PT2061878E

PT2061878E - Supressor híbrido arnt para células de vertebrados

Info

Publication number: PT2061878E
Application number: PT78379716T
Authority: PT
Inventors: Thea Norman; Feng Tian; Stephanie Chu
Original assignee: Ambrx Inc
Priority date: 2006-09-08
Filing date: 2007-09-07
Publication date: 2014-04-22
Also published as: CA2662753A1; AU2007292892A1; EP2061878A4; NZ574721A; EP2061878B1; JP5399906B2; WO2008030613A3; IL196912A; CN101541955B; DK2061878T3; CN101541955A; KR20090051227A; CN106190983B; CN106190983A; JP2010502222A; US9133495B2; EP2061878A2; WO2008030613A2; US9868972B2; CA2662753C

Description

DESCRI Ο

SUPRESSOR HÍBRIDO ARNT PARA CÉLULAS DE VERTEBRADOS CAMPO DA INVEN O A invenção refere-se ao campo da tradução bioquímica em células de vertebrados. A invenção refere-se a métodos para 3 produção e composições de ARNt ortogonais, sintetases ortogonais e pares destas, em células de vertebrados. A invenção também se refere a composições de aminoácidos não naturais, proteínas e métodos de produção de proteínas em células de vertebrados, que incluem aminoácidos não naturais.

ANTECEDENTES DA INVEN O 0 código genético de cada organismo conhecido, de bactérias a seres humanos, codifica os mesmos vinte aminoácidos comuns. Diferentes combinações dos mesmos vinte aminoácidos naturais formamr proteínas que realizam praticamente todos os complexos processos da vida, a partir da fotossíntese para a transdução de sinal e a resposta imune. A fim de estudar e modificar a estrutura e função da proteína, os cientistas tentaram manipular, tanto o código genético como a sequência de aminoácidos das proteínas. No entanto, tem sido difícil remover as limitações impostas pelo código genético que limitam as proteínas aos vinte blocos de construção padrão codificados geneticamente (com a rara exceção da selenocisteína (ver, por exemplo, A. ock et al., (1991), Molecular Microbiology 5:515-20) e da pirrolisina (ver, por exemplo, G. Srinivasan, et al., (2002), .Science 2 96:1459-62). sido feito para eliminar essas

Algum progresso tem restrições, embora este progresso tenha sido limitado e a capacidade de controlar racionalmente a estrutura e função da proteína ainda esteja na infância. Por exemplo, os químicos têm desenvolvido métodos e estratégias para sintetizar e manipular as estruturas de moléculas pequenas (ver, por exemplo, EJ Corey, e X. -M. Cheng, The logic of Chemical Synthesis (Wiley-InterScience, New York, 1995}). A síntese total (ver, por exemplo, , Merrifield, (19 6), Science 232:341-7 (19 6}}, e em metodologias semissintéticas (ver, por exemplo, DY Jackson et al., (1994) Science 256:243-7; e, PE Dawson, S & Kent, (2000), Annual Review of iochemistry 69:923-60), tornaram possível sintetizar os péptidos e proteínas pequenas, mas estas abordagens têm uma utilidade limitada, com proteínas com mais de 10 kilo Daltons (kDa) . Métodos de mutagénese, apesar de poderosos, estão restritos a um número limitado de mudanças estruturais. Num certo número de casos, tem ar a. vi dos

Na tentativa de expandi estrutura e função das a capacidade de manipu proteínas, foram desenvo. sido possível incorporar c omp e t i t ivame n te análogos estruturais de aminoácidos comuns através de proteínas. Ver, por exemplo , R. Furter, (199 ), Protein Sei ence 7:419- 26; Kirshenbaum K., et al., (2002), Chem ioChem 3:235-7, e V. Doring et al. , (2001) , Science 29; 2:501-4. métodos in vitro utilizando ARNt's ortogonais quimicamente acilados que permitem que aminoácidos não-naturais sejam incorporados seletivamente em resposta a um códão aberrante, in vitro (ver, por exemplo, JA Ellrnan, et al., (1992), Science 255:197-200). Aminoácidos com novas estruturas e propriedades físicas foram incorporados seletivamente em proteínas para o estudo da dobragem de proteínas e a estabilidade e reconnecimento biomolecular e de catálise. Ver, por exemplo, D. Mendei, et ai., (1995), Annual Review of iophysics and iomelecular Structure 24:435-462 e, VW Cornish, et al. (31 de Março de 1995), Angewandte Chemie International, edição em inglês, 34:621-633. No entanto, a natureza estequiométrica deste processo limita severamente a quantidade de proteína que pode ser gerada.

Aminoácidos não naturais foram micro-injetados em células. Por exemplo, aminoácidos não-naturais foram introduzidos no receptor de acetilcoiina nicotínico em oócitos de Xenopus (por exemplo, MW Nowak, et al. (199 ), a incorporação, in vivo, de aminoácidos não naturais em canais iónicos no sistema de expressão de oociclo de Xenopus, Method Enzymol. 293:504-529} por microinieção de ARNt de Tetrahymena tnermophila quimicamente misacilatada (por exemplo, ME Saks, et al. (1996), An engineered Tetrahymena tRNAGin for in vivo incorporation of unnatural amino acids into p r o teín s b y ηo nse n s e gαρρression, J. io1, C h e m. 2/1.2o 169-231 75} , e o ARNm correspondente. Isto permitiu estudos biofísicos detalhados do receptor em oócitos através da introdução de aminoácidos contendo cadeias laterais com propriedades físicas ou químicas únicas. Ver, poi exempio, DA Dougrierty (2000) , Unnatural amino acids as prooes of protein s Chem. iol. L.

Rcture and function, Curr. Opin. 4-, oõ2. Infelizmente, este método está era célul< limitado a proteínas que podem ser micro- injetadas, e porque o ARNt relevante é acilado quimicamente in vii.ro, e nao poae ser re-acilado, o rendimento das proteínas é muito baixo. novos

Para superar estas limitações, os novos componentes roram adicionados à máquina biossintética da proteína da. E. coli procariota (E. coli) (por exemplo, L. Wang, et al., (2001), Science 292:49 -500}, o que permitiu a codificação genética de aminoácidos não naturais in vivo. Uma série de novos oácidos com novas p r op r i e da.de s químicas, z í s i c a s ou ógicas, incluindo marcadores de fotoai l midade oácidos photoisomerizáveis, ceto amino ácidos, e aminoácidos glicosilados, foram incorporados de forma eficiente e com alta fidelidade em proteínas em E. coli, em resposta ao códão âmbar, TAG, utilizando esta metodologia. Ver, por exemplo, JW Chin et al., (2002), Journal of the American Chemical Society 124:9026-9027; JW Chin, e PG Schultz, (2002), Chern ioChem 11:1135-1137; JW Chin et al., (2 002), PNAS Uni ted States of America 99:11020-11024; e, L. Wang, PG Ò£ Schultz, (2002), Chem. Com. 1-10. No en t a n r o, a maqi zinaria translacional de procariotas »r> eucariotas, não é altamente conse rvada; assim, os componentes da maquinaria biossintética adicionados a E. coli não podem muitas vezes ser utilizados para incorporar, em sítio específico, aminoácidos não naturais em proteínas em células de vertebrados. Por exemplo, o par de tirosil-ARNt-sintetase de Methanococcus j annaschii/ERNt que foi utilizado, em. E. coli não é ortogonal em células de vertebrados. Além disso, a transcrição de ARNt em eucariotas, mas não em procariotas, é efectuada pela polimerase III de ARN, e isto coloca restrições à sequência primária dos genes estruturais de ARNt que podem ser transcritas em células de vertebrados. .Além disso, em contraste com as células procariotas, o ARNt em células de vertebrados necessita de ser exportado a partir do núcleo, onde é t r a n s c r i. t o, p a r a. o citoplasma, para. f u n c i o n a r na tradução Finalmente, o ribossoma 0S do vertebrado Θ distinto do r i b o s s o ma 7 0 S procariótico. Assim, existe uma necessidade de desenvolver -............ melhores componentes d.a maquinaria biossintética para expandir o código genético de vertebrados. A presente invenção preenche estas e outras necessidades, como será evidente após a revisão da descrição que se segue.

SUMÁRIO ΏΑ INVEN O A invenção proporciona células de vertebrados, em que a célula de vertebrado não é uma célula estaminal embrionária humana ou células humanas in vivo, com componentes de tradução, por exemplo, pares de sintetases de aminoacil-ARNt ortogonais (O-RS) e ARNt ortogonal (O-ARNt com uma. sequência tal como estabelecido na SEQ ID N°: 7} e seus componentes individuais, que são utilizados na maquinaria biossintética de proteínas de vertebrados para incorporar um aminoácido não natural de uma cadeia polipeptídica em crescimento, numa célula de vertebrado.

As composições da invenção incluem uma célula de vertebrado (por exemplo, uma célula de mamífero, uma célula de ave, uma célula de peixe, uma célula de réptil, uma célula de anfíbio, células derivadas a partir de animais não mamíferos, etc.), que compreende uma sintetase aminoacil-ARNt ortogonal (O-RS) (por exemplo, derivada de um organismo não-vertebrado, como Escherichia coli, Bacillus stearothermophilus, etc.), em que o O-RS preferencialmente arainoacila o ARNt. ortogonal com uma sequência tal como estabelecido na SEQ ID N°: 7 (O-ARNt) com peio menos um aminoácido não-natural na célula de vertebrado. onalmente, do i s uma dada célula oacila o O-ARNt rte, dois ou mais OARNt podem ser aminoacilados de vertebrado. Num aspecto, um O-RS com o aminoácido não natural, por exemplo, pelo menos 40 , pelo menos 45 , pelo menos 50 , pelo menos 60 , pelo me no s 7b , pelo menos 0 , ou mesmo 90 ou mais , de forma tão eficiente como o t az um O-RS que possui uma sequência de aminoácidos, Por exemplo, como descrito na SEQ ID N° : 6 ou 45. Numa forma de realização, um O-RS da descrição aminoacila o O-ARNt com o aminoácido não natural, por exemplo, pelo menos 10 vezes, pelo menos 20 vezes, pelo menos de 30 vezes, etc., de modo ma is eficiente do que o O-RS aminoacila o O-ARNt com um aminoácido natural.

Numa forma de realização, o O-RS ou uma porção do mesmo é codificado por uma sequência de polinucieótido como definido em qualquer uma das SEQ ID N°: 3-35, ou uma sequência polinucleotídica complementar destas. Numa outra forma de realização, o O-RS compreende uma sequência de aminoácidos tal como exposto em qualquer uma das SEQ ID N°:. 36-63, e/ou 6, ou uma variação conservativa destas. Em ainda outra forma de realização, o O-RS compreende uma sequência de aminoácidos que é, por exemplo, pelo menos 90 , pelo menos 95 , pelo menos 9 , pelo menos 9 9 , ou pelo menos 99,5 ou mais, idêntica à de uma sintetase de tirosil aminoacil-ARNt- que ocorre naturalmente (TyrRS) e compreende dois ou mais aminoácidos dos grupos A-E. O aruoo A inclui valina, isoleucina, leucina, glicina, serina, alanina, ou treonina na posição correspondente a Tyr37 de uma E. coli TyrRS. O grupo inclui aspartato na posição correspondente a Asnl26 de uma E. coli TyrRS. O grupo C inclui treonina, serina, arginína, asparagina ou glicina numa posição correspondente a Aspl 2 de um E. coli TyrRS. O grupo D inclui metionina, alanina, valina, ou tirosina na posição correspondente a Phel 3 de uma E. coli TyrRS, e, o grupo E inclui serina, metionina, valina, cisteína, treonina ou alanina na posição uma E. coli TyrRS. correspondente a Leul 6 de

Numa outra forma de realização, o O-RS tem uma ou mais propriedades enzimáticas melhoradas ou aprimoradas para o aminoácido não natural em comparação com um aminoácido natural. Por exemplo, as propriedades melhoradas ou aprimoradas para o aminoácido não natural em comparação com um aminoácido natural incluem qualquer de, por exemplo, um Km mais elevado, um Km mais baixo, um maior kcat, um kcat mais baixo, um kcat/Km mais baixo, um kcat/Km mais elevado, etc. opcionalmente, um vertebrado também uma sequência tal em que o O-ARNt p r efere n c i a1me nte al pelo O-RS. Num A célula de vertebrado também inclui, aminoácido não natural. A célula de inclui um ARNt ortogonal (O-ARNt) , coro como estabelecido na SEQ ID N°: 7, reconhece um códão seletor e é aminoacilado com o aminoácido não natur aspecto, o O-ARNt medeia a incorporação do aminoácido não natural numa proteína com, por exemplo, pelo menos 45 , pelo menos 50 , peio menos 60 , peio menos 75 , pelo menos 0 , peio menos 90 , peio menos 95 , ou 99 , da eficácia de um ARNt que compreende ou é processado numa célula a partir de uma sequência polinucleotídica, conforme estabelecido na SEQ ID N°: 65.

Numa outra forma de realização, a célula de vertebrado compreende um. ácido nucleico que compreende um polinucleótido que em que o polinucle reconhecido peio codifica um polipeptídeo de interesse, ótido compreende um códão seletor que é O-ARNt. Num aspecto, o rendimento do polipeptideo de interesse, compreendendo o aminoácido não natural é, por exemplo, pelo menos 2,5 , pelo menos 5 , pelo menos 10 , pelo menos 25 , pelo menos 30 , pelo menos 4 0 , 50 ou mais, do que o obtido para o polipeptídeo que que o po. aspecto, a ausência H -'-'i ocorre naturalmente, de interesse a partir de uma célula em polinucleótido não possui o códão seletor. Sm outro lula produz o polipeptídeo de interesse, na ausência do aminoácido não natural, com um rendimento que é f por exemplo, menos do que 3o , menos do que 30 , menos do que 20 , men os do que 15 , menos do que 10 , menos do que 5 , menos do que z, 5 f etc./ d.o rendimento do polipeptídeo na presença do aminoácido não natural. A invenção também fornece uma célula de um vertebrado, compreendendo uma sintetase de aminoacil-ARNt ortogonal (O-RS) , um ARNt ortogonal (O-ARNt com uma sequência tal como estabelecido na SEQ ID N°: 7), um aminoácido não-natural, e um ácido nucleico que compreende um polinucleótido que codifica um polipeptídeo de interesse. O polinucleótido compreende um códão seletor que é reconhecido pelo O-ARNt. Além disso, o O-RS preferencialmente aminoacila o ARNt ortogonal (O-ARNt), com o aminoácido não natural na célula do vertebrado, e a célula produza o polipeptídeo de interesse, na ausência do aminoácido não natural, com um rendimento que é, por exemplo, menos do que 30 , menos do que 20 , menos do que 15 , menos do que 10 , menos do que 5 , menos do que 2,5 , etc., do rendimento do polipeptídeo na presença do aminoácido não natural.

As composições que incluem uma célula de um vertebrado, compreendendo um ARNt ortogonal (O-ARNt com uma. sequência tal como estabelecido na SEQ ID N°: 7) são também uma característrca da invenção. Tipicamente, o O-ARNt medeia a incorporação de um aminoácido não-natural numa proteína que é codificada por um polinucleótido que compreende um códão seletor que é reconhecido pelo O-ARNt, in vivo, Numa forma de realização, o O-ARNt medeia a incorporação do aminoácido não natural na proteína com, por exemplo, pelo menos 45 , pelo menos 50 , pelo menos 60 , pelo menos 75 , pelo menos 0 , pelo menos 90 , pelo menos 95 , ou mesmo 99 ou mais, a eficiência de um ARNt que compreende ou é processado numa célula a partir de uma sequência polinucleotídica, conforme estabelecido na SEQ ID N°: 65.

Num aspecto da divulgação, o O-ARNt O O -l·-·' ' transcricionalmente modificado. A divulgação também fornece um ácido nucleico que codifica um O-ARNt, numa célula de um mesma, vertebrado, ou um polinucleótido complementar

Numa forma de realização, o ácido nucleico compreende uma caixa A e uma caixa A invenção também fornece métodos para a produção, numa célula de um vertebrado, de pelo menos uma proteína que compreende pelo menos um aminoácido não natural (assim como as proteínas produzidas por tais métodos), Os métodos incluem, por exemplo, crescimento, num meio apropriado, de uma célula de um vertebrado, que compreende um ácido nucleico que compreende pelo menos um códão seletor e codifica a proteína. A célula de vertebrado também compreende um ARNt ortogonal, com uma sequência tal como estabelecido na SEQ ID N°: 7 ou (O-ARNt) que funciona na célula e reconhece o códão seletor e uma sintetase de aminoacil-ARNt- ortogonal (O-RS) que preferencialmente aminoacila o O-ARNt com o aminoácido não natural, e o meio compreende um aminoácido não natural. Numa forma de realização, o O-RS aminoacila o O-ARNt com o aminoácido não exemplo 50 natural a, por exemplo, pelo menos 45 , pelo menos pelo menos 60 , pelo menos 75 , pelo menos 90 , pelo menos 90 , pelo menos 95 , ou mesmo 99 ou mais, de forma tão eficiente como o faz um O-RS que possui uma sequência de aminoácidos, por exemplo, como descrito em SEQ ID M°: 6 ou 45. Em ainda outra forma de realização, o O-RS compreende uma sequência de aminoácidos tal como exposto em qualquer uma das SEQ ID N°: 36-63, e/ou 6.

Em certas formas de realização, a proteína codificada compreende uma. proteína terapêutica, uma proteína. de diagnóstico, uma. enzima industrial ou urna sua porção. Numa forma de .realização, a proteína que é produzida pelo método é ainda modificada através do aminoácido não natural. Por exemplo, o aminoácido não natural é modificado por meio de, por exemplo, uma reação nucleófila-electrofílica, por meio de uma cicloadição [3 + 2], etc. Numa outra concretização, a. proteína produzida pelo método é modi menos, uma modificação pós-translacional glicosilação, 0-glicosilação, acetilação, moc paimitoi 1 a ç ao, adiçãc fosforilação, modificação da ligação giic semelhantes), in vivo. ficada por, peio (por exemplo, N-acilação, lípido-de palrai tato, olípida, e outros

Em certas formas de realização, as composições e os métodos da 'presente invenção incluem células de vertebrados. Uma célula de vertebrado da presente invenção inclui qualquer uma da, por exemplo, uma célula de mamífero, uma célula de levedura, uma célula de fungo, uma célula de planta, uma célula de insecto, etc., em que a célula não é uma célula estarninal embrionária humana ou células humanas in vivo. Os componentes de tradução da presente invenção podem ser derivados a partir de uma variedade de organismos, por por exemplo um col i, Baci11us a r c h a e b a c t e r i u m, exemplo, organismos não vertebrados, como organismo procariota (por exemplo, E. stearothermophilus, ou semelhante}, ou uma ou Dor exemplo, um organismo de vertebrados ética s de ódãos ódãos

Um códão seletor da invenção expande a estrutura gen· do códão da maquinaria biossintética das proteína vertebrados. Qualquer uma de uma variedade de c seletores pode ser utilizado na invenção, incluindo c de paragem (por exemplo um códão de terminação raros, quatro (ou mais) re, ou códãos es. , um códão âmbar, um códão o opalino), códãos aberrantes, códâos de base e/ου semelhan idos não naturais que podem ser Lções e mét odos aqui descritos incluem ios a) : um p-acetil- L-fenilalanina, um

Exemplos d€ (mas nao estão niai p-iodo-L-fenilalanina, um O-metil-L-tirosina, um p- propargi 1 oxifeni 1 a 1 anina, um p-proparg 1.1.-feni 1 a. 1 anina, uma L-3-(2-naftil) alanina, uma 3-metil-fenilalanina, um 0-4-alil-L-tirosina, uma 4-propil-L-tirosina, uma tri-O-acetil-GlcNAc3~serina, uma L-Dopa, uma fenilalanina fluorada, uma i s op r op i 1 - L - feni 1 a 1 an i na, uma p-a z i do - L - í en i 1 a 1 an i na, uma. p-acil-L-fenilaianina, um p-benzoil-L-fenilalanina, uma L-fosfosserina, uma fosfonoserina, uma fosfonotirosina, uma p -bromofenilalanina, uma p-amino-L-fenilalanina, uma isopropil-L-fenilalanina, um análogo não natural de um aminoácido tirosina; um análogo não natural de um aminoácido glutamina, um análogo não natural de um aminoácido fenilalanina, um análogo não natural de um aminoácido serina, um análogo não natural de um aminoácido treonina; um alquilo, arilo, acilo, azido, ciano, halo, hidrazina, hidrazida, hidroxilo, aleenilo, alcinilo, éter, tiol, sulfoniio, seleno, éster, tioácido, borato, boronato, fosfo, fosfono, fosfina, heterocíclico, enona, imina, aldeído, hidroxilamina, ceto, ou aminoácido amino substituído, ou qualquer combinação dos mesmos; um aminoácido com um aaente de reticulação fotoativável; um aminoácido marcado com rotação; um aminoácido fluorescente; uma ligação de aminoácidos de metal; um aminoácido contendo um metal; um aminoácido radioativo; um aminoácido fotocontido e/ou fotoisomerizável; uma biotina ou um análogo de biotina contendo aminoácidos; um aminoácido contendo ceto; um aminoácido que compreende polietilenoglicol ou. poliéter; um aminoácido de átomo pesado substituído; um aminoácido quimicamente clivável ou fotoclivável; um aminoácido com uma cadeia lateral alongada; um aminoácido que contém um grupo tóxico; um aminoácido de açúcar substituído; um aminoácido contendo açúcar ligado a carbono; um aminoácido redox-ativo; um a-hidroxi contendo ácido; um aminoácido tio; um aminoácido a,a bissubstituído; um aminoácido β; um aminoácido cíclico que não seja prolina ou histidina, um aminoácido aromático diferente da fenilalanina, tirosina ou triptofano, e/ou semelhantes.

