CN115261344B - 基于非天然氨基酸的离子液体、其制备方法及应用 - Google Patents

基于非天然氨基酸的离子液体、其制备方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及基于非天然氨基酸的离子液体、其制备方法及应用，具体提供了一种用于制备含非天然氨基酸蛋白的物质组合，包括：(1)一种或多种氨基酰‑tRNA合成酶，其能够结合突变的tRNA；(2)一种或多种突变的tRNA，所述突变的tRNA反密码子环上突变为终止密码子的互补序列；(3)多种基于非天然氨基酸的离子液体。所述物质组合可用于重组表达含非天然氨基酸目的蛋白。基于非天然氨基酸的离子液体能够提高基因密码子拓展系统对提前终止密码子(PTC)的通读效率、和/或插入非天然氨基酸效率。

Description

基于非天然氨基酸的离子液体、其制备方法及应用
技术领域
本发明属于生物制药领域，通过合成新型的非天然氨基酸-胆碱型离子液体，提高了难溶性非天然氨基酸的溶解度、插入效率和在体内的生物利用率，对基因密码子拓展技术的完善和在疾病治疗领域的推广应用具有很大的突破意义。
背景技术
自然界中总共有64个三联体密码子，在一般的生物体中，其中61个密码子编码20种天然氨基酸，而另外三种密码子(UAA,UGA,UAG)不编码任何氨基酸，当核糖体翻译到这些密码子的时候，会有正常的终止因子来终止蛋白质翻译。
2002年，美国Ohio州立大学的Krzycki团队在Science期刊上相继发表两篇研究论文，发现在一些古细菌甲烷八叠球菌(Methanosarcina barkeri)中，UAG可编码自然界第22种氨基酸—吡咯赖氨酸。该UAG密码子位于甲基转移酶的基因组中，且不是作为终止信号而是被核糖体通读。该研究为之后基因密码子拓展技术的研究奠定了基础。以Peter Schultz为先驱的科学家们，尝试将自然界古细菌中的氨酰tRNA合成酶/tRNA对转导入细菌E.coli中，发现其在细菌中也可正常编码吡咯赖氨酸而不编码其他种类的氨基酸，也不影响其他的氨基酸的正常编码，说明该氨酰tRNA合成酶与tRNA是一组正交对。随后又尝试将该正交体系拓展到酵母、哺乳动物细胞中，发现其均可在真核生物体内利用UAG密码子编码吡咯赖氨酸。基于此，该正交体系被验证可成功拓展到古细菌之外的其他生物体中，且可正常发挥编码UAG密码子的功能。这相当于该正交对将本来不编码氨基酸的UAG终止密码子变成了可以编码正交的非天然氨基酸的有义密码子，生物体内的有义基因密码子从61个拓展到62个，人们可利用该正交对在基因水平上进行人为设计从而改造蛋白质。因此，该方法也被称为基因密码子拓展技术。
近十年来，该技术的研究迅速发展，科学家在古菌中也发现了其他种类类似的氨酰tRNA合成酶/tRNA正交对。目前，已发现的新的正交翻译系统多达15种。基于不同体系的非天然氨基酸系统，包括酪氨酸体系，吡咯赖氨酸体系，苯丙氨酸体系，大大丰富了非天然氨基酸结构的选择；而越来越多的物种，包括大肠杆菌，哺乳动物细胞，酵母，昆虫细胞等，都可以进行非天然氨基酸的插入，也为这套技术的广泛应用奠定了基础；在插入方法上，从最早的琥珀终止密码子，到其他终止密码子，四联体密码子，稀有密码子，甚至优化的特殊核糖体等，为插入方法提供了更多的选择。基因密码子拓展技术在蛋白质功能调控、疾病治疗、生物防控等领域有重要的应用。
