CN113651868B - 基于顺铂衍生的含熊果酸配体的四价铂抗癌配合物及其制备方法和应用 - Google Patents

基于顺铂衍生的含熊果酸配体的四价铂抗癌配合物及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于药物化学领域，具体涉及一种基于顺铂衍生的含熊果酸配体的四价铂抗癌配合物及其制备方法和应用。本发明公开的该系列含熊果酸配体的Pt(IV)配合物以顺铂为基础母核，在轴向一端引入熊果酸衍生配体，另一端引入‑Cl或‑OH基团；或在轴向两端均引入熊果酸衍生配体，该系列Pt(IV)配合物的制备所使用的原料价廉易得，方法简单易行，易于操作，适用于规模化生产。体外实验表明Pt(IV)配合物US‑CIS‑CL和US‑CIS‑OH显示出很高的抗癌活性，优于顺铂，并具有较好的癌细胞选择性，同时对顺铂耐药的癌细胞也表现出良好的抗癌活性，有潜力开发成为一种高效低毒并克服顺铂耐药的抗癌新药。

Description

基于顺铂衍生的含熊果酸配体的四价铂抗癌配合物及其制备 方法和应用
技术领域
本发明属于药物化学领域，具体涉及一种用于抗肿瘤的基于顺铂衍生的含熊果酸配体的四价铂抗癌配合物、制备方法和应用。
背景技术
自1978年顺铂问世以来，铂类药物一直是抗肿瘤药物研发的热点。目前，已有数个铂类抗癌药物被批准用于临床上多种肿瘤的治疗，其中顺铂、卡铂和奥沙利铂被批准在全球范围内广泛应用。尽管经典二价铂类药物的临床应用广泛且优势明显，但其仍然存在一定的局限性，如常会产生一定的毒副作用，顺铂表现为较为严重的肾毒性、耳毒性、胃肠道毒性等；卡铂的毒副作用主要为骨髓抑制，常常表现为短暂性血小板减少；而奥沙利铂的神经毒性较为明显。此外，铂类药物在临床应用中普遍会产生不同程度的耐药性。因此，经典铂类抗癌药物易产生毒副作用和耐药性的缺点，在一定程度上又限制了其临床应用。
鉴于二价铂Pt(II)药物存在一定的缺陷，越来越多的研发人员开始将目光集中在了新型四价铂配合物的研发上。四价铂Pt(IV)相较于二价铂Pt(II)具有固有的优势，首先四价铂中心为d6电子构型，比二价铂多了两个轴向位置，这样可以构成非常稳定的八面体配位构型,减少和体内亲核物质的反应，从而使得其在血液中相对稳定，并能够适当减少药物的代谢损失，还可能降低毒副反应的发生几率。此外，可以对四价铂配合物的轴向位置进行相应的化学配体修饰从而进一步影响和调节四价铂配合物的物理和化学性能，也可以将铂类药物与不同作用机制的药物通过共价键连接的方式形成多功能前药加以改善。四价铂配合物的这些优势为改善二价铂类抗癌药物的部分缺陷提供了良好途径。通常认为四价铂配合物的抗癌作用机制为：铂(IV)配合物首先与体内的还原性物质(如谷胱甘肽、抗坏血酸等小分子；酶、还原蛋白等大分子)发生氧化还原反应，使其失去轴向配体，变成相应的铂(II)配合物，铂(II)配合物可与核DNA发生反应，生成铂-DNA加合物，进而使DNA的构象发生改变，从而破坏DNA的生物功能并发挥抗癌作用，因此，四价铂配合物也被认为是铂(II)药物的前药。
随着四价铂配合物受到越来越多的研究人员关注，大量具有抗肿瘤活性的铂(IV)配合物被陆续合成出来。其中最为常规的设计是以非功能性基团作为轴向配体，主要通过调节轴向配体而影响整个铂(IV)分子的理化性质及药效而设计，其典型的代表是iproplatin(异丙铂)、ormaplatin(奥马铂)、JM-21和LA-12，其中异丙铂在进入III期临床试验时发现不良反应更甚于卡铂而终止试验，并在体内治疗卵巢癌时效果欠佳，生存期和应答率都不如顺铂，最终以疗效不佳而遭淘汰。奥马铂尽管在动物实验中效果良好，然而却在I期临床试验中发现其具有严重的神经毒性，因而终止实验并遭淘汰。JM-21因在临床III期试验中并未表现出突出的疗效而被终止实验。LA-12体外实验研究结果表明其对癌细胞的抑制活性要远远强于顺铂，且不与顺铂产生交叉耐药性，目前正处于临床III期试验研究。此外，将功能性基团引入到四价铂Pt(IV)的轴向配体以形成新型四价铂配合物的设计方法也是近年来的研究热点，由此形成的多功能多靶标的新型铂分子可以更好地发挥抗肿瘤作用。尽管关于新型四价铂类抗癌药的研发日益增加，但至今尚未有四价铂类抗癌配合物获得临床批准，因此，进一步研发新型四价铂类抗癌药并探究其作用规律非常必要。
发明内容
为了改善顺铂的毒副作用大、容易发生耐药等缺点，本发明采用多靶标分子“药效团拼合”模式设计以顺铂为基础，以相应的linker将熊果酸连接为配体，合成了系列以顺铂为基础的含熊果酸衍生物的新型四价铂抗癌配合物。本发明的新型Pt(IV)配合物相较于顺铂能展现出增效、减毒并能克服顺铂交叉耐药的作用。本发明还提供了基于顺铂衍生的含熊果酸配体的四价铂抗癌配合物的制备方法和应用。
基于顺铂衍生的含熊果酸配体的四价铂抗癌配合物，其特征在于，所述四价铂抗癌配合物为US-CIS-CL，其结构式如式Ⅰ所示(化学式C35H59Cl3N2O6Pt)：
Figure BDA0003272019160000031
基于顺铂衍生的含熊果酸配体的四价铂抗癌配合物，其特征在于，所述四价铂抗癌配合物为US-CIS-SU，其结构式如式Ⅱ所示(化学式C70H112Cl2N2O12Pt)：
Figure BDA0003272019160000041
基于顺铂衍生的含熊果酸配体的四价铂抗癌配合物，其特征在于，所述四价铂抗癌配合物为US-CIS-OH，其结构式如式Ⅲ所示(化学式C35H60Cl2N2O7Pt)：
Figure BDA0003272019160000042
进一步的，所述四价铂抗癌配合物US-CIS-CL的制备方法，包括如下步骤：
Figure BDA0003272019160000043
Figure BDA0003272019160000051
进一步的，所述四价铂抗癌配合物US-CIS-SU的制备方法，包括如下步骤：
Figure BDA0003272019160000052
Figure BDA0003272019160000061
进一步的，所述四价铂抗癌配合物US-CIS-OH的制备方法，包括如下步骤：
Figure BDA0003272019160000062
本发明还提供了所述四价铂抗癌配合物US-CIS-CL、US-CIS-SU、US-CIS-OH在制备抗癌药物中的应用。
有益效果：本发明设计并成功合成了系列基于顺铂衍生的含熊果酸配体的新型四价铂抗癌配合物；抗肿瘤作用研究发现的四价铂抗癌配合物具有比顺铂更优的抗肿瘤效果，且毒性较小，同时具有克服顺铂耐药的潜力。
附图说明
图1是Pt(IV)中间体(单氯单羟基顺铂)的合成路线图。
图2是Pt(IV)中间体(氧化顺铂)的合成路线图。
图3是熊果酸衍生物UM和U-SA的合成路线。
图4是熊果酸衍生物-铂(IV)配合物US-CIS-CL的合成路线。
图5是熊果酸衍生物-铂(IV)配合物US-CIS-SU的合成路线。
图6是熊果酸衍生物-铂(IV)配合物US-CIS-OH的合成路线。
图7是化合物UM的核磁共振氢谱图。
图8是化合物UM的核磁共振碳谱图。
图9是化合物U-SA的核磁共振氢谱图。
图10是化合物U-SA的核磁共振碳谱图。
图11是化合物US-CIS-CL的核磁共振氢谱图。
图12是化合物US-CIS-CL的核磁共振碳谱图。
图13是化合物US-CIS-SU的核磁共振氢谱图。
图14是化合物US-CIS-SU的核磁共振碳谱图。
图15是化合物US-CIS-OH的核磁共振氢谱图。
图16是化合物US-CIS-OH的核磁共振碳谱图。
图17是四价铂配合物US-CIS-CL(1μM)在PBS溶液及还原型PBS溶液(含5mM抗坏血酸钠)在37℃条件下温孵24h内的水解稳定性结果。(a)US-CIS-CL原型的剩余量随温孵时间变化趋势图；(b)US-CIS-CL转化生成的顺铂量随温孵时间变化趋势图；(c)US-CIS-CL转化生成的U-SA量随温孵时间变化趋势图(Mean±SD,n＝3)。
