시험관 내에서 만들어진다. 이러한 측면에는 또한 적어도 하나의 그러한 번역과 동시 또는 번역후 변형된 비-천연 아미노산을 함유하는 폴리펩티드를 제조, 정제, 특성화 및(또는) 사용하는 방법이 포함된다.
본 명세서에 기재된 방법, 조성물, 전략 및 기술의 범위에는 폴리펩티드의 일부인 비-천연 아미노산 (카르보닐, 디카르보닐, 옥심 또는 히드록실아민 또는 그들의 차폐 또는 보호된 형태를 함유함)과 반응하여 상기 번역후 변형을 생성할 수 있는 화합물이 포함된다. 일반적으로, 생성된 번역후 변형된 비-천연 아미노산은 적어도 하나의 옥심을 함유할 것이며, 변형된 옥심-함유 비-천연 아미노산은 차후의 변형 반응을 수행할 수 있다. 이와 같은 측면에는 또한 비-천연 아미노산을 그와 같이 변형시킬 수 있는 화합물을 제조, 정제, 특성화 및(또는) 사용하는 방법이 포함된다.
특정 실시태양에서, 폴리펩티드는 하나의 숙주세포에 의해 생체내 만들어진 적어도 하나의 번역과 동시 또는 번역후 변형을 포함하며, 여기서 번역후 변형은 다른 숙주세포 유형에서는 보통 만들어지지 않는다. 특정 실시태양에서, 폴리펩티드는 진핵 세포에 의해 생체내 만들어진 적어도 하나의 번역과 동시 또는 번역후 변형을 포함하며, 여기서 번역과 동시 또는 번역후 변형은 비-진핵 세포에 의해서는 보통 만들어지지 않는다. 그와 같은 번역과 동시 또는 번역후 변형은 글리코실화, 아세틸화, 아실화, 지질-변형, 팔미토일화, 팔미테이트 부가, 포스포릴화, 당지질-결합 변형 등을 포함하나, 이에 국한되는 것은 아니다. 하나의 실시태양에서, 번역과 동시 또는 번역후 변형은 올리고사카라이드를 아스파라긴에 GlcNAc-아스파라긴 결합을 통해 부착시키는 것 (비제한적인 예로서, 올리고사카라이드가 (GlcNAc-Man)2-Man-GlcNAc-GlcNAc 등인 경우)을 포함한다. 다른 실시태양에서, 번역과 동시 또는 번역후 변형은 올리고사카라이드 (예를 들어, Gal-GalNAc, Gal-GlcNAc 등)를 세린 또는 트레오닌에 GalNAc-세린, GalNAc-트레오닌, GlcNAc-세린, 또는 GlcNAc-트레오닌 결합을 통해 부착시키는 것을 포함한다. 특정 실시태양에서, 단백질 또는 폴리펩티드는 분비 또는 위치 서열, 에피토프 태그, FLAG 태그, 폴리히스티딘 태그, GST 융합부 등을 포함할 수 있다. 이와 같은 측면에는 또한 적어도 하나의 번역과 동시 또는 번역후 변형을 함유하는 폴리펩티드를 제조, 정제, 특성화 및(또는) 사용하는 방법이 포함된다. 다른 실시태양에서, 글리코실화 비-천연 아미노산 폴리펩티드는 비-글리코실화 형태로 제조된다, 글리코실화 비-천연 아미노산의 비-글리코실화 형태는 단리되거나 실질적으로 정제 또는 정제되지 않은 글리코실화 비-천연 아미노산 폴리펩티드로부터 올리고사카라이드를 화학적 또는 효소적으로 제거하는 것, 비-천연 아미노산 폴리펩티드를 글리코실화하지 않는 숙주(그러한 폴리펩티드를 글리코실화하지 않도록 엔지니어링 또는 변이된 원핵 또는 진핵 세포) 중에서 생성하는 것, 정상적으로는 비-천연 아미노산 폴리펩티드를 글리코실화하는 진핵 세포에 의해 그러한 폴리펩티드가 생산되고 있는 배양 배지에 글리코실화 억제제를 투입하는 것, 또는 이들의 조합을 포함하는 방법에 의해 제조될 수 있다. 그와 같은 정상적으로는 글리코실화되는('정상적으로는 글리코실화되는'이란 천연 폴리펩티드가 글리코실화되는 조건하에서는 글리코실화되었을 폴리펩티드를 의미함) 비-천연 아미노산 폴리펩티드의 비-글리코실화 형태가 본 명세서에 기재되어 있다. 물론, 정상적으로는 글리코실화되는 비-천연 아미노산 폴리펩티드의 비-글리코실화 형태 (또는 본 명세서에 기재된 모든 폴리펩티드)는 정제되지 않은 형태, 실질적으로 정제된 형태, 또는 단리된 형태일 수 있다.
특정 실시태양에서, 비-천연 아미노산 폴리펩티드는 가속화제의 존재하에 만들어진 적어도 하나의 번역후 변형을 포함하며, 여기서 번역후 변형은 화학양론, 화학양론 유사 또는 화학양론 근사치로 일어난다. 다른 실시태양에서, 폴리펩티드는 가속화제의 존재하에 화학식(XIX)의 화합물과 접촉된다. 다른 실시태양에서, 가속화제는 하기 군으로부터 선택된다:
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비-천연 아미노산-함유 폴리펩티드는 카르보닐, 디카르보닐, 옥심, 히드록실아민 기 또는 그의 보호된 형태를 함유하는, 적어도 하나, 적어도 둘, 적어도 셋, 적어도 넷, 적어도 다섯, 적어도 여섯, 적어도 일곱, 적어도 여덟, 적어도 아홉 또는 열 또는 그 이상의 비-천연 아미노산을 함유할 수 있다. 비-천연 아미노산은 동일하거나 상이할 수 있으며, 예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 개 또는 그 이상의 상이한 비-천연 아미노산을 포함하는 단백질 중에는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 개 또는 그 이상의 상이한 위치가 존재할 수 있다. 특정 실시태양에서, 단백질의 천연 형태에 존재하는 특정 아미노산 중 적어도 하나, 하지만 아미노산 총수보다는 작은 수의 아미노산이 비-천연 아미노산으로 치환된다.
본 명세서에 제공되고 기재된 방법 및 조성물은 카르보닐, 디카르보닐, 옥심, 히드록실아민 기 또는 그의 보호된 형태를 함유하는 적어도 하나의 비-천연 아미노산을 포함하는 폴리펩티드를 포함한다. 폴리펩티드 내로 적어도 하나의 비-천연 아미노산을 도입하는 것은, 예컨대, 하나 이상의 비-천연 아미노산과는 반응하지만 통상의 20종의 아미노산과는 반응하지 않는 특이적 화학 반응을 포함하는 컨쥬게이션 화학을 응용하도록한다. 비-천연 아미노산 측쇄는 일단 도입이 되면 본 명세서에 기재된 화학적 방법 또는 천연적으로 코딩되는 아미노산에 존재하는 특정 관능기 또는 치환기에 적절한 방법을 이용하여 변형될 수 있다.
본 명세서에 기재된 비-천연 아미노산 방법 및 조성물은 광범위한 관능기, 치환기 또는 잔기를 갖는 물질과 다른 물질과의 컨쥬게이트를 제공하는데, 다른 물질은 표지, 염료, 중합체, 수용성 중합체, 폴리에틸렌 글리콜 유도체, 광가교결합제, 세포독성 화합물, 약물, 친화도 표지, 광친화도 표지, 반응성 화합물, 수지, 제2의 단백질 또는 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 유사체, 항체 또는 항체 단편, 금속 킬레이트제, 조인자, 지방산, 탄수화물, 폴리뉴클레오티드, DNA, RNA, 안티센스 폴리뉴클레오티드, 사카라이드, 수용성 덴드리머, 시클로덱스트린, 생물질, 나노입자, 스핀 표지, 형광물질, 금속-함유 잔기, 방사성 잔기, 신규 관능기, 다른 분자와 공유적으로 또는 비공유적으로 상호작용하는 기, 포토케이지드 잔기, 화학선 여기가능한 잔기, 리간드, 광이성화성 잔기, 비오틴, 비오틴 유사체, 중량급 원자를 포함하는 잔기, 화학적으로 절단가능한 기, 광-절단가능한 기, 신장된 측쇄, 탄소-결합 당, 산화환원 활성제, 아미노 티오산, 독성 잔기, 동위원소 표지된 잔기, 생물리학적 프로브, 인광 기, 화학발광 기, 전자밀도가 높은 기, 자성 기, 인터캘레이팅 기, 발색단, 에너지 전달기, 생물학적 활성제, 검출가능한 표지, 소분자, 억제성 리보핵산, 방사성 핵종, 중성자 포획제, 비오틴 유도체, 콴텀 도트, 나노트랜스미터, 라디오트랜스미터, 아브자임, 활성화된 복합 활성화제, 바이러스, 보조제, 아글리칸, 알러간, 안지오스타틴, 항호르몬, 항산화제, 압타머, 가이드 RNA, 사포닌, 셔틀 벡터, 거대 분자, 미모토우프, 수용체, 역상 미셀 및 그들의 조합을 포함하나, 이에 국한되는 것은 아니다.
특정 실시태양에서, 화학식 (I) 내지 (XXXIII)를 포함하는 본 명세서에 기재된 비-천연 아미노산, 비-천연 아미노산 폴리펩티드, 링커 및 화합물은 온화한 산성 조건(비제한적인 예로서 pH 2 내지 8) 하에 수성 용액 중에서 안정하다. 다른 실 실시태양에서, 그와 같은 화합물은 온화한 산성 조건하에서 적어도 한 달 동안 안정하다. 다른 실시태양에서, 그와 같은 화합물은 온화한 산성 조건하에서 적어도 2주 동안 안정하다. 다른 실시태양에서, 그와 같은 화합물은 온화한 산성 조건하에서 적어도 5일 동안 안정하다.
본 명세서에 기재된 방법, 조성물, 기술 및 전략의 다른 측면에서, 상기한 "변형 또는 비변형된" 비-천연 아미노산 폴리펩티드를 연구 및 이용하는 방법이 제공된다. 이와 같은 측면에는, 예를 들어, "변형 또는 비변형된" 비-천연 아미노산 폴리펩티드 또는 단백질을 포함하는 폴리펩티드이어서 유리할 수 있는 치료, 진단, 분석의 기초, 화장제, 식물 생물학, 환경, 에너지 생산, 소비자 제품, 및 군사 용도가 포함된다.
III. 폴리펩티드 내 비-천연 아미노산의 위치
본 명세서에 기재된 방법 및 조성물은 하나 이상의 비-천연 아미노산을 폴리펩티드 내에 도입시키는 것을 포함한다. 하나 이상의 비-천연 아미노산은 폴리펩티드의 활성을 방해하지 않는 하나 이상의 위치에 도입될 수 있다. 이는 비제한적인 예로서 소수성 아미노산을 비-천연 또는 천연 소수성 아미노산으로, 벌키 아미노산을 비-천연 또는 천연 벌키 아미노산으로, 친수성 아미노산을 비-천연 또는 천연 친수성 아미노산으로 치환하는 등의 "보존적" 치환을 하고/하거나 비-천연 아미노산을 활성에 필요하지 않은 위치에 도입하여 달성할 수 있다.
폴리펩티드 내에 비-천연 아미노산으로 치환하기에 적절한 바람직한 위치를 선정하는데 각종 생화학 및 구조학적 접근 방법이 사용될 수 있다. 폴리펩티드 내의 어떤 위치라도 비-천연 아미노산을 삽입하도록 선택되는데 적절하며, 선택은 합리적인 설계에 기초하거나, 특정하지 않거나 특정한 목적을 위하여 무작위적으로 이루어질 수도 있다. 목적하는 위치의 선택은 비제한적인 예로서 효능제, 슈퍼효능제, 부분효능제, 역효능제, 길항제, 수용체 결합 조절제, 수용체 활성 조절제, 결합자 파트너에 대한 결합의 조절제, 결합 파트너 활성 조절제, 결합 파트너 구조 조절제, 이합체 또는 다합체 형성, 천연 분자에 비교한 활성 또는 특성의 변화 없음과 같은 목적하는 특성 또는 활성을 갖는 비-천연 아미노산을 생산하는 것, 또는 용해도, 응집 또는 안정성과 같은 폴리펩티드의 물리 또는 화학적 특성을 조절하는 것에 기초하여 이루어질 수 있다. 예를 들어, 폴리펩티드의 생물학적 활성에 필요한 폴리펩티드 내의 위치는 비제한적인 예로서 점 돌연변이 분석, 알라닌 스캐닝 또는 상동체 스캐닝 방법과 같은 방법을 사용하여 찾아낼 수 있다. 알라닌 또는 상동체 스캐닝 변이 유발을 포함하는 방법에 의해 생물학적 활성에 결정적인 것으로 확인된 잔기 이외의 잔기는, 그 폴리펩티드에 부여하고자 하는 목적하는 활성에 따라 비-천연 아미노산으로 치환하기에 좋은 후보가 될 수 있다. 생물학적 활성에 결정적인 것으로 확인된 잔기도 또한 그 폴리펩티드에 부여하고자 하는 목적하는 활성에 따라 비-천연 아미노산으로 치환하기에 좋은 후보가 될 수 있다. 다른 방법은 폴리펩티드의 각 위치를 단순히 비-천연 아미노산으로 연속 치환하고, 폴리펩티드의 활성에 미치는 효과를 관찰하는 것이다. 임의의 폴리펩티드 내에 비-천연 아미노산으로 치환하기에 적절한 위치를 선택하는 어떠한 수단, 기술 또는 방법이라도 본 명세서에 기재된 방법, 조성물 및 기술에 사용하기에 적절하다.
결실을 함유하는 폴리펩티드의 천연 변이체의 구조 및 활성은 또한 비-천연 아미노산으로의 치환을 감내할 수 있는 것으로 예측되는 단백질 영역을 결정하기 위해 검사할 수 있다. 일단 비-천연 아미노산으로의 치환을 감내할 수 없는 것으로 예상되는 잔기를 제외하고, 나머지 위치 각각에서 제안된 치환의 영향을, 비제한적인 예로서 관련 펩티드의 삼차원 구조, 및 관련된 리간드 또는 결합 단백질을 포함하는 방법으로 검사할 수 있다. 많은 폴리펩티드의 X-선 결정 구조 및 NMR 구조를 단백질 및 핵산 대분자의 삼차원 구조 데이터를 함유하는 중앙 데이터베이스인 단백질 데이터 뱅크 (PDB, www.rcsb.org)로부터 입수할 수 있으며, 이중 하나를 사용하여 비-천연 아미노산으로 치환될 수 있는 아미노산 위치를 찾을 수 있다. 또한, 삼차원 구조 데이터를 입수할 수 없는 경우, 폴리펩티드의 2차 및 3차 구조를 연구하는 모델을 만들 수 있다. 따라서, 비-천연 아미노산으로 치환될 수 있는 아미노산 위치는 쉽게 찾아낼 수 있다.
비-천연 아미노산을 도입할 수 있는 위치의 예는 가능한 수용체 결합 영역이나 결합 단백질 또는 리간드에의 결합 영역으로부터 배제된 위치, 완전히 또는 부분적으로 용매에 노출될 수 있는 위치, 근접 잔기와의 수소 결합 상호작용이 최소이거나 전무한 위치, 근접 반응성 잔기에 최소한으로 노출된 위치, 및(또는) 특정 폴리펩티드의 삼차원 결정 구조로부터 예상되는 바로서 관련 수용체, 리간드 또는 결합 단백질과의 결합이 매우 유동적인 영역에 있는 위치를 포함하나, 이에 국한되는 것은 아니다.
아주 다양한 비-천연 아미노산이 폴리펩티드 내의 소정의 위치를 치환하거나 또는 그에 도입될 수 있다. 예를 들어, 특정 비-천연 아미노산을 결합된 리간드, 수용체 및(또는) 결합 단백질과의 삼차원 결정 구조 검사에 기초하여 삽입하기 위해 선택할 수 있으며, 보존적 치환이 바람직하다.
하나의 실시태양에서, 본 명세서에 기재된 방법은 제1 반응성 기를 포함하는 비-천연 아미노산을 폴리펩티드 내로 도입한 다음, 그 폴리펩티드를 제2의 반응성 기를 포함하는 분자와 접촉시키는 것을 포함한다. 제2의 반응성 기를 포함하는 분자는 표지, 염료, 중합체, 수용성 중합체, 폴리에틸렌 글리콜 유도체, 광가교결합제, 세포독성 화합물, 약물, 친화도 표지, 광친화도 표지, 반응성 화합물, 수지, 제2의 단백질 또는 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 유사체, 항체 또는 항체 단편, 금속 킬레이트제, 조인자, 지방산, 탄수화물, 폴리뉴클레오티드, DNA, RNA, 안티센스 폴리뉴클레오티드, 사카라이드, 수용성 덴드리머, 시클로덱스트린, 생물질, 나노입자, 스핀 표지, 형광물질, 금속-함유 잔기, 방사성 잔기, 신규 관능기, 다른 분자와 공유적으로 또는 비공유적으로 상호작용하는 기, 포토케이지드 잔기, 화학선 여기가능한 잔기, 리간드, 광이성화성 잔기, 비오틴, 비오틴 유사체, 중량급 원자를 포함하는 잔기, 화학적으로 절단가능한 기, 광-절단가능한 기, 신장된 측쇄, 탄소-결합 당, 산화환원 활성제, 아미노 티오산, 독성 잔기, 동위원소 표지된 잔기, 생물리학적 프로브, 인광 기, 화학발광 기, 전자밀도가 높은 기, 자성 기, 인터캘레이팅 기, 발색단, 에너지 전달기, 생물학적 활성제, 검출가능한 표지, 소분자, 억제성 리보핵산, 방사성 핵종, 중성자 포획제, 비오틴 유도체, 콴텀 도트, 나노트랜스미터, 라디오트랜스미터, 아브자임, 활성화된 복합 활성화제, 바이러스, 보조제, 아글리칸, 알러간, 안지오스타틴, 항호르몬, 항산화제, 압타머, 가이드 RNA, 사포닌, 셔틀 벡터, 거대 분자, 미모토우프, 수용체, 역상 미셀 및 그들의 조합으로부터 선택되는 기를 포함하나, 이에 국한되는 것은 아니다. 특정 실시태양에서, 제1의 반응성 기는 카르보닐 또는 디카르보닐 잔기이고, 제2의 반응성 기는 히드록실아민 잔기이어서, 옥심 결합이 형성된다. 특정 실시태양에서, 제1의 반응성 기는 히드록실아민 잔기이고, 제2의 반응성 기는 카르보닐 또는 디카르보닐 잔기이어서, 옥심 결합이 형성된다. 특정 실시태양에서, 제1의 반응성 기는 카르보닐 또는 디카르보닐 잔기이고, 제2의 반응성 기는 옥심 잔기이어서, 옥심 교환 반응이 일어난다. 특정 실시태양에서, 제1의 반응성 기는 옥심 잔기이고, 제2의 반응성 기는 카르보닐 또는 디카르보닐 잔기이어서, 옥심 교환 반응이 일어난다.
몇몇 경우에, 비-천연 아미노산 치환 또는 도입은 다른 화학적, 물리적, 약물학적 및(또는) 생물학적 특질에 영향을 미치도록 폴리펩티드 내의 다른 추가, 치환 또는 결실과 병행될 수 있다. 몇몇 경우에, 다른 추가, 치환 또는 결실은 폴리펩티드의 안정성(비제한적인 예로서 단백질 분해에 대한 내성)을 증가시키거나, 포폴리펩티드의 그의 적절한 수용체, 리간드 및(또는) 결합 단백질에의 친화도를 증가시킬 수 있다. 몇몇 경우에, 다른 추가, 치환 또는 결실은 폴리펩티드의 용해도(비제한적인 예로서 이. 콜라이 또는 다른 숙주세포에서 발현되는 경우)를 증가시킬 수 있다. 일부 실시태양에서, 이. 콜라이 또는 다른 재조합 숙주세포에서 발현된 후 폴리펩티드의 용해도를 증가시킬 목적으로, 비-천연 아미노산을 도입할 위치 외에 천연적으로 코딩되는 또는 비-천연 아미노산으로 치환할 위치가 선택된다. 일부 실시태양에서, 폴리펩티드는 관련 리간드, 결합 단백질 및(또는) 리간드에 대한 친화도를 조절하거나, 수용체 이합체화를 조절(증가 또는 감소)하거나, 수용체 이합체를 안정화시키거나, 순환 반감기를 조절하거나, 방출 또는 생이용성을 조절하거나, 정제를 촉진하거나, 특정 투여 경로를 개선 또는 변화시키는 다른 추가, 치환 또는 결실을 포함한다. 마찬가지로, 비-천연 아미노산 폴리펩티드는 화학적 또는 효소 절단 서열, 프로테아제 절단 서열, 반응성 기, 항체-결합 도메인(비제한적인 예로서 FLAG 또는 폴리-His) 또는 다른 치환된 기초 서열(비제한적인 예로서 FLAG, 폴리-His, GST 등) 또는 검출(비제한적인 예로서 GFP), 정제, 조직 또는 세포막을 통한 수송, 전구약물 방출 또는 활성화, 크기 감소, 또는 폴리펩티드의 다른 특질을 개선하는 결합된 분자 (비제한적인 예로서 비오틴)를 포함할 수 있다.
IV. 성장 호르몬 슈퍼유전자 패밀리를 예로 든 경우
본 명세서에 기재된 방법, 조성물, 전략 및 기술은 특정 유형, 클래스 또는 족의 폴리펩티드 또는 단백질에 국한되는 것은 아니다. 사실상, 어느 폴리펩티드나 본 명세서에 기재된 적어도 하나의 "변형 또는 비변형된" 비-천연 아미노산을 포함하도록 설계 또는 변형될 수 있다. 예를 들어, 폴리펩티드는 하기 물질로 구성되는 군으로부터 선택되는 치료 단백질에 상동적일 수 있다: 알파-1 안티트립신, 안지오스타틴, 항용혈 인자, 항체, 항체 단편, 아포리포단백질, 아포단백질, 심방 나트륨이뇨 인자, 심방 나트륨이뇨 폴리펩티드, 심방 펩티드, C-X-C 케모카인, T39765, NAP-2, ENA-78, gro-a, gro-b, gro-c, IP-10, GCP-2, NAP-4, SDF-1, PF4, MIG, 칼시토닌, c-키트 리간드, 사이토카인, CC 케모카인, 단핵구 화학유인 단백질-1, 단핵구 화학유인 단백질-2, 단핵구 화학유인 단백질-3, 단핵구 소염 단백질-1 알파, 단핵구 소염 단백질-1 베타, RANTES, 1309, R83915, R91733, HCC1, T58847, D31065, T64262, CD40, CD40 리간드, c-키트 리간드, 콜라겐, 콜로니 자극인자 (CSF), 보체 인자 5a, 보체 억제제, 보체 수용체 1, 사이토카인, 상피 호중구 활성화 펩티드-78, MIP-16, MCP-1, 표피 성장 인자 (EGF), 상피 호중구 활성화 펩티드, 에리쓰로포이에틴 (EPO), 박리 독소, 인자 IX, 인자 VII, 인자 VIII, 인자 X, 섬유아세포 성장 인자 (FGF), 피브리노겐, 피브로넥틴, 4중 나선 번들 단백질, G-CSF, glp-1, GM-CSF, 글루코세레브로시다제, 고나도트로핀, 성장 인자, 성장 인자 수용체, grf, 헷지호그 단백질, 헤모글로빈, 간세포 성장 인자 (hGF), 히루딘, 인간 성장 인자 (hGH), 인간 혈청 알부민, ICAM-1, ICAM-1 수용체, LFA-1, LFA-1 수용체, 인슐린, 인슐린-유사 성장 인자 (IGF), IGF-I, IGF-II, 인터페론 (IFN), IFN-알파, IFN-베타, IFN-감마, 인터루킨 (IL), IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, 각질 세포 성장 인자 (KGF), 락토페린, 백혈병 억제 인자, 루시퍼라제, 뉴투린, 호중구 억제 인자 (NIF), 온코스타틴 M, 골원성 단백질, 종양유전자 생성물, 파라시토닌, 부갑상선 호르몬, PD-ECSF, PDGF, 펩티드 호르몬, 플레이오트로핀, 단백질 A, 단백질 G, pth, 발열성 외독소 A, 발열성 외독소 B, 발열성 외독소 C, pyy, 릴랙신, 레닌, SCF, 생합성 소 단백질, 가용성 보체 수용체 I, 가용성 I-CAM 1, 가용성 인터루킨 수용체, 가용성 TNF 수용체, 소마토메딘, 소마토스타틴, 소마토트로핀, 스트렙토키나제, 슈퍼항원, 스타필로코커스 내독소, SEA, SEB, SECl, SEC2, SEC3, SED, SEE, 스테로이드 호르몬 수용체, 슈퍼옥시드 디스뮤타제, 독성 쇼크 증후 독소, 티모신 알파 1, 조직 플라스미노겐 활성화제, 종양 성장 인자 (TGF), 종양 괴사 인자, 종양 괴사 인자 알파, 종양 괴사 인자 베타, 종양 괴사 인자 수용체 (TNFR), VLA-4 단백질, VCAM-1 단백질, 혈관 내피 성장 인자 (VEGF), 유로키나제, mos, ras, raf, met, ρ53, tat, fos, myc, jun, myb, rel, 에스트로겐 수용체, 프로게스테론 수용체, 테스토스테론 수용체, 알도스테론 수용체, LDL 수용체 및 코르티코스테론.
따라서, 후술하는 성장 호르몬 (GH) 슈퍼유전자 패밀리에 관한 기재는 단지 예시의 목적으로 제공되는 것으로, 본 명세서에 기재된 방법, 조성물, 기술 및 전략의 범주에 어떠한 제한도 가하는 것이 아니다. 또한, 본 출원에서 GH 폴리펩티드에 대해 언급하는 것은 GH 슈퍼유전자 패밀리의 한 구성원에 대해서 단지 예시의 목적으로 총괄적으로 언급하는 것으로 이해되어야 한다. 따라서, 본 명세서에 기재된 GH 폴리펩티드 또는 단백질에 대한 변형 또는 화학은 GH 슈퍼유전자 패밀리의 다른 어떠한 구성원에나 동등하게 적용될 것이다.
하기 단백질들은 성장 호르몬(GH) 슈퍼유전자 패밀리에 의해 코딩되는 것 들을 포함한다[참조: Bazan, F., Immunology Today 11: 350-354 (1990); Bazan, J. F. Science 257: 410-411 (1992); Mott, H. R. and Campbell, I. D., Current Opinion in Structural Biology 5: 114-121 (1995); Silvennoinen, O. and IhIe, J. N., Signalling by the Hematopoietic Cytokine Receptors (1996)]: 성장 호르몬, 프로락틴, 태반 락토겐, 에리쓰로포이에틴 (EPO), 트롬보포이에틴(TPO), 인터루킨-2 (IL-2), IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-9, IL-IO, IL-11, IL-12 (p35 서브유닛), IL-13, IL-15, 온코스타틴 M, 섬모 신경영양 인자, 백혈병 억제 인자, 알파 인터페론, 베타 인터페론, 엡실론 인터페론, 감마 인터페론, 오메가 인터페론, 타우 인터페론, 과립구-콜로니 자극 인자 (G-CSF), 과립구-매크로파아지 콜로니 자극 인자 (GM-CSF), 매크로파아지 콜로니 자극 인자 (M-CSF) 및 카디오트로핀-1 (CT-1) ("GH 슈퍼유전자 패밀리"). 장래에 유전자 클로닝 및 서열화에 의해 이와 같은 유전자 패밀리의 추가의 구성원이 밝혀질 것이다. GH 슈퍼유전자 패밀리의 구성원은 그들이 일반적으로 제한된 아미노산 및 DNA 서열 일치도를 가짐에도 불구하고, 유사한 2차 및 3차 구조를 갖는다. 공유되는 구조적 특징으로 인하여 유전자 패밀리의 새로운 구성원을 쉽게 찾아낼 수 있으며, 본 명세서에 기재된 비-천연 아미노산 방법 및 조성물이 유사하게 적용될 수 있다.
G-CSF [Zink et al., FEBS Lett. 314:435 (1992); Zink et al., Biochemistry 33:8453 (1994); Hill et al., Proc. Natl. Acad. Sci.USA 90:5167 (1993)]; GM-CSF [Diederichs, K., et al. Science 154: 1779-1782 (1991); Walter et al., J. MoI. Biol. 224:1075-1085 (1992)]; IL-2 [Bazan, J. F. and McKay, D. B., Science 257: 410-413 (1992)]; IL-4 [Redfield et al., Biochemistry 30: 11029-11035 (1991); Powers et al., Science 256:1673-1677 (1992)]; 및 IL-5 [Milburn et al., Nature 363: 172-176 (1993)]을 포함하는 다수의 사이토카인의 구조가 X-선 회절 및 NMR 연구에서 결정되었으며, 상당한 1차 서열 상동성이 결여되어 있음에도 불구하고 GH 구조와 놀랄만큼 보존적이다. IFN은 모델링 및 다른 연구에 기초하여 이 패밀리의 구성원인 것으로 여겨진다[참조: Lee et al., J. Interferon Cytokine Res. 15:341 (1995); Murgolo et al., Proteins 17:62 (1993); Radhakrishnan et al., Structure 4:1453 (1996); Klaus et al., J. MoI. Biol. 274:661 (1997)]. 다수의 추가의 사이토카인 및 성장 인자, 예컨대, 섬모 신경영양 인자 (CNTF), 백혈병 억제 인자 (LIF), 트롬보포이에틴 (TPO), 온코스타틴 M, 매크로파아지 콜로니 자극 인자 (M-CSF), IL-3, IL-6, IL-7, IL-9, IL-12, IL-13, IL-15 및 과립구-콜로니 자극 인자 (G-CSF) 뿐만 아니라 알파, 베타, 오메가, 타우, 엡실론 및 감마 인터페론 등도 이 패밀리에 속한다[참조: Mott and Campbell, Current Opinion in Structural Biology 5: 114-121 (1995); Silvennoinen and IhIe (1996) Signalling by the Hematopoietic Cytokine Receptors]. 상기 모든 사이토카인 및 성장 인자가 현재 하나의 큰 유전자 패밀리를 이루고 있는 것으로 여겨진다.
유사한 2차 및 3차 구조를 공유하는 외에, 이 패밀리의 구성원들은 세포 표면 수용체들을 올리고머화하여 세포 내 신호 경로를 활성화시킨다는 특성을 공유한다. 비제한적인 예로서 GH 및 EPO 등을 포함하는 GH 패밀리 구성원은 한 가지 유형의 수용체에 결합하여 호모이합체를 형성한다. IL-2, IL4 및 IL-6 등의 다른 패밀리 구성원은 두 가지 이상의 수용체에 결합함으로써 수용체가 헤테로이합체 또는 보다 높은 차수의 응집체를 형성하게한다[참조: Davis et al, (1993) Science 260: 1805-1808; Paonessa et al., 1995) EMBO J. 14: 1942-1951; Mott and Campbell, Current Opinion in Structural Biology 5: 114-121 (1995)]. 변이 유발 연구는 GH와 마찬가지로 이들 다른 사이토카인 및 성장 인자들도 전형적으로는 2개인 다수의 수용체 결합 위치를 함유하며, 그들의 동종 수용체에 연속적으로 결합한다는 것을 밝혀냈다[참조: Mott and Campbell, Current Opinion in Structural Biology 5: 114-121 (1995); Matthews et al., (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 9471-9476)]. GH와 마찬가지로, 이들 다른 패밀리 구성원에 대한 일차적 수용체 결합 위치는 주로 4개의 알파 나선 및 A-B 루프에 존재한다. 수용체 결합에 참여하는 나선형 번들 중의 특이적 아미노산은 패밀리 구성원 간에 차이가 있다. GH 슈퍼유전자 패밀리의 구성원과 상호작용하는 세포 표면 수용체의 대부분은 구조적으로 연관되어 있으며, 제2의 큰 다-유전자 패밀리를 이룬다[참조: 전문이 본 명세서에 포함되는 미합중국 특허 제6,608,183호].
GH 슈퍼유전자 패밀리의 여러 구성원의 변이 연구를 통해 내려진 일반적인 결론은 알파 나선을 연결하는 루프는 일반적으로 수용체 결합에 관여하지 않는 경향이 있다는 것이다. 특히, 짧은 B-C 루프는 모두는 아닐지언정 대부분의 경우에 수용체 결합에 필수적이지 않다. 이러한 이유로, B-C 루프가 GH 슈퍼유전자 패밀리에 있어서 본 명세서에 기재된 비-천연 아미노산으로 치환될 수 있다. A-B 루프, C-D 루프 (및 GH 슈퍼유전자 패밀리의 인터페론/IL-10-유사 구성원의 D-E 루프)도 또한 비-천연 아미노산으로 치환될 수 있다. 나선 A에 근접하고 최종 나선에 대해 원위치에 존재하는 아미노산 또한 수용체 결합에 관여하지 않는 경향이 있고, 따라서, 비-천연 아미노산의 도입 위치가 될 수 있다. 일부 실시태양에서, 비-천연 아미노산은 A-B, B-C, C-D 또는 D-E 루프의 첫번째 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 그 이상의 아미노산을 포함하여, 루프 구조 내의 어느 위치에서나 치환된다. 일부 실시태양에서, 비-천연 아미노산은 A-B, B-C, C-D 또는 D-E 루프의 마지막 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 그 이상의 아미노산 내에서 치환된다.
비제한적인 예로서 EPO, IL-2, IL-3, IL-4, IL-6, IFN, GM-CSF, TPO, IL-10, IL-12 p35, IL-13, IL-15 및 베타 인터페론을 포함하는 GH 패밀리의 구성원 중 일부는 N-결합된 및(또는) O-결합된 당을 함유한다. 단백질 내의 글리코실화 위치는 거의 독점적으로 루프 영역내에 존재하며, 알파 나선 번들에는 존재하지 않는다. 루프 영역은 일반적으로 수용체 결합에는 참여하지 않고, 당 기의 공유결합 부착 위치이기 때문에, 단백질 내로 비-천연 아미노산 치환을 도입하는데 유용한 위치일 수 있다. N- 및 O-결합 글리코실화 위치를 이루는 아미노산은 그들이 표면에 노출되어 있기 때문에 비-천연 아미노산 치환 위치가 될 수 있다. 따라서, 천연 단백질은 이들 위치에서 단백질에 부착된 벌키한 당 기를 수용할 수 있으며, 글리코실화 위치는 수용체 결합 위치로부터 멀리 떨어져 위치하는 경향이 있다.
GH 슈퍼유전자 패밀리의 또 다른 구성원이 장래에 발견될 것이다. GH 슈퍼유전자 패밀리의 새로운 구성원은 예상되는 단백질 구조의 컴퓨터 보조된 2차 및 3차 구조 분석, 및 특정 표적에 결합하는 분자를 찾아내도록 설계된 선별 기술에 의해 확인될 것이다. GH 슈퍼유전자 패밀리의 구성원은 전형적으로 비-나선 아미노산(루프 영역)에 의해 연결된 4 내지 5개의 양쪽성 나선을 갖는다. 단백질은 N-말단에 세포로부터의 분비를 촉진하는 소수성 신호 서열을 함유할 수 있다. 이와 같이 나중에 발견되는 GH 슈퍼유전자 패밀리 구성원도 본 명세서에 기재된 방법 및 조성물에 포함된다.
V. 비-천연 아미노산
본 명세서에 기재된 방법 및 조성물에 사용되는 비-천연 아미노산은 다음 4가지 특성 중 적어도 하나를 갖는다: (1) 비-천연 아미노산 측쇄 상의 적어도 하나의 관능기는 20가지 통상의 유전적으로 코딩되는 아미노산(즉, 알라닌, 아르기닌, 아스파라긴, 아스파르트산, 시스테인, 글루타민, 글루탐산, 글리신, 히스티딘, 이소류신, 류신, 리신, 메티오닌, 페닐알라닌, 프롤린, 세린, 트레오닌, 트립토판, 티로신 및 발린)의 화학적 반응성에 오르쏘고날하거나, 적어도 비-천연 아미노산을 포함하는 폴리펩티드 중에 천연적으로 존재하는 아미노산의 화학적 반응성에 오르쏘고날한 특성 및(또는) 활성 및(또는) 반응성을 갖고; (2) 도입된 비-천연 아미노산은 20가지 통상의 유전적으로 코딩되는 아미노산에 대하여 실질적으로 화학적으로 불활성이며; (3) 비-천연 아미노산은 바람직하게는 천연 아미노산과 대등한 안정성으로 또는 전형적인 생리적 조건하에 폴리펩티드 내로 안정하게 도입될 수 있으며, 추가로 바람직하게는 그러한 도입이 생체내 계를 통하여 일어날 수 있고; (4) 비-천연 아미노산은 옥심 관능기, 또는 바람직하게는 비-천연 아미노산 함유 폴리펩티드의 생물학적 특성을 파괴하지 않는(그러한 생물학적 특성의 파괴가 변형/전환의 목적이 아닌 한) 조건하에, 또는 그와 같은 전환이 pH 약 4 내지 약 8의 수성 조건하에 일어날 수 있는 경우에 또는 비-천연 아미노산 상의 반응성 위치가 친전자 위치인 경우에 다른 화합물과 반응하여 옥심으로 전환될 수 있는 기를 포함한다. 본 명세서에 기재된 방법 및 조성물에 사용될 수 있는 비-천연 아미노산에 대한 위와 같은 네 가지 요건을 충족시키는 아미노산의 비제한적인 예는 도 2, 3, 35 및 40 내지 43에 제시되어 있다. 어떠한 수의 비-천연 아미노산이 폴리펩티드 내로 도입되어도 무방하다. 비-천연 아미노산은 또한 보호된 또는 차폐된 옥심, 또는 보호된 기의 탈보호 후 또는 차폐된 기의 차폐 제거 후 옥심 기로 전환될 수 있는 보호된 또는 차폐된 기를 포함할 수 있다. 비-천연 아미노산은 또한 보호된 기의 탈보호 후 또는 차폐된 기의 차폐 제거 후 카르보닐 또는 디카르보닐 기로 전환될 수 있고, 따라서, 히드록실아민 또는 옥심과 반응하여 옥심 기를 형성할 수 있는 카르보닐 또는 디카르보닐 기를 포함할 수 있다.
본 명세서에 기재된 방법 및 조성물에 사용될 수 있는 비-천연 아미노산은 비제한적인 예로서 광활성화 가교결합제를 포함하는 아미노산, 스핀-표지된 아미노산, 형광 아미노산, 금속 결합 아미노산. 금속-함유 아미노산, 방사성 아미노산, 신규 관능기가 있는 아미노산, 다른 분자와 공유 또는 비공유적으로 상호작용할 수 있는 아미노산, 포토케이지드 및(또는) 광이성화가능한 아미노산, 비오틴 또는 비오틴 유사체를 포함하는 아미노산, 글리코실화 아미노산(예를 들어, 당으로 치환된 세린), 다른 탄수화물 변형된 아미노산, 케토-함유 아미노산, 알데히드-함유 아미노산, 폴리에틸렌 글리콜 또는 기타 폴리에테르를 포함하는 아미노산, 중량급 원자로 치환된 아미노산, 화학적 절단 및(또는) 광절단될 수 있는 아미노산, 천연 아미노산에 비해 긴 측쇄(비제한적인 예로서 폴리에테르 또는 약 5개 또는 10개 탄소 원자의 탄화수소)를 갖는 아미노산, 탄소-결합된 당-함유 아미노산, 산화환원-활성 아미노산, 아미노 티오산 함유 아미노산, 또는 하나 이상의 독성 잔기를 갖는 아미노산을 포함한다.
일부 실시태양에서, 비-천연 아미노산은 사카라이드 잔기를 포함한다. 그와 같은 아미노산의 예는 N-아세틸-L-글루코사미닐-L-세린, N-아세틸-L-갈락토사미닐-L-세린, N-아세틸-L-글루코사미닐-L-트레오닌, N-아세틸-L-글루코사미닐-L-아스파라긴 및 O-만노사미닐-L-세린을 포함한다. 그와 같은 아미노산의 예는 아미노산과 사카라이드 사이의 천연적으로 발견되는 N- 또는 O-결합이 자연에서 통상적으로 발견되지 않는 공유 결합, 예컨대, 알켄, 옥심, 티오에테르 또는 아미드 등으로 치환된 예를 포함한다. 그와 같은 아미노산의 예는 또한 천연의 단백질에서 통상적으로 발견되지 않는 사카라이드, 예컨대, 2-데옥시-글루코스, 2-데옥시갈락토스 등을 포함한다.
비-천연 아미노산의 도입을 통해 폴리펩티드 내로 도입되는 화학적 잔기는 각종 잇점 및 폴리펩티드의 조작 변형을 제공한다. 예를 들어, 카르보닐 또는 디카르보닐 관능기(케토- 또는 알데히드-관능기 포함)의 독특한 반응성은 단백질을 생체내 또는 시험관내에서 다수의 히드라진- 또는 히드록실아민-함유 반응 화합물로 선택적으로 변형시키는 것을 가능하게 한다. 중량급 원자 비-천연 아미노산은, 예컨대, X-선 구조 데이타 프레이징에 유용하다. 비-천연 아미노산을 사용하여 중량급 원자를 위치-특이적으로 도입하는 것은 중량급 원자의 도입 위치 선택에 있어서 선택성 및 유연성을 제공한다. 광반응성 비-천연 아미노산(비제한적인 예로서, 벤조페논, 또는 페닐아지드와 같은 아릴아지드가 측쇄가 있는 아미노산)은 예컨대, 폴리펩티드의 생체내 또는 시험관내 광가교결합을 효율적이게 한다. 광반응성 비-천연 아미노산은 비제한적인 예로서 p-아지도-페닐알라닌 및 p-벤조일-페닐알라닌을 포함한다. 광반응성 비-천연 아미노산을 포함하는 폴리펩티드는 광반응성 기를 여기시켜 의도하는 바에 따라 가교결합시킬 수 있으며, 즉, 시기를 제어할 수 있다. 비제한적인 예로서, 비-천연 아미노산의 메틸기는 핵자기 공명이나 진동 분석 등을 사용하여 지엽적 구조 및 동태학을 탐지하는 프로브로서, 예를 들어, 동위원소 표지된 메틸기로 치환될 수 있다.
A. 비-천연 아미노산의 구조 및 합성: 카르보닐, 카르보닐-유사, 차폐된 카르보닐 및 보호된 카르보닐 기
친전자 반응성 기를 갖는 아미노산은 비제한적인 예로서는 친핵성 부가 반응을 포함하는, 다양한 화학적 반응을 통하여 분자를 결합시키는 반응이 일어나게 한다. 그와 같은 친전자 반응성 기는 카르보닐 또는 디카르보닐 기(케토- 또는 알데히드 기 포함), 카르보닐-유사 또는 디카르보닐-유사 기(카르보닐 또는 디카르보닐 기에 유사한 반응성을 가지며, 카르보닐 또는 디카르보닐 기에 구조적으로 유사함), 차폐된 카르보닐- 또는 차폐된 디카르보닐 기(카르보닐 또는 디카르보닐 기로 쉽게 전환될 수 있음), 또는 보호된 카르보닐- 또는 보호된 디카르보닐-기(탈보호시 카르보닐 또는 디카르보닐 기에 유사한 반응성을 가짐)을 포함한다. 그와 같은아미노산은 하기 화학식 (I)의 구조를 갖는다:
Figure 112007052373933-pct00003
상기 식에서,
A는 임의로 존재하고, 존재하는 경우에는 저급 알킬렌, 치환된 저급 알킬렌, 저급 시클로알킬렌, 치환된 저급 시클로알킬렌, 저급 알케닐렌, 치환된 저급 알케닐렌, 알키닐렌, 저급 헤테로알킬렌, 치환된 헤테로알킬렌, 저급 헤테로시클로알킬렌, 치환된 저급 헤테로시클로알킬렌, 아릴렌, 치환된 아릴렌, 헤테로아릴렌, 치환된 헤테로아릴렌, 알크아릴렌, 치환된 알크아릴렌, 아르알킬렌 또는 치환된 아르알킬렌이며;
B는 임의로 존재하고, 존재하는 경우에는 저급 알킬렌, 치환된 저급 알킬렌, 저급 알케닐렌, 치환된 저급 알케닐렌, 저급 헤테로알킬렌, 치환된 저급 헤테로알킬렌, -O-, -O-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -S-, -S-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -S(O)k- (k는 1, 2 또는 3임), -S(O)k(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(O)-, -NS(O)2-, -OS(O)2-, -C(O)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(S)-, -C(S)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')-, -NR'-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(O)N(R')-, -CON(R')-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -CSN(R')-, -CSN(R')-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')CO-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')C(O)O-, -S(O)kN(R')-, -N(R')C(0)N(R')-, -N(R')C(S)N(R')-, -N(R')S(O)kN(R')-, -N(R')-N=, -C(R')=N-, -C(R')=N-N(R')-, -C(R')=N-N=, -C(R')2-N=N- 및 -C(R')2-N(R')-N(R')-(여기서, R' 는 각각 독립적으로 H, 알킬 또는 치환된 알킬임)로 구성되는 군으로부터 선택되는 링커이며;
J는
Figure 112007052373933-pct00004
이고;
R은 H, 알킬, 치환된 알킬, 시클로알킬 또는 치환된 시클로알킬이며;
R"는 각각 독립적으로 H, 알킬, 치환된 알킬 또는 보호기이거나, 2개 이상의 R" 기가 존재하는 경우, 2개의 R"는 임의로는 헤테로시클로알킬을 형성하고;
R1은 H, 아미노 보호기, 수지, 아미노산, 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드이며;
R2는 OH, 에스테르 보호기, 수지, 아미노산, 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드이고;
R3 및 R4는 각각 독립적으로 H, 할로겐, 저급 알킬 또는 치환된 저급 알킬이거나, R3와 R4 또는 2개의 R3 기가 임의로는 시클로알킬 또는 헤테로시클로알킬을 형성하며;
-A-B-J-R 기는 함께 디카르보닐 기를 포함하는 카르보닐 기, 보호된 디카르보닐 기를 포함하는 보호된 카르보닐 기, 또는 차폐된 디카르보닐 기를 포함하는 차페된 카르보닐 기를 적어도 하나 포함하는 비시클릭 또는 트리시클릭 시클로알킬 또는 헤테로시클로알킬을 형성하거나;
-J-R 기는 함께 디카르보닐 기를 포함하는 카르보닐 기, 보호된 디카르보닐 기를 포함하는 보호된 카르보닐 기, 또는 차폐된 디카르보닐 기를 포함하는 차폐된 카르보닐 기를 적어도 하나 포함하는 모노시클릭 또는 비시클릭 시클로알킬 또는 헤테로시클로알킬을 형성하거나;
단, A가 페닐렌이고, 각 R3가 H일 때, B가 존재하고; A가 -(CH2)4- 이고, 각 R3가 H일 때, B는 -NHC(O)(CH2CH2)-가 아니며; A 및 B가 부재하고, 각 R3가 H일 때, R은 메틸이 아니다. 그와 같은 비-천연 아미노산은 염 형태로 존재하거나, 비-천연 아미노산 폴리펩티드, 중합체, 폴리사카라이드, 또는 폴리뉴클레오티드 내로 혼입될 수 있으며, 임의로는 번역후 변형될 수 있다.
특정 실시태양에서, 화학식 (I)의 화합물은 온화한 산성 조건하에 수용액 중에서 적어도 1개월 동안 안정하다. 특정 실시태양에서, 화학식 (I)의 화합물은 온화한 산성 조건하에 적어도 2주 동안 안정하다. 특정 실시태양에서, 화학식 (I)의 화합물은 온화한 산성 조건하에 수용액 중에서 적어도 5일 동안 안정하다. 특정 실시태양에서, 그와 같은 조건은 pH 2 내지 8이다.
화학식 (I)의 화합물의 특정 실시태양에서, B는 저급 알킬렌, 치환된 저급 알킬렌, -O-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(R')=N-N(R')-, -N(R')CO-, -C(O)-, -C(R')=N-, -C(O)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -CON(R')-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -S(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, - S(O)(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)- 또는 -S(O)2(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)- 이다. 화학식 (I)의 화합물의 특정 실시태양에서, B는 -O(CH2)-, -CH=N-, -CH=N-NH-, -NHCH2-, -NHCO-, -C(O)-, -C(O)-(CH2)-, -CONH-(CH2)-, -SCH2-, -S(=O)CH2- 또는 -S(O)2CH2- 이다. 화학식 (I)의 화합물의 특정 실시태양에서, R은 C1-6 알킬 또는 시클로알킬이다. 화학식 (I)의 화합물의 특정 실시태양에서, R은 -CH3, -CH(CH3)2 또는 시클로프로필이다. 화학식 (I)의 화합물의 특정 실시태양에서, R1은 H, tert-부틸옥시카르보닐 (Boc), 9-플루오레닐메톡시카르보닐 (Fmoc), N-아세틸, 테트라플루오로아세틸 (TFA) 또는 벤질옥시카르보닐 (Cbz)이다. 화학식 (I)의 화합물의 특정 실시태양에서, R1은 수지, 아미노산, 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드이다. 화학식 (I)의 화합물의 특정 실시태양에서, R2는 OH, O-메틸, O-에틸 또는 O-t-부틸이다. 화학식 (I)의 화합물의 특정 실시태양에서, R2는 수지, 아미노산, 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드이다. 화학식 (I)의 화합물의 특정 실시태양에서, R2는 폴리뉴클레오티드이다. 화학식 (I)의 화합물의 특정 실시태양에서, R2는 리보핵산 (RNA)이다. 화학식 (I)의 화합물의 특정 실시태양에서, R2는 tRNA이다. 화학식 (I)의 화합물의 특정 실시태양에서, tRNA는 셀렉터 코돈을 특이적으로 인식한다. 화학식 (I)의 화합물의 특정 실 시태양에서, 셀렉터 코돈은 암버 코돈, 오커 코돈, 오팔 코돈, 독특한 코돈, 희귀 코돈, 비천연 코돈, 5-염기 코돈 및 4-염기 코돈으로 구성되는 군으로부터 선택된다. 화학식 (I)의 화합물의 특정 실시태양에서, R2는 서프레서 tRNA이다.
화학식 (I)의 화합물의 특정 실시태양에서,
Figure 112007052373933-pct00005
은 하기 구성되는 군으로부터 선택되고;
((i) A는 치환된 저급 알킬렌, C4-아릴렌, 치환된 아릴렌, 헤테로아릴렌, 치환된 헤테로아릴렌, 알크아릴렌, 치환된 알크아릴렌, 아르알킬렌 또는 치환된 아르알킬렌이고;
B는 임의로 존재하고, 존재하는 경우에는 저급 알킬렌, 치환된 저급 알킬렌, 저급 알케닐렌, 치환된 저급 알케닐렌, -O-, -O-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -S-, -S(O)-, -S(O)2-, -NS(O)2-, -OS(O)2-, -C(O)-, -C(O)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(S)-, -N(R')-, -C(O)N(R')-, -CON(R')-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -CSN(R')-, -N(R')CO-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')C(0)0-, -N(R')C(S)-, -S(O)N(R'), -S(O)2N(R'), -N(R')C(O)N(R')-, -N(R')C(S)N(R')-, -N(R')S(O)N(R')-, -N(R')S(O)2N(R')-, -N(R')-N=, -C(R')=N-N(R')-, -C(R')=N-N=, -C(R')2-N=N- 및 -C(R')2-N(R')-N(R')-로 구성되는 군으로부터 선택되는 이가 링커임;
(ii) A는 임의로 존재하고, 존재하는 경우에는 치환된 저급 알킬렌, C4-아릴 렌, 치환된 아릴렌, 헤테로아릴렌, 치환된 헤테로아릴렌, 알크아릴렌, 치환된 알크아릴렌, 아르알킬렌 또는 치환된 아르알킬렌이고;
B는 저급 알킬렌, 치환된 저급 알킬렌, 저급 알케닐렌, 치환된 저급 알케닐렌, -O-, -O-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -S-, -S(O)-, -S(O)2-, -NS(O)2-, -OS(O)2-, -C(O)-, -C(O)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(S)-, -N(R')-, -C(O)N(R')-, -CON(R')-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -CSN(R')-, -N(R')CO-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')C(0)0-, -N(R')C(S)-, -S(O)N(R'), -S(O)2N(R'), -N(R')C(O)N(R')-, -N(R')C(S)N(R')-, -N(R')S(O)N(R')-, -N(R')S(O)2N(R')-, -N(R')-N=, -C(R')=N-N(R')-, -C(R')=N-N=, -C(R')2-N=N- 및 -C(R')2-N(R')-N(R')-로 구성되는 군으로부터 선택되는 이가 링커임;
(iii) A는 저급 알킬렌이고;
B는 임의로 존재하고, 존재하는 경우에는 저급 알킬렌, 치환된 저급 알킬렌, 저급 알케닐렌, 치환된 저급 알케닐렌, -O-, -O-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -S-, -S(O)-, -S(O)2-, -NS(O)2-, -OS(O)2-, -C(O)-, -C(O)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(S)-, -N(R')-, -C(O)N(R')-, -CSN(R')-, -CON(R')-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')C(0)0-, -N(R')C(S)-, -S(O)N(R'), -S(O)2N(R'), -N(R')C(O)N(R')-, -N(R')C(S)N(R')-, -N(R')S(O)N(R')-, -N(R')S(O)2N(R')-, -N(R')-N=, -C(R')=N-N(R')-, -C(R')=N-N=, -C(R')2-N=N- 및 -C(R')2-N(R')-N(R')-로 구성되는 군으로부터 선택되는 이가 링커임; 및
(iv) A는 페닐렌이고;
B는 저급 알킬렌, 치환된 저급 알킬렌, 저급 알케닐렌, 치환된 저급 알케닐렌, -O-, -O-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -S-, -S(O)-, -S(O)2-, -NS(O)2-, -OS(O)2-, -C(O)-, -C(O)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(S)-, -N(R')-, -C(O)N(R')-, -CON(R')-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -CSN(R')-, -N(R')CO-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')C(0)0-, -N(R')C(S)-, -S(O)N(R'), -S(O)2N(R'), -N(R')C(O)N(R')-, -N(R')C(S)N(R')-, -N(R')S(O)N(R')-, -N(R')S(O)2N(R')-, -N(R')-N=, -C(R')=N-N(R')-, -C(R')=N-N=, -C(R')2-N=N- 및 -C(R')2-N(R')-N(R')-로 구성되는 군으로부터 선택되는 이가 링커임);
J는
Figure 112007052373933-pct00006
이고;
각 R'는 각각 독립적으로 H, 알킬 또는 치환된 알킬이고;
R1은 임의로 존재하고, 존재하는 경우에는 H, 아미노 보호기, 수지, 아미노산, 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드이고;
R2는 임의로 존재하고, 존재하는 경우에는 OH, 에스테르 보호기, 수지, 아미노산, 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드이며;
R3 및 R4는 각각 독립적으로 H, 할로겐, 저급 알킬 또는 치환된 저급 알킬이고;
R은 H, 알킬, 치환된 알킬, 시클로알킬 또는 치환된 시클로알킬이다.
또한, 화학식 (II)의 아미노산이 포함된다:
Figure 112007052373933-pct00007
상기 식에서,
A는 임의로 존재하고, 존재하는 경우에는 저급 알킬렌, 치환된 저급 알킬렌, 저급 시클로알킬렌, 치환된 저급 시클로알킬렌, 저급 알케닐렌, 치환된 저급 알케닐렌, 알키닐렌, 저급 헤테로알킬렌, 치환된 헤테로알킬렌, 저급 헤테로시클로알킬렌, 치환된 저급 헤테로시클로알킬렌, 아릴렌, 치환된 아릴렌, 헤테로아릴렌, 치환된 헤테로아릴렌, 알크아릴렌, 치환된 알크아릴렌, 아르알킬렌 또는 치환된 아르알킬렌이며;
B는 임의로 존재하고, 존재하는 경우에는 저급 알킬렌, 치환된 저급 알킬렌, 저급 알케닐렌, 치환된 저급 알케닐렌, 저급 헤테로알킬렌, 치환된 저급 헤테로알킬렌, -O-, -O-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -S-, -S-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -S(O)k- (k는 1, 2 또는 3임), -S(O)k(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(O)-, -NS(O)2-, -OS(O)2-, -C(O)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(S)-, -C(S)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')-, -NR'-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(O)N(R')-, -CON(R')-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -CSN(R')-, -CSN(R')-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')CO-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')C(O)O-, -S(O)kN(R')-, -N(R')C(0)N(R')-, -N(R')C(S)N(R')-, -N(R')S(O)kN(R')-, -N(R')-N=, -C(R')=N-, -C(R')=N-N(R')-, -C(R')=N-N=, -C(R')2-N=N- 및 -C(R')2-N(R')-N(R')-(여기서, R' 는 각각 독립적으로 H, 알킬 또는 치환된 알킬임)로 구성되는 군으로부터 선택되는 링커이며;
R은 H, 알킬, 치환된 알킬, 시클로알킬 또는 치환된 시클로알킬이며;
R1은 H, 아미노 보호기, 수지, 아미노산, 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드이며;
R2는 OH, 에스테르 보호기, 수지, 아미노산, 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드이고;
단, A가 페닐렌일 때, B가 존재하고; A가 -(CH2)4-일 때, B는 -NHC(O)(CH2CH2)-가 아니며; A 및 B가 부재할 때, R은 메틸이 아니다. 그와 같은 비-천연 아미노산은 염 형태로 존재하거나, 비-천연 아미노산 폴리펩티드, 중합체, 폴리사카라이드, 또는 폴리뉴클레오티드 내로 혼입될 수 있으며, 임의로는 번역후 변형될 수 있다.
또한 화학식 (III)의 구조를 갖는 아미노산이 포함된다:
Figure 112007052373933-pct00008
상기 식에서,
B는 저급 알킬렌, 치환된 저급 알킬렌, 저급 알케닐렌, 치환된 저급 알케닐렌, 저급 헤테로알킬렌, 치환된 저급 헤테로알킬렌, -O-, -O-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -S-, -S-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -S(O)k- (k는 1, 2 또는 3임), -S(O)k(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(O)-, -NS(O)2-, -OS(O)2-, -C(O)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(S)-, -C(S)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')-, -NR'-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(O)N(R')-, -CON(R')- (알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -CSN(R')-, -CSN(R')-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')CO- (알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')C(O)O-, -S(O)kN(R')-, -N(R')C(O)N(R')-, -N(R')C(S)N(R')-, -N(R')S(0)kN(R')-, -N(R')-N=, -C(R')=N-, -C(R')=N-N(R')-, -C(R')=N-N=, -C(R')2-N=N- 및 -C(R')2-N(R')-N(R')-(여기서, R'는 각각 독립적으로 H, 알킬 또는 치환된 알킬임)로 구성되는 군으로부터 선택되는 링커이고;
R은 H, 알킬, 치환된 알킬, 시클로알킬 또는 치환된 시클로알킬이며;
R1은 H, 아미노 보호기, 수지, 아미노산, 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드이고;
R2는 OH, 에스테르 보호기, 수지, 아미노산, 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드이며;
Ra는 각각 독립적으로 H, 할로겐, 알킬, 치환된 알킬, -N(R')2, - C(O)kR' (k는 1, 2 또는 3임), -C(O)N(R')2, -OR' 및 -S(O)kR'(여기서, R'은 각각 독립적으로 H, 알킬 또는 치환된 알킬임)로 구성되는 군으로부터 선택된다. 그와 같은 비-천연 아미노산은 염 형태로 존재하거나, 비-천연 아미노산 폴리펩티드, 중합체, 폴리사카라이드, 또는 폴리뉴클레오티드 내로 혼입될 수 있으며, 임의로는 번역후 변형될 수 있다.
또한, 하기 아미노산이 포함된다:
Figure 112007052373933-pct00009
그와 같은 비-천연 아미노산은 염 형태로 존재하거나, 비-천연 아미노산 폴리펩티드, 중합체, 폴리사카라이드, 또는 폴리뉴클레오티드 내로 혼입될 수 있으며, 임의로는 번역후 변형될 수 있다.
또한, 화학식 (IV)의 구조를 갖는 하기 아미노산이 포함된다:
Figure 112007052373933-pct00010
상기 식에서,
B는 저급 알킬렌, 치환된 저급 알킬렌, 저급 알케닐렌, 치환된 저급 알케닐렌, 저급 헤테로알킬렌, 치환된 저급 헤테로알킬렌, -O-, -O-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -S-, -S-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -S(O)k- (k는 1, 2 또는 3임), -S(O)k(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(O)-, -C(O)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(S)-, -C(S)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')-, -NR'-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(O)N(R')-, -CON(R')-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -CSN(R')-, -CSN(R')-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')CO-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')C(O)O-, -S(O)kN(R')-, -N(R')C(O)N(R')-, -N(R')C(S)N(R')-, -N(R')S(0)kN(R')-, -N(R')-N=, -C(R')=N-, -C(R')=N-N(R')-, -C(R')=N-N=, -C(R')2-N=N- 및 -C(R')2-N(R')-N(R')-(여기서, R'는 각각 독립적으로 H, 알킬 또는 치환된 알킬임)로 구성되는 군으로부터 선택되는 링커이고;
R은 H, 알킬, 치환된 알킬, 시클로알킬 또는 치환된 시클로알킬이며;
R1은 H, 아미노 보호기, 수지, 아미노산, 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드이고;
R2는 OH, 에스테르 보호기, 수지, 아미노산, 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드이며;
Ra는 각각 독립적으로 H, 할로겐, 알킬, 치환된 알킬, -N(R')2, - C(O)kR' (k는 1, 2 또는 3임), -C(O)N(R')2, -OR' 및 -S(O)kR'(여기서, R'은 각각 독립적으로 H, 알킬 또는 치환된 알킬임)로 구성되는 군으로부터 선택되고;
n은 0 내지 8이며; 단, A가 -(CH2)4-일 때, B는 -NHC(O)(CH2CH2)-이 아니다. 그와 같은 비-천연 아미노산은 염 형태로 존재하거나, 비-천연 아미노산 폴리펩티드, 중합체, 폴리사카라이드, 또는 폴리뉴클레오티드 내로 혼입될 수 있으며, 임의로는 번역후 변형될 수 있다.
또한, 하기 아미노산이 포함된다:
Figure 112007052373933-pct00011
그와 같은 화합물은 임의로는 아미노 보호되거나, 임의로는 카르복실 보호되거나, 임의로는 아미노 및 카르복실 보호되거나 염 형태로 존재하거나, 비-천연 아미노산 폴리펩티드, 중합체, 폴리사카라이드, 또는 폴리뉴클레오티드 내로 혼입될 수 있으며, 임의로는 번역후 변형될 수 있다.
또한, 화학식 (VIII)의 구조를 갖는 하기 아미노산이 포함된다:
Figure 112007052373933-pct00012
상기 식에서,
A는 임의로 존재하고, 존재하는 경우에는 저급 알킬렌, 치환된 저급 알킬렌, 저급 시클로알킬렌, 치환된 저급 시클로알킬렌, 저급 알케닐렌, 치환된 저급 알케 닐렌, 알키닐렌, 저급 헤테로알킬렌, 치환된 헤테로알킬렌, 저급 헤테로시클로알킬렌, 치환된 저급 헤테로시클로알킬렌, 아릴렌, 치환된 아릴렌, 헤테로아릴렌, 치환된 헤테로아릴렌, 알크아릴렌, 치환된 알크아릴렌, 아르알킬렌 또는 치환된 아르알킬렌이며;
B는 임의로 존재하고, 존재하는 경우에는 저급 알킬렌, 치환된 저급 알킬렌, 저급 알케닐렌, 치환된 저급 알케닐렌, 저급 헤테로알킬렌, 치환된 저급 헤테로알킬렌, -O-, -O-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -S-, -S-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -S(O)k- (k는 1, 2 또는 3임), -S(O)k(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(O)-, -NS(O)2-, -OS(O)2-, -C(O)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(S)-, -C(S)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')-, -NR'-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(O)N(R')-, -CON(R')-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -CSN(R')-, -CSN(R')-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')CO-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')C(O)O-, -S(O)kN(R')-, -N(R')C(0)N(R')-, -N(R')C(S)N(R')-, -N(R')S(O)kN(R')-, -N(R')-N=, -C(R')=N-, -C(R')=N-N(R')-, -C(R')=N-N=, -C(R')2-N=N- 및 -C(R')2-N(R')-N(R')-(여기서, R' 는 각각 독립적으로 H, 알킬 또는 치환된 알킬임)로 구성되는 군으로부터 선택되는 링커이며;
R1은 H, 아미노 보호기, 수지, 아미노산, 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드이며;
R2는 OH, 에스테르 보호기, 수지, 아미노산, 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드이다. 그와 같은 비-천연 아미노산은 염 형태로 존재하거나, 비-천연 아미노산 폴리펩티드, 중합체, 폴리사카라이드, 또는 폴리뉴클레오티드 내로 혼입될 수 있으며, 임의로는 번역후 변형될 수 있다.
또한, 화학식 (IX)의 구조를 갖는 아미노산이 포함된다:
Figure 112007052373933-pct00013
상기 식에서,
B는 임의로 존재하고, 존재하는 경우에는 저급 알킬렌, 치환된 저급 알킬렌, 저급 알케닐렌, 치환된 저급 알케닐렌, 저급 헤테로알킬렌, 치환된 저급 헤테로알킬렌, -O-, -O-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -S-, -S-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -S(O)k- (k는 1, 2 또는 3임), -S(O)k(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(O)-, -NS(O)2-, -OS(O)2-, -C(O)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(S)-, -C(S)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')-, -NR'-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(O)N(R')-, -CON(R')-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -CSN(R')-, -CSN(R')-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')CO-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')C(O)O-, -S(O)kN(R')-, -N(R')C(0)N(R')-, -N(R')C(S)N(R')-, -N(R')S(O)kN(R')-, -N(R')-N=, -C(R')=N-, -C(R')=N-N(R')-, -C(R')=N-N=, -C(R')2-N=N- 및 -C(R')2-N(R')-N(R')-(여기서, R' 는 각각 독립적으로 H, 알킬 또는 치환된 알킬임)로 구성되는 군으로부터 선택되는 링커이며;
R은 H, 알킬, 치환된 알킬, 시클로알킬 또는 치환된 시클로알킬이고;
R1은 H, 아미노 보호기, 수지, 아미노산, 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드이며;
R2는 OH, 에스테르 보호기, 수지, 아미노산, 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드이고;
Ra는 각각 독립적으로 H, 할로겐, 알킬, 치환된 알킬, -N(R')2, - C(O)kR' (k는 1, 2 또는 3임), -C(O)N(R')2, -OR' 및 -S(O)kR'(여기서, R'은 각각 독립적으로 H, 알킬 또는 치환된 알킬임)로 구성되는 군으로부터 선택된다. 그와 같은 비-천연 아미노산은 염 형태로 존재하거나, 비-천연 아미노산 폴리펩티드, 중합체, 폴리사카라이드, 또는 폴리뉴클레오티드 내로 혼입될 수 있으며, 임의로는 번역후 변형될 수 있다.
또한, 하기 아미노산이 포함된다:
Figure 112007052373933-pct00014
그와 같은 화합물은 임의로는 아미노 보호되거나, 임의로는 카르복실 보호되거나, 임의로는 아미노 및 카르복실 보호되거나 염 형태로 존재하거나, 비-천연 아미노산 폴리펩티드, 중합체, 폴리사카라이드, 또는 폴리뉴클레오티드 내로 혼입될 수 있으며, 임의로는 번역후 변형될 수 있다.
화학식 (X)의 구조를 갖는 아미노산이 또한 포함한다:
Figure 112007052373933-pct00015
상기 식에서,
B는 임의로 존재하고, 존재하는 경우에는 저급 알킬렌, 치환된 저급 알킬렌, 저급 알케닐렌, 치환된 저급 알케닐렌, 저급 헤테로알킬렌, 치환된 저급 헤테로알킬렌, -O-, -O-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -S-, -S-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -S(O)k- (k는 1, 2 또는 3임), -S(O)k(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(O)-, -NS(O)2-, -OS(O)2-, -C(O)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(S)-, -C(S)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')-, -NR'-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(O)N(R')-, -CON(R')-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -CSN(R')-, -CSN(R')-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')CO-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')C(O)O-, -S(O)kN(R')-, -N(R')C(0)N(R')-, -N(R')C(S)N(R')-, -N(R')S(O)kN(R')-, -N(R')-N=, -C(R')=N-, -C(R')=N-N(R')-, -C(R')=N-N=, -C(R')2-N=N- 및 -C(R')2-N(R')-N(R')-(여기서, R' 는 각각 독립적으로 H, 알킬 또는 치환된 알킬임)로 구성되는 군으로부터 선택되는 링커이며;
R은 H, 알킬, 치환된 알킬, 시클로알킬 또는 치환된 시클로알킬이고;
R1은 H, 아미노 보호기, 수지, 아미노산, 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드이며;
R2는 OH, 에스테르 보호기, 수지, 아미노산, 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드이고;
Ra는 각각 독립적으로 H, 할로겐, 알킬, 치환된 알킬, -N(R')2, - C(O)kR' (k는 1, 2 또는 3임), -C(O)N(R')2, -OR' 및 -S(O)kR'(여기서, R'은 각각 독립적으로 H, 알킬 또는 치환된 알킬임)로 구성되는 군으로부터 선택된다. 그와 같은 비-천연 아미노산은 염 형태로 존재하거나, 비-천연 아미노산 폴리펩티드, 중합체, 폴리사카라이드, 또는 폴리뉴클레오티드 내로 혼입될 수 있으며, 임의로는 번역후 변형 될 수 있다.
또한, 하기 아미노산이 포함된다:
Figure 112007052373933-pct00016
그와 같은 화합물은 임의로는 아미노 보호되거나, 임의로는 카르복실 보호되거나, 임의로는 아미노 및 카르복실 보호되거나 염 형태로 존재하거나, 비-천연 아미노산 폴리펩티드, 중합체, 폴리사카라이드, 또는 폴리뉴클레오티드 내로 혼입될 수 있으며, 임의로는 번역후 변형될 수 있다.
모노카르보닐 구조 외에, 본 명세서에 기재된 비-천연 아미노산은 디카르보닐, 디카르보닐-유사, 차폐된 디카르보닐 또는 보호된 디카르보닐 기와 같은 기를 포함할 수 있다. 예를 들어, 화학식 (V)의 구조를 갖는 아미노산이 포함된다:
Figure 112007052373933-pct00017
상기 식에서,
A는 임의로 존재하고, 존재하는 경우에는 저급 알킬렌, 치환된 저급 알킬렌, 저급 시클로알킬렌, 치환된 저급 시클로알킬렌, 저급 알케닐렌, 치환된 저급 알케 닐렌, 알키닐렌, 저급 헤테로알킬렌, 치환된 헤테로알킬렌, 저급 헤테로시클로알킬렌, 치환된 저급 헤테로시클로알킬렌, 아릴렌, 치환된 아릴렌, 헤테로아릴렌, 치환된 헤테로아릴렌, 알크아릴렌, 치환된 알크아릴렌, 아르알킬렌 또는 치환된 아르알킬렌이며;
B는 임의로 존재하고, 존재하는 경우에는 저급 알킬렌, 치환된 저급 알킬렌, 저급 알케닐렌, 치환된 저급 알케닐렌, 저급 헤테로알킬렌, 치환된 저급 헤테로알킬렌, -O-, -O-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -S-, -S-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -S(O)k- (k는 1, 2 또는 3임), -S(O)k(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(O)-, -NS(O)2-, -OS(O)2-, -C(O)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(S)-, -C(S)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')-, -NR'-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(O)N(R')-, -CON(R')-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -CSN(R')-, -CSN(R')-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')CO-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')C(O)O-, -S(O)kN(R')-, -N(R')C(0)N(R')-, -N(R')C(S)N(R')-, -N(R')S(O)kN(R')-, -N(R')-N=, -C(R')=N-, -C(R')=N-N(R')-, -C(R')=N-N=, -C(R')2-N=N- 및 -C(R')2-N(R')-N(R')-(여기서, R' 는 각각 독립적으로 H, 알킬 또는 치환된 알킬임)로 구성되는 군으로부터 선택되는 링커이며;
R은 H, 알킬, 치환된 알킬, 시클로알킬 또는 치환된 시클로알킬이고;
R1은 H, 아미노 보호기, 수지, 아미노산, 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드 이며;
R2는 OH, 에스테르 보호기, 수지, 아미노산, 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드이다. 그와 같은 비-천연 아미노산은 염 형태로 존재하거나, 비-천연 아미노산 폴리펩티드, 중합체, 폴리사카라이드, 또는 폴리뉴클레오티드 내로 혼입될 수 있으며, 임의로는 번역후 변형될 수 있다.,
또한, 화학식 (VI)의 구조를 갖는 하기 아미노산이 포함된다:
Figure 112007052373933-pct00018
상기 식에서,
B는 임의로 존재하고, 존재하는 경우에는 저급 알킬렌, 치환된 저급 알킬렌, 저급 알케닐렌, 치환된 저급 알케닐렌, 저급 헤테로알킬렌, 치환된 저급 헤테로알킬렌, -O-, -O-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -S-, -S-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -S(O)k- (k는 1, 2 또는 3임), -S(O)k(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(O)-, -NS(O)2-, -OS(O)2-, -C(O)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(S)-, -C(S)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')-, -NR'-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(O)N(R')-, -CON(R')-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -CSN(R')-, -CSN(R')-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')CO-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')C(O)O-, -S(O)kN(R')-, -N(R')C(0)N(R')-, -N(R')C(S)N(R')-, -N(R')S(O)kN(R')-, -N(R')-N=, -C(R')=N-, -C(R')=N-N(R')-, -C(R')=N-N=, -C(R')2-N=N- 및 -C(R')2-N(R')-N(R')-(여기서, R' 는 각각 독립적으로 H, 알킬 또는 치환된 알킬임)로 구성되는 군으로부터 선택되는 링커이며;
R은 H, 알킬, 치환된 알킬, 시클로알킬 또는 치환된 시클로알킬이고;
R1은 H, 아미노 보호기, 수지, 아미노산, 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드이며;
R2는 OH, 에스테르 보호기, 수지, 아미노산, 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드이고;
Ra는 각각 독립적으로 H, 할로겐, 알킬, 치환된 알킬, -N(R')2, - C(O)kR' (k는 1, 2 또는 3임), -C(O)N(R')2, -OR' 및 -S(O)kR'(여기서, R'은 각각 독립적으로 H, 알킬 또는 치환된 알킬임)로 구성되는 군으로부터 선택된다. 그와 같은 비-천연 아미노산은 염 형태로 존재하거나, 비-천연 아미노산 폴리펩티드, 중합체, 폴리사카라이드, 또는 폴리뉴클레오티드 내로 혼입될 수 있으며, 임의로는 번역후 변형될 수 있다.
또한, 하기 아미노산 포함된다:
Figure 112007052373933-pct00019
그와 같은 화합물은 임의로는 아미노 보호되거나, 임의로는 카르복실 보호되거나, 임의로는 아미노 및 카르복실 보호되거나 염 형태로 존재하거나, 비-천연 아미노산 폴리펩티드, 중합체, 폴리사카라이드, 또는 폴리뉴클레오티드 내로 혼입될 수 있으며, 임의로는 번역후 변형될 수 있다.
또한, 화학식 (VII)의 구조를 갖는 아미노산이 포함된다:
Figure 112007052373933-pct00020
상기 식에서,
B는 임의로 존재하고, 존재하는 경우에는 저급 알킬렌, 치환된 저급 알킬렌, 저급 알케닐렌, 치환된 저급 알케닐렌, 저급 헤테로알킬렌, 치환된 저급 헤테로알킬렌, -O-, -O-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -S-, -S-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -S(O)k- (k는 1, 2 또는 3임), -S(O)k(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(O)-, -NS(O)2-, -OS(O)2-, -C(O)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(S)-, -C(S)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')-, -NR'-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(O)N(R')-, -CON(R')-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -CSN(R')-, -CSN(R')-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')CO-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')C(O)O-, -S(O)kN(R')-, -N(R')C(0)N(R')-, -N(R')C(S)N(R')-, -N(R')S(O)kN(R')-, -N(R')- N=, -C(R')=N-, -C(R')=N-N(R')-, -C(R')=N-N=, -C(R')2-N=N- 및 -C(R')2-N(R')-N(R')-(여기서, R' 는 각각 독립적으로 H, 알킬 또는 치환된 알킬임)로 구성되는 군으로부터 선택되는 링커이며;
R은 H, 알킬, 치환된 알킬, 시클로알킬 또는 치환된 시클로알킬이고;
R1은 H, 아미노 보호기, 수지, 아미노산, 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드이며;
R2는 OH, 에스테르 보호기, 수지, 아미노산, 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드이고;
Ra는 각각 독립적으로 H, 할로겐, 알킬, 치환된 알킬, -N(R')2, - C(O)kR' (k는 1, 2 또는 3임), -C(O)N(R')2, -OR' 및 -S(O)kR'(여기서, R'은 각각 독립적으로 H, 알킬 또는 치환된 알킬임)로 구성되는 군으로부터 선택된다. 그와 같은 비-천연 아미노산은 염 형태로 존재하거나, 비-천연 아미노산 폴리펩티드, 중합체, 폴리사카라이드, 또는 폴리뉴클레오티드 내로 혼입될 수 있으며, 임의로는 번역후 변형될 수 있다.
또한, 하기 아미노산이 포함된다:
Figure 112007052373933-pct00021
그와 같은 화합물은 임의로는 아미노 보호되거나, 임의로는 카르복실 보호되거나, 임의로는 아미노 및 카르복실 보호되거나 염 형태로 존재하거나, 비-천연 아미노산 폴리펩티드, 중합체, 폴리사카라이드, 또는 폴리뉴클레오티드 내로 혼입될 수 있으며, 임의로는 번역후 변형될 수 있다.
화학식 (XXX)의 구조를 갖는 하기 아미노산이 또한 포함된다:
Figure 112007052373933-pct00022
상기 식에서,
A는 임의로 존재하고, 존재하는 경우에는 저급 알킬렌, 치환된 저급 알킬렌, 저급 시클로알킬렌, 치환된 저급 시클로알킬렌, 저급 알케닐렌, 치환된 저급 알케 닐렌, 알키닐렌, 저급 헤테로알킬렌, 치환된 헤테로알킬렌, 저급 헤테로시클로알킬렌, 치환된 저급 헤테로시클로알킬렌, 아릴렌, 치환된 아릴렌, 헤테로아릴렌, 치환된 헤테로아릴렌, 알크아릴렌, 치환된 알크아릴렌, 아르알킬렌 또는 치환된 아르알킬렌이며;
R은 H, 알킬, 치환된 알킬, 시클로알킬 또는 치환된 시클로알킬이고;
R1은 H, 아미노 보호기, 수지, 아미노산, 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드이며;
R2는 OH, 에스테르 보호기, 수지, 아미노산, 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드이고;
X1은 C, S 또는 S(O)이고;
L은 알킬렌, 치환된 알킬렌, N(R')(알킬렌) 또는 N(R')(치환된 알킬렌)(여기서, R'는 H, 알킬, 치환된 알킬, 시클로알킬 또는 치환된 시클로알킬임)이다. 그와 같은 비-천연 아미노산은 염 형태로 존재하거나, 비-천연 아미노산 폴리펩티드, 중합체, 폴리사카라이드, 또는 폴리뉴클레오티드 내로 혼입될 수 있으며, 임의로는 번역후 변형될 수 있다.
또한, 화학식 (XXXa)의 구조를 갖는 하기 아미노산이 포함된다:
Figure 112007052373933-pct00023
상기 식에서,
A는 임의로 존재하고, 존재하는 경우에는 저급 알킬렌, 치환된 저급 알킬렌, 저급 시클로알킬렌, 치환된 저급 시클로알킬렌, 저급 알케닐렌, 치환된 저급 알케닐렌, 알키닐렌, 저급 헤테로알킬렌, 치환된 헤테로알킬렌, 저급 헤테로시클로알킬렌, 치환된 저급 헤테로시클로알킬렌, 아릴렌, 치환된 아릴렌, 헤테로아릴렌, 치환된 헤테로아릴렌, 알크아릴렌, 치환된 알크아릴렌, 아르알킬렌 또는 치환된 아르알킬렌이며;
R은 H, 알킬, 치환된 알킬, 시클로알킬 또는 치환된 시클로알킬이고;
R1은 H, 아미노 보호기, 수지, 아미노산, 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드이며;
R2는 OH, 에스테르 보호기, 수지, 아미노산, 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드이고;
L은 알킬렌, 치환된 알킬렌, N(R')(알킬렌) 또는 N(R')(치환된 알킬렌)(여기서, R'는 H, 알킬, 치환된 알킬, 시클로알킬 또는 치환된 시클로알킬임)이다. 그와 같은 비-천연 아미노산은 염 형태로 존재하거나, 비-천연 아미노산 폴리펩티드, 중합체, 폴리사카라이드, 또는 폴리뉴클레오티드 내로 혼입될 수 있으며, 임의로는 번역후 변형될 수 있다.
또한, 화학식 (XXXb)의 구조를 갖는 하기 아미노산이 포함된다:
Figure 112007052373933-pct00024
상기 식에서,
A는 임의로 존재하고, 존재하는 경우에는 저급 알킬렌, 치환된 저급 알킬렌, 저급 시클로알킬렌, 치환된 저급 시클로알킬렌, 저급 알케닐렌, 치환된 저급 알케닐렌, 알키닐렌, 저급 헤테로알킬렌, 치환된 헤테로알킬렌, 저급 헤테로시클로알킬렌, 치환된 저급 헤테로시클로알킬렌, 아릴렌, 치환된 아릴렌, 헤테로아릴렌, 치환된 헤테로아릴렌, 알크아릴렌, 치환된 알크아릴렌, 아르알킬렌 또는 치환된 아르알킬렌이며;
R은 H, 알킬, 치환된 알킬, 시클로알킬 또는 치환된 시클로알킬이고;
R1은 H, 아미노 보호기, 수지, 아미노산, 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드이며;
R2는 OH, 에스테르 보호기, 수지, 아미노산, 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드이고;
L은 알킬렌, 치환된 알킬렌, N(R')(알킬렌) 또는 N(R')(치환된 알킬렌)(여기서, R'는 H, 알킬, 치환된 알킬, 시클로알킬 또는 치환된 시클로알킬임)이다. 그와 같은 비-천연 아미노산은 염 형태로 존재하거나, 비-천연 아미노산 폴리펩티드, 중합체, 폴리사카라이드, 또는 폴리뉴클레오티드 내로 혼입될 수 있으며, 임의로는 번역후 변형될 수 있다.
또한, 화학식 (XXXI)의 구조를 갖는 하기 아미노산이 포함된다:
Figure 112007052373933-pct00025
상기 식에서,
A는 임의로 존재하고, 존재하는 경우에는 저급 알킬렌, 치환된 저급 알킬렌, 저급 시클로알킬렌, 치환된 저급 시클로알킬렌, 저급 알케닐렌, 치환된 저급 알케닐렌, 알키닐렌, 저급 헤테로알킬렌, 치환된 헤테로알킬렌, 저급 헤테로시클로알킬렌, 치환된 저급 헤테로시클로알킬렌, 아릴렌, 치환된 아릴렌, 헤테로아릴렌, 치환된 헤테로아릴렌, 알크아릴렌, 치환된 알크아릴렌, 아르알킬렌 또는 치환된 아르알킬렌이며;
R은 H, 알킬, 치환된 알킬, 시클로알킬 또는 치환된 시클로알킬이고;
R1은 H, 아미노 보호기, 수지, 아미노산, 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드이며;
R2는 OH, 에스테르 보호기, 수지, 아미노산, 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드이고;
X1은 C, S, 또는 S(O)이며;
n은 0, 1, 2, 3, 4 또는 5이며;
CR8R9 기 상의 R8 및 R9는 각각 독립적으로 H, 알콕시, 알킬아민, 할로겐, 알킬, 아릴로 구성되는 군으로부터 선택되거나, 임의의 R8 및 R9는 함께 =0 또는 시클로알킬을 형성하거나, 인접한 R8 기가 함께 시클로알킬을 형성할 수 있다. 그와 같은 비-천연 아미노산은 염 형태로 존재하거나, 비-천연 아미노산 폴리펩티드, 중합체, 폴리사카라이드, 또는 폴리뉴클레오티드 내로 혼입될 수 있으며, 임의로는 번역후 변형될 수 있다.
또한, 화학식 (XXXIa)의 구조를 갖는 하기 아미노산이 포함된다:
Figure 112007052373933-pct00026
상기 식에서,
A는 임의로 존재하고, 존재하는 경우에는 저급 알킬렌, 치환된 저급 알킬렌, 저급 시클로알킬렌, 치환된 저급 시클로알킬렌, 저급 알케닐렌, 치환된 저급 알케 닐렌, 알키닐렌, 저급 헤테로알킬렌, 치환된 헤테로알킬렌, 저급 헤테로시클로알킬렌, 치환된 저급 헤테로시클로알킬렌, 아릴렌, 치환된 아릴렌, 헤테로아릴렌, 치환된 헤테로아릴렌, 알크아릴렌, 치환된 알크아릴렌, 아르알킬렌 또는 치환된 아르알킬렌이며;
R은 H, 알킬, 치환된 알킬, 시클로알킬 또는 치환된 시클로알킬이고;
R1은 H, 아미노 보호기, 수지, 아미노산, 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드이며;
R2는 OH, 에스테르 보호기, 수지, 아미노산, 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드이고;
n은 0, 1, 2, 3, 4 또는 5이며;
CR8R9 기 상의 R8 및 R9는 각각 독립적으로 H, 알콕시, 알킬아민, 할로겐, 알킬, 아릴로 구성되는 군으로부터 선택되거나, 임의의 R8 및 R9는 함께 =0 또는 시클로알킬을 형성하거나, 인접한 R8 기가 함께 시클로알킬을 형성할 수 있다. 그와 같은 비-천연 아미노산은 염 형태로 존재하거나, 비-천연 아미노산 폴리펩티드, 중합체, 폴리사카라이드, 또는 폴리뉴클레오티드 내로 혼입될 수 있으며, 임의로는 번역후 변형될 수 있다.
또한, 화학식 (XXXIb)의 구조를 갖는 아미노산이 포함된다:
Figure 112007052373933-pct00027
상기 식에서,
A는 임의로 존재하고, 존재하는 경우에는 저급 알킬렌, 치환된 저급 알킬렌, 저급 시클로알킬렌, 치환된 저급 시클로알킬렌, 저급 알케닐렌, 치환된 저급 알케닐렌, 알키닐렌, 저급 헤테로알킬렌, 치환된 헤테로알킬렌, 저급 헤테로시클로알킬렌, 치환된 저급 헤테로시클로알킬렌, 아릴렌, 치환된 아릴렌, 헤테로아릴렌, 치환된 헤테로아릴렌, 알크아릴렌, 치환된 알크아릴렌, 아르알킬렌 또는 치환된 아르알킬렌이며;
R은 H, 알킬, 치환된 알킬, 시클로알킬 또는 치환된 시클로알킬이고;
R1은 H, 아미노 보호기, 수지, 아미노산, 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드이며;
R2는 OH, 에스테르 보호기, 수지, 아미노산, 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드이고;
n은 0, 1, 2, 3, 4 또는 5이며;
CR8R9 기 상의 R8 및 R9는 각각 독립적으로 H, 알콕시, 알킬아민, 할로겐, 알 킬, 아릴로 구성되는 군으로부터 선택되거나, 임의의 R8 및 R9는 함께 =0 또는 시클로알킬을 형성하거나, 인접한 R8 기가 함께 시클로알킬을 형성할 수 있다. 그와 같은 비-천연 아미노산은 염 형태로 존재하거나, 비-천연 아미노산 폴리펩티드, 중합체, 폴리사카라이드, 또는 폴리뉴클레오티드 내로 혼입될 수 있으며, 임의로는 번역후 변형될 수 있다.
또한, 화학식 (XXXII)의 구조를 갖는 하기 아미노산이 포함된다:
Figure 112007052373933-pct00028
상기 식에서,
A는 임의로 존재하고, 존재하는 경우에는 저급 알킬렌, 치환된 저급 알킬렌, 저급 시클로알킬렌, 치환된 저급 시클로알킬렌, 저급 알케닐렌, 치환된 저급 알케닐렌, 알키닐렌, 저급 헤테로알킬렌, 치환된 헤테로알킬렌, 저급 헤테로시클로알킬렌, 치환된 저급 헤테로시클로알킬렌, 아릴렌, 치환된 아릴렌, 헤테로아릴렌, 치환된 헤테로아릴렌, 알크아릴렌, 치환된 알크아릴렌, 아르알킬렌 또는 치환된 아르알킬렌이며;
R은 H, 알킬, 치환된 알킬, 시클로알킬 또는 치환된 시클로알킬이고;
R1은 H, 아미노 보호기, 수지, 아미노산, 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드 이며;
R2는 OH, 에스테르 보호기, 수지, 아미노산, 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드이고;
X1은 C, S 또는 S(O)이고;
L은 알킬렌, 치환된 알킬렌, N(R')(알킬렌) 또는 N(R')(치환된 알킬렌)(여기서, R'는 H, 알킬, 치환된 알킬, 시클로알킬 또는 치환된 시클로알킬임)이다. 그와 같은 비-천연 아미노산은 염 형태로 존재하거나, 비-천연 아미노산 폴리펩티드, 중합체, 폴리사카라이드, 또는 폴리뉴클레오티드 내로 혼입될 수 있으며, 임의로는 번역후 변형될 수 있다.
또한, 화학식 (XXXIIa)의 구조를 갖는 아미노산이 포함된다:
Figure 112007052373933-pct00029
상기 식에서,
A는 임의로 존재하고, 존재하는 경우에는 저급 알킬렌, 치환된 저급 알킬렌, 저급 시클로알킬렌, 치환된 저급 시클로알킬렌, 저급 알케닐렌, 치환된 저급 알케닐렌, 알키닐렌, 저급 헤테로알킬렌, 치환된 헤테로알킬렌, 저급 헤테로시클로알킬렌, 치환된 저급 헤테로시클로알킬렌, 아릴렌, 치환된 아릴렌, 헤테로아릴렌, 치환 된 헤테로아릴렌, 알크아릴렌, 치환된 알크아릴렌, 아르알킬렌 또는 치환된 아르알킬렌이며;
R은 H, 알킬, 치환된 알킬, 시클로알킬 또는 치환된 시클로알킬이고;
R1은 H, 아미노 보호기, 수지, 아미노산, 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드이며;
R2는 OH, 에스테르 보호기, 수지, 아미노산, 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드이고;
L은 알킬렌, 치환된 알킬렌, N(R')(알킬렌) 또는 N(R')(치환된 알킬렌)(여기서, R'는 H, 알킬, 치환된 알킬, 시클로알킬 또는 치환된 시클로알킬임)이다. 그와 같은 비-천연 아미노산은 염 형태로 존재하거나, 비-천연 아미노산 폴리펩티드, 중합체, 폴리사카라이드, 또는 폴리뉴클레오티드 내로 혼입될 수 있으며, 임의로는 번역후 변형될 수 있다.
또한, 화학식 (XXXIIb)의 구조를 갖는 아미노산이 포함된다:
Figure 112007052373933-pct00030
상기 식에서,
A는 임의로 존재하고, 존재하는 경우에는 저급 알킬렌, 치환된 저급 알킬렌, 저급 시클로알킬렌, 치환된 저급 시클로알킬렌, 저급 알케닐렌, 치환된 저급 알케닐렌, 알키닐렌, 저급 헤테로알킬렌, 치환된 헤테로알킬렌, 저급 헤테로시클로알킬렌, 치환된 저급 헤테로시클로알킬렌, 아릴렌, 치환된 아릴렌, 헤테로아릴렌, 치환된 헤테로아릴렌, 알크아릴렌, 치환된 알크아릴렌, 아르알킬렌 또는 치환된 아르알킬렌이며;
R은 H, 알킬, 치환된 알킬, 시클로알킬 또는 치환된 시클로알킬이고;
R1은 H, 아미노 보호기, 수지, 아미노산, 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드이며;
R2는 OH, 에스테르 보호기, 수지, 아미노산, 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드이고;
L은 알킬렌, 치환된 알킬렌, N(R')(알킬렌) 또는 N(R')(치환된 알킬렌)(여기서, R'는 H, 알킬, 치환된 알킬, 시클로알킬 또는 치환된 시클로알킬임)이다. 그와 같은 비-천연 아미노산은 염 형태로 존재하거나, 비-천연 아미노산 폴리펩티드, 중합체, 폴리사카라이드, 또는 폴리뉴클레오티드 내로 혼입될 수 있으며, 임의로는 번역후 변형될 수 있다.
또한, 화학식 (XXXX)의 구조를 갖는 아미노산이 포함된다:
Figure 112007052373933-pct00031
상기 식에서,
A는 임의로 존재하고, 존재하는 경우에는 저급 알킬렌, 치환된 저급 알킬렌, 저급 시클로알킬렌, 치환된 저급 시클로알킬렌, 저급 알케닐렌, 치환된 저급 알케닐렌, 알키닐렌, 저급 헤테로알킬렌, 치환된 헤테로알킬렌, 저급 헤테로시클로알킬렌, 치환된 저급 헤테로시클로알킬렌, 아릴렌, 치환된 아릴렌, 헤테로아릴렌, 치환된 헤테로아릴렌, 알크아릴렌, 치환된 알크아릴렌, 아르알킬렌 또는 치환된 아르알킬렌이며;
M은
Figure 112007052373933-pct00032
이고, 여기서, (a)는 A 기로의 결합을 나타내고, (b)는 각 카르보닐 기로의 결합을 나타내며;
R3 및 R4는 독립적으로 H, 할로겐, 알킬, 치환된 알킬, 시클로알킬 또는 치 환된 시클로알킬로부터 선택되거나, R3 및 R4 또는 두 개의 R3 기 또는 두 개의 R4 기는 임의로는 함께 시클로알킬 또는 헤테로시클로알킬을 형성하고;
R은 H, 할로겐, 알킬, 치환된 알킬, 시클로알킬 또는 치환된 시클로알킬이고;
T3는 결합, C(R)(R), 0 또는 S이고;
R은 H, 할로겐, 알킬, 치환된 알킬, 시클로알킬 또는 치환된 시클로알킬이고;
R1은 H, 아미노 보호기, 수지, 아미노산, 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드이며;
R2는 OH, 에스테르 보호기, 수지, 아미노산, 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드이다. 그와 같은 비-천연 아미노산은 염 형태로 존재하거나, 비-천연 아미노산 폴리펩티드, 중합체, 폴리사카라이드, 또는 폴리뉴클레오티드 내로 혼입될 수 있으며, 임의로는 번역후 변형될 수 있다.
또한, 화학식 (XXXXI)의 구조를 갖는 하기 아미노산이 포함된다:
Figure 112007052373933-pct00033
상기 식에서,
M은
Figure 112007052373933-pct00034
이고, 여기서, (a)는 A 기로의 결합을 나타내고, (b)는 각 카르보닐 기로의 결합을 나타내며;
R3 및 R4는 독립적으로 H, 할로겐, 알킬, 치환된 알킬, 시클로알킬 또는 치환된 시클로알킬로부터 선택되거나, R3 및 R4 또는 두 개의 R3 기 또는 두 개의 R4 기는 임의로는 함께 시클로알킬 또는 헤테로시클로알킬을 형성하고;
R은 H, 할로겐, 알킬, 치환된 알킬, 시클로알킬 또는 치환된 시클로알킬이고;
T3는 결합, C(R)(R), 0 또는 S이고;
R1은 H, 아미노 보호기, 수지, 아미노산, 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드이며;
R2는 OH, 에스테르 보호기, 수지, 아미노산, 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드이고;
Ra는 각각 독립적으로 H, 할로겐, 알킬, 치환된 알킬, -N(R')2, - C(O)kR' (k는 1, 2 또는 3임), -C(O)N(R')2, -OR' 및 -S(O)kR'(여기서, R'은 각각 독립적으로 H, 알킬 또는 치환된 알킬임)로 구성되는 군으로부터 선택된다. 그와 같은 비-천연 아미노산은 염 형태로 존재하거나, 비-천연 아미노산 폴리펩티드, 중합체, 폴리사카라이드, 또는 폴리뉴클레오티드 내로 혼입될 수 있으며, 임의로는 번역후 변형될 수 있다.
또한, 화학식 (XXXXII)의 구조를 갖는 아미노산이 포함된다:
Figure 112007052373933-pct00035
상기 식에서,
R은 H, 할로겐, 알킬, 치환된 알킬, 시클로알킬 또는 치환된 시클로알킬이고;
T3 은 O 또는 S이다. 그와 같은 비-천연 아미노산은 염 형태로 존재하거나, 비-천연 아미노산 폴리펩티드, 중합체, 폴리사카라이드, 또는 폴리뉴클레오티드 내로 혼입될 수 있으며, 임의로는 번역후 변형될 수 있다.
또한, 화학식 (XXXXIII)의 구조를 갖는 아미노산이 포함된다:
Figure 112007052373933-pct00036
상기 식에서, R은 H, 할로겐, 알킬, 치환된 알킬, 시클로알킬 또는 치환된 시클로알킬이다.
또한, 화학식 (XXXXIII)의 구조를 갖는 하기 아미노산이 포함된다:
Figure 112007052373933-pct00037
그와 같은 비-천연 아미노산은 염 형태로 존재하거나, 비-천연 아미노산 폴리펩티드, 중합체, 폴리사카라이드, 또는 폴리뉴클레오티드 내로 혼입될 수 있으며, 임의로는 번역후 변형될 수 있다.
카르보닐 또는 디카르보닐 관능기는 온화한 조건하에 수성 용액중에서 히드록실아민-함유 화합물과 선택적으로 반응하여 생리적 조건하에 안정한 상응하는 옥심 결합을 형성할 수 있다[참조: Jencks, W. P., J. Am. Chem. Soc. 81, 475-481 (1959); Shao, J. and Tarn, J. P., J. Am. Chem. Soc. 117(14):3893-3899 (1995)]. 또한, 카르보닐 또는 디카르보닐 관능기의 독특한 반응성은 다른 아미노산 측쇄의 존재하에 선택적 변형을 가능하게 한다[참조: Cornish, V. W., et al., J. Am. Chem. Soc. 118:8150-8151 (1996); Geoghegan, K. F. & Stroh, J. G., Bioconjug. Chem. 3:138-146 (1992); Mahal, L. K., et al., Science 276:1125-1128 (1997)].
p-아세틸-(+/-)-페닐알라닌 및 m-아세틸-(+/-)-페닐알라닌의 합성은 그 내용이 본 명세서에 포함되는 문헌[Zhang, Z., et al., Biochemistry 42: 6735-6746 (2003)]에 기재되어 있다. 다른 카르보닐- 또는 디카르보닐-함유 아미노산이 유사하게 제조될 수 있다. 또한, 본 명세서에 포함되는 비-천연 아미노산의 기타 합성예는 도 4, 24 내지 34 및 36 내지 39에 기재되어 있다.
일부 실시태양에서, 비-천연 아미노산을 포함하는 폴리펩티드는 반응성 카르보닐 또는 디카르보닐 관능기를 생성하도록 화학적으로 변형된다. 예를 들어, 컨쥬게이션 반응에 유용한 알데히드 관능기는 인접한 아미노 및 히드록실 기를 갖는 관능기로부터 생성될 수 있다. 생물학적 활성 분자가 폴리펩티드인 경우, 예를 들어, N-말단 세린 또는 트레오닌(원래 존재하거나 화학 또는 효소 분해에 의해 노출될 수 있음)은 온화한 산화적 절단 조건하에 퍼요오데이트를 사용하여 알데히드 관능기를 생성하는데 사용될 수 있다[참조: Gaertner, et. al, Bioconjug. Chem. 3: 262-268 (1992); Geoghegan, K. & Stroh, J., Bioconjug. Chem. 3:138-146 (1992); Gaertner et al., J. Biol. Chem. 269:7224-7230 (1994)]. 그러나, 당업계에 알려진 방법은 펩티드 또는 단백질의 N-말단 아미노산으로 제한된다.
또한, 예를 들어, 인접한 히드록실 및 아미노 기를 함유하는 비-천연 아미노산은 폴리펩티드 내에 "차폐된" 알데히드 관능기로서 도입될 수 있다. 예컨대, 5-히드록시리신은 엡실론 아민에 인접하여 히드록실 기를 함유한다. 알데히드를 생 성하기 위한 반응 조건은 전형적으로는 온화한 조건하에 몰 과량의 나트륨 메타퍼요오데이트를 가하여 폴리펩티드 내 다른 위치에서의 산화를 피하는 것을 포함한다. 산화 반응의 pH는 전형적으로는 약 7.0이다. 전형적인 반응은 폴리펩티드의 완충된 용액에 약 1.5 몰 과량의 나트륨 메타퍼요오데이트를 가하고, 암소에서 약 10분 동안 인큐베이션하는 것을 포함한다[참조: 미합중국 특허 제6,423,685호].