基因密码子拓展技术的快速发展在生物制药等领域的应用前景日趋明朗，但目前仍存在多个技术瓶颈，包括：1)某些种类的非天然氨基酸的溶解度低。非天然氨基酸目前主要是通过体外化学合成实现，合成成本较高。除此外，一些带有功能基团的非天然氨基酸难溶于水，只能溶于有机溶剂，这类非天然氨基酸溶液会对细胞产生毒性，进而限制了这类非天然氨基酸的应用。因此，如何优化该类非天然氨基酸的结构使其能正常溶解于水从而在细胞中发挥作用，是该领域目前亟需解决的问题。2)非天然氨基酸在动物体内的口服生物利用度较低。目前非天然氨基酸作为药物的给药方式主要是通过局部定点给药或者腹腔注射，给药方式不是很方便安全，而且生物利用度较低。在血清中很快被代谢完全，在靶器官组织的含量较少，需要多次注射。所用的非天然氨基酸总的剂量较大，成本较高。因此，非天然氨基酸的口服生物利用度低限制了基因密码子拓展技术在动物水平上的应用研究。3)应用基因密码子拓展技术插入非天然氨基酸的效率仍需进一步提高。在蛋白翻译过程中，当核糖体移动到提前密码子处时，携带非天然氨基酸的正交tRNA与原核/真核释放因子竞争与终止密码子的识别与结合，会使得非天然氨基酸不能百分之百编码到PTC的位置。因此，制约该技术应用的又一个核心问题是非天然氨基酸的插入效率。目前，科学家们已在改进氨酰tRNA合成酶/tRNA结构、优化EF-Tu、优化真核释放因子eRF1等翻译元件方面进行了一系列深入的工作，提高了非天然氨基酸的插入效率。然而通过优化非天然氨基酸底物以提高其插入效率的工作目前还未有研究开展。
离子液体(Ionic Liquids)是以阴、阳离子按照一定的化学计量比，在一定条件下形成的液态熔融盐，一般由有机阳离子和无机/有机阴离子组成。常见的阳离子包括季铵盐、咪唑盐和吡咯盐离子等，阴离子包括卤素离子、四硼酸根离子、六氟磷酸根离子等，其组成成分之间的相互作用力主要是以氢键和范德华力为主。同时，离子液体还可以通过组合不同的阴、阳离子或者改变其组成比例，从而使得离子液体具有不同的物理、化学性质。根据离子液体的发展历史，将其发展过程分为三代：第一代离子液体具有低黏度、高热稳定性等性质，但是其也对氧敏感、吸湿性强等，需要在惰性气体的环境中才能合成与应用，因此应用范围有限。第二代离子液体克服了第一代离子液体的缺点，具有高化学稳定性，常被用作高性能材料、金属离子络合剂等。第三代离子液体选用胆碱、氨基酸、烷基硫酸盐等，该类化合物合成过程简单、生物降解性高、毒性低且无需纯化，因此也被称为“绿色溶剂”。第三代离子液体目前已在合成催化、药物开发及递送、新型聚合材料等领域得到了广泛应用。由于咪唑类具有较强的细胞毒性，该类离子液体在药物递送中的应用一直受限。而胆碱类离子液体因具有原料天然绿色、毒性低和生物降解性好等优点，其在药物递送领域开展的应用更广，递送的药物种类和给药途径则更为多样化。根据之前的研究，我们可得知，离子液体具有提高小分子的溶解度、提高药物的渗透性、促进小分子药物和生物大分子的口服吸收等功能，因而应用前景广阔。
发明内容
针对上述现有技术中存在的缺陷，本发明的目的在于改变非天然氨基酸的理化参数、提高基因密码子拓展系统对PTC的通读效率和在目的蛋白中插入非天然氨基酸的效率。提供了一种基于非天然氨基酸的离子液体、其制备方法及应用，利用所述基于非天然氨基酸的离子液体提高了基因密码子拓展系统对提前终止密码子(PTC)的通读效率、和/或插入非天然氨基酸效率。
具体而言，本发明所采用的技术方案如下：
第一方面，本发明提供一种用于制备含非天然氨基酸蛋白的物质组合，包括：
(1)一种或多种氨基酰-tRNA合成酶，其能够结合突变的tRNA；
(2)一种或多种突变的tRNA，所述突变的tRNA反密码子环上突变为终止密码子的互补序列；
(3)基于非天然氨基酸的离子液体。
进一步，本发明所述用于制备含非天然氨基酸蛋白的物质组合中(1)所述的氨基酰-tRNA合成酶能将(2)所述突变的tRNA结合到非天然氨基酸上产生氨基酰-tRNA；
进一步，本发明所述用于制备含非天然氨基酸蛋白的物质组合中(3)所述基于非天然氨基酸的离子液体与对应的非天然氨基酸相比具有改善的溶解度、和/或生物利用度。
优选的，本发明所述用于制备含非天然氨基酸蛋白的物质组合，其中(3)非天然氨基酸离子液体为非天然氨基酸-胆碱，包括但不限于NAEK-胆碱、Anap-胆碱、pAcF-胆碱。
