CN108084088B - 一种绿脓杆菌来源的喹啉类化合物jh62及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于医药技术领域，具体公开了一种绿脓杆菌来源的喹啉类化合物JH62，其结构式如式(I)所示：
Figure DDA0001530911930000011
所述JH62具有亲水的头部和疏水性的尾部，可自由通过任何生理屏障，能特异识别细胞中的Stat3蛋白并与其结合；本发明还公开了所述喹啉类化合物JH62在制备抑制肿瘤生长药物中的应用，JH62通过直接结合Stat3蛋白，一方面抑制Stat3的同二聚体形成来降低Stat3功能，另一方面阻断了Stat3与转运蛋白GRIM19的结合从而使其不能进入线粒体，最终导致线粒体功能破坏，肿瘤细胞死亡，且对正常细胞的毒性小，在肿瘤治疗方面有较好的应用前景。

Description

一种绿脓杆菌来源的喹啉类化合物JH62及其应用
技术领域
本发明涉及医药技术领域，具体地，涉及一种绿脓杆菌来源的喹啉类化合物JH62及其应用。
背景技术
随着当今人们生活水平的提高和医疗条件的改善，人类的平均寿命提高很多。但因为环境，生活习惯和饮食习惯等因素的影响，癌症的发病率越来越高。根据世界卫生组织报告，2015年全世界有超900万人死于癌症，到2030年将有1200万人死于癌症。癌症己是仅排在心血管疾病之后的第二大死因。当前治疗癌症的主要化学药物包括顺钼、甲氨蝶呤、5-氟尿嘧啶、吉西他滨、奥沙利钼等，这些药物都是通过非特异性地抑制细胞生长从而使细胞死亡来达到治疗的目的，虽然杀死了肿瘤细胞，但对人体正常细胞以及骨髓、消化道、肝、肾等正常组织也带来损害。因此寻找具有特异性的靶标以及针对这种靶标的特异性药物显得非常迫切。肿瘤的靶向治疗及个体化治疗具有以下优点：特异性好、针对性强，患者耐受性较好，效果明显，毒副反应相对较低。目前常见的分子靶向抗肿瘤药物主要有蛋白激酶抑制剂和单克隆抗体两类。
信号传递和激活转录因子3(Stat3)在生物体正常发育、炎症、自身免疫、代谢以及癌症发生发展中起着重要作用。现已发现有少量的Stat3存在于线粒体中，对线粒体的电子呼吸链起正调控作用。大量的研究表明，线粒体中的Stat3除了在细胞代谢中起关键作用以外，在细胞死亡、发育、癌症转化中也有很重要的作用。在人肿瘤中Stat3异常活化现象相当普遍，许多肿瘤细胞通过Stat3活化来更好地抵制死亡。而线粒体Stat3在肿瘤的发生和癌症的发展过程中有更重要的功能，线粒体Stat3在原癌基因的转化和肿瘤的发生中是代谢开关的必要成分，在癌细胞中线粒体Stat3促进呼吸链复合物的活性，这样可以产生更多的ATP；此外，线粒体Stat3在肿瘤的发生中还抑制ROS的产生。目前已开发一些直接以Stat3为靶标的Stat3抑制药物，很多都是通过影响Stat3二聚体的形成或Stat3与DNA的结合，很少有见直接影响线粒体Stat3的药物。目前尚未见有能够直接特异性结合Stat3，进而影响Stat3活性导致细胞死亡的小分子化合物。
发明内容
本发明为了克服现有技术的上述不足，提供一种绿脓杆菌来源的喹啉类化合物JH62。本发明所提供的JH62通过直接结合Stat3蛋白，一方面抑制Stat3的同二聚体形成来降低Stat3功能，另一方面阻断了Stat3与转运蛋白GRIM19的结合从而使其不能进入线粒体，最终导致线粒体功能破坏，细胞死亡。
本发明的另一目的在于提供所述喹啉类化合物JH62在制备抑制肿瘤生长药物中的应用。