B. 비-천연 아미노산의 구조 및 합성: 히드록실아민-함유 아미노산
히드록실아민(아미노옥시라고도 함)을 함유하는 비-천연 아미노산은 각종 친전자기와 반응하여 컨쥬게이트(비제한적인 예로서 PEG 또는 기타 수용성 중합체)를 형성할 수 있게 한다. 히드라진, 히드라지드 및 세미카바지드와 같이, 아미노옥시 기의 증가된 친핵성으로 인해 카르보닐 또는 디카르보닐 기(비제한적인 예로서, 케톤, 알데히드 또는 유사한 화학적 반응성을 갖는 다른 관능기 포함)를 함유하는 각종 분자와 효율적이고 선택적으로 반응할 수 있다[참조: Shao, J. and Tarn, J., J. Am. Chem. Soc. 117:3893-3899 (1995); H. Hang and C. Bertozzi, Ace. Chem. Res. 34(9): 727-736 (2001)]. 히드라진 기와의 반응 결과는 상응하는 히드라존인 반면, 옥심은 일반적으로 아미노옥시 기와 카르보닐 또는 디카르보닐 기(비제한적인 예로서, 케톤, 알데히드 또는 유사한 화학적 반응성을 갖는 다른 관능기 포함)와의 반응으로부터 생성된다.
따라서, 명세서에 기재된 특정 실시태양은 히드록실아민 기, 히드록실아민-유사 기(히드록실아민 기와 유사한 반응성을 가지며, 구조적으로 히드록실아민 기에 유사함), 차폐된 히드록실아민 기(히드록실아민 기로 쉽게 전환될 수 있음), 또 는 보호된 히드록실아민 기 (탈보호시 히드록실아민 기와 유사한 반응성을 가짐)를 포함하는 측쇄를 갖는 비-천연 아미노산이다.
그와 같은 아미노산은 화학식 (XIV)의 구조를 갖는 아미노산을 포함한다:
Figure 112007052373933-pct00038
상기 식에서,
A는 임의로 존재하고, 존재하는 경우에는 저급 알킬렌, 치환된 저급 알킬렌, 저급 시클로알킬렌, 치환된 저급 시클로알킬렌, 저급 알케닐렌, 치환된 저급 알케닐렌, 알키닐렌, 저급 헤테로알킬렌, 치환된 헤테로알킬렌, 저급 헤테로시클로알킬렌, 치환된 저급 헤테로시클로알킬렌, 아릴렌, 치환된 아릴렌, 헤테로아릴렌, 치환된 헤테로아릴렌, 알크아릴렌, 치환된 알크아릴렌, 아르알킬렌 또는 치환된 아르알킬렌이며;
B는 임의로 존재하고, 존재하는 경우에는 저급 알킬렌, 치환된 저급 알킬렌, 저급 알케닐렌, 치환된 저급 알케닐렌, 저급 헤테로알킬렌, 치환된 저급 헤테로알킬렌, -O-, -O-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -S-, -S-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -S(O)k- (k는 1, 2 또는 3임), -S(O)k(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(O)-, -NS(O)2-, -OS(O)2-, -C(O)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(S)-, -C(S)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')-, -NR'-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(O)N(R')-, -CON(R')-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -CSN(R')-, -CSN(R')-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')CO-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')C(O)O-, -S(O)kN(R')-, -N(R')C(0)N(R')-, -N(R')C(S)N(R')-, -N(R')S(O)kN(R')-, -N(R')-N=, -C(R')=N-, -C(R')=N-N(R')-, -C(R')=N-N=, -C(R')2-N=N- 및 -C(R')2-N(R')-N(R')-(여기서, R' 는 각각 독립적으로 H, 알킬 또는 치환된 알킬임)로 구성되는 군으로부터 선택되는 링커이며;
K는 -NR6R7 또는 -N=CR6R7이고;
R1은 H, 아미노 보호기, 수지, 아미노산, 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드이며;
R2는 OH, 에스테르 보호기, 수지, 아미노산, 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드이고;
R3 및 R4는 독립적으로 H, 할로겐, 알킬, 치환된 알킬, 시클로알킬 또는 치환된 시클로알킬로부터 선택되거나, R3 및 R4 또는 두 개의 R3 기는 임의로는 함께 시클로알킬 또는 헤테로시클로알킬을 형성하고;
R6 및 R7은 각각 독립적으로 H, 알킬, 치환된 알킬, 알케닐, 치환된 알케닐, 알콕시, 치환된 알콕시, 폴리알킬렌 옥시드, 치환된 폴리알킬렌 옥시드, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 알크아릴, 치환된 알크아릴, 아르알 킬, 치환된 아르알킬, -C(O)R", -C(O)2R", -C(0)N(R")2 (여기서, 각 R"는 독립적으로 수소, 알킬, 치환된 알킬, 알케닐, 치환된 알케닐, 알콕시, 치환된 알콕시, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 알크아릴, 치환된 알크아릴, 아르알킬, 치환된 아르알킬임)이거나,
R6 또는 R7은 L-X이고;
X는 표지, 염료, 중합체, 수용성 중합체, 폴리에틸렌 글리콜 유도체, 광가교결합제, 세포독성 화합물, 약물, 친화도 표지, 광친화도 표지, 반응성 화합물, 수지, 제2의 단백질 또는 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 유사체, 항체 또는 항체 단편, 금속 킬레이트제, 조인자, 지방산, 탄수화물, 폴리뉴클레오티드, DNA, RNA, 안티센스 폴리뉴클레오티드, 사카라이드, 수용성 덴드리머, 시클로덱스트린, 생물질, 나노입자, 스핀 표지, 형광물질, 금속-함유 잔기, 방사성 잔기, 신규 관능기, 다른 분자와 공유적으로 또는 비공유적으로 상호작용하는 기, 포토케이지드 잔기, 광이성화성 잔기, 비오틴, 비오틴 유사체, 중량급 원자를 포함하는 잔기, 화학적으로 절단가능한 기, 광-절단가능한 기, 신장된 측쇄, 탄소-결합 당, 산화환원 활성제, 아미노 티오산, 독성 잔기, 동위원소 표지된 잔기, 생물리학적 프로브, 인광 기, 화학발광 기, 전자밀도가 높은 기, 자성 기, 인터캘레이팅 기, 발색단, 에너지 전달기, 생물학적 활성제, 검출가능한 표지 및 그들의 조합으로 구성되는 군으로부터 선택되고;
L은 임의로 존재하며, 존재하는 경우에는 알킬렌, 치환된 알킬렌, 알케닐렌, 치환된 알케닐렌, -O-, -O-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -S-, -S-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -S(O)k- (k는 1, 2 또는 3임), -S(O)k(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(O)-, -C(O)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(S)-, -C(S)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')-, -NR'-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(O)N(R')-, -CON(R')-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -CSN(R')-, -CSN(R')-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')CO-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')C(O)O-, -S(O)kN(R')-, -N(R')C(0)N(R')-, -N(R')C(S)N(R')-, -N(R')S(0)kN(R')-, -N(R')-N=, -C(R')=N-, -C(R')=N-N(R')-, -C(R')=N-N=, -C(R')2-N=N- 및 -C(R')2-N(R')-N(R')- (여기서, R'는 각각 독립적으로 H, 알킬 또는 치환된 알킬임)로 구성되는 군으로부터 선택된다. 그와 같은 비-천연 아미노산은 염 형태로 존재하거나, 비-천연 아미노산 폴리펩티드, 중합체, 폴리사카라이드, 또는 폴리뉴클레오티드 내로 혼입될 수 있으며, 임의로는 번역후 변형될 수 있다.
화학식 (XIV)의 화합물의 특정 실시태양에서, A는 페닐렌 또는 치환된 페닐렌이다. 화학식 (XIV)의 화합물의 특정 실시태양에서, B는 -(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -O-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -S-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, 또는 -C(O)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-이다. 화학식 (XIV)의 화합물의 특정 실시태양에서, B는 -O(CH2)2-, -S(CH2)2-, -NH(CH2)2-, -CO(CH2)2- 또는 -(CH2)n- (n은 1 내지 4임)이다. 화학식 (XIV)의 화합물의 특정 실시태양에서, R1은 H, tert-부틸옥 시카르보닐 (Boc), 9-플루오레닐메톡시카르보닐 (Fmoc), N-아세틸, 테트라플루오로아세틸 (TFA) 또는 벤질옥시카르보닐 (Cbz)이다. 화학식 (XIV)의 화합물의 특정 실시태양에서, R1은 수지, 아미노산, 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드이다. 화학식 (XIV)의 화합물의 특정 실시태양에서, R2는 OH, O-메틸, O-에틸 또는 O-t-부틸이다. 화학식 (XIV)의 화합물의 특정 실시태양에서, R2는 수지, 아미노산, 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드이다. 화학식 (XIV)의 화합물의 특정 실시태양에서, R2는 폴리뉴클레오티드이다. 화학식 (XIV)의 화합물의 특정 실시태양에서, R2는 리보핵산 (RNA)이다. 화학식 (XIV)의 화합물의 특정 실시태양에서, R2는 tRNA이다. 화학식 (XIV)의 화합물의 특정 실시태양에서, tRNA는 셀렉터 코돈을 특이적으로 인식한다. 화학식 (XIV)의 화합물의 특정 실시태양에서, 셀렉터 코돈은 암버 코돈, 오커 코돈, 오팔 코돈, 독특한 코돈, 희귀 코돈, 비천연 코돈, 5-염기 코돈 및 4-염기 코돈으로 구성되는 군으로부터 선택된다. 화학식 (XIV)의 화합물의 특정 실시태양에서, R2는 서프레서 tRNA이다. 화학식 (XIV)의 화합물의 특정 실시태양에서, R6 및 R7은 각각 독립적으로 H, 알킬, 치환된 알킬, 알케닐, 치환된 알케닐, 알콕시, 치환된 알콕시, 폴리알킬렌 옥시드, 치환된 폴리알킬렌 옥시드, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 알크아릴, 치환된 알크아릴, 아르알킬, 치환된 아르알킬로 구성되는 군으로부터 선택된다. 화학식 (XIV)의 화합물의 특정 실 시태양에서, R6 및 R7은 각각 독립적으로 H, 메틸, 페닐, 및 -[(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-O-(수소, 알킬 또는 치환된 알킬)]x (x는 1 내지 50임)로 구성되는 군으로부터 선택된다. 화학식 (XIV)의 화합물의 특정 실시태양에서, K는 -NR5R7이다.
화학식 (XIV)의 화합물의 특정 실시태양에서, X는 펩티드, 단백질, 효소, 항체, 약물, 염료, 지질, 뉴클레오시드, 올리고뉴클레오티드, 세포, 바이러스, 리포조옴, 마이크로입자, 미셀로 구성되는 군으로부터 선택되는 생물학적 활성제이다. 화학식 (XIV)의 화합물의 특정 실시태양에서, X는 항생제, 살진균제, 항바이러스제, 소염제, 항-종양제, 심혈관계 치료제, 항불안제, 호르몬, 성장 인자 및 스테로이드제로 구성되는 군으로부터 선택되는 약물이다. 화학식 (XIV)의 화합물의 특정 실시태양에서, X는 양고추냉이 퍼옥시다제, 알칼라인 포스파타제, 베타-갈락토시다제 및 글루코스 옥시다제로 구성되는 군으로부터 선택되는 효소이다. 화학식 (XIV)의 화합물의 특정 실시태양에서, X는 형광 물질, 인광 물질, 화학발광 물질, 킬레이트제, 전자밀도가 높은 기, 자성 물질, 인터캘레이팅제, 방사성 물질, 발색단 및 에너지 전달 잔기로 구성되는 군으로부터 선택되는 검출가능한 표지이다.
특정 실시태양에서, 화학식 (XIV)의 화합물은 온화한 산성 조건하에 수용액 중에서 적어도 1개월 동안 안정하다. 특정 실시태양에서, 화학식 (XIV)의 화합물은 온화한 산성 조건하에 적어도 2주 동안 안정하다. 특정 실시태양에서, 화학식 (XIV)의 화합물은 온화한 산성 조건하에 수용액 중에서 적어도 5일 동안 안정하다. 특정 실시태양에서, 그와 같은 조건은 pH 2 내지 8이다.
그와 같은 아미노산은 화학식 (XV)의 구조를 갖는 아미노산을 포함한다:
Figure 112007052373933-pct00039
상기 식에서,
A는 임의로 존재하고, 존재하는 경우에는 저급 알킬렌, 치환된 저급 알킬렌, 저급 시클로알킬렌, 치환된 저급 시클로알킬렌, 저급 알케닐렌, 치환된 저급 알케닐렌, 알키닐렌, 저급 헤테로알킬렌, 치환된 헤테로알킬렌, 저급 헤테로시클로알킬렌, 치환된 저급 헤테로시클로알킬렌, 아릴렌, 치환된 아릴렌, 헤테로아릴렌, 치환된 헤테로아릴렌, 알크아릴렌, 치환된 알크아릴렌, 아르알킬렌 또는 치환된 아르알킬렌이며;
B는 임의로 존재하고, 존재하는 경우에는 저급 알킬렌, 치환된 저급 알킬렌, 저급 알케닐렌, 치환된 저급 알케닐렌, 저급 헤테로알킬렌, 치환된 저급 헤테로알킬렌, -O-, -O-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -S-, -S-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -S(O)k- (k는 1, 2 또는 3임), -S(O)k(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(O)-, -NS(O)2-, -OS(O)2-, -C(O)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(S)-, -C(S)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')-, -NR'-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(O)N(R')-, -CON(R')-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -CSN(R')-, -CSN(R')-(알킬 렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')CO-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')C(O)O-, -S(O)kN(R')-, -N(R')C(0)N(R')-, -N(R')C(S)N(R')-, -N(R')S(O)kN(R')-, -N(R')-N=, -C(R')=N-, -C(R')=N-N(R')-, -C(R')=N-N=, -C(R')2-N=N- 및 -C(R')2-N(R')-N(R')-(여기서, R' 는 각각 독립적으로 H, 알킬 또는 치환된 알킬임)로 구성되는 군으로부터 선택되는 링커이며;
R1은 H, 아미노 보호기, 수지, 아미노산, 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드이며;
R2는 OH, 에스테르 보호기, 수지, 아미노산, 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드이고;
R3 및 R4는 독립적으로 H, 할로겐, 알킬, 치환된 알킬, 시클로알킬 또는 치환된 시클로알킬로부터 선택되거나, R3 및 R4 또는 두 개의 R3 기는 임의로는 함께 시클로알킬 또는 헤테로시클로알킬을 형성한다. 그와 같은 비-천연 아미노산은 염 형태로 존재하거나, 비-천연 아미노산 폴리펩티드, 중합체, 폴리사카라이드, 또는 폴리뉴클레오티드 내로 혼입될 수 있으며, 임의로는 번역후 변형될 수 있다.
대표적인 아미노산의 비제한적인 예는 하기 구조를 갖는다:
Figure 112007052373933-pct00040
그와 같은 비-천연 아미노산은 염 형태로 존재하거나, 비-천연 아미노산 폴 리펩티드, 중합체, 폴리사카라이드, 또는 폴리뉴클레오티드 내로 혼입될 수 있으며, 임의로는 번역후 변형될 수 있다.
아미노옥시-함유 아미노산은 쉽게 구할 수 있는 아미노산 전구체 (호모세린, 세린 및 트레오닌)로부터 제조할 수 있다[참조: M. Carrasco and R. Brown, J. Org. Chem. 68: 8853-8858 (2003)]. L-2-아미노-4-(아미노옥시)부티르산과 같은 몇몇 아미노옥시-함유 아미노산은 천연 공급원으로부터 단리되었다[참조: Rosenthal, G. et al., Life Sci. 60: 1635-1641 (1997)]. 다른 아미노옥시-함유 아미노산은 유사하게 제조될 수 있다. 또한, 비-천연 아미노산의 비제한적 합성 예가 도 5에 도시되어 있다.
C. 비-천연 아미노산의 합성: 옥심-함유 아미노산
옥심 기를 함유하는 비-천연 아미노산은 특정 반응성 카르보닐 또는 디카르보닐 기(비제한적인 예로서, 케톤, 알데히드 또는 유사한 화학적 반응성을 갖는 다른 관능기 포함)를 함유하는 각종 화합물과 반응하여 새로운 옥심 기를 함유하는 새로운 비-천연 아미노산을 형성하게한다. 그와 같은 옥심 교환 반응은 비-천연 아미노산 폴리펩티드를 더욱 관능성화할 수 있게 한다. 또한, 옥심 기를 함유하는 원래의 아미노산은 옥심 결합이 폴리펩티드 내로 아미노산을 도입하는 조건(예를 들어, 본 명세서에 기재된 생체내, 시험관내 및 화학적 합성법)하에 안정한 한 그 자체로 사용될 수 있다.
따라서, 명세서에 기재된 특정 실시태양은 옥심 기, 옥심-유사 기(옥심 기와 유사한 반응성을 가지며, 구조적으로 옥심 기에 유사함), 차폐된 옥심 기(옥심 기 로 쉽게 전환될 수 있음), 또는 보호된 옥심 기 (탈보호시 옥심 기와 유사한 반응성을 가짐)를 포함하는 측쇄를 갖는 비-천연 아미노산이다. 그와 같은 아미노산은 화학식 (XI)의 구조를 갖는 아미노산을 포함한다:
Figure 112007052373933-pct00041
상기 식에서,
A는 임의로 존재하고, 존재하는 경우에는 저급 알킬렌, 치환된 저급 알킬렌, 저급 시클로알킬렌, 치환된 저급 시클로알킬렌, 저급 알케닐렌, 치환된 저급 알케닐렌, 알키닐렌, 저급 헤테로알킬렌, 치환된 헤테로알킬렌, 저급 헤테로시클로알킬렌, 치환된 저급 헤테로시클로알킬렌, 아릴렌, 치환된 아릴렌, 헤테로아릴렌, 치환된 헤테로아릴렌, 알크아릴렌, 치환된 알크아릴렌, 아르알킬렌 또는 치환된 아르알킬렌이며;
B는 임의로 존재하고, 존재하는 경우에는 저급 알킬렌, 치환된 저급 알킬렌, 저급 알케닐렌, 치환된 저급 알케닐렌, 저급 헤테로알킬렌, 치환된 저급 헤테로알킬렌, -O-, -O-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -S-, -S-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -S(O)k- (k는 1, 2 또는 3임), -S(O)k(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(O)-, -NS(O)2-, -OS(O)2-, -C(O)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(S)-, -C(S)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')-, -NR'-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(O)N(R')-, -CON(R')-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -CSN(R')-, -CSN(R')-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')CO-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')C(O)O-, -S(O)kN(R')-, -N(R')C(0)N(R')-, -N(R')C(S)N(R')-, -N(R')S(O)kN(R')-, -N(R')-N=, -C(R')=N-, -C(R')=N-N(R')-, -C(R')=N-N=, -C(R')2-N=N- 및 -C(R')2-N(R')-N(R')-(여기서, R' 는 각각 독립적으로 H, 알킬 또는 치환된 알킬임)로 구성되는 군으로부터 선택되는 링커이며;
R은 H, 알킬, 치환된 알킬, 시클로알킬 또는 치환된 시클로알킬이고;
R1은 H, 아미노 보호기, 수지, 아미노산, 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드이며;
R2는 OH, 에스테르 보호기, 수지, 아미노산, 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드이고;
R3 및 R4는 독립적으로 H, 할로겐, 알킬, 치환된 알킬, 시클로알킬 또는 치환된 시클로알킬로부터 선택되거나, R3 및 R4 또는 두 개의 R3 기는 임의로는 함께 시클로알킬 또는 헤테로시클로알킬을 형성하고;
R5는 H, 알킬, 치환된 알킬, 알케닐, 치환된 알케닐, 알키닐, 치환된 알키닐, 알콕시, 치환된 알콕시, 알킬알콕시, 치환된 알킬알콕시, 폴리알킬렌 옥시드, 치환된 폴리알킬렌 옥시드, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 알크아릴, 치환된 알크아릴, 아르알킬, 치환된 아르알킬, -(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-ON(R")2, -(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-C(O)SR", -(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-S-S-(알릴 또는 치환된 아릴), -C(O)R", -C(O)2R", -C(0)N(R")2 (여기서, 각 R"는 독립적으로 수소, 알킬, 치환된 알킬, 알케닐, 치환된 알케닐, 알콕시, 치환된 알콕시, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 알크아릴, 치환된 알크아릴, 아르알킬, 치환된 아르알킬임)이거나,
R5는 L-X이고;
X는 표지, 염료, 중합체, 수용성 중합체, 폴리에틸렌 글리콜 유도체, 광가교결합제, 세포독성 화합물, 약물, 친화도 표지, 광친화도 표지, 반응성 화합물, 수지, 제2의 단백질 또는 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 유사체, 항체 또는 항체 단편, 금속 킬레이트제, 조인자, 지방산, 탄수화물, 폴리뉴클레오티드, DNA, RNA, 안티센스 폴리뉴클레오티드, 사카라이드, 수용성 덴드리머, 시클로덱스트린, 생물질, 나노입자, 스핀 표지, 형광물질, 금속-함유 잔기, 방사성 잔기, 신규 관능기, 다른 분자와 공유적으로 또는 비공유적으로 상호작용하는 기, 포토케이지드 잔기, 광이성화성 잔기, 비오틴, 비오틴 유사체, 중량급 원자를 포함하는 잔기, 화학적으로 절단가능한 기, 광-절단가능한 기, 신장된 측쇄, 탄소-결합 당, 산화환원 활성제, 아미노 티오산, 독성 잔기, 동위원소 표지된 잔기, 생물리학적 프로브, 인광 기, 화학발광 기, 전자밀도가 높은 기, 자성 기, 인터캘레이팅 기, 발색단, 에너지 전달기, 생물학적 활성제, 검출가능한 표지 및 그들의 조합으로 구성되는 군으로부터 선택되고;
L은 임의로 존재하며, 존재하는 경우에는 알킬렌, 치환된 알킬렌, 알케닐렌, 치환된 알케닐렌, -O-, -O-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -S-, -S-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -S(O)k- (k는 1, 2 또는 3임), -S(O)k(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(O)-, -C(O)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(S)-, -C(S)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')-, -NR'-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(O)N(R')-, -CON(R')-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -CSN(R')-, -CSN(R')-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')CO-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')C(O)O-, -(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-O-N=CR'-, -(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-C(O)NR'-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-S(0)k-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-S-, -(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-S-S-, -S(O)kN(R')-, -N(R')C(0)N(R')-, -N(R')C(S)N(R')-, -N(R')S(0)kN(R')-, -N(R')-N=, -C(R')=N-, -C(R')=N-N(R')-, -C(R')=N-N=, -C(R')2-N=N- 및 -C(R')2-N(R')-N(R')- (여기서, R'는 각각 독립적으로 H, 알킬 또는 치환된 알킬임)로 구성되는 군으로부터 선택되며; 단, A 및 B가 부재하는 때, R은 메틸이 아니다. 그와 같은 비-천연 아미노산은 염 형태로 존재하거나, 비-천연 아미노산 폴리펩티드, 중합체, 폴리사카라이드, 또는 폴리뉴클레오티드 내로 혼입될 수 있으며, 임의로는 번역후 변형될 수 있다.
화학식 (XI)의 화합물의 특정 실시태양에서, B는 -O-(알킬렌 또는 치환된 알 킬렌)-이다. 화학식 (XI)의 화합물의 특정 실시태양에서, B는 -O(CH2)-이다. 화학식 (XI)의 화합물의 특정 실시태양에서, R은 C1-6알킬이다. 화학식 (XI)의 화합물의 특정 실시태양에서, R은 -CH3이다. 화학식 (XI)의 화합물의 특정 실시태양에서, R1은 H, tert-부틸옥시카르보닐 (Boc), 9-플루오레닐메톡시카르보닐 (Fmoc), N-아세틸, 테트라플루오로아세틸 (TFA) 또는 벤질옥시카르보닐 (Cbz)이다. 화학식 (XI)의 화합물의 특정 실시태양에서, R1은 수지, 아미노산, 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드이다. 화학식 (XI)의 화합물의 특정 실시태양에서, R2는 OH, O-메틸, O-에틸 또는 O-t-부틸이다. 화학식 (XI)의 화합물의 특정 실시태양에서, R2는 수지, 아미노산, 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드이다. 화학식 (XI)의 화합물의 특정 실시태양에서, R2는 폴리뉴클레오티드이다. 화학식 (XI)의 화합물의 특정 실시태양에서, R2는 리보핵산 (RNA)이다. 화학식 (XIV)의 화합물의 특정 실시태양에서, R2는 tRNA이다. 화학식 (XI)의 화합물의 특정 실시태양에서, tRNA는 셀렉터 코돈을 특이적으로 인식한다. 화학식 (XI)의 화합물의 특정 실시태양에서, 셀렉터 코돈은 암버 코돈, 오커 코돈, 오팔 코돈, 독특한 코돈, 희귀 코돈, 비천연 코돈, 5-염기 코돈 및 4-염기 코돈으로 구성되는 군으로부터 선택된다. 화학식 (XIV)의 화합물의 특정 실시태양에서, R2는 서프레서 tRNA이다. 화학식 (XI)의 화합물의 특정 실시태양에서, R5는 알킬알콕시, 치환된 알킬알콕시, 폴리알킬렌 옥시드, 치환된 폴리 알킬렌 옥시드 또는 -C(O)2R"이다. 화학식 (XI)의 화합물의 특정 실시태양에서, R5는 -[(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-O-(수소, 알킬 또는 치환된 알킬)]x (x는 1 내지 50임)이다. 화학식 (XI)의 화합물의 특정 실시태양에서, R5는 -(CH2CH2)-O-CH3 또는 -COOH이다.
특정 실시태양에서, 화학식 (XI)의 화합물은 온화한 산성 조건하에 수용액 중에서 적어도 1개월 동안 안정하다. 특정 실시태양에서, 화학식 (XI)의 화합물은 온화한 산성 조건하에 적어도 2주 동안 안정하다. 특정 실시태양에서, 화학식 (XI)의 화합물은 온화한 산성 조건하에 수용액 중에서 적어도 5일 동안 안정하다. 특정 실시태양에서, 그와 같은 조건은 pH 2 내지 8이다.
화학식 (XI)의 아미노산은 화학식 (XII)의 구조를 갖는 아미노산을 포함한다:
Figure 112007052373933-pct00042
상기 식에서,
B는 임의로 존재하고, 존재하는 경우에는 저급 알킬렌, 치환된 저급 알킬렌, 저급 알케닐렌, 치환된 저급 알케닐렌, 저급 헤테로알킬렌, 치환된 저급 헤테로알킬렌, -O-, -O-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -S-, -S-(알킬렌 또는 치환된 알킬 렌)-, -S(O)k- (k는 1, 2 또는 3임), -S(O)k(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(O)-, -NS(O)2-, -OS(O)2-, -C(O)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(S)-, -C(S)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')-, -NR'-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(O)N(R')-, -CON(R')-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -CSN(R')-, -CSN(R')-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')CO-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')C(O)O-, -S(O)kN(R')-, -N(R')C(0)N(R')-, -N(R')C(S)N(R')-, -N(R')S(O)kN(R')-, -N(R')-N=, -C(R')=N-, -C(R')=N-N(R')-, -C(R')=N-N=, -C(R')2-N=N- 및 -C(R')2-N(R')-N(R')-(여기서, R' 는 각각 독립적으로 H, 알킬 또는 치환된 알킬임)로 구성되는 군으로부터 선택되는 링커이며;
R은 H, 알킬, 치환된 알킬, 시클로알킬 또는 치환된 시클로알킬이고;
R1은 H, 아미노 보호기, 수지, 아미노산, 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드이며;
R2는 OH, 에스테르 보호기, 수지, 아미노산, 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드이고;
R5는 H, 알킬, 치환된 알킬, 알케닐, 치환된 알케닐, 알키닐, 치환된 알키닐, 알콕시, 치환된 알콕시, 알킬알콕시, 치환된 알킬알콕시, 폴리알킬렌 옥시드, 치환된 폴리알킬렌 옥시드, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 알크아릴, 치환된 알크아릴, 아르알킬, 치환된 아르알킬, -(알킬렌 또는 치환된 알 킬렌)-ON(R")2, -(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-C(O)SR", -(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-S-S-(알릴 또는 치환된 아릴), -C(O)R", -C(O)2R", -C(0)N(R")2 (여기서, 각 R"는 독립적으로 수소, 알킬, 치환된 알킬, 알케닐, 치환된 알케닐, 알콕시, 치환된 알콕시, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 알크아릴, 치환된 알크아릴, 아르알킬, 치환된 아르알킬임)이거나,
R5는 L-X이고;
X는 표지, 염료, 중합체, 수용성 중합체, 폴리에틸렌 글리콜 유도체, 광가교결합제, 세포독성 화합물, 약물, 친화도 표지, 광친화도 표지, 반응성 화합물, 수지, 제2의 단백질 또는 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 유사체, 항체 또는 항체 단편, 금속 킬레이트제, 조인자, 지방산, 탄수화물, 폴리뉴클레오티드, DNA, RNA, 안티센스 폴리뉴클레오티드, 사카라이드, 수용성 덴드리머, 시클로덱스트린, 생물질, 나노입자, 스핀 표지, 형광물질, 금속-함유 잔기, 방사성 잔기, 신규 관능기, 다른 분자와 공유적으로 또는 비공유적으로 상호작용하는 기, 포토케이지드 잔기, 광이성화성 잔기, 비오틴, 비오틴 유사체, 중량급 원자를 포함하는 잔기, 화학적으로 절단가능한 기, 광-절단가능한 기, 신장된 측쇄, 탄소-결합 당, 산화환원 활성제, 아미노 티오산, 독성 잔기, 동위원소 표지된 잔기, 생물리학적 프로브, 인광 기, 화학발광 기, 전자밀도가 높은 기, 자성 기, 인터캘레이팅 기, 발색단, 에너지 전달기, 생물학적 활성제, 검출가능한 표지 및 그들의 조합으로 구성되는 군으로부터 선택되고;
L은 임의로 존재하며, 존재하는 경우에는 알킬렌, 치환된 알킬렌, 알케닐렌, 치환된 알케닐렌, -O-, -O-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -S-, -S-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -S(O)k- (k는 1, 2 또는 3임), -S(O)k(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(O)-, -C(O)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(S)-, -C(S)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')-, -NR'-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(O)N(R')-, -CON(R')-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -CSN(R')-, -CSN(R')-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')CO-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')C(O)O-, -(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-O-N=CR'-, -(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-C(O)NR'-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-S(0)k-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-S-, -(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-S-S-, -S(O)kN(R')-, -N(R')C(0)N(R')-, -N(R')C(S)N(R')-, -N(R')S(0)kN(R')-, -N(R')-N=, -C(R')=N-, -C(R')=N-N(R')-, -C(R')=N-N=, -C(R')2-N=N- 및 -C(R')2-N(R')-N(R')- (여기서, R'는 각각 독립적으로 H, 알킬 또는 치환된 알킬임)로 구성되는 군으로부터 선택되는 링커이다. 그와 같은 비-천연 아미노산은 염 형태로 존재하거나, 비-천연 아미노산 폴리펩티드, 중합체, 폴리사카라이드, 또는 폴리뉴클레오티드 내로 혼입될 수 있으며, 임의로는 번역후 변형될 수 있다.
그와 같은 아미노산은 화학식 (XIII)의 구조를 갖는 아미노산을 포함한다:
Figure 112007052373933-pct00043
상기 식에서,
R은 H, 알킬, 치환된 알킬, 시클로알킬 또는 치환된 시클로알킬이고;
R1은 H, 아미노 보호기, 수지, 아미노산, 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드이며;
R2는 OH, 에스테르 보호기, 수지, 아미노산, 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드이고;
R5는 H, 알킬, 치환된 알킬, 알케닐, 치환된 알케닐, 알키닐, 치환된 알키닐, 알콕시, 치환된 알콕시, 알킬알콕시, 치환된 알킬알콕시, 폴리알킬렌 옥시드, 치환된 폴리알킬렌 옥시드, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 알크아릴, 치환된 알크아릴, 아르알킬, 치환된 아르알킬, -(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-ON(R")2, -(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-C(O)SR", -(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-S-S-(알릴 또는 치환된 아릴), -C(O)R", -C(O)2R", -C(0)N(R")2 (여기서, 각 R"는 독립적으로 수소, 알킬, 치환된 알킬, 알케닐, 치환된 알케닐, 알콕시, 치환된 알콕시, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 알크아릴, 치환된 알크아릴, 아르알킬, 치환된 아르알킬임)이거나,
R5는 L-X이고;
X는 표지, 염료, 중합체, 수용성 중합체, 폴리에틸렌 글리콜 유도체, 광가교결합제, 세포독성 화합물, 약물, 친화도 표지, 광친화도 표지, 반응성 화합물, 수지, 제2의 단백질 또는 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 유사체, 항체 또는 항체 단편, 금속 킬레이트제, 조인자, 지방산, 탄수화물, 폴리뉴클레오티드, DNA, RNA, 안티센스 폴리뉴클레오티드, 사카라이드, 수용성 덴드리머, 시클로덱스트린, 생물질, 나노입자, 스핀 표지, 형광물질, 금속-함유 잔기, 방사성 잔기, 신규 관능기, 다른 분자와 공유적으로 또는 비공유적으로 상호작용하는 기, 포토케이지드 잔기, 광이성화성 잔기, 비오틴, 비오틴 유사체, 중량급 원자를 포함하는 잔기, 화학적으로 절단가능한 기, 광-절단가능한 기, 신장된 측쇄, 탄소-결합 당, 산화환원 활성제, 아미노 티오산, 독성 잔기, 동위원소 표지된 잔기, 생물리학적 프로브, 인광 기, 화학발광 기, 전자밀도가 높은 기, 자성 기, 인터캘레이팅 기, 발색단, 에너지 전달기, 생물학적 활성제, 검출가능한 표지 및 그들의 조합으로 구성되는 군으로부터 선택되고;
L은 임의로 존재하며, 존재하는 경우에는 알킬렌, 치환된 알킬렌, 알케닐렌, 치환된 알케닐렌, -O-, -O-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -S-, -S-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -S(O)k- (k는 1, 2 또는 3임), -S(O)k(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(O)-, -C(O)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(S)-, -C(S)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')-, -NR'-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(O)N(R')-, -CON(R')-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -CSN(R')-, -CSN(R')-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')CO-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')C(O)O-, -(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-O-N=CR'-, -(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-C(O)NR'-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-S(0)k-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-S-, -(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-S-S-, -S(O)kN(R')-, -N(R')C(0)N(R')-, -N(R')C(S)N(R')-, -N(R')S(0)kN(R')-, -N(R')-N=, -C(R')=N-, -C(R')=N-N(R')-, -C(R')=N-N=, -C(R')2-N=N- 및 -C(R')2-N(R')-N(R')- (여기서, R'는 각각 독립적으로 H, 알킬 또는 치환된 알킬임)로 구성되는 군으로부터 선택되는 링커이다. 그와 같은 비-천연 아미노산은 염 형태로 존재하거나, 비-천연 아미노산 폴리펩티드, 중합체, 폴리사카라이드, 또는 폴리뉴클레오티드 내로 혼입될 수 있으며, 임의로는 번역후 변형될 수 있다.
그와 같은 아미노산의 또다른 비제한적인 예는 하기 구조를 갖는 아미노산이다:
Figure 112007052373933-pct00044
그와 같은 비-천연 아미노산은 염 형태로 존재하거나, 비-천연 아미노산 폴리펩티드, 중합체, 폴리사카라이드, 또는 폴리뉴클레오티드 내로 혼입될 수 있으며, 임의 로는 번역후 변형될 수 있다.
또한, 그와 같은 아미노산은 화학식 (XIV)의 구조를 갖는 아미노산을 포함한다:
[화학식 XIV]
Figure 112007052373933-pct00045
상기 식에서,
A는 임의로 존재하고, 존재하는 경우에는 저급 알킬렌, 치환된 저급 알킬렌, 저급 시클로알킬렌, 치환된 저급 시클로알킬렌, 저급 알케닐렌, 치환된 저급 알케닐렌, 알키닐렌, 저급 헤테로알킬렌, 치환된 헤테로알킬렌, 저급 헤테로시클로알킬렌, 치환된 저급 헤테로시클로알킬렌, 아릴렌, 치환된 아릴렌, 헤테로아릴렌, 치환된 헤테로아릴렌, 알크아릴렌, 치환된 알크아릴렌, 아르알킬렌 또는 치환된 아르알킬렌이며;
B는 임의로 존재하고, 존재하는 경우에는 저급 알킬렌, 치환된 저급 알킬렌, 저급 알케닐렌, 치환된 저급 알케닐렌, 저급 헤테로알킬렌, 치환된 저급 헤테로알킬렌, -O-, -O-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -S-, -S-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -S(O)k- (k는 1, 2 또는 3임), -S(O)k(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(O)-, -NS(O)2-, -OS(O)2-, -C(O)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(S)-, -C(S)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')-, -NR'-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(O)N(R')-, -CON(R')-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -CSN(R')-, -CSN(R')-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')CO-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')C(O)O-, -S(O)kN(R')-, -N(R')C(0)N(R')-, -N(R')C(S)N(R')-, -N(R')S(O)kN(R')-, -N(R')-N=, -C(R')=N-, -C(R')=N-N(R')-, -C(R')=N-N=, -C(R')2-N=N- 및 -C(R')2-N(R')-N(R')-(여기서, R' 는 각각 독립적으로 H, 알킬 또는 치환된 알킬임)로 구성되는 군으로부터 선택되는 링커이며;
K는 -NR6R7 또는 -N=CR6R7이고;
R1은 H, 아미노 보호기, 수지, 아미노산, 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드이며;
R2는 OH, 에스테르 보호기, 수지, 아미노산, 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드이고;
R3 및 R4는 독립적으로 H, 할로겐, 알킬, 치환된 알킬, 시클로알킬 또는 치환된 시클로알킬로부터 선택되거나, R3 및 R4 또는 두 개의 R3 기는 임의로는 함께 시클로알킬 또는 헤테로시클로알킬을 형성하고;
R6 및 R7은 각각 독립적으로 H, 알킬, 치환된 알킬, 알케닐, 치환된 알케닐, 알콕시, 치환된 알콕시, 폴리알킬렌 옥시드, 치환된 폴리알킬렌 옥시드, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 알크아릴, 치환된 알크아릴, 아르알 킬, 치환된 아르알킬, -C(O)R", -C(O)2R", -C(0)N(R")2 (여기서, 각 R"는 독립적으로 수소, 알킬, 치환된 알킬, 알케닐, 치환된 알케닐, 알콕시, 치환된 알콕시, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 알크아릴, 치환된 알크아릴, 아르알킬, 치환된 아르알킬임)이거나,
R6 또는 R7은 L-X이고;
X는 표지, 염료, 중합체, 수용성 중합체, 폴리에틸렌 글리콜 유도체, 광가교결합제, 세포독성 화합물, 약물, 친화도 표지, 광친화도 표지, 반응성 화합물, 수지, 제2의 단백질 또는 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 유사체, 항체 또는 항체 단편, 금속 킬레이트제, 조인자, 지방산, 탄수화물, 폴리뉴클레오티드, DNA, RNA, 안티센스 폴리뉴클레오티드, 사카라이드, 수용성 덴드리머, 시클로덱스트린, 생물질, 나노입자, 스핀 표지, 형광물질, 금속-함유 잔기, 방사성 잔기, 신규 관능기, 다른 분자와 공유적으로 또는 비공유적으로 상호작용하는 기, 포토케이지드 잔기, 광이성화성 잔기, 비오틴, 비오틴 유사체, 중량급 원자를 포함하는 잔기, 화학적으로 절단가능한 기, 광-절단가능한 기, 신장된 측쇄, 탄소-결합 당, 산화환원 활성제, 아미노 티오산, 독성 잔기, 동위원소 표지된 잔기, 생물리학적 프로브, 인광 기, 화학발광 기, 전자밀도가 높은 기, 자성 기, 인터캘레이팅 기, 발색단, 에너지 전달기, 생물학적 활성제, 검출가능한 표지 및 그들의 조합으로 구성되는 군으로부터 선택되고;
L은 임의로 존재하며, 존재하는 경우에는 알킬렌, 치환된 알킬렌, 알케닐렌, 치환된 알케닐렌, -O-, -O-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -S-, -S-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -S(O)k- (k는 1, 2 또는 3임), -S(O)k(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(O)-, -C(O)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(S)-, -C(S)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')-, -NR'-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(O)N(R')-, -CON(R')-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -CSN(R')-, -CSN(R')-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')CO-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')C(O)O-, -S(O)kN(R')-, -N(R')C(0)N(R')-, -N(R')C(S)N(R')-, -N(R')S(0)kN(R')-, -N(R')-N=, -C(R')=N-, -C(R')=N-N(R')-, -C(R')=N-N=, -C(R')2-N=N- 및 -C(R')2-N(R')-N(R')- (여기서, R'는 각각 독립적으로 H, 알킬 또는 치환된 알킬임)로 구성되는 군으로부터 선택된다. 그와 같은 비-천연 아미노산은 염 형태로 존재하거나, 비-천연 아미노산 폴리펩티드, 중합체, 폴리사카라이드, 또는 폴리뉴클레오티드 내로 혼입될 수 있으며, 임의로는 번역후 변형될 수 있다.
그와 같은 아미노산은 또한 화학식 (XVI)의 구조를 갖는 아미노산을 포함한다:
Figure 112007052373933-pct00046
상기 식에서,
A는 임의로 존재하고, 존재하는 경우에는 저급 알킬렌, 치환된 저급 알킬렌, 저급 시클로알킬렌, 치환된 저급 시클로알킬렌, 저급 알케닐렌, 치환된 저급 알케닐렌, 알키닐렌, 저급 헤테로알킬렌, 치환된 헤테로알킬렌, 저급 헤테로시클로알킬렌, 치환된 저급 헤테로시클로알킬렌, 아릴렌, 치환된 아릴렌, 헤테로아릴렌, 치환된 헤테로아릴렌, 알크아릴렌, 치환된 알크아릴렌, 아르알킬렌 또는 치환된 아르알킬렌이며;
B는 임의로 존재하고, 존재하는 경우에는 저급 알킬렌, 치환된 저급 알킬렌, 저급 알케닐렌, 치환된 저급 알케닐렌, 저급 헤테로알킬렌, 치환된 저급 헤테로알킬렌, -O-, -O-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -S-, -S-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -S(O)k- (k는 1, 2 또는 3임), -S(O)k(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(O)-, -NS(O)2-, -OS(O)2-, -C(O)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(S)-, -C(S)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')-, -NR'-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(O)N(R')-, -CON(R')-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -CSN(R')-, -CSN(R')-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')CO-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')C(O)O-, -S(O)kN(R')-, -N(R')C(0)N(R')-, -N(R')C(S)N(R')-, -N(R')S(O)kN(R')-, -N(R')-N=, -C(R')=N-, -C(R')=N-N(R')-, -C(R')=N-N=, -C(R')2-N=N- 및 -C(R')2-N(R')-N(R')-(여기서, R' 는 각각 독립적으로 H, 알킬 또는 치환된 알킬임)로 구성되는 군으로부터 선택되는 링커이며;
R1은 H, 아미노 보호기, 수지, 아미노산, 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드이며;
R2는 OH, 에스테르 보호기, 수지, 아미노산, 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드이고;
R3 및 R4는 독립적으로 H, 할로겐, 알킬, 치환된 알킬, 시클로알킬 또는 치환된 시클로알킬로부터 선택되거나, R3 및 R4 또는 두 개의 R3 기는 임의로는 함께 시클로알킬 또는 헤테로시클로알킬을 형성하고;
R6 및 R7은 각각 독립적으로 H, 알킬, 치환된 알킬, 알케닐, 치환된 알케닐, 알콕시, 치환된 알콕시, 폴리알킬렌 옥시드, 치환된 폴리알킬렌 옥시드, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 알크아릴, 치환된 알크아릴, 아르알킬, 치환된 아르알킬, -C(O)R", -C(O)2R", -C(0)N(R")2 (여기서, 각 R"는 독립적으로 수소, 알킬, 치환된 알킬, 알케닐, 치환된 알케닐, 알콕시, 치환된 알콕시, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 알크아릴, 치환된 알크아릴, 아르알킬, 치환된 아르알킬임)이거나,
R6 또는 R7은 L-X이고;
X는 표지, 염료, 중합체, 수용성 중합체, 폴리에틸렌 글리콜 유도체, 광가교결합제, 세포독성 화합물, 약물, 친화도 표지, 광친화도 표지, 반응성 화합물, 수지, 제2의 단백질 또는 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 유사체, 항체 또는 항체 단편, 금속 킬레이트제, 조인자, 지방산, 탄수화물, 폴리뉴클레오티드, DNA, RNA, 안티센스 폴리뉴클레오티드, 사카라이드, 수용성 덴드리머, 시클로덱스트린, 생물질, 나노입자, 스핀 표지, 형광물질, 금속-함유 잔기, 방사성 잔기, 신규 관능기, 다른 분자와 공유적으로 또는 비공유적으로 상호작용하는 기, 포토케이지드 잔기, 광이성화성 잔기, 비오틴, 비오틴 유사체, 중량급 원자를 포함하는 잔기, 화학적으로 절단가능한 기, 광-절단가능한 기, 신장된 측쇄, 탄소-결합 당, 산화환원 활성제, 아미노 티오산, 독성 잔기, 동위원소 표지된 잔기, 생물리학적 프로브, 인광 기, 화학발광 기, 전자밀도가 높은 기, 자성 기, 인터캘레이팅 기, 발색단, 에너지 전달기, 생물학적 활성제, 검출가능한 표지 및 그들의 조합으로 구성되는 군으로부터 선택되고;
L은 임의로 존재하며, 존재하는 경우에는 알킬렌, 치환된 알킬렌, 알케닐렌, 치환된 알케닐렌, -O-, -O-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -S-, -S-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -S(O)k- (k는 1, 2 또는 3임), -S(O)k(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(O)-, -C(O)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(S)-, -C(S)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')-, -NR'-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(O)N(R')-, -CON(R')-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -CSN(R')-, -CSN(R')-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')CO-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')C(O)O-, -S(O)kN(R')-, -N(R')C(0)N(R')-, -N(R')C(S)N(R')-, -N(R')S(0)kN(R')-, -N(R')-N=, -C(R')=N-, -C(R')=N-N(R')-, -C(R')=N-N=, -C(R')2-N=N- 및 -C(R')2-N(R')- N(R')- (여기서, R'는 각각 독립적으로 H, 알킬 또는 치환된 알킬임)로 구성되는 군으로부터 선택된다. 그와 같은 비-천연 아미노산은 염 형태로 존재하거나, 비-천연 아미노산 폴리펩티드, 중합체, 폴리사카라이드, 또는 폴리뉴클레오티드 내로 혼입될 수 있으며, 임의로는 번역후 변형될 수 있다.
또한, 그와 같은 아미노산은 화학식 (XVII)의 구조를 갖는 아미노산을 포함한다:
Figure 112007052373933-pct00047
상기 식에서,
B는 임의로 존재하고, 존재하는 경우에는 저급 알킬렌, 치환된 저급 알킬렌, 저급 알케닐렌, 치환된 저급 알케닐렌, 저급 헤테로알킬렌, 치환된 저급 헤테로알킬렌, -O-, -O-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -S-, -S-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -S(O)k- (k는 1, 2 또는 3임), -S(O)k(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(O)-, -NS(O)2-, -OS(O)2-, -C(O)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(S)-, -C(S)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')-, -NR'-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(O)N(R')-, -CON(R')-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -CSN(R')-, -CSN(R')-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')CO-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')C(O)O-, -S(O)kN(R')-, -N(R')C(0)N(R')-, -N(R')C(S)N(R')-, -N(R')S(O)kN(R')-, -N(R')-N=, -C(R')=N-, -C(R')=N-N(R')-, -C(R')=N-N=, -C(R')2-N=N- 및 -C(R')2-N(R')-N(R')-(여기서, R' 는 각각 독립적으로 H, 알킬 또는 치환된 알킬임)로 구성되는 군으로부터 선택되는 링커이며;
R1은 H, 아미노 보호기, 수지, 아미노산, 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드이며;
R2는 OH, 에스테르 보호기, 수지, 아미노산, 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드이고;
R6 및 R7은 각각 독립적으로 H, 알킬, 치환된 알킬, 알케닐, 치환된 알케닐, 알콕시, 치환된 알콕시, 폴리알킬렌 옥시드, 치환된 폴리알킬렌 옥시드, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 알크아릴, 치환된 알크아릴, 아르알킬, 치환된 아르알킬, -C(O)R", -C(O)2R", -C(0)N(R")2 (여기서, 각 R"는 독립적으로 수소, 알킬, 치환된 알킬, 알케닐, 치환된 알케닐, 알콕시, 치환된 알콕시, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 알크아릴, 치환된 알크아릴, 아르알킬, 치환된 아르알킬임)이거나,
R6 또는 R7은 L-X이고;
X는 표지, 염료, 중합체, 수용성 중합체, 폴리에틸렌 글리콜 유도체, 광가교결합제, 세포독성 화합물, 약물, 친화도 표지, 광친화도 표지, 반응성 화합물, 수 지, 제2의 단백질 또는 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 유사체, 항체 또는 항체 단편, 금속 킬레이트제, 조인자, 지방산, 탄수화물, 폴리뉴클레오티드, DNA, RNA, 안티센스 폴리뉴클레오티드, 사카라이드, 수용성 덴드리머, 시클로덱스트린, 생물질, 나노입자, 스핀 표지, 형광물질, 금속-함유 잔기, 방사성 잔기, 신규 관능기, 다른 분자와 공유적으로 또는 비공유적으로 상호작용하는 기, 포토케이지드 잔기, 광이성화성 잔기, 비오틴, 비오틴 유사체, 중량급 원자를 포함하는 잔기, 화학적으로 절단가능한 기, 광-절단가능한 기, 신장된 측쇄, 탄소-결합 당, 산화환원 활성제, 아미노 티오산, 독성 잔기, 동위원소 표지된 잔기, 생물리학적 프로브, 인광 기, 화학발광 기, 전자밀도가 높은 기, 자성 기, 인터캘레이팅 기, 발색단, 에너지 전달기, 생물학적 활성제, 검출가능한 표지 및 그들의 조합으로 구성되는 군으로부터 선택되고;
L은 임의로 존재하며, 존재하는 경우에는 알킬렌, 치환된 알킬렌, 알케닐렌, 치환된 알케닐렌, -O-, -O-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -S-, -S-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -S(O)k- (k는 1, 2 또는 3임), -S(O)k(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(O)-, -C(O)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(S)-, -C(S)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')-, -NR'-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(O)N(R')-, -CON(R')-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -CSN(R')-, -CSN(R')-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')CO-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')C(O)O-, -S(O)kN(R')-, -N(R')C(0)N(R')-, -N(R')C(S)N(R')-, -N(R')S(0)kN(R')-, -N(R')- N=, -C(R')=N-, -C(R')=N-N(R')-, -C(R')=N-N=, -C(R')2-N=N- 및 -C(R')2-N(R')-N(R')- (여기서, R'는 각각 독립적으로 H, 알킬 또는 치환된 알킬임)로 구성되는 군으로부터 선택된다. 그와 같은 비-천연 아미노산은 염 형태로 존재하거나, 비-천연 아미노산 폴리펩티드, 중합체, 폴리사카라이드, 또는 폴리뉴클레오티드 내로 혼입될 수 있으며, 임의로는 번역후 변형될 수 있다.
그와 같은 아미노산의 비제한적인 예는 하기 구조를 갖는 아미노산을 포함한다:
Figure 112007052373933-pct00048
그와 같은 비-천연 아미노산은 염 형태로 존재하거나, 비-천연 아미노산 폴리펩티드, 중합체, 폴리사카라이드, 또는 폴리뉴클레오티드 내로 혼입될 수 있으며, 임의로는 번역후 변형될 수 있다.
또한, 그와 같은 아미노산은 화학식 (XVIII)의 구조를 갖는 아미노산을 포함한다:
Figure 112007052373933-pct00049
상기 식에서,
B는 임의로 존재하고, 존재하는 경우에는 저급 알킬렌, 치환된 저급 알킬렌, 저급 알케닐렌, 치환된 저급 알케닐렌, 저급 헤테로알킬렌, 치환된 저급 헤테로알킬렌, -O-, -O-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -S-, -S-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -S(O)k- (k는 1, 2 또는 3임), -S(O)k(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(O)-, -NS(O)2-, -OS(O)2-, -C(O)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(S)-, -C(S)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')-, -NR'-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(O)N(R')-, -CON(R')-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -CSN(R')-, -CSN(R')-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')CO-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')C(O)O-, -S(O)kN(R')-, -N(R')C(0)N(R')-, -N(R')C(S)N(R')-, -N(R')S(O)kN(R')-, -N(R')-N=, -C(R')=N-, -C(R')=N-N(R')-, -C(R')=N-N=, -C(R')2-N=N- 및 -C(R')2-N(R')-N(R')-(여기서, R' 는 각각 독립적으로 H, 알킬 또는 치환된 알킬임)로 구성되는 군으로부터 선택되는 링커이며;
R1은 H, 아미노 보호기, 수지, 아미노산, 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드이며;
R2는 OH, 에스테르 보호기, 수지, 아미노산, 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드이고;
R6 및 R7은 각각 독립적으로 H, 알킬, 치환된 알킬, 알케닐, 치환된 알케닐, 알콕시, 치환된 알콕시, 폴리알킬렌 옥시드, 치환된 폴리알킬렌 옥시드, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 알크아릴, 치환된 알크아릴, 아르알킬, 치환된 아르알킬, -C(O)R", -C(O)2R", -C(0)N(R")2 (여기서, 각 R"는 독립적으로 수소, 알킬, 치환된 알킬, 알케닐, 치환된 알케닐, 알콕시, 치환된 알콕시, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 알크아릴, 치환된 알크아릴, 아르알킬, 치환된 아르알킬임)이거나,
R6 또는 R7은 L-X이고;
X는 표지, 염료, 중합체, 수용성 중합체, 폴리에틸렌 글리콜 유도체, 광가교결합제, 세포독성 화합물, 약물, 친화도 표지, 광친화도 표지, 반응성 화합물, 수지, 제2의 단백질 또는 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 유사체, 항체 또는 항체 단편, 금속 킬레이트제, 조인자, 지방산, 탄수화물, 폴리뉴클레오티드, DNA, RNA, 안티센스 폴리뉴클레오티드, 사카라이드, 수용성 덴드리머, 시클로덱스트린, 생물질, 나노입자, 스핀 표지, 형광물질, 금속-함유 잔기, 방사성 잔기, 신규 관능기, 다른 분자와 공유적으로 또는 비공유적으로 상호작용하는 기, 포토케이지드 잔기, 광이성화성 잔기, 비오틴, 비오틴 유사체, 중량급 원자를 포함하는 잔기, 화학적으로 절단가능한 기, 광-절단가능한 기, 신장된 측쇄, 탄소-결합 당, 산화환원 활성제, 아미노 티오산, 독성 잔기, 동위원소 표지된 잔기, 생물리학적 프로브, 인광 기, 화학발광 기, 전자밀도가 높은 기, 자성 기, 인터캘레이팅 기, 발색단, 에너지 전달기, 생물학적 활성제, 검출가능한 표지 및 그들의 조합으로 구성되는 군으로부터 선택되고;
L은 임의로 존재하며, 존재하는 경우에는 알킬렌, 치환된 알킬렌, 알케닐렌, 치환된 알케닐렌, -O-, -O-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -S-, -S-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -S(O)k- (k는 1, 2 또는 3임), -S(O)k(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(O)-, -C(O)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(S)-, -C(S)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')-, -NR'-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(O)N(R')-, -CON(R')-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -CSN(R')-, -CSN(R')-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')CO-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')C(O)O-, -S(O)kN(R')-, -N(R')C(0)N(R')-, -N(R')C(S)N(R')-, -N(R')S(0)kN(R')-, -N(R')-N=, -C(R')=N-, -C(R')=N-N(R')-, -C(R')=N-N=, -C(R')2-N=N- 및 -C(R')2-N(R')-N(R')- (여기서, R'는 각각 독립적으로 H, 알킬 또는 치환된 알킬임)로 구성되는 군으로부터 선택되고;
Ra는 각각 독립적으로 H, 할로겐, 알킬, 치환된 알킬, -N(R')2, - C(O)kR' (k는 1, 2 또는 3임), -C(O)N(R')2, -OR' 및 -S(O)kR'(여기서, R'은 각각 독립적으로 H, 알킬 또는 치환된 알킬임)로 구성되는 군으로부터 선택된다. 그와 같은 비-천 연 아미노산은 염 형태로 존재하거나, 비-천연 아미노산 폴리펩티드, 중합체, 폴리사카라이드, 또는 폴리뉴클레오티드 내로 혼입될 수 있으며, 임의로는 번역후 변형될 수 있다.
그와 같은 아미노산의 비제한적인 예는 하기 구조를 갖는 아미노산을 포함한다:
Figure 112007052373933-pct00050
그와 같은 비-천연 아미노산은 염 형태로 존재하거나, 비-천연 아미노산 폴리펩티드, 중합체, 폴리사카라이드, 또는 폴리뉴클레오티드 내로 혼입될 수 있으며, 임의로는 번역후 변형될 수 있다.
옥심-기초 비-천연 아미노산은 당업계에 공지된 방법에 의하거나, (a) 히드록실아민-함유 비-천연 아미노산을 카르보닐- 또는 디카르보닐-함유 반응 화합물과 반응시키는 것; (b) 카르보닐- 또는 디카르보닐-함유 비-천연 아미노산을 히드록실아민-함유 반응 화합물과 반응시키는 것; 또는 (c) 옥심-함유 비-천연 아미노산을 특정 카르보닐- 또는 디카르보닐-함유 반응 화합물(예를 들어, 케톤-함유 또는 알데히드-함유 반응 화합물 포함)과 반응시키는 것을 포함하는, 본 명세서에 기재된 방법에 따라 합성될 수 있다.
D. 비-천연 아미노산의 세포 흡수
진핵 세포에 의한 비-천연 아미노산의 흡수는 예를 들어, 단백질 내로 도입시킬 목적으로 비-천연 아미노산을 설계 및 선택함에 있어서 전형적으로 고려되는 문제이다. 예를 들어, α-아미노산의 높은 전하 밀도는 이들 화합물이 세포 투과성이지 않다는 것을 암시한다. 천연 아미노산은 일련의 단백질-기재 수송계를 통해 진핵 세포 내로 흡수된다. 있다면 어떤 아미노산이 세포에 의해 흡수되는지를 알아보는 고속 스크리닝을 수행할 수 있다(본 명세서의 실시예 15 및 16은 비-천연 아미노산에 대해 수행될 수 있는 비제한적인 시험 방법의 예를 제시하고 있다). 예를 들어, 문헌[전문이 본 명세서에 포함되는 "단백질 분석"이라는 제명의 미합중국 특허 공개 제2004/198637호; 및 Liu, D.R. & Schultz, P.G. (1999) Progress toward the evolution of an organism with an expanded genetic code. PNAS United States 96:4780-4785]에 기재된 독성 분석이 한 예이다. 여러 방법으로 흡수가 쉽게 분석될 수 있지만, 세포 흡수 경로에 적합한 비-천연 아미노산을 설계하는 다른 대안은 생체내 아미노산을 생산하는 생합성 경로를 제공하는 것이다.
전형적으로, 본 명세서에 기재된 바와 같이 세포 흡수를 통해 생산된 아미노산은 효율적인 단백질 생합성에 충분한 농도, 예컨대, 자연적인 세포 내 농도로 생산되지만, 다른 아미노산의 농도에 영향을 미치거나 세포내 공급원을 고갈시키는 정도는 아니다. 이와 같은 방법으로 생산되는 전형적인 농도는 약 10 mM 내지 약 0.05 mM이다.
E. 비-천연 아미노산의 생합성
아미노산 및 기타 화합물의 제조를 위한 여러 생합성 경로가 세포에 존재한 다. 특정 아미노산을 위한 생합성 경로가 세포를 포함하는 자연계에 존재하지 않을지라도, 본 명세서에 기재된 방법 및 조성물은 그와 같은 방법을 제공한다. 예를 들어, 비-천연 아미노산을 위한 생합성 경로는 숙주세포에 새로운 효소를 가하거나 존재하는 숙주세포 경로를 변형시켜 생산될 수 있다. 추가의 새로운 효소는 천연 효소 또는 인공적으로 유도된 효소를 포함한다. 예를 들어, 베타-아미노페닐알라닌 (발명의 명칭 "In vivo incorporation of unnatural amino acids" 하의 WO 2002/085923의 실시예에 제시)의 생합성은 다른 유기체로부터의 공지의 효소 조합을 가하여 이루어진다. 이와 같은 효소에 대한 유전자가 세포를 이들 유전자를 포함하는 플라스미드로 형질전환시킴으로써 도입될 수 있다. 유전자는 세포 내에서 발현될 때 목적하는 화합물을 합성하는 효소 경로를 제공한다. 임의로 가해지는 효소 유형의 예가 본 명세서에 기재되어 있다. 추가의 효소 서열이, 예컨대, 유전자은행에 기탁되어 있다. 인위적으로 유도한 효소는 동일한 방법으로 세포 내로 가해질 수 있다. 이와 같은 방식에서, 세포 기구 및 자원은 비-천연 아미노산을 생성하도록 조작된다.
생합성 경로 또는 존재하는 경로의 진화에 사용하기 위한 새로운 효소를 생성하는 각종 방법이 있다. 예를 들어, 맥시진 (Maxygen, Inc.; www.maxygen.com)에 의해 개발된 것을 포함하는 반복적 재조합법을 새로운 효소 및 경로를 개발하는데 사용할 수 있다[참조: Stemmer (1994), Rapid evolution of a protein in vitro by DNA shuffling, Nature 370(4):389- 391; and, Stemmer, (1994), DNA shuffling by random fragmentation and reassembly: In vitro recombination for molecular evolution, Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 91:10747-10751]. 마찬가지로, 등록상표명 디자인패쓰 (DesignPath™, Genencor에 의해 개발되고, 웹 페이지 genencor.com에서 입수 가능)를, 비제한적인 예로서, 세포내에서 비-천연 아미노산을 생성하는 경로를 엔지니어링하는 등의 대사 경로 엔지니어링에 사용할 수 있다. 이와 같은 기술은 기능적 유전학, 분자 진화 및 설계를 통해 확인된 것을 포함하는새로운 유전자를 조합함으로써 숙주세포에 존재하는 경로를 재구성하는 것이다. 디버사 코포레이션(Diversa Corporation; diversa.com)은 또한 비-천연 아미노산을 생합성 생산하는 새로운 경로를 만들어내는 것을 포함하여, 유전자 라이브러리 및 유전자 경로를 급속히 스크리닝하는 기술을 제공한다.
전형적으로, 본 명세서에 기재된 엔지니어링된 생합성 경로에 의해 생산되는 비-천연 아미노산은 자연세포 농도와 같이 효율적인 단백질 생합성을 위해 충분한 농도로 생산되지만, 다른 아미노산 농도에 영향을 미치거나 세포 자원을 고갈시키는 정도는 아니다. 이 방식으로 전형적으로 생체내 생산되는 농도는 약 10 mM 내지 약 0.05 mM이다, 세포가 일단 특정 경로에 요구되는 효소를 생산하는 유전자를 포함하는 플라스미드로 형질전환되면, 비-천연 아미노산이 생산되며, 리보조옴 단백질 합성 및 세포 성장을 위해 비-천연 아미노산의 생성을 더욱 적정화하기 위해 생체내 선택이 임의로 사용된다.
F. 추가의 합성 방법
본 명세서에 기재된 비-천연 아미노산은 당업계에 공지된 방법 또는 본 명세서에 기재된 방법 또는 이들의 조합에 의해 합성될 수 있다. 이해를 돕기 위해, 하기 표는 함께 목적하는 관능기를 생성할 수 있는 여러 가지 출발 친전자체 및 친핵체를 제공한다. 제공된 정보는 단지 예시를 위한 것이며, 본 명세서에 기재된 합성 기술을 제한하려는 것이 아니다.
공유 결합 및 그들의 전구체의 예
공유결합 생성물 친전자체 친핵체
카르복스아미드 활성화 에스테르 아민/아닐린
카르복스아미드 아실 아지드 아민/아닐린
카르복스아미드 아실 할라이드 아민/아닐린
에스테르 아실 할라이드 알콜/페놀
에스테르 아실 니트릴 알콜/페놀
카르복스아미드 아실 니트릴 아민/아닐린
이민 알데히드 아민/아닐린
히드라존 알데히드 또는 케톤 히드라진
옥심 알데히드 또는 케톤 히드록실아민
알킬 아민 알킬 할라이드 아민/아닐린
에스테르 알킬 할라이드 카르복실산
티오에테르 알킬 할라이드 티올
에테르 알킬 할라이드 알콜/페놀
티오에테르 알킬 술포네이트 티올
에스테르 알킬 술포네이트 카르복실산
에테르 알킬 술포네이트 알콜/페놀
에스테르 무수물 알콜/페놀
카르복스아미드 무수물 아민/아닐린
티오페놀 아릴 할라이드 티올
아릴 아민 아릴 할라이드 아민
티오에테르 아진딘 티올
보로네이트 에스테르 보로네이트 글리세롤
카르복스아미드 카르복실산 아민/아닐린
에스테르 카르복실산 알콜
히드라진 히드라지드 카르복실산
N-아실우레아 또는 무수물 카르보디이미드 카르복실산
에스테르 디아조알칸 카르복실산
티오에테르 에폭시드 티올
티오에테르 할로아세트아미드 티올
암모트리아진 할로트리아진 아민/아닐린
트리아지닐 에테르 할로트리아진 알콜/페놀
아미딘 이미도 에스테르 아민/아닐린
우레아 이소시아네이트 아민/아닐린
우레탄 이소시아네이트 알콜/페놀
티오우레아 이소티오시아네이트 아민/아닐린
티오에테르 말레이미드 티올
포스파이트 에스테르 포스포르아미다이트 알콜
실릴 에테르 실릴 할라이드 알콜
알킬 아민 술포네이트 에스테르 아민/아닐린
티오에테르 술포네이트 에스테르 티올
에스테르 술포네이트 에스테르 카르복실산
에테르 술포네이트 에스테르 알콜
술폰아미드 술포닐 할라이드 아민/아닐린
술포네이트 에스테르 술포닐 할라이드 페놀/알콜
일반적으로, 탄소 친전자체는 탄소 친핵체를 포함하는 상보적 친핵체에 의해 공격을 받기 쉬운 반면, 공격하는 친핵체는 친핵체 및 탄소 친전자체 사이에 새로운 결합을 생성하기 위하여 전자쌍을 친전자체에 부여한다.
탄소 친핵체의 비제한적인 예는 알킬, 알케닐, 아릴 및 알키닐 그리나드 (Grignard), 유기리튬, 유기아연, 알킬-, 알케닐-, 아릴- 및 알키닐-주석 화합물 (유기주석화합물), 알킬-, 알케닐-, 아릴- 및 알키닐-보란 화합물 (유기보란 및 유기보라네이트)를 포함하며, 이들 탄소 친핵체는 물 및 극성 용매 중에서 역학적으로 안정하다는 잇점이 있다. 탄소 친핵체의 다른 비제한적인 예는 인 일리드, 에놀 및 에놀레이트 반응 화합물을 포함하며, 이들 친핵체는 합성 유기 화학분야의 전문가에게 공지된 전구체로부터 비교적 쉽게 생성될 수 있다는 잇점이 있다. 탄소 친핵체는 탄소 친전자체와 함께 사용될 때, 탄소 친핵체와 탄소 친전자체 사이에 새로은 탄소-탄소 결합을 생성시킨다.
탄소 친전자체에 커플링시키기에 적절한 비-탄소 친핵체의 비제한적인 예는 1급 및 2급 아민, 티올, 티올레이트 및 티오에테르, 알콜, 알콕시드, 아지드, 세미카바지드 등을 포함한다. 이들 비-탄소 친핵체는 탄소 친전자체와 함께 사용될 때, 전형적으로 헤테로원자 결합 (C-X-C) (X는 비제한적인 예로서 산소, 황 또는 질소임)을 형성한다.
VI. 비-천연 아미노산이 있는 폴리펩티드
간편하게, 이 섹션에 기재된 화합물의 형태, 특성 및 기타 특징은 특정 예를 들어 총괄적으로 기재한 것이다. 그러나, 이 섹션에 기재된 화합물의 형태, 특성 및 기타 특징은 단지 이 섹션에서 제공된 총괄적 기술 사항 또는 특정 예에 국한되는 것이 아니라, 본 명세서, 청구 범위 및 도면에 기재된 화학식 I - XVIII, XXX - XXXIV (A 및 B) 및 XXXX - XXXXIII의 범주에 드는 화합물, 그들의 범주에 드는 하위범위 내의 화합물 또는 특정 개별적 화합물 모두에 균등하게 적용되는 것이다.
본 명세서에 기재된 방법 및 조성물은 적어도 하나의 비-천연 아미노산을 폴리펩티드 내로 도입하는 것을 제공한다. 비-천연 아미노산은 임의의 말단 위치 또는 임의의 내부 위치를 포함하여, 폴리펩티드 내의 어떤 위치에나 존재할 수 있다. 바람직하게는, 비-천연 아미노산은 폴리펩티드의 활성 및(또는) 3차 구조의 파괴가 비-천연 아미노산을 폴리펩티드 내로 도입하는 목적이 아닌 한, 상동적인 천연 아미노산 폴리펩티드에 비하여 비-천연 아미노산 폴리펩티드의 활성 및(또는) 3차 구조를 파괴하지 않는다. 또한, 비-천연 아미노산을 폴리펩티드 내로 도입하는 것은 어느 정도 활성을 변형시킬 수 있는데, 예컨대, 폴리펩티드의 치료 효과를 조작하거나 폴리펩티드의 안전성 프로파일을 개선하거나, 폴리펩티드의 약물동태학, 약물학 및(또는) 약물역학을 조정하거나(예를 들어, 수용해도, 생이용성을 증가시키거나, 혈청 반감기 또는 치료 반감기를 증가시키거나, 면역원성 또는 생물학적 활성을 조절하거나, 순환 시간을 연장시키거나), 폴리펩티드에 추가의 관능기를 제공하거나, 폴리펩티드 내로 태그, 표지 또는 검출가능한 신호를 도입하거나, 폴리펩티드의 단리 특성을 쉽게하거나 또는 이들의 조합을 이룰 수 있고/있거나 폴리펩티드의 활성 및(또는) 3차 구조를 완전히 파괴하지 않으면서 상동적인 천연 아미노산 폴리펩티드에 비하여 폴리펩티드의 3차 구조를 변형시킬 수 있다. 그 활성 및(또는) 3차 구조의 변형은 종종 도입을 수행하는 목적 중의 하나이지만, 비-천연 아미노산을 폴리펩티드 내로 도입시키는 것이 상동적인 천연 아미노산 폴리펩티드에 비하여 그와 같은 폴리펩티드의 활성 및(또는) 3차 구조에 거의 영향을 미치지 않을 수도 있다. 따라서, 비-천연 아미노산 폴리펩티드, 비-천연 아미노산 폴리펩티드를 포함하는 조성물, 및 비-천연 아미노산 폴리펩티드 조성물을 제조하는 방법, 그와 같은 폴리펩티드 및 폴리펩티드 조성물의 정제, 단리 및 특성화 방법, 그와 같은 폴리펩티드 및 폴리펩티드 조성물을 사용하는 방법이 본 발명의 범주 내에 속한다. 또한, 본 명세서에 기재된 비-천연 아미노산 폴리펩티드는 다른 폴리펩티드 (예를 들어, 비-천연 아미노산 폴리펩티드 또는 천연 아미노산 폴리펩티드)에 리게이션될 수 있다.
본 명세서에 기재된 비-천연 아미노산 폴리펩티드는 생합성적으로 또는 비-생합성적으로 생산될 수 있다. "생합성적으로"란 어떠한 방법이 폴리뉴클레오티드, 코돈, tRNA 및 리보조옴 중 적어도 하나의 성분을 사용하는 것을 포함하여, 세포 또는 비-세포 번역계를 사용하는 것을 이른다. "비-생합성적으로"란 어떠한 방법이 번역계를 이용하지 않는 것을 이르며, 이와 같은 방법은 다시 고체 상태 펩티드 합성법을 이용하는 방법, 고상 펩티드 합성 방법, 적어도 하나의 효소를 사용하는 방법, 적어도 하나의 효소도 사용하지 않는 방법으로 나누일 수 있으며, 추가로 이들 방법의 소분류는 중첩될 수 있으며, 다수의 방법이 이들 소분류된 방법을 조합하여 이용한다.
본 명세서에 기재된 방법, 조성물, 전략 및 기술은 특정 유형, 부류 또는 족의 폴리펩티드 또는 단백질에 국한되는 것이 아니다. 사실상, 어느 폴리펩티드나 본 명세서에 기재된 비-천연 아미노산을 적어도 하나 포함할 수 있다. 예를 들어, 폴리펩티드는 하기 군으로부터 선택되는 치료 단백질에 상동적일 수 있다: 알파-1 안티트립신, 안지오스타틴, 항용혈 인자, 항체, 항체 단편, 아포리포단백질, 아포단백질, 심방 나트륨이뇨 인자, 심방 나트륨이뇨 폴리펩티드, 심방 펩티드, C-X-C 케모카인, T39765, NAP-2, ENA-78, gro-a, gro-b, gro-c, IP-10, GCP-2, NAP-4, SDF-1, PF4, MIG, 칼시토닌, c-키트 리간드, 사이토카인, CC 케모카인, 단핵구 화학유인 단백질-1, 단핵구 화학유인 단백질-2, 단핵구 화학유인 단백질-3, 단핵구 소염 단백질-1 알파, 단핵구 소염 단백질-1 베타, RANTES, 1309, R83915, R91733, HCC1, T58847, D31065, T64262, CD40, CD40 리간드, c-키트 리간드, 콜라겐, 콜로니 자극인자 (CSF), 보체 인자 5a, 보체 억제제, 보체 수용체 1, 사이토카인, 상피 호중구 활성화 펩티드-78, MIP-16, MCP-1, 표피 성장 인자 (EGF), 상피 호중구 활성화 펩티드, 에리쓰로포이에틴 (EPO), 박리 독소, 인자 IX, 인자 VII, 인자 VIII, 인자 X, 섬유아세포 성장 인자 (FGF), 피브리노겐, 피브로넥틴, 4중 나선 번들 단백질, G-CSF, glp-1, GM-CSF, 글루코세레브로시다제, 고나도트로핀, 성장 인자, 성장 인자 수용체, grf, 헷지호그 단백질, 헤모글로빈, 간세포 성장 인자 (hGF), 히루딘, 인간 성장 인자 (hGH), 인간 혈청 알부민, ICAM-1, ICAM-1 수용체, LFA-1, LFA-1 수용체, 인슐린, 인슐린-유사 성장 인자 (IGF), IGF-I, IGF-II, 인터페론 (IFN), IFN-알파, IFN-베타, IFN-감마, 인터루킨 (IL), IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, 각질 세포 성장 인자 (KGF), 락토페린, 백혈병 억제 인자, 루시퍼라제, 뉴투린, 호중구 억제 인자 (NIF), 온코스타틴 M, 골원성 단백질, 종양유전자 생성물, 파라시토닌, 부갑상선 호르몬, PD-ECSF, PDGF, 펩티드 호르몬, 플레이오트로핀, 단백질 A, 단백질 G, pth, 발열성 외독소 A, 발열성 외독소 B, 발열성 외독소 C, pyy, 릴랙신, 레닌, SCF, 생합성 소 단백질, 가용성 보체 수용체 I, 가용성 I-CAM 1, 가용성 인터루킨 수용체, 가용성 TNF 수용체, 소마토메딘, 소마토스타틴, 소마토트로핀, 스트렙토키나제, 슈퍼항원, 스타필로코커스 내독소, SEA, SEB, SECl, SEC2, SEC3, SED, SEE, 스테로이드 호르몬 수용체, 슈퍼옥시드 디스뮤타제, 독성 쇼크 증후 독소, 티모신 알파 1, 조직 플라스미노겐 활성화제, 종양 성장 인자 (TGF), 종양 괴사 인자, 종양 괴사 인자 알파, 종양 괴사 인자 베타, 종양 괴사 인자 수용체 (TNFR), VLA-4 단백질, VCAM-1 단백질, 혈관 내피 성장 인자 (VEGF), 유로키나제, mos, ras, raf, met, ρ53, tat, fos, myc, jun, myb, rel, 에스트로겐 수용체, 프로게스테론 수용체, 테스토스테론 수용체, 알도스테론 수용체, LDL 수용체 및 코르티코스테론. 관련 또는 또 다른 실시태양에서, 비-천연 아미노산 폴리펩티드는 또한 성장 호르몬 슈퍼유전자 패밀리에 속하는 임의의 폴리펩티드 구성원에 상동적일 수 있다.
비-천연 아미노산 폴리펩티드는 본 명세서에 기재된 바와 같이 추가로 변형되거나, 더 이상의 변형없이 사용될 수 있다. 비-천연 아미노산을 폴리펩티드 내로 도입시키는 것은 여러 가지 목적, 비제한적인 예로는, 단백질 구조 및(또는) 기능에 있어서의 변화를 테일러링하거나, 크기, 산성도, 친핵성, 수소 결합, 소수성 결합, 프로테아제 표적 위치의 근접성을 변화시키거나, 잔기로 표적화 (예를 들어, 폴리펩티드 어레이 포함)하는데 사용될 수 있다. 비-천연 아미노산을 포함하는 폴리펩티드는 증가되거나 완전히 새로운 촉매 또는 생물리학적 특성을 가질 수 있다. 예를 들어, 비-천연 아미노산을 폴리펩티드 내로 혼입시킴으로써 다음과 같은 특성을 변형시킬 수 있다: 독성, 생분포성, 구조적 특성, 분광분석 특성, 화학적 및(또는) 광화학적 특성, 촉매 능력, 반감기 (비제한적인 예로서, 혈청 반감기), 다른 분자와 공유 또는 비공유결합적으로 반응하는 능력 등.
적어도 하나의 비-천연 아미노산을 포함하는 폴리펩티드를 함유하는 조성물은, 비제한적인 예로서 치료제, 진단제, 촉매효소, 산업용 효소, 결합 단백질 (항체 포함), 및 단백질 구조 및 기능 등에 관한 연구에 유용하다[참조: Dougherty, (2000) Unnatural Amino Acids as Probes of Protein Structure and Function, Current Opinion in Chemical Biology, 4:645-652].
또한, 폴리펩티드의 비-천연 아미노산의 측쇄는 폴리펩티드에 다양한 종류의 추가 관능기를 제공할 수 있으며; 폴리펩티드의 비-천연 아미노산의 측쇄 부분은 하기와 같은 물질 중 어느 것이나 포함할 수 있다: 표지, 염료, 중합체, 수용성 중합체, 폴리에틸렌 글리콜 유도체, 광가교결합제, 세포독성 화합물, 약물, 친화도 표지, 광친화도 표지, 반응성 화합물, 수지, 제2의 단백질 또는 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 유사체, 항체 또는 항체 단편, 금속 킬레이트제, 조인자, 지방산, 탄수화물, 폴리뉴클레오티드, DNA, RNA, 안티센스 폴리뉴클레오티드, 사카라이드, 수용성 덴드리머, 시클로덱스트린, 생물질, 나노입자, 스핀 표지, 형광물질, 금속-함유 잔기, 방사성 잔기, 신규 관능기, 다른 분자와 공유적으로 또는 비공유적으로 상호작용하는 기, 포토케이지드 잔기, 화학선 여기가능한 잔기, 리간드, 광이성화성 잔기, 비오틴, 비오틴 유사체, 중량급 원자를 포함하는 잔기, 화학적으로 절단가능한 기, 광-절단가능한 기, 신장된 측쇄, 탄소-결합 당, 산화환원 활성제, 아미노 티오산, 독성 잔기, 동위원소 표지된 잔기, 생물리학적 프로브, 인광 기, 화학발광 기, 전자밀도가 높은 기, 자성 기, 인터캘레이팅 기, 발색단, 에너지 전달기, 생물학적 활성제, 검출가능한 표지, 소분자, 억제성 리보핵산, 방사성 핵종, 중성자 포획제, 비오틴 유도체, 콴텀 도트, 나노트랜스미터, 라디오트랜스미터, 아브자임, 활성화된 복합 활성화제, 바이러스, 보조제, 아글리칸, 알러간, 안지오스타틴, 항호르몬, 항산화제, 압타머, 가이드 RNA, 사포닌, 셔틀 벡터, 거대 분자, 미모토우프, 수용체, 역상 미셀 및 그들의 조합.
하나의 측면에서, 조성물은 비제한적으로는 적어도 둘, 적어도 셋, 적어도 넷, 적어도 다섯, 적어도 여섯, 적어도 일곱, 적어도 여덟, 적어도 아홉 또는 적어도 열 또는 그 이상의 수를 포함하여, 적어도 하나 이상의 비-천연 아미노산을 갖는 적어도 하나의 폴리펩티드를 포함한다. 그와 같은 천연 아미노산은 동일하거나 상이할 수 있다. 또한, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 또는 그 이상의 상이하거나 동일한 비-천연 아미노산을 포함하는 폴리펩티드 내에 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 또는 그 이상의 상이한 위치가 존재할 수 있다. 또 다른 측면에서, 조성물은 폴리펩티드 내에 존재하는 특정 아미노산의 총수 보다는 작지만 적어도 하나의 아미노산이 비-천연 아미노산으로 치환된 폴리펩티드를 포함한다. 둘 이상의 비-천연 아미노산을 포함하는 폴리펩티드에 있어서, 비-천연 아미노산은 동일하거나 상이할 수 있다 (예를 들어, 폴리펩티드가 둘 이상의 상이한 유형의 아미노산을 포함하거나, 두 개의 동일한 아미노산을 포함할 수 있다). 둘 이상의 비-천연 아미노산을 포함하는 폴리펩티드에 있어서, 비-천연 아미노산은 동일하거나 상이하거나 또는 적어도 하나가 상이한 아미노산이고 다른 비-천연 아미노산은 동일한 것인 다수의 아미노산의 조합일 수 있다.
본 명세서에 기재된 비-천연 아미노산 폴리펩티드의 실시태양이 고상 펩티드 합성법(예를 들어, 고체 수지 상에서)에 의하거나, 용액상 펩티드 합성법에 의하거나, 및(또는) 효소의 도움없이 화학적으로 합성될 수 있을지라도, 본 명세서에 기재된 비-천연 아미노산 폴리펩티드의 다른 실시태양은 세포막, 세포 추출물 또는 용해물 계를 통해, 또는 원핵 또는 진핵 세포의 세포기구를 사용한 생체내 계를 통하여 합성하는 것이다. 또 다른 또는 추가의 실시태양에서, 본 명세서에 기재된 비-천연 아미노산 폴리펩티드의 주요 특징 중의 하나는 그들이 리보조옴을 통하여 합성될 수 있다는 것이다. 본 명세서에 기재된 비-천연 아미노산의 또 다른 또는 추가의 실시태양은, 비-천연 아미노산 폴리펩티드가, 비제한적인 예로는, 고상 수지와 무효소, 리보조옴 첨가 및(또는) 생체내 계 이용의 조합을 포함하는 조합 방법으로 합성될 수 있다는 것이다.
리보조옴 및(또는) 생체내 계를 통한 비-천연 아미노산 폴리펩티드 합성은 고체 수지 또는 효소 비사용법에 비하여 현저한 잇점 및 특징을 갖는다. 이와 같은 잇점 및 특징은 상이한 불순물 프로파일을 포함한다: 즉, 리보조옴 및(또는) 생체내 계를 이용하는 계는 숙주세포 단백질, 막 부분 및 지질을 포함하는 사용된 생물학적 계로부터 유래하는 불순물을 함유할 것인 반면, 고체 수지 및(또는) 효소 비사용법을 이용하는 계는 합성 과정에 사용된 유기 용매, 보호기, 수지 물질, 커플링제 및 기타 화학 물질을 함유할 것이다. 또한, 리보조옴 및(또는) 생체내 계를 이용하여 합성된 비-천연 아미노산 폴리펩티드의 동위원소 패턴은 세포에 사용된 공급물의 동위원소 패턴을 반영하는 반면, 고체 수지 및(또는) 효소 비사용법을 이용하여 합성된 비-천연 아미노산 폴리펩티드의 동위원소 패턴은 합성에 사용된 아미노산의 동위원소 패턴을 반영할 것이다. 또한, 리보조옴 및(또는) 생체내 계를 이용하여 합성된 비-천연 아미노산 폴리펩티드는 아미노산의 D-이성체가 실질적으로 없고/거나 내부 시스테인 아미노산을 폴리펩티드의 구조내로 쉽게 혼입시킬 수 있고/거나 내부 아미노산 결실 폴리펩티드는 거의 제공하지 않을 것이다. 한편, 고체 수지 및(또는) 효소 비사용법을 이용하여 합성된 비-천연 아미노산 폴리펩티드는 아미노산의 D-이성체 함량이 보다 높을 것이고, 내부 시스테인 아미노산 함량이 보다 낮을 것이고/거나, 내부 아미노산 결실 폴리펩티드 퍼센트가 보다 높을 것이다. 또한, 당업자는 리보조옴 및(또는) 생체내 계를 이용하여 합성된 비-천연 아미노산 폴리펩티드와 고체 수지 및(또는) 효소 비사용법을 이용하여 합성된 비-천연 아미노산 폴리펩티드를 구별할 수 있을 것이다.
VII. 핵산 및 올리고뉴클레오티드를 포함하는 조성물 및 방법
A. 사용되는 일반적 재조합 핵산 방법
본 명세서에 기재된 방법 및 조성물의 여러 실시태양에서, 목적하는 폴리펩티드 (예를 들어, GH 폴리펩티드)를 코딩하는 핵산은 단리, 클로닝 및 종종 재조합법을 이용하여 변화된다. 그와 같은 실시태양은 단백질 발현을 위하여, 또는 변이체, 유도체, 발현 카세트, 또는 폴리펩티드로부터 유도된 다른 서열의 생성 중에 사용된다. 일부 실시태양에서, 폴리펩티드를 코딩하는 서열은 이종 프로모터에 작동가능하게 연결되어 있다.
비-천연 아미노산 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 패런트 폴리펩티드의 아미노산 서열에 기초하여 합성되고, 이어서 관련 아미노산 잔기를 도입(즉, 혼입 또는 치환) 또는 제거(즉, 결실 또는 치환)시키기 위해 서열을 변화시킬 수 있다. 뉴클레오티드 서열은 종래의 방법에 따라 위치-유도 변이 유발에 의해 쉽게 변형될 수 있다. 다른 방법으로서, 화학적 합성에 의해 제조될 수 있으며, 예를 들어, 올리고뉴클레오티드 합성기를 사용하여, 목적하는 폴리펩티드 아미노산 서열에 따라 올리고뉴클레오티드를 설계하고, 바람직하게는 재조합 폴리펩티드가 생산될 숙주세포에 의해 선호되는 코돈을 선택하여 제조할 수 있다. 예를 들어, 목적하는 폴리펩티드의 일부를 코딩하는 수 개의 작은 올리고뉴클레오티드를 합성하고, 이들을 PCR, 리게이션 또는 리게이션 연쇄 반응에 의해 통합할 수 있다[참조: Barany, et al, Proc. Natl. Acad. ScL 88: 189-193 (1991); 미합중국 특허 제6,521,427호, 전문이 본 명세서에 포함됨].
본 명세서에 기재된 비-천연 아미노산 방법 및 조성물은 재조합 유전학 분야에 통상적인 기술을 이용한다. 본 명세서에 기재된 방법 및 조성물에 사용될 일반적 방법을 개시한 기초적 문헌으로서, 문헌[Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual (3rd ed. 2001); Kriegler, Gene Transfer and Expression: A Laboratory Manual (1990); and Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., eds., 1994)] 등이 있다.
분자 생물학적 기술을 기재한 일반적인 문헌으로는, 문헌[Berger and Kimmel, Guide to Molecular Cloning Techniques, Methods in Enzymology volume 152 Academic Press, Inc., San Diego, CA (Berger); Sambrook et al., Molecular Cloning - A Laboratory Manual (2nd Ed.), Vol. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, 1989 ("Sambrook") and Current Protocols in Molecular Biology, F.M. Ausubel et al., eds., Current Protocols, a joint venture between Greene Publishing Associates, Inc. and John Wiley & Sons, Inc., (supplemented through 1999) ("Ausubel")] 등이 있다. 이들 문헌은 변이유발, 벡터, 프로모터의 사용 및, 예컨대, 비-천연 아미노산을 포함하는 단백질의 생산을 위한 셀렉터 코돈을 포함하는 유전자 또는 폴리뉴클레오티드의 생성, 오르쏘고날 tRNA, 오르쏘고날 신써타제 및 그들의 쌍에 관련된 많은 다른 문제를 기술하고 있다.
여러 종류의 변이유발이 본 명세서에 기재된 비-천연 아미노산 방법 및 조성물에 여러 가지 목적을 위하여, 예컨대, 신규 신써타제 또는 tRNA를 생산하기 위하여, tRNA 분자, 신써타제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, tRNA 라이브러리를 변이시키기 위하여, 신써타제 라이브러리를 생산하기 위하여, 셀렉터 코돈을 생산하기 위하여, 목적하는 단백질 또는 폴리펩티드 중 비-천연 아미노산을 코딩하는 셀렉터 코돈을 삽입하기 위하여 사용된다. 그와 같은 방법은 비제한적인 예로서 위치-유도된 변이유발, 무작위 점 변이유발, 상동 재조합, DNA 셔플링 또는 기타 반복적 변이유발법, 키메라 작제, 우라실-함유 주형을 사용한 변이유발, 올리고뉴클레오티드-유도 변이유발, 포스포로티오에이트-변형 DNA 변이유발, 갭을 낸 듀플렉스 DNA 등을 사용한 변이유발 또는 이들의 이들의 조합을 포함한다. 추가의 적절한 방법은 점 미스매치 복구, 복구 결함 숙주를 사용한 변이유발, 제한-선택 및 제한-정제, 결실 변이유발, 총 유전자 합성에 의한 변이유발, 이중가닥 붕괴 복구 등을 포함한다. 비제한적인 예로서 키메라 작제를 포함하는 변이유발법이 또한 본 명세서에 기재된 비-천연 아미노산 방법 및 조성물에 포함된다. 하나의 실시태양에서, 변이유발은 천연 분자 또는 변형, 변화 또는 변이된 천연 분자에 관한, 예컨대, 서열 비교, 물리적 특성 또는 결정 구조 등의 공지된 정보에 의해 가이딩될 수 있다.
본 명세서에 기재된 문헌 및 실시예는 이들 및 다른 관련 과정을 기술하고 있다. 추가의 정보는 하기 문헌 및 그에 인용된 참고 문헌에서 찾아볼 수 있다[참조: Ling et al., Approaches to DNA mutagenesis: an overview, Anal Biochem. 254(2): 157-178 (1997); Dale et al., Oligonucleotide-directed random mutagenesis using the phosphorothioate method, Methods MoI. Biol. 57:369-374 (1996); Smith, In vitro mutagenesis, Ann. Rev. Genet. 19:423-462(1985); Botstein & Shortle, Strategies and applications of in vitro mutagenesis, Science 229:1193-1201(1985); Carter, Site-directed mutagenesis, Biochem. J. 237:1-7 (1986); Kunkel, The efficiency of oligonucleotide directed mutagenesis, in Nucleic Acids & Molecular Biology (Eckstein, F. and Lilley, D.MJ. eds., Springer Verlag, Berlin)) (1987); Kunkel, Rapid and efficient site-specific mutagenesis without phenotypic selection, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:488-492 (1985); Kunkel et al., Rapid and efficient site-specific mutagenesis without phenotypic selection, Methods in Enzymol. 154, 367-382 (1987); Bass et al., Mutant Trp repressors with new DNA-binding specificities, Science 242:240-245 (1988); Methods in Enzymol. 100: 468-500 (1983); Methods in Enzymol. 154: 329-350 (1987); Zoller & Smith, Oligonucleotide-directed mutagenesis using Ml 3-derived vectors: an efficient and general procedure for the production of point mutations in any DNA fragment, Nucleic Acids Res. 10:6487-6500 (1982); Zoller & Smith, Oligonucleotide-directed mutagenesis of DNA fragments clotted into M13 vectors, Methods in Enzymol. 100:468-500 (1983); Zoller & Smith, Oligonucleotide- directed mutagenesis: a simple method using two oligonucleotide primers and a single-stranded DNA template, Methods in Enzymol. 154:329-350 (1987); Taylor et al., The use of phosphorothioate-modified DNA in restriction enzyme reactions to prepare nicked DNA, Nucl. Acids Res. 13: 8749-8764 (1985); Taylor et al., The rapid generation of oligonucleotide-directed mutations at high fi-equency using phosphorothioate-modified DNA, Nucl. Acids Res. 13: 8765-8785 (1985); Nakamaye & Eckstein, Inhibition of restriction endonuclease Nd I cleavage by phosphorothioate groups and its application to oligonucleotide-directed mutagenesis, Nucl. Acids Res. 14: 9679- 9698 (1986); Sayers et al., 5 '-3 ' Exonucleases in phosphorothioate-based oligonucleotide-directed mutagenesis, Nucl. Acids Res. 16:791-802 (1988); Sayers et al., Strand specific cleavage of phosphorothioate-containing DNA by reaction with restriction endonucleases in the presence ofethidium bromide, (1988) Nucl. Acids Res. 16: 803-814; Kramer et al., The gapped duplex DNA approach to oligonucleotide-directed mutation construction, Nucl. Acids Res. 12: 9441-9456 (1984); Kramer & Fritz Oligonucleotide-directed construction of mutations via gapped duplex DNA, Methods in Enzymol. 154:350-367 (1987); Kramer et al., Improved enzymatic in vitro reactions in the gapped duplex DNA approach to oligonucleotide-directed construction of mutations, Nucl. Acids Res. 16: 7207 (1988); Fritz et al., Oligonucleotide-directed construction of mutations: a gapped duplex DNA procedure without enzymatic reactions in vitro, Nucl. Acids Res. 16: 6987-6999 (1988); Kramer et al., Point Mismatch Repair, Cell 38:879-887 (1984); Carter et al., Improved oligonucleotide site-directed mutagenesis using M13 vectors, Nucl. Acids Res. 13: 4431-4443 (1985); Carter, Improved oligonucleotide-directed mutagenesis using Ml 3 vectors, Methods in Enzymol. 154: 382-403 (1987); Eghtedarzadeh & Henikoff, Use of oligonucleotides to generate large deletions, Nucl. Acids Res. 14: 5115 (1986); Wells et al., Importance of hydrogen-bond formation in stabilizing the transition state of subtilisin, Phil. Trans. R. Soc. Lond. A 317: 415-423 (1986); Nambiar et al., Total synthesis and cloning of a gene coding for the ribonuclease S protein, Science 223: 1299-1301 (1984); Sakmar and Khorana, Total synthesis and expression of a gene for the a-subunit of bovine rod outer segment guanine nucleotide-binding protein (transducin), Nucl. Acids Res. 14: 6361-6372 (1988); Wells et al., Cassette mutagenesis: an efficient method for generation of multiple mutations at defined sites, Gene 34:315-323 (1985); Grundstr?m et al., Oligonucleotide-directed mutagenesis by microscale 'shot-gun' gene synthesis, Nucl. Acids Res. 13: 3305-3316 (1985); Mandecki, Oligonucleotide-directed double-strand break repair in plasmids of Escherichia coli: a method for site-specific mutagenesis, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83:7177-7181 (1986); Arnold, Protein engineering for unusual environments, Current Opinion in Biotechnology 4:450-455 (1993); Sieber, et al., Nature Biotechnology, 19:456- 460 (2001). W. P. C. Stemmer, Nature 370, 389-91 (1994); and, I. A. Lorimer, I. Pastan, Nucleic Acids Res. 23, 3067-8 (1995)]. 많은 방법에 관한 보다 상세한 사항은 각종 변이유발법과 더불어 문제를 해결하는 유용한 방법을 기재하고 있는 문헌[Methods in Enzymology Volume 154]에서 찾아볼 수 있다.
본 명세서에 기재된 방법 및 조성물은 또한 진핵 숙주세포, 비-진핵 숙주세포, 및 비-천연 아미노산을 오르쏘고날 tRNA/RS 쌍을 통해 생체내 도입시키는 유기체를 사용하는 것을 포함한다. 숙주세포는 본 명세서에 기재된 폴리펩티드에 상응하는 폴리뉴클레오티드 또는 본 명세서에 기재된 폴리펩티드에 상응하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 구조물, 예컨대, 본 명세서에 기재된 폴리펩티드에 상응하는 클로닝 벡터 또는 발현 벡터 등의 벡터로 유전학적으로 엔지니어링(비제한적인 예로서, 형질전환, 형질도입 또는 형질감염)된다. 또한, 오르쏘고날 tRNA, 오르쏘고날 tRNA 신써타제 및 유전자 단백질에 대한 코딩 영역은 목적하는 숙주세포에서 기능하는 유전자 발현 조절 요소에 작동가능하게 연결된다. 벡터는, 예를 들어, 플라스미드, 코스미드, 파아지, 세균, 바이러스, 네이키드 폴리뉴클레오티드, 또는 컨쥬게이트된 폴리뉴클레오티드일 수 있다. 벡터는 전기천공 (Fromm et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 5824 (1985)), 바이러스 벡터에 의한 감염, 작은 비드 또는 입자의 매트릭스 내 또는 표면 상에 핵산을 갖는 소립자의 고속 충격 침투법(Klein et al., Nature 327, 70-73 (1987)) 등을 포함하는 표준 방법에 의해 세포 및(또는) 미생물 내로 도입될 수 있다.
엔지니어링된 숙주세포는 스크리닝 단계, 프로모터의 활성화 또는 형질전환체의 선택과 같은 활동에 적절하도록 개질된 통상의 영양 배지에서 배양될 수 있다. 이들 세포는 임의로는 트랜스제닉 유기체 내로 배양될 수 있다. 세포 단리 및 배양 (예를 들어, 추후의 핵산 단리)에 관한 다른 유용한 문헌으로는 문헌[Freshney (1994) Culture of Animal Cells, a Manual of Basic Technique, third edition, Wiley- Liss, New York; Payne et al. (1992) Plant Cell and Tissue Culture in Liquid Systems John Wiley & Sons, Inc. New York, NY; Gamborg and Phillips (eds) (1995) Plant Cell, Tissue and Organ Culture; Fundamental Methods Springer Lab Manual, Springer- Verlag (Berlin Heidelberg New York) and Atlas and Parks (eds) The Handbook of Microbiological Media (1993) CRC Press, Boca Raton, FL] 및 이들에 인용된 문헌들이 있다.
표적 핵산을 세포 내로 도입하는 몇몇 공지된 방법을 이용할 수 있는데, 이들 중 어느 것이나 본 명세서에 기재된 방법 및 조성물에 사용될 수 있다. 이들 방법은 수용 세포를 DNA를 함유하는 세균 원형질체와 융합, 전기 천공, 돌출 충격, 바이러스 벡터로 감염 (상세히 논의됨) 등을 포함한다. 세균 세포는 본 명세서에 기재된 폴리펩티드에 상응하는 DNA 구조물을 함유하는 플라스미드를 증폭시키는데 사용될 수 있다. 세균은 로그상까지 성장되며, 세균 내의 플라스미드를 당업계에 공지된 각종 방법으로 단리할 수 있다 (예를 들어, 상기 Sambrook의 문헌 참조). 또한, 세균으로부터 플라스미드를 정제하는 다양한 키트가 시판되고 있다 (Pharmacia Biotech에서 제조, 판매되는 이지프렙 (EasyPrep™), 플렉시프렙 (FlexiPrep™); Stratagene에서 제조, 판매되는 스트라타클린(StrataClean™); 및 Qiagen에서 제조, 판매되는 퀴아프렙 (QIAprep™)). 단리되고 정제된 플라스미드는 다른 플라스미드를 생산하기 위하여 조작되거나, 세포를 감염시는데 사용되거나 또는 유기체를 감염시키기 위하여 관련 벡터 내로 혼입시키는데 사용된다. 전형적인 벡터는 전사 및 번역 종결 서열, 전사 및 번역 개시 서열, 및 특정 표적 핵산의 발현을 조절하는데 유용한 프로모터를 함유한다. 벡터는 임의로는 적어도 하나의 독립적인 종결 서열을 함유하는 총괄적 발현 카세트, 진핵 세포 또는 원핵 세포, 또는 둘 다에서 카세트의 복제를 허용하는 서열 (비제한적으로 셔틀 벡터 포함), 및 원핵 및 진핵 세포계 모두를 위한 선택 마커를 포함한다. 벡터는 원핵 세포, 진핵 세포, 또는 바람직하게는 둘 다에서 복제 및 통합되기에 적절하다[참조: Gillam & Smith, Gene 8:81 (1979); Roberts, et al, Nature, 328:731 (1987); Schneider, E., et al, Protein Expr. Purif. 6(l):10-14 (1995); Ausubel, Sambrook, Berger, 상기 문헌 모두]. 클로닝에 유용한 세균 및 박테리오파아지는 예컨대, ATCC에 의해 발행되는 카탈로그[The ATCC Catalogue of bacteria and bacteriophage (1992) Gherna et al. (eds) published by the ATCC]에 제공되어 있다. 서열 분석 및 클로닝을 위한 추가의 기본적 과정 및 분자 생물학 및 근간이 되는 기술적 고려 사상이 문헌[Watson et al, (1992) Recombinant DNA Second Edition Scientific American Books, NY]에 기재되어 있다. 또한, 실질적으로 어떠한 핵산(표준형 또는 비-표준형이던 간에 실제로 어떠한 표지된 핵산이라도)이라도 여러 상업적 공급처[예를 들어, the Midland Certified Reagent Company (Midland, TX mcrc.com), The Great American Gene Company (Ramona, CA available on the World Wide Web at genco.com), ExpressGen Inc. (Chicago, IL available on the World Wide Web at expressgen.com), Operon Technologies Inc. (Alameda, CA)]로부터 맞춤 또는 표준 주문될 수 있다.