Aqui descritos são polipep por exemplo, O-ARNt, polinu suas porções {por exemplo, o1igonuc1eót i dos ut i1i zados mutantes de aminoacil-ARNt, tídeos (Q-RS) e polinucleídos, cleótidos que codificam O-RS ou o sítio ativo da. sintetase) , os para a construção de sintetases polinucleótidos que codificam por uma uma proteína ou polipeptídeo de interesse, que compreendem um ou rriais códãos seletores, etc. Por exemplo, um polipéptido inclui um polipeptídeo que compreende uma sequência de aminoácidos tal como exposto em qualquer uma das SEQ ID N°; 36-63, e/ou 6, um polipeptídeo que compreende uma sequência de aminoácidos codificada sequência, de polinucleótido como definido em. qualquer uma das SEQ ID N°: 3-35, e um polipeptídeo que é especificamente imunorreativo com um anticorpo especifico para um polipeptídeo que compreende uma sequência de aminoácido como mostrado em qualquer uma das SEQ TD N°: 36-63, e/ou 6, ou um polipeptídeo que compreende uma sequência de arninoáciclos codificada por uma sequência de polinucleótidos, como mostrado em qualquer uma das SEQ ID N°: 3-35.

Também incluídos entre os polipeptídeos aqui descritos é um polipeptídeo que compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 90 idêntica à de uma sintetase de tirosil aminoacil-ARNt- que ocorre naturalmente (TyrRS) (por exemplo, SEQ ID N°: 2) e compreende dois ou mais aminoácidos dos grupos A-E (referido acima). Do mesmo modo, os polipeptídeos também. incluem, opcionalmente, um polipeptídeo que compreende pelo menos 20 aminoácidos contíguos, de qualquer uma das SEQ ID N°: 36-63, e/ou 6, e dois ou mais substituições de aminoácidos, tal como indicado acima, em grupos A-E. Uma sequência de aminoácidos compreendendo uma variação conservativa de qualquer um dos polipeptídeos acima referidos é também incluída como um polipeptídeo da invenção.

Kits também são uma característica da invenção.

Por exemplo, é fornecido um kit para a produção de uma proteína que compreende peio menos um aminoácido não natural numa célula, em que o kit inclui um recipj_0n-r0 contendo uma sequência polinucieotídica, conforme estabelecido na SEQ ID N°: 7 ou . Numa. forma de realização, 0 pit inclui ainda pelo menos um aminoácido não natural. NUItia outra forma de a i n d a x n s t r u ç õ e s realização, o kit compreende a proteína.BREVE DESCRI O DOS DESENHOS A Figura 1 mostra o aumento da expressão de hGH usando o ARNt híb r ido. para produzir

DESCRI O DETALHADA

Antes de descrever ser entendido que d i s p o s 1.1 ivos ρ a r t i c é claro, variar. a presente invenção em detalhe, é para esta invenção não está limitada a ulares ou sistemas biológicos que podem, É também para ser compreendido que a terminologia utilizada aqui é para o propósito descrever apenas formas de realização particu] a ser limitativa. Tal como é usado ires, e não se destina nesta especificação e nas reivindicações anexas, as formas singulares "um", uma o contexto exemplo, a de duas ou misturas de e "o" incluem referentes plurais a menos que indique claramente o contrário. Assim, por referência a "uma célula" inclui Uma combinação ma is células, a referência a "bactérias" inclui bactérias e semelhantes. A menos que de outra forma aqui abaixo definida ou na restante descrição, todos os termos técnicos e científicos aqui utilizados têm o mesmo significado que o normalmente entendido por aqueles peritos na técnica à qual a invenção pertence.

Homólogo:

Proteínas homólogas quando e/ou sequências de proteínas são s ã o de r i va da s, na t u r a1me n t e ou artif icialmente, cie uma proteína ancestral comum, ou sequência de proteína. Do mesmo modo, os ácidos nucleicos e/ou sequências de ácidos nucleicos sao nomologas quando são derivados, naturalmente ou artificialmente, de um ácido nucleico ancestral comum, ou sequência de ácido nucleico. Por exemplo, qualquer ácido nucleico de ocorrência natural pode ser modificado por qualquer método de mutagénese disponível para incluir um ou raars codãos seletores. Quando expresso, este ácido nucleico mutado codifica um polipeptídeo compreendendo um ou mais aminoácidos não naturais. 0 processo de mutação pode, naturalmente, alterar adicionalmente um ou mais códãos padrão, mudando, assim, um ou mais aminoácidos padrão da proteína mutante resultante, também. A homologia é geralmente inferida a partir de semelhança de sequência entre dois ou mais ácidos nucleicos ou proteínas (ou sequências das mesmas). A percentagem precisa de similaridade entre as sequências que sao úteis para estabelecer homologia varia com o ácido nucleico e a proteína em questão, mas tão pouco quanto 25 de semelhança de sequências é rotineiramente utilizado para estabelecer a. homologia. Níveis mais elevados de similaridade de sequência, por exemplo, 30 , 40 , 50 , 60 , 95 , ou 99 ou mais, também podem ser utilizados para. estabelecer a homologia. Métodos para determinar as percentagens de similaridade da sequência (por exemplo, LASTP e LASTN usando parâmetros padrão) são descritos aqui e estão geralmente disooníveis.

Ortogonal: Tal como aqui utilizado, o termo "ortogonal" refere-se a uma molécula (por exemplo, um ARNt ortogonal (O-ARNt) e/ou uma sintetase de aminoacil-ARNt- ortogonal (O-RS)) que funciona com componentes endógenos de uma célula com reduzida eficiência., em comparação em com uma s i s tema molécula correspondente que é endógena à célula ou de tradução, o u que não funcionam com os componentes endógenos da célula. No contexto de sinte fases de amiη o a c i1-ARNt e ARNt, ortogonal refere-se a uma incapacidade ou reduzida efi. ciência, por exemplo, menos de 20 de eficiência, menos de 10 de eficiência, menos de 5 ortogonal ARNt para funcionar com uma sintetase de ARNt-endógena comparada com um ARNt endógeno para funcionar com uma sintetase de ARNt endógeno, ou uma sintetase de am i noac i. 1 - ARN i ortogonal para funcionar com um ARNt endógeno comparada com uma sintetase de ARNt··· endógena para funcionar com o ARNt endógeno. A molécula ortogonal carece de uma molécula complementar endógena funcional na. célula. Por exemplo, um ARNt ortogonal numa célula é aminoaciiado por qualquer RS endógeno da célula com reduzida eficiência ou mesmo nula, quando em comparação com a aminoacilação de um ARNt endógeno pelo RS endógeno. Em outro exemplo, um RS ortogonal aminoacila qualquer .ARNt endógeno numa célula de interesse com reduzida ou mesmo nula a eficiência, em comparação com a aminoacilação do .ARNt endógeno por um RS endógeno. Uma segunda molécula ortogonal pode ser introduzida na célula, que funciona com a primeira molécula ortogonal. Por exemplo, um par ARNt/RS ortogonal inclui componentes complementares introduzidos que funcionam em conjunto na cé lu 1 cl com uma eficiência (por exemplo, 50 de eficiência, 60 de eficiência, 70 de eficiência, 75 de eficiência, 0 de eficiência, 90 de eficiência, 95 de eficiência, ou 99 ou mais, de efic iênc ia) para a de um par ARNt/RS endógeno correspondente.

Complementar: O termo "complementar" refere-se a componentes de um par ortogonal, Ο-ARNt e O-RS, que podem eficiente, menoí do que 1 da eficiência, de im funcionar em conjunto, aminoacila o O-ARNt. por exemplo( em que o

O-RS

Preferencialmente aminoacila.: 0 termo "preferencialmente aminoacila" refere-se a uma eficiência, por exemplo, 70 eficaz, 75 eficaz, 5 eficaz, 90 eficaz, 95 eficaz, ou 99 ou rnais eficiente, em que um O-RS aminoacila um O-ARNt com um aminoácido não natural em comparação com a aminicilação de um O-RS para um ARNt que ocorre naturalmente ou um material de partida usado para gerar o O-ARNt. O aminoácido não natural é incorporado na cadeia crescente do polipeptídeo com alta fidelidade, por exemplo, com uma. eficiência superior a 75 para um determinado códão seletor, a uma maior eficiência do que cerca de 0 de um determinado códão seletor, a uma maior eficiência do que cerca de 90 de um determinado códão seletor, a uma maior eficiência do que cerca de 95 de um determinado códão seletor, ou em mais do que cerca de 99 ou mais de eficiência de um determinado códão seletor. refere-se a códãos de tradução e não rcuito do anticódão ARNrrt e incorpora o Códão seletor: O termo "códão seietor" reconhecidos pelo O-ARNt num processo reconhecidos por um ARNt endógeno. O ci do O-ARNt reconhece o códão seletor no seu aminoácido, por exemplo, um aminoácido não-natural, neste sítio no polipeptídeo. Códãos seletores podem incluir, por: exemplo, códãos aberrantes, tais como, códãos de paragem, por exemplo, códãos âmbar, ocre e opala; quatro ou mais códãos de base; códãos raros; códãos derivados de pares de bases naturais ou não naturais e/ou semelhantes.

Supressores de ARN t: Um supressor de ARNt é um ARNt que altera a ieiti ira de um ARN me ns a ge iro (ARNm) num dado sistema de tradução, por exemplo, proporcionando um mecanismo para incorporar um aminoácido numa cadeia de polipeptideo, em resposta a um um ARNt supressor pode ler, paragem, um códâo de quatro semelhantes. códão seletor. Por exemplo, por exemplo, um códâo de base, um códão raro, e/ou refere-se a um. repeti damen t e exemplo, um do aminoácido numa ou ma is ARNt. recic 1 á.ve 1.: 0 termo "ARNt reciclável" ARNt que é aminoacilado e pode ser reaminoacilado com um aminoácido (por aminoácido não natural) para a incorporação (por: exemplo, o aminoácido não natural) cadeias de poiipeptídeos durante a tradução.

Sistema de tradução: 0 termo "sistema de tradução" refere-se ao conjunto de componentes colectivos que incorporam um aminoácido de ocorrência natural numa cadeia poiipeptidica em crescimento (proteínas). Os componentes de um sistema de tradução podem incluir, por exemplo, ribossomas, ARNt, sintetases, mRNA, aminoácidos, e similares. Os componentes da invenção (por exemplo, ORS, OARNt, aminoácidos não naturais, etc.) podem ser adicionados a um sistema de tradução in vitro ou in vivo, por exemplo, uma célula de um vertebrado, por exemplo, uma célula de levedura, uma célula de mamífero, uma célula de planta, uma célula de alga, unia célula de fungo, uma célula de inseeto, e/ou semelhantes.

Aminoácido "aminoácido aminoácido um dos 2 0 cisterna se não natural: Tal como aqui utilizado, o termo não natural" refere-se a qualquer aminoácido, modificado, e/ou análogo de aminoácido que não ó aminoácidos comuns que ocorrem naturalmente, leno ou pirrolisina.

Derivado de: referemei o de ai como aqui utilizado, o termo "derivado" se a um componente que é isolado de, ou feito por informações a partir de uma molécula ou organismo espec cado. utilizado, o termo "RS inactivo" que tenha sido mutada de modo que seu ARNt cognato natural com um RS inativo: Tal como aqui refere-se a uma sintetase já não pode aminoacilar c aminoácido.

Marcador de seleção positiva ou de rastreio: Tal como aqui utilizado, o termo "marcador de seleção positiva ou de rastreio” refere-se a um marcador que quando presente, por exemplo, expresso, ativado ou semelhante, resulta na identificação de uma célula com o marcador de seleção positiva daqueles sem o marcador de seleção positiva. í]ai como aqui

Marcador de seleção negativa ou de rastreio: utilizado, o termo "marcador de seleção negativa ou de rastreio" refere-se a um marcador que quando presente, por exemplo, expresso, ativado ou semelhante, permite a identificação de uma célula que não possua a propriedade desejada (por exemplo, quando comparada a uma célula que possua a propriedade desejada), .er" refere-se selecionar os Por exemplo,

Repórter: Corno aqui utilizado, o termo "repor a um, componente que pode ser utilizado para componentes-alvo de um sistema de interesse. um repórter pode incluir um marcador de rastreio fluorescente (por exemplo, a proteína fluorescente verde), um marcador luminescente (por exemplo, uma. proteína de luciferase de pirilampo), um marcador de rastreio baseado em afinidade, ou marcador de genes selecionáveis, tais como h i s 3, u r a 3, 1 e u 2, 1 y s 2, .1 a c Z Adh (desidrogenase de álcool β-gal/lacZ (β-galactosidase), ou outros semelhantes.

Vertebrados: Tal como aqui utilizado, o termo "vertebrado" refere-se a organismos pertencentes ao domínio filogenético Eucarya, tais como animais, por exemplo, mamíferos, répteis, pá.s saros, etc. Não eucarlota: Tal como aqui utilizado, o termo "não-eucariota" refere-se a organismos não vertebrados. Por exemplo, um organismo não vertebrado pode pertencer ao domínio filogenético Eubacteria (por exemplo, Escherichia colir Thermus thermophilus, Bacillus stearothermophilus, etc.), ou ao domínio filogenético Archaea (por exemplo, Methanococcus jannaschii, Methanobacterium thermoautotrophicum, Halobacterium tal como Haloferax volcanii e Halobacterium espécies MRC-J, Archaeoglobus fulgidas, Pyrococcus furiosas, Pyrococcus horikoshí i, Aeuropvruni pernix, etc) .

Anticorpo: 0 termo "anticorpo", como aqui utilizado, inclui, mas não está limitado sl um polipeptídeo substancialmente codificado por um gene de imunoglobulina ou genes de imunoglobulina, ou seus fragmentos, que especificamente se ligam e reconhecem um analito (antigénio). Os exemplos incluem anticorpos policlonais, monoclonais, quiméricos, e anticorpos de cadeia simples, e semelhantes. Os fragmentos de imunoglobulinas, incluindo fragmentos Fab e fragmentos produzidos por uma biblioteca de expressão, incluindo a exibição de fagos, estão também íncruxdos

Ver, por no termo exemplo, "anticorpo" tal como aqui utilizado. Paul, Fundamental Immunology, 4 ed., 1999, Raven Press, Nova Iorque, para a estrutura do anticorpo e terminologia.

Variante conservativa: O termo "variante eonservativa" refere-se a um componente de tradução, por exemplo, uma variante conservativa de O-ARNt ou uma variante conservativa de O-RS, que realiza funcionalmente como o componente a partir da qual a variante conservativa se baseia, por exemplo, um O-ARNt ou O-RS, mas tem variações na sequência. Por exemplo, um O-RS irá aminoacilar um 0-ARNt complementar ou uma variante conservativa do O-ARNt com um aminoácido não-natural, embora o O-ARNt e a variante conservativa do O-ARNt não tenham a mesma sequência. A variante conservativa pode ter, por exemplo, uma variação, duas variações, três variações, quatro variações, ou cinco ou mais variações na sequência, desde que a variante conservativa seja complementar do O-ARNt ou O-RS correspondente. etc.

Agente de seleção ou de rastreio: Tal como aqui utilizado, o termo "agente de seleção ou de rastreio" refere-se a um agente que, quando presente, permite uma seleção/rastreio de determinados componentes a partir de uma população. Por exemplo, um agente de seleção ou de rastreio inclui, mas não está limitado a, por exemplo, um nutriente, um antibiótico, um comprimento de onda de luz, um anticorpo, um polinucleotídeo expresso (por exemplo, um modulador da transcrição de proteínas), ou outros semelhantes. 0 agente de seleção pode ser variado, por exemplo, por concentração, intensidade, detectável » f ^ i que, quando permite a

Substância detectável: 0 termo "substância como aqui utilizado, refere-se a. um agente ativado, alterado, expresso ou similar, seleção/rastreio de uma p opu 1. a ç ã o . P o r ser um agente quimic determinados componentes a partir de exemplo, a substância detectável pode por exemplo, o ácido 5-fluroorótico (5-FOA), que sob certas condições, por exemplo, a expressão do gene repórter URA3, torna-se detectável, por exemplo, um produto tóxico que mata as células que expressam o repórter ura: A capacidade de modificar geneticamente as estruturas de proteínas diretamente em células de vertebrados, para além das limitações químicas impostas pelo código genético, fornece uma ferramenta molecular poderosa tanto para sondar como para manipular os processos celulares, A invenção proporciona os componentes de translação que expandem o número de aminoácidos geneticamente codificados em células de vertebrados. Estas incluem ARNt (por exemplo, ARMt ortogonais (O-ARNt)), sintetases de aminoacil-ARNt (por exemplo, sinteta.se ortogonal (O-RS) ) , pares de O-ARNt/0-RSs, e aminoácidos não-naturais.

Tipicamente, O-ARNt da invenção é expresso e processado de forma eficiente, em função da tradução numa célula de um vertebrado, mas não é significativamente aminoacilado pelas sintetases do aminoacil-ARNt do hospedeiro. Em resposta a um códão seletor, o O-ARNt da invenção proporciona um aminoácido não natural, que não codifica qualquer um dos vinte aminoácidos comuns, a uma cadeia polipeptídica em crescimento durante a tradução do mRNA, um O-ARNt

Um O-RS preferencialmente aminoacila um O-ARNt da invenção com um aminoácido não natural numa célula de vertebrado, mas não aminoacila qualquer ARNt citoplasmático do hospedeiro. Além disso, a especificidade de uma sintetase de aminoacil-ARNt fornece aceitação de um aminoácido natural, enquanto exclui quaisquer aminoácidos endógenos. Os polipeptídeos que incluem sequências de aminoácidos do exemplo O-RS, ou pc >eí dos mesmos, são também descritos aqui. Além disso, os polinucleótidos que codificam os componentes de translação, O-ARNt, O-RS, e porções dos mesmos, são também descritos aqui. A invenção proporciona ainda métodos para. a produção de uma proteína de uma célula de um vertebrado, onde a proteína compreende um aminoácido não natural. A proteína é produzida usando os componentes de tradução da presente invenção.

Os kits para a produção de uma proteína ou polipeptídeo com um aminoácido não natural também são uma característica da invenção.

Sinteta e de aminoacil-ARNt ortogonal (O-RS) A fim de incorporar espec.ificam.ente um aminoácido não-natural numa proteína ou polipeptídeo de interesse, numa célula de um vertebrado, a especificidade do substrato da sintetase é alterado de modo a. que apenas o aminoácido não natural desejado, mas não qualquer um dos 20 aminoácidos comuns, seja imputado ao ARNt. Se a sintetase ortogonal é promíscua, irá resultar em proteínas mutantes com uma mistura de aminoácidos naturais e não naturais, na posição alvo. A invenção proporciona composições e métodos para, cru® produzir sintetases de ami η o a c i1-ARMt ortogonais modificaram a especificidade do substrato aminoácido não natural especifico. para am É revelada uma célula de vertebrado ou linha cexuiar u-* inclui uma sintetase de aminoacil-ARNt ortogonal (O-kS) O-RS preferencialmente aminoacila um ARNt ortogonal, cOÍ ;D N°: 7 (0' ;élula de :iliza ou :§-0 um uma sequência tal como estabelecido na b.uy ARNt) com um aminoácido não natural na vertebrado. Em certas formas de realização, o O-kí mais do que um aminoácido não natural, por exemplo, aox» mais, de três ou mais, etc. Assim, um O-RS da divuigaÇ·-pode ter a. capacidade de aminoa.ci.iar preferencialmente Ο-ARNt com uma sequência tal como estabelecido na SEQ ^

* -r ¢1 + O N°: 7 com diferentes aminoácidos não naturais. i^1' permite um nível adicional de controlo ao selecionar aminoácidos não naturais ou a combinação de aminoacidos π naturais que são colocados com a célula e/ou selecionando as diferentes quantidades de aminoácidos não naturais são colocados com a célula para a sua incorporação.