本发明的另一目的在于提供一种Stat3蛋白活性抑制剂。
本发明的另一目的在于提供一种抑制肿瘤细胞生长的药物或制剂。
本发明的另一目的在于提供一种抑制细胞中Stat3蛋白活性的方法。
本发明的另一目的在于提供一种抑制Stat3蛋白过表达的细胞生长的方法。
本发明的另一目的在于提供一种诱导细胞死亡或细胞周期停滞的方法。
本发明的另一目的在于提供一种提高细胞对死亡诱导剂敏感性的方法。
为了实现上述目的，本发明是通过以下方案予以实现的：
一种绿脓杆菌来源的喹啉类化合物JH62，其结构式如式(I)所示：
Figure BDA0001530911910000021
本发明从绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa，PAO1)中制备得到一种新的化合物JH62，通过研究发现，化合物JH62可直接结合Stat3，降低Stat3蛋白的磷酸化位点Y705的磷酸化水平，同时阻断Stat3与GRIM19的结合。由于GRIM19是Stat3进入线粒体的运输工具，这样Stat3就不能进入线粒体。而Stat3在线粒体中的功能相当重要，尤其在维持线粒体呼吸链的稳定方面。如果Stat3不能进入线粒体，由于呼吸链稳定受到影响，进而导致ATP产出减少，肿瘤细胞比正常细胞更需要ATP来维持其快速的生长和分裂，故经JH62处理后的肿瘤细胞的分裂和生长更容易受到破坏，最终引起细胞的死亡；而正常细胞由于对线粒体的依赖性比肿瘤细胞小，因此受到的影响也更小。
因此，本发明还请求保护上述喹啉类化合物JH62在制备抑制肿瘤生长药物中的应用。
优选地，所述肿瘤为白血病、肝癌、结肠癌、前列腺癌、乳腺癌、肺癌、骨肉瘤、绒毛膜癌或肾母细胞瘤。
更优选地，所述肝癌为HEP3B细胞系，所述胰脏癌为BXPC3细胞系，所述结肠癌为HCT116细胞系，所述前列腺癌为DU145、A549或MCF-7细胞系。
一种Stat3蛋白活性抑制剂，包含上述喹啉类化合物JH62，或其衍生物，或其类似物，或其药学上可接受的盐；所述衍生物或类似物或药学上可接受的盐的结构通式如式(II)所示：
Figure BDA0001530911910000031
其中，R1和R2各自独立地为烷基、卤素、环烷基、烯烃基、炔基、苄基、杂环基、芳基、杂芳基、苯基氧代甲基、苯基硫代甲基、苯基氨基氧代甲基、苯基氨基硫代甲基、苯基乙基、5-或6-元芳杂环、5-或6-元芳杂环氧代甲基、5-或6-元芳杂环硫代甲基、5-或6-元芳杂环乙基、稠合的苯基-不饱和的或饱和的5-或6-元碳环、稠合的苯基-不饱和的或饱和的5-或6-元碳环氧代甲基、稠合的苯基-不饱和的或饱和的5-或6-元碳环硫代甲基、稠合的苯基-不饱和的或饱和的5-或6-元碳环乙基、稠合的苯基-5-或6-元芳杂环、稠合的苯基-5-或6-元芳杂环氧代甲基、稠合的苯基-5-或6-元芳杂环硫代甲基、稠合的苯基-5-或6-元芳杂环乙基。
优选地，所述式(II)中的R1和R2各自独立地为-Cl、-Br、-CH3、-CH2Cl、-CH2Br、-CH2OH、-OCH3、-CF3、-CH2NH2、-CH(NH2)2，以上衍生物或类似物或药学上可接受的盐的主要活性为抑制细胞生长和诱导细胞死亡。
本发明还请求保护一种抑制肿瘤细胞生长的药物或制剂，包含上述Stat3蛋白活性抑制剂。