B. 셀렉터 코돈
본 명세서에 기재된 방법 및 조성물에 포함되는 셀렉터 코돈은 단백질 생합성 기구의 유전적 코돈 프레임워크를 확장한다. 셀렉터 코돈은 비제한적인 예로서 독특한 3염기 코돈, 암버 코돈(UAG) 또는 오팔 코돈 (UGA) 등의 중지 코돈과 같은 넌센스 코돈, 비자연 코돈, 4 이상의 염기 코돈, 희귀 코돈 등을 포함한다. 목적하는 유전자 또는 폴리뉴클레오티드 내로 도입될 수 있는 광범위한 수의 셀렉터 코돈이 있으며, 목적하는 폴리펩티드의 적어도 일부를 코딩하는 단일 폴리뉴클레오티드 안에 비제한적인 예로서 하나 이상, 둘 이상, 셋 이상, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 그 이상이 있을 수 있다.
하나의 실시태양에서, 방법은 하나 이상의 비-천연 아미노산을 생체내 도입하기 위하여 중지 코돈인 셀렉터 코돈을 사용하는 것을 포함한다. 예를 들어, UAG를 포함하는 중지 코돈을 인식하지 않는 O-tRNA가 생산되고, 목적하는 비-천연 아미노산으로 O-RS에 의해 아미노아실화된다. 이와 같은 O-tRNA는 천연 숙주세포의 아미노아실-tRNA 신써타제에 의해 인식되지 않는다. UAG와 같은 중지 코돈을 목적하는 폴리펩티드의 목적하는 위치에 도입시키기 위해 종래의 위치-유도 변이유발을 이용할 수 있다[참조: Sayers, J.R., et al. (1988), 5', 3' Exonuclease in phosphorothioate-based oligoniicleotide-directed mutagenesis. Nucleic Acids Res, 16(3):791-802]. O-RS, O-tRNA 및 목적하는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산을 생체내 합할 때, 비-천연 아미노산이 UAG 코돈에 반응하여 도입됨으로써 특정 위치에 비-천연 아미노산을 함유하는 폴리펩티드가 만들어진다.
생체내에서 비-천연 아미노산의 도입은 진핵 숙주세포의 상당한 교란이 없이도 수행될 수 있다. 예를 들어, UAG 코돈의 억제 효율이 O-tRNA(비제한적인 예로서, 암버 서프레서 tRNA) 및 진핵 방출 인자 (예를 들어, eRF와 같은, 중지 코돈에 결합하여 성장하는 펩티드의 방출을 개시함) 사이의 경쟁에 따라 달라지기 때문에, 억제 효율은 O-tRheNA 및(또는) 서프레서 tRNA의 발현 수준을 증가시키는 등의 방법으로 조절될 수 있다.
셀렉터 코돈은 또한 4, 5, 6 또는 그 이상의 염기 코돈을 포함하여, 4개 이상의 염기 코돈을 포함한다. 사염기 코돈의 비제한적인 예는 AGGA, CUAG, UAGA, CCCU 등을 포함한다.. 오염기 코돈의 비제한적인 예는 AGGAC, CCCCU, CCCUC, CUAGA, CUACU, UAGGC 등을 포함한다. 본 명세서에 기재된 방법 및 조성물의 특징은 프레임쉬프트 억제에 기초한 확장된 코돈을 사용한다는 것이다. 4개 또는 그 이상의 염기 코돈은 하나 또는 다수의 비-천연 아미노산을 동일한 단백질 내로 도입할 수 있다. 예를 들어, 안티코돈 루프, 적어도 8 내지 10개 뉴클레오티드의 안티코돈 루프를 갖는 특정 프레임쉬프트 서프레서 tRNA와 같은 변이된 O-tRNA의 존재하에, 4개 또는 5개 염기 코돈은 단일 아미노산으로 읽힌다. 다른 실시태양에서, 안티코돈 루프는 적어도 4-염기 코돈, 적어도 5-염기 코돈 또는 적어도 6 또는 그 이상의 염기 코돈을 탈코드화할 수 있다. 가능한 256 가지 4 염기 코돈이 존재하므로, 다수의 비-천연 아미노산이 4 또는 그 이상의 염기 코돈을 사용하여 동일한 세포 내에서 코딩될 수 있다[참조: Anderson et al., (2002) Exploring the Limits of Codon and Anticodon Size, Chemistry and Biology, 9:237-244; Magliery, (2001) Expanding the Genetic Code: Selection of Efficient Suppressors of Four-base Codons and Identification of "Shifty" Four-base Codons with a Library Approach in Escherichia coli, J. MoI. Biol. 307: 755-769].
예를 들어, 4 염기 코돈은 시험관내 생합성 방법을 사용하여 비-천연 아미노산을 단백질 내로 도입하는데 사용되어 왔다[참조: Ma et al., (1993) Biochemistry, 32:7939-7945; and Hohsaka et al., (1999) J. Am. Chem. Soc, 121:34-40]. CGGG 및 AGGU는 두 개의 화학적으로 아실화된 프레임쉬프트 서프레서 tRNA로 시험관내에서 스트렙타비딘 내로 2-나프틸알라닌 및 리신의 JNBD 유도체를 동시에 삽입하는데 사용되었다[참조: Hohsaka et al., (1999) J. Am. Chem. Soc, 121:12194-12195]. 생체내 연구에서, 무어(Moore) 등은 NCUA 안티코돈(N은 U, A, G, 또는 C일 수 있음)을 갖는 tRNALeu 유도체가 UAGN 코돈을 억제하는 능력을 검사하고, 4중 UAGA가 NCUA 안티코돈을 갖는 tRNALeutRNALeu로 0 또는 -1 프레임에서는 탈코드가 거의 일어나지 않으면서 13 내지 26 %의 효율로 탈코드될 수 있다는 것을 밝혀냈다[참조: Moore et al., (2000) J. MoI. Biol., 298:195-205]. 하나의 실시태양에서, 희귀 코돈 또는 넌센스 코돈에 기초한 확장된 코돈은 본 명세서에 기재된 방법 및 조성물에 사용될 수 있으며, 다른 원하지 않는 위치에서 미스센스 리드 쓰루(readthrough)와 프레임쉬프트 억제를 감소시킨다.
주어진 계에서, 셀렉터 코돈은 또한 천연적 3염기 코돈 중의 하나를 포함할 수 있는데, 이때 내생계는 천연적 3염기 코돈을 이용하지 않거나 거의 이용하지 않는다. 예를 들어, 이는 천연적 3염기 코돈을 인식하는 tRNA가 결여된 계 및(또는) 3염기 코돈이 희귀 코돈인 계를 포함한다.
셀렉터 코돈은 임의로는 비천연 염기 쌍을 포함한다. 이들 비천연 염기쌍은 기존의 유전적 알파벳을 더욱 확장시킨다. 하나의 추가의 염기쌍은 삼중 코돈의 수를 64에서 125로 증가시킨다. 제3 염기쌍의 특징은 안정하고 선택적인 염기쌍 형성, 폴리머라제에 의해 높은 신뢰도로 DNA 내로 효율적으로 효소적 삽입됨, 인접한 비천연 염기쌍 합성 후에도 효율적으로 계속되는 프라이머 확장을 포함한다. 본 명세서에 기재된 방법 및 조성물에 적절한 비천연 염기쌍은 문헌[Hirao, et al., (2002) An unnatural base pair for incorporating amino acid analogues into protein, Nature Biotechnology, 20:177-182; Wu, Y., et. al. (2002) J. Am. Chem. Soc. 124:14626-14630]에 기재되어 있으며, 다른 관련 문헌이 본 명세서에 열거되어 있다.
생체내 이용을 위하여, 비천연 뉴클레오시드는 막투과성이고, 포스포릴화되어 상응하는 트리포스페이트를 형성한다. 또한, 증가된 유전 정보는 안정하고, 세포 효소에 의해 파괴되지 않는다. 베너(Benner) 등에 의한 종래의 노력은 캐논식 왓슨-크릭(Watson-Crick) 쌍과는 다른 수소 결합 패턴을 이용한 것이었으며, 가장 주목할 만한 예는 iso-C:iso-G 쌍이다[참조: Switzer et al., (1989) J. Am. Chem. Soc, 111:8322-8322; and Piccirilli et al., (1990) Nature, 343:33-37; Kool, (2000) Curr. Opin. Chem. Biol., 4:602-608]. 이들 염기는 일반적으로 어느 정도 천연 염기와 미스페어링되며, 효소적으로 복제될 수 없다. 쿨 (Kool)과 공동 연구자들은 염기 간의 소수성 팩킹 상호작용이 수소 결합을 대체하여 염기쌍을 형성하도록 할 수 있는 것을 입증하였다[참조: Kool, (2000) Curr. Opin. Chem. Biol., 4:602-608; and Guckian and Kool, (1998) Angew. Chem. Int. Ed. Engl., 36(24): 2825-2828]. 상기 모든 요건을 충족하는 비천연 염기쌍을 개발할 노력으로, 슐츠(Schultz), 로메스버그(Romesberg) 및 공동 연구자들은 일련의 비천연 소수성 염기를 체계적으로 합성하고 연구하였다. PICS:PICS 자기-쌍은 천연 염기쌍보다 안정한 것으로 나타났으며, 이. 콜라이 DNA 폴리머라제 I의 클레나우(Klenow) 단편 (KF)에 의해 DNA로 효율적으로 도입될 수 있다[참조: McMinn et al., (1999) J. Am. Chem. Soc, 121:11585-11586; and Ogawa et al., (2000) J. Am. Chem. Soc, 122:3274-3278]. 3MN:3MN 자기-쌍은 KF에 의해 생물학적 기능에 충분한 효율 및 선택성으로 합성될 수 있다[참조: Ogawa et al., (2000) J. Am. Chem. Soc, 122:8803-8804]. 그러나. 이들 두 염기들은 더 이상의 복제에 대하여 종결제로 작용한다. PICS 자기 쌍을 복제하는데 사용될 수 있는 변이 DNA 폴리머라제가 최근 개발되었다. 또한, 7AI 자기 쌍이 복제될 수 있다[참조: Tae et al., (2001) J. Am. Chem. Soc, 123:7439-7440]. 신규 금속 염기쌍인 Dipic:Py가 개발되었으며, 이는 Cu(II)과 결합할 때 안정한 쌍을 형성한다[참조: Meggers et al., (2000) J. Am. Chem. Soc, 122: 10714-10715]. 확장된 코돈 및 비천연 코돈은 본래 천연 코돈에 오르쏘고날하기 때문에, 본 명세서에 기재된 비-천연 아미노산 방법은 그들에 대한 오르쏘고날 tRNA를 생성하기 위하여 이 특성을 이용할 수 있다.
목적하는 폴리펩티드에 비-천연 아미노산을 도입시키기 위하여 번역 바이패싱계를 사용할 수 있다. 번역 바이패싱계에서, 큰 서열은 유전자 내로 도입되기는 하나 단백질로 번역되지는 않는다. 서열은 리보조옴이 그 서열을 건너 뛰고 삽입 위치 하류에서 다시 번역을 시작하도록 유도하는 신호로서 작용하는 구조를 함유한다.
특정 실시태양에서, 본 명세서에 기재된 방법 및 조성물에서 목적하는 단백질 또는 폴리펩티드 (또는 그의 부분)은 핵산에 의해 코딩된다. 핵산은 적어도 하나의 셀렉터 코돈, 적어도 두 개의 셀렉터 코돈, 적어도 세 개의 셀렉터 코돈, 적어도 네 개의 셀렉터 코돈, 적어도 다섯 개의 셀렉터 코돈, 적어도 여섯 개의 셀렉터 코돈, 적어도 일곱 개의 셀렉터 코돈, 적어도 여덟 개의 셀렉터 코돈, 적어도 아홉 개의 셀렉터 코돈, 적어도 열 개 또는 그 이상의 셀렉터 코돈을 포함한다.
목적하는 단백질 또는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자는 당업계에 잘 알려져 있으며, 본 명세서에서 "변이유발 및 다른 분자생물학적 기술"이라는 제목하에 기술된, 예를 들어, 비-천연 아미노산을 도입시키기 위해 하나 이상의 셀렉터 코돈을 포함하는 방법을 사용하여 변이시킬 수 있다. 예를 들어, 관심있는 단백질에 대한 핵산을 변이시켜 하나 이상의 셀렉터 코돈을 함유하게 함으로써, 하나 이상의 비-천연 아미노산이 도입되게 한다. 본 명세서에 기재된 방법 및 조성물은 그와 같은 임의의 변이체, 예를 들어, 적어도 하나의 비-천연 아미노산을 포함하는 변이체 형태를 포함한다. 마찬가지로, 본 명세서에 기재된 방법 및 조성물은 상응하는 핵산, 즉 하나 이상의 비-천연 아미노산을 생체내 도입하는 것을 가능하게 하는 하나 이상의 셀렉터 코돈을 포함하는 핵산을 포함한다.
비제한적인 예로서 GH 폴리펩티드와 같은 목적하는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자는 폴리펩티드 내의 임의의 목적하는 위치에 시스테인을 혼입하도록 쉽게 변이될 수 있다. 시스테인은 반응성 분자, 수용성 중합체, 단백질 또는 각종 다른 분자를 관심있는 단백질 상으로 도입시키는데 널리 사용된다. 폴리펩티드의 목적하는 위치에 시스테인을 도입시키는 방법은 당업계에 잘 알려져 있으며, 예로서 전문이 본 명세서에 포함되는 미합중국 특허 제6,608,183호 및 표준 변이유발 기술이 있다. 그와 같은 시스테인 도입 및 이용 기술은 본 명세서에 기재된 비-천연 아미노산 도입 및 이용 기술과 함께 사용될 수 있다.
VIII. 비-천연 아미노산을 포함하는 폴리펩티드의 생체내 생산
간편하게, 이 섹션에 기재된 비-천연 아미노산-함유 폴리펩티드의 생체내 생산은 특정 예를 들어 총괄적으로 기재한 것이다. 그러나, 이 섹션에 기재된 비-천연 아미노산-함유 폴리펩티드의 생체내 생산은 단지 이 섹션에서 제공된 총괄적 기술 사항 또는 특정 예에 국한되는 것이 아니라, 본 명세서, 청구 범위 및 도면에 기재된 화학식 I - XVIII, XXX - XXXIV (A 및 B) 및 XXXX - XXXXIII의 범주에 드는 화합물, 그들의 범주에 드는 하위 화학식의 화합물 또는 특정 개별적 화합물 모두에 균등하게 적용되는 것이다.
본 명세서에 기재된 폴리펩티드는 천연적 계에서 코딩되지 않는 아미노산을 부가 또는 치환하기 위하여 개질된 tRNA 및 tRNA 신써타제를 사용하여 생체내에서 생산될 수 있다.
천연적 계에서 코딩되지 않는 아미노산을 사용하는 tRNA 및 tRNA 신써타제를 생성하는 방법은 전문이 본 명세서에 포함되는 미합중국 출원 공개 2003/0082575 (출원 번호 제10/126,927호) 및 2003/0108885 (출원 번호 제10/126,931호)에 기재되어 있다. 이들 방법은 번역계에 내생적인 신써타제 및 tRNA와 독립적으로 기능하는(따라서, 때때로 "오르쏘고날"하다고 함) 번역 기구를 생성하는 것을 포함하며; 폴리뉴클레오티드는 상응하는 DNA로부터 전사된 mRNA일 수 있거나, mRNA는 RNA 바이러스 벡터로부터 유래될 수 있고, 또한 폴리뉴클레오티드는 비-천연 아미노산을 위한 예정된 도입 위치에 상응하는 셀렉터 코돈을 포함한다. 번역계는 추가로 상기 셀렉터 코돈을 특이적으로 인식하는 tRNA 및 적절한 경우에는 비-천연 아미노산을 포함하며, 또 다른 실시태양에서, 비-천연 아미노산은 아미노아실화되어 있다. 비-천연 아미노산은 본 명세서에 기재된 화학식 I - XVIII, XXX - XXXIV (A 및 B) 및 XXXX - XXXXIII 중 어느 하나의 구조를 갖는 것을 포함한다. 또 다른 또는 추가의 실시태양에서, 번역계는 tRNA에 특이적인 아미노아실 신써타제를 포함하며, 또 다른 또는 추가의 실시태양에서, 번역계는 오르쏘고날 tRNA 및 오르쏘고날 아미노아실 tRNA 신써타제를 포함한다. 또 다른 또는 추가의 실시태양에서, 번역계는 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 플라스미드 (예를 들어, DNA 형태로), 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 게놈 DNA (예를 들어, DNA 형태로), 상기 폴리뉴클레오티드가 통합된 게놈 DNA (또 다른 실시태양에서, 통합은 안정한 것임) 중 적어도 하나를 포함한다. 번역계의 또 다른 또는 추가의 실시태양에서, 셀렉터 코돈은 암버 코돈, 오커 코돈, 오팔 코돈, 독특한 코돈, 희귀 코돈, 비천연 코돈, 5염기 코돈, 4염기 코돈으로 구성되는 군으로부터 선택된다. 번역계의 또 다른 또는 추가의 실시태양에서, tRNA는 서프레서 tRNA이다. 또 다른 또는 추가의 실시태양에서, 비-천연 아미노산 폴리펩티드는 리보조옴에 의해 합성된다.
또 다른 또는 추가의 실시태양에서, 번역계는 오르쏘고날 tRNA (O-tRNA) 및 오르쏘고날 아미노아실 tRNA 신써타제(O-RS)를 포함한다. 전형적으로, O-RS는 번역계 중 우선적으로 O-tRNA를 적어도 하나의 비-천연 아미노산으로 아미노아실화시키고, O-tRNA는 계 중의 다른 tRNA에 의해 인식되지 않는 적어도 하나의 셀렉터 코돈을 인식한다. 번역계는 따라서 코딩된 셀렉터 코돈에 대응하여 계에서 생산되는 폴리펩티드 내로 비-천연 아미노산을 삽입하게 되며, 그에 의해 코딩된 폴리펩티드 내의 한 위치를 비-천연 아미노산으로 치환하는 것이다.
특정 합성 아미노산을 폴리펩티드 내로 삽입하기 위한 다양한 오르쏘고날 tRNA 및 아미노아실 tRNA 신써타제가 기술되었으며, 이들은 일반적으로 본 명세서에 기재된 비-천연 아미노산 폴리펩티드를 생산하는데 적절하다. 예를 들어, 케토 특이적 O-tRNA/아미노아실-tRNA 신써타제가 문헌[Wang, L., et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100(l):56-61 (2003) and Zhang, Z. et al., Biochem. 42(22):6735-6746 (2003)]에 기재되어 있다. 예시적인 O-RS 또는 그의 부분은 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되며, 각각의 전문이 본 명세서에 포함되는 미합중국 특허 출원 공개 2003/0082575 및 2003/0108885에 기재된 아미노산 서열을 포함한다. O-RS와 함께 사용하기 위한 상응하는 O-tRNA 분자는 전문이 본 명세서에 포함되는 미합중국 출원 공개 2003/0082575 (출원 제10/126,927호) 및 2003/0108885 (출원 제10/126,931호)에 기재되어 있다. 또한 전문이 본 명세서에 포함되는 문헌[Mehl et al. in J. Am. Chem. Soc. 2003; 125:935-939 and Santoro et al. Nature Biotechnology 2002 Oct; 20: 1044-1048]은 스크리닝 방법 및 p-아미노페닐알라닌을 폴리펩티드 내로 삽입하기 위한 아미노아실 tRNA 신써타제 및 tRNA 분자를 논의하고 있다.
본 명세서에 기재된 방법에 사용하기에 적절한 예시적인 O-tRNA 서열은 비제한적인 예로서, 전문이 본 명세서에 포함되는 미합중국 출원 공개 2003/0108885 (출원 제10/126,931호)에 개시된 서열 번호 1-3을 포함한다. 특정 비-천연 아미노산에 특이적인 다른 O-tRNA/아미노아실-tRNA 신써타제 쌍의 예는 전문이 본 명세서에 포함되는 미합중국 출원 공개 2003/0082575 (출원 제10/126,927호)에 기재되어 있다. 에스. 세레비지에(S. cerevisiae)에서 케토- 및 아지드-함유 아미노산을 둘다 삽입하는 O-RS 및 O-tRNA는 문헌[Chin, J. W., et al, Science 301:964-967 (2003)]에 기재되어 있다.
O-tRNA/아미노아실-tRNA 신써타제의 사용은 비-천연 아미노산을 코딩하는 특이적 코돈의 선택을 포함한다. 어느 코돈이라도 사용할 수 있지만, O-tRNA/아미노아실-tRNA 신써타제가 발현되는 세포에서 거의 또는 전혀 사용되지 않는 코돈을 선택하는 것이 바람직하다. 그와 같은 코돈의 예는 중지 코돈(암버, 오커, 오팔)과 같은 넌센스 코돈, 4 또는 그 이상의 염기 코돈, 또는 거의 또는 전혀 사용되지 않는 다른 천연 코돈을 포함한다.
특이적 셀렉터 코돈은 폴리뉴클레오티드 코딩 서열의 적절한 위치에 당업계에 공지된 변이유발법, 예컨대, 위치-특이적 변이유발, 카세트 변이유발 및 제한-선택 변이유발법에 의해 도입될 수 있다.
비-천연 아미노산을 도입시키는데 사용될 수 있는 O-RS, O-tRNA 및 O-tRNA/O-RS 쌍과 같은, 단백질 생합성 기구의 성분을 생산하는 방법은 문헌[Wang, L., et al, Science 292: 498-500 (2001); Chin, J. W., et al, J. Am. Chetn. Soc. 124:9026-9027 (2002); Zhang, Z. et al, Biochemistry 42: 6735-6746 (2003)]에 기재되어 있다. 비-천연 아미노산의 생체내 도입을 위한 방법 및 조성물은 전문이 본 명세서에 포함되는 미합중국 출원 공개 2003/0082575 (출원 제10/126,927호)에 기재되어 있다. 유기체의 생체내 번역계에 사용하기 위한 오르쏘고날 tRNA-tRNA 신써타제 쌍은 전문이 본 명세서에 포함되는 미합중국 출원 공개 2003/0082575 (출원 제10/126,927호) 및 2003/0108885 (출원 제10/126,931호)에 기재되어 있다. 또한, 전문이 본 명세서에 포함되는, "케토 아미노산의 단백질 내로의 위치-특이적 도입"이라는 제하의 PCT 공개 WO 04/035743는 케토 아미노산을 도입시키기 위한 오르쏘고날 RS 및 tRNA 쌍을 기재하고 있다. 전문이 본 명세서에 포함되는 "진핵 생물 유전 코드의 확장"이라는 제하의 PCT 공개 WO 04/094593는 진핵 세포 중에서 비천연적으로 코딩되는 아미노산을 도입하기 위한 오르쏘고날 RS 및 tRNA 쌍을 기재하고 있다.
적어도 하나의 재조합 오르쏘고날 아미노아실-tRNA 신써타제(O-RS)를 제조하는 방법은 (a) 원핵 생물 (비제한적인 예로서, 메타노코커스 자나쉬 (Methanococcus jannaschii), 메타노박테리움 써모오토트로피쿰 (Methanobacterium thermoautotrophicum), 할로박테리움 (Halobacterium), 에스케리치아 콜라이 (Escherichia coli), 에이. 풀지더스 (A. fulgidus), 피. 퓨리오서스 (P. furiosus), 피. 호리코시 (P. horikoshii), 에이. 페르닉스 (A. pernix), 티. 써모필러스 (T. thermophilus) 등) 또는 진핵 생물과 같은 제1 생물체로부터의 적어도 하나의 아미노아실-tRNA 신써타제 (RS)로부터 유도된 (임의로는 변이체) RS의 라이브러리를 생성하는 단계; (b) 비-천연 아미노산 및 천연 아미노산의 존재하에 오르쏘고날 tRNA (O-tRNA)를 아미노아실화하는 종류를 찾기 위해 (임의로는 변이체) RS의 라이브러리를 선택 및 스크리닝함으로써, 활성 (임의로는 변이체) RS의 풀을 제공하는 단계; 및(또는) (c) 비-천연 아미노산의 부재하에 O-tRNA를 우선적으로 아미노아실화하는 활성 RS (비제한적인 예로서 변이 RS 포함)를 찾기 위해 풀을 선택 (임의로는 음성 선택을 통하여)함으로써, O-tRNA를 비-천연 아미노산으로 우선적으로 아미노아실화하는 적어도 하나의 재조합 O-RS를 제공하는 단계를 포함한다.
하나의 실시태양에서, RS는 불활성 RS이다. 불활성 RS는 활성 RS를 변이시켜 생성할 수 있다. 예를 들어, 불활성 RS는 적어도 약 1, 적어도 약 2, 적어도 약 3, 적어도 약 4, 적어도 약 5, 적어도 약 6, 또는 적어도 약 10 또는 그 이상의 아미노산을, 비제한적인 예로서 알라닌을 포함하는 다른 아미노산으로 변이시켜 생성할 수 있다.
변이 RS의 라이브러리는 당업계 공지된 여러 기술, 비제한적인 예로는, 단백질 3차원 RS 구조에 기초한 합리적인 설계, 무작위 또는 합리적 설계 기술에서 RS 뉴클레오티드의 변이유발을 포함하는 기술을 사용하여 생성될 수 있다. 단지 예를 들어, 변이 RS는 위치-특이적 변이유발, 무작위 변이유발, 다양성 생성 재조합 변이유발 및 키메라 작제 및 합리적 설계 및 본 명세서에 기재되거나 당업계에 공지된 방법으로 생성될 수 있다.
하나의 실시태양에서, 활성적인, 예를 들어, 비-천연 아미노산 및 천연 아미노산의 존재하에 오르쏘고날 tRNA (O-tRNA)를 아미노아실화하는 것을 찾아내기 위해 RS (임의로는 변이 RS)의 라이브러리를 선택 및(또는) 스크리닝 하는 것은, 예를 들어, 항생 물질 내성 유전자와 같은 양성 선택 또는 스크리닝 마커 (이들은 암버 코돈, 오커 코돈, 오팔 코돈, 독특한 코돈, 희귀 코돈, 비천연 코돈, 5염기 코돈, 4염기 코돈과 같은 적어도 하나의 셀렉터 코돈을 포함함) 및 RS (임의로는 변이 RS)를 다수의 세포에 도입하는 단계; 다수의 세포를 선택제의 존재하에 생육시키는 단계; 양성 선택 또는 스크리닝 마커 중의 적어도 하나의 셀렉터 코돈을 억제함으로써 선택 및(또는) 스크리닝제의 존재하에 생존하는 (또는 특이적 반응을 보이는) 세포를 찾아냄으로써 활성 (임의로는 변이체) RS의 풀을 함유하는 양성 선택된 세포의 서브셋을 제공하는 것을 포함한다. 임의로는, 선택 및(또는) 스크리닝제의 농도는 변화될 수 있다.
하나의 측면에서, 양성 선택 마커는 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라제 (CAT) 유전자이고, 셀렉터 코돈은 CAT 유전자 중 암버 중지 코돈이다. 임의로는, 양성 선택 마커는 β-락타마제 유전자이고, 셀렉터 코돈은 β-락타마제 유전자 중의 암버 중지 코돈이다. 또 다른 측면에서, 양성 선택 마커는 형광 또는 발광 스크리닝 마커 또는 친화도-기초 스크리닝 마커 (비제한적인 예로서 세포 표면 마커)를 포함한다.
하나의 실시태양에서, 비-천연 아미노산의 부재하에 오르쏘고날 tRNA (O-tRNA)를 우선적으로 아미노아실화하는 것을 찾아내기 위해 RS (임의로는 변이 RS)의 라이브러리를 음성적으로 선택 및(또는) 스크리닝 하는 것은, 예를 들어, 적어도 하나의 셀렉터 코돈을 포함하는 음성 선택 또는 스크리닝 마커 (클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라제 (CAT) 유전자와 같은 항생제 내성 유전자를 포함)를 양성 선택 및(또는) 스크리닝으로부터의 활성 (임의로는 변이체) RS의 풀과 함께 제2의 생물체의 다수의 세포에 도입하는 단계; 비-천연 아미노산으로 보충된 제1의 배지 및 선택 또는 스크리닝제의 존재하에는 생존하거나 특이적 반응을 보이나, 비-천연 아미노산으로 보충되지 않은 제2의 배지 및 선택 또는 스크리닝제의 존재하에서는 생존하거나 특이적 반응을 보이지 않는 세포를 찾아냄으로써 적어도 하나의 재조합 O-RS를 갖는 생존 또는 스크리닝된 세포를 제공하는 것을 포함한다. 예를 들어, CAT 확인 프로토콜은 임의로는 적절한 O-RS 재조합체를 결정하는데 있어서 양성 선택 및(또는) 음성 스크리닝으로 작용한다. 예를 들어, 클론의 풀이 하나 이상의 비-천연 아미노산의 존재 또는 부재하에 CAT (적어도 하나의 셀렉터 코돈을 포함함)를 함유하는 성장 플레이트 상에서 임의로 복제된다. 비-천연 아미노산을 함유하는 플레이트 상에서 독점적으로 성장하는 콜로니는 재조합 O-RS를 함유하는 것으로 여겨진다. 하나의 측면에서, 선택제 및(또는) 스크리닝제의 농도는 다양하다. 일부 측면에서, 제1 및 제2 유기체는 다르다. 따라서, 제1 및 제2 유기체는 임의로는 원핵 생물, 진핵 생물, 포유류, 이. 콜라이, 진균, 효모, 시원세균, 진정세균, 식물, 곤충, 원생생물 등을 포함한다. 다른 실시태양에서, 스크리닝 마커는 형광 또는 발광 스크리닝 마커 또는 친화도 기초 스크리닝 마커를 포함한다.
또 다른 실시태양에서, 활성 (임의로는 변이된) RS를 찾기 위해 풀을 스크리닝 또는 선택 (비제한적인 예로서 음성 선택 포함)하는 것은, 양성 선택 단계 (b)로부터의 활성 변이 RS의 풀을 단리하는 단계; 적어도 하나의 셀렉터 코돈을 포함하는 음성 선택 또는 스크리닝 마커 (비제한적인 예로서, 독성 마커 유전자, 리보뉴클레아제 바나제 유전자) 및 활성 (임의로는 변이) RS의 풀을 제2 유기체의 다수의 세포에 도입하는 단계; 비-천연 아미노산으로 보충되지 않은 제1의 배지 중에서는 생존하거나 특이적 반응을 보이나, 비-천연 아미노산으로 보충된 제2의 배지 중에서는 생존하거나 특이적 반응을 보이지 않는 세포를 찾아냄으로써 비-천연 아미노산에 대해 특이적인 적어도 하나의 재조합 O-RS를 갖는 생존 또는 스크리닝된 세포를 제공하는 것을 포함한다. 하나의 측면에서, 적어도 하나의 셀렉터 코돈은 약 둘 이상의 셀렉터 코돈을 포함한다. 그와 같은 실시태양은 임의로는 적어도 하나의 셀렉터 코돈이 둘 이상의 셀렉터 코돈을 포함하는 경우, 및 제1 및 제2 유기체가 상이한 경우(비제한적인 예로서, 임의로는 원핵 생물, 진핵 생물, 포유류, 이. 콜라이, 진균, 효모, 시원세균, 진정 세균, 식물, 곤충, 원생생물 등임)를 포함할 수 있다. 또한, 몇몇 측면은 음성 선택 마커가 리보뉴클레아제 바나제 유전자(적어도 하나의 셀렉터 코돈 포함)를 포함하는 경우를 포함한다. 다른 측면은 스크리닝 마커가 형광 또는 발광 스크리닝 마커 또는 친화도 기초 스크리닝 마커를 포함하는 경우를 포함한다. 본 명세서의 실시태양에서, 스크리닝 및(또는) 선택은 임의로는 스크리닝 및(또는) 선택 엄격도를 변화시키는 것을 포함한다.
또 다른 실시태양에서, 적어도 하나의 재조합 오르쏘고날 아미노아실-tRNA 신써타제(O-RS)를 생산하는 방법은 또한 (d) 적어도 하나의 재조합 O-RS를 단리하는 단계; (e) 단리된 적어도 하나의 재조합 O-RS로부터 유도된 제2의 O-RS (임의로는 변이된) 셋을 생성하는 단계; 및 (f) O-tRNA를 우선적으로 아미노아실화할 수 있는 능력을 포함하는 변이된 O-RS가 얻어질 때 까지 단계 (b) 및 (c)를 반복하는 단계를 포함한다. 임의로는, 단계 (d) 내지 (f)가, 예컨대, 적어도 약 2회 이상 반복된다. 하나의 측면에서, 적어도 하나의 재조합 O-RS로부터 유도된 제2의 O-RS (임의로는 변이된) 셋은 변이유발, 비제한적인 예로서, 랜덤 변이유발, 위치-특이적 변이유발, 재조합 또는 이들의 조합에 의해 이루어질 수 있다.
상술한 방법에서 양성 선택 및(또는) 스크리닝 단계 (b), 음성 선택 및(또는) 스크리닝 단계(c) 또는 양성 및 음성 선택 및(또는) 스크리닝 단계 (b) 및 (c)를 포함하는 선택 및(또는) 스크리닝 단계의 엄격도는 임의로는 선택 및(또는) 스크리닝 엄격도를 변화시키는 것을 포함한다. 다른 실시태양에서, 양성 선택 및(또는) 스크리닝 단계 (b), 음성 선택 및(또는) 스크리닝 단계(c) 또는 양성 및 음성 선택 및(또는) 스크리닝 단계 (b) 및 (c)는 리포터를 사용하는 것을 포함하며, 이때 리포터는 형광-활성화 세포 분류 (FACS) 또는 발광에 의해 검출된다. 임의로는 리포터는 세표 표면 상에 또는 파아지 디스플레이상에 표시되며, 비-천연 아미노산 또는 그의 유사체와 관련이 있는 친화도 또는 촉매 활성에 기초하여 선택된다. 하나의 실시태양에서, 변이된 신써타제는 세표 표면 상에 또는 파아지 디스플레이상에 표시된다.
재조합 오르쏘고날 tRNA (O-tRNA)의 생산 방법은, 비제한적으로, (a) 서프레서 tRNA와 같은, 제1 유기체로부터의 적어도 하나의 tRNA로부터 유도된 변이된 tRNA의 아미노산를 생성하는 단계; (b) 제1 유기체로부터의 RS의 부재하에 제2 유기체로부터의 아미노아실-fRNA 신써타제 (RS)에 의해 아미노아실화되는(임의로 변이된) tRNA를 찾기 위해 라이브러리를 선택 (음성 선택 포함) 또는 스크리닝함으로써 (임의로는 변이된) tRNA의 풀을 제공하는 단계; (c) 도입된 오르쏘고날 RS (O-RS)에 의해 아미노아실화되는 것을 찾기 위해 (임의로는 변이된) tRNA의 풀을 선택 또는 스크리닝함으로써, 셀렉터 코돈을 인식하며 제2 유기체로부터의 RS에 의해서는 효율적으로 인식되지 않으며, O-RS에 의해 우선적으로 아미노아실화되는 적절한 재조합 O-tRNA를 제공하는 단계를 포함한다. 일부 실시태양에서, 적어도 하나의 tRNA는 서프레서 tRNA이고/거나 천연 및(또는) 비천연 염기의 독특한 3염기 코돈을 포함하거나, 넌센스 코돈, 희귀 코돈, 비천연 코돈, 적어도 4개 염기를 포함하는 코돈, 암버 코돈, 오커 코돈 또는 오팔 코돈이다. 하나의 실시태양에서, 재조합 O-tRNA는 개선된 오르쏘고날 특성을 갖는다. 일부 실시태양에서, O-tRNA는 변형될 필요없이 제2 유기체로부터 제1 유기체로 입수된다. 다른 실시태양에서, 제1 및 제2 유기체는 동일하거나 상이할 수 있으며, 임의로는, 비제한적인 예로서, 원핵 생물(메타노코커스 자나쉬, 메타노박테리움 써모오토트로피쿰, 이. 콜라이, 할로박테리움 등), 진핵 생물, 포유류, 진균, 효모, 원시세균, 진정 세균, 식물, 곤충, 원생생물 등을 포함한다. 추가로, 재조합 tRNA는 임의로는 비-천연 아미노산으로 아미노아실화되며, 이 때 비-천연 아미노산은 천연적으로 또는 유전적 조작을 통하여 생체내에서 생합성된다. 비-천연 아미노산은 임의로는 적어도 제1 및 제2 유기체의 성장 배지에 가해지며, 이 때 비-천연 아미노산은 비-천연 아미노산 폴리펩티드내로 혼입되기에 충분한 정도의 세포내 농도를 달성할 수 있다.
하나의 측면에서, 아미노아실-tRNA 신써타제에 의해 아미노아실화되는 (임의로는 변이된) tRNA를 찾기 위해 (임의로는 변이된) tRNA의 라이브러리를 선택(비제한적인 예로서 음성 선택 포함) 또는 스크리닝 하는 것(단계 (b))은 적어도 하나의 셀렉터 코돈을 포함하는 독성 마커 유전자(또는 독성 또는 생육정지제를 생산하는 유전자 또는 적어도 하나의 셀렉터 코돈을 포함하는 유기체에 필수적인 유전자) 및 (임의로는 변이된) tRNA의 라이브러리를 제2 유기체로부터의 다수의 세포에 가하는 단계; 적어도 하나의 오르쏘고날 tRNA 또는 비기능적 tRNA를 포함하는 (임의로는 변이된) tRNA의 풀을 함유하는 생존 세포를 선택하는 단계를 포함한다. 예를 들어, 생존 세포는 비교 비율 세포 밀도 분석을 사용하여 선택될 수 있다.
또 다른 측면에서, 독성 마커 유전자는 둘 이상의 셀렉터 코돈을 포함할 수 있다. 본 명세서에 기재된 방법의 또 다른 실시태양에서, 독성 마커 유전자는 적어도 하나의 암버 코돈을 포함하는 리보뉴클레아제 바나제 유전자이다. 임의로는, 리보뉴클레아제 바나제 유전자는 둘 이상의 암버 코돈을 포함할 수 있다.
하나의 실시태양에서, 도입된 오르쏘고날 RS (O-RS)에 의해 아미노아실화되는 (임의로는 변이된) tRNA를 찾기 위해 (임의로는 변이된) tRNA의 풀을 선택 또는 스크리닝 하는 것은 약물 내성 유전자 (암버 코돈과 같은 적어도 하나의 셀렉터 코돈을 포함하는 β-락타마제 유전자 포함) 또는 유기체에 필수적인 유전자, 또는 독성제를 탈독시키는 유전자를 O-RS와 함께, 및 (임의로는 변이된) tRNA의 풀을 제2 유기체로부터의 다수의 세포에 가하는 단계; 및 항생제와 같은 선택제 또는 스크리닝제의 존재하에 성장된 생존 또는 스크리닝된 세포를 찾아냄으로써 O-RS에 의해 아미노아실화되고, 적어도 하나의 셀렉터 코돈에 반응하여 아미노산을 양성 마커 유전자에 의해 코딩되는 번역 생성물 내로 삽입하는 적어도 하나의 재조합 tRNA를 포함하는 세포의 풀을 제공하는 단계를 포함한다. 다른 실시태양에서, 선택제 및(또는) 스크리닝제의 농도는 변화된다.
특이적 O-tRNA/O-RS 쌍을 생산하는 방법이 제공된다. 방법은 비제한적으로는, (a) 제1 유기체로부터의 적어도 하나의 tRNA로부터 유도된 변이된 tRNA를 생성하는 단계; (b) 제1 유기체로부터의 RS의 부재하에 제2 유기체로부터의 아미노아실-tRNA 신서타제(RS)에 의해 아미노아실화되는(임의로 변이된) tRNA를 찾기 위해 라이브러리를 선택(음성 선택 포함) 또는 스크리닝함으로써 tRNA (임의로는 변이된)의 풀을 제공하는 단계; (c) 도입된 오르쏘고날 RS (O-RS)에 의해 아미노아실화되는 것을 찾기 위해 tRNA (임의로는 변이된)의 풀을 선택 또는 스크리닝함으로써, 적어도 하나의 재조합 O-tRNA를 제공하는 단계를 포함한다. 적어도 하나의 재조합 O-tRNA는 셀렉터 코돈을 인식하며, 제2 유기체로부터의 RS에 의해 효율적으로 인식되지 않으며, O-RS에 의해 우선적으로 아미노아실화된다. 그 방법은 또한 (d) 제3 유기체로부터의 아미노아실-tRNA 신써타제 (RS)로부터 유도된 (임의로는 변이된)의 RS의 라이브러리를 생산하는 단계; 및 (e) 비-천연 아미노산 및 천연 아미노산의 존재하에 적어도 하나의 O-tRNA를 우선적으로 아미노아실화하는 것을 찾기 위해 변이 RS의 라이브러리를 선택 또는 스크리닝함으로써, 활성 (임의로는 변이) RS의 풀을 제공하는 단계; 및 (f) 비-천연 아미노산의 부재하에 적어도 하나의 재조합 O-tRNA를 우선적으로 아미노아실화하는 활성(임의로는 변이) RS를 찾기 위해 풀을 음성적으로 선택 또는 스크리닝함으로써, 비-천연 아미노산 및 적어도 하나의 재조합 O-tRNA에 특이적인 적어도 하나의 재조합 O-RS를 포함하는 적어도 하나의 0-tRNA/O-RS 쌍을 제공하는 단계를 포함한다. 본 명세서에 기재된 방법에 의해 생산되는 특이적 0-tRNA/O-RS 쌍은 본 명세서에 기재된 범주 및 방법 내에 있다. 예를 들어, 특이적 O-tRNA/0-RS 쌍은 비제한적인 예로서 mutRNATyr-SS12TyrRS 쌍과 같은 mutRNATyr-mutTyrRS 쌍, mutRNALeu-mutLeuRS 쌍, mutRNAThr-mutThrRS 쌍, mutRNAGlu-mutGluRS 쌍 등을 포함한다. 또한, 그와 같은 방법은 제1 및 제3 유기체가 동일한 경우 (비제한적인 예로서, 메타노코커스 자나쉬)를 포함한다.
제2 유기체의 생체내 번역계에 사용하기 위한 오르쏘고날 tRNA-tRNA 쌍을 선택하는 방법도 또한 본 명세서에 기재된 방법에 포함된다. 그와 같은 방법은 비제한적으로는 제1 유기체로부터 유도 또는 단리된 마커 유전자, tRNA 및 아미노아실-tRNA 신써타제 (RS)를 제1 유기체로부터의 제1 세포 세트에 도입하고, 마커 유전자와 tRNA를 제2 유기체로부터의 중복 세포 세트에 도입하고, 중복 세포 세트에서는 생존하지 못하나 제1 세트에서 생존하는 세포를 선택하거나, 중복 세포 세트에서는 특이적인 스크리닝 반응을 보이지 않으나 제1 세트에서는 그와 같은 반응을 보이는 세포에 대해 스크리닝하며, 여기서, 제1 세트 및 중복 세트는 선택제 또는 스크리닝제의 존재하에 성장되며, 생존 또는 스크리닝된 세포는 제2 유기체의 생체내 번역계에 사용되는 오르쏘고날 tRNA-tRNA 신써타제 쌍을 포함한다. 하나의 실시태양에서, 비교와 선택 또는 스크리닝은 생체내 상보성 분석을 포함한다. 선택제 또는 스크리닝제의 농도는 변화될 수 있다.
본 명세서에 기재된 유기체는 각종 유기체 및 이들의 조합을 포함한다. 하나의 실시태양에서, 유기체는 임의로는 원핵 생물 (비제한적인 예로서, 메타노코커스 자나쉬 (Methanococcus jannaschii), 메타노박테리움 써모오토트로피쿰 (Methanobacterium thermoautotrophicum), 할로박테리움 (Halobacterium), 에스케리치아 콜라이 (Escherichia coli), 에이. 풀지더스 (A. fulgidus), 피. 퓨리오서스 (P. furiosus), 피. 호리코시 (P. horikoshii), 에이. 페르닉스 (A. pernix), 티. 써모필러스 (T. thermophilus) 등)이다. 다른 실시태양에서, 유기체는 진핵 생물, 비제한적인 예를 들면, 식물(예를 들어, 단자엽 또는 쌍자엽 식물과 같은 고등 식물), 남조류, 원생생물, 진균(예를 들어, 효모 등 포함), 동물(포유류, 곤충, 절지동물 등 포함) 등이다.
A. 비-진핵 생물 또는 진핵 생물에서의 발현
이 섹션에 개시된 기술은 비-진핵 생물 또는 진핵 생물에서 본 명세서에 기재된 비-천연 아미노산 폴리펩티드를 발현시키는데 적용될 수 있다.
클로닝된 폴리펩티드를 높은 수준으로 발현시키기 위해서, 목적하는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 전사를 유도하는 강한 프로모터, 전사/번역 종결 서열, 단백질을 코딩하는 핵산인 경우에는, 번역 개시를 위한 리보조옴 결합 부위를 함유하는 벡터 내로 서브클로닝하는 것이 전형적이다[참조: Sambrook et al. and Ausubel et al].
폴리펩티드 발현을 위한 세균 발현계는, 예를 들어, 이. 콜라이 (E. coli), 바실러스 (Bacillus) 종, 슈도모나스 플루오레센스 (Pseudomonas fluorescens), 슈도모나스 에어루기노사 (Pseudomonas aeruginosa), 슈도모나스 푸티다 (Pseudomonas putida) 및 살모넬라 (Salmonella) 등에서 이용할 수 있다[참조: Palva et al., Gene 22:229-235 (1983); Mosbach et al, Nature 302:543-545 (1983)]. 그와 같은 발현계 키트가 시판되고 있다. 포유류 세포, 효모 및 곤충 세포를 위한 진핵 생물 발현계 또한 시판되고 있다. 폴리펩티드를 발현하기 위하여 오르쏘고날 tRNA 및 아미노아실 tRNA 신써타제(본 명세서에 기재된 것들)가 사용되는 경우, 발현을 위한 숙주세포는 오르쏘고날 성분을 사용할 수 있는 능력에 기초하여 선택된다. 예시적인 숙주세포로는 그램 양성균, 예를 들어, 비. 브레비스 (B. brevis) 또는 비. 서브틸리스 (B. subtilis) 또는 스트렙토마이세스 (Streptomyces) 또는 그램 음성균, 예를 들어, 이. 콜라이 (E. coli) 또는 슈도모나스 플루오레세인 (Pseudomonas fluorescein), 슈도모나스 에어루기노사 (Pseudomonas aeruginosa), 슈도모나스 푸티다 (Pseudomonas putida), 또한 효모 및 기타 진핵 세포가 있다. O-tRNA/O-RS 쌍을 포함하는 세포가 본 명세서에 기재된 바와 같이 사용될 수 있다.
본 명세서에 기재된 바와 같은 진핵 숙주세포 또는 비-진핵 숙주세포는 비-천연 아미노산을 포함하는 폴리펩티드를 다량의 유용한 양으로 합성하는 능력을 제공한다. 하나의 측면에서, 조성물은 비-천연 아미노산을 포함하는 폴리펩티드를 적어도 10 ㎍, 적어도 50 ㎍, 적어도 75 ㎍, 적어도 100 ㎍, 적어도 200 ㎍, 적어도 250 ㎍, 적어도 500 ㎍, 적어도 1 mg, 적어도 10 mg, 적어도 100 mg, 적어도 1 g 또는 그 이상이 되는 양으로, 또는 생체내 폴리펩티드 생산 방법(재조합 단백질의 생산 및 정제에 관하여 본 명세서에서 상세히 기재되어 있음)으로 얻을 수 있는 양으로 포함한다. 또 다른 실시태양에서, 폴리펩티드는 임의로는 조성물 중에 예를 들어, 적어도 10 ㎍ 폴리펩티드/L, 적어도 50 ㎍ 폴리펩티드/L, 적어도 75 ㎍ 폴리펩티드/L, 적어도 100 ㎍ 폴리펩티드/L, 적어도 200 ㎍ 폴리펩티드/L, 적어도 250 ㎍ 폴리펩티드/L, 적어도 500 ㎍ 폴리펩티드/L, 적어도 1 mg 폴리펩티드/L, 또는 적어도 10 mg 폴리펩티드/L 또는 그 이상의 농도로, 예를 들어, 세포 용해물, 완충액, 약제학적 완충액, 또는 다른 액체 현탁액 (예를 들어, 약 1 nl 내지 약 100 L) 중에 존재한다. 비-천연 아미노산을 포함하는 단백질을 진핵 세포에서 다량(예컨대, 시험관내 번역과 같은 다른 방법에 의해 얻어지는 것보다 일반적으로 많은 양)으로 생산하는 것이 본 명세서에 기재된 방법, 조성물, 전략 및 기술의 특징이다.
본 명세서에 기재된 바와 같은 진핵 숙주세포 또는 비-진핵 숙주세포는 비-천연 아미노산을 포함하는 폴리펩티드를 다량의 유용한 양으로 생합성하는 능력을 제공한다. 예를 들어, 비-천연 아미노산을 포함하는 폴리펩티드는 세포 추출물, 세포 용해물, 배양 배지 또는 완충액 중에 적어도 10 μg/L, 적어도 50 μg/L, 적어도 75 μg/L, 적어도 100 μg/L, 적어도 200 μg/L, 적어도 250 μg/L, 또는 적어도 500 μg/L, 적어도 l mg/L, 적어도 2 mg/L, 적어도 3 mg/L, 적어도 4 mg/L, 적어도 5 mg/L, 적어도 6 mg/L, 적어도 7 mg/L, 적어도 8 mg/L, 적어도 9 mg/L, 적어도 10 mg/L, 적어도 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900 mg/L, 1 g/L, 5 g/L, 10 g/L 또는 그 이상의 농도로 생성될 수 있다.
1. 발현계, 배양 및 단리
이 섹션에 기재된 기술은 본 명세서에 기재된 비-천연 아미노산의 발현계, 배양 및 단리에 사용될 수 있다. 비-천연 아미노산 폴리펩티드는 다수의 적절한 발현계, 예를 들어, 효모, 곤충 세포, 포유류 세포 및 세균 등에서 발현될 수 있다. 발현계의 예에 대하여 본 명세서에 기재되어 있다.
효모 : 본 명세서에서 "효모"란 비-천연 아미노산 폴리펩티드를 코딩하는 유전자를 발현할 수 있는 각종 효모를 포함한다. 그와 같은 효모에는 비제한적인 예로서 유포자 효모(엔도마이세탈레스 (Endomycetales)), 담자 효모 및 불완전균 (블라스토마이세테스 (Blastomycetes)) 군에 속하는 효모가 있다. 유포자 효모는 두 개의 과, 즉 스페르모프쏘라세스 과 (Spermophthoraceae) 및 사카로마이세테스 과 (Saccharomycetaceae)로 분류된다. 후자는 4 개의 아과, 즉, 스키조사카로마이세스 아과 (예를 들어, 스키조사카로마이세스 속), 나드소니에스 (Nadsonioideae), 림포마이세스(Lipomycoideae) 및 사카로마이세스 아과 (Saccharomycoideae), 예를 들어, 피치아, 크루이베로마이세스, 및 사카로마이세스 속을 포함한다. 담자 효모는 류코스포리듐 (Leucosporidium), 로도스포리듐 (Rhodosporidium), 스포리디오볼러스 (Sporidiobolus), 필로바시디움 (Filobasidium) 및 필로바시디엘라 (Filobasidiella) 속을 포함한다. 불완전균 (블라스토마이세테스) 군에 속하는 효모는 두 개의 과, 즉 스포로볼로마이세스 과 (예를 들어, 스포로볼로마이세스 및 불레라 속) 및 크립토코커스 과 (예를 들어, 캔디다 속)으로 분류된다.
특정 실시태양에서, 피치아, 클루이베로마이세스, 사카로마이세스, 스키조사카로마이세스, 한세눌라, 토룰롭시스 및 캔디다 속에 속하는 종, 예를 들어, 피. 파스토리스 (P. pastoris), 피. 구일레리몬디 (P. guillerimondii), 에스. 세레비지 (S. cerevisiae), 에스. 칼스베르제네시스 (S. carlsbergensis), 에스. 디아스타티커스 (S. diastaticus), 에스. 도글라시 (S. douglasii), 에스. 키이베리 (S. khiyveri), 에스. 노르벤시스 (S, norbensis), 에스. 오비포르미스 (S. oviformis), 케이. 락티스 (K. lactis), 케이. 프래질리스 (K. fragilis), 씨. 알비칸스 (C. albicans), 씨. 말토사 (C. maltosa) 및 에이치. 폴리모파 (H. polymorpha)는 본 명세서에 기재된 방법, 조성물, 전략 및 기술에 사용된다.
비-천연 아미노산 폴리펩티드의 발현에 적절한 효모를 선택하는 것은 당업자 의 기술 수준에 포함된다. 발현을 위한 효모 숙주를 선택함에 있어서, 적절한 숙주는 양호한 분비능, 낮은 단백질 분해 활성, 전체적인 강건성을 갖는 것으로 나타난 것을 포함한다. 효모는 일반적으로으로 다양한 공급처[the Yeast Genetic Stock Center, Department of Biophysics and Medical Physics, University of California (Berkeley, CA), and the American Type Culture Collection ("ATCC") (Manassas, VA)]로부터 입수할 수 있다.
"효모 숙주 또는 "효모 숙주세포"란 재조합 벡터 또는 다른 전달 DNA의 수용체로서 사용될 수 있거나 사용되는 효모를 이른다. 이 용어는 재조합 벡터 또는 다른 전달 DNA를 수용한 본래의 효모 숙주세포의 자손도 포함한다. 단일 패런트 세포의 자손은 우연적인 또는 의도적인 변이에 의하여 형태 또는 게놈 또는 총 DNA 상보물에 있어서 패런트와 반드시 완전히 일치하는 것이 아님을 이해하여야 한다. 비-천연 아미노산 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 존재와 같은 관련 특성으로 특징지워지는 정도로 패런트 세포에 유사한 자손이 이 정의에 의해 의도되는 자손에 포함된다.
염색체외 레플리콘 또는 통합 벡터와 같은 발현 빛 형질전환 벡터가 많은 효모 숙주세포 내로 형질전환시키기 위해 개발되어 왔다. 예를 들어, 에스. 세레비지에 [Sikorski et al., GENETICS (1998) 112:19; Ito et al., J. BACTERIOL. (1983) 153:163; Hinnen et al., PROC. NATL. ACAD. Sci. USA (1978) 75:1929]; 씨. 알비칸스 [Kurtz et al., MOL. CELL. BIOL. (1986) 6:142); C. maltosa (Kunze et al., J. BASIC MICROBIOL. (1985) 25:141]; 에이치. 폴리모파 [Gleeson et al., J. GEN. MICROBIOL. (1986) 132:3459; Roggenkamp et al., MOL. GEN. GENET. (1986) 202:302]; 케이. 프래질리스 [Das et al., J. BACTERIOL. (1984) 158:1165); K. lactis (De Louvencourt et al., J. BACTERIOL. (1983) 154:737; Van den Berg et al., BIO/TECHNOLOGY (1990) 8:135]; 피. 구일레리몬디 [Kunze et al., J. BASIC MICROBIOL. (1985) 25: 141]; 피. 파스토리스 [미합중국 특허 제5,324,639호; 제4,929,555호; 및 제4,837,148호; Cregg et al., MOL. CELL. BIOL. (1985) 5:3376]; 스키조사카로마이세스 폼베 [Beach and Nurse, NATURE (1981) 300:706); 및 와이. 리폴리티카 (Y. lipolytica) [Davidow et al., CURR. GENET. (1985) 10:380 (1985); Gaillardin et al., CURR. GENET. (1985) 10:49]; 티. 니듈란스 [Ballance et al., BIOCHEM. BIOPHYS. RES. COMMUN. (1983) 112:284-89; Tilburn et al., GENE (1983) 26:205-221; and Yelton et al., PROC NATL. ACAD. SCI. USA (1984) 81:1470-74]; 에이. 니거 (A. niger) [Kelly and Hynes, EMBO J. (1985) 4:475-479]; 티. 레에지아 (EP 0 244 234); 및 필라멘트 진균, 예컨대, 뉴로스포라, 페니실리륨, 톨리포클라듐 (WO 91/00357)에 대하여 발현 벡터가 개발되었으며, 인용된 문헌의 전문이 본 명세서에 포함된다.
효모 벡터를 위한 조절 서열은, 예컨대, 알콜 데히드로게나제 (ADH) (EP 0 284 044); 에놀라제; 글루코키나제; 글루코스-6-포스페이트 이소머라제; 글리세르알데히드-3-포스페이트-데히드로게나제 (GAP 또는 GAPDH); 헥소키나제; 포스포프럭토키나제; 3-포스포글리세레이트 뮤타제; 및 피루베이트 키나제 (PyK) (EP 0 329 203) 유전자로부터의 프로모터 영역을 포함한다. 산 포스파타제를 코딩하는 효모 PHO5 유전자 또한 유용한 프로모터 서열을 제공할 수 있다[참조: Miyanohara et al., PROC. NATL. ACAD. SCI. USA (1983) 80:1]. 효모 숙주에 사용할 수 있는 다른 적절한 프로모터는 3-포스포글리세레이트 키나제 [Hitzeman et al., J. BlOL. CHEM. (1980) 255(4):12073-12080]; 및 다른 당분해 효소, 예컨대, 피루베이트 데카르복실라제, 트리오세포스페이트 데카르복실라제, 트리오세포스페이트 이소머라제, 및 포스포글루코스 이소머라제 [Holland et al., BIOCHEMISTRY (1978) 17(23):4900-4907; Hess et al., J. ADV. ENZYME REG. (1969) 7:149-167]에 대한 프로모터를 포함할 수 있다. 성장 조건에 의해 전사가 조절될 수 있는 잇점을 갖는 유도가능한 프로모터는 알콜 데히드로게나제 2; 이소씨토크롬 C; 산 포스파타제; 메탈로티오네인; 글리세르알데히드-3-포스페이트 데히드로게나제; 질소 대사와 관련된 분해 효소; 말토스 갈락토스 이용에 관여하는 효소에 대한 프로모터 영역을 포함할 수 있다. 효모 발현에 사용될 수 있는 적절한 벡터 및 프로모터는 또한 EP 0073 657에 기재되어 있다..
효모 프로모터와 함께 효모 인핸서를 사용할 수 있다. 또한, 합성 프로모터가 효모 프로모터로 기능할 수 있다. 예를 들어, 효모 프로모터의 상류 활성화 서열 (UAS)이 다른 효모 프로모터의 전사 활성화 영역과 연결되어 합성 하이브리드 프로모터를 생성할 수 있다. 그와 같은 하이브리드 프로모터의 예는 GAP 전사 활성화 영역에 연결된 ADH 조절 서열을 포함한다[참조: 전문이 본 명세서에 포함되는 미합중국 특허 제4,880,734호 및 제4,876,197호]. 하이브리드 프로모터의 다른 예는 ADH2, GAL4, GALlO, 또는 PHO5 유전자의 조절 서열과, 이에 결합된 GAP 또는 PyK 등의 당분해 효소의 전사 활성화 영역으로 구성되는 프로모터를 포함한다[참조: EP 0 164 556]. 또한, 효모 프로모터는 효모 RNA 폴리머라제에 결합하여 전사를 개시할 수 있는 비-효모 기원의 천연 프로모터를 포함할 수 있다.
효모 발현 벡터의 일부를 이룰 수 있는 다른 조절 요소는, 예를 들어, GAPDH 또는 에놀라제 유전자로부터의 종결 서열이다[참조: Holland et al., J. BlOL. CHEM. (1981) 256:1385]. 또한, 2μ 플라스미드 기원의 복제 기점이 효모에 적절하다. 효모에 사용하기에 적절한 선택 유전자는 효모 플라스미드에 존재하는 trpl 유전자이다[참조: Tschumper et al., GENE (1980) 10:157; Kingsman et al., GENE (1979) 7:141]. trpl 유전자는 트립토판 존재하의 성장능이 결여된 효모 변이 균주에 대한 선택 마커를 제공한다. 마찬가지로, Leu2-결여 효모 균주 (ATCC 20,622 또는 38,626)는 Leu2 유전자를 포함하는 공지의 플라스미드로 보충된다.
효모 숙주 내로 외래 DNA를 도입시키는 방법은, 비제한적인 예로서, 스페로플라스트 또는 알칼리 양이온으로 처리한 온전한 효모 숙주세포를 형질전환시키는 것을 포함한다. 예를 들어, 효모의 형질전환은 문헌[Hsiao et al., PROC. NATL. ACAD. Sci. USA (1979) 76:3829 and Van Solingen et al., J. BACT. (1977) 130:946]에 기재된 바에 따라 수행될 수 있다. 그러나, 핵 주입, 전기천공 또는 원형질 융합과 같은, DNA를 세포내로 도입시키는 다른 방법을 문헌[SAMBROOK ET AL., MOLECULAR CLONING: A LAB. MANUAL (2001)]에 일반적으로 기술된 바에 따라 이용할 수 있다. 효모 숙주세포는 이어서 당업계에 알려진 표준 기술로 배양될 수 있다.
효모 숙주세포에서 이종 단백질을 발현하는 다른 방법은 미합중국 특허 공개 제20020055169호, 미합중국 특허 6,361,969; 6,312,923; 6,183,985; 6,083,723; 6,017,731; 5,674,706; 5,629,203; 5,602,034; 및 5,089,398; 미합중국 재발행 특허 RE37,343 및 RE35,749; PCT 특허 출원 공개 WO 99/07862; WO 98/37208; 및 WO 98/26080; 유럽 특허 출원 EP 0 946 736; EP 0 732 403; EP 0 480 480; WO 90/10277; EP 0 460 071; EP 0 340 986; EP 0 329 203; EP 0 324 274; 및 EP 0 164 556 및 문헌 [Gellissen et al., ANTONIE VAN LEEUWENHOEK (1992) 62(l-2):79-93; Romanos et al., YEAST (1992) 8(6):423-488; Goeddel, METHODS IN ENZYMOLOGY (1990) 185:3-7]에 기재되어 있으며, 이들 문헌의 전문이 본 명세서에 포함된다.
효모 숙주 균주는 증폭 단계 동안 표준 공급 배치 발효 방법을 사용하여 발효기 중에서 성장될 수 있다. 발효 방법은 특정 효모 균주의 탄소 이용 경로 또는 발현 조절 모드에 있어서의 차이를 감안하여 적절하게 조정될 수 있다. 예를 들어, 적정 성장 및 발현을 위하여 사카로마이세스 효모 숙주의 발효는 단일 글루코스 공급원, 복합 질소원(예를 들어, 카제인 가수분해물), 및 여러 종류의 비타민 보충을 필요로 하는 반면, 메틸요구성 효모 피. 파스토리스(P. pastoris)는 글리세롤, 메탄올 및 미량 무기질과, 단순한 암모늄염(질소원)을 요한다[참조: 미합중국 특허 제5,324,639호; Elliott et al., J. PROTEIN CHEM. (1990) 9:95; and Fieschko et al., BIOTECH. BlOENG. (1987) 29: 1113, 각 문헌의 전문이 본 명세서에 포함됨].
그러나, 발효 방법은 사용되는 효모 숙주 균주와 무관하게 공통적인 특징을 가질 수 있다. 예를 들어, 최대 성장을 얻기 위해서는 전형적으로 탄소와 같은 성장 제한 영양 성분을 증폭 단계 중에 발효기에 가할 수 있다. 또한, 발효 방법은 일반적으로 충분량의 탄소, 질소, 기본 염류, 인 및 기타 미량 영양소(비타민, 미량 무기질, 염 등)를 함유하도록 설계된 발효 배지를 이용한다. 피치아(Pichia)에 사용하기에 적절한 발효 배지의 예는 미합중국 특허 제5,324,639호 및 제5,231,178호 (전문이 본 명세서에 포함됨)에 기재되어 있다.
배큘로바이러스-감염된 곤충 세포 : "곤충 숙주" 또는 "곤충 숙주세포"란 재조합 벡터 또는 다른 전달 DNA의 수용체로서 사용될 수 있거나 사용된 곤충을 이른다. 이 용어는 형질감염된 본래의 곤충 숙주 세포의 자손도 포함한다. 단일 패런트 세포의 자손은 우연적인 또는 의도적인 변이에 의하여 형태 또는 게놈 또는 총 DNA 상보물에 있어서 패런트와 반드시 완전히 일치하는 것이 아님을 이해하여야 한다. 비-천연 아미노산 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 존재와 같은 관련 특성으로 특징지워지는 정도로 패런트 세포에 유사한 자손이 이 정의에 의해 의도되는 자손에 포함된다.
폴리펩티드의 발현에 적절한 곤충 세포의 선택은 당업자에게 잘 알려져 있다. 몇몇 곤충 종이 당업계에 잘 기재되어 있고 또한 시판되고 있으며, 예를 들어, 이데스 이집티 (Aedes aegypti), 봄빅스 모리 (Bombyx mori), 드로소필라 멜라노가스터 (Drosophila melanogaster), 스포도프테라 푸르기페르다 (Spodoptera frugiperda) 및 트리코플리시아 니 (Trichopliisia ni) 등이 있다. 발현을 위한 곤충 숙주를 선택함에 있어서, 적절한 숙주는 양호한 분비능, 낮은 단백질 분해 활성, 전체적인 강건성을 갖는 것으로 나타난 것을 포함한다. 곤충은 일반적으로 다양한 공급처[the Insect Genetic Stock Center, Department of Biophysics and Medical Physics, University of California (Berkeley, CA); and the American Type Culture Collection ("ATCC") (Manassas, VA)]로부터 입수할 수 있다.
일반적으로, 배큘로바이러스-감염된 곤충 발현계의 성분은 배큘로바이러스 게놈의 단편과 발현될 이종 유전자의 삽입에 편리한 제한 부위를 둘 다 함유하는 전달 벡터, 대개는 세균 플라스미드; 전달 벡터 중 배큘로바이러스 특이적 단편에 상동적인 서열을 갖는 야생형 배큘로바이러스(이종 유전자가 배큘로바이러스 게놈 내로 상동 재조합되게 함); 및 적절한 곤충 세포 및 성장 배지를 포함한다. 벡터를 제작하고, 세포를 형질감염시키고, 플라크를 뽑아내고, 세포를 배지에서 성장시키는 등에 사용되는 물질, 방법 및 기술은 당업계에 알려져 있으며 이들 기술에 관한 매뉴얼을 구입할 수 있다.
이종 유전자를 전달 벡터내로 삽입한 후에, 벡터와 야생형 바이러스 게놈을 곤충 숙주세포내로 감염시키며, 여기서 벡터와 바이러스 게놈이 재조합한다. 포장된 재조합 바이러스가 발현되고, 재조합 플라크가 확인되어 정제된다. 배큘로바이러스/곤충 세포 발현계를 위한 물질 및 방법은 키트 형태로 시중에서, 예를 들어, 공급처[Invitrogen Corp. (Carlsbad, CA)]로부터 구입할 수 있다. 예시적인 기술이 문헌[SUMMERS AND SMITH, TEXAS AGRICULTURAL EXPERIMENT STATION BULLETIN NO. 1555 (1987); RICHARDSON, 39 METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY-. BACULOVIRUS EXPRESSION PROTOCOLS (1995); AUSUBEL ET AL., CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY 16.9-16.11 (1994); KING AND POSSEE, THE BACULOVIRUS SYSTEM: A LABORATORY GUIDE (1992); and O'REILLY ET AL., BACULOVIRUS EXPRESSION VECTORS: A LABORATORY MANUAL (1992)]에 기재되어 있으며, 이들 문헌은 전문이 본 명세서에 포함된다.
배큘로바이러스/곤충 세포 발현계를 이용한 이종 단백질의 생산이, 전문이 본 명세서에 포함되는 문헌[미합중국 특허 6,368,825; 6,342,216; 6,338,846; 6,261,805; 6,245,528, 6,225,060; 6,183,987; 6,168,932; 6,126,944; 6,096,304; 6,013,433; 5,965,393; 5,939,285; 5,891,676; 5,871,986; 5,861,279; 5,858,368; 5,843,733; 5,762,939; 5,753,220; 5,605,827; 5,583,023; 5,571,709; 5,516,657; 5,290,686; WO 02/06305; WO 01/90390; WO 01/27301; WO 01/05956; WO 00/55345; WO 00/20032 WO 99/51721; WO 99/45130; WO 99/31257; WO 99/10515; WO 99/09193; WO 97/26332; WO 96/29400; WO 96/25496; WO 96/06161; WO 95/20672; WO 93/03173; WO 92/16619; WO 92/03628; WO 92/01801; WO 90/14428; WO 90/10078; WO 90/02566; WO 90/02186; WO 90/01556; WO 89/01038; WO 89/01037; WO 88/07082]에 기재되어 있으며, 그와 같은 기술은 본 명세서에 기재된 비-천연 아미노산 폴리펩티드를 생산하는데 사용될 수 있다.
배큘로바이러스/곤충 세포 발현계에 유용한 벡터는, 비제한적인 예로서, 배큘로바이러스 오토그래파캘리포니카(Autographacalifornica) 핵 폴리히드로시스 바이러스 (AcNPV)로부터 유도된 곤충 발현 및 전달 벡터(헬퍼-독립적인, 바이러스성 발현 벡터임)을 포함한다. 이러한 계로부터 유도된 바이러스 발현 벡터는 보통 이종 유전자의 발현을 유도하는 강한 바이러스 폴리헤드린 프로모터를 사용한다[참조: Reilly ET AL., BACULOVIRUS EXPRESSION VECTORS: A LABORATORY MANUAL (1992)].
외래 유전자를 배큘로바이러스 게놈에 삽입하기 전에, 프로모터, 리더(바람직한 경우), 관심있는 코딩 서열, 및 전사 종결 서열을 포함하는 상기 성분들을 전형적으로는 중간 전달 구조물(전달 벡터) 내로 통합시킨다. 중간 전달 구조물은 세균과 같은 숙주에서 안정하게 유지될 수 있는 염색체외 요소(예를 들어, 플라스미드)와 같은 레플리콘 내에 종종 유지된다. 레플리콘은 복제계를 가지므로, 클로닝과 증폭에 적절한 숙주 중에서 유지될 수 있게 한다. 보다 구체적으로, 이. 콜라이 중에서 선택 및 증폭하기 위한 플라스미드는 폴리헤드린 폴리아데닐화 신호[참조: Miller et al., ANN. REV. MICROBIOL. (1988) 42:177)] 및 원핵 생물 암피실린-내성 (amp) 유전자 및 복제 기점을 함유할 수 있다.
이종 유전자를 AcNPV내로 도입하기 위해 통상적으로 사용되는 전달 벡터의 한 예는 ρAc373이다. 당업자에 알려진 많은 다른 벡터, 예를 들어, pVL985가 개발되었으며, 이는 폴리헤드린 개시 코돈을 ATG로 부터 ATT로 변화시키고, ATT 하위에 BamHI 클로닝 위치 32 염기쌍을 포함한다[참조: Luckow and Summers, VIROLOGY 170:31-39 (1989)]. 다른 시판용 벡터의 예로는 PBlueBac4.5/V5-His; pBlueBacHis2; pMelBac; pBlueBac4.5 (Invitrogen Corp., Carlsbad, CA) 등이 있다.
이종 유전자를 삽입한 후에, 전달 벡터 및 야생형 배큘로바이러스 게놈으로 곤충 세포 숙주를 동시 형질감염시켰다. 이종 DNA를 배큘로바이러스 중 목적하는 위치로 도입하는 방법은 예를 들어, 문헌[SUMMERS AND SMITH, TEXAS AGRICULTURAL EXPERIMENT STATION BULLETIN NO. 1555 (1987); Smith et al., MθL. CELL. BlOL. (1983) 3:2156; Luckow and Summers, VIROLOGY (1989) 170:31-39]에 기재되어 있다. 예를 들어, 삽입은 폴리헤드린 유전자와 같은 유전자 내로 상동적 이중 교차 재조합에 의해 이루어지거나, 또한 목적하는 배큘로바이러스 유전자 내에 엔지니어링된 제한 위치 내로 이루어질 수 있다[참조: Miller et al., BlOESSAYS (1989) 4:91].
형질감염은 문헌[TROTTER AND WOOD, 39 METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY (1995); Mann and King, J. GEN. VIROL. (1989) 70:3501]에 기재된 방법에 따라 전기천공으로 이루어질 수 있다. 다른 방법으로는, 리포조옴을 사용하여 곤충 세포를 재조합 및 배큘로바이러스로 형질감염시킬 수 있다[참조: Liebman et al., BlOTECHNlQUES (1999) 26(1):36; Graves et al., BIOCHEMISTRY (1998) 37:6050; Nomura et al., J. BlOL. CHEM. (1998) 273(22): 13570; Schmidt et al., PROTEIN EXPRESSION AND PURIFICATION (1998) 12:323; Siffert et al., NATURE GENETICS (1998) 18:45; TILKINS ET AL., CELL BIOLOGY: A LABORATORY HANDBOOK 145-154 (1998); Cai et al., PROTEIN EXPRESSION AND PURIFICATION (1997) 10:263; Dolphin et al., NATURE GENETICS (1997) 17:491; Kost et al., GENE (1997) 190:139; Jakobsson et al., J. BIOL. CHEM. (1996) 271:22203; Rowles et al., J. BlOL. CHEM. (1996) 271(37):22376; Reversey et al., J. BlOL. CHEM. (1996) 271(39):23607-10; Stanley et al., J. BlOL. CHEM. (1995) 270:4121; Sisk et al., J. VlROL. (1994) 68(2):766; and Peng et al., BIOTECHNIQUES (1993) 14.2:274]. 시판되는 리포조옴은, 예를 들어, 셀펙틴 (Cellfectin®) 및 리포펙틴 (Lipofectin®) (Invitrogen, Corp., Carlsbad, CA)를 포함한다. 또한, 인산 칼슘 형질감염법이 이용될 수 있다[참조: TROTTER AND WOOD, 39 METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY (1995); Kitts, NAR (1990) 18(19):5667; and Mann and King, J. GEN. VIROL. (1989) 70:3501].
배큘로바이러스 발현 벡터는 일반적으로 배큘로바이러스 프로모터를 함유한다. 배큘로바이러스 프로모터는 배큘로바이러스 RNA 폴리머라제에 결합하여 코딩 서열 (예를 들어, 구조 유전자)를 mRNA로 전사할 수 있는 임의의 DNA 서열이다. 프프로모터는 대개 코딩 서열의 5' 말단에 근접하여 위치하는 전사 개시 영역을 갖는다. 이 전사 개시 영역은 전형적으로는 RNA 폴리머라제 결합 부위 및 전사 개시 부위를 포함한다. 배큘로바이러스 프로모터는 또한 인핸서라고 불리우는 제2의 도메인을 갖는데, 이는 존재하는 경우, 구조 유전자와는 멀리 떨어져 있다. 또한, 발현은 조절되거나 항상적일 수 있다.
감염 주기의 끝 부분에서 풍부하게 전사되는 구조 유전자는 특히 유용한 프로모터 서열을 제공한다. 예로서, 바이러스 폴리헤드론 단백질을 코딩하는 유전자로부터 유래된 서열이 있다[참조: FRIESEN ET AL., The Regulation of Baculovirus Gene Expression in THE MOLECULAR BIOLOGY OF BACULOVIRUSES (1986); EP 0 127 839 and 0 155 476) and the gene encoding the plO protein (Vlak et al., J. GEN. VlROL. (1988) 69:765].
새로 형성된 배큘로바이러스 발현 벡터는 감염성 재조합 배큘로바이러스로 포장되며, 후에 자라난 플라크는 문헌[Miller et al., BIOESSAYS (1989) 4:91; SUMMERS AND SMITH, TEXAS AGRICULTURAL EXPERIMENT STATION BULLETIN NO. 1555 (1987)] 등에 기재된 기술로 정제될 수 있다.
재조합 배큘로바이러스 발현 벡터는 몇몇 곤충 세포 내로 감염시키도록 개발된 것이다. 예를 들어, 재조합 배큘로바이러스는, 대표적으로, 이데스 이집티 (ATCC No. CCL- 125), 봄빅스 모리 (ATCC No. CRL-8910), 드로소필라 멜라노가스터 (ATCC No. 1963), 스포도프테라 푸르기페르다 및 트리코플루시아 니를 감염시키도록 개발되었다[참조: WO 89/046,699; Wright, NATURE (1986) 321:718; Carbonell et al., J. VlROL. (1985) 56: 153; Smith et al., MOL. CELL. BIOL. (1983) 3:2156; Fraser et al., IN VITRO CELL. DEV. BIOL. (1989) 25:225]. 보다 구체적으로, 배큘로바이러스 발현 벡터계에 사용되는 세포주는 공통적으로 Sf9 (스포도프테라 푸르기페르다) (ATCC No. CRL-1711), Sf21 (스포도프테라 푸르기페르다) (Invitrogen Corp., Cat. No. 11497-013 (Carlsbad, CA)), Tri-368 (트리코플루시아 니), 및 하이-파이브(High-Five™) BTI-TN-5B1-4 (트리코플루시아 니)를 포함한다.
배큘로바이러스/발현에서 이종 폴리펩티드의 직접 및 융합 발현에 사용되는 세포 및 배양 배지가 시판되고 있다.
세균 : 세균 발현 기술은 당업계에 잘 알려져 있다. 다양한 벡터가 세균 발현에 사용될 수 있다. 벡터는 단일 카피, 또는 크거나 작은 수의 멀티카피 벡터일 수 있다. 벡터는 클로닝 및(또는) 발현에 사용된다. 벡터에 관련된 수 많은 문헌, 많은 벡터의 시중 구입 가능성, 벡터, 그의 제한 지도 및 특성을 기술하고 있는 매뉴얼을 고려할 때, 본 명세서에 광범위한 기재가 필요할 것 같지는 않다. 잘 알려져 있는 바와 같이, 벡터는 보통 선택을 위한 마커를 포함하며, 이는 독성 물질 내성, 영양 요구성 또는 면역특성을 제공한다. 빈번하게는 다수의 마커가 존재하여, 각각 다른 특성을 나타낸다.
세균 프로모터는 세균 RNA 폴리머라제에 결합하여 코딩 서열(예를 들어, 구조 유전자)을 mRNA로 전사할 수 있는 임의의 DNA 서열이다. 프로모터는 대개 코딩 서열의 5' 말단에 근접하여 위치하는 전사 개시 영역을 갖는다. 이 전사 개시 영역은 전형적으로는 RNA 폴리머라제 결합 부위 및 전사 개시 부위를 포함한다. 세균 프로모터는 또한 오퍼레이터라고 불리우는, RNA 합성이 시작되는 인접 RNA 폴리머라제 결합 부위와 중첩할 수 있는 제2의 도메인을 갖는다. 오퍼레이터는 음성 조절 (유도) 전사를 허용하며, 유전자 리프레서 단백질이 오퍼레이터에 결합함으로써 특정 유전자의 전사를 방해하는 방식이다. 구성적 발현은 오퍼레이터와 같은 음성 조절 요소의 부재하에 일어날 수 있다. 또한, 유전자 활성화 단백질에 의해 양성 조절이 이루어질 수 있는에, 이는 존재하는 경우 대개 RNA 폴리머라제 결합 서열의 (5') 말단에 근접하여 존재한다. 유전자 활성화 단백질의 예는 카타볼라이트 활성화 단백질(CAP)로서, 이는 이. 콜라이에서 lac 오페론의 전사 개시를 돕는다 [참조: Raibaud et al., ANNU. REV. GENET. (1984) 18: 173]. 조절된 발현은 따라서 양성적이거나 음성적일 수 있으며, 그에 따라 전사를 증가시키거나 감소시킬 수 있다.
대사 경로 효소를 코딩하는 서열은 특히 유용한 프로모터 서열을 제공한다. 예로는 갈락토스, 락토스(lac) [Chang et al., NATURE (1977) 198:1056], 및 말토스와 같은 당 대사 효소로부터 유도된 프로모터 서열이 있다. 또다른 예로는 트립토판 (trp) 프로모터와 같은 생합성 효소로부터 유도된 프로모터 서열이 있다[참조: Goeddel et al., NUC. ACIDS RES. (1980) 8:4057; Yelverton et al., NUCL. ACIDS RES. (1981) 9:731; 미합중국 특허 제4,738,921호; IFNPub. Nos. 036 776 and 121 775), 전문이 본 명세서에 포함됨]. 베타-갈락토시다제 (bla) 프로모터 시스템[Weissmann (1981) "The cloning of interferon and other mistakes." In Interferon 3 (Ed. I. Gresser)], 박테리오파아지 람다 PL [Shimatake et al., NATURE (1981) 292:128] 및 T5 [미합중국 특허 제4,689,406호] 프로모터 시스템 또한 유용한 프로모터 서열을 제공하며, 상기 각 문헌은 전문이 본 명세서에 포함된다. 비제한적인 예로서 방법은 T7 프로모터와 같은 강력 프로모터를 사용하여 폴리펩티드 생산을 높은 수준으로 유도하는 것이다. 그와 같은 벡터의 예는 비제한적으로는 pET29 시리즈(Novagen) 및 pPOP 벡터(WO99/05297)이다. 그와 같은 발현 시스템은 숙주 세포 생활성 또는 성장 조건을 상쇄함이 없이 숙주세포 내에서 폴리펩티드를 높은 수준으로 생산한다.
또한, 자연에 없는 합성 프로모터도 세균 프로모터로 기능한다. 예를 들어, 하나의 세균 또는 박테리오파아지 프로모터의 전사 활성화 서열을 다른 세균 또는 박테리오파아지 프로모터의 오페론 서열에 연결시킬 수 있다[참조: 미합중국 특허 제4,551,433호], 예컨대, tac 프로모터는 리프레서에 의해 조절되는, trp 프로모터와 lac 오페론 서열로 이루어진 하이브리드 trp-lac 프로모터이다[참조: Amann et al., GENE (1983) 25:167; de Boer et al., PROC. NATL. ACAD. SCI. (1983) 80:21]. 또한, 세균 프로모터는 세균 RNA 폴리머라제에 결합하여 전사를 개시시킬 수 있는 비-세균 기원의 천연 프로모터를 함유할 수 있다. 비-세균 기원의 천연 프로모터는 또한 사용가능한 RNA 폴리머라제와 결합하여 원핵생물 내에서 일부 유전자를 높은 수준으로 발현한다[참조: Studier et al., J. MOL. BlOL. (1986) 189:113; theTabor et al., Proc Natl. Acad. Sci. (1985) 82:1074]. 또한 하이브리드 프로모터는 박테리오파아지 프로모터와 이. 콜라이 오퍼레이터 영역으로 이루어질 수 있다[참조: IFNPub. No. 267 851].
기능적 프로모터 서열에 더하여, 효율적인 리보조옴 결합 부위 또한 원핵 생물에서 외래 유전자를 발현시키는데 유용하다. 이. 콜라이에서 리보조옴 결합 부위는 샤인-달가르노 (Shine-Dalgarno; SD) 서열이라 불리우며, 개시 코돈(ATG) 및 개시 코돈 상류 3 내지 11개 뉴클레오티드에 위치하는 3 내지 9 뉴클레오티드 길이의 서열을 포함한다[참조: Shine et al., NATURE (1975) 254:34]. SD 서열은 SD 서열과 이. 콜라이 16S rRNA 3' 말단 사이에서 염기의 짝짓기를 통해 mRNA 가 리보조옴에 결합하는 것을 촉진시키는 것으로 생각된다[참조: Steitz et al. "Genetic signals and nucleotide sequences in messenger RNA", In Biological Regulation and Development: Ciene Expression (Ed. R. F. Goldberger, 1979)]. 진핵 유전자 및 원핵 유전자를 약한 리보조옴-결합 부위로 발현하는 것은 문헌을 참조할 수 있다[참조: Sambrook et al. "Expression of cloned genes in Escherichia coli", Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 1989].
"세균 숙주" 또는 "세균 숙주세포"는 재조합 벡터 또는 다른 전달 DNA의 수용체로서 사용될 수 있거나 사용되는 세균을 이른다. 이 용어는 형질감염된 본래의 세균 숙주세포의 자손도 포함한다. 단일 패런트 세포의 자손은 우연적인 또는 의도적인 변이에 의하여 형태 또는 게놈 또는 총 DNA 상보물에 있어서 패런트와 반드시 완전히 일치하는 것이 아님을 이해하여야 한다. 비-천연 아미노산 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 존재와 같은 관련 특성으로 특징지워지는 정도로 패런트 세포에 유사한 자손이 이 정의에 의해 의도되는 자손에 포함된다.
목적하는 폴리펩티드를 발현하기 위한 적절한 숙주 세균의 선택은 당업자에게 잘 알려져 있다. 발현을 위한 세균 숙주를 선택함에 있어서, 적절한 숙주는 비제한적인 예로는, 양호한 함입체 형성 능력, 낮은 단백질 분해 활성, 양호한 분비능, 양호한 가용성 단백질 생산능, 전체적인 강건성 중 적어도 하나, 바람직하게는 적어도 두 가지 특징을 갖는 숙주이다. 세균 숙주는 일반적으로 다양한 공급원[the Bacterial Genetic Stock Center, Department of Biophysics and Medical Physics, University of California (Berkeley, CA); and the American Type Culture Collection ("ATCC") (Manassas, VA)]으로 부터 입수할 수 있다. 산업/제약용 발효는 일반적으로 K 균주로부터 유래된 세균 (예를 들어, W3110) 또는 B 균주로부터 유래된 세균 (예를 들어, BL21)을 사용한다. 이들 균주는 그들의 성장 파라미터가 아주 잘 알려져 있고 강건하기 때문에 특히 유용하다. 또한, 이들 균주는 비-병원성인데, 이 점이 안전 및 환경상의 측면에서 중요하다. 본 명세서에 기재되고 포함되는 방법의 또 다른 실시태양에서, 이. 콜라이 숙주는 비제한적인 예로서 OMP- 및 LON- 과 같은 프로테아제 마이너스 균주이다. 또 다른 실시태양에서, 세균 숙주는 슈도모나스 종, 예컨대, 피. 플루오레센스, 피. 에어루기노사, 또는 피. 푸티다이다. 슈도모나스 발현 균주의 예는 피. 플루오레센스 생변이체 I, 균주 MBlOl (Dow Chemical)이다.
일단 재조합 숙주세포 균주가 확립된 후 (즉, 발현 구조물이 숙주 세포 내로 도입되고, 적절한 발현 구조물을 갖는 숙주세포가 단리된 후), 재조합 숙주세포 균주는 폴리펩티드의 발현에 적절한 조건하에 배양된다. 재조합 숙주세포 균주를 배양하는 방법은 사용된 발현 구조물, 숙주세포에 따라서 달라질 것이다. 재조합 숙주세포 균주는 통상적으로 당업계에 잘 알려져 있는 방법으로 배양된다. 재조합 숙주세포 균주는 전형적으로는 동화성 탄소 및 질소 공급원, 무기 염류 및 임의로는 비타민, 아미노산, 성자 인자 및 기타 당업계에 알려진 단백질성 배지 보충물을 함유하는 액체 배지 중에서 배양된다. 숙주세포 배양을 위한 액채 배지는 또한 임의로는, 바람직하지 않은 미생물의 성장을 방지하기 위한 항균제 또는 항진균제, 또는 발현 벡터를 함유하는 숙주세포를 선택하기 위한 항생물질과 같은 화합물을 포함할 수 있다.
재조합 숙주세포는 배치 또는 연속 방식으로 배양될 수 있으며, 배치나 연속 방식 모두에서, 세포를 수확하거나 (즉, 폴리펩티드가 세포 내에 축적되는 경우) 또는 배양액 상등액을 수확할 수 있다. 원핵 숙주세포 내 생산에 있어서, 배치 배양 및 세포 수확이 바람직하다.
하나의 실시태양에서, 비-천연 아미노산 폴리펩티드는 재조합 시스템에서 발현된 후 정제된다. 폴리펩티드는 숙주세포 또는 배양액으로부터 당업계에 알려진 다양한 방법으로 정제될 수 있다. 일반적으로 세균 숙주세포에서 생산된 많은 폴리펩티드가 용해성이 불량하거나 불용성 함입체의 형태이다. 하나의 실시태양에서, 재조합 생산된 폴리펩티드의 용해성을 증가시킬 목적으로 선택된 폴리펩티드 중에 본 명세서에 기재된 방법 또는 당업계 공지의 방법에 따라 아미노산 치환을 쉽게 수행할 수 있다. 불용성 폴리펩티드의 경우에는, 숙주세포 용해물로부터 폴리펩티드를 원심분리 또는 여과에 의해 얻고, 추가로 세포를 균질화할 수 있다. 용해도가 낮은 폴리펩티드의 경우에는, 폴리에틸렌 이민 (PEI)과 같은 화합물을 가하여 부분적 가용성 폴리펩티드의 침강을 유도한다. 침강된 폴리펩티드는 이어서 원심분리 또는 여과에 의해 간단하게 수거할 수 있다. 재조합 숙주세포는 또한 세포 내에 있는 함입체를 방출시키기 위하여 당업계에 잘 알려진 방법으로 파쇄 또는 균질화될 수 있다. 숙주세포의 파쇄 또는 균질화는 세포 파괴, 음파 처리, 다운스 균질화 또는 고압 방출 파괴 등과 같은 공지된 방법으로 수행될 수 있다. 하나의 실시태양에서, 고압 방출 기술은 이. 콜라이 숙주세포를 파괴하여 폴리펩티드 함입체를 방출시키는데 사용된다. 함입체 형태의 불용성 폴리펩티드의 수율은 균질화기를 통하여 오직 1회분의 이. 콜라이 균질화를 이용함으로써 증가될 수 있는 것으로 밝혀졌다. 폴리펩티드 함입체를 다룰 때, 용해도, 기계적 전단력, 단백질 분해 등과 같은 요인에 의한 손실 없이 함입체의 수율을 최대로 하기 위해서는 반복시 균질화 시간을 최소로 하는 것이 유리하다.
불용성 또는 침강된 폴리펩티드는 이어서 당업계에 알려진 다수의 적절한 가용화제를 사용하여 용해시킬 수 있다. 예컨대, 폴리펩티드는 우레아 또는 구아니딘 염산염으로 가용화된다. 용해된 폴리펩티드의 부피는 간편하게 관리할 수 있는 배치 크기로 큰 배치 분량이 생산될 수 있도록 최소화되어야 한다. 이러한 인자는 재조합 숙주세포가 수천 리터 부피의 배치에서 성장하는 대규모 상업용 셋팅에서 중요하다. 또한, 의약 제조시와 같이 대규모 상업용 셋팅으로 폴리펩티드를 생산할 때, 기계나 용기 또는 폴리펩티드 생산물 자체에 유해한 화합물은 가능한 한 피해야 한다. 본 명세서에서 기재되고 포함되는 방법에서, 온화한 변성제인 우레아를 독한 구아니딘 염산염 변성제 대신 사용하여 폴리펩티드 함입체를 용해시킬 수 있다는 것이 밝혀졌다. 우레아를 사용하면 폴리펩티드의 생산 및 정제 과정에서 사용되는 스테인레스 스틸 장치에 대한 위험을 상당히 감소시킬 수 있을 뿐아니라, 폴리펩티드 함입체를 효율적으로 용해시킨다.
가용성 폴리펩티드의 경우에는, 펩티드는 세포주변 공간 또는 배양액 내로 배출될 수 있다. 또한, 가용성 펩티는 숙주세포의 세포질에도 존재할 수 있다. 가용성 펩티드는 정제 단계를 수행하기 전에 농축시킬 수 있다. 본 명세서에 기재된 것을 포함하는 표준 기술을 사용하여, 예컨대, 세포 용해물 또는 배양액으로부터 가용성 펩티드를 농축시킬 수 있다. 또한, 본 명세서에 기재된 것을 포함하는 표준 기술을 사용하여, 숙주세포를 파괴하여 그의 세포질 또는 세포 주변 공간으로부터 가용성 펩티드를 방출시킬 수 있다.
폴리펩티드가 융합 단백질로 생산되는 경우, 바람직하게는 융합 서열이 제거된다. 융합 서열의 제거는, 비제한적인 예로서 효소 또는 화학적 분해를 포함하는 방법으로 수행할 수 있으며, 효소 절단이 바람직하다. 융합 서열의 효소적 제거는 당업계에 공지된 방법으로 수행할 수 있다. 융합 서열 제거를 위한 효소의 선택은 융합 부분에 따라 결정될 것이며, 반응 조건도 효소에 따라 결정될 것이다. 화학적 절단은 브롬화시안, TEV 프로테아제 등과 같은 약품을 사용하여 수행될 수 있다. 절단된 폴리펩티드는 임의로는 적절한 융합 서열로부터 공지된 방법에 따라 정제된다. 그와 같은 방법은 융합 부분과 폴리펩티드의 종류 및 성질에 따라 결정될 것이다. 정제 방법은 비제한적인 예로서 크기-배제 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 이온-교환 크로마토그래피 또는 투석 또는 이들의 조합을 포함한다.
폴리펩티드는 또한 임의로는 단백질 용액으로부터 DNA를 제거하도록 정제된다. DNA는 당업계 공지된 적절한 방법, 비제한적인 예로서 침강 또는 이온-교환 크로마토그래피에 의해 제거될 수 있다. 하나의 실시태양에서, DNA는 비제한적인 예로서 프로타민 술페이트와 같은 핵산 침전제로 침전시켜 제거된다. 폴리펩티드는 침전된 DNA로부터 당업계 표준 방법, 비제한적인 예로서, 원심분리 또는 여과에 의해 분리될 수 있다. 숙주 핵산 분자의 제거는 폴리펩티드가 인간 의약으로 사용되는 셋팅에서 중요한 요소이며, 본 명세서에 기재된 방법은 숙주세포 DNA를 약제학적으로 허용가능한 수준으로 감소시킨다.
소-규모 또는 대-규모 발효 방법을 또한 단백질 발현에 사용할 수 있으며, 비제한적인 예로서 발효기, 진탕 플라스크, 유동상 생물반응기, 중공사 생물반응기, 롤러 보틀 배양 시스템, 교반 탱크 생물반응기 시스템을 사용할 수 있다. 이들 방법 각각은 배치, 공급-배치 또는 연속 모드 공정으로 수행될 수 있다.
본 명세서에 기재된 비-천연 아미노산 폴리펩티드 인간 형태는 일반적으로 당업계 표준 기술을 사용하여 회수할 수 있다. 예를들어, 배양액 또는 세포 용해물을 원심분리 또는 여과하여 세포 파편을 제거할 수 있다. 상등액을 목적하는 부피로 농축 또는 희석하거나 적절한 완충낵 내로 투석여과하여 추가의 정제를 위해 제제를 컨니셔닝할 수 있다. 본 명세서에 기재된 비-천연 아미노산 폴리펩티드를 추가로 정제하는 것은 상응하는 온전한 형태로부터 폴리펩티드 변이체의 탈아미드 및 클립된 형태를 분리해내는 것이다.
하기 예시적 과정 중 어느 것이나 본 명세서에 기재된 비-천연 아미노산 폴리펩티드를 정제하는데 사용할 수 있다: 친화도 크로마토그래피, 양이온- 또는 음 이온-교환 크로마토그래피(비제한적인 예로서 DEAE 세파로즈), 실리카 크로마토그래피, 역상 HPLC, 겔 여과 크로마토그래피(예를 들어, 세파덱스 G-75 사용), 소수성 상호작용 크로마토그래피, 크기-배제 크로마토그래피, 금속-킬레이트 크로마토그래피, 한외여과/투석여과, 에탄올 침전, 황산암모늄 침전, 크로마토포커싱, 치환 크로마토그래피, 전기 영동 과정(예컨대, 분취용 등전위 포커싱), 시차 용해도 (비제한적인 예로서 황산암모늄 침전), SDS-PAGE, 추출 또는 이들의 조합.
본 명세서에 기재된 방법 및 조성물 내에 드는 폴리펩티드, 비제한적인 예로서 비-천연 아미노산-함유 폴리펩티드, 비-천연 아미노산-함유 폴리펩티드에 대한 항체, 비-천연 아미노산 함유 폴리펩티드에 대한 결합 파트너는 당업계에 알려지거나 사용되는 표준 방법에 따라 부분적으로 또는 실질적으로 균질한 상태로 정제될 수 있다. 따라서, 본 명세서에 기재된 폴리펩티드는 당업계에 알려진 수 많은 방법으로, 비제한적인 예로서는, 황산암모늄 또는 에탄올 침전, 산 또는 염기 추출, 칼럼 크로마토그래피, 친화도 크로마토그래피, 음이온 또는 양이온 교환 크로마토그래피, 포스포셀룰로스 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 히드록실아파타이트 크로마토그래피, 렉틴 크로마토그래피, 겔 전기영동 및 이들의 조합을 사용하여 회수되고 정제될 수 있다. 정확히 접혀진 성숙 단백질을 제조하는데는 필요에 따라 단백질 재접힘 단계를 사용할 수 있다. 고순도가 요구되는 경우, 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC), 친화도 크로마토그래피 또는 다른 적절한 방법을 최종 정제 단계에 사용할 수 있다. 하나의 실시태양에서, 비-천연 아미노산 (비-천연 아미노산을 함유하는 폴리펩티드)에 대해 유도된 항체가 정제 시약으로 사용될 수 있으며, 비제한적인 예로서, 하나 이상의 비-천연 아미노산을 포함하는 폴리펩티드의 친화도 크로마토그래피가 그러하다. 필요에 따라 부분적으로나 균질한 정도로 정제되면, 폴리펩티드는 광범위한 용도, 예를 들어, 분석 성분, 치료제, 예방제, 진단제, 연구용 시약, 및(또는) 항체 생산을 위한 면역원으로서 사용된다.
본 명세서에 기재된 참고 문헌에 더하여, 각종 정제/단백질 접힘 방법이 당 분야에 잘 알려져 있으며, 예를 들어, 문헌[R. Scopes, Protein Purification, Springer- Verlag, N.Y. (1982); Deutscher, Methods in Enzymologv Vol. 182: Guide to Protein Purification, Academic Press, Inc. N.Y. (1990); Sandana (1997) Bioseparation of Proteins, Academic Press, Inc.; Bollag et al. (1996) Protein Methods. 2nd Edition Wiley-Liss, NY; Walker (1996) The Protein Protocols Handbook Humana Press, NJ, Harris and Angal (1990) Protein Purification Applications: A Practical Approach IRL Press at Oxford, Oxford, England; Harris and Angal Protein Purification Methods: A Practical Approach IRL Press at Oxford, Oxford, England; Scopes (1993) Protein Purification: Principles and Practice 3rd Edition Springer Verlag, NY; Janson and Ryden (1998) Protein Purification: Principles. High Resolution Methods and Applications, Second Edition Wiley-VCH, NY; and Walker (1998) Protein Protocols on CD-ROM Humana Press, NJ] 및 여기에 인용된 문헌에 기재되어 있다.
진핵 숙주 세포 또는 비-진핵 숙주 세포에서 적어도 하나의 비-천연 아미노산을 포함하는 폴리펩티드를 생산하는 하나의 잇점은 폴리펩티드가 전형적으로 그들의 천연의 상태로 접힌다는 것이다. 그러나, 본 명세서에 기재된 방법 및 조성물의 몇몇 실시태양에서는, 합성, 발현 및(또는) 정제 후에 폴리펩티드가 관련 폴리펩티드의 바람직한 형태와 다른 형태를 가질 수 있다는 것이다. 본 명세서에 기재된 방법 및 조성물의 한 측면에서, 발현된 단백질은 임의로는 변성된 후 다시 재생된다. 이와 같은 임의의 변성 및 재생 과정은 당업계 알려진 방법을 이용하여 수행하며, 예를 들어, 샤페로닌을 폴리펩티드에 가하거나, 폴리펩티드를 구아니딘 HCL과 같은 케이오트로프에 용해시키거나, 단백질 디술파이드 이소머라제를 사용하여 수행한다.
일반적으로, 발현된 폴리펩티드를 변성하고 환원시킨 다음, 폴리펩티드가 바람직한 형태로 다시 접히도록 하는 것이 때때로 바람직하다. 그와 같은 재접힘은 구아니딘, 우레아, DTT, DTE 및(또는) 샤페로닌을 번역 생성물에 가하여 수행된다. 단백질을 환원, 변성 및 재생시키는 방법은 당업자에 잘 알려져 있다[참조: 상기 문헌; Debinski, et al. (1993) J. Biol. Cherα, 268: 14065-14070; Kreitman and Pastan (1993) Bioconjug. Chem.,4: 581-585; and Buchner, et al., (1992) Anal. Biochem., 205: 263-270)]. 위 데빈스키(Debinski) 등의 문헌은 구아니딘-DTE 중에서의 함입체 단백질의 변성 및 환원을 기재하고 있다. 단백질은 산화된 글루타티온 및 L-아르기닌을 함유하는 레독스 완충액 중에서 다시 접힐 수 있다. 재접힘 시약을 하나 이상의 폴리펩티드 또는 다른 발현 생성물과 접촉하도록 흘려넣거나 다른 방법으로 이동시키며, 그 반대로도 할 수 있다.
