CN114908066B - 一种正交翻译系统及其在再分配密码子恢复ptc疾病中功能蛋白表达方面的应用 - Google Patents

一种正交翻译系统及其在再分配密码子恢复ptc疾病中功能蛋白表达方面的应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种哺乳动物细胞的正交翻译系统的开发以及在制备治疗人类PTC疾病药物中的应用，特别涉及一种正交翻译系统及其在再分配密码子恢复PTC疾病中功能蛋白表达方面的应用，属于基因工程技术领域。所述的正交翻译系统，包括正交tRNA和正交氨酰‑tRNA合成酶，正交氨酰‑tRNA合成酶chPheRS、chHisRS、chAlaRS、chSerRS、chTrpRS、EcTyrRS、EcLeuRS的核苷酸序列依次如SEQ ID NO.1～7所示，正交tRNA的核苷酸序列依次如SEQ ID NO.8～28所示。

Description

一种正交翻译系统及其在再分配密码子恢复PTC疾病中功能 蛋白表达方面的应用
技术领域
本发明涉及一种哺乳动物细胞的正交翻译系统的开发以及在制备治疗人类PTC疾病药物中的应用，特别涉及一种正交翻译系统及其在再分配密码子恢复PTC疾病中功能蛋白表达方面的应用，属于基因工程技术领域。
背景技术
蛋白质是生物体内行使功能的主要物质，在生物体内承担了高度多样性的功能，包括维持细胞结构稳定性，催化体内生物化学反应，通过信号传导调节细胞反应，通过免疫系统靶向外源分子等。蛋白质是通过装载有20种氨基酸的氨酰化tRNA在核糖体中解码61种编码氨基酸的密码子，并通过3种终止密码子(UAA,UGA,UAG)进行合成的终止，产生功能性的氨基酸多聚体。一旦发生基因突变导致其他61种密码子突变成3种终止密码子(无义突变)，就会导致蛋白质在翻译过程中发生提前终止，产生无功能的截短体，使蛋白质功能丧失，影响细胞内稳态，导致提前终止密码子(Premature termination codons，PTC)疾病。据统计，在所有人类基因突变引起疾病的病例中，约有11％的病例是由于发生了提前终止密码子突变(Mort et al.,2008)。由于蛋白质功能的缺失，该类疾病的表型是进行性发展，患者最终会因器官衰竭等问题在年轻时死亡。
提前终止密码子突变不仅可见于许多遗传性疾病中，也常见于许多癌症中。与PTC突变相关的遗传性疾病有很多，包括杜氏肌肉萎缩症、遗传性肾炎、β-地中海贫血、Rett综合症、共济失调毛细血管扩张症、I型尤塞氏综合症、I型黏多糖贮积症、甲基丙二酸血症、脊髓性肌肉萎缩症、过氧化物酶体生物发生缺陷病等等(Lee and Dougherty,2012)。PTC突变也是很多癌症发生、发展的驱动力，如抑癌基因apc基因发生无义突变后会引起Wnt信号通路的持续激活，导致家族性腺瘤性息肉病，表现为结直肠中出现数以万计的腺瘤(Yang etal.,2021)，随着时间的推移将发展成结肠癌。抑癌基因p53的无义突变，也与多种癌症存在相关性，包括但不限于小细胞肺癌、非小细胞肺癌和子宫瘤息肉等(Robles et al.,2016)。抑癌基因RB1发生无义突变后，会引起细胞生长和分裂的不受控制，最终导致视网膜母细胞瘤、膀胱癌、胆管癌等等(Herwig and Strauss,1997)。
目前针对PTC疾病的治疗方法主要是对症状进行缓解的一些保守疗法，也有一些在蛋白质翻译水平上重新实现通读的潜在疗法，主要有以下几种：1、小分子通读药物：如庆大霉素B1等氨基糖苷类抗生素；2、来源于甲烷古菌Methanosarcina mazei或Methanosarcina barkeri的pyrrolysyl—tRNA合成酶(PylRS)/tRNAPyl正交对识别非天然氨基酸进行读通；3、直接改造内源tRNA反密码子环成抑制性tRNA进行通读。
小分子通读药物是用氨基糖苷类抗生素以广谱作用形式作用于体内的核糖体，使核糖体在翻译过程中发生错误，实现概率性通读。这种方法虽能实现通读，但对机体其他蛋白的翻译也有较大影响，且由于氨基糖苷类药物自身的肾毒性、耳毒性，其应用大大受限。利用正交的PylRS-tRNAPyl的策略进行通读，引入非天然氨基酸，达到翻译全长蛋白质的治疗目的，由于需要额外递送非天然氨基酸，涉及吸收效率、非天然氨基酸合成成本、用量及安全性等问题；且PylRS-tRNAPyl体系自身可工程化的程度较差，适用范围有限。抑制性tRNA进行通读的策略，是对机体内识别稀有密码子的tRNA进行反密码子环改造，使其能与终止密码子配对，从而实现通读。但由于其tRNA来源于机体自身，会与体内的氨酰-tRNA合成酶发生识别和结合，无法实现正交，会产生难以预测的不良影响。
以上三种方法还存在着难以应用到蛋白质功能氨基酸位点的无义突变。这类突变并不是仅仅恢复蛋白质的通读，产生全长蛋白质就可以恢复这一蛋白质的功能行使，其需要在这一无义突变位置解码为原来的氨基酸或者是与原来氨基酸类似的氨基酸，产生功能性的全长蛋白质。
现有的在蛋白质翻译水平上对PTC突变进行通读的技术存在的以上缺陷限制了这些技术的在PTC疾病治疗的疗法开发和临床应用。尚无一种方案既能规避药物(或非天然氨基酸)的毒性，又能在个体水平上进行提前终止密码子正交的解码翻译，且能避免引入非天然氨基酸导致的通读效率低、成本较高等问题。因此，在哺乳动物细胞中开发不依赖于非天然氨基酸，而是利用天然氨基酸的正交翻译系统，实现安全、高效的、位点特异性的在提前终止密码子处引入天然氨基酸，恢复功能蛋白质的表达是本领域亟待解决的核心技术问题。
Herwig,S.,and Strauss,M.(1997).The retinoblastoma protein:a masterregulator of cell cycle,differentiation and apoptosis.Eur J Biochem 246,581-601.
Lee,H.L.,and Dougherty,J.P.(2012).Pharmaceutical therapies to recodenonsense mutations in inherited diseases.Pharmacol Ther 136,227-266.
Mort,M.,Ivanov,D.,Cooper,D.N.,and Chuzhanova,N.A.(2008).A meta-analysis of nonsense mutations causing human genetic disease.Hum Mutat 29,1037-1047.
Robles,A.I.,Jen,J.,and Harris,C.C.(2016).Clinical Outcomes of TP53Mutations in Cancers.Cold Spring Harb Perspect Med 6.
Yang,J.,Wen,Z.,Li,W.,Sun,X.,Ma,J.,She,X.,Zhang,H.,Tu,C.,Wang,G.,Huang,D.,et al.(2021).Immune Microenvironment:New Insight for FamilialAdenomatous Polyposis.Front Oncol 11,570241.
发明内容
本发明的目的在于提供一种正交翻译系统，该正交翻译系统包括21对识别天然氨基酸的正交翻译系统，其正交氨酰-tRNA合成酶不识别体内的任一tRNA，且正交tRNA也不会被体内的任一氨酰-tRNA合成酶识别，从而实现了再分配密码子恢复PTC疾病中功能蛋白表达的发明目的。
本发明的另一目的在于提供一种所述正交翻译系统在再分配密码子恢复PTC疾病中功能蛋白表达方面的应用。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
一种正交翻译系统，包括正交tRNA和正交氨酰-tRNA合成酶，其特征在于：
正交tRNA，所述tRNA的反密码子能识别三种终止密码子UAG/UGA/UAA中的任一序列，且所述tRNA能被对应的正交氨酰-tRNA合成酶识别；
正交氨酰-tRNA合成酶，所述正交氨酰-tRNA合成酶能将对应的氨基酸连接到与其正交tRNA上形成氨酰tRNA；
所述正交翻译系统选自以下tRNA与氨酰tRNA合成酶正交对中的一种或多种，
chSerRS/chSerTCUA
chSerRS/chSerTUCA
chSerRS/chSerTUUA
chPheRS/chPheTCUA
chPheRS/chPheTUCA
chPheRS/chPheTUUA
chAlaRS/chAlaTCUA
chAlaRS/chAlaTUCA
chAlaRS/chAlaTUUA
chHisRS/chHisTCUA
chHisRS/chHisTUCA
chHisRS/chHisTUUA
chTrpRS/chTrpTCUA
chTrpRS/chTrpTUCA
chTrpRS/chTrpTUUA
EcTyrRS/BsTyrTCUA
EcTyrRS/BsTyrTUCA
EcTyrRS/BsTyrTUUA
EcLeuRS/EcLeuTCUA
EcLeuRS/EcLeuTUCA
EcLeuRS/EcLeuTUUA，
其中，正交氨酰-tRNA合成酶chPheRS、chHisRS、chAlaRS、chSerRS、chTrpRS、EcTyrRS、EcLeuRS的核苷酸序列依次如SEQ ID NO.1～7所示，
正交tRNA chPheTCUA、chPheTUCA、chPheTUUA、chHisCUA、chHisTUCA、chHisTUUA、chAlaCUA、chAlaTUCA、chAlaTUUA、chSerCUA、chSerTUCA、chSerTUUA、chTrpCUA、chTrpTUCA、chTrpTUUA、BsTyrCUA、BsTyrTUCA、BsTyrTUUA、EcLeuTCUA、EcLeuTUCA、EcLeuTUUA的核苷酸序列依次如SEQ ID NO.8～28所示。
本发明所述的正交氨酰-tRNA合成酶不识别宿主细胞内的任一tRNA，且正交tRNA也不会被宿主细胞内的任一氨酰-tRNA合成酶识别。
作为优选，所述的氨基酸包括苯丙氨酸、组氨酸、丙氨酸、丝氨酸、色氨酸、酪氨酸、亮氨酸中的一种或几种。
一种宿主细胞，其包含编码本发明所述的正交氨酰-tRNA合成酶的核苷酸序列和相对应的正交tRNA序列。
作为优选，其中所述宿主细胞是哺乳动物细胞。进一步的本发明中采用的HEK293T细胞评估正交翻译系统效率。
一种利用正交翻译系统再分配密码子恢复PTC疾病中功能蛋白表达的方法，所述方法包括下述步骤：
(a)提供所述的正交翻译系统，
和
(b)将所述正交tRNA序列、编码所述正交氨酰-tRNA合成酶的核苷酸序列和编码所述目标蛋白质的核酸序列克隆并递送到适当的宿主细胞中，在无义突变mRNA的翻译期间，正交氨酰-tRNA合成酶识别正交tRNA并使其携带对应的天然氨基酸，携带天然氨基酸的正交tRNA解码无义突变的mRNA上的无义突变密码子，并将天然氨基酸引入到无义突变位置，实现恢复提前终止密码子疾病中功能蛋白的正常表达和功能行使。
利用本发明所述的正交翻译系统再分配密码子恢复PTC疾病中功能蛋白表达的示意图如图1所示：如图1左所示，提前终止密码子疾病是由于无义突变导致的，mRNA在翻译成蛋白质的过程中发生提前终止，产生无功能的截短蛋白质，破坏细胞稳态。如图1右所示，正交翻译系统中正交氨酰-tRNA合成酶可识别正交tRNA使其带上天然氨基酸，带上天然氨基酸的正交tRNA解码无义突变的mRNA上的无义突变密码子，在翻译过程中将天然氨基酸引入到无义突变位置，从而恢复有功能的全长蛋白质的表达，达到疾病缓解治疗的目的。
一种所述的正交翻译系统在制备治疗由基因无义突变形成提前终止密码子(PTC)所引起的疾病的药物中的应用。
作为优选，所述疾病是与UAG PTC相关的疾病或病症，对应的应用包括施用至少一种特异性识别UAG的正交翻译系统；
所述疾病是与UGA PTC相关的疾病或病症，对应的应用包括施用至少一种特异性识别UGA的正交翻译系统。
所述疾病是与UAA PTC相关的疾病或病症，对应的应用包括施用至少一种特异性识别UAA的正交翻译系统。
所述应用中，当施用至少两种正交翻译系统时，所述至少两种正交翻译系统在多肽链上特异性插入同种或至少两种不同的氨基酸分子，该所述至少两种正交翻译系统编码在相同或不同的核酸分子上。
作为优选，施用至少一种特异性识别UAG、UGA或UAA的正交翻译系统时，所述正交翻译系统选自chPheRS/chPheTCUA、chPheRS/chPheTUCA或chPheRS/chPheTUUA。
作为优选，所述疾病是Col4a5蛋白、Dystrophin蛋白和或抑癌基因Apc蛋白中发生无义突变形成提前终止密码子所导致。进一步的，所述疾病是奥尔波特综合征、杜氏和贝克尔肌营养不良或家族性腺瘤性息肉病。