优选地，所述药物或制剂中还包含死亡诱导剂，所述死亡诱导剂为诱发肿瘤细胞凋亡的大部分癌症治疗药物或放射制剂，如羟基喜树碱、三氧化二砷、紫杉醇、全反式维甲酸、奥曲肽或5-氟尿嘧啶。由于很多抗肿瘤药物抵抗产生的原因是Stat3的活性增加而使细胞不能经历凋亡，而本发明的化合物JH62能够有效抑制细胞中Stat3活性的增加，增强细胞对药物的敏感性，减弱肿瘤细胞的耐药性，从而使肿瘤细胞对抗肿瘤药物或放射疗法诱导细胞死亡的活性更加敏感特异，从而可将本发明的化合物JH62与死亡诱导剂联用，提高死亡诱导剂的药效。
本发明还请求保护一种抑制细胞中Stat3蛋白活性的方法，向细胞中添加上述Stat3蛋白活性抑制剂。
一种抑制Stat3蛋白过表达的细胞生长的药物或制剂，包括上述Stat3蛋白活性抑制剂。
本发明还请求保护一种抑制Stat3蛋白过表达的细胞生长的方法，向细胞中添加上述Stat3蛋白活性抑制剂。
本发明还请求保护一种诱导细胞死亡或细胞周期停滞的方法，向细胞中添加上述Stat3蛋白活性抑制剂。
优选地，上述方法中述Stat3蛋白活性抑制剂浓度为10～200μM。在实际用于抑制肿瘤细胞时，考虑到大剂量抑制剂虽然可以更好的抑制肿瘤细胞的生长，但是不可避免也会对正常细胞造成一定的影响，综合考虑Stat3蛋白活性抑制剂对肿瘤的抑制效果和对正常细胞的毒害作用，选择上述范围作为最合适的浓度范围。
由于很多抗肿瘤药物抵抗产生的原因是Stat3的活性增加而使细胞不能经历凋亡，而本发明的化合物JH62能够有效抑制细胞中Stat3活性的增加，增强细胞对药物的敏感性，减弱肿瘤细胞的耐药性，从而使肿瘤细胞对抗肿瘤药物或放射疗法诱导细胞死亡的活性更加敏感特异。
因此，本发明还请求保护一种提高细胞对死亡诱导剂敏感性的方法，向细胞中添加上述Stat3蛋白活性抑制剂。所述死亡诱导剂为诱发肿瘤细胞凋亡的大部分癌症治疗药物或放射制剂，如羟基喜树碱、三氧化二砷、紫杉醇、全反式维甲酸、奥曲肽或5-氟尿嘧啶。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
(1)本发明首次从绿脓杆菌中制备得到了一种喹啉类化合物JH62，JH62具有亲水的头部和疏水性的尾部，可自由通过任何生理屏障，能特异识别细胞中的Stat3蛋白并与其结合，是第一个直接结合转录因子的小分子抑制剂。
(2)本发明的喹啉类化合物JH62可通过直接结合Stat3蛋白，一方面抑制Stat3的同二聚体形成来降低Stat3功能，另一方面阻断了Stat3与转运蛋白GRIM19的结合从而使其不能进入线粒体，最终导致线粒体功能破坏，细胞死亡，由于肿瘤细胞对线粒体依赖更大且，因此JH62对正常细胞的毒性小，在肿瘤治疗方面有较好的应用前景。
(3)本发明所提供的JH62能够有效抑制细胞中Stat3活性的增加，增强肿瘤细胞对抗肿瘤药物或放射疗法的敏感性，减弱肿瘤细胞的耐药性，从而提高治疗效果。
附图说明
图1为实施例1中JH62的鉴定图谱；A为1H NMR核磁氢谱，B和C为1H-13C NMR碳氢核磁联谱的HMBC和HMQC谱，D为高分辨质谱图。
图2为实施例1中JH62对细胞生长的影响情况；A为经不同浓度JH62处理后A549细胞的存活率；B为经JH62处理后不同细胞系的IC50值。
图3为实施例2中分别经JH62和DOX处理后，A549细胞的形态及染色体DNA等变化情况；A为细胞形态变化情况；B为染色体形态变化情况；C为总DNA电泳图；D为单细胞凝胶电泳图；E为蛋白免疫印迹凝胶图谱。
图4为实施例2中JH62和DOX对STAT3的影响；A为JH6处理A549细胞后STAT3的Y705位点活化的免疫印迹结果；B为DOX处理A549细胞后增加STAT3的Y705的活性(C：对照组，T：处理组)。