Um O-RS, opcionalmente tem um ou mais propriedades enzimáticas melhoradas ou. aprimoradas para o aminoácido na° natural em comparação com um aminoácido natural. Estas propriedades incluem, por exemplo, Km mais elevado, Km menos elevado, kcat mais elevador, kcat menos elevado, kcat/Km menos elevado, kcat/km mais elevado, etc., para o aminoácido não-natural, em relação a um aminoácido que ocorre naturalmente, por exemplo, um dos 20 aminoácidos conhecidos comuns. à célula de IQ ID K° : 3-35. :ar de st. ·*>/"· T a de aminoá SE( 2 ID N°: : .. Vâ . Ver , por 6 aqui para

Opcionalmente, o O-RS pode ser fornecido vertebrado por um polipeptídeo que inclui um O-RS e/ou por um polinucleótido que codifica um O-RS ou uma sua porção. Por exemplo, um O-RS, ou uma sua porção, é coQifrc<aao por uma sequência de polinucleótido como aefini.0.0 em qualquer uma das SEQ ID N°: 3-35, ou uma sequência poiinucleotídica uma das conserva·

sequências de moléculas O-RS

Exemplo exemplares pelo menos 9 , pelo idêntica à de u.m.a

Um O-RS pode também compreender uma sequência de aminoácidos que é, por exemplo, pelo menos 90 , pelo menos 95 , pelo menos 9 , pelo menos 99 , ou ainda pelo menos uma sintetase de tiros.il aminoac.il-ARN t - ocorrendo naturalmente (TyrRS) (por exemplo, como descrito em SEQ ID N°: 2) e compreende dois ou mais aminoácidos do grupo A-E. 0 grupo A inclui valina, isoleucina, leucina, glicina, serina, alanina, ou treonina, na posição correspondente a Tyr37 o'a E. coli TyrRS; o grupo inclui aspartato na posição correspondente a Asnl26 de E. coli TyrRS; o grupo C inclui treonina, serina, arginina, asparagi na ou glicina numa posi ção correspondente a Aspl 2 de E. coli TyrRS; o grupo D inclui metionina, a lanina, valina, ou tirosina na posição correspondente a Phe 1 3 de E. col i TyrRS; e, o grupo E inclui serina, met ionina, va 1. i na, cisteína, t reonina ou alanina na posição correspondente a Leu 1 6 de E. coli TyrRS. a divulgação exemplo, um

Além de que o Q-RS, uma célula de vertebrado podem incluir componentes adicionais, por aminoácido não natural. A célula de vertebrado também inclui um ARNt orrogonai (O-ARNt) (por exemplo, derivado de um organismo não-vertebrado, tais como Escherichia coli, Bacillus stearothermophilus, e/ou semelhantes), em que o 0-ARNt reconhece um codão seletor e é pref erencialruente aminoacilado com o aminoácido não natural pelo 0-RS. Um ácido nucleico que compreende um polinucleótido que codifica um polipeptídeo de interesse, em que o poli nu c1e ó ti do compreende um códão s e1e t o r que é reconhecido pe lo O-ARNt, ou uma. combinação de um ou mais destes, também pode estar present e na célula.

Num aspecto, o < O-ARNt medeia, a in corporação do aminoácido não natural numa proteína com, por exemplo, pelo menos 45 , pelo menos 50 , pelo menos 60 , pe lo menos 75 , pelo menos r\ u / pelo menos 90 , pelo menos 95 , ou 99 ou a eficiência de como um ARNt que compreende ou é processado c i. partir de uma sequência polinucleotídica, conforme estabelecido na SEQ ID N°: 65. ARNt ortogonal

Uma célula ou linha de células de vertebrado que incluem um ARNt ortogonal (O-ARNt), com uma sequência como apresentado na SEQ ID N°: 7 ou são fornecidos pela invenção, em que a célula não é uma célula estaminal embrionária humana ou células humanas in vivo e a linha de células não é uma linha de células estaminais embrionárias humanas. 0 ARNt ortogonal medeia a incorporação de um aminoácido não-natural para uma proteína que é codificada por um polinucleótido que compreende um códão seletor que é reconhecido pelo O-ARNt, in vivo. Em certas formas de realização, um O-ARNt da invenção medeia a incorporação de um aminoácido não-natural numa proteína com, por exemplo, pelo menos 4 0 , pelo menos 45 , pelo menoí 3 50 , pelo menos 60 , pelo menos 75 , pelo menos 0 , ou mesmo 90 ou mais, de forma tão eficiente < como ARNt que compreende ou é processado numa célula a partir de uma sequência p o1i n u c1e o 11d i c a, c o n f o rme estabeleci .do n a SEQ ID N° : 65 Ver, Tabela 5, aqui

Fidelidade, Eficiência e Rendimento :aç ao de um amin O '<6 O ido não na tu ral /- rescente de pol ipe; ptídeo, n uma xemplo, em re SDO; sta a um có dão -o, maior do que 7 5 f maior do que ou mesmo mais do que 99 ou mai O? O f ou A ii cie lida de refere-se à precisão com que uma molécula desejada, por exemplo, um amínoácido não natural ou aminoácidos, é incorporada num polipeptídeo em crescimento, numa posição desejada. Os componentes traducionais da invenção incorporam aminoácidos não naturais, com elevada fidelidade, em proteínas, em resposta a um códão seletor. Por exemplo, utilizando os componentes da invenção, a eficiência da incorporaçã desejado numa cadeia mais eficiente em comparação com a incorporação indesejada dum amínoácido natural específico a ser incorporado na cadeia polipeptídica em crescimento na posição desejada-.

Eficiência também pode referir-se ao grau com que o 0-Rfí aminoacila o O-ARNt com o amínoácido não natural em comparação com um controlo relevante. 0 O-RS pode ser definido peia sua eficiência. Em certas formas de realização da divulgação, um O-RS é comparado com outros 0-RS. Por exemplo, um O-RS da divulgação aminoacila um 0-ARNt com um amínoácido não natural, por exemplo, pelo menos 4 0 , pelo menos 50 , peio menos 60 , pelo menos /5 , pelo menos 0 , pelo menos 90 , pelo menos 95 , ou mesmo 99 ou ΓΠ3 -1 S r Q0 f o rma. tão eficiente como um O-RS que possui uma sequência de am inoá eidos, por exemplo, como descrito em SEQ ID N°: 6 ou 45} ou outro sspe cifico na Tabela 5) aminoacila um O-ARNt. Numa outra forma de realização, um 0—RS da divulgação aminoacila o O-ARNt com o aminoácido não natural, pelo menos, 10 vezes, pelo menos, o 0-RS aminoacila o O-ARNt 20 vezes, pelo menos 30 vezes, etc., de forma mais eficiente do que o O-RS aminoacila o O-ARNt com um aminoácido natural.

Usando os componentes traducionais da divulgação, o rendimento do polipeptídeo de interesse, compreendendo o aminoácido não natural é, por exemplo, pelo menos 5 , pelo menos 10 , pelo menos 2 0 , pelo menos 30 , pelo menos 4 0 , 50 ou mais, do que o obtido para o polipeptídeo de interesse que ocorre naturalmente, a partir de uma célula em que o polinucleótido não possui o códão seietor. Em na do 2, tro aspecto, a célula produz o polipeptídeo de interesse, ausência do aminoácido não natural com um rendimento que por exemplo, menos do que 30 , menos do que 2 0 , menos que 15 , menos do que 10 , menos do que 5 , menos do que 5 , etc., do rendimento do polipeptídeo na presença do natural. aminoácido nao

Origem e organi mo ho pedeiro

Os componentes traducionais ortogonais da divulgação são tipicamente derivados de organismos não-vertebrados para uso em células de vertebrados ou sistemas de tradução. Por exemplo, o O-ARNt ortogonal pode ser derivado de um organismo não-vertebrado, por exemplo, um Eubacterium, tais como Escherichia coli, Thermus thermcphilus, Bacillus stearothermphilus, ou semelhantes, ou um archaebacterium, tal como Methanococcus jannaschii, Methanobacterium thermoautotrophicum, Halobacterium tal como Haloferax volcanii e Halobacterium sp NRC-1, Archaeoglobus fulgidus, Pyrococcus furiosus, Pyrococcus horikoshii, um pernix europyrum, ou semelhantes, enquanto que os O-RS ortogonais podem ser derivados de um organismo não-vertebrado, por exemplo, um Eubacterium, tais como Escherichia coli,

Th e rm u s t h e rm oph i 1 u s, Bac: . Ui :ear o the rmph íhn ou semelhantes, annaschíi, um archaebacterium, tal como Methanococcus Metha n oba c t e r í um th erm o a u t o t: r oph i c um ,

Halobacterium tal como Haloferax volcanii e Halobacterium sp NRC-1, Archaeoglobus fulgidus, Pyrococcus fu ri osus, Pyrococcus horikoshii, Aeuropyrum pernix, ou outros semelhantes. Em alternativa, também podem ser usadas as fontes de vertebrados, por exemplo, plantas, algas, protistas, fungos, leveduras, animais (por exemplo, mamíferos, insectos, artrópodes, etc.), ou semelhan tes, por exemplo, onde os componentes sâo ortogonais a uma célula ou sistema de tradução de interesse, ou se forem modificados (por exemplo, mutant.es) para serem ortogonais para a célula ou o sistema de tradução.

Os componentes individuais de um par O-ARNt/O-RS podem ser derivados do mesmo organismo ou de organismos diferentes. Numa forma de realização, o par O-ARNt/O-RS é a partir do mesmo organismo. Por exemplo, o par O-ARNt/O-RS pode ser derivado a partir de um par de sintetase/ARNtcuA de tirosil-ARNt- de E. coli. Alternativamente, o O-ARNt e o O-RS do par O-ARNt/O-RS são opcionalmente a partir de organismos diferentes. 0 O-ARNt ortogor ia!, O-RS ou o par O-ARNt/O-RS podem ser selecionados ou rastreados e/ou uti1izados numa célula de vertebrado para produzir um poiipeptídeo com um aminoácido não natural. Uma célula de vertebrado, em que a célula não é uma célula estaminal embrionária humana ou células humanas in vivo, podem ser de uma variedade de fontes, por exemplo, um animal vertebrado (por exemplo, um mamífero, um anfíbio, aves, répteis, peixes, etc.), ou outros semelhantes. As composições de células de vertebrados com componentes traducionais da divulgação são também uma característica da divulgação. ilaação também fornece para o rastreio ficiente de uma especre

>clITcL utilização opcional em espécies e/ou numa segunda espécie (opcionalmente, sem seleção/rastreio adicional). Por exemplo, os componentes dos O-ARNt/O-RS são selecionados ou rastreados numa espécie, por exemplo, uma espécie de levedura, vertebrados, complexa tal alga, um pro exemplo, um semelhantes, facilmente manipulada (-por exemplo, uma célula etc.) e introduzidos numa segunda espécie de por exemplo, uma planta (por exemplo, planta como monocotiledóneas ou dicotiledóneas) , uma cista, um fungo, uma levedura, um animal (por mamífero, um insecto, um artrópode, etc.), ou para uso na incorporação in vivo de um aminoaciao nao natura na segunaa especie. relativ ausente urke, et al Spring Harbor York. Além d de eucariotas (1996) Trans.

Por exemplo, Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) pode ser escolhido como a primeira espécie de vertebrado, como é unicelular, tem um tempo de geração genética rápida e bem caracterizada. Ver, por exemplo, D, et al., (2000) Methods in Yeast Genetics, Cold aboratory Press, Cold Spring Harbor, New lém disso, uma vez que a maquinaria translacional é altamente conservada (ver, por exemplo, ational Control. Cold Spring Harbor

Laboratory, Cold Spring Harbor, New York; Y. Kwok & JT

Wong, (19 0), Evolutionary relationship between Halobacterium cutirubrum and eukaryotes determined by use of aminoacyl-TRNA synthetases as phylogenetic, Canadian Journal of iochemistry 5 :213-21 e, (200i) The Ribosoma. Cold Spring Harbor Lahoratory Press, Coid Spring Harbor, New York), genes aaRSs para a incorporação de aminoaciaos não naturais descobertos em S. cerevisiae podem ser introduzidos em organismos vertebrados superiores e usados, em parceria com ARNt cognato de (ver, por exemplo, K. Sakamoto, et al(2002) Site-specific inincorporation of na unnatural amino acid into proteins in mammalian cells, Nucleic Acids Res. 30:4692-4639 e, C. Kohrer, et al, (2001), Import of amber and ochre supressor tRNA's into mammalian cells: a general approach to site-specific insertion of amino acids ana.logu.es into, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 9 :14310-14315) para incorporar os aminoácidos não naturais.

Num exemplo, o método de produção de O-ARNt/O-RS numa primeira espécie, tal como aqui descritos inclui ainda a. introdução de um ácido nucleico que codifica o O-ARNt e um ácido nucleico que codifica o O-RS numa célula de uma segunda espécie de vertebrado (por exemplo, um mamífero, um insecto, um fungo, uma algo, uma planta e semelhantes) . Em outro exemplo, um método de produção de uma si.nteta.se de aminoacil-ARNt- ortogonal (O-RS) que preferencialmente aminoacila um ARNt ortogonal com um aminoácido não natural numa célula de vertebrado inclui: (a) submeter a seleção positiva, na. presença de um aminoácido não natural, uma população de células de vertebrados de uma primeira espécie ias células biblioteca ii) um ARNt (por exemplo, levedura e semelhantes). Cada uma de vertebrados compreende: i) um membro de uma de sintetases de aminoacil-ARNt- (RSs) , ortogonal (O-ARNt), iii) um polinucleótido que codifica um marcador de seleção positiva, e iv) um poiinucleóLido que codifica um marcador de seleção negativa. As células que sobrevivem à seleção positiva compreendem um RS ativo que aminoacila o ARNt ortogonal {O-ARNt}, na presença ae um aminoácido não natural. As células que soorevivem à sereçao positiva são submetidas á seleção negativa, na ausência do aminoácido natural para eliminar RS ativos que ammoacilam o O-ARNt com um aminoácido natural. Isto proporciona um 0-RS que preferencialmente aminoacila o O-ARNt com o aminoácido não natural. Um ácido nucleico que codifica o 0- ARN t e um ácido nuclei co que codifica o 0 -RS (ou os componentes de O-ARNt e, / /*·, ·. Ί ' K.J CA CO cr 1 o são in troduzidos numa célula de vertebrado duma í segunda espécie, por exemplo, um mamífero, um. insecto, um fun go, uma 3 IOg f uma planta e/ou semelhantes. Tipicamente, o O-ARNt obtido por sujeição a seleçâo negativa de uma população de células de vertebrados duma primeira espécie, em que as células de vertebrados compreendem um membro de uma biblioteca de ARNt. A seleção negativa elimina as células que compreendem um membro da biblioteca de ARNt que é aminoacilado por uma sintetase de aminoacil-ARNt (RS) que é endógena às células de vertebrados, o que proporciona um conjunto de ARNt que é ortogonls para a célula de vertebrado da primeira espécie e da segunda espécie. Cód o eletore

Os códãos seletores da divulgação expandem a estrutura genética do códão da maquinaria biossintética da proteína. Por exemplo, um códão seletor inclui, por exemplo, um único códão de três bases, um códão aberrante, tal como um códão de paragem, por exemplo, um códão âmbar (UAG) opala (UGA) , um códão não natural, pelo menos i quatro bases, u m códão raro, ou semelhantes.

Um certo número de códãos seletores pode ser introduzido num gene por exempJ of uni ou mai^, goís ou mai3, ms-is do oue três, etc. Uma vez que o gene pode incluir várias cópias de um dsit exniinao.o coduo se~Letor, ou pode incliij-r vários códãos seletores diferentes, ou qualquer combinação dos mesmos.

Lvem o uso de um ra a. incorp ora ção numa célu la de do q ;ue rec onh ece e é aminoa cil ado

Numa forma de realização, os metOv códao seletor que é um codão de pai de aminoácidos nâo naturais m vertebrado. Por exemplo , um O-ARNt £ o códão de terminação, por exemplo, por um O-RS com um aminoácido nao na ARNt não é reconhecido peias sintet do hospedei ro natural. A mutagénese sintetases de aminoacil-ARNt itaqénese dirigida convencional códão de paragem, por , num pc.' Lipeptídeo de JR, et ai í : Q ) » » \ -- ) r s .izada para inti exemplo, TAG, no sitio de mteresí interesse. Ver, por exemplo, Sayers, )SP horoth ioate- based o ligc onucleoti Nu ί C A. Θ I. C Acids Res., ' 7 91- • 02. Qua ndo o ácido Γ1 La O -h eico qi ae codifica r\ V.· resse são combinados / Ln vivo, o é incor porado na seqi aênc ;ia do códão .pe ptideo cont( sndo o ami noácido não 3! Exonuclease in directed mutagenesis. Nucleic os RS-O, O-ARM polipeptídeo de aminoácido nâo n. natural na posição especificada A incorporação de aminoácidos não naturais in vivo pode ser feita sem perturbação significativa da célula do vertebrado hospedeiro. Por exemplo, porque a eficácia de supressão do códáo UAG depende da competição entre o O-ARNt, por exemplo, o ARNt supressor âmbar, e um factor de libertação de vertebrados (por exemplo, eRF) (que se liga a um códão o'e paragem e inicia a libertação do péptido crescente a partir do riDOásomd)t a θriciência da supressão pode ser modulada por, por exemplo, aumenranGo o nível de expressão de O-ARNt, por exemplo, o ARNt supressor.

Os C ódaos seletores também compreendi: códãos estendidos, por exemplo. quatro ou mais códãos de base, tais como, quat: cr o, cinco , seis ou mais códãos de base. Exemplos de quatro códãos de base incluem, por exemplo, AGGA, CUAG, UAGA, , CCCU e semelhantes. Exemplos de cinco có dãos de base incluem, por exemplo, AGGAC, CCCCU, CCCUC, CUAGA, COACU, UAGGC e semelhantes. Uma característica da invenção inclui o uso de códãos estendidos baseados na supressão de enquadramento. Quatro ou mais códãos de base podem inserir, por exemplo, um ou vários aminoácidos não naturais na mesma proteína. Por exemplo, na presença de mutantes de O-ARNt, por exemplo, um quadro de leitura especial de um ARNt supressor, com laços anticódão, por exemplo, com, pelo menos, -10 nt laços anticódão, os quatro ou mais códãos de base são lidos como um único aminoácido. Em outras formas de realização, os laços anticódão podem descodificar, por exemplo, pelo menos um códão de quatro bases, pelo menos um códâo de cinco bases, ou, pelo menos, um códão de sers bases cu mais. Uma vez que existem 256 possíveis códãos de quatro bases, vários aminoácidos não naturais podem ser codificados na mesma célula através de um códão de quatro bases ou mais. Ver, Anderson et ai., (2002) Exploring the Limits of Codon and Anticodon Size, Chemistry and ioiogy, 9:237-244; Magliery, (2001) Expanding the Gexietic Code: Selection of Efficient Suppressors of Four-base Codons and Identification of "Shifty" Four-base Codons with a Library Approach in Escherichia coli, J. Mol. iol. 307; 755--/69.

Por exemplo, os códãos de quatro bases foram usados para incorporar os aminoácidos não naturais em proteínas, utilizando os métodos biossintéticos in vitro. Ver, por exemplo, Ma et al., (1993) iochemistry, 32:7939; e Hobsaka et al., (1999) J. Am. Chern. Chem. Soc., 121:34. CGGG e AGGU foram utilizados para incorporar simultaneamente 2-naftilalanina e um derivado ND de lisina na estreptavidina, in vitro, com duas molduras de enquadramento de supressores ARNt quimicamente acilados. Ver, por exemplo, Hohsaka et al., (1999) J. Am. Chem, Chem. Soc., 121:12194. Num estudo in vivo, Moore et ai. examinaram a capacidade de derivados de ARNtLeu com anticódãos NCUA para suprimir códãos UAGN (N pode ser U, A, G ou C) e verificaram que o quadrupleto UAGA pode ser descodificado por um. ARNtLeu com um anticódão UCUA com. uma. eficiência de 13 a 26 com pouco decodificaçâo no quadro 0 ou 1. Veja, Moore et ar., (2uOQ) J. Mol. ror., c9 .j.3o. Numa concretização, os códãos extensos baseados em códãos raros ou códãos aberrantes podem ser utilizados na invenção, os quais podem reduzir a. leitura aberrante e supressão de desvio de enquadramento em outros sítios i nde s e jado s.