图18是四价铂配合物US-CIS-SU(1μM)在PBS溶液及还原型PBS溶液(含5mM抗坏血酸钠)在37℃条件下温孵24h内的US-CIS-SU原型的剩余量随温孵时间的变化趋势图(Mean±SD,n＝3)。
图19是四价铂配合物US-CIS-OH(1μM)在PBS溶液及还原型PBS溶液(含5mM抗坏血酸钠)在37℃条件下温孵24h内的水解稳定性结果。(a)US-CIS-OH原型的剩余量随温孵时间变化趋势图；(b)US-CIS-OH转化生成的顺铂量随温孵时间变化趋势图；(c)US-CIS-OH转化生成的U-SA量随温孵时间变化趋势图(Mean±SD,n＝3)。
图20是顺铂(1μM)在PBS溶液及还原型PBS溶液(含5mM抗坏血酸钠)在37℃条件下温孵24h内的水解稳定性结果(Mean±SD,n＝3)。
图21是U-SA(1μM)在PBS溶液及还原型PBS溶液(含5mM抗坏血酸钠)在37℃条件下温孵24h内的水解稳定性结果(Mean±SD,n＝3)。
图22是四价铂配合物原药US-CIS-CL,US-CIS-SU,US-CIS-OH和二价顺铂在PBS溶液、还原型PBS溶液在37℃条件下温孵24h内的原药剩余量随时间变化结果(Mean±SD,n＝3)。
图23是四价铂配合物US-CIS-SU在血浆中室温或-20℃放置2h内的稳定性(Mean±SD,n＝3)。
图24是四价铂配合物US-CIS-OH在血浆中室温或-20℃放置2h内的稳定性(Mean±SD,n＝3)。
图25是各给药组在A2780细胞分别作用24h、48h、72h的IC50值(Mean±SD,n＝3)。
图26是各给药组在HCT-116细胞的IC50值(Mean±SD,n＝3)。
图27是各给药组在A549DDP细胞分别作用24h、48h、72h的IC50值(Mean±SD,n＝3)。
图28是各给药组在L-O2细胞分别作用24h、48h、72h的IC50值(Mean±SD,n＝3)。
图29是各给药组在HFL-1细胞分别作用24h、48h、72h的IC50值(Mean±SD,n＝3)。
具体实施方式
下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案，但本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的具体的物料配比、工艺条件及其结果仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。
实施例1基于顺铂衍生的四价铂抗癌配合物的制备
所有的试剂和溶剂都是从商业供应商购买的。以四甲基硅烷为内标，用BrukerAvance 300和500MHz光谱仪在303K记录1H NMR(300或500MHz)和13C NMR(125MHz)光谱。在硅胶(200-300目)GF/UV 254板上进行分析和制备薄层色谱，色谱图在254nm的紫外光下显示。
1.1中间体的合成
1.1.1铂(IV)中间体的合成
铂(IV)中间体的制备以相应的二价顺铂为原料，经过N-氯代丁二酰亚胺(NCS)或双氧水氧化制得。
铂(IV)中间体单氯单羟基顺铂的合成路线见图1，其详细合成方法如下：向顺铂(8.0mmoL,1eq)的水溶液(450mL)中，逐滴加入NCS(1.2g,8.8mmoL,1.1eq)。将混合物在室温搅拌过夜后，通过过滤除去黑色沉积物。减压浓缩滤液，并沉淀出黄色固体。收集固体，分别用乙醇和乙醚洗涤，然后真空干燥，得到所需产物，该粗产物无需进一步纯化即可直接使用。
铂(IV)中间体氧化顺铂的合成路线见图2，其详细合成方法如下：在铝箔覆盖的圆底烧瓶中，将顺铂(1.0g，3.05mmoL)和30％w/v的H2O2(3.5mL，30.5mmoL)的混合物在70℃加热5h。然后去除加热，并将反应混合物搅拌过夜。产物在4℃下原位重结晶。通过真空过滤获得产物，并用冰冷的水，乙醇和乙醚洗涤,过滤后，减压除去溶剂，得到期望的产物，为亮黄色粉末,收率约90％。
1.1.2熊果酸衍生物的合成
熊果酸衍生物中间体，熊果酸甲酯(UM)和熊果酸甲酯琥珀酸酯(U-SA)的合成路线见图3，其详细合成方法如下：
向1当量的熊果酸溶液(500mg,1.09mmoL,1eq溶解在10mL的DMF)，加入2当量的碳酸钾(303mg,2.19mmoL,2eq),在室温下搅拌30分钟后，加入2当量的甲基碘(311mg，148μL，3.27mmoL，2eq)，并继续搅拌24h。将混合物缓慢加入5％盐酸(30mL)中，滤出沉淀物并用水洗涤。经甲醇重结晶或色谱纯化后，得到UM白色固体(487mg，95％)。
向UM(500mg，1.06mmoL，1eq)和4-二甲基氨基吡啶(13mg，0.106mmoL，0.1eq)的无水二氯甲烷(15mL)溶液中加入琥珀酸酐(424mg，4.24mmoL，4eq)和三乙胺(107mg室温下加入134μL，1.06mmoL，1eq)，继续搅拌36小时，减压蒸发溶剂。将残余物用乙酸乙酯稀释，并用水和饱和氯化钠溶液洗涤，有机相用无水硫酸镁干燥。减压过滤和蒸发溶剂，得到白色固体，将其通过硅胶色谱法纯化，用乙酸乙酯-石油醚的梯度洗脱，得到U-SA，为白色固体(490mg，81％)。
1.2目标四价铂配合物的合成
1.2.1熊果酸衍生物-铂(IV)配合物US-CIS-CL的合成
熊果酸衍生物-铂(IV)配合物US-CIS-CL的合成路线见图4，其详细合成方法如下：向U-SA(500mg，0.88mmoL，1eq)和TBTU(283mg，0.88mmoL，1eq)的无水DMF(20mL)溶液中加入单氯单羟基顺铂(310.2mg，0.88mmoL，1eq)和乙基二异丙胺(在室温下113.7mg，142μL，0.88mmoL，1eq)，继续搅拌5小时。减压蒸发溶剂，将其通过硅胶色谱法纯化，用二氯甲烷-甲醇的梯度洗脱，得到黄色粉末状的US-CIS-CL(438mg，55％)。
1.2.2熊果酸衍生物-铂(IV)配合物US-CIS-SU的合成
熊果酸衍生物-铂(IV)配合物US-CIS-SU的合成路线见图5，其详细合成方法如下：向U-SA(1g，1.76mmoL，2eq)和TBTU(566mg，1.76mmoL，2eq)的无水DMF(30mL)中的溶液中加入氧化顺铂(310.2mg，0.88mmoL，1eq)和乙基二异丙胺(227.4mg，284μL，1.76mmoL，2eq)在60℃下，继续反应5小时。减压蒸发溶剂，将其通过硅胶色谱法纯化，用二氯甲烷-甲醇的梯度洗脱，得到黄色粉末状的US-CIS-SU(494mg，39％)。
1.2.3熊果酸衍生物-铂(IV)配合物US-CIS-OH的合成
熊果酸衍生物-铂(IV)配合物US-CIS-OH的合成路线见图6，其详细合成方法如下：将U-SA(500mg，0.88mmoL)和N-羟基琥珀酰亚胺(101mg，0.88mmoL)溶解在二氯甲烷(15mL)中。然后将N，N-二环己基碳二亚胺(182mg，0.88mmoL)加入到二氯甲烷溶液中。将混合物在室温搅拌6h。反应后，通过过滤除去副产物二环己基脲(DCU)，将溶液切下。在减压状态下蒸发溶剂，然后将产物在DMSO中溶解。将Pt(NH3)2Cl2(OH)2(294mg，0.88mmoL)加入到DMSO溶液(5mL)中。将该溶液在80℃下搅拌12小时，以获得相对澄清的橙色溶液。将该溶液离心以除去未反应的Pt(IV)化合物。然后向DMSO溶液中加入水和二氯甲烷，分别用水和饱和氯化钠溶液洗涤三次。有机相用无水硫酸镁干燥。减压蒸发溶剂，将其通过硅胶色谱法纯化，用二氯甲烷-甲醇的梯度洗脱，得到黄色粉末状的US-CIS-OH(374mg，48％)。
实施例2化合物的鉴定
2.1化合物UM的鉴定