图5为实施例2中JH62对A549细胞中STAT3/上游激酶相互作用的影响；A、B为免疫共沉淀法检测JH62对A549细胞中STAT3/上游激酶相互作用的影响；C、D为等温滴定量热法显示JH62可以直接与STAT3结合。
图6为实施例3中经JH62处理后A549细胞线粒体形态变化。
图7为实施例3中经JH62处理后A549细胞线粒体膜电位变化。
图8为实施例4中JH62对STAT3与GRIM-19结合的影响情况。
图9为实施例5中JH62对小鼠模型中异体移植肿瘤生长的抑制情况；A为JH62在异体移植小鼠模型中对肿瘤生长的抑制情况；B为对照组与处理组中实体瘤的大小；C为对照组与处理组中肿瘤的质量；D为对照组与处理组中肿瘤的体积；E为对照组与处理组中小鼠的体重。
图10为JH62的作用模型，红色箭头所指为线粒体。
具体实施方式
下面结合说明书附图及具体实施例对本发明作出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。
细胞株：11株肿瘤细胞，包括A549，MEF，HEPG2，HCTl16，DU145，HEP3B，MAL12，MCF7，BXPC3，U87，Hela均通过了支原体检测。
试剂及培养基：RPMI 1640培养液，DMEM培养液，使用前加入10％胎牛血清、100μg/mL的链霉素、100U/mL的青霉素。
实施例1 JH62的分离纯化及其对细胞生长的影响
1、JH62的分离纯化
绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa，PAO1)在LB培养基中过夜培养，第二天将其按体积比为1：200接种到新鲜LB培养基中，于37℃、260rpm条件下继续培养。当培养菌液的OD600值达1.5左右时离心取上清。用盐酸调节pH至3.5，然后用乙酸乙酯抽提。取有机相蒸干并用甲醇溶解，用高效液相色谱分离此溶解物(C18反相柱4.6×250mm,Waters)，用乙腈-水(体积比为80:20)按每分钟1mL洗脱，收集抑制细胞生长的活性峰。
NMR谱用Bruker Avance仪器(1H NMR at 500MHz；1H-13C NMR at 125MHz)获得。1H-13C相关的HMBC和HMQC谱用Bruker AVANCE DRX500获得。产物进一步用高分辨质谱进行分析(MicrOTOF-QII于20-40eV)。
从绿脓杆菌的上清液中分离和鉴定到10种化合物与诱导细胞死亡有关。其中，包括一种新的化合物JH62，其结构式如式(I)所示：
Figure BDA0001530911910000071
鉴定结果如图1所示，再通过常规方法合成上述化合物，用于后续研究。
2、细胞活性分析
采用WST-1(Roche)分析JH62对A549等肿瘤细胞的生长抑制作用。具体操作步骤如下：
(1)化合物处理前一天将肿瘤细胞接种在96孔细胞培养板中。接种密度为：2000细胞/1000μL/孔或者4000细胞/100μL/孔，具体数量根据细胞生长速率决定。
(2)第二天，将用培养基配制好的2×化合物JH62溶液按照实验设置要求加入到细胞培养板中，每孔加入100μL。
(3)轻轻震荡细胞板，将其放置在37℃培养箱中继续培养72h。
(4)孵育结束后按照WST-1试剂说明书要求在细胞版中加入配制好的试剂，充分混匀后放置在37℃培养箱避光孵育30min。
(5)将细胞板放入读板仪进行分析，设定读取450nm数据。