Par a um dado si stema, um códão um dos três c :ódãos de base end ógeno não ut; ou utiliz nat ural. Por ex emplo. isto inc ARN t que reconhece o < códão de sis tema em qu e c j códão de três :

Os códãos seletores incluem opcionalmente pares de bases não naturais. Estes pares de bases não naturais expandem ainda ma is o alfabeto genético existente. Um par de bases adicional aumenta o numero de códãos triplos 64-125. As propriedades dos terceiros pares de bases incluem emparelhamento de base estável e seletivo, incorporação enzimática eticiente no ADN com , alta fidelidade por uma polimerase, Θ cl θ X t‘, β Ώ S 8 O do iniciador continuo eficiente cipos s s i í itese do par de bases nso natural nascente.

Descrições de p ares cie bases não naturais que podem ser adaptados para os métodos e composições incluem, por exemplo, H ira o, et a 1., (2002) An unnatural base pair for incorporating amino acid analogues into protein, Nature iotechnology, 20:177-1 2. Outras publicações relevantes estão listadas abaixo.

Para uso in vivo, o nucleosídeo não natural é permeável e é fosforilado para formar o trifosfato correspondente. Além disso, o aumento da informação genética é estável e não destruído por enzimas celulares. Esforços anteriores por enner e outros aproveitaram padrões de ligação de hidrogénio, que são diferentes dos pares canónicos Watson-Crick, o exemplo mais notável dos quais é o par iso-C:iso-

Ver, por exemplo, Switzer et al., (19 J. Am. "hem. oo: ) Curr. Opin. Chem. iol., 4:602; e / 1 V 1 99 ) Angew. Chem. Int. Ed. EngI., 36, ço para desenvolver um pa r de bases não

Soc., 111: 322; e Piccirilli et al., (1990) Nature, 343:33; Kool, (2000) Curr. Opin. Chem. iol., 4:602. Estas bases em geral emparelham incorretamente em algum grau com bases naturais e não podem ser replicadas por via enzimática. Kool e colaboradores demonstraram que as interações hidrofóbicas entre as bases podem substituir ligações de hidrogénio para conduzir à formação de pares de bases. Veja, Kool, í natural satisfazendo todos os requisitos acima, Schultz, Romesberg e colaboradores têm sistematicamente sintetizado

e estudado urna série de bases hidrofóbicas não-naturais. Um auto-par PICS:PICS é encontrado ser mais estável do que os pares de bases naturais e pode ser eficientemente incorporado no ADN pelo fragmento de Klenow de ADN 0 1 ei imera se i de E. c : 01 i (KF) . Ve;; ia-se, por exempl al., (1999) J. Am . Chem. Chem . Soc., 121:115 6 ai., (2000) J. A: m. Chem. Q o o O c. , 122:3274. Um : 3 MN pode ser sintetiz. a do por KF com ef seletividade suficiente para a função biológica Ver, por exemplo, Ogawa et al., (2000) J. Am. Chem. Soc., 122: 03.

Mo entanto, ambas as bases agem como um terminador de cadeia para replícação adicional. Uma polimerase de ADN mutante recentemente desenvolvida pode ser usada para replicar o auto-par PICS. Além disso, um auto-par 7A1 pode ser replicado. Veja-se, por exemplo, Tae et ai., (2001) J. Am. Chem. Soc:., 123:7439. Um novo par de metalobase, Dipic:Py, também tem sido desenvolvido, o qual forma um par-estável sobre a ligação Cu (II). Veja, Meggers et al., (2000) J. Am. Chem. Soc., 122:10714. Porque códãos estendidos e os códãos não naturais são intrinsecamente ortogonais aos códãos naturais, os métodos da invenção podem tirar proveito dessa propriedade para gerar ARNt o r t o go n a i s p a r a ele s.

Um sistema de bypass de translação, também pode ser utilizado para incorporar um aminoácido não natural num. polipeptídeo desejado. Num sistema de bypass de translação, uma grande sequência é inserida num gene, mas não é traduzida em proteína.. A sequência contém uma estrutura que serve como uma sugestão para induzir o ribossomo para pular por cima da sequência e retomar a tradução a jusante da inserção. Âmino eido η o natural

Tal como aqui utilizado, um aminoácido não natural refere-se a qualquer aminoácido, aminoácido modificado, ou análogo de aminoácido diferente de selenocisteína e/ou pirrolisina e dos seguintes vinte alfa-aminoácidos codificados geneticamente: alanina, arginina, asparagina, ácido aspártico, cisteína, giutamina, ácido glutâmico, glicina, histidina, isoleucina, leucina, lisina, metíonina, feniJ. alanina, prolina, serina, treonina, triptofano, tirosina, valina, A estrutura genérica de um alfa-aminoácido é ilustrada pela Fórmula I:

I

R

H2N CojH

Um aminoácido possuindo a substituinte naturais, Vej não natural é tipicamente qualquer estrutura Fórmula 1, em que o grupo R é qualquer que não seja utilizado nos vinte aminoácidos a-se, por exemplo, iochemistry de L, Stryer,

Freeman and Company, Nev/ York, para as vinte amir loáci dos naturais. Note-se que, os naturais da invenção podem ser composi ;.os naturalmente diferentes dos vinte alfa- 3rd ed. 19 e s t r u t u r a s d o aminoácidos n que ocorrem aminoácidos acima.

Uma vez que os aminoácidos não naturais da divulgação tipicamente diferem dos aminoácidos naturais na cadeia lateral, os aminoácidos não naturais formam ligações amida com outros aminoácidos, por exemplo, naturais ou não naturais, da mesma maneira em que são formados em proteínas que ocorrem naturalmente. No entanto, os aminoácidos não naturais têm grupos de cadeia lateral que os diferenciam dos aminoácidos naturais. Por exemplo, R na Fórmula I compreende opcionalmente um grupo alquilo-, arilo-, acilo-, ceto-, azido-, hidroxil-, hxdrazina, ciano, halo, hidrazida, alceniio, axcxnilo, éter, tiox, seleno-, sulfonil-, borato, boronato, fosto, fosfono, fosfina, heteroc enona, imina, aldeído, éster, tioácidos, hidroxilamina, aminas, e outros semelhantes, ou qualquer combinação dos mesmos. Outros aminoácidos não naturais de interesse incluem, mas não estão limitados a, aminoácidos, compreendendo um agente de ligação cruzada fotoativável, aminoácidos marcados com rotação, aminoácidos fluorescente, aminoácidos de ligação a metais, aminoácidos que contêm metais, aminoácidos radioativos, aminoácidos com novos grupos funcionais, aminoácidos que interagem covalentemente ou não covalentemente com outras moléculas, aminoácidos fotocontidos e/ou fotoisomerizáveis, aminoácidos contendo biotina ou análogos de biotina, aminoácidos contendo ceto, aminoácidos que compreendem polieti lenogiicol ou poliéter, aminoácidos contendo um átomo pesado substituído, aminoácidos qu imicamente cliváve is ou fotocliváveis, ami no á eidos com uma cadeia lateral alongada em comparação J -L. -L -çf L, tP J. O U U, raa: com os aminoácidos naturais (por exemplo, po! hidrocarbonetos de cadeia longa, por exemplo, maiores do que cerca de 5, maiores do que cerca de 10 átomos de carbono, etc.), aminoácidos contendo açúcar ligado a carbono, aminoácidos redox-ativo, aminoácidos contendo aminotioácido, e aminoácidos que contenham um ou mais licais tóxicos. Em algumas formas de realização, os aminoácidos não naturais têm um agente de ligação cruzada fotoativável que é utilizado, por exemplo, para ligar uma proteína a um suporte sólido. Numa forma de realização, os aminoácidos não naturais têm uma porção sacarídeo ligada à cadeia lateral do aminoácido (por exemplo, aminoácidos glicosilados) e/ou outra modificação hidratos cie cartono.

Além dos aminoácidos não naturais -pie laterais novas, Oí aminoácidos contêm c .a d. e 1. a s ião tcLturais, também, c ompre e ndem e s t r u tu ra s .ficadas, por exemplo, como ilustrado opcionaiaente, mo< de esqueleto Pe1a s e s t ru tu ra s

ie Fórmulí :i e III Π RA. ΠΙ R «' em que Z normalmente compreende OH, nh2, sh, I R1 , X e Y, que poaem ser iguais ou c liferentes, tip icamente S ou 0, e R e R' , CTU0 são, opcií mes mo ou diferentes, são selecionado is tipicame: da mesma lista de constituintes do grupo R de para os aminoácidos não naturais que têm a Fórmula I, bem como hidrogénio. Por exemplo, aminoácidos não naturais da invenção compreendem opcionalmente substituições no grupo amino ou carboxilo, t al como i lustrado pe las Fórmulas III. Aminoácidos não naturais deste tipo inc ruem, mas estão limitados a, ácidos a-hidroxi, a- tioácidos aminotiocarboxilatos, por exemplo, com cadeias laterais correspondentes aos vinte aminoácidos naturais comuns ou cadeias laterais não naturais.

Além disso, as substituições no α-carbono incluem opcionalmente L, D, ou aminoácidos α-α-dissubstituídos, tais como D-glutamato, D-alanina, D-metil-O-tirosina, ácido aminobutírico, e semelhantes. Outras alternativas estruturais incluem aminoácidos cíclicos, tais como análogos de prolina, bem como um. anel de 3,4,6, /, e 9 membros de análogos de prolina, aminoácidos β e γ, tais como β-alanina substituída e ácido γ-amino-butírico. p0r exemplo, muitos aminoácidos não naturais são baseados em aminoácidos naturais, tais corno tirosina, glutamina, fenilalanina e similares. Os análogos de tirosina incluem tirosinas para-substituidas, tirosinas orto-substituídas, e tirosinas meta substituídas, onde a tirosina substituída inclui, por exemplo, um grupo ceto (por exemplo, um grupo acetilo) , um grupo benzoílo, um grupo amino, uma hidrazina, uma hidroxiamina, um grupo tiol, um grupo carboxilo, um grupo isopropilo, um grupo metilo, uma cadeia linear ou ramificada de hidrocarboneto Cç-C20r um hidrocarboneto saturado ou insaturado, um grupo O-metilo, um grupo poliéter, um grupo nitro, um grupo alcinilo ou semelhantes. ui ol os

Além disso, os anéis de arilo rnultiplamente subi também são contemplados. Análogos de glutamina da invenção incluem, mas não estão limitados a, derivados de a-hidroxi, derivados de γ-substituídos, derivados cíclicos, e derivados de glutamina amida substituídos. Exemplo de análogos de fenilalanina incluem, mas não estão limitados a, fenilalaninas para-substituídas, fenialaninas orto-substituídas, e fenilalaninas meta-substituídas, em que o substituinte compreende, por exemplo, um grupo hidroxi, um grupo meroxi, um grupo metilo, um grupo alilo, aldeído, azido, iodo, bromo, um grupo ceto (por exemplo, um grupo acetilo), um benzoílo, um grupo alcinilo, ou semelhantes. Os exemplos específicos de aminoácidos não naturais iiiCruem, mas não estão limitados a, p-acetil-n- fenilalanina, a p-propargiloxifenilalanina, O-metil-L-tirosina, uma L-alanina-3-(2-naftilo), uma 3-metil-fenilalanina, uma 4-alil-L-tirosina-O, uma 4 propil-L- tirosina, uma tri-O-acetil-GlcNAcp-serina, uma L-Dopa, uma fenilalanina fluorada, uma isopropil-L-fenilalanina, uma p-azido-L-fenilalanina, uma p-acil-L-fenilalanina, uma p-benzoil-L-fenilalanina, uma L-fosfosserina, uma fosfoserina, uma fosfonotirosina, uma p-iodo-fenilalanina, uma p-bromofenilalanina, uma p-amino-L-fenilalanina, e uma i s o p r ο ρ i 1 - L - f e n i 1 a 1 a n i n a e o u t r o s s e me 1 ha n t e s , E s t r u t u r a s adicionais de uma variedade de aminoácidos não naturais são fornecidos, por exemplo, as Figuras 16, 17, 1 , 19, 26, e 29 do documento WO 2002/0 5923, intitulado "In vivo incorporation of unatural amino acids". Ver também, a Figura 1, estruturas 2-5 do Kiick et al., (2002)

Incorporation of azides into recombinante proteins for chemoselecyive modifications by the Staudinger ligation, PNAS 99:19-24, para análogos de metionina adicionais. São fornecidas composições que incluem um aminoácido não natural (tal como p-(propargiloxi)-fenilalanina). Várias composições compreendendo p-(propargiloxi)-fenilalanina e, por exemplo, proteínas e/ou células, são também fornecidas. Num aspecto, uma composição que inclui o aminoácido não natural p-(propargiloxi)-fenilalanina inclui adicionalmente um ARNt ortogonal. O aminoácido não natural pode ser ligado (por exemplo, de forma covalente) ao ARNt ortogonal, por exemplo, ligado de forma covalente ao ARNt ortogonal através de uma ligação amino-acilo, ligada de forma covalente a um 3'OH ou um 2ΌΗ um açúcar ribose terminal do ARNt o r to gona1, e tc.

Os grupos químicos através de aminoácidos não naturais que podem ser incorporadas em proteínas oferecem uma variedade de vantagens e manipulações da proteína. Por exemplo, a reatividade original de um grupo funcional ceto permite a modificação seletiva de proteínas com qualquer urn de uma série de reagentes contendo hidrazina ou hidroxilamina in vitro e in vivo. Um aminoácido não natural de átomo pesado, por exemplo, pode ser útil para o faseamento de dados de estrutura de raios-x. A introdução do sitio específico de átomos pesados utilizando aminoácidos não naturais também proporciona seletividade e flexibilidade na escolha de posições dos átomos pesados. Aminoácidos não naturais fotorreativos (por exemplo, aminoácidos com cadeias 1 a tera is dt

Denzofenona e arilazidas (por exemplo, fenilazida)), por exemplo, permitem a eficiente in vivo e in vitro de proteínas de fotorreticulaçâo. Exemplos de aminoácidos não naturais fotorreativos incluem, mas não estão limitados a, por exemplo, p-azido-fenilalanina e p-benzoil-fenilalanina, A proteína com os aminoácidos não naturais fotorreativos pode então ser reticulada à vontade pela excitação do grupo fotoreativo proporcionando controlo temporal (e/ou espacial). Num exemplo, o grupo metilo de um aminoácido não natural pode ser substituído com um marcado isotopicamente, por exemplo, um grupo metilo, como uma sonda ou estrutura local e dinâmica, por exemplo, com a utilização de ressonância magnética espectrosc ooia vibracional. Os grupos f uncion. ou azrdo, por exemplo, permitem a modi ficação através uma nuclear e reação de proteínas com moléculaí cicloadição [3+2].

Sinte e quimica de amino eido η o natural

Muitos dos aminoácidos não naturais fornecidas acima estão comercialmente disponíveis, por exemplo, a partir de Sigma (SUA) ou de Aldrich (Milwaukee, WI, EUA), Aqueles que não estão disponíveis comercialmente são opcionalmente sintetizados tal como aqui fornecido ou como fornecido em várias publicações, ou utilizando métodos correntes conhecidos pelos especialistas na técnica. Para técnicas de síntese orgânica, ver, por exemplo, Organic Chemistry pela Fessendon e Fessendon, (19 2, segunda edição, Willard Grant Press, oston Mass); Advanced Organic Chemistry de March (Third Edition, 19 5, Wiley and Sons, Nova Iorque); e Advanced Organic Chemistry de Carey e Sundberg (Third Edition, Parts A and , 1990, Plenum Press, Mova Iorque).

Outras publicações que descrevem a síntese de aminoácidos nat naturais mc-Luem, po]

exeuiD document.·:

WO 2002/0 5923 intitulado "In vivo incorporation of unnatural amino acids"; Matsoukas et al., (1995) J. Med. Chem., 3 , 4660-4669; King, F.E, & Kidd, D.A.A. (1949) A New Synthesís of Glutamine and of γ-Dipeptides of Glutamic Acid from Phthylated Intermediated. J. Chem. Soc., 3315-3319; Friedman, O.M. & Chatterrji, R. (1959) Synthesís of Derivatives of Glutamine as Modei Substrates for Anti-Tumor Agents. J. Am. Chem. Soc. 1, 3750-3752; Craig, J.C. et. al. (19 ) Absolute Configuration of the Enantiomers of 7-Chloro-4 [[4-(diethylamino)-1-methylbutyl]amino]quinoline (Chloroquine). J. Org. Chem. 53, 1167-1170; Azoulay, M., Vilmont, M, & Frappier, F. (1991) Glutamine analogues as

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Synthesis of (+)-Apovincamine through Amino Acid Decarbonylation and Iminium Ion Cyelization. J. Org. Chem. 19 9:1 59-1 66; arton et al., (19 7) Synthesis of Novel a-Amino-Acids and Derivatives Using Radical Chemistry: Synthesis of L- and. D-a-Amino-Adipic Acids, L-a-aminopimelic Acid and Appropriate Unsaturated. Derivatives. Tetrahedron Lett. 43:4297-430 ; and, Subasinghe et al., (1992) Quisqualic acid analogues: synthesis of beta--heterocyclic 2-ami nopropanoic acid derivatives and their activity at a novel quisqualate-sensitized site, J. Med. Chem. 35:4602-7.

Capta o celular de amino eido η o naturai A captação de aminoácidos não naturais por uma célula de vertebrados é uma questão que é normalmente considerada ao projetar e selecionar aminoácidos não naturais, por exemplo, para incorporação numa proteína. Por exemplo, a elevada densidade de carga dos aminoácidos α sugere que estes compostos são susceptíveis de ser permeáveis a células. Os aminoácidos naturais são levados para dentro da célula de vertebrados por meio de uma coleção de sistemas de transporte à base de proteínas. Pode ser feito um rastreio rápido que avalia quais os aminoácidos não naturais, caso existam, que são absorvidos peias células. Ver, por exemplo, os ensaios de toxicidade em, por exemplo, 0 pedido intitulado "Protein arrays", número PiOOiUSOO, apresentado em 22 de Dezembro, 2002; e Liu, DR & Schultz, PG (1999) Progress toward the evolution of an organism with an expanded genetic code. PNAS United States 96:47 0-47 5. Embora a absorção seja facilmente analisada com vários ensaios, uma alternativa para a concepção de aminoácidos não naturais que são passíveis de vias de captação celular é proporcionar vias de biossíntese para criar aminoácidos 1 n vi vo.

Bio inte e de amino eido η o natural

Muitas vias biossintéticas produção de amínoácidos e método biossintético para particular pode não existir célula de um vertebrado, já existem em células para a outros compostos. Enquanto um um aminoácid o não-natura 1 em na natureza, por exemplo, numa a invenção proporciona r. a. i s biossintéticas de amínoácidos métodos. Por exemplo, vias nâo naturais são opcionalmente gerados na célula hospedeira através da adição de novas enzimas ou modificação dos caminhos existentes da célula hospedeira. Enzimas novas adicionais são, opcionalmente, enzimas ocorrendo naturalmente ou enzimas que evoluíram artificialmente. Por exemplo, a biossíntese de p-aminofen ilalanina (como apresentada num exernplo no documento WO 2002/0 5923, intitulado "In vivo ineorporation of unnatural amino acids") baseia-se na adição de uma combinação de enzimas conhecidas de outros organismos. Os genes para estas enzimas podem ser introduzidos numa célula de vertebrado pela transformação da célula com um plasmídeo que compreende os genes. Os genes, quando expressos na célula, proporcionam uma via enzimática, para sintetizar o composto desejado. Exemplos dos tipos de enzimas que são opcionalmente adicionadas são fornecidos nos exemplos abaixo. Sequências de enzimas adicionais podem ser encontradas, por exemplo, no Genbank. Enzimas artificialmente evoluídas também são opcionalmente adicionadas maquinaria manipulados a uma célula da mesma maneira. Deste modo, a celular e os recursos de uma célula são para produzir aminoácidos não naturais.

Está disponível uma variedade de métodos para a produção de novas enzimas para uso em vias biossintéticas, ou para a evolução de vias existentes. Por exemplo, a recombinação recursiva, por exemplo, tal como desenvolvida por Maxygen, Inc. (disponível na Internet em www.maxygen.com) , é eventualmente usada para desenvolver novas enzimas e caminhos. Ver, por exemplo, Stemmer (1994), Rapid evolution of a protein in vitro by DMA shuffling, Nature 370(4):3 9-391; and, Stemmer, (1994), DNA shuffling by random fragmentation and reassembly: In vitro recombination for molecular evolution, Proc. Natl. Acad. Sei. USA., 91:10747-10751. Similarmente, DesignPath™, desenvolvido pela Genencor (disponível na Internet em genencor.com) é opcionalmente utilizado para manipulação da via metabólica, por exemplo, para manipular uma via para criar S-metil-L-tirosina numa célula. Esta tecnologia reconstrói as vias existentes em organismos hospedeiros usando uma combinação de novos genes, por: exemplo, .identificados através de genómica funcional e evolução molecular e design. Diversa Corporation (disponível na Internet em diversa.com) também fornece tecnologia para rastrear rapidamente bibliotecas de genes e vias de genes, por exemplo, para criar novos caminhos.