ESI-MS:m/z[M+H]+＝471.5，纯度为96％，核磁氢谱(见图7)和碳谱(见图8)。详细信息如下：1HNMR(300MHz,CDCl3):δ＝5.21(m,1H,CH(12)),3.58(s,3H,CH3(31)),3.18(dd,J＝11.0,4.9Hz,1H,CH(3)),2.21(d,J＝11.3Hz,1H,CH(18)),1.98(ddd,J＝13.4,13.4,4.6Hz,1H,Cha(2)),1.89(dd,J＝8.9,3.7Hz,2H,CH2(11)),1.77(ddd,J＝13.8,13.8,4.8Hz,1H,Cha(15)),1.65–1.54(m,5H,CH2(7)+Cha(1)+CHa(16)+CHb(2)),1.47(m,5H,CH(9)+Cha(6)+Cha(21)+Cha(22)+CHb(16)),1.36-1.25(m,4H,CH(19)+CHb(6)+CHb(22)+CHb(21)),1.19–1.09(m,1H,CHb(15)),1.05(s,3H,CH3(27)),1.03–0.97(m,2H,CH(20)+CHb(1)),0.96(s,3H,CH3(23)),0.92(d,J＝6.0Hz,3H,CH3(30)),0.90(s,3H,CH3(25)),0.83(d,J＝6.4Hz,3H,CH3(29)),0.76(s,3H,CH3(24)),0.72(s,3H,CH3(26)),0.71(brd,J＝10.4Hz,1H,CH(5))ppm；13CNMR(125MHz,CDCl3):δ＝177.95(C＝0,C28),138.14(C＝CH,C13),125.57(HC＝C,C12),78.96(CHOH,C3),55.27(CH,C5),52.90(CH,C18),51.36(CH3,C31),48.09(Cquart,C17),47.59(CH,C9),42.00(Cquart,C14),39.51(Cquart,C8),39.05(CH,C19),38.88(CH,C20),38.74(Cquart,C4),38.66(CH2,C1),36.98(Cquart,C10),36.63(CH2,C22),33.00(CH2,C7),30.66(CH2,C21),28.14(CH3,C23),28.04(CH2,C15),27.24(CH2,C16),24.24(CH2,C2),23.60(CH3,C27),23.30(CH2,C11),21.15(CH3,C30),18.33(CH2,C6),17.01(CH3,C29),16.90(CH3,C26),15.61(CH3,C24),15.42(CH3,C25)ppm。
2.2化合物U-SA的鉴定
ESI-MS:m/z[M-H]-＝569,纯度为95％，核磁氢谱(见图9)和碳谱(见图10)。详细信息如下：1HNMR(300MHz,CDCl3)：δ＝5.22(t,J＝3.6Hz,1H,CH(12)),4.50(dd,J＝9.1,6.8Hz,1H,CH(3)),3.58(s,3H,CH3(31)),2.66-2.60(m,4H,-CH2CH2COOH),2.21(d,J＝11.3Hz,1H,CH(18)),1.96(ddd,J＝13.4,13.4,4.6Hz,1H,Cha(2)),1.89(dd,J＝8.9,3.7Hz,2H,CH2(11)),1.77(ddd,J＝13.8,13.8,4.8Hz,1H,CHa(15)),1.67–1.60(m,5H,CH2(7)+Cha(1)+Cha(16)+CHb(2)),1.50(m,5H,CH(9)+CHa(6)+CHa(21)+Cha(22)+CHb(16)),1.36–1.25(m,4H,CH(19)+CHb(6)+CHb(22)+CHb(21)),1.15–1.05(m,1H,CHb(15)),1.05(s,3H,CH3(27)),1.03–1.00(m,2H,CH(20)+CHb(1)),0.93-0.92(m,6H,CH3(23)+CH3(30)),0.85-0.83(m,9H,CH3(25)+CH3(29)+CH3(24)),0.78(brd,J＝10.4Hz,1H,CH(5)),0.72(s,3H,CH3(26))ppm；13CNMR(125MHz,CDCl3):δ＝178.19(COOH),177.92(C＝0,C28),171.90(CH2COO),138.31(C＝CH,C13),125.58(HC＝C,C12),81.65(CHOH,C3),55.45(CH,C5),53.01(CH,C18),51.53(CH3,C31),48.22(Cquart,C17),47.61(CH,C9),42.11(Cquart,C14),39.65(Cquart,C8),39.16(CH,C19),39.00(CH,C20),38.40(Cquart,C4),37.84(CH2,C1),36.98(Cquart,C10),36.75(CH2,C22),33.02(CH2,C7),30.77(CH2,C21),29.47(CH3,C23),29.18(CH2,C15),28.13(CH2,C16),24.34(CH2,C2),23.69(-CH2CH2COOH),23.58(CH3,C27),23.42(CH2,C11),21.27(CH3,C30),18.31(CH2,C6),17.16(CH3,C29),17.01(CH3,C26),16.84(CH3,C24),15.58(CH3,C25)ppm。
2.3化合物US-CIS-CL的鉴定
化合物US-CIS-CL：ESI-MS:m/z[M-H]-＝903,纯度为98％，核磁氢谱(见图11)和碳谱(见图12)详细信息如下：1HNMR(500MHz,CDCl3):δ5.53(s,6H,PtNH3),5.22(s,1H,CH(12)),4.46(d,J＝7.0Hz,1H,CH(3)),3.58(s,3H,CH3(31)),2.65-2.58(m,4H,-CH2CH2COOH),2.20(d,J＝10.7Hz,1H,Cha(2)),2.00(d,J＝9.9Hz,1H,CH(18)),1.89(dd,J＝8.9,3.7Hz,2H,CH2(11)),1.76(ddd,J＝13.8,13.8,4.8Hz,1H,Cha(15)),1.64-1.61((m,5H,CH2(7)+Cha(1)+Cha(16)+CHb(2)),1.53-1.48(m,5H,CH(9)+Cha(6)+Cha(21)+Cha(22)+CHb(16)),1.35-1.19(m,4H,CH(19)+CHb(6)+CHb(22)+CHb(21)),1.19–1.12(m,1H,CHb(15)),1.09-1.02(m,5H,CH3(27)+CH(20)+CHb(1)),0.95-0.88(m,6H,CH3(23)+CH3(30)),0.87-0.79(m,10H,CH3(25)+CH3(29)+CH3(24)+CH(5)),0.72(s,3H,CH3(26))ppm；13CNMR(125MHz,CDCl3):δ＝181.86(COOH),178.12(C＝0,C28),173.74(CH2COO),138.33(C＝CH,C13),125.59(HC＝C,C12),81.89(CHOH,C3),55.61(CH,C5),53.04(CH,C18),51.48(CH3,C31),48.22(Cquart,C17),47.55(CH,C9),43.63(Cquart,C14),39.66(Cquart,C8),39.17(CH,C19),39.02(CH,C20),37.91(Cquart,C4),37.00(CH2,C1),36.78(Cquart,C10),36.64(CH2,C22),33.03(CH2,C7),31.19(CH2,C21),29.99(CH3,C23),28.50(CH2,C15),28.17(CH2,C16),24.37(CH2,C2),23.81(-CH2CH2COOH),23.70(CH3,C27),23.45(CH2,C11),21.26(CH3,C30),18.33(CH2,C6),17.21(CH3,C29),17.03(CH3,C26),15.95(CH3,C24),15.60(CH3,C25)ppm。