针对上述现有技术中存在的缺陷，发明人经过对现有技术的思考和研究，构建了21对识别天然氨基酸的正交翻译系统，正交翻译系统由正交氨酰-tRNA合成酶(序列如SEQID NO.1～7)、正交tRNA(序列如SEQ ID NO.8～28)组成，其中正交氨酰-tRNA合成酶不识别体内的任一tRNA，且正交tRNA也不会被体内的任一氨酰tRNA合成酶识别。在细胞中，正交氨酰-tRNA合成酶能识别正交tRNA，并使其携带对应的天然氨基酸，正交tRNA的反密码子环与提前终止密码子完全互补配对，通读无义密码子突变，并将天然氨基酸插入至功能蛋白质的序列中，可实现恢复提前终止密码子疾病中功能蛋白的正常表达和功能行使。本发明基于嵌合体系，对其进行进一步的优化改造和筛选，发展出了21对识别天然氨基酸的正交翻译系统，分别为与Amber密码子配对的正交tRNA(Phe)、正交tRNA(His)、正交tRNA(Trp)、正交tRNA(Tyr)、正交tRNA(Ala)、正交tRNA(Ser)、正交tRNA(Leu)；与Ocher密码子配对的正交tRNA(Phe)、正交tRNA(His)、正交tRNA(Trp)、正交tRNA(Tyr)、正交tRNA(Ala)、正交tRNA(Ser)、正交tRNA(Leu)；与Opal密码子配对的正交tRNA(Phe)、正交tRNA(His)、正交tRNA(Trp)、正交tRNA(Tyr)、正交tRNA(Ala)、正交tRNA(Ser)、正交tRNA(Leu)以及与之一对一识别的正交氨酰-tRNA合成酶。发明人构建了在哺乳动物细胞中用于评估正交翻译系统效率的双荧光报告系统，并对其进行了评估验证，进一步，发明人选用了三种人类提前终止密码子疾病中的功能蛋白对正交翻译系统恢复完整蛋白质表达进行了评估和验证。
具体地，发明人首先在哺乳动物细胞系中构建了可用于评估正交翻译系统对UAG、UGA、UAA无义突变通读效率的双荧光报告系统，该系统由双荧光报告质粒和正交翻译系统质粒构成。双荧光报告质粒以pEGFP质粒为骨架，表达由T2A连接的mcherry荧光蛋白和GFP荧光蛋白，其中GFP荧光蛋白的190位氨基酸由编码天冬氨酸的密码子突变为无义密码子：TAG、TGA和TAA(分别见SEQ ID NO.29～31)，分别与识别TAG、TGA、TAA的正交翻译系统共转染至哺乳动物HEK293T细胞系中，采用流式细胞术的方法分别评估了本发明中的21对正交翻译系统在哺乳动物细胞中通读无义突变的效率，测定结果显示21种正交翻译系统均能哺乳动物细胞内实现不同效率的通读，说明本发明中的21种正交翻译系统均可在哺乳动物细胞中恢复PTC疾病中功能蛋白的表达。
进一步，发明人选择了人类提前终止密码子疾病杜氏肌肉萎缩症(Duchennemuscular dystrophy,DMD)的功能蛋白Dystrophin蛋白，将含有TAA无义突变的Dystrophin蛋白亚基基因的一部分克隆至DMD双荧光报告质粒，选取的核苷酸序列见SEQID NO.32中，该报告质粒由带有TAA突变的Dystrophin基因的一部分连接mcherry荧光蛋白和GFP荧光蛋白，其中GFP荧光蛋白不含无义突变，不含转录起始的甲硫氨酸，以此通过GFP荧光蛋白的产生有无与多少对正交翻译系统的通读效率进行评估。将DMD双荧光报告质粒与正交翻译系统质粒共转染至哺乳动物HEK 293T细胞系中，使用流式细胞术测定正交翻译系统在哺乳动物细胞中对功能蛋白亚基的通读效率，结果表明10.6％的细胞恢复了Dystrophin蛋白的表达，说明本发明中的正交翻译系统能恢复带有TAA-PTC突变疾病的功能蛋白质的全长表达。
进一步，发明人选择了人类提前终止密码子疾病里伴性显性遗传遗传病之一遗传性进行性肾炎(Alport syndrome,AS)中的功能蛋白COL4A5蛋白、将含有TGA无义突变的COL4A5蛋白亚基基因克隆至COL4A5双荧光报告质粒，选取的核苷酸序列见SEQ ID NO.33中，该报告质粒由带有TGA突变的COL4A5蛋白亚基基因连接mcherry荧光蛋白和GFP荧光蛋白，其中GFP荧光蛋白不含无义突变，不含转录起始的甲硫氨酸，以此通过GFP荧光蛋白的产生有无与多少对正交翻译系统的通读效率进行评估。将COL4A5双荧光报告质粒与正交翻译系统质粒共转染至哺乳动物HEK 293T细胞系中，使用流式细胞术测定正交翻译系统在哺乳动物细胞中对功能蛋白亚基的通读效率，结果表明12.6％的细胞恢复了Col4a5蛋白的表达，说明本发明中的正交翻译系统能恢复带有TGA-PTC突变疾病的功能蛋白质的全长表达。
进一步，发明人选择了人类提前终止密码子疾病里常染色体显性遗传病之一家族性腺瘤性息肉病(Familial adenomatous polyposis,FAP)中的功能蛋白APC蛋白，将含有TAGTAG无义突变的APC蛋白亚基基因克隆至APC双荧光报告质粒，选取的核苷酸片段见SEQID NO.34中，该报告质粒由带有TAGTAG突变的APC蛋白亚基基因连接mcherry荧光蛋白和GFP荧光蛋白，其中GFP荧光蛋白不含无义突变，不含转录起始的甲硫氨酸，以此通过GFP荧光蛋白的产生有无与多少对正交翻译系统的通读效率进行评估。将APC双荧光报告质粒与正交翻译系统质粒共转染至哺乳动物HEK 293T细胞系中，使用流式细胞术测定正交翻译系统在哺乳动物细胞中对功能蛋白亚基的通读效率，结果表明12.3％的细胞恢复了Apc蛋白的表达，说明本发明中的正交翻译系统能恢复带有TAG-PTC突变疾病的功能蛋白质的全长表达。
进一步，发明人选择了带有提前终止密码子TAA突变的4周龄杜氏肌肉萎缩症小鼠作为研究对象，通过腺相关病毒(Adeno-associated virus,AAV)经眼眶后静脉窦注射递送chPheRS正交翻译系统，对疾病患者体内无法正常表达的Dystrophin蛋白进行通读恢复。递送正交翻译系统5周后，测定实验组(AAV)与对照组(PBS)小鼠血清中的肌酸激酶(Creatinekinase,CK)浓度，使用蛋白质免疫印迹的方法检测蛋白质恢复表达的水平，并使用苏木精-伊红(Hematoxylin-eosin,HE)染色方法对小鼠肌肉组织的形态及病理学特征进行评估，随机选择6个区域并进行正常肌纤维数量统计。实验结果显示递送5周后，实验组恢复了全长Dystrophin蛋白的表达且与对照组相比，表达量增加了55％；血清中肌酸激酶浓度恢复至正常范围内；在组织形态学上，实验组肌肉纤维之前的间隙缩短，肌肉组织中的炎症水平降低，正常肌纤维数量比例极显著增加，这说明了正交翻译系统能通过AAV递送的方式在哺乳动物体细胞内恢复TAA-PTC突变相关疾病蛋白质的全长表达。
进一步，发明人选择了带有提前终止密码子TGA突变的3周龄遗传性进行性肾炎小鼠作为研究对象，通过腺相关病毒(Adeno-associated virus,AAV)经眼眶后静脉窦注射递送正交翻译系统，对疾病患者体内无法正常表达的Col4a5蛋白质进行通读恢复。递送正交翻译系统5周后，采用苏木精-伊红(Hematoxylin-eosin,HE)染色以及马松三色(Masson'strichrome,MT)染色方法对小鼠肾脏组织的形态及病理学特征进行评估，从切片HE染色结果中可以看出，与对照组(Col4a5-PBS)相比，实验组(Col4a5-AAV)肾小球基底膜结构边界更清晰、分明，从切片MT染色结果中可以看出与对照组相比，实验组无肾小球纤维化、基底膜形态异常等表现，这说明了正交翻译系统能通过AAV递送的方式在哺乳动物体细胞内恢复TGA-PTC突变相关疾病蛋白质的全长表达。
与现有技术相比，本发明的优点为：
1、获得了21种能够高效通读无义突变的正交氨酰-tRNA合成酶/tRNA组合；
2、正交的氨酰-tRNA合成酶能够将天然氨基酸连接到正交tRNA上，在蛋白质翻译时引入到提前终止密码子对应的位置，恢复功能性蛋白质的表达；
3、以更高效的策略实现了在哺乳动物细胞中通读含有无义突变的蛋白；
4、应用正交的氨酰-tRNA合成酶/tRNA体系，不会影响哺乳动物细胞中正常的翻译系统，且能有的放矢的恢复特定的无义突变序列；
5、整个体系无需额外添加非天然氨基酸，灵活性、可用性、安全性进一步得到提升。
附图说明
图1是利用正交翻译系统再分配密码子恢复PTC疾病中功能蛋白表达的示意图；
图2是21种正交翻译系统；
图3是使用流式细胞仪定量分析正交翻译系统通读效率的实验流程示意图及正交翻译系统通读效率定量计算公式；
图4是21种正交翻译系统在HEK 293T细胞系中的通读效率定量结果图；
图5是识别TAA的苯丙氨酸正交翻译系统对带有无义突变的Dystrophin蛋白亚基基因的通读效率测定流程图及结果图；
图6是识别TGA的苯丙氨酸正交翻译系统对带有无义突变的COL4A5蛋白亚基基因的通读效率测定流程图及结果图；
图7是识别TAG的苯丙氨酸正交翻译系统对带有无义突变的APC蛋白亚基基因的通读效率测定流程图及结果图；
图8是使用正交翻译系统chPheRS/chPheTUUA治疗Dmd小鼠的结果，其中，(A)Western印记表明chPheRS/chPheTUUA治疗小鼠的dystrophin全长蛋白的恢复表达,其中C57BL对照上样量是实验组的四分之一；(B)小鼠血清肌酸激酶(CK)在不同组小鼠水平；(C)不同治疗小鼠的肌纤维的HE染色图；(D)不同治疗小鼠正常肌纤维的定量图；
图9是使用正交翻译系统chPheRS/chPheTUCA在Col4a5小鼠体内通读TGA无义突变的组织学结果图,其中箭头所指是肾小球细胞；
图10是本发明部分核苷酸/氨基酸序列。
具体实施方式
下面通过具体实施例，对本发明的技术方案作进一步的具体说明。应当理解，本发明的实施并不局限于下面的实施例，对本发明所做的任何形式上的变通和/或改变都将落入本发明保护范围。
在本发明中，若非特指，所有的份、百分比均为重量单位，所采用的设备和原料等均可从市场购得或是本领域常用的。下述实施例中的方法，如无特别说明，均为本领域的常规方法。
lip2000试剂，采购自BioSharp公司。
实施例1：用于评估正交翻译系统的双荧光报告系统的构建
(1)双荧光报告质粒的构建
来自于蘑菇珊瑚(mushroom coral)的红色荧光蛋白基因mCherry作为内参，使用源于明脉扁刺蛾病毒(Thosea asigna virus)的2A肽，T2A作为连接片段，在翻译时，2A肽会发生断裂提早将前半段已合成的肽链放出，2A肽可令一个开放读框(ORF)转译出的肽链分为数个独立的肽链。T2A片段后连接改造自野生型绿色荧光蛋白(wt-GFP)的不含转录起始密码子ATG的增强型绿色荧光蛋白(EGFP)，将EGFP的190位氨基酸编码DNA分别突变为TAG、TGA和TAA，将其构建到pEGFP质粒骨架上得到双荧光报告质粒pEGFP-CMV-mCherry-T2A-EGFP190TAG、pEGFP-CMV-mCherry-T2A-EGFP190TGA、
pEGFP-CMV-mCherry-T2A-EGFP190TAA。通过mCherry的荧光亮度归一化EGFP的荧光强度，可分别用于评估TAG、TGA和TAA正交翻译系统的通读效率。
如图10所示，mCherry-T2A-EGFP190TAG的核苷酸序列如SEQ ID NO.29所示，mCherry-T2A-EGFP190TGA的核苷酸序列如SEQ ID NO.30所示，mCherry-T2A-EGFP190TAA的核苷酸序列如SEQ ID NO.31所示。
(2)正交翻译系统质粒的构建
用CMV启动子表达正交氨酰-tRNA合成酶，用U6启动子表达正交tRNA，将两组元件克隆到同一载体pCMV质粒骨架上，得到正交翻译系统质粒。分别将正交tRNA替换为与Amber配对的正交tRNA(Phe)、正交tRNA(His)、正交tRNA(Trp)、正交tRNA(Tyr)、正交tRNA(Ala)、正交tRNA(Ser)、正交tRNA(Leu)；与Ocher配对的正交tRNA(Phe)、正交tRNA(His)、正交tRNA(Trp)、正交tRNA(Tyr)、正交tRNA(Ala)、正交tRNA(Ser)、正交tRNA(Leu)；与Opal配对的正交tRNA(Phe)、正交tRNA(His)、正交tRNA(Trp)、正交tRNA(Tyr)、正交tRNA(Ala)、正交tRNA(Ser)、正交tRNA(Leu)，并将与之一对一识别的正交氨酰tRNA合成酶克隆到CMV启动子下游进行表达。由此获得21种正交翻译系统质粒。
21种正交翻译系统如图2所示，分别为识别TAG、TGA、TAA的丙氨酸、丝氨酸、组氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、亮氨酸正交翻译系统。
实施例2：在哺乳动物细胞系HEK 293T中评估正交翻译系统效率
(1)HEK 293T细胞系的培养与传代