Tipicamente, o aminoácido não natural produzido com uma via biossintética manipulada da invenção é produzido numa concentração suficiente para a biossíntese eficiente de proteínas, por exemplo, uma quantidade celular natural, mas nao para um tal grau que afecte a concentração de outros aminoácidos ou exaustão dos recursos celulares. As concentrações típicas produzidas deste modo in vivo, são cerca de 10 mM a cerca de 0,05 mM. Urna vez que uma célula é transformada com um plasmídeo que compreende os genes utilizados para produzir as enzimas desejadas para uma via específica e um aminoácido não natural é gerado, in vivo, as seleções são opcionalmente utilizadas para optirnizar ainda ruais a produção do aminoácido não natural tanto para a síntese de proteínas ribossomais e o crescimento celular.

Polipeptideo com amino eido η o naturai

Proteínas ou po ami ηo á c i do n ã o ipeptídeos de interesse com, pelo menos, um natural são descritas aqui A descrição também inclui polipeptídeos ou proteínas com pelo menos um aminoácido não natural produzido usando as c o mp o s i ç õ e s e métodos da invenção. Um excipiente (por exemplo, um excipiente farmaceuticamente aceitável) pode também estar presente com a proteína.

Através da produção de proteínas ou polipeptídeos de interesse com, pelo menos, um aminoácido não natural em células de vertebrados, as proteínas ou polipeptídeos incluirão, tipicamente, modificações pós-translacionais de vertebrados. Uma proteína pode incluir pelo menos um aminoácido não natural e, pelo menos, uma modificação pós-translacional de que é feita in vivo, por uma célula de um vertebrado, onde a modificação pós-tradução não é produzida por uma célula procariótica. Por exemplo, a modificação pós-tradução inclui, por exemplo, acetilação, acilação, adição de palmitato, ligação glicolípida, cto, a modificação pós- 1 ipido "-modificação, palmitoilação, fosforilação, modificação da glicosilação e similares. Num aspe tradução inclui a fixação de um oiigosacárido (por exemplo, (GlcNAc-Man) 2-Man-GlcNAc-GicNAc) ) de uma asparagina por uma ligação de asparagina-GlcNAc. Ver também, a Tabela 7, que lista alguns exemplos de oligossacarideos N-ligados de proteínas de vertebrados (resíduos adicionais também podem estar presentes, que não são mostradas) . Em outro aspecto, a modificação pós-tradução inclui a ligação de um oligossacárido { τ' exemplo, Gal-GalNAc, Gal-GicNAc, etc.) a uma serina ou treonina por uma ligação GalNAc-serina ou GalNAc-treonina, ou uma ligação GlcNAc-serina ou GlcNAc- treonina.

TABELA 7: EXEMPLOS DE OLIGOSACÁRIDOS ATRAVÉS DE LIGA O

GlcNac

Type Base Strueture Manai *6·^ Hígh-mannose Manai-6%. Manai-3"^ Manpi-4GlcNAcp1-4G(cNAc01-Asn Manai

Type Base Strueture Hybrid Mana Manpl -4G!cNAcp 1 -4GlcNAc01 -Asn GlcNAc01-2-Manai Complex GteNAcjJ1-2-Mana1~6*. J> Μβηβ 1 -4GtcNAcp1 -4GlcNAcp 1 -Asn G!eNAç01-2-Mana 1-3-"^ Xyíose Manai-6-^ Manp 1 -4 GtcNAcp 1 -4G!cN Acp 1 -Asn Xylp1-2^ nina, precur :sor de caicitonina gene de P éptido, hormona roins ul ina, pró- insulin a, prepro- )piome mocort ina e seme lhantes), a e sub un idades mú 1 tipias ou montagem para um outr o lo CcL -L licl· célula (por elos, tais como o reticulo o de Golgi, nú cleo, 1isossornas, Las, cl oropla s t o s , v a c ú o 1 o s, e t c ,, ecret or a) . E m c :ertas formas de ompre ende uma S 0 O" uência de secreção

Em ainda outro aspecto, a modificação pós-tradução inclui o processamento proteolítico de precursores (por exemplo, precursor de caicitonina, relacionado com exemplo, para organelos, ou localização, um marcador de epítopo, uma etiqueta FLAG, uma etiqueta de poli-histidina, uma fusão de GST, ou semelhantes.

Uma vantagem po r ç õ 6s gu i m adicionar mo de um aminoácido não natural é que apresenta cas adicionais que podem ser utilizadas para .éculas adicionais. Estas modificações podem ser feitas in vivo numa célula de vertebrado, ou in vitro. Assim, em certas formas de realização, a modificação pós-traducão é através do aminoácido não natural. Por exemplo, a modificação pós-tradução pode ser através de uma reação nucleófila-electrofílica. A maioria das reações atualmente utilizadas para a modificação seletiva de proteínas envolve a formação de uma ligação covalente entre os parceiros de reação nucleofílica e electrofílica, por exemplo, a reação de α-halocetonas com cadeias laterais de histidina ou cisteína. A seletividade, nestes casos, é determinada pelo número e acessibilidade dos resíduos nucleofílicos da proteína. Nas proteínas da invenção, outras reações mais

Science, podem ser us ;adas , tais como a reaç âo de um ceto- não natural com hidrazidas ou corapos tos aminoxi, e in rivo. Ver, por exemp io, Cor :ni sh, et al., Chem. Soc,, 11 : 15 0- 151; Maha1, et al ., (1997) 2 7 6: 112 15-112 r Wang, et â 1 . , ( 20 01) Science 0; Chin, et al., (2002 ) Am. Chem. So C · 124:9026- n, et al., (2 0 Q 2) Proc. Natl. Aca d. Sei., 1024; Wang, et CÁ 1 . , (2003 ’) Proc Nat • 1. Acad. in vitro e i

Sei., 100:56-61,· Zhang, et al., (200.3) iochemistry, 42:6735-6746; and, Chin, et al., (2003) Science, no prelo. Isto permite a marcação seletiva de virtualmente qualquer proteína com uma série de reagentes, incluindo fluoróforos, agentes de reticulação, derivados de sacarídeos e moléculas citotóxicas. Ver também, Pedido de Patente USSN 10/6 6,944 intitulado "Giycoprotein synthesis" depositado em 15 de Outubro de 2003. Modificações pós-translacionais, por exemplo, por: meio de um aminoácido azido, podem também ser feitas através da ligação de Staudinger (por exemplo, com

Kixck et reagentes de triarilfosfina) . Ver, por exemplo ai ., (2 Ο Ο 2) ιηcοrpοra t i on proteins for chemoselective ligtation, PNAS 99:19--24. of azides into recombinant modification by the Staudinger

Uma célula de vertebrado da divulgação proporciona a capacidade de sintetizar proteínas que compreendem os aminoácidos não naturais em grandes quantidades úteis. Num aspecto, a composição inclui, opcionalmente, por exemplo, pelo menos 10 microgramas, pelo menos 50 microgramas, pelo menos 75 microgramas, pelo menos 100 microgramas, pelo menos 200 microgramas, pelo menos 250 microgramas, pelo menos 500 microgramas, pelo menos 1 miligrama, pelo menos 10 miligramas ou mais de uma proteína que compreende um aminoácido não natural, ou uma quantidade que pode ser conseguida com métodos in vivo de produção de proteína (pormenores sobre a produção de proteína recombinante e purificação são aqui proporcionados) . Noutro aspecto, a. proteína está opcionalmente presente na composição a uma concentração de, por exemplo, pelo menos 10 microgramas de proteína por litro, pelo menos 50 microgramas de proteína por litro, pelo menos 75 microgramas de proteína por litro, pelo menos 100 microgramas de proteína por litro, pelo menos 200 microgramas de proteína por litro, pelo menos 250 microgramas de proteína por litro, pelo menos 500 microgramas de proteína por litro, pelo menos 1 miligrama de proteína por litro, ou, pelo menos, 10 miligramas de proteína por litro ou mais, em, por exemplo, um lisado celular, um tampão, um tampão farmacêutico, ou outra suspensão liquidei, (por exemplo, num volume de, por exemplo, de cerca de 1 nl a cerca de 100 1) . A produção de grandes quantidades (por exemplo, maior do que a geralmente possível com outros métodos, por exemplo, a tradução in vitro) de uma proteína de uma célula de um vertebrado, incluindo pelo menos um aminoácido não natural é uma característica da invenção. A incorporação de um aminoácido não natural pode ser feiro de, por exemplo, mudanças de medida na estrutura e/ou função da proteína, por exemplo, para alterar o tamanho, a acidez, nucleofilicidade, a ligação de hidrogénio, a h idro fohi c idade, a c e s s i. b i .1 i d a di de locais-aivo proteases, porção alvo (po proteínas), etc. Proteínas natural podem ter melhorada p r op r i e dade s c a t. a 1 í t. .1 c a s propriedades seguintes são r exemplo, para um conjunto de que incluem um aminoácido nao .s ou até mesmo totalmente novas ou físicas. Por exemplo, as opcionalmente modificadas pela ínciusao ie um ammoacio'o nac natural numa pr oteína : toxicidade, biodistribuição, p r op r i e dade s estruturais, propriedades espectroscópicas, propriedades químicas e/ou f o t o qu í m i c a s, capacidade catalítica, me ia-vida (por exemplo, meia-vida no soro), capacidade de reagir com outras moléculas, por exemplo, de forma covalente ou não covaiente, e semelhantes. As composições, incluindo proteínas, que incluem pelo menos um aminoácido não natural-são úteis para, por exemplo, novas terapêuticas, de industriais, torpos) e, por proteínas. Ver, Amino Acids as Current Opinion diagnóstico, enzimas catalíticas, enzima proteínas de ligação (por exemplo, antíc exemplo, o estudo da estrutura e função das por exemplo, Dougherty, (2000) Unnatural Probes of Protein Structure and Function, in Chemical iology, 4:645-652652.

Num aspecto aqui descrito uma prote ;ína inclui pelo menos um, por exemplo, peio menos dois, pelo menos três, pelo menos quatro, pelo menos cinco, pelo menos seis, pelo menos peio menos oito, pelo sete menos nove, ou pelo menos dez ou mais arninoácidos não naturais. Os naturais podem ser o mesmo ou diferente, por exemplo, pode haver 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, arninoácidos não Q t 10 ou mais loc 2, 3, 4, o, 6, , 9, ou 10 ou mais arninoácidos não naturais diferentes.

Noutro aspecto, descrito neste documento, uma proteína, com pelo menos um, mas menos do que todos, de um determinado aminoácido presente na proteína é substituída com o aminoácido não natural. Para uma dada proteína, com mais de um aminoácido não-natural, os arninoácidos não naturais podem ser iguais ou diferentes (por exemplo, a proteína pode incluir dois ou mais tipos diferentes de arninoácidos não naturais, ou pode incluir dois dos mesmos aminoácido não naturais). Para uma dada proteína, com mais do que dois arninoácidos não naturais, os arninoácidos não naturais podem ser iguais, diferentes ou uma combinação múltipla de um aminoácido não natural do mesmo tipo com pelo menos um aminoácido não natural diferente.

Essencialmente, qualquer proteína (ou sua porção) que inclui um aminoácido não natural (e qualquer ácido nucleico codificante correspondente, por exemplo, que inclui um ou mais códãos seletores) pode ser produzida usando as composições e métodos aqui descritos. Não é feita qualquer tentativa para identificar as centenas de milhares de proteínas conhecidas, qualquer das quais pode ser modificada para incluir um ou mais arninoácidos não naturais, por exemplo, adaptando quaisquer métodos de mutação disponíveis para incluir um ou mais códãos seletores apropriados num sistema, de tradução relevante. Repositórios de sequências comuns de proteínas conhecidas incluem Gen ank EM L, DD J eo NC I. Outros repositórios podem se internet .1: a c i 1 me n t e i de n t i ..cados através de pesquisa na

Norma Imente, as prote iriôS SaO f por exemplo, pel .o menos 60 , pelo menos 70 , pelo menos 75 , pelo menos 0 , pelo menos 90 , pelo menos 95 , ou, pelo menos, 99 ou ma .is idênticas a qualquer proteína disponível (por exemplo, uma proteína terapêutica, uma proteína de diagnóstico, uma enzima industrial, ou parte da mesma, e semelhantes), e compreendem um ou ma is aminoácidos não naturais. Exemplos de proteínas terapêuticas, de diagnóstico, e outras que podem ser modificadas para compreender um ou roais aminoácidos não naturais incluem, mas não estão limitados a, por exemplo, alfa-l-antitripsina, angiostatina, tactor antihemolítico, anticorpos (roais detalhes sobre os anticorpos encontram-se abaixo) , apolipoprotema, apoproteína, fator natriurético atrial, polipeptídeo natriurético atrial, peptídeos atriais, quimiocmas C-X-C (por exemplo, T39765, ΝΆΡ-2, ΕΝΆ-7 , Gro-a, Gro-b, Gro-c, IP-10, GCP-2, NAP-2, SDF-1, PF4, MlG), calcitonina, quimiocinas CC (por exemplo, monócitos da protema-1 quimioatrativos, monócitos da proteína-2 quimioatrativos, monócitos da proteína-3 quimioatrativos, monocitos da proteína-1 inflamatória alfa, monócitos aa protexna-i inflamatória beta, RANTES, 1309, R 3915, R91733, HCC1. T5 47, D31065, T64262), ligando CD40, ligando C-kit, de um ou rriais para colagénio, fator estimulante de colónia (CSF), tactor do complemento 5a, inibidor do complemento, receptor 1 do complemento, citoquinas, (por exemplo, péptido ativaaor de neutrófilos epiteliais-7 , GROa/MGSA, ΟΚΟβ, GROy, MlP-la, ΜΙΡ-Ιδ, MCP-I), tactor de Crescimento Epidermxco (EGF), eritropoietina ("EPO", que representa um alvo prererencial modificação pela incorporação aminoácidos não naturais), toxinas de exíoliação A e

Factor IX, Factor crescimento de VII, Factor Vi II, Factor X, factor de fibroblastos (FGF), fibrinogénio, fibronectina, G-CSF, GM-CSF, glucocerebrosidase, gonadotropina, factores de crescimento, proteínas Hedgehog (por exemplo, Sonic, Indian, Desert), hemoglobina, factor de crescimento de hepatócitos (HGF), hirudina, albumina de soro humano, insulina, factor de crescimento semelhante a insulina (IGF), interferões (por exemplo, IFN-a, IFN-β, IFN-γ), interleucinas (por exemplo, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL - 6, IL-7, IL- , IL- 9, IL-10, IL-11, IL-12, etc.), factor de crescimento de queratinócitos (KGF), laactoferrina, factor inibidor da leucemia, luciferase, neurturina, factor inibidor de neutrófilos (NIF), oncostatina M, proteína osteogénica, hormona paratireoide, PD-ECSF, PDGF, hormonas peptídicas (por exemplo, hormona do crescimento humano), pleiotropina, Proteína A, Proteínan G, exotoxinas pirogénicas A, , e C, relaxina, renina, SCF, complemento solúveç do receptor I, I-CAM 1 solúvel, receptores de interleucinas solúveis (IL-1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15), receptor de TNF solúvel, s o ma tomedina, soma t o statina, s omatotropina, é, e n t e r o t o x i n a s SEC3, SED, SEE) , e s t r e p t o q u i n ase, s u p e r a n t; i gén i o s, i s t o Staphylococcal (SEA, SE , SEC1, SEC2, superóxido dismutase (SOD), síndrome de choque tóxico plasminogénio de (TNF beta), factor , factor alfa de de crescimento (TSST-1), timosina alfa 1, ativador de tecidos, factor beta de necrose turnoral do receptor de necrose turnoral (TNFR) necrose turnoral (TNF alfa), factor endotelial vascular (VEGEF), uroquinase e muitos outros

Uma classe de proteínas que podem ser feitas usando as composições e métodos para a incorporação in vivo de os aminoácidos nã o naturais a qu i d e s c r i t o s inclui os moduladores de transcrição, ou parte destes. Exemplos de moduladores de transcrição incluem genes e proteínas mo du1a do r a s de transcrição que modulam o crescimento celular, diferenciação, regulação, ou algo semelhante. Moduladores de transcrição são encontrados em procariotas, vírus, e eucariotas, incluindo fungos, plantas, leveduras, insectos e animais, incluindo os mamíferos, que oferecem uma vasta gama de alvos terapêuticos. Será apreciado que ativadores da expressão e da transcrição regulam a transcrição de muitos mecanismos, por exemplo, por ligação a receptores, estimulando uma cascata de transdução de sinal, regulando a expressão de factores de transcrição, ligação a promotores e potenciadores, ligação às proteínas que se ligara a promotores e potenciadores, ADN de desenrolamento, splícing de pré-ARNm, ARN poliadenilado, e degradação de ARN. Por exemplo, as composições da proteína GAL4, ou uma sua porção numa célula de vertebrado são também uma característica da invenção. Tipicamente, a proteína GAL4 ou porção da mesma compreende pelo menos um aminoácido não natural. Veja tambéra a seção intitulada sintetases de aminoacil-tRNA ortogonal". descrita (por exemplo, dos não naturais) inclui as citoquinas, mo 1 écu.1 as

Uma classe de proteínas aqui proteínas com um ou mais aminoáci ativadores de expressão, tais como miiainatoria; factoreí ae :rescimento, os seus receptoreí e os produtos de oncogenes, por exemplo, interleucinas (por exemplo, IL-1, IL -2, IL- , etc.), interferões, FGF, IGF-1, IGF-II, FGF, PDGF, TNF, TGF-a, TGF-β, FGF, KGF, SCF/c-Kit, CD40L/CD40, VLA-4/VCAM-1, ICAM-l/LFA-1 e hialurina/CD44; moléculas de transdução de sinal e os correspondentes produtos de oncogenes, por exemplo, Mos, Ras, Raf e Met; e exemplo, p53, de hormonas progesterona, >tor LDL e ativadores da transcrição e supressores, por Tat, Fos, Myc, Jun, Myb, Rei, e receptores esteroides como os de estrogémo, testosterona, aldosterona, ligante recep c o r ticosterona. riais}, ou nãonatural, de enzimas as enzimas indus menos um aminoácido invenção. Exemplos

As enzimas (por exemplo, porções das mesmas com pelo são também fornecidas pela incluem, mas racemases dioxigenases não estão limitacos a, por exempro, amrdases, de amiηoácidoε, aci1ases, deha1ogenases, , peroxidases de diarilpropano, epimerases, hidrolases de epóxido, esterases, isomerases, quinases, isomerases de glucose, glicosrdases, transferases de glicosil, haloperoxidases, monooxigenases (por exempro, P450), lipases, peroxidases de lenhma, hidratases de nitrilo, nitrilases, proteases, fosfatases, subuilrsinas, transaminase e nucleases.

Muitas destas proteínas estão comercialmente disponíveis (Veja, por exemplo, o catálogo de Sigma ioSciences 2002 e lista de preços) e as sequências de proteínas e genes correspondentes e, normalmente, muitas variantes das mesmas, são bem conhecidas Qualquer uma delas pode ser de um ou rnais aminoácidos (ver, por exemplo, Genoank). modificada através da inserção não naturais de acordo com a invenção, por exemplo, para alterar a proteína em relação a uma ou mais propriedades terapêuticas, de diagnóstico ou enzimáticas de interesse. Os exemplos de propriedades terapeuticamente relevantes incluem a semivida no soro, semivida de prateleira, estabilidade, imunogenicidade, atividade terapêutica, detectabilidade (por exemplo, pela inclusão de grupos repórter (por exemplo, marcadores ou locais de ligação de marcadores} nos aminoácidos não naturais), redução do LD$0 ou outros efeitos secundários, capacidade de entrar no corpo através do trato gástrico (por exemplo, disponibilidade oral), ou outros semelhantes. Exemplos de propriedades de diagnóstico incluem meia-vida de prateleira, estabilidade, atividade de diagnóstico, detecçâo, ou semelhantes. Exemplos de propriedades enzimáticas relevantes incluem meia-vida de prateleira, estabilidade, atividade enzimática, capacidade de produção, ou similar.