(6)将每孔中的读数需要被转换成细胞存活率。细胞存活率可以使用下列公式计算得出：
Figure BDA0001530911910000072
处理后的数据将被用来做非线性回归分析，得到剂量效应曲线，并计算出JH62对每种细胞的半数抑制浓度(IC50)。
在培养的A549细胞中加入不同浓度的JH62，并分别在24、48、72h后用WST-1试剂检测细胞存活率。结果表明，JH62诱导的细胞死亡具有时间和剂量的依赖性(如图2A所示)。
采用一系列与对照组浓度平行的JH62处理A549和其他细胞系，包括MEF：鼠标胚胎成纤维细胞(鼠)、HEPG2：肝细胞系(人)、HEP3B：肝癌细胞系(人)、MAL12：小鼠肝细胞(鼠)、BXPC3：胰脏癌细胞(人)、U87：胶质瘤细胞系(人)、DU145：前列腺癌细胞(人)、A549：前列腺癌细胞(人)、MCF-7：前列腺癌细胞(人)、Hela：宫颈癌细胞(人)、HCT116：结肠癌细胞(人)。处理48h后，使用WST-1法测得细胞存活率，并基于三次以上单独试验得到的不同肿瘤细胞系的IC50值(IC50值表示使细胞存活率达50％时的JH62的浓度)。结果表明，JH62不仅能诱导A549细胞死亡，还能诱导许多其它的细胞死亡，包括正常细胞和癌细胞系。JH62作用于不同的细胞系有不同的IC50值(如图2B所示)，且JH62对肿瘤细胞系的IC50相比正常体细胞MEF少两倍以上。IC50值最低的为癌症细胞系HCT116，而最高为癌症细胞系DU145。
实施例2 JH62诱导A549细胞非凋亡性细胞死亡
分别用JH62和DOX(一种诱导细胞凋亡的肿瘤治疗药物)诱导A549细胞死亡，发现JH62诱导的A549细胞死亡前其形态与DOX诱导的A549细胞凋亡不管在形态还是分子化学水平上都有较大差别：首先在形态上，经JH62诱导的细胞其细胞质膜周围没有小泡(凋亡小体)，细胞无皱缩，细胞核中也没有染色体萎缩或断裂(如图3A所示)；但所有这些特征在DOX处理的细胞中可以很清楚地观察到。JH62处理的细胞染色体形态与对照组相似，而DOX处理的细胞其染色体由于DNA的破坏而粘在一起(如图3B所示)。
进一步实验表明其他细胞凋亡特征(包括DNA片段化和Caspase 3的活化)在经JH62处理的A549细胞中也没有出现：
1、DNA损伤分析
把A549细胞用6cm组织培养皿过夜培养。在加JH62前，将细胞用无血清DMEM培养基培养16h。然后加入JH62再用完全培养基培养不同的时间，将细胞用PBS洗涤3次，再使用MasterPureTM DNA纯化试剂盒提取基因组DNA。将DNA沉淀风干，并悬浮于10mM的Tris-Cl溶液中，pH值为8.0(2.5mg)，所得DNA用1％琼脂糖凝胶(TEA)进行电泳，并用溴化乙锭染色。作为阳性对照，将细胞经DOX处理的DNA样品也同样地按照上述步骤电泳。
结果表明，A549细胞经JH62从低到高浓度(5～100μM)处理24h后基因组DNA没有明显损伤，细胞总DNA电泳无明显拖带；而DOX处理组中形成了许多DNA小片段，细胞总DNA电泳拖带很明显(如图3C所示)。
2、细胞电泳
单细胞电泳是目前细胞水平显示与评价DNA毒性与损伤的检测技术，其特点是在一块经过琼脂糖包被(coating)玻璃片上，将实验细胞与低熔点琼脂糖混匀后，再“涂布”在其上面，此后再经细胞裂解、DNA解旋，将断裂的DNA片段在电场中“泳动”向阳极(anode)，再经过中和，荧光染色，在荧光显微镜下可见一呈彗星状图像，因其细胞电泳形状颇似彗星，又称彗星试验(comet assay)。