HEK 293T细胞用完全培养基(DMEN,Gibco,8120106；10％胎牛血清,ExCellBio,FSP500；1％青霉素/链霉素)培养至汇合度为80％以上时，吸弃原培养基，用预热过的1xPBS溶液轻柔地清洗两遍细胞，去除残留的培养基、血清和抗生素，用含有0.02％EDTA的0.25％胰酶(Biological industry,03-050-1B)消化、收集至15mL离心管中，200rcf，3分钟离心收集细胞，吸弃上清，用1mL培养基重悬细胞沉淀，根据需要按照一定比例将细胞分至新的培养皿，加入培养基，十字法混匀，继续培养。
(2)双荧光报告系统转染HEK 293T细胞系
按上述(1)中步骤收集、重悬细胞，取15微升进行细胞计数，将1.8x10^5个HEK293T细胞/孔分到24孔板中，到第二天，至24孔板每空细胞汇合度为50％-70％时，用lip2000试剂将待测试的正交翻译系统质粒与对应的无义突变双荧光报告质粒按照1∶1(g∶g)的比例共转染到HEK 293T细胞中。转染后6小时更换培养基为完全培养基，继续培养。
(3)使用流式细胞仪定量分析正交翻译系统的通读效率
48小时后，按照上述(1)中步骤分别消化、收集24孔板中的HEK 293T细胞至流式管中，使用流式细胞仪(Beckman Coulter,CytoFlex S)进行EGFP荧光蛋白及mCherry荧光蛋白的荧光强度测定。EGFP荧光蛋白的荧光强度选用FITC通道测定，mCherry荧光蛋白的荧光强度选用PE通道测定，首先用空白的HEK 293T细胞、只转染EGFP的HEK 293T细胞、只转染mCherry的HEK 293T细胞以及转染了mCherry-T2A-EGFP的HEK 293T细胞对流式测定程序进行分区设置，根据流式测定结果，用mCherry荧光强度作为内参归一化分析EGFP荧光强度，定量分析21种正交翻译系统的通读效率。
使用流式细胞仪定量分析正交翻译系统通读效率的实验流程示意图及正交翻译系统通读效率定量计算公式如图3所示，21种正交翻译系统在HEK 293T细胞系中的通读效率定量结果图如图4所示。根据图4可知，21种正交翻译系统均能哺乳动物细胞内实现不同效率的通读，说明本发明中的21种正交翻译系统均可在哺乳动物细胞中恢复PTC疾病中功能蛋白的表达。
实施例3：在HEK 293T细胞系中评估正交翻译系统对特定蛋白的通读效率
(1)构建特定蛋白的双荧光报告质粒
优选伴性隐性遗传病DMD、伴性显性遗传遗传病AS、常染色体显性遗传病FAP中的功能蛋白Dystrophin蛋白、COL4A5蛋白、APC蛋白作为验证对象。分别选取其带有无义突变的亚基(如图8所示)：Dystrophin蛋白的832-1156位氨基酸(序列如SEQ ID NO.32所示)，其中995位谷氨酰胺密码子突变为TAA；COL4A5蛋白的344-602位氨基酸(序列如SEQ ID NO.33所示)，其中471位精氨酸密码子突变为TGA、APC蛋白的766-942位氨基酸(序列如SEQ IDNO.34所示)，其中850位亮氨酸密码子突变为TAG，851位谷氨酸密码子突变为TAG。将上述蛋白质亚基编码基因以T2A连接在mCherry基因下游，以及不含转录起始密码子的EGFP基因上游，其中EGFP不带有无义突变。由此获得可用于评估正交翻译系统通读效率的特定蛋白双荧光报告质粒。
(2)转染HEK 293T细胞系
按照实施例2中(2)中的步骤将比例为1∶1(g∶g)的特定蛋白的双荧光报告质粒和对应的正交翻译系统质粒共转染至HEK 293T细胞中。
(3)使用流式细胞仪定量分析正交翻译系统对特定蛋白的通读效率，按照实施例2(3)中的步骤对通读效率进行分析，其中，识别TAA的苯丙氨酸正交翻译系统对带有无义突变的Dystrophin蛋白亚基基因的通读效率测定流程图及结果见图5，结果表明10.6％的细胞恢复了Dystrophin蛋白的表达，说明本发明中的正交翻译系统能恢复带有TAA-PTC突变疾病的功能蛋白质的全长表达。识别TGA的苯丙氨酸正交翻译系统对带有无义突变的COL4A5蛋白亚基通读效率测定流程图及结果见图6，结果表明12.6％的细胞恢复了Col4a5蛋白的表达，说明本发明中的正交翻译系统能恢复带有TGA-PTC突变疾病的功能蛋白质的全长表达。识别TAG的苯丙氨酸正交翻译系统对带有无义突变的APC蛋白亚基基因的通读效率测定流程图及结果见图7，结果表明12.3％的细胞恢复了Apc蛋白的表达，说明本发明中的正交翻译系统能恢复带有TAG-PTC突变疾病的功能蛋白质的全长表达。
实施例4：在Dystrophin-PTC突变小鼠中评估正交系统的通读效率
(1)构建带有正交翻译系统的pAAV-cis-transgene质粒
用CMV启动子表达正交氨酰-tRNA合成酶，用U6启动子表达正交tRNA，将两组元件克隆到同一载体上，优选正交翻译系统chPheRS/chPheTUUA构建到腺相关病毒pAAV-cis-transgene质粒载体上，由此获得腺相关病毒转基因质粒。
(2)腺相关病毒的包装
用去内毒素质粒大提试剂盒(Qiagen，12362)提取AAV包装所需的质粒：pAAV-2/9、pAAV-Helper以及克隆有正交翻译系统的质粒pAAV-cis-chPheRS/chPheTUUA。按照addgene.org上提供的AAV生产操作步骤(https://www.addgene.org/protocols/aav-production-hek293-cells/)、AAV纯化操作步骤(https://www.addgene.org/protocols/aav-purification-iodixanol-gradient-ultracentrifugation/)逐步进行AAV的包装，获得带有正交翻译系统chPheRS/chPheTUUA的AAV，并使用SDS-PAGE的方法对AAV进行检测定量。由测定结果分析可知最终获得的带有正交翻译系统chPheRS/chPheTUUA的AAV浓度为5.2*10^13μg/mL。
(3)通过AAV递送正交翻译系统至C57BL-Dys955TAA/955TAA(DMD-TAA)疾病小鼠体内
将定量后的AAV稀释在50μl PBS溶液中，以2.5*10^11μg每只小鼠的剂量对实验组小鼠(3周龄，2只)进行注射，对照组小鼠(3周龄，2只)注射等体积不含AAV的PBS溶液。首先将DMD-TAA突变小鼠置于呼吸麻醉机(瑞沃德，R550)的有机玻璃室中，通入异氟醚(麦克林，26675-46-7)气体进行诱导麻醉，等小鼠完全麻醉后，逐只取出小鼠，将其右侧朝上侧躺于加热垫上，施加压力，使小鼠右眼球从眼窝中突出，将装有药剂的胰岛素针以大约30°的角度向下倾斜插入内眦，针头沿着眼球边缘向下，直到针尖位于眼睛底部，然后缓慢而平稳地注射注射液，注射完成后。缓慢拔出针头，逐只完成注射。
(4)小鼠组织样品收集及处理
注射5周后，将实验组和对照组小鼠进行安乐死后，收集血清样品、胫骨前肌等。取小鼠全血，将其置于室温2小时，等血液凝血后，将样品离心15分钟(4℃，4000g)，收集上部淡黄色透明血清，进行血清肌酸激酶活性的测定，测定结果显示实验组与对照组相比，CK恢复至正常范围内，说明正交翻译系统在体内恢复了Dystrophin的表达(图8B)。将一部分胫骨前肌置于4％多聚甲醛中，4℃固定24小时以上，包埋在石蜡块中进行切片及后续HE染色；另一部分加入RIPA裂解液并在组织匀浆机中进行组织匀浆，后8000rpm，5min，4℃离心后收集上清蛋白质液体。
(5)蛋白质免疫印记分析
提取肌肉组织总蛋白，取一部分组织总蛋白质液加入蛋白上样缓冲液，SDS-PAGE分析，转膜、5％脱脂牛奶封闭1小时后，TBST洗膜，用抗Dystrophin抗体(Proteintech，12715-1-ap)、抗vinculin抗体(Proteintech，66305-1-Ig)4℃过夜孵育，TSBT洗膜，二抗孵育1小时后显色。从WB结果可知，实验组Dystrophin蛋白质全长蛋白的表达水平比对照组提升了183％(图8A)。
(6)肌肉组织苏木精-伊红(HE)染色结果及分析
将4％多聚甲醛固定的胫骨前肌样品进行石蜡包埋、组织切片以及HE染色，对染色结果进行分析可知，在组织形态学上，实验组肌肉纤维之前的间隙变窄，肌肉组织中的炎症水平降低(图8C)。随机截取切片中6个视野下的照片，并对其中正常肌纤维和异常肌纤维数量进行计数，计算正常肌纤维的占比，统计分析结果可知，实验组较对照组而言，正常肌纤维比例极显著增加(图8D)。
以上结果显示实验组较对照组在蛋白质水平、血清学分析以及组织形态学上有显著改善，说明了通过AAV递送正交翻译系统到哺乳动物体内，能很好的恢复PTC疾病中功能蛋白的表达，缓解疾病症状。
实施例5：在Col4a5-PTC突变小鼠中评估正交翻译系统的通读效率
(1)构建带有正交翻译系统的pAAV-cis-transgene质粒
步骤如实施例4(1)中所述，优选正交翻译系统chPheRS/chPheTUCA克隆至pAAV-cis-chPheRS/chPheTUCA质粒上。
(2)腺相关病毒的包装
步骤如实施例4(2)中所述，最终获得的带有正交翻译系统chPheRS/chPheTUCA的AAV浓度为5.7*10^13μg/mL
(3)通过AAV递送正交翻译系统至Col4a5-TGA疾病小鼠体内
将定量后的AAV稀释在50ul PBS溶液中，以2.5*10^11μg每只小鼠的剂量对实验组小鼠(4周龄，2只)进行注射，对照组小鼠(4周龄，2只)注射等体积不含AAV的PBS溶液。方法同实施例4。
(4)小鼠组织样品收集及处理
注射5周后，将实验组和对照组小鼠进行安乐死后，收集血清样品、肾脏等。一部分肾脏置于4％多聚甲醛中，4℃固定24小时以上，包埋在石蜡块中进行切片及后续HE染色；另一部分加入RIPA裂解液并在组织匀浆机中进行组织匀浆，后8000rpm，5min，4℃离心后收集上清蛋白质液体。
(5)肾脏组织苏木精-伊红(HE)、马松三色(MT)染色分析
将4％多聚甲醛固定的肾脏样品送至公司进行石蜡包埋、组织切片以及HE、MT染色，从切片HE染色结果中可以看出，与对照组(Col4a5-PBS)相比，实验组(Col4a5-AAV)肾小球基底膜结构边界更清晰、分明，从切片MT染色结果中可以看出与对照组相比，实验组无肾小球纤维化、基底膜形态异常等表现，这说明了正交翻译系统能通过AAV递送的方式在哺乳动物体细胞内恢复TGA-PTC突变相关疾病功能蛋白质的全长表达，从而缓解疾病症状(见图9)。
本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其它实施例的不同之处，各个实施例之间相同或相似部分互相参见即可。对于实施例公开的装置而言，由于其与实施例公开的方法相对应，所以描述的比较简单，相关之处参见方法部分说明即可。
以上对本发明所提供的一种正交翻译系统及其在再分配密码子恢复PTC疾病中功能蛋白表达方面的应用进行了详细介绍。本文中应用了具体个例对本发明的原理及实施方式进行了阐述，以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。
序列表
<110> 浙江大学
<120> 一种正交翻译系统及其在再分配密码子恢复PTC疾病中功能蛋白表达方面的应用
<130> ZJDX220405
<160> 34
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1665
<212> DNA
<213> 人工序列(synthetic sequence)
<400> 1
atggataaga agccgctgga tgttctgatc tctgcgaccg gtctgtggat gtcccgtacc 60
ggcacgctgc acaagatcaa gcactatgag atttctcgtt ctaaaatcta catcgaaatg 120
gcgtgtggtg accatctggt tgtgaacaac tctcgttctt gtcgtcccgc acgtgcattc 180
cgttatcata aataccgtaa aacctgcaaa cgttgtcgtg tttctgacga agatatcaac 240
aacttcctga cccgttctac cgaaggcaaa acctctgtta aagttaaagt tgtttctgag 300
ccgaaagtga aaaaagcgat gccgaaatct gtttctcgtg cgccgaaacc gctggaaaat 360
ccggtttctg cgaaagcgtc taccgacacc tctcgttctg ttccgtctcc ggcgaaatct 420
accccgaact ctccggttcc gacctctgca agcgccccag ctctgactaa atcccagacg 480
gaccgtctgg aggtgctgct gaacccaaag gatgaaatct ctctgaacag cggcaagcct 540