Uma variedade de outras proteínas também pode ser modificada para incluir um ou mais aminoácidos não naturais, Por exemplo, a substituição de um ou mais aminoácidos naturais numa ou mais proteínas de vacina com um aminoácido não natural, por exemplo, nas proteínas de fungos infecciosos, por exemplo, espécies de Aspergillus, Cândida; bactérias, particularmente S. coli, que serve de modelo para bactérias patogénicas, bem como bactérias medicamente importantes como Staphylococci (por exemplo, aureus), ou Streptococci (por exemplo, pneumoniae); protozoários tais como Sporozoa (por exemplo, Plasmodia), rhizopods (por exemplo, Entamoeha) e flagelados (Trypanosoma, :'ihmania.,

Trichomonas, Gi a raia, e t c.); vírus, tais como (+) vírus de ARN (por exemplo, poxvírus, vaccinia, picornavírus, por exemplo poli o/ Togaviruses, por exemplo, rubéola; flavivírus, por exemplo, HCV, e coronavírus), (-) vírus de ARN (por exemplo, rabdovírus, por exemplo, o VSV; paramixovírus, por exemplo, RSV; ortomixovírus, por exemplo, gripe; buniavírus e arenavírus), vírus dsDNA (reovírus, por exemplo), vírus de ARN para ADN, isto é, retrovírus, por exemplo, HIV e HTLV, θ determinados vírus de ADN parra ARN, s ã o a qu i de s c ri tos. como hepat e tais como isetos (por exemplo, as de produção de lipídios, proteínas r* ssistentes a xicação de micotoxinas, ,s (por exemp lo, Ribulose igenase, "RU ISCO"), iruvato (PEP) - c a r b o x i 1 a s e modificação de aminoácido

Proteínas relacionadas com a proteínas de resistência de i proteínas Cry), amido e enzimas toxinas de plantas e insectos, toxinas, proteínas de desintc enzimas de crescimento de plant; 1,5-bifosfato Carboxilase/oj lipoxigenase (LOX) e fostoenolp também são alvos adequados para a nao natural. A invenção também, fornece me rodos’ para a produção nutria célula de vertebrado de, pelo menos uma proteína que compreende pelo menos um amxnoacido nao natural (e proteínas produzidas por esses métodos}. Por exemplo, um método compreende: o crescimento, num meio apropriado, duma célula de um vertebrado, que compreende um ácido nucleíco que compreende pelo menos um eòdão seietor e codifica a proteína. A célula de vertebrado compreende também: um ARNt ortogonal que tem uma sequência de nucleótidos como apresentada na SEQ ID N°: 7 (O-ARNt) que funciona na célula e reconhece o códão seietor; e uma sintetase de aminoacil-ARNt- ortogonal (O-RS) que preferencialmente aminoacila o O-ARNt com o aminoácido nao natural, e o meio compreende um aminoácido não natural. contactar

Numa concretização, o método inclui ainda a incorporação na proteína do aminoácido não natural, em que o aminoácido não natural compreende um primeiro grupo recativo; e a proteína com uma molécula (por exemplo, τη co.ra.nt um eno glicol, marcador de uma segunda polímero, por exemplo, um derivado de polieti um fotoreticulador, um composto citotóxico, um afinidade, um derivado de biotina, uma resina. proteína ou polipeptídeo, um quelante de metais, um co-factor, um ácido gordo, um hidrato de carbono, um polinucleótido (por exemplo, ADN, ARN, etc.}, e semelhantes) que compreende um segundo grupo reativo. 0 primeiro grupo reativo reage com o segundo grupo reativo para ligar a molécula ao aminoácido não natural através de uma cicloadição [3+2], Numa forma de realização, o primeiro grupo reativo é uma porção alcinilo ou azido e o segundo grupo reativo é uma porção azido ou alcinilo. Por exemplo, o primeiro g.t’ upo reativo é o radical a 1 c i n i. 1 o (por exemplo, o aminoácido não natural. p - p r opa r g i 1 o x i f e n i I. alanina) e o segundo grupo reativo é o radical azido. Em o utro exerrrplo, o primeiro grupo reativo é o radical azido (por exemplo, o aminoácido não natural p-azido-L-fenilaianina) e o segundo grupo reativo é o radical alcinilo. iS, 50 de forma tão OSSl ii uma sequência de ito em SEQ ID N°: 6 ou

Numa forma de realização, o O-RS aminoacila o O-ARNt com o aminoácido não natural, pelo menos, 50 eficiente como o faz um 0”RS que aminoácidos, por exemplo, como des 45. Em. ainda outra forma de realização, o O-RS compreende um aminoácido como descrito em qualquer uma das SEQ ID M°: 36"63 e/ou 6. A proteína codificada pode compreender, por exemplo, uma proteína terapêutica, uma proteína de diagnóstico, uma enzima industrial ou uma sua porção. Opcionalmente, a proteína que é produzida pelo método é ainda modificada através do aminoácido não natural. Por exemplo, a proteína produzida pelo método é opcionalmente modificada em pelo menos uma modificação pós-tradução in vivo. Métodos de produção de um rastreio ou seleção de proteína moduladora transcricional são também descritos (e rastreio ou seleção de proteínas moduladores de transcrição produzido por estes métodos). Por exemplo, um método compreende: selecionar uma primeira sequência de polinucleóticio, em que a sequência de polinucleotídeo codifica para um domínio de ligação de ácido nucleico; e mutação da primeira sequência de polinucleótido para incluir, pelo menos, um eódão seletor. Isso fornece uma triagem ou seleção da sequência polinucleótida, 0 método também inclui: escolher uma segunda sequência de polinucleótido, em que a segunda sequência polinucleotídica codifica um domínio de ativação da transcrição; proporcionar uma construção que compreende o rastreio ou seleção da sequência de polinucleótido ligado operacionalmente à segunda sequência polinucleotídica, e, introdução da construção, um aminoácido não natural, uma sintetase ortogonal de ARNt (O-RS) e um ARNt ortogonal (0-ARNt) numa célula. Com estes componentes, o O-RS preferencialmente aminoacila o 0-ARNt com o aminoácido não natural e o 0-ARNt reconhece o códão seletor e incorpora o aminoácido não natural no domínio de ligação do ácido nucleico, em resposta ao códão seletor no rastreio ou seleção da sequência polinucleotídica, proporcionando assim o rastreio ou seleção da proteína moduladora transcricional.

Em certas formas de realização, a proteína ou o polipeptídeo de interesse (ou parte deles) nos métodos da invenção é codificada por um ácido nucleico. Tipicamente, um códão seletor o ácido nucleico compreende, pelo menos, pelo menos, dois códãos seletores, pelo menos, três códãos seletores, pelo menos, quatro códãos seletores, pelo menos, cinco códãos seletores, pelo menos, seis códãos seletores, pelo menos, sete códãos seletores, pelo menos oito códãos seletores, pelo menos nove códãos seletores, dez ou mais códãos seletores.

Os genes que codificam para proteínas ou polipeptídeos de interesse podem ser mutados, utilizando métodos bem conhecidos para um perito na técnica e aqui descritos sob "mutagénese e outras técnicas de biologia molecular", para. incluir, por exemplo, um ou mais códãos seletores para a incorporação de um aminoácido não natural. Por exemplo, um ácido nucleico para uma proteína de interesse é mutado para incluir um ou mais códãos seletores, fornecendo a inserção de um ou mais aminoácidos não naturais. A divulgação inclui qua. ir variante, por exemplo, mutante, versões de qualquer proteina, por exemplo, incluindo pelo menos um aminoácido não natural. Da mesma forma, a invenção também i n c 1 u i o s á. c i dos n u c 1 e i c o s c o r r espondentes, ou seja, qualquer ácido nucleico com uma ou mais códãos seletores que codifica um ou mais aminoácidos não naturais.

Ai purificação de proteínas recombinantes compreende os aminoácidos não naturais

Proteínas compreendendo os aminoácidos não naturais, os anticorpos para proteínas compreendendo os aminoácidos não naturais, etc., podem ser purificadas, parcialmente ou de maneira substancialmente para a homogeneidade, de acordo com procedimentos convencionais conhecidos e utilizados pelo: seritos na téenic

Deste modo, os polipeptideos podem ser recuperados e purificados por: qualquer de um número de métodos bem conhecidos na técnica, incluindo, por exemplo, precipitação com sulfato de amónio ou etanol, extração de ácido ou base, cromatografia de coluna, cromatografia de coluna de afinidade, cromatografia de tr oca anionica ou catiónica. ;romatoarafia de fosfocelulose, cromatografia de interação hidrofóbica, cromatografia de hidroxilapatite, cromatografia de lectina, electroforese em gel e semelhantes. Etapas de redobragem da proteína podem ser utilizadas, se for o caso, na produção de proteínas maduras corretamente dobradas. Cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC), cromatografia de afinidade ou outros métodos adequados podem ser utilizados nos passos de purificação finais onde é desejado uma elevada pureza. Anticorpos produzidos contra os aminoácidos não naturais (ou proteínas compreendendo os aminoácidos não naturais) são utilizados como reagentes de purificação, por exemplo, para a purificação baseada na afinidade de proteínas que compreendem. um ou ma is aminoácidos não naturais. Uma vez purificados, parcialmente ou até à homogeneidade, conforme desejado, os polipeptideos são opcionalmente utilizados, por exemplo, como componentes de ensaio, reagentes terapêuticos ou como imunogénios para a produção de anticorpos.

Para além de outras referências aqui mencionadas, uma variedade de métodos de purificação/dobragem de proteína são bem conhecidos na técnica, incluindo, por exemplo, os que constam na R. Scopes, Protein Purification, Springer-Verlag, NY (19 2 ); Deutscher, Methods in Enzymology Vol, 1 2; Guide to Protein Purification, Academic Press, Inc. NY (1990) ; Sandana (1997) ioseparation of Proteins, Academic

Press, Inc.; ollag et al. (1996) Protein Methods, 2nd

Edition Wiley-Liss, NY; Walker (1996) The Protein

Protocols í-Iandbook Humana Press, NJ, Harris and Angal (1990) Protein Purification Applications: A Practical Approach IRL Press at Oxford, Oxford, England; Harris and Angal Protein Purification Methods: A Practical Approach IRL Press at Oxford, Oxford, England; Scopes (1993) Protein Purification: Principies and Practice 3rd Edition Springer Verlag, NY; Janson and Ryden (199 ) Protein Purification: Principies, High Resolution Methods and

Applications, Second Edition Wiley-VCH, NY; e Walker (199 ) Protein Protocols on CD-ROM Humana Press, NJ; e as referências aí citadas.

Uma vantagem de produzir uma proteína ou polipeptídeo de interesse, com um aminoácido não natural numa célula de vertebrado é que normalmente as proteínas ou polipeptídeos os nas suas conformações nativas. No tos na técnica irão rec onhecer que ressao e/ou purificação, as proteír síntese, ex possuir uma conformação diferente das conformações desejadas dos polipeptídeos relevantes • Num aspecto da invenção, a proteína expressa é facultativamente desnaturada e depois renaturada. Isto conseguido, por exemplo, pela adição de uma chaperonina pa ra a proteína ou polipeptídeo de interesse, e/ou através da solubilizaçao das proteínas num agente caotrópico tal como guanidina HC1,

Em geral, é ocasíonalmente desejável para desnaturar e reduzir polipeptídeos expressos e, em seguida, fazer com que os polipeptídeos re-dobrem na conformação preferida.

Por exemplo, guanidina, ureia, DTT, DTE, e/ou chaperonina pode ser adicionada a um produto de tradução de interesse. Métoaos de .redução, desnaturação e renaturação de proteínas são .bem conhecidos dos peritos na técnica (ver, as referências anteriores, e Debinski, et al. (1993} J. ioi. Chern., 26 : 14065-14070; Kreitrnan and Pastan (1993) ioconjug. Chem., 4:5 1-5 5; e uchner, et al., (1992)

Anar. íochem. 205: 263-270). Debinski, et al., por exempio, descrevem a desnaturação e redução de 'proteínas de corpos de inclusão em guanidina-DTE. As proteínas podem ser redobradas num tampão redox contendo, por exemplo, giutationa oxidada, e L-arginina. Reagentes de re-dobragem podem ser vertidos ou de outro modo movidos em contacto com um ou mais polipeptídeo ou outro produto de expressão, ou vice-versa.

Anticorpo

Aqui descritos são os divulgação, por exemplo compreendendo os aminoác para as moléculas da divu purificação, por exemplo, da divulgação. Além d. anticorpos para as moléculas da , sintetases, ARNt e proteínas idos não naturais. Os anticorpos Igaçao são úteis como reagentes de para a purificação das moléculas isso, os anticorpos podem ser utilizados como reagentes de indicador para indicar a presença de uma sintetase, um ARNt, ou uma proteína comp reendendo um aminoácido nãc i natural, por exemplo, para controlar a presença ou a localização (por exemplo, in vi^ ou in situ) da molécula.

Um ant i corpo pode ser uma proteína que compreende um ou mais p o 1 i p e p t í d e o s s ub s t a n c i a 1 me n t e ou par ciai. mente codific rados por genes de imunoglobulinas ou fragmentos de genes de imunoglobul inas. Os genes d e imunoglobuiina incluem genes da região constante capa, reconhecidos lambaa, alfa, gama, delta, épsilon e mu, assim como os genes da região variável de imunoglobulina miríade. As cadeias leves são classificadas como capa ou lambda. As cadeias Pesadas são classificadas como gama, mu, alfa, delta, ou épsilon, que por sua vez definem as classes de imunoglobulina, IgG, IqM, IgA, IgD e IgE, respectivamente. Uma unidade estrutural de imunoglobulina típica (por exemplo, anticorpo) compreende um tetrâmero. Cada tetrâmero é composto por dois pares idênticos de cadeias de polipeptídeo, tendo cada par uma cadeia. "leve" (cerca de 25 k.D) e uma cadeia "pesada” (cerca de 50-70 kDa) . O terminal N de cada cadeia define uma região variável de cerca de 100 a 110 ou mais aminoácidos primeiramente responsáveis pelo reconhecimento do antigénio. Os termos cadeia leve variável (VL) e cadeia pesada variável (VH) referem-se a estas cadeias leves e pesadas, respectivamente.

Os anticorpos existem, como imunoglobulinas intactas ou como um número de fragmentos bem caracterizados produzidos por digestão com várias peptidases. Assim, por exemplo, a pepsina digere u.m anticorpo abaixo das ligações de dissulfureto na região de charneira para produzir F (ab!).?,

mero de E ’ab que por si só é uma cadeia leve unida \ r ο- V H por uma 1 igação dissulfureto 0 F(ab')2 pode ser ido sob ondições suaves pa ra quebrar a lig [ação .1 fure to r 1 d região de charneira c o n ve r t. e n do assim o F (ab")2 do dimero em monómero Fab". O monómero Fab* é essencialmente um Fab com parte da região de charneira (ver, Fundamentai Immunoiogy, 4th addition, WE Paul, ed.,

Raven Press, NY (1999), para uma descrição mais detalhada de outros fragmentos de anticorpo) . Embora vários fragmentos de anticorpos sejam definidos em termos da digestão de um anticorpo intacto, um perito compreenderá que tais fragmentos Fab', etc., podem ser sintetizados de novo tanto quimicamente como utilizando metodologia de ADN recombinante. Assim, o termo anticorpo, como aqui utilizado, também inclui fragmentos de anticorpo, opcionalmente, quer produzidos por modificação de anticorpos inteiros ou sintetizados de novo utilizando metodologias de ADN recombinante. Anticorpos incluem anticorpos de cadeia simples, incluindo Fv de cadeia simples (sFv ou scFv) em que os anticorpos ; de \i m 6. c cX cl θ -η ci pesada variável e dma cadeia leve variável são unidos (diretamente ou através de um ligante peptídico) para formar um polipeptídeo contínuo. Os anticorpos da invenção podem ser, -por exemplo, anticorpos policlonais, monocionais, quiméricos, de cadeia humanizada, de cadeia única, fragmentos Fab, fragmentos produzidos por uma. biblioteca de expressão de Fab, ou semelhantes.

Em geral, os anticorpos são úteis, tanto como reagentes gerais e como reagentes terapêuticos numa variedade de processos moleculares biológicos ou farmacêuticos. Métodos de produção de anticorpos policlonais e monocionais, estão disponíveis, e podem ser aplicados para fazer os anticorpos da invenção. Uma série de textos básicos descrevem processos de produção de anticorpos padrão, incluindo, por exemplo, orrebaeck (ed) (1995} Antibody Engineering, 2nd Edition Freeman and Company, NY ( orrebaeck); McCafferty et al. (1996) Antibody Engineering, A Practícal Approach IRL at Oxford Press, Oxford, England (McCafferty ) , and Paul (199b) Antibody Engineering Protocols Humana Press, Towata, NJ (Paul); Paul (ed.), (1999) Fundamental Immunology, Fifth edition Raven Press, NY; Coligan (1991) \ Laboratory Manual Cold Spring

Current Protocols ín Immunology Wiley/Greene, NY; Harlow and Lane (19 9) Antibodies: A

Harbor Press, NY; Stites et al. (eds.) asic and Clinicai Immunology (4th ed.) Lange Medicai Publications, Los Altos, CA, e referências aí citadas; Goding (19 6) Monoclonal Antibodies: Principies and Practice (2d ed.) Academic Press, New York, NY; e Kohler and Milstein (1975) Nature 256: 495-497.

Uma variedade de técnicas recoiri.binant.es para preparação de anticorpos que não dependera de, por exemplo, injeção de um antigénio num animal, foram desenvolvidas e podem ser utilizadas no contexto da. presente invenção. Por exemplo, é possível gerar e selecionar bibliotecas de anticorpos recombinant.es em fagos ou vectores semelhantes. Ver, por exemplo, Winter et al. (1994) Making Antibodies by Phage Display Technology Anrru. P.ev. Immunol. 12:433-55 e as referências ali citadas para uma revisão. Veja também, Griffiths and Duncan (199 ) Strategi.es for seiection of antibodies by phage display Curr Opin iotechnol 9: 102- ; Hoogenboom et al. (199 ) Antibody phage display teehnology and. its applications Immunotechnology 4: 1-20; Gram et al. (1992) ín vit.ro seiection and. affinity maturation of antibodies from a naive combinatorial immunoglobu1in library PNAS 9:357 6-35 0; Huse et al. (19 9) Science 246: 1275-12 1; e Ward, et al. (19 9) Nature 341: 544-546. ibliotecas de anticorpos podem incluir os repertórios de genes V (por exemplo, colhidos a partir de populações de linfócitos ou montados in vitro), que são clonados para exibição dos domínios variáveis das cadeias pesada e leve associados na superfície de bacteriófagos filamentosos. Os fagos são selecionados por: ligação a um antigénio. Anticorpos solúveis são expressos a partir de bactérias de fagos infectados e o anticorpo pode ser melhorado, por exemplo, através de mutagénese. Ver, por exemplo, alint and Larrick (1993) Antibody Engineering by Parsimonious Mutagenesis Gene 137:109-11 ; Stemmer et al. (1993)

Selection of an Active Single Chain Fv Antibody From a Protein Linker Library Prepared by Enzymatic Inverse PCR iotechniques 14(2):256-65; Crameri et al, (1996)

Construction and evoluíion of antibody-phage iibraries by DMA shuffling Nature Medicine 2:100-103; e Crameri e Stemmer (1995) Combinatória1 muitiple cassette mutagenesis creates all the permutations of mutant and wildtype cassettes io Techniaues 1 :194--195. fagos de e estão

Kits para a clonagem e expressão de sistemas de anticorpos recombinantes também são conhecidos disponíveis, por exemplo, o "sistema de anticorpo de faço recombinante, módulo de rato ScFv ", de Amersham-Pharmacia iotechnology (Uppsala, Suécia). ibliotecas de anticorpos de bacteriófagos, também têm sido produzidas para produção de anticorpos humanos de alta afinidade por baralhamento de cadeias (Ver, por exemplo, Marks et al. (1992) y- Passing

Immunization: uilding High Affinity Human Antibodies by

Chain Snuffling iotechniques 10:779-7 2. Será também reconhecido que os anticorpos podem ser preparados por qualquer: de um certo número de serviços comerciais (por exemplo, ethyl Laboratories (Montgomery, TX) , Anawa (Suíça) , Eurogentec ( élgica e nos EUA em Filadélfia, PA,, etc.) e muitos outros.

Em certos casos, e x e mp1o, o n de o s te.rapeuticam.ente. tende a reduzir é útil "humanizar" anticorpos, por anticorpos estão a ser administrados A utilização de anticorpos humanizados a incidência de respostas imunes indesejadas contra os anticorpos terapêuticos (por: exemplo, quando o paciente é um ser humano) . As referências de anticorpos acima descrevem estratégias de humanização. Além dos anticorpos humanizados, anticorpos humanos também são uma característica da invenção. Os anticorpos humanos consistem em sequências de imunoglobulina caracteristicamente humanas. Os anticorpos humanos podem ser produzidos usando uma variedade de métodos (ver, por exemplo, Larrick et al., Patente ÍJS 5001065, para uma revisão)♦ Uma abordagem geral para a produção de anticorpos humanos por tecnologia de trioma descrita por Ostberg et al. (19 3), í-Iybridoma 2: 361-367, Ostberg, Patente US 4634664, e Sngelman et al., Patente US 4634666.