单细胞凝胶电泳，按照产品要求操作(Trevigen，Gaithersburg，MD，USA)来测试DOX或JH62对A549细胞造成的DNA损伤。在6孔培养板上对生长到约30％密度的细胞分别加入DOX或JH62培养6h。将细胞进行胰蛋白酶消化并通过离心沉淀。洗涤细胞并再悬浮在200mL冰冷的1倍PBS中。将细胞与42℃低熔点琼脂悬浮液混合并立即吸移到Comet SlideTM区域。载玻片于4℃下在黑暗中孵育30min，浸渍在冷却的裂解溶液中，并在4℃下再次温育30min。载玻片放置在一个水平电泳室，并加入缓冲液(0.3的1N NaOH，1mM EDTA)，电泳以1V/cm进行15min。样品干燥，用Vista的绿色DNA染料染色(Cell Biolabs，Singapore.#235003)。彗尾用一个模型DM 2500荧光显微镜(Leica，Wetzlar，Germany)成像和Komet公司5.5软件(Andor Technology，Belfast，UK)量化。所有实验都独立进行至少三次。
Cometic尾分析表明JH62处理不影响细胞DNA的完整性，细胞电泳显示经JH62处理的细胞无卫星尾，而经DOX处理的细胞卫星尾很清晰(如图3D所示)。
3、蛋白免疫印迹
细胞用冷的PBS洗2次后，再用冷的TNEN缓冲液(50mM的Tris-HCl，pH值为7.5，0.5％的NP-40，10mM EDTA，50mM NaCl并加入0.1％的Triton X-100)裂解细胞，TNEN缓冲液中加入蛋白酶抑制剂cocktail，2mM钒酸钠和2mM氟化钠。然后将裂解物在4℃下以16.1×103g离心10min，收集上清液作为全细胞裂解液。蛋白浓度用BioRad公司蛋白定量测定法测定。取80μg蛋白进行SDS-PAGE电泳，然后转移到PVDF膜上，依次用一抗和二抗孵育，并用ECL试剂盒(Amersham)显影。
蛋白印迹实验结果表明，经JH62处理的细胞中Caspase3没有任何变化，其它与细胞凋亡和坏死有关的蛋白(Bax、Bcl-2和Bcl-xl等)也没有变化(如图3E所示)。
另外，蛋白免疫印迹结果表明JH62能显著降低STAT3的Tyr705(Y705)磷酸化水平，STAT3的活性降低(如图4A所示)。然而DOX却增加STAT3的Tyr705(Y705)磷酸化水平(如图4B所示)。JH62对STAT3的Ser727(Y7727)磷酸化水平没有明显影响。
4、JH62直接与STAT3结合并抑制其与上游激酶的相互作用
细胞用CO-IP缓冲液(20mM的Tris-HCl，pH为7.5，0.5％NP-40，5mM的EDTA，100mM的NaCl)溶解，蛋白酶抑制剂cocktail，2mM钒酸钠和2mM氟化钠。然后将裂解物在4℃下以16.1×103g离心10min，收集上清液作为全细胞裂解液。蛋白浓度通过Bio-Rad公司的蛋白质定量试验测定。在4℃用蛋白A beads作用1h。然后离心去beads，在含总蛋白的裂解液中加入兔单克隆抗STAT3抗体在4℃下作用16h，然后加入50μL 50％的蛋白A beads于4℃下作用3h。用提取缓冲液洗3次。再用2×SDS-PAGE样品缓冲液悬浮beads，最后用于Western检测和分析。所用兔单克隆抗人JAK1、JAK2、Src抗体购自Abcam公司。