优选的，本发明所述用于制备含非天然氨基酸蛋白的物质组合，其中(1)所述氨基酰-tRNA合成酶选自MmPylRS、EcLeuRS、EcTyrRS。
优选的，本发明所述用于制备含非天然氨基酸蛋白的物质组合，其中(2)所述突变的tRNA选自突变的tRNAMmPyl、突变的tRNAEcLeu、突变的tRNAEcTyr。
优选的，本发明所述用于制备含非天然氨基酸蛋白的物质组合，其中：
所述氨基酰-tRNA合成酶为来自马氏古甲烷球菌的MmPylRS、突变的tRNA为tRNAMmPyl UCA；
所述氨基酰-tRNA合成酶为来自大肠杆菌的EcLeuRS、突变的tRNA为tRNAEcLeu CUA；
所述氨基酰-tRNA合成酶为来自大肠杆菌的EcTyrRS、突变的tRNA为tRNAEcTyr UUA。
第二方面，本发明提供一种重组表达含非天然氨基酸目的蛋白的方法，其利用本发明前述任一所述用于制备含非天然氨基酸蛋白的物质组合在目的蛋白中插入非天然氨基酸。
优选的，本发明所述重组表达含非天然氨基酸目的蛋白的方法，其中，利用大肠杆菌、酵母、哺乳动物细胞、昆虫细胞作为宿主细胞重组表达含非天然氨基酸蛋白；
更优选的，所述非天然氨基酸由提前终止密码子(PTC)编码。
优选的，本发明所述重组表达含非天然氨基酸目的蛋白的方法，包括：
步骤1.改造宿主细胞，使其表达所述一种或多种氨基酰-tRNA合成酶、和所述一种或多种突变tRNA；
步骤2.向步骤1获得的改造宿主细胞中转入含非天然氨基酸蛋白编码核酸的表达盒，制备重组宿主细胞；
步骤3.在添加基于非天然氨基酸的离子液体的培养基中培养步骤2获得的重组宿主细胞。
进一步，本发明所述重组表达含非天然氨基酸目的蛋白的方法在步骤3.之后还可选的包括
步骤4.培养重组宿主细胞、从培养物中分离含非天然氨基酸目的蛋白。
第三方面，本发明提供基于非天然氨基酸的离子液体在提高基因密码子拓展系统对PTC通读效率、和/或插入非天然氨基酸效率中的应用，
其中，所述基因密码子拓展系统包括一种或多种氨基酰-tRNA合成酶、一种或多种突变的tRNA；
所述基于非天然氨基酸的离子液体包括但不限于Ch-NAEK、Ch-Anap、Ch-pAcF。
优选的，本发明所述的基于非天然氨基酸的离子液体在提高基因密码子拓展系统对PTC通读效率、和/或插入非天然氨基酸效率中的应用，其中以所述非天然氨基酸离子液体替代或部分替代非天然氨基酸，加入重组细胞培养基中。
第四方面，本发明提供一种非天然氨基酸离子液体，其以胆碱和非天然氨基酸为原料制备产生，其中胆碱和非天然氨基酸的摩尔比为1:0.1-10，优选的，所述非天然氨基酸选自NAEK、Anap、pAcF。
本方法的有益效果在于：
1)在前期建立的三种基因密码子拓展系统基础上，通过化学合成方法将三种非天然氨基酸Anap、NAEK、pAcF制备成非天然氨基酸-胆碱离子液体，经过质谱鉴定、红外光谱表征、核磁共振氢谱表征确认成功合成了三种不同的非天然氨基酸-胆碱离子液体。
2)将三种不同的非天然氨基酸-胆碱离子液体用于完善基因密码子拓展系统，经过检测本发明制备的非天然氨基酸-胆碱离子液体具有明显提高的溶解度和生物利用度，细胞毒性小、安全性好，尤其令人惊奇的是本发明的非天然氨基酸-胆碱离子液体还能够提高基因密码子拓展系统对PTC通读效率、插入非天然氨基酸效率。
3)利用本发明非天然氨基酸-胆碱离子液体，结合前期建立的三种基因密码子拓展系统在小鼠模型中进行了药代和药效学研究，特别是在肌营养不良症小鼠模型中验证了能够恢复肌肉组织Dystrophin蛋白的表达量，从而为生物制药临床前研究奠定了基础。
附图说明
通过参考附图阅读下文的详细描述，本公开示例性实施方式的上述以及其他目的、特征和优点将变得易于理解。在附图中，以示例性而非限制性的方式示出了本公开的若干实施方式，并且相同或对应的标号表示相同或对应的部分，其中：
图1A.三种UAA-胆碱离子液体合成路线图