2.4化合物US-CIS-SU的鉴定
化合物US-CIS-SU：ESI-MS:m/z[M+H]+＝1439.7,纯度为95％，核磁氢谱(见图13)和碳谱(见图14)详细信息如下：1HNMR(500MHz,CDCl3):δ＝5.94(s,6H,PtNH3)5.22(s,1H,CH(12)),4.44(t,J＝7.7Hz,1H,CH(3)),3.58(s,3H,CH3(31)),2.69-2.49(m,4H,-CH2CH2COOH),2.21(d,J＝11.0Hz,1H,CH(18)),2.00((t,J＝7.2Hz,1H,Cha(2)),1.89(dd,J＝8.9,3.7Hz,2H,CH2(11)),1.76(dd,J＝13.7,4.3Hz,1H,Cha(15)),1.69–1.56(m,5H,CH2(7)+Cha(1)+Cha(16)+CHb(2)),1.55-1.39(m,5H,CH(9)+Cha(6)+Cha(21)+Cha(22)+CHb(16)),1.38–1.22(m,4H,CH(19)+CHb(6)+CHb(22)+CHb(21)),1.21–1.07(m,1H,CHb(15)),1.08-0.98(m,5H,CH3(27)+CH(20)+CHb(1)),0.96-0.90(m,6H,CH3(23)+CH3(30)),0.87-0.77(m,10H,CH3(25)+CH3(29)+CH3(24)+CH(5)),0.72(s,3H,CH3(26))ppm；13CNMR(125MHz,CDCl3):δ＝182.59(COOH),177.96(C＝0,C28),173.90(CH2COO),138.22(C＝CH,C13),125.42(HC＝C,C12),81.95(CHOH,C3),55.37(CH,C5),52.91(CH,C18),51.37(CH3,C31),48.09(Cquart,C17),47.53(CH,C9),42.02(Cquart,C14),39.55(Cquart,C8),39.07(CH,C19),38.88(CH,C20),38.64(Cquart,C4),37.79(CH2,C1),36.89(Cquart,C10),36.63(CH2,C22),32.91(CH2,C7),30.84(CH2,C21),30.66(CH3,C23),28.34(CH2,C15),28.05(CH2,C16),24.24(CH2,C2),23.64(-CH2CH2COOH),23.60(CH3,C27),23.31(CH2,C11),21.14(CH3,C30),18.22(CH2,C6),17.05(CH3,C29),16.89(CH3,C26),16.79(CH3,C24),15.46(CH3,C25)ppm。
2.5化合物US-CIS-OH的鉴定
化合物US-CIS-OH：ESI-MS:m/z[M+H]+＝887.8,纯度为95.7％，核磁氢谱(见图15)和碳谱(见图16)详细信息如下：1HNMR(500MHz,CDCl3):δ＝5.91(s,6H,PtNH3)5.24(s,1H,CH(12)),4.47(t,J＝7.7Hz,1H,CH(3)),3.61(s,3H,CH3(31)),2.65-2.58(m,4H,-CH2CH2COOH),2.35(s,1H,CH(18)),2.23(d,J＝10.5Hz,1H,Cha(2)),1.91(dd,J＝8.9,3.7Hz,2H,CH2(11)),1.77(ddd,J＝13.8,13.8,4.8Hz,1H,Cha(15)),1.70–1.61(m,5H,CH2(7)+Cha(1)+Cha(16)+CHb(2)),1.53-1.48(m,5H,CH(9)+Cha(6)+Cha(21)+Cha(22)+CHb(16)),1.37–1.25(m,4H,CH(19)+CHb(6)+CHb(22)+CHb(21)),1.23–1.12(m,1H,CHb(15)),1.08(m,5H,CH3(27)+CH(20)+CHb(1)),0.93-0.92(m,6H,CH3(23)+CH3(30)),0.85-0.83(m,10H,CH3(25)+CH3(29)+CH3(24)+CH(5)),0.72(s,3H,CH3(26))ppm；13CNMR(125MHz,CDCl3):δ＝182.21(COOH),178.08(C＝0,C28),173.77(CH2COO),138.32(C＝CH,C13),125.54(HC＝C,C12),81.84(CHOH,C3),55.27(CH,C5),52.99(CH,C18),51.49(CH3,C31),48.17(Cquart,C17),47.50(CH,C9),42.11(Cquart,C14),39.62(Cquart,C8),39.17(CH,C19),39.00(CH,C20),38.34(Cquart,C4),37.91(CH2,C1),36.98(Cquart,C10),36.75(CH2,C22),32.98(CH2,C7),30.77(CH2,C21),29.75(CH3,C23),28.53(CH2,C15),28.17(CH2,C16),24.36(CH2,C2),23.85(-CH2CH2COOH),23.72(CH3,C27),23.43(CH2,C11),21.30(CH3,C30),18.34(CH2,C6),17.25(CH3,C29),17.06(CH3,C26),16.99(CH3,C24),15.61(CH3,C25)ppm。
实施例1以顺铂为基础母核，利用双氧水氧化或氯气氯化得到四价铂配合物中间体，然后以熊果酸衍生物为连接配体，在缩合剂的作用下成功合成了系列含熊果酸衍生物的新型四价铂配合物US-CIS-CL、US-CIS-SU、US-CIS-OH；实施例2对合成的各个化合物结构经核磁共振氢谱和碳谱、高分辨质谱进行了鉴定和确认。
实施例3基于顺铂衍生的四价铂抗癌配合物的稳定性及还原性
3.1溶液的配制
3.1.1抗坏血酸溶液的配制
精密称量一定质量的抗坏血酸，加入PBS溶解配制成浓度为10mM的抗坏血酸溶液。
3.1.2含铂配合物的PBS溶液配制
四价铂配合物PBS溶液配制：精密称量一定质量的四价铂配合物US-CIS-CL或US-CIS-SU或US-CIS-OH，先加入乙腈溶解配制成10μM的溶液，再用PBS溶液将其稀释，得到终浓度为1μM的溶液，用于稳定性温孵实验。
顺铂的PBS溶液配制：精密称量一定质量的顺铂，加入含10％乙腈的PBS溶液，涡旋至充分溶解，配制成浓度为1μM的顺铂溶液，用于稳定性温孵实验。
3.1.3含铂配合物的还原型PBS溶液配制
精密称量一定质量的四价铂配合物US-CIS-CL/US-CIS-SU/US-CIS-OH，先加入乙腈配制成10μM的溶液，再用PBS溶液将其稀释至2μM的浓度，最后用含10mM抗坏血酸的PBS溶液将其稀释，得到终浓度为1μM的四价铂溶液，用于稳定性温孵实验。
3.1.4含铂配合物的血浆基质配制
先精密称量一定质量的四价铂配合物US-CIS-CL/US-CIS-SU/US-CIS-OH/LA-12，每个铂配合物均用乙腈溶解配制成低浓度为1μM、高浓度为20μM的溶液，然后吸取一定体积低浓度溶液加入到20倍体积的大鼠空白血浆，涡旋混匀配制成终浓度为50nM的铂血浆基质，再吸取一定体积的高浓度溶液加入到20倍体积的大鼠空白血浆，涡旋混匀配制成终浓度为1000nM的铂血浆基质，配制的含铂血浆基质用于稳定性温孵实验。
3.2铂配合物在PBS及还原型PBS溶液的稳定性实验