免疫共沉淀结果显示JH62能显著减少STAT3与其上游激酶(JAK1，JAK2，Src)的结合，而DOX却没有影响(如图5A和图5B所示)。此外，在STAT3免疫共沉淀其上游激酶以后，再洗去其它蛋白，只剩STAT3与其上游激酶的复合体，这时再用PBS缓冲也溶解STAT3与其上游激酶的复合体，在此溶液中加入JH62，在此情况下JH62也影响STAT3与其上游激酶的结合。等温滴定量热法(ITC)分析表明JH62可以直接与STAT3结合，如图5C和图5D所示，JH62结合STAT3的亲和力Kd值为25nm。
实施例3 JH62处理后A549细胞线粒体的变化情况
1、线粒体形态变化
A549细胞长在12mm盖玻片上，从37℃培养箱中取出后，以培养基溶解得到含2.5％戊二醛、4％多聚甲醛和0.2％苦味酸的终浓度的固定液。细胞用该固定液在室温下作用30min后，再换成0.1M二甲胂酸钠缓冲液(pH7.6)并含2.5％戊二醛、4％多聚甲醛和0.2％苦味酸，并放于4℃过夜。样品随后用0.1M二甲胂酸钠缓冲液(pH7.6)，含1％四氧化锇和1.5％铁氰化钾(亚铁氰化钾)洗涤。样品再用25％、50％、75％、95％和100％的乙醇脱水，用Epon树脂包埋，再切片，最后用JEOL 1010 80KV的TEM成像。
将A549细胞用JH62处理24h后，用线粒体特殊染料Mito Tracter Red染色，然后再用共聚焦显微镜拍照，红色为线粒体。如图6A、图6B所示，结果表明，JH62处理的细胞线粒体的完整性受到了严重破坏。
将A549细胞用JH62处理24h后，固定细胞用透射电子显微镜拍照，红色箭头所指为线粒体。电子显微镜观察到用JH62处理的不同时间点的细胞其线粒体的结构发生较大变化(如图6C、图6D所示)。结果表明，用JH62处理A549细胞24h后线粒体膨胀，同时线粒体内嵴受损，通过电子显微镜观察经JH62处理的细胞线粒体在尺寸大得多，并且线粒体内嵴减少甚至消失；而经DOX处理的细胞则没有明显变化。
2、线粒体膜电位变化
线粒体膜电位，使用5,5′,6,6′-tetrachloro-1,1′,3,3′-tetraethylbenzimidazole carbocyanide iodide(JC-1，分子探针)进行检测。JC-1在低浓度时是以单体的形式存在的荧光化合物(excitation maximum，490nm)。在浓度较高时，JC-1形成聚合体。单体的荧光是绿色(emission，527nm)，而聚合体是红色(emission，590nm)。线粒体有完整的膜电位(高于100mV)这时聚集的JC-1发红色荧光，而膜电位不完整的线粒体JC-1以单体的形式存在发绿色荧光。细胞在6孔培养皿中生长到60％时，对照组细胞和用25μm的JH62处理不同时间的细胞，分别用PBS 3次洗涤后，再加入6.5μmol的JC-1放置于暗处，于37℃下反应20min。最后用PBS洗涤，并于共聚焦显微镜下观察样品。用JC-1染料来研究线粒体膜电位，JC-1在线粒体膜电位正常时会聚集而呈红色，在膜去极化而导致膜电位很低或失去时，JC-1呈单体而显绿色。结果表明，JH62处理不同的时间后A549细胞的膜电位随时间降低(如图7所示)。
实施例4 JH62影响STAT3与GRIM-19的结合
A549细胞在无血清条件下培养16h，然后用完全培养基并加入JH62培养3h。把细胞分成线粒体和细胞质用于免疫印迹分析。细胞质和线粒体分别用SOD1和VDAC作参照。
免疫印迹结果显示STAT3与GRIM-19的结合受到JH62的影响而显著减弱。同时在JH62处理后线粒体中STAT3的量和Ser727位点磷酸化的STAT3的量也呈时间依赖性减少(如图8所示)。