비-천연 아미노산 폴리펩티드를 원핵 생물에서 생산하는 경우, 생성된 폴리펩티드는 잘못 접혀져 있을 수 있으며, 따라서, 전무하거나 감소된 생물학적 활성을 갖게 된다. 단백질의 생활성은 "재접힘"에 의해 회복될 수 있다. 하나의 실시태양에서, 잘못 접혀진 폴리펩티드는 폴리펩티드 사슬을 하나 이상의 케이오트로프 (비제한적인 예로서 우레아 및(또는) 구아니딘) 및 디술파이드 결합을 환원시킬 수 있는 환원제(비제한적인 예로서 디티오트레이톨, DTT 또는 2-머캅토에탄올, 2-ME)를 사용하여 용해(폴리펩티드가 불용성인 경우에도), 풀림 또는 환원시켜 다시 접혀지게 할 수 있다. 케이오트로프의 적정 농도에서, 산화제를 가하면 (비제한적인 예로서 산소, 시스틴 또는 시스타민) 디술파이드 결합이 다시 형성된다. 풀리거나 잘못 접혀진 폴리펩티드는 당업계에 알려진 표준 방법으로, 예컨대, 전문이 본 명세서에 포함되는 미합중국 특허 제4,511,502허, 제4,511,503호 및 제4,512,922호에 기재된 방법에 따라 다시 접혀질 수 있다. 폴리펩티드는 또한 다른 단백질과 함께 접혀서 헤테로이합체 또는 헤테로다합체를 형성할 수 있다. 재접힘 또는 함께 접힘 후에는, 폴리펩티드는 임의로는 더욱 정제된다.
비-천연 아미노산 폴리펩티드의 정제는 본 명세서에 기재된 것에 제한되지 않는 각종 기술, 예컨대, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 크기 배제 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피, 역상 고성능 액체 크로마토그래피, 친화도 크로마토그래피 및 이들의 조합으로 수행될 수 있다. 추가의 정제는 또한 정제된 단백질을 건조 또는 침전시키는 것을 포함할 수 있다.
정제 후에, 비-천연 아미노산 폴리펩티드는 다른 완충액 내로 교환되거나 투석여과 및 투석과 같은 당업계 공지의 방법으로 농축될 수 있다. 정제된 단일 단백질로 제공되는 hGH는 응집 및(또는) 침전 처리될 수 있다. 특정 실시태양에서, 정제된 비-천연 아미노산 폴리펩티드는 적어도 90% 순수(역상 고성능 액체 크로마토그래피, RP-HPLC, 또는 나트륨 도데실 술페이트-폴리아크릴아미드 겔 전기영동, SDS-PAGE으로 측정)할 수 있다. 특정 실시태양에서, 정제된 비-천연 아미노산 폴리펩티드는 적어도 95% 순수, 적어도 98% 순수 또는 적어도 99% 또는 그 이상으로 순수할 수 있다. 비-천연 아미노산 폴리펩티드 순도의 정확한 수치와 관계없이, 비-천연 아미노산 폴리펩티드는, 예컨대, PEG와 같은 수용성 중합체와의 컨쥬게이션 등과 같은 추후 가공 또는 약제용 생성물 자체로 사용하기에 충분히 순수하다.
특정 실시태양에서, 비-천연 아미노산 폴리펩티드 분자는 다른 활성 성분 또는 단백질의 부재(부형제, 담체, 안정화제, 혈청 알부민 등을 제외)하에 사용되거나, 다른 실시태양에서는, 비-천연 아미노산 폴리펩티드 분자는 다른 폴리펩티드 또는 중합체와 복합체를 이룰 수 있다.
2. 비-천연 아미노산 폴리펩티드의 정제
일반적 정제 방법 이 섹션에 기재된 기술은 본 명세서에 기재된 비-천연 아미노산 폴리펩티드의 일반적인 정제에 사용될 수 있다.
각종 단리 기술 중 어느 하나를 세포 용해물 추출물, 배양액, 함입체, 숙주 세포의 막주변 공간, 숙주세포의 세포질, 목적하는 폴리펩티드를 포함하는 다른 물질에 수행하거나, 또는 비제한적인 예로서, 친화도 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 겔 여과 크로마토그래피, 고성능 액체 ("HPLC"), 역상-HPLC ("RP-HPLC"), 확장상 흡착을 포함하는 임의의 단리 단계로부터 생성된 폴리펩티드 혼합물에 수행할 수 있다.
본 명세서에 기재된 기술을 수행하는데 사용되는 장치 및 기타 재료는 시중에서 구입할 수 있다. 펌프, 분획 수거기, 모니터, 레코더, 및 전체 시스템은, 예시적으로는 공급원(Applied Biosystems (Foster City, CA), Bio-Rad Laboratories, Inc. (Hercules, CA), and Amersham Biosciences, Inc. (Piscataway, NJ))으로부터 구입할 수 있다. 크로마토그래피 재료, 비제한적인 예로서, 교환 매트릭스 재료, 매질 및 완충액 등도 위와 같은 회사로부터 구입할 수 있다.
평형, 및 세척, 용출과 같은 칼럼 크로마토그래피 과정의 다른 단계는 펌프와 같은 특수 장치를 사용하여 신속히 수행할 수 있다 시판되고 있는 펌프의 예로는 하이로드 (HILOAD®) 펌프 P-50, 페리스탈틱 펌프 P-I, 펌프 P-901, 및 펌프 P-903 (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ)이 있다.
분획 수거기의 예는 레디프랙 (RediFrac) 분획 수거기인 FRAC-100 및 FRAC-200 프랙션 콜렉터 및 슈퍼프랙 (SUPERFRAC®) 프랙션 콜렉터(Amersham Biosciences, Piscataway, NJ)가 있다. 혼합기가 또한 pH 및 선형 농도 구배를 형성하는데 사용된다. 시판되고 있는 혼합기로는 그래디언트 믹서 GM-I 및 인-라인 믹서 (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ)가 있다.
크로마토그래피 과정은 시판되고 있는 임의의 모니터로 모니터링될 수 있다. 그와 같은 모니터는 UV, 형광, pH 및 전도도와 같은 정보를 수집하는데 사용될 수 있다. 검출기의 예로서 모니터 UV-I, UVICORD® S II, 모니터 UV-M II, 모니터, 모니터 UV-900, 모니터 UPC-900, 모니터 pH/C-900 및 컨닥티비티 모니터 (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ)가 있다. 사실상, 전체 시스템, 예컨대, 각종 AKTA® 시스템(Amersham Biosciences (Piscataway, NJ))을 시중에서 구입할 수 있다.
본 명세서에 기재된 방법 및 조성물의 하나의 실시태양에서, 폴리펩티드는 먼저 생성된 정제된 폴리펩티드를 우레아 중에서 변성시킨 다음, 적절한 pH에서 환원제(예를 들어, DTT)를 함유하는 TRIS 완충액 내로 희석시켜 환원 및 변성시킬 수 있다. 또 다른 실시태양에서, 폴리펩티드는 우레아 중 약 2 M 내지 약 9 M의 농도 범위에서 변성되고, 약 5.0 내지 약 8.0의 pH에서 TRIS 완충액 중으로 희석된다. 이 실시태양의 재접힘 혼합물은 이어서 인큐베이션될 수 있다. 하나의 실시태양에서, 재접힘 혼합물은 실온에서 4 내지 24 시간 동안 인큐베이션된다. 환원 및 변성된 폴리펩티드 혼합물은 추가로 단리 또는 정제될 수 있다.
기재된 바와 같이, 제1 폴리펩티드의 pH는 임의의 추후 단리 단계를 수행하기 전에 조정될 수 있다. 또한, 제1 폴리펩티드 혼합물 또는 그의 차후의 혼합물은 당업계에 공지된 방법으로 농축될 수 있다. 더우기, 제1 폴리펩티드 혼합물 또는 그의 차후의 혼합물을 포함하는 용출 완충액은 당업자에게 잘 알려진 기술을 이용하여 다음 단리 단계에 적절한 완충액으로 교환될 수 있다.
이온 교환 크로마토그래피 이 섹션에 기재된 기술은 본 명세서에 기재된 비-천연 아미노산 폴리펩티드의 이온 교환 크로마토그래피에 적용될 수 있다.
하나의 실시태양에서, 임의의 추가적 단계로서, 제1 폴리펩티드 혼합물에 이온 교환 크로마토그래피를 수행할 수 있다[참조: ION EXCHANGE CHROMATOGRAPHY: PRINCIPLES AND METHODS (Cat. No. 18-1114-21, Amersham Biosciences (Piscataway, NJ)]. 시판되는 이온 교환 칼럼은 하이트랩 (HITRAP®), 하이프렙 (HIPREP®), 및 하이로드 (HILOAD®) 칼럼(Amersham Biosciences, Piscataway, NJ)을 포함한다. 그와 같은 칼럼은 강한 음이온 교환기, 예컨대, 큐 세파로즈 (Q SEPHAROSE®) 패스트 플로우, 큐 세파로즈® 하이 퍼포먼스 및 큐 세파로즈 ® XL; 강한 양이온 교환기, 예컨대, 에스피 세파로즈 (SP SEPHAROSE®) 하이 퍼포먼스, 에스피 세파로즈® 패스트 플로우, 및 에스피 세파로즈® XL; 약한 음이온 교환기. 예를 들어, 디이에이이 세파로즈 (DEAE SEPHAROSE®) 패스트 플로우; 및 약한 양이온 교환기, 예를 들어, 씨엠 세파로즈 (CM SEPHAROSE®) 패스트 플로우 (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ)를 사용한다. 음이온 또는 양이온 교환 칼럼 크로마토그래피는 실질적으로 정제된 폴리펩티드를 단리하도록 정제 과정의 어느 단계에서나 수행될 수 있다. 양이온 교환 크로마토그래피 단계는 적절한 양이온 교환 매트릭스를 사용하여 수행될 수 있다. 양이온 교환 매트릭스는 비제한적인 예로서 섬유성, 다공성, 비-다공성, 미세과립형, 비드형 또는 기교결합된 양이온 교환 매트릭스 물질을 포함한다. 그와 같은 양이온 교환 매트릭스 물질은 비제한적으로는 셀룰로스, 아가로스, 덱스트란, 폴리아크릴레이트, 폴리비닐, 폴리스티렌, 실리카, 폴리에테르, 또는 이들의 조성물을 포함할 수 있다. 폴리펩티드를 양이온 교환 매트릭스에 흡착시킨 후, 매트릭스를 그로부터 폴리펩티드를 치환할 정도로 높은 pH 또는 이온 강도의 완충액과 접촉시켜 실질적으로 정제된 폴리펩티드를 용출시킬 수 있다. 실질적으로 정제된 폴리펩티드의 높은 pH 용출에 적절한 완충액은 비제한적인 예로서 적어도 약 5 IDM 내지 약 100 mM 농도의 시트레이트, 포스페이트, 포르메이트, 아세테이트, HEPES 및 MES 완충액을 포함한다.
역상 크로마토그래피 이 섹션에 기재된 기술은 본 명세서에 기재된 비-천연 아미노산 폴리펩티드의 역상 크로마토그래피에 적용될 수 있다.
당업계 알려진 적절한 프로토콜에 따라 KT-HFLC를 단백질을 정제하는데 사용할 수 있다[참조: Pearson et al., ANAL BlOCHEM. (1982) 124:217-230 (1982); Rivier et al., J. CHROM. (1983) 268:112-119; Kunitani et al., J. CHROM. (1986) 359:391-402]. RP-HPLC를 폴리펩티드에 수행하여 실질적으로 정제된 폴리펩티드를 단리할 수 있다. 이와 관련하여, 여러 길이의 알킬 관능기, 예를 들어, 적어도 약 C3 내지 적어도 약 C30, 적어도 약 C3 내지 적어도 약 C20, 또는 적어도 약 C3 내지 적어도 약 C18로 유도된 실리카 수지가 사용될 수 있다. 다른 방법으로는, 중합체 수지를 사용할 수 있다. 예를 들어, 스티렌 중합체 수지인 토소하스 암버크롬(TosoHaas Amberchrome) CGlOOOsd 수지가 사용될 수 있다. 다양한 알킬 쇄 길이로 유도된 시아노 또는 중합체 수지가 또한 사용될 수 있다. 또한, RP-HPLC 칼럼은 에탄올과 같은 용매로 세척될 수 있다. 이온쌍 형성제 및, 메탄올, 이소프로판올, 테트라히드로푸란, 아세토니트릴 또는 에탄올과 같은 유기 개질제를 함유하는 적절한 용출 완충액이 폴리펩티드를 RP-HPLC 칼럼으로부터 용출시키는데사용될 수 있다. 가장 통상적으로 사용되는 이온쌍 형성제는 비제한적인 예로서 아세트산, 포름산, 퍼클로르산, 인산, 트리플루오로아세트산, 헵타플루오로부티르산, 트리에틸아민, 테트라메틸암모늄, 테트라부틸암모늄, 테트라에틸암모늄 아세테이트를 포함한다. 용출은 하나 이상의 구배 또는 일정 용매 조건으로 사용하여 수행될 수 있으며, 분리 시간을 단축시키고 피크 폭을 감소시키는데는 구배 조건이 바람직하다. 또 다른 방법은 다른 용매 농도 범위의 두 가지 구배를 사용하는 것을 포함한다. 사용하기에 적절한 용출 완충액의 예는 비제한적인 예로서 암모늄 아세테이트 및 아세토니트릴 용액을 포함한다.
소수성 상호작용 크로마토그래피 정제 기술 이 섹션에 기재된 기술은 본 명세서에 기재된 비-천연 아미노산 폴리펩티드의 소수성 상호작용 크로마토그래피 정제에 적용될 수 있다.
소수성 상호작용 크로마토그래피(HIC)가 폴리펩티드에 수행될 수 있다[참조: 일반적인 사항에 관하여, HYDROPHOBIC INTERACTION CHROMATOGRAPHY HANDBOOK: PRINCIPLES AND METHODS (Cat. No. 18-1020-90, Amersham Biosciences (Piscataway, NJ), 전문이 본 명세서에 포함됨]. 적절한 HIC 매트릭스는 비제한적인 예로서, 아가로스, 가교결합 아가로스, 세파로스, 셀룰로스, 실리카, 덱스트란, 폴리스티렌, 폴리(메타크릴레이트) 매트릭스를 포함하는 알킬- 또는 아릴-치환된 매트릭스(예를 들어, 부틸-, 헥실-, 옥틸- 또는 페닐-치환된 매트릭스), 및 폴리에틸렌아민 수지 또는 부틸- 또는 페닐-치환된 폴리(메타크릴레이트)와 같은 혼합 수지 매트릭스를 포함한다. 소수성 상호작용 칼럼 크로마토그래피의 시판되는 예는, 하이트랩®, 하이프렙®, 및 하이로드® 칼럼(Amersham Biosciences, Piscataway, NJ)등이 있다. 간략히 설명하여, HIC 칼럼은 로딩 전에, 아세트산/염화나트륨 용액, 또는 황산암모늄 함유 HEPES와 같은, 당업계 공지된 표준 완충액을 사용하여 평형화시켜야 한다. 황산암모늄은 HIC 칼럼 로딩용 완충액으로 사용될 수 있다. 폴리펩티드를 로딩시킨 후에, 칼럼을 표준 완충액 및 조건으로 세척하여 폴리펩티드를 HIC 칼럼내에 유지시키면서 원하지 않는 물질을 제거할 수 있다. 폴리펩티드는 약 3 내지 약 10 칼럼 부피의 표준 완충액, 예를 들어, 평형 완충액 보다 낮은 황산암모늄 농도를 함유하는 HEPES 완충액 또는 아세트산/염화나트륨 완충액으로 용출될 수 있다. 감소하는 염 구배, 예를 들어, 인산칼륨 구배가 폴리펩티드 분자를 용출시키는데 사용될 수 있다. 용출제는 투석여과 또는 한외여과에 의해 농축될 수 있다. 투석여과는 폴리펩티드를 용출시키는데 사용되는 염을 제거하는데 사용될 수 있다.
다른 정제 기술 이 섹션에 기재된 기술은 본 명세서에 기재된 비-천연 아미노산 폴리펩티드의 다른 정제 기술에 적용될 수 있다.
다른 단리 단계는, 예를 들어, 겔 여과[GEL FILTRATION: PRINCIPLES AND METHODS (Cat. No. 18-1022-18, Amersham Biosciences, Piscataway, NJ), 전문이 본 명세서에 포함됨]; 히드록시아파타이트 크로마토그래피 (적절한 매트릭스는 HA-울트로겔, 하이 레졸루션 (Calbiochem), CHT 세라믹 히드록시아파타이트 (BioRad), 바이오-겔 HTP 히드록시아파타이트 (BioRad)를 포함함), HPLC, 확장상 흡착, 한외여과, 투석여과, 동결 건조 등을 이용하며, 이와 같은 단계는 존재할 수 있는 과량의 염을 제거하고 완충액을 다음 단리 단계 또는 최종 약물 생성물을 배합하는데 적절한 완충액으로 교환하기 위하여, 제1 폴리펩티드 혼합물 또는 그의 차후의 혼합물에 수행할 수 있다. 실질적으로 정제된 폴리펩티드를 포함하는 폴리펩티드의 수율은 본 명세서에 기재된 것과 같은 여러 기술로 기재된 단계에서 모니터링할 수 있다. 그와 같은 기술은 최종 단리 단계 후의 실질적으로 정제된 폴리펩티드 수율 또한 평가할 수 있다. 예를 들어, 폴리펩티드의 수율은 각종 알킬 쇄 길이를 갖는 수개의 역상 고압 액체 크로마토그래피, 예를 들어, 시아노 RP-HPLC, CigRP-HPLC, 또는 양이온 교환 HPLC 및 겔 여과 HPLC로 모니터링될 수 있다..
순도는 SDS-PAGE와 같은 표준 방법을 표준 방법을 사용하여, 또는 웨스턴 블롯이나 ELISA 분석으로 결정할 수 있다. 예를 들어, 음성 대조 효모 발효 및 양이온 교환 회수로부터 단리된 단백질에 대한 폴리클로날 항체를 생산할 수 있다. 그 항체는 오염 숙주세포 단백질의 존재를 검출하는 프로브로 사용될 수 있다.
특정 실시태양에서, 각 정제 단계 후의 폴리펩티드의 수율은 각 정제 단계의 출발 물질 중 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%, 적어도 약 99.9%, 또는 적어도 약 99.99%의 폴리펩티드일 수 있다.
RP-HPLC 물질 Vydac C4 (Vydac)는 표면이 C4-알킬 쇄를 수반하는 실리카 겔 입자로 이루어진다. 단백질성 불순물로부터 폴리펩티드를 분리하는 것은 소수성 상호작용 강도의 차이에 기초한다. 용출은 희석 트리플루오로아세트산 중 아세토니트릴 구배로 수행된다. 분취용 HPLC는 스테인레스 강 칼럼(2.8 내지 3.2 리터의 Vydac C4 실리카 겔로 채워짐)으로 수행한다. 히드록시아파타이트 울트로겔 용출물을 트리플루오로아세트산을 가하여 산성화하고, Vydac C4 칼럼에 로딩한다. 세척 및 용출을 위해 희석 트리플루오로아세트산 중 아세토니트릴 구배를 사용한다. 분획을 모으고, 인산염 완충액으로 즉시 중화시킨다. IPC 한계내에 있는 폴리펩티드 분획을 합한다.
DEAE 세파로즈 (Pharmacia) 물질은 세파로스 비드의 표면에 공유 결합된 디에틸아미노에틸(DEAE)-기로 이루어진다. 폴리펩티드가 DEAE 기에 결합하는 것은 이온 상호작용에 의해 매개된다. 트리플루오로아세트산 및 아세토니트릴은 보유됨이 없이 칼럼을 통과한다. 이 물질들이 세척 제거된 후, 미량 불순물은 칼럼을 낮은 pH에서 아세테이트 완충액으로 세척함으로써 제거된다. 이어서, 칼럼은 중성 인산염 완충액으로 세척되고, 폴리펩티드가 증가하는 이온 강도의 완충액으로 용출된다. 칼럼이 DEAE 세파로즈 패스트 플로우로 충전된다. 칼럼 부피는 폴리펩티드 로드가 3 내지 10 mg 폴리펩티드/ml 겔이 되도록 조정된다. 칼럼이 물 및 평형 완충액 (나트륨/칼륨 포스페이트)으로 세척된다. 합해진 HPLC 용출물이 로딩되고, 칼럼이 평형 완충액으로 세척된다. 이어서, 칼럼이 세척 완충액 (나트륨 아세테이트 완충액)으로 세척된 다음, 평형 완충액으로 세척된다. 계속하여, 폴리펩티드가 용출 완충액(염화나트륨, 인산나트륨/칼륨)으로 채워진 칼럼으로부터 용출되고, 마스터 용출 프로파일에 따라 단일 분획 내에 모아진다. DEAE 세파로즈 칼럼의 용출물은 특정 전도도로 조정된다. 생성된 약물은 테플론 병으로 멸균 여과되어 들어가고, -70 ℃에서 보관된다.
아주 다양한 방법 및 과정이 하나 이상의 비-천연 아미노산을 포함하는 폴리펩티드의 수율 및 순도를 평가하는데 사용될 수 있으며, 비제한적인 예로서, 브래드포드 분석(Bradford assay), SDS-PAGE, 은 염색 SDS-PAGE, 쿠마씨 염색 SDS-PAGE, 질량 분석 (예를 들어, MALDI-TOF) 및 당업계 공지된 단백질 특성화 방법을 사용할 수 있다.
추가의 방법은 내독소를 제거하는 단계를 포함하는 것이다. 내독소는, 예컨대, 이. 콜라이와 같은 그램 음성 숙주세포 외막에 존재하는 리포폴리사카라이드 (LPS)이다. 내독소 수준을 감소시키는 방법은 비제한적인 예로서, 실리카 지지체, 유리 분말 또는 히드록시아파타이트를 사용하는 정제 기술, 역상, 친화도, 크기-배제, 음이온 교환 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 및 이들의 조합을 포함한다. 목적하는 폴리펩티드로부터 같이 딸려들어온 단백질을 제거하기 위해 추가의 방법이 요구될 수 있다. 내독소 수준을 측정하는 방법은 당업계에 공지되어 있으며, 비제한적인 예로서 리물러스 아메보사이트(Limulus Amebocyte) 용해물 (LAL) 분석을 수행할 수 있다.
추가의 방법 및 과정은 단백질 염색과 함께 하는 SDS-PAGE, 면역 블롯팅, 매트릭스 보조 레이저 탈착/이온화 질량 분석(MALDI-MS), 액체 크로마토그래피/질량 분석, 등전점 포커싱, 분석 음이온 교환, 크로마토 포커싱 및 순환 디크로이즘을 포함한다.
특정 실시태양에서, 화학식 I - XVIII, XXX - XXXIV (A 및 B), 및 XXXX - XXXXIII의 범위에 속하는 하위 화학식 및 개별 특정 화합물을 포함하는 상기 화학식의 아미노산은 폴리펩티드 내에 생합성 도입됨으로써, 비-천연 아미노산 폴리펩티드를 생성할 수 있다. 다른 실시태양에서, 그와 같은 아미노산은 폴리펩티드 내의 특정 위치에 도입된다. 다른 실시태양에서, 폴리펩티드 내의 번역계를 사용하여 도입된다. 다른 실시태양에서, 그와 같은 번역계는 (i) 폴리펩티드를 코딩하며, 아미노산의 예정된 도입 위치에 셀렉터 코돈을 포함하는 폴리뉴클레오티드, 및 (ii) 아미노산을 포함하며, 셀렉터 코돈에 특이적인 tRNA를 포함한다. 그와 같은 번역계의 다른 실시태양에서, 폴리뉴클레오티드는 번역계에서 생산된 mRNA이다. 그와 같은 번역계의 다른 실시태양에서, 번역계는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 플라스미드 또는 파아지이다. 그와 같은 번역계의 다른 실시태양에서, 번역계는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 게놈 DNA를 포함한다. 그와 같은 번역계의 다른 실시태양에서, 폴리뉴클레오티드는 게놈 DNA내로 안정하게 통합된다. 그와 같은 번역계의 다른 실시태양에서, 번역계는 암버 코돈, 오커 코돈, 오팔 코돈, 독특한 코돈, 희귀 코돈, 비천연 코돈, 5염기 코돈, 4염기 코돈으로 구성되는 군으로부터 선택되는 셀렉터 코돈에 특이적인 tRNA를 포함한다. 그와 같은 번역계의 다른 실시태양에서, tRNA는 서프레서 tRNA이다. 그와 같은 번역계의 다른 실시태양에서, 번역계는 상기 아미노산으로 아미노아실화된 tRNA를 포함한다. 그와 같은 번역계의 다른 실시태양에서, 번역계는 tRNA에 특이적인 아미노아실 신써타제를 포함한다. 그와 같은 번역계의 다른 실시태양에서, 번역계는 오르쏘고날 tRNA 및 오르쏘고날 아미노아실 tRNA 신써타제를 포함한다. 그와 같은 번역계의 다른 실시태양에서, 폴리펩티드는 리보조옴을 통해 생성되며, 또 다른 실시태양에서, 번역계는 세균 세포, 시원세균 세포, 진핵 세포로 구성되는 군으로부터 선택되는 세포를 포함하는 생체내 번역계이다. 다른 실시태양에서, 세포는 이. 콜라이, 효모 세포, 슈도모나스 종의 세포, 포유류 세포, 식물 세포 또는 곤충 세포이다. 그와 같은 번역계의 다른 실시태양에서, 번역계는 세균 세포, 시원세균 세포, 진핵 세포로 구성되는 군으로부터 선택되는 세포 추출물을 포함하는 시험관내 번역계이다. 다른 실시태양에서, 세포 추출물은 이. 콜라이, 효모 세포, 슈도모나스 종의 세포, 포유류 세포, 식물 세포 또는 곤충 세포로부터 유래하는 것이다. 다른 실시태양에서, 폴리펩티드의 적어도 일부는 고상 또는 용액상 펩티드 합성 또는 이들의 조합에 의해 합성되는 반변, 다른 실시태양에서는 폴리펩티드를 다른 폴리펩티드에 연결시키는 것을 추가로 포함한다. 다른 실시태양에서, 화학식 I - XVIII, XXX - XXXIV (A 및 B) 및 XXXX - XXXXIII의 범위에 속하는 하위 화학식 및 개별 특정 화합물을 포함하는 상기 화학식의 아미노산은 하기 단백질로 구성되는 군으로부터 선택되는 치료용 단백질에 상동적인 폴리펩티드 내로 생합성 도입될 수 있다: 알파-1 안티트립신, 안지오스타틴, 항용혈 인자, 항체, 항체 단편, 아포리포단백질, 아포단백질, 심방 나트륨이뇨 인자, 심방 나트륨이뇨 폴리펩티드, 심방 펩티드, C-X-C 케모카인, T39765, NAP-2, ENA-78, gro-a, gro-b, gro-c, IP-10, GCP-2, NAP-4, SDF-1, PF4, MIG, 칼시토닌, c-키트 리간드, 사이토카인, CC 케모카인, 단핵구 화학유인 단백질-1, 단핵구 화학유인 단백질-2, 단핵구 화학유인 단백질-3, 단핵구 소염 단백질-1 알파, 단핵구 소염 단백질-1 베타, RANTES, 1309, R83915, R91733, HCC1, T58847, D31065, T64262, CD40, CD40 리간드, c-키트 리간드, 콜라겐, 콜로니 자극인자 (CSF), 보체 인자 5a, 보체 억제제, 보체 수용체 1, 사이토카인, 상피 호중구 활성화 펩티드-78, MIP-16, MCP-1, 표피 성장 인자 (EGF), 상피 호중구 활성화 펩티드, 에리쓰로포이에틴 (EPO), 박리 독소, 인자 IX, 인자 VII, 인자 VIII, 인자 X, 섬유아세포 성장 인자 (FGF), 피브리노겐, 피브로넥틴, 4중 나선 번들 단백질, G-CSF, glp-1, GM-CSF, 글루코세레브로시다제, 고나도트로핀, 성장 인자, 성장 인자 수용체, grf, 헷지호그 단백질, 헤모글로빈, 간세포 성장 인자 (hGF), 히루딘, 인간 성장 인자 (hGH), 인간 혈청 알부민, ICAM-1, ICAM-1 수용체, LFA-1, LFA-1 수용체, 인슐린, 인슐린-유사 성장 인자 (IGF), IGF-I, IGF-II, 인터페론 (IFN), IFN-알파, IFN-베타, IFN-감마, 인터루킨 (IL), IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, 각질 세포 성장 인자 (KGF), 락토페린, 백혈병 억제 인자, 루시퍼라제, 뉴투린, 호중구 억제 인자 (NIF), 온코스타틴 M, 골원성 단백질, 종양유전자 생성물, 파라시토닌, 부갑상선 호르몬, PD-ECSF, PDGF, 펩티드 호르몬, 플레이오트로핀, 단백질 A, 단백질 G, pth, 발열성 외독소 A, 발열성 외독소 B, 발열성 외독소 C, pyy, 릴랙신, 레닌, SCF, 생합성 소 단백질, 가용성 보체 수용체 I, 가용성 I-CAM 1, 가용성 인터루킨 수용체, 가용성 TNF 수용체, 소마토메딘, 소마토스타틴, 소마토트로핀, 스트렙토키나제, 슈퍼항원, 스타필로코커스 내독소, SEA, SEB, SECl, SEC2, SEC3, SED, SEE, 스테로이드 호르몬 수용체, 슈퍼옥시드 디스뮤타제, 독성 쇼크 증후 독소, 티모신 알파 1, 조직 플라스미노겐 활성화제, 종양 성장 인자 (TGF), 종양 괴사 인자, 종양 괴사 인자 알파, 종양 괴사 인자 베타, 종양 괴사 인자 수용체 (TNFR), VLA-4 단백질, VCAM-1 단백질, 혈관 내피 성장 인자 (VEGF), 유로키나제, mos, ras, raf, met, ρ53, tat, fos, myc, jun, myb, rel, 에스트로겐 수용체, 프로게스테론 수용체, 테스토스테론 수용체, 알도스테론 수용체, LDL 수용체 및 코르티코스테론.
B. 생체내 번역후 변형
적어도 하나의 비-천연 아미노산을 포함하는 폴리펩티드를 진핵 세포 내에서 생성함으로써, 폴리펩티드는 진핵 세포 번역후 변형을 포함할 수 있다. 특정 실시태양에서, 단백질은 적어도 하나의 비-천연 아미노산과, 진핵 세포에 의해 생체내 이루어진 적어도 하나의 번역후 변형을 포함하며, 번역후 변형은 원핵 세포에 의해 만들어진 것이 아니다. 예를 들어, 번역후 변형의 비제한적인 예로서, 아세틸화, 아실화, 지질-변형, 팔미토일화, 팔미테이트 부가, 포스포릴화, 당지질-결합 변형, 글리코실화 등이 있다. 하나의 측면에서, 번역후 변형은 올리고사카라이드 (비제한적인 예로서, (GIcNAc- Man)2-Man-GlcNAc-GlcNAc))를 아스파라긴에 GlcNAc-아스파라긴 결합을 통해 부착시키는 것을 포함한다. 이와 관련하여, 표 1은 진핵 세포 단백질 (제시되지 않은 추가의 잔기가 존재할 수 있음)의 N-결합 올리고사카라이드의 몇몇 예를 열거하고 있다. 다른 측면에서, 번역후 변형은 올리고사카라이드 (비제한적인 예로서 UaI-(JaINAc, GaI-GIcNAc, etc.)를 세린 또는 트레오닌에 GalNAc-세린 또는 GaINAc-트레오닌 결합 또는 GlcNAc-세린 또는 GlcNAc-트레오닌 결합에 의해 부착시키는 것을 포함한다. 하기 표 2는 GlcNAc-결합을 통한 올리고사카라이드의 예를 나타내는 것이다.
Figure 112007052373933-pct00051
또 다른 측면에서, 번역후 변형은 전구체 (비제한적인 예로서, 칼시토닌 전구체, 칼시토닌 유전자-관련 펩티드 전구체, 프리프로부갑상선 호르몬, 프리프로인슐린, 프로인슐린, 프리프로-오피오멜라노코르틴, 프로오피오멜라노코르틴 등)의 단백질 분해 과정, 다중 소단위 단백질로의 회합 또는 거대 분자 회합, 세포내 다른 위치로의 번역(세포질세망, 골지체, 핵, 리소조옴, 퍼옥시좀, 미토콘드리아, 엽록체, 액포 등과 같은 소기관, 또는 분비 경로를 통하여)을 포함한다. 특정 실시태양에서, 단백질은 분비 또는 위치지정 서열, 에피토프 태그, FLAG 태그, 폴리히스티딘 태그, GST 융합부 등을 포함한다.
비-천연 아미노산의 하나의 잇점은 추가의 분자를 결합시키는데 사용될 수 있는 추가의 화학적 잔기를 제공한다는 것이다. 이들 변형은 진핵 세포 또는 비-진핵 세포 중에서 생체내 만들어지거나 시험관내 만들어질 수 있다. 따라서, 특정 실시태양에서, 번역후 변형은 비-천연 아미노산을 통해 일어난다. 예를 들어, 번역후 변형은 친핵-친전자 반응을 통해 일어날 수 있다. 단백질의 선택적 변형에 현재 사용되고 있는 대부분의 반응은 친전자/친핵 반응 파트너 간의 공유 결합 형성을 포함하며, 비제한적인 예로서 알파-할로케톤과 히스티딘 또는 시스테인 측쇄와의 반응이 그러하다. 이들 반응에 있어서 선택성은 단백질 중 친핵성 잔기의 수 및 접근성에 의해 결정된다. 본 명세서에 기재되거나 본 명세서에 기재된 방법으로 생산되는 폴리펩티드에서, 다른 보다 선택적인 반응이 사용될 수 있으며, 비제한적인 예로서, 생체내 및 시험관내에서 비-천연 케토 아미노산과 히드라지드 또는 아미노옥시 화합물과의 반응이 있다[참조: Cornish, et al., (1996) Am. Chern. Soc. 118:8150-8151; Mahal, et al., (1997) Science, 276:1125-1128; Wang, et al., (2001) Science 292:498-500; Chin, et al., (2002) Am. Chem, Soc. 124:9026-9027; Chin, et al., (2002) Proc. Natl. Acad. ScL 99:11020-11024; Wang, et al., (2003) Proc. Natl. Acad. ScL 100:56-61; Zhang, et al., (2003) Biochemistry. 42:6735-6746; and, Chin, et al., (2003) Science 300:964-967]. 이는 사실상 어느 단백질이라도 형광물질, 가교결합제, 사카라이드 유도체 및 세포독성 분자를 포함하는 분자로 선택적으로 표지화하는 것을 가능하게 한다[참조: 미합중국 특허 출원 제10/686,944호, 발명의 명칭: "Glycoprotein synthesis," 2003년 1월 16일 출원, 전문이 본 명세서에 포함됨]. 예컨대, 아지도 아미노산을 통한 번역후 변형은 스타우딩거(Staudinger) 리게이션(예를 들어, 트리아릴포스핀 시약을 사용하여)을 통해 일어날 수 있다[참조: Kiick et al, (2002) Incorporation of azides into recombinant proteins for chemoselective modification by the Staudinger ligtation, PNAS 99(1): 19-24].
IX. 비-천연 아미노산 폴리펩티드 생산을 위한 다른 계
비-재조합 숙주세포, 변이된 숙주세포 또는 무세포계에서 비-천연 아미노산을 단백질 내로 도입하기 위한 몇가지 전략이 이용되어 왔다. 이 섹션에 기재된 다른 계는 본 명세서에 기재된 비-천연 아미노산 폴리펩티드를 생산하는데 적용될 수 있다. 예를 들어, 반응성 측쇄가 있는 아미노산, Lys, Cys 및 Tyr을 유도하는 것은 리신을 N2-아세틸-리신으로 전환시키는 것이다. 화학 합성 역시 비-천연 아미노산을 도입하는 직접적인 방법이다. 최근, 펩티드 단편의 효소 연결 및 천연 화학적 연결 방법의 개발에 따라, 보다 큰 단백질을 제조하는 것이 가능하게 되었다[참조: P. E. Dawson and S. B. H. Kent, Annu. Rev. Biochem, 69:923 (2000)]. 화학적 펩티드 리게이션 및 천연 화학 리게이션은 문헌[미합중국 특허 제6,184,344호, 미합중국 특허 공개 2004/0138412, 미합중국 특허 공개 2003/0208046, WO 02/098902 및 WO 03/042235, 전문이 본 명세서에 포함됨]에 기재되어 있다. 일반적인 시험관내 생합성 방법은 목적하는 비-천연 아미노산으로 화학적으로 아미노아실화된 서프레서 tRNA를 단백질 생합성을 지지할 수 있는 시험관내 추출물에 가하는 것으로, 100 가지가 넘는 비-천연 아미노산이 사실상 어떤 크기의 각종 단백질에나 위치-특이적으로 도입하는데 사용되어 왔다[참조: V. W. Cornish, D. Mendel and P. G. Schultz, Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 1995, 34:621-633 (1995); CJ. Noren, SJ. Anthony-Cahill, M.C. Griffith, P.G. Schultz, A general method for site-specific incorporation of unnatural amino acids into proteins, Science 244 182-188 (1989); and, J.D. Bain, CG. Glabe, T.A. Dix, A.R. Chamberlin, E.S. Diala, Biosynthetic site-specific incorporation of a non- natural amino acid into a polypeptide, J. Am. Chem. Soc. 111 8013-8014 (1989)]. 단백질의 안정성, 접힘, 효소 메카니즘 및 신호 유도 등을 연구하기 위해, 광범위한 관능기가 단백질 내로 도입되어 왔다.
선택적 압력 도입이라고 불리우는 생체내 방법은 야생형 신써타제의 광범위 적응성을 이용하기 위해 개발되었다[참조: N. Budisa, C. Minks, S. Alefelder, W. Wenger, F. M. Dong, L. Moroder and R. Huber, FASEB J.. 13:41-51 (1999)]. 세포에 특정 천연 아미노산을 공급하는 관련 대사 경로가 끊어진 영양요구성 균주를 제한된 농도의 천연 아미노산을 포함하는 최소 배지에서 성장시키는 한편, 표적 유전자의 전사는 리프레스된다. 정상적 성장상 시작 시기에 천연 아미노산이 고갈되고, 비-천연 아미노산 유사체로 대체된다. 재조합 단백질의 발현을 유도하면 비-천연 아미노산 유사체를 포함하는 단백질이 축적된다. 예를 들어, 이 전략을 사용하여, o, m 및 p-플루오로페닐알라닌이 단백질 내로 도입되었으며, 이러한 단백질은 UV 스펙트럼 중에 쉽게 찾아낼 수 있는 두 개의 특징적 쇼울더를 나타낸다[참조: C. Minks, R. Huber, L. Moroder and N. Budisa, Anal. Biochem., 284:29-34 (2000)]. 마찬가지로, 박테리오파아지 T4 리소자임과 키토올리고사카라이드의 상호작용을 19F NMR로 연구하기 위하여 트리플루오로메티오닌이 박테리오파아지 T4 리소자임 중 메티오닌을 대체하였으며[참조: H. Duewel, E. Daub, V. Robinson and J. F. Honek, Biochemistry, 36:3404-3416 (1997)]; 트리플루오로류신은 류신을 교체하여 류신-지퍼 단백질의 열 및 화학안정성을 증가시켰다[참조: Y. Tang, G. Ghirlanda, W. A. Petka, T. Nakajima, W. F. DeGrado and D. A. Tirrell, Angew. Chem. Int. Ed. Engl.. 40(8): 1494-1496 (2001)]. 더우기, 셀레노메티오닌 및 텔루로메티오닌은 각종 재조합 단백질내로 도입되어 X-선 결정 분석의 상의 해석을 촉진시킨다[참조: W. A. Hendrickson, J. R. Horton and D. M. Lemaster, EMBO J., 9(5):1665-1672 (1990); J. O. Boles, K. Lewinsk, M. Kunkle, J. D. Odom, B. Dunlap, L. Lebioda and M. Hatada, Nat. Struct. Biol, 1 :283-284 (1994); N. Budisa, B. Steipe, P. Demange, C. Eckerskorn, J. Kellermann and R. Huber, Eur. J. Biochem.. 230:788-796 (1995); and, N. Budisa, W. Kambrock, S. Steinbacher, A. Humm, L. Prade, T. Neuefeind, L. Moroder and R. Huber, J. MoI. Biol. 270:616-623 (1997)]. 알켄 또는 알킨 관능기가 있는 메티오닌 유사체는 효율적으로 도입되어 단백질을 화학적 수단에 의해 추가로 변형시킬 수 있게 한다[참조: J. C. M. vanHest and D. A. Tirrell, FEBS Lett.. 428:68-70 (1998); J. C. M. van Hest, K. L. Kiick and D. A. Tirrell, J. Am. Chem. Soc. 122:1282-1288 (2000); and, K. L. Kiick and D. A. Tirrell, Tetrahedron, 56:9487-9493 (2000); 미합중국 특허 제6,586,207호; 미합중국 특허 공개 2002/0042097, 전문이 본 명세서에 포함됨].
이 방법의 성공 여부는 단백질 번역의 신뢰도를 보장하기 위해 일반적으로 높은 선택성을 요구하는 아미노아실-tRNA 신써타제에 의해 비-천연 아미노산 유사체를 인식하는 것에 달려 있다. 이 방법의 범위를 확장하는 한 가지 방법은 아미노아실-tRNA 신써타제의 기질 특이성을 완화시키는 것으로, 몇몇 경우에 달성된 바 있다. 예를 들어, 이. 콜라이 페닐알라닐-tRNA 신써타제 (PheRS)에서 Ala294를 GIy로 교체하는 것은 기질 결합 포켓의 크기를 증가시켜, tRNAPhe를 p-Cl-페닐알라닌(p-Cl-Phe)으로 아실화시킨다[참조: M. Ibba, P. Kast and H. Hennecke, Biochemistry. 33:7107-7112 (1994)]. 이와 같은 변이 PheRS를 함유하는 이. 콜라이 균주는 페닐알라닌을 교체하여 p-Cl-페닐알라닌 또는 p-Br-페닐알라닌을 도입하는 것을 가능하게 한다[참조: M. Ibba and H. Hennecke, FEBS Lett.. 364:272-275 (1995); and, N. Sharma, R. Furter, P. Kast and D. A. Tirrell, FEBS Lett.. 467:37-40 (2000)]. 마찬가지로, 이. 콜라이 티로실-tRNA 신써타제의 아미노산 결합 부위 근처의 점 돌연변이 Phel30Ser는 티로신 보다 아자티로신이 보다 효율적으로 도입되게 하는 것으로 밝혀졌다[참조: F. Hamano-Takaku, T. Iwama, S. Saito-Yano, K. Takaku, Y. Monden, M. Kitabatake, D. Soil and S. Nishimura, J1 Biol. Chem.. 275(51):40324-40328 (2000)].
생체내 비-천연 아미노산을 단백질 내로 도입하는 또 다른 전략은 교정 메카니즘을 갖는 신써타제를 변형시키는 것이다. 이들 신써타제는 아미노산 구별하지 못하고, 동종 천연 아미노산에 구조적으로 유사한 아미노산을 활성화시킨다. 이와 같은 착오는 분리된 위치에서 교정되며, tRNA로부터 잘못 충전된 아미노산을 데아실화하여 단백질 번역 신뢰도를 유지하는 것이다. 신써타제의 교정 활성이 불능으로 된 경우, 잘못 활성화된 구조적 유사체는 교정 기능을 피하여 도입될 수 있다. 이와 같은 방법은 최근에 발릴-tRNA 신써타제 (VaIRS)와 관련하여 입증되었다[참조: V. Doring, H. D. Mootz, L. A. Nangle, T. L. Hendrickson, V. de Crecy-Lagard, P. Schimmel and P. Marliere, Science. 292:501-504 (2001)]. VaIRS은 tRNAVal을 Cys, Thr 또는 아미노부티레이트 (Abu)로 잘못 아미노아실화 할 수 있으며, 이들 비동종 아미노산은 교정 영역에서 추후 가수분해된다. 이. 콜라이 염색체의 부작위 변이유발 후, VaIRS의 교정 부위에 변이를 갖는 변이된 이. 콜라이 균주를 선택한다. 이와 같은 교정-결함 VaIRS는 tRNAVal을 Cys로 잘못 충전시킨다. Abu는 입체적으로 Cys (Cys의 -SH 기가 Abu의 -CH3와 교체됨)와 유사하기 때문에, 변이 VaIRS는 변이 이. 콜라이 균주가 Abu의 존재하에 성장할 때 Abu를 단백질 내로 도입한다. 질량 분석은 천연 단백질 중의 각각의 발린 위치에서 약 24%의 발린이 Abu로 치환되었다.
고상 합성 및 반합성 방법은 신규 아미노산을 함유하는 다수의 단백질을 합성하는데 사용되어 왔다[참조: Crick, F.J.C., Barrett, L. Brenner, S. Watts-Tobin, R. General nature of the genetic code for proteins. Nature , 192(4809): 1227-1232 (1961); Hofmann, K., Bohn, H. Studies on polypeptides. XXXVI. The effect of pyrazole-imidazole replacements on the S-protein activating potency of an S-peptide fragment, J. Am Chem , 88(24):5914-5919 (1966); Kaiser, E.T. Synthetic approaches to biologically active peptides and proteins including enyzmes, Ace Chem JK.es, 22(2):47-54 (1989); Nakatsuka, T., Sasaki, T., Kaiser, E.T. Peptide segment coupling catalyzed by the semisynthetic enzyme thiosubtilisin, J Am Chem Soc , 109, 3808-3810 (1987); Schnolzer, M., Kent, S B H. Constructing proteins by dovetailing unprotected synthetic peptides: backbone-engineered HIV protease, Science, 256, 221-225 (1992); Chaiken, LM. Semisynthetic peptides and proteins, CRC Crit Rev Biocherou 255-301 (1981); Offord, R.E. Protein engineering by chemical means, Protein Eng., 1 (3):151-157 (1987); and, Jackson, D.Y., Burnier, J., Quan, C, Stanley, M., Tom, J., Wells, J.A. A Designed Peptide Ligase for Total Synthesis of Ribonuclease A with Unnatural Catalytic Residues, Science, 266, 243-247 (1994)].
화학적 변형은 조인자. 스핀 표지 및 올리고뉴클레오티드를 포함하는 비-천연 아미노산 측쇄를 시험관내에서 단백질 내로 도입하는데 사용되어 왔다[참조: Corey, D.R., Schultz, P. G. Generation of a hybrid sequence-specific single-stranded deoxyribonuclease, Science, 238, 1401-1403 (1987); Kaiser, E. T., Lawrence D. S., Rokita, S.E. The chemical modification of enzymatic specificity, Ann. Rev Biochem, 54, 565-595 (1985); Kaiser, E.T., Lawrence, D.S. Chemical mutation ofenyzme active sites, Science, 226, 505-511 (1984); Neet, K.E., Nanci A, Koshland, D.E. Properties of thiol-substilisin, J Biol. Chem, 243(24): 6392-6401 (1968); Polgar, L.B., M.L. A new enzyme containing a synthetically formed active site. Thiol-substilisin. J. Am Chem Soc, 88(13):3153- 3154 (1966); and, Pollack, SJ., Nakayama, G. Schultz, P. G. Infroduction of nucleophiles and spectroscopic probes into antibody combining sites, Science, 1(242): 1038-1040 (1988)].
다른 방법으로서, 화학적으로 변형된 아미노아실-tRNA를 사용하는 생합성 방법이 몇몇 생물리적 프로브를 시험관내 합성되는 단백질 내로 도입시키는데 사용되어 왔다[참조: Brunner, J. New Photolabeling and crosslinking methods, Annu. Rev Biochem, 483-514 (1993); and, Krieg, U.C., Walter, P., Hohnson, A.E. Photocrosslinking of the signal sequence of nascent preprolactin of the 54-kilodalton polypeptide of the signal recognition particle, Proc. Natl. Acad. Sci. 83, 8604-8608 (1986)].
이전에, 화학적으로 아미노아실된 서프레서 tRNA를 목적하는 암버 넌센스 변이를 함유하는 유전자로 프로그램된 단백질 합성 반응에 가하여 비-천연 아미노산이 생체내에서 단백질 내에 위치-특이적으로 도입될 수 있음이 밝혀졌다. 이 방법을 이용하여, 다수의 통상의 20가지 아미노산을 구조적으로 유사한 동종체, 예를 들어, 페닐알라닌 대신 플루오로페닐알라닌으로, 특정 아미노산에 대해 영양요구성인 균주를 사용하여 치환할 수 있다[참조: Noren, CJ., Anthony-Cahill, Griffith, M.C., Schultz, P. G. A general method for site-specific incorporation of unnatural amino acids into proteins, Science. 244: 182-188 (1989); M. W. Nowak, et al., Science 268:439-42 (1995); Bain, J.D., Glabe, C.G., Dix, T.A., Chamberlin, A.R., Diala, E.S. Biosynthetic site-specific Incorporation of a non-natural amino acid into a polypeptide, J. Am Chem Soc. 111:8013-8014 (1989); N. Budisa et al., FASEB J. 13:41-51 (1999); Elhnan, J.A., Mendel, D., Anthony-Cahill, S., Noren, C.J., Schultz, P.G. Biosynthetic method for introducing unnatural amino acids site-specifically into proteins. Methods in Enz., 202, 301-336 (1992); and, Mendel, D., Cornish, V. W. & Schultz, P.G. Site-Directed Mutagenesis with an Expanded Genetic Code, Annu Rev Biophys. Biomol Struct. 24, 435-62 (1995)].
예를 들어, 중지 코돈 UAG를 인식하고 비-천연 아미노산으로 화학적으로 아미노아실화된 서프레서 tRNA가 제조되었다. 종래 위치-유도 변이유발은 단백질 유전자 중 중지 코돈 TAG를 목적하는 위치에 도입하는데 사용되었다[참조: Sayers, J.R., Schmidt, W. Eckstein, F. 5', 3' Exonuclease in phosphorothioate-based oligonucleotide-directed mutagenesis, Nucleic Acids Res. 16(3):791-802 (1988)]. 아실화된 서프레서 tRNA 및 변이 유전자가 시험관내 전사/번역게 중에 합해질 때, 비-천연 아미노산이 UAG 코돈에 반응하여 도입되어 특정 위치에 그 아미노산을 포함하는 단백질을 생산한다. [3H]-Phe를 사용하는 실험 및 α-히드록시 산을 사용하는 실험은 UAG 코돈에 의해 특정된 위치에 단지 목적하는 아미노산이 삽입되고, 이 아미노산은 단백질의 다른 위치에는 도입되지 않음을 증명하였다[참조: Noren, et al, supra; Kobayashi et al., (2003) Nature Structural Biology 10(6):425-432; and, Ellman, J.A., Mendel, D., Schultz, P.G. Site- specific incorporation of novel backbone structures into proteins, Science, 255, 197-200 (1992)].
미세주입 기술 또한 비-천연 아미노산을 단백질 내로 도입하는데 사용되어 왔다[참조: M. W. Nowak, P. C. Kearney, J. R. Sampson, M. E. Saks, C. G. Labarca, S. K. Silverman, W. G. Zhong, J. Thorson, J. N. Abelson, N. Davidson, P. G. Schultz, D. A. Dougherty and H. A. Lester, Science, 268:439-442 (1995); and, D. A. Dougherty, Curr. Opin. Chern. Biol., 4:645 (2000)]. 제노퍼스 오오사이트(Xenopus oocyte)에 시험관내 만들어진 2종의 RNA 종, 즉, 목적하는 위치에 UAG 중지 코돈을 갖는 표적 단백질을 코딩하는 mRNA 및 목적하는 비-천연 아미노산으로 아미노아실화된 암버 서프레서 tRNA를 동시에 주입한다. 오오사이트의 번역 기구는 UAG로 특정된 위치에 비-천연 아미노산을 도입시킨다. 이 방법은 일반적으로 시험관내 발현계에 적절하지 않은 통합 막 단백질의 생체내 구조-기능 연구를 가능하게 한다. 예를 들어, 형광 아미노산을 타치키닌 뉴로키닌-2 수용체에 도입하여 형광 공명 에너지 전달로 거리를 측정하고[참조: G. Turcatti, K. Nemeth, M. D. Edgerton, U. Meseth, F. Talabot, M. Peitsch, J. Knowles, H. Vogel and A. Chollet, I Biol. Chem., 271(33):19991-19998 (1996)]; 비오티닐화 아미노산을 도입하여 이온 채널 둥 표면 노출된 잔기를 확인하며[참조: J. P. Gallivan, H. A. Lester and D. A. Dougherty, Chem. Biol., 4(10):739-749 (1997)]; 케이지된 티로신 유사체를 사용하여 이온 채널에 있어서 실시간 형태 변화를 모니터하고[참조: J. C. Miller, S. K. Silverman, P. M. England, D. A. Dougherty and H. A. Lester, Neuron, 20:619-624 (1998)]; 알파 히드록시 아미노산을 사용하여 게이팅 메카니즘을 프로빙하기 위하여 이온 채널 골격을 변화시키나 [참조: P. M. England, Y. Zhang, D. A. Dougherty and H. A. Lester, Cell, 96:89-98 (1999); and, T. Lu, A. Y. Ting, J. Mainland, L. Y. Jan, P. G. Schultz and J. Yang, Nat. Neurosci, 4(3):239-246 (2001)], 이러한 예에 국한되는 것은 아니다.
비-천연 아미노산을 생체내에서 단백질 내로 직접 도입하는 능력은 고수율의 변이 단백질, 기술적 용이성, 변이 단백질을 세포 내에서, 가능하게는 살아있는 생물체에서 연구할 수 있는 가능성, 이들 변이 단백질의 치료에서의 용도라는 잇점을 제공한다. 각종 크기, 산성도, 친핵성, 소수성, 및 기타 특성을 갖는 비-천연 아미노산을 단백질 내에 포함하는 능력은, 단백질 기능을 찾아내거나 새로운 특성을 갖는 새로운 단백질 또는 유기체를 생성하기 위하여 단백질의 구조를 합리적으로 또한 체계적으로 조작하는 능력을 매우 확장시킬 수 있다.
para-F-Phe를 위치-특이적 도입시키는 하나의 시도로서, 효모 암버 서프레서 tRNAPheCUA /페닐알라닐-tRNA 신써타제 쌍을 p-F-Phe 내성, Phe 영양요구성 이. 콜라이 균주 중에 사용하였다[참조: R. Furter, Protein Sci., 7:419-426 (1998)].
무세포 (시험관내) 번역계를 사용하여 목적하는 폴리뉴클레오티드의 발현물을 얻는 것도 또한 가능하다. 주형으로서 mRNA (시험관내 번역) 또는 DNA (시험관내 전사 및 번역의 조합)를 포함할 수 있는 이와 같은 계에서, 시험관내 합성은 리보조옴에 의해 유도된다. 무세포 단백질 발현계의 개발을 위해 상당한 노력이 기울여져 왔다[참조: Kim, D.- M. and J.R. Swartz, Biotechnology and Bio engineering, 74(4) :309-316 (2001); Kim, D.-M. and J.R. Swartz, Biotechnology Letters, 22, 1537-1542, (2000); Kim, D.-M., and J.R. Swartz, Biotechnology Progress, 16, 385-390, (2000); Kim, D.-M., and J.R. Swartz, Biotechnology and Bioengineering, 66(3): 180-188, (1999); and Patnaik, R. and J.R. Swartz, Biotechniques 24(5): 862-868, (1998); 미합중국 특허 제6,337,191호; 미합중국 특허 공개 2002/0081660; WO 00/55353; WO 90/05785, 전문이 본 명세서에 포함됨]. 비-천연 아미노산을 포함하는 폴리펩티드의 발현에 적용될 수 있는 다른 방법은, 비제한적인 예로서, mRNA-펩티드 융합 기술이다[참조: R. Roberts and J. Szostak, Proc. Natl Acad. Sci. (USA) 94 A. Frankel, et al, Chemistry & Biology 10, 1043-1050 (2003)]. 이 방법에서, 퓨로마이신에 결합된 mRNA 주형이 리보조옴 상에서 펩티드로 번역된다. 하나 이상의 tRNA 분자가 변형되었다면, 비-천연 아미노산 또한 펩티드 내로 도입될 수 있을 것이다. 마지막 mRNA 코돈이 판독된 후에, 퓨로마이신은 펩티드의 C-말단을 포획한다. 생성된 mRNA-펩티드 컨쥬게이트가 시험관내 분석에서 흥미있는 특성을 갖는 것으로 나타나면, mRNA 서열로부터 그 정체를 쉽게 밝혀낼 수 있다. 이러한 방법으로, 목적하는 특성을 갖는 폴리펩티드를 찾아내기 위해 하나 이상의 비-천연 아미노산 또는 폴리펩티드의 라이브러리를 스크리닝할 수 있다. 보다 최근에는, 정제된 성분을 이용한 시험관내 리보조옴 번역이 보고되었으며, 이는 비-천연 아미노산으로 치환된 펩티드의 합성을 가능하게 한다[참조: A. Forster et al, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 100(11): 6353-6357 (2003)].
X. 폴리펩티드 비-천연 아미노산 성분의 번역후 변형
편의를 위하여, 이 섹션에 기재된 폴리펩티드의 비-천연 아미노산 성분 (XA 내지 XJ)의 번역후 변형은 총괄적으로 및(또는) 특정 예를 들어 기재한다. 그러나, 이 섹션에 기재된 폴리펩티드의 비-천연 아미노산 성분 (XA 내지 XJ)의 번역후 변형은 이 섹션에 제공된 총괄적 기재 사항 또는 특정 예에만 한정되는 것이 아니라, 본 명세서, 청구 범위 및 도면에 기재된 화학식 I - XVIII, XXX - XXXIV (A 및 B) 및 XXXX-XXXXIII, 및 이의 하위 화학식의 범위에 속하는 특정 화합물에 동동하게 적용된다.
단백질의 생체내 번역 중 비-천연 아미노산을 위치-특이적으로 도입하는 방법, 조성물, 기술 및 전략이 개발되어 왔다. 천연 아미노산의 측쇄 화학기에 오르쏘고날한 측쇄 화학기를 갖는 비-천연 아미노산을 도입함으로써, 이러한 기술은 재조합 단백질의 위치-특이적 유도를 가능하게 한다. 결과적으로, 본 명세서에 기재된 방법, 조성물, 전략 및 기술은 유도된 단백질이 정의되는 바에 따라 균질한 생성물로 제조될 수 있다는 것이다. 그러나, 본 명세서에 기재된 방법, 조성물, 반응 혼합물, 전략 및 기술은 생체내 단백질 번역 기술에 의해 형성된 비-천연 아미노산 폴리펩티드 뿐만 아니라, 발현 단백질 연결, 화학 합성, 리보자임-기초 기술 (본 명세서 중 섹션 "다른 계에서의 발현" 참조)을 포함하는 임의의 기술로 형성된 비-천연 아미노산 폴리펩티드도 포함한다. .
비-천연 아미노산을 재조합 단백질 내로 도입하는 능력은 번역후 유도 반응 에 응용될 수 있는 화학 반응을 상당히 확장하며, 그와 같은 유도는 생체내 또는 시험관내에서 일어날 수 있다. 보다 구체적으로, 폴리펩티드의 비-천연 아미노산 부분 상에 옥심 결합을 형성하기 위한 단백질 유도는 몇 가지 잇점을 제공한다. 첫째, 천연 아미노산은 일반적으로 옥심 결합을 형성하지 않으므로, 옥심 결합을 형성하도록 설계된 화합물은 폴리펩티드의 비-천연 아미노산 성분과 위치-특이적으로 반응할 것이며(비-천연 아미노산과 상응하는 화합물이 옥심 결합을 형성하도록 설계된 경우), 따라서, 단백질을 위치-특이적으로 유도하는 것은 선행 기술을 사용하여 생산된 유도된 단백질의 혼합물이 아니라 단일의 균질 생성물을 제공한다. 둘째로, 옥심 부가물은 생물학적 조건하에 안정하므로, 옥심 교환을 통해 유도된 단백질은 치료제로서 유효한 후보가 된다. 세번째로, 생성된 옥심 결합의 안정성은 옥심 결합이 형성된 비-천연 아미노산 자체(즉, 관능성 기 및(또는) 구조)에 의해 조작될 수 있다. 따라서, 실시예 16에 나타난 바와 같이, 비-천연 아미노산에 대한 옥심 결합의 pH 안정성은 한 시간 미만으로부터 상당하게는 일주일이 넘는 시간 까지 다양할 수 있다. 따라서, 몇몇 실시태양에서, 비-천연 아미노산 폴리펩티드에 대한 옥심 결합은 한 시간 미만, 다른 실시태양에서는 1 일 미만, 다른 실시태양에서는 2 일 미만, 다른 실시태양에서는 1 주 미만, 및 다른 실시태양에서는 1주를 넘는 분해 반감기를 갖는다. 또 다른 실시태양에서, 생성된 옥심은 온화한 산성 조건하에 적어도 2주 이상, 다른 실시태양에서는 온화한 산성 조건하에 적어도 5일 이상 안정하다. 다른 실시태양에서, 비-천연 아미노산 폴리펩티드는 pH 약 2 내지 약 8에서, 다른 실시태양에서는 pH 약 2 내지 약 6, 다른 실시태양에서는 pH 약 2 내지 약 4에서 적어도 1일 이상 안정하다. 다른 실시태양에서, 본 명세서에 기재된 방법, 조성물, 전략 및 기술을 사용하여, 당업자는 필요에 따라 (서방 제제 또는 진단용 제제와 같은 치료제 용도 또는 산업상 용도 또는 군용) 조정된 분해 반감기를 갖는 비-천연 아미노산 폴리펩티드에 대한 옥심 결합을 합성할 수 있을 것이다.
상기 기재된 비-천연 아미노산 폴리펩티드는 비제한적인 예로서 신규 치료제, 진단제, 촉매 효소, 산업상 효소, 결합 단백질 (비제한적인 예로서, 항체 및 항체 단편 유효)에 유용할 뿐만 아니라, 단백질 구조 및 기능 연구에 사용될 수 있다[참조: Dougherty, (2000) Unnatural Amino Acids as Probes of Protein Structure and Function, Current Opinion in Chemical Biology, 4:645-652]. 본 명세서에 기재된 비-천연 아미노산 폴리펩티드의 다른 용도로는, 비제한적인 예로서, 분석 기초물질, 화장제, 식물 생물학, 환경, 에너지 생산 및(또는) 군대 용도가 있다. 그러나, 본 명세서에 기재된 비-천연 아미노산 폴리펩티드는 새롭거나 변형된 관능기를 도입하기 위해 추가로 변형될 수 있는데, 예를 들어, 폴리펩티드의 치료 효과를 조작하기 위하여, 폴리펩티드의 안전성 프로파일을 개선시키기 위하여, 폴리펩티드의 약물동태학, 약물학 및(또는) 약물역학적 특성을 조정하기 위하여 (예를 들어, 수용해도, 생이용성을 증가시키거나, 혈청 반감기 또는 치료 반감기를 증가시키거나, 면역원성을 조절하거나, 생물학적 활성을 조절하거나, 순환시간을 연장시키기 위하여), 폴리펩티드에 추가의 관능기를 제공하기 위하여, 폴리펩티드 내로 태그, 표지 또는 검출가능한 신호를 도입하기 위하여, 폴리펩티드의 단리 특성을 용이하게 하기 위하여, 또는 이들의 조합된 목적을 위하여 추가 변형될 수 있다.
특정 실시태양은 옥심-함유 비-천연 아미노산, 카르보닐-함유 비-천연 아미노산, 히드록실아민-함유 비-천연 아미노산으로 구성되는 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 비-천연 아미노산을 포함하는 상동적 생합성 비-천연 아미노산 폴리펩티드를 사용하여, 폴리펩티드의 단리 특성을 용이하게 하는 방법이다. 다른 실시태양에서, 그와 같은 비-천연 아미노산은 본 명세서에 기재된 폴리펩티드 내로 생합성적으로 도입되었다. 또 다른 또는 추가의 실시태양에서, 그와 같은 비-천연 아미노산은 화학식 I - XVIII, XXX - XXXIV (A 및 B), 또는 XXXX - XXXXIII의 아미노산으로부터 선택되는 적어도 하나의 비-천연 아미노산을 포함한다.
본 명세서에 기재된 방법, 조성물, 전략 및 기술은, 특정 유형, 종류 또는 과의 폴리펩티드에 한정되지 않는다. 사실상 어느 폴리펩티드라도 본 명세서에 기재된 적어도 하나의 비-천연 아미노산을 포함할 수 있다. 예를 들어, 폴리펩티드는 다음 군으로부터 선택되는 치료용 단백질에 상동적일 수 있다: 알파-1 안티트립신, 안지오스타틴, 항용혈 인자, 항체, 항체 단편, 아포리포단백질, 아포단백질, 심방 나트륨이뇨 인자, 심방 나트륨이뇨 폴리펩티드, 심방 펩티드, C-X-C 케모카인, T39765, NAP-2, ENA-78, gro-a, gro-b, gro-c, IP-10, GCP-2, NAP-4, SDF-1, PF4, MIG, 칼시토닌, c-키트 리간드, 사이토카인, CC 케모카인, 단핵구 화학유인 단백질-1, 단핵구 화학유인 단백질-2, 단핵구 화학유인 단백질-3, 단핵구 소염 단백질-1 알파, 단핵구 소염 단백질-1 베타, RANTES, 1309, R83915, R91733, HCC1, T58847, D31065, T64262, CD40, CD40 리간드, c-키트 리간드, 콜라겐, 콜로니 자극인자 (CSF), 보체 인자 5a, 보체 억제제, 보체 수용체 1, 사이토카인, 상피 호중구 활성화 펩티드-78, MIP-16, MCP-1, 표피 성장 인자 (EGF), 상피 호중구 활성화 펩티드, 에리쓰로포이에틴 (EPO), 박리 독소, 인자 IX, 인자 VII, 인자 VIII, 인자 X, 섬유아세포 성장 인자 (FGF), 피브리노겐, 피브로넥틴, 4중 나선 번들 단백질, G-CSF, glp-1, GM-CSF, 글루코세레브로시다제, 고나도트로핀, 성장 인자, 성장 인자 수용체, grf, 헷지호그 단백질, 헤모글로빈, 간세포 성장 인자 (hGF), 히루딘, 인간 성장 인자 (hGH), 인간 혈청 알부민, ICAM-1, ICAM-1 수용체, LFA-1, LFA-1 수용체, 인슐린, 인슐린-유사 성장 인자 (IGF), IGF-I, IGF-II, 인터페론 (IFN), IFN-알파, IFN-베타, IFN-감마, 인터루킨 (IL), IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, 각질 세포 성장 인자 (KGF), 락토페린, 백혈병 억제 인자, 루시퍼라제, 뉴투린, 호중구 억제 인자 (NIF), 온코스타틴 M, 골원성 단백질, 종양유전자 생성물, 파라시토닌, 부갑상선 호르몬, PD-ECSF, PDGF, 펩티드 호르몬, 플레이오트로핀, 단백질 A, 단백질 G, pth, 발열성 외독소 A, 발열성 외독소 B, 발열성 외독소 C, pyy, 릴랙신, 레닌, SCF, 생합성 소 단백질, 가용성 보체 수용체 I, 가용성 I-CAM 1, 가용성 인터루킨 수용체, 가용성 TNF 수용체, 소마토메딘, 소마토스타틴, 소마토트로핀, 스트렙토키나제, 슈퍼항원, 스타필로코커스 내독소, SEA, SEB, SECl, SEC2, SEC3, SED, SEE, 스테로이드 호르몬 수용체, 슈퍼옥시드 디스뮤타제, 독성 쇼크 증후 독소, 티모신 알파 1, 조직 플라스미노겐 활성화제, 종양 성장 인자 (TGF), 종양 괴사 인자, 종양 괴사 인자 알파, 종양 괴사 인자 베타, 종양 괴사 인자 수용체 (TNFR), VLA-4 단백질, VCAM-1 단백질, 혈관 내피 성장 인자 (VEGF), 유로키나제, mos, ras, raf, met, ρ53, tat, fos, myc, jun, myb, rel, 에스트로겐 수용체, 프로게스테론 수용체, 테스토스테론 수용체, 알도스테론 수용체, LDL 수용체 및 코르티코스테론. 비-천연 아미노산 폴리펩티드는 또한 성장 호르몬 슈퍼유전자 패밀리 중 어느 구성원에나 상동적일 수 있다.
그와 같은 변형은 폴리펩티드의 비-천연 아미노산 성분 상으로 추가의 관능기를 도입하는 것을 포함하며, 추가의 관능기는 비제한적인 예로서, 표지, 염료, 중합체, 수용성 중합체, 폴리에틸렌 글리콜 유도체, 광가교결합제, 세포독성 화합물, 약물, 친화도 표지, 광친화도 표지, 반응성 화합물, 수지, 제2의 단백질 또는 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 유사체, 항체 또는 항체 단편, 금속 킬레이트제, 조인자, 지방산, 탄수화물, 폴리뉴클레오티드, DNA, RNA, 안티센스 폴리뉴클레오티드, 사카라이드, 수용성 덴드리머, 시클로덱스트린, 생물질, 나노입자, 스핀 표지, 형광물질, 금속-함유 잔기, 방사성 잔기, 신규 관능기, 다른 분자와 공유적으로 또는 비공유적으로 상호작용하는 기, 포토케이지드 잔기, 화학선 여기가능한 잔기, 리간드, 광이성화성 잔기, 비오틴, 비오틴 유사체, 중량급 원자를 포함하는 잔기, 화학적으로 절단가능한 기, 광-절단가능한 기, 신장된 측쇄, 탄소-결합 당, 산화환원 활성제, 아미노 티오산, 독성 잔기, 동위원소 표지된 잔기, 생물리학적 프로브, 인광 기, 화학발광 기, 전자밀도가 높은 기, 자성 기, 인터캘레이팅 기, 발색단, 에너지 전달기, 생물학적 활성제, 검출가능한 표지, 소분자, 억제성 리보핵산, 방사성 핵종, 중성자 포획제, 비오틴 유도체, 콴텀 도트, 나노트랜스미터, 라디오트랜스미터, 아브자임, 활성화된 복합 활성화제, 바이러스, 보조제, 아글리칸, 알러간, 안지오스타틴, 항호르몬, 항산화제, 압타머, 가이드 RNA, 사포닌, 셔틀 벡터, 거대 분자, 미모토우프, 수용체, 역상 미셀 및 그들의 조합으로부터 선택되는 기를 포함한다.
또한, 비-천연 아미노산 폴리펩티드는 다른 관능기, 예컨대, 카르보닐, 디카르보닐 또는 히드록실아민으로 전환될 수 있는 잔기를 함유할 수 있다. 도 63A는 폴리펩티드를 카르보닐 또는 디카르보닐-함유 비-천연 아미노산 폴리펩티드로 화학적으로 전환시키는 과정을 도시하고 있는 반면, 도 63B는 비-천연 아미노산 폴리펩티드를 히드록실아민-함유 비-천연 아미노산 폴리펩티드로 화학적으로 전환시키는 과정을 도시하고 있다. 생성된 카르보닐 또는 디카르보닐-함유 비-천연 아미노산 폴리펩티드 및 히드록실아민-함유 비-천연 아미노산 폴리펩티드는, 본 명세서에 기재된 비-천연 아미노산, 비-천연 아미노산 폴리펩티드 및 변형된 비-천연 아미노산 폴리펩티드를 제조, 정제, 특성화 및 사용하는 방법, 조성물, 기술 및 전략에 사용되거나 도입될 수 있다. 화학적 잔기의, 예컨대, 카르보닐, 디카르보닐 또는 히드록실아민과 같은 다른 관능기로의 화학적 전환은 당업자에게 알려진 기술 및 물질을 사용하여, 문헌[March, ADVANCED ORGANIC CHEMISTRY 5th Ed., (Wiley 2001); and Carey and Sundberg, ADVANCED ORGANIC CHEMISTRY 4th Ed., VoIs. A and B (Plenum 2000, 2001), 전문이 본 명세서에 포함됨] 등에 기술된 바와 같이 수행할 수 있다.
따라서, 단지 예시의 목적으로서, 하기 (a) 내지 (e), 즉 화학식 (I), (XI), (XIV), (XXX) 또는 (XXXX)의 아미노산 중 적어도 하나를 함유하는 비-천연 아미노산 폴리펩티드는 본 명세서에 기재된 방법 및 조성물을 사용하여 추가로 변형될 수 있다:
(a) <화학식 I>
Figure 112007052373933-pct00052
(상기 식에서, A는 임의로 존재하고, 존재하는 경우에는 저급 알킬렌, 치환된 저급 알킬렌, 저급 시클로알킬렌, 치환된 저급 시클로알킬렌, 저급 알케닐렌, 치환된 저급 알케닐렌, 알키닐렌, 저급 헤테로알킬렌, 치환된 헤테로알킬렌, 저급 헤테로시클로알킬렌, 치환된 저급 헤테로시클로알킬렌, 아릴렌, 치환된 아릴렌, 헤테로아릴렌, 치환된 헤테로아릴렌, 알크아릴렌, 치환된 알크아릴렌, 아르알킬렌 또는 치환된 아르알킬렌이며;
B는 임의로 존재하고, 존재하는 경우에는 저급 알킬렌, 치환된 저급 알킬렌, 저급 알케닐렌, 치환된 저급 알케닐렌, 저급 헤테로알킬렌, 치환된 저급 헤테로알킬렌, -O-, -O-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -S-, -S-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -S(O)k- (k는 1, 2 또는 3임), -S(O)k(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(O)-, -NS(O)2-, -OS(O)2-, -C(O)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(S)-, -C(S)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')-, -NR'-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(O)N(R')-, -CON(R')-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -CSN(R')-, -CSN(R')-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')CO-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')C(O)O-, -S(O)kN(R')-, -N(R')C(0)N(R')-, -N(R')C(S)N(R')-, -N(R')S(O)kN(R')-, -N(R')-N=, -C(R')=N-, -C(R')=N-N(R')-, -C(R')=N-N=, -C(R')2-N=N- 및 -C(R')2-N(R')-N(R')-(여기서, R' 는 각각 독립적으로 H, 알킬 또는 치환된 알킬임)로 구성되는 군으로부터 선택되는 링커이며;
J는
Figure 112007052373933-pct00053
이고;
R은 H, 알킬, 치환된 알킬, 시클로알킬 또는 치환된 시클로알킬이며;
R"는 각각 독립적으로 H, 알킬, 치환된 알킬 또는 보호기이거나, 2개 이상의 R" 기가 존재하는 경우, 2개의 R"는 임의로는 헤테로시클로알킬을 형성하고;
R1은 H, 아미노 보호기 또는 수지이며;
R2는 OH, 에스테르 보호기 또는 수지이고;
R3 및 R4는 각각 독립적으로 H, 할로겐, 저급 알킬 또는 치환된 저급 알킬이거나, R3와 R4 또는 2개의 R3 기가 임의로는 시클로알킬 또는 헤테로시클로알킬을 형성하며;
-A-B-J-R 기는 함께 디카르보닐 기를 포함하는 카르보닐 기, 보호된 디카르보닐 기를 포함하는 보호된 카르보닐 기, 또는 차폐된 디카르보닐 기를 포함하는 차페된 카르보닐 기를 적어도 하나 포함하는 비시클릭 또는 트리시클릭 시클로알킬 또는 헤테로시클로알킬을 형성하거나;
-J-R 기는 함께 디카르보닐 기를 포함하는 카르보닐 기, 보호된 디카르보닐 기를 포함하는 보호된 카르보닐 기, 또는 차폐된 디카르보닐 기를 포함하는 차폐된 카르보닐 기를 적어도 하나 포함하는 모노시클릭 또는 비시클릭 시클로알킬 또는 헤테로시클로알킬을 형성함);
(b) <화학식 XI>
Figure 112007052373933-pct00054
(상기 식에서, A는 임의로 존재하고, 존재하는 경우에는 저급 알킬렌, 치환된 저급 알킬렌, 저급 시클로알킬렌, 치환된 저급 시클로알킬렌, 저급 알케닐렌, 치환된 저급 알케닐렌, 알키닐렌, 저급 헤테로알킬렌, 치환된 헤테로알킬렌, 저급 헤테로시클로알킬렌, 치환된 저급 헤테로시클로알킬렌, 아릴렌, 치환된 아릴렌, 헤테로아릴렌, 치환된 헤테로아릴렌, 알크아릴렌, 치환된 알크아릴렌, 아르알킬렌 또는 치환된 아르알킬렌이며;
B는 임의로 존재하고, 존재하는 경우에는 저급 알킬렌, 치환된 저급 알킬렌, 저급 알케닐렌, 치환된 저급 알케닐렌, 저급 헤테로알킬렌, 치환된 저급 헤테로알킬렌, -O-, -O-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -S-, -S-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -S(O)k- (k는 1, 2 또는 3임), -S(O)k(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(O)-, -NS(O)2-, -OS(O)2-, -C(O)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(S)-, -C(S)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')-, -NR'-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(O)N(R')-, -CON(R')-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -CSN(R')-, -CSN(R')-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')CO-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')C(O)O-, -S(O)kN(R')-, -N(R')C(0)N(R')-, -N(R')C(S)N(R')-, -N(R')S(O)kN(R')-, -N(R')-N=, -C(R')=N-, -C(R')=N-N(R')-, -C(R')=N-N=, -C(R')2-N=N- 및 -C(R')2-N(R')-N(R')-(여기서, R' 는 각각 독립적으로 H, 알킬 또는 치환된 알킬임)로 구성되는 군으로부터 선택되는 링커이며;
R은 H, 알킬, 치환된 알킬, 시클로알킬 또는 치환된 시클로알킬이고;
R1은 H, 아미노 보호기 또는 수지이며;
R2는 OH, 에스테르 보호기 또는 수지이고;
R3 및 R4는 독립적으로 H, 할로겐, 저급 알킬 또는 치환된 저급알킬이거나, R3 및 R4 또는 두 개의 R3 기는 임의로는 함께 시클로알킬 또는 헤테로시클로알킬을 형성하고;
R5는 H, 알킬, 치환된 알킬, 알케닐, 치환된 알케닐, 알키닐, 치환된 알키닐, 알콕시, 치환된 알콕시, 알킬옥시, 치환된 알킬옥시, 폴리알킬렌 옥시드, 치환된 폴리알킬렌 옥시드, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 알크아릴, 치환된 알크아릴, 아르알킬, 치환된 아르알킬, -(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-N(R")2, -(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-C(O)SR", -(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-S-S-(아릴렌 또는 치환된 아릴렌), -C(O)R", -C(O)2R", -C(0)N(R")2 (여기서, 각 R"는 독립적으로 수소, 알킬, 치환된 알킬, 알케닐, 치환된 알케닐, 알콕시, 치환된 알콕시, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 알크아릴, 치환된 알크아릴, 아르알킬, 치환된 아르알킬임)이거나,
R5는 L-X이고;
X는 표지, 염료, 중합체, 수용성 중합체, 폴리에틸렌 글리콜 유도체, 광가교결합제, 세포독성 화합물, 약물, 친화도 표지, 광친화도 표지, 반응성 화합물, 수지, 제2의 단백질 또는 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 유사체, 항체 또는 항체 단편, 금속 킬레이트제, 조인자, 지방산, 탄수화물, 폴리뉴클레오티드, DNA, RNA, 안티센스 폴리뉴클레오티드, 사카라이드, 수용성 덴드리머, 시클로덱스트린, 생물질, 나노입자, 스핀 표지, 형광물질, 금속-함유 잔기, 방사성 잔기, 신규 관능기, 다른 분자와 공유적으로 또는 비공유적으로 상호작용하는 기, 포토케이지드 잔기, 화학선 여기가능한 잔기, 리간드, 광이성화성 잔기, 비오틴, 비오틴 유사체, 중량급 원자를 포함하는 잔기, 화학적으로 절단가능한 기, 광-절단가능한 기, 신장된 측쇄, 탄소-결합 당, 산화환원 활성제, 아미노 티오산, 독성 잔기, 동위원소 표지된 잔기, 생물리학적 프로브, 인광 기, 화학발광 기, 전자밀도가 높은 기, 자성 기, 인터캘레이팅 기, 발색단, 에너지 전달기, 생물학적 활성제, 검출가능한 표지, 소분자, 억제성 리보핵산, 방사성 핵종, 중성자 포획제, 비오틴 유도체, 콴텀 도트, 나노트랜스미터, 라디오트랜스미터, 아브자임, 활성화된 복합 활성화제, 바이러스, 보조제, 아글리칸, 알러간, 안지오스타틴, 항호르몬, 항산화제, 압타머, 가이드 RNA, 사포닌, 셔틀 벡터, 거대 분자, 미모토우프, 수용체, 역상 미셀 및 그들의 조합으로 구성되는 군으로부터 선택되고;
L은 임의로 존재하며, 존재하는 경우에는 알킬렌, 치환된 알킬렌, 알케닐렌, 치환된 알케닐렌, -O-, -O-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -S-, -S-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -S(O)k- (k는 1, 2 또는 3임), -S(O)k(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(O)-, -C(O)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(S)-, -C(S)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')-, -NR'-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(O)N(R')-, -CON(R')-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -CSN(R')-, -CSN(R')-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')CO-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')C(O)O-, -(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-O-N=CR'-, -(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-C(O)NR'-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-S(O)k-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-S-, -(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-S-S-, -S(O)kN(R')-, -N(R')C(0)N(R')-, -N(R')C(S)N(R'), -N(R')S(0)kN(R')-, -N(R')-N=, -C(R')=N-, -C(R')=N-N(R')-, -C(R')=N-N= -C(R')2-N=N- 및 -C(R')2-N(R')-N(R')- (여기서, R'는 각각 독립적으로 H, 알킬 또는 치환된 알킬임)로 구성되는 군으로부터 선택됨);
(c) <화학식 XIV>
Figure 112007052373933-pct00055
(상기 식에서, A는 임의로 존재하고, 존재하는 경우에는 저급 알킬렌, 치환된 저급 알킬렌, 저급 시클로알킬렌, 치환된 저급 시클로알킬렌, 저급 알케닐렌, 치환된 저급 알케닐렌, 알키닐렌, 저급 헤테로알킬렌, 치환된 헤테로알킬렌, 저급 헤테로시클로알킬렌, 치환된 저급 헤테로시클로알킬렌, 아릴렌, 치환된 아릴렌, 헤테로아릴렌, 치환된 헤테로아릴렌, 알크아릴렌, 치환된 알크아릴렌, 아르알킬렌 또는 치환된 아르알킬렌이며;
B는 임의로 존재하고, 존재하는 경우에는 저급 알킬렌, 치환된 저급 알킬렌, 저급 알케닐렌, 치환된 저급 알케닐렌, 저급 헤테로알킬렌, 치환된 저급 헤테로알킬렌, -O-, -O-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -S-, -S-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -S(O)k- (k는 1, 2 또는 3임), -S(O)k(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(O)-, -NS(O)2-, -OS(O)2-, -C(O)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(S)-, -C(S)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')-, -NR'-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(O)N(R')-, -CON(R')-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -CSN(R')-, -CSN(R')-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')CO-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')C(O)O-, -S(O)kN(R')-, -N(R')C(0)N(R')-, -N(R')C(S)N(R')-, -N(R')S(O)kN(R')-, -N(R')-N=, -C(R')=N-, -C(R')=N-N(R')-, -C(R')=N-N=, -C(R')2-N=N- 및 -C(R')2-N(R')-N(R')-(여기서, R' 는 각각 독립적으로 H, 알킬 또는 치환된 알킬임)로 구성되는 군으로부터 선택되는 링커이며;
K는 -NR6R7 또는 -N=CR6R7이고;
R은 H, 알킬, 치환된 알킬, 시클로알킬 또는 치환된 시클로알킬이고;
R1은 H, 아미노 보호기 또는 수지이며;
R2는 OH, 에스테르 보호기 또는 수지이고;
R3 및 R4는 독립적으로 H, 할로겐, 저급 알킬, 치환된 저급 알킬이거나, R3 및 R4 또는 두 개의 R3 기는 임의로는 함께 시클로알킬 또는 헤테로시클로알킬을 형성하고;
R6 및 R7은 각각 독립적으로 H, 알킬, 치환된 알킬, 알케닐, 치환된 알케닐, 알콕시, 치환된 알콕시, 폴리알킬렌 옥시드, 치환된 폴리알킬렌 옥시드, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 알크아릴, 치환된 알크아릴, 아르알킬, 치환된 아르알킬, -C(O)R", -C(O)2R", -C(0)N(R")2 (여기서, 각 R"는 독립적으로 수소, 알킬, 치환된 알킬, 알케닐, 치환된 알케닐, 알콕시, 치환된 알콕시, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 알크아릴, 치환된 알크아릴, 아르알킬, 치환된 아르알킬임)이거나,
R6 또는 R7은 L-X이고;
X는 표지, 염료, 중합체, 수용성 중합체, 폴리에틸렌 글리콜 유도체, 광가교결합제, 세포독성 화합물, 약물, 친화도 표지, 광친화도 표지, 반응성 화합물, 수지, 제2의 단백질 또는 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 유사체, 항체 또는 항체 단편, 금속 킬레이트제, 조인자, 지방산, 탄수화물, 폴리뉴클레오티드, DNA, RNA, 안티센스 폴리뉴클레오티드, 사카라이드, 수용성 덴드리머, 시클로덱스트린, 생물질, 나노입자, 스핀 표지, 형광물질, 금속-함유 잔기, 방사성 잔기, 신규 관능기, 다른 분자와 공유적으로 또는 비공유적으로 상호작용하는 기, 포토케이지드 잔기, 화학선 여기가능한 잔기, 리간드, 광이성화성 잔기, 비오틴, 비오틴 유사체, 중량급 원자를 포함하는 잔기, 화학적으로 절단가능한 기, 광-절단가능한 기, 신장된 측쇄, 탄소-결합 당, 산화환원 활성제, 아미노 티오산, 독성 잔기, 동위원소 표지된 잔기, 생물리학적 프로브, 인광 기, 화학발광 기, 전자밀도가 높은 기, 자성 기, 인터캘레이팅 기, 발색단, 에너지 전달기, 생물학적 활성제, 검출가능한 표지, 소분자, 억제성 리보핵산, 방사성 핵종, 중성자 포획제, 비오틴 유도체, 콴텀 도트, 나노트랜스미터, 라디오트랜스미터, 아브자임, 활성화된 복합 활성화제, 바이러스, 보조제, 아글리칸, 알러간, 안지오스타틴, 항호르몬, 항산화제, 압타머, 가이드 RNA, 사포닌, 셔틀 벡터, 거대 분자, 미모토우프, 수용체, 역상 미셀 및 그들의 조합으로 구성되는 군으로부터 선택되고;
L은 임의로 존재하며, 존재하는 경우에는 알킬렌, 치환된 알킬렌, 알케닐렌, 치환된 알케닐렌, -O-, -O-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -S-, -S-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -S(O)k- (k는 1, 2 또는 3임), -S(O)k(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(O)-, -C(O)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(S)-, -C(S)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')-, -NR'-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(O)N(R')-, -CON(R')-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -CSN(R')-, -CSN(R')-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')CO-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')C(O)O-, -S(O)kN(R')-, -N(R')C(0)N(R')-, -N(R')C(S)N(R')-, -N(R')S(0)kN(R')-, -N(R')-N=, -C(R')=N-, -C(R')=N-N(R')-, -C(R')=N-N=, -C(R')2-N=N- 및 -C(R')2-N(R')-N(R')- (여기서, R'는 각각 독립적으로 H, 알킬 또는 치환된 알킬임)로 구성되는 군으로부터 선택됨);
(d) <화학식 XXX>
Figure 112007052373933-pct00056
(상기 식에서, A는 임의로 존재하고, 존재하는 경우에는 저급 알킬렌, 치환된 저급 알킬렌, 저급 시클로알킬렌, 치환된 저급 시클로알킬렌, 저급 알케닐렌, 치환된 저급 알케닐렌, 알키닐렌, 저급 헤테로알킬렌, 치환된 헤테로알킬렌, 저급 헤테로시클로알킬렌, 치환된 저급 헤테로시클로알킬렌, 아릴렌, 치환된 아릴렌, 헤테로아릴렌, 치환된 헤테로아릴렌, 알크아릴렌, 치환된 알크아릴렌, 아르알킬렌 또는 치환된 아르알킬렌이며;
R은 H, 알킬, 치환된 알킬, 시클로알킬 또는 치환된 시클로알킬이고;
R1은 H, 아미노 보호기, 수지, 아미노산, 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드이며;
R2는 OH, 에스테르 보호기, 수지, 아미노산, 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드이고;
X1은 C, S 또는 S(O)이고;
L은 알킬렌, 치환된 알킬렌, N(R')(알킬렌) 또는 N(R')(치환된 알킬렌)(여기서, R'는 독립적으로 H, 알킬, 치환된 알킬임)임);
(e) <화학식 XXXX>
Figure 112007052373933-pct00057
(상기 식에서, A는 임의로 존재하고, 존재하는 경우에는 저급 알킬렌, 치환된 저급 알킬렌, 저급 시클로알킬렌, 치환된 저급 시클로알킬렌, 저급 알케닐렌, 치환된 저급 알케닐렌, 알키닐렌, 저급 헤테로알킬렌, 치환된 헤테로알킬렌, 저급 헤테로시클로알킬렌, 치환된 저급 헤테로시클로알킬렌, 아릴렌, 치환된 아릴렌, 헤테로아릴렌, 치환된 헤테로아릴렌, 알크아릴렌, 치환된 알크아릴렌, 아르알킬렌 또는 치환된 아르알킬렌이며;
M은
Figure 112007052373933-pct00058
이고, 여기서, (a)는 A 기로의 결합을 나타내고, (b)는 각 카르보닐 기로의 결합을 나타내며;
R3 및 R4는 독립적으로 H, 할로겐, 알킬, 치환된 알킬, 시클로알킬 또는 치환된 시클로알킬로부터 선택되거나, R3 및 R4 또는 두 개의 R3 기 또는 두 개의 R4 기는 임의로는 함께 시클로알킬 또는 헤테로시클로알킬을 형성하고;
R은 H, 할로겐, 알킬, 치환된 알킬, 시클로알킬 또는 치환된 시클로알킬이고;
T3는 결합, C(R)(R), 0 또는 S이고;
R은 H, 할로겐, 알킬, 치환된 알킬, 시클로알킬 또는 치환된 시클로알킬이고;
R1은 H, 아미노 보호기, 수지, 아미노산, 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드이며;
R2는 OH, 에스테르 보호기, 수지, 아미노산, 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드임).
본 명세서에 기재된 방법 및 조성물의 하나의 측면은 번역후 변형된 적어도 하나, 비제한적인 예로는, 적어도 둘, 적어도 셋, 적어도 넷, 적어도 다섯, 적어도 여섯, 적어도 일곱, 적어도 여덟, 적어도 아홉, 적어도 열 개 또는 그 이상의 비-천연 아미노산을 갖는 적어도 하나의 폴리펩티드에 관한 것이다. 번역후 변형된 비-천연 아미노산은 동일하거나 상이할 수 있으며, 폴리펩티드 중에는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 또는 그 이상의 상이한 번역후 변형된 비-천연 아미노산을 포함하는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 또는 그 이상의 상이한 위치가 존재할 수 있다. 또 다른 측면에서, 조성물은 폴리펩티드에 존재하는 아미노산의 수 보다는 작지만 적어도 하나 이상의 아미노산이 번역후 변형된 비-천연 아미노산으로 치환된 폴리펩티드를 포함한다. 둘 이상의 번역후 변형된 비-천연 아미노산을 포함하는 폴리펩티드에 있어서, 번역후 변형된 비-천연 아미노산은 동일하거나 상이할 수 있으며, 예컨대, 폴리펩티드는 둘 이상의 상이한 유형의 번역후 변형된 비-천연 아미노산을 포함하거나, 동일한 번역후 변형된 비-천연 아미노산을 두 개 포함할 수 있다. 둘 이상의 번역후 변형된 비-천연 아미노산을 포함하는 폴리펩티드에 있어서, 번역후 변형된 비-천연 아미노산은 동일하거나 상이하거나, 또는 적어도 하나의 상이한 번역후 변형된 비-천연 아미노산을 갖는 동일한 유형의 다수의 번역후 변형된 비-천연 아미노산의 조합일 수 있다.
A. 비-천연 아미노산 폴리펩티드의 번역후 변형 방법: 카르보닐-함유 비-천연 아미노산과 히드록실아민-함유 화합물과의 반응
천연 아미노산의 측쇄는 고도로 친전자성인 위치가 없다. 따라서, 친전자체-함유 측쇄를 갖는 비-천연 아미노산, 비제한적인 예로서 케톤 또는 알데히드와 같은 카르보닐 또는 디카르보닐 기 함유 아미노산의 도입은, 카르보닐 또는 디카르보닐 기를 친핵 공격함으로써 측쇄를 위치-특이적으로 변형시키는 것을 가능하게 한다. 공격 친핵체가 히드록실아민인 경우, 옥심-유도 단백질이 생성될 것이다. 유도 및(또는) 추가의 변형 방법은 유도 단계 전에 정제된 단백질 또는 유도 단계 후에 수행될 수 있다. 또한, 유도 및(또는) 추가의 변형 방법은 그와 같은 변형 전 또는 후에 정제된 합성 중합체, 폴리사카라이드 또는 폴리뉴클레오티드로 수행될 수 있다. 또한 유도 단계는 온화한 산성 내지 약한 염기성, 비제한적인 예로서 pH 약 2 내지 8, 또는 pH 약 4 내지 8에서 일어날 수 있다.
카르보닐- 또는 디카르보닐-함유 폴리펩티드와 히드록실아민-치환된 분자의 반응에 기초한 폴리펩티드-유도 방법은 현저한 잇점을 갖는다. 첫째, 히드록실아민은 카르보닐- 또는 디카르보닐-함유 화합물과 pH 2 내지 8 (또 다른 실시태양에서는 pH 4 내지 8)에서 축합되어 옥심 부가물을 생성한다. 이와 같은 조건하에, 천연 아미노산의 측쇄는 비반응성이다. 둘째, 그와 같은 선택적인 화학 반응은 재조합 단백질의 위치-특이적 유도를 가능하게하며, 즉, 유도된 단백질을 정의된 바와 같이 균질한 생성물일 수 있다. 셋째로, 본 명세서에 기재된 카르보닐- 또는 디카르보닐-함유 폴리펩티드와 히드록실아민-치환된 분자의 반응에 필요한 온화하 조건은 일반적으로 폴리펩티드의 3차 구조를 비가역적으로 파괴하지 않는다 (반응의 목적이 그와 같은 3차 구조의 파괴인 경우는 제외함). 마지막으로, 히드록실아민의 아미노 기가 이. 콜라이에 의해 대사되는 것으로 보이나, 히드록실아민과 카르보닐- 또는 디카르보닐-함유 화합물과의 축합은 생물학적 조건하에 안정한 옥심 부가물을 생성한다.
단지 예를 들자면, 하기 비-천연 아미노산은 카르보닐- 또는 디카르보닐-함유 비-천연 아미노산 폴리펩티드를 추가로 변형하는데 사용될 수 있는 것으로 본 명세서에 기재된 히드록실아민 함유 화합물과 반응성인, 카르보닐- 또는 디카르보닐-함유 유형의 아미노산이다:
<화학식 I>
Figure 112007052373933-pct00059
상기 식에서,
A는 임의로 존재하고, 존재하는 경우에는 저급 알킬렌, 치환된 저급 알킬렌, 저급 시클로알킬렌, 치환된 저급 시클로알킬렌, 저급 알케닐렌, 치환된 저급 알케닐렌, 알키닐렌, 저급 헤테로알킬렌, 치환된 헤테로알킬렌, 저급 헤테로시클로알킬렌, 치환된 저급 헤테로시클로알킬렌, 아릴렌, 치환된 아릴렌, 헤테로아릴렌, 치환된 헤테로아릴렌, 알크아릴렌, 치환된 알크아릴렌, 아르알킬렌 또는 치환된 아르알킬렌이며;
B는 임의로 존재하고, 존재하는 경우에는 저급 알킬렌, 치환된 저급 알킬렌, 저급 알케닐렌, 치환된 저급 알케닐렌, 저급 헤테로알킬렌, 치환된 저급 헤테로알킬렌, -O-, -O-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -S-, -S-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -S(O)k- (k는 1, 2 또는 3임), -S(O)k(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(O)-, -NS(O)2-, -OS(O)2-, -C(O)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(S)-, -C(S)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')-, -NR'-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(O)N(R')-, -CON(R')-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -CSN(R')-, -CSN(R')-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')CO-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')C(O)O-, -S(O)kN(R')-, -N(R')C(0)N(R')-, -N(R')C(S)N(R')-, -N(R')S(O)kN(R')-, -N(R')-N=, -C(R')=N-, -C(R')=N-N(R')-, -C(R')=N-N=, -C(R')2-N=N- 및 -C(R')2-N(R')-N(R')-(여기서, R' 는 각각 독립적으로 H, 알킬 또는 치환된 알킬임)로 구성되는 군으로부터 선택되는 링커이며;
J는
Figure 112007052373933-pct00060
이고;
R은 H, 알킬, 치환된 알킬, 시클로알킬 또는 치환된 시클로알킬이며;
R"는 각각 독립적으로 H, 알킬, 치환된 알킬 또는 보호기이거나, 2개 이상의 R" 기가 존재하는 경우, 2개의 R"는 임의로는 헤테로시클로알킬을 형성하고;
R1은 H, 아미노 보호기 또는 수지이며;
R2는 OH, 에스테르 보호기 또는 수지이고;
R3 및 R4는 각각 독립적으로 H, 할로겐, 저급 알킬 또는 치환된 저급 알킬이거나, R3와 R4 또는 2개의 R3 기가 임의로는 시클로알킬 또는 헤테로시클로알킬을 형성하며;
-A-B-J-R 기는 함께 디카르보닐 기를 포함하는 카르보닐 기, 보호된 디카르보닐 기를 포함하는 보호된 카르보닐 기, 또는 차폐된 디카르보닐 기를 포함하는 차페된 카르보닐 기를 적어도 하나 포함하는 비시클릭 또는 트리시클릭 시클로알킬 또는 헤테로시클로알킬을 형성하거나;
-J-R 기는 함께 디카르보닐 기를 포함하는 카르보닐 기, 보호된 디카르보닐 기를 포함하는 보호된 카르보닐 기, 또는 차폐된 디카르보닐 기를 포함하는 차폐된 카르보닐 기를 적어도 하나 포함하는 모노시클릭 또는 비시클릭 시클로알킬 또는 헤테로시클로알킬을 형성한다.
특정 실시태양에서, 화학식 (I)의 화합물은 온화한 산성 조건하에 수성 용액 중에서 히드록실아민과 반응성이다. 특정 실시태양에서, 그와 같은 산성 조건은 pH 2 내지 8이다.
상기한 목적을 위하여, 예를 들어, 화학식 (I)의 화합물은 하기 화학식 (XXX)의 구조를 갖는 화합물을 포함한다.
<화학식 XXX>
Figure 112007052373933-pct00061
상기 식에서, A는 임의로 존재하고, 존재하는 경우에는 저급 알킬렌, 치환된 저급 알킬렌, 저급 시클로알킬렌, 치환된 저급 시클로알킬렌, 저급 알케닐렌, 치환된 저급 알케닐렌, 알키닐렌, 저급 헤테로알킬렌, 치환된 헤테로알킬렌, 저급 헤테로시클로알킬렌, 치환된 저급 헤테로시클로알킬렌, 아릴렌, 치환된 아릴렌, 헤테로아릴렌, 치환된 헤테로아릴렌, 알크아릴렌, 치환된 알크아릴렌, 아르알킬렌 또는 치환된 아르알킬렌이며;
R은 H, 알킬, 치환된 알킬, 시클로알킬 또는 치환된 시클로알킬이고;
R1은 H, 아미노 보호기, 수지, 아미노산, 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드이며;
R2는 OH, 에스테르 보호기, 수지, 아미노산, 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드이고;
X1은 C, S 또는 S(O)이고;
L은 알킬렌, 치환된 알킬렌, N(R')(알킬렌) 또는 N(R')(치환된 알킬렌)(여기서, R'는 독립적으로 H, 알킬, 치환된 알킬임)이다.
상기한 목적을 위하여, 예를 들어, 화학식 (I)의 화합물은 하기 화학식 (XXXX)의 구조를 갖는 화합물을 포함한다.
<화학식 XXXX>
Figure 112007052373933-pct00062
상기 식에서, A는 임의로 존재하고, 존재하는 경우에는 저급 알킬렌, 치환된 저급 알킬렌, 저급 시클로알킬렌, 치환된 저급 시클로알킬렌, 저급 알케닐렌, 치환된 저급 알케닐렌, 알키닐렌, 저급 헤테로알킬렌, 치환된 헤테로알킬렌, 저급 헤테로시클로알킬렌, 치환된 저급 헤테로시클로알킬렌, 아릴렌, 치환된 아릴렌, 헤테로아릴렌, 치환된 헤테로아릴렌, 알크아릴렌, 치환된 알크아릴렌, 아르알킬렌 또는 치환된 아르알킬렌이며;
M은
Figure 112007052373933-pct00063
이고, 여기서, (a)는 A 기로의 결합을 나타내고, (b)는 각 카르보닐 기로의 결합을 나타내며;
R3 및 R4는 독립적으로 H, 할로겐, 알킬, 치환된 알킬, 시클로알킬 또는 치환된 시클로알킬로부터 선택되거나, R3 및 R4 또는 두 개의 R3 기 또는 두 개의 R4 기는 임의로는 함께 시클로알킬 또는 헤테로시클로알킬을 형성하고;
R은 H, 할로겐, 알킬, 치환된 알킬, 시클로알킬 또는 치환된 시클로알킬이고;
T3는 결합, C(R)(R), 0 또는 S이고;
R은 H, 할로겐, 알킬, 치환된 알킬, 시클로알킬 또는 치환된 시클로알킬이고;
R1은 H, 아미노 보호기, 수지, 아미노산, 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드이며;
R2는 OH, 에스테르 보호기, 수지, 아미노산, 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드이다.