三种UAA-胆碱离子液体合成路线如图1A所示，通过所述合成路线制备获得非天然氨基酸为阴离子、胆碱为阳离子的离子液体。
图1B.三种UAA-胆碱离子液体外观性状
三种不同UAA-胆碱离子液体实物外观性状如图1B所示，Ch-NAEK在常温下呈淡黄色透明液体，流动性好；Anap-胆碱在常温下呈液体，颜色为褐色(可能是由于胆碱的含量比例较高)；pAcF-胆碱在常温下为黏稠状，颜色较深，呈棕黄色，当温度升高到50℃，则很快融化成液体。
图2.三种UAA-胆碱型离子液体提高UAA溶解度的结果图
三种UAA-胆碱型离子液体在水中的溶解度均显著高于相应的游离非天然氨基酸粉末，Ch-NAEK在水中的溶解度超过70％。将相应的UAA溶解于水中，检测其溶解度。
图3.三种UAA-胆碱型离子液体在293T细胞水平上安全浓度筛选
当加入的Ch-NAEK/pAcF浓度>2mM时，细胞的数目开始下降，之后随着Ch-UAA浓度的增大而迅速减少。表明，2mM为这两种Ch-UAA在细胞水平上的最大安全使用浓度；而500μM则为Ch-Anap的最大安全使用浓度。
图4A.三种UAA-胆碱型离子液体在293T细胞重组表达GFP中UAA的插入效率荧光图
图4A表明培养基中的三种UAA-胆碱型离子液体均可以正常参与蛋白质的翻译过程，可实现终止密码子TAA的通读。
图4B.三种UAA-胆碱型离子液体在293T细胞重组表达GFP中UAA的插入效率流式分析图
图4B表明三种UAA-胆碱型离子液体组通读TAA的效率均高于UAA水溶液组，且Ch-NAEK组的通读效率提高最明显，约20％；Ch-Anap组的通读效率提高超过5％；Ch-pAcF组的通读效率提高约10％。
图5A.三种UAA-胆碱型离子液体在小鼠水平上提高UAA生物利用度的免疫印迹
图5A表明，pylRS-tRNA-GFP39TAA转基因小鼠口服剂量为30mg与50mg的Ch-NAEK的肌肉组织GFP蛋白恢复表达量基本一致，因此我们将30mg Ch-NAEK作为最佳口服剂量。
图5B.小鼠口服Ch-NAEK后的血清浓度曲线图
图5B表明，Ch-NAEK组别的小鼠的NAEK生物利用度比NAEK-水溶液组的更高。从NAEK水溶液组的曲线可知，口服2小时后，血清中的NAEK含量达到最大值，约1.6μg/mL。在口服8小时后，血清中的NAEK含量几乎为零，表明NAEK的代谢速度很快，6个小时即可代谢完成。而从Ch-NAEK组的曲线可知，口服9小时后，血清中NAEK的含量达到最大值，约7μg/mL，是对照组的7倍左右。且口服22小时后，血清中的NAEK含量才趋近为零，约15个小时才可代谢完成。该结果说明，Ch-NAEK这种剂型显著提高了NAEK在小鼠体内的利用率，延长其半衰期，提高了小鼠机体细胞对NAEK的吸收率，并延长其代谢时间，为提高不同组织中NAEK的利用率奠定了基础。
图6.UAA-胆碱型离子液体在小鼠水平的组织分布测定
Ch-NAEK组别小鼠不同组织中的NAEK含量高于NAEK-水溶液组，而且肌肉、胃、脑、心脏组织中NAEK含量的提高为更明显。
图7.小鼠不同组织荧光蛋白通读表达的蛋白免疫印迹检测
Ch-NAEK组别小鼠的心脏、脑、胃和肌肉组织GFP通读表达量明显高于NAEK-水溶液组，且胃组织GFP表达量的提高最为明显。该结果说明，组织中NAEK含量的提高有助于GFP蛋白通读率的提高，与上述组织中NAEK含量结果的趋势保持一致。
图8.小鼠肌肉组织Dystrophin蛋白全长表达的蛋白免疫印迹检测
mdx小鼠在口服Ch-NAEK溶液2周时，其疾病蛋白已有明显的全长表达恢复，而口服NAEK水溶液组的疾病蛋白恢复表达量非常低。此外，口服2周和4周组别的小鼠蛋白恢复表达量无显著性差异，约45％左右，表明小鼠在口服2周后，其疾病蛋白恢复表达程度已接近平台期，而且该蛋白恢复表达量明显高于同时间点的口服NAEK水溶液组和之前所采用的腹腔注射组。该结果表明，Ch-NAEK可有效提高NAEK在小鼠体内的利用率，从而达到仅以较少的NAEK剂量，就可以实现疾病蛋白的高效表达的效果。