实施例5 JH62体内抗肿瘤活性
HCT116细胞(1×106)被接种在BALB/c裸鼠的背部皮下，一星期后，小鼠(每组6只)注射JH62或对照溶剂，通过腹腔每周两次分别用5mg/kg和10mg/kg的剂量连续注射20天(如图9A所示)。实验最后麻醉小鼠，取出肿瘤比较对照组与处理组实体瘤大小(如图9B所示)。称取肿瘤的重量，结果表明，JH62注射的肿瘤重量减轻，且呈剂量依赖性(如图9C所示)。通过体积的测定，结果表明JH62抑制肿瘤的生长(如图9D所示)。实验最后称取小鼠的体重，结果表明JH62明显抑制肿瘤的生长(如图9E所示)。综上，JH62有显著抗肿瘤活性。
综上所述，JH62直接与STAT3结合后，阻止其与上游激酶和STAT3线粒体转运蛋白GRIM-19之间的相互作用。导致STAT3无法在Y705位点磷酸化，也不能进入线粒体。因为STAT3在线粒体有重要的作用，从而影响了线粒体的稳定和功能，最后引起细胞的死亡。JH62可以利用同样的原理在体内抑制肿瘤的生长，又由于正常细胞对线粒体的依赖小于肿瘤细胞，所以JH62对正常细胞的损伤也远远小于JH62对肿瘤细胞的作用，这也是JH62对试验小鼠正常生长影响较小的原因。因此JH62在抗肿瘤药物的制备中有很好的应用前景。
实施例6 JH62衍生物或类似物对细胞生长的影响
1、采用常规方法制备JH62衍生物或类似物，所述JH62衍生物或类似物的结构通式如式(II)所示：
Figure BDA0001530911910000121
其中，R1和R2各自独立地为-Cl、-Br、-CH3、-CH2Cl、-CH2Br、-CH2OH、-OCH3、-CF3、-CH2NH2、-CH(NH2)2。
2、采用实施例1中细胞活性分析方法分析JH62衍生物或类似物对肿瘤细胞生长的影响，区别仅在于步骤(2)中加入的是2×JH62衍生物或类似物溶液。结果表明，JH62衍生物或类似物的主要活性为抑制细胞生长和诱导细胞死亡。
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，对于本领域的普通技术人员来说，在上述说明及思路的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种绿脓杆菌来源的喹啉类化合物JH62，其特征在于，所述喹啉类化合物JH62的结构式如式(I)所示：
Figure FDA0002781117690000011
2.权利要求1所述的喹啉类化合物JH62在制备抑制肿瘤生长药物中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述肿瘤为白血病、肝癌、结肠癌、前列腺癌、乳腺癌、肺癌、骨肉瘤、绒毛膜癌或肾母细胞瘤。
4.一种Stat3蛋白活性抑制剂，其特征在于，包含权利要求1所述的喹啉类化合物JH62。
5.权利要求4所述的Stat3蛋白活性抑制剂在制备抑制细胞中Stat3蛋白活性药物中的应用。
6.权利要求4所述的Stat3蛋白活性抑制剂在制备抑制Stat3蛋白过表达的细胞生长药物中的应用。
7.权利要求4所述的Stat3蛋白活性抑制剂在制备诱导细胞死亡或细胞周期停滞药物中的应用。
8.权利要求4所述的Stat3蛋白活性抑制剂在制备提高细胞对死亡诱导剂敏感性药物中的应用。
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