폴리펩티드 내에 카르보닐- 또는 디카르보닐-함유 비-천연 아미노산이 위치함으로써 히드록실아민 화합물이 그 카르보닐- 또는 디카르보닐-함유 비-천연 아미노산과 반응할 수 있고, 폴리펩티드의 3차 구조를 파괴하는 변형된 비-천연 아미노산을 생성하지 않는 한 (3차 구조의 파괴가 반응의 목적인 경우를 제외함), 실질적으로 그와 같은 카르보닐- 또는 디카르보닐-함유 비-천연 아미노산을 포함하는 폴리펩티드의 유형에는 제한이 없다.
예를 들어, 하기 히드록실아민-함유 화합물은 본 명세서에 기재된 카르보닐- 또는 디카르보닐-함유 비-천연 아미노산과 반응성이고, 카르보닐- 또는 디카르보닐-함유 비-천연 아미노산 폴리펩티드를 추가로 변형시킬 수 있는 히드록실아민-함유 화합물의 유형이다:
Figure 112007052373933-pct00064
상기 식에서,
X는 각각 독립적으로 H, 알킬, 치환된 알킬, 알케닐, 치환된 알케닐, 알키닐, 치환된 알키닐, 알콕시, 치환된 알콕시, 알킬알콕시, 치환된 알킬알콕시, 폴리 알킬렌 옥시드, 치환된 폴리알킬렌 옥시드, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 알크아릴, 치환된 알크아릴, 아르알킬, 치환된 아르알킬, -(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-ON(R")2, -(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-C(O)SR", -(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-S-S-(아릴 또는 치환된 아릴), -C(O)R", -C(O)2R" 또는 -C(O)N(R")2 (여기서, R"는 각각 독립적으로 수소, 알킬, 치환된 알킬, 알케닐, 치환된 알케닐, 알콕시, 치환된 알콕시, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 알크아릴, 치환된 알크아릴, 아르알킬, 치환된 아르알킬임)이거나;
X는 각각 독립적으로 표지, 염료, 중합체, 수용성 중합체, 폴리에틸렌 글리콜 유도체, 광가교결합제, 세포독성 화합물, 약물, 친화도 표지, 광친화도 표지, 반응성 화합물, 수지, 제2의 단백질 또는 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 유사체, 항체 또는 항체 단편, 금속 킬레이트제, 조인자, 지방산, 탄수화물, 폴리뉴클레오티드, DNA, RNA, 안티센스 폴리뉴클레오티드, 사카라이드, 수용성 덴드리머, 시클로덱스트린, 생물질, 나노입자, 스핀 표지, 형광물질, 금속-함유 잔기, 방사성 잔기, 신규 관능기, 다른 분자와 공유적으로 또는 비공유적으로 상호작용하는 기, 포토케이지드 잔기, 화학선 여기가능한 잔기, 리간드, 광이성화성 잔기, 비오틴, 비오틴 유사체, 중량급 원자를 포함하는 잔기, 화학적으로 절단가능한 기, 광-절단가능한 기, 신장된 측쇄, 탄소-결합 당, 산화환원 활성제, 아미노 티오산, 독성 잔기, 동위원소 표지된 잔기, 생물리학적 프로브, 인광 기, 화학발광 기, 전자밀도가 높은 기, 자성 기, 인터캘레이팅 기, 발색단, 에너지 전달기, 생물학적 활성제, 검출가 능한 표지, 소분자, 억제성 리보핵산, 방사성 핵종, 중성자 포획제, 비오틴 유도체, 콴텀 도트, 나노트랜스미터, 라디오트랜스미터, 아브자임, 활성화된 복합 활성화제, 바이러스, 보조제, 아글리칸, 알러간, 안지오스타틴, 항호르몬, 항산화제, 압타머, 가이드 RNA, 사포닌, 셔틀 벡터, 거대 분자, 미모토우프, 수용체, 역상 미셀 및 그들의 조합으로 구성되는 군으로부터 선택되고;
L은 각각 독립적으로 알킬렌, 치환된 알킬렌, 알케닐렌, 치환된 알케닐렌, -O-, -O-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -S-, -S-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -S(O)k- (k는 1, 2 또는 3임), -S(O)k(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(O)-, -C(O)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(S)-, -C(S)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')-, -NR'-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(O)N(R')-, -CON(R')-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-N(R')C(O)O-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -O-CON(R')-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -CSN(R')-, -CSN(R')-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')CO-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')C(O)O-, -N(R')C(O)O-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -S(O)kN(R')-, -N(R')C(0)N(R')-, -N(R')C(0)N(R')-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')C(S)N(R')-, -N(R')S(0)kN(R')-, -N(R')-N=, -C(R')=N-, -C(R')=N-N(R')-, -C(R')=N-N=, -C(R')2-N=N- 및 -C(R')2-N(R')-N(R')- (여기서, R'는 각각 독립적으로 H, 알킬 또는 치환된 알킬임)로 구성되는 군으로부터 선택됨)로 구성되는 군으로부터 선택되며;
L1은 임의로 존재하고, 존재하는 경우, -C(R')p-NR'-C(O)O-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)- (p는 0, 1 또는 2이고; R'은 각각 독립적으로 H, 알킬 또는 치환된 알킬임)이고;
W는 -N(R8)2 (여기서, R8은 각각 독립적으로 H 또는 아미노 보호기임)이고;
n은 1 내지 3이며; 단, L-L1-W는 함께 비-천연 아미노산 또는 "변형 또는 비변형된" 비-천연 아미노산 폴리펩티드 상의 카르보닐 기(디카르보닐 기 포함)와 반응할 수 있는 적어도 하나의 히드록실아민 기를 제공한다.
화학식 (XIX)의 화합물의 특정 실시태양에서, X는 알킬, 치환된 알킬, 알케닐, 치환된 알케닐, 알키닐, 치환된 알키닐, 알콕시, 치환된 알콕시, 알킬알콕시, 치환된 알킬알콕시, 폴리알킬렌 옥시드, 치환된 폴리알킬렌 옥시드, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 알크아릴, 치환된 알크아릴, 아르알킬, 치환된 아르알킬을 포함하는 중합체이다. 화학식 (XIX)의 화합물의 특정 실시태양에서, X는 폴리알킬렌 옥시드 또는 치환된 폴리알킬렌 옥시드를 포함하는 중합체이다. 화학식 (XIX)의 화합물의 특정 실시태양에서, X는 -[(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-O-(수소, 알킬 또는 치환된 알킬)]x (x는 20 내지 10,000임)를 포함하는 중합체이다. 화학식 (XIX)의 화합물을 포함하는 특정 실시태양에서, X는 분자량 약 2 내지 40 KDa의 m-PEG이다. 화학식 (XIX)의 화합물을 포함하는 특정 실시태양에서, X는 펩티드, 단백질, 효소, 항체, 약물, 염료, 지질, 뉴클레오시드, 올리고뉴클레오티드, 세포, 바이러스, 리포조옴, 마이크로입자 및 미셀로 구성되는 군으로 부터 선택되는 생물학적 활성제이다. 화학식 (XIX)의 화합물을 포함하는 특정 실시태양에서, X는 항생제, 항진균제, 항바이러스제, 소염제, 항종양제, 심혈관계 치료제, 항불안제, 호르몬, 성장 인자 및 스테로이드제로 구성되는 군으로부터 선택되는 약물이다. 화학식 (XIX)의 화합물을 포함하는 특정 실시태양에서, X는 양고추냉이 퍼옥시다제, 알칼라인 포스파타제, β-갈락토시다제 및 글루코스 옥시다제 로 구성되는 군으로부터 선택되는 효소이다. 화학식 (XIX)의 화합물을 포함하는 특정 실시태양에서, X는 형광물질, 인광물질, 화학발광 기, 킬레이트 기, 전자밀도가 높은 기, 자성 기, 인터켈레이팅 기, 방사성 기, 발색단 및 에너지 전달 잔기로 구성되는 군으로부터 선택되는 검출가능한 표지이다. 화학식 (XIX)의 화합물을 포함하는 특정 실시태양에서, L은 -N(R')CO-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -CON(R')-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')C(O)N(R')-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -O- CON(R')-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -O-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(O)N(R')- 및 -N(R')C(O)O-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-로 구성되는 군으로부터 선택된다.
화학식 (XIX)의 화합물을 포함하는 특정 실시태양에는 화학식 (XX)의 구조를 갖는 화합물이 포함된다.
Figure 112007052373933-pct00065
화학식 (XX)의 화합물의 특정 실시태양에는 하기 화합물로 구성되는 군으로 부터 선택되는 화합물이 포함된다:
Figure 112007052373933-pct00066
다른 실시태양에서, m-PEG 또는 PEG 기는 분자량이 5 내지 30 kDa이다.
화학식 (XIX)의 화합물의 특정 실시태양에는 화학식 (XXI)의 구조를 갖는 화합물이 포함된다:
Figure 112007052373933-pct00067
화학식 (XXI)의 화합물의 특정 실시태양에는 하기 화합물로 구성되는 군으로부터 선택되는 화합물이 포함된다:
Figure 112007052373933-pct00068
화학식 (XIX)의 화합물의 특정 실시태양에은 화학식 (XXII)의 구조를 갖는 화합물이 포함된다:
Figure 112007052373933-pct00069
화학식 (XXII)의 화합물의 특정 실시태양에서, L은 -(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-N(R')C(O)O-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-이다. 화학식 (XXII)의 화합물의 특정 실시태양에는 화학식 (XXIII)의 구조를 갖는 화합물이 포함된다:
Figure 112007052373933-pct00070
화학식 (XXII)의 화합물의 다른 실시태양에서, m-PEG 기의 분자량은 5 내지 30 kDa이다.
화학식 (XIX)의 화합물의 특정 실시태양에는 화학식 (XXIV)의 구조를 갖는 화합물이 포함된다:
Figure 112007052373933-pct00071
화학식 (XXIV)의 화합물의 특정 실시태양에서, L은 -(알킬렌 또는 치환된 알 킬렌)-N(R')C(O)O-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)- 또는 -N(R')C(O)O-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-이다. 화학식 (XXIV)의 화합물의 특정 실시태양에는 화학식 (XXV)의 구조를 갖는 화합물이 포함된다:
Figure 112007052373933-pct00072
화학식 (XXIV)의 화합물의 다른 실시태양에서, m-PEG 기의 분자량은 5 내지 30 kDa이다.
화학식 (XIX)의 화합물의 특정 실시태양에는 화학식 (XXVI)의 구조를 갖는 화합물이 포함된다:
Figure 112007052373933-pct00073
(상기 식에서, R10은 각각 독립적으로 H 또는 아미노 보호기임)
화학식 (XXVI)의 화합물의 특정 실시태양에서, 폴리알킬렌 옥시드는 PEG이다. 화학식 (XXVI)의 화합물의 다른 실시태양에서, PEG 기는 분자량이 5 내지 30 kDa이다. 화학식 (XXVI)의 화합물의 또 다른 실시태양은 하기 화합물이다:
Figure 112007052373933-pct00074
히드록실아민을 폴리펩티드 상의 카르보닐-함유 비-천연 아미노산에 커플링시키는 방법의 3가지 예시적인 실시태양이 도 7에 나타나있다. 이 예시적 실시태양에서, 히드록실아민-유도된 화합물이 카르보닐-함유 비-천연 아미노산 폴리펩티드의 완충 용액(pH 2-8)에 가해진다. 반응은 주위 온도에서 수 시간 내지 수 일 동안 진행된다. 결합을 가속화하기 위해, 도 8에 제시된 바와 같은 첨가제를 가한다. 그와 같은 화합물은 본 명세서에 가속화제라고도 칭해진다. 특정 실시태양에서, 가속화제 또는 첨가제는 염기 촉매 반응할 수 있다. 생성된 옥심-함유 비-천연 아미노산 폴리펩티드는 HPLC, FPLC 또는 크기-배제 크로마토그래피에 의해 정제된다.
하나의 실시태양에서, 다중 링커 화합물은 카르보닐- 또는 디카르보닐-치환 비-천연 아미노산 폴리펩티드와 위치-특이적으로 반응할 수 있다. 하나의 실시태양에서, 본 명세서에 기재된 링커 방법은 적어도 하나의 링커 말단(일-, 이- 또는 다관능성 링커의)에 히드록실아민 관능기를 함유하는 링커를 사용한다. 히드록실아민-유도된 링커와 케토-치환된 단백질의 축합은 안정한 옥심 결합을 생성한다. 이- 및(또는) 다관능성 링커(예를 들어, 다른 결합 화학기를 갖는 히드록실아민)는 비-천연 아미노산 폴리펩티드에 상이한 분자들(예를 들어, 다른 단백질, 중합체 또는 소분자)을 위치-특이적으로 연결시키는 반면, 일-관능성 링커 (모든 말단에 히드록실아민-치환됨)는 비-천연 아미노산 폴리펩티드의 위치-특이적 이합체화 또는 올리고머화를 촉진한다. 이와 같은 링커 전략을 본 명세서에 기재된 생체내 번역 기술과 조합함으로써, 화학적으로 조절된 단백질의 3차원 구조를 특정하는 것이 가능하다.
특정 실시태양은 적어도 하나의 화학식 I - XVIII, XXX - XXXIV (A 및 B), 또는 XXXX - XXXXIII의 아미노산을 포함하는 폴리펩티드를 화학식 (XIX)의 화합물과 접촉시키는 것을 포함하는, 화학식 I - XVIII, XXX - XXXIV (A 및 B) 및 XXXX - XXXXIII 및 이의 하위 화학식의 범위에 속하는 아미노산 및 그 범위에 속하는 특정 아미노산을 포함하는 폴리펩티드를 유도하는 방법이다. 특정 실시태양에서, 폴리펩티드는 화학식 (XIX)의 화합물과 접촉 전 또는 후에 정제된다. 다른 실시태양에서, 생성된 유도된 폴리펩티드는 화학식 (XI)에 상응하는 적어도 하나의 옥심-함유 아미노산을 포함하는 반면, 다른 실시태양에서 그와 같은 유도된 폴리펩티드는 온화한 산성 조건하에 수성 용액 중 적어도 한 달 이상 안정하다. 다른 실시태양에서, 그와 같은 유도된 폴리펩티드는 온화한 산성 조건하에 적어도 2주 이상 안정하다. 다른 실시태양에서, 그와 같은 유도된 폴리펩티드는 온화한 산성 조건하에 적어도 5일 이상 안정하다. 다른 실시태양에서, 그와 같은 조건은 pH 2 내지 8이다. 특정 실시태양에서, 유도된 폴리펩티드의 3차 구조는 보존된다. 다른 실시태양에서, 폴리펩티드의 유도는 유도된 폴리펩티드를 다른 폴리펩티드에 연결시키는 것을 포함한다. 다른 실시태양에서, 유도되는 폴리펩티드는 다음 군으로부터 선택되는 치료용 단백질에 상동적일 수 있다: 알파-1 안티트립신, 안지오스타틴, 항용혈 인자, 항체, 항체 단편, 아포리포단백질, 아포단백질, 심방 나트륨이뇨 인자, 심방 나트륨이뇨 폴리펩티드, 심방 펩티드, C-X-C 케모카인, T39765, NAP-2, ENA-78, gro-a, gro-b, gro-c, IP-10, GCP-2, NAP-4, SDF-1, PF4, MIG, 칼시토닌, c-키트 리간드, 사이토카인, CC 케모카인, 단핵구 화학유인 단백질-1, 단핵구 화학유인 단백질-2, 단핵구 화학유인 단백질-3, 단핵구 소염 단백질-1 알파, 단핵구 소염 단백질-1 베타, RANTES, 1309, R83915, R91733, HCC1, T58847, D31065, T64262, CD40, CD40 리간드, c-키트 리간드, 콜라겐, 콜로니 자극인자 (CSF), 보체 인자 5a, 보체 억제제, 보체 수용체 1, 사이토카인, 상피 호중구 활성화 펩티드-78, MIP-16, MCP-1, 표피 성장 인자 (EGF), 상피 호중구 활성화 펩티드, 에리쓰로포이에틴 (EPO), 박리 독소, 인자 IX, 인자 VII, 인자 VIII, 인자 X, 섬유아세포 성장 인자 (FGF), 피브리노겐, 피브로넥틴, 4중 나선 번들 단백질, G-CSF, glp-1, GM-CSF, 글루코세레브로시다제, 고나도트로핀, 성장 인자, 성장 인자 수용체, grf, 헷지호그 단백질, 헤모글로빈, 간세포 성장 인자 (hGF), 히루딘, 인간 성장 인자 (hGH), 인간 혈청 알부민, ICAM-1, ICAM-1 수용체, LFA-1, LFA-1 수용체, 인슐린, 인슐린-유사 성장 인자 (IGF), IGF-I, IGF-II, 인터페론 (IFN), IFN-알파, IFN-베타, IFN-감마, 인터루킨 (IL), IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, 각질 세포 성장 인자 (KGF), 락토페린, 백혈병 억제 인자, 루시퍼라제, 뉴투린, 호중구 억제 인자 (NIF), 온코스타틴 M, 골원성 단백질, 종양유전자 생성물, 파라시토닌, 부갑상선 호르몬, PD-ECSF, PDGF, 펩티드 호르몬, 플레이오트로핀, 단백질 A, 단백질 G, pth, 발열성 외독소 A, 발열성 외독소 B, 발열성 외독소 C, pyy, 릴랙신, 레닌, SCF, 생합성 소 단백질, 가용성 보체 수용체 I, 가용성 I-CAM 1, 가용성 인터루킨 수용체, 가용성 TNF 수용체, 소마토메딘, 소마토스타틴, 소마토트로핀, 스트렙토키나제, 슈퍼항원, 스타필로코커스 내독소, SEA, SEB, SECl, SEC2, SEC3, SED, SEE, 스테로이드 호르몬 수용체, 슈퍼옥시드 디스뮤타제, 독성 쇼크 증후 독소, 티모신 알파 1, 조직 플라스미노겐 활성화제, 종양 성장 인자 (TGF), 종양 괴사 인자, 종양 괴사 인자 알파, 종양 괴사 인자 베타, 종양 괴사 인자 수용체 (TNFR), VLA-4 단백질, VCAM-1 단백질, 혈관 내피 성장 인자 (VEGF), 유로키나제, mos, ras, raf, met, ρ53, tat, fos, myc, jun, myb, rel, 에스트로겐 수용체, 프로게스테론 수용체, 테스토스테론 수용체, 알도스테론 수용체, LDL 수용체 및 코르티코스테론.
특정 실시태양은 (i) 화학식 (I)의 아미노산을 포함하는 제1 폴리펩티드를 화학식 (XXVI)의 화합물로 유도하는 단계; 및 (ii) 단계 (i)에서 생성된 유도된 단백질을 화학식 (I)의 아미노산을 포함하는 제2 폴리펩티드와 접촉시켜 제1 및 제2 폴리펩티드를 포함하는 이합체를 생성하는 단계를 포함하는, 폴리펩티드 이합체의 제조 방법이다. 다른 실시태양은 제1 및 제2 폴리펩티드가 화학식 (II)에 상응하는 아미노산을 포함하는 제1 및 제2 폴리펩티드의 이합체를 제조하는 방법이다. 특정 실시태양에서, 폴리펩티드는 화학식 (XXVI)의 화합물과 접촉 전 또는 후에 정제된다. 다른 실시태양에서, 단계 (i)에서 생성된 유도된 단백질은 화학식 (XXVIII)에 상응하는 적어도 하나의 옥심-함유 아미노산을 포함한다:
Figure 112007052373933-pct00075
B. 비-천연 아미노산 폴리펩티드의 번역후 변형 방법: 옥심-함유 비-천연 아미노산과 카르보닐-함유 화합물의 반응
옥심-함유 단백질과 카르보닐- 또는 디카르보닐-치환된 분자의 교환 반응에 기초한 단백질 유도 방법은 차별된 잇점을 갖는다. 첫째로, 연구 결과 아미노산 기초 옥심 부가물은 본래의 옥심을 생성하는데 사용된 것보다 반응성인 카르보닐- 또는 디카르보닐-함유 화합물과의 평형에 의한 옥심 교환을 일으키는 것으로 나타났다. 이러한 교환 반응은 pH 4 내지 8의 범위에서 일어나며, 이러한 조건하에 천연 아미노산의 측쇄는 비반응성이다. 따라서, 옥심-함유 단백질과의 반응에 적절한 카르보닐- 또는 디카르보닐-치환된 분자의 제조에 일반적인 방법은 광범위한 위치-특이적으로 유도된 단백질로의 접근을 제공할 수 있다. 생체내 번역 기술의 이와 같은 관점에서, 단백질을 유도하는데 전형적으로 사용되는 분자 (비제한적인 예로서, 폴리에틸렌 글리콜과 같은 친수성 중합체 포함)의 카르보닐- 또는 디카르보닐-치환된 형태를 제조하는 일반적인 방법이 유용하며, 광범위한 위치-특이적으로 유도된 폴리펩티드로의 접근을 제공할 수 있을 것이다. 둘째로, 그와 같은 선택적인 화학기는 재조합 단백질을 위치-특이적으로 유도하는 것을 가능케하여, 유도된 단백질이 정의된 바와 같이 균질한 생성물로 제조될 수 있게 한다. 세째로, 본 명 세서에 기재된 교환 반응을 수행하는데 필요한 온화한 반응 조건은 일반적으로 폴리펩티드의 3차 구조를 비가역적으로 파괴하지 않는다(반응의 목적이 3차 구조를 파괴하는 것인 경우는 제외). 마지막으로, 교환 반응은 생물학적 조건하에 안정한 새로운 옥심 부가물을 생성한다.
예를 들어, 하기 비-천연 아미노산은 본 명세서에 기재된 카르보닐- 또는 디카르보닐-함유 비-천연 아미노산과 반응성이고, 새로운 옥심-함유 비-천연 아미노산 폴리펩티드를 생성할 수 있는 옥심-함유 아미노산의 유형이다:
[화학식 XI]
Figure 112007052373933-pct00076
상기 식에서,
A는 임의로 존재하고, 존재하는 경우에는 저급 알킬렌, 치환된 저급 알킬렌, 저급 시클로알킬렌, 치환된 저급 시클로알킬렌, 저급 알케닐렌, 치환된 저급 알케닐렌, 알키닐렌, 저급 헤테로알킬렌, 치환된 헤테로알킬렌, 저급 헤테로시클로알킬렌, 치환된 저급 헤테로시클로알킬렌, 아릴렌, 치환된 아릴렌, 헤테로아릴렌, 치환된 헤테로아릴렌, 알크아릴렌, 치환된 알크아릴렌, 아르알킬렌 또는 치환된 아르알킬렌이며;
B는 임의로 존재하고, 존재하는 경우에는 저급 알킬렌, 치환된 저급 알킬렌, 저급 알케닐렌, 치환된 저급 알케닐렌, 저급 헤테로알킬렌, 치환된 저급 헤테로알 킬렌, -O-, -O-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -S-, -S-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -S(O)k- (k는 1, 2 또는 3임), -S(O)k(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(O)-, -NS(O)2-, -OS(O)2-, -C(O)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(S)-, -C(S)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')-, -NR'-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(O)N(R')-, -CON(R')-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -CSN(R')-, -CSN(R')-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')CO-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')C(O)O-, -S(O)kN(R')-, -N(R')C(0)N(R')-, -N(R')C(S)N(R')-, -N(R')S(O)kN(R')-, -N(R')-N=, -C(R')=N-, -C(R')=N-N(R')-, -C(R')=N-N=, -C(R')2-N=N- 및 -C(R')2-N(R')-N(R')-(여기서, R' 는 각각 독립적으로 H, 알킬 또는 치환된 알킬임)로 구성되는 군으로부터 선택되는 링커이며;
R은 H, 알킬, 치환된 알킬, 시클로알킬 또는 치환된 시클로알킬이고;
R1은 H, 아미노 보호기, 수지, 아미노산, 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드이며;
R2는 OH, 에스테르 보호기, 수지, 아미노산, 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드이고;
R3 및 R4는 독립적으로 H, 할로겐, 저급 알킬, 치환된 저급 알킬이거나, R3 및 R4 또는 두 개의 R3 기는 임의로는 함께 시클로알킬 또는 헤테로시클로알킬을 형성하고;
R5는 H, 알킬, 치환된 알킬, 알케닐, 치환된 알케닐, 알키닐, 치환된 알키닐, 알콕시, 치환된 알콕시, 알킬알콕시, 치환된 알킬알콕시, 폴리알킬렌 옥시드, 치환된 폴리알킬렌 옥시드, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 알크아릴, 치환된 알크아릴, 아르알킬, 치환된 아르알킬, -(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-ON(R")2, -(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-C(O)SR", -(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-S-S-(아릴 또는 치환된 아릴), -C(O)R", -C(O)2R", -C(0)N(R")2 (여기서, 각 R"는 독립적으로 수소, 알킬, 치환된 알킬, 알케닐, 치환된 알케닐, 알콕시, 치환된 알콕시, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 알크아릴, 치환된 알크아릴, 아르알킬, 치환된 아르알킬임)이거나,
R5는 L-X이고;
X는 표지, 염료, 중합체, 수용성 중합체, 폴리에틸렌 글리콜 유도체, 광가교결합제, 세포독성 화합물, 약물, 친화도 표지, 광친화도 표지, 반응성 화합물, 수지, 제2의 단백질 또는 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 유사체, 항체 또는 항체 단편, 금속 킬레이트제, 조인자, 지방산, 탄수화물, 폴리뉴클레오티드, DNA, RNA, 안티센스 폴리뉴클레오티드, 사카라이드, 수용성 덴드리머, 시클로덱스트린, 생물질, 나노입자, 스핀 표지, 형광물질, 금속-함유 잔기, 방사성 잔기, 신규 관능기, 다른 분자와 공유적으로 또는 비공유적으로 상호작용하는 기, 포토케이지드 잔기, 화학선 여기가능한 잔기, 리간드, 광이성화성 잔기, 비오틴, 비오틴 유사체, 중량급 원자를 포함하는 잔기, 화학적으로 절단가능한 기, 광-절단가능한 기, 신장된 측쇄, 탄소-결합 당, 산화환원 활성제, 아미노 티오산, 독성 잔기, 동위원소 표지된 잔기, 생물리학적 프로브, 인광 기, 화학발광 기, 전자밀도가 높은 기, 자성 기, 인터캘레이팅 기, 발색단, 에너지 전달기, 생물학적 활성제, 검출가능한 표지, 소분자, 억제성 리보핵산, 방사성 핵종, 중성자 포획제, 비오틴 유도체, 콴텀 도트, 나노트랜스미터, 라디오트랜스미터, 아브자임, 활성화된 복합 활성화제, 바이러스, 보조제, 아글리칸, 알러간, 안지오스타틴, 항호르몬, 항산화제, 압타머, 가이드 RNA, 사포닌, 셔틀 벡터, 거대 분자, 미모토우프, 수용체, 역상 미셀 및 그들의 조합으로 구성되는 군으로부터 선택되고;
L은 임의로 존재하며, 존재하는 경우, 알킬렌, 치환된 알킬렌, 알케닐렌, 치환된 알케닐렌, -O-, -O-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -S-, -S-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -S(O)k- (k는 1, 2 또는 3임), -S(O)k(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(O)-, -C(O)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(S)-, -C(S)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')-, -NR'-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(O)N(R')-, -CON(R')-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -CSN(R')-, -CSN(R')-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')CO-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')C(O)O-, -(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-O-N=CR'-, -(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-C(O)N(R')-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-S(O)k-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-S-, -(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-S-S-, -S(O)kN(R')-, -N(R')C(0)N(R')-, -N(R')C(S)N(R')-, -N(R')S(0)kN(R')-, -N(R')-N=, -C(R')=N-, -C(R')=N-N(R')-, -C(R')=N-N=, -C(R')2-N=N- 및 -C(R')2-N(R')-N(R')- (여기서, R'는 각각 독립적으로 H, 알킬 또는 치환된 알킬임)로 구성되는 군으로부터 선택되는 링커이다.
예를 들어, 하기 비-천연 아미노산은 본 명세서에 기재된 카르보닐- 또는 디카르보닐-함유 비-천연 아미노산과 반응성이고, 새로운 옥심-함유 비-천연 아미노산 폴리펩티드를 생성할 수 있는 옥심-함유 아미노산의 유형이다:
<화학식 XVI>
Figure 112007052373933-pct00077
상기 식에서,
A는 임의로 존재하고, 존재하는 경우에는 저급 알킬렌, 치환된 저급 알킬렌, 저급 시클로알킬렌, 치환된 저급 시클로알킬렌, 저급 알케닐렌, 치환된 저급 알케닐렌, 알키닐렌, 저급 헤테로알킬렌, 치환된 헤테로알킬렌, 저급 헤테로시클로알킬렌, 치환된 저급 헤테로시클로알킬렌, 아릴렌, 치환된 아릴렌, 헤테로아릴렌, 치환된 헤테로아릴렌, 알크아릴렌, 치환된 알크아릴렌, 아르알킬렌 또는 치환된 아르알킬렌이며;
B는 임의로 존재하고, 존재하는 경우에는 저급 알킬렌, 치환된 저급 알킬렌, 저급 알케닐렌, 치환된 저급 알케닐렌, 저급 헤테로알킬렌, 치환된 저급 헤테로알킬렌, -O-, -O-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -S-, -S-(알킬렌 또는 치환된 알킬 렌)-, -S(O)k- (k는 1, 2 또는 3임), -S(O)k(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(O)-, -NS(O)2-, -OS(O)2-, -C(O)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(S)-, -C(S)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')-, -NR'-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(O)N(R')-, -CON(R')-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -CSN(R')-, -CSN(R')-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')CO-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')C(O)O-, -S(O)kN(R')-, -N(R')C(0)N(R')-, -N(R')C(S)N(R')-, -N(R')S(O)kN(R')-, -N(R')-N=, -C(R')=N-, -C(R')=N-N(R')-, -C(R')=N-N=, -C(R')2-N=N- 및 -C(R')2-N(R')-N(R')-(여기서, R' 는 각각 독립적으로 H, 알킬 또는 치환된 알킬임)로 구성되는 군으로부터 선택되는 링커이며;
R1은 H, 아미노 보호기, 수지, 아미노산, 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드이며;
R2는 OH, 에스테르 보호기, 수지, 아미노산, 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드이고;
R3 및 R4는 독립적으로 H, 할로겐, 저급 알킬, 치환된 저급 알킬이거나, R3 및 R4 또는 두 개의 R3 기는 임의로는 함께 시클로알킬 또는 헤테로시클로알킬을 형성하고;
R6 및 R7은 각각 독립적으로 H, 알킬, 치환된 알킬, 알케닐, 치환된 알케닐, 알콕시, 치환된 알콕시, 폴리알킬렌 옥시드, 치환된 폴리알킬렌 옥시드, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 알크아릴, 치환된 알크아릴, 아르알킬, 치환된 아르알킬, -C(O)R", -C(O)2R", -C(0)N(R")2 (여기서, 각 R"는 독립적으로 수소, 알킬, 치환된 알킬, 알케닐, 치환된 알케닐, 알콕시, 치환된 알콕시, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 알크아릴, 치환된 알크아릴, 아르알킬, 치환된 아르알킬임)이거나,
R6 또는 R7은 L-X이고;
X는 표지, 염료, 중합체, 수용성 중합체, 폴리에틸렌 글리콜 유도체, 광가교결합제, 세포독성 화합물, 약물, 친화도 표지, 광친화도 표지, 반응성 화합물, 수지, 제2의 단백질 또는 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 유사체, 항체 또는 항체 단편, 금속 킬레이트제, 조인자, 지방산, 탄수화물, 폴리뉴클레오티드, DNA, RNA, 안티센스 폴리뉴클레오티드, 사카라이드, 수용성 덴드리머, 시클로덱스트린, 생물질, 나노입자, 스핀 표지, 형광물질, 금속-함유 잔기, 방사성 잔기, 신규 관능기, 다른 분자와 공유적으로 또는 비공유적으로 상호작용하는 기, 포토케이지드 잔기, 화학선 여기가능한 잔기, 리간드, 광이성화성 잔기, 비오틴, 비오틴 유사체, 중량급 원자를 포함하는 잔기, 화학적으로 절단가능한 기, 광-절단가능한 기, 신장된 측쇄, 탄소-결합 당, 산화환원 활성제, 아미노 티오산, 독성 잔기, 동위원소 표지된 잔기, 생물리학적 프로브, 인광 기, 화학발광 기, 전자밀도가 높은 기, 자성 기, 인터캘레이팅 기, 발색단, 에너지 전달기, 생물학적 활성제, 검출가능한 표지, 소분 자, 억제성 리보핵산, 방사성 핵종, 중성자 포획제, 비오틴 유도체, 콴텀 도트, 나노트랜스미터, 라디오트랜스미터, 아브자임, 활성화된 복합 활성화제, 바이러스, 보조제, 아글리칸, 알러간, 안지오스타틴, 항호르몬, 항산화제, 압타머, 가이드 RNA, 사포닌, 셔틀 벡터, 거대 분자, 미모토우프, 수용체, 역상 미셀 및 그들의 조합으로 구성되는 군으로부터 선택되고;
L은 임의로 존재하며, 존재하는 경우에는 알킬렌, 치환된 알킬렌, 알케닐렌, 치환된 알케닐렌, -O-, -O-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -S-, -S-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -S(O)k- (k는 1, 2 또는 3임), -S(O)k(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(O)-, -C(O)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(S)-, -C(S)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')-, -NR'-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(O)N(R')-, -CON(R')-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -CSN(R')-, -CSN(R')-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')CO-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')C(O)O-, -S(O)kN(R')-, -N(R')C(0)N(R')-, -N(R')C(S)N(R'), -N(R')S(0)kN(R')-, -N(R')-N=, -C(R')=N-, -C(R')=N-N(R')-, -C(R')=N-N= -C(R')2-N=N- 및 -C(R')2-N(R')-N(R')- (여기서, R'는 각각 독립적으로 H, 알킬 또는 치환된 알킬임)로 구성되는 군으로부터 선택된다.
예를 들어, 하기 카르보닐- 또는 디카르보닐-함유 화합물은 본 명세서에 기재된 옥심-함유 비-천연 아미노산과 반응성이고, 교환 반응을 통해 새로운 옥심 결합을 생성할 수 있고, 따라서, 옥심-함유 비-천연 아미노산 폴리펩티드를 변형할 수 있는 카르보닐- 또는 디카르보닐-함유 화합물의 유형이다:
<화학식 XIX>
Figure 112007052373933-pct00078
상기 식에서,
X는 각각 독립적으로 H, 알킬, 치환된 알킬, 알케닐, 치환된 알케닐, 알키닐, 치환된 알키닐, 알콕시, 치환된 알콕시, 알킬알콕시, 치환된 알킬알콕시, ㅍ포폴리알킬렌 옥시드, 치환된 폴리알킬렌 옥시드, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 알크아릴, 치환된 알크아릴, 아르알킬, 치환된 아르알킬, -(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-ON(R")2, -(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-C(O)SR", -(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-S-S-(아릴 또는 치환된 아릴), -C(O)R", -C(O)2R" 또는 -C(O)N(R")2 (여기서, R"는 각각 독립적으로 수소, 알킬, 치환된 알킬, 알케닐, 치환된 알케닐, 알콕시, 치환된 알콕시, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 알크아릴, 치환된 알크아릴, 아르알킬, 치환된 아르알킬임)이거나;
X는 각각 독립적으로 표지, 염료, 중합체, 수용성 중합체, 폴리에틸렌 글리콜 유도체, 광가교결합제, 세포독성 화합물, 약물, 친화도 표지, 광친화도 표지, 반응성 화합물, 수지, 제2의 단백질 또는 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 유사체, 항체 또는 항체 단편, 금속 킬레이트제, 조인자, 지방산, 탄수화물, 폴리뉴클레오티드, DNA, RNA, 안티센스 폴리뉴클레오티드, 사카라이드, 수용성 덴드리머, 시클로 덱스트린, 생물질, 나노입자, 스핀 표지, 형광물질, 금속-함유 잔기, 방사성 잔기, 신규 관능기, 다른 분자와 공유적으로 또는 비공유적으로 상호작용하는 기, 포토케이지드 잔기, 화학선 여기가능한 잔기, 리간드, 광이성화성 잔기, 비오틴, 비오틴 유사체, 중량급 원자를 포함하는 잔기, 화학적으로 절단가능한 기, 광-절단가능한 기, 신장된 측쇄, 탄소-결합 당, 산화환원 활성제, 아미노 티오산, 독성 잔기, 동위원소 표지된 잔기, 생물리학적 프로브, 인광 기, 화학발광 기, 전자밀도가 높은 기, 자성 기, 인터캘레이팅 기, 발색단, 에너지 전달기, 생물학적 활성제, 검출가능한 표지, 소분자, 억제성 리보핵산, 방사성 핵종, 중성자 포획제, 비오틴 유도체, 콴텀 도트, 나노트랜스미터, 라디오트랜스미터, 아브자임, 활성화된 복합 활성화제, 바이러스, 보조제, 아글리칸, 알러간, 안지오스타틴, 항호르몬, 항산화제, 압타머, 가이드 RNA, 사포닌, 셔틀 벡터, 거대 분자, 미모토우프, 수용체, 역상 미셀 및 그들의 조합으로 구성되는 군으로부터 선택되고;
L은 각각 독립적으로 알킬렌, 치환된 알킬렌, 알케닐렌, 치환된 알케닐렌, -O-, -O-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -S-, -S-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -S(O)k- (k는 1, 2 또는 3임), -S(O)k(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(O)-, -C(O)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(S)-, -C(S)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')-, -NR'-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(O)N(R')-, -CON(R')-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-N(R')C(O)O-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, O-C(O)N(R')-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -CSN(R')-, -CSN(R')-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')CO-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')C(O)O-, -N(R')C(O)O-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -S(O)kN(R')-, -N(R')C(0)N(R')-, -N(R')C(0)N(R')-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')C(S)N(R')-, -N(R')S(0)kN(R')-, -N(R')-N=, -C(R')=N-, -C(R')=N-N(R')-, -C(R')=N-N=, -C(R')2-N=N- 및 -C(R')2-N(R')-N(R')- (여기서, R'는 각각 독립적으로 H, 알킬 또는 치환된 알킬임)로 구성되는 군으로부터 선택되며;
L1은 임의로 존재하고, 존재하는 경우, -C(R')p-NR'-C(O)O-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)- (p는 0, 1 또는 2이고; R'은 각각 독립적으로 H, 알킬 또는 치환된 알킬임)이고;
W는 -C(=O)R9 (여기서, R9는 각각 독립적으로 H 또는 OR'임)이고;
n은 1 내지 3이며; 단, L-L1-W는 함께 비-천연 아미노산 또는 "변형 또는 비변형된" 비-천연 아미노산 폴리펩티드 상의 옥심 기와 옥심 교환 반응할 수 있는 적어도 하나의 카르보닐 기(디카르보닐 기 포함)를 제공한다.
폴리펩티드 상의 옥심-함유 아미노산과 카르보닐-함유 화합물 사이의 옥심 교환 반응을 수행하는 방법의 두 가지 예시적 실시태양이 도 9에 제시되어 있다. 이 예시적 실시태양에서, 카르보닐-함유 화합물이 옥심-함유 비-천연 아미노산 폴리펩티드의 완충된 용액 (pH 2-8)에 가해진다. 반응은 주위 온도에서 수 시간 내지 수 일 동안 진행된다. 생성된 옥심-함유 비-천연 아미노산 폴리펩티드는 HPLC, FPLC 또는 크기-배제 크로마토그래피에 의해 정제된다.
하나의 실시태양에서, 다중 링커 화합물은 옥심-치환 비-천연 아미노산 폴리펩티드와 위치-특이적으로 반응할 수 있다. 하나의 실시태양에서, 본 명세서에 기재된 링커 방법은 적어도 하나의 링커 말단(일-, 이- 또는 다관능성 링커의)에 카르보닐- 또는 디카르보닐 관능기를 함유하는 링커를 사용한다. 카르보닐- 또는 디카르보닐 유도된 링커와 옥심-치환된 단백질의 축합은 안정한 옥심 결합을 생성한다. 이- 및(또는) 다관능성 링커(예를 들어, 다른 결합 화학기와 함께 카르보닐- 또는 디카르보닐 관능기 함유)는 비-천연 아미노산 폴리펩티드에 상이한 분자들(예를 들어, 다른 단백질, 중합체 또는 소분자)을 위치-특이적으로 연결시키는 반면, 일-관능성 링커 (모든 말단에 카르보닐- 또는 디카르보닐-치환됨)는 비-천연 아미노산 폴리펩티드의 위치-특이적 이합체화 또는 올리고머화를 촉진한다. 이와 같은 링커 전략을 본 명세서에 기재된 생체내 번역 기술과 조합함으로써, 화학적으로 조절된 단백질의 3차원 구조를 특정하는 것이 가능하다.
C. 비-천연 아미노산 폴리펩티드의 번역후 변형 방법: 히드록실아민-함유 비-천연 아미노산과 카르보닐-함유 화합물의 반응
상기 번역후 변형 기술 및 조성물은 또한 히드록실아민-함유 비-천연 아미노산과 카르보닐- 또는 디카르보닐-함유 화합물이 반응하여 변형된 옥심-함유 비-천연 아미노산 폴리펩티드를 생성하는데 이용될 수 있다.
히드록실아민-함유 단백질과 카르보닐-치환된 분자의 반응에 기초한 단백질-유도 방법은 차별된 잇점을 갖는다. 첫째로, 히드록실아민은 카르보닐- 또는 디카 르보닐-함유 화합물과 pH 4 내지 8의 범위에서 축합하여 옥심 부가물을 생성한다. 이러한 조건하에 천연 아미노산의 측쇄는 비반응성이다. 둘째로, 그와 같은 선택적인 화학기는 재조합 단백질을 위치-특이적으로 유도하는 것을 가능케하여, 유도된 단백질이 정의된 바와 같이 균질한 생성물로 제조될 수 있게 한다. 세째로, 본 명세서에 기재된 카르보닐- 또는 디카르보닐-함유 화합물과 히드록실아민-함유 폴리펩티드와의 반응을 수행하는데 필요한 온화한 반응 조건은 일반적으로 폴리펩티드의 3차 구조를 비가역적으로 파괴하지 않는다(반응의 목적이 3차 구조를 파괴하는 것인 경우는 제외). 마지막으로, 히드록실아민 기의 아미노가 이. 콜라이에 의해 대사될 지라도, 카르보닐- 또는 디카르보닐-함유 화합물과 히드록실아민-함유 아미노산의 축합 생성물은 생물학적 조건하에 안정하다.
예를 들어, 하기 비-천연 아미노산은 본 명세서에 기재된 히드록실아민-함유 비-천연 아미노산 폴리펩티드를 더 변형시킬 수 있는 카르보닐- 또는 디카르보닐-함유 화합물과 반응성인 히드록실아민-함유 아미노산의 유형이다:
<화학식 XIV>
Figure 112007052373933-pct00079
상기 식에서,
A는 임의로 존재하고, 존재하는 경우에는 저급 알킬렌, 치환된 저급 알킬렌, 저급 시클로알킬렌, 치환된 저급 시클로알킬렌, 저급 알케닐렌, 치환된 저급 알케 닐렌, 알키닐렌, 저급 헤테로알킬렌, 치환된 헤테로알킬렌, 저급 헤테로시클로알킬렌, 치환된 저급 헤테로시클로알킬렌, 아릴렌, 치환된 아릴렌, 헤테로아릴렌, 치환된 헤테로아릴렌, 알크아릴렌, 치환된 알크아릴렌, 아르알킬렌 또는 치환된 아르알킬렌이며;
B는 임의로 존재하고, 존재하는 경우에는 저급 알킬렌, 치환된 저급 알킬렌, 저급 알케닐렌, 치환된 저급 알케닐렌, 저급 헤테로알킬렌, 치환된 저급 헤테로알킬렌, -O-, -O-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -S-, -S-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -S(O)k- (k는 1, 2 또는 3임), -S(O)k(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(O)-, -NS(O)2-, -OS(O)2-, -C(O)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(S)-, -C(S)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')-, -NR'-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(O)N(R')-, -CON(R')-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -CSN(R')-, -CSN(R')-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')CO-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')C(O)O-, -S(O)kN(R')-, -N(R')C(0)N(R')-, -N(R')C(S)N(R')-, -N(R')S(O)kN(R')-, -N(R')-N=, -C(R')=N-, -C(R')=N-N(R')-, -C(R')=N-N=, -C(R')2-N=N- 및 -C(R')2-N(R')-N(R')-(여기서, R' 는 각각 독립적으로 H, 알킬 또는 치환된 알킬임)로 구성되는 군으로부터 선택되는 링커이며;
K는 -NR6R7 또는 -N=CR6R7이고;
R1은 H, 아미노 보호기, 수지, 아미노산, 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드 이며;
R2는 OH, 에스테르 보호기, 수지, 아미노산, 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드이고;
R3 및 R4는 독립적으로 H, 할로겐, 저급 알킬, 치환된 저급 알킬이거나, R3 및 R4 또는 두 개의 R3 기는 임의로는 함께 시클로알킬 또는 헤테로시클로알킬을 형성한다.
화학식 (XIV)의 화합물의 특정 실시태양에서, K는 NH2이다.
폴리펩티드 내에 히드록실아민-함유 비-천연 아미노산이 위치함으로써 카르보닐- 또는 디카르보닐-함유 화합물이 그 히드록실아민-함유 비-천연 아미노산과 반응할 수 있고, 폴리펩티드의 3차 구조를 파괴하는 변형된 비-천연 아미노산을 생성하지 않는 한 (3차 구조의 파괴가 반응의 목적인 경우를 제외함), 실질적으로 그와 같은 히드록실아민-함유 비-천연 아미노산을 포함하는 폴리펩티드의 유형에는 제한이 없다.
예를 들어, 하기 카르보닐- 또는 디카르보닐-함유 화합물은 본 명세서에 기재된 히드록실아민-함유 비-천연 아미노산과 반응성이고, 히드록실아민-함유 비-천연 아미노산 폴리펩티드를 추가로 변형시킬 수 있는 카르보닐- 또는 디카르보닐-함유 화합물의 유형이다:
<화학식 XIX>
Figure 112007052373933-pct00080
상기 식에서,
X는 각각 독립적으로 H, 알킬, 치환된 알킬, 알케닐, 치환된 알케닐, 알키닐, 치환된 알키닐, 알콕시, 치환된 알콕시, 알킬알콕시, 치환된 알킬알콕시, 폴리알킬렌 옥시드, 치환된 폴리알킬렌 옥시드, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 알크아릴, 치환된 알크아릴, 아르알킬, 치환된 아르알킬, -(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-ON(R")2, -(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-C(O)SR", -(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-S-S-(아릴 또는 치환된 아릴), -C(O)R", -C(O)2R" 또는 -C(O)N(R")2 (여기서, R"는 각각 독립적으로 수소, 알킬, 치환된 알킬, 알케닐, 치환된 알케닐, 알콕시, 치환된 알콕시, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 알크아릴, 치환된 알크아릴, 아르알킬, 치환된 아르알킬임)이거나;
X는 각각 독립적으로 표지, 염료, 중합체, 수용성 중합체, 폴리에틸렌 글리콜 유도체, 광가교결합제, 세포독성 화합물, 약물, 친화도 표지, 광친화도 표지, 반응성 화합물, 수지, 제2의 단백질 또는 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 유사체, 항체 또는 항체 단편, 금속 킬레이트제, 조인자, 지방산, 탄수화물, 폴리뉴클레오티드, DNA, RNA, 안티센스 폴리뉴클레오티드, 사카라이드, 수용성 덴드리머, 시클로덱스트린, 생물질, 나노입자, 스핀 표지, 형광물질, 금속-함유 잔기, 방사성 잔기, 신규 관능기, 다른 분자와 공유적으로 또는 비공유적으로 상호작용하는 기, 포토케이지드 잔기, 화학선 여기가능한 잔기, 리간드, 광이성화성 잔기, 비오틴, 비오틴 유사체, 중량급 원자를 포함하는 잔기, 화학적으로 절단가능한 기, 광-절단가능한 기, 신장된 측쇄, 탄소-결합 당, 산화환원 활성제, 아미노 티오산, 독성 잔기, 동위원소 표지된 잔기, 생물리학적 프로브, 인광 기, 화학발광 기, 전자밀도가 높은 기, 자성 기, 인터캘레이팅 기, 발색단, 에너지 전달기, 생물학적 활성제, 검출가능한 표지, 소분자, 억제성 리보핵산, 방사성 핵종, 중성자 포획제, 비오틴 유도체, 콴텀 도트, 나노트랜스미터, 라디오트랜스미터, 아브자임, 활성화된 복합 활성화제, 바이러스, 보조제, 아글리칸, 알러간, 안지오스타틴, 항호르몬, 항산화제, 압타머, 가이드 RNA, 사포닌, 셔틀 벡터, 거대 분자, 미모토우프, 수용체, 역상 미셀 및 그들의 조합으로 구성되는 군으로부터 선택되고;
L은 각각 독립적으로 알킬렌, 치환된 알킬렌, 알케닐렌, 치환된 알케닐렌, -O-, -O-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -S-, -S-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -S(O)k- (k는 1, 2 또는 3임), -S(O)k(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(O)-, -C(O)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(S)-, -C(S)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')-, -NR'-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(O)N(R')-, -CON(R')-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-N(R')C(O)O-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, O-C(O)N(R')-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -CSN(R')-, -CSN(R')-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')CO-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')C(O)O-, -N(R')C(O)O-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -S(O)kN(R')-, -N(R')C(0)N(R')-, -N(R')C(0)N(R')-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')C(S)N(R')-, -N(R')S(0)kN(R')-, -N(R')-N=, -C(R')=N-, -C(R')=N-N(R')-, -C(R')=N-N=, -C(R')2-N=N- 및 -C(R')2-N(R')-N(R')- (여기서, R'는 각각 독립적으로 H, 알킬 또는 치환된 알킬임)로 구성되는 군으로부터 선택되며;
L1은 임의로 존재하고, 존재하는 경우, -C(R')p-NR'-C(O)O-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)- (p는 0, 1 또는 2이고; R'은 각각 독립적으로 H, 알킬 또는 치환된 알킬임)이고;
W는 -J-R이고, J는
Figure 112007052373933-pct00081
이고;
R은 H, 알킬, 치환된 알킬, 시클로알킬 또는 치환된 시클로알킬이며, R"는 각각 독립적으로 H, 알킬, 치환된 알킬 또는 보호기를 나타내거나, 두 개 이상의 R" 기가 존재하는 경우, 두 개의 R"는 임의로는 헤테로시클로알킬을 형성하며;
n은 1 내지 3이며; 단, L-L1-W는 함께 비-천연 아미노산 또는 "변형 또는 비변형된" 비-천연 아미노산 폴리펩티드 상의 히드록실아민 기와 반응할 수 있는 적 어도 하나의 카르보닐 기(디카르보닐 기 포함)를 제공한다.
화학식 (XIX)의 화합물의 특정 실시태양은 화학식 (XXI)의 구조를 갖는 화합물이다:
<화학식 XXI>
Figure 112007052373933-pct00082
카르보닐-함유 화합물을 폴리펩티드 상의 히드록실아민-함유 비-천연 아미노산에 커플링시키는 방법의 두 가지 예시적인 실시태양이 도 10에 나타나있다. 이 예시적 실시태양에서, 카르보닐-유도된 화합물이 히드록실아민-함유 비-천연 아미노산 폴리펩티드의 완충 용액 (pH 2-8)에 가해진다. 반응은 주위 온도에서 수 시간 내지 수 일 동안 진행된다. 결합을 가속화하기 위해, 도 8에 제시된 바와 같은 첨가제를 가한다. 생성된 옥심-함유 비-천연 아미노산 폴리펩티드는 HPLC, FPLC 또는 크기-배제 크로마토그래피에 의해 정제된다.
하나의 실시태양에서, 다중 링커 화합물은 히드록실아민-치환 비-천연 아미노산 폴리펩티드와 위치-특이적으로 반응할 수 있다. 하나의 실시태양에서, 본 명세서에 기재된 링커 방법은 적어도 하나의 링커 말단(일-, 이- 또는 다관능성 링커의)에 카르보닐 또는 디카르보닐 관능기를 함유하는 링커를 사용한다. 카르보닐 또는 디카르보닐-유도된 링커와 히드록실아민-치환된 단백질의 축합은 안정한 옥심 결합을 생성한다. 이- 및(또는) 다관능성 링커(예를 들어, 카르보닐 또는 디카르보닐 관능기와 함께 다른 결합 화학기를 가짐)는 비-천연 아미노산 폴리펩티드에 상이한 분자들(예를 들어, 다른 단백질, 중합체 또는 소분자)을 위치-특이적으로 연결시키는 반면, 일-관능성 링커 (모든 말단에 카르보닐 또는 디카르보닐-치환됨)는 비-천연 아미노산 폴리펩티드의 위치-특이적 이합체화 또는 올리고머화를 촉진한다. 이와 같은 링커 전략을 본 명세서에 기재된 생체내 번역 기술과 조합함으로써, 화학적으로 조절된 단백질의 3차원 구조를 특정하는 것이 가능하다.
특정 실시태양에서, 화학식 XIV-XVI 및 그의 하위 구조식의 아미노산 또는 이러한 범위에 드는 특정 화합물을 포함하는 폴리펩티드를 유도하는 방법은 적어도 하나의 화학식 XIV- XVI의 아미노산을 포함하는 폴리펩티드를 화학식 (XIX)의 화합물과 접촉시키는 것을 포함한다. 특정 실시태양에서, 폴리펩티드는 화학식 (XIX)의 화합물과 접촉시키기 전 또는 후에 정제된다. 다른 실시태양에서, 생성된 유도된 폴리펩티드는 화학식 (XXIX)에 상응하는 적어도 하나의 옥심-함유 아미노산을 포함한다:
<화학식 XXIX>
Figure 112007052373933-pct00083
상기 식에서,
A는 임의로 존재하고, 존재하는 경우에는 저급 알킬렌, 치환된 저급 알킬렌, 저급 알케닐렌, 치환된 저급 알케닐렌, 아릴렌, 치환된 아릴렌, 헤테로아릴렌, 치환된 헤테로아릴렌, 알크아릴렌, 치환된 알크아릴렌, 아르알킬렌 또는 치환된 아르알킬렌이며;
B는 임의로 존재하고, 존재하는 경우에는 저급 알킬렌, 치환된 저급 알킬렌, 저급 알케닐렌, 치환된 저급 알케닐렌, -O-, -O-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -S-, -S-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -S(O)k- (k는 1, 2 또는 3임), -S(O)k(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(O)-, -NS(O)2-, -OS(O)2-, -C(O)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(S)-, -C(S)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')-, -NR'-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(O)N(R')-, -CON(R')-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -CSN(R')-, -CSN(R')-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')CO-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')C(O)O-, -S(O)kN(R')-, -N(R')C(0)N(R')-, -N(R')C(S)N(R')-, -N(R')S(O)kN(R')-, -N(R')-N=, -C(R')=N-, -C(R')=N-N(R')-, -C(R')=N-N=, -C(R')2-N=N- 및 -C(R')2-N(R')-N(R')-(여기서, R' 는 각각 독립적으로 H, 알킬 또는 치환된 알킬임)로 구성되는 군으로부터 선택되는 링커이며;
L은 알킬렌, 치환된 알킬렌, 알케닐렌, 치환된 알케닐렌, -O-, -O-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -S-, -S-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -S(O)k- (k는 1, 2 또는 3임), -S(O)k(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(O)-, -C(O)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(S)-, -C(S)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')-, -NR'-(알킬 렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(O)N(R')-, -CON(R')-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-N(R')C(O)O-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -O-C(O)N(R')-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -CSN(R')-, -CSN(R')-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')CO-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')C(O)O-, -N(R')C(0)N(R')-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -S(O)kN(R')-, -N(R')C(0)N(R')-, -N(R')C(S)N(R')-, -N(R')S(0)kN(R')-, -N(R')-N=, -C(R')=N-, -C(R')=N-N(R')-, -C(R')=N-N=, -C(R')2-N=N- 및 -C(R')2-N(R')-N(R')- (여기서, R'는 각각 독립적으로 H, 알킬 또는 치환된 알킬임)로 구성되는 군으로부터 선택되는 링커이고;
R1은 임의로 존재하며, 존재하는 경우, H, 아미노 보호기, 수지, 아미노산, 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드이며;
R2는 임의로 존재하며, 존재하는 경우, OH, 에스테르 보호기, 수지, 아미노산, 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드이고;
R3 및 R4는 독립적으로 H, 할로겐, 저급 알킬 또는 치환된 저급 알킬이며;
X는 독립적으로 검출가능한 표지, 생물학적 활성제 또는 중합체이다.
다른 실시태양에서, 그와 같은 유도된 폴리펩티드는 온화한 산성 조건하에 수성 용액 중 적어도 한 달 이상 안정하다. 다른 실시태양에서, 그와 같은 유도된 폴리펩티드는 온화한 산성 조건하에 적어도 2주 이상 안정하다. 다른 실시태양에서, 그와 같은 유도된 폴리펩티드는 온화한 산성 조건하에 적어도 5일 이상 안정하 다. 다른 실시태양에서, 그와 같은 조건은 pH 2 내지 8이다. 특정 실시태양에서, 유도된 폴리펩티드의 3차 구조는 보존된다. 다른 실시태양에서, 폴리펩티드의 유도는 유도된 폴리펩티드를 다른 폴리펩티드에 연결시키는 것을 포함한다. 다른 실시태양에서, 유도되는 폴리펩티드는 다음 군으로부터 선택되는 치료용 단백질에 상동적일 수 있다: 알파-1 안티트립신, 안지오스타틴, 항용혈 인자, 항체, 항체 단편, 아포리포단백질, 아포단백질, 심방 나트륨이뇨 인자, 심방 나트륨이뇨 폴리펩티드, 심방 펩티드, C-X-C 케모카인, T39765, NAP-2, ENA-78, gro-a, gro-b, gro-c, IP-10, GCP-2, NAP-4, SDF-1, PF4, MIG, 칼시토닌, c-키트 리간드, 사이토카인, CC 케모카인, 단핵구 화학유인 단백질-1, 단핵구 화학유인 단백질-2, 단핵구 화학유인 단백질-3, 단핵구 소염 단백질-1 알파, 단핵구 소염 단백질-1 베타, RANTES, 1309, R83915, R91733, HCC1, T58847, D31065, T64262, CD40, CD40 리간드, c-키트 리간드, 콜라겐, 콜로니 자극인자 (CSF), 보체 인자 5a, 보체 억제제, 보체 수용체 1, 사이토카인, 상피 호중구 활성화 펩티드-78, MIP-16, MCP-1, 표피 성장 인자 (EGF), 상피 호중구 활성화 펩티드, 에리쓰로포이에틴 (EPO), 박리 독소, 인자 IX, 인자 VII, 인자 VIII, 인자 X, 섬유아세포 성장 인자 (FGF), 피브리노겐, 피브로넥틴, 4중 나선 번들 단백질, G-CSF, glp-1, GM-CSF, 글루코세레브로시다제, 고나도트로핀, 성장 인자, 성장 인자 수용체, grf, 헷지호그 단백질, 헤모글로빈, 간세포 성장 인자 (hGF), 히루딘, 인간 성장 인자 (hGH), 인간 혈청 알부민, ICAM-1, ICAM-1 수용체, LFA-1, LFA-1 수용체, 인슐린, 인슐린-유사 성장 인자 (IGF), IGF-I, IGF-II, 인터페론 (IFN), IFN-알파, IFN-베타, IFN-감마, 인터루킨 (IL), IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, 각질 세포 성장 인자 (KGF), 락토페린, 백혈병 억제 인자, 루시퍼라제, 뉴투린, 호중구 억제 인자 (NIF), 온코스타틴 M, 골원성 단백질, 종양유전자 생성물, 파라시토닌, 부갑상선 호르몬, PD-ECSF, PDGF, 펩티드 호르몬, 플레이오트로핀, 단백질 A, 단백질 G, pth, 발열성 외독소 A, 발열성 외독소 B, 발열성 외독소 C, pyy, 릴랙신, 레닌, SCF, 생합성 소 단백질, 가용성 보체 수용체 I, 가용성 I-CAM 1, 가용성 인터루킨 수용체, 가용성 TNF 수용체, 소마토메딘, 소마토스타틴, 소마토트로핀, 스트렙토키나제, 슈퍼항원, 스타필로코커스 내독소, SEA, SEB, SECl, SEC2, SEC3, SED, SEE, 스테로이드 호르몬 수용체, 슈퍼옥시드 디스뮤타제, 독성 쇼크 증후 독소, 티모신 알파 1, 조직 플라스미노겐 활성화제, 종양 성장 인자 (TGF), 종양 괴사 인자, 종양 괴사 인자 알파, 종양 괴사 인자 베타, 종양 괴사 인자 수용체 (TNFR), VLA-4 단백질, VCAM-1 단백질, 혈관 내피 성장 인자 (VEGF), 유로키나제, mos, ras, raf, met, ρ53, tat, fos, myc, jun, myb, rel, 에스트로겐 수용체, 프로게스테론 수용체, 테스토스테론 수용체, 알도스테론 수용체, LDL 수용체 및 코르티코스테론.
D. 관능기를 부가하는 예: 비-천연 아미노산 폴리펩티드에 커플링된 거대 분자 중합체
본 명세서에 기재된 비-천연 아미노산 폴리펩티드에 대한 여러 가지 변형은 본 명세서에 기재된 방법, 조성물, 전략 및 기술을 이용하여 이루어진다. 이와 같은 변형은 폴리펩티드의 비-천연 아미노산 성분 상으로 추가의 관능기를 도입하는 것을 포함하며, 이와 같은 추가의 관능기의 비제한적인 예로서 표지, 염료, 중합 체, 수용성 중합체, 폴리에틸렌 글리콜 유도체, 광가교결합제, 세포독성 화합물, 약물, 친화도 표지, 광친화도 표지, 반응성 화합물, 수지, 제2의 단백질 또는 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 유사체, 항체 또는 항체 단편, 금속 킬레이트제, 조인자, 지방산, 탄수화물, 폴리뉴클레오티드, DNA, RNA, 안티센스 폴리뉴클레오티드, 사카라이드, 수용성 덴드리머, 시클로덱스트린, 생물질, 나노입자, 스핀 표지, 형광물질, 금속-함유 잔기, 방사성 잔기, 신규 관능기, 다른 분자와 공유적으로 또는 비공유적으로 상호작용하는 기, 포토케이지드 잔기, 화학선 여기가능한 잔기, 리간드, 광이성화성 잔기, 비오틴, 비오틴 유사체, 중량급 원자를 포함하는 잔기, 화학적으로 절단가능한 기, 광-절단가능한 기, 신장된 측쇄, 탄소-결합 당, 산화환원 활성제, 아미노 티오산, 독성 잔기, 동위원소 표지된 잔기, 생물리학적 프로브, 인광 기, 화학발광 기, 전자밀도가 높은 기, 자성 기, 인터캘레이팅 기, 발색단, 에너지 전달기, 생물학적 활성제, 검출가능한 표지, 소분자, 억제성 리보핵산, 방사성 핵종, 중성자 포획제, 비오틴 유도체, 콴텀 도트, 나노트랜스미터, 라디오트랜스미터, 아브자임, 활성화된 복합 활성화제, 바이러스, 보조제, 아글리칸, 알러간, 안지오스타틴, 항호르몬, 항산화제, 압타머, 가이드 RNA, 사포닌, 셔틀 벡터, 거대 분자, 미모토우프, 수용체, 역상 미셀 및 그들의 조합이 있다. 본 명세서에 기재된 방법, 조성물, 전략 및 기술의 예시적, 비제한적인 예로서, 하기 기재 사항은 비-천연 아미노산 폴리펩티드에 거대분자 중합체를 가하는 것에 촛점을 맞춘 것이지만, 본 명세서에 기재된 방법, 조성물, 전략 및 기술은 상기한 분자들 이외의 다른 관능기에도 적용 (필요에 따라서 본 명세서에 개시된 바에 따라 당업자가 생각 해낼 수 있는 정도의 적절한 변형을 가하여)될 수 있다는 것을 이해하여햐 한다.
다양한 종류의 거대분자 중합체 또는 다른 분자가 본 명세서에 기재된 비-천연 아미노산 폴리펩티드에 커플링되어 비-천연 아미노산 폴리펩티드 (또는 상응하는 천연 아미노산 폴리펩티드)의 생물학적 특성을 조절하고/거나 비-천연 아미노산 폴리펩티드 (또는 상응하는 천연 아미노산 폴리펩티드)에 새로운 생물학적 특성을 제공할 수 있다. 이들 거대분자 중합체는 비-천연 아미노산 폴리펩티드에 비-천연 아미노산 또는 그의 임의의 관능기 또는 치환기 또는 그에 부가된 치환기 또는 관능기를 통하여 커플링될 수 있다.
수용성 중합체는 본 명세서에 기재된 폴리펩티드 (천연 또는 합성), 폴리뉴클레오티드, 폴리사카라이드 또는 합성 중합체 내에 도입된 비-천연 아미노산에 커플링될 수 있다. 수용성 중합체는 폴리펩티드 내에 도입된 비-천연 아미노산, 또는 그의 임의의 관능기 또는 치환기 또는 그에 부가된 치환기 또는 관능기를 통하여 커플링될 수 있다. 일부 실시태양에서, 본 명세서에 기재된 비-천연 아미노산 폴리펩티드는 수용성 중합체에 커플링된 하나 이상의 비-천연 아미노산 및 수용성 중합체에 커플링된 하나 이상의 천연 아미노산을 포함한다. 친수성 중합체를 생물학적 활성 분자에 공유결합시키는 것은 단백질, 펩티드 및 특히 소수성 분자와 같은 생물학적 활성 분자의 수용해도 (예를 들어, 생리적 조건하에), 생이용성을 증가시키고, 혈청 반감기, 치료 반감기를 증가시키고, 면역원성을 조절하고, 생물학적 활성을 조절하고, 순환 시간을 연장시키는 방법이다. 친수성 중합체의 다른 중요한 특성은 생이용성. 무독성, 면역원성의 결핍 등이다. 바람직하게는, 최종 생 성물 제제를 치료제로 사용하기 위하여 중합체는 약제학적으로 허용되는 것일 것이다.
친수성 중합체의 예는, 비제한적으로는, 폴리알킬 에테르 및 그의 알콕시-캡핑된 유사체 (예를 들어, 폴리옥시에틸렌 글리콜, 폴리옥시에틸렌/프로필렌 글리콜 및 그의 메톡시 또는 에톡시-캡핑된 유사체, 특히 폴리옥시에틸렌 글리콜(이는 또한 폴리에틸렌 글리콜 또는 PEG로 알려짐)); 폴리비닐피롤리돈; 폴리비닐알킬 에테르; 폴리옥사졸린, 폴리알킬 옥사졸린 및 폴리히드록시알킬 옥사졸린; 폴리아크릴아미드, 폴리알킬 아크릴아미드 및 폴리히드록시알킬 아크릴아미드 (예를 들어, 폴리히드록시프로필 메타크릴아미드 및 그의 유도체); 폴리히드록시알킬 아크릴레이트; 폴리시알산 및 그의 유사체; 친수성 펩티드 서열; 폴리사카라이드 및 그의 유도체, 예를 들어, 덱스트란 및 덱스트란 유도체, 카르복시메틸덱스트란, 덱스트란 술페이트, 아미노덱스트란; 셀룰로스 및 그의 유도체, 예를 들어, 카르복시메틸 셀룰로스, 히드록시알킬 셀룰로스; 키틴 및 그의 유도체, 예를 들어, 키토산, 숙시닐 키토산, 카르복시메틸키틴, 카르복시메틸키토산; 히알루론산 및 그의 유도체; 전분; 알기네이트; 콘드로이틴 술페이트; 알부민; 풀룰란 및 카르복시메틸 풀룰란; 폴리아미노산 및 그의 유도체, 예를 들어, 폴리글루탐산, 폴리리신, 폴리아스파르트산; 말레산 무수물 공중합체, 예를 들어, 스티렌 말레산 무수물 공중합체, 디비닐에틸 에테르 말레산 무수물 공중합체; 폴리비닐 알콜; 상기 성분들의 공중합체, 삼원중합체, 혼합물 및 유도체를 포함한다. 수용성 중합체는 선형, 포크형 또는 분지형을 포함하는 어느 형태로나 존재할 수 있다. 일부 실시태양에서, 중합체 골 격은 수용성이며, 2 내지 약 300 개의 말단을 가지는 것이 특히 유용하다. 다관능성 중합체 유도체는 비제한적인 예로서, 각 말단이 동일하거나 상이할 수 있는 관능기에 결합된 두 개의 말단을 갖는 선형 중합체를 포함한다. 일부 실시태양에서, 수용성 중합체는 폴리(에틸렌 글리콜) 잔기를 포함한다. 중합체의 분자량은 광범위할 수 있으며, 비제한적으로는 약 100 Da 내지 약 100,000 Da 또는 그 이상이다. 중합체의 분자량은 약 100 Da 내지 약 100,000 Da, 비제한적인 예로서 100,000 Da, 95,000 Da, 90,000 Da, 85,000 Da, 80,000 Da, 75,000 Da, 70,000 Da, 65,000 Da, 60,000 Da, 55,000 Da, 50,000 Da, 45,000 Da, 40,000 Da, 35,000 Da, 30,000 Da, 25,000 Da, 20,000 Da, 15,000 Da, 10,000 Da, 9,000 Da, 8,000 Da, 7,000 Da, 6,000 Da, 5,000 Da, 4,000 Da, 3,000 Da, 2,000 Da, 1,000 Da, 900 Da, 800 Da, 700 Da, 600 Da, 500 Da, 400 Da, 300 Da, 200 Da 또는 100 Da일 수 있다. 일부 실시태양에서, 중합체 분자량은 약 100 Da 내지 40,000 Da이다. 일부 실시태양에서, 중합체의 분자량은 약 1,000 Da 내지 40,000 Da이다. 일부 실시태양에서, 중합체의 분자량은 약 5,000 Da 내지 40,000 Da이다. 일부 실시태양에서, 중합체의 분자량은 약 10,000 Da 내지 40,000 Da이다. 일부 실시태양에서, 폴리(에틸렌 글리콜) 분자는 분지된 중합체이다. 분지쇄 PEG의 분자량은 약 1,000 Da 내지 약 100,000 Da 사이, 비제한적인 예로서 100,000 Da, 95,000 Da, 90,000 Da, 85,000 Da, 80,000 Da, 75,000 Da, 70,000 Da, 65,000 Da, 60,000 Da, 55,000 Da, 50,000 Da, 45,000 Da, 40,000 Da, 35,000 Da, 30,000 Da, 25,000 Da, 20,000 Da, 15,000 Da, 10,000 Da, 9,000 Da, 8,000 Da, 7,000 Da, 6,000 Da, 5,000 Da, 4,000 Da, 3,000 Da, 2,000 Da 또는 1,000 Da일 수 있다. 일부 실시태양에서, 분지쇄 PEG의 분자량은 약 1,000 Da 내지 약 50,000 Da이다. 일부 실시태양에서, 분지쇄 PEG의 분자량은 약 1,000 Da 내지 40,000 Da이다. 일부 실시태양에서, 분지쇄 PEG의 분자량은 약 5,000 Da 내지 40,000 Da이다. 일부 실시태양에서, 분지쇄 PEG의 분자량은 약 5,000 Da 내지 약 20,000 Da이다. 당업자는 상기 열거한 실질적으로 수용성인 골격이 결코 한정적인 것이 아니고 예시적이라는 것과, 상기 성질을 갖는 모든 중합체 물질이 본 명세서에 기재된 방법 및 조성물에 적절히 사용될 수 있다는 것을 잘 인식하고 있을 것이다.
상기한 바와 같이, 친수성 중합체의 한 예는 폴리(에틸렌 글리콜)이며, 약어로는 PEG로 표시되는데, 이 중합체는 약제, 인공 임플란트, 및 생체적합성, 무독성 및 면역원성의 결여가 중요한 다른 분야에 널리 사용되어 왔다. 본 명세서에 기재된 중합체 폴리펩티드 실시태양은 친수성 중합체의 예로서 PEG를 사용할 것이나, 다른 친수성 중합체 또한 본 발명의 실시태양에 마찬가지로 사용될 수 있음을 이해하여야 한다.
PEG는 잘 알려진 수용성 중합체로서, 시판되고 있으며, 당업계에 알려진 방법에 따라 에틸렌 글리콜을 개환 중합하여 제조할 수 있다[참조: Sandler and Karo, Polymer Synthesis, Academic Press, New York, Vol. 3, pages 138-161)]. PEG는 전형적으로 투명하고 무색, 무취이며, 물에 가용성이고 열에 안정하며, 많은 화학 약품에 불활성이고, 가수분해되거나 열화되지 않고, 일반적으로 비독성이다. 폴리(에틸렌 글리콜)은 생체적합성인데, 이는 PEG가 살아있는 조직 또는 기관에 해 를 끼치지 않으면서 공존할 수 있다는 것을 말한다. 보다 구체적으로, PEG는 실질적으로 비-면역원성인데, 이는 PEG가 체내에서 면역 반응을 일으키는 경향이 없다는 것이다. 체내에서 바람직한 기능을 하는 분자, 예컨대, 생물학적 활성제에 부착될 때, PEG는 그와 같은 활성제를 마스킹하여 면역 반응을 감소시키거나 제거함으로써 생물체가 활성제의 존재를 참아낼 수 있게 한다. PEG 컨쥬게이트는 실질적으로 면역 반응을 일으킨다거나 응집 또는 다른 바람직하지 않은 효과를 유발하지 않는 경향이 있다.
"PEG"는 그 크기 또는 말단에서의 변형에 관계없이 광범위하게 폴리에틸렌 글리콜 분자를 칭하는데 사용되며, 하기 식에 의해 비-천연 아미노산 폴리펩티드에 결합된 상태로 표현될 수 있다:
XO-(CH2CH2O)n-CH2CH2-Y
(상기 식에서, n은 2 내지 10,000이고, X는 H 또는 말단 변형, 예를 들어, C1-4 알킬, 보호기 또는 말단 관능기임). 용어 "PEG"에는 모든 형태의 폴리(에틸렌 글리콜), 비제한적인 예로서 이관능성 PEG, 다중암(multiarmed) PEG, 유도된 PEG, 포크형 PEG, 분지쇄 PEG (각 쇄는 분자량이 약 1 kDa 내지 약 100 kDa, 약 1 kDa 내지 약 50 kDa 또는 약 1 kDa 내지 약 20 kDa임), 펜던트 PEG (중합체 골격에 펜던트한 하나 이상의 관능기를 갖는 PEG 또는 관련 중합체) 또는 분해가능한 결합을 포함하는 PEG를 포함한다. 하나의 실시태양에서, n이 약 20 내지 약 2000인 PEG가 본 명세서에 기재된 방법 및 조성물에 사용하기에 적절하다. 일부 실시태양에서, 수용성 중합체는 폴리(에틸렌 글리콜) 잔기를 포함한다. PEG 중합체의 분자량은 광범위하며, 비제한적인 예로서 약 100 Da 내지 약 100,000 Da 또는 그 이상이다. PEG 중합체의 분자량은 약 100 Da 내지 약 100,000 Da, 비제한적인 예로서 100,000 Da, 95,000 Da, 90,000 Da, 85,000 Da, 80,000 Da, 75,000 Da, 70,000 Da, 65,000 Da, 60,000 Da, 55,000 Da, 50,000 Da, 45,000 Da, 40,000 Da, 35,000 Da, 30,000 Da, 25,000 Da, 20,000 Da, 15,000 Da, 10,000 Da, 9,000 Da, 8,000 Da, 7,000 Da, 6,000 Da, 5,000 Da, 4,000 Da, 3,000 Da, 2,000 Da, 1,000 Da, 900 Da, 800 Da, 700 Da, 600 Da, 500 Da, 400 Da, 300 Da, 200 Da 및 100 Da을 포함한다. 일부 실시태양에서, 중합체의 분자량은 약 100 Da 내지 약 50,000 Da이다. 일부 실시태양에서, 중합체의 분자량은 약 100 Da 내지 40,000 Da이다. 일부 실시태양에서, 중합체의 분자량은 약 1,000 Da 내지 40,000 Da이다. 일부 실시태양에서, 중합체의 분자량은 약 5,000 Da 내지 약 40,000 Da이다. 일부 실시태양에서, 중합체의 분자량은 약 10,000 Da 내지 40,000 Da이다. 일부 실시태양에서, 폴리(에틸렌 글리콜) 분자는 분지된 중합체이다. 분지쇄 PEG의 분자량은 약 1,000 Da 내지 약 100,000 Da으로서, 비제한적인 예로는, 100,000 Da, 95,000 Da, 90,000 Da, 85,000 Da, 80,000 Da, 75,000 Da, 70,000 Da, 65,000 Da, 60,000 Da, 55,000 Da, 50,000 Da, 45,000 Da, 40,000 Da, 35,000 Da, 30,000 Da, 25,000 Da, 20,000 Da, 15,000 Da, 10,000 Da, 9,000 Da, 8,000 Da, 7,000 Da, 6,000 Da, 5,000 Da, 4,000 Da, 3,000 Da, 2,000 Da 또는 1,000 Da이다. 일부 실시태양에서, 분지쇄 PEG의 분자량은 약 1,000 Da 내지 50,000 Da이다. 일부 실시태양에서, 분지쇄 PEG의 분자량은 약 1,000 Da 내지 약 40,000 Da이다. 일부 실시태양에서, 분지쇄 PEG의 분자량은 약 5,000 Da 내지 40,000 Da이다. 일부 실시태양에서, 분지쇄 PEG의 분자량은 약 5,000 Da 내지 20,000 Da이다. 아주 광범위한 PEG 분자가 문헌[the Shearwater Polymers, Inc. catalog, Nektar Therapeutics catalog, 전문이 본 명세서에 포함됨]에 기재되어 있다.
문헌에 기재된 말단 관능기의 특정 예는, 비제한적인 예로서, N-숙신이미딜 카르보네이트[미합중국 특허 제5,281,698호 및 제5,468,478호], 아민[Buckmann et al, Makromol Chem. 132:1379 (1981); Zalipsky et al, Eur Polym J. 19:1177 (1983)]; 히드라지드 [Andresz et al. Makromol Chem., 179:301 (1978)]; 숙신이미딜 프로피오네이트, 숙신이미딜 부타노에이트[Olson et al, in Poly(ethylene glycol) Chemistry and Biological Applications, pp 170-181, Harris and Zalispsky Eds. ACS. Washington D.C. 1997; 미합중국 특허 제5,672,662호], 숙신이미딜 숙시네이트 [Abuchowski et al, Cancer Biochem. Biophys. 7:175 (1984) and Joppich et al. Makromol. Chem. 180:1381 (1979)], 숙신이미딜 에스테르[미합중국 특허 제4,670,417호], 벤조트리아졸 카르보네이트[미합중국 특허 제5,650,234호], 글리시딜 에테르[Pitha et al. Eur. J Biochem. 94:11 (1979), Elling et al., Biotech. Appl. Biochem. 13:354 (1991)], 옥시카르보닐이미다졸[Beauchamp, et al., Anal. Biochem. 131:25 (1983), Tondelli et al. J. Controlled Release 1:251 (1985)], p-니트로페닐 카르보네이트[Veronese, et al., Appl. Biochem. Biotech., 11: 141 (1985); and Sartore et al., Appl. Biochem. Biotech., 27:45 (1991)], 알데히드[Harris et al. J. Polym. Sci. Chem. Ed. 22:341 (1984), 미합중국 특허 제5,824,784호, 미합중국 특허 제5,252,714호], 말레이미드[Goodson et al. Bio/Technology 8:343 (1990), Romani et al. in Chemistry of Peptides and Proteins 2:29 (1984)), and Kogan, Synthetic Comm. 22:2417 (1992)], 오르쏘피리딜-디술피드[Woghiren, et al. Bioconj. Chem. 4:314(1993)], 아크릴로일[Sawhney et al., Macromolecules, 26:581 (1993)], 비닐술폰[미합중국 특허 제5,900,461호]을 포함하며, 상기 인용 문헌 및 특허 문헌 전문이 본 명세서에 포함된다.
일부 실시태양에서, PEG는 한 쪽 말단에서 히드록시 또는 메톡시로 끝나며, 즉 X가 H 또는 CH3 ("메톡시 PEG")이다. 다른 식으로는, PEG가 반응성 기로 종결하여 이관능성 중합체를 형성할 수 있다. 전형적인 반응성 기는 20 가지 통상의 아미노산에서 발견되는 관능기 (말레이미드 기, 활성화된 카르보네이트 (p-니트로페닐 에스테르 포함), 활성화된 에스테르 (비제한적인 예로서 N-히드록시숙신이미드, p-니트로페닐 에스테르) 및 알데히드) 뿐만 아니라 20가지 통상의 아미노산에는 불활성이나 비-천연 아미노산에 존재하는 상보적 관능기 (옥심, 카르보닐 또는 디카르보닐 및 히드록실아민 기)와 특이적으로 반응하는 반응성 기를 포함할 수 있다.
상기 화학식에서 Y로 표시된 PEG의 다른 쪽 말단은 폴리펩티드(합성 또는 천연), 폴리뉴클레오티드, 폴리사카라이드 또는 합성 중합체에 비-천연 아미노산을 통해 부착된다. Y가 히드록실아민 기인 경우, 히드록실아민-함유 PEG 화합물은 폴리펩티드 중 카르보닐- 또는 디카르보닐-함유 비-천연 아미노산과 반응하여 옥심 결합을 통해 폴리펩티드에 결합된 PEG 기를 형성한다. Y가 카르보닐- 또는 디카르보닐 기인 경우, 카르보닐- 또는 디카르보닐-함유 PEG 화합물은 폴리펩티드 중의 히드록실아민-함유 비-천연 아미노산과 반응하여 옥심 결합을 통해 폴리펩티드에 결합된 PEG 기를 형성한다. Y가 카르보닐- 또는 디카르보닐 기인 경우, 카르보닐- 또는 디카르보닐-함유 PEG 화합물은 폴리펩티드 중의 옥심 함유 비-천연 아미노산과 반응하여 새로운 옥심 결합을 통해 폴리펩티드에 결합된 PEG 기를 형성한다. 적절한 반응 조건, 정제 방법 및 시약의 예는 본 명세서 및 첨부된 도면에 기재되어 있다. 예를 들어, 도 7은 카르보닐-함유 비-천연 아미노산 폴리펩티드와 히드록실아민-함유 PEG 화합물의 반응 결과 PEG 기에 결합된 옥심-함유 비-천연 아미노산 폴리펩티드가 생성되는 3 가지 예를 도시하고 있다. 도 9는 옥심-함유 비-천연 아미노산 폴리펩티드와 카르보닐-함유 PEG 화합물의 반응 결과 PEG 기에 결합된 새로운 옥심-함유 비-천연 아미노산 폴리펩티드가 생성되는 두 가지 예를 도시하고 있다. 도 10은 히드록실아민-함유 비-천연 아미노산 폴리펩티드와 카르보닐-함유 PEG 화합물의 반응 결과 PEG 기에 결합된 옥심-함유 비-천연 아미노산 폴리펩티드가 생성되는 한 가지 예를 도시하고 있다.
본 명세서에 기재된 방법, 조성물, 전략 및 기술에 사용될 수 있는 PEG 화합물의 유형 또는 종류를 한정하려는 것이 아닌 단지 예시하려는 목적으로, 도 11은 카르보닐-함유 비-천연 아미노산 폴리펩티드와 반응하여 PEG 기에 결합된 옥심-함유 비-천연 아미노산 폴리펩티드를 형성할 수 있는 히드록실아민-함유 PEG 화합물의 예, 및 옥심-함유 비-천연 아미노산 폴리펩티드 또는 히드록실아민-함유 비-천 연 아미노산 폴리펩티드와 반응하여 PEG 기에 결합된 새로운 옥심-함유 비-천연 아미노산 폴리펩티드를 형성할 수 있는 카르보닐-함유 PEG 화합물의 예를 도시하고 있다. 도 12는 히드록실아민-함유 PEG 화합물, 그의 보호된 형태 또는 그의 차폐된 형태를 합성하는 방법의 네 가지 예를 도시하고 있다. 도 13은 아미드-결합된 히드록실아민-함유 PEG 화합물, 그의 보호된 형태 또는 그의 차폐된 형태를 합성하는 방법의 예를 도시하고 있다. 도 14 및 도 15는 카르바메이트-결합된 히드록실아민-함유 PEG 화합물, 그의 보호된 형태 또는 그의 차폐된 형태를 합성하는 방법의 예를 도시하고 있다. 도 16은 단순한 히드록실아민-함유 PEG 화합물, 그의 보호된 형태 또는 그의 차폐된 형태를 합성하는 방법의 예를 도시하고 있다. 또한, 도 17은 결합된 PEG 기의 다수의 분지를 갖는 히드록실아민-함유 화합물의 예와, 그와 같은 히드록실아민-함유 다중-PEG-분지 화합물과 카르보닐-함유 비-천연 아미노산 폴리펩티드가 반응하여 다중-PEG-분지 기가 결합된 옥심-함유 비-천연 아미노산 폴리펩티드를 형성하는 반응을 도시하고 있다.
헤테로이관능성 유도체는 또한 상이한 분자를 중합체의 각 말단에 부착하는 것이 바람직할 때 특히 유용하다. 예를 들어, 오메가-N-아미노-N-아지도 PEG는 알데히드, 케톤, 활성화된 에스테르, 활성화된 카르보네이트 등과 같은 활성화 친전자기를 갖는 분자를 PEG의 한 쪽 말단에 부착하고, 아세틸렌 기를 갖는 분자를 PEG의 다른 말단에 부착하는 것을 가능하게 한다.
일부 실시태양에서, 강한 친핵체(비제한적인 예로서 히드록실아민 포함)는 비-천연 아미노산에 존재하는 알데히드 또는 케톤 기와 반응하여 옥심을 형성하며, 이는 몇몇 경우에 적절한 환원제로 추가로 환원된다. 다른 방식으로는 강한 친핵체는 비-천연 아미노산을 통하여 폴리펩티드 내로 도입되어 수용성 중합체 중에 존재하는 알데히드 또는 케톤 기와 우선적으로 반응할 수 있다. 일반적으로, PEG 분자의 적어도 하나의 말단은 비-천연 아미노산과의 반응에 이용할 수 있다.
따라서, 일부 실시태양에서, 비-천연 아미노산을 포함하는 폴리펩티드는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)과 같은 수용성 중합체에 비-천연 아미노산의 측쇄를 통해 결합된다. 본 명세서에 기재된 비-천연 아미노산 방법 및 조성물은 20 가지의 천연적으로 도입된 아미노산에서는 발견되지 않는 관능기 또는 치환기를 함유하는 비-천연 아미노산을 셀렉터 코돈에 반응하여 단백질 내로 선택적으로 도입시키고, 후에 그와 같은 아미노산을 적절히 반응성인 PEG 유도체로 변형시키는 것을 포함하는, 단백질을 PEG 유도체로 선택적으로 변형시키는 매우 효율적인 방법을 제공한다. 많은 화학적 방법이 수용성 중합체를 단백질 내로 도입시키는 본 명세서에 기재된 비-천연 아미노산 방법 및 조성물에 사용하기에 적절하다.
중합체 골격은 직쇄 또는 분지쇄일 수 있다. 분지된 중합체 골격은 일반적으로 당업계에 알려져 있다. 전형적으로, 분지된 중합체는 중앙 분지 코어 잔기 및 이에 결합된 다수의 선형 중합체 쇄를 갖는다. PEG는 에틸렌 옥시드를 각종 폴리올, 예를 들어, 글리세롤, 글리세롤 올리고머, 펜타에리트리톨 및 솔비톨 등에 부가하여 제조될 수 있는 분지된 형태로 사용된다. 중앙 분지 잔기는 또한 리신과 같은 몇몇 아미노산으로부터 유도될 수 있다. 분지된 폴리(에틸렌 글리콜)은 일반 적 형태로 R(-PEG-OH)m (여기서, R은 글리세롤, 글리세롤 올리고머, 펜타에리트리톨과 같은 코어 잔기로부터 유도되고, m은 암(arm)의 수임)로 표시된다. 멀티-암PEG 분자, 예컨대, 미합중국 특허 5,932,462 5,643,575; 5,229,490; 4,289,872; 미합중국 특허 출원 2003/0143596; WO 96/21469; 및 WO 93/21259 (전문이 본 명세서에 포함됨)에 기재된 바와 같은 것이 또한 중합체 골격으로 사용될 수 있다.
분지된 PEG는 또한 화학식 PEG(-YCHZ2)n (여기서, Y는 결합 기이고, Z은 정의된 길이의 원자 쇄에 의해 CH에 결합된 활성화된 말단 기임)로 표시되는 포크 형태일 수 있다. 또 다른 분지된 형태인 펜던트 PEG는 PEG 쇄의 말단이 아니라 PEG 골격을 따라서 카르복실과 같은 반응성 기를 갖는다.
이와 같은 PEG 형태에 더하여, 중합체는 골격 내에 약한 또는 분해 가능한 결합을 갖는 중합체가 제조될 수 있다. 예를 들어, 중합체 골격 내에 가수분해에 민감한 결합을 갖는 PEG가 제조될 수 있다. 하기 나타낸 바와 같이, 가수 분해 결과 중합체가 절단되어 보다 작은 분자량의 단편이 된다:
-PEG-CO2-PEG- + H2O -≫ PEG-CO2H + HO-PEG-
폴리에틸렌 글리콜 또는 PEG는 본 명세서에 기재된 형태에 제한되지 않는 모든 공지된 형태를 나타내며 또한 포함한다는 것이 당업자에 의해 이해되어야 한다. 중합체의 분자량은 다양할 수 있으며, 비제한적인 예로서 약 100 Da 내지 약 100,000 Da 또는 그 이상이다. 중합체의 분자량은 약 100 Da 내지 약 100,000 Da이며, 비제한적인 예로서 100,000 Da, 95,000 Da, 90,000 Da, 85,000 Da, 80,000 Da, 75,000 Da, 70,000 Da, 65,000 Da, 60,000 Da, 55,000 Da, 50,000 Da, 45,000 Da, 40,000 Da, 35,000 Da, 30,000 Da, 25,000 Da, 20,000 Da, 15,000 Da, 10,000 Da, 9,000 Da, 8,000 Da, 7,000 Da, 6,000 Da, 5,000 Da, 4,000 Da, 3,000 Da, 2,000 Da, 1,000 Da, 900 Da, 800 Da, 700 Da, 600 Da, 500 Da, 400 Da, 300 Da, 200 Da 및 100 Da을 포함한다. 일부 실시태양에서, 중합체 분쟈량은 약 100 Da 내지 약 50,000 Da이다. 일부 실시태양에서, 중합체의 분자량은 약 100 Da 내지 약 40,000 Da이다. 일부 실시태양에서, 중합체의 분자량은 약 1,000 Da 내지 약 40,000 Da이다. 일부 실시태양에서, 중합체의 분자량은 약 5,000 Da 내지 약 40,000 Da이다. 일부 실시태양에서, 중합체의 분자량은 약 10,000 Da 내지 40,000 Da이다.
PEG의 목적하는 특성을 극대화하기 위하여, 생물학적 활성 분자에 결합된 PEG 중합체의 총 분자량 또는 수화 상태는 전형적으로는 PEG 중합체 부착과 관련된 유리한 특성, 예를 들어, 증가된 수용해도 및 순환 반감기를 부여하는 반면, 패런트 분자의 생활성에 영향을 미치지 않도록 충분히 높아야한다.
본 명세서에 기재된 방법 및 조성물은 실질적으로 균질한 중합체:단백질 컨쥬게이트 제제를 생산하는데 사용될 수 있다. "실질적으로 균질한"이란 중합체:단백질 컨쥬게이트 분자가 총 단백질의 반 보다 많은 경우를 이른다. 중합체:단백질 컨쥬게이트는 생물학적 활성을 가지며, 본 발명의 "실질적으로 균질한" PEG화 폴리펩티드 제제는 균질한 제제의 잇점, 즉, 로트-투-로트(lot to lot) 약물동태학의 예견에 있어서 이상적 사용의 용이성을 나타내기에 충분히 균질한 것이다.
또한, 중합체:단백질 컨쥬게이트 분자의 혼합물을 제조할 수 있으며, 그 잇점은 혼합물 중에 포함될 단일-중합체:단백질 컨쥬게이트의 비율을 선택할 수 있다. 따라서, 필요에 따라, 다양한 수의 중합체 잔기가 부착된(즉, 디-, 트리-, 테트라- 등) 다양한 단백질의 혼합물을 제조하고, 상기 컨쥬게이트를 본 명세서에 기재된 방법으로 제조된 단일-중합체:단백질 컨쥬게이트와 조합하고, 소정 비율의 단일-중합체:단백질 컨쥬게이트를 갖는 혼합물을 수득한다.
단백질 분자에 대한 폴리에틸렌 글리콜 분자의 비율은 반응 혼합물 중에서의 그들의 비율처럼 다양할 것이다. 일반적으로, 적정 비율(최소 과량의 미반응 단백질 또는 중합체가 존재한다는 반응 효율의 측면에서)은 선택된 폴리에틸렌 글리콜의 분자량 및 이용가능한 반응성 기의 수에 의해서 결정될 것이다. 분자량과 관련하여, 전형적으로는 분자량이 클수록 단백질에 결합될 수 있는 중합체 분자의 수는 적어진다. 마찬가지로, 중합체의 분지가 이들 파라미터를 최적화하는데 있어서 고려되어야 한다. 일반적으로, 분자량이 클수록(또는 분지가 많을 수록), 중합체:단백질 비율은 커진다.
본 명세서에서 친수성 중합체: 폴리펩티드/단백질 컨쥬게이트를 논의할때, "치료 유효량"이란 환자에게 바람직한 이익을 증가시키는 양이다. 그와 같은 양은 환자 개인에 따라 달라질 것이며, 여러 인자, 예컨대, 환자의 전체적 건강 상태, 치료될 질병, 장애 또는 증상의 근본 원인에 따라 달라질 것이다. 본 발명 조성물의 치료 유효량은 공중 이용가능한 자료 및 과정을 통해 당업자에 의해 쉽게 결정될 수 있을 것이다.
본 명세서에 기재된 "변형 또는 비변형된" 비-천연 아미노산 폴리펩티드에 결합된 수용성 중합체의 수(즉, PEG화 또는 글리코실화 정도)는 변화된 (증가 또는 감소된) 약물학, 약물동태학 또는 약물역학 특성, 예컨대, 생체내 반감기를 제공하도록 조정될 수 있다. 일부 실시태양에서, 폴리펩티드의 반감기는 비변형된 폴리펩티드에 비해 적어도 약 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 퍼센트, 2배, 5배, 10배, 50배 또는 적어도 약 100 배 증가된다.
일부 실시태양에서, 카르보닐- 또는 디카르보닐-함유 비-천연 아미노산을 포함하는 폴리펩티드는 PEG 골격에 직접 결합된 말단 히드록실아민 잔기를 함유하는 PEG 유도체로 변형된다.
일부 실시태양에서, 히드록실아민-말단 PEG 유도체는 하기 구조를 가질 것이다:
RO-(CH2CH2O)n-O-(CH2)m-O-NH2
(상기 식에서, R은 단순 알킬 (메틸, 에틸, 프로필 등)이고, m은 2 내지 10이고, n은 100 내지 1,000, 즉 평균 분자량이 5 내지 40 kDa임). 중합체의 분자량은 광범위할 수 있으며, 비제한적인 예로서 약 100 Da 내지 약 100,000 Da 또는 그 이상일 수 있다. 중합체의 분자량은 약 100 Da 내지 약 100,000 Da, 비제한적인 예로서, 100,000 Da, 95,000 Da, 90,000 Da, 85,000 Da, 80,000 Da, 75,000 Da, 70,000 Da, 65,000 Da, 60,000 Da, 55,000 Da, 50,000 Da, 45,000 Da, 40,000 Da, 35,000 Da, 30,000 Da, 25,000 Da, 20,000 Da, 15,000 Da, 10,000 Da, 9,000 Da, 8,000 Da, 7,000 Da, 6,000 Da, 5,000 Da, 4,000 Da, 3,000 Da, 2,000 Da, 1,000 Da, 900 Da, 800 Da, 700 Da, 600 Da, 500 Da, 400 Da, 300 Da, 200 Da 또는 100 Da일 수 있다. 일부 실시태양에서, 중합체의 분자량은 약 100 Da 내지 50,000 Da이다. 일부 실시태양에서, 중합체의 분자량은 약 100 Da 내지 40,000 Da이다. 일부 실시태양에서, 중합체의 분자량은 약 1,000 Da 내지 40,000 Da이다. 일부 실시태양에서, 중합체의 분자량은 약 5,000 Da 내지 40,000 Da이다. 일부 실시태양에서, 중합체의 분자량은 약 10,000 Da 내지 40,000 Da이다.
또 다른 실시태양에서, 카르보닐- 또는 디카르보닐-함유 비-천연 아미노산을 포함하는 폴리펩티드는 아미드 결합을 통하여 PEG 골격에 직접 결합된 말단 히드록실아민 잔기를 함유하는 PEG 유도체로 변형된다.
일부 실시태양에서, 히드록실아민-말단 PEG 유도체는 하기 구조를 갖는다:
RO-(CH2CH2O)n-O-(CH2)2-NH-C(0)(CH2)m-O-NH2
(상기 식에서, R은 단순 알킬(메틸, 에틸, 프로필 등)이고, m은 2 내지 10이고, n은 100 내지 1,000, 즉 평균 분자량이 5 내지 40 kDa임). 중합체 분자량은 광범위할 수 있으며, 비제한적인 예로서 약 100 Da 내지 약 100,000 Da 또는 그 이상일 수 있다. 중합체의 분자량은 약 100 Da 내지 약 100,000 Da이며, 비제한적인 예로서, 100,000 Da, 95,000 Da, 90,000 Da, 85,000 Da, 80,000 Da, 75,000 Da, 70,000 Da, 65,000 Da, 60,000 Da, 55,000 Da, 50,000 Da, 45,000 Da, 40,000 Da, 35,000 Da, 30,000 Da, 25,000 Da, 20,000 Da, 15,000 Da, 10,000 Da, 9,000 Da, 8,000 Da, 7,000 Da, 6,000 Da, 5,000 Da, 4,000 Da, 3,000 Da, 2,000 Da, 1,000 Da, 900 Da, 800 Da, 700 Da, 600 Da, 500 Da, 400 Da, 300 Da, 200 Da 또는 100 Da일 수 있다. 일부 실시태양에서, 중합체의 분자량은 약 100 Da 내지 50,000 Da이다. 일부 실시태양에서, 중합체의 분자량은 약 100 Da 내지 40,000 Da이다. 일부 실시태양에서, 중합체의 분자량은 약 1,000 Da 내지 40,000 Da이다. 일부 실시태양에서, 중합체의 분자량은 약 5,000 Da 내지 40,000 Da이다. 일부 실시태양에서, 중합체의 분자량은 약 10,000 Da 내지 40,000 Da이다.
또 다른 실시태양에서, 카르보닐- 또는 디카르보닐-함유 비-천연 아미노산을 포함하는 폴리펩티드는 말단 히드록실아민 잔기를 함유하는 분지된 PEG 유도체로 변형되며, 이 때 분지된 PEG의 각 쇄는 분자량이 10 내지 40 kDa, 다른 실시태양에서는 5 내지 20 kDa이다. 분지된 중합체의 분자량은 광범위할 수 있으며, 비제한적인 예로서 약 100 Da 내지 약 100,000 Da 또는 그 이상이다. 중합체의 분자량은 약 100 Da 내지 약 100,000 Da일 수 있으며, 비제한적인 예로서 100,000 Da, 95,000 Da, 90,000 Da, 85,000 Da, 80,000 Da, 75,000 Da, 70,000 Da, 65,000 Da, 60,000 Da, 55,000 Da, 50,000 Da, 45,000 Da, 40,000 Da, 35,000 Da, 30,000 Da, 25,000 Da, 20,000 Da, 15,000 Da, 10,000 Da, 9,000 Da, 8,000 Da, 7,000 Da, 6,000 Da, 5,000 Da, 4,000 Da, 3,000 Da, 2,000 Da, 1,000 Da, 900 Da, 800 Da, 700 Da, 600 Da, 500 Da, 400 Da, 300 Da, 200 Da 또는 100 Da일 수 있다. 일부 실시태양에서, 중합체의 분자량은 약 100 Da 내지 50,000 Da이다. 일부 실시태양에서, 중합체의 분자량은 약 100 Da 내지 40,000 Da이다. 일부 실시태양에서, 중 합체의 분자량은 약 1,000 Da 내지 40,000 Da이다. 일부 실시태양에서, 중합체의 분자량은 약 5,000 Da 내지 40,000 Da이다. 일부 실시태양에서, 중합체의 분자량은 약 10,000 Da 내지 40,000 Da이다.