图9A.Ch-NAEK的质谱鉴定(目标分子峰：466)
图9B.Ch-pAcF的质谱鉴定(目标分子峰：414)
图9C.Ch-Anap的质谱鉴定(目标分子峰：895)
经过质谱鉴定，所合成的三种UAA-胆碱型离子液体的质谱峰均与理论值相符，表明合成产物的纯度较高。
图10A.Ch-NAEK的核磁共振氢谱鉴定
图10B.Ch-pAcF的核磁共振氢谱鉴定
图10C.Ch-Anap的核磁共振氢谱鉴定
通过对Anap/Ch-Anap、NAEK/Ch-NAEK、pAcF/Ch-pAcF三组的核磁共振氢谱结果进行分析，可以得知，新合成的三种Ch-UAA均成功合成。
图11A.Ch-NAEK的红外光谱图
图11B.Ch-pAcF的红外光谱图
图11C.Ch-Anap的红外光谱图
Ch-UAA与UAA的红外光谱峰型基本一致，关键官能团的峰型一致，因胆碱离子的影响，一些峰的基本位置发生了偏移。
图12.在Mdx小鼠模型采用离子液体Ch-NAEK和密码子拓展系统治疗DMD疾病的流程示意图
进行治疗DMD疾病的实验性探究。在成功合成了Ch-NAEK、Ch-pAcF、Ch-Anap三种离子液体，并且进行了鉴定和活性评价的基础上，选择Ch-NAEK作为后续疾病治疗的离子液体。首先对DMD疾病小鼠--mdx小鼠进行了肌注了AAV-MmpylRS-tRNA病毒，每日口服Ch-NAEK(质量体积分数为70％)，时长为四周，分别在第一、二、四周取肌肉组织，进行Dystrophin蛋白恢复量的检测，小鼠肌肉组织HE病理染色检测，血清CK激酶含量的测定及小鼠握力测试实验。在疾病模型小鼠水平上全面评价了该递送方式的治疗效果，结果表明该剂型对非天然氨基酸的递送和插入效率有非常显著的优化效果，使得口服非天然氨基酸治疗DMD疾病成为可能，对无义突变疾病的治疗具有很大的突破意义。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明作进一步地详细描述。
实施例一、通过化学合成的方式合成三种UAA-胆碱型离子液体
1、Ch-NAEK的合成路线及方法
具体的合成路线如图1A所示，具体流程如下：以氢氧化胆碱和NAEK为反应原料，比例为氢氧化胆碱：NAEK＝1:1，合成Ch-NAEK离子液体。首先称取适量的NAEK，放入反应瓶中，加入适量水，放置于搅拌器上使之溶解；再将含有45％甲醇的氢氧化胆碱在旋蒸仪上除甲醇，称取适量使用玻璃滴管将其滴加到反应瓶中，保持温度在0℃，反应48小时。待反应完全后，将反应产物在旋蒸仪上55℃除去水，再加入氨基酸沉淀剂ACN/MeOH(9/1)，然后过滤，收集滤液，最后将滤液在40℃下旋去除有机溶剂。放入60℃的真空干燥箱中烘干，时间为48h，收集最终液体物质。
2、Anap-胆碱的合成方法
具体方法同上，其中胆碱：Anap＝6：1。
3、pAcF-胆碱的合成方法
具体方法同上，其中胆碱：pAcF＝1：1。
将合成三种离子型液体Ch-NAEK、Ch-Anap、Ch-pAcF的外观性状如图1B所示。
检测三种离子型液体在H2O中的溶解度，结果如图2所示。
实施例二、三种UAA-胆碱型离子液体的鉴定和表征
1、红外光谱鉴定
1)样品制备：分别取20mg的NAEK、Anap、pAcF三种UAA粉末和相应摩尔量的UAA-胆碱型离子液体，分别放置于1.5mL离心管中，保持干燥。
2)送样检测：将六个样品分别加样于红外光谱仪加样口处，进行仪器分析。分辨率为4cm-1，扫描范围为4,200-400cm-1(图11A-C)。
2、核磁共振氢谱鉴定
取20mg离子液体于3mL离心管中，加入氘代的DMSO试剂，使其充分溶解，再将其转移至核磁管中，并做好标记，之后送样检测(图10A-C)。
3、质谱鉴定