ttccgtgagc tggaaagcga gctgctgtct cgtcgtaaaa aggatctgca acagatctac 600
gctgaggaac gcgagggtgg cggaagcggc ggcggaagcg gtggcggaag tggtggcgga 660
agcggcggcg gaagccaggc ctggggatcg aggcctcctg cagcagagtg tgccacccaa 720
agagctccag gcagtgtggt ggagctgctg ggcaaatcct accctcagga cgaccacagc 780
aacctcaccc ggaaggtcct caccagagtt ggcaggaacc tgcacaacca gcagcatcac 840
cctctgtggc tgatcaagga gagggtgaag gagcacttca acaagcagta tgtggactgc 900
tttgggaccc cgttgttctc ggtctacgac aacctttctc cagtggtcac gacctggcag 960
aactttgaca gcctgctcat cacagctgat cacccctgca ggaggaaggg ggacaactat 1020
tacctgaatc ggactcacat gctgagagcg cacacgtccg cacaccagtg ggacttgctg 1080
cacgcgggac tggatgcctt cctggtggtg ggtgatgtct acaggcgaga ccagatcgac 1140
tcccagcact accctatttt ccaccagctg gaggccgtgc ggctcttcac caagcatgag 1200
ttatttgctg gtataaagga tggagaaagc cagcagctct ttgaacaaag ttctcgctct 1260
gcgcataaac aagagtcaca caccatggag gccgtgaagc ttgtagagtt tgatcttaag 1320
caaacgctta ccaggctcat ggcacatctt tttggagatg agccggagat aagatgggta 1380
gacagctact tcccttttac ccatccttcc tttgagatgg agatcaactt tcatggagaa 1440
tggctggaag ttcttggctg cggggtgttg gaacaacaac tggtcaattc agctggtgct 1500
caagaccgaa tcggctgggc tttcggccta ggattagaaa ggctggccat gatcctctac 1560
gacatccctg atatccgtct cttctggtgt gaggacgagc gcttcctgaa gcagttctgt 1620
gtatccaaca ttaatcagaa ggtgaagttt cagcctctta gcaaa 1665
<210> 2
<211> 1632
<212> DNA
<213> 人工序列(synthetic sequence)
<400> 2
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ggcacgctgc acaagatcaa gcactatgag atttctcgtt ctaaaatcta catcgaaatg 120
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cgttatcata aataccgtaa aacctgcaaa cgttgtcgtg tttctgacga agatatcaac 240
aacttcctga cccgttctac cgaaggcaaa acctctgtta aagttaaagt tgtttctgag 300
ccgaaagtga aaaaagcgat gccgaaatct gtttctcgtg cgccgaaacc gctggaaaat 360
ccggtttctg cgaaagcgtc taccgacacc tctcgttctg ttccgtctcc ggcgaaatct 420
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<210> 3
<211> 2088
<212> DNA
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<400> 3
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ggcacgctgc acaagatcaa gcactatgag atttctcgtt ctaaaatcta catcgaaatg 120
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ggagcgagat acagaaaaat ggacaactac atcgttgata ctggctacgg tcttgaaagg 1380
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gcctcgcacg gcatccccgt tgagcttgcg gttggcattg ccgctgaaaa gggtgctgag 2040
gttgaaatgc caaaggatat ctacgctgag ctggcaaaga ggcactca 2088
<210> 4
<211> 1620
<212> DNA
<213> 人工序列(synthetic sequence)
<400> 4
atggataaga agccgctgga tgttctgatc tctgcgaccg gtctgtggat gtcccgtacc 60
ggcacgctgc acaagatcaa gcactatgag atttctcgtt ctaaaatcta catcgaaatg 120
gcgtgtggtg accatctggt tgtgaacaac tctcgttctt gtcgtcccgc acgtgcattc 180
cgttatcata aataccgtaa aacctgcaaa cgttgtcgtg tttctgacga agatatcaac 240
aacttcctga cccgttctac cgaaggcaaa acctctgtta aagttaaagt tgtttctgag 300
ccgaaagtga aaaaagcgat gccgaaatct gtttctcgtg cgccgaaacc gctggaaaat 360
ccggtttctg cgaaagcgtc taccgacacc tctcgttctg ttccgtctcc ggcgaaatct 420
accccgaact ctccggttcc gacctctgca agcgccccag ctctgactaa atcccagacg 480
gaccgtctgg aggtgctgct gaacccaaag gatgaaatct ctctgaacag cggcaagcct 540
ttccgtgagc tggaaagcga gctgctgtct cgtcgtaaaa aggatctgca acagatctac 600
gctgaggaac gcgagggtgg cggaagcggc ggcaccatcc ctaacctgcc tgcagatgaa 660
gtgccggtag gtagagacga aaatgacaac gttgaagtca gccgctgggg taccccgcgt 720
gagtttgact ttgaagttcg tgaccacgtg acgctgggtg aaatgcactc tggcctcgac 780
tttgcagctg cagttaagct gactggttcc cgctttgtgg taatgaaagg gcagattgct 840
cgcatgcacc gcgcactgtc gcagtttatg ctggatctgc ataccgaaca gcatggctac 900
agtgagaact atgttccgta cctggttaac caggacacgc tgtacggtac gggtcaactg 960
ccgaaatttg ccggcgatat gtaccatact cgtccgctgg aagaagaagc agacaccagt 1020
aactatgcgc tgatcccaac ggcagaagtt ccgctgacta acctggtgcg cggtgaaatc 1080
atcgatgaag atgatctgcc aattaagatg accgcccaca ccccatgctt ccgttctgaa 1140
gccggttcat atggtcgtga cacccgtggt ctgatccgta tgcaccagtt cgacaaagtt 1200
gaaatggtgc agatcgtgcg cccagaagac tcaatggcgg cgctggaaga gatgactggt 1260
catgcagaaa aagtcctgca gttgctgggc ctgccgtacc gtaaaatcat cctttgcact 1320
ggcgacatgg gctttggcgc ttgcaaaact tacgacctgg aagtatggat cccggcacag 1380
aacacctacc gtgagatctc ttcctgctcc aacgtttggg atttccaggc acgtcgtatg 1440
caggcacgtt gccgcagcaa gtcggacaag aaaacccgtc tggttcatac cctgaacggt 1500
tctggtctgg ctgttggtcg tacgctggtt gcagtaatgg aaaactatca gcaggctgat 1560
ggtcgtattg aagtaccaga agttctgcgt ccgtatatga acggactgga atatattggc 1620
<210> 5
<211> 1665
<212> DNA
<213> 人工序列(synthetic sequence)
<400> 5
atggataaga agccgctgga tgttctgatc tctgcgaccg gtctgtggat gtcccgtacc 60
ggcacgctgc acaagatcaa gcactatgag atttctcgtt ctaaaatcta catcgaaatg 120
gcgtgtggtg accatctggt tgtgaacaac tctcgttctt gtcgtcccgc acgtgcattc 180
cgttatcata aataccgtaa aacctgcaaa cgttgtcgtg tttctgacga agatatcaac 240
aacttcctga cccgttctac cgaaggcaaa acctctgtta aagttaaagt tgtttctgag 300
ccgaaagtga aaaaagcgat gccgaaatct gtttctcgtg cgccgaaacc gctggaaaat 360
ccggtttctg cgaaagcgtc taccgacacc tctcgttctg ttccgtctcc ggcgaaatct 420
accccgaact ctccggttcc gacctctgca agcgccccag ctctgactaa atcccagacg 480
gaccgtctgg aggtgctgct gaacccaaag gatgaaatct ctctgaacag cggcaagcct 540
ttccgtgagc tggaaagcga gctgctgtct cgtcgtaaaa aggatctgca acagatctac 600
gctgaggaac gcgagggtgg cggaagcggc ggcggaagcg gtggcggaag tggtggcgga 660
agcggcggcg gaagccaggc ctggggatcg aggcctcctg cagcagagtg tgccacccaa 720
agagctccag gcagtgtggt ggagctgctg ggcaaatcct accctcagga cgaccacagc 780
aacctcaccc ggaaggtcct caccagagtt ggcaggaacc tgcacaacca gcagcatcac 840