Uma variedade de métodos de utilização de anticorpos para a purificação e detecção de proteínas são conhecidos e podem ser aplicados à detecção e purificação de proteínas compreendendo os aminoácidos nâo naturais, como aqui referido. Em geral, os anticorpos são reagentes úteis para ELISA, Western bíotting, imun o química., métodos de cromatografia de afinidade, SPR, e muitos outros métodos. As referências citadas acima fornecem detalhes sobre como realizar testes ELISA, Western blot, ressonância plasmónica de superfície (SPR) e afins.

Num aspecto, os anticorpos eles próprios incluem os aminoácidos não naturais, proporcionando aos anticorpos propriedades de interesse (por exemplo, a melhoria da semivida, estabilidade, toxicidade, ou semelhante). Ver também, a secção aqui intitulada "polipeptídeos com aminoácidos não naturais". Os anticorpos são responsáveis por quase 50 de todos os compostos atualmente em ensaios clínicos (Wittrup, (1999) Phage on display Tibtech 17: 423- o utilizados i .ibiquamente como Por conseguinte, a capacidade de aminoácidos não naturais fornece para modificar estes reagentes 424 e os anticorpos s! reagentes de diagnóstico, modificar anticorpos com uma ferramenta importante va1i o s o s.

Por exemplo, há muitas aplicações de Mabs no campo de diagnóstico. Os Ensaios variam de testes simples de mancha a métodos mais comuns como o rádio marcado NR-LU-10 MAb da DuPont Merck Co. usado para imagens de tumor (Rusch et ai. (1993) digitalização anticorpo monoclonal NR-LU-10. Um novo complemento útil à tomocrrafia computadorizada, na avaliação de pulmão de c élulas nãc ^-pequenas. J Thorac Sur< j 106: 200-4) . Como se observa, os MAbs são ces xtrais para ELISA, Western blotting, a, métodos de cromatogra fia de afi .n idade e reagentes imunoquímica, semelhantes. Qualquer anticorpo de diagnóstico pode ser modificado para incluir um ou mais aminoácidos não naturais, alterando, por exemplo, a especificidade ou a avidez do Ab para um alvo, ou alterando uma ou mais propriedades detectáveis, por exemplo, através da inclusão de um marcador detectável (por exemplo, espectrográficp, fluorescente, luminescente, etc.), no aminoácido não natural. áo os Abs ser MAfos tumor em :oxicidade

Uma classe de reagentes de anticorpos valiosos s terapêuticos. Por exemplo, os anticorpos podem específicos de tumor que param o crescimento do células tumorais alvo para destruição por citoi mediada por células dependente anticors (ADCC) xi se gerais de Abs mágicas”). Um tratamento de mediada pelo complemento (CML) (estes tipos são muitas vezes referidos como "balas exemplo é o Rituxan, um mAb anti~CD20 para o linfoma não- Η o dg k i n (S c o 11 (199 } Rituxin lab: a new therapeutic m ο η o c 1 o n a 1 a n t i b o d y for non-Hodgki n's lymphoma Câncer Pract 6:195-7) . Um se< gundo exemplo refere-se a anticorpos qi. ie interferem com um componente critico do c r e s c i me n to d o tumor. Herceptin é um anticorpo monoclonal anti-HER-2 para o tratamento do cancro da. mama metastático, e fornece um exemplo de um anticorpo com este mecanismo de ação ( aselga et al. (199 ) Recomfoinant humanized arrti--HER2 antibody (Herceptin) enhances the antiturnor activity of paclitaxel and doxorubicin against HER2/neu overexpressing human breast câncer xenografts [published erratum appears in Câncer Res (1999) 59 ( ) :2020] , Câncer Res 5 : 2 25-31}. Um terceiro exemplo diz respeito a anticorpos para a entrega de compostos citotóxicos (toxinas, radionuclídeos, etc.) diretamente para um tumor ou outro local de interesse. Por exemplo, uma aplicação Mab é CYT-356, um anticorpo ligado a 90Y que dirige a rõidiação diretamente para as células do tumor da próstata (Deb et al. (1996) Treatment of hormone-refractory prostate câncer with 90Y-CYT-356 monoclonal antibody Clin Câncer Res 2: 12 9--97. Uma quarta aplicação é a terapia de pró-fármaco de enzima dirigida por anticorpos, em que uma enzima co- localizada num tumor ativa um pró-fármaco sistemicamente administrado na vizinhança do tumor. Por exemplo, um anticorpo anti-Ep-CAMl ligada a carboxipeptidase A está a ser desenvolvido para o tratamento do cancro colo-rectal (Wolfe et al. (1999) Antibody-directed enzyme prodrug therapy with the T26 G mutant of human carboxypeptidase Al: in vitro and in vivo studies with prodrugs of methotrexate and the thymidylate synthase inhibitors GW1031 and GW1 43 ioconjug Chem 10:3 -4 ). antagonistas) são concebidos funções celulares normais, exemplo é o Ortoclone OKT3,

Outros Abs (por exemplo, para inibir especificamente as para beneficio terapêutico. Um um KAb anti-CD3 oferecido pela

Johnson & Johnson para reduzir a rejeição aguda de transplante de órgãos (Strate et al. (1990) Orthoclone OKT3 as first-líne therapy in acute renal allograft rejection Transplant Pro c 22 produtos de anticorpos sao projetados e s p e c i f i c ame n te celulares normais para 0 : 219-20) . Outra classe de agonistas. Estes Mabs são Para melhorar as funções benefício terapêutico. Por exemplo, os agonistas baseados em Mab de receptores de

acetilcolina para neuroterapia estão em desenvolvimento (Xie et; al. (1997) Direct demonstration of MuSK involvement in acetylcholine receptor clustering through identi ;ation of aaonist ScFv Nat. iotechnol 71)

Qi -qu< deste anticorr pode ser modificado para incluir um ou mais aminoácidos não naturais para melhorar uma ou mais propriedades terapêuticas (especificidade, avidez, meia-vida em soro, etc.).

Outra classe de produtos de anticorpos proporciona novas funções. Os principais anticorpos deste grupo são anticorpos catalíticos, tais como sequências de Ig que foram modificadas para imitar as capacidades catalíticas de enzimas (Wentworth and Janda (199 ) Catalytic antibodies Curr Opin Chem iol 2: 13 -44}. Por exemplo, uma aplicação muito interessante envolve o uso do anticorpo catalítico mAb-15A10 para hidrolisar cocaína in vivo para a terapia de adição (Mets et al. (199 ) A catalytic antibody against cocaine prevents cocaine's reinforcing and toxic effects in rats Proc Natl Acad Sei USA 95: 1017 6- 1). Os anticorpos catalíticos também podem ser modificados para incluir um ou mais aminoácidos não naturais para melhorar uma ou mais propriedades de interesse. Ácido nucleico e a equência de polipeptideo e variante

Tal como descrito acima e abaixo, a revelação providencia sequências polinucleotídicas de ácido nucleico e as sequências de aminoácidos do polipeptídeo, por exemplo, 0-ARlNit e 0-RS e as composições e os métodos compreendendo as referidas sequências. Exemplos das ditas sequências, por exemplo, de 0-ARNt e 0-RS são aqui divulgados (ver, Tabela >, por exemplo, ID SEQ N° 3-65, 6, 7 e , e outras que na o as SEQ ID K°: 1 e 2).

Mutagéne e e outra técnica de biologia molecular

Textos gerais que descrevem técnicas de biologia molecular incluem erger and Kimmel, Guide to Molecular Cloning Techniques, Methods in Enzymology volume 152 Acadernic Press, Inc., San Diego, CA ( erger); Sambrook et al., Molecular Cloning - A Laboratory Manual (2nd Ed.), Vol. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, 19 9 ("Sambrook") and Current Protocols in Molecular iology, F.M. Ausubel et al., eds., Current Protocols, a joint venture between Greene Publishing Associates, Inc. and John Wiley & Sons, Inc., (supplemented through 1999) ("Ausubel")). Estes textos descrevem mutagénese, a utilização de vectores, promotores e muitos outros assuntos relevantes relacionados com, por exemplo, a geração de genes que incluem códãos seletores para a produção de proteínas que incluem ammoáciaos nso naturais, ARNt ortogonais, sintetases ortogonais e pares destes.

Eles incluem, mas não estão não Vários tipos de mutagénese são usados na descrição, por exemplo, para produzir bibliotecas de ARNt, para produzir bibliotecas de sintetases, para introduzir códãos seletores aue codificam aminoácidos não naturais numa proteína ou polipeptídeo de interesse, limitados a, mutagénese dirigida ao local de pontos aleatórios, recombinação homóloga, embaralhamento de ADN ou construção >utros métodos de mutagénese recursivas, quimérica, mutagénese utilizando modelos contendo uracilo, mutagénese dirigida a oligonucleótidos, mutagénese de ADN modificado com fosforotioato, mutagénese usando hélice dupla com hiatos de ADN ou semelhante, ou qualquer combinação dos mesmos. Métodos adequados adicionais incluem reparação de incompatibilidade de pontos, mutagénese usando reparação deficiente de estirpes hospedeiras, restrição-seleção e restrição-purificação, mutagénese de exclusão, mutagénese por síntese total de genes, reparação de pausa de cadeia dupla, e assim por diante. Mutagénese, por exemplo, envolvendo construções quiméricas, também está incluída na presente descrição. Num enquadramento, a mutagénese pode ser guiada por informação conhecida da molécula que ocorre naturalmente ou molécula que ocorre naturalmente alterada ou mutado, por exemplo, sequência, comparações de sequências, propriedades físicas, estrutura cristalina ou semelhantes. us textos acima e exemplos aqui encontrados descrevem esses procedimentos. Informação adicional pode ser encontrada nas seguintes publicações e referências citadas: Ling et al., Approacnes to DMA mutagenesis: an overview, Anal iochem. 254(2): 15/-1'/ (1997); Dale et al., Oligonucleot ide-drrected random mutagenesis using the phosphorothioate method, Methods Mol. iol. 57:369-374 (1996); Smith, In vitro mutagenesis, Ann. Rev. Genet. 19:423-462(19 5); otstein & Shortle, Strategies and applications of in vitro mutagenesis, Science 229:1193-1201(19 5); Cárter, Site-directed mutagenesis, iochem. J. 237:1-7 (19 6); Kunkel, Tne efiiciency of oiigonucleotide directed mutagenesis, in

Nucleic Acids & Molecular ioiogy (Eckstein, F. and Liliev, D.M.J. eds., Springer Verlag, erlin)) (19 7); Kunkel,

Rapid and efficient site-specific mutagenesis without phenotypic selection, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 2:4 -492 (19 5); Kunkel et al., Rapid and efficient site-specific mutagenesis without phenotypic selection, Methods in Enzymol. 154, 367-3 2 (19 7); ass et al., Mutant Trp repressors with new DNA-binding specificities, Science 242:240-245 (19 ); Methods in Enzymol. 100: 46 -500 (19 3); Methods in Enzymol. 154: 329-350 (19 7); Zoller &

Smith, Oligonucleotide-directed mutagenesis using M13-

Res tors: an efficient and general prociedure for the o f ρ o i n t mu t a t i o n s in any DNA fragment, Nucleic 10:64 7-6500 (19 2} ; Z o 11 e r & Smith, tide-directed. mut agenesis of DMA f ragments

Acids cloned into Ml3 vectors, Methods in Enzymol. 100:46 -500 (19 3); Zoller & Smith, oligonucleotide-directed mutagenesis: a simple method using two oligonucleotide primers and a single-stranded DMA template, Methods in Enzymol. 154:32 9-350 (19 7); Taylor et ai., The use of phosphorothioate-modified DMA in restriction enzyme reactions to prepare nicked DNA, Nucl. Acids Res. 13: 749- 764 (19 5); Taylor et al., The rapid generation of oligonucleotide-directed mutations at high frequency using phosphorothioate-modified DNA, Nucl. Acids Res. 13: 765- 7 7 (19 5); Nakamaye & Eckstein, Inhibition of restriction

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Exonucleases in phosphorothioate-based oligonucleotide-directed mutagenesis, Nucl. Acids Res. 16:791- 02 (19 };

Sayers et al.Strand specif ic cleavage of phosphorothioate-containing DNA by reaction with restriction endonucleases in the presencie of ethidium 03- 14; al„, The gapped duplex DMA approach to oligonucleotide-directed mutation construction, Nucl. ACxds Kes* 12: 9456 (19 4} ; Krame r & c o n s t ru c t i ο η o ± ^.^50-367 (19 7); Kramer et al., Improved in vitro reactions in the gapped dupiex DNA to oligonucleotide-directed construction Res. 16: 7207 (19 ) ; Fritz et bromide (19

Mu cl cíds Res. 16:

Kramer et

Enz enzymati approach ofmutati

Fritz oligonucleotide-directed of mutations via gapped duplex DNA, Methods in 154:350--'

Nucl. Acids irected construction of mutations: a al., Oligonucleotide-d gapoed duolex DNA procedure without enzymatic reactions in vitro, Nucl. Acids Res. 16: 69 7-6999 (19 >; Kramer et al., point Mismatch Kepaxr, Cerl 3 : '9 ·' (19 4)' Cárter et al., Improved oligonucleotide site-directed mutagenesis using Ml3 vectors, Nucl. Acids Res. 13: 4431-4443 (19 b) ; Cárter, Improved oligonucleotide-directed mutagenesis using M13 vectors, Methods in Enzymol. 154: 3 2-403 (19 7); E α h t e da r z a de h & henikofx, Use of 0l190nucj.e0tj.des to generate large deletions, Kuci. Acids P.es. j4: 51io v r — o) ! Wells et al., Importance of hydrogen-bond formation in stabiiizing the transition State of subtilisin, Phil. Trans. R. Soc. Lond. A 317: 415-423 (19 6); Nambiar et al., Total synthesis and cloning of a gene coding for the ribonuclease S protein, Science 223: 1299-1301 (19 4) ;

Sakamar and Khorana, Total synthesis and expression of a gene for the α-subunit of bovine rod outer segment guanine nucleotide-binding protein (transducin), Nucl. Acids Res. 14: 6361-6372 (19 ); Wells et al., Cassette mutagenesis: a.n eíficient method for generation of mui tiple mutations at aennec sití

Gene 34 .5-323 (19 b) ; Grundstr m

Oligonucleotide-directed mutagenesis by microscale 1shot-gun’gene synthesis, Nucl. Acids Res. 13: 3305-3316 (19 5) ; Mandecki, Oligonuc1e o t ide-directed doub1e-strand b r e a k repair m piasmids of Escherichia coli: a method for site- specific rautagenesis, Proc. Natl. Acad. Sei, USA, 3:7177-71 1 (19 6}; Arnold, Protein engineering for unusual

envi ronment s, Current Opinion in iotechnology 4:450-455 (1993); Sieber, et a. . L., Nature iotechnology, 19:456-460 (2001). W. P . c. Stem mer, Nature 370, 3 9-91 (1 994) ; and, I. A. Lorimer, I. Pa stan, Nuclei .c Acids Res. 23, 3067- (1995) . Detalhes adicionais sobre muitos do s métodos anterio res podem ser encontrados em Methods in Enzymology Volume 154, que tamb ém descreve controles úte S p cl T.' cl cL resolução de problemas com vários métodos de mutagênese. A descrição também se refere a células hospedeiras de vertebrados, em que as células não são células embrionárias humanas ou células humanas in vivo e organismos para a incorporação in vivo de um aminoácido não natural via pares de ARNt/RS ortogonais. As células hospedeiras são geneticamente manipuladas (por exemplo, transformadas, transduzidas ou transfectadas) com os polinucleótidos da divulgação ou construções, que incluem um polinucleótido da divulgação, por exemplo, um vector da divulgação, que pode ser, por exemplo, um vector de clonagem ou um vector de expressão. 0 vector pode ser, por exemplo, sob a forma de um plasmídeo, uma bactéria, um vírus, um polinucleído nu ou um polinucleído conjugado. Os vectores são introduzidos em células e/ου microrganismos por meio de métodos padrão, incluindo a electroporação (From et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 2, 5 24 (19 5), infecção por vectores virais, 70-73 (19 7)).

Nature ar. penetração balística de alta velocidade de partículas pequenas com o ácido nucleico quer no interior da matriz de pequenas esferas ou partículas, ou na superfície (Klein et " ' 327,

As células hospedeiras manipuladas podem ser cultivadas em meios nutrientes convencionais modificados conrorme apropriado para atividades como, por exemplo, taSureio de passos, ativar os promotores ou selecionar tranotormantes. Estas células podem ser opcionalmente cultivadas em organismos transgénicos. Outras referências úteis, por exemplo, para o isolamento de células e cultura (por exemplo, para posterior isolamento de ácido nucieico) incluem Freshney (1994) Culture of Animal Cell», a Manual, of asic Technique, third edition, Wiley- Liss, New York e as referências ai citadas; Payne et al. (1992) Piant Cell and Tissue Culture in liquid Systems John Wiley & Sons, Inc. New York, NY; Gamborg and Phillips (eds} (r995) Piant Cell, Tissue and Organ Culture; Fundamental Metnods Springer Lab Manual, Springer-Verlag ( eriin Heideiberg New York) e Atlas and Parks (eds) The Handioook of Microbiological Media (1993) CRC Press, oca Raton, FL. A invenção também se refere a linhas de células de vertebrados, em que a linha de células não é uma linha de células estaminais embrionárias humanas, com a capacidade de incorporar um aminoácido não natural ou áci ClOS ci t ΙΓ ο. V Θ S de pares ortogonais ARNt/RS , em que o ARNt compreende uma sequência tal como estabelecido na SEQ ID N ° : / . E S t â s linhas de c élulas podem ser estabeleci das utilizando técnicas de < cultura de cél ulas conhecidas na técnica em células hospedeiras que foram transformadas, transduzidas ou transfectadas com os polinucleótidos da invenção, ou construções, que incluem um polinucleótido da invenção. Os métodos de introdução de ácidos nucleicos exógenos em células hospedeiras são bem conhecidos na técnica, e variarão com a célula hospedeira utilizada. As técnicas incluem, mas não estão limitados a, transfecção mediada por dextrano, precipitação com fosfato de cálcio, tratamento com cloreto de cálcio, transfecção mediada por polibreno, fusão de protoplastos, electroporação, infecção virai ou fago, encapsulação do polinucleótido (s) era lipossomas, e microinjeção direta. de células podem ser transformadas ou transfectadí forma, a permitir A incorporação, quer transiente ou estável de ADN. Para longo prazo, a produção de alto rendimento de proteínas recombinantes, a expressão estável é a preferida. Por exemplo, as linhas celulares que expressam estavelmente a molécula de anticorpo podem ser manipuladas. Em vez de utilizar vectores de expressão que contenham origens de replicação virais, as células hospedeiras podem ser transformadas com ADN controlado por elementos adequados de controlo da expressão (por exemplo, promotor, intensificador, sequências, terminadores de transcrição, sítios de poliadenilação, etc.), e um marcador selecionável. No seguimento da introdução do ADN estranho, as células manipuladas podem ser deixadas a crescer durante 1-2 dias num meio enriquecido e depois serem mudadas para um meio seletivo. 0 marcador selecionável no plasmídeo recombinante confere resistência à seleção e permite às células integrarem estavelmente o plasmídeo nos seus cromossomas e crescer para formar focos que por sua vez podem ser clonados e expandidos em linhas celulares. Este método pode vantajosamente ser utilizado para manipular linhas celulares que expressam a molécula do anticorpo. Tais linhas celulares manipuladas podem ser particularmente úteis no rastreio e avaliação de compostos que interagem direta ou indiretamente com a molécula de anticorpo. Alternativamente, outras técnicas, tais como algumas técnicas de transfecção mediada de vectores virais, bem conhecidos para os peritos na técnica, pode permitir: a transfeccão transitória de células. Vários métodos bem conhecidos de introdução de ácidos nucleicos alvos em células estão disponíveis, cada um dos quais pode ser usado na invenção. Estes incluem: a fusão das células receptoras com protoplastos bacterianos que contêm, o ADN, electroporação, bombardeamento de projétil (para expressão mais estável), e infecção com vectores virais (que podem ser utilizados para a transfecção estável ou transitória e que também é discutido mais abaixo), etc. As células bacterianas podem ser utilizados para amplificar o número de piasmídeos contendo construções de ADN da presente invenção. As bactérias são cultuivadas até à fase logarítmica e os piasmídeos no interior das bactérias podem ser isolados por uma variedade de métodos conhecidos na técnica (ver, por exemplo, Sambrook). Além disso, um grande número de kits disponíveis comercialmente para a purificação de piasmídeos a partir de bactérias (ver, por exemplo, EasyPrep™, FlexiPrep™, ambas de Pharmacia iotech; StrataClean™, a partir de Stratagene, e, QIAprep™ da Qiagen). Os piasmídeos isolados e purificados são em seguida manipulados adicionalmente para produzir outros piasmídeos utilizados para transfectar células ou incorporados em vectores para infectar organismos relacionados. Os vectores típicos contêm terminadores de transcrição e de tradução, sequências de iniciação de transcrição e tradução, e promotores úteis para a regulação da expressão do ácido nucleico alvo em particular. Os vectores compreendem opcionalmente cassetes de expressão genéricas que contêm pelo menos uma sequência terminadora independente, sequências que permitem a replicação da cassete em eucariotas, ou procariotas, ou amboí (por exemplo, vectores de vaivém) e marcadores de seleção tanto para sistemas procarióticos e vertebrados. Os vectores são adequados para 3. replicação e integração em procariotas eucarxotas, ou de preferência ambos. Veja, Giliman & Smith, Gene : 1 (197 9) ; Roberts, et al., Nature, 32 :731 (19 7); Schneider, el a/., Protein Expr. Purif. 6435:10 (1995);

Ausubel, Sambrook, erger (supra) . Um catálogo de bactérias e bacteriófagos úteis para a clonagem é fornecido, por exemplo, pela ATCC, por exemplo, The ATCC Catalogue of acteria and acteriophag .992) Ghema et al (eds) publicado pela ATCC. Procedimentos básicos adicionais para a sequenciação, clonagem e outros aspectos da biologia molecular e considerações teóricas subjacentes são também e n c o n t r a d o s e m W a t s o n e t a 1. (1992) Re c o mb i n a nt DN A S e c o n d

Edition Scientific American ooks, NY. Além disso, essencialmente qualquer ácido nucleico (e virtuaimente qualquer ácido nucleico marcado, seja normal ou não-padrão) pode ser personalizado ou ordenado a partir de qualquer de uma variedade de fontes comerciais, tais como Midland Certified Reagent Company (Midland, TX CRCm. com), The Great American Gene Company (Ramona, CA disponíveis na Internet em genco.com), ExpressGen Inc. (Chicago, IL disponíveis na Internet. em expressgen.com}, Operon Technologies Inc. (Alameda, CA) e muitos outros.