用少量的去离子水溶解合成的三种非天然氨基酸-胆碱化合物，将其配成1ug/ml的溶液。之后上样，进行总分子量质谱分析(图9A-C)。
4、数据处理分析
因三种新合成的物质中胆碱个数不同，在溶液中胆碱离子可能会解离。因此，每种物质可能有多种存在形式。根据质谱鉴定、核磁共振氢谱解谱、红外光谱解谱的要求，进行数据分析，验证合成的化合物的准确性。具体质谱数据如下：
Ch-NAEK：259+104×2＝467(1个NAEK离子+2个胆碱离子)
Ch-pAcF：310+104＝414(1个pAcF离子+1个胆碱离子)
Ch-Anap：273+104×6-2＝895(1个Anap离子+6个胆碱离子)。
实施例三、UAA-胆碱离子液体对哺乳动物细胞的毒性和安全性
1、配制三种UAA-胆碱浓度梯度
首先称量适量的UAA-胆碱型离子液体，将其溶于水中，配成Ch-NAEK、Ch-Anap、Ch-pAcF三种50mM的UAA-胆碱溶液，之后按照0mM、0.5mM、1.5mM、2mM、4mM、6mM、8mM稀释配制成含不同浓度UAA-胆碱型离子液体的293T细胞培养基，待用。
2、细胞活力测定
a.细胞铺板：在10cm皿的细胞中加入1mL 0.25％Trypsin-EDTA消化液，消化成单细胞并重悬后，使用细胞计数仪计算细胞数目。细胞六孔板的铺板密度为每孔3×105个细胞。将细胞铺板混匀后转移至37℃孵箱中，培养过夜，待细胞数量生长至70％左右，进行转染。
b.细胞数目与UAA-胆碱浓度曲线：将含不同浓度UAA-胆碱的细胞培养基分别加入到293T细胞中，进行48h的细胞状态观察和活力检测。培养48h时，消化收集细胞，通过细胞计数仪统计细胞数目，做细胞数目与UAA-胆碱浓度的拟合曲线。
c.细胞生长曲线：设置两个实验组，一组在铺好板的293T细胞中分别加入适量的UAA水溶液，另一组在细胞中加入等摩尔量UAA-胆碱型离子液体，每组设两个复孔，进行培养。在0h，6h，24h，48h，56h和72h时间点进行消化收集各组别的细胞，并进行计数，绘制不同条件下的细胞生长曲线(图3)。
实施例四、UAA-胆碱离子液体在动物细胞中提高UAA插入效率
参考第202111050643.3号发明专利申请的方法检测UAA-胆碱离子液体在动物细胞中的UAA插入效率。简言之，在293T细胞中转入三种氨酰合成酶和突变tRNA正交密码子拓展系统，再将携带有PTC的GFP重组表达盒的质粒转入293T细胞中。在质粒转染细胞6小时后换液，分别配制含1mM/100μM的UAA-胆碱和1mM/100μM的UAA的细胞培养基，加入到293T细胞中，培养48h，之后进行荧光显微镜观察拍照(图4A)和细胞荧光流式分析(图4B)，比较在加入两种不同剂型的非天然氨基酸情况下，三种基因密码子拓展系统通读TAA效率的差异。
实施例五、Ch-NAEK在小鼠水平上口服剂量的优化
1、Ch-NAEK的最佳口服安全浓度的确定
a.首先以如下质量体积分数100％、90％、80％、70％、60％、50％配制Ch-NAEK溶液。
b.小鼠分别口服不同质量体积分数的Ch-NAEK溶液，观察其生长状态情况。
2、最佳口服剂量的确定
前期我们已通过原核显微注射pylRS-tRNA-GFP39TAA成功制备获得了转基因小鼠，设置了每天口服10mg、30mg、50mg Ch-NAEK的剂量组别，将pylRS-tRNA-GFP39TAA转基因小鼠分别口服三种剂量的Ch-NAEK，一周后提取各组别小鼠的肌肉组织，进行荧光蛋白GFP恢复表达量的检测(图5A)。
实施例六、Ch-NAEK在小鼠体内生物利用度的检测
设两个实验组，每组12只小鼠。一组每只小鼠口服30mg NAEK水溶液，另一组每只小鼠口服等摩尔量的Ch-NAEK，之后在1h、2h、4h、6h、8h、9h、10h、14h、19h、22h时间点对小鼠进行眼眶取血，绘制小鼠血清中NAEK含量-时间的变化曲线(图5B)。