将配制的浓度为1μM的铂配合物PBS溶液，放置于37℃恒温水浴锅中温孵0、5min、15min、30min、1h、2h、4h、8h、12h、24h,每个时间点设置平行3个样品，温孵结束后终止实验，终止时吸取50μL样品立即加至含200μL冰乙腈的Eppendorf管中，涡旋混匀，待进样。
3.3铂配合物在血浆基质的稳定性实验
将配制的浓度为50nM、1000nM的含铂配合物血浆基质样品，放置于37℃恒温水浴锅或-20℃冰箱中温孵0、30min、1h、2h，每个时间点设置平行3个样品，于相应的时间点终止实验，终止时吸取50μL样品加入到含有200μL冰乙腈的Eppendorf管中，涡旋混匀，待进样。
3.4铂配合物稳定性样品的仪器分析
U-SA、US-CIS-CL、US-CIS-SU、US-CIS-OH及顺铂均是运用UPLC-MS/MS分析系统进行测定，ACQUITY UPLC I-class液相系统由自动进样器、泵、柱温箱和控制器(waters,MA,USA)组成。Xevo TQ-XS Mass质谱仪配有MassLynx V4.2软件系统(waters,MA,USA)。
3.4.1质谱条件
质谱扫描方式为多级反应监测(MRM)，U-SA和US-CIS-CL的测定采用负离子模式；US-CIS-SU、US-CIS-OH及顺铂的测定采用正离子模式；用于U-SA定量的离子反应为m/z569.13→98.89，碰撞能量(CE)＝-20eV，锥孔电压(cone)＝-26eV；用于US-CIS-CL定量的离子反应为m/z 903→315.57，碰撞能量(CE)＝-30eV，锥孔电压(cone)＝-20eV；用于US-CIS-SU定量的离子反应为m/z 1439.7→416.7，碰撞能量(CE)＝25eV,锥孔电压(cone)＝50eV；用于US-CIS-OH定量的离子反应为m/z 887.84→417，碰撞能量(CE)＝20eV，锥孔电压(cone)＝25eV；用于顺铂定量的离子反应为m/z 318.1→265.0，碰撞能量(CE)＝12eV，锥孔电压(cone)＝25eV。
3.4.2液相条件
U-SA、US-CIS-CL、US-CIS-SU、US-CIS-OH的分离色谱柱为ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱(柱号：186002350，1.7μm,2.1×50mm,waters,MA,USA)，流动相A为含0.1％甲酸的水溶液，流动相B为乙腈，流速为0.6mL/min，柱温为40℃，进样体积2μL。顺铂的分离色谱柱为ACQUITY UPLC BEH Amide色谱柱(柱号：186004800，1.7μm,2.1×50mm,waters,MA,USA)，流动相A为含5mM乙酸铵的水溶液，流动相B为乙腈，流速为0.6mL/min，柱温为40℃，进样体积2μL。U-SA、US-CIS-CL、US-CIS-OH的详细液相梯度条件如下表1所示，US-CIS-SU的详细液相梯度条件如下表2所示，顺铂的详细液相洗脱梯度条件如下表3所示。
表1化合物U-SA、US-CIS-CL、US-CIS-OH的液相梯度条件
Figure BDA0003272019160000191
表2化合物US-CIS-SU的液相梯度条件
Figure BDA0003272019160000192
表3化合物顺铂的液相梯度条件
Figure BDA0003272019160000193
实施例4稳定性实验结果及分析
US-CIS-CL化合物在PBS及还原型PBS溶液的稳定性实验结果见图17。
US-CIS-SU化合物在PBS及还原型PBS溶液的稳定性实验结果见图18。
US-CIS-OH在PBS及还原型PBS溶液的稳定性实验结果见图19。
顺铂在PBS及还原型PBS溶液的稳定性实验结果见图20。
U-SA在PBS及还原型PBS溶液的稳定性实验结果见图21。
四价铂配合物及顺铂在PBS及还原型PBS溶液的稳定性比较结果见图22。
US-CIS-CL在血浆基质的稳定性实验结果：血浆基质中无法检测到US-CIS-CL原药，即US-CIS-CL在血浆中极不稳定，迅速转化。
US-CIS-SU在血浆基质的稳定性实验结果见图23。
四价铂配合物US-CIS-OH在血浆基质的稳定性实验结果见图24。
4.1铂配合物在PBS及还原型PBS溶液的稳定性实验结果讨论
基于四价铂配合物只是铂(II)的前药，需被还原生成相应的铂(II)配合物才可能与细胞核DNA发生反应，破坏DNA的生物功能，从而发挥抗肿瘤作用。因此，四价铂配合物的稳定性及还原性是影响其活性的关键理化性质之一。
4.1.1 US-CIS-CL在PBS及还原型PBS溶液的稳定性实验结果讨论
由US-CIS-CL在PBS及还原型PBS溶液于37℃温孵不同时间的稳定性实验结果(图17a)可知，US-CIS-CL原药在PBS溶液中的含量随时间(24h内)缓慢下降，其中在4h时约下降为初始含量的50％，在12h时约下降为初始含量的10％，而在24h时，PBS溶液中的US-CIS-CL原药基本完全转化降解；而US-CIS-CL原药在还原型PBS溶液(含5mM抗坏血酸)中含量下降迅速，在5min时US-CIS-CL原药的含量即下降为初始含量的10％，在1h内基本完全降解，提示US-CIS-CL在还原型PBS溶液中极不稳定，具有很强的还原敏感性。
由US-CIS-CL在PBS及还原型PBS溶液于37℃温孵不同时间转化生成的顺铂含量变化结果(图17b)可知，US-CIS-CL在PBS溶液中温孵4h内生成的顺铂含量逐渐增加，而在8-24h内，顺铂含量趋于平稳，这可能是由于刚开始温孵前4h的时间内，溶液中US-CIS-CL原药含量较高，由US-CIS-CL转化生成顺铂的速率大于顺铂在PBS的降解速率，因而表现出生成顺铂的量逐渐增加，而在8h以后，随着US-CIS-CL含量的减少，其转化生成顺铂的速率逐渐降低，使得生成顺铂的速率与顺铂的降解速率基本持平，表现出顺铂含量基本平稳不变的趋势；US-CIS-CL在还原型PBS溶液(含5mM抗坏血酸)中温孵生成顺铂的含量在5min内迅速增加，在5min～2h内，顺铂含量缓慢增加，而在2h以后，顺铂含量则表现出缓慢下降的趋势，这可能是由于US-CIS-CL原药在还原型PBS溶液中温孵前5min内就迅速发生还原转化，导致在5min内即迅速生成大量的顺铂，而在5min～2h内，随着US-CIS-CL含量的降低，导致其转化生成顺铂的速率也在减小，但仍大于顺铂的降解速率，表现出顺铂含量逐渐增加，而在2h以后，US-CIS-CL已完全降解，则主要发生顺铂的降解过程，表现出顺铂含量又缓慢下降。
由US-CIS-CL在PBS及还原型PBS溶液于37℃温孵不同时间转化生成的U-SA含量变化结果(图17c)可知，US-CIS-CL在PBS溶液中温孵1h内生成的U-SA含量逐渐增加，而在1h以后，U-SA含量又表现出缓慢下将的趋势，这可能是由于在开始的1h内，US-CIS-CL含量相对较高，使得其转化生成U-SA的速率大于U-SA在PBS溶液的降解速率，表现出U-SA含量逐渐增加的趋势，而在1h以后，随着US-CIS-CL含量相对较低，使得其转化生成U-SA的速率小于U-SA的降解速率，表现出U-SA含量逐渐下降的趋势；US-CIS-CL在还原型PBS溶液(含5mM抗坏血酸)中温孵生成U-SA的含量在5min内迅速增加,5min后U-SA含量又表现出迅速下降的趋势，这可能是由于在开始的5min时间内，US-CIS-CL发生迅速还原转化导致5min内迅速生成大量的U-SA,而5min以后，则主要表现出U-SA的降解过程，U-SA含量随时间迅速下降。
4.1.2 US-CIS-SU在PBS及还原型PBS溶液的稳定性实验结果讨论