또 다른 실시태양에서, 비-천연 아미노산을 포함하는 폴리펩티드는 분지된 구조를 갖는 적어도 하나의 PEG 유도체로 변형된다. 일부 실시태양에서, 히드록실아민 기를 갖는 PEG 유도체는 하기 구조를 갖는다:
[RO-(CH2CH2O)n-O-(CH2)2-C(O)-NH-CH2-CH2]2CH-X-(CH2)m-O-NH2
(상기 식에서, R은 단순 알킬 (메틸, 에틸, 프로필 등)이고, X는 임의로는 NH, O, S, C(O)이거나 존재하지 않으며, m은 2 내지 10이고, n은 100 내지 1,000임). 중합체의 분자량은 약 1,000 Da 내지 약 100,000 Da, 비제한적인 예로서, 100,000 Da, 95,000 Da, 90,000 Da, 85,000 Da, 80,000 Da, 75,000 Da, 70,000 Da, 65,000 Da, 60,000 Da, 55,000 Da, 50,000 Da, 45,000 Da, 40,000 Da, 35,000 Da, 30,000 Da, 25,000 Da, 20,000 Da, 15,000 Da, 10,000 Da, 9,000 Da, 8,000 Da, 7,000 Da, 6,000 Da, 5,000 Da, 4,000 Da, 3,000 Da, 2,000 Da 또는 1,000 Da일 수 있다. 일부 실시태양에서, 분지쇄 PEG의 분자량은 약 1,000 Da 내지 50,000 Da이다. 일부 실시태양에서, 분지쇄 PEG의 분자량은 약 1,000 Da 내지 40,000 Da이다. 일부 실시태양에서, 분지쇄 PEG의 분자량은 약 5,000 Da 내지 40,000 Da이다. 일부 실시태양에서, 분지쇄 PEG의 분자량은 약 5,000 Da 내지 20,000 Da이다.
PEG의 관능성화 및 컨쥬게이션에 관한 몇몇 리뷰 및 모노그래프를 이용할 수 있다[참조: Harris, Macromol. Chem. Phys. C25: 325-373 (1985); Scouten, Methods in Enzymology 135: 30-65 (1987); Wong et al, Enzyme Microb. Technol. 14: 866-874 (1992); Delgado et al, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems 9: 249-304 (1992); Zalipsky, Bioconjugate Chem. 6: 150-165 (1995)].
중합체를 활성화시키는 방법은 문헌[WO 94/17039, 미합중국 특허 제5,324,844호, WO 94/18247, WO 94/04193, 미합중국 특허 제5,219,564호, 미합중국 특허 제5,122,614호, WO 90/13540, 미합중국 특허 제5,281,698호, 및 WO 93/15189]에서 찾아볼 수 있으며, 활성화된 중합체와 효소, 예컨대, 컨쥬게이션 인자 VIII (WO 94/15625), 헤모글로빈(WO 94/09027), 산소 운반 분자(미합중국 특허 제4,412,989호), 리보뉴클레아제 및 슈퍼옥시드 디스뮤타제 (Veronese at al, App. Biochem. Biotech. 11: 141-152 (1985))사이의 컨쥬게이트가 문헌에 기재되어 있다. 상기 문헌은 그 전문이 본 명세서에 포함된다.
필요에 따라, 소수성 크로마토그래피에 의해 얻어진 본 명세서에 기재된 PEG화 비-천연 아미노산 폴리펩티드는 당 분야에 알려진 하나 이상의 방법, 예컨대, 친화도 크로마토그래피; 음이온 또는 양이온 교환 크로마토그래피 (예를 들어, DEAE 세파로즈); 실리카 크로마토그래피; 역상 HPLC; 겔 여과(예를 들어, 세파덱스 G-75 사용); 소수성 상호작용 크로마토그래피; 크기-배제 크로마토그래피; 금속 킬레이트 크로마토그래피; 한외여과/투석여과; 에탄올 침전; 황산암모늄 침전; 크로마토포커싱; 디스플레이스먼트 크로마토그래피; 전기영동(비제한적인 예로서 분취 용 등전 포커싱); 시차 용해도 (황산암모늄 침전 포함) 또는 추출법을 사용하여 더욱 정제될 수 있다. 겉보기 분자량은 세계 단백질 표준(Preneta AZ, PROTEIN PURIFICATION METHODS, A PRACTICAL APPROACH (Harris & Angal, Eds.) IRL Press 1989, 293-306)과 비교하여 GPC로 평가할 수 있다. 비-천연 아미노산 폴리펩티드:PEG 컨쥬게이트의 순도는 다단계 분해 (예를 들어, 트립신 절단)에 이은 질량 스펙트럼 분석으로 평가될 수 있다[참조: Pepinsky RB., et.al, J. Pharmacol. & Exp. Ther. 297(3): 1059-66 (2001)].
본 명세서에 기재된 폴리펩티드의 비-천연 아미노산에 결합된 수용성 중합체는 아무런 제한없이 더욱 유도되거나 치환될 수 있다.
E. 혈청 알부민에 대한 친화도 향상
각종 분자를 본 명세서에 기재된 비-천연 아미노산 폴리펩티드에 융합시켜 혈청 반감기를 조절할 수 있다. 일부 실시태양에서, 분자는 본 명세서에 기재된 "변형 또는 비변형된" 비-천연 아미노산 폴리펩티드에 결합 또는 융합되어 동물 중 내생 혈청 알부민에 대한 친화도를 증가시킬 수 있다.
예를 들어, 일부 실시태양에서, 폴리펩티드와 알부민 결합 서열의 재조한 융합체가 만들어진다. 알부민 결합 서열의 비제한적인 예로는 스트렙토코커스 단백질 G로부터의 알부민 결합 도메인[Makrides et al, J. Pharmacol. Exp. Ther. 277(l):534-542 (1996) and Sjolander et al, J, Immunol. Methods 201:115-123 (1997)] 또는 문헌[ Dennis, et al, J. Biol. Chem. 277(38):35035-35043 (2002)]에 기재된 것과 같은 알부민 결합 펩티드가 있다.
다른 실시태양에서, 본 명세서에 기재된 "변형 또는 비변형된" 비-천연 아미노산 폴리펩티드는 지방산으로 아실화된다. 몇몇 경우에, 지방산은 혈청 알부민으로의 결합을 촉진한다[참조: Kurtzhals, et al, Biochem. J. 312:725-731 (1995)].
다른 실시태양에서, 본 명세서에 기재된 "변형 또는 비변형된" 비-천연 아미노산 폴리펩티드는 혈청 알부민(예를 들어, 인간 혈청 알부민)과 직접 융합된다. 당업자는 여러 다른 분자를 본 명세서에 기재된 "변형 또는 비변형된" 비-천연 아미노산 폴리펩티드에 결합시켜 혈청 알부민 또는 다른 혈청 성분에의 결합을 조절할 수 있다는 것을 잘 인식하고 있다.
F. 본 명세서에 기재된 비-천연 아미노산 폴리펩티드의 글리코실화
본 명세서에 기재된 방법 및 조성물은 사카라이드잔기를 함유하는 하나 이상의 비-천연 아미노산을 포함하는 폴리펩티드를 포함한다. 사카라이드 잔기는 천연의 것이거나 (예를 들어, N-아세틸글루코사민) 비-천연의 것 (예를 들어, 3-플루오로갈락토스)일 수 있다.
사카라이드 (비제한적인 예로서 글리코실) 잔기는 비-천연 아미노산 폴리펩티드에 시험관내 또는 생체내에서 부가될 수 있다. 일부 실시태양에서, 카르보닐- 또는 디카르보닐-함유 비-천연 아미노산을 포함하는 폴리펩티드는 아미노옥시 기로 유도된 사카라이드로 변형되어 옥심 결합을 통해 결합된 상응하는 글리코실화 폴리펩티드를 생성할 수 있다. 일단 비-천연 아미노산에 부착되면, 사카라이드는 글리코실트랜스퍼라제 및 다른 효소로 처리되어 비-천연 아미노산 폴리펩티드에 결합된 올리고사카라이드를 생성할 수 있다[참조: H. Liu, et al. J. Am. Chem. Soc. 125: 1702-1703 (2003)].
G. 결합 기의 용도 및 폴리펩티드 이합체 및 다합체에의 응용
비-천연 아미노산 폴리펩티드에 관능기를 직접 도입하는 것 외에, 폴리펩티드의 비-천연 아미노산 부분을 우선 다관능성 (예를 들어, 비-, 트리-, 테트라-) 링커 분자로 변형시킨 다음, 후속하여 더욱 변형시킬 수 있다. 즉, 다관능성 링커 분자의 적어도 하나의 말단이 폴리펩티드 중 적어도 하나의 비-천연 아미노산 부분과 반응하고, 다관능성 링커 분자의 적어도 하나의 다른 말단은 추가의 관능화에 이용도 될 수 있다. 다관능성 링커 분자의 모든 말단이 동일한 경우, (화학양론적 조건에 따라) 비-천연 아미노산 폴리펩티드의 호모다합체가 생성될 수 있다. 다관능성 링커 분자의 말단이 상이한 화학 반응성을 갖는 경우에, 다관능성 링커 분자의 적어도 하나의 말단은 비-천연 아미노산 폴리펩티드에 결합하고, 다른 말단은 이후에 다른 관능기와 결합하게 된다. 이와 같은 다른 관능기의 비제한적인 예로는 표지, 염료, 중합체, 수용성 중합체, 폴리에틸렌 글리콜 유도체, 광가교결합제, 세포독성 화합물, 약물, 친화도 표지, 광친화도 표지, 반응성 화합물, 수지, 제2의 단백질 또는 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 유사체, 항체 또는 항체 단편, 금속 킬레이트제, 조인자, 지방산, 탄수화물, 폴리뉴클레오티드, DNA, RNA, 안티센스 폴리뉴클레오티드, 사카라이드, 수용성 덴드리머, 시클로덱스트린, 생물질, 나노입자, 스핀 표지, 형광물질, 금속-함유 잔기, 방사성 잔기, 신규 관능기, 다른 분자와 공유적으로 또는 비공유적으로 상호작용하는 기, 포토케이지드 잔기, 화학선 여기가능한 잔기, 리간드, 광이성화성 잔기, 비오틴, 비오틴 유사체, 중량급 원자를 포함하 는 잔기, 화학적으로 절단가능한 기, 광-절단가능한 기, 신장된 측쇄, 탄소-결합 당, 산화환원 활성제, 아미노 티오산, 독성 잔기, 동위원소 표지된 잔기, 생물리학적 프로브, 인광 기, 화학발광 기, 전자밀도가 높은 기, 자성 기, 인터캘레이팅 기, 발색단, 에너지 전달기, 생물학적 활성제, 검출가능한 표지, 소분자, 억제성 리보핵산, 방사성 핵종, 중성자 포획제, 비오틴 유도체, 콴텀 도트, 나노트랜스미터, 라디오트랜스미터, 아브자임, 활성화된 복합 활성화제, 바이러스, 보조제, 아글리칸, 알러간, 안지오스타틴, 항호르몬, 항산화제, 압타머, 가이드 RNA, 사포닌, 셔틀 벡터, 거대 분자, 미모토우프, 수용체, 역상 미셀 및 그들의 조합이 있다.
다관능성 링커 기는 하기 화학식 (XIX)와 같은 일반적 구조를 갖는다:
<화학식 XIX>
Figure 112007052373933-pct00084
상기 식에서,
X는 각각 독립적으로 NH2, -C(=O)R9, -SR' 또는 -J-R이고,
R9는 H 또는 OR'이며, J는
Figure 112007052373933-pct00085
이고;
R은 H, 알킬, 치환된 알킬, 시클로알킬 또는 치환된 시클로알킬이고;
R"는 각각 독립적으로 H, 알킬, 치환된 알킬 또는 보호기를 나타내거나, 두 개 이상의 R" 기가 존재하는 경우, 두 개의 R"는 임의로는 헤테로시클로알킬을 형성하며;
R'는 각각 독립적으로 H, 알킬 또는 치환된 알킬이고;
L은 각각 독립적으로 알킬렌, 치환된 알킬렌, 알케닐렌, 치환된 알케닐렌, -O-, -O-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -S-, -S-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -S(O)k- (k는 1, 2 또는 3임), -S(O)k(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(O)-, -C(O)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(S)-, -C(S)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')-, -NR'-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(O)N(R')-, -CON(R')-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-N(R')C(O)O-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -O-C(O)N(R')-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -CSN(R')-, -CSN(R')-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')CO-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')C(O)O-, -S(O)kN(R')-, -N(R')C(0)N(R')-, -N(R')C(0)N(R')-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')C(S)N(R')-, -N(R')S(0)kN(R')-, -N(R')-N=, -C(R')=N-, -C(R')=N-N(R')-, -C(R')=N-N= -C(R')2-N=N- 및 -C(R')2-N(R')-N(R')- (여기서, R'는 각각 독립적으로 H, 알킬 또는 치환된 알킬임)로 구성되는 군으로부터 선택되며;
L1은 임의로 존재하고, 존재하는 경우, -C(R')p-NR'-C(O)O-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)- (p는 0, 1 또는 2이고; R'은 각각 독립적으로 H, 알킬 또는 치환된 알킬임)이고;
W는 NH2, -C(=O)R9, -SR' 또는 -J-R이고;
n은 1 내지 3이며; 단, L-L1-W는 함께 (a) 비-천연 아미노산 또는 "변형 또는 비변형된" 비-천연 아미노산 폴리펩티드 상의 카르보닐 기(디카르보닐 기 포함)와 반응할 수 있는 적어도 하나의 히드록실아민 기, (b) 비-천연 아미노산 또는 "변형 또는 비변형된" 비-천연 아미노산 폴리펩티드 상의 히드록실아민 기와 반응할 수 있는 적어도 하나의 카르보닐 기(디카르보닐 기 포함), 또는 (c) 비-천연 아미노산 또는 "변형 또는 비변형된" 비-천연 아미노산 폴리펩티드 상의 옥심 기와 교환 반응할 수 있는 적어도 하나의 카르보닐 기(디카르보닐 기 포함)를 제공한다.
도 18은 두 개의 동일한 말단, 즉, 히드록실아민 기를 갖는 이관능성 호모링커를 합성하는 비제한적인 예를 도시하고 있다. 그와 같은 링커는 두 개의 옥심 결합을 형성하는, 카르보닐- 또는 디카르보닐-함유 비-천연 아미노산을 포함하는 폴리펩티드의 호모이합체를 형성하는데 사용될 수 있다. 다른 식으로, 그와 같은 링커의 한쪽 말단이 보호된 경우, 비보호된 히드록실아민 말단은 옥심 결합을 통하여 카르보닐- 또는 디카르보닐-함유 비-천연 아미노산을 포함하는 폴리펩티드에 결합하게 하고, 나머지 보호된 말단은 탈보호 후 추가의 결합 반응에 이용되도록 할 수 있다. 또 다른 식으로는, 목적하는 헤테로이합체가 일부 호모이합체로 오염될 수 있을 지라도, 반응물의 화학량을 잘 조절하여 유사한 결과(헤테로 이합체)를 얻을 수 있다.
도 19는 각각의 링커가 두 가지 이상의 말단 반응성 기, 즉, 히드록실아민, 옥심 및 티오에스테르 기를 갖는 두 가지 다관능성 헤테로링커를 비제한적으로 제시하고 있다. 그와 같은 링커는 본 명세서를 통하여 논의된 옥심-기초 화학 반응성을 이용하여 비-천연 아미노산 폴리펩티드의 헤테로이합체를 형성하는데 사용될 수 있다.
도 20은 PEG 기를 비-천연 아미노산 폴리펩티드에 다단계 합성으로 부착시키는데 헤테로이관능성 링커를 사용하는 예를 비제한적으로 도시하고 있다. 도시되어 있는 바와 같이, 제1 단계에서, 카르보닐-함유 비-천연 아미노산 폴리펩티드가 히드록실아민-함유 이관능성 링커와 반응하여 변형된 옥심-함유 비-천연 아미노산 폴리펩티드를 형성한다. 그러나, 이관능성 링커는 여전히 적절한 반응성(도면에서, 짝지어져 있는 어둡게 표시된 부분)을 갖는 화합물과 반응을 할 수 있는 관능기(어둡게 표시된 오각형)를 보유하여 변형된 옥심-함유 관응성 비-천연 아미노산 폴리펩티드를 형성한다. 이 도면에서, 관능기는 PEG 기 이지만, 상술한 관능기 중 어느 것이나 포함할 수 있는 것이며, 또는, 트리- 또는 테트라-관능성 링커를 사용하는 경우에는 두 가지 유형 이상의 관능기 또는 동일한 관능기 다수 개를 포함할 수 있다. 도 21은 히드록실아민-함유 비-천연 아미노산 폴리펩티드를 PEG 기에 결합시키는데 사용되는 네 가지 링커 기의 예를 도시하고 있다. 앞서와 마찬가지로, PEG 관능기는 단지 예시의 목적으로 주어진 것이다. 따라서, 본 명세서에 기재된 링커 기는 비-천연 아미노산 폴리펩티드를 위치-선택적인 방법으로 더욱 변형시키는 추가의 수단을 제공한다.
본 명세서에 기재된 방법 및 조성물은 호모이합체, 헤테로이합체, 호모다합체, 헤테로다합체(즉, 삼합체, 사합체 등)와 같은 폴리펩티드 복합체를 또한 제공한다. 예를 들어, 후술하는 기재는 GH 슈퍼유전자 패밀리 구성원에 촛점을 두고 있지만, 이 섹션에 기재된 방법, 기술 및 조성물은 이합체 또는 다합체 형태로 제공되는 것이 유리한 사실상 다른 폴리펩티드 어느 것에나 적용될 수 있으며, 그와 같은 폴리펩티드의 예는 다음과 같다: 알파-1 안티트립신, 안지오스타틴, 항용혈 인자, 항체, 항체 단편, 아포리포단백질, 아포단백질, 심방 나트륨이뇨 인자, 심방 나트륨이뇨 폴리펩티드, 심방 펩티드, C-X-C 케모카인, T39765, NAP-2, ENA-78, gro-a, gro-b, gro-c, IP-10, GCP-2, NAP-4, SDF-1, PF4, MIG, 칼시토닌, c-키트 리간드, 사이토카인, CC 케모카인, 단핵구 화학유인 단백질-1, 단핵구 화학유인 단백질-2, 단핵구 화학유인 단백질-3, 단핵구 소염 단백질-1 알파, 단핵구 소염 단백질-1 베타, RANTES, 1309, R83915, R91733, HCC1, T58847, D31065, T64262, CD40, CD40 리간드, c-키트 리간드, 콜라겐, 콜로니 자극인자 (CSF), 보체 인자 5a, 보체 억제제, 보체 수용체 1, 사이토카인, 상피 호중구 활성화 펩티드-78, MIP-16, MCP-1, 표피 성장 인자 (EGF), 상피 호중구 활성화 펩티드, 에리쓰로포이에틴 (EPO), 박리 독소, 인자 IX, 인자 VII, 인자 VIII, 인자 X, 섬유아세포 성장 인자 (FGF), 피브리노겐, 피브로넥틴, 4중 나선 번들 단백질, G-CSF, glp-1, GM-CSF, 글루코세레브로시다제, 고나도트로핀, 성장 인자, 성장 인자 수용체, grf, 헷지호그 단백 질, 헤모글로빈, 간세포 성장 인자 (hGF), 히루딘, 인간 성장 인자 (hGH), 인간 혈청 알부민, ICAM-1, ICAM-1 수용체, LFA-1, LFA-1 수용체, 인슐린, 인슐린-유사 성장 인자 (IGF), IGF-I, IGF-II, 인터페론 (IFN), IFN-알파, IFN-베타, IFN-감마, 인터루킨 (IL), IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, 각질 세포 성장 인자 (KGF), 락토페린, 백혈병 억제 인자, 루시퍼라제, 뉴투린, 호중구 억제 인자 (NIF), 온코스타틴 M, 골원성 단백질, 종양유전자 생성물, 파라시토닌, 부갑상선 호르몬, PD-ECSF, PDGF, 펩티드 호르몬, 플레이오트로핀, 단백질 A, 단백질 G, pth, 발열성 외독소 A, 발열성 외독소 B, 발열성 외독소 C, pyy, 릴랙신, 레닌, SCF, 생합성 소 단백질, 가용성 보체 수용체 I, 가용성 I-CAM 1, 가용성 인터루킨 수용체, 가용성 TNF 수용체, 소마토메딘, 소마토스타틴, 소마토트로핀, 스트렙토키나제, 슈퍼항원, 스타필로코커스 내독소, SEA, SEB, SECl, SEC2, SEC3, SED, SEE, 스테로이드 호르몬 수용체, 슈퍼옥시드 디스뮤타제, 독성 쇼크 증후 독소, 티모신 알파 1, 조직 플라스미노겐 활성화제, 종양 성장 인자 (TGF), 종양 괴사 인자, 종양 괴사 인자 알파, 종양 괴사 인자 베타, 종양 괴사 인자 수용체 (TNFR), VLA-4 단백질, VCAM-1 단백질, 혈관 내피 성장 인자 (VEGF), 유로키나제, mos, ras, raf, met, ρ53, tat, fos, myc, jun, myb, rel, 에스트로겐 수용체, 프로게스테론 수용체, 테스토스테론 수용체, 알도스테론 수용체, LDL 수용체 및 코르티코스테론.
따라서, 본 명세서에 기재된 방법, 기술 및 조성물에는 하나 이상의 비-천연 아미노산을 함유하는 GH 슈퍼유전자 패밀리 구성원 폴리펩티드가 다른 GH 슈퍼유전 자 패밀리 구성원 또는 그의 변이체 또는 비-GH 슈퍼유전자 패밀리 구성원 또는 그의 변이체인 다른 폴리펩티드에 골격에 직접 또는 링커를 통하여 결합되어 있는 것을 포함된다. 단량체에 비하여 분자량이 증가하였기 때문에, GH 슈퍼유전자 패밀리 이합체 또는 다합체 컨쥬게이트는 새롭거나 바람직한 특성, 예컨대, 단량체 GH 슈퍼유전자 패밀리에 비하여 상이한 약물학적, 약물동태학적 또는 약물역학적 특성, 조절된 치료-반감기, 또는 조절된 혈장 반감기를 나타낼 수 있다. 일부 실시태양에서, 본 명세서에 기재된 GH 슈퍼유전자 패밀리 구성원 이합체는 GH 슈퍼유전자 패밀리 구성원 수용체의 이합체화를 조절할 것이다. 다른 실시태양에서, 본 명세서에 기재된 GH 슈퍼유전자 패밀리 구성원 이합체 또는 다합체는 GH 슈퍼유전자 패밀리 구성원 수용체 길항제, 효능제 또는 조절제로 작용할 것이다.
일부 실시태양에서, GH 슈퍼유전자 패밀리 구성원 폴리펩티드는 비제한적인 예로서 예컨대, Asn-Lys 아민 결합 또는 Cys-Cys 디술피드 결합을 통하여 직접 결합되어 있다. 일부 실시태양에서, 결합된 GH 슈퍼유전자 패밀리 구성원 폴리펩티드 및(또는) 결합된 비-GH 슈퍼유전자 패밀리 구성원은 이합체 형성을 촉진하는 상이한 비-천연 아미노산을 포함할 것이며, 비제한적인 예로서, 케톤-함유 비-천연 아미노산을 포함하는 제1 GH 슈퍼유전자 패밀리 구성원 및(또는) 비--GH 슈퍼유전자 패밀리 구성원 폴리펩티드는 히드록실아민-함유 비-천연 아미노산을 포함하는 제2 GH 슈퍼유전자 패밀리 구성원 폴리펩티드에 컨쥬게이트되며, 폴리펩티드들은 상응하는 옥심을 형성하여 반응된다.
다른 방식으로는, 두 개의 GH 슈퍼유전자 패밀리 구성원 폴리펩티드 및(또 는) 결합된 비-GH 슈퍼유전자 패밀리 구성원이 링커를 통하여 결합된다. 동일하거나 상이한 일차 서열을 가질 수 있는 두 개의 GH 슈퍼유전자 패밀리 구성원 및(또는) 결합된 비-GH 슈퍼유전자 패밀리 구성원 폴리펩티드를 결합시키는데는 어느 헤테로- 또는 호모- 이관능성 링커나 사용할 수 있다. 일부 실시태양에서, GH 슈퍼유전자 패밀리 구성원 및(또는) 결합된 비-GH 슈퍼유전자 패밀리 구성원 폴리펩티드를 결합시키는데 사용되는 링커는 이관능성 PEG 화합물일 수 있다.
일부 실시태양에서, 본 명세서에 기재된 방법 및 조성물은 a) 중합체 골격의 적어도 제1 말단에 아지드, 알킨, 히드라진, 히드라지드, 히드록실아민 또는 카르보닐 또는 디카르보닐-함유 잔기; 및 b) 중합체 골격의 제2 말단에 적어도 하나의 제2의 관능기를 포함하는, 아령 구조의 수용성 이관능성 링커를 제공한다. 제2 관능기는 제1 관능기와 동일하거나 상이할 수 있다. 제2 관능기는, 일부 실시태양에서, 제1 관능기와 반응성이지 않다. 본 명세서에 기재된 방법 및 조성물은 분지된 분자 구조의 적어도 하나의 암을 포함하는 수용성 화합물을 제공한다.
일부 실시태양에서, 본 명세서에 기재된 방법 및 조성물은 하기 구조를 갖는 수용성 활성화 중합체와의 반응에 의해 형성되는, 하나 이상의 GH 슈퍼유전자 패밀리 구성원을 포함하는 다합체를 제공한다:
R-(CH2CH2O)n-O-(CH2)m-X
상기 식에서, n은 약 5 내지 3,000이고, m은 2 내지 10이고, X는 아지드, 알킨, 히드라진, 히드라지드, 아미노옥시, 히드록실아민, 아세틸 또는 카르보닐 또는 디카르보닐-함유 잔기이며, R은 X와 동일하거나 상이할 수 있는 캡핑기 또는 이탈기이다. R은 예컨대, 히드록실, 보호된 히드록실, 알콕실, N-히드록시숙신이미딜 에스테르, 1-벤조트리아졸릴 에스테르, N-히드록시숙신이미딜 카르보네이트, 1-벤조트리아졸릴 카르보네이트, 아세탈, 알데히드, 알데히드 수화물, 알케닐, 아크릴레이트, 메타크릴레이트, 아크릴아미드, 활성 술폰, 아민, 아미노옥시, 보호된 아민, 히드라지드, 보호된 히드라지드, 보호된 티올, 카르복실산, 보호된 카르복실산, 이소시아네이트, 이소티오시아네이트, 말레이미드, 비닐술폰, 디티오피리딘, 비닐피리딘, 요오도아세타미드, 에폭시드, 글리옥살, 디온, 메실레이트, 토실레이트, 트레실레이트, 알켄 및 케톤으로 구성되는 군으로부터 선택되는 관능기일 수 있다.
도 22는 본 명세서에 기재된 비-천연 아미노산 폴리펩티드의 호모이합체를 형성하기 위해 본 명세서에 기재된 링커 기를 사용하는 것을 비제한적으로 예시하고 있다. 이 예에서, 카르보닐-함유 비-천연 아미노산 폴리펩티드가 결합된 호모이합체 옥심-함유 비-천연 아미노산 폴리펩티드를 형성하기에 적절한 조건 하에 두 개의 이용가능한 히드록실아민 기를 갖는 이관능성 링커 기와 반응된다. 이 도면에 도시된 방법은 히드록실아민-함유 이관능성 링커에 커플링된 카르보닐-함유 비-천연 아미노산 폴리펩티드에 제한되지 않는다. 비-천연 아미노산 폴리펩티드는 또한 카르보닐-함유 다관능성 링커 기와 옥심 교환 반응하여 다수의 옥심 기를 함유하는 구조에 의해 결합된 호모다합체를 형성할 수 있는 옥심기를 추가로 함유하거나, 비-천연 아미노산 폴리펩티드는 카르보닐-함유 다관능성 링커 기와 반응하여 다수의 옥심 기를 함유하는 구조에 의해 결합된 호모다합체를 형성할 수 있는 히드록실아민 기를 추가로 함유할 수 있다. 물론, 호모다합체는 호모이합체, 호모삼합체 또는 호모사합체일 수 있다.
도 23은 헤테로이합체의 적어도 하나의 구성원이 본 명세서에 기재된 비-천연 아미노산 폴리펩티드이고, 다른 구성원이 임의로는 본 명세서에 기재된 비-천연 아미노산 폴리펩티드, 다른 유형의 비-천연 아미노산 폴리펩티드 또는 천연 아미노산 폴리펩티드인 헤테로이합체를 형성하기 위해 헤테로 관능성 기를 사용하는 비제한적인 예를 도시하고 있다. 이 도면에 제시된 예에서, 링커 기는 두 개의 히드록실아민 기를 함유하며, 화학양론, 온도 및 기타 반응 조건을 조절하여 링커와 카르보닐-함유 비-천연 아미노산 폴리펩티드와의 반응의 우세한 생성물이 이용가능한 히드록실아민 기를 갖는 링커에 결합된 변형된 옥심-함유 비-천연 아미노산 폴리펩티드이다. 이용가능한 히드록실아민 기는 다른 카르보닐- 또는 디카르보닐-함유 비-천연 아미노산 폴리펩티드와 더욱 반응하여 옥심-함유 비-천연 아미노산 폴리펩티드의 이관능성 헤테로이합체를 형성한다. 물론, 링커 상의 관능기는 동일할 필요는 없을 뿐더러, 히드록실아민 기일 필요도 없다. 본 명세서에 상세히 기재된 화학 반응학에 기초하여, 당업자는 적어도 하나의 관능기가 비-천연 아미노산 폴리펩티드와 옥심 기를 형성할 수 있고, 링커 상의 다른 관능기가 다른 공지된 화학 반응성, 예컨대, 유기 화학 분야에 잘 알려진 친핵체/친전자체 반응성을 이용하는 링커를 설계할 수 있다.
H. 관능기를 부착시키는 것의 예: 폴리펩티드의 단리 특성을 용이하게 함
천연 또는 비-천연 아미노산 폴리펩티드는 폴리펩티드의 용해도 또는 결합 특성 등의 여러 이유로 단리하기가 어려울 수 있다. 예를 들어, 치료용 폴리펩티드의 제조에 있어서, 그와 같은 폴리펩티드는 그를 과생산하도록 엔지니어링된 재조합계로부터 단리될 수 있다. 그러나, 폴리펩티드의 용해도 또는 결합 특성으로 인하여 목적하는 정도의 순도를 얻는 것이 종종 어렵다는 것이 밝혀졌다. 본 명세서에 기재된 방법, 조성물, 기술 및 전략은 이에 대한 해결책을 제공한다.
본 명세서에 기재된 방법, 조성물, 전략 및 기술을 이용하여, 당업자는 개선된 단리 특성을 갖는, 목적하는 폴리펩티드에 상동적인 옥심-함유 비-천연 아미노산 폴리펩티드를 생산할 수 있다. 하나의 실시태양에서, 상동 비-천연 아미노산 폴리펩티드는 생합성적으로 생성된다. 또 다른 또는 추가의 실시태양에서, 비-천연 아미노산 폴리펩티드는 그의 구조 내로 본 명세서에 기재된 비-천연 아미노산을 혼입하였다. 또 다른 또는 추가의 실시태양에서, 비-천연 아미노산은 말단 또는 내부 위치에 도입되며, 더우기 위치-특이적으로 도입된다.
하나의 실시태양에서, 생합성적으로 생성된 비-천연 아미노산은 이미 개선된 단리 특성을 갖는다. 또 다른 또는 추가의 실시태양에서, 비-천연 아미노산은 개선된 단리 특성을 제공하는 기에의 옥심 결합을 포함한다. 또 다른 또는 추가의 실시태양에서, 비-천연 아미노산은 변형된 옥심-함유 비-천연 아미노산 폴리펩티드를 형성하도록 추가로 변형되며, 그와 같은 변형은 개선된 단리 특성을 제공하는 기에의 옥심 결합을 제공한다. 일부 실시태양에서, 그와 같은 기는 비-천연 아미노산에 직접 결합되며, 다른 실시태양에서, 그와 같은 기는 링커를 통해 비-천연 아미노산에 결합된다. 특정 실시태양에서, 그와 같은 기는 비-천연 아미노산에 단일 화학 반응을 통하여 결합되며, 다른 실시태양에서, 그와 같은 기를 비-천연 아미노산에 결합시키는게 화학 반응이 필요하다. 바람직하게는, 개선된 단리 특성을 부여하는 기는 비-천연 아미노산 폴리펩티드 중의 비-천연 아미노산에 위치-특이적 결합되며, 사용된 반응 조건하에서 천연 아미노산에 결합되지 않는다.
또 다른 또는 추가의 실시태양에서, 생성된 비-천연 아미노산 폴리펩티드는 GH 슈퍼유전자 패밀리 구성원에 상동적이나, 이 섹션에 기재된 방법, 기술 및 조성물은 사실상 개선된 단리 특성이 이로울 수 있는 다른 폴리펩티드 어느 것에나 적용될 수 있다. 그와 같은 폴리펩티드의 예는 다음과 같다: 알파-1 안티트립신, 안지오스타틴, 항용혈 인자, 항체, 항체 단편, 아포리포단백질, 아포단백질, 심방 나트륨이뇨 인자, 심방 나트륨이뇨 폴리펩티드, 심방 펩티드, C-X-C 케모카인, T39765, NAP-2, ENA-78, gro-a, gro-b, gro-c, IP-10, GCP-2, NAP-4, SDF-1, PF4, MIG, 칼시토닌, c-키트 리간드, 사이토카인, CC 케모카인, 단핵구 화학유인 단백질-1, 단핵구 화학유인 단백질-2, 단핵구 화학유인 단백질-3, 단핵구 소염 단백질-1 알파, 단핵구 소염 단백질-1 베타, RANTES, 1309, R83915, R91733, HCC1, T58847, D31065, T64262, CD40, CD40 리간드, c-키트 리간드, 콜라겐, 콜로니 자극인자 (CSF), 보체 인자 5a, 보체 억제제, 보체 수용체 1, 사이토카인, 상피 호중구 활성화 펩티드-78, MIP-16, MCP-1, 표피 성장 인자 (EGF), 상피 호중구 활성화 펩티드, 에리쓰로포이에틴 (EPO), 박리 독소, 인자 IX, 인자 VII, 인자 VIII, 인자 X, 섬유아세포 성장 인자 (FGF), 피브리노겐, 피브로넥틴, 4중 나선 번들 단백질, G-CSF, glp-1, GM-CSF, 글루코세레브로시다제, 고나도트로핀, 성장 인자, 성장 인자 수용체, grf, 헷지호그 단백질, 헤모글로빈, 간세포 성장 인자 (hGF), 히루딘, 인간 성장 인자 (hGH), 인간 혈청 알부민, ICAM-1, ICAM-1 수용체, LFA-1, LFA-1 수용체, 인슐린, 인슐린-유사 성장 인자 (IGF), IGF-I, IGF-II, 인터페론 (IFN), IFN-알파, IFN-베타, IFN-감마, 인터루킨 (IL), IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, 각질 세포 성장 인자 (KGF), 락토페린, 백혈병 억제 인자, 루시퍼라제, 뉴투린, 호중구 억제 인자 (NIF), 온코스타틴 M, 골원성 단백질, 종양유전자 생성물, 파라시토닌, 부갑상선 호르몬, PD-ECSF, PDGF, 펩티드 호르몬, 플레이오트로핀, 단백질 A, 단백질 G, pth, 발열성 외독소 A, 발열성 외독소 B, 발열성 외독소 C, pyy, 릴랙신, 레닌, SCF, 생합성 소 단백질, 가용성 보체 수용체 I, 가용성 I-CAM 1, 가용성 인터루킨 수용체, 가용성 TNF 수용체, 소마토메딘, 소마토스타틴, 소마토트로핀, 스트렙토키나제, 슈퍼항원, 스타필로코커스 내독소, SEA, SEB, SECl, SEC2, SEC3, SED, SEE, 스테로이드 호르몬 수용체, 슈퍼옥시드 디스뮤타제, 독성 쇼크 증후 독소, 티모신 알파 1, 조직 플라스미노겐 활성화제, 종양 성장 인자 (TGF), 종양 괴사 인자, 종양 괴사 인자 알파, 종양 괴사 인자 베타, 종양 괴사 인자 수용체 (TNFR), VLA-4 단백질, VCAM-1 단백질, 혈관 내피 성장 인자 (VEGF), 유로키나제, mos, ras, raf, met, ρ53, tat, fos, myc, jun, myb, rel, 에스트로겐 수용체, 프로게스테론 수용체, 테스토스테론 수용체, 알도스테론 수용체, LDL 수용체 및 코르티코스테론.
또 다른 또는 추가의 실시태양에서, 개선된 단리 특성을 부여하는 기는 폴리 펩티드의 수용성을 개선시키고, 다른 실시태양에서, 그와 같은 기는 폴리펩티드의 결합 특성을 개선시키며, 다른 실시태양에서, 그와 같은 기는 폴리펩티드에 새로운 결합 특성(예를 들어, 비오틴기 또는 비오틴 결합 기를 통하여)을 부여한다. 그와 같은 기가 폴리펩티드의 수용성을 개선시키는 실시태양에서, 그러한 기는 수용성 중합체, 예를 들어, 본 명세서에 기재된 PEG 중합체 기로부터 선택된다.
I. 관능기를 부착시키는 것의 예: 폴리펩티드 존재의 검출
천연 또는 비-천연 아미노산 폴리펩티드는 폴리펩티드에 쉽게 결합할 수 시약이나 표지 등의 결여 등의 여러 이유로 샘플(예를 들어, 생체내 및 시험관내 샘플) 중에서 검출하는 것이 어려울 수 있다. 본 명세서에 기재된 방법, 조성물, 기술 및 전략은 이에 대한 해결책을 제공한다.
본 명세서에 기재된 방법, 조성물, 전략 및 기술을 이용하여, 당업자는 생체내 및 시험관내 샘플 중 폴리펩티드의 검출을 가능하게 하는, 목적하는 폴리펩티드에 상동적인 옥심-함유 비-천연 아미노산 폴리펩티드를 생산할 수 있다. 하나의 실시태양에서, 상동 비-천연 아미노산 폴리펩티드는 생합성적으로 생성된다. 하나의 실시태양에서, 상동 비-천연 아미노산 폴리펩티드는 생합성적으로 생성된다. 또 다른 또는 추가의 실시태양에서, 비-천연 아미노산 폴리펩티드는 그의 구조 내로 본 명세서에 기재된 비-천연 아미노산을 혼입하였다. 또 다른 또는 추가의 실시태양에서, 비-천연 아미노산은 말단 또는 내부 위치에 도입되며, 더우기 위치-특이적으로 도입된다.
하나의 실시태양에서, 생합성적으로 생성된 비-천연 아미노산은 이미 개선된 검출 특성을 갖는다. 또 다른 또는 추가의 실시태양에서, 비-천연 아미노산 폴리펩티드는 옥심-함유 비-천연 아미노산, 카르보닐-함유 비-천연 아미노산, 히드록실아민-함유 비-천연 아미노산으로 구성되는 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 비-천연 아미노산을 포함한다. 다른 실시태양에서, 그와 같은 비-천연 아미노산은 본 명세서에 기재된 폴리펩티드 내로 생합성적으로 도입되어 있다. 또 다른 또는 추가의 실시태양에서, 비-천연 아미노산 폴리펩티드는 화학식 I - XVIII, XXX - XXXIV (A 및 B), 또는 XXXX - XXXXIII로부터 선택되는 적어도 하나의 비-천연 아미노산을 포함한다. 또 다른 또는 추가의 실시태양에서, 비-천연 아미노산은 개선된 검출 특성을 제공하는 기에의 옥심 결합을 포함한다. 또 다른 또는 추가의 실시태양에서, 비-천연 아미노산은 변형된 옥심-함유 비-천연 아미노산 폴리펩티드를 형성하도록 추가로 변형되며, 그와 같은 변형은 개선된 검출 특성을 제공하는 기에 의 옥심 결합을 제공한다. 일부 실시태양에서, 그와 같은 기는 비-천연 아미노산에 직접 결합되며, 다른 실시태양에서, 그와 같은 기는 링커를 통해 비-천연 아미노산에 결합된다. 특정 실시태양에서, 그와 같은 기는 비-천연 아미노산에 단일 화학 반응을 통하여 결합되며, 다른 실시태양에서, 그와 같은 기를 비-천연 아미노산에 결합시키는데 일련의 화학 반응이 필요하다. 바람직하게는, 개선된 검출 특성을 부여하는 기는 비-천연 아미노산 폴리펩티드 중의 비-천연 아미노산에 위치-특이적으로 결합되며, 사용된 반응 조건하에서 천연 아미노산에 결합되지 않는다.
또 다른 또는 추가의 실시태양에서, 생성된 비-천연 아미노산 폴리펩티드는 GH 슈퍼유전자 패밀리 구성원에 상동적이나, 이 섹션에 기재된 방법, 기술 및 조성 물은 사실상 개선된 검출 특성이 이로울 수 있는 다른 폴리펩티드 어느 것에나 적용될 수 있다. 그와 같은 폴리펩티드의 예는 다음과 같다: 알파-1 안티트립신, 안지오스타틴, 항용혈 인자, 항체, 항체 단편, 아포리포단백질, 아포단백질, 심방 나트륨이뇨 인자, 심방 나트륨이뇨 폴리펩티드, 심방 펩티드, C-X-C 케모카인, T39765, NAP-2, ENA-78, gro-a, gro-b, gro-c, IP-10, GCP-2, NAP-4, SDF-1, PF4, MIG, 칼시토닌, c-키트 리간드, 사이토카인, CC 케모카인, 단핵구 화학유인 단백질-1, 단핵구 화학유인 단백질-2, 단핵구 화학유인 단백질-3, 단핵구 소염 단백질-1 알파, 단핵구 소염 단백질-1 베타, RANTES, 1309, R83915, R91733, HCC1, T58847, D31065, T64262, CD40, CD40 리간드, c-키트 리간드, 콜라겐, 콜로니 자극인자 (CSF), 보체 인자 5a, 보체 억제제, 보체 수용체 1, 사이토카인, 상피 호중구 활성화 펩티드-78, MIP-16, MCP-1, 표피 성장 인자 (EGF), 상피 호중구 활성화 펩티드, 에리쓰로포이에틴 (EPO), 박리 독소, 인자 IX, 인자 VII, 인자 VIII, 인자 X, 섬유아세포 성장 인자 (FGF), 피브리노겐, 피브로넥틴, 4중 나선 번들 단백질, G-CSF, glp-1, GM-CSF, 글루코세레브로시다제, 고나도트로핀, 성장 인자, 성장 인자 수용체, grf, 헷지호그 단백질, 헤모글로빈, 간세포 성장 인자 (hGF), 히루딘, 인간 성장 인자 (hGH), 인간 혈청 알부민, ICAM-1, ICAM-1 수용체, LFA-1, LFA-1 수용체, 인슐린, 인슐린-유사 성장 인자 (IGF), IGF-I, IGF-II, 인터페론 (IFN), IFN-알파, IFN-베타, IFN-감마, 인터루킨 (IL), IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, 각질 세포 성장 인자 (KGF), 락토페린, 백혈병 억제 인자, 루시퍼라제, 뉴투린, 호중구 억제 인자 (NIF), 온코스타틴 M, 골원성 단백질, 종양유전자 생성물, 파라시토닌, 부갑상선 호르몬, PD-ECSF, PDGF, 펩티드 호르몬, 플레이오트로핀, 단백질 A, 단백질 G, pth, 발열성 외독소 A, 발열성 외독소 B, 발열성 외독소 C, pyy, 릴랙신, 레닌, SCF, 생합성 소 단백질, 가용성 보체 수용체 I, 가용성 I-CAM 1, 가용성 인터루킨 수용체, 가용성 TNF 수용체, 소마토메딘, 소마토스타틴, 소마토트로핀, 스트렙토키나제, 슈퍼항원, 스타필로코커스 내독소, SEA, SEB, SECl, SEC2, SEC3, SED, SEE, 스테로이드 호르몬 수용체, 슈퍼옥시드 디스뮤타제, 독성 쇼크 증후 독소, 티모신 알파 1, 조직 플라스미노겐 활성화제, 종양 성장 인자 (TGF), 종양 괴사 인자, 종양 괴사 인자 알파, 종양 괴사 인자 베타, 종양 괴사 인자 수용체 (TNFR), VLA-4 단백질, VCAM-1 단백질, 혈관 내피 성장 인자 (VEGF), 유로키나제, mos, ras, raf, met, ρ53, tat, fos, myc, jun, myb, rel, 에스트로겐 수용체, 프로게스테론 수용체, 테스토스테론 수용체, 알도스테론 수용체, LDL 수용체 및 코르티코스테론.
또 다른 또는 추가의 실시태양에서, 검출 특성을 부여하는 기는 표지; 염료; 친화도 표지; 광친화도 표지; 스핀 표지; 형광물질; 방사선 잔기; 중량급 원자를 포함하는 잔기; 동위원소 표지된 잔기; 생물리학적 프로브; 인광 기; 화학발광 기; 전자밀도가 높은 기: 자성 기; 발색단; 에너지 전달제; 검출가능한 표지; 및 그의 조합으로부터 선택된다.
J. 관능기를 부착시키는 것의 예: 폴리펩티드의 치료 특성의 개선
천연 또는 비-천연 아미노산 폴리펩티드는 특정 장애, 질병 또는 증상이 있는 환자에 특정 치료 효과를 제공할 수 있다. 그와 같은 치료 효과는 여러 가지 인자, 예컨대, 폴리펩티드의 안전성 프로파일, 폴리펩티드의 약물동태학, 역물학 및(또는) 약물역학(예를 들어, 수용해성, 생이용성, 혈청 반감기, 치료 반감기, 면역원성, 생물학적 활성 또는 순환 시간)에 따라 달라질 것이다. 또한, 폴리펩티드에 세포독성 화합물 또는 약물과 같은 추가의 관능기를 제공하는 것이 바람직할 수 있거나, 추가의 폴리펩티드를 부착시켜 본 명세서에 기재된 호모-다합체 또는 헤테로 다합체를 형성시키는 것이 바람직할 수 있다. 그와 같은 변형은 바람직하게는 본래의 폴리펩티드의 활성 및(또는) 3차 구조를 파괴하지 않는다. 본 명세서에 기재된 방법, 조성물, 전략 및 기술은 이들 문제에 대한 해결책을 제시한다.
본 명세서에 기재된 방법, 조성물, 전략 및 기술을 이용하여, 당업자는 개선된 치료 특성을 갖는, 목적하는 폴리펩티드에 상동적인 옥심-함유 비-천연 아미노산 폴리펩티드를 생산할 수 있다. 하나의 실시태양에서, 상동 비-천연 아미노산 폴리펩티드는 생합성적으로 생성된다. 또 다른 또는 추가의 실시태양에서, 비-천연 아미노산 폴리펩티드는 그의 구조 내로 본 명세서에 기재된 비-천연 아미노산을 혼입하였다. 또 다른 또는 추가의 실시태양에서, 비-천연 아미노산은 말단 또는 내부 위치에 도입되며, 더우기 위치-특이적으로 도입된다.
하나의 실시태양에서, 생합성적으로 생성된 비-천연 아미노산은 이미 개선된 치료 특성을 갖는다. 또 다른 또는 추가의 실시태양에서, 비-천연 아미노산은 개선된 치료 특성을 제공하는 기에의 옥심 결합을 포함한다. 또 다른 또는 추가의 실시태양에서, 비-천연 아미노산은 변형된 옥심-함유 비-천연 아미노산 폴리펩티드를 형성하도록 추가로 변형되며, 그와 같은 변형은 개선된 치료 특성을 제공하는 기에의 옥심 결합을 제공한다. 일부 실시태양에서, 그와 같은 기는 비-천연 아미노산에 직접 결합되며, 다른 실시태양에서, 그와 같은 기는 링커를 통해 비-천연 아미노산에 결합된다. 특정 실시태양에서, 그와 같은 기는 비-천연 아미노산에 단일 화학 반응을 통하여 결합되며, 다른 실시태양에서, 그와 같은 기를 비-천연 아미노산에 결합시키는데 일련의 화학 반응이 필요하다. 바람직하게는, 개선된 치료 특성을 부여하는 기는 비-천연 아미노산 폴리펩티드 중의 비-천연 아미노산에 위치-특이적으로 결합되며, 사용된 반응 조건하에서 천연 아미노산에 결합되지 않는다.
또 다른 또는 추가의 실시태양에서, 생성된 비-천연 아미노산 폴리펩티드는 GH 슈퍼유전자 패밀리 구성원에 상동적이나, 이 섹션에 기재된 방법, 기술 및 조성물은 사실상 개선된 치료 특성이 이로울 수 있는 다른 폴리펩티드 어느 것에나 적용될 수 있다. 그와 같은 폴리펩티드의 예는 다음과 같다: 알파-1 안티트립신, 안지오스타틴, 항용혈 인자, 항체, 항체 단편, 아포리포단백질, 아포단백질, 심방 나트륨이뇨 인자, 심방 나트륨이뇨 폴리펩티드, 심방 펩티드, C-X-C 케모카인, T39765, NAP-2, ENA-78, gro-a, gro-b, gro-c, IP-10, GCP-2, NAP-4, SDF-1, PF4, MIG, 칼시토닌, c-키트 리간드, 사이토카인, CC 케모카인, 단핵구 화학유인 단백질-1, 단핵구 화학유인 단백질-2, 단핵구 화학유인 단백질-3, 단핵구 소염 단백질-1 알파, 단핵구 소염 단백질-1 베타, RANTES, 1309, R83915, R91733, HCC1, T58847, D31065, T64262, CD40, CD40 리간드, c-키트 리간드, 콜라겐, 콜로니 자극인자 (CSF), 보체 인자 5a, 보체 억제제, 보체 수용체 1, 사이토카인, 상피 호중구 활성화 펩티드-78, MIP-16, MCP-1, 표피 성장 인자 (EGF), 상피 호중구 활성화 펩티드, 에리쓰로포이에틴 (EPO), 박리 독소, 인자 IX, 인자 VII, 인자 VIII, 인자 X, 섬유아세포 성장 인자 (FGF), 피브리노겐, 피브로넥틴, 4중 나선 번들 단백질, G-CSF, glp-1, GM-CSF, 글루코세레브로시다제, 고나도트로핀, 성장 인자, 성장 인자 수용체, grf, 헷지호그 단백질, 헤모글로빈, 간세포 성장 인자 (hGF), 히루딘, 인간 성장 인자 (hGH), 인간 혈청 알부민, ICAM-1, ICAM-1 수용체, LFA-1, LFA-1 수용체, 인슐린, 인슐린-유사 성장 인자 (IGF), IGF-I, IGF-II, 인터페론 (IFN), IFN-알파, IFN-베타, IFN-감마, 인터루킨 (IL), IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, 각질 세포 성장 인자 (KGF), 락토페린, 백혈병 억제 인자, 루시퍼라제, 뉴투린, 호중구 억제 인자 (NIF), 온코스타틴 M, 골원성 단백질, 종양유전자 생성물, 파라시토닌, 부갑상선 호르몬, PD-ECSF, PDGF, 펩티드 호르몬, 플레이오트로핀, 단백질 A, 단백질 G, pth, 발열성 외독소 A, 발열성 외독소 B, 발열성 외독소 C, pyy, 릴랙신, 레닌, SCF, 생합성 소 단백질, 가용성 보체 수용체 I, 가용성 I-CAM 1, 가용성 인터루킨 수용체, 가용성 TNF 수용체, 소마토메딘, 소마토스타틴, 소마토트로핀, 스트렙토키나제, 슈퍼항원, 스타필로코커스 내독소, SEA, SEB, SECl, SEC2, SEC3, SED, SEE, 스테로이드 호르몬 수용체, 슈퍼옥시드 디스뮤타제, 독성 쇼크 증후 독소, 티모신 알파 1, 조직 플라스미노겐 활성화제, 종양 성장 인자 (TGF), 종양 괴사 인자, 종양 괴사 인자 알파, 종양 괴사 인자 베타, 종양 괴사 인자 수용체 (TNFR), VLA-4 단백질, VCAM-1 단백질, 혈관 내피 성장 인자 (VEGF), 유로키나제, mos, ras, raf, met, ρ53, tat, fos, myc, jun, myb, rel, 에스트로겐 수용체, 프로게스테론 수용체, 테스토스테론 수용체, 알도스 테론 수용체, LDL 수용체 및 코르티코스테론.
또 다른 또는 추가의 실시태양에서, 개선된 치료 특성을 부여하는 기는 폴리펩티드의 수용해성을 개선시키며, 다른 실시태양에서, 그와 같은 기는 폴리펩티드의 결합 특성을 개선시키며, 다른 실시태양에서, 그와 같은 기는 폴리펩티드에 새로운 결합 특성(예를 들어, 비오틴 기 또는 비오틴-결합 기)을 부여한다. 그와 같은 기가 폴리펩티드의 수용해성을 개선하는 실시태양에 있어서, 그러한 기는 본 명세서에 기재된 수용성 중합체, 비제한적인 예로서, PEG 중합체 기로부터 선택된다. 또 다른 또는 추가의 실시태양에서, 그와 같은 기는 세포독성 화합물인 반면, 다 실시태양에서 그와 같은 기는 약물이다. 또 다른 실시태양에서, 결합되어 있는 약물 또는 세포독성 화합물은 비-천연 아미노산 폴리펩티드로부터 절단되어 약물 또는 세포독성 화합물을 목적하는 치료 위치에 전달할 수 있다. 다른 실시태양에서, 그와 같은 기는 제2의 폴리펩티드, 예컨대, 옥심-함유 비-천연 아미노산 폴리펩티드, 또는 제1 비-천연 아미노산 폴리펩티드와 같은 아미노산 구조를 갖는다.
또 다른 또는 추가의 실시태양에서, 옥심-함유 비-천연 아미노산 폴리펩티드는 변형된 옥심-함유 비-천연 아미노산 폴리펩티드이다. 또 다른 또는 추가의 실시태양에서, 옥심-함유 비-천연 아미노산 폴리펩티드는 상동적인 천연 아미노산 폴리펩티드에 비하여 폴리펩티드의 생이용성을 증가시킨다. 또 다른 또는 추가의 실시태양에서, 옥심-함유 비-천연 아미노산 폴리펩티드는 상동적인 천연 아미노산 폴리펩티드에 비하여 폴리펩티드의 안전성 프로파일을 증가시킨다. 또 다른 또는 추가의 실시태양에서, 옥심-함유 비-천연 아미노산 폴리펩티드는 상동적인 천연 아미 노산 폴리펩티드에 비하여 폴리펩티드의 수용해도를 증가시킨다. 또 다른 또는 추가의 실시태양에서, 옥심-함유 비-천연 아미노산 폴리펩티드는 상동적인 천연 아미노산 폴리펩티드에 비하여 폴리펩티드의 치료 반감기를 증가시킨다. 또 다른 또는 추가의 실시태양에서, 옥심-함유 비-천연 아미노산 폴리펩티드는 상동적인 천연 아미노산 폴리펩티드에 비하여 폴리펩티드의 혈청 반감기를 증가시킨다. 또 다른 또는 추가의 실시태양에서, 옥심-함유 비-천연 아미노산 폴리펩티드는 상동적인 천연 아미노산 폴리펩티드에 비하여 폴리펩티드의 순환시간을 연장시킨다. 또 다른 또는 추가의 실시태양에서, 옥심-함유 비-천연 아미노산 폴리펩티드는 상동적인 천연 아미노산 폴리펩티드에 비하여 폴리펩티드의 활성을 조절한다. 또 다른 또는 추가의 실시태양에서, 옥심-함유 비-천연 아미노산 폴리펩티드는 상동적인 천연 아미노산 폴리펩티드에 비하여 폴리펩티드의 면역원성을 조절한다.
XI. 변형된 폴리펩티드의 치료 용도
편의를 위하여, 이 섹션에 기재된 "변형 또는 비변형된" 비-천연 아미노산 폴리펩티드는 총괄적으로 및(또는) 특정 예를 들어 기재한다. 그러나, 이 섹션에 기재된 "변형 또는 비변형된" 비-천연 아미노산 폴리펩티드는 이 섹션에 제공된 총괄적 기재 사항 또는 특정 예에만 한정되는 것이 아니라, 본 명세서, 청구 범위 및 도면에 기재된 화학식 I - XVIII, XXX - XXXIV (A 및 B) 및 XXXX - XXXXIII, 및 이의 하위 화학식의 범위에 속하는 특정 화합물인 적어도 하나의 비-천연 아미노산을 포함하는 폴리펩티드에 동등하게 적용된다.
본 명세서에 기재된, 호모다합체 및 헤테로다합체를 포함하는 "변형 또는 비 변형된" 비-천연 아미노산 폴리펩티드는 치료, 진단, 분석의 기초, 산업, 화장제, 식물 생물학, 환경, 에너지 생산 및(또는) 군사 용도 등의 다수의 용도를 갖는다. 비제한적인 예로서, "변형 또는 비변형된" 비-천연 아미노산 폴리펩티드의 다음과 같은 치료 용도가 제공된다.
본 명세서에 기재된 "변형 또는 비변형된" 비-천연 아미노산 폴리펩티드는 광범위한 장애, 질병 또는 증상을 치료하는데 유용하다. 본 명세서에 기재된 "변형 또는 비변형된" 비-천연 아미노산 폴리펩티드 생성물을 투여하면, 인간에 있어서 사용이 승인된 시판 폴리펩티드 제제에 의해 입증된 바와 같은 활성을 나타낸다. "변형 또는 비변형된" 비-천연 아미노산 폴리펩티드 생성물의 평균량은 변화할 수 있으며, 특히 의사의 권장 및 처방에 의하여야 한다. "변형 또는 비변형된" 비-천연 아미노산 폴리펩티드의 정확한 양은 증상의 정확한 유형, 치료되는 환자의 상태, 및 조성물 내의 기타 성분 등과 같은 요소에 우선하는 문제이다. 투여될 양은 "변형 또는 비변형된" 비-천연 아미노산 폴리펩티드로의 치료법에 기초하여 당업자에 의해 쉽게 결정될 수 있을 것이다.
A. 투여 및 약제학적 조성물
본 명세서에 기재된, 호모다합체 및 헤테로다합체를 포함하는 "변형 또는 비변형된" 비-천연 아미노산 폴리펩티드는 치료, 진단, 분석의 기초, 산업, 화장제, 식물 생물학, 환경, 에너지 생산 및(또는) 군사 용도 등의 다수의 용도를 갖는다. 비제한적인 예시로서, "변형 또는 비변형된" 비-천연 아미노산 폴리펩티드의 다음과 같은 치료 용도가 제공된다.
본 명세서에 기재된 "변형 또는 비변형된" 비-천연 아미노산 폴리펩티드는 광범위한 장애, 질병 또는 증상을 치료하는데 유용하다. 본 명세서에 기재된 "변형 또는 비변형된" 비-천연 아미노산 폴리펩티드 생성물을 투여하면, 인간에 있어서 사용이 승인된 시판 폴리펩티드 제제에 의해 입증된 바와 같은 활성을 나타낸다. "변형 또는 비변형된" 비-천연 아미노산 폴리펩티드 생성물의 평균량은 변화할 수 있으며, 특히 의사의 권장 및 처방에 의하여야 한다. "변형 또는 비변형된" 비-천연 아미노산 폴리펩티드의 정확한 양은 증상의 정확한 유형, 치료되는 환자의 상태, 및 조성물 내의 기타 성분 등과 같은 요소에 우선하는 문제이다. 투여될 양은 "변형 또는 비변형된" 비-천연 아미노산 폴리펩티드로의 치료법에 기초하여 당업자에 의해 쉽게 결정될 수 있을 것이다.
본 명세서에 변형되거나 변형되지 않은 비-천연 아미노산 폴리펩티드 (비제한적인 예로서, 하나 이상의 비-천연 아미노산을 포함하는 신써타제 또는 단백질 등)은 임의로는 적절한 약제학적 담체와 함께 치료용으로 사용된다. 그와 같은 조성물은 예를 들어, 치료 유효량의 변형되거나 변형되지 않은 비-천연 아미노산 폴리펩티드 및 약제학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제를 포함한다. 그와 같은 담체 또는 부형제는 비제한적인 예로서 생리식염수, 완충 생리식염수, 덱스트로스, 물, 글리세롤, 에탄올, 및(또는) 이들의 조합을 포함한다. 제제는 투여 방식에 적절하도록 만들어진다. 일반적으로, 단백질의 투여 방법은 당업계에 잘 알려져 있으며, 본 명세서에 기재된 변형되거나 변형되지 않은 비-천연 아미노산 폴리펩티드를 투여하는데 적용될 수 있다.
본 명세서에 기재된 변형되거나 변형되지 않은 비-천연 아미노산 폴리펩티드를 포함하는 치료 조성물은 당업계에 잘 알려져 있는 방법에 따라서 효능, 조직 대사를 확인하고 투여량을 평가하기 위해 임의로는 하나 이상의 적절한 시험관내 또는 생체내 동물 질병 모델에서 시험된다. 특히, 투여량은 비-천연 아미노산 동족체의 활성, 안정성 또는 기타 적절한 측정치에 의해 (비제한적인 예로서, 하나 이상의 비-천연 아미노산을 포함하도록 변형된 폴리펩티드를 천연 아미노산 폴리펩티드에 비교하는 것을 포함), 즉, 관련 분석법에 의해 초기에 결정될 수 있다.
투여는 분자를 궁극적으로는 혈액 또는 조직 세포와 접촉하도록 도입시키는 통상의 경로로 투여된다. 본 명세서에 기재된 변형되거나 변형되지 않은 비-천연 아미노산 폴리펩티드는, 임의로는 하나 이상의 약제학적으로 허용가능한 담체와 함께, 적절한 어느 방법으로나 투여된다. 변형되거나 변형되지 않은 비-천연 아미노산 폴리펩티드를 환자에 투여하는 적절한 방법을 이용할 수 있으며, 특정 조성물을 투여함에 있어서는 하나 이상의 경로를 이용할 수 있지만, 특정 경로가 다른 경로 보다 종종 더 즉각적이고 효율적인 작용 또는 반응을 제공할 수 있다.
약제학적으로 허용가능한 담체는 부분적으로는 투여되는 특정 조성물 뿐만 아니라 그 조성물을 투여하기 위해 사용되는 방법에 의해 정해진다. 따라서, 본 명세서에 기재된 약제학적 조성물의 적절한 제제 형태는 아주 다양하다.
본 명세서에 기재된 비-천연 아미노산 폴리펩티드 및 그와 같은 폴리펩티드를 포함하는 조성물은 단백질 또는 펩티드의 투여에 적절한 통상의 경로, 비제한적인 예로서, 피하 또는 정맥내 등의 주사 또는 다른 형태의 주사 또는 주입에 의해 비경구적으로 투여될 수 있다. 폴리펩티드 약제학적 조성물은 (본 명세서에 기재된 다양한 비-천연 아미노산 폴리펩티드 포함) 다수의 경로, 비제한적인 예로서, 경구, 정맥내, 복강내, 근육내, 경피, 피하, 국소, 설하 또는 직장내 투여 수단으로 투여될 수 있다. 본 명세서에 기재된 변형되거나 변형되지 않은 비-천연 아미노산 폴리펩티드를 포함하는 조성물은 또한 리포조옴을 통하여 투여될 수 있다. 그와 같은 투여 경로 및 적절한 제제는 일반적으로 당업자에게 알려져 있다. 본 명세서에 기재된 비-천연 아미노산 폴리펩티드는 단독으로 또는 약제학적으로 허용가능한 담체와 같은 기타 적절한 성분과 함께 투여될 수 있다.
본 명세서에 기재된 변형되거나 변형되지 않은 비-천연 아미노산 폴리펩티드는 단독으로 또는 기타 적절한 성분과 함께 흡입을 통해 투여될 수 있도록 에어로졸 제제(즉, 네뷸라이저)로 제형화될 수 있다. 에어로졸 제제는 디클로로디플루오로메탄, 프로판, 질소 등과 같은 가압된 허용가능한 추진제 내로 주입된다.
비경구 투여에 적절한 제제, 예를 들어, 관절내, 정맥내, 근육내, 피내, 복강내 및 피하 경로에 적절한 제제는 항산화제, 완충액, 정균제, 용질을 함유할 수 있으며, 제제를 수약자의 혈액과 등장성으로 만드는 수성 및 비-수성, 등장 멸균 주사 용액, 또는 현탁화제, 가용화제, 증점제, 안정화제 및 보존제를 포함할 수 있는 수성 및 비수성 멸균 현탁액을 포함할 수 있다. 포장된 폴리펩티드의 제제는 앰풀 또는 바이알과 같은 단일 용량 또는 다중 용량 밀봉 용기에 넣어질 수 있다.
비경구 및 정맥 투여가 바람직한 투여 방법이다. 특히, 현재 사용되고 있는 제제로서 천연 아미노산 폴리펩티드 동족체 치료제에 이미 사용되고 있는 투여 경 로 (비제한적인 예로서, EPO, IFN, GH, G-CSF, GM-CSF, IFN, 인터루킨, 항체 및(또는) 기타 약제학적으로 전달되는 단백질에 전형적으로 사용되는 경로)는 본 명세서에 기재된 변형되거나 변형되지 않은 비-천연 아미노산 폴리펩티드에 대한 바람직한 투여 경로 및 제제이다.
본 명세서에 기재된 방법 및 조성물과 관련하여 환자에 투여되는 양은 시간에 걸쳐 환자에서 유익한 치료 응답을 나타내기에 충분한 양이다. 그와 같은 양은 특정 제제의 효능, 및 사용된 변형되거나 변형되지 않은 비-천연 아미노산 폴리펩티드의 활성, 안정성 또는 혈청 반감기 또는 치료될 환자의 체중 또는 표면적에 의하여 정해진다. 투여량의 크기는 또한 환자에 있어서 특정 제제의 투여에 수반될 수 있는 부작용의 존재, 특성 및 정도에 따라 정해진다.
질병 (비제한적인 예로서, 암, 유전병, 당뇨병, AIDS 등)의 치료 또는 예방시에 투여되는 제제의 유효량을 결정함에 있어서, 의사는 순환 혈장 수준, 제제 독성, 질병의 진전 및(또는) 관련이 있는 경우, 항-비-천연 아미노산 폴리펩티드 항체의 생산을 평가한다.
예를 들어, 체중 70 kg의 환자에 투여되는 양은 전형적으로는 관련 조성물의 변화된 활성 또는 혈청 반감기에 대하여 조정된, 현재 사용되는 치료 단백질의 투여량에 대등한 범위이다. 본 명세서에 기재된 약제학적 제제는 항체 투여, 백신 투여, 세포독성제의 투여, 천연 아미노산 폴리펩티드, 핵산, 뉴클레오티드 유사체, 생물학적 반응 조절제 등을 포함하는 임의의 공지된 통상의 요법에 의한 치료 상태를 보조할 수 있다.
투여에 있어서, 본 명세서에 기재된 약제학적 제제는 관련 제제의 LD-50 또는 ED-50, 및(또는) 환자의 체중 및 전체적인 건강 상태에 따른 여러 농도에서의 변형되거나 변형되지 않은 비-천연 아미노산 폴리펩티드의 부작용의 관찰에 의해 정해진 비율로 투여된다. 투여는 단일 용량 또는 분할 용량으로 이루어질 수 있다.
제제를 주입받는 환자가 발열, 오한 또는 근육 통증을 일으키는 경우에, 환자에게 적절한 양의 아스피린, 이부프로펜, 아세타미노펜 또는 기타 통증/열 조절 약물을 투여한다. 주입에 대하여 발열, 오한 또는 근육 통증 등의 반응을 나타내는 환자에게는 이후에 투여하기 30분 전에 아스피린, 아세타미노펜, 디펜히드라민을 투여한다. 메페르딘은 해열제 및 항히스타민제에 즉각적으로 반응하지 않는 보다 심한 오한 및 근육통에 사용된다. 반응의 심각도에 따라 세포 주입 속도를 늦추거나 중단시킨다.
본 명세서에 기재된 변형되거나 변형되지 않은 비-천연 아미노산 폴리펩티드은 직접 포유류 개체에 투여될 수 있다. 투여는 개체에 폴리펩티드를 투여하는데 통상 사용되는 어느 경로를 통하여도 무방하다. 본 명세서에 기재된 변형되거나 변형되지 않은 비-천연 아미노산 폴리펩티드는 경구, 직장, 국소, 흡입(예컨대, 에어로졸을 통하여), 협측 (예를 들어, 설하 투여 포함), 질, 비경구 (비제한적인 예로서, 피하, 근육내, 피내, 관절내, 늑막내, 복강내, 뇌내, 동맥내 또는 정맥내 투여 포함), 국소 (즉, 기도 표면을 포함하는 피부 및 점막 표면), 및 경피 투여에 적절한 것을 포함하나, 주어진 경우에 가장 적절한 경로는 치료되는 증상의 성질 및 중증도에 따라 달라질 것이다. 투여는 국소적 또는 전신적일 수 있다. 제제는 앰풀 및 바이알과 같은 밀봉 용기 중의 단위 용량 또는 다단위 용량으로 주어질 수 있다. 변형되거나 변형되지 않은 비-천연 아미노산 폴리펩티드는 약제학적으로 허용가능한 담체와의 혼합물로서 주사가능한 단위 용량 형태 (비제한적인 예로서, 용액제, 현탁제 및 에멀젼 포함)로 제조될 수 있다. 변형되거나 변형되지 않은 비-천연 아미노산 폴리펩티드는 또한 연속 주입 (예를 들어, 삼투압 펌프와 같은 미니 펌프를 사용하여), 단일 볼러스 또는 서방성 데포 제제로 투여될 수 있다.
투여에 적절한 제제는 항산화제, 완충액, 정균제, 용질을 함유할 수 있으며, 제제를 수약자의 혈액과 등장성으로 만드는 수성 및 비-수성, 등장 멸균 주사 용액, 또는 현탁화제, 가용화제, 증점제, 안정화제 및 보존제를 포함할 수 있는 수성 및 비수성 멸균 현탁액을 포함할 수 있다. 용액 및 현탁제는 상술한 유형의 멸균 분말, 과립 및 정제 형태로부터 제조될 수 있다.
동결 건조는 관심있는 단백질 제제로부터 물을 제거하여 단백질을 제공하는데 일반적으로 사용되는 기술이다. 동결 건조, 또는 리오필라이제이션은 건조시킬 물질을 일단 동결시킨 다음 얼거나 또는 동결된 용매를 진공 환경하에 승화에 의해 제거하는 과정이다. 부형제를 동결건조 전 제제에 가하여 동결 건조 과정 동안의 안정성을 향상시키고/거나 보관시 동결 건조된 생성물의 안정성을 개선할 수 있다[참조: Pikal, M. Biopharm. 3(9)26-30 (1990) and Arakawa et al. Pharm. Res. 8(3):285-291 (1991)].
약제의 분무 건조 또한 당업자에 잘 알려져 있다[참조: Broadhead, J. et al., "The Spray Drying of Pharmaceuticals," in Drug Dev. Ind. Pharm, 18 (11 & 12), 1169-1206 (1992)]. 소분자 약물 이외에, 각종 생물학적 물질이 분무 건조되어 왔으며, 예로서 효소, 혈청, 혈장, 미생물 및 효소 등이 있다. 분무 건조는 일단계 공정으로 액상 약제를 미세하고 분진이 없는 응집된 분말로 전환시킬 수 있기 때문에 유용한 기술이다. 기본적인 기술은 a) 공급 용액을 분무로 분사시키는 단계: b) 분무-공기 접촉 단계; c) 분무의 건조 단계; 및 d) 건조 공기로부터 건조된 생성물의 분리 단계를 포함한다. 미합중국 특허 제6,235,710호 및 제6,001,800 호(전문이 본 명세서에 포함됨)는 분무 건조에 의해 재조합 에리쓰로포이에틴을 제조하는 것을 기술한다.
본 명세서에 기재된 약제학적 조성물은 약제학적으로 허용가능한 담체, 부형제 또는 안정화제를 포함할 수 있다. 약제학적으로 허용가능한 담체는 부분적으로는 투여되는 조성물 뿐만 아니라 그 조성물을 투여하는데 사용되는 방법에 의해 정해진다. 따라서, 본 명세서에 기재된 변형되거나 변형되지 않은 비-천연 아미노산 폴리펩티드에 대한 여러 가지 적절한 약제학적 조성물 (임의로는 약제학적으로 허용가능한 담체, 부형제 또는 안정화제 포함)이 있다[참조: Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Nineteenth Ed (Easton, Pa.: Mack Publishing Company, 1995); Hoover, John E., Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, Pennsylvania 1975; Liberman, H.A. and Lachman, L., Eds., Pharmaceutical Dosage Forms, Marcel Decker, New York, N.Y., 1980; and Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Seventh Ed. (Lippincott Williams & Wilkins, 1999)]. 적절한 담체는 숙시네이트, 포스페이트, 보레이트, HEPES, 시트레이트, 이미다졸, 아세테이트, 중탄산염 기타 유기산을 함유하는 완충액; 비제한제인 예로서, 아스코르브산을 포함하는 항산화제; 비제한적인 예로서, 약 10개 잔기 미만의 저분자량 폴리펩티드를 포함하는 저분자량 폴리펩티드; 예를 들어, 혈청 알부민, 젤라틴 또는 면역글로불린을 포함하는 단백질; 폴리비닐피롤리돈을 포함하는 친수성 중합체; 비제한적인 예로서, 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 아르기닌, 히스티딘, 히스티딘 유도체, 메티오닌, 글루타메이트 또는 리신을 포함하는 아미노산; 비제한적인 예로서, 트레할로스, 슈크로스, 글루코스, 만노스 또는 덱스트란을 포함하는 모노사카라이드, 디사카라이드 및 다른 탄수화물; EDTA를 포함하는 킬레이트제; 아연, 코발트 또는 구리를 포함하는 이가 금속 이온; 만니톨 또는 솔비톨을 포함하는 당 알콜; 비제한적인 예로 나트륨 등을 포함하는 염형성 카운터 이온 및(또는) 비이온성 계면활성제, 예컨대, 트윈™ 80 (폴리소르베이트 80) 및 트윈™ 20 (폴리소르베이트 20) 등의 트윈™, 플루로닉스(Pluronics)™ 및 플루론산 F68 (폴록사머 188)과 같은 플루론산, 또는 PEG를 포함한다. 적절한 계면활성제는, 비제한적인 예로서, 폴리(에틸렌 옥시드)-폴리(프로필렌 옥시드)-폴리(에틸렌 옥시드), 즉, (PEO-PPO-PEO), 또는 폴리(프로필렌 옥시드)-폴리(에틸렌 옥시드)-폴리(프로필렌 옥시드), 즉, (PPO-PEO-PPO)을 기재로 한 폴리에테르 또는 그의 조합을 포함한다. PEO-PPO-PEO 및 PPO-PEO-PPO는 상표명 플루로닉스(PluronicsTM), R-플루로닉스(R-PluronicsTM), 테트로닉스 (TetronicsTM) 및 R-테트로닉스(R-TetronicsTM) (BASF Wyandotte Corp., Wyandotte, Mich.)하에 시판되고 있으며, 전문이 본 명세서에 포함되는 미합중국 특허 제4,820,352호에 기재되어 있다. 다른 에틸렌/폴리프로필렌 블록 중합체는 적절한 계면활성제일 수 있다. 계면활성제 또는 계면활성제의 조합은 교반 등으로부터 야기되는 하나 이상의 스트레스로부터 PEG화 비-천연 아미노산 폴리펩티드를 안정화시키는데 사용될 수 있다. 상기한 것 중 일부는 "벌크제"라 불리우며, 일부는 "삼투압 조절제"라 불리울 수 있다.
PEG와 같은 수용성 중합체에 결합된 것과 같은 것을 포함하는, 본 명세서에 기재된 변형되거나 변형되지 않은 비-천연 아미노산 폴리펩티드는 서방성 계에 의해 또는 그의 일부로서 투여될 수 있다. 서방성 조성물은, 비제한적인 예로서, 필름 또는 마이크로캡슐과 같은 형태가 있는 반투과성 중합체 매트릭스를 포함한다. 서방성 매트릭스는 생체적합성 물질, 예컨대, 폴리(2-히드록시에틸 메타크릴레이트) [Langer et al, J. Biomed. Mater. Res., 15: 167- 277 (1981); Langer, Chem. Tech., 12: 98-105 (1982)], 에틸렌 비닐 아세테이트 (Langer et al, 상기 문헌) 또는 폴리-D-(-)-3-히드록시부티르산 (EP 133,988), 폴리락티드 (폴리락트산) (미합중국 특허 제3,773,919호; EP 58,481), 폴리글리콜라이드 (글리콜산의 중합체), 폴리락티드 코-글리콜라이드 (락트산과 글리콜산의 공중합체) 폴리무수물, L-글루탐산과 감마-에틸-L-글루타메이트의 공중합체 [U. Sidman et al., Biopolymers, 22, 547-556 (1983)], 폴리(오르쏘)에스테르, 폴리펩티드, 히알루론산, 콜라겐, 콘드로이틴 술페이트, 카르복실산 , 지방산, 인지질, 폴리사카라이드, 핵산, 폴리아미노산, 페닐알라닌, 티로신, 이소류신, 폴리뉴클레오티드, 폴리비닐 프로필렌, 폴 리비닐피롤리돈과 같은 아미노산 및 실리콘을 포함한다. 서방성 조성물은 또한 리포조옴 트랩핑된 화합물을 포함한다. 화합물을 함유하는 리포조옴은 그 자체로 공지된 방법으로 제조된다 [DE 3,218,121; Epstein et al, Proc. Natl. Acad. ScL U.S.A., 82: 3688-3692 (1985); Hwang et al, Proc. Natl. Acad. Sd. U.S.A., 11: 4030-4034 (1980); EP 52,322; EP 36,676; EP 88,046; EP 143,949; EP 142,641; 일본 특허 출원 83-118008; 미합중국 특허 제4,485,045호 및 제4,544,545호; 및 EP 102,324].
리포조옴 트랩핑된 폴리펩티드는 문헌[DE 3,218,121; Epstein et al, Proc. Natl. Acad. Sd. U.S.A., 82: 3688-3692 (1985); Hwang et al, Proc. Natl. Acad. Sd. U.S.A., 77: 4030-4034 (1980); EP 52,322; EP 36,676; EP 88,046; EP 143,949; EP 142,641; 일본 특허 출원 83-118008; 미합중국 특허 제4,485,045호 및 제4,544,545호; 및 EP 102,324]에 기재된 방법으로 제조될 수 있다. 리포조옴의 조성 및 크기는 잘 알려져 있거나, 당업자에 의해 경험적으로 쉽게 결정될 수 있 다. 리포조옴의 몇몇 예가 문헌에 기재되어 있다[참조: Park JW, et al, Proc. Natl. Acad. Sd. USA 92:1327-1331 (1995); Lasic D and Papahadjopoulos D (eds): MEDICAL APPLICATIONS OF LIPOSOMES (1998); Drummond DC, et al, Liposomal drug delivery systems for cancer therapy, in Teicher B (ed): CANCER DRUG DISCOVERY AND DEVELOPMENT (2002); Park JW, et al, Clin. Cancer Res. 8: 1172- 1181 (2002); Nielsen UB, et al, Biochim. Biophys. Ada 1591(l-3):109-118 (2002); Mamot C, et al, Cancer Res. 63: 3154-3161 (2003)].
본 명세서에 기재된 조성물, 제제 및 방법과 관련하여 환자에 투여되는 양은 시간에 걸쳐 개체에 유익한 반응을 나타내기에 충분하여야 한다. 일반적으로, 변형되거나 변형되지 않은 비-천연 아미노산 폴리펩티드의 비경구 투여되는 총 유효 투여량은 약 0.01 ㎍/kg/일 내지 약 100 μg/kg이거나, 약 0.05 mg/kg 내지 약 1 mg/kg 범위 내이나, 치료시 의사의 재량에 따라 달라질 수 있다. 투여 빈도 또한 치료시 의사의 재량에 따라 달라질 수 있으며, 인간에의 사용이 승인된 시판 제품의 사용 빈도보다 빈번하거나 덜 빈번할 수 있다. 일반적으로, 예를 들어, 본 명세서에 기재된 PEG화 폴리펩티드와 같은 중합체:폴리펩티드 컨쥬게이트는 상술한 투여 경로 중 어느 경로로나 투여될 수 있다.
실시예 1
이 실시예는 도 4에 제시된 카르보닐-함유 아미노산의 합성을 상세히 설명한다. 카르보닐-함유 비-천연 아미노산은 도 4에 기재된 바와 같이 제조되었다.
실시예 2
이 실시예는 도 5a에 제시된 보호된 히드록실아민-함유 아미노산의 합성을 상세히 설명한다. 보호된 히드록실아민-함유 비-천연 아미노산은 도 5a에 기재된 바와 같이 제조되었다.
실시예 3
이 실시예는 도 5b에 제시된 히드록실아민-함유 아미노산의 합성을 상세히 설명한다. 히드록실아민-함유 비-천연 아미노산은 도 5b에 기재된 바와 같이 제조 되었다.
실시예 4
이 실시예는 도 5c에 제시된 히드록실아민-함유 아미노산의 합성을 상세히 설명한다. 히드록실아민-함유 비-천연 아미노산은 도 5c에 기재된 바와 같이 제조되었다.
실시예 5
이 실시예는 도 5d에 제시된 옥심-함유 아미노산의 합성을 상세히 설명한다. 옥심-함유 비-천연 아미노산은 도 5d에 기재된 바와 같이 제조되었다.
실시예 6
이 실시예는 도 6a에 제시된 옥심-함유 아미노산의 합성을 상세히 설명한다. 옥심-함유 비-천연 아미노산은 도 6a에 기재된 바와 같이 제조되었다.
실시예 7
이 실시예는 도 6b에 제시된 옥심-함유 아미노산의 합성을 상세히 설명한다. 옥심-함유 비-천연 아미노산은 도 6b에 기재된 바와 같이 제조되었다.
실시예 8
이 실시예는 도 6c에 제시된 옥심-함유 아미노산의 합성을 상세히 설명한다. 옥심-함유 비-천연 아미노산은 도 6c에 기재된 바와 같이 제조되었다.
실시예 9
이 실시예는 도 24에 제시된 카르보닐-함유 아미노산의 합성을 상세히 설명한다.
합성:
Figure 112007052373933-pct00086
NaOH 용액 (40 mL, 25 부피%)에 0 ℃에서 에테르 (60 mL)를 가하였다. 블래스트 쉴드를 반응 플라스크 앞에 놓았다. 생성된 혼합물에 N-니트로소-N-메틸 우레아 (6.0 g, 57.9 mmol)를 3회분으로 나누어 3분에 걸쳐 가하였다. 반응 혼합물을 0 ℃에서 10분간 교반하였다. 디에틸 에테르와 수산화나트륨 층이 분리되도록 두었다. 유기층을 무수 THF (20 mL) 중 N-Boc-4-히드록시메틸페닐알라닌 (7.5 g, 25.4 mmol)의 용액에 조금씩 (대략 6회에 나누어) 5분간에 걸쳐 출발 물질이 완전히 사라질 때 까지 (TLC로 모니터링) 가하였다. 5 방울의 빙초산을 가하여 반응을 켄칭하였다. 유기 용매를 회전 증발에 의해 제거한 다음, 에틸 아세테이트를 가하였다. 유기층을 포화 NaHCO3 용액, H2O 및 염수로 연속적으로 세척하고, 무수 MgSO4 상에서 건조시킨 다음, 여과하고 농축시켜 생성물 (5.9 g, 75%)을 백색 분말로서 수득하였다.
합성:
Figure 112007052373933-pct00087
CH2Cl2 (400 mL) 중 알콜 (6.0 g, 19.4 mmol)과 피리딘 (12 mL, 150 mmol)의 교반된 용액에 0 ℃에서 데스-마르틴 퍼요오디난 (14.2 g, 33.4 mmol)을 가하였다. 혼합물을 실온에서 밤새 교반하였다. 반응을 포화 Na2S2O3-NaHCO3 수용액 (1:1, 300 mL)으로 켄칭하고, CH2Cl2로 추출하였다. 유기층을 합하여 H2O 및 염수로 세척한 다음, 무수 Na2SO4 상에서 건조시키고, 여과하여 진공 하에 농축시켰다. 잔사를 플래쉬 크로마토그래피 (실리카, 1:100 - 1:1 헥산:EtOAc)로 정제하여 알데히드 생성물 (5.48 g, 92%)을 백색 고체로서 수득하였다.
합성:
Figure 112007052373933-pct00088
EtOH (40 mL) 중 알데히드 (3.07 g, 10 mmol)의 용액에 아세트산 히드라지드 (1.7 g, 20 mmol)를 가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 30 분간 교반하고 농축시켰다. 잔사에 H2O (200 mL)에 이어 CH2Cl2를 가하였다. 유기층을 분리하고, 진공하에 농축시켰다. 잔사를 플래쉬 크로마토그래피(실리카, 3:7 - 1:9 헥산:EtOAc)로 정제하여 생성물 (3.29 g, 90%)을 백색 고체로서 수득하였다.
합성:
Figure 112007052373933-pct00089
디옥산 (10 mL) 중 상기 메틸 에스테르 (3.29 g, 9.1 mmol)의 용액에 0 ℃에서 LiOH (10 mL, 1 N)를 가하였다. 혼합물을 같은 온도에서 한 시간 동안 교반한 다음, 시트르산 (5 g)을 가하여 켄칭시키고, H2O로 희석하였다. 혼합물을 EtOAc로 추출하였다. 유기층을 H2O 및 염수로 연속적으로 세척한 다음, 무수 Na2SO4 상에서 건조시킨 후, 여과하고 농축시켜 백색 고체 (3.05 g, 96%)를 수득하였다.
합성:
Figure 112007052373933-pct00090
CH2Cl2 (20 mL) 중 상기 산 (3.02 g, 8.6 mmol)의 용액에 0 ℃에서 트리플루오로아세트산 (20 mL)을 가하였다. 반응 혼합물을 0 ℃에서 2 시간 동안 교반하고 농축시켰다. 잔사에 MeOH (1 mL) 및, 이어서 HCl (2.0 mL, 디옥산 중 4 N)를 가하였다. 에테르 (200 mL)를 가하여 생성물 (2.07 g, 83%)을 황색 고체로서 침전시켰다.
실시예 10
이 실시예는 도 25에 제시된 디카르보닐-함유 아미노산의 합성을 상세히 설명한다.
합성:
Figure 112007052373933-pct00091
DMF (70 mL) 중 아민 (10 g, 34 mmol)의 교반된 용액에 0 ℃에서 피루브산 (5 mL, 72 mmol), l-(3-디메틸아미노프로필)-3-에틸카르보디이미드 히드로클로라이드 (EDC, 20 g, 104 mmol), 1-히드록시벤조트리아졸 수화물 (HOBt, 85 g, 71 mmol) 및 N,N-디이소프로필에틸아민 (DIEA, 35 mL, 200 mmol)을 가하였다. 혼합물을 실온에서 6시간 동안 교반한 다음, 시트르산 수용액 (5%, 500 mL)으로 켄칭하고, EtOAc (500 mL)로 추출하였다. 유기층을 H2O 및 염수로 연속적으로 세척하고, 무수 Na2SO4 상에서 건조시킨 다음, 여과하고 진공 하에 농축시켰다. 잔사를 플래쉬 크로마토그래피(실리카, 3:1 - 1:1 헥산:EtOAc)로 정제하여 생성물을 고체 (4.78 g, 40%)로 수득하였다.
합성:
Figure 112007052373933-pct00092
디옥산 (10 mL) 중 상기 메틸 에스테르 (2.96 g, 8.1 mmol)의 용액에 0 ℃에서 LiOH (10 mL, 1 N)를 가하였다. 혼합물을 같은 온도에서 3시간 동안 교반하였다. 반응을 시트르산 수용액 (5%)으로 켄칭하고, EtOAc로 희석하였다. 유기층을 분리하여 H2O 및 염수로 연속적으로 세척하고, 무수 Na2SO4 상에서 건조시킨 다음, 여과하고 농축시켜 생성물을 황색 고체 (2.87 g, 100%)로서 수득하였다.
합성:
Figure 112007052373933-pct00093
CH2Cl2 (10 mL) 중 상기 산 (2.05 g, 5.9 mmol)의 용액에 0 ℃에서 트리플루오로아세트산 (10 mL)을 가하였다. 혼합물을 2시간 동안 교반하고, 진공하에 농축시켰다. 잔사에 HCl (1 mL, 디옥산 중 4 N) 및, 이어서 에테르 (400 mL)를 가하였다. 침점물을 백색 고체 (1.38 g, 82%)로서 수득하였다.
실시예 11
이 실시예는 도 26에 제시된 디카르보닐-함유 아미노산의 합성을 상세하게 설명한다.
합성:
Figure 112007052373933-pct00094
벤젠 (300 mL) 중 4'-메틸프로피오페논 (20 g, 122 mmol) 및 N-브로모숙신이미드 (NBS, 23 g, 130 mmol)의 용액에 90 ℃에서 2,2'-아조비스이소부티로니트릴 (AIBN, 0.6 g, 3.6 mmol)을 가하였다. 생성된 용액을 밤새 환류하에 가열하였다. 반응물을 실온으로 식혔다. 갈색 용액을 H2O 및 염수로 연속적으로 세척하고, 무수 Na2SO4 상에서 건조시킨 다음, 여과하고 진공하에 농축시켰다. 잔사를 헥산으로부 터 결정화하여 생성물을 연황색 고체 (27 g, 87%)로 수득하였다.
합성:
Figure 112007052373933-pct00095
EtOH (400 mL) 중 EtONa (14.5 g, 203 mmol)의 용액에 0 ℃에서 디에틸 아세트아미도말로네이트 (39 g, 180 mmol) 및, 이어서 EtOH (100 mL) 중 상기 브로마이드 (27 g, 119 mmol)의 용액을 가하였다. 생성된 혼합물을 1시간 동안 환류 온도로 가열하고, 시트르산 (30 g)으로 켄칭한 다음, H2O (300 mL)로 희석하였다. 대부분의 용매를 진공하에 제거한 다음, 잔사를 EtOAc로 추출하였다. 유기층을 H2O 및 염수로 연속적으로 세척하고, 무수 Na2SO4 상에서 건조시킨 다음, 여과하고 진공하에 농축시켰다. 잔사를 플래쉬 크로마토그래피(실리카, 10:1 - 3:1 헥산: EtOAc)로 정제하여 생성물 (37 g, 88%)을 황색 고체로서 수득하였다.
합성:
Figure 112007052373933-pct00096
에테르 (100 mL) 중 케톤 (5 g, 13.8 mmol)의 용액에 0 ℃에서 Br2 (0.8 mL, 15.6 mmol)를 가하였다. 혼합물을 실온에서 3시간 동안 교반하고, NaHCO3 포화 수 용액으로 켄칭하였다. 혼합물을 Et2O로 추출하였다. 유기층을 H2O 및 염수로 연속적으로 세척하고, 무수 Na2SO4 상에서 건조시킨 다음, 여과하고 진공하에 농축시켜 생성물을 황색 고체 (5.4 g, 88%)로서 수득하고, 이를 추가로 정제하지 않고 다음 단계에 직접 사용하였다.
합성:
Figure 112007052373933-pct00097
DMSO (20 mL) 중 α-브로모 케톤 (5.4 g, 12.2 mmol) 및 Na2CO3 (2.0 g, 18.9 mmol)의 용액에 KI (2.1 g, 13.2 mmol)를 가하였다. 혼합물을 질소 대기하에 90 ℃에서 28시간 동안 교반하였다. 반응을 H2O로 켄칭하고, EtOAc로 희석하였다. 유기층을 분리하여 H2O 및 염수로 연속적으로 세척하고, 무수 Na2SO4 상에서 건조시킨 다음, 여과하고 진공하에 농축시켰다. 잔사를 플래쉬 크로마토그래피 (실리카, 6:1 - 1:10 헥산:EtOAc)로 정제하여 생성물을 고체 (1.12 g, 24%)로서 수득하였다.
합성:
Figure 112007052373933-pct00098
농축 HCl (10 mL) 및 디옥산 (10 mL) 중 디케톤 (1.12 g, 3.0 mmol)의 용액 을 밤새 환류하에 가열하였다. 용매를 진공하에 제거한 후, MeOH (3 mL)를 가하여 잔사를 용해시켰다. 이어서, 에테르 (300 mL)를 가하여 생성물 (302 mg, 42%)을 연황색 고체로서 침전시켰다.
실시예 12
이 실시예는 도 27에 제시된 디카르보닐-함유 아미노산의 합성을 상세히 설명한다.
합성:
Figure 112007052373933-pct00099
에테르 (25 mL) 중 C3H7MgCl (2 M, 50 mmol)의 용액에 0 ℃에서 벤즈알데히드 (5 mL, 42.5 mmol)를 가하였다. 생성된 용액을 0 ℃에서 30분간 교반하였다. 반응을 포화 NH4Cl로 켄칭하고, 에테르로 희석하였다. 유기층을 분리하여 H2O 및 염수로 연속적으로 세척하고, 무수 Na2SO4 상에서 건조시킨 다음, 여과하고 진공하에 농축시켜 조 생성물 (7.2 g)을 수득하고, 이를 추가로 정제하지 않고 다음 단계에 직접 사용하였다.
합성:
Figure 112007052373933-pct00100
CH2Cl2 (300 mL) 중 상기 알콜 (7.2 g, 43.9 mmol) 및 피리딘 (7 mL, 86.7 mmol)의 용액에 0 ℃에서 데스-마르틴 퍼요오디난 (19.2 g, 45.3 mmol)을 가하였다. 생성된 혼합물을 밤새 교반한 다음, 포화 Na2S2O3 수용액 및 포화 NaHCO3 수용액 (1:1)으로 켄칭하였다. 유기층을 H2O 및 염수로 연속적으로 세척하고, 무수 Na2SO4 상에서 건조시킨 다음, 여과하고 진공하에 농축시켰다. 잔사를 플래쉬 크로마토그래피 (실리카, 8:1 - 4:1 헥산:EtOAc)로 정제하여 생성물을 무색 오일 (6.28 g, 두 단계 동안 91%)로서 수득하였다.
합성:
Figure 112007052373933-pct00101
벤젠 (150 mL) 중 상기 케톤 (4.43 g, 27.3 mmol)과 N-브로모숙신이미드 (NBS, 5.5 g, 30.9 mmol)의 용액에 2,2'-아조비스이소부티로니트릴 (AIBN, 0.2 g, 1.2 mmol)을 90 ℃에서 가하였다. 생성된 용액을 밤새 환류온도로 가열하고, 실온으로 식혔다. 갈색 용액을 H2O 및 염수로 연속적으로 세척하고, 무수 Na2SO4 상에서 건조시킨 다음, 여과하고 진공하에 농축시켰다. 잔사를 헥산으로부터 결정화하여 생성물을 백색 고체 (6.21 g, 95%)를 수득하였다.
합성:
Figure 112007052373933-pct00102
EtOH (200 mL) 중 EtONa (2.5 g, 34.9 mmol)의 용액에 0 ℃에서 디에틸 아세트아미도말로네이트 (6.7 g, 30.9 mmol) 및, 이어서 EtOH (100 mL) 중 상기 브로마이드 (6.2 g, 25.8 mmol)의 용액을 가하였다. 생성된 혼합물을 환류온도로 1시간 동안 가열하고, 시트르산 (9 g)으로 켄칭한 다음, H2O로 희석하였다. 대부분의 용매를 제거한 다음, 잔사를 EtOAc로 추출하였다. 유기층을 H2O 및 염수로 연속적으로 세척하고, Na2SO4 상에서 건조시킨 다음, 여과하고 진공하에 농축시켰다. 잔사를 플래쉬 크로마토그래피(실리카, 4:1 -2:1 헥산:EtOAc)로 정제하여 생성물을 연황색 고체 (8.92 g, 92%)로서 수득하였다.
합성:
Figure 112007052373933-pct00103
HOAc (50 mL) 중 상기 케톤 (1.4 g, 3.71 mmol)의 용액에 Br2 (0.7 mL, 13.6 mmol)를 가하였다. 혼합물을 실온에서 밤새 교반한 다음, 포화 NaHCO3 수용액으로 켄칭하였다. 혼합물을 Et2O로 추추하였다. 유기층을 H2O 및 염수로 연속적으로 세척하고, 무수 Na2SO4 상에서 건조시킨 다음, 여과하고 진공하에 농축시켰다. 잔사를 플래쉬 크로마토그래피 (실리카, 5:1 - 3:2 헥산:EtOAc)로 정제하여 생성물을 황색 고체 (1.23 g, 73%)로서 수득하였다.
합성:
Figure 112007052373933-pct00104
DMSO (30 mL) 중 α-브로모 케톤 (1.12 g, 2.46 mmol)과 Na2CO3 (0.4 g, 3.77 mmol)의 용액에 KI (0.45 g, 13.2 mmol)를 가하였다. 혼합물을 90 ℃에서 밤새 교반한 다음, 시트르산 (2 g) 및 H2O (200 mL)로 켄칭하였다. 혼합물을 EtOAc로 추출하였다. 유기층을 H2O 및 염수로 연속적으로 세척하고, 무수 Na2SO4 상에서 건조시킨 다음, 여과하고 진공하에 농축시켰다. 잔사를 플래쉬 크로마토그래피 (실리카, 6:1 - 1:10 헥산:EtOAc)로 정제하여 α-히드록실 케톤을 오일 (0.62 g, 64%)로서 수득하였다.
CH2Cl2 (100 mL) 중 상기 알콜 (0.62 g, 1.58 mmol) 및 피리딘 (0.5 mL, 6.19 mmol)의 용액에 0 ℃에서 데스-마르틴 퍼요오디난 (0.9 g, 2.12 mmol)을 가하였다. 생성된 혼합물을 밤새 교반한 다음, 포화 Na2S2O3 수용액 및 포화 NaHCO3 수용액 (1:1)으로 켄칭하였다. 유기층을 H2O 및 염수로 연속적으로 세척하고, 무수 Na2SO4 상에서 건조시킨 다음, 여과하고 진공하에 농축시켰다. 잔사를 플래쉬 크로마토그래피 (실리카, 9:1 - 3:2 헥산:EtOAc)로 정제하여 생성물을 황색 오일 (287 mg, 두 단계 동안 30 %)로서 수득하였다.
합성:
Figure 112007052373933-pct00105
농축 HCl (10 mL) 및 디옥산 (10 mL) 중 상기 디케톤 (272 mg, 0.7 mmol)의 혼합물을 환류온도로 밤새 가열하였다. 용매를 진공하에 제거한 후, MeOH (1 mL)를 가하여 잔사를 용해시켰다. 에테르 (200 mL)를 가하여 생성물을 황색 고체(162 mg, 81%)로서 침전시켰다.
실시예 13
이 실시예는 도 28에 도시된 디카르보닐-함유 아미노산의 합성을 상세히 설명한다. 화합물은 도 28에 도시된 바와 같이 제조되었다.