实施例七、小鼠体内不同组织UAA的含量确定
两个实验组小鼠口服等摩尔量的NAEK 9h后，进行处死，提取各器官组织，置于匀浆管中，按照0.1g/mL的浓度将组织中加入去离子水进行匀浆，并绘制小鼠口服不同剂型NAEK 9h后的NAEK含量-组织类型柱状图(图6)。
实施例八、小鼠体内不同组织GFP蛋白表达量的测定
两个实验组的pylRS-tRNA-GFP39TAA转基因小鼠每天口服等摩尔量的NAEK，一周后，获取心脏、肌肉、脑和肝组织，并进行组织匀浆和蛋白提取，进行免疫印迹(图7)。
实施例九、UAA-胆碱型离子液体优化mdx小鼠Dystrophin蛋白的全长表达
mdx小鼠是DMD疾病研究的经典小鼠模型，mdx小鼠的Dystrophin蛋白的外显子23位密码子发生TAA的无义突变，导致Dystrophin蛋白无法正常表达，小鼠的肌肉组织、心脏等出现肌肉萎缩的症状。
将肌注了AAV-MmpylRS-tRNA病毒的mdx小鼠分为两个实验组，一组小鼠每天口服NAEK水溶液，另一组小鼠每天口服等摩尔量的Ch-NAEK水溶液。在口服后的第1、2、4周时间点分别对其进行治疗效果评价。分别取出小鼠口服NAEK第1、2和4周三个时间点的对照组和实验组小鼠胫前肌组织，进行组织处理和蛋白提取，进行免疫印迹检测(图8、图12)。
以上介绍了本发明的较佳实施方式，旨在使得本发明的精神更加清楚和便于理解，并不是为了限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的修改、替换、改进，均应包含在本发明所附的权利要求概括的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种用于制备含非天然氨基酸蛋白的物质组合，包括：
(1)一种或多种氨基酰-tRNA合成酶，其能够结合突变的tRNA；
(2)一种或多种突变的tRNA，所述突变的tRNA反密码子环上突变为终止密码子的互补序列；
(3)基于非天然氨基酸的离子液体，所述基于非天然氨基酸的离子液体为非天然氨基酸-胆碱离子液体，其以胆碱和非天然氨基酸为原料通过化学合成产生；
其中，(1)所述的氨基酰-tRNA合成酶能将(2)所述突变的tRNA结合到非天然氨基酸上产生氨基酰-tRNA；并且
所述基于非天然氨基酸的离子液体与非天然氨基酸相比具有改善的溶解度、和/或生物利用度；
所述氨基酰-tRNA合成酶为来自马氏古甲烷球菌的MmPylRs、突变的tRNA为tRNAMmPylUCA；
所述氨基酰-tRNA合成酶为来自大肠杆菌的EcLeuRs、突变的tRNA为tRNAEcLeuCUA；
所述氨基酰-tRNA合成酶为来自大肠杆菌的EcTyrRs、突变的tRNA为tRNAEcTyrUUA。
2.如权利要求1所述用于制备含非天然氨基酸蛋白的物质组合，其特征在于，所述非天然氨基酸-胆碱离子液体为Ch-NAEK、Ch-pAcF、Ch-Anap。
3.一种重组表达含非天然氨基酸目的蛋白的方法，其特征在于利用权利要求1-2任一所述用于制备含非天然氨基酸蛋白的物质组合在目的蛋白中插入非天然氨基酸。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于利用大肠杆菌、酵母、哺乳动物细胞、昆虫细胞作为宿主细胞重组表达含非天然氨基酸蛋白；所述非天然氨基酸由提前终止密码子(PTC)编码。
5.如权利要求4所述的方法，其包括：
步骤1.改造宿主细胞，使其表达所述一种或多种氨基酰-tRNA合成酶、和所述一种或多种突变tRNA；
步骤2.向步骤1获得的改造宿主细胞中转入含非天然氨基酸蛋白编码核酸的表达盒，制备重组宿主细胞；
步骤3.在添加基于非天然氨基酸的离子液体的培养基中培养步骤2获得的重组宿主细胞。
6.如权利要求5所述的方法，在步骤3之后还包括：