cctctgtggc tgatcaagga gagggtgaag gagcacttca acaagcagta tgtggactgc 900
tttgggaccc cgttgttctc ggtctacgac aacctttctc cagtggtcac gacctggcag 960
aactttgaca gcctgctcat cacagctgat cacccctgca ggaggaaggg ggacaactat 1020
tacctgaatc ggactcacat gctgagagcg cacacgtccg cacaccagtg ggacttgctg 1080
cacgcgggac tggatgcctt cctggtggtg ggtgatgtct acaggcgaga ccagatcgac 1140
tcccagcact accctatttt ccaccagctg gaggccgtgc ggctcttcac caagcatgag 1200
ttatttgctg gtataaagga tggagaaagc cagcagctct ttgaacaaag ttctcgctct 1260
gcgcataaac aagagtcaca caccatggag gccgtgaagc ttgtagagtt tgatcttaag 1320
caaacgctta ccaggctcat ggcacatctt tttggagatg agccggagat aagatgggta 1380
gacagctact tcccttttgg acatccttcc tttgagatgg agatcaactt tcatggagaa 1440
tggctggaag ttcttggctg cggggtgttg gaacaacaac tggtcaattc agctggtgct 1500
caagaccgaa tcggctgggg attcggccta ggattagaaa ggctggccat gatcctctac 1560
gacatccctg atatccgtct cttctggtgt gaggacgagc gcttcctgaa gcagttctgt 1620
gtatccaaca ttaatcagaa ggtgaagttt cagcctctta gcaaa 1665
<210> 6
<211> 1272
<212> DNA
<213> 人工序列(synthetic sequence)
<400> 6
atggcaagca gtaacttgat taaacaattg caagagcggg ggctggtagc ccaggtgacg 60
gacgaggaag cgttagcaga gcgactggcg caaggcccga tcgcgctcta ttgcggcttc 120
gatcctaccg ctgacagctt gcatttgggg catcttgttc cattgttatg cctgaaacgc 180
ttccagcagg cgggccacaa gccggttgcg ctggtaggcg gcgcgacggg tctgattggc 240
gacccgagct tcaaagctgc cgagcgtaag ctgaacaccg aagaaactgt tcaggagtgg 300
gtggacaaaa tccgtaagca ggttgccccg ttcctcgatt tcgactgtgg agaaaactct 360
gctatcgcgg cgaacaacta tgactggttc ggcaatatga atgtgctgac cttcctgcgc 420
gatattggca aacacttctc cgttaaccag atgatcaaca aagaagcggt taagcagcgt 480
ctcaaccgtg aagatcaggg gatttcgttc actgagtttt cctacaacct gttgcagggt 540
tatgacttcg cctgtctgaa caaacagtac ggtgtggtgc tgcaaattgg tggttctgac 600
cagtggggta acatcacttc tggtatcgac ctgacccgtc gtctgcatca gaatcaggtg 660
tttggcctga ccgttccgct gatcactaaa gcagatggca ccaaatttgg taaaactgaa 720
ggcggcgcag tctggttgga tccgaagaaa accagcccgt acaaattcta ccagttctgg 780
atcaacactg cgcgtgccga cgtttaccgc ttcctgaagt tcttcacctt tatgagcatt 840
gaagagatca acgccctgga agaagaagat aaaaacagcg gtaaagcacc gcgcgcccag 900
tatgtactgg cggagcaggt gactcgtctg gttcacggtg aagaaggttt acaggcggca 960
aaacgtatta ccgaatgcct gttcagcggt tctttgagtg cgctgagtga agcggacttc 1020
gaacagctgg cgcaggacgg cgtaccgatg gttgagatgg aaaagggcgc agacctgatg 1080
caggcactgg tcgattctga actgcaacct tcccgtggtc aggcacgtaa aactatcgcc 1140
tccaatgcca tcaccattaa cggtgaaaaa cagtccgatc ctgaatactt ctttaaagaa 1200
gaagatcgtc tgtttggtcg ttttacctta ctgcgtcgcg gtaaaaagaa ttactgtctg 1260
atttgctgga aa 1272
<210> 7
<211> 2583
<212> DNA
<213> 人工序列(synthetic sequence)
<400> 7
atgcaagagc aataccgccc ggaagagata gaatccaaag tacagcttca ttgggatgag 60
aagcgcacat ttgaagtaac cgaagacgag agcaaagaga agtattactg cctgtctatg 120
cttccctatc cttctggtcg actacacatg ggccacgtac gtaactacac catcggtgac 180
gtgatcgccc gctaccagcg tatgctgggc aaaaacgtcc tgcagccgat cggctgggac 240
gcgtttggtc tgcctgcgga aggcgcggcg gtgaaaaaca acaccgctcc ggcaccgtgg 300
acgtacgaca acatcgcgta tatgaaaaac cagctcaaaa tgctgggctt tggttatgac 360
tggagccgcg agctggcaac ctgtacgccg gaatactacc gttgggaaca gaaattcttc 420
accgagctgt ataaaaaagg cctggtatat aagaagactt ctgcggtcaa ctggtgcccg 480
aacgaccaga ccgtactggc gaacgaacaa gttatcgacg gctgctgctg gcgctgcgat 540
accaaagttg aacgtaaaga gatcccgcag tggtttatca aaatcactgc ttacgctgac 600
gagctgctca acgatctgga taaactggat cactggccag acaccgttaa aaccatgcag 660
cgtaactgga tcggtcgttc cgaaggcgtg gagatcacct tcaacgttaa cgactatgac 720
aacacgctga ccgtttacac tacccgcccg gacaccttta tgggttgtac ctacctggcg 780
gtagctgcgg gtcatccgct ggcgcagaaa gcggcggaaa ataatcctga actggcggcc 840
tttattgacg aatgccgtaa caccaaagtt gccgaagctg aaatggcgac gatggagaaa 900
aaaggcgtcg atactggctt taaagcggtt cacccattaa cgggcgaaga aattcccgtt 960
tgggcagcaa acttcgtatt gatggagtac ggcacgggcg cagttatggc ggtaccgggg 1020
cacgaccagc gcgactacga gtttgcctct aaatacggcc tgaacatcaa accggttatc 1080
ctggcagctg acggctctga gccagatctt tctcagcaag ccctgactga aaaaggcgtg 1140
ctgttcaact ctggcgagtt caacggtctt gaccatgaag cggccttcaa cgccatcgcc 1200
gataaactga ctgcgatggg cgttggcgag cgtaaagtga actaccgcct gcgcgactgg 1260
ggtgtttccc gtcagcgtta ctggggcgcg ccgattccga tggtgacgct ggaagacggt 1320
accgtaatgc cgaccccgga cgaccagctg ccggtgatcc tgccggaaga tgtggtaatg 1380
gacggcatta ccagcccgat taaagcagat ccggagtggg cgaaaactac cgttaacggt 1440
atgccagcac tgcgtgaaac cgacactttc gacaccttta tggagtcctc ctggtactat 1500
gcgcgctaca cttgcccgca gtacaaagaa ggtatgctgg attccgaagc ggctaactac 1560
tggctgccgg tggatatcta cattggtggt attgaacacg ccattatgca cctgctctac 1620
ttccgcttct tccacaaact gatgcgtgat gcaggcatgg tgaactctga cgaaccagcg 1680
aaacagttgc tgtgtcaggg tatggtgctg gcagatgcct tctactatgt tggcgaaaac 1740
ggcgaacgta actgggtttc cccggttgat gctatcgttg aacgtgacga gaaaggccgt 1800
atcgtgaaag cgaaagatgc ggcaggccat gaactggttt ataccggcat gagcaaaatg 1860
tccaagtcga agaacaacgg tatcgacccg caggtgatgg ttgaacgtta cggcgcggac 1920
accgttcgtc tgtttatgat gtttgcttct ccggctgata tgactctcga atggcaggaa 1980
tccggtgtgg aaggggctaa ccgcttcctg aaacgtgtct ggaaactggt ttacgagcac 2040
acagcaaaag gtgatgttgc ggcactgaac gttgatgcgc tgactgaaaa tcagaaagcg 2100
ctgcgtcgcg atgtgcataa aacgatcgct aaagtgaccg atgatatcgg ccgtcgtcag 2160
accttcaaca ccgcaattgc ggcgattatg gagctgatga acaaactggc gaaagcacca 2220
accgatggcg agcaggatcg cgctctgatg caggaagcac tgctggccgt tgtccgtatg 2280
cttaacccgt tcaccccgca catctgcttc acgctgtggc aggaactgaa aggcgaaggc 2340
gatatcgaca acgcgccgtg gccggttgct gacgaaaaag cgatggtgga agactccacg 2400
ctggtcgtgg tgcaggttaa cggtaaagtc cgtgccaaaa tcaccgttcc ggtggacgca 2460