由US-CIS-SU在PBS及还原型PBS溶液于37℃温孵不同时间的稳定性实验结果(图18)可知，US-CIS-SU无论在PBS溶液还是还原型PBS溶液中其原药含量随时间(24h内)未发生明显的下降趋势，提示US-CIS-SU在PBS溶液中稳定性良好，同时在还原型的PBS溶液中也较稳定，并未表现出还原敏感性，这一结果提示US-CIS-SU稳定性较好，可能会比较难以被还原生成二价铂。
4.1.3 US-CIS-OH在PBS及还原型PBS溶液的稳定性实验结果讨论
由US-CIS-OH在PBS及还原型PBS溶液于37℃温孵不同时间的稳定性实验结果(图19a)可知，US-CIS-OH原药在PBS溶液中含量随时间(24h内)缓慢下降，其中在4h时约下降为初始含量的60％，在12h时约下降为初始含量的20％，而在24h时，PBS溶液中的US-CIS-OH原药基本完全转化降解；而US-CIS-OH原药在还原型PBS溶液(含5mM抗坏血酸)中含量也表现出随时间缓慢下降，并且下降速率高于其在PBS溶液的原药下降速率，在4h时US-CIS-OH原药的含量即下降为初始含量的16％，在12h时US-CIS-OH基本降解完全，提示US-CIS-OH在还原型PBS溶液的稳定性小于其在PBS溶液的稳定性，US-CIS-OH存在一定的还原敏感性。
由US-CIS-OH在PBS及还原型PBS溶液于37℃温孵不同时间转化生成的顺铂含量变化结果(图19b)可知，US-CIS-OH在PBS溶液中温孵的前30min内生成顺铂的含量基本保持平稳不变，提示这个过程中由US-CIS-OH转化生成顺铂的速率与顺铂的降解速率基本持平，而在1～24h，顺铂的含量开始逐渐下降，提示在这个时间内，顺铂的生成速率小于顺铂的降解速率；US-CIS-OH在还原型PBS溶液(含5mM抗坏血酸)中温孵生成顺铂的含量在5min内迅速增加，在5min～8h内，顺铂含量缓慢增加，而在8h以后，顺铂含量则表现出缓慢下降的趋势，这可能是由于US-CIS-OH原药在还原型PBS溶液中温孵前5min内就迅速发生还原转化，导致在5min内即迅速生成大量的顺铂，而在5min～8h内，随着US-CIS-OH含量的降低，导致其转化生成顺铂的速率也在减小，但仍大于顺铂的降解速率，表现出顺铂含量逐渐增加，而在8h以后，US-CIS-OH基本已完全降解，则主要发生顺铂的降解过程，表现出顺铂含量又缓慢下降。
4.1.4顺铂在PBS及还原型PBS溶液的稳定性实验结果讨论
由顺铂在PBS及还原型PBS溶液于37℃温孵不同时间的稳定性实验结果(图20)可知，顺铂在PBS溶液及还原型PBS溶液的稳定性无明显差异，并且在两种溶液中均表现出随时间缓慢下降的趋势，在4h时顺铂含量下降为初始含量的50～60％，在12h时约下降为初始含量的25～30％，而在24h时顺铂含量约下降为初始含量的15％。
4.1.5 U-SA在PBS及还原型PBS溶液的稳定性实验结果讨论
由U-SA在PBS及还原型PBS溶液于37℃温孵不同时间的稳定性实验结果(图21)可知，U-SA含量在PBS溶液及还原型PBS溶液均随时间逐渐下降，并且还原型PBS溶液的U-SA含量下降速率大于PBS溶液的U-SA含量下降速率；U-SA在PBS溶液中含量缓慢下降，并在24h时下降为初始含量的60％，而U-SA在还原型PBS溶液中2h内含量下降为初始的31％，在12h时U-SA基本完全降解，结果提示U-SA在PBS和还原型PBS溶液的稳定性均不太好，并且U-SA具备明显的还原敏感性。
4.1.6四价铂配合物原药及二价顺铂在PBS及还原型PBS溶液的稳定性结果比较讨论
由四价铂配合物US-CIS-CL、US-CIS-SU、US-CIS-OH及二价顺铂在PBS溶液于37℃温孵不同时间的稳定性结果(图22a)可知,US-CIS-CL、US-CIS-OH及顺铂含量在PBS溶液中均随时间缓慢下降，并且四价铂US-CIS-CL、US-CIS-OH与二价顺铂含量下降速率相当，提示US-CIS-CL、US-CIS-OH及顺铂在PBS溶液的稳定性相当，US-CIS-SU在PBS溶液较稳定，其含量随时间基本不变。
由四价铂配合物US-CIS-CL、US-CIS-SU、US-CIS-OH及二价顺铂在还原型PBS溶液于37℃温孵不同时间的稳定性结果(图22b)可知,US-CIS-CL含量迅速下降，US-CIS-OH含量缓慢下降，且二者下降速率均大于顺铂的下降速率，并以US-CIS-SU最稳定，24h内含量基本不变。
4.2铂配合物在在血浆基质的稳定性实验结果讨论
4.2.1 US-CIS-CL在血浆基质的稳定性实验结果讨论
由制备得到的浓度分别为50nM、1000nM的US-CIS-CL血浆溶液稳定性结果，无论是室温条件还是在-20℃冰箱放置，均无法检测到US-CIS-CL原药，并且新鲜制备得到的样品立即处理进样，也无法检测到US-CIS-CL原药，提示US-CIS-CL在血浆基质中极不稳定，遇血浆即发生迅速降解，在制备血浆溶液的短时间内即转化完全。
4.2.2 US-CIS-SU在血浆基质的稳定性实验结果讨论
由制备得到的浓度分别为50nM、1000nM的US-CIS-SU血浆溶液稳定性结果(图23)，无论在室温条件还是-20℃冰箱放置，US-CIS-SU在两个浓度的血浆溶液中，2h内含量未表现出明显变化，提示US-CIS-SU在血浆基质中2h内稳定性很好。
4.2.3 US-CIS-OH在血浆基质的稳定性实验结果讨论
由制备得到的浓度分别为50nM、1000nM的US-CIS-OH血浆溶液稳定性结果(图24)，无论在室温条件还是在-20℃冰箱放置，US-CIS-OH在两个浓度的血浆溶液中，2h内其US-CIS-OH原药含量均发生轻微下降，其中高浓度1000nM时US-CIS-OH的含量下降不超过20％,低浓度50nM时US-CIS-OH的含量下降不超过30％。
实施例5基于顺铂衍生的四价铂抗癌配合物的体外细胞药效评估
试验细胞：A2780细胞、HCT-116细胞、A549DDP细胞、HFL-1细胞、L-O2细胞：均购自中国科学院上海生命科学院细胞库。
5.1试验用液的配制
5.1.1细胞培养液的配制
A2780细胞培养液的配制：不完全高糖DMEM培养基中加入10％体积的胎牛血清，混合均匀，置于4℃冰箱中保存，使用前在37℃水浴锅中预温。
HCT-116细胞培养液的配制：McCoy's 5a培养基中加入10％体积的胎牛血清，混合均匀，置于4℃冰箱中保存，使用前在37℃水浴锅中预温。
A549DDP细胞培养液的配制：1640培养基中加入10％体积的胎牛血清，混合均匀，置于4℃冰箱中保存，使用前在37℃水浴锅中预温。
L-O2细胞培养液的配制：1640培养基中加入10％体积的胎牛血清，混合均匀，置于4℃冰箱中保存，使用前在37℃水浴锅中预温。
HFL-1细胞培养液的配制：F-12K培养基中加入10％体积的胎牛血清，混合均匀，置于4℃冰箱中保存，使用前在37℃水浴锅中预温。
5.1.2受试药物溶液的配制
5.1.2.1受试药物母液的配制
四价铂配合物US-CIS-CL、US-CIS-SU、US-CIS-OH母液：精密称量一定质量的US-CIS-CL/US-CIS-SU/US-CIS-OH，溶解于DMSO溶剂中，配制成浓度为50mM的母液。
熊果酸UA或熊果酸衍生物U-SA母液：精密称量一定质量的UA或熊果酸衍生物U-SA，溶解于DMSO溶剂中，配制成浓度为50mM的母液。
顺铂母液：精密称量一定质量的顺铂，溶解于PBS溶液中，配制成浓度为1mM的母液。
5.1.2.2受试药物给药溶液的配制
单药细胞毒考察实验给药溶液的配制：分别将各化合物U-SA、US-CIS-CL、US-CIS-SU、US-CIS-OH、顺铂、熊果酸的母液，用不含血清的细胞培养基进行梯度稀释至一系列目标浓度：200、100、60、40、20、10、4、1μM，用于各化合物细胞毒考察的给药实验。