실시예 14
이 실시예는 이. 콜라이 중 변형된 폴리펩티드의 클로닝 및 발현을 상세히 설명한다. 오르쏘고날 tRNA (O-tRNA) 및 오르쏘고날 아미노아실 tRNA 신써타제 (O-RS)를 포함하는 도입된 번역계를 사용하여 비-천연 아미노산을 함유하는 폴리펩티드를 발현시킨다. O-RS는 O-tRNA를 비-천연 아미노산으로 우선적으로 아미노아실화한다. 번역계는 코딩된 셀렉터 코돈에 대응하여 비-천연 아미노산을 폴리펩티드 내로 삽입한다. 비-천연 아미노산을 삽입하는데 유용한 O-tRNA 및 O-RS의 아미노산 및 폴리뉴클레오티드 서열은 미합중국 특허 출원 제10/126,927호(발명의 명칭: "In Vivo Incorporation of Unnatural Amino Acids") 및 동 제10/126,931호(발 명의 명칭: "Methods and Compositions for the Production of Orthogonal tRNA-Aminoacyl tRNA Synthetase Pairs")에 기재되어 있으며, 상기 문헌은 본 명세서에포함된다. 다음과 같은 O-RS 및 O-tRNA 서열을 또한 사용할 수 있다:
서열 번호 1 엠. 자나쉬 mtRNA Tyr, CUA tRNA
서열 번호 2 HLAD03; 적정 암버 서프레서 tRNA tRNA
서열 번호 3 HL325A; 적정 AGGA 프레임쉬프트 서프레서 tRNA tRNA
서열 번호 4 p-아지도-L-페닐알라닌 도입을 위한 아미노아실 tRNA 신써타제, p-Az-PheRS(6) RS
서열 번호 5 p-벤조일-L-페닐알라닌 도입을 위한 아미노아실 tRNA 신써타제, p-BpaRS(1) RS
서열 번호 6 프로파르길-페닐알라닌 도입을 위한 아미노아실 tRNA 신써타제, Propargyl-PheRS RS
서열 번호 7 프로파르길-페닐알라닌 도입을 위한 아미노아실 tRNA 신써타제, Propargyl-PheRS RS
서열 번호 8 프로파르길-페닐알라닌 도입을 위한 아미노아실 tRNA 신써타제, Propargyl-PheRS RS
서열 번호 9 p-아지도-페닐알라닌 도입을 위한 아미노아실 tRNA 신써타제, p-Az-PheRS(1) RS
서열 번호 10 p-아지도-페닐알라닌 도입을 위한 아미노아실 tRNA 신써타제, p-Az-PheRS(3) RS
서열 번호 11 p-아지도-페닐알라닌 도입을 위한 아미노아실 tRNA 신써타제, p-Az-PheRS(4) RS
서열 번호 12 p-아지도-페닐알라닌 도입을 위한 아미노아실 tRNA 신써타제, p-Az-PheRS(2) RS
서열 번호 13 p-아지도-페닐알라닌 도입을 위한 아미노아실 tRNA 신써타제, (LW1) RS
서열 번호 14 p-아지도-페닐알라닌 도입을 위한 아미노아실 tRNA 신써타제, (LW5) RS
서열 번호 15 p-아지도-페닐알라닌 도입을 위한 아미노아실 tRNA 신써타제, (LW6) RS
서열 번호 16 p-아지도-페닐알라닌 도입을 위한 아미노아실 tRNA 신써타제, (AzPheRS-5) RS
서열 번호 17 p-아지도-페닐알라닌 도입을 위한 아미노아실 tRNA 신써타제, (AzPheRS-6) RS
이. 콜라이를 변형된 유전자 및 (목적하는 비-천연 아미노산에 특이적인) 오르쏘고날 아미노아실 tRNA 신써타제/tRNA 쌍을 함유하는 플라스미드로 형질전환시킴으로써 비-천연 아미노산을 폴리펩티드 내로 위치-특이적으로 삽입할 수 있다. 0.01 내지 100 mM의 특정 비-천연 아미노산을 함유하는 배지 중 37 ℃에서 배양된 형질전환된 이. 콜라이는 변형된 폴리펩티드를 높은 신뢰도 및 효율로 발현한다. 비-천연 아미노산을 함유하는 His-태깅된 폴리펩티드가 이. 콜라이 숙주 세포에 의해 함입체 또는 응집물로 생산된다. 응집물을 용해시키고, 6M 구아니딘 HCl 중 변성 조건하에 친화도 정제한다. 4 ℃, 5OmM TRIS-HCl, pH8.0, 40μM CuSO4 및 2% (w/v) 사르코실 중에서 밤새 투석하여 재접힘이 일어나게 한다. 물질을 이어서 2OmM TRIS-HCl, pH 8.0, 10OmM NaCl, 2mM CaCl2에 대해 투석하고, His-태그를 제거한다[참조: Boissel et al., J. Biol. Chem., (1993) 268:15983-93]. 폴리펩티드의 정제 방법은 당업계에 잘 알려져 있으며, SDS-PAGE, 웨스턴 블롯 분석 또는 전자스프레이-이온화 이온 트랩 질량분석 등에 의해 확인된다.
실시예 15: 비-천연 아미노산의 시험
이 실시예는 비-천연 아미노산 폴리펩티드 내로의 삽입에 관한 특성을 예견하는 보조 수단으로서, 특정 예시적 비-천연 아미노산에 대해 수행된 네 가지 시험의 결과를 제공한다.
Figure 112007052373933-pct00106
Figure 112007052373933-pct00107
Figure 112007052373933-pct00108
실시예 16: 비-천연 아미노산의 시험
이 실시예는 비-천연 아미노산 폴리펩티드 내로의 삽입에 관한 특성을 예견하는 보조 수단으로서, 특정 예시적 비-천연 아미노산에 대해 수행된 pH 안정성 시험의 결과를 제공한다.
Figure 112007052373933-pct00109
Figure 112007052373933-pct00110
실시예 17
이 실시예는 도 29에 도시된 디카르보닐-함유 아미노산의 합성을 상세히 설명한다.
합성:
Figure 112007052373933-pct00111
H2O-디옥산 (300 mL, 1:1) 중 아미노산 pAF (10 g, 41.1 mmol)의 용액에 NaHCO3 (12 g, 142.9 mmol) 및 Boc2O (12 g, 55.0 mmol)를 가하였다. 혼합물을 실온에서 7시간 동안 교반한 다음, 시트르산으로 켄칭하였다. 혼합물을 EtOAc로 추출하였다. 유기층을 H2O 및 염수로 연속적으로 세척하고, 무수 Na2SO4 상에서 건조시킨 다음, 여과하고 농축시켜 N-Boc-pAF를 백색 고체 (13.7 g, 정량적)로 수득하였다.
합성:
Figure 112007052373933-pct00112
NaOH (40 mL, 25 부피%)에 0 ℃에서 에테르 (60 mL)를 가하였다. 블래스트 쉴드를 반응 플라스미드 앞에 놓았다. 생성된 혼합물에 N-니트로소-N-메틸 우레아 (6.0 g, 57.9 mmol)를 3회로 나누어 3분에 걸쳐 가하였다. 반응 혼합물을 0 ℃에서 10분간 교반하였다. 디에틸 에테르 및 수산화나트륨 층이 분리하도록 두었다. 유기층을 무수 THF (20 mL) 중 N-Boc-pAF (5.0 g, 16.2 mmol)의 용액에 조금씩 (대략 6회로 나누어) 5분에 걸쳐 출발 물질이 완전히 사라질 때까지 가하였다 (TLC로 모니터링). 5 방울의 빙초산을 가하여 반응을 켄칭하였다. 유기 용매를 회전 증발로 제거한 다음, 에틸 아세테이트를 가하였다. 유기층을 NaHCO3 포화용액, H2O 및 염수로 연속적으로 세척하고, 무수 MgSO4 상에서 건조시킨 다음, 여과하고 농축시켜 백색 분말 (4.1 g, 80%)을 수득하였다.
합성:
Figure 112007052373933-pct00113
t-BuOK (60 mL, THF 중 1.0 M)에 새로 증류된 메틸 프로피오네이트 (20 mL, 208 mmol) 중 보호된 pAF ( 3.82 g, 11.9 mmol)의 용액에 서서히 가하였다. 생성된 혼합물을 실온에서 30분간 교반한 다음, 시트르산 용액 (10%, 300 mL)으로 켄칭하였다. 혼합물을 EtOAc로 추출하였다. 유기층을 H2O 및 염수로 연속적으로 세척하고, 무수 Na2SO4 상에서 건조시킨 다음, 여과하고 농축시켰다. 잔사를 플래쉬 크로마토그래피(실리카, 4:1 - 1:1 헥산:EtOAc)로 정제하여 생성물을 백색 고체 (3.89 g, 87%)로서 수득하였다.
합성:
Figure 112007052373933-pct00114
디옥산 (4 mL) 중 상기 메틸 에스테르 (1.12 g, 2.97 mmol)의 용액에 0 ℃에서 LiOH (4 mL, 1 N)를 가하였다. 혼합물을 0 ℃에서 3시간 동안 교반한 다음, 시트르산 수용액 (5%, 200 mL)으로 켄칭하고, EtOAc로 희석하였다. 유기층을 분리하여 H2O 및 염수로 연속적으로 세척하고, 무수 Na2SO4 상에서 건조시킨 다음, 여과하고 농축시켜 백색 고체 (1.02 g, 94%)를 수득하였다.
합성:
Figure 112007052373933-pct00115
CH2Cl2 (10 mL) 중 상기 산 (1.0 g, 2.75 mmol)의 용액에 0 ℃에서 트리플루오로아세트산 (10 mL)을 가하였다. 혼합물을 0 ℃에서 2시간 동안 교반한 다음, 농축시켰다. 잔사에 MeOH (1 mL) 및, 이어서 HCl (1.5 mL, 디옥산 중 4 N)을 가하였다. 에테르 (200 mL)를 가하여 생성물 (701 mg, 96%)을 백색 고체로서 침전시켰다.
실시예 18
이 실시예는 도 30에 도시된 디카르보닐-함유 아미노산의 합성을 상세히 설명한다.
합성:
Figure 112007052373933-pct00116
t-BuOK (15 mL, THF 중 1.0 M)에 메틸 디플루오로아세테이트 (6 mL, 68.7 mmol) 중 보호된 pAF (1.09 g, 3.4 mmol)의 용액을 서서히 가하였다. 생성된 혼합물을 실온에서 30분간 교반한 다음, 시트르산 (5 g, 25.4 mmol)으로 켄칭하고, H2O로 희석하였다. 혼합물을 EtOAc로 추출하였다. 유기층을 H2O 및 염수로 연속적으로 세척하고, 무수 Na2SO4상에서 건조시킨 다음, 여과하고 농축시켰다. 잔사를 플래쉬 크로마토그래피 (실리카, 20:1 - 3:2 헥산:EtOAc)로 정제하여 생성물을 연갈색 고체 (1.27 g, 94%)로서 수득하였다.
합성:
Figure 112007052373933-pct00117
디옥산 (30 mL) 중 상기 메틸 에스테르(1.26 g, 3.17 mmol)의 용액에 0 ℃에서 LiOH (30 mL, 1 N)를 가하였다. 혼합물을 0 ℃에서 30분간 교반한 다음, 시트르산 (10 g, 51 mmol)으로 켄칭하고, H2O로 희석하였다. 혼합물을 EtOAc로 추출하였다. 유기층을 H2O 및 염수로 연속적으로 세척하고, 무수 Na2SO4 상에서 건조시킨 다음, 여과하고 농축시켰다. 잔사를 플래쉬 크로마토그래피 (실리카, 100:1 - 10:1 CH2Cl2:MeOH, 0.5% HOAc)로 정제하여 갈색 오일 (1.19 g, 98%)을 수득하였다.
합성:
Figure 112007052373933-pct00118
CH2Cl2 (15 mL) 중 상기 산 (1.19 g, 3.1 mmol)의 용액에 0 ℃에서 트리플루오로아세트산 (15 mL)을 가하였다. 혼합물을 30분간 교반하고, 농축시켰다. 잔사에 MeOH (2 mL) 및 이어서 HCl (2 mL, 디오산 중 4 N)을 가하였다. 에테르 (200 mL)를 가하여 생성물 (0.82 mg, 82%)을 백색 고체로서 수득하였다.
실시예 19
이 실시예는 도 12a에 도시된 히드록실아민-함유 PEG 화합물의 합성을 상세히 설명한다. 히드록실아민-함유 PEG 화합물은 도 12a에 도시된 바와 같이 제조되었다.
실시예 20
이 실시예는 도 12b에 도시된 히드록실아민-함유 PEG 화합물의 합성을 상세히 설명한다. 히드록실아민-함유 PEG 화합물은 도 12b에 도시된 바와 같이 제조되었다.
실시예 21
이 실시예는 도 12c에 도시된 히드록실아민-함유 PEG 화합물의 합성을 상세히 설명한다. 히드록실아민-함유 PEG 화합물은 도 12c에 도시된 바와 같이 제조되었다.
실시예 22
이 실시예는 도 12d에 도시된 히드록실아민-함유 PEG 화합물의 합성을 상세히 설명한다. 히드록실아민-함유 PEG 화합물은 도 12d에 도시된 바와 같이 제조되었다.
실시예 23
이 실시예는 도 13에 도시된 히드록실아민-함유 PEG 화합물의 합성을 상세히 설명한다. 히드록실아민-함유 PEG 화합물은 도 13에 도시된 바와 같이 제조되었다.
실시예 24
이 실시예는 도 14에 도시된 히드록실아민-함유 PEG 화합물의 합성을 상세히 설명한다. 히드록실아민-함유 PEG 화합물은 도 14에 도시된 바와 같이 제조되었다.
실시예 25
이 실시예는 도 15에 도시된 히드록실아민-함유 PEG 화합물의 합성을 상세히 설명한다. 히드록실아민-함유 PEG 화합물은 도 15에 도시된 바와 같이 제조되었다.
실시예 26
이 실시예는 도 16a에 도시된 히드록실아민-함유 PEG 화합물의 합성을 상세히 설명한다. 히드록실아민-함유 PEG 화합물은 도 16a에 도시된 바와 같이 제조되었다.
실시예 27
이 실시예는 도 16b에 도시된 히드록실아민-함유 PEG 화합물의 합성을 상세히 설명한다. 히드록실아민-함유 PEG 화합물은 도 16b에 도시된 바와 같이 제조되었다.
실시예 28
이 실시예는 도 18에 도시된 히드록실아민-함유 PEG 링커 화합물의 합성을 상세히 설명한다. 히드록실아민-함유 PEG 링커 화합물은 도 18에 도시된 바와 같이 제조되었다.
실시예 29
이 실시예는 도 36에 도시된 l,2-비스(4-(브로모메틸)페닐)디술판 (1)의 합성을 상세히 설명한다. 교반 막대가 있는 오븐 건조된 둥근바닥 플라스크에 질소 가스압 하에 p-톨릴 디술파이드 (5.0 g, 20.3 mmol), N-브로모 숙신이미드 (8.6 g, 48.4 mmol) 및 60 mL 무수 벤젠을 가하였다. 용액을 95 ℃로 가열하였다. 아조비스이소부티로니트릴 (.106 g, .64 mmol)을 한꺼번에 가하였다. 반응 혼합물을 16시간 동안 환류시켰다. 용매를 회전 증발로 제거하고, 갈색 고체를 100 mL 에틸 아세테이트에 용해시켰다. 반응 혼합물을 포화 중탄산나트륨 수용액 (2 X 50 mL), 탈이온수 (1 X 50 mL) 및 염수 (1 X 50 mL)로 연속적으로 세척하였다. 유기층을 분리하여 무수 황산나트륨 상에서 건조시킨 다음, 여과하고 감압하에 농축시켰다. 조 생성물을 상표명 호라이즌(HORIZON™) 크로마토그래피 시스템(Biotage Inc.)을 사용한 실리카 크로마토그래피로 정제하여, 적절한 분획의 농축 및 미량 용매의 제거(진공 펌프) 후, l,2-비스(4-(브로모메틸)페닐)디술판 (2.1 g, 25 %)을 백색 고체로서 수득하였다. 1H NMR 스펙트럼 데이터 및 질량 스펙트럼을 얻었다. 반응을 반복하여 생성물 (2.0 g, 23%)을 수득하였다.
실시예 30
이 실시예는 도 36에 도시된 l,2-비스(4-디에틸-2-아세트아미도말로네이트)페닐디술판 (2)의 합성을 상세히 설명한다. 교반 막대가 있는 오븐 건조된 둥근바닥 플라스크에 질소 가스압 하에 디에틸 아세트아미도말로네이트 (6.48 g, 30 mmol) 및 50 mL 무수 EtOH를 가하였다. 용액에 나트륨 에톡사이드 (2.6 g, 38 mmol)를 한꺼번에 가하였다. 반응을 0 ℃로 냉각시켰다. l,2-비스(4-(브로모메틸)페닐)디술판 (4.1 g, 10.1 mmol)을 20 mL 1:1 EtOH/THF에 용해시키고, 첨가 펀넬을 통해 상기 냉각된 용액에 1시간에 걸쳐 가하였다. 빙욕을 제거하고, 반응 혼합물을 실온에서 6시간 동안 교반하였다. 용매를 회전증발로 제거하여, 적색 고체를 100 mL 에틸 아세테이트에 용해시켰다. 반응 혼합물을 5 % 시트르산 용액 (2 X 50 mL), 탈이온수 (1 X 50 mL) 및 염수(1 X 50 mL)로 연속적으로 세척하였다. 유기층을 분리하여 무수 황산나트륨 상에서 건조시킨 다음, 여과하고 감압하에 농축시켰다. 조 생성물을 상표명 호라이즌(HORIZON™) 크로마토그래피 시스템(Biotage Inc.)을 사용한 실리카 크로마토그래피로 정제하여, 적절한 분획의 농축 및 미량 용매의 제거(진공 펌프) 후, l,2-비스(4-디에틸-2-아세트아미도말로네이트)페닐디술판 (5.0 g, 73 %)을 황색 고체로서 수득하였다. 1H NMR 스펙트럼 데이터, HPLC 트레이스 및 질량 스펙트럼을 얻었다.
실시예 31
이 실시예는 도 36에 도시된 l,2-비스(4-(2-아미노-3-프로판산)페닐)디술판 (3)의 합성을 상세히 설명한다. 교반 막대가 있는 오븐 건조된 둥근바닥 플라스크에 질소 가스압 하에 1,2-비스(4-디에틸-2-아세트아미도말로네이트)페닐디술판 (1.0 g, 1.4 mmol), HCl (8 mL, 12 M) 및 8 mL 1,4-디옥산을 가하였다. 반응을 환류 온도에서 16시간 동안 교반하였다. 용매를 회전 증발 및 진공 펌프에 의해 제거하여 조질의 l,2-비스(4-(2-아미노-3-프로판산)페닐)디술판 (0.75 g, 135 %)을 투명한 오일로서 수득하였다. 1H NMR 스펙트럼 데이터 및 질량 분석을 수득하였다.
실시예 32
이 실시예는 도 36에 도시된 N,N'-디Boc-l,2-비스(4-(2-아미노-3-프로판산)페닐)디술판 (4)의 합성을 상세히 설명한다. 건조된 둥근바닥 플라스크 중의 l,2-비스(4-(2-아미노-3-프로판산)페닐디술판 (0.75 g, 1.9 mmol)에 5 mL 1,4 디옥산, 5 mL 탈이온수, 디-t-부틸 디카르보네이트 (.65 g, 3.0 mmol) 및 중탄산나트륨(0.98 g, 12 mmol)을 가하였다. 반응을 실온에서 16시간 동안 교반하였다. 용매를 회전 증발에 의해 제거하고, 투명한 오일을 100 mL 에틸 아세테이트에 용해시켰다. 반응 혼합물을 5 % 시트르산 용액 (5 mL X 2), 탈이온수 (50 mL) 및 염수 (50 mL)로 연속적으로 세척하였다. 유기층을 분리하여 무수 황산마그네슘 상에서 건조시킨 다음, 여과하고 감압하에 농축시켰다. 조 생성물을 호라이즌(HORIZON™) 크로마토그래피 시스템(Biotage Inc.)을 사용한 실리카 크로마토그래피로 정제하여, 적절한 분획의 농축 및 미량 용매의 제거(진공 펌프) 후, N,N'-디Boc-l,2-비스(4-(2-아미노-3-프로판산)페닐)디술판 (0.5 g, 조 생성물로부터 44 %, 두 단계에 걸쳐 52 %)을 백색 고체로서 수득하였다. 1H NMR 스펙트럼 데이터, HPLC 트레이스 및 질량 스펙트럼을 얻었다.
실시예 33
이 실시예는 도 36에 도시된 N-BOC-2-아미노-3-(4-머캅토페닐)프로판산 (5) 의 합성을 상세히 설명한다. 교반 막대가 있는 오븐 건조된 둥근바닥 플라스크에 질소 가스압 하에 N,N'-디Boc-l,2-비스(4-(2-아미노-3-프로판산)페닐디술판 (0.5 g, 0.84 mmol), n-부틸 포스핀 (0.6 mL, 2.44 mmol) 및 15 mL 무수 THF를 가하였다. 반응을 실온에서 2시간 동안 교반하였다. 용매를 회전 증발에 의해 제거하고, 투명한 오일을 50 mL 에틸 아세테이트에 용해시켰다. 반응 혼합물을 5 % 시트르산 용액 (25 mL X 2), 탈이온수 (25 mL) 및 염수 (25 mL)로 연속적으로 세척하였다. 유기층을 분리하여 무수 황산마그네슘 상에서 건조시킨 다음, 여과하고 감압하에 농축시켰다. 조 생성물을 호라이즌(HORIZON™) 크로마토그래피 시스템(Biotage Inc.)을 사용한 실리카 크로마토그래피로 정제하여, 적절한 분획의 농축 및 미량 용매의 제거(진공 펌프) 후, N-BOC-2-아미노-3-(4-머캅토페닐)프로판산 (0.5 g, 100 %)을 백색 고체로서 수득하였다. 1H NMR 스펙트럼 데이터, HPLC 트레이스 및 질량 스펙트럼을 얻었다.
실시예 34
이 실시예는 도 36에 도시된 2-아미노-3-(4-머캅토페닐)프로판산 히드로클로라이드 (6)의 합성을 상세히 설명한다. 교반 막대가 있는 오븐 건조된 둥근바닥 플라스크에 N-BOC-2-아미노-3-(4-머캅토페닐)프로판산 (.5g, 1.6 mmol), 10 mL 무수 디클로로메탄 및 3 mL 트리플루오로아세트산을 가하였다. 반응을 실온에서 2시간 동안 교반하였다. 용매를 회전 증발에 의해 제거하고, 1 mL 1,4-디옥산 중 4.0 M 염화수소를 가하였다. 둥근 바닥 플라스크를 잠시 흔든 다음, 100 mL 무수 디에틸 에테르를 가하여 2-아미노-3-(4-머캅토페닐)프로판산 히드로클로라이드 (0.39 g, 100%)를 백색 고체로서 침전시켰다. 1H NMR 스펙트럼 데이터, HPLC 트레이스 및 질량 스펙트럼을 얻었다.
실시예 35
이 실시예는 도 37에 도시된 디에틸 2-(4-(2-옥소프로필티오)벤질)-2-아세트아미도말로네이트 (7)의 합성을 상세히 설명한다. 교반 막대가 있는 오븐 건조된 둥근바닥 플라스크에 질소 가스압 하에 화합물 (2) (1.1 g, 1.6 mmol), n-Bu3P (1.2 mL, 4.8 mmol) 및 25 mL 무수 THF (25 mL)를 가하였다. 반응을 실온에서 2시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물에 클로로아세톤 (0.16 mL, 2.0 mmol) 및 NaHCO3 (0.98 g, 12 mmol)를 가하였다. 반응을 실온에서 2시간 동안 교반하였다. 용매를 회전 증발에 의해 제거하고, 백색 고체를 100 mL 에틸 아세테이트에 용해시켰다. 반응 혼합물을 중탄산나트륨 수용액 (50 mL X 2), 탈이온수 (50 mL) 및 염수 (50 mL)로 연속적으로 세척하였다. 유기층을 분리하여 무수 황산마그네슘 상에서 건조시킨 다음, 여과하고 감압하에 농축시켰다. 조 생성물을 호라이즌(HORIZON™) 크로마토그래피 시스템(Biotage Inc.)을 사용한 실리카 크로마토그래피로 정제하여, 적절한 분획의 농축 및 미량 용매의 제거(진공 펌프) 후, 디에틸 2-(4-(2-옥소프로필티오)벤질)-2-아세트아미도말로네이트 (0.62 g, 98 %)를 백색 고체로서 수득하였다. 1H NMR 스펙트럼 데이터, HPLC 트레이스 및 질량 스펙트럼을 얻었다.
실시예 36
이 실시예는 도 37에 도시된 3-(4-(2-옥소프로필티오)페닐)-2-아미노프로판산 (8)의 합성을 상세히 설명한다. 교반 막대가 있는 오븐 건조된 둥근바닥 플라스크에 질소 가스압 하에 화합물 (7) (0.62 g, 1.5 mmol), 10 mL 1,4-디옥산 및 10 mL 12M HCl을 가하였다. 반응을 환류시키고 밤새 교반하였다. 용매를 회전 증발에 의해 제거하여 3-(4-(2-옥소프로필티오)페닐)-2-아미노프로판산 (0.40 g, 99 % 조 생성물)을 수득하였다.
실시예 37
이 실시예는 도 37에 도시된 N-BOC-3-(4-(2-옥소프로필티오)페닐)-2-아미노프로판산 (9)의 합성을 상세히 설명한다. 교반 막대가 있는 오븐 건조된 둥근바닥 플라스크 중의 화합물 (8) (0.35 g, 1.3 mmol)에 질소 가스압하에 디-t-부틸 디카르보네이트 (0.63 g, 3.0 mmol), 중탄산나트륨 (0.98 g, 12 mmol), 8 mL 1,4-디옥산 및 8 mL 탈이온수를 가하였다. 반응을 실온에서 16시간 동안 교반하였다. 용매를 회전 증발에 의해 제거하여 투명한 오일을 100 mL 에틸 아세테이트에 용해시켰다. 반응 혼합물을 5 % 시트르산 용액 (50 mL X 2), 탈이온수 (50 mL) 및 염수 (50 mL)로 연속적으로 세척하였다. 유기층을 분리하여 무수 황산마그네슘 상에서 건조시킨 다음, 여과하고 감압하에 농축시켰다. 조 생성물을 호라이즌(HORIZON™) 크로마토그래피 시스템(Biotage Inc.)을 사용한 실리카 크로마토그래피로 정제하여, 적절한 분획의 농축 및 미량 용매의 제거(진공 펌프) 후, N-BOC-3-(4-(2-옥소프로필티오)페닐)-2-아미노프로판산 (0.30 g, 조 생성물로부터 66 %)을 백색 고체로서 수득하였다. 1H NMR 스펙트럼 데이터, HPLC 트레이스 및 질량 스펙트럼을 얻었다.
실시예 38
이 실시예는 도 37에 도시된 N-BOC-3-(4-(2-옥소프로필술피닐)페닐)-2-아미노프로판산 (10)의 합성을 상세히 설명한다. 교반 막대가 있는 오븐 건조된 둥근바닥 플라스크에 질소 가스압 하에 화합물 (9) (150 mg, .4 mmol), 8 mL 빙초산 및 2 mL 30 % v/v 물 중 과산화수소를 가하였다. 반응을 실온에서 2시간 동안 교반하였다. 용매를 회전 증발에 의해 제거하고, 투명한 오일을 50 mL 에틸 아세테이트에 용해시켰다. 반응 혼합물을 5 % 시트르산 용액 (25 mL X 2), 탈이온수 (25 mL) 및 염수 (25 mL)로 연속적으로 세척하였다. 유기층을 분리하여 무수 황산마그네슘 상에서 건조시킨 다음, 여과하고 감압하에 농축시켰다. 조 생성물을 호라이즌(HORIZON™) 크로마토그래피 시스템(Biotage Inc.)을 사용한 실리카 크로마토그래피로 정제하여, 적절한 분획의 농축 및 미량 용매의 제거(진공 펌프) 후, N-BOC-3-(4-(2-옥소프로필술피닐)페닐)-2-아미노프로판산 (0.13 g, 조 생성물 86%)을 수득하였다. HPLC 트레이스 및 질량 스펙트럼을 얻었다.
실시예 39
이 실시예는 도 37에 도시된 3-(4-(2-옥소프로필술피닐)페닐)-2-아미노프로판산 (11)의 합성을 상세히 설명한다. 교반 막대가 있는 오븐 건조된 둥근바닥 플라스크에 N-BOC-3-(4-(2-옥소프로필술피닐)페닐)-2-아미노프로판산 (10) (0.13 g, 0.35 mmol), 10 mL 무수 디클로로메탄 및 3 mL 트리플루오로아세트산을 가하였다. 반응을 실온에서 2시간 동안 교반하였다. 용매를 회전 증발에 의해 제거하고, 1 mL 1,4-디옥산 중 4.0 M 염화수소를 가하였다. 둥근바닥 플라스크를 잠시 흔든 다음, 100 mL 무수 디에틸 에테르를 가하여 3-(4-(2-옥소프로필술피닐)페닐)-2-아미노프로판산 (0.072 g, 조 생성물로부터 74 %)을 백색 고체로서 침전시켰다. 1H NMR 스펙트럼 데이터, HPLC 트레이스 및 질량 스펙트럼을 얻었다.
실시예 40
이 실시예는 도 37에 도시된 N-BOC-3-(4-(2-옥소프로필술포닐)페닐)-2-아미노프로판산 (12)의 합성을 상세히 설명한다. 교반 막대가 있는 오븐 건조된 둥근바닥 플라스크에 질소 가스압 하에 화합물 (9) (150 mg, 0.4 mmol), 8 mL 빙초산 및 2 mL 30 % v/v 물 중 과산화수소를 가하였다. 반응을 실온에서 24시간 동안 교반하였다. 용매를 회전 증발에 의해 제거한 다음, 투명한 오일을 50 mL 에틸 아세테이트에 용해시켰다. 반응 혼합물을 5 % 시트르산 용액 (25 mL X 2), 탈이온수 (25 mL) 및 염수 (25 mL)로 연속적으로 세척하였다. 유기층을 분리하여 무수 황산마그네슘 상에서 건조시킨 다음, 여과하고 감압하에 농축시켰다. 조 생성물을 호라이즌(HORIZON™) 크로마토그래피 시스템(Biotage Inc.)을 사용한 실리카 크로마토그래피로 정제하여, 적절한 분획의 농축 및 미량 용매의 제거(진공 펌프) 후, N-BOC-3-(4-(2-옥소프로필술포닐)페닐)-2-아미노프로판산 (12) (0.13 g, 조 생성물 86%)을 수득하였다. HPLC 트레이스 및 질량 스펙트럼을 얻었다.
실시예 41
이 실시예는 도 37에 도시된 3-(4-(2-옥소프로필술포닐)페닐)-2-아미노프로판산 (13)의 합성을 상세히 설명한다. 교반 막대가 있는 오븐 건조된 둥근바닥 플라스크에 N-BOC-3-(4-(2-옥소프로필술포닐)페닐)-2-아미노프로판산 (12) (0.13 g, 0.35 mmol), 10 mL 무수 디클로로메탄 및 3 mL 트리플루오로아세트산을 가하였다. 반응을 실온에서 2시간 동안 교반하였다. 용매를 회전 증발에 의해 제거하고, 1 mL 1,4-디옥산 중 4.0 M 염화수소를 가하였다. 둥근바닥 플라스크를 잠시 흔든 다음, 100 mL 무수 디에틸 에테르를 가하여 3-(4-(2-옥소프로필술포닐)페닐)-2-아미노프로판산 (0.067 g, 조 생성물로부터 65 %)을 백색 고체로서 침전시켰다. 1H NMR 스펙트럼 데이터, HPLC 트레이스 및 질량 스펙트럼을 얻었다.
실시예 42
이 실시예는 도 37에 도시된 3-(4-(2-옥소프로필티오)페닐)-2-아미노프로판산 (14)의 합성을 상세히 설명한다. 교반 막대가 있는 오븐 건조된 둥근바닥 플라스크에 N-BOC-3-(4-(2-옥소프로필티오)페닐)-2-아미노프로판산 (9) (0.10 g, .28 mmol), 10 mL 무수 디클로로메탄 및 3 mL 트리플루오로아세트산을 가하였다. 반응을 실온에서 2시간 동안 교반하였다. 용매를 회전 증발에 의해 제거한 다음, 1 mL 1,4-디옥산 중 4.0 M 염화수소를 가하였다. 둥근바닥 플라스크를 잠시 흔든 다음, 100 mL 무수 디에틸 에테르를 가하여 3-(4-(2-옥소프로필티오)페닐)-2-아미노프로판산 (0.062 g, 조 생성물로부터 85 %)을 백색 고체로 침전시켰다. 1H NMR 스펙트럼 데이터, HPLC 트레이스 및 질량 스펙트럼을 얻었다.
실시예 43
이 실시예는 도 38에 도시된 N-BOC-3-(4-(2-옥소시클로펜틸티오)페닐)-2-아미노프로판산 (15)의 합성을 상세히 설명한다. 교반 막대가 있는 오븐 건조된 둥근바닥 플라스크에 질소 가스압 하에 화합물 (5) (0.15 g, 0.76 mmol), 2-클로로시클로펜타논 (0.12 mL, 1.25 mmol), 중탄산나트륨 (0.98 g, 12 mmol), 15 mL 무수 THF를 가하였다. 반응을 실온에서 16시간 동안 교반하였다. 용매를 회전 증발에 의해 제거하고, 백색 고체를 100 mL 에틸 아세테이트에 용해시켰다. 반응 혼합물을 중탄산나트륨 포화 수용액 (50 mL X 2), 탈이온수 (50 mL) 및 염수 (50 mL)로 연속적으로 세척하였다. 유기층을 분리하여 무수 황산마그네슘 상에서 건조시킨 다음, 여과하고 감압하에 농축시켰다. 조 생성물을 호라이즌(HORIZON™) 크로마토그래피 시스템(Biotage Inc.)을 사용한 실리카 크로마토그래피로 정제하여, 적절한 분획의 농축 및 미량 용매의 제거(진공 펌프) 후, N-BOC-3-(4-(2-옥소시클로펜틸티오)페닐)-2-아미노프로판산 (0.15 g, 51 %)을 백색 고체로서 수득하였다. HPLC 트레이스 및 질량 스펙트럼을 얻었다.
실시예 44
이 실시예는 도 38에 도시된 3-(4-(2-옥소시클로펜틸티오)페닐)-2-아미노프로판산 (16)의 합성을 상세히 설명한다. 교반 막대가 있는 오븐 건조된 둥근바닥 플라스크에 N-BOC-3-(4-(2-옥소시클로펜틸티오)페닐)-2-아미노프로판산 (15) (0.15 g, 0.39 mmol), 10 mL 무수 디클로로메탄 및 3 mL 트리플루오로아세트산을 가하였다. 반응을 실온에서 2시간 동안 교반하였다. 용매를 회전 증발에 의해 제거하고, 1 mL 1,4-디옥산 중 4.0 M 염화수소를 가하였다. 둥근바닥 플라스크를 잠시 흔든 다음, 100 mL 무수 디에틸 에테르를 가하여 3-(4-(2-옥소시클로펜틸티오)페닐)-2-아미노프로판산 (0.108 g, 100 %)을 백색 고체로서 침전시켰다. 1H NMR 스펙트럼 데이터, HPLC 트레이스 및 질량 스펙트럼을 얻었다.
실시예 45
이 실시예는 도 38에 도시된 N-BOC-3-(4-(2-옥소부틸티오)페닐)-2-아미노프로판산 (18)의 합성을 상세히 설명한다. 교반 막대가 있는 오븐 건조된 둥근바닥 플라스크에 질소 가스압하에 화합물 (5) (0.15 g, 0.76 mmol), l-브로모-2-부타논 (0.12 mL, 1.25 mmol), 중탄산나트륨 (0.98 g, 12 mmol), 15 mL 무수 THF를 가하였다. 반응을 실온에서 16시간 동안 교반하였다. 용매를 회전 증발에 의해 제거하고, 백색 고체를 100 mL 에틸 아세테이트에 용해시켰다. 반응 혼합물을 중탄산나트륨 포화 수용액 (50 mL X 2), 탈이온수 (50 mL) 및 염수 (50 mL)로 연속적으로 세척하였다. 유기층을 분리하여 무수 황산마그네슘 상에서 건조시킨 다음, 여과하고 감압하에 농축시켰다. 조 생성물을 호라이즌(HORIZON™) 크로마토그래피 시스템(Biotage Inc.)을 사용한 실리카 크로마토그래피로 정제하여, 적절한 분획의 농축 및 미량 용매의 제거(진공 펌프) 후, N-BOC-3-(4-(2-옥소부틸티오)페닐)-2-아미노프로판산 (0.15 g, 51 %)을 백색 고체로서 수득하였다. HPLC 트레이스 및 질량 스펙트럼을 얻었다.
실시예 46
이 실시예는 도 38에 도시된 화합물 19 내지 22의 합성을 상세히 설명한다. 화합물 19 내지 22는 화합물 10 내지 14에 대하여 기술한 방법과 유사한 방법으로 제조되었다.
실시예 47
이 실시예는 도 38에 도시된 3-(4-(2-옥소부틸티오)페닐)-2-아미노프로판산 (23)의 합성을 상세히 설명한다. 교반 막대가 있는 오븐 건조된 둥근바닥 플라스크에 N-BOC-3-(4-(2-옥소부틸티오)페닐)-2-아미노프로판산 (18) (0.15 g, .56 mmol), 10 mL 무수 디클로로메탄 및 3 mL 트리플루오로아세트산을 가하였다. 반응을 실온에서 2시간 동안 교반하였다. 용매를 회전 증발에 의해 제거하고, 1 mL 1,4-디옥산 중 4.0 M 염화수소를 가하였다. 둥근바닥 플라스크를 잠시 흔든 다음, 100 mL 무수 디에틸 에테르를 가하여 3-(4-(2-옥소부틸티오)페닐)-2-아미노프로판산 (0.149 g, 100 %)을 백색 고체로서 침전시켰다. 1H NMR 스펙트럼 데이터, HPLC 트레이스 및 질량 스펙트럼을 얻었다.
실시예 48
이 실시예는 도 39에 도시된 화합물 24 내지 27의 합성을 상세히 설명한다. 화합물 24 내지 27은 화합물 10 내지 14에 대하여 기술한 방법과 유사한 방법으로 제조되었다.
실시예 49
이 실시예는 도 31에 도시된 디카르보닐-함유 아미노산의 합성을 상세히 설명한다.
합성:
Figure 112007052373933-pct00119
t-BuOK (15 mL, THF 중 1.0 M)에 메틸 트리플루오로아세테이트 (5 mL, 50 mmol) 중 보호된 pAF ( 1.0 g, 3.1 mmol)의 용액을 서서히 가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 30분간 교반한 다음, 시트르산 (5 g, 25.4 mmol)으로 켄칭하고 EtOAc로 희석하였다. 유기층을 H2O 및 염수로 연속적으로 세척하고, 무수 Na2SO4 상에서 건조시킨 다음, 여과하고 농축시켰다. 잔사를 플래쉬 크로마토그래피 (실리카, 20:1 - 3:2 헥산:EtOAc)로 정제하여 생성물 (1.07 g, 83%)을 연갈색 고체로서 수득하였다.
합성:
Figure 112007052373933-pct00120
디옥산 (30 mL) 중 상기 메틸 에스테르 (1.0 g, 2.4 mmol)의 용액에 0 ℃에서 LiOH (30 mL, 1 N)를 가하였다. 혼합물을 0 ℃에서 30분간 교반한 다음, 시트르산 (10 g, 51 mmol)으로 켄칭하고 H2O로 희석하였다. 혼합물을 EtOAc로 추출하였다. 유기층을 H2O 및 염수로 연속적으로 세척하고, 무수 Na2SO4 상에서 건조시킨 다음, 여과하고 농축시켰다. 잔사를 플래쉬 크로마토그래피 (실리카, 100:1 - 10:1 CH2Cl2:MeOH, 0.5% HOAc)로 정제하여 갈색 오일 (0.87 g, 98%)을 수득하였다.
합성:
Figure 112007052373933-pct00121
CH2Cl2 (15 mL) 중 상기 산 (1.0 g, 2.5 mmol)의 용액에 0 ℃에서 트리플루오로아세트산 (15 mL)을 가하였다. 생성된 혼합물을 30분간 교반한 다음, 진공하에 농축시켰다. 잔사에 MeOH (2 mL) 및, 이어서 HCl (2 mL, 디옥산 중 4 N)를 가하였다. 에테르 (200 mL)를 가하여 생성물 (0.56 g, 75%)을 백색 고체로서 침전시켰다.
실시예 50
이 실시예는 도 32에 도시된 디카르보닐-함유 아미노산의 합성을 상세히 설명한다.
합성:
Figure 112007052373933-pct00122
t-BuOK (15 mL, THF 중 1.0 M)에 메틸 펜타플루오로프로피오네이트 (8 mL, 62 mmol) 중 보호된 pAF ( 1.0 g, 3.1 mmol)의 용액을 가하였다. 생성된 혼합물을 실온에서 1시간 동안 교반한 다음, 시트르산 (5 g, 25.4 mmol)으로 켄칭하고, H2O (100 mL)로 희석하였다. 용매를 제거한 후, 잔사를 EtOAc로 추출하였다. 유기층을 H2O 및 염수로 연속적으로 세척하고, 무수 Na2SO4 상에서 건조시킨 다음, 여과하고 농축시켰다. 잔사를 플래쉬 크로마토그래피 (실리카, 20:1 - 3:2 헥산:EtOAc)로 정제하여 생성물 (1.1 g, 76%)을 연갈색 고체로서 수득하였다.
합성:
Figure 112007052373933-pct00123
디옥산 (30 mL) 중 상기 메틸 에스테르 (1.0 g, 2.1 mmol)의 용액에 0 ℃에서 LiOH (30 mL, 1 N)를 가하였다. 생성된 혼합물을 0 ℃에서 30분간 교반한 다음, 시트르산 (10 g, 51 mmol) 및 H2O로 켄칭하였다. 혼합물을 EtOAc로 추출하였다. 유기층을 H2O 및 염수로 연속적으로 세척하고, 무수 Na2SO4 상에서 건조시킨 다음, 여과하고 농축시켰다. 잔사를 플래쉬 크로마토그래피 (실리카, 100:1 - 10:1 CH2Cl2:MeOH, 0.5% HOAc)로 정제하여 생성물 (0.8 g, 84%)을 황색 고체로서 수득하였다.
합성:
Figure 112007052373933-pct00124
CH2Cl2 (15 mL) 중 상기 산 (0.7 g, 2.5 mmol)의 용액에 0 ℃에서 트리플루오로아세트산 (15 mL)을 가하였다. 혼합물을 같은 온도에서 30분간 교반하고 농축시켰다. 잔사에 MeOH (2 mL) 및, 이어서 HCl (2 mL, 디옥산 중 4 N)를 가하였다. 에테르 (200 mL)를 가하여 생성물 (0.62 g, 70%)을 백색 고체로서 침전시켰다.
실시예 51
이 실시예는 도 33에 도시된 디카르보닐-함유 아미노산의 합성을 상세히 설명한다.
합성:
Figure 112007052373933-pct00125
CH2Cl2 (150 mL) 중 알콜 (1) (2.35 g, 7.6 mmol)과 피리딘 (1.5 mL, 18.6 mmol)의 교반된 용액에 0 ℃에서 데스-마르틴 퍼요오디난 (3.5 g, 8.3 mmol)을 가하였다. 혼합물을 실온에서 밤새 교반하고, Na2S2O3-NaHCO3 포화 수용액 (1:1, 100 mL)으로 켄칭한 다음, CH2Cl2로 희석하였다. 유기층을 분리하여 H2O 및 염수로 세척하고, 무수 Na2SO4 상에서 건조시킨 다음, 여과하고 진공하에 농축시켰다. 잔사를 플래쉬 크로마토그래피 (실리카, 20:1 - 3:1 헥산:EtOAc)로 정제하여 알데히드 (2)를 백색 고체 (2.15 g, 92%)로서 수득하였다. ESI-MS, m/z: 292 (M+ -OH), 232, 204, 175, 131, 115 (100).
합성:
Figure 112007052373933-pct00126
THF (60 mL) 중 디이소프로필아민 (0.33 mL, 2.33 mmol)의 교반된 용액에 0 ℃에서 n-부틸리튬 (1.46 mL, 2.34 mmol)을 가하였다. 혼합물을 0 ℃에서 20분 동안 교반한 다음, -78 ℃로 냉각시키고, 시클로펜타논을 가하였다. 혼합물을 -78 ℃에서 20분 동안 교반한 다음, THF (20 mL, 20 mL로 세척) 중 알데히드 (2) (0.5 g, 1.63 mmol)의 용액을 가하였다. 생성된 혼합물을 -78 ℃에서 1시간 동안 교반한 다음, NH4Cl 포화 수용액으로 켄칭하였다. 대부분의 용매를 제거한 다음, 잔사를 EtOAc로 추출하였다. 유기층을 H2O 및 염수로 세척하고, 무수 Na2SO4 상에서 건조시킨 다음, 여과하고 진공하에 농축시켰다. 잔사를 플래쉬 크로마토그래피 (실리카, 10:1 - 1:1 헥산:EtOAc)로 정제하여 화합물 (3)을 무색 오일 (482 mg, 80%)로서 수득하였다.
합성:
Figure 112007052373933-pct00127
CH2Cl2 (150 mL) 중 알콜 (3) (0.44 g, 1.13 mmol) 및 피리딘 (0.6 mL, 7.44 mmol)의 교반된 용액에 0 ℃에서 데스-마르틴 퍼요오디난 (0.6 g, 1.41 mmol)을 가하였다. 혼합물을 실온에서 밤새 교반하였다. 반응을 Na2S2O3-NaHCO3 포화 수용액 (1:1, 100 mL)으로 켄칭하고, CH2Cl2로 추출하였다. 유기층을 합하여 H2O 및 염수로 세척하고, 무수 Na2SO4 상에서 건조시킨 다음, 여과하고 진공하에 농축시켰다. 잔사를 플래쉬 크로마토그래피 (실리카, 20:1 - 2:1 헥산:EtOAc)로 정제하여 디케톤 (4) (342 mg, 78%)을 무색 오일로서 수득하였다. ESI-MS, m/z: 412 (M++ Na), 356, 312, 230, 212, 184, 146 (100).
합성:
Figure 112007052373933-pct00128
디옥산 (4 mL) 중 메틸 에스테르 (4) (330 mg, 0.85 mmol)의 용액에 0 ℃에서 LiOH (4 mL, 1 N)를 가하였다. 생성된 혼합물을 0 ℃에서 30분 동안 교반한 다음, 시트르산 수용액 (5%, 100 mL)으로 켄칭하였다. 혼합물을 EtOAc로 추출하였다. 유기층을 H2O 및 염수로 연속적으로 세척하고, 무수 Na2SO4 상에서 건조시킨 다음, 여과하고 농축시켜 백색 고체 (310 mg, 97%)를 수득하였다. ESI-MS, m/z: 342, 330 (M+ - COOH), 298, 230, 185, 119 (100).
합성:
Figure 112007052373933-pct00129
CH2Cl2 (4 mL) 중 산 (5) (310 mg, 0.83 mmol)의 용액에 0 ℃에서 트리플루오로아세트산 (4 mL)을 가하였다. 혼합물을 0 ℃에서 30분 동안 교반한 다음, 진공하에 농축시켰다. 잔사에 MeOH (1 mL) 및, 이어서 HCl (1 mL, 디옥산 중 4 N)을 가하였다. 에테르 (100 mL)를 가하여 생성물 (241 mg, 94%)을 백색 고체로서 침전시켰다. ESI-MS, m/z: 298 (M+ + Na), 276 (M+ + 1), 230 (M+ - COOH), 184, 119 (100).
실시예 52
이 실시예는 도 34에 도시된 디카르보닐-함유 아미노산의 합성을 상세히 설명한다.
합성:
Figure 112007052373933-pct00130
CH2Cl2 (400 mL) 중 알콜 (6.0 g, 19.4 mmol) 및 피리딘 (12 mL, 150 mmol)의 교반된 용액에 0 ℃에서 데스-마르틴 퍼요오디난 (14.2 g, 33.4 mmol)을 가하였다. 혼합물을 실온에서 밤새 교반하였다. 반응을 Na2S2O3-NaHCO3 포화 수용액 (1:1, 300 mL)으로 켄칭하고, CH2Cl2로 추출하였다. 유기층을 합하여 H2O 및 염수로 세척하고, 무수 Na2SO4 상에서 건조시킨 다음, 여과하고 진공하에 농축시켰다. 잔사를 플래쉬 크로마토그래피 (실리카, 1:100 - 1:1 헥산:EtOAc)로 정제하여 알데히드 (5.48 g, 92%)를 백색 고체로서 수득하였다.
합성:
Figure 112007052373933-pct00131
아세톤 (70 mL) 중 상기 알데히드 (3.41 g, 11.1 mmol)의 용액에 H2O (10 mL) 중 KMnO4 (2.5 g, 15.8 mmol)를 가하였다. 생성된 혼합물을 실온에서 밤새 교반하였다. 대부분의 용매를 제거한 후, 잔사를 시트르산 수용액 (5%, 300 mL)에 용해시키고, EtOAc로 추출하였다. 유기층을 합하여 H2O 및 염수로 세척하고, 무수 Na2SO4 상에서 건조시킨 다음, 여과하고 진공하에 농축시켜 생성물을 백색 고체 (2.83 g, 79%)로서 얻고, 이를 추가로 정제하지 않고 다음 단계에 직접 사용하였다.
합성:
Figure 112007052373933-pct00132
DMF (60 mL) 중 상기 산 (2.83 g, 8.76 mmol)의 용액에 0 ℃에서 l-아미노-2-프로판올 (1.4 mL, 17.9 mmol), l-(3-디메틸아미노프로필)-3-에틸카르보디이미드 히드로클로라이드 (EDC, 4.1 g, 21.4 mmol), 1-히드록시벤조트리아졸 수화물 (HOBt, 2.2 g, 18.5 mmol) 및 N, N-디이소프로필에틸아민 (DIEA, 9 mL, 51.6 mmol)을 가하였다. 혼합물을 실온에서 밤새 교반하고, 시트르산 수용액 (5%, 200 mL)으로 켄칭한 다음, EtOAc로 추출하였다. 유기층을 합하여 H2O 및 염수로 세척하고, 무수 Na2SO4 상에서 건조시킨 다음, 여과하고 진공하에 농축시켰다. 잔사를 플래쉬 크로마토그래피 (실리카, 10:1 - 1:1 헥산:EtOAc)로 정제하여 생성물 (2.45 g, 74%)을 백색 발포체로 수득하였다.
합성:
Figure 112007052373933-pct00133
CH2Cl2 (100 mL) 중 상기 알콜 (2.44 g, 6.4 mmol) 및 피리딘 (4 mL, 49.6 mmol)의 교반된 용액에 0 ℃에서 데스-마르틴 퍼요오디난 (4.1 g, 9.7 mmol)을 가하였다. 혼합물을 실온에서 밤새 교반하였다. 반응을 Na2S2O3-NaHCO3 포화수용액 (1:1, 300 mL)으로 켄칭하고 CH2Cl2로 추출하였다. 유기층을 H2O 및 염수로 세척하고, 무수 Na2SO4 상에서 건조시킨 다음, 여과하고 진공하에 농축시켰다. 잔사를 플래쉬 크로마토그래피 (실리카, 1:1 - 1:3 헥산:EtOAc)로 정제하여 생성물 (1.84 g, 76%)을 황색 고체로서 수득하였다.
합성:
Figure 112007052373933-pct00134
디옥산 (10 mL) 중 상기 메틸 에스테르 (1.72 g, 4.6 mmol)의 용액에 0 ℃에서 LiOH (10 mL, 1 N)를 가하였다. 혼합물을 같은 온도에서 3시간 동안 교반한 다음, 시트르산 수용액 (5%)으로 켄칭하였다. 혼합물을 EtOAc로 추출하였다. 유기층을 H2O 및 염수로 연속적으로 세척하고, 무수 Na2SO4 상에서 건조시킨 다음, 여과하고 농축시켜 생성물 (1.7 g)을 백색 고체로서 수득하고, 이를 정제하지 않고 다음 단계에 직접 사용하였다.
CH2Cl2 (15 mL) 중 상기 산 (1.7 g, 4.7 mmol)의 용액에 0 ℃에서 트리플루오로아세트산 (15 mL)을 가하였다. 혼합물을 같은 온도에서 2시간 동안 교반한 다음, 진공하에 농축시켰다. 잔사에 HCl (1.5 mL, 디옥산 중 4 N) 및, 이어서 에테르 (400 mL)를 가하였다. 침전된 생성물 (1.52 g, 두 단계 동안 90%)을 백색 고체로서 수거하였다.
실시예 53
이 실시예는 도 44에 도시된 히드라지드-함유 아미노산의 합성을 상세히 설명한다.
합성:
Figure 112007052373933-pct00135
EtOH (15 mL) 중 알데히드 (410 mg, 1.34 mmol)의 용액에 포름산 히드라지드 (170 mg, 2.83 mmol)를 가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 1시간 동안 교반하였다. 대부분의 용매를 제거한 후, 잔사를 CH2Cl2로 추출하였다. 유기층을 합하여 진공하에 농축시켰다. 잔사를 플래쉬 크로마토그래피 (실리카, 1:6 - 1:1 헥산:EtOAc)로 정제하여 백색 고체(390 mg, 83%)를 수득하였다.
합성:
Figure 112007052373933-pct00136
디옥산 (7 mL) 중 상기 메틸 에스테르 (349 mg, 1 mmol)의 용액에 0 ℃에서 LiOH (7 mL, 1 N)를 가하였다. 혼합물을 같은 온도에서 10분 동안 교반한 다음, 시트르산 (2.5 g)으로 켄칭하고 H2O로 희석하였다. 혼합물을 EtOAc로 추출하였다. 유기층을 H2O 및 염수로 연속적으로 세척하고, 무수 Na2SO4 상에서 건조시킨 다음, 여과하고 농축시켜 백색 고체 (290 mg, 87%)를 수득하였다.
합성:
Figure 112007052373933-pct00137
CH2Cl2 (20 mL) 중 상기 산 (290 mg, 0.87 mmol)의 용액에 0 ℃에서 트리플루오로아세트산 (20 mL)을 가하였다. 혼합물을 실온에서 20분 동안 교반하고 농축시켰다. 잔사에 MeOH (ImL) 및, 이어서 HCl (1.0 mL, 디옥산 중 4 N)을 가하였다. 이어서, 에테르 (200 mL)를 가하여 생성물 (195 mg, 83%)을 연황색 고체로서 수득하였다.
실시예 54
이 실시예는 도 45에 도시된 히드라지드-함유 아미노산의 합성을 상세히 설명한다.
합성:
Figure 112007052373933-pct00138
DMF (100 mL) 중 N-Boc-4-히드록시메틸 페닐알라닌 (11.73 g, 39.8 mmol)의 용액에 알라닌 메틸 에스테르 히드로클로라이드 (9.0 g, 64.5 mmol), l-(3-디메틸아미노프로필)-3-에틸카르보디이미드 히드로클로라이드 (EDC, 15.4 g, 80.3mmol), N,N-디이소프로필에틸아민 (DIEA, 30 mL, 172 mmol) 및 1-히드록시벤조트리아졸 수화물 (HOBt, 8.4 g, 70.6 mmol)을 가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 밤새 교반한 다음, EtOAc로 희석하였다. 유기층을 분리하여 H2O, 시트르산 (5%), H2O, NaHCO3, H2O 및 염수로 연속적으로 세척하고, 무수 Na2SO4 상에서 건조시킨 다음, 여과하고 농축시켜 보호된 디펩티드를 백색 고체 (13.74 g, 91%)로서 수득하였다.
합성:
Figure 112007052373933-pct00139
CH2Cl2 (300 mL) 중 상기 보호된 디펩티드 (10.33 g, 27.2 mmol)의 용액에 0 ℃에서 피리딘 (8 mL, 99.1 mmol) 및 데스-마르틴 퍼요오디난 (14 g, 33.0 mmol)을 가하였다. 반응 혼합물을 밤새 교반한 다음, NaHCO3/Na2S203 (1:1) 포화 수용액으로 켄칭하였다. 유기층을 H2O, 시트르산, H2O 및 염수로 연속적으로 세척하고, 무수 Na2SO4 상에서 건조시킨 다음, 여과하고 농축시켰다. 잔사를 플래쉬 크로마토그래피 (실리카, 9:1 - 1:1 헥산:EtOAc)로 정제하여 생성물 (10.12 g, 98%)을 백색 고체로서 수득하였다.
합성:
Figure 112007052373933-pct00140
EtOH (200 mL) 중 디펩티드 알데히드 (10.1 g, 26.7 mmol)의 용액에 아세트산 히드라지드 (3.7 g, 45 mmol)를 가하였다. 반응 혼합물을 같은 온도에서 30분 동안 교반한 다음, 농축시켰다. 잔사에 H2O (1 L) 및 CH2Cl2 (500 mL)를 가하였다. 유기층을 분리하고 농축시켜 백색 고체 (11.21 g, 97%)를 수득하였다.
합성:
Figure 112007052373933-pct00141
디옥산 (50 mL) 중 상기 메틸 에스테르 (11.1 g, 25.6 mmol)의 용액에 0 ℃에서 LiOH (50 mL, 1 N)를 가하였다. 혼합물을 같은 온도에서 30분 동안 교반한 다음, 시트르산 (20 g)으로 켄칭하고, H2O (200 mL)로 희석하였다. 혼합물을 EtOAc로 추출하였다. 유기층을 H2O 및 염수로 연속적으로 세척하고, 무수 Na2SO4 상에서 건조시킨 다음, 여과하고 농축시켜 백색 고체 (9.52 g, 88%)를 수득하였다.
합성:
Figure 112007052373933-pct00142
CH2Cl2 (50 mL) 중 상기 산 (9.5 g, 22.6 mmol)의 용액에 0 ℃에서 트리플루오로아세트산 (50 mL)을 가하였다. 혼합물을 0 ℃에서 1시간 동안 교반한 다음, 진공하에 농축시켰다. 잔사에 HCl (7 mL, 디옥산 중 4 N) 및, 이어서 에테르 (500 mL)를 가하였다. 침전물을 백색 고체 (7.25 g, 90%)로서 수거하였다.
실시예 55
이 실시예는 도 46A에 도시된 옥심-함유 아미노산의 합성을 상세히 설명한다.
합성:
Figure 112007052373933-pct00143
MeOH/H+ 중 알데히드 (3.0 g)의 용액에 2 당량의 히드록실아민 히드로클로라이드를 가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 2시간 동안 교반한 다음 농축시켰다. 잔사에 H2O (200 mL) 및, 이어서 CH2Cl2를 가하였다. 유기층을 분리하여 진공하에 농축시켰다. 잔사를 플래쉬 크로마토그래피 (실리카, 3:7 - 1:9 헥산:EtOAc)로 정제하여 생성물 (96%)을 고체로서 수득하였다.
합성:
Figure 112007052373933-pct00144
디옥산 (10 mL) 중 상기 메틸 에스테르 (3.0 g)의 용액에 0 ℃에서 LiOH (10 mL, 1 N)를 가하였다. 혼합물을 같은 온도에서 3시간 동안 교반한 다음, 시트르산 (5 g)을 가하여 켄칭하고 H2O로 희석하였다. 혼합물을 EtOAc로 추출하였다. 유기층을 H2O 및 염수로 연속적으로 세척하고, 무수 Na2SO4 상에서 건조시킨 다음, 여과하고 농축시켜 고체를 수득하였다. 이어서, CH2Cl2 (20 mL) 중 생성된 산의 용액에 0 ℃에서 트리플루오로아세트산 (20 mL)을 가하였다. 반응 혼합물을 0 ℃에서 1시간 동안 교반한 후 농축시켰다. 잔사에 MeOH (1 mL) 및, 이어서 HCl (2.0 mL, 디옥산 중 4 N)을 가하였다. 에테르 (200 mL)를 가하여 생성물 (87%)을 고체로서 침전시켰다.
실시예 56
이 실시예는 도 46B에 도시된 옥심-함유 아미노산의 합성을 상세히 설명한다.
합성:
Figure 112007052373933-pct00145
MeOH/H+ 중 알데히드 (3.0 g)의 용액에 2 당량의 메톡시아민 히드로클로라이드를 가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 2시간 동안 교반시킨 다음에 농축시켰다. 잔사에 H2O (200 mL) 및, 이어서 CH2Cl2를 가하였다. 유기층을 분리하여 진공하에 농축시켰다. 잔사를 플래쉬 크로마토그래피 (실리카, 3:7 - 1:9 헥산:EtOAc)로 정제하여 생성물 (93%)을 고체로서 수득하였다.
합성:
Figure 112007052373933-pct00146
디옥산 (10 mL) 중 상기 메틸 에스테르 (3.0 g)의 용액에 0 ℃에서 LiOH (10 mL, 1 N)를 가하였다. 혼합물을 같은 온도에서 3시간 동안 교반한 다음, 시트르산 (5 g)을 가하여 켄칭하고, H2O로 희석하였다. 혼합물을 EtOAc로 추출하였다. 유기층을 H2O 및 염수로 연속적으로 세척하고, 무수 Na2SO4 상에서 건조시킨 다음, 여과하고 농축시켜 고체를 수득하였다. 이어서, CH2Cl2 (20 mL) 중 생성된 산의 용액에 0 ℃에서 트리플루오로아세트산 (20 mL)을 가하였다. 반응 혼합물을 0 ℃에서 1시간 동안 교반하 다음 농축시켰다. 잔사에 MeOH (1 mL) 및, 이어서 HCl (2.0 mL, 디옥산 중 4 N)을 가하였다. 에테르 (200 mL)를 가하여 생성물 (89%)을 고체로서 수득하였다.
실시예 57
이 실시예는 도 46C에 도시된 히드라진-함유 아미노산의 합성을 상세히 설명한다.
합성:
Figure 112007052373933-pct00147
MeOHZH+ 중 알데히드 (3.0 g)의 용액에 2 당량의 메틸히드라진을 가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 2시간 동안 교반하고 농축시켰다. 잔사에 H2O (200 mL) 및, 이어서 CH2Cl2를 가하였다. 유기층을 분리하여 진공하에 농축시켰다. 잔사를 플래쉬 크로마토그래피 (실리카, 3:7 - 1:9 헥산:EtOAc)로 정제하여 생성물 (93%)을 고체로서 수득하였다.
합성:
Figure 112007052373933-pct00148
디옥산 (10 mL) 중 상기 메틸 에스테르 (3.0 g)의 용액에 0 ℃에서 LiOH (10 mL, 1 N)를 가하였다. 혼합물을 같은 온도에서 3시간 동안 교반한 다음, 시트르산 (5 g)을 가하여 켄칭하고, H2O로 희석하였다. 혼합물을 EtOAc로 추출하였다. 유기층을 H2O 및 염수로 연속적으로 세척하고, 무수 Na2SO4 상에서 건조시킨 다음, 여과하고 농축시켜 고체를 수득하였다. 이어서, CH2Cl2 (20 mL) 중 생성된 산의 용액에 0 ℃에서 트리플루오로아세트산 (20 mL)을 가하였다. 반응 혼합물을 0 ℃에서 1시간 동안 교반한 다음 농축시켰다. 잔사에 MeOH (1 mL) 및, 이어서 HCl (2.0 mL, 디옥산 중 4 N)을 가하였다. 에테르 (200 mL)를 가하여 생성물 (89%)을 고체로서 수득하였다.
실시예 58
이 실시예는 도 48A에 도시된 mPEG-히드록실아민의 합성을 상세히 설명한다.
합성:
Figure 112007052373933-pct00149
무수 CH2Cl2 (10 mL) 중 mPEG(30K)-OH (1.0 g, 0.033 mmol)의 용액에 p-니트로페놀 클로로포르메이트 (60 mg, 0.28 mmol)를 가하였다. 혼합물을 실온에서 15시간 동안 교반하였다. 에테르 (200 mL)를 가하였다. 침전물을 여과하고 에테르로 세척한 다음, 진공하에 건조시켜 생성물 (1.0 g, 100%)을 백색 분말로서 수득하였다.
합성:
Figure 112007052373933-pct00150
THF (60 mL) 중 t-부틸 3-히드록시에틸카르바메이트 (1.75 g, 10 mmol)의 용액에 N-히드록시프탈이미드 (3.2 g, 20 mmol), 트리페닐포스핀 (2.0 g, 15 mmol)을 가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 10분 동안 교반한 다음, 0 ℃로 냉각하였다. 디이소프로필아조디카르복실레이트 (DIAD, 2.0 mL, 10.5 mmol)를 시린지를 통해 1시간에 걸쳐 적가하였다. 빙욕을 제거하고 혼합물을 밤새 교반한 다음 농축시켰다. 백색 고체를 에틸 아세테이트 (100 mL)에 용해시켰다. 반응 혼합물을 중탄산나트륨 포화 수용액 (100 mL), H2O (100 mL) 및 염수 (100 mL)로 연속적으로 세척하고, 무수 MgSO4 상에서 건조시킨 다음, 여과하고 진공하에 농축시켰다. 조 생성물을 플래쉬 크로마토그래피 (실리카, 100:1 - 10:1 헥산:EtOAc)로 정제하여 표제 화합물 (2.6 g, 81 %)을 백색 고체로서 수득하였다.
합성:
Figure 112007052373933-pct00151
CH2Cl2 (5 mL) 중 Boc-보호된 링커 (2.0 g, 9.1 mmol)의 용액에 트리플루오로아세트산 (5 mL)을 가하였다. 생성된 혼합물을 실온에서 1시간 동안 교반하고 농축시켰다. 잔사에 HCl (디옥산 중 4 N, 1.5 mL) 및, 이어서 Et2O (150 mL)를 가하였다. 침점물을 여과하고, 에테르로 세척한 다음, 진공하에 건조시켜 아민 링커 (1.1 g, 85 %)를 백색 고체로서 수득하였다.
합성:
Figure 112007052373933-pct00152
DMF-CH2Cl2 (10 mL, 1 :2) 중 mPEG(30 K) p-니트로페놀카르보네이트 (1.0 g, 0.033 mmol) 및 아민 링커 (53 mg, 0.21 mmol)의 혼합물에 디이소프로필에틸아민 (50 μL, 0.28 mmol) 및 DMAP (5 mg, 0.041 mmol)를 가하였다. 생성된 혼합물을 실온에서 15시간 동안 교반하였다. 에테르 (200 mL)를 가하였다. 침점물을 여과한 다음, 에테르로 세척하고 진공하에 건조시켜 생성물 (0.83 g, 83%)을 백색 분말로서 수득하였다.
합성:
Figure 112007052373933-pct00153
MeOH (5 mL) 중 mPEG 프탈이미드 (30K, 0.8 g, 0.0266 mmol)의 용액에 히드라진 (8.5 μL, 0.27 mmol)을 가하였다. 생성된 혼합물을 45 ℃에서 1시간 동안 교반하였다. 반응을 실온으로 냉각시키고, CH2Cl2 (150 mL)를 가한 다음, 용액을 HCl 수용액 (0.1 N, 100 mL)으로 세척하였다. 수층을 CH2Cl2 (150 mL)로 추출하였다. 유기층을 합하여 H2O (100 mL)로 세척하고, 무수 Na2SO4 상에서 건조시킨 다음, 여과하고 농축시켰다. 잔사를 CH2Cl2 (5 mL)에 용해시켰다. 에테르 (200 mL)를 가하여 히드록실아민 생성물 (0.72 g, 90%)을 백색 분말로서 침전시켰다.
실시예 59
이 실시예는 도 48B에 도시된 mPEG-히드록실아민의 합성을 상세히 설명한다.
합성:
Figure 112007052373933-pct00154
무수 CH2Cl2 (10 mL) 중 mPEG(3 OK)-OH (1.0 g, 0.033 mmol)의 용액에 p-니트로페놀 클로로포르메이트 (60 mg, 0.28 mmol)를 가하였다. 혼합물을 실온에서 15시간 동안 교반하였다. 에테르 (200 mL)를 가하였다. 침전물을 여과하고, 에테르로 세척한 다음, 진공하에 건조시켜 생성물 (1.0 g, 100%)을 백색 분말로서 수득하였다.
합성:
Figure 112007052373933-pct00155
THF (60 mL) 중 t-부틸 2-히드록시에틸카르바메이트 (2.8 mL, 18 mmol)의 용액에 N-히드록시프탈이미드 (5.8 g, 36 mmol), 트리페닐포스핀 (3.6 g, 27 mmol)을 가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 10분 동안 교반한 다음, 0 ℃로 냉각시켰다. 디이소프로필아조 디카르복실레이트 (DIAD, 3.6 mL, 19 mmol)를 1시간에 걸쳐 시린지를 통하여 적가하였다. 빙욕을 제거하고, 혼합물을 밤새 교반한 다음, 농축시켰다. 백색 고체를 에틸 아세테이트 (100 mL)에 용해시켰다. 반응 혼합물을 중 탄산나트륨 포화 수용액 (2 X 50 mL), H2O (50 mL) 및 염수 (50 mL)로 연속적으로 세척하고, 무수 MgSO4 상에서 건조시킨 다음, 여과하고 진공하에 농축시켰다. 조 생성물을 호라이즌(HORIZON™) 크로마토그래피 시스템(Biotage Inc.)을 사용한 플래쉬 크로마토그래피로 정제하여 불순물과 함께 표제 화합물 (12 g, 206 %)을 백색 고체로서 수득하였다.
합성:
Figure 112007052373933-pct00156
CH2Cl2 (5 mL) 중 조질의 Boc-보호된 링커 (12 g)의 용액에 트리플루오로아세트산 (5 mL)을 가하였다. 생성된 혼합물을 실온에서 1시간 동안 교반하고 농축하였다. 잔사에 HCl (디옥산 중 4 N, 1.5 mL) 및, 이어서 Et2O (150 mL)를 가하였다. 침점물을 여과하고 에테르로 세척한 다음, 진공하에 건조시켜 아민 링커 (3.0 g, 두 단계 동안 68 %)를 백색 고체로서 수득하였다.
합성:
Figure 112007052373933-pct00157
DMF-CH2Cl2 (10 mL, 1:2) 중 mPEG(30 K) p-니트로페놀카르보네이트 (1.0 g, 0.033 mmol) 및 아민 링커 (50 mg, 0.21 mmol)의 혼합물에 디이소프로필에틸아민 (50 μL, 0.28 mmol) 및 4-디메틸아미노피리딘 (4 mg, 0.033 mmol)을 가하였다. 생성된 혼합물을 실온에서 15시간 동안 교반하였다. 에테르 (200 mL)를 가하였다. 침전물을 여과하고, 에테르로 세척한 다음, 진공하에 건조시켜 생성물 (0.81 g, 81 %)을 백색 분말로서 수득하였다.
합성:
Figure 112007052373933-pct00158
MeOH (5 mL) 중 mPEG(30K) 프탈이미드 (0.8 g, 0.0266 mmol)의 용액에 히드라진 (8.5 μL, 0.27 mmol)을 가하였다. 생성된 혼합물을 45 ℃에서 1시간 동안 교반하였다. 반응을 실온으로 냉각시킨 후에 CH2Cl2 (150 mL)를 가하고, 용액을 HCl 수용액 (0.1 N, 100 mL)으로 세척하였다. 수층을 CH2Cl2 (150 mL)로 추출하였다. 유기층을 합하여 H2O (100 mL)로 세척하고, 무수 Na2SO4 상에서 건조시킨 다음, 여과하고 농축시켰다. 잔사를 CH2Cl2 (5 mL)에 용해시켰다. 에테르 (200 mL)를 가하여 히드록실아민 생성물 (0.68 g, 85%)을 백색 분말로서 침전시켰다.
실시예 60
이 실시예는 도 49 A에 도시된 mPEG-히드록실아민의 합성을 상세히 설명한다.
합성:
Figure 112007052373933-pct00159
DMF (50 mL) 중 N-(3-브로모프로필)프탈이미드 (4.0 g, 15.0 mmol)의 용액에 0 ℃에서 K2CO3 (10 g, 73 mmol) 및 t-부틸 N-히드록시카르바메이트 (2.5 g, 18.8 mmol)를 가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 3시간 동안 교반하였다. 혼합물을 H2O (200 mL)로 희석한 다음, EtOAc (200 mL)로 추출하였다. 유기층을 H2O 및 염수로 세척하고, 무수 Na2SO4 상에서 건조시킨 다음 여과하고 진공하에 농축시켰다. 잔사를 플래쉬 크로마토그래피 (실리카, 20:1 - 3:1 헥산:EtOAc)로 정제하여 생성물 (3.5 g, 72%)을 무색 오일로서 수득하였다.
합성:
Figure 112007052373933-pct00160
EtOH (10 mL) 중 상기 프탈이미드 (500 mg, 1.6 mmol)의 용액에 히드라진 (0.25 mL, 8.0 mmol)을 가하였다. 생성된 혼합물을 실온에서 3시간 동안 교반하였다. 침전물을 제거한 후, 여액을 농축시켰다. 잔사를 고 진공하에 밤새 두었다. 잔사를 플래쉬 크로마토그래피 (실리카, 3:1 - 1:1 EtOAc:MeOH)로 정제하여 아민 링커 (252 mg, 85%)를 백색 고체로서 수득하였다.
합성:
Figure 112007052373933-pct00161
무수 CH2Cl2 (10 mL) 중 mPEG(30K)-OH (1.0 g, 0.033 mmol)의 용액에 p-니 트로페놀 클로로포르메이트 (60 mg, 0.28 mmol)를 가하였다. 혼합물을 실온에서 15시간 동안 교반하였다. 에테르 (200 mL)를 가하였다. 침전물을 여과하고 에테르로 세척한 다음, 진공하에 건조시켜 생성물 (1.0 g, 100%)을 백색 고체로서 수득하였다.
합성:
Figure 112007052373933-pct00162
무수 CH2Cl2 (30 mL) 중 상기 활성화된 mPEG(30K) (3.0 g, 0.1 mmol)의 용액에 디이소프로필에틸아민 (88 μL, 0.5 mmol) 및 아민 링커 (76 mg, 0.4 mmol)를 가하였다. 생성된 혼합물을 실온에서 15시간 동안 교반하였다. 에테르 (700 mL)를 반응 혼합물에 가하였다. 침전물을 여과하고, 에테르로 세척한 다음 진공하에 건조시켜 백색 분말 (2.8 g, 93%)을 수득하였다.
합성:
Figure 112007052373933-pct00163
무수 CH2Cl2 (10 mL) 중 Boc 보호된 mPEG(30 K) (2.0 g, 0.067 mmol)의 용액에 0 ℃에서 트리플루오로아세트산 (10 mL)을 가하였다. 생성된 혼합물을 실온에서 5시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물에 에테르 (500 mL)를 가하였다. 침전물을 여과하여 에테르로 세척한 다음, 진공하에 건조시켜 백색 분말 (1.8 g, 90%)을 수득하였다.
실시예 61
이 실시예는 도 49B에 도시된 mPEG-히드록실아민의 합성을 상세히 설명한다.
합성:
Figure 112007052373933-pct00164
DMF (30 mL) 중 t-부틸 N-히드록시카르바메이트 (5.0 g, 37.6 mmol)의 용액에 0 ℃에서 K2CO3 (12 g, 87.6 mmol) 및 N-(2-브로모에틸)프탈이미드(10.0 g, 39.7 mmol)를 가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 3 시간 동안 교반하였다. 혼합물을 H2O (200 mL)로 희석하고, EtOAc (200 mL)로 추출하였다. 유기층을 H2O 및 염수로 세척하고 무수 Na2SO4 상에서 건조시킨 다음, 여과하고 진공하에 농축시켰다. 잔사를 플래쉬 크로마토그래피 (실리카, 20:1 - 1:1 헥산:EtOAc)로 정제하여 생성물 (5.2 g, 55%)을 백색 고체로서 수득하였다.
합성:
Figure 112007052373933-pct00165
EtOH (10 mL) 중 상기 프탈이미드 (500 mg, 1.6 mmol)의 용액에 히드라진 (0.25 mL, 8.0 mmol)을 가하였다. 생성된 혼합물을 실온에서 3시간 동안 교반하였다. 침전물을 제거한 후 여액을 농축시켰다. 잔사를 고진공하에 밤새 두었다. 잔사를 플래쉬 크로마토그래피 (실리카, 3:1 - 1:1 EtOAc:MeOH)로 정제하여 아민 링커 (301 mg, 86%)를 백색 고체로서 수득하였다.
합성:
Figure 112007052373933-pct00166
무수 CH2Cl2 (10 mL) 중 상기 활성화된 mPEG(30K) (1.0 g, 0.033 mmol)의 용액에 디이소프로필에틸아민 (58 μL, 0.33 mmol), 4-디메틸아미노피리딘 (4 mg, 0.033 mmol) 및 상기 아민 링커 (64 mg, 0.31 mmol)를 가하였다. 생성된 혼합물을 실온에서 15시간 동안 교반하였다. 에테르 (200 mL)를 반응 혼합물에 가하였다. 침전물을 여과하고 에테르로 세척한 다음 진공하에 건조시켜 백색 분말 (0.85 g, 85%)을 수득하였다.
합성:
Figure 112007052373933-pct00167
무수 CH2Cl2 (10 mL) 중 Boc 보호된 mPEG(30K) (0.85 g, 0.028 mmol)의 용액에 0 ℃에서 트리플루오로아세트산 (10 mL)을 가하였다. 생성된 혼합물을 실온에서 5시간 동안 교반하였다. 에테르 (200 mL)를 반응 혼합물에 가하였다. 침전물을 여과하고 에테르로 세척한 다음, 진공하에 건조시켜 백색 분말 (0.68 g, 80%)을 수득하였다.
실시예 62
이 실시예는 도 5OA에 도시된 mPEG-히드록실아민의 합성을 상세히 설명한다.
합성:
Figure 112007052373933-pct00168
피리딘 (50 mL) 중 모노-Boc 프탈이미드 (2.1 g, 6.9 mmol)의 용액에 0 ℃에서 Boc2O (3.3 g, 15.1 mmol)를 가하였다. 생성된 혼합물을 밤새 60 ℃로 가열하였다. 용매를 진공하에 제거하고, 잔사를 EtOAc (200 mL)로 희석한 다음 시트르산 (5%, 200 mL), 물 (200 mL) 및 염수 (200 mL)로 세척하고 무수 Na2SO4 상에서 건조시킨 다음, 여과하고 진공하에 농축시켰다. 잔사를 플래쉬 크로마토그래피 (실리카, 20:1 - 3:1 헥산:EtOAc)로 정제하여 생성물 (2.37 g, 85%)을 황색 오일로서 수득하였다.
합성:
Figure 112007052373933-pct00169
MeOH (15 mL) 중 디-Boc 프탈이미드 (1.21 g, 2.98 mmol)의 용액에 0 ℃에서 MeOH 중 암모니아 (15 mL, 7 N, 105 mmol)를 가하였다. 생성된 혼합물을 실온에서 밤새 교반하였다. 침전물을 여과해내고, 여액을 진공하에 농축시켰다. 잔사를 플래쉬 크로마토그래피 (실리카, 10:1 - 6:4 EtOAc:MeOH)로 정제하여 아민 링커 (0.61 g, 74%)를 백색 고체로서 수득하였다.
합성:
Figure 112007052373933-pct00170
무수 CH2Cl2 (10 mL) 중 mPEG(3 OK)-OH (1.0 g, 0.033 mmol)의 용액에 p-니트로페놀 클로로포르메이트 (60 mg, 0.28 mmol)를 가하였다. 혼합물을 실온에서 15시간 동안 교반하였다. 에테르 (200 mL)를 가하여 mPEG(30K) 생성물을 침전시켰다. 생성물을 여과하고 에테르로 세척한 다음, 진공하에 건조시켰다 (1.0 g, 100%).
합성:
Figure 112007052373933-pct00171
무수 CH2Cl2 (10 mL) 중 상기 활성화된 mPEG(30K) (1.0 g, 0.033 mmol)의 용액에 디이소프로필에틸아민 (58 μL, 0.33 mmol), 4-디메틸아미노피리딘 (5 mg, 0.041 mmol) 및 상기 디-Boc 아민 링커 (90 mg, 0.33 mmol)를 가하였다. 생성된 혼합물을 실온에서 15시간 동안 교반하였다. 에테르 (200 mL)를 반응 혼합물에 가하였다. 침전물을 여과하고 에테르로 세척한 다음, 진공하에 건조시켜 백색 분말 (0.82 g, 82%)을 수득하였다.
합성:
Figure 112007052373933-pct00172
무수 CH2Cl2 (8 mL) 중 Boc 보호된 mPEG(30K) (0.82 g, 0.027 mmol)의 용액에 0 ℃에서 트리플루오로아세트산 (8 mL)을 가하였다. 생성된 혼합물을 실온에서 5시간 동안 교반하였다. 에테르 (200 mL)를 반응 혼합물에 가하였다. 침전물을 여과하고 에테르로 세척한 다음, 진공하에 건조시켜 백색 분말 (0.57 g, 70%)을 수득하였다.
실시예 63
이 실시예는 도 50B에 도시된 mPEG-히드록실아민의 합성을 상세히 설명한다.
합성:
Figure 112007052373933-pct00173
피리딘 중 모노-Boc 프탈이미드 (1.5 g, 4.7 mmol)의 용액에 0 ℃에서 Boc2O (2.2 g, 10.0 mmol)를 가하였다. 생성된 혼합물을 60 ℃로 밤새 가열하였다. 용매를 진공하에 제거하여 잔사를 EtOAc (200 mL)로 희석하고, 시트르산 (5%, 200 mL), 물 (200 mL) 및 염수 (200 mL)로 세척하고, 무수 Na2SO4 상에서 건조시킨 다음, 여과하고 진공하에 농축시켰다. 잔사를 플래쉬 크로마토그래피 (실리카, 20: 1 - 3:1 헥산:EtOAc)로 정제하여 생성물 ( 1.6 g, 81 %)을 오일로서 수득하였다.
합성:
Figure 112007052373933-pct00174
MeOH (15 mL) 중 디-Boc 프탈이미드 (1.5 g, 3.6 mmol)의 용액에 0 ℃에서 MeOH 중 암모니아 (15 mL, 7 N, 105 mmol)를 가하였다. 생성된 혼합물을 실온에서 밤새 교반하였다. 침전물을 여과하여 제거하고, 여액을 진공하에 농축시켰다. 잔사를 플래쉬 크로마토그래피 (실리카, 10:1 - 6:4 EtOAc:MeOH)로 정제하여 아민 링커 (0.85 g, 82%)를 백색 고체로서 수득하였다.
합성:
Figure 112007052373933-pct00175
무수 CH2Cl2 (10 mL) 중 mPEG(30K)-OH (1.0 g, 0.033 mmol)의 용액에 p-니트로페놀 클로로포르메이트 (60 mg, 0.28 mmol)를 가하였다. 혼합물을 실온에서 15시간 동안 교반하였다. 에테르 (200 mL)를 가하였다. 침전물을 여과하고, 에테르로 세척한 다음, 진공하에 건조시켜 생성물 (1.0 g, 100%)을 백색 분말로서 수득하였다.
합성:
Figure 112007052373933-pct00176
무수 CH2Cl2 (10 mL) 중 상기 활성화된 mPEG(30K) (1.0 g, 0.033 mmol)의 용액에 디이소프로필에틸아민 (58 μL, 0.33 mmol), 4-디메틸아미노피리딘 (5 mg, 0.041mmol) 및 상기 디-Boc 아민 링커 (100 mg, 0.34 mmol)를 가하였다. 생성된 혼합물을 실온에서 15시간 동안 교반하였다. 에테르 (200 mL)를 반응 혼합물에 가하였다. 침전물을 여과하고 에테르로 세척한 다음, 진공하에 건조시켜 백색 분말 (0.89 g, 89%)을 수득하였다.
합성:
Figure 112007052373933-pct00177
무수 CH2Cl2 (8 mL) 중 Boc 보호된 mPEG(30K) (0.89 g, 0.030 mmol)의 용액에 0 ℃에서 트리플루오로아세트산 (8 mL)을 가하였다. 생성된 혼합물을 실온에서 5시간 동안 교반하였다. 에테르 (200 mL)를 반응 혼합물에 가하였다. 침전물을 여과하고 에테르로 세척한 다음, 진공하에 건조시켜 백색 분말 (0.65 g, 73%)을 수득하였다.
실시예 64
이 실시예는 도 51A에 도시된 mPEG-히드록실아민의 합성을 상세히 설명한다.
합성:
Figure 112007052373933-pct00178
MeOH (10 mL) 중 mPEG(30K) 프로피온알데히드 (0.5 g, 0.0166 mmol) 및 아민 링커 (73 mg, 0.25 mmol)의 혼합물에 NaCNBH3 (20 mg, 0.30 mmol)를 가하였다. 생성된 혼합물을 실온에서 48시간 동안 교반하였다. 대부분의 용매를 제거한 후, 에테르 (200 mL)를 가하였다. 침전물을 여과하고 에테르로 세척한 다음, 진공하에 건조시켜 백색 분말 (0.43 g, 86%)을 수득하였다.
합성:
Figure 112007052373933-pct00179
무수 CH2Cl2 (4 mL) 중 디-Boc 보호된 mPEG(30K) (0.42 g, 0.014 mmol)의 용액에 0 ℃에서 트리플루오로아세트산 (4 mL)을 가하였다. 생성된 혼합물을 실온에서 8시간 동안 교반하였다. 에테르 (100 mL)를 반응 혼합물에 가하였다. 침전물을 여과하고 에테르로 세척한 다음, 진공하에 건조시켜 백색 분말 (0.35 g, 83%)을 수득하였다.
실시예 65
이 실시예는 도 51B에 도시된 mPEG-히드록실아민의 합성을 상세히 설명한다.
합성:
Figure 112007052373933-pct00180
CH2Cl2 (60 mL) 중 mPEG(30K) (6.0 g, 0.2 mmol) 및 피리딘 (0.1 mL, 1.2 mmol)의 교반된 용액에 0 ℃에서 데스-마르틴 퍼요오디난 (0.2 g, 0.47 mmol)을 가하였다. 혼합물을 실온에서 밤새 교반하였다. 반응을 Na2S2O3-NaHCO3 포화 수용액 (1:1, 100 mL)으로 켄칭하고, CH2Cl2 (500 mL x 2)로 추출하였다. 유기층을 합하여 H2O 및 염수로 세척하고, 무수 Na2SO4 상에서 건조시킨 다음, 여과하고 진공하에 농축시켰다. 잔사를 CH2Cl2 (50 mL)에 용해시켰다. 에테르 (1 L)를 용액에 가하였다. 침전물을 여과하고 에테르로 세척한 다음, 진공하에 건조시켜 백색 분말 (4.9 g, 82%)을 수득하였다.
합성:
Figure 112007052373933-pct00181
MeOH (10 mL) 중 mPEG(30K) 알데히드 (0.5 g, 0.0166 mmol) 및 아민 링커 (73 mg, 0.25 mmol)의 혼합물에 NaCNBH3 (20 mg, 0.30 mmol)를 가하였다. 생성된 혼합물을 실온에서 48시간 동안 교반하였다. 대부분의 용매를 제거한 후, 에테르 (200 mL)를 가하였다. 침전물을 여과하고 에테르로 세척한 다음, 진공하에 건조시켜 백색 분말 (0.43 g, 85%)을 수득하였다.
합성:
Figure 112007052373933-pct00182
무수 CH2Cl2 (4 mL) 중 디-Boc 보호된 mPEG(30K) (0.42 g, 0.014 mmol)의 용액에 0 ℃에서 트리플루오로아세트산 (4 mL)을 가하였다. 생성된 혼합물을 실온에서 8시간 동안 교반하였다. 에테르 (100 mL)를 반응 혼합물에 가하였다. 침전물을 여과하고 에테르로 세척한 다음, 진공하에 건조시켜 백색 분말 (0.35 g, 83%)을 수득하였다.
실시예 66
이 실시예는 도 52A에 도시된 mPEG-히드록실아민의 합성을 상세히 설명한다.
합성:
Figure 112007052373933-pct00183
DMF (60 mL) 중 mPEG(3 OK)-NH2 (6.0 g, 0.2 mmol)의 용액에 Boc-Ser-OH (205 mg, 1.0 mmol), l-에틸l-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드 히드로클로라이드 (EDC, 190 mg, 1.0 mmol) 및 N,N'-디이소프로필에틸아민 (0.17 mL, 1.0 mmol)을 가하였다. 혼합물을 실온에서 10시간 동안 교반한 다음, EtOAc (500 mL)로 희석하였다. 생성된 혼합물을 NaHCO3 포화 수용액 (300 mL), H2O (300 mL) 및 염수 (300 mL)로 연속적으로 세척하고, 무수 Na2SO4 상에서 건조시킨 다음, 여과하고 진공하에 농축시켰다. 잔사를 CH2Cl2 (50 mL)에 용해시켰다. 에테르 (700 mL)를 가하였다. 침전물을 여과하고 에테르로 세척한 다음, 진공하에 건조시켜 백색 분말 (5.1 g, 82%)을 수득하였다.
합성:
Figure 112007052373933-pct00184
CH2Cl2 (15 mL) 중 상기 mPEG(30K) (3.0 g, 0.1 mmol)의 용액에 0 ℃에서 트리플루오로아세트산 (15 mL)을 가하였다. 생성된 혼합물을 실온에서 3시간 동안 교반한 다음 농축시켰다. 잔사에 CH2Cl2 (5 mL) 및, 이어서 HCl (디옥산 중 4 N , 2 mL)을 가하였다. 에테르 (400 mL)를 가하여 디히드록실아민 (2.6 g, 85%)을 백색 고체로서 수득하였다.
합성:
Figure 112007052373933-pct00185
H2O-CH3CN (1:1, 20 mL) 중 상기 mPEG(30K) (2.0 g, 0.067 mmol)의 용액에 NaIO4 (15 mg, 0.07 mmol)를 가하였다. 혼합물을 실온에서 4시간 동안 교반한 다음 CH2Cl2 (500 mL)로 희석하였다. 생성된 혼합물을 H2O (100 mL) 및 염수 (100 mL)로 세척하고, 무수 Na2SO4 상에서 건조시킨 다음, 여과하고 진공하에 농축시켰다. 잔사를 CH2Cl2 (50 mL)에 용해시켰다. 에테르 (700 mL)를 가하였다. 침전물을 여과하고 에테르로 세척한 다음, 진공하에 건조시켜 백색 분말 (1.8 g, 90%)을 수득하였다.
합성:
Figure 112007052373933-pct00186
MeOH (10 mL) 중 mPEG(30K) 알데히드 (0.5 g, 0.0166 mmol) 및 아민 링커 (73 mg, 0.25 mmol)의 혼합물에 NaCNBH3 (20 mg, 0.30 mmol)를 가하였다. 생성된 혼합물을 실온에서 48시간 동안 교반하였다. 대부분의 용매를 제거한 다음, 에테르 (200 mL)를 가하였다. 침전물을 여과하고 에테르로 세척한 다음, 진공하에 건조시켜 백색 분말 (0.43 g, 86%)을 수득하였다.
합성:
Figure 112007052373933-pct00187
무수 CH2Cl2 (4 mL) 중 디-Boc 보호된 mPEG(30K) (0.42 g, 0.014 mmol)의 용액에 0 ℃에서 트리플루오로아세트산 (4 mL)을 가하였다. 생성된 혼합물을 실온에서 8시간 동안 교반하였다. 에테르 (100 mL)를 반응 혼합물에 가하였다. 침전물을 여과하고 에테르로 세척한 다음, 진공하에 건조시켜 백색 분말 (0.35 g, 83%)을 수득하였다.
실시예 67
이 실시예는 도 52B에 도시된 mPEG-히드록실아민의 합성을 상세히 설명한다.
합성:
Figure 112007052373933-pct00188
MeOH (10 mL) 중 mPEG 프로피온알데히드 (30 K, 0.5 g, 0.0166 mmol) 및 아민 링커 (70 mg, 0.25 mmol)의 혼합물에 NaCNBH3 (20 mg, 0.30 mmol)를 가하였다. 생성된 혼합물을 실온에서 48시간 동안 교반하였다. 대부분의 용매를 제거한 다음, 에테르 (200 mL)를 가하였다. 침전물을 여과하고 에테르로 세척한 다음, 진공하에 건조시켜 백색 분말 (0.40 g, 80%)을 수득하였다.
합성:
Figure 112007052373933-pct00189
무수 CH2Cl2 (4 mL) 중 디-Boc 보호된 mPEG(30K) (0.40 g, 0.013 mmol)의 용액에 0 ℃에서 트리플루오로아세트산 (4 mL)을 가하였다. 생성된 혼합물을 실온에서 8시간 동안 교반하였다. 에테르 (100 mL)를 반응 혼합물에 가하였다. 침전물을 여과하고 에테르로 세척한 다음, 진공하에 건조시켜 백색 분말 (0.35 g, 87%)을 수득하였다.
실시예 68
이 실시예는 도 53A에 도시된 mPEG-히드록실아민의 합성을 상세히 설명한다.
합성:
Figure 112007052373933-pct00190
CH2Cl2 (60 mL) 중 mPEG(30K) (6.0 g, 0.2 mmol) 및 피리딘 (0.1 mL, 1.2 mmol)의 교반된 용액에 0 ℃에서 데스-마르틴 퍼요오디난 (0.2 g, 0.47 mmol)을 가하였다. 혼합물을 실온에서 밤새 교반하였다. 반응을 Na2S2O3-NaHCO3 포화 수용액 (1:1, 100 mL)으로 켄칭하고, CH2Cl2 (500 mL x 2)로 추출하였다. 유기층을 합하여 H2O 및 염수로 세척하고, 무수 Na2SO4 상에서 건조시킨 다음, 여과하고 진공하에 농축시켰다. 잔사를 CH2Cl2 (50 mL)에 용해시켰다. 에테르 (1 L)를 용액에 가하였다. 침전물을 여과하여 에테르로 세척한 다음, 진공하에 건조시켜 백색 분말 (4.9 g, 82%)을 수득하였다.
합성:
Figure 112007052373933-pct00191
MeOH (10 mL) 중 mPEG(30K) 알데히드 (0.5 g, 0.0166 mmol) 및 아민 링커 (70 mg, 0.25 mmol)의 혼합물에 NaCNBH3 (20 mg, 0.30 mmol)를 가하였다. 생성된 혼합물을 실온에서 48시간 동안 교반하였다. 대부분의 용매를 제거한 후, 에테르 (200 mL)를 가하였다. 침전물을 여과하고 에테르로 세척한 다음, 진공하에 건조시켜 백색 분말 (0.40 g, 80%)을 수득하였다.
합성:
Figure 112007052373933-pct00192
무수 CH2Cl2 (4 mL) 중 디-Boc 보호된 mPEG(30K) (0.40 g, 0.013 mmol)의 용액에 0 ℃에서 트리플루오로아세트산 (4 mL)을 가하였다. 생성된 혼합물을 실온에서 8시간 동안 교반하였다. 에테르 (100 mL)를 반응 혼합물에 가하였다. 침전물을 여과하고 에테르로 세척한 다음, 진공하에 건조시켜 백색 분말 (0.35 g, 87%)을 수득하였다.
실시예 69
이 실시예는 도 53B에 도시된 mPEG-히드록실아민의 합성을 상세히 설명한다.
합성:
Figure 112007052373933-pct00193
DMF (60 mL) 중 mPEG(30K)-NH2 (6.0 g, 0.2 mmol)의 용액에 Boc-Ser-OH (205 mg, 1.0 mmol), l-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드 히드로클로라이드 (EDC, 190 mg, 1.0 mmol) 및 N,N'-디이소프로필에틸아민 (0.17 mL, 1.0 mmol)을 가하였다. 혼합물을 실온에서 10시간 동안 교반하고, EtOAc (500 mL)로 세척하였다. 생성된 혼합물을 NaHCO3 포화 수용액 (300 mL), H2O (300 mL) 및 염수 (300 mL)로 연속적으로 세척하고, 무수 Na2SO4 상에서 건조시킨 다음, 여과하고 진공하에 농축시켰다. 잔사를 CH2Cl2 (50 mL)에 용해시켰다. 에테르 (700 mL)를 가하였다. 침전물을 여과하고 에테르로 세척한 다음, 진공하에 건조시켜 백색 분말 (5.1 g, 82%)을 수득하였다.
합성:
Figure 112007052373933-pct00194
CH2Cl2 (15 mL) 중 상기 mPEG(30K) (3.0 g, 0.1 mmol)의 용액에 0 ℃에서 트리플루오로아세트산 (15 mL)을 가하였다. 생성된 혼합물을 실온에서 3시간 동안 교반하고 농축시켰다. 잔사에 CH2Cl2 (5 mL) 및, 이어서 HCl (디옥산 중 4 N, 2 mL)을 가하였다. 에테르 (400 mL)를 가하여 디히드록실아민 (2.6 g, 85%)을 백색 고체로서 수득하였다.
합성:
Figure 112007052373933-pct00195
H2O-CH3CN (1:1, 20 mL) 중 상기 mPEG(30K) (2.0 g, 0.067 mmol)의 용액에 NaIO4 (15 mg, 0.07 mmol)를 가하였다. 혼합물을 실온에서 4시간 동안 교반하고, CH2Cl2 (500 mL)로 세척하였다. 생성된 혼합물을 H2O (100 mL) 및 염수 (100 mL)로 세척하고, 무수 Na2SO4 상에서 건조시킨 다음, 여과하고 진공하에 농축시켰다. 잔사를 CH2Cl2 (50 mL)에 용해시켰다. 에테르 (700 mL)를 가하였다. 침전물을 여과하고 에테르로 세척한 후 진공하에 건조시켜 백색 분말 (1.8 g, 90%)을 수득하였다.
합성:
Figure 112007052373933-pct00196
MeOH (10 mL) 중 mPEG(30K) 알데히드 (0.5 g, 0.0166 mmol) 및 아민 링커 (70 mg, 0.25 mmol)의 혼합물에 NaCNBH3 (20 mg, 0.30 mmol)를 가하였다. 생성된 혼합물을 실온에서 48시간 동안 교반하였다. 대부분의 용매를 제거한 후 에테르 (200 mL)를 가하였다. 침전물을 여과하고 에테르로 세척한 다음, 진공하에 건조시켜 백색 분말 (0.40 g, 80%)을 수득하였다.
합성:
Figure 112007052373933-pct00197
무수 CH2Cl2 (4 mL) 중 디-Boc 보호된 mPEG(30K) (0.40 g, 0.013 mmol)의 용액에 0 ℃에서 트리플루오로아세트산 (4 mL)을 가하였다. 생성된 혼합물을 실온에서 8시간 동안 교반하였다. 에테르 (100 mL)를 반응 혼합물에 가하였다. 침전물을 여과하고 에테르로 세척한 다음, 진공하에 건조시켜 백색 분말 (0.35 g, 87%)을 수득하였다.
실시예 70
이 실시예는 도 54A에 도시된 mPEG-히드록실아민의 합성을 상세히 설명한다.
합성:
Figure 112007052373933-pct00198
MeOH (10 mL) 중 mPEG(30K) 프로피온알데히드 (0.5 g, 0.0166 mmol) 및 아민 링커 (40 mg, 0.16 mmol)의 용액에 NaCNBH3 (12 mg, 0.17 mmol)를 가하였다. 생성된 혼합물을 실온에서 60시간 동안 교반하였다. 대부분의 용매를 제거한 후, 잔사를 CH2Cl2 (200 mL)에 용해시킨 다음, 시트르산 (5%, 100 mL)으로 세척하였다. 유기층을 무수 Na2SO4 상에서 건조시킨 다음, 여과하고 진공하에 농축시켜 백색 고체 (0.42 g, 84%)를 수득하였다.
합성:
Figure 112007052373933-pct00199
MeOH (4 mL) 중 mPEG(30K) 프탈이미드 (0.4 g, 0.013mmol)의 혼합물에 H2NNH2 (4.2 μL, 0.13 mmol)를 가하였다. 혼합물을 45 ℃에서 1 시간 동안 교반하고 농축시켰다. 잔사를 CH2Cl2 (100 mL)에 용해시키고, HCl (0.1 N, 100 mL)로 세척하였다. 수층을 CH2Cl2 (100 mL)로 추출하였다. 유기층을 합하여 H2O로 세척하고, 무수 Na2SO4 상에서 건조시킨 다음 여과하고 농축시켰다. 잔사를 CH2Cl2 (5 mL)에 용해시켰다. 에테르 (200 mL)를 가하여 히드록실아민 생성물 (0.34 g, 85%)을 백색 분말로서 수득하였다.
실시예 71
이 실시예는 도 54B에 도시된 mPEG-히드록실아민의 합성을 상세히 설명한다.
합성:
Figure 112007052373933-pct00200
CH2Cl2 (60 mL) 중 mPEG(30K) (6.0 g, 0.2 mmol) 및 피리딘 (0.1 mL, 1.2 mmol)의 교반된 용액에 0 ℃에서 데스-마르틴 퍼요오디난 (0.2 g, 0.47 mmol)을 가하였다. 혼합물을 실온에서 밤새 교반하였다. 반응을 Na2S2O3-NaHCO3 포화 수용액(1:1, 100 mL)으로 켄칭한 다음, CH2Cl2 (500 mL x 2)로 추출하였다. 유기층을 합하여 H2O 및 염수로 세척하고, 무수 Na2SO4 상에서 건조시킨 다음, 여과하고 진공하에 농축시켰다. 잔사를 CH2Cl2 (50 mL)에 용해시켰다. 에테르 (1 L)를 용액에 가하였다. 침전물을 여과하고 에테르로 세척한 다음, 진공하에 건조시켜 백색 분말 (4.9g, 82 %)을 수득하였다.
합성:
Figure 112007052373933-pct00201
MeOH (10 mL) 중 mPEG(30K) 알데히드 (0.5 g, 0.0166 mmol) 및 아민 링커 (40 mg, 0.16 mmol)의 혼합물에 NaCNBH3 (12 mg, 0.17 mmol)를 가하였다. 생성된 혼합물을 실온에서 60시간 동안 교반하였다. 대부분의 용매를 제거한 후. 잔사를 CH2Cl2 (200 mL)에 용해시키고, 시트르산 (5%, 100 mL)으로 세척하였다. 유기층을 무수 Na2SO4 상에서 건조시킨 다음, 여과하고 진공하에 농축시켜 백색 고체 (0.42 g, 84%)를 수득하였다.
합성:
Figure 112007052373933-pct00202
MeOH (4 mL) 중 mPEG(30K) 프탈이미드 (0.4 g, O.O13 mmol)의 혼합물에 H2NNH2 (4.2 μL, 0.13 mmol)를 가하였다. 혼합물을 45 ℃에서 1시간 동안 교반하고 농축시켰다. 잔사를 CH2Cl2 (100 mL)에 용해시키고, HCl (0.1 N, 100 mL)로 세척하였다. 수층을 CH2Cl2 (100 mL)로 추출하였다. 유기층을 합하여 H2O로 세척하고, 무수 Na2SO4 상에서 건조시킨 다음, 여과하고 농축시켰다. 잔사를 CH2Cl2 (5 mL)에 용해시켰다. 에테르 (200 mL)를 가하여 히드록실아민 생성물 (0.34 g, 85%)을 백색 분말로서 수득하였다.
실시예 72
이 실시예는 도 55에 도시된 mPEG-히드록실아민의 합성을 상세히 설명한다.