acggaagaac aggttcgcga acgtgctggc caggaacatc tggtagcaaa atatcttgat 2520
ggcgttactg tacgtaaagt gatttacgta ccaggtaaac tcctcaatct ggtcgttggc 2580
taa 2583
<210> 8
<211> 72
<212> DNA
<213> 人工序列(synthetic sequence)
<400> 8
ggtgaggtga tcatgtagat cgaacggact ctaaatccgt tcagccgggt tagattcccg 60
gcctcaccac ca 72
<210> 9
<211> 72
<212> DNA
<213> 人工序列(synthetic sequence)
<400> 9
ggtgaggtga tcatgtagat cgaacggact tcaaatccgt tcagccgggt tagattcccg 60
gcctcaccac ca 72
<210> 10
<211> 72
<212> DNA
<213> 人工序列(synthetic sequence)
<400> 10
ggtgaggtga tcatgtagat cgaacggact ttaaatccgt tcagccgggt tagattcccg 60
gcctcaccac ca 72
<210> 11
<211> 73
<212> DNA
<213> 人工序列(synthetic sequence)
<400> 11
ggtggctatg atcatgtaga tcgaacggac tctaaatccg ttcagccggg ttagattccc 60
ggtagccacc cca 73
<210> 12
<211> 73
<212> DNA
<213> 人工序列(synthetic sequence)
<400> 12
ggtggctatg atcatgtaga tcgaacggac ttcaaatccg ttcagccggg ttagattccc 60
ggtagccacc cca 73
<210> 13
<211> 73
<212> DNA
<213> 人工序列(synthetic sequence)
<400> 13
ggtggctatg atcatgtaga tcgaacggac tttaaatccg ttcagccggg ttagattccc 60
ggtagccacc cca 73
<210> 14
<211> 72
<212> DNA
<213> 人工序列(synthetic sequence)
<400> 14
ggactcgtga tcatgtagat cgaacggact ctaaatccgt tcagccgggt tagattcccg 60
gcgagtccac ca 72
<210> 15
<211> 72
<212> DNA
<213> 人工序列(synthetic sequence)
<400> 15
ggactcgtga tcatgtagat cgaacggact tcaaatccgt tcagccgggt tagattcccg 60
gcgagtccac ca 72
<210> 16
<211> 72
<212> DNA
<213> 人工序列(synthetic sequence)
<400> 16
ggactcgtga tcatgtagat cgaacggact ttaaatccgt tcagccgggt tagattcccg 60
gcgagtccac ca 72
<210> 17
<211> 72
<212> DNA
<213> 人工序列(synthetic sequence)
<400> 17
ggtaaggtga tcatgtagat cgaacggact ctaaatccgt tcagccgggt tagattcccg 60
gccttaccgc ca 72
<210> 18
<211> 72
<212> DNA
<213> 人工序列(synthetic sequence)
<400> 18
ggtaaggtga tcatgtagat cgaacggact tcaaatccgt tcagccgggt tagattcccg 60
gccttaccgc ca 72
<210> 19
<211> 72
<212> DNA
<213> 人工序列(synthetic sequence)
<400> 19
ggtaaggtga tcatgtagat cgaacggact ttaaatccgt tcagccgggt tagattcccg 60
gccttaccgc ca 72
<210> 20
<211> 72
<212> DNA
<213> 人工序列(synthetic sequence)
<400> 20
ggtaaggtga tcatgtagat cgaacggact ttaaatccgt tcagccgggt tagattcccg 60
gccttaccgc ca 72
<210> 21
<211> 72
<212> DNA
<213> 人工序列(synthetic sequence)
<400> 21
gtgagagtga tcatgtagat cgaacggact ctaaatccgt tcagccgggt tagattcccg 60
gctctcacac ca 72
<210> 22
<211> 72
<212> DNA
<213> 人工序列(synthetic sequence)
<400> 22
gtgagagtga tcatgtagat cgaacggact ctaaatccgt tcagccgggt tagattcccg 60
gctctcacac ca 72
<210> 23
<211> 85
<212> DNA
<213> 人工序列(synthetic sequence)
<400> 23
ggtggggtag cgaagtggct aaacgcggcg gactctaaat ccgctccctt tgggttcggc 60
ggttcgaatc cgtcccccac cacca 85
<210> 24
<211> 86
<212> DNA
<213> 人工序列(synthetic sequence)
<400> 24
ggtggggtag cgaagtggct aaacgcggcg gacttcaaat ccgctccctt tgggttcggc 60
ggttcgaatc cgtcccccac caccaa 86
<210> 25
<211> 85
<212> DNA
<213> 人工序列(synthetic sequence)
<400> 25
ggtggggtag cgaagtggct aaacgcggcg gactttaaat ccgctccctt tgggttcggc 60
ggttcgaatc cgtcccccac cacca 85
<210> 26
<211> 85
<212> DNA
<213> 人工序列(synthetic sequence)
<400> 26
gccgaagtgg cgaaatcggt agacgcagtt gattctaaat caaccgtaga aatacgtgcc 60
ggttcgagtc cggccttcgg cacca 85
<210> 27
<211> 85
<212> DNA
<213> 人工序列(synthetic sequence)
<400> 27
gccgaagtgg cgaaatcggt agacgcagtt gatttcaaat caaccgtaga aatacgtgcc 60
ggttcgagtc cggccttcgg cacca 85
<210> 28
<211> 85
<212> DNA
<213> 人工序列(synthetic sequence)
<400> 28
gccgaagtgg cgaaatcggt agacgcagtt gattttaaat caaccgtaga aatacgtgcc 60
ggttcgagtc cggccttcgg cacca 85
<210> 29
<211> 1506
<212> DNA
<213> 人工序列(synthetic sequence)
<400> 29
atggtgagca agggcgagga ggataacatg gccatcatca aggagttcat gcgcttcaag 60
gtgcacatgg agggctccgt gaacggccac gagttcgaga tcgagggcga gggcgagggc 120
cgcccctacg agggcaccca gaccgccaag ctgaaggtga ccaagggtgg ccccctgccc 180
ttcgcctggg acatcctgtc ccctcagttc atgtacggct ccaaggccta cgtgaagcac 240
cccgccgaca tccccgacta cttgaagctg tccttccccg agggcttcaa gtgggagcgc 300
gtgatgaact tcgaggacgg cggcgtggtg accgtgaccc aggactcctc cctgcaggac 360
ggcgagttca tctacaaggt gaagctgcgc ggcaccaact tcccctccga cggccccgta 420
atgcagaaga agaccatggg ctgggaggcc tcctccgagc ggatgtaccc cgaggacggc 480
gccctgaagg gcgagatcaa gcagaggctg aagctgaagg acggcggcca ctacgacgct 540
gaggtcaaga ccacctacaa ggccaagaag cccgtgcagc tgcccggcgc ctacaacgtc 600
aacatcaagt tggacatcac ctcccacaac gaggactaca ccatcgtgga acagtacgaa 660
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gggagaggaa gtctgctaac atgcggtgac gtcgaggaga atcctggccc aatggtgagc 780
aagggcgagg agctgttcac cggggtggtg cccatcctgg tcgagctgga cggcgacgta 840
aacggccaca agttcagcgt gtccggcgag ggcgagggcg atgccaccta cggcaagctg 900
accctgaagt tcatctgcac caccggcaag ctgcccgtgc cctggcccac cctcgtgacc 960
accctgacct acggcgtgca gtgcttcagc cgctaccccg accacatgaa gcagcacgac 1020
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gacggcaact acaagacccg cgccgaggtg aagttcgagg gcgacaccct ggtgaaccgc 1140
atcgagctga agggcatcga cttcaaggag gacggcaaca tcctggggca caagctggag 1200
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gtgaacttca agatccgcca caacatcgag gacggcagcg tgcagctcgc cgaccactac 1320
cagcagaaca cccccatcgg ctagggcccc gtgctgctgc ccgacaacca ctacctgagc 1380
acccagtccg ccctgagcaa agaccccaac gagaagcgcg atcacatggt cctgctggag 1440
ttcgtgaccg ccgccgggat cactctcggc atggacgagc tgtacaagca tcatcaccat 1500
caccat 1506
<210> 30
<211> 1506
<212> DNA
<213> 人工序列(synthetic sequence)
<400> 30
atggtgagca agggcgagga ggataacatg gccatcatca aggagttcat gcgcttcaag 60
gtgcacatgg agggctccgt gaacggccac gagttcgaga tcgagggcga gggcgagggc 120
cgcccctacg agggcaccca gaccgccaag ctgaaggtga ccaagggtgg ccccctgccc 180