Kit jiga çâo. Por uma proteína natural numa

Kits também são uma característica da div exemplo, é fornecido um kit para a produção de que compreende pelo menos um aminoácido não célula, em que o kit inclui um recipiente contendo uma sequência polinucleotídica que codifica um O-ARNt com a sequência tal como estabelecido na SEQ ID M°: 7, e./ou um O-ARNt. com a sequência tal como estabelecido na SEQ ID Nc: 7, e/ou uma sequência de polinucleótido que codifica um 0- kit inclui

RS , e/ou um O-RS. Numa forma de realização, o ainda pelo menos ura aminoácido não natural. Numa outra forma de realizaçao, o kit compreende ainda instruções para produzir a proteína.

EXEMPLOS

Exemplo 1: Método de produ o e compo i õe de inteta e de aminoacil-ARMt que incorporam amíno eido η o natural em célula de vertebrado A expansão do código genético vertebrado para incluir aminoácidos não naturais com novas propriedades físicas, químicas ou biológicas, fornece ferramentas poderosas para analisar e controlar a função da proteína nestas células. Para atingir este objetivo, é descrita uma abordagem gerai para o isolamento de sintetases de aminoacil-ARNt que incorporam aminoácidos não naturais com alta fidelidade em proteínas em resposta a um códão âmbar em Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae). 0 método baseia-se na ativação de genes repórteres responsivos GAL4, HIS3, URA3 ou LacZ, por supressão de códãos âmbar entre o domínio de ligação ao ADN e o domínio de ativação transcricional de GAL4. A otimização de um repórter GAL4 para seleção positiva de sintetase de tirosil-ARNt ativa de Escherichia coli (EcTyrRS) variantes é descrita. A seleção negativa de variantes EcTyrRS inativas também tem sido desenvolvida com o repórter URAS por utilização de uma molécula pequena (ácido 5-fluroorótico (5-FOA)) adicionado ao meio de crescimento, como uma "alelo tóxico. Importantes seleções positivas e negativas podem, ser realizadas numa única célula e com uma gama de severidade. Isto pode facilitar o isolamento de uma variedade de atividades de sintetase de aminoacil-ARNt- (aaRS) de grandes bibliotecas de sintetases

aaRS mutantes. A potência do método para isolar fenó desejados é demonstrada pela seleção do modelo.

Exemplo 2 coli e 3

Saccharomyces

Con tru o de ARNt hibrido de E. stearothermophilus Tyr ARNt É conhecido a partir de trabalho em cerevisiae, que os pares ARNt Tyr/RS de E. coli são ortogonais para endógenos pares de ARNt/RS e suportam a supressão do aminoácido não natural. No entanto, os esforços para transcrever E. coli ARNtTyi funcional ín vivo em células de mamíferos têm sido um desafio. Devido a isso, o interesse virou-se para B, stearothermophilus como fonte de sequência de ARNt que possa apoiar a supressão do aminoácido não natural em células de mamífero. Embora B. stearothermophilus ARNt seja um substrato para a sinteta.se de E. coli ARNtTyr, é necessário manipulação adicional de ARNt para melhorar a eficiência da aminoacilação de ARNt. Melhoria da aminoacilacão de ARNt irá melhorar a eficiência ae supressão. iste aceitadora do ARNt um fat or determinante para o reconhecimento da sintetase de ARNt. Neste exemplo, um ARNt híbrido foi construído através da combinação de diferentes componentes estruturais de E. coli e B. stearothermophilus ARNtTyr. Este ARNt híbrido tem a haste aceitadora de E, coli ARNtiyi, e o braço D, o braco ae anticódão de b. rido ARNt, tendo uma colif é um melhor ARMtTyr. Mo st.ramos na

Ti variável e haste .Tyr ^ * 1 /·*·· ! st:earothermophilus ARNtJ haste aceitadora que deriva de E. substrato para. a. sintetase de E, col. experiência abaixo que uma melhoria da eficiência de supressão de âmbar foi obtida quando foi usada a supressão do âmbar ARNt híbrido recém-criado. Para comparação, o ARNt híbrido foi testado juntamente com o B. stearothermophilus ARNtTyc partir do qual foi derivado.

Experimental:

Construção do plasmideo de codificação de ARNt híbrido:

Inserção de uma cópia única de expressão de ARNt híbrido com supressão âmbar que inclui sítios de restrição 5' (ScoRI e gl II), sequência de acompanhamento humano 5’ ARNtTyr (GGATTACGC ATGCTC AGTGCAATCTTCGGTTGCCTGGACT AGCGCTCCGGTTTT TCTGTGCTGAACCTCAGGGGACGCCGACACACGTACACGTC (SEQID NO: 89)),

Supressão âmbar de ARNt híbrido mutante a. que falta 3 * -CCA (A sequência de nucleótidos do ARNt híbrido é como se segue: GGUGGGGUAGCGAAGUGGCUAAACGCGGCGGACUCUAAAUCCGCUCCCUUUG GGUUCGGCGGTUCGAAUCCGUCCCCCUCCACCA (SEQ 1D NÔ:87), e a sequência de ADN que codifica para o ARNt é a seguinte: GGTGGGGTAGCGAAGTGGCTAAACGCGGCGGACTCTAAATCCGCTCCCTTTGG GTTCGGCGGTTCGAATCCGTCCCCCA (SEQIDNO: 88)),

Sequência flanqueadora 3'flanqueando de ARNtTyr humano (GACAAGTGCGGTTTTTTTCTCCAGCTCCCGATGACTTATGGC (SEQ ID N°: 90)) e sítios de restrição 3' ( amHI e Hind III), foi construído por sobreposição de PCR utilizando os iniciadores:

FIAM 73: iniciador para a frente, com o sítio EcoR I e gl II GTACGAATTCCCGAGATCTGGATTACGCATGCTCAGTGCAATCTTCGGTTGCCT GGACTAGCGCTCCGGTmTCTGTGC (SEQ ID NO: 91) FTAM 11b: iniciador reverso: AGTCCGCCGCGTTTAGCCACTTCGCTACCCCACCOACGTGTACGTGTGTCGGCG TCCCCTGAGGTTCAGCACAGAAAAACCGGAGCGC (SBQ1D NO: 92) FTAM 116: iniciador para a frente para a peça 2: GTGGCTAAACGCGGCGGACTCTAAATCCGCTCCCTTTGGGTTCGGCGGTTCGAA TCCGTCCCCCACCAGACAAGTG (SEQID NO: 93) FTAM 117: iniciador reverso para a peça 2: GATGCAAGCTTGATGGATCCGCCATAAGTCATCGGGAGCTGGAGAAAAAAACC GCACTTGTCTGGTGGGGGACGG {SEQ ID NO: 94). 0 inserto foi ligado a pUC19 nos sítios EcoR I e Hind III.

Experiência de supressão âmbar com o ARNt híbrido (Figura D :

Os plasmideos que codificam o mutante âmbar hGH E , a sintetase E. coli ARNt e tanto a supressão âmbar de cópia única de B. stearothermophilus ARNt como a supressão âmbar de cópia única de ARNt híbrido foram co-transfectados em células CHO Kl. A expressão de hGH foi ensaiada 42 horas após a transfecção. Quando o ARNt híbrido (H 1} foi utilizado, a eficiência da supressão âmbar aumentou aproximadamente 30 em relação à obtida quando a. supressão âmbar de B, stearothermophilus ARNt foi utilizada.

Exemplo 3 A adição de moléculas de proteínas com um aminoacido não natural.

Num aspecto, a invenção proporciona métodos e composições relacionados de proteínas compreendendo os aminoácidos não naturais acoplados a moléculas de substituintes adicionais. aqui descritos as modificações

Entende-se que os exemplos e concretizaçõe são apenas para fins ilustrativos e que vár ou alterações à luz na técnica e são p âmbito deste pedido dos mesmos serão sugeridas aos perito ara ser incluídas dentro do espírito e do âmbito das reivindicações anexas.

Embora detalh a invenção anterior tenha sido descrita em para efeitos de clareza e compreensão, será. algum claro para um perito na técnica a partir de uma leitura desta descrição que várias alterações na forma e detalhe podem ser feitas sem se sair do verdadeiro âmbito da invenção. Por exemplo, todas as técnicas e aparelhos aqui descritos podem ser usados em várias combinações. LU Ο z LU Dσ LU ifí Φ Δ <9 O z 9σ LU C0

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Claims

REIVINDICA OES Λο 1. Célula ou linha de células de vertebrado, compreende11 rp uma sequência de nucleótidos como apresentada na SEQ N°: 7 ou SjsQ ID N°: , em que a ceiuia não é α célula estaminal embrionária humana ou células huma11^ 1 pjp in vivo e a linha de células não é uma linha de cél11-1'^' estaminais embrionárias humanas. d© d°
2. Célula de acordo com a reivindicação 1, em qu© sequência nucleotídica codifica para uma molécula ARNt que tem uma sequência de reconhecimento anticódâo que é específica para um códâo seletor. e
3. Célula da reivindicação 2, em que o códao seletoi- ia© selecionado a partir do grupo que consiste em: c âmbar, códão ocre, códão opala, ou quatro ou mais códãu de base.
4. Célula da reivindicação 2, em que a sequeu^ nucleotídica codifica para uma molécula de ARNt que s©Ja n HO capaz de ser aminoacilada com pelo menos um aminoae— não natural.
5. Célula de acordo com a reivindicação 1, em que a sequência, nucleotídica codrtica para uma moiécuxa d® ARNt que é um ARNt ortogonal (O-ARNt).
6. Célula de acordo com a reivindicação 5, em que o O-ARNt é capaz de aminoacilaçao com um aminoácido natural ou um am i η o á c id o n a o na tur a1. /. Céruis de acordo com a reivindicação 4 , em que o u-ARNt é capaz de aminoacilaçao com um aminoácido natural ou um aminoácido não natural. O-ARNt . Célula de acordo com a reivindicação 5, em que o é capaz de aminoacilação com um aminoácido não natural.
9. Linha celular de acordo com a reivindicação 1, em que a linha celular foi transfectada de forma estável. Linha celular linha celular de acordo com a reivindicação 1, era foi transfectada de forma transiente e a
11. Método para produzir numa célula de um vertebrado, em que a célula de vertebrado não é uma célula estam inal embrionária 1 íumana ou célul as humanas in vivo de, pelo menos, uma proteína que compreende pelo menos um aminoácido não-natural, compreendendo: o crescimento, num meio apropriado, da referida célula, de vertebrado que compreende um ácido nucleico que compreende pelo menos um códão seletor e codifica a proteína; em que o meio compreende um aminoácido nâo natural e a célula de vertebrado compreende: um O-ARNt com uma sequência de nucleótidos descrita em SEQ ID N°: 7 ou SEQ ID N°: , que funciona na célula e reconhece o códão seletor; e uma sintetase de aminoacil-ARNt- ortogonal (O-RS) que preferencialmente aminoacila o O-ARNt comi o aminoácido não natural,
12. Método da reivindicação 11, em que a célula foi estavelmente transfectada para compreender o O-ARNt e O-RS.
13. Método da reivindicação 11, em que a célula foi transitoriamente transfectada para compreendem o O-ARNt e O-RS.
14, Método da reivindicação 11, em que a célula foi estavelmente transfectada para compreender um dos 0-ARNt ou 0-RS e transientemente transfectada para compreender o outro 0-ARNt ou 0-RS, de modo que a célula compreenda tanto um Ot-RNA como um 0-RS.
15. Método da reivindicação 11 ou a célula de acordo com a reivindicação , em que o aminoácido não natural é =cionaao partir ao grupo que consiste em: acetil-L-fenilalanina, p-iodo-L-fenilalanina, 0-metil -L-tirosina, p-propargiloxifenilalanina, L-3-(2-naftil)-alanina, 3-metil-fenilalanina, 0-4-alil-L-tirosina, 4-propi1-L-1irosina, tri-O-aceti1-G1cNAcβ-serina, L-Dopa, f e n i 1 a 1 a η i n a f 1 u o r a d a, i s o p r o p i 1 - L - f e η i 1 a 1 a n i n a, p - azido-L-feniialanina, p-acil-L fenilaianina, p-beηzoi 1 -L-fenilalanina, L-fosfosserina, fosfonoserina, f o s f ο η o t i .r: o s i n a, p-b r o m o f e n i 1 a 1 anina, p-arctino-L- f e n i 1 ala. n ina, um análogo não natural de um aminoácido da tirosina, u m análogo não natural de um aminoácido da glutamina, um análogo não natural de um aminoácido da fenilalanina, um análogo não natural de um aminoácido da. ser ina, um análogo não natural de um aminoácido da. treonina., um alquilo, ariio, acilo, azido, ciano, halo, hidrazina, hidrazida, hidroxilo, alcenilo, alcinilo, éter, tiol, sulfonilo, seleno, éster, tíoácído, borato, baronato, fosfo, fosfono, fosfina, heterocíclico, enona, imina, aldeído, hidroxilamina, ceto, ou aminoácidos substituído com amino, ou qualquer combinação do s mesmos; um aminoácido com um agente de reticulação J :o t o at iváve1; um amiηo á c i do marcado com rotação; um aminoácido fluorescente; uma J. .l Q 3. Ç 3 O aminoácido do metal; um aminoácido contendo um metal; um aminoácido radioativo; um aminoácido fotocontido e/ ou fotoisomerizável; um aminoácido contendo biotina ou um análogo de Pi. o tina; um aminoácido contendo ceto; um aminoácido que compreende polietilenoglicol ou poliéter; um aminoácido substituído por um átomo pesado; um aminoácido quimicamente clivável ou fotoclivável; um aminoácido com uma cadeia lateral alongada; um aminoácido que contém um grupo tóxico; um aminoácido substituído por açúcar; um aminoácido contendo açúcar ligado a carbono; um aminoácido redox-ativo; um ácido contendo α-hidroxi; um aminoácido tio; urn aminoácido α,α bissubstituído; um aminoácido β; um aminoácido cíclico diferente de prolina ou histidina, e um aminoácido aromático diferente de fenilalanina, tirosina ou triptofano.
16. Método da reivindicação 11, em que a proteína compreende uma proteína terapêutica, uma proteína de diagnóstico, uma enzima industrial ou uma sua porção. Método da reiv indi cação 11, em que a proteína ou polipeptideo de interesse compreende uma proteína ou uma porção de uma proteína selecionada a partir do grupo que consiste em: uma citoquina, um factor de crescimento, um rec eptor do :J -actor de cr6 ;scimento, um interferão, uma interleucina, uma molécula inflamatória, um produto de oncogene, uma. hormona peptídica, uma molécula de transduçâo de sinal, um receptor da hormona esteroide, eritropoietina (EPO), insulina, hormona de crescimento humano, uma alfa-1-antirripsina, angiostatina, um factor antihemolítico, um anticorpo, uma apolipoproteína, uma apoproteína, um factor natriuretico atriai, um poxíoeptido naLr1 urti 1 co atrial, um peptido atriai, uma quimiocina C-X-c, T39765, NAP-2, SNA-7 , Gro-a, Gr0~b, Gro-c, IP-10, GCP-2, NíiP,"ih nuF-i, PF4, MIG, uma calcitonina, um ligando de c-kit, uma quimiocina CC, um rnonócito quimioatrativo de proteína-1, um rnonócito quimioatrativo de proteína-2, um rnonócito quimioatrativo de proteína-3 uma proteína inflamatória de monócitos-1 alfa, uma proteína inflamatória de monócitos-1 beta, RANTES, 1309, R 3915, Ryi/.r>3, HCC1, T5 47, D31065, T64262, CD40, um ligante CD40, colagénio, um factor estimulante de colónias (CSF), fator de complemento 5a, inibidor do complemento, receptor do complemento 1, DHFR, péptídeo-/ ae ativação epitelial de neutrófilos, GROa/MGSA, GROp, GROY, MIP-la, MIP-16, MCP-1, um factor de crescimento epidérmico (EGF), um peptídeo ativador epitelial de neutrófilos, uma toxina exfoliante, Factor IX, Factor VII, Factor VIII, Fator X, um factor de crescimento de fibroblastos (FGF), um fibrinogénio, uma fibronectina A, G-CSF, GM-CSF, glucocerebrosidase, uma gonadotrofina, uma proteína hedgehog, uma hemoglobina, um factor cie crescimento de hepatócitos (HGF) , hirudina, albumina do soro humano, ICAM-1, um receptor de ICAM-1, LFA-1, um receptor de LFA-1, insulina, factor de crescimento semelhante à insulina (IGF), IGF-I, IGF-II, IFN-a, IFN-β, IFN-γ, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL - 5, IL- IL-7 , IL- 9, IL -10, IL -11, 12, um factor de crescimento de queratinócitos (KGF), uma iactoferrina, factor inibidor de leucemia, uma luciferase, neurturina, factor inibitório de neutrófilos (NIF}, oncostatina M, uma proteína osteogènica, uma hormona da paratireoi.de, PD-ECSF, PDGF, pleiotropina, Proteína A, Proteína G, exotoxinas pirogénicas A, , ou C, relaxina, renina, SCF, um receptor de complemento solúvel I, I-CAM 1 solúvel, receptor de interleucina solúvel, receptor de TNF solúvel, somatomedina, somatostatina, somatotropina, estreptoquinase, superantigénio, enterotoxinas estafilocócicas, SE A, SE , SEC1, SEC2, SEC3, SED, SEE, um receptor da hormona esteroide, um superóxido dismutase (SOD), síndrome do choque tóxico da toxina, alfa-1 timosina, um ativador do plasminoqénio de tec ido, factor de T^p"1 ” β , f. actor de n tum oral alfa, um rec: eptor do factoi VLA -4, proteína ctor de necrose de tumor, um factor de necrose LCtor de necrose tumoral beta, um ECAM-l, factor de crescimento endotelial vascular (VEGEF), uroquinase, Mos, Ras, Raf, Met f p5 3, Tat, Fos, Myc, Jun, Myb, Rei, um receptor de estrogénio, um receptor de proges j- o 27 Q ΓΊ -Ά um receptor de testosterona, receptor de aldosl :erona, um receptor de LDL, SCF/c- -Kit, CD4 0L/CD4 0, VLA -4/VCAM -1, :AM-1/LFA-1, hia1urina/CD44, e corticosterona. içâo de uma proteína < SLcido i são na tural, contém uma s equênci SEQ TD N° : 7 ou SEQ cação 1 , em ΟΊ se o ki compreendendo: um poli n ucleotidica Kit para a menos um pelo menos, um aminoácido não natui compreende ainda
20. Kit da reivindicação 1 , em que o kc instruções para produzir a proteína.