联合给药细胞毒考察实验给药溶液的配制：分别将各化合物U-SA、熊果酸、顺铂的母液,用不含血清的细胞培养基进行梯度稀释至一系列目标浓度:400、200、120、80、40、20、8、2μM，然后将同浓度的U-SA化合物溶液与顺铂溶液按照等体积混合配制成U-SA与顺铂联合给药的药液溶液用于考察U-SA与顺铂联合给药的细胞毒；将同浓度的熊果酸溶液与顺铂溶液按照等体积混合配制成熊果酸与顺铂联合给药的药液溶液用于考察熊果酸与顺铂联合给药的细胞毒。
5.2细胞培养
5.2.1细胞的消化和传代
A2780细胞、HCT-116细胞、A549DDP细胞、HFL-1细胞和L-O2细胞均是贴壁细胞，相应的细胞均用各自对应的细胞培养液培养，贴壁生长在细胞培养瓶中，并放置于37℃培养箱中培养。每隔一天对细胞更换一次新鲜培养液，直至细胞生长至覆盖瓶底80％左右时，用0.25％胰蛋白酶对细胞进行消化收集细胞，然后用细胞培养液重悬细胞和计数，并按照1:3比例进行细胞传代，将传代后的细胞继续放置于培养箱中进行培养。
5.2.2细胞计数
消化细胞后，用血球计数板法对细胞进行计数，取少量细胞培养基重悬的细胞悬液于载玻片上，并在显微镜下观察细胞，计数细胞数N＝细胞数n/4×稀释倍数×104个/mL。
5.2.3细胞接种
96孔板细胞接种：按照“5.2.1”消化细胞，按照“5.2.2”进行细胞计数，并将细胞悬液用细胞培养基稀释至合适的浓度，并调整至5000个/孔的细胞密度进行接种铺板，每孔100μL,与此同时，设置空白组(仅用不含细胞的空白培养基进行铺板)，并将接种好细胞的96孔板放置于培养箱中培养。
5.3细胞毒考察实验
将96孔板中细胞培养24h后，开始进行给药实验，分别将配制的梯度系列给药溶液，加入到对应的96孔板中，每个浓度组设置6个复孔，每孔加药液体积为100μL,其中空白组和阴性对照组每孔加入100μL的不含药不含血清的空白培养基，每个给药组均平行设置三个96孔板，分别用于考察药物作用于细胞24h、48h和72h时的细胞毒情况。给药后，将96孔板放置于培养箱中继续培养分别于24h、48h或72h后,向96孔板的每孔加入20μL的CCK-8试剂，继续于37℃培养箱中培养2h后，取出96孔板，在450nm波长条件下测定各孔的吸光度。细胞存活率计算公式为：Cell viability(％)＝(给药组吸光度-空白组吸光度)×100％/(阴性对照组吸光度-空白组吸光度)，以药物浓度对数值为横坐标，细胞相对存活率为纵坐标，利用GraphPad Prism 5求算对应各给药组的IC50值。
5.4结果
为了探究四价铂配合物US-CIS-CL、US-CIS-SU、US-CIS-OH在细胞水平的生物活性，选用几种不同的细胞系进行研究。其中卵巢癌细胞系A2780和结肠癌细胞系HCT-116用作为考察铂配合物体外抗癌活性的细胞模型，顺铂耐药细胞株A549DDP作为考察四价铂配合物是否与顺铂有交叉耐药的细胞模型，正常人肝细胞L-O2和正常人肺成纤细胞HFL-1作为考察铂配合物对正常细胞毒性的细胞模型。并将四价铂配合物给药组与顺铂给药组、顺铂与U-SA联合给药组(CIS+U-SA)、顺铂与熊果酸联合给药组(CIS+UA)、U-SA给药组、熊果酸给药组进行平行对照实验。各给药组对A2780细胞的细胞毒实验结果见表4、表5和图25；各给药组对HCT-116细胞的细胞毒实验结果见表6、表7和图26；各给药组对A549DDP细胞的细胞毒实验结果见表8、表9和图27；各给药组对L-02细胞的细胞毒实验结果见表10、表11和图28；各给药组对HFL-1细胞的细胞毒实验结果见表12、表13和图29。
由各组化合物在A2780细胞的细胞毒实验结果(表4和图25)，并将三个四价铂配合物US-CIS-CL、US-CIS-SU及US-CIS-OH的细胞毒IC50值与顺铂的IC50值对比，发现US-CIS-CL和US-CIS-OH对A2780细胞的细胞毒强于顺铂，而US-CIS-SU对A2780的细胞毒要小于顺铂；再将US-CIS-CL、US-CIS-SU、US-CIS-OH的细胞毒IC50值与联合给药组(CIS+U-SA、CIS+UA)及U-SA、UA给药组对比发现，仍然以US-CIS-CL和US-CIS-OH化合物表现出明显的细胞毒优势，而US-CIS-SU的细胞毒效果不理想。
表4各给药组在A2780细胞分别作用24h、48h、72h的IC50(μM,Mean±SD,n＝3)
Figure BDA0003272019160000291
进一步将细胞毒效果比较好的四价铂US-CIS-CL和US-CIS-OH的IC50值与顺铂的IC50值做比值(表5)发现IC50(US-CIS-CL)/IC50(CIS)的范围在0.24-0.30，IC50(US-CIS-OH)/IC50(CIS)的范围在0.002-0.081，提示US-CIS-CL和US-CIS-OH相对于顺铂均具有明显的A2780细胞毒优势，并且以US-CIS-OH的细胞毒作用强于US-CIS-CL。
表5四价铂配合物US-CIS-CL或US-CIS-OH与顺铂在A2780细胞IC50的比值
Figure BDA0003272019160000292
继续分析各组化合物在HCT-116细胞的细胞毒结果(表6和图26)，以四价铂配合物US-CIS-CL和US-CIS-OH表现出较为明显的细胞毒优势，并且由表7可知，IC50(US-CIS-CL)/IC50(CIS)在HCT-116细胞系的范围在0.21-0.38，IC50(US-CIS-OH)/IC50(CIS)在HCT-116细胞系的范围在0.022-0.033,且以US-CIS-OH的细胞毒作用强于US-CIS-CL该结果与在A2780细胞的细胞毒结果类似。
表6各给药组在HCT-116细胞分别作用24h、48h、72h的IC50值(μM,Mean±SD,n＝3)
Figure BDA0003272019160000301
表7四价铂配合物US-CIS-CL或US-CIS-OH与顺铂在HCT-116细胞IC50的比值
Figure BDA0003272019160000302
由各组化合物在顺铂耐药A549DDP的细胞毒实验结果(表8和图27)可知，三个四价铂配合物中，US-CIS-CL和US-CIS-OH表现出比顺铂、CIS+U-SA、CIS+UA、U-SA、UA等给药组别的明显优势，US-CIS-SU的A549DDP细胞毒药效不理想，另外，将四价铂US-CIS-CL和US-CIS-OH的IC50值与顺铂的IC50值做比值比较(表9)，IC50(US-CIS-CL)/IC50(CIS)在A549DDP细胞系的范围在0.11-0.26，IC50(US-CIS-OH)/IC50(CIS)在A549DDP的范围在0.009-0.035,以US-CIS-OH的细胞毒作用强于US-CIS-CL。这一结果与在癌细胞系A2780和HCT-116的实验结果相一致。
表8各给药组在A549DDP细胞分别作用24h、48h、72h的IC50值(μM,Mean±SD,n＝3)
Figure BDA0003272019160000303
表9四价铂配合物US-CIS-CL或US-CIS-OH与顺铂在A549DDP细胞IC50的比值
Figure BDA0003272019160000304
由各组化合物在正常细胞L-O2的细胞毒实验结果(表10和图28)可知，US-CIS-CL表现出比顺铂、CIS+U-SA、CIS+UA组更小的细胞毒作用，提示其体外细胞安全性相对较好。结合US-CIS-CL在癌细胞A2780、HCT-116、A549DDP的细胞毒作用强于顺铂、CIS+U-SA和CIS+UA组的结果可知，US-CIS-CL在细胞水平上，兼具比顺铂更强的抗癌效果及更低的对正常细胞的毒性，是一个比较有潜力进一步开发的化合物。
US-CIS-OH在正常L-O2细胞中虽然表现出较高的毒性，但是其相对于对癌细胞更强的细胞毒作用，综合评判也是一个比较有潜力可以进一步开发的化合物。US-CIS-SU、U-SA和UA组表现出对L-O2较小的细胞毒作用，安全性较好。然而考虑到US-CIS-SU、U-SA和UA在癌细胞A2780、HCT-116及A549DDP的细胞毒药效较差，尽管安全性好，因药效较差，因此仍为不理想化合物。