步骤4.培养重组宿主细胞、从培养物中分离含非天然氨基酸目的蛋白。
7.基于非天然氨基酸的离子液体在提高基因密码子拓展系统对提前终止密码子(PTC)通读效率、和/或插入非天然氨基酸效率中的应用，
其中，所述基因密码子拓展系统包括：
(1)一种或多种氨基酰-tRNA合成酶，其能够结合突变的tRNA；和
(2)一种或多种突变的tRNA，所述突变的tRNA反密码子环上突变为终止密码子的互补序列；
并且，(1)所述的氨基酰-tRNA合成酶能将(2)所述突变的tRNA结合到非天然氨基酸上产生氨基酰-tRNA；
所述基于非天然氨基酸的离子液体为Ch-NAEK、Anap-胆碱、pAcF-胆碱；
所述氨基酰-tRNA合成酶为来自马氏古甲烷球菌的MmPylRs、突变的tRNA为tRNAMmPylUCA；
所述氨基酰-tRNA合成酶为来自大肠杆菌的EcLeuRs、突变的tRNA为tRNAEcLeuCUA；
所述氨基酰-tRNA合成酶为来自大肠杆菌的EcTyrRs、突变的tRNA为tRNAEcTyrUUA。
8.如权利要求7所述的基于非天然氨基酸的离子液体在提高基因密码子拓展系统对提前终止密码子(PTC)通读效率、和/或插入非天然氨基酸效率中的应用，其特征在于以所述基于非天然氨基酸的离子液体替代或部分替代非天然氨基酸，加入重组细胞培养基中。
9.如权利要求7所述的基于非天然氨基酸的离子液体在提高基因密码子拓展系统对提前终止密码子(PTC)通读效率、和/或插入非天然氨基酸效率中的应用，其中所述非天然氨基酸的离子液体是以胆碱和非天然氨基酸为原料通过化学合成产生，其中胆碱和非天然氨基酸的摩尔比为1:0.1-10。
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Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107012121A (zh) * 2016-01-27 2017-08-04 北京大学 携带正交tRNA/氨酰tRNA合成酶的稳定细胞系的构建

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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU2004233083B2 (en) * 2003-04-17 2010-09-16 The Scripps Research Institute Expanding the eukaryotic genetic code
SG174781A1 (en) * 2006-09-08 2011-10-28 Ambrx Inc Hybrid suppressor trna for vertebrate cells
CN107177593B (zh) * 2016-03-10 2020-10-23 北京大学 利用优化的基因密码子扩展系统通读提前终止密码子疾病中的截短蛋白
CN110835633B (zh) * 2018-08-13 2021-10-01 北京大学 利用优化的基因密码子扩展系统制备ptc稳定细胞系及应用
CN113699124B (zh) * 2021-09-08 2022-04-12 北京大学 一种含非天然氨基酸蛋白的制备方法
CN115261344B (zh) * 2022-08-29 2023-07-21 北京大学 基于非天然氨基酸的离子液体、其制备方法及应用

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107012121A (zh) * 2016-01-27 2017-08-04 北京大学 携带正交tRNA/氨酰tRNA合成酶的稳定细胞系的构建

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