ttcgcctggg acatcctgtc ccctcagttc atgtacggct ccaaggccta cgtgaagcac 240
cccgccgaca tccccgacta cttgaagctg tccttccccg agggcttcaa gtgggagcgc 300
gtgatgaact tcgaggacgg cggcgtggtg accgtgaccc aggactcctc cctgcaggac 360
ggcgagttca tctacaaggt gaagctgcgc ggcaccaact tcccctccga cggccccgta 420
atgcagaaga agaccatggg ctgggaggcc tcctccgagc ggatgtaccc cgaggacggc 480
gccctgaagg gcgagatcaa gcagaggctg aagctgaagg acggcggcca ctacgacgct 540
gaggtcaaga ccacctacaa ggccaagaag cccgtgcagc tgcccggcgc ctacaacgtc 600
aacatcaagt tggacatcac ctcccacaac gaggactaca ccatcgtgga acagtacgaa 660
cgcgccgagg gccgccactc caccggcggc atggacgagc tgtacaaggg aagcggagag 720
gggagaggaa gtctgctaac atgcggtgac gtcgaggaga atcctggccc aatggtgagc 780
aagggcgagg agctgttcac cggggtggtg cccatcctgg tcgagctgga cggcgacgta 840
aacggccaca agttcagcgt gtccggcgag ggcgagggcg atgccaccta cggcaagctg 900
accctgaagt tcatctgcac caccggcaag ctgcccgtgc cctggcccac cctcgtgacc 960
accctgacct acggcgtgca gtgcttcagc cgctaccccg accacatgaa gcagcacgac 1020
ttcttcaagt ccgccatgcc cgaaggctac gtccaggagc gcaccatctt cttcaaggac 1080
gacggcaact acaagacccg cgccgaggtg aagttcgagg gcgacaccct ggtgaaccgc 1140
atcgagctga agggcatcga cttcaaggag gacggcaaca tcctggggca caagctggag 1200
tacaactaca acagccacaa cgtctatatc atggccgaca agcagaagaa cggcatcaag 1260
gtgaacttca agatccgcca caacatcgag gacggcagcg tgcagctcgc cgaccactac 1320
cagcagaaca cccccatcgg ctgaggcccc gtgctgctgc ccgacaacca ctacctgagc 1380
acccagtccg ccctgagcaa agaccccaac gagaagcgcg atcacatggt cctgctggag 1440
ttcgtgaccg ccgccgggat cactctcggc atggacgagc tgtacaagca tcatcaccat 1500
caccat 1506
<210> 31
<211> 1506
<212> DNA
<213> 人工序列(synthetic sequence)
<400> 31
atggtgagca agggcgagga ggataacatg gccatcatca aggagttcat gcgcttcaag 60
gtgcacatgg agggctccgt gaacggccac gagttcgaga tcgagggcga gggcgagggc 120
cgcccctacg agggcaccca gaccgccaag ctgaaggtga ccaagggtgg ccccctgccc 180
ttcgcctggg acatcctgtc ccctcagttc atgtacggct ccaaggccta cgtgaagcac 240
cccgccgaca tccccgacta cttgaagctg tccttccccg agggcttcaa gtgggagcgc 300
gtgatgaact tcgaggacgg cggcgtggtg accgtgaccc aggactcctc cctgcaggac 360
ggcgagttca tctacaaggt gaagctgcgc ggcaccaact tcccctccga cggccccgta 420
atgcagaaga agaccatggg ctgggaggcc tcctccgagc ggatgtaccc cgaggacggc 480
gccctgaagg gcgagatcaa gcagaggctg aagctgaagg acggcggcca ctacgacgct 540
gaggtcaaga ccacctacaa ggccaagaag cccgtgcagc tgcccggcgc ctacaacgtc 600
aacatcaagt tggacatcac ctcccacaac gaggactaca ccatcgtgga acagtacgaa 660
cgcgccgagg gccgccactc caccggcggc atggacgagc tgtacaaggg aagcggagag 720
gggagaggaa gtctgctaac atgcggtgac gtcgaggaga atcctggccc aatggtgagc 780
aagggcgagg agctgttcac cggggtggtg cccatcctgg tcgagctgga cggcgacgta 840
aacggccaca agttcagcgt gtccggcgag ggcgagggcg atgccaccta cggcaagctg 900
accctgaagt tcatctgcac caccggcaag ctgcccgtgc cctggcccac cctcgtgacc 960
accctgacct acggcgtgca gtgcttcagc cgctaccccg accacatgaa gcagcacgac 1020
ttcttcaagt ccgccatgcc cgaaggctac gtccaggagc gcaccatctt cttcaaggac 1080
gacggcaact acaagacccg cgccgaggtg aagttcgagg gcgacaccct ggtgaaccgc 1140
atcgagctga agggcatcga cttcaaggag gacggcaaca tcctggggca caagctggag 1200
tacaactaca acagccacaa cgtctatatc atggccgaca agcagaagaa cggcatcaag 1260
gtgaacttca agatccgcca caacatcgag gacggcagcg tgcagctcgc cgaccactac 1320
cagcagaaca cccccatcgg ctaaggcccc gtgctgctgc ccgacaacca ctacctgagc 1380
acccagtccg ccctgagcaa agaccccaac gagaagcgcg atcacatggt cctgctggag 1440
ttcgtgaccg ccgccgggat cactctcggc atggacgagc tgtacaagca tcatcaccat 1500
caccat 1506
<210> 32
<211> 975
<212> DNA
<213> 人工序列(synthetic sequence)
<400> 32
accaacatca ttacctttta taatcagcta caacaattgg aacagatgac aactactgcc 60
gaaaacttgt tgaaaaccca gtctaccacc ctatcagagc caacagcaat taaaagccag 120
ttaaaaattt gtaaggatga agtcaacaga ttgtcagctc ttcagcctca aattgagcaa 180
ttaaaaattc agagtctaca actgaaagaa aagggacagg ggccaatgtt tctggatgca 240
gactttgtgg cctttactaa tcattttaac cacatctttg atggtgtgag ggccaaagag 300
aaagagctac agacaatttt tgacacttta ccaccaatgc gctatcagga gacaatgagt 360
agcatcagga cgtggatcca gcagtcagaa agcaaactct ctgtacctta tcttagtgtt 420
actgaatatg aaataatgga ggagagactc gggaaattac aggctctgca aagttctttg 480
aaagagcaat aaaatggctt caactatctg agtgacactg tgaaggagat ggccaagaaa 540
gcaccttcag aaatatgcca gaaatatctg tcagaatttg aagagattga ggggcactgg 600
aagaaacttt cctcccagtt ggtggaaagc tgccaaaagc tagaagaaca tatgaataaa 660
cttcgaaaat ttcagaatca cataaaaacc ttacagaaat ggatggctga agttgatgtt 720
ttcctgaaag aggaatggcc tgccctgggg gatgctgaaa tcctgaaaaa acagctcaaa 780
caatgcagac ttttagttgg tgatattcaa acaattcagc ccagtttaaa tagtgttaat 840
gaaggtgggc agaagataaa gagtgaagct gaacttgagt ttgcatccag actggagaca 900
gaacttagag agcttaacac tcagtgggat cacatatgcc gccaggtcta caccagaaag 960
gaagccttaa aggca 975
<210> 33
<211> 651
<212> DNA
<213> 人工序列(synthetic sequence)
<400> 33
cttgtaattc ctgcacctgg aactggtgtg actatgggag aaaaaggaaa tatcgggtta 60
cctggtttgc ctggagaaaa gggagagcga ggatttcctg gaatacaagg tccacctggc 120
tttcctggac ctccaggaac agcagttgtg ggtccccctg gtcctcctgg atatcctggt 180
gaaaggggcc agaaaggtga tgaaggtccc cctggaattt gtattcctgg atctcctgga 240
cttgatggac agcctggggc tcctggcctt ccaggacctc ctggcccccc tggcccccag 300
ttgccatcca gagatgaaat ctgtaaagca ggccctcctg ggcctccagg acctccaggt 360
gataaaggac tccaaggaga gtgaggagta aaaggtgaca aaggtgatac ttgcttcaac 420
tgtattggaa ctggcatttc agggcctcca ggccaacctg gtttaccagg tctcccaggt 480
cctccaggat ctcttggaat ccctggagag aagggggaca aaggacaagc tgggataact 540
ggtccgaaag gattgccagg catacctgga cctccaggtg ctccaggctt tccagggtct 600
aagggtgacc ctggggatgt cctcactctt ccaggaatga aaggtgacaa a 651
<210> 34
<211> 531
<212> DNA