表10各给药组在L-O2细胞分别作用24h、48h、72h的IC50值(μM,Mean±SD,n＝3)
Figure BDA0003272019160000311
将US-CIS-CL和US-CIS-OH化合物在L-O2细胞的IC50值进一步与顺铂的IC50做比值比较(表11)，在L-O2细胞系中，IC50(US-CIS-CL)/IC50(CIS)的范围在2.68-3.36，这提示US-CIS-CL对L-O2的毒性小于顺铂，结合US-CIS-CL与顺铂在癌细胞A2780、HCT-116等的IC50比值发现，与顺铂比较，US-CIS-CL对癌细胞具有明显的选择性作用；在L-O2细胞系中，IC50(US-CIS-OH)/IC50(CIS)的范围在0.190-0.286,提示US-CIS-OH对L-O2的毒性大于顺铂，然而结合US-CIS-OH与顺铂在癌细胞A2780、HCT-116细胞的IC50比值发现，正常细胞L-O2的IC50(US-CIS-OH)/IC50(CIS)明显高于癌细胞A2780、HCT-116等的IC50(US-CIS-OH)/IC50(CIS)，结果提示US-CIS-OH与顺铂比较，对癌细胞也具有一定的选择性作用。此外，进一步用正常细胞HFL-1验证各组化合物的细胞毒结果(表12，表13和图29)，发现在HFL-1的细胞毒实验结果与L-O2细胞的细胞毒实验结果相一致。
表11四价铂配合物US-CIS-CL或US-CIS-OH与顺铂在L-O2细胞IC50的比值
Figure BDA0003272019160000321
表12各给药组在HFL-1细胞分别作用24h、48h、72h的IC50值(μM,Mean±SD,n＝3)
Figure BDA0003272019160000322
表13四价铂配合物US-CIS-CL或US-CIS-OH与顺铂在HFL-1细胞IC50的比值
Figure BDA0003272019160000323

Claims (5)

1.基于顺铂衍生的含熊果酸配体的四价铂抗癌配合物，其特征在于，所述四价铂抗癌配合物为US-CIS-CL，其结构式如式Ⅰ所示(化学式C35H59Cl3N2O6Pt)：
Figure FDA0003573314850000011
2.基于顺铂衍生的含熊果酸配体的四价铂抗癌配合物，其特征在于，所述四价铂抗癌配合物为US-CIS-OH，其结构式如式Ⅲ所示(化学式C35H60Cl2N2O7Pt)：
Figure FDA0003573314850000012
3.根据权利要求1所述的四价铂抗癌配合物的制备方法，其特征在于，所述四价铂抗癌配合物US-CIS-CL的制备方法，包括如下步骤：
(1)铂(IV)中间体的合成
Figure FDA0003573314850000021
向1当量的8.0mmoL顺铂的水溶液450mL中，逐滴加入1.1当量的8.8mmoL的N-氯代丁二酰亚胺1.2g；将混合物在室温搅拌过夜后，通过过滤除去黑色沉积物；减压浓缩滤液，并沉淀出黄色固体；收集固体，分别用乙醇和乙醚洗涤，然后真空干燥，得到所需产物铂(IV)中间体单氯单羟基顺铂；
(2)熊果酸衍生物的合成
Figure FDA0003573314850000022
向1当量的1.09mmoL熊果酸溶液500mg溶解在10mL的N,N-二甲基甲酰胺DMF，加入2当量的2.19mmoL碳酸钾303mg，在室温下搅拌30分钟后，加入2当量的3.27mmoL甲基碘311mg、148μL，并继续搅拌24h；将混合物缓慢加入5％盐酸30mL中，滤出沉淀物并用水洗涤；经甲醇重结晶或色谱纯化后，得到UM白色固体487mg，收率95％；
向1当量1.06mmoL的UM 500mg和0.1当量0.106mmoL的4-二甲基氨基吡啶13mg的无水二氯甲烷15mL溶液中加入4当量4.24mmoL的琥珀酸酐424mg和1当量的1.06mmoL的三乙胺107mg、134μL，继续搅拌36小时，减压蒸发溶剂；将残余物用乙酸乙酯稀释，并用水和饱和氯化钠溶液洗涤，有机相用无水硫酸镁干燥；减压过滤和蒸发溶剂，得到白色固体，将其通过硅胶色谱法纯化，用乙酸乙酯-石油醚的梯度洗脱，得到U-SA白色固体490mg，收率81％；
(3)熊果酸衍生物-铂(IV)配合物US-CIS-CL的合成
Figure FDA0003573314850000031
向1当量0.88mmoL的U-SA 500mg和1当量0.88mmoL的O-苯并三氮唑-N,N,N,N-四甲基脲四氟硼酸TBTU 283mg的无水DMF 20mL溶液中加入1当量0.88mmoL单氯单羟基顺铂310.2mg和1当量0.88mmoL乙基二异丙胺113.7mg、142μL，继续搅拌5小时；减压蒸发溶剂，将其通过硅胶色谱法纯化，用二氯甲烷-甲醇的梯度洗脱，得到黄色粉末状的US-CIS-CL 438mg，收率55％。
4.根据权利要求2所述的四价铂抗癌配合物的制备方法，其特征在于，所述四价铂抗癌配合物US-CIS-OH的制备方法，包括如下步骤：
(1)铂(IV)中间体的合成
Figure FDA0003573314850000041
在铝箔覆盖的圆底烧瓶中，将3.05mmoL顺铂1.0g和30％w/v的30.5mmoL的H2O2 3.5mL的混合物在70℃加热5h；然后去除加热，并将反应混合物搅拌过夜；产物在4℃下原位重结晶；通过真空过滤获得产物，并用冰冷的水，乙醇和乙醚洗涤，过滤后，减压除去溶剂，得到期望的产物，为亮黄色粉末，收率90％；
(2)熊果酸衍生物的合成
Figure FDA0003573314850000042
向1当量的1.09mmoL熊果酸溶液500mg溶解在10mL的N,N-二甲基甲酰胺DMF，加入2当量的2.19mmoL碳酸钾303mg，在室温下搅拌30分钟后，加入2当量的3.27mmoL甲基碘311mg、148μL，并继续搅拌24h；将混合物缓慢加入5％盐酸30mL中，滤出沉淀物并用水洗涤；经甲醇重结晶或色谱纯化后，得到UM白色固体487mg，收率95％；
向1当量1.06mmoL的UM 500mg和0.1当量0.106mmoL的4-二甲基氨基吡啶13mg的无水二氯甲烷15mL溶液中加入4当量4.24mmoL的琥珀酸酐424mg和1当量的1.06mmoL的三乙胺107mg、134μL，继续搅拌36小时，减压蒸发溶剂；将残余物用乙酸乙酯稀释，并用水和饱和氯化钠溶液洗涤，有机相用无水硫酸镁干燥；减压过滤和蒸发溶剂，得到白色固体，将其通过硅胶色谱法纯化，用乙酸乙酯-石油醚的梯度洗脱，得到U-SA白色固体490mg，收率81％；
(3)熊果酸衍生物-铂(IV)配合物US-CIS-OH的合成
Figure FDA0003573314850000051
将0.88mmoL的U-SA 500mg和0.88mmoL的N-羟基琥珀酰亚胺101mg溶解在15mL二氯甲烷中；然后将0.88mmoL的N,N-二环己基碳二亚胺182mg加入到二氯甲烷溶液中；将混合物在室温搅拌6h；反应后，通过过滤除去副产物二环己基脲(DCU)，将溶液留下；在减压状态下蒸发溶剂，然后将产物在DMSO中溶解；将0.88mmoL的Pt(NH3)2Cl2(OH)2 294mg加入到5mL DMSO溶液中；将该溶液在80℃下搅拌12小时，以获得澄清的橙色溶液；将该溶液离心以除去未反应的Pt(IV)化合物；然后向DMSO溶液中加入水和二氯甲烷，分别用水和饱和氯化钠溶液洗涤三次；有机相用无水硫酸镁干燥；减压蒸发溶剂，将其通过硅胶色谱法纯化，用二氯甲烷-甲醇的梯度洗脱，得到黄色粉末状的US-CIS-OH 374mg，收率48％。
5.根据权利要求1-2任一所述的四价铂抗癌配合物在制备抗癌药物中的应用。
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