합성:
Figure 112007052373933-pct00203
DMF (60 mL) 중 mPEG(3 OK)-NH2 (6.0 g, 0.2 mmol)의 용액에 Boc-Ser-OH (205 mg , 1.0 mmol), l-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카로보디이미드 히드로클로라이드 (EDC, 190 mg, 1.0 mmol) 및 N,N'-디이소프로필에틸아민 (0.17 mL, 1.0 mmol)을 가하였다. 혼합물을 실온에서 10시간 동안 교반하고, EtOAc (500 mL)로 추출하였다. 생성된 혼합물을 NaHCO3 포화 수용액 (300 mL), H2O (300 mL) 및 염수 (300 mL)로 연속적으로 세척하고, 무수 Na2SO4 상에서 건조시킨 다음, 여과하고 진공하에 농축시켰다. 잔사를 CH2Cl2 (50 mL)에 용해시켰다. 에테르 (700 mL)를 가하였다. 침전물을 여과하고 에테르로 세척한 다음 진공하에 건조시켜 백색 분말 (5.1 g, 82%)을 수득하였다.
합성:
Figure 112007052373933-pct00204
CH2Cl2 (15 mL) 중 상기 mPEG(30K) (3.0 g, 0.1 mmol)의 용액에 0 ℃에서 트리플루오로아세트산 (15 mL)을 가하였다. 생성된 혼합물을 실온에서 3시간 동안 교반하고 농축시켰다. 잔사에 CH2Cl2 (5 mL) 및, 이어서 HCl (디옥산 중 4 N, 2 mL)을 가하였다. 에테르 (400 mL)를 가하여 디히드록실아민 (2.6 g, 85%)을 백색 고체로서 수득하였다.
합성:
Figure 112007052373933-pct00205
H2O-CH3CN (1:1, 20 mL) 중 상기 mPEG(30K) (2.0 g, 0.067 mmol)의 용액에 NaIO4 (15 mg, 0.07 mmol)를 가하였다. 혼합물을 실온에서 4시간 동안 교반하고 CH2Cl2 (500 mL)로 희석하였다. 생성된 혼합물을 H2O (100 mL) 및 염수 (100 mL)로 세척하고, 무수 Na2SO4 상에서 건조시킨 다음, 여과하고 진공하에 농축시켰다. 잔사를 CH2Cl2 (50 mL)에 용해시켰다. 에테르 (700 mL)를 가하였다. 침전물을 여과하고 에테르로 세척한 다음, 진공하에 건조시켜 백색 분말 (1.8 g, 90%)을 수득하였다.
합성:
Figure 112007052373933-pct00206
MeOH (10 mL) 중 mPEG(30K) 알데히드 (0.5 g, 0.0166 mmol) 및 아민 링커 (40 mg, 0.16 mmol)의 혼합물에 NaCNBH3 (12 mg, 0.17 mmol)를 가하였다. 생성된 혼합물을 실온에서 60시간 동안 교반하였다. 대부분의 용매를 제거한 후, 잔사를 CH2Cl2 (200 mL)에 용해시키고 시트르산 (5%, 100 mL)으로 세척하였다. 유기층을 무수 Na2SO4 상에서 건조시킨 다음, 여과하고 진공하에 농축시켜 백색 고체 (0.42 g, 84%)를 수득하였다.
합성:
Figure 112007052373933-pct00207
MeOH (4 mL) 중 mPEG(30K) 프탈이미드 (0.4 g, 0.013mmol)의 혼합물에 H2NNH2 (4.2 μL, 0.13 mmol)를 가하였다. 혼합물을 45 ℃에서 1시간 동안 교반하고 농축시켰다. 잔사를 CH2Cl2 (100 mL)에 용해시키고, HCl (0.1 N, 100 mL)로 세척하였다. 수층을 CH2Cl2 (100 mL)로 추출하였다. 유기층을 합하여 H2O로 세척하고 무수 Na2SO4 상에서 건조시킨 다음, 여과하고 농축시켰다. 잔사를 CH2Cl2 (5 mL)에 용해시켰다. 에테르 (200 mL)를 가하여 히드록실아민 생성물 (0.34 g, 85%)을 백색 분말로서 침전시켰다.
실시예 73
이 실시예는 도 56A에 도시된 mPEG-히드록실아민의 합성을 상세히 설명한다.
합성:
Figure 112007052373933-pct00208
MeOH (10 mL) 중 mPEG(30K) 프로피온알데히드 (0.5 g, 0.0166 mmol) 및 아민 링커 (40 mg, 0.16 mmol)의 혼합물에 NaCNBH3 (12 mg, 0.17 mmol)를 가하였다. 생성된 혼합물을 실온에서 60시간 동안 교반하였다. 대부분의 용매를 제거한 다음, 잔사를 CH2Cl2 (200 mL)에 용해시키고 시트르산 (5%, 100 mL)으로 세척하였다. 유기층을 무수 Na2SO4 상에서 건조시킨 다음, 여과하고 진공하에 농축시켜 백색 고체 (0.41 g, 82%)를 수득하였다.
합성:
Figure 112007052373933-pct00209
MeOH (4 mL) 중 mPEG(30K) 프탈이미드 (0.4 g, 0.013mmol)의 혼합물에 H2NNH2 (4.2 μL, 0.13 mmol)를 가하였다. 혼합물을 45 ℃에서 1시간 동안 교반하고 농축시켰다. 잔사를 CH2Cl2 (100 mL)에 용해시키고 HCl (0.1 N, 100 mL)로 세척하였다. 수층을 CH2Cl2 (100 mL)로 추출하였다. 유기층을 합하여 H2O로 세척하고 무수 Na2SO4 상에서 건조시킨 다음, 여과하고 농축시켰다. 잔사를 CH2Cl2 (5 mL)에 용해시켰다. 에테르 (200 mL)를 가하여 히드록실아민 생성물 (0.34 g, 83%)을 백색 분말로서 수득하였다.
실시예 74
이 실시예는 도 56B에 도시된 mPEG-히드록실아민의 합성을 상세히 설명한다.
합성:
Figure 112007052373933-pct00210
CH2Cl2 (60 mL) 중 mPEG(30K) (6.0 g, 0.2 mmol) 및 피리딘 (0.1 mL, 1.2 mmol)의 교반된 용액에 0 ℃에서 데스-마르틴 퍼요오디난 (0.2 g, 0.47 mmol)을 가하였다. 혼합물을 실온에서 밤새 교반하였다. 반응을 Na2S2O3-NaHCO3 포화 수용액 (1:1, 100 mL)으로 켄칭하고, CH2Cl2 (500 mL x 2)로 추출하였다. 유기층을 합하여 H2O 및 염수로 세척하고, 무수 Na2SO4 상에서 건조시킨 다음, 여과하고 진공하에 농축시켰다. 잔사를 CH2Cl2 (50 mL)에 용해시켰다. 에테르 (1 L)를 용액에 가하였다. 침전물을 여과하고 에테르로 세척한 다음, 진공하에 건조시켜 백색 분말 (4.9 g, 82%)을 수득하였다.
합성:
Figure 112007052373933-pct00211
MeOH (10 mL) 중 mPEG(30K) 알데히드 (0.5 g, 0.0166 mmol) 및 아민 링커 (40 mg, 0.16 mmol)의 혼합물에 NaCNBH3 (12 mg, 0.17 mmol)를 가하였다. 생성된 혼합물을 실온에서 60시간 동안 교반하였다. 대부분의 용매를 제거한 후, 잔사를 CH2Cl2 (200 mL)에 용해시키고, 시트르산 (5%, 100 mL)으로 세척하였다. 유기층을 무수 Na2SO4 상에서 건조시킨 다음, 여과하고 진공하에 농축시켜 백색 고체 (0.41 g, 82%)를 수득하였다.
합성:
Figure 112007052373933-pct00212
MeOH (4 mL) 중 mPEG(30K) 프탈이미드 (0.4 g, 0.013 mmol)의 혼합물에 H2NNH2 (4.2 μL, 0.13 mmol)를 가하였다. 혼합물을 45 ℃에서 1시간 동안 교반시키고 농축시켰다. 잔사를 CH2Cl2 (100 mL)에 용해시키고, HCl (0.1 N, 100 mL)로 세척하였다. 수층을 CH2Cl2 (100 mL)로 추출하였다. 유기층을 합하여 H2O로 세척하고, 무수 Na2SO4 상에서 건조시킨 다음, 여과하고 진공하에 농축시켰다. 잔사를 CH2Cl2 (5 mL)에 용해시켰다. 에테르 (200 mL)를 가하여 히드록실아민 생성물 (0.34 g, 83%)을 백색 분말로서 수득하였다.
실시예 75
이 실시예는 도 57에 도시된 mPEG-히드록실아민의 합성을 상세히 설명한다.
합성:
Figure 112007052373933-pct00213
DMF (60 mL) 중 mPEG(30K)-NH2 (6.0 g, 0.2 mmol)의 용액에 Boc-Ser-OH (205 mg, 1.0 mmol), l-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드 히드로클로라이드 (EDC, 190 mg, 1.0 mmol) 및 N,N'-디이소프로필에틸아민(0.17 mL, 1.0 mmol)을 가하였다. 혼합물을 실온에서 10시간 동안 교반하고, EtOAc (500 mL)로 세척하였다. 생성된 혼합물을 NaHCO3 포화 수용액 (300 mL), H2O (300 mL) 및 염수 (300 mL)로 연속적으로 세척하고, 무수 Na2SO4 상에서 건조시킨 다음, 여과하고 진공하에 농축시켰다. 잔사를 CH2Cl2 (50 mL)에 용해시켰다. 에테르 (700 mL)에 가하였다. 침전물을 여과하고, 에테르로 세척한 다음, 진공하에 건조시켜 백색 분말 (5.1 g, 82%)을 수득하였다.
합성:
Figure 112007052373933-pct00214
CH2Cl2 (15 mL) 중 상기 mPEG(30K) (3.0 g, 0.1 mmol)의 용액에 0 ℃에서 트리플루오로아세트산 (15 mL)을 가하였다. 생성된 혼합물을 실온에서 3시간 동안 교반하고 농축시켰다. 잔사에 CH2Cl2 (5 mL) 및, 이어서 HCl (디옥산 중 4 N, 2 mL)을 가하였다. 에테르 (400 mL)를 가하여 디히드록실아민 (2.6 g, 85%)을 백색 고체로서 침전시켰다.
합성:
Figure 112007052373933-pct00215
H2O-CH3CN (1:1, 20 mL) 중 상기 mPEG(30K) (2.0 g, 0.067 mmol)의 용액에 NaIO4 (15 mg, 0.07 mmol)를 가하였다. 혼합물을 실온에서 4.0시간 동안 교반하고, CH2Cl2 (500 mL)로 희석하였다. 생성된 혼합물을 H2O (100 mL) 및 염수 (100 mL)로 세척하고, 무수 Na2SO4 상에서 건조시킨 다음, 여과하고 진공하에 농축시켰다. 잔사를 CH2Cl2 (50 mL)에 용해시켰다. 에테르 (700 mL)를 가하였다. 침전물을 여과하고 에테르로 세척한 다음, 진공하에 농축시켜 백색 분말 (1.8 g, 90%)을 수득하였다.
합성:
Figure 112007052373933-pct00216
MeOH (10 mL) 중 mPEG(30K) 알데히드 (0.5 g, 0.0166 mmol) 및 아민 링커 (40 mg, 0.16 mmol)의 혼합물에 NaCNBH3 (12 mg, 0.17 mmol)를 가하였다. 생성된 혼합물을 실온에서 60시간 동안 교반하였다. 대부분의 용매를 제거한 후, 잔사를 CH2Cl2 (200 mL)에 용해시키고 시트르산 (5%, 100 mL)으로 세척하였다. 유기층을 무수 Na2SO4 상에서 건조시킨 다음, 여과하고 진공하에 농축시켜 백색 고체 (0.41 g, 82%)를 수득하였다.
합성:
Figure 112007052373933-pct00217
MeOH (4 mL) 중 mPEG(30K) 프탈이미드 (0.4 g, 0.013mmol)의 혼합물에 H2NNH2 (4.2 μL, 0.13 mmol)를 가하였다. 혼합물을 45 ℃에서 1시간 동안 교반하고 농축시켰다. 잔사를 CH2Cl2 (100 mL)에 용해시키고, HCl (0.1 N, 100 mL)로 세척하였다. 수층을 CH2Cl2 (100 mL)로 추출하였다. 유기층을 합하여 H2O로 세척하고, 무수 Na2SO4 상에서 건조시킨 다음, 여과하고 농축시켰다. 잔사를 CH2Cl2 (5 mL)에 용해시켰다. 에테르 (200 mL)를 가하여 히드록실아민 생성물 (0.34 g, 83%)을 백색 분말로서 수득하였다.
실시예 76
이 실시예는 도 58A에 도시된 mPEG-히드록실아민의 합성을 상세히 설명한다.
합성:
Figure 112007052373933-pct00218
CH2Cl2 (40 mL) 중 mPEG(5K)-OH (1.0 g, 0.2 mmol)의 용액에 트리에틸아민 (110 μL, 0.79 mmol) 및 MsCl (50 μL, 0.64 mmol)을 가하였다. 혼합물을 실온에서 10시간 동안 교반한 다음 농축시켰다. 조 생성물 (1.0 g)을 정제하지 않고 다음 단계에 직접 사용하였다.
합성:
Figure 112007052373933-pct00219
CH2Cl2 (10 mL) 중 조 mPEG(5K)-OMs (1.0 g, 0.2 mmol)의 용액에 t-부틸-N-히드록시카르바메이트 (0.3 g, 2.2 mmol) 및 트리에틸아민 (0.4 mL, 2.9 mmol)을 가하였다. 생성된 혼합물을 45 ℃에서 10시간 동안 교반하고 실온으로 냉각시켰다. 에테르 (200 mL)를 가하였다. 침전물을 여과하고 세척한 다음, 진공하에 건조시켜 생성물 (0.42, 42%)을 백색 고체로서 수득하였다.
합성:
Figure 112007052373933-pct00220
CH2Cl2 (3 mL) 중 mPEG(5K)-ONHBoc (0.2 g, 0.04 mmol)의 용액에 0 ℃에서 트리플루오로아세트산 (7 mL)을 가하였다. 생성된 혼합물을 실온에서 1시간 동안 교반한 다음 농축시켰다. 잔사에 CH2Cl2 (5 mL) 및, 이어서 HCl (디옥산 중 4 N, 2 mL)을 가하였다. 에테르 (300 mL)를 가하여 PEG 디히드록실아민 유도체 (170 mg, 85%)를 백색 고체로서 침전시켰다.
실시예 77
이 실시예는 도 58B에 도시된 mPEG-히드록실아민의 합성을 상세히 설명한다.
합성:
Figure 112007052373933-pct00221
CH2Cl2 (30 mL) 중 mPEG(3 OK)-OH (3.0 g, 0.1 mmol)의 용액에 2,6-루티딘 (60 μL, 0.5 mmol) 및 Tf2O (65 μL, 0.4 mmol)를 가하였다. 혼합물을 실온에서 10시간 동안 교반하였다. 에테르 (400 mL)를 혼합물에 가하였다. 침전물을 여과하고 에테르로 세척한 다음, 진공하에 건조시켜 백색 분말 (2.7 g, 90%)을 수득하였다.
합성:
Figure 112007052373933-pct00222
CH2Cl2 (25 mL) 중 mPEG(30K)-OTf (2.5 g, 0.083 mmol)의 용액에 t-부틸 N- 히드록시카르바메이트 (HOmg, 0.84 mmol) 및 디이소프로필에틸아민 (0.2 mL, 1,1 mmol)을 가하였다. 혼합물을 실온에서 밤새 교반하였다. 에테르 (200 mL)를 가하여 생성물 (2.2 g, 88%)을 백색 분말로서 침전시켰다.
합성:
Figure 112007052373933-pct00223
CH2Cl2 (15 mL) 중 상기 mPEG(30K)-ONHBoc (2.0 g, 0.067 mmol)의 용액에 0 ℃에서 트리플루오로아세트산 (15 mL)을 가하였다. 생성된 혼합물을 실온에서 3시간 동안 교반하고 농축시켰다. 잔사에 CH2Cl2 (5 mL) 및, 이어서 HCl (디옥산 중 4 N, 2 mL)을 가하였다. 에테르 (300 mL)를 가하여 PEG 디히드록실아민 유도체 (1.72 g, 86%)를 백색 고체로서 수득하였다.
실시예 78
이 실시예는 도 59A에 도시된 mPEG-히드록실아민의 합성을 상세히 설명한다.
합성:
Figure 112007052373933-pct00224
CH2Cl2 (20 mL) 중 2-(2-히드록시에톡시)프탈이미드 (0.5 g, 2.4 mmol)의 용액에 포스겐 (톨루엔 중 20%, 8.0 mL, 15.0 mmol)을 가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 10시간 동안 교반하고 진공하에 농축시켰다. 잔사 (0.45 g, 70%)를 정제하지 않고 다음 단계에 직접 사용하였다.
합성:
Figure 112007052373933-pct00225
CH2Cl2 (30 mL) 중 mPEG(3 OK)-NH2 (3 g, O.l mmol) 및 클로로포르메이트 링커 (0.27 g, 1.0 mmol)의 혼합물에 디이소프로필에틸아민 (0.2 mL, 1.1 mmol)을 가하였다. 생성된 혼합물을 실온에서 15시간 동안 교반하였다. 에테르 (500 mL)를 혼합물에 가하였다. 침전물을 여과하고 세척한 다음, 진공하에 건조시켜 생성물 (2.7 g, 90%)을 백색 고체로서 수득하였다.
합성:
Figure 112007052373933-pct00226
MeOH (15 mL) 중 mPEG(30K) 프탈이미드 (2.1 g, 0.07 mmol)의 용액에 암모니아 (메탄올 중 7 N, 15 mL)를 가하였다. 생성된 혼합물을 실온에서 15시간 동안 교반하고 농축시켰다. 잔사에 CH2Cl2 (5 mL) 및, 이어서 HCl (디옥산 중 4 N, 1 mL)를 가하였다. 에테르 (300 mL)를 가하여 생성물 (2.4 g, 89%)을 백색 고체로서 침전시켰다.
실시예 79
이 실시예는 도 59B에 도시된 mPEG-히드록실아민의 합성을 상세히 설명한다.
합성:
Figure 112007052373933-pct00227
CH2Cl2 (80 mL) 중 (Boc-아미노옥시)아세트산 (3.0 g, 16 mmol)의 용액에 N-N'-디이소프로필카르보디이미드 (DIC, 1.3 mL, 8 mmol)를 가하였다. 혼합물을 실온에서 1시간 동안 교반하고 진공하에 농축시켰다. 조 생성물 (4.9 g, 84%)을 정제하지 않고 다음 단계에 직접 사용하였다.
합성:
Figure 112007052373933-pct00228
DMF (20 mL) 중 무수물 (7.3 g, 20 mmol)의 용액에 mPEG(5K)-NH2 (20 g, 4 mmol)를 가하였다. 혼합물을 실온에서 10시간 동안 교반한 다음, H2O (200 mL)로 희석하였다. 혼합물을 CH2Cl2 (500 mL)로 추출하였다. 유기층을 H2O 및 염수 (100 mL)로 세척하고, 무수 Na2SO4 상에서 건조시킨 다음, 여과하고 진공하에 농축시켰다. 잔사에 CH2Cl2 (10 mL) 및, 이어서 에테르 (500 mL)를 가하였다. 침전물을 여과하고 에테르로 세척한 다음, 진공하에 건조시켜 생성물 (19.8 g. 99%)을 백색 분말로서 수득하였다.
합성:
Figure 112007052373933-pct00229
CH2Cl2 (5 mL) 중 Boc-보호된 mPEG(5K) (1.0 g, 0.2 mmol)의 용액에 트리플루오로아세트산 (5 mL)을 가하였다. 생성된 혼합물을 실온에서 1시간 동안 교반하고 농축시켰다. 잔사에 CH2Cl2 (2 mL) 및, 이어서 HCl (디옥산 중 4 N, 0.1 mL) 및 에테르 (40 mL)를 가하였다. 침전물을 여과하고 에테르로 세척한 후 진공하에 건조시켜 생성물 (0.75 g, 75%)을 수득하였다.
실시예 80
이 실시예는 도 6OA에 도시된 mPEG-히드록실아민의 합성을 상세히 설명한다.
합성:
Figure 112007052373933-pct00230
CH2Cl2 (50 mL) 중 mPEG(3 OK)-OH (4.5 g, 0.15 mmol)의 용액에 포스겐 (톨루엔 중 20%, 1.6 mL, 3.0 mmol)을 가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 10시간 동안 교반한 다음 진공하에 농축시켰다. 잔사 (4.2 g, 93%)를 정제하지 않고 다음 단계에 직접 사용하였다.
합성:
Figure 112007052373933-pct00231
DMF-CH2Cl2 (10 mL, 1:2) 중 상기 활성화된 mPEG(30 K) II (4.2 g, 0.14 mmol) 및 아민 링커 VIII (67 mg, 0.28 mmol)의 혼합물에 디이소프로필에틸아민 (75 μL, 0.42 mmol)을 가하였다. 생성된 혼합물을 실온에서 15시간 동안 교반한 후, 에테르 (200 mL)를 가하였다. 침전물을 여과하고 에테르로 세척한 다음, 진공하에 건조시켜 생성물 (3.8 g, 90%)을 백색 분말로서 수득하였다.
합성:
Figure 112007052373933-pct00232
MeOH (15 mL) 중 mPEG(30K) 프탈이미드 III (3.5 g, 0.12 mmol)의 용액에 암모니아 (메탄올 중 7 N, 15 mL)를 가하였다. 생성된 혼합물을 실온에서 15시간 동안 교반하고 농축시켰다. 잔사에 CH2Cl2 (5 mL) 및, 이어서 HCl (디옥산 중 4 N, 1 mL)을 가하였다. 에테르 (300 mL)를 가하여 생성물 (3.0 g, 86%)을 백색 고체로서 수득하였다.
합성:
Figure 112007052373933-pct00233
THF (60 mL) 중 t-부틸 2-히드록시에틸카르바메이트 (2.8 mL, 18 mmol)의 용액에 N-히드록시프탈이미드 (5.8 g, 36 mmol), 트리페닐포스핀 (3.6 g, 27 mmol)을 가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 10분 동안 교반시킨 다음, 0 ℃로 냉각시켰다. 디이소프로필아조디카르복실레이트 (DIAD, 3.6 mL, 19 mmol)를 1시간에 걸쳐 시린지를 통하여 적가하였다. 빙욕을 제거하고 혼합물을 밤새 교반한 다음 농축시켰다. 백색 고체를 에틸 아세테이트 (100 mL)에 용해시켰다. 반응 혼합물을 중탄산나트륨 포화 수용액 (2 X 50 mL), 탈이온수 (50 mL) 및 염수 (50 mL)로 연속적으로 세척하고, 무수 MgSO4 상에서 건조시킨 다음, 여과하고 진공하에 농축시켰다. 조 생성물을 호라이즌(HORIZON™) 크로마토그래피 시스템(Biotage Inc.)을 사용한 플래쉬 크로마토그래피로 정제하여 불순물이 있는 표제 화합물 (12 g, 206 %)을 백색 고체로서 수득하였다.
합성:
Figure 112007052373933-pct00234
CH2Cl2 (5 mL) 중 조질의 Boc-보호된 링커 (12 g)의 용액에 트리플루오로아세트산 (5 mL)을 가하였다. 생성된 혼합물을 실온에서 1시간 동안 교반한 다음 농축시켰다. 잔사에 HCl (디옥산 중 4 N, 1.5 mL) 및, 이어서 Et2O (150 mL)를 가하였다. 침전물을 여과하고 에테르로 세척한 다음, 진공하에 건조시켜 아민 링커 (3.0 g, 두 단계 동안 68 %)를 백색 고체로서 수득하였다.
실시예 81
이 실시예는 도 6OB에 도시된 mPEG-히드록실아민의 합성을 상세히 설명한다.
합성:
Figure 112007052373933-pct00235
CH2Cl2-THF (2:3, 45 mL) 중 mPEG(5K)-0H (10 g, 2.0 mmol), Ph3P (790 mg, 3.0 mmol) 및 N-히드록시프탈이미드 (0.49 g, 3.0 mmol)의 용액에 0 ℃에서 디이소프로필 아조디카르복실레이트 (DIAD, 409 μL, 2.0 mmol)를 가하였다. 혼합물을 실온에서 15시간 동안 교반한 후, 에테르 (1 L)를 혼합물에 가하였다. 침전물을 여과하고 에테르로 세척한 다음, 진공하에 건조시켜 mPEG(5K)-프탈이미드 (9.8 g, 98%)를 백색 분말로서 수득하였다.
합성:
Figure 112007052373933-pct00236
MeOH (25 mL) 중 mPEG(5K) 프탈이미드 (3 g, 0.6 mmol)의 용액에 암모니아 (메탄올 중 7 N, 25 mL)를 가하였다. 생성된 혼합물을 실온에서 15시간 동안 교반한 다음 농축시켰다. 잔사에 CH2Cl2 (5 mL) 및, 이어서 HCl (디옥산 중 4 N, 1 mL)을 가하였다. 에테르 (300 mL)를 가하여 히드록실아민 (2.5 g, 83%)을 백색 고체로서 수득하였다.
합성:
Figure 112007052373933-pct00237
CH2Cl2-THF (2:3, 45 mL) 중 mPEG(3 OK)-OH (6 g, 0.2 mmol), Ph3P (80 mg, 0.3 mmol) 및 N-히드록시프탈이미드 (49 mg, 0.3 mmol)의 용액에 0 ℃에서 디이소프로필 아조디카르복실레이트 (DIAD, 41 μL, 0.2 mmol)를 가하였다. 혼합물을 실온에서 15시간 동안 교반하였다. 에테르 (200 mL)를 혼합물에 가하였다. 침전물을 에테르로 세척하고 진공하에 건조시켜 mPEG(30K)-프탈이미드 생성물 (5.8 g, 96%)을 백색 분말로서 수득하였다.
합성:
Figure 112007052373933-pct00238
MeOH (20 mL) 중 mPEG(30K) 프탈이미드 (3 g, 0.1 mmol)의 용액에 암모니아 (메탄올 중 7 N, 20 mL)를 가하였다. 생성된 혼합물을 실온에서 15시간 동안 교반하고 농축시켰다. 잔사에 CH2Cl2 (5 mL) 및, 이어서 HCl (디옥산 중 4 N, 1 mL)을 가하였다. 에테르 (300 mL)를 가하여 mPEG(30K)-ONH2 (2.6 g, 87%)를 백색 고체로서 침전시켰다.
실시예 82
이 실시예는 도 61A에 도시된 mPEG-히드록실아민의 합성을 상세히 설명한다.
합성:
Figure 112007052373933-pct00239
DMF (100 mL) 중 2-(2-(2-아미노에톡시)에톡시)에탄아민 (5.0 g, 33.8 mmol)의 용액에 (Boc-아미노옥시)아세트산 (14.2 g, 74.2 mmol), l-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드 히드로클로라이드 (EDC, 28.5 g, 0.15 mol) 및 N,N'-디이소프로필에틸아민 (26 mL, 0.15 mol)을 가하였다. 혼합물을 실온에서 10시간 동안 교반하고, EtOAc (500 mL)로 희석하였다. 생성된 혼합물을 NaHCO3 포화 수용액 (300 mL), H2O (300 mL) 및 염수 (300 mL)로 연속적으로 세척하고, 무수 Na2SO4 상에서 건조시킨 다음, 여과하고 진공하에 농축시켰다. 조 생성물(14.2 g, 85%)을 정제하지 않고 다음 단계에 직접 사용하였다.
합성:
Figure 112007052373933-pct00240
CH2Cl2 (15 mL) 중 상기 디-Boc 링커 (3.0 g, 6.1 mmol)의 용액에 0 ℃에서 트리플루오로아세트산 (15 mL)을 가하였다. 생성된 혼합물을 실온에서 3시간 동안 교반하고 농축시켰다. 잔사에 CH2Cl2 (5 mL) 및, 이어서 HCl (디옥산 중 4 N, 2 mL)을 가하였다. 에테르 (400 mL)를 가하여 디히드록실아민 (1.47 g, 82%)을 백색 고체로서 수득하였다.
실시예 83
이 실시예는 도 61B에 도시된 mPEG-히드록실아민의 합성을 상세히 설명한다.
합성:
Figure 112007052373933-pct00241
THF (100 mL) 중 트리(에틸렌 글리콜) (1.5 g, 10 mmol)의 용액에 0 ℃에서 Ph3P (8.0 g, 30 mmol) 및 N-히드록시프탈이미드 (4.9 g, 30 mmol)를 가하였다. 혼합물에 디이소프로필 아조디카르복실레이트 (DIAD, 4.08 mL, 20 mmol)를 서서히 가하였다. 생성된 혼합물을 0 ℃에서 4시간 및 실온에서 2일 동안 교반하였다. 에테르 (25 mL)를 반응 혼합물에 가하였다. 침전물을 에테르로 세척하고 진공하에 건조시켜 디-프탈이미드 생성물 (3.72 g, 82%)을 백색 분말로서 수득하였다.
합성:
Figure 112007052373933-pct00242
MeOH (20 mL) 중 디프탈이미드 (2.2 g, 5.0 mmol)의 용액에 암모니아 (메탄올 중 7 N, 20 mL)를 가하였다. 생성된 혼합물을 실온에서 15시간 동안 교반하고 농축시켰다. 잔사에 CH2Cl2 (5 mL) 및, 이어서 HCl (디옥산 중 4 N, 1 mL)을 가하였다. 에테르 (300 mL)를 가하여 트리(에틸렌 글리콜) 디히드록실아민 링커 (1.1 g, 87%)를 백색 고체로서 침전시켰다.
실시예 84
이 실시예는 도 61C에 도시된 mPEG-히드록실아민의 합성을 상세히 설명한다.
합성:
Figure 112007052373933-pct00243
THF (100 mL) 중 테트라(에틸렌 글리콜) (1.94 g, 10 mmol)의 용액에 0 ℃에서 Ph3P (8.0 g, 30 mmol) 및 N-히드록시프탈이미드 (4.9 g, 30 mmol)를 가하였다. 혼합물에 디이소프로필 아조디카르복실레이트 (DIAD, 4.08 mL, 20 mmol)를 서서히 가하였다. 생성된 혼합물을 0 ℃에서 4시간 및 실온에서 2일 동안 교반하였다. 에테르 (25 mL)를 반응 혼합물에 가하였다. 침전물을 에테르로 세척하고 진공하에 건조시켜 디-프탈이미드 생성물 (3.58 g, 74%)을 백색 분말로서 수득하였다.
합성:
Figure 112007052373933-pct00244
MeOH (20 mL) 중 디프탈이미드 (2.42 g, 5.0 mmol)의 용액에 암모니아 (메탄올 중 7 N, 20 mL)를 가하였다. 생성된 혼합물을 실온에서 15시간 동안 교반하고 농축시켰다. 잔사에 CH2Cl2 (5 mL) 및, 이어서 HCl (디옥산 중 4 N, 1 mL)을 가하였다. 에테르 (300 mL)를 가하여 테트라(에틸렌 글리콜) 디히드록실아민 링커 (1.27 g, 85%)를 백색 고체로서 수득하였다.
실시예 85
이 실시예는 도 62A에 도시된 mPEG-히드록실아민의 합성을 상세히 설명한다.
합성:
Figure 112007052373933-pct00245
THF (100 mL) 중 헥사(에틸렌 글리콜) (2.82 g, 10 mmol)의 용액에 0 ℃에서 Ph3P (8.0 g, 30 mmol) 및 N-히드록시프탈이미드 (4.9 g, 30 mmol)를 가하였다. 혼합물에 디이소프로필 아조디카르복실레이트 (DIAD, 4.08 mL, 20 mmol)를 서서히 가하였다. 생성된 혼합물을 0 ℃에서 4시간 동안 및 실온에서 2일 동안 교반하였다. 에테르 (25 mL)를 반응 혼합물에 가하였다. 침전물을 에테르로 세척하고 진공하에 건조시켜 디-프탈이미드 생성물 (4.40 g, 77%)을 백색 분말로서 수득하였다.
합성:
Figure 112007052373933-pct00246
MeOH (20 mL) 중 디프탈이미드 (2.86 g, 5.0 mmol)의 용액에 암모니아 (메탄올 중 7 N, 20 mL)를 가하였다. 생성된 혼합물을 실온에서 15시간 동안 교반하고 농축시켰다. 잔사에 CH2Cl2 (5 mL) 및, 이어서 HCl (디옥산 중 4 N, 1 mL)을 가하였다. 에테르 (300 mL)를 가하여 헥사(에틸렌 글리콜) 디히드록실아민 링커 (1.68 g, 87%)를 백색 고체로서 수득하였다.
실시예 86
이 실시예는 도 62B에 도시된 mPEG 화합물의 합성을 상세히 설명한다.
합성:
Figure 112007052373933-pct00247
무수 CH2Cl2 (30 mL) 중 mPEG-OH (30 K, 3.0 g, 0.1 mmol)의 용액에 디포스겐 (63 μL, 0.5 mmol)을 가하였다. 혼합물을 실온에서 밤새 교반하였다. 에테르 (700 mL)를 가하여 mPEG를 침전시켰다. 생성물을 여과하고 에테르로 세척한 다음 진공하에 건조시켰다 (3.0 g, 100%).
하기 실시예는 치료적으로 활성인 천연 아미노산 폴리펩티드의 시험관내 및 생체내 활성에 대하여 치료적으로 활성인 변형된 비-천연 아미노산 폴리펩티드의 시험관내 및 생체내 활성을 측정 및 비교하는 방법을 기재하고 있다.
실시예 87: 세포 결합 분석
세포 (3 x lO6개)를 각종 농도 (부피: 10 μl)의 비표지된 GH, hGH 또는 GM-CSF의 부재 또는 존재하에, 또한 125I-GH (약 100,000 cpm 또는 1 ng) 존재하에 PBS/1% BSA (100 μl) 중에서 0 ℃에서 90 분간 이중으로 인큐베이션시켰다 (총 부피: 120 μl). 세포를 재현탁시킨 다음, 350 μl 플라스틱 원심분리 튜브 중 200 μl 빙냉 FCS 상에 층으로 깔고 원심분리시켰다(1000 g; 1 분). 튜브의 말단을 잘라 펠렛을 모으고, 펠렛과 상등액을 감마 계수기(Packard) 중에서 분리하여 계수하였다.
특이적 결합(cpm)은 경쟁자 부재하의 총 결합(중복 시험의 평균)에서 100-배 과량의 비표지된 GH (비-특이적 결합) 존재하의 결합(cpm)을 뺀 것으로 결정하였다. 사용된 각각의 세포 유형에 대하여 비-특이적 결합을 측정하였다. 실험은 동일한 125I-GH 제제를 사용하여 다른 날에 수행되며, 내부적 일치를 나타내야 한다. 125I-GH는 GH 수용체-생산 세포에 대한 결합을 증명한다. 결합은 비표지된 천연 GH 또는 hGH에 의해서는 용량 의존적 방식으로 억제되지만, GM-CSF 또는 다른 음성 대조에 의해서는 그러하지 않았다. hGH가 천연 GH에 유사한 천연 125I-GH의 결합에 대하여 경쟁하는 것은 수용체가 두 가지 형태를 대등하게 잘 인식한다는 것을 나타낸다.
실시예 88: PEG화 hGH의 생체내 연구
PEG-hGH, 비변형된 hGH 및 완충액을 마우스 또는 래트에 투여하였다. 결과는 상당한 체중 증가로서 나타나며, 비변형된 hGH에 비하여 본 발명의 PEG화 hGH가 월등한 활성 및 연장된 반감기를 갖는 것으로 나타났다.
실시예 89: 컨쥬게이트 및 비-컨쥬게이트 hGH 및 변이체의 생체내 반감기 측정
모든 동물 실험은 AAALAC 인증 시설에서, 동물 보호 및 사용 위원회(the Institutional Animal Care and Use Committee of St. Louis University)에 의해 인증된 프로토콜 하에 수행되었다. 래트는 12-시간 명암 주기로 가동되는 방 안에서 우리 중에 따로따로 사육되었다. 동물들은 인증된 사료인 퓨리나 로던트 쵸우(Purina rodent chow) 5001 및 물을 제한없이 공급받았다. 뇌하수체 제거된 래트에 있어서는, 음료수는 추가로 5% 포도당을 함유하였다.
실시예 90: 약물동태학 연구
각 PEG화 변이 hGH의 품질을 동물 실험에 들어가기 전에 세 가지 방법으로 평가하였다. PEG-hGH의 순도는 비-환원 조건하에 MES SDS 완충액을 사용하여 4 내지 12% 아크릴아미드 NuPAGE 비스-트리스 겔(Invitrogen, Carlsbad, CA)로 검사하였다. 겔을 쿠마씨 블루로 염색하였다. PEG-hGH 밴드는 밀도측정 스캐닝하였을때 95% 넘게 순수하였다. PEG-hGH 중의 내독소 수준을 KTA2 키트(Charles River Laboratories, Wilmington, MA)를 사용하여 동태 LAL 분석으로 시험하였으며, 용량 당 5 EU 미만이었다. PEG-hGH의 생물학적 활성을 IM-9 pSTAT5 생검정으로 평가하였으며, EC50 값은 15 nM 미만인 것으로 확인되었다.
PEG-변형 성장 호르몬 화합물의 약물동태학적 특성을 서로서로 및 비PEG화 성장 호르몬과 수컷 스프라그-돌리(Sprague-Dawley) 래트 (체중 261 내지 425g, Charles River Laboratories)에서 비교하였다. 채혈하기 위하여 카테테르를 경동맥 내로 외과적으로 삽입하였다. 성공적인 카테테르 삽입 후, 투여 전 동물을 처리군(군 당 3 내지 6 마리)으로 배정하였다. 동물에 1 mg/kg의 화합물을 투여 부피 0.41 내지 0.55 ml/kg로 피하투여하였다. 카테테르를 통해 여러 시간대에서 혈액 샘플을 취하여 EDTA-코팅된 마이크로퓨즈 튜브에 넣었다. 원심분리 후 혈장을 모아 분석시까지 -8O ℃에서 보관하였다. 화합물 농도를 항체 샌드위치 성장 호르몬 ELISA 키트(BioSource International (Camarillo, CA) 또는 Diagnostic Systems Laboratories (Webster, TX)의 제품)를 사용하여 측정하였다. 농도는 투여된 유사체에 상응하는 표준을 사용하여 계산하였다. 약물동태학적 파라미터를 모델링 프로그램 윈논린(WinNonlin; Pharsight, version 4.1)을 사용하여 평가하였다. 리니어-업/로그-다운(linear-up/log-down) 사다리꼴 적분법을 사용한 비구획 분석이 이용되었으며, 농도 데이터는 균일하게 무게를 두었다.
래트에 단일 피하투여한 후에 정해진 간격을 두고 혈청 농도를 얻었다. 래트 (군 당 3 내지 6 마리)에 단일회로 1 mg/kg 단백질을 1회 볼러스 투여하였다. hGH 야생형 단백질(WHO hGH), His-태깅된 hGH 폴리펩티드(his-hGH), 또는 각각 상이한 6개 위치에서 30 kDa PEG에 결합된 비-천연 아미노산 p-아세틸-페닐알라닌을 포함하는 His-태깅된 hGH 폴리펩티드를 비교하였다. 혈장 샘플을 일정 간격을 두고 취하여 상기한 바와 같이 주사된 화합물에 대해 분석하였다. 하기 표는 각종 hGH 폴리펩티드를 단일 용량 투여한 경우의 약물동태학적 파라미터를 나타낸다. 농도 대 시간 곡선은 비구획 분석(Pharsight, version 4.1)으로 평가되었다. 값은 (+/- 표준 편차)로 주어졌다: Cmax: 최대 농도; 말기 tl/2: 말기 반감기; AUC0->inf: 무한대로 외삽한 농도-시간 곡선하의 면적; MRT: 평균 체류 시간; Cl/f: 겉보기 총 혈장 투명도; Vz/f: 말기상 중 겉보기 분포 부피. 30KPEG- pAF92 (his)hGH는 대조 hGH에 비하여 월등히 연장된 순환, 증가된 혈청 반감기 및 증가된 생이용성을 갖는 것으로 나타났다. 표 6은 정상적인 수컷 스프라그-돌리 래트에 단일 용량 1 mg/kg 볼러스 피하 투여한 경우의 약물동태학적 파라미터 값을 나타낸다.
Figure 112007052373933-pct00248
실시예 91: 약물역학 연구
뇌하수체 제거된 수컷 스프라그-돌리 래트를 공급처(Charles River Laboratories)로부터 구입하였다. 뇌하수체를 3 내지 4 주령에 이르렀을 때 외과적으로 제거하였다. 동물을 3주 동안 적응하도록 하였으며, 그 기간 동안 체중을 모니터링하였다. 연구 개시 전에 7일 동안 0 내지 8g의 체중 증가가 있는 동물을 포함시켰으며, 무작위로 처리군에 배정하였다. 래트에 볼러스 또는 매일 피하 투여하였다. 연구 전 기간을 통해, 래트를 매일 및 연속적으로 체중측정하고, 필요에 따라 마취시키고, 채혈하고 투여하였다. 혈액은 헤파린 처리된 모세관 튜브를 사용하여 안와저로부터 채취하여 EDTA 코팅된 마이크로퓨즈 튜브에 넣었다. 혈장을 원심분리에 의해 단리하여 분석시까지 -8O ℃에 보관하였다. 평균 (+/- 표준 편차) 혈장 농도를 시간 간격에 대하여 플롯팅하였다.
펩티드 IGF-1은 소마토메딘 또는 인슐린 유사 성장 인자 과의 구성원이다. IGF-1은 성장 호르몬의 여러 가지 성장 촉진 효과를 매개한다. IGF-1 농도를 제공된 래트/마우스 IGF-1 표준(Diagnosic Systems Laboratories)에 대하여 경쟁적 결합 효소 면역검정 키트를 사용하여 측정하였다. 뇌하수체 제거된 래트 (군 당 5 내지 7 마리)에 단일 용량으로 또는 매일 피하투여하였다. 동물을 연속하여 매일 체중측정하고, 필요에 따라 마취시키고, 채혈하고 투여하였다. 체중측정 결과는 위약 처리군, 야생형 hGH (hGH), His-태깅된 hGH ((his)hGH), 및 각각 위치 35 및 92에서 30 kDa PEG에 결합된 비-천연 아미노산 p-아세틸-페닐알라닌을 포함하는 His-태깅된 hGH 폴리펩티드에서 취하였다. 30KPEG-pAF35(his)hGH 화합물에 대한 제9일의 체중 증가는 그 증가가 크다는 점에서 30KPEG-pAF92(his)hGH 화합물과는 통계적으로 상이한 (p<0.0005) 것이었다. PEG화된 비-천연적으로 코딩되는 아미노산을 포함하는 hGH 폴리펩티드를 단일 용량 투여한 후 순환하는 혈장 IGF-1 수준에 미치는 효과는, 투-테일드 분포, 짝짓지 않은 동일한 변수를 사용한 t-테스트 결과 상당히 차이가 나는 것으로 밝혀졌다.
실시예 92: 비-천연적으로 코딩되는 아미노산을 포함하는 PEG화 hGH의 안전성 및(또는) 효능의 인간 임상 시험
목적: 피하 투여된, 비-천연적으로 코딩되는 아미노산을 포함하는 PEG화 재조합 인간 hGH의 안전성 및 약물동태학을 하나 이상의 시판용 hGH 제품, 비제한적인 예로서, 휴마트롭(Humatrope™; Eli Lilly & Co.), 뉴트로핀(Nutropin™; Genentech), 노르디트로핀(Norditropin™; Novo-Nordisk), 제노트로핀(Genotropin™; Pfizer) 및 사이젠/세로스팀(Saizen/Serostim™; Serono)과 비교하기 위한 것이다.
환자: 연령 20 내지 40세, 체중 60 내지 90 kg의 건강한, 18명의 지원자를 연구에 등록하였다. 대상자들은 혈액 또는 혈청 검사, 음성 요독성 스크리닝, HIV 스크리닝 및 간염 B 표면 항원에 있어서, 임상병리적으로 중요한 비정상적 측정치를 나타내지 않았다. 대상자들은 다음의 증상을 가져서는 안된다: 고혈압; 1차적 혈액 질병력; 중요한 간, 신장, 심혈관계, 위장관계, 비뇨생식계, 대사계, 신경계 질병력; 빈혈 또는 발작의 병력; 세균 또는 포유동물 유래 생성물, PEG 또는 인간 혈청 알부민에 대한 민감성: 카페인 함유 음료에 대한 습관 또는 중독성. 대상자들은 연구 개시 30일 이내에 다른 임상 실험에 참여하거나, 수혈 또는 헌혈한 적이 없어야하고, 연구 개시 3개월 이내에 hGH에 노출된 적이 없어야 하고, 연구 개시 7일 이내에 아픈 적이 없어야 하고, 연구 개시 14일 이내에 연구 개시전 신체 검사 또는 임상병리 평가에서 중요한 이상 증상을 나타내지 않아야 한다. 모든 대상자는 안전성에 대하여 평가되어야 하며, 약물동태학 분석을 위한 채혈은 일정에 따라야한다. 모든 연구는 윤리위원회의 승인 및 환자 허락하에 수행되었다.
연구 설계: 건강한 남성 자원자 중에서 I상, 단일 중심, 개방-표지, 무작위, 2-주기 크로스오버 연구로 행해졌다. 18명의 대상자를 두 개의 처리 군에 무작위로 배정하였다(9명/군). GH는 비-천연적으로 코딩되는 아미노산을 포함하는 PEG화 hGH 및 선택된 시판 제품을 같은 양으로 사용하여, 2회의 분리된 투여기에 걸쳐 상부 넓적다리에 피하 볼러스 주사하였다. 시판 제품의 투여 용량 및 빈도는 패키지 라벨에 지시된 바에 따랐다. 시판 제품의 경우, 요구되는 또다른 투여량, 투여 빈도 또는 다른 피라미터는 추가의 실험 대상자 군을 포함시켜 연구에 추가될 수 있다. 각 투여기는 14-일 워시아웃 기간 만큼 분리되었다. 2회의 각 투여기에 있어서, 대상자들은 투여 기간 사이가 아니라, 투여 전 적어도 12 시간에서 투여 후 적어도 72시간 까지는 연구 센터에 머물도록 하였다. PEG화 hGH에 대하여도 또다른 투여량, 투여 빈도 또는 다른 피라미터를 시험하고자 하는 경우, 실험 대상군을 추가할 수 있다. 인간 사용이 승인된 다수의 GH 제제가 이 연구에 사용될 수 있다. 휴마트롭(Humatrope™; Eli Lilly & Co.), 뉴트로핀(Nutropin™; Genentech), 노르디트로핀(Norditropin™; Novo-Nordisk), 제노트로핀(Genotropin™; Pfizer) 및 사이젠/세로스팀(Saizen/Serostim™; Serono)은 인간 사용이 승인된 시판 GH 제품이다. hGH 실험 제제는 비-천연적으로 코딩되는 아미노산을 포함하는 PEG화 hGH이다.
혈액 샘플링: hGH를 투여하기 전 및 후에 정맥에 직접 꽂아서 혈액을 채취하였다. 혈청 GH 농도를 측정하기 위한 정맥 혈액 샘플 (5 mL)을 투여 전 약 30, 20 및 10 분에(세 개의 기본가 샘플) 및 투여 후 약 30 분 및 약 1, 2, 5, 8, 12, 15, 18, 24, 30, 36, 48, 60 및 72 시간에 취하였다. 각 혈청 샘플을 두 개의 분취액으로 나누었다. 모든 혈청 샘플을 -20 ℃에서 보관하였다. 혈청 샘플을 드라이 아이스 위에 얹었다. 공복 임상병리 시험 (혈액, 혈청 및 뇨 검사)을 제1일 최초 투여 직전에, 제4일 아침에, 제6일 투여 직전에, 및 제19일 아침에 수행하였다.
생분석 방법: ELISA 키트 과정(Diagnostic Systems Laboratory [DSL], Webster TX)을 혈청 GH 농도를 측정하는데 사용하였다.
안전성 측정: 활력 징후를 각각의 투여 (제1일 및 제16일) 직전 및 각 투여 후 6, 24, 48 및 72 시간에 측정하였다. 안전성 측정은 부작용의 발발 및 유형, 및 임상병리 시험에서 기본값으로부터의 변화에 기초한다. 또한, 혈압을 포함하는 활력 징후 측정에 있어서, 연구 개시 전으로부터의 변화 및 신체 검사 결과가 평가되었다.
데이터 분석: 각 투여 후 값에서 투여 전 30, 20 및 10 분에 채취된 세 개의 샘플로부터의 GH 수준을 평균하여 얻어진 기본 GH 농도 평균가를 빼서, 투여 후 혈청 농도 값을 투여 전 기본 GH 농도에 대하여 보정하였다. 투여 전 혈청 GH 농도는 그것이 분석 정량 수준 미만의 값일 때는 평균치 계산에 포함시키지 않는다. 약물동태학 파라미터는 기본 GH 농도에 대하여 보정된 혈청 농도 데이터로 부터 결정한다. 약물동태학 파라미터는 디지털 이큅먼트 코포레이션 VAX 8600 컴퓨터 시스템 상에서 BIOAVL 소프트웨어의 최근 버전을 사용하여 모델 독립적 방법으로 계산하였다. 다음 약물동태학 파라미터가 측정되었다: 피크 혈청 농도(Cmax); 피크 혈청 농도에 이르는 시간(tmax); 선형 사다리꼴 법칙을 사용하여 계산된 시간 0에서 최후 혈액 샘플링 시간 까지의 농도-시간 곡선 (AUC) 하의 면적(AUC0-72); 제거 속도 상수로부터 계산된 말기 제거 반감기 (t1/2). 제거 속도 상수는 로그-선형 농도-시간 플롯 중 말기 선형 영역에서 연속적인 점 데이터를 선형 회귀하여 평가하였다. 약물동태학 파라미터의 평균, 표준 편차 (SD) 및 변화 계수는 각 처리에 대하여 계산되었다. 파라미터 평균의 비율(보존된 공식/비-보존 공식)이 계산되었다.
안전성 결과: 부작용의 발발은 처리 군 사이에 균등하게 분포하였다. 기본가 또는 개시 전 임상병리 시험 또는 혈압으로부터의 변화가 임상적으로 중요하지 않았으며, 신체검사 결과 및 활력 징후 측정에 있어 연구 개시 전과 다른 주목할 만한 변화가 없었다. 두 처리군의 안전성 프로파일은 유사하게 나타났다.
약물동태학 결과: 하나 이상의 시판 hGH 제품, 즉, 비제한적인 예로서, 휴마트롭(Humatrope™; Eli Lilly & Co.), 뉴트로핀(Nutropin™; Genentech), 노르디트로핀(Norditropin™; Novo-Nordisk), 제노트로핀(Genotropin™; Pfizer) 및 사이젠/세로스팀(Saizen/Serostim™; Serono)을 단일회 투여받은 18명의 대상자 전원에 있어서, 평균 혈청 GH 농도-시간 프로파일(기본 GH 수준에 대해 보정되지 않음)을 각 시간대에 측정한 비-천연적으로 코딩되는 아미노산 함유 PEG화 hGH와 비교하였다. 모든 대상자는 투여 전 기본 GH 농도가 정상 범위 내에 있었다. 투여 전 평균 기본 GH 농도에 대하여 보정된 혈청 데이터로부터 약물동태학 파라미터를 결정하였으며, Cmax 및 tmax를 결정하였다. 선택된 임상 비교 제품, 휴마트롭(Humatrope™; Eli Lilly & Co.), 뉴트로핀(Nutropin™; Genentech), 노르디트로핀(Norditropin™; Novo-Nordisk), 제노트로핀(Genotropin™; Pfizer) 및 사이젠/세로스팀(Saizen/Serostim™; Serono)에 대한 평균 tmax는 비-천연적으로 코딩되는 아미노산을 포함하는 PEG화 hGH의 tmax 보다 훨씬 짧았다. 말기 반감기 값은 시험된 시판 hGH 제품이 비-천연적으로 코딩되는 아미노산을 포함하는 PEG화 hGH에 비하여 훨씬 짧았다.
본 연구가 건강한 남성을 대상으로하여 수행되었지만, 암 또는 만성 신부전이 있는 남성 또는 여성 환자, 소아 신부전 환자, 자가조직 예치 프로그램 환자, 또는 비응급성 선택적 수술계획이 있는 환자와 같은 다른 환자 집단에서도 유사한 흡수 특성과 안전성 프로파일이 예상된다.
결론적으로, 비-천연적으로 코딩되는 아미노산을 포함하는 PEG화 hGH의 단일 용량 피하 투여는 안전하며 건강한 남성 대상자에 의해 허용되는 수준이었다. 부작용 발발의 비교, 임상병리 값, 활력 징후 및 신체 검사 결과에 기초하여, 시판되는 hGH 형태 및 비-천연적으로 코딩되는 아미노산을 포함하는 PEG화 hGH의 안전성 프로파일은 대등한 것이었다. 비-천연적으로 코딩되는 아미노산을 포함하는 PEG화 hGH는 환자 및 건강관리 제공자에게 더 광범위한 임상적 용도를 제공할 것이다.
실시예 93: PEG화 hGH 및 비-PEG화 hGH의 수용해도 비교
hGH 야생형 단백질 (WHO hGH), His-태깅된 hGH 폴리펩티드 (his-hGH) 및 위치 92에서 30 kDa PEG에 공유 결합된 비-천연 아미노산 p-아세틸-페닐알라닌을 갖는 His-태깅된 hGH 폴리펩티드의 수용해도를 100 μL의 물 상에 용해될 수 있는 각 폴리펩티드의 양을 측정하여 얻었다. PEG화 hGH의 양은 WHO hGH 및 hGH보다 많았으며, 이는 비-천연 아미노산 폴리펩티드의 PEG화가 수용해도를 증가시킨다는 것을 의미한다.
실시예 94: 변형된 치료적 활성 비-천연 아미노산 폴리펩티드의 생체내 연구
전립선암 종양 이종이식편을 마우스에 심고, 두 군으로 나누었다. 하나의 군은 변형된 치료적 활성 비-천연 아미노산 폴리펩티드로 매일 처리하고, 다른 군은 치료적 활성 천연 아미노산 폴리펩티드로 매일 처리하였다. 종양의 크기를 매일 측정하였으며, 변형된 치료적 활성 비-천연 아미노산 폴리펩티드는 그것으로 처리한 군에서 종양 크기가 감소하는 것으로 보아 치료적 활성 천연 아미노산 폴리펩티드보다 치료 효과가 개선되었다.
실시예 95: 변형된 치료적 활성 비-천연 아미노산 폴리펩티드의 생체내 연구
전립선암 종양 이종이식편을 마우스에 심고, 두 군으로 나누었다. 하나의 군은 변형된 치료적 활성 비-천연 아미노산 폴리펩티드로 매일 처리하고, 다른 군은 치료적 활성 천연 아미노산 폴리펩티드로 매일 처리하였다. 종양의 크기를 매일 측정하였으며, 변형된 치료적 활성 비-천연 아미노산 폴리펩티드는 그것으로 처리한 군에서 종양 크기가 감소하는 것으로 보아 치료적 활성 천연 아미노산 폴리펩티드보다 치료 효과가 개선되었다.
본 명세서에 기재된 실시예 및 실시태양은 단지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 이들에 기초한 각종 수정 및 변형법이 당업자에게 자명할 것이며, 또한 그와 같은 수정 및 변형법이 본 명세서의 요지와 핵심 및 첨부된 청구범위의 범주에 든다는 것을 이해하여야 한다. 본 명세서에 인용된 모든 간행물, 특허 및 출원 등의 명세서는 그 전문이 모든 목적을 위하여 본 명세서에서 포함된다. 표 7을 서열 목록을 나타낸다.
Figure 112007052373933-pct00249
Figure 112007052373933-pct00250
Figure 112007052373933-pct00251
SEQUENCE LISTING <110> AMBRX, INC. <120> COMPOSITIONS CONTAINING, METHODS INVOLVING, AND USES OF NON-NATURAL AMINO ACIDS AND POLYPEPTIDES <130> 31362-701.601 <140> PCT/US05/046618 <141> 2005-12-21 <150> 60/638,418 <151> 2004-12-22 <150> 60/638,527 <151> 2004-12-22 <150> 60/639,195 <151> 2004-12-22 <150> 60/696,210 <151> 2005-07-01 <150> 60/696,302 <151> 2005-07-01 <150> 60/696,068 <151> 2005-07-01 <160> 17 <170> PatentIn Ver. 3.3 <210> 1 <211> 77 <212> DNA <213> Methanococcus jannaschii <400> 1 ccggcggtag ttcagcaggg cagaacggcg gactctaaat ccgcatggcg ctggttcaaa 60 tccggcccgc cggacca 77 <210> 2 <211> 88 <212> DNA <213> Halobacterium sp. <400> 2 cccagggtag ccaagctcgg ccaacggcga cggactctaa atccgttctc gtaggagttc 60 gagggttcga atcccttccc tgggacca 88 <210> 3 <211> 89 <212> DNA <213> Halobacterium sp. <400> 3 gcgagggtag ccaagctcgg ccaacggcga cggacttcct aatccgttct cgtaggagtt 60 cgagggttcg aatccctccc ctcgcacca 89 <210> 4 <211> 306 <212> PRT <213> Methanococcus jannaschii <400> 4 Met Asp Glu Phe Glu Met Ile Lys Arg Asn Thr Ser Glu Ile Ile Ser 1 5 10 15 Glu Glu Glu Leu Arg Glu Val Leu Lys Lys Asp Glu Lys Ser Ala Gly 20 25 30 Ile Gly Phe Glu Pro Ser Gly Lys Ile His Leu Gly His Tyr Leu Gln 35 40 45 Ile Lys Lys Met Ile Asp Leu Gln Asn Ala Gly Phe Asp Ile Ile Ile 50 55 60 Leu Leu Ala Asp Leu His Ala Tyr Leu Asn Gln Lys Gly Glu Leu Asp 65 70 75 80 Glu Ile Arg Lys Ile Gly Asp Tyr Asn Lys Lys Val Phe Glu Ala Met 85 90 95 Gly Leu Lys Ala Lys Tyr Val Tyr Gly Ser Thr Phe Gln Leu Asp Lys 100 105 110 Asp Tyr Thr Leu Asn Val Tyr Arg Leu Ala Leu Lys Thr Thr Leu Lys 115 120 125 Arg Ala Arg Arg Ser Met Glu Leu Ile Ala Arg Glu Asp Glu Asn Pro 130 135 140 Lys Val Ala Glu Val Ile Tyr Pro Ile Met Gln Val Asn Thr Tyr Tyr 145 150 155 160 Tyr Leu Gly Val Asp Val Ala Val Gly Gly Met Glu Gln Arg Lys Ile 165 170 175 His Met Leu Ala Arg Glu Leu Leu Pro Lys Lys Val Val Cys Ile His 180 185 190 Asn Pro Val Leu Thr Gly Leu Asp Gly Glu Gly Lys Met Ser Ser Ser 195 200 205 Lys Gly Asn Phe Ile Ala Val Asp Asp Ser Pro Glu Glu Ile Arg Ala 210 215 220 Lys Ile Lys Lys Ala Tyr Cys Pro Ala Gly Val Val Glu Gly Asn Pro 225 230 235 240 Ile Met Glu Ile Ala Lys Tyr Phe Leu Glu Tyr Pro Leu Thr Ile Lys 245 250 255 Arg Pro Glu Lys Phe Gly Gly Asp Leu Thr Val Asn Ser Tyr Glu Glu 260 265 270 Leu Glu Ser Leu Phe Lys Asn Lys Glu Leu His Pro Met Asp Leu Lys 275 280 285 Asn Ala Val Ala Glu Glu Leu Ile Lys Ile Leu Glu Pro Ile Arg Lys 290 295 300 Arg Leu 305 <210> 5 <211> 306 <212> PRT <213> Methanococcus jannaschii <400> 5 Met Asp Glu Phe Glu Met Ile Lys Arg Asn Thr Ser Glu Ile Ile Ser 1 5 10 15 Glu Glu Glu Leu Arg Glu Val Leu Lys Lys Asp Glu Lys Ser Ala Gly 20 25 30 Ile Gly Phe Glu Pro Ser Gly Lys Ile His Leu Gly His Tyr Leu Gln 35 40 45 Ile Lys Lys Met Ile Asp Leu Gln Asn Ala Gly Phe Asp Ile Ile Ile 50 55 60 Leu Leu Ala Asp Leu His Ala Tyr Leu Asn Gln Lys Gly Glu Leu Asp 65 70 75 80 Glu Ile Arg Lys Ile Gly Asp Tyr Asn Lys Lys Val Phe Glu Ala Met 85 90 95 Gly Leu Lys Ala Lys Tyr Val Tyr Gly Ser Ser Phe Gln Leu Asp Lys 100 105 110 Asp Tyr Thr Leu Asn Val Tyr Arg Leu Ala Leu Lys Thr Thr Leu Lys 115 120 125 Arg Ala Arg Arg Ser Met Glu Leu Ile Ala Arg Glu Asp Glu Asn Pro 130 135 140 Lys Val Ala Glu Val Ile Tyr Pro Ile Met Gln Val Asn Thr Ser His 145 150 155 160 Tyr Leu Gly Val Asp Val Ala Val Gly Gly Met Glu Gln Arg Lys Ile 165 170 175 His Met Leu Ala Arg Glu Leu Leu Pro Lys Lys Val Val Cys Ile His 180 185 190 Asn Pro Val Leu Thr Gly Leu Asp Gly Glu Gly Lys Met Ser Ser Ser 195 200 205 Lys Gly Asn Phe Ile Ala Val Asp Asp Ser Pro Glu Glu Ile Arg Ala 210 215 220 Lys Ile Lys Lys Ala Tyr Cys Pro Ala Gly Val Val Glu Gly Asn Pro 225 230 235 240 Ile Met Glu Ile Ala Lys Tyr Phe Leu Glu Tyr Pro Leu Thr Ile Lys 245 250 255 Arg Pro Glu Lys Phe Gly Gly Asp Leu Thr Val Asn Ser Tyr Glu Glu 260 265 270 Leu Glu Ser Leu Phe Lys Asn Lys Glu Leu His Pro Met Asp Leu Lys 275 280 285 Asn Ala Val Ala Glu Glu Leu Ile Lys Ile Leu Glu Pro Ile Arg Lys 290 295 300 Arg Leu 305 <210> 6 <211> 304 <212> PRT <213> Methanococcus jannaschii <400> 6 Met Asp Glu Phe Glu Met Ile Lys Arg Asn Thr Ser Glu Ile Ile Ser 1 5 10 15 Glu Glu Glu Leu Arg Glu Val Leu Lys Lys Asp Glu Lys Ala Ala Ile 20 25 30 Gly Phe Glu Pro Ser Gly Lys Ile His Leu Gly His Tyr Leu Gln Ile 35 40 45 Lys Lys Met Ile Asp Leu Gln Asn Ala Gly Phe Asp Ile Ile Ile Leu 50 55 60 Leu Ala Asp Leu His Ala Tyr Leu Asn Gln Lys Gly Glu Leu Asp Glu 65 70 75 80 Ile Arg Lys Ile Gly Asp Tyr Asn Lys Lys Val Phe Glu Ala Met Gly 85 90 95 Leu Lys Ala Lys Tyr Val Tyr Gly Ser Pro Phe Gln Leu Asp Lys Asp 100 105 110 Tyr Thr Leu Asn Val Tyr Arg Leu Ala Leu Lys Thr Thr Leu Lys Arg 115 120 125 Ala Arg Arg Ser Met Glu Leu Ile Ala Arg Glu Asp Glu Asn Pro Lys 130 135 140 Val Ala Glu Val Ile Tyr Pro Ile Met Gln Val Asn Ala Ile Tyr Leu 145 150 155 160 Ala Val Asp Val Ala Val Gly Gly Met Glu Gln Arg Lys Ile His Met 165 170 175 Leu Ala Arg Glu Leu Leu Pro Lys Lys Val Val Cys Ile His Asn Pro 180 185 190 Val Leu Thr Gly Leu Asp Gly Glu Gly Lys Met Ser Ser Ser Lys Gly 195 200 205 Asn Phe Ile Ala Val Asp Asp Ser Pro Glu Glu Ile Arg Ala Lys Ile 210 215 220 Lys Lys Ala Tyr Cys Pro Ala Gly Val Val Glu Gly Asn Pro Ile Met 225 230 235 240 Glu Ile Ala Lys Tyr Phe Leu Glu Tyr Pro Leu Thr Ile Lys Arg Pro 245 250 255 Glu Lys Phe Gly Gly Asp Leu Thr Val Asn Ser Tyr Glu Glu Leu Glu 260 265 270 Ser Leu Phe Lys Asn Lys Glu Leu His Pro Met Asp Leu Lys Asn Ala 275 280 285 Val Ala Glu Glu Leu Ile Lys Ile Leu Glu Pro Ile Arg Lys Arg Leu 290 295 300 <210> 7 <211> 305 <212> PRT <213> Methanococcus jannaschii <400> 7 Met Asp Glu Phe Glu Met Ile Lys Arg Asn Thr Ser Glu Ile Ile Ser 1 5 10 15 Glu Glu Glu Leu Arg Glu Val Leu Lys Lys Asp Glu Lys Ser Ala Ala 20 25 30 Ile Gly Phe Glu Pro Ser Gly Lys Ile His Leu Gly His Tyr Leu Gln 35 40 45 Ile Lys Lys Met Ile Asp Leu Gln Asn Ala Gly Phe Asp Ile Ile Ile 50 55 60 Leu Leu Ala Asp Leu His Ala Tyr Leu Asn Gln Lys Gly Glu Leu Asp 65 70 75 80 Glu Ile Arg Lys Ile Gly Asp Tyr Asn Lys Lys Val Phe Glu Ala Met 85 90 95 Gly Leu Lys Ala Lys Tyr Val Tyr Gly Ser Pro Phe Gln Leu Asp Lys 100 105 110 Asp Tyr Thr Leu Asn Val Tyr Arg Leu Ala Leu Lys Thr Thr Leu Lys 115 120 125 Arg Ala Arg Arg Ser Met Glu Leu Ile Ala Arg Glu Asp Glu Asn Pro 130 135 140 Lys Val Ala Glu Val Ile Tyr Pro Ile Met Gln Val Asn Ile Pro Tyr 145 150 155 160 Leu Pro Val Asp Val Ala Val Gly Gly Met Glu Gln Arg Lys Ile His 165 170 175 Met Leu Ala Arg Glu Leu Leu Pro Lys Lys Val Val Cys Ile His Asn 180 185 190 Pro Val Leu Thr Gly Leu Asp Gly Glu Gly Lys Met Ser Ser Ser Lys 195 200 205 Gly Asn Phe Ile Ala Val Asp Asp Ser Pro Glu Glu Ile Arg Ala Lys 210 215 220 Ile Lys Lys Ala Tyr Cys Pro Ala Gly Val Val Glu Gly Asn Pro Ile 225 230 235 240 Met Glu Ile Ala Lys Tyr Phe Leu Glu Tyr Pro Leu Thr Ile Lys Arg 245 250 255 Pro Glu Lys Phe Gly Gly Asp Leu Thr Val Asn Ser Tyr Glu Glu Leu 260 265 270 Glu Ser Leu Phe Lys Asn Lys Glu Leu His Pro Met Asp Leu Lys Asn 275 280 285 Ala Val Ala Glu Glu Leu Ile Lys Ile Leu Glu Pro Ile Arg Lys Arg 290 295 300 Leu 305 <210> 8 <211> 305 <212> PRT <213> Methanococcus jannaschii <400> 8 Met Asp Glu Phe Glu Met Ile Lys Arg Asn Thr Ser Glu Ile Ile Ser 1 5 10 15 Glu Glu Glu Leu Arg Glu Val Leu Lys Lys Asp Glu Lys Ser Ala Ala 20 25 30 Ile Gly Phe Glu Pro Ser Gly Lys Ile His Leu Gly His Tyr Leu Gln 35 40 45 Ile Lys Lys Met Ile Asp Leu Gln Asn Ala Gly Phe Asp Ile Ile Ile 50 55 60 Leu Leu Ala Asp Leu His Ala Tyr Leu Asn Gln Lys Gly Glu Leu Asp 65 70 75 80 Glu Ile Arg Lys Ile Gly Asp Tyr Asn Lys Lys Val Phe Glu Ala Met 85 90 95 Gly Leu Lys Ala Lys Tyr Val Tyr Gly Ser Lys Phe Gln Leu Asp Lys 100 105 110 Asp Tyr Thr Leu Asn Val Tyr Arg Leu Ala Leu Lys Thr Thr Leu Lys 115 120 125 Arg Ala Arg Arg Ser Met Glu Leu Ile Ala Arg Glu Asp Glu Asn Pro 130 135 140 Lys Val Ala Glu Val Ile Tyr Pro Ile Met Gln Val Asn Ala Ile Tyr 145 150 155 160 Leu Ala Val Asp Val Ala Val Gly Gly Met Glu Gln Arg Lys Ile His 165 170 175 Met Leu Ala Arg Glu Leu Leu Pro Lys Lys Val Val Cys Ile His Asn 180 185 190 Pro Val Leu Thr Gly Leu Asp Gly Glu Gly Lys Met Ser Ser Ser Lys 195 200 205 Gly Asn Phe Ile Ala Val Asp Asp Ser Pro Glu Glu Ile Arg Ala Lys 210 215 220 Ile Lys Lys Ala Tyr Cys Pro Ala Gly Val Val Glu Gly Asn Pro Ile 225 230 235 240 Met Glu Ile Ala Lys Tyr Phe Leu Glu Tyr Pro Leu Thr Ile Lys Arg 245 250 255 Pro Glu Lys Phe Gly Gly Asp Leu Thr Val Asn Ser Tyr Glu Glu Leu 260 265 270 Glu Ser Leu Phe Lys Asn Lys Glu Leu His Pro Met Asp Leu Lys Asn 275 280 285 Ala Val Ala Glu Glu Leu Ile Lys Ile Leu Glu Pro Ile Arg Lys Arg 290 295 300 Leu 305 <210> 9 <211> 306 <212> PRT <213> Methanococcus jannaschii <400> 9 Met Asp Glu Phe Glu Met Ile Lys Arg Asn Thr Ser Glu Ile Ile Ser 1 5 10 15 Glu Glu Glu Leu Arg Glu Val Leu Lys Lys Asp Glu Lys Ser Ala Thr 20 25 30 Ile Gly Phe Glu Pro Ser Gly Lys Ile His Leu Gly His Tyr Leu Gln 35 40 45 Ile Lys Lys Met Ile Asp Leu Gln Asn Ala Gly Phe Asp Ile Ile Ile 50 55 60 Leu Leu Ala Asp Leu His Ala Tyr Leu Asn Gln Lys Gly Glu Leu Asp 65 70 75 80 Glu Ile Arg Lys Ile Gly Asp Tyr Asn Lys Lys Val Phe Glu Ala Met 85 90 95 Gly Leu Lys Ala Lys Tyr Val Tyr Gly Ser Asn Phe Gln Leu Asp Lys 100 105 110 Asp Tyr Thr Leu Asn Val Tyr Arg Leu Ala Leu Lys Thr Thr Leu Lys 115 120 125 Arg Ala Arg Arg Ser Met Glu Leu Ile Ala Arg Glu Asp Glu Asn Pro 130 135 140 Lys Val Ala Glu Val Ile Tyr Pro Ile Met Gln Val Asn Pro Leu His 145 150 155 160 Tyr Gln Gly Val Asp Val Ala Val Gly Gly Met Glu Gln Arg Lys Ile 165 170 175 His Met Leu Ala Arg Glu Leu Leu Pro Lys Lys Val Val Cys Ile His 180 185 190 Asn Pro Val Leu Thr Gly Leu Asp Gly Glu Gly Lys Met Ser Ser Ser 195 200 205 Lys Gly Asn Phe Ile Ala Val Asp Asp Ser Pro Glu Glu Ile Arg Ala 210 215 220 Lys Ile Lys Lys Ala Tyr Cys Pro Ala Gly Val Val Glu Gly Asn Pro 225 230 235 240 Ile Met Glu Ile Ala Lys Tyr Phe Leu Glu Tyr Pro Leu Thr Ile Lys 245 250 255 Arg Pro Glu Lys Phe Gly Gly Asp Leu Thr Val Asn Ser Tyr Glu Glu 260 265 270 Leu Glu Ser Leu Phe Lys Asn Lys Glu Leu His Pro Met Asp Leu Lys 275 280 285 Asn Ala Val Ala Glu Glu Leu Ile Lys Ile Leu Glu Pro Ile Arg Lys 290 295 300 Arg Leu 305 <210> 10 <211> 306 <212> PRT <213> Methanococcus jannaschii <400> 10 Met Asp Glu Phe Glu Met Ile Lys Arg Asn Thr Ser Glu Ile Ile Ser 1 5 10 15 Glu Glu Glu Leu Arg Glu Val Leu Lys Lys Asp Glu Lys Ser Ala Thr 20 25 30 Ile Gly Phe Glu Pro Ser Gly Lys Ile His Leu Gly His Tyr Leu Gln 35 40 45 Ile Lys Lys Met Ile Asp Leu Gln Asn Ala Gly Phe Asp Ile Ile Ile 50 55 60 Leu Leu Ala Asp Leu His Ala Tyr Leu Asn Gln Lys Gly Glu Leu Asp 65 70 75 80 Glu Ile Arg Lys Ile Gly Asp Tyr Asn Lys Lys Val Phe Glu Ala Met 85 90 95 Gly Leu Lys Ala Lys Tyr Val Tyr Gly Ser Ser Phe Gln Leu Asp Lys 100 105 110 Asp Tyr Thr Leu Asn Val Tyr Arg Leu Ala Leu Lys Thr Thr Leu Lys 115 120 125 Arg Ala Arg Arg Ser Met Glu Leu Ile Ala Arg Glu Asp Glu Asn Pro 130 135 140 Lys Val Ala Glu Val Ile Tyr Pro Ile Met Gln Val Asn Pro Leu His 145 150 155 160 Tyr Gln Gly Val Asp Val Ala Val Gly Gly Met Glu Gln Arg Lys Ile 165 170 175 His Met Leu Ala Arg Glu Leu Leu Pro Lys Lys Val Val Cys Ile His 180 185 190 Asn Pro Val Leu Thr Gly Leu Asp Gly Glu Gly Lys Met Ser Ser Ser 195 200 205 Lys Gly Asn Phe Ile Ala Val Asp Asp Ser Pro Glu Glu Ile Arg Ala 210 215 220 Lys Ile Lys Lys Ala Tyr Cys Pro Ala Gly Val Val Glu Gly Asn Pro 225 230 235 240 Ile Met Glu Ile Ala Lys Tyr Phe Leu Glu Tyr Pro Leu Thr Ile Lys 245 250 255 Arg Pro Glu Lys Phe Gly Gly Asp Leu Thr Val Asn Ser Tyr Glu Glu 260 265 270 Leu Glu Ser Leu Phe Lys Asn Lys Glu Leu His Pro Met Asp Leu Lys 275 280 285 Asn Ala Val Ala Glu Glu Leu Ile Lys Ile Leu Glu Pro Ile Arg Lys 290 295 300 Arg Leu 305 <210> 11 <211> 306 <212> PRT <213> Methanococcus jannaschii <400> 11 Met Asp Glu Phe Glu Met Ile Lys Arg Asn Thr Ser Glu Ile Ile Ser 1 5 10 15 Glu Glu Glu Leu Arg Glu Val Leu Lys Lys Asp Glu Lys Ser Ala Leu 20 25 30 Ile Gly Phe Glu Pro Ser Gly Lys Ile His Leu Gly His Tyr Leu Gln 35 40 45 Ile Lys Lys Met Ile Asp Leu Gln Asn Ala Gly Phe Asp Ile Ile Ile 50 55 60 Leu Leu Ala Asp Leu His Ala Tyr Leu Asn Gln Lys Gly Glu Leu Asp 65 70 75 80 Glu Ile Arg Lys Ile Gly Asp Tyr Asn Lys Lys Val Phe Glu Ala Met 85 90 95 Gly Leu Lys Ala Lys Tyr Val Tyr Gly Ser Thr Phe Gln Leu Asp Lys 100 105 110 Asp Tyr Thr Leu Asn Val Tyr Arg Leu Ala Leu Lys Thr Thr Leu Lys 115 120 125 Arg Ala Arg Arg Ser Met Glu Leu Ile Ala Arg Glu Asp Glu Asn Pro 130 135 140 Lys Val Ala Glu Val Ile Tyr Pro Ile Met Gln Val Asn Pro Val His 145 150 155 160 Tyr Gln Gly Val Asp Val Ala Val Gly Gly Met Glu Gln Arg Lys Ile 165 170 175 His Met Leu Ala Arg Glu Leu Leu Pro Lys Lys Val Val Cys Ile His 180 185 190 Asn Pro Val Leu Thr Gly Leu Asp Gly Glu Gly Lys Met Ser Ser Ser 195 200 205 Lys Gly Asn Phe Ile Ala Val Asp Asp Ser Pro Glu Glu Ile Arg Ala 210 215 220 Lys Ile Lys Lys Ala Tyr Cys Pro Ala Gly Val Val Glu Gly Asn Pro 225 230 235 240 Ile Met Glu Ile Ala Lys Tyr Phe Leu Glu Tyr Pro Leu Thr Ile Lys 245 250 255 Arg Pro Glu Lys Phe Gly Gly Asp Leu Thr Val Asn Ser Tyr Glu Glu 260 265 270 Leu Glu Ser Leu Phe Lys Asn Lys Glu Leu His Pro Met Asp Leu Lys 275 280 285 Asn Ala Val Ala Glu Glu Leu Ile Lys Ile Leu Glu Pro Ile Arg Lys 290 295 300 Arg Leu 305 <210> 12 <211> 306 <212> PRT <213> Methanococcus jannaschii <400> 12 Met Asp Glu Phe Glu Met Ile Lys Arg Asn Thr Ser Glu Ile Ile Ser 1 5 10 15 Glu Glu Glu Leu Arg Glu Val Leu Lys Lys Asp Glu Lys Ser Ala Thr 20 25 30 Ile Gly Phe Glu Pro Ser Gly Lys Ile His Leu Gly His Tyr Leu Gln 35 40 45 Ile Lys Lys Met Ile Asp Leu Gln Asn Ala Gly Phe Asp Ile Ile Ile 50 55 60 Leu Leu Ala Asp Leu His Ala Tyr Leu Asn Gln Lys Gly Glu Leu Asp 65 70 75 80 Glu Ile Arg Lys Ile Gly Asp Tyr Asn Lys Lys Val Phe Glu Ala Met 85 90 95 Gly Leu Lys Ala Lys Tyr Val Tyr Gly Ser Ser Phe Gln Leu Asp Lys 100 105 110 Asp Tyr Thr Leu Asn Val Tyr Arg Leu Ala Leu Lys Thr Thr Leu Lys 115 120 125 Arg Ala Arg Arg Ser Met Glu Leu Ile Ala Arg Glu Asp Glu Asn Pro 130 135 140 Lys Val Ala Glu Val Ile Tyr Pro Ile Met Gln Val Asn Pro Ser His 145 150 155 160 Tyr Gln Gly Val Asp Val Ala Val Gly Gly Met Glu Gln Arg Lys Ile 165 170 175 His Met Leu Ala Arg Glu Leu Leu Pro Lys Lys Val Val Cys Ile His 180 185 190 Asn Pro Val Leu Thr Gly Leu Asp Gly Glu Gly Lys Met Ser Ser Ser 195 200 205 Lys Gly Asn Phe Ile Ala Val Asp Asp Ser Pro Glu Glu Ile Arg Ala 210 215 220 Lys Ile Lys Lys Ala Tyr Cys Pro Ala Gly Val Val Glu Gly Asn Pro 225 230 235 240 Ile Met Glu Ile Ala Lys Tyr Phe Leu Glu Tyr Pro Leu Thr Ile Lys 245 250 255 Arg Pro Glu Lys Phe Gly Gly Asp Leu Thr Val Asn Ser Tyr Glu Glu 260 265 270 Leu Glu Ser Leu Phe Lys Asn Lys Glu Leu His Pro Met Asp Leu Lys 275 280 285 Asn Ala Val Ala Glu Glu Leu Ile Lys Ile Leu Glu Pro Ile Arg Lys 290 295 300 Arg Leu 305 <210> 13 <211> 306 <212> PRT <213> Methanococcus jannaschii <400> 13 Met Asp Glu Phe Glu Met Ile Lys Arg Asn Thr Ser Glu Ile Ile Ser 1 5 10 15 Glu Glu Glu Leu Arg Glu Val Leu Lys Lys Asp Glu Lys Ser Ala Leu 20 25 30 Ile Gly Phe Glu Pro Ser Gly Lys Ile His Leu Gly His Tyr Leu Gln 35 40 45 Ile Lys Lys Met Ile Asp Leu Gln Asn Ala Gly Phe Asp Ile Ile Ile 50 55 60 Leu Leu Ala Asp Leu His Ala Tyr Leu Asn Gln Lys Gly Glu Leu Asp 65 70 75 80 Glu Ile Arg Lys Ile Gly Asp Tyr Asn Lys Lys Val Phe Glu Ala Met 85 90 95 Gly Leu Lys Ala Lys Tyr Val Tyr Gly Ser Glu Phe Gln Leu Asp Lys 100 105 110 Asp Tyr Thr Leu Asn Val Tyr Arg Leu Ala Leu Lys Thr Thr Leu Lys 115 120 125 Arg Ala Arg Arg Ser Met Glu Leu Ile Ala Arg Glu Asp Glu Asn Pro 130 135 140 Lys Val Ala Glu Val Ile Tyr Pro Ile Met Gln Val Asn Gly Cys His 145 150 155 160 Tyr Arg Gly Val Asp Val Ala Val Gly Gly Met Glu Gln Arg Lys Ile 165 170 175 His Met Leu Ala Arg Glu Leu Leu Pro Lys Lys Val Val Cys Ile His 180 185 190 Asn Pro Val Leu Thr Gly Leu Asp Gly Glu Gly Lys Met Ser Ser Ser 195 200 205 Lys Gly Asn Phe Ile Ala Val Asp Asp Ser Pro Glu Glu Ile Arg Ala 210 215 220 Lys Ile Lys Lys Ala Tyr Cys Pro Ala Gly Val Val Glu Gly Asn Pro 225 230 235 240 Ile Met Glu Ile Ala Lys Tyr Phe Leu Glu Tyr Pro Leu Thr Ile Lys 245 250 255 Arg Pro Glu Lys Phe Gly Gly Asp Leu Thr Val Asn Ser Tyr Glu Glu 260 265 270 Leu Glu Ser Leu Phe Lys Asn Lys Glu Leu His Pro Met Asp Leu Lys 275 280 285 Asn Ala Val Ala Glu Glu Leu Ile Lys Ile Leu Glu Pro Ile Arg Lys 290 295 300 Arg Leu 305 <210> 14 <211> 306 <212> PRT <213> Methanococcus jannaschii <400> 14 Met Asp Glu Phe Glu Met Ile Lys Arg Asn Thr Ser Glu Ile Ile Ser 1 5 10 15 Glu Glu Glu Leu Arg Glu Val Leu Lys Lys Asp Glu Lys Ser Ala Leu 20 25 30 Ile Gly Phe Glu Pro Ser Gly Lys Ile His Leu Gly His Tyr Leu Gln 35 40 45 Ile Lys Lys Met Ile Asp Leu Gln Asn Ala Gly Phe Asp Ile Ile Ile 50 55 60 Leu Leu Ala Asp Leu His Ala Tyr Leu Asn Gln Lys Gly Glu Leu Asp 65 70 75 80 Glu Ile Arg Lys Ile Gly Asp Tyr Asn Lys Lys Val Phe Glu Ala Met 85 90 95 Gly Leu Lys Ala Lys Tyr Val Tyr Gly Ser Glu Phe Gln Leu Asp Lys 100 105 110 Asp Tyr Thr Leu Asn Val Tyr Arg Leu Ala Leu Lys Thr Thr Leu Lys 115 120 125 Arg Ala Arg Arg Ser Met Glu Leu Ile Ala Arg Glu Asp Glu Asn Pro 130 135 140 Lys Val Ala Glu Val Ile Tyr Pro Ile Met Gln Val Asn Gly Thr His 145 150 155 160 Tyr Arg Gly Val Asp Val Ala Val Gly Gly Met Glu Gln Arg Lys Ile 165 170 175 His Met Leu Ala Arg Glu Leu Leu Pro Lys Lys Val Val Cys Ile His 180 185 190 Asn Pro Val Leu Thr Gly Leu Asp Gly Glu Gly Lys Met Ser Ser Ser 195 200 205 Lys Gly Asn Phe Ile Ala Val Asp Asp Ser Pro Glu Glu Ile Arg Ala 210 215 220 Lys Ile Lys Lys Ala Tyr Cys Pro Ala Gly Val Val Glu Gly Asn Pro 225 230 235 240 Ile Met Glu Ile Ala Lys Tyr Phe Leu Glu Tyr Pro Leu Thr Ile Lys 245 250 255 Arg Pro Glu Lys Phe Gly Gly Asp Leu Thr Val Asn Ser Tyr Glu Glu 260 265 270 Leu Glu Ser Leu Phe Lys Asn Lys Glu Leu His Pro Met Asp Leu Lys 275 280 285 Asn Ala Val Ala Glu Glu Leu Ile Lys Ile Leu Glu Pro Ile Arg Lys 290 295 300 Arg Leu 305 <210> 15 <211> 306 <212> PRT <213> Methanococcus jannaschii <400> 15 Met Asp Glu Phe Glu Met Ile Lys Arg Asn Thr Ser Glu Ile Ile Ser 1 5 10 15 Glu Glu Glu Leu Arg Glu Val Leu Lys Lys Asp Glu Lys Ser Ala Ala 20 25 30 Ile Gly Phe Glu Pro Ser Gly Lys Ile His Leu Gly His Tyr Leu Gln 35 40 45 Ile Lys Lys Met Ile Asp Leu Gln Asn Ala Gly Phe Asp Ile Ile Ile 50 55 60 Leu Leu Ala Asp Leu His Ala Tyr Leu Asn Gln Lys Gly Glu Leu Asp 65 70 75 80 Glu Ile Arg Lys Ile Gly Asp Tyr Asn Lys Lys Val Phe Glu Ala Met 85 90 95 Gly Leu Lys Ala Lys Tyr Val Tyr Gly Ser Glu Phe Gln Leu Asp Lys 100 105 110 Asp Tyr Thr Leu Asn Val Tyr Arg Leu Ala Leu Lys Thr Thr Leu Lys 115 120 125 Arg Ala Arg Arg Ser Met Glu Leu Ile Ala Arg Glu Asp Glu Asn Pro 130 135 140 Lys Val Ala Glu Val Ile Tyr Pro Ile Met Gln Val Asn Gly Gly His 145 150 155 160 Tyr Leu Gly Val Asp Val Ile Val Gly Gly Met Glu Gln Arg Lys Ile 165 170 175 His Met Leu Ala Arg Glu Leu Leu Pro Lys Lys Val Val Cys Ile His 180 185 190 Asn Pro Val Leu Thr Gly Leu Asp Gly Glu Gly Lys Met Ser Ser Ser 195 200 205 Lys Gly Asn Phe Ile Ala Val Asp Asp Ser Pro Glu Glu Ile Arg Ala 210 215 220 Lys Ile Lys Lys Ala Tyr Cys Pro Ala Gly Val Val Glu Gly Asn Pro 225 230 235 240 Ile Met Glu Ile Ala Lys Tyr Phe Leu Glu Tyr Pro Leu Thr Ile Lys 245 250 255 Arg Pro Glu Lys Phe Gly Gly Asp Leu Thr Val Asn Ser Tyr Glu Glu 260 265 270 Leu Glu Ser Leu Phe Lys Asn Lys Glu Leu His Pro Met Asp Leu Lys 275 280 285 Asn Ala Val Ala Glu Glu Leu Ile Lys Ile Leu Glu Pro Ile Arg Lys 290 295 300 Arg Leu 305 <210> 16 <211> 306 <212> PRT <213> Methanococcus jannaschii <400> 16 Met Asp Glu Phe Glu Met Ile Lys Arg Asn Thr Ser Glu Ile Ile Ser 1 5 10 15 Glu Glu Glu Leu Arg Glu Val Leu Lys Lys Asp Glu Lys Ser Ala Ala 20 25 30 Ile Gly Phe Glu Pro Ser Gly Lys Ile His Leu Gly His Tyr Leu Gln 35 40 45 Ile Lys Lys Met Ile Asp Leu Gln Asn Ala Gly Phe Asp Ile Ile Ile 50 55 60 Leu Leu Ala Asp Leu His Ala Tyr Leu Asn Gln Lys Gly Glu Leu Asp 65 70 75 80 Glu Ile Arg Lys Ile Gly Asp Tyr Asn Lys Lys Val Phe Glu Ala Met 85 90 95 Gly Leu Lys Ala Lys Tyr Val Tyr Gly Ser Arg Phe Gln Leu Asp Lys 100 105 110 Asp Tyr Thr Leu Asn Val Tyr Arg Leu Ala Leu Lys Thr Thr Leu Lys 115 120 125 Arg Ala Arg Arg Ser Met Glu Leu Ile Ala Arg Glu Asp Glu Asn Pro 130 135 140 Lys Val Ala Glu Val Ile Tyr Pro Ile Met Gln Val Asn Val Ile His 145 150 155 160 Tyr Asp Gly Val Asp Val Ala Val Gly Gly Met Glu Gln Arg Lys Ile 165 170 175 His Met Leu Ala Arg Glu Leu Leu Pro Lys Lys Val Val Cys Ile His 180 185 190 Asn Pro Val Leu Thr Gly Leu Asp Gly Glu Gly Lys Met Ser Ser Ser 195 200 205 Lys Gly Asn Phe Ile Ala Val Asp Asp Ser Pro Glu Glu Ile Arg Ala 210 215 220 Lys Ile Lys Lys Ala Tyr Cys Pro Ala Gly Val Val Glu Gly Asn Pro 225 230 235 240 Ile Met Glu Ile Ala Lys Tyr Phe Leu Glu Tyr Pro Leu Thr Ile Lys 245 250 255 Arg Pro Glu Lys Phe Gly Gly Asp Leu Thr Val Asn Ser Tyr Glu Glu 260 265 270 Leu Glu Ser Leu Phe Lys Asn Lys Glu Leu His Pro Met Asp Leu Lys 275 280 285 Asn Ala Val Ala Glu Glu Leu Ile Lys Ile Leu Glu Pro Ile Arg Lys 290 295 300 Arg Leu 305 <210> 17 <211> 306 <212> PRT <213> Methanococcus jannaschii <400> 17 Met Asp Glu Phe Glu Met Ile Lys Arg Asn Thr Ser Glu Ile Ile Ser 1 5 10 15 Glu Glu Glu Leu Arg Glu Val Leu Lys Lys Asp Glu Lys Ser Ala Gly 20 25 30 Ile Gly Phe Glu Pro Ser Gly Lys Ile His Leu Gly His Tyr Leu Gln 35 40 45 Ile Lys Lys Met Ile Asp Leu Gln Asn Ala Gly Phe Asp Ile Ile Ile 50 55 60 Leu Leu Ala Asp Leu His Ala Tyr Leu Asn Gln Lys Gly Glu Leu Asp 65 70 75 80 Glu Ile Arg Lys Ile Gly Asp Tyr Asn Lys Lys Val Phe Glu Ala Met 85 90 95 Gly Leu Lys Ala Lys Tyr Val Tyr Gly Ser Thr Phe Gln Leu Asp Lys 100 105 110 Asp Tyr Thr Leu Asn Val Tyr Arg Leu Ala Leu Lys Thr Thr Leu Lys 115 120 125 Arg Ala Arg Arg Ser Met Glu Leu Ile Ala Arg Glu Asp Glu Asn Pro 130 135 140 Lys Val Ala Glu Val Ile Tyr Pro Ile Met Gln Val Asn Thr Tyr Tyr 145 150 155 160 Tyr Leu Gly Val Asp Val Ala Val Gly Gly Met Glu Gln Arg Lys Ile 165 170 175 His Met Leu Ala Arg Glu Leu Leu Pro Lys Lys Val Val Cys Ile His 180 185 190 Asn Pro Val Leu Thr Gly Leu Asp Gly Glu Gly Lys Met Ser Ser Ser 195 200 205 Lys Gly Asn Phe Ile Ala Val Asp Asp Ser Pro Glu Glu Ile Arg Ala 210 215 220 Lys Ile Lys Lys Ala Tyr Cys Pro Ala Gly Val Val Glu Gly Asn Pro 225 230 235 240 Ile Met Glu Ile Ala Lys Tyr Phe Leu Glu Tyr Pro Leu Thr Ile Lys 245 250 255 Arg Pro Glu Lys Phe Gly Gly Asp Leu Thr Val Asn Ser Tyr Glu Glu 260 265 270 Leu Glu Ser Leu Phe Lys Asn Lys Glu Leu His Pro Met Asp Leu Lys 275 280 285 Asn Ala Val Ala Glu Glu Leu Ile Lys Ile Leu Glu Pro Ile Arg Lys 290 295 300 Arg Leu 305

Claims (91)

  1. 하기 화학식 (Ⅰ)의 아미노산을 하나 이상 포함하는 폴리펩티드의 유도 방법으로서, 상기 방법은 상기 폴리펩티드를 화학식 (ⅩⅠⅩ)의 시약과 접촉시키는 것을 포함하는 방법:
    <화학식 I>
    Figure 112013018445415-pct00378
    상기 식에서,
    A는 페닐렌이며;
    B는 결합이며;
    J는
    Figure 112013018445415-pct00379
    이고;
    R은 C1-C10알킬이며;
    R1은 H, 아미노 보호기 또는 하나 이상의 아미노산이며;
    R2는 OH, 에스테르 보호기 또는 하나 이상의 아미노산이고; 및
    R3 및 R4는 H이며;
    <화학식 (ⅩⅠⅩ)>
    Figure 112013018445415-pct00380
    상기 식에서,
    X는 검출가능한 표지이며, 검출 가능한 표지는 형광물질, 인광물질, 화학발광물질, 킬레이트제, 방사성 물질 및 발색단 및 이들의 조합으로부터 선택되거나 폴리알킬렌 글리콜이며;
    L은 C1-C24알킬렌, C1-C10알케닐렌, -O-, -O-(C1-C24알킬렌)-, -S-, -S-(C1-C24알킬렌)-, -S(O)k- (k는 1, 2 또는 3임), -S(O)k(C1-C24알킬렌)-, -C(O)-, -C(O)-(C1-C24알킬렌)-, -C(S)-, -C(S)-(C1-C24알킬렌)-, -N(R')-, -NR'-(C1-C24알킬렌)-, -C(O)N(R')-, -CON(R')-(C1-C24알킬렌)-, -(C1-C24알킬렌)NR'C(O)O-(C1-C24알킬렌)-, -O-CON(R')-(C1-C24알킬렌)-, -CSN(R')-, -CSN(R')-(C1-C24알킬렌)-, -N(R')CO-(C1-C24알킬렌)-, -N(R')C(O)O-, -N(R')C(O)O-(C1-C24알킬렌)-, -S(O)kN(R')-, -N(R')C(0)N(R')-, -N(R')C(0)N(R')-(C1-C24알킬렌)-, -N(R')C(S)N(R')-, -N(R')S(O)kN(R')-, -N(R')-N=, -C(R')=N-, -C(R')=N-N(R')-, -C(R')=N-N=, -C(R')2-N=N- 및 -C(R')2-N(R')-N(R')-로 구성되는 군으로부터 선택되는 링커이고, 상기 R' 각각은 독립적으로 H 또는 C1-C10알킬이고;
    L1 은 결합 또는 -C(R')p-NR'-C(O)O-(C1-C24알킬렌)- (p는 0,1, 또는 2임)이며;
    W는 -ON(R1)2이며, R1은 각각 독립적으로 H 또는 아미노 보호기이며; 및
    n은 1인 것인 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 시약은 하기 화학식인 것인 방법.
    Figure 112013121059860-pct00381
  3. 제1항에 있어서, 상기 유도된 폴리펩티드는 하기 구조를 갖는 아미노산을 함유하는 하나 이상의 옥심을 포함하는 것인 방법:
    <화학식 XI>
    Figure 112013018445415-pct00382
    상기 식에서, A는 페닐렌이고;
    B는 결합이고;
    R은 C1-C10알킬이고;
    R3 및 R4 각각은 H이고;
    R1은 H, 아미노 보호기, 또는 하나 이상의 아미노산이고;
    R2는 OH, 에스테르 보호기, 또는 하나 이상의 아미노산이고; 및
    R5는 L-X이고, X는 검출가능한 표지이며, 검출 가능한 표지는 형광물질, 인광물질, 화학발광물질, 킬레이트물질, 방사성물질 및 발색단 및 이들의 조합으로부터 선택되거나 폴리알킬렌 글리콜이며;
    L은 결합이거나 C1-C24알킬렌, C1-C10알케닐렌, -O-(C1-C24알킬렌)-, -S-(C1-C24알킬렌)-, -S(O)k(C1-C24알킬렌)-, -C(O)-, -C(O)-(C1-C24알킬렌)-, -C(S)-, -C(S)-(C1-C24알킬렌)-, -NR'-(C1-C24알킬렌)-, -C(O)N(R')-, -CON(R')-(C1-C24알킬렌)-, (C1-C24알킬렌)N(R')C(O)O-(C1-C24알킬렌)-, -O-CON(R')-(C1-C24알킬렌)-, -CSN(R')-, -CSN(R')-(C1-C24알킬렌)-, -N(R')CO-(C1-C24알킬렌)-, -N(R')C(O)O-, -N(R')C(O)O-(C1-C24알킬렌)-, -C(R')=N-, -C(R')=N-N(R')-, -C(R')=N-N=, -C(R')2-N=N-, 및 C(R')2-N(R')-N(R')-로 이루어진 군으로부터 선택되는 링커이며, 상기 R'각각은 독립적으로 H 또는 C1-C10알킬인 것인 방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 폴리펩티드가 온화한 산성 조건 하에 수성 용액 중에서 화학식 (ⅩⅠⅩ)의 시약과 접촉하는 것인 방법.
  5. 제4항에 있어서, 상기 조건은 pH 2 내지 8인 것인 방법.
  6. 제1항에 있어서, 상기 폴리펩티드는 하기 화학식으로 이루어진 군으로부터 선택되는 가속화제의 존재 하에서 화학식(ⅩⅠⅩ)의 시약과 접촉하는 것인 방법.
    Figure 112013018445415-pct00383
    ,
    Figure 112013018445415-pct00384
    ,
    Figure 112013018445415-pct00385
    ,
    Figure 112013018445415-pct00386
    ,
    Figure 112013018445415-pct00387
    ,
    Figure 112013018445415-pct00388
    ,
    Figure 112013018445415-pct00389
    ,
    Figure 112013018445415-pct00390
    ,
    Figure 112013018445415-pct00391
    ,
    Figure 112013018445415-pct00392
    ,
    Figure 112013018445415-pct00393
    및
    Figure 112013018445415-pct00394
  7. 제1항에 있어서, 상기 X는 형광물질, 인광물질, 화학발광 물질, 킬레이트제, 인터캘레이팅제, 방사성 물질, 발색단 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 검출가능한 표지인 것인 방법.
  8. 제1항에 있어서, 상기 X는 폴리에틸렌 글리콜인 것인 방법.
  9. 제3항에 있어서, 상기 X는 형광물질, 인광물질, 화학발광 물질, 킬레이트제, 인터캘레이팅제, 방사성 물질, 발색단 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 검출가능한 표지인 것인 방법.
  10. 제3항에 있어서, 상기 X는 폴리에틸렌 글리콜인 것인 방법.
  11. 제1항에 있어서, 상기 L은 결합인 것인 방법.
  12. 제1항에 있어서, 각 R1은 H인 것인 방법.
  13. 제8항에 있어서, 상기 폴리에틸렌 글리콜은 한 쪽 말단에서 히드록시 또는 메톡시로 끝나는 것인 방법.
  14. 제8항에 있어서, 상기 폴리에틸렌 글리콜의 분자량은 100Da 내지 100,000Da사이인 것인 방법.
  15. 제14항에 있어서, 상기 폴리에틸렌 글리콜의 분자량은 1,000Da 내지 40,000Da사이인 것인 방법.
  16. 제15항에 있어서, 상기 폴리에틸렌 글리콜의 분자량은 10,000Da 내지 40,000Da사이인 것인 방법.
  17. 제1항에 있어서, 상기 L은 -O-(C1-C24알킬렌)-, C-(O)-(C1-C24알킬렌)-, NR'-(C1-C24알킬렌)-, -CON(R')-(C1-C24알킬렌)-, -N(R')CO-(C1-C24알킬렌)-, 각 R'는 독립적으로 H 또는 C1-C10알킬인 것인 방법.
  18. 제17항에 있어서, 상기 L은 -CON(R')-(C1-C24알킬렌)-이고, R'는 H인 것인 방법.
  19. 제18항에 있어서, 상기 X는 폴리에틸렌 글리콜인 것인 방법.
  20. 제13항에 있어서, 상기 폴리에틸렌 글리콜은 한 쪽 말단에서 메톡시로 끝나는 것인 방법.
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