<213> 人工序列(synthetic sequence)
<400> 34
catttatcag aaaccttcga caacattgac aacctaagtc ccaaggcctc tcaccggagt 60
aagcagagac acaagcagaa tctttatggt gactatgctt ttgacgccaa tcgacatgat 120
gatagtaggt cagacaattt caatactgga aacatgactg ttctttcacc atatttaaat 180
actacggtat tgcccagctc ttcttcctca aggggaagtt tagacagttc tcgttctgag 240
aaagacagaa gttagtagag agagcgaggt attggcctca gtgcttacca tccaacaaca 300
gaaaatgcag gaacctcatc aaaacgaggt ctgcagatca ctaccactgc agcccagata 360
gccaaagtta tggaagaagt atcagccatt catacctccc aggacgacag aagttctgct 420
tctaccaccg agttccattg tgtggcagac gacaggagtg cggcacgaag aagctctgcc 480
tcccacacac actcaaacac atacaacttc actaagtcgg aaaattcaaa t 531

Claims (8)

1.一种正交翻译系统，包括正交tRNA和正交氨酰-tRNA合成酶，其特征在于：
正交tRNA，所述tRNA的反密码子能识别三种终止密码子UAG/UGA/UAA中的任一序列，且所述tRNA能被对应的正交氨酰-tRNA合成酶识别；
正交氨酰-tRNA合成酶，所述正交氨酰-tRNA合成酶能将对应的氨基酸连接到与其正交tRNA上形成氨酰tRNA；
所述正交翻译系统选自以下tRNA与氨酰tRNA合成酶正交对中的一种或多种，
chPheRS/chPheTCUA
chPheRS/chPheTUCA
chPheRS/chPheTUUA
其中，正交氨酰-tRNA合成酶chPheRS的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，
正交tRNA chPheTCUA、chPheTUCA、chPheTUUA的核苷酸序列依次如SEQ ID NO.8～10所示。
2.根据权利要求1所述的正交翻译系统，其特征在于：所述的氨基酸为苯丙氨酸。
3.一种宿主细胞，其包含编码权利要求1所述的正交氨酰-tRNA合成酶的核苷酸序列和相对应的正交tRNA序列。
4.根据权利要求3所述的宿主细胞，其特征在于：所述宿主细胞是哺乳动物细胞。
5.根据权利要求3所述的宿主细胞，其特征在于：采用HEK 293T 细胞评价正交翻译系统效率。
6.一种非诊断或治疗目的利用正交翻译系统再分配密码子恢复PTC疾病中功能蛋白表达的方法，所述PTC疾病是由基因无义突变形成提前终止密码子（PTC）所引起的疾病，其特征在于所述方法包括下述步骤：
(a) 提供权利要求1所述的正交翻译系统，
和
(b) 将所述正交翻译系统导入到宿主细胞中，在无义突变的mRNA翻译期间，正交氨酰-tRNA合成酶识别正交tRNA并使其携带对应的天然氨基酸，携带天然氨基酸的正交tRNA解码无义突变的mRNA上的无义突变密码子，并将天然氨基酸引入到无义突变位置，实现恢复提前终止密码子疾病中功能蛋白的正常表达和功能行使。
7.根据权利要求6所述的一种非诊断或治疗目的利用正交翻译系统再分配密码子恢复PTC疾病中功能蛋白表达的方法，其特征在于：所述正交翻译系统的正交tRNA和正交氨酰-tRNA合成酶以质粒或病毒或RNA 的方式导入到宿主细胞。
8.一种权利要求1所述的正交翻译系统在制备治疗由基因无义突变形成提前终止密码子（PTC）所引起的疾病的药物中的应用，所述疾病是奥尔波特综合征、杜氏和贝克尔肌营养不良或家族性腺瘤性息肉病。
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Citations (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2005019415A2 (en) * 2003-07-07 2005-03-03 The Scripps Research Institute Compositions of orthogonal lysyl-trna and aminoacyl-trna synthetase pairs and uses thereof
CN106190983A (zh) * 2006-09-08 2016-12-07 Ambrx公司 用于脊椎动物细胞的杂合抑制tRNA
CN107012121A (zh) * 2016-01-27 2017-08-04 北京大学 携带正交tRNA/氨酰tRNA合成酶的稳定细胞系的构建
CN107177593A (zh) * 2016-03-10 2017-09-19 北京大学 利用优化的基因密码子扩展系统通读提前终止密码子疾病中的截短蛋白
WO2018161032A1 (en) * 2017-03-03 2018-09-07 The Regents Of The University Of California RNA TARGETING OF MUTATIONS VIA SUPPRESSOR tRNAs AND DEAMINASES
CN110172467A (zh) * 2019-05-24 2019-08-27 浙江大学 一种利用嵌合设计方法构建正交的氨酰-tRNA合成酶/tRNA体系
CN110835633A (zh) * 2018-08-13 2020-02-25 北京大学 利用优化的基因密码子扩展系统制备ptc稳定细胞系及应用
CN111118048A (zh) * 2019-11-11 2020-05-08 浙江大学 嵌合苯丙氨酰-tRNA合成酶/tRNA的应用
CN111849929A (zh) * 2019-04-30 2020-10-30 苏州鲲鹏生物技术有限公司 高效引入赖氨酸衍生物的氨酰基—tRNA合成酶
WO2021165968A1 (en) * 2020-02-20 2021-08-26 B. G. Negev Technologies And Applications Ltd., At Ben-Gurion University Mutant aminoacyl-trna synthetases
WO2022032186A2 (en) * 2020-08-07 2022-02-10 Brickbio, Inc. Stable cell lines for site-specific incorporation of unnatural amino acids

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2155890A4 (en) * 2007-04-13 2010-04-21 Salk Inst For Biological Studi METHODS FOR GENETICALLY ENCODING NON-NATURAL AMINO ACIDS IN EUKARYOTIC CELLS USING ORTHOGONAL ARNTA / SYNTHASE PAIRS

Patent Citations (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101076598A (zh) * 2003-07-07 2007-11-21 斯克利普斯研究院 正交赖氨酰－tRNA和氨酰－tRNA合成酶对的组合物及其应用
WO2005019415A2 (en) * 2003-07-07 2005-03-03 The Scripps Research Institute Compositions of orthogonal lysyl-trna and aminoacyl-trna synthetase pairs and uses thereof
CN106190983A (zh) * 2006-09-08 2016-12-07 Ambrx公司 用于脊椎动物细胞的杂合抑制tRNA
CN107012121A (zh) * 2016-01-27 2017-08-04 北京大学 携带正交tRNA/氨酰tRNA合成酶的稳定细胞系的构建
CN107177593A (zh) * 2016-03-10 2017-09-19 北京大学 利用优化的基因密码子扩展系统通读提前终止密码子疾病中的截短蛋白
WO2018161032A1 (en) * 2017-03-03 2018-09-07 The Regents Of The University Of California RNA TARGETING OF MUTATIONS VIA SUPPRESSOR tRNAs AND DEAMINASES
CN110612353A (zh) * 2017-03-03 2019-12-24 加利福尼亚大学董事会 经由抑制性tRNAs和脱氨酶对突变进行RNA靶向
CN110835633A (zh) * 2018-08-13 2020-02-25 北京大学 利用优化的基因密码子扩展系统制备ptc稳定细胞系及应用
CN111849929A (zh) * 2019-04-30 2020-10-30 苏州鲲鹏生物技术有限公司 高效引入赖氨酸衍生物的氨酰基—tRNA合成酶
CN110172467A (zh) * 2019-05-24 2019-08-27 浙江大学 一种利用嵌合设计方法构建正交的氨酰-tRNA合成酶/tRNA体系
CN111118048A (zh) * 2019-11-11 2020-05-08 浙江大学 嵌合苯丙氨酰-tRNA合成酶/tRNA的应用
WO2021165968A1 (en) * 2020-02-20 2021-08-26 B. G. Negev Technologies And Applications Ltd., At Ben-Gurion University Mutant aminoacyl-trna synthetases
WO2022032186A2 (en) * 2020-08-07 2022-02-10 Brickbio, Inc. Stable cell lines for site-specific incorporation of unnatural amino acids

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Amber codon is genetically unstable in generation of premature termination codon (PTC)-harbouring Foot-and-mouth disease virus (FMDV) via genetic code expansion;Hao RZ等;《RNA Biology》;第18卷(第12期);第2330-2341页 *
Directed-evolution of translation system for efficient unnatural amino acids incorporation and generalizable synthetic auxotroph construction;Hongxiao Zhao等;《Nature Communications》;第12卷(第1期);全文 *
Generation of Premature Termination Codon (PTC)-Harboring Pseudorabies Virus (PRV) via Genetic Code Expansion Technology;Tong-Yun Wang等;《Viruses》;第14卷(第3期);全文 *
Recent Developments of Engineered Translational Machineries for the Incorporation of Non-Canonical Amino Acids into Polypeptides;Naohiro Terasaka等;《Int J Mol Sci》;第16卷(第3期);第6513-6531页 *
基于遗传密码扩展技术构建复制可控的重组口蹄疫病毒的研究;郝荣增;《中国博士学位论文（电子期刊）基础科学辑》(第1期);全